CN105601746B - 一种嵌合Fc受体的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嵌合Fc受体的融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。该融合蛋白可以与IgG的Fc结合，尤其是在与IgG的免疫复合物结合后，能够有效激活嵌合Fc受体细胞内部的信号传导功能，刺激细胞活化、增殖和分化，最终激活其免疫杀伤功能。

Description

一种嵌合Fc受体的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型重组融合蛋白及其制备方法和应用，特别涉及一种嵌合了Fc受体的重组融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。

大量研究表明，肿瘤在形成过程中，可通过多重机制，逃避免疫系统的监视，我们将这一过程称之为肿瘤组织的免疫逃逸或免疫编辑。T细胞在肿瘤免疫的过程中处于核心地位，如果能调动体内的杀伤武器，将是非常有效且安全的治疗策略。T细胞的活化启动和效应发挥的过程中至少需要两种信号存在，第一种信号是抗原特异性的，由主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)以及与其结合的抗原肽被T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别并结合后，由TCR复合物向T细胞内传导激活信号；第二种激活信号是抗原非特异性的，是由抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)和T细胞上多种辅助分子之间的配对和相互作用而提供的，能够提供第二种激活信号的一类T细胞膜蛋白又被称为共刺激分子，在T细胞活化中发挥重要作用。

随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中起主要作用，包括CIK(cytokine-induced killer)细胞治疗在内的T细胞过继性细胞免疫治疗虽然在部分肿瘤中取得了一定的效果，但在大多数肿瘤中疗效尚不能令人满意。近年来发展的利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的T细胞显示出持久的靶向杀伤活性，为过继性细胞免疫治疗注入了新的解决方案。CAR是将识别肿瘤相关抗原的ScFv(single-chain variablefragment，ScFv)单链抗体、跨膜区和能诱导T细胞活化的信号转导结构域在体外进行基因重组，形成重组质粒，在体外通过慢病毒转染技术转染经纯化和大规模扩增后的T细胞，稳定表达CAR的T细胞称之为CAR-T细胞。这种基因改造也可帮助T细胞直接识别肿瘤而不必要求通过TCR来识别MHC-抗原肽的限制性。临床前和临床研究均显示(Cancer Res 2010；70:9053-9061；Sci Transl Med 3，95ra73)，CAR-T在体外及体内均有对特定肿瘤抗原的高度亲和性及对抗原负荷细胞的高效杀伤性。

CAR-T细胞较其他基于T细胞的治疗方式存在以下优势：①使用患者自体细胞，降低排异反应风险；②鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；③CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围；④CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制；⑤CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

通常情况下，CAR包含一个用来识别肿瘤细胞表面抗原的胞外结构域，一个保证抗原识别域具有一定自由度铰链区，一个跨膜结构域，以及一个或几个串联的胞内结构域/模体(motif)用以触发能导致T细胞活化的下游信号(Leukemia(2004)18,676–684)。大多数CAR的抗原识别域是一种ScFv单链抗体，整合了单克隆抗体重链和轻链的可变区。许多CAR的识别域来自抗体可变区，这可能被宿主的免疫系统识别并导致抗可变区片段的免疫反应，这有可能限制体内过继性T细胞的持久性。最初CAR的胞内信号转导结构域/模体一般仅含有CD3ζ结构域，往往不能有效诱导T细胞的活化，但经过近十年的发展，新一代融合了多种免疫共刺激分子(如CD28和4-1BB等)信号转导结构域的CAR能够充分诱导过继性T淋巴细胞的增殖和效应活性(Molecular Therapy vol.17no.8,1453–1464aug.2009)。CD28分子在调节淋巴细胞生存和增殖方面有着重要作用，也对的效应功能和细胞记忆的建立起着关键作用；这些作用的产生是由于募集如PI3K，Grb2和Lck之类的信号转导分子，这些分子反过来调节关键转录因子如NF-κB的活性，进而增加IL-2和INF-γ的合成和分泌。TNF受体超家族，如4-1BB，也为维持T细胞应答提供共刺激信号，在T细胞生存和CD8⁺T细胞的记忆维持中发挥关键作用；这类受体通过招募肿瘤坏死因子受体相关因子-1/2(TNF receptor-associated factor 1/2，TRAF1)和下游的衔接子，激活下游的MAPK和NF-κB信号途径。

寻找完美的信号组合时，除了增加共刺激结构域，目前还有其他一些方法用于增加CARs的抗肿瘤活性。在最近的一项研究中，经基因改造的T细胞表达含CD28和CD3ζ结构域的CARs并产生IL-15(一种对T淋巴细胞稳态和生存至关重要的细胞因子)，这一组合将使T淋巴细胞在体内和体外具有较高的生存能力和增殖潜能，以及体内更高效的抗肿瘤活性。另外，过继性T淋巴细胞还可被修饰使其可诱导表达自杀基因iCasp9以限制其增殖和毒性，因为这些刺激信号的结合可以造成危险的无法控制的过度增殖。

最初的CAR用总的T淋巴细胞作为基因转化的靶细胞。然而，最近研究显示，中央记忆性T细胞(central memory T cells)这一亚群更适合进行CAR转移，它们在体内具有更持久性且更高效的抗肿瘤活性。除了利用T淋巴细胞外，一些研究者提出利用其它淋巴细胞群进行CAR修饰。例如，NK细胞经过CAR修饰后，对靶细胞表现出高的细胞毒性。

重度免疫缺陷小鼠(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull，NOG)是体内检测CARs修饰淋巴细胞最常用的动物模型。这种小鼠没有成熟的T和B淋巴细胞，允许接种人细胞(肿瘤细胞或淋巴细胞)到体内而没有明显的排斥反应。

FcR为一类能结合免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)可结晶段(fragmentcrystallizable，Fc)的受体，在免疫调节过程中发挥重要作用。人Ig根据其重链的差异可分为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五类，各类Ig的功能差异主要与其Fc段结构有关。机体内许多细胞表面表达不同类Ig的Fc受体，通过Fc受体与Fc的结合，参与Ig介导的生理功能或病理损伤过程。目前已鉴定明确属于簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)的Fc受体有FcγR、FcαR、FcεR，它们分别可以结合IgG、IgA和IgE。

小鼠FcγR有四种，分别为FcγRI、FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIV。FcγR很保守，相应的人类蛋白为FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIC、FcγRIIIA(CD16A)和FcγRIIIB(CD16B)。从结构上说，FcR及其配体都属于一个免疫球蛋白的大家族。大多数FcγR都有两个胞外结构域，而FcγRI有三个。按照它们与配体结合的亲和力不同，FcγR又可大致分为高亲和力和低亲和力受体；按照它们的功能差异，FcγR可大致分为激活性和抑制性受体。小鼠和人的FcγR中，FcγRI均为唯一高亲和力受体，而其它均为低亲和力受体。信号通路方面，小鼠和人的FcγRIIB结合相应配体后可以转导抑制性信号，其它FcγR一般在配体结合后转导激活性信号。

CAR-T细胞技术在美国已获得III期临床研究许可。目前，重大产业项目部门致力于CAR技术的前期技术转化及与现有CIK-Prominent技术的产业整合研究。在此，我们将常规CAR识别肿瘤相关抗原的ScFv置换成FcγR的Fc结合结构域，构建了一类新型嵌合Fc受体，转染这类受体的T细胞与肿瘤特异性抗体组合使用，在体外对表达特定抗原的肿瘤细胞具有很高的杀伤效能，在体内也有很好的抑制肿瘤生长的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的嵌合了Fc受体的融合蛋白及其制备方法和应用，该融合蛋白能与Ig结合并诱导T细胞活化从而实现抗肿瘤的作用。

本发明的第一方面，提供了一种嵌合Fc受体的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4。

本发明的第二方面，提供了一种编码本发明第一方面所述融合蛋白的核苷酸序列，编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；编码氨基酸序列SEQ IDNO:4的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种工程T细胞，所述工程T细胞含有本发明第三方面所述的载体或其基因组中整合有本发明第二方面所述的核苷酸序列。

本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的融合蛋白或本发明第四方面所述的工程T细胞，以及药学上可接受的载体。

本发明的第六方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的融合蛋白的方法，其步骤包括：在合适的表达条件下，培养本发明第四方面所述的工程T细胞，并表达本发明第一方面所述的融合蛋白。

本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白或表达所述融合蛋白的工程T细胞在制备抗肿瘤的药物的应用。

本发明公开的上述嵌合Fc受体的融合蛋白可通过本领域常规方法得到的，例如：编码人源FcγRIA(CD64)和FcγRIIIA(CD16A)的cDNA购买自北京义翘神州生物技术有限公司，其序列分别与国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)中所提供的参照序列NM000566.3、NM001136219.1和NM001127596.1相同。嵌合Fc受体，为包含FcγR的Fc结合结构域、跨膜区和能诱导T细胞活化的信号转导结构域的融合蛋白。其中跨膜区和信号转导结构域参照专利US 20130309258 A1。上述FcγR的Fc结合结构域分别与跨膜区和信号转导结构域以重叠PCR法重组后克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1(Clontech公司产品)中构建成真核表达载体；用脂质体法将上述表达载体质粒与病毒包装质粒转染HEK293细胞，通过过滤和高速离心制备高滴度复制缺陷的转染用病毒。用血液透析白细胞去除法分离健康志愿者提供的血液样品中的原代人白细胞，然后用试剂盒RossetSep(购买自Stem cell technology公司)进一步富集CD4和CD8阳性T细胞，所得细胞在培养基中和抗CD3/CD28抗体包被的免疫磁珠共同培养以使T细胞群体扩增。用上述病毒转染所获得的扩增后的T细胞，进而得到稳定持续表达嵌合Fc受体的治疗用基因工程T细胞。

本发明的发明人对上述嵌合Fc受体进行亲和力检测、基因工程T细胞增殖实验、体内抑制肿瘤生长等实验。实验结果表明，本发明公开的基因工程T细胞可以与IgG的Fc结合，尤其是在与IgG的免疫复合物结合后，能够有效激活嵌合Fc受体细胞内部的信号传导功能，刺激细胞活化、增殖和分化，最终激活其免疫杀伤功能。实验表明，与相应IgG抗体组合使用，基因工程T细胞在体内外对表达特定抗原的肿瘤细胞均具有很高的杀伤效能。

现有CAR-T细胞在移植到患者体内后经常会导致无法控制的强烈免疫反应，细胞因子大量分泌，从而产生严重的毒副作用。然而，本发明融合蛋白能够通过调整相应抗体的使用剂量来控制毒副作用。另外，本发明CAR-T细胞能够与靶向多种抗原的抗体组合使用，可以用于治疗不同类型的疾病而不用重新设计新的基因表达载体。

附图说明

图1是CD64-CART和CD16A-CART对IgG Fc段的亲和力效果图；

图2是由抗体介导的细胞毒作用结果图；

图3是由抗体介导的细胞因子产生结果图；

图4是由Trastuzumab介导的体内抗肿瘤作用效果图；

图5是由Cetuximab介导的体内抗肿瘤作用效果图；

图6是由Rituximab介导的体内抗肿瘤作用效果图。

具体实施方式

以下实施例、实验例是对本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对常规方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。

实施例1.嵌合Fc受体表达载体的构建以及慢病毒制备

编码人源FcγRIA(CD64)和FcγRIIIA(CD16A)的cDNA购买自北京义翘神州生物技术有限公司。其中跨膜区和信号转导结构域参照专利US20130309258 A1中的SEQ ID NO12，其编码序列由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成。根据DNA序列分别设计引物用聚合酶链式反应扩增FcγR基因的Fc结合结构域编码区，以及跨膜区和信号转导结构域的编码区；设计引物时引入一定长度的互补重叠区，以便用重组PCR法将Fc结合结构域基因连接到跨膜区和信号转导结构域的基因片段上。

PCR均采用高保真DNA聚合酶(例如：Takara公司的

HS DNAPolymerase)。反应条件按照DNA聚合酶生产商说明书合理设置：95℃ 20秒；55℃ 10秒，72℃ 1分/kb；30个循环。以上PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后用于重组PCR的模板，重组PCR反应条件为：95℃ 20秒；55℃ 10秒，72℃2分；6个循环后再加入相应的引物；95℃ 20秒；55℃ 10秒，72℃ 1分/kb。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2分别显示了嵌合CD64的核苷酸和氨基酸序列；SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4分别显示了嵌合CD16A的核苷酸和氨基酸序列。

携带目的基因的慢病毒载体与相应慢病毒包装质粒共同转染HEK293细胞，48小时后收集细胞上清液，0.45μm滤膜过滤后，4℃以25000rpm离心2h，离心前在离心管底部加入2ml含有20％蔗糖的磷酸盐缓冲溶液形成一个蔗糖垫。离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。100μL冷PBS重悬，并轻轻吹打溶解沉淀，注意避免产生气泡，-80℃冻存。

实施例2.表达嵌合Fc受体的基因工程T细胞的制备

分离白细胞的血液样品均来自健康志愿者。血液的采集遵循本公司机构审查委员会和并获得志愿者的签署的知情同意书。人外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)通过以下方法获得：在离心管中加入适量PBMC(Sigma公司产品)；取肝素抗凝静脉血与等量RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面；水平离心2000rpm×20分钟；离心后管内分为三层，上层为血浆和RPMI1640，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，此细胞层包含单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，此外，还含有皿小板；用滴管擦到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一离心管中，加入5倍以上体积的RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次；末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞；取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计细胞总数和活率。然后获得的PBMC用试剂盒RossetSep(购买自Stem celltechnology公司)进一步富集CD4和CD8阳性T细胞，所得细胞在培养基中和抗CD3/CD28抗体包被的免疫磁珠(Life technologies公司产品；磁珠与细胞之比为1：3)于37℃、5％CO₂培养箱中共同培养以使T细胞群体扩增；第二天，用上述病毒转染所获得的扩增后的T细胞，进而得到稳定持续表达嵌合Fc受体的基因工程T细胞；第四天，洗涤细胞除去残余病毒粒子，继续培养；第六天，在小型生物反应器中继续培养；第十天左右，除去免疫磁珠，离心收集细胞，洗涤和浓缩后，将所得细胞用可注射的冷冻培养基冻存于液氮。最终得到的两种工程T细胞根据嵌合受体的来源分别命名为CD64-CART和CD16A-CART。

实施例3.基因工程T细胞对IgG Fc亲和力检测实验-流式细胞法

实验步骤：上述两种基因工程T细胞分别用磷酸盐缓冲液(以下简称PBS:135mMNaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄；pH 7.2)洗涤后将细胞密度均调整为2×10⁵/ml；上述每种细胞悬液分成若干小份，各份中加入梯度释度的Trastuzumab(购买自罗氏制药有限公司)、Cetuximab(购买自默克雪兰诺公司)或Rituximab(购买自罗氏制药有限公司)；共同孵育一小时后，用PBS洗涤细胞两遍；用相同体积的PBS重悬细胞后，加入相同浓度的FITC标记的羊抗人IgGκ链抗体F(ab′)₂段(Sigma公司产品)；孵育一小时后，在流式细胞仪(BD公司FACSCalibur)上测定细胞的平均荧光强度。

实验结果：如图1所示，上述上述两种基因工程T细胞均可结合IgG抗体Trastuzumab、Cetuximab或Rituximab，其中CD64-CART的结合力明显强于CD16A-CART。

实施例4.基因工程T细胞的由抗体介导的细胞毒作用和细胞因子产生

实验步骤：PBMC获得方法与与实施例2中所述相同；PBMC作为效应细胞与作为靶细胞的BT474(乳腺癌细胞系，购自ATCC)、HT29(结肠癌细胞系，购自ATCC)和Daudi细胞(Burkitt淋巴瘤细胞系，购自ATCC)(分别高表达肿瘤相关抗原HER2、EGFR和CD20)分别混合，效应细胞与靶细胞之比为20：1；另外，上述基因工程T细胞作为效应细胞也分别与BT474、HT-29和Daudi等靶细胞以20：1的比例混合；然后在含有BT474、HT-29和Daudi的混合细胞培养物中分别加入梯度稀释的Trastuzumab、Cetuximab和Rituximab，共同孵育4小时；然后用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒检测试剂盒(Roche公司产品)检测细胞培养上清中LDH的活性。

丝裂霉素处理过的BT474、HT29和Daudi细胞分别与上述基因工程T细胞以1：20的比例混合，然后在细胞培养混合物中分别加入梯度稀释的Trastuzumab、Cetuximab和Rituximab，于37℃、5％CO₂培养箱中共同孵育24小时；然后取细胞培养物上清用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定上清中IL-2的含量。ELISA法测定上清中IL-2含量的具体实施步骤如下：大鼠抗人的IL-2捕获抗体(BD Biosciences公司产品)用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释成2μg/ml，96孔酶标板(Corning公司产品)每孔添加100μl上述稀释后的抗体溶液，置于37℃恒温箱中孵育2小时；用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗3次，每次3分钟；然后加入封闭液(含有5％脱脂奶粉的0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)，于4℃冰箱内过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；将稀释4倍的100μl上清加于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时；用洗涤缓冲液洗涤后，加浓度1μg/ml的生物素化大鼠抗人的IL-2检测抗体(BD Biosciences公司产品)于各反应孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时；洗涤缓冲液洗涤后，加浓度1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP，BD Biosciences公司产品)于各反应孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时；用洗涤缓冲液洗涤后，于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl显色，37℃放置10～30分钟；于各反应孔中加入2M硫酸50μl终止反应；置SpectraMax i3酶标仪(美国Molecular Devices公司产品)测定450nm波长处吸光值。

如图2和图3所示，结果表明上述基因工程T细胞与相应抗体组合后可以通过裂解靶细胞实现杀伤作用，细胞毒性明显强于PBMC，并且可同时分泌与增强免疫紧密相关的细胞因子IL-2。

实施例5.基因工程T细胞的体内抗肿瘤作用

为检测抗基因工程T细胞的体内抗肿瘤活性，此处采用以重度免疫缺陷NOG小鼠为宿主的人肿瘤移植模型。由于实验规模的限制和处于动物保护的考虑，此实施例只选用CD64-CART进行相关动物实验。

将BT474接种于5-6周龄的雄性NOG小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)右侧皮下，待接种细胞需要与一定量的Matrigel(BD Bioscience公司产品)预先混合，每只接种1×10⁷个肿瘤细胞，；待肿瘤生长至200mm³左右时，将小鼠随机分组，每组8只，各个实验组分别向肿瘤内部直接注射Trastuzumab或相应抗体与CD64-CART细胞的组合，各个对照组分别注射无关对照蛋白人IgG1或无关对照人IgG1与CD64-CART细胞的组合，Trastuzumab剂量设置为0.5和2mg/kg；一周后再重复给予相同处理一次。

将HT-29接种于5-6周龄的雄性NOG小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)右侧皮下，每只接种5×10⁶个肿瘤细胞；待肿瘤生长至200mm³左右时，将小鼠随机分组，每组8只，各个实验组分别向肿瘤内部直接注射Cetuximab或相应抗体与CD64-CART细胞的组合，各个对照组分别注射无关对照蛋白人IgG1或无关对照人IgG1与CD64-CART细胞的组合，Cetuximab剂量设置为1和4mg/kg；一周后再重复给予相同处理一次。

尾静脉注射将Daudi接种于5-6周龄的雄性NOG小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，每只接种1×10⁵个肿瘤细胞；第二天将小鼠随机分组，每组8只，各个实验组分别向肿瘤内部直接注射Rituximab或相应抗体与CD64-CART细胞的组合，各个对照组分别注射无关对照蛋白人IgG1或无关对照人IgG1与CD64-CART细胞的组合，Rituximab剂量设置为0.5和2mg/kg；一周后再重复给予相同处理一次。

每3天用游标卡尺测量肿瘤直径的长(a)和宽(b)，用如下公式计算肿瘤体积：V＝a×b²/2；最后用统计软件GraphPad Prism 5作图并分析实验结果。对接种Daudi细胞的小鼠，每天统计各组小鼠的死亡情况，最终数据用Kaplan-Meier生存曲线分析。

结果表明：如图4所示，对于免疫缺陷小鼠的BT474移植瘤模型，Trastuzumab和抗体与CD64-CART细胞的组合均明显能够显著抑制肿瘤的生长，但后者能够使肿瘤完全消退并且长时间不再复发；如图5所示，对于免疫缺陷小鼠的HT29移植瘤模型，Cetuximab没有显著抑制肿瘤的生长，而抗体与CD64-CART细胞的组合能够使显著抑制肿瘤生长，在抗体高剂量时甚至使肿瘤完全消退；如图6所示，对于免疫缺陷小鼠的Daudi移植瘤模型，Rituximab显著延长了小鼠的生存率，但抗体与CD64-CART细胞的组合比Rituximab能够更加显著地延长生存率，在抗体剂量最高时小鼠的生存率也最高。

Claims (7)

1.一种嵌合Fc受体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:2。

2.一种编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，编码氨基酸序列SEQID NO:2的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.一种表达权利要求1所述融合蛋白的载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一种表达权利要求1所述融合蛋白的工程T细胞，其特征在于，所述工程T细胞含有权利要求3所述的载体或其基因组中整合有权利要求2所述的核苷酸序列。

5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的融合蛋白或表达权利要求1所述融合蛋白的工程T细胞，以及药学上可接受的载体。

6.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：在合适的表达条件下，培养权利要求4所述的工程T细胞，并表达权利要求1所述的融合蛋白。

7.权利要求1所述融合蛋白或表达权利要求1所述融合蛋白的工程T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为乳腺癌、结肠癌或Burkitt淋巴瘤。

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