ES2641870T3

ES2641870T3 - Utilización de linfocitos T modificados con receptores de antígeno quiméricos para tratar el cáncer

Info

Publication number: ES2641870T3
Application number: ES11846757.0T
Authority: ES
Inventors: Carl H. June; Bruce L. Levine; David L. Porter; Michael D. Kalos; Michael C. Milone
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: PT3214091T; NI201300051A; TR201820015T4; HRP20171577T1; HUS1900006I1; JP2014507118A; CN106220739A; PL3214091T3; CY2019007I2; HUS1900007I1; PL2649086T3; EP3214091B1; JP2018029595A; US9102760B2; MX385933B; SI2649086T1; US9499629B2; LT2649086T; CL2013001645A1; KR102417796B1

Description

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establecieron usando controles de FMO (CAR, CD45RA, PD-1, CD25, CD127, CCR7) o seleccionando poblaciones de células positivas (CD3, CD4, CD8) y subgrupos claramente delineados (CD27, CD28, CD57); los datos se mostraron después de la transformación biexponencial para la visualización objetiva de los eventos. La figura 4D muestra la capacidad funcional de las células CAR persistentes. Las muestras de sangre periférica congeladas de UPN 03 obtenidas por aféresis a los días 56 y 169 después de la infusión de linfocitos T reposaron durante la noche en medio de cultivo sin factores añadidos, se lavaron y se evaluaron directamente ex vivo para la capacidad de reconocer células diana que expresan CD19 usando ensayos de desgranulación de CD107. Después de una incubación de dos horas en presencia de anti-CD28, anti-CD49d y CD107-FITC, se recogieron las mezclas de células, se lavaron y se sometieron a un análisis citométrico de flujo multiparamétrico para evaluar la capacidad de las células CART19 de desgranular en respuesta a las dianas que expresan CD19. La estrategia de selección implicó una selección inicial en células CD3-PE-positivas y canales de descarte (CD14-PE-Cy7, CD16-PE-Cy7, Live/Dead Aqua) negativas, seguido por selección en células CD8-PE-Texas Red positivas; los datos presentados corresponden a la población seleccionada por CD8+. En todos los casos, se establecieron cuadrantes de selección negativa en controles no teñidos.

La Figura 5, que comprende las Figuras 5A a 5C, es una serie de imágenes que representan los resultados de experimentos que evalúan respuestas clínicas después de la infusión de células CART19. La Figura 5A muestra que UPN 02 se trató con dos ciclos de rituximab y bendamustina con una respuesta mínima (R/B, flecha). Los linfocitos T CART19 se infundieron comenzando 4 días después de bendamustina solamente (B, flecha). El rituximab y la leucemia resistente a bendamustina se eliminaron rápidamente de la sangre, como se indica por una disminución en el recuento absoluto de linfocitos (ALC) de 60.600/ml a 200/ml dentro de los 18 días de la infusión. El tratamiento con corticosteroides se inició el día 18 después de la infusión debido a malestar y síndrome febril no infeccioso. La línea de referencia (punteada) indica el límite superior normal para ALC. La Figura 5B representa los resultados de experimentos ejemplares que tiñen una biopsia de corte secuencial de médula ósea o especímenes de coágulos de pacientes UPN 01 y 03 para CD20. La infiltración de pretratamiento con leucemia presente en ambos pacientes estuvo ausente en muestras post tratamiento acompañadas de normalización de la celularidad y hematopoyesis de triple linaje. UPN 01 no ha detectado ninguna célula LLC evaluada por citometría de flujo, citogenética e hibridación in situ fluorescente o linfocitos B normales detectados por citometría de flujo en médula ósea o sangre. UPN 03 tenía 5% de linfocitos B CD5negativos normales residuales confirmados por citometría de flujo en el día +23, lo que también mostró que eran policlonales; no se detectaron linfocitos B normales al día +176. La Figura 5C representa los resultados de experimentos utilizando imágenes de TC secuencial para evaluar la resolución rápida de linfadenopatía generalizada resistente a quimioterapia. Masas axilares bilaterales resueltas por 83 (UPN 01) y 31 (UPN 03) días post infusión, según se indica mediante flechas y circulo.

La Figura 6, que comprende las Figuras 6A a 6C, es una serie de imágenes que representan los recuentos absolutos de linfocitos y las células CART19+ totales en circulación para UPN 01, 02, 03. El número total de linfocitos (células LLC y células normales totales) vs. células CART19+ totales en circulación se representa para los 3 sujetos usando el recuento absoluto de linfocitos de los valores de CBC y asumiendo un volumen de sangre de 5,0 L. El número total de células CART19 en circulación se calculó usando los valores de CBC en tándem con recuentos de linfocitos absolutos y los valores de marcado de Q-PCR como se muestra en la Figura 2, convirtiendo copias/g de ADN al % de marcado medio como se describe en otra parte del presente documento. Se encontró que el % marcaje de Q-PCR se correlacionaba estrechamente (variación <2 veces) con la caracterización de citometría de flujo de los productos de infusión y con datos de muestras en los que se disponía de datos de citometría de flujo concomitantes para numerar directamente células CART19 por tinción.

La Figura 7, que comprende las Figuras 7A a 7D son una serie de imágenes que representan experimentos que implican la detección directa ex vivo de células CART19 positivas en (UPN-01 PBMC, 71 días después de la infusión de células. Las PBMC de UPN-01 recogidas tras aféresis el día 71 tras infusión o congelados en el momento de la aféresis para la fabricación del producto de linfocitos T (línea de base) y se descongelaron de forma viable antes de la tinción, se sometieron a análisis de citometría de flujo para detectar la presencia de células CART19 que expresan la porción CAR 19 en la superficie. Para evaluar la expresión de CAR19 en el linfocito, las muestras fueron coteñidas con CD3-PE y el anticuerpo anti-IDR1 idiotípico conjugado con Alexa647, o coteñido con CD3-PE solo (FMO para CAR19). La Figura 7A describe que una selección inicial de linfocitos se estableció basándose en la dispersión hacia adelante y en el lado (FSC vs SSC), seguido por la selección de células CD3+. La Figura 7B representa la selección de los linfocitos CD3+; La Figura 7C representa la tinción idiotípica CAR; La Figura 7D representa el idiotipo CAR FMO. La selección positiva para CAR19 se estableció en las muestras FMO CAR19.

La Figura 8, que comprende las Figuras 8A a 8C, es una serie de imágenes que representan la estrategia de selección para identificar la expresión de CART19 usando citometría de flujo policromática en muestras de sangre UPN 03. La estrategia de bloqueo para la Figura 8C se muestra para la muestra de UPN 03 día 56 y es representativa de la estrategia utilizada en la muestra de UPN 03 día 169. La Figura 8A representa la selección primaria: descarte (CD14, CD16, live/dead Aqua) negativo, CD3-positivo. La Figura 8B representa la selección secundaria: CD4-positivas, CD8 positivas. La Figura 8C representa la selección terciaria: CAR19-positivas y CAR19-negativas, establecidas en las muestras de CAR FMO (paneles de la derecha).

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receptor antigénico quimérico se expandieron a niveles que eran 1000 veces más altos que los niveles iniciales de injerto en la sangre periférica y la médula ósea. Los niveles máximos de linfocitos T de receptor de antígeno quimérico se correlacionaron temporalmente con el síndrome de lisis tumoral. Una muestra de sangre obtenida el día 0 y una muestra de médula ósea obtenida el día 1 no tenía señal de PCR en la línea basal. El análisis de citometría de flujo de aspirados de médula ósea en la línea basal (Figura 14C) muestra una infiltración predominante con células clonales CD19+ CD5+, evaluadas mediante tinción de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina, con una escasez de linfocitos T. El día 31 después de la infusión, había presentes linfocitos T CD5+, y no se detectaron linfocitos B normales o malignos. Los números indican la frecuencia relativa de las células en cada cuadrante. Tanto el eje x como el eje y muestran una escala log10. La estrategia de bloqueo implicó un bloqueo inicial en las células CD19+ y CD5+ en los cuadros de la izquierda y la posterior identificación de la expresión de kappa y lambda de inmunoglobulina en el subconjunto CD19+ CD5+ (cuadros de la derecha)

Descripción detallada

La invención se refiere a composiciones para tratar el cáncer incluyendo, pero sin limitarse a, neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos. La presente invención se refiere a una estrategia de transferencia de células adoptivas de linfocitos T transducidos para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los CAR son moléculas que combinan especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular activador del receptor de linfocitos T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmune celular antitumoral específica.

La presente invención se refiere en general al uso de linfocitos T genéticamente modificados para expresar de manera estable un CAR deseado como se define en las reivindicaciones. Los linfocitos T que expresan un CAR se denominan en el presente documento como linfocitos T CAR o linfocitos T CAR modificados. Preferiblemente, la célula puede modificarse genéticamente para expresar de manera estable un dominio de unión a anticuerpo en su superficie, confiriendo una nueva especificidad de antígeno que es independiente del MHC. El linfocito T se modifica genéticamente para expresar de manera estable un CAR que combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio intracelular de la proteína de cadena de CD3-zeta en una única proteína quimérica.

Tal como se describe en el presente documento, el CAR descrito en el presente documento comprende un dominio extracelular que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. Como se describe en el presente documento, se utiliza el dominio transmembranal que está naturalmente asociado con uno de los dominios en el CAR. También como se describe aquí, el dominio transmembranal puede seleccionarse o modificarse mediante la sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. Preferiblemente, el dominio transmembrana es el dominio de bisagra CD8.

Con respecto al dominio citoplásmico, el CAR descrito en el presente documento comprende el dominio de señalización 4-1BB. El dominio citoplásmico del CAR puede ser diseñado para comprender adicionalmente el dominio de señalización de CD3-zeta. El dominio citoplásmico del CAR incluye módulos de señalización CD3zeta y 4-1BB. Por consiguiente, la invención proporciona linfocitos T CAR y su uso para terapia adoptiva.

Tal como se describe en el presente documento, los linfocitos T CAR descritos en el presente documento pueden generarse introduciendo un vector lentiviral que comprende un CAR deseado, por ejemplo un CAR que comprende anticuerpo anti CD19, CD8 y dominio transmembrana y dominios humanos de señalización 4-1BB y CD3-zeta, en las células. Los linfocitos T CAR de la invención son capaces de replicarse in vivo dando como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir a un control sostenido del tumor.

También se describe aquí la administración de un linfocito T genéticamente modificado que expresa un CAR para el tratamiento de un paciente que tiene cáncer o que está en riesgo de tener cáncer usando infusión de linfocitos. Preferiblemente, se utiliza infusión linfocítica autóloga en el tratamiento. Las PBMC autólogas se recogen de un paciente que necesita tratamiento y los linfocitos T se activan y expanden usando los métodos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica y luego se infunden de nuevo al paciente.

También se describe aquí el tratamiento de un paciente en riesgo de desarrollar LLC. También se describe en la presente invención el tratamiento de una neoplasia maligna o una enfermedad autoinmune en la que la quimioterapia y/o la inmunoterapia en un paciente da como resultado una inmunosupresión significativa en el paciente, aumentando así el riesgo de que el paciente desarrolle LLC.

Como se describe en el presente documento, se usan métodos que usan linfocitos T que expresan un CAR anti-CD19 que incluye CD3-zeta y el dominio coestimulador 4-1 BB (también denominados linfocitos T CART19). Los linfocitos T CART19 descritos en este documento pueden someterse a una fuerte expansión de linfocitos T in vivo y pueden establecer células de memoria específicas de CD19 que persisten a niveles elevados durante un

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periodo prolongado de tiempo en sangre y médula ósea. En algunos casos, los linfocitos T CART19 infundidos en un paciente pueden eliminar las células de leucemia in vivo en pacientes con LLC resistente a la quimioterapia avanzada.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica al que pertenece la invención. Aunque en la práctica se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para ensayar la presente invención, se describen los materiales y métodos preferidos. En la descripción y reivindicación de la presente invención, se usará la siguiente terminología.

También se debe entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende limitarlas.

Los artículos "un/uno" y "una" se usan aquí para referirse a uno o a más de uno (es decir, por lo menos a uno) del objeto gramatical del artículo. Por ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Se entiende que "alrededor de" tal como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, abarca variaciones de ±20% o ±10%, más preferiblemente ±5%, incluso más preferiblemente ±1%, y aún más preferiblemente ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos.

"Activación", como se usa en el presente documento, se refiere al estado de un linfocito T que ha sido suficientemente estimulado para inducir una proliferación celular detectable. La activación también puede estar asociada con la producción inducida de citoquinas y funciones efectoras detectables. El término "linfocitos T activados" se refiere, entre otras cosas, a linfocitos T que están experimentando división celular.

El término anticuerpo, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1999, en: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY, Harlow y col., 1989, en: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426).

El término “fragmento de anticuerpo” se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Una "cadena pesada de anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, se refiere al más grande de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales.

Una "cadena ligera de anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales, las cadenas ligeras κ y λ se refieren a los dos isotipos de cadena ligera de anticuerpo .

Por el término "anticuerpo sintético" tal como se utiliza en el presente documento, se entiende un anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como se describe en el presente documento. El término debe entenderse también como un anticuerpo que ha sido generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en la que la secuencia de ADN o aminoácidos se ha obtenido utilizando tecnología de secuencia de aminoácidos o de ADN sintético que está disponible y es bien conocida en la técnica.

El término "antígeno" o "Ag" tal como se utiliza en el presente documento se define como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede implicar ya sea la producción de anticuerpos, o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la técnica comprenderá que cualquier macromolécula, incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un experto en la materia comprenderá que cualquier ADN que comprenda secuencias de nucleótidos o una secuencia de

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nucleótidos parcial que codifique una proteína que provoque una respuesta inmune, por lo tanto, codifica un "antígeno" tal como se utiliza en el presente documento. Además, un experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita estar codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Es evidente que la presente invención incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para provocar la respuesta inmune deseada. Además, un experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita ser codificado por un "gen" en absoluto. Es fácilmente evidente que se puede generar un antígeno sintetizado o puede derivarse de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero no está limitada a, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido biológico.

El término "efecto antitumoral" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por una disminución en el volumen tumoral, una disminución en el número de linfocitos tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la esperanza de vida, o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la condición cancerosa. Un "efecto antitumoral" también puede manifestarse por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la invención en la prevención de la aparición de tumor en primer lugar.

El término "auto-antígeno" significa, de acuerdo con la presente invención, cualquier auto-antígeno que el sistema inmune reconozca erróneamente como exógeno. Los auto-antígenos comprenden, pero no se limitan a, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de superficie celular, lípidos celulares, ácidos nucleicos, glicoproteínas, incluyendo receptores de superficie celular.

El término "enfermedad autoinmune" tal como se usa en el presente documento se define como un trastorno que resulta de una respuesta autoinmune. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inadecuada y excesiva a un auto-antígeno. Ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addison, alopecia greata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (Tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pemphigus vulgaris, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitiligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa, entre otras.

Tal como se usa en el presente documento, el término "autólogo" pretende referirse a cualquier material derivado del mismo individuo al que más tarde será reintroducido en el individuo.

"Alogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.

"Xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

El término "cáncer" tal como se utiliza en el presente documento se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden propagarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los ejemplos de varios cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.

El término "ligando coestimulador", tal como se utiliza en el presente documento, incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, aAPC, célula dendrítica, linfocito B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en un linfocito T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, por la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, media una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitarse a, proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero sin limitación, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BB, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Tall y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en un linfocito T, tal como, pero sin limitarse a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado a función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83.

Una "molécula coestimuladora" se refiere a la pareja de unión cognada en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de ese modo una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, moléculas MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll.

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polinucleótido tal como se usan en el presente documento son intercambiables. Un experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos pueden hidrolizarse en nucleósidos. Como se usan aquí, los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o genoma celular, usando tecnología de clonación ordinaria y PCR ™, y similares, y por medios sintéticos.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente, y se refieren a un compuesto formado por residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos y no se limita el número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término se refiere a ambas cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, y a cadenas más largas, que en general se denominan en la técnica proteínas, de las que hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, o una combinación de los mismos.

El término promotor, tal como se utiliza aquí, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.

Tal como se utiliza aquí, el término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico unido operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora del núcleo y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, ser una que exprese el producto génico en una forma específica de tejido.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está operativamente unido a un polinucleótido codificado o especificado por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula bajo la mayor parte o en todas las condiciones fisiológicas de la célula.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está operativamente unido a un polinucleótido codificado o especificado por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo cuando está presente un inductor en la célula que corresponde al promotor.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está operativamente unido a un polinucleótido codificado o especificado por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo si la célula es una célula del tejido tipo correspondiente al promotor.

Por el término "se une específicamente", tal como se usa aquí con respecto a un anticuerpo, se entiende un anticuerpo que reconoce un antígeno específico, pero no reconoce o se une a otras moléculas en una muestra.

Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de una especie también puede unirse a ese antígeno de una o más especies. Sin embargo, tal reactividad entre especies no altera por sí misma la clasificación de un anticuerpo como específica. En otro ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno también puede unirse a diferentes formas alélicas del antígeno. Sin embargo, tal reactividad cruzada no altera la clasificación de un anticuerpo como específica. En algunos casos, los términos "unión específica" o "se une específicamente" pueden usarse en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, para significar que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) sobre las especies químicas; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o A libre, sin marcar), en una reacción que contiene la etiqueta "A" y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcada unida al anticuerpo .

Por el término "estimulación" se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando afín, mediando así un evento de transducción de señales, tal como, pero sin limitarse a, transducción de señales a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas, tales como la regulación negativa de TGF-β, y/o la reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.

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Una "molécula estimuladora", como se usa aquí el término, significa una molécula en un linfocito T que se une específicamente con un ligando estimulador afín presente en una célula presentadora de antígeno.

Un "ligando estimulador", tal como se utiliza en el presente documento, significa un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, una célula B y similares) puede unirse específicamente con una pareja de unión afín (referido aquí como una "molécula estimuladora") en un linfocito T, mediando de este modo una respuesta primaria por la célula T, incluyendo, pero sin limitarse a, la activación, el inicio de una respuesta inmune, la proliferación y similares. Los ligandos estimuladores son bien conocidos en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula MHC de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 superagonista y un anticuerpo anti-CD2 superagonista.

El término “sujeto” pretende incluir organismos vivos en los que se puede inducir una respuesta inmune (por ejemplo, mamíferos). Ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos.

Tal como se utiliza en el presente documento, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos celulares con los que está normalmente asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a células que han sido separadas de las células con las que están naturalmente asociadas en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivan in vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivan in vitro.

El término "terapéutico" tal como se utiliza en el presente documento significa un tratamiento y/o profilaxis. Se obtiene un efecto terapéutico mediante supresión, remisión o erradicación de un estado patológico.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad del compuesto objeto que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema o sujeto que está siendo buscada por el investigador, veterinario, médico u otro clínico. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” incluye la cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar hasta cierto punto, uno o más signos o síntomas del trastorno o enfermedad que se está tratando. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto a tratar.

Para "tratar" una enfermedad tal como se utiliza en el presente documento, significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido" como se usa en el presente documento se refiere a un proceso mediante el cual el ácido nucleico exógeno se transfiere o se introduce en la célula huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es una célula que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula del sujeto primario y su progenie.

La frase "bajo control transcripcional" o "unido operativamente" como se usa en el presente documento significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con un polinucleótido para controlar la iniciación de la transcripción mediante ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede usarse para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Numerosos vectores son conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, el término "vector" incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. El término también debe interpretarse que incluye compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia de ácidos nucleicos en células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Ejemplos de vectores víricos incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales, y similares.

Rangos: a lo largo de esta descripción, se pueden presentar varios aspectos de la invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo describe específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subconjuntos específicamente descritos de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como los números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente a la amplitud del intervalo.

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tumoral específica constituye un antígeno de inmunoglobulina verdaderamente tumoral específico del tumor individual. Los antígenos de diferenciación de linfocitos B tales como CD19, CD20 y CD37 son otros candidatos para antígenos diana en el linfoma de linfocitos B. Algunos de estos antígenos (CEA, HER-2, CD19, CD20, idiotipo) se han utilizado como objetivos para inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales con éxito limitado.

El tipo de antígeno tumoral referido en la descripción puede ser también un antígeno específico de tumor (TSA)

o un antígeno asociado a tumor (TAA). Un TSA es único a las células del tumor y no ocurre en otras células en el cuerpo. Un antígeno asociado a TAA no es exclusivo de una célula tumoral y en su lugar también se expresa en una célula normal en condiciones que no logran inducir un estado de tolerancia inmunológica al antígeno. La expresión del antígeno sobre el tumor puede ocurrir en condiciones que permitan al sistema inmune responder al antígeno. Los TAA pueden ser antígenos que se expresan en células normales durante el desarrollo fetal cuando el sistema inmune es inmaduro y no puede responder o pueden ser antígenos que están normalmente presentes a niveles extremadamente bajos en células normales pero que se expresan a niveles mucho más altos en células tumorales.

Ejemplos no limitantes de antígenos TSA o TAA incluyen los siguientes: antígenos de diferenciación tales como MART-1/MelanA (MART-1), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos específicos de tumores multilinaje tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antígenos embrionarios sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorales únicos resultantes de translocaciones cromosómicas; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4RET, IGH-IGK, MYLRAR; y antígenos virales, tales como los antígenos EBVA del virus de Epstein Barr y los antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (HPV). Otros antígenos grandes de base proteica incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19 -9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 153\CA 27,29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733EpCAM, HTgpM344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NYCO-1, RCAS1, SDCCAG16, proteína TA-90Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS.

Tal como se describe en el presente documento, otros antígenos incluyen CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, glicolípido F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR y similares.

Tal como se describe en el presente documento, la parte de la porción de unión al antígeno del CAR de la invención está dirigida a CD19. Preferiblemente, la parte de la porción de unión al antígeno en el CAR de la invención es scFv anti-CD19, en donde la secuencia de ácido nucleico del scFv anti-CD19 comprende la secuencia expuesta en el Id. de Sec. Nº: 14. Alternativamente, el scFv anti-CD19 comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 20. En otra realización, la porción scFv anti-CD19 del CAR de la invención comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en Id. de Sec. Nº:

20.

Dominio transmembrana

Con respecto al dominio transmembrana, el CAR puede ser diseñado para comprender un dominio transmembrana que está fusionado al dominio extracelular del CAR. En una realización, se utiliza el dominio transmembranal que está naturalmente asociado con uno de los dominios en el CAR. En algunos casos, el dominio transmembranal puede ser seleccionado o modificado por sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o de una fuente sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. Las regiones transmembranales de uso particular en esta invención pueden derivar de (es decir, comprender al menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, el dominio transmembranal puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrofóbicos tales como leucina y valina. Preferiblemente, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. Opcionalmente, un oligo-o polipéptido corto enlazante, preferiblemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmico del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazante particularmente adecuado.

Preferiblemente, el dominio transmembrana en el CAR de la invención es el dominio transmembrana CD8. En una realización, el dominio transmembrana CD8 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la Id. de Sec. Nº: 22. En otra realización, el dominio transmembrana CD8

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normalización del ácido úrico y la función renal. Se realizó una evaluación clínica detallada con CXR, sangre, orina y cultivos de heces y todos fueron negativos o normales.

Al cabo de un mes de las infusiones de CART-19, el paciente tenía eliminación de la LLC circulante de la sangre

5 y la médula ósea por morfología, citometría de flujo, citogenética y análisis FISH y las tomografías computarizadas mostraron resolución de adenopatía anormal (Figura 5C). La remisión del paciente se ha mantenido más allá de 8 meses desde la infusión de células CART19 inicial.

Los resultados de los experimentos se describen a continuación.

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Protocolo clínico

Se incluyeron tres pacientes con LLC avanzada, resistente a la quimioterapia, en un ensayo clínico piloto como se muestra en la Figura 1. Todos los pacientes fueron extensamente pretratados con diversos regímenes de 15 quimioterapia y biológicos como se muestra en la Figura 10. Dos de los pacientes tenían LLC deficiente en p53, una deleción que presagia una respuesta deficiente a la terapia convencional y una progresión rápida (Dohner et al., 1995, Blood, 851580-1589). Cada uno de los pacientes tenía cargas tumorales grandes después de la quimioterapia preparativa, incluyendo infiltración extensa de la médula (40 a 95%) y linfadenopatía; el paciente UPN 02 también tuvo linfocitosis periférica significativa. Los linfocitos T CART19 se prepararon como se

20 representa en la Figura 1B y se muestran detalles de la fabricación de células y caracterización del producto para cada paciente en la Tabla 4. Todos los pacientes fueron pretratados 1-4 días antes de las infusiones de linfocitos T CART19 con quimioterapia de eliminación de linfoma. Se utilizó un programa de infusión de células de dosis dividida debido a que el ensayo probaba un CAR que incorporaba un dominio de señalización coestimulador 4-1BB como se representa en la Figura 1A.

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Tabla 4: Productos de aféresis y criterios de liberación del producto CART19

Ensayo: Especificación UPN 01 UPN 02 UPN 03

Producto de aféresis

Citometría de flujo para CD3+ de CD45+: N/A 4,46% 2,29% 2,67%

Producto CART19

Número total de células Infundido: ~2 5 x 109 5 x 109 1,275 x 109 1,275 x 109 [2,55 x 109 total] 3 x 108

Viabilidad celular: > = 70% 96,2% 95,3 (90,5)1 90,3%

Células CD3+: > 80% 88,9% 98,8 98,9

Nº Cuentas residuales: <= 100 cuentas / 3 x 106 células 3,95 1 4

Endotoxina: <= 3,5 EU/mL <0,5 EU/mL <0,5 EU/mL

Micoplasma: Negativo Negativo Negativo Negativo

Esterilidad (Bactec): Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento

Cultivo de hongos: Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento

ELISA BSA: <= 1 g/ml <0,5 ng/mL <0,5 ng/mL <0,5 ng/mL

Replicación Lentivirus Competente (RCL): RCL No Detectable No Detectable No concluyente2 No concluyente2

Eficiencia de transducción (expresión scFv): > = 20% 22,6% 23% 4,74%4

Secuencia de ADN del vector (PCR CART19): 0,2-3 copias/célula 0,153 0,275 0,101

1 = Dosis nº 2. 2 = valor de ensayo en el día 12 por debajo de LOQ y había disminuido a partir de la expansión anterior consistente con la transferencia del ADN plasmídico a partir de la generación del vector. Presentado a la FDA como una enmienda informativa. 3 = Liberación del producto basada en la tinción superficial por FACS. 4 = Excepción de tratamiento otorgada por los criterios de liberación por DSMC externo e IRB.

Expansión in vivo y persistencia de CART19 y tráfico a médula ósea

Se cree que los linfocitos T CAR+ expandidos usando cuentas de CD3/CD28 y que expresan un dominio de señalización de 4-1BB están en mejoras para CAR carentes de 4-1BB. Se desarrolló un ensayo de Q-PCR para permitir el seguimiento cuantitativo de células CART 19 en sangre y médula ósea. Todos los pacientes tuvieron expansión y persistencia de las células CART19 en sangre durante al menos 6 meses como se muestra en las

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del cromosoma 17p y la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) mostró que 170 de 200 células tenían una deleción que implicaba TP53 en el cromosoma 17p. Recibió rituximab con bendamustina durante un ciclo y tres ciclos adicionales de bendamastina sin rituximab (debido a una reacción alérgica grave). Este tratamiento dio como resultado sólo una mejora transitoria en la linfocitosis. La adenopatía progresiva se documentó mediante tomografía computarizada (CT) después de la terapia.

Los linfocitos T autólogos se recogieron por medio de leocoféresis y se crioconservaron. El paciente recibió entonces alemtuzumab (anti-CD52, linfocitos maduros, antígeno de superficie celular) durante 11 semanas, con hematopoyesis mejorada y resolución parcial de la adenopatía. Durante los siguientes 6 meses tuvo una enfermedad estable con médula persistente y extensa y adenopatía difusa con múltiples ganglios linfáticos de 1 a 3 cm. En julio de 2010, el paciente se inscribió en un ensayo clínico de fase 1 de linfocitos T con receptor de antígeno quimérico modificado.

Infusiones de células

Los linfocitos T autólogos del paciente se descongelaron y transdujeron con lentivirus para expresar el receptor de antígeno quimérico específico de CD19 (Figura 12A); los identificadores de secuencia para el vector lentiviral y las secuencias relevantes se describen en la Tabla 5. Cuatro días antes de la infusión celular, el paciente recibió quimioterapia diseñada para el agotamiento de linfocitos (pentostatina a una dosis de 4 mg por metro cuadrado de superficie corporal y ciclofosfamida a una dosis de 600 mg por metro cuadrado) sin rituximab (Lamanna et al., 2006, J Clin Oncol, 24: 1575-81). Tres días después de la quimioterapia pero antes de la infusión celular, la médula ósea era hipercelular con una afectación aproximada del 40% por LLC. Las células de leucemia expresaron cadena ligera kappa y CD5, CD19, CD20 y CD23. El análisis citogenético mostró dos clones separados, ambos resultando en la pérdida del cromosoma 17p y el locus TP53 (46, XY, del(17) (p12)[5]/46, XY, del(17)t(17;21)(q10;q10)[5]/46, XY[14]). Cuatro días después de la quimioterapia, el paciente recibió un total de 33x108 linfocitos T, de las cuales el 5% fueron transducidos, para un total de 1,42x107 células transducidas (1,46x105 células por kilogramo) divididas en tres intravenosas infusiones diarias consecutivas (10% el día 1, 30% el día 2 y 60% el día 3). No se administraron citoquinas postinfusión. No se observaron efectos tóxicos de las infusiones.

Tabla 5: Identificadores de secuencia para el vector de transferencia pELPS-CD19-BBz

Nº de Id. de Sec.: IDENTIDAD

Id. de Sec. Nº: 1: vector de transferencia pELPS-CD19-BBZ (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 2: U3 de VRS (secuencia de ácidos nucleicos)

Id. de Sec. Nº: 3: Repetición del VIH R (secuencia de ácidos nucleicos)

Id. de Sec. Nº: 4: Repetición del VIH U5 (secuencia de ácidos nucleicos)

Id. de Sec. Nº: 5: Gag/Pol parcial (secuencia de ácidos nucleicos)

Id. de Sec. Nº: 6: cPPT (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 7: promotor EF1 alfa (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 8: CD19-BBzeta CAR (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 9: PRE Hu de marmota americana (secuencia de ácido nucleico) t

Id. de Sec. Nº: 10: repetición R (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 11: repetición U5 (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 12: CD19-BBzeta CAR (secuencia de aminoácidos)

Id. de Sec. Nº: 13: Líder CD8 (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 14: anti CD19scFv (secuencia ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 15: bisagra CD8 (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 16: transmembrana CD8 (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 17: 4-1BB (secuencia de ácido nucleico)

Id. de Sec. Nº: 18: CD3zeta (secuencia de aminoácidos)

Id. de Sec. Nº: 19: Líder CD8 (secuencia de aminoácidos)

Id. de Sec. Nº: 20: anti CD19scFv (secuencia de aminoácidos)

Id. de Sec. Nº: 21: bisagra CD8 (secuencia de aminoácidos)

Id. de Sec. Nº: 22: transmembrana CD8 (secuencia de aminoácidos)

Id. de Sec. Nº: 23: 4-1BB (secuencia de aminoácidos)

Id. de Sec. Nº: 24: CD3zeta (secuencia de aminoácidos)

Respuesta clínica y evaluaciones

Catorce días después de la primera infusión, el paciente comenzó a tener escalofríos y fiebre ligera asociada con fatiga de grado 2. Durante los siguientes 5 días, los escalofríos se intensificaron y su temperatura aumentó a 39,2 °C (102,5 ºF), asociada con rigidez, diaforesis, anorexia, náuseas y diarrea. No tenía síntomas respiratorios o cardíacos. Debido a las fiebres, se realizaron radiografías de tórax y cultivos de sangre, orina y heces y todas fueron negativas o normales. El síndrome de lisis tumoral se diagnosticó al día 22 después de la

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Claims

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