UA121017C2 - Композиція і спосіб моделювання експресії hbv - Google Patents

Композиція і спосіб моделювання експресії hbv Download PDF

Info

Publication number
UA121017C2
UA121017C2 UAA201511840A UAA201511840A UA121017C2 UA 121017 C2 UA121017 C2 UA 121017C2 UA A201511840 A UAA201511840 A UA A201511840A UA A201511840 A UAA201511840 A UA A201511840A UA 121017 C2 UA121017 C2 UA 121017C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
nucleoside
group
oligonucleotide
antisense
hepmer
Prior art date
Application number
UAA201511840A
Other languages
English (en)
Inventor
Тхазха П. Пракаш
Пуніт П. Сетх
Пунит П. Сетх
Ерік Е. Свайзе
Эрик Э. Свайзэ
Original Assignee
Айоніс Фармасьютікалз, Інк.
Айонис Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51843959&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA121017(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Айоніс Фармасьютікалз, Інк., Айонис Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Айоніс Фармасьютікалз, Інк.
Publication of UA121017C2 publication Critical patent/UA121017C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3511—Conjugate intercalating or cleaving agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід стосується сполуки, що має формулу: або її фармацевтично прийнятної солі. Винахід також стосується композиції, що містить дану сполуку, та застосування сполуки при виготовленні лікарського засобу для лікування у суб'єкта захворювання, розладу або патологічного стану, пов'язаного з вірусом гепатиту B (HBV).

Description

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Цей винахід зареєстрований разом з переліком послідовностей в електронному форматі.
Перелік послідовностей представлений у вигляді файлу під назвою ВІОЇ 0248УМО5БО 5Т25.ХІ, створеного 1 травня 2014 року, розміром 16 Кб. Інформація про перелік послідовностей в електронному форматі в повному об'ємі включена до даного документу шляхом посилання.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Принцип, що лежить в основі антисмислової технології, полягає у тому, що антисмислова сполука гібридизується з цільовою нуклеїновою кислотою і модулює кількість, активність та/або функцію цільової нуклеїнової кислоти. Наприклад, у деяких випадках антисмислові сполуки приводять до зміни транскрипції або трансляції мішені. Така модуляція експресії може бути досягнута, наприклад, руйнуванням цільової мРНК або інгібуванням за механізмом заміщення.
Прикладом модуляції цільової функції РНК за рахунок руйнування є руйнування за рахунок
РНКази Н цільової РНК при гібридизації з ДНК-подібною антисмисловою сполукою. Іншим прикладом модуляції генної експресії за рахунок спрямованого руйнування є РНК-інтерференція (РНК). РНКІ стосується антисмислового сайленсингу гена за механізмом, у якому застосовується РНК-індукований комплекс сайленсинга (КІЗС). Додатковим прикладом модуляції цільової функції РНК є механізм заміщення, такий як використовувана в природних умовах мікроРНК. МікроРНК являють собою невеликі некодуючі РНК, що регулюють експресію
РНК, які кодують білки. Зв'язування антисмислової сполуки з мікроРНК перешкоджає зв'язуванню мікроРНК з її матричними РНК мішенями, і, отже, ускладнює функцію мікроРНК.
МікроРНК-міметики можуть підсилювати природну функцію мікроРНК. Деякі антисмислові сполуки модифікують сплайсинг пре-мРНК. Незалежно від конкретного механізму, специфічність відносно послідовностей робить антисмислові сполуки перспективними як засоби для підтвердження наявності мети і функціоналізації генів, а також як терапевтичні засоби для селективної модуляції експресії генів, що залучені до патогенезу захворювань.
Антисмислова технологія є ефективним способом модуляції експресії одного або декількох специфічних генних продуктів і, отже, може бути визнана виключно придатною у ряді терапевтичних, діагностичних і дослідницьких застосувань. Хімічно модифіковані нуклеозиди можуть бути введені до антисмислових сполук для підсилення однієї або декількох
Зо властивостей, таких як стійкість до нуклеази, фармакокінетика або афінність до цільової нуклеїнової кислоти. У 1998 році антисмислова сполука МігамепефФ (фомівірсен; розроблений компанією біб РПагтасецшіісаіє Іпс., Карлобад, штат Каліфорнія) стала першими антисмисловими ліками, що одержали дозвіл на продаж від Адміністрації США з харчових продуктів і лікарських речовин (ЕБА), і на даний час є засобом для лікування спричиненого цитомегаловірусом (СММУ) ретиніту у пацієнтів із СНІДом.
Нові хімічні модифікації мають покращену активність і ефективність антисмислових сполук, розкриваючи потенціал для пероральної доставки, а також для удосконалення підшкірного введення, зниження можливих побічних ефектів, і приводять до покращення зручності для пацієнта. Хімічні модифікації, що підсилюють активність антисмислових сполук, дозволяють здійснювати введення нижчих доз, що знижує можливість токсичності, а також зменшує загальну вартість лікування. Модифікації, що збільшують стійкість до руйнування, приводять до повільнішого виведення з організму, забезпечуючи можливість менш частого введення доз.
Різні типи хімічних модифікацій можуть бути комбіновані в одній сполуці для подальшої оптимізації ефективності сполуки.
СУТЬ ВИНАХОДУ
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені кон'юговані антисмислові сполуки. У деяких варіантах реалізації даного опису наведені кон'юговані антисмислові сполуки, що містять антисмисловий олігонуклеотид, комплементарний транскрипту нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації даного опису наведені способи, що включають контакт клітини з кон'югованою антисмисловою сполукою, що містить антисмисловий олігонуклеотид, комплементарний транскрипту нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації даного опису наведені способи, що включають контакт клітини з кон'юЮгованою антисмисловою сполукою, яка містить антисмисловий олігонуклеотид, і зменшення кількості або активності транскрипту нуклеїнової кислоти в клітині.
Раніше був описаний асіалоглікопротеїновий рецептор (АБОР-К). Див., наприклад, Рагк еї аІ!., РМАБ, том 102, Мо 47, сс. 17125-17129 (2005). Такі рецептори експресуються на клітинах печінки, зокрема, гепатоцитах. Крім того, було показано, що сполуки, які містять кластери трьох
М-ацетилгалактозамінових (СаїЇМАс) лігандів, здатні зв'язуватися з АБОР-К, приводячи до захоплення вказаної сполуки в клітину. Див., наприклад, Кпогем еї аї., Віоогдапіс апа Медаісіпаї 60 Спетізігу, 16, 9, сс. 5216-5231 (травень, 2008). Відповідно, кон'югати, що містять такі кластери саїІМАс, застосовували для полегшення захоплення деяких сполук в клітини печінки, зокрема, гепатоцити. Наприклад, було показано, що деякі саіМАс-вмісні кон'югати збільшують активність дуплексних міРНК сполук у клітинах печінки іп мімо. У таких випадках заіМАс-вмісний кон'югат, як правило, прикріплюється до смислової спіралі дуплексу міРНК. Оскільки смислова спіраль відкидається перед остаточною гібридизацією антисмислової спіралі із цільовою нуклеїновою кислотою, то маловірогідно, що такий кон'югат впливатиме на активність. Як правило, кон'югат приєднується до 3'-кінця смислової спіралі міРНК. Див., наприклад, патент США 8106022. Деякі кон'югувальні групи, описані у даному документі, є більш активними та/або синтезуються легше, ніж кон'югувальні групи, описані раніше.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу кон'югати приєднуються до одноланцюгових антисмислових сполук, включаючи, але не обмежуючись ними, антисмислові сполуки на основі
РНКази Н їі антисмислові сполуки, що змінюють сплайсинг цільової нуклеїнової кислоти пре-
МРНК. У таких варіантах реалізації винаходу кон'югат повинен залишатися приєднаним до антисмислової сполуки достатньо довго для забезпечення переваги (покращеного захоплення в клітини), але потім він повинен або розщеплюватися, або іншим чином не перешкоджати подальшим стадіям, необхідним для активності, таким як гібридизація з цільовою нуклеїновою кислотою і взаємодія з РНКазою Н або ферментами, пов'язаними із сплайсингом або модуляцією сплайсинга. Такий баланс властивостей є більш важливим при підготовці одноланцюгових антисмислових сполук, ніж сполук міРНК, де кон'югат може бути просто приєднаний до смислової спіралі. У даному документі описані одноланцюгові антисмислові сполуки, що мають покращену активність в клітинах печінки іп мімо, порівняно з такою ж антисмисловою сполукою, що не має кон'югату. Враховуючи необхідний баланс властивостей для цих сполук, така покращена активність є несподіваною.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи відповідно до даного документу містять розщеплюваний фрагмент. Як було відмічено, не обмежуючись яким-небудь механізмом, логічно, що кон'югат повинен зберігатися у сполуці достатньо довго для забезпечення підсилення захоплення, але після цього бажаним є, щоб деяка його частина або, в ідеалі, весь кон'югат розщеплювався, виділяючи початкову сполуку (наприклад, антисмислову сполуку) в її найактивнішій формі. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний
Зо фрагмент є розщеплюваним нуклеозидом. Такі варіанти реалізації винаходу використовують ендогенні нуклеази в клітині за рахунок приєднання решти частини кон'югату (кластера) до антисмислового олігонуклеотиду через нуклеозид за допомогою одного або декількох розщеплюваних зв'язків, таких як фосфодіестерні зв'язки. У деяких варіантах реалізації винаходу кластер пов'язаний з розщеплюваним нуклеозидом через фосфодіестерний зв'язок. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний нуклеозид приєднаний до антисмислового олігонуклеотиду (антисмислової сполуки) фосфодіестерним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група може містити два або три розщеплюваних нуклеозиди. У таких варіантах реалізації винаходу вказані розщеплювані нуклеозиди, пов'язані один з одним, з антисмисловою сполукою та/або з кластером за допомогою розщеплюваних зв'язків (таких як фосфодіестерний зв'язок). Деякі кон'югати за даним документом не містять розщеплюваного нуклеозиду, а натомість містять розщеплюваний зв'язок. Показано, що достатнє розщеплення кон'югату з олігонуклеотиду забезпечується щонайменше за рахунок одного зв'язку, який легко піддається розщепленню в клітині (розщеплюваний зв'язок).
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки є проліками. Такі проліки вводять тварині, і вони зрештою метаболізуються до активнішої форми. Наприклад, кон'юговані антисмислові сполуки розщеплюються з видаленням всього або частини кон'югату, приводячи до активної (або активнішої) форми антисмислової сполуки, що не містить всього або частини кон'югату.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югати приєднані на 5'-кінці олігонуклеотиду.
Деякі такі 5'-кон'югати розщеплюються ефективніше, ніж аналоги, що мають таку ж кон'югувальну групу, приєднану на 3'-кінці. У деяких варіантах реалізації винаходу покращена активність може корелювати з покращеним розщепленням. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди, що містять кон'югат на 5'-кінці, мають вищу ефективність, ніж олігонуклеотиди, що містять кон'югат на 3'-кінці (див., наприклад, Приклади 56, 81, 83 і 84). Крім того, 5'-приєднання забезпечує простіший синтез олігонуклеотиду. Як правило, олігонуклеотиди синтезують на твердій основі в напрямку від 3" до 5". Для одержання 3'-кон'югованого олігонуклеотиду, як правило, приєднують попередньо кон'югований 3'-нуклеозид до твердої основи, а потім звичайним шляхом створюють олігонуклеотид. Однак приєднання такого кон'югованого нуклеозиду до твердої основи ускладнює синтез. Крім того, застосовуючи такий бо підхід, кон'югат далі присутній в ході всього синтезу олігонуклеотиду і може руйнуватися під час подальших стадій або може обмежувати типи реакцій і реагентів, які можна застосовувати.
Застосовуючи структури і методики, описані в даному документі для 5'-кон'югованих олігонуклеотидів, можна синтезувати олігонуклеотид за допомогою стандартних автоматизованих методик і вводити кон'югат разом з останнім (5'-крайнім) нуклеозидом або після відокремлення олігонуклеотиду від твердої основи.
З урахуванням відомого рівня техніки і даного опису, фахівці в даній галузі техніки можуть з легкістю одержати будь-які з кон'югатів і кон'югованих олігонуклеотидів, описаних в даному документі. Крім того, синтез деяких таких кон'югатів і кон'югованих олігонуклеотидів, описаних в даному документі, простіший та/або вимагає менше стадій і, отже, менш дорогий, ніж синтез раніше описаних кон'югатів, що дає перевагу при виробництві. Наприклад, синтез деяких кон'югувальних груп складається з меншої кількості синтетичних стадій, що приводить до збільшення виходу, порівняно з раніше описаними групами кон'югату. Кон'югувальні групи, такі як саіМАс3-10 в Прикладі 46 і сСаіїМАс3-7 в Прикладі 48, набагато простіше, ніж раніше описані кон'югати, такі як описані в публікаціях Ш.5. 8106022 або Ш.5. 7262177, для яких необхідне збирання більшої кількості хімічних проміжних сполук. Відповідно, ці та інші кон'югати, описані в даному документі, мають перевагу порівняно з раніше описаними сполуками для застосування з будь-яким олігонуклеотидом, включаючи одноланцюгові олігонуклеотиди і будь-яку спіраль дволанцюгових олігонуклеотидів (наприклад, міРНК).
Так само в даному документі описані кон'югувальні групи, що мають рівно один або два ліганди саіМАс. Як показано, такі кон'юговані групи підсилюють активність антисмислових сполук. Такі сполуки набагато простіше одержати, ніж кон'югати, що містять три ліганди саїМмАс.
Кон'югувальні групи, що містять один або два ліганди саіІМАс, можуть бути приєднані до будь- яких антисмислових сполук, включаючи одноланцюгові олігонуклеотиди і будь-яку спіраль дволанцюгових олігонуклеотидів (наприклад, міРНК).
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югати, описані в даному документі, істотно не змінюють деякі показники переносимості. Наприклад, у даному документі показано, що кон'юговані антисмислові сполуки є не більш імуногенними, ніж некон'юговані початкові сполуки.
Оскільки активність покращується, то варіанти реалізації, у яких переносимість залишається такою ж (або, насправді, якщо навіть переносимість тільки незначно погіршується, порівняно з
Зо приростом активності), мають покращені характеристики для терапії.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югація дозволяє змінювати антисмислові сполуки таким чином, щоб вони мали менш виражені наслідки за відсутності кон'югації. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу заміна одного або декількох тіофосфатних зв'язків повністю тіофосфатної антисмислової сполуки на фосфодіестерні зв'язки приводить до покращення деяких показників переносимості. Наприклад, у деяких випадках такі антисмислові сполуки, що мають один або декілька фосфодіестерів, є менш імуногенними, ніж такі ж сполуки, у яких кожен зв'язок є тіофосфатним. Однак у деяких випадках, як показано у Прикладі 26, таке ж заміщення одного або декількох тіофосфатних зв'язків на фосфодіестерні зв'язки приводить також до зниження клітинного захоплення та/або до зниження активності. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки, описані в даному документі, допускають таку зміну зв'язків з невеликим зниженням або без зниження захоплення і активності, порівняно з кон'югованим повністю тіофосфатним аналогом. Насправді, в деяких варіантах реалізації, наприклад, у Прикладах 44, 57, 59 і 86, олігонуклеотиди, що містять кон'югат і щонайменше один фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок, фактично демонструють підвищену активність іп мімо, навіть порівняно з повністю тіофосфатним аналогом, що також містить такий же кон'югат. Більше того, оскільки кон'югація приводить до значного збільшення захоплення/активності, то невелике зниження такого істотного приросту може бути прийнятним для досягнення покращеної переносимості. Відповідно, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки містять щонайменше один фосфодіестерний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югація антисмислових сполук за даним документом приводить до покращеної доставки, захоплення і активності в гепатоцитах. Отже, до тканини печінки доставляється більша кількість сполуки. Однак у деяких варіантах реалізації винаходу винаходу така покращена доставка сама по собі не пояснює загального збільшення активності. У деяких таких варіантах реалізації винаходу більша кількість сполуки надходить до гепатоцитів. У деяких варіантах реалізації винаходу навіть таке покращене захоплення гепатоцитами само по собі не пояснює загального збільшення активності. У таких варіантах реалізації винаходу збільшується продуктивне захоплення кон'югованої сполуки. Наприклад, як показано у Прикладі 102, деякі варіанти реалізації сЗаіМАс-вмісних кон'югатів збільшують збагачення антисмислових олігонуклеотидів у гепатоцитах, порівняно з непаренхімальними 60 клітинами. Таке збагачення є переважним для олігонуклеотидів, націлених на гени, що експресуються у гепатоцитах.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки за даним документом приводять до зменшення дії на нирки. Наприклад, як показано у Прикладі 20, концентрації антисмислових олігонуклеотидів, що містять деякі варіанти реалізації саІМАс- вмісних кон'югатів, в нирках є нижчими за концентрації антисмислових олігонуклеотидів, що не мають сзаіІМАс-вмісного кон'югату. Це має декілька сприятливих терапевтичних ефектів. Для терапевтичних показань, при яких непотрібний прояв активності у нирках, дія на нирки піддає їх ризику токсичності без відповідної користі. Більше того, висока концентрація в нирках звичайно призводить до виведення сполуки із сечею, забезпечуючи швидше виведення. Відповідно, для позаниркових мішеней накопичення у нирках є небажаним.
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені кон'юговані антисмислові сполуки, представлені формулою: -- в о о в-- Я 9 де
А являє собою антисмисловий олігонуклеотид;
В являє собою розщеплюваний фрагмент;
С являє собою лінкер кон'югату; р являє собою групу розгалуження; кожен Е являє собою зв'язку; кожен Е являє собою ліганд; і д дорівнює цілому числу від 1 до 5.
На наведеній вище схемі і в аналогічних схемах у даному документі група розгалуження "0" розгалужується таку кількість разів, яка є необхідною для відповідності кількості груп (Е-Е) вказаній кількості "д". Тобто, якщо д-1, то формула є наступною:
А- - - В - - Ж (3 2 - - - - 05 - - 6 --1 в 6 якщо 4-2, то формула є наступною: рані
А- - В5 З - 0 --о3
М Е--4'е якщо 4-3, то формула є наступною: /
А- 5 о - - - 5 - - - - 2 Е - - х Е--Аї-
Зо якщо 4-4, то формула є наступною:
Е--4- р ші нини
Е--хйб
Е---:.
якщо 4-5, то формула є наступною:
Е---Я ре Щі
А- Я 8 -- - 0 - А 02 --- 67757
Сх .
Е--А-
У деяких варіантах реалізації винаходу наведені кон'юговані антисмислові сполуки, що мають структуру:
Націпюючиий фрапмент » тн й З з К ві. зн ет ; зи 4 І те ре ре тр ї й Й СУ й бля, в Е ей у й не шк вона ни ші ще й Щі і КУ сть в: ва. ЩІ льже у Ян
Ліганя Зв'язка - х р : --К Ух Розщептвенаний о в я Мене Я Група розгалуження вах м
У деяких варіантах реалізації винаходу наведені кон'юговані антисмислові сполуки, що мають структуру:
Фрапмент, ще націлює на кпітиву / о х -- а Розщенпюваний ето, фрагавнх ден у нОоОН шо й о і й ї о Ух
АН з он о о : з
Піганд М тро о - ра а Ще но он
МНАс Група розгапуження
У деяких варіантах реалізації винаходу наведені кон'юговані антисмислові сполуки, що мають структуру:
АБО Розщенплюваний фрапивнт но-в-о мот ух сі
ПпОо-в-о0
Ффрапмент що націлює на кпптину г шк их с волею лох о У
АНІ й й он нНОоОНн а ЛЕ Кон'югунапьний но к ото є ій о її ден о он
Піганд Зв'язка до он З ш-х за а ко; о й 0- но
МНАсС Груна розгапуження
У деяких варіантах реалізації винаходу наведені кон'юговані антисмислові сполуки, що мають структуру:
АБО
Ліганд Розщшеплюваний ? дон Зв'язка фрапмент не її
ОО й т
НО то М о 4 го
АСНІ о ! 4, нОвон н о щу : Н 0) - ж ЩІ з но-кт «0-х та М Е
АСНМ о на А Кон'югувальний а а н лінкер я ЩІ нот До
АС а
Група розгалуження гррагиент, ща націпює на клітину (с;
У варіантах реалізації, що мають більше однієї конкретної змінної (наприклад, більше одного "т" або "п"), якщо не вказано інше, кожна така конкретна змінна вибрана незалежно.
Отже, для структури, що має більш одного п, кожен п вибраний незалежно, таким чином, що вони можуть бути або не бути однаковими між собою.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Потрібно розуміти, що наведений вище загальний опис і наступний детальний опис є тільки ілюстративними і пояснюючими, вони не обмежують даного опису. У даному документі використання однини включає множину, якщо спеціально не вказано інше. При використанні в даному документі, термін "або" позначає "та/або" якщо не вказано інше. Крім того, використання терміну "включаючи", а також інших форм, таких як "включає" і "включений", не є обмежуючим. Крім того, такі терміни як "елемент" або "компонент" охоплюють елементи і компоненти, що містять одну одиницю, та елементи і компоненти, що містять більше однієї субодиниці, якщо спеціально не вказано інше.
Назви розділів, використані в даному документі, призначені лише для організаційних цілей, і їх не потрібно тлумачити як обмеження описаного об'єкту винаходу. Всі документи або частини документів, процитовані в даній заявці, включаючи, але не обмежуючись ними, патенти, патентні заявки, статті, книги і монографії, в явній формі включені до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі для всіх цілей.
А. Визначення
За відсутності конкретних визначень, номенклатура, використана у зв'язку з ними, а також у зв'язку з прийомами і методиками аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, а також медичної і фармацевтичної хімії описана у даному документі, є загальновідомою і загальноприйнятою в даній галузі техніки. Для хімічного синтезу і хімічного аналізу можуть бути використані стандартні методики. Деякі такі методики і прийоми наведені, наприклад, у публікаціях "СагроПпуайгаїе Моаййсайопе іп Апіїзепхе Кезеагсй" під редакцією Запдмі і Соок,
Атегісап Спетіса! 5осіеїу, федеральний округ Вашинітон, 1994; "Кетіпдіоп'є Рпагтасешісаї! зсієпсе5, " Маск Рибіїзпіпу Со., Істон, штат Пенсильванія, 212 видання, 2005; і "Апіїзепзе Югид
Тесппооду, Ргіпсіріе5, зігагедіеєз, апа Арріїсайопе" під редакцією Зіапіеу Т. СтооКе, СКС Ргез5,
Бока-Ратон, штат Флорида; а також у книзі Затюогоок еї аї., "МоіІесшаг Сіопіпд, А Іарогагу
Мапиа!Ї, " 22 видання, Соїй Зргіпд Нагрог Гарогаїгу Ргеб55, 1989, які включені до даного документу шляхом посилання для всіх цілей. Якщо це допустимо, всі патенти, заявки, опубліковані заявки та інші публікації, а також інші дані, згадувані в тексті даного опису, включені до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі.
Якщо не вказано інше, наступні терміни мають наступні значення:
При використанні в даному документі, "нуклеозид" позначає сполуку, що містить фрагмент азотистої основи і цукровий фрагмент. Нуклеозиди включають, без обмеження, природні нуклеозиди (що знаходяться в ДНК і РНК) і модифіковані нуклеозиди. Нуклеозиди можуть бути зв'язані з фосфатним фрагментом.
При використанні в даному документі, "хімічна модифікація" позначає хімічну відмінність в сполуці, порівняно з природним аналогом. Хімічні модифікації олігонуклеотидів включають нуклеозидні модифікації (включаючи модифікації цукрового фрагмента і модифікації азотистих основ) і модифікації міжнуклеозидних зв'язків. Відносно олігонуклеотиду хімічна модифікація включає не тільки відмінності в послідовності азотистих основ.
При використанні в даному документі, "фуранозил" позначає структуру, що містить 5-ч-ленне кільце, яке містить чотири атоми карбону і один атом оксигену.
При використанні в даному документі, "природний цукровий фрагмент" позначає рибофуранозил, що зустрічається в природній РНК, або дезоксирибофуранозил, що зустрічається в природній ДНК.
При використанні в даному документі, "цукровий фрагмент" позначає природний цукровий фрагмент або модифікований цукровий фрагмент нуклеозиду.
При використанні в даному документі, "модифікований цукровий фрагмент" позначає заміщений цукровий фрагмент або замінник цукру.
При використанні в даному документі, "заміщений цукровий фрагмент" позначає фуранозил, що не є природним цукровим фрагментом. Заміщені цукрові фрагменти включають, без обмеження, фуранозили, що містять замісники у 2'-положенні, 3'-положенні, 5'-положенні та/або 4 -положенні. Деякі заміщені цукрові фрагменти є біциклічними цукровими фрагментами.
При використанні в даному документі, "2'--заміщений цукровий фрагмент" позначає фуранозил, що містить у 2'-положенні замісник, відмінний від Н або ОН. Якщо не вказано інше, бо то 2'-заміщений цукровий фрагмент не є біциклічним цукровим фрагментом (тобто 2'-замісник
2'-заміщеного цукрового фрагмента не утворює місток з іншим атомом радикалу фуранозного кільця).
При використанні в даному документі, "МОЕ" позначає -ОСНа.СНгОСН».
При використанні в даному документі, "2-Е нуклеозид" стосується нуклеозиду, що містить цукор, який містить флуор у 2'і-положенні. Якщо не вказано інше, то флуор у 2-Е нуклеозиді знаходиться у рибо-положенні (замінюючи ОН природної рибози).
При використанні в даному документі, термін "замінник цукру" позначає структуру, яка не містить фуранозилу і здатна замінювати природний цукровий фрагмент нуклеозиду, таким чином, що нуклеозидні субодиниці, які утворюються, можуть зв'язуватися разом та/або зв'язуватися з іншими онуклеозидами з утворенням олігомерної сполуки, яка може гібридизуватися з комплементарною олігомерною сполукою. Такі структури включають кільця, що містять іншу кількість атомів, ніж фуранозил (наприклад, 4, 6 або 7-членні кільця); заміну оксигену фуранозилу неоксигеновим атомом (наприклад, карбоном, сульфуром або нітрогеном); або одночасну зміну кількості атомів і заміну оксигену. Крім того, такі структури можуть містити заміщення, відповідні заміщенням, описаним для заміщених цукрових фрагментів (наприклад, б-членні карбоциклічні біциклічні замінники цукру, що необов'язково містять додаткові замісники). Замінники цукру включають також складніші цукрові замісники (наприклад, некільцеві системи пептидної нуклеїнової кислоти). Замінники цукру включають, без обмеження, морфоліно, циклогексеніли і циклогекситоли.
При використанні в даному документі, "біциклічний цукровий фрагмент" позначає модифікований цукровий фрагмент, що містить 4-7-членне кільце (включаючи, без обмеження, фуранозил), яке містить місток, що зв'язує два атоми 4-7-членного кільця з утворенням другого кільця, що приводить до одержання біциклічної структури. В деяких варіантах реалізації винаходу 4-7-членне кільце є цукровим кільцем. У деяких варіантах реалізації винаходу 4-7- членне кільце є фуранозилом. У деяких таких варіантах реалізації винаходу місток сполучає 2'- карбон і 4--карбон фуранозилу.
При використанні в даному документі, "нуклеотид" позначає нуклеозид, що додатково містить фосфатну зв'язувальну групу. При використанні в даному документі, "зв'язані нуклеозиди" можуть бути або не бути зв'язані фосфатними зв'язками і, отже, включають, без обмеження, "зв'язані нуклеотиди". При використанні в даному документі, "зв'язані нуклеозиди" являють собою нуклеозиди, що зв'язані в безперервну послідовність (тобто між зв'язаними нуклеозидами немає додаткових нуклеозидів).
При використанні в даному документі, "азотиста основа" позначає групу атомів, яка може бути пов'язана із цукровим фрагментом з утворенням нуклеозиду, що може бути введений до олігонуклеотиду, і при цьому вказана група атомів може зв'язуватися з комплементарною природною азотистою основою іншого олігонуклеотиду або нуклеїнової кислоти. Азотисті основи можуть бути природними або можуть бути модифікованими.
При використанні в даному документі, терміни "немодифікована азотиста основа" або "природна азотиста основа" позначають природні гетероциклічні азотисті основи РНК або ДНК: пуринові основи аденін (А) і гуанін (С) і піримідинові основи тимін (Т), цитозин (С) (включаючи 5- метил С) і урацил ()).
При використанні в даному документі, "модифікована азотиста основа" позначає будь-яку азотисту основу, що не є природною азотистою основою.
При використанні в даному документі, "модифікований нуклеозид" позначає нуклеозид, який містить щонайменше одну хімічну модифікацію, порівняно з природними нуклеозидами РНК або
ДНК. Модифіковані нуклеозиди містять модифікований цукровий фрагмент та/або модифіковану азотисту основу.
При використанні в даному документі, "біциклічний нуклеозид" або "ВМА" позначає нуклеозид, що містить біциклічний цукровий фрагмент.
При використанні в даному документі, "стерично ускладнений етил-нуклеозид" або "сг" позначає нуклеозид, що містить біциклічний цукровий фрагмент, який містить місток 4-СН(СНз)-
О-2".
При використанні в даному документі, "нуклеозид закритої нуклеїнової кислоти" або "МА" позначає нуклеозид, що містить біциклічний цукровий фрагмент, який містить місток 4-СНе»-О- 2".
При використанні в даному документі, "2'-заміщений нуклеозид" позначає нуклеозид, що містить замісник в 2'--положенні, відмінний від Н або ОН. Якщо не вказано інше, то 2'--заміщений нуклеозид не є біциклічним нуклеозидом.
При використанні в даному документі, "дезоксинуклеозид" позначає нуклеозид, що містить бо 2-Н фуранозний цукровий фрагмент, що знаходиться в природних дезоксирибонуклеозидах
(ДНК). У деяких варіантах реалізації винаходу 2'--дезоксинуклеозид може містити модифіковану азотисту основу або може містити азотисту основу РНК (наприклад, урацил).
При використанні в даному документі, "олігонуклеотид" позначає сполуку, що містить множину зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить один або декілька немодифікованих рибонуклеозидів (РНК) та/або немодифікованих дезоксирибонуклеозидів (ДНК) та/або один або декілька модифікованих нуклеозидів.
При використанні в даному документі, "олігонуклеозид" позначає олігонуклеотид, в якому жоден з міжнуклеозидних зв'язків не містить атома фосфору. При використанні в даному документі, олігонуклеотиди включають олігонуклеозиди.
При використанні в даному документі, "модифікований олігонуклеотид" позначає олігонуклеотид, який містить щонайменше один модифікований нуклеозид та/"або щонайменше один модифікований міжнуклеозидний зв'язок.
При використанні в даному документі, "зв'язок" або "зв'язувальна група" позначає групу атомів, яка зв'язує разом дві або більше інших груп атомів.
При використанні в даному документі, "міжнуклеозидний зв'язок" позначає ковалентний зв'язок між сусідніми нуклеозидами в олігонуклеотиді.
При використанні в даному документі, "природний міжнуклеозидний зв'язок" позначає фосфодіестерний зв'язок З" із 5".
При використанні в даному документі, "модифікований міжнуклеозидний зв'язок" позначає будь-який міжнуклеозидний зв'язок, відмінний від природного міжнуклеозидного зв'язку.
При використанні в даному документі, "кінцевий міжнуклеозидний зв'язок" позначає зв'язок між останніми двома нуклеозидами олігонуклеотиду або його певної ділянки.
При використанні в даному документі, "фосфорна зв'язувальна група" позначає зв'язувальну групу, що містить атом фосфору. Фосфорні зв'язувальні групи включають, без обмеження, групи, що мають формулу:
Що
Ка ву в,
Ка лм з де:
Ва і Ва, кожен незалежно, являє собою 0, 5, СНег, МН або М:, де уУї являє собою Сі1-Св алкіл або заміщений С:-Св алкіл;
Ко) Вь являє собою О або 5;
Вс являє собою ОН, 5Н, Сиі-Св алкіл, заміщений Сі1-Сє алкіл, Сі-Сє алкокси, заміщений С1-Св алкокси, аміно або заміщений аміно; і
У: являє собою Еь являє собою О або 5.
Фосфорні зв'язувальні групи включають, без обмеження, фосфодіестер, тіофосфат, дитіофосфат, фосфонат, фосфорамідат, фосфортіоамідат, тіоноалкілфосфонат, фосфотриестери, тіоноалкілфосфотриестери і боранофосфат.
При використанні в даному документі, "міжнуклеозидна фосфорна зв'язувальна група" позначає фосфорну зв'язувальну групу, що напряму зв'язує два нуклеозиди.
При використанні в даному документі, "не міжнуклеозидна фосфорна зв'язувальна група" позначає фосфорну зв'язувальну групу, яка не зв'язує напряму два нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу не міжнуклеозидна фосфорна зв'язувальна група зв'язує нуклеозид із групою, відмінною від нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації винаходу не міжнуклеозидна фосфорна зв'язувальна група зв'язує дві групи, жодна з яких не є нуклеозидом.
При використанні в даному документі, "нейтральна зв'язувальна група" означає зв'язувальну групу, що не має заряду. Нейтральні зв'язувальні групи включають, без обмеження, фосфотриестери, метилфосфонати, ММІ (-СН»-М(СНз)-О-), амід-3 (-СН2-С(-0)-М(Н)-), амід-4 (-
Сно-М(Н)-С(-0)-), формацеталь (-0О-СНе-О-) і тіоформацеталь (-5-СН2г-О-). Додаткові нейтральні зв'язувальні групи включають неіїонні зв'язки, що містять силокасан (діалкілсилоксан), карбоксильний естер, карбоксамід, сульфід, сульфоновий естер і аміди (див., наприклад:
Сагропуагаїє Моайісайопе іп Апіїзепхе Кезеагсій; під ред. М.5. Запупмі і Р.О. СоокК, АС5
Зутровіцт, серія 580; розділи З і 4, (сс. 40-65)). Додаткові нейтральні зв'язувальні групи включають неїонні зв'язки, що містять змішані складові частини М, 0, 5 і СН».
При використанні в даному документі, "міжнуклеозидна нейтральна зв'язувальна група" позначає нейтральну зв'язувальну групу, яка напряму зв'язує два нуклеозиди.
При використанні в даному документі, "не міжнуклеозидна нейтральна зв'язувальна група"
позначає нейтральну зв'язувальну групу, яка не зв'язує напряму два нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу не міжнуклеозидна нейтральна зв'язувальна група зв'язує нуклеозид із групою, відмінною від нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації винаходу не міжнуклеозидна нейтральна зв'язувальна група зв'язує дві групи, жодна з яких не є нуклеозидом.
При використанні в даному документі, "олігомерна сполука" позначає полімерну структуру, що містить дві або більше субструктур. У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерна сполука містить олігонуклеотид. У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерна сполука містить одну або декілька кон'югованих груп та/або кінцевих груп. У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерна сполука складається з олігонуклеотиду. Олігомерні сполуки включають також природні нуклеїнові кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерна сполука містить скелет однієї або декількох зв'язаних мономерних субодиниць, при цьому кожна зв'язана мономерна субодиниця прямо або непрямо приєднана до гетероциклічного основного фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерні сполуки можуть містити також мономерні субодиниці, що не зв'язані з гетероциклічним основним фрагментом, забезпечуючи таким чином сайти з видаленими основами. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язки, що сполучають мономерні субодиниці, цукрові фрагменти або замінники і гетероциклічні основні фрагменти, можуть бути незалежно модифікованими. У деяких варіантах реалізації винаходу одиниця зв'язок-цукор, що може містити або не містити гетероциклічної основи, може бути заміщена міметиком, таким як мономери у пептидних нуклеїнових кислотах.
При використанні в даному документі, "кінцева група" позначає один або декілька атомів, приєднаних до будь-якого або до обох 3- або 5'-кінців олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу кінцева група є кон'югувальною групою. У деяких варіантах реалізації винаходу кінцева група містить один або декілька нуклеозидів кінцевої групи.
При використанні в даному документі, "кон'югат" або "кон'югувальна група" позначає атом або групу атомів, зв'язану з олігонуклеотидом або олігомерною сполукою. Як правило, кон'югувальні групи модифікують одну або декілька властивостей сполуки, до якої вони приєднані, включаючи, без обмеження, властивості фармакодинаміки, фармакокінетики, зв'язування, поглинання, клітинного розподілу, клітинного захоплення, заряду та/або виведення.
Зо При використанні в даному документі, "лінкер кон'югату" або "лінкер' в контексті кон'югувальної групи позначає частину кон'югувальної групи, що містить будь-який атом або групу атомів і ковалентно зв'язує (1) олігонуклеотид з іншою частиною кон'югувальної групи або (2) дві або декілька частин кон'югувальної групи.
Кон'югувальні групи показані в даному документі як радикали, що забезпечують зв'язок для утворення ковалентного приєднання до олігомерної сполуки, такої як антисмисловий олігонуклеотид. У деяких варіантах реалізації винаходу точка приєднання в олігомерній сполуці являє собою 3'-атом оксигену 3'-гідроксильної групи 3'-кінцевого нуклеозиду олігомерної сполуки. У деяких варіантах реалізації винаходу точка приєднання в олігомерній сполуці являє собою 5'-атом оксигену 5'-гідроксильної групи 5'-кінцевого нуклеозиду олігомерної сполуки. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язок для утворення приєднання до олігомерної сполуки є розщеплюваним зв'язком. У деяких таких варіантах реалізації винаходу такий розщеплюваний зв'язок складає весь або частину розщеплюваного фрагмента.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи містять розщеплюваний фрагмент (наприклад, розщеплюваний зв'язок або розщеплюваний нуклеозид) і частину вуглеводного кластера, таку як частина кластера саіМАс. Така частина вуглеводного кластера містить: націлюючий фрагмент і, необов'язково, лінкер кон'югату. У деяких варіантах реалізації винаходу частину вуглеводного кластера визначають за кількістю і природою ліганду.
Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу частина вуглеводного кластера містить три групи СбСаіМАс і позначена як "сСаМАсз. У деяких варіантах реалізації винаходу частина вуглеводного кластера містить 4 групи саіІМАс і позначена як "сзаіМАсге. Конкретні частини вуглеводних кластерів (що мають конкретну зв'язку, групи розгалуження і лінкера кон'югату) описані в даному документі і позначені римською цифрою з подальшим нижнім індексом "а".
Відповідно, "сзаіМас3-1а" стосується конкретної частини вуглеводного кластера кон'югувальної групи, що містить З групи ЗаїЇМас і конкретно визначену зв'язку, групи розгалуження і лінкера.
Такий фрагмент вуглеводного кластера приєднаний до олігомерної сполуки через розщеплюваний фрагмент, такий як розщеплюваний зв'язок або розщеплюваний нуклеозид.
При використанні в даному документі, "розщеплюваний фрагмент" позначає зв'язок або групу, яка може бути розщеплена за фізіологічних умов. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент розщеплюється усередині клітини або у внутрішньоклітинних бо відділах, таких як лізосома. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент розщеплюється ендогенними ферментами, такими як нуклеази. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент містить групу атомів, що має один, два, три, чотири або більше чотирьох розщеплюваних зв'язків.
При використанні в даному документі, "розщеплюваний зв'язок" позначає будь-який хімічний зв'язок, що може бути розщеплений. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний зв'язок вибраний з: аміду, поліаміду, естеру, етеру, одного або обох естерів фосфодіестеру, фосфатного естеру, карбамату, дисульфіду або пептиду.
При використанні в даному документі, "вуглеводний кластер" позначає сполуку, що має один або декілька вуглеводних залишків, приєднаних до скелету або зв'язувальної групи. (див., наприклад, публікацію Маїег еї аї., "Зупіпев5і5 ої Апіїзепзе Оіїдописіеоїіде5 Сопідайєєа ю а
Миймаїепі Сагропуагаїе Сіивіег тог СеїЇшіаг Тагдейіпу, " Віосопічдаєтє Спетівігу, 2003, (14): 18-29, яка включена до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі, або Кепзеп еї аї., "Оезідп апа бупіпевзіє ої Моме! М-АсеїуІдаіасіозатіпе- Гептіпаїєд Спусоїїрідв ог Тагдеїйпу ої
Проргоїеїп5 0 пе Нераїййс Азіадіусоргоївеіп Кесеріог, " У. Мей. Спет. 2004, (47): 5798-5808, де наведені приклади вуглеводних кон'югованих кластерів).
При використанні в даному документі, "похідне вуглеводу" позначає будь-яку сполуку, яка може бути синтезована із застосуванням вуглеводу як початкового матеріалу або проміжної сполуки.
При використанні в даному документі, "вуглевод" позначає природний вуглевод, модифікований вуглевод або похідне вуглеводу.
При використанні в даному документі, "захисна група" позначає будь-яку сполуку або захисну групу, відому фахівцям у даній галузі техніки. Необмежуючі приклади захисних груп наведені в публікації "Ргоїесіїме Сгоимирз іп Огдапіс Спетівігу", Т. МУ. сгеепе, Р. б. М. Му/шцв5, ІЗВМ 0-471-62301-6, Чопп УМієу 5 Зопв5, Іпс, Нью-Йорк, повний зміст якої включений до даного документу шляхом посилання.
При використанні в даному документі, "одноланцюгова" позначає олігомерну сполуку, що не гібридизована з комплементарною до неї і не має достатню самокомплементарність для утворення стабільного власного дуплексу.
При використанні в даному документі, "дволанцюгова" позначає пару олігомерних сполук,
Зо що гібридизовані одна з одною, або одну самокомплементарну олігомерну сполуку, що утворює шпилькову структуру. У деяких варіантах реалізації винаходу дволанцюгова олігомерна сполука містить першу і другу олігомерну сполуку.
При використанні в даному документі, "антисмислова сполука" позначає сполуку, що містить або складається з олігонуклеотиду, щонайменше частина якого є комплементарною цільовій нуклеїновій кислоті, з якою можлива його гібридизація, що приводить до одержання щонайменше однієї антисмислової активності.
При використанні в даному документі, "антисмислова активність" позначає будь-яку зміну, що може бути виявлена та/або виміряна, обумовлену гібридизацією антисмислової сполуки з її цільовою нуклесновою кислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислова активність включає модуляцію кількості або активності транскрипту цільової нуклеїнової кислоти (наприклад, мРНК). У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислова активність включає модуляцію сплайсинга пре-мРНК.
При використанні в даному документі, "антисмислова сполука на базі РНКази Н" позначає антисмислову сполуку, в якій щонайменше частина антисмислової активності антисмислової сполуки обумовлена гібридизацією антисмислової сполуки із цільовою нуклеїновою кислотою і подальшим розщепленням цільової нуклеїнової кислоти під дією РНКази Н.
При використанні в даному документі, "антисмислова сполука на базі КІЗС" позначає антисмислову сполуку, в якій щонайменше частина антисмислової активності антисмислової сполуки обумовлена РНК-індукованим комплексом сайленсинга (КІС).
При використанні в даному документі, "виявлення" або "вимірювання" позначає, що проведене випробування або аналіз для виявлення або вимірювання. Таке виявлення та/або вимірювання може приводити до результату з нульовим значенням. Отже, навіть якщо випробування для виявлення або вимірювання приводить до виявлення відсутності активності (нульової активності), то стадія виявлення або вимірювання активності була проведена.
При використанні в даному документі, "активність, що може бути виявлена та/або виміряна" позначає статистично значущу активність, що не є нульовою.
При використанні в даному документі, "по суті не змінений" позначає невелику або відсутність зміни конкретного параметра, зокрема, порівняно з іншим параметром, що змінився набагато більше. У деяких варіантах реалізації винаходу параметр є по суті не зміненим, якщо бо його зміна становила менше 5 95. У деяких варіантах реалізації винаходу параметр є по суті не зміненим, якщо його зміна становила менше двох разів, тоді як зміна іншого параметра становила щонайменше десять разів. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу антисмислова активність є зміною кількості цільової нуклеїнової кислоти. У деяких таких варіантах реалізації винаходу кількість нецільової нуклеїнової кислоти є по суті не зміненою, якщо вона змінюється набагато менше, ніж змінюється кількість цільової нуклеїнової кислоти, але ця зміна не обов'язково повинна бути нульовою.
При використанні в даному документі, "експресія" позначає процес, за допомогою якого ген зрештою перетвориться на білок. Експресія включає, без обмеження, транскрипцію, посттранскрипційну модифікацію (наприклад, сплайсинг, поліаденілювання, додавання 5'-кепу) і трансляцію.
При використанні в даному документі, "цільова нуклеїнова кислота" позначає молекулу нуклеїнової кислоти, з якою передбачається гібридизація антисмислової сполуки із забезпеченням бажаної антисмислової активності. Антисмислові олігонуклеотиди мають достатню комплементарність їх цільовим нуклеїновим кислотам для забезпечення гібридизації за фізіологічних умов.
При використанні в даному документі, "комплементарність азотистих основ" або "комплементарність" відносно азотистих основ позначає азотисту основу, що здатна до парування основ з іншою азотистою основою. Наприклад, у ДНК аденін (А) є комплементарним тиміну (Т). Наприклад, у РНК аденін (А) є комплементарним урацилу (Ш). У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарна азотиста основа позначає азотисту основу антисмислової сполуки, що здатна до парування основ з азотистою основою її цільової нуклеїнової кислоти.
Наприклад, якщо азотиста основа в певному положенні антисмислової сполуки здатна до утворення гідрогенового зв'язку з азотистою основою в певному положенні цільової нуклеїнової кислоти, то це положення утворення гідрогенового зв'язку між олігонуклеотидом і цільовою нуклеїновою кислотою вважається комплементарним за цією парою азотистих основ. Азотисті основи, що містять певні модифікації, можуть зберігати здатність до парування з протилежною азотистою основою і, отже, все ще можуть мати комплементарність азотистих основ.
При використанні в даному документі, "некомплементарні" відносно азотистих основ позначає пару азотистих основ, що не утворюють гідрогенові зв'язки одна з одною.
Зо При використанні в даному документі, "комплементарні" відносно олігомерних сполук (наприклад, зв'язаних нуклеозидів, олігонуклеотидів або нуклеїнових кислот) позначає здатність таких олігомерних сполук або їх ділянок до гібридизації з іншою олігомерною сполукою або її ділянкою за рахунок комплементарності азотистих основ. Комплементарні олігомерні сполуки не повинні обов'язково мати комплементарність азотистих основ в кожному нуклеозиді. До деякого ступеня є припустимими деякі невідповідності. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні олігомерні сполуки або ділянки є комплементарними за 70 95 азотистих основ (комплементарність 70 95). У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні олігомерні сполуки або ділянки є комплементарними на 80 95. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні олігомерні сполуки або ділянки є комплементарними на 9095. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні олігомерні сполуки або ділянки є комплементарними на 95 95. У деяких варіантах реалізації винаходу комплементарні олігомерні сполуки або ділянки є комплементарними на 100 95.
При використанні в даному документі, "невідповідність" позначає азотисту основу першої олігомерної сполуки, яка не здатна паруватися з азотистою основою у відповідному положенні другої олігомерної сполуки при вирівнюванні першої і другої олігомерної сполуки. Будь-яка або обидві перша і друга олігомерні сполуки можуть бути олігонуклеотидами.
При використанні в даному документі, "гібридизація" позначає парування комплементарних олігомерних сполук (наприклад, антисмислової сполуки та її цільової нуклеїнової кислоти). Не обмежуючись конкретним механізмом, найпоширеніший механізм парування включає утворення гідрогенового зв'язку, який може бути уотсон-криковським, хугстиновським або зворотним хугстиновським гідрогеновим зв'язком між комплементарними азотистими основами.
При використанні в даному документі, "специфічно гібридизується" позначає здатність олігомерної сполуки гібридизуватися з одним сайтом нуклеїнової кислоти з більшою афінністю, ніж вона гібридизується з іншим сайтом нуклеїнової кислоти.
При використанні в даному документі, "повністю комплементарний" відносно олігонуклеотиду або його частини позначає, що кожна азотиста основа олігонуклеотиду або його частини здатна до парування з азотистою основою комплементарної нуклеїнової кислоти або її безперервною частиною. Отже, повністю комплементарна ділянка не містить невідповідностей або негібридизованих азотистих основ в обидвох спіралях. 60 При використанні в даному документі, "відсоток комплементарності" позначає відсоток азотистих основ олігомерної сполуки, що є комплементарними рівній за довжиною частині цільової нуклеїнової кислоти. Відсоток комплементарності обчислюють шляхом ділення кількості азотистих основ олігомерної сполуки, що є комплементарними азотистим основам у відповідних положеннях цільової нуклеїнової кислоти, на загальну довжину олігомерної сполуки.
При використанні в даному документі, "відсоток ідентичності" позначає кількість азотистих основ у першій нуклеїновій кислоті, що відносяться до того ж типу (незалежно від хімічної модифікації), що і азотисті основи у відповідних положеннях другої нуклеїнової кислоти, розділену на загальну кількість азотистих основ у першій нуклеїновій кислоті.
При використанні в даному документі, "модуляція" позначає зміну кількості або якості молекули, функції або активності, порівняно з кількістю або якістю молекули, функції або активності до модуляції. Наприклад, модуляція включає зміну, як збільшення (стимуляцію або індукцію), так ії зниження (інгібування або зменшення) генної експресії. Як додатковий приклад, модуляція експресії може включати зміну вибору сайта сплайсингу при процесингу пре-мРНК, що приводить до зміни абсолютної або відносної кількості певного сплайс-варіанту, порівняно з його кількістю за відсутності модуляції.
При використанні в даному документі, "хімічний мотив" позначає характерну ділянку хімічних модифікацій в олігонуклеотиді або його ділянці. Мотиви можуть бути визначені за модифікаціями у певних нуклеозидах та/або у певних зв'язувальних групах олігонуклеотиду.
При використанні в даному документі, "нуклеозидний мотив" позначає характерну ділянку нуклеозидних модифікацій в олігонуклеотиді або його ділянці. Зв'язки такого олігонуклеотиду можуть бути модифікованими або немодифікованими. Якщо не вказано інше, мотиви, що описують у даному документі тільки нуклеозиди, є нуклеозидними мотивами. Отже, у таких випадках зв'язки не обмежені.
При використанні в даному документі, "цукровий мотив" позначає характерну ділянку цукрових модифікацій в олігонуклеотиді або його ділянці.
При використанні в даному документі, "зв'язувальний мотив" позначає характерну ділянку зв'язувальних модифікацій в олігонуклеотиді або його ділянці Нуклеозиди такого олігонуклеотиду можуть бути модифікованими або немодифікованими. Якщо не вказано інше, мотиви, що описують в даному документі тільки зв'язки, є зв'язувальними мотивами. Отже, в таких випадках нуклеозиди не обмежені.
При використанні в даному документі, "мотив модифікації азотистих основ" позначає характерну ділянку модифікацій азотистих основ уздовж олігонуклеотиду. Якщо не вказано інше, то мотив модифікації азотистих основ не залежить від послідовності азотистих основ.
При використанні в даному документі, "мотив послідовності" позначає характерну ділянку азотистих основ, розташованих уздовж олігонуклеотиду або його частини. Якщо не вказано інше, то мотив послідовності не залежить від хімічних модифікацій і, отже, може мати будь-яку комбінацію хімічних модифікацій, включаючи відсутність хімічних модифікацій.
При використанні в даному документі, "тип модифікації" відносно нуклеозиду або нуклеозиду певного "типу" позначає хімічну модифікацію нуклеозиду і включає модифіковані і немодифіковані нуклеозиди. Відповідно, якщо не вказано інше, "нуклеозид, що має модифікацію першого типу" може бути немодифікованим нуклеозидом.
При використанні в даному документі, "по-різному модифіковані" позначає хімічні модифікації або хімічні замісники, відмінні один від одного, включаючи їх відсутність або модифікації. Таким чином, наприклад, МОЕ нуклеозид і немодифікований нуклеозид ДНК є "по- різному модифікованими", навіть незважаючи на те, що нуклеозид ДНК є немодифікованим. Так само, ДНК і РНК є "по-різному модифікованими", навіть незважаючи на те, що обидві являють собою природні немодифіковані нуклеозиди. Нуклеозиди, що є однаковими, але містять різні азотисті основи, не є по-різному модифікованими. Наприклад, нуклеозид, що містить 2'-ОМе модифікований цукор і немодифіковану аденінову нуклеооснову, і нуклеозид, що містить 2'-ОМе модифікований цукор і немодифіковану тимінову азотисту основу, не є по-різному модифікованими.
При використанні в даному документі, "модифікації одного типу" стосується модифікацій, що є однаковими одна відносно одної, включаючи відсутність модифікацій. Таким чином, наприклад, два немодифікованих нуклеозиди ДНК мають "модифікацію одного типу", навіть незважаючи на те, що нуклеозид ДНК є немодифікованим. Такі нуклеозиди, що мають модифікацію одного типу, можуть містити різні азотисті основи.
При використанні в даному документі, "окремі ділянки" позначають частини олігонуклеотиду, в яких хімічні модифікації або мотив хімічних модифікацій будь-якої із сусідніх частин містить щонайменше одну відмінність для забезпечення можливості відрізняти ділянки одна від одної. бо При використанні в даному документі, "фармацевтично прийнятний носій або розріджувач"
позначає будь-яку речовину, придатну для застосування при введенні тварині. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтично прийнятний носій або розріджувач є стерильним сольовим розчином. У деяких варіантах реалізації винаходу такий стерильний сольовий розчин є сольовим розчином фармацевтичної категорії.
При використанні в даному документі, термін "метаболічний розлад" позначає захворювання або патологічний стан, що характеризується, перш за все, порушеною регуляцією метаболізму - складного набору хімічних реакцій, пов'язаних з розщепленням їжі та продукуванням енергії.
При використанні в даному документі, термін "серцево-судинний розлад" позначає захворювання або патологічний стан, що характеризується, перш за все, погіршеною функцією серця або кровоносних судин.
При використанні в даному документі, термін "моно- або поліциклічна кільцева система" включає всі кільцеві системи, вибрані з одиночних або поліциклічних радикальних кільцевих систем, у яких вказані кільця є конденсованими або зв'язаними, і включає одиничні або змішані кільцеві системи, індивідуально вибрані з аліфатичних, аліциклічних, арильних, гетероарильних, аралкільних, арилалкільних, гетероциклічних, гетероарильних, гетероароматичних (Іі гетероарилалкільних. Такі моно- і поліциклічні структури можуть містити кільця, кожне з яких має однаковий ступінь насиченості, або кожне незалежно має змінні ступені насиченості, включаючи повністю насичені, частково насичені або повністю ненасичені. Кожне кільце може містити кільцеві атоми, вибрані з С, М, О ї 5, з утворенням гетероциклічних кілець, а також кілець, що містять тільки кільцеві атоми С, які можуть бути представлені у змішаному мотиві, як, наприклад, у бензімідазолі в якому одне кільце має тільки кільцеві атоми карбону, а конденсоване кільце має два атоми нітрогену. Моно- або поліциклічна кільцева система може бути додатково заміщеною групами замісників, як, наприклад, фталімід, який має дві групи 50, приєднані до одного з кілець. Моно- або поліциклічні кільцеві системи можуть бути приєднані до початкових молекул різними способами, наприклад, безпосередньо через кільцевий атом, шляхом конденсації через декілька кільцевих атомів, через групу замісника або через біфункціональний зв'язувальний фрагмент.
При використанні в даному документі, "проліки" позначають неактивну або менш активну форму сполуки, яка при введенні суб'єкту метаболізується з утворенням активної або
Зо активнішої сполуки (наприклад, ліків).
При використанні в даному документі, "замісник" і "група замісника" позначає атом або групу, що витісняє атом або групу вказаної початкової сполуки. Наприклад, замісник модифікованого нуклеозиду є будь-яким атомом або групою, що є відмінною від атома або групи, яка знаходиться у природному нуклеозиді (наприклад, модифікований 2'-замісник є будь- яким атомом або групою у 2'-положенні нуклеозиду, відмінною від Н або ОН). Групи замісників можуть бути захищеними або незахищеними. У деяких варіантах реалізації винаходу сполуки відповідно до даного опису мають замісники в одному або більше ніж в одному положенні початкової сполуки. Замісники також можуть бути додатково заміщені іншими групами замісників і можуть бути приєднані напряму або через зв'язувальну групу, таку як алкільна або гідрогенкарбонова група, до початкової сполуки.
Так само, при використанні в даному документі, "замісник" відносно хімічної функціональної групи позначає атом або групу атомів, що є відмінною від атома або групи атомів, які звичайно містяться у вказаній функціональній групі. У деяких варіантах реалізації винаходу замісник витісняє атом гідрогену функціональної групи (наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу замісник заміщеної метильної групи є атомом або групою, відмінною від гідрогену, яка витісняє один або декілька атомів гідрогену незаміщеної метильної групи). Якщо не вказано інше, групи, що можуть бути використані як замісники, включають, без обмеження, галоген, гідроксил, алкіл, алкеніл, алкініл, ацил (-С(О)Нза), карбоксил (-С(0)О-Ваа), аліфатичні групи, аліциклічні групи, алкокси, заміщений окси (-О-Ваг), арил, аралкіл, гетероциклічний радикал, гетероарил, гетероарилалкіл, аміно (-М(Аьь)(Нсс)), іміно (-МЕКьь), амідо (-С(О)М(Рьь)(Несс). або -М(Вь)С(О)Наа), азидо (-Ма), нітро (-МО2), ціано (-СМ), карбамідо (ОС(О)М(Ньь)Асс) або -МЩАь)С(О)ОНаз), уреїдо (-М(Ньь)С(О)М(НАьь)(Нес)), тіоуреїдо (-М(Ньь)С(5)М(Ньь)(Нес)), гуанідиніл (-М(Аь)С(-МАьь) М(Аьь) (Нес)), амідиніл (-С(-МАь)М(Аьь)(Нсс) або -М(Ньь)С(-МАьь)(Наа)), тіол (-
ЗАьь), сульфініл. (-5(О)Нь»), сульфоніл (-5(0)2Ньь) і сульфонамідил (-5(0)2М(Ньь)(Неос) або -М(Аь)5(О)2АНьь). Де кожен Каза, Ньь і Кос незалежно являє собою Н, необов'язково зв'язану хімічну функціональну групу або додаткову групу замісника, при цьому переважний перелік включає, без обмеження, алкіл, алкеніл, алкініл, аліфатичні, алкокси, ацил, арил, аралкіл, гетероарил, аліциклічні, гетероциклічні і гетероарилалкіл. Вибрані замісники із сполуками, описаними в цьому документі, знаходяться в рекурсивному ступені. 60 При використанні в даному документі, "алкіл", використаний в даному документі, позначає насичений, прямий або розгалужений гідрогенкарбоновий радикал, що містить до двадцяти чотирьох атомів карбону. Приклади алкільних груп включають, без обмеження, метил, етил, пропіл, бутил, ізопропіл, н-гексил, октил, децил, додецил, тощо. Алкільні групи звичайно містять від 1 до близько 24 атомів карбону, частіше від 1 до близько 12 атомів карбону (С1-С:2 алкіл), при цьому більш переважно від 1 до близько 6 атомів карбону.
При використанні в даному документі, "алкеніл" позначає прямий або розгалужений гідрогенкарбоновий радикал, що містить до двадцяти чотирьох атомів карбону і має щонайменше один подвійний карбон-карбоновий зв'язок. Приклади алкенільних груп включають, без обмеження, етеніл, пропеніл, бутеніл, 1-метил-2-бутен-1-іл, дієни, такі як 1,3- бутадієн, тощо. Алкенільні групи звичайно містять від 2 до близько 24 атомів карбону, частіше від 2 до близько 12 атомів карбону, при цьому більш переважно від 2 до близько 6 атомів карбону. Алкенільні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити одну або декілька додаткових груп замісників.
При використанні в даному документі, "алкініл" позначає прямий або розгалужений гідрогенкарбоновий радикал, що містить до двадцяти чотирьох атомів карбону і має щонайменше один потрійний карбон-карбоновий зв'язок. Приклади алкінільних груп включають, без обмеження, етиніл, 1-пропініл, 1-бутиніл, тощо. Алкінільні групи звичайно містять від 2 до близько 24 атомів карбону, частіше від 2 до близько 12 атомів карбону, при цьому переважніше від 2 до близько 6 атомів карбону. Алкінільні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити одну або декілька додаткових груп замісників.
При використанні в даному документі, "ацил" позначає радикал, утворений за рахунок видалення гідроксильної групи із органічної кислоти, і має загальну формулу -С(О0)-Х, де Х звичайно є собою аліфатичним, аліциклічним або ароматичним. Приклади включають аліфатичні карбоніли, ароматичні карбоніли, аліфатичні сульфоніли, ароматичні сульфініли, аліфатичні сульфініли, ароматичні фосфати, аліфатичні фосфати, тощо. Ацильні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити додаткові групи замісників.
При використанні в даному документі, "аліциклічна" позначає циклічну кільцеву систему, у якій кільце є аліфатичним. Кільцева система може містити одне або декілька кілець, при цьому щонайменше одне кільце є аліфатичним. Переважні аліциклічні системи включають кільця, що
Зо мають від близько 5 до близько 9 атомів карбону в кільці. Аліциклічні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити додаткові групи замісників.
При використанні в даному документі, "аліфатичний" позначає прямий або розгалужений гідрогенкарбоновий радикал, що містить до двадцяти чотирьох атомів карбону, у якому ступінь насиченості між будь-якими двома атомами карбону відповідає одинарному, подвійному або потрійному зв'язку. Аліфатична група переважно містить від 1 до близько 24 атомів карбону, частіше від 1 до близько 12 атомів карбону, при цьому переважніше від 1 до близько 6 атомів карбону. Прямий або розгалужений ланцюг аліфатичної групи може перериватися одним або декількома гетероатомами, що включають нітроген, оксиген, сульфур і фосфор. Такі аліфатичні групи, що перериваються гетероатомами, включають, без обмеження, поліалкокси, такі як поліалкіленгліколі, поліаміни і поліїміни. Аліфатичні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити додаткові групи замісників.
При використанні в даному документі, "алкокси" позначає радикал, утворений між алкільною групою і атомом оксигену, при цьому атом оксигену застосовується для приєднання алкоксигрупи до початкової молекули. Приклади алкоксигруп включають, без обмеження, метокси, етокси, пропокси, ізопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, неопентокси, н-гексокси, тощо. Алкоксигрупи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити додаткові групи замісників.
При використанні в даному документі, "аміноалкіл" позначає амінозаміщений С1-Сч12 алкільний радикал. Алкільна частина вказаного радикалу утворює ковалентний зв'язок з початковою молекулою. Аміногрупа може бути розташована в будь-якому положенні, і аміноалкільна група може бути заміщена додатковою групою замісника в алкільній та/або аміночастині.
При використанні в даному документі, "аралкіл" і "арилалкіл" позначає ароматичну групу, ковалентно зв'язану з С1-С1і2 алкільним радикалом. Частина алкільного радикалу аралкільної (або арилалкільної) групи, що утворилася, утворює ковалентний зв'язок з початковою молекулою. Приклади включають, без обмеження, бензил, фенетил, тощо. Аралкільні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити додаткові групи замісників, приєднані до алкільної, арильної або до обох груп, що утворюють вказану радикальну групу.
При використанні в даному документі, "арил" і "ароматичний" позначає радикали моно- або бо поліциклічної карбоциклічної кільцевої системи, що мають одне або декілька ароматичних кілець. Приклади арильних груп включають, без обмеження, феніл, нафтил, тетрагідронафтил, інданіл, інденіл, тощо. Переважні арильні кільцеві системи мають від близько 5 до близько 20 атомів карбону в одному або декількох кільцях. Арильні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити додаткові групи замісників.
При використанні в даному документі, "галоген" і "галоген" позначає атом, вибраний з флуору, хлору, брому і йоду.
При використанні в даному документі, "гетероарил" і "гетероароматичний" позначає радикал, що містить моно- або поліциклічне ароматичне кільце, кільцеву систему або конденсовану кільцеву систему, у якому щонайменше одне з кілець є ароматичним і містить один або декілька гетероатомів. Гетероарил включає також конденсовані кільцеві системи, включаючи системи, у яких одне або декілька з конденсованих кілець не містять гетероатомів.
Гетероарильні групи, як правило, містять один кільцевий атом, вибраний із сульфуру, нітрогену або оксигену. Приклади гетероарильних груп включають, без обмеження, піридиніл, піразиніл, піримідиніл, піроліл, піразоліл, імідазоліл, тіазоліл, оксазоліл, ізооксазоліл, тіадіазоліл, оксадіазоліл, тіофеніл, фураніл, хінолініл, ізохінолініл, бензімідазоліл, бензоксазоліл, хіноксалініл, тощо. Гетероарильні радикали можуть бути приєднані до початкової молекули напряму або через зв'язувальний фрагмент, такий як аліфатична група або гетероатом.
Гетероарильні групи, використані в даному документі, можуть необов'язково містити додаткові групи замісників.
При використанні в даному документі, "кон'югована сполука" позначає будь-які атоми, групи атомів або групу зв'язаних атомів, придатну для застосування як кон'югувальна група. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юЮюговані сполуки можуть мати або впливати на одну або декілька властивостей, включаючи, без обмеження, властивості фармакодинаміки, фармакокінетики, зв'язування, адсорбції, клітинного розподілу, клітинного захоплення, заряду та/або виведення.
При використанні в даному документі, якщо не вказано або не модифіковано іншим чином, "дволанцюгові" стосується двох окремих олігомерних сполук, що гібридизовані одна з одною.
Такі дволанцюгові сполуки можуть мати один або декілька негібридизованих нуклеозидів у одного або обох кінців однієї або обох спіралей (виступи) та/або один або декілька внутрішніх негібридизованих нуклеозидів (невідповідностей), за умови, що існує достатня комплементарність для збереження гібридизації за фізіологічно релевантних умов.
В Деякі сполуки
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені кон'юговані антисмислові сполуки, що містять антисмислові олігонуклеотиди і кон'югат. а. Деякі антисмислові олігонуклеотиди
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені антисмислові олігонуклеотиди. Такі антисмислові олігонуклеотиди містять зв'язані нуклеозиди, і кожен нуклеозид містить цукровий фрагмент і азотисту основу. Структура таких антисмислових олігонуклеотидів може бути розглянута з точки зору хімічних особливостей (наприклад, модифікацій і характерних ділянок модифікацій) і послідовності азотистих основ (наприклад, послідовність антисмислового олігонуклеотиду, суть і послідовність цільової нуклеїнової кислоти). і. Деякі хімічні особливості
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид містить одну або декілька модифікацій. У деяких таких варіантах реалізації винаходу антисмислові олігонуклеотиди містять один або декілька модифікованих нуклеозидів та/"або модифікованих міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу модифіковані нуклеозиди містять модифікований цукровий фрагмент та/або модифіковану азотисту основу. 1. Деякі цукрові фрагменти
У деяких варіантах реалізації винаходу сполуки за даним описом містять один або декілька модифікованих нуклеозидів, що містять модифікований цукровий фрагмент. Такі сполуки, що містять один або декілька модифікованих за цукром нуклеозидів, можуть мати бажані властивості, такі як покращена стійкість до нуклеази або збільшена афінність зв'язування із цільовою нуклеїновою кислотою, порівняно з олігонуклеотидом, що містить тільки нуклеозиди, які містять природні цукрові фрагменти. У деяких варіантах реалізації винаходу модифіковані цукрові фрагменти є заміщеними цукровими фрагментами. У деяких варіантах реалізації винаходу модифіковані цукрові фрагменти є замінниками цукру. Такі замінники цукру можуть містити одне або декілька заміщень, що відповідають заміщенням заміщених цукрових фрагментів.
У деяких варіантах реалізації винаходу модифіковані цукрові фрагменти є заміщеними бо цукровими фрагментами, що містять один або декілька немісткових цукрових замісників,
включаючи, без обмеження, замісники у 2" та/або 5'-положеннях. Приклади замісників цукру, придатних для 2'-положення, включають, без обмеження: 2-Е, 2'-ОСНз ("ОМе" або "О-метил") і 2-О(СНг)2ОСН:»: ("МОЄ"). У деяких варіантах реалізації винаходу замісник цукру у 2'-положенні вибраний з алілу, аміно, азидо, тіо, О-алілу, О-С1-Сто алкілу, О-С1-С1о заміщеного алкілу; ОСЕ»,
Оо(СНгаЗСН:з, О(СНг)2-О-М(АКт)(Кп) її О-СНа-С(-0)-М(Ат)(Ап), де кожен Кт і Кп незалежно являє собою Н або заміщений або незаміщений С1-С:1о алкіл. Приклади замісників цукру у 5'- положенні включають, але не обмежуються ними: 5'-метил (А або 5), 5-вініл і 5'-метокси. У деяких варіантах реалізації винаходу заміщені цукри містять більше одного немісткового цукрового замісника, наприклад, 2'-Е-5'-метил-цукрові фрагменти (див., наприклад, Міжнародну заявку РСТ УМО 2008/101157, де наведені додаткові 5", 2'-біс-заміщені цукрові фрагменти і нуклеозиди).
Нуклеозиди, що містять 2'-заміщені цукрові фрагменти, згадуються як 2'-заміщені нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу 2'--заміщений нуклеозид містить 2"-групу замісника, вибрану з галогену, алілу, аміно, азидо, 5Н, СМ, ОСМ, СЕз, ОСЕ», О, 5 або М(Кт)- алкілуї; О, 5 або М(Кл)-алкенілу;ї О, 5 або М(Нт)-алкінілу; О-алкіленіл-О-алкілу, алкінілу, алкарилу, аралкілу, О-алкарилу, О-аралкілу,ї О(СН2г)25ЗСНз,О-(СНг)»-О-М(Ат) Ап) або О-СНе-
С(-0)-МЩ(Ат)(Ао), де кожен Нт і Ки незалежно являє собою Н, амінозахисну групу або заміщений або незаміщений С1-С:о алкіл. Ці 2'-групи замісників можуть бути додатково заміщені однією або декількома групами замісників, незалежно вибраними з гідроксилу, аміно, алкокси, карбокси, бензилу, фенілу, нітро (МО»), тіолу, тіоалкокси (5-алкілу), галогену, алкілу, арилу, алкенілу і алкінілу.
У деяких варіантах реалізації винаходу 2'-заміщений нуклеозид містить 2"-групу замісника, вибрану з Е, МН», Мз, ОСЕз, О-СНз, О(СНг)зМН:, СН»-АСН-АСН»:, О-СН»-АСН-СНо, ОСННгОСсН 5,
Оо(СНг»ЗСН», О-(СНг)2-О-М(Ат)(Ае), О(СНггО(СНг)М(СНЗз)2 і М-заміщеного ацетаміду (О-СНе-
Фб(-0)-МЩ(Ат) (Ви), де кожен Нт і Ка незалежно являє собою Н, амінозахисну групу або заміщений або незаміщений С1-Сно алкіл.
У деяких варіантах реалізації винаходу 2'-заміщений нуклеозид містить цукровий фрагмент, що містить 2'"-групу замісника, вибрану з Е, ОСЕз, О-СНз3, ОСНСНгОСснН», О(СНг)26 ЗОН», О-(СНг2г)»-
Оо-М(СНз)», - (СН 25 О(СНг) а М(СНзі)» і О-СН2г-С(-0)-М(Н)СН.
Зо У деяких варіантах реалізації винаходу 2'-заміщений нуклеозид містить цукровий фрагмент, що містить 2'"-групу замісника, вибрану з Е, О-СНз і ОСНг.СНгОСсН.».
Деякі модифіковані цукрові фрагменти містять містковий цукровий замісник, який утворює друге кільце, що приводить до одержання біциклічного цукрового фрагмента. У деяких таких варіантах реалізації винаходу біциклічний цукровий фрагмент містить місток між 4" і 2" атомами фуранозного кільця. Приклади таких 4-2" цукрових замісників включають, без обмеження: -ІС(ВахАВье-, -(С(ВахРь)и-О-,. -С(ВаВь)-М(А)-О- або -С(ВаНВь)-О-М(В)-; 4-СНе-2, 4-(СНг)г-2, 4- (СНг)з-2,. 4-(СНг)-О-2 (МА); 4-(СНег)-5-2 4-(бНг)»-О-2 (ЕММА); 4-СН(СНз)-О-2 (СЕ Її 4-
СнН(СНгОСН»)-0-2", та його аналоги (див., наприклад, патент США 7399845, виданий 15 липня 2008 року); 4-С(СНз)(СНз)-О-2" та його аналоги (див., наприклад, УУО2009/006478, опубліковану 8 січня 2009 року); 4-СН».АМ(ОСНз)-2' та його аналоги (див., наприклад, УУО2008/150729, опубліковану 11 грудня 2008 року); 4-СНо-О-М(СНз)-2 (див., наприклад, 052004/0171570, опубліковану 2 вересня 2004 року); 4-СН2-О-М(В)-2' ї 4-СНоАМ(Н)-О-2"-, де кожен К незалежно являє собою Н, захисну групу або С1-С12 алкіл; 4-СНо-М(Н)-О-2, де К являє собою Н, С1-С12 алкіл або захисну групу (див., наприклад, патент США 7427672, виданий 23 вересня 2008 року); 4-СНо-С(НуСНЗ)-2 (див., наприклад, Спайораануауа, еї аї., У. Огуд. Спет.,2009, 74, 118-134); і 4-
СНна-С(-СН»г)-2' та його аналоги (див. опубліковану Міжнародну заявку РСТ УМО 2008/154401, опубліковану 8 грудня 2008 року).
У деяких варіантах реалізації винаходу такі містки 4-2" незалежно містять від 1 до 4 зв'язаних груп, незалежно вибраних з -ІС(Ва)(Вь)и-, «С(На)-С(Вь)-, -С(Ва)-М-, -«С(-МВа)-, -С(-0)-, -б(-5)-, -О-, -5І(На)2-, -5(-0)х- і -М(Ва)-; де: х дорівнює 0, 1 або 2; п дорівнює 1, 2, З або 4; кожен Ка і Кь незалежно являє собою Н, захисну групу, гідроксил, С1-С12 алкіл, заміщений
С1-Сі12 алкіл, С2-С1» алкеніл, заміщений С2-С12 алкеніл, С2-С1» алкініл, заміщений С2-Сі» алкініл,
С5-Сго арил, заміщений С5-Сго арил, гетероциклічний радикал, заміщений гетероциклічний радикал, гетероарил, заміщений гетероарил, С5-С7 аліциклічний радикал, заміщений С5-С7 аліциклічний радикал, галоген, ОО), МуУ1ог2, 5), Мз, СОУ, ацил (С(2О)-Н), заміщений ацил, СМ, сульфоніл (5(-0)2-)1) або сульфоксил (5(-0)-)1); і бо кожен .: і дг незалежно являє собою Н, С1-Сі2 алкіл, заміщений С1-С12 алкіл, С2-С:і2» алкеніл,
заміщений С2-С:2 алкеніл, С2-С12 алкініл, заміщений С2-С:2 алкініл, Се-Сго арил, заміщений С5-
Со оарил, ацил (С(-О)-Н) заміщений ацил, гетероциклічний радикал, заміщений гетероциклічний радикал, С1-С12 аміноалкіл, заміщений С1-Сі2 аміноалкіл або захисну групу.
Нуклеозиди, що містять біциклічні цукрові фрагменти, згадуються як біциклічні нуклеозиди або ВМА. Біциклічні нуклеозиди включають, без обмеження, (А) а-І -метиленокси (4-СН2-О-27)
ВМА, (В) В-О-метиленокси (4-СН2г-0-2") ВМА (також згадується як закрита нуклеїнова кислота або І МА), (С) етиленокси (4-(СНг)2-0-2") ВМА, (0) аміноокси (4-СН2-0О-М(Н)-2") ВМА, (Е) оксіаміно (4-СНо-М(Н)-0О-23 ВМА, (Р) метил(метиленокси) (4-СН(СНз)-О-23 ВМА (також згадується як стерично ускладнений етил або сЕЮ, (б) метилен-тіо (4-СНо-5-27) ВМА, (Н) метилен-аміно (4-СН2-М(Н)-2") ВМА, (І) метил-карбоциклічний (4-СНо-СН(СНз)-2") ВМА і (у) пропілен-карбоциклічний (4"-(СНг)з-2") ВМА, як показано нижче.
З о. Вх З о. Вх бах,
З о -о0 ллл, лад, (А) (В) (С 3-0. /Вх 3-0. Вх 2-0. Вх х пл, я,
Кк (0) (Б) (В)
В ей Ід « М в СНУ (5) (9) () пед -, (9) ! де Вх являє собою фрагмент азотистої основи, а К незалежно являє собою Н, захисну групу або Сі-Сі2 алкіл.
В даній галузі техніки відомі додаткові біциклічні цукрові фрагменти, наприклад: 5іпоп еї аї.,
Спет. Соттип., 1998, 4, 455-456; КознКіп єї а!., Теїганедгоп, 1998, 54, 3607-3630; У/аніезієдії єї аІ.,, Ргос. Маї). Асай. 5сі. О. 5. А., 2000, 97, 5633-5638; Китаг єї аї!., Віоогу. Мед. Спет. І ей., 1998, 8, 2219-2222; біпоп еї а!., У. Огу. Спет., 1998, 63, 10035-10039; 5іїмазіама еї аї., у). Ат.
Спет. 5ос., 129(26) 8362-8379 (4 липня 2007 року); ЕІауаді еї аї., Си. Оріпіоп Іпуепв. Югав, 2001, 2, 558-561; Вгаазсп еї а!Ї., Спет. Віоі!., 2001, 8, 1-7; Огит еї аї., Сшт. Оріпіоп Мої. Тнег., 2001, 3, 239-243; патенти США Мо 7053207 6268490 6770748 6794499 7034133 6525191 6670461 і 7399845; УМО 2004/106356, УМО 1994/14226, МО 2005/021570 і УМО 2007/134181; публікації патентів США Ме 052004/0171570, 052007/0287831 і 052008/0039618; патенти США з серійними номерами 12/129154 60/989574 61/026995 61/026998 61/056564 61/086231 61/097787 і 61/099844; і Міжнародні заявки РСТ Ме РСТ/О52008/064591, РСТ/052008/066154 і
РСТ/0О52008/068922.
У деяких варіантах реалізації винаходу біциклічні цукрові фрагменти і нуклеозиди, що містять такі біциклічні цукрові фрагменти, додатково визначають за ізомерною конфігурацією.
Наприклад, нуклеозид, що містить місток 4'-2'-метилен-окси, може знаходитися в а-Ї конфігурації або у В-О конфігурації. Раніше с-І -метиленокси (4"-СН2-0-2") біциклічні нуклеозиди були введені до антисмислових олігонуклеотидів, що мають антисмислову активність (Егієдеп еї а|., Мисівєїс Асід5 Незеагси, 2003, 21, 6365-6372).
У деяких варіантах реалізації винаходу заміщені цукрові фрагменти містять один або декілька немісткових цукрових замісників і один або декілька місткових цукрових замісників (наприклад, 5'-заміщені і 4"-2'-місткові цукри). (див., наприклад, Міжнародну заявку РСТ УМО 2007/134181, опубліковану 11/22/07, у якій МА заміщена, наприклад, 5'-метильною або 5'- вініловою групою).
У деяких варіантах реалізації винаходу модифіковані цукрові фрагменти є замінниками цукру. У деяких таких варіантах реалізації винаходу атом оксигену природного цукру є заміщеним, наприклад, атомом сульфуру, карбону або нітрогену. У деяких таких варіантах реалізації винаходу такий модифікований цукровий фрагмент містить також місткові та/або немісткові замісники, як описано вище. Наприклад, деякі замінники цукру містять 4-атом сульфуру і заміщення у 2"--положенні (див., наприклад, опубліковану патентну заявку США
О52005/0130923, опубліковану 16 червня 2005 року) та/(або 5'-положенні. Як додатковий приклад, були описані карбоциклічні біциклічні нуклеозиди, що мають місток 4-2" (див., наприклад, Егеїег еї аї., Мисіеіс Асід5 Кезеагсі, 1997, 25(22), 4429-4443 і АІраєк еї аї., у). Ога.
Спет., 2006, 71, 7731-7740).
У деяких варіантах реалізації винаходу замінники цукру містять кільця, що мають не 5 атомів. Наприклад, в деяких варіантах реалізації винаходу замінник цукру містить морфоліно.
Морфоліно-сполуки та їх застосування в олігомерних сполуках було описано у численних патентах і опублікованих статтях (див., наприклад: Вгаазсп еї аї!., Віоспетівігу, 2002, 41, 4503- 4510; ії патенти США 5698685; 5166315; 5185444 і 5034506). При використанні в даному документі, термін "морфоліно" позначає замінник цукру, що має наступну структуру: у"
Ї
У деяких варіантах реалізації винаходу морфоліно можуть бути модифікованими, наприклад, додаванням або зміною різних груп замісників у представленій вище структурі морфоліно. Такі замінники цукру згадуються у даному документі як "модифіковані морфоліно".
Як інший приклад, у деяких варіантах реалізації винаходу замінник цукру містить шестичленний тетрагідропіран. Такі тетрагідропірани можуть бути додатково модифікованими або заміщеними. Нуклеозиди, що містять такі модифіковані тетрагідропірани, включають, без обмеження, гекситолову нуклеїнову кислоту (НМА), анітолову нуклеїнову кислоту (АМА),
Зо манітолову нуклеїнову кислоту (ММА) (див. Геитапп, СУ. Віоогу. 5 Мед. Спет. (2002) 10:841- 854), флуор-НМА (Б-НМА) і сполуки, що мають Формулу МІ: а а» т3-о0 о аз а; ад ав Вх / В В, 5
Та МІ, де незалежно для кожного із вказаного щонайменше одного тетрагідропіранового нуклеозидного аналога Формули МІ:
Вх являє собою фрагмент азотистої основи;
Тз ії Та, кожен незалежно, являє собою міжнуклеозидну зв'язувальну групу, що зв'язує тетрагідропірановий нуклеозидний аналог з антисмисловою сполукою, або один із Тз і Т. являє собою міжнуклеозидну зв'язувальну групу, що зв'язує тетрагідропірановий нуклеозидний аналог з антисмисловою сполукою, а інший з Тз і Т4 являє собою Н, гідроксил-захисну групу, зв'язану кон'югувальну групу або 5" або 3'-кінцеву групу; ат, а», аз, дл, д5, Де і д7, кожен незалежно, являє собою Н, С1-Св алкіл, заміщений С:1-Св алкіл,
С2-Свалкеніл, заміщений Сг-Свє алкеніл, С2-Св алкініл або заміщений С2-Св алкініл; і кожен з Кі: і Ко незалежно вибраний з: гідрогену, галогену, заміщеного або незаміщеного алкокси, МУтуг, 51, Мз, "С(ЕХ)9ї, "С(ЕХ)МО 2, Мозб(-Х)МУ о» і СМ, де Х являє собою О, 5 або
Му, і кожен 5, 9» і дз незалежно являє собою Н або С:-Св алкіл.
У деяких варіантах реалізації винаходу наведені модифіковані ТНР нуклеозиди Формули МІ, у яких кожен ді, дг2, з, дя, д5, дб ії ду являє собою Н. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один з ад, д2, Оз, да, 95, де ії д7 відмінний від Н. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один з ад, д2, з, да, д5, дв і 47 є метилом. У деяких варіантах реалізації винаходу наведені ТНР нуклеозиди Формули МІ, у яких один з Кі: і Ко» являє собою Р. У деяких варіантах реалізації винаходу К: являє собою флуор, а Ко являє собою Н, Кі являє собою метокси, а Е2 являє собою Н, і КЕ: являє собою метоксіетокси, а Е2 являє собою Н.
У даній галузі техніки відомо також багато інших біциклічних і трициклічних кільцевих систем замінників цукру, які можуть бути використані для модифікації нуклеозидів з метою введення до антисмислових сполук (див., наприклад, оглядову статтю: І ештапп, 4). С, Віоогдапіс 8 Медісіпа!
Спетівігу, 2002, 10, 841-854).
Без обмеження, наведені також комбінації модифікацій, такі як 2'-Е-5'-метил-заміщені нуклеозиди (див. Міжнародну заявку РСТ УМО 2008/101157, опубліковану 8/21/08, де описані інші 5", 2'-бис-заміщені нуклеозиди) і заміна атома оксигену рибозильного кільця на 5 і додаткове заміщення у 2'-положенні (див. опубліковану заявку на патент США О0О52005-0130923, опубліковану 16 червня 2005 року) або, альтернативно, 5'-заміщення біциклічної нуклеїнової кислоти (див. Міжнародну заявку РСТ УМО 2007/134181, опубліковану 11/22/07, у якій 4-СН»-О-2! біциклічний нуклеозид додатково заміщений у 5'- положенні 5'і-метильною або 5'-вініловою групою). Було описано також синтез і одержання карбоциклічних біциклічних нуклеозидів разом з їх олігомеризацією і біохімічними дослідженнями (див., наприклад, 5гімавіама еї аї.,». Ат.
Спет. 5ос. 2007, 129(26), 8362-8379).
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені олігонуклеотиди, що містять модифіковані нуклеозиди. Такі модифіковані нуклеотиди можуть містити модифіковані цукри, модифіковані азотисті основи та/або модифіковані зв'язки. Конкретні модифікації вибирають таким чином, щоб одержані олігонуклеотиди мали бажані характеристики. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять один або декілька РНК-подібних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять один або декілька ДНК-подібних нуклеотидів. 2. Деякі модифікації азотистих основ
У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеозиди відповідно до даного опису містять одну або декілька немодифікованих азотистих основ. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеозиди відповідно до даного опису містять одну або декілька модифікованих азотистих основ.
Зо У деяких варіантах реалізації винаходу модифіковані азотисті основи вибрані з: універсальних основ, гідрофобних основ, змішаних основ, збільшених у розмірі основ і флуорованих основ, описаних в даному документі. 5-заміщені піримідини, б-азапіримідини і М-2,
М-6 ої 0-6-заміщені пурини, включаючи 2-амінопропіладенін, 5-пропінілурацил; 5- пропінілцитозин; 5-гідроксиметил-цитозин, ксантин, гіпоксантин, 2-аміноаденін, б-метил та інші алкільні похідні аденіну і гуаніну, 2-пропіл та інші алкільні похідні аденіну і гуаніну, 2-тіоурацил, 2-тіотимін і 2-тіоцитозин, 5-галогенурацил і цитозин, 5-пропініл (-С-0-СНз) урацил і цитозин та інші алкінільні похідні піримідинових основ, б-азоурацил, цитозин і тимін, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тіоурацил, 8-галоген, 8-аміно, 8-тіол, 8-тіоалкіл, 8-гідроксил та інші 8-заміщені аденіни і гуаніни, 5-галоген, зокрема, 5-бром, 5-трифлуорметил та інші 5-заміщені урацили і цитозини, 7-метилгуанін і 7-метиладенін, 2-Е-аденін, 2-аміноаденін, 8-азагуанін і 8-азааденін, 7- деазагуанін і 7-деазааденін, 2-деазагуанін і З-деазааденін, універсальні основи, гідрофобні основи, змішані основи, збільшені у розмірі основи і флуоровані основи, описані в даному документі. Додаткові модифіковані азотисті основи включають трициклічні піримідини, такі як феноксазину цитидин (І5,4-0111,4|бензоксазин-2(ЗН)-он), фенотіазину цитидин (1Н-піримідо|5,4-
БІ1,4Ібензотіазин-2(ЗН)-он), так звані (з-сіатр, такі як заміщений феноксазину цитидин (наприклад, 9-(2-аміноетокси)-Н-піримідо|5,4-5111,4|бензоксазин-2(ЗН)-он), карбазолу цитидин (2Н-піримідо|4,5-В|індол-2-он), піридоїндолу цитидин (Н-піридо|/3',2"4,5|піроло|2,3-4|піримідин-2- он). Модифіковані азотисті основи також можуть включати азотисті основи, в яких пуринова або піримідинова основа замінена іншими гетероциклами, наприклад, 7-деаза-аденін, 7- деазагуанозин, 2-амінопіридин і 2-піридон. Додаткові азотисті основи включають азотисті основи, описані в патенті США Мо 3687808, описані в публікації Тиє Сопсізе Епсусіоредіа ОЇ
Роїутег Зсіепсе Апа Епдіпеегіпо, Кго5спм/йя, 9.І., ред., Уопп Уміеу 5 5опв, 1990, 858-859; описані авторами Епоії5сі еї аї., Апдеу"апаєге Спетіє, Міжнародне видання, 1991, 30, 613; та описані в публікації Запопмі, М.5., розділ 15, Апіїзепзе Кезеагс! апа Арріїсайоп5, СтоокКе, 5.Т. і І ерієн, В., ред., СКС Ргез5, 1993, 273-288.
Ілюстративні патенти США, в яких описано одержання деяких з вищезазначених модифікованих азотистих основ, а також інших модифікованих азотистих основ, включають, без обмеження, Ш.5. 3687808; 4845205: 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 60 5681941; 5750692; 5763588; 5830653 і 6005096, деякі з яких знаходяться в процесі розгляду одночасно з даною заявкою, і кожен з яких включений до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі.
З. Деякі міжнуклеозидні зв'язки
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені олігонуклеотиди, що містять зв'язані нуклеозиди. У таких варіантах реалізації винаходу нуклеозиди можуть бути зв'язані разом за допомогою будь-якого міжнуклеозидного зв'язку. Два основних класи міжнуклеозидних зв'язувальних груп визначаються за наявністю або відсутністю атома фосфору. Ілюстративні фосфоровмісні міжнуклеозидні зв'язки включають, без обмеження, фосфодіестери (РО), фосфотриестери, метилфосфонати, фосфорамідати і тіофосфати (РБ). Ілюстративні міжнуклеозидні зв'язувальні групи, що не містять фосфору, включають, без обмеження, метиленметиліміно (-СН2-М(СНз)-О-СнНе-), тіодіестер (-0-С(0)-5-), тіонокарбамат (-0О-С(О)(МН)-
З-); силоксан (-0О-51і(Н)2-О-); і М, М'-диметилгідразин (-СН»-М(СНз)-М(СНз)-). Модифіковані зв'язки, порівняно з природними фосфодіестерними зв'язками, можуть бути використані для зміни, звичайно збільшення стійкості олігонуклеотиду до нуклеази. У деяких варіантах реалізації винаходу міжнуклеозидні зв'язки, що мають хіральний атом, можуть бути одержані у вигляді рацемічної суміші або у вигляді окремих енантіомерів. Ілюстративні хіральні зв'язки включають, без обмеження, алкілфосфонати і тіофосфати. Способи одержання фосфоровмісних і міжнуклеозидних зв'язків, що не містять фосфору, добре відомі фахівцям в даній галузі техніки.
Олігонуклеотиди, описані в даному документі, містять один або декілька асиметричних центрів і, отже, можуть утворювати енантіомери, діастереомери та інші стереоізомерні конфігурації, які відповідно до абсолютної стереохімії можуть бути визначені як (К) або (5), або, як для аномерів цукру, або як (0) або (І), як для амінокислот, тощо. До антисмислових сполук, представлених у даному документі, включені всі такі можливі ізомери, а також їх рацемічні і оптично чисті форми.
Нейтральні зв'язувальні лінкери включають, без обмеження, фосфотриестери, метилфосфонати, ММІ (3-СНо-М(СНз)-0О-5), амід-3 (3'-СН»-С(-0)-М(Н)-5), амід-4 (3-СН2-М(Н)-
С(-0)-5)3, формацеталь (3'-0-СНг-О-5) і тіоформацеталь (3'-5-СН2-0-5). Додаткові нейтральні міжнуклеозидні зв'язки включають неіїонні зв'язки, що містять силоксан (діалкілсилоксан), карбоксильний естер, карбоксамід, сульфід, сульфоновий естер і аміди (див., наприклад:
Зо Сатопнуагаїе Моаіїсайопв5 іп Апіїзепзе Незеагсі; У.5. Запопмі і Р.О. СоокК, ред., АСЗ Зутрозішт зегіез5 580; розділи З і 4, 40-65). Додаткові нейтральні міжнуклеозидні зв'язки включають неїонні зв'язки, що містять змішані складові частини М, 0, 5 і СН». 4. Деякі мотиви
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові олігонуклеотиди містять один або декілька модифікованих нуклеозидів (наприклад, нуклеозид, що містить модифікований цукор та/або модифіковану азотисту основу) та/або один або декілька модифікованих міжнуклеозидних зв'язків. Характерна ділянка таких модифікацій в олігонуклеотиді згадується в даному документі як мотив. У деяких варіантах реалізації винаходу мотиви цукру, азотистих основ і лінкера не залежать один від одного. а. Деякі цукрові мотиви
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять один або декілька типів модифікованих цукрових фрагментів та/"або природних цукрових фрагментів, розташованих уздовж олігонуклеотиду або його ділянки певним чином або у вигляді мотиву цукрової модифікації. Такі мотиви можуть містити будь-які цукрові модифікації, розглянуті в даному документі, та/або інші відомі модифікації цукру.
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять або складаються з ділянки, що має цукровий мотив гепмеру, який містить дві зовнішні ділянки або "крила" і центральну або внутрішню ділянку, або "геп". Ці три ділянки цукрового мотиву гепмеру (5'-крило, геп і 3'-крило) утворюють безперервну послідовність азотистих основ, у якій щонайменше деякі із цукрових фрагментів нуклеозидів у кожному крилі відрізняються щонайменше від деяких цукрових фрагментів нуклеозидів у гепі. Зокрема, щонайменше ті цукрові фрагменти нуклеозидів кожного крила, які розташовані найближче до гепу (3'-'найближчий нуклеозид 5'-крила і 5'-найближчий нуклеозид 3'-крила), відрізняються від цукрового фрагмента сусідніх нуклеозидів у гепі, визначаючи таким чином межу між крилами і гепом. У деяких варіантах реалізації винаходу цукрові фрагменти у гепі є однаковими між собою. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один або декілька нуклеозидів, що мають цукровий фрагмент, який відрізняється від цукрового фрагмента одного або декількох інших нуклеозидів у гепі. У деяких варіантах реалізації винаходу цукрові мотиви двох крил є однаковими між собою (симетричний цукровий гепмер). У деяких варіантах реалізації винаходу цукрові мотиви 5'-крила відрізняються від бо цукрового мотиву 3'-крила (асиметричний цукровий гепмер).
і. Деякі 5'-крила
У деяких варіантах реалізації винаходу 5'і--крило гепмеру складається з 1-8 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5-крило гепмеру складається з 1-7 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається з 1- 6 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається з 1-5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 2-5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 3-5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 4 або 5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'- крило гепмеру складається з 1-4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу
Б'і-крило гепмеру складається з 1-3 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'--крило гепмеру складається з 1 або 2 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 2-4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 2 або З зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'і-крило гепмеру складається із З або 4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5-крило гепмеру складається з 1 нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 2 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із З зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру складається із 6 зв'язаних нуклеозидів.
У деяких варіантах реалізації винаходу 5-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше два біциклічних нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше три біциклічних нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше чотири біциклічних нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу 5-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить
Зо щонайменше один І МА нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'- крила гепмеру являє собою біциклічний нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'-крила гепмеру являє собою стерично ускладнений етил-нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'-крила гепмеру являє собою І МА нуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'- крило гепмеру містить щонайменше один 2-МОЄЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один 2'-ОМе нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5-крила гепмеру являє собою не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'-крила гепмеру являє собою 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'-крила гепмеру являє собою 2-МОЄЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'-крила гепмеру являє собою 2'-ОМе нуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один 2'- дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'-крила гепмеру являє собою 2'-дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один рибонуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 5'-крила гепмеру являє собою рибонуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу один, більше одного або кожен з нуклеозидів 5'-крила являє собою РНК-подібний нуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу
Б5-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'-«МОЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'-ОМе нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'"--дезоксинуклеозид. бо У деяких варіантах реалізації винаходу 5-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один 2-МОЄЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'і-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил- нуклеозид і щонайменше один 2-ОМе нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 5'- крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один 2'"--дезоксинуклеозид. іі. Деякі 3'-крила
У деяких варіантах реалізації винаходу З'-крило гепмеру складається з 1-8 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається з 1-7 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається з 1- 6 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається з 1-5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із 2-5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру складається із 3-5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із 4 або 5 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'- крило гепмеру складається із 1-4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу
З-крило гепмеру складається з 1-3 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'--крило гепмеру складається з 1 або 2 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'--крило гепмеру складається із 2-4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із 2 або З зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із З або 4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу З3-крило гепмеру складається з 1 нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із 2 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із З зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із 4 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається з 5 зв'язаних
Зо нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру складається із б зв'язаних нуклеозидів.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один МА нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою біциклічний нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою стерично ускладнений етил-нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою І МА нуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше два не біциклічних модифікованих нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше три не біциклічних модифікованих нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше чотири не біциклічних модифікованих нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'- крило гепмеру містить щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'--крило гепмеру містить щонайменше один 2'-МОЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3і--крило гепмеру містить щонайменше один 2'-ОМе нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою 2-МОЄЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою 2'-ОМе нуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один 2'- дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою 2'-дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один рибонуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид 3'-крила гепмеру являє собою рибонуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу один, більше одного або кожен з нуклеозидів 5'-крила являє собою РНК-подібний
Гс10) нуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'-МОЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'-ОМе нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид і щонайменше один 2'"--дезоксинуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один 2-МОЄЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил- нуклеозид і щонайменше один 2-ОМе нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'- крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид і щонайменше один 2'"--дезоксинуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один МА нуклеозид і щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один І МА нуклеозид і щонайменше один 2'--заміщений нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один І МА нуклеозид і щонайменше один 2-МОЕ нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один І МА нуклеозид і щонайменше один 2-ОМе нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один І МА нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид, щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид і
Зо щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид, щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один І МА нуклеозид, щонайменше один не біциклічний модифікований нуклеозид і щонайменше один 2'- дезоксинуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид, щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид і щонайменше один 2'- дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид, щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'- крило гепмеру містить щонайменше один МА нуклеозид, щонайменше один 2'-заміщений нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид, щонайменше один 2'-МОЕ нуклеозид і щонайменше один 2- дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид, щонайменше один 2'-МОЕ нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один МА нуклеозид, щонайменше один 2'--МОЕ нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид.
У деяких варіантах реалізації винаходу 3-крило гепмеру містить щонайменше один біциклічний нуклеозид, щонайменше один 2-ОМе нуклеозид і щонайменше один 2- дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один стерично ускладнений етил-нуклеозид, щонайменше один 2'-ОМе нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу 3'-крило гепмеру містить щонайменше один МА нуклеозид, щонайменше один 2'-ОМе нуклеозид і щонайменше один 2'-дезоксинуклеозид. ії. Деякі центральні ділянки (гепи)
У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 6-20 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 6-15 зв'язаних бо нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 6-12 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 6-10 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 6-9 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 6-8 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 6 або 7 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 7-10 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 7-9 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 7 або 8 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 8-10 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається з 8 або 9 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається із б зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається із 7 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається із 8 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається із 9 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається із 10 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається із 11 зв'язаних нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп гепмеру складається із 12 зв'язаних нуклеозидів.
У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид гепа гепмеру являє собою 2'- дезоксинуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один або декілька модифікованих нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен нуклеозид гепа гепмеру являє собою 2'-дезоксинуклеозид або являє собою модифікований "ДНК-подібний" нуклеозид. У таких варіантах реалізації винаходу "ДНК-подібний" означає, що нуклеозид має такі ж характеристики, що і ДНК, тобто що дуплекс, який містить гепмер і молекулу РНК може активувати РНКазу Н. Наприклад, було показано, що за деяких умов 2'-(ага)-Е підтримує активацію РНКази Н і, отже, є ДНК-подібним. У деяких варіантах реалізації винаходу один або декілька нуклеозидів гепа гепмеру не є 2'-дезоксинуклеозидом і не є ДНК-подібним. Однак, у деяких з таких варіантів реалізації винаходу гепмер підтримує активацію РНКази Н (наприклад, за рахунок кількості або положення не-ДНК нуклеозидів).
У деяких варіантах реалізації винаходу гепи містять ділянку немодифікованого 2'- дезоксинуклеозиду, що переривається одним або декількома модифікованими нуклеозидами, що приводить до утворення трьох субрайонів (двох ділянок одного або декількох 2'- дезоксинуклеозидів і ділянки одного або декількох перериваючих модифікованих нуклеозидів).
У деяких варіантах реалізації винаходу жодна ділянка немодифікованих 2'-дезоксинуклеозидів не довша за 5, 6 або 7 нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу такі короткі ділянки утворюються за рахунок застосування коротких геп-доменів. У деяких варіантах реалізації винаходу короткі ділянки утворюються за рахунок переривання довшого геп-домену.
У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один або декілька модифікованих нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу сгеп містить один або декілька модифікованих нуклеозидів, вибраних з СсЕЇ, ЕНМА, І МА і 2-тіотимідину. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить 5'-заміщений цукровий фрагмент, вибраний з 5'-Ме і 5(8)-Ме. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить два модифікованих нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить три модифікованих нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить чотири модифікованих нуклеозиди. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить два або більше модифікованих нуклеозидів, і кожен модифікований нуклеозид є таким же. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить два або більше модифікованих нуклеозидів, і кожен модифікований нуклеозид є іншим.
У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один або декілька модифікованих зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один або декілька метилфосфонатних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить два або більше модифікованих зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один або декілька модифікованих зв'язків і один або декілька модифікованих нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить один модифікований зв'язок і один модифікований нуклеозид. У деяких варіантах реалізації винаходу геп містить два модифікованих зв'язки і два або більше модифікованих нуклеозидів. р. Деякі мотиви міжнуклеозидних зв'язків
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять модифіковані міжнуклеозидні зв'язки, розташовані вздовж олігонуклеотиду або його ділянки певним чином або у вигляді мотиву модифікованого міжнуклеозидного зв'язку. У деяких варіантах реалізації бо винаходу олігонуклеотиди містять область, що має мотив почережних міжнуклеозидних зв'язків.
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди за даним описом містять область однаковим чином модифікованих міжнуклеозидних зв'язків. У деяких таких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить область, яка рівномірно зв'язана тіофосфатними міжнуклеозидними зв'язками. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид рівномірно зв'язаний тіофосфатними міжнуклеозидними зв'язками. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен міжнуклеозидний зв'язок олігонуклеотиду вибраний з фосфодіестеру і тіофосфату. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен міжнуклеозидний зв'язок олігонуклеотиду вибраний з фосфодіестеру і тіофосфату, і щонайменше один міжнуклеозидний зв'язок є тіофосфатним.
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 6 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 7 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 8 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 9 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 10 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 11 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 12 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 13 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше 14 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків.
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше один блок щонайменше з б суміжних тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше один блок щонайменше з 7 суміжних тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше один блок щонайменше з 8 суміжних тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше один блок щонайменше з 9 суміжних тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить щонайменше один блок щонайменше з 10 суміжних тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид
Зо містить щонайменше один блок щонайменше з 12 суміжних тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких таких варіантах реалізації винаходу щонайменше один такий блок розташований на 3'-кінці олігонуклеотиду. У деяких таких варіантах реалізації винаходу щонайменше один такий блок розташований в межах З нуклеозидів 3'-кінця олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 15 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 14 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 13 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 12 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 11 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 10 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 9 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 8 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу оолігонуклеотид містить менше 7 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше б тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид містить менше 5 тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків. с. Деякі мотиви модифікацій азотистих основ
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять хімічні модифікації азотистих основ, розташовані вздовж олігонуклеотиду або його ділянки певним чином або у вигляді мотиву модифікації азотистих основ. У деяких таких варіантах реалізації винаходу модифікації азотистих основ розташовані у розірваному мотиві. У деяких варіантах реалізації винаходу модифікації азотистих основ розташовані у почережному мотиві. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна азотиста основа є модифікованою. У деяких варіантах реалізації винаходу жодна з азотистих основ не є хімічно модифікованою.
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять блок модифікованих азотистих основ. У деяких таких варіантах реалізації винаходу блок знаходиться на 3'-кінці олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу блок знаходиться в межах 3 нуклеотидів З3'-кінця олігонуклеотиду. У деяких таких варіантах реалізації винаходу блок бо знаходиться на 5'-кінці олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу блок знаходиться в межах З нуклеотидів 5'-кінця олігонуклеотиду.
У деяких варіантах реалізації винаходу модифікації азотистих основ залежать від природної основи в конкретному положенні олігонуклеотиду. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу кожен пурин або кожен піримідин в олігонуклеотиді є модифікованим. У деяких варіантах реалізації винаходу модифікованим є кожен аденін. У деяких варіантах реалізації винаходу модифікованим є кожен гуанін. У деяких варіантах реалізації винаходу модифікованим є кожен тимін. У деяких варіантах реалізації винаходу модифікованим є кожен цитозин. У деяких варіантах реалізації винаходу модифікованим є кожен урацил.
У деяких варіантах реалізації винаходу деякі, всі або жодні із цитозинових фрагментів в олігонуклеотиді не є 5-метилцитозиновими фрагментами. У цьому документі 5-метилцитозин не є "модифікованою азотистою основою". Відповідно, якщо не вказано інше, то немодифіковані азотисті основи включають як цитозинові залишки, що містять 5-метил, так і ті, що не містять 5- метилу. У деяких варіантах реалізації винаходу обумовлений стан метилювання всіх або деяких цитозинових азотистих основ.
У деяких варіантах реалізації винаходу хімічні модифікації азотистих основ включають приєднання деяких кон'югувальних груп до азотистих основ. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен пурин або кожен піримідин в олігонуклеотиді може бути необов'язково модифікований таким чином, щоб він містив кон'югувальну групу. й. Деякі загальні довжини
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені олігонуклеотиди будь-якого з різноманітних діапазонів довжин. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять від Х до У зв'язаних нуклеозидів, де Х є найменшою кількістю нуклеозидів у діапазоні, а
У є найбільшою кількістю нуклеозидів у діапазоні. У деяких таких варіантах реалізації винаходу кожен Х і У незалежно вибраний з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 4911 50; за умови, що Х х У. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотид може складатися із 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 8-21, 8-22, 8-23, 8- 24, 8-25, 8-26, 8-27, 8-28, 8-29, 8-30, 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 9-21, 9-22, 9-23, 9-24, 9-25, 9-26, 9-27, 9-28, 9-29, 9-30, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16,
Зо 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 10-21, 10-22, 10-23, 10-24, 10-25, 10-26, 10-27, 10-28, 10-29, 10-30, 11- 12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 11-21, 11-22, 11-23, 11-24, 11-25, 11-26, 11-27, 11-28, 11-29, 11-30, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 12-21, 12-22, 12- 23, 12-24, 12-25, 12-26, 12-27, 12-28, 12-29, 12-30, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 13-21, 13-22, 13-23, 13-24, 13-25, 13-26, 13-27, 13-28, 13-29, 13-30, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14- 19, 14-20, 14-21, 14-22, 14-23, 14-24, 14-25, 14-26, 14-27, 14-28, 14-29, 14-30, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 15-21, 15-22, 15-23, 15-24, 15-25, 15-26, 15-27, 15-28, 15-29, 15-30, 16-17, 16-18, 16- 19, 16-20, 16-21, 16-22, 16-23, 16-24, 16-25, 16-26, 16-27, 16-28, 16-29, 16-30, 17-18, 17-19, 17-20, 17-21,17-22,17-23, 17-24, 17-25, 17-26, 17-27, 17-28, 17-29, 17-30, 18-19, 18-20, 18-21, 18-22, 18- 23, 18-24, 18-25, 18-26, 18-27, 18-28, 18-29, 18-30, 19-20, 19-21, 19-22, 19-23, 19-24, 19-25, 19-26, 19-27, 19-28, 19-29, 19-30, 20-21, 20-22, 20-23, 20-24, 20-25, 20-26, 20-27, 20-28, 20-29, 20-30, 21- 22, 21-23, 21-24, 21-25, 21-26, 21-27, 21-28, 21-29, 21-30, 22-23, 22-24, 22-25, 22-26, 22-21, 22-28, 22-29, 22-30, 23-24, 23-25, 23-26, 23-27, 23-28, 23-29, 23-30, 24-25, 24-26, 24-27, 24-28, 24-29, 24- 30, 25-26, 25-27, 25-28, 25-29, 25-30, 26-27, 26-28, 26-29, 26-30, 27-28, 27-29, 27-30, 28-29, 28-30 або 29-30 зв'язаних нуклеозидів. У тих варіантах реалізації, в яких кількість нуклеозидів в олігонуклеотиді сполуки є обмеженою, до діапазону або до певного числа, така сполука може, однак, додатково містити інші додаткові замісники. Наприклад, олігонуклеотид, що містить 8-30 нуклеозидів, виключає олігонуклеотиди, що мають 31 нуклеозид, але, якщо не вказано інше, такий олігонуклеотид може додатково містити, наприклад, одну або декілька кон'югувальних груп, кінцевих груп або інших замісників.
Більше того, якщо олігонуклеотид описаний загальним діапазоном довжини і областями, що мають певну довжину, і якщо сума вказаних довжин областей є меншою, ніж верхня межа діапазону загальної довжини, то олігонуклеотид може мати додаткові нуклеозиди, крім тих, які знаходяться у вказаних областях, за умови, що загальна кількість нуклеозидів не перевищує верхню межу діапазону загальної довжини. 5. Деякі хімічні мотиви антисмислових олігонуклеотидів
У деяких варіантах реалізації винаходу хімічні структурні особливості антисмислових олігонуклеотидів описуються їх цукровим мотивом, мотивом міжнуклеозидного зв'язку, мотивом модифікації азотистих основ і загальною довжиною. У деяких варіантах реалізації винаходу такі параметри не залежать один від одного. Так, кожен міжнуклеозидний зв'язок олігонуклеотиду, бо що має цукровий мотив гепмеру, може бути модифікованим або немодифікованим і може повторювати або не повторювати характер модифікації цукрових модифікацій гепмеру. Отже, міжнуклеозидні зв'язки в областях крил цукру-гепмеру можуть бути однаковими або відмінними один від одного і можуть бути однаковими або відмінними від міжнуклеозидних зв'язків геп- домену. Так само, такі цукор-гепмерні олігонуклеотиди можуть містити одну або декілька модифікованих азотистих основ, незалежно від характеру цукрових модифікацій гепмеру.
Фахівцям у даній галузі техніки зрозуміло, що такі мотиви можуть бути комбіновані з одержанням численних олігонуклеотидів.
У деяких варіантах реалізації винаходу вибір міжнуклеозидного зв'язку і модифікації нуклеозиду не залежать один від одного. і. Деякі послідовності і мішені
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені антисмислові олігонуклеотиди, що мають послідовність, комплементарну цільовій нуклеїновій кислоті. Такі антисмислові сполуки можуть гібридизуватися з цільовою нуклеїновою кислотою з одержанням щонайменше однієї антисмислової активності. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки специфічно гібридизуються з однією або декількома цільовими нуклеїновими кислотами. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислова сполука, що специфічно гібридизується, має послідовність азотистих основ, що містить область з достатньою комплементарністю цільовій нуклеїновій кислоті для забезпечення можливості гібридизації і одержання антисмислової активності, і недостатньою комплементарністю будь-якій нецільовій нуклеїновій кислоті для запобігання або зниження неспецифічної гібридизації з послідовностями нецільових нуклеїнових кислот в умовах, у яких необхідна специфічна гібридизація (наприклад, у фізіологічних умовах для іп мімо або терапевтичних застосувань і в умовах виконання аналізів - у випадку іп мійго аналізів). У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди є селективними між мішенню і не мішенню, навіть якщо мішень і не мішень містять цільову послідовність. У таких варіантах реалізації винаходу селективність може бути результатом відносної доступності цільової ділянки однієї молекули нуклеїнової кислоти, порівняно з іншою.
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені антисмислові сполуки, що містять олігонуклеотиди, які є повністю комплементарними цільовій нуклеїновій кислоті по всій довжині олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди є на 99 95
Зо комплементарними цільовій нуклеїновій кислоті. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди є на 95 95 комплементарними цільовій нуклеїновій кислоті. У деяких варіантах реалізації винаходу такі олігонуклеотиди є на 90 95 комплементарними цільовій нуклеїновій кислоті.
У деяких варіантах реалізації винаходу такі олігонуклеотиди є на 85 95 комплементарними цільовій нуклеїновій кислоті. У деяких варіантах реалізації винаходу такі олігонуклеотиди є на 80 96 комплементарними цільовій нуклеїновій кислоті. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислова сполука містить область, що є повністю комплементарною цільовій нуклеїновій кислоті, і є щонайменше на 80 95 комплементарною цільовій нуклеїновій кислоті по всій довжині олігонуклеотиду. У деяких таких варіантах реалізації винаходу область повної комплементарності має довжину від 6 до 14 нуклеозидів.
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди містять область гібридизації і кінцеву область. У деяких таких варіантах реалізації винаходу область гібридизації складається із 12-30 зв'язаних нуклеозидів і є повністю комплементарною цільовій нуклеїновій кислоті. У деяких варіантах реалізації винаходу область гібридизації містить одну невідповідність порівняно із цільовою нуклеїновою кислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу область гібридизації містить дві невідповідності порівняно із цільовою нуклеїновою кислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу область гібридизації містить три невідповідності порівняно із цільовою нуклеїновою кислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу кінцева область складається з 1-4 кінцевих нуклеозидів. У деяких варіантах реалізації винаходу кінцеві нуклеозиди знаходяться на 3'-кінці. У деяких варіантах реалізації винаходу один або декілька кінцевих нуклеозидів не є комплементарними цільовій нуклеїновій кислоті.
Антисмислові механізми включають будь-який механізм, що зачіпає гібридизацію олігонуклеотиду із цільовою нуклеїновою кислотою, причому гібридизація приводить до біологічного ефекту. У деяких варіантах реалізації винаходу така гібридизація приводить до руйнування або до застосування цільової нуклеїнової кислоти із супутнім пригніченням або стимуляцією клітинного механізму, що зачіпає, наприклад, трансляцію, транскрипцію або сплайсинг цільової нуклеїнової кислоти.
Один із типів антисмислового механізму, що зачіпає руйнування цільової РНК являє собою антисмисл, опосередкований РНКазою Н. РНКаза Н являє собою клітинну ендонуклеазу, яка бо розщеплює спіраль РНК дуплексу РНК:ДНК. У даній галузі техніки відомо, що одноланцюгові антисмислові сполуки, що є "ДНК-подібними", викликають активність РНКази Н у клітинах ссавців. Отже, активація РНКази Н приводить до розщеплення РНК-мішені, за допомогою чого значною мірою підсилюється ефективність пригнічення генної експресії, опосередкованої ДНК- подібним олігонуклеотидом.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група містить розщеплюваний фрагмент. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група містить один або декілька розщеплюваних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група містить лінкер. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер містить фрагмент, що зв'язує білки. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група містить фрагмент, що націлює на клітину (також згадується як група, що націлює на клітину). У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент, що націлює на клітину, містить групу розгалуження. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент, що націлює на клітину, містить одну або декілька зв'язок. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент, що націлює на клітину, містить вуглевод або вуглеводний кластер. і. Деякі розщеплювані фрагменти
У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент є розщеплюваним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент містить розщеплюваний зв'язок. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група містить розщеплюваний фрагмент. У деяких таких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднується до антисмислового олігонуклеотиду. У деяких таких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднується безпосередньо до фрагмента, що націлює на клітину. У деяких таких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднується до лінкера кон'югату. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент містить фосфат або фосфодіестер. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою розщеплюваний нуклеозид або нуклеозидний аналог. У деяких варіантах реалізації винаходу нуклеозид або нуклеозидний аналог містить необов'язково захищену гетероциклічну основу, вибрану з пурину, заміщеного пурину, піримідину або заміщеного піримідину. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою нуклеозид, що містить необов'язково захищену гетероциклічну основу, вибрану з
Зо урацилу, тиміну, цитозину, 4-М-бензоїлцитозину, 5-метилцитозину, /4-М-бензоїл-5- метилцитозину, аденіну, 6-М-бензоїладеніну, гуаніну і 2-М-ізобутирилгуаніну. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою 2'-дезоксинуклеозид, що приєднаний до 3-положення антисмислового олігонуклеотиду фосфодіестерним зв'язком і приєднаний до лінкера фосфодіестерним або тіофосфатним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою 2'-дезоксіаденозин, що приєднаний до 3-положення антисмислового олігонуклеотиду фосфодіестерним зв'язком і приєднаний до лінкера фосфодіестерним або тіофосфатним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою 2'-дезоксіаденозин, що приєднаний до 3'-положення антисмислового олігонуклеотиду фосфодіестерним зв'язком і приєднаний до лінкера фосфодіестерним зв'язком.
У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднаний до 3'- положення антисмислового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднаний до 5'-положення антисмислового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднаний до 2'-положення антисмислового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднаний до антисмислового олігонуклеотиду фосфодіестерним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднаний до вказаного лінкера фосфодіестерним або тіофосфатним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент приєднаний до вказаного лінкера фосфодіестерним зв'язком. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група не містить розщеплюваного фрагменту.
У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент розщеплюється після введення вказаного комплексу в організм тварини тільки після його поглинання цільовою клітиною. Всередині клітини розщеплюваний фрагмент розщеплюється, вивільняючи таким чином активний антисмисловий олігонуклеотид. Не обмежуючись теорією, передбачається, що розщеплюваний фрагмент розщеплюється під дією однієї або декількох нуклеаз усередині клітини. У деяких варіантах реалізації винаходу одна або декілька нуклеаз розщеплюють фосфодіестерний зв'язок між розщеплюваним фрагментом і лінкером. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент має структуру, вибрану з наступних:
ї о-в-оНн 1 9 кує ; о-в-он о-р-оНн о о
Ф о вх; К о Вх рани А ох ве З ай й щ Я Й 7
Й й б ії о-рР-оНн ї !
В о-в-он О-вооН о о г ! о. КК, , ; Що ті у ї ; 1
Оо-рР-ОоН о-в-оНн о-в-он . де кожний з Вх, Вх:, Вх: і Вхз незалежно є гетероциклічним основним фрагментом. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент має структуру, вибрану з наступних: т о-в-он Мне
М фев; су й гі о-есон 5 іі. Деякі лінкери
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи містять лінкер. У деяких таких варіантах реалізації винаходу лінкер ковалентно зв'язаний із розщеплюваним фрагментом. У деяких таких варіантах реалізації винаходу лінкер ковалентно зв'язаний з антисмисловим олігонуклеотидом. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер ковалентно зв'язаний із фрагментом, що націлює на клітину. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер додатково містить ковалентне приєднання до твердої основи. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер додатково містить ковалентне приєднання до білкового зв'язувального фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер додатково містить ковалентне приєднання до твердої основи і додатково містить ковалентне приєднання до білкового зв'язувального фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер містить декілька положень для приєднання зв'язаних лігандів. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер містить декілька положень для приєднання зв'язаних лігандів і не приєднаний до групи розгалуження. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер додатково містить один або декілька розщеплюваних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група не містить лінкера.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер містить щонайменше одну лінійну групу, що містить групи, вибрані з алкільних, амідних, дисульфідних, поліетиленгліколевих, тіоетерних (-5- ) і гідроксиламіно (-О-М(Н)-) груп. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група містить групи, вибрані з алкільних, амідних і етерних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група містить групи, вибрані з алкільних і етерних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група містить щонайменше одну фосфорну зв'язувальну групу. У деяких
Зо варіантах реалізації винаходу лінійна група містить щонайменше одну фосфодіестерну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група містить щонайменше одну нейтральну зв'язувальну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до фрагмента, що націлює на клітину, і до розщеплюваного фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до фрагмента, що націлює на клітину, і до антисмислового олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до фрагмента, що націлює на клітину, до розщеплюваного фрагмента і до твердої основи. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до фрагмента, що націлює на клітину, до розщеплюваного фрагмента, до твердої основи і до білкового зв'язувального фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група містить один або декілька розщеплюваних зв'язків.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер містить лінійну групу, ковалентно приєднану до групи скелета. У деяких варіантах реалізації винаходу скелет містить розгалужену аліфатичну групу, що містить групи, вибрані з алкільних, амідних, дисульфідних, полієтиленгліколевих, етерних, тіоетерних і гідроксиламіногруп. У деяких варіантах реалізації винаходу скелет містить розгалужену аліфатичну групу, що містить групи, вибрані з алкільних, амідних і естерних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу скелет містить щонайменше одну моно- або поліциклічну кільцеву систему. У деяких варіантах реалізації винаходу скелет містить щонайменше дві моно- або поліциклічні кільцеві системи. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до групи скелета, а група скелета ковалентно приєднана до розщеплюваного фрагмента і лінкера. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до групи скелета, а група скелета ковалентно приєднана до розщеплюваного фрагмента, лінкера і твердої основи. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до групи скелета, а група скелета ковалентно приєднана до розщеплюваного фрагмента, лінкера і білкового зв'язувального фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу лінійна група ковалентно приєднана до групи скелета, а група скелета ковалентно приєднана до розщеплюваного фрагмента, лінкера, білкового зв'язувального фрагмента і твердої основи. У деяких варіантах реалізації винаходу група скелета містить один або декілька розщеплюваних зв'язків.
Зо У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер містить фрагмент, що зв'язує білки. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент, що зв'язує білки, є ліпідом, таким як, наприклад, включаючи, без обмеження, холестерин, холева кислота, адамантан-оцтова кислота, 1-пірен- масляна кислота, дигідротестостерон, 1,3-біс-О(гексадецил)гліцерин, геранілоксигексилова група, гексадецилгліцерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандіол, гептадецилова група, пальмітинова кислота, міристинова кислота, О3-(олеоїл)літохолева кислота, О3- (олеоїл)ухоленова кислота, диметокситритил або феноксазин, вітамін (наприклад, фолат, вітамін
А, вітамін Е, біотин, піридоксаль), пептид, вуглевод (наприклад, моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олігосахарид, полісахарид), ендосомолітичний компонент, стероїд (наприклад, уваол, гецигенін, діосгенін), терпен (наприклад, тритерпен, наприклад, сарсасапогенін, фриделін, літохолева кислота, дериватизована епіфриделанолом) або катіонний ліпід. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент, що зв'язує білки, є насиченою або ненасиченою жирною кислотою із довжиною ланцюга від С1б до С22, холестерином, холевою кислотою, вітаміном Е, адамантаном або 1-пентафлуорпропілом.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з:
Н н шк 7 й пр : ще о ч Ех М ни и й а ; ГУ оон мл СХ о . В хг до й н Е в - ів; шк щі о | ще до ! Ци п
Н ' ШИ сеї
Е х ще І я. то Х Я Є о-5-он :
ГУ очно | ї
В; Ше ін. но о . -фк і-чЧН яя- - і А ян. . А ц , Й х м пан а ее ! ж чия ЩІ у :
Пт Су. Ба, т К о т ть
А А, - Я. З І 2 ов У те --- Щ -я чита лво
Не - з ї Й Й 7 ра У ; ' й І пан ШИ вия дня й Чер по по н ; нн нн но г Афво, пи ЩО і ув, 7, ил ство ' о й що ї час т-й а 2 - в СЯ я І Ва щі р їі он : М- 3 я шк і ях шкх М 7 са ій бен Й й н їй и Ин ді йо М дер
Ка ко й о де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20; і р дорівнює від 1 до 6.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з:
т те
Я тт, з й й вай 2 ц ШЕ ша Ж в ХК - Е. Й : К ве и ко де тн Й вс Воло : : у ли них пива ШЕ . 5 , ця т
М р я м -А. ря : Е : о о й н ! МО -І- Я м рн - бу шо
Сех к н Чі 0 хво и ГУ вх
Ам в боту Мо
Б ян пе І
В. ш ще х г Ев. шт
Ху А Г о ! я і М т 5 що Й ця Н й тн 4 дич -- й х й-- ще - о кое ря - їв що а МИ н с ек не де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з:
Он о он Ов а
Ж н А х : Ї рух те т АХ ери. у он т
ДЕ они а | т- І у її ці ГТ Жив о пон що й ноша щи їв ший ше го ше н п п т і т. КО; и шо й - я яю, й -- | з, і; рі й Н Ко М. т н ря У ї уко ди ч-ї й Ш-и , НН. Б А М , п ви рака я
Не: Нв; прту що то в г -к ср і не о со з
ОЗ,
Я нят ; пра я З претр тотою
Б їі де п дорівнює від 1 до 20.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з:
З . їть ї (в Е. С їх н --й Й о н Н
М дм Ж Ах «А яю сх ди У, о іти КИШнуй ; з : ши ней ший Мт. й у щ: в
СІ з Б; ЕК. Тв: п нн х Сх тр ан а о ние ; гй За Й ! щі
А, з свй : я З ді : че» :
Я - М о з о і пад я і я а н
Ше ше ле м Шк ше ще хх НИ ї п п х й з 2 . Б й -й КІ . с ту щу й -о -- т - Е Я рай й . - Зк у Ше: 004 ши г от зр ото в, пог ем МНН І: зе
Но. г р я , і и М и бере У того - ; 7 вати що с-г й о ЇЇ С її я
Ш- Ї" и : а ;
Ш- щи Оу і- щу ду - п й В й й- мая я А х і ОТИТ роб туя де кожен Ї незалежно є фосфорною зв'язувальною групою або нейтральною зв'язувальною групою; і кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану уз:
т: й
УК 5 о, і о Н ГФ) Н м
ХА . Кит М. тчви вино , м 87 о й Е мн у, | Сикоо-р-он ра
СМ о -Ї Т ц о н й й
М М.В ; и й
С и Ви 39 ль у»
МНН (9) / " й і р | о я мо "
Суетрн - 7 НІШУ й о А- МН
АХ МВА У
М М ,
М о 9 тут
Й бан
Щ Ї. в о М ; і дом -ї щи
Хна о / Щ нео ї
М ло он -0 1 й
Е о Т Ї У лм хв У Шо :
Я ку» ; х ї -ї - о, нн нн но їй ою км уМуюМ му» у, Ї М певен и НН ВЧ ФО ще К ето о, Щи о М о, ло ун гу
Н м ву Со ; Й реа Оу м 8 о см ТУ 878 Й Ї щи ви З о ; Ху 4 ; ух ц Й я нь їх 1070 Н де»
І Нове
Ї хи т а 4 "т леї п-ї що ІТ Су ї-- ЩЕ и М їК ! г й ' ОО ї3 (У
М -- еї о. 2-2 Гл пив м -7 си ву мА тм З 5 но Кт ти деео а пе! й Ї й ч Бо
Я й до. пк ето СМ, н ши ЕВ: т ти ше -тяде а :і
Й ц х А пе
ЕІ пе С: ї . й |! С- в й о 41 шк М МАЙ дих о її че зи бот г --8 й в н т ї -к шильш З ее н й
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану «аз: я г я я пк Ж кА ; і з рі на а зи че Кк й ен чи "м 5 й щ ту ще зі р дитя м У , Еч о Її ес те
ІЗ ї З Й е : і з се х а хи ше й Н й речі р
КО г ї й Ї гй З Н г. Я 1. : й і вав ху ше ай З з ЯК ме реву Мч 2 й б х 1 мо:
Е І Н її г і; НІ М т р. нм, В бе и І о х її н |! щі З
Е й й г М ту (а па и а нь в ЇЇ ча й чих
Й кі Гай ж ці що М (й Бо сон оон я млонік ШИ дн по КД янйне ше й і ! с и Ин ма п Ме о С в о
Ян а щі ї ій я ІЙ 5 Ії й й ми ІЗ : ЦЕ я М т ї Е В шк м і і Е; ек шк еле о и В МЕ В ши ще
ЛЕ В Ї К: т шк ре дит реч ит - в : о о І ши и ше: !
ЕВ); а я в В є Га й у Й ЧУ « . і ї - ї . с і ЧИ З ви з с: и й 3-й : г Ки Тв з М дя ту бору ие о с Ге; са я з р Що я
Мене и Он ЧУ ов а, зт Ко бутмєростето о
І9, о
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану «уз:
о : о Ге НИ а н о
А і ЇЇ Е Ж ї що А м ра о р ер ле а її у
НІ Н з І НА: Н " Х Й д- он о Й че
Н ІТ т її. Х г СТ, че що; у :; пИМИ . біт Я ша що: | я; ан
ТІЙ У
НН а й
Як - Мід чне ж н я Н т-- й. стр ситу Ж -ий з - , Нн - ї - і ях А ш- ами ї й | поту панна НЕ
А ш-щш М Кк ГЕ зичних ша п ги вв п о о о
Я хе а Янг пед : бдитчитнрут ек о и
Он й. М Ситник: 1 0-Р-О0 У ко
Я ще зичу те : х тт М си нан І ке мВт
Он я -к що ; й ч -0--03, Оууа-в-О-- ян Дн, вн й Тк вно Ві с в і
КЕ а ак и
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану «уз: х о
А ГУ ох р; г ' й у п о -: о й о и й о і я до Н де п дорівнює від 1 до 20. 5 У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з: -е ти ше : КІ у о сови ная о а ит : і ще о (ут Ше до отрут реж т.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з:
Он сн - и щ Поу - 1 пи щи -
Б-Ш2-в- лО С л-Б-0- | ККБ-ШВХ--У и СУЧАЖ у й ша ; : ша
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з: : г: єв г - Й 7. р С в г 7 й. А і: й п м пу ше Й вішки М шия 4 щі н 5 Сн Кк Н й -
Ге: Е: у
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер кон'югату має структуру: сі о,
СХ о
ХаВХА й т о.
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер кон'югату має структуру:
АХ ч Мт ко-
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з: о о 9 ! їй ЩІ х й з. 7 Я дич ато і в м
Ол Й ЕК і - 5 ше Н я сон ' о Н ' ! їх
У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер має структуру, вибрану з: п ешчн ша нях в , с -5-02-7 я шов п канви м а шия ! Е пт сн КЕ Н 7 в В ха й де кожне п незалежно дорівнює 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 або 7. ім. Деякі фрагменти, що націлюють на клітину
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи містять фрагменти, що націлюють на клітину. Деякі з таких фрагментів, що націлюють на клітину, збільшують клітинне захоплення антисмислових сполук. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагменти, що націлюють на клітину, містять групу розгалуження, одну або декілька зв'язок і один або декілька лігандів. У деяких варіантах реалізації винаходу фрагменти, що націлюють на клітину, містять групу розгалуження, одну або декілька зв'язок, один або декілька лігандів і один або декілька розщеплюваних зв'язків. 1. Деякі групи розгалуження
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи містять націлюючий фрагмент, що містить групу розгалуження і щонайменше два зв'язаних ліганди. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження приєднує лінкер кон'югату. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження приєднує розщеплюваний фрагмент. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження приєднує антисмисловий олігонуклеотид. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження ковалентно приєднана до лінкера і кожного із зв'язаних лігандів. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження містить розгалужену аліфатичну групу, яка містить групи, вибрані з алкільних, амідних, дисульфідних, поліетиленгліколевих, етерних, тіоетерних і гідроксиламіногруп. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження містить групи, вибрані з алкільних, амідних і етерних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження містить групи, вибрані з алкільних і етерних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження містить моно- або поліциклічну кільцеву систему. У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження містить один або декілька розщеплюваних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальна група не містить групи розгалуження.
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з: ох т 6) в) з МН о о (о) Ге) нивхя: содою У, че п НН по ' п он - п п У з сСнНЗ т ' ох роя : о (й : о злфя З в З я М м Як, р
Н Н . М М (Оп о (Оп , ій п, о пн; ;
Кк У бе п ля чл т ря й о з. | п сну з " сн п /п мно т (Ов з о
МН МН и ( о ) п . Ї ; п (Ф) ; Алл
А м п ш-МНО
Но - о рН
Ой І й ї КЯ ня ва т чер с вн ще й т її ше си -кн 5 У Зк с ї- а Ї Вч іх я ї ; й ща В Ти ше пу «й г н о а ЧИ Н є рі ц р г" л |! , сощии щи: ї фе КАК у А ; і Це Ще - 1 ли МН ї с: шк ни ди, шк ше і ту
Еш аа їх й й г 7 Й На Сус ни я З . ши Є Е в
Ї ! н І « ще ій ее М я з що у т ях биття, і сови и зм с - І кл кіт б : і М й | н ков 1 І ок ОО аю
Н І Гн ЦЕЙ г ; й Її" ій сне . Ф чна я М м «МН | ! х о 5 де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20; дорівнює від 1 до З; і т дорівнює від 2 до 6.
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з: з г Т
Ся Й х ; с т у їі у вве ку три і ож Її ен щих Коди шт Зх ї - В ї й З Й й й іх Що .
У ел М с дело НИ вх вс в
КІ " й ТК ї й Гу х І хв я
МН Го св, он). а. і м хост им т з і ях г ПЕ Я: п й з (-- : фе аа С я й І ши їм У Од їі т Я і о
У я Є | і
Р х , і ; ши КО айв а а яті ї ат Ко ій ЦЯ 7 як Б у з й хво: ШУ : и ут
І Цій Ї Ше що з | о, -к Й ОН 5 Кв і й в і її ! аА-МН ОО ж З Яд щ ух 0 ут ГА 4- в
І й Зв І біоеня :і
Ка) і х т ям
Що о, ї й , я ї
Мн в пу МК я Б о й я і ше аю я м г ай пе ча Ди и шині м "Ві Ши ї 5- МН З
В ді
У Я т де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20; і т дорівнює від 2 до 6.
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з: і); ря Ох 99 як АКА АХ р аа: В шк; ї о
Н ' в) в) ; о чн о) МН
Іо) гл лм плач (Ф)
МН о МН ц Ге) в) (в) о оо ок в. ШМК
М ; лм лу Ге)
г о у З - В нм Її У пити й Зре ии ит МН і ї. й х і а
Я й йо х
В са З ше : Її вн їх ! її вно ач Х. . . 7 й й К М і. і ї Й ей пк т бо Х ї І Є -а ай Я х - шт Х с х що м ши ше о ше паща а бе ше на я н Н ; ї М Ї ой ц о
В: а
НМ. ї в ти МН
З
З -
ЇЇ з тк вів и пяти М КІ Її і о ща о - ї й ха У г ї С ро я ще Є Її . со не а о а аа ше ве и та Ноя ха ій Н г і ше бо й .
Ви 7 !
Ко у й Мн
В гм син, ока хї Я - УЧ вош ааи ж
І:
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з: скатних ш х м А,
А ' ях (а д, х не -4 і зе т рок У ' х
Не їч «Мід «ех де кожен Аї незалежно являє собою О, 5, 0-0 або МН; і кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20.
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з:
Ме рай май Н І ; А ва ой б оова проовату и, ае т, ув ее М
Шини ши ' Бод віт Овод по в
МА А . ій ! А ї , - ж « ее СЯ я де кожен Аї незалежно являє собою О, 5, 0-0 або МН; і кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20.
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з:
Ка ех
Що ж Зх чіт і ані п
А, й . з де де А; являє собою 0, 5, С-О або МН; і кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20.
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з: «ллли у
Ом о. 4 кін / лу (о) ни ящк
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з: ла у о лах,
Я жу (в) м й
У деяких варіантах реалізації винаходу група розгалуження має структуру, вибрану з:
Кі д «и я 2. Деякі зв'язки
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи містять одну або декілька зв'язок, ковалентно приєднаних до групи розгалуження. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи містять одну або декілька зв'язок, ковалентно приєднаних до зв'язувальної групи. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка є лінійною аліфатичною групою, що містить одну або декілька груп, вибраних з алкільних, етерних, тіоетерних, дисульфідних, амідних і поліетиленгліколевих груп в будь-якій комбінації. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка є лінійною аліфатичною групою, що містить одну або декілька груп, вибраних з алкільних, заміщених алкільних, етерних, тіоетерних, дисульфідних, амідних, фосфодіестерних і поліетиленгліколевих груп в будь-якій комбінації. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка є лінійною аліфатичною групою, що містить одну або декілька груп, вибраних з алкільних, етерних і амідних груп в будь-якій комбінації. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка є лінійною аліфатичною групою, що містить одну або декілька груп, вибраних з алкільних, заміщених алкільних, фосфодіестерних, етерних і амідних груп в будь-якій комбінації. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка є лінійною аліфатичною групою, що містить одну або декілька груп, вибраних з алкілу і фосфодіестеру в будь-якій комбінації. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка містить щонайменше одну фосфорну зв'язувальну групу або нейтральну зв'язувальну групу.
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка містить один або декілька розщеплюваних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до групи розгалуження через
Зо амідну або етерну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до групи розгалуження через фосфодіестерну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до групи розгалуження через фосфорну зв'язувальну групу або через нейтральну зв'язувальну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до групи розгалуження через етерну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до ліганду або через амідну, або через етерну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до ліганду через етерну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до ліганду або через амідну, або через етерну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка приєднана до ліганду через етерну групу.
У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка має довжину від близько 8 до близько 20 атомів в ланцюгу між лігандом і групою розгалуження. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка має довжину від близько 10 до близько 18 атомів в ланцюгу між лігандом і групою розгалуження. У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка має довжину близько 13 атомів в ланцюгу.
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка має структуру, вибрану з: ро: н ц ; З : т з ди сит, й - цу, с : «АК й : шк МІ ди -К Ка ї-ї ЗО т рен Кя
Ен УК. Де ї ПО ке щи йти фр вк ак: є й З ЩЕ: М ве о ж іш я ' б щ р'є іме ; й | їв : й ї Й х тв ої 7 й : ти дк ра ху Де хі щі ГНН М оо ун ях Й ит Му М Ук ке і і п "му я С Ши НИ ев г у в Кк, ше ВО х ВИШ їв ни в ше п нм и і а й єв) / Її. Її н | щі Н 1... ВК е г. ж І; ке адм в що : ши и о и ИН уч спа м іх ї І І її К й Пе ши здо. дог ох х у т я . в Ноя, яю Ай й Я й ! Я ' х Ов ше: СА 9 о
НН,
ШИНИ Ай отчий р) М. я ку са и ЧИ щокох сви Ех ча ЧИ пен и НН а НН я н по К
Ні де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20; і кожне р дорівнює від 1 до близько 6.
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка має структуру, вибрану з: о н 1 Д з М пе як с в « ння яри тут нн а ав св о сл не г о
К. 7 -
Н о
Н В п воші й ат. ще о а ро з ють се т , і Я ие чу йо я .
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка має структуру, вибрану з:
Н н милих иви ни п п п в) в) де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20.
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка має структуру, вибрану з: іо. Я
КЗ : е ДЕ Е Е ге у Е ЕН й . Є : в ко «Ми чиї й п ге г М т Цей о г й
Ор сб ; тях де Ї являє собою або фосфорну зв'язувальну групу, або нейтральну зв'язувальну групу; 71 являє собою С(-0)0О-НВ2; 72 являє собою Н, С:-Св алкіл або заміщений С.і-Св алкіл;
Вг являє собою Н, Сі-Св алкіл або заміщений С.-Св алкіл; і кожне т: незалежно дорівнює від 0 до 20, при цьому щонайменше одне т: більше 0 для кожної зв'язки.
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка має структуру, вибрану з:
Н н ана піна (в) о) І
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка має структуру, вибрану з: с я | с он СН и чи ін й ШО оз та Що - СН НН -к ЕН; де 72 являє собою Н або СН»;і кожне т: незалежно дорівнює від 0 до 20, при цьому щонайменше одне т: більше 0 для кожної зв'язки.
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка має структуру, вибрану з: (в) (о) 4 Н п Н на або я. де кожне п незалежно дорівнює 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 або 7.
У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка містить фосфорну зв'язувальну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка не містить жодного амідного зв'язку. У деяких варіантах реалізації винаходу зв'язка містить фосфорну зв'язувальну групу і не містить жодного амідного зв'язку. 3. Деякі ліганди
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені ліганди, при цьому кожен ліганд ковалентно приєднаний до зв'язки. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен ліганд вибраний таким чином, щоб він мав афінність щонайменше до одного типу рецептора на клітині-мішені. У деяких варіантах реалізації винаходу ліганди вибрані таким чином, щоб вони мали афінність щонайменше до одного типу рецептора на поверхні клітини печінки ссавця. У деяких варіантах реалізації винаходу ліганди вибрані таким чином, щоб вони мали афінність до печінкового асіалоглікопротеїнового рецептора (АБОР-К). У деяких варіантах реалізації винаходу кожен ліганд є вуглеводом. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен ліганд незалежно вибраний з галактози, М-ацетилгалактозаміну, манози, глюкози, глюкозаміну і фукози. У деяких варіантах реалізації винаходу кожен ліганд є М-ацетилгалактозаміном (саіІМАс). У деяких варіантах реалізації винаходу націлюючий фрагмент містить 2-6 лігандів. У деяких варіантах реалізації винаходу націлюючий фрагмент містить З ліганди. У деяких варіантах реалізації винаходу націлюючий фрагмент містить З М-ацетилгалактозамінових ліганди.
У деяких варіантах реалізації винаходу ліганд є вуглеводом, похідним вуглеводу, модифікованим вуглеводом, полівалентним вуглеводним кластером, полісахаридом, модифікованим полісахаридом або похідним полісахариду. У деяких варіантах реалізації винаходу ліганд є аміноцукром або тіоцукром. Наприклад, аміноцукри можуть бути вибрані з будь-якої кількості сполук, відомих у даній галузі техніки, наприклад, глюкозаміну, сіалової кислоти, «-ЮО-галактозаміну, М-ацетилгалактозаміну, 2-ацетамідо-2-дезокси-О-галактопіранози (СаІМАс), 2-аміно-3-0О-(А)-1-карбоксіетил|-2-дезокси-В-О-глюкопіранози (В-мурамової кислоти), 2-дезокси-2-метиламіно-і! -глюкопіранози, 4,6-дидезокси-4-формамідо-2,3-ди-О-метил-О- манопіранози, 2-дезокси-2-сульфоаміно-О-глюкопіранози і М-сульфо-О-глюкозаміну і М- гліколоїл-д-нейрамінової кислоти. Наприклад, тіоцукри можуть бути вибрані з групи, що складається З 5-тіо-В-Ю-глюкопіранози, метил-2,3,4-три-О-ацетил-1-тіо-6-О-тритил-а-О- глюкопіранозиду, 4-тіо-В-ЮО-галактопіранози і етил-3,4,6,7-тетра-О-ацетил-2-дезокси-1,5-дитіо-а-
О-глюко-гептопіранозиду.
У деяких варіантах реалізації винаходу "СаІМас" або "саІ-МАс" стосується 2-(ацетиламіно)- 2-дезокси-О-галактопіранози, звичайно згадуваної в літературі як М-ацетилгалактозамін. У деяких варіантах реалізації винаходу "М-ацетилгалактозамін" стосується 2-(ацетиламіно)-2- дезокси-О-галактопіранози. У деяких варіантах реалізації винаходу "СЗаІМас" або "СаІ-МАс" стосується 2-(ацетиламіно)-2-дезокси-О-галактопіранози. У деяких варіантах реалізації винаходу "ЗаІМас" або "саІ-МАс" стосується 2-(ацетиламіно)-2-дезокси-О-галактопіранози, яка включає і ВД-форму: 2-(ацетиламіно)-2-дезокси-В-ЮО-галактопіранозу, і а-форму: 2-(ацетиламіно)- 2-дезокси-О-галактопіранозу. У деяких варіантах реалізації винаходу обидві форми, В-форма: 2- (ацетиламіно)-2-дезокси-В-Ю-галактопіраноза, і а-форма: 2-(ацетиламіно)-2-дезокси-О-
галактопіраноза, можуть бути застосовані взаємозамінним чином. Відповідно, в структурах, у яких зображена одна форма, мається на увазі, що ці структури включають також іншу форму.
Наприклад, якщо показана структура для о-форми: /2-(ацетиламіно)-2-дезокси-О- галактопіранози, то мається на увазі, що ця структура включає також іншу форму. У деяких переважних варіантах реалізації винаходу В-форма /2-(ацетиламіно)-2-дезокси-О- галактопіранози є переважним варіантом реалізації винаходу. ді он но т о цо п нн он 2-(Ацетиламіно)-2-дезокси-О-галактопіраноза он он о) но 0-3
МНАс 2-(Ацетиламіно)-2-дезокси-В-О-галактопіраноза он он о, щі)
МНАс о)
СУ
2-(Ацетиламіно)-2-дезокси-а-ЮО-галактопіраноза
У деяких варіантах один або декілька лігандів мають структуру, вибрану з:
ОА й он но--2х.о у нОо--0 роти но : нот он в -ї5-07 В 1 т. О---5 2 дня в) -
Кі де кожен Ки: вибраний з ОН і МНСООН.
У деяких варіантах один або декілька лігандів мають структуру, вибрану з чо й; шко - о ан -О о АЙ | -2 о ноя. Подолооитя НО Во, ба,
А з Он - , ноОо-- щ з
МНАс я
З ія
Нор он с -єї Го ; «М ше ла я нОо--- иа -о о. їй Н носон
КЕ: - а С нОо-. ОН
ОН Он с-м оо ОО Йуиля Ах до НО яю зи НО тен кож Кк У У. і оно Он не ' он
НО. он но-о, нео-- но. пон
ОН но-ьО х чив; ра ми -- ря 5 7 ЗУ
У деяких варіантах один або декілька лігандів мають структуру, вибрану з: нооНн
Н ха но туя
МНАс .
У деяких варіантах один або декілька лігандів мають структуру, вибрану з: нОоОн о ною,
МНАс - і. Деякі кон'югати
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи містять структурні особливості, представлені вище. У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: но он (в) Мч о о НМ М є мли що
МНАс о) п но ОН 5
Ге) ці М й Н о Ге М- о зро ри
МНАс у о о й се он но НМ
Н о но вили й
МНАс о ' де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру:
но он ге) І. о еру
МНАс (9) о Нн Ці Н о М М о МА йо вай кит аа А
МНА с о Ге! о но НМ н (о) о о рано цо ма
МНАс о .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: но он --
Е в) но Е
МНАс те йо ) Я 0. вх о п но он о о ко ; ,, " с о. М о. М 1 н п О- Р Х но вла воя в -
МНАс о ) о он в) Ге) п ії но он о Н Нм
А. МИ но п
МНАс в 0) де кожне п незалежно дорівнює від 1 до 20; 27 являє собою Н або зв'язану тверду основу;
О являє собою антисмислову сполуку;
Х являє собою О або 5; і
Вх являє собою гетероциклічний основний фрагмент.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: но он -- о о ці н о он оті-он но т ол Е (в) : о
МНАс о вх но ОН іх (в) о н Н М ї о)
М М Ге) М о Са зр А ше 5-х
МНАс о о он о о но он ( о) Н ни кА. о но. ай
МНАс 10 . . й "
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру:
но ОН -
А М й он очртох І"
Ге) о ; М но е о а но он Ге) (в)
Ге) 19) М 7 По но Н 0о-Р-о0 шк -с мя а Ї і (в; но он ( о Н Ям
М о
СА. вкла й
МНАс (в
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: нОоОн -о (9) о її іш/Ф) - До п о
АСсНМ оно) нНОооНн п ) і; є) (Ф) П р ною Уго о-бБо-
АснНМ он о но он о о рі ) ода то о п но п он
МНАс
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: нОооНн ,; ою оо
АсСНМ ОН іх нОооНн
Ф) о Ге!
З ока а Р. но о" | ото
АСНМ он в) 0; но он Ь. / о Он де) но он
МНАс
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру:
нОоОНн (0) о; нос о щі
Уоїо
АснНМ он ) ноон п йХ МН, ) Щ (0) нота М хоїко --. о-о у Ме! у) 1
АснМ ОН о он б носн о З 4 но-р-о тот (0) но ток ї
МНАс .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: нОоон (Ф) ною І о Я)
АсНнМ ОН
М МН, он 2 нон о о о о Є вд
ОО ил, Р о-в-0 Ме
АСНМ он о б г но-р-о о о но он Р. о о. ли ТОЮ Щ дів)
МНАс
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру:
т Мн
НОо-рР-О хі ? 0о-е ді М
Кум з ногуто о; но он (в но Зо 7 4 ото он
АСНМ ОН ) о но сн "в квест ФИМДа ще но АР. --
Мо го о о7уто
АСНМ он о он но ОН о | ії (Ф) АВ оо п м и ОН
МНАс .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: т МН вою у / М у М о нолито 0) (з нОоон 6) -а олто
АсНнНМ ОН і б 3 ноти т) о І
ІФ) ЩІ --
Оо-Р-О0 паса Ін
АснМ он о 6) но он р. Г о ОТ Ще) но он
МНАс
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югати не містять піролідину.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру:
М Мне
І с ут нооН а «фе; М М. оо ї но т чл і о-р-о: (в) нооно0/0/ЛеНМ о о хо М й й А
АТМ Ге! ОК но мя З -Я-е В М
АсСНМ (е) Ге) Ге - с он нОоОн нот кА т (в)
АсНнМ І
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: ноон (о) т Іі
АСНМ о ще но о о о о О. ,Вх но о. хол той Доу
АСНМ 9) о вто нОооНн о Бо лм 0 ини ТО о: но
МНАс І
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: но он ної о Н
АСНМ тА о З оо о он он мТл о.А-кй попав -о-р- но То 0-77 Кок о Н Ї (6) но с
МНАс нм тм о ва і в) бо їв но Уд но
МНАс .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру:
ноон о о ска в
АснМ о й Хо ХХ (о) (Ф) нота отв ї кет (ем)-
АснМ о ноон г о нот отцю
АснМ .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: ноон (є; о ото НИК
АснНМ о що Хо ХА о (Ф) ІФ) ЩІ но тов М м То-р-
АСНМ о о ноон г о но ка о Нумо
АсНнМ .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: ноон Н ще) М. о но кт ДУЛи
АснМ нон о о) Ге) о
АснНМ нооНн М оо (с) но кт ун
АСНМ .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: нооНн Н оо Мо нота УЛ
АснМ ноон о о о о о ї нок НВ ММ рто-в-
АснМ (9) нНооН М оо (с) но кт ун
АснМ ,
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру:
онон о МН
АснМ онон ного о но Н ко о М М-во (см)
М ТТ в
АсНнМ Но Н Ге! (о); но он ди фе, но
МНАс .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: онон о МН
АснМ онОн но о і; но Но
АсНМ Но Н о Ге) (в) но он ди фе) но
МНАс .
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: он ноон ї
Ге) М но кто Ну К.
АсНнМ о-р-ОН
Ко, нооН х
Ге) М но кто Ну К.
АснМ охв-ОН
Ко) ноон Х
Ге! Тег (в)
З нот 5 Хей
АснМ І
У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи мають наступну структуру: 5А он нОооНн АХ
Ге) М оо нгу,
АснМ о-те-оН
Ко, ноОоН х
Ге) М нота о Ну К,
АснМ осеотон
Ко) ноон Х
Ге) М юку в.
АснНМ о
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: ноон (о) но сто
АСНМ ч ноон о о -3ИА А тТОЬЯ хх ра нот о х ші
АснМ о он х но о 9 но
АснНнМ , де Х являє собою заміщену або незаміщену зв'язку із шести-одинадцяти послідовно зв'язаних атомів.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: ноон (о) но сто
АСНМ ке ноон о о --БББШ А НТ ра нот о х о. й
АснМ о он х щі) о 9 но
АснМ , де Х являє собою заміщену або незаміщену зв'язку із десяти послідовно зв'язаних атомів.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру:
нОоОНн о но сто.
АСНМ ке ноон о о жЖжА нок о х І
АснНМ (в) он х но й но
АснМ , де Х являє собою заміщену або незаміщену зв'язку з чотирьох-одинадцяти послідовно зв'язаних атомів, причому вказана зв'язка містить тільки один амідний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: ноОн о) нота, Х
АсНМ М 7-0 ноон (о) нота ши
АСНМ ж ноон и (Ф) б Ге) но
АснМ , де У і 7 незалежно вибрані з С1-С12 заміщеної або незаміщеної алкільної, алкенільної або алкінільної групи або групи, що містить етер, кетон, амід, естер, карбамат, амін, піперидин, фосфат, фосфодіестер, тіофосфат, триазол, піролідин, дисульфід або тіоестер.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: нОоОоНн о но то, Х
АсНМ М 7-0 нооНн (о) оп ю А нот о су А
АСНМ Н х. ноон У о б с! но
АснМ , де У і 7 незалежно вибрані з С1-С12 заміщеної або незаміщеної алкільної групи або групи, що містить рівно один естер або рівно два естери, амід, амін, піперидин, фосфат, фосфодіестер або тіофосфат.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру:
ноОн о нота, Х
АснМ М 7-0 нОоОоНн (о; (в) но тож А
АСНМ нн ноон ле и о б Ге) но
АснНМ , де У і 7 незалежно вибрані з Сі-С12 заміщеної або незаміщеної алкільної групи.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: нОооНн (в) о оС Ге) но їв
АСНМ о й ч ноон Хе р но Н
АСНМ он М то
Со Хе о о); нота
АснМ , де т і п незалежно вибрані з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 і 12.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: нОоОоНн о но їх
АсНМ ів; й ч ноон Хе я но Н
АСНМ он око)
НС о Хе с) г) нота
АснМ , де т дорівнює 4, 5, 6, 7 або 8, і п дорівнює 1, 2, З або 4.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: нОоОоН хо ноон о / НО тх о АснМ но о х М
АснМ Н оНон х ново
АснМ , де Х являє собою заміщену або незаміщену зв'язку з чотирьох-тринадцяти послідовно зв'язаних атомів, і при цьому Х не містить естерної групи.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру:
НООН хо ноон о / НО тх о АснМ но о х М
АснМ Н оНон х
АснМ , де Х являє собою заміщену або незаміщену зв'язку із восьми послідовно зв'язаних атомів, причому Х не містить естерної групи.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: нНОоОоН хо ноон о / НО тХ о АснМ но о х М
АсНнНМ Н оНон х
АснМ , де Х являє собою заміщену або незаміщену зв'язку з чотирьох-тринадцяти послідовно зв'язаних атомів, і при цьому вказана зв'язка містить тільки один амідний зв'язок, а Х не містить естерної групи.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру:
НОоОН хо ноон о / НО тх о АснМ но о х М
АснМ Н оНон х
АснМ , де Х являє собою заміщену або незаміщену зв'язку з чотирьох-тринадцяти послідовно зв'язаних атомів, і при цьому вказана зв'язка складається з амідного зв'язку і заміщеної або незаміщеної С2-Сч1 алкільної групи.
У деяких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру:
нооНн Н о 0о- У -бМюмМ о но
АснНМ ноон ФО - оо М А но Н М
АснМ нон о о--у-ї (о) но
АснМ , де У вибраний з С1-С12 заміщеної або незаміщеної алкільної, алкенільної або алкінільної групи або групи, що містить етер, кетон, амід, естер, карбамат, амін, піперидин, фосфат, фосфодіестер, тіофосфат, триазол, піролідин, дисульфід або тіоестер.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: ноОон Н о 0о-У-М 0 щі)
АснМ ноон о у о о М А но Н М
АснНМ ноон о о--у- (в) но
АснМ , де У вибраний з С1-С12 заміщеної або незаміщеної алкільної групи або групи, що містить естер, амін, піперидин, фосфат, фосфодіестер або тіофосфат.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: ноОон Н о 0о-У-М 0 щі)
АснМ ноон о у о о М А но Н М
АснНМ ноон о 0о-ху-Н о но
АснМ , де У вибраний з С1-С12 заміщеної або незаміщеної алкільної групи.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру:
ноОон Н о оО/М 0 но 7,
АснМ ноон 9 о оС) А нот "Н М
АснНМ
М о ов оо Мо нок Н
АснМ , де п дорівнює 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу фрагмент кон'югувальної групи, що націлює на клітину, має наступну структуру: нОооНн Н
О ом, но о,
АснМ ноон о о оС) А но кт "Н М
АснНМ
М о ов оо Мо нота Н
АснНнМ , де п дорівнює 4, 5, 6, 7 або 8. р. Деякі кон'юговані антисмислові сполуки
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югати зв'язані з нуклеозидом антисмислового олігонуклеотиду в 2", 3" або 5" положенні нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має наступну структуру:
К- - 6 0 Е--я 9 де
А являє собою антисмисловий олігонуклеотид;
В являє собою розщеплюваний фрагмент
С являє собою лінкер кон'югату р являє собою групу розгалуження кожен Е являє собою зв'язку; кожен Е являє собою ліганд; і д дорівнює цілому числу від 1 до 5.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має наступну структуру: -- 6 в (в) 4 де
А являє собою антисмисловий олігонуклеотид;
С являє собою лінкер кон'югату р являє собою групу розгалуження кожен Е являє собою зв'язку; кожен Е являє собою ліганд; і д дорівнює цілому числу від 1 до 5.
Зо У деяких таких варіантах реалізації винаходу лінкер кон'югату містить щонайменше один розщеплюваний зв'язок. бо
У деяких таких варіантах реалізації винаходу група розгалуження містить щонайменше один розщеплюваний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка містить щонайменше один розщеплюваний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югати зв'язані з нуклеозидом антисмислового олігонуклеотиду в 2", 3" або 5" положенні нуклеозиду.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має наступну структуру: к-в- о ве Я 4 де
А являє собою антисмисловий олігонуклеотид;
В являє собою розщеплюваний фрагмент
С являє собою лінкер кон'югату кожен Е являє собою зв'язку; кожен Е являє собою ліганд; і д дорівнює цілому числу від 1 до 5.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югати зв'язані із нуклеозидом антисмислового олігонуклеотиду в 2", 3" або 5" положенні нуклеозиду. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має наступну структуру: к-о- ( е- я 4 де
А являє собою антисмисловий олігонуклеотид;
С являє собою лінкер кон'югату кожен Е являє собою зв'язку; кожен Е являє собою ліганд; і д дорівнює цілому числу від 1 до 5.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має наступну структуру: ство Кв) м
Зо де
А являє собою антисмисловий олігонуклеотид;
В являє собою розщеплюваний фрагмент р являє собою групу розгалуження кожен Е являє собою зв'язку; кожен Е являє собою ліганд; і д дорівнює цілому числу від 1 до 5.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має наступну структуру: к-т) 9 де
А являє собою антисмисловий олігонуклеотид; р являє собою групу розгалуження кожен Е являє собою зв'язку; кожен Е являє собою ліганд; і 4 дорівнює цілому числу від 1 до 5.
У деяких таких варіантах реалізації винаходу лінкер кон'югату містить щонайменше один розщеплюваний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу кожна зв'язка містить щонайменше один розщеплюваний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має структуру, вибрану з наступних:
Нанціпюючий фрагмент ї й: соц й і ЩУ «Мити то Ї їх !
Бош це с я В; ваш х Пивня І ї 7 Зв'язка Й З БІЙ У їянкев -ї 4 тен, шк м ца З що у, Розщапниюванмй ро ще я фрагмент ну реа ан НИ Група розгалуження паст КІ
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має структуру, вибрану з наступних:
Фрогинет ск націлює на кину
Ж дп г но й і. 0-Й Я І но а а р В. Розіеллюваникх фряент дені ши ! В; ми юн В. в У ши з ме о а Є вд: що пе В С арс чит нок тити то т 53 щ ие у М
АСНМ що о З літянд Зв'язка -3--а сь ОЗ насн в Аво р вина ан «АВ на он
МНнАсС Група рожхапуження
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука має структуру, вибрану з наступних: Що
А4АБО розщеплюваний фраптент носвго Фе г п-- а ді Й тя у тн а но-в-о
Фрапмент, що націлює на клітину г
А ТЕ т оон Що 5 - --й т я « не сві т хи а щ- ве а ня в ит й
ЩЕ 7 їй та с деНК в ні е нОоон р-н, І по щ а о З Кон'югувапьний
С Я ЩІ - нНОА- -- мл мит дядя «734 оч ліЖер
АСН о- о он ліганд Зв'язка -ВЗХ-- - 5 йЙ"К-УУЛЯ -к а но реч І
ЩІ ї на ША. ту, у ра; тт нт пе Го) в- но
МНАс Грпа розгалуження
Ілюстративні патенти Сполучених Штатів Америки, публікації патентних заявок Сполучених
Штатів Америки і публікації міжнародних патентних заявок, у яких розкрито одержання деяких із вказаних вище кон'югатів, кон'югованих антисмислових сполук, зв'язок, лінкерів, груп розгалуження, лігандів, розщеплюваних фрагментів, а також інших модифікацій, включають, без обмеження, 05 5994517, 5 6300319, 05 6660720, 005 6906182, 005 7262177, 05 7491805, 05 8106022, 005 7723509, 5 2006/0148740, 005 2011/0123520, УМО 2013/033230 і МО 2012/037254, кожна з яких включена до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі.
Ілюстративні публікації, в яких описано одержання деяких із вказаних вище кон'югатів, кон'юЮгованих антисмислових сполук, зв'язок, лінкерів, груп розгалуження, лігандів, розщеплюваних фрагментів, а також інших модифікацій, включають, без обмеження, ВІЕЗ5ЕМ еї а), "Пе Споїевзієгої Оеєгімаїйме ої а Тііапіеппагу Саїасіозіде мій Нідн Айіпйу тог Ше Нераїйс
Авзіаіодіусоргоївіп Весеріоюог: а Роїепі Споїевієгої! І омегіпуд Адепі" ). Мед. Спет. (1995) 38:1846- 1852, ВІЕЗБЕМ еї аї., "Зупійевзів ої Сіивієї Саїасіозідев м/йй Нідн АНіпйу ог Ше Нераїїс
Авіаіодіусоргоївіп Несеріог" У. Мед. Спет. (1995) 38:1538-1546, ІЕЕ еї аїЇ., "Мем/ апа тоге ейісіепі тиймаїеєпі діусо-Ідапав ог абвіаюдіусоргоїєїп гесеріої ої таттаїйап Пераїосуїев"
Віоогдапіс 4. Медісіпа! Спетівігу (2011) 19:2494-2500, ВЕМ5ЕМ еї аї., "Оєсїеттіпайоп ої Ше Оррег
Зі2ге ГІтії ог ОріаКе апа Ргосеззіпд ої Гідапаз Бу Ше Азіаіодіусоргоївіп Весеріог оп Нераїосуїєв іп Міо апа іп Мімо" 9). Віої. Спет. (2001) 276(40):37577-37584, ВЕМ5ЕМ еї аї., "Оевзідп апа
Зупіпезіз ої Моме! М-АсеїуІдаїасіюозатіпе- Тептіпаїєйд Спіусоїїріав ог Тагдеїйпо ої І іроргоївїпв Ю їйе
Нераїйс Авіаіодіусоргоївіп Весеріог" У. Мей. Спет. (2004) 47:5798-5808, 5БІПЕОВЕСТ еї аї., "Оевідп апа Зупіпезів ої Моме! АтрпПірпіїїс ЮОепаййіс (заіасіовіде5 їТог Зеїесіїме Тагдеїййп9 ої
Прозотез іо Ше Нераїйс Авіаіодіусоргоїєїп Весерюг" У. Мед. Спет. (1999) 42:609-618 і МаІепііп еї аї., "Зоїйа4-рпазе зупіпевзів ої Іузіпе-разей сіивієгї даїасіобзідез й підн айіпйу тог те
Авіаіодіусоргоївїп Несеріог" Темапеагоп, 1997, 53(2), 759-770, кожна з яких включена до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки містять олігонуклеотид на базі РНКази Н (такий як гепмер) або сплайс-модулюючий олігонуклеотид (такий як повністю модифікований олігонуклеотид) і будь-яку кон'югувальну групу, яка містить щонайменше одну, дві або три групи самМАс. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука містить будь-яку кон'югувальну групу, наведену у наступних посиланнях: І ее, Сагропуаг Кез, 1978, 67, 509-514; СоппопПу єї аї!., ) Віої Снет, 1982, 257, 939- 945; Раміа вї аї., Іпї У Рер Ргоївіп Нев, 1983, 22, 539-548; І ее ві а!., Віоспет, 1984, 23, 4255-4261;
Ї ее єї аї., Сіусосопіцдаїе ./), 1987, 4, 317-328; ТоуоКипі єї аї!., Теманеєадгоп І ей, 1990, 31, 2673- 2676; Вієззеп вї аї., / Мей Спет, 1995, 38, 1538-1546; МаїІепіі|п єї а!., Темганєдгоп, 1997, 53, 759- 770; Кіт єї а)., Теманеадгоп ГІ ей, 1997, 38, 3487-3490; І ее єї аї!., Віосопіцшд Спет, 1997, 8, 762-765;
Кат еї а!., Спусобіої, 2001, 11, 821-829; Вепзеп ві а!., У Віої Снет, 2001, 276, 37577-37584;1 еє вї аІ., Меїноде» Епгутої, 2003, 362, 38-43; Мевіепіпа еї аї., Спусосопі у), 2004, 21, 227-241;1 ее ві аї.,
Віоогд Мей Спет Гей, 2006, 16(19), 5132-5135; Маіетоїег єї а!., Вісогд Мей Спет, 2007, 15, 7661-7676; Кпогем еї а!., Вісогд Мей Спет, 2008, 16, 5216-5231; І ве еї а!., Віоога Мед Спет, 2011, 19, 2494-2500; Коптіїома еї аї., Апаїуї Віоспет, 2012, 425, 43-46; Рціо! еї аІ., Апдем Спетіє п Ей Еподі, 2012, 51, 7445-7448; Віеззеп еї а!., / Мей Спет, 1995, 38, 1846-1852; 5іієдгецві еї аї.,
У Мей Спет, 1999, 42, 609-618; Вепзеп еї аї., У Мей Спет, 2004, 47, 5798-5808; Вепзеп еї аї.,
Апепозсівег Тиготр Мавзс Віої, 2006, 26, 169-175; мап ВКоззепбрего єї аі!., Сепе Тег, 2004, 11, 457- 464; Зайо еї а!., У Ат Спет 5ос, 2004, 126, 14013-14022; 1 ее вї аї., У Огу Спет, 2012, 77, 7564- 7571; Віеззеп евї а)І., ЕАБЕВ У, 2000, 14, 1784-1792; Ва)сшг єї а!., Віосопіца Спет, 1997, 8, 935-940; рий еї аї., Мешоав Епгутої, 2000, 313, 297-321; Маїег еї аї!., Віосопішд Спет, 2003, 14, 18-29;
УауаргакКавзн еї аї!., Ог9у Гей, 2010, 12, 5410-5413; Мапонагап, Апіїзепзе Мисієїс Асій Огид Оеєм, 2002, 12, 103-128; Мегміп еї аї., Віосопінд Спет, 1994, 5, 612-620; Тотіуа єї аї!., Віосогд Мей
Спет, 2013, 21, 5275-5281; Міжнародні заявки УУО1998/013381; УМО2011/038356;
МО1997/046098; М/О2008/098788; МО2004/101619; М/О2012/037254; МО г2011/120053; МО2011/100131; УО2011/163121; УО2012/177947; МО2013/033230; УМО 2013/075035;
МО2012/083185; М/О2012/083046; М/О2009/082607; УМ/О2009/134487; М/О2010/144740;
МО2010/148013; М/О01997/020563; МО2010/088537; УМО2002/043771; М Ог2010/129709;
МО2012/068187; МО2009/126933; МО2004/024757; МО2010/054406; УМО 2012/089352;
УМО2012/089602; УММО2013/166121; ММО2013/165816; патенти США 4751219; 8552163; 6908903; 7262177; 5994517; 6300319; 8106022; 7491805; 7491805; 7582744; 8137695; 6383812; 6525031; 6660720; 7723509; 8541548; 8344125; 8313772; 8349308; 8450467; 8501930; 8158601; 7262177; 6906182; 6620916; 8435491; 8404862; 7851615; опубліковані заявки на патент США
ОБ2гО11/0097264; ИБ2О11/0097265; И52013/0004427; И52005/0164235; И52О0О06/0148740;
ОБ2гО08/0281044; О5Б2гОТ0/0240730; О5Б2О03/0119724; ИБ52О06/0183886; О52гО08/0206869; бо ОБ2гО11/0269814; О5Б2гО0О09/0286973; И5Б2О11/0207799; ИО52012/0136042; О52012/0165393;
ОБгО08/0281041; О52009/0203135; О5Б2012/0035115; 052012/0095075; О52012/0101148;
О52О12/0128760; О52012/0157509; О52012/0230938; О052013/0109817; 052013/0121954;
О52013/0178512; 052013/0236968; 052011/0123520; И52003/0077829; И52008/0108801; і
О05Б2009/0203132; кожна з яких включена до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі.
С Деякі застосування і особливості
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки демонструють ефективне зниження цільової РНК іп мімо. У деяких варіантах реалізації винаходу некон'юговані антисмислові сполуки накопичуються в нирках. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки накопичуються в печінці. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки є добре переносимими. Такі властивості роблять кон'юговані антисмислові сполуки особливо придатними для інгібування багатьох цільових РНК, включаючи, але без обмеження, ті, які приймають участь в метаболічних, серцево-судинних та інших захворюваннях, розладах або патологічних станах. Таким чином, в даному документі наведені способи лікування таких захворювань, розладів або патологічних станів приведенням тканин печінки в контакт з кон'югованими антисмисловими сполуками, націленими на РНК, пов'язані з такими захворюваннями, розладами або патологічними станами. Отже, наведені також способи покращення будь-яких з численних метаболічних, серцево-судинних та інших захворювань, розладів або патологічних станів за допомогою кон'югованих антисмислових сполук за даним винаходом.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки є ефективнішими, ніж некон'юговані аналоги при певній концентрації в тканині Не обмежуючись будь-якою теорією або механізмом, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'югат може забезпечувати можливість ефективнішого входження кон'югованої антисмислової сполуки у клітину або можливість продуктивнішого входження у клітину. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки можуть демонструвати більш значне зниження мішені, порівняно з некон'югованим аналогом, при цьому і кон'югована антисмислова сполука, і її некон'югований аналог знаходяться у тканині в однакових концентраціях. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки можуть демонструвати більш
Зо значне зниження мішені, порівняно з їх некон'югованими аналогами, при цьому і кон'югована антисмислова сполука, і її некон'югований аналог знаходяться у печінці в однакових концентраціях.
Раніше було розглянуте продуктивне і непродуктивне захоплення олігонуклеотидів (див., наприклад, Сеагу, К. 5., Е. Мапсемі/ісг, еї аї!. (2009). "ЕЄМНесі ої бозе апа Ріазта Сопсепігайоп оп
Пімег ОріаКке апіа РНІаптасоїодіс Асімйу ої а 2'-Меїйохуєїйпу! Моадйей СНітегіс Апіізепзе
Оїїдописієоііде Тагдеїпуд РТЕМ." Віоспет. РНаптасої. 78(3): 284-91; і КопПег, Е., Т. М. Міпсепі, еї аІ. (2011). "Меспапізт5 ої в5іпдіе-зітапдей рпо5зрпогоїйіоаїє тоайей апіїзепзе оїЇїдописієоїіаеє асситшиайоп іп пераїосуїев." Мисівєїс Асіа5 Нез. 39(11): 4795-807). Кон'югувальні групи, описані в даному документі, можуть покращувати продуктивне захоплення.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи, описані в даному документі, можуть додатково підсилювати ефективність за рахунок збільшення афінності кон'югованої антисмислової сполуки до конкретного типу клітини або тканини. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи, описані в даному документі, можуть додатково підсилювати ефективність за рахунок збільшення розпізнавання кон'югованої антисмислової сполуки одним або декількома рецепторами клітинної поверхні. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи, описані в даному документі, можуть додатково підсилювати ефективність за рахунок полегшення ендоцитозу кон'югованої антисмислової сполуки.
У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент може додатково підсилювати ефективність за рахунок забезпечення можливості розщеплення кон'югату з антисмислового олігонуклеотиду після надходження кон'югованої антисмислової сполуки в клітину. Відповідно, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки можуть бути введені у нижчих дозах, ніж необхідні для некон'югованих антисмислових олігонуклеотидів.
Раніше до антисмислових олігонуклеотідів уже були введені тіофосфатні зв'язки. Такі тіофосфатні зв'язки є стійкими до нуклеаз і за рахунок цього покращують стабільність олігонуклеотиду. Крім того, тіофосфатні зв'язки зв'язують також деякі білки, що приводить до накопичення антисмислового олігонуклеотиду в печінці. Олігонуклеотиди з меншою кількістю тіофосфатних зв'язків меншою мірою накопичуються в печінці і більшою - в нирках (див., наприклад, Ссієагу, В., "Рпаптасокіпеїїс Ргорепієв ої 2'-0-(2-МеїпохуєїНпуї)-Моаітєа Оіїдописіеоїіде 60 Апа!о95 іп Наїв, " доитаї ої Рпаптасоіоду апа Ехрегітепіа! ТПегарешісв, том 296, Мо З, 890-897; і
Рпагтасоїодіса! Ргорепівв ої 2'-О-Меїпохуєїну! Модійей Оіїдописіеоїіде5 іп Апіїзепхзе а Огид
Тесппоїоду, розділ 10, СтооКе, 5.Т., ред., 2008). У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотіди з меншою кількістю тіофосфатних межнуклеозидних зв'язків і з великою кількістю фосфодіестерних міжнуклеозидних зв'язків меншою мірою накопичуються в печінці і більшою - в нирках. При лікуванні захворювань печінки це є небажаним з декількох причин: (1) менша кількість лікарського засобу надходить до центру бажаної дії (печінка); (2) лікарський засіб виводиться із сечею; (3) нирки піддаються впливу відносно високої концентрації лікарського засобу, що може призводити до токсичності в нирках. Отже, при захворюваннях печінки тіофосфатні зв'язки забезпечують суттєву перевагу.
Однак у деяких варіантах реалізації винаходу введення олігонуклеотидів, рівномірно зв'язаних тіофосфатними міжнуклеозидними зв'язками, спричиняє одну або декілька прозапальних реакцій. (Див., наприклад: . І аб Сіїп Мед. 1996 Зер;/128(3):329-38. "Атрійісайоп ої апіброду ргодисіп Бу рпозрпогоїпіоаїе оїїдодеохуписіеоїіде5". Вгапда єї аї.; і див. також, наприклад: ТохісоЇодіс Ргорепієв5 іп Апіїзеп5е а Огид Тесппоіоду, розділ 12, сторінки 342-351,
СтгоокКе, 5.Т., ред., 2008). У деяких варіантах реалізації винаходу введення олігонуклеотидів, у яких велика частина міжнуклеозидних зв'язків містить тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки, спричиняє одну або декілька прозапальних реакцій.
У деяких варіантах реалізації винаходу ступінь прозапального ефекту може залежати від декількох змінних (наприклад, модифікація скелету, нецільова дія, модифікації азотистих основ та/або модифікації нуклеозиду), див., наприклад: Тохісоіодієс Ргорегпіве5 іп Апіїзепхзе а Огид
Тесппоіоду, розділ 12, сторінки 342-351, СтоокКе, 5.Т., ред., 2008). У деяких варіантах реалізації винаходу ступінь прозапального ефекту може бути послаблений за рахунок підбору однієї або декількох змінних. Наприклад, ступінь прозапального ефекту даного олігонуклеотиду може бути послаблений за рахунок заміни будь-якої кількості тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків фосфодіестерними міжнуклеозидними зв'язками із зменшенням за допомогою цього загальної кількості тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків.
У деяких варіантах реалізації винаходу може бути бажаним зменшити кількість тіофосфатних зв'язків, якщо це може бути здійснено без втрати стабільності і без зсуву розподілу із печінки в нирки. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу кількість
Зо тіофосфатних зв'язків може бути зменшена за рахунок заміни тіофосфатних зв'язків на фосфодіестерні зв'язки. У такому варіанті реалізації винаходу антисмислова сполука, що має меншу кількість тіофосфатних зв'язків і більшу кількість фосфодіестерних зв'язків, може спричиняти меншу кількість прозапальних реакцій або не спричиняти прозапальних реакцій.
Хоча антисмислова сполука, що має меншу кількість тіофосфатних зв'язків і більшу кількість фосфодіестерних зв'язків, може спричиняти меншу кількість прозапальних реакцій, антисмислова сполука, що має меншу кількість тіофосфатних зв'язків і більшу кількість фосфодіестерних зв'язків, може не накопичуватися в печінці і може бути менш ефективною в такій же або аналогічній дозі, порівняно з антисмисловою сполукою, що має більшу кількість тіофосфатних зв'язків. Тому в деяких варіантах реалізації винаходу бажано розробити антисмислову сполуку, яка має численні фосфодіестерні зв'язки і численні тіофосфатні зв'язки, але яка при цьому має також стабільність і хороший розподіл в печінці.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки більшою мірою накопичуються в печінці і меншою мірою - в нирках, ніж некон'юговані аналоги, навіть якщо деякі тіофосфатні зв'язки замінені менш прозапальними фосфодіестерними межнуклеозидними зв'язками. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки більшою мірою накопичуються в печінці і не так сильно виводяться із сечею, як їх некон'юговані аналоги, навіть якщо деякі тіофосфатні зв'язки замінені менш прозапальними фосфодіестерними межнуклеозидними зв'язками. У деяких варіантах реалізації винаходу застосування кон'югату забезпечує можливість розробки ефективніших і краще переносимих антисмислових ліків.
Дійсно, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки мають ширший терапевтичний індекс, ніж некон'юговані аналоги. Це дозволяє вводити кон'юговану антисмислову сполуку у вищій абсолютній дозі завдяки меншому ризику прозапальної реакції і меншому ризику токсичності для нирок. Така вища доза дає можливість вводити дозу рідше, оскільки очікується такий же коефіцієнт очищення (метаболізм). Крім того, оскільки сполука є ефективнішою, як описано вище, то можна допускати зниження концентрації перед введенням наступної дози, без втрати терапевтичної активності, що забезпечує ще триваліші періоди між введенням доз.
У деяких варіантах реалізації винаходу зберігається необхідність у впровадженні деякої кількості тіофосфатних зв'язків. Наприклад, кінцеві зв'язки легко піддаються дії екзонуклеа»з», і бо тому в деяких варіантах реалізації винаходу ці зв'язки являють собою тіофосфатні або інші модифіковані зв'язки. Міжнуклеозидні зв'язки, що сполучають два дезоксинуклеозиди, легко піддаються дії ендонуклеаз, і тому в деяких варіантах реалізації винаходу ці зв'язки являють собою тіофосфатні або інші модифіковані зв'язки. Міжнуклеозидні зв'язки між модифікованим нуклеозидом і дезоксинуклеозидом, де дезоксинуклеозид розташований на 5'-стороні зв'язувального дезоксинуклеозиду, легко піддаються дії ендонуклеаз, і тому в деяких варіантах реалізації винаходу ці зв'язки являють собою тіофосфатні або інші модифіковані зв'язки.
Міжнуклеозидні зв'язки між двома модифікованими нуклеозидами певних типів і між дезоксинуклеозидом і модифікованим нуклеозидом певного типу, де модифікований нуклеозид розташований на 5'-стороні лінкера, є достатньо стійкими до нуклеазного розщеплення, тому зв'язок може бути фосфодіестером.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 16 тіофосфатних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 15 тіофосфатних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 14 тіофосфатних зв'язків.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 13 тіофосфатних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 12 тіофосфатних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 11 тіофосфатних зв'язків.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 10 тіофосфатних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 9 тіофосфатних зв'язків. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмисловий олігонуклеотид кон'югованої антисмислової сполуки містить менш, ніж 8 тіофосфатних зв'язків.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки, що містять одну або декілька кон'югувальних груп, описаних в даному документі, мають підвищену активність та/або ефективність, та/або переносимість, порівняно з початковою антисмисловою сполукою, що не має такої однієї або декількох кон'югувальних груп. Відповідно, у деяких варіантах реалізації
Зо винаходу приєднання таких кон'югувальних груп до олігонуклеотиду є бажаним. Такі кон'югувальні групи можуть бути приєднані при 5'- та/або 3-кінці олігонуклеотиду. В деяких випадках синтетично бажаним є приєднання на 5'-кінці Як правило, олігонуклеотиди синтезують приєднанням 3'-кінцевого нуклеозиду до твердої основи з подальшим з'єднанням нуклеозидів від 3" до 5" за допомогою методик, загальновідомих з рівня техніки. Відповідно, якщо кон'югувальна група є необхідною на 3'-кінці, то можна (1) приєднати кон'югувальну групу до 3'-кінцевого нуклеозиду і приєднати цей кон'югований нуклеозид до твердої основи для подальшого одержання олігонуклеотиду або (2) приєднати кон'югувальну групу до 3'-кінцевого нуклеозиду готового олігонуклеотиду після синтезу. Жоден з цих підходів не є особливо ефективним, і тому обидва вони є затратними. Зокрема, приєднання кон'югованого нуклеозиду до твердої основи, хоча і наведено в даному документі у розділі "Приклади", не є ефективним способом. У деяких варіантах реалізації винаходу приєднання кон'югувальної групи до 5'- кінцевого нуклеозиду є синтетично простішим, ніж приєднання до 3'-кінця. Можна приєднати некон'югований 3'-кінцевий нуклеозид до твердої основи і одержати олігонуклеотид за стандартними і добре описаними реакціями. Далі потрібно тільки приєднати 5'-нуклеозид, що має кон'югувальну групу, на останній стадії з'єднання. У деяких варіантах реалізації винаходу це більш ефективно, ніж приєднання кон'югованого нуклеозиду безпосередньо до твердої основи, як це звичайно роблять для отримання 3'-кон'югованого олігонуклеотиду. У представлених в даному документі Прикладах показане приєднання до 5'-кінця. Крім того, деякі кон'югувальні групи мають синтетичні переваги. Наприклад, деякі кон'югувальні групи, що містять фосфорні зв'язувальні групи, одержують синтетично простіше і більш ефективно, ніж інші кон'югувальні групи, включаючи кон'югувальні групи, описані раніше (наприклад, М/О0/2012/037254).
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні антисмислові сполуки вводять суб'єкту. У таких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки, що містять одну або декілька кон'югувальних груп, описаних у даному документі, мають підвищену активність та/або ефективність та/або переносимість, порівняно з початковою антисмисловою сполукою, що не має такої однієї або декількох кон'югувальних груп. Не обмежуючись механізмом, передбачається, що кон'югувальна група сприяє розподілу, доставці та/або поглинанню у цільовій клітині або тканині. У деяких варіантах реалізації, після надходження у цільову клітину або тканину бажано, щоб вся або частина кон'югувальної групи розщеплювалася з бо вивільненням активного олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу необов'язково,
щоб з олігонуклеотиду розщеплювалася вся кон'югувальна група. Наприклад, у Прикладі 20 кон'югований олігонуклеотид вводили мишам і знаходили численні різноманітні хімічні частинки, кожна з яких містила різні частини кон'югувальної групи, що залишилися на олігонуклеотиді (Табл. 10а). Ця кон'югована антисмислова сполука показала хорошу ефективність (Табл. 10).
Так, у деяких варіантах реалізації винаходу такий метаболітний профіль багаторазового часткового розщеплення кон'югувальної групи не впливає на активність/ефективність. Однак, у деяких варіантах реалізації винаходу бажаним є, щоб проліки (кон'югований олігонуклеотид) давали одну активну сполуку. У деяких випадках, при виявленні численних форм активної сполуки, може бути необхідним визначити відносні кількості і дію для кожної з них. У деяких варіантах реалізації, при необхідності тестування регуляції (наприклад, ЕЮОА США або іншим органом), бажано мати одну (або переважно одну) активну частинку. У деяких таких варіантах реалізації винаходу бажано, щоб така одна активна частинка була антисмисловим олігонуклеотидом, що не містить жодних частин кон'югувальної групи. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югувальні групи на 5'-кінці ймовірніше приводять до повного метаболізму кон'югувальної групи. Не обмежуючись механізмом, можливо, ендогенні ферменти, які відповідають за метаболізм на 5'-кінці (наприклад, 5-нуклеази), є більш активними/ефективними, ніж 3-аналоги. У деяких варіантах реалізації винаходу певні кон'югувальні групи більш схильні до метаболізму до однієї активної частинки. У деяких варіантах реалізації винаходу деякі кон'югувальні групи більш схильні до метаболізму до олігонуклеотиду.
Ор. Антисмисл
У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерні сполуки за даним винаходом є антисмисловими сполуками. У таких варіантах реалізації винаходу олігомерна сполука є комплементарною цільовій нуклеїновій кислоті. У деяких варіантах реалізації винаходу цільова нуклеїнова кислота являє собою РНК. У деяких варіантах реалізації винаходу цільова нуклеїнова кислота являє собою некодуючу РНК. У деяких варіантах реалізації винаходу цільова нуклеїнова кислота кодує білок. У деяких варіантах реалізації винаходу цільова нуклеїнова кислота вибрана з мРНК, пре-мРНК, мікроРНК, некодуючої РНК, включаючи малу некодуючу РНК, і промотор-націлюваної РНК. У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерні
Зо сполуки є щонайменше частково комплементарними більш ніж одній цільовій нуклеїновій кислоті. Наприклад, олігомерні сполуки за даним винаходом можуть бути міметиками мікроРНК, що звичайно зв'язуються з декількома мішенями.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки містять частину, що має послідовність азотистих основ, яка є щонайменше на 7095 комплементарною послідовності азотистих основ цільової нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки містять частину, що має послідовність азотистих основ, яка є щонайменше на 80 95 комплементарною послідовності азотистих основ цільової нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки містять частину, що має послідовність азотистих основ, яка є щонайменше на 90 95 комплементарною послідовності азотистих основ цільової нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки містять частину, що має послідовність азотистих основ, яка є щонайменше на 95 95 комплементарною послідовності азотистих основ цільової нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки містять частину, що має послідовність азотистих основ, яка є щонайменше на 98 95 комплементарною послідовності азотистих основ цільової нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки містять частину, що має послідовність азотистих основ, яка є на 100 95 комплементарною послідовності азотистих основ цільової нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки є щонайменше на 70 95, 80 95, 90 Уо, 95 Фо, 98 95 або 100 95 комплементарними послідовності азотистих основ цільової нуклеїнової кислоти по всій довжині антисмислової сполуки.
Антисмислові механізми включають будь-який механізм, що зачіпає гібридизацію олігомерної сполуки з цільовою нуклеїновою кислотою, при цьому гібридизація приводить до біологічного ефекту. У деяких варіантах реалізації винаходу така гібридизація приводить або до руйнування, або до застосування цільової нуклеїнової кислоти із супутнім пригніченням або стимуляцією клітинного механізму, що зачіпає, наприклад, трансляцію, транскрипцію або поліаденілювання цільової нуклеїнової кислоти або нуклеїнової кислоти, з якою цільова кислота може взаємодіяти в інший спосіб.
Один із типів антисмислового механізму, що зачіпає руйнування цільової РНК являє собою антисмисл, опосередкований РНКазою Н. РНКаза Н є клітинною ендонуклеазою, що розщеплює бо спіраль РНК дуплексу РНК:ДНК. З рівня техніки відомо, що одноланцюгові антисмислові сполуки, що є "ДНК-подібними", спричиняють активність РНКази Н у клітинах ссавців. Отже, активація РНКази Н приводить до розщеплення РНК-мішені, за допомогою чого значною мірою підсилюється ефективність пригнічення генної експресії, опосередкованої ДНК-подібним олігонуклеотидом.
Антисмислові механізми також включають, без обмеження, РНКі механізми, у яких застосовується шлях КІЗС. Такі РНКІі механізми включають, без обмеження, міРНК, олРНК і мікроРНК механізми. Такі механізми включають створення міметику мікроРНК та/або анти-мікро
РНК.
Антисмислові механізми також включають, без обмеження, механізми, які гібридизують або імітують некодуючу РНК, відмінну від мікроРНК або мРНК. Такі некодуючі РНК включають, без обмеження, промотор-націлену РНК та малу і довгу РНК, яка впливає на транскрипцію або трансляцію однієї або декількох нуклеїнових кислот.
У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди, що містять описані в даному документі кон'югати, є РНКі сполуками. У деяких варіантах реалізації винаходу олігомерні олігонуклеотиди, що містять описані в даному документі кон'юЮгати, є олРНК сполуками. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди, що містять описані в даному документі кон'югати, спарені з іншою олігомерною сполукою з утворенням міРнНК. У деяких таких варіантах реалізації винаходу друга олігомерна сполука також містить кон'югат. У деяких варіантах реалізації винаходу друга олігомерна сполука є будь-якою модифікованою або немодифікованою нуклеїновою кислотою. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди, що містять описані в даному документі кон'югати, є антисмисловим ланцюгом в міРНК сполуці. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди, що містять описані в даному документі кон'югати, є смисловим ланцюгом в міРНК сполуці. У тих варіантах реалізації, в яких кон'югована олігомерна сполука є дволанцюговою міРнНК, кон'югат може знаходитися на смисловому ланцюгу, антисмисловому ланцюгу або і на смисловому ланцюгу, і на антисмисловому ланцюгу. р Цільові нуклеїнові кислоти, ділянки і сегменти
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки націлені на будь- яку нуклеїнову кислоту. У деяких варіантах реалізації винаходу цільова нуклеїнова кислота
Зо кодує білок-мішень, що є клінічно значущим. У таких варіантах реалізації винаходу модуляція цільової нуклегснової кислоти приводить до сприятливого клінічного ефекту. Деякі цільові нуклеїнові кислоти включають, без обмеження, цільові нуклеїнові кислоти, представлені в Табл. 1.
Таблиця 1
Деякі цільові нуклеїнові кислоти 01111111 Мішень///////// | Види | НомердостулусЕМВАМКО З |ЗЕОІЮ МО
Процес таргетингу звичайно включає визначення щонайменше однієї цільової ділянки, сегменту або сайту на цільовій нуклеїновій кислоті для антисмислової взаємодії, з виникненням в результаті такого бажаного ефекту.
У деяких варіантах реалізації винаходу цільова область являє собою структурно визначену область нуклеїнової кислоти. Наприклад, у деяких таких варіантах реалізації винаходу цільова область може охоплювати 3" ТК, 5" ТЕ, екзон, інтрон, кодуючу область, область ініціації трансляції, область термінації трансляції або іншу визначену область або цільовий сегмент нуклеїнової кислоти.
У деяких варіантах реалізації винаходу цільовий сегмент є частиною цільової ділянки щонайменше з близько 8 азотистих основ, на яку націлена кон'югована антисмислова сполука.
Цільові сегменти можуть містити послідовності ДНК або РНК, які містять щонайменше 8 суміжних азотистих основ від 5'-кінця одного з цільових сегментів (решта азотистих основ простягається одна за одною з тієї ж ДНК або РНК, починаючись відразу перед 5'-кінцем цільового сегменту і триваючи до моменту, коли ДНК або РНК буде містити від близько 8 до близько 30 азотистих основ). Цільові сегменти представлені також послідовностями ДНК або
РНК, які містять щонайменше 8 суміжних азотистих основ від З3'-кінця одного з цільових сегментів (решта азотистих основ простягається одна за одною з тієї ж ДНК або РНК, починаючись відразу після 3'-кінця цільового сегменту і триваючи до моменту, коли ДНК або
РНК буде містити від близько 8 до близько 30 азотистих основ). Цільові сегменти також можуть бути представлені послідовностями ДНК або РНК, які містять щонайменше 8 суміжних азотистих основ з внутрішньої частини послідовності цільового сегменту, і можуть простягатися в будь-якому або обох напрямках до моменту, коли кон'югована антисмислова сполука міститиме від близько 8 до близько 30 азотистих основ.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки, націлені на нуклеїнові кислоти, що наведені в Табл. 1, можуть бути модифіковані таким чином, як описано в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки можуть мати модифікований цукровий фрагмент, немодифікований цукровий фрагмент або суміш модифікованих і немодифікованих цукрових фрагментів, як описано в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки можуть мати модифікований міжнуклеозидний зв'язок, немодифікований міжнуклеозидний зв'язок або суміш модифікованих і немодифікованих міжнуклеозидних зв'язків, як описано в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки можуть мати модифіковану азотисту основу, немодифіковану азотисту основу або суміш модифікованих і немодифікованих азотистих основ, як описано в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки можуть мати мотив, описаний в даному документі.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки, націлені на нуклеїнові кислоти, що наведені в Табл. 1, можуть бути кон'югованими таким чином, як описано в даному документі. 1. Гепатит В (НВУ)
Гепатит В являє собою вірусне захворювання, що передається парентеральним шляхом через заражений матеріал, такий як кров і продукти крові, забруднені голки, статевим шляхом і вертикально від інфікованої або несучої вірус матері до її потомства. За оцінками Всесвітньої організації охорони здоров'я, у всьому світі інфіковано більше 2 мільярдів людей, при цьому щорічно відбувається близько 4 мільйонів гострих випадків, 1 мільйон смертельних випадків на рік і 350-400 мільйонів хронічних носіїв (Всесвітня організація охорони здоров'я: Зеодгарпіс
РгемаІепсе Годі Нерайшів в Ргемаіепсе, 2004. пЕру/лимли мно. іпі/уассіпев- 5цгмейапсе/дгарпісз/пітів/перрргем. піт).
Зо Вірус НВМ являє собою дволанцюговий гепатотропний вірус, що інфікує тільки людину і людиноподібних приматів. Вірусна реплікація відбувається переважно в печінці і, меншою мірою, в нирках, підшлунковій залозі, кістковому мозку і селезінці (Нераїйі5 В міги5 бБіоіоду.
Містобріо! Мої! Віо! Веу. 64: 2000; 51-68.). Вірусні та імунні маркери можуть бути знайдені в крові і є характерними профілями антигенів-антитіл, що розвиваються з часом. Першим вірусним маркером, що виявляється, є НВ5ЗАОЯ, за ним слідує антиген е гепатиту В (НВедАо) і ДНК НВУ. У інкубаційному періоді титри можуть бути високими, але рівні ДНК і НВеАд НВМ починають різко знижуватися на початку захворювання і можуть не піддаватися виявленню на піку клінічної хвороби (Нераїййі5 В міги5 іптесіоп-паїшга! Нпізіюгу апа сіїпіса! сопеедоепсев. М Епді У Мед. 350: 2004; 1118-1129). НВедоЗ є вірусним маркером, який виявляють у крові, що корелює з активною вірусною реплікацією і, отже, високим вірусним навантаженням та інфекційністю (Нераййі5 В е апіїдеп-Ше дапдегоив5 епа дате ої Пераїйів В. М Епа! У Мед. 347: 2002; 208-210). Наявність анти-
НВ5АБ і анти-НВсСАБ (Ід) вказує на одужання і імунітет у раніше інфікованого індивідуума.
На даний час засоби терапії хронічної інфекції НВМУ, рекомендовані Американською асоціацією з вивчення захворювань печінки (ААБІО) і Європейською асоціацією з вивчення печінки (ЕА5І), включають інтерферон-альфа (ІМЕа), пегильований інтерферон-альфа-га (Ред-
ІЕМ2га), ентекавір і тенофовір. Терапія нуклеозидами і азотистими основами, ентекавіром і тенофовіром, є успішною для зниження вірусного навантаження, але швидкість сероконверсії
НВедо і зниження НВ5АОЯ є навіть нижчою, ніж швидкість, що може бути досягнута за допомогою
ІРМа терапії. Застосовують також інші аналогічні терапевтичні засоби, зокрема ламівудин (ЗТ), телбівудин (147) і адефовір, але терапевтична ефективність терапевтичних засобів з нуклеозидами/азотистами основами в цілому обмежена появою резистентності.
Отже, в даній галузі техніки існує необхідність у відкритті і розробці нових противірусних терапевтичних засобів. Крім того, існує необхідність у нових анти-НВМ терапевтичних засобах, здатних збільшувати швидкість сероконверсії НВело і НВ5Ад. У нешщодавніх клінічних дослідженнях була знайдена кореляція між сероконверсією і зниженням НВелАад (Ртгієей еї аї (2008) НерашіІоду 47:428) та зниженням НВ5ЗАд (Моисагі еї а! (2009) НерайюіІоду 49:1151).
Зниження рівнів антигенів може забезпечувати можливість імунологічного контролю інфекції
НВМ, оскільки передбачається, що високі рівні антигенів спричиняють імунологічну толерантність. Існуючі нуклеозидні терапевтичні засоби проти НВМ можуть значно знижувати бо рівні НВМ у сироватці, але мало впливають на рівні НВеда і НВзАа.
Антисмислові сполуки, націлені на НВУ, були описані раніше у УМО2011/047312,
УМО2012/145674 і МЛО2012/145697, повний зміст кожної з яких включений до даного документу шляхом посилання. Заплановані клінічні дослідження для оцінки впливу антисмислових сполук, націлених на НВУ, на пацієнтів. Однак все ще існує необхідність у забезпеченні пацієнтів додатковими і ефективнішими можливостями лікування.
Деякі кон'юговані антисмислові сполуки, націлені на нуклеїнову кислоту НВМ
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки націлені на нуклеїнову кислоту НВУ, що має послідовність з номером доступу СЗЕМВАМКФ Ш95551.1, яка включена до даного документу як ЗЕО ІЮ МО: 1. У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'юЮгована антисмислова сполука, націлена на 5ЕБО ІЮ МО: 1, є щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або на 100 95 комплементарною 5ЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІЮО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності ЗХЕО ІЮО МО: 3. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 3.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності 5ЕО ІЮО МО: 4. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІЮО МО: 4.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності ЗЕО ІЮО МО: 5. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІЮО МО: 5.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності ЗЕО ІЮ МО: 6. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 6.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності ХЕО ІЮ МО: 7. У
Зо деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 7.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності ЗЕО ІЮ МО: 8. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 8.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності ЗЕО ІЮ МО: 9. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 9.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮ МО: 10. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 10.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 1, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮ МО: 11. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 1, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 11.
Таблиця 2
Антисмислові сполуки, націлені на НВМ 5ЕО ІЮ МО: 1
Сайт- ініціації 552023 | 7266 |АОСАСТІССОСАСТАТОСАТ |сеееееадодаййодасєєє | 6
Таблиця 2
Антисмислові сполуки, націлені на НВМ 5ЕО ІЮ МО: 1
Сайт-
ІВІВ Ме | мішень Послідовність (5-37) Мотив ЗЕСИО ініціації МО 552032 | 1585 |СТОСАСАССТОААОСОААСТ (еесеееадссй0йаєєєє | 8 552859 | 71583 |АОСТОАДАССОСААСТОС ЕККасйсбсоаааюке | 9
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 505358 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 505358 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Се5 тСез Ае5 Сбе5 Ае5 аз саз Таз саз даз дах саз тсСаз саз Ааз5 Ае5 Се Те5 бе5 тсСе, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з І5ЗІ5 509934 і кон'югувальної групи. ІБІЗ5 509934 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: тСе5 тСев5 Ае5 Ае5 Тез Таз Таз Ааз Таз саз тСаз тсСаз Таз дах тсСаз Аез5 без тсСез тсСезх Те, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 510100 і кон'югувальної групи. ІЗІ5 510100 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Се5 Се5 тСез дав таз Ааз са тсСаз Ааз саз тсСаз дав саз без Аез Тез бе, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з І5ЗІ5 552023 і кон'югувальної групи. ІЗІ5 552023 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Ае5 Се5 бе5 Ае5 бе5 Те5 Таз тСаз тСавз ваз тсСаз даз са таз даз таз Се5 бе5
Аез Те, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІЗІЗ 552024 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 552024 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Се5 Те5 бе5 Ае5 Ае5 бе5 тсСаз (аз даз дах саз Таз саз тСаз дах тсСав Ае5 тСев5
Се5 Се, де
А:аденін,
тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 552032 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 552032 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Се5 Те5 бе5 тСез Ае5 Се Дав Саз Сав Таз Ссза5 Адз Адз Са тбав Саз Ае5 Аез Сев
Те, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з І5І5 552859 і кон'югувальної групи. ІБІ5 552859 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Ае5 сКк5 оК5 Таз саз Ааз Ааз саз тсСаз баз даз даз саз ТКк5 оК5 тсСе, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид,
К-СЕгі-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 552925 і
Зо кон'югувальної групи. ІЗІ5 552925 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Те5 тСКк5 тСаз вав тсСаз Аа са Таз Ааз Таз саз са5 АК5 Те5 токКз5 бе, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид,
К-СЕгі-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок. 5ЕтТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 577119 і кон'югувальної групи. ІБІ5 577119 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: АК5 Ааз ТКк5 Таз Тк5 Ааз Таз сах тСаз тсСаз таз дах тсСавз Аеб5 Се5 тСев тсСез Те, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид,
К-СЕгі-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука, що має наступну хімічну структуру, містить або складається з ІЗІ5 505358 із 5-Х, де Х являє собою кон'югувальну групу, описану в даному документі:
З б о вн; х з х 3 ІЙ мб квь Ме ге іх х їй щі | 7 і і о. ше в ; о ї ке ре
Я. З вевно фі Ї Ме г и ; 8 уро ре й у ще в-ва в з б у й 2 ї -ий 3 ї Я ІЖН» я г і я; о дей М А а й М і і 4 и і ув зі й ги А а у Ов-вха ї
Ще 7 я 2 й і М Мах в-ва м Ї Ва бео Мк і а оо тн, ; ! ба йно яв о, о 4 Ї лк що у»
Файно г у вро ві х а й -5 |; зе (ке; ролет у б З ру ще ; Мн і З -йео і
Здай и н ї ! вніно й в. | Я збкн; ве НК й ! в. й " А с. нт» і - 97 г ч в і в. щ
З е в; ев 9 в-во а ! вка ій мін, Й В ква о і ! З с-/ о У СН ще в 5 Одно і вро / п,
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 712408, що має наступну хімічну структуру:
2 Х чна нан З же Ж, со ви а ча М, щі йУЗК - пав 1 о се Еш 8 т й т ЖЕ й її | - ше 1. і бю і ! е я М А, пф ате шин шин: ке вч зр - І; ; ї СУ Е я нази " Б з -5о АХ " Е |, пот зіне є; ше; ї , І ше 2 ! зно нео В я Овчрю вуз | в ще з в и гу - п о га Й 5 у оо Зв ще
Я в і в нь втра т | й /
С У Я М - й- ; «дн; - ЕК - ро й мк У я | ую мо
Ое-й-о пн м Ан ї Гі у, зії й ма ще ї с
Кай | ГІ М й веб гу зн ба
У. в Е -ї «Я 2 Ще до що ; у ши ШИШ А век г чно сел зе, а іо яд ї т ї
Є гий ру зх |! 7 зі й ї ве ще о. і-яо н вче че вч ї2у ї дк й е з ре ; о дев ї і з чер бе і м юн; ! ря вч е 9 во ; 0. вн дека ї й т
Сн з ми ни Яні й р у су 7» лю ш- он Ми
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з І5ЗІ5 695324, що має наступну хімічну структуру:
е і мне но з деяза є щ ге іа у е рпотеснся іш и за Ач й см ат і З насн о й У сни в; | ; і ' Я п що аж) А |. СОКИ М н юку вб-Т ші ро ав щу гг | ке І с ту і де нос Е. м у о я п кН, х ; е. 5 ЩО | вер о осв бе «А си вв вчена і. в ' о / о й ек, 1 - 3 ее Шк о
Фр-йно «о | Пк; чо НИ Я. ден зе В що й Мн нн» ї пе г в і Яойно гу еф М а. з вяю гай І о вл нен,
З ! і т а ча же ! ра ж ше х
Ко ко» ен ою фр ей прерії і в з М
В і і ВН коня в Є кн
На іл Ь Й т дю 23 ї ет мА це а- м ї вхо й ред й з а ГЗ Й ж
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з 5ЕО ІЮО МО: 3, 5'- саїІМАс і хімічних модифікацій і представлена наступною хімічною структурою:
ве Ще вн насн ГК | «ря і | вв нен у з а, ; вд шия у 4 у
ЗИ ки дах н о й с сн с і в їе нок Нг вно зу |! в я і о
ВІ зе шк М В ' в! о і тер Ям що д-р а ї в. Не
Щ ! Сея м і зе шишка.
Хв х ; у
З ет і ї я-ї чн
Гео ; і зро ко Мет ! 9 у | Я ї з в ги ї Ж Г жі
Є, йо Мен а зву
І ч м | Ше . в х ва ї о
С чн ро йо в А А
С: ву я се шересь т "З Мен
Еф н ве а і я як
Ве ' : х й до ху ке ї ба к й г і Те що з в, 5. ве І! у де будь-який ЕК являє собою -ОСН»СНгОСН:»: (МОЕ,), а Кг являє собою Н; або Е" і БК? разом утворюють місток, причому К' являє собою -0-, а КК? являє собою -СНе-, -СН(СНз)- або -
СНеСНне-, і ЕК ії К2 з'єднані напряму таким чином, що місток, який утворюється, вибраний з: -0-
СнНе-, -0-СН(СнНаз)- і-0-СН.СНе-; і для кожної пари з КЗ ї К" у одного кільця, для кожного кільця незалежно: будь-який КЗ вибраний з Н ії -«ОСН».СНгОСН», а К" являє собою Н; або КЗ ї К" разом утворюють місток, причому КЗ являє собою -О-, а К" являє собою -СНе-, -СН(СНЗз)- або -СНеСНе-, і ВЗ і КЕ" з'єднані напряму таким чином, що місток, який утворюється, вибраний з: -0О-СНе-, -0О-СН(СНЗз)- і -0-
Сснсне-; і Е? вибраний з Н і -СНз; а 7 вибраний з 5- і О-.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, описаний в публікації МО 2012/145697, повний зміст якої включений до даного документу шляхом посилання, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ будь-якої із БЕО ІЮ МО 5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 і 1379, описаних у УМО 2012/145697, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, описаний в публікації УМО 2011/047312, повний зміст якої включений до даного документу шляхом посилання, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ будь-якої із ЗЕО ІЮ МО 14-22, описаних у УМО 2011/047312, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, описаний в публікації УМО 2012/145674, повний зміст якої включений до даного документу шляхом посилання, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ будь-якої із БЕО ІЮ МО 18-35, описаних у УМО 2012/145674. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить дволанцюговий олігонуклеотид, описаний в публікації УМО 2013/159109, повний зміст якої включений до даного документу шляхом посилання, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить дволанцюговий олігонуклеотид, в якому одна спіраль має послідовність азотистих основ будь-якої із ЗЕО ІЮ МО 300-125, описаних у МО 2013/159109.
Послідовності азотистих основ всіх вищезгаданих референтних ЗЕО ІЮО МО включені до даного документу шляхом посилання.
Терапевтичні показання для НВМ
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені способи застосування кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту НВУ, для модуляції експресії НВМ у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації винаходу експресія НВМ знижується.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені способи застосування кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту НВУ, у фармацевтичній композиції для лікування суб'єкта. У деяких варіантах реалізації винаходу суб'єкт страждає на патологічний стан, пов'язаний з НВУ. У деяких варіантах реалізації винаходу патологічний стан, пов'язаний з
НВМ, включає, але без обмеження, хронічну НВМ інфекцію, запалення, фіброз, цироз, рак печінки, сироватковий гепатит, розлиття жовчі, рак печінки, запалення печінки, фіброз печінки, цироз печінки, печінкову недостатність, дифузне гепатоцелюлярне запальне захворювання, гемофагоцитарний синдром, сироватковий гепатит і НВМ віремію. У деяких варіантах реалізації винаходу патологічний стан, пов'язаний з НВМ, може характеризуватися симптомами, які
Зо можуть включати будь-яку або всі з наступних ознак: грипопідобне захворювання, слабкість, біль, головний біль, гарячка, втрата апетиту, діарея, розлиття жовчі, нудота і блювання, біль у ділянці печінки, випорожнення глинистого або сірого кольору, загальний свербіж і сеча темного кольору, в поєднанні з позитивним тестом на наявність вірусу гепатиту В, вірусного антигену гепатиту В або позитивним тестом на наявність антитіла, специфічного до вірусного антигену гепатиту В. У деяких варіантах реалізації винаходу суб'єкт має ризик патологічного стану, пов'язаного з НВМ. Сюди входять суб'єкти, що мають один або декілька факторів ризику розвитку патологічного стану, пов'язаного з НВУ, включаючи статевий контакт з індивідуумом, інфікованим вірусом гепатиту В, проживання в одному будинку з індивідуумом з довічною інфекцією вірусом гепатиту В, контакт із кров'ю людини, інфікованої вірусом гепатиту В, ін'єкція заборонених речовин суб'єктом з гемофілією і відвідування місць розповсюдження гепатиту В. У деяких варіантах реалізації винаходу у суб'єкта ідентифікована необхідність лікування патологічного стану, пов'язаного з НВМ.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропонований спосіб зниження рівнів ДНК НВМ та/або антигенів НВМ у тварини, інфікованої НВМ, який включає введення вказаній тварині кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту НВУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антиген являє собою НВ5ЗАсС або НВедо. У деяких варіантах реалізації винаходу кількість антигену НВМ може істотно знижуватися, що приводить до сероконверсії.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені способи застосування кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту НВМ, для виробництва лікарського засобу.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу запропонована кон'югована антисмислова сполука, націлена на нуклеїнову кислоту НВМ, або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропонована кон'югована антисмислова сполука, націлена на нуклеїнову кислоту НВМ, для застосування при лікуванні патологічного стану, пов'язаного з НВУ. Патологічний стан, пов'язаний з НВУ, включає, але без обмеження, хронічну
НВМУ інфекцію, запалення, фіброз, цироз, рак печінки, сироватковий гепатит, розлиття жовчі, рак печінки, запалення печінки, фіброз печінки, цироз печінки, печінкову недостатність, дифузне гепатоцелюлярне запальне захворювання, гемофагоцитарний синдром, сироватковий гепатит і бо НВМ віремію.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропонована кон'югована антисмислова сполука, націлена на нуклеїнову кислоту НВМ, для застосування з метою зниження рівнів ДНК НВМУ та/або антигену НВМ у тварини, інфікованої НВМУ, що включає введення вказаній тварині кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту НВУ. У деяких варіантах реалізації винаходу антиген являє собою НВ5ЗАС або НВедо. У деяких варіантах реалізації винаходу кількість антигену НВМ може істотно знижуватися, що приводить до сероконверсії.
Потрібно розуміти, що будь-яку з описаних в даному документі сполук можна застосовувати у вищезазначених способах і видах застосування. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на нуклеїнову кислоту НВМ, у вищезазначених способах і видах застосування може включати, але без обмеження, кон'юговану антисмислову сполуку, націлену на 5БО ІЮО МО: 1, яка містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності 5ЕО 1Ю МО: 3-11; кон'юговану антисмислову сполуку, націлену на 5ЕО ІЮО МО: 1, яка містить послідовність азотистих основ будь-якої із «ЕО ІЮ МО: 3- 11; сполуку, що містить або складається з І5ЗІ5 505358, ІБІ5 509934, ІБІ5 510100, ІБІ5 552023,
ІБІБ 552024, ІБІ5 552032, ІБІЗ 552859, ІБІ5 552925, або ІБІЗ 577119 і кон'югувальної групи; сполуку, що містить антисмисловий олігонуклеотид, описаний в публікації УМО 2012/145697, повний опис якої включений до даного документу шляхом посилання, і кон'югувальну групу; сполуку, що містить антисмисловий олігонуклеотид, який має послідовність азотистих основ будь-якої із ЗЕО ІЮО МО 5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 і 1379, описаних у УМО 2012/145697, і кон'югувальну групу, описану в даному документі; сполуку, що містить антисмисловий олігонуклеотид, який має послідовність азотистих основ будь-якої із
ЗЕО Ір МО 14-22, описаних у МО 2011/047312, і кон'югувальну групу, описану в даному документі; сполуку, що містить антисмисловий олігонуклеотид, який має послідовність азотистих основ будь-якої із БЕО ІЮ МО 18-35, описаних у УМО 2012/145674; або сполуку, що містить дволанцюговий олігонуклеотид, в якому одна спіраль має послідовність азотистих основ будь-якої із БЕО ІЮ МО 30-125, описаних у МО 2013/159109. 2. Транстиретин (ТТК)
ТТА (також відомий як преальбумін, гіпертироксинемія, диспреальбумінемічна, тироксин; старечий системний амілоїдоз, амілоїдна поліневропатія, амілоїдоз Ї, РАІ В;
Зо дистранстиретинемічна, НОТ2651; ТВРА; диспреальбумінемічна еутиреоїдна гіпертироксинемія) являє собою білок сироватки/плазми і спинномозкової рідини, що відповідає за транспорт тироксину і ретинолу (ЗакКакі еї аї, Мої! Віої Мей. 1989, 6:161-8). Структурно ТТЕ являє собою гомотетрамер; точкові мутації і неправильне згортання білка призводять до відкладення амілоїдних фібрил і супроводжуються такими розладами як старечий системний амілоїдоз (55А), родинна амілоїдна поліневропатія (БАР) і родинна амілоїдна кардіопатія (ЕАС).
У людини ТТА синтезується, в основному, печінкою і хоріоїдним сплетінням головного мозку, а також, меншою мірою, сітківкою ока (Раїна, Сіїп Спет І ар Мед, 2002, 40, 1292-1300).
Транстиретин, синтезований в печінці, секретується в кров, тоді як транстиретин з хоріоїдного сплетіння призначений для спинномозкової рідини (СЕ). Синтез транстиретину в хоріоїдному сплетінні складає близько 2095 від загального локального синтезу білка і аж 2595 від загального білка С5Е (Оіскзоп еї а!., У Віої Снет, 1986, 261, 3475-3478).
Завдяки можливості виконання генетичних та імуногістохімічних діагностичних тестів, були знайдені пацієнти з ТТК амілоїдозом у багатьох народів світу. Нещодавні дослідження показали, що ТТЕК амілоїдоз не є рідкісним ендемічним захворюванням, як вважалося раніше, і може вражати не менше 25 9о дорослого населення (ТапзхзКапеп еї аї, Апп Мед. 2008;:40(3):232- 9).
На біохімічному рівні ТТ було визначено як основний білковий компонент в амілоїдних відкладеннях пацієнтів з ЕАР (Совіа єї а!, Ргос. Май. Асад. осі. ОБА 1978, 75:4499-4503), а пізніше було знайдено, що заміна метіоніну на валін в положенні 30 цього білка є найпоширенішим молекулярним дефектом, що спричиняє дане захворювання (5агаїма вї аї,..
Сіїй. Іпмеві. 1984, 74: 104-119). При ЕАР відбувається повсюдне системне позаклітинне відкладення скупчень ТТН, і амілоїдні волокнини виникають по всій сполучній тканині, особливо у периферичній нервовій системі (5ойза апа Загаїма, Ргод. Мейгобіо!. 2003, 71: 385-400). Після відкладення ТТК відбувається аксонна дегенерація, що бере початок в немієлінізованих і мієлінізованих волокнах малого діаметру і зрештою призводить до втрати нейронів у гангліонарних центрах.
Антисмислові сполуки, націлені на ТТЕ, були описані раніше в И52005/0244869,
МО2010/017509 ії УМО2011/139917, повний зміст кожного з яких включений до даного документу шляхом посилання. Антисмислова олігоазотиста основа, націлена на ТТН, ІБІ5-ТТ Авех, на даний бо час проходить 2/3 фазу клінічних випробувань для дослідження її ефективності при лікуванні суб'єктів, які страждають на родинну амілоїдну поліневропатію. Однак, все ще існує необхідність в забезпеченні пацієнтів додатковими, більш ефективними можливостями лікування.
Деякі кон'юговані антисмислові сполуки, націлені на нуклеїнову кислоту ТТтК
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'юговані антисмислові сполуки націлені на нуклеїнову кислоту ТТК, що має послідовність з номером доступу СЕМВАМКФ ММ 000371.3, яка включена до даного документу як 5ЕО ІЮ МО: 2. У деяких таких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ МО: 2, є щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або на 100 95 комплементарною ЗЕО ІЮО МО: 2.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ будь-якої із «ЕО ІЮ МО: 12-19. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО ІЮ
МО: 2, містить послідовність азотистих основ будь-якої із ФЕО ІЮ МО: 12-19.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮ МО: 12. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 2, містить послідовність азотистих основ ЗЕО ІЮ МО: 12.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮ МО: 13. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 2, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 13.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮО МО: 14. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІО
МО: 2, містить послідовність азотистих основ ЗЕО ІЮ МО: 14.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮО МО: 15. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО ІЮ
МО: 2, містить послідовність азотистих основ ЗЕО ІЮО МО: 15.
Зо У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5Е0
ІО МО: 16, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності 5ХЕО ІЮ МО: 78. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО ІЮ
МО: 16, містить послідовність азотистих основ 5ЕО ІО МО: 78.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БЕО ІЮО МО: 17. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на 5ЕО ІЮ
МО: 2, містить послідовність азотистих основ ЗЕО ІЮ МО: 17.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮО МО: 18. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО ІЮ
МО: 2, містить послідовність азотистих основ ЗЕО ІЮ МО: 18.
У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО
ІО МО: 2, містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ послідовності БХЕО ІЮО МО: 19. У деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на ЗЕО ІЮ
МО: 2, містить послідовність азотистих основ ЗЕО ІЮ МО: 19.
Таблиця З
Антисмислові сполуки, націлені на ТТК 5ЕО ІО МО: 2
Сайт-мішень . . вт ЗЕО І
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з І5ЗІ5 420915 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 420915 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Те5 тСев5 Те5 Те5 бе5 баз Таз Таз Ааз тсСаз даз таз саз даз Ааз Аез Те5 тСев5 тСез тсСе, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 304299 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 304299 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: тСев5 Те5 Те5 бе5 бе Таз таз дах тсСаз дав Таз са Аа Ааз Ааз Те5 тСе5 тСев тсСез Ае, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 420921 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 420921 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Сез Се5 Ае5 Ае5 Тез Ааз тсСаз Таз тсСавз Таз Таз саз са Таз Таз Ае5 тСевз Аез
Те5 бе, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 420922 і кон'югувальної групи. ІЗІ5 420922 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Те5 Се5 Се5 Ае5 Аез5 Тах Ааз тСавз Таз тСаз тах тах сах сах тах Те5 Ае5 тСев
Аез Те, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІЗІЗ 420950 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 420950 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Те5 Те5 Те5 Те5 Ае5 Таз Таз саз таз тсСаз Таз тсСавх Таз ваз тСавзх тСез Те5 бе5
Се Аеє, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕтТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 420955 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 420955 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Се5 Ае5 Ае5 Те5 С1і65 Таз Таз Таз Таз Ааз Таз Таз Сав5 Таз тбаз Те5 тСев Те5 Сев тсСе, де 60 А:аденін,
тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з І5І5 420957 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 420957 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Ае5 Се5 (зе5 Ае5 Ае5 Таз саз Таз таз таз Таз Ааз Таз таз сав5 Те5 тСев5 Те5 тСев
Те, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 420959 і кон'югувальної групи. ІБІЗ 420959 являє собою модифікований олігонуклеотид, що має формулу: Ае5 тСев5 Ае5 Се5 без Ааз Ааз Таз сах таз таз Таз Таз Ааз Таз Те5 Се5 Те5 тСев
Те, де
А:аденін, тО-5'-метилцитозин сС-гуанін,
Тетимін, е-2-О-метоксіетил-модифікований нуклеозид, а-2г'-дезоксинуклеозид і 5ЕТІофосфатний міжнуклеозидний зв'язок.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука, що має наступну хімічну структуру, містить
Зо або складається з ІЗІЗ 420915 із 5-Х, де Х являє собою кон'югувальну групу, описану в даному документі:
о
Ми а мн щу о шо ня р е щи Кене ; ше і Ше / щи но в Мне , ще ; , -Вах м г шу да у о о но о у й, мне | й й кю че Мо бок р "и о нини ОБ: нище ях шу А 28-й - ; 8-й ж я з ще ЩШ зе і 1 а в-во же ' з о гу ; Я т ви ; й й А вано в о Ж з ь ших! 5 і " ню
Овчіко зві Звскно й ! а
Є ' ; у. х ке нно ща і 7 Е а" - Мне
Е! т х 7 у -- о а-йа й ши и м ї і "в-во ав 9 мо
Ми . й, | Х - ша а о Мн» ба й ! Овна ту ши зе в в ! о М чо во у вчуо
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з ІБІ5 682877, ЩО має наступну хімічну структуру:
о. її нм» нон ; 2-й-о мн муЗ и ю (Се й о ре» й З ; Ге ке о а. яйю ТОВ но в о й А : ал ба Бор «т ово ун | о Мне вий йо у ат і Мем а а і З В го ре і оч ї пе Мн. і бю ОК , , (2 м тв зе я ШШ о ше : ' ть еф ви 25 в хо дер ї Те ! й о | ба бо ОК нн в : ! ме | й го що. ї ; | :
В-во Я у
У йо ! ей
В яжь | ще
Зно М. ї ї 2. Я ща АХ од й А мно е. з | Ям в. Я ше й у чу а й
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з І5І5 682884, що має наступну хімічну структуру:
се м ув и ши сови їй Ї ї у Явно де а ї н на А г ! ! фе ко о у що а й ГаЗ і а, і з. но і : с : бою за у КЯ і Мне і 7 ї ще й уд й о о і й
ЧІ А й Мне о Ми /й а ії й нд о
Бен е7 у а ч і у, вд зве і й, е | а | боніе ре а--й МН Г дя | бі а і ; МН; е | Фр-лно в-йо но. мі на еЇ7 | цгй зн, а ї КН
В ' а : в хо КА
Ме і й а. ет ФІ Мне й Я ть зо Ко у яУ
З ії -вя
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить або складається з 5ЕО ІО МО: 12, 5- саїІМАс і хімічних модифікацій, і представлена наступною хімічною структурою:
в ги "ох че на о п-ва й Мощі крат ши фа: ет но ч І їчк) Ї ше що я зе Кт ща он У о в КИ Її ай я но «А еВ Вернех йо 9. ва С ве тт ще орав ярон ке пі ов в І З, де в одну чех ши ше в ша з ня з й у рег Ок 3 | я-в-о Й реа ре ! в |. я
За | й 1 7 Ге, мм, щу ше ша т-й-а ле нн х ай" й а м -6 вн сю) 1 ГКІ м іс:
Її т о і бю о 8-фзй м ув а ; у а ее а й їх й я ВЗ не З | дев ве бю 0 ен ! 8. чна ; й о | | й ЕТ і» об ж ! па «НН тей Он і
З Іва ! що 8. вою І йо: сию ! 8. «Я у тю ньо ру мно ? ве :
Явно т ! т є їн в | аа З вно й
У а 8 би с 5 ' Ку ї ние | х де будь-який ВЕ! являє собою -ОСНгСН2гОСН:» (МОЕ), а КВ? являє собою Н; або ЕК" і К2 разом утворюють місток, причому К' являє собою -0О-, а К? являє собою -СНе-, -СН(СНз)- або -
СНеСНе-, і А Її 22 з'єднані напряму таким чином, що місток, який утворюється, вибраний з: -О-
СнНе-, -0-СН(СнНаз)- і-0-СН.СНе-; і для кожної пари з КЗ ї КЕ" у одного кільця, для кожного кільця незалежно: будь-який. КЗ вибраний з Н ії -«ОСН».СНгОСсСН», а КК" являє собою Н; або З ії КК" разом утворюють місток, причому КЗ являє собою -О-, а КЕ" являє собою -СНе-, -СН(СНз)- або -«СНСН»-, і З ії КЕ" з'єднані напряму таким чином, що місток, який утворюється, вибраний з: -0О-СНе-, -0О-СН(СНЗз)- і -0-
Сснсне-; і З» вибраний з Н і -СНз; а 7 вибраний з 5- і О-.
У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, описаний в публікації М/О 2011/139917 або 05 8101743, повний зміст яких включений до даного документу шляхом посилання, і кон'югувальну групу. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ будь-якої із 560 1Ю МО 8-160, 170-177, описаних у УМО 2011/139917, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ будь-якої із ФЕО ІЮ МО 12-89, описаних в
О5 8 101 743, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сполука містить антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ, комплементарну переважному цільовому сегменту будь-якої із 5ЕО ІЮ МО 90-133, описаних в 05 8101743, і кон'югувальну групу, описану в даному документі. Послідовності азотистих основ всіх вищезгаданих довідкових ЗЕО ІЮ МО включені до даного документу шляхом посилання.
Терапевтичні показання для ТТК
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені способи застосування кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту ТТК, для модуляції експресії ТТК у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації винаходу експресія ТТК знижується.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені способи застосування кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту ТТК, у фармацевтичній композиції для лікування суб'єкта. У деяких варіантах реалізації винаходу суб'єкт страждає на захворювання, розлад або патологічний стан, пов'язаний з транстиретином, або його симптом. У деяких варіантах реалізації винаходу захворювання, розлад або патологічний стан, пов'язані з транстиретином, являють собою транстиретиновий амілоїдоз. "Амілоїдоз, пов'язаний з транстиретином" або "транстиретиновий амілоїдоз", або "транстиретинове амілоїдне захворювання", при використанні в даному документі, є будь-якою патологією або захворюванням, пов'язаним з дисфункцією або дисрегуляцією транстиретину, яка приводить до утворення амілоїдних фібрил, що містять транстиретин. Транстиретиновий амілоїдоз включає, але без обмеження, спадковий ТТК амілоїдоз, лептоменінгеальний амілоїдоз, родинну амілоїдну поліневропатію (ЕАР), родинну амілоїдну кардіоміопатію, родинний окулолептоменінгеальний амілоїдоз, старечий амілоїдоз серця або старечий системний амілоїдоз.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу наведені способи застосування кон'югованої антисмислової сполуки, націленої на нуклеїнову кислоту ТТЕ, для виробництва лікарського засобу.
У деяких варіантах реалізації даного винаходу запропонована кон'югована антисмислова сполука, націлена на нуклеїнову кислоту ТТК, або її фармацевтично прийнятна сіль для
Зо застосування в терапії.
У деяких варіантах реалізації винаходу запропонована кон'югована антисмислова сполука, націлена на нуклеїнову кислоту ТТК, для застосування при лікуванні захворювання, розладу, патологічного стану або його симптому, пов'язаного з транстиретином. У деяких варіантах реалізації винаходу захворювання, розлад або патологічний стан, пов'язаний з транстиретином, є транстиретиновим амілоїдозом.
Потрібно розуміти, що будь-яку з описаних в даному документі сполук можна застосовувати у вищезазначених способах і видах застосування. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу кон'югована антисмислова сполука, націлена на нуклеїнову кислоту ТІК, у вищезазначених способах і видах застосування може включати, але без обмеження, кон'юговану антисмислову сполуку, націлену на 5БО ІЮО МО: 2, яка містить щонайменше 8 суміжних азотистих основ будь-якої із ЗЕО ІЮО МО: 12-19; кон'юговану антисмислову сполуку, націлену на ЗЕО ІЮ МО: 2, яка містить послідовність азотистих основ будь-якої із БЗЕО ІЮО МО: 12-19; сполуку, що містить або складається з І5БІ5 420915, ІБІ5 304299, ІБІ5 420921, ІБІ5 420922, ІБІ5 420950, ІБІ5 420955, ІБІ5 420957 або І5І5 420959 і кон'югувальної групи; сполуку, що містить антисмисловий олігонуклеотид, описаний у МО 2011/139917 або 05 8101743, повний зміст кожної з яких включений до даного документу шляхом посилання, і кон'югувальну групу; сполуку, що містить антисмисловий олігонуклеотид, який має послідовність азотистих основ будь-якої із ЗЕО ІЮ МО 8-160, 170-177, описаних у УУО 2011/139917, і кон'югувальну групу, описану в даному документі; антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ будь-якої із ЗЕО ІЮ МО 12-89, описаних в 5 8101743, і кон'югувальну групу, описану в даному документі; або сполуку, що містить антисмисловий олігонуклеотид, що має послідовність азотистих основ, комплементарну переважному цільовому сегменту будь-якої із
ЗЕО І МО 90-133, описаних в 5 8101743, і кон'югувальну групу, описану в даному документі.
Послідовності азотистих основ всіх вищезгаданих довідкових 5ЕО ІЮО МО включені до даного документу шляхом посилання.
Е Деякі фармацевтичні композиції
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені фармацевтичні композиції, що містять одну або декілька антисмислових сполук. У деяких варіантах реалізації винаходу така фармацевтична композиція містить відповідний фармацевтично прийнятний розріджувач або бо носій. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція містить стерильний сольовий розчин і одну або декілька антисмислових сполук. У деяких варіантах реалізації винаходу така фармацевтична композиція складається із стерильного сольового розчину і однієї або декількох антисмислових сполук. У деяких варіантах реалізації винаходу стерильний сольовий розчин є сольовим розчином фармацевтичної категорії. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція містить одну або декілька антисмислових сполук і стерильну воду. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція складається з однієї або декількох антисмислових сполук і стерильної води. У деяких варіантах реалізації винаходу стерильний сольовий розчин є водою фармацевтичної категорії. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція містить одну або декілька антисмислових сполук і фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5). У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція складається з однієї або декількох антисмислових сполук і фосфатно-сольового буферного розчину (РВ5). У деяких варіантах реалізації винаходу стерильний сольовий розчин являє собою РВ5 фармацевтичної категорії.
У деяких варіантах реалізації винаходу антисмислові сполуки можуть бути змішані з фармацевтично прийнятними активними та/або інертними речовинами для одержання фармацевтичних композицій або складів. Композиції і способи складання фармацевтичних композицій залежать від численних критеріїв, включаючи, але без обмеження, спосіб введення, тяжкість захворювання або дозу, що підлягає введенню.
Фармацевтичні композиції що містять антисмислові сполуки, охоплюють будь-які фармацевтично прийнятні солі, естери або солі таких естерів. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції, що містять антисмислові сполуки, містять один або декілька олігонуклеотидів, які при введенні ссавцю, включаючи людину, можуть забезпечувати (прямо або непрямо) її біологічно активний метаболіт або залишок. Відповідно, наприклад, даний опис стосується також фармацевтично прийнятних солей антисмислових сполук, проліків, фармацевтично прийнятних солей таких проліків та до інших біоеквівалентів.
Відповідні фармацевтично прийнятні солі включають, без обмеження, солі натрію і калію.
Проліки можуть включати введення додаткових нуклеозидів на одному або обох кінцях олігонуклеотиду, які розщеплюються в організмі під дією ендогенних нуклеаз з утворенням активного антисмислового олігонуклеотиду.
Зо У численних способах у терапевтичних засобах з нуклеїновими кислотами були застосовані ліпідні фрагменти. У деяких із таких способів нуклеїнову кислоту вводять до попередньо сформованих ліпосом або ліпоплексів, одержаних із сумішей катіонних ліпідів і нейтральних ліпідів. У деяких способах одержують ДНК комплекси з моно- або полікатіонними ліпідами без участі нейтрального ліпіду. У деяких варіантах реалізації винаходу ліпідний фрагмент вибраний для покращення розподілу фармацевтичного агента у певній клітині або тканині. У деяких варіантах реалізації винаходу ліпідний фрагмент вибраний для покращення розподілу фармацевтичного агента у жировій тканині. У деяких варіантах реалізації винаходу ліпідний фрагмент вибраний для покращення розподілу фармацевтичного агента у м'язовій тканині.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції, представлені в даному документі, містять один або декілька модифікованих олігонуклеотидів і одну або декілька допоміжних речовин. У деяких таких варіантах реалізації винаходу допоміжні речовини вибрані з води, сольових розчинів, спирту, поліетиленгліколей, желатину, лактози, амілази, стеарату магнію, тальку, кремнієвої кислоти, в'язкого парафіну, гідроксиметилцелюлози (« полівінілпіролідону.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція, представлена в даному документі, містить систему доставки. Приклади систем доставки включають, без обмеження, ліпосоми і емульсії. Деякі системи доставки підходять для одержання деяких фармацевтичних композицій, включаючи композиції, що містять гідрофобні сполуки. У деяких варіантах реалізації винаходу застосовують деякі органічні розчинники, такі як диметилсульфоксид.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція, представлена в даному документі, містить одну або декілька тканиноспецифічних молекул доставки, призначених для доставки одного або декількох фармацевтичних агентів даного опису в певну тканину або типи клітин. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції включають ліпосоми, вкриті тканиноспецифічним антитілом.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція, представлена в даному документі, містить систему сумісного розчинника. Деякі такі системи сумісних розчинників містять, наприклад, бензиловий спирт, неполярну поверхнево-активну речовину, змішуваний з водою органічний полімер і водну фазу. У деяких варіантах реалізації винаходу такі системи сумісних розчинників застосовують для гідрофобних сполук. Необмежуючим прикладом такої бо системи сумісних розчинників є система сумісних розчинників МРО, що є розчином абсолютного етанолу, який містить З мас./об. 96 бензилового спирту, 8 мас./об. 95 неполярної поверхнево- активної речовини Роіузограїє 807Мм і 65 мас./об. 95 поліетиленгліколю 300. Пропорції таких систем сумісних розчинників можуть істотно варіювати без значної зміни їх характеристик розчинності і токсичності. Крім того, може варіювати суть компонентів сумісних розчинників: наприклад, замість Роїузограїе 80"М можуть бути застосовані інші поверхнево-активні речовини; може варіювати розмір фракції поліетиленгліколю; замість поліетиленгліколю можуть бути застосовані інші біосумісні полімери, наприклад, полівінілпіролідон; і замість декстрози можуть бути застосовані інші цукри або полісахариди.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичну композицію, представлену в даному документі, одержують для перорального введення. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції одержують для букального введення.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичну композицію одержують для введення ін'єкцією (наприклад, внутрішньовенною, підшкірною, внутрішньом'язовою, тощо). У деяких таких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція містить носій і складена у водному розчині, такому як вода або фізіологічно сумісні буфери, такі як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний сольовий буфер. У деяких варіантах реалізації винаходу включені інші інгредієнти (наприклад, інгредієнти, що покращують розчинність або слугують консервантами). У деяких варіантах реалізації винаходу суспензії для ін'єкцій одержують за допомогою відповідних рідких носіїв, суспендувальних агентів, тощо. Деякі фармацевтичні композиції для ін'єкцій представлені у формі разової дози, наприклад, в ампулах або багатодозових контейнерах. Деякі фармацевтичні композиції для ін'єкцій є суспензіями, розчинами або емульсіями в масляних або водних рідких носіях, і вони можуть містити допоміжні агенти, такі як суспендувальні, стабілізувальні та/або диспергувальні агенти. Деякі розчинники, придатні для застосування у фармацевтичних композиціях для ін'єкцій, включають, без обмеження, ліпофільні розчинники і жирні масла, такі як кунжутне масло, синтетичні естери жирних кислот, такі як етилолеат або тригліцериди, і ліпосоми. Водні суспензії для ін'єкцій можуть містити речовини, які збільшують в'язкість суспензії, такі як карбоксиметилцелюлоза натрію, сорбіт або декстран. Такі суспензії можуть також необов'язково містити придатні стабілізатори або агенти, що збільшують розчинність фармацевтичних агентів із забезпеченням
Зо можливості одержання висококонцентрованих розчинів.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичну композицію одержують для трансмукозального введення. У деяких таких варіантах реалізації винаходу в складі застосовують пенетранти, відповідні до бар'єру, крізь який необхідно проникнути. Такі пенетранти є загальновідомими в даній галузі техніки.
У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція, представлена в даному документі, містить олігонуклеотид у терапевтично ефективній кількості. У деяких варіантах реалізації винаходу терапевтично ефективна кількість є достатньою для запобігання, пом'якшення або полегшення симптомів захворювання або для збільшення тривалості життя суб'єкта, що підлягає лікуванню. Визначення терапевтично ефективної кількості знаходиться в межах можливостей фахівців у даній галузі техніки.
У деяких варіантах реалізації винаходу один або декілька модифікованих олігонуклеотидів, представлених в даному документі, складають у вигляді проліків. У деяких варіантах реалізації винаходу при введенні іп мімо проліки хімічно перетворюються на біологічно, фармацевтично або терапевтично більш активну форму олігонуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу проліки є придатними завдяки тому, що їх простіше вводити, ніж відповідну активну форму. Наприклад, у деяких випадках проліки можуть мати більшу біодоступність (наприклад, при пероральному введенні), ніж відповідна активна форма. В деяких випадках проліки можуть мати покращену розчинність, порівняно з відповідною активною формою. У деяких варіантах реалізації винаходу проліки є менш розчинними у воді, ніж відповідна активна форма. В деяких випадках такі проліки чудово переносяться через клітинні мембрани, причому розчинність у воді погіршує їх рухливість. У деяких варіантах реалізації винаходу проліки являють собою естер. У деяких таких варіантах реалізації винаходу естер при введенні метаболічно гідролізується до карбоксильної кислоти. В деяких випадках сполука, що містить карбоксильну кислоту, є відповідною активною формою. У деяких варіантах реалізації винаходу проліки містять короткий пептид (поліамінокислоту), з'єднаний з кислотною групою. У деяких таких варіантах реалізації винаходу пептид розщеплюється при введенні з утворенням відповідної активної форми.
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені композиції і способи зниження кількості або активності цільової нуклеїнової кислоти в клітині. У деяких варіантах реалізації винаходу клітина знаходиться в організмі тварини. У деяких варіантах реалізації винаходу тварина є бо ссавцем. У деяких варіантах реалізації винаходу тварина є гризуном. У деяких варіантах реалізації винаходу тварина є приматом. У деяких варіантах реалізації винаходу тварина є приматом, що не є людиною. У деяких варіантах реалізації винаходу тварина є людиною.
У деяких варіантах реалізації даного опису наведені способи введення тварині фармацевтичної композиції, що містить олігонуклеотид відповідно до даного опису. Придатні способи введення включають, без обмеження, пероральний, ректальний, трансмукозальний, інтестинальний, ентеральний, місцевий, у вигляді супозиторіїв, інгаляційний, інтратекальний, інтрацеребровентрикулярний, внутрішньоочеревинний, інтраназальний, інтраокулярний, внутрішньопухлинний і парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, інтрамедулярний і підшкірний). У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтичні засоби вводять інтратекально для забезпечення місцевої а не системної дії. Наприклад, фармацевтичні композиції можуть бути введені ін'єкцією безпосередньо в ділянку бажаного ефекту (наприклад, у печінку).
Необмежуючий опис і включення шляхом посилання
Незважаючи на те, що деякі сполуки, композиції і способи, описані в даному документі, були детально описані відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, наступні приклади служать тільки для ілюстрації сполук, описаних у даному документі, і їх не потрібно інтерпретувати як обмеження. Кожне з посилань, номери доступу сепВанпк і подібні посилання, згадувані в даній заявці, включені до даного документу шляхом посилання в повному об'ємі.
Деякі сполуки, композиції і способи в даному документі описані як такі, що "містять точно" або "містять тільки" певну кількість конкретних елементів або характеристик. Такий опис використаний для позначення того, що, хоча сполука, композиція або спосіб може включати інші додаткові елементи, кількість конкретного елементу або характеристики є конкретним числом.
Наприклад, "кон'югат, що містить рівно один саіМАс" являє собою кон'югат, що містить один і рівно один ЗаїЇМАс, хоча він може містити інші елементи, крім вказаного одного заїЇІМАс.
Незважаючи на те, що перелік послідовностей, який супроводжує даний файл, вказує кожну послідовність як ""НК" або як "ДНК", по необхідності, насправді ці послідовності можуть бути модифіковані будь-якою комбінацією хімічних модифікацій. Фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що таке позначення як "РНК" або "ДНК" для опису модифікованих олігонуклеотидів, у деяких випадках є довільним. Наприклад, олігонуклеотид, що містить нуклеозид, який містить
Зо цукровий фрагмент 2-ОН і тимінову основу, може бути описаний як ДНК, що має модифікований цукор (2-ОН замість природного 2"-Н у ДНК) або як РНК, що має модифіковану основу (тимін (метильований урацил) замість природного урацилу в РНК).
Відповідно, послідовності нуклеїнових кислот, представлені в даному документі, включаючи, але без обмеження, послідовності в переліку послідовностей, призначені для охоплення нуклеїнових кислот, що містять будь-яку комбінацію природних або модифікованих РНК та/або
ДНК, зокрема, але без обмеження, такі нуклеїнові кислоти, що містять модифіковані азотисті основи. Як додатковий приклад і без обмеження, олігонуклеотид, що містить послідовність азотистих основ "АТСОАТСО", охоплює будь-які олігонуклеотиди, що мають таку послідовність азотистих основ, модифікованих або немодифікованих, включаючи, але без обмеження, такі сполуки, які містять РНК основи, наприклад, ті, що мають послідовність "ЛХОСОСАИСС, і ті, що мають деякі ДНК основи і деякі РНК основи, такі як "ЯДАОСОСАТСИ", а також олігонуклеотиди, що мають інші модифіковані основи, такі як "АТ"ебцЗАОСсИ", де пес позначає цитозинову основу, яка містить метильну групу в положенні 5.
ПРИКЛАДИ
Наступні приклади ілюструють деякі варіанти реалізації даного опису і не є обмежуючими.
Більше того, якщо наведені конкретні варіанти реалізації, автори винаходу мають на увазі загальне застосування вказаних конкретних варіантів реалізації. Наприклад, опис олігонуклеотиду, що містить конкретний мотив, дає обгрунтовану базу для додаткових олігонуклеотидів, що містять такий же або подібний мотив. І, наприклад, якщо конкретна високоафінна модифікація виникає в певному положенні, то в цьому ж положенні вважаються придатними інші високоафінні модифікації, якщо не вказано інше.
Приклад 1. Загальний спосіб одержання фосфорамідитів, Сполук 1, Таі2
? о
Ко; злу о. Ше наш їв чн ож іх Я: а оМТО А /
Мо я .МТО їх / щ- Н се я щу - биття ве З БІ 0 0 00 - 0 ! ооо АВ. МО. ся Ме. Вот
МО лто Моро, сто МОР» -то Мо; 1 1а 2
Вх являє собою гетероциклічну основу
Сполуки 1, Та і 2 одержали за методиками, загальновідомими у даній галузі техніки, що описані в даному описі (див. 5еїй єї аї., Віоогду. Мед. Спет., 2011, 21(4), 1122-1125, 9. Оп.
СПет., 2010, 75(5), 1569-1581, Мисієїс Асіаз Зутровзійт 5егівев, 2008, 52(1), 553-554); див. також опубліковані Міжнародні заявки РСТ (МО 2011/115818, УМО 2010/077578, УММО2010/036698,
УМО2009/143369, УМО 2009/006478 ії ММО 2007/090071) і патент США 7569686).
Приклад 2. Одержання Сполуки 7 дою де
АСООАс кн о ри о 1 що" ль с о тмеот;Бобс ЛО з но о тув
АеО. х Од Прешене цЦ--2ШЩИ 6 (Я Р '«'т- -Т»
ОЇ
АСНМ й 2 - тМвОг дхЕ
З (9355) до (66 95) ооо лосюло о шо я НуРа к-3 о ОН ст (Фо) д ж Е | М, х й вав
АсО к- ан сив МИ -в о І
ЩІ : ден во (95965) дон 7 о
Сполука З (2-ацетамідо-1,3,4,6-тетра-О-ацетил-2-дезокси-В-ЮО-галактопіраноза або галактозаміну пентаацетат) є в продажу. Сполуку 5 одержали за опублікованими методиками (Уебег еї аї!., ). Мед. Снет., 1991, 34, 2692).
Приклад 3. Одержання Сполуки 11
ЕЕ. т но пе я 0. вич рес; їн Її кі н шен З НО ЕН пр нт з Не їз ЩА. це с - - | ; «А Своя КОН Моя що МА: вкпятння їз засо Овод но 1.4-діоксан, о хоподильником,, 8 Ні мс. й Ко КЕМН.т-ра, а) й 1
Сполуки 8 і 9 є в продажу.
Приклад 4. Одержання Сполуки 18 во чт ЕВ. т пов шензилелорвормізт, ши ле: о сі Ноя
О вд Й зн. дюожсан, МаесСо» єю о ши де ОН не у жо г аньа ш Га діоксан т - ча: б -е фу
Од п х : - Еш о - Не ж ди А Ще а
ОВ й щі - н н 13 ; і но - Пед мана ке п Но - у г ди З пит ІН « т і в ни Ше її іп нині | ше ПЕ г Шия - іден суч ото тла ОСИ О ; Н ТО НЕТ, ТЕА, ДИ ФА ні й т
Ат зе ная - н ме ПИ ашоАє
НУ я ; - на А Мая шт мн це н гл ІВ. АсНнИ Т Й ром М м а щи М 5 діт й
СеяАкан Шо а ня а НЕТИ, СЕ, НОВІ ца ж й як н я яння во -- 13 а МА с 12 Ба ди - н Ся
АСАС ву Не я Н н
Ас хту» яти шиття т «слткин 0 ВЕН о ш вся й - й я ян н М ті - о нх А
Ас ШИ тт зт - - а - тент й ЩІ й ЧИ Ос сне ї нУ пе
Ас яд Й М ня з чи її ди
В 2-3 кт ШЕ м и й
АНІ В
Сполуку 11 одержали за способами, описаними у Прикладі 3. Сполука 14 є в продажу.
Сполуку 17 одержали за таким же способом, як описаний в публікації Репзеп еї аї.,.). Меа.
Спнет., 2004, 47, 5798-5808.
Приклад 5. Одержання Сполуки 23 - ї соч он 21 чо ших й о Я ТВОЯ, ДМ, за гоєх зіллядя ік т-кзовдк ми ТОМИ НЕТТО, ЕХ і
ЕОВОИ А, Меси, кін. 1-а ї 2 ТЕА ЗНЕ ТЕВ ТФ і, де са ЗТВОМЯ ОС ов та - я рУто З ' а но опо 14 ОНта, ру, х Тр щі в А Ї кімнот пат й 5 ОН м ас ШПОЛІ оо о ол рр у 2. ОН, дівнсяв СА Й я іа, : 73 : 22 бн
Он
Сполуки 19 і 21 є в продажу.
Приклад 6. Одержання Сполуки 24 вкООде І : й З, я Н я- -- А М М. шо
Ас - тр зх сиШНЯї г т наРЄ, МеОНІННЮ
ВЕС НЕ Н | о -ШЙЙШИькн 6щ(7:37 аа і Н Й х нету. гНЕв, певА сла дсо Ул ит 2-Д ого ї - ОоМт деНМ о К ал но ту оо н НУ но он -К дн МИТ сн й
Аве І - н В кто М М. шо
Асо - о пиття ів доОбдо 0 пи у о Вомт
Тк я | я т доо Утлоссг Ї, иа чо Зник»
АСНІ і Д ай во
АсООде ї щ- б, - При й ШИ й до о ще й 58 вен
Сполуки 18 і 23 одержали таким чином, як описано в способах у Прикладах 4 і 5.
Приклад 7. Одержання Сполуки 25
ВН й В В І ав вче щі титр птн т депювсо о 0 ЛІНК 9 Шк орит востка бнвіІ
Її як н н 0 я 0 дсп хлаю п а т па соб -М Арі. ї «7 З Бурштиновий анпдрмд СТЕ, ДХЕ цик і т - ву 2022 2 02 ЛИ ОО От вен Ні п го щ 8 ДЕфА НЯТО ЕЕКІТУ, ВАВ ксвочи я : с со Н Я шк 7 ден й т
Аа
СЯ - Н Н во Ха тити пиття ев дссюде 0 ВсНМ 5 й ормт - й нн ор й ї Шк Ї т : ІВ) їн асо пні тт мити пр Ав "М МН ден й р ай В с і --
А Ь
АсОдАс нон -хе о шин ан
Асо т С дснМ Й щі
Сполуку 24 одержали за способами, представленими у Прикладі 6.
Приклад 8. Одержання Сполуки 26
АсООА тд н н
Ар кл яр питний т допюдоо Тен 9 ї а А ВОМт о, ! Н ме ШИ ЦО. део те А ння г. пра ча пт -- вен Нефоєсфворилування
АСНІЯ ї Іа: м й нс
І у Я
І бо А СК ж дсо ст май Й тек, Ї та
ЕН
НА лота З. Н Н
Аг Ко ет тр питний т де І, й пав дгроде ЛеНК н д рі ов М о : і щі її мо-Ктаю -е пра и КШ Ав шо,
АСНМ ій ї о й і с Ь т МО че Р
Ас Оде но пи
Ов Мо део-кото т
АСНУ | 5
Сполуку 24 одержали за способами, представленими у Прикладі 6.
Приклад 9. Загальне одержання кон'югованих АБО, що містять СаіІМАсз-1 на 3'-кінці,
Сполуки 29
АсСООАс ц Н - о М. и Мо
АсО ван С (6)
АССОАС АСНМ у ї і о о ДОМ е -3 м ох ; о де-то. кит зр Й м МН
АСНМ о о о х (в)
НМ 1, рСА, ДХМ
АсООАс Ми о 2. ПС, ММІ, АСМ -0 От тиИ фосфорамідитний автоматичний синтезатор
АсОо ра будівельний блок ї ДНЕІРНК
ІФ) 25 3. Кепування
АсНМ 4. ЕвиООН о. ВХ омто у
АСОСАсС Кк со тут ово в) ї
АСОСАС СОН и. . і, оо й - 7 о о М М В мосту ою сину ан
АСНМ о ро ра й я 1. ОСА, ДХМ о
НМ 2. ОСІ, ММІ, АСМ
АСООДс Н О 0 вдівсльмй блог - будівельний блок 15 - Отит М 3. Кепування ДНЮРНК
Асо ща о 27 4. іВІООН
АснМ мот ух с ул ОМе о-ро ом пу"
АсООАс о Н Н ої ро сто. ор в) о-р-о-
Аснм о С о
АсСООАс Н ц 5 обі -3 А ї о (Ф) М М дво ст кт 00 --хк шнне МН т л- м й
АСНМ о о о; ФІ (9)
НМ 1, ОСА, ДХМ
АСООАс НУ О | 2.осі, ММ АСМ 202- От фосфорамідитні автоматичний синтезатор
АсОо а будівепьні блоки ДНЕРНК
Ів) 28 3. Кепування
АснМ 4, Підрид ксантану або Вон 5. ЕВМ/СНЗСМ (1:1) 6. Водний МН» ( розщелленя )
он
Х-п-О-
О-о пу
Ву - петерюоцклячнаа сохрка ТЕ г
Ж вна я Ь ев й 8 0-9. ,х і о Н н с те - Її М. А но яння тн най Он -о- ноон | | 1 Ов. со о нн о 191 ден о ни щі й н нон «с -к
Е т Дб нн - но що ; - вия
АсНМ що
Де захищений СаІМАсз-1 має структуру:
МН»
З бо ді ую нООн с
О о М М. со й но виття ів ор. (в) нооно 0 лен о о хо М ий й То
Ат в) МОХ но т р Я ВМ
АснМ (Ф) Ге) (в) с он ноОн ноя ж и ()
АснНМ
Кластерна частина СаіМАсз кон'югувальної групи (заіїМАсз-ї (СеаіМАсз-14) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. При цьому СаІМАсз-1 має формулу:
нОоОон
О о М М. оо но т ил і т
Нооно 0/0 ЛеНМ о о р оо М ц о ї но тре мані ен ви,
АСНМ (6) ГФ) ІФ) ОН ноон С
Ге) Ми о но о ів)
АснМ
Тверду основу, що зв'язує захищений СтіаіМАсз-ї, Сполуку 25, одержали за способами, представленими у Прикладі 7. Олігомерну Сполуку 29, що містить СаіМАсз-1 на 3'-кінці, одержали за стандартними методиками у автоматичному синтезаторі ДНК/РНК (див. ЮБироцу єї аІ., Апдем/. Спет. Іпі. ред., 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамідитні будівельні блоки, Сполуки 1 і 1а, одержали за способами, представленими у Прикладі 1. Зображені фосфорамідити є ілюстративними і не призначені для обмеження, оскільки можуть бути застосовані інші фосфорамідитні будівельні блоки для одержання олігомерних сполук, що мають бажану послідовність і склад. Порядок і кількість фосфорамідитів, що додаються до твердої основи, можуть бути підібрані для одержання розірваних олігомерних сполук, описаних у даному документі. Такі розірвані олігомерні сполуки можуть мати бажаний склад і послідовність основ, продиктовану будь-якою заданою мішенню.
Приклад 10. Загальне одержання кон'югованих АБО, що містять СаіМАсз-1 на 5'-кінці,
Сполуки 34 агат ії. Келування (л230. МК,
Я Кх пудемдМноО о 1 пса, дХМ СНО. 2. БАБУ або ЕВ ші а ння | З. ВСАА ДИМ
ФО кОм з ось ас о пеЛоЕВЕ - -
Фкокфоретіднтні Ї ех з г ММІ АСК їй і фор; г КЗ пз с: Ж й ЩО
Зо будівельні блоки Сук: Воду фосфорпмідит
МАТИ ЖАХ о ,8х що доза вто у 1. Келування ТАС МУ, піриведино З А г. вин хо а їж ск 3. ОСА ДХМ --то-в я тк веще З
Фесфорямідит ЛЕ ГО
Ваетоувткную тННТазягОЮ ї
Х - (3 вдо 5 БЕ ВНК ЩО Й
ВХ - гпетероцикпічна оєнова З для а-В,, ут и хх їх
Ж 13 (о Я Н ї ; п МА М Мо - -я АСНМ С нт деО Одес 1 НЕ (Щі г ї н ли і, З «А ж-О о М М | ДА,
Ак щ м чит проти и ші: з М ден о В -г ( ге ци МС. -- 27 боту
ДЕООАє нотою ! КЕ - г дет М Ка щі дсо я м пи то-в-й ден о
СНО
1. Кепування ТАС. ХА, піреюбднян З У с де ат ня пхтт ян Ср хін О-водини
З ВБМСНІМіКіовлово ї. й - Ех . т Ек з. МН, КІМН. 1-08 ( розщеплення | 72 нан нні ї о, док о поитттЙ сні - нано У ов пече М Н 0 ро ин і і і ШИ МИ аку» нот тити ото М МУ асен г; й 7 іже: ї і шк вича
Її Ов яю МК Ох нон но Ае їй М-
Ян п нн ШИ АК но-ия Є ев сві о о
ЩО) он
ОпуїїпКегтм 30 є в продажу. Олігомерну сполуку 34, що містить кластер СаІМАсз-1 на 5'-кінці, одержали за стандартними способами в автоматичному синтезаторі ДНК/РНК (див. Юироцу єї аІ,, Апдем/. Спет. Іпі. Еа., 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамідитні будівельні блоки, Сполуки 1 і
Та, одержали за способами, представленими у Прикладі 1. Зображені фосфорамідити є ілюстративними і не призначені для обмеження, оскільки можуть бути застосовані інші фосфорамідитні будівельні блоки для одержання олігомерної сполуки, що має бажану послідовність і склад. Порядок і кількість фосфорамідитів, що додаються до твердої основи, можуть бути підібрані для одержання розірваних олігомерних сполук, описаних у даному документі. Такі розірвані олігомерні сполуки можуть мати бажаний склад і послідовність основ, продиктовану будь-якою заданою мішенню.
Приклад 11. Одержання Сполуки 39 ій,
АССНАє 4 ; . х й де шк че ! І - , йо ту 7 ТМБОТЕ, дхЕ део-Жсть пиття
Ше 2. НУРЯ. МеОН ден 35 4 лику ит ен у со ли М 4 но РаАЄ Мао
НЕТ, ДМФА, ВВР ва й вай
Спапука 13 ен ша шк 2. НЕТ. СЧЕА, ДМА доп Оле н п! 9-4 Н Сполука 23 пече он М ! - зи Ме: - 3 5 дро Хр - т Троя ой - уко 4. -
НА о а м її
Сьдр їх кора и їх и я. МН г
Асо тн
АСНЮ со САс дез. доМмт і А І Пофосфорилування
Шо, а ЕНЕТУ де н М З Й Шин ма нт ці де З о я о . па я ан - зош о кін іх
МНАс Ода о - Оле . у, до | т г - в "а їв доп Ки пит Е денм Ї
Аг СПАС х Щ Й дсо о ц і лом
АН тр -- "не
БВ) ПО - і Е ЕВ; г АХ й є Ей І Мих |: дю МТВ пр А ь
ЧНАс Об ава о Мито МОР: до ие жи лю МВ 38 дес ж -ч тт ах ден
Сполуки 4, 13 ії 23 одержали за способами, описаними у Прикладах 2, 4 і 5. Сполуку 35 одержали за такими ж способами, як описані в публікації Воиснаца еї аї., Єиг. У. Огу. Спет., 2011, 12, 2346-2353.
Приклад 12. Одержання Сполуки 40
АкО САС
Ас. ні ШК н | МОМ днМо 00 бр нш У А іде щ | Не Не
Ас де щ я 5 о у; Де ва до ла сл я її і І
Мне бо 5 1. Бурштиновий ангідрид, ОМАР. ДХЕ
А Оде й
Ар С ря -- 9 - - Я - хі и и или. ши ши
Щ пф щй чТя 2. ДКФА, НЕТИ, ЕІМОРЬ, РО-55
Адо пу за
АЄНМ в ОАс дей у-о с д дом
ОА й І Зах дя о
А : нина и Ен ша М - свя пра що шко КН НВ ск кот остяе ту с
МНАс ее; ш Щі
Ас ' й с ап сої - в й- 40 дрс-- кон в пол Й
АСНІ
Сполуку 38 одержали за способами, представленими у Прикладі 11.
Приклад 13. Одержання Сполуки 44
Асо Ас НВТу, ДМФА, ЕІМОРА -- о її ні -т- її: (30-50 -ї,0-:205----Д7--ДА-- -- део Ул ва ля з й
АснЕ - но ща / 4 у
Ох -- зв! 7 но но у й 0
А пАс х Щ
АсОо-Х -- в в шк з ! дит ті
АН нт ваш г -- 25 д- ут 2. НЕТ, ЩЕА ДМФА
Ів; я Сполука 23 кед ЕФ до хи У - й С МН ро ат тріть Й; ще 5 49
АЕН
АБО Ас мо сект й то в. н лом
АсНЯ 8 ши з : тТюфосоорилуВваННЯ г а ще не г Й о 43 пас у
А о и део тео. ДЯ
АеНВ й лес ПАС де -0 нище со 5-3 о. - ВОМ ко ва Чи Я їх ? о і. Ель Я а я битою Пет
ОАс у | :
АкО вА я и 44 нм ЕЕ
Ге. ден
Сполуки 23 і 36 одержали за способами, представленими в Прикладах 5 і 11. Сполуку 41 одержали за такими ж способами, як описані в публікації УУО 2009082607.
Приклад 14. Одержання Сполуки 45
Ас оОде
Ї дсоДнкВв, Ка ї нсормт і й ши я дин й ря дени ше Мишка а А. ві З 0 а и А й Ге й Он лі де а 43 ко о - ІБ ий ангідрид, ОМАР, ОСЕ рен ний : і зу 1 Бурдштиновий знидрнд ІМАР ПС
ВЕН 8. ДМА, НЕТО, ЕОР, РУ
Ве Овес коли Коен дод о я он ОМ «ен : ри диня З Мк
ЗА що ять ев ен ЧИ. сич КВ реестру та а й де, Од. х А 45
В ей 2 і є Кай ко кодах твою МН і В денм й
Сполуку 43 одержали за способами, представленими у Прикладі 13.
Приклад 15. Одержання Сполуки 47 но У -7 рмто (6) в 1. ОМТОЇ, руг |в; 7 2. ра/С, Н», МЕеЕон Ї 46 шин 547 5 но но
Сполука 46 є в продажу.
Приклад 16. Одержання Сполуки 53 ною. НЕТИ, БМР» ДМФА ав
Ж й Мн. дог нео пед -М
Я в т: М ЩО в бос
Щ ;- чн Й - кад в БО с ях 7 ки 7 св
ОКХ не
Но Уже Ж щН м зісВІ мал і так В 7 і А-(Н ц зТішн, мен 4. НЕТ, ЕНЕР. ДМА Й в! 2. НЕТТО ЕШЩУРТ. ДМ ФА
СВ й Спопука 47
НМ о, МН НМ св; ці н СЕ: -да
Мт І Щі 1 н. Ра боти ово 2. НЕТИ, ЕКЧСРТЬ ДМФА : ру і п-щ й папою я
Ножі т М МН ше Спопука 17 ц н пед ВЕ ас п - М
АД пуття чн
Мнає ї ок пе їз нт а Н ВА ан т сік не. шу ве Ми ни М
Сас т ій щ- т с », т | її що кое дитя МА Що
Сполуки 48 і 49 є в продажу. Сполуки 17 і 47 одержали так, як описано в способах у
Прикладах 4 і 15.
Приклад 17. Одержання Сполуки 54
Од о ГІ ло Ал -в птн м Н
МНАс Е од ас 7 С
ОА, а Мі нн «', р-он
Са АД
АБО дитини ту ЧУ Ї ;
Нас не не о 9
Од С Не ор 0 х ва
Ас се й - а пу чн що щі НАсЄ тюфосфорилування -к МІС ще Ї -о ко ія одини МН
МНАс
ТР, щи о Одес о Я
Одес; й г г і у А сан том і ке р ни - М
АСО схо тк
Мне ще о 9 де С се Вомт век; Ї » БА
МНАс
Сполуку 53 одержали за способами, представленими у Прикладі 16.
Приклад 18. Одержання Сполуки 55 пд А їх о ЇЇ
АсОскин дути -Н
МЧнНАсС їде 0
ОАгуТс - Нн ОН (5 АХ нм М ОД» м
АсО-У са а а | р ї д- пуд вки
ЧНАЄ 1-й НВ:
ОАЕ щі З ОН - р , дл -- Мн З
ІЧНАсС 1 Бурштиновий знгідрид, ПМАР. ДХЕ 2 ДМА НЕТТО ЕОР БВ
Аг.
Одсрг а т ТТ деоо --я Я. МН
МНАс й «Одес о о
ОАс : Н ї я М ло АХ шк Н -- НМ У й їх | '
АСО СЮ дути и тн т ; нас ни -5 9 ( ба а ОТ
ЕФ Ї К гей тм, чн по
Ас ст -й
УнАс
Сполуку 53 одержали за способами, представленими у Прикладі 16.
Приклад 19. Загальний спосіб одержання кон'югованих АБО, що містять СіаіМАсз-1 в 3- положенні, за допомогою твердофазних методик (одержання ІбІ5 647535, 647536 і 651900)
Якщо не вказано інше, всі реагенти і розчини, використовувані для синтезу олігомерних сполук, придбані у комерційних постачальників. Стандартні фосфорамідитні будівельні блоки і тверду основу застосували для введення нуклеозидних залишків, які включають, наприклад, залишки Т, А, с і "С. 0,1 М розчин фосфорамідиту в безводному ацетонітрилі застосували для
В-О-2-дезоксирибонуклеозиду і 2'-МОЕ.
Синтез антисмислових олігонуклеотидів (АБО) виконали на синтезаторі АВІ 394 (у масштабі 1-2 мкмоль) або на синтезаторі ДКТА Оіідоріюї виробництва СЕ Неєайнсаге Віо5сіепсе (у масштабі 40-200 мкмоль) за способом фосфорамідитного зв'язування на твердій основі МІМАЮ, наповненій саіМАсз-1 (110 мкмоль/г, Сигаєм єї а!Ї., 2003), упакованій в колонку. Для стадії зв'язування фосфорамідити вводили у 4-разовому надлишку, порівняно із завантаженням на твердій основі, а конденсацію фосфорамідиту виконували протягом 10 хвилин. Всю решту стадій виконували за протоколами, наданими виробником. Для видалення диметокситритильної (ОМТ) групи з 5"-гідроксильної групи нуклеотиду застосували 6 95 розчин дихлороцтової кислоти в толуені. На стадії зв'язування як активатор застосували 4,5-диціаноіїмідазол (0,7 М) в безводному СНзСМ. Тіофосфатні зв'язки вводили сульфіруванням за допомогою 0,1 М розчину гідриду ксантану в суміші пиридину/СНзСМ 1:11 протягом З хвилин часу контакту. Як окиснювальний агент для забезпечення фосфодіестерних міжнуклеозидних зв'язків застосували 20 95 розчин трет-бутилгідропероксиду в СНІСМ, що містить 6 95 води, протягом 12 хвилин часу контакту.
Після збирання бажаної послідовності ціаноетил-фосфатні захисні групи видаляли за допомогою суміші триетиламіну і ацетонітрилу 1:1 (06./06.) протягом 45 хвилин часу контакту.
Зв'язані з твердою основою АБО суспендували у водному розчині аміаку (28-30 мас. 9б) і нагрівали при 55 "С протягом 6 годин.
Потім відфільтровували незв'язані АБО і випаровували аміак кип'ятінням. Залишок очищували рідинною хроматографією високого тиску на потужній аніонообмінній колонці (ЗЕ
Неакрсаге Віозсіепсе, Зоцгсе 300), 30 мкм, 2,54 х 8 см, А-100 мМ ацетату амонію у 30 95 водному СНЗСМ, В-1,5 М МавВ»г в А, 0-40 95 В за 60 хвилин, швидкість потоку 14 мл.хв-1, А-260 нм). Залишок знесолювали за допомогою ВЕРХ на обернено-фазовій колонці з одержанням бажаних АБО з виділеним виходом 15-30 95 відносно первинного завантаження на тверду основу. АБО характеризували за допомогою іон-парної ВЕРХ, суміщеної з МСОС-аналізом на системі Адіїепі 1100 М50.
Антисмислові олігонуклеотиди, що не містять кон'югату, синтезували за стандартними способами синтезу олігонуклеотидів, загальновідомими у даній галузі техніки.
Застосовуючи ці способи, одержали три окремі антисмислові сполуки, націлені на Арос І.
Як показано в Табл. 4 нижче, кожна з трьох антисмислових сполук, націлених на Аробс ІІ, має одну і ту ж послідовність азотистих основ. ІЗІЗ 304801 являє собою 5-10-5 МОЕ гепмер, що містить тільки тіофосфатні зв'язки; ІБІЗ 647535 є таким же, як ІБІ5 304801, за винятком того, що він містить саіМАсз-1, кон'югований на його 3'-кінці; і ІБІ5 647536 є таким же, як ІЗІ5 647535, за винятком того, що деякі міжнуклеозидні зв'язки цієї сполуки є фосфодіестерними зв'язками. Як додатково показано в Табл. 4, були синтезовані дві окремі антисмислові сполуки, націлені на
ЗАВ-1. ІБІ5 440762 являє собою 2-10-2 сЕї гепмер, що містить тільки тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки; ІЗІ5 651900 є таким же, як ІБІ5 440762, за винятком того, що він містить
СаіМАсз-1 на його 3'-кінці.
Таблиця 4
Модифіковані АБ5О, націлені на Арос ПІ ї БКВ-1 хоо00опянюнняюю 00 нен о
АБО Послідовність (від 5" до 3") Мішень ІО кова | жувана | м, маса | маса
ІБІЄ АезСев"Сев Тез Гев'"Сав Газ Гав(зав Гав'"Сав'"СавАавСав" Св
ІБІ5 АезСев"Сев Тез Гев'"Сав Газ Гав(зав Гав'"Сав'"СавАвавСЯав" Св Ге Ге Т
ІБІ5 АезСво"Сео Гео Гео"Сав Газ ГавСав Гав'"Сав"СавАвавСав'""Сав Тео Гео
ІБІВ Ткв"СквАвдеСіав Гав'"СавАвв ГавСтавАвав "Сов Гав Пке"СкоАдо -
Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЄЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-0-2- дезоксирибонуклеозид; "К" позначає 6'-(5)-СНз біциклічний нуклеозид (наприклад, СЕЮ; "5" позначає тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки (РБ); "о" позначає фосфодіестерні міжнуклеозидні зв'язки (РО); і "о"» позначає -О-Р(-ОХОН)-. Верхній індекс "т" позначає 5-метилцитозини. "СаіМАсз-1" позначає кон'югувальну групу, що має структуру, зображену раніше у Прикладі 9.
Потрібно зазначити, що СаіМАсз-1ї містить розщеплюваний аденозин, який з'єднує АБО з рештою частини кон'югату, що позначений як "саїІМАсз-1а. Номенклатура, використана у
Зо представленій вище таблиці, ілюструє повну послідовність азотистих основ, включаючи аденозин, що є частиною кон'югату. Отже, у представленій вище таблиці послідовності також можуть бути наведені із закінченням "СаІМАсз-1", без "Адое. Таке умовне застосування нижнього індексу "га" для позначення частини кон'югувальної групи, що не містить розщеплюваного нуклеозиду або розщеплюваного фрагмента, застосовується у всіх представлених Прикладах.
Частина кон'югувальної групи, що не містить розщеплюваного фрагмента, згадується у даному документі як "кластер" або "кластер кон'югату" або "кластер СаіМАсзу. У деяких випадках кон'югувальна група для зручності описана шляхом окремого представлення її кластера та її розщеплюваного фрагмента.
Приклад 20. Дозозалежне антисмислове інгібування АроС Ш людини у пПиАроС ІІ трансгенних мишей
ІБІ5 304801 і І5БІ5 647535, кожен з яких націлений на АросС І людини і описаний вище, окремо випробовували і оцінювали в дозозалежному дослідженні відносно їх здатності інгібувати Арос ІІЇ людини у трансгенних мишей з Аробс ІІ людини.
Лікування
Трансгенних мишей з АроСіІїЇ людини витримували при 12-годинному циклі освітлення/темряви і забезпечували вільний доступ до корму ТекКіайд аб. До початку експерименту тварин акліматизували щонайменше протягом 7 днів у дослідницькій лабораторії.
Приготували А5бО в РВЗ і стерилізували фільтрацією крізь фільтр з розміром отворів 0,2 мкм.
АБО розчинили в 0,9 95 РВ5 для ін'єкцій.
Трансгенним мишам з АроС ІШШ людини один раз на тиждень протягом двох тижнів внутрішньочеревинно вводили ін'єкції ІБІ5 304801 або 647535 в дозі 0,08, 0,25, 0,75, 2,25 або 6,75 мкмоль/кг або РВЗ5 як контрольний зразок. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Через сорок вісім годин після введення останньої дози кожну мишу знекровили і умертвили, і зібрали тканини.
Аналіз МРНК Арос ІЇЇ
Рівні мРНК АросС І в печінці мишей визначили за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМФО (МоїІесшаг Ргорев, Іпс., Юджин, штат
Орегон) за стандартними протоколами. Рівні мРНК Аробс І визначали відносно загальної РНК (за допомогою Кіродгееп), потім нормалізували до контрольного зразка, обробленого РВ5.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів мРНК Арос І для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого РВ5, і позначені як «96 РВ5". В Табл. 5 нижче представлена також напівмаксимальна ефективна доза (Ерво) для кожного АБО.
Показано, що обидві антисмислові сполуки знижують РНК Аробс І, порівняно з контрольним зразком, обробленим РВ5. Крім того, антисмислова сполука, кон'югована з саіМАсз-1 (І5І5 647535), була значно ефективнішою, ніж антисмислова сполука, що не містить кон'югату
СаімМАсз-ї (ІБІ5 304801).
Таблиця 5
Вплив АБО лікування на рівні мРНК Арос ІІ у трансгенних мишей з Арос ІІЇ людини
Доза о ЕОзо , ' Міжнуклеозидний | 5ЕО 1
РАВ | 0 |л00Ї - Ї! - ЇЇ - її ун 0,77 Немає РБ/гО 20
Басов вся ЕН 0,074 СаМАсз-1 РБ/2О 21 675 | 8
Аналіз білка Аробс ПІ (турбідиметричний аналіз)
Аналіз білка АробС І в плазмі виконали за способами, описаними в роботі Стапат 6ї аї,
Зо Сіксиайноп Резвагсиі, до друку, опублікованій онлайн 29 березня 2013 року.
Близько 100 мкл плазми, виділеної від мишей, аналізували без розбавлення, застосовуючи клінічний аналізатор ОіІутризх і турбідиметричний аналітичний набір Арос І, що є в продажу (Катіуа, кат. Мо КАЇІ-006, Катіуа ВіотедісаІЇ, Сіеєтл, штат Вашингтон). Протокол аналізу виконували за описом постачальника.
Як показано нижче у Табл. б, обидві антисмислові сполуки знижують білок АросС ЇЇ, порівняно з РВ5 контрольним зразком. Крім того, антисмислова сполука, кон'югована з Са!МАсз- 1 (І15І5 647535), була значно ефективнішою, ніж антисмислова сполука, що не містить кон'югату
СаіМмАсз-ї (ІБІ5 304801).
Таблиця 6
Вплив АБО лікування на рівні білка Арос ІІ в плазмі трансгенних мишей з людським Арос ЇЇ
Доза о ЕОзо був Міжнуклеозидний ЗЕО І
АБО (мкмоль/кг) 5 РВЗ (мкмоль/кг) З-кон'югат зв'язок/довжина МО.
РВ5 | 0 | 7100 ЇЇ - її - / - ЇЇ 008 86
ІВІВ
ІВІВ
Тригліцериди і холестерин плазми виділили за способом Віїдп і Суег (Відй, Е.О. апа Буєег,
МУ... Сап. у. Віоспет. РНувіої. 37: 911-917, 1959) (ВіїдН, Е апа ОСуег, М, Сап У Віоснет Рпузіої, 37, 911-917, 1959) (Він, Е апа Буєг, МУ, Сап ) Віоспет РнНузіої, 37, 911-917, 1959) і виміряли за допомогою клінічного аналізатора ВесКктапп СошгГег і реагентів, що є у продажу.
Рівні тригліцеридів виміряли відносно мишей, ін'єктованих РВ5, і виразили як «96 РВ5".
Результати представлені у Табл. 7. Показано, що обидві антисмислові сполуки знижують рівні тригліцеридів. Крім того, антисмислова сполука, кон'югована з саїіМАсз-1 (ІЗІ5 647535), була значно ефективнішою, ніж антисмислова сполука, що не містить кон'югату саїіМАсз-1 (ІБІ5 304801).
Таблиця 7
Вплив АБО лікування на рівні тригліцеридів у трансгенних мишей
Доза о ЕОбво був Міжнуклеозидний ЗЕО І
АБО (мкмоль/кг) 5 РВЗ (мкмоль/кг) З-кон'югат зв'язок/довжина МО.
РВ5 | 0 | 100 Її - / - її - Її
ІВІВ зоаво! 03 бемає Шк 7
БІВ 075 | 9 675 | 9
Зразки плазми аналізували за допомогою ВЕРХ для визначення кількості загального холестерину і різних фракцій холестерину (НОЇ і 01). Результати представлені в Табл. 8 і 9.
Показано, що обидві антисмислові сполуки знижують загальні рівні холестерину; обидві знижують 01; і обидві підвищують НОЇ. Крім того, антисмислова сполука, кон'югована з
СаіМмАсз-1 (ІЗІЗ 647535), була значно ефективнішою, ніж антисмислова сполука, що не містить кон'югату саїІМАсз-1 (І5І5 304801). Збільшення рівнів НОЇ. і зниження рівнів І ОЇ. є сприятливим серцево-судинним ефектом антисмислового інгібування Арос ПІ.
Таблиця 8
Вплив АБО лікування на рівні загального холестерину у трансгенних мишей
Доза Загальний були Міжнуклеозидний / |ІБЕО ІЮ
АБО (мкмоль/кг) | холестерин (мг/дл) З-кон'югат зв'язокю/довжина МО.
РВ5 | 0. 7777257 | - | ЩА ЇЇ
ВІВ ВОтВО Немає гв/2о 29 675 | щ(х99 ЮЖ ІЖ
Таблиця 9
Вплив АБО лікування на рівні НОЇ і І 0. холестерину у трансгенних мишей
Доза НО. ГО. були Міжнуклеозидний | 5ЕО І
АБО (мкмоль/кг) (мг/дл) (мг/дл) З-кон'югат зв'язокю/довжина МО.
РВ5 | 0 | 717 | 28 | - | - її
ВІВ ВОтВО Немає Г8/2о 32
Фармакокінетичний аналіз (ФК)
Оцінили також ФК АБО. Зразки печінки і нирок подрібнили і екстрагували за стандартними протоколами. Зразки аналізували на М5О1 за допомогою ІП-ВЕРХ-МС. Визначили вміст (мкг/г) в тканині І5ІЗ 304801 і 647535 повної довжини, і результати представлені у Табл. 10. Показано, що концентрації в печінці антисмислових сполук повної довжини були подібними для двох антисмислових сполук. Отже, навіть незважаючи на те, що сбаїЇМАсз-1-кон'югована антисмислова сполука є активнішою в печінці (як показано за даними РНК і білка, представленими вище), її вміст у печінці не набагато вищий. Дійсно, обчислене значення ЕС5о (представлене у Табл. 10) підтверджує, що спостережуване збільшення ефективності кон'югованої сполуки не може бути віднесене виключно на рахунок підвищеного накопичення.
Такий результат дозволяє припустити, що кон'югат покращує ефективність за іншим механізмом, ніж просте накопичення у печінці, можливо за рахунок збільшення продуктивного захоплення антисмислової сполуки у клітини.
Ці результати показують також, що концентрація саїІМАсз-1-кон'югованої антисмислової сполуки у нирках є нижчою, ніж концентрація антисмислової сполуки, що не містить кон'югату
Саї!МАс. Це має декілька сприятливих терапевтичних ефектів. Для терапевтичних показань, при яких не потрібен прояв активності в нирках, вплив на нирки піддає їх ризику токсичності без відповідної користі. Більше того, висока концентрація в нирках звичайно приводить до виведення сполуки із сечею, забезпечуючи швидше виведення. Відповідно, для позаниркових мішеней накопичення в нирках є небажаним. Ці дані дозволяють припустити, що кон'югація з
СаіМАсз-1 знижує накопичення в нирках.
Таблиця 10
ФК аналіз АБО лікування у трансгенних мишей
АеО Доза Печінка | Нирки печінці 3- Міжнуклеозидний шк (мкмоль/кг) | (мкг/г) (мкг/г) (мкг/г) кон'югат зв'язок/довжина МО. ві | 08 | 628 | 1196 68 | 2023 | 3377
ВІ | 08 щ | 727 | 343
І 68 | 2372 | 1793
Ідентифікували також метаболіти І5БІ5 647535 і підтвердили їх маси за допомогою мас- спектрометричного аналізу з високим розрізненням. Сайти розщеплення і структури спостережуваних метаболітів представлені нижче. Відносний 96 від загальної довжини АБО обчислили за стандартними прийомами, а результати представлені в Табл. 10а. Основний метаболіт ІБІ5 647535 є АБО повної довжини без всього кон'югату (тобто ІЗІ5 304801), який утворюється в результаті розщеплення за сайтом розщеплення А, представленим нижче. Крім того, спостерігали також додаткові метаболіти, що утворюються з інших сайтів розщеплення. Ці результати дозволяють припустити, що може бути придатним також введення інших розщеплюваних зв'язків, таких як естери, пептиди, дисульфіди, фосфорамідати або ацил- гідразони, між цукром самМАсз-1 ії АБО, які можуть розщеплюватися під дією ферментів усередині клітини або які можуть розщеплюватися у відновному середовищі цитозолю, або які є лабільними при кислотному рН усередині ендосом і лізосом.
Таблиця 10ба
Спостережувані метаболіти повної довжини І5І5 647535
Метаболіт АБО Сайт Відносний 90 розщеплення
ІЗІ5 304801
ІЗІЗ 304801-аА в | (105
ІЗІЗ 647535 мінус ІЗ СаїМАсі
ІБІЗ 647535 мінус 4 ІЗ саіМАс-1 зв'язка Б-гідрокси-пентанової 17,6 кислоти)
ІБІЗ 647535 мінус 5 (2 сбаМАсь2 зв'язки / 5-гідрокси-пентанової кислоти)
ІБІЗ 647535 мінус
ІЗ самАсеЗ зв'язки /5-гідрокси-пентанової кислоти)
АВО зо
Сайти розщеплення ; наон Сайт розщеплення С ши ого ще у Сайт розщеплення ру З я В Дюк, в дор то "и ше но он М й я Мора пд й к- сайт розщеплення С , н н і Н пет ший Сайт розщеплення В
В : - м пора я р-н М Я 6-25 55--5-в- то» " тр Сайт розщеплення ше ВОК, о. он ре зв я ск
Й я миня к
ЗТ де пнтьсї, се петенни
АБО Хиви дво не м МА» - 304801 о У Б
Метаболіт 1 Ін Метаболіт 2 и це
Гой а не з н І яти " Ей су ва й ЩІ, - н х Жололния І. етте ва как ше ї їй ш
Метаболіт 5 с н р » рн
Шен й -е Ї а Осв-юн
Ін п он в вати й Ї су я! о г (о Її
М Ні ит і. ши й зи а в
Метаболіт 4 З но кл г -е-є шк и те а Я я -и Н щу
Ге У к ЯК о і ге еф й- і нн рн дн
Метаболіт 5
ЦІ їв зна ша й нора Г , Й ж бй-ов Ї; Де че то Й м о, ня. Я АЖ очи і к за а Н шия
Метабопіт 5 пан
Приклад 21. Антисмислове інгібування людського Арос ПІ у трансгенних мишей з Арос ПП у дослідженні з одним введенням
ІБІ5 304801, 647535 і 647536, кожний з яких націлений на людський Арос І і описаний у
Табл. 4, додатково оцінювали в дослідженні одноразового введення відносно їх здатності інгібувати людський Арос ІІІ у трансгенних мишей з людським Арос ЇЇ.
Лікування
Трансгенних мишей з людським АроСіїЇ витримували при 12-годинному циклі освітлення/гемряви і забезпечували вільний доступ до їжі ТеКіІай Іаб. До початку експерименту тварин акліматизували щонайменше протягом 7 днів у дослідницькій лабораторії. Приготували
АБО у РВ5 і стерилізували фільтрацією крізь фільтр 0,2 мікрони. АБО розчинили в 0,9 95 РВ5 для ін'єкцій.
Трансгенним мишам з людським Арос ПІ внутрішньочеревинно ввели одноразову ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки ІбБІ5 304801, 647535 або 647536 (описаних вище) або РВ5 як контрольний зразок. Експериментальна група складалася із З тварин, а контрольна група складалася із 4 тварин. Перед лікуванням, а також після останньої дози у кожної миші брали кров і аналізували зразки плазми. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення.
Зразки зібрали і аналізували для визначення рівнів мРНК АроС ПП і білка в печінці; тригліцеридів у плазмі; і холестерину, включаючи фракції НОЇ і 101, які аналізували так, як описано вище (Приклад 20). Дані цих аналізів представлені нижче у Табл. 11-15. Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АТ) їі аспартат-амінотрансферази (А5Т) у сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Рівні АЇТ і А5Т показали, що антисмислові сполуки добре переносяться при усіх введених дозах.
Ці результати демонструють підсилення ефективності антисмислових сполук, що містять кон'югат СаІМАсз-1 на 3'-кінці (І5І5 647535 і 647536), порівняно з антисмисловою сполукою, що не містить кон'югату СаіМАсз-1ї (ІБІ5 304801). Крім того, І5ІЗ 647536, що містить кон'югат
СаМАсз-1 і декілька фосфодіестерних зв'язків, був таким же ефективним, як ІБІ5 647535, що містить такий же кон'югат, і всі міжнуклеозидні зв'язки в цьому АБО є тіофосфатними.
Коо)
Таблиця 11
Вплив АБО лікування на рівні мРНК Арос ІІ у трансгенних мишей з людським Ароб ІІ (мг/кг) зв'язок/дов-жина "
РВ5 7/0 99 | - ЇЇ - ЇЇ - Ї 03 | 98
ІБІ5 647536 1,7 СаімМАсз-1 РБ/РО/20 21
Таблиця 12
Вплив АБО лікування на рівні білка Арос ІІІ в плазмі трансгенних мишей з людським Арос ЇЇ
ЕОво , ' Міжнуклеозидний
АБО Доза (мг/кг) | о РВ5 (мг/кг) З3'-кон'югат зв'язок/довжина ЗЕО І МО.
Р | 0 ЇЇ 99 | - | - ЇЇ - 7! 03 | 98
ІБІ5 647536 1,68 сСаІМАсз-1 РБ/РО/20 21
Таблиця 13
Вплив АБО лікування на рівні трігліцеридів у трансгенних мишей
ЕЮго , ' Міжнуклеозидний
АБО Доза (мг/кг)| 95 РВ5 (мг/кг) З3'-кон'югат зв'язок/довжина ЗЕО ІЮ МО.
РВ5 | 0 1 ЮДБ98 | щ- - її - / 1 | 80
ІВІВ зоаво! пи бемає Шк 7
ІВІВ
БІВ | 1 | 66
Таблиця 14
Вплив АБО лікування на рівні загального холестерину у трансгенних мишей о, бути Міжнуклеозидний
Доза (мг/кг) у РВ5 3'-кон'югат зв'язок/довжина ЗЕО ІО МО.
РВ5 | 0 ЇЇ 96 | - ! - Ї/ 73 | 96 ів батва сама | Рв » ів батвае самаст | Ретого »
Таблиця 15
Вплив АБО лікування на рівні НОЇ. і ГО. холестерину у трансгенних мишей
НО. ГО , ' Міжнуклеозидний
РВ8 770771 7191 | 90 1 ЮДЩщф- її - /
ВІВ ВОтВО Немає Г8/2о 29 03 | 98 | 86 03 | 7143 | 89
ІБІ5 647536 СаімМАсз-1 РБ/РО/20 21 "
Ці результати підтверджують, що кон'югат СаІМАсз-1 покращує ефективність антисмислової сполуки. Ці результати показують також однакову ефективність СаїіМАсз-1-кон'югованих антисмислових сполук, у яких антисмислові олігонуклеотиди мають змішані зв'язки (ІЗІ5 647536, який має шість фосфодіестерних зв'язків), і повністю тіофосфатної версії тієї ж антисмислової сполуки (ІБІ5 647535).
Тіофосфатні зв'язки забезпечують декілька властивостей антисмислових сполук.
Наприклад, вони є стійкими до нуклеазного розщеплення і зв'язуються з білками, що приводить до накопичення сполуки у печінці, а не в нирках/сечі. Ці властивості є бажаними, особливо при лікуванні показань у печінці. Однак тіофосфатні зв'язки пов'язані також із запальною реакцією.
Відповідно, зменшення кількості тіофосфатних зв'язків у сполуці імовірно знижує ризик запалення, але знижує також концентрацію сполуки у печінці, підвищує концентрацію в нирках і сечі, знижує стабільність у присутності нуклеаз і зменшує загальну ефективність. Представлені результати демонструють, що саїЇМАсз-1-кон'югована антисмислова сполука, у якій деякі тіофосфатні зв'язки замінені фосфодіестерними зв'язками, є настільки ж ефективною проти мішені у печінці, як ії аналог, що містить тільки тіофосфатні зв'язки. Такі сполуки ймовірно є меншою мірою прозапальними (див. Приклад 24, у якому описаний експеримент, який демонструє, що зменшення тіофосфатів (Р5) приводить до зниження запальної дії).
Приклад 22. Вплив модифікованого СаІМАсз-1-кон'югованого АБО, націленого на 5ВАВ-1, іп мімо
ІБІБ 440762 і 651900, кожен з яких націлений на ЗКВ-1 і описаний у Табл. 4, оцінили в дозозалежному дослідженні відносно їх здатності інгібувати 5ЕВ-1 у мишей Ваїр/с.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей ВаїбБ/с (даскзоп І арогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки ІБІ5 440762, 651900 або РВ5 як контрольний зразок. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 48 годин після останнього введення для визначення рівнів МРНК 5КВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення. РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Рівні мРНК 5КВ-1 визначали відносно загальної РНК (за допомогою Кіродгееп), потім нормалізували до контрольного зразка, обробленого РВ5. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого РВБ5, і позначені як «96 РВО".
Як показано у Табл. 16, обидві антисмислові сполуки знижують рівні мРНК ЗАВ-1. Крім того, антисмислова сполука, що містить кон'югат СбамМАсз-ї (І5І5 651900), була значно ефективнішою, ніж антисмислова сполука, що не містить кон'югату СаІМАсз-1 (ІБІ5 440762). Ці результати демонструють, що перевага ефективності кон'югатів СаіМАсз-1 спостерігається при застосуванні антисмислових олігонуклеотидів, що є комплементарними різним мішеням і мають різні хімічно модифіковані нуклеозиди, в цьому випадку модифіковані нуклеозиди містять стерично ускладнені етил-цукрові фрагменти (біциклічний цукровий фрагмент).
Таблиця 16
Вплив АБО лікування на рівні мРНК 58В-1 у мишей Ваїр/с
Печінка ЕОбво ' ' Міжнуклеозид-ний | 5ЕО ІЮ
ОАВО дого Ре (мір | Зонюєт | язоддовжиння | МО.
РВ5 ЇЇ 0 | 700 Її (ЇЇ 7-17 5 Я 007 | 98 вів 651900 0,3 СаіМАсз-1 РБЗ/14 23 2 16
Приклад 23. Протокол аналізу людських мононуклеарних клітин периферичної крові (пРВМС)
Аналіз ПРВМС виконали за допомогою пробірного способу ВО Машаїпег СРТ. Одержали зразок цільної крові, одержаної від донорів-добровольців, що дали поінформовану згоду у
Медичній клініці США (Рагадау є Е! Сатіпо Веаї, Карлебад), і зібрали його в 4-15 пробірок ВО
Масшіаійпег СРТ по 8 мл (ММУК, кат. Мо ВО362753). Приблизний початковий загальний об'єм
Зо цільної крові у пробірках СРТ для кожного донора записали у формулярі аналізу РВМО.
Перед центрифугуванням зразок крові негайно повторно перемішали, обережно перевертаючи пробірки 8-10 разів. Пробірки СРТ центрифугували при кімнатній температурі (18-25 7С) в горизонтальному (з надмірним повертанням) роторі протягом 30 хвилин з фактором розділення (КСЕ) 1500-1800 із загальмовуванням (2700 об/хв ВесКтап АПедга 6К). Клітини зняли з лейкоцитарної поверхні розділу (між шарами фіколу і полімерного гелю); перенесли до стерильної 50 мл конічної пробірки і згрупували по 5 СРТ пробірок/50 мл конічна пробірка/донор. Далі клітини двічі промили РВЗ (без Са», Ма"; СІВСО). Пробірки поповнили до 50 мл і перемішали, перевертаючи декілька разів. Далі зразок центрифугували при 330 х 49 протягом 15 при кімнатній температурі (1215 об/хв у ВесКтап АїЇедга 6К) і аспірували максимальну кількість супернатанту, не порушуючи осаду. Клітинний осад зняли, обережно повертаючи пробірку, і ресуспендували клітини в КРМІН1О 95 ЕВ5--пеніцилін/стрептоміцин (1 мл/10 мл початкового об'єму цільної крові). Піпеткою відібрали 60 мкл зразка і вмістили до флакону з пробою (ВесКтап СошГег), що містить 600 мкл реагенту Мегза! узе (ВесКтап СоиПег, кат. Мо А0О9777), та обережно перемішували вихровим перемішуванням протягом 10-15 секунд.
Зразок залишили інкубуватися протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, і знову перемішали перед підрахунком. Суспензію клітин зчитували на аналізаторі життєздатності клітин Місе! ХЕ (ВесКктап СошиМнег), використовуючи клітини типу РВМС (зберегли фактор розведення 1:11 з іншими параметрами). Записали кількість живих клітин/мл і життєздатність.
Клітинну суспензію розбавили до 1 х 107 живих РВМС/мл КРМІНІО 95
ЕВзЗакпеніцилін/стрептоміцин.
Клітини вмістили на планшет при 5 х 105 в 50 мкл/ямку 96б-лункового тканинного культурального планшета (РаЇсоп Місгоїе5)). 50 мкл/ямку 2х концентрації олігомерів/контролю, розбавлених ВРМІ--10 95 ЕВ5--пеніцилін/стрептоміцин, додали відповідно до експериментальної матриці (в цілому 100 мкл/ямку). Планшети вмістили на шейкер і залишили перемішуватися приблизно на 1 хвилину. Після інкубації протягом 24 годин при 37 С; 595 СО», планшети центрифугували при 400 х д протягом 10 хвилин, потім видалили супернатант для аналізу цитокінів М5О (тобто людських ІІ -6, ІІ -10, 1-8 ії МСР-1).
Приклад 24. Оцінка прозапальних ефектів в аналізі ПРВМС для саіМАсз-1-кон'юЮгованих АБО
Антисмислові олігонуклеотиди (АБО), наведені у Табл. 17, оцінили відносно прозапальної дії в аналізі ПРВМС, використовуючи протокол, описаний у Прикладі 23. І5БІ5 353512 є внутрішнім стандартом, що, як відомо, має високу відповідь на вивільнення 1-6 в цьому аналізі. ПРВМС виділили із свіжих зразків, одержаних від донорів-добровольців, і обробили АБО у концентраціях 0, 0,0128, 0,064, 0,32, 1,6, 8, 40 ії 200 мкМ. Через 24 години обробки виміряли рівні цитокінів.
Рівні І/-6 застосували як первинне показання. ЕСво і Етах обчислили стандартними способами. Результати виразили як середнє співвідношення Етах/ЕСхо для двох донорів і позначили як "Етах/ЕСво. Нижче співвідношення означає відносне зниження прозапальної відповіді, а вище співвідношення означає відносне збільшення прозапальної відповіді.
Відносно досліджуваних сполук, найменш прозапальною сполукою був АБО, з'єднаний за допомогою РБ/РО (І5БІ5 616468). (заїМАсз-1-кон'югований АБО, ІбБІ5 647535, був небагато менш прозапальним, ніж його некон'югований аналог, ІБІ5 304801. Ці результати показують, що введення декількох РО зв'язків знижує прозапальну реакцію, а додавання кон'югату саіІМАсз-1 не робить сполуку більш прозапальною, і може знижувати прозапальну реакцію. Відповідно,
Зо можна очікувати, що антисмислова сполука, яка містить змішані РБ/РО зв'язки і кон'югат
СаіМАсз-1, може спричиняти слабші прозапальні реакції, порівняно з антисмисловою сполукою, з'єднаною тільки за допомогою Рб, з кон'югатом СаМАсз-1 або без нього. Ці результати показують, що саїІМАсз-1-кон'юговані антисмислові сполуки, зокрема, сполуки, що мають менший вміст Р5, є менш прозапальними.
В цілому, ці результати дозволяють припустити, що СзаіМАсз-1-кон'югована сполука, зокрема, сполука із зниженим вмістом Р5, може бути введена у вищій дозі, ніж аналогічна повністю РЗ5 антисмислова сполука без кон'югату СсСаіМАсз-1. Оскільки не очікується, що період напіввиведення для цих сполук істотно відрізнятиметься, то таке введення у вищій дозі зумовить менш часте введення доз. Насправді, таке введення може бути ще рідшим, оскільки
СаіМАсз-1-кон'юговані сполуки є ефективнішими (див. Приклади 20-22), а повторне введення дози необхідне тільки при зниженні концентрації сполуки нижче за бажаний рівень, при цьому такий бажаний рівень обумовлений ефективністю.
Таблиця 17
Модифіковані АБО 104838 АдеСіавАвае Став Се Гев'"Сев"Сев"Се 353512 СіавАчеСіавАвв "Сов" Сов ГезСЗез Се 304801 пав" авАвазСіав "С дв Тез Тез ГезАез Ге р 647535 | "Сав"СавАвазСіав"Сдв Т ев Тез ГевАев ГеоДао-(1агМАсз- 1 а р 616468 пав" авАвазСіав "С дв Т ео Гео ГезАев Ге р
Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЄЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає рВ-0-2-
дезоксирибонуклеозид; "К" позначає 6'-(5)-СНз біциклічний нуклеозид (наприклад, СЕЮ; "5" позначає тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки (Р); "о" позначає фосфодіестерні міжнуклеозидні зв'язки (РО); і "о"'» позначає -О-Р(-ОХОН)-. Верхній індекс "т" позначає 5-метилцитозини. "Адо-
СаіМмАсз-14аг позначає кон'югат, що має структуру саіМАсз-1, представлену у Прикладі 9, приєднаний до 3'-кінця вказаного антисмислового олігонуклеотиду.
Таблиця 18
Прозапальна дія АБО, націлених на Арос ІІ, в аналізі НРВМСО
ЕСво Етах ' ' Міжнуклеозидний | 5ЕО ІЮ
ІБІБ 353512 (з високою 0,01 265,9 26,590 Немає рБ/г20 25 відповіддю)
Приклад 25. Вплив модифікованого СаІМАсз-1-кон'югованого А5БО, націленого на людський
Ароб ЇЇ, іп міо
ІБІБ 304801 і 647535, описані вище, випробували іп міго. Первинні гепатоцитарні клітини трансгенних мишей при густині 25000 клітин на ямку обробили концентраціями 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 і 20 мкМ модифікованих олігонуклеотидів. Після обробки протягом близько 16 годин, з клітин виділили РНК і виміряли рівні мРНК за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі, а рівні МРНК пАрос ПІ скоректували відповідно до загального вмісту РНК, виміряного за допомогою КІВОСКЕЕМ.
ІСво обчислили стандартними способами, і результати представлені у Табл. 19. Показано, що спостерігали порівнянну ефективність у клітинах, оброблених ІБІ5 647535, порівняно з контрольним зразком, І5І5 304801.
Таблиця 19
Модифіковані АБО, націлені на людські Арос ПІ, у первинних гепатоцитах
У цьому експерименті іп міго не спостерігали такої великої переваги в ефективності для кон'югації з СаіМАсз-1, як спостерігали іп мімо. Подальші експерименти з вільним захопленням у первинних гепатоцитах іп міго не показали підвищеної ефективності олігонуклеотидів, що містять різні кон'югати СаІМАс, порівняно з олігонуклеотидами, що не містять кон'югатів (заіїМмАс (див. Приклади 60, 82 і 92).
Приклад 26. Вплив зв'язків РО/РБ5 на активність АБО відносно Ароб ПІ
Трансгенним мишам з людським Арос ІІ внутрішньоочеревинною ін'єкцією вводили 25 мг/кг
ІБІБ 304801 або І5І5 616468 (обидва описані вище) або РВ5 як контрольний зразок, один раз на тиждень протягом двох тижнів. Експериментальна група складалася із З тварин, а контрольна
Зо група складалася із 4 тварин. Перед лікуванням, а також після введення останньої дози у кожної миші брали кров і аналізували зразки плазми. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення.
Зразки зібрали і аналізували для визначення рівнів білка Арос Ії у печінці, як описано вище (Приклад 20). Дані цих аналізів представлені нижче у Табл. 20.
Ці результати демонструють зниження ефективності антисмислових сполук з РО/РБ5 (ІБІ5 616468) у крилах, порівняно із сполуками, що містять тільки РБ5 (ІБІ5 304801).
Таблиця 20
Вплив АБО лікування на рівні білка Ароб ІІ у трансгенних мишей з людським Аробс ЇЇ о бути Міжнуклеозидний | 5ЕО ІЮ
АБО Доза (мг/кг) то РВЗ | 3'-кон'югат зв'язок/довжина МО.
РОЗ ЇЇ 77777170 Ї1178911 11111111 тижнів
Приклад 27. Сполука 56
МР),
РМТО. ин вто, 7 Др тоттютт рмто"7 бо 56
Сполука 56 є в продажу у компанії Сієп ВНевзєагсі або може бути одержана за опублікованими методиками, описаними авторами 5ЗпеПеріпом еї аї., Мисієїс Асій5 Везеагси, 1997, 25(22), 4447-4454.
Приклад 28. Одержання Сполуки 60 леОоле о АкрОде - Ноти иа --5к неві ек, Птвданию 370 Ст ова Суво
М шк бак у АСНМХ 38 Ікітьькісн.)
СНУ
С
АеОбАс СМЕЮЄСЦРЕЮВСЇ, АвОде МВВ о о ЕР - в Р дк мол ванни зі сть Аг п вс я о детро хо ів АЕНМ о
Сполуку 4 одержали за способами, описаними у Прикладі 2. Сполука 57 є в продажу.
Сполуку 60 підтвердили структурним аналізом.
Сполука 57 є ілюстративною, та її не потрібно вважати обмежуючою, оскільки можуть бути застосовані інші монозахищені заміщені або незаміщені алкілдіоли, включаючи, але без обмеження, ті, які представлені в даному описі, для одержання фосфорамідитів, що мають бажаний склад.
Приклад 29. Одержання Сполуки 63 ії ві он Е. ВМС ри і МЕ но о, з кон до з. вас н. дос сп ВО дно 2-0 ви? ормт з. нс мен щі 53. Тівфосфорилу- ПИ Ці 4 хансо- ге вання ВР. ям ві : З «з й ах щі
Сполуки 61 і 62 одержали за такими ж способами, як описані авторами ТоБбег єї аї., Єиг. у.
Ог9. Спет., 2013, 3, 566-577; і Лапо еї аї., Теїгапейдгоп, 2007, 63(19), 3982-3988.
Альтернативно, Сполуку 63 одержали за такими ж способами, як описані в науковій і патентній літературі авторами Кіт еї аї!., 5упієй, 2003, 12, 1838-1840; і Кіт еї а!ї., в опублікованій
Міжнародній заявці РСТ УМО 2004063208.
Приклад 30. Одержання Сполуки 63р р сх ДИМ т га с) ОО
І що І. МІС ду й теп дл 3 ТАБ о. во дл ВМ 3. Тюфоєфорилува І 3. є пування МЕРА» г «За он «ь СБ
Сполуку бЗа одержали за такими ж способами, як описані авторами Напезвзіап еї аї.,
Сападіап доштпаї ої Спетівігу, 1996, 74(9), 1731-1737.
Приклад 31. Одержання Сполуки 63а гасу ПАТО--
ЖЕ р - севи в їв ян ЕН КОР
ОБЛ, - туту я їй її
БО ти а дин ова 3. РО, Б вто. и Д отит дитя її 3. тюфосфродитевання З т Же Шяк «а
Сполуку 63с одержали за такими ж способами, як описані авторами Спеп еї аї., Спіпезе
СНетісаї І енегз, 1998, 9(5), 451-453.
Приклад 32. Одержання Сполуки 67
СОВа
АспОае в Що | отв дО Од - ою Ж во й о о СОва де п нн т їй - о ОтвпУ св он мо КСтЬ й миши ше
АЕНМ а НВ, ЕЕА АсНМ :
В-Навеаснь
І. ТЕАЗНЕ, ТФ о О Сова - і хе ке й о..а й 2. Тюфоєфоралування лей ж мана що в- ща аенМ рен МИР
Сполуку 64 одержали за способами, представленими у Прикладі 2. Сполуку 65 одержали за такими ж способами, як описані авторами Ог єї а!., в опублікованій Міжнародній заявці РОСТ МО 2009003009. Захисні групи, застосовані для Сполуки 65, є ілюстративними, і їх не потрібно вважати обмеженням, оскільки можуть бути застосовані інші захисні групи, включаючи, але без обмеження, ті, які представлені в даному описі.
Приклад 33. Одержання Сполуки 70 ще ОН лерОде о вов опо
З пр в шк т --- Газ й твтт: ГНЕ сів я мот -- о шин ше жа ХЕ тн лов
АСсЕМ го 7 Ден «в н фін
КЕ. вас, НІ; ко со о в с . шо й деНМ А сн. мову 10
Сполуку 64 одержали за способами, описаними у Прикладі 2. Сполука 68 є в продажу.
Захисна група, застосована для Сполуки 68, є ілюстративною, і її не потрібно вважати обмеженням, оскільки можуть бути застосовані інші захисні групи, включаючи, але без обмеження, ті, які представлені в даному описі.
Приклад 34. Одержання Сполуки 75а о. св їй 1 помсня нію. же» ше 3. СЕЗСОВІ, МеОН но Вин КМ
Ме7-о он - Ж -Л - - в «ох Мои алто
Ки пан ї ТЕАЗНЕ,ТІФ її нка я Тефосфорипування 75 -з ТУ
ЕВ осв,
Сполуку 75 одержали за опублікованими методиками, описаними авторами 5псперіпом єї а!., Мисівїс Асід5 Незеагсі, 1997, 25(22), 4447-4454.
Приклад 35. Одержання Сполуки 79 прУпо о но о. І ху Ас пан сь Щ 1 Вис хаб де ПС, ХМ АСХ пите яти у й. А СВК Аа налтет тео
АсО ОАс МС я у я гакя » Я ло Х вин Ще нн а
АсНІ 0 хо щ і. НУРа МеОпП део Ас Що дек А нини та щ - га М З Тюефосфорюклування
Аа ра п ни вто пт ру Ва ман ч г - де і во А рин. рек ри од о Й де ОА МО
З І доб кл то
Що т по а ан К: доні ото де Ар
Асо дит ит тити ди дити Ти ви о лен ко А тео дсо Ос щу шт р: о пра й я Ше Шк:
Й Ж дсо
ІЧНАС -2
Сполуку 76 одержали за опублікованими методиками, описаними авторами 5псперіпом єї а!., Мисівїс Асід5 Незеагсі, 1997, 25(22), 4447-4454.
Приклад 36. Одержання Сполуки 79а що - Епос я МТВ поши фан нні ї ЕтосоїЇ ще пн а ги сх но г птн нт й. ВА, Н. Епос х яд ких о а, ОВа ЗГАС. Н; Кос тн Я» зле нал тас 5 ТПоефеєформлування того ек 77 та
Сполуку 77 одержали за способами, представленими у Прикладі 35.
Приклад 37. Загальний спосіб одержання кон'югованої олігомерної сполуки 82, що містить фосфодіестер-зв'язаний кон'югат СаІМАсз-2 на 5'-кінці, на твердій основі (Спосіб І)
ОМ бо ов Є дини ТОМ омтоо у т ол итчормт (І
А а -
МС о-во ІПСА ДдХМ еплтатитту а З ВСЕ ММ СМ ще а
Фосферамідит 56 пото сих у
АвтоуатичнУх скнтазатой а ; дивне
С) хімар-о-Р-дєтох
БИ с «А ть ц | .
Су хімар-о-водтисМ 5 п
Х 5 абе о х - во
Нх- тетероцеклчна спснова 1. Каплування іс ММ хо) 8. ВН у з. ІА ДМ Е дес Овес Ме. 4. ВСІ ХМІ АС й у ХМ а Фосфеаракідит 50 /
Ас а а а і ден отче - Ме у І депвОАс о о по а. ,вВх х т ла ни Р п-в-ет у й
Ас кт го з маки В К
АсНМ хе Оу о и А ан що о Ї З де пе кВА х -Щ її рак Га та нити до
МНАс а (І й х
Ї. Келування іс МАН, оУгі Зі зн 3. соб БОМА в'юлудні бобові 4. МН. Зо, 5 ноон
ГІ о) ях но-к ю. дО що че а ся "у пе - доНМ ба
М нОаОн 3 й сьо о ОО жов рот х - ши аз шко, м лий х ши ж й Щі ей я ноя а ай друку т- г С) Х и . о те од
АСНМ о о й й Оер-сх а їі а но щі 2-4 я Як шин пан шк іч ііі нОо-т нини
МНАсС Ко де саІМАсз-2 має структуру: нон (о; п т нь
АСНМ о у йо ноти ГФ) о о о О. ,Вх о. кити, р -в-
АснМ в) о о ото но он Ь. лм но
МНАс .
Кластерна частина СаіМАсз кон'югувальної групи (заїМАсз-2 (СееіМАсз-2а) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. При цьому СаІМАсз-2а має формулу: ноон о) а Іі
АСНМ о к он ін/Ф) о о о о но пли ооо оч
АснМ (в) (0) ноон ор. / но
МНАс .
МІМАЮ-зв'язану олігомерну сполуку 7960 одержали стандартними способами в автоматичному синтезаторі ДНК/РНК (див. Юироиу еї аї., Апдем/. Спет. Іпі. Ед., 2006, 45, 3623- 3627). Фосфорамідитні Сполуки 56 і 60 одержали так, як описано в способах у Прикладах 27 і 28, відповідно. Зображені фософорамідити є ілюстративними, і їх не потрібно вважати обмеженням, оскільки можуть бути застосовані інші фосфорамідитні будівельні блоки, включаючи, але без обмеження, ті, які представлені в даному описі, для одержання олігомерної сполуки, що містить фосфодіестер-зв'язану кон'югувальну групу на 5'-кінці. Порядок і кількість фосфорамідитів, що додаються до твердої основи, можуть бути підібрані для одержання олігомерних сполук, описаних у даному документі, що мають будь-яку бажану послідовність і склад.
Приклад 38. Альтернативний спосіб одержання олігомерної сполуки 82, що містить фосфодіестер-зв'язаний кон'югат Са!МАсз-2 на 5'-кінці (Спосіб І) ще ОО ,8х пМто У х тен о пла ДМ до В.І, ММ АС в Фосфорамідит 79
Ї Ото датопматичний сннтезатар
У дттх т яке Х - 5 або СГ
С) мА 0-0 д ре т й -1 вх - тетероцеклічна сенова «ль то о - - ї; де гі ЕВ
АсО м Є
АСНМ вто в
Ас з Г ять Її лк ! овожу : -М
АСНМ м з ша о шк Ос изо-в-о
А 9 г о в - у и а ІН олго
Ас й 1. Кепування (У упмао-о-в щу що ту --503 и К-й х в. ВВС
З БВБМСНСЕ ЇЇ облова 4 мн.
Сингомерна сполука 52
МІМАЮ-зв'язану олігомерну сполуку 795 одержали стандартними способами в автоматичному синтезаторі ДНК/РНК (див. Юиропу еї аї!., Апдем/. Спет. Іпі. Ед., 2006, 45, 3623- 3627). СзаіМАсз-2-кластерний фосфорамідит, Сполуку 79, одержали за способами, представленими у Прикладі 35. Альтернативний спосіб забезпечує можливість одностадійної установки фосфодіестер-зв'язаного саіМАсз-2 кон'югату на олігомерну сполуку на останній стадії синтезу. Зображені фосфорамідити є ілюстративними, і їх не потрібно вважати обмеженням, оскільки можуть бути застосовані інші фосфорамідитні будівельні блоки, включаючи, але без обмеження, ті, які представлені в даному описі, для одержання олігомерних сполук, що містять фосфодіестерний кон'югат на 5'-кінці. Порядок і кількість фосфорамідитів, що додаються до твердої основи, можуть бути підібрані для одержання олігомерних сполук, описаних у даному документі, які мають будь-яку бажану послідовність і склад.
Приклад 39. Загальний спосіб одержання олігомерної сполуки 83, що містить кон'югат
СаіМАсз-3 на 5'-кінці (саІМАсз-1, модифікований для 5'-кінцевого приєднання), на твердій основі дсо де у я) й ання М й 1. Но, РУС, МеОН (9396)
АснМ / г хто пи пи н ї 6 Її 2. пути а 7 м з | | 8За
М. дими ДМ ол В в во то Ї Гн щі хе о щ о я НВТИ, ОІЕА, ДМФА, 78965
АсоО--з
МНАс ден С 3. На, РИС, МеОН о у й
Пк 0-7 дсео Ас дво де 18 Гч дови дго- КО, о н 7 Ї ша н
МНАс ! кН ден тя в о о ф щу ї.
М Щ о 95 т он коло ММ лю. Її й тру оося доео Ос ик зр 83 ! З М в от х да о о вла (в) І
Е ЩІ я до . кор я Шк нм мо 8Зс
Піридин, ДМФА Що кв
ОАс /
Ї о 0-
Асо, ву х х до Оле до х кі о МНАс ; ; ває
АсО- Ко) Нн 8 тя ц БЕ (олюю | о-8-о-(снав-МНо деНМ хи лу о о / т х р і ЩІ - Ін
М Щі 9 о т й й-Е птн Пт вевкай но А--МН о Боратний буфер, ДМСО, рН 8,5, кімн. дсо Оле и те - ше кри ИН ще
Й у
Асо- Й р
МНАс дено ї
Р НО вза й с) одо РИ дсо си
Асо- х
МНАс
АсО чо
М-0
Асо (ке; Нн і а М ч нин ан ШО ІН СЕ в .
Ф н о о у
Коло оеД м 77 См-нав-о-р-о-( око дво ори г ДНІ жим 77 о
АсО-- у НА Щ с Ваг с рака ото / Зо
ОА. рн ко,
АСОМ
МНАс
Водний аміак но он ' ї но-0-о Ко) н Н ! Щ т дит, М
АснНМ її хи М падоижтня о о 9 нн он - Мк ж ------я (« 5
МОМ л-9А-ВН М (Снов-о-Ро- Соло ) но. їо о р Ша - хи К о о а уж ІФ) І нот нм м ЗЗп
МНАс но он /т о о0оО- но хо но
МНАс
Сполуку 18 одержали за способами, описаними у Прикладі 4. Сполуки 83а і 836 є в продажу.
Олігомерну Сполуку 83е, що містить з'єднаний через фосфодіестер гексиламін, одержали стандартними способами синтезу олігонуклеотидів. В результаті обробки захищеної олігомерної сполуки водним розчином аміаку одержали 5'-СаІМАсз-3 кон'юговану олігомерну сполуку (83), де саІМАсз-3 має структуру: но он ної о Н
АСНМ Ше шо: о пз оо о он он ная о.А-кй -(СНг)в-О-р-- рот нав Я: ДИ (в) но с
МНАс Нм о ва і в)
Со їв но ЗД» но
МНАс .
Кластерна частина СаіМАсз кон'югувальної групи СаЇМАсз-3 ((заїМАсз-За) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. При цьому СаІМАсз-За має формулу: но он но-К со Нн
АСНМ тра о) Мах в) (в)
МОМ. оо аа (СНодв-о- он У о.А-мй пеп2в-о- но Ге! 0-7 ок о Н но г
МНАс нм о вн і в) г о но Ул» но
МНАс .
Приклад 40. Загальний спосіб одержання олігомерної сполуки 89, що містить фосфодіестер- зв'язаний кон'югат СсаІМАсз-4 на 3'-кінці, на твердій основі
ОСІХЯТ ши я 1 СА пит ур б) схінормі С- - - - --- Тео си Ос ні З ІМЯ КМ АС я | но їй хе (фр мнОо-Р ри ран те г я ІІТ Е
Ні ін в еенан и Ї - а й ст ДоВодин СМ і 85
ПМІО. 00 ал 5. Капування опмто сх Ето 4 євІЮОЮН пил Т о улобиєє
Й пудри 3 (її ЮА г 1 755 зав тт ни і. яжтерую са ПВ, ре . д и тт збо ДМА й дит затр ООвлює юс кН ; І ем и
З. ІСІ ХМ АС ФВ мін О- Ряди ве !
Фосфораміднт 78 що а
ЗвховижтечнУй синтеате 1. Кепування дню В. 3. 2бавую сові;
Ас пас Збза ДУКВ дсео г а КЛ КМ АС й З фосфорамідні 50 в 7 5. Кепунання со Сас - "а щ а--
Ассо у -й Мо Кк в; й о. сх п й -О т дев Мч за ш а- як , пу Ка: ;
Он тв-о - ВИТ а і 87 о, Я Годі -о НИ шо
Ве ей - ГУ. дсо Ос нак: й І й | Ск дсо І С) сласо-в-от
ЧНАс 1 вон Шлано ьо
З гуча ОО -. 1 аль 3 Синтез опіомеру (звтоматичний синтезатор
ДНЮРНЮ. й Кепування х. Окиснення 8 БВМСНЯ Мі. ад
АБО дае о
Со й З ї
АсНМО ту, ще
Асо де т о
ЩИ -Е сен а о ше ши Ся ре шу
АЕН ень, г з СК ще бе й ее и ви ще п чне І не ен м 7
З меня а І щ Я с ДИДИХ . "ж нях, кеш САН шк т де: Й Кк Ме х ЩІ осн, де Ме я й й Клея ГУ й й р
Що а о а Ж биту го
Дан ї ПТ еЯ Оп нету Б: ПИ А А аа - І | йонів іх Кк рю
МНАЄ ки р Іо 6. нини їз не он аЕНМ О-О ан пато, ск ях но он З в 5. АДДИКЯ що яр наду-но шо ше шу ВО шо
А ше деНМ мч з (її м и КУ тр ДЕ ча
З ЕК НВ Мк ще К;
ЕВ. 7 зо ря Ї їег3 г. явно й і г як ї й. ше не їЕ г бе не - Кок ян ! на Ко; Іа ді іо Зк її да п ння дено
МНАе Солюю ем де СаІМАсз-4 має структуру:
НО он но о)
АСНМ о но он в Ко;
Оо-в нов бо
АСНМ ни о; о"
Р. (9) О., / год т (9)
Р-- о, /0 о (Ф) 5
МА (см) де СМ являє собою розщеплюваний фрагмент. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою:
Ши
О-Р-ОН М ше ою. тру 9
О-Р-ОНн 4
Кластерна частина СаіМАсз кон'югувальної групи (заїМАсз-4 (Са|ІМАсз-44) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. При цьому СаІМАсз-44а має формулу:
НО он ів) (о,
АСНМ о но ОН де о //
Оо-Р но бо (о, -КХ о
АСНМ о о-
Р. (9) о. / гол - (6) ;В-- нот о оо У І-х
ХМ ото он но ко
МНАс
Захищена Сполука 30 на функціоналізованій твердій основі ОпуїїпКег є в продажу. Сполуку 84 одержали за такими ж способами, як описані в літературі (див. Зпсоперіпом еї аї., Мисівїс
Асіаз Везєагсі, 1997, 25(22), 4447-4454; ЗнеПперіпом еї аї., Мисієїс Асідх Везвєагсі, 1999, 27, 3035-3041; і Ногппеї єї а!., Мисієїс Асід5 Кезеагсі, 1997, 25, 4842-4849).
Фосфорамідитні будівельні блоки, Сполуки 60 і 79а, одержали за способами, представленими у Прикладах 28 і 36. Зображені фосфорамідити є ілюстративними і не призначені для обмеження, оскільки можуть бути застосовані інші фосфорамідитні будівельні блоки для одержання олігомерної сполуки, що має фосфодіестер-зв'язаний кон'югат на 3'"-кінці, яка має бажану послідовність і склад. Порядок і кількість фосфорамідитів, що додаються до твердої основи, можуть бути підібрані для одержання олігомерних сполук, описаних у даному документі, які мають будь-яку бажану послідовність і склад.
Приклад 41. Загальний спосіб одержання АБО, що містять фосфодіестер-зв'язаний кон'югат
СаіМмАсз-2 (див. Приклад 37, Вх являє собою аденін) у 5'-положенні, твердофазним способом (одержання І5І5 661134)
Якщо не вказано інше, всі реагенти і розчини, застосовані для синтезу олігомерних сполук, придбані у комерційних постачальників. Стандартні фосфорамідитні будівельні блоки і тверду основу застосували для введення нуклеозидних залишків, які включають, наприклад, залишки
Т, А, о і "С. Фосфорамідитні сполуки 56 і 60 застосували для синтезу фосфодіестер-зв'язаного кон'югату СаіМАсз-2 на 5'-кінці 0,1 М розчин фосфорамідиту у безводному ацетонітрилі застосували для ВД-ЮО-2"-дезоксирибонуклеозиду і 2'-МОЕ.
Синтез антисмислових олігонуклеотидів (АБО) виконали на синтезаторі АВІ 394 (у масштабі 1-2 мкмоль) або на синтезаторі ДКТА Оїідоріюї виробництва ЗЕ Неаййсаге Віозсіеєпсе (у масштабі 40-200 мкмоль) за способом фосфорамідитного зв'язування на твердій основі МІМАЮ (110 мкмоль/г, Си?гаєм еї а!., 2003), упакованій в колонку. Для стадії зв'язування фосфорамідити вводили у 4-разовому надлишку порівняно з первинним завантаженням на твердій основі, а зв'язування фосфорамідиту виконували протягом 10 хвилин. Всю решту стадій виконували за протоколами, наданими виробником. Для видалення диметокситритильних (ОМТ) груп з 5'-
Зо гідроксильних груп нуклеотиду застосували 6 96 розчин дихлороцтової кислоти у толуені. На стадії зв'язування як активатор застосували 4,5-диціаноїмідазол (0,7 М) у безводному СНЗСМ.
Тіофосфатні зв'язки вводили сульфіруванням за допомогою 0,1 М розчину гідриду ксантану в суміші піридину/СНзСМ 1:11 протягом часу контакту З хвилини. Як окиснювальний агент для забезпечення фосфодіестерних міжнуклеозидних зв'язків застосували 2095 розчин трет- бутилгідропероксиду в СНІСМ, що містить 6 95 води, протягом часу контакту 12 хвилин.
Після збирання бажаної послідовності ціаноетил-фосфатні захисні групи знімали за допомогою 20 об./0б. 95 діетиламіну в толуені протягом часу контакту 45 хвилин. Зв'язані з твердою основою АБО суспендували у водному розчині аміаку (28-30 мас. 95) і нагрівали при
55 "С протягом 6 годин.
Потім відфільтровували незв'язані АБО і випаровували аміак кип'ятінням. Залишок очищували рідинною хроматографією з високим тиском на високоактивній аніонообмінній колонці (СЕ Неайсаге Віозсіепсе, Зоцгсе 300), 30 мкм, 2,54 х 8 см, А-100 мМ ацетату амонію в 30 95 водному СНЗСМ, В-1,5 М МавВг в А, 0-40 95 В за 60 хвилин, швидкість потоку 14 мл.хв-ї,
А-260 нм). Залишок знесолювали за допомогою ВЕРХ на обернено-фазовій колонці з одержанням бажаних АБО з виділеним виходом 15-30 95 відносно первинного завантаження на тверду основу. АБО характеризували за допомогою іон-парної ВЕРХ, сполученої з МС-аналізом на системі Адіїепі 1100 М50.
Таблиця 21
АБО, що містять фосфодіестер-зв'язаний кон'югат СаІМАсз-2 у 5'-положенні, націлені на 5КВ-1 . . «рт ' Розрахункова |Спостережу-| ЗЕО І ав" Св Га Тк" Ск
Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЄЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-0-2- дезоксирибонуклеозид; "К" позначає 6'-(5)-СНз біциклічний нуклеозид (наприклад, СЕЮ; "5" позначає тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки (Р); "о" позначає фосфодіестерні міжнуклеозидні зв'язки (РО); і "ої'» позначає -О-Р(-ОХОН)-. Верхній індекс "т" позначає 5-метилцитозини.
Структура СаІМАсз-24, представлена у Прикладі 37.
Приклад 42. Загальний спосіб одержання АБО, що містять кон'югат СаМАсз-З у 5- положенні, за твердофазними методиками (одержання І5ІЗ 661166)
Синтез І5І5 661166 виконали за такими ж способами, як представлені у Прикладах 39 і 41.
ІБІЗ 661166 являє собою 5-10-5 МОЄ гепмер, у якому 5'-(положення містить кон'югат
СаіМАсз-3. Це АБО характеризували за допомогою іон-парної ВЕРХ, сполученої з МС-аналізом на системі Адіїепі 1100 М50.
Таблиця 21а
АБО, що містить кон'югат СаІМАсз-3 у 5'- положенні через гексиламіно-фосфодіестерний зв'язок, націлений на Маїаї-1 маса вана маса МО. 5-СаіМАсз-За-о"Сев(ЗевСТев ГезСев в'-«СаІМАсз- 661166 тоавАвазАввСавСав""Сав Газ ГазАвде Став З З 8992,16 8990,51 27
СіезАезАез Тез Те
Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЄЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-0-2- дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки (Р); "о" позначає фосфодіестерні міжнуклеозидні зв'язки (РО); і "о"'» позначає -0О-Р(-ОХОН)-. Верхній індекс "т" позначає 5-метилцитозини. Структура "5'-СаІМАсз-За" представлена у Прикладі 39.
Приклад 43 Дозозалежне дослідження фосфодіестер-зв'язаного (заіМАсз-2 (див. Приклади
Ко) 37 і 41, Вх являє собою аденін) на 5'-кінці, націленого на 5В88В-1, іп мімо
ІБІ5 661134 (див. Приклад 41), що містить фосфодіестер-зв'язаний кон'югат СаІМАсз-2 на 5'- кінці, випробовували в дозозалежному дослідженні на антисмислове інгібування 5АВ-1 у мишей. Некон'юговані І5І5 440762 і 651900 (кон'югат СаіМАсз-ї у 3-кінця, див. Приклад 9) включені в дослідження для порівняння і описані раніше у Табл. 4.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей ВаїбБ/с (даскзоп І арогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки ІБІ5 440762, 651900, 661134 або РВ5 як контрольний зразок. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів МРНК 5КВ-1 в печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення. РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Рівні мРНК 5КВ-1 визначали відносно загальної РНК (за допомогою Кіродгееп), потім нормалізували до контрольного зразка, обробленого РВ5. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого РВ5, і позначені як «95 РВ5". ЕЮОво вимірювали такими ж способами, як описані раніше, і вони представлені нижче.
Як показано в Табл. 22, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином. Дійсно, антисмислові олігонуклеотиди, що містять фосфодіестер- зв'язаний кон'югат СаІМАсз-2 на 5'-кінці (ІЗІЗ 661134) або кон'югат саЇМАсз-1, зв'язаний на 3- кінці (ІБІ5 651900), демонструють значне покращення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (І5ІЗ5 440762). Крім того, І5БІ5 661134, який містить фосфодіестер-зв'язаний кон'югат (заіМАсз-2 на 5'-кінці, був настільки ж ефективним, як і І5ІЗ 651900, що містить кон'югат заІМАсз-1 на 3'-кінці.
Таблиця 22
АБО, що містять СаІМАсз-1 або СаІМАсз-2, націлені на ЗК В-1
РВ5 | 0 | ющ лю Її 7-1 - Її « 440762.ї2169 2,58 Без кон'югату 22 651900 0,26 3" СсаіМмАсз-1 23 7 | в' 02 | 86 661134 0,25 5" СаїмАсз-2. 26 7 | 6
Структури 3" СаІМАсз-1 і 5" (заЇМАсз-2 описані раніше у Прикладах 9 і 37.
Фармакокінетичний аналіз (ФК)
ФК для АБО з групи високої дози (7 мг/кг) дослідили і оцінили в такий же спосіб, як описано у
Прикладі 20. Зразки печінки подрібнили і екстрагували за стандартними протоколами.
Ідентифікували метаболіти повної довжини 661134 (5" сзаіМАсз-2) і ІБІ5 651900 (3" СаІМАсз-1) і підтвердили їх маси за допомогою мас-спектрометричного аналізу з високим розрізненням.
Результати показали, що основним метаболітом, знайденим для АБО, що містить фосфодіестер-зв'язаний кон'югат СаїІМАсз-2 на 5'-кінці (І5І5 661134), був ІЗІЗ 440762 (дані не показані). Не спостерігали жодних додаткових метаболітів у придатній для виявлення кількості.
На відміну від нього, для АБО, що містить кон'югат саіМАсз-1ї на 3'-кінці (І5І5 651900), спостерігали додаткові метаболіти, аналогічні описаним раніше у Табл. 10а. Ці результати дозволяють припустити, що наявність фосфодіестер-зв'язаного кон'югату саїЇМАсз-1 або
СаіМмАсз-2 може покращувати ФК профіль АБО без погіршення їх ефективності.
Приклад 44. Вплив РО/РБ зв'язків на антисмислове інгібування АБО, що містять кон'югат
СаіМАсз-1 (див. Приклад 9) на 3'-кінці, націлених на 5АВ-1
Зо ІБІБ 655861 і 655862, що містять кон'югат (заіМАсз-1 на 3'-кінці, кожен з яких націлений на
ЗВАВ-1, випробували в дослідженні одноразового введення відносно їх здатності інгібувати 5АВ- 1 у мишей. Початкову некон'юговану сполуку, ІЗІЗ 353382, включили в дослідження для порівняння.
Ці АБО являють собою 5-10-5 МОЄ гепмери, у яких геп-ділянка містить десять 2'- дезоксирибонуклеозидів, і кожна ділянка крил містить п'ять 2-МОЕ модифікованих нуклеозидів.
Ці АБО одержали за такими ж способами, як показані раніше у Прикладі 19, і вони описані нижче у Табл. 23.
Таблиця 23
Модифіковані АБО, що містять кон'югат СаІМАсз-1 на 3'-кінці, націлені на 5ЗКВ-1
ЗЕО
ІБІВ Мо Послідовність (від 5" до 3") Хімізм ІО
МО. 353382 т т т т т т ї (почат- Сев"Сев Тез Гев'"СевАвдеСав Гав'"СавАвв ГавСтазАвав"Сав Газ Ге'""Сев Тільки РБ, без 28 кова СевТевТе кон югату
СевТев Тео Адо-С3аЇМАсз-1 а кон'югатом Са!ІМАсз- 1 тав Гах Гео"Сео"Сев Ге ГеоАао-СЗатмМАсз- 1 а кон'югатом СаімМАсз-1
Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЄЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-0-2- дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки (Р); "о" позначає фосфодіестерні міжнуклеозидні зв'язки (РО); і "ої'» позначає -0О-Р(-ОХОН)-. Верхній індекс "т" позначає 5-метилцитозини. Структура "ЗаІМАсз-1" представлена у Прикладі 9.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей ВаїбБ/с (даскзоп І арогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки ІБІ5 353382, 655861, 655862 або РВ5 як контрольний зразок. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Перед лікуванням, а також після останньої дози у кожної миші брали кров і аналізували зразки плазми.
Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів мРНК
ЗАВ-1 в печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Рівні мРНК 5КВ-1 визначали відносно загальної РНК (за допомогою Кіродгееп), потім нормалізували до контрольного зразка, обробленого РВ5. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого РВ5, і позначені як «95 РВ5". ЕЮво вимірювали за такими ж способами, як описані раніше, і вони представлені нижче.
Як показано в Табл. 24, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином, порівняно з контрольним зразком, обробленим РВ5. Дійсно, антисмислові олігонуклеотиди, що містять кон'югат (заіМАсз-1 на 3'-кінці (ІЗІ5 655861 і 655862), демонструють значне підсилення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (І5І5 353382). Крім того, І5І5 655862 із змішаними РБ/РО зв'язками демонструє підсилення ефективності, порівняно із сполукою, що містить тільки Р (І5І5 655861).
Таблиця 24
Вплив РО/РЗ зв'язків на антисмислове інгібування АБО, що містять кон'югат
СаМАсз-1 на 3'-кінці, націлених на 5АВ-1
Доза Рівні мРНК ЕОбво г.
РВ5 170 Ї17717100 ЇЇ 7-1 Ї177711111171-11Ї1111 353382 Тільки Р5, без (початкова) 10,4 кон'югату 28
Тільки Р5 з кон'югатом бооев! 26 |баімАсзя що
Змішані РБ/РО з 655862 18 |кон'югатом СаїМАсз-1 23
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АТ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також масу органів. Результати показують, що не спостерігали жодного збільшення рівнів трансамінази (Таблиця 25) або маси органів (дані не показані) у мишей, оброблених АБО, порівняно з РВ5 контролем. Крім того, АБО із змішаними РБ/РО зв'язками (ІЗІЗ 655862) демонструє подібні рівні трансамінази, порівняно із сполукою, що містить тільки РБ (ІЗІ5 655861).
Таблиця 25
Вплив РО/РЗ зв'язків на рівні трансамінази АБО, що містять кон'югат
СаМАсз-1 на 3"-кінці, націлених на 5АВ-1
АТ А5Т г.
ІЇЗІЗ Мо Доза (мг/кг) (Од/л) (Оді/л) ЗЕО І МО
С РВ5 | 0177 285 | 65 | - / 78 | 5025 | 89 |. 353382 З 50,25 Тільки Р, без (початкова) конюгат 28 у
Тільки Р з бооев! аїМАсз-ї що
Змішані РБ/РО з баби ГО75О 1 72953 | 69 |бамдозя що
Приклад 45. Одержання РЕР естеру, Сполуки 11ба ання дк РШС, Во пас пдв 7 ли АС Ед є Маезн с- /5 п 1о38; пе к-ла па що ний мо - 1035 п: 7 АС няття 7
Й ше - ь я '|"«;-- я т юю ВснНМ Зода; пн ' у 1 пе я ! 3 рас дого др»
АЕНМ Я о ' о
Сас уп ; ОСА с оох г шк: им
З цооБЕВОТЯ щ н
Незви швни ви палка ж вс ДИФА, ДУ денім щу п і І Но: аа; пи блвапука що Обдсє пд о й
АД - ми че
ПО пт у - карі дво а, соя он З 1ова; пт ово; пе т
Ас и мн о. о
САс соде - дм
Бач но и Н НЕТ, СЕ, ДИ ФА -- 6 :- - - - - о Ку що паля зттру тя МН Мн. пп якій
МеОН, ЕЮ Ас АсНМ в Ге : 8 п
Сас опаде й ето деле инто ною со си К диня СЯ пох дсНМ 29 т07а пт
ЗУ пи У
САє вно о ке дове 00 ТМ шли ве
АсО лить пиття 1
АСНМ п пана ши щ й г 9
Сас ппове у дит них всо сення о З
АсНіч чо тва: леї де чОаЗБ п- 7 ї
Ни
Сідє кофедою - АсСНУ (З п
Ра, На па Й : й
За вп Ес. мес Оле мн миль Я
ЗвБн я 00000007 код о іде о деню Мн мА
АеЕНМ т па хо а с-г дет у НИ Зо
Асо ни ЕІ т Що ден я 1098: п щи 1 я п-ї но
САС веб рес оле мнМ7 З о я;
ОАс о оде пат 0 я Н
Асо ре прорна пиття чн
РЕВ-тТФК що г у-
ВМФА ру удо Що -----6И6НННН кА с аа а ; това асо ян вен А вчу 1108 го Е
БО
Сполуку 4 (9,5 г, 28,8 ммоль) обробили окремо сполукою 103За або 10356 (38 ммоль) і ТМ5ОТІ (0,5 екв.), і молекулярними ситами в дихлорметані (200 мл), і перемішували протягом 16 годин при кімнатній температурі. Потім органічний шар відфільтрували крізь целіт, далі промили бікарбонатом натрію, водою і насиченим сольовим розчином. Потім відокремили органічний шар і висушили над сульфатом натрію, відфільтрували і упарили при зниженому тиску.
Одержану маслянисту речовину очистили хроматографією на силікагелі (2 95-10 95 метанолу/дихлорметану) з одержанням сполук 104а і 1046 із виходом »80 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 104а і 10465 обробили в тих же умовах, що і сполуки 100а-4 (Приклад 47), з одержанням сполук 105а і 1056 з виходом 290 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 105а і 10565 окремо обробили сполукою 90 за тих же умов, що і сполуки 901а-й, з одержанням сполук 106ба (80 Фо) ії 1066 (20 95). Дані РХМС ії протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 10ба і 106р обробили в тих же умовах, що і сполуки 9ба-і (Приклад 47), з одержанням сполук 107а (60 9в5) і 1076 (20 95). Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 107а і 107606 обробили в тих же умовах, що і сполуки 97а-і (Приклад 47), з одержанням сполук 108а і 1086 з виходом 40-60 9о. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 108а (60 9б5) і 1085 (40 95) обробили в тих же умовах, що і сполуки 100а-4 (Приклад 47), з одержанням сполук 109а і 1090 з виходом »80 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуку 109а обробили в тих же умовах, що і сполуки 101а-4 (Приклад 47), з одержанням сполуки 110а з виходом 30-60 905. Дані РХМСОС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. Альтернативно, Сполука 1106 може бути одержана в такий же спосіб, виходячи із
Сполуки 1096.
Приклад 46. Загальний спосіб кон'югації з РЕР естерами (олігонуклеотид 111); одержання
ІБІ5 666881 (Сіа!МАсз-10)
Синтезували і очистили 5'-гексиламіно-модифікований олігонуклеотид за стандартними способами твердофазного одержання олігонуклеотидів. 5'-Гексиламіно-модифікований олігонуклеотид розчинили в 0,1 М розчині тетраборату натрію, рН 8,5 (200 мкл) і додали З екв. вибраного РЕР-естерифікованого кластера саіМАсз, розчиненого в ДМСО (50 мкл). Якщо при додаванні розчину АБО естер РЕР осаджувався, то додавали ДМСО до переходу всього естеру
РЕР у розчин. Реакція була завершена через близько 16 годин перемішування при кімнатній температурі. Одержаний розчин розбавили водою до 12 мл, а потім центрифугували при 3000 об/хв. у віддентровому фільтрі з відсіканням по масі 3000 Да. Цей прийом повторили двічі для видалення низькомолекулярних домішок. Потім розчин ліофілізували до сухого стану, повторно розчинили в концентрованому водному розчині аміаку, і перемішували при кімнатній температурі протягом 2,5 годин, після чого концентрували під вакуумом для видалення більшої частини аміаку. Кон'югований олігонуклеотид очистили і знесолили за допомогою ОФ-ВЕРХ, та ліофілізували з одержанням СаїЇМАсз кон'югованого олігонуклеотиду. й що о ве. о оо й
У 5 Ї с ки шо У а ("вяко 1-0-2-0-СНав-чН: он сон тити
Он ве У й - ба 0 --ЖЯ т о т т т «Нео НО ит тм ж 1 Борятний буфер, ДМОСО. рН В. 5. юМмн. 1-рз ЗсНМ - ми 2. МА сводя о» КНЯНО Тора й са но Ко дети В Ко
АСНМ б
Сввге (в) о МН 113
Олігонуклеотид 111 кон'югований із баіІМАсз-10. Кластерна частина СаІМАсз кон'югувальної групи аіМАсз-10 ((заїМАсз-104) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-О)(ОН)-Аа-Р(-О)(ОН)-, як показано нижче в олігонуклеотиді (І5І5 666881), синтезованому з СаІМАсз-10. Структура СаіМАсз-10 (СаІМАсз- 104-СМ-) представлена нижче: нон Н но ка о (в)
АснМ ноон о є! о нок ММ рто-(м)--
АснМ нооНн мо нота Й
АснМ
За вказаним загальним способом одержали І5І5 666881. Синтезували і очистили 5'- гексиламіно-модифікований олігонуклеотид, І5ЗІ5 660254, за стандартними способами твердофазного одержання олігонуклеотидів. І5І5 660254 (40 мг, 5,2 мкмоль) розчинили в 0,1 М розчині тетраборату натрію, рН 8,5 (200 мкл) і додали З еквіваленти РЕР естеру (Сполука 110а), розчиненого в ДМСО (50 мкл). Ефір РЕР осаджувався при додаванні розчину АБО, тому необхідно додати додаткову кількість ДМСО (600 мкл) для повного розчинення РЕР естеру.
Зо Реакція була завершена через 16 годин перемішування при кімнатній температурі. Розчин розбавили водою до загального об'єму 12 мл, а потім центрифугували при 3000 об/хв. у віддентровому фільтрі з відсіканням по масі 3000 Да. Цей прийом повторили двічі для видалення низькомолекулярних домішок. Розчин ліофілізували до сухого стану і повторно розчинили в концентрованому водному розчині аміаку, перемішуючи при кімнатній температурі протягом 2,5 годин, і далі концентрували під вакуумом для видалення більшої частини аміаку.
Кон'югований олігонуклеотид очистили і знесолили за допомогою ОФ-ВЕРХ, та ліофілізували з одержанням І5І5 666881 з виходом 90 мас. 95 (42 мг, 4,7 мкмоль).
СаіМмАсз-10-кон'югований олігонуклеотид
ІБІ5 660254 Гексиламін 30 тоавАвв ГавСіавАвав"Сав Гав Гев"Сев'"Сев Гев Ге пвівввввВ СаіМАсз-1 Оа-о АдоСіев""Сев Ге Гез'"СевАвавзСвв ТІ ав бамАсото 0030
ІБІ5 666881 СаімМАсз-10 30 тоавАвв ГавСіавАвав"Сав Гав Гев"Сев'"Сев Гев Ге З
Заголовні букви вказують на азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2-«МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О- 2г"-дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (РБ); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Приклад 47. Одержання олігонуклеотиду 102, що містить СаіМмАсз-8 0 я З во На У МН осн трретм це й дід: пт й ст ну но с аа еНк я й пак ях
З МО дів ян Восню Тор МН ах мог С ТКОДХМ
Й щ РЕР-ТОЖ ДІРА, ДМА, о
НО У сі ЩЕ ї Восн нм з
Зап щ о пах нажоуєтм й в ц
ООвро сде наАТМН мо» тич тмвОот дхМ
ЩО | де КО од - 7. : - - '-«-
З АСНМ з на НМ «и и
ЗЗап-ї
ЗБ в-
З4іва опе щи о Оде ок
Оде од ул Ви рудою н о а до З но Щй ко во. Др итчурон
Що М пий СНІ т В ' у тивотІ Тіт й
САС
АСНМО М ДИ рн ми о щ тн ем
За 38) ло ААВЄ а щ нам н - ' «2: 5 Я - о стердх МН ш-я СЯ МОН: - кості са; : А МА Щоб о -ЗШВУНВИНИНННН
НВТИ, ПІРЕХ, со о щі т ню г МО
ПА лог
ДІВА С одеосод ц г ше -
Збал-ї. пі
БВ ов ви сопе, т
Б ей птене
АеНМ али ня о т Н ак НЕТИ ПІБА, ДМА що дини ще и
АрО Кв о т мов Ше МН:
АснМ Н ЩІ а ОбМтт
ОСОдє сОде ц щі но с
Свв. дич ду» вро » Щ " х т фи ТЯ ї М ден Но з
Я7вія-і т-ї - 87. п-й т
Затв ть спаде со -бАс ша нор асНМ о М іди р н кп
САЄ ЗАС о Нн Й т що - ч о ОМ ден ЦО
СДС пдАе о 7 ї еВ й шко " що лосося Ди ки то я Он еВ т п ден т аба:п-ї ті!
Я пе тег
Зсо вжи, те
ЯВИ пе, тег
ОАс мо со 9) денм о М--о ТО ди ?
НВТИ, ОІЕА, ДМФА Н що о 97а; п-1, т т дее Ге) н о
ЯТЬ; пе1, та ---- ри чи й 97с: пт, т о до ло ин М о 974; п-2, т-2 В АСНМ н 5 Н "Ва ноз Ото: " во н
Ге) М НМ 59 "осн щ- жу вки й о 100а; п-1, т 1005; п-1, т-2 10Ос; п-2, т: 1
ОАс 1004; п-2, т-2 лего сусло Ге)
АсНМ отож (в) 2 о, А РЕР-ТФК, ДМФА, руг - же у дво 9, лю вн м оно
АсНМ н Н ос лов Н о (в)
Се (9) М НМ 1014; п-1, т-1 сни й тр й ? 1016; п-1, т-2 о 101с; пе2, те 1 1014; п2, т:2
ОАс вео (со сне (9) о
АсНМ З отиту ? Е вс соде о й й о рі (в) ше Е ев ет А До,
Фенм н Го Н Й
ОАс Одес Н о о двотсто. и нч є) 102а; п-1, т-1
АснМ т о п 1026; п-1, т-2 102с; п-2, т 102а; п-2, т-2
Трикислотну сполуку 90 (4 г, 14,43 ммоль) розчинили в ДМФА (120 мл) і М, М-
діізопропілетиламіні (12,35 мл, 72 ммоль) По краплях додали пентафлуорфенілу трифлуорацетат (8,Р9 мл, 52 ммоль) в атмосфері аргону і залишили реакційну суміш перемішуватися при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Додали Вос-діамін 91а або 916 (68,87 ммоль) разом з М, М-діїзопропілетиламіном (12,35 мл, 72 ммоль) і залишили реакційну суміш перемішуватися при кімнатній температурі протягом 16 годин. Потім упарили ДМФА на »75 о при зниженому тиску, і далі розчинили суміш в дихлорметані. Органічний шар промили бікарбонатом натрію, водою і насиченим сольовим розчином. Потім відокремили органічний шар і висушили над сульфатом натрію, відфільтрували і упарили при зниженому тиску до маслянистого залишку. Одержану маслянисту речовину очистили хроматографією на силікагелі (2 96-10 95 метанолу/дихлорметану) з одержанням сполук 92а і 925 з приблизним виходом 80 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуку 92а або 925 (6,7 ммоль) обробляли 20 мл дихлорметану і 20 мл трифлуороцтової кислоти при кімнатній температурі протягом 16 годин. Одержаний розчин випарували, а потім розчинили в метанолі і обробляли смолою ВООМ/ЕХ-ОН протягом 30 хвилин. Одержаний розчин відфільтрували і упарили до маслянистої речовини при зниженому тиску з одержанням 85-90 Фо виходу сполук 93За і 936.
Сполуку 7 або 64 (96 ммоль) обробляли НВТИ (3,7 г, 9,6 ммоль) і М, М- діізопропілетиламіном (5 мл) в ДМФА (20 мл) протягом 15 хвилин. До суміші додали сполуку 9За або 935 (3 ммоль) і залишили перемішуватися при кімнатній температурі на 16 годин. Потім упарили ДМФА на »75 95 при зниженому тиску, і далі розчинили суміш в дихлорметані.
Органічний шар промили бікарбонатом натрію, водою і насиченим сольовим розчином. Потім відокремили органічний шар і висушили над сульфатом натрію, відфільтрували і упарили при зниженому тиску до маслянистого залишку. Одержану маслянисту речовину очистили хроматографією на силікагелі (5 96-20 956 метанолу/дихлорметанолу) з одержанням сполук 96а- а з виходом 20-40 9о. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 9ба-й (0,75 ммоль) окремо гідрогенізували на нікелі Ренею протягом З годин в етанолі (75 мл). Потім каталізатор видалили фільтруванням крізь целіт, а етанол видалили при зниженому тиску з одержанням сполук 97а-й з виходом 80-90 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Ко) Сполуку 23 (0,32 г, 0,53 ммоль) обробляли НВТИО (0,2 г, 0,53 ммоль) і М, М- діізопропілетиламіном (0,19 мл, 1,14 ммоль) в ДМФА (30 мл) протягом 15 хвилин. До суміші окремо додали сполуки 97а-4 (0,38 ммоль) і залишили перемішуватися при кімнатній температурі на 16 годин. Потім упарили ДМФА на 275 95 при зниженому тиску, і далі розчинили суміш в дихлорметані. Органічний шар промили бікарбонатом натрію, водою і насиченим сольовим розчином. Потім відокремили органічний шар і висушили над сульфатом натрію, відфільтрували і упарили при зниженому тиску до маслянистого залишку. Одержану маслянисту речовину очистили хроматографією на силікагелі (2950-2095 метанолу/дихлорметану) з одержанням сполук 9ва-4 з виходом 30-40 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуку 99 (0,17 г, 0,76 ммоль) обробляли НВТИО (0,29 г, 0,76 ммоль) і М, М- діззопропілетиламіном (0,35 мл, 2,0 ммоль) в ДМФА (50 мл) протягом 15 хвилин. До суміші окремо додали сполуки 97а-4ї (0,51 ммоль) і залишили перемішуватися при кімнатній температурі на 16 годин. Потім упарили ДМФА на 275 95 при зниженому тиску, і далі розчинили суміш в дихлорметані. Органічний шар промили бікарбонатом натрію, водою і насиченим сольовим розчином. Потім відокремили органічний шар і висушили над сульфатом натрію, відфільтрували і упарили при зниженому тиску до маслянистого залишку. Одержану маслянисту речовину очистили хроматографією на силікагелі (5905-2095 метанолу/дихлорметану) з одержанням сполук 100а-й з виходом 40-60 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 100а-а (0,16 ммоль) окремо гідрогенізували на 10 95 РА(ОН)2г/С протягом З годин в метанолі/етилацетаті (1:11, 50 мл). Потім каталізатор видалили фільтруванням крізь целіт, а органічні розчинники видалили при зниженому тиску з одержанням сполук 101а-4 з виходом 80- 90 95. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Сполуки 101а-4 (0,15 ммоль) окремо розчинили в ДМФА (15 мл) і піридині (0,016 мл, 0,2 ммоль). По краплях додали пентафлуорфенілу трифлуорацетат (0,034 мл, 0,2 ммоль) в атмосфері аргону і залишили реакційну суміш перемішуватися при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Потім упарили ДМФА на »75 95 при зниженому тиску, і далі розчинили суміш в дихлорметані. Органічний шар промили бікарбонатом натрію, водою і насиченим сольовим розчином. Потім відокремили органічний шар і висушили над сульфатом натрію, бо відфільтрували і упарили при зниженому тиску до маслянистого залишку. Одержану маслянисту речовину очистили хроматографією на силікагелі (290-595 метанолу/дихлорметану) з одержанням сполук 102а-4 із приблизним виходом 8095. Дані РХМС і протонного ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. г ш3е
Сейто ро--очснлаомн; вв
БОрЕТНИМ будо, ДМК рн В.В. кімн. тора
Яд оостнннннннннннннннннтннннтнннттнннттнннтннннн-
Яд. водновакак, ка пера нота втеч
НО: їх їх я щи -3 ин ноя поле отннчии ДК До
ЩІ зн ан ет НИ нон о -- Се ух -- ке но-іло В, тити й - БІ: 7 Е 7 н не ден
Олігомерну Сполуку 102, що містить кон'югувальну групу СамМАсз-8, одержали за загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина СаїЇМАсз кон'югувальної групи СзаіМАсз-8 ((3аїМАсз-8ва) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У переважному варіанті реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою - Р(-ОХОН) -
А-Р(-ОХОН).-.
Структура СаЇІМАсз-8 (Са!МАсз-8а-СМ-) представлена нижче: ноОн (в) ГФ) г) тре но-кстао ла:
АснМ (в) (в) (в) ноон пенал (ер но 4 Н 2 но
АсНнМ й нооН (в)
АСНМ ,
Приклад 48. Одержання олігонуклеотиду 119, що містить СаІМАсз-7 всООАЄ дсп ОАЕ хо і 2 . піч ТВО ДХЕ Вспох сх мно РшОНнюЄ 7 хо з Й Ії са и 4. Ед " С но схя і: ех дек вк МЕС во чої нал я п вози Й о а й зЕв но но.
Ша по НЕТТО, ФЕВ по ЩІ 7 95 о- ДМА в г і я мновІ --------5х деп Хорта рон -- но ка А Ки ден | б в В 058 ци с 13 дво бАс
Її - НО. вдо. й рен ди сі
Х я... АСНЯ вго Ас
В н НЕ лох тк що асо Кл А ша одн вон й в с ще ове кч ке з й
Ас блять вн
АНМ їн доо УА
Ії. - в я до Ко ния : не з 4
АН - ще йсю ОА 1 сно 7 кА з 114 сон Ас ль, ! в тин ший Пи и ве і ІН 2 дсню 8 не
Аео Се ра її о. Я дод і 4 дон тів вс ва м і н ню ; З де код ен р
Ї 4 ї гу ЯКА Му з
НТ, СЕ, дм. У доб ОАде дені З а о ня ще ще ме! ж Кс до Ко, юн ВМ ЯМ, аз їз чи ее з Ки ри ж ї Це кож ен її Що ! Ї сн а 2: ек а а а і
ЦІ ов її тн ми? ря с в; де З а. Ге! Іа Е ек сі 7 й я вза леНМ зів
Сполуку 112 синтезували за способом, описаним в літературі (). Мед. Спет. 2004, 47, 5798-
Сполуку 112 (5 г, 8,6 ммоль) розчинили в суміші метанолу/етилацетату 1:1 (22 мл/22 мл).
Додали гідроксид паладію на вугіллі (0,5 г). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі в атмосфері гідрогену протягом 12 годин. Реакційну суміш відфільтрували крізь шар целіту, і промили цей шар сумішшю метанолу/етилацетату 1:1. Фільтрат і промивні розчини об'єднали і концентрували до сухого стану з одержанням Сполуки 105а (кількісно). Структуру підтвердили методом РХМС.
Сполуку 113 (1,25 г, 2,7 ммоль), НВТИ (3,2 г, 8,4 ммоль) і СІЕА (2,8 мл, 16,2 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (17 мл), і перемішували реакційну суміш при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. До цієї суміші додали розчин Сполуки 105а (3,77 г, 8,4 ммоль) в безводному ДМФА (20 мл). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом б годин. Розчинник видалили при зниженому тиску з одержанням маслянистої речовини.
Залишок розчинили в СНесСі2 (100 мл) і промили насиченим водним розчином Мансоз (100 мл) і насиченим сольовим розчином (100 мл). Органічну фазу відокремили, висушили (Маг5Ох), відфільтрували і випарували. Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі та елюювали від 10 до 20 96 МеоН в дихлорметані з одержанням Сполуки 114 (1,45 г, 30 Об).
Структуру підтвердили аналізом РХМС і '"Н ЯМР.
Сполуку 114 (1,43 г, 0,8 ммоль) розчинили в суміші метанолу/етилацетату 1:1 (4 мл/4 мл).
Додали паладій на вугіллі (вологий, 0,14 г). Реакційну суміш продували гідрогеном і перемішували при кімнатній температурі в атмосфері гідрогену протягом 12 годин. Реакційну суміш відфільтрували крізь шар целіту. Шар целіту промили метанолом/етилацетатом (1:1).
Фільтрат і промивні розчини об'єднали і випарували при зниженому тиску з одержанням
Сполуки 115 (кількісно). Структуру підтвердили аналізом РХМС і'"Н ЯМР.
Сполуку 8За (0,17 г, 0,75 ммоль), НВТИ (0,31 г, 0,83 ммоль) і ОСІЕА (0,26 мл, 1,5 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (5 мл) і перемішували реакційну суміш при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. До цієї суміші додали розчин Сполуки 115 (1,22 г, 0,75 ммоль) в безводному ДМФА і перемішували реакційну суміш при кімнатній температурі протягом 6 годин.
Розчинник видалили при зниженому тиску, а залишок розчинили в СНеСі». Органічний шар промили насиченим водним розчином МанНсо:з і насиченим сольовим розчином, висушили над
Зо безводним Маг5О: і відфільтрували. Органічний шар концентрували до сухого стану, та одержаний залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі з елюацією від З до 1595 Меон в дихлорметані, з одержанням Сполуки 116 (0,84 г, 61 90). Структуру підтвердили аналізом РХМС і'Н ЯМР. со Ас в. ц г ретельний о
Ас я
РИС, Не, де Одес о а тд А Клен ца: ; «їв ЕКОА до, МЕН ко 2-0 ре й чн о А Й ще вені й аз ка 1417 денім вро Ас - Н Е до екв й Я ! 5 Е Е дк Вон ) ге. сан
РЕБ-ТЯЖ ДМФА ри 0003 Ас у т на до Ж АТ Ше З мА Її де Оле р , --АК «б 18 део ке я В МН сн
Сполуку 116 (0,74 г, 0,4 ммоль) розчинили в суміші метанолу/етилацетату 1:1 (5 мл/5 мл).
Додали паладій на вугіллі (вологий, 0,074 г). Реакційну суміш продували гідрогеном і перемішували при кімнатній температурі в атмосфері гідрогену протягом 12 годин. Реакційну суміш відфільтрували крізь шар целіту. Шар целіту промили метанолом/етилацетатом (1:1).
Фільтрат і промивні розчини об'єднали і випарували при зниженому тиску з одержанням сполуки 117 (0,73 г, 98 95). Структуру підтвердили аналізом РХМС і 'Н ЯМР.
Сполуку 117 (0,63 г, 0,36 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (3 мл). До цього розчину додали М, М-діїізопропілетиламін (70 мкл, 0,4 ммоль) і пентафлуорфенілу трифлуорацетат (72 мкл, 0,42 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 12 годин і вилили в насичений водний розчин МансСоОз. Суміш екстрагували дихлорметаном, промили насиченим сольовим розчином і висушили над безводним Маг25О4. Дихлорметановий розчин концентрували до сухого стану і очистили колонковою хроматографією на силікагелі, елююючи від 5 до 1095 МеОН в дихлорметані з одержанням сполуки 118 (0,51 г, 79 95). Структуру підтвердили методом РХМС ін, а також "Н і "є ЯМР. й 9 ле (блю 1-0-Р-0-(СНІ- МН; ів 1. Боратний буфер, ДМСОСЬ рН 8.5, кв. т-ра 115 --- Б Б - - Я -л « --Ь-тит- г.БОДни ЗМміак, Юм. т-ря й на тп ї ш- не - 3 н
АеНМ -
І З т ІІ ї- Хласв? вит ит ВИ в Йко-Етсвнте) щі 4 нн ноз но денім ет
АсНнМ
Олігомерну Сполуку 119, що містить кон'югувальну групу СіаіМАсз-7, одержали за загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина саїЇМАсз кон'югувальної групи СаіМАсз-7 ((заїМАсз-74) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-О)(ОН)-Аа-Р(-ОХОН) -.
Структура СаЇІМАсз-7 (СаІМАсз-7а-СМ-) представлена нижче: ноон се) о ска в
АснМ о й Хо ХХ (о) (о) но кто ї ктерто-(вм)-
АснМ о ноон г о нот оцю
АснМ І
Приклад 49. Одержання олігонуклеотиду 132, що містить СаІМАсз-5 нм п: Вос вос пе нн нисбос т т
З : НЕ о ! З : - Ва ї і н і нам Весои и що- де. ХМ М ще і о ї її М М он
Бос -Щ7 Сі | о: нн : й їм щ Що г
НЕТ, ТЕА т інн "нн Ор «Кк - 6 ( 525: дме НМ нос месн. пФ н щі 126 зо 122 що коуч 423
Сполуку 120 (14,01 г, 40 ммоль) і НВТИ (14,06 г, 37 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (80 мл). Додали триетиламін (11,2 мл, 80,35 ммоль) і перемішували протягом 5 хвилин.
Реакційну суміш охолодили на льодяній бані і додали розчин сполуки 121 (10 г, ммоль) в 5 безводному ДМФА (20 мл). Додали додаткову кількість триетиламіну (4,5 мл, 32,28 ммоль) і перемішували реакційну суміш протягом 18 годин в атмосфері аргону. Реакцію контролювали методом ТШХ (етилацетат:гексан; 1:1; КІ-0,47). Розчинник видалили при зниженому тиску.
Залишок розчинили в ЕІОАс (300 мл) і промили 1 М розчином Манзох (3 х 150 мл), насиченим водним розчином МаНсСо: (3 х 150 мл) і насиченим сольовим розчином (2 х 100 мл). Органічний шар висушили за допомогою Маг2505. Висушуючий агент видалили фільтруванням, а органічний шар концентрували на ротаційному випарнику. Неочищену суміш очистили колонковою хроматографією на силікагелі, елююючи за допомогою 35-50 956 ЕОАсС в гексані, з одержанням сполуки 122 (15,50 г, 78,13 95). Структуру підтвердили аналізом РХМС і 'Н ЯМР. Маса м/з 589,3
ІМ-АНІ..
До охолодженого розчину сполуки 122 (7,75 г, 13,16 ммоль), розчиненої в метанолі (15 мл) додали розчин ГІОН (92,15 ммоль) у воді (20 мл) і ТГФ (10 мл). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 45 хвилин і контролювали методом ТШХ (ЕАс:гексан; 1:1).
Реакційну суміш концентрували до половини об'єму при зниженому тиску. Розчин, що залишився, охолодили на льодяній бані і нейтралізували додаванням концентрованої НОСІ.
Реакційну суміш розбавили, екстрагували ЕАс (120 мл) і промили насиченим сольовим розчином (100 мл). При стоянні протягом ночі утворилася і освітлилася емульсія. Органічний шар відокремили, висушили (Маг250О54), відфільтрували і випарували з одержанням Сполуки 123 (8,42 г). Надмірну масу ймовірно обумовлює залишкова сіль. РХМС узгоджувався із структурою.
Продукт застосували без якого-небудь додаткового очищення. М. м., розрахункова: 574,36 9о;
М. м., знайдена: 575,3 |М.--НІ". 2 Ф що о --73-4 -Ное ни рин нн А оно ху Й я й ЩІ
БМ. тити пр Її Я д-- 6 о о ВИ - й Топувн, кип'ятіння и їз зворотним хоподипьникКОоМ В 124 125 зад 1ж
Сполуку 126 синтезували за способом, описаним в літературі (У. Ат. Спет. бос. 2011, 133, 958-963).
-Вас но
К 125 Ввс М о свзсОооН т В ою еру лу
НОВІ, ОІБА, на зо снась
М 137 -8ОО сво Мн.
З я у моя А он це й р що ий фе
Нам ЩІ М чл НМ т а свою є д ЯН Би тт г НАТИ. НОМ ЕІЕА, ДМА
СРСОб е мн. 128 ше де г а ло с, рай д дони
МН дес Оде й ше нич на тт ш-А а : н Ко 5
Ас тн ій й г
АсНМ о вс Оле й
Шк; З Ме вксо тних --
дво бе молю. м
Ас о
Мн яза ЯСНО ло Одес з я Ї дя й не з Те - Он дО и а ї 7 дес рай г ден о ос САС й - т чн
Ако аа й деко Одес ден о 1ю ї- -3 г до ра ча І: ен шко
ЧА
РЕБЕР ДМА ру -ТНЯНТНТНТНТНТНТНТНТНТНТНТНН н о г - ко Одес М о Й ни | а й і Ш-- део ян й ови тя
АЄНМ о й люд Ас г Е
Ні МН мо Коло ит
АсеНУ но 133
Сполуку 123 (7,419 г, 12,91 ммоль), НОВІ (3,49 г, 25,82 ммоль) і сполуку 126 (6,33 г, 16,14 ммоль) розчинили в ДМФА (40 мл), та одержану реакційну суміш охолодили на льодяній бані.
До цієї суміші додали М, М-дізопропілетиламін (4,42 мл, 25,82 ммоль), РуВор (8,7 г, 16,7 ммоль), потім зв'язувальний агент Вор (1,17 г, 2,66 ммоль) в атмосфері аргону. Льодяну баню прибрали, і розчин залишили нагріватися до кімнатної температури. Реакція завершилася через 1 годину, що визначили за методом ТШХ (ДХМ:МеоОН:АА; 89:10:11). Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску. Залишок розчинили в ЕАс (200 мл) і промили 1 М розчином Манзох (3 х 100 мл), насиченим водним розчином МанНсСоО:з (3 х 100 мл) і насиченим сольовим розчином (2 х 100 мл). Органічну фазу відокремили, висушили (Маг5Ох), відфільтрували і концентрували. Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі з градієнтом від 50 95 гексанів в ЕОАс до 10095 ЕІЮАс з одержанням Сполуки 127 (9,4 г) у вигляді білої пінистої речовини. РХМС і 'Н ЯМР узгоджувалися із структурою. Маса м/з 778,4
ІМ-АНІ..
Трифлуороцтову кислоту (12 мл) додали до розчину сполуки 127 (1,57 г, 2,02 ммоль) в дихлорметані (12 мл) і перемішували при кімнатній температурі протягом 1 години. Реакційну суміш випарували спільно з толуеном (30 мл) при зниженому тиску до сухого стану. Одержаний залишок двічі спільно випарували з ацетонітрилом (30 мл) і толуеном (40 мл) з одержанням
Сполуки 128 (1,67 г) у вигляді трифлуорацетатної солі, і застосували його на наступній стадії без додаткового очищення. РХМС і "Н ЯМР узгоджувалися із структурою. Маса м/з 478,2 ІМ.--НГ..
Сполуку 7 (0,43 г, 0,963 ммоль), НАТИ (0,35 г, 0,91 ммоль) і НОАЇ (0,035 г, 0,26 ммоль) змішали і висушували протягом 4 годин над Рг2О5 при зниженому тиску в круглодонній колбі, і далі розчинили в безводному ДМФА (1 мл) і перемішували протягом 5 хвилин. До цієї суміші додали розчин сполуки 128 (0,20 г, 0,26 ммоль) в безводному ДМФА (0,2 мл) і додали М, М- дііззопропілетиламін (0,2 мл). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі в атмосфері аргону. Реакція завершилася через 30 хвилин, що визначили за допомогою РХМС і
ТШХ (7906 Меон/дхм). Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску. Залишок розчинили в ДХМ (30 мл) і промили 1 М розчином МанНзохз (3 х 20 мл), насиченим водним розчином МаНСоОз (3 х 20 мл) і насиченим сольовим розчином (3 х 20 мл). Органічну фазу відокремили, висушили над Ма»5О»:, відфільтрували і концентрували. Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі, застосувавши 5-1595 МеоОонН в дихлорметані, з одержанням Сполуки 129 (96,6 мг). РХМС і"Н ЯМР узгоджувалися із структурою. Маса м/з 883,4
ІМ--2НЕ.
Сполуку 129 (0,09 г, 0,051 ммоль) розчинили в метанолі (5 мл) у 20 мл сцинтиляційній пробірці. До неї додали невелику кількість 10 95 Ра/С (0,015 мг) і продували реакційну ємність газоподібним Но. Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі в атмосфері Нео протягом 18 годин. Реакційну суміш відфільтрували крізь шар Целіту, а шар Целіту промили метанолом. Фільтрат і промивні розчини злили разом і концентрували при зниженому тиску з одержанням Сполуки 130 (0,08 г). РХМС і "Н ЯМР узгоджувалися із структурою. Продукт застосували без додаткового очищення. Маса м/з 838,3 МАНІ".
У 10 мл мірну круглодонну колбу додали сполуку 130 (75,8 мг, 0,046 ммоль), 0,37 М розчин піридину в ДМФА (200 мкл) і встановили мішалку. До цього розчину по краплях додали 0,7 М розчин пентафлуорфенілу трифлуорацетату в ДМФА (100 мкл) при перемішуванні. Реакція завершилася через 1 годину, що визначили за допомогою РХМСО. Розчинник видалили при зниженому тиску, і залишок розчинили в СНеіз (-- 10 мл). Органічний шар обробили Манзох (1
М, 10 мл), насиченим водним розчином Мансоз (10 мл) і насиченим сольовим розчином (10 мл), тричі кожним. Органічну фазу відокремили і висушили над Маг5О»4, відфільтрували і концентрували з одержанням Сполуки 131 (77,7 мг). Дані РХМС узгоджувалися із структурою.
Застосували без додаткового очищення. Маса м/з 921,3 (М--2НІ". но он (| ся | 0-5-0-снав ни ів 1. Боратний буфер, ЛЮЄ, рН 85, кімн. т-ра
ФА дня ьЬ н СВ 2.водн. аміак, КІМН. тТ-Д но сон ї 2 водно ямкак, ІМ. т-23 Н ; й не шо -н їх г зо лоти що г вен о я- в вн і но кла т ни до ден їз - Н що
Олігомерну Сполуку 132, що містить кон'югувальну групу СамМАсз-5, одержали за
Зо загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина саїЇМАсз кон'югувальної групи СзаіМАсз-5 ((3аїМАсз-ба) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)-
Структура СаІМАсз-5 (Са!МАсз-5а-СМ-) представлена нижче:
но он о; сов о о
АснНнМ мо
МН
Н в) но он НМ М
МН оо о но
АСНМ о но он
Ге) о! МН но зтту б мо (СМ) З
АСНМ о н
Приклад 50. Одержання олігонуклеотиду 144, що містить СаІМАса-11 рУтОо 0 бтас Т.В. БА рмто 0Блює й АСМ слола УЩАВ У пес дюиФА --ЯЯ НТ Є - я -тт ;А-А-л - т л 7 йле- --фЖ Я -т -- 2-н с / по 8. Ас) кепування во ЖЕ 0- уон Каївег: негативний 5-4 /є х ше с 134 нм птос
Мт в ра зн /
Н В т на шо Н ще т- о що, 435 М ТЯ тер КІ х. ї Я хх - 6 65656 |(" '« '« («т «чт ть К. її 5-й - НЕТ, БА, ДНФА з
Фо, (/ са іх 137
Н-Етос
БМ, р з А
З віри ТА ій ів; В З 1, 8 пдразнніЗ ВА
Каїсоег: пазитивник / «ен 5 СГ пе Каївег. позитивний - «4 ль ! Ян Ь ння 7 2. Пов та лтосьи НІВ; - Її н 8. БпюсіуветосьОН а нап! пЕХ, ДМФА 4 о . нати рі, ДМФА
Квівег: негативний хе Квігег: негативний а 39
Епюс хе
Но 7. пюс ра М не
ОМ З
У
13 шк з З в - і
Х ни сни - о зи Мета ч- дя уко / о 141 й й й НМ втрє о х Ух 5 я о п
Ас ж ой ден ДОМ я її ОН її й р п 1 дей й ша Но О--
Ши АСНЕ и МД її 1. вів сво ДМА Мн я о 441 Каівег позитивний і Н Я У- т - («- Ж - 2 Ж ---ЯЖ4к- З х 2. Ж, НАТИ, ПЧЕД, доро пас 1 0 Ї дМФа Ще Н Й ВМО
Каївае: негативних до т ко; піт туя ун
АсНИМ Но У дсо Ко зе У МН :
Ас г
Синтез Сполуки 134. У колбу Меріфілда додали амінометилову смолу МІМАО (2,5 г, 450 мкмоль/г), яку промили ацетонітрилом, диметилформамідом, дихлорметаном і ацетонітрилом.
Смолу залишили набухати в ацетонітрилі (4 мл). Сполуку 133 попередньо активували в 100 мл круглодонній колбі шляхом додавання 20 (1,0 ммоль, 0,747 г), ТВТО (1,0 ммоль, 0,321 г), ацетонітрилу (5 мл) і ОІЕА (3,0 ммоль, 0,5 мл). Цей розчин залишили перемішуватися на 5 хвилин, і далі додали в колбу Меріфілда при струшуванні. Суспензію залишили струшуватися на З години. Реакційну суміш злили, а смолу промили ацетонітрилом, ДМФА і ДХМ. Заповнення нової смоли кількісно визначили за вимірюванням абсорбції ОМТ катіону при 500 нм (коефіцієнт екстинції- 76000) у ДХМ, яке склало 238 мкмоль/г. Смолу кепували триразовим суспендуванням в розчині оцтового ангідриду протягом десяти хвилин.
Сполуку 141, зв'язану із твердою основою, синтезували багаторазовим повторенням способів твердофазного синтезу пептидів за допомогою Еітос. Узяли невелику кількість твердої основи і суспендували у водному розчині аміаку (28-30 мас. 95) протягом 6 годин. Розщеплену сполуку аналізували методом РХ-МС і спостерігали, що маса узгоджується із структурою. Маса м/з 1063,8 (МА НІ.
Сполуку 142, зв'язану із твердою основою, синтезували за способами твердофазного синтезу пептидів.
ТК дей дл зт,
ШИК. -кН «кох,
АсНІ є С її.
Асо Од ) А дос ма НН о оо
АСНМ Ша - ! і
ДНК сентезатор а і ї ще. С бу с ре о о с-м н І т лен ЕВ. Ка о, я4з
АсО дого в 3
АЕН й на он , нео я ит, ден Дн но он З - в їх дснМ а рах он водний МН 9 й ї ние ву но он ц те і
НВ. да ке я во йООЖН ! пис пу Гео) ден а Но: на он оси дон Па 144
Сполуку 143, зв'язану із твердою основою, синтезували за допомогою стандартного твердофазного синтезу на ДНК синтезаторі.
Сполуку 143, зв'язану із твердою основою, суспендували у водному аміаку (28-30 мас. 9б) і нагрівали при 55 "С протягом 16 годин. Розчин охолодили, і тверду основу відфільтрували.
Фільтрат концентрували, залишок розчинили у воді і очистили за допомогою ВЕРХ на високоактивній аніонообмінній колонці. Фракції, що містять сполуку 144 повної довжини, злили разом і знесолили. Одержану СаїІМАса4-11-кон'юговану олігомерну сполуку аналізували за допомогою РХ-МС і спостерігали, що маса узгоджується із структурою.
Кластерна частина СаіМАса кон'югувальної групи СаіМАса-11 (СаІМАс4-114) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аа-Р(-ОХОН)-.
Структура сСаіМАса-11 (СсаІМАса-114-СМ) представлена нижче:
но он (о) ей тл
МН
АснМ о но он о юоте но
АСНМ Ти он о М ї
З М но он о (); о
Н
АснМ Го) о но он о юоте і
АснМ о
Приклад 51. Одержання олігонуклеотиду 155, що містить СаіМмАсз-б он (в) ак
Н
«Алл «Ам Св
ВІЙ - (6-7 Вій (Фін! о н (в) оо 2м маон о стон 145 146
Сполуку 146 синтезували таким чином, як описано в літературі (Апа/пуїїса! Віоспетівігу 1995, 229, 54-60).
НВ:
НО тт яд сх АсО Ойс 4 спасти дей т дитини и ден ну
ТМ5-ОПІ Я А мопекупярні сита, СН кімнот-оа ден ц Ще
МА З 12 нт де» ше:
Її Н Ї
Ако Од С о г ща на. РІОнНЬА С, зар пот мо яв З Ше й Ши птн
ЕСАсСМеОН АН зоба НАТО, БЕК, ДМ кімнот-ра
АрОо САС я- її н о ї и А НИК ан о, . . АН. РН Рдгея. Сі пас Ммесн
АсНМ 48 Н Її
АрОо ОСА ц с Е о к 35 до й Й пуття А ще МА вен Н
Сполуку 4 (15 г, 45,55 ммоль) і сполуку 356 (14,3 грам, 57 ммоль) розчинили в СНесСі» (200 мл). Додали активовані молекулярні сита (4 А, 2 г, порошкоподібні) і залишили реакційну суміш перемішуватися протягом 30 хвилин в атмосфері нітрогену. Додали ТМ5-ОТІЇ (4,1 мл, 22,77 ммоль) і залишили реакційну суміш перемішуватися при кімнатній температурі протягом ночі.
Після завершення реакції суміш погасили, виливши у насичений водний розчин МансСоз (500 мл) з подрібненим льодом (-- 150 г). Органічний шар відокремили, промили насиченим сольовим розчином, висушили над Ма5О»5, відфільтрували і концентрували до оранжевої маслянистої речовини при зниженому тиску. Неочищений матеріал очистили колонковою хроматографією на силікагелі і елюювали 2-10 95 МеОН в СНоСі» з одержанням Сполуки 112 (16,53 г, 63 95). Дані
РХМС і"Н ЯМР узгоджувалися з передбачуваною сполукою.
Сполуку 112 (4,27 г, 7,35 ммоль) розчинили в Меон/ЕАс 1:1 (40 мл). Реакційну суміш очистили пропусканням потоку аргону через розчин протягом 15 хвилин. Додали каталізатор
Перлмана (гідроксид паладію на вугіллі, 400 мг) і пропускали через розчин газоподібний гідроген протягом 30 хвилин. Після завершення (ТШХ, 1095 МеОН в СНеСіІ», і РХМОС), каталізатор видалили фільтрацією крізь шар целіту. Фільтрат концентрували на ротаційному випарнику і швидко висушили під високим вакуумом з одержанням Сполуки 105а (3,28 г). Дані
РХМС і ІН ЯМР узгоджувалися з бажаним продуктом.
Сполуку 147 (2,31 г, 11 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (100 мл). Додали М, М- діізопропілетиламін (ОІЕА, 3,9 мл, 22 ммоль), потім НВТИ (4 г, 10,5 ммоль). Реакційну суміш залишили перемішуватися протягом «15 хвилин в атмосфері нітрогену. До цієї суміші додали розчин сполуки 105а (3,3 г, 7,4 ммоль) в сухому ДМФА і перемішували протягом 2 годин в атмосфері нітрогену. Реакційну суміш розбавили ЕЇОАсС і промили насиченим водним розчином
МансСоз і насиченим сольовим розчином. Органічну фазу відокремили, висушили (Мо95Ох4), відфільтрували і концентрували до оранжевої сиропоподібної речовини. Неочищений матеріал очистили колонковою хроматографією з 2-5 95 МеОнН в СНосСі» з одержанням Сполуки 148 (3,44 г, 73 95). Дані РХМС і"Н ЯМР узгоджувалися з передбачуваним продуктом.
Сполуку 148 (3,3 г, 5,2 ммоль) розчинили в Меон/ЕЮАс 1:1 (75 мл). Реакційну суміш очистили пропусканням потоку аргону через розчин протягом 15 хвилин. Додали каталізатор
Зо Перлмана (гідроксид паладію на вугіллі (350 мг). Через розчин продували газоподібний гідроген протягом 30 хвилин. Після завершення (ТШХ, 1095 МеоН в ДХМ, і РХМС), каталізатор видалили фільтрацією крізь шар целіту. Фільтрат концентрували на ротаційному випарнику і швидко висушили під високим вакуумом з одержанням Сполуки 149 (2,6 г). Дані РХМС узгоджувалися з бажаним продуктом. Залишок розчинили в сухому ДМФА (10 мл) і негайно використали на наступній стадії. - лу нн моля шо ря Не до гуд В -т З о мо тд чу в ани н ТО денМ 3 н У -е
МЕ (- Я 2 Є - - Асо Одес ой денних М
НАС с- . ій н молю. і я до ВАС ан М то вань, Не КСО ВАС аснм щЕШИ. т нини - в ТІ м пяти МН
МеОН. ЕЮдс пах о ма М Й
АснМ 3 нН о те др Ас з ке а А х мод
НА м 151
Сполуку 146 (0,68 г, 1,73 ммоль) розчинили в сухому ДМФА (20 мл). До неї додали ОІЕА (450 мкл, 2,6 ммоль, 1,5 екв.) і НВТИО (1,96 г, 0,52 ммоль). Реакційну суміш залишили перемішуватися протягом 15 хвилин при кімнатній температурі в атмосфері нітрогену. Додали розчин сполуки 149 (2,6 г) в безводному ДМФА (10 мл). рН реакційної суміші довели до рН-9-10 додаванням ОІЕА (при необхідності). Реакційну суміш залишили перемішуватися при кімнатній температурі в атмосфері нітрогену протягом 2 годин. Після завершення реакції суміш розбавили ЕОАс (100 мл) і промили насиченим водним розчином Мансоз, потім насиченим сольовим розчином. Органічну фазу відокремили, висушили над М5оО», відфільтрували і концентрували. Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі і елюювали 2- 1095 Меон в СНеоСіг з одержанням Сполуки 150 (0,62 г, 2095). Дані РХМС і 'нН ЯМР узгоджувалися з бажаним продуктом.
Сполуку 150 (0,62 г) розчинили в МеонН/ЕЮАс 1:1 (5 л). Реакційну суміш очистили пропусканням потоку аргону через розчин протягом 15 хвилин. Додали каталізатор Перлмана (гідроксид паладію на вугіллі (60 мг). Через розчин продували газоподібний гідроген протягом 30 хвилин. Після завершення (ТШХ, 1095 МеОН в ДХМ, і РХМС), каталізатор видалили фільтрацією (тефлоновий фільтр з перехідною канюлею шприца, 0,45 мкм). Фільтрат концентрували на ротаційному випарнику і швидко висушили під високим вакуумом з одержанням Сполуки 151 (0,57 г). Дані РХМС узгоджувалися з бажаним продуктом. Продукт розчинили в 4 мл сухого ДМФА і негайно використали на наступній стадії.
ба о ЕЕ
Кх су дк с дет дк | що Ша а А ій а ц а а асо дае ден З щі р М. З
КА од ря и, вот Тон моло ваш л Кт ов 15 з еНМ З нн - г
РЕВ-ТФК, ГІЕА, ДФ сяде я яр ЧАС На мн асо зх ре й и
МнАс шо ї5а сх З і о н хи уд Шк що Ша я Ам З дО УАС АСВ з В й о о ---- дсо т читця ща рт З і що
Месн,Ею ас ден З нн їх --о і
ВО д А 0-АТН дсо Ка -и тн
МНАсС 1- асо ОАЄ д--й те мо: н Ся го зн Е їй
Бо яки у ванни, с й їж Р. шо 1 г дом Я: й пз г і і АД. В й І І ї; ї
Р-ТЯЖ, ГНЕА За я : Е
РЕР-ТЯЖ, ГНЕд хна й » З я
ДМФА АсНМ 3 н 9 -е і я САС ї-
ША он
Аго шлья наш шк чне
Сполуку 8За (0,11 г, 0,33 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (5 мл) і додали М, М- діізопропілетиламін (75 мкл, 1 ммоль) і РЕР-ТФК (90 мкл, 0,76 ммоль). При дотику реакційна суміш стала пурпурною і поступово змінила колір на оранжевий протягом наступних 30 хвилин.
Перебіг реакції контролювали за допомогою ТШХ і РХМС. Після завершення (утворення естеру
РЕР) додали розчин сполуки 151 (0,57 г, 0,33 ммоль) в ДМФА. рН реакційної суміші довели до рН-Я-10 додаванням М, М-діїізопропілетиламіну (при необхідності). Реакційну суміш перемішували в атмосфері нітрогену протягом «30 хвилин. Після завершення реакції більшу частину розчинника видалили при зниженому тиску. Залишок розбавили СНеоСі» і промили насиченим водним розчином МанНсСоО»з, потім насиченим сольовим розчином. Органічну фазу відокремили, висушили над Мо5зО»., відфільтрували і концентрували до оранжевої сиропоподібної речовини. Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі (2-10 95
Меон в СНеосі») з одержанням Сполуки 152 (0,35 г, 55 95). Дані РХМС і'"Н ЯМР узгоджувалися з бажаним продуктом.
Сполуку 152 (0,35 г, 0,182 ммоль) розчинили в Меон/ЕОАс 1:1 (10 мл). Реакційну суміш очистили пропусканням потоку аргону через розчин протягом 15 хвилин. Додали каталізатор
Перлмана (гідроксид паладію на вугіллі (35 мг). Через розчин продували газоподібний гідроген протягом 30 хвилин. Після завершення (ТШХ, 1095 МеОН в ДХМ, і РХМС), каталізатор видалили фільтрацією (тефлоновий фільтр з перехідною канюлею шприца, 0,45 мкм). Фільтрат концентрували на ротаційному випарнику і швидко висушили під високим вакуумом з одержанням Сполуки 153 (0,33 г, кількісно). Дані РХМС узгоджувалися з бажаним продуктом.
Сполуку 153 (0,33 г, 0,18 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (5 мл) при перемішуванні в атмосфері нітрогену. До неї додали М, М-діїзопропілетиламін (65 мкл, 0,37 ммоль) і РЕР-ТФК (35 мкл, 0,28 ммоль). Реакційну суміш перемішували в атмосфері нітрогену протягом «30 хвилин.
При дотику реакційна суміш стала пурпурною і поступово змінила колір на оранжевий. рн реакційної суміші підтримували при рН-Я-10 додаванням додаткової кількості М, М- діізопропілетиламіну. Перебіг реакції контролювали за допомогою ТШХ і РХМС. Після завершення реакції більшу частину розчинника видалили при зниженому тиску. Залишок розбавили СНеСі» (50 мл) і промили насиченим водним розчином МанНсСоО»з, потім насиченим сольовим розчином. Органічний шар відокремили, висушили над МоазоО», відфільтрували і концентрували до оранжевої сиропоподібної речовини. Залишок очистили колонковою хроматографією і елюювали 2-10 95 МеОнН в СНеСі» з одержанням Сполуки 154 (0,29 г, 79 95).
Дані РХМС і '"Н ЯМР узгоджувалися з бажаним продуктом. зх в її | | но сн з
Сет Зо ле сн Мн; цо долити ан В щі АсНМ НМ я тв. 1 Боратний буфер ДМсо, НООН бно ж н ц
ЕН В.Б, кін. т-ра но сотник утро (53) (вто)
З. БОодНн. аміак кімн. т-53 кгн н / М: 5 й нан С іо деНнм й
Олігомерну Сполуку 155, що містить кон'югувальну групу СамМАсз-6, одержали за загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина саїЇМАсз кон'югувальної групи СзаіМАсз-б ((3а!їМАсз-ба) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)-
Структура СаІМАсз-6 (СаІМАсз-ба-СМ-) представлена нижче: ноон (в)
Го) но кто гу
АснМ НМ о М нот он зм рт рто-(см| З ну зо (є;
АснНМ
М ноОн ре (в) о нот он о
АснНМ
Приклад 52. Одержання олігонуклеотиду 160, що містить СаіМмАсз-9
АГА е т по ЩІ х о А. дит п май ще Я р-ні 5: А т т к пре й сеть но 4 ЕФ. до КЕ ок пото У Пе. в ів. КЯсауУуте Ка
АсНМ сіснасносї, кімн. Мощі ТЯБОТЕ,АХЕ. ве 3 т-ра, 3365 4 ЩІ
Агро САС ду ПА -д Но, Ра Її я
ЕН ! й МеОН, зять АеНнМ т 156 157 нє
НВ ДМА ЕК. - о мой Нофосфорнилування нн ці дво х Й рин Я -- нн щі рМтОо й щі не т ї 81 х., | АенМ о ОооМмт щн з нео не іх
ГУК - и /
У дей Одес т РИ. сні 700000 тоомт 159
Сполуку 156 синтезували за способом, описаним в літературі (). Мед. Спет. 2004, 47, 5798- 5808).
Сполуку 156 (18,60 г, 29,28 ммоль) розчинили в метанолі (200 мл). Додали паладій на вугіллі (6,15 г, завантаження 10 мас. 95 (у перерахунку на суху речовину), матриця з порошкоподібного вугілля, вологий). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі в атмосфері гідрогену протягом 18 годин. Реакційну суміш відфільтрували крізь шар целіту і ретельно промили шар целіту метанолом. Об'єднаний фільтрат промили і концентрували до сухого стану.
Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі і елюювали 5-10 95 метанолу в дихлорметані з одержанням Сполуки 157 (14,26 г, 89 95). Маса м/з 5441 ІМ-НГ.
Сполуку 157 (5 г, 9,17 ммоль) розчинили в безводному ДМФА (30 мл). Додали НВТИ (3,65 г, 9,61 ммоль) і М, М-діїізопропілетиламін (13,73 мл, 78,81 ммоль) і перемішували реакційну суміш при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. До неї додали розчин сполуки 47 (2,96 г, 7,04 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 8 годин. Реакційну суміш вилили в насичений водний розчин МанНсСоОз. Суміш екстрагували етилацетатом, органічний шар промили насиченим сольовим розчином і висушили (Маг50О»5), відфільтрували і випарували. Одержаний залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі і елюювали 50 9о етилацетатом в гексані з одержанням Сполуки 158 (8,25 г, 73,3 905). Структуру підтвердили аналізом МС і"Н ЯМР.
Сполуку 158 (7,2 г, 7,61 ммоль) висушили над Рг2О5 при зниженому тиску. Висушену сполуку розчинили в безводному ДМФА (50 мл). До неї додали 1Н-тетразол (0,43 г, 6,09 ммоль) і М- метилімідазол (0,3 мл, 3,81 ммоль), і 2-ціаноетил-М, М,М",М'-тетраізопропіл-фосфородіамідит (3,65 мл, 11,50 ммоль). Реакційну суміш перемішували в атмосфері аргону протягом 4 годин.
Реакційну суміш розбавили етилацетатом (200 мл). Реакційну суміш промили насиченим розчином МанНСОз і насиченим сольовим розчином. Органічну фазу відокремили, висушили (Маг2504), відфільтрували і випарували. Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі і елюювали 50-90 906 етилацетатом в гексані з одержанням Сполуки 159 (7,82 г, 80,5 95). Структуру підтвердили аналізом РХМС і з'Р ЯМР.
ОВ нас х но Кс льше і В.
АЄНМ о--ОН ! ре: 1. ДНК синтезатою нос ! ГУ 158 - - (:( : :-- з пан ол
З. вади. МНАСН но що "ве Ха засни о-е-он ноон і а В: са м МА нот АВ х.
АснЕ їі50
Олігомерну сполуку 160, що містить кон'югувальну групу СамМАсз-9, одержали за стандартними способами синтезу олігонуклеотидів. Три одиниці сполуки 159 зв'язали з твердою основою, потім з фосфорамідитами нуклеотидів. В результаті обробки захищеної олігомерної сполуки водним аміаком одержали сполуку 160. Кластерна частина СаІМАсз кон'югувальної групи СаІМАсз-9 (СаІМАсз-94) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-А«--Р(І-ОХОН)-. Структура СаїІМАсз-9 (СаіМАсз-94-СМ) представлена нижче: он нОооНн Х
Ге) М но-ктао нг К.
АснМ о-е-он
Ко, ноон Х
Ге) М но-ктао гу К,
АснМ отроон
Ка), ноон Х
Ге) М о 9 нот 4 най ем)
АснМ й
Приклад 53. Альтернативний спосіб одержання Сполуки 18 (СаІМАсз-1а і СаіМАсз-За)
ЕЕ
А нал Мне у і здо ТЕО -Н дбо Б: г САС -- КЕН ябо сь а ОА 181 вен воа уАК-ЯО
СЕС, бЬМ |. Св дов по
В-сСвио 1625 ща: нс
РРО
МЛ і КВ;
Ки нн щі 7 в В з во 4 щ г НС
МНАС а п о і
Й расоноЇ увів рЕвоТ я жо КК. ГОЛ 4 д4 -я МАД шАє | т
АсО льно не ч і
ШНАЄ и нн
Ас й ї бле | НВ. н Ще - о
З ц
Ку кі Б МногевЯ оо аЙА-М. ИЙ на Ан В
І Кожа
МНАС 5 а ЕВ. йде р ре іде о, й 17 ря нем
АБО --, і У
МНАс , 18
Виконали реакцію лактону 161 з діамінопропаном (3-5 екв.) або моно-Вос-захищеним діамінопропаном (1 екв.) з одержанням спирту 162а або 162р. При застосуванні для описаної вище реакції незахищеного пропандіаміну, надлишок діаміну видалили випаровуванням під високим вакуумом, а вільну аміногрупу в 162а захистили за допомогою Ср:2СІ з одержанням 1625 у вигляді білої твердої речовини після очищення колонковою хроматографією. Спирт 162Б6 далі ввели в реакцію із сполукою 4 у присутності ТМ5ОТІ з одержанням 163а, яку перетворили на 1635 шляхом зняття Сб; групи за допомогою каталітичного гідрування.
Пентафлуорфеніловий (РЕР) естер 164 одержали взаємодією трикислотної сполуки 113 (див.
Приклад 48) з РЕР-ТФК (3,5 екв.) і піридином (3,5 екв.) в ДМФА (від 0,1 до 0,5 М). Триестер 164 безпосередньо взаємодіяв з аміном 16360 (3-4 екв.) і ОІРЕА (3-4 екв.) з одержанням Сполуки 18.
Представлений вище спосіб значно полегшує очищення проміжних сполук і мінімізує утворення побічних продуктів, які утворюються при застосуванні способу, описаного у Прикладі 4.
Приклад 54. Альтернативний спосіб одержання Сполуки 18 (СаІМАсз-їа і СаіМАсз-За)
но З вЕР-ТаК пишне ЧИ а ДМА, р 5 о із чне нн Е - нед деяодитни чнНСвХ вЕРО ниця нове но й т вро з ї 184 осн пан - у се ЕК іх г ЕКЗ Е ух я иври
Босни па ШИН н - калія З нНСіаба ЖК -И--- ВоНМ. М. ни НОВ СЗТ 69 Я « ----
ПІРЕА ї й 2. адс
М. р. яка ША ГЕ
Наг З со ї й ГІЯ о й с с й посим і пот БАХ ТОРЕР 15 МНнАс ра; ! Я 4 б.геусанліон де - шко н Боби---еклнднл
Асо 7-00 мн і ябо 1,5-пентандіоя
МНАс тя у як тМаОт я 4 піде САС 8 в 2. ТЕМНО п ра Он но й З. РЕР-ТОЖК, вуг шо, | : їх чне ву йо ко - М оц нн - щи тт чАсве
САС
Оле шо дети в ї-яко я Є Н дод пт го
НАС ї8
Три-РЕР естер 164 одержали з кислоти 113 за способом, наведеним вище у Прикладі 53, виконали реакцію цього естеру з моно-Вос-захищеним діаміном з одержанням 165 практично з кількісним виходом. Вос групи видалили хлористоводневою кислотою або трифлуороцтовою кислотою з одержанням триаміну, який взаємодіяв з активованою кислотою РЕР 166 у присутності відповідної основи, такої як ОІРЕА, з одержанням Сполуки 18.
РЕР-захищену кислоту СаІ-МАс 166 одержали з відповідної кислоти обробкою РЕР-ТФК (1- 1,2 екв.) і піридином (1-14,2 екв.) в ДМФА. Кислоту-прекурсор, в свою чергу, одержали з відповідного спирту окисненням із застосуванням ТЕМРО (0,2 екв.) і ВАІВ в ацетонітрилі і воді.
Спирт-прекурсор одержали із цукрової проміжної сполуки 4 взаємодією з 1,6-гександіолом (або 1,5-гександіолом або іншим діолом для інших значень п) (2-4 екв.) і ТМ5ОТІ, застосувавши умови, описані раніше у Прикладі 47.
Приклад 55. Дозозалежне дослідження олігонуклеотидів, що містять 3' або 5'-кон'югувальну групу (порівняння СаїЇМАсз-1, 3, 8 і 9), націлених на 5КВ-1, іп мімо
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5А8В-1 у мишей. Некон'югований Іб5БІ5 353382 включили як стандарт.
Кожна з різних кон'югувальних груп СаіМАсз була приєднана або до 3", або до 5'-кінця відповідного олігонуклеотиду за допомогою фосфодіестер-зв'язаного 2'-дезоксіаденозинового нуклеозиду (розщеплюваний фрагмент).
Таблиця 26
Модифіковані АБО, націлені на 58В-1
ІБІВ
353382 Сев"Сев Тез Гев'"СевАвдеСав Гав'"СавАвв ГавСтавАвав"Сав (почат- | ТаєТевп"Сев"СевТеєТе 5/10/5 | немає 28 кова)
ІБІЄ Сев"Сев Тез Гев'"СевАвдв ав Гав'"СавАвв ГавСтавАвав"Сав 655861. | ТаєТев"Сев"СехТех Геодос'-СаїМАсз-та зл10/5 | баїмАсз
ІБІЄ Сев"Сев Тез Гев'"СевАвде ав Гав'"СавАвв ГавСтазАвв 664078 тав Газ Гев'""Сев"Сев Тез ГеоЛао -с1аІМАсз-ЗУа 5/10/5 |баімАсз9
ІБІ5 СаіМАсз-За-оАвдостев"Севє Ге Гев'""СевАвеСав Гав'"СавАвв 6бб1161 ТавСавАвв"Сав Газ Гев'"Сев"Сев Ге Ге ЗЛо/5 бамАсзЗ
ІБІ5 СаіМАсз-Ва-оАвдостев"Севє Ге Гев'""СевАвеСав Гав'"СавАвв 665001 ТавСавАвв"Сав Газ Гев'"Сев"Сев Ге Ге ЗЛо/5 баїмлсз 8
Заголовні букви вказують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає в-О- 2г'--дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (Р); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9. Структура СаІМАсз-9 показана раніше у
Прикладі 52. Структура СаїіМАсз-3 показана раніше у Прикладі 39. Структура СаЇМАсз-8 показана раніше у Прикладі 47.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей ВаїбБ/с (даскзоп І арогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки І5І5 353382, 655861, 664078, 661161, 665001 або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин.
Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів мРНК
ЗАВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 27, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином. Дійсно, антисмислові олігонуклеотиди, що містять фосфодіестер- зв'язані кон'югати СаїІМАсз-ї1 і СаіМАсз-9 на 3'-кінці (БІ 655861 і ІЗІ5 664078), а також кон'югати
СаіМАсз-3 і саіМмАсз-8, зв'язані на 5'-кінці (І5ІЗ 661161 і ІЗІ5 665001) демонструють істотне покращення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (ЗІЗ 353382). Крім того, ІЗІ5 664078, що містить кон'югат заїІМАсз-9 на 3'-кінці, був по суті настільки ж ефективним, як І5БІ5 655861, який містить кон'югат СаіМАсз-1ї на 3'-кінці. 5'-кон'юговані антисмислові олігонуклеотиди, І5ІЄ 661161 і ІБІ5 665001, що містять саІМАсз-3 або саїіМАсз-9, відповідно, мають підвищену ефективність, порівняно з 3-кон'югОвВаними антисмисловими сполуками (ІБІ5 655861 і І5ІЗ 664078).
Таблиця 27
АБО, що містять СаІМАсз-ї1, 3, 8 або 9, націлені на 5АВ-1
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) МРНК 5В8В-1 (95 від сольового розчину)
Сольовийрозчин | нд. /313330313101010111001 звззва 0 |177771030301168 немає о 01000000 98 бББВВ! За!масе-1 (5) 561078 За!масз-9 (5) бвТ1Тв! За!масз-З (5) ббБОг За!масз-8 (5)
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АГ ТТ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін і нітроген сечовини в крові (НСК).
Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину. Значення
АЇ Т, АТ, загального білірубіну і НСК представлені нижче в таблиці.
Таблиця 28
ІВІЗ Мо Доза мг/кг АТ АТ Загальний нСК Кон'югат білірубін
Сольовий а 7177211 66 | 02 1 3465 353382 немає 33,72 30,65 30,97 й зааа р 31,62 3275 ши зоба р 347 33,37
БП вт 17728711 7778811 0 зав; 679590) 31,32 32,32 й ст:
Приклад 56. Дозозалежне дослідження олігонуклеотидів, що містять 3' або 5'-кон'югувальну групу (порівняння СаіІМАсз-1, 2, 3, 5, 6, 7 і 10), націлених на 5В8В-1, іп мімо
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5А8В-1 у мишей. Некон'югований Іб5БІ5 353382 включили як стандарт.
Кожна з різних кон'югувальних груп СтаіїМАсз була приєднана до 5'-кінця відповідного олігонуклеотиду фосфодіестер-зв'язаним 2'-дезоксіаденозиновим нуклеозидом (розщеплюваний фрагмент), за винятком ІБІ5 655861, в якому кон'югувальна група саіІМАсз приєднана до 3'-кінця.
Таблиця 29
Модифіковані АБО, націлені на 58В-1
Н Н Н " 16 ' ЗЕ
АБО Послідовність (від 5" до 3") Мотив Кон'югат Ів МО
ІБІЗ 3533821 Сев"Сев Геє Гев'""СевАввСав Гав'"СавАва» ГаєСіавАсв "Свв Т ав вБ/10/5 Без 28 (початкова) | Тев"Сев'"Сев Геє Ге кон'югату
Сев"Сев Тез Гев'"СевАвдв ав Гав'"СавАвв ГавСтазАвав"Сав Га»
ІБІБ 655861 ТеетСеєтСеєТеє ТеоАао-СаїМАСя-Та Б5Б/10/5 |СаіМАсз-1
СаіМАсз-га-оАвдостев"Севє Геє Гев'""СевАвеСав Г ав
ІБІБ 664507 тіСаеАве Та«СаеАвет Са Та Твет Сет СеєТесТе Б5Б/10/5 |СаМАсз-2
СаіМАсз-За-оАвдостев"Севє Геє Гев'""СевАвеСав Г ав
ІБІЗ 661161 тіСаеАве Та«СаеАвет Са Та Твет Сет СеєТесТе Б5Б/10/5 |СаіМАсз-3
СаіМАсз-ба-оАвдостев"Севє Геє Гев'""СевАвеСав Г ав
ІБІБ 666224 тіСаеАве Та«СаеАвет Са Та Твет Сет СеєТесТе Б5Б/10/5 |СаіМАсз-5
СаіМАсз-ба-оАвдостев"Севє Геє Гев'""СевАвеСав Г ав
ІБІ5 666961 тіСвеАве ТаеСіа«АветСве Тає ТаетСевтСеє Те Те Б5Б/10/5 |СаіМАсз-б
СаіМАсз-7а-оАвдостев"Севє Ге Гев'""СевАвеСав Г ав
ІБІ5 666981 тіСаеАве Та«СаеАвдет Се Та ТветСевтСеєТесТе Б5Б/10/5 |СаіМАсз-7
СаіМмАсз-1Оа-оАвдоСтев"Сев Ге Гев'""СевАвав(Зав І дв
ІБІ5 666881 тіСаеАве Та«СаеАвдетСав Та ТаетСеєтСеєТеєТе Б5Б/10/5 |СаіМАсз-10
Заголовні букви вказують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2'-МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О- 2г"-дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (Р); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9. Структура СаІМАсз-2а показана раніше у Прикладі 37. Структура саїіМАсз-3а показана раніше у Прикладі 39. Структура СаІМАсз-5а показана раніше у Прикладі 49. Структура СаІМАсз-ба показана раніше у Прикладі 51. Структура
СаІМмАсз-7а показана раніше у Прикладі 48. Структура сСаІМАсз-104 показана раніше у Прикладі 46.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей ВаїбБ/с (даскзоп І арогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки І5І5 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів МРНК 5АВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМФОФ (Моїесшіаг Ргобевз, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного
Зо зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 30, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином. Дійсно, кон'юговані антисмислові олігонуклеотиди демонструють значне підсилення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (ІБІБ 353382). 5'-кон'юговані антисмислові олігонуклеотиди демонструють невелике підсилення ефективності, порівняно з 3'-кон'юЮгованим антисмисловим олігонуклеотидом.
Таблиця 30 - о, ї
І5І5 Мо Доза (мг/кг) МРНК 5РЕВ-1 (95 від сольового розчину)
С Сольовийрозчин 1/3 нд 331 100,0 ИШВЗ- - -ютл нин: І І: І ПН 353382 Немає 655861 Заїмасз-1 (3) 102,0 бба507 ЗаїМасз-2 (5) 661161 ИШВЗ-25ШИШ2Ш0- И-2025222724852 СаїМасз-3 (5) бббгая ЗаїМмасз-5 (5) бббовт ЗаїмАсз-6 (5) бббоВт ЗаїмАсз 7 (5) тоб бббВВт ЗаїмАсз-10 (5)
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АГ ТТ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін і нітроген сечовини в крові (НСК).
Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину. Значення
АЇ Т, АТ, загального білірубіну і НСК представлені нижче у Табл. 31.
Таблиця 31
ІБІ5 Мо Доза мг/кг АТ АТ Загальний нсК Кон'югат білірубін
Сольовий ше МИ ВС СЕ ВВ ПО 353382 Немає 5 17772833313860102126. 655861 ЗаїМасз-1 (3)
Таблиця 31 ілірубін ' бвл5оу Заїмасг'2 (5) ' бвттв! Заїмасг"З (5) ' бввигя Заїмасг'5 (5) 15 | 23 | 68 | 02 | 26 | ' бввав! вла | 660 020 | 26 |аМАсеб (5) ' ббвоВ! Заїмдсз-7 (5) ' бббвВ! ЗаїмАсз"10 (5)
Приклад 57. Дослідження тривалості дії олігонуклеотидів, що містять 3'-кон'югувальну групу, націлених на Ароб ПП, іп мімо
Мишам одноразово ввели ін'єкцію дози, вказаної нижче, і протягом 42 днів спостерігали рівні
Ароб-П і тригліцеридів в плазмі (ТО в плазмі). Дослідження виконали, використовуючи в кожній групі З трансгенних мишей, які експресують людський АРОС-ПІ.
Таблиця 32
Модифіковані АБО, націлені на АроС ПІ
Послідовність (від 5" до 3") ши
ІБІЗ 304801 АезСівв"Сев Тез Гев'"Сав Г ав ГазСіав Гав'"Сав"СавАвавСіав'" Сов Тез Тез ГезАевз Те
ІВІВ 647535 АееСбев"Сев Тев Гев"Сав Га ГавСіає Тав'"Сав"СавАав(Яв "Сов Тв Ге ГевДес Те Р 21 оАдо -СаіМАсз-1 а
ІВІВ 647536 АезСбео"Сео Гео Гео "Сов Гоав Гав(бов Гав"Сав"СавАсв Сів "Св Г во Гео ГеЛес Т РО/Р5 еоАдо -СаМАсз-1 а
Заголовні букви вказують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2-«МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О- 2г"-дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (Р); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаІМАсз-14 показана раніше у Прикладі 9.
Таблиця 33
МРНК Арос ЇЇ (95 від сольового розчину на 1-й день) і рівні ТО в плазмі (95 від сольового розчину на 1-й день) (Сольовий розчин | Омг/кг |Арос-Ш | 98 / 100 | 700 | 95 | 16 /
І8ІЗ 304801 | ЗОмг/кг |ТСвплазмі| 34 / 37 | 50 | 69 | 698
Як можна бачити у представленій вище таблиці, тривалість дії збільшується при додаванні 3'-кон'югувальної групи, порівняно з некон'югованим олігонуклеотидом. Додаткове збільшення тривалості дії спостерігали для змішаного кон'югованого РО/Р5 олігонуклеотиду 647536, порівняно з кон'югованим олігонуклеотидом 647535, що містить тільки Р5Б.
Приклад 58. Дозозалежне дослідження олігонуклеотидів, що містять 3'-кон'югувальну групу (порівняння СаІМАсз-1 і саіМАса-11), націлених на 5В8В-1, іп мімо
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей. Некон'югований ІБІ5 440762 включили як некон'югований стандарт. Кожна з кон'югувальних груп була приєднана до 3'-кінця відповідного олігонуклеотиду за допомогою розщеплюваного фрагмента фосфодіестер-зв'язаного 2'- дезоксіаденозинового нуклеозиду.
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9. Структура СаІМАсз-114 показана раніше у Прикладі 50.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей ВаїбБ/с (даскзоп І арогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки І5БІ5 440762, 651900, 663748 або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів мРНК 5АВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення. РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 34, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином. Антисмислові олігонуклеотиди, що містять фосфодіестер-зв'язані кон'югати саіМмАсз-1 і СаІМАса-11 на 3'-кінці (ІЗІЗ 651900 ї ІБІЗ 663748), демонструють значне підсилення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (І5І5 440762). Ці два кон'югованих олігонуклеотиди, самМАсз-1 і (заїМАса-11, були однаково ефективними.
Таблиця 34
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1
Фо від контролю ФЕОІЮ
АБО Послідовність (від 5" до 3") Доза, мг/кг! з сольовим МО розчином
Сольовий вин 011 06 | 7345
ІБІ5 440762. | Ть"СквАввСтав Газ'"СавАвв ГавСідвАвав "Свв ТГав Пкв"Єк 22 6 | 23,50
Таблиця 34
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1
Фо від контролю ФЕОІЮ
АБО Послідовність (від 5" до 3") Доза, мг/кг! з сольовим МО розчином І 62,75
Ткв"СквАвдеСіав Гав'"СавАвв ГаСтазАвав "Сов Гав Пкв"Ско 06. | 29,1 4 915 851900 Аво-СаїМАсз-1з 23 6 | 52 02 1їмБжь..ШБ 6399 (
Ткв"СквАвдеСіав Гав'"СавАвв ГаСтазАвав "Сов Гав Пкв"Ско 06. | 33,53 515 668718 доо-баїМАса-11а 23 6 | 552
Заголовні букви указують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЕ модифікований нуклеозид; "К" позначає 6'- (5)-СНз біциклічний нуклеозид; "а" позначає В-О-2'-дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки (РБ5); "о" позначає фосфодіестерні міжнуклеозидні зв'язки (РО); і"о» позначає -О-Р(-ОХОН)-. Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АГЇТ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін і нітроген сечовини в крові (НСК).
Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину. Значення
АЇ Т, А5Т, загального білірубіну і НСК представлені нижче у Табл. 35.
Таблиця 35 білірубін
Сольовий бом | | сю | ж 12 | яю 060 | 32 | 70 | Бющ 01 | 95 440762 Немає 76 ЇЇ з | 48 | 01 | 39 06 | 93 | 61 | 01 | 95 | ' боттоо Замасет (8) 76 | 934 | 52 |БЮюж о | 36 06 | 34 | 60 | 01 | 5 | ' баг Замасют (8) 6 | 98 | 7 1 0 | з
Приклад 59. Вплив СаІМАсз-1-кон'югованих АБО, націлених на ЕХІ, іп мімо
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували вв дослідженні впливу множинних наростаючих доз на антисмислове інгібування ЕХІ у мишей. І5ЗІ5 404071 включили як некон'югований стандарт. Кожна з кон'югувальних груп була приєднана до 3'-кінця відповідного олігонуклеотиду за допомогою розщеплюваного фрагмента фосфодіестер-зв'язаного 2'- дезоксіаденозинового нуклеозиду.
Таблиця 36
Модифіковані АБО, націлені на ЕХІ
Послідовність (від 5" до 3") | Зв'язки |БЕО Ю МО.
ТевІЗев(Зеє ГеєАезАвв Гав'"Сав"СавАвав"Сав
ІЗІЗ 404071 Таз Газ Гав"СавАезСіввАезСтев(Зе
ТевІЗев(Зеє ГеєАезАвв Гав'"Сав"СавАвав"Сав
ІЗІЗ 656172 Таз Газ Гав"СавАееСіевАезСтевСЗеоАдо -С1а! МАсз-1 а
Тев(ЗеоСтво ГеоЛеоЛав Гав'"Сав""СавАвав"Сав
ІЗІЗ 656173 Таз Газ Гав"СавАеоСТеоАезСев(ЗеоАао -С1а)МАсз-їа РО/Р5
Заголовні букви указують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2-«МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О- 2г'--дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (Р); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаІМАсз-14 показана раніше у Прикладі 9.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей ВаїЇр/с (даскзоп І арогаюгу, Бар-Харбор, штат Мен) двічі на тиждень протягом З тижнів вводили підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки ІБІ5 404071, 656172, 656173 або РВ5 як контрольного зразка. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів МРНК ЕХІ в печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМФО (МоїІесшіаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами. Виміряли також рівні білка ЕХІ в плазмі за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Рівні МРНК ЕХІ визначали відносно загальної РНК (за допомогою КІВОСКЕЕМФ)), потім нормалізували до контрольного зразка, обробленого РВ5.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК ЕХІ для кожної експериментальної групи. Дані нормалізували до контрольного зразка, обробленого РВУ, і позначили як «95 РВБЗ". ЕЮво5 вимірювали такими ж способами, як описані раніше, і вони представлені нижче.
Таблиця 37
МРНК фактора ХІ (95 від сольового розчину) 5705 зразка ше 2 рою рн 177111 розчин
ІЗІ5 404071 Немає РБ
ІЗІ5 656172 сСаїмАсз-1 РЗ 176 | хК9
ІЗІ5 656173 сСаїмАсз-1 РО/РЗ 76 111111
Як показано в Табл. 37, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЕХІ дозозалежним чином. Олігонуклеотиди, що містять кон'югувальну групу 3'-СаІМАсз-1, демонструють значне підсилення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (І5І5 404071). Між цими двома кон'югованими олігонуклеотидами додаткове підсилення ефективності було забезпечене за рахунок заміни деяких РО зв'язків на РО (І5І5
Зо 656173).
Як показано в Табл. 37а, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні білка
ЕХІ дозозалежним чином. Олігонуклеотиди, що містять кон'югувальну групу 3-СаІМАсз-1,
демонструють значне підсилення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (І5І5 404071). Між цими двома кон'югованими олігонуклеотидами додаткове підсилення ефективності було забезпечене за рахунок заміни деяких РБ5 зв'язків на РО (І5БІЗ 656173).
Таблиця 37а
Білок фактора ХІ (95 від сольового розчину)
Білок (95 від
АБО Доза, мг/кг контрольного Кон'югат Зв'язки зразка)
Сольовийрозчин. | (| 7771/1100 (Немає / |77777СССсСсСсС2шС
ІБІ5 404071 Немає РБ5
ІБІ6 656172 СаїіМАсз-1 РБ 76 ЇЇ 1
ІЗІ5 656173 2001 |1111101016 0 |СамАсз-ї РО/Р5 6 ЇЇ 0
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АГ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін, загальний альбумін, СРЕ і нітроген сечовини в крові (НСК). Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину. Значення АЇТ, А5Т, загального білірубіну і НСК представлені нижче в таблиці.
Таблиця 38 мг/кг альбумін | білірубін і солені | з |ефт розчин 404071 немає 656172 СаїМасз-1 (3) 6 | 650 | 715 | з2 | 02 | 02 | 23,9 656173 СаїМасз-1 (3) 6 | ло | 708 | 33 | 02 | 02 | 22.7
Приклад 60. Вплив кон'югованих АБО, націлених на 5АВ-1, іп міто
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дослідженні впливу множинних наростаючих доз на антисмислове інгібування 5АВ-1 у первинних гепатоцитах мишей. ІЗІ5 353382 включили як некон'югований стандарт. Кожна з кон'югувальних груп була приєднана до
З" або 5-кінця відповідного олігонуклеотиду за допомогою розщеплюваного фрагмента фосфодіестер-зв'язаного 2'-дезоксіаденозинового нуклеозиду.
Таблиця 39
Модифіковані АБО, націлені на 5ЕВ-1
Стев"Сев Тез Гев'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГавСзавАвв
ІБІБ 655861 тає Та ТветСеєтСеє Те Теодао-СаІМАсз-Та Б5Б/10/5 | СаМАсз-1 23
Стев"Сео Гео Гео"Сеоав(Став Гав'"СавАвв ГавСзавАвв
ІЗІЗ 655862 тав Гав Гео"Сео"Сев Те ГеоАао-Сс1апМАсз-їа з/10/5 баїмАсз-
СаіМмАсз-За-ойАвдоСтев""Сев Ге Гев'""СевАвав(Яав
ІЗІ5 661161 Тав"СавАв» ГазСтазАвав"Сав Газ Гев'"Сев"Сев Ге Ге з/10/5 СбаїМмАсз-З
СаіМмАсз-8Ва-ойАвоСтев"Сев Ге Гев'""СевАвав(Яав
ІЗІЗ 665001 Тав"СавАв» ГазСтазАвав"Сав Газ Гев'"Сев"Сев Ге Ге з/10/5 СаїМмАсз-8
Стев"Сев Тез Ге'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГавСзавАвв
ІБІБ 664078 тає Та ТветОСестОеє Те Теодао-СаІМАсз-Оа Б5Б/10/5 | СаІМАсз-9
СаіМмАсз-ба-оАвоСев"Сев Гев Гев'"СевАвдвСав
ІЗІЗ5 666961 Тав"СавАв» ГазСтазАвав"Сав Газ Гев'"Сев"Сев Ге Ге з/10/5 СаїмАсз-6
СаімМАсз-2а-оАвдоСіев"Сев Гев Гев'"СевАвв Сов Та
ІБІБ 664507 тіСвеАве Та«СаеАвдетСає Та Те" СветСеє Те-Те Б5Б/10/5 |СаІМАсз-2
СваіМмАсз-1Оа-оАвдостев"Сев Геє Гев'"СевАвз Свв Т ав
ІБІ5 666881 тіСвеАве Та«СіаеАвдетає Та Тее"СветСеє Те«Те Б/10/5 | СаІМАсз-10
СаіМмАсз-Бба-оАвдоСіев"Сев Гев Гев'"СевАвв Сов Та
ІБІБ 666224 тіСвеАве Та«СаеАвдет Са Та Тее"СветСеє Те-Те Б5Б/10/5 | СаІМАсз-5
СаімАсз-7а-оАвдоСіев"Сев Гев Гев'"СевАвдв Сов Та
ІБІ5 666981 тіСвеАве Та«СаеАвдет Са Та Те" СветСеє Те-Те Б5Б/10/5 | СаІМАсз-7
Заголовні букви указують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2-«МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О- 2г'--дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (Р); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаІМАсз-14 показана раніше у Прикладі 9. Структура СаІМАсз-За показана раніше у Прикладі 39. Структура саіМАсз-ва показана раніше у Прикладі 47. Структура СаІМАсз-За показана раніше у Прикладі 52. Структура СаІМАсз-ба показана раніше у Прикладі 51. Структура
СаіМАсз-2а показана раніше у Прикладі 37. Структура СаІМАсз-10а показана раніше у Прикладі 46. Структура СаІМАсз-ба показана раніше у Прикладі 49. Структура сСаІМАсз-7а показана раніше у Прикладі 48.
Лікування
Олігонуклеотиди, наведені вище, випробовували іп мйго у первинних гепатоцитарних клітинах мишей, вміщених на планшети із густиною 25000 клітин на ямку і оброблених 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 або 20 нМ модифікованого олігонуклеотиду. Після обробки протягом близько 16 годин, з клітин виділили РНК і виміряли рівні мРНК за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі, а рівні мРНК 5АВ-1 ПШ скоректували відповідно до загального вмісту РНК, виміряного за допомогою КІВОСКЕЕМФ).
ІСво обчислили за стандартними способами, а результати представлені у Табл. 40.
Результати показують, що за умов вільного поглинання, при яких не застосовували ніяких реагентів або електроїмпульсних прийомів для штучного прискорення входження олігонуклеотидів у клітини, олігонуклеотиди, що містять кон'югат (заіМАс, були значно ефективнішими у гепатоцитах, ніж початковий олігонуклеотид (І5ІЗ5 353382), який не містить кон'югату СсаІїМАс.
Таблиця 40
ІСво (НМ) ЗЕО ІВ МО.
ІБІ5 353382
ІБІ5 655861 саМмАсз-ї
ІБІ5 655862 РО/Р5 сСамАсз-1
ІБІ5 661161 самАсз-З
ІБІ5 665001 самАсз-8
ІБІ5 664078 саМмАсз-9
ІБІ5 666961 самАсз-б
ІБІ5 664507 саМмАсз-2
ІБІ5 666881 самАсз-10
ІБІ5 666224 саМмАсз-5
ІБІ5 666981 самАсз-7 аСереднє для декількох паралельних експериментів.
Приклад 61. Одержання олігомерної сполуки 175, що містить СсаіМАсз-12
Хв ти «е а н о А 0 ОАс вро есте вв Вос.нн о
НК де й М пли тя де 166 о А де ноОос йо а АсО Оде сНфЕЗ т еп тек і сою її нд лою РТ ож нн дхи НМ де НВТІ ОжБА ДМФА 163
Ас. Ас о ма) нан нак я н лсо
СТ о М дитя т о САС
ВІЙ -- - и нь А С о ще "де о
НМ со ни Й 19 "де шк СА.
І о
З долветею ваОНЬ, нь оно, Нм НМ де
МеОНЕюЮАс й " со
НАМ. тн я о Оле
Х А ой олою лож
Он н н я де "де нії Асо о ви
Мая є т НМ. де сф: бач: й забити о и -
Банзнліперфторфеніпітутават -- 5 6 « '«: - Л;еИ 5 5 5 5 6 6 Я - 5656(5 ж ЯХ Ж 2 (ЩЗ З 52 2 л-е-
ДМФА п - С: 42 де
Ж нини нят пін ет; ШИ НМ. ймои Щ
М ц щ щк о ло с кити з пат т т М ї. й - Ас -- ; ї
З о А Мт ит «РЕ дод 3 ну н Ії н х й де шт бік а Ж ит
Не тА бле ет г ваш чик а; З а ни де т Кам
Мотя З я ан НУ Не
РЖОН» СО. Но МО Що т Мені ОХ ц що пса засн вас но а а щих не о пАг у й Х те ян ке: о й Отам н н тт я " ще Но
Ше Аг
Ас 173 в
ВЕ вод пас
РЕР-ТФЕ н 54
ПА лм ур орли
А ДУ а дно нм нн
Е Е й
Н - хг
Нут г. 2 Ще сьс - ЦД с В І й д ран и ьо. я вх
Е К- ші хх от й НЕ - зЕпровове й Не че о - шо Ав
З Ас спо «ЕЕ де та ни
Ве
- ща и в дн їт« 1. Есоазтнум Будеш, ДО НЕ ВВ, жімнотеря
З воли вміщк кімснот-ра що оон
Шик; З в А 7 пад они ит Й н Ба
Кі пов, че й їі щі о-я вно вишич їтЕ
Но МО
Сполука 169 Є в продажу. Сполуку 172 одержали додаванням бензил(перфлуорфеніл)глутарату до сполуки 171. Бензил(перфлуорфеніл)глутарат одержали додаванням РЕР-ТФК і СІЕА до 5-(бензилоксі)-5-оксопентанової кислоти в ДМФА. Олігомерну
Сполуку 175, що містить кон'югувальну групу СаіМАсз-12, одержали із сполуки 174 за загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина саїЇМАсз кон'югувальної групи СаюмМАсз-12 ((заіїМАсз-124) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аа-Р(-О)(ОН)- - Структура СаІМАсз-12 (СсаіМАсз-12а-СМ-) представлена нижче: онОНн
АснМ МН он -н ної о о о Ж о (в)
АСНМ Ша о М Нуо ; й Нн | Н шуй т(ем|-
М я й о р но
МНАс
Приклад 62. Одержання олігомерної сполуки 180, що містить заіМмАсз-13 чн а - І «І ШІ НАТИ, НОВІ
АСВ ЗНО ий р о ре А п 476 БІЙ ка те СЕЕА, ДМ ФА г 128
ПАБ оз щ
АсНМ пит і
С
САС спде до ке М о з: в ут "
ОАЄ Ооде г ш-в що 477 ет ав пити
ОСА о пах дсо С-ко о ри
АСНМ - МН
ОСАс дес а я
Й с-г й я 000 ВЕРЛФК ТЕА йсо я дини у М че ОН
СНІ і лиФА
ОСАс о сде щ 145
С-о нм
АЄНМ пити о
ОАс Одес о (6) дсо о. и
АсНнНМ МН
ОАс Лодс о Ге) Н (Ф) Е дсо ср в М о Е
АСНМ й митр о о Е Е
Е
ОАс Одес о НМ 179
Асо О. и
АсНнМ о о ЗЗе лише жі ( олюо Сов ло (бно), он 1. Боратний буфер, ДМСО, рН. 855, кімн. т-ра -- ЛЯ 2. водн. аміак, кімн. т-ра он оон но о Ї юн зт тт о І
ЯБНМ ян оно оон но се о ї іще 1 шо чи пе дит рн ра М кто ше чн Ши Ше - Й
АСНМ рай ща й М Ії Т МО ит тя Щі 4 ГФ) І см І- Ол но Н о й оно сон й 180 іо Нм
НО ян Он, ра А денм ни в)
Сполуку 176 одержали за загальним способом, представленим у Прикладі 2. Олігомерну сполуку 180, що містить кон'югувальну групу СзаїМАсз-13, одержали із сполуки 177 за загальними способами, представленими у Прикладі 49. Кластерна частина СаїЇМАсз кон'югувальної групи СамМАсз-13 ((заїМАсз-134) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)- - Структура СаіМАсз-13 (СсаіМАсз-13а-СМ-) представлена нижче: онон о МН
АснМ оноОн ного о но Н ко о М М-во (см)
М т в
АсНнМ Но Н Ге! (о); но он ди оре) но
МНАс
Приклад 63. Одержання олігомерної сполуки 188, що містить СаіМАсз-14 н хе пас рих с- ЕК о
Що Щ Не на г ЕІ їх - У - ди і : еп щч. В борт чновх Та ном ж и МчноВ: , т
Фо НЕТИ, ЕХ б. З нн й надам на й 13 182 й САС АЄ вс н до н ї й М кокету от кове соб - р А т З А Мо БЖ паг НАС с. о п й САС нас н о. о йо я пане го йо м пвх БЯЮ, Не пт М п Мн х - М о МНоВ: 2 ої-- 2-5 з о ра Ж пи тк: и я у
М ій а а ік 0 -5 о
Мнас р; и А 2 нн дво пий ря «-д бАЕ Вк а м
Ас, р о кот Кв веб ЧНас
МНас 185 185 де Р н песо о І но ; Мекеоь Я 8 й- ВРУ Н;
ВИЙ део САС де н Й її 2 ВЕРІФК, рук, 0 лв8 8 Н за кн Мн днея - 56565 « - - 5. - - т го сх 8 п - дро-уиНИиНТтН-- нд ми я; т -
НЕТ, ОЖБА ДИФА Й Що де ря А Шо ще ї Ї
МнАг пСАс со, н Е щ це косо З т п й А й зе Во МНАє до 9 о ЇЇ Її г
Бан т каф пн и во т вон Е
МНнАє в т сл ВАС и
АЕС ог кот ян
МАС
187 - ВЗе нат н з Е - х М
З З ІЇ но рові для 1-8 -3-42НАЬ-Н а нал т, і за гв:
ЗролснатчН: дан Мнас, Н ГУ. ЖЖ о
Но. - 4 З у тт ш-б) «5-1. Боратний буфер, ДМСО, дови Д-т - ня см - олЕо 18; ВН 8.5, кЕмн. т-ра МНнас Зв й 2. одн амівк кімн. т-ра но ук ря
Ск к «ва нах вн 88
НА
Сполуки 181 ії 185 є в продажу. Олігомерну Сполуку 188, що містить кон'югувальну групу
СаіМмАсз-14, одержали із сполуки 187 за загальними способами, представленими у Прикладі 46.
Кластерна частина СаМАсз кон'югувальної групи (заіїМАсз-14 (СаІМАсз-1434) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аа-РІ-ОХОН)-. Структура СаІМАсз-14 (СсаІМАсз-144-СМ-) представлена нижче:
нон о) о М вок НК
АСНМ о нОоОоНн о (в) о о о м --о ХА Яр нот УЖ: М ме то-(ем)-
АсНнМ (в) ноон г оо М нот ом (в;
АснНМ
Приклад 64. Одержання олігомерної сполуки 197, що містить СаіМАсз-15 дго Ас що ства св о рно00ОН8 нн дог ЕВ «аа - ТЯ.
А и як її , наш
АсНМ 7 яко хм - ЩІ 7 НЕТО, ФА ден да 190 7 в. МНУМеОН Б ш- я оон І Ве, ОМАР і й и й но жо Зк ї денім 191
СН отв с
Бали й Вб СБ І до ОВ (й ін і З - Мо, нище М ЕБМНЕ КА цит щи в кдд 1000 вю-китУ :
ВО - А ден хені 193 денМ 495 т М ни о
Тіюфосфорилування до ОВ: щі а -- ц Ен но оси ,
Во й і; що
СНУ їм рмто.
Я -о, МР).
ОМ п о Ї о-в ет о рмто. или о Ши --о Я . рмто см рмто 5 ЗИ 195 хо оч см | Сопіт ен вв) с ра а о) оМто 55, ДНК синтезатор 196 он он й дети ного пі о 1. 194, ДНК синтезатор АсНМ Шк ке о ре -- т --- т -що 2. водн. МН» 55 С, 18 год. у дк | Чон 9) о но он рани тотем о - но Го о / В (оно - и Том | Олі с пані ная - он се рай ІФ) вне ше ІЇ о-Р- ОН к- 197 -- он и (9) но Си
Но Мне
Сполука 189 є в продажу. Сполуку 195 одержали за загальним способом, представленим у
Прикладі 31. Олігомерну сполуку 197, що містить кон'югувальну групу СаІМАсз-15, одержали із сполук 194 і 195, застосувавши стандартні способи синтезу олігонуклеотидів. Кластерна 5 частина СаЇМАсз кон'югувальної групи саіМАсз-15 (СаІМАсз-153) може бути комбінована з будь- яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аа-Р(-О)(ОН)- - Структура СаІМАсз-15 (СсаІМАсз-154-СМ-) представлена нижче: (9) ноон о» но-е-9 о Фе мч ме
АснМ о о о! носн одер о С о о но том чу
АСНМ в) з о ОН нон (Ф) о лит щі) в)
МНАс
Приклад 65. Дозозалежне дослідження олігонуклеотидів, що містять 5'-кон'югувальну групу (порівняння СаІМАсз-3, 12, 13, 14 і 15), націлених на 5АВ-1, іп мімо
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей. Некон'югований ІЗІЗ 353382 включили як стандарт.
Кожна з кон'югувальних груп СаІМАсз була приєднана до 5'-кінця відповідного олігонуклеотиду за допомогою розщеплюваного фрагмента фосфодіестер-зв'язаного 2'-дезоксіаденозинового нуклеозиду.
Таблиця 41
Модифіковані АБО, націлені на 5ЕВ-1 ев е5 езієзІе
СаімАсз-12а4- 671144 | сАцдоСіев"Сев Тез Гев"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГазСзавАав"Сав Га» СаіМАсз-12 30
Тевп"Сев"Сев Тез Те
СаімАсз-1 За- 670061 | осАвоСіев"Сев Тез Гев'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГазСзавАав" Свв Га» СаіМАсз-13 30
Тевп"Сев"Сев Тез Те
СаімАсз-144- 671261 | осАвоСіев"Сев Тез Гев'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГазСзавАав" Свв Га» СаіМАсз-14 30
Тевп"Сев"Сев Тез Те
СаімАсз-15а- 671262 | оАвоСіев"Сев Тез Гев'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГазСзавАав" Свв Га» СаіМАсз-15 30
Тев"Сев"Сев Тез Те
Заголовні букви вказують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2'-МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О- 2г'--дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (Р); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаіІМАсз-3а показана раніше у Прикладі 39. Структура СаІМАсз-12а показана раніше у Прикладі 61. Структура СаіМАсз-1І3а показана раніше у Прикладі 62. Структура
СаіМмАсз-14а показана раніше у Прикладі 63. Структура саІМАсз-15а показана раніше у Прикладі 64.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам С57Б16 (ЧасКзоп І арогаюгу, Бар-Харбор, штат Мен) один раз або двічі ввели підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки ІБІ5 353382, 661161, 671144, 670061, 671261, 671262 або сольового розчину. Мишам, яким вводили дозу двічі, другу дозу вводили через три дні після першої дози. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів
МРНК 5КВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення
РНК КІВОСКЕЕМОФ (Моїесшіаг Ргобез, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 42, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином. Не спостерігали значної різниці нокдауну мішені між тваринами, що одержували одну дозу, і тваринними, що одержували дві дози (див. І5ІЗ 353382 в дозах 30 і 2 х 15 мг/кг; та І5І5 661161 в дозах 5 і 2 х 2,5 мг/кг). Антисмислові олігонуклеотиди, що містять фосфодіестер-зв'язані кон'югати сзаїІМАсз-3, 12, 13, 14 і 15, демонструють значне підсилення ефективності, порівняно з некон'югованим антисмисловим олігонуклеотидом (ІБІ5 335382).
Таблиця 42
МРНК ЗВВ-1 (95 від сольового розчину) -1 (95 ві
ІВІВ Ме Доза(мгикс) | МРНКЗАВЛ' Овід р (мг/кг) сольового розчину) (Сольовийрозчин | нд. | 100,0 нд | нд поззве ги немає 661161 22 СаімАсз-З 01,2 ти за Замлотя бтсов! щі Залози 110,7 бля щі Замлстя 109,4 бив Замлотя
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АГ ТТ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін і нітроген сечовини в крові (НСК).
Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину (дані не показані). Значення АЇ Т, АТ, загального білірубіну і НСК представлені нижче у Табл. 43.
Таблиця 43
Загальний нсК
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) (АТ (Од/л) | АЗТ (Од/л)| білірубін Кон'югат (мг/дл) (мг/дл)
Сольовий роми || мое одна 2958882 Немає вб116ї 17115 | 41 | 80 | 02 | 32 |СамАсз3 | 32 | 69 | 02 | з6 671144 СаімАсз-12
Таблиця 43 овен весно итнюнстсяю ЗИ дя жк
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) (АТ (Од/л) | АЗТ (Од/л)| білірубін Кон'югат (мг/дл) (мг/дл) 1115 | 23 | 46 | 02 1 3 тов! ЗаїмАсв т 05 | 69 1 99 | 01 | з бля Заїмлсятя бив Заїмасвт5
Приклад 66. Вплив різних розщеплюваних фрагментів на антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять кластер 5'-СаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей. Кожна з кон'югувальних груп СаїЇМАсз була приєднана до 5'-кінця відповідного олігонуклеотиду за допомогою фосфодіестер-зв'язаного нуклеозиду (розщеплюваний фрагмент (СМ)).
Таблиця 44
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1
СаіМАсз-За-оАдоСівв "Се Тез Гев'""СевАвавСав Гав'"СавАвв сіаімМАсз-За- 670699 |оТаосіев"Сео Гео Гео" СеоАавСівав Гав'"СавАдвв Т ав СаіМмАсз-За Та ЗЗ
СіавАвв"Сав Т ав Тео"Сео"Сев Гев Ге сіаімМАсз-За- 670700 |осАвоСіев"Сео Гео Гео"СеоАавСіав Гав'""СавАвв» Т ав СаіМмАсз-За Ае 30
СіавАвав"Сав Гав Гео"Сео"Сев Гев Ге сіаімМАсз-За- 670701 о ТГеоСлев'""Сео Гео Гео" СеойавСівав Гав'"СсвАдвв Т ав СаіМмАсз-За Те ЗЗ
СіавАвав"Сав Гав Гео"Сео"Сев Гев Ге
СаіМАсз-13За- 671165 |осАдоСіев"Сео Гео Гео"СеоАавСіав Гав'""СавАвв» Т ав СаіМАсз-1За Аа 30
СіавАвав"Сав Гав Гео"Сео"Сев Гев Ге
Заголовні букви вказують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5- метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2'-МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О- 2г"-дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (Р); "о" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "о» позначає -О-Р(-ОХОН).-.
Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаіМАсз-3За показана раніше у Прикладі 39. Структура СаІМАсз-1За показана раніше у Прикладі 62.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам С57БІб6 (Часкзоп І абогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, сполуки ІБІ5 661161, 670699, 670700, 670701, 671165 або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин.
Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів мРНК
ЗАВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 45, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином. Всі антисмислові олігонуклеотиди, що містять різні розщеплювані фрагменти, демонструють однакову ефективність.
Таблиця 45
МРНК ЗВВ-1 (95 від сольового розчину)
МРНК ЗЕВ-1 (95 см
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) від сольового Кластер СаІМАсз розчину) Сольовийрозчин | нд. | 100,0 нд. |ндо бот! Замлсв За 7» бтов28 Замлсв За з бтотто Замлсв За їй бтото Замлсв За т блтв5 Замлотза з
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АГ ТТ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін і нітроген сечовини в крові (НСК).
Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину (дані не показані). Значення АЇ Т, АТ, загального білірубіну і НСК представлені нижче у Табл. 46.
Таблиця 46
Загаль-ний
Доза А Т А5Т пд Кластер
ІБІЗ Мо (мг/кг) (Оді/л) (Оді/л) білірубін. |НСК (мг/дл) самАс» СМ (мг/дл)
Сольовий боми | на мов | оф на бБттВи Оаімлсх За й 70659 Оаімлсх За з
Таблиця 46
Загаль-ний
Доза А Т А5Т пд Кластер
ІБІЗ Мо (мг/кг) (Оді/л) (Оді/л) білірубін. |НСК (мг/дл) самАс» СМ (мг/дл) бто70о ЗаїмАсв за ле бТото! ЗаїмАсв за Щ блтв5 Замлеіза я
Приклад 67. Одержання олігомерної сполуки 199, що містить СаіМАсз-16 ка ад і вІНф МО вра о
ДО вк Н ет 4 ми ГИ ди но домі до св тиви 97 Шан м-ї - 1. Бурштиновий знідрид
АНЯ. Н ї р / ОМАР, ДХЕ
Ов ном н У їм Х З НАХ, МЕТО СТЕ. асн и -
Щ я в В и в дей май тре У іє ди СНУ а м
М І й - Й ул А ИЙ, птн
Аго пит й І че 5 Ру птн й пі доп оде н ник (с -О її пт ша й її
Аг Кк т Ух І т, Не що вони | 438 неон їх нн Н по Коул Мід о но з ше цес нан денМ 7 ай о н тої - В В М А я ср- й -к , - -ь гом ат втту вт ЯНВ, сні Не: й ей наон ц пт
В- то. АЖ коні 128
Олігомерну сполуку 199, що містить кон'югувальну групу СаїіМАсз-16, одержали за загальними способами, представленими у Прикладах 7 і 9. Кластерна частина СаІМАсз кон'югувальної групи СамМАсз-16 ((заїМАсз-16б4) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)- - Структура СаІМАсз-16 (СсаІМАсз-16а-СМ-) представлена нижче: ноон в) (в) о оту м М осо КН Се
АсНнМ
Н (0) (в) -0 нон о) М :
З оту иВу в, но Но
АснНнМ он ноОНн о) о Ве ) М (0) нок Й ММ
АснМ
Приклад 68. Одержання олігомерної сполуки 200, що містить СаІМАсз-17 баг . В3а сне ла б Е Сет оч осно їз т ї-З н й й с З Е Я Е Кк виш СЕ Б; н ні Зд-- Он дей СВ для и З м и вва 1. Бортник буфер, ДЯСО, рН БА, кімн. тра
АС АЄ і -й г « БОДдН.ЗМмЕаК, КЗ. сов, З шк х КК
АВ А др ут й порти НВ;
АСНМ м 1п28 назн а в мли о АсНМ І ЕВ: Го; нООн о о ши о Ше вола осв ДТ пет єм. | й Й но ви ви щ коти З н Н
АСНІЯ Що
Олігомерну сполуку 200, що містить кон'югувальну групу СаіМАсз-17, одержали за загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина саїЇМАсз кон'югувальної групи СаюмМАсз-17 ((заіїМАсз-174) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)- - Структура СаІМАсз-17 (СсзаІМАсз-17а-СМ-) представлена нижче: ноон о) о) в) М нота з Н М он АснМ о Н АХ но М з Н (в)
АснМ ноон о
Ге) М г о) но ков
АснМ
Приклад 69. Одержання олігомерної сполуки 201, що містить СаіМмАсз-18
(ах
Аро че Ос о вза ще! КЕ - ВЗе
АН ОТ цик, 8; Е 3 5
ОО Од що Н м ре о щ «Е Со уовооченовемн; де г чщ шк НІ о, шк ій я дою т Хо и МА М я 7 Е он
Ас - в ї АН Е 1 Боразний буфер, ДМОО.. БА В.Б, кімн. ра х АенсАс Н о А -- « - НС 65 6 6 6 (« ( Ж
АСОКАО, дв дич дин ЯМ й ЇХ. водн.амізк, кімн. т-ра
ДСН 5/2 зов нан ке-о де і Що хшьх он ден Ше: а нос 0) а сен о Щяку К пу нтннннннннння
Св я ПАСИ ГАМ У нок М ваше / Н В ето-Темі-
АНУ й
НОооН 9 і
З кА, Ав но клао у, : о
НІ І н
Ас 2
Олігомерну сполуку 201, що містить кон'югувальну групу СаїіМАсз-18, одержали за загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина саїЇМАсз кон'югувальної групи СамМАсз-18 ((заїМАсз-184) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'юЮгувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)- - Структура СаІМАсз-18 (СсаіМАсз-18а-СМ-) представлена нижче: нон (в) (е) (9) М нота ян М, но М о -ж її ме то-їсм)- но кто В Ге) н Н
АСНМ нон (е)
Ге) ве ут в) М і) нота Ли М
АСНМ
Приклад 70. Одержання олігомерної сполуки 204, що містить СаіМАсз-19 дос Ає асо щ о я Ї НЕТТО, ДМФА ТНЕА К-- о Д де МТА А, за Ел су кни ти, й
Ух з і ден рмито АєНМ йИ- Н що у 2 омта и
Но ї х М ї Шев; їз
Пефосфорилування Кука: ; вів Й прин, рн й 4 ВНЕ синтезатой -- ющЩ ( - - ДТ - ях -х'55-- й М я ще «я СИНІ ЗВ ОМ ден Шо; тр ян й пи в і 2. вапно МН. 203 рито (впЬМ дн но сн - втричио
НУ - йтР-ОоН і но ОН г
ГК ні Не. --т ДУ т
НИ й З
АНІ о-. он но шн т
І -й р. ше кі
З щі З
АсНМ й 204
Олігомерну Сполуку 204, що містить кон'югувальну групу СаІМАсз-19, одержали із сполуки 64 за загальними способами, представленими у Прикладі 52. Кластерна частина сСаЇМАсз кон'югувальної групи СаюмМАсз-19 ((заїМАсз-194) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'юЮгувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)- - Структура СаІМАсз-19 (СсаІМАсз-194-СМ-) представлена нижче: он нОооНн Х
Ге) М но-ктаонгу К,
АснМ о-р-он
Ко) ноон х
Ге) М но кто НК К.
АснНМ оср-он
Ко) ноОоНн х
Ге) М ог
З нок Ї щей
АсНнНМ
Приклад 71. Одержання олігомерної сполуки 210, що містить СсаіМАсз-20
Е
Й доб я ЯКО вІМОвть СНаСМ Щ ій й дж й мл й С іт ор з Мн ак прак аа оз р шин п й- с; Р Мн пе й ле омто вк р Я
АОС А
! й З в; доз Кл пити о
КСО даетанов нев их чад ній т нення щі 5-5 птн у
ВМТ 0озау поле о п, як Текросформлування у З З КУ ДН мо Мото е и " денім | є 208 рито у вспсде А ч і Я. НК сянтаздтор а ух АЖ. Ве т што й Мо --- тн лсо ит чини чн хви А 2 водно МНЕ вен / 29 ромб ПРП рн но ЯН н 4 а ;
І - в Й
Е Я по я що У-к на ко й й 7 щ
Кен Со -шото
Що в-во 4 но хо гр і: во и ре аснМ 7 7 дев. оц он 2 Ки но; Н Цї !
Мою дич ВИ це ше З но м 3 її, сне зо
Сполуку 205 одержали додаванням РЕР-ТФК і СІЕА до 6-(2,2,2- трифлуорацетамідо)гексанової кислоти в ацетонітрилі, яку одержали додаванням трифлуороцтового ангідриду до б-аміногексанової кислоти. Реакційну суміш нагріли до 80 "С, потім охолодили до кімнатної температури. Олігомерну Сполуку 210, що містить кон'югувальну групу СаіМАсз-20, одержали із сполуки 208 загальними способами, представленими у Прикладі 52. Кластерна частина СаїЇМАсз кон'югувальної групи СаІМАсз-20 (СаіМАсз-204) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аа-РІ-ОХОН)-. Структура СаІМАсз-20 (СсаІМАсз-204-СМ-) представлена нижче:
он но ен Н о ; о М. Ав (в) юка г З
АСНМ о ? от тон он о Ки о М
Ге) но ша З
АСНМ о ? опетон он о - о М
АСНМ о о-Їсм|-
Приклад 72. Одержання олігомерної сполуки 215, що містить СаіМАсз-21 я-- га - -
З вн -ща її шо он
Асо м шити вн ко їй с я т г денНМ їв зй Хл Я пит, шн БОВ, ВМР. 12-дихпораетан сне шк й т не що соит дос Ас 2 т
ПО ТСІ. пірндин, кВяя т-б8 «о кт» и щі) Тіофосфорклування вон 213 це
Не 8-7 5-й 1. ВНК сантязатор всорвс 2 й К- вн ОТ
Ас ве о мин 2. водн. МН 214 оомт но ИЙ і -щ ни не ке І ше вени 7 Її
Ош-в- ОН
А що ВН Кк на ці А , т но ван зв ї доні па 1 ви т й у
Ще фран но ха іже Щі М в т - оліго) 215
Сполука 211 є в продажу. Олігомерну Сполуку 215, що містить кон'югувальну групу СаіМАсз- 21, одержали із сполуки 213 загальними способами, представленими у Прикладі 52. Кластерна частина СаЇМАсз кон'югувальної групи СзаІМАсз-21 (СаІМАсз-21з) може бути комбінована з будь- яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(-ОХОН)-Аза-Р(-О)(ОН)- - Структура СаіМАсз-21 (СсаІМАсз-214-СМ-) представлена нижче: он он но Г о М
АснМ ? о-есоН в) он но о М т Нр
АСНМ ? остео в) он но о М но Ов 5 оч
АСНМ
Приклад 73. Одержання олігомерної сполуки 221, що містить СаіМАсз-22
В п Н.Н пАдоОВ 2 дж уттив Мотя шк т пи ші ЦЗН й кож вк 211 і 5. 205 Ж, - - : 4 215 Мн во ПТЕА АС н НО ки рмт-сі вк. М пити оС НЯТЬ оя-- т пірчидин її ІВ МецнтнІо вал ВІ
Ж ст п Е
НЯ. ян Я, рин ЮМИХ дво ую ши се щі пе Дт тн Хо в вод йо Її 218 ан МНА 15 ЕЙ 7 птн тн тн тн тн тн нт тн тн тн тн ри
Од н о йо шо дити тн з -н ун. ОоМте Тюфосформпування
Аг най З нн
МНАс Ії ш 218 он
Оле н о й
АО боодитчитдтий дит и дет ою де до г І
С вні й
ПІ
226 нотних он Н 9
Що сети кити рин но о С
ЧНАС
1. ДНК синтазатов он ц З 1 Кв но ЕВ
НАС
Бо: ; Е ІЙ Іо (ун В де оді п а ен пити дини С зе
Но З 2
Сполуку 220 одержали із сполуки 219, застосувавши тетразолід діїзопропіламонію.
Олігомерну сполуку 221, що містить кон'югувальну групу СаІМАсз-21, одержали із сполуки 220 загальним способом, представленим у Прикладі 52. Кластерна частина СаІМАсз кон'югувальної групи СаМАсз-22 ((заїМАсз-224) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою -Р(І-ОХОН)-Аз--Р(І-О0О)ХОН)-. Структура
СаіМмАсз-22 (СаІМАсз-2234-СМ-) представлена нижче: о он Н о н ск вк лай и щі) Ге)
МНАс в) (Фін! он А АЛ оон рве м но Ге)
МНАс 1 он й А АХ о" "он рве й но Ге!
МНАс о); "Ссм)-?
Приклад 74. Вплив різних розщеплюваних фрагментів на антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять кон'югат 5'-бСаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей. Кожна з кон'югувальних груп СаіМАсз була приєднана до 5'-кінця відповідного олігонуклеотиду.
Таблиця 47
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМАсз 353382 Сев"Сев Тез Ге'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ТавІавАвав"Сав Газ Гев вдо | до 28 тев"Сев І ев Ге
СаіМмАсз-За-оАвдоСіев"Сев Ге Гев'"СевАввСав Гав'"СавАвв ГТ ав 661161 СіавАвче "Свв Гав Гев"Сев"Сев Тез Ге баїМмАсз За
Таблиця 47
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІВ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМАсз
СаіМмАсз-За-о(Зев"Сев Геє Гев'"СевАвавзСав Гав'"СавАвв Т ав 566904 СіавАвче "Свв Гав Гев'"Сев"Сев Тез Ге СаїмАсз-За во в
СаімАсз-1 7а-оАвдостев"Сев Геє Гев'"СевАвазСав Гав'""СавАвв І дв СаіМАсз-
СаіМмАсз-1 8а-оАвдостев"Сев Геє Гев'"СевАвазСав Гав'""СавАвв І дв СаіМАсз-
У всіх таблицях заголовні букви вказують азотисту основу для кожного нуклеозиду, а "С позначає 5-метилцитозин. Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О-2'-дезоксирибонуклеозид; "5" позначає тіофосфатний міжнуклеозидний зв'язок (РБ); "бо" позначає фосфодіестерний міжнуклеозидний зв'язок (РО); і "0» позначає -О-Р(-ОХОН)-. Кон'югувальні групи виділені напівжирним шрифтом.
Структура СаіМАсз-3а показана раніше у Прикладі 39. Структура СаІМАсз-17а показана раніше у Прикладі 68, а структура СаІМАсз-18а показана раніше у Прикладі 69.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам С57ВІ/6 (даскзоп І абогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 47, або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів мМРНК 5АВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення. РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 48, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином. Антисмислові олігонуклеотиди, що містять кон'югат саїМАс, демонструють однакову ефективність і є значно ефективнішими, ніж початковий олігонуклеотид, що не має кон'югату СаІМАс.
Таблиця 48
МРНК ЗВВ-1 (95 від сольового розчину)
ІВІВ Ме Доза(мг/ку | МРНКЗАВЛ Овід о) Кластер СаМАсз сольового розчину) Сольовийрозчин | нд. 100,0 нд | нд 79,38 353382 68,67 40,70 79,18 75,96 661161 5 Ш2313053 СаМмАсз-За Аа 12,52 91,30 57,88 666904 21,22 СаімМАсз-За 16,49 76,71 63,63 675441 29,57 СаіМАсз-17а Аа 13,49
Таблиця 48
МРНК ЗВВ-1 (95 від сольового розчину) - о, І
ІІ Ме Доза (мг/кг) | МРНКЗАВ- Овід | Кластер саІМАсз сольового розчину) 95,03 60,06 675442 31 04 СаіМАсз-1в8а Аа 19,40
Рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АГ ТТ) і аспартат-амінотрансферази (А5Т) в сироватці вимірювали відносно мишей, ін'єктованих сольовим розчином, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін і нітроген сечовини в крові (НСК).
Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину (дані не показані). Значення АЇ Т, АТ, загального білірубіну і НСК представлені нижче у Табл. 49.
Таблиця 49
Загальний
АТ А5Т од неКк
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) (Од/л) | (Од/л) білірубін (мг/дл) Кластер СаіМАсзі СМ (мг/дл)
Сольовий бром | мя 619) б | вана 353382 бот! Замлсиза бовгох Оаімлсх За 15 | 60 | 95 | 016 | з4 би Замлстта ую ма 517271 | ва. 05.0 37 | баМасва
Приклад 75. Фармакокінетичний аналіз олігонуклеотидів, що містять 5'-кон'югувальну групу
ФК АБО, представлених вище у Табл. 41, 44 і 47, оцінили із застосуванням зразків печінки, які одержали після виконання способів лікування, описаних у Прикладах 65, 66 і 74. Зразки печінки подрібнили і екстрагували за стандартними протоколами, і аналізували за допомогою
ІП-ВЕРХ-МС разом з внутрішнім стандартом. Сумарний рівень (мкг/г) всіх метаболітів у тканині виміряли інтеграцією відповідних УФ піків, а рівні в тканині АБО повної довжини, що не містять кон'югату ("початковий", в даному випадку ібзізє Мо 353382), виміряли із застосуванням відповідних іон-екстракційних хроматограм (ЕС).
Таблиця 50
ФК аналіз в печінці
Загальний рівень в Рівень початкового
ІБІЗ Мо | Доза (мг/кг) печінці за УФ (мкг/г) АБО в печінці за ЕІС Кластер СаІМАсз СМ (мкг/г) 8 ИШ012228800031333386 353382
ББТТви Заїмлсз За й бля ЗамАситза | А
БТООБи СаїмАсеїЗа | й бутави СаїмАсзтза | й 671262 СаїмАсиї5а | ло 570699 баїМАсз-За те 5234 2 2388000110001021089 1 самдвя А 670700 баїМАсз-За ле бТОГо1 баїМАсз-За те 671165 СаїмАсиїЗа | ло
А 54 Л 5 08 171170010120240 | сама бБББЗО баїМАсз-За во буБжИ СаїмАсиї/ла | й булла СаїмАсоіва | А
Результати, представлені вище у Табл. 50, демонструють, що спостерігали вищі рівні в печінці олігонуклеотидів, що містять кон'югувальну групу СамМАсз, ніж початкового олігонуклеотиду, що не містить кон'югувальну групу СаЇМАсз (ІБІ5 353382) через 72 години після введення олігонуклеотиду, особливо з урахуванням введення різних доз для олігонуклеотидів з групою кон'югату СаїІМАсз і без неї. Крім того, через 72 годин 40-98 95 кожного олігонуклеотиду, що містить кон'югувальну групу СсаІМАсз, було метаболізовано до початкової сполуки, що вказує на те, що кон'югувальні групи сСаіМмАсз розщеплюються у вказаних олігонуклеотидах.
Приклад 76. Отримання олігомерної сполуки 230, що містить СсаІМАсз-23
- сн 1980 а ста Май;
Нут труть пня дО тн и рт
РЕ ут т - нм 4.тивот ав пе Ст ок щ
Налити тут - ( 4 - - - -- - --- Й ШО крити із
ПАС ан пок пре вЖКОоНне За Ас т ї ща -- КН.
Не ЕОдс, Мен ок в рема в а й
ЛО М пд п- Е Е
ЧНнАс се - ук) г шк
І х і їх - о
Е п . с-Ммо,
Б - і; А ен п Т
ОА: ваш с.
САС 4 . н чу Й
ОА МНає пн ГО: 0 у Відновлення х Є одини Ер що й 271 Зв'язування з двохислотною сполукою тпде й чи я ла пу
ПАС (7 Що їх про Р ЕОМ й нас и ВАЄ ФРЕР-ТЯК о Ас кі
Мо дити пиття
МнАє 228 .. ПАБ нн
Ас М. о -к пана о в В
САС ий Е «ОА Такя н ; .
Ас Мнає с у ен чи, зн оно Й Що Її т й х що о З ЕОТуТе : й Іде
МН: дя КЕ шк 8 ян
АЄ - нас 22
З зле 3 ЩІ (опо З о--0-(снНа-МНо 1. Бератний буфер, ДМОСО вН ОВ. Жено т-о8 шо 2. одн. акбзх, кімн. т-ра он н що а -/й дитини Ще; она | Щ . . СН піду ж! з ; у я он НАе ; Як ЗА м , а пу сне ені они ПМ ит онАдлти / "ше
Її пк ОН т іНАСЄС он Я, хо я птн пд пРОУ кі; н он п
МНАс 230
Сполука 222 є в продажу. 44,48 мл (0,33 моль) сполуки 222 обробляли тозилхлоридом (25,39 г, 0,13 моль) в піридині (500 мл) протягом 16 годин. Потім реакційну суміш випарували до маслянистої речовини, розчинили в ЕІАс і промили водою, насиченим розчином МанНсо»з, насиченим сольовим розчином і висушили над Маг25О05. Етилацетат концентрували до сухого стану і очистили колонковою хроматографією, елюювали ЕЇОАсС в гексанах (171), потім 10 95 метанолу в СНеСі2г з одержанням сполуки 223 у вигляді безбарвної маслянистої речовини. Дані
РХМС і ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. 10 г (32,86 ммоль) 1- тозилтриєтиленгліколю (сполука 223) обробляли азидом натрію (10,68 г, 164,28 ммоль) в ДМСО (100 мл) при кімнатній температурі протягом 17 годин. Потім реакційну суміш вилили у воду і екстрагували ЕІЮАс. Органічний шар тричі промили водою і висушили над Маг50О0». Органічний шар концентрували до сухого стану з одержанням 5,3 г сполуки 224 (92 95). Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. 1-Азидотриетиленгліколь (сполука 224, 5,53 г, 23,69 ммоль) і сполуку 4 (6 г, 18,22 ммоль) обробили 4А молекулярними ситами (5 г) і ТМ5ОТІ (1,65 мл, 9,11 ммоль) в дихлорметані (100 мл) в інертній атмосфері. Через 14 годин реакційну суміш відфільтрували для видалення сит, а органічний шар промили насиченим розчином Мансо»з, водою, насиченим сольовим розчином і висушили над Маг25О»х. Органічний шар концентрували до сухого стану і очистили колонковою хроматографією, елююючи з градієнтом від 2 до 4 95 метанолу в дихлорметані з одержанням сполуки 225. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із структурою. Сполуку 225 (11,9 г, 23,59 ммоль) гідрогенізували в ЕІОАс/метанолі (4:1, 250 мл) на каталізаторі Перлмана. Через 8 годин каталізатор видалили фільтрацією, а розчинники видалили до сухого стану з одержанням сполуки 226. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із структурою.
Для одержання сполуки 227 розчин нітрометантриспропіонової кислоти (4,17 г, 15,04 ммоль) і основи Хюніга (10,3 мл, 60,17 ммоль) в ДМФА (100 мл) по краплях обробили пентафлуортрифлуорацетатом (9,05 мл, 52,65 ммоль). Через 30 хвилин реакційну суміш вилили в льодяну воду і екстрагували ЕМОАс. Органічний шар промили водою, насиченим сольовим розчином і висушили над Ма»5Ох4. Органічний шар концентрували до сухого стану, і далі перекристалізували з гептану з одержанням сполуки 227 у вигляді білої твердої речовини.
Зо Дані РХМС їі ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. Сполуку 227 (1,5 г, 1,93 ммоль) і сполуку 226 (3,7 г, 7,74 ммоль) перемішували при кімнатній температурі в ацетонітрилі (15 мл) протягом 2 годин. Потім реакційну суміш випарували до сухого стану і очистили колонковою хроматографією, елююючи з градієнтом від 2 до 10 95 метанолу в дихлорметані, з одержанням сполуки 228. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із структурою. Сполуку 228 (1,7 г, 1,02 ммоль) обробили нікелем Ренею (близько 2 г, вологий) в етанолі (100 мл) в атмосфері гідрогену. Через 12 годин каталізатор видалили фільтрацією, а органічний шар випарували до твердої речовини, яку застосували безпосередньо на наступній стадії. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. Цю тверду речовину (0,87 г, 0,53 ммоль) обробили бензилглутаровою кислотою (0,18 г, 0,8 ммоль), НВТИи (0,3 г, 0,8 ммоль) і ОІЕА (273,7 мкл, 1,6 ммоль) в ДМФА (5 мл). Через 16 годин ДМФА видалили при зниженому тиску при 65 "С з одержанням маслянистої речовини, і цю маслянисту речовину розчинили в дихлорметані. Органічний шар промили насиченим розчином МансСоОз, насиченим сольовим розчином і висушили над Маг5О». Після випаровування органічного шару сполуку очистили колонковою хроматографією, елююючи з градієнтом від 2 до 20 956 метанолу в дихлорметані з одержанням зв'язаного продукту. Дані
РХМС і ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. З бензилового естеру зняли захист на каталізаторі Перлмана в атмосфері гідрогену протягом 1 години. Потім каталізатор видалили фільтрацією, а розчинники видалили до сухого стану з одержанням кислоти. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою. Цю кислоту (486 мг, 0,27 ммоль) розчинили в сухому
ДМФА (З мл). Додали піридин (53,61 мкл, 0,66 ммоль) і продули реакційну суміш аргоном. До реакційної суміші поволі додали пентафлуортрифлуорацетат (46,39 мкл, 0,4 ммоль). Колір реакційної суміші змінився з блідо-жовтого на винний, і з'явився легкий димок, який випарувався з потоком аргону. Реакційну суміш залишили перемішуватися при кімнатній температурі на одну годину (завершення реакції підтвердили методом РХМС). Розчинник видалили при зниженому тиску (ротаційний випарник) при 70 С. Залишок розбавили ДХМ і промили 1 н Манзох, насиченим сольовим розчином, насиченим розчином бікарбонату натрію і знову насиченим сольовим розчином. Органічний шар висушили над Маг50О5, відфільтрували і концентрували до сухого стану з одержанням 225 мг сполука 229 у вигляді крихкої жовтої піни. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із вказаною структурою.
Олігомерну Сполуку 230, що містить кон'югувальну групу СаІМАсз-23, одержали із сполуки 229 загальними способами, представленими у Прикладі 46. Кластерна частина сСаїЇМАсз кон'югувальної групи СамМАсз-23 ((заіМАсз-234) може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом для одержання різноманітних кон'югувальних груп. Структура
СаіМмАсз-23 (СаіМАсз-23а-СМ) представлена нижче: он Н он М. О.О о ооо он он Н он МНАс М МН М. А ло о ооо Яр и Сом З он о о і) о (в)
МНАс оно! Ту є) ото он
МНАс
Приклад 77. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять кон'югат СаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні
Зо антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей.
Таблиця 51
Модифіковані АБО, націлені на 58В-1 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМАсз
СаіМАсз-За-оАвдостев"Севє Геє Гев'""СевАвеСав Гав'"СавАвдв ТГав 661161 СіавАвв "Свв Гав Гев'"Сев"Сев Тез Те баїМмАсз За
СаіМАсз-За-облев"Сев Ге Гев'""СевАвав(ав Гав'""СавАвв Т дв 566904 СіавАвв "Свв Гав Гев'"Сев"Сев Тез Те баїМмАсз За Щ-Я
СаіМмАсз-1Оа-оАвдоСтев"Сео Гео Гео" СеоАазСіав Гав'""СавАвв Т дв 673502 СіавАвв "Свв Гав Гео" Сео"Сев Тез Те баїМмАсз 1ба
СаіМАсз-У9а-оАвдостев"Севє Геє Гев'""СевАвеСав Гав'"СавАдв ТГав 677844 СіавАвв "Свв Гав Гев'"Сев"Сев Тез Те баїМмАсз За 677843 СвеАветСає Та ТеетСевтСеєТеєТе СаіМмАсз-2За Аа 30
Сев"Сев Тез Гев'"СевАвдеСав Гав'"СавАвв ГавСтазАвав"Сав Газ Ге'""Сев 655861 тез Геє ГеоАао-С(1аіМАсз-Та баїмАсзла
Таблиця 51
Модифіковані АБО, націлені на 58В-1 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМАсз
Сев"Сев Тез Гев'"СевАвдеСав Гав'"СавАвв ГавСтазАвав"Сав Газ Ге'""Сев 677841 тез Тез ТГеоАао -С1а!/МАсз-19а баїмАсз19а
Сев"Сев Тез Гев'"СевАвдв ав Гав'"СавАдв Т ав 677842 СіавАвв "Свв Гав Гев'""Сев "Сев Гез ГеоАао -С1аІМАсз-2Оа СаїМмАсз-2ба
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9, СаІМАсз-За показана у Прикладі 39,
СаіМАсз-За показана у Прикладі 52, СаІМАсз-10а показана у Прикладі 46, СаіМАсз-194 показана у Прикладі 70, СсаІ!МАсз-20а2 показана у Прикладі 71, і саіМАсз-23а показана у Прикладі 76.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам С57ВІ/6 (даскзоп І абогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 51, або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення для визначення рівнів мМРНК 5АВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення. РНК
КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобев5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5КВ-1 для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 52, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
ЗАВ-1 дозозалежним чином.
Таблиця 52
МРНК ЗВАВ-1 (95 від сольового розчину) -1 (95 ві
ІІ Ме Доза(мг/ку | МРНИКЗАВЛООввід о кластер саМАсз сольового розчину) Сольовийрозчин | нд. | 100,0 нд. | нд 89,18 77.02 661161 2941 0 СаіМАсз-За Аа 12,64 931 55,85 666904 21,29 СаМмАсз-За 13,43 77,15 41.05 673502 1 927 СаіМмАсз-1ба Аа та 87,65 93,04 677844 40,77 СаіМАсз-За Аа 16,95 102,28 70,51 677843 30,68 СаіМмАсз-2За Аа 13,26 79,72 55,48 655861 26,99 СаіМмАсз-1а Аа 17,58
Таблиця 52
МРНК ЗВАВ-1 (95 від сольового розчину) - о, ї
ІІ Ме Доза(мг/ку | МРНИКЗАВЛООввід о кластер саМАсз сольового розчину) 67,43 45,13 677841 27,02 СаіМАсз-19а Аа 12,41 64,13 53,56 677842 20,47 СаіМмАсз-2ба Аа 10,23
Виміряли також рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АЇТ) і аспартат- амінотрансферази (А5Т) в сироватці, застосовуючи стандартні протоколи. Оцінили також загальний білірубін і нітроген сечовини в крові (НСК). Перевірили зміну маси тіла, яка істотно не відрізнялася від групи сольового розчину (дані не показані). Значення АЇТ, А5Т, загального білірубіну і НСК представлені нижче у Табл. 53.
Таблиця 53
Загальний Класте
ІБІЗ Мо |Доза (мг/кг) | АГТ (Од/л) | А5Т (Од/л) | білірубін |НСК (мг/дл) й СМ
СаіМАсз (мг/дл)
Сольовий роми 12 | виз | я |на ндо бБТТвІ ЗаїмАсзЗа ло 1,5 | 26 | 68 | 015 |ЙД з35 ббвЗоя ЗаїмАсз За 715... 24 | 60 | 03 1.35 673502 ЗаїмАсзтба| Ав бТтвля ЗаїмАсзва ло бла тв 1772171111776011. 0и5...34 ІМС тЗа А бБ5вб1 в 172211 6011..0и3.1...36. | СаїМАсота А
Таблиця 53
Загальний Класте
ІБІЗ Мо |Доза (мг/кг) | АГТ (Од/л) | А5Т (Од/л) | білірубін |НСК (мг/дл) й СМ
СаімМАсз (мг/дл) бттви Замасютва ло бттвл2 Замаситоа ло
Приклад 78. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на ангіотензиноген, що містять кон'югат СаіМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування ангіотензиногену(АСТ) у нормотензивних мишей Спрага-Доулі.
Таблиця 54
Модифіковані АБО, націлені на АСТ . . «рн " Кластер
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") саМмАсз ЗЕО ІЮ МО. 5Б2668 доле беТебидетеТеТетеТеба Се Сеня до | ндо| З
СіезАез Те тОевАев""Сеє ГезСіевАвв Т де Т ав І ав Г ав ГавСіав'"Сав'"Сав"СвАевзСівв 669509 СевАез ГеоАао-С1аїЇМАсз-їа бамлсьто| А | 3500
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9.
Лікування
Шеститижневим самцям щурів Спрага-Доулі один раз на тиждень вводили підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, в цілому три дози олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 54, або РВ5.
Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Щурів умертвили через 72 години після введення останньої дози. Рівні МРНК АСТ в печінці виміряли за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМФ (Моїесшіаг Ргобев, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами. Рівні білка АСТ в плазмі виміряли за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу для визначення загального ангіотензиногену (кат. Мо
УР27412, ІВГ. Іпгегпайіопа!, Торонто, штат Онтаріо) з розведенням плазми 1:20000. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток від рівнів МРНК АСТ в печінці або від рівнів білка АСТ в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка з РВ5.
Як показано в Табл. 55, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
АСТ в печінці і рівні білка в плазмі дозозалежним чином, і олігонуклеотид, що містить кон'югат
СаіМАс, був значно ефективнішим, ніж початковий олігонуклеотид, що не містить кон'югату
СаіМАс.
Таблиця 55
Рівні мРНК АСТ в печінці і білка в плазмі
МРНК АСТ в Білок АСТ в
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) печінці (95 РВЗ) | плазмі (95 РВЗ) Кластер СаІМАсз РВ5 | нд. | 100 | 100 | - нд | нд ооебоВ 7860 | в ЇЇ! "Чч
Таблиця 55
Рівні мРНК АСТ в печінці і білка в плазмі
МРНК АСТ в Білок АСТ в
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) печінці (95 РВЗ) | плазмі (95 РВЗ) Кластер СсСаІМАсз 663509 Замлсзта ле о Її 9 1 23 2
Виміряли також рівні трансамінази в печінці, аланін-амінотрансферази (АЇТ) і аспартат- амінотрансферази (А5Т) в плазмі, а також масу тіла на момент умертвіння, застосовуючи стандартні протоколи. Результати представлені нижче у Табл. 56.
Таблиця 56
Рівні трансамінази в печінці і маса тіла щурів
Маса тіла (95 від Класте
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) | АТ (Од/л) | А5Т (Од/л) початкового й СМ
СаІМмАсз значення) РВ5 | нд. | 51 | 81 | 186 | нд | нд. озаббв Гоово 01177759 | 98 182 780 | 56 | БЮ Д 75 | 170 03 | 53 1БЮюж и юю90 | щ 190 663509 Замасла
Приклад 79. Тривалість дії іп мімо олігонуклеотидів, націлених на АРОС-ЇЇ, що містять кон'югат саіМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 57, випробували в дослідженні одноразової дози на тривалість дії у мишей.
Таблиця 57
Модифіковані АБО, націлені на АРОС-ІЇ . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СамаАсз 304801 пен беТеТе ОеТетабете Си СельбелбеТтете до Тндо) 200
ТевАез Те
АезСіев"Сев Тез Гев'"Сав Г ав ГавСіав Гав'"Сав'"СавАвавСіав" Сов Гев Тез 647535 ТезАезТеоАдо -Сс1аМАсз-Та баімАсзта
СаімМАсз-За-оАвдоАезСівв"Сев Ге Гев'"Сав Газ ГавСіав Гав'"Сав 563083 тавАввСтав" Св Гев Ї ев ТезАез Те Са!МмАсз-За
СаіМмАсз-7а-оАвдоАезСівв"Сев Ге Гев'"Сав Газ ГавСіав Гав'"Сав 674449 тавАввСтав" Св Гев Ї ев ТезАез Те Са!МмАсз-7а
СаімМАсз-10а-оАдоАевСіев"Сев Ге Гев'""Сав Г ав ГазСіав Гав'"Сав 674450 тоавАвавСіав" Св Т ев Ге ГезАез Те ОаїмАсз-1ба
СаіМмАсз-1За-оАдоАевСіев"Сев Ге Гев'""Сав Г ав ГазСіав Гав'"Сав 674451 тоавАввСтав" Св Гев Ї ев ТезАез Те баїМмАсз 1За
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9, СаІМАсз-За показана у Прикладі 39,
СаіМмАсз-7а показана у Прикладі 48, саіМАсз-104 показана у Прикладі 46, і СаіМАсз-13а показана у Прикладі 62.
Лікування
Шести-восьмитижневим трансгенним мишам, які експресують людський АРОС-ЇЇ, ввели одноразову підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду, наведеного у Табл. 57, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із З тварин. Зразки крові відбирали до введення дози для визначення початкового значення, а також через 72 години, 1 тиждень, 2 тижні, З тижні, 4 тижні, 5 тижнів і 6 тижнів після введення дози. Рівні тригліцеридів і білка АРОС-ПЇ в плазмі виміряли таким чином, як описано у Прикладі 20. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток від рівнів тригліцеридів і АРОС-ІПЇ у плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових значень, і вони демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югувальну групу СзапМАс, мають тривалішу дію, ніж початковий олігонуклеотид, що не містить кон'югувальної групи (ІБІ5 304801), навіть незважаючи на те, що доза початкової сполуки була втричі вищою, ніж доза олігонуклеотидів, що містять кон'югувальну групу саїіМАс.
Таблиця 58
Рівні тригліцеридів і білка АРОС-Ц в плазмі трансгенних мишей віємо доза дні Тригліцериди (96. ІБілокАРОС-Ш (96, Кластер - о (мг/кг) введення від початкового | від початкового самАс» значення) значення) дози 27171111 1111981 714. 708198 2 2щ зЯ«
РВ5 95 | 88 6юж5жк Я 9 з04801| зо 95 | 6 5 щЩ | 7 647535| 10 сСаМмАсз-1а Ав | щх66в щю ю(ї (69 ( 663083 | 10 сСаМмАсз-За Ав 742 | 6 2 6ющж рВЯМ1 78 674449 | 10 СаМмАсз-7а Ав 85 | щКК6б9 | 7 42 | Юм ющ 1 9
Таблиця 58
Рівні тригліцеридів і білка АРОС-І|ІІ в плазмі трансгенних мишей
Точки часу . о . по
Доза (дні після Тригліцериди (до Білок АРОС-П (Фо Кластер см
ІБІВ Мо від початкового | від початкового (мг/кг) введення СаімМАсз значення) значення) дози) 674450 | 10 бамАсз-їба Аз 7935 | 68 | 7 |і 674451 10 бамАсз-і3За/ Аз
Приклад 80. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на альфа-1 антитрипсин (АТАТ), що містять кон'югат заіМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 59, випробували в дослідженні дозозалежного інгібування АТАТ у мишей.
Таблиця 59
Модифіковані АБО, націлені на АТАТ . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМАсз 476366 Аев"Сев'"Сев"СевАевзАоввз Гав Гав'"СавАвавСіавАвавАвавз(ЗавСіавАевАев вдо |до 87
Сіе5Се5Ае
Аев"Сев'"Сев"СевАевзАоввз Гав Гав'"СавАвавСіавАвавАвавз(ЗавСіавАевАев 656326 СіевСТевАевоАас -Сс1а!МАсз- 1 а баїмАсзла
СаіМАсз-За-оАдоАев"Сев'"Сев"СевАезАвв Пав Гав'"СавАваеСіазАсів 678381 АвавСіавСіаеАезАев СевСевАе Сба!мАсз-За
СаіМАсз-7а-оАдоАев"Сев'"Сев"СевАезАвв Пав Гав'"СавАваеСіазАсів 678382 АвдеСіавСтазАезАев» СезСевАе баїмлсз та
СаімМАсз-1Оа-оАдоАев"Сев"Сев"СевАееАвв Таз Гав'"СавАваз Свв 678383 АдеАвазСідеСіазАееАев СезСевзАе бамАсз ба
СаіМАсз-1За-оАвдоДАев"Сев"Сев"СевАееАвв Таз Гав'"СавАваз Свв 578384 АдеАвазСідеСіазАееАев СезСевзАе баїмлсз 1За
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9, СаІМАсз-За показана у Прикладі 39,
СаіМмАсз-7а показана у Прикладі 48, сзаіМАсз-104 показана у Прикладі 46, і СаіМАсз-13а показана у Прикладі 62.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей С57ВІ/6 (даскзоп І арогаюгу, Бар-Харбор, штат Мен) один раз на тиждень вводили підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, в цілому три дози олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 59, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення. Рівні МРНК АТАТ в печінці визначили за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення
РНК КІВОСКЕЕМОФ (Моїесшаг Ргобрев, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами.
Рівні білка АТАТ в плазмі визначили за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу для визначення мишачого альфа 1-антитрипсину (кат. Мо 41-АТАМ5-ЕО1, АЇІрсо, Салем, штат
Нью-Гемпшир). Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів мРНК
АТАТ в печінці і білка в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка з РВ5.
Як показано в Табл. 60, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК
АТАТ в печінці і рівні білка АТАТ в плазмі дозозалежним чином. Олігонуклеотиди, що містять кон'югат СаІМАс, були значно ефективнішими, ніж початкова сполука (ІБІ5 476366).
Таблиця 60
Рівні мРНК АТАТ в печінці і білка в плазмі
МРНК АТАТ в Білок АТАТ в СМ
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) печінці (25 РВЗ) | плазмі (95 РВЗ) Кластер Фамдеі ЄМО
РВ5 | нд. | 700 | 700 | нд | нд. 775 ЮЩ| Юющв8в6 | 78 476366 7706 юю. 6ЮБ9 БЮЖюЮкЖ( | 9 беж гтв6 0117777л5000011700030 | бамаста 7» 718... 6 | 0 7706 | ющло5 | 9 772 | 5 | 6 бів 1177л60000117011200 | бамасева 7» 7706 2 юЮ.Ї ЮБ(80 | ...792ЮщЩ( ба ттв ОО л21000101170112700| бамаста 7» 218 71117181 7706 2 ЮюЮ.| щ(94 | 84 б п6 11772300 240) бамлетоа 7» 718... 6 | 0 7706 | щоб | 9 бе тв6 ОО 221177777260000170111310000 | бамлетва 7»
Під час умертвіння виміряли рівні трансамінази в печінці і НСК в плазмі за стандартними протоколами. Виміряли також масу тіла і масу органів. Результати представлені нижче у Табл. 61. Маса тіла представлена як 95 від початкового значення. Маса органів представлена як 95 від маси тіла відносно контрольної групи РВ5.
Таблиця 61 . Маса Маса (в)
Доза | діт | АБтТ о нско 0 Масатіла 60) децінки(95 Маса нирок! седезні-ки
ІІ Ме | (мг/кг) | (Од/л) (Од/л)| (мг/длу (Я початково! відн маси Сб відн. | о; відн д д д го значення) | "МН. маси тіла) о ВІДН. тіла) маси тіла) РВ5 | нд. | 25 | 51 | 37 | 7119 | 100 | 00 | 00 / 5 /|34 | 68| 35 | 16 | 91 | 98 | 106 476366 45 | 30147 | 31 | 8 | 99 | 108 | 123 06 | 29 57 | 40 | 123 | 7100 | 103 | 119 вБбзов / 2 | 36 | 75 | 39 | 114 | 98 | 1 | лоб 6 | 32167 | 39 | 125 | 99 | 97 | 122
Таблиця 61 . Маса Маса
Доза | діт о| Ат | 3нско 0 Масатіла 06) децінки (95 | Маса нирок! едезні-ки
ІІ Мо (мг/кг). | (Од/л) | (Од/л) | (мг/дл) Від початково- відн. маси С» відн. (95 відн го значення) я маси тіла) НИ тіла) маси тіла) 06 | 2657 | З2 | 117 | 93 | 109 | 10 вувзвя / 2 | 26 | 52 | 33 | 121. | 96 | 106 | 725 6 |40 78 | З2 | 124 | 92 | р рл06 | 126 06 | 26/42 | 35 | 114 | 700 | 103 | 103 678382 6 | 301 79| 29 | 117 | 89 | 102 | 107 18 | 65 | 112| 31 | 120 | 89 | 104 | з ( 06 | 3067 | 938 | 121 | 91 | 100 | 123 вувзва / 2 | 33 | 53 | 33 | 118 | 98 | 102 | 21 6 |32 1 63| 32 | 117 | 97 | 105 | 105 18 | 36 68 | 31 | 118 | 99 | 103 | 108 06 | 36 63| 31 | 18 | 98 | 103 | 98 678384 6 /|34 1691 34 | 122 | 7100 | 100 | 96 18 | 28 | 55 | 30 | 17 | 98 | 101 | 104
Приклад 81. Тривалість дії іп мімо олігонуклеотидів, націлених на АТАТ, що містять кластер
СаімМАсз
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 59, випробували в дослідженні одноразової дози на тривалість дії у мишей.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей С57ВІ/6 ввели одноразову підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 59, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Зразки крові відбирали за день до введення дози для визначення початкового значення, а також на 5, 12, 19 і 25 день після введення дози. Рівні білка АТАТ в плазмі виміряли за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (див. Приклад 80). Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів білла АТАТ в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових рівнів. Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югат саіМАс, були ефективнішими і мали тривалішу дію, ніж початкова сполука без кон'югату СаІМАс (ІЗІЗ 476366). Крім того, олігонуклеотиди, що містять 5-СаїІМАс кон'югат (І5І5 678381, 678382, 678383 і 678384), були, в цілому, ще ефективнішими з ще тривалішою дією, ніж олігонуклеотид, що містить 3'-сСаїІМАс кон'югат (ІБІ5 656326).
Таблиця 62
Рівні білка АТАТ в плазмі мишей емо внсто МУМИ ери; сееесне 7
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) після введення початкового Кластер СсСаІМАсз дози) значення) 7в8 77781790 "т6з66 то 656326 18 СаіМАсз-та Ав
Таблиця 62
Рівні білка АТАТ в плазмі мишей
Точки часу (дні АЗАТ (95 від см
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) після введення початкового Кластер СсСаІМАсз дози) значення) шинннншишааяаяааО ЕЕ ин и и о тва! 78 Заїмлсв За тв 78382 78 Заїмлсв Та тв 25 6 Щ | 6 г гФ 78383 78 Замлсвтоа тв бтвзви 78 ЗамлсвтЗа тв
Приклад 82. Антисмислове інгібування іп міїго під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять кон'югат СаІМАсз
Первинні гепатоцити печінки мишей висівали у 96-ямкові планшети при 15000 клітин на ямку за 2 години до обробки. Олігонуклеотиди, наведені в Табл. 63, додали в концентрації 2, 10, 50 або 250 нМ в середовищі Уїльяма Е, і інкубували клітини протягом ночі при 37 "С в 5 95 СО».
Клітини лізували через 16 годин після додавання олігонуклеотиду, а загальну РНК очистили за допомогою КМеазе 3000 ВіоНобої (Оіадеп). Рівні МРНК 5КВ-1 визначили за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМО (Моїесшціаг Ргобез, Іпс.,
Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами. Значення ІСв5о визначили за допомогою програми Ргізт 4 (СгарпРад). Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять численні різноманітні кон'югувальні групи сатмМАс і численні різноманітні розщеплювані фрагменти, є значно ефективнішими в іп міго експерименті вільного поглинання, ніж початкові олігонуклеотиди, що не містять кон'югувальної групи СсаїІМАс (І5БІ5 353382 і 666841).
Таблиця 63
Інгібування експресії 5АВ-1 іп мйго . . осн " ' Кластер ІСво | ФЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") самАс
Стев"Сев Гев Гев"СевАввСіав ТГав"СавАвв ГавСіавАсів
Стев"Сев Гев Гев"СевАввСіав ТГав"СавАвв ГавСіавАсів 655861 пСоеТавТев"Сев"СесТеТеойсс -СаІМАсз-1а Ре сама моА| о | ге
СаіМАсз-За-оАдоСіев"Севє Ге Гев'"СевАвавСвав І ав 661161 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Т дв Тев"Сев"Сев Тез Ге Ре баїмс» зі Ах) 40 | зо
СаіМАсз-За-оАвдоСіев"Сео Гео Гео" СеоАазСвав І ав 661162 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Т дв Тео"Сео"Сев Тез Ге РО/Р5 баїМмАсз з 8 | зо
Стев"Сев Гев Гев'"СевАввСіав ТГав"СавАвв ГавСіавАсів 664078 псоеТавТев"Сев"СесТеТеойсс -СаІМАсз- Ве Ре сама в А| го | г
СаіМАсз-ва-оАдоСіев "Се Тез Гев'""СевАвавзСвав І ав 665001 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Г ав Гев'"Сев"Сев Тез Те Ре баїмс» ва Ах | то | зо
СаіМАсз-Ба-оАдоСівв "Се Тез Гев'""СевАвавзСвав І ав 666224 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Г ав Гев'"Сев"Сев Тез Те Ре баїмс» ва Ах | во | зо
Таблиця 63
Інгібування експресії 5АВ-1 іп мйго . . осн " ' Кластер ІСво | ФЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") самАс
Сев"Сео Гео Гео"СевАвзСав Гав"СавАв» ГаєСіавАсів вБввЕт ст Талслотет Роте| на нд) ов
СаіМАсз-1 Оад-оАдоСівв"Сев І ев Гев'"СевАвав Свв Т ав СаіМАсз-
СаіМмАсз-За-о(Зев"Сев Геє Гев'"СевАвавСав Гав'""Сав 566904 Аве ГавСтавАвв "Св Т ав Тев"Сев"Сев Тез Те Ре (бамдсзу РО 928
СаіМмАсз-За-о Гаобслев'""Сев Ге Гев'"СевАвав(Зав І дв 566924 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Т дв Тев"Сев"Сев Тез Ге Ре бамАсьзя та | 15038
СаіМмАсз-ба-оАвоСіев"Сев Гев Гев'"СевАвв Сов Та 666961 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Г ав Гев'"Сев"Сев Тез Те Ре бамАсьві Ах | 15030
СаімАсз-7а-оАвдоСіев"Сев Гев Гев'"СевАвдв Сов Та 666981 тоавАвв ГавСіавАвав "Сов ГТ ав Гев'"Сев""Сев Ге Ге РО бамасеті А; | 20130
СаіМАсз-1 За-оАвдоСівв'"Сев І ев Гев'"СезАввОав Г ав СаіМАсз-
СаіМмАсз-За-о Паобслев""Сео Гео Гео" СеоДав(Зав І дв 670699 тавАвв» Га» СіавАвче "Свв Газ Гео"Сео"Сев Т ев Ге РО/Р5 саімАсьЗ Те 15033
СаіМмАсз-За-оАеоСіев"Сео Гео Гео" СеойАавСав Га 670700 тавАвв» Га» СіавАвче "Свв Газ Гео"Сео"Сев Ге ГТ РО/Р5 самАсьЗ А 03030
СаіМмАсз-За-о ГеоСтев'""Сео Гео Гео" СеоДав(Зав І дв 670701 тавАвв» Га» СіавАвче "Свв Газ Гео"Сео"Сев Т ев Ге РО/Р5 саімАсьЗі Те 2533
СаіМАсз-1 2а-оАвдоСіев"Сев Тез Гев'"СевАвавСвав І ав СаіМАсз-
СаіМАсз-1 За-оАвоСівв'"Сео Ї во І во"7"СвоАавСвв Т ав СаіМАсз- 671165 тавАвв» Га» СіавАвче "Свв Газ Гео"Сео"Сев Ге ГТ РО/Р5 бак А во | зо
СаіМАсз-144-оАвдоСіев"Сев Тез Гев'"СевАвавСвав І ав СаіМАсз-
СаіМАсз-1 Ба-оАдоСівв""Сев І ев Гев'"СевАвав Свв Т ав СаіМАсз-
СаімАсз-7а-оАвдоСіев"Сео Гео Гео" СеойАавСав Га 673501 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Гав Гео" Сео"Сев Тез Те РО/Р5 саімАсьті Аз 03030
СаіМАсз-1 Оа-оАдоСівв"Сео Гео Гео"СеойавОСівв І ав СаіМАсз- 673502 тіавАв» ГазСіавАвв "Св Т дв Тео"Сео"Сев Тез Ге РО/Р5 бак ді в | зо
СаіМАсз-1 7а-оАвдоСіев"Сев Тез Гев'"СевАвавСвав І ав СаіМАсз- бу5аи пСавАвв ГавСіавАвав"Сав Гав Тев'"Сев'"Сев Гев Ге
СаіМАсз-1 Ва-оАдоСівв""Сев І ев Гев'"СевАвав Свв Т ав СаіМАсз-
Стев"Сев Тез Ге'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГавСзавАвв СаіМАсз-
ВВА | псоеТаеТевтСев"СесТесТеодог -«Са/МАсз- 195
Стев"Сев Тез Ге'"СевАвав(Став Гав'"СавАвв ГавСзавАвв СаіМАсз- бТТВТЯ | пооеТаеТевтСев"СесТесТеодг «Са/МАсз-20»
СаіМмМАсз-2За-оАвдоСіев""Сев Тез Гев'"СевАавОСав Т ав СаіМАсз-
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9, сСаіМАсз-3За показана у Прикладі 39,
СаіМАсз-5а показана у Прикладі 49, СаіМАсз-ба показана у Прикладі 51, СаІМАсз-7а показана у
Прикладі 48, саіМАсз-8а показана у Прикладі 47, саіМАсз-9а показана у Прикладі 52, СсСаІМАсз- показана у Прикладі 46, сСаіМАсз-12а показана у Прикладі 61, СаІМАсз-13а показана у
Прикладі 62, сСаіМАсз-14а показана у Прикладі 63, сзаіїМАсз-154 показана у Прикладі 64, сСаіМАсз- 174 показана у Прикладі 68, СаіМАсз-184 показана у Прикладі 69, СаІМАсз-194 показана у
Прикладі 70, саІМАсз-20а показана у Прикладі 71, і саіМАсз-23а показана у Прикладі 76.
Приклад 83. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 10 фактор ХІ, що містять кластер СаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 64, випробували в дослідженні дозозалежного інгібування фактора ХІ у мишей.
Таблиця 64
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на фактор ХІ . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІВ Мо Послідовність (від 5" до 3") самАс 404071 Тев(ЗезСеє ГеєАезАвв Гав'"Сав"СавАвв"Сав Газ Гав Гав'"СаєАев(Зев ондо | нд)
АезСівзСе
Тев(Зеобстео ГеоАеойав Гав'"Сав"СавАвв"Сав Газ Гав Гав'"СаєАвоСтео 656173 АезСіевСТвоАао -С1а!МАсз-їа СаімАсз-1а
СаіМмАсз-За-оАво ГеєСівоСіво ГеоАеойав Гав'""Сав"СавАвдв"Сав ГТ ав 563086 Таз Гав"СавАвоСТеоАезСез(Зе баїМмАсз-За
СаімМАсз-7а-оАво ГеєСівоСіво ГеоАеойав Гав'""Сав"СавАвдв"Сав ГТ ав 678347 Таз Гав"СавАвоСТеоАезСез(Зе баїМАсз-7а
СаімАсз-1Оа-оАво ГезСЗеослео ГеоАеойДавз Гав'"Сав"СавАвав"Сав 678348 Таз Газ Гав"СавАеоСЗеоАезСТез Се ба!МмАсз- Оз
СаімАсз-1 За-оАво ГезСЗеослео ГеоАеойавз Гав'"Сав"СавАвав"Сав 678349 Таз Газ Гав"СавАеоСЗеоАезСТез Се ба!МмАсз- За
Структура СаІМАсз-14 показана раніше у Прикладі 9, (заіМАсз-За показана у Прикладі 39,
СаіМмАсз-7а показана у Прикладі 48, саіМАсз-104 показана у Прикладі 46, і СаіМАсз-13а показана у Прикладі 62.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам один раз на тиждень вводили підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, в цілому три дози олігонуклеотиду, наведеного нижче, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останньої дози. Рівні мРНК фактора ХІ в печінці виміряли за допомогою ПЛР у реальному часі і нормалізували до циклофіліну за стандартними протоколами. Виміряли також трансаміназу в печінці, НСК і білірубін. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток для кожної експериментальної групи, нормалізований до контролю з РВ5.
Як показано в Табл. 65, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні мРНК фактора ХІ в печінці дозозалежним чином. Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югат сЗаіМмАс, були ефективнішими, ніж початкова сполука без кон'югату саіМмМАс (БІБ 404071). Крім того, олігонуклеотиди, що містять 5'-саІМАс кон'югат (ІБІ5 663086, 678347, 678348 і 678349), були ще ефективнішими, ніж олігонуклеотид, що містить 3-саїіМАс кон'югат (ІБІ5 656173).
Таблиця 65
Рівні мРНК фактора ХІ в печінці, трансамінази в печінці, НСК і білірубіну
І5ІВ Ме Доза |мРНК фактора| АТ АЗТ НСК | Біліру-бін | Кластер | 5ЕО І (мг/кг) | ХІ (95 від РВ5) | (Од/л) | (Од/л) | (мг/дл) (мг/дл) СаіМАсз МО. РВ5 | нд. | 100 2юЮБм-ї/ 63 | 70 | 21 | 08 | нд | нд. 404071 31 07 | 43 | 90 | 89 | 21 | об 656173) 2 | ще БЮБжюЮБЮСЮ«М| 36 | 58 | 26 | 017 (СаМАсзла| 32 6 ЇЇ щз1 | 50 | 63 | 25 | о5 663086 СаМАсз-За| 40 6 ЇЇ 1 | 34 | 40 | 23 | ол4 678347 СаМАсз-7а| 40 6 ЇЇ 1 | 44 | 76 | 19 | о5 678348 саїМАсз-
Таблиця 65
Рівні мРНК фактора ХІ в печінці, трансамінази в печінці, НСК і білірубіну (мг/кг) | ХІ (95 від РВ5) | (Од/л) | (Од/л) | (мг/дл) (мг/дл) СаіМАсз МО.
Б--- -- 2 -А---2 -- 5 А -- 55 - 5 ж 5 5 2 2 5 6 ЇЇ ющ2г | 25 | 38 | го | ол4
СамАсз- 678349| 2 | 8 щЩ | 43 | 63 | 21 | 04 | за 40 6 ЇЇ 2 | 28 | й | го | ола
Приклад 84. Тривалість дії іп мімо олігонуклеотидів, націлених на фактор ХІ, що містять кон'югат СаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені в Табл. 64, випробували в дослідженні одноразової дози на тривалість дії у мишей.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам ввели одноразову підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду, наведеного у Табл. 64, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Зразки крові відбирали із хвостової вени за день до введення дози для визначення початкового значення, а також на 3, 10 і 17 день після введення дози. Рівні білка фактора Хі в плазмі визначали твердофазним імуноферментним аналізом, застосовуючи іммобілізовані і біотинільовані детекторні антитіла для фактора ХІ виробництва А 5 О Ббувіетв5, Мінеаполіс, штат Мінесота (кат. Мо АЕ2460 і Мо ВАЕ2460, відповідно), а також реагент ОрІЕЇА, набір В (кат.
Мо 550534, ВО Віозсіеєпсе5, Сан-Хосе, штат Каліфорнія). Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів білка фактора Хі в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових рівнів. Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югат саіМАс, були ефективнішими і мали тривалішу дію, ніж початкова сполука без кон'югату СаІМАс (ІЗІЗ 404071). Крім того, олігонуклеотиди, що містять 5-СаіМАс кон'югат (ІЗІЗ 663086, 678347, 678348 і 678349), були ще ефективнішими з ще тривалішою дією, ніж олігонуклеотид, що містить 3'-саїІМАс кон'югат (ІБІ5 656173).
Таблиця 66
Рівні білка фактора ХІ в плазмі мишей
Точки часу (дні Фактор ХІ (95 від ФЕОІЮ
ІБІЗ Мо | Доза (мг/кг)| після введення початкового Кластер СаіїМАсз| СМ МО дози значення
РВ5 404071 30 31 656173 СаМАсз-та Ав з2 663086 СаїМАсз-За Ав 40 27711118 678347 СаїМАсз-7а Ав 40 и 111181
Таблиця 66
Рівні білка фактора ХІ в плазмі мишей
Точки часу (дні Фактор ХІ (95 від ФЕОІЮ
ІБІЗ Мо | Доза (мг/кг)| після введення початкового Кластер СаіїМАсз| СМ МО дози) значення) " 678348 СаїМАсз-10а Ав 40 27711116 678349 СаїМАсз-13а Ав 40
Приклад 85. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять кон'югат СаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені в Табл. 63, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам С57ВІ/б один раз на тиждень вводили підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, в цілому три дози олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 63, або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 48 годин після останнього введення для визначення рівнів мРНК 5АВ-1 у печінці за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМО (МоїІесшаг Ргобе5, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів мРНК ЗКВ-1 у печінці для кожної експериментальної групи, нормалізованих до контрольного зразка, обробленого сольовим розчином.
Як показано в Табл. 67 і 68, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні
МРНК 5КВ-1 дозозалежним чином.
Таблиця 67
МРНК 5КВ-1 у печінці
МРНК 5КВ-1 (95 від Кластер
ЗІЗ Ме Доза (мг/кг) сольового розчину) СаімАсз СМ
Сольовийрозчин | нд. | 100 | нд | нд. вввові саімАс-7а А 670061 20236085 189 1 саімдсуза /й
Таблиця 67
МРНК 5КВ-1 у печінці
МРНК 5КВ-1 (95 від Кластер 08 203172223396 бТтвл2 ЗаїмАсз2ба ло
Таблиця 68
МРНК 5КВ-1 у печінці
МРНК 5КВ-1 (95 від Кластер ббТтв1 ЗаїмАсз За ло
Виміряли також рівні трансамінази в печінці, загального білірубіну, НСК і масу тіла за стандартними протоколами. Середні значення для кожної експериментальної групи представлені нижче у Табл. 69.
Таблиця 69
Білі- Маса тіла (905
ІВІ5 Мо Доза АТ АТ бін неКк від почат- Кластер СМ
Й (мг/кг) | (Од/л) | (Од/л) РУ (мг/дл) кового СаімМАсз (мг/дл) значення
Сольовий рима) 1939 | 07 в |в нд | на бо5ВБІ баїмАсота ле битві го1784 1,760 08 | 221. 116 |СаМАсоЗа ле бОбВВІ баїмАсотба / Аве бббоВІ баїмАсота / ле
БТООБи баїмАсо За ле 677842 саМмАсз ба
Таблиця 69
Білі- Маса тіла (905
ІВІ5 Мо Доза АТ АТ рубін неКк від почат- Кластер СМ (мг/кг) | (Од/л) | (Од/л) (мг/дл) кового СаімМАсз (мг/дл) значення)
Приклад 86. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на ТА, що містять кластер саІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 70, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування людського транстиретину (ТТК) у трансгенних мишей, які експресують людський ТТЕ ген.
Лікування
Восьмитижневим ТТК трансгенним мишам один раз на тиждень протягом трьох тижнів, в цілому три дози, вводили підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду і дози, наведені в представлених нижче таблицях, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення. Протягом експерименту в різних точках часу відбирали зразки крові з хвостової вени і вимірювали рівні білка ТТК у плазмі, АГ Т і А5Т, які представлені в Табл. 72-74. Після умертвіння тварин виміряли рівні АТ, А5Т і людського
ТТЕ в плазмі, а також масу тіла, масу органів і рівні мРНК людського ТТЕК у печінці. Рівні білка
ТТК виміряли за допомогою клінічного аналізатора (4480, ВесКтап СошипПег, штат Каліфорнія).
ПЛР у реальному часі і реагент для кількісного визначення РНК КІВОСОКЕЕМФ (Моїіесшаг
Ргтобевз, Іпс., Юджин, штат Орегон) застосовували за стандартними протоколами для визначення рівнів МРНК людського ТТК у печінці. Результати, наведені в Табл. 71-74, є середніми значеннями для кожної експериментальної групи. Рівні мРНК є середніми значеннями відносно середнього значення для РВ5 групи. Рівні білка в плазмі є середніми значеннями відносно середнього значення для РВО групи в початковому стані. Маса тіла є середньою відсотковою зміною маси від початкового значення до умертвіння для кожної окремої експериментальної групи. Представлена маса органів нормалізована до маси тіла тварини, і далі представлена середня нормалізована маса органів для кожної експериментальної групи відносно середньої нормалізованої маси органів для РВ5 групи.
У Табл. 71-74 "ВІ" позначає початкове значення вимірювань, виконаних безпосередньо перед введенням першої дози. Як показано в Табл. 71 і 72, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні експресії ТК дозозалежним чином. Олігонуклеотиди, що містять кон'югат саіМмАс, були ефективнішими, ніж початкова сполука без кон'югату саіМАс
Зо (ІБІБ 420915). Крім того, олігонуклеотиди, що містять кон'югат баМАс і змішані РБ/РО міжнуклеозидні зв'язки, були ще ефективнішими, ніж олігонуклеотид, що містить кон'югат
СаїМАс і тільки Р зв'язки.
Таблиця 70
Олігонуклеотиди, націлені на людський ТТК . . . «рт ' ' Кластер ЗЕО І
Тев"Сев Гез Гез(ЗевСав Газ ГавАсв"СдавАва» ГаєСіавАсеАа»
Тев"Сев Гез Гез(ЗевСав Газ ГавАсв"СавАва» ГаєСіавАсеАа»
ОБОВ А оТестСес"Сес"Ссосе -ба/МАсз- 1 баїмАсзта
СаіМмАсз-За-о Гев"Сео Гео Ї еобслео(зав Пав ГаєАав"СавАвв 682883 ТаеСаеАвеАвеАво ГеотСеетОеетсь РБ/РО |СаїІМАсз-За Ром
СваімАсз-7а-о ТГев"Сео Гео Ї еобслео(зав Пав ГаєАав"СавАвв 582884 Тав(авАвзАвеАео Гео"Сев"Сев"Се РРО ба!МмАсз та во
СаіМмАсз-1Оа-оТев"Сео Гео ГеобСтеобСлав Таз ГазАвав"Сав 682885 Аве Та«СівеАдеАдеАео ТвотСеєтОе-тоОе РБ/РО |СаїІМАсз-10ба во
Таблиця 70
Олігонуклеотиди, націлені на людський ТТК . . . «рт ' ' Кластер ЗЕО І
СаімАсз-1 За-о ТГев"Сео Гео ГеобСтеобСлав Таз ГазАвав"Сав 682886 Аве Та«СівеАдеАдеАео Тво"СеєтСестОе РБ/РО |СаїІМАсз-1За во
Тев"Сео Гео ГеоСлтеоСав Газ ГавАсв"СдаєАва» ГаєСіавАсеАа» 684057 Аво ТеотСевтОестОвоАво-Са!МАсз-19а РБ/РО |СаїІМАсз-19а
Легенда для Табл. 72 представлена у Прикладі 74. Структура СаіМАсз-1 показана у
Прикладі 9. Структура саіМАсз-3а показана у Прикладі 39. Структура сСаїІМАсз-7а показана у
Прикладі 48. Структура СаІМАсз-10а показана у Прикладі 46. Структура СаІМАсз-1За показана у
Прикладі 62. Структура СаІМАсз-19а показана у Прикладі 70.
Таблиця 71
Антисмислове інгібування людського ТТ іп мімо віз Ме Доза (мг/кг) мРНК тв (96 Рв) Рілок Ан Кластер СаІМАС ши
РВБ5Ї| нд. | 100 | -/-( (100 | нд. | нд. У 76 1 БюЮжфя.юкКкаьє | юр г гФ 420915... 20. | 48... | .-./«/65 г | 4 60 | .ЮюЮЙИилв 777728 2 2щ 06 | 5 Ююжю я" ліз | 787 2 660261 СамАсз-та А 42 76 | щ20 2 2 Щ | 27 | " й 11198 Її п
Таблиця 72
Антисмислове інгібування людського ТТ іп мімо
МРНК Білок ТТК у плазмі (95 РВ5 при ВІ) вів Ме Доза ттв (х 17-й день Кластер СМ ЗЕО 7 (мг/кг) Рв). ВІ |3-й день|10-й день (після СаМмАс ІО МО. умертвіння) РВ5 | нд. | 100 /100| 96 | 90 | 114 | нд | нд 6 | 74 |л06| 86 | 76 | 83 420915| 20 | 43 /102| 66 | 61 | 58 | 4 60 | 24 |92| 43 | 29 | 32 06 | 60 |88| 73 | 63 | 68 ( 682883 СаімАсз-За 4 6 | ло |80| 35 | "| 9 06 | 56 |88| 78 | 63 | 67 682884 СаімАсз-7а 4 6 | 15 |82| 35 | 21 | 24 06 | 60 |92| 77 | 68 | 76 ( 682885 СаімАсз-1ба 4 6 | 17 |85| 37 | 25 | го
Таблиця 72
Антисмислове інгібування людського ТТ іп мімо мРНК вів Ме Доза ттв (96 17-й день Кластер СМ ЗЕО 7 (мг/кг) РВБ) ВІ |3-й день|10-й день (після СаМмАс ІО МО. умертвіння) 06 1 57 91| 70 | 64 | 69 6ввгввв| 2 | 21 |891 50 | 31 | 30 |СаМмАсз-13а 4 6 1 18 1102| 41 | 24 | 27 06 | 53 180| 69 | 56 | 62 684057 СамАсз-19а| Аз | 42 6 1 1 182| 50 | 18 | їз
Таблиця 73
Рівні трансамінази, зміна маси тіла і відносна маса органів
Печін-| Селе: | Нирки! 8ЕО ечін-| 7. о
Доза Маса ка (96 зінка (до ІО
Ібі5 Мо (мг/кг)! ВІ. З 10 | 17 ВІ З 10 | 17 тіла (95 РВО) (до РВБ5) | МО. день|день |день день|день|день| ВІ) ВІ РВБ) 10 17
З день| день | день РВ5 | нд. 33| 34 33|24| 58/62 |67 | 52) 105 | 100 | 100 | 100 | нд. 6 |34/|33|27|211|64 159 731 47 | 115| 99 | 89 | 91 420915| 20 | 34 | 30 | 2819 64| 54/56 42| 111 | 97 | 83 | 89 ) 41 во |34/|35|31|241|61 58) 71 | 58 113 | 102 | 98 | 55 06|331|38|28|26| 70 71| 63159 111 | 96 | 99 | 92 ввогвбі 2 129 3213134 | 61160 68| 61) 118 | 100 | 82 | 90 |, 6 1291|29|28|34/|58 159) 70190 114 | 99 | 97 | 55 |331|32|28|33| 64 | 54 | 68 | 95 | 114 | 101 | тоб | 92
Таблиця 74
Рівні трансамінази, зміна маси тіла і відносна маса органів
Печін-| Селе- | Нирки | ЗЕО ечін-| 7. о
Доза Маса ка (96 зінка (90 ІО
Ібі5 Мо (мг/кг) | ВІ. З 10 | 17 в З 10 | 17 | тіла РВБ5) (90 РВБ) | МО. день |день|день день|день|день (95 ВІ) ВІ. РВБ) 10 17
З день| день | день РВ5 | нд. | 32| 34/37 | 41 | 621 78 | 76 | 77 | 104 | 100 | 100 | 100 | нд. 6 /321|30|34/| 34 | 61 | 71 | 72 | 66 | 102 | 103 | 102 | 105 420915| 20 |41 34 373380 7663 54 106 | 107 | 135 | 101 | 41 60 з36|301/32/|34| 58/81 157 | 60 | 106 | 105 | 104 | 99 06 | 321|351|381/40| 53 | 81 | 74 | 76 | 104 | 101 | 112 | 55 6вгв83і 2 |381|391|42/|43|71| 8470177 | 107 | 98 | 116 | 99 | 4 6 135135) 41/|381| 62) 79 1031) 65 | 105 | 103 | 7143 | 97 06 331|32|35/|34| 70) 74 751| 67 | 101 | 100 | 130 | 99 68вгв84) 2 |311|32| 38138 631 77 | 66 | 55 | 104 | 103 | 122 | 100 | 41 6 1381 32/|36/|341|651|851801|62)| 99 | 105 | 129 | 595 06 39126137 /|351| 63163 77 | 59 | 100 | 109 | 109 | 112 6вгв85) 2 |30|261|381|40| 54156 71 | 72 102 | 98 | 111 | 102 | 4 6 /27|27|34|351| 46/52/1561 64) 102 | 98 | Із | 96 ввоває 0-30 об зд ее ЕТ ето а 2 |27|26|34|з36| 51551551 69) 103 | 91 | 705 | 92
Таблиця 74
Рівні трансамінази, зміна маси тіла і відносна маса органів
Печін-| Селе- Нирки 5ЕО ечін-| 7. о
Доза Маса ка (96 зінка (до ІО
Іві Мо (мг/кг) | ВІ. З 10 | 17 в З 10 | 17 | тіла РВБ5) (У6 | РВБ5) | МО. день |день|день день|день|день (95 ВІ) ВІ. РВБ) 10 17
З день| день | день 6 |401|28| 34137 |107| 54 61| 69 109 | 100 | 102 | 995 06 |351|26|33139|56| 51151169 104 | 99 | 110 | 102 684057 42
І 6 |391/33|35|40|67| 52155921 98 | 104 | 121 | 108
Приклад 87. Тривалість дії іп мімо одноразових доз олігонуклеотидів, націлених на ТА, що містять кластер СаІМАсз
ІБІЄ Мо 420915 і 660261 (див. Таблицю 70) випробували в дослідженні одноразової дози на тривалість дії у мишей. І5ІЗ Мо 420915, 682883 і 682885 (див. Табл. 70) також випробували в дослідженні одноразової дози на тривалість дії у мишей.
Лікування
Восьмитижневим самцям трансгенних мишей, які експресують людський ТТК, ввели одноразову підшкірну ін'єкцію 100 мг/кг І5ІЗ Мо 420915 або 13,5 мг/кг І5БІЗ5 Мо 660261. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Зразки крові з хвостової вени відбирали до введення дози для визначення початкових показників і на 3-й, 7-й, 10-й, 17-й, 24-й і 39-й день після введення дози. Рівні білка ТТЕ в плазмі вимірювали таким чином, як описано у Прикладі 86. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів ТТК в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових рівнів.
Таблиця 75
Рівні білка ТТЕ у плазмі
Точки часу (дні ТК (95 від (мг/кг) СаіМАсз дози) значення) 420915 100 ИШЗ2И25 52225153 41 777789 юЩщ 1 69 2
Лікування
Восьмитижневим самкам трансгенних мишей, які експресують людський ТТК, ввели одноразову підшкірну ін'єкцію 100 мг/кг ІЗІ5 Мо 420915, 10,0 мг/кг ІБІ5 Мо 682883 або 10,0 мг/кг
ІБІ5 Мо 682885. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Зразки крові з хвостової вени відбирали до введення дози для визначення початкових показників і на 3-й, 7-й, 10-й, 17-й, 24-й і 39-й день після введення дози. Рівні білка ТТ в плазмі вимірювали таким чином, як описано у Прикладі 86. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів
ТТ в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових рівнів.
Таблиця 76
Рівні білка ТТЕ у плазмі
Точки часу (дні ТК (95 від
ІБІЗ Мо Доза після введення початкового Кластер саіІМАсз СМ ЗЕ о (мг/кг) МО. дози) значення) 420915| 100 4 77171166 1111180 682883. 10,0 СаїМАсз-За 4 682885| 10,0 СаімАсз-1ба 4
Результати в Табл. 75 і 76 демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югат саїЇМАс, є ефективнішими і мають тривалішу дію, ніж початковий олігонуклеотид без кон'югату (ЗІЗ 420915).
Приклад 88. Сплайсинг-модуляція іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 5ММ, що містять кон'югат саіМмАсз
Олігонуклеотиди, наведені в Табл. 77, випробували на сплайсинг-модуляцію людських генів виживаності мотонейронів (5ММ) у мишей.
Таблиця 77
Модифіковані АБО, націлені на ММ . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМмАсз 387954 детегте Село" СесТевТевТев"СеоЛевТевЛовЛевТевСев"СевТе вдо | до) 430 ев е
СаіМмАсз-7а-оАев ев Гев'"СевАев'""Сев І ев І ез Гев'"СевзАев ГезЛАезАев ввовто | МАС ТетоловТе самАсз-7а Ро | 43
СаіМмАсз-7а-оАев ео Гео" СевоАео"Сео Ї во І ео Гео" СеоАео Ї егоДео 699821 Аео ГеоСівю"Сео ГезСієв(Зе бамАсз-7а ЩК-КЯ
АевгТев Гев'""СезАев""Сев Ї ев І ев Гез'"СевАев І езАевЛАевз ГезСівв'"Сев ев 700000 Се СівоАдо - аіІМАсз-їа ОаімАсз та 703421 |Х-АТТ"СА"СТТТ"САТААТат"сТОс нд. | нд. | 43 703422 | СаїМАсз-75-Х-АТТ"СА"СТТТ"САТААТО"СТоС СамАсз-7р | нд. | 43
Структура СаіМАсз-7а показана раніше у Прикладі 48. "Х" позначає 5'-первинний амін, одержаний компанією СбСепе Тооі5 (Філомат, штат Орегон), а СаІМАсз-7ь означає структуру
СаіМмАсз-7а, що не містить частини -МН-Св-О зв'язку, як показано нижче:
ноон (є) о ото НИК
АснНМ є) о (о) нотою їх пе
АснМ о ноон г о но кто і)
АснМ І
ІБІ5 Мо 703421 і 703422 являють собою морфоліно-олігонуклеотиди, при цьому кожен нуклеотид із двох олігонуклеотидів є морфоліно-нуклеотидом.
Лікування
Шеститижневим трансгенним мишам, які експресують людський 5ММ, ввели одноразову підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 78, або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 2 самців і 2 самок. Мишей умертвили через З дні після введення дози для визначення рівнів МРНК людського 5ММ в печінці з екзоном 7 і без нього, застосувавши ПЛР у реальному часі за стандартними протоколами. Загальну РНК виміряли за допомогою реагенту Ніродгееп. Рівні МРНК 5ММ нормалізували до загальної мРНК, і далі нормалізували до середніх значень в групі, обробленій сольовим розчином. Одержані середні співвідношення мРНК ММ, що містить екзон 7, до мРНК 5ММ, що не містить екзону 7, представлені у Табл. 78. Результати демонструють, що повністю модифіковані олігонуклеотиди, які модулюють сплайсинг і містять кон'югат сЗаМАс, є значно ефективнішими для зміни сплайсингу в печінці, ніж початкові олігонуклеотиди, що не містять кон'югату саІМАс. Крім того, ця тенденція зберігається для хімізму багаторазових модифікацій, включаючи 2'-МОЕ і морфоліно-модифіковані олігонуклеотиди.
Таблиця 78
Вплив олігонуклеотидів, націлених на людський 5ММ, іп мімо
ЗЕО І
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) тнекзон 7/-екзон 7 Кластер СсСаІМАсз СМ МО
Сольовий рн мона | на 387954 | (32 2 ющ | 165 | нд | нд | 43 387954 | 288. | ---.КИ/ 500 | 777 нд.//// | нд 43 ( 699819 СамАсз-7а | РО | 43 699821 СамМмАсз-7а | РО | 43 700000 СаїМАсз-та то3421 | 32 | ..ЮюЮюЮюЮюЮюллтлеї11|7171717171лнд. 17 нд. 7 43 703422 СаМмАсз--7б | нд. | 43
Приклад 89. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на аполіпопротеїн А (Ард(а)), що містять кон'югат саіМмАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 79, випробували в дослідженні дозозалежного інгібування Аро(а) у трансгенних мишей.
Таблиця 79
Модифіковані АБО, націлені на Арод(а) . . «рт ' Кластер ЗЕО І
Тев(Зев'"Сев Гев'""Сев"Сав(Сав ав ГавСавСЯав ГавСлав'""Сав явяата сан
СваімАсз-7а-о Геє(Зео"Сео Гео" Сво"СавСЯав Газ Газа Став ветавт | обдати 000 | бамаета| Ро | 5
Структура СаІМАсз-7а показана у Прикладі 48.
Лікування
Восьмитижневим самкам мишей С57ВІ /6 (даскзоп І арогагу, Бар-Харбор, штат Мен) один раз на тиждень вводили підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, в цілому шість доз олігонуклеотиду, наведеного в Табл. 79, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 3-4 тварин. Зразки крові з хвостової вени відбирали за день до введення першої дози і щотижня після введення кожної дози для визначення рівнів білка Аро(а) в плазмі. Мишей умертвили через два дні після останнього введення. Рівні мРНК Арода) в печінці визначили за допомогою
ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМФ (МоїІесшаг
Ргобрев, Іпс., Юджин, штат Орегон) за стандартними протоколами. Рівні білка Аро(а) в плазмі визначили за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу, і визначили рівні трансамінази в печінці. Результати аналізу мРНК і білка в плазмі в Табл. 80 представлені як середнє відсоткове значення для експериментальної групи відносно групи, обробленої РВ5.
Рівні білка в плазмі додатково нормалізували до початкового значення (ВІ) для групи з РВ5.
Середні абсолютні рівні трансамінази і маса тіла (95 відносно середнього початкового значення) представлені у Табл. 81.
Як показано у Табл. 80, лікування олігонуклеотидами знижує рівні мРНК Арода) в печінці і рівні білка в плазмі дозозалежним чином. Крім того, олігонуклеотид, що містить кон'югат
Са!МАс, був значно ефективнішим з тривалішою дією, ніж початковий олігонуклеотид, що не містить кон'югату СаІМАс. Як показано у Табл. 81, представлені олігонуклеотиди не впливають на рівні трансамінази і маси тіла, що вказує на хорошу переносимість олігонуклеотидів.
Таблиця 80
Рівні мРНК Арода) в печінці і білка в плазмі
БОЛЕСЯК д сте ралі (мг/кг) (9 РВБ5) в день 1 | день2 | деньЗ |день4| день 5 | день 6 РВ5 | нд. | 100 | 700 | 120 | 119 | 113 | 88 | 7121 | 97 3 | 80 1 84 | 89 | 91 98 | 87 | 87 | 79 494372 30 | 5 | 92 | 54 | 28 | 10 | 7 | 9 | 7 03 | 75 | 79 | 76 | 89 | 98 | 7 | 94 | 78 ввіову 1 | 19 1 79 1 88 | 66 | 60 54 | 32 | 24 73 | 2 1 82 | 52 | 17 | 7 | 4 | 6 | 5 10 | 2 1 79 | 17 | 6 | з | 2 | 4 | 5
Таблиця 81
Маса тіла (95 від
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) АЇ ТТ (Од/п) АБ5Т (Од/л) о РВ5 77777 вдо | 77/37 | 77771754 |Ї77771717171111031С 728.28 | 68 | ющ мб 494372 777605... 30 ЇЇ 80 | щРл04 бвт25у
Приклад 90. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на ТА, що містять кластер саІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 82, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування людського транстиретину (ТТК) у трансгенних мишей, які експресують людський ТТЕ ген.
Лікування
ТТА трансгенним мишам один раз на тиждень протягом трьох тижнів, в цілому три дози, вводили підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду і дози, наведених в Табл. 83, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Перед введенням першої дози узяли зразок крові з хвостової вени для визначення рівнів білка ТТК в плазмі в початковому стані (ВІ).
Мишей умертвили через 72 години після останнього введення. Рівні більуа ТТК виміряли за допомогою клінічного аналізатора (АШ480, ВесКтап Сошег, штат Каліфорнія). ПЛР у реальному часі і реагент для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМФ (МоїІесшаг Ргобев, Іпс., Юджин, штат Орегон) застосовували за стандартними протоколами для визначення рівнів мРНК людського ТТК в печінці. Результати, наведені в Табл. 83, є середніми значеннями для кожної експериментальної групи. Рівні МРНК є середніми значеннями відносно середнього значення для РВЗ групи. Рівні білка в плазмі є середніми значеннями відносно середнього значення для
РВО групи в початковому стані. "В" позначає початкове значення вимірювань, виконаних безпосередньо перед введенням першої дози. Як показано в Табл. 83, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні експресії ТТК дозозалежним чином.
Олігонуклеотид, що містить кон'югат СаіМАс, був ефективнішим, ніж початкова сполука без кон'югату СаіМАс (ІБІЗ5 420915), а олігонуклеотиди, що містять фосфодіестерний або дезоксіаденозиновий розщеплюваний фрагмент, демонстрували значне підсилення ефективності, порівняно з початковою сполукою, що не містить кон'югату (див. І5ІЗ Мо 682883 і 666943 порівняно з 420915, а також див. Приклади 86 і 87).
Таблиця 82
Олігонуклеотиди, націлені на людський ТТ . . . «рт ' ' Кластер ЗЕО І
Тев"Сев Гез Гез(ЗевСав Газ ГавАсв"СавАва» ГаєСіавАсеАа»
СаіМмАсз-За-о Гев"Сео Гео Ї еобслео(зав Пав ГаєАав"СавАвв 682883 ТаеСаеАвеАвеАво ТеотСеет"СеетСе РБ/РО | СаІМАсз-За Ро и
СаіМмАсз-За-ойАво Гев""Сео Гео ГеобієоСіав Газ ГавАсів 666943 тіавАв» ГазСідвАвз Ав» Аео Гео"Сев"Сев"Се РРО ба!МмАсз За
СаіМмАсз-7а-ойАво Гев'""Сео Гео ГеобієоСіав Газ ГавАсів 582887 тіавАв» ГазСідвАваз Аве Аео Гео"Сев"Сев"Се РРО ба!МмАсз та
СваіМмАсз-1Оа-сАво Гев"Сео Гео ГеоСіео(сЗвав І ав ГаєАав 582888 тіавАв» ГазСідвАваз Аве Аео Гео"Сев"Сев"Се РРО баїМмАсз 1ба
СаімАсз-1 За-оАво Гев"Сео Гео ГеоСіео(сЗвав І ав ГаєАав 582889 тіавАв» ГазСідвАваз Аве Аео Гео"Сев"Сев"Се РРО баїМмАсз 1За
Зо Легенда для Табл. 82 представлена у Прикладі 74. Структура СаІМАсз-За показана у
Прикладі 39. Структура СаІМАсз-7а показана у Прикладі 48. Структура саіМАсз-10а показана у
Прикладі 46. Структура СаІМАсз-13За показана у Прикладі 62.
Таблиця 83
Антисмислове інгібування людського ТТ іп мімо
Кластер баїМмАсє СМ
РВ5 | нд. | - 700 | 7777777771/712477777771717171С|нд. н.д. 76 ЇЇ 69 6 щЩ / щЩ м 420915| 20 1.777111 Ї7717171717171717171718611117171717171Суна. н.д. нити ши пи по Го 06 | щЩщф6 г ! З 682883 сСаМмАсз-За РО 6 ЇЇ 1718 17777711 23с21С 06 | щ 74 | щЩ 99 Ф 666943 сСаМмАсз-За Ав 6 1111771 11111122 06 | щ (6 г ю !/ 9 г 682887 СаМмАсз-7а Ав 76 | ще | 19 06 | щ 6 !/| щ М р Ж 682888 СаіМАсз-1ба Ав 6 11117171 11111122 06 | щ Б | щЩщ(Б 74 г 682889 сСамАсз-1За Аа 76 | юЮющфщ16 | Б южщ КК 18 Ж
Приклад 91. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на фактор МІЇ, що містять кон'югат саїІМАсз, у приматів, що не є людиною
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 84, випробували в нетермінальному дослідженні з підвищенням дози на антисмислове інгібування фактора МІ! у мавп.
Лікування
Мавпам, яких раніше не використовували в експериментах, на 0-й, 15-й і 29-й день вводили підшкірні ін'єкції доз олігонуклеотидів, наведених в Табл. 84, що підвищувалися, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 самців і 1 самки. Перед введенням першої дози і в різних точках часу після нього відбирали зразки крові для визначення рівнів білка фактора МІ в плазмі. Рівні білка фактора МІЇ визначали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Результати, наведені у Табл. 85, є середніми значеннями для кожної експериментальної групи відносно середнього значення для групи РВ5 в початковому стані (ВІ), вимірювання виконані безпосередньо перед введенням першої дози. Як показано у Табл. 85, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні експресії фактора Мі дозозалежним чином, і олігонуклеотид, що містить кон'югат заїіМАс, був значно ефективнішим у мавп, ніж олігонуклеотид, що не містить кон'югату ЗаїІМАс.
Таблиця 84
Олігонуклеотиди, націлені на фактор МІЇ . й й осн , , Кластер ЗЕО І
Аег Те«Сев'""СевАев ГавСлав(ав ГавСіавАсів ГавСлав'""Сав Пав
ВЕС кос нів НОЗІ НОСИ Я ЩЕСТ
СаімАсз-1Оа-оАевз Тезе "СевАев Газа Са Газ(СЯав неви нин НИЙ Ся СЯ ЩЕ
Легенда для Табл. 84 представлена у Прикладі 74. Структура СаІМАсз-104 показана у
Прикладі 46.
Таблиця 85
Рівні білка фактора МІ! в плазмі
ІБІЗ Мо 00000000 День | Доза (мг/кг) Фактор МІ! (95 ВІ) шини нн ти пи СТ о шипнннУтИЯИЧМІИ В І У 707935 11786117 нд! 46711 31 77771711 нд ЇЇ шини Ін"ЕЮЕНШВШШИВВ ВО І С шин УтИи и т пи п бвбвче 11786117 нд Ї77777777111577771 них пиши шу ти Пол К по
Приклад 92. Антисмислове інгібування в первинних гепатоцитах під дією олігонуклеотидів, націлених на Аро-СІЇ, що містять кон'югат СаіМАсз
Первинні мишачі гепатоцити висівали на 9б6-ямкові планшети при 15000 клітин на ямку і додавали олігонуклеотиди, наведені у Табл. 86, націлені на мишачий Арос-ІІЇ, в концентрації 0,46, 1,37, 4,12 або 12,35, 37,04, 111,11 або 333,33 нМ або 1,00 мкМ. Після інкубації з олігонуклеотидами протягом 24 годин клітини лізували і очистили загальну РНК за допомогою
ЕМеазу (Оіадеп). Рівні мРНК Арос-І визначили за допомогою ПЛР у реальному часі і реагенту для кількісного визначення РНК КІВОСКЕЕМФО (МоїІесшіаг Ргоре5, Іпс.) за стандартними протоколами. Значення ІСво визначили за допомогою програми Ргізт 4 (огарпРад). Результати демонструють, що незалежно від того, чи є розщеплюваний фрагмент фосфодіестером або фосфодіестер-зв'язаним дезоксіаденозином, олігонуклеотиди, що містять кон'югат саІМАс, були значно ефективнішими, ніж початковий олігонуклеотид, що не містить кон'югату.
Таблиця 86
Інгібування експресії мишачого АРОС-ІІЇ в первинних гепатоцитах мишей
ІІ Ме Послідовність (від 5" до 3") ІСво (НМ) мою 440670 тОевАез(СЗев"Сев Т ев І ав ГавАвав ТГав ГазАвавСавСЗавСавАсв"Сев нд 13,20
АезСівв"СевАе тОевАез(СЗев"Сев Т ев І ав ГавАвав ТГав ГазАвавСавСЗавСавАсв"Сев 661180 АевСтев"СевАво Адо -(3а!МАсз-їа
СаіМАсз-За-о"СевзАезСев"Севз Ге І ав ГавАдвів Таз ГавАсв 580771 СтавСтав(СавАав "Св АезСтев"СезАе Ро оо | я
СаіМАсз-7а-о"СевАевСтев"Сев Т ев І ав ГавАвв 580772 Таз ГавАсв Сава СіавАвав"Сев АезСтев"СевАе Ро | т
СаімМАсз-1Оа-о"СевАезСев""Сев ТГев Г ав ГавАсв 580773 Таз ГавАсв Сава СіавАвав"Сев АезСтев"СевАе Ро) аю | я
СаімМАсз-1Зао"СевАезСівв""Сев Тег І ав ГаєАсв Г ав 580774 ТавАвчеСтавСавСіав Ав "С ев АезСтіев"СевАе Ро) тво | я
СаіМАсз-За-о"СезАвоСівюо"Сео Гео І ав І авАвв Т ав 681272 ТавАвчеСтіавСавСіав Ав "С во АвоСівв"СевАе Ро лом | я 681273 ТавАваеСіазСіав Сід Ав тОевАезСтівв"СевАе да 1,0 49 тОевАезСЗев""Сев Т ев І ав ГавАвв Гав ГазАвавСавСЗавСавАсв"Сев 683733 АезСтев"СевАвоДао -СаіМАсз-19а
Структура СаІМАсз-1 показана раніше у Прикладі 9, СаІМАсз-За показана у Прикладі 39,
СаіМмАсз-7а показана у Прикладі 48, саіМАсз-104 показана у Прикладі 46, і СаіМАсз-13а показана у Прикладі 62, і саіМмАсз-19а показана у Прикладі 70.
Приклад 93. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять змішані крила і 5'-СаіМАсз кон'югат
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 87, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей.
Таблиця 87
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СамаАсз 449093 | Тк Тке"СкеАвае Сов Га" Са Адє Тов Со Авт СаєТаєТко"СктлСко Інд. 00000000 | ндо| 50 699806 СаіМмАсз-За-о кв Гке"СкеАвавСіав Гав'"Сав Авдв Гав СідвАвсв'"Сав СаімАс»-За Ро| во
Тав Тк "Скв"ЄСк 699807 Са!МмАсз-7а-о кв Гке"СкеАвавСіав Гав'"Сав Авдв Гав СідвАвсв'"Сав СаімАс»-7а Ро| во
Тав Тк "Скв"ЄСк 699809 Са!МмАсз-7а-о" Тке Пке"СкеАвав(Сав Гав"Сав Ас Гав Сід Ав" Свв СаімАс»-7а Ро| во
Таз ТГев"Сев"Се 699811 СаіМАсз-7а-оТГев Гее"СевАвавСтав Гав'"Сав Авав Гав СтазАвав"Сав СаМмАсз-7а Ро| во
Тав Тк "Скв"ЄСк 699813 Са!МмАсз-7а-о кв Гав'"СквАвавСіав Гав'"Сав Асв ТГав СіавАвав"Сав СаімАс»-7а Ро| во
Тав ТГкв"Сав"ЄСк 699815 СаіМмАсз-7а-о ев Пке"СквАвавСіав Гав'"Сав Асв ТГав СіавАвав"Сав СаімАс»-7а Ро| во
Тав Гкв"Скв"Се
Структура СаІМАсз-3а показана раніше у Прикладі 39, а структура СаІМАсз-7а показана раніше у Прикладі 48. Нижні індекси: "е" позначає 2-МОЕ модифікований нуклеозид; "а" позначає В-О-2'-дезоксирибонуклеозид; "К" позначає 6'-(5)-СНз біциклічний нуклеозид (СЕ); "8" позначає тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки (Р); "о" позначає фосфодіестерні міжнуклеозидні зв'язки (РО). Верхній індекс "т" позначає 5-метилцитозини.
Лікування
Шести-восьмитижневим мишам С57ВІ/6 (даскзоп І абогаїюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію дози, представленої нижче, олігонуклеотиду, наведеного у Табл. 87, або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення. Рівні МРНК 5АВ-1 у печінці виміряли за допомогою ПЛР у реальному часі. Рівні МРНК 5КВ-1 нормалізували до рівнів мРНК циклофіліну за стандартними протоколами. Результати, наведені нижче, представлені як середній відсоток рівнів МРНК 5АВ-1 для кожної експериментальної групи, порівняно з контрольною групою, обробленою сольовим розчином. Як показано у Табл. 88, лікування антисмисловими олігонуклеотидами знижує рівні МРНК 5КВ-1 дозозалежним чином, а гепмерні олігонуклеотиди, що містять кон'югат СаЇМАс і мають крила, які є або повністю СсЕЇ або змішаними цукровими модифікаціями, були значно ефективнішими, ніж початковий олігонуклеотид, що не містить кон'югату і містить повністю СсЕЇ модифіковані крила.
Виміряли також масу тіла, рівні трансамінази в печінці, загальний білірубін і НСК, а середні значення для кожної експериментальної групи представлені у Табл. 88. Маса тіла показана як середній відсоток маси тіла відносно початкової маси тіла (95 ВІ), виміряної безпосередньо перед введенням дози олігонуклеотиду.
Таблиця 88
Рівні мРНК 5АВ-1, АГ Т, А5Т, НСК і загального білірубіну, а також маси тіла вів Ме |Доза (мг/л) я я вве, АТ (Од/л) (АЄТ (Од/л)| Білірубін Меса тла РВ5 | нд. | 100 | 31 | 84 | 05 | 28 | 102 449093 бтввов
Таблиця 88
Рівні мРНК 5АВ-1, АГ Т, А5Т, НСК і загального білірубіну, а також маси тіла
ІВІВ Ме Доза (мг/кг) вве АІ Т (Од/л) І(А5Т (Од/л) |. Білірубін Меса тла 17171171 25 | 30 | 6 | 012 | з0 | 704 699807 71 1 24 | 22 | 69 | 014 | 25 | 102 699809 699811 71 1 66 | 57 | 7104 | 0714 | 24 | 107 в99813 | 03 / 98 | 22 | 61 | 017 | 28 | 705 ( 699815
Приклад 94. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять 2'-цукрові модифікації і 5'-саІМАсз кон'югат
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 89, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей.
Таблиця 89
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМАсз 353382 Стев"Сев Гев Гев"СевАсвСтав Гав'"СавАвв» ГавСіавАвв "Св Гав Гев'""Сев'" вдо | нд 28
Се Те Те 700989 ЗиествОтвОтвСтвлес ав Тов "ОввласТевбавЛев "Свв ТевОивСтьО вдо | нд Б твоотеот
СаіМАсз-За-оСев""Сев Ге Гев'"СевАвав (ав Гав'"СавАвв ГавСіазАсв ввввоя | ЗаІМАсо Зв оС есе самлсьза| РО | 28.
СаіМмАсз-7а-обітвСтвОтв твСтвАавСіав Гав'"СавАвв ГавСіав 700991 Ада ГавОтеСтвСтвО тет самдсьта РО | 51
Нижній індекс "т" позначає 2'-О-метил-модифікований нуклеозид. Повна легенда до таблиці представлена у Прикладі 74. Структура СаіМАсз-3а показана раніше у Прикладі 39, а структура СаІМАсз-7а показана раніше у Прикладі 48.
Лікування
Дослідження виконали за протоколом, описаним у Прикладі 93. Результати представлені нижче у Табл. 90 і демонструють, що і 2'-МОЕ, і 2''ОМе-модифіковані олігонуклеотиди, які містять кон'югат заїІМАс, були значно ефективнішими, ніж відповідні початкові олігонуклеотиди, що не містять кон'югату. Результати вимірювань маси тіла, трансамінази в печінці, загального білірубіну і НСК демонструють, що ці сполуки добре переносяться.
Таблиця 90
МРНК ЗКВ-1
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) МРНК ЗКВ-1 (925 РВ5 пи 2: СИ ТТ МОХ ПОЛОН СТ? ПО 353382 700989 ннквєИяШВИНИНиИнннши инші 666904 700991
Приклад 95. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 58В-1, що містять біциклічні нуклеозиди і 5'-саіМАсз кон'югат
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 91, випробували в дозозалежному дослідженні антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей.
Таблиця 91
Модифіковані АБО, націлені на ЗКВ-1 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СамаАсз 440762 | Тке"СкеАвзСав Гав'"СавАвв ГазСзавАвав "Свв Пав Гк"Ск Інд. 000000 | нд. | 22
СаіМАсз-За- 666905 о Ткв"СкеАвазСіав Гав'""СавАвв ТГазСіазАвв "Сов Т ав Ткв"Ск баїМмАсз За РО | 22
СаіМАсз-7а- 699782 о Ткв"СкеАвазСіав Гав'""СавАвв ТГазСіазАвв "Сов Т ав Ткв"Ск баїМмАсз Та РО | 22 699783 |СзактмАсз-За-о Пв"СівАвазСіов Газ" СавАвв ГавСіазАвав" Сов Газ Пв"Сі | саІМАсз-За РО | 22 653621 Тів"СівАваеСав Гав'""СавАвв ГавСтавАвав "Сов Гав Пе"СтоАдо - СаМмАсз-1 а Аа 23
СаіМАсз-1а 439879 | Тов" СовАввСов Гов"СавАвв Та СіавАвв "Сов Т ав Гов"Со нд. | нд. | 22 веев СаіМАсз-За-о Гов"СовАваеСав Гав'"СавАвв Та само | РОЇ 22 699789 СавАсет Свв Та Та" Со СаіМАсз-За 22
Нижній індекс "д" позначає флуор-НМА нуклеозид, нижній індекс "І" позначає закритий нуклеозид, що містить місток 2-0-СН2-4". Інші скорочення представлені в легенді таблиці
Прикладу 74. Структура СаіМАсз-14а показана раніше у Прикладі 9, структура СіаМАсз-За показана раніше у Прикладі 39, а структура СаІМАсз-7а показана раніше у Прикладі 48.
Лікування
Дослідження виконали за протоколом, описаним у Прикладі 93. Результати представлені нижче у Табл. 92 і демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югат СаїЇМАс і різні біциклічні нуклеозидні модифікації, були значно ефективнішими, ніж початковий олігонуклеотид, що не містить кон'югату і містить біциклічні нуклеозидні модифікації. Крім того, олігонуклеотид, що містить кон'югат саїЇМАс і флуор-НМА модифікації, був значно ефективнішим, ніж початкова сполука, що не містить кон'югату і містить флуор-НМА модифікації. Результати вимірювань маси тіла, трансамінази в печінці, загального білірубіну і НСК демонструють, що ці сполуки добре переносяться.
Таблиця 92
Рівні мРНК 5АВ-1, АГ Т, А5Т, НСК і загального білірубіну, а також маси тіла
ІЗІЗ Мо Доза (мг/кг) МРНК ЗКВ-1 (925 РВ5 п с: З ЗИ ПОТ ОО ПОООООООООООН То О 440762 666905 699782 699783 653621 нини, нин 439879 699789... .777717171717108777711111111111711111111111111111169111111
Приклад 96. Зв'язування білка плазми антисмисловими олігонуклеотидами, що містять кон'югувальну групу СаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 57, націлені на Арос-ІІІ, і олігонуклеотиди у Табл. 93, націлені на Аро(а), випробували в аналізі ультрафільтрації для оцінки зв'язування білка в плазмі.
Таблиця 93
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на Аро(а) . й св " Кластер ЗЕ
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СамаАсз д94372 теле СеєТев "Свв" Сов СовТев Тевбов ов ТевЯюв "Свв ТевТевСЯеТе» вдо | нд 53 ез е 693401 тела От Св" СовСбовТов ТевбоввТов ов Сов ТеєТеоСбеоТе нд ндо) 53 ез е 681251 СаіМАсз-7а-о Гев(СЗев'"Сев Гев'"Сев'"Сав(Сав Газ ГазСзавСав ГавСлав" Св СаМмАсз-7а Ро в
Таз ГезСтев Гез Гев"Се 681257 СаіМАсз-7а-о ГевСЗео"Сео Гео"Сео" Сава Га ГазСзавСав ГавСлав" Св СаМмАсз-7а Ро Б
Таз ТГеоСіво Гез Гев"Се
Легенда таблиці представлена у Прикладі 74. Структура СаІМАсз-7а показана раніше у
Прикладі 48.
Елементи для ультрафільтрації ОКгаїтее-МС (номінальне обмеження молекулярної маси 30000, слабкозв'язувальна регенерована целюлозна мембрана, Мійроге, Бедфорд, штат
Масачусетс) попередньо кондиціонували з 300 мкл 0,5 ую Ту'ееп 80 і центрифугували при 2000 а протягом 10 хвилин, потім з 300 мкл 300 мкг/мл розчину контрольного олігонуклеотиду в Нео і центрифугували при 2000 д протягом 16 хвилин. Для оцінки неспецифічного зв'язування з фільтрами кожного досліджуваного олігонуклеотиду із Табл. 57 і 93, які застосовували. у випробуваннях, 300 мкл 250 нг/мл розчину олігонуклеотиду в Н2гО при рН 7,4 вмістили на попередньо кондиційовані фільтри і центрифугували при 2000 д протягом 16 хвилин.
Нефільтровані і фільтровані зразки аналізували твердофазним імуноферментним аналізом для визначення концентрацій олігонуклеотидів. Для одержання середньої концентрації для кожного зразка виконували три паралельних експерименти. Середню концентрацію фільтрованого зразка відносно нефільтрованого зразка застосовували для визначення відсотка олігонуклеотиду, що пройшов через фільтр без плазми (95 виділення).
Заморожені зразки цільної плазми, зібрані в КЗ-ЕДТК і одержані від здорових, не приймаючих лікарських засобів людей-добровольців, макак яванців і мишей СО-1, придбали у компанії Віогесіатацйоп ГІ С (Вестбері, штат Нью-Йорк). Досліджувані олігонуклеотиди додавали до 1,2 мл аліквот плазми у двох концентраціях (5 і 150 мкг/мл). Аліквоту (300 мкл) кожного маркованого зразка плазми вмістили на попередньо кондиційований фільтрувальний елемент та інкубували при 37 "С протягом 30 хвилин, потім негайно виконали центрифугування при 2000 д протягом 16 хвилин. Аліквоти фільтрованих і нефільтрованих маркованих зразків плазми аналізували твердофазним імуноферментним аналізом для визначення концентрації олігонуклеотиду в кожному зразку. Виконували три паралельних експерименти для кожної концентрації для визначення середнього відсотка зв'язаного і незв'язаного олігонуклеотиду в кожному зразку. Середню концентрацію фільтрованого зразка відносно концентрації нефільтрованого зразка використали для визначення відсотка олігонуклеотиду в плазмі, не зв'язаного з білками плазми (95 незв'язаного). Кінцеві значення незв'язаного олігонуклеотиду коректували на неспецифічне зв'язування шляхом ділення 9о незв'язаного на 9о виділення для кожного олігонуклеотиду. Кінцеві значення 95 зв'язаного олігонуклеотиду визначили відніманням кінцевих значень 95 незв'язаного від 100. Результати показані у Табл. 94 для двох концентрацій випробуваного олігонуклеотиду (5 і 150 мкг/мл) в плазмі кожного виду. Результати демонструють, що кон'югувальні групи сзаіІМАс не здійснюють істотного впливу на зв'язування білка плазми. Крім того, олігонуклеотиди, що містять тільки Р5 міжнуклеозидні зв'язки і змішані
РО/РЗ зв'язки, - обидва варіанти зв'язують білки плазми, при цьому олігонуклеотиди, що містять тільки Р5 зв'язки, зв'язують білки плазми дещо більшою мірою, ніж олігонуклеотиди, що містять змішані РО/РЗ зв'язки.
Таблиця 94
Відсоток модифікованого олігонуклеотиду, зв'язаного з білками плазми й 663083 978 | 909 | 993 | 9953 | 965 | 930
Коо)
Приклад 97. Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на ТТЕ, що містять кон'югувальну групу
СаімМАсз
Олігонуклеотиди, представлені у Табл. 95, що містять кон'югат ЗаіІМАс, призначені для впливу на ТК.
Таблиця 95
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на ТтК . . «рт ' Кластер ЗЕО І
СаіМмАсз-За-ойАдо Тев'"Сев Тез Гез Сів Сідв Тав ТГав Аав'"Сав Ав»
Тев"Сео Тео Тео Сео Сав Тав Тав Ав" Ав Тав Сав Ав Аза
СваіМмАсз-За-о Гев'"Сев Те Тез Сіеє Став Тов Гав Адв'"Савє Адв Таз оввовте одини 00 ам | Ро
Таблиця 95
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на ТтК . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІВ Мо Послідовність (від 5" до 3") СамаАсз
СваіМмАсз-7а-о Гев'"Сев Те Тез Сіеє Став Тав Гав Адв'"Сдав Адв Таз 582877 Став Аде Аве Аез Тев"Сев"Сев"Се баїМмАсз 7 во
СваіМмАсз-1Оа-о ТГев"Сев Те Теє Се Слав Тов Тає Авав"Сав. Авв 582878 Та» Став Аве Ав Аез Тев"Сев"Сев"Се баїмАсз- о во 682879 Та Став Аве Ав Аез Тев"Сев"Сев"Се баїмАсз 13 М
СаіМмАсз-7а-сойАдо Тев'"Сев Тев Ге Слеє Став Тав Газ Аав"Сав Авв 582880 Та» Став Аде Ав Аез Тев"Сев"Сев"Се баїмлсз 7
СваіМмАсз-1Оа-ойАцо Тев'Сеє Те Те Стев Сов Тов Тов Авав'"Сав 682881 Аваз Та» Сав Ав Аваз Аез Тев"Сев"Сев"Се баїмлсз 10
СваіМмАсз-1ЗаойАцо Тев'Сеє Те Те Стев Сов Тов Тов Авав'"Сав 682882 Аваз Та» Сав Ав Аваз Аез Тев"Сев"Сев"Се баїмлсз 13
Тев"Сев Тев Тев Сев Сав Тав Тав АдепСав Ав Тав Сав Аде Аза 684056 Аез Тев"Сев"Сев"СеоАао-Сіа!/МАсз-19а бамАсз19
Легенда для Табл. 95 представлена у Прикладі 74. Структура СаіМАсз-1ї1 показана у
Прикладі 9. Структура саіМАсз-3а показана у Прикладі 39. Структура СсСаІМАсз-7а показана у
Прикладі 48. Структура СаІМАсз-10а показана у Прикладі 46. Структура СаІМАсз-1За показана у
Прикладі 62. Структура СаІМАсз-19а показана у Прикладі 70.
Приклад 98. Оцінка прозапальної дії олігонуклеотидів, що містять кон'югат заїЇМАс, в аналізі пРМВС
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 96, досліджували на прозапальну дію в аналізі ПРМВС, описаному у Прикладах 23 і 24 (див. Табл. 17, 70, 82 і 95, де представлений опис олігонуклеотидів). ІБІ5 353512 має високу відповідь, і його застосовували як позитивний контроль, а інші олігонуклеотиди описані у Табл. 70, 82 і 95. Результати, представлені у Табл. 96, одержані із застосуванням крові, одержаної від одного донора-добровольця. Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять змішані РО/Р5 міжнуклеозидні зв'язки, спричиняють значно слабші прозапальні реакції, порівняно з тими ж олігонуклеотидами, що містять тільки РБ5 зв'язки. Крім того, в цьому аналізі кон'югувальна група саїІМАс не здійснює істотного впливу.
Таблиця 96
ІБІЗ Мо Етах/ЕСво Кластер САаІМАсз 353512 3630 нд. 77777777 77711 РОУ | нд. 420915 | 802 |нд. 77777777 | 7 Р | нд. 682881 1311 СаіМАсз-10 682888 СаіМАсз-10 РО/РЗ 684057 СаМАсз-19 РО/Р5
Приклад 99. Зв'язувальні афінності олігонуклеотидів, що містять кон'югат саїІМАс, відносно асіалоглікопротеїнового рецептора
Зв'язувальні афінності олігонуклеотидів, наведених у Табл. 97 (див. Табл. 63, у якій представлено опис олігонуклеотидів), відносно асіалоглікопротеїнового рецептора випробували в аналізі конкурентного зв'язування рецепторів. Конкуруючий ліганд, а1-кислий глікопротеїн (АСР), інкубували у 50 мМ ацетатно-натрієвому буфері (рН 5) з 1 Од нейрамінідази-агарози протягом 16 годин при 37 "С, і » 90 95 дезалілування підтвердили аналізом із сіааловою кислотою або ексклюзійною хроматографією (ЗЕС). Для йодування АГФ застосували монохлорид йоду за способом, описаним авторами Аїсхта еї аї. (див. У Гірій Ке5. січень 1991 г.; 32(1):173-81.) У даному способі дезалілований а1-кислий глікопротеїн (де-АСР) додавали до 10 мМ хлориду йоду, Ма!25| з 1 М гліцину у 0,25 М Маон. Після інкубації протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, 725І-мічений де-АСР відокремили від вільного "25ІЇ дворазовим концентруванням суміші із застосуванням спін-колонки з номінальним відсіканням за молекулярною масою З кДа.
Білок випробували на ефективність мічення і чистоту на системі ВЕРХ, обладнаною колонкою
Адіїєтї БЕС-3 (7,8 х 300 мм) та лічильником Б-КАМ. Конкуретні дослідження із застосуванням 125|-міченого де-АОР і АБО, що містять різні саіМАс-кластери, виконали наступним чином.
Людські клітини Нерс2 (105 клітин/мл) вмістили на б-ямкові планшети у 2 мл відповідного поживного середовища. Застосовували середовище МЕМ з додаванням 1095 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5), 2 мМ І -глутаміну і 10 мМ НЕРЕЗ. Клітини вирощували протягом 16-20 годин при 37"С з 595 і 1095 СО», відповідно. Перед експериментом клітини промили середовищем без ЕВ5. Клітини вирощували протягом 30 хвилин при 37 "С з 1 мл конкурентної суміші, що містила відповідне поживне середовище з 2 95 ЕВ5, 109 М 725|І-міченого де-АСР та
АБО, що містив саІМАс-кластер в концентраціях у діапазоні від 10-71 до 105 М. Неспецифічне зв'язування визначали в присутності 102 М СаїІМАс цукру. Клітини двічі промили середовищем без ЕВ5 для видалення незв'язаного "2»І-міченого де-АСР і конкуруючого сСаіМАс АЗО. Клітини лізували із застосуванням буфера КІТ виробництва компанії Оіадеп, що містить 1 95 б- меркаптоетанолу. Лізати перенесли до круглодонних аналітичних пробірок після швидкого 10- хвилинного циклу заморожування/розморожування, і аналізували на у-лічильнику.
Неспецифічне зв'язування відняли, і далі розділили імпульси білка 7"25| на значення імпульсів при найнижчій концентрації (заіМмАс-АБО. Криві інгібування побудували за рівнянням моносайтового конкурентного зв'язування, застосувавши алгоритм нелінійної регресії для розрахунку зв'язувальної афінності (Ко).
Результати у Табл. 97 були одержані в експериментах, виконаних у п'ять різних днів.
Результати для олігонуклеотидів, відмічених верхнім індексом "а", є середніми значеннями експериментів, виконаних у два різні дні. Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югувальну групу СаіМАс на 5'-кінці, зв'язують асіалоглікопротеїновий рецептор людських клітин Нерсі2 з афінністю, що є в 1,5-16 разів більшою, ніж для олігонуклеотидів, які містять кон'югувальну групу СаІМАс на 3'-кінці.
Таблиця 97
Результати аналізу зв'язування асіалоглікопротеїнового рецептора приєднаний кон'югат СсаіМмАс 666981. баМАєз7 (| (5 | 60
Приклад 100. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, що містять кон'югувальну групу СаІМАс, націлених на Арода), іп мімо
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 9в8а, випробували в дослідженні одноразової дози
Зо на тривалість дії у мишей.
Таблиця 9ва
Модифіковані АБО, націлені на АРОХСа)
СаіМАсз-7а-о ГевСівв"Сев Гев'"Сев'""СавСав Т ав ГавСіавСав ввові соте тилс сама РО 53
СваімАсз-7а-о Геє(Зео"Сео Гео" Сво"СавСЯав Газ Газа Став оввтовт (бат ети0самата | РО 5
Структура СаІМАсз-7а показана у Прикладі 48.
Лікування
Кожній самці трансгенних мишей, які експресують людський Арода), один раз на тиждень, в цілому 6 доз, вводили підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду і дози, наведеної у Табл. 9860, або РВ5.
Кожна експериментальна група складалася із З тварин. Зразки крові відбирали за день до введення дози для визначення початкових рівнів білка Арод(а) в плазмі, а також через 72 години,
1 тиждень і 2 тижні після введення першої дози. Додаткові проби крові відбирали через З тижні, 4 тижні, 5 тижнів і б тижнів після введення першої дози. Рівні білка Аро(а) в плазмі вимірювали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Результати у Табл. 986 представлені як середній відсоток від рівнів білка Аро(а) в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових рівнів (96 ВІ). Результати показують, що олігонуклеотиди, які містять кон'югувальну групу сзаіМАс, демонструють ефективне зниження експресії Арода).
Вказаний потужний ефект спостерігали для олігонуклеотиду, що містить тільки Р5 міжнуклеозидні зв'язки, і для олігонуклеотиду, що містить змішані РО і РБ5 зв'язки.
Таблиця 98р
Рівні білка Арод(а) в плазмі
Арода) через 72 Арода) через 1 . 95 ВІ. 95 ВІ. (бе ВО)
РВ5 | до 17777777 11677 Ї777171717111047 |777717111107 бвТев ние ЕН Пт По: То ПО «У о и. овю 77177776 16
Приклад 101. Антисмислове інгібування олігонуклеотидами, що містять кластер СаїЇМАс, зв'язаний через стабільний фрагмент
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 99, випробували на інгібування експресії мишачого
АРОС-П іп мімо. Мишам С57ВІ/б ввели одноразову підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду, наведеного у Табл. 99, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Кожній миші, обробленій сполукою ІбБІ5 440670, ввели дозу 2, 6, 20 або 60 мг/кг. Кожній миші, обробленій сполукою І5ІЗ 680772 або 696847, ввели 0,6, 2, 6 або 20 мг/кг. Кон'югувальна група
Саї!МАс в І5І5 696847 зв'язана через стабільний фрагмент, тіофосфатний зв'язок, замість легко розщеплюваного фосфодіестер-вмісного зв'язку. Тварин умертвили через 72 години після введення дози. Рівні мРНК АРОС-ІЇ в печінці виміряли за допомогою ПЛР у реальному часі.
Рівні мРНК АРОС-ІІ нормалізували до рівнів мРНК циклофіліну за стандартними протоколами.
Результати представлені у Табл. 99 як середній відсоток рівнів МРНК АРОС-ЦШ для кожної експериментальної групи, порівняно з контрольною групою, обробленою сольовим розчином.
Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югувальну групу саіІМАс, були значно ефективнішими, ніж олігонуклеотид, що не містить кон'югувальної групи. Крім того, олігонуклеотид, що містить кон'югувальну групу СаіМАс, з'єднану з олігонуклеотидом через розщеплюваний фрагмент (ІБІ5 680772), був ще ефективнішим, ніж олігонуклеотид, що містить кон'югувальну групу саіІМАс, з'єднану з олігонуклеотидом через стабільний фрагмент (І5ЗІ5 696847).
Зо
Таблиця 99
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на мишачий АРОС-ІЇ овемо0педюнечтитю оси ее
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СМ Доза (мг/кОЛАРОС-ПІ (95 МО
РВ5 І 440670 тОевАезСЗев""Сев Т ев Г ав ГавАвв Т ав ГазАсв 6801086 47
СіавСтавСзавАвав"Сев АезСев тОевАе 60 | 37
СаіМАсз-7ао"СевАев(Зев"Сев ев Га ГаАсів (5:06 | 79 580772 Таз ГавАвдвСтаз СтавСідвАвв "Сев АезСівв "СевА м
З З. З З З З. З ез глев'яев езлче 60191
Таблиця 99
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на мишачий АРОС-ІЇ
МРНК о вЕОО
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СМ Доза (мг/кОЛАРОС-ПІ (95
РВ5 МО. 1111г111111го |з її 06 | 83
СаіМАсз-7ав"СевАееСіев"Сез Гев Газ ГазАвв Га» 696847 ТавАвзСіазСіавСідвАвав"Сев АезСТев""СевАе н.д. (Р) 060140 м
Структура СаІМАсз-7а показана у Прикладі 48.
Приклад 102. Розподіл у печінці антисмислових олігонуклеотидів, що містять кон'югат
СамАс
Оцінили розподіл у печінці ІЗІЗ 353382 (див. Таблицю 23), що не містить кон'югату СсаїМАС, і
ІБІЗ 655861 (див. Таблицю 23), що містить кон'югат сзамАс. Самцям мишей бБаїЇр/с ввели одноразову підшкірну ін'єкцію І5І5 353382 або 655861 в дозі, наведеній у Табл. 100. Кожна експериментальна група складалася із З тварин, за винятком групи з дозою 18 мг/кг для ІБІ5З 655861, яка складалася із 2 тварин. Тварин умертвили через 48 годин після введення дози для визначення розподілу олігонуклеотидів у печінці Для вимірювання кількості молекул антисмислового олігонуклеотиду на клітину, мітку трис-біпіридину рутенію (І) (МБО ТАС, Мезо зсаіе Оіб5сомегу) кон'югували з олігонуклеотидним зразком, застосовуваним для виявлення антисмислових олігонуклеотидів. Результати, представлені у Табл. 100, є середніми концентраціями олігонуклеотиду для кожної експериментальної групи в одиницях вимірювання мільйонів молекул олігонуклеотиду на клітину. Результати демонструють, що при рівних дозах олігонуклеотид, що містить кон'югат заїІМАс, містився у вищих концентраціях в цілому у печінці і в гепатоцитах, ніж олігонуклеотид, що не містить кон'югату саІМАс. Крім того, олігонуклеотид, що містить кон'югат саіМАс, містився в нижчих концентраціях у непаренхіматозних клітинах печінки, ніж олігонуклеотид, що не містить кон'югату заїЇМАС. І тоді як концентрації ІБІ5 655861 в гепатоцитах і непаренхіматозних клітинах печінки були однаковими в перерахунку на одну клітину, вміст гепатоцитів в печінці складає близько 80 95 за об'ємом. Отже, основна частина олігонуклеотиду ІБІ5 655861, що міститься в печінці, знаходилася в гепатоцитах, тоді як основна частина олігонуклеотиду ІБІЗ 353382, що міститься в печінці, знаходилася в непаренхіматозних клітинах печінки.
Таблиця 100 іві Ко Доза Концентрація в печінці в Концентрація в непаренхінатозних о цілому (молекул"1076 на гепатоцитах : : (мг/кг) клітину) (молекул"1076 на клітину) клітинах печінки (молекул"1076 на клітину) 20 177717171717171112367 |777171717171711716611111111171 11111111 656сС21С 293882 60 17777717171117734 77 | 77771717171171487777777 77717171 9801 90 1777777117896 777 777717171717117185 | юр р 1199 ДЮ 655861 61111111 4871 11111155
Приклад 103. Тривалість дії іп мімо олігонуклеотидів, націлених на АРОС-ЇЇЇ, що містять кон'югат СаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 101, випробували в дослідженні одноразової дози
Зо на тривалість дії у мишей.
Таблиця 101
Модифіковані АБО, націлені на АРОС-П . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") СамаАсз 304801 АезСев"Сев Тез Гев'"Сав Газ Гав(зав Гав'"Сав"СавАвавСЯав" Св Гев Г ев нд нд) 20
ТевАез Те
СаіМАсз-За-оАвдоАезСтво"Сео Гео Гео"Сав Газ ГавСтав Гав'"Сав б63о8А тоавАввСтав" Св Гео Гео ТезАез Те ба!МмАсз За
АезСво"Сео Гео Гео"Сав Газ ГавСав Гав'"Сав"СавАвавСав'""Сав Тео Гео 6792 | ТооАесТеоАсо-СаїМАсз-195 баїмАсз-19а
Структура СаІМАсз-За показана в прикладі 39, а СаІ!МАсз-19а показана у Прикладі 70.
Лікування
Самкам трансгенних мишей, які експресують людський АРОС-ЇЇ, ввели одноразову підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду, наведеного у Табл. 101, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із З тварин. Зразки крові відбирали до введення дози для визначення початкових показників і на 3-й, 7-й, 14-й, 21-й, 28-й, 35-й і 42-й день після введення дози. Рівні тригліцеридів і більюа АРОС-ІЇЇ в плазмі вимірювали таким чином, як описано у Прикладі 20.
Результати у Табл. 102 представлені як середній відсоток рівнів тригліцеридів і АРОС-ЇЇЇ в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових рівнів. Порівняння результатів у Табл. 58 прикладу 79 з результатами, представленими нижче у Табл. 102, демонструє, що олігонуклеотиди, які містять суміш фосфодіестерних і тіофосфатних міжнуклеозидних зв'язків, мають збільшену тривалість дії, ніж еквівалентні олігонуклеотиди, що містять тільки тіофосфатні міжнуклеозидні зв'язки.
Таблиця 102
Рівні тригліцеридів і білка АРОС-І|ІІ в плазмі трансгенних мишей
Точки часу (днії Тригліцериди | Білок АРОС-ПЇ . бу: бу:
ІВІВ Ме | Доза (мг/кг) після (95 від (95 від Кластер СМ введення початкового | початкового СаімМАсз дози) значення) значення) 78. 96 | ли 777. | 88 1 щ 98 Ф
РВ5 21. | .69 |Дрюи92 | 65 | 86 7714. 595 | 69 304801 30 663084 10 СаїМАсз-За Ав
Таблиця 102
Рівні тригліцеридів і білка АРОС-ІЦЇ в плазмі трансгенних мишей
Точки часу (днії Тригліцериди | Білок АРОС-ПЇ . бу: бу:
ІВІВ Ме | Доза (мг/кг) після (95 від (95 від Кластер СМ введення початкового | початкового СаМАсз дози) значення) значення) 679241 10 сСаМмАсз-19а Ав
Приклад 104. Синтез олігонуклеотидів, що містять кон'югат 5'-СаІМАсе2 нюорос ню бос
С С о нвти, НОВІ Нн о тек ще НОМ. и дит Що М. о дор к
М Ще о Що ОІЕА, ДМФА м ї тя я дхм 120 126 Б 231 й ве у в) ОАс Ї н ; ро Е Е ПІЕА
КОМ тут дути - о) 9 гр т нм йо о С с ДМА 232 166 Е
Оле Одес -о о ос оре 9 вно Ді после пр щи що 1. Н5, РИС, Меон С Е
Ос Ос 2. РЕР-ТФК, ДМФА Ос Одс 1 Ко
Го ив о он о -йо о Ці ГІ ан М М М ниття мото в-во М сААДИАХ Е но ЇЇ я но Е 233 ва 234 8Зе он. й и Ї ного о у
Її олію боситоленосни, ру пан ати он щі 1. Боратний буфер, ДМСО, рН 8,5, кімн. т-ра св о Ві н о 2. водн. аміак, кімн. т-ра т биттям в нт ем і спко 9 235
Сполука 120 є у продажу, а синтез сполуки 126 описаний у Прикладі 49. Сполуку 120 (1 г, 2,89 ммоль), НВТИи (0,39 г, 2,89 ммоль) і НОВІ (1,64 г, 4,33 ммоль) розчинили в ДМФА (10 мл) і додали М, М-діїзопропілетиламін (1,75 мл, 10,1 ммоль). Приблизно через 5 хвилин в реакційну суміш додали бензиловий естер аміногексанової кислоти (1,36 г, 3,46 ммоль). Через З години реакційну суміш вилили у 100 мл 1 М розчину Манзох та екстрагували 2 х 50 мл етилацетату.
Органічні шари об'єднали і промили З х 40 мл насиченого розчину МанНсоз і 2 х насиченим сольовим розчином, висушили за допомогою Маг50», відфільтрували і концентрували. Продукт очистили колонковою хроматографією на силікагелі (ДХМ:ЕА:гексани, 1:1:1) з одержанням сполуки 231. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із структурою. Сполуку 231 (1,34 г, 2,438 ммоль) розчинили в дихлорметані (10 мл) і додали трифлуороцтову кислоту (10 мл). Після перемішування при кімнатній температурі протягом 2 годин, реакційну суміш концентрували під зниженим тиском і випарували разом з толуеном (З х 10 мл). Залишок висушили при зниженому тиску з одержанням сполуки 232 у вигляді трифлуорацетатної солі. Синтез сполуки 166 описаний у Прикладі 54. Сполуку 166 (3,39 г, 5,40 ммоль) розчинили у ДМФА (3 мл). Розчин сполуки 232 (1,3 г, 2,25 ммоль) розчинили у ДМФА (3 мл) і додали М, М-діїззопропілетиламін (1,55 мл). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, потім вилили у воду (80 мл), а водний шар екстрагували ЕЮАс (2 х 100 мл). Органічну фазу відокремили і промили насиченим водним розчином МанНсСоО:з (3 х 80 мл), 1 М Манзох (3 х 80 мл) і насиченим сольовим розчином (2 х 80 мл), потім висушили (Маг5054), відфільтрували і концентрували. Залишок очистили колонковою хроматографією на силікагелі з одержанням сполуки 233. Дані РХМС їі ЯМР узгоджувалися із структурою. Сполуку 233 (0,59 г, 0,48 ммоль) розчинили в метанолі (2,2 мл) і етилацетаті (2,2 мл). Додали паладій на вугіллі (10 мас. 95 Ра/С, вологий, 0,07 г) і перемішували реакційну суміш в атмосфері гідрогену протягом З годин.
Реакційну суміш профільтрували крізь шар целіту і концентрували з одержанням карбоксильної кислоти. Карбоксильну кислоту (1,32 г, 1,15 ммоль, кислота, що не містить кластера) розчинили у ДМФА (3,2 мл). До неї додали додали М, М-діїзопропілетиламін (0,3 мл, 1,73 ммоль) і РЕР-ТФК (0,30 мл, 1,73 ммоль). Через 30 хвилин перемішування при кімнатній температурі реакційну суміш вилили у воду (40 мл) і екстрагували ЕІЮАс (2 х 50 мл). Виконали стандартну процедуру виділення продукту, як описано вище, з одержанням сполуки 234. Дані РХМС і ЯМР узгоджувалися із структурою. Олігонуклеотид 235 одержали за загальним способом, описаним в
Прикладі 46. Кластерна частина саІМАсг (СаІМАс2-244) кон'югувальної групи СаіМАс2-24 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом, що міститься в олігонуклеотиді, з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. Структура сСаіМАс»-24 (СаіМАс»-244-СМ) представлена нижче: он он се А но Ге)
АСНМ вана
Он он но о (о!
Приклад 105. Синтез олігонуклеотидів, що містять кон'югат СсаІМАс1і-25 0 За дея Е ОРОС - 5 55 «СН О-МН. поле Е І Е І !
Асо со ЕВ; г 7 он
М я, ра а І 1 бордатний б убер ДМС ен В кімн. т-ра ден | її Р ниття і66 т. водн. амівк киМн. т-ра
ОН он й ТУ на НВ: ТТ - то пит В 2 СМ олпго ден нов 23Е
Синтез сполуки 166 описаний у Прикладі 54. Олігонуклеотид 236 одержали за загальним способом, описаним у Прикладі 46.
Альтернативно, олігонуклеотид 236 синтезували за схемою, зображеною нижче, а сполуку 238 застосовували для одержання олігонуклеотиду 236 за способами, описаними у Прикладі 10.
ОдоОАс На итиоН одве со о о 7 дсо що, о о оо а он - РЕР-ТФК С сО- НА ди піти ОН в4 ТЕА, ацетонітрил 257 н тетразол, 1-метилімідазол, ДМФА оо о з -Щ67-2.7:.2.2:.:2::2:2:2:2:2:2:2:2:2Щ8Ш8Ш86К::92ГІЙ0(7"ИЗЖЙЖЗЧ62К2НЄЄЄКШ28НЄН8КВ8КИЩ89ОО8ШЗУЗЄНШНТННОНШНШНШНШНШНт Асо Ко о вана р (Ф) 2-ціаноетиптетраіїзопропілфосфородіамідит МНАс ше ша в но гзв 7
Синтез Он Ку: олігонуклеотидів мо го Не м шо
Пас і ож Є Ак еї спо Ї ден Во ОВ00000000
Кластерна частина СаїЇМАсі (СаІМАсі-25а)кон'югувальної групи саМАсі-25 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом, що міститься в олігонуклеотиді, 3 одержанням різноманітних кон'югувальних груп. Структура СаІМАсі-25 (СаіМАсі-254-СМ) представлена нижче: он он но о о 8 А АЛМ В дю
АСНМ Но 6
Приклад 106. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, націлених на 5АВ- 1, що містять кон'югат 5'-СаІМАсг або 5'-сСаІМАсз
Олігонуклеотиди, наведені у Табл. 103 і 104, випробували в дозозалежних дослідженнях антисмислового інгібування 5АВ-1 у мишей.
Лікування
Шеститижневим самцям мишей С57ВІ /6 (Часкзоп І арогаюгу, Бар-Харбор, штат Мен) ввели одноразову підшкірну ін'єкцію 2, 7 або 20 мг/кг ІБІ5 Мо 440762; або 0,2, 0,6, 2, 6 або 20 мг/кг ІБІ5
Мо 686221, 686222 або 708561; або сольового розчину. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Мишей умертвили через 72 години після останнього введення. Рівні
МРНК 5КВ-1 у печінці виміряли за допомогою ПЛР у реальному часі. Рівні мРНК 5А8В-1 нормалізували до рівнів мРНК циклофіліну за стандартними протоколами. Антисмислові олігонуклеотиди знижують рівні мРНК 5КВ-1 дозозалежним чином, а результати ЕЮО»во представлені у Табл. 103 ії 104. Хоча в попередніх дослідженнях показано, що тривалентні
СаіМАс-кон'юговані олігонуклеотиди значно більш ефективні, ніж двохвалентні сбаїЇМАс- кон'юговані олігонуклеотиди, що, у свою чергу, є значно більш ефективними, ніж одновалентні
СаІМмАс-кон'юговані олігонуклеотиди (див., наприклад, Кпогем еї аї., Віоогд. 5 Мей. Спет., том 16, 5216-5231 (2008)), обробка антисмисловими олігонуклеотидами, що містять одновалентні, двохвалентні і тривалентні кластери баіМмАс, приводить до зниження рівнів МРНК 5АВ-1 з однаковою ефективністю, як показано у Табл. 103 і 104.
Таблиця 103
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на 5КВ-1 . . «рт ' Кластер ЕОво ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") самАс 440762 | Тке"СкеАвазСіав Гав'""СавАвв ГавСіавАвав"Сав ТГав Гкв"ЄСк нд. 00014122 ввв221 СаіМАс2-24а-оАво Гк"СкеАавСіав Гав'"СавАвв Гав(СЯавАав СаімАс»-24а тав Гав Гкв"Ск 686222 СаіМАсз-1 За-оАво Гк"СкеАавСіав Гав'"СавАвв Гав(СЯавАав СаМАС»-1 За тав Гав Гкв"Ск
Легенда до таблиці представлена у Прикладі 93. Структура СаІМАсз-1З3а показана у
Прикладі 62, а структура СаІМАс2-24а показана у Прикладі 104.
Таблиця 104
Модифіковані олігонуклеотиди, націлені на 5КВ-1 . . «рт ' Кластер ЕОво |5ЕО ІЮ
ІБІВ Мо Послідовність (від 5" до 3") самАс 440762 | Ткеи"СквАвавСіав Гав"СавАвав» ГавСЗавАвв" Сов Гав Гкв"Ск нд. 0000105 | 22
СаімМАс:1і-25а-оТкв"СкеАвавСіав Гав'"СавАвсв ГавСіавАвв СаіМАс:-
Легенда до таблиці представлена у Прикладі 93. Структура СаІМАсі-25а показана у
Прикладі 105.
Оцінили також концентрації олігонуклеотидів, представлених у Табл. 103 ії 104, в печінці, застосувавши способи, описані у Прикладі 75. Результати, наведені нижче у Табл. 104а їі 1046, є середніми значеннями загального вмісту антисмислових олігонуклеотидів в тканинах для кожної експериментальної групи, виміряні за УФ, в одиницях вимірювання мкг олігонуклеотиду на грам тканини печінки. Результати демонструють, що олігонуклеотиди, які містять кон'югувальну групу саїІМАс, накопичуються в печінці у значно вищих кількостях, ніж при тій же дозі олігонуклеотиду, що не містить кон'югувальної групи СаіМАс. Крім того, антисмислові олігонуклеотиди, що містять один, два або три ліганди саЇМАс в своїх відповідних групах кон'югату, накопичуються в печінці у рівних кількостях. Цей результат є несподіваним з урахуванням даних, представлених вище в літературному джерелі КПогем еї аїЇ., і він узгоджується 3 даними активності, представленими вище у Табл. 103 і 104.
Таблиця 104а
Концентрації в печінці олігонуклеотидів, що містять кон'югувальну групу саіМАсг» або СаІМАсз
ІВІВ Ме | Доза (мг/кг) п Кластер СаіМАС 440762 бе | щхк 08 Щщ вва 12061112 ам А 7 й 76 ЇЇ ..юрир2865 706 | щЩщБ 16 беваля баімлсз тв, те 776 ЇЇ ..юрюр77198 щЩщ щГМж
Таблиця 104р
Концентрації в печінці олігонуклеотидів, що містять кон'югувальну групу СаіІМАсі
ІВІВ Ме | Доза (мг/кг) п Кластер СаіМАС 440762. | ..Й7. Й. | -.КЙЙ.ЙИЙДЙДЮюийлеИс;2 06 17777111 708561 СаїМАсІ-25а 76 Її 71111123
Приклад 107. Синтез олігонуклеотидів, що містять кон'югат СаІМАс1і-26 або СаІМАс1і-27 зону У З це ОН і ем б дит З но; 9 ДеМ Л бяе ден р й вної но Жду кон ДИ ШИ
АсНМ р ан
Олігонуклеотид 239 синтезували зв'язуванням сполуки 47 (див. Приклад 15) з кислотою 64 (див. Приклад 32), застосовуючи НВТО і СІЕА в ДМФА. Одержану амідовмісну сполуку тіофосфорилували, і далі приєднали до 5'-кінця олігонуклеотиду способами, описаними у
Прикладі 10. Кластерна частина СаІМАс: (СаІМАсі-264) кон'югувальної групи СаіМАсі-26 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом, що міститься в олігонуклеотиді, З одержанням різноманітних кон'югувальних груп. Структура сСаіМАсі-26 (СаіМАсі-264-СМ) представлена нижче: рн см
З руч (Ф) Не) но М
АснМ он й
Для приєднання кон'югувальні групи СаІМАс! до 3'-кінця олігонуклеотиду амід, утворений за реакцією сполук 47 і 64, приєднали до твердої основи за способами, описаними у Прикладі 7.
Потім виконали синтез олігонуклеотиду за способами, описаними у Прикладі 9, з одержанням олігонуклеотиду 240. на ВН в щ ї3 а ше ши ше ї М З
АснМ щен 24й С рення Ж дя
Кластерна частина СаІМАс: (СаІМАсі-274) кон'югувальної групи СаіМАсі-27 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом, що міститься в олігонуклеотиді, з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. Структура СаІМАсі-27 (СаіМАс1і-274-СМ) представлена нижче:
он но о
З рук (Ф) он но М
АснМ о-Ї см )
Приклад 108. Антисмислове інгібування іп мімо під дією олігонуклеотидів, що містять кон'югувальну групу СаІМАс, націлених на Арода), іп мімо
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 105, випробували в дослідженні одноразової дози на мишах.
Таблиця 105
Модифіковані АБО, націлені на АРОа) . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІВ Мо Послідовність (від 5" до 3") СаМАсз
Тев(Зев'"Сев Гев'""Сев"Сав(Сав ав ГавСавСЯав ГавСлав'""Сав
СваімАсз-7а-о Гев(Зев"Сев Гев'"Сев"С вав Газ Газа Став 681251 Тавав'"Сав Гав ГеєСев ТевТев"Се баїмлсз та РОЇ в
СаіМмАсз-За-о ГезСлео"Сео Гео" Сво"СвСЯав Газ Газа Став 681255 Тав(ав'"Сав Гав Геобслео ТевТев"Се бамАсз За РОЇ в
СваіМмАсз-10Оа-о ТГевСтво"Сео Гео" Сео"Сав(Зав Т ав Газа Сів 681256 Тав(ав'"Сав Гав Геобслео ТевТев"Се бамАсз ба РОЇ в
СваімАсз-7а-о Геє(Зео"Сео Гео" Сво"СавСЯав Газ Газа Став 681257 ТавСіав'"Св Т ав ГеоСіво ТевТев"Се ба!мАсз-7а РОБ
СаімАсз-1 За-о ГевСтво"Сео Гео" Сео"Сав(Зав Т ав Газа Сів 681258 Тав(ав"Сав Гав Геобслео ТевТев"Се баїмлсз 1За РОЇ в
Тев(Зео"Сео Гео"Сео"Сав(Сав Т ав ГавСав Свв 681260 Тавав"Сав Гав Геосіео Тез Гез'"СвоАао -(3а!іМАсз-19 баїмАсз19а
Структура СаІМАсз-7а показана у Прикладі 48.
Лікування
Самцям трансгенних мишей, які експресують людський Арод(а), ввели одноразову підшкірну ін'єкцію олігонуклеотиду і дози, наведених у Табл. 106, або РВ5. Кожна експериментальна група складалася із 4 тварин. Зразки крові відбирали за день до введення дози для визначення початкових рівнів білка Арод(а) в плазмі, а також через 1 тиждень після введення першої дози.
Зразки крові відбирали додатково щотижня протягом близько 8 тижнів. Рівні білка Аро(а) в плазмі вимірювали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Результати у
Табл. 106 представлені як середній відсоток від рівнів білка Аро(а) в плазмі для кожної експериментальної групи, нормалізованих до початкових рівнів (96 ВІ). Результати показують, що антисмислові олігонуклеотиди знижують експресію білка Аро(а). Крім того, олігонуклеотиди, що містять кон'югувальну групу СаМАс, демонструють ще ефективніше зниження експресії
Арода), ніж олігонуклеотид, що не містить кон'югувальної групи.
Таблиця 106
Рівні білка Арод(а) в плазмі
ІБІЗ Мо Доза (мг/кг) Арод(а) через 1 тиждень (о ВІ. пи с: ЗИ ПОТУ МОЯ ПО Р УДО 494372 681251 681255 681256 681257 681258 681260
Приклад 109. Синтез олігонуклеотидів, що містять кон'югат СаІМАс:і-28 або СаІМАс1і-29 0 в г. тк СМ оп но з и ди он В дик дк щ Кчі й нини й ай Ей ще речи в ж
АНІ й 1
Олігонуклеотид 241 синтезували за такими ж способами, як описані у Прикладі 71, з одержанням фосфорамідитної проміжної сполуки, після чого виконали прийоми, описані у
Прикладі 10, для синтезу олігонуклеотиду. Кластерна частина СаМАсї: (СаІМАс:і-2854) кон'югувальної групи (заїМАсі-28 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом, що міститься в олігонуклеотиді, з одержанням різноманітних кон'югувальних груп.
Структура СаІМАсі-28 (саІМАсі-28а-СМ) представлена нижче: он о
АСНМ р о ОН
Для приєднання кон'югувальні групи саїІМАс!: до 3'-кінця олігонуклеотиду застосовували такі ж способи, як описані у Прикладі 71, з одержанням гідроксильної проміжної сполуки, яку далі приєднали до твердої основи за способами, описаними у Прикладі 7. Потім виконали синтез олігонуклеотиду за способами, описаними у Прикладі 9, з одержанням олігонуклеотиду 242.
НО; - дн ще: кв; г т Р хх сн ре о. денМ їК ТІ Ї х х ще й ю нні Се щі ла 1 5 Аль х У
Кластерна частина СаІМАс: (СаІМАсі-293) кон'югувальної групи СаіМАсі-29 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом, що міститься в олігонуклеотиді, 3 одержанням різноманітних кон'югувальних груп. Структура СаІМАсі-29 (СаіМАсі-294-СМ) представлена нижче: он но о о Кен но о. М
АСНМ а (9) о-Ссм)- і
Приклад 110. Синтез олігонуклеотидів, що містять кон'югат СсаІМАс:1-30
Ас САС я Налити зотрпрае а щ денти етан -- -- -я- деО Кто дитин и ОТВОРВ тд ТМВОТІ АСНМ шк 2-43 й 1. ЯНОМеОН ОМ - з. МТС яса 1. ТВАР з. Ас. ВУ Ка А ствлеє 02. Пофосфорилування т ни да др щу и а Шк ----лу-5 -т --
НЯ дО НЕ ізо 1. Зв'язування з 5-ЯНнцем АВ ще ої й гр ден 45 щирий 2. Зняття захисту і очищення АБО нн Иге за дапомално способів сеемецення
СМТ оп ; Он
НО КЗ
1 х ча Ши кни Ку пиво щи рон
НО ит тиви Одко
АсНнМ У -
Олігонуклеотид 246, що містить кон'юЮгувальну групу СаіМАсі-30, де М вибраний з 0, 5, заміщеного або незаміщеного С1-С1іо алкілу, аміно, заміщеного аміно, азидо, алкенілу або алкінілу, синтезували таким чином, як показано вище. Кластерна частина саїІМАс!: (СаІМАс:-ЗОа) кон'югувальної групи СаіїМАсі-30 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різноманітних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу У є частиною розщеплюваного фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу У є частиною стабільного фрагмента, а розщеплюваний фрагмент знаходиться в олігонуклеотиді.
Структура сСаіМАс:і-З0а представлена нижче: он но
Ге) но о или
АснМ
Приклад 111. Синтез олігонуклеотидів, що містять кон'югат СаІМАс2-31 або сСаіМмАс2-32 на НМТ о І
Ше я сут ОСЕ Зв'язування з я-кінцем АБО 2! о -- -- 5 я:- - )-Е інн й. попи форилування М Пет ода МТ а
НО 247 " 48 пато Вх 1. Зняття пуп ОМТх
НУТ ТО . Яра, й . пк ЛЕ
З Ро. 2. Зв'язування ямідиту 245 т й ах нтитжижиажажалалалаєгшг ання
Шо -2 в що -щф З. Зняття захисту г очищення АБО ся пе х пе, За допомогою спасобів очищення 249 У
: С а що
НО диня с в ій
АСНМ У. - Ку
Її З СТ . ЖК і Око ах
Ех он рання о
ЕВ) Е с нн кн 28 ре і и
НОСНМ
Олігонуклеотид 250, що містить кон'юЮгувальну групу СаіМАс2-31, де М вибраний з 0, 5, заміщеного або незаміщеного С1-С1іо алкілу, аміно, заміщеного аміно, азидо, алкенілу або алкінілу, синтезували таким чином, як показано вище. Кластерна частина СаЇМАсг (СаІМАс2-314) кон'югувальної групи СтаіїМАс»-31 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу
У-вмісна група, яка знаходиться безпосередньо біля 5'-кінця олігонуклеотиду, є частиною розщеплюваного фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу ХУ-вмісна група, яка знаходиться безпосередньо біля 5'-кінця олігонуклеотиду, є частиною стабільного фрагмента, а розщеплюваний фрагмент знаходиться в олігонуклеотиді. Структура СсаіМАс2-31 представлена нижче: он щі) но о о. ит риО хх
АсНМ о У о
Шк в)
Оо-р; ши он ша (в)
НеКсНм
Синтез олігонуклеотиду, що містить кон'югат СаіМАс2-32, представлений нижче.
З ОМ
2. Апіпбромід пит Я. Зв'язунання з 5'-кіннем АВО: но 3 55, МО А, 2. Зняття груп ЕМ 4. Мавн. т З. Зв'язування амідиту 245
С ---хтля фжза я- - оилинл лядшифтшвилжллвзшв«яв ши зт нннннжжяжюнжянлЛлЛлжлнжтжтжнжнжнжОнОНнжНФЖжОнІнННВОООВОВЄВБОВООВООВВОВВН Я
З Пофосфорнпу. -о 4. Зняття захисту г очищення АВС с т ТЗ о В . - на" вання ОоМтю р-мдет. задопомогою способів очищення 247 -, СЕС Стоп
Мак
ТЯ а З
Но ожини че а Кв, -к х ке Ж
НМ Гая х і Ка З ран щу М я Ж хо зх ря І - п ОО ЧИ Оліго щ Ку й ай бчЧЕк тах іі от ах ще Я до он пови
ГЕ Її їЗ 3 лес ре су ех н ра ту
НТ вна
Олігонуклеотид 252, що містить кон'юЮгувальну групу СаіМАс2-32, де М вибраний з 0, 5, заміщеного або незаміщеного С1-С1іо алкілу, аміно, заміщеного аміно, азидо, алкенілу або алкінілу, синтезували таким чином, як показано вище. Кластерна частина СаЇМАсг (СаІМАс2-Зга) кон'югувальної групи (заіМАс»-32 може бути комбінована з будь-яким розщеплюваним фрагментом з одержанням різних кон'югувальних груп. У деяких варіантах реалізації винаходу
У-вмісна група, яка знаходиться безпосередньо біля 5'-кінця олігонуклеотиду, є частиною розщеплюваного фрагмента. У деяких варіантах реалізації винаходу У-вмісна група, яка знаходиться безпосередньо біля 5'-кінця олігонуклеотиду, є частиною стабільного фрагмента, а розщеплюваний фрагмент знаходиться в олігонуклеотиді. Структура СсСаІМАс2-32а представлена нижче: но он в)
Ко. ло
АСНМ Я с О У | де-то
Ге) бУ
О-р; он ут 8
НО МнАс
Приклад 112. Модифіковані олігонуклеотиди, що містять кон'югат СаІМАсі
Олігонуклеотиди у Табл. 107, націлені на 5АВ-1, були синтезовані з групою кон'югату
СаіМмАсі для додаткової перевірки ефективності олігонуклеотидів, що містять кон'югувальні групи, які містять ліганд зЗаіМАс.
Таблиця 107 . . «рт ' Кластер ЗЕО І
ІБІЗ Мо Послідовність (від 5" до 3") самАс
Саї!МАсі-25Ба-ойАдо Стев'Сев Те Гев'"Сев Дав Став Тав'"Сав Ас тав Тав Став Аав"Сав Тов Тев"Сев"Сев Тев Те ЗаїмАстеб»
Саї!МАсі-25Ба-оев"Сев Ге Тев'"Сев Адв Став Тав'"Сав Адв Таз 711462 Са Адв"Сав Та Тев'"Сев"Сев Тез Те баїМмАстоба Ро | 2в
Саї!МАсі-25Ба-оев'"Сео Тео Тео"Сео Адв Сів Тав'"Сав Адв Таз 711463 Са Адв"Сав Та Тео"Сео"Сев Тев Те баїМмАстоба Ро | 2в
Саї!МАсі-2ба-ойАвдо Стев'Сев Те Гев'"Сев Дав Став Тав'"Сав Ас 711465 Тав Став Аав"Сав Тов Тев"Сев"Сев Тев Те ЗаїмАстаб»
Саї!МАсі-2ба-отев"Сев ТГев Тев'"Сев Адв Став Тав'"Сав Адв Таз 711466 Са Адв"Сав Та Тев'"Сев"Сев Тез Те баїмАст ва Ро | 2в
Саї!МАсі-2ба-отев"Сео Тео Тео"Сео Адв Сіав Тав'"Сав Адв Таз 711467 Сід Адв"Сав Та Тео"Сео"Сев Тев Те баїмАст ва Ро | 2в
Саї!МАсі-28а-ойАдвдо Стев'Сев Те Гев'"Сев Дав Став Тав'Сав Ас 711468 Тав Став Аав"Сав Тов Тев'"Сев"Сев Тев Те ЗаїмАстгв»
Саї!МАсі-28а-оев"Сев ТГев Тев'"Сев Адв Став Тав'Сав Адв Таз 711469 Са Адв"Сав Та Тев'"Сев'"Сев Тез Те СаїмАст Ва Ро | 2в
СаїІМАсі-28а-оев'"Сео Тео Тео"Сео Ав» Сіав Тав'Сав Адв Таз 711479 Сід Адв"Сав Та Тео"Сео"Сев Тев Те СаїмАст Ва Ро | 2в
Сев"Сев Тев Тев'"Сев Адв Са Тав'"Сав Адв Таз Сід Аав'"Сав Таз
Сев"Сео Тео Гео"Сео Адв Став Тав'"Сав Адв Таз Сід Аав'"Сав Таз
Сев"Сео Тео Гео"Сео Адв Став Тав'"Сав Адв Таз Сід Аав'"Сав Таз
Сев"Сев Тев Гев'"Сев Адв Са Тав'"Сав Адв Таз Сідв Аав'"Сав Таз
Сев"Сео Тео Гео"Сео Адв Став Тав'"Сав Адв Таз Сід Аав'"Сав Таз
Сев"Сев Тев Гев'"Сев Адв Са Тав'"Сав Адв Таз Сідв Аав'"Сав Таз
Сев"Сео Тео Гео"Сео Адв Став Тав'"Сав Адв Таз Сід Аав'"Сав Таз
Приклад 113. Модифіковані олігонуклеотиди, що містять кон'югувальну групу саїМАс, націлені на вірус гепатиту В (НВМ)
Олігонуклеотиди, наведені нижче у Табл. 108, призначені для впливу на НВМ. У деяких варіантах реалізації винаходу розщеплюваний фрагмент являє собою фосфодіестерний зв'язок.
Таблиця 108
Послідовність (від 5" до 3") ЗЕО ІО Мо.
СаіМмАсз-3-Сівв"СевАез(ЗевАевСіав(Зав Газ СіавАвавАвазСіав"С ав (Зав Аве Аев(Зев ГевСівв "Се
СіаіМмАсз-3-Сів"СевоАеоСівоДеоСіаз(Зав ГавСіавАвазАваз Са" Сава АвдвАвосіво ГевСівв'"Се
СаіМмАсз-7-Сівв"СевАез(ЗевАевСіав(Зав Газ СіавАвавАвазСіав"С ав (Зав Аве Аев(Зев ГевСівв "Се
СіаіМмАсз-7-Сів"СвоАеоСівоДеоСіаз(Зав ГавСіавАвазАваз Са" Сава АвдвАвосіво ГевСівв'"Се
СаімМАсз-1 0О-Сев"СевзАезСіввАезСіазСав Пав СіазАвазАсав Сів" Сов СіавАвавАезСівв ГевСев'"Се
СаімМАсз-1 0-Сев"СеоАвоСівоАеоСіазСвав Пав СіазАвазАвавСіав'" Сов СіавАвавАвосіео ГевСЗев'"Се
СаімМАсз-1 3-Сіев"СевАевЗевАев(Зав(ав ГТ авіа АвавАвав(Зав" Сов СіавАвазАезСЗев ГезСЗев'"Се
СаімМАсз-1 3-Сіев"СвоАеоСЗеоАео(Зав(ав ТГ авСіавАвавАвавав" Сов СіавАазАвоСіво ГевСіев'"Се
Сев"СевАезСіевАев(ЗазСівдв ГазСідвАвазАвдв ав" СоазСідвАвдвАезСівв ГезСіев"Се-(3агМмАсз-19
Сев"СеоАвоСівоДеоСіазСіав ГавСідвАвдвАвв Зав"СавСідвАвдвАеоСіво ГезСівв'"Се-(3аІМАсз-19
СаіМмАсз-24-Сев"СевАевСіевАез(Зав(ав Г ав СіаАвавАвавЗав" Сов СіавАвазАезСЗев ГезСіев"Се
СаіМмАсз-24-Сев"СеоАеоСівоАеосіав(Сіав ГТ авСіавАвавАвавСав" Сов СіавАвазАвеоСіво ГезСіев"Се
СаіМмАсз-25-Сев"СевАевСіевАез(Зав(ав Т ав СіаАвавАвавЗав" Сов СіавАвазАезСЗев ГевСіев"Се
СаіМмАсз-25-Сев"СеоАеоСівоАеосіав(Сіав ГТ авСіавАвавАвавСав" Сов СіавАвазАвеоСіво ГезСіев"Се
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Ібів Рпаппасешцісаї!в, Іпс. «120». КОМПОЗИЦІЇ І СПОСОБИ МОДУЛЮВАННЯ ЕКСПРЕСІЇ НВМ І ТТА -130» ВІОІ 02480 -1505» 61/818442 -1515 2013-05-01 -1505» 61/823826 -1515 2013-05-15 -150» 61/843887 -151» 2013-07-08 -1505 61/871673 -1515» 2013-08-29 -150» 61/880790 -1515 2013-09-20 -1505» 61/976991 «151» 2014-04-08 -150» 61/986867 «151» 2014-04-30 «-1605 53 170» РаїепіНнп версії 3.5 -2105 1 «2115 3182 2125 ДНК -213» Вірус гепатиту В -4005 1 аайссасаа ссЦісасса аасісдсаа даїсссадад дададаоссі діацісссі (610)
дсюддіддсі ссаднсаду адсадіааас ссіднессда сіасідссіс ІсссНаїса 120 їсааіснсї сдадданду ддасссідсод сідаасаща адаасаїсас аїсаддайцс 180 сіаддасссс Неїсдідії асаддсддаа НШсСЦоІ дасаадааї ссісасааїа /--240 ссдсададіс їадасісдід даюддаснсі сісаашіс їадддддаасіассаїдідаї 300 спддссааа айсдсадіс сссаассісс ааїсасісас саассіссід іссіссаасі 360
"7 Ідіссідаї аїсдсюдаї дідісідсодод сдішаїса іІсносіси саїссідсід 420 сіадссіса Існенаї донснед дасіаїсаад діаносс сашоіссі 480 сіаанссад даїссісаас сассадсасду ддассаїдсс даассідсаї дасіасідсі 540 сааддаассі сіаїдаїсс сіссіднос щіассааас сісодасоддаааносасс 600 щайнссса ісссаїсаїс сідадеціс ддаааайсс їаїдддадія ддссісадсс 660
7 сашсіссі додсісадій асіадідсса Шодісаді дунсдїада дспісссос 0720 асюшодс шсаонаї аїддаюаїй юддіанодо доссаацдісі діасадсаїс 780 пдавдісссі Шассдсі дпассаан Нсшідіс Шодаїайасашааасс 840 сіаасаааас ааададаща допцасісіс дааїшаї ддонаїдіс айддаадни 900 адоддіссії дссасаадаа сасаїсаїас ааааааїсаа адааіцішадаааасис 960
7 сіанаасад дссіайдаї! ддааацсднаї дісаасоааї! дідааісі йодоаннЯ 1020 сідссссаї! їІасасаащші донаїссід сонаадсс сідіадвса щіайсааї 1080 сіаадсаддс Шсасціс іІсдссаасії асааддссії ісідідіааа сааїассіда 1140 ассшассс суноассс99 саасддссад дісідідсса адаідшосі дасдсаассс 1200 ссасіддесід адаснодіс аддассаїс адсодсоїдсо ддаассш ісдусіссіс 1260
7 тдссдаїсса їасюсддаа сіссіадссу сідішос іІсдсадсадо ісїддадсаа 1320 асацаїсду дасідаїаас ісіднаїсс ісісссдсаа аїагасаїсо їаїссаддс 1380 юдсіадасід ідсідссаас ддаїссідс дсдадасоїіс сшоашас дісссдісдд 1440 сдсюааїсс Ідсодасдас ссіїсісдоад дісдснодад асісісісді сссснсісс 1500 дісідссдії ссдассдасс асдадодсодса ссісісша сдсоддасісс ссдісідідс 1560
7 снеїсаїсі дссддассаї аідсасіїсу сіїсассісї дсасдісдса ддадассас 1620 сдюдаасодсс сассдаайщі ідсссаадої снасаїаад аддасісно дасісісідс 1680 аашісаасду ассдассно аддсаїасії сааадасюді пошааад асідддадда 1740 анададодад дадайнадаї їаааддісії ютасіадда досідіадоас аїагаацйдудяі 1800 сідсдсасса дсассаюса асішісас сісідссіаа ісаїсісно йсаїдіссї 1860
60 асщіїсаад ссіссаадсі діяссндаа юдсшо9да одсаїддасаї сдасссцаї 1920 ааадаащша дадсіасюі ддаднасіс ісданшос спсідаси сшісснса 1980 діасдадаїс Неїадаїас сдссісадсі сідіаєс9дод аадсснада дісіссідад 2040 сандіїсас сісассаїас дсасісадд саадсаайс Шосіддо99 ддаасіааюд 2100 асісіадсіа ссідддщад юНаашяо даадаїссад саїсіадада ссіадіадіє 2160 "7 аоцащіса асасіааїа!ї дддссіаааяд йсаддсаас Іспаюдн їсасашісї 2220
Ідістісасії Нддаадада аассойцата давіашоод щісшсод адіоюддай 2280 сдсасіссіс садснагад ассассаааї дссссіаїсс Іаїсаасасі іссддааасі 2340 асюйцона дасдасдадо саддіссссї адаадаадаа сісссісдсс ісдсадасда 2400 аддісісааї сдссдсодісу садаадаїсі сааїсісдду аассісаац Падіанос 2460 7 пддасісаї ааддідддда асшасідо ІсшШайсі істасідіас сідісшаа 2520
Іссісацдо аааасассаї сішссіаа іІаїасаша сассаадаса Наісааааа 2580 адідаасад Шаїаддсс сасцасаді Ідзаїдадааа адааданос аайдацаї 2640 дссідсіаду Шаїссаа адунНассаа аїашасса Нодаїаада діайааасс 2700
Нанаїсса даасаїсіад Нааїсайца снссааасі адасасіай асасасісї 2760 7 ащддаадодсяо даїаганаї аїаададада аасаасасаї адсодссісаї Шаїддаїс 2820 ассаїайсі (дддаасаад аїсіасадса юдадсадаа Ісшссасс адсаассіс 2880 тщадайсії Ісссдассас саднддаїс садссісад адсааасаса дсаааїссад 2940 айдддасії сааісссаас ааддасассії ддссадасодс саасаадата ддадсюдад 3000 сайсодддсі дддашсасс ссассдсасу даддсснн ддодіддадс ссісаддсіс 3060 7 аддодсаїасі асааасщо9 ссадсаааїс сдссіссідс сіссассааї сдссадасад 3120 дааддсадсс їассссосід ісіссассії щадааасас ісаїссісад дссаїдсаді 3180 99 3182 -2105 2 «2115» 938 «2125» ДНК «213» Ното 5арієп5о «4005 2 дідасіаад ісааіааіса дааїсадсад ащосадієс аданпддсад ддаїаадсад (610) ссіадсісад дзадаадюад їаїаааадсс ссаддсідад адсадссаїс асадаадієс 120 асісайсії ддсаддаїда сіїсісаїсо ісідсіссіс сісіюдссно сіддасідді 180 ашоцісії даддсіддсс сіасдддсас сддюдааїсс аадідіссіс ідаддісаа 240 60 аднсіадаї дсідіссдад дсадіссідс саїсаащія оссаїдса дНсадааа /-Зз00 ддасюсщаї дасассідду адссашос сісюддааа ассадідаді сіддададсі збо дсаюдаосіс асаасюада аддаашої адаадддаца іасааадіду аааїйадасас 420 саааїснас ддааддсас Нодсаїсіс сссанссаї дадсаїдсад аддіддіан 480 сасадссаас дасіссоддсс сссдссдсіа сассанодсс дсссідсда дссосіасіс 540 сіанссасс асоддсіцдісод Ісассааїсс сааддааца додасіїсіс сіссадідда 600 ссідааддас даддадаюодяд ацсаїщдіа ассаададіа нссанншй асіааадсад 660
Ідшшсасс іІсагйадсіа юпнадааді ссаддсадад асааіаааасайссідіда 720 ааддсасці іІсайссасі Наасіїдаї пШааай сссНайдісссіссааа 780 ааааададаа ісаааацшії асааадааїс аааддаайс їіадааацдіаі сідддсадаа 840 сдсіаддада даїссааай іссанадісі (дсаадсааа одсасаїаца аагашаїсї 900 дсадссаца аааадасаса Нсідіаааа аааааааа 938 -2105 З «211» 20 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005 З дсададдіда адсдаадідс 20 «210» 4 «211» 20 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 4 ссаащшаїд ссіасадссі 20 -2105 5 «2115 17 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005 5 дасаїадсад саддаюд 17 -2105» 6 «211» 20 бо «2125 ДНК
213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 6 аддаднссд садіаюдаї 20 «-2105 7 «-2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 7 дюаадсдаа дідсасасда 20 «-210» 8 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 8 дюсададодї даадсдаасді 20 «210» 9 «-2115 16 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 9 аддідаадсу аадідс 16 «-2105» 10 «-2115 16 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005 10 їссдсадіаї ддаїсд 16 «-2105 11 «-2115» 18 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид
Гс10)
«4005 11 аашаюдсс їасадссі 18 «-2105 12 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 12
Існдойнас аїдаааїссс 20 «-2105 13 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 13 спдонаса Ідаааїссса 20 «-2105» 14 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 14 ддааїасісї ї(дданасаїд 20 «-2105 15 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 15 ддааїасіс НдоНасаї 20 «-2105» 16 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 16
Ішайноїс ісюдссідда 20 «-2105» 17 60 «2115» 20
«2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 17 даашіщша падісісідс 20 «-2105» 18 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 18 аддаадики їтаноісісі 20 «-2105» 19 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 19
Зо асаддааюі Шайноісі 20 «-210» 20 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 20 аасісцоі ссадстшаї 20 «-2105» 21 «2115 21 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 21 адснсної ссадсшаї а 21 «-2105» 22 «-2115» 14 -212» ДНК -213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетичний олігонуклеотид
«4005» 22 їсадісаюа снс 14 «-2105» 23 «-2115 15 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 23 їсадісаюа сіса 15 «-210» 24 «2115» 20 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4А00» 24 дсідайнада дададдіссс 20 «-2105» 25 «2115» 20 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 25
Іїсссашса даадассіда 20 «-2105» 26 «-2115 15 «212» ДНК -213» Штгтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 26 аїсадісаїд аснс 15 «-2105» 27 «2115» 20 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 27 сддаюсаадд снаддаай 20 бо «-210» 28
«2115» 20 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 28 дснсадіса даснесії 20 «-2105» 29 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 29 одсіїсадіса дасіссна 21 «2105 30 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид
Ко) «400» 30 адснсадіс ащдаснесії 21 «-2105 31 «2115» 20 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005 31 даїааїсса сшсадада 20 «-2105 32 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 32 їддіааїсса сштсадада а 21 «210» 33 «2115 21 212» ДНК -213» Штвтучна послідовність 60 «020»
«223» Синтетичний олігонуклеотид -4005 33 тдсіїсадіє аасіїссії 21 «-2105» 34 «2115» 20 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 34 сасщаці Ідсссаддаї 20 «2105 35 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «-4005 35 сасідайй юсссаддаї а 21 «2105 36 «2115 21
Зо «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид -4005 36 аадснсно іссадсша ї 21 «-2105» 37 «2115» 20 -212» ДНК -213» Штгтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 37 асссаайса даааддаадда 20
БО «210» 38 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид -4005» 38 асссаайса дааддаадда а 21
Гс10)
«2105» 39 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «-4005 39 аасссаайс адааддааддаа 21 «-210» 40 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 40 аюддіааїсс асшсадад а 21 «2105» 41 «2115» 20 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 41
Існдонас адаааїссс 20 «-2105» 42 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «4005» 42 ісйдонНас аюдааассс а 21 «-2105» 43 «2115» 20 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 43 айсасціс аїаа(сща 20 «-210» 44 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
Гс10)
«020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 44 ансасніс аїздзаюсідда 21 «-210» 45 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 45 аснддна саїдаааїсс с 21 «-210» 46 «2115» 20 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид
«400» 46 аюсагадю аюдсісіда 20 «-2105» 47 «2115» 20 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 47 садсшаїй адддасадса 20 «-210» 48 «2115 21 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 48 садсшШай адддасадсаа 21
«-210» 49 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
«020» «223» Синтетичний олігонуклеотид «400» 49 бо асадснаї іддддасадса 21
«2105 50
«-2115 16
-212» ДНК -213» Штвтучна послідовність
«020»
«223» Синтетичний олігонуклеотид «-4005 50 нсадісаїд асцсс 16
«-2105 51
«-2115» 18 «212» ДНК
-213» Штвтучна послідовність
«020»
«223» Синтетичний олігонуклеотид
«020»
«221» тівс ївєайшге
«222» (1)..(4)
«223» основи у вказаних положеннях являють собою РНК
«020»
«221» тівс ївєайшге
«222» (15)..(18)
«223» основи у вказаних положеннях являють собою РНК
«4005 51 дсиийсадіса щдасіисс 18
«-2105 52 «2115 21
-212» ДНК
-213» Штвтучна послідовність
«020» «223» Синтетичний олігонуклеотид
«4005 52 їдсіссо но дідстойе а 21 «2105 53
«2115» 20
-212» ДНК
-213» Штвтучна послідовність «020»
«223» Синтетичний олігонуклеотид
-4005 53 їдсіссонЯа аїдсноуне 20

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Сполука А, що має формулу: е у Мне нон о о-в-о а оз т 4 о не о ММ мн 2 се вв и: ДОМ а МН о7 о. тре о носно (в) о е9 Ми Мне оо М ї о ХА о МН в-во а 8-в-о же (Ф) М | | Й (4 Ї нта ДУ: о. мо о о М м мно й о о Ге! о7 Мне ноон 2-о с о | 5-9 о. й Мне збо зх но со з'юго т. о мо МН о А о то Ге) Мові (9) Й 97 е о в ї /4 оо о. о 8-80 ен 8-р-о в о. 2 (о) « | о о М М мн» Мне о7 ев во р оо ща Ов-р-о мм Й « | А о) (о) М М о7 оо ме о р 89 ми М 8-Р-О і ее в-Р-О0 / МН о 1 г в о о ММ мн, 07 ру 59 а о 8-р-о М вубо Й ша. 8-Р-О Фі МН (о) ММ нн»; 0) т о 59 о о о 8-Р-о0 в-Рео з ї ов (о) мо І, Шк с) о) 9); о 97 е о М о ї пев бо ФО ММ вл о МО Мнь Ге) М мен;
о. о - Мне о7 о М зо зи 1 - П Ге) о т 8-80 з о. ру о. Ло ее о7 ву он 9.4 або її фармацевтично прийнятну сіль.
2. Композиція, що містить сполуку за п. 1 і фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.
3. Застосування сполуки за п. 1, при виготовленні лікарського засобу, для лікування у суб'єкта захворювання, розладу або патологічного стану, пов'язаного з вірусом гепатиту В (НВУ), де захворювання, розлад або патологічний стан є розлиттям жовчі, запаленням печінки, фіброзом печінки, запаленням, цирозом печінки, печінковою недостатністю, раком печінки, дифузним гепатоцелюлярним запальним захворюванням, гемофагоцитарним синдромом, сироватковим гепатитом, НВМ віремією або трансплантацією, пов'язаною із захворюванням печінки.
4. Застосування композиції за п. 2, при виготовленні лікарського засобу, для лікування у суб'єкта захворювання, розладу або патологічного стану, пов'язаного з вірусом гепатиту В (НВУ), де захворювання, розлад або патологічний стан є розлиттям жовчі, запаленням печінки, фіброзом печінки, запаленням, цирозом печінки, печінковою недостатністю, раком печінки, дифузним гепатоцелюлярним запальним захворюванням, гемофагоцитарним синдромом, сироватковим гепатитом, НВМ віремією або трансплантацією, пов'язаною із захворюванням печінки.
5. Застосування сполуки за п. 1, при виготовленні лікарського засобу, для зниження рівня антигену НВУ суб'єкта, інфікованого вірусом гепатиту В (НВМ).
6. Застосування за п. 5, де антиген НВМ являє собою НВзАд або НВедод.
7. Застосування композиції за п. 2, при виготовленні лікарського засобу, для зниження рівня антигену НВУ суб'єкта, інфікованого вірусом гепатиту В (НВМ).
8. Застосування за п. 7, де антиген НВМ являє собою НВ5ЗАд або НВеда.
UAA201511840A 2013-05-01 2014-05-01 Композиція і спосіб моделювання експресії hbv UA121017C2 (uk)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361818442P 2013-05-01 2013-05-01
US201361823826P 2013-05-15 2013-05-15
US201361843887P 2013-07-08 2013-07-08
US201361871673P 2013-08-29 2013-08-29
US201361880790P 2013-09-20 2013-09-20
US201461976991P 2014-04-08 2014-04-08
US201461986867P 2014-04-30 2014-04-30
PCT/US2014/036463 WO2014179627A2 (en) 2013-05-01 2014-05-01 Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA121017C2 true UA121017C2 (uk) 2020-03-25

Family

ID=51843959

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201708429A UA120287C2 (uk) 2013-05-01 2014-05-01 Сполука, яка здатна інгібувати експресію ттr, та її застосування
UAA201511840A UA121017C2 (uk) 2013-05-01 2014-05-01 Композиція і спосіб моделювання експресії hbv

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201708429A UA120287C2 (uk) 2013-05-01 2014-05-01 Сполука, яка здатна інгібувати експресію ттr, та її застосування

Country Status (35)

Country Link
US (24) US9714421B2 (uk)
EP (11) EP2992098B1 (uk)
JP (21) JP6387084B2 (uk)
KR (16) KR20230113835A (uk)
CN (11) CN114058617A (uk)
AU (19) AU2014259756B2 (uk)
BR (6) BR112015027377B1 (uk)
CA (5) CA2921518A1 (uk)
CL (2) CL2015003217A1 (uk)
CR (2) CR20190269A (uk)
CY (2) CY1121879T1 (uk)
DK (4) DK2992098T3 (uk)
DO (3) DOP2015000268A (uk)
EA (2) EA031393B1 (uk)
ES (4) ES2730015T3 (uk)
HK (5) HK1221485A1 (uk)
HR (2) HRP20190987T1 (uk)
HU (2) HUE043697T2 (uk)
IL (18) IL284593B2 (uk)
LT (2) LT2992009T (uk)
ME (1) ME03390B (uk)
MX (11) MX2015015234A (uk)
MY (2) MY178929A (uk)
NZ (6) NZ728517A (uk)
PE (2) PE20152002A1 (uk)
PH (3) PH12015502493A1 (uk)
PL (2) PL2992098T3 (uk)
PT (3) PT2992009T (uk)
RS (2) RS58981B1 (uk)
RU (8) RU2699985C2 (uk)
SG (5) SG10201801813YA (uk)
SI (2) SI2992009T1 (uk)
UA (2) UA120287C2 (uk)
WO (5) WO2014179627A2 (uk)
ZA (2) ZA201507216B (uk)

Families Citing this family (436)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3335715A3 (en) 2008-10-15 2018-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor 11 expression
CN102282155B (zh) 2008-12-02 2017-06-09 日本波涛生命科学公司 磷原子修饰的核酸的合成方法
US9744183B2 (en) 2009-07-06 2017-08-29 Wave Life Sciences Ltd. Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
DK2620428T3 (da) 2010-09-24 2019-07-01 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
JP6126009B2 (ja) 2010-11-17 2017-05-10 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． α−シヌクレイン発現の調節
DK2734208T3 (en) 2011-07-19 2017-06-19 Wave Life Sciences Ltd PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS
DK2751270T3 (en) 2011-08-29 2018-10-29 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER-CONJUGATE COMPLEXES AND THEIR USE
AU2013202595B2 (en) 2012-03-30 2016-04-21 Biogen Ma Inc. Methods for modulating Tau expression for reducing seizure and modifying a neurodegenerative syndrome
EP3336189A1 (en) * 2012-04-20 2018-06-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US20160002624A1 (en) 2012-05-17 2016-01-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
US9574193B2 (en) 2012-05-17 2017-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating apolipoprotein (a) expression
RU2748495C2 (ru) * 2012-05-24 2021-05-26 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для модулирования экспрессии аполипопротеина (а)
CN104684923B (zh) 2012-07-13 2018-09-28 株式会社新日本科学 手性核酸佐剂
EP2872485B1 (en) 2012-07-13 2020-12-16 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
RU2015104762A (ru) 2012-07-13 2018-08-31 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Хиральный контроль
EP2920304B1 (en) * 2012-11-15 2019-03-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
EP2951305B1 (en) * 2013-01-30 2018-08-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
KR20200123263A (ko) * 2013-02-14 2020-10-28 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 지질단백질 리파제 결핍 (lpld) 모집단에서 아포지질단백질 c-iii (apociii) 발현의 조절
EP2992098B1 (en) 2013-05-01 2019-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
AU2014259954B2 (en) 2013-05-01 2019-11-07 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compounds and methods for modulating miR-122
CN105164261B (zh) 2013-05-01 2022-03-18 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
SG10201908122XA (en) * 2013-06-27 2019-10-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
EP3019200B1 (en) * 2013-07-11 2022-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
JP6617702B2 (ja) 2013-07-15 2019-12-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｆｔｙ７２０のアザサイクリック拘束アナログ
TWI657819B (zh) 2013-07-19 2019-05-01 美商Ionis製藥公司 用於調節τ蛋白表現之組合物
US9943604B2 (en) 2013-09-20 2018-04-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutic nucleosides and their use
EP3052626A1 (en) * 2013-10-02 2016-08-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
EP3060664B1 (en) 2013-10-25 2021-07-07 Sanofi Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
MX2016005855A (es) * 2013-11-14 2016-07-13 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compuestos de conjugados antisentido de apolipoproteina b (apob).
JP6482475B2 (ja) * 2014-01-07 2019-03-13 レナセラピューティクス株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
PT3094728T (pt) 2014-01-16 2022-05-19 Wave Life Sciences Ltd Desenho quiral
JP6594902B2 (ja) 2014-02-11 2019-10-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
EP3978610A3 (en) 2014-03-19 2022-08-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating ataxin 2 expression
US10006027B2 (en) 2014-03-19 2018-06-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating Ataxin 2 expression
JP6622214B2 (ja) 2014-04-01 2019-12-18 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Ｓｏｄ−１発現を調節するための組成物
BR122020024443B1 (pt) * 2014-05-01 2022-02-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto e composição farmacêutica para modulação da expressão de angptl3
DK3137091T3 (da) 2014-05-01 2021-01-25 Ionis Pharmaceuticals Inc Konjugater af modificerede antisense-oligonukleotider og anvendelse deraf til modulation af pkk-ekspression
KR102369736B1 (ko) 2014-05-01 2022-03-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 보체 인자 b 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP6667453B2 (ja) 2014-05-01 2020-03-18 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 成長ホルモン受容体発現を調節するための組成物及び方法
EP4223315A3 (en) * 2014-05-01 2023-08-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method for synthesis of reactive conjugate clusters
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
AU2015264038B2 (en) 2014-05-22 2021-02-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen (AGT) iRNA compositions and methods of use thereof
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
US9487783B2 (en) 2014-08-07 2016-11-08 Regulus Therapeutics Inc. Targeting microRNAs for metabolic disorders
BR112017004056A2 (pt) 2014-09-12 2017-12-05 Biogen Ma Inc composições e métodos para detecção da proteína smn em um indivíduo e tratamento de um indivíduo
CN107109411B (zh) 2014-10-03 2022-07-01 冷泉港实验室 核基因输出的定向增加
WO2016055601A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
WO2016061487A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting aminolevulinic acid synthase-1 (alas1) and uses thereof
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
JP2017535552A (ja) 2014-11-17 2017-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
WO2016112132A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
US10538763B2 (en) 2015-01-16 2020-01-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of DUX4
AU2016219263B2 (en) 2015-02-13 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (PNPLA3) iRNA compositions and methods of use thereof
AU2016217825B2 (en) 2015-02-15 2022-03-10 Arcturus Therapeutics, Inc. Acyl-amino-LNA and/or hydrocarbyl-amino-LNA oligonucleotides
US11129844B2 (en) 2015-03-03 2021-09-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
US10415038B2 (en) 2015-04-03 2019-09-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating TMPRSS6 expression
WO2016164746A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
US10407678B2 (en) 2015-04-16 2019-09-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2016172734A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 California Institute Of Technology Reactivation of x chromosome genes
WO2016205323A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
JP2018519811A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 修飾ｃｒｉｓｐｒ ｒｎａ及び修飾単一ｃｒｉｓｐｒ ｒｎａならびにその使用
MY192997A (en) 2015-07-10 2022-09-20 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of diacyglycerol acyltransferase 2 (dgat2)
WO2017011286A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (igfals) and insulin-like growth factor 1 (igf-1) irna compositions and methods of use thereof
US20180193471A1 (en) * 2015-07-16 2018-07-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ß2GPI GENE EXPRESSION-SUPPRESSING NUCLEIC ACID CONJUGATE
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
CN107709342B (zh) 2015-08-06 2021-09-03 豪夫迈·罗氏有限公司 制备乙酰半乳糖胺酸衍生物的方法
CN105111118B (zh) * 2015-08-14 2017-04-12 天津小新医药科技有限公司 L‑薄荷醇类p2y12受体拮抗剂、制备方法及其用途
CN105111119B (zh) * 2015-08-14 2017-04-12 天津小新医药科技有限公司 一类卤代苯l‑薄荷醇类p2y12受体拮抗剂及其用途
US10633653B2 (en) 2015-08-14 2020-04-28 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
KR20180043819A (ko) 2015-08-24 2018-04-30 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 Lna-g 방법
KR20180051550A (ko) 2015-09-02 2018-05-16 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) iRNA 조성물 및 그의 사용 방법
CA2999177A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 The Regents Of The University Of California Synthetic sphingolipid-like molecules, drugs, methods of their synthesis and methods of treatment
SG10201913209WA (en) 2015-09-24 2020-02-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of kras expression
US20180273948A1 (en) * 2015-09-25 2018-09-27 Tarveda Therapeutics, Inc. RNAi CONJUGATES, PARTICLES AND FORMULATIONS THEREOF
EP3353305A4 (en) * 2015-09-25 2019-09-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
EP3353306A4 (en) 2015-09-25 2019-06-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE CONJUGATED COMPOUNDS AND THEIR USE
EP4285912A3 (en) 2015-09-25 2024-07-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating ataxin 3 expression
JOP20210043A1 (ar) 2015-10-01 2017-06-16 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
US10577388B2 (en) 2015-10-02 2020-03-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process
IL308174A (en) 2015-10-09 2024-01-01 Univ Southampton Gene expression modulation and dysregulated protein expression scanning
WO2017068087A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide detection method
EP3394258B1 (en) 2015-10-22 2021-09-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S In vitro toxicity screening assay
BR122023026882A2 (pt) 2015-11-06 2024-01-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc Uso de um composto oligomérico
WO2017079745A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
AR106683A1 (es) * 2015-11-16 2018-02-07 Hoffmann La Roche FOSFORAMIDITA DE AGRUPACIÓN DE GalNAc
WO2017096395A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating breast cancer
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
EP3390636B1 (en) 2015-12-14 2021-05-19 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of dravet syndrome
CA3006599A1 (en) 2016-01-05 2017-07-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lrrk2 expression
WO2017123696A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 Interleukin Genetics, Inc. Methods for predicting response to treatment
AU2017211461B2 (en) 2016-01-26 2023-01-12 Nissan Chemical Corporation Single-stranded oligonucleotide
KR20180103166A (ko) 2016-01-29 2018-09-18 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 핵산 복합체
EP3408391A4 (en) * 2016-01-31 2019-08-28 University of Massachusetts BRANCHED OLIGONUCLEOTIDES
EP3426261A4 (en) 2016-03-07 2020-03-25 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. TARGETED LIGANDS FOR THERAPEUTIC CONNECTIONS
AU2017229778A1 (en) 2016-03-09 2018-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibiting PMP22 expression
RS61528B1 (sr) 2016-03-14 2021-04-29 Hoffmann La Roche Oligonukleotidi za smanjenje ekspresije pd-l1
AU2017234678A1 (en) 2016-03-16 2018-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating KEAP1
WO2017161168A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of dyrk1b expression
EP3228326A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
MA45478A (fr) 2016-04-11 2019-02-20 Arbutus Biopharma Corp Compositions de conjugués d'acides nucléiques ciblés
CA3017532A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing c9orf72 expression
WO2017178656A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S TRITYL-MONO-GalNAc COMPOUNDS AND THEIR USE
MA45295A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser
WO2017188898A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Nanyang Technological University G-quadruplex-containing antisense oligonucleotides
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
BR112018072362A2 (pt) 2016-05-06 2019-02-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. oligonucleotídeos conjugados a uma unidade de ligando do receptor glp-1 e seus usos
US11236339B2 (en) 2016-06-17 2022-02-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of GYS1 expression
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
US11105794B2 (en) 2016-06-17 2021-08-31 Hoffmann-La Roche Inc. In vitro nephrotoxicity screening assay
CN109312403B (zh) 2016-06-17 2023-06-27 豪夫迈·罗氏有限公司 体外肾毒性筛选测定法
AU2017281497B2 (en) 2016-06-22 2023-04-06 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
CN109415401B (zh) 2016-06-30 2023-02-03 协和麒麟株式会社 核酸复合物
AU2017296195A1 (en) 2016-07-11 2019-01-24 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
US10781175B2 (en) 2016-07-15 2020-09-22 Am Chemicals Llc Solid supports and phosphoramidite building blocks for oligonucleotide conjugates
SG11201900238UA (en) 2016-07-15 2019-02-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulation of smn2
CA3033368A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
JP2019532027A (ja) 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
AU2017320582B2 (en) 2016-09-02 2023-11-16 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc Targeting ligands
JOP20190065A1 (ar) 2016-09-29 2019-03-28 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن tau
WO2018067900A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
JP2019537427A (ja) 2016-10-27 2019-12-26 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー Ｘ染色体の再活性化のためのｈｄａｃ阻害剤組成物
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
JP2019533472A (ja) * 2016-11-11 2019-11-21 ヤンセン バイオファーマ インク． Ｈｂｖ ｃｃｃｄｎａのオリゴヌクレオチド標的化戦略
TWI788312B (zh) 2016-11-23 2023-01-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
JP2019535839A (ja) 2016-11-29 2019-12-12 ピュアテック ヘルス エルエルシー 治療剤の送達のためのエクソソーム
WO2018102745A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Cold Spring Harbor Laboratory Modulation of lnc05 expression
CA3047076A1 (en) * 2016-12-13 2018-06-21 Am Sciences Inc Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis b
KR20230166146A (ko) 2016-12-16 2023-12-06 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물을 사용하여 TTR-관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법
CN108239644B (zh) * 2016-12-23 2021-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
US10337070B2 (en) 2017-01-12 2019-07-02 Cardioforecast Ltd. Methods and kits for treating cardiovascular disease
US20200216845A1 (en) 2017-01-13 2020-07-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rela expression
EP3568480A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb2 expression
WO2018130585A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating relb expression
WO2018130583A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb1 expression
WO2018130582A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rel expression
CN110337495B (zh) 2017-02-06 2024-03-29 日产化学株式会社 单链寡核苷酸
WO2018165564A1 (en) * 2017-03-09 2018-09-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Morpholino modified oligomeric compounds
EP3594346A4 (en) 2017-03-10 2020-12-16 National Center For Child Health And Development ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF GLYCOGEN STORAGE DISEASE TYPE IA
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
DK3607069T3 (da) * 2017-04-05 2022-11-21 Silence Therapeutics Gmbh Produkter og sammensætninger
EP3385272A1 (en) * 2017-04-05 2018-10-10 Silence Therapeutics GmbH Further novel oligonucleotide-ligand conjugates
CN118460536A (zh) 2017-04-11 2024-08-09 阿布特斯生物制药公司 靶向组合物
SG11201909572QA (en) 2017-04-18 2019-11-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (hbv) infection
WO2018215049A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
US11273222B2 (en) * 2017-05-26 2022-03-15 National Cerebral And Cardiovascular Center Antisense nucleic acid targeting PCSK9
CN111050806A (zh) 2017-06-02 2020-04-21 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸组合物及其使用方法
WO2018223073A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
US11401519B2 (en) 2017-06-07 2022-08-02 University Of Massachusetts Anti-ADAM33 oligonucleotides and related methods
JP7406793B2 (ja) 2017-06-23 2023-12-28 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ ２テイル自己デリバリー型ｓｉＲＮＡおよび関連方法
CA3069868A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Lactate dehydrogenase a (ldha) irna compositions and methods of use thereof
BR112020001430A2 (pt) 2017-07-26 2020-07-28 Nissan Chemical Corporation oligonucleotídeo de fita simples
WO2019027009A1 (ja) * 2017-08-02 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸複合体
WO2019027015A1 (ja) * 2017-08-02 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸複合体
WO2019030313A2 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF UBE3C EXPRESSION
CA3073213A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tunable reversir tm compounds
AU2018318231A1 (en) 2017-08-18 2020-02-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of the notch signaling pathway for treatment of respiratory disorders
WO2019038228A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF TOM1 EXPRESSION
GB2599884B (en) 2017-08-25 2022-08-31 Stoke Therapeutics Inc Antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
US10517889B2 (en) 2017-09-08 2019-12-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of SMAD7 expression
SG11202002149XA (en) * 2017-09-14 2020-04-29 Janssen Biopharma Inc Galnac derivatives
US20190098879A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use
WO2019067872A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Intellia Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR EDITING THE TTR GENE AND TREATING AMYLOID DOSE ATTR
CN111226114A (zh) 2017-10-13 2020-06-02 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 用部分立体限定的寡核苷酸子文库鉴定反义寡核苷酸改进的立体限定硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法
UA126931C2 (uk) 2017-10-16 2023-02-22 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг МОЛЕКУЛИ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ ДЛЯ ЗМЕНШЕННЯ РІВНЯ мРНК PAPD5 І PAPD7 ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЙНОГО ГЕПАТИТУ B
WO2019089922A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
TWI809004B (zh) 2017-11-09 2023-07-21 美商Ionis製藥公司 用於降低snca表現之化合物及方法
US20200385719A1 (en) 2017-11-16 2020-12-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Kisspeptin 1 (kiss1) irna compositions and methods of use thereof
WO2019100039A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
JP7360716B2 (ja) * 2017-12-01 2023-10-13 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用
CN111050807B (zh) * 2017-12-01 2024-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN110945131B (zh) * 2017-12-01 2024-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN118291456A (zh) 2017-12-01 2024-07-05 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
EP3719126A4 (en) * 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID, ASSOCIATED PREPARATION PROCESS AND USE
US11414665B2 (en) 2017-12-01 2022-08-16 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate comprising the same, and preparation method and use thereof
WO2019105418A1 (zh) 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
WO2019115416A2 (en) 2017-12-11 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating fndc3b expression
WO2019115417A2 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating rb1 expression
US11725208B2 (en) 2017-12-14 2023-08-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
US20200308588A1 (en) 2017-12-18 2020-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. High mobility group box-1 (hmgb1) irna compositions and methods of use thereof
EP3729095A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 F. Hoffmann-La Roche AG Companion diagnostic for htra1 rna antagonists
WO2019126641A2 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
EP4092117A1 (en) 2017-12-22 2022-11-23 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Gapmer oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
JP7476102B2 (ja) 2017-12-22 2024-04-30 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド
EP3728590A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel thiophosphoramidites
CN109957566B (zh) * 2017-12-26 2023-08-25 广州市锐博生物科技有限公司 修饰的寡核苷酸和可用于合成修饰的寡核苷酸的化合物
AU2017444369B2 (en) * 2017-12-26 2022-02-24 Guangzhou Ribobio Co., Ltd. Modified oligonucleotides and compound that can be used for synthesizing same
AU2018394875B2 (en) * 2017-12-29 2023-08-03 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
EP3737758A1 (en) 2018-01-10 2020-11-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating pias4 expression
EP3737424A4 (en) * 2018-01-10 2021-10-27 Translate Bio MA, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR FACILITATING THE DELIVERY OF SYNTHETIC NUCLEIC ACIDS TO CELLS
US20220119811A1 (en) 2018-01-12 2022-04-21 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Alpha-synuclein antisense oligonucleotides and uses thereof
JP7455746B2 (ja) 2018-01-12 2024-03-26 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー アルファ－シヌクレインを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
EP3737760A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating gsk3b expression
PE20211749A1 (es) 2018-01-12 2021-09-06 Bristol Myers Squibb Co Oligonucleotidos antisentido que actuan sobre alfa-sinucleina, y usos de estos
MX2020007369A (es) 2018-01-15 2020-10-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de dnm2.
US20210095276A1 (en) 2018-01-17 2021-04-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating erc1 expression
JP2021511029A (ja) 2018-01-18 2021-05-06 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Ｓｒｅｂｐ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2019145386A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating csnk1d expression
AU2019218987A1 (en) 2018-02-12 2020-07-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
CA3090517A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Deep Genomics Incorporated Oligonucleotide therapy for wilson disease
BR112020016347A2 (pt) 2018-02-21 2021-01-12 Bristol-Myers Squibb Company Oligonucleotídeos antisense de camk2d e seus usos
US11732260B2 (en) 2018-03-02 2023-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the modulation of amyloid-β precursor protein
TWI840345B (zh) 2018-03-02 2024-05-01 美商Ionis製藥公司 Irf4表現之調節劑
US11958878B2 (en) 2018-03-09 2024-04-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Therapeutic agent for glycogen storage disease type IA
US11661601B2 (en) 2018-03-22 2023-05-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating FMR1 expression
CA3097544A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of fubp1 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
JP7275164B2 (ja) 2018-04-11 2023-05-17 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｅｚｈ２発現の調節因子
JP2021523227A (ja) 2018-05-04 2021-09-02 ストーク セラピューティクス，インク． コレステリルエステル蓄積症の処置のための方法及び組成物
JP2021522808A (ja) 2018-05-07 2021-09-02 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチド治療剤の超並列発見方法
US12005120B2 (en) 2018-05-08 2024-06-11 Regulus Therapeutics Inc. Galnac conjugated modified oligonucleotides as miR-122 inhibitor having HCV antiviral activity with reduced hyperbilirubinemia side-effect
MX2020011913A (es) * 2018-05-09 2021-01-29 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para la reduccion de la expresion de fxi.
CR20200604A (es) 2018-05-09 2021-02-09 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y métodos para reducir de la expresión de atxn3
FI3794122T3 (fi) 2018-05-14 2023-11-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc Angiotensinogeenin (AGT) IRNA-koostumuksia ja niiden käyttömenetelmä
CA3103429A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 Don W. Cleveland Compounds and methods for increasing stmn2 expression
TWI833770B (zh) 2018-06-27 2024-03-01 美商Ionis製藥公司 用於減少 lrrk2 表現之化合物及方法
MX2020013366A (es) 2018-07-03 2021-03-09 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de tau.
WO2020007826A1 (en) 2018-07-05 2020-01-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting mbtps1
WO2020011745A2 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting cers6
WO2020011744A2 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting cers5
BR112021000538A2 (pt) 2018-07-13 2021-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotídeos para modular a expressão de rtel1
AU2019310097A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing ATXN2 expression
WO2020025563A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
JP2021532075A (ja) 2018-07-31 2021-11-25 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス ホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド
WO2020033748A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and agents against nonalcoholic steatohepatitis
SG11202101288TA (en) 2018-08-10 2021-03-30 Univ Massachusetts Modified oligonucleotides targeting snps
MX2021001056A (es) 2018-08-13 2021-04-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de agente de acido ribonucleico bicatenario (arnbc) de virus de la hepatitis b (vhb) y metodos de uso de las mismas.
EP3842534A4 (en) 2018-08-21 2022-07-06 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID AND METHOD OF USE THEREOF
EP3844274A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Neoantigen engineering using splice modulating compounds
WO2020060986A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
TW202023573A (zh) 2018-09-19 2020-07-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
CN111655297A (zh) * 2018-09-30 2020-09-11 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途
WO2020077390A1 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 Murdoch University Antisense therapy for ptp1b related conditions
US10913951B2 (en) 2018-10-31 2021-02-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure
US20210395737A1 (en) 2018-11-09 2021-12-23 Novartis Ag Method for reducing the risk of a cardiovascular event with conjugated antisense compounds targeting apo(a)
TW202028222A (zh) 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
EA202191342A1 (ru) 2018-11-15 2021-08-10 Айонис Фармасьютикалз, Инк. Модуляторы экспрессии irf5
TWI841633B (zh) 2018-11-21 2024-05-11 美商Ionis製藥公司 用於減少朊病毒表現之化合物及方法
EP3884051A2 (en) 2018-11-23 2021-09-29 Sanofi Novel rna compositions and methods for inhibiting angptl8
WO2020111280A1 (ja) 2018-11-30 2020-06-04 協和キリン株式会社 核酸複合体
JP2022515744A (ja) 2018-12-20 2022-02-22 プラクシス プレシジョン メディシンズ， インコーポレイテッド Ｋｃｎｔ１関連障害の治療のための組成物及び方法
US20220062427A1 (en) * 2018-12-28 2022-03-03 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing nucleic acid, preparation method therefor and use thereof
GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
CN111377985B (zh) * 2018-12-29 2023-11-10 苏州瑞博生物技术股份有限公司 化合物和缀合物及其制备方法和用途
CN113330117B (zh) * 2019-01-18 2024-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
BR112021013369A2 (pt) 2019-01-31 2021-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Moduladores de expressão de yap1
CN113474352A (zh) 2019-02-20 2021-10-01 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 新型亚磷酰胺
TW202102516A (zh) 2019-02-20 2021-01-16 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 膦醯基乙酸酯間隙子寡核苷酸
CN109799330B (zh) * 2019-02-22 2021-03-02 华中科技大学同济医学院附属同济医院 神经氨酸及神经氨酸酶抑制剂在慢性心力衰竭中的应用
WO2020173845A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide formulation method
US11279932B2 (en) 2019-02-27 2022-03-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of MALAT1 expression
EP3931323A4 (en) * 2019-02-28 2023-04-05 Deep Genomics Incorporated LIGAND AGGREGATES AND METHODS OF USE AND PREPARATION
JP7550165B2 (ja) 2019-03-29 2024-09-12 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｕｂｅ３ａ－ａｔｓを調節するための化合物及び方法
EP3947678A1 (en) 2019-04-02 2022-02-09 ProQR Therapeutics II B.V. Antisense oligonucleotides for immunotherapy
WO2020206115A2 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Bristol-Myers Squibb Company Angptl2 antisense oligonucleotides and uses thereof
WO2020233650A1 (zh) 2019-05-22 2020-11-26 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
WO2020233651A1 (zh) 2019-05-22 2020-11-26 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CN118252843A (zh) 2019-05-22 2024-06-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
US20230313195A1 (en) 2019-05-22 2023-10-05 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition, conjugate, preparation method, and use
JP2022534069A (ja) 2019-05-24 2022-07-27 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、薬物組成物及び複合体並びに調製方法と使用
EP3978609A4 (en) 2019-05-24 2024-02-07 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, CONJUGATE, PROCESS OF PREPARATION AND USE
US20220186221A1 (en) 2019-05-24 2022-06-16 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate, preparation method and use
EP3976791A4 (en) 2019-05-28 2023-10-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR REDUCING FOOT EXPRESSION
US11466274B2 (en) 2019-05-31 2022-10-11 Aligos Therapeutics, Inc. Modified gapmer oligonucleotides and methods of use
CA3137761A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
EP3990465A1 (en) 2019-06-25 2022-05-04 Amgen Inc. Purification methods for carbohydrate-linked oligonucleotides
WO2021021673A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gfap
WO2021022109A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SERPIN FAMILY F MEMBER 2 (SERPINF2) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2021022108A2 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. CARBOXYPEPTIDASE B2 (CPB2) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
JP2022547790A (ja) 2019-08-09 2022-11-16 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ Ｓｎｐを標的とする化学修飾オリゴヌクレオチド
EP4013870A1 (en) 2019-08-13 2022-06-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Small ribosomal protein subunit 25 (rps25) irna agent compositions and methods of use thereof
CN114555621A (zh) * 2019-08-15 2022-05-27 Ionis制药公司 键修饰的寡聚化合物及其用途
JP2022546040A (ja) 2019-08-27 2022-11-02 サノフイ Ｐｃｓｋ９を阻害するための組成物および方法
EP4023659A4 (en) 2019-08-29 2024-02-28 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. COMPOUND AND DRUG CONJUGATE, PRODUCTION METHOD AND USE THEREOF
EP4022062A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
WO2021046260A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Arcturus Therapeutics, Inc. Asialoglycoprotein receptor mediated delivery of therapeutically active conjugates
US20220378920A1 (en) * 2019-09-10 2022-12-01 Daiichi Sankyo Company, Limited CONJUGATE OF GalNAc-OLIGONUCLEOTIDE FOR DELIVERY TO LIVER AND MANUFACTURING METHOD THEREOF
TW202126304A (zh) 2019-09-20 2021-07-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用核心蛋白異位調節劑治療hbv感染之方法
EP4045062A1 (en) 2019-10-14 2022-08-24 Astrazeneca AB Modulators of pnpla3 expression
EP4045652A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Solute carrier family member irna compositions and methods of use thereof
JP2022553348A (ja) 2019-10-22 2022-12-22 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体成分Ｃ３ ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
TW202132567A (zh) 2019-11-01 2021-09-01 美商阿尼拉製藥公司 亨汀頓蛋白（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法
BR112022009216A2 (pt) 2019-11-13 2022-08-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc Métodos e composições para tratar um distúrbio associado a angiotensinogênio (agt)
EP4061945A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ataxin3 (atxn3) rnai agent compositions and methods of use thereof
CN112876534B (zh) * 2019-11-29 2024-02-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 肝靶向化合物及缀合物
TW202140509A (zh) 2019-12-13 2021-11-01 美商阿尼拉製藥公司 人類染色體９開讀框７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法
TW202138559A (zh) 2019-12-16 2021-10-16 美商阿尼拉製藥公司 含類ＰＡＴＡＴＩＮ磷脂酶結構域３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
CN111041025B (zh) * 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN114901821A (zh) 2019-12-19 2022-08-12 豪夫迈·罗氏有限公司 Sept9抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
WO2021122993A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of saraf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
JP2023506550A (ja) 2019-12-19 2023-02-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのｓｂｄｓ阻害剤の使用
CN114829599A (zh) 2019-12-19 2022-07-29 豪夫迈·罗氏有限公司 Scamp3抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
WO2021122921A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
US20230044958A1 (en) 2019-12-24 2023-02-09 Hoffmann-La Roche Inc. Method of treating virus infection using a tlr7 agonist
TW202137987A (zh) 2019-12-24 2021-10-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於治療ｈｂｖ之靶向ｈｂｖ的治療性寡核苷酸及ｔｌｒ７促效劑之醫藥組合
JP2023509872A (ja) 2019-12-24 2023-03-10 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｈｂｖを標的とする抗ウイルス剤及び／又はｈｂｖの処置のための免疫調節剤の医薬組合せ
CN114929729A (zh) * 2020-01-30 2022-08-19 卫材R&D管理有限公司 核酸复合体及包含该核酸复合体的医药组合物
MX2022009763A (es) 2020-02-10 2022-09-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para silenciar la expresion del factor de crecimiento endotelial vascular a (vegf-a).
WO2021167841A1 (en) 2020-02-18 2021-08-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
AU2021225957A1 (en) 2020-02-28 2022-09-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating SMN2
WO2021178607A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
BR112022017822A2 (pt) 2020-03-06 2022-11-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de cetoexocinase (khk) e métodos de uso das mesmas
CN115461460A (zh) 2020-03-06 2022-12-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制转甲状腺素蛋白(ttr)的表达的组合物和方法
WO2021188611A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
EP4126967A1 (en) 2020-03-23 2023-02-08 Amgen Inc. Monoclonal antibodies to chemically-modified nucleic acids and uses thereof
JP2023519274A (ja) 2020-03-26 2023-05-10 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド コロナウイルスｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
CN115485381A (zh) * 2020-03-26 2022-12-16 国立研究开发法人国立循环器病研究中心 以apoc3为靶点的反义核酸
AR121769A1 (es) 2020-04-06 2022-07-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para el silenciamiento de la expresión de myoc
WO2021206922A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
WO2021206917A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ANGIOTENSIN-CONVERTING ENZYME 2 (ACE2) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
IL297130A (en) 2020-04-07 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for silencing scn9a expression
BR112022021813A2 (pt) 2020-04-27 2023-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de agente de apolipoproteína e (apoe) irna e métodos de uso das mesmas
CN111575279A (zh) * 2020-04-27 2020-08-25 江苏为真生物医药技术股份有限公司 利用asgpr小分子配体特异性捕获肝细胞外囊泡或循环肿瘤细胞的方法
IL297680A (en) 2020-04-30 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc IRNA compounds complement factor b (cfb) and methods of using them
MX2022013707A (es) 2020-05-01 2022-12-07 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular atxn1.
KR20230022409A (ko) 2020-05-11 2023-02-15 스톡 테라퓨틱스, 인크. 병태 및 질환의 치료를 위한 opa1 안티센스 올리고머
WO2021231675A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate synthetase (ass1)
WO2021231691A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of retinoschisin 1 (rsi)
EP4150076A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2021231692A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of otoferlin (otof)
WO2021231673A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2)
EP4150087A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of gap junction protein beta 2 (gjb2)
EP4150078A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate lyase (asl)
EP4150077A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of transmembrane channel-like protein 1 (tmc1)
US11408000B2 (en) 2020-06-03 2022-08-09 Triplet Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders associated with MSH3 activity
WO2021252557A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
WO2021249484A1 (zh) * 2020-06-10 2021-12-16 南京明德新药研发有限公司 缀合基团及其缀合物
EP4168546A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Xanthine dehydrogenase (xdh) irna compositions and methods of use thereof
AR122731A1 (es) 2020-06-26 2022-10-05 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos mejorados para modular la expresión de fubp1
TW202216996A (zh) 2020-06-29 2022-05-01 美商Ionis製藥公司 調節ｐｌｐ１之化合物及方法
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
AU2021305665A1 (en) 2020-07-10 2023-02-23 Centre National De La Recherche Scientifique Methods and compositions for treating epilepsy
CR20230126A (es) * 2020-08-13 2023-05-03 Amgen Inc CONSTRUCCIONES DE iARN Y MÉTODOS PARA INHIBIR LA EXPRESIÓN DE MARC1
EP4200419A2 (en) 2020-08-21 2023-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Use of a1cf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2022066847A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) irna compositions and methods of use thereof
JP2023544413A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｇタンパク質共役受容体７５（ＧＰＲ７５）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
WO2022079222A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Sanofi Novel rna compositions and methods for inhibiting angptl3
US20240035029A1 (en) 2020-10-16 2024-02-01 Sanofi Rna compositions and methods for inhibiting lipoprotein(a)
WO2022087329A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin 5b (muc5b) irna compositions and methods of use thereof
WO2022103999A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COAGULATION FACTOR V (F5) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CA3201661A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
US20240002853A1 (en) 2020-11-23 2024-01-04 Alpha Anomeric Sas Nucleic acid duplexes
EP4259795A1 (en) 2020-12-08 2023-10-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coagulation factor x (f10) irna compositions and methods of use thereof
GB2603454A (en) 2020-12-09 2022-08-10 Ucl Business Ltd Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2022133278A2 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating factor xii
JP2024500035A (ja) 2020-12-23 2024-01-04 アルゴノート アールエヌエー リミテッド 心血管疾患の治療
EP4273245A1 (en) 2020-12-29 2023-11-08 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition and sirna conjugate containing the nucleic acid, preparation method therefor, and use thereof
WO2022150260A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT 9 (C9) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
AU2022215065A1 (en) * 2021-01-30 2023-07-27 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
CA3204340A1 (en) * 2021-01-30 2022-08-04 Ahmad Ali MORTAZAVI Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
WO2022162157A1 (en) * 2021-01-30 2022-08-04 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
WO2022162161A1 (en) * 2021-01-30 2022-08-04 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
KR20230146048A (ko) 2021-02-12 2023-10-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(sod1) irna 조성물 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1- (sod1-) 관련 신경퇴행성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 이의 사용 방법
WO2022175749A1 (en) * 2021-02-18 2022-08-25 Oneglobe Holdings Limited Compositions for conjugating oligonucleotides and carbohydrates
WO2022182864A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Prion protein (prnp) irna compositions and methods and methods of use thereof
EP4298218A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
WO2022187435A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
EP4305168A1 (en) 2021-03-08 2024-01-17 Les Laboratoires Servier Antisense oligonucleotides for inhibiting alpha-synuclein expression
WO2022189861A1 (en) 2021-03-08 2022-09-15 Tollys Carbohydrate conjugates of tlr3 ligands and uses thereof
EP4305169A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
MX2023011466A (es) 2021-03-29 2024-02-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de agentes de ácido ribonucleico de interferencia (arni) de huntingtina (htt) y métodos de uso de estas.
WO2022212153A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
KR20230171431A (ko) 2021-04-14 2023-12-20 다이서나 파마수이티컬, 인크. Pnpla3 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
EP4330392A1 (en) 2021-04-26 2024-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane protease, serine 6 (tmprss6) irna compositions and methods of use thereof
EP4330396A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (stat6) irna compositions and methods of use thereof
WO2022232650A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing agt expression
EP4341401A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
US20240263177A1 (en) 2021-05-20 2024-08-08 Korro Bio, Inc. Methods and Compositions for Adar-Mediated Editing
WO2022256283A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
TW202317762A (zh) 2021-06-02 2023-05-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 含有類ＰＡＴＡＴＩＮ磷脂酶結構域３（ＰＮＰＬＡ３）的ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
KR20240017911A (ko) 2021-06-04 2024-02-08 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 염색체 9 개방 해독 프레임 72(C9orf72) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법
EP4351541A2 (en) 2021-06-08 2024-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing stargardt's disease and/or retinal binding protein 4 (rbp4)-associated disorders
BR112023026050A2 (pt) 2021-06-18 2024-03-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para reduzir expressão de ifnar1
BR112023026862A2 (pt) 2021-06-23 2024-03-05 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Compostos de oligonucleotídeos anti-flt1 otimizados para tratamento de pré-eclâmpsia e outros distúrbios angiogênicos
JP2024523565A (ja) * 2021-06-24 2024-06-28 イーライ リリー アンド カンパニー 新規ｒｎａ治療法及びその使用
CN117858948A (zh) * 2021-06-24 2024-04-09 伊莱利利公司 新的治疗剂递送部分及其用途
US20230194709A9 (en) 2021-06-29 2023-06-22 Seagate Technology Llc Range information detection using coherent pulse sets with selected waveform characteristics
EP4363574A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
IL309296A (en) 2021-06-30 2024-02-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Methods and compositions for the treatment of angiotensinogen-related disorder (AGT-)
TW202317197A (zh) * 2021-07-02 2023-05-01 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司 一種核酸配體及其綴合物、其製備方法和用途
TW202317147A (zh) 2021-07-08 2023-05-01 日商日本新藥股份有限公司 析出抑制劑
JPWO2023282344A1 (uk) 2021-07-08 2023-01-12
EP4368186A1 (en) 2021-07-08 2024-05-15 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nephrotoxicity reducing agent
WO2023003805A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating subjects having or at risk of developing a non-primary hyperoxaluria disease or disorder
TW202325312A (zh) 2021-07-23 2023-07-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 β－鏈蛋白（ＣＴＮＮＢ１）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP4377458A1 (en) 2021-07-29 2024-06-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa reductase (hmgcr) irna compositions and methods of use thereof
EP4380576A2 (en) * 2021-08-03 2024-06-12 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted rna delivery
CN117795074A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 转甲状腺素蛋白（TTR）iRNA组合物和其使用方法
JP2024531914A (ja) 2021-08-04 2024-09-03 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アンジオテンシノーゲン（ａｇｔ）をサイレンシングするためのｉｒｎａ組成物および方法
AU2022328347A1 (en) 2021-08-13 2024-02-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Factor xii (f12) irna compositions and methods of use thereof
CA3229020A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Stella Khan Treatment of cardiovascular disease
EP4401742A2 (en) 2021-09-17 2024-07-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing complement component 3 (c3)
AU2022348141A1 (en) * 2021-09-18 2024-04-04 Chengdu Xinzhenghe Pharmaceutical Technology Co. Ltd Lpa inhibitor and use thereof
CA3232420A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Inhibin subunit beta e (inhbe) modulator compositions and methods of use thereof
KR20240082358A (ko) * 2021-09-23 2024-06-10 상하이 아르고 바이오파마슈티칼 씨오., 엘티디. 치료제의 표적화된 전달을 위한 디아민 스캐폴드를 갖는 다가 리간드 클러스터
MX2024004011A (es) 2021-10-01 2024-07-01 Adarx Pharmaceuticals Inc Composiciones moduladoras de precalicreína y métodos de uso de estas.
AU2022370009A1 (en) 2021-10-22 2024-05-16 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for disrupting nrf2-keap1 protein interaction by adar mediated rna editing
EP4423273A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b (cfb) irna compositions and methods of use thereof
EP4423272A2 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof
IL312635A (en) 2021-11-11 2024-07-01 Hoffmann La Roche Pharmaceutical combinations for the treatment of HBV
CA3241316A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 Quralis Corporation Gapmer antisense oligonucleotides with modified backbone chemistries
GB202117758D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Ucl Business Ltd Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2023109945A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其制备方法及应用
CN118076738A (zh) * 2021-12-16 2024-05-24 上海拓界生物医药科技有限公司 靶向LPA的siRNA及缀合物
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
WO2023138659A1 (zh) * 2022-01-20 2023-07-27 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其应用及制备方法
TW202345865A (zh) * 2022-01-24 2023-12-01 大陸商上海舶望製藥有限公司 抑制LPA(Apo(a))蛋白表達的組合物和方法
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
CN116917477B (zh) * 2022-01-30 2024-04-09 大睿生物医药科技(上海)有限公司 含有n-乙酰半乳糖胺的靶向配体
US20240167040A1 (en) 2022-02-21 2024-05-23 Hoffmann-La Roche Inc. Antisense oligonucleotide
CN114703184B (zh) * 2022-03-11 2024-06-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 Lpa抑制剂及其用途
WO2023178144A2 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Empirico Inc. Galnac compositions for improving sirna bioavailability
CN115028670B (zh) * 2022-06-24 2023-07-28 四川大学华西医院 一种n-乙酰基-d-半乳糖胺三聚体前体的制备方法
WO2024001172A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Ractigen Therapeutics Oligonucleotide modulators activating complement factor h expression
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
CN116814621A (zh) * 2022-08-05 2023-09-29 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制apoc3基因表达的rna抑制剂及其应用
WO2024039776A2 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Universal non-targeting sirna compositions and methods of use thereof
WO2024059165A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (hsd17b13) irna compositions and methods of use thereof
WO2024098061A2 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Genkardia Inc. Oligonucleotide-based therapeutics targeting cyclin d2 for the treatment of heart failure
WO2024108217A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Genkardia Inc. Methods and compositions for preventing, treating, or reversing cardiac diastolic dysfunction
WO2024106539A1 (ja) * 2022-11-18 2024-05-23 株式会社ボナック リガンドコンジュゲート物質及びそれを含む核酸並びにその用途
WO2024112937A2 (en) * 2022-11-23 2024-05-30 Pretzel Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of cancer and metabolic disease
WO2024114776A1 (zh) * 2022-12-02 2024-06-06 上海舶望制药有限公司 双环脱碱基核酸类似物以及由它们制备的寡聚化合物
WO2024137729A1 (en) * 2022-12-21 2024-06-27 Eli Lilly And Company NOVEL FAS RNAi THERAPEUTICS AND USES THEREOF
WO2024149282A1 (en) * 2023-01-10 2024-07-18 Ausperbio Therapeutics Inc. Modified multi-segmented antisense oligonucleotides for use
WO2024168010A2 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir molecules and methods of use thereof
WO2024175113A1 (zh) * 2023-02-24 2024-08-29 南京明德新药研发有限公司 包含R和E的双链siRNA类似物及其缀合物
CN116925160B (zh) * 2023-09-15 2023-12-08 天津全和诚科技有限责任公司 一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法
CN117568313B (zh) * 2024-01-15 2024-04-26 上海贝斯昂科生物科技有限公司 基因编辑组合物及其用途
CN118146284B (zh) * 2024-05-08 2024-07-26 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种GalNAc化合物、其与寡核苷酸缀合物及制备方法

Family Cites Families (379)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
USRE34036E (en) 1984-06-06 1992-08-18 National Research Development Corporation Data transmission using a transparent tone-in band system
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US4751219A (en) 1985-02-05 1988-06-14 Nederlandse Centrale Organisatie Voor Toegepast-Natuur-Wetenschappelijk Onderzoek Synthetic glycolipides, a process for the preparation thereof and several uses for these synthetic glycolipides
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
GB8712540D0 (en) * 1987-05-28 1987-07-01 Ucb Sa Expression of human proapolipoprotein a-i
WO1988010264A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Nucleoside derivatives
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5859221A (en) 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US7101993B1 (en) 1990-01-11 2006-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5614617A (en) 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5948903A (en) 1991-01-11 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3-deazapurines
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
JP3739785B2 (ja) 1991-11-26 2006-01-25 アイシス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
AU669353B2 (en) * 1991-12-24 1996-06-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
RU95104940A (ru) 1992-07-27 1997-01-10 Хайбрайдон Способ введения в олигонуклеотид алкилфосфонотиоатной или арилфосфонотиоатной межнуклеотидной связи, способ получения олигонуклеотида, олигонуклеотиды, способ ингибирования генной экспрессии, способ лечения
JPH08504559A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 ハネウエル・インコーポレーテッド 個別に制御される冗長巻線を有するモータシステム
JPH08508714A (ja) 1993-01-25 1996-09-17 ハイブライドン インコーポレイテッド オリゴヌクレオチド・アルキルホスホネートおよびアルキルホスホノチオエート
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
PT733059E (pt) 1993-12-09 2001-03-30 Univ Jefferson Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5728518A (en) 1994-01-12 1998-03-17 The Immune Response Corporation Antiviral poly-and oligonucleotides
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5599706A (en) 1994-09-23 1997-02-04 Stinchcomb; Dan T. Ribozymes targeted to apo(a) mRNA
US5681940A (en) 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US6908903B1 (en) 1994-12-07 2005-06-21 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Cluster clearing agents
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US20030119724A1 (en) 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
WO2005121370A2 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds that facilitate risc loading
WO1998013381A1 (fr) 1996-09-26 1998-04-02 Ajinomoto Co., Inc. Proteines modifiees physiologiquement actives et compositions medicamenteuses les contenant
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
EP1557424A1 (en) 1997-09-12 2005-07-27 Exiqon A/S Bi-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20040171564A1 (en) 1997-11-20 2004-09-02 Honkanen Richard E. Antisense oligonucleotide modulation of human serine/threonine protein phosphatase gene expression
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
NZ509986A (en) 1998-08-19 2003-10-31 Baxter Healthcare S Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines
PL346645A1 (en) * 1998-08-19 2002-02-25 North American Vaccine IMMUNOGENIC β-PROPIONAMIDO-LINKED POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE USEFUL AS A VACCINE PRODUCED USING AN N-ACRYLOYLATED POLYSACCHARIDE
US6166239A (en) 1998-09-04 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide protecting groups
ID30093A (id) 1999-02-12 2001-11-01 Sankyo Co Analog-analog nukleosida dan oligonukleotida baru
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
US6159694A (en) 1999-04-08 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of stat3 expression
US7098192B2 (en) * 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
WO2000063364A2 (en) 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
ES2283298T3 (es) 1999-05-04 2007-11-01 Santaris Pharma A/S Analogos de l-ribo-lna.
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6383812B1 (en) 1999-05-28 2002-05-07 Academia Sinica Anti liver disease drug R-YEEE and method of synthesizing branched galactose-terminal glycoproteins
US8541548B2 (en) 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
AU6605900A (en) 1999-07-16 2001-02-05 Hyseq, Inc. Novel angiopoietin materials and methods
JP4151751B2 (ja) 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
DE19935303A1 (de) * 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
US20020082227A1 (en) 1999-09-30 2002-06-27 Scott Henry Use of oligonucleotides for inhibition of complement activation
US20050112118A1 (en) 1999-12-02 2005-05-26 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2001042499A1 (fr) 1999-12-09 2001-06-14 Sankyo Company, Limited Procede d'essai d'agent curatif ou preventif de l'hyperlipemie
AU2698301A (en) 1999-12-30 2001-07-16 K.U. Leuven Research And Development Cyclohexene nucleic acids
US7179796B2 (en) 2000-01-18 2007-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US6602857B1 (en) 2000-01-18 2003-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
WO2001060860A2 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
US7053199B2 (en) 2000-08-29 2006-05-30 Takeshi Imanishi Nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
US6426220B1 (en) 2000-10-30 2002-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
AU2002217980A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
IL159153A0 (en) 2001-06-08 2004-06-01 Sankyo Co Methods for testing drugs for treating or preventing diseases such as hyperlipidemia
JP2005504020A (ja) 2001-07-03 2005-02-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチド
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030175906A1 (en) 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
US7227014B2 (en) * 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
WO2003014397A1 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Biomedlab Corporation Probe for detection of enteric virus detection kit and method for enteric virus with the same
US7060809B2 (en) 2001-09-04 2006-06-13 Exiqon A/S LNA compositions and uses thereof
US7439043B2 (en) 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
NZ532852A (en) 2001-11-16 2006-08-31 Genentech Inc Composition comprising and method of using angiopoietin-like protein 3 Angptl3
US20100240730A1 (en) 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP1540004A4 (en) 2002-07-31 2007-10-03 Nucleonics Inc DOUBLE-STRING RNA STRUCTURES AND CONSTRUCTS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
WO2004014933A1 (en) 2002-08-07 2004-02-19 University Of Massachusetts Compositions for rna interference and methods of use thereof
WO2004024757A2 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
AU2003284323A1 (en) 2002-10-18 2004-05-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
AU2003287502B2 (en) 2002-11-05 2010-12-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
CA2505801A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rosanne Crooke Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US20060009410A1 (en) 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
US7511131B2 (en) 2002-11-13 2009-03-31 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
US6673661B1 (en) 2002-12-20 2004-01-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Self-aligned method for forming dual gate thin film transistor (TFT) device
EP2500440B1 (en) 2002-12-20 2015-12-16 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof
US20070015927A1 (en) 2003-01-09 2007-01-18 Kim Byeang H New phosphoramidite compounds
WO2004072046A2 (en) 2003-02-12 2004-08-26 Carex S.A. Quinoline derivatives and their use for modulation of lxr activity
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
AU2004227414A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals iRNA conjugates
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
JP4597976B2 (ja) 2003-04-17 2010-12-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 修飾ｉＲＮＡ剤
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
US7750142B2 (en) 2003-04-28 2010-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
JPWO2004101619A1 (ja) 2003-05-15 2006-10-26 塩野義製薬株式会社 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
JP5379347B2 (ja) 2003-09-18 2013-12-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ４’−チオヌクレオシドおよびオリゴマー化合物
EP2256200A3 (en) 2003-09-18 2012-07-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E expression
US8258105B2 (en) * 2003-10-07 2012-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
US7959919B2 (en) 2003-11-19 2011-06-14 Novelmed Therapeutics, Inc. Method of inhibiting factor B-mediated complement activation
WO2005065686A1 (en) 2004-01-07 2005-07-21 Adipogen Pharmaceuticals Pty Limited Differentiation modulating agents and uses therefor
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
WO2005075453A1 (ja) * 2004-02-05 2005-08-18 Japan Science And Technology Agency リンカー化合物及びリガンド複合体、並びにそれらの製造方法
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
JPWO2005097155A1 (ja) 2004-04-08 2008-02-28 タカラバイオ株式会社 神経突起伸長誘導剤
JPWO2005116204A1 (ja) 2004-05-11 2008-06-19 株式会社アルファジェン Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
RU2380411C2 (ru) 2004-07-20 2010-01-27 Дженентек, Инк. Способ ингибирования пролиферации гепатоцитов, способ ингибирования клеточной адгезии гепатоцитов и способ ингибирования биологической активности angptl4 в гепатоцитах или предшественниках гепатоцитов
JP4947717B2 (ja) 2004-07-20 2012-06-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド アンジオポエチン様４タンパク質のインヒビター、組み合わせ、およびそれらの使用
JP5192234B2 (ja) 2004-08-10 2013-05-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 化学修飾オリゴヌクレオチド
EP2409713B1 (en) 2004-08-10 2015-07-22 Genzyme Corporation Oligonucleotides for use in modulating lipoprotein and cholesterol levels in humans
WO2006031461A2 (en) 2004-09-09 2006-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
CA2582464A1 (en) 2004-10-13 2006-04-27 Sanjay Bhanot Antisense modulation of ptp1b expression
EP1812569A2 (en) 2004-11-08 2007-08-01 K.U. Leuven Research and Development Modified nucleosides for rna interference
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
WO2006078217A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Avaris Ab COMPLEX CONTAINING SiRNA, ShRNA OR ANTISENSE MOLECULE AND FUNCTIONAL ENTITY, FOR IMPROVED SPECIFICITY AND DELIVERY
KR20080068019A (ko) * 2005-09-15 2008-07-22 산타리스 팔마 에이/에스 아포지단백질-ｂ100 발현 억제용 ｒｎａ 길항제 화합물
EP1941040A1 (en) 2005-09-19 2008-07-09 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development L.L.C. Modulation of glucocorticoid receptor expression
EA200800869A1 (ru) 2005-09-19 2008-10-30 ДЖОНСОН ЭНД ДЖОНСОН ФАРМАСЬЮТИКАЛ РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ, Эл. Эл. Си. Модуляция экспрессии рецептора глюкагона
EP2428227B1 (en) * 2006-01-26 2016-06-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to Huntingtin
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
AU2007211080B9 (en) 2006-01-27 2012-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007257094B2 (en) 2006-05-05 2012-10-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of SGLT2
CN101553236A (zh) * 2006-05-05 2009-10-07 埃西斯药品公司 调节gccr的表达的化合物和方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
US8101585B2 (en) 2006-08-04 2012-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of JNK proteins
CN102614528B (zh) 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
JP5352462B2 (ja) 2006-09-22 2013-11-27 ダーマコン， インコーポレイテッド 二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、ｒｎａ干渉による遺伝子サイレンシング方法、および医薬品組成物
DK2092065T4 (da) 2006-10-18 2019-10-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
MX2009005527A (es) 2006-11-27 2009-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Metodos para el tratamiento de hipercolesterolemia.
HUE033960T2 (en) 2006-12-08 2018-01-29 Lexicon Pharmaceuticals Inc Monoclonal Antibodies to ANGPTL3
CA2839162A1 (en) * 2006-12-20 2008-06-26 Xoma Technology Ltd. Methods for the treatment of il-1-.beta. related diseases
US20100190837A1 (en) 2007-02-15 2010-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Substituted-2-F' Modified Nucleosides and Oligomeric Compounds Prepared Therefrom
EP2604283A1 (en) 2007-02-16 2013-06-19 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor And Antigen Targeted Prodrug
CA2678774A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Advanced Vision Therapies, Inc. Treatment of diseases characterized by inflammation
EP2126085A2 (en) 2007-03-02 2009-12-02 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting myc gene expression and uses thereof
AU2008242583B2 (en) 2007-04-23 2013-10-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of RNA interference agents
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
US20090004140A1 (en) 2007-06-26 2009-01-01 Yao-Ling Qiu 4-substituted pyrrolidine as anti-infectives
ES2376507T5 (es) 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
AU2008286771B2 (en) 2007-08-15 2013-08-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
EP2192924B1 (en) * 2007-08-20 2017-10-11 Protalix Ltd. Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof
NZ584827A (en) 2007-10-01 2012-10-26 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
JP2011502514A (ja) 2007-11-09 2011-01-27 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 第７因子発現の調節
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
EP4074344A1 (en) 2007-12-04 2022-10-19 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
SG10202001748VA (en) 2007-12-27 2020-04-29 Stelic Institute Of Regenerative Medicine Stelic Institute & Co Sugar chain-related gene and use thereof
BRPI0907008A2 (pt) 2008-01-31 2015-07-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc Métodos otimizados para liberação de dsrna alvejando o gene pcsk9
WO2009100320A2 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
US20110269814A1 (en) 2008-03-26 2011-11-03 Alnylam Pharamaceuticals, Inc. 2'-f modified rna interference agents
EP3604533A1 (en) 2008-04-11 2020-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009143369A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing nucleosides and analogs thereof without using chromatography
WO2009148605A2 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
EP2733222A1 (en) 2008-07-09 2014-05-21 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
EP2323667A4 (en) * 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
EP3587434A1 (en) 2008-09-23 2020-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with click components for conjugation with ligands
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
DK2361256T3 (da) 2008-09-24 2013-07-01 Isis Pharmaceuticals Inc Cyclohexenyl-nukleinsyreanaloger
EP3335715A3 (en) 2008-10-15 2018-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor 11 expression
CN103937793B (zh) * 2008-10-20 2017-08-11 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法
US20120059045A1 (en) 2008-10-24 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of using oligomeric compounds comprising 2'-substituted nucleosides
WO2010048585A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
EP3808177A1 (en) 2008-11-10 2021-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
US9023820B2 (en) 2009-01-26 2015-05-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein C-III expression
CA3036963A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
CA2753975C (en) 2009-03-02 2017-09-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
FR2943060B1 (fr) 2009-03-13 2013-01-04 Commissariat Energie Atomique Agents chelatants d'ions metalliques, leurs procedes de preparation et leurs applications
EP2419146A4 (en) 2009-04-15 2013-11-27 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF INFLAMMATORY RESPONSES BY FACTOR XI
EP2416760A4 (en) 2009-05-05 2014-01-22 Tekmira Pharmaceuticals Corp LIPID COMPOSITIONS
US9200276B2 (en) 2009-06-01 2015-12-01 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent RNA interference, compositions and methods of use thereof
PL3431076T3 (pl) 2009-06-10 2022-01-31 Arbutus Biopharma Corporation Ulepszona formulacja lipidowa
KR20120050429A (ko) 2009-06-15 2012-05-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ
BR112012000421A2 (pt) 2009-07-06 2019-09-24 Alnylam Pharmaceuticals Inc composições e métodos para intensificar a produção de um produto biológico.
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
WO2011005861A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US20120214862A1 (en) 2009-07-16 2012-08-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor 7 expression
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US8901072B2 (en) * 2009-08-12 2014-12-02 The Medicines Company Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics with improved solubility
WO2011038356A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Johns Hopkins University Novel liver-targeting agents and their synthesis
WO2011047312A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 Glaxo Group Limited Hbv antisense inhibitors
TWI391144B (zh) 2009-10-26 2013-04-01 Iner Aec Executive Yuan 一種定量肝殘餘功能的檢驗方法與其新穎肝受體造影檢驗藥劑
TWI388338B (zh) 2009-10-26 2013-03-11 Iner Aec Executive Yuan 對聚合醣鏈進行放射標誌以作為肝受體造影劑之方法
EP2496238A4 (en) * 2009-11-03 2013-10-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc FORMULATED LIPID COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING TRANSTHYRETIN EXPRESSION (TTR)
WO2011072290A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Regents Of The University Of Michigan Targeted dendrimer-drug conjugates
WO2011085271A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of angiopoietin-like 3 expression
WO2011100131A2 (en) 2010-01-28 2011-08-18 Alnylam Pharmacuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
DK2539451T3 (da) * 2010-02-24 2016-04-04 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til målrettet tilførsel af siRNA
WO2011115818A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
JP2013528665A (ja) 2010-03-26 2013-07-11 メルサナ セラピューティックス， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドの送達のための修飾ポリマー、その製造方法、およびその使用方法
US20130109817A1 (en) 2010-03-26 2013-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Modified Polymers for Delivery of Polynucleotides, Method of Manufacture, and Methods of Use Thereof
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011133871A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
US9127033B2 (en) 2010-04-28 2015-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′ modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US8993738B2 (en) 2010-04-28 2015-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified nucleosides, analogs thereof and oligomeric compounds prepared therefrom
PT2563920T (pt) * 2010-04-29 2017-05-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulação da expressão de transtirretina
US20130236968A1 (en) 2010-06-21 2013-09-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
EP2616543A1 (en) * 2010-09-15 2013-07-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
WO2012067970A2 (en) 2010-11-11 2012-05-24 Ted M Dawson Transcriptional repression leading to parkinson's disease
WO2012068187A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
JP2014504295A (ja) 2010-12-17 2014-02-20 アローヘッド リサーチ コーポレイション ｓｉＲＮＡ用ガラクトースクラスター−薬物動態調節剤標的指向部分
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
EP2658981B1 (en) 2010-12-29 2016-09-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
EP3067421B1 (en) 2011-02-08 2018-10-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
CN107012144A (zh) 2011-04-01 2017-08-04 Ionis制药公司 信号转导及转录激活蛋白3(stat3)表达的调节
JP5951752B2 (ja) * 2011-04-13 2016-07-13 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｐｔｐ１ｂ発現のアンチセンス調節
TW201303013A (zh) 2011-04-21 2013-01-16 Isis Pharmaceuticals Inc Ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）表現之調節
SI3505528T1 (sl) 2011-04-21 2021-04-30 Glaxo Group Limited Modulacija izražanja virusa hepatitisa B (HBV)
KR20190062511A (ko) 2011-04-27 2019-06-05 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 아포지방단백질 ｃｉｉｉ （ａｐｏｃｉｉｉ） 발현의 조정
WO2012174154A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of inflammatory responses by factor vii
EP2721156B1 (en) 2011-06-16 2016-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
KR102540778B1 (ko) 2011-06-21 2023-06-07 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 아포리포단백질 c-iii(apoc3) 유전자의 발현 억제를 위한 조성물 및 방법
EP2723758B1 (en) * 2011-06-21 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compostions and methods of use thereof
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
US20130017250A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods For High Density Lipoprotein Cholesterol Regulation
US8932572B2 (en) 2011-08-26 2015-01-13 Arrowhead Madison Inc. Poly(vinyl ester) polymers for in vivo nucleic acid delivery
DK2751270T3 (en) 2011-08-29 2018-10-29 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER-CONJUGATE COMPLEXES AND THEIR USE
CA2849273C (en) * 2011-09-20 2020-07-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of gcgr expression
AU2012328680A1 (en) 2011-10-25 2014-05-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCCR expression
DK3301177T3 (da) 2011-11-18 2020-06-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Rnai-midler, sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling af transthyretin (ttr)-forbundne sygdomme
JP2015507924A (ja) 2012-02-08 2015-03-16 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 第ｖｉｉ因子の発現を調節するための方法と組成物
US9340784B2 (en) 2012-03-19 2016-05-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating alpha-1-antitrypsin expression
WO2013142571A2 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Cornell University Assays for the identification of compounds that modulate lipid homeostasis
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
EP3336189A1 (en) 2012-04-20 2018-06-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
TWI595885B (zh) 2012-05-02 2017-08-21 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
WO2013165816A2 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Merck Sharp & Dohme Corp. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
US20160002624A1 (en) 2012-05-17 2016-01-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
US9574193B2 (en) 2012-05-17 2017-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating apolipoprotein (a) expression
RU2748495C2 (ru) 2012-05-24 2021-05-26 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для модулирования экспрессии аполипопротеина (а)
US20150322428A1 (en) 2012-06-18 2015-11-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for improved cellular uptake of antisense compounds
US10086081B2 (en) 2012-08-06 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugated RNA agents and process for their preparation
US9695418B2 (en) 2012-10-11 2017-07-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and uses thereof
EP2920304B1 (en) 2012-11-15 2019-03-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
EP2951305B1 (en) 2013-01-30 2018-08-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
EP2992098B1 (en) 2013-05-01 2019-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
WO2014184973A1 (ja) 2013-05-16 2014-11-20 大日本住友製薬株式会社 神経前駆細胞を用いた細胞治療における移植補助剤
EP3730619A1 (en) 2013-06-21 2020-10-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of target nucleic acids
SG10201908122XA (en) 2013-06-27 2019-10-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
MX2015017863A (es) 2013-07-02 2016-11-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de receptor de hormona de crecimiento.
EP3019200B1 (en) 2013-07-11 2022-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
CN105744959B (zh) 2013-09-13 2020-12-01 Ionis制药公司 补体因子b的调节剂
US9943604B2 (en) 2013-09-20 2018-04-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutic nucleosides and their use
MX2016005855A (es) 2013-11-14 2016-07-13 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compuestos de conjugados antisentido de apolipoproteina b (apob).
US10150965B2 (en) 2013-12-06 2018-12-11 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of transthyretin (TTR) by double-stranded RNA
KR102369736B1 (ko) 2014-05-01 2022-03-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 보체 인자 b 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP6667453B2 (ja) 2014-05-01 2020-03-18 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 成長ホルモン受容体発現を調節するための組成物及び方法
BR122020024443B1 (pt) 2014-05-01 2022-02-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto e composição farmacêutica para modulação da expressão de angptl3
EP4223315A3 (en) 2014-05-01 2023-08-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method for synthesis of reactive conjugate clusters
DK3137091T3 (da) 2014-05-01 2021-01-25 Ionis Pharmaceuticals Inc Konjugater af modificerede antisense-oligonukleotider og anvendelse deraf til modulation af pkk-ekspression
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
WO2015188194A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
BR122023026882A2 (pt) * 2015-11-06 2024-01-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc Uso de um composto oligomérico
WO2017079745A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy

Also Published As

Publication number Publication date
CN110042098A (zh) 2019-07-23
US20210395734A1 (en) 2021-12-23
CN108064162A (zh) 2018-05-22
JP2018027091A (ja) 2018-02-22
IL242126B (en) 2019-01-31
US20200224198A1 (en) 2020-07-16
AU2014259756A1 (en) 2015-10-22
US9163239B2 (en) 2015-10-20
NZ631552A (en) 2017-02-24
KR20230113835A (ko) 2023-08-01
EP2991661B1 (en) 2019-03-13
KR102315836B1 (ko) 2021-10-22
PT2992098T (pt) 2019-07-05
EP3524680A1 (en) 2019-08-14
IL296543A (en) 2022-11-01
KR20210037752A (ko) 2021-04-06
ZA201507218B (en) 2023-09-27
JP2020058370A (ja) 2020-04-16
AU2020217347A1 (en) 2020-08-27
RU2015151204A (ru) 2017-06-02
AU2020207820A1 (en) 2020-08-06
KR102212275B1 (ko) 2021-02-05
CA2921509A1 (en) 2014-11-06
IL284593A (en) 2021-08-31
IL242132B (en) 2018-10-31
RU2015151202A3 (uk) 2018-03-27
US10927372B2 (en) 2021-02-23
US20160076032A1 (en) 2016-03-17
US10683499B2 (en) 2020-06-16
JP2020007361A (ja) 2020-01-16
KR102235678B1 (ko) 2021-04-05
MX2021008901A (es) 2021-08-19
US20160090595A1 (en) 2016-03-31
KR20230006933A (ko) 2023-01-11
KR20180051678A (ko) 2018-05-16
ME03390B (me) 2020-01-20
RU2018136140A3 (uk) 2022-04-27
RU2015151199A (ru) 2017-06-05
IL284593B2 (en) 2023-02-01
BR112015027321A8 (pt) 2018-01-02
EP4155403A1 (en) 2023-03-29
MX2015015239A (es) 2016-10-03
CR20190269A (es) 2019-09-13
AU2024200296A1 (en) 2024-02-08
US9957504B2 (en) 2018-05-01
JP6652602B2 (ja) 2020-02-26
US20160076030A1 (en) 2016-03-17
CL2015003217A1 (es) 2016-07-08
ES2730015T3 (es) 2019-11-07
CA2921162A1 (en) 2014-11-06
JP6639629B2 (ja) 2020-02-05
JP2024010070A (ja) 2024-01-23
NZ728517A (en) 2021-12-24
MX2015015264A (es) 2016-08-12
IL242124B (en) 2019-02-28
EP2992097A4 (en) 2017-01-04
RS60796B1 (sr) 2020-10-30
JP2020039355A (ja) 2020-03-19
KR20200090966A (ko) 2020-07-29
CN105378082A (zh) 2016-03-02
US20180273952A1 (en) 2018-09-27
US20140343123A1 (en) 2014-11-20
AU2020233603A1 (en) 2020-10-01
RU2686080C2 (ru) 2019-04-24
CA2921514C (en) 2023-10-24
JP2024116224A (ja) 2024-08-27
MX2015015234A (es) 2016-10-03
DK2992009T3 (da) 2020-09-14
BR112015027377A2 (pt) 2017-08-29
PL2992098T3 (pl) 2019-09-30
SG11201508870VA (en) 2015-11-27
JP2021107408A (ja) 2021-07-29
ES2778442T3 (es) 2020-08-10
US20160017323A1 (en) 2016-01-21
EP3690049A1 (en) 2020-08-05
PE20161430A1 (es) 2017-01-06
JP6387084B2 (ja) 2018-09-05
RS58981B1 (sr) 2019-08-30
EP2991656A2 (en) 2016-03-09
CL2016002262A1 (es) 2017-06-09
HRP20201378T1 (hr) 2020-11-27
CN105378085B (zh) 2019-02-15
BR112015027322A2 (pt) 2017-09-26
IL283660A (en) 2021-07-29
US10883104B2 (en) 2021-01-05
AU2014259756B2 (en) 2017-02-23
KR20210129257A (ko) 2021-10-27
AU2014259757B2 (en) 2017-03-02
CR20150612A (es) 2016-03-03
AU2019204784A1 (en) 2019-07-25
MX2020004209A (es) 2020-08-13
AU2019203674A1 (en) 2019-06-27
IL270464B (en) 2021-07-29
US20210130823A1 (en) 2021-05-06
AU2019204784B2 (en) 2022-01-27
WO2014179625A1 (en) 2014-11-06
EP2991661A1 (en) 2016-03-09
HK1221475A1 (zh) 2017-06-02
EP2992009A1 (en) 2016-03-09
PT3524680T (pt) 2021-01-04
EP2992097A2 (en) 2016-03-09
EP3633039A1 (en) 2020-04-08
WO2014179626A3 (en) 2015-02-26
AU2017200365B2 (en) 2018-11-08
KR20220108195A (ko) 2022-08-02
US11299736B1 (en) 2022-04-12
AU2017203436A1 (en) 2017-06-08
IL264241B (en) 2020-04-30
MX2021008899A (es) 2021-08-19
AU2014259755A1 (en) 2015-10-22
RU2019124314A (ru) 2019-08-21
NZ753018A (en) 2022-01-28
KR20160002975A (ko) 2016-01-08
RU2697152C2 (ru) 2019-08-12
PH12019501191A1 (en) 2021-03-01
BR112015027369A8 (pt) 2018-01-02
AU2019200820A1 (en) 2019-02-28
HK1221403A1 (zh) 2017-06-02
IL242125B (en) 2019-02-28
CY1121879T1 (el) 2020-10-14
US20150126719A1 (en) 2015-05-07
SI2992009T1 (sl) 2020-10-30
JP2021020901A (ja) 2021-02-18
NZ712737A (en) 2021-08-27
PT2992009T (pt) 2020-09-21
IL273184B (en) 2021-07-29
EA201891479A1 (ru) 2018-11-30
WO2014179627A9 (en) 2015-02-26
CA2921514A1 (en) 2014-11-06
JP2020039354A (ja) 2020-03-19
US9181550B2 (en) 2015-11-10
US9181549B2 (en) 2015-11-10
AU2022202770A1 (en) 2022-05-19
KR102558571B1 (ko) 2023-07-21
HRP20190987T1 (hr) 2019-09-20
EP2991661A4 (en) 2017-02-15
CN110079524A (zh) 2019-08-02
WO2014179620A1 (en) 2014-11-06
IL284000A (en) 2021-07-29
JP7339294B2 (ja) 2023-09-05
US20180044676A1 (en) 2018-02-15
IL273184A (en) 2020-04-30
RU2670614C2 (ru) 2018-10-24
CN114058617A (zh) 2022-02-18
JP2020074787A (ja) 2020-05-21
IL273205A (en) 2020-04-30
NZ631537A (en) 2017-05-26
EP2991656B1 (en) 2019-12-18
IL264580A (en) 2019-02-28
JP2016526874A (ja) 2016-09-08
HK1221404A1 (zh) 2017-06-02
KR20190084138A (ko) 2019-07-15
EP2992097B1 (en) 2019-11-06
AU2014259755B2 (en) 2018-08-30
BR112015027377A8 (pt) 2017-10-03
JP6592486B2 (ja) 2019-10-16
IL274064A (en) 2020-06-30
ZA201507216B (en) 2017-08-30
IL272617A (en) 2020-03-31
IL264241A (en) 2019-02-28
US20180002693A1 (en) 2018-01-04
BR112015027369A2 (pt) 2017-09-26
AU2014259757A1 (en) 2015-10-22
CN105377887B (zh) 2020-11-03
JP6216444B2 (ja) 2017-10-18
JP6769866B2 (ja) 2020-10-14
CN110066795A (zh) 2019-07-30
RU2650510C2 (ru) 2018-04-16
US20230151365A1 (en) 2023-05-18
EP3546579A1 (en) 2019-10-02
US9127276B2 (en) 2015-09-08
JP6456362B2 (ja) 2019-01-23
US20160090596A1 (en) 2016-03-31
CY1123369T1 (el) 2021-12-31
JP6866459B2 (ja) 2021-04-28
EP2992098B1 (en) 2019-03-27
AU2017200950B2 (en) 2019-01-17
WO2014179629A3 (en) 2015-01-22
JP2023113843A (ja) 2023-08-16
WO2014179627A3 (en) 2015-04-16
MX2019010443A (es) 2019-10-17
US11851655B2 (en) 2023-12-26
CA2921518A1 (en) 2014-11-06
AU2021204244A1 (en) 2021-07-22
KR20160002974A (ko) 2016-01-08
PE20152002A1 (es) 2016-01-21
CN112921036A (zh) 2021-06-08
RU2015151200A3 (uk) 2019-01-14
SG10201801813YA (en) 2018-04-27
EP2992009B1 (en) 2020-06-24
BR112015027321A2 (pt) 2017-09-26
JP2016523515A (ja) 2016-08-12
KR102138781B1 (ko) 2020-07-28
US20220275365A9 (en) 2022-09-01
EP2991656A4 (en) 2017-02-22
NZ740338A (en) 2022-04-29
AU2017200365C1 (en) 2019-04-18
BR112015027369B1 (pt) 2021-06-08
CN110042098B (zh) 2023-02-24
US9932580B2 (en) 2018-04-03
JP2023012548A (ja) 2023-01-25
US20210087566A1 (en) 2021-03-25
BR112015027377B1 (pt) 2023-01-10
IL274064B (en) 2021-06-30
IL273312A (en) 2020-04-30
AU2014259750B2 (en) 2019-02-28
AU2017200365A1 (en) 2017-02-23
DK3524680T3 (da) 2020-12-14
MX2015015263A (es) 2016-12-16
SG10201906382QA (en) 2019-08-27
EA036584B1 (ru) 2020-11-26
BR112015027319A8 (pt) 2018-01-02
US10844379B2 (en) 2020-11-24
DK2992098T3 (da) 2019-06-17
CN113293163A (zh) 2021-08-24
US9714421B2 (en) 2017-07-25
BR112015027322A8 (pt) 2018-01-02
AU2019200820B2 (en) 2020-04-30
CN105378085A (zh) 2016-03-02
NZ725538A (en) 2021-02-26
MY178929A (en) 2020-10-23
JP7177127B2 (ja) 2022-11-22
IL263843A (en) 2019-01-31
AU2019204784C1 (en) 2022-11-03
AU2017200950A1 (en) 2017-03-02
AU2018267625A1 (en) 2018-12-13
JP2016522683A (ja) 2016-08-04
RU2015151204A3 (uk) 2018-03-27
US20150126720A1 (en) 2015-05-07
EP2992009A4 (en) 2016-12-28
AU2017203436B2 (en) 2018-10-18
US20150176007A1 (en) 2015-06-25
CN108064162B (zh) 2021-12-03
KR20210151260A (ko) 2021-12-13
JP7429103B2 (ja) 2024-02-07
RU2699985C2 (ru) 2019-09-11
CN111593051A (zh) 2020-08-28
AU2014259759A1 (en) 2015-10-22
IL264580B (en) 2020-04-30
EP3524680B1 (en) 2020-11-11
IL261901A (en) 2018-10-31
EP2992098A4 (en) 2017-01-11
CN105377887A (zh) 2016-03-02
MX2019010441A (es) 2019-10-17
AU2014259759B2 (en) 2020-06-18
JP2019056001A (ja) 2019-04-11
RU2019110030A (ru) 2019-05-06
DOP2021000095A (es) 2021-09-15
EP3828275A1 (en) 2021-06-02
RU2015151202A (ru) 2017-06-06
PH12015502493B1 (en) 2016-02-22
SI2992098T1 (sl) 2019-06-28
JP2016522817A (ja) 2016-08-04
CN105392488A (zh) 2016-03-09
WO2014179629A2 (en) 2014-11-06
KR20160002976A (ko) 2016-01-08
ES2819213T3 (es) 2021-04-15
UA120287C2 (uk) 2019-11-11
AU2018267625B2 (en) 2020-09-10
BR122018009831B1 (pt) 2021-12-21
LT2992098T (lt) 2019-07-10
AU2021204244B2 (en) 2023-10-19
KR20240042220A (ko) 2024-04-01
WO2014179627A2 (en) 2014-11-06
JP2016526018A (ja) 2016-09-01
DOP2016000287A (es) 2017-02-15
US9932581B2 (en) 2018-04-03
US20240247260A1 (en) 2024-07-25
RU2018136140A (ru) 2018-12-17
PH12018501963A1 (en) 2020-07-20
HUE043697T2 (hu) 2019-09-30
US20150126718A1 (en) 2015-05-07
SG10201801507RA (en) 2018-03-28
JP2022017514A (ja) 2022-01-25
US20190055554A1 (en) 2019-02-21
KR20160003723A (ko) 2016-01-11
PL2992009T3 (pl) 2020-11-30
RU2018112167A (ru) 2019-03-07
PH12015502493A1 (en) 2016-02-22
US20180273953A1 (en) 2018-09-27
ES2885174T3 (es) 2021-12-13
JP6995478B2 (ja) 2022-01-14
JP2021074021A (ja) 2021-05-20
SG11201508800WA (en) 2015-11-27
IL263843B (en) 2020-03-31
EP2992098A2 (en) 2016-03-09
KR20210014758A (ko) 2021-02-09
AU2019202598A1 (en) 2019-05-02
IL284593B (en) 2022-10-01
KR102482890B1 (ko) 2022-12-30
CN105378082B (zh) 2020-06-09
NZ631512A (en) 2016-10-28
MX2015015220A (es) 2016-01-12
MY198359A (en) 2023-08-28
MX2020002184A (es) 2020-07-14
RU2670614C9 (ru) 2018-11-23
AU2014259750A1 (en) 2015-10-22
IL261901B (en) 2020-05-31
HK1221486A1 (zh) 2017-06-02
US9145558B2 (en) 2015-09-29
RU2015151200A (ru) 2019-01-14
EA031393B1 (ru) 2018-12-28
KR102424855B1 (ko) 2022-07-26
AU2019203674B2 (en) 2021-03-25
HUE050394T2 (hu) 2020-11-30
EA201592093A1 (ru) 2016-06-30
WO2014179629A8 (en) 2016-06-02
LT2992009T (lt) 2020-11-10
HK1221485A1 (zh) 2017-06-02
JP2018183184A (ja) 2018-11-22
WO2014179626A2 (en) 2014-11-06
DOP2015000268A (es) 2015-11-30
KR20160002977A (ko) 2016-01-08
RU2015151203A (ru) 2017-06-02
CA2921167A1 (en) 2014-11-06
RU2015151199A3 (uk) 2018-03-27
BR112015027319A2 (pt) 2017-09-26
US20210024923A1 (en) 2021-01-28
KR102651423B1 (ko) 2024-03-27
US20190367914A1 (en) 2019-12-05
DK2991656T3 (da) 2020-03-23
CN105392488B (zh) 2021-04-30
KR101857707B1 (ko) 2018-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA121017C2 (uk) Композиція і спосіб моделювання експресії hbv
JP6882411B2 (ja) 成長ホルモン受容体発現を調節するための組成物及び方法
KR102369736B1 (ko) 보체 인자 b 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
CN108368507A (zh) 程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)的iRNA组合物及其使用方法
UA126276C2 (uk) КОМПОЗИЦІЯ НА ОСНОВІ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНУ (TTR) І СПОСІБ ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ TTR-АСОЦІЙОВАНОГО ЗАХВОРЮВАННЯ
RU2782034C2 (ru) Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr
EA046363B1 (ru) Олигомерные соединения для модулирования экспрессии ttr
NZ764037A (en) Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression
NZ764037B2 (en) Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression
NZ724366B2 (en) Compositions and methods for modulating complement factor b expression
NZ728517B2 (en) Compositions and methods for modulating ttr expression