KR20160002976A - 아포지질단백질 (a) 발현을 조절하는 조성물 및 방법 - Google Patents

아포지질단백질 (a) 발현을 조절하는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

아포지질단백질 (a) [apo(a)]을 표적으로 하는, 콘주게이트 그룹을 갖는 올리고머 화합물이 본원에서 제공된다. 어떤 구현예에서, apo(a)를 표적으로 하는 올리고머 화합물은 N-아세틸갈락토사민에 접합된다. apo(a) 및/또는 Lp(a)와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방, 도는 개선하기 위해 apo(a)를 감소시키는데 사용하기 위한, apo(a)를 치료하는 접합된 올리고머 화합물이 본원에서 또한 개시된다. apo(a) 및/또는 Lp(a)와 관련된 어떤 질환, 장애 또는 병태는 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애 또는 병태를 포함한다. 본원에서 개시된 접합된 올리고머 화합물은 그것에 필요한 개체에서 그와 같은 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

아포지질단백질 (a) 발현을 조절하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOLIPOPROTEIN (a) EXPRESSION}
서열목록
본원은 전자 형태의 서열목록과 함께 출원되었다. 서열목록은 그 크기가 432 Kb인 파일명 BIOL0250WOSEQ_ST25.txt (2014년 5월 1일에 만들어짐)로서 제공되어 있다. 서열목록의 전자 형태의 정보는 본원에 그 전체가 참고로 편입되어 있다.
안티센스 기술 배후에 있는 원리는 안티센스 화합물이 표적 핵산에 혼성화하고 표적 핵산의 양, 활성, 및/또는 기능을 조절한다는 것이다. 예를 들면 어떤 예에서, 안티센스 화합물은 표적의 변경된 전사 또는 번역을 야기한다. 그와 같은 발현의 조절은, 예를 들면, 표적 mRNA 분해 또는 점유-기반 억제에 의해 달성될 수 있다. 분해에 의한 RNA 표적 기능의 조절의 예는 DNA-유사 안티센스 화합물과 혼성화시 RNase H-기반의 표적 RNA의 분해이다. 표적 분해에 의한 유전자 발현의 조절의 또 하나의 예는 RNA 간섭 (RNAi)이다. RNAi는 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)를 이용하는 기전을 통한 안티센스-매개된 유전자 침묵을 지칭한다. RNA 표적 기능의 조절의 추가의 예는 microRNA에 의해 천연적으로 이용되는 것과 같은 점유-기반의 기전에 의한다. microRNA는 단백질-코딩 RNA의 발현을 조절하는 작은 비-코딩 RNA이다. microRNA에 대한 안티센스 화합물의 결합은 microRNA가 그것의 메신저 RNA 표적에 결합하는 것을 막음으로써 microRNA의 기능을 방해한다. microRNA 모사체는 원상태 microRNA 기능을 향상시킬 수 있다. 어떤 안티센스 화합물은 전-mRNA의 스플라이싱을 변경한다. 특정 기전과 무관하게, 서열-특이성은 표적 검증 및 유전자 관능화를 위한 도구로서 뿐만 아니라 질환의 병인에 연루된 유전자의 발현을 선택적으로 조절하는 치료제로서 안티센스 화합물을 매력적이게 한다.
안티센스 기술은 하나 이상의 특정 유전자 생성물의 발현을 조절하는 효과적인 방법이며 따라서 수많은 치료, 진단, 및 연구 적용에서 독특하게 유용한 것으로 입증될 수 있다. 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드는 하나 이상의 특성, 예컨대 뉴클레아제 저항성, 약동학 또는 표적 핵산에 대한 친화성을 향상시키기 위해 안티센스 화합물 내로 혼입될 수 있다. 1998에, 안티센스 화합물, Vitravene® (포미비르센; Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, CA에 의해 개발됨)은 U.S. 식품의약품안전청 (FDA)으로부터 시판 승인을 받은 첫 번째 안티센스 약물이고, 현재 AIDS 환자에서 사이토메갈로바이러스 (CMV)-유도된 망막염의 치료에 사용된다.
새로운 화학적 변형이 안티센스 화합물의 효력 및 효능을 개선하여, 경구 전달에 대한 잠재성을 드러낼 뿐만 아니라 피하 투여를 향상시키고, 부작용에 대한 잠재성을 낮추고, 환자 편의성을 개선해왔다. 안티센스 화합물의 효능을 증가시키는 화학적 변형은 더 낮은 용량의 투여를 허용하며, 이는 독성에 대한 잠재성을 낮출 뿐만 아니라 요법의 전체 비용을 감소시킨다. 분해에 대한 저항성을 증가시키는 변형은 신체로부터 더 느린 소거능을 야기하여, 덜 빈번한 복용을 허용한다. 화합물의 효능을 더 최적화하기 위해 하나의 화합물 내에서 상이한 유형의 화학적 변형들이 조합될 수 있다.
지질단백질은 단백질, 인지질 및 콜레스테롤의 양친매성 코팅에 의해 둘러싸인 아실글리세롤과 콜레스테릴 에스테르의 비극성 코어로 이루어진 구상의 마이셀 유사 입자이다. 지질단백질은 그들의 기능적 및 물리적 특성에 기초하여 5개의 넓은 카테고리로 분류되어 왔다: 카일로마이크론, 초저밀도 지질단백질(VLDL), 중간체 밀도 지질단백질(IDL), 저밀도 지질단백질(LDL), 및 고밀도 지질단백질(HDL). 카일로마이크론은 식이 지질을 창자에서 조직으로 수송한다. VLDL, IDL 및 LDL 모두 트리아실글리세롤 및 콜레스테롤을 간에서 조직으로 수송한다. HDL은 내인성 콜레스테롤을 조직에서 간으로 수송한다
지질단백질 입자는 연속적인 대사 과정을 겪고 다양한 특성 및 조성을 갖는다. 지질단백질 밀도는 입자 직경을 증가하지 않고도 증가하는데, 이는 그들의 외부 코팅의 밀도가 내부 코어의 밀도보다 낮기 때문이다. 지질단백질의 단백질 구성성분은 아포지질단백질로서 알려져 있다. 다양한 인간 지질단백질 중에서 적어도 9개 아포지질단백질이 상당한 양으로 분배되어 있다.
지질단백질(a)[Lp(a)] 입자는 거의 50년 전에 확인되었고 매우 독특한 LDL 입자로 구성되어 있으며, 여기서 하나의 아포지질단백질 B(apoB) 단백질은 디설파이드 결합을 통해 단일 아포지질단백질(a)[apo(a)] 단백질에 연결되어 있다. apo(a) 단백질은 특히 크링글 IV 2형 반복 도메인 내에서 플라스미노겐과 높은 정도의 상동성을 갖는다. 순환하는 Lp(a)의 수준은 분자 내에 존재하는 크링글 IV 2형 가변 반복 수와 반비례하고, 두 대립유전자가 개인들 사이에서 공동발현되므로, 이종 혈장 동형 프로파일을 나타낼 수 있다(Kraft 등, Eur J Hum Genet, 1996; 4(2): 74-87). apo(a) 내의 이 크링글 반복 도메인이 그것의 혈전촉진 및 항-섬유소용해 특성을 담당할 수 있어서, 잠재적으로 죽상경화성 진행을 향상시키는 것으로 여겨진다.
Apo(a)는 IL-6에 의해 전사적으로 조절되며 IL-6 억제제(토실리주맙)로 처리된 류마티스성 관절염 환자에서의 연구에서, 혈장 수준은 3개월 치료 이후 30%로 감소하였다(Schultz 등, PLoS One 2010; 5:e14328).
Apo(a)은 산화된 인지질에 우선적으로 결합하여 혈관 염증을 강화하는 것으로 나타났다(Bergmark 등, J Lipid Res 2008; 49:2230-2239; Tsimikas 등, Circulation. 2009; 119(13):1711-1719).
또한, 연구들은 Lp(a) 입자가 또한 내피 투과성을 자극하고, 플라스미노겐 활성제 억제제 1형 발현을 유도하며 대식세포 인터루킨-8 분비를 활성화할 수 있음을 제시한다(Koschinsky and Marcovina, Curr Opin Lipidol 2004; 15:167-174). 중요하게도, 최근 유전자 협회 연구는 Lp(a)가 심근경색, 뇌졸중, 말초혈관 질환 및 복부 대동맥 동맥류에 대해 독립적인 위험 인자였음을 밝혀내었다(Rifai 등, Clin Chem 2004; 50:1364-71; Erqou 등, JAMA 2009;302:412-23; Kamstrup 등, Circulation 2008;117:176-84). 또한, 최근 조숙한 관상동맥 질환(PROCARDIS) 연구에서, Clarke 등(Clarke 등, NEJM (2009)361; 2518-2528)은 관상동맥 심장병과 혈장 Lp(a) 농도 사이에 강력하고 독립적인 연관관계를 기술하였다. 추가로, Solfrizzi 등은 증가된 혈청 Lp(a)가 알츠하이머병(AD)에 대한 위험성 증가와 연관될 수 있음을 제시하였다(Solfrizzi 등, J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002, 72:732-736). 현재, 임상 환경에서, 심혈관 질환을 치료하기 위한 간접적인 apo(a) 억제제의 예는 아스피린, 니아스판, 미포메르센, 아나세트라핍, 에피로티로메 및 로미타파이드를 포함하고, 이들은 혈장 Lp(a) 수준을 18%, 39%, 32%, 36%, 43% 및 17%로 낮춘다. 추가로, Lp(a) 분리반출법은 Lp(a) 입자를 함유하는 apo(a)를 감소시키기 위해 병원에서 사용되어 왔다.
현재까지, 직접적으로 표적 apo(a)를 표적화함으로써 심혈관 질환을 치료하는 치료 전략이 제한되어 왔다. 리보자임 올리고뉴클레오타이드(U.S. 특허 제5,877,022호) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드(WO 2005/000201; WO 2003/014397; WO2013/177468; US20040242516; U.S. 특허 제8,138,328호, 제8,673,632호 및 제7,259,150호; Merki 등, J Am Coll Cardiol 2011; 57:1611-1621; 각각의 공보는 그전체가 참고로 편입되어 있음)가 개발되었으나, 어느 것도 상업적 사용을 위해 승인을 받진 못하였다.
따라서, 만성적으로 증가된 혈장 Lp(a) 수준으로 인해 심혈관 사건에 대해 증가된 위험에 있는 환자에게서 apo(a) 수준을 강력하게 그리고 선택적으로 감소시킬 수 있는 신규 제제에 대해 명확한 충족되지 않은 의료적 요구가 여전히 남아있다.
발명의 요약
apo(a) mRNA 및 단백질의 발현을 조절하는 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 apo(a) mRNA 및 단백질의 발현을 감소시킨다. Lp(a) 수준의 발현을 조절하는 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다.
어떤 구현예에서, 조성물은 apo(a) 특이적 억제제이다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 핵산, 단백질, 또는 소분자이다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 접착체를 갖는, apo(a)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트가고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 1의 핵염기 3901 내지 3920의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8 개의 인접 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호: 1에 대해 적어도 80% 상보적이다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 1-130, 133, 134의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트가고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 58의 임의의 것의 적어도 8 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 가지며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 아래를 포함한다: (a) 10 개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절; (b) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절; (c) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절; 및상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고 여기서 각각의 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
어떤 구현예는 본원에서 기재된 접합된 안티센스 화합물, 또는 그것의 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
어떤 구현예에서, apo(a) 발현의 조절은 세포 또는 조직에서 일어난다. 어떤 구현예에서, 조절은 동물의 세포 또는 조직에서 일어난다. 어떤 구현예에서, 동물은 인간이다. 어떤 구현예에서, 조절은 apo(a) mRNA 수준의 감소이다. 어떤 구현예에서, 조절은 apo(a) 단백질 수준의 감소이다. 어떤 구현예에서, apo(a) mRNA 및 단백질 수준 둘 모두는 감소된다. 어떤 구현예에서, 조절은 Lp(a) 수준의 감소이다. 그와 같은 감소는 시간-의존적 방식 또는 용량-의존 방식으로 일어날 수 있다.
어떤 구현예는 치료에 사용하기 위한 접합된 안티센스 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예는 apo(a) 관련된 질환, 장애, 및 병태를 예방, 치료, 지연, 그것의 진행을 느리게 하고/거나 그것을 개선하는 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예는 Lp(a) 관련된 질환, 장애, 및 병태를 예방, 치료, 지연, 그것의 진행을 느리게 하고/거나 그것을 개선하는 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 질환, 장애, 및 병태는 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애, 및 병태이다. 어떤 구현예에서, 치료용 조성물 및 방법은 apo(a) 특이적 억제제를 그것이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 핵산이다. 어떤 구현예에서, 핵산은 안티센스 화합물이다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 변형된 올리고뉴클레오타이드이다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 콘주게이트를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드이다.
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 개시내용은 핵산 전사체에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 개시내용은 세포를 핵산 전사체에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 접합된 안티센스 화합물와 접촉시키는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 개시내용은 세포를 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 접합된 안티센스 화합물과 접촉시키고 세포에서 핵산 전사체의 양 또는 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)가 이전에 기재되었다. 예를 들면, Park 등, PNAS vol. 102, No. 47, pp 17125-17129 (2005). 그와 같은 수용체들은 간 세포, 특히 간세포(hepatocyte) 상에서 발현된다. 게다가, 3개의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 리간드들의 클러스트를 포함하는 화합물은 ASGP-R에 결합하여, 세포 내로 상기 화합물의 흡수를 야기할 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들면, 문헌[Khorev 등, Bioorganic 및 Medicinal Chemistry, 16, 9, pp 5216-5231 (May 2008)]을 참조한다. 따라서, 그와 같은 GalNAc 클러스터를 포함하는 콘주게이트들은 간 세포, 특이적으로 간세포 내로 어떤 화합물의 흡수를 촉진하는데 사용되어 왔다. 예를 들면 어떤 GalNAc-함유 콘주게이트들은 생체내에서 간 세포에서 듀플렉스 siRNA 화합물의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 그와 같은 경우에, GalNAc-함유 콘주게이트는 전형적으로 siRNA 듀플렉스의 센스 가닥에 부착된다. 센스 가닥은 안티센스 가닥이 결국 표적 핵산과 혼성화되기 전에 버려지므로, 상기 콘주게이트는 활성을 방해할 염려가 거의 없다. 전형적으로, 상기 콘주게이트는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 예를 들면, U.S. 특허 제8,106,022호를 참고한다. 본원에서 기재된 어떤 콘주게이트 그룹은 더 활성이고/거나 이전에 기재된 콘주게이트 그룹보다 합성하기 더 쉽다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 콘주게이트는 비제한적으로 RNase H 기반 안티센스 화합물 및 전-mRNA의 표적 핵산의 스플라이싱을 변경하는 안티센스 화합물을 포함하는, 단일가닥 안티센스 화합물에 부착된다. 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트는 이점 (세포 내로의 개선된 흡수)을 제공하기에 충분히 긴 안티센스 화합물에 계속 부착되어 있어야 하지만, 이후에 절단되거나, 또는 표적 핵산에 대한 혼성화 및 스플라이싱 또는 스플라이스 조절과 연관된 RNase H 또는 효소와의 상호작용과 같은, 활성에 필요한 차후 단계를 방해하지 않을 수 있다. 특성들의 이러한 균형이 siRNA 화합물에서보다 단일가닥 안티센스 화합물의 셋팅에서 더 중요하며, 상기 콘주게이트는 센스 가닥에 간편하게 부착될 수 있다. 콘주게이트가 결여된 동일한 안티센스 화합물과 비교하여 생체내에서 간 세포에서 개선된 효능을 갖는 접합된 단일가닥 안티센스 화합물이 본원에 개시된다. 이들 화합물에 대해 특성들의 요구되는 균형을 고려할 때, 그와 같은 개선된 효능은 놀랍다.
어떤 구현예에서, 본원의 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함한다. 언급한 바와 같이, 기전에 의해 얽매이지 않으면서, 콘주게이트가 흡수 증진을 제공하기 위해 충분히 긴 화합물 상에 유지되어야 하는 것이 논리적이지만, 이후에, 상기 콘주게이트의 일부분 또는 이상적으로는 모두가 절단되어 그것의 가장 활성 형태의 모 화합물 (예를 들면, 안티센스 화합물)을 방출하는 것이 바람직하다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 뉴클레오사이드이다. 그와 같은 구현예는하나 이상의 절단가능 결합, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 통한 뉴클레오사이드를 통해 상기 콘주게이트 (클러스터)의 나머지를안티센스 올리고뉴클레오타이드에 부착시킴으로써 세포에서 내인성 뉴클레아제의 이점을 이용한다. 어떤 구현예에서, 클러스터는 포스포디에스테르 연결을 통해 절단가능 뉴클레오사이드에 결합된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 뉴클레오사이드는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (안티센스 화합물)에 부착된다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 2 또는 3 개의 절단가능 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 그와 같은 절단가능 뉴클레오사이드는 서로 연결되고/거나, 안티센스 화합물에 연결되고/거나 절단가능 결합 (예컨대 포스포디에스테르 연결)을 통해 클러스트에 연결된다. 본원의 어떤 콘주게이트는 절단가능 뉴클레오사이드를 포함하지 않으며 대신에 절단가능 결합을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드로부터의 콘주게이트의 충분한 절단은 세포에서 절단에 취약한 적어도 하나의 결합 (절단가능 결합)에 의해 제공되는 것으로 나타난다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 전구약물이다. 그와 같은 전구약물은 동물에게 투여되고 결국 더 많은 활성 형태로 대사작용된다. 예를 들면, 접합된 안티센스 화합물은 콘주게이트의 모두 또는 일부를 제거하기 위해 절단되어 콘주게이트의 모두 또는 일부가 결여된 안티센스 화합물의 활성 (또는 더 많은 활성) 형태를 야기한다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 부착된다. 어떤 그와 같은 5'-콘주게이트는 3' 말단에서 부착된 유사한 콘주게이트 그룹을 갖는 대응물보다 더 효율적으로 절단된다. 어떤 구현예에서, 개선된 활성은 개선된 절단과 관련될 수 있다. 어떤 구현예에서, 5' 말단에 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드보다 더 큰 효능을 갖는다 (예를 들면, 실시예 56, 81, 83, 및 84 참고). 게다가, 5'-부착은 보다 간단한 올리고뉴클레오타이드 합성을 허용한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 3'에서 5' 방향으로 고체 지지체 상에서 합성된다. 3'-접합된 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해, 전형적으로 전-접합된 3' 뉴클레오사이드를고체 지지체에 부착시킨 다음 종래와 같이 올리고뉴클레오타이드를 만든다. 그러나, 상기 접합된 뉴클레오사이드를 고체 지지체에 부착하는 것은 합성에 문제가 된다. 게다가, 상기 접근법을 이용시, 이후 콘주게이트가 올리고뉴클레오타이드의 합성 내내 존재하고 이후 단계 동안 분해될 수 있거나 사용될 수 있는 반응 및 시약의 종류를 제한할 수 있다. 5'-접합된 올리고뉴클레오타이드에 대해 본원에 기재된 구조 및 기술을 이용하여, 당업자는 표준 자동화된 기술을 이용하여 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 올리고뉴클레오타이드가 고체 지지체로부터 절단된 후 최종 (5'-최말단) 뉴클레오사이드를 갖는 콘주게이트를 도입할 수 있다.
본 기술분야 및 본 개시내용에 비추어, 숙련가는 본원에서 임의의 콘주게이트 및 접합된 올리고뉴클레오타이드를 쉽게 제조할 수 있다. 게다가, 본원에 개시된 어떤 그와 같은 콘주게이트 및 접합된 올리고뉴클레오타이드의 합성은 더쉽고/거나 단계를 거의 필요로 하지 않으며, 따라서 이전에 개시된 콘주게이트보다 덜 비싸, 제조시 이점을 제공한다. 예를 들면, 어떤 콘주게이트 그룹의 합성은 더 적은 합성 단계로 구성되어, 이전에 기재된 콘주게이트 그룹과 비교하여 증가된 수율을 야기한다. 실시예 46에서의 GalNAc3-10 및 실시예 48에서의 GalNAc3-7과 같은 콘주게이트 그룹들은 더 많은 화학적 중간체들의 조립을 요구하는 U.S. 제8,106,022호 또는 U.S. 제7,262,177호에 기술된 것과 같은 이전에 기재된 콘주게이트보다 훨씬 더 단순하다. 따라서, 본원에 기재된 이들 및 다른 콘주게이트들은 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 및 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드 중 어느 가닥 (예를 들면, siRNA)을 포함하는,임의의 올리고뉴클레오타이드를 이용하기 위해 이전에 기재된 화합물보다 이점을 갖는다.
유사하게, 단지 1 또는 2개의 GalNAc 리간드를 갖는 콘주게이트 그룹들이 본원에서 개시된다. 나타난 바와 같이, 그러한 콘주게이트 그룹들은 안티센스 화합물의 활성을 개선한다. 그러한 화합물들은 3개의 GalNAc 리간드를 포함하는 콘주게이트보다 제조하기 훨씬 더 쉽다. 1 또는 2개의 GalNAc 리간드를 포함하는 콘주게이트 그룹들은 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 및 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나 (예를 들면, siRNA)를 포함하는, 임의의 안티센스 화합물에 부착될 수 있다.
어떤 구현예에서, 본원의콘주게이트들은내성의 어떤 측정값을 실질적으로 변화시키지 않는다. 예를 들면, 접합된 안티센스 화합물들은 비접합된 모 화합물보다 더 면역원성이 아닌 것으로 본원에 나타나 있다. 효능이 개선되므로, 내성이 동일하게 유지되는 (또는 사실상 내성이 효능 증가와 비교하여 단지 약간 악화되긴 하지만) 구현예는 치료요법에 대해 개선된 특성을 갖는다.
어떤 구현예에서, 콘주게이션은 콘주게이션 부재시 덜 매력적인 결과를 갖는 방식으로 안티센스 화합물을 변경시키는 것을 허용한다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 완전히 포스포로티오에이트 안티센스 화합물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 포스포디에스테르 연결로 대체하는 것은 내성의 일부 측정에서 개선을 야기한다. 예를 들면, 어떤 예에서, 하나 이상의 포스포디에스테르를 갖는 그와 같은안티센스 화합물은각각의 연결이 포스포로티오에이트인 동일한 화합물보다 덜 면역원성이다. 그러나, 어떤 예에서, 실시예 26에서 나타난 바와 같이, 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결의 포스포디에스테르 연결로의 동일한 대체는 또한 감소된 세포성 흡수 및/또는 효능의 손실을 야기한다. 어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 접합된 안티센스 화합물은 접합된 완전한-포스포로티오에이트 대응물과 비교하여 흡수 및 효능에서 손실이 거의 없거나 전혀 없이 연결에서 그와 같은 변화를 견딘다. 사실상, 어떤 구현예에서, 예를 들면, 실시예 44, 57, 59, 및 86에서, 콘주게이트및 적어도 하나의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드들은 실제로 또한 동일한 콘주게이트를 포함하는 완전한 포스포로티오에이트 대응물과 비교하여도 생체내에서 증가된 효능을 나타낸다. 게다가, 콘주게이션은 흡수/효능에서 실질적인 증가를 야기하므로, 상기 실질적인 증가에서의 작은 손실은 개선된 내성을 달성하기 위해 허용될 수 있다. 따라서, 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 적어도 하나의 포스포디에스테르 연결을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본원의 안티센스 화합물의 콘주게이션은 간세포에서 증가된 전달, 흡수 및 활성을 야기한다. 따라서, 더 많은 화합물은 간 조직에 전달된다. 그러나, 어떤 구현예에서, 상기 그러한 증가된 전달은 단독으로 활성의 전체 증가를 설명하지 못한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 더 많은 화합물은 간세포에 들어간다. 어떤 구현예에서, 심지어 증가된 간세포 흡수도 활성의 전체 증가를 설명하지 못한다. 그와 같은 구현예에서, 접합된 화합물의 생산적인 흡수는 증가된다. 예를 들면, 실시예 102에 나타난 바와 같이, GalNAc-함유 콘주게이트의 어떤 구현예는 비-실질 세포에 비해 간세포에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농축을 증가시킨다. 이 농축은 간세포에서 발현된 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 대해 유익하다.
어떤 구현예에서, 본원의 접합된 안티센스 화합물은 감소된 신장 노출을 야기한다. 예를 들면, 실시예 20에 나타난 바와 같이, GalNAc-함유 콘주게이트의 어떤 구현예를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도는 GalNAc-함유 콘주게이트가 없는 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 신장에서 더 낮다. 이것은 몇 개의 유익한 치료적 연루성을 갖는다. 신장에서의 활성이 추구되지 않는 치료적 징후에 대해, 신장에의 노출은 상응하는 이점 없이 신장 독성을 위태롭게 한다. 게다가, 신장의 고농도는 전형적으로 화합물의 소변으로 손실을 야기하고, 이로써 더 빠른 청소능을 얻는다. 따라서 비-신장 표적에 대해, 신장 축적은 바람직하지 않다.
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 하기 식으로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다:
Figure pct00001
여기서
A는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고;
C은 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더(tether)이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
본원의 상기 도표 및 유사한 도표에서, 분지화 그룹 "D"는 "q"에 의해 명시되는 바와 같이 (E-F) 그룹의 수를 수용하기 위해 필요한 만큼 여러 번 분기된다. 따라서, q = 1인 경우, 식은 하기와 같다:
Figure pct00002
q = 2인 경우, 식은 하기와 같다:
Figure pct00003
q = 3인 경우, 식은 하기와 같다:
Figure pct00004
q = 4인 경우, 식은 하기와 같다:
Figure pct00005
q = 5인 경우, 식은 하기와 같다:
Figure pct00006
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
Figure pct00007
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
Figure pct00008
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
Figure pct00009
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는 것으로 제공된다:
Figure pct00010
본 개시내용은 비제한적인 넘버링된 구현예를 제공한다:
특정한 변수의 1 초과 (예를 들면, 1 초과 "m" 또는 "n")를 갖는 구현예에서, 달리 지적되지 않으면, 각각의 그와 같은 특정한 변수는 독립적으로 선택된다. 따라서, 1 초과 n을 갖는 구조에 대해, 각각의 n은 선택된 독립적으로 선택되고, 이로써, 서로 동일하거나 그렇지 않을 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 5'-X를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 494372를 포함하고, 여기서 X는 GalNAc를 포함하는 콘주게이트 그룹이다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 5'-X를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 494372로 구성되고, 여기서 X는 GalNAc를 포함하는 콘주게이트 그룹이다.
Figure pct00011
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681251을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681251로 이루어진다.
Figure pct00012
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681257을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681257로 이루어진다.
Figure pct00013
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 윙의 당 모델에서 가변성을 갖는 5'-GalNA와 함께 서열번호: 58을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 윙의 당 모델에서 가변성을 갖는 5'-GalNAc와 함께 서열번호: 58을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다.
Figure pct00014
여기서 둘 중 하나의 R1은 -OCH2CH2OCH3 (MOE)이고 R2는 H이거나; 또는 R1 및 R2는 함께 브릿지를 형성하고, 여기서 R1은 -O-이고 R2는 -CH2-, -CH(CH3)-, 또는 -CH2CH2-이고, 그리고 R1 및 R2는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 브릿지는 아래로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
그리고 동일한 고리 상의 R3 및 R4의 각각의 쌍에 대해, 독립적으로 각각의 고리에 대해: 둘 중 하나의 R3은 H 및 -OCH2CH2OCH3로부터 선택되고 R4는 H이거나; 또는 R3 및 R4는 함께 브릿지를 형성하고, 여기서 R3은 -O-이고, 그리고 R4는 -CH2-, -CH(CH3)-, 또는 -CH2CH2-이고 R3 및 R4는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 브릿지는 아래로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
그리고 R5는 H 및 -CH3로부터 선택되고;
그리고 Z는 S- 및 O- 로부터 선택된다.
본 개시내용은 아래의 비제한적인 넘버링된 구현예를 제공한다:
상세한 설명
전술된 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적인 것이고 개시내용을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 여기서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않으면 복수를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않으면 "및/또는"를 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함된"의 사용은 제한적인 것이 아니다. 또한, 용어들 예컨대 "요소" 또는 "구성성분"은, 달리 구체적으로 언급되지 않으면 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 구성성분 둘 모두 및 1 초과의 서브유닛을 포함하는 요소 및 구성성분을 포함한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직상의 목적을 위한 것이고, 기재된 요지를 제한하는 것으로 해석되서는 안 된다. 특허들, 특허 출원, 규약, 서적, 및 논문을 비제한적으로 포함하는 본원에서 인용된 모든 문서, 또는 문서의 일부는, 임의의 목적을 위해 그 전체가 참고로 명확히 본원에 편입되어 있다.
A. 정의
달리 구체적인 정의가 제공되지 않으면, 본원에서 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 약효 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 그것들의 절차 및 기술은 잘 알려져 있고 당해기술에서 통상적으로 사용된 것들이다. 표준 기술 화학적 합성, 및 화학적 분석을 위해 사용될 수 있다. 어떤 그와 같은 기술 및 절차는 예를 들면 하기에서 발견될 수 있다: "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21st edition, 2005; and "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Edited by Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; and Sambrook 등, "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 이들은 임의의 목적을 위해 참고로 본원에 편입되어 있다. 허용되는 경우, 본 개시내용에서 명세서에서 언급된 모든 특허들, 적용, 공개 출원 및 다른 공보 및 다른 데이타는 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
달리 지적되지 않으면, 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다:
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오사이드"는 핵염기 모이어티 및 당 모이어티를 포함하는 화합물을 의미한다. 뉴클레오사이드는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 자연 발생 뉴클레오사이드 (DNA 및 RNA에서 발견됨) 및 변형된 뉴클레오사이드. 뉴클레오사이드는 포스페이트 모이어티에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "화학적 변형"은 자연 발생 대응물과 비교할 때 화합물에서 화학적 차이를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드의 화학적 변형은 뉴클레오사이드 변형 (당 모이어티 변형 및 핵염기 변형 포함) 및 뉴클레오사이드간 연결 변형을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드에 관하여, 화학적 변형은 핵염기 서열에서 단지 차이를 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "푸라노실"은 4 탄소 원자 및 하나의 산소 원자를 포함하는 5-원 고리를 포함하는 구조를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "자연 발생 당 모이어티"는 자연 발생 RNA에서 발견된 리보푸라노실 또는 자연 발생 DNA로서 발견된 데옥시리보푸라노실을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "당 모이어티"는 뉴클레오사이드의 자연 발생 당 모이어티 또는 변형된 당 모이어티를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 당 모이어티"는 치환된 당 모이어티 또는 당 대용물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치환된 당 모이어티"는 자연 발생 당 모이어티가 아닌 푸라노실을 의미한다. 치환된 당 모이어티는 2'-위치, 3'-위치, 5'-위치 및/또는 4'-위치에서 치환기를 포함하는 푸라노실을 비제한적으로 포함한다. 어떤 치환된 당 모이어티는 바이사이클릭 당 모이어티이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-치환된 당 모이어티"는 H 또는 OH 이외의 2'-위치에서 치환기를 포함하는 푸라노실을 의미한다. 달리 지적되지 않으면, 2'-치환된 당 모이어티는 바이사이클릭 당 모이어티가 아니다 (즉, 2'-치환된 당 모이어티의 2'-치환기는 푸라노실 고리의 또 하나의 원자에 대해 프릿지를 형성하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MOE"는 -OCH2CH2OCH3을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-F 뉴클레오사이드"는 2' 위치에서 불소를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 달리 지적되지 않으면, 2'-F 뉴클레오사이드 중 불소는 (천연 리보오스의 OH를 대체하는) 리보 위치에 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "당 대용물"은 푸라노실을 포함하지 않고 뉴클레오사이드의 자연 발생 당 모이어티를 대체할 수 있는 구조를 의미하고, 이로써 수득한 뉴클레오사이드 서브-유닛은 함께 연결될 수 있고/거나 다른 뉴클레오사이드에 연결되어 상보적 올리고머 화합물을 혼성화할 수 있는 올리고머 화합물을 형성할 수 있다. 그와 같은 구조는 푸라노실보다 상이한 원자를 포함하는 고리 (예를 들면, 4, 6, 또는 7-원 고리); 비-산소 원자 (예를 들면, 탄소, 황, 또는 질소)에 의한 푸라노실의 산소의 대체; 또는 원자의 수의 변화 및 산소의 대체 둘 모두를 포함한다. 그와 같은 구조는 치환된 당 모이어티를 대신하는 것 (예를 들면, 추가의 치환기를 임의로 포함하는 6-원 카보사이클릭 바이사이클릭 당 대용물)에 상응하는 치환을 또한 포함할 수 있다. 당 대용물은 또한 더 많은 복합 당 대체물질 (예를 들면, 펩타이드 핵산의 비-고리계)를 포함한다. 당 대용물은 비제한적으로 모폴리노, 사이클로헥세닐 및 사이클로헥시톨을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "바이사이클릭 당 모이어티"는 바이사이클릭 구조가 되는, 제 2 고리를 형성하기 위해 4 내지 7 원 고리의 2 개의 원자를 연결하는 브릿지를 포함하는 (비제한적으로 푸라노실을 포함하는) 4 내지 7 원 고리를 포함하는 변형된 당 모이어티를 의미한다. 어떤 구현예에서, 4 내지 7 원 고리는 당 고리이다. 어떤 구현예에서 4 내지 7 원 고리는 푸라노실이다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 브릿지는 푸라노실의 2'-탄소 및 4'-탄소를 연결한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵산"은 모노머 뉴클레오타이드로 구성된 분자를 의미한다. 핵산은 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 단일가닥 핵산 (ssDNA), 이중-가닥 핵산 (dsDNA), 작은 개재 리보핵산 (siRNA), 및 microRNAs (miRNA)을 포함한다. 핵산은 단일 분자에 이들 요소의 임의의 조합을 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 포스페이트 연결 그룹을 추가로 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "연결된 뉴클레오사이드"는 포스페이트 연결에 의해 연결되거나 그렇지 않을 수 있고 따라서, 비제한적으로 "연결된 뉴클레오타이드"를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "연결된 뉴클레오사이드"는 연속적 서열로 연결된 뉴클레오사이드이다 (즉 추가의 뉴클레오사이드는 연결된 것들 사이에 존재하지 않는다).
본원에서 사용된 바와 같이, "핵염기"는 올리고뉴클레오타이드에 편입될 수 있는 뉴클레오타이드를 만들기 위해 당 모이어티에 연결될 수 있는 원자의 그룹을 의미하고, 상기 원자의 그룹은 또 하나의 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산의 상보적 자연 발생 핵염기와 결합할 수 있다. 핵염기는 자연 발생일 수 있거나 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "핵염기 서열"은 임의의 당, 연결, 또는 핵염기 변형에 독립적인 인접 핵염기의 순서를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어들, "비변형된 핵염기" 또는 "자연 발생 핵염기"는 RNA 또는 DNA의 자연 발생 헤테로사이클릭 핵염기: 퓨린계 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘계 티민 (T), 시토신 (C) (5-메틸 C 포함), 및 우라실 (U)을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 핵염기"는 자연 발생 핵염기가 아닌 임의의 핵염기를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 뉴클레오사이드"는 자연 발생 RNA 또는 DNA 뉴클레오사이드와 비교하여 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 변형된 뉴클레오사이드는 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 핵염기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "바이사이클릭 뉴클레오사이드" 또는 "BNA"는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "구속된 에틸 뉴클레오사이드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "잠겨진 핵산 뉴클레오사이드" 또는 "LNA"는 4'-CH2-O-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-치환된 뉴클레오사이드"는 H 또는 OH 외에 2'-위치에서 치환기를 포함하는 뉴클레오사이드 의미한다. 달리 지적되지 않으면, 2'-치환된 뉴클레오사이드는 바이사이클릭 뉴클레오사이드가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "데옥시뉴클레오사이드"는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오사이드 (DNA)에서 발견되는 바와 같이, 2'-H 푸라노실 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 어떤 구현예에서, 2'-데옥시뉴클레오사이드는 변형된 핵염기를 포함할 수 있거나 RNA 핵염기 (예를 들면, 우라실)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오타이드"는 복수의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하는 화합물을 의미한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 1 이상의 비변형된 리보뉴클레오사이드 (RNA) 및/또는 비변형된 데옥시리보뉴클레오사이드 (DNA) 및/또는 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "올리고뉴클레오사이드"는, 뉴클레오사이드간 연결의 어떤 것도 인 원자를 함유하지 않는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오사이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 올리고뉴클레오타이드"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드 및/또는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "연결" 또는 "연결 그룹"은 원자의 2 이상의 다른 그룹과 함께 연결되는 원자의 그룹을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "뉴클레오사이드간 연결"은 올리고뉴클레오타이드에서 인접한 뉴클레오사이드 사이의 공유 결합을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "자연 발생 뉴클레오사이드간 연결"은 3' 내지 5' 포스포디에스테르 연결을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 뉴클레오사이드간 연결"은 자연 발생 뉴클레오사이드간 연결 이외의 임의의 뉴클레오사이드간 연결을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "말단 뉴클레오사이드간 연결"은 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 규정된 영역의 마지막 2 개의 뉴클레오사이드의 사이의 연결을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인 연결 그룹"은 인 원자를 포함하는 연결 그룹을 의미한다. 인 연결 그룹은 하기 식을 갖는 그룹을 비제한적으로 포함한다:
Figure pct00015
여기서:
Ra 및 Rd 각각은, 독립적으로, O, S, CH2, NH, 또는 NJ1이고 여기서 J1은 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
Rb은 O 또는 S이고;
Rc은 OH, SH, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, 아미노 또는 치환된 아미노이고; 그리고
J1은 Rb은 O 또는 S이다.
인 연결 그룹은 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로티오아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 포스포트리에스테르, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보라노포스페이트.
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오사이드간 인 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오사이드를 직접적으로 연결하는 인 연결 그룹을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-뉴클레오사이드간 인 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오사이드를 직접적으로 연결하지 않는 인 연결 그룹을 의미한다. 어떤 구현예에서, 비-뉴클레오사이드간 인 연결 그룹은 뉴클레오사이드를 뉴클레오사이드 이외의 그룹에 연결한다. 어떤 구현예에서, 비-뉴클레오사이드간 인 연결 그룹은 2 개의 그룹을 연결하고, 이것 중 어떤 것도 뉴클레오사이드가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "중성 연결 그룹"은 충전되지 않은 연결 그룹을 의미한다. 중성 연결 그룹은 비제한적으로 하기를 포함한다: 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), 아미드-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), 아미드-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), 포름아세탈 (-O-CH2-O-), 및 티오포름아세탈 (-S-CH2-O-). 추가의 중성 연결 그룹은 실록산 (디알킬실록산), 카복실레이트 에스테르, 카복사마이드, 설파이드, 설포네이트 에스테르 및 아미드를 포함하는 비이온성 연결을 포함한다 (참고 예를 들면: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi 및 P.D. Cook Eds. ACS Symposium 시리즈 580; Chapters 3 및 4, (pp. 40-65)). 추가의 중성 연결 그룹은 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 포함하는 비이온성 연결을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오사이드간 중성 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오사이드를 직접적으로 연결하는 중성 연결 그룹을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-뉴클레오사이드간 중성 연결 그룹"은 2 개의 뉴클레오사이드를 직접적으로 연결하지 않는 중성 연결 그룹을 의미한다. 어떤 구현예에서, 비-뉴클레오사이드간 중성 연결 그룹은 뉴클레오사이드를 뉴클레오사이드 이외의 그룹에 연결한다. 어떤 구현예에서, 비-뉴클레오사이드간 중성 연결 그룹은 2 개의 그룹을 연결하고, 이것 중 어떤 것도 뉴클레오사이드가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "올리고머 화합물"은 2 이상의 하부구조를 포함하는 폴리머 구조를 의미한다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물은 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물은 1 이상의 콘주게이트 그룹 및/또는 말단기를 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물은 올리고뉴클레오타이드로 구성된다. 올리고머 화합물은 또한 자연 발생 핵산을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물은 1 이상의 연결된 모노머 서브유닛의 골격을 포함하고, 여기서 각각의 연결된 모노머 서브유닛은 헤테로사이클릭 염기 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물은 헤테로사이클릭 염기 모이어티에 연결되지 않는 모노머 서스유닛을 또한 포함할 수 있고, 그렇게 함으로써 무염기성 부위를 제공한다. 어떤 구현예에서, 모노머 서브유닛, 당 모이어티 또는 대용물 및 헤테로사이클릭 염기 모이어티를 잇는 연결은 독립적으로 변형될 수 있다. 어떤 구현예에서, 헤테로사이클릭 염기를 포함할 수 있거나 그렇지 않는 연결-당 단위는, 모방체 예컨대 펩타이드 핵산 중 모노머로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "말단기"는 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단 중 하나 또는 둘 모두에 부착된 1 이상의 원자를 의미한다. 어떤 구현예에서 말단기는 콘주게이트 그룹이다. 어떤 구현예에서, 말단기는 1 이상의 말단기 뉴클레오사이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "콘주게이트" 또는 "콘주게이트 그룹"은 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고머 화합물에 결합된 원자 또는 원자의 그룹을 의미한다. 일반적으로, 콘주게이트 그룹은 약동학적, 약력학적, 결합, 흡수, 세포성 분포, 세포성 흡수, 전하 및/또는 청소능 특성을 비제한적으로 포함하는, 부착된 화합물의 1 이상의 특성을 변형시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 콘주게이트 그룹의 문맥 중 "콘주게이트 링커" 또는 "링커"는 임의의 원자 또는 원자의 그룹을 포함하고 (1) 올리고뉴클레오타이드를 콘주게이트 그룹의 또 하나의 부분 또는 (2) 콘주게이트 그룹의 2 이상의 부분에 공유 결합하는 콘주게이트 그룹의 구분을 의미한다.
콘주게이트 그룹은 올리고머 화합물 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 공유 결합을 형성하는 결합을 제공하는 라디칼로서 본원에서 보여진다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물 상의 부착점은 올리고머 화합물의 3' 말단 뉴클레오사이드의 3'-하이드록실 그룹의 3'-산소 원자이다. 어떤 구현예에서 올리고머 화합물 상의 부착점은 올리고머 화합물의 5' 말단 뉴클레오사이드의 5'-하이드록실 그룹의 5'-산소 원자이다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물에 대한 부착을 형성하는 결합은 절단가능 결합이다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 그와 같은 절단가능 결합은 절단가능 모이어티의 모두 또는 일부를 구성한다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티 (예를 들면, 절단가능 결합 또는 절단가능 뉴클레오사이드) 및 탄수화물 클러스터 부분, 예컨대 GalNAc 클러스터 부분을 포함한다. 그와 같은 탄수화물 클러스터 부분은 하기를 포함한다: 표적 모이어티, 및 임의로, 콘주게이트 링커. 어떤 구현예에서, 탄수화물 클러스터 부분은 리간드의 수 및 동일성에 의해 확인된다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 탄수화물 클러스터 부분은 3 개의 GalNAc 그룹을 포함하고 "GalNAc3"로 칭한다. 어떤 구현예에서, 탄수화물 클러스터 부분은 4 개의 GalNAc 그룹을 포함하고 "GalNAc4"로 칭한다. (구체적인 테더, 분지화 및 콘주게이트 링커 그룹을 갖는) 구체적인 탄수화물 클러스터 부분은 본원에서 기재되어 있고, 로마 숫자 그 다음 하첨자 "a"로 지정된다. 따라서 "GalNac3-1a"는 3 개의 GalNAc 그룹을 갖는 콘주게이트 그룹 및 구체적으로 확인된 테더, 분지화 및 연결 그룹의 구체적인 탄수화물 클러스터 부분을 의미한다. 그와 같은 탄수화물 클러스터 단편은 절단가능 모이어티, 예컨대 절단가능 결합 또는 절단가능 뉴클레오사이드를 통해 올리고머 화합물에 부착된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "절단가능 모이어티"는 생리적 조건 하에서 분열될 수 있는 결합 또는 그룹을 의미한다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 세포 또는 아-세포성 구획, 예컨대 용해소체 내에서 절단된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 내인성 효소, 예컨대 뉴클레아제에 의해 절단된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 1, 2, 3, 4, 또는 그 초과의 4 개의 절단가능 결합을 갖는 원자의 그룹을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "절단가능 결합"은 분열질 수 있는 임의의 화학 결합을 의미한다. 어떤 구현예에서, 절단가능 결합은 하기 중으로부터 선택된다: 아미드, 폴리아미드, 에스테르, 에테르, 포스포디에스테르의 에스테르 하나 또는 둘 모두, 포스페이트 에스테르, 카바메이트, 디-설파이드, 또는 펩타이드.
본원에서 사용된 바와 같이, "탄수화물 클러스터"는 스캐폴드 또는 링커 그룹에 부착된 1 이상의 탄수화물 잔기를 갖는 화합물을 의미한다. 예를 들면 하기 (참고: Maier 등, "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, 이것은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있음, 또는 Rensen 등, "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, 탄수화물 콘주게이트 클러스터의 예에 대해).
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 탄수화물"은 자연 발생 탄수화물에 대해 1 이상의 화학적 변형을 갖는 임의의 탄수화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "탄수화물 유도체"는 탄수화물을 개시 물질 또는 중간체로서 사용하여 합성될 수 있는 임의의 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "탄수화물"은 자연 발생 탄수화물, 변형된 탄수화물, 또는 탄수화물 유도체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "보호 그룹"은 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 화합물 또는 보호 그룹을 의미한다. 보호 그룹의 비-제한적인 예는 하기에서 발견될 수 있다: "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. 그린, P. G. M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, New York, 이것은 본원에 그 전체가 참고로 편입되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일가닥"은 그것의 보체에 대해 혼성화되지 않고 안정한 자가-듀플렉스를 형성하기 위한 충분한 자가-상보성이 없는 올리고머 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이중가닥"은 서로 혼성화된 한 쌍의 올리고머 화합물 또는 헤어핀 구조를 형성하는 단일 자가-상보적 올리고머 화합물을 의미한다. 어떤 구현예에서, 이중-가닥 올리고머 화합물은 제 1 및 제 2 올리고머 화합물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "안티센스 화합물"은, 적어도 하나의 안티센스 활성이 생기는, 혼성화할 수 있는 표적 핵산에 대해 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 적어도 부분을 포함하거나 그것으로 구성된 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "안티센스 활성"은 그것의 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 혼성화가 그 원인인 임의의 검출가능한 및/또는 측정가능한 변화를 의미한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 전사체 (예를 들면 mRNA)의 양 또는 활성의 조절을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 활성은 전-mRNA의 스플라이싱의 조절을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RNase H 기반 안티센스 화합물"이란, 안티센스 화합물을 의미하고, 여기서 안티센스 화합물의 안티센스 활성의 적어도 일부는 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 혼성화 및 RNase H에 의한 표적 핵산의 차후의 절단이 그 원인이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RISC 기반 안티센스 화합물"은 안티센스 화합물을 의미하고, 여기서 안티센스 화합물의 안티센스 활성의 적어도 일부는 RNA 유도된 사일런싱 복합체 (RISC)가 그 원인이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "검출" 또는 "측정"이란, 검출 또는 측정을 위한 시험 또는 검정이 수행된다는 것을 의미한다. 그와 같은 검출 및/또는 측정으로 값이 제로일 수 있다. 따라서, 검출 또는 측정용 시험으로 활성 없음 (활성 제로)을 발현하면, 그럼에도 불구하고 상기 활성을 검출 또는 측정하는 단계가 수행되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, "검출가능한 및/또는 측정가능한 활성"이란, 제로가 아닌 통계적으로 유의미한 활성을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "본질적으로 변하지 않는다"란, 특히 훨씬 더 변하는 또 하나의 파라미터에 대해 특정한 파라미터의 변화가 거의 없거나 없다는 것을 의미한다. 어떤 구현예에서, 파라미터는, 5% 미만 변할 때 본질적으로 변하지 않는다. 어떤 구현예에서, 파라미터는, 2-배 미만 변하지만 또 하나의 파라미터가 적어도 10-배 변한다면 본질적으로 변하지 않는다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 안티센스 활성은 표적 핵산의 양의 변화이다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 비-표적 핵산의 양은, 그것이 표적 핵산보다 훨씬 더 적게 변하지만 그 변화가 제로일 필요는 없다면, 본질적으로 변하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현"은, 유전자가 결국 단백질로 되는 과정을 의미한다. 발현은, 비제한적으로, 전사, 후-전사 변형 (예를 들면, 5'-캡의 스플라이싱, 폴리아데닐화, 부가), 및 번역을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 핵산"은, 안티센스 화합물이 원하는 안티센스 활성이 생기도록 혼성화하는 것으로 의도된 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생리적 조건 하에서 혼성화를 허용하기 위해 그것의 표적 핵산에 대해 충분한 상보성을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵염기 상보성" 또는 "상보성"은, 핵염기를 참조할 때, 또 하나의 핵염기와 염기 짝짓기할 수 있는 핵염기를 의미한다. 예를 들면, DNA에서, 아데닌 (A)은 티민 (T)에 대해 상보적이다. 예를 들면, RNA에서, 아데닌 (A)은 우라실 (U)에 대해 상보적이다. 어떤 구현예에서, 상보적 핵염기는 그것의 표적 핵산의 핵염기와 염기 짝짓기할 수 있는 안티센스 화합물의 핵염기를 의미한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 어떤 위치에 있는 핵염기가 표적 핵산의 어떤 위치에서 핵염기와 수소 결합할 수 있다면, 이때 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산 사아의 수소 결합의 위치는 핵염기쌍에서 상보적인 것으로 간주된다. 어떤 변형을 포함하는 핵염기는 대응물 핵염기와 쌍을 이루는 능력을 유지할 수 있고 따라서, 여전히 핵염기 상보성을 유지할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵염기에 관한 "비-상보적"이란, 수소 결합을 서로 형성하지 않는 한 쌍의 핵염기를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 올리고머 화합물 (예를 들면, 연결된 뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드, 또는 핵산)에 관한 "상보적"이란, 핵염기 상보성을 통해 또 하나의 올리고머 화합물 또는 그것의 영역과 혼성화하기 위한 그와 같은 올리고머 화합물 또는 그것의 영역의 용량을 의미한다. 상보적 올리고머 화합물는 각각의 뉴클레오사이드에서 핵염기 상보성을 가질 필요는 없다. 오히려, 일부 미스매치가 용인된다. 어떤 구현예에서, 상보적 올리고머 화합물 또는 영역은 핵염기의 70%에서 상보적이다 (70% 상보적). 어떤 구현예에서, 상보적 올리고머 화합물 또는 영역은 80% 상보적이다. 어떤 구현예에서, 상보적 올리고머 화합물 또는 영역은 90% 상보적이다. 어떤 구현예에서, 상보적 올리고머 화합물 또는 영역은 95% 상보적이다. 어떤 구현예에서, 상보적 올리고머 화합물 또는 영역은 100% 상보적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미스매치"는, 제 1 및 제 2 올리고머 화합물이 정렬될 때 제 2 올리고머 화합물의 상응하는 위치에서 핵염기와 짝짓기할 수 없는 제 1 올리고머 화합물의 핵염기를 의미한다. 제 1 및 제 2 올리고머 화합물 중 하나 또는 둘 모두는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "혼성화"는 상보적 올리고머 화합물 (예를 들면, 안티센스 화합물 및 그것의 표적 핵산)의 짝짓기를 의미한다. 특정한 기전에 제한되지 않으면서, 짝짓기의 가장 공통의 기전은 상보적 핵염기 사이의 왓슨-크릭, 휴그스틴 또는 역전된 휴그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 수반한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화하는"이란, 또 하나의 핵산 부위에 혼성화하는 것보다 더 큰 친화성으로 하나의 핵산 부위에 혼성화하기 위한 올리고머 화합물의 능력을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 부분에 대한"완전히 상보적"이란, 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 부분의 각각의 핵염기가 상보적 핵산 또는 그것의 인접부의 핵염기와 짝짓기할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 완전히 상보적 영역은 하나의 가닥에서 미스매치 또는 비혼성화된 핵염기를 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "퍼센트 상보성"은 표적 핵산의 동등-길이부에 대해 상보적인 올리고머 화합물의 핵염기의 백분율을 의미한다. 퍼센트 상보성은 올리고머 화합물의 총 길이로, 표적 핵산에서 상응하는 위치에서 핵염기에 대해 상보적인 올리고머 화합물의 핵염기의 수를 나누어서 계산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "퍼센트 동일성"은 제 1 핵산에서 핵염기의 총수에 의해 분할된, 제 2 핵산에서의 상응하는 위체에서 핵염기와 동일한 (화학적 변형에 독립적인) 유형인 제 1 핵산에서 핵염기의 수를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조절"은 조절 전의 분자, 기능, 또는 활성의 양 또는 품질과 비교할 때, 분자, 기능, 또는 활성의 양 또는 품질의 변화를 의미한다. 예를 들면, 조절은 유전자 발현에서 변화, 증가 (자극 또는 유도) 또는 축소감소 (억제 또는 축소)를 포함한다. 추가 예로서, 발현의 조절은 전-mRNA 처리의 스플라이스 부위 선택의 변화를 포함할 수 있고, 조절의 부재에서의 양과 비교하여 특정한 스플라이스 -변이체의 절대적인 또는 상대적인 양이 변한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "화학적 모티프"는 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 영역에서 화학적 변형의 패턴을 의미한다. 모티프는 어떤 뉴클레오사이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드의 어떤 연결 그룹에서의 변형에 의해 규정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오사이드 모티프"는 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 영역에서 뉴클레오사이드 변형의 패턴을 의미한다. 그와 같은 올리고뉴클레오타이드의 연결은 변형 또는 비변형될 수 있다. 달리 지적되지 않으면, 뉴클레오사이드를 단지 기재하는 본원의 모티프는 뉴클레오사이드 모티프인 것으로 의도된다. 따라서, 그와 같은 경우에, 연결은 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "당 모티프"는 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 영역에서 당 변형의 패턴을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "연결 모티프"는 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 영역에서 연결 변형의 패턴을 의미한다. 그와 같은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드는 변형 또는 비변형될 수 있다. 달리 지적되지 않으면, 연결을 단지 기재하는 본원의 모티프는 연결 모티프인 것으로 의도된다. 따라서, 그와 같은 경우에, 뉴클레오사이드는 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵염기 변형 모티프"는 올리고뉴클레오타이드에 따른 핵염기에 대한 변형의 패턴을 의미한다. 달리 지적되지 않으면, 핵염기 변형 모티프는 핵염기 서열에 독립적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "서열 모티프"는 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 부분을 따라 배열된 핵염기의 패턴을 의미한다. 달리 지적되지 않으면, 서열 모티프는 화학적 변형에 독립적이고 따라서 화학적 변형을 포함하지 않으면서 화학적 변형의 임의의 조합을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유형"의 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드에 관한 "변형의 유형"은 뉴클레오사이드의 화학적 변형을 의미하고 변형된 및 비변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 따라서, 달리 지적되지 않으면, "제 1 형의 변형을 갖는 뉴클레오사이드"는 비변형된 뉴클레오사이드일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "상이하게 변형된"은 변형의 부재를 포함하여, 서로 상이한 화학적 변형 또는 화학적 치환기를 의미한다. 따라서, 예를 들면, MOE 뉴클레오사이드 및 비변형된 DNA 뉴클레오사이드는, DNA 뉴클레오사이드는 비변형될지라도 "상이하게 변형"된다. 마찬가지로, DNA 및 RNA는, 둘 모두가 자연 발생 비변형된 뉴클레오사이드일지라도, "상이하게 변형"된다. 동일한하지만 상이한 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드는 상이하게 변형되지 않는다. 예를 들면, 2'-OMe 변형된 당 및 비변형된 아데닌 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드 및 2'-OMe 변형된 당 및 비변형된 티민 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드는 상이하게 변형되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "동일한 유형의 변형"은 변형의 부재를 포함하여 서로 동일한 변형을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 2 개의 비변형된 DNA 뉴클레오사이드는, DNA 뉴클레오사이드가 비변형될지라도 "동일한 유형의 변형"를 갖는다. 동일한 유형 변형을 갖는 그와 같은 뉴클레오사이드는 상이한 핵염기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "별개의 영역"는 올리고뉴클레오타이드의 부분을 의미하고, 상기 화학적 변형 또는 임의의 인접하는 구분의 화학적 변형의 모티프는 별개의 영역이 서로 구별되도록 하는 적어도 하나의 차이를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 보균자 또는 희석제"는 동물에게 투여하는데 사용하기에 적당한 임의의 물질을 의미한다. 어떤 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 보균자 또는 희석제는 멸균한 염수이다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 멸균한 염수는 약품 등급 염수이다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "대사성 장애"는 대사의 조절 장애 - 에너지를 생산하기 위해 음식의 분해와 연관된 화학 반응의 복합 세트를 주로 특징으로 하는 질환 또는 병태를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심혈관 장애"는 심장 또는 혈관의 손상된 기능을 주요하게 특징으로 하는 질환 또는 병태를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "모노 또는 폴리사이클릭 고리계"는 단일 또는 폴리사이클릭 라디칼 고리계로부터 선택된 모든 고리계를 포함하는 것을 의미하고, 상기 고리는 융합 또는 연결되고, 지방족, 지환족, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 아릴알킬, 헤테로사이클릭, 헤테로아릴, 헤테로방향족 및 헤테로아릴알킬로부터 개별적으로 선택된 단일 및 혼합된 고리계를 포함하는 것을 의미한다. 그와 같은 모노 및 폴리 고리형 구조는, 각각이 동일한 수준의 포화를 갖거나, 각각이, 독립적으로, 완전 포화된, 부분적으로 포화된 또는 완전 불포화된을 포함하는 가변 포화도를 갖는 고리를 함유할 수 있다. 각각의 고리는 C, N, O 및 S로부터 선택된 고리 원자를 포함하여 헤테로사이클릭 고리 뿐만 아니라 혼합된 모티프 예컨대 벤즈이미다졸에서 존재할 수 있는 C 고리 원자만을 포함하는 고리를 얻을 수 있고, 여기서 하나의 고리는 유일한 탄소 고리 원자를 가지며 융합 고리는 2 개의 질소 원자를 갖는다. 모노 또는 폴리사이클릭 고리계는 치환기 그룹 예컨대 고리 중의 하나에 부착된 2 =O 그룹을 갖는 프탈이미드로 추가로 치환될 수 있다. 모노 또는 폴리사이클릭 고리계는 다양한 전략을 사용하여 예컨대 직접적으로 고리 원자를 통해 모 분자에 부착될 수 있고, 다중 고리 원자를 통해, 치환기 그룹을 통해 또는 이작용성 연결 모이어티를 통해 융합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전구약물"은 불활성 이하 활성 형태의 화합물을 의미하고, 이 화합물은, 대상체에 투여될 때, 대사작용되어 활성, 또는 더 많은 활성, 화합물 (예를 들면, 약물)을 형성한다.
- 본원에서 사용된 바와 같이, "치환기" 및 "치환기 그룹"은, 명명된 모 화합물의 원자 또는 그룹을 대체하는 원자 또는 그룹을 의미한다. 예를 들면 변형된 뉴클레오사이드의 치환기는 자연 발생 뉴클레오사이드에서 발견된 원자 또는 그룹과 상이한 임의의 원자 또는 그룹이다 (예를 들면, 변형된 2'-치환기는 H 또는 OH 이외의 뉴클레오사이드의 2'-위치에 있는 임의의 원자 또는 그룹이다). 치환기 그룹은 보호 또는 비보호될 수 있다. 어떤 구현예에서, 본 개시내용의 화합물은 모 화합물의 하나 또는 하나 초과의 위치에서 치환기를 갖는다. 치환기는 또한, 다른 치환기 그룹으로 추가로 치환될 수 있고 직접적으로 또는 연결 그룹 예컨대 알킬 또는 하이드로카르빌 그룹을 통해 모 화합물에 부착될 수 있다.
마찬가지로, 본원에서 사용된 바와 같이, 화학적 관능 그룹에 관한"치환기"는 명명된 관능 그룹에 통상적으로 존재하는 원자 또는 원자의 그룹과 상이한 원자 또는 원자의 그룹을 의미한다. 어떤 구현예에서, 치환기는 관능 그룹의 수소 원자를 대체한다 (예를 들면, 어떤 구현예에서, 치환된 메틸 그룹의 치환기는 비치환된 메틸 그룹의 수소 원자 중의 하나는 대체하는 수소 이외의 원자 또는 그룹이다). 달리 지적되지 않으면, 치환기로서 잘 받아들이는 그룹은 비제한적으로, 하기를 포함한다: 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 (-C(O)Raa), 카복실 (-C(O)ORaa), 지방족 그룹, 지환족 그룹, 알콕시, 치환된 옥시 (-O-Raa), 아릴, 아랄킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 아미노 (-N(Rbb)(Rcc)), 이미노(=NRbb), 아미도 (-C(O)N(Rbb)(Rcc) 또는 -N(Rbb)C(O)Raa), 아지도 (-N3), 니트로 (-NO2), 시아노 (-CN), 카바미도 (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) 또는 -N(Rbb)C(O)ORaa), 우레이도 (-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), 티오우레이도 (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), 구아니디닐 (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), 아미디닐 (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) 또는 -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), 티올 (-SRbb), 설피닐 (-S(O)Rbb), 설포닐 (-S(O)2Rbb) 및 설폰아미딜 (-S(O)2N(Rbb)(Rcc)--또는 -N(Rbb)S(O)2Rbb).여기서 각각의 Raa, Rbb 및 Rcc는, 독립적으로, H, 임의로 연결된 화학적 관능 그룹 또는 추가 치환기 그룹이고, 바람직한 목록은 비제한적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 지방족, 알콕시, 아실, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 지환족, 헤테로사이클릭 및 헤테로아릴알킬을 포함한다. 본원에서 기재된 화합물 내의 선택된 치환기는 반복되는 정도로 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알킬"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하는 포화된 곧은 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬 그룹의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, n-헥실, 옥틸, 데실, 도데실 등. 알킬 그룹은 전형적으로 1 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 1 내지 약 12의 탄소 원자 (C1-C12 알킬)를 포함하고, 1 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알케닐"은, 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하고 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는, 곧은 또는 분지된 탄화수소 사슬 라디칼을 의미한다. 알케닐 그룹의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일, 디엔 예컨대 1,3-부타디엔 등. 알케닐 그룹은 전형적으로 2 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 2 내지 약 12의 탄소 원자를 포함하고 2 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 알케닐 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 1 이상의 추가 치환기 그룹을 임의로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알키닐"은, 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하고 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 곧은 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알키닐 그룹의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 에티닐, 1-프로피닐, 1-부티닐, 등. 알키닐 그룹은 전형적으로 2 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 2 내지 약 12의 탄소 원자를 포함하고 2 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 알키닐 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 1 이상의 추가 치환기 그룹을 임의로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아실"은, 유기산으로부터 하이드록실 그룹의 제거에 의해 형성될 라디칼을 의미하고 일반식 -C(O)-X (여기서 X은 전형적으로 지방족, 지환족 또는 방향족임)을 갖는다. 예들은 지방족 카보닐, 방향족 카보닐, 지방족 설포닐, 방향족 설피닐, 지방족 설피닐, 방향족 포스페이트, 지방족 포스페이트 등을 포함한다. 아실 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지환족"은 고리형 고리계를 의미하고, 상기 고리는 지방족이다. 고리계는 1 이상의 고리를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 하나의 고리는 지방족이다. 바람직한 지환족은 고리 중 약 5 내지 약 9 개의 탄소 원자를 갖는 고리를 포함한다. 지환족은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지방족"은 최대 24 개의 탄소 원자를 함유하는 곧은 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 의미하고, 상기 임의의 2 개의 탄소 원자 사이의 포화는 단일, 이중 또는 삼중결합이다. 지방족 그룹은 바람직하게는 1 내지 약 24 개의 탄소 원자, 더욱 전형적으로 1 내지 약 12의 탄소 원자를 함유하고, 1 내지 약 6 개의 탄소 원자가 더 바람직하다. 지방족 그룹의 곧은 또는 분지된 사슬은 질소, 산소, 황 및 인을 포함하는 1 이상의 헤테로원자로 방해될 수 있다. 헤테로원자에 의해 방해된 그와 같은 지방족 그룹은 비제한적으로, 폴리알콕시, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민, 및 폴리이민을 포함한다. 지방족 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알콕시"는 알킬 그룹과 산소 원자 사이에 형셩된 라디칼을 의미하고, 상기 산소 원자는 알콕시 그룹을 모 분자에 부착하도록 사용된다. 알콕시 그룹의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시, 네오펜톡시, n-헥소시 등. 알콕시 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노알킬"은 아미노 치환된 C1-C12 알킬 라디칼을 의미한다. 라디칼의 알킬부는 모 분자와 공유 결합을 형성한다. 아미노 그룹은 임의의 위치에 있을 수 있고 아미노알킬 그룹은 알킬 및/또는 아미노 부분에서 추가 치환기 그룹으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아랄킬" 및 "아릴알킬"은 C1-C12 알킬 라디칼에 공유 결합된 방향족 구릅을 의미한다. 수득한 아랄킬 (또는 아릴알킬) 그룹의 알킬 라디칼 부는 모 분자와 공유 결합을 형성한다. 예들은 비제한적으로, 벤질, 펜에틸 등을 포함한다. 아랄킬 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 아릴, 또는 라디칼 그룹을 형성하는 둘 모두 그룹에 부착된 추가 치환기 그룹을 임의로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아릴" 및 "방향족"은 1 이상의 방향족 고리를 갖는,모노- 또는 폴리사이클릭 카보사이클릭 고리계 라디칼을 의미한다. 아릴 그룹의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 이데닐 등. 바람직한 아릴 고리계는 1 이상의 고리 중 약 5 내지 약 20 개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "할로" 및 "할로겐"은, 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "헤테로아릴," 및 "헤테로방향족"은, 모노- 또는 폴리-고리형 방향족 고리, 고리계 또는 융합 고리계를 포함하는 라디칼을 의미하고, 여기서 고리 중 적어도 하나는 방향족이고 1 이상의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로아릴은 또한, 융합 고리 중 1 이상이 헤테로원자를 함유하지 않는 시스템을 포함하는 융합 고리계를 포함하는 것을 의미한다. 헤테로아릴 그룹은 전형적으로, 황, 질소 또는 산소로부터 선택된 하나 이상의 고리 원자를 포함한다. 헤테로아릴 그룹의 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐 등. 헤테로아릴 라디칼은 연결 모이어티 예컨대 지방족 그룹 또는 헤테로 원자를 통해 모 분자에 부착될 수 있다. 헤테로아릴 그룹은, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의로 추가 치환기 그룹을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "콘주게이트 화합물"은 임의의 원자, 원자의 그룹, 또는 콘주게이트 그룹으로서 사용하기에 적당한 연결된 원자의 그룹을 의미한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 화합물은 약동학적, 약력학적, 결합, 흡수, 세포성 분포, 세포성 흡수, 전하 및/또는 청소능 특성을 비제한적으로 포함하는 1 이상의 특성을 보유하거나 부여할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 지적되지 않으면 또는 변형된, 용어 "이중-가닥"은 서로 혼성화된 2 개의 별개의 올리고머 화합물을 의미한다. 그와 같은 이중가닥 화합물은 하나 또는 둘 모두 가닥 (오버행)의 하나 또는 둘 모두 말단에서 1 이상의 또는 비-혼성화 뉴클레오사이드 및/또는 1 이상의 내부 비-혼성화 뉴클레오사이드 (미스매치)를 가질 수 있고, 단, 생리적으로 관련된 조건 하에서 혼성화를 유지하기 위한 충분한 상보성이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "5' 표적 부위"는 표적 핵산의 뉴클레오타이드를 의미하고, 이것은 특정한 안티센스 화합물의 5'-최말단 뉴클레오타이드에 대해 상보적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약"은 값의 ±10% 내인 것을 의미한다. 예를 들면, 언급된다면, "마커는 약 50%까지 증가될 수 있다"는, 마커가 45% 내지 55%로 증가될 수 있다는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, "동시에 투여된"은 둘 모두의 약리적 효과가 동시에 환자에서 나타나는 임의의 방식으로 2 종의 제제의 공-투여를 의미한다. 수반되는 투여는, 둘 제제가 단일 약제학적 조성물에서, 동일한 복용 형태로, 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여되는 것을 요구하지는 않는다. 둘 제제 모두의 효과는 동시에 자체로 나타날 필요는 없다. 효과는 일정 기간 동안 단지 중첩될 필요는 있고 동일한 시(공)간에 걸칠 필요는 없다.
본원에서 사용된 바와 같이, "투여하는" 또는 "투여"는 약제를 개체에게 제공하는 것을 의미하고 의료 전문가에 의한 투여 및 자가-투여를 비제한적으로 포함한다. 약제의 개체에의 투여는 연속적, 만성적, 짧은 또는 간헐적일 수 있다. 투여는 비경구 또는 비-비경구일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제제"는 포유동물에게 투여될 때 치료적 이점을 제공할 수 있는 활성 물질을 의미한다. "제 1 제제"는 본 발명의 치료적 화합물을 의미한다. 예를 들면, 제 1 제제는 apo(a)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. "제 2 제제"는 본 발명의 제 2 치료적 화합물 (예를 들면 apo(a)를 표적으로 하는 제 2 안티센스 올리고뉴클레오타이드) 및/또는 비-apo(a) 치료적 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개선" 또는 "개선한다" 또는 "개선하는"은 연관된 질환, 장애, 또는 병태의 적어도 하나의 인디케이터, 징후, 또는 증상의 완화를 의미한다. 인디케이터의 중증도는 당해분야의 숙련가에게 공지된 주관적 또는 객관적인 방안에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "동물"은 인간 또는 비-인간 동물을 의미하고, 이 동물은, 비제한적으로, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 및 원숭이 및 침팬지를 비제한적으로 포함하는 비-인간 영장류를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "apo(a)"는 apo(a)를 인코딩하는 임의의 핵산 또는 단백질 서열을 의미한다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, apo(a)는 Apo(a)를 인코딩하는 DNA 서열, Apo(a)를 인코딩하는 DNA로부터 전사된 RNA 서열 (인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 DNA를 포함함), apo(a)를 인코딩하는 mRNA 서열, 또는 apo(a)를 인코딩하는 펩타이드 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "apo(a) 핵산"은 apo(a)를 인코딩하는 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, apo(a) 핵산은 Apo(a)를 인코딩하는 DNA 서열, Apo(a)를 인코딩하는 DNA로부터 전사된 RNA 서열 (인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 DNA를 포함함), 및 apo(a)를 인코딩하는 mRNA 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "apo(a) mRNA"는 apo(a) 단백질을 인코딩하는 mRNA를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "apo(a) 단백질"은 Apo(a)를 인코딩하는 임의의 단백질 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "apo(a) 특이적 억제제"는 apo(a) 핵산 및/또는 apo(a) 단백질의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 임의의 제제를 의미한다. 예를 들면, apo(a) 특이적 억제제는 핵산 (안티센스 화합물 포함), 펩타이드, 항체, 소분자, 및 apo(a) 핵산 및/또는 apo(a) 단백질의 발현을 억제할 수 있는 다른 제제를 포함한다. 어떤 구현예에서, apo(a) 핵산 발현 및/또는 apo(a) 단백질 발현을 특이적으로 조절하여, apo(a) 특이적 억제제는 다운스트림 구성성분을 포함하는 지질 수송 시스템의 다른 구성성분에 영향을 미칠 수 있다. 유사하게, 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 동물에서 다른 분자 과정에 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "죽상동맥경화증"은, 큰 및 중간-크기의 동맥에 영향을 미치는 동맥의 경화가 지방 축적의 존재를 특징으로 한다는 것을 의미한다. 지방 축적은 "죽종" 또는 "플라크"로 불리고, 이것은 콜레스테롤 및 다른 지방, 칼슘 및 반흔 조직으로 주로 구성되고, 동맥의 라이닝을 손상시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, "관상동맥 심장병 (CHD)"는, 종종 죽상동맥경화증의 결과인, 혈액 및 산소를 심장에 공급하는 작은 혈괄의 협소화를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "진성 당뇨병" 또는 "당뇨병"은 무질서한 대사 및 불충분한 수준의 인슐린 또는 감소된 인슐린 민감도로부터 야기된 비정상적인 고혈당 (고혈당증)을 특징으로 하는 증후군을 의미한다. 특징적인 증상은 고혈당 수준으로 인한 과도한 소변 생산 (다뇨증), 증가된 배뇨를 보충하려고 하는 과도한 갈증 및 증가된 수분 섭취 (조갈증), 눈의 광학에 대한 고혈당 영향으로 인한 흐릿한 시력, 원인불명 체중 감소, 및 무기력이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "당뇨병성 이상지질혈증" 또는 "이상지질혈증을 갖는 2형 당뇨병"은 2형 당뇨병, 감소된 HDL-C, 상승된 트리글리세라이드 (TG), 및 상승된 작은, 조밀한 LDL 입자를 특징으로 하는 병태를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "희석제"는 약리적 활성은 없지만 약제학적으로 필요한 또는 바람직한 조성물 중 성분을 의미한다. 예를 들면, 주입된 조성물 중 희석제는 액체, 예를 들면 염수 용액일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이상지질혈증"은 지질 및/또는 지질단백질 과잉생산 또는 결핍을 포함하는, 지질 및/또는 지질단백질 대사의 장애를 의미한다. 이상지질혈증은 지질 예컨대 카일로마이크론, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 뿐만 아니라 지질단백질 예컨대 저-밀도 지질단백질 (LDL) 콜레스테롤의 상승에 의해 명시될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "복용량 단위"는 약제가 제공된 형태, 예를 들면 알약, 정제, 또는 당해기술에서 공지된 다른 복용량 단위를 의미한다. 어떤 구현예에서, 복용량 단위는 동결건조된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 바이알이다. 어떤 구현예에서, 복용량 단위는 재구성된 안티센스 올리고뉴클레오타이드을 함유하는 바이알이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "용량"은 단일 투여로, 또는 명시된 기간 내에 제공된 약제의 명시된 양을 의미한다. 어떤 구현예에서, 용량은 1, 2, 또는 초과의 볼러스, 정제, 또는 주사로 투여될 수 있다. 예를 들면, 어떤 구현예에서 피하 투여를 원하면, 원하는 용량은 단일 주사에 의해 쉽게 수용되지 않는 용적을 필요로 하고, 따라서, 2 이상의 주사가 사용되어 원하는 용량을 달성할 수 있다. 어떤 구현예에서, 약제는 장시간에 걸쳐 또는 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 용량은 시간, 일, 주, 또는 개월 당 약제의 양으로서 언급될 수 있다. 용량은 mg/kg 또는 g/kg로서 또한 언급될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "효과적인 양" 또는 "치료적으로 효과적인 양"은 제제가 필요한 개체에서 원하는 생리적 결과를 유발하는데 충분한 활성 약제의 양을 의미한다. 효과적인 양은 치료될 개체의 건강 및 신체 조건, 치료될 개체의 분류학적 그룹, 조성물의 제형, 개체의 질병의 평가, 및 다른 관련된 인자에 따라 개체 중에서 변할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "완전히 상보적" 또는 "100% 상보적"이란, 제 1 핵산의 핵염기 서열의 각각의 핵염기가 제 2 핵산의 제 2 핵염기 서열에서 상보적 핵염기를 갖는다는 것을 의미한다. 어떤 구현예에서, 제 1 핵산은 안티센스 화합물이고 제 2 핵산은 표적 핵산이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "글루코오스"는 에너지의 공급원 및 염증성 중간체로서 세포에 의해 사용된 모노사카라이드이다. "혈장 글루코스"는 혈장에 존재하는 글루코오스를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "고밀도 지질단백질-C" 또는 "HDL-C"는 고밀도 지질단백질 입자와 연관된 콜레스테롤을 의미한다. 혈청 (또는 혈장) 중 HDL-C의 농도는 전형적으로 mg/dL 또는 nmol/L로 정량화된다. "혈청 HDL-C" 및 "혈장 HDL-C"는 혈청 및 혈장 각각에서 HDL-C를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "HMG-CoA 환원효소 억제제"는 효소 HMG-CoA 환원효소의 억제를 통해 작용하는 제제, 예컨대 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 및 심바스타틴을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "고콜레스테롤혈증"은 하기의 지침에 따라, 상승된 콜레스테롤 또는 순환 (혈장) 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 VLDL-콜레스테롤을 특징으로 하는 병태를 의미한다: Expert Panel Report of National Cholesterol Educational Program (NCEP) of Detection, Evaluation of Treatment of high cholesterol in adults (참고, Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
본원에서 사용된 바와 같이, "고지혈증" 또는 "고지방혈증"은 상승된 혈청 지질 또는 순환 (혈장) 지질을 특징으로 하는 병태이다. 이러한 병태는 비정상적으로 고농도인 지방을 나타낸다. 순환 혈액 중 지질 분획은 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질, 초저밀도 지질단백질, 카일로마이크론 및 트리글리세라이드이다. 고지혈증의 프레드릭슨 분류는 전기영동 또는 초원심분리에 의해 측정된 바와 같이 TG 및 콜레스테롤-풍부 지질단백질 입자의 패턴을 기반으로 하고, 고지혈증 예컨대 초고트리글리세라이드혈증의 일차 원인을 특성화하기 위해 통상적으로 사용된다 (Fredrickson 및 Lee, Circulation, 1965, 31:321-327; 프레드릭슨 등, New Eng J Med, 1967, 276 (1): 34-42).
본원에서 사용된 바와 같이, "초고트리글리세라이드혈증"은 상승된 트리글리세라이드 수준을 특징으로 하는 병태를 의미한다. 그것의 병인은 하기를 포함한다: 일차 (즉 유전적 원인) 및 2차 (다른 근본적인 원인 예컨대 당뇨병, 대사성 증후군/인슐린 저항성, 비만, 신체적 불활성, 담배 흡연, 과잉의 알코올 및 탄수화물이 매우 높은 다이어트) 인자, 또는 가장 자주, 둘 모두의 조합 (Yuan 등 CMAJ, 2007, 176:1113-1120).
본원에서 사용된 바와 같이, "확인하는" 또는 "대사성 또는 심혈관 질환이 있는 동물을 선택하는"은 대사성 질환, 심혈관 질환, 또는 대사성 증후군에 걸리기 쉽거나 그것으로 진단된 대상체를 확인 또는 선택하고 또는, 하기를 비제한적으로 포함하는 대사성 질환, 심혈관 질환, 또는 대사성 증후군 중 임의의 증상을 갖는 대상체를 확인 또는 선택하는 것을 의미한다: 고콜레스테롤혈증, 고혈당증, 고지혈증, 초고트리글리세라이드혈증, 고혈압 증가된 인슐린 저항성, 줄어든 인슐린 민감도, 정상 체중 초과, 및/또는 정상 체지방 함량 초과 또는 이들의 임의의 조합. 그와 같은 확인은 하기를 비제한적으로 포함하는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다: 표준 임상 시험 또는 평가, 예컨대 혈청 또는 순환 (혈장) 콜레스테롤의 측정, 혈청 또는 순환 (혈장) 혈액-글루코오스의 측정, 혈청 또는 순환 (혈장) 트리글리세라이드의 측정, 혈압의 측정, 체지방 함량의 측정, 체중의 측정, 등.
본원에서 사용된 바와 같이, "개선된 심혈관 결과"는 부정적인 심혈관 사건의 발생, 또는 그것의 위험의 감소를 의미한다. 부정적인 심혈관 사건의 예는, 비제한적으로, 사망, 재경색, 뇌졸중, 심장성 충격, 폐 부종, 심장정지, 및 심방 율동부정을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "바로 인접한"은, 바로 인접한 요소 사이, 예를 들면, 영역, 분절, 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오사이드 사이에 개재 요소가 없다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "HDL 증가" 또는 "HDL 상승"은 임의의 화합물이 투여되지 않은 동물에서 HDL 수준과 비교하여, 본 발명의 적어도 하나의 화합물의 투여 후 동물에서 HDL의 수준의 증가를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개체" 또는 "대상체" 또는 "동물"은 치료 또는 요법에 대해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "그것이 필요한 개체"는 그와 같은 치료 또는 요법이 필요한, 치료 또는 요법에 대해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유도하다", "억제하다", "강력하게 하다", "상승시키다", "증가시키다", "줄이다", "감소시키다" 등은 2 개의 상태 사이의 정량적 차이를 나타낸다. 예를 들면, "apo(a)의 활성 또는 발현을 억제하는데 효과적인 양"은 처리된 샘플 중 apo(a)의 활성 또는 발현의 수준이 미처리된 샘플 중 apo(a) 활성 또는 발현의 수준과 상이할 것이라는 것을 의미한다. 그와 같은 용어들은, 예를 들면, 발현의 수준, 및 활성의 수준에 적용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "염증성 병태"는 질환, 질환 상태, 증후군, 또는 염증을 야기하는 다른 병태를 의미한다. 예를 들면, 류마티스성 관절염 및 간 섬유증은 염증성 병태이다. 염증성 병태의 다른 예는 패혈증, 심근 허혈/재관류 손상, 성인 호흡기 곤란 증후군, 신염, 이식 거부, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 동맥경화증, 죽상동맥경화증 및 혈관염을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현 또는 활성을 억제하는"은 RNA 또는 단백질의 발현 또는 활성의 감소 또는 봉쇄를 의미하고 반드시 발현 또는 활성의 전체 제거를 나타내는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인슐린 저항성"은 정상적인 양의 인슐린이 지방, 근육 및 간 세포로부터 정상 인슐린 반응을 생산하는데 부적절한 상태로서 규정된다. 지장 세포에서의 인슐린 저항성은 보관된 트리글리세라이드의 가수분해를 야기하고, 이것은 혈당에서 유리 지방산을 상승시킨다. 근육 중 인슐린 저항성은 글루코오스 흡수를 감소시키고, 반면에 간에서의 인슐린 저항성은 글루코오스 저장을 감소시키고, 이들 둘 모두의 효과는 혈당을 상승시키는데 기여한다. 인슐린 저항성으로 인한 높은 혈장 수준의 인슐린 및 글루코오스는 종종 대사성 증후군 및 2형 당뇨병을 초래한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인슐린 민감도"는 개체가 어떻게 글루코오스를 효과적으로 처리하는 지에 대한 측정이다. 높은 인슐린 민감도를 갖는 개체는 효과적으로 글루코오스를 처리하고 반면에 낮은 인슐린 민감도를 갖는 개체는 효과적으로 글루코오스를 처리하지 못한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지질-저하"는 대상체에서 1 이상의 지질 (예를 들면, LDL, VLDL)의 감소를 의미한다. "지질-상승"은 대상체에서 지질 (예를 들면, HDL)의 상승을 의미한다. 지질-저하 또는 지질-상승은 1 이상의 용량으로 경시적으로 일어날 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지질-저하 치료" 또는 "지질 저하제"는 대상체에서 1 이상의 지질을 감소시키기 위해 대상체에게 제공된 치료적 레지멘을 의미한다. 어떤 구현예에서, 지질-저하 치료는 대상체에서 apo(a), CETP, apoB, 총 콜레스테롤, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, 비-HDL-C, 트리글리세라이드, 작은 조밀한 LDL 입자, 및 Lp(a) 중 하나 이상을 감소시키기 위해 제공된다. 지질-저하 치료제의 예는, 비제한적으로, apoB 억제제, 스타틴, 피브레이트 및 MTP 억제제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지질단백질", 예컨대 VLDL, LDL 및 HDL은, 혈청, 혈장 및 림프에서 발견되는 단백질의 그룹을 의미하고 지질 수송을 위해 중요하다. 각각의 지질단백질의 화학 조성은, 예를 들면, HDL은 높은 비율의 단백질 대 지질을 가지며, 반면에 VLDL은 낮은 비율의 단백질 대 지질을 갖는다는 점에서 상이하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Lp(a)"는 apo(a) 및 LDL 예컨대 apoB를 함유하는 입자를 포함한다. apo(a)는 디설파이드 결합에 의해 apoB에 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "저밀도 지질단백질-콜레스테롤 (LDL-C)"는 저밀도 지질단백질 입자에서 운반된 콜레스테롤을 의미한다. 혈청 (또는 혈장)에서의 LDL-C의 농도는 전형적으로 mg/dL 또는 nmol/L로 정량화된다. "혈청 LDL-C" 및 "혈장 LDL-C"는 혈청 및 혈장 각각에서 LDL-C를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주요 위험 인자"는 특정한 질환 또는 병태에 대한 고위험에 기여하는 인자를 의미한다. 어떤 구현예에서, 관상동맥 심장병에 대한 주요 위험 인자는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 담배 흡연, 고혈압, 높은 LDL, 낮은 HDL-C, 관상동맥 심장병의 가족력, 연령, 및 본원에서 개시된 다른 인자.
본원에서 사용된 바와 같이, "대사성 장애" 또는 "대사성 질환"은 대사성 기능의 변경 또는 방해를 특징으로 하는 병태를 의미한다. "대사성" 및 "대사"는 당해기술에서 잘 알려진 용어들이고 일반적으로 살아있는 유기체 내에서 일어나는 생화학적 과정의 전체 범위를 포함한다. 대사성 장애는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 고혈당증, 전당뇨병, 당뇨병 (유형 1 및 2형), 비만, 인슐린 저항성, 대사성 증후군 및 2형 당뇨병으로 인한 이상지질혈증.
본원에서 사용된 바와 같이, "대사성 증후군"은 대상 기원의 지질 및 비-지질 심혈관 위험 인자의 군집화를 특징으로 하는 병태를 의미한다. 어떤 구현예에서, 대사성 증후군은 아래 인자 중 임의의 3 개에 의해 확인된다: 남성 102 cm 초과 또는 여성 88 cm 초과의 허리 둘레; 적어도 150 mg/dL의 혈청 트리글리세라이드; 남성에서는 40 mg/dL 또는 여성에서는 50 mg/dL 미만의 HDL-C; 적어도 130/85 mmHg의 혈압; 및 적어도 110 mg/dL의 공복 혈당. 이들 결정요인은 임상 실시예서 쉽게 측정될 수 있다 (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).
"비경구 투여"는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 또는 두개내 투여, 예를 들면 척추강내 또는 뇌심실내 투여를 포함한다. 투여는 연속적, 만성적, 짧은 또는 간헐적일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "펩타이드"는 아미드 결합에 의해 적어도 2 개의 아미노산을 연결하여 형성된 분자를 의미한다. 펩타이드는 폴리펩타이드 및 단백질을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제"는 개체에게 투여될 때 치료적 이점을 제공하는 물질을 의미한다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, apo(a)에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약제이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적 조성물" 또는 "조성물"은 개체에게 투여하기에 적합한 물질의 혼합물을 의미한다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 1 이상의 활성제 및 약제학적 담체 예를 들면, 멸균한 수용액을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 유도체"는 본원에서 기재된 화합물의 유도체 예컨대 용매화물, 수화물, 에스테르, 전구약물, 다형체, 이성질체, 동위원소로 라벨링된 변이체, 약제학적으로 허용가능한 염 및 당해기술에서 공지된 다른 유도체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염"은 안티센스 화합물의 생리적으로 및 약제학적으로 허용가능한 염, 즉, 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 원하지 않는 독물학적 효과를 그것에 부여하지 않는 염을 의미한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 염" 또는 "염"은 무기 또는 유기 산 및 염기를 포함하는, 약제학적으로 허용가능한 비독성 산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 본원에서 기재된 화합물의 "약제학적으로 허용가능한 염"은 당해기술에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염의 검토에 대해, 참고 Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002). 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 나트륨 염은 유용하고 인간에 대한 치료적 투여를 위해 잘 허용된다. 따라서, 일 구현예에서 본원에서 기재된 화합물은 나트륨 염의 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부분"은 핵산의 인접 (즉 연결된) 핵염기의 규정된 수를 의미한다. 어떤 구현예에서, 구분은 표적 핵산의 인접 핵염기의 규정된 수이다. 어떤 구현예에서, 부분은 안티센스 화합물의 인접 핵염기의 규정된 수를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방한다" 또는 "예방하는"은 극히 작은 시간으로부터 규정되지 않은 시간 동안 질환, 장애, 또는 병태의 개시 또는 발달을 지연 또는 예방하는 것을 의미한다. 예방한다란 또한 질환, 장애, 또는 병태를 발달시킬 위험을 감소시킨다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "상승"은 양의 증가를 의미한다. 예를 들면, 혈장 HDL 수준의 상승은 혈장 중 HDL 양의 증가를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "감소"는 더 작은 정도로, 크기, 양 또는 수를 낮추는 것을 의미한다. 예를 들면, 혈장 트리글리세라이드 수준의 감소는 혈장 중 트리글리세라이드의 양을 낮추는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "영역" 또는 "표적 영역"은 적어도 하나의 확인가능한 구조, 기능, 또는 특징을 갖는 표적 핵산의 부분으로서 규정된다. 예를 들면, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 접합, 코딩 영역, 번역 개시 영역, 번역 종료 영역, 또는 다른 규정된 핵산 영역을 포함할 수 있다. apo(a)에 대한 구조적으로 규정된 영역은 서열 데이타베이스 예컨대 NCBI로부터 수납 번호에 의해 수득될 수 있고 그와 같은 정보는 본원에 참고로 편입되어 있다. 어떤 구현예에서, 표적 영역은 표적 영역 내의 하나의 표적 분절의 5' 표적 부위로부터 표적 영역 내의 또 하나의 표적 분절의 3' 표적 부위로의 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제 2 제제" 또는 "제 2 치료제"는 "제 1 제제"와 함께 사용될 수 있는 제제를 의미한다. 제 2 치료제는, 비제한적으로, apo(a) 또는 apoB를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제 2 제제는 항- apo(a) 항체, apo(a) 펩타이드 억제제, 콜레스테롤 저하제, 지질 저하제, 글루코오스 저하제 및 항-염증제를 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "분절"은 핵산 내의 영역의 더 작은, 하위-부분으로서 규정된다. 예를 들면, "표적 분절"은, 1 이상의 안티센스 화합물이 표적화된 표적 핵산의 뉴클레오타이드의 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 분절의 5'-최말단 뉴클레오타이드를 의미한다. "3' 표적 부위"는 표적 분절의 3'-최말단 뉴클레오타이드를 의미한다. 대안적으로, "개시 부위"는 표적 분절의 5'-최말단 뉴클레오타이드를 의미할 수 있고 "중단 부위"는 표적 분절의 3'-최말단 뉴클레오타이드를 의미한다. 표적 분절은 또한, 하나의 서열의 "개시 부위"에서 시작하고 또 하나의 서열의 "중단 부위"에서 종료될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "스타틴"은 HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하는 제제를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "피하 투여"는 피부 바로 아래의 투여를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"는 치료 또는 요법에 대해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "심혈관 질환 또는 장애의 증상"은 심혈관 질환 또는 장애로부터 생기고 그것을 수반하며 그것의 조짐으로서 쓰이는 현상을 의미한다. 예를 들면, 협심증; 가슴 통증; 숨가쁨; 심계항진; 약화; 현기증; 메스꺼움; 땀흘리기; 빈맥; 서맥; 부정맥; 심방세동; 하지의 팽윤; 청색증; 피로; 실신; 얼굴의 저림; 팔다리의 저림; 근육의 파행 또는 경련; 복부 팽만; 또는 열병은 심혈관 질환 또는 장애의 증상이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적으로 하는" 또는 "표적화된"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하고 원하는 효과를 유도하는 안티센스 화합물의 설계 및 선택의 과정을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료적으로 효과적인 양"은 치료적 이점을 개체에게 제공하는 약제의 양을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 생활방식 변화"는 낮은 지방/지방 조직 질량 및/또는 콜레스테롤에 대해 의도된 식이 및 생활방식 변화를 의미한다. 그와 같은 변화는 심장병을 발달시킬 위험을 감소시킬 수 있고, 총 매일 칼로리, 총 지방, 포화된 지방, 다중불포화된 지방, 모노불포화된 지방, 탄수화물, 단백질, 콜레스테롤, 불용성 섬유의 식이 섭취에 대한 권고, 뿐만 아니라 신체 활동에 대한 권고를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료한다" 또는 "치료하는"은 본원에서 기재된 화합물을 투여하여 질환, 장애, 또는 병태의 변경 또는 개선에 영향을 주는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "트리글리세라이드" 또는 "TG"는 3 개의 지방산 분자와 조합된 글리세롤로 이루어진 지질 또는 중성 지방을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2형 당뇨병," ("2형 진성 당뇨병", "진성 당뇨병, 2형", "비-인슐린-의존적 당뇨병", "NIDDM", "비만 관련된 당뇨병", 또는 "성인형 당뇨병"로도 공지됨)는 인슐린 저항성, 상대적 인슐린 결핍, 및 고혈당증을 주로 특징으로 하는 대사성 장애이다.
어떤 구현예
어떤 구현예에서, 본 화합물은 당해기술에서 공지된 아포지질단백질(a) (apo(a))에 대해 표적화된 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹을 포함한다. 콘주게이션에 적합한 apo(a)에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 예는 하기에서 개시된 것들을 비제한적으로 포함한다: WO 2013/177468; US 8,673,632; US 7,259,150; 및 US 특허 출원 공보 번호 US 2004/0242516; 이들은 그 전체가 본원에 참고로 편입되어 있다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 WO 2013/177468에서 개시된 서열번호 12-130, 133, 134 중 임의의 것의 핵염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 US 8,673,632에서 개시된 서열번호 11-45 및 85-96 중 임의의 것의 핵염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 US 7,259,150에서 개시된 서열번호 11-45 중 임의의 것의 핵염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 US 특허 출원 공보 번호 US 2004/0242516에서 개시된 서열번호 7-41 중 임의의 것의 핵염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹을 포함한다. 모든 상기 언급된 참조된 서열번호의 핵염기 서열은 본원에 참고로 편입되어 있다.
어떤 구현예는 apo(a) mRNA 및 단백질 발현을 감소시키는 화합물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 apo(a) 연관된 질환을 치료, 예방, 또는 개선하기 위한 apo(a) 특이적 억제제이다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 apo(a)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 apo(a)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹이다.
어떤 구현예는 Lp(a) 수준을 감소시키는 화합물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 Lp(a) 연관된 질환을 치료, 예방, 또는 개선하기 위한 apo(a) 특이적 억제제이다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 apo(a)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 어떤 구현예에서, 본 화합물은 apo(a)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 13 내지 25, 14 내지 25, 15 내지 25 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29 또는 30 개의 연결된 뉴클레오사이드르르 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 1-4의 임의의 것의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함한다.
어떤 구현예는 apo(a) 분절을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 실시예 114 및 117에서 보여진 표적 분절의 임의의 것의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함한다. 표에서, "개시 부위"는 표적 분절의 5'-최말단 뉴클레오타이드를 의미하고 "중단 부위"는 표적 분절의 3'-최말단 뉴클레오타이드를 의미한다. 표적 분절은 표에서 열거된 각각의 서열의 개시 부위로부터 중단 부위의 범위일 수 있다. 대안적으로, 표적 분절은 하나의 서열의 개시 부위 범위로부터 또 하나의 서열의 중단 부위에서 종료할 수 있다. 예를 들면, 표 125에서 보여진 바와 같이, 표적 분절은 3901-3920, 서열번호: 58의 개시 부위로부터 중단 부위의 범위일 수 있다. 또 하나의 예에서, 표 125에서 보여진 바와 같이, 표적 분절은 3900-3923, 서열번호: 57의 개시 부위로부터 서열번호: 61의 중단 부위까지의 범위일 수 있다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호: 1-4의 임의의 것에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 상보적이다. 어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 예를 들면, 실시예 114 및 117에서 보여진 표적 분절 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 상보적이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 1의 핵염기 3901 내지 3920의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기의 일부를 포함하는 핵염기 서열을 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호: 1에 대해 적어도 80% 상보적이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 1의 핵염기 3900 내지 3923의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29 또는 30 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호: 1에 대해 적어도 80% 상보적이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 12-130, 133, 134의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 12-130, 133, 134의 핵염기 서열 중 임의의 하나의 적어도 8 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 12-130, 133, 134 중 임의의 하나 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 12-20, 22-33, 35-44, 47-50, 51, 53, 57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 12-20, 22-33, 35-44, 47-50, 51, 53, 57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134의 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 12-19, 26-30, 32, 35, 38-44, 46-47, 50, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 12-19, 26-30, 32, 35, 38-44, 46-47, 50, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110의 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 111, 114-121, 123-129의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 111, 114-121, 123-129의 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 14, 17, 18, 26-28, 39, 71, 106-107의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 14, 17, 18, 26-28, 39, 71, 106-107 중 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 14, 26-29, 39-40, 82의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 14, 26-29, 39-40, 82 중 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 14, 16-18의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 14, 16-18의 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 26-27, 107의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 26-27, 107의 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 28-29, 39-40, 47의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 28-29, 39-40, 47의 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 28, 93, 104, 134의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 28, 93, 104, 134의 임의의 핵염기 서열 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 58의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 58의 핵염기 서열 중 적어도 8 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 서열번호: 58 및 콘주게이트 그룹으로 이루어진다.
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 5'-X를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 494372를 포함하고, 여기서 X는 GalNAc를 포함하는 콘주게이트 그룹이다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 5'-X를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 494372로 구성되고, 여기서 X는 GalNAc를 포함하는 콘주게이트 그룹이다.
Figure pct00016
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681251을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681251로 이루어진다.
Figure pct00017
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681257을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 접합된 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 681257로 이루어진다.
Figure pct00018
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 아래 구조로 나타낸 접합된 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 서열번호: 58의 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를, 윙의 당 모델에서 가변성을 갖는 5'-GalNAc와 함께 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 윙의 당 모델에서 가변성을 갖는 5'-GalNAc와 함께 서열번호: 58의 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드으로 이루어진다.
Figure pct00019
여기서 둘 중 하나의 R1은 -OCH2CH2OCH3 (MOE)이고 R2는 H이거나; 또는 R1 및 R2는 함께 브릿지를 형성하고, 여기서 R1은 -O-이고 R2는 -CH2-, -CH(CH3)-, 또는 -CH2CH2-이고, 그리고 R1 및 R2는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 브릿지는 아래로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
그리고 동일한 고리 상의 R3 및 R4의 각각의 쌍에 대해, 독립적으로 각각의 고리에 대해: 둘 중 하나의 R3은 H 및 -OCH2CH2OCH3로부터 선택되고 R4는 H이거나; 또는 R3 및 R4는 함께 브릿지를 형성하고, 여기서 R3은 -O-이고, 그리고 R4는 -CH2-, -CH(CH3)-, 또는 -CH2CH2-이고 R3 및 R4는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 브릿지는 아래로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
그리고 R5는 H 및 -CH3로부터 선택되고;
그리고 Z는 S- 및 O-로부터 선택된다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 단일가닥이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 변형된 뉴클레오사이드간 연결이다. 어떤 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결이다. 어떤 구현예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10 개의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결이다. 어떤 구현예에서, 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결이다. 어떤 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10 개의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 및 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결로부터 선택된다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 핵염기를 포함한다. 어떤 구현예에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 변형된 당을 포함한다. 어떤 구현예에서, 변형된 당은 바이사이클릭 당이다. 어떤 구현예에서, 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸, 구속된 에틸, 3'-플루오로-HNA 또는 4' (CH2)n-O-2' 브릿지를 포함하고, 여기서 n은 1 또는 2이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 아래를 포함한다: (a) 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절; (b) 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절; (c) 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절; 및상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함한다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고는 아래를 포함한다: (a) 10 개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절; (b) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절; (c) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절; 및상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고 여기서 각각의 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 12-130, 133, 134의 임의의 것의 적어도 8 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 가지며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 아래를 포함한다: (a) 10 개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절; (b) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절; (c) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절; 및상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고 여기서 각각의 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 포함하는 화합물을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 58의 적어도 8 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 가지며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 아래를 포함한다: (a) 10 개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절; (b) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절; (c) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절; 및상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고 여기서 각각의 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
어떤 구현예는 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹을 제공하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 58의 핵염기 서열을 갖는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 아래를 포함한다: (a) 10 개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절; (b) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절; (c) 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절; 및상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고 여기서 각각의 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 변형된 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 변형된 올리고뉴클레오타이드에 연결된다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 변형된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 변형된 올리고뉴클레오타이드에 연결된다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 1 이상의 리간드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 2 이상의 리간드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 3 개 이상의 리간드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 3 개의 리간드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 아래 중으로부터 선택된다: 다당류, 변형된 다당류, 만노스, 갈락토오스, 만노스 유도체, 갈락토오스 유도체, D-만노파이라노스, L-만노파이라노스, D-아라비노오스, L-갈락토오스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코오스, L-글루코오스, D-갈락토오스, L-갈락토오스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노파이라노스, β-D-만노파이라노스, α-D-글루코파이라노스, β-D-글루코파이라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프룩토푸라노스, α-D-프룩토파이라노스, α-D-갈락토파이라노스, β-D-갈락토파이라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, α-D-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코파이라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코파이라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노파이라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코파이라노스, N-글라이콜로일-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코파이라노스, 메틸 2,3,4-트리-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토파이라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코-헵토피라노사이드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스, L-4-티오리보오스. 어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 N-아세틸 갈락토사민이다.
어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 N-아세틸 갈락토사민이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00020
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00021
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00022
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00023
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00024
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹 중 적어도 하나를 포함한다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래 중으로부터 선택된 구조를 포함한다:
Figure pct00025
Figure pct00026
및
Figure pct00027
Figure pct00028
여기서 n은 1 내지 12이고; 그리고
여기서 m은 1 내지 12이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는 테더를 갖는다:
Figure pct00029
및
Figure pct00030
여기서 L은 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹이고;
Z1은 C(=O)O-R2이고;
Z2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
R2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고; 그리고
각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는 테더를 갖는다:
Figure pct00031
및
Figure pct00032
여기서 Z2는 H 또는 CH3이고; 그리고
각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는 테더를 갖는다:
Figure pct00033
여기서 n은 1 내지 12이고; 그리고
여기서 m은 1 내지 12이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 변형된 올리고뉴클레오타이드에 공유결합된다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00034
여기서
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고
C는 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00035
여기서:
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고
C는 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고;
각각의 n은 독립적으로 0 또는 1이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00036
여기서
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고;
C는 콘주게이트 링커이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00037
여기서
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
C는 콘주게이트 링커이고;
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00038
여기서
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
C는 콘주게이트 링커이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00039
여기서
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고;
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00040
여기서
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 식으로 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00041
여기서
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00042
Figure pct00043
및
Figure pct00044
여기서 각각의 L은, 독립적으로, 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00045
Figure pct00046
및
Figure pct00047
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00048
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00049
및
Figure pct00050
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00051
및
Figure pct00052
.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00053
및
Figure pct00054
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 피롤리딘을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 피롤리딘을 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 PEG를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아미드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 적어도 2 개의 아미드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아미드를 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 폴리아미드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아민을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 1 이상의 디설파이드 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 단백질 결합 모이어티를 포함한다. 어떤 구현예에서, 단백질 결합 모이어티는 지질을 포함한다.
어떤 구현예에서, 단백질 결합 모이어티는 아래 중으로부터 선택된다: 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 그룹, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 그룹, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 펜옥사진), 비타민 (예를 들면, 폴레이트, 비타민 A, 비타민 E, 바이오틴, 피리독살), 펩타이드, 탄수화물 (예를 들면, 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고당, 다당류), 엔도솜분해적 구성성분, 스테로이드 (예를 들면, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌), 테르펜 (예를 들면, 트리테르펜, 예를 들면, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리델라놀 유도된 리토콜산), 또는 양이온성 지질.
어떤 구현예에서, 단백질 결합 모이어티는 아래 중으로부터 선택된다: C16 내지 C22 장쇄 포화된 또는 불포화된 지방산, 콜레스테롤, 콜산, 비타민 E, 아다만탄 또는 1-펜타플루오로프로필.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00055
Figure pct00056
및
Figure pct00057
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고 p는 1 내지 6이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00058
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00059
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00060
여기서 n은 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00061
및
Figure pct00062
.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00063
및
Figure pct00064
여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00065
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00066
및
Figure pct00067
여기서 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00068
및
Figure pct00069
여기서 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00070
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00071
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00072
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00073
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 에테르를 포함한다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00074
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
m은 2 내지 6이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00075
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00076
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00077
Figure pct00078
및
Figure pct00079
여기서 각각의 j는 정수 1 내지 3이고; 그리고
여기서 각각의 n은 정수 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00080
Figure pct00081
또는
Figure pct00082
어떤 구현예에서, 각각의 테더는 아래 중으로부터 선택된다:
Figure pct00083
및
Figure pct00084
여기서 L은 인 연결 그룹 및 중성 연결 그룹으로부터 선택되고;
Z1은 C(=O)O-R2이고;
Z2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
R2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고; 그리고
각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
어떤 구현예에서, 각각의 테더는 아래 중으로부터 선택된다:
Figure pct00085
및
Figure pct00086
여기서 Z2는 H 또는 CH3이고; 그리고
각각의 m2은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m2은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
어떤 구현예에서, 각각의 테더는 아래 중으로부터 선택된다:
Figure pct00087
여기서 n은 1 내지 12이고; 그리고
여기서 m은 1 내지 12이다.
어떤 구현예에서, 적어도 하나의 테더는 에틸렌 글리콜을 포함한다. 어떤 구현예에서, 적어도 하나의 테더는 아미드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 적어도 하나의 테더는 폴리아미드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 적어도 하나의 테더는 아민을 포함한다. 어떤 구현예에서, 적어도 2 개의 테더는 서로 상이하다. 어떤 구현예에서, 모든 테더는 서로 동일하다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더는 아래 중으로부터 선택된다:
Figure pct00088
Figure pct00089
및
Figure pct00090
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
각각의 p는 1 내지 약 6이다.
어떤 구현예에서, 각각의 테더는 아래 중으로부터 선택된다:
Figure pct00091
Figure pct00092
및
Figure pct00093
어떤 구현예에서, 각각의 테더는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00094
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 각각의 테더는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00095
어떤 구현예에서, 테더는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00096
또는
Figure pct00097
; 여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
어떤 구현예에서, 테더는 아래 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00098
어떤 구현예에서, 리간드는 갈락토오스이다. 어떤 구현예에서, 리간드는 만노스-6-포스페이트이다.
어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 아래 중으로부터 선택된다:
Figure pct00099
및
Figure pct00100
여기서 각각의 R1은 OH 및 NHCOOH로부터 선택된다.
어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 아래 중으로부터 선택된다:
Figure pct00101
및
Figure pct00102
어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00103
어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00104
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 세포-표적화 모이어티를 포함한다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래 구조를 갖는 세포-표적화 모이어티를 포함한다:
Figure pct00105
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00106
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00107
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00108
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00109
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00110
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00111
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00112
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00113
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00114
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00115
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00116
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00117
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00118
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00119
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00120
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00121
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00122
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00123
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00124
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00125
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00126
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00127
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00128
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00129
어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 아래를 포함한다:
Figure pct00130
여기서 각각의 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택된다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00131
여기서 각각의 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택된다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00132
여기서 각각의 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택된다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00133
.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00134
.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00135
.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00136
.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래 중으로부터 선택된 절단가능 모이어티를 포함한다: 포스포디에스테르, 아미드, 또는 에스테르.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 절단가능 모이어티를 포함한다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함하지 않고, 상기 콘주게이트 그룹은 콘주게이트 그룹과 올리고뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아미드 절단가능 모이어티를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 에스테르 절단가능 모이어티를 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00137
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00138
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00139
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
Z는 H 또는 연결된 고형 지지체이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00140
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
Z는 H 또는 연결된 고형 지지체이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00141
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00142
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00143
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00144
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00145
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00146
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00147
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00148
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00149
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00150
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 아래 구조를 갖는다:
Figure pct00151
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00152
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00153
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 아래를 포함한다:
Figure pct00154
여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 구현예에서, Bx는 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실, 또는 시토신, 또는 5-메틸 시토신 중으로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, Bx는 아데닌이다. 어떤 구현예에서, Bx는 티민이다. 어떤 구현예에서, Q13은 O(CH2)2-OCH3이다. 어떤 구현예에서, Q13은 H이다.
어떤 구현예에서, 본 화합물은 염 형태이다. 추가 구현예에서, 본 화합물은 추가로, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 화합물은 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹, 또는 그것의 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
어떤 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 접합된 안티센스 화합물을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 화합물의 점도 수준은 40 센티푸아즈 (cP) 미만이다. 어떤 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 접합된 안티센스 화합물은, 실시예 125에서 기재된 바와 같은 파라미터로 측정될 때 40 cP 미만, 35 cP 미만, 30 cP 미만, 25 cP 미만, 20 cP 미만 또는 15 cP 미만의 점도를 갖기 때문에 유효하다.
어떤 구현예는 조성물 및 방법을 제공하고, 이 방법은 동물에게 본원에서 개시된 접합된 안티센스 화합물 또는 조성물을 투여한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 투여는 심혈관, 대사성 및/또는 염증성 질환을 예방, 치료, 개선하거나 그 진행을 느리게 한다
어떤 구현예는 apo(a) 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 치료제에서 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예는 Lp(a) 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 치료제에서 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, apo(a) 및/또는 Lp(a) 수준은 동물에서 상승된다. 어떤 구현예에서, 조성물은 apo(a) 특이적 억제제를 포함하는 화합물이다. 어떤 구현예에서, apo(a) 특이적 억제제는 핵산이다. 어떤 구현예에서, 핵산은 안티센스 화합물이다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드이다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 그룹이다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹을 갖는, apo(a)를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드는, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방, 그 진행을 느리게 하고 그것을 개선하는데 사용된다. 어떤 구현예에서, 치료용 조성물 및 방법은 apo(a) 특이적 억제제를 그것이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
어떤 구현예는 apo(a) 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예는 Lp(a) 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 조직, 기관 또는 대상체에서의 apo(a) 수준의 감소는 LDL 대 HDL의 비 또는 TG 대 HDL의 비를 개선한다. 어떤 구현예는 동물에서 apo(a) mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 이 방법은 apo(a) mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키기 위해 상기 동물에게 본원에서 개시된 접합된 안티센스 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구현예는 동물에서 Lp(a) 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 이 방법은 apo(a) mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키기 위해 상기 동물에게 본원에서 개시된 접합된 안티센스 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
어떤 구현예는 그것을 필요로 하는 대상체에서 apo(a) 관련된 질환, 장애, 및 병태를 예방, 치료, 지연, 그것의 진행을 느리게 하고/거나 그것을 개선하는 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예는 그것을 필요로 하는 대상체에서 Lp(a) 관련된 질환, 장애, 및 병태를 예방, 치료, 지연, 그것의 진행을 느리게 하고/거나 그것을 개선하는 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 질환, 장애, 및 병태는 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애, 및 병태를 포함한다. 어떤 그와 같은 심혈관 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 대동맥 협착증, 동맥류 (예를 들면, 복부 대동맥 동맥류), 협심증, 부정맥, 죽상동맥경화증, 뇌혈관 질환, 관상동맥 질환, 관상동맥 심장병, 이상지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고혈압, 초고트리글리세라이드혈증, 심근경색증, 말초혈관 질환 (예를 들면, 말초 동맥 질환, 말초 동맥 폐쇄성 질환), 망막 혈관 폐색, 또는 뇌졸중. 어떤 그와 같은 대사성 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 고혈당증, 전당뇨병, 당뇨병 (제I형 및 제II형), 비만, 인슐린 저항성, 대사성 증후군 및 당뇨병성 이상지질혈증. 어떤 그와 같은 염증성 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 대동맥 협착증, 관상동맥 질환 (CAD), 알츠하이머병 및 혈전색전성 질환, 장애 또는 병태. 어떤 혈전색전성 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 뇌졸중, 혈전증 (예를 들면, 정맥 혈전색전증), 심근경색증 및 말초혈관 질환. 어떤 구현예는 대동맥 협착증을 예방, 치료, 지연, 그것의 진행을 느리게 하고/거나 그것을 개선하는 조성물 및 방법을 제공한다.
어떤 구현예는 심혈관 질환, 장애 또는 병태 중 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 증상은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 협심증, 가슴 통증, 숨가쁨, 심계항진, 약화, 현기증, 메스꺼움, 땀흘리기, 빈맥, 서맥, 부정맥, 심방세동, 하지의 팽윤, 청색증, 피로, 실신, 얼굴의 저림, 팔다리의 저림, 근육의 파행 또는 경련, 복부 팽만, 및 열. 어떤 구현예는 대동맥 협착증 중 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법을 제공한다.
어떤 구현예에서, apo(a) 또는 Lp(a) 발현의 조절은 세포, 조직 또는 장기에서 일어난다. 어떤 구현예에서, 조절은 동물의 세포, 조직 또는 장기에서 일어난다. 어떤 구현예에서, 조절은 apo(a) mRNA 수준의 감소이다. 어떤 구현예에서, 조절은 apo(a) 단백질 수준의 감소이다. 어떤 구현예에서, apo(a) mRNA 및 단백질 수준 둘 모두는 감소된다. 어떤 구현예에서, 조절은 Lp(a) 수준의 감소이다. 그와 같은 감소는 시간-의존적 방식 또는 용량-의존 방식으로 일어날 수 있다.
어떤 구현예에서, 대상체 또는 동물은 인간이다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 비경구로 투여된다. 추가 구현예에서, 비경구 투여는 피하이다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물 또는 조성물은 제 2 제제 또는 치료제와 공-투여된다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물 또는 조성물 및 제 2 제제는 함께 투여된다.
어떤 구현예에서, 제 2 제제는 글루코오스-저하제이다. 어떤 구현예에서, 제 2 제제는 LDL, TG 또는 콜레스테롤 저하제이다. 어떤 구현예에서, 제 2 제제는 항-염증제이다. 어떤 구현예에서, 제 2 제제는 알츠하이머 질환 약물이다. 어떤 구현예에서, 제 2 제제는, 비제한적으로, 하기일 수 있다: 비-스테로이드 항-염증성 약물 (NSAID 예를 들면, 아스피린), 니아신 (예를 들면, 니아스판), 니코틴산, apoB 억제제 (예를 들면, 미포메르센), CETP 억제제 (예를 들면, 아나세트라핍), apo(a) 억제제, 갑상선 호르몬 유사체 (예를 들면, 에프로티롬), HMG-CoA 환원효소 억제제 (예를 들면, 스타틴), 피브레이트 (예를 들면, 젬피브로질) 및 마이크로솜 트리글리세라이드 전이 단백질 억제제 (예를 들면, 로미타파이드). 치료는, 비제한적으로, Lp(a) 분리반출법일 수 있다. 제제 또는 치료제는 공-투여되거나 동시에 투여될 수 있다. 제제 또는 치료제는 순차적으로 또는 차후에 투여될 수 있다.
어떤 구현예는 동물에서 apo(a) 수준을 감소시키기 위한, apo(a)에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다. 어떤 구현예는 동물에서 Lp(a) 수준을 감소시키기 위한, apo(a)에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다. 어떤 구현예는 apo(a)와 연관된 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방, 또는 개선을 위한, apo(a)에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다. 어떤 구현예는 Lp(a)와 연관된 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방, 또는 개선을 위한, apo(a)에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다.
어떤 구현예는 동물에서 apo(a) 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의, apo(a)에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다. 어떤 구현예는 동물에서 Lp(a) 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의, apo(a)에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다. 어떤 구현예는 apo(a)와 연관된 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 약제의 제조를 위한, 접합된 안티센스 화합물의 용도. 어떤 구현예는 Lp(a)와 연관된 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방, 또는 개선용 약제의 제조를 의한, 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다.
어떤 구현예는 apo(a) 및/또는 Lp(a)와 관련된 질환 중 하나 이상을 치료, 개선, 지연 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 본원에 기재된 바와 같은 접합된 안티센스 화합물의 용도를 제공한다.
어떤 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방 또는 개선하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 아래를 포함한다: (i) apo(a) 특이적 억제제 본원에 기재된 바와 같이; 및 임의로 (ii) 본원에 기재된 바와 같은 제 2 제제 또는 치료제.
본 발명의 키트는 본원에 기재된 바와 같은 병용 치료에 의해 본원에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방, 또는 개선하기 위해 키트를 사용하는 설명을 추가로 포함할 수 있다.
B. 어떤 화합물
어떤 구현예에서, 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트를 포함하는 접합된 안티센스 화합물을 제공한다.
a. 어떤 안티센스 올리고뉴클레오타이드
어떤 구현예에서, 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 그와 같은 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 연결된 뉴클레오사이드를 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드는 당 모이어티 및 핵염기를 포함한다. 그와 같은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 구조는는 화학적 특징에 관한 것으로 고려된다 (예를 들면, 변형 및 변형의 패턴) 및 핵염기 서열 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열, 표적 핵산의 동일성 및 서열).
i. 어떤 화학 특징
어떤 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1 이상의 변형을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드 및/또는 변형된 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 핵염기를 포함한다.
1. 어떤 당 모이어티
어떤 구현예에서, 개시내용의 화합물 변형된 당 모이어티를 포함하는 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 1 이상의 당-변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 그와 같은 화합물은 자연 발생 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드만을 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 대해 바람직한 특성, 예컨대 증대된 뉴클레아제 안정성 또는 표적 핵산과의 증가된 결합 친화도를 가질 수 있다. 어떤 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 치환된 당 모이어티이다. 어떤 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 당 대용물이다. 그와 같은 당 대용물은 치환된 당 모이어티의 것에 상응하는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
어떤 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 2' 및/또는 5' 위치에서 치환기를 비제한적으로 포함하는, 1 이상의 비-브릿징 당 치환기를 포함하는 치환된 당 모이어티이다. 2'-위치에 적당한 당 치환기의 예는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 2'-F, 2'-OCH3 ("OMe" 또는 "O-메틸"), 및 2'-O(CH2)2OCH3 ("MOE"). 어떤 구현예에서, 2'-위치에 있는 당 치환기는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, O-C1-C10 치환된 알킬; OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)로부터 선택되고, 여기서 각각의 Rm 및 Rn은, 독립적으로, H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 5'-위치에 있는 당 치환기의 예는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 5'-메틸 (R 또는 S); 5'-비닐, 및 5'-메톡시. 어떤 구현예에서, 치환된 당류는 1 초과 비-브릿징 당 치환기, 예를 들면, 2'-F-5'-메틸 당 모이어티를 포함한다 (참고, 추가의 5', 2'-비스 치환된 당 모이어티 및 뉴클레오사이드에 대해 예를 들면, PCT 국제 출원 WO 2008/101157.
2'-치환된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드는 2'-치환된 뉴클레오사이드로 불린다. 어떤 구현예에서, 2'- 치환된 뉴클레오사이드는 할로, 알릴, 아미노, 아지도, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S, 또는 N(Rm)-알킬; O, S, 또는 N(Rm)-알케닐; O, S 또는 N(Rm)-알키닐; O-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, O(CH2)2SCH3,O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)로부터 선택된 2'-치환기 그룹을 포함하고, 여기서 각각의 Rm 및 Rn은, 독립적으로, H, 아미노 보호 그룹 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 이들 2'-치환기 그룹은 하이드록실, 아미노, 알콕시, 카복시, 벤질, 페닐, 니트로 (NO2), 티올, 티오알콕시 (S-알킬), 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체 그룹으로 추가로 치환될 수 있다.
어떤 구현예에서, 2'- 치환된 뉴클레오사이드는 F, NH2, N3, OCF3, O-CH3, O(CH2)3NH2, CH2-CH=CH2, O-CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 N-치환된 아세트아미드 (O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)로부터 선택된 2'-치환기 그룹을 포함하고, 여기서 각각의 Rm 및 Rn은, 독립적으로, H, 아미노 보호 그룹 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다.
어떤 구현예에서, 2'- 치환된 뉴클레오사이드는 F, OCF3, O-CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(CH3)2, -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 O-CH2-C(=O)-N(H)CH3로부터 선택된 2'-치환기 그룹을 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
어떤 구현예에서, 2'- 치환된 뉴클레오사이드는 F, O-CH3, 및 OCH2CH2OCH3로부터 선택된 2'-치환기 그룹을 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
어떤 변형된 당 모이어티는 바이사이클릭 당 모이어티가 생기는 제 2 고리를 형성하는 브릿징 당 치환기를 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티는 4' 및 2' 푸라노스 고리 원자 사이의 브릿지를 포함한다. 그와 같은 4' 내지 2' 당 치환기의 예는, 비제한적으로 하기를 포함한다: -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- 또는, -C(RaRb)-O-N(R)-; 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2',. 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 및 그것의 유사체 (참고, 예를 들면, U.S. 특허 7,399,845, 2008년 7월 15일 발표); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 그것의 유사체, (참고, 예를 들면, WO2009/006478, 2009년 1월 8일 공개); 4'-CH2-N(OCH3)-2' 및 그것의 유사체 (참고, 예를 들면, WO2008/150729, 2008년 12월 11일 공개); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (참고, 예를 들면, US2004/0171570, 2004년 9월 2일 공개); 4'-CH2-O-N(R)-2', 및 4'-CH2-N(R)-O-2'-, 여기서 각각의 R는, 독립적으로, H, 보호 그룹, 또는 C1-C12 알킬; 4'-CH2-N(R)-O-2'이고, 여기서 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호 그룹이다 (참고, U.S. 특허 7,427,672, 2008년 9월 23일 발표); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (참고, 예를 들면, Chattopadhyaya, 등, J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2' 및 그것의 유사체 (참고, 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/154401, 2008년 9월 8일 공개).
어떤 구현예에서, 그와 같은 4' 내지 2' 브릿지는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, 및 -N(Ra)-로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 개의 연결된 그룹을 독립적으로 포함하고;
여기서:
x는 0, 1, 또는 2이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
각각의 Ra 및 Rb은, 독립적으로, H, 보호 그룹, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환족 라디칼, 치환된 C5-C7 지환족 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고; 그리고
각각의 J1 및 J2은, 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬, 또는 보호 그룹이다.
바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드는 바이사이클릭 뉴클레오사이드 또는 BNA로 불린다. 바이사이클릭 뉴클레오사이드는, 이하에서 묘사된 바와 같이 비제한적으로, 하기를 포함한다: (A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA (또한 일명 잠겨진 핵산 또는 LNA), (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA (또한 일명 구속된 에틸 또는 cEt), (G) 메틸렌-thio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노 (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 카보사이클릭 (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, 및 (J) 프로필렌 카보사이클릭 (4'-(CH2)3-2') BNA.
Figure pct00155
여기서 Bx는 핵염기 모이어티이고 R은, 독립적으로, H, 보호 그룹, 또는 C1-C12 알킬이다.
추가의 바이사이클릭 당 모이어티는 하기의 예와 같은 당해기술에 공지되어 있다: Singh 등, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin 등, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh 등, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava 등, J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi 등, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch 등, Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum 등, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; U.S. 특허 번호 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 6,670,461, 및 7,399,845; WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570, 및 WO 2007/134181; U.S. 특허 공보 번호 US2004/0171570, US2007/0287831, 및 US2008/0039618; U.S. 특허 시리즈 번호 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787, 및 61/099,844; 및 PCT 국제 출원 번호 PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, 및 PCT/US2008/068922.
어떤 구현예에서, 바이사이클릭 당 모이어티 및 그와 같은 바이사이클릭 당 모이어티를 편입시키는 뉴클레오사이드는 이성질체 배치에 의해 추가로 규정된다. 예를 들면, 4'-2' 메틸렌-옥시 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드는, α-L 배치 또는 β-D 배치로 존재한다. 이전에, α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 안티센스 활성을 보여준 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 편입되었다 (Frieden 등, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
어떤 구현예에서, 치환된 당 모이어티는 1 이상의 비-브릿징 당 치환기 및 1 이상의 브릿징 당 치환기를 포함한다 (예를 들면, 5'-치환된 및 4'-2' 다리걸친 당류). (참고, PCT 국제 출원 WO 2007/134181, 11/22/07 공개, 여기서 LNA는예를 들면, 5'-메틸 또는 5'-비닐 그룹로 치환됨).
어떤 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 당 대용물이다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 자연 발생 당의 산소 원자는 치환되고, 예를 들면, 황, 탄소 또는 질소 원자로 치환된다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 그와 같은 변형된 당 모이어티는 상기에서 기재된 바와 같이 브릿징 및/또는 비-브릿징 치환기를 또한 포함한다. 예를 들면, 어떤 당 대용물은 2'-위치에서 (참고, 예를 들면, 공개된 미국 특허 출원 US2005/0130923, 2005년 6월 16일 공개) 및/또는 5' 위치에서4'-황 원자 및 치환을 포함한다. 추가적인 예로써, 4'-2' 브릿지를 갖는 카보사이클릭 바이사이클릭 뉴클레오사이드가 기재되었다 (참고, 예를 들면, Freier 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 및 Albaek 등, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740).
어떤 구현예에서, 당 대용물은 5-원자 이외 것을 갖는 고리를 포함한다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 당 대용물은 모폴리노를 포함한다. 모폴리노 화합물 및 올리고머 화합물 중 그것의 용도는 수많은 특허들 및 공개된 물품에서 보고되었다 (참고 예를 들면: Braasch 등, Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; 및 미국 특허들 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; 및 5,034,506). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모폴리노"는 하기 구조를 갖는 당 대용물을 의미한다:
Figure pct00156
어떤 구현예에서, 모폴리노는, 상기 모폴리노 구조로부터의 다양한 치환기 그룹을 부가하거나 변경시킴으로써 변형될 수 있다. 그와 같은 당 대용물은 본원에서 "변형된 모폴리노"라 칭한다.
또 하나의 예에 대해, 어떤 구현예에서, 당 대용물은 6-원 테트라하이드로피란을 포함한다. 그와 같은 테트라하이드로피란은 추가로 변형 또는 치환될 수 있다. 그와 같은 변형된 테트라하이드로피란을 포함하는 뉴클레오사이드는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 헥시톨 핵산 (HNA), 아니톨 핵산 (ANA), 만니톨 핵산 (MNA) (참고 Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), 플루오로 HNA (F-HNA), 및 식 VI을 갖는 화합물들:
Figure pct00157
여기서 독립적으로 식 VI의 각각의 상기 적어도 하나의 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체에 대해
Bx는 핵염기 모이어티이고;
T3 및 T4 각각은, 독립적으로, 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 뉴클레오사이드간 연결 그룹이거나, T3 및 T4 중 하나는 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 뉴클레오사이드간 연결 그룹이고 T3 및 T4 중 다른 것은 H, 하이드록실 보호 그룹, 연결된 콘주게이트 그룹, 또는 5' 또는 3'-말단기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 각각은, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고; 그리고
각각의 R1 및 R2는 하기: 수소, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2, 및 CN 중으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 X은 O, S 또는 NJ1이고, 각각의 J1, J2, 및 J3은, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이다.
어떤 구현예에서, 식 VI의 변형된 THP 뉴클레오사이드가 제공되고, 여기서 q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 각각은 H이다. 어떤 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 H 이외의 것이다. 어떤 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 메틸이다. 어떤 구현예에서, 식 VI의 THP 뉴클레오사이드가 제공되고 여기서 R1 및 R2 중 하나는 F이다. 어떤 구현예에서, R1은 플루오로이고 R2은 H이고, R1은 메톡시이고 R2은 H이고, R1은 메톡시에톡시이고 R2은 H이다.
많은 다른 바이사이클로 및 트리사이클로 당 대용물 고리계는 안티센스 화합물에 혼합시키기 위해 뉴클레오사이드를 변형시키기 위해 사용될 수 있는 당해기술에서 또한 공지되어 있다 (참고, 예를 들면, 하기 논문 검토: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
하기와 같은 변형의 조합이 또한 비제한적으로 제공된다: 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오사이드 (참고 다른 개시된 5', 2'-비스 치환된 뉴클레오사이드에 대해 8/21/08에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/101157) 및 2'-위치에서의 리보실 고리 산소 원자 대신에 S에 의한 대체 및 추가 치환 (참고 2005년 6월 16일에 공개된 미국 특허 출원 US2005-0130923) 또는 대안적으로 바이사이클릭 핵산의 5'-치환 (참고 11/22/07에 공개된 PCT 국제 출원 WO 2007/134181, 여기서 4'-CH2-O-2' 바이사이클릭 뉴클레오사이드는 5' 위치에서 5'-메틸 또는 5'-비닐 그룹로 추가로 치환된다). 올리고머화에 의한 카보사이클릭 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 합성 및 제조 및 생화학 연구는 하기에서 또한 기재되었다: (참고, 예를 들면, Srivastava 등, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 이들 변형된 뉴클레오타이드는 변형된 당, 변형된 핵염기, 및/또는 변형된 연결을 포함할 수 있다. 특이적 변형은, 수득한 올리고뉴클레오타이드가 바람직한 특성을 갖도록 선택된다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 1 이상의 RNA-유사 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 1 이상의 DNA-유사 뉴클레오타이드를 포함한다.
2. 어떤 핵염기 변형
어떤 구현예에서, 본 개시내용의 뉴클레오사이드는 1 이상의 비변형된 핵염기를 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 개시내용의 뉴클레오사이드는 1 이상의 변형된 핵염기를 포함한다.
어떤 구현예에서, 변형된 핵염기는 하기로부터 선택된다: 본원에서 규정된 바와 같은 보편적인 염기, 소수성 염기, 부정확한 염기, 크기-확장된 염기, 및 플루오르화된 염기. 본원에서 규정된 바와 같이 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실을 포함하는 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린; 5-프로피닐시토신; 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘계의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌, 보편적인 염기, 소수성 염기, 부정확한 염기, 크기-확장된 염기, 및 플루오르화된 염기. 추가의 변형된 핵염기는 하기를 포함한다: 트리사이클릭 피리미딘 예컨대 펜옥사진 시티딘([5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-c램프 예컨대 치환된 펜옥사진 시티딘 (예를 들면 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온). 변형된 핵염기는, 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들면 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체횐 것을 또한 포함할 수 있다. 추가의 핵염기는 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 3,687,808에서 개시된 것, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science 및 Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859 에서 개시된 것; Englisch 등, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 의해 개시된 것; 및 Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. 및 Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288에 의해 개시된 것.
상기 언급된 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기 중 어떤 것의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 비제한적으로, U.S. 3,687,808; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653 및 6,005,096를 포함하고, 이들중 어떤 것은 통상적으로 본원과 함께 소유되고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
3. 어떤 뉴클레오사이드간 연결
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 연결된 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 그와 같은 구현예에서, 뉴클레오사이드는 임의의 뉴클레오사이드간 연결을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 뉴클레오사이드간 연결 그룹의 2 개의 주요 클래스는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 규정된다. 뉴클레오사이드간 연결을 함유하는 대표적인 인은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스포디에스테르 (PO), 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트 (PS). 뉴클레오사이드간 연결 그룹을 함유하는 대표적인 비-인은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 메틸렌메틸이미노 (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르 (-O-C(O)-S-), 티오노카바메이트 (-O-C(O)(NH)-S-); 실록산 (-O-Si(H)2-O-); 및 N, N'-디메틸하이드라진 (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). 천연 포스포디에스테르 연결과 비교된 변형된 연결은, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레아제 저항성을 변형하기 위해, 전형적으로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 키랄 원자를 갖는 뉴클레오사이드간 연결은 라세미 혼합물로서, 또는 별개의 거울상이성질체로서 제조될 수 있다. 대표적인 키랄 연결, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트. 인-함유 및 비-인-함유 뉴클레오사이드간 연결의 제조 방법은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
본원에서 기재된 올리고뉴클레오타이드는 1 이상의 비대칭 중심을 함유하고 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 다른 입체이성질체 배치를 생기헤 하고 이것은 당 아노머에 대해서와 같이 (R) 또는 (S), α 또는 β, 또는 아미노산 등에 대해서와 같이 (D) 또는 (L)로서 절대적인 입체화학에 관하여 규정될 수 있다. 본원에서 제공된 안티센스 화합물 내에 모든 그와 같은 가능한 이성질체, 뿐만 아니라 그것의 라세미 및 광학적으로 순수한 형태가 포함된다.
중성 뉴클레오사이드간 연결은 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), 아미드-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), 아미드-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), 포름아세탈 (3'-O-CH2-O-5'), 및 티오포름아세탈 (3'-S-CH2-O-5'). 추가의 중성 뉴클레오사이드간 연결은 실록산 (디알킬실록산), 카복실레이트 에스테르, 카복사마이드, 설파이드, 설포네이트 에스테르 및 아미드를 포함하는 비이온성 연결을 포함한다 (참고 예를 들면: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi 및 P.D. Cook, Eds., ACS Symposium 시리즈 580; Chapters 3 및 4, 40-65). 추가의 중성 뉴클레오사이드간 연결은 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 포함하는 비이온성 연결을 포함한다.
4. 어떤 모티프
어떤 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드 (예를 들면, 변형된 당 및/또는 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드) 및/또는 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드에 대한 그와 같은 변형의 패턴은 모티프로서 칭한다. 어떤 구현예에서, 당, 핵염기, 및 연결 모티프는 서로 독립적이다.
a. 어떤 당 모티프
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 규정된 패턴 또는 당 변형 모티프 중 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 영역을 다라 배열된 1 이상의 유형의 변형된 당 모이어티 및/또는 자연 발생 당 모이어티를 포함한다. 그와 같은 모니프는 본원에서 논의된 당 변형 및/또는 다른 공지된 당 변형 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 2 개의 외부 영역 또는 "윙" 및 중심 또는 내부 영역 또는 "갭"을 포함하는 갭머 당 모티프를 갖는 영역을 포함하거나 그것으로 구성된다. 갭머 당 모티프의 3 개의 영역 (5'-윙, 갭, 및 3'-윙)은 뉴클레오사이드의 인접 서열을 형성하고, 여기서 각각의 윙의 뉴클레오사이드의 당 모이어티의 적어도 일부는 갭의 뉴클레오사이드의 당 모이어티의 적어도 일부와 상이하다. 특이적으로, 갭에 아주 가까운 각각의 윙의 뉴클레오사이드 (5'-윙의 3'-대부분 뉴클레오사이드 및 3'-윙의 5'-대부분 뉴클레오사이드)의 적어도 당 모이어티는 인접하는 갭 뉴클레오사이드의 당 모이어티와 상이하고, 따라서 윙과 갭 사이의 경계를 규정한다. 어떤 구현예에서, 갭 내의 당 모이어티는 서로 동일하다. 어떤 구현예에서, 갭은 1 이상의 다른 갭의 뉴클레오사이드의 당 모이어티와 상이한 당 모이어트를 갖는 1 이상의 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 2 개의 윙의 당 모이프는 서로 동일하다 (대칭 당 갭머). 어떤 구현예에서, 5'-윙의 당 모티프는 3'-윙의 당 모티프와 상이하다 (비대칭 당 갭머).
i. 어떤 5'-윙
어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 내지 8 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 내지 7 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 내지 6 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 내지 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 2 내지 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 3 내지 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 4 또는 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 내지 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 내지 3 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 또는 2 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 2 내지 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 2 또는 3 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 3 또는 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 1 개의 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 2 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 3 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 6 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다.
어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 2 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 3 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 4 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 바이사이클릭 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 LNA 뉴클레오사이드이다.
어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-치환된 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-OMe 뉴클레오사이드이다.
어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-데옥시뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 리보뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 리보뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 5'-윙의 1, 1 초과, 또는 각각의 뉴클레오사이드는 RNA-유사 뉴클레오사이드이다.
어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 5'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
ii. 어떤 3'-윙
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 내지 8 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 내지 7 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 내지 6 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 내지 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 2 내지 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 3 내지 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 4 또는 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 내지 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 내지 3 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 또는 2 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 2 내지 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 2 또는 3 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 3 또는 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 1 개의 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 2 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 3 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 4 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 6 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 바이사이클릭 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 LNA 뉴클레오사이드이다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 2 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 3 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 4 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-치환된 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-OMe 뉴클레오사이드이다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-데옥시뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 리보뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙의 각각의 뉴클레오사이드는 리보뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 5'-윙의 1, 1 초과, 또는 각각의 뉴클레오사이드는 RNA-유사 뉴클레오사이드이다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 비-바이사이클릭 변형된 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-치환된 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-MOE 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 바이사이클릭 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 구속된 에틸 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭머의 3'-윙은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오사이드, 적어도 하나의 2'-OMe 뉴클레오사이드, 및 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함한다.
iii. 어떤 중심 영역 (갭)
어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 내지 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 내지 15 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 내지 12 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 내지 10 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 내지 9 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 내지 8 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 또는 7 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 7 내지 10 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 7 내지 9 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 7 또는 8 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 8 내지 10 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 8 또는 9 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 6 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 7 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 8 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 9 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 10 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 11 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 갭머의 갭은 12 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다.
어떤 구현예에서, 각각의 갭의 뉴클레오사이드머의 갭은 2'-데옥시뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 갭은 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 각각의 갭의 뉴클레오사이드머의 갭은 2'-데옥시뉴클레오사이드이거나 "DNA-유사"인 변형된 뉴클레오사이드이다. 그와 같은 구현예에서, "DNA-유사"는, 뉴클레오사이드가 DNA에 대해 유사한 특성을 갖는다는 것을 의미하고, 이로써 갭머 및 RNA 분자를 포함하는 듀플렉스는 RNase H를 활성화할 수 있다. 예를 들면, 어떤 조건 하에서, 2'-(ara)-F는 RNase H 활성화를 지지하는 것으로 보여졌고, 따라서 DNA-유사이다. 어떤 구현예에서, 1 이상의 갭의 뉴클레오사이드머의 갭은 2'-데옥시뉴클레오사이드가 아니고 DNA-유사가 아니다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 갭머는, 그럼에도 불구하고, (예를 들면, 비-DNA 뉴클레오사이드의 수 또는 배치에 의해) RNase H 활성화를 지지한다.
어떤 구현예에서, 갭은 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드에 의해 방해된 비변형된 2'-데옥시뉴클레오사이드의 스트레치를 포함하고, 따라서 3 개의 아-영역 (1 이상의 2'-데옥시뉴클레오사이드의 2 개의 스트레치 및 1 이상의 차단 변형된 뉴클레오사이드의 스트레치)가 생긴다. 어떤 구현예에서, 비변형된 2'-데옥시뉴클레오사이드의 스트레치는 5, 6, 또는 7 개의 뉴클레오사이드보다 더 길지 않다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 짧은 스트레치는 짧은 갭 영역을 사용하여 달성된다. 어떤 구현예에서, 짧은 스트레치는 더 긴 갭 영역을 차단하여 달성된다.
어떤 구현예에서, 갭은 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 cEt, FHNA, LNA, 및 2-티오-티미딘 중으로부터 선택된 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 1 개의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 5'-Me, 및 5'-(R)-Me 중으로부터 선택된 5'-치환된 당 모이어티를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 2 개의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 3 개의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 4 개의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 2 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하고 각각의 변형된 뉴클레오사이드는 동일하다. 어떤 구현예에서, 갭은 2 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하고 각각의 변형된 뉴클레오사이드는 상이하다.
어떤 구현예에서, 갭은 1 이상의 변형된 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 1 이상의 메틸 포스포네이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서 갭은 2 이상의 변형된 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 1 이상의 변형된 연결 및 1 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 1 개의 변형된 연결 및 1 개의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 갭은 2 개의 변형된 연결 및 2 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
b. 어떤 뉴클레오사이드간 연결 모티프
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 규정된 패턴 또는 변형된 뉴클레오사이드간 연결 모티프에서 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 영역을 따라 배열된 변형된 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 교대 뉴클레오사이드간 연결 모티프를 갖는 영역을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드는 균일하게 변형된 뉴클레오사이드간 연결의 영역을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결에 의해 균일하게 연결된 영역을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결에 의해 균일하게 연결된다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택되고 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 6 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 7 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 8 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 9 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 10 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 11 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 12 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 13 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 14 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다.
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 6 개의 연속되는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 7 개의 연속되는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 8 개의 연속되는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 9 개의 연속되는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 10 개의 연속되는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 12 개의 연속되는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 적어도 하나의 블록을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 적어도 하나의 그와 같은 블록은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 위치한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 적어도 하나의 그와 같은 블록은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단의 3 개의 뉴클레오사이드 내에 위치한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 15 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 14 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 13 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 12 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 11 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 10 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 9 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 8 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 7 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 6 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 5 개 미만의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다.
c. 어떤 핵염기 변형 모티프
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 규정된 패턴 또는 핵염기 변형 모티프에서 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 영역을 따라 배열된 핵염기에 대한 화학적 변형을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 핵염기 변형은 갭핑된 모티프에서 배열되어 있다. 어떤 구현예에서, 핵염기 변형은 교대 모티프에서 배열되어 있다. 어떤 구현예에서, 각각의 핵염기은 변형된다. 어떤 구현예에서, 핵염기의 어떤 것도 화학적으로 변형되지 않는다.
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 변형된 핵염기의 블록을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 블록은 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 있다. 어떤 구현예에서 블록은 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단의 3 개의 뉴클레오타이드 내에 있다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 블록은 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 있다. 어떤 구현예에서 블록은 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단의 3 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
어떤 구현예에서, 핵염기 변형은 올리고뉴클레오타이드의 특정한 위치에서 천연 염기의 기능이다. 예를 들면, 어떤 구현예에서 올리고뉴클레오타이드 중 각각의 퓨린 또는 각각의 피리미딘은 변형된다. 어떤 구현예에서, 각각의 아데닌은 변형된다. 어떤 구현예에서, 각각의 구아닌은 변형된다. 어떤 구현예에서, 각각의 티민은 변형된다. 어떤 구현예에서, 각각의 시토신은 변형된다. 어떤 구현예에서, 각각의 우라실은 변형된다.
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 중 시토신 모이어티의 일부 또는 모두는 5-메틸 시토신 모이어티이거나, 어떤 것도 그것은 아니다. 여기서, 5-메틸 시토신은 "변형된 핵염기"가 아니다. 따라서, 달리 지적되지 않으면, 비변형된 핵염기는 5-메틸을 갖는 시토신 잔기 및 5 메틸이 없는 것들 둘 모두를 포함한다. 어떤 구현예에서, 모든 또는 일부의 시토신 핵염기의 메틸화 상태가 명시된다.
어떤 구현예에서, 핵염기에 대한 화학적 변형은 어떤 콘주게이트 그룹의 핵염기에의 부착을 포함한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 중 각각의 퓨린 또는 각각의 피리미딘은 임의로 변형되어 콘주게이트 그룹을 포함할 수 있다.
d. 어떤 전장
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 다양한 범위의 길이의 임의의 것의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 X 내지 Y 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고, 여기서 X는 범위 내의 가장 작은 수의 뉴클레오사이드를 나타내고 Y는 범위 내의 최대 수의 뉴클레오사이드를 나타낸다. 어떤 그와 같은 구현예에서, X 및 Y 각각은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50로부터 독립적으로 선택되고; 단 X=Y. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기로 구성될 수 있다: 8 내지 9, 8 내지 10, 8 내지 11, 8 내지 12, 8 내지 13, 8 내지 14, 8 내지 15, 8 내지 16, 8 내지 17, 8 내지 18, 8 내지 19, 8 내지 20, 8 내지 21, 8 내지 22, 8 내지 23, 8 내지 24, 8 내지 25, 8 내지 26, 8 내지 27, 8 내지 28, 8 내지 29, 8 내지 30, 9 내지 10, 9 내지 11, 9 내지 12, 9 내지 13, 9 내지 14, 9 내지 15, 9 내지 16, 9 내지 17, 9 내지 18, 9 내지 19, 9 내지 20, 9 내지 21, 9 내지 22, 9 내지 23, 9 내지 24, 9 내지 25, 9 내지 26, 9 내지 27, 9 내지 28, 9 내지 29, 9 내지 30, 10 내지 11, 10 내지 12, 10 내지 13, 10 내지 14, 10 내지 15, 10 내지 16, 10 내지 17, 10 내지 18, 10 내지 19, 10 내지 20, 10 내지 21, 10 내지 22, 10 내지 23, 10 내지 24, 10 내지 25, 10 내지 26, 10 내지 27, 10 내지 28, 10 내지 29, 10 내지 30, 11 내지 12, 11 내지 13, 11 내지 14, 11 내지 15, 11 내지 16, 11 내지 17, 11 내지 18, 11 내지 19, 11 내지 20, 11 내지 21, 11 내지 22, 11 내지 23, 11 내지 24, 11 내지 25, 11 내지 26, 11 내지 27, 11 내지 28, 11 내지 29, 11 내지 30, 12 내지 13, 12 내지 14, 12 내지 15, 12 내지 16, 12 내지 17, 12 내지 18, 12 내지 19, 12 내지 20, 12 내지 21, 12 내지 22, 12 내지 23, 12 내지 24, 12 내지 25, 12 내지 26, 12 내지 27, 12 내지 28, 12 내지 29, 12 내지 30, 13 내지 14, 13 내지 15, 13 내지 16, 13 내지 17, 13 내지 18, 13 내지 19, 13 내지 20, 13 내지 21, 13 내지 22, 13 내지 23, 13 내지 24, 13 내지 25, 13 내지 26, 13 내지 27, 13 내지 28, 13 내지 29, 13 내지 30, 14 내지 15, 14 내지 16, 14 내지 17, 14 내지 18, 14 내지 19, 14 내지 20, 14 내지 21, 14 내지 22, 14 내지 23, 14 내지 24, 14 내지 25, 14 내지 26, 14 내지 27, 14 내지 28, 14 내지 29, 14 내지 30, 15 내지 16, 15 내지 17, 15 내지 18, 15 내지 19, 15 내지 20, 15 내지 21, 15 내지 22, 15 내지 23, 15 내지 24, 15 내지 25, 15 내지 26, 15 내지 27, 15 내지 28, 15 내지 29, 15 내지 30, 16 내지 17, 16 내지 18, 16 내지 19, 16 내지 20, 16 내지 21, 16 내지 22, 16 내지 23, 16 내지 24, 16 내지 25, 16 내지 26, 16 내지 27, 16 내지 28, 16 내지 29, 16 내지 30, 17 내지 18, 17 내지 19, 17 내지 20, 17 내지 21, 17 내지 22, 17 내지 23, 17 내지 24, 17 내지 25, 17 내지 26, 17 내지 27, 17 내지 28, 17 내지 29, 17 내지 30, 18 내지 19, 18 내지 20, 18 내지 21, 18 내지 22, 18 내지 23, 18 내지 24, 18 내지 25, 18 내지 26, 18 내지 27, 18 내지 28, 18 내지 29, 18 내지 30, 19 내지 20, 19 내지 21, 19 내지 22, 19 내지 23, 19 내지 24, 19 내지 25, 19 내지 26, 19 내지 29, 19 내지 28, 19 내지 29, 19 내지 30, 20 내지 21, 20 내지 22, 20 내지 23, 20 내지 24, 20 내지 25, 20 내지 26, 20 내지 27, 20 내지 28, 20 내지 29, 20 내지 30, 21 내지 22, 21 내지 23, 21 내지 24, 21 내지 25, 21 내지 26, 21 내지 27, 21 내지 28, 21 내지 29, 21 내지 30, 22 내지 23, 22 내지 24, 22 내지 25, 22 내지 26, 22 내지 27, 22 내지 28, 22 내지 29, 22 내지 30, 23 내지 24, 23 내지 25, 23 내지 26, 23 내지 27, 23 내지 28, 23 내지 29, 23 내지 30, 24 내지 25, 24 내지 26, 24 내지 27, 24 내지 28, 24 내지 29, 24 내지 30, 25 내지 26, 25 내지 27, 25 내지 28, 25 내지 29, 25 내지 30, 26 내지 27, 26 내지 28, 26 내지 29, 26 내지 30, 27 내지 28, 27 내지 29, 27 내지 30, 28 내지 29, 28 내지 30, 또는 29 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드. 화합물의 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드의 수가 제한되는 구현예에서, 범위 또는 특정 개수이든 아니든, 상기 화합물은, 그럼에도 불구하고, 추가의 다른 치환기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 8-30 개의 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는, 달리 지적되지 않으면 31 개의 뉴클레오사이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제외하고, 그와 같은 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들면 1 이상의 콘주게이트 그룹, 말단기, 또는 다른 치환기를 추가로 포함할 수 있다.
게다가, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 전장 범위에 의해 그리고 명시된 길이를 갖는 영역에 의해 기재되고, 그리고 상기 영역의 명시된 길이의 합은 전장 범위의 상한 미만이고, 올리고뉴클레오타이드는 명시된 영역의 초과하여 추가의 뉴클레오사이드를 가질 수 있고, 단, 뉴클레오사이드의 총수는 전장 범위의 상한을 초과하지 않는다.
5. 어떤 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화학 모티프
어떤 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 화학적 구조적 특징은 그것의 당 모티프, 뉴클레오사이드간 연결 모티프, 핵염기 변형 모티프 및 전장을 특징으로 한다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 파라미터 각각은 서로 독립적이다. 따라서, 갭머 당 모티프를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 변형 또는 비변형될 수 있고 당 변형의 갭머 변형 패턴을 따르거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 당-갭머의 윙 영역 내의 뉴클레오사이드간 연결은 서로 동일 또는 상이할 수 있고 갭 영역의 뉴클레오사이드간 연결과 동일 또는 상이할 수 있다. 마찬가지로, 그와 같은 당-갭머 올리고뉴클레오타이드는 당 변형의 갬머 패턴에 독립적인1 이상의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 당해분야의 숙련가는, 그와 같은 모티프가 조합되어 다양한 올리고뉴클레오타이드를 만들 수 있다는 것을 인식할 것이다.
어떤 구현예에서, 뉴클레오사이드간 연결 및 뉴클레오사이드 변형의 선택은 서로 독립적이지 않다.
i. 어떤 서열 및 표적
어떤 구현예에서, 본 발명은 표적 핵산에 대해 상보적인 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 그와 같은 안티센스 화합물은 표적 핵산에 혼성화될 수 있고, 이로써 적어도 하나의 안티센스 활성이 생긴다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 1 이상의 표적 핵산에 특이적으로 혼성화된다. 어떤 구현예에서, 특이적 혼성화 안티센스 화합물은 혼성화를 허용하고 안티센스 활성이 생기도록 하는 표적 핵산에 대한 충분한 상보성 및 특이적 혼성화를 원하는 조건 하에서 (예를 들면, 생체내 또는 치료 용도를 위한 생리적 조건 하에서, 그리고 검정이 시험관내 검정의 경우에 수행된 조건 하에서) 비-표적 핵산 서열에 대한 비-특이적 혼성화를 피하거나 축소시키기 위해 임의의 비-표적에 대한 불충분한 상보성을 갖는 영역을 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는, 표적 및 비-표적 둘 모두가 표적 서열을 포함할지라도 표적 및 비-표적 사이에서 선택적이다. 그와 같은 구현예에서, 선택성 다른 것과 비교하여 하나의 핵산 분자의 표적 영역의 상대적 접근성으로부터 기인할 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 올리고뉴클레오타이드의 전장을 가로질러 표적 핵산에 대해 완전히 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 화합물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산에 대해 99% 상보적이다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산에 대해 95% 상보적이다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산에 대해 90% 상보적이다.
어떤 구현예에서, 그와 같은 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산에 대해 85% 상보적이다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산에 대해 80% 상보적이다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산에 대해 완전히 상보적이고 올리고뉴클레오타이드의 전장에 걸쳐 표적 핵산에 대해 적어도 80% 상보적인 영역을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 완전 상보성의 영역은 그 길이가 6 내지 14 개의 핵염기이다.
어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 혼성화 영역 및 말단 영역을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 혼성화 영역은 12-30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 표적 핵산에 대해 완전히 상보적이다. 어떤 구현예에서, 혼성화 영역은 표적 핵산에 대해 하나의 미스매치를 포함한다. 어떤 구현예에서, 혼성화 영역은 표적 핵산에 대해 2 개의 미스매치를 포함한다. 어떤 구현예에서, 혼성화 영역은 표적 핵산에 대해 3 개의 미스매치를 포함한다. 어떤 구현예에서, 말단 영역은 1-4 말단 뉴클레오사이드로 구성된다. 어떤 구현예에서, 말단 뉴클레오사이드는 3' 말단에 있다. 어떤 구현예에서, 말단 뉴클레오사이드 중 1 이상은 표적 핵산에 대해 상보적이지 않다.
안티센스 기전은 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산과의 혼성화를 수반하는 임의의 기전을 포함하고, 상기 혼성화로 생물학적 효과가 생긴다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 혼성화로, 표적 핵산 저하 또는 예를 들면, 표적 핵산의 번역, 전사, 또는 스플라이싱을 수반하는 세포 기구의 수반되는 억제 또는 자극에 의한 점유가 생긴다.
표적 RNA의 저하를 수반하는 유형의 안티센스 기전은 RNase H 매개된 안티센스이다. RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. "DNA-유사"한 단일가닥 안티센스 화합물이 포유동물 세포에서 RNase H 활성을 유도하는 것으로 당해기술에서 공지되어 있다. 따라서 RNase H의 활성화로, RNA 표적이 절단되고, 그렇게 함으로써 유전자 발현의 DNA-유사 올리고뉴클레오타이드-매개된 억제의 효율이 크게 향상된다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 링커를 포함한다. 어떤 구현예에서, 링커는 단백질 결합 모이어티를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 세포-표적화 모이어티 (또한 일명 세포-표적화 그룹)을 포함한다. 어떤 구현예에서 세포-표적화 모이어티는 분지화 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 1 이상의 테더를 포함한다. 어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 탄수화물 또는 탄수화물 클러스터를 포함한다.
ii. 어떤 절단가능 모이어티
어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 결합이다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 부착된다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 절단가능 모이어티는 세포-표적화 모이어티에 직접적으로 부착된다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 절단가능 모이어티는 콘주게이트 링커에 부착된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스페이트 또는 포스포디에스테르를 포함한다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 절단가능 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체이다. 어떤 구현예에서, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체는 퓨린, 치환된 퓨린, 피리미딘 또는 치환된 피리미딘로부터 선택된 임의로 보호된 헤테로사이클릭 염기를 포함한다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 우라실, 티민, 시토신, 4-N-벤조일시토신, 5-메틸시토신, 4-N-벤조일-5-메틸시토신, 아데닌, 6-N-벤조일아데닌, 구아닌 및 2-N-이소부티릴구아닌로부터 선택된 임의로 보호된 헤테로사이클릭 염기를 포함하는 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3' 위치에 부착되고 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 링커에 부착된 2'-데옥시 뉴클레오사이드이다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3' 위치에 부착되고 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 링커에 부착된2'-데옥시 아데노신이다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3' 위치에 부착되고 포스포디에스테르 연결에 의해 링커에 부착된2'-데옥시 아데노신이다이다.
어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3' 위치에 부착된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 5' 위치에 부착된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 2' 위치에 부착된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 부착된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결에 의해 링커에 부착된다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 포스포디에스테르 연결에 의해 링커에 부착된다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 절단가능 모이어티를 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는, 표적화된 세포에 의해 내면화된 직후에 복합물이 동물에게 투여된 후에 절단된다. 세포 내에서 절단가능 모이어티는 절단되고 그렇게 함으로써 활성 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 방출한다. 이론에 의해 구속되지를 바라지 않지만 절단가능 모이어티가 세포 내의 1 이상의 뉴클레아제에 의해 절단죄는 것으로 믿는다. 어떤 구현예에서, 1 이상의 뉴클레아제는 절단가능 모이어티와 링커 사이의 포스포디에스테르 연결을 절단한다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00158
및
Figure pct00159
여기서 각각의 Bx, Bx1, Bx2, 및 Bx3은 독립적으로 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00160
iii. 어떤 링커
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 링커를 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 링커는 절단가능 모이어티에 공유결합된다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 링커는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 링커는 세포-표적화 모이어티에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 링커는 추가로, 고형 지지체에 대한 공유 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 링커는 추가로, 단백질 결합 모이어티에 대한 공유 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 링커는 추가로, 고형 지지체에 대한 공유결합을 포함하고, 추가로, 단백질 결합 모이어티에 대한 공유 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 링커는 테더링된 리간드의 부착을 위한 다중 위치를 포함한다. 어떤 구현예에서, 링커는 테더링된 리간드의 부착을 위한 다중 위치를 포함하고 분지화 그룹에 부착되지 않는다. 어떤 구현예에서, 링커는 추가로, 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 링커를 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 링커는 알킬, 아미드, 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 (-S-) 및 하이드록실아미노 (-O-N(H)-) 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함하는 적어도 하나의 선형 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 알킬, 아미드 및 에테르 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 알킬 및 에테르 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 적어도 하나의 인 연결 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 적어도 하나의 포스포디에스테르 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 적어도 하나의 중성 연결 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티 및 절단가능 모이어티에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티, 절단가능 모이어티 및 고형 지지체에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 세포-표적화 모이어티, 절단가능 모이어티, 고형 지지체 및 단백질 결합 모이어티에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다.
어떤 구현예에서, 링커는 스캐폴드 그룹에 공유결합된 선형 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 스캐폴드는 알킬, 아미드, 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 하이드록실아미노 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함하는 분지된 지방족 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 스캐폴드는 알킬, 아미드 및 에테르 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함하는 분지된 지방족 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 스캐폴드는 적어도 하나의 모노 또는 폴리사이클릭 고리계를 포함한다. 어떤 구현예에서, 스캐폴드는 적어도 2 개의 모노 또는 폴리사이클릭 고리계를 포함한다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티 및 링커에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티, 링커 및 고형 지지체에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티, 링커 및 단백질 결합 모이어티에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 선형 그룹은 스캐폴드 그룹에 공유결합되고, 스캐폴드 그룹은 절단가능 모이어티, 링커, 단백질 결합 모이어티 및 고형 지지체에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 스캐폴드 그룹은 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다.
어떤 구현예에서, 링커는 단백질 결합 모이어티를 포함한다. 어떤 구현예에서, 단백질 결합 모이어티는 하기를 비제한적으로 포함하는 지질이다: 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 그룹, 헥사데실글리세롤, 용뇌, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 그룹, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 펜옥사진), 비타민 (예를 들면, 폴레이트, 비타민 A, 비타민 E, 바이오틴, 피리독살), 펩타이드, 탄수화물 (예를 들면, 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고당, 다당류), 엔도솜분해적 구성성분, 스테로이드 (예를 들면, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌), 테르펜 (예를 들면, 트리테르펜, 예를 들면, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리델라놀 유도된 리토콜산), 또는 양이온성 지질. 어떤 구현예에서, 단백질 결합 모이어티는 C16 내지 C22 장쇄 포화된 또는 불포화된 지방산, 콜레스테롤, 콜산, 비타민 E, 아다만탄 또는 1-펜타플루오로프로필이다.
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00161
Figure pct00162
및
Figure pct00163
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고 p는 1 내지 6이다.
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00164
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00165
Figure pct00166
및
Figure pct00167
여기서 n은 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00168
Figure pct00169
및
Figure pct00170
여기서 각각의 L은, 독립적으로, 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00171
Figure pct00172
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00173
Figure pct00174
및
Figure pct00175
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00176
Figure pct00177
및
Figure pct00178
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00179
여기서 n은 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00180
및
Figure pct00181
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00182
및
Figure pct00183
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00184
및
Figure pct00185
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00186
어떤 구현예에서, 콘주게이트 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00187
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00188
및
Figure pct00189
어떤 구현예에서, 링커는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00190
및
Figure pct00191
여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
iv. 어떤 세포- 표적화 모이어티
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 세포-표적화 모이어티를 포함한다. 어떤 그와 같은 세포-표적화 모이어티는 안티센스 화합물의 세포성 흡수를 증가시킨다. 어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 분지화 그룹, 1 이상의 테더, 및 1 이상의 리간드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 세포-표적화 모이어티는 분지화 그룹, 1 이상의 테더, 1 이상의 리간드 및 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다.
1. 어떤 분지화 그룹
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 분지화 그룹 및 적어도 2 개의 테더링된 리간드를 포함하는 표적 모이어티를 포함한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 콘주게이트 링커를 첨부한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 절단가능 모이어티를 첨부한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 첨부한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 링커 및 각각의 테더링된 리간드에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 알킬, 아미드, 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 하이드록실아미노 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함하는 분지된 지방족 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 알킬, 아미드 및 에테르 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 알킬 및 에테르 그룹으로부터 선택된 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 모노 또는 폴리사이클릭 고리계를 포함한다. 어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 분지화 그룹을 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00192
Figure pct00193
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
j는 1 내지 3이고; 그리고
m은 2 내지 6이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00194
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
m은 2 내지 6이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00195
Figure pct00196
및
Figure pct00197
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00198
및
Figure pct00199
여기서 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00200
및
Figure pct00201
여기서 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00202
및
Figure pct00203
여기서 A1은 O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00204
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00205
어떤 구현예에서, 분지화 그룹은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00206
2. 어떤 테더
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 분지화 그룹에 공유결합된 1 이상의 테더를 포함한다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 연결 그룹에 공유결합된 1 이상의 테더를 포함한다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더는 임의의 조합으로 알킬, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 아미드 및 폴리에틸렌 글리콜 그룹으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더는 임의의 조합으로 알킬, 치환된 알킬, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 아미드, 포스포디에스테르 및 폴리에틸렌 글리콜 그룹으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더는 임의의 조합으로 알킬, 에테르 및 아미드 그룹으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더는 임의의 조합으로 알킬, 치환된 알킬, 포스포디에스테르, 에테르 및 아미드 그룹으로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더는 임의의 조합으로 알킬 및 포스포디에스테르로부터 선택된 1 이상의 그룹을 포함하는 선형 지방족 그룹이다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더는 적어도 하나의 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹을 포함한다.
어떤 구현예에서, 테더는 1 이상의 절단가능 결합을 포함한다. 어떤 구현예에서, 테더는 아미드 또는 에테르 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 어떤 구현예에서, 테더는 포스포디에스테르 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 어떤 구현예에서, 테더는 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 어떤 구현예에서, 테더는 에테르 그룹을 통해 분지화 그룹에 부착된다. 어떤 구현예에서, 테더는 아미드 또는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다. 어떤 구현예에서, 테더는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다. 어떤 구현예에서, 테더는 아미드 또는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다. 어떤 구현예에서, 테더는 에테르 그룹을 통해 리간드에 부착된다.
어떤 구현예에서, 각각의 테더는 리간드와 분지화 그룹 사이에 약 8 내지 약 20 개의 원자의 사슬 길이를 포함한다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더 기는 리간드와 분지화 그룹 사이에 약 10 내지 약 18 개의 원자의 사슬 길이를 포함한다. 어떤 구현예에서, 각각의 테더 기는 약 13 개의 원자의 사슬 길이를 포함한다.
어떤 구현예에서, 테더는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00207
Figure pct00208
및
Figure pct00209
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
각각의 p는 1 내지 약 6이다.
어떤 구현예에서, 테더는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00210
Figure pct00211
및
Figure pct00212
어떤 구현예에서, 테더는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00213
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 구현예에서, 테더는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00214
및
Figure pct00215
여기서 L은 인 연결 그룹 또는 중성 연결 그룹 중 하나이고;
Z1은 C(=O)O-R2이고;
Z2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
R2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고; 그리고
각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
어떤 구현예에서, 테더는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00216
어떤 구현예에서, 테더는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00217
및
Figure pct00218
여기서 Z2는 H 또는 CH3이고; 그리고
각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
어떤 구현예에서, 테더는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00219
또는
Figure pct00220
여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
어떤 구현예에서, 테더는 인 연결 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서, 테더는 임의의 아미드 결합을 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 테더는 인 연결 그룹을 포함하고 임의의 아미드 결합을 포함하지 않는다.
3. 어떤 리간드
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 리간드를 제공하고, 여기서 각각의 리간드는 테더에 공유결합된다. 어떤 구현예에서, 표적 세포 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대한 친화성을 갖는 각각의 리간드가 선택된다. 어떤 구현예에서, 포유동물 간 세포의 표면 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드가 선택된다. 어떤 구현예에서, 간 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)에 대해 친화성을 갖는 리간드가 선택된다. 어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 탄수화물이다. 어떤 구현예에서, 각각의 리간드는, 갈락토오스, N-아세틸 갈락토오스아민, 만노스, 글루코오스, 글루코사몬 및 푸코스로부터 독립적으로 선택된다. 어떤 구현예에서, 각각의 리간드는 N-아세틸 갈락토오스아민 (GalNAc)이다. 어떤 구현예에서, 표적 모이어티는 2 내지 6 개의 리간드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 표적 모이어티는 3 개의 리간드를 포함한다. 어떤 구현예에서, 표적 모이어티는 3 N-아세틸 갈락토오스아민 리간드를 포함한다.
어떤 구현예에서, 리간드는 탄수화물, 탄수화물 유도체, 변형된 탄수화물, 다가 탄수화물 클러스터, 다당류, 변형된 다당류, 또는 다당류 유도체이다. 어떤 구현예에서, 리간드는 아미노 당 또는 티오 당이다. 예를 들면, 아미노 당은 당해기술에서 공지된 임의의 수의 화합물, 예를 들면 글루코사민, 시알산, α-D-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 2-아세트아미도-2-데옥시-D-갈락토파이라노스 (GalNAc), 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코파이라노스 (β-뮤람산), 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코파이라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노파이라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코파이라노스 및 N-설포-D-글루코사민, 및 N-글리콜로일-α-뉴라민산으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 티오 당류는 5-티오-β-D-글루코파이라노스, 메틸 2,3,4-트리-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토파이라노스, 및 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코-헵토피라노사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
어떤 구현예에서, "GalNac" 또는 "Gal-NAc"는 N-아세틸 갈락토사민으로서 문헌에서 통상적으로 칭해지는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 의미한다. 어떤 구현예에서, "N-아세틸 갈락토사민"는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 의미한다. 어떤 구현예에서, "GalNac" 또는 "Gal-NAc"는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 의미한다. 어떤 구현예에서, "GalNac" 또는 "Gal-NAc"는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 의미하고, 이것은 β-형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스 및 α-형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스 둘 모두를 포함한다. 어떤 구현예에서, β-형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스 및 α-형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스 둘 모두는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 형태가 묘사된 구조에서, 이들 구조는 다른 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, α-형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스의 구조가 보여지는경우, 이러한 구조는 다른 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 어떤 구현예에서, 어떤 바람직한 구현예에서, β-형 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스는 바람직한 구현예이다.
Figure pct00221
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스
Figure pct00222
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스
Figure pct00223
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토파이라노스
어떤 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00224
및
Figure pct00225
여기서 각각의 R1은 OH 및 NHCOOH로부터 선택된다.
어떤 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00226
및
Figure pct00227
어떤 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00228
어떤 구현예에서 1 이상의 리간드는 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00229
i. 어떤 콘주게이트
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 상기의 구조적 특징을 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00230
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00231
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00232
여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
Z는 H 또는 연결된 고형 지지체이고;
Q는 안티센스 화합물이고;
X는 O 또는 S이고; 그리고
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00233
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00234
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00235
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00236
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00237
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00238
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00239
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00240
어떤 구현예에서, 콘주게이트는 피롤리딘을 포함하지 않는다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00241
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00242
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00243
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00244
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00245
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00246
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00247
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00248
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00249
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00250
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00251
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00252
여기서 X는 6 내지 11 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 테더이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00253
여기서 X는 10 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 테더이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00254
여기서 X는 4 내지 11 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 테더이고 상기 테더는 정확하게 하나의 아미드 결합을 포함한다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00255
여기서 Y 및 Z는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 그룹, 또는 에테르, 케톤, 아미드, 에스테르, 카바메이트, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 트리아졸, 피롤리딘, 디설파이드, 또는 티오에테르를 포함하는 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00256
여기서 Y 및 Z는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 그룹, 또는 정확하게 하나의 에테르 또는 정확하게 2 개의 에테르, 아미드, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 또는 포스포로티오에이트를 포함하는 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00257
여기서 Y는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00258
여기서 m 및 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로부터 독립적으로 선택된다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00259
여기서 m은 4, 5, 6, 7, 또는 8이고, n은 1, 2, 3, 또는 4이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00260
여기서 X는 4 내지 13 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 테더이고, 여기서 X는 에테르 그룹을 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00261
여기서 X는 8 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 테더이고, 여기서 X는 에테르 그룹을 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00262
여기서 X는 4 내지 13 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 테더이고, 상기 테더는 정확하게 하나의 아미드 결합을 포함하고, 여기서 X는 에테르 그룹을 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00263
여기서 X는 4 내지 13 개의 연속하여 결합된 원자의 치환된 또는 비치환된 테더이고, 상기 테더는 아미드 결합 및 치환된 또는 비치환된 C2-C11 알킬 그룹으로 구성된다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00264
여기서 Y는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 그룹, 또는 에테르, 케톤, 아미드, 에스테르, 카바메이트, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 트리아졸, 피롤리딘, 디설파이드, 또는 티오에테르를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00265
여기서 Y는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 그룹, 또는 에테르, 아민, 피페리딘, 포스페이트, 포스포디에스테르, 또는 포스포로티오에이트를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00266
여기서 Y는 C1-C12 치환된 또는 비치환된 알킬 그룹으로부터 선택된다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00267
여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12이다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00268
여기서 n은 4, 5, 6, 7, 또는 8이다.
b. 어떤 접합된 안티센스 화합물
어떤 구현예에서, 콘주게이트는 뉴클레오사이드의 2', 3', 또는 5' 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드에 결합된다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00269
여기서
A는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고;
C은 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00270
여기서
A는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고;
C은 콘주게이트 링커이고
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 링커는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 분지화 그룹은 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
어떤 구현예에서 각각의 테더는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트는 뉴클레오사이드의 2', 3', 또는 5' 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드에 결합된다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00271
여기서
A는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고;
C은 콘주게이트 링커이고
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 콘주게이트는 뉴클레오사이드의 2', 3', 또는 5' 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드에 결합된다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00272
여기서
A는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고;
C은 콘주게이트 링커이고
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00273
여기서
A는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고;
B는 절단가능 모이어티이고;
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00274
여기서
A는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고;
D는 분지화 그룹이고;
각각의 E는 테더이고;
각각의 F는 리간드이고; 그리고
q는 정수 1 내지 5이다.
어떤 그와 같은 구현예에서, 콘주게이트 링커는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
어떤 구현예에서 각각의 테더는 적어도 하나의 절단가능 결합을 포함한다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00275
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00276
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 중으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00277
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00278
상기 언급된 콘주게이트, 접합된 안티센스 화합물, 테더, 링커, 분지화 그룹, 리간드, 절단가능 모이어티 뿐만 아니라 다른 변형 중 어떤 것의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허들, 미국 특허 출원 공보, 및 국제 특허 출원 공보는 비제한적으로, 하기를 포함한다: US 5,994,517, US 6,300,319, US 6,660,720, US 6,906,182, US 7,262,177, US 7,491,805, US 8,106,022, US 7,723,509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 및 WO 2012/037254, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
상기 언급된 콘주게이트, 접합된 안티센스 화합물, 테더, 링커, 분지화 그룹, 리간드, 절단가능 모이어티 뿐만 아니라 다른 변형의 어떤 것의 제조를 교시하는 대표적인 공보는 비제한적으로, 하기를 포함한다: BIESSEN 등, "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN 등, "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor " J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE 등, "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN 등, "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN 등, "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor " J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT 등, "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, 및 Valentijn 등, "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 RNase H 기반 올리고뉴클레오타이드 (예컨대 갭머) 또는 스플라이스 조절 올리고뉴클레오타이드 (예컨대 완전히 변형된 올리고뉴클레오타이드) 및 적어도 1, 2 또는 3 개의 GalNAc 그룹을 포함하는 임의의 콘주게이트 그룹을 포함한다. 어떤 구현예에서 접합된 안티센스 화합물은 하기 참조 중 임의의 것에서 발견된 임의의 콘주게이트 그룹을 포함한다: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly 등, J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia 등, Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee 등, Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee 등, Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni 등, Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen 등, J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn 등, Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim 등, Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee 등, Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato 등, Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen 등, J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee 등, Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind 등, Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee 등, Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer 등, Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev 등, Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee 등, Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova 등, Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol 등, Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen 등, J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt 등, J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen 등, J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen 등, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg 등, Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato 등, J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee 등, J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen 등, FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur 등, Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff 등, Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier 등, Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash 등, Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic 산 Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin 등, Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya 등, Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; 국제 출원 WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098; WO2008/098788; WO2004/101619; WO2012/037254; WO2011/120053; WO2011/100131; WO2011/163121; WO2012/177947; WO2013/033230; WO2013/075035; WO2012/083185; WO2012/083046; WO2009/082607; WO2009/134487; WO2010/144740; WO2010/148013; WO1997/020563; WO2010/088537; WO2002/043771; WO2010/129709; WO2012/068187; WO2009/126933; WO2004/024757; WO2010/054406; WO2012/089352; WO2012/089602; WO2013/166121; WO2013/165816; 미국 특허들 4,751,219; 8,552,163; 6,908,903; 7,262,177; 5,994,517; 6,300,319; 8,106,022; 7,491,805; 7,491,805; 7,582,744; 8,137,695; 6,383,812; 6,525,031; 6,660,720; 7,723,509; 8,541,548; 8,344,125; 8,313,772; 8,349,308; 8,450,467; 8,501,930; 8,158,601; 7,262,177; 6,906,182; 6,620,916; 8,435,491; 8,404,862; 7,851,615; 공개된 미국 특허 출원 공보 US2011/0097264; US2011/0097265; US2013/0004427; US2005/0164235; US2006/0148740; US2008/0281044; US2010/0240730; US2003/0119724; US2006/0183886; US2008/0206869; US2011/0269814; US2009/0286973; US2011/0207799; US2012/0136042; US2012/0165393; US2008/0281041; US2009/0203135; US2012/0035115; US2012/0095075; US2012/0101148; US2012/0128760; US2012/0157509; US2012/0230938; US2013/0109817; US2013/0121954; US2013/0178512; US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; 및 US2009/0203132; 이들 각각은 그 전체가 참고로 편입되어 있다.
C. 어떤 용도 및 특징
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 생체내 강력한 표적 RNA 축소를 나타낸다. 어떤 구현예에서, 비접합된 안티센스 화합물은 신장에서 축적된다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 간에서 축적된다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 잘 용인된다. 그와 같은 특성이 대사성, 심혈관 및 다른 질환, 장애 또는 병태에 연루된 것을 비제한적으로 포함하는, 많은 표적 RNA의 억제에 특히 유용한 접합된 안티센스 화합물에게 부여된다. 따라서, 간 조직을 그와 같은 질환, 장애 또는 병태와 연관된 RNA에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물과 접촉시켜 그와 같은 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 따라서, 다양한 대사성, 심혈관 및 다른 질환, 장애 또는 병태의 임의의 것을 본 발명의 접합된 안티센스 화합물로 개선하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 특정한 조직 농도에서 비접합된 대응물보다 더 강하다. 임의의 이론 또는 기전에 구속되지를 바라지 않으면서, 어떤 구현예에서, 콘주게이트는, 접합된 안티센스 화합물이 세포에 더 효율적으로 들어가거나 세포에 더 생산적으로 들어가도록 할 수 있다. 예를 들면, 어떤 구현예에서 접합된 안티센스 화합물은 그것의 비접합된 대응물과 비교하여 더 큰 표적 축소를 나타낼 수 있고, 여기서 접합된 안티센스 화합물 및 그것의 비접합된 대응물 둘 모두는 동일한 농도로 조직에서 존재한다. 예를 들면, 어떤 구현예에서 접합된 안티센스 화합물은 그것의 비접합된 대응물과 비교하여 더 큰 표적 축소를 나타낼 수 있고, 여기서 접합된 안티센스 화합물 및 그것의 비접합된 대응물 둘 모두는 동일한 농도로 간에서 존재한다.
올리고뉴클레오타이드의 생산적인 및 비-생산적인 흡수는 이전에 논의되었다 (참조 예를 들면 Geary, R. S., E. Wancewicz, 등 (2009). "Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptake and Pharmacologic Activity of a 2'-Methoxyethyl Modified Chimeric Antisense Oligonucleotide Targeting PTEN." Biochem. Pharmacol. 78(3): 284-91; & Koller, E., T. M. Vincent, 등 (2011). "Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified antisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes." Nucleic Acids Res. 39(11): 4795-807). 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹은 생산적인 흡수을 향상시킬 수 있다.
어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹은 특정한 유형의 세포 또는 조직에 대해 접합된 안티센스 화합물의 친화성을 증가시켜서 효능을 추가로 향상시킬 수 있다. 어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹은 1 이상의 세포-표면 수용체에 의해 접합된 안티센스 화합물의 인식을 증가시켜서 효능을 추가로 향상시킬 수 있다.. 어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트 그룹은 접합된 안티센스 화합물의 세포내이입을 용이하기 하여 효능을 추가로 향상시킬 수 있다.
어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는, 접합된 안티센스 화합물이 세포에 들어간 후 콘주게이트가 안티센스 올리고뉴클레오타이드로부터 절단되도록 하여 효능을 추가로 향상시킬 수 있다. 따라서, 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 필요한 것보다 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다.
포스포로티오에이트 연결은 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 이전에 편입되었다. 그와 같은 포스포로티오에이트 연결은 뉴클레아제에 대해 내성이 있고 따라서 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 향상시킨다. 게다가, 포스포로티오에이트 연결은 또한 어떤 단백질에 결합하고, 이 단백질은 간에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 축적하도록 한다. 더 적은 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 간에서 덜 축적되고 신장에서 더 축적된다 (참고, 예를 들면, Geary, R., "Pharmacokinetic Properties of 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats," -Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics-, Vol. 296, No. 3, 890-897; &-Pharmacological Properties of 2'-O-Methoxyethyl Modified Oligonucleotides- in Antisense a Drug Technology, Chapter 10, Crooke, S.T., ed., 2008)어떤 구현예에서, 더 적은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 및 더 많은 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 간에서 덜 축적되고 신장에서 더 축적된다. 간에서의 질환을 표적으로 할 때, 이것은 몇 개의 이유 때문에 바람직하지 않다: (1) 더 적은 약물은 원하는 작용 부위 (간)에 영향을 미치고; (2) 약물은 소변으로 빠져 들어가고 있고; 그리고 (3) 신장은 신장에서 독성이 생길 수 있는 비교적 고농도의 약물에 노출된다. 따라서, 간 질환에 대해, 포스포로티오에이트 연결은 중요한 이점을 제공한다.
어떤 구현예에서, 그러나, 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결에 의해 균일하게 연결된 올리고뉴클레오타이드의 투여는 1 이상의 전염증 반응을 포함한다. (참고 예를 들면: J Lab Clin Med . 1996 Sep; 128 ( 3 ): 329 -38. "Amplification of antibody production by phosphorothioate oligodeoxynucleotides". Branda 등; and see also for example: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Chapter 12, pages 342-351, Crooke, S.T., ed., 2008). 어떤 구현예에서, 대부분의 뉴클레오사이드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 투여는 1 이상의 전염증 반응을 포함한다.
어떤 구현예에서, 전염증 효과의 정도는 몇 개의 변수에 의존할 수 있다 (예를 들면 골격 변형, 부정확한 효과, 핵염기 변형, 및/또는 뉴클레오사이드 변형) 참고 예를 들면: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Chapter 12, pages 342-351, Crooke, S.T., ed., 2008). 어떤 구현예에서, 전염증 효과의 정도 1 이상의 변수를 조정하여 완화될 수 있다. 예를 들면 주어진 올리고뉴클레오타이드의 전염증 효과의 정도는 임의의 수의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결로 대체하고 그렇게 함으로써 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 총수를 감소시켜서 완화될 수 있고.
어떤 구현예에서, 안정성을 잃지 않으면서 그리고 간으로부터 신장으로의 분포를 이동시키지 않으면서 그렇게 행해질 수 있다면, 포스포로티오에이트 연결의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결의 수는 포스포로티오에이트 연결을 포스포디에스테르 연결로 대체하여 감소될 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 더 적은 포스포로티오에이트 연결 및 더 많은 포스포디에스테르 연결을 갖는 안티센스 화합물은 더 적은 전염증 반응을 유도하거나 전염증 반응을 유도하지 않을 수 있다. 더 적은 포스포로티오에이트 연결 및 더 많은 포스포디에스테르 연결을 갖는 안티센스 화합물이 더 적은 전염증 반응을 유도할 수 있을지라도, 더 적은 포스포로티오에이트 연결 및 더 많은 포스포디에스테르 연결을 갖는 안티센스 화합물은 간에서 축적되지 않을 수 있고 더 많은 포스포로티오에이트 연결을 갖는 안티센스 화합물과 비교하여 동일한 또는 유사한 용량에서 덜 유효할 수 있다. 어떤 구현예에서, 따라서 복수의 포스포디에스테르 결합 및 복수의 포스포로티오에이트 결합을 갖지만 또한 간에 대한 안정성 및 우수한 분포을 갖는 안티센스 화합물을 설계하는 것이 바람직하다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은, 포스포로티오에이트 연결의 일부가 더 적은 전염증 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결로 대체될 때라도 비접합된 대응물보다 간에서 더 많이 축적되고 신장에서 덜 축적된다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은, 포스포로티오에이트 연결의 일부가 더 적은 전염증 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결로 대체될 때라도 그것의 비접합된 대응물과 비교하여 간에서 더 많이 축적되고 소변에서 만큼 배출되지는 않는다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트를 사용하면 더 강한 및 더 나은 용인된 안티센스 약물을 설계할 수 잇다. 사실상, 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 비접합된 대응물보다 더 큰 치료 지수를 갖는다. 이것으로 접합된 안티센스 화합물이 더 높은 절대적인 용량으로 투여될 수 있는 것은, 전염증 반응의 위험이 더 적고 신장 독성의 위험이 더 적기 때문이다. 이러한 더 높은 용량이 덜 빈번하게 투여하게 되는 것은, 청소능 (대사)가 유사한 것으로 기대되기 때문이다. 게다가, 화합물은 상기에서 기재된 바와 같이 더 강하기 때문에, 농도를 더 낮게 한 후, 치료 활성을 잃지 않으면서 다음 용량 전에 더 낮게 하고, 복용 사이에 더욱 더 긴 기간을 허용한다.
어떤 구현예에서, 일부 포스포로티오에이트 연결의 포함은 여전히 바람직하다. 예를 들면, 말단 연결은 엑소뉴클레아제에 취약하고 어떤 구현예에서, 그러한 연결은 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 연결이다. 2 개의 데옥시뉴클레오사이드를 연결하는 뉴클레오사이드간 연결은 엔도뉴클레아제에 취약하고 어떤 구현예에서 그러한 연결은 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 연결이다. 데옥시뉴클레오사이드가 연결 데옥시뉴클레오사이드의 5' 측 상에 있는 변형된 뉴클레오사이드와 데옥시뉴클레오사이드 사이의 뉴클레오사이드간 연결은 엔도뉴클레아제에 대해 취약하고 어떤 구현예에서 그러한 연결은 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 연결이다. 어떤 유형의 2 개의 변형된 뉴클레오사이드와, 변형된 뉴클레오사이드가 연결의 5' 측에 있는 어떤 유형의 데옥시뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오사이드 사이의 뉴클레오사이드간 연결은, 연결이 포스포디에스테르일 수 있는 뉴클레아제 소화에 대해 충분히 내성이 있다.
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 16 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 15 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 14 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 13 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 12 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 11 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 10 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 9 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다. 어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 8 개 미만의 포스포르티오에이트 연결을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 1 이상의 콘주게이트 그룹을 포함하는 안티센스 화합물은 그와 같은 1 이상의 콘주게이트 그룹이 없는 모 안티센스 화합물과 비교하여 증가된 활성 및/또는 효능 및/또는 내성을 갖는다. 따라서, 어떤 구현예에서, 그와 같은 콘주게이트 그룹의 올리고뉴클레오타이드에의 부착은 바람직하다. 그와 같은 콘주게이트 그룹은 올리고뉴클레오타이드의 5'-, 및/또는 3'-말단에서 부착될 수 있다. 어떤 예에서, 5'-말단에서의 부착은 합성적으로 바람직하다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 당해기술에 공지되어 있는 기술을 사용하여 3' 말단 뉴클레오사이드의 고형 지지체에의 부착 및 3'에서 5'로의 뉴클레오사이드의 순차적인 커플링에 의해 합성된다. 따라서 콘주게이트 그룹이 3'-말단에 있는 것이 바람직하면, (1) 올리고뉴클레오타이드의 차후의 제조를 위해 콘주게이트 그룹을 3'-말단 뉴클레오사이드에 부착하고 상기 접합된 뉴클레오사이드를 고형 지지체에 부착할 수 있거나 (2) 합성 후에 콘주게이트 그룹을 완료된 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 뉴클레오사이드에 부착할 수 있다. 이들 접근법의 어떤 것은 그렇제 효율적이지 않고 따라서 둘 모두는 비용이 많이 든다. 특히, 본원의 실시예에서 실증된 접합된 뉴클레오사이드의 고형 지지체에의 부착은 비효율적인 과정이다. 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 5'-말단 뉴클레오사이드에의 부착은 3'-말단에서의 부착보다 합성적으로 쉽다. 비-접합된 3' 말단 뉴클레오사이드를 고형 지지체에 부착할 수 있고 표준 및 잘 특성화된 반응을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 그 다음 필요하지만 그 결과 최종 커플링 단계에서 콘주게이트 그룹을 갖는 5'뉴클레오사이드를 부착한다. 어떤 구현예에서, 이것은, 3'-접합된 올리고뉴클레오타이드를 제고하기 위해 전형적으로 행행지는 바와 같이, 접합된 뉴클레오사이드를 직접적으로 고형 지지체에 부착시키는 것보다 더 효율적이다. 본원의 실시예는 5'-말단에서의 부착을 실증한다. 또한, 어떤 콘주게이트 그룹은 합성 이점을 갖는다. 예를 들면, 인 연결 그룹을 포함하는 어떤 콘주게이트 그룹은 합성적으로 더 간단하고 이전에 보고된 콘주게이트 그룹을 포함하는 다른 콘주게이트 그룹보다 더 효율적으로 제조된다 (예를 들면, WO/2012/037254).
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 대상체에게 투여된다. 그와 같은 구현예에서, 본원에서 기재된 1 이상의 콘주게이트 그룹을 포함하는 안티센스 화합물은 그와 같은 1 이상의 콘주게이트 그룹이 없는 모 안티센스 화합물과 비교하여 증가된 활성 및/또는 효능 및/또는 내성을 갖는다. 기전에 구속되지 않으면서, 콘주게이트 그룹은 표적 세포 또는 조직으로의 분포, 전달, 및/또는 흡수를 돕는 것으로 믿는다. 어떤 구현예에서, 표적 세포 또는 조직에 일단 들어오면, 콘주게이트 그룹의 모두 또는 일부가 절단되어 활성 올리고뉴클레오타이드를 방출하는 것이 바람직하다. 어떤 구현예에서, 전체 콘주게이트 그룹이 올리고뉴클레오타이드로부터 절단되는 것이 필요한 것은 아니다. 예를 들면, 실시예 20에서, 접합된 올리고뉴클레오타이드는 마우스 및 수많은 상이한 화학적 종에 투여되었고, 올리고뉴클레오타이드 상에 남아 있는 콘주게이트 그룹의 상이한 부분을 포함하는 각각이 검출되었다 (표 23a). 이러한 접합된 안티센스 화합물은 우수한 효능을 실증했다 (표 23). 따라서, 어떤 구현예에서, 콘주게이트 그룹의 다중 부분 절단의 그와 같은 대사물 프로파일은 활성/효능을 방해하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 어떤 구현예에서 전구약물 (접합된 올리고뉴클레오타이드)가 단일 활성 화합물을 산출하는 것이 바람직하다. 어떤 예에서, 다중 형태의 활성 화합물은 발견되면, 각각의 화합물에 대해 상대적인 양 및 활성을 측정하는 것이 필요할 수 있다. 어떤 구현예에서 조절 검토가 필요한 경우 (예를 들면, USFDA 또는 대응물), 단일 (또는 주로 단일) 활성종을 갖는 것이 바람직하다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 그와 같은 단일 활성종이 임의의 부분의 콘주게이트 그룹이 없는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것이 바람직하다. 어떤 구현예에서, 5'-말단에 있는 콘주게이트 그룹은 콘주게이트 그룹의 완벽한 대사를 생기게 할 수 있을 것 같다. 기전에 구속되지 않으면서, 5' 말단에서 대사에 책임있는 내인성 효소 (예를 들면, 5' 뉴클레아제)는 3' 대응물보다 더 많은 활성/효율적인 것 같다. 어떤 구현예에서, 특이적 콘주게이트 그룹은 단일 활성종에 대한 대사를 더 잘 받아들인다. 어떤 구현예에서, 어떤 콘주게이트 그룹은 올리고뉴클레오타이드에 대한 대사를 더 잘 받아들인다.
D. 안티센스
어떤 구현예에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 안티센스 화합물이다. 그와 같은 구현예에서, 올리고머 화합물은 표적 핵산에 대해 상보적이다. 어떤 구현예에서, 표적 핵산은 RNA이다. 어떤 구현예에서, 표적 핵산은 비-코딩 RNA이다. 어떤 구현예에서, 표적 핵산은 단백질을 인코딩한다. 어떤 구현예에서, 표적 핵산은 mRNA, 전-mRNA, microRNA, 작은 비-코딩 RNA를 포함하는 비-코딩 RNA, 및 프로모터-지향된 RNA로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, 올리고머 화합물은 1 초과의 표적 핵산에 대해 적어도 부분적으로 상보적이다. 예를 들면, 본 발명의 올리고머 화합물은 다중 표적에 전형적으로 결합하는 microRNA 모사체일 수 있다.
어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산의 핵염기 서열에 대해 적어도 70% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 부분을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산의 핵염기 서열에 대해 적어도 80% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 부분을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산의 핵염기 서열에 대해 적어도 90% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 부분을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산의 핵염기 서열에 대해 적어도 95% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 부분을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산의 핵염기 서열에 대해 적어도 98% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 부분을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산의 핵염기 서열에 대해 적어도 100% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 부분을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 안티센스 화합물의 전장에 걸쳐 표적 핵산의 핵염기 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 상보적이다.
안티센스 기전은 올리고머 화합물과 표적 핵산과의 혼성화를 수반하는 임의의 기전을 포함하고, 상기 혼성화로 생물학적 효과가 생긴다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 혼성화로, 예를 들면, 표적 핵산 또는 표적 핵산과 상호작용하는 핵산의 번역, 전사, 또는 폴리아데닐화를 수반하는 세포 기구의 수반되는 억제 또는 자극과 함께 표적 핵산 저하 또는 점유가 생긴다.
표적 RNA의 저하를 수반하는 유형의 안티센스 기전은 RNase H 매개된 안티센스이다. RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. "DNA-유사"한 단일가닥 안티센스 화합물이 포유동물 세포에서 RNase H 활성을 유도하는 것으로 당해기술에서 공지되어 있다. 따라서 RNase H의 활성화로, RNA 표적이 절단되고, 그렇게 함으로써 유전자 발현의 DNA-유사 올리고뉴클레오타이드-매개된 억제의 효율이 크게 향상된다.
안티센스 기전은 또한, RISC 경로를 이용하는 RNAi 기전을 비제한적으로 포함한다. 그와 같은 RNAi 기전은, 비제한적으로 siRNA, ssRNA 및 microRNA 기전을 포함한다. 그와 같은 기전은 microRNA 모사체 및/또는 항-microRNA의 창출을 포함한다.
안티센스 기전 또한, microRNA 또는 mRNA 이외의 비-코딩 RNA를 혼성화하거나 모방하는 기전을 비제한적으로 포함한다. 그와 같은 비-코딩 RNA는 1 이상의 핵산의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 프로모터-지향된 RNA 및 짧은 및 긴 RNA를 비제한적으로 포함한다.
어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 RNAi 화합물이다. 어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트를 포함하는 올리고머 올리고뉴클레오타이드는 ssRNA 화합물이다. 어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 제 2 올리고머 화합물과 쌍을 이루어 siRNA를 형성한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 제 2 올리고머 화합물은 또한 콘주게이트를 포함한다. 어떤 구현예에서, 제 2 올리고머 화합물은 임의의 변형된 또는 비변형된 핵산이다. 어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 siRNA 화합물 중 안티센스 가닥이다. 어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 siRNA 화합물 중 센스 가닥이다. 접합된 올리고머 화합물이 이중-가닥 siRNA인 구현예에서, 콘주게이트는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 모두 상에 있을 수 있다.
C. 아포지질단백질 (a) ( apo (a))
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 임의의 apo(a) 핵산을 표적으로 한다. 어떤 구현예에서, 표적 핵산은 임상적으로 관련된 apo(a) 표적 단백질을 인코딩한다. 그와 같은 구현예에서, 표적 핵산의 조절로 임상 이득이 생긴다.
표적화 과정은 보통, 원하는 효과가 생기도록 하기 위해 안티센스 상호작용에 대한 표적 핵산 내의 적어도 하나의 표적 영역, 분절, 또는 부위의 결정을 포함한다.
어떤 구현예에서, 표적 영역은 핵산의 구조적으로 규정된 영역이다. 예를 들면, 어떤 그와 같은 구현예에서, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 코딩 영역, 번역 개시 영역, 번역 종료 영역, 또는 다른 규정된 핵산 영역 또는 표적 분절을 포함할 수 있다.
어떤 구현예에서, 표적 분절은, 접합된 안티센스 화합물이 표적화된 표적 영역의 8-핵염기부에 적어도 관한 것이다. 표적 분절은 표적 분절 중 하나의 5'-말단으로부터 적어도 8 개의 연속되는 핵염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다 (잔여 핵염기는 표적 분절의 5'-말단의 업스트림을 즉시 시작하고 DNA 또는 RNA가 약 8 내지 약 30 개의 핵염기를 포함할 때까지 계속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속되는 스트레치이다). 표적 분절은 또한 표적 분절 중 하나의 3'-말단으로부터 적어도 8 개의 연속되는 핵염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열로 나타낸다 (잔여 핵염기는 표적 분절의 3'-말단의 업스트림을 즉시 시작하고 DNA 또는 RNA가 약 8 내지 약 30 개의 핵염기를 포함할 때까지 계속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속되는 스트레치이다). 표적 분절은 표적 분절의 서열의 내부 부분으로부터 적어도 8 개의 연속되는 핵염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열로 또한 나타낼 수 있고, 접합된 안티센스 화합물이 약 8 내지 약 30 개의 핵염기를 포함할 때까지 하나 또는 둘 모두 방향으로 연장될 수 있다.
어떤 구현예에서, apo(a) 핵산에 대해 표적화된 안티센스 화합물은 본원에서 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 본원에서 기재된 바와 같이 변형된 당 모이어티, 비변형된 당 모이어티 또는 변형된 및 비변형된 당 모이어티의 혼합물을 가질 수 있다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 본원에서 기재된 바와 같이 변형된 뉴클레오사이드간 연결, 비변형된 뉴클레오사이드간 연결 또는 변형된 및 비변형된 뉴클레오사이드간 연결의 혼합물을 가질 수 있다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 본원에서 기재된 바와 같이 변형된 핵염기, 비변형된 핵염기 또는 변형된 및 비변형된 핵염기의 혼합물을 가질 수 있다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 본원에서 기재된 모티프를 가질 수 있다.
어떤 구현예에서, apo(a) 핵산에 대해 표적화된 안티센스 화합물은 본원에서 기재된 바와 같이 접합될 수 있다.
하나의 apo(a) 단백질은 디설파이드 결합을 통해 단일 아포지질단백질 (apoB) 단백질에 연결되어 지질단백질(a) (Lp(a)) 입자를 형성한다. apo(a) 단백질은, 특히 크링글 IV 2형 반복적인 도메인 내의 플라스미노겐과 고도의 상동성을 공유한다. apo(a) 중 크링글 반복 도메인은 그것의 프로-혈전성 및 항-섬유소용해 특성에 책임있을 수 있고, 잠재적으로 죽상경화성 진행을 향상시키는 것으로 생각된다. Apo(a)은 IL-6에 의해 전사적으로 조절되고 IL-6 억제제 (토실리주맙)로 치료된 류마티스성 관절염 환자에서의 연구에서, 혈장 수준은 3 개월 치료 후에 30%까지 감소되었다. Apo(a)는 산화된 인지질에 우선적으로 결합하고 혈관 염증을 강력하게 하는 것으로 보여졌다. 게다가, 연구는, Lp(a) 입자가 또한 내피 투과성을 또한 자극하고, 플라스미노겐 활성제 억제제 1형 발현을 유도하고 대식세포 인터루킨-8 분비를 활성화시킬 수 있다는 것을 제안한다. 중요하게, 최근 유전적 연관성 연구는, Lp(a)가 심근경색증, 뇌졸중, 말초혈관 질환 및 복부 대동맥 동맥류에 대한 독립적인 위험 인자라는 것을 밝혔다. 게다가, 조숙한 관상동맥 질환 (PROCARDIS) 연구에서, Clarke 등은 관상동맥 심장병 및 혈장 Lp(a) 농도 사이의 강력한 및 독립적인 연관성을 기재했다. 추가로, Solfrizzi 등은, 증가된 혈청 Lp(a)가 알츠하이머병 (AD)의 증가된 위험과 관려될 수 있다는 것을 제안했다. apo(a)을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 하기에서 이전에 개시되었다: WO2005/000201 및 US 2010-0331390, 이것은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다. Apo(a), ISIS-APOARx을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 그것의 안전성 프로파일을 연구하기 위해 I상 임상시험에서 평가되었다.
Apo (a) 핵산에 대해 표적화된 어떤 접합된 안티센스 화합물
어떤 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 서열번호: 1로서 본원에 편입된 GENBANK® 수납 번호 NM_005577.2; 서열번호: 2로서 편입된 뉴클레오타이드 3230000 내지 3380000로부터 끝이 잘린 유전자은행 수납 번호 NT_007422.12; 서열번호: 3으로서 본원에서 지정된 뉴클레오타이드 65120000 내지 65258000로부터 끝이 잘린 유전자은행 수납 번호 NT_025741.15; 및 서열번호: 4로서 본원에 편입된 유전자은행 수납 번호 NM_005577.1의 서열을 갖는 Apo(a) 핵산에 대해 표적화된다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 접합된 안티센스 화합물은 서열번호: 1-4의 임의의 핵염기 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 상보적이다.
어떤 구현예에서, 서열번호: 1-4의 임의의 핵염기 서열에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물은 서열번호: 12-130, 133, 134의 임의의 것의 핵염기 서열로부터 선택된 적어도 8 개의 연속되는 핵염기 서열을 포함한다. 어떤 구현예에서, 서열번호: 1-4의 임의의 것에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물은 서열번호: 12-130, 133, 134의 임의의 것의 핵염기 서열로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다.
표 A: Apo (a) 서열번호: 1에 대해 표적화된 안티센스 화합물
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Apo(a) 치료적 징후
어떤 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 apo(a)의 발현을 조절하기 위해 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, apo(a)의 발현은 감소된다.
어떤 구현예에서, 대상체를 치료하는 방법이 본원에서 제공되고, 이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 1 이상의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 발명은 대상체를 치료하기 위한 약제학적 조성물에서 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 개체는 apo(a) 관련된 질환을 갖는다. 어떤 구현예에서, 개체는 Lp(a) 관련된 질환을 갖는다. 어떤 구현예에서, 개체는 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애 또는 병태를 갖는다.
어떤 구현예에서, 대상체는 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애 또는 병태를 갖는다.
어떤 구현예에서, 심혈관 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 대동맥 협착증, 동맥류 (예를 들면, 복부 대동맥 동맥류), 협심증, 부정맥, 죽상동맥경화증, 뇌혈관 질환, 관상동맥 질환, 관상동맥 심장병, 이상지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고혈압, 초고트리글리세라이드혈증, 심근경색증, 말초혈관 질환 (예를 들면, 말초 동맥 질환), 뇌졸중 등.
어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 apo(a)에 대해 표적화된 화합물은 심혈관 질환, 장애 또는 병태의 생리적 마커 또는 표현형을 조절한다. 예를 들면, 화합물의 동물에의 투여는 미처리된 동물과 비교하여 동물들에서 LDL 및 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 어떤 구현예에서, 생리적 마커 또는 표현형의 조절은 화합물에 의해 apo(a)의 억제와 연관될 수 있다.
어떤 구현예에서, 심혈관 질환, 장애 또는 병태의 생리적 마커는 정량화가능할 수 있다. 예를 들면, LDL 또는 콜레스테롤 수준은 예를 들면, 표준 지질 시험에 의해 측정도디고 정량화될 수 있다. 그와 같은 마커에 대해, 어떤 구현예에서, 마커는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 이들 값의 임의의 2 개에 의해 규정된 범위까지 줄어들 수 있다.
또한, 그것을 필요로 하는 대상체에서 심혈관 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상을 예방, 치료 또는 개선하는 방법이 본원에서 제공된다. 어떤 구현예에서, 심혈관 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 발병률을 감소시키는 방법이 제공된다. 어떤 구현예에서, 심혈관 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 중증도를 감소시키는 방법이 제공된다. 그와 같은 구현예에서, 본 방법은 치료적으로 효과적인 양의 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 화합물을 그것이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
심혈관 질환, 장애 또는 병태는 수많은 신체적 증상을 특징으로 할 수 있다. 심혈관 질환, 장애 또는 병태와 연관될, 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 증상은 본원에서 기재된 화합물 및 방법로 예방, 치료 개선되건나 그렇지 않으면 조절될 수 있다. 어떤 구현예에서, 증상은 비제한적으로 하기 중 임의의 것일 수 있다: 협심증, 가슴 통증, 숨가쁨, 심계항진, 약화, 현기증, 메스꺼움, 땀흘리기, 빈맥, 서맥, 부정맥, 심방세동, 하지의 팽윤, 청색증, 피로, 실신, 얼굴의 저림, 팔다리의 저림, 근육의 파행 또는 경련, 복부 팽만 또는 열병.
어떤 구현예에서, 대사성 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 고혈당증, 전당뇨병, 당뇨병 (제I형 및 제II형), 비만, 인슐린 저항성, 대사성 증후군 및 당뇨병성 이상지질혈증.
어떤 구현예에서, 본원에 기재된 apo(a)에 대해 표적화된 화합물은 대사성 질환, 장애 또는 병태의 생리적 마커 또는 표현형을 조절한다. 예를 들면, 화합물의 동물에의 투여는 미처리된 동물과 비교하여 동물들에서 글루코오스 및 인슐린 저항성 수준을 감소시킬 수 있다. 어떤 구현예에서, 생리적 마커 또는 표현형의 조절은 화합물에 의해 apo(a)의 억제와 연관될 수 있다.
어떤 구현예에서, 대사성 질환, 장애 또는 병태의 생리적 마커는 정량화가능할 수 있다. 예를 들면, 글루코오스 수준 또는 인슐린 저항성은 당해기술에서 공지된 표준 시험에 의해 측정 및 정량화될 수 있다. 그와 같은 마커에 대해, 어떤 구현예에서, 마커는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 이들 값의 임의의 2 개에 의해 규정된 범위까지 줄어들 수 있다. 또 하나의 예에서, 인슐린 민감도는 당해기술에서 공지된 표준 시험에 의해 측정 및 정량화될 수 있다. 그와 같은 마커에 대해, 어떤 구현예에서, 마커는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 이들 값의 임의의 2 개에 의해 규정된 범위까지 증가될 수 있다.
또한, 그것을 필요로 하는 대상체에서 대사성 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상을 예방, 치료 또는 개선하는 방법이 본원에서 제공된다. 어떤 구현예에서, 대사성 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 발병률을 감소시키는 방법이 제공된다. 어떤 구현예에서, 대사성 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 중증도를 감소시키는 방법이 제공된다. 그와 같은 구현예에서, 본 방법은 치료적으로 효과적인 양의 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 화합물을 그것이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
대사성 질환, 장애 또는 병태는 수많은 신체적 증상을 특징으로 할 수 있다. 대사성 질환, 장애 또는 병태와 연관된, 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 증상은 본원에서 기재된 화합물 및 방법으로 예방, 치료, 개선 또는 그렇지 않으면 조절될 수 있다. 어떤 구현예에서, 증상은 비제한적으로 하기 중 임의의 것일 수 있다: 과도한 소변 생산 (다뇨증), 과도한 갈증 및 증가된 수분 섭취 (조갈증), 흐릿한 시력, 원인불명 체중 감소 및 무기력.
어떤 구현예에서, 염증성 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 대동맥 협착증, 관상동맥 질환 (CAD), 알츠하이머병 및 혈전색전성 질환, 장애 또는 병태. 어떤 혈전색전성 질환, 장애 또는 병태는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 뇌졸중, 혈전증, 심근경색증 및 말초혈관 질환.
어떤 구현예에서, 본원에서 기재된 apo(a)에 대해 표적화된 화합물은 염증성 질환, 장애 또는 병태의 생리적 마커 또는 표현형을 조절한다. 예를 들면, 화합물의 동물에의 투여는 미처리된 동물과 비교하여 동물들에서 염증성 사이토카인 또는 다른 염증성 마커 수준을 감소시킬 수 있다. 어떤 구현예에서, 생리적 마커 또는 표현형의 조절은 화합물에 의해 apo(a)의 억제와 연관될 수 있다.
어떤 구현예에서, 염증성 질환, 장애 또는 병태의 생리적 마커는 정량화가능할 수 있다. 예를 들면, 사이토카인 수준은 당해기술에서 공지된 표준 시험에 의해 측정 및 정량화될 수 있다. 그와 같은 마커에 대해, 어떤 구현예에서, 마커는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 이들 값의 임의의 2 개에 의해 규정된 범위까지 줄어들 수 있다.
또한, 그것을 필요로 하는 대상체에서 염증성 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상을 예방, 치료 또는 개선하는 방법이 본원에서 제공된다. 어떤 구현예에서, 염증성 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 발병률을 감소시키는 방법이 제공된다. 어떤 구현예에서, 염증성 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 중증도를 감소시키는 방법이 제공된다. 그와 같은 구현예에서, 본 방법은 치료적으로 효과적인 양의 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 화합물을 그것이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
어떤 구현예에서, apo(a) 관련된 질환, 장애 또는 병태가 있는 개체를 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료적으로 효과적인 양의 1 이상의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, 개체는 apo(a) 수준을 갖는다. 어떤 구현예에서, Lp(a) 관련된 질환, 장애 또는 병태가 있는 개체를 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료적으로 효과적인 양의 1 이상의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, 개체는 상승된 Lp(a) 수준을 갖는다. 어떤 구현예에서, 개체는 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애 또는 병태를 갖는다. 어떤 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양의 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 안티센스 화합물의 투여는 apo(a) 또는 Lp(a) 수준의 모니터링이 동반된다. 어떤 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양의 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 안티센스 화합물의 투여는 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 또는 apo(a)의 발현과 연관된 다른 질환 과정의 마커의 모니터링에 의해 동반되어, 안티센스 화합물에 대한 개체의 반응을 측정한다. apo(a)를 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 반응은 의사에 의해 사용되어 화합물와의 치료적 개인의 양 및 지속시간을 측정할 수 있다.
어떤 구현예에서, apo(a) 핵산에 대해 표적화된 안티센스 화합물의 투여로 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 이들 값의 임의의 2 개에 의해 규정된 범위까지 apo(a) 발현이 감소된다. 어떤 구현예에서, apo(a) 발현은 적어도 ≤ 100 mg/dL, ≤ 90 mg/dL, ≤ 80 mg/dL, ≤ 70 mg/dL, ≤ 60 mg/dL, ≤ 50 mg/dL, ≤ 40 mg/dL, ≤ 30 mg/dL, ≤20 mg/dL 또는 ≤ 10 mg/dL로 감소된다.
어떤 구현예에서, apo(a) 핵산에 대해 표적화된 안티센스 화합물의 투여로 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 이들 값의 임의의 2 개에 의해 규정된 범위까지 Lp(a) 발현이 감소된다. 어떤 구현예에서, Lp(a) 발현은 적어도 ≤ 200 mg/dL, ≤ 190 mg/dL, ≤ 180 mg/dL, ≤ 175 mg/dL, ≤ 170 mg/dL, ≤ 160 mg/dL, ≤ 150 mg/dL, ≤ 140 mg/dL, ≤ 130 mg/dL, ≤ 120 mg/dL, ≤ 110 mg/dL, ≤ 100 mg/dL, ≤ 90 mg/dL, ≤ 80 mg/dL, ≤ 70 mg/dL, ≤ 60 mg/dL, ≤ 55 mg/dL, ≤ 50 mg/dL, ≤ 45 mg/dL, ≤ 40 mg/dL, ≤ 35 mg/dL, ≤ 30 mg/dL, ≤ 25 mg/dL, ≤ 20 mg/dL, ≤ 15 mg/dL, 또는 ≤ 10 mg/dL로 감소된다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 약제의 제조에서 apo(a) 핵산에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, apo(a)에 대해 표적화된 접합된 안티센스 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 염증성, 심혈관 및/또는 대사성 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 그것에 민감한 환자를 치료하는 약제의 제조에 사용된다.
Apo (a) 치료 모집단
높은 Lp(a) 수준을 갖는 어떤 대상체는 다양한 질환의 유의미한 위험에 처해 있다 (Lippi 등, Clinica Chimica Acta, 2011, 412:797-801; Solfrizz 등). 높은 Lp(a) 수준을 갖는 많은 대상체에서, 현재 치료는 안전한 수준으로 그것의 Lp(a) 수준을 감소시킬 수 없다. Apo(a)는 Lp(a)의 형성에 중요한 역할을 하고, 따라서 apo(a)의 감소는 Lp(a)를 감소시킬 수 있고 Lp(a)와 연관된 질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.
어떤 구현예에서, 본원에서 개시된 화합물 및 방법에 의한 치료는 상승된 apo(a) 수준 및/또는 Lp(a) 수준을 갖는 인간 동물에 대해 명시된다. 어떤 구현예에서, 인간은 apo(a) 수준 ≥ 10 mg/dL, ≥ 20 mg/dL, ≥ 30 mg/dL, ≥ 40 mg/dL, ≥ 50 mg/dL, ≥ 60 mg/dL, ≥ 70 mg/dL, ≥ 80 mg/dL, ≥ 90 mg/dL 또는 ≥ 100 mg/dL를 갖는다. 어떤 구현예에서, 인간은 Lp(a) 수준 ≥ 10 mg/dL, ≥ 15 mg/dL, ≥ 20 mg/dL, ≥ 25 mg/dL, ≥ 30 mg/dL, ≥ 35 mg/dL, ≥ 40 mg/dL, ≥ 50 mg/dL, ≥ 60 mg/dL, ≥ 70 mg/dL, ≥ 80 mg/dL, ≥ 90 mg/dL, ≥ 100 mg/dL, ≥ 110 mg/dL, ≥ 120 mg/dL, ≥ 130 mg/dL, ≥ 140 mg/dL, ≥ 150 mg/dL, ≥ 160 mg/dL, ≥ 170 mg/dL, ≥ 175 mg/dL, ≥ 180 mg/dL, ≥ 190 mg/dL, ≥ 200 mg/dL를 갖는다.
D. 어떤 약제학적 조성물
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 1 이상의 안티센스 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 약제학적 조성물은 적당한 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 보균자를 포함한다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 멸균한 염수 용액 및 1 이상의 안티센스 화합물을 포함한다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 약제학적 조성물은 멸균한 염수 용액 및 1 이상의 안티센스 화합물로 구성된다. 어떤 구현예에서, 멸균한 염수는 약품 등급 염수이다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 이상의 안티센스 화합물 및 멸균수를 포함한다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 이상의 안티센스 화합물 및 멸균수로 구성된다. 어떤 구현예에서, 멸균한 염수는 약품 등급 물이다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 이상의 안티센스 화합물 및 포스페이트-완충된 염수 (PBS)를 포함한다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 이상의 안티센스 화합물 및 멸균한 포스페이트-완충된 염수 (PBS)로 구성된다. 어떤 구현예에서, 멸균한 염수는 약품 등급 PBS이다.
어떤 구현예에서, 안티센스 화합물은 약제학적 조성물 또는 제형의 제조를 위해 약제학적으로 허용가능한 활성 및/또는 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 약제학적 조성물의 제형을 위한 조성물 및 방법은 투여 경로, 질환 정도, 또는 투여될 용량을 비제한적으로 포함하는 수많은 기준에 의존한다.
안티센스 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 그와 같은 에스테르의 염을 포함한다. 어떤 구현예에서, 안티센스 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은, 인간을 포함하는 동물에게 투여시, (직접적으로 또는 간접적으로) 생물학적 활성 대사물 또는 그것의 잔류물을 제공할 수 있는 1 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 본 개시내용은 또한 안티센스 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염, 전구약물, 그와 같은 전구약물의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 다른 생물동등성에 관한 것이다. 적당한 약제학적으로 허용가능한 염은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 나트륨 및 칼륨 염.
전구약물은 활성 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위해 신체 내의 내인성 뉴클레아제에 의해 절단된 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 둘 모두의 말단에서 추가의 뉴클레오사이드의 편입을 또한 포함할 수 있다.
지질 모이어티는 다양한 방법으로 핵산 치료에서 사용되었다. 어떤 그와 같은 방법에서, 핵산은 양이온성 지질 및 중성 지질의 혼합물로 만들어진 미리형성된 리포좀 또는 리포플렉스에 도입된다. 어떤 방법에서, 모노- 또는 폴리-양이온성 지질을 갖는 DNA 복합체는 중성 지질의 존재없이 형성된다. 어떤 구현예에서, 지질 모이어티는 특정한 세포 또는 조직에 대한 약제의 분포를 증가시키기 위해 선택된다. 어떤 구현예에서, 지질 모이어티는 지방 조직에 대한 약제의 분포를 증가시키기 위해 선택된다. 어떤 구현예에서, 지질 모이어티는 근육 조직에 대한 약제의 분포를 증가시키기 위해 선택된다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 1 이상의 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 1 이상의 부형제를 포함한다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀라아제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈로부터 선택된다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 전달 시스템을 포함한다. 전달 시스템의 예는, 비제한적으로, 리포좀 및 에멀젼을 포함한다. 어떤 전달 시스템은 소수성 화합물을 포함하는 것을 포함하는 어떤 약제학적 조성물을 제조하는데 유용하다. 어떤 구현예에서, 어떤 유기 용매 예컨대 디메틸설폭사이드가 사용된다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 본 개시내용의 1 이상의 약제를 특정 조직 또는 세포형에 전달하기 위해 설계된 1 이상의 조직-특이적 전달 분자를 포함한다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 조직-특이적 항체로 코팅된 리포좀을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 보조용매 시스템을 포함한다. 그와 같은 보조용매 시스템의 어떤 것은, 예를 들면, 벤질 알코올, 무극성 계면활성제, 수-혼화성 유기 폴리머, 및 수성상을 포함한다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 보조용매 시스템은 소수성 화합물을 위해 사용된다. 그와 같은 보조용매 시스템의 비-제한적인 예는 VPD 보조용매 시스템이고, 이것은 3% w/v 벤질 알코올, 8% w/v의 무극성 계면활성제 Polysorbate 80TM 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300을 포함하는 무수 에탄올의 용액이다. 그와 같은 보조용매 시스템의 부분은 그것의 용해도 및 독성 특성을 유의미하게 변경시키기 않으면서 상당히 변화될 수 있다. 더욱이, 보조용매 구성성분의 동일성은 변할 수 있고: 예를 들면, 다른 계면활성제는 Polysorbate 80TM 대신에 사용될 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜의 분획 크기는 변할 수 있고; 다른 생체적합성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면, 폴리비닐 피롤리돈를 대신할 수 있다; 및 다른 당류 또는 다당류는 덱스트로오스 대신에 치환될 수 있다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제조된다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 구강 투여용으로 제조된다.
어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사 투여용으로 제조된다 (예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 등). 그와 같은 구현예의 어떤 것에서, 약제학적 조성물은 보균자를 포함하고 수용액, 예컨대 물 또는 생리적으로 양립가능한 버퍼 예컨대 한스 용액, 링거액, 또는 생리적 염수 버퍼에서 제형된다. 어떤 구현예에서, 다른 성분이 포함된다 (예를 들면, 용해도에 도움이 되거나 보존제로서 쓰이는 성분). 어떤 구현예에서, 주사가능 서스펜션은 적절한 액체 보균자, 현탁화제 등을 사용하영 제조된다. 주사용 어떤 약제학적 조성물은, 예를 들면, 앰풀 또는 다중-용량 용기에서단위 투여 형태로 제공된다. 주사용 어떤 약제학적 조성물은 오일성 또는 수성 비히클에서 서스펜션, 용액 또는 에멀젼이고, 제형제 예컨대 현탁화제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 주사용 약제학적 조성물에서 사용하는데 적당한 어떤 용매는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 친지질성 용매 및 지방 오일, 예컨대 참께 오일, 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드, 및 리포좀. 수성 주사 서스펜션은 서스펜션, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 임의로, 그와 같은 서스펜션은 고농축 용액의 제조를 허용하도록 약제의 용해도를 증가시키는 적당한 안정제 및 제제들을 또한 함유할 수 있다.
어떤 구현예에서, 약제학적 조성물은 점막통과 투여용으로 제조된다. 그와 같은 구현예의 어떤 것에서 침투될 배리어에 적절한 침투제는 제형에서 사용된다. 그와 같은 침투제는 일반적으로 당해기술에서 공지되어 있다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 올리고뉴클레오타이드를 치료적으로 효과적인 양으로 포함한다. 어떤 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양은 질환의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나 치료될 대상체의 생존을 지속하는데 충분하다. 치료적으로 효과적인 양의 결정은 당해분야의 숙련가의 능력 내에 있다.
어떤 구현예에서, 본원에서 제공된 1 이상의 변형된 올리고뉴클레오타이드는 전구약물로서 제형된다. 어떤 구현예에서, 생체내 투여 시, 전구약물은 생물학적으로, 약제학적으로 또는 치료적으로 더 많은 활성 형태의 올리고뉴클레오타이드로 화학적으로 전환된다. 어떤 구현예에서, 전구약물이 유용한 것은, 상응하는 활성 형태보다 투여가 더 쉽기 때문이다. 예를 들면, 어떤 예에서, 전구약물은 상응하는 활성 형태인 것보다(예를 들면, 경구 투여를 통해) 더 생체이용가능할 수 있다. 어떤 예에서, 전구약물은 상응하는 활성 형태와 비교하여 개선된 용해도를 가질 수 있다. 어떤 구현예에서, 전구약물은 상응하는 활성 형태보다 덜 수용성이다. 어떤 예에서, 그와 같은 전구약물은 세포막을 가로지르는 우수한 전달을 가지며, 여기서 수용해도는 이동도에 해롭다. 어떤 구현예에서, 전구약물은 에스테르이다. 어떤 그와 같은 구현예에서, 에스테르는, 투여 시 카복실산으로 대사작용으로 가수분해된다. 어떤 예에서 카복실산 함유 화합물은 상응하는 활성 형태. 어떤 구현예에서, 전구약물은 산 그룹에 결합된 짧은 펩타이드 (폴리아미노산)을 포함한다. 그와 같은 구현예의 어떤 것에서, 펩타이드는 투여히 절단되어 상응하는 활성 형태를 형성한다.
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 세포에서 표적 핵산의 양 또는 활성을 축소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 세포는 동물 내의 것이다. 어떤 구현예에서, 동물은 포유동물이다. 어떤 구현예에서, 동물은 설치류이다. 어떤 구현예에서, 동물은 영장류이다. 어떤 구현예에서, 동물은 비-인간 영장류이다. 어떤 구현예에서, 동물은 인간이다
어떤 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 방법을 제공한다. 적당한 투여 경로, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 경구, 직장, 점막통과, 창자, 장의, 국소, 좌약, 흡입을 통해, 척추강내, 뇌심실내, 복강내, 비강내, 안구내, 종양내, 및 비경구 (예를 들면, 정맥내, 근육내, 수질내, 및 피하). 어떤 구현예에서, 약제학적 척추강내는 전신 노출보다는 오히려 국소를 달성하기 위해 투여된다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 원하는 효과 면적에서 (예를 들면, 간으로) 직접적으로 주입될 수 있다.
참조에 의한 비제한 개시내용 및 편입
본원에서 기재된 어떤 화합물, 조성물 및 방법이 어떤 구현예에 따라 구체적으로 기재되었지만, 하기 실시예는 본원에서 기재된 화합물을 단지 설명하기 위해 쓰이고 그것을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 인용된 각각의 참조, 유전자은행 수납 번호, 등은 본원에 그 전체가 참고로 편입되어 있다.
이러한 제출을 수반하는 서열목록은 요구되는 바와 같은 "RNA" 또는 "DNA"로서 각각의 서열을 확인하지만, 실제로는, 이들 서열은 화학적 변형의 임의의 조합으로 변형될 수 있다. 당해분야의 숙련가는, 변형된 올리고뉴클레오타이드를 기재하기 위한 "RNA" 또는 "DNA"와 같은 명칭이, 어떤 예에서, 임의적이라는 것을 쉽게 인식할 것이다. 예를 들면, 2'-OH 당 모이어티 및 티민 염기를 포함하는 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 변형된 당 (DNA의 천연 2'-H에 대한 2'-OH)을 갖는 DNA로서 또는 변형된 염기 (RNA의 천연 우라실에 대한 티민 (메틸화된 우라실))을 갖는 RNA로서 기재될 수 있다.
따라서, 서열목록에 있는 것들 것 비제한적으로 포함하는 본원에서 제공된 핵산 서열은, 변형된 핵염기를 갖는 그와 같은 핵산을 비제한적으로 포함하는, 천연 또는 변형된 RNA 및/또는 DNA의 임의의 조합을 함유하는 핵산을 포함하는 것으로 의도된다. 추가 실시예에 의해 그리고 비제한적으로, 핵염기 서열 "ATCGATCG"을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 변형 또는 비변형되든지, 그와 같은 화합물을 비제한적으로 포함하는 그와 같은 핵염기 서열을 갖는 임의의 올리고뉴클레오타이드을 포함하고, 상기 화합물은 RNA 염기, 예컨대 서열 "AUCGAUCG"를 갖는 것들 및 일부 DNA 염기 및 일부 RNA 염기 예컨대 "AUCGATCG"를 갖는 것들 및 다른 변형된 염기, 예컨대 "ATmeCGAUCG"를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 meC는 5-위치에서 메틸 그룹을 포함하는 시토신 염기를 나타낸다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 어떤 구현예를 설명하고 제한하지는 않는다. 게다가, 특정 구현예가 제공되는 경우, 본 발명자들 특정 구현예의 포괄적인 적용을 고려했다. 예를 들면, 특정한 모티프를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 개시내용은 동일한 또는 유사한 모티프를 갖는 추가의 올리고뉴클레오타이드에 대한 합리적인 지지를 제공한다. 그리고, 예를 들면, 특정한 고-친화성 변형이 특정한 위치에서 나타나는 경우, 동일한 위치에서의 다른 고-친화성 변형은, 달리 지적되지 않으면 적당한 것으로 고려된다.
실시예 1: 포스포르아미다이트, 화합물 1, 1a 및 2의 일반적인 제조 방법
Figure pct00280
Bx는 헤테로사이클릭 염기이다;
화합물 1, 1a 및 2는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 잘 알려진 당해기술에서 잘 알려진 절차에 따라 제조되었다: (참고 Seth 등, Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic 산 Symposium 시리즈, 2008, 52(1), 553-554); 및 또한 참고 공개된 PCT 국제 출원 (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478, 및 WO 2007/090071), 및 US 특허 7,569,686).
실시예 2: 화합물 7의 제조
Figure pct00281
화합물 3 (2-아세트아미도-1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-데옥시-β-D갈락토파이라노스 또는 갈락토사민 펜타아세테이트)는 시판되고 있다. 화합물 5은 공개된 절차에 따라 제조되었다 (Weber 등, J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).
실시예 3: 화합물 11의 제조
Figure pct00282
화합물 8 및 9는 시판되고 있다.
실시예 4: 화합물 18의 제조
Figure pct00283
화합물 11은 실시예 3에서 실증된 절차에 따라 준비되었다. 화합물 14는 시판되고 있다. 화합물 17은 하기에 의해 보고된 유사한 절차를 사용하여 준비되었다: Rensen 등, J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
실시예 5: 화합물 23의 제조
Figure pct00284
화합물 19 및 21는 시판되고 있다.
실시예 6: 화합물 24의 제조
Figure pct00285
화합물 18 및 23는 실시예 4 및 5에서 실증된 절차에 따라 준비되었다.
실시예 7: 화합물 25의 제조
Figure pct00286
화합물 24은 실시예 6에서 실증된 절차에 따라 준비되었다.
실시예 8: 화합물 26
Figure pct00287
화합물 24은 실시예 6에서 실증된 절차에 따라 준비된다.
실시예 9: GalNAc 3 -1를 3' 말단에서 포함하는 접합된 ASO의 일반적인 제조, 화합물 29
Figure pct00288
Figure pct00289
상기 보호된 GalNAc 3 -1는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00290
콘주게이트 그룹 GalNAc3-1 (GalNAc3-1a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-1a는 하기 식을 갖는다:
Figure pct00291
고형 지지체 결합된 보호된 GalNAc 3 -1, 화합물 25는 실시예 7에서 실증된 절차에 따라 준비되었다. GalNAc 3 -1를 3' 말단에서 포함하는 올리고머 화합물 29는 자동화된 DNA/RNA 합성에서 표준 절차를 사용하여 제조되었다 (참고 Dupouy 등, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627 참고). 포스포르아미다이트 빌딩 블록, 화합물 1 및 1a는 실시예 1에서 실증된 절차에 따라 준비되었다. 실증된 포스포르아미다이트는 대표적이고, 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록이 사용되어 예정된 순서 및 조성을 갖는 올리고 화합물을 제조할 수 있는 것처럼 한정으로서 의도되지 않는다는 것을 의미한다. 고형 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 조정되어 본원에서 기재된 갭핑된 올리고머 화합물을 제조할 수 있다. 그와 같은 갭핑된 올리고머 화합물은 임의의 주어진 표적에 의해 지시되는 바와 같이 예정된 조성물 및 염기 서열을 가질 수 있다.
실시예 10: 5' 말단에서 GalNAc 3 -1을 포함하는 접합된 ASO의 일반적인 제조, 화합물 34
Figure pct00292
Figure pct00293
임의의 링커TM 30는 시판되고 있다. 5' 말단에서 GalNAc 3 -1클러스터를 포함하는 올리고머 화합물 34는 자동화된 DNA/RNA 합성에서 표준 절차를 사용하여 제조된다 (참고 Dupouy 등, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627 참고). 포스포르아미다이트 빌딩 블록, 화합물 1 및 1a는 실시예 1에서 실증된 절차에 따라 준비되었다. 실증된 포스포르아미다이트는 대표적이고, 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록이 사용되어 예정된 순서 및 조성을 갖는 올리고 화합물을 제조할 수 있는 것처럼 한정으로서 의도되지 않는다는 것을 의미한다. 고형 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 조정되어 본원에서 기재된 갭핑된 올리고머 화합물을 제조할 수 있다. 그와 같은 갭핑된 올리고머 화합물은 임의의 주어진 표적에 의해 지시되는 바와 같이 예정된 조성물 및 염기 서열을 가질 수 있다.
실시예 11: 화합물 39의 제조
Figure pct00294
Figure pct00295
화합물 4, 13 및 23는 실시예 2, 4, 및 5에서 실증된 절차에 따라 준비되었다. 화합물 35는 하기에서 공지된 유사한 절차를 사용하여 준비된다: Rouchaud 등, Eur. J. Org. Chem., 2011, 12, 2346-2353.
실시예 12: 화합물 40의 제조
Figure pct00296
화합물 38은 실시예 11에서 실증된 절차에 따라 준비된다.
실시예 13: 화합물 44의 제조
Figure pct00297
Figure pct00298
화합물 23 및 36은 실시예 5 및 11에서 실증된 절차에 따라 준비된다. 화합물 41는 하기에서 공지된 유사한 절차를 사용하여 준비된다: WO 2009082607.
실시예 14: 화합물 45의 제조
Figure pct00299
화합물 43은 실시예 13에서 실증된 절차에 따라 준비된다.
실시예 15: 화합물 47의 제조
Figure pct00300
화합물 46는 시판되고 있다.
실시예 16: 화합물 53의 제조
Figure pct00301
화합물 48 및 49는 시판되고 있다. 화합물 17 및 47은 실시예 4 및 15에서 실증된 절차에 따라 준비된다.
실시예 17: 화합물 54의 제조
Figure pct00302
화합물 53은 실시예 16에서 실증된 절차에 따라 준비된다.
실시예 18: 화합물 55의 제조
Figure pct00303
화합물 53은 실시예 16에서 실증된 절차에 따라 준비된다.
실시예 19: 3' 고체상 기술을 통해 위치에서 GalNAc 3 -1을 포함하는 접합된 ASO의 일반적인 제조 방법 (ISIS 647535, 647536 및 651900의 제조)
달리 언급되지 않으면, 올리고머 화합물의 합성을 위해 사용된 모든 시약 및 용액은 상업적 공급원으로부터 구매된다. 표준 포스포르아미다이트 빌딩 블록 및 고체 지지체는, 예를 들면 T, A, G, 및 mC 잔기를 포함하는 뉴클레오사이드 잔기의 혼입을 위해 사용된다. 무수 아세토니트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1 M 용액을 b-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 및 2'-MOE에 사용하였다.
ASO 합성은 ABI 394 합성기 (1-2 μmol 규모) 상에서, 또는 칼럼에 충전된 GalNAc 3 -1 로딩된 VIMAD 고형 지지체 (110 μmol/g, Guzaev 등, 2003) 상에서 포스포르아미다이트 커플링 방법에 의해 GE Healthcare Bioscience
Figure pct00304
올리고파일럿 합성기 (40-200 μmol 규모) 상에서 수행되었다. 커플링 단계에 대해, 포스포르아미다이트는 고형 지지체 상에 로딩 4 배 과잉으로 전달되었고 포스포르아미다이트 축합은 10 분 동안 수행되었다. 모든 다른 단계는 제조자에 의해 공급된 표준 프로토콜을 따랐다. 톨루엔 중 6% 디클로로아세트산의 용액은 디메톡시트리틸 (DMT) 그룹을 뉴클레오타이드의 5'-하이드록실 그룹로부터 제거하기 위해 사용되었다. 무수 CH3CN 중 4,5-디시아노이미다졸 (0.7 M)은 커플링 단계 동안에 활성제로서 사용되었다. 포스포로티오에이트 연결을 3분의 접촉 시간 동안에 1:1 피리딘/CH3CN 중의 크산탄 하이드라이드의 0.1 M 용액을 이용한 황화에 의해 도입하였다. 6% 물을 함유하는 CH3CN 중의 20% tert-부틸하이드로퍼옥사이드의 용액을 산화제로서 사용하여 12분의 접촉 시간으로 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 제공하였다.
원하는 서열이 조립된 후, 시아노에틸 포스페이트 보호 그룹은 45 분의 접촉 시간과 함께 트리에틸아민 및 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물을 사용하여 탈보호되었다. 상기 고체-지지체 결합된 ASO를 암모니아수 (28-30 중량 %)에 현탁시키고 55 ℃에서 6시간 동안 가열하였다.
그리고 나서, 미결합된 ASO를 여과하고 암모니아를 가열로 제거하였다. 잔류물을 강한 음이온 교환 칼럼 상에서 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다(GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 μm, 2.54 x 8 cm, A = 30% 수성 CH3CN 중의 100 mM 암모늄 아세테이트, B = A 중의 1.5 M NaBr, 60분에 0-40%의 B, 유량 14 mL min-1, λ = 260 nm). 잔류물을 역상 칼럼 상의 HPLC에 의해 탈염하여, 고체 지지체 상의 초기 로딩을 기준으로 15-30%의 단리된 수율로 원하는 ASO를 얻었다. ASO를 Agilent 1100 MSD 시스템을 갖는 이온-쌍-HPLC 커플링된 MS 분석에 의해 규명하였다.
콘주게이트를 포함하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당해기술에서 잘 알려진 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 절차를 사용하여 합성되었다.
이들 방법을 사용하여, ApoC III을 표적으로 하는 3 개의 별개의 안티센스 화합물이 제조되었다. 아래의 표 17에서 요약된 바와 같이, 각각의 ApoC III를 표적으로 하는 3 개의 안티센스 화합물은 동일한 핵염기 서열을 가졌고; ISIS 304801는 모든 포스포로티오에이트 연결을 갖는 5-10-5 MOE 갭머이고; ISIS 647535은 ISIS 304801와 동일하고, 단, 3' 말단에서 접합된 GalNAc 3 -1을 가졌고; 그리고 ISIS 647536은 ISIS 647535와 동일하고, 단, 상기 화합물의 어떤 뉴클레오사이드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 표 17에서 추가로 요약된 바와 같이, SRB-1을 표적으로 하는 2 개의 별개의 안티센스 화합물이 합성되었다. ISIS 440762는 모든 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 갖는 2-10-2 cEt 갭머였고; ISIS 651900는 ISIS 440762와 동일하고, 단, 3'-말단에서 GalNAc 3 -1을 포함했다.
표 17
ApoC III 및 SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00305
하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "k"는 6'-(S)-CH3 바이사이클릭 뉴클레오사이드 (예를 들면 cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "GalNAc 3 -1"는 실시예 9에서 이전에 보여진 구조를 갖는 콘주게이트 그룹을 나타낸다. GalNAc 3 -1은 ASO를 "GalNAc 3 -1 a "인 것으로 지정된 콘주게이트의 나머지에 연결하는 절단가능 아데노신을 포함하는 것에 주목한다. 이러한 명명법은 콘주게이트의 일부인 아테노신을 포함하는 완전한 핵염기 서열을 보여주기 위해 상기 표에서 사용된다. 따라서, 상기 표에서, 서열은 "GalNAc 3 -1"와 함께 생략된 "A do "로 종료되는 바와 같이 또한 열거될 수 있었다. 절단가능 뉴클레오사이드 또는 절단가능 모이어티가 없는 콘주게이트 그룹의 부분을 나타내기 위해 하첨자 "a"를 사용하는 이러한 관례는 이들 실시예를 통해 사용된다. 절단가능 모이어티가 없는 콘주게이트 그룹의 이러한 부분은 "클러스터" 또는 "콘주게이트 클러스터" 또는 "GalNAc3 클러스터"로서 본원에서 칭해진다. 어떤 예에서 그것의 클러스터 및 그것의 절단가능 모이어티를 별도로 제공하여 콘주게이트 그룹을 기재하는 것이 편리하다.
실시예 20: huApoC III 이식유전자 마우스에서 인간 ApoC III의 용량-의존적 안티센스 억제
인간 ApoC III를 각각 표적으로 하고 상기에서 기재된 ISIS 304801 및 ISIS 647535는, 별도로 시험되었고 인간 ApoC III 이식유전자 마우스에서 인간 ApoC III을 억제하기 위한 그것의 능력에 대한 용량-의존적 연구에서 평가되었다.
처리
인간 ApoCIII 이식유전자 마우스는 12-시간 명/암 사이클에서 유지되었고 임의로 Teklad 실험실 초우에 제공되었다. 동물은 실험의 개시 전 연구 시설에서 적어도 7일 동안 순응되었다. ASO는 PBS에서 제조되었고 0.2 마이크론 필터를 통한 필터링으로 멸균되었다. ASO는 주사를 위해 0.9PBS %에서 용해되었다.
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에게 복강내로 2 주 동안 1주 1회 ISIS 304801 또는 647535가 0.08, 0.25로 주입되었다. 0.75, 2.25 또는 6.75 μmol/kg 또는 PBS 대조군으로서. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 마지막 용량의 투여 48 시간 후, 혈액을 각 마우스로부터 뽑고 그리고 마우스는 희생되었고 조직은 수집되었다.
ApoC III mRNA 분석
마우스의 간 중 ApoC III mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). ApoC III mRNA 수준은 PBS-처리된 대조군에 대한 정상화 전에 (리보그린을 사용하여) 총 RNA에 대해 결정되었다. 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 ApoC III mRNA 수준의 평균 퍼센트로버 제공되고, "PBS %"로서 나타낸다. 각 ASO의 반 최대 효과적인 복용량 (ED50)은 아래의 표 18에서 또한 제공된다.
실증된 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 PBS 대조군에 대한 ApoC III RNA를 감소시켰다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 접합된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다.
표 18
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에서 ApoC III mRNA 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00306
ApoC III 단백질 분석 (비탁 검정)
혈장 ApoC III 단백질 분석은 하기에 의해 보고된 절차를 사용하여 결정되었다: Graham 등, Circulation Research, 2013년 3월 29일 인쇄 전에 온라인에서공개.
마우스로부터 단리된 대략 100 μl의 혈장은 Olympus 임상 분석기 및 시판되는 비탁 ApoC III 검정을 사용하여 희석없이 분석되었다 (Kamiya, Cat# KAI-006, Kamiya Biomedical, Seattle, WA). 검정 프로토콜은 판매인에 의해 기재된 바와 같이 수행되었다.
아래의 표 19에서 보여진 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 PBS 대조군에 대한 ApoC III 단백질을 감소시켰다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 접합된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다.
표 19
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에서 ApoC III 혈장 단백질 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00307
혈장 트리글리세라이드 및 콜레스테롤은 블라이 및 다이어 (Bligh, 예를 들면 및 Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959)(Bligh, E 및 Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959)(Bligh, E 및 Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959)의 방법에 의해 추출되었고, Beckmann Coulter 임상 분석기 및 시판되는 시약을 사용하여 측정되었다.
트리글리세라이드 수준은 PBS 주입된 마우스에 대해 측정되었고 "PBS %"로서 나타낸다. 결과는 표 20에서 제공된다. 실증된 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 트리글리세라이드 수준을 낮게 했다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 접합된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다.
표 20
이식유전자 마우스에서 트리글리세라이드 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00308
혈장 샘플은 HPLC에 의해 분석되어 총 콜레스테롤 및 콜레스테롤 (HDL 및 LDL)의 상이한 분획의 양을 결정했다. 결과는 표 21 및 22에서 제공된다. 실증된 바와 같이, 안티센스 화합물 둘 모두는 총 콜레스테롤 수준을 낮게 했고; 둘 모두는 LDL을 낮게 했고; 그리고 둘 모두는 HDL을 상승시켰다. 게다가, GalNAc 3 -1 (ISIS 647535)에 접합된 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강했다. HDL의 증가 및 LDL 수준의 감소는 ApoC III의 안티센스 억제의 심혈관 유익한 효과이다.
표 21
이식유전자 마우스에서 총 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리의 효과
표 22
이식유전자 마우스에서 HDL 및 LDL 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00310
약동학 분석 (PK)
ASO의 PK가 또한 평가되었다. 간 및 신장 샘플은 다져졌고 표준 프로토콜을 사용하여 추출되었다. 샘플은 IP-HPLC-MS을 이용하여 MSD1 상에서 분석되었다. 전장 ISIS 304801 및 647535의 조직 수준 (μg/g)은 측정되었고 결과는 표 23에서 제공된다. 실증된 바와 같이, 총 전장 안티센스 화합물의 간 농도는 2 개의 안티센스 화합물에 대해 유사했다. 따라서, GalNAc 3 -1 접합된 안티센스 화합물기 (상기의 RNA 및 단백질 데이터에 의해 실질되는 바와 같이) 간에서 활성이 더 많을 지라도, 간에서 실질적으로 더 높은 농도로 존재하지 않는다. 사실상, 계산된 EC50 (표 23에서 제공)은, 접합된 화합물의 효능의 관찰된 증가가 증가된 축적에 전적으로 기인할 수 없다는 것을 확인해 준다. 이러한 결과는, 콘주게이트가 안티센스 화합물의 세포로의 생산적인 흡수를 가능하게 개선하여 간 축적 단독 이외의 기전에 의해 효능을 개선했다는 것을 암시한다.
상기 결과는 또한, 신장 중 GalNAc 3 -1 접합된 안티센스 화합물의 농도가 GalNAc 콘주게이트가 없는 안티센스 화합물의 농도보다 더 낮다는 것을 보여준다. 이것은 몇 개의 유익한 치료적 연루성을 갖는다. 신장에서의 활성이 추구되지 않는 치료적 징후에 대해, 신장에의 노출은 상응하는 이점 없이 신장 독성을 위태롭게 한다. 게다가, 신장의 고농도는 전형적으로 화합물의 소변으로 손실을 야기하고, 이로써 더 빠른 청소능을 얻는다. 따라서, 비-신장 표적에 대해, 신장 축적은 원치 않는다. 이들 데이타는, GalNAc 3 -1 콘주게이션이 신장 축적을 축소시킨다는 것을 암시한다.
표 23
이식유전자 마우스에서 ASO 처리의 PK 분석
Figure pct00311
ISIS 647535의 대사물이 또한 확인되었고, 그것의 질량은 고분해능 질량 분광분석법 분석에 의해 확인되었다. 관찰된 대사물의 절단 부위 및 구조는 아래에서 보여진다. 전장 ASO의 상대 %는 표준 절차를 사용하여 계산되었고 결과는 표 23a에서 제공된다. ISIS 647535의 주요 대상물은 아래에서 보여진 절단 부위 A에서의 절단을 야기하는 전체 콘주게이트 (즉 ISIS 304801)가 없는 전장 ASO였다. 게다가, 다른 절단 부위로부터 수득된 추가 대상물이 또한 관찰되었다. 이들 결과는, 다른 절단가능 결합 예컨대 에스테르, 펩타이드, 디설파이드, 포스포르아미데이트 또는 아실-하이드라존을 GalNAc 3 -1 당과 ASO (이것은 세포 내의 효소에 의해 절단될 수 있거나, 사이토졸의 환원 환경에서 전달될 수 있거나 엔도솜 및 리소좀 내의 산성 pH에 대해 불안정함) 사이에 도입하는 것이 또한 유용할 수 있다는 것을 암시한다.
표 23a
ISIS 647535의 관찰된 전장 대사물
Figure pct00312
Figure pct00313
Figure pct00314
실시예 21: 단일 투여 연구에서 인간 ApoC III 이식유전자 마우스에서 인간 ApoC III의 안티센스 억제
인간 ApoC III를 표적으로 하고 표17에서 기재된 ISIS 304801, 647535 및 647536 각각은, 인간 ApoC III 이식유전자 마우스 인간 ApoC III을 억제하기 위해 그것의 능력에 대한 단일 투여 연구에서 추가로 평가되었다.
처리
인간 ApoCIII 이식유전자 마우스는 12-시간 명/암 사이클에서 유지되었고 임의로 Teklad 실험실 초우에 공급되었다. 동물은 실험의 개시 전 연구 시설에서 적어도 7 일 동안 순응되었다. ASO는 PBS에서 제조되었고 0.2 마이크론 필터을 통해 여과하여 멸균되었다. ASO는 주사를 위해 0.9PBS %에서 용해되었다.
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에게 복강내로 1 회 아래에서 보여진 복용량으로 ISIS 304801, 647535 또는 647536 (상기에서 기재됨) 또는 PBS 처리된 대조군이 주입되었다. 처리 그룹은 3마리의 동물로 구성되었고 대조군 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 처리 전에 뿐만 아니라 마지막 용량 후에, 혈액을 각 마우스로부터 채혈하고 혈장 샘플을 분석하였다. 마우스는 마지막 투여 72 시간 후에 희생되었다.
샘플은 수집되고 분석되어 HDL 및 LDL 분획을 포함하는간; 혈장 트리글리세라이드; 및 콜레스테롤에서 ApoC III mRNA 및 단백질 수준을 결정하고, 상기에서 기재된 바와 같이 평가되었다 (실시예 20). 이들 분석으로부터의 데이타는 아래의 표 24-28에서 제공된다. 혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. ALT 및 AST 수준은, 안티센스 화합물이 모든 투여된 용량으로 용인되었다는 것을 보여주었다.
이들 결과는 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 304801)가 없는 안티센스 화합물과 비교하여 3' 말단 (ISIS 647535 및 647536)에서 GalNAc 3 -1 콘주게이트를 포함하는 안티센스 화합물에 대한 효능의 개선을 보여준다. 게다가, GalNAc 3 -1 콘주게이트 및 일부 포스포디에스테르 연결을 포함하는 ISIS 647536은 동일한 콘주게이트를 포함하는 ISIS 647535만큼 강력했고, ASO 내의 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
표 24
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에서 ApoC III mRNA 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00315
표 25
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에서 ApoC III 혈장 단백질 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00316
표 26
이식유전자 마우스에서 트리글리세라이드 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00317
표 27
이식유전자 마우스에서 총 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00318
표 28
이식유전자 마우스에서 HDL 및 LDL 콜레스테롤 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00319
이들 결과는, GalNAc 3 -1 콘주게이트가 안티센스 화합물의 효능을 개선한다는 것을 확인한다. 결과는 또한, GalNAc 3 -1 접합된 안티센스 화합물의 동등한 효능을 보여주고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 혼합된 연결 (6개의 포스포디에스테르 연결을 갖는 ISIS 647536) 및 동일한 안티센스 화합물의 완전한 포스포로티오에이트 버전 (ISIS 647535)을 갖는다.
포스포로티오에이트 연결은 안티센스 화합물에 대한 몇 개의 특성을 제공한다. 예를 들면, 뉴클레아제 소화에서 저장하고 단백질에 결합하고, 이것은 신장/소변에서보다 간에서 화합물의 축적을 야기한다. 이들은, 특히 간에서 조짐을 치료할 때 바람직한 특성이다. 그러나, 포스포로티오에이트 연결은 또한 염증성 반응과 연관되었다. 따라서, 화합물 중 포스포로티오에이트 연결의 수를 감소시키는 것은 염증의 위험, 뿐만 아니라 간에서 저농도의 화합물을 감소시키고, 신장 및 소변에서 농도를 증가시키고, 뉴클레아제의 존재에서의 안정성을 증가시키고, 더 낮은 전체 효능을 낮추는 것으로 기대된다. 본 결과는, 어떤 포스포로티오에이트 연결이 포스포디에스테르 연결로 대체되었던 GalNAc 3 -1 접합된 안티센스 화합물이 완전한 포스포로티오에이트 연결을 갖는 대응물로서 간에서 표적에 대항하여 강력하다는 것을 보여준다. 그와 같은 화합물은 전염증이 덜한 것으로 기재된다 (PS의 축소를 보여주는 실험은 감소된 염증성 효과를 야기한다는 것을 기재하는 실시예 24 참고).
실시예 22: 생체내에서 SRB-1을 표적으로 하는 GalNAc 3 -1 접합된 변형된 ASO의 효과
SRB-1을 표적으로 하고 표 17에서 기재된 ISIS 440762 및 651900 각각을 대상으로 Balb/c 마우스에서 SRB-1을 억제하는 그 능력을 용량-의존적 연구에서 평가하였다.
처리
6주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 440762, 651900 또는 PBS 처리된 대조군을하기에 제시된 복용량으로 피하로 1회 주입하였다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). SRB-1 mRNA 수준을 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화하기 전에 총 RNA에 대해 결정하였다(리보그린을 이용하여). 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대해 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제공되고, "PBS %"로서 나타낸다.
표 29에서 입증된 바와 같이, 두 안티센스 화합물들은 SRB-1 mRNA 수준을 낮추었다. 게다가, GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 651900)을 포함하는 안티센스 화합물은 GalNAc 3 -1 콘주게이트 (ISIS 440762)가 없는 안티센스 화합물보다 실질적으로 더 강력하였다. 이들 결과는, GalNAc 3 -1 콘주게이트의 효능 이점이 상이한 표적에 대해 상보적이고 상이한 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 관찰된다는 것을 입증하고, 이러한 예에서 변형된 뉴클레오사이드는 제한된 에틸 당 모이어티 (바이사이클릭 당 모이어티)를 포함한다.
표 29
Balb/c 마우스에서 SRB-1 mRNA 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00320
실시예 23: 인간 말초 혈액 단핵 세포 (hPBMC) 검정 프로토콜
hPBMC 검정은 BD Vautainer CPT 튜브 방법을 사용하여 수행하였다. US HealthWorks clinic (Faraday & El Camino Real, Carlsbad)에서 고지에 의한 동의로 자원된 공여체로부터 전혈 샘플을 얻어 4-15 BD 진공채혈기 CPT 8 ml 튜브 (VWR Cat.# BD362753)에 모았다. 각 공여체에 대한 CPT 튜브에서의 대략적인 개시되는 총 전혈액량을 PBMC 검정 데이타 시트를 사용하여 기록하였다.
튜브를 8-10회 뒤집어 원심분리 바로 전에 혈액 샘플을 재혼합하였다. CPT 튜브를브레이크 없이(2700 RPM Beckman Allegra 6R)1500-1800 RCF에서 30분간 수평 (swing-out) 로터에서 실온(18-25 ℃)에서 원심분리하였다. 세포를 버피 코트 계면 (피콜 및 폴리머 겔 층 사이)로부터 회수하고; 멸균한 50 ml 원뿔형 튜브로 옮기고 5 CPT 튜브/50 ml 원뿔형 튜브/공여체까지 모았다. 그리고 나서, 세포를 PBS (Ca++, Mg++없음; GIBCO)로 2회 세정하였다. 튜브를 50 ml까지 가득 채우고몇 번 뒤집어 혼합하였다. 그리고 나서, 샘플을 330 x g에서 15분 동안 실온에서 원심분리하고(Beckman Allegra 6R에서 1215 RPM), 펠렛을 건드리지 않고 가능한 한 많은 상청액을 흡인하였다. 튜브를 와류시켜 세포 펠렛을 제거하고 RPMI+10% FBS+펜/스트렙 (~1 ml / 10 ml 시작하는 전혈량)에서 세포를 재현탁시켰다. 60 μl 샘플을 600 μl VersaLyse 시약 (Beckman Coulter Cat# A09777)을 갖는 샘플 바이알 (Beckman Coulter) 내로 피펫팅하고 10-15초 동안 부드럽게 볼텍싱하였다. 샘플을 10분 동안 실온에서 10분 동안 배양하고 다시 혼합한 후 계수하였다. 세포 현탁액을 PBMC 세포형 (1:11의 희석 인자가 다른 파라미터를 이용하여 보관되었음)을 이용하여 Vicell XR 세포 생존력 분석기 (Beckman Coulter) 상에서 계수하였다. 생존 세포/ml 및 생존력을 기록하였다. 세포 현탁액을 1 x 107 생존 PBMC/ RPMI+ 10% FBS+펜/스트렙 중에서의 ml로 희석하였다.
세포를 50 μl/웰의 96-웰 조직 배양판 (Falcon Microtest)에 5 x 105로 플레이팅하였다. RPMI+10% FBS+펜/스트렙에 희석된 50 μl/웰의 2x 농도 올리고/대조군을 실험 템플레이트 (100 μl/웰 총)에 따라 부가하였다. 플레이트를 진탕기에 놓고 대략 1분간 혼합하였다. 37 ℃에서 24시간 동안 배양한 후; 5% CO2, 플레이트를 400 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음 MSD 사이토카인 검정 (즉 인간 IL-6, IL-10, IL-8 및 MCP-1)을 위해 상청액을 제거하였다.
실시예 24: GalNAc 3 -1 접합된 ASO를 위한 hPBMC 검정에서의 전염증 효과의 평가
표 30에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO)에 대해 실시예 23에서 기재된 프로토콜을 사용하여 hPBMC 검정에서의 전염증 효과를 평가하였다. ISIS 353512는 검정에서의 IL-6 방출에 대한 고반응군인 것으로 알려진 내부 표준이다. hPBMC를 신선한, 지원된 공여체로부터 단리하고 0, 0.0128, 0.064, 0.32, 1.6, 8, 40 및 200 μM 농도의 ASO로 처리하였다. 24시간 처리 후, 사이토카인 수준을 측정하였다.
IL-6의 수준을 일차 판독으로서 사용하였다. EC50 및 Emax를 표준 절차를 이용하여 계산하였다. 결과는 두 공여체로부터 Emax/EC50의 평균 비로서 표현되고 "Emax/EC50 "로 나타내어진다. 더 낮은 비율은 전염증 반응에서 상대적 감소를 가리키고 더 높은 비율은 전염증 반응에서 상대적 증가를 가리킨다.
시험 화합물과 관련하여, 가장 낮은 전염증 화합물은 PS/PO 연결된 ASO (ISIS 616468)였다. GalNAc 3 -1 접합된 ASO인 ISIS 647535는그의 비-접합된 대응물 ISIS 304801보다 약간 덜 전염증이었다. 이들 결과는, 일부 PO 연결의 혼입이 전염증 반응을 감소시키며 GalNAc 3 -1 콘주게이트의 부가가 화합물을 더 전염증성으로 만들며 전염증 반응을 감소시킬 수 있음을 가리킨다. 따라서, 당업자라면 혼합된 PS/PO 연결 및 GalNAc 3 -1 콘주게이트 모두를 포함하는 안티센스 화합물이 GalNAc 3 -1 콘주게이트를 갖거나 갖지 않는 완벽한 PS 연결된 안티센스 화합물과 비교하여 더 낮은 전염증 반응을 생성할 것임을 예상할 것이다. 이들 결과는, GalNAc 3 -1 접합된 안티센스 화합물, 특히 감소된 PS 함량을 갖는 화합물이 덜 전염증이라는 것을 보여준다.
함께, 이들 결과는, GalNAc 3 -1 접합된 화합물, 특히 감소된 PS 함량을 갖는 화합물이 GalNAc 3 -1 콘주게이트가 없는 대응되는 완전한 PS 안티센스 화합물보다 더 높은 용량으로 투여될 수 있음을 제시한다. 이들 화합물의 경우 반감기가 실질적으로 상이할 것으로 예상되지 않으므로, 그러한 더 높은 투여는 덜 빈번한 복용을 야기할 것이다. 사실상 그러한 투여는 훨씬 덜 빈번할 수 있는데, GalNAc 3 -1 접합된 화합물이 더 강하고(실시예 20-22 참고), 화합물의 농도가 효능에 기초하여 원하는 수준 이하로 떨어지면 재-복용이 필요하기 때문이다.
표 30
변형된 ASO
Figure pct00321
하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "k"는 6'-(S)-CH3 바이사이클릭 뉴클레오사이드 (예를 들면 cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "A do' - GalNAc 3 -1 a "는, 명시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 부착된 실시예 9에 나타난 구조 GalNAc 3 - 1를 갖는 콘주게이트를 가리킨다.
표 31
hPBMC 검정에서 ApoC III를 표적으로 하는 ASO의 전염증 효과
Figure pct00322
실시예 25: 시험관 내에서 인간 ApoC III을 표적으로 하는 GalNAc 3 -1 접합된 변형된 ASO의 효과
상기 기재된 ISIS 304801 및 647535를시험관 내에서 시험하였다. 웰당 25,000 세포의 밀도로 이식유전자 마우스 유래의 일차 간세포 세포를 0.03,0.08, 0.24, 0.74, 2.22, 6.67 및 20 μM 농도의 변형된 올리고뉴클레오타이드로 처리하였다. 대략 16시간의 처리 기간 후, RNA를 상기 세포로부터 분리하고 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하고 hApoC III mRNA 수준을, 리보그린에 의해 측정된 바와 같이, 총 RNA 함량에 따라 조정하였다.
IC50을 표준 방법을 사용하여 계산하였고 그 결과가 표 32에서 제시되어 있다. 예시된 바와 같이, 대조군 ISIS 304801과 비교하여 ISIS 647535로 처리된 세포에서 비교할만한 효능이 관찰되었다.
표 32
일차 간세포에서 인간 ApoC III를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00323
이 실험에서, 생체내에서 관찰된 GalNAc 3 -1 콘주게이션의 큰 효능 이점은시험관 내에서 관찰되지 않았다. 시험관 내에서 일차 간세포에서의 차후의 자유 흡수 실험은 GalNAc 콘주게이트가 없는 올리고뉴클레오타이드(실시예 60, 82, 및 92 참고)와 비교하여 다양한 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 증가된 효능을 나타내지 않았다.
실시예 26: ApoC III ASO 활성에 대한 PO/PS 연결의 효과
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에게 25 mg/kg의 ISIS 304801, 또는 ISIS 616468 (모두 상기에 기재됨)를 1회 복강내로 주입하거나 PBS 처리된 대조군은 2주간 주당 1회 주입하였다. 처리 그룹은 3마리의 동물로 구성되었고 대조군 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 처리 전에 뿐만 아니라 마지막 용량 후에, 혈액을 각 마우스로부터 채혈하고 혈장 샘플을 분석하였다. 마우스를 마지막 투여 72시간 후에 희생시켰다.
샘플을 수집하고 상기에서 기재된 바와 같이(실시예 20)간에서의 ApoC III 단백질 수준을 분석하였다. 이들 분석으로부터의 데이타가 하기 표 33에 나타나 있다.
이들 결과는 전체 PS (ISIS 304801) 대비 윙에서 PO/PS (ISIS 616468)를 갖는 안티센스 화합물의 효능 감소를 보여준다.
표 33
인간 ApoC III 이식유전자 마우스에서 ApoC III 단백질 수준에 대한 ASO 처리의 효과
Figure pct00324
실시예 27: 화합물 56
Figure pct00325
화합물 56은 Glen Research사부터 상업적으로 이용가능하거나 문헌[Shchepinov 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454]에 의해 보고된 공개된 과정에 따라 제조할 수 있다.
실시예 28: 화합물 60의 제조
Figure pct00326
화합물 4를 실시예 2에서 예시된 과정에 따라 제조하였다. 화합물 57는 상업적으로 이용가능하다. 화합물 60을 구조적 분석에 의해 확인하였다.
화합물 57은 대표적인 것으로 여겨지며, 예정된 조성물을 갖는 포스포르아미다이트를 제조하는데 사용될 수 있는 본 명세서에서 제공된 것들을 포함하나 이제 제한되지 않는 다른 모노보호된 치환된 또는 비치환된 알킬 디올로서 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 29: 화합물 63의 제조
Figure pct00327
화합물 61 및 62를 하기에 의해 보고된 것과 유사한 과정을 이용하여 제조한다: Tober 등, Eur. J. Org. Chem., 2013, 3, 566-577; 및 Jiang 등, Tetrahedron, 2007, 63(19), 3982-3988.
대안적으로, 화합물 63을 Kim 등, Synlett, 2003, 12, 1838-1840; 및 Kim 등, 공개된 PCT 국제 출원, WO 2004063208에 의해 과학 및 특허 문헌에 보고된 것과 유사한 과정을 이용하여 제조한다. 실시예 30: 화합물 63b의 제조
Figure pct00328
화합물 63a를 하기에 의해 보고된 것들과 유사한 과정을 이용하여 제조한다: Hanessian 등, Canadian Journal of Chemistry, 1996, 74(9), 1731-1737.
실시예 31: 화합물 63d의 제조
Figure pct00329
화합물 63c를 Chen 등, Chinese Chemical Letters, 1998, 9(5), 451-453에 의해 보고된 것들과 유사한 과정을 이용하여 제조한다.
실시예 32: 화합물 67의 제조
Figure pct00330
화합물 64는 실시예 2에 예시된 과정에 따라 제조하였다. 화합물 65는 Or 등,</ i0>공개된 PCT 국제 출원, WO 2009003009에 의해 보고된 것들과 유사한 과정을 이용하여 제조된다. 화합물 65에 대해 사용된 보호 그룹은 대표적인 것을 의미하며, 사용될 수 있는 본원 명세서에 제시된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 보호 그룹으로서 제한되지 않는 것으로 의도된다.
실시예 33: 화합물 70의 제조
Figure pct00331
화합물 64는 실시예 2에 예시된 과정에 따라 제조하였다. 화합물 68는 상업적으로 이용가능하다. 화합물 68에 대해 사용된 보호 그룹은 대표적인 것을 의미하며, 사용될 수 있는 본원 명세서에서 제공된 것들 것 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 보호 그룹으로서 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 34: 화합물 75a의 제조
Figure pct00332
화합물 75를 Shchepinov 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454에 의해 공개된 과정을 이용하여 제조한다.
실시예 35: 화합물 79의 제조
Figure pct00333
화합물 76을 Shchepinov 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454에 의해 공개된 과정을 이용하여 제조하였다.
실시예 36: 화합물 79a의 제조
Figure pct00334
화합물 77을 실시예 35에 예시된 과정에 따라 제조한다.
실시예 37: 고체 지지체를 통해 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc 3 -2 콘주게이트를 포함하는 접합된 올리고머 화합물 82의 일반적인 제조 방법 (방법 I)
Figure pct00335
Figure pct00336
여기서 GalNAc3-2는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00337
콘주게이트 그룹 GalNAc3-2의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-2a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-2a는 하기 식을 갖는다:
Figure pct00338
VIMAD-결합된 올리고머 화합물 79b를 하기에 대한 표준 과정을 이용하여 제조하였다: 자동화된 DNA/RNA 합성 (Dupouy 등, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627 참고). 포스포르아미다이트 화합물 56 및 60을 각각 실시예 27 및 28에 예시된 과정에 따라 제조하였다. 실증된 포스포르아미다이트는 대표적인 것으로 여겨지며, 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 콘주게이트 그룹을 갖는 올리고머 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 본 명세서에서 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록으로 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 고체 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 임의의 예정된 순서 및 조성을 갖는 본원에서 기재된 올리고머 화합물을 제조하기 위해 조정될 수 있다.
실시예 38: 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc 3 -2 콘주게이트를 포함하는 올리고머 화합물 82의 대안적인 제조 방법 (방법 II)
Figure pct00339
VIMAD-결합된 올리고머 화합물 79b를 하기에 대한 표준 과정을 이용하여 제조하였다: 자동화된 DNA/RNA 합성 (Dupouy 등, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627 참고). GalNAc3-2 클러스터 포스포르아미다이트인 화합물 79를 실시예 35에 예시된 과정에 따라 제조하였다. 이 대안적인 방법은 합성의 최종 단계에서 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트의 올리고머 화합물에의 1-단계 설치를 허용한다. 예시된 포스포르아미다이트는 대표적인 것으로 여겨지며, 5' 말단에 포스포디에스테르 콘주게이트를 갖는 올리고머 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 본 명세서에서 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록으로서 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 고체 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 임의의 예정된 순서 및 조성을 갖는 본원에서 기재된 올리고머 화합물을 제조하기 위해 조정될 수 있다.
실시예 39: 고체 지지체를 통한 5' 말단에 (5' 말단 부착을 위해 변형된 GalNAc3-1)GalNAc 3 -3 콘주게이트를 포함하는 올리고머 화합물 83h의 일반적인 제조 방법
Figure pct00340
Figure pct00341
화합물 18을 실시예 4에 예시된 과정에 따라 제조하였다. 화합물 83a 및 83b는 상업적으로 이용가능하다. 포스포디에스테르 연결된 헥실아민을 포함하는 올리고머 화합물 83e를 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 과정을 이용하여 제조하였다. 암모니아수를 이용한 상기 보호된 올리고머 화합물의 처리는 5'-GalNAc3-3 접합된 올리고머 화합물 (83h)을 제공하였다.
여기서 GalNAc3-3는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00342
콘주게이트 그룹 GalNAc3-3의 클러스터 부분 (GalNAc3-3a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-3a는 하기 식을 갖는다:
Figure pct00343
실시예 40: 고체 지지체를 통한포스포디에스테르 연결된 GalNAc 3 -4 콘주게이트를 포함하는 올리고머 화합물 89의 일반적인 제조 방법
Figure pct00344
Figure pct00345
여기서 GalNAc3-4는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00346
여기서 CM은 절단가능 모이어티이다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 아래와 같다:
Figure pct00347
콘주게이트 그룹 GalNAc3-4의 클러스트 부분 (GalNAc3-4a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 여기서 GalNAc3-4a는 하기 식을 갖는다:
Figure pct00348
보호된 Unylinker 관능화된 고체 지지체 화합물 30은 상업적으로 이용가능하다. 화합물 84는 문헌에 의해 보고된 것과 유사한 과정을 이용하여 제조된다: (Shchepinov 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454; Shchepinov 등, Nucleic Acids Research, 1999, 27, 3035-3041; 및 Hornet 등, Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4842-4849 참고).
포스포르아미다이트 빌딩 블록, 화합물 60 및 79a를 실시예 28 및 36에 예시된 과정에 따라 제조한다. 예시된 포스포르아미다이트는 대표적인 것으로 여겨지며, 예정된 순서 및 조성으로 3' 말단에 포스포디에스테르 연결된 콘주게이트를 갖는 올리고머 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 다른 포스포르아미다이트 빌딩 블록로서 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 고체 지지체에 부가된 포스포르아미다이트의 순서 및 양은 임의의 예정된 순서 및 조성을 갖는 본원에서 기재된 올리고머 화합물을 제조하기 위해 조정될 수 있다.
실시예 41: 고체상 기술을 통해 5' 위치에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc 3 -2 (실 시예 37 참고, Bx 는 아데닌임) 콘주게이트를 포함하는 ASO 의 일반적인 제조 방법(ISIS 661134의 제조)
달리 언급되지 않으면, 올리고머 화합물의 합성을 위해 사용된 모든 시약 및 용액은 상업적 공급원으로부터 구매된다. 표준 포스포르아미다이트 빌딩 블록 및 고체 지지체는, 예를 들면 T, A, G, 및 mC 잔기를 포함하는 뉴클레오사이드 잔기의 혼입을 위해 사용된다. 사용된 포스포르아미다이트 화합물 56 및 60을 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 합성하기 위해 사용하였다. 무수 아세토니트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1 M 용액을 b-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 및 2'-MOE에 사용하였다.
ASO 합성을 칼럼 내에 패킹된 VIMAD 고체 지지체 (110 μmol/g, Guzaev 등, 2003) 상의 포스포르아미다이트 커플링 방법에 의해 ABI 394 합성기 (1-2 μmol 크기) 또는 GE Healthcare Bioscience
Figure pct00349
올리고파일럿 합성기 (40-200 μmol 크기) 상에서 수행하였다. 커플링 단계의 경우, 포스포르아미다이트를 고체 지지체의 초기 로딩에 대해 4배 과량으로 전달하였고, 포스포르아미다이트 커플링을 10분 동안 수행하였다. 다른 모든 단계들은 제조자에 의해 공급된 표준 프로토콜을 따랐다. 톨루엔 중의 6% 디클로로아세트산 용액을 뉴클레오타이드의 5'-하이드록실 그룹으로부터 디메톡시트리틸 (DMT) 그룹을 제거하는데 사용하였다. 무수 CH3CN 중의 4,5-디시아노이미다졸 (0.7 M)을 커플링 단계 동안에 활성제로서 사용하였다. 포스포로티오에이트 연결을 3분의 접촉 시간 동안에 1:1 피리딘/CH3CN 중의 크산탄 하이드라이드의 0.1 M 용액을 이용한 황화에 의해 도입하였다. 6% 물을 함유하는 CH3CN 중의 20% tert-부틸하이드로퍼옥사이드의 용액을 산화제로서 사용하여 12분의 접촉 시간으로 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 제공하였다.
원하는 서열이 조립된 후, 시아노에틸 포스페이트 보호 그룹을 45분의 접촉 시간으로 톨루엔 (v/v) 중의 20% 디에틸아민을 이용하여 탈보호화시켰다. 상기 고체-지지체 결합된 ASO를 암모니아수 (28-30 중량 %)에 현탁시키고 55 ℃에서 6시간 동안 가열하였다.
그리고 나서, 미결합된 ASO를 여과하고 암모니아를 가열로 제거하였다. 잔류물을 강한 음이온 교환 칼럼 상에서 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다(GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 μm, 2.54 x 8 cm, A = 30% 수성 CH3CN 중의 100 mM 암모늄 아세테이트, B = A 중의 1.5 M NaBr, 60분에 0-40%의 B, 유량 14 mL min-1, λ = 260 nm). 잔류물을 역상 칼럼 상의 HPLC에 의해 탈염하여, 고체 지지체 상의 초기 로딩을 기준으로 15-30%의 단리된 수율로 원하는 ASO를 얻었다. ASO를 Agilent 1100 MSD 시스템을 갖는 이온-쌍-HPLC 커플링된 MS 분석에 의해 규명하였다.
표 34
SRB-1를 표적화하는 5' 위치에포스포디에스테르 연결된 GalNAc 3 -2 콘주게이트를 포함하는 ASO
Figure pct00350
하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "k"는 6'-(S)-CH3 바이사이클릭 뉴클레오사이드 (예를 들면 cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. GalNAc3-2a의 구조가 실시예 37에 나타나 있다.
실시예 42: 고체상 기술을 통해 5' 위치에 GalNAc 3 -3 콘주게이트를 포함하는 ASO의 일반적인 제조 방법(ISIS 661166의 제조)
ISIS 661166을 위한 합성을 실시예 39 및 41에 예시된 것과 유사한 과정을 이용하여 수행하였다.
ISIS 661166은 5-10-5 MOE 갭머이며, 상기 5' 위치는 GalNAc3-3 콘주게이트를 포함한다. ASO를 Agilent 1100 MSD 시스템을 갖는이온-쌍-HPLC 커플링된 MS 분석에 의해 규명하였다.
표 34a
Malat-1을 표적화하는 헥실아미노포스포디에스테르 연결을 통한 5' 위치에 GalNAc 3 -3
Figure pct00351
콘주게이트를 포함하는 ASO
하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "5'-GalNAc3-3a"의 구조가 실시예 39에 나타나 있다.
실시예 43: 생체내에서SRB-1을 표적화하는 5' 말단에서의 포스포디에스테르 연결된 GalNAc 3 -2 ( 실시예 37 및 41 참고, Bx 는 아데닌임)의 용량-의존적 연구
5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 ISIS 661134 (실시예 41 참고)를 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제를 위해 용량-의존적 연구에서 시험하였다. 비접합된 ISIS 440762 및 651900 (3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트, 실시예 9 참고)을비교를 위해 연구에 포함시켰고, 이들은 앞서 표 17에 기재되어 있다.
처리
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 440762, 651900, 661134 또는 PBS 처리된 대조군으로 하기 제시된 복용량으로 피하로 1회 주입하였다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). SRB-1 mRNA 수준을 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화하기 전에 총 RNA에 대해 결정하였다(리보그린을 이용하여). 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제시되며, "PBS %"로서 표시된다. ED50을 이전에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 측정하였고 하기에 제시되어 있다.
표 35에 예시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리는 SRB-1 mRNA 수준을 용량-의존적 방식으로 낮추었다. 사실상, 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 661134) 또는 3' 말단에 연결된 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ISIS 651900)는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 440762)와 비교하여 실질적인 효능 개선을 나타내었다. 게다가, 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 ISIS 661134는 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 ISIS 651900과 비교하여 효능이 동등하였다.
표 35
SRB-1을 표적화하는 GalNAc 3 -1 또는 GalNAc 3 -2를 포함하는 ASO
Figure pct00352
3' GalNAc3-1 및 5' GalNAc3-2에 대한 구조는 실시예 9 및 37에 앞서 기술되었다.
약동학 분석 (PK)
고용량 그룹 (7 mg/kg)으로부터의 ASO의 PK를 조사하고 실시예 20에 예시된것과 동일한 방식으로 평가하였다. 간 샘플을 갈고 표준 프로토콜을 사용하여 추출하였다. 661134 (5' GalNAc3-2) 및 ISIS 651900 (3' GalNAc3-1)의 전장 대사물을 확인하고 이들의 질량을 고분해능 질량 분광분석법 분석에 의해 확인하였다. 상기 결과는 5' 말단에 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-2 콘주게이트를 포함하는 ASO (ISIS 661134)에 대해 검출된 주요 대사물이 ISIS 440762였음을 보여주었다 (데이타 도시되지 않음). 검출가능한 수준에서 추가의 대사물이 관찰되지 않았다. 그의 대응물과 달리, 표 23a에서 이전에 보고된 것과 유사한 추가의 대사물이 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 갖는 ASO에 대해 관찰되었다(ISIS 651900). 이들 결과는, 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-1 또는 GalNAc3-2콘주게이트를 갖는 것이 그것의 효능을없애지 않고 ASO의 PK 프로파일을 개선할 수 있음을 제시한다.
실시예 44: SRB-1을 표적화하는 3' 말단에 GalNAc 3 -1 콘주게이트를 포함하는 ASO (실시예 9 참고)의 안티센스 억제에 대한 PO/PS 연결의 효과
각각 SRB-1을 표적화하는 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 ISIS 655861 및 655862를 대상으로 단일 투여 연구에서 마우스에서 SRB-1을 억제하는 이들의 능력을 시험하였다. 모 비접합된 화합물인 ISIS 353382를 비교를 위해 연구에 포함시켰다.
ASO는 5-10-5 MOE 갭머이며, 상기 갭 영역은10개의 2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 포함하고 각 윙 영역은 5개의 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. ASO를 실시예 19에서 앞서 예시된 것과 유사한 방법을 이용하여 제조하였고 이는 하기 표 36에 기술되어 있다.
표 36
SRB-1를 표적화하는 3' 말단에 GalNAc 3 -1 콘주게이트를 포함하는 변형된 ASO
Figure pct00353
하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다. "GalNAc3-1"의 구조가 실시예 9에 나타나 있다.
처리
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 353382, 655861, 655862 또는 PBS 처리된 대조군으로 하기에 제시된 복용량으로 피하로 1회 주입하였다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 처리 전에 뿐만 아니라 마지막 용량 후에, 혈액을 각 마우스로부터 채혈하고 혈장 샘플을 분석하였다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). SRB-1 mRNA 수준을 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화하기 전에 총 RNA에 대해 결정하였다(리보그린을 이용하여). 아래의 결과는 PBS-처리된 대조군에 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제시되어 있고, "PBS %"로서 표시되어 있다. ED50을 이전에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 측정하였고, 하기에 보고되어 있다.
표 37에서 예시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리는 PBS 처리된 대조군과 비교하여 용량-의존 방식으로 SRB-1 mRNA 수준을 낮추었다. 사실상, 3' 말단에 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 655861 및 655862)는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 353382)와 비교하여 실질적인 효능 개선을 나타내었다. 게다가, 혼합된 PS/PO 연결을 갖는 ISIS 655862는전체 PS (ISIS 655861)와 비교하여 효능 개선을 나타내었다.
표 37
SRB-1을 표적화하는 3' 말단에 GalNAc 3- 1 콘주게이트를 포함하는 ASO의 안티센스 억제에 대한 PO/PS 연결의 효과
Figure pct00354
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 장기 중량을 또한 평가하였다. 상기 결과는 PBS 대조군과 비교하여 ASO 처리된 마우스에서 아미노기전달효소 수준 (표 38) 또는 장기 중량 (데이타 도시되지 않음)의 상승이 관찰되지 않았음을 입증하였다 (데이타 도시되지 않음). 게다가, 혼합된 PS/PO 연결을 갖는 ASO (ISIS 655862)는 전체 PS (ISIS 655861)와 비교하여 유사한 아미노기전달효소 수준을 나타내었다.
표 38
SRB-1를 표적화하는 3' 말단에 GalNAc 3- 1 콘주게이트를 포함하는 ASO의 아미노기전달효소 수준에 대한 PO/PS 연결의 효과
Figure pct00355
실시예 45: PFP 에스테르, 화합물 110a의 제조
Figure pct00356
Figure pct00357
화합물 4 (9.5g, 28.8 mmol)를개별적으로 화합물 103a 또는 103b (38 mmol), 및 디클로로메탄 (200 mL) 중 TMSOTf (0.5 eq.) 및 분자체로 처리하고, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 때, 유기 층을 셀라이트를 통해 여과한 다음 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->10% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여 >80% 수율로 화합물 104a 및 104b를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 104a 및 104b를 화합물 100a-d (실시예 47)와 동일한 조건으로 처리하여>90% 수율로 화합물 105a 및 105b를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 105a 및 105b를 화합물 901a-d와 동일한 조건 하에서 화합물 90으로 개별적으로 처리하여, 화합물 106a (80%) 및 106b (20%)를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 106a 및 106b를 화합물 96a-d (실시예 47)와 동일한 조건 하에서 처리하여 107a (60%) 및 107b (20%)를 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 107a 및 107b를 화합물 97a-d (실시예 47)와 동일한 조건 하에서 처리하여, 화합물 108a 및 108b를 40-60% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 108a (60%) 및 108b (40%)을 화합물 100a-d (실시예 47)와 동일한 조건으로처리하여, 화합물 109a 및 109b를 >80% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 109a를 화합물 101a-d (실시예 47)와 동일한 조건 하에서 처리하여, 화합물 110a를 30-60% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다. 대안적으로, 화합물 110b는 화합물 109b로 시작하는 개시되는 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
실시예 46: PFP 에스테르 (올리고뉴클레오타이드 111)과의 콘주게이션을 위한 일반적인 절차; ISIS 666881 (GalNAc 3 -10)의 제조
5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 표준 고체상 올리고뉴클레오타이드 과정을 이용하여 정제하였다. 5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오타이드를 0.1 M 나트륨 테트라보레이트, pH 8.5 (200 μL)에 용해시키고 DMSO (50 μL)에 용해된 3 당량의 선택된 PFP 에스테르화된 GalNAc3 클러스터를 부가하였다. 만약 PFP 에스테르가 ASO 용액 부가시 침전되면, 모든 PFP 에스테르가 용액 내에 있을 때까지 DMSO를 부가하였다. 반응은 실온에서 약 16시간 혼합 후 완료하였다. 수득한 용액을 12 mL의 물로 희석한 다음 스핀 필터에서 3000 Da의 질량 컷오프로 3000 rpm으로 스핀다운하였다. 이 과정을 2회 반복하여 소분자 불순물을 제거하였다. 그 다음 용액을 동결건조하고 농축된 암모니아수에서 재용해하고 실온에서 2.5시간 동안 혼합한 다음 진공에서 농축하여 대부분의 암모니아를 제거하였다. 접합된 올리고뉴클레오타이드를 정제하고 RP-HPLC로 탈염하고 동결건조하여 GalNAc3 접합된 올리고뉴클레오타이드를 제공하였다.
Figure pct00358
올리고뉴클레오타이드 111은 GalNAc3-10과 접합된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-10의 클러스트 부분 (GalNAc3-10a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 하기GalNAc3-10을 이용하여 합성된 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 666881)에서 나타난 바와 같은 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-10 (GalNAc3-10a-CM-)의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00359
일반적인 절차에 따라 ISIS 666881을 제조하였다. 5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오타이드 ISIS 660254을 합성하고 표준 고체상 올리고뉴클레오타이드 과정을 이용하여 정제하였다. ISIS 660254 (40 mg, 5.2 μmol)을 0.1 M 나트륨 테트라보레이트, pH 8.5 (200 μL)에 용해시키고 DMSO (50 μL)에 용해된 3 당량의 PFP 에스테르 (화합물 110a)를 부가하였다. PFP 에스테르는 PFP 에스테르를 완전히 용해시키기 위해 추가의 DMSO (600 μL)를 필요로 하는 ASO 용액에 부가시 침전되었다. 상기 반응을 실온에서 16시간 혼합한 후 완료하였다. 상기 용액을 물로 12 mL 총 용적으로 희석하고 스핀 필터에서 3000 Da의 질량 컷오프로 3000 rpm으로 스핀다운하였다. 이 과정을 2회 반복하여 소분자 불순물을 제거하였다. 용액을 동결건조하고 실온에서 2.5시간 동안 혼합하면서 농축된 암모니아수에 재용해한 다음 진공에서 농축하여 대부분의 암모니아를 제거하였다. 접합된 올리고뉴클레오타이드를 정제하고 RP-HPLC로 탈염하고 동결건조하여 중량으로 90% 수율로 ISIS 666881를 얻었다 (42 mg, 4.7 μmol).
GalNAc 3 -10 접합된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00360
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)를 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
실시예 47: GalNAc 3 -8을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 102의 제조
Figure pct00361
Figure pct00362
Figure pct00363
3가산 90 (4 g, 14.43 mmol)을 DMF (120 mL) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (12.35 mL, 72 mmol)에 용해시켰다. 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (8.9 mL, 52 mmol)를 아르곤 하에 적가하고, 반응을 실온에서 30분 동안 교반하였다. Boc-디아민 91a 또는 91b (68.87 mmol)를 N, N-디이소프로필에틸아민 (12.35 mL, 72 mmol)과 함께 부가하고, 반응을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->10% 메탄올/디클로로메탄)로 정제하여 화합물 92a 및 92b를 대략적인 80% 수율로 생성하였다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 92a 또는 92b (6.7 mmol)를 20 mL의 디클로로메탄 및 20 mL의 트리플루오로아세트산으로 실온에서 16시간 동안 처리하였다. 얻어진 용액을 증발시킨 다음 메탄올에 용해시키고 DOWEX-OH 수지로 30분 동안 처리하였다. 얻어진 용액을 여과하고 오일 감압 하에서 환원하여 화합물 93a 및 93b를 85-90% 수율로 얻었다.
화합물 7 또는 64 (9.6 mmol)를 DMF (20 mL) 중의 HBTU (3.7g, 9.6 mmol) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (5 mL)로 15분 동안 처리하였다. 여기에 화합물 93a 또는 93b (3 mmol) 중 하나를 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (5%-->20% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 96a-d를 20-40% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 96a-d (0.75 mmol)를 개별적으로, 에탄올 (75 mL)에서 3시간 동안 라니 니켈에 대해 수소첨가하였다. 이때, 촉매를 셀라이트를 통해 여과에 의해 제거하고, 에탄올을 감압 하에서 제거하여 화합물 97a-d를 80-90% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 23 (0.32g, 0.53 mmol)을 DMF (30mL) 중에서 HBTU (0.2g, 0.53 mmol) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (0.19 mL, 1.14 mmol)으로 15분 동안 처리하였다. 여기에 화합물 97a-d (0.38 mmol)를 개별적으로 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->20% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 98a-d를 30-40% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 99 (0.17g, 0.76 mmol)를 DMF (50mL) 중의HBTU (0.29 g, 0.76 mmol) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (0.35 mL, 2.0 mmol)으로 15분 동안 처리하였다. 여기에 화합물 97a-d (0.51 mmol)를 개별적으로 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (5%-->20% 메탄올/ 디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 100a-d를 40-60% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 100a-d (0.16 mmol)를 개별적으로, 메탄올/에틸 아세테이트 (1:1, 50 mL) 중에서 3시간 동안 10% Pd(OH)2/C에 대해 수소첨가하였다. 이때, 촉매를 셀라이트를 통한 여과에 의해 제거하고, 유기물을 감압 하에서 제거하여 화합물 101a-d를 80-90% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
화합물 101a-d (0.15 mmol)를 개별적으로DMF (15 mL) 및 피리딘 (0.016 mL, 0.2 mmol)에 용해시켰다. 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (0.034 mL, 0.2 mmol)를아르곤 하에서 적가하고, 반응을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이때, DMF를 >75% 감압 하에서 환원시킨 다음 상기 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세정하였다. 그 다음 유기층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 오일 감압 하에서 환원시켰다. 얻어진 오일을 실리카겔 크로마토그래피 (2%-->5% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제하여 화합물 102a-d를약 80% 수율로 얻었다. LCMS 및 양성자 NMR은 상기 구조와 일치하였다.
Figure pct00364
GalNAc3-8 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 102를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-8의 클러스트 부분 (GalNAc3-8a)의 GalNAc3은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-8 (GalNAc3-8a-CM-)의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00365
실시예 48: GalNAc 3 -7을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 119의 제조
Figure pct00366
Figure pct00367
화합물 112를 문헌에 기재된 과정에 따라 합성하였다: (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).
화합물 112 (5 g, 8.6 mmol)를 1:1 메탄올/에틸 아세테이트 (22 mL/22 mL)에 용해시켰다. 탄소상 수산화팔라듐 (0.5 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 수소 하에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 1:1 메탄올/에틸 아세테이트로 패드로 세정하였다. 여과물과 세정물을 조합하고 농축 건조하여 화합물 105a (정량적)를 얻었다. 상기 구조를 LCMS에 의해 확인하였다.
화합물 113 (1.25 g, 2.7 mmol), HBTU (3.2 g, 8.4 mmol) 및 DIEA (2.8 mL, 16.2 mmol)를 무수 DMF (17 mL)에 용해시키고상기 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 여기에 무수 DMF (20 mL) 중의 화합물 105a (3.77 g, 8.4 mmol)의 용액을 부가하였다. 상기 반응을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하여 오일을 얻었다. 잔류물을 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고 수성 포화된 NaHCO3 용액 (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중의 10 내지 20 % MeOH로 용출시켜 화합물 114 (1.45 g, 30%)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 114 (1.43 g, 0.8 mmol)를 1:1 메탄올/에틸 아세테이트 (4 mL/4 mL)에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (습성, 0.14 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 수소로 씻어내고 실온에서 수소 하에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 셀라이트 패드를 메탄올/에틸 아세테이트 (1:1)로 세정하였다. 여과물과 세정물을 함께 조합하고 감압 하에서 증발시켜 화합물 115 (정량적)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 83a (0.17 g, 0.75 mmol), HBTU (0.31 g, 0.83 mmol) 및 DIEA (0.26 mL, 1.5 mmol)를 무수 DMF (5 mL)에 용해시키고 상기 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 여기에 무수 DMF 중의 화합물 115 (1.22 g, 0.75 mmol)의 용액을 부가하고 반응을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고 잔류물을 CH2Cl2에 용해시켰다. 유기층을 수성 포화된 NaHCO3 용액 및 염수로 세정하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 여과하였다. 유기층을 농축 건조하고 수득된 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중의 3 내지 15 % MeOH로 용출시켜 화합물 116 (0.84 g, 61%)을 얻었다. 구조를 LC MS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
Figure pct00368
화합물 116 (0.74 g, 0.4 mmol)을 1:1 메탄올/에틸 아세테이트 (5 mL/5 mL)에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (습성, 0.074 g)을 부가하였다. 반응 혼합물을 수소로 씻어내고 실온에서 수소 하에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 셀라이트 패드를 메탄올/에틸 아세테이트 (1:1)로 세정하였다. 여과물과 세정물을 함께 조합하고 감압 하에서 증발시켜 화합물 117 (0.73 g, 98%)을 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 117 (0.63 g, 0.36 mmol)을 무수 DMF (3 mL)에 용해시켰다. 이용액에N, N-디이소프로필에틸아민 (70 μL, 0.4 mmol) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (72 μL, 0.42 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하고 수성 포화된 NaHCO3 용액에 부었다. 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 염수로 세정하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 상기 디클로로메탄 용액을 농축 건조하고 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중 5 내지 10 % MeOH로 용출하여 화합물 118 (0.51 g, 79%)을 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H 및 1H 및 19F NMR에 의해 확인하였다.
Figure pct00369
GalNAc3-7 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 119를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-7의 GalNAc3클러스트 부분 (GalNAc3-7a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-)의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00370
실시예 49: GalNAc 3 -5를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 132의 제조
Figure pct00371
화합물 120 (14.01 g, 40 mmol) 및 HBTU (14.06 g, 37 mmol)를 무수 DMF (80 mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민 (11.2 mL, 80.35 mmol)을 부가하고 5분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 빙욕에서 냉각하고 무수 DMF (20 mL) 중의 화합물 121 (10 g, mmol)의 용액을 부가하였다. 추가의 트리에틸아민 (4.5 mL, 32.28 mmol)을 부가하고 반응 혼합물을 18시간 동안 아르곤 분위기 하에서 교반하였다. 반응을 TLC (에틸 아세테이트:헥산; 1:1; Rf = 0.47)에 의해 관찰하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 EtOAc (300 mL)에서 취하고 1M NaHSO4 (3 x 150 mL), 수성 포화된 NaHCO3 용액 (3 x 150 mL) 및 염수 (2 x 100 mL)로 세정하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시켰다. 건조제를 여과로 제거하고 유기층을 회전식 증발로 농축하였다. 조 혼합물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 헥산 중 35 ◎50% EtOAc를 사용하여 용출하여 화합물 122 (15.50 g, 78.13%)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다. 질량 m/z 589.3 [M + H]+.
물 (20 mL) 및 THF (10 mL) 중의 LiOH (92.15 mmol)의 용액을 메탄올 (15 mL)에 용해된 화합물 122 (7.75 g,13.16 mmol)의 냉각된 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하고 TLC (EtOAc:헥산; 1:1)로 관찰하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 절반 용적으로 농축하였다. 남아있는 용액을 빙욕에서 냉각하고 농축된 HCl를 부가하여 중화하였다. 상기 반응 혼합물을 희석하고, EtOAc (120 mL)로 추출하고 염수 (100 mL)로 세정하였다. 에멀젼 형성하고 밤새 정치하여 제거하였다. 유기층을 분리하고, (Na2SO4)로 건조시키고, 여과하고 증발시켜 화합물 123 (8.42 g)을 얻었다. 잔류 염은 과다 질량의 원인인 것 같다. LCMS는 구조와 일치한다. 생성물을 임의의 추가 정제없이 사용하였다. M.W.cal:574.36; M.W.fd:575.3 [M + H]+.
Figure pct00372
화합물 126을 문헌에 기재된 과정에 따라 합성하였다: (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 958-963).
Figure pct00373
Figure pct00374
화합물 123(7.419 g, 12.91 mmol), HOBt (3.49 g, 25.82 mmol) 및 화합물 126 (6.33 g, 16.14 mmol)을 DMF (40 mL)에 용해시키고 수득한 반응 혼합물을 빙욕에서 냉각하였다. 여기에N, N-디이소프로필에틸아민 (4.42 mL, 25.82 mmol), PyBop (8.7 g, 16.7 mmol) 그 다음 Bop 커플링 시약 (1.17 g, 2.66 mmol)을 아르곤 분위기 하에서부가하였다. 얼음 수조를 제거하고 용액을 실온으로 가온하였다. 반응을 TLC (DCM:MeOH:AA; 89:10:1)에 의해 결정된 바와 같이 1시간 후에 완료시켰다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (200 mL)에 용해시키고 1 M NaHSO4 (3x100 mL), 수성 포화된 NaHCO3 (3x100 mL) 및 염수 (2x100 mL)로 세정하였다. 분리된 유기상을 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 농축하였다. 잔류물을 50% 헥산/EtOAC 내지 100% EtOAc의 구배로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 포말로서 화합물 127 (9.4 g)을 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 구조와 일치하였다. 질량 m/z 778.4 [M + H] +.
트리플루오로아세트산 (12 mL)을 디클로로메탄 (12 mL) 중의 화합물 127 (1.57 g, 2.02 mmol)의 용액에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 톨루엔 (30 mL)으로 공-증발시켜 건조하였다. 수득된 잔류물을 아세토니트릴 (30 mL) 및 톨루엔 (40 mL)으로 2회 공-증발시켜 화합물 128 (1.67 g)을 트리플루오로 아세테이트 염으로서 얻었고 다음 단계 동안에 추가 정제없이 사용하였다. LCMS 및 1H NMR은 구조와 일치하였다. 질량 m/z 478.2 [M + H] +.
화합물 7 (0.43 g, 0.963 mmol), HATU (0.35 g, 0.91 mmol), 및 HOAt (0.035 g, 0.26 mmol)을 함께 조합하고 둥근바닥 플라스크에서 감압 하에서 P2O5로 4시간 동안 건조시킨 다음 무수 DMF (1 mL)에 용해시키고 5분 동안 교반하였다. 여기에 무수 DMF (0.2 mL) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (0.2 mL) 중의 화합물 128 (0.20 g, 0.26 mmol)의 용액을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에서 교반하였다. 반응을 LCMS 및 TLC (7% MeOH/DCM)에 의해 결정된 바와 같이 30분 후에 완료시켰다. 상기 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 DCM (30 mL)에 용해시키고 1 M NaHSO4 (3x20 mL), 수성 포화된 NaHCO3 (3 x 20 mL) 및 염수 (3x20 mL)로 세정하였다. 유기상을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 중의 5-15% MeOH를 이용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 129 (96.6 mg)를 얻었다. LC MS 및 1H NMR은 구조와 일치한다. 질량 m/z 883.4 [M + 2H]+.
화합물 129 (0.09 g, 0.051 mmol)를 20 mL 섬광 바이알 내에서 메탄올 (5 mL)에 용해시켰다. 여기에 소량의 10% Pd/C (0.015 mg)를 부가하고 반응 용기를 H2 가스로 씻어 내었다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 H2 분위기 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 셀라이트 패드를 메탄올로 세정하였다. 여과물 및 세정물을 모으고 감압 하에서 농축하여 화합물 130 (0.08 g)을 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 구조와 일치하였다. 생성물을 추가 정제없이 사용하였다. 질량 m/z 838.3 [M + 2H]+.
10 mL 표시된 둥근바닥 플라스크에 화합물 130 (75.8 mg, 0.046 mmol), 0.37 M 피리딘/DMF (200 μL) 및 교반 바를 부가하였다. 이 용액에 0.7 M 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트/DMF (100 μL)를 교반하면서 적가하였다. 반응을 LC MS에 의해 결정된 바와 같이 1시간 후에 완료하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고 잔류물을 CHCl3 (~ 10 mL)에 용해시켰다. 유기층을 NaHSO4 (1 M, 10 mL), 수성 포화된 NaHCO3 (10 mL) 및 염수 (10 mL)에 대해 각각 3회 분할하였다. 유기상을 분리하고 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축하여 화합물 131 (77.7 mg)을 얻었다. LCMS는 구조와 일치한다. 추가 정제없이 사용하였다. 질량 m/z 921.3 [M + 2H]+.
Figure pct00375
GalNAc3-5 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 132를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-5의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-5a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-5 (GalNAc3-5a-CM-)의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00376
실시예 50: GalNAc 4 -11을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 144의 제조
Figure pct00377
Figure pct00378
화합물 134의 합성. 메리필드 플라스크에 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄 및 아세토니트릴로 세정된 아미노메틸 VIMAD 수지 (2.5 g, 450 μmol/g)를 부가하였다. 상기 수지를 아세토니트릴 (4 mL)에서 팽창시켰다. 화합물 133을 20 (1.0 mmol, 0.747 g), TBTU (1.0 mmol, 0.321 g), 아세토니트릴 (5 mL) 및 DIEA (3.0 mmol, 0.5 mL)를 첨가하여 100 mL 둥근바닥 플라스크에서 전-활성화시켰다. 이 용액을 5분 동안 교반한 다음, 흔들면서 메리필드 플라스크에 첨가하였다. 상기 현탁액을 3시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 빼내고 수지를 아세토니트릴, DMF 및 DCM으로 세정하였다. 새로운 수지 로딩을 DCM 중에서 500 nm (소멸 계수 = 76000)에서 DMT 양이온의 흡광도를 측정하여 정량화하였고 238 μmol/g인 것으로 결정되었다. 상기 수지를 아세트산 무수물 용액에서 10분간 3회 현탁시켜 캠핑하였다.
고체 지지체 결합된 화합물 141을 반복적인 Fmoc-기반 고체상 펩타이드 합성 방법을 사용하여 합성하였다. 소량의 고체 지지체를 빼내고, 암모니아수 (28-30 wt%)에서 6시간 동안 현탁시켰다. 절단된 화합물을 LC-MS에 의해 분석하였고 상기 관찰된 질량은 구조와 일치하였다. 질량 m/z 1063.8 [M + 2H]+.
고체 지지체 결합된 화합물 142를 고체상 펩타이드 합성 방법을 사용하여 합성하였다.
Figure pct00379
고체 지지체 결합된 화합물 143을 DNA 합성기 상에서 표준 고체상 합성을 사용하여 합성하였다.
고체 지지체 결합된 화합물 143을 암모니아수 (28-30 wt%)에 현탁시키고 55 ℃에서 16시간 동안 가열하였다. 상기 용액을 냉각하고 고체 지지체를 여과하였다. 상기 여과물을 농축하고 잔류물을 물에서 용해시키고 강한 음이온 교환 칼럼 상에서 HPLC로 정제하였다. 전장 화합물 144을 함유하는 분획들을 모으고 탈염하였다. 수득한 GalNAc4-11 접합된 올리고머 화합물을 LC-MS로 분석하였고, 상기 관찰된 질량은 구조와 일치하였다.
콘주게이트 그룹 GalNAc4-11의 GalNAc4 클러스터 부분 (GalNAc4-11a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc4-11 (GalNAc4-11a-CM)의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00380
실시예 51: GalNAc 3 -6을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 155의 제조
Figure pct00381
화합물 146을 문헌에 기재된 바와 같이 합성하였다: (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).
Figure pct00382
화합물 4 (15 g, 45.55 mmol) 및 화합물 35b (14.3 그램, 57 mmol)를 CH2Cl2 (200 ml)에 용해시켰다. 활성화된 분자체 (4 Å. 2 g, 분말화됨)를 첨가하고, 반응을 30분 동안 질소 분위기 하에서 교반하였다. TMS-OTf를 첨가하고(4.1 ml, 22.77 mmol), 반응을 밤새 실온에서 교반하였다. 완료되자마자, 상기 반응을 포화된 수성 NaHCO3의 용액 (500 ml) 및 부서진 얼음 (~ 150 g) 내로 부어 켄칭하였다. 유기층을 분리하고, 염수로 세정하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 오렌지색 오일을 얻었다. 조 물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 CH2Cl2 중의 2-10 % MeOH로 용출시켜 화합물 112 (16.53 g, 63 %)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 예상된 화합물과 일치하였다.
화합물 112 (4.27 g, 7.35 mmol)를 1:1 MeOH/EtOAc (40 ml)에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐, 400 mg)를 부가하고, 수소 가스로 30분 동안 용액에 거품을 일으켰다. 완료시(CH2Cl2 중의 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 셀라이트의 패드를 통해 여과로 제거하였다. 상기 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 고진공 하에서 잠시 건조하여 화합물 105a (3.28 g)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 원하는 생성물과 일치하였다.
화합물 147 (2.31 g, 11 mmol)을 무수 DMF (100 mL)에 용해시켰다. N, N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 3.9 mL, 22 mmol)을 부가한 다음 HBTU (4 g, 10.5 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 ~ 15 분 동안 질소 하에서 교반하였다. 여기에, 건조 DMF 중의 화합물 105a (3.3 g, 7.4 mmol)의 용액을 부가하고 질소 분위기 하에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 EtOAc로 희석하고 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축하여 오렌지색 시럽을 얻었다. 조 물질을 CH2Cl2 중의 칼럼 크로마토그래피 2-5 % MeOH에 의해 정제하여 화합물 148(3.44 g, 73 %)을 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 예상된 생성물과 일치하였다.
화합물 148 (3.3 g, 5.2 mmol)을 1:1 MeOH/EtOAc (75 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐)을 부가하였다 (350 mg). 수소 가스로 30분 동안 용액에 거품을 일으켰다. 완료시 (DCM 중의 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 셀라이트의 패드를 통해 여과로 제거하였다. 상기 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 고진공 하에서 간단히 건조하여 화합물 149 (2.6 g)를 얻었다. LCMS는 원하는 생성물과 일치하였다. 잔류물을 건조 DMF (10 ml)에 용해시키고 이것을 다음 단계에서 즉시 사용하였다.
Figure pct00383
화합물 146 (0.68 g, 1.73 mmol)을 건조 DMF (20 ml)에 용해시켰다. 여기에, DIEA (450 μL, 2.6 mmol, 1.5 eq.) 및 HBTU (1.96 g, 0.5.2 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 15분 동안 실온에서 질소 하에서 교반하였다. 무수 DMF (10 mL) 중의 화합물 149 (2.6 g)의 용액을 부가하였다. 반응의 pH을 DIEA (필요한 경우)를 첨가하여 pH = 9-10으로 조정하였다. 반응을 실온에서 질소 하에서 2시간 동안 교반하였다. 완료시, 반응을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 수성 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 CH2Cl2 중의 2-10 % MeOH로 용출시켜 화합물 150 (0.62 g, 20 %)을 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 원하는 생성물과 일치하였다.
화합물 150 (0.62 g)을 1:1 MeOH/ EtOAc (5 L)에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐)을 부가하였다 (60 mg). 수소 가스로 30분 동안 용액에 거품을 일으켰다. 완료시 (DCM 중 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 여과 (주사기-팁 테플론 필터, 0.45 μm)에 의해 제거하였다. 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 고진공 하에서 간단히 건조하여 화합물 151 (0.57 g)을 얻었다. LCMS는 원하는 생성물과 일치하였다. 생성물을 4 mL 건조 DMF에서 용해시키고 다음 단계에서 즉시 사용하였다.
Figure pct00384
화합물 83a (0.11 g, 0.33 mmol)을 무수 DMF (5 mL)에서 용해시키고 N, N-디이소프로필에틸아민 (75 μL, 1 mmol) 및 PFP-TFA (90 μL, 0.76 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물은 접촉시 자홍색으로 변하였고, 그 다음 30분 동안 점차 오렌지색으로 변하였다. 반응의 진행을 TLC 및 LCMS로 관찰하였다. 완료시 (PFP 에스테르의 형성), DMF 중의 화합물 151(0.57 g, 0.33 mmol)의 용액을 부가하였다. 반응의 pH를 N, N-디이소프로필에틸아민 (필요한 경우)을 첨가하여 pH = 9-10으로 조정하였다. 반응 혼합물을 질소 하에서 ~ 30분 동안 교반하였다. 완료시, 대다수의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 CH2Cl2로 희석하고 수성 포화된 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 오렌지색 시럽을 얻었다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 2-10 % MeOH)에 의해 정제하여 화합물 152(0.35 g, 55 %)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 원하는 생성물과 일치하였다.
화합물 152 (0.35 g, 0.182 mmol)를 1:1 MeOH/EtOAc (10 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 아르곤 스트림을 15분간 기포발생시켜 상기 반응 혼합물을 퍼징하였다. 펄만 촉매 (탄소상 수산화팔라듐)을 부가하였다 (35 mg). 용액에 수소 가스를 30분간 기포발생시켰다. 완료시 (DCM 중 TLC 10% MeOH, 및 LCMS), 촉매를 여과 (주사기-팁 테플론 필터, 0.45 μm)에 의해 제거하였다. 상기 여과물을 회전식 증발로 농축하고, 고진공 하에서 잠시 건조하여 화합물 153 (0.33 g, 정량적)을 얻었다. LCMS는 원하는 생성물과 일치하였다.
화합물 153 (0.33 g, 0.18 mmol)을 교반하면서 질소 하에서 무수 DMF (5 mL)에 용해시켰다. 여기에 N, N-디이소프로필에틸아민 (65 μL, 0.37 mmol) 및 PFP-TFA (35 μL, 0.28 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에서 ~ 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 접촉시 자홍색으로 변하였고, 점차 오렌지색으로 변하였다. 더 많은N,-디이소프로필에틸아민을 첨가하여 상기 반응 혼합물의 pH를 pH = 9-10으로 유지시켰다. 반응의 진행을 TLC 및 LCMS로 관찰하였다. 완료시, 대다수의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 CH2Cl2 (50 mL)로 희석하고, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 오렌지색 시럽을 얻었다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 CH2Cl2 중의 2-10 % MeOH로 용출시켜 화합물 154 (0.29 g, 79 %)를 얻었다. LCMS 및 1H NMR은 원하는 생성물과 일치하였다.
Figure pct00385
GalNAc3-6 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 155를 실시예 46에 예시된 일반적인 과정을 이용하여 제조하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-6의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-6a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다.
GalNAc3-6 (GalNAc3-6a-CM-)의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00386
실시예 52: GalNAc 3 -9를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 160의 제조
Figure pct00387
화합물 156를 문헌에 기재된 과정에 따라 합성하였다: (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).
화합물 156(18.60 g, 29.28 mmol)을 메탄올 (200 mL)에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (6.15 g, 10 wt%, 로딩 (건조 기준), 매트릭스 탄소 분말, 습성)을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 수소 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 셀라이트 패드를 메탄올로 철저히 세정하였다. 조합된 여과물을 세정하고 농축 건조하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중의 5-10 % 메탄올로 용출시켜 화합물 157 (14.26 g, 89%)을 얻었다. 질량 m/z 544.1 [M-H]-.
화합물 157 (5 g, 9.17 mmol)을 무수 DMF (30 mL)에 용해시켰다. HBTU (3.65 g, 9.61 mmol) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (13.73 mL, 78.81 mmol)을 부가하고 상기 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 여기에, 화합물 47 (2.96 g, 7.04 mmol)의 용액을 부가하였다. 반응을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3 수용액에 부었다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고 유기층을 염수로 세정하고 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 헥산 중의 50% 에틸 아세테이트로 용출시켜 화합물 158 (8.25g, 73.3%)을 얻었다. 구조를 MS 및 1H NMR 분석에 의해 확인하였다.
화합물 158 (7.2 g, 7.61 mmol)을 감압 하에서P2O5로 건조시켰다. 상기 건조된 화합물을 무수 DMF (50 mL)에 용해시켰다. 여기에, 1H-테트라졸 (0.43 g, 6.09 mmol) 및 N-메틸이미다졸 (0.3 mL, 3.81 mmol) 및 2-시아노에틸-N, N, N', N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (3.65 mL, 11.50 mmol)를 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL)로 희석하였다. 상기 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3 및 염수로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 헥산 중의 50-90 % 에틸 아세테이트로 용출시켜 화합물 159 (7.82 g, 80.5%)를 얻었다. 구조를 LCMS 및 31P NMR 분석에 의해 확인하였다.
Figure pct00388
GalNAc3-9 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 160을 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 과정을 이용하여 제조하였다. 화합물 159의 3 유닛을고체 지지체에 커플링시킨다음 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트에 커플링시켰다. 암모니아수를 이용한 상기 보호된 올리고머 화합물의처리는 화합물 160을 생성하였다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-9의 GalNAc3 클러스터 부분 (GalNAc3-9a)은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-9 (GalNAc3-9a-CM)의 구조가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00389
실시예 53: 화합물 18 (GalNAc 3 -1a 및 GalNAc 3 -3a)의 제조를 위한 대안적인 절차
Figure pct00390
락톤 161을 디아미노 프로판 (3-5 eq) 또는 모노-Boc 보호된 디아미노 프로판 (1 eq)과 반응시켜 알코올 162a 또는 162b를 제공하였다. 비보호된 프로판디아민이 상기 반응에 사용되는 경우, 과잉 디아민을 고진공 하에서 증발에 의해 제거하였고, 162a 내의 유리 아미노 그룹을 CbzCl을 이용하여 보호하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제 후백색 고체물로서 162b를 제공하였다. 알코올 162b를 TMSOTf의 존재하에 화합물 4와 추가 반응시켜 163a를 제공하였고, 이는 촉매적 수소첨가를 이용한 Cbz 그룹의 제거에 의해 163b로 전환되었다. 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르 164를 3가산 113 (참고 실시예 48)을 DMF (0.1 내지 0.5 M) 중의 PFPTFA (3.5 eq) 및 피리딘 (3.5 eq)과 반응시켜 제조하였다. 상기 트리에스테르 164를 아민 163b (3-4 eq) 및 DIPEA (3-4 eq)와 직접 반응시켜 화합물 18을 제공하였다. 상기 방법은 중간체의 정제를 상당히 용이하게 하며 실시예 4에 기재된 과정을 이용하여 형성된 부산물의 형성을 최소화한다.
실시예 54: 화합물 18 (GalNAc 3 -1a 및 GalNAc 3 -3a)의 제조를 위한 대안적인 절차
Figure pct00391
triPFP 에스테르 164를 상기 실시예 53에 개괄된 절차를 이용하여 산 113으로부터 제조하였고 모노-Boc 보호된 디아민과 반응시켜 165를 본질적으로 정량적 수율로 제공하였다. 상기 Boc 그룹을 염산 또는 트리플루오로아세트산으로 제거하여 트리아민을 제공하였고, 이를 적당한 염기, 예컨대 DIPEA의 존재하에 PFP 활성화된 산 166과 반응시켜 화합물 18을 제공하였다.
PFP 보호된 Gal-NAc 산 166을 DMF 중 PFPTFA (1-1.2 eq) 및 피리딘 (1-1.2 eq)으로 처리하여 상응하는 산으로부터 제조하였다. 전구체 산을 결국, 아세토니트릴 및 물 중의 TEMPO (0.2 eq) 및 BAIB를 아용한 산화에 의해 상응하는 알코올로부터 제조하였다. 전구체 알코올을 실시예 47에 앞서 기재된 조건을 이용하여 1,6-헥산디올 (또는 1,5-펜탄디올 또는 다른 n 값에 대한 다른 디올) (2-4 eq) 및 TMSOTf와의 반응에 의해 당 중간체 4로부터 제조하였다.
실시예 55: 생체내에서 SRB-1을 표적으로 하는 3' 또는 5'-콘주게이트 그룹 (GalNAc 3 -1, 3, 8 및 9의 비교)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용량-의존적 연구
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비접합된 ISIS 353382는 표준으로서 포함된다. 각각의 다양한 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오사이드 (절단가능 모이어티)에 의해 각 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에서 부착되었다.
표 39
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00392
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)를 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-9는 실시예 52에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-3는 실시예 39에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-8는 실시예 47에서 이전에 보여졌다.
처리
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 353382, 655861, 664078, 661161, 665001 또는 염수가 아래에서 보여진 복용량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 40에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다. 사실상, 3' 말단에서 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-1 및 GalNAc3-9 콘주게이트 (ISIS 655861 및 ISIS 664078) 및 5' 말단에서 연결된 GalNAc3-3 및 GalNAc3-8 콘주게이트 (ISIS 661161 및 ISIS 665001)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 353382)와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 더욱이, 3' 말단에서 GalNAc3-9 콘주게이트를 포함하는 ISIS 664078은 3' 말단에서 GalNAc3-1 콘주게이트를 포함하는 ISIS 655861와 비교하여 본질적으로 동등하게 강력했다. GalNAc3-3 또는 GalNAc3-9, 각각을 포함하는 5' 접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드, ISIS 661161 및 ISIS 665001은, 3' 접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 655861 및 ISIS 664078)와 비교하여 증가된 효능을 가졌다.
표 40
SRB-1을 표적으로 하는 GalNAc 3 -1, 3, 8 또는 9를 함유하는 ASO
Figure pct00393
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 그룹으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표에서 보여진다.
표 41
Figure pct00394
실시예 56: 생체내에서 SRB-1를 표적으로 하는 3' 또는 5'-콘주게이트 그룹 (GalNAc 3 -1, 2, 3, 5, 6, 7 및 10의 비교)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용량-의존적 연구
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비접합된 ISIS 353382는 표준으로서 포함된다. 각각의 다양한 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오사이드 (절단가능 모이어티)에 의해 각 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 부착되었고, 단 3' 말단에서 부착된 GalNAc3 콘주게이트 그룹을 갖는 ISIS 655861는 제외된다.
표 42
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00395
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)를 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-2a의 구조는 실시예 37에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-5a의 구조는 실시예 49에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-6a의 구조는 실시예 51에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 이전에 보여졌다.
처리
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 또는 염수가 아래에서 보여진 복용량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 결정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 43에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다. 사실상, 접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 353382) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 5' 접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 3' 접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 효능의 약간의 증가를 보여주었다.
표 43
Figure pct00396
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 그룹으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 44에서 보여진다.
표 44
Figure pct00397
실시예 57: 생체내 에서 ApoC III을 표적으로 하는 3'- 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 작용 연구의 지속 시간
마우스에게 아래에서 명시된 용량이 1 회 주입되었고 42 일의 과정 동안 ApoC-III 및 혈장 트리글리세라이드 (혈장 TG) 수준에 대해 모니터링되었다. 연구는 각 그룹에서 인간 APOC-III을 발현시키는 3 개의 이식유전자 마우스을 사용하여 수행되었다.
표 45
ApoC III를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00398
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)를 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다.
표 46
ApoC III mRNA (1 일째 염수 %) 및 혈장 TG 수준 (1 일째 염수 %)
Figure pct00399
상기 표에서 보여질 수 있는 바와 같이, 작용의 지속시간은 비접합된 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 3'-콘주게이트 그룹의 부가와 함께 증가되었다. 접합된 완벽한 PS 올리고뉴클레오타이드 647535와 비교하여 접합된 혼합된 PO/PS 올리고뉴클레오타이드 647536에 대한 작용의 지속시간이 추가로 증가되었다.
실시예 58: 생체내에서 SRB-1을 표적으로 하는 3'-콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용량-의존적 연구 (GalNAc 3 -1 및 GalNAc 4 -11의 비교)
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비접합된 ISIS 440762은 비접합된 표준으로서 포함되었다. 각각의 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오사이드 절단가능 모이어티에 의해 각 올리고뉴클레오타의 3' 말단에서 부착되었다.
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-11a의 구조는 실시예 50에서 이전에 보여졌다.
처리
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 440762, 651900, 663748 또는 염수가 아래에서 보여진 복용량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 47에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다. 3' 말단(ISIS 651900 및 ISIS 663748)에서 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-1 및 GalNAc4-11 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 440762) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 2 개의 접합된 올리고뉴클레오타이드, GalNAc3-1 및 GalNAc4-11는, 동등하게 강력했다.
표 47
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00400
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "k"는 6'-(S)-CH3 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 그룹으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 48에서 보여진다.
표 48
Figure pct00401
실시예 59: 생체내 FXI을 표적으로 하는 GalNAc 3 -1 접합된 ASO의 효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 FXI의 안티센스 억제에 대한 다중 용량 연구에서 시험되었다. ISIS 404071은 비접합된 표준으로서 포함되었다. 각각의 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오사이드 절단가능 모이어티에 의해 각 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 부착되었다.
표 49
FXI 를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00402
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)를 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다.
처리
6 주령 수컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 피하로 매주 2회 3 주 동안 아래에서 보여진 복용량으로 ISIS 404071, 656172, 656173 또는 PBS 처리된 대조군이 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 FXI mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 혈장 FXI 단백질 수준은 ELISA을 사용하여 또한 측정되었다. FXI mRNA 수준은 PBS-처리된 대조군에 대한 정상화 전에 (RIBOGREEN®를 사용하여) 총 RNA에 대해 결정되었다. 아래의 결과는 각 처리 그룹에 대한 FXI mRNA 수준의 평균 퍼센트로저 제공된다. 데이타는 PBS-처리된 대조군에 대해 정규화되었고 "% PBS"로 나타낸다. ED50s는 이전에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 측정되었고 아래에서 제공된다.
표 50
인자 XI mRNA (염수 %)
Figure pct00403
표 50에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 FXI mRNA 수준을 낮게 했다. 3'-GalNAc3-1 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 404071) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 2 개의 접합된 올리고뉴클레오타이드 사이에 효능의 개선이 추가로, PS 연결의 일부를 PO (ISIS 656173)로 치환하여 제공되었다.
표 50a에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 FXI 단백질 수준을 낮게 했다. 3'-GalNAc3-1 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 404071) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다. 2 개의 접합된 올리고뉴클레오타이드 사이에 효능의 개선이 추가로, PS 연결의 일부를 PO (ISIS 656173)로 치환하여 제공되었다.
표 50a
인자 XI 단백질 (염수 %)
Figure pct00404
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈, 총 알부민, CRE 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 그룹으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다. ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표에서 보여진다.
표 51
Figure pct00405
실시예 60: 시험관내 SRB-1을 표적으로 하는 접합된 ASO의 효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 일차 마우스 간세포에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 다중 용량 연구에서 시험되었다. ISIS 353382은 비접합된 표준으로서 포함되었다. 각각의 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오사이드 절단가능 모이어티에 의해 각 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에서 부착되었다.
표 52
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00406
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-8a의 구조는 실시예 47에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-9a의 구조는 실시예 52에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-6a의 구조는 실시예 51에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-2a의 구조는 실시예 37에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-5a의 구조는 실시예 49에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다.
처리
상기 열거된 올리고뉴클레오타이드는 25,000 세포/웰의 밀도에서 플레이팅된 일차 마우스 간세포 세포에서 시험관 내에서 시험되었고, 0.03, 0.08, 0.24, 0.74, 2.22, 6.67 또는 20 nM 변형된 올리고뉴클레오타이드로 처리되었다. 대략 16 시간의 치료 기간 후, RNA는 세포로부터 단리되었고 mRNA 수준은 정량적 실시간 PCR에 의해 측정되었고 SRB-1 mRNA 수준은 RIBOGREEN®에 의해 측정된 바와 같이 총 RNA 함량에 따라 조정되었다.
IC50는 표준 방법을 사용하여 계산되었고 결과는 표 53에서 제공된다. 이 결과는, 시약 또는 전기천공 기술이 올리고뉴클레오타이드의 세포로의 유입을 인공적으로 촉진하기 위해 사용되지 않은 유리 흡수 조건 하에서, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 모 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 353382)보다 간세포에서 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다.
표 53
Figure pct00407
a다중 시행의 평균.
실시예 61: GalNAc 3 -12를 포함하는 올리고머 화합물 175의 제조
Figure pct00408
Figure pct00409
Figure pct00410
Figure pct00411
화합물 169는 시판되고 있다. 화합물 172를, 벤질 (퍼플루오로페닐) 글루타레이트를 화합물 171에 부가하여 제조했다. 벤질 (퍼플루오로페닐) 글루타레이트를, DMF 중 PFP-TFA 및 DIEA을 5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄산에 부가하여 제조했다. GalNAc3-12 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 175는, 실시예 46에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 174로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-12 (GalNAc3-12a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-12 (GalNAc3-12a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00412
실시예 62: GalNAc 3 -13을 포함하는 올리고머 화합물 180의 제조
Figure pct00413
Figure pct00414
화합물 176은 실시예 2에서 보여진 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. GalNAc3-13 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 180은, 실시예 49에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 177로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-13 (GalNAc3-13a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-13 (GalNAc3-13a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00415
실시예 63: GalNAc 3 -14를 포함하는 올리고머 화합물 188의 제조
Figure pct00416
Figure pct00417
화합물 181 및 185는 시판되고 있다. GalNAc3-14 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 188은, 실시예 46에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 187로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-14 (GalNAc3-14a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-14 (GalNAc3-14a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00418
실시예 64: GalNAc 3 -15를 포함하는 올리고머 화합물 197의 제조
Figure pct00419
Figure pct00420
화합물 189는 시판되고 있다. 화합물 195은 실시예 31에서 보여진 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. GalNAc3-15 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 197은, 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 절차를 사용하여 화합물 194 및 195로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-15 (GalNAc3-15a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-15 (GalNAc3-15a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00421
실시예 65: 생체내에서 SRB-1를 표적으로 하는 5'-콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용량-의존적 연구 (GalNAc 3 -3, 12, 13, 14, 및 15의 비교)
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 비접합된 ISIS 353382는 표준으로서 포함된다. 각각의 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 2'-데옥시아데노신 뉴클레오사이드 (절단가능 모이어티)에 의해 각 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 부착되었다.
표 54
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00422
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-12a의 구조는 실시예 61에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-14a의 구조는 실시예 63에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-15a의 구조는 실시예 64에서 이전에 보여졌다.
처리
6 내지 8 주령 C57bl6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 아래에서 보여진 복용량으로 ISIS 353382, 661161, 671144, 670061, 671261, 671262, 또는 염수가 1 회 또는 2 회 피하로 주입되었다. 2 회 복용된 마우스는 제 1 용량 3일 후에 제 2 용량을 수용했다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 55에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다. 표준 녹다운의 유의미한 차이는 단회 용량을 수용한 동물과 2 회 용량을 수용한 동물 사이에 관찰되지 않았다 (참고 ISIS 353382 복용량 30 및 2 x 15 mg/kg; 및 ISIS 661161 복용량 5 및 2 x 2.5 mg/kg). 포스포디에스테르 연결된 GalNAc3-3, 12, 13, 14, 및 15 콘주게이트을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 335382) 와 비교하여 효능의 실질적인 개선을 보여주었다.
표 55
SRB-1 mRNA (% 염수)
Figure pct00423
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화는 염수 그룹으로부터 유의미한 차이 없이 평가되었다 (데이타 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 56에서 보여진다.
표 56
Figure pct00424
실시예 66: 5'-GalNAc 3 클러스터를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제에 대한 다양한 절단가능 모이어티의 효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 각각의 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오사이드 (절단가능 모이어티 (CM))에 의해 각 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 부착되었다.
표 57
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00425
대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 이전에 보여졌다.
처리
6 내지 8 주령 C57bl6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 ISIS 661161, 670699, 670700, 670701, 671165, 또는 염수가 아래에서 보여진 복용량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 간 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 58에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다. 다양한 절단가능 모이어티 모두을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 유사한 효능을 보여주었다.
표 58
SRB-1 mRNA (염수 %)
Figure pct00426
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화는 염수 그룹으로부터 유의미한 차이 없이 평가되었다 (데이타 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 56에서 보여진다.
표 59
Figure pct00427
실시예 67: GalNAc 3 -16을 포함하는 올리고머 화합물 199의 제조
Figure pct00428
GalNAc3-16 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 199는, 실시예 7 및 9에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 제조된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-16 (GalNAc3-16a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-16 (GalNAc3-16a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00429
실시예 68: GalNAc 3 -17을 포함하는 올리고머 화합물 200의 제조
Figure pct00430
GalNAc3-17 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 200은, 실시예 46에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-17 (GalNAc3-17a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-17 (GalNAc3-17a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00431
실시예 69: GalNAc 3 -18을 포함하는 올리고머 화합물 201의 제조
Figure pct00432
GalNAc3-18 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 201은, 실시예 46에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-18 (GalNAc3-18a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-18 (GalNAc3-18a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00433
실시예 70: GalNAc 3 -19을 포함하는 올리고머 화합물 204의 제조
Figure pct00434
GalNAc3-19 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 204는, 실시예 52에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 64로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-19 (GalNAc3-19a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-19 (GalNAc3-19a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00435
실시예 71: GalNAc 3 -20을 포함하는 올리고머 화합물 210의 제조
Figure pct00436
화합물 205을, 트리플릭산 무수물을 6-아미노헥산산에 부가하여 제조된 아세토니트릴에서 PFP-TFA 및 DIEA을 6-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)헥산산에 부가하여 제조했다. 반응 혼합물을 80 oC로 가열하고, 그 다음 실온으로 낮게 했다. GalNAc3-20 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 210은, 실시예 52에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 208로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-20 (GalNAc3-20a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-20 (GalNAc3-20a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00437
실시예 72: GalNAc 3 -21을 포함하는 올리고머 화합물 215의 제조
Figure pct00438
화합물 211는 시판되고 있다. GalNAc3-21 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 215은, 실시예 52에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 213로부터 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-21 (GalNAc3-21a)의 GalNAc3 클러스터 부분는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-21 (GalNAc3-21a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00439
실시예 73: GalNAc 3 -22을 포함하는 올리고머 화합물 221의 제조
Figure pct00440
Figure pct00441
화합물 220은 디이소프로필암모늄 테트라졸라이드를 사용하여 화합물 219로부터 제조되었다. GalNAc3-21 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 221은, 실시예 52에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 220로부터 제조된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc3-22 (GalNAc3-22a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 절단가능 모이어티는 -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-이다. GalNAc3-22 (GalNAc3-22a-CM-)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00442
실시예 74: 5'-GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제에 대한 다양한 절단가능 모이어티의 효과
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다. 각각의 GalNAc3 콘주게이트 그룹은 각 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 부착되었다.
표 60
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00443
모든 표에서, 대문자는 각 뉴클레오사이드에 대한 핵염기를 나타내고 mC는 5-메틸 시토신을 나타낸다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)을 나타내고; 그리고 "o'"는 -O-P(=O)(OH)-를 나타낸다. 콘주게이트 그룹은 굵은 글자체이다.
GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌다. GalNAc3-17a의 구조는 실시예 68에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-18a의 구조는 실시예 69에서 보여졌다.
처리
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 표 60에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 염수가 아래에서 보여진 복용량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 61에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유사한 효능을 보여주었고 GalNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다.
표 61
SRB-1 mRNA (염수 %)
Figure pct00444
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 염수 주입된 마우스에 대해 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화를 염수 그룹으로부터 유의미한 변화 없이 평가했다 (데이타 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 62에서 보여진다.
표 62
Figure pct00445
실시예 75: 5'-콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 약력학적 분석
상기 표 54, 57 및 60 중 ASO의 PK를, 실시예 65, 66, 및 74에서 기재된 처리 절차에 따라 수득된 간 샘플을 사용하여 평가했다. 간 샘플을 다지고 표준 프로토콜을 사용하여 추출하고 내부 표준과 함께 IP-HPLC-MS로 분석했다. 모든 대사물의 조합된 조직 수준 (㎍/g)은 적절한 UV 피크를 통합하여 측정되었고, (이 경우에 Isis 번호 353382인 "모") 콘주게이트를 누락한 전장 ASO의 조직 수준을 적절한 추출된 이온 크로마토그램 (EIC)를 사용하여 측정했다.
표 63
간 중 PK 분석
Figure pct00446
상기 표 63의 결과는, 특히 GalNAc3 콘주게이트 그룹의 유무에 따라 올리고뉴클레오타이드 사이의 복용의 차리를 고려할 때, 올리고뉴클레오타이드 투여 72 시간 후에 GalNAc3 콘주게이트 그룹 (ISIS 353382)를 포함하지 않는 모 올리고뉴클레오타이드보다 GalNAc3 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 간 조직 수준이 더 크다는 것을 보여준다. 더욱이, 72 시간까지, GalNAc3 콘주게이트 그룹을 포함하는 각 올리고뉴클레오타이드의 40-98%는 대사작용되어 모 화합물을 얻었고, 이것은, GalNAc3 콘주게이트 그룹이 올리고뉴클레오타이드로부터 절단되었다는 것을 나타낸다.
실시예 76: GalNAc 3 -23을 포함하는 올리고머 화합물 230의 제조
Figure pct00447
Figure pct00448
화합물 222는 시판되고 있다. 44.48 ml (0.33 mol)의 화합물 222를 피리딘 (500mL) 중 토실 클로라이드 (25.39 g, 0.13 mol)로 16 시간 동안 처리했다. 그 다음 반응을 증발시켜 오일을 얻고, EtOAc에서 용해시키고 물, 포화 NaHCO3, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트를 농축 건조하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하고, EtOAc/헥산 (1:1) 그 다음 CH2Cl2 중 10% 메탄올로 용출하여 화합물 223을 무색 오일로서 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 10 g (32.86 mmol)의 1-토실트리에틸렌 글리콜 (화합물 223)을 DMSO (100mL) 중 아지드화나트륨 (10.68 g, 164.28 mmol)로 실온에서 17 시간 동안 처리했다. 그 다음 반응 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 추출했다. 유기 층을 물로 3 회 세정하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기 층을 농축 건조하여 5.3g의 화합물 224 (92%)을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 1-아지도트리에틸렌 글리콜 (화합물 224, 5.53 g, 23.69 mmol) 및 화합물 4 (6 g, 18.22 mmol)을 4A 분자체 (5g), 및 디클로로메탄 (100mL) 중 TMSOTf (1.65 ml, 9.11 mmol)로 불활성 분위기 하에서 처리했다. 14 시간 후, 반응을 여과하여 체를 제거하고, 유기 층을 포화 NaHCO3, 물, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기 층을 농축 건조하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하고, 디클로로메탄 중 2 내지 4% 메탄올의 구배로 용출하여 화합물 225를 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 225 (11.9 g, 23.59 mmol)을 펄만 촉매 상에서 EtOAc/메탄올 (4:1, 250mL)에서 수소첨가했다. 8 시간 후, 촉매를 여과로 제거하고 용매를 제거하고 건조시켜 화합물 226을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다.
화합물 227를 산출하기 위해, DMF (100mL) 중 니트로메탄트리스프로피온산 (4.17 g, 15.04 mmol) 및 휘니그 염기 (10.3 ml, 60.17 mmol)의 용액을 펜타플루오로트리플루오로 아세테이트 (9.05 ml, 52.65 mmol)로 적가 처리했다. 30 분 후, 반응을 빙수에 붓고 EtOAc로 추출했다. 유기 층을 물, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조했다. 유기 층을 농축 건조하고 그 다음 헵탄으로부터 재결정화하여 화합물 227을 백색 고형물로서 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물227(1.5 g, 1.93 mmol) 및 화합물 226 (3.7 g, 7.74 mmol)을 실온에서 아세토니트릴 (15 mL)에서 2 시간 동안 교반했다. 그 다음 반응을 증발 건조하고 디클로로메탄 중 2 내지 10% 메탄올의 구배로 용출하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 228을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 228 (1.7 g, 1.02 mmol)을 에탄올 (100mL) 중 라니 니켈 (약 2g 습성)로 수소의 분위기에서 처리했다. 12 시간 후, 촉매를 여과로 제거하고 유기 층을 증발시켜 고형물을 얻었고, 이것을 직접적으로 다음 단계에서 사용했다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 이러한 고형물 (0.87 g, 0.53 mmol)을 DMF (5mL) 중 벤질글루타르산 (0.18 g, 0.8 mmol), HBTU (0.3 g, 0.8 mmol) 및 DIEA (273.7 μl, 1.6 mmol)로 처리했다. 16 시간 후, DMF를 감압 하에서 65℃에서 제거하여 오일을 얻었고, 오일을 디클로로메탄에서 용해시켰다. 유기 층을 포화 NaHCO3, 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 유기 층의 증발 후, 화합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하고 디클로로메탄 중 2 내지 20% 메탄올의 구배로 용출하여 커플링된 생성물을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 벤질 에스테르를 수소 분위기 하에서 1 시간 동안 펄만 촉매로 탈보호했다. 그 다음 촉매를 여과로 제거하고 용매를 제거하고 건조시켜 산을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 산 (486 mg, 0.27 mmol)을 건조 DMF (3 mL)에서 용해시켰다. 피리딘(53.61 μl, 0.66 mmol)을 부가하고 반응을 아르곤으로 퍼지했다. 펜타플루오로트리플루오로 아세테이트 (46.39 μl, 0.4 mmol)을 반응 혼합물에 서서히 부가했다. 반응의 색상은 담황색에서 암적색으로 변했고, 옅은 연기가 생겼고, 이것을 아르곤의 스트림으로 없앴다. 반응을 실온에서 1 시간 동안 교반되도록 했다 (반응의 완료는 LCMS으로 확인되었다). 용매를 감압 (회전증발기) 하에서 70 ℃에서 제거했다. 잔류물을 DCM으로 희석하고 1N NaHSO4, 염수로 세정하고, 포화된 중탄산나트륨 및 염수로 다시 세정했다. 유기물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축 건조하여 225 mg의 화합물 229를 잘 부서지는 황색 폼으로서 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다.
GalNAc3-23 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고머 화합물 230은, 실시예 46에서 실증된 일반적인 절차를 사용하여 화합물 229로부터 제조되었다. GalNAc3-23 콘주게이트 그룹 (GalNAc3-23a)의 GalNAc3 클러스터 부분은 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc3-23 (GalNAc3-23a-CM)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00449
실시예 77: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 64
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00450
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-9a의 구조는 실시예 52에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌고, GalNAc3-20a의 구조는 실시예 71에서 보여졌고, GalNAc3-23a의 구조는 실시예 76에서 보여졌다.
처리
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 각각에게 아래에서 보여진 복용량으로 표 64에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 염수가 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 72 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 65에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다.
표 65
SRB-1 mRNA (% 염수)
Figure pct00451
혈청 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 표준 프로토콜을 사용하여 또한 측정되었다. 총 빌리루빈 및 BUN가 또한 평가되었다. 체중의 변화가 평가되었고, 염수 그룹으로부터 유의미한 변화는 없었다 (데이타 도시되지 않음). ALT, AST, 총 빌리루빈 및 BUN 값은 아래의 표 66에서 보여진다.
표 66
Figure pct00452
Figure pct00453
실시예 78: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 안지오텐시노겐을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 정상혈압 스프래그 다우리 랫트에서 안지오텐시노겐 (AGT)의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 67
AGT을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00454
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다.
처리
6 주령, 수컷 스프래그 다우리 랫트 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 복용량으로, 총 3 회 용량 동안, 표 67에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 랫트는 최종 용량 후 72 시간에 희생되었다. AGT 간 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). AGT 혈장 단백질 수준은 총 안지오텐시노겐 ELISA (카탈로그 # JP27412, IBL International, Toronto, ON)을 1:20,000 희석된 혈장과 함께 사용하여 측정되었다. 아래의 결과는 간에서 AGT mRNA 수준 또는 PBS 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹의 혈장에서 AGT 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 68에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 AGT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준을 낮게 했고, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오타이드 보다 유의미하게 더 강했다.
표 68
AGT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준
Figure pct00455
혈장 및 체중 중 간 아미노기전달효소 수준, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST)는, 또한 표준 프로토콜을 사용하여 희생 시에 측정되었다. 결과는 아래의 표 69에서 보여준다.
표 69
간 아미노기전달효소 수준 및 랫트 체중
Figure pct00456
실시예 79: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 ApoC-III을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 생체내 작용의 지속시간
아래의 표 70에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 70
APOC-III을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00457
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다.
처리
인간 APOC-III을 발현시키는 6 내지 8 주령 이식유전자 마우스 각각에게 표 70에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS가 피하로 1 회 주입되었다. 각각의 처리 그룹은 3 마리의 동물로 구성되었다. 복용 전에 채혈하여 기준선을 결정하고 복용 후 72 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 및 6 주에서 결정했다. 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준은 실시예 20에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹의 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 수준의 평균 퍼센트로서 나타내고, 이것은, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가, 모의 복용량이 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 복용량의 3 배일지라도, 콘주게이트 그룹 (ISIS 304801)없는 모 올리고뉴클레오타이드보다 더 긴 작용의 지속시간을 나타낸다는 것을 보여준다.
표 71
이식유전자 마우스 중 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준
Figure pct00458
Figure pct00459
실시예 80: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 알파-1 항트립신 (A1AT)를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
아래의 표 72에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 A1AT의 용량-의존적 억제에 대한 연구에서 시험되었다.
표 72
A1AT을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00460
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다.
처리
6 주령, 수컷 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 복용량으로, 총 3 회 용량 동안, 표 72에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. A1AT 간 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). A1AT 혈장 단백질 수준은 마우스 알파 1-항트립신 ELISA을 사용하여 결정되었다 (카탈로그 # 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). 아래의 결과는 PBS 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 A1AT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준의 평균 퍼센트로부터 나타낸다.
표 73에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 A1AT 간 mRNA 및 A1AT 혈장 단백질 수준을 낮게 했다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 모 (ISIS 476366)보다 유의미하게 더 강했다.
표 73
A1AT 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준
Figure pct00461
혈장 중 간 아미노기전달효소 및 BUN 수준은 표준 프로토콜을 사용하여 희생 시에 측정되었다. 체중 및 장기 중량이 또한 측정되었다. 결과는 아래의 표 74에서 보여진다. 체중은 기준선에 대한 %로서 보여진다. 장기 중량은 PBS 대조군 그룹에 대한 체중의 %로서 보여진다.
표 74
Figure pct00462
실시예 81: GalNAc 3 클러스터를 포함하는 A1AT를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 생체내 작용의 지속시간
표 72에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
처리
6 주령, 수컷 C57BL/6 마우스 각각에게 표 72에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 혈액을 복용 전날에 취하여 기준선을 결정했고 복용 후 5, 12, 19, 및 25 일에서 결정했다. 혈장 A1AT 단백질 수준은 ELISA을 통해 측정되었다 (참고 실시예 80). 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 A1AT 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 더 강했고 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 476366) 없는 모보다 더 긴 작용의 지속시간을 가졌다는 것을 보여준다. 더욱이, 5'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 678381, 678382, 678383, 및 678384)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 3'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 656326)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드보다 더욱 더 긴 작용의 지속시간과 함께 일반적으로 더욱 더 강했다.
표 75
마우스 중 혈장 A1AT 단백질 수준
Figure pct00463
실시예 82: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 시험관내 안티센스 억제
일차 마우스 간 간세포는 96 웰 플레이트에서 15,000 세포/웰에서 처리 2시간 전에 씨딩되었다. 표 76에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 2, 10, 50, 또는 250 nM에서 Williams E 배지에서 부가되었고 세포는 밤새 37 ℃에서 5% CO2에서 인큐베이션되었다. 세포는 올리고뉴클레오타이드 부가 다음 16 시간 동안 용해되었고, 총 RNA는 RNease 3000 BioRobot (Qiagen)를 사용하여 정제되었다. SRB-1 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). IC50 값은 Prism 4 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하여 측정되었다. 이 결과는, 다양한 상이한 GalNAc 콘주게이트 그룹 및 다양한 상이한 절단가능 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 GalNAc 콘주게이트 그룹 (ISIS 353382 및 666841)이 없는 모 올리고뉴클레오타이드보다 시험관내 유리 흡수 실험에서 유의미하게 더 강하다는 것을 보여준다.
표 76
시험관내 SRB-1 발현의 억제
Figure pct00464
Figure pct00465
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-5a의 구조는 실시예 49에서 보여졌고, GalNAc3-6a의 구조는 실시예 51에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-8a의 구조는 실시예 47에서 보여졌고, GalNAc3-9a의 구조는 실시예 52에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-12a의 구조는 실시예 61에서 보여졌고, GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌고, GalNAc3-14a의 구조는 실시예 63에서 보여졌고, GalNAc3-15a의 구조는 실시예 64에서 보여졌고, GalNAc3-17a의 구조는 실시예 68에서 보여졌고, GalNAc3-18a의 구조는 실시예 69에서 보여졌고, GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌고, GalNAc3-20a의 구조는 실시예 71에서 보여졌고, GalNAc3-23a의 구조는 실시예 76에서 보여졌다.
실시예 83: GalNAc 3 클러스터를 포함하는 인자 XI를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
아래의 표 77에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 인자 XI의 용량-의존적 억제에 대한 연구에서 시험되었다.
표 77
인자 XI를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00466
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌다, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다.
처리
6 내지 8 주령 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 복용량으로, 총 3 회 용량 동안, 아래에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 동물로 구성되었다. 인자 XI 간 mRNA 수준은 실시간 PCR을 사용하여 측정되었고 표준 프로토콜에 따라 사이클로필린에 대해 정규화되었다. 간 아미노기전달효소, BUN, 및 빌리루빈이 또한 측정되었다. 아래의 결과는 PBS 대조군에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 78에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 인자 XI 간 mRNA를 낮게 했다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 404071)가 없는 모보다 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, 5'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 663086, 678347, 678348, 및 678349)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 3'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 656173)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드보다 더욱 더 강했다.
표 78
인자 XI 간 mRNA, 간 아미노기전달효소, BUN, 및 빌리루빈 수준
Figure pct00467
실시예 84: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 인자 XI를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 생체내 작용의 지속시간
표 77에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
처리
6 내지 8 주령 마우스 각각에게 표 77에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 혈액을 복용 전날에 꼬리 출혈에 의해 취해서 기준선을 결정하고 복용 후 3, 10, 및 17 일에서 측정했다. 혈장 인자 XI 단백질 수준은 인자 XI 포획 및 바이오티닐화된 검출 항체 (R & D SYSTEMS, Minneapolis, MN (카탈로그 # AF2460 및 # BAF2460, 각각)) 및 OptEIA 시약 세트 B (카탈로그 # 550534, BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 인자 XI 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 404071) 없는 모보다 더 긴 작용의 지속시간과 함께 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, 5'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 663086, 678347, 678348, 및 678349)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 3'-GalNAc 콘주게이트 (ISIS 656173)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드보다 더욱 더 긴 작용의 지속시간과 함께 더 더욱 더 강했다.
표 79
마우스 중 혈장 인자 XI 단백질 수준
Figure pct00468
실시예 85: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
표 76에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
처리
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 복용량으로, 총 3 회 용량 동안, 표 76에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 염수가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 후 48 시간에 희생되었고 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 SRB-1 mRNA 수준을 측정했다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 아래의 결과는 염수 대조군으로 정규화된 각 처리 그룹에 대한 간 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 80 및 81에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다.
표 80
간 중 SRB-1 mRNA
Figure pct00469
표 81
간 중 SRB-1 mRNA
Figure pct00470
간 아미노기전달효소 수준, 총 빌리루빈, BUN, 및 체중은 표준 프로토콜을 사용하여 또한 측정되었다. 각 처리 그룹의 평균 값은 아래의 표 82에서 보여진다.
표 82
Figure pct00471
실시예 86: GalNAc 3 클러스터를 포함하는 TTR를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
아래의 표 83에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 인간 TTR 유전자를 발현시키는 이식유전자 마우스에서 인간 트랜스티레틴 (TTR)의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
처리
8 주령 TTR 이식유전자 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 3 주 동안, 총 3 회 용량 동안, 아래의 표에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 및 복용량 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. 꼬리 출혈은 실험을 통해 다양한 시점에서 수행되었고, 혈장 TTR 단백질, ALT, 및 AST 수준은 측정되고 표 85-87에서 보고되었다. 상기 동물이 희생된 후, 혈장 ALT, AST, 및 인간 TTR 수준은 체중, 장기 중량, 및 간 인간 TTR mRNA 수준에서와 같이 측정되었다. TTR 단백질 수준은 임상 분석기 (AU480, Beckman Coulter, CA)를 사용하여 측정되었다. 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)은 표준 프로토콜에 따라 사용되어 간 인간 TTR mRNA 수준을 측정했다. 표 84-87에서 제공된 결과는 각 처리 그룹의 평균 값이다. mRNA 수준은 PBS 그룹의 평균에 대한 평균 값이다. 혈장 단백질 수준은 기준선에서 PBS 그룹의 평균 값에 대한 평균 값이다. 체중은 각 개별적인 처리 그룹에 대한 희생까지 기준선으로부터의 평균 퍼센트 체중 변화이다. 보여진 장기 중량은 동물의 체중으로 정규화되고, 그 다음 각 처리 그룹의 평균 정규화된 장기 중량은 PBS 그룹의 평균 정규화된 장기 중량에 대해 나타낸다.
표 84 내지 87에서, "BL"는 제 1 용량 직전에 취한 기준선, 측정을 나타낸다. 표 84 및 85에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 TTR 발현 수준을 낮게 했다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 420915)가 없는 모보다 더 강했다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 및 혼합된 PS/PO 뉴클레오사이드간 연결를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트 및 완벽한 PS 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
표 83
인간 TTR을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00472
표 85에 대한 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. GalNAc3-1의 구조는 실시예 9에서 보여졌다. GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌다. GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다. GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌다. GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다. GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌다.
표 84
생체내 인간 TTR의 안티센스 억제
Figure pct00473
표 85
생체내 인간 TTR의 안티센스 억제
Figure pct00474
표 86
아미노기전달효소 수준, 체중 변화, 및 장기 장기 중량
Figure pct00475
표 87
아미노기전달효소 수준, 체중 변화, 및 장기 장기 중량
Figure pct00476
실시예 87: GalNAc 3 클러스터를 포함하는 TTR 를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 단회 용량에 의한 생체내 작용의 지속시간
ISIS 번호 420915 및 660261 (참고 표 83)은 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다. ISIS 번호 420915, 682883, 및 682885 (참고 표 83)은 또한 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
처리
인간 TTR을 발현시키는 8 주령, 수컷 이식유전자 마우스 각각에게 100 mg/kg ISIS 번호 420915 또는 13.5 mg/kg ISIS 번호 660261가 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 꼬리 출혈은 복용 전에 수행되어 기준선을 결정했고 복용 3, 7, 10, 17, 24, 및 39 일 후에 측정했다. 혈장 TTR 단백질 수준은 실시예 86에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 TTR 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 88
혈장 TTR 단백질 수준
Figure pct00477
처리
인간 TTR을 발현시키는 암컷 이식유전자 마우스 각각에게 100 mg/kg ISIS 번호 420915, 10.0 mg/kg ISIS 번호 682883, 또는 10.0 mg/kg 682885가 피하로 한번 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 꼬리 출혈은 복용 전에 수행되어 기준선을 결정했고 복용 3, 7, 10, 17, 24, 및 39 일 후에 측정했다. 혈장 TTR 단백질 수준은 실시예 86에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 아래의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된 각 처리 그룹에 대한 혈장 TTR 수준의 평균 퍼센트로서 나타낸다.
표 89
혈장 TTR 단백질 수준
Figure pct00478
표 88 및 89의 결과는, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오타이드 (ISIS 420915)보다 더 긴 지속시간과 함께 더 강하다는 것을 보여준다.
실시예 88: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SMN을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 스플라이싱 조절
표 90에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 운동 뉴런 (SMN)의 인간 생존의 스플라이싱 조절에 대해 시험되었다.
표 90
SMN를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00479
GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다. "X"는 Gene Tools (Philomath, OR)에 의해 산출된 5' 일차 아민을 나타내고, GalNAc3-7b는 이하에서 보여진 바와 같은 링커의 -NH-C6-O 부분이 없는 GalNAc3-7a의 구조를 나타낸다:
Figure pct00480
ISIS 번호 703421 및 703422는 모플리노 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 2 개의 올리고뉴클레오타이드의 각 뉴클레오타이드는 모폴리노 뉴클레오타이드이다.
처리
인간 SMN를 발현시키는 6 주령 이식유전자 마우스는 표 91에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 염수가 피하로 한번 주입되었다. 각 처리 그룹은 2 마리 수컷 및 2 마리 암컷으로 구성되었다. 마우스는 복용 3 일 후에 희생되어 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR을 사용하여 엑손 7 유무에 따른 간 인간 SMN mRNA 수준을 측정했다. 총 RNA는 리보그린 시약을 사용하여 측정되었다. SMN mRNA 수준은 총 mRNA로 정규화되었고, 염수 처리 그룹의 평균으로 추가로 정규화되었다. 엑손 7 포함 SMN mRNA 대 엑손 7 누락 SMN mRNA의 수득한 평균 비는 표 91에서 보여진다. 이 결과는, 스플라이싱을 조절하고 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 완전히 변형된 올리고뉴클레오타이드가 GlaNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오타이드보다 간에서 스플라이싱을 변경할 때 유의미하게 더 강하다는 것을 보여준다. 더욱이, 이러한 추세는 2'-MOE 및 모폴리노 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 다중 변형 화학을 위해 유지된다.
표 91
생체내에서 인간 SMN을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 효과
Figure pct00481
실시예 89: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 아포지질단백질 (Apo(a))을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
아래의 표 92에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 이식유전자 마우스에서 Apo(a)의 용량-의존적 억제에 대한 연구에서 시험되었다.
표 92
APO(a)를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00482
GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다.
처리
8 주령, 암컷 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 각각에게 피하로 주당 1회 아래에서 보여진 복용량으로, 총 6 번 용량 동안에, 표 92에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS가 주입되었다. 각 처리 그룹은 3 내지 4 마리의 동물로 구성되었다. 꼬리 출혈은 제 1 용량 전날에 및 각 용량 다음 매주 수행되어 혈장 Apo(a) 단백질 수준을 측정했다. 마우스는 최종 투여 2 일 후에 희생되었다. Apo(a) 간 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약을 사용하여 측정되었다 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Apo(a) 혈장 단백질 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었고, 간 아미노기전달효소 수준이 측정되었다. 표 93의 mRNA 및 혈장 단백질 결과는 PBS 처리된 그룹에 대한 처리 그룹 평균 퍼센트로서 나타낸다. 혈장 단백질 수준은 PBS 그룹의 기준선 (BL) 값으로 추가로 정규화되었다. 평균 절대적인 아미노기전달효소 수준 및 체중 (기준선 평균에 대한 %)은 표 94에서 보고된다.
표 93에서 실증된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 Apo(a) 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준을 낮게 했다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오타이드보다 더 긴 작용의 지속시간과 함께 유의미하게 더 강했다. 표 94에서 실증된 바와 같이, 아미노기전달효소 수준 및 체중은 올리고뉴클레오타이드에 의해 영향을 받지 않았고, 이것은, 올리고뉴클레오타이드가 잘 용인되었다는 것을 나타낸다.
표 93
Apo(a) 간 mRNA 및 혈장 단백질 수준
Figure pct00483
표 94
Figure pct00484
실시예 90: GalNAc 3 클러스터를 포함하는 TTR을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 안티센스 억제
아래의 표 95에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 인간 TTR 유전자를 발현시키는 이식유전자 마우스에서 인간 트랜스티레틴 (TTR)의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
처리
TTR 이식유전자 마우스 각각에게 피하로 주당 1회 3 주 동안, 총 3 회 용량 동안, 표 96에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 및 복용량 또는 PBS이 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 제 1 용량 전에, 꼬리 출혈이 수행되어 기준선 (BL)에서 혈장 TTR 단백질 수준을 측정했다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. TTR 단백질 수준은 임상 분석기 (AU480, Beckman Coulter, CA)를 사용하여 측정되었다. 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)은 표준 프로토콜에 따라 사용되어 간 인간 TTR mRNA 수준을 측정했다. 표 96에서 제공된 결과는 각 처리 그룹의 평균 값이다. mRNA 수준은 PBS 그룹의 평균에 대한 평균 값이다. 혈장 단백질 수준은 기준선에서 PBS 그룹의 평균 값에 대한 평균 값이다. "BL"는 제 1 용량 직전에 취한 기준선, 측정을 나타낸다. 표 96에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식에서 TTR 발현 수준을 낮게 했다. GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트 (ISIS 420915)가 없는 모보다 더 강했고, 포스포디에스테르 또는 데옥시아데노신 절단가능 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 콘주게이트가 없는 모와 비교하여 효능의 유의미한 개선을 보여주었다 (참고 ISIS 번호 682883 및 666943 vs 420915 및 실시예 86 및 87 참고).
표 95
인간 TTR을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00485
표 95에 대한 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌다. GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다. GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌다. GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다.
표 96
생체내 인간 TTR의 안티센스 억제
Figure pct00486
실시예 91: 비-인간 영장류에서 GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 인자 VII를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 의 안티센스 억제
아래의 표 97에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 원숭이에서 인자 VII의 안티센스 억제에 대해 비-말단, 용량 단계적 확대 연구에서 시험되었다.
처리
비-나이브 원숭이 각각에게 0, 15, 및 29일에 상승하는 용량의 표 97에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS가 피하로 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷으로 구성되었다. 제 1 용량 전에 및 그 후 다양한 시점에서, 채혈이 수행되어 혈장 인자 VII 단백질 수준을 측정했다. 인자 VII 단백질 수준은 ELISA에 의해 측정되었다. 표 98에서 제공된 결과는 기준선 (BL)에서 PBS 그룹의 평균 값에 대한 각 처리 그룹의 평균 값이고, 상기 측정은 제 1 용량 직전에 취해졌다. 표 98에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식으로 인자 VII 발현 수준을 낮게 했고, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트가 없는 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 원숭이에서 유의미하게 더 강했다.
표 97
인자 VII을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00487
표 97에 대한 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌다.
표 98
인자 VII 혈장 단백질 수준
Figure pct00488
실시예 92: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 ApoCIII을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 일차 간세포에서의 안티센스 억제
일차 마우스 간세포는 15,000 세포/웰에서 96-웰 플레이트에서 씨딩되었고, 마우스 ApoC-III을 표적으로 하는, 표 99에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는, 0.46, 1.37, 4.12, 또는 12.35, 37.04, 111.11, 또는 333.33 nM 또는 1.00 μM에서 부가되었다. 24 시간 동안 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션한 후, 세포는 용해되었고 총 RNA는 RNeasy (Qiagen)를 사용하여 정제되었다. ApoC-III mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 실시간 PCR 및 RIBOGREEN® RNA 정량화 시약 (Molecular Probes, Inc.)을 사용하여 측정되었다. IC50 값은 Prism 4 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하여 측정되었다. 이 결과는, 절단가능 모이어티가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-연결된 데옥시아데노신인 지와는 무관하게, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 콘주게이트가 없는 모 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다.
표 99
마우스 일차 간세포 중 마우스 APOC-III 발현의 억제
Figure pct00489
GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌고, GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌고, GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌다.
실시예 93: 혼합된 윙 및 5'-GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 의 안티센스 억제
표 100에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 100
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00490
GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다. 하첨자: "e"는 2'-MOE 변형된 뉴클레오사이드를 나타내고; "d"는 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오사이드를 나타내고; "k"는 6'-(S)-CH3 바이사이클릭 뉴클레오사이드 (cEt)를 나타내고; "s"는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결 (PS)을 나타내고; "o"는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 (PO)를 나타낸다. 상첨자 "m"은 5-메틸시토신을 나타낸다.
처리
6 내지 8 주령 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 표 100에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 염수가 아래에서 보여진 복용량으로 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. 간 SRB-1 mRNA 수준은 실시간 PCR를 사용하여 측정되었다. SRB-1 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 사이클로필린 mRNA 수준에 대해 정규화되었다. 결과는 염수 대조군 그룹에 대한 각 처리 그룹을 위해 SRB-1 mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 제공된다. 표 101에서 실증된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리는 용량-의존 방식으로 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했고, GalNAc 콘주게이트를 포함하고 완전한 cEt 또는 혼합된 당 변형이었던 윙을 갖는 갭머 올리고뉴클레오타이드는 콘주게이트가 없고 완전한 cEt 변형된 윙을 포함하는 모 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다.
체중, 간 트랜스아미나제, 총 빌리루빈, 및 BUN가 또한 측정되었고, 각 처리 그룹에 대한 평균 값은 표 101에서 보여진다. 체중은 올리고뉴클레오타이드 용량 직전에 측정된 기준선 체중 (% BL)에 대한 평균 퍼센트 체중로서 보여진다.
표 101
SRB-1 mRNA, ALT, AST, BUN, 및 총 빌리루빈 수준 및 체중
Figure pct00491
실시예 94: 2'-당 변형 및 5'-GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 의 안티센스 억제
표 102에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 102
SRB-1를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00492
하첨자 "m"은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오사이드를 나타낸다. 완전한 표 범례에 대한 실시예 74 참고. GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다.
처리
이러한 연구는 실시예 93에서 기재된 프로토콜을 사용하여 완료되었다. 결과는 아래의 표 103에서 보여지고 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 2'-MOE 및 2'-OMe 변형된 올리고뉴클레오타이드 둘 모두가 콘주게이트가 없는 각 모 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다. 체중, 간 트랜스아미나제, 총 빌리루빈, 및 BUN 측정의 결과는, 모든 화합물이 용인되었다는 것을 명시했다.
표 103
SRB-1 mRNA
Figure pct00493
실시예 95: 바이사이클릭 뉴클레오사이드 및 5'-GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 의 안티센스 억제
표 104에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
표 104
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00494
하첨자 "g"는 플루오로-HNA 뉴클레오사이드를 나타내고, 하첨자 "l"는 2'-O-CH2-4' 브릿지를 포함하는 잠겨진 뉴클레오사이드를 나타낸다. 다른 약어에 대한 실시예 74 표 범례 참고. GalNAc3-1a의 구조는 실시예 9에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 이전에 보여졌고, GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다.
처리
이러한 연구는 실시예 93에서 기재된 프로토콜을 사용하여 완료되었다. 결과는 아래의 표 105에서 보여지고 GalNAc 콘주게이트 및 다양한 바이사이클릭 뉴클레오사이드 변형을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 콘주게이트가 없고 바이사이클릭 뉴클레오사이드 변형을 포함하는 모 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 및 플루오로-HNA 변형을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 콘주게이트가 없고 플루오로-HNA 변형을 포함하는 모 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다. 체중, 간 트랜스아미나제, 총 빌리루빈, 및 BUN 측정의 결과는, 모든 화합물이 용인되었다는 것을 명시했다.
표 105
SRB-1 mRNA, ALT, AST, BUN, 및 총 빌리루빈 수준 및 체중
Figure pct00495
실시예 96: GalNAc 3 콘주게이트 그룹을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혈장 단백질 결합
ApoC-III을 표적으로 하는 표 70에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 및 Apo(a)을 표적으로 하는 표 106에서의 올리고뉴클레오타이드는 한외 검정에서 시험되어 혈장 단백질 결합을 평가했다.
표 106
Apo(a)을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00496
표 범례에 대한 실시예 74 참조 GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 이전에 보여졌다.
Ultrafree-MC 한외여과 장치 (30,000 NMWL, 저-결합 재생된 셀룰로오스 막, 밀리포어, Bedford, MA)을 300 μL의 0.5% Tween 80으로 전-컨디셔닝하고 10 분 동안 2000 g에서 원심분리하고, 그 다음 H2O 중 대조 올리고뉴클레오타이드의 300μL의 300 μg/mL 용액으로 전-컨디셔닝하고 16 분 동안 2000 g에서 원심분리했다. 본 연구에서 사용될 표 70 및 106으로부터의 각 시험 올리고뉴클레오타이드의 필터에 대한 비-특이적 결합을 평가하기 위해, H2O 중 올리고뉴클레오타이드의 300 μL의 250 ng/mL 용액을 pH 7.4에서 전-컨디셔닝된 필터 내에 두었고 16 분 동안 2000 g에서 원심분리했다. 비여과된 및 여과된 샘플을 ELISA 검정로 분석하여 올리고뉴클레오타이드 농도를 측정했다. 3개의 복제물을 사용하여 각 샘플에 대한 평균 농도를 얻었다. 미여과된 샘플에 대한 여과된 샘플의 평균 농도를 사용하여 혈장의 주재에서 필터를 통해 회수된 올리고뉴클레오타이드의 퍼센트를 결정한다 (% 회수율).
정상, 무약물 인간 지원자, 사이노몰구스 원숭이, 및 CD-1 마우스로부터의 K3-EDTA에서 수집된 냉동된 전체의 혈장 샘플을, Bioreclamation LLC (Westbury, NY)로부터 구매했다. 시험 올리고뉴클레오타이드를 1.2 mL 분취량의 혈장에 2 개의 농도 (5 및 150 μg/mL)에서 부가했다. 분취량 (300 μL)의 각 스파이킹된 혈장 샘플을 전-컨디셔닝된 필터 장치에 내에 두고 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 즉시 그 다음 2000 g에서 16 분 동안 원심분리했다. 분취량의 여과된 및 미여과된 스파이킹된 혈장 샘플을 ELISA로 분석하여 각 샘플 중 올리고뉴클레오타이드 농도를 측정했다. 농도 당 3 개의 복제물을 사용된 각 샘플 중 결합된 및 미결합된 올리고뉴클레오타이드의 평균 백분율을 측정했다. 미여과된 샘플의 농도에 대한 여과된 샘플의 평균 농도는 사용되어 혈장 단백질에 결합되지 않는 혈장(미결합된 %) 중 올리고뉴클레오타이드의 퍼센트를 측정한다. 최종 미결합된 올리고뉴클레오타이드 값은 각 올리고뉴클레오타이드에 대해 % 미결합된 %를 % 회수율로 나누어서 비-특이적 결합을 위해 수정된다. 최종 % 결합된 올리고뉴클레오타이드 값은 100에서 최종 % 미결합된 값을 빼서 결정된다. 결과는 각 종의 혈장에서 시험된2 개의 올리고뉴클레오타이드의 농도 시험 (5 및 150 μg/mL)에 대해 표 107에서 보여진다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹이 혈장 단백질 결합에 대한 유의미한 영향을 갖지 않는다는 것을 보여준다. 더욱이, 완벽한 PS 뉴클레오사이드간 연결 및 혼합된 PO/PS 연결 둘 모두를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 혈장 단백질에 결합하고, 완벽한 PS 연결을 갖는 것은 혼합된 PO/PS 연결을 갖는 것보다 어느 정도 더 큰 정도로 혈장 단백질에 결합한다.
표 107
혈장 단백질에 결합된 변형된 올리고뉴클레오타이드의 퍼센트
Figure pct00497
실시예 97: GalNAc 3 콘주게이트 그룹을 포함하는 TTR을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
GalNAc 콘주게이트를 포함하는 표 108에서 보여진 올리고뉴클레오타이드는 설계되어 TTR을 표적으로 했다.
표 108
TTR을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00498
표 108의 범례는 실시예 74에서 발견될 수 있다. GalNAc3-1의 구조는 실시예 9에서 보여졌다. GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌다. GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다. GalNAc3-10a의 구조는 실시예 46에서 보여졌다. GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 보여졌다. GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌다.
실시예 98: hPMBC 검정에서 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 전-염증 효과의 평가
표 109에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 실시예 23 및 24에서 기재된 바와 같이 hPMBC 검정에서 전-염증 효과에 대해 시험되었다. (올리고뉴클레오타이드의 설명에 대한 표 30, 83, 95, 및 108을 참고한다) ISIS 353512는 양성 대조군으로서 사용된 고반응군이고, 다른 올리고뉴클레오타이드는 표 83, 95, 및 108에서 기재되어 있다. 표 109에서 보여진 이러한 결과는 하나의 지원자 공여체로부터의 혈액을 사용하여 수득되었다. 이 결과는, 혼합된 PO/PS 뉴클레오사이드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 완벽한 PS 연결을 갖는 동일한 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 유의미하게 더 낮은 전-염증 반응을 생산했다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 그룹은 이러한 검정에서 유의미한 효과를 가지지 않았다.
표 109
Figure pct00499
실시예 99: 아시알로당단백질 수용체에 대한 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화성
아시알로당단백질 수용체에 대한 표 110에서 열거된 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화성 (올리고뉴클레오타이드의 설명에 대한 표 76 참고)은 경쟁적 수용체 결합 검정에서 시험되었다. 경쟁자 리간드, α1-산 당단백질 (AGP)는, 50 mM 나트륨 아세테이트 버퍼 (pH 5)에서 1 U 뉴라미니다제-아가로스와 함께 16 시간 동안 37℃에서 인큐베이션되었고, > 90% 탈시알릴화는 시알산 검정 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 확인되었다. 요오드 모노클로라이드는 사용되어 Atsma 등에 의한 절차에 따라 AGP를 요오드화했다 (참고J Lipid Res. 1991 Jan; 32(1):173-81.) 이러한 방법에서, 탈시알릴화된 α1-산 당단백질 (de-AGP)을 0.25 M NaOH 중 10 mM 염화요오드, Na125I, 및 1 M 글리신에 부가했다. 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 125I -라벨링된 de-AGP를, 3 KDMWCO 스핀 칼럼을 시용하여 혼합물을 2회 농축하여 유리 125I로부터 분리했다. 단백질을, Agilent SEC-3 칼럼 (7.8x300mm) 및 β-RAM 계수기가 구비된 HPLC 시스템 상에서 라벨링 효율 및 순도에 대해 시험했다. 125I -라벨링된 de-AGP 및 ASO를 함유하는 다양한 GalNAc-클러스터를 이용하는 경쟁 실험을 하기와 같이 수행했다. 인간 HepG2 세포 (106 세포/ml)을 2 mL의 적절한 성장 배지에서 6-웰 플레이트 상에서 플레이팅했다. 10% 우태 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민 및 10mM HEPES로 보강된 MEM 배지를 사용했다. 세포를 16-20 시간 동안 37℃에서 5% 및 10% CO2 각각과 함께 인큐베이션했다. 세포를 실험 전에 FBS가 없는 배지로 세정했다. 세포를, 적절한 성장 배지를 2% FBS, 10-8 M 125I -라벨링된 de-AGP와 함게 함유하는 1ml 경쟁 혼합물 및 10-11 내지 10-5 M 범위의 농도에서 ASO를 함유하는 GalNAc-클러스터로 30 분 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 비-특이적 결합을 10-2 M GalNAc 당의 존재에서 결정했다. 세포를 FBS가 없는 배지로 2회 세정하여 미결합된 125I -라벨링된 de-AGP 및 경쟁자 GalNAc ASO를 제거했다. 세포를, 1% β-머캅토에탄올을 함유하는 Qiagen's RLT 버퍼를 사용하여 용해시켰다. 용해물을 짧은 10 분 동결/융해 사이클 후 둥근바닥 검정 튜브로 이동시키고 γ-계수기 상에서 검정했다. 비-특이적 결합을 공제한 후 125I 단백질 카운트를 최저 GalNAc-ASO 농도 카운트의 값으로 나누었다. 억제 곡선 비선형회귀 알고리즘을 사용하는 단일 부위 경쟁적 결합 방정식에 따라 적합화되어 결합 친화성 (KD's)을 계산했다.
표 110의 결과는 5 개의 상이한 날에 수행된 실험으로부터 수득되었다. 상첨자 "a"로 나타낸 올리고뉴클레오타이드에 대한 결과는 2 개의 상이한 날에 실험 시행의 평균이다. 이 결과는, 5'-말단 상에 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 3'-말단 상에 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드보다 1.5 내지 16-배 더 큰 친화성을 갖는 인간 HepG2 세포 상에서 아시알로당단백질 수용체를 결합햇다는 것을 보여준다.
표 110
아시알로당단백질 수용체 결합 검정 결과
Figure pct00500
실시예 100: 생체내에서 Apo(a)를 표적으로 하는 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 의 안티센스 억제
아래의 표 111a에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 111a
APO(a)를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00501
GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다.
처리
인간 Apo(a)을 발현시키는 암컷 이식유전자 마우스 각각에게, 피하로 주당 1회, 총 6 번 용량 동안에, 표 111b에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 및 복용량 또는 PBS이 주입되었다. 각각의 처리 그룹은 3 마리의 동물로 구성되었다. 혈액을, 복용 전날에 뽑아서 Apo(a) 단백질의 기준선 수준을 혈장에서 그리고 제 1 용량 다음72 시간, 1 주, 및 2 주에서 측정했다. 추가의 채혈은 제 1 용량 다음 3 주, 4 주, 5 주, 및 6 주에서 일어날 것이다. 혈장 Apo(a) 단백질 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었다. 표 111b의 결과는 기준선 수준 (% BL)에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 혈장 Apo(a) 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 제공되고, 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 Apo(a) 발현에서 강력한 축소를 나타내었다는 것을 보여준다. 이러한 강력한 효과는 완벽한 PS 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 혼합된 PO 및 PS 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 대해 관찰되었다.
표 111b
Apo(a) 혈장 단백질 수준
Figure pct00502
실시예 101: 안정한 모이어티를 통해 연결된 GalNAc 클러스터를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 안티센스 억제
표 112에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스 APOC-III 발현의 억제에 대해 생체내에서 시험되었다. C57Bl/6 마우스 각각에게 표 112에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. ISIS 440670로 처리된 각각의 마우스는 2, 6, 20, 또는 60 mg/kg의 용량을 수용했다. ISIS 680772 또는 696847로 처리된 각각의 마우스는 0.6, 2, 6, 또는 20 mg/kg을 수용했다. ISIS 696847의 GalNAc 콘주게이트 그룹은 쉽게 절단가능 포스포디에스테르 함유 연결 대신에 안정한 모이어티, 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다. 동물은 용량 후 72 시간에 희생되었다. 간 APOC-III mRNA 수준은 실시간 PCR를 사용하여 측정되었다. APOC-III mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 사이클로필린 mRNA 수준에 대해 정규화되었다. 결과는 염수 대조군 그룹에 대한 각 처리 그룹을 위해 APOC-III mRNA 수준의 평균 퍼센트로서 표 112에서 제공된다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 콘주게이트 그룹이 없는 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여준다. 더욱이, 절단가능 모이어티 (ISIS 680772)를 통해 올리고뉴클레오타이드에 연결된 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 안정한 모이어티 (ISIS 696847)를 통해 올리고뉴클레오타이드에 연결된 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드보다 더욱 더 강했다.
표 112
마우스 APOC-III를 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00503
GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다.
실시예 102: GalNAc 콘주게이트를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 간에서의 분포
GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 ISIS 353382 (참고 표 36) 및 GalNAc 콘주게이트를 포함하는 ISIS 655861 (참고 표 36)의 간 분포는 평가되었다. 수컷 balb/c 마우스에게 표 113에서 열거된 복용량으로 ISIS 353382 또는 655861을 피하로 1회 주입했다. 각각의 처리 그룹은 2 마리의 동물로 구성된 ISIS 655861에 대한 18 mg/kg 그룹을 제외하고 3 마리의 동물로 구성되었다. 동물을 복용 48 시간 후에 희생시켜 올리고뉴클레오타이드의 간 분포를 측정했다. 세포 당 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자의 수를 측정하기 위해, 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 태그 (MSD TAG, 중간 규모발견)을 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 검출하기 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드 프로브에 접합된다. 표 113에 존재하는 결과는 세포 당 올리고뉴클레오타이드 분자의 수백만 단위로 각 처리 그룹에 대한 올리고뉴클레오타이드의 평균 농도이다. 이 결과는, 동등 투여량에서, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오타이드보다 전체 간 및 간세포에서 더 높은 농도로 존재한다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 GalNAc 콘주게이트를 포함하지 않는 올리고뉴클레오타이드 보다 더 낮은 비-실질 간 세포 중 농도로 존재했다. 그리고 간세포 및 비-실질 간 세포 중 ISIS 655861의 농도는 세포에 대해 유사했지만, 간은 용적으로 대략 80% 간세포이다. 따라서, 간에 존재했던 대다수의 ISIS 655861 올리고뉴클레오타이드는 간세포에서 발견되었고, 반면에 간에 존재했던 대다수의 ISIS 353382 올리고뉴클레오타이드는 비-실질 간 세포에서 발견되었다.
표 113
Figure pct00504
실시예 103: GalNAc 3 콘주게이트를 포함하는 ApoC-III을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 생체내 작용의 지속시간
아래의 표 114에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 작용의 지속시간에 대한 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 114
APOC-III을 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00505
GalNAc3-3a의 구조는 실시예 39에서 보여졌고, GalNAc3-19a의 구조는 실시예 70에서 보여졌다.
처리
인간 APOC-III을 발현시키는 암컷 이식유전자 마우스 각각에게 표 114에서 열거된 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS를 피하로 1 회 주입했다. 각각의 처리 그룹은 3 마리의 동물로 구성되었다. 복용 전에 채혈하여 복용 다음에 기준선 및 3, 7, 14, 21, 28, 35, 및 42 일에서 측정했다. 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준은 실시예 20에서 기재된 바와 같이 측정되었다. 표 115에서의 결과는 기준선 수준에 대해 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 수준의 평균 퍼센트로서 제공된다. 실시예 79의 표 71의 결과와 아래의 표 115의 결과와의 비교는, 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결만을 포함하는 동등한 올리고뉴클레오타이드보다 작용의 증가된 지속시간을 나타냈다는 것을 보여준다.
표 115
이식유전자 마우스 중 혈장 트리글리세라이드 및 APOC-III 단백질 수준
Figure pct00506
실시예 104: 5'-GalNAc 2 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00507
화합물 120은 시판되고 있고, 화합물 126의 합성은 실시예 49에서 기재되어 있다. 화합물 120 (1 g, 2.89 mmol), HBTU (0.39 g, 2.89 mmol), 및 HOBt (1.64 g, 4.33 mmol)을 DMF (10 mL)에서 용해시키고, N, N-디이소프로필에틸아민 (1.75 mL, 10.1 mmol)을 부가했다. 약 5 분 후, 아미노헥산산 벤질 에스테르 (1.36 g, 3.46 mmol)을 반응에 부가했다. 3 시간 후, 반응 혼합물을 100 mL의 1 M NaHSO4에 붓고 2 x 50 mL 에틸 아세테이트로 추출했다. 유기 층들을 조합하고 3 x 40 mL 포화 NaHCO3 및 2 x 염수로 세정하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축했다. 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (DCM:EA:Hex, 1:1:1)로 정제하여 화합물 231을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 231 (1.34 g, 2.438 mmol)을 디클로로메탄 (10 mL)에서 용해시키고 트리플루오르아세트산 (10 mL)을 부가했다. 실온에서 2 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고 톨루엔 (3 x 10 mL)로 공-증발시켰다. 잔류물을 감압 하에서 건조하여 화합물 232을 트리플루오르아세테이트 염으로서 얻었다. 화합물 166의 합성은 실시예 54에서 기재되어 있다. 화합물 166 (3.39 g, 5.40 mmol)을 DMF (3 mL)에서 용해시켰다. 화합물 232 (1.3 g, 2.25 mmol)의 용액을 DMF (3 mL)에서 용해시키고 N, N-디이소프로필에틸아민 (1.55 mL)을 부가했다. 반응을 실온에서 30 분 동안 교반하고, 그 다음 물 (80 mL)에 붓고 수성 층을 EtOAc (2x100 mL)로 추출했다. 유기 상을 분리하고 포화 수성 NaHCO3 (3 x 80 mL), 1 M NaHSO4 (3 x 80 mL) 및 염수 (2 x 80 mL)로 세정하고, 그 다음 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축했다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 233을 얻었다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 화합물 233 (0.59 g, 0.48 mmol)을 메탄올 (2.2 mL) 및 에틸 아세테이트 (2.2 mL)에서 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (10 wt% Pd/C, 습성, 0.07 g)을 부가하고, 반응 혼합물을 수소 분위기 하에서 3 시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고 농축하여 카복실산을 얻었다. 카복실산 (1.32 g, 1.15 mmol, 클러스터 유리 산)을 DMF (3.2 mL)에서 용해시켰다. 이것에 N, N-디이소프로필에틸아민 (0.3 mL, 1.73 mmol) 및 PFPTFA (0.30 mL, 1.73 mmol)을 부가했다. 실온에서 30 분 교반 후 반응 혼합물을 물 (40 mL)에 붓고 EtOAc (2 x 50 mL)로 추출했다. 표준 워크업은 상기에서 기재된 바와 같이 완료되어 화합물 234를 산출했다. LCMS 및 NMR은 구조와 일치했다. 올리고뉴클레오타이드 235는 실시예 46에서 기재된 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다. 콘주게이트 그룹 GalNAc2-24의 GalNAc2 클러스터 부분 (GalNAc2-24a)은 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc2-24 (GalNAc2-24a-CM)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00508
실시예 105: GalNAc 1 -25 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00509
화합물 166의 합성은 실시예 54에서 기재되어 있다. 올리고뉴클레오타이드 236는 실시예 46에서 기재된 일반적인 절차를 사용하여 제조되었다.
대안적으로, 올리고뉴클레오타이드 236은 아래에서 보여진 도식을 사용하여 합성되었고, 및 화합물 238은 사용되어 실시예 10에서 기재된 절차를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 236을 형성했다.
Figure pct00510
콘주게이트 그룹 GalNAc1-25의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-25a)은 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-25 (GalNAc1-25a-CM)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00511
실시예 106: 5'-GalNAc2 또는 5'-GalNAc3 콘주게이트를 포함하는 SRB-1을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 의 안티센스 억제
표 116 및 117에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 SRB-1의 안티센스 억제에 대한 용량-의존적 연구에서 시험되었다.
처리
6 주령, 수컷 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에게 2, 7, 또는 20 mg/kg의 ISIS 번호 440762; 또는 0.2, 0.6, 2, 6, 또는 20 mg/kg의 ISIS 번호 686221, 686222, 또는 708561; 또는 염수가 피하로 1회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 마우스는 최종 투여 72 시간 후에 희생되었다. 간 SRB-1 mRNA 수준은 실시간 PCR를 사용하여 측정되었다. SRB-1 mRNA 수준은 표준 프로토콜에 따라 사이클로필린 mRNA 수준에 대해 정규화되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 용량-의존 방식으로 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했고, ED50 결과는 표 116 및 117에서 제공된다. 이전의 연구는, 3가 GalNAc-접합된 올리고뉴클레오타이드가 결국 1가 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드로부터 유의미하게 더 강했던 2가 GalNAc-접합된 올리고뉴클레오타이드보다 유의미하게 더 강했다는 것을 보여주었지만, (참고, 예를 들면, Khorev 등, Bioorg. Bioorg.& Med. Chem., Vol. 16, 5216-5231 (2008)), 1가, 2가, 및 3가 GalNAc 클러스터를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한처리는 표 116 및 117에서 보여진 바와 같은 유사한 효능으로 SRB-1 mRNA 수준을 낮게 했다.
표 116
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00512
표 범례에 대한 실시예 93 참조. GalNAc3-13a의 구조는 실시예 62에서 이전에 보여졌고, GalNAc2-24a의 구조는 실시예 104에서 보여졌다.
표 117
SRB-1을 표적으로 하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00513
표 범례에 대한 실시예 93 참조. GalNAc1-25a의 구조는 실시예 105에서 보여졌다.
간 중 표 116 및 117에서의 올리고뉴클레오타이드의 농도는 실시예 75에서 기재된 절차를 사용하여 또한 평가되었다. 아래의 표 117a 및 117b에서 보여진 결과는 μg 올리고뉴클레오타이드 / 간 조직의 그램의 단위로 UV에 의해 측정된 바와 같이, 각 처리 그룹에 대한 평균 총 안티센스 올리고뉴클레오타이드 조직 수준이다. 이 결과는, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 GalNAc 콘주게이트 그룹이 없는 올리고뉴클레오타이드의 동일한 용량보다 유의미하게 더 높은 수준에서 간에서 축적된다는 것을 보여준다. 더욱이, 그의 각 콘주게이트 그룹 모두 중 1, 2 또는 3 개의 GalNAc 리간드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 유사한 수준으로 간에서 축적된다. 이러한 결과는 상기에서 인용된 Khorev 등 문헌 참조의 관점에서 놀랍고 상기 표 116 및 117에서 보여진 활성 데이타와 일치한다.
표 117a
GalNAc 2 또는 GalNAc 3 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 간 농도
Figure pct00514
표 117b
GalNAc 1 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 간 농도
Figure pct00515
실시예 107: GalNAc 1 -26 또는 GalNAc 1 -27 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00516
올리고뉴클레오타이드 239는 DMF 중 HBTU 및 DIEA를 사용하여 화합물 47 (참고 실시예 15)의 산 64 (참고 실시예 32)에의 커플링을 통해 합성된다. 수득한 아미드 함유 화합물은 포스피틸화되고, 그 다음 실시예 10에서 기재된 절차를 사용하여 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부가된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc1-26의GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-26a)은 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-26 (GalNAc1-26a-CM)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00517
GalNAc1 콘주게이트 그룹을 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 부가하기 위해, 화합물 47 및 64의 반응으로부터 형성된 아미드는 실시예 7에서 기재된 절차를 사용하여 고형 지지체에 부가된다. 그 다음 올리고뉴클레오타이드 합성은 실시예 9에서 기재된 절차를 사용하여 완료되어 올리고뉴클레오타이드 240을 형성한다.
Figure pct00518
콘주게이트 그룹 GalNAc1-27의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-27a)은 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-27 (GalNAc1-27a-CM)의 구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00519
실시예 108: 생체내에서 Apo(a)를 표적으로 하는 GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 의한 생체내 의 안티센스 억제
아래의 표 118에서 열거된 올리고뉴클레오타이드는 마우스에서 단회 용량 연구에서 시험되었다.
표 118
APO (a)를 표적으로 하는 변형된 ASO
Figure pct00520
GalNAc3-7a의 구조는 실시예 48에서 보여졌다.
처리
인간 Apo(a)를 발현시키는 수컷 이식유전자 마우스 각각에게, 올리고뉴클레오타이드가 그리고 그리고 표 119에서 열거된 복용량으로 또는 PBS가 피하로 1 회 주입되었다. 각 처리 그룹은 4 마리 동물로 구성되었다. 혈액은 혈장 중 Apo(a) 단백질의 기준선 수준을 측정하기 위해 복용 전 날 및 제 1 용량 다음 1 주에 뽑았다. 추가의 채혈은 대략 8 주 동안 매주 일어날 것이다. 혈장 Apo(a) 단백질 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었다. 표 119의 결과는 기준선 수준 (% BL)으로 정규화된, 각 처리 그룹에 대한 혈장 Apo(a) 단백질 수준의 평균 퍼센트로서 제공된다. 이 결과는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 Apo(a) 단백질 발현을 축소시킨다는 것을 보여준다. 더욱이, GalNAc 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 콘주게이트 그룹을 포함하지 않는 올리고뉴클레오타이드보다 Apo(a) 발현에서 더욱 더 강한 축소를 나타내었다.
표 119
Apo(a) 혈장 단백질 수준
Figure pct00521
실시예 109: GalNAc 1 -28 또는 GalNAc 1 -29 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00522
올리고뉴클레오타이드 241은 실시예 71에서 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 합성되어 포스포르아미다이트 중간체를 형성하고, 그 다음 실시예 10에서 기재된 절차를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 콘주게이트 그룹 GalNAc1-28의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-28a)은 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-28 (GalNAc1-28a-CM)의구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00523
GalNAc1 콘주게이트 그룹을 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 부가하기 위해, 실시예 71에서 기재된 것과 유사한 절차가 사용되어 하이드록실 중간체를 형성하고, 그 다음 이것은 실시예 7에서 기재된 절차를 사용하여 고형 지지체에 부가된다. 그 다음 올리고뉴클레오타이드 합성은 실시예 9에서 기재된 절차를 사용하여 완료되어 올리고뉴클레오타이드 242를 형성한다.
Figure pct00524
콘주게이트 그룹 GalNAc1-29의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-29a)은 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. GalNAc1-29 (GalNAc1-29a-CM)의구조는 이하에서 보여진다:
Figure pct00525
실시예 110: GalNAc 1 -30 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00526
Figure pct00527
GalNAc1-30 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 246(여기서 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택됨)는, 상기에 보여진 바와 같이 합성된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc1-30의 GalNAc1 클러스터 부분 (GalNAc1-30a)은 다양한 콘주게이트 그룹을 제공하기 위해 임의의 절단가능 모이어티와 조합될 수 있다. 어떤 구현예에서, Y는 절단가능 모이어티의 일부이다. 어떤 구현예에서, Y는 안정한 모이어티의 일부이고 절단가능 모이어티는 올리고뉴클레오타이드 상에 존재한다. GalNAc1-30a의 구조는 아래에서 보여진다:
Figure pct00528
실시예 111: GalNAc 2 -31 또는 GalNAc 2 -32 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00529
GalNAc2-31 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 250(여기서 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택됨)은, 상기에 보여진 바와 같이 합성된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc2-31의 GalNAc2 클러스터 부분 (GalNAc2-31a)는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 절단가능 모이어티의 일부이다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 안정한 모이어티의 일부이고 절단가능 모이어티는 올리고뉴클레오타이드 상에 존재한다. GalNAc2-31a의 구조는 아래에서 보여진다:
Figure pct00530
GalNAc2-32 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성은 아래에서 보여진다.
Figure pct00531
GalNAc2-32 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 252(여기서 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택됨)는, 상기에 보여진 바와 같이 합성된다. 콘주게이트 그룹 GalNAc2-32의 GalNAc2 클러스터 부분 (GalNAc2-32a)는 임의의 절단가능 모이어티와 조합되어 다양한 콘주게이트 그룹을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 절단가능 모이어티의 일부이다. 어떤 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 직접적으로 인접한 Y-함유 그룹은 안정한 모이어티의 일부이고 절단가능 모이어티는 올리고뉴클레오타이드 상에 존재한다. GalNAc2-32a의 구조는 아래에서 보여진다:
Figure pct00532
실시예 112: GalNAc 1 콘주게이트를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오타이드
SRB-1를 표적으로 하는 표 120 중 올리고뉴클레오타이드는 1 개의 GalNAc 리간드를 함유하는 콘주게이트 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 효능을 추가 시험하기 위해 GalNAc1 콘주게이트 그룹으로 합성되었다.
표 120
Figure pct00533
실시예 113: 인간 일차 간세포에서 인간 아포지질단백질(a)(apo(a))의 용량-의존적 안티센스 억제
이전 문헌(WO2005/000201, 그 내용 전체가 본원에 참고로 편입됨)으로부터의 선택된 갭머 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 인간 일차 간세포에서 단일 용량 분석에서 시험하였다. 세포를 Tissue Transformation Technologies(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)로부터 얻어 150 nM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하였다. 약 16시간의 처리 기간 이후, 세포로부터 RNA를 분리하고 apo(a) mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 apo(a) 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 3'(정방향 서열 ACAGCAATCAAACGAAGACACTG, 서열번호: 5로서 본원에서 지정됨; 역방향 서열 AGCTTATACACAAAAATACCAAAAATGC, 서열번호: 6으로서 본원에서 지정됨; 프로브 서열 TCCCAGCTACCAGCTATGCCAAACCTT, 서열번호: 7로서 본원에서 지정됨)을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 또한, mRNA 수준을 인간 apo(a) 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 12kB(정방향 서열 CCACAGTGGCCCCGGT, 서열번호: 8로서 본원에서 지정됨; 역방향 서열 ACAGGGCTTTTCTCAGGTGGT, 서열번호: 9로서 본원에서 지정됨; 프로브 서열 CCAAGCACAGAGGCTCCTTCTGAACAAG, 서열번호: 10으로서 본원에서 지정됨)를 사용하여 측정하였다. Apo(a) mRNA 수준을 GAPDH mRNA 발현에 대해 정규화하였다. 결과가 미처리된 대조군 세포 대비 apo(a)의 퍼센트 억제로서 하기 표에 제시되어 있다.
표 121
인간 일차 간세포에서의 인간 apo(a)의 안티센스 억제
Figure pct00534
Figure pct00535
용량 반응 분석에서의 추가 시험을 위해 몇 가지 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하였다.
상기 선택된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를, 하기 표에 명시된 바와 같이, 25 nM, 50 nM, 150 nM, 또는 300 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 인간 일차 간세포에서 시험하였다. 약 16시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리하고 apo(a) mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 apo(a) 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 3'를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. Apo(a) mRNA 수준을 GAPDH mRNA 발현에 대해 정규화하였다. 결과는 미처리된 대조군 세포 대비 apo(a)의 퍼센트 억제로서 하기 표에 제시되어 있다.
표 122
hAPO(a)3'로 측정된 바와 같이, 인간 일차 간세포에서 인간 apo(a)의 용량-의존적 안티센스 억제
Figure pct00536
ISIS 144367은 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 더 우수한 효능 및 용량-의존성을 입증하였다. 그러므로, ISIS 144367은 새로 설계된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능을 비교하기 위한 기준 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 간주하였다.
실시예 114: 이식유전자 마우스 일차 간세포에서의 인간 apo (a)의 안티센스 억제
apo(a) 핵산을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 새로 설계하였고 시험관내에서 apo(a) mRNA에 대한 이들의 효과를 시험하였다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 인간 apo(a) 이식유전자 마우스로부터의 일차 간세포(Frazer, K.A. 등, Nat. Genet. 1995. 9: 424-431)를 이 연구에 사용하였다. 웰당 35,000 세포의 밀도의 간세포를 1,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리하고 apo(a) mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 12kB를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. Apo(a) mRNA 수준을 RIBOGREEN®에 의해 측정된 바와 같이, 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 각각의 실험에 대한 결과가 하기에 나타난 별도의 표에 제시되어 있다. ISIS 144367을 새로운 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 기준으로서 사용하였고 또한 본 연구에 포함시켰다. 결과가 미처리된 대조군 세포 대비 apo(a)의 퍼센트 억제로서 제시되어 있다. 총 1,511 갭머를 이들 배양 조건하에 실험하였다. 추가 연구를 위해 선택된 안티센스 올리고뉴클레오타이드만이 하기 표에 제시되어 있으며, 각 표는 별도의 실험을 나타낸다.
새로 설계된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 5-10-5 MOE 갭머로서 설계하였다. 상기 갭머는 20 개의 뉴클레오사이드 길이이며, 여기서 중심 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되어 있고 각각 5개의 뉴클레오사이드를 포함하는 5' 방향 및 3' 방향 상에 윙 분절의 측면에 있다.
5' 윙 분절 내의 각 뉴클레오사이드 및 3' 윙 분절 내의 각 뉴클레오사이드는 2'-MOE 변형을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트(P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
apo(a) 표적 서열은 다중 크링글 반복 서열을 함유하며, 따라서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드가 크링글 서열을 표적화하는지 여부에 따라 apo(a)의 하나 이상의 영역을 표적화할 수 있다. "개시 부위"는 갭머가 인간 서열에서 표적화되는 5'-최말단 뉴클레오사이드를 가리킨다. "중단 부위"는 갭머가 인간 서열에서 표적화되는 3'-최말단 뉴클레오사이드를 가리킨다. apo(a) 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그것이 크링글 반복을 표적화하는지 여부에 따라 하나를 초과하는 "개시 부위" 또는 "중단 부위"를 가질 수 있다.
표에 열거된 대부분의 갭머는, 본원에서 서열번호: 1로서 지정된 인간 apo(a) mRNA(GENBANK Accession No. NM_005577.2) 또는 본원에서 서열번호: 2로서 지정된 인간 apo(a) 게놈 서열(뉴클레오타이드 3230000 내지 3380000까지 끝이 잘린 GENBANK Accession No. NT_007422.12) 중 하나, 또는 둘의 하나 이상의 영역에 100% 상보적으로 표적화된다. 'n/a'는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 100% 상보적으로 상기 특정한 서열을 표적화하지는 않는다는 것을 가리킨다.
표 123
Figure pct00537
Figure pct00538
표 124
Figure pct00539
Figure pct00540
Figure pct00541
Figure pct00542
표 125
Figure pct00543
표 126
Figure pct00544
표 127
Figure pct00545
표 128
Figure pct00546
표 129
Figure pct00547
표 130
Figure pct00548
표 131
Figure pct00549
표 132
Figure pct00550
표 133
Figure pct00551
실시예 115: 이식유전자 마우스 일차 간세포에서 apo (a)의 용량-의존적 안티센스 억제
apo(a) mRNA의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 상기 기재된 연구로부터의 갭머들을 선택하고 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 연구에서 이식유전자 마우스 일차 간세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 35,000의 밀도로 플레이팅하고 0.0625 μM, 0.125 μM, 0.25 μM, 0.500 μM, 또는 1.000 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리하였고 apo(a) mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. Apo(a) 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 12kB를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. Apo(a) mRNA 수준을 RIBOGREEN®에 의해 측정된 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과가 미처리된 대조군 세포 대비 apo(a)의 퍼센트 억제로서 제시되어 있다.
각 연구 결과가 하기 제시된 표에 나타나 있으며, 각 표는 별도의 실험을 나타낸다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 반 최대 억제 농도(IC50) 역시 표에 제시되어 있다. Apo(a) mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 세포에서 용량-의존적 방식으로 유의미하게 감소하였다. 새로 설계된 올리고의 효능을 기준 올리고뉴클레오타이드 ISIS 144367과 비교하였다.
표 134
Figure pct00552
표 135
Figure pct00553
표 136
표 137
Figure pct00555
표 138
Figure pct00556
표 139
Figure pct00557
표 140
Figure pct00558
표 141
Figure pct00559
표 142
Figure pct00560
상기 표에 제시된 바와 같이, ISIS 494157 (서열번호: 12), ISIS 494158 (서열번호:13), ISIS 494159 (서열번호:14), ISIS 494160 (서열번호: 15), ISIS 494161 (서열번호:16), ISIS 494162 (서열번호: 17), ISIS 494163 (서열번호: 18), ISIS 494164 (서열번호: 19), ISIS 494165 (서열번호: 20), ISIS 494167 (서열번호: 22), ISIS 494168 (서열번호: 23), ISIS 494169 (서열번호: 24), ISIS 494170 (서열번호: 25), ISIS 494230 (서열번호: 105), ISIS 494243 (서열번호: 106), ISIS 494244 (서열번호: 107), ISIS 494283 (서열번호: 26), ISIS 494284 (서열번호: 27), ISIS 494285 (서열번호: 28), ISIS 494286 (서열번호: 29), ISIS 494287 (서열번호: 30), ISIS 494288 (서열번호: 31), ISIS 494290 (서열번호: 32), ISIS 494291 (서열번호: 33), ISIS 494292 (서열번호: 35), ISIS 494294 (서열번호: 36), ISIS 494299 (서열번호: 37), ISIS 494300 (서열번호: 38), ISIS 494301 (서열번호: 39), ISIS 494302 (서열번호: 40), ISIS 494303 (서열번호: 41), ISIS 494304 (서열번호: 42), ISIS 494305 (서열번호:43), ISIS 494306 (서열번호: 44), ISIS 494311 (서열번호: 47), ISIS 494334 (서열번호: 48), ISIS 494336 (서열번호: 49), ISIS 494337 (서열번호: 50), ISIS 494338 (서열번호: 133), ISIS 494371 (서열번호: 57), ISIS 494372 (서열번호: 58), ISIS 494373 (서열번호: 59), ISIS 494374 (서열번호: 60), ISIS 494375 (서열번호: 61), ISIS 494386 (서열번호: 62), ISIS 494389 (서열번호: 65), ISIS 494390 (서열번호: 66), ISIS 494392 (서열번호: 68), ISIS 494466 (서열번호: 108), ISIS 494470 (서열번호: 109), ISIS 494472 (서열번호: 110), ISIS 494521 (서열번호: 51), ISIS 494530 (서열번호: 53), ISIS 498229 (서열번호: 75), ISIS 498238 (서열번호: 76), ISIS 498239 (서열번호: 77), ISIS 498240 (서열번호: 78), ISIS 498241 (서열번호: 79), ISIS 498243 (서열번호: 81), ISIS 498379 (서열번호: 70), ISIS 498408 (서열번호: 71), ISIS 498433 (서열번호: 72), ISIS 498434 (서열번호: 73), ISIS 498435 (서열번호: 74), ISIS 498517 (서열번호: 85), ISIS 498523 (서열번호: 92), ISIS 498524 (서열번호: 93), ISIS 498525 (서열번호: 94), ISIS 498550 (서열번호: 97), ISIS 498580 (서열번호: 103), ISIS 498581 (서열번호: 104), ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; 서열번호: 134), ISIS 498833 (서열번호: 86), ISIS 498875 (서열번호: 89), 및 ISIS 499020 (서열번호: 90)은 IS 144367 (서열번호: 11)보다 더 강력하였다.
실시예 116: 이식유전자 마우스 일차 간세포에서의 apo (a)의 용량-의존적 안티센스 억제
상기 기재된 연구로부터의 강력한 갭머들을 추가로 선택하고 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 연구에서 이식유전자 마우스 일차 간세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 35,000의 밀도로 플레이팅하고 하기 표에 나타난 바와 같이 0.049 μM, 0.148 μM, 0.444 μM, 1.333 μM, 또는 4.000 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리하였고 apo(a) mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. Apo(a) 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 12kB를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. Apo(a) mRNA 수준을 RIBOGREEN®에 의해 측정된 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과가 미처리된 대조군 세포 대비 apo(a)의 퍼센트 억제로 제시되어 있다.
각 연구 결과가 하기 제시된 표에 나타나 있으며, 각각의 표는 별도의 실험을 나타낸다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 반 최대 억제 농도(IC50) 역시 표에 나타나 있다. Apo(a) mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 세포에서 용량-의존적 방식으로 유의미하게 감소하였다. 새로 설계된 올리고의 효능을 기준 올리고뉴클레오타이드 ISIS 144367과 비교하였다. 하기 표에 제시된 바와 같이, ISIS 494157 (서열번호: 12), ISIS 494158 (서열번호:13), ISIS 494159 (서열번호:14), ISIS 494160 (서열번호: 15), ISIS 494161 (서열번호:16), ISIS 494162 (서열번호: 17), ISIS 494163 (서열번호: 18), ISIS 494164 (서열번호: 19), ISIS 494230 (서열번호: 105), ISIS 494243 (서열번호: 106), ISIS 494244 (서열번호: 107), ISIS 494283 (서열번호: 26), ISIS 494284 (서열번호: 27), ISIS 494285 (서열번호: 28), ISIS 494286 (서열번호: 29), ISIS 494287 (서열번호: 30), ISIS 494290 (서열번호: 32), ISIS 494292 (서열번호: 35), ISIS 494300 (서열번호: 38), ISIS 494301 (서열번호: 39), ISIS 494302 (서열번호: 40), ISIS 494303 (서열번호: 41), ISIS 494304 (서열번호: 42), ISIS 494305 (서열번호: 43), ISIS 494306 (서열번호: 44), ISIS 494310 (서열번호: 46), ISIS 494311 (서열번호: 47), ISIS 494337 (서열번호: 50), ISIS 494371 (서열번호: 57), ISIS 494372 (서열번호: 58), ISIS 494375 (서열번호: 61), ISIS 494388 (서열번호: 64), ISIS 494389 (서열번호: 65), ISIS 494390 (서열번호: 66), ISIS 494392 (서열번호: 68), ISIS 494466 (서열번호: 108), ISIS 494470 (서열번호: 109), ISIS 494472 (서열번호: 110), ISIS 498238 (서열번호: 76), ISIS 498239 (서열번호: 77), ISIS 498433 (서열번호: 72), ISIS 498434 (서열번호: 73), ISIS 498435 (서열번호: 74), ISIS 498523 (서열번호: 92), ISIS 498524 (서열번호: 93), ISIS 498525 (서열번호: 94), ISIS 498580 (서열번호: 103), 및 ISIS 498581 (서열번호: 104)은 IS 144367 (서열번호: 11)보다 더 강력하였다.
표 143
Figure pct00561
표 144
Figure pct00562
표 145
Figure pct00563
표 146
Figure pct00564
표 147
Figure pct00565
실시예 117: 이식유전자 마우스 일차 간세포에서의 인간 apo (a)의 안티센스 억제
apo(a) 핵산을 표적화하는 부가적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하였고, 시험관내에서 apo(a) mRNA 에 대한 이들의 효과를 시험하였다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 실험에서 효력을 시험하였다. 인간 apo(a) 이식유전자 마우스로부터의 일차 간세포를 이 연구에 사용하였다. 웰당 35,000 세포의 밀도의 간세포를 1,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리하고 apo(a) mRNA 수준을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 12kB를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. Apo(a) mRNA 수준을 RIBOGREEN®에 의해 측정된 바와 같이, 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 각각의 실험에 대한 결과가 하기에 나타난 별도의 표에 제시되어 있다. ISIS 144367을 비교를 위해 본 연구에 또한 포함시켰다. 결과가 미처리된 대조군 세포 대비 apo(a)의 퍼센트 억제로서 제시되어 있다. 총 231개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이들 배양 조건하에 실험하였다. 추가 연구를 위해 선택된 안티센스 올리고뉴클레오타이드만이 하기 표에 제시되어 있다.
새로 설계된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 3-10-4 MOE 갭머로서 설계하였다. 상기 갭머들은 17 뉴클레오사이드 길이이며, 여기서 중심 갭 분절은 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되어 있고 3개의 뉴클레오사이드 및 4개의 뉴클레오사이드를 각각 포함하는 5' 방향 및 3' 방향 상에 윙 분절의 측면에 있다. 5' 윙 분절 내의 각 뉴클레오사이드 및 3' 윙 분절 내의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-MOE 변형을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트(P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
apo(a) 표적 서열은 다중 크링글 반복 서열을 함유하므로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드가 크링글 서열을 표적화하는지 여부에 따라 apo(a)의 하나 이상의 영역을 표적화할 수 있다. "개시 부위"는 갭머가 인간 서열에서 표적화되는 5'-최말단 뉴클레오사이드를 가리킨다. "중단 부위"는 갭머가 인간 서열에서 표적화되는 3'-최말단 뉴클레오사이드를 가리킨다. apo(a) 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그것이 크링글 반복을 표적화하는지 여부에 따라 하나를 초과하는 "개시 부위" 또는 "중단 부위"를 가질 수 있다.
표에 열거된 대부분의 갭머들은 서열번호: 1로 지정된 인간 apo(a) mRNA(GENBANK Accession No. NM_005577.2) 또는 서열번호: 2로 지정된 인간 apo(a) 게놈 서열(뉴클레오타이드 3230000부터 3380000까지 끝이 잘린 GENBANK Accession No. NT_007422.12) 중 하나, 또는 둘 모두의 다수의 영역에 100% 상동적으로 표적화된다. 'n/a'는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 100% 상보적으로 특정한 서열을 표적화하지는 않는다는 것을 가리킨다.
표 148
Figure pct00566
Figure pct00567
표 149
Figure pct00568
표 150
Figure pct00569
실시예 118: 이식유전자 마우스 일차 간세포에서의 apo (a)의 용량-의존적 안티센스 억제
상기 기재된 연구로부터의 강력한 갭머들을 추가로 선택하고 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 평행 연구에서 이식유전자 마우스 일차 간세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 35,000의 밀도로 플레이팅하고 하기 표에 나타난 바와 같이 0.156 μM, 0.313 μM, 0.625 μM, 1.250 μM, 2.500 μM, 또는 5.000 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, RNA를 세포로부터 분리하였고 apo(a) mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. Apo(a) 프라이머 프로브 세트 hAPO(a) 12kB를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. Apo(a) mRNA 수준을 RIBOGREEN®에 의해 측정된 바와 같은 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과가 미처리된 대조군 세포 대비 apo(a)의 퍼센트 억제로 제시되어 있다.
각 연구 결과가 하기 제시된 표에 나타나 있으며, 각각의 표는 별도의 실험을 나타낸다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 반 최대 억제 농도(IC50) 역시 표에 나타나 있다.
표 151
Figure pct00570
표 152
Figure pct00571
표 153
Figure pct00572
표 154
Figure pct00573
Apo(a) mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드-처리된 세포에서 용량-의존적 방식으로 유의미하게 감소하였다. 새로 설계된 올리고뉴클레오타이드의 효력을 기준 올리고뉴클레오타이드, ISIS 144367와 비교하였다. 상기 표에 제시된 바와 같이, ISIS 510542 (서열번호: 111), ISIS 510545 (서열번호: 114), ISIS 510546 (서열번호: 115), ISIS 510547 (서열번호: 116), ISIS 510548 (서열번호: 117), ISIS 510549 (서열번호: 118), ISIS 510595 (서열번호: 119), ISIS 510597 (서열번호: 120), ISIS 510598 (서열번호: 121), ISIS 510701 (서열번호: 127), ISIS 510702 (서열번호: 128), ISIS 510704 (서열번호: 129), ISIS 512944 (서열번호: 123), ISIS 512947 (서열번호: 124), ISIS 512958 (서열번호: 125), 및 ISIS 512959 (서열번호: 126)은 IS 144367 (서열번호: 11)보다 더 강력하였다.
실시예 119: 인간 apo (a) 이식유전자 마우스에서의 인간 apo(a)의 생체내 안티센스 억제 효과
인간 apo(a) 유전자를 갖는 이식유전자 마우스(Frazer, K.A. 등, Nat. Genet. 1995. 9: 424-431)를 하기 기재된 연구에서 이용하였다. 상기 기재된 바와 같이 시험관내에서 apo(a) mRNA의 통계적으로 유의미한 억제를 입증한 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이 모델에서 추가로 평가하였다.
연구 1
암컷 인간 apo(a) 이식유전자 마우스를 12시간 명/암 주기에 유지시키고 자유롭게 정상적인 실험식 식이를 공급하였다. 상기 마우스를 각각 4마리의 마우스로 이루어진 치료 그룹으로 나누었다. 상기 그룹은 2주 동안 매주 2회씩 25 mg/kg 용량의 ISIS 494159, ISIS 494160, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163, ISIS 494230, ISIS 494243, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494304, ISIS 494466, ISIS 494470, ISIS 494472, ISIS 498239, ISIS 498408, ISIS 498517, ISIS 494158, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372, ISIS 498238, ISIS 498523, ISIS 498525, ISIS 510548, ISIS 512944, ISIS 512947 또는 ISIS 512958의 복강내 주사를 받았다. 마우스의 한 그룹은 2주 동안 매주 2회씩 PBS의 복강내 주사를 받았다. PBS 그룹은 대조군으로서 제공되었다. 최종 용량 후 2일째에, 마우스를 안락사시키고, 장기를 수확하고, 분석을 수행하였다.
인간 apo (a) mRNA 의 억제
일부 치료 그룹의 간으로부터 총 RNA를 추출하였고, 인간 apo(a) mRNA를 RT-PCR에 의해 정량하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 표현되어 하기 표에 제시되어 있다.
표 155
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제
Figure pct00574
상기 데이타는 몇 가지 ISIS 올리고뉴클레오타이드에 의한 apo(a) mRNA의 유의미한 억제를 입증한다. ISIS 494159 (서열번호: 14), ISIS 494162 (서열번호: 17), ISIS 494163 (서열번호: 18), ISIS 494243 (서열번호: 106), ISIS 494244 (서열번호: 107), ISIS 494283 (서열번호: 26), ISIS 494284 (서열번호: 27), ISIS 494285 (서열번호: 28), ISIS 494301 (서열번호: 39), 및 ISIS 498408 (서열번호: 71)은 기준 ISIS 144367 (서열번호: 11)보다 더 강력하였다.
인간 apo (a) 단백질의 억제
혈장 인간 apo(a) 단백질을 Apo(a) ELISA 키트(Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Sweden)를 사용하여 모든 치료 그룹으로부터 측정하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 표현되어 하기의 표에 제공되어 있다.
표 156
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) 단백질의 억제 퍼센트
Figure pct00575
상기 데이타는 몇 가지 ISIS 올리고뉴클레오타이드에 의한 apo(a) mRNA의 유의미한 억제를 입증한다. ISIS 494159 (서열번호: 14), ISIS 494244 (서열번호: 82), ISIS 494283 (서열번호: 26), ISIS 494284 (서열번호: 27), ISIS 494285 (서열번호: 28), ISIS 494286 (서열번호: 29), ISIS 494301 (서열번호: 39), 및 ISIS 494302 (서열번호: 40)는 기준 ISIS 144367 (서열번호: 11)만큼 강력하거나 더 강력하였다.
연구 2
ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163, 및 ISIS 494243을 이식유전자 모델에서 추가로 평가하였다. ISIS 144367을 비교를 위해 포함시켰다.
치료
암컷 인간 apo(a) 이식유전자 마우스를 각각 4마리의 마우스로 이루어진 치료 그룹으로 나누었다. 상기 그룹에게 2주 동안 매주 2회씩 1.5 mg/kg, 5 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 50 mg/kg의 용량의 ISIS 144367, ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163, 또는 ISIS 494243을 복강내 주사하였다. PBS 그룹은 대조군으로서 제공되었다. 최종 용량 후 2일째에, 마우스를 안락사시키고, 장기를 수확하고, 분석을 수행하였다.
인간 apo (a) mRNA 의 억제
총 RNA를 치료 그룹의 간으로부터 추출하였고, 인간 apo(a) mRNA를 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 표현되어 하기 표에 제시되어 있다.
표 157
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) mRNA의 용량-의존적 억제
Figure pct00576
상기 데이타는 몇 가지 ISIS 올리고뉴클레오타이드에 의한 apo(a) mRNA의 유의미한 억제를 입증한다. ISIS 494159 (서열번호: 14), ISIS 494161 (서열번호: 16), 494162 (서열번호:17), 및 ISIS 94163 (서열번호: 18)은 기준 ISIS 144367 (서열번호: 11)보다 더 효과적이었다.
인간 apo(a) 단백질 수준의 감소
치료 그룹으로부터 혈액을 수집하고, 인간 apo(a) 단백질 수준을 Apo(a) ELISA 키트(Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Sweden)에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) 단백질 수준의 퍼센트 감소로서 표현되어, 하기 표에 제시되어 있다.
표 158
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) 단백질의 용량-의존적 억제
Figure pct00577
상기 데이타는 몇 가지 ISIS 올리고뉴클레오타이드에 의한 apo(a) 혈장 단백질 수준의 유의미한 감소를 입증한다. ISIS 494159 (서열번호: 14), ISIS 494161 (서열번호: 16), ISIS 494162 (서열번호: 17), 및 ISIS 494163 (서열번호: 18)은 기준 ISIS 144367 (서열번호: 11)보다 더 효과적이었다.
연구 3
ISIS 494244, ISIS 494283, 및 ISIS 494284을 이 모델에서 추가로 평가하였다. ISIS 144367은 비교를 위해 포함시켰다.
치료
암컷 인간 apo(a) 이식유전자 마우스를 각각 4마리의 마우스로 이루어진 치료 그룹으로 나누었다. 상기 그룹에게 2주 동안 매주 2회씩 0.75 mg/kg, 2.5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 또는 25 mg/kg의 용량의 ISIS 144367, ISIS 494244, ISIS 494283, 또는 ISIS 494284를 복강내 주사하였다. PBS 그룹은 대조군으로서 제공되었다. 최종 용량 후 2일째에, 마우스를 안락사시키고, 장기를 수확하고, 분석을 수행하였다.
인간 apo (a) mRNA 의 억제
총 RNA를 치료 그룹의 간으로부터 추출하였고, 인간 apo(a) mRNA를 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 표현되어 하기 표에 제시되어 있다.
표 159
이식유전자 마우스에서의 인간 apo(a) mRNA의 용량-의존적 억제
Figure pct00578
상기 데이타는 몇 가지 ISIS 올리고뉴클레오타이드에 의한 apo(a) mRNA의 유의미한 억제를 입증한다. ISIS 494244 (서열번호: 107), ISIS 494283 (서열번호: 26), 및 ISIS 494284 (서열번호: 27)은 기준, ISIS 144367 (서열번호: 11)보다 더 효과적이었다.
인간 apo (a) 단백질 수준의 감소
치료 그룹으로부터 혈액을 수집하고, 인간 apo(a) 단백질 수준을 Apo(a) ELISA 키트(Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Sweden)에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) 단백질 수준의 퍼센트 감소로서 표현되어, 하기 표에 제시되어 있다.
표 160
이식유전자 마우스에서의 인간 apo(a) 혈장 단백질의 용량-의존적 억제
Figure pct00579
상기 데이타는 몇 가지 ISIS 올리고뉴클레오타이드에 의한 apo(a) 혈장 단백질 수준의 유의미한 감소를 입증하였다. ISIS 494244 (서열번호: 107), ISIS 494283 (서열번호: 26), 및 ISIS 494284 (서열번호: 27)는 기준, ISIS 144367 (서열번호: 11)보다 더 효과적이었다.
연구 4
ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, 및 ISIS 494311을 이 모델에서 추가로 평가하였다.
치료
수컷 apo(a) 이식유전자 마우스를 각각 4마리의 마우스로 이루어진 치료 그룹으로 나누었다. 상기 각 그룹에게 2주 동안 1주 1회씩 5 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 50 mg/kg 용량으로 ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, 또는 ISIS 494311을 복강내 주사하였다. 3마리 마우스의 한 그룹에게는 2주 동안 1주에 1회씩 PBS를 복강내 주사하였다. PBS 그룹은 대조군으로서 제공되었다. 최종 용량 후 2일째에, 마우스를 안락사시키고, 장기를 수확하고, 분석을 수행하였다.
인간 apo (a) mRNA 의 억제
총 RNA를 치료 그룹의 간으로부터 추출하였고, 인간 apo(a) mRNA를 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 표현되어 하기 표에 제시되어 있다. 상기 데이터는 ISIS 494285 (서열번호: 28), ISIS 494286 (서열번호: 29), ISIS 494301 (서열번호: 39), ISIS 494302 (서열번호: 40) 및 ISIS 494311 (서열번호: 47)에 의한 apo(a) mRNA의 유의미한 억제를 입증한다.
표 161
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) mRNA의 용량-의존적 억제
Figure pct00580
인간 apo (a) 단백질 수준의 감소
치료 그룹으로부터 혈액을 수집하고, 인간 apo(a) 단백질 수준을 Apo(a) ELISA 키트(Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Sweden)에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) 단백질 수준의 퍼센트 감소로서 표현되어, 하기 표에 제시되어 있다. 상기 데이타는 ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 및 ISIS 494311에 의한 apo(a) 혈장 단백질 수준의 유의미한 감소를 입증한다.
표 162
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) mRNA의 용량-의존적 억제
Figure pct00581
연구 5
ISIS 494372, ISIS 498524, ISIS 498581, ISIS 498721, 및 ISIS 498833을 이 모델에서 추가로 평가하였다.
치료
암컷 인간 apo(a) 이식유전자 마우스를 각각 4마리의 마우스로 이루어진 치료 그룹으로 나누었다. 상기 그룹에게 2주 동안 1주에 1회씩 5 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 50 mg/kg의 용량의 ISIS 494372, ISIS 498524, ISIS 498581, ISIS 498721, 또는 ISIS 498833을 복강내 주사하였다. 3마리의 마우스의 한 그룹에게는 2주 동안 1주에 1회씩 PBS를 복강내 주사하였다. PBS 그룹은 대조군으로서 제공되었다. 최종 용량 후 2일째에, 마우스를 안락사시키고, 장기를 수확하고, 분석을 수행하였다.
인간 apo (a) mRNA 의 억제
총 RNA를 치료 그룹의 간으로부터 추출하였고, 인간 apo(a) mRNA를 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 표현되어 하기 표에 제시되어 있다. 상기 데이타는 ISIS 494372 (서열번호: 28), ISIS 498524 (서열번호: 93), ISIS 498581 (서열번호: 104), 및 ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; 서열번호: 134)에 의한 apo(a) mRNA의 유의미한 억제를 입증한다.
표 163
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) mRNA의 용량-의존적 억제
Figure pct00582
인간 apo (a) 단백질 수준의 감소
치료 그룹으로부터 혈액을 수집하고, 인간 apo(a) 단백질 수준을 Apo(a) ELISA 키트(Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Sweden)에 의해 정량화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) 단백질 수준의 퍼센트 감소로서 표현되어, 하기 표에 제시되어 있다. 상기 데이타는 ISIS 494372 (서열번호: 28), ISIS 498581 (서열번호: 104), 및 ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; 서열번호: 134)에 의한 apo(a) 혈장 단백질 수준의 유의미한 감소를 입증한다.
표 164
이식유전자 마우스에서 인간 apo(a) mRNA의 용량-의존적 억제
Figure pct00583
실시예 120: 설치류 모델에서 인간 apo (a)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 내성
CD1 마우스 및 스프래그 다우리 랫트에서 내성 연구를 위해 상기 기재한 연구로부터 인간 apo(a)를 표적으로 하는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선택하였다. 설치류는 내인성 apo(a)를 발현하지 않으므로, 이들 연구는 동물에서 apo(a)를 억제함으로써 야기될 수 있는 어떤 표현형 변화보다는 동물에서의 각각의 인간 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 내성을 시험하였다.
CD1 마우스에서 내성: 연구 1
CD1® 마우스(Charles River, MA)는 다중목적 마우스 모델이고, 흔히 안전성 및 효능 시험에 이용된다. 상기 마우스를 상기 기재된 연구로부터 선택된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고 다양한 혈장 화학 마커의 수준 변화를 평가하였다.
치료
수컷 CD1 마우스의 그룹에게 50 mg/kg의 ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372, 및 ISIS 510548을 6주 동안 매주 2회씩 피하로 주사하였다. 6주령 수컷 CD1 마우스의 한 그룹에게는 PBS를 6주 동안 매주 2회씩 피하로 주사하였다. 마우스를 마지막 용량 후 48시간에 안락사시키고, 추가 분석을 위해 장기 및 혈장을 수확하였다.
혈장 화학 마커
ISIS 올리고뉴클레오타이드가 간 및 신장 기능에 미치는 효과를 평가하기 위하여, 아미노기전달효소, 빌리루빈, 알부민, 크레아티닌, 및 BUN의 혈장 수준을 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 예상되는 범위를 벗어나 간 또는 신장 중 어느 하나의 수준 변화를 야기한 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 추가 연구에서 제외시켰다.
표 165
CD1 마우스의 혈장 화학 마커
Figure pct00584
장기 중량
간, 비장 및 신장 중량을 연구의 말기에 측정하였고, 이는 하기 표에 제시되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 예상되는 범위를 벗어나 어떤 장기 중량 변화를 야기한 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 추가 연구에서 제외시켰다.
표 166
CD1 마우스의 장기 중량(g)
Figure pct00585
스프래그 다우리 랫트에서 내성
스프래그-다우리 랫트는 안전성 및 효능 평가에 사용되는 다목적 모델이다. 상기 랫트를 상기 기재된 연구로부터 선택된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하고 다양한 혈장 화학 마커의 수준 변화를 평가하였다.
치료
수컷 스프래그 다우리 랫트의 그룹에게 30 mg/kg의 ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372, 및 ISIS 510548을 8주 동안 매주 2회씩 피하로 주사하였다. 6마리의 수컷 스프래그 다우리 랫트의 한 그룹에게는 PBS를 8주 동안 매주 2회씩 피하로 주사하였다. 랫트를 마지막 용량 후 48시간에 안락사시키고, 추가 분석을 위해 장기 및 혈장을 수확하였다.
혈장 화학 마커
ISIS 올리고뉴클레오타이드가 간 및 신장 기능에 미치는 효과를 평가하기 위해 아미노기전달효소, 빌리루빈, 알부민, 크레아티닌, 및 BUN의 혈장 수준을 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 예상되는 범위를 벗어나 간 또는 신장 중 어느 하나의 수준 변화를 야기한 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 추가 연구에서 제외시켰다.
표 167
스프래그 다우리 랫트의 혈장 화학 마커
Figure pct00586
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 총 단백질 및 크레아티닌의 소변 수준을 자동화된 임상 화학 분석기(Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY)를 사용하여 측정하였다. 결과가 mg/dL로 표현되어 하기 표에 제시되어 있다.
표 168
스프래그-다우리 랫트에서의 신장 기능 마커 (mg/dL)
Figure pct00587
장기 중량
간, 비장 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이는 하기 표에 제시되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 예상되는 범위를 벗어나 간 또는 신장 중 어느 하나의 수준 변화를 야기한 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 추가 연구에서 제외시켰다.
표 169
스프래그 다우리 랫트의 장기 중량(g)
Figure pct00588
설치류 내성 연구로부터의 발견은, 일반적으로, 스크린된 모든 내성 마커를 고려할 때, ISIS 494372가 CD1 마우스 모델 및 스프래그 다우리 랫트 모델 모두에서 가장 내성이 좋은 안티센스 화합물이라는 것을 보여주었다.
실시예 121: CD1 마우스에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 약동학
CD1 마우스를 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리하고 간 및 신장에서의 올리고뉴클레오타이드 농도를 평가하였다.
치료
4마리의 CD1 마우스의 그룹들에게 각각 50 mg/kg의 ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, 또는 ISIS 494372를 6주 동안 주 2회씩 피하로 주사하였다. 마우스를 최종 용량 후 2일째에 희생시켰다. 분석을 위해 간을 수확하였다.
올리고뉴클레오타이드 농도의 측정
총 올리고뉴클레오타이드 농도를 측정하였다. 사용된 방법은 종래 공개된 방법(Leeds 등, 1996; Geary 등, 1999)의 변형이며, 이는 페놀-클로로포름 추출 후 고체상 추출로 구성되어 있다. 추출에 앞서 내부 표준(ISIS 355868, 27-mer 2'-O-메톡시에틸 변형된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, 본원에서 서열번호: 131로서 지정됨)을 첨가하였다. 조직 샘플 농도를 대략 1.14 μg/g의 정량화의 하한(LLOQ)으로 보정 곡선을 사용하여 계산하였다. 그리고 나서, 반감기를 WinNonlin 소프트웨어(PHARSIGHT)를 사용하여 계산하였다.
상기 결과가 μg/g 간 또는 신장 조직으로서 표현되어 하기 표에 제시되어 있다. 상기 데이타는 ISIS 494372가 간 및 신장에서 허용가능한 농도였음을 나타낸다.
표 170
CD1 마우스에서 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드 농도 (μg/g 조직)
Figure pct00589
실시예 122: 스프래그 다우리 랫트에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 약동학
수컷 스프래그 다우리 랫트를 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리하고 간 및 신장에서의 올리고뉴클레오타이드 농도를 평가하였다.
치료
4마리의 랫트의 그룹에게 각각 10 mg/kg의 ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, 또는 ISIS 494372를 3주 동안 일주일에 2회씩 피하로 주사하였다. 랫트를 최종 용량 후 2일째에 희생시켰다. 분석을 위해 간을 수확하였다.
올리고뉴클레오타이드 농도의 측정
총 올리고뉴클레오타이드 농도를 측정하였다. 사용된 방법은 종래 공개된 방법(Leeds 등, 1996; Geary 등, 1999)의 변형이며, 이는 페놀-클로로포름 추출 후 고체상 추출로 구성되어 있다. 추출에 앞서 내부 표준(ISIS 355868, 27-mer 2'-O-메톡시에틸 변형된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, 본원에서 서열번호: 131로 지정됨)을 첨가하였다. 조직 샘플 농도를 대략 1.14 μg/g의 정량화의 하한(LLOQ)으로 보정 곡선을 사용하여 계산하였다. 그리고 나서, 반감기를 WinNonlin 소프트웨어(PHARSIGHT)를 사용하여 계산하였다.
상기 결과가 μg/g 간 또는 신장 조직으로서 표현되어 하기 표에 제시되어 있다. 상기 데이타는 ISIS 494372가 간 및 신장에서 허용가능한 농도였음을 나타낸다.
표 171
스프래그 다우리 랫트에서의 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드 농도 (μg/g 조직)
Figure pct00590
실시예 123: 사이노몰구스 원숭이에서 인간 apo (a)를 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과
사이노몰구스 원숭이를 상기 기재된 연구로부터 선택된 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리하였다. 이 연구가 착수될 시점에, 사이노몰구스 원숭이 게놈 서열은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI) 데이터베이스에서 이용할 수 없었으므로, 사이노몰구스 원숭이 유전자 서열과의 교차-반응성은 확인할 수 없었다. 대신에, 사이노몰구스 원숭이에서 사용된 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열을 상동성을 위해 붉은털원숭이 서열과 비교하였다. 붉은털원숭이 서열과 상동인 ISIS 올리고뉴클레오타이드는 또한 사이노몰구스 원숭이 서열과 완전히 교차-반응하는 것으로 예상된다.
시험한 인간 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 또한 붉은털원숭이 mRNA 서열(XM_001098061.1; 본원에서 서열번호: 132로 지정됨)과 교차-반응한다. 인간 올리고뉴클레오타이드와 붉은털원숭이 서열 사이의 상보성이 크면 클수록, 아마도 인간 올리고뉴클레오타이드가 붉은털원숭이 서열과 더 교차-반응할 수 있다. 서열번호: 132에 대한 각각의 올리고뉴클레오타이드의 개시 및 중단 부위가 하기 표에 제시되어 있다. 각 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호:132에서 하나를 초과하는 영역을 표적화하며, 다수의 시작 부위를 갖는다. "개시 부위"는 갭머가 붉은털원숭이 서열에서 표적화되는 5'-최말단 뉴클레오타이드를 가리킨다. '불일치'는 인간 올리고뉴클레오타이드 서열과 붉은털원숭이 서열 사이에서 불일치된 뉴클레오타이드의 수를 가리킨다 .
안티센스 올리고뉴클레오타이드 내성 뿐만 아니라 간 및 신장에서 이들의 약력학적 프로파일을 평가하였다.
표 172
서열번호: 132에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00591
Figure pct00592
치료
연구에 앞서, 원숭이를 적어도 30일 기간 동안 격리시켰고, 이 기간 동안 동물들을 매일 일반적인 건강을 관찰하였다. 원숭이들은 2-4세였고 체중은 2 내지 4 kg 사이였다. 4마리의 무작위로 할당된 수컷 사이노몰구스 원숭이의 7 그룹 각각에게 스테인레스강 투여 바늘 및 적절한 크기의 주사기를 사용하여 ISIS 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS를 원숭이 등의 4 부위 중 하나 내로 피하 주사하였다. 주사는 시계 방향으로, 투여 당 하나의 부위에 제공하였다. 원숭이에게 로딩 용량으로서 첫 1주 동안 1주에 4회(1, 3, 5, 및 7일), 및 이후 2-12주 동안 1주에 1회 40 mg/kg의 ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, 또는 ISIS 494372를 투여하였다. 8마리의 사이노몰구스 원숭이의 대조군에게는 첫 1주 동안 1주에 3~4회((1, 3, 5, 및 7일), 및 이후에 2-12주 동안 1주에 1회 PBS를 피하로 주사하였다.
상기 연구 기간 동안, 원숭이들을 매일 적어도 한번 병 또는 고통의 징후를 관찰하였다. 치료, 손상 또는 병으로 인해 순간적이거나 가벼운 통증 또는 고통 이상을 경험하는 어떤 동물은 연구 지도자와 협의한 후 통증을 완화시키기 위해 수의과 직원에 의해 승인받은 진통제 또는 제제로 처리하였다. 건강하지 못하거나 가능한 빈사 상태에 있는 어떤 동물은 추가 관찰 및 가능한 안락사를 확인하였다. 예를 들면, ISIS 494302의 치료군 내의 하나의 동물은 56일에 빈사 상태에 있는 것으로 확인되었고, 안락사시켰다. 동물들의 계획된 안락사는 86일 및 87일에 깊은 마취하에 출혈과다에 의해 수행하였다. 본 실시예에 기재된 프로토콜은 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인되었다.
표적 감소
RNA 분석
86일에, 인간 프라이머 프로브 세트 ABI Hs00916691_m1(Applied Biosystems, Carlsbad CA)을 이용한 apo(a)의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 제시되어 있다. 하기 표에 나타난 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 치료는 PBS 대조군과 비교하여 apo(a) mRNA의 유의미한 감소를 야기하였다.
또 다른 크링글-함유 단백질인 플라스미노겐의 mRNA 수준을 또한 측정하였다. ISIS 494372 치료는 플라스미노겐의 mRNA 수준을 바꾸지 않았다 .
표 173
PBS 대조군 대비 사이노몰구스 원숭이 간에서의 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제
Figure pct00593
단백질 분석
상이한 날에는, 모든 연구 원숭이의 머리, 복재정맥, 또는 대퇴부 정맥로부터 1 mL의 혈액을 수집하였다. 혈장 분리를 위해 상기 혈액 샘플을 K2-EDTA를 함유하는 튜브에 넣었다. 상기 튜브를 실온에서 10분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하여 혈장을 얻었다. Apo(a) 단백질 수준을 Apo(a) ELISA 키트(Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Sweden)에 의해 분석하였다. 하기 표에 나타난 바와 같이, 몇 가지 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리는 PBS 대조군 대비 apo(a) 단백질 수준의 유의미한 감소를 야기하였다. 특이적으로, ISIS 494372 처리는 apo(a)의 사이노몰구스 혈장 단백질 수준을 감소시켰다.
apoB의 단백질 수준을 상기 연구 그룹에서 측정하였다. apo(a)의 안티센스 억제는 apoB 수준에 영향을 끼치지 않았다.
표 174
사이노몰구스 원숭이에서의 Apo(a) 혈장 단백질 수준(기준선 값 대비 % 억제)
Figure pct00594
내성 연구
체중 및 장기 중량 측정
동물의 전체 건강에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 86일에 체중 및 장기 중량을 측정하였다. 장기 중량을 측정하였고, 이것이 하기 표 1에 제시되어 있다. 상기 결과는 ISIS 494372 처리가 원숭이의 체중 및 장기 중량의 측면에서 잘 용인되었음을 보여준다.
표 175
사이노몰구스 원숭이에서의 체중(g)
Figure pct00595
표 176
사이노몰구스 원숭이에서의 장기 중량(% 체중)
Figure pct00596
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 원숭이들을 채혈에 앞서 밤새 단식시켰다. 각 동물로부터 약 1.5 mL의 혈액을 수집하였고, 혈청 분리를 위해 이를 혈액 응고 방지제가 없는 튜브에 넣었다. 상기 튜브를 최소 90분 동안 실온에서 유지시킨 다음, 10분 동안 실온에서 3,000 rpm에서 원심분리하여 혈청을 얻었다. 다양한 간 기능 마커의 수준을 Toshiba 200FR NEO Chemistry 분석기(Toshiba Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. ALT 및 AST의 혈장 수준을 측정하였고, 결과가 IU/L로 표현되어 하기 표에 제시되어 있다. 간 기능 마커인 빌리루빈을 유사하게 측정하였고, 이것이 mg/dL로 표현되어 하기 표에 제시되어 있다. 상기 결과는 ISIS 494372 처리가 원숭이의 간 기능 측면에서 잘 용인되었음을 보여준다.
표 177
사이노몰구스 원숭이 혈장에서의 간 기능 마커
Figure pct00597
C-반응성 단백질 수준 분석
사이노몰구스 원숭이에서 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 염증성 효과를 평가하기 위해, 혈액 샘플을 분석을 위해 채취하였다. 상기 원숭이들은 채혈에 앞서 밤새 단식시켰다. 각 동물로부터 약 1.5 mL의 혈액을 수집하였고, 혈청 분리를 위해 이를 혈액 응고 방지제가 없는 튜브에 넣었다. 상기 튜브를 최소 90분 동안 실온에서 유지시킨 다음, 10분 동안 실온에서 3,000 rpm에서 원심분리하여 혈청을 얻었다. 간에서 합성되고 염증의 마커로 작용하는 C-반응성 단백질(CRP)을 Toshiba 200FR NEO 화학 분석기(Toshiba Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. ALT 및 AST의 혈장 수준을 측정하였고, 결과가 IU/L로 표현되어 하기 표에 제시되어 있다. 상기 결과는 ISIS 494372 처리가 원숭이에서 어떤 염증을 유발하지 않았음을 보여준다.
표 178
사이노몰구스 원숭이 혈장에서의 C-반응성 단백질 수준 (mg/L)
Figure pct00598
보체 C3 분석
사이노몰구스 원숭이에서 보체 경로에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 임의의 효과를 평가하기 위해, 혈액 샘플을 84일(투여전) 및 85일(24시간 복용후)에 분석을 위해 채취하였다. 각각의 동물로부터 약 0.5 mL의 혈액을 수집하였고, 혈청 분리를 위해 이를 혈액 응고 방지제가 없는 튜브에 넣었다. 상기 튜브를 최소 90분 동안 실온에서 유지시킨 다음, 10분 동안 실온에서 3,000 rpm에서 원심분리하여 혈청을 얻었다. C3을 Toshiba 200FR NEO 화학 분석기(Toshiba Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. 상기 결과는 ISIS 494372 처리가 원숭이에서 보체 경로에 대해 어떠한 효과를 유발하지 않았음을 보여준다.
표 179
사이노몰구스 원숭이 혈장에서의 보체 C3 수준(mg/dL)
Figure pct00599
혈액학
혈액 파라미터에 대한 사이노몰구스 원숭이에서의 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 임의의 효과를 평가하기 위해, K2-EDTA를 함유하는 튜브에 상기 이용가능한 연구 동물 각각으로부터 87일에 약 0.5 mL의 혈액의 혈액 샘플을 수집하였다. 샘플을 대상으로 ADVIA120 혈액학 분석기(Bayer, USA)를 이용하여 적혈구(RBC) 수, 백혈구(WBC) 수 뿐만 아니라 혈소판 수를 분석하였다. 상기 데이터가 하기 표에 제시되어 있다.
상기 데이터는 ISIS 494372 처리가 원숭이의 혈액 파라미터 측면에서 잘 용인되었음을 보여준다.
표 180
사이노몰구스 원숭이에서 혈구 수
Figure pct00600
실시예 124: 사이노몰구스 원숭이에서의 ISIS 494372의 약리적 활성의 특성규명
13주간 상기 화합물을 투여하고 또 다른 13주 동안 회복되게 한 원숭이에서 간 apo(a) mRNA 및 혈장 apo(a) 수준을 측정함으로써 ISIS 494372의 약리적 활성을 규명하였다.
치료
14마리의 무작위로 할당된 수컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이의 4개의 그룹들 각각에게 스테인레스강 투여 바늘 및 적절한 크기의 주사기를 사용하여 ISIS 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS를 원숭이 등(견갑골 영역)의 4 부위 중 하나 내로 피하 주사하였다. 하기 표에 나타난 바와 같이, 원숭이에게 로딩 용량으로서 첫 1주 동안 1주에 4회(1, 3, 5, 및 7일), 및 이후 유지 용량으로서 2-13주 동안 1주에 1회 투여하였다. 첫 주 동안의 로딩 용량은 mg/kg/용량으로서 표현되는 반면, 2-13주에 유지 용량은 mg/kg/주로 표현된다.
표 181
사이노몰구스 원숭이에서의 복용 그룹
Figure pct00601
동물로부터의 간 샘플을 apo(a) mRNA의 분석을 위한 연구의 중간, 말기 및 회복 단계에서 취하였다. 또한, apo(a) 단백질 수준을 측정하기 위해 혈장 샘플을 상이한 날에 수집하였다. 이 비-임상 연구는 미국 식품의약품안전청(FDA) 우수한 실험실 실시(GLP) 규약, 21 CFR Part 58에 따라 수행하였다.
RNA 분석
간 샘플을 30일, 93일, 및 182일에 원숭이로부터 수집하여 냉동시켰다. 요약하면, 냉동된 간의 일부(0.2 g)를 2 mL의 RLT 용액(Qiagen)에서 균질화시켰다. 얻어진 용해물을 Qiagen RNeasy 미니 칼럼에 적용하였다. 정제 및 정량화 후, 조직을 RT-PCR 분석하였다. 실시간 형광 RT-PCR 검출을 사용하는 Perkin-Elmer ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템을 사용하여 apo(a) mRNA를 정량화하였다. 상기 분석은 형광 리포터 및 반대쪽 말단에 켄쳐 염료로 라벨링된 표적-특이적 프로브에 기초한다. 상기 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'-엑소뉴클레아제 활성을 통해 가수분해되었고, 이는 반응 동안 검출될 수 있는 리포터 염료의 형광 방출 증가를 야기한다. 붉은털원숭이 apo(a) mRNA의 표적 위치 1512 전사체 GENBANK Accession No. XM_001098061.2(서열번호: 132) 서열의 위치 1512를 표적으로 하는 프로브 세트(ABI 붉은털원숭이 LPA 프로브 세트 ID Rh02789275_m1, Applied Biosystems, Carlsbad CA)를 사용하여 사이노몰구스 원숭이 간 apo(a) mRNA 발현 수준을 측정하였다. Apo(a) 발현을 RIBOGREEN®을 사용하여 정규화하였다. 결과가 PBS 대조군 대비 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제로서 제시되어 있다.
하기 표에 나타난 바와 같이, ISIS 494372 처리는 PBS 대조군과 비교하여 apo(a) mRNA의 용량-의존적 감소를 야기하였다. 30일에, 간 apo(a) mRNA 발현이 12 mg/kg/주 및 40 mg/kg/주 복용 집단에서 각각 74% 및 99%로 용량-의존 방식으로 감소하였다. 이들 감소는 일월 ANOVA(던넷 다중 비교 실험, P<0.05)에 의해 통계적으로 유의미하다.
Apo(a) mRNA 수준을 또한 회복 단계 동안 측정하였다. 마지막 용량 후 88일에 간 발현 수준은 2 mg/kg/주 및 40 mg/kg/주 복용 집단에서 각각 49% 및 69% 여전히 감소하였다.
표 182
ISIS 494372로 처리된 사이노몰구스 원숭이에서 복용 단계에서의 간 apo(a) mRNA의 퍼센트 억제 수준
Figure pct00602
단백질 분석
약 20 μl의 혈장을 상업적으로 이용가능한 apo(a) ELISA 키트(Mercodia 10-1106-01, Uppsala, Sweden)를 사용하여 분석하였다. 상기 분석 프로토콜은 제조자에 의해 기재된 대로 수행하였다. 상기 결과가 1일 투여전 apo(a) 혈장 단백질로부터의 백분율 변화로서 하기 표에 제시되어 있다. 던넷 다중비교 시험을 이용한 1일 기준 혈장 apo(a)로부터의 통계적으로 유의미한 차이가 별표로서 표시된다.
혈장 apo(a) 단백질에서의 최대 감소가 93일에 모든 복용 집단에서 관찰되었다. 회복 단계에서, 40 mg/kg/주 복용 집단에서의 apo(a) 혈장 단백질 수준은 각각 4주 및 13주(121일 및 182일)의 회복 후 기준선의 22% 및 93%였다. 12 mg/kg/주 집단에서의 회복률은 40 mg/kg/주 집단에서 관찰된 것과 유사하였다.
표 183
ISIS 494372로 처리된 사이노몰구스 원숭이에서 복용 단계에서의 1일 수준의 퍼센트로서의 Apo(a) 혈장 단백질 수준
Figure pct00603
표 184
ISIS 494372로 처리된 사이노몰구스 원숭이에서 회복 단계에서의 1일 수준의 퍼센트로서의 Apo(a) 혈장 단백질 수준
Figure pct00604
실시예 125: 인간 Apo (a)를 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 점도 측정
40 센티포즈(cP)가 넘는 점도를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 스크리닝하는 것을 목표로, 상기 기재된 연구로부터의 선택된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 점도를 측정하였다. 40 cP보다 큰 점도를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 최적 미만의 점도를 가질 것이다.
ISIS 올리고뉴클레오타이드(32-35 mg)를 개량하여 유리 바이알에 넣고, 120 μL 물을 첨가하고 상기 바이알을 50℃에서 가열함으로써 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 용액으로 용해시켰다. 미리 가열된 샘플의 일부(75 μL)를 마이크로-점도계(Cambridge)로 피펫팅하였다. 마이크로-점도계의 온도를 25℃로 설정하고, 샘플의 점도를 측정하였다. 또 다른 부분의 (20 μL)의 전-가열된 샘플을, 85℃에서 260 nM에서 UV 판독을 위해 10 mL의 물에 피펫팅했다 (Cary UV 장치). 상기 결과가 하기 표에 제시되어 있으며, 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 용액의 대부분이 상기 언급된 기준 하에 이들의 점도 내에서 최적이라는 것을 가리킨다. 최적이 아닌 것들은 '점성'로서 표시된다. 구체적으로, ISIS 494372은 상기 언급된 기준 하에 그의 점도에서 최적이었다.
표 185
인간 apo(a)를 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 점도 및 농도
Figure pct00605
SEQUENCE LISTING <110> Isis Pharnaceuticals, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOLIPOPROTEIN (a) EXPRESSION <130> BIOL0250WO <150> 61/818,442 <151> 2013-05-01 <150> 61/823,826 <151> 2013-05-15 <150> 61/843,887 <151> 2013-07-08 <150> 61/871,673 <151> 2013-08-29 <150> 61/880,790 <151> 2013-09-20 <150> 61/976,991 <151> 2014-04-08 <150> 61/986,867 <151> 2014-04-30 <160> 167 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6489 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggtaccttt ggggctggct ttctcaagga agcccagctc cctgtgattg agaatgaagt 60 gtgcaatcgc tatgactggg attgggacac actttctggg cactgctggc cagtcccaaa 120 atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagc agcacctgag 180 caaagccatg tggtccagga ttgctaccat ggtgatggac agagttatcg aggcacgtac 240 tccaccactg tcacaggaag gacctgccaa gcttggtcat ctatgacacc acatcaacat 300 aataggacca cagaaaacta cccaaatgct ggcttgatca tgaactactg caggaatcca 360 gatgctgtgg cagctcctta ttgttatacg agggatcccg gtgtcaggtg ggagtactgc 420 aacctgacgc aatgctcaga cgcagaaggg actgccgtcg cgcctccgac tgttaccccg 480 gttccaagcc tagaggctcc ttccgaacaa gcaccgactg agcaaaggcc tggggtgcag 540 gagtgctacc atggtaatgg acagagttat cgaggcacat actccaccac tgtcacagga 600 agaacctgcc aagcttggtc atctatgaca ccacactcgc atagtcggac cccagaatac 660 tacccaaatg ctggcttgat catgaactac tgcaggaatc cagatgctgt ggcagctcct 720 tattgttata cgagggatcc cggtgtcagg tgggagtact gcaacctgac gcaatgctca 780 gacgcagaag ggactgccgt cgcgcctccg actgttaccc cggttccaag cctagaggct 840 ccttccgaac aagcaccgac tgagcaaagg cctggggtgc aggagtgcta ccatggtaat 900 ggacagagtt atcgaggcac atactccacc actgtcacag gaagaacctg ccaagcttgg 960 tcatctatga caccacactc gcatagtcgg accccagaat actacccaaa tgctggcttg 1020 atcatgaact actgcaggaa tccagatgct gtggcagctc cttattgtta tacgagggat 1080 cccggtgtca ggtgggagta ctgcaacctg acgcaatgct cagacgcaga agggactgcc 1140 gtcgcgcctc cgactgttac cccggttcca agcctagagg ctccttccga acaagcaccg 1200 actgagcaga ggcctggggt gcaggagtgc taccacggta atggacagag ttatcgaggc 1260 acatactcca ccactgtcac tggaagaacc tgccaagctt ggtcatctat gacaccacac 1320 tcgcatagtc ggaccccaga atactaccca aatgctggct tgatcatgaa ctactgcagg 1380 aatccagatg ctgtggcagc tccttattgt tatacgaggg atcccggtgt caggtgggag 1440 tactgcaacc tgacgcaatg ctcagacgca gaagggactg ccgtcgcgcc tccgactgtt 1500 accccggttc caagcctaga ggctccttcc gaacaagcac cgactgagca aaggcctggg 1560 gtgcaggagt gctaccatgg taatggacag agttatcgag gcacatactc caccactgtc 1620 acaggaagaa cctgccaagc ttggtcatct atgacaccac actcgcatag tcggacccca 1680 gaatactacc caaatgctgg cttgatcatg aactactgca ggaatccaga tgctgtggca 1740 gctccttatt gttatacgag ggatcccggt gtcaggtggg agtactgcaa cctgacgcaa 1800 tgctcagacg cagaagggac tgccgtcgcg cctccgactg ttaccccggt tccaagccta 1860 gaggctcctt ccgaacaagc accgactgag caaaggcctg gggtgcagga gtgctaccat 1920 ggtaatggac agagttatcg aggcacatac tccaccactg tcacaggaag aacctgccaa 1980 gcttggtcat ctatgacacc acactcgcat agtcggaccc cagaatacta cccaaatgct 2040 ggcttgatca tgaactactg caggaatcca gatgctgtgg cagctcctta ttgttatacg 2100 agggatcccg gtgtcaggtg ggagtactgc aacctgacgc aatgctcaga cgcagaaggg 2160 actgccgtcg cgcctccgac tgttaccccg gttccaagcc tagaggctcc ttccgaacaa 2220 gcaccgactg agcaaaggcc tggggtgcag gagtgctacc atggtaatgg acagagttat 2280 cgaggcacat actccaccac tgtcacagga agaacctgcc aagcttggtc atctatgaca 2340 ccacactcgc atagtcggac cccagaatac tacccaaatg ctggcttgat catgaactac 2400 tgcaggaatc cagatgctgt ggcagctcct tattgttata cgagggatcc cggtgtcagg 2460 tgggagtact gcaacctgac gcaatgctca gacgcagaag ggactgccgt cgcgcctccg 2520 actgttaccc cggttccaag cctagaggct ccttccgaac aagcaccgac tgagcagagg 2580 cctggggtgc aggagtgcta ccacggtaat ggacagagtt atcgaggcac atactccacc 2640 actgtcactg gaagaacctg ccaagcttgg tcatctatga caccacactc gcatagtcgg 2700 accccagaat actacccaaa tgctggcttg atcatgaact actgcaggaa tccagatcct 2760 gtggcagccc cttattgtta tacgagggat cccagtgtca ggtgggagta ctgcaacctg 2820 acacaatgct cagacgcaga agggactgcc gtcgcgcctc caactattac cccgattcca 2880 agcctagagg ctccttctga acaagcacca actgagcaaa ggcctggggt gcaggagtgc 2940 taccacggaa atggacagag ttatcaaggc acatacttca ttactgtcac aggaagaacc 3000 tgccaagctt ggtcatctat gacaccacac tcgcatagtc ggaccccagc atactaccca 3060 aatgctggct tgatcaagaa ctactgccga aatccagatc ctgtggcagc cccttggtgt 3120 tatacaacag atcccagtgt caggtgggag tactgcaacc tgacacgatg ctcagatgca 3180 gaatggactg ccttcgtccc tccgaatgtt attctggctc caagcctaga ggcttttttt 3240 gaacaagcac tgactgagga aacccccggg gtacaggact gctactacca ttatggacag 3300 agttaccgag gcacatactc caccactgtc acaggaagaa cttgccaagc ttggtcatct 3360 atgacaccac accagcatag tcggacccca gaaaactacc caaatgctgg cctgaccagg 3420 aactactgca ggaatccaga tgctgagatt cgcccttggt gttacaccat ggatcccagt 3480 gtcaggtggg agtactgcaa cctgacacaa tgcctggtga cagaatcaag tgtccttgca 3540 actctcacgg tggtcccaga tccaagcaca gaggcttctt ctgaagaagc accaacggag 3600 caaagccccg gggtccagga ttgctaccat ggtgatggac agagttatcg aggctcattc 3660 tctaccactg tcacaggaag gacatgtcag tcttggtcct ctatgacacc acactggcat 3720 cagaggacaa cagaatatta tccaaatggt ggcctgacca ggaactactg caggaatcca 3780 gatgctgaga ttagtccttg gtgttatacc atggatccca atgtcagatg ggagtactgc 3840 aacctgacac aatgtccagt gacagaatca agtgtccttg cgacgtccac ggctgtttct 3900 gaacaagcac caacggagca aagccccaca gtccaggact gctaccatgg tgatggacag 3960 agttatcgag gctcattctc caccactgtt acaggaagga catgtcagtc ttggtcctct 4020 atgacaccac actggcatca gagaaccaca gaatactacc caaatggtgg cctgaccagg 4080 aactactgca ggaatccaga tgctgagatt cgcccttggt gttataccat ggatcccagt 4140 gtcagatggg agtactgcaa cctgacgcaa tgtccagtga tggaatcaac tctcctcaca 4200 actcccacgg tggtcccagt tccaagcaca gagcttcctt ctgaagaagc accaactgaa 4260 aacagcactg gggtccagga ctgctaccga ggtgatggac agagttatcg aggcacactc 4320 tccaccacta tcacaggaag aacatgtcag tcttggtcgt ctatgacacc acattggcat 4380 cggaggatcc cattatacta tccaaatgct ggcctgacca ggaactactg caggaatcca 4440 gatgctgaga ttcgcccttg gtgttacacc atggatccca gtgtcaggtg ggagtactgc 4500 aacctgacac gatgtccagt gacagaatcg agtgtcctca caactcccac agtggccccg 4560 gttccaagca cagaggctcc ttctgaacaa gcaccacctg agaaaagccc tgtggtccag 4620 gattgctacc atggtgatgg acggagttat cgaggcatat cctccaccac tgtcacagga 4680 aggacctgtc aatcttggtc atctatgata ccacactggc atcagaggac cccagaaaac 4740 tacccaaatg ctggcctgac cgagaactac tgcaggaatc cagattctgg gaaacaaccc 4800 tggtgttaca caaccgatcc gtgtgtgagg tgggagtact gcaatctgac acaatgctca 4860 gaaacagaat caggtgtcct agagactccc actgttgttc cagttccaag catggaggct 4920 cattctgaag cagcaccaac tgagcaaacc cctgtggtcc ggcagtgcta ccatggtaat 4980 ggccagagtt atcgaggcac attctccacc actgtcacag gaaggacatg tcaatcttgg 5040 tcatccatga caccacaccg gcatcagagg accccagaaa actacccaaa tgatggcctg 5100 acaatgaact actgcaggaa tccagatgcc gatacaggcc cttggtgttt taccatggac 5160 cccagcatca ggtgggagta ctgcaacctg acgcgatgct cagacacaga agggactgtg 5220 gtcgctcctc cgactgtcat ccaggttcca agcctagggc ctccttctga acaagactgt 5280 atgtttggga atgggaaagg ataccggggc aagaaggcaa ccactgttac tgggacgcca 5340 tgccaggaat gggctgccca ggagccccat agacacagca cgttcattcc agggacaaat 5400 aaatgggcag gtctggaaaa aaattactgc cgtaaccctg atggtgacat caatggtccc 5460 tggtgctaca caatgaatcc aagaaaactt tttgactact gtgatatccc tctctgtgca 5520 tcctcttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagcatt 5580 gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct cagaacaagg 5640 tttggaaagc acttctgtgg aggcacctta atatccccag agtgggtgct gactgctgct 5700 cactgcttga agaagtcctc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 5760 gaagtgaacc tcgaatctca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 5820 acacaagcag atattgcctt gctaaagcta agcaggcctg ccgtcatcac tgacaaagta 5880 atgccagctt gtctgccatc cccagactac atggtcaccg ccaggactga atgttacatc 5940 actggctggg gagaaaccca aggtaccttt gggactggcc ttctcaagga agcccagctc 6000 cttgttattg agaatgaagt gtgcaatcac tataagtata tttgtgctga gcatttggcc 6060 agaggcactg acagttgcca gggtgacagt ggagggcctc tggtttgctt cgagaaggac 6120 aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct 6180 ggtgtctatg ctcgtgtttc aaggtttgtt acttggattg agggaatgat gagaaataat 6240 taattggacg ggagacagag tgaagcatca acctacttag aagctgaaac gtgggtaagg 6300 atttagcatg ctggaaataa tagacagcaa tcaaacgaag acactgttcc cagctaccag 6360 ctatgccaaa ccttggcatt tttggtattt ttgtgtataa gcttttaagg tctgactgac 6420 aaattctgta ttaaggtgtc atagctatga catttgttaa aaataaactc tgcacttatt 6480 ttgatttga 6489 <210> 2 <211> 150001 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atctttcagc ctctatatta ttttattgtg atttttaatt tccttgaatt ggattttgcc 60 attgtgctaa atcttgatga tcttcatttg tatccgtagt ctgaattata tttctgtcat 120 ttgagttagc tcagtcttgt taagaaccct tgttggaaaa ctggtgcagt tgtttggagg 180 acatatgacc ttctggccat ttgatttatt ggagttctta cgttggttct ttctcatgtc 240 tctgtgtggg tgtttcttta actgcagtgt agattgagta cagccaatag acttcttctt 300 tggaggtttt cacagggcca aggccttgta cagggtcttt atttgtagct gacttcttgt 360 ctttggtttc atagtggggc atgttagcaa aatagttttg ctgttgaagt tttggggtgt 420 gatccatttt ttattttaat gattgtgtat ttcctttata cctaaaacaa gcagaaaacc 480 agtaaaggtc tttgagtctc tgaattcata actccagcat tcatattgct tcctcaggta 540 agtggggttt tcacccagcc cttaagggtg ttagattatt ttttatgtga aattagccag 600 attgtatttc taaacatgat gtaaaacaat aatgacaaaa gttataataa actagccttc 660 ttaccaaatc cacatgtcta atgtgtgtgg gagggtgtta ggcaggggac ctgcagctaa 720 gggagaggca gacaggcccc atggccccaa atctaggata gtatttggta ttggttgatg 780 ggtgagagaa agagagggaa catctgtgca ggatgtggta tcagcacctg gactacatct 840 tagggattcc ttcttcattt ttcagtatgc cctgacaata attatatcta tcagacttac 900 ccccttgacc actggaacac taagactgtt ttgggatctc tgcctgactt tctcagaggt 960 gctggtgagg acattatgag tctggaacct agaaaagcgt tctgactctg ctgactttct 1020 cagaggtgct ggtgaggaca ttatgagtct ggagccctag aaaagcgttc tgactctgcc 1080 actagccaga cagacctgga ctaggcacgt taactctttg tatgacttga ctccaacccc 1140 tcatttgtaa aaccagcatt ttcaagtggt gttttccaca tcagcctttt gcataagctg 1200 tcatttgaag aaaggttttt gtttgtttgt tttttgttta acaaaaaggt taaaaaccac 1260 tggtctagat aattgcaaag tttgctttcc tttttctgtg ctttttctac tatttttaaa 1320 atgtcatcct ccttggtttc ttgatccccc tttctgcact cctgagtctg ggaacactga 1380 ggccaactaa aaggaaactt ggcaaaagag gaacaccttt gggtgtgcca ggctgctccc 1440 agtgttttgc acttataaaa atttaaatgc tgcaaacctc taagacttag atattattgt 1500 tcctatttta caagtgagga acctgaggct cagagaaggt gcaggatggc acagggagac 1560 ctgaattgga accctggttc ccacttactg gctgtcggga cttagaaaag tcatgaactc 1620 tcattgattg ttttcttata tgaaatgggg gctgcagggt tgtcggggga gaaacaataa 1680 gaatgtgcat caagtgtcga gcacgtgcta cgcactccat catggcagct cctactaata 1740 tacagaatag agttgtatct aacatgactc tttcttgcaa gtgacagaaa atccaactta 1800 agatggatta agcaaaaaag gggaattctt gttgagctga aaagtcttta ggctcacatg 1860 atggccccag ggcccaggcc ctgtccagcc atgcagtagg catcatcctt gggcacaaag 1920 gtgagattct tgtggtggca gatgctgtgg cagctcttgc tttgccagga aagactgagg 1980 aaggccactg tccccattaa gtgaacaata gttggccagg tctgagaggt tgaacttggg 2040 tcacaggcct gtccctgaac ccatcactga ttggctccaa cctgcatcag ctattacatg 2100 ctagaggtgg aggcaggacc ccactcatac ccagaagggc aaagggtgga tccctcaaca 2160 ggattatggg atgtagggtg atagactgct gggcagccag aaagcaaaca gatcctctcc 2220 aatacctcaa ctgatgaaag caccaagcta aaatcataag gatctgggtg tgaattctgg 2280 ctctaccatc ttccatgtga cattgggcag ttatttaatc tcttttagcc ttggctttct 2340 tacctgtact aacatataag gtgattgtga tgagcatcat catcgtcaac atcatcatca 2400 ccatccacat tgccaccacc actcccatta tcatcttcat caacatcatc accaccgcca 2460 ccatcaccat tatcattacc accaccgcta tcactattat catcaccctc aacatcatca 2520 ccatcatcac tatcatcacc accaccatca tcgttactac cactaccacc accatcatca 2580 ccacagccac caccaccatc accatcatta ctactcagca ccaccatcat cattccacca 2640 ccatcaccat cattccacca tcaccattat cattaccacc accactgtca ctattatcat 2700 caccctcaac atcatcacca ccaccatcat cattactacc accaccacca ccatcaccat 2760 catcatcatt ctaccaccat caccattatc atcaccatca ccatcaccac cgctatcatc 2820 atgataatca ttatcattac caccaccatt agcattatca ttaccaccac catcactatc 2880 actatcacca tcaccacgac cactaccacc atcaccaaca ccatcattac tacccaccac 2940 caccatcatc atcattccac caccatcaca attattacca ccaccaccat caccaccacc 3000 accaccatca ctatcatcat cagtagacat catataacca gtttgtagct ggcccagagc 3060 ctacttgctg tttcttctgc cccacaacca tccacacatt tctaaccacc atcccccact 3120 aggcttctgc ctcgcctggt ctcacctgca ggtccactga gaaaatgatt ctcagaacac 3180 taactagacc atgaggtgcc acaaaacata actcaggcct gttcatcaat tttctacatg 3240 tcaataatga catcaggtca attggcgttc tcagcctctg agagggaggt caaagttttc 3300 ctgctctccc cttcatgttt ccaggtgttc cctgacttgg atcaaatgca gagtttggag 3360 gtgttgaggc caaggggatt ttccaggtca gtcgtcatcc acaatcaatg gactgatcct 3420 gccgctggac ttaccctgct gccctctccc caaggcccca tcagggaggg cttcaatcct 3480 cttgtcacct gtggcctacc tgccctcaga gatgacatct ctatgtcggc cactggatgg 3540 cagcacctac tcgcagacca catcaacttt cctggcaact tgcggtaggt tttcaccatt 3600 atcaggatgt ttgccttgct caaatagcag attctagaga acggtgctcc ctcacacaac 3660 tatgtagtcc aggtgatgca ccctctgccc gatgcttggt agtcagaaac ttccatcatg 3720 cagctctgcc cagattgagc tgagctggcc tctggagtga ggtgctggga caaacatctt 3780 ccatgctgct catgtcaact ccagatgcag tcaggtttct gaaccaaagt caatgatcta 3840 agtgcagtca aaggctctgg gggaagaaag agagagtgcc tcatctcttg cctgtgccat 3900 gctcgcaaag caaggatttt tgcaaaattc taatgaaagc tgggcttgca aaattagaaa 3960 actggattat ttgtgagaac actgaaacat ccctgggtgt gtccatctgg aaaaacagca 4020 tttcctctgg caattttgca accgttctat ttgaatttgg caaagaaaat aaagcagttt 4080 ttcacaaaag aataaacaca accaggagaa tcttcactct cccaaattgt caaagaagta 4140 taaattagaa aatgaatcag gacaatttca acctgttaga ttagctaata tttaaaaatt 4200 gaacactcat acaagtgtgg tgaagtgatt gttttctagt gacattttac actgtcataa 4260 ccttctagaa aataaattgg cagtgttatt gggagacaga aatatgtcta tataatttat 4320 gggaacttag gctcagaaaa tattaaggaa taagaatgaa ctttatgaac aaagatgtgg 4380 agggttggaa gcaagagggg ggccaacgcg cacggggagg aagcatttgg gcagtgactc 4440 cgcagaccca ggctcaggtt gaactagaca acctccttac acctcagttt ccttaactgt 4500 agagcaggag tgatggaact gcctgtttca taggactgtt gtgaggatga agtgagatac 4560 accacattat aagcttgtgc ctggaaagga taatgcttag taaatgatga ctattctttt 4620 ttattgcaat aaaatgtaca cagcgtaaga gttactattt taaccatttt tgcagggtac 4680 caccaagtgg catttagtac attcacagtg gtgtgcaacc atcatcatat ttccagaata 4740 ttttcctcat ccccaaagga aacctcatgc tcattaatca gtagctctcc tttaaaatat 4800 tagttatgaa gatcatagca ctatacaaaa ctcattatgt aatgttgagt gaaaaaatca 4860 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Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 cttcctgtga cagtggtgga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 ccttcctgtg acagtggtgg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 tccttcctgt gacagtggtg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 gtccttcctg tgacagtggt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 ggtccttcct gtgacagtgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 aggtccttcc tgtgacagtg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 caggtccttc ctgtgacagt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 gcaggtcctt cctgtgacag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 tggcaggtcc ttcctgtgac 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 ttggcaggtc cttcctgtga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 cttggcaggt ccttcctgtg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 gcttggcagg tccttcctgt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 tcttcctgtg acagtggtgg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 ttcttcctgt gacagtggtg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 gttcttcctg tgacagtggt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 ggttcttcct gtgacagtgg 20 <210> 30 <211> 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accttaaaag 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 gaatttgtca gtcagacctt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 55 agaatttgtc agtcagacct 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 ccttaataca gaatttgtca 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 gctccgttgg tgcttgttca 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 tgctccgttg gtgcttgttc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 ttgctccgtt ggtgcttgtt 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 tttgctccgt tggtgcttgt 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 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<220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 93 cctctgtgct tggatctggg 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 94 gcctctgtgc ttggatctgg 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 95 agaagcctct gtgcttggat 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 96 ttcagaagaa gcctctgtgc 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 97 gctccgttgg tgcttcttca 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 98 tttgctccgt tggtgcttct 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 99 gctttgctcc gttggtgctt 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 100 ggctttgctc cgttggtgct 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> 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<211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 109 ctgtgcttgg aactgggacc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 110 ctctgtgctt ggaactggga 20 <210> 111 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 111 cctgtgacag tggtgga 17 <210> 112 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 112 tcctgtgaca gtggtgg 17 <210> 113 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 113 ttcctgtgac agtggtg 17 <210> 114 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 114 cttcctgtga cagtggt 17 <210> 115 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 115 ccttcctgtg acagtgg 17 <210> 116 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 116 tccttcctgt gacagtg 17 <210> 117 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 117 gtccttcctg tgacagt 17 <210> 118 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 118 ggtccttcct gtgacag 17 <210> 119 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 119 ccgactatgc gagtgtg 17 <210> 120 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 120 gtccgactat gcgagtg 17 <210> 121 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 121 ggtccgacta tgcgagt 17 <210> 122 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 122 gtcagacctt aaaagct 17 <210> 123 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 123 aagcctctgt gcttgga 17 <210> 124 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 124 agcctctgtg cttggat 17 <210> 125 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 125 gcctctgtgc ttggatc 17 <210> 126 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 126 gctccgttgg tgcttct 17 <210> 127 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 127 ctctgtgctt ggaactg 17 <210> 128 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 128 tgcctcgata actctgt 17 <210> 129 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 129 tgtgcctcga taactct 17 <210> 130 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 130 gctcagttgg tgctgct 17 <210> 131 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 131 gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27 <210> 132 <211> 3987 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 132 atgtatcgtt ttggaatttc cagtggcttg atcaggaact actgcaggaa tccagatcct 60 gtggcagccc cttattgtta tacgatggat cccaatgtca ggtgggagta ctgcaacctg 120 acacaatgct cagatgcaga agggactgcc gtcgcacctc cgaatgtcac cctggttcca 180 agcctagagg ctccttccga acaatcaccg actgagcaaa ggcctggggt gcaggagtgc 240 taccacggta atggacagag ttatcgaggc acatacttca ccactgtgac aggaagaacc 300 tgccaagctt ggtcatctat gacaccgcac tctcatagtc ggaccccgga aaactaccca 360 aatggtggct tgatcaggaa ctactgcagg aatccagatc ctgtggcagc cccttattgt 420 tataccatgg atcccaatgt caggtgggag tactgcaacc taacacaatg ctcagacgca 480 gaagggattg ccgtcacacc tctgactgtt accccggttc caagcctaga ggctccttcc 540 aagcaagcac caactgagca aaggcctggt gtccaggagt gctaccatgg taatggacag 600 agttatcgag gcacatactt caccactgtg acaggaagaa cctgccaagc ttggtcatct 660 atgacaccac attctcatag tcgtacccca gaaaactacc caaatggcag tccgacctct 720 tcagatctct tagtctaccc tgccgtcttc cttgatgcca tgggtcccac tgttctttca 780 actcatccgc tttccctcag tcccggagtg gctgcgacca gcagaggata tattgagagc 840 aagagagaag caccgactga gcaaaggcct ggggtgcagg agtgctacca cggtaatgga 900 cagagttatc gaggcacata cttcaccact gtgacaggaa gaacctgcca agcttggtca 960 tctatgacac cgcactctca tagtcggacc ccggaaaact acccaaatgg tggcttgatc 1020 aggaactact gcaggaatcc agatcctgtg gcagcccctt attgttatac catggatccc 1080 agtgtcaggt gggagtactg caacctgaca caatgctcag acgcagaagg gactgccgtc 1140 gcacctccga atgtcacccc ggttccaagc ctagaggctc cttctgagca agcaccaact 1200 gagcaaaggc ttggggtgca ggagtgctac cacagtaatg gacagagtta tcgaggcaca 1260 tacttcacca ctgtgacagg aagaacctgc caagcttggt catctatgac accacactct 1320 catagtcgga ccccagaaaa ctacccaaat gctggcttgg tcaagaacta ctgccgaaat 1380 ccagatcctg tggcagcccc ttggtgttat acaacggatc ccagtgtcag gtgggagtac 1440 tgcaacctga cacgatgctc agatgcagaa gggactgctg tcgtgcctcc aaatattatt 1500 ccggttccaa gcctagaggc ttttcttgaa caagaaccga ctgaggaaac ccccggggta 1560 caggagtgct actaccatta tggacagagt tatagaggca catactccac cactgttaca 1620 ggaagaactt gccaagcttg gtcatctatg acaccacacc agcatagtcg gaccccaaaa 1680 aactatccaa atgctggcct gaccaggaac tactgcagga atccagatgc tgagattcgc 1740 ccttggtgtt ataccatgga tcccagtgtc aggtgggagt actgcaacct gacacaatgt 1800 ctggtgacag aatcaagtgt ccttgaaact ctcacagtgg tcccagatcc aagcacacag 1860 gcttcttctg aagaagcacc aacggagcaa agtcccgagg tccaggactg ctaccatggt 1920 gatggacaga gttatcgagg ctcattctcc accactgtca caggaaggac atgtcagtct 1980 tggtcctcta tgacaccaca ctggcatcag aggacaacag aatattatcc agatggtggc 2040 ctgaccagga actactgcag gaatccagat gctgagattc gcccttggtg ttataccatg 2100 gatcccagtg tcaggtggga gtactgcaac ctgacacaat gtccagtgac agaatcaagt 2160 gtcctcgcaa cgtccatggc tgtttctgaa caagcaccaa tggagcaaag ccccggggtc 2220 caggactgct accatggtga tggacagagt tatcgaggtt cattctccac cactgtcaca 2280 ggaaggacat gtcagtcttg gtcctctatg acaccacact ggcatcagag gaccatagaa 2340 tactacccaa atggtggcct gaccaagaac tactgcagga atccagatgc tgagattcgc 2400 ccttggtgtt ataccatgga tcccagagtc agatgggagt actgcaacct gacacaatgt 2460 gtggtgatgg aatcaagtgt ccttgcaact cccatggtgg tcccagttcc aagcagagag 2520 gttccttctg aagaagcacc aactgaaaac agccctgggg tccaggactg ctaccaaggt 2580 gatggacaga gttatcgagg cacattctcc accactatca caggaagaac atgtcagtct 2640 tggttgtcta tgacaccaca tcggcatcgg aggatcccat tacgctatcc aaatgctggc 2700 ctgaccagga actattgcag aaatccagat gctgagattc gcccttggtg ttacaccatg 2760 gatcccagtg tcaggtggga gtactgcaac ctgacacaat gtccagtgac agaatcaagt 2820 gtcctcacaa ctcccacggt ggtcccggtt ccaagcacag aggctccttc tgaacaagca 2880 ccacctgaga aaagccctgt ggtccaggat tgctaccatg gtgatggaca gagttatcga 2940 ggcacatcct ccaccactgt cacaggaagg aactgtcagt cttggtcatc tatgatacca 3000 cactggcatc agaggacccc agaaaactac ccaaatgctg gcctgaccag gaactactgc 3060 aggaatccag attctgggaa acaaccctgg tgttacacga ctgatccatg tgtgaggtgg 3120 gagtactgca acctgacaca atgctcagaa acagaatcag gtgtcctaga gactcccact 3180 gttgttccgg ttccaagcat ggaagctcat tctgaagcag caccaactga gcaaacccct 3240 gtggtccagc agtgctacca tggtaatgga cagagttatc gaggcacatt ctccaccact 3300 gtcacaggaa ggacatgtca atcttggtca tccatgacac cacaccagca taagaggacc 3360 ccggaaaacc acccaaatga tggcttgaca atgaactact gcaggaatcc agatgctgac 3420 acaggccctt ggtgttttac catggacccc agcgtcaggc gggagtactg caacctgacg 3480 cgatgctcag acacagaagg gactgtggtc acacctccga ctgttatccc ggttccaagc 3540 ctagaggctc cttctgaaca agtgcttgga attcatcctg aattaaacga cacaattgct 3600 aacttggact caaaggtgaa ttctttccca ccttgtgcca cagcatcctc ttcatttgat 3660 tgtgggaagc ctcaagtgga gccaaagaaa tgtcctggaa gcattgtagg tgggtgtgtg 3720 gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc agtcttagaa caaggtttgg aaagcacttc 3780 tgtggaggca ccttaatatc cccagagtgg gtgctgactg ctgcttgctg cttggagacg 3840 ttctcaaggc cttccttcta caaggtcatc ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa 3900 tctcatgttc aagaaataga agtgtctagg ttgttcttgg agcccatagg agcagatatt 3960 gccttgctaa agctaagcag gtactaa 3987 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 133 ggttcttcca gtgacagtgg 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 134 atgcctcgat aactccgtcc 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 135 agcttcttgt ccagctttat 20 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 136 agcttcttgt ccagctttat a 21 <210> 137 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 137 tcagtcatga cttc 14 <210> 138 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 138 tcagtcatga cttca 15 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 139 gctgattaga gagaggtccc 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 140 tcccatttca ggagacctgg 20 <210> 141 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 141 atcagtcatg acttc 15 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 142 cggtgcaagg cttaggaatt 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 143 gcttcagtca tgacttcctt 20 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 144 gcttcagtca tgacttcctt a 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 145 agcttcagtc atgacttcct t 21 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 146 tggtaatcca ctttcagagg 20 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 147 tggtaatcca ctttcagagg a 21 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 148 tgcttcagtc atgacttcct t 21 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 149 cactgatttt tgcccaggat 20 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 150 cactgatttt tgcccaggat a 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 151 aagcttcttg tccagcttta t 21 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 152 acccaattca gaaggaagga 20 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 153 acccaattca gaaggaagga a 21 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 154 aacccaattc agaaggaagg a 21 <210> 155 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 155 atggtaatcc actttcagag g 21 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 156 tcttggttac atgaaatccc 20 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 157 tcttggttac atgaaatccc a 21 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 158 attcactttc ataatgctgg 20 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 159 attcactttc ataatgctgg a 21 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 160 atcttggtta catgaaatcc c 21 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 161 atgcatggtg atgcttctga 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 162 cagctttatt agggacagca 20 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 163 cagctttatt agggacagca a 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 164 acagctttat tagggacagc a 21 <210> 165 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 165 ttcagtcatg acttcc 16 <210> 166 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> bases at these positions are RNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> bases at these positions are RNA <400> 166 gcuucagtca tgactucc 18 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 167 tgctccgttg gtgcttgttc a 21

Claims (193)

  1. 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 기를 포함하는 화합물로서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 1의 핵염기 3901 내지 3920의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8 개의 인접 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호: 1에 대해 적어도 80% 상보적인 것인 화합물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 1의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20 개의 인접 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 화합물.
  3. 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 기를 포함하는 화합물로서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 1의 핵염기 3900 내지 3923의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 인접 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하고, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호: 1에 대해 적어도 80% 상보적인 것인 화합물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 서열번호: 1에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 상보적인 것인 화합물.
  5. 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 기를 포함하는 화합물로서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 58의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 화합물.
  6. 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 기를 포함하는 화합물로서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 12-130, 133, 134의 임의의 핵염기 서열의 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 20 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 화합물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 단일가닥인 화합물.
  8. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥인 화합물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결인 화합물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2 개의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 3 개의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 4 개의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  15. 청구항 10에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 5 개의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  16. 청구항 10에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 6 개의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  17. 청구항 10에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 7 개의 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  18. 청구항 11 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결 및 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결로부터 선택되는 화합물.
  19. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 화합물.
  20. ISIS 494372 및 콘주게이트 기로 이루어진 화합물.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 변형된 당을 포함하는 화합물.
  22. 청구항 21에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당은 바이사이클릭 당인 화합물.
  23. 청구항 21에 있어서, 적어도 하나의 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸, 구속된 에틸, 3'-플루오로-HNA 또는 4'-(CH2)n-O-2' 브릿지를 포함하고, 여기서 n은 1 또는 2인 화합물.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오사이드는 변형된 핵염기를 포함하는 화합물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 5-메틸시토신인 화합물.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 12 내지 30 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 하기를 포함하는 화합물:
    연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절;
    연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절;
    연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절;
    상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 변형된 당을 포함한다.
  27. 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 13 내지 25, 14 내지 25, 15 내지 25, 16 또는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 화합물.
  28. 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 콘주게이트 기를 포함하는 화합물로서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 20 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어지고 서열번호: 58의 임의의 것의 동등 길이부에 대해 상보적인 적어도 8 개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 가지며, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 하기를 포함하는 화합물:
    10 개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 이루어진 갭 분절;
    5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 5' 윙 분절;
    5 개의 연결된 뉴클레오사이드로 이루어진 3' 윙 분절;
    상기 갭 분절은 상기 5' 윙 분절과 상기 3' 윙 분절 사이에 배치되고, 여기서 각각의 윙 분절의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이고 여기서 각각의 시토신 잔기는 5-메틸시토신이다.
  29. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 변형된 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 변형된 올리고뉴클레오타이드에 연결되는 화합물.
  30. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 변형된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 변형된 올리고뉴클레오타이드에 연결되는 화합물.
  31. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 정확하게 하나의 리간드를 포함하는 화합물.
  32. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 정확하게 2 개의 리간드를 포함하는 화합물.
  33. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 3 개 이상의 리간드를 포함하는 화합물.
  34. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 정확하게 3 개의 리간드를 포함하는 화합물.
  35. 청구항 31 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 리간드는 하기 중에서 선택되는 화합물: 다당류, 변형된 다당류, 만노스, 갈락토오스, 만노스 유도체, 갈락토오스 유도체, D-만노파이라노스, L-만노파이라노스, D-아라비노오스, L-갈락토오스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코오스, L-글루코오스, D-갈락토오스, L-갈락토오스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노파이라노스, β-D-만노파이라노스, α-D-글루코파이라노스, β-D-글루코파이라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프룩토푸라노스, α-D-프룩토파이라노스, α-D-갈락토파이라노스, β-D-갈락토파이라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, α-D-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코파이라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코파이라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노파이라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코파이라노스, N-글라이콜로일-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코파이라노스, 메틸 2,3,4-트리-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토파이라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코 -헵토피라노사이드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스, L-4-티오리보오스.
  36. 청구항 35에 있어서, 각각의 리간드는 N-아세틸 갈락토사민인 것인 화합물.
  37. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00606
  38. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00607
  39. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00608
  40. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00609
  41. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00610
  42. 청구항 30 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 인 연결 기 또는 중성 연결 기 중 적어도 하나를 포함하는 화합물.
  43. 청구항 1 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기 중에서 선택된 구조를 포함하는 화합물:
    Figure pct00611

    Figure pct00612
    및
    Figure pct00613

    Figure pct00614

    여기서 n은 1 내지 12이고; 그리고
    여기서 m은 1 내지 12이다.
  44. 청구항 30 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 테더(tether)를 갖는 화합물:
    Figure pct00615
    및
    Figure pct00616

    여기서 L은 인 연결 기 또는 중성 연결 기이고;
    Z1은 C(=O)O-R2이고;
    Z2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
    R2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고; 그리고
    각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 테더를 갖는 화합물:
    Figure pct00617
    및
    Figure pct00618

    여기서 Z2는 H 또는 CH3이고; 그리고
    각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
  46. 청구항 30 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 테더를 갖는 화합물:
    Figure pct00619

    여기서 n은 1 내지 12이고; 그리고
    여기서 m은 1 내지 12이다.
  47. 청구항 1 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 변형된 올리고뉴클레오타이드에 공유결합되는 화합물.
  48. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00620

    여기서
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    B는 절단가능 모이어티이고
    C는 콘주게이트 링커이고
    D는 분지화 기이고
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  49. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00621

    여기서:
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    B는 절단가능 모이어티이고
    C는 콘주게이트 링커이고
    D는 분지화 기이고
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고;
    각각의 n은 독립적으로 0 또는 1이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  50. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00622

    여기서
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    B는 절단가능 모이어티이고;
    C는 콘주게이트 링커이고;
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  51. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00623

    여기서
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    C는 콘주게이트 링커이고;
    D는 분지화 기이고;
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  52. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00624

    여기서
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    C는 콘주게이트 링커이고;
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  53. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00625

    여기서
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    B는 절단가능 모이어티이고;
    D는 분지화 기이고;
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  54. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00626

    여기서
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    B는 절단가능 모이어티이고;
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  55. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 식으로 나타낸 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00627

    여기서
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    D는 분지화 기이고;
    각각의 E는 테더이고;
    각각의 F는 리간드이고; 그리고
    q는 정수 1 내지 5이다.
  56. 청구항 48 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00628

    Figure pct00629
    및
    Figure pct00630

    여기서 각각의 L은, 독립적으로, 인 연결 기 또는 중성 연결 기이고; 그리고
    각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
  57. 청구항 48 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00631

    Figure pct00632
    및
    Figure pct00633
  58. 청구항 48 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00634
  59. 청구항 48 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00635
    및
    Figure pct00636
  60. 청구항 48 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00637
    및
    Figure pct00638
    .
  61. 청구항 48 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00639
    및
    Figure pct00640
    .
  62. 청구항 48 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 피롤리딘을 포함하는 화합물.
  63. 청구항 48 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 피롤리딘을 포함하지 않는 화합물.
  64. 청구항 48 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 PEG를 포함하는 화합물.
  65. 청구항 48 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 아미드를 포함하는 화합물.
  66. 청구항 48 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 적어도 2 개의 아미드를 포함하는 화합물.
  67. 청구항 48 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 아미드를 포함하지 않는 화합물.
  68. 청구항 48 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 폴리아미드를 포함하는 화합물.
  69. 청구항 48 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 아민을 포함하는 화합물.
  70. 청구항 48 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 1개 이상의 디설파이드 결합을 포함하는 화합물.
  71. 청구항 48 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 단백질 결합 모이어티를 포함하는 화합물.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 단백질 결합 모이어티는 지질을 포함하는 화합물.
  73. 청구항 71에 있어서, 상기 단백질 결합 모이어티는 하기 중에서 선택되는 화합물: 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 펜옥사진, 비타민 (예를 들면, 폴레이트, 비타민 A, 비타민 E, 바이오틴, 피리독살), 펩타이드, 탄수화물 (예를 들면, 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고당, 다당류), 엔도솜분해적 구성성분, 스테로이드 (예를 들면, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌), 테르펜 (예를 들면, 트리테르펜, 예를 들면, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리델라놀 유도된 리토콜산), 또는 양이온성 지질.
  74. 청구항 71에 있어서, 상기 단백질 결합 모이어티는 하기 중에서 선택되는 화합물: C16 내지 C22 장쇄 포화된 또는 불포화된 지방산, 콜레스테롤, 콜산, 비타민 E, 아다만탄 또는 1-펜타플루오로프로필.
  75. 청구항 48 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00641

    Figure pct00642
    및
    Figure pct00643

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고 p는 1 내지 6이다.
  76. 청구항 48 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00644

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
  77. 청구항 48 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00645
  78. 청구항 48 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00646

    여기서 n은 1 내지 20이다.
  79. 청구항 48 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00647
    및
    Figure pct00648
  80. 청구항 48 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00649
    및
    Figure pct00650

    여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
  81. 청구항 48 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 링커는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00651
  82. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조 중 하나를 갖는 화합물:
    Figure pct00652
    및
    Figure pct00653

    여기서 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
    각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
  83. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조 중 하나를 갖는 화합물:
    Figure pct00654
    및
    Figure pct00655

    여기서 각각의 A1은 독립적으로, O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
    각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
  84. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00656
  85. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00657
  86. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00658
  87. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00659
  88. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 에테르를 포함하는 화합물.
  89. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00660

    각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
    m은 2 내지 6이다.
  90. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00661
  91. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00662
  92. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00663

    Figure pct00664
    또는
    Figure pct00665

    여기서 각각의 j는 정수 1 내지 3이고; 그리고
    여기서 각각의 n은 정수 1 내지 20이다.
  93. 청구항 48 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분지화 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00666

    Figure pct00667
    또는
    Figure pct00668
  94. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테더는 하기 중에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00669
    및
    Figure pct00670

    여기서 L은 인 연결 기 및 중성 연결 기로부터 선택되고;
    Z1은 C(=O)O-R2 이고;
    Z2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
    R2는 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고; 그리고
    각각의 m1은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m1은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
  95. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테더는 하기 중에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00671
    및
    Figure pct00672

    여기서 Z2는 H 또는 CH3이고; 그리고
    각각의 m2은, 독립적으로, 0 내지 20이고, 여기서 적어도 하나의 m2은 각각의 테더에 대해 0 초과이다.
  96. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테더는 하기 중에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00673

    여기서 n은 1 내지 12이고; 그리고
    여기서 m은 1 내지 12이다.
  97. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 테더는 에틸렌 글리콜을 포함하는 화합물.
  98. 청구항 48 내지 93 또는 95 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 테더는 아미드를 포함하는 화합물.
  99. 청구항 48 내지 93 또는 95 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 테더는 폴리아미드를 포함하는 화합물.
  100. 청구항 48 내지 93 또는 95 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 테더는 아민을 포함하는 화합물.
  101. 청구항 48 내지 93 또는 95 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2 개의 테더는 서로 상이한 것인 화합물.
  102. 청구항 48 내지 93 또는 95 중 어느 한 항에 있어서, 모든 테더는 서로 동일한 것인 화합물.
  103. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테더는 하기 중에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00674

    Figure pct00675
    및
    Figure pct00676

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고; 그리고
    각각의 p는 1 내지 약 6이다.
  104. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테더는 하기 중에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00677

    Figure pct00678
    및
    Figure pct00679
    .
  105. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테더는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00680

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
  106. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 테더는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00681
  107. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테더는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00682
    또는
    Figure pct00683

    여기서 각각의 n은 독립적으로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이다.
  108. 청구항 48 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테더는 하기 중에서 선택된 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00684
  109. 청구항 47 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 갈락토오스인 화합물.
  110. 청구항 47 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 만노스-6-포스페이트인 화합물.
  111. 청구항 47 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 리간드는 하기 중에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00685
    및
    Figure pct00686

    여기서 각각의 R1은 OH 및 NHCOOH로부터 선택된다.
  112. 청구항 47 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 리간드는 하기 중에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00687
    및
    Figure pct00688
    .
  113. 청구항 47 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 리간드는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00689
  114. 청구항 47 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 리간드는 하기 구조를 갖는 접합된 안티센스 화합물:
    Figure pct00690
  115. 청구항 1 내지 30 또는 56 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 세포-표적화 모이어티를 포함하는 화합물.
  116. 청구항 116에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기 구조를 갖는 세포-표적화 모이어티를 포함하는 화합물:
    Figure pct00691

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
  117. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00692
  118. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00693

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이다.
  119. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00694
  120. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00695
  121. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00696
  122. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00697
  123. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00698
  124. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00699
  125. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00700
  126. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00701
  127. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00702
  128. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00703
  129. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00704
  130. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00705
  131. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00706
  132. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00707
  133. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00708
  134. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00709
  135. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00710
  136. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00711
  137. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00712
  138. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00713
  139. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00714
  140. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00715
  141. 청구항 116에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00716

    여기서 각각의 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택된다.
  142. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00717

    여기서 각각의 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택된다.
  143. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00718

    여기서 각각의 Y는 O, S, 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 아미노, 치환된 아미노, 아지도, 알케닐 또는 알키닐로부터 선택된다.
  144. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00719
    .
  145. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00720
    .
  146. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00721
  147. 청구항 117에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00722
  148. 청구항 1 내지 147 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기 중에서 선택된 절단가능 모이어티를 포함하는 화합물: 포스포디에스테르, 아미드, 또는 에스테르.
  149. 청구항 1 내지 147 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 포스포디에스테르 절단가능 모이어티를 포함하는 화합물.
  150. 청구항 1 내지 147 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 절단가능 모이어티를 포함하지 않고, 상기 콘주게이트 기는 콘주게이트 기와 올리고뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 화합물.
  151. 청구항 1 내지 150 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 아미드 절단가능 모이어티를 포함하는 화합물.
  152. 청구항 1 내지 150 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 에스테르 절단가능 모이어티를 포함하는 화합물.
  153. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00723

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
    Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  154. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00724

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
    Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  155. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00725

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
    Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    Z는 H 또는 연결된 고형 지지체이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  156. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00726

    여기서 각각의 n은, 독립적으로, 1 내지 20이고;
    Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고;
    Z는 H 또는 연결된 고형 지지체이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  157. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00727

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  158. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00728

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  159. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00729

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  160. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00730

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  161. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00731

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  162. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00732

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  163. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00733

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  164. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00734

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  165. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00735

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  166. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00736

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  167. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00737

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  168. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00738

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  169. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00739

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  170. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘주게이트 기는 하기를 포함하는 화합물:
    Figure pct00740

    여기서 Q13은 H 또는 O(CH2)2-OCH3이고;
    A는 변형된 올리고뉴클레오타이드이고; 그리고
    Bx는 헤테로환 염기 모이어티이다.
  171. 청구항 153 내지 170 중 어느 한 항에 있어서, Bx는 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실, 또는 시토신, 또는 5-메틸 시토신 중에서 선택되는 화합물.
  172. 청구항 153 내지 170 중 어느 한 항에 있어서, Bx는 아데닌인 화합물.
  173. 청구항 153 내지 170 중 어느 한 항에 있어서, Bx는 티민인 화합물.
  174. 청구항 153 내지 170 중 어느 한 항에 있어서, Q13은 O(CH2)2-OCH3인 화합물.
  175. 청구항 153 내지 170 중 어느 한 항에 있어서, Q13은 H인 화합물.
  176. 아래의 식을 갖는 화합물:
    Figure pct00741

    여기서 x는 GalNAc를 포함하는 콘주게이트 기이다.
  177. 아래의 식을 갖는 화합물:
    Figure pct00742
  178. 아래의 식을 갖는 화합물:
    Figure pct00743
  179. 아래의 식을 갖는 화합물:
    Figure pct00744

    여기서 둘 중 하나의 R1은 -OCH2CH2OCH3 (MOE)이고 R2는 H이거나; 또는
    R1 및 R2는 함께 브릿지를 형성하고, 여기서 R1은 -O-이고 R2는 -CH2-, -CH(CH3)-, 또는 -CH2CH2-이고, 그리고 R1 및 R2는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 브릿지는 하기로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
    그리고 동일한 고리 상의 R3 및 R4의 각각의 쌍에 대해, 독립적으로 각각의 고리에 대해:
    둘 중 하나의 R3은 H 및 -OCH2CH2OCH3로부터 선택되고 R4는 H이거나; 또는
    R3 및 R4는 함께 브릿지를 형성하고, 여기서 R3은 -O-이고, 그리고 R4는 -CH2-, -CH(CH3)-, 또는 -CH2CH2-이고 R3 및 R4는 직접적으로 연결되고, 이로써 수득한 브릿지는 하기로부터 선택되고: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, 및 -O-CH2CH2-;
    그리고 R5는 H 및 -CH3로부터 선택되고;
    그리고 Z는 S- 및 O-로부터 선택된다.
  180. 청구항 1 내지 179 중 어느 한 항의 화합물 또는 그것의 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  181. 청구항 1 내지 180 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 전구약물.
  182. 동물에게 청구항 1 내지 181 중 어느 한 항의 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  183. 청구항 181에 있어서, 상기 동물은 인간인 방법.
  184. 청구항 181에 있어서, 상기 화합물의 투여는 심혈관, 대사성 및/또는 염증성 질환을 예방, 치료, 개선하거나 그 진행을 느리게 하는 방법.
  185. 청구항 182에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물 및 제 2 제제를 공-투여하는 것을 포함하는 방법.
  186. 청구항 185에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물 및 제 2 제제를 함께 투여하는 방법.
  187. 청구항 176에 있어서, 상기 투여는 비경구인 방법.
  188. 청구항 176에 있어서, 상기 투여는 피하인 방법.
  189. 동물에서 apo(a) mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 동물에게 청구항 1 내지 181 중 어느 한 항의 화합물 또는 조성물을 투여하여 상기 동물에서 apo(a) mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  190. 동물에서 Lp(a) 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 동물에게 청구항 1 내지 181 중 어느 한 항의 화합물 또는 조성물을 투여하여 상기 동물에서 apo(a) mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  191. 요법에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 179 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 조성물.
  192. 청구항 191에 있어서, 상승된 apo(a) 및/또는 상승된 Lp(a)와 관련된 질환을 치료, 예방 또는 그 진행을 느리게 하는데 사용하기 위한 화합물.
  193. 청구항 191에 있어서, 상기 질환은 염증성, 심혈관 또는 대사성 질환, 장애 또는 병태인 화합물.
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