ES2778442T3 - Composiciones y procedimientos de modulación de la expresión de la apolipoproteína C-III - Google Patents

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Thazha P Prakash
Punit P Seth
Eric E Swayze
Mark J Graham
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase que comprende 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 3533 a 3552 de SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a la SEQ ID NO: 3; y en donde el grupo conjugado comprende: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos de modulación de la expresión de la apolipoproteína C-III
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0001] El principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido hibrida con un ácido nucleico diana y modula la cantidad, actividad y/o la función del ácido nucleico diana. Por ejemplo, en ciertos casos, los compuestos antisentido dan como resultado una transcripción o traducción alterada de una diana. Dicha modulación de la expresión puede lograrse mediante, por ejemplo, degradación de ARNm diana o inhibición basada en la ocupación. Un ejemplo de modulación de la función diana del ARN por degradación es la degradación basada en RNasa H del ARN diana tras la hibridación con un compuesto antisentido similar al ADN. Otro ejemplo de modulación de la expresión génica por degradación diana es la interferencia de ARN (ARNi). ARNi se refiere a silenciamiento génico mediado por antisentido a través de un mecanismo que utiliza el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ejemplo adicional de modulación de la función diana de ARN es mediante un mecanismo basado en la ocupación, tal como lo emplea naturalmente el microARN. Los microARN son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión de los ARN codificadores de proteínas. La unión de un compuesto antisentido a un microARN evita que el microARN se una a sus objetivos de ARN mensajero y, por lo tanto, interfiere con la función del microARN. Los imitadores de microARN pueden mejorar la función nativa de microARN. Ciertos compuestos antisentido alteran el empalme de pre-ARNm. Independientemente del mecanismo específico, la especificidad de secuencia hace que los compuestos antisentido sean atractivos como herramientas para la validación de objetivos y la funcionalización de genes, así como la terapéutica para modular selectivamente la expresión de genes involucrados en la patogénesis de enfermedades.
[0002] La tecnología antisentido es un medio eficaz para modular la expresión de uno o más productos específicos de genes y por lo tanto puede llegar a ser únicamente útil en un número de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. Los nucleósidos modificados químicamente pueden incorporarse en compuestos antisentido para mejorar una o más propiedades, tales como resistencia a la nucleasa, farmacocinética o afinidad por un ácido nucleico diana. En 1998, el compuesto antisentido, Vitravene® (fomivirsen; desarrollado por Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, CA) fue el primer medicamento antisentido en lograr la autorización de comercialización de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), y actualmente es un tratamiento para el citomegalovirus inducida por retinitis (CMV) en pacientes con SIDA.
[0003] Las nuevas modificaciones químicas han mejorado la potencia y la eficacia de los compuestos antisentido, descubriendo el potencial para el suministro oral, así como mejorando la administración subcutánea, disminuyendo el potencial de efectos secundarios y conduciendo a mejoras en la conveniencia del paciente. Las modificaciones químicas que aumentan la potencia de los compuestos antisentido permiten la administración de dosis más bajas, lo que reduce el potencial de toxicidad, además de disminuir el costo general de la terapia. Las modificaciones que aumentan la resistencia a la degradación dan como resultado una eliminación más lenta del cuerpo, lo que permite una dosificación menos frecuente. Se pueden combinar diferentes tipos de modificaciones químicas en un compuesto para optimizar aún más la eficacia del compuesto.
[0004] La apolipoproteína C-III (también llamada APOC3, APOC-III, ApoCIII y APO C-III) es un componente de HDL y de lipoproteínas ricas en triglicéridos (TG). Los niveles elevados de ApoCIII están asociados con niveles elevados de TG y enfermedades tales como enfermedades cardiovasculares, síndrome metabólico, obesidad y diabetes (Chan et al., Int J Clin Pract, 2008, 62: 799-809; Onat et al., Atherosclerosis, 2003, 168: 81-89; Mendivil et al., Circulation, 2011, 124: 2065-2072; Mauger et al., J. Lipid Res, 2006. 47: 1212-1218; Chan et al., Clin. Chem, 2002. 278-283; Ooi et al., Clin. Sci, 2008. 114: 611-624; Davidsson et al., J. Lipid Res. 2005. 46: 1999-2006; Sacks et al., Circulation, 2000.
102: 1886-1892; Lee et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003. 23: 853-858). ApoCIII ralentiza el aclaramiento de las lipoproteínas ricas en TG al inhibir la lipólisis mediante la inhibición de la lipoproteína lipasa (LPL) y al interferir con la unión de las lipoproteínas a la matriz de glucosaminoglucano de la superficie celular (Shachter, Curr. Opin. Lipidol, 2001, 12, 297-304).
[0005] La tecnología antisentido está emergiendo como un medio eficaz para reducir la expresión de ciertos productos génicos y puede llegar a ser únicamente útil en un número de, y aplicaciones de investigación de diagnóstico terapéuticos para la modulación de ApoCIII. Los compuestos antisentido dirigidos a ApoCIII y los métodos asociados para inhibir ApoCIII se han descrito previamente (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 7.598.227, la Patente de Estados Unidos 7.750.141, la publicación Pc T WO 2004/093783, la publicación PCT WO 2012/149495 y PCT/US14/016546). Un compuesto antisentido dirigido a ApoCIII, ISIS-APOCIIIrx, se ha probado en ensayos clínicos de fase I y II. Sin embargo, no se han aprobado compuestos antisentido dirigidos a ApoCIII para uso comercial, por lo tanto, todavía es necesario proporcionar a los pacientes opciones de tratamiento adicionales y más potentes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0006] La presente invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleobases contiguos complementarios a una porción de longitud igual de nucleobases 3533 a 3552 de la SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a la SEQ ID NO: 3; y donde el grupo de conjugado comprende:
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[0007] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0008] La presente invención también proporciona el compuesto de la invención para uso en terapia.
[0009] La presente invención también proporciona el compuesto o composición de la invención para uso en:
a) prevenir, tratar, mejorar o retrasar la progresión de un trastorno cardiovascular, metabólico y/o inflamatorio de la enfermedad, trastorno o afección; o
b) tratar, prevenir o retrasar la progresión de hipertrigliceridemia, FCS, pancreatitis, diabetes o dislipidemia.
SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN
[0010] En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y reducir la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico en una célula.
[0011] El receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) se ha descrito previamente. Ver, por ejemplo, Park et al., PNAS vol. 102, núm. 47, págs. 17125-17129 (2005). Dichos receptores se expresan en las células del hígado, particularmente en los hepatocitos. Además, se ha demostrado que los compuestos que comprenden grupos de tres ligandos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) son capaces de unirse al ASGP-R, dando como resultado la absorción del compuesto en la célula. Véase, por ejemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, págs. 5216­ 5231 (mayo de 2008). Por consiguiente, los conjugados que comprenden dichos grupos de GalNAc se han usado para facilitar la absorción de ciertos compuestos en las células del hígado, específicamente los hepatocitos. Por ejemplo, se ha demostrado que ciertos conjugados que contienen GalNAc aumentan la actividad de los compuestos de ARNip dúplex en células hepáticas in vivo. En tales casos, el conjugado que contiene GalNAc se une típicamente a la cadena sentido del dúplex de ARNip. Dado que la cadena sensorial se descarta antes de que la cadena antisentido finalmente hibrida con el ácido nucleico diana, existe poca preocupación de que el conjugado interfiera con la actividad. Típicamente, el conjugado está unido al extremo 3’ de la cadena sensorial del ARNip. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 8.106.022. Ciertos grupos conjugados descritos aquí son más activos y/o más fáciles de sintetizar que los grupos conjugados descritos previamente.
[0012] En ciertas realizaciones de la presente invención, los conjugados se unen a los compuestos antisentido de una sola hebra, incluyendo, pero no limitado a compuestos antisentido basados en RNasa H y compuestos antisentido que alteran el empalme de un ácido nucleico diana pre-mARN. En tales realizaciones, el conjugado debe permanecer unido al compuesto antisentido el tiempo suficiente para proporcionar un beneficio (captación mejorada en las células) pero luego debe ser escindido o no interferir con los pasos posteriores necesarios para la actividad, como la hibridación a un ácido nucleico diana e interacción con RNasa H o enzimas asociadas con empalme o modulación de empalme. Este equilibrio de propiedades es más importante en el establecimiento de compuestos antisentido monocatenarios que en los compuestos de ARNsi, donde el conjugado puede simplemente unirse a la cadena sensorial. Se describen en el presente documento compuestos antisentido monocatenarios conjugados que tienen potencia mejorada en células hepáticas in vivo en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece del conjugado. Dado el equilibrio de propiedades requerido para estos compuestos, tal potencia mejorada es sorprendente.
[0013] En ciertas realizaciones, grupos conjugados en el presente documento comprenden un resto escindible. Como se señaló, sin desear estar limitado por un mecanismo, es lógico que el conjugado permanezca en el compuesto el tiempo suficiente para proporcionar una mejora en la absorción, pero después de eso, es deseable que una parte o, idealmente, todo el conjugado sea escindido, liberando el compuesto original (p. ej., compuesto antisentido) en su forma más activa. En ciertas realizaciones, el resto escindible es un nucleósido escindible. Dichas realizaciones aprovechan las nucleasas endógenas en la célula uniendo el resto del conjugado (el grupo) al oligonucleótido antisentido a través de un nucleósido a través de uno o más enlaces escindibles, como los de un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo está unido al nucleósido escindible a través de un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el nucleósido escindible está unido al oligonucleótido antisentido (compuesto antisentido) mediante un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado puede comprender dos o tres nucleósidos escindibles. En tales realizaciones, dichos nucleósidos escindibles están unidos entre sí, al compuesto antisentido y/o al grupo a través de enlaces escindibles (tales como los de un enlace fosfodiéster). Ciertos conjugados de la presente memoria no comprenden un nucleósido escindible y en su lugar comprenden un enlace escindible. Se muestra que al menos un enlace que es vulnerable a la división en la célula (un enlace escindible) proporciona suficiente escisión del conjugado del oligonucleótido.
[0014] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son profármacos. Tales profármacos se administran a un animal y finalmente se metabolizan a una forma más activa. Por ejemplo, los compuestos antisentido conjugados se escinden para eliminar todo o parte del conjugado dando como resultado que la forma activa (o más activa) del compuesto antisentido carezca de todo o parte del conjugado.
[0015] En ciertas realizaciones, los conjugados están unidos en el extremo 5' de un oligonucleótido. Ciertos de tales conjugados 5’ se escinden más eficientemente que sus contrapartes que tienen un grupo conjugado similar unido en el extremo 3'. En ciertas realizaciones, una actividad mejorada puede correlacionarse con una escisión mejorada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 5’ tienen mayor eficacia que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 3' (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 56, 81, 83 y 84). Además, la unión 5’ permite una síntesis de oligonucleótidos más simple. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan en un soporte sólido en la dirección 3’ a 5'. Para hacer un oligonucleótido conjugado en 3’, típicamente uno une un nucleósido 3' previamente conjugado al soporte sólido y luego construye el oligonucleótido como de costumbre. Sin embargo, unir ese nucleósido conjugado al soporte sólido agrega complicación a la síntesis. Además, usando ese enfoque, el conjugado está presente a lo largo de la síntesis del oligonucleótido y puede degradarse durante los pasos posteriores o puede limitar el tipo de reacciones y reactivos que se pueden usar. Usando las estructuras y técnicas descritas en el presente documento para oligonucleótidos conjugados en 5’, se puede sintetizar el oligonucleótido utilizando técnicas automatizadas estándar e introducir el conjugado con el nucleósido final (la mayoría 5') o después de que el oligonucleótido se haya separado del soporte sólido.
[0016] En vista de la técnica y la presente descripción, un experto puede hacer fácilmente cualquiera de los conjugados y oligonucleótidos conjugados de este documento. Además, la síntesis de ciertos conjugados y oligonucleótidos conjugados descritos en este documento es más fácil y/o requiere pocos pasos, y por lo tanto es menos costosa que la de los conjugados descritos anteriormente, proporcionando ventajas en la fabricación. Por ejemplo, la síntesis de ciertos grupos conjugados consiste en menos pasos sintéticos, lo que resulta en un mayor rendimiento, en relación con los grupos conjugados descritos anteriormente. Los grupos conjugados como GalNAc3-10 en el Ejemplo 46 y GalNAc3-7 en el Ejemplo 48 son mucho más simples que los conjugados descritos anteriormente, como los descritos en los documentos US 8.106.022 o US 7.262.177 que requieren el ensamblaje de más productos químicos intermedios. En consecuencia, estos y otros conjugados descritos en el presente documento tienen ventajas sobre los compuestos descritos previamente para su uso con cualquier oligonucleótido, incluidos oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquier cadena de oligonucleótidos de cadena doble (por ejemplo, ARNip).
[0017] De manera similar, se da a conocer en el presente documento son grupos conjugados que tienen sólo uno o dos ligandos GalNAc. Como se muestra, dichos grupos conjugados mejoran la actividad de los compuestos antisentido. Tales compuestos son mucho más fáciles de preparar que los conjugados que comprenden tres ligandos de GalNAc. Los grupos conjugados que comprenden uno o dos ligandos de GalNAc pueden unirse a cualquier compuesto antisentido, incluidos los oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquiera de las cadenas de oligonucleótidos de cadena doble (p. ej., ARNip).
[0018] En ciertas realizaciones, los conjugados de la presente memoria no sustancialmente alteran ciertas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, se muestra aquí que los compuestos antisentido conjugados no son más inmunogénicos que los compuestos parentales no conjugados. Dado que se mejora la potencia, las realizaciones en las que la tolerabilidad sigue siendo la misma (o incluso si la tolerabilidad empeora solo ligeramente en comparación con las ganancias en potencia) tienen propiedades mejoradas para la terapia.
[0019] En ciertas realizaciones, la conjugación permite que se alteren compuestos antisentido en formas que tienen consecuencias menos atractivas en la ausencia de conjugación. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, reemplazar uno o más enlaces de fosforotioato de un compuesto antisentido de fosforotioato completo con enlaces de fosfodiéster da como resultado una mejora en algunas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en ciertos casos, dichos compuestos antisentido que tienen uno o más fosfodiésteres son menos inmunogénicos que el mismo compuesto en donde cada enlace es un fosforotioato. Sin embargo, en ciertos casos, como se muestra en el Ejemplo 26, ese mismo reemplazo de uno o más enlaces de fosforotioato con enlaces de fosfodiéster también da como resultado una absorción y/o pérdida celular reducida en la potencia. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados descritos en el presente documento toleran dicho cambio en los enlaces con poca o ninguna pérdida en la absorción y potencia en comparación con la contraparte de fosforotioato completo conjugado. De hecho, en ciertas realizaciones, por ejemplo, en los Ejemplos 44, 57, 59, y 86, de oligonucleótidos que comprenden un conjugado y al menos un enlace internucleosídico de fosfodiéster realmente exhibe mayor potencia in vivo incluso con respecto a un homólogo de fosforotioato completo también comprende el mismo conjugado. Además, dado que la conjugación da como resultado aumentos sustanciales en la absorción/potencia, una pequeña pérdida en esa ganancia sustancial puede ser aceptable para lograr una tolerabilidad mejorada. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden al menos un enlace de fosfodiéster.
[0020] En ciertas realizaciones, la conjugación de compuestos antisentido en este documento resulta en un incremento de entrega, la absorción y la actividad en los hepatocitos. Por lo tanto, se entrega más compuesto al tejido hepático. Sin embargo, en ciertas realizaciones, ese aumento de la entrega por sí solo no explica el aumento completo de la actividad. En ciertas realizaciones de este tipo, más compuesto ingresa a los hepatocitos. En ciertas realizaciones, incluso ese aumento en la absorción de hepatocitos no explica el aumento completo de la actividad. En tales realizaciones, se incrementa la absorción productiva del compuesto conjugado. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 102, ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc aumentan el enriquecimiento de oligonucleótidos antisentido en hepatocitos versus células no parenquimatosas. Este enriquecimiento es beneficioso para los oligonucleótidos que se dirigen a los genes que se expresan en los hepatocitos.
[0021] En ciertas realizaciones, compuestos antisentido conjugados en el presente documento resultan en una exposición renal reducida. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 20, las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que comprenden ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc son más bajas en el riñón que la de los oligonucleótidos antisentido que carecen de un conjugado que contiene GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para las indicaciones terapéuticas donde no se busca actividad en el riñón, la exposición al riñón corre el riesgo de toxicidad renal sin el beneficio correspondiente. Además, la alta concentración en el riñón generalmente resulta en la pérdida de compuesto en la orina, lo que resulta en un aclaramiento más rápido. De acuerdo con los objetivos no renales, la acumulación renal no es deseada.
[0022] En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
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Resto de dianas ce u ares
[0023] La presente descripción proporciona las siguientes realizaciones no limitantes: Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado de orientación ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo conjugado consiste en 20 nucleósidos enlazados.
[0024] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado de orientación ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado se compone de 12 a 30 enlaces nucleósidos y comprende una secuencia complementaria nucleobase a una porción de longitud igual de nucleobases 3.533-3.552 de la SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos un 80% complementario a la SEQ ID NO: 3.
[0025] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado de orientación ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende una secuencia de nucleobase complementaria a una porción de igual longitud de las nucleobases 3514 a 3558 de SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80% complementario a la SEQ ID NO: 3.
[0026] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 19-96, 209-221. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado conjugado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 19-96, 209-221. En ciertas realizaciones, el compuesto consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 19-96, 209-221 y un grupo conjugado.
[0027] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado de orientación ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado se compone de 12 a 30 enlaces nucleósidos y tiene una secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo conjugado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, el compuesto consiste en SEQ ID NO: 87 y un grupo conjugado.
[0028] El compuesto antisentido conjugado puede ser representado por la siguiente estructura. El compuesto antisentido puede comprender el oligonucleótido modificado ISIS 304801 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc, como se define en las reivindicaciones. El compuesto antisentido puede consistir en el oligonucleótido modificado ISIS 304801 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc, como se define en las reivindicaciones.
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[0029] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado puede ser representado por la siguiente estructura. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el conjugado modificado oligonucleótido ISIS 678354. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en la conjugado modificado oligonucleótido ISIS 678354.
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[0030] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado puede ser representado por la siguiente estructura. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el conjugado modificado oligonucleótido ISIS 678357. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en la conjugado modificado oligonucleótido ISIS 678357.
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[0031] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar por la siguiente estructura. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado con la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87 con un 5'-GalNAc, como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en un oligonucleótido modificado con la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87 con un 5'-GalNAc, como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas.
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[0032] en donde o bien R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente, en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-, y R1 y R2 son conectados directamente de modo que el puente resultante se seleccione entre: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
[0033] Y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: o bien R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-y R3 y R4 son conectados directamente de modo que el puente resultante se seleccione entre: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
[0034] Y R5 se selecciona entre H y -CH3 ;
Y Z se selecciona de S- y O-.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DESCRIPCIÓN
[0035] Ha de entenderse que tanto la anterior descripción general y la siguiente descripción detallada son a modo de ejemplo y sólo explicativas y no son restrictivas de la divulgación. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluido", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
[0036] Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben considerarse como limitativos de la materia diana descrita.
A. Definiciones
[0037] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico. Ciertas técnicas y procedimientos de este tipo pueden encontrarse, por ejemplo, en "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington DC, 1994; "Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21a edición, 2005; y "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory Manual", 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[0038] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados: Como se usa aquí, "nucleósidos" significa un compuesto que comprende un resto nucleobase y un resto azúcar. Los nucleósidos incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos naturales (como se encuentran en el ADN y el ARN) y nucleósidos modificados. Los nucleósidos pueden estar unidos a un resto fosfato.
[0039] Como se usa en este documento, "modificación química" significa una diferencia química en un compuesto en comparación con un homólogo que se produce de forma natural. Las modificaciones químicas de los oligonucleótidos incluyen modificaciones de nucleósidos (incluidas modificaciones de restos de azúcar y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlaces internucleosídicos. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobase.
[0040] Como se usa en este documento, "furanosilo" significa una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
[0041] Como se usa en este documento, "resto de azúcar de origen natural" significa un ribofuranosilo como se encuentra en forma natural de ARN o un desoxiribofuranosilo como se encuentra en forma natural de ADN.
[0042] Como se usa en este documento, "resto de azúcar" significa un resto de azúcar de origen natural o un resto de azúcar modificado de un nucleósido.
[0043] Como se usa en este documento, "resto de azúcar modificado" significa un resto de azúcar sustituido o un sustituto de azúcar.
[0044] Como se usa en este documento, "resto de azúcar sustituido" significa un furanosilo que no es un resto de azúcar de origen natural. Los restos de azúcar sustituidos incluyen, pero no se limitan a furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2’, la posición 3', la posición 5’ y/o la posición 4'. Ciertos restos de azúcar sustituidos son restos de azúcar bicíclicos.
[0045] Como se usa en este documento, "resto de azúcar 2’-sustituido" significa un furanosilo que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto a H u OH. A menos que se indique lo contrario, un resto de azúcar 2’-sustituido no es un resto de azúcar bicíclico (es decir, el sustituyente 2' de un resto de azúcar 2’-sustituido no forma un puente a otro átomo del anillo de furanosilo.
[0046] Como se utiliza aquí, "MOE" significa -OCH2CH2OCH3.
[0047] Como se usa en este documento, "nucleósido de 2’-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende flúor en la posición 2'. A menos que se indique lo contrario, el flúor en un nucleósido de 2'-F está en la posición ribo (en sustitución del OH de una ribosa natural).
[0048] Tal como se utiliza aquí, el término "sustituto de azúcar" significa una estructura que no comprende un furanosilo y que es capaz de reemplazar la resto de azúcar natural de un nucleósido, de modo que las subunidades de nucleósidos resultantes son capaces de unirse entre sí y/o unirse a otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridarse con un compuesto oligomérico complementario. Dichas estructuras incluyen anillos que comprenden un diferente número de átomos que el furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); reemplazo del oxígeno de un furanosilo con un átomo que no es de oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Dichas estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para restos de azúcar sustituidos (por ejemplo, sustitutos del azúcar carbocíclico bicíclico de 6 miembros que opcionalmente comprenden sustituyentes adicionales). Los sustitutos del azúcar también incluyen reemplazos de azúcar más complejos (por ejemplo, los sistemas sin anillo del ácido nucleico peptídico). Los sustitutos del azúcar incluyen, sin limitación, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
[0049] Como se usa en este documento, "resto de azúcar bicíclico" significa un resto de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (incluyendo pero no limitado a un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que resulta en una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En ciertas realizaciones de este tipo, el puente conecta el carbono 2’ y el carbono 4' del furanosilo.
[0050] Como se usa en el presente documento, "nucleótido" significa un nucleósido que comprende además un grupo de enlace de fosfato. Como se usa en el presente documento, los "nucleósidos enlazados" pueden o no estar unidos por enlaces fosfato y, por lo tanto, incluyen, pero no se limitan a, "nucleótidos enlazados". Como se usa en el presente documento, "nucleósidos enlazados" son nucleósidos que están conectados en una secuencia continua (es decir, no hay nucleósidos adicionales presentes entre los que están enlazados).
[0051] Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios (ssADN), ácidos nucleicos bicatenarios (dsADN), ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARNs (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender cualquier combinación de estos elementos en una sola molécula.
[0052] Como se usa en el presente documento, significa "nucleótido" un nucleósido que comprende además un grupo de enlace de fosfato. Como se usa en el presente documento, los "nucleósidos enlazados" pueden o no estar unidos por enlaces fosfato y, por lo tanto, incluyen, pero no se limitan a, “nucleótidos enlazados”. Como se usa en el presente documento, "nucleósidos enlazados" son nucleósidos que están conectados en una secuencia continua (es decir, no hay nucleósidos adicionales presentes entre los que están enlazados).
[0053] Como se usa en el presente documento, “nucleobase” significa un grupo de átomos que puede ser ligado a un resto de azúcar para crear un nucleósido que es capaz de la incorporación en un oligonucleótido, y donde el grupo de los átomos es capaz de unirse con una nucleobase complementaria de origen natural de otro oligonucleótido o ácido nucleico. Las nucleobases pueden ser de origen natural o pueden modificarse. Como se usa en este documento, "secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azúcar, enlace o modificación de nucleobase.
[0054] En la presente memoria los términos "nucleobase no modificada" o "nucleobase de origen natural" significan las nucleobases heterocíclicas de origen natural de ARN o ADN de las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina de timina (T), citosina (C) (incluido 5-metilo C) y uracilo (U).
[0055] Como se usa en este documento, "nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase que no es una nucleobase de origen natural.
[0056] Como se usa en el presente documento, "nucleósido modificado" significa un nucleósido que comprende al menos una modificación química en comparación con nucleósidos de ARN o ADN de origen natural. Los nucleósidos modificados comprenden un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
[0057] Como se usa en este documento, "nucleósido bicíclico" o "BNA" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico.
[0058] Como se usa en este documento, "nucleósido de etilo restringido" o "cEt" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente de 4'-CH(CH3)-O-2'.
[0059] Como se usa en el presente documento, "nucleósido de ácido nucleico bloqueado" o "LNA" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente de 4’-CH2-O-2'.
[0060] Como se usa en este documento, "nucleósidos 2’-sustituidos" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto a H u OH. A menos que se indique lo contrario, un nucleósido sustituido en 2' no es un nucleósido bicíclico.
[0061] Como se usa en el presente documento, "desoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende la fracción de azúcar furanosilo 2'-H, como se encuentra en los desoxirribonucleósidos (ADN) que se producen naturalmente. En ciertas realizaciones, un 2’-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).
[0062] Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos no modificados (ARN) y/o desoxirribonucleósidos no modificados (ADN) y/o uno o más nucleósidos modificados.
[0063] Como se usa en este documento, "oligonucleósido" significa un oligonucleótido en donde ninguno de los enlaces de internucleósido contiene un átomo de fósforo. Como se usa en el presente documento, los oligonucleótidos incluyen oligonucleósidos.
[0064] Como se usa en este documento, "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleósido modificado y/o al menos un enlace internucleosídico modificado.
[0065] Como se usa en el presente documento, "enlace" o "grupo de enlace" significa un grupo de átomos que enlazan entre sí dos o más otros grupos de átomos.
[0066] Como se usa en este documento, "enlace internucleosídico" significa un enlace covalente entre nucleósidos adyacentes en un oligonucleótido.
[0067] En la presente memoria "enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace 3' a 5' fosfodiéster.
[0068] Como se usa en el presente documento, un "enlace internucleósido modificado" significa cualquier enlace internucleosídico distinto de un enlace internucleosídico de origen natural.
[0069] Como se usa en el presente documento, "enlace internucleósido terminal" significa la relación entre los dos últimos nucleósidos de un oligonucleótido o región definida de los mismos.
[0070] Como se usa en este documento, "grupo de enlace de fósforo" se refiere a un grupo de enlace que comprende un átomo de fósforo. Los grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, grupos que tienen la fórmula:
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en donde:
Ra y Rd son cada uno, independientemente, O, S, CH2 , NH o NJ1 en donde J1 es C1-C6 alquilo o C1-C6 alquilo sustituido;
Rb es O o S;
Rc es OH, SH, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi sustituido, amino o amino sustituido; y
J1 es Rb es O o S.
grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tionoalquilfosfonato, fosfotriésteres, tionoalquilfosfotriester y boranofosfato.
[0071] Como se usa en este documento, "grupo de enlace de fósforo internucleósido" significa un grupo de enlace de fósforo que directamente une dos nucleósidos.
[0072] Como se usa en este documento, "grupo de enlace de fósforo no internucleósido" significa un grupo de enlace de fósforo que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico une un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico une dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
[0073] Como se usa en este documento, "grupo de enlace neutral" significa un grupo de enlace que no está cargado. Los grupos de enlace neutro incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), amida-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) y tioformacetal (-S-CH2-O-). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (véase, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; YS Sanghvi y PD Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, (págs. 40-65)). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
[0074] Como se usa en este documento, "grupo de enlace internucleosídico neutro" significa un grupo de enlace neutral que enlaza directamente dos nucleósidos.
[0075] Como se usa en este documento, "grupo de enlace neutral no internucleosídico" significa un grupo de enlace neutral que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico une un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico une dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
[0076] Como se usa en el presente documento, "compuesto oligomérico" se refiere a una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico consiste en un oligonucleótido. Los compuestos oligoméricos también incluyen ácidos nucleicos naturales. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende una cadena principal de una o más subunidades monoméricas unidas donde cada subunidad monomérica unida está unida directa o indirectamente a un resto de base heterocíclico. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos también pueden incluir subunidades monoméricas que no están unidas a un resto de base heterocíclico, proporcionando de ese modo sitios abásicos. En ciertas realizaciones, los enlaces que unen las subunidades monoméricas, los restos de azúcar o sustitutos y los restos de base heterocíclica pueden modificarse independientemente. En ciertas realizaciones, la unidad de enlace de azúcar, que puede incluir o no una base heterocíclica, puede estar sustituida con un mimético tal como los monómeros en ácidos nucleicos peptídicos.
[0077] Como se usa en el presente documento, "grupo terminal" significa uno o más átomos unidos a cualquiera de los dos, o ambos, el extremo 3’ o el extremo 5' de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un grupo terminal es un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos del grupo terminal.
[0078] Como se usa en el presente documento, "conjugado" o "grupo conjugado" significa un átomo o grupo de átomos unidos a un oligonucleótido o un compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están unidas, incluidas, entre otras, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, absorción celular, carga y/o eliminación.
[0079] Como se usa en este documento, "enlazador conjugado" o "enlazador" en el contexto de un grupo conjugado significa una porción de un conjugado de grupo que comprende cualquier átomo o grupo de átomos y que enlazan covalentemente (1) un oligonucleótido a otra porción del grupo conjugado o (2) dos o más porciones del grupo conjugado.
[0080] Los grupos conjugados se muestran en el presente documento como radicales, proporcionando un enlace para la formación de unión covalente a un compuesto oligomérico tal como un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 3’ del grupo hidroxilo 3' del nucleósido terminal 3’ del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 5’ del grupo hidroxilo 5' del nucleósido terminal 5’ del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el enlace para formar la unión al compuesto oligomérico es un enlace escindible. En ciertas de tales realizaciones, dicho enlace escindible constituye todo o parte de un resto escindible.
[0081] En ciertas realizaciones, grupos conjugados comprenden un resto escindible (por ejemplo, un enlace escindible o nucleósido escindible) y una porción de clúster de hidratos de carbono, tal como una porción de clúster GalNAc. Dicha porción de grupo de carbohidratos comprende: un resto de direccionamiento y, opcionalmente, un conector conjugado. En ciertas realizaciones, la porción del grupo de carbohidratos se identifica por el número y la identidad del ligando. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la porción del grupo de carbohidratos comprende 3 grupos GalNAc y se designa "GalNAc3”. En ciertas realizaciones, la porción del grupo de carbohidratos comprende 4 grupos GalNAc y se designa "GalNAc4”. Las porciones específicas de los grupos de carbohidratos (que tienen grupos específicos de enlace, ramificación y conjugado) se describen aquí y se designan con un número romano seguido del subíndice "a". Por consiguiente, "GalNac3-1a" se refiere a una porción de grupo de carbohidratos específicos de un grupo conjugado que tiene 3 grupos GalNac y grupos de enlace, ramificación y unión específicamente identificados. Dicho fragmento de grupo de carbohidratos se une a un compuesto oligomérico a través de un resto escindible, tal como un enlace escindible o un nucleósido escindible.
[0082] Como se usa en el presente documento, "resto escindible" significa un enlace o grupo que es capaz de ser dividido bajo condiciones fisiológicas. En ciertas realizaciones, un resto escindible se escinde dentro de una célula o compartimentos subcelulares, tales como un lisosoma. En ciertas realizaciones, un resto escindible es escindido por enzimas endógenas, tales como nucleasas. En ciertas realizaciones, un resto escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles.
[0083] Como se usa en el presente documento, "enlace escindible" significa cualquier enlace químico capaz de ser dividido. En ciertas realizaciones, un enlace escindible se selecciona entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido.
[0084] Como se usa en el presente documento, "grupo de hidratos de carbono" significa un compuesto que tiene uno o más hidratos de carbono residuos unidos a un grupo andamio o enlazador. (véase, por ejemplo, Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, o Rensen et al., " Design and Synthesis of Novel N-AcetylgalactosamineTerminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, para ejemplos de grupos de conjugados de carbohidratos).
[0085] Como se usa en este documento, "carbohidrato modificado" significa cualquier hidrato de carbono que tiene una o más modificaciones químicas en relación con hidratos de carbono de origen natural.
[0086] Como se usa en este documento, "hidratos de carbono derivados" significa cualquier compuesto que puede sintetizarse utilizando un hidrato de carbono como material de partida o intermedio.
[0087] Como se usa en este documento, "hidrato de carbono" significa un hidrato de carbono de origen natural, un carbohidrato modificado, o un derivado de hidrato de carbono.
[0088] Como se usa en el presente documento "grupo protector" significa cualquier compuesto o grupo protector conocido por los expertos en la técnica. Se pueden encontrar ejemplos no limitantes de grupos protectores en "Protective Groups in Organic Chemistry", TW Greene, PGM Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Nueva York.
[0089] Como se usa en el presente documento, "de cadena sencilla" significa un compuesto oligomérico que no se hibrida con su complemento y que carece de suficiente auto-complementariedad para formar un auto-duplex estable.
[0090] Como se usa en este documento, "doble cadena" significa un par de compuestos oligoméricos que se hibridan entre sí o de un solo compuesto oligomérico auto-complementario que forma una estructura de horquilla. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico de doble cadena comprende un primer y un segundo compuesto oligomérico.
[0091] Como se usa en el presente documento, "compuesto antisentido" significa un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido en menos una parte de los cuales es complementario a un ácido nucleico diana a la que es capaz de hibridarse, lo que resulta en al menos una actividad antisentido.
[0092] Como se utiliza aquí, "actividad antisentido" significa cualquier cambio detectable y/o cuantificable atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido incluye la modulación de la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm). En ciertas realizaciones, la actividad antisentido incluye la modulación del empalme de pre-ARNm.
[0093] Como se usa en este documento, "compuesto antisentido basado en RNasa H" significa un compuesto antisentido en donde al menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible a la hibridación del compuesto antisentido a una diana de ácido nucleico y la posterior escisión del ácido nucleico diana por la RNasa H.
[0094] Como se usa en el presente documento, "compuesto antisentido basado en RISC" significa un compuesto antisentido en donde al menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC).
[0095] Como se usa en este documento, "detectar" o "medir" significa que se realiza una prueba o ensayo para la detección o medición. Dicha detección y/o medición puede dar como resultado un valor de cero. Por lo tanto, si una prueba de detección o medición resulta en un hallazgo de ausencia de actividad (actividad de cero), no obstante, se ha realizado el paso de detectar o medir la actividad.
[0096] Como se utiliza aquí, "actividad detectable y/o medible" significa una actividad estadísticamente significativa que no es cero.
[0097] Como se usa en el presente documento, "esencialmente sin cambios" significa poco o ningún cambio en un parámetro determinado, en particular relativo a otro parámetro que cambia mucho más. En ciertas realizaciones, un parámetro esencialmente no cambia cuando cambia menos del 5%. En ciertas realizaciones, un parámetro esencialmente no cambia si cambia menos de dos veces mientras que otro parámetro cambia al menos diez veces. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una actividad antisentido es un cambio en la cantidad de un ácido nucleico diana. En ciertas de dichas realizaciones, la cantidad de un ácido nucleico no diana es esencialmente sin cambios si cambia mucho menos que el ácido nucleico diana, pero el cambio no tiene que ser cero.
[0098] Como se usa en el presente documento, "expresión" significa el proceso por el cual un gen en última instancia resulta en una proteína. La expresión incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional (p. ej., empalme, poliadenilación, adición de tapa 5') y traducción.
[0099] Como se usa en este documento, "ácido nucleico diana" se refiere a una molécula de ácido nucleico al que se destina un compuesto antisentido para hibridar con resultar en una actividad antisentido deseada. Los oligonucleótidos antisentido tienen una complementariedad suficiente con sus ácidos nucleicos diana para permitir la hibridación en condiciones fisiológicas.
[0100] Como se usa en el presente documento, "complementariedad de nucleobase" o "complementariedad" cuando se refiere a nucleobases significa una nucleobase que es capaz de emparejarse con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria significa una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejarse con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de unirse por hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces se considera que la posición de la unión de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es complementario en ese par de nucleobases. Las nucleobases que comprenden ciertas modificaciones pueden mantener la capacidad de emparejarse con una nucleobase homóloga y, por lo tanto, todavía son capaces de complementariedad de nucleobase.
[0101] Como se usa en el presente documento, "no complementario" en referencia a las nucleobases significa un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí.
[0102] Como se usa en el presente documento, "complementario" en referencia a los compuestos oligoméricos (por ejemplo, enlaces nucleósidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos) significa la capacidad de tales compuestos o regiones oligómeros de los mismos para hibridar con otro compuesto oligomérico o zona del mismo a través de la complementariedad de nucleobase. Los compuestos oligoméricos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobase en cada nucleósido. Por el contrario, se toleran algunos desajustes. En ciertas realizaciones, los compuestos o regiones oligoméricas complementarias son complementarias al 70% de las nucleobases (70% complementarias). En ciertas realizaciones, los compuestos o regiones oligoméricas complementarias son 80% complementarias. En ciertas realizaciones, los compuestos o regiones oligoméricas complementarias son 90% complementarias. En ciertas realizaciones, los compuestos o regiones oligoméricas complementarias son 95% complementarios. En ciertas realizaciones, los compuestos o regiones oligoméricas complementarias son 100% complementarias.
[0103] Como se usa en el presente documento, "desajuste" significa una nucleobase de un primer compuesto oligomérico que no es capaz de emparejarse con una nucleobase en la posición correspondiente de un segundo compuesto oligomérico, cuando los compuestos oligoméricos primero y segundo están alineados. Cualquiera o ambos de los compuestos oligoméricos primero y segundo pueden ser oligonucleótidos.
[0104] Como se usa en el presente documento, "hibridación" significa el apareamiento de compuestos oligoméricos complementarios (por ejemplo, un antisentido compuesto y su ácido nucleico diana). Si bien no se limita a un mecanismo particular, el mecanismo más común de emparejamiento involucra enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido, entre nucleobases complementarias.
[0105] Como se usa en este documento, "hibrida específicamente" significa la capacidad de un compuesto oligomérico para hibridar con un sitio de ácido nucleico con mayor afinidad que se hibrida a otro sitio del ácido nucleico.
[0106] Como se usa en este documento, "totalmente complementario" en referencia a un oligonucleótido o porción del mismo significa que cada nucleobase del oligonucleótido o parte del mismo es capaz de aparearse con una nucleobase de un nucleico complementario ácido o porción contigua de la misma. Por lo tanto, una región completamente complementaria no comprende desajustes o nucleobases no hibridadas en cualquiera de las cadenas.
[0107] Como se usa en este documento, "por ciento de complementariedad" significa el porcentaje de nucleobases de un compuesto oligomérico que son complementarios a una porción igual de longitud de un ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad se calcula dividiendo el número de nucleobases del compuesto oligomérico que son complementarias a las nucleobases en las posiciones correspondientes en el ácido nucleico diana por la longitud total del compuesto oligomérico.
[0108] Como se usa en este documento, "porcentaje de identidad" significa el número de nucleobases en un primer ácido nucleico que son del mismo tipo (independiente de la modificación química) como nucleobases en posiciones correspondientes en un segundo ácido nucleico, dividido por el número total de nucleobases en el primer ácido nucleico.
[0109] Como se usa en el presente documento, "modulación" significa un cambio de cantidad o calidad de una molécula, la función o actividad cuando se compara con la cantidad o calidad de una molécula, la función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, la modulación incluye el cambio, ya sea un aumento (estimulación o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) en la expresión génica. Como otro ejemplo, la modulación de la expresión puede incluir un cambio en la selección del sitio de empalme del procesamiento previo al ARNm, lo que da como resultado un cambio en la cantidad absoluta o relativa de una variante de empalme particular en comparación con la cantidad en ausencia de modulación.
[0110] Como se usa en el presente documento, "motivo químico" significa un patrón de modificaciones químicas en un oligonucleótido o una región del mismo. Los motivos pueden definirse mediante modificaciones en ciertos nucleósidos y/o en ciertos grupos de enlace de un oligonucleótido.
[0111] Como se usa en el presente documento, "motivo nucleósido" se refiere a un patrón de modificaciones de nucleósidos en un oligonucleótido o una región del mismo. Los enlaces de dicho oligonucleótido pueden modificarse o no modificarse. A menos que se indique lo contrario, los motivos en el presente documento que describen solo nucleósidos están destinados a ser motivos de nucleósidos. Por lo tanto, en tales casos, los enlaces no están limitados.
[0112] Como se usa en el presente documento, "motivo de azúcar" significa un patrón de modificaciones de azúcar en un oligonucleótido o una región del mismo.
[0113] Como se usa en el presente documento, "motivo de enlace" significa un patrón de modificaciones de ligamiento en un oligonucleótido o zona del mismo. Los nucleósidos de dicho oligonucleótido pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique lo contrario, los motivos que en este documento describen solo enlaces son motivos de enlace. Por lo tanto, en tales casos, los nucleósidos no están limitados.
[0114] Como se usa en el presente documento, "motivo de modificación de nucleobase" significa un patrón de modificaciones de nucleobases lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobase es independiente de la secuencia de nucleobase.
[0115] Como se usa en este documento, "motivo de secuencia" significa un patrón de nucleobases dispuesto a lo largo de un oligonucleótido o una porción del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de las modificaciones químicas y, por lo tanto, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluidas las modificaciones químicas.
[0116] Como se usa en este documento, "tipo de modificación" en referencia a un nucleósido o un nucleósido de un "tipo" significa la modificación química de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, un "nucleósido que tiene una modificación de un primer tipo" puede ser un nucleósido no modificado.
[0117] Como se usa en este documento, "modificado de forma diferente" significa modificaciones químicas medias o sustituyentes químicos que son diferentes uno de otro, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado están "modificados de manera diferente", aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Del mismo modo, el ADN y el ARN están "modificados de manera diferente", aunque ambos son nucleósidos no modificados de origen natural. Los nucleósidos que son iguales pero que comprenden nucleobases diferentes no se modifican de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una nucleobase de timina no modificada no se modifican de manera diferente.
[0118] Como se usa en el presente documento, "el mismo tipo de modificaciones" se refiere a modificaciones que son iguales entre sí, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, dos nucleósidos de ADN no modificados tienen "el mismo tipo de modificación", aunque el nucleósido de a Dn no esté modificado. Dichos nucleósidos que tienen la misma modificación de tipo pueden comprender diferentes nucleobases.
[0119] Como se usa en el presente documento, "regiones separadas" significa partes de un oligonucleótido en donde las modificaciones químicas o del motivo de modificaciones químicas de cualesquiera porciones vecinas incluyen al menos una diferencia para permitir que se distingan las distintas regiones una de otra.
[0120] Como se usa en el presente documento, "vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sustancia adecuada para su uso en la administración a un animal. En ciertas realizaciones, un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina estéril. En ciertas realizaciones, dicha solución salina estéril es solución salina de grado farmacéutico.
[0121] Como se usa en el presente documento, el término "trastorno metabólico" significa una enfermedad o afección caracterizada principalmente por la desregulación del metabolismo, el complejo conjunto de reacciones químicas asociadas con la descomposición de los alimentos para producir energía.
[0122] Como se usa en el presente documento, el término "trastorno cardiovascular" significa una enfermedad o afección caracterizada principalmente por una función deteriorada del corazón o los vasos sanguíneos.
[0123] Tal como se utiliza aquí, el término "sistema de anillos mono o policíclicos" se entiende que incluye todos los sistemas de anillo seleccionados de sistemas de anillos radicales individuales o policíclicos en donde los anillos están condensados o enlazados y están destinados a ser incluidos de individuales y sistemas de anillos mezclados individualmente seleccionados de alifático, alicíclico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático y heteroarilalquilo. Dichas estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que tienen cada uno el mismo nivel de saturación o cada uno, independientemente, tienen diferentes grados de saturación, incluyendo completamente saturados, parcialmente saturados o completamente insaturados. Cada anillo puede comprender átomos en el anillo seleccionados de C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos, así como a anillos que comprenden solo átomos en el anillo C que pueden estar presentes en un motivo mixto, como por ejemplo bencimidazol en donde un anillo tiene solo un anillo de átomos de carbono y el anillo fusionado tiene dos átomos de nitrógeno. El sistema de anillo mono o policíclico puede sustituirse adicionalmente con grupos sustituyentes tales como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =O unidos a uno de los anillos. Los sistemas de anillos mono o policíclicos se pueden unir a las moléculas parentales utilizando diversas estrategias, como directamente a través de un átomo del anillo, fundido a través de múltiples átomos del anillo, a través de un grupo sustituyente o mediante un resto de enlace bifuncional.
[0124] Como se usa en el presente documento, "profármaco" significa una forma inactiva o menos activa de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto, se metaboliza para formar el compuesto activo o más activo (por ejemplo, fármaco).
[0125] Como se usa en el presente documento, "sustituyente" y "grupo sustituyente", significa un átomo o grupo que reemplaza el átomo o grupo de un compuesto original nombrado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiere del átomo o grupo que se encuentra en un nucleósido natural (por ejemplo, un sustituyente 2’ modificado es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un nucleósido otro que H o OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o no protegidos. En ciertas realizaciones, los compuestos de la presente descripción tienen sustituyentes en una o en más de una posición del compuesto original. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con otros grupos sustituyentes y pueden estar unidos directamente o mediante un grupo de enlace tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo a un compuesto original.
[0126] Del mismo modo, como se usa aquí, "sustituyente" en referencia a un grupo funcional químico significa un átomo o grupo de átomos que se diferencia del átomo o un grupo de átomos que normalmente están presentes en el grupo funcional llamado. En ciertas realizaciones, un sustituyente reemplaza un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en ciertas realizaciones, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto del hidrógeno que reemplaza uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido) A menos que se indique lo contrario, los grupos susceptibles de uso como sustituyentes incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)ORaa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxi sustituido (-ORaa), arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino (=NRbb), amido (-C(O)N-(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinilo(-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb) y sulfonamidilo (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)S(o)2Rbb). En donde cada Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo químico funcional opcionalmente unido o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida que incluye, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en el presente documento están presentes en un grado recursivo.
[0127] Como se usa en este documento, "alquilo", como se usa aquí, significa un anillo saturado lineal o radical hidrocarburo ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen típicamente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (C1-C12 alquilo), siendo más preferido 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.
[0128] Como se usa en el presente documento, "alquenilo", significa una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un enlace doble carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metilo-2-buten-1-ilo, dienos tales como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
[0129] Como se usa en el presente documento, "alquinilo", significa un radical de hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo típicamente incluyen de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
[0130] Como se usa en el presente documento, "acilo" significa un radical formado por la eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X donde X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. Los ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
[0131] Como se usa en el presente documento, "alicíclicos" significa un sistema de anillo cíclico en donde el anillo es alifático. El sistema de anillos puede comprender uno o más anillos en los que al menos un anillo es alifático. Los alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico, como se usa en el presente documento, puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
[0132] Como se usa en el presente documento, "alifático" significa un radical hidrocarbonado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en donde la saturación entre dos átomos de carbono es un enlace simple, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferiblemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede interrumpirse con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Dichos grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
[0133] Como se usa en este documento, "alcoxi" significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en donde el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula parental. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
[0134] Como se usa en este documento, "aminoalquilo" significa un radical C1-C12 alquilo de amino sustituido. La porción alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula original. El grupo amino se puede ubicar en cualquier posición y el grupo aminoalquilo se puede sustituir con un grupo sustituyente adicional en las porciones alquilo y/o amino.
[0135] Como se usa en el presente documento, "aralquilo" y "arilalquilo" significa un grupo aromático que está unido covalentemente a un radical de C1-C12 alquilo. La porción radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula parental. Los ejemplos incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales unidos al alquilo, al arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.
[0136] Como se usa en este documento, "arilo" y "aromático" significa radicales de sistema de anillo carbocíclico mono- o policíclico que tienen uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Los sistemas de anillo de arilo preferidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
[0137] Como se usa en el presente documento, "halo" y "halógeno", significa un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
[0138] Como se usa en este documento, "heteroarilo" y "heteroaromático", significa un radical que comprende un anillo aromático mono- o poli-cíclico, sistema del anillo o sistema de anillos fusionados en donde al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. Heteroarilo también está destinado a incluir sistemas de anillos fusionados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos fusionados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo incluyen típicamente un átomo de anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo se pueden unir a una molécula original directamente o mediante un resto de enlace, como un grupo alifático o un heteroátomo. Los grupos heteroarilo como se usan en el presente documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
[0139] Como se usa en el presente documento, "compuesto conjugado" significa cualquier átomo, grupo de átomos o grupo de átomos unidos adecuado para su uso como grupo conjugado. En ciertas realizaciones, los compuestos conjugados pueden poseer o impartir una o más propiedades, que incluyen, pero no se limitan a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, absorción celular, carga y/o eliminación.
[0140] Como se usa en el presente documento, a menos que se indique o modifique lo contrario, el término "bicatenario" se refiere a dos compuestos oligoméricos separados que se hibridan entre sí. Dichos compuestos de doble cadena pueden tener uno o más nucleósidos no hibridantes en uno o ambos extremos de una o ambas cadenas (voladizos) y/o uno o más nucleósidos no hibridantes internos (desajustes) siempre que haya suficiente complementariedad para mantener la hibridación bajo condiciones fisiológicamente relevantes.
[0141] Como se usa en este documento, "sitio diana 5’” se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
[0142] Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" significa dentro del 10% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "un marcador puede incrementarse en aproximadamente un 50%", se implica que el marcador puede incrementarse entre 45%-55%.
[0143] Como se usa en el presente documento, "administrado concomitantemente" se refiere a la administración conjunta de dos agentes de cualquier manera en donde los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una sola composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse por un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
[0144] Como se usa en el presente documento, "administrar" o "administración" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo, e incluye, pero no se limita a, la administración por un profesional médico y la autoadministración. La administración de un agente farmacéutico a un individuo puede ser continua, crónica, corta o intermitente. La administración puede ser parenteral o no parenteral.
[0145] Como se usa en el presente documento, "agente" significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. "Primer agente" significa un compuesto terapéutico de la invención. Por ejemplo, un primer agente puede ser un oligonucleótido antisentido dirigido a apoCIII. "Segundo agente" significa un segundo compuesto terapéutico de la invención (por ejemplo, un segundo oligonucleótido antisentido dirigido a apoCIII) y/o un compuesto terapéutico no apoCIII.
[0146] Como se usa en este documento, "mejora" o "mejorar" o "mejorado" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la materia.
[0147] Como se usa en el presente documento, "animal" se refiere a un animal humano o no humano, que incluye, pero no se limita a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, que incluyen, pero sin limitación a, monos y chimpancés.
[0148] Como se usa en el presente documento, "ApoCIII", "Apolipoproteína C-III" o "ApoC3" significa cualquier secuencia de ácido nucleico o proteína que codifica ApoCIII. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ApoCIII incluye una secuencia de ADN que codifica ApoCIII, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica ApoCIII (que incluye ADN genómico que comprende intrones y exones), una secuencia de ARNm que codifica ApoCIII o una secuencia de péptidos que codifica ApoCIII.
[0149] Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico de ApoCIII" significa cualquier ácido nucleico que codifica ApoCIII. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de ApoCIII incluye una secuencia de ADN que codifica ApoCIII, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica ApoCIII (que incluye ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica ApoCIII.
[0150] Como se usa en el presente documento, "inhibidor específico de ApoCIII" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión de ARNm de ApoCIII y/o la expresión o actividad de la proteína ApoCIII a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de ApoCIII incluyen ácidos nucleicos (incluidos compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ARNm de ApoCIII y/o proteína ApoCIII. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido dirigido a ApoCIII. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido dirigido a ApoCIII es un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido dirigido a ApoCIII es un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII con un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido dirigido a ApoCIII tiene una secuencia como se muestra en SEQ ID NOs: 19­ 96, 209-221 u otra secuencia (por ejemplo, como las descritas en la publicación PCT WO 2004/093783 o la publicación PCT WO 2012/149495) En ciertas realizaciones, modulando específicamente el nivel de ARNm de ApoCIII y/o la expresión de la proteína ApoCIII, los inhibidores específicos de ApoCIII pueden afectar los componentes de la ruta lipogénica o glucogénica. De manera similar, en ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de ApoCIII pueden afectar otros procesos moleculares en un animal.
[0151] Como se usa en el presente documento, "ARNm de ApoCIII" significa un ARNm que codifica una proteína de ApoCIII.
[0152] Como se usa en el presente documento, "proteína ApoCIII" significa cualquier secuencia de proteína que codifica ApoCIII.
[0153] Como se usa en el presente documento, "aterosclerosis" significa un endurecimiento de las arterias que afecta a las arterias grandes y medianas y se caracteriza por la presencia de depósitos grasos. Los depósitos grasos se denominan "ateromas" o "placas", que consisten principalmente en colesterol y otras grasas, calcio y tejido cicatricial, y dañan el revestimiento de las arterias.
[0154] Como se usa en el presente documento, "enfermedad coronaria (CHD)" significa un estrechamiento de los pequeños vasos sanguíneos que suministran sangre y oxígeno al corazón, que a menudo es el resultado de la aterosclerosis.
[0155] Como se usa en el presente documento, "diabetes mellitus" o "diabetes" es un síndrome caracterizado por un metabolismo desordenado y un nivel de azúcar en sangre anormalmente alto (hiperglucemia) como resultado de niveles insuficientes de insulina o sensibilidad reducida a la insulina. Los síntomas característicos son la producción excesiva de orina (poliuria) debido a los altos niveles de glucosa en la sangre, la sed excesiva y el aumento de la ingesta de líquidos (polidipsia) que intentan compensar el aumento de la micción, la visión borrosa debido a los altos efectos de glucosa en la sangre en la óptica del ojo, la pérdida de peso inexplicable, y letargo.
[0156] Como se usa en este documento, "dislipidemia diabética" o "diabetes tipo 2 con dislipidemia" significa una afección caracterizada por diabetes tipo 2, HDL-C reducido, triglicéridos elevados (TG) y partículas LDL pequeñas y densas elevadas.
[0157] Como se usa en este documento, "diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
[0158] Como se usa en el presente documento, "dislipidemia" se refiere a un trastorno del metabolismo de lípidos y/o lipoproteínas, que incluye la sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Las dislipidemias pueden manifestarse por la elevación de lípidos como el quilomicrón, el colesterol y los triglicéridos, así como las lipoproteínas como el colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL).
[0159] Como se usa en el presente documento, "unidad de dosificación" significa una forma en donde se proporciona un agente farmacéutico, por ejemplo, píldora, tableta u otra unidad de dosificación conocida en la técnica. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido liofilizado. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido reconstituido.
[0160] Como se usa en el presente documento, "dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una única administración, o en un período de tiempo especificado. En ciertas realizaciones, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes. Las dosis también se pueden indicar como mg/kg o g/kg.
[0161] Como se usa en la presente memoria, "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo en necesidad del agente. La cantidad efectiva puede variar entre las personas dependiendo de la salud y la condición física de la persona a tratar, el grupo taxonómico de las personas a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
[0162] Como se usa en este documento, "Fredrickson Tipo I" también se conoce como "Deficiencia de lipoproteína lipasa", "LPLD", "Síndrome de quilomicronemia familiar" o "FCS" y existe en varias formas: Tipo 1 a (también conocido como síndrome Buerger-Gruestz) es una deficiencia de lipoproteína lipasa comúnmente debido a una deficiencia de LPL o ApoC-II alterado; el Tipo 1b (también conocido como deficiencia familiar de apoproteína CII) es una afección causada por la falta de apoproteína activadora de lipoproteína lipasa C-II; y el Tipo 1c es una quilomicronemia debido al inhibidor circulante de la lipoproteína lipasa. El tipo I es un trastorno raro que generalmente se presenta en la infancia. Se caracteriza por elevaciones severas en quilomicrones y niveles de TG extremadamente elevados (siempre alcanzando muy por encima de 1000 mg/dL y con poca frecuencia aumentando hasta 10.000 mg/dL o más) con episodios de dolor abdominal, pancreatitis aguda recurrente, xantomas cutáneos eruptivos, y hepatoesplenomegalia. Los pacientes rara vez desarrollan aterosclerosis, tal vez porque sus partículas de lipoproteínas plasmáticas son demasiado grandes para entrar en la íntima arterial (Nordestgaard et al., J Lipid Res, 1988, 29: 1491-1500; Nordestgaard et al., Arteriosclerosis, 1988, 8: 421 -428). El tipo I generalmente es causado por mutaciones del gen LPL o del cofactor del gen ApoC-II, lo que resulta en la incapacidad de los individuos afectados para producir suficiente LPL funcionalmente activa. Los pacientes son homocigotos para tales mutaciones o compuestos heterocigotos. Fredrickson Tipo I también puede deberse a mutaciones en GPIHBP1, APOA5, LMF1 u otros genes que conducen a LPL disfuncional. Brunzell, en: Pagon RA, Adam MP, Bird TD, Dolan CR, Fong CT, Stephens K, editores. GeneReviews™ [Internet]. Seattle (WA): Universidad de Washington, Seattle; 1993-2013.1999 12 de octubre [actualizado el 15 de diciembre de 2011]. Además, Fredrickson Tipo I, en algunos casos, puede deberse a la presencia de inhibidores de LPL (p. ej., anticuerpos anti-LPL) en un individuo que causa LPL disfuncional. La prevalencia de Fredrickson Tipo I es aproximadamente 1 en 1.000.000 en la población general y mucho más alta en Sudáfrica y el este de Quebec como resultado de un efecto fundador. Los pacientes responden mínimamente, o no responden, a los medicamentos reductores de TG (Tremblay et al., J Clin Lipidol, 2011,5: 37-44; Brisson et al., Pharmacogenet Genom, 2010, 20: 742-747) y, por lo tanto, La restricción de grasa en la dieta a 20 gramos/día o menos se usa para controlar los síntomas de este trastorno raro.
[0163] Como se usa en este documento, "totalmente complementario" o "100% complementario" significa cada nucleobase de una nucleobase secuencia de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria de una segunda secuencia de nucleobase de un segundo nucleico ácido. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un segundo ácido nucleico es un ácido nucleico diana.
[0164] Como se usa en el presente documento, "glucosa" es un monosacárido usado por las células como fuente de energía e intermediario inflamatorio. "Glucosa en plasma" se refiere a la glucosa presente en el plasma.
[0165] Como se usa en este documento, "lipoproteína C de alta densidad" o "HDL-C" significa colesterol asociado con las partículas de lipoproteínas de alta densidad. La concentración de HDL-C en suero (o plasma) generalmente se cuantifica en mg/dL o nmol/L. "HDLC en suero" y "HDL-C en plasma" significan HDL-C en suero y plasma, respectivamente.
[0166] Como se usa en el presente documento, "inhibidor de reductasa HMG-CoA" significa un agente que actúa a través de la inhibición de la enzima reductasa HMG-CoA, tal como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina y simvastatina.
[0167] Como se usa en el presente documento, "hipercolesterolemia" significa una afección caracterizada por colesterol elevado o colesterol circulante (plasma), colesterol LDL y colesterol VLDL, según las directrices del Informe del Panel de Expertos del Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol (NCEP) de detección, evaluación del tratamiento del colesterol alto en adultos (véase, Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
[0168] Como se usa en este documento, "hiperlipidemia" o "hiperlipemia" es una afección caracterizada por lípidos séricos elevados o lípidos circulantes (plasma). Esta condición manifiesta una concentración anormalmente alta de grasas. Las fracciones lipídicas en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad, quilomicrones y triglicéridos. La clasificación de las hiperlipidemias de Fredrickson se basa en el patrón de partículas de lipoproteínas ricas en colesterol y TG, medida por electroforesis o ultracentrifugación, y se usa comúnmente para caracterizar las causas principales de las hiperlipidemias como la hipertrigliceridemia (Fredrickson y Lee, Circulation, 1965, 31: 321 -327; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967, 276 (1): 34-42).
[0169] Como se usa en el presente documento, "hipertrigliceridemia" significa una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos. La hipertrigliceridemia es la consecuencia del aumento de la producción y/o catabolismo reducido o retrasado de las lipoproteínas ricas en triglicéridos (TG): VLDL y, en menor medida, quilomicrones (CM). Su etiología incluye factores primarios (es decir, causas genéticas) y secundarios (otras causas subyacentes como diabetes, síndrome metabólico/resistencia a la insulina, obesidad, inactividad física, tabaquismo, exceso de alcohol y una dieta muy alta en hidratos de carbono) o, con mayor frecuencia, un combinación de ambos (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176: 1113-1120). La hipertrigliceridemia es un rasgo clínico común asociado con un mayor riesgo de enfermedad cardiometabólica (Hegele et al. 2009, Hum Mol Genet, 18: 4189-4194; Hegele y Pollex 2009, Mol Cell Biochem, 326: 35-43), así como de aparición de pancreatitis aguda en las formas más graves (Toskes 1990, Gastroenterol Clin North Am, 19: 783-791; Gaudet et al.2010, Atherosclerosis Supplements, 11: 55-60; Catapano et al.2011, Atherosclerosis, 217S: S1 -S44; Tremblay et al.2011, J Clin Lipidol, 5: 37-44). Los ejemplos de enfermedad cardiometabólica incluyen, entre otros, diabetes, síndrome metabólico/resistencia a la insulina y trastornos genéticos como el síndrome de quilomicronemia familiar (FCS), hiperlipidemia combinada familiar e hipertrigliceridemia familiar. Los niveles límite altos de TG (150-199 mg/dL) se encuentran comúnmente en la población general y son un componente común del síndrome metabólico/estados de resistencia a la insulina. Lo mismo es cierto para los niveles altos de TG (200-499 mg/dL), excepto que a medida que aumentan los niveles de TG en plasma, los factores genéticos subyacentes juegan un papel etiológico cada vez más importante. Los niveles muy altos de TG (> 500 mg/dL) también se asocian con mayor frecuencia con niveles elevados de CM, y se acompañan de un mayor riesgo de pancreatitis aguda. El riesgo de pancreatitis se considera clínicamente significativo si los niveles de TG superan los 880 mg/dL (> 10 mmol) y las directrices de la Sociedad Europea de Aterosclerosis/Sociedad Europea de Cardiología (EAS/ESC) 2011 establecen que las acciones para prevenir la pancreatitis aguda son obligatorias (Catapano et al. al.2011, aterosclerosis, 217S: S1-S44). De acuerdo con las directrices de EAS/ESC 2011, la hipertrigliceridemia es la causa de aproximadamente el 10% de todos los casos de pancreatitis, y el desarrollo de pancreatitis puede ocurrir a niveles de TG entre 440-880 mg/dL. Según las pruebas de los estudios clínicos que demuestran que los niveles elevados de TG son un factor de riesgo independiente para la ECV aterosclerótica, las pautas del Panel Nacional de Tratamiento de Adultos del Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol III (NCEP 2002, Circulation, 106: 3143-421) y la Asociación Americana de Diabetes (ADA 2008, Diabetes Care, 31: S12-S54.) Recomiendan un nivel diana de TG inferior a 150 mg/dL para reducir el riesgo cardiovascular.
[0170] Como se usa en el presente documento, "identificar" o "seleccionar un animal con enfermedad metabólica o cardiovascular" significa identificar o seleccionar un sujeto propenso o que ha sido diagnosticado con una enfermedad metabólica, una enfermedad cardiovascular o un síndrome metabólico; o, identificar o seleccionar un sujeto que tenga algún síntoma de una enfermedad metabólica, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico, incluyendo, pero sin limitarse a, hipercolesterolemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de la resistencia a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina, por encima del peso corporal normal y/o por encima del contenido normal de grasa corporal o cualquier combinación de los mismos. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, que incluye, entre otros, pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como medir el suero o el colesterol circulante (plasma), medir el suero o la glucosa en sangre circulante (plasma), medir el suero o triglicéridos circulantes (plasma), medir la presión sanguínea, medir el contenido de grasa corporal, medir el peso corporal y similares.
[0171] Como se usa en el presente documento, "resultado cardiovascular mejorado" significa una reducción en la aparición de eventos cardiovasculares adversos, o el riesgo de los mismos. Los ejemplos de eventos cardiovasculares adversos incluyen, entre otros, muerte, reinfarto, accidente cerebrovascular, shock cardiogénico, edema pulmonar, paro cardíaco y disritmia auricular.
[0172] Como se usa en el presente documento, "inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intervinientes entre los elementos inmediatamente adyacentes, por ejemplo, entre las regiones, segmentos, nucleótidos y/o nucleósidos.
[0173] Como se usa en este documento, "aumentar HDL" o "aumentar HDL" significa aumentar el nivel de HDL en un animal después de la administración de al menos un compuesto de la invención, en comparación con el nivel de HDL en un animal al que no se le administró ningún compuesto.
[0174] Como se usa en el presente documento, "individual" o "sujeto" o "animal" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
[0175] Como se usa en este documento, "individuo que lo necesita" se refiere a un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia que necesita dicho tratamiento o terapia.
[0176] Como se usa en este documento, "inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir", "reducir" o similares denotan diferencias cuantitativas entre dos estados. Por ejemplo, "una cantidad eficaz para inhibir la actividad o expresión de apoCIII" significa que el nivel de actividad o expresión de apoCIII en una muestra tratada será diferente del nivel de actividad o expresión de apoCIII en una muestra no tratada. Dichos términos se aplican, por ejemplo, a niveles de expresión y niveles de actividad.
[0177] Como se usa en el presente documento, "afección inflamatoria" se refiere a una enfermedad, estado de enfermedad, síndrome u otra afección que produce inflamación. Por ejemplo, la artritis reumatoide y la fibrosis hepática son afecciones inflamatorias. Otros ejemplos de afecciones inflamatorias incluyen sepsis, isquemia miocárdica/lesión por reperfusión, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, nefritis, rechazo del injerto, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, arteriosclerosis, aterosclerosis y vasculitis.
[0178] Como se usa en el presente documento, "inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad de un ARN o proteína y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
[0179] Como se usa en el presente documento, "resistencia a la insulina" se define como la afección en la cual las cantidades normales de insulina son inadecuadas para producir una respuesta normal a la insulina de las células de grasa, músculo y hígado. La resistencia a la insulina en las células grasas produce hidrólisis de triglicéridos almacenados, que eleva los ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo. La resistencia a la insulina en el músculo reduce la absorción de glucosa, mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de glucosa, y ambos efectos sirven para elevar la glucosa en sangre. Los altos niveles plasmáticos de insulina y glucosa debido a la resistencia a la insulina a menudo conducen al síndrome metabólico y a la diabetes tipo 2.
[0180] Como se usa en el presente documento, la "sensibilidad a la insulina" es una medida de la eficacia con que un individuo procesa la glucosa. Un individuo que tiene alta sensibilidad a la insulina procesa efectivamente la glucosa, mientras que un individuo con baja sensibilidad a la insulina no procesa efectivamente la glucosa.
[0181] Como se usa en el presente documento, "reducción de lípidos" significa una reducción en uno o más lípidos (por ejemplo, LDL, VLDL) en un sujeto. "Aumento de lípidos" significa un aumento de un lípido (p. ej., HDL) en un sujeto. La disminución o aumento de lípidos puede ocurrir con una o más dosis con el tiempo.
[0182] Como se usa en este documento, "terapia hipolipemiante" o "agente hipolipemiante" significa un régimen terapéutico proporcionado a un sujeto para reducir uno o más lípidos en un sujeto. En ciertas realizaciones, se proporciona una terapia hipolipemiante para reducir uno o más de los triglicéridos apo(a), apoCIII, CETP, apoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no HDL-C, pequeñas partículas densas de LDL y Lp(a) en un sujeto. Los ejemplos de terapia hipolipemiante incluyen, entre otros, inhibidores de apoB, estatinas, fibratos e inhibidores de MTP.
[0183] Como se usa en este documento, "lipoproteína", tales como VLDL, LDL y HDL, se refiere a un grupo de proteínas que se encuentra en el suero, plasma y la linfa y son importantes para el transporte de lípidos. La composición química de cada lipoproteína difiere, por ejemplo, en que el HDL tiene una mayor proporción de proteína frente a lípidos, mientras que el VLDL tiene una menor proporción de proteína frente a lípidos.
[0184] Como se usa en el presente documento, "lipoproteína lipasa" o "LPL" se refiere a una enzima que hidroliza los TG que se encuentran en las lipoproteínas, tales como CM o VLDL, en ácidos grasos libres y monoacilgliceroles. LPL requiere apo C-II como cofactor para funcionar en la hidrolización de TG. La LPL se produce principalmente en el músculo esquelético, el tejido adiposo y el músculo cardíaco. La hidrólisis y la eliminación de TG de CM y VLDL normalmente protegen contra el aumento posprandial excesivo de la masa de CM y TG.
[0185] Como se usa en el presente documento, "deficiencia de lipoproteína lipasa", "deficiencia de lipoproteína lipasa", "deficiencia de LPL" o "LPLD" también se conoce como "dislipidemia tipo I de Fredrickson", "quilomicronemia", "síndrome de quilomicronemia familiar" o "FCS”. Aunque los sujetos con LPLD generalmente carecen de la actividad de LPL o LPL necesaria para la descomposición efectiva de los ácidos grasos como los TG, estos sujetos aún pueden tener una actividad mínima de LPL o expresar un nivel mínimo de LPL. En algunos casos, un sujeto con LPLD puede expresar LPL o tener actividad de LPL de hasta aproximadamente 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de actividad. En otros casos, el sujeto LPLD no tiene actividad LPL o LPL medible. Una realización de LPLD abarca sujetos con "hiperlipoproteinemia Tipo 1a" (también conocida como "Tipo Ia de Fredrickson") y se refiere a la incapacidad de los sujetos para producir suficientes enzimas funcionales de lipoproteína lipasa necesarias para la descomposición efectiva de ácidos grasos tales como TG. La incapacidad de descomponer los TG conduce a hipertrigliceridemia en el sujeto y, a menudo más de 12 horas después de las comidas, la hiperTG y la quilomicronemia aún están presentes y son visibles como lipemia. El Tipo 1a es comúnmente causado por una o más mutaciones en el gen LPL. Como se describe en el presente documento, LPLD también abarca sujetos que tienen lipoproteína lipasa disfuncional, como aquellos sujetos con "hiperlipoproteinemia Tipo 1b" (también conocida como "Fredrickson Tipo 1b") y "hiperlipoproteinemia Tipo 1c" (también conocida como "Fredrickson Tipo 1c"). El Tipo 1b es causado por la falta de activador de la lipoproteína lipasa apoproteína C-II. El Tipo 1c se debe a un inhibidor circulante de la lipoproteína lipasa. Al igual que con el Tipo 1a, los sujetos Tipo 1 b/1 c sufren de la incapacidad de descomponer TG que conducen a hipertrigliceridemia e hiperTG y quilomicronemia todavía están presentes y visibles como la lipemia a menudo más de 12 horas después de las comidas. En ciertas realizaciones, LPLD está asociado con al menos una mutación en el gen LPL como P207L, G188L o D9N u otras mutaciones que afectan a LPL (Brunzell, In: Pagon RA, Adam MP, Bird TD, Dolan CR, Fong CT, Stephens K, editores. GeneReviews™ [Internet]. Seattle (WA): Universidad de Washington, Seattle; 1993-2013.1999 12 de octubre [actualizado el 15 de diciembre de 2011]).
[0186] Como se usa en este documento, "lipoproteína-colesterol de baja densidad (LDL-C)" significa colesterol transportado en partículas de lipoproteína de baja densidad. La concentración de LDL-C en suero (o plasma) generalmente se cuantifica en mg/dL o nmol/L. "LDL-C en suero" y "LDL-C en plasma" significan LDL-C en suero y plasma, respectivamente.
[0187] Como se usa en el presente documento, "factores de riesgo principales" se refiere a factores que contribuyen a un alto riesgo de una enfermedad o afección particular. En ciertas realizaciones, los principales factores de riesgo para la enfermedad coronaria incluyen, sin limitación, fumar cigarrillos, hipertensión, LDL alto, HDL-C bajo, antecedentes familiares de enfermedad coronaria, edad y otros factores descritos aquí.
[0188] Como se usa en el presente documento, "trastorno metabólico" o "enfermedad metabólica" se refiere a una afección caracterizada por una alteración o perturbación de la función metabólica. "Metabólico" y "metabolismo" son términos bien conocidos en la técnica y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que ocurren dentro de un organismo vivo. Los trastornos metabólicos incluyen, pero no se limitan a, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo 1 y tipo 2), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia debido a la diabetes tipo 2.
[0189] Como se usa en el presente documento, "síndrome metabólico" significa una afección caracterizada por una agrupación de factores de riesgo cardiovascular lipídicos y no lípidos de origen metabólico. En ciertas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica por la presencia de cualquiera de los 3 factores siguientes: circunferencia de la cintura mayor de 102 cm en hombres o mayor de 88 cm en mujeres; triglicéridos séricos de al menos 150 mg/dL; HDL-C menos de 40 mg/dL en hombres o menos de 50 mg/dL en mujeres; presión arterial de al menos 130/85 mmHg; y glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dL. Estos determinantes pueden medirse fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001,285: 2486-2497).
[0190] "Administración parenteral" significa la administración mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
[0191] Como se usa en la presente memoria, "péptido" significa una molécula formada mediante la vinculación de al menos dos amino ácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
[0192] Como se usa en el presente documento, "agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a apoCIII es un agente farmacéutico.
[0193] Como se usa en el presente documento, "composición farmacéutica" o medios "composición" una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y un vehículo farmacéutico, por ejemplo, una solución acuosa estéril.
[0194] Como se usa en el presente documento, "derivado farmacéuticamente aceptable" abarca derivados de los compuestos descritos en el presente documento, tales como solvatos, hidratos, ésteres, profármacos, polimorfos, isómeros, variantes marcadas isotópicamente, sales farmacéuticamente aceptables y otros derivados conocidos en la técnica.
[0195] Como se usa en el presente documento, "sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto parental y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo. El término "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal" incluye una sal preparada a partir de ácidos o bases no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que incluyen ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Las "sales farmacéuticamente aceptables" de los compuestos descritos en este documento pueden prepararse por métodos bien conocidos en la técnica. Para una revisión de las sales farmacéuticamente aceptables, ver Stahl y Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002). Las sales de sodio de los oligonucleótidos antisentido son útiles y están bien aceptadas para la administración terapéutica en humanos. Por consiguiente, en una realización, los compuestos descritos en el presente documento están en forma de una sal de sodio.
[0196] Como se usa en el presente documento, "parte" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlaces) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
[0197] Como se usa en el presente documento, "prevenir" o "prevención" se refiere a retrasar o prevenir el inicio o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
[0198] Como se usa en el presente documento, "elevar" significa aumentar en cantidad. Por ejemplo, aumentar los niveles de HDL en plasma significa aumentar la cantidad de HDL en el plasma.
[0199] Como se usa en el presente documento, "reducir" significa reducir en menor medida, tamaño, cantidad o número. Por ejemplo, reducir los niveles de triglicéridos en plasma significa reducir la cantidad de triglicéridos en el plasma.
[0200] Como se usa en este documento, "región" o "región diana" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una UTR 3’, una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de iniciación de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región definida de ácido nucleico. Las regiones estructuralmente definidas para apoCIII pueden obtenerse mediante el número de acceso a partir de bases de datos de secuencias tales como NCBI. En ciertas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5’ de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la región diana.
[0201] Como se usa en el presente documento, "segundo agente" o "segundo agente terapéutico" significa un agente que puede usarse en combinación con un "primer agente". Un segundo agente terapéutico puede incluir, entre otros, oligonucleótidos antisentido dirigidos a apoCIII. Un segundo agente también puede incluir anticuerpos anti-apoCIII, inhibidores de péptidos apoCIII, agentes reductores del colesterol, agentes reductores de lípidos, agentes reductores de glucosa y agentes antiinflamatorios.
[0202] Como se usa en el presente documento, los "segmentos" se definen como sub-porciones más pequeñas de regiones dentro de un ácido nucleico. Por ejemplo, un "segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige uno o más compuestos antisentido. "Sitio diana 5’” se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3’” se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana. Alternativamente, un "sitio de inicio" puede referirse al nucleótido más 5’ de un segmento diana y un "sitio de detención" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana. Un segmento diana también puede comenzar en el "sitio de inicio" de una secuencia y terminar en el "sitio de detención" de otra secuencia.
[0203] Como se usa en el presente documento, "estatina" significa un agente que inhibe la actividad de la HMG-CoA reductasa.
[0204] Como se usa en el presente documento, "administración subcutánea" significa administración justo debajo de la piel.
[0205] Como se usa en el presente documento, "sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
[0206] Como se usa en el presente documento, "síntoma de enfermedad o trastorno cardiovascular" significa un fenómeno que surge y acompaña a la enfermedad o trastorno cardiovascular y sirve como una indicación de ello. Por ejemplo, angina; dolor de pecho; falta de aliento; palpitaciones; debilidad; mareo; náusea; transpiración; taquicardia; bradicardia arritmia; fibrilación auricular; hinchazón en las extremidades inferiores; cianosis; fatiga; desmayo; entumecimiento de la cara; entumecimiento de las extremidades; claudicación o calambres musculares; hinchazón del abdomen; o fiebre son síntomas de enfermedad o trastorno cardiovascular.
[0207] Como se usa en el presente documento, "direccionamiento" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
[0208] Como se usa en el presente documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
[0209] Como se usa en este documento, "cambio terapéutico en el estilo de vida" significa cambios en la dieta y en el estilo de vida destinados a reducir la masa de grasa/tejido adiposo y/o el colesterol. Dicho cambio puede reducir el riesgo de desarrollar enfermedades cardíacas y puede incluir recomendaciones para la ingesta dietética de calorías diarias totales, grasas totales, grasas saturadas, grasas poliinsaturadas, grasas monoinsaturadas, hidratos de carbono, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como recomendaciones para la actividad física.
[0210] Como se usa en el presente documento, "tratar" o "tratado" se refiere a la administración de un compuesto descrito en el presente documento para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
[0211] Como se usa en el presente documento, "triglicérido" o "TG" significa un lípido o grasa neutra que consiste en glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso.
[0212] Como se usa en el presente documento, "diabetes tipo 2", (también conocida como "diabetes mellitus tipo 2", "diabetes mellitus, tipo 2", "diabetes no dependiente de insulina", "NIDDM", "diabetes relacionada con la obesidad", o "diabetes de inicio en adultos") es un trastorno metabólico que se caracteriza principalmente por resistencia a la insulina, deficiencia relativa de insulina e hiperglucemia.
Ciertas realizaciones de la divulgación
[0213] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan compuestos y métodos para disminuir la expresión de ARNm y proteína de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el compuesto es un inhibidor específico de ApoCIII para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada a ApoCIII. En ciertas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido antisentido dirigido a ApoCIII. En ciertas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado.
[0214] En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un ARNip o un oligonucleótido antisentido dirigido a Apolipoproteína C-III (ApoC-III) conocido en la técnica y un grupo conjugado descrito aquí. Los ejemplos de oligonucleótidos antisentido dirigidos a ApoC-III adecuados para la conjugación incluyen, pero no se limitan a los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° US 2013/0317085. En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia de nucleobase de cualquiera de las SEQ ID NO 19-96 y 209-221 descritas en el documento US 2013/0317085 y un grupo conjugado descrito aquí.
[0215] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo conjugado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de cualquier secuencia descrita en la Patente de Estados Unidos 7.598.227, Patente de Estados Unidos 7.750.141, Publicación PCT WO 2004/093783 o Publicación PCT WO 2012/149495. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia seleccionada de cualquier secuencia descrita en la Patente de Estados Unidos 7.598.227, la Patente de Estados Unidos 7.750.141, la Publicación PCT WO 2004/093783 o la Publicación PCT WO 2012/149495.
[0216] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo conjugado consiste en 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo conjugado comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o 30 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo conjugado consiste en 20 nucleósidos enlazados.
[0217] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado con un grupo conjugado que se dirige a ApoCIII y tiene una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias establecidas en GENBANK N° de acceso NM_000040.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1), N° de acceso GENBANK NT_033899.8 truncado de los nucleótidos 20262640 a 20266603 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), y/o N° de acceso GenBank NT_035088.1 truncado de los nucleótidos 6238608 a 6242565 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 3). En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 100% complementario a cualquier de SEQ ID NOs: 1-3. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado dirigido a un segmento ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de cualquiera de los segmentos diana que se muestran en las Tablas 121 y 124. En las tablas, el "sitio de inicio" se refiere al nucleótido más 5’ de un segmento diana y "sitio de detención" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana. Un segmento de destino puede ir desde el sitio de inicio hasta el sitio de detención de cada secuencia que figura en las tablas. Alternativamente, el segmento diana puede variar desde el sitio de inicio de una secuencia y terminar en el sitio de detención de otra secuencia. Por ejemplo, como se muestra en las tablas, un segmento diana puede variar de 3533 a 3552, el sitio de inicio al sitio de detención de SEQ ID NO: 87. En otro ejemplo, como se muestra en las tablas, un segmento diana puede variar de 3514 a 3558, el sitio de inicio de SEQ ID NO: 83 hasta el sitio de parada de SEQ ID NO: 88. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende al menos 8 nucleobases de la secuencia de SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, el el compuesto antisentido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es ISIS 304801.
[0218] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% complementaria a cualquiera de SEQ ID NOs: 1-3. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% complementario a cualquiera de los segmentos diana descritos aquí.
[0219] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende una secuencia de nucleobase que comprende una porción de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas complementarias de igual longitud porción de las nucleobases 3533 a 3552 de SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80% complementaria a SEQ ID NO: 3.
[0220] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos t 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o 30 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 3514 a 3558 de la SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80% complementario a la SEQ ID NO: 3.
[0221] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene un secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 19-96, 209-221. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado conjugado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 19-96, 209-221. En ciertas realizaciones, el compuesto consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 19-96, 209-221 y un grupo conjugado.
[0222] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo conjugado tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, el compuesto consiste en SEQ ID NO: 87 y un grupo conjugado
[0223] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado con ISIS 304801 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc, como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en un oligonucleótido modificado con ISIS 304801 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc, como se define en las reivindicaciones.
Figure imgf000027_0001
[0224] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 678354. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 678354.
Figure imgf000028_0001
[0225] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado puede estar representado por la siguiente estructura. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 678357. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 678357.
Figure imgf000029_0001
[0226] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado puede estar representado por la siguiente estructura. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado con la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87 con un 5'-GalNAc, como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en un oligonucleótido modificado con la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87 con un 5'-GalNAc, como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas.
Figure imgf000030_0001
[0227] En donde R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente, en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-, y R1 y R2 están conectados directamente de modo que el puente resultante se seleccione entre: -O-CH2-, -O-CH(c H3)- y -O-CH2CH2-;
[0228] Y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: o bien R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-y R3 y R4 están conectados directamente de modo que el puente resultante se seleccione entre: - O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
[0229] Y R5 se selecciona entre H y -CH3 ;
Y Z se selecciona de S- y O-.
[0230] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado es monocatenario.
[0231] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleósido modificado. En ciertas realizaciones, el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleósido fosforotioato. En ciertas realizaciones, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 enlaces internucleosídicos de dicho oligonucleótido modificado son enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleósido de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 enlaces internucleósidos de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace internucleosídico de fosfodiéster y un enlace internucleósido de fosforotioato.
[0232] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
[0233] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado comprende al menos un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado comprende un-O-metoxietilo 2’, un acetato de constreñido, un extremo 3' fluoro-HNA o un puente 4’-(CH2)nO-2', donde n es 1 o 2.
[0234] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende: (a) un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala 5’ que consiste en nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
[0235] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados y comprende: (a) un segmento de separación que consta de diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala 3’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato y en donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
[0236] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las SEQ ID NO: 19-96, 209-221, en donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala 3’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato y en donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
[0237] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de SEQ ID NO: 87, en donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala 3’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato y en donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
[0238] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados con la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87, en donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de separación que consta de diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala 3’ que consta de cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato y en donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
[0239] En ciertas realizaciones, el grupo conjugado está unido al oligonucleótido modificado en el extremo 5’ del oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado está unido al oligonucleótido modificado en el extremo 3’ del oligonucleótido modificado.
[0240] El grupo conjugado de la presente invención comprende exactamente tres ligandos, en donde cada ligando es N-acetilo galactosamina.
[0241] El grupo conjugado de la presente invención comprende:
Figure imgf000032_0001
[0242] El grupo conjugado se une covalentemente al oligonucleótido modificado.
[0243] El compuesto se puede representar por la fórmula:
A-B-C-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido modificado;
B es el resto escindible
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
[0244] En ciertas realizaciones de la presente descripción, el compuesto tiene una estructura representada por la fórmula:
A-C-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido modificado;
C es el enlazador conjugado;
D es el grupo de ramificación;
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
[0245] El grupo conjugado de la presente invención comprende un resto dirige a una célula que comprende:
Figure imgf000032_0002
[0246] En ciertas realizaciones, el grupo conjugado comprende:
Figure imgf000033_0001
en donde Q13 es H o O(CH2)2-OCH3;
A es el oligonucleótido modificado; y
Bx es un resto de base heterocíclico.
[0247] En ciertas realizaciones, Bx se selecciona entre adenina, guanina, timina, uracilo o citosina, o 5- metilo citosina. En ciertas realizaciones, Bx es adenina. En ciertas realizaciones, Bx es timina. En ciertas realizaciones, Q13 es O(CH2)2-OCH3. En ciertas realizaciones, Q13 es H.
[0248] Ciertas realizaciones de la invención proporcionan un profármaco que comprende las composiciones o compuestos descritos aquí.
[0249] En ciertas realizaciones, el compuesto está en forma de sal. En realizaciones adicionales, el compuesto comprende además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCI 1 y un grupo conjugado, o una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0250] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto o composición antisentido conjugado divulgado aquí. En ciertas realizaciones, la administración del compuesto antisentido conjugado previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de una enfermedad cardiovascular, metabólica y/o inflamatoria.
[0251] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan composiciones y métodos para usar en terapia para tratar una enfermedad, trastorno o afección relacionada con ApoCIII. En ciertas realizaciones, los niveles de ApoCIII están elevados en un animal. En ciertas realizaciones, la composición es un compuesto que comprende un inhibidor específico de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de ApoCIII es un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII y un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado dirigido a ApoCIII con el grupo conjugado, se usa en el tratamiento, prevención, enlentecimiento de la progresión, mejora de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria, cardiovascular y/o metabólica. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos para la terapia incluyen la administración de un inhibidor específico de ApoCIII a un individuo en necesidad del mismo.
[0252] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan compuestos antisentido conjugados y composiciones y métodos para reducir los niveles de ApoCIII. En ciertas realizaciones, los niveles de ApoCIII se reducen en el hígado, tejido adiposo, corazón, músculo esquelético o intestino delgado.
[0253] En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de ApoCIII en un tejido, órgano o sujeto aumenta los niveles de HDL. En ciertas realizaciones, los niveles de HDL aumentan al menos 90%, al menos 8 0 %, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, al menos 15%, al menos 10% o al menos 5% desde el nivel basal de HDL.
[0254] En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de ApoCIII en un tejido, órgano o sujeto reduce los niveles de TG. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un nivel de triglicéridos > 100 mg/dL, > 200 mg/dL, > 300 mg/dL, > 400 mg/dL, > 440 mg/dL, > 500 mg/dL, > 600 mg/dL dL, > 700 mg/dL, > 800 mg/dL, > 880 mg/dL, > 900 mg/dL, > 1000 mg/dL, > 1100 mg/dL, > 1200 mg/dL, > 1300 mg/dL, > 1400 mg/dL, > 1500 mg/dL, > 1600 mg/dL, > 1700 mg/dL, > 1800 mg/dL, > 1900 mg/dL, > 2000 mg/dL.
[0255] En ciertas realizaciones, los niveles de TG (posprandial o en ayunas) se reducen en al menos 90%, en al menos 80%, en al menos 70%, en al menos 60%, en al menos 50%, en al menos 45%, al menos 40%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, al menos 15%, al menos 10%, al menos 5% o en al menos 1% desde el nivel basal de TG. En ciertas realizaciones, el nivel de TG (postprandial o en ayunas) se reduce a < 1900mg/dL, < 1800mg/dL, < 1700mg/dL, < 1600mg/dL, < 1500mg/dL, < 1400mg/dL, < 1300mg/dL, < 1200 mg/dl, < 1100 mg/dl, < 1000 mg/dl, < 900 mg/dl, < 800 mg/dl, < 750 mg/dl, < 700 mg/dl, < 650 mg/dl, < 600 mg/dl, < 550 mg/dl, < 500mg/dL, < 450mg/dL, < 400mg/dL, < 350mg/dL, < 300mg/dL, < 250mg/dL, < 200mg/dL, < 150mg/dL o < 100mg/dL.
[0256] En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de ApoCIII en un tejido, órgano o sujeto mejora la relación de LDL a HDL o la relación de TG a HDL.
[0257] En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de ApoCIII en un tejido, órgano o sujeto mejora la sensibilidad a la insulina.
[0258] En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de ApoCIII en un tejido, órgano o sujeto aumenta el aclaramiento de quilomicrones.
[0259] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para reducir la expresión de ARNm o proteína de ApoCIII en un animal que comprende administrar al animal un compuesto o composición antisentido conjugada divulgada aquí para reducir la expresión de ARNm o proteína de ApoCIII en el animal.
[0260] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan compuestos antisentido conjugados y composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con ApoCIII en un sujeto que lo necesite. En ciertas realizaciones, tales enfermedades, trastornos y afecciones incluyen enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorias, cardiovasculares y/o metabólicas. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares incluyen, entre otras, quilomicronemia, hipertrigliceridemia, estenosis aórtica, aneurisma (p. ej., aneurisma aórtico abdominal), angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad coronaria, dislipidemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, hipertensión, infarto de miocardio, enfermedad vascular periférica (p. ej., enfermedad de la arteria periférica, enfermedad oclusiva de la arteria periférica), dislipidemia de Fredrickson tipo I, FCS, deficiencia de LPL, oclusión vascular retiniana o accidente cerebrovascular. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones metabólicas incluyen, entre otras, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo I y tipo II), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia diabética. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorias incluyen, entre otras, pancreatitis, estenosis aórtica, enfermedad de las arterias coronarias (CAD), enfermedad de Alzheimer y enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicas. Ciertas enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicas incluyen, entre otros, apoplejía, trombosis (p. ej., tromboembolismo venoso), infarto de miocardio y enfermedad vascular periférica. Ciertas realizaciones proporcionan compuestos antisentido conjugados y composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar la hipertrigliceridemia. Ciertas realizaciones proporcionan compuestos antisentido conjugados y composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar la quilomicronemia. Ciertas realizaciones proporcionan compuestos antisentido conjugados y composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar la pancreatitis.
[0261] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un método para reducir al menos un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular. En ciertas realizaciones, los síntomas incluyen, pero no se limitan a, angina, dolor en el pecho, dificultad para respirar, palpitaciones, debilidad, mareos, náuseas, sudoración, taquicardia, bradicardia, arritmia, fibrilación auricular, hinchazón en las extremidades inferiores, cianosis, fatiga, desmayos, entumecimiento de la cara, entumecimiento de las extremidades, claudicación o calambres musculares, hinchazón del abdomen y fiebre. En ciertas realizaciones, los síntomas de una enfermedad metabólica, trastorno o afección incluyen, entre otros, micción frecuente, sed inusual, hambre extrema, pérdida de peso inusual, fatiga extrema, irritabilidad, infecciones frecuentes, visión borrosa, cortes/contusiones que son lentos para sanar, hormigueo/entumecimiento en las manos/pies y recurrentes infecciones de la piel, las encías o la vejiga. Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un método para reducir al menos un síntoma de hipertrigliceridemia. Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un método para reducir al menos un síntoma de quilomicronemia. Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan un método para reducir al menos un síntoma de pancreatitis.
[0262] En ciertas realizaciones, la modulación de la expresión de ApoCIII se produce en una célula, tejido u órgano. En ciertas realizaciones, las modulaciones ocurren en una célula, tejido u órgano en un animal. En ciertas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de ARNm de ApoCIII. En ciertas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de proteína ApoCIII. En ciertas realizaciones, tanto el ARNm de ApoCIII como los niveles de proteína se reducen. Dicha reducción puede ocurrir de una manera dependiente del tiempo o de una dosis.
[0263] En ciertas realizaciones, el sujeto o animal es humano.
[0264] En ciertas realizaciones, el compuesto se administra parenteralmente. En realizaciones adicionales, la administración parenteral es subcutánea.
[0265] En ciertas realizaciones, el compuesto o composición antisentido conjugado se administra conjuntamente con un segundo agente o terapia. En ciertas realizaciones, el compuesto o composición antisentido conjugado y el segundo agente se administran concomitantemente.
[0266] En ciertas realizaciones, el segundo agente es un agente reductor de glucosa. En ciertas realizaciones, el segundo agente es un LDL, TG o agente reductor de colesterol. En ciertas realizaciones, el segundo agente es un agente antiinflamatorio. En ciertas realizaciones, el segundo agente es un medicamento para la enfermedad de Alzheimer. En ciertas realizaciones, el segundo agente puede ser, entre otros, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE, por ejemplo, aspirina), niacina (por ejemplo, Niaspan), ácido nicotínico, un inhibidor de apoB (por ejemplo, Mipomersen), un inhibidor de la CETP (p. ej., Anacetrapib), un inhibidor de la apo (a), un análogo de la hormona tiroidea (p. ej., Eprotirome), un inhibidor de la HMG-CoA reductasa (p. ej., una estatina), un fibrato (p. ej., Gemfibrozil) y un triglicérido microsomal inhibidor de proteínas de transferencia (p. ej., lomitapida). Los agentes o las terapias pueden administrarse conjuntamente o administrarse concomitantemente. Los agentes o terapias pueden administrarse secuencialmente o posteriormente.
[0267] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan el uso de las composiciones y compuestos antisentido conjugados descritos en el presente documento dirigidos a ApoCIII para disminuir los niveles de ApoCIII en un animal. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto dirigido a ApoCIII para disminuir los niveles de ApoCIII en un animal. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto dirigido a ApoCIII para aumentar los niveles de HDL en un animal. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto dirigido a ApoCIII para aumentar el aclaramiento de quilomicrón de HDL en un animal. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de compuestos dirigidos a ApoCIII para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociada con ApoCIII. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto dirigido a ApoCIII para el tratamiento, prevención o mejora de una hipertrigliceridemia. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto dirigido a ApoCIII para el tratamiento, prevención o mejora de una quilomicronemia (por ejemplo, FCS y/o LPLD). Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto dirigido a ApoCIII para el tratamiento, prevención o mejora de una pancreatitis.
[0268] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan el uso de las composiciones y compuestos antisentido conjugados descritos en el presente documento dirigidos a ApoCIII en la preparación de un medicamento para disminuir los niveles de ApoCIII en un animal. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de las composiciones y compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociada con ApoCIII.
[0269] Ciertas realizaciones de la presente descripción proporcionan el uso de las composiciones y compuestos antisentido conjugados como se describe aquí en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar, retrasar o prevenir una o más enfermedades relacionadas con ApoCIII.
[0270] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección como se describe en el presente documento en donde el kit comprende: (i) un inhibidor específico de ApoCIII como se describe en el presente documento; y opcionalmente (ii) un segundo agente o terapia como se describe en el presente documento.
[0271] Un kit puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección como se describe en el presente documento mediante la terapia de combinación como se describe en el presente documento.
B. Ciertos compuestos
[0272] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden oligonucleótidos antisentido y un conjugado.
a. Ciertos oligonucleótidos antisentido
[0273] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona oligonucleótidos antisentido. Dichos oligonucleótidos antisentido comprenden nucleósidos enlazados, cada nucleósido comprende un resto de azúcar y una nucleobase. La estructura de dichos oligonucleótidos antisentido puede considerarse en términos de características químicas (por ejemplo, modificaciones y patrones de modificaciones) y secuencia de nucleobase (por ejemplo, secuencia de oligonucleótido antisentido, identidad y secuencia de ácido nucleico diana).
i. Ciertas características químicas
[0274] El oligonucleótido antisentido comprende una o más modificaciones. En ciertas de tales realizaciones, los oligonucleótidos antisentido comprenden uno o más nucleósidos modificados y/o enlaces internucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
I. Ciertos restos de azúcar
[0275] En ciertas realizaciones, los compuestos de la descripción comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar modificado. Dichos compuestos que comprenden uno o más nucleósidos modificados con azúcar pueden tener propiedades deseables, tales como mayor estabilidad de la nucleasa o mayor afinidad de unión con un ácido nucleico diana en relación con un oligonucleótido que comprende solo nucleósidos que comprenden restos de azúcar naturales. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son restos de azúcar sustituidos. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son sustitutos de azúcar. Tales sustitutos de azúcar pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de restos de azúcar sustituidos.
[0276] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son restos de azúcar sustituidos que comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no híbridos, que incluyen pero no se limitan a sustituyentes en las posiciones 2’ y/o 5'. Los ejemplos de sustituyentes de azúcar adecuados para la posición 2’ incluyen, pero no se limitan a: 2'-F, 2'-OCH3 ("OMe" u "O-metilo") y 2’-O(CH2)2OCH3 ("MOE"). En ciertas realizaciones, los sustituyentes de azúcar en la posición 2’ se seleccionan de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, OC1-C10 alquilo, OC1-C10 alquilo sustituido; OCF3 , O(CH2)2SCH3 , O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) y OCH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o sustituido o no sustituido C1-C10 alquilo. Los ejemplos de sustituyentes de azúcar en la posición 5’ incluyen, pero no se limitan a:, 5'-metilo (R o S); 5'-vinilo y 5'-metoxi. En ciertas realizaciones, los azúcares sustituidos comprenden más de un sustituyente de azúcar no puente, por ejemplo, restos de azúcar 2'-F-5’-metilo (véase, por ejemplo, Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157, para restos de azúcares 5’, 2'-bis sustituidos y nucleósidos adicionales).
[0277] Restos de azúcar que comprenden nucleósidos 2’-sustituidos se conocen como nucleósidos sustituidos en 2'. En ciertas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2’ comprende un grupo sustituyente en 2' seleccionado de halo, alilo, amino, azido, SH, Cn , OCN, CF3 , OCF3 , O, S o N(Rm)-alquilo; O, S, o N(Rm) alquenilo; O, S o N(Rm) alquinilo; O-alquilenilo-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, O(CH2)2SCH3 , O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector de amino o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido. Estos grupos sustituyentes en 2’ pueden sustituirse adicionalmente con uno o más grupos sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, amino, alcoxi, carboxilo, bencilo, fenilo, nitro (NO2), tiol, tioalcoxi (S-alquilo), halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
[0278] En ciertas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2’ comprende un grupo sustituyente en 2' seleccionado de F, NH2 , N3 , OCF3 , O-CH3 , O(CH2)3NH2 , CH2-CH=CH2, O-CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3 , O(CH2)2SCH3 , O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, y acetamida N-sustituida (O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) donde cada Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector de amino o sustituido o no sustituido C1-C10 alquilo.
[0279] En ciertas realizaciones, un nucleósido 2' sustituido comprende un resto de azúcar que comprende un grupo sustituyente 2’ seleccionado de F, OCF3 , O-CH3 , OCH2CH2OCH3 , O(CH2)2SCH3 , O-(CHz )2-ON(CH3)2, -O(CH2)2O (CH2)2N(CH3)2, y O-CH2-C(=O)-N(H)CH3.
[0280] En ciertas realizaciones, un nucleósido 2’ sustituido comprende un resto de azúcar que comprende un sustituyente 2’ grupo seleccionado de F, OCH3 , y OCH2CH2OCH3.
[0281] Ciertos restos de azúcar modificados comprenden un sustituyente de azúcar puente que forma un segundo anillo que da como resultado un resto de azúcar bicíclico. En ciertas de tales realizaciones, el resto de azúcar bicíclico comprende un puente entre los átomos del anillo 4’ y 2' furanosa. Los ejemplos de dichos sustituyentes de azúcar de 4’ a 2' incluyen, entre otros-[C(Ra )(Rb )]n-, -[C(Ra)(Rb )]n-O-, -C(Ra Rb )-N(R)-O- or, -C(Ra Rb )-O-N(R)-; 4’-CH2 -2’, 4 ’-(CH2 )2 -2’, 4’-(CH2)3 -2’,. 4’-(CH2 )-O-2’ (LNA); 4’-(CH2 )-S-2’; 4’-(CH2 )2 -O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3 )-O-2’ (cEt) and 4’-CH(CH2 OCH3 )-O-2’, y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 7.399.845, emitida el 15 de julio, 2008); 4’-C(CH3) (CH3)-O-2' y análogos de los mismos, (véase, por ejemplo, WO2009/006478, publicada el 8 de enero de, 2009); 4’-CH2-N(o Ch 3)-2' y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, WO2008/150729, publicado en diciembre 11, 2 0 0 8 ); 4’-CH2-On (CH3)-2' (véase, por ejemplo, US2004/0171570, publicada el 2 de septiembre del 2004); 4'-CH2-O-N(R)-2', y 4'-CH2-N(R)-O-2'-, en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector, o C1-C12 alquilo; 4’-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector (véase, Patente de Estados Unidos 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4’-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase, por ejemplo, Chattopadhyaya, et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-13); y 4’-CH2-C(=CH2)-2' y análogos de los mismos (ver, publicada Solicitud Internacional PCT WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre, 2008).
[0282] En ciertas realizaciones, tales puentes de 4’ a 2' comprenden independientemente de 1 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, Si(Ra)2-, -S(=O)x -, y -N(Ra)-;
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1,2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, radical de heterociclo, radical de heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical de C5-C7 alicíclico, radical C5 -C7 alicíclico sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2 , SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)-J1); y cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 aminoalquilo sustituido, o un grupo protector.
[0283] Los nucleósidos que comprenden restos de azúcar bicíclicos se denominan nucleósidos bicíclicos o BNA. Los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-Metileneoxi (4'-CH2-O-2’) BNA, (B) p-D-Metileneoxi (4'-CH2-O-2 ’) BNA (también denominado ácido nucleico bloqueado o LNA), (C) Etileneoxi (4’-(CH2)2-O-2’) BNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2’) BNA, (E) Oxyamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) Metilo (metileneoxi) (4'-CH(CH3)-O-2’) BNA (también denominado como etilo constreñido o cEt), (G) metilenetio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metileno-amino (4'-CH2-N(R)-2’) BNA, (I) metilo carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA y (J) propileno carbocíclico (4’-(CH2)3-2') BNA como se muestra a continuación.
Figure imgf000037_0001
en donde Bx es un resto de nucleobase y R es, independientemente, H, un grupo protector, o C1-C12 alquilo.
[0284] Se conocen restos de azúcar bicíclicos adicionales en la técnica, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava y col., J. Am. Chem Soc., 129 (26) 8362-8379 (4 de julio de 2007); Elayadi y col., Curr. Opinión Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum y col., Curr. Opinión Mol. Ther., 2001,3, 239-243; Patentes de los Estados Unidos Nos 7.053.207, 6.268.490, 6.770.748, 6.794.499, 7.034.133, 6.525.191, 6.670.461 y 7.399.845; WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570 y WO 2007/134181; Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos US2004/0171570, US2007/0287831 y US2008/0039618; Patentes de Estados Unidos números de serie 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787 y 61/099,844; y las publicaciones internacionales PCT Nos WO/2008/150729, WO/2008/154401 y WO/2009/006478.
[0285] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar bicíclicos y los nucleósidos que incorporan dichos restos de azúcar bicíclicos se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2’ metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, los nucleósidos bicíclicos a-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2') que se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
[0286] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar sustituidos comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no puente y uno o más sustituyentes de azúcar puenteados (por ejemplo, azúcares puenteados 5'-sustituidos y 4'-2’), (véase, Publicación Internacional PCT WO 2007/134181, publicado el 11/22/07, en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
[0287] En ciertas realizaciones, los restos de azúcar modificados son sustitutos de azúcar. En ciertas de tales realizaciones, el átomo de oxígeno del azúcar natural está sustituido, por ejemplo, con un átomo de azufre, carbono o nitrógeno. En ciertas de tales realizaciones, dicho resto de azúcar modificado también comprende sustituyentes puenteantes y/o no puenteantes como se describió anteriormente. Por ejemplo, ciertos sustitutos de azúcar comprenden un átomo 4’-sulfer y una sustitución en la posición 2' (ver, p. ej., solicitud de patente estadounidense publicada US2005/0130923, publicada el 16 de junio, 2005) y/o la posición 5’. A modo de ejemplo adicional, se han descrito nucleósidos bicíclicos carbocíclicos que tienen un puente 4’-2' (véase, p. ej., Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71,7731-7740).
[0288] En ciertas realizaciones, los sustitutos del azúcar comprenden anillos que tienen otros átomos que no son 5. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un morfolino. Los compuestos de morfolino y su uso en compuestos oligoméricos han sido reportados en numerosas patentes y artículos publicados (ver por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y las patentes de los Estados Unidos 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; y 5,034,506). Como se usa aquí, el término "morfolino" significa un sustituto de azúcar que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000038_0001
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, agregando o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Tales sustitutos del azúcar se denominan en la presente memoria como "morfolinos modificados".
[0289] Para otro ejemplo, en ciertas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un tetrahidropirano de seis miembros. Tales tetrahidropiranos pueden modificarse o sustituirse adicionalmente. Los nucleósidos que comprenden dichos tetrahidropiranos modificados incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (m Na ) (véase Leumann, CJ. Bioorg. Y Med. Chem. (2002) 10: 841-854), fluoro HNA (F-HNA) y aquellos compuestos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000038_0002
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VI:
Bx es un resto de nucleobase;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado, o un o grupo terminal 5' o 3';
q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, o C2-C6 alquinilo sustituido; y
cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente entre: hidrógeno, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2 , SJ1, N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJaC(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1, y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o C1-C6 alquilo.
[0290] En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VI en donde q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 yq 7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de THP de fórmula se proporcionan VI en donde uno de R1 y R2 es F. En algunas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H, R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
[0291] Muchos otros sistemas de anillo sustitutos de azúcar biciclo y triciclo también son conocidos en la técnica que se puede utilizar para modificar los nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, p. ej, artículo de revisión:. Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
[0292] También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 8/21/08 para otros nucleósidos 5’, 2’-bis sustituidos) y sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S y sustitución adicional en la posición 2’ (véase la solicitud de patente publicada de EE.UU. US2005-0130923, publicado el 16 de junio, 2005) o, alternativamente, 5'-sustitución de un ácido nucleico bicíclico (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 11/22/07 en donde un nucleósido bicíclico 4’-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5' con un grupo de 5’-metilo o un 5’-vinilo). La síntesis y la preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos también se han descrito (véase, p. ej., Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc.
2007, 129 (26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona oligonucleótidos que comprenden nucleósidos modificados. Esos nucleótidos modificados pueden incluir azúcares modificados, nucleobases modificadas y/o enlaces modificados. Las modificaciones específicas se seleccionan de manera que los oligonucleótidos resultantes posean características deseables. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleósidos de tipo ARN. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleótidos similares a ADN.
2. Ciertas modificaciones de nucleobase
[0293] En ciertas realizaciones, los nucleósidos de la presente descripción comprenden una o más nucleobases no modificadas. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de la presente descripción comprenden una o más nucleobases modificadas.
[0294] En ciertas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan de: bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases expandidas por tamaño y bases fluoradas como se define en el presente documento. Pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas N-2, N-6 y O-6, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo; 5-propinilcitosina; 5-hidroximetilo citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina, 3-deazaguanina y 3-deazaadenina, bases universales, bases hidrofóbicas, bases promiscuas, bases expandidas en tamaño y bases fluoradas como se define en el presente documento. Nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina ([5,4-b][1,4]benzoxazina-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazina-2(3H)-ona), abrazaderas G como una citidina de fenoxazina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazina-2(3H)-una), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3’,2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidina-2-ona). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 3.687.808, las descritas en la Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, JI, Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; los divulgados por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición internacional, 1991, 30, 613; y los divulgados por Sanghvi, YS, Capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, ST y Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288.
[0295] Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas incluyen, entre otros, los documentos US 3.687.808; 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5,367,066; 5.432.272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5.502.177; 5.525.711; 5,552,540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.681.941; 5,750,692; 5,763,588; 5.830.653 y 6.005.096.
3. Ciertos enlaces internucleosídicos
[0296] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona oligonucleótidos que comprenden nucleósidos enlazados. En tales realizaciones, los nucleósidos pueden unirse entre sí usando cualquier enlace internucleosídico. Las dos clases principales de grupos de enlace internucleosídicos se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres (PO), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos (PS). Los grupos de enlace internucleósidos representativos que no contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, metilenometilimino (-CH2-N(CHa)-O-CH2-), tiodiester (-OC(O)-S-), tionocarbamato (-OC(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2 -O-); y N,N'-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Los enlaces modificados, en comparación con los enlaces fosfodiéster naturales, pueden usarse para alterar, típicamente aumentar, la resistencia a nucleasas del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos que tienen un átomo quiral se pueden preparar como una mezcla racémica, o como enantiómeros separados. Los enlaces quirales representativos incluyen, pero sin limitación, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de preparación de enlaces internucleósidos que contienen fósforo y no fósforo.
[0297] Los oligonucleótidos descritos en este documento contienen uno o más centros asimétricos y por lo tanto dar lugar a enantiómeros, diastereómeros, y otras configuraciones estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S), a o p tales como para los anómeros de azúcar, o como (D) o (L) como para aminoácidos, etc. Incluidos en los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento se encuentran todos los isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras.
[0298] Enlaces internucleósidos neutrales incluyen sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), amida-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), y tioformacetal (3'-S-CH2-O-5'). Otros enlaces internucleosídicos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster sulfonato y amidas (ver, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; YS Sanghvi y PD Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, 40­ 65). Otros enlaces internucleósido neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden mixtos de N, O, S y CH2 partes componentes.
4. Ciertos motivos
[0299] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido comprenden uno o más nucleósidos modificados (por ejemplo, nucleósidos que comprenden un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada) y/o uno o más enlaces internucleósidos modificados. El patrón de tales modificaciones en un oligonucleótido se denomina aquí como motivo. En ciertas realizaciones, el azúcar, la nucleobase y los motivos de enlace son independientes entre sí.
a. Ciertos motivos de azúcar
[0300] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de restos de azúcar modificados y/o restos de azúcar de origen natural dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Dichos motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar discutidas aquí y/u otras modificaciones de azúcar conocidas.
[0301] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de azúcar de gápmero, que comprende dos regiones externas o "alas" y una región central o interna o “brecha”. Las tres regiones de un motivo de azúcar gápmero (el ala 5', el espacio y el ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en donde al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos de la brecha. Específicamente, al menos los restos de azúcar de los nucleósidos de cada ala que están más cerca de la brecha (el nucleósido más 3' del ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren del resto de los nucleósidos de azúcar de la brecha vecina, definiendo así el límite entre las alas y la brecha. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar dentro del espacio son iguales entre sí. En ciertas realizaciones, el espacio incluye uno o más nucleósidos que tienen un resto de azúcar que difiere del resto de azúcar de uno o más nucleósidos del espacio. En ciertas realizaciones, los motivos de azúcar de las dos alas son iguales entre sí (separador de azúcar simétrico). En ciertas realizaciones, los motivos de azúcar del ala 5' difieren del motivo de azúcar del ala 3' (separador de azúcar asimétrico).
i. Ciertas alas 5’
[0302] En ciertas realizaciones, el ala 5' de un separador consta de 1 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 1 a 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 1 a 6 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 1 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 3 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 1 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 1 a 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 1 o 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consiste en 2 o 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 3 o 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consiste en 1 nucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero consta de 6 nucleósidos enlazados.
[0303] En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos dos nucleósidos bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos tres nucleósidos bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos cuatro nucleósidos bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un gápmero comprende al menos un nucleósido de LNA. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un gápmero es un nucleósido bicíclico. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un separador es un nucleósido de etilo restringido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un gápmero es un nucleósido de LNA.
[0304] En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un gápmero es un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un separador es un nucleósido sustituido en 2’. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un gápmero es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un gápmero es un nucleósido 2'-OMe.
[0305] En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un separador es un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un ribonucleósido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 5’ de un separador es un ribonucleósido. En ciertas realizaciones, uno, más de uno, o cada uno de los nucleósidos del ala 5’ es un nucleósido similar a ARN.
[0306] En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0307] En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido de 2'-OMe. En ciertas realizaciones, el ala 5’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un 2'-desoxinucleósido.
ii. Ciertas alas 3’
[0308] En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 1 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 1 a 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 1 a 6 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 1 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 3 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 1 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 1 a 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consiste en 1 o 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consiste en 2 o 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consiste en 3 o 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consiste en 1 nucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consiste en nucleósidos enlazados en 3. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero consta de 6 nucleósidos enlazados.
[0309] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos un nucleósido de LNA. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un gápmero es un nucleósido bicíclico. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un separador es un nucleósido de etilo restringido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un gápmero es un nucleósido de LNA.
[0310] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos tres nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos cuatro nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un gápmero es un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un separador es un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un gápmero es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un gápmero es un nucleósido 2'-OMe.
[0311] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un 2’-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un separador es un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un ribonucleósido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del ala 3’ de un separador es un ribonucleósido. En ciertas realizaciones, uno, más de uno, o cada uno de los nucleósidos del ala 5’ es un nucleósido similar a ARN.
[0312] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0313] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido de 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido de 2'-OMe. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0314] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido sustituido en 2'. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido de 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido de 2'-OMe. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0315] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido modificado no bicíclico, y al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido modificado no bicíclico y al menos un 2’-desoxinucleósido modificado. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido modificado no bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0316] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido sustituido en 2', y al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido sustituido en 2' y al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido sustituido en 2’ y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0317] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido 2'-MOE y al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido de 2'-MOE y al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido 2'-MOE y al menos un 2'-desoxinucleósido.
[0318] En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido 2'-OMe y al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un separador comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido de 2'-OMe y al menos un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3’ de un gápmero comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido de 2'-OMe y al menos un de 2’-deoxinucleósido.
iii) Ciertas regiones centrales (huecos)
[0319] En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 6 a 20 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el espacio de un gápmero consta de 6 a 15 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el espacio de un gápmero consta de 6 a 12 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el espacio de un gápmero consta de 6 a 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 6 a 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el espacio de un gápmero consta de 6 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 6 o 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consta de 7 a 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el espacio de un gápmero consta de 7 a 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 7 u 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el espacio de un gápmero consta de 8 a 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consta de 8 o 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 6 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 11 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, la brecha de un gápmero consiste en 12 nucleósidos enlazados.
[0320] En ciertas realizaciones, cada nucleósido del hueco de un gápmero es un 2'-desoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el espacio comprende uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del hueco de un gápmero es un 2'-desoxinucleósido o es un nucleósido modificado que es "similar al ADN". En tales realizaciones, “similar al ADN " significa que el nucleósido tiene características similares al ADN, de modo que un dúplex que comprende el gápmero y una molécula de ARN es capaz de activar la ARNasa H. Por ejemplo, bajo ciertas condiciones, 2’-(ara) Se ha demostrado que -F admite la activación de RNasa H y, por lo tanto, es similar al ADN. En ciertas realizaciones, uno o más nucleósidos del espacio de un gápmero no es un 2’-desoxinucleósido y no es similar al ADN. Sin embargo, en ciertas realizaciones de este tipo, el gápmero admite la activación de RNasa H (por ejemplo, en virtud del número o la ubicación de los nucleósidos que no son de ADN).
[0321] En ciertas realizaciones, los huecos comprenden un tramo de 2'-desoxinucleósido no modificado interrumpido por uno o más nucleósidos modificados, dando como resultado tres subregiones (dos tramos de uno o más 2'-desoxinucleósidos y un tramo de uno o más nucleósidos modificados de interrupción). En ciertas realizaciones, ningún tramo de 2'-desoxinucleósidos no modificados es más largo que 5, 6 o 7 nucleósidos. En ciertas realizaciones, tales estiramientos cortos se logran utilizando regiones de brecha corta. En ciertas realizaciones, se consiguen tramos cortos interrumpiendo una región de espacio más larga.
[0322] En ciertas realizaciones, el espacio comprende uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, el espacio comprende uno o más nucleósidos modificados seleccionados entre cEt, FHNA, LNA y 2-tio-timidina. En ciertas realizaciones, el espacio comprende un nucleósido modificado. En ciertas realizaciones, el espacio comprende un resto de azúcar sustituido en 5’ seleccionado entre 5'-Me y 5'-(R)-Me. En ciertas realizaciones, el espacio comprende dos nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, el espacio comprende tres nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, el espacio comprende cuatro nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, el espacio comprende dos o más nucleósidos modificados y cada nucleósido modificado es el mismo. En ciertas realizaciones, el espacio comprende dos o más nucleósidos modificados y cada nucleósido modificado es diferente.
[0323] En ciertas realizaciones, el espacio comprende uno o más enlaces modificados. En ciertas realizaciones, el espacio comprende uno o más enlaces de metilfosfonato. En ciertas realizaciones, el espacio comprende dos o más enlaces modificados. En ciertas realizaciones, el espacio comprende uno o más enlaces modificados y uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, el espacio comprende un enlace modificado y un nucleósido modificado. En ciertas realizaciones, el espacio comprende dos enlaces modificados y dos o más nucleósidos modificados.
b. Ciertos motivos de enlace internucleosídico
[0324] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleósido alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos de la presente descripción comprenden una región de enlaces internucleósidos modificados uniformemente. En ciertas realizaciones de este tipo, el oligonucleótido comprende una región que está unida uniformemente por enlaces internucleósidos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido está unido de manera uniforme por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y al menos un enlace internucleósido es fosforotioato.
[0325] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 7 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 9 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 11 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 13 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 14 enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
[0326] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 6 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 7 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 9 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 10 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 12 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos.
s de s de s de
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s de s de fosforotioato.
c. Ciertos motivos de modificación de nucleobase
[0327] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden modificaciones químicas a nucleobases dispuestas a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de nucleobases. En ciertas realizaciones de este tipo, las modificaciones de nucleobase están dispuestas en un motivo vacío. En ciertas realizaciones, las modificaciones de nucleobase están dispuestas en un motivo alternativo. En ciertas realizaciones, cada nucleobase se modifica. En ciertas realizaciones, ninguna de las nucleobases se modifica químicamente.
[0328] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden un bloque de nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones de este tipo, el bloque está en el extremo 3’ del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está dentro de 3 nucleótidos del extremo 3’ del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, el bloque está en el extremo 5’ del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el bloque está dentro de 3 nucleótidos del extremo 5’ del oligonucleótido.
[0329] En ciertas realizaciones, las modificaciones de nucleobase son una función de la base natural en una posición particular de un oligonucleótido. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, cada purina o cada pirimidina en un oligonucleótido se modifica. En ciertas realizaciones, cada adenina se modifica. En ciertas realizaciones, cada guanina se modifica. En ciertas realizaciones, cada timina se modifica. En ciertas realizaciones, cada citosina se modifica. En ciertas realizaciones, cada uracilo se modifica.
[0330] En ciertas realizaciones, algunos, todos o ninguno de los restos de citosina en un oligonucleótido son restos de 5-metilo citosina. Aquí, la 5-metilo citosina no es una "nucleobase modificada". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, las nucleobases no modificadas incluyen tanto residuos de citosina que tienen un 5-metilo como aquellos que carecen de un 5-metilo. En ciertas realizaciones, se especifica el estado de metilación de todas o algunas nucleobases de citosina.
[0331] En ciertas realizaciones, las modificaciones químicas a las nucleobases comprenden la unión de ciertos grupos conjugados a las nucleobases. En ciertas realizaciones, cada purina o cada pirimidina en un oligonucleótido puede modificarse opcionalmente para comprender un grupo conjugado.
d. Ciertas longitudes totales
[0332] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona oligonucleótidos de cualquiera de una variedad de intervalos de longitudes. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos consisten en nucleósidos enlazados de X a Y, donde X representa el menor número de nucleósidos en el rango e Y representa el mayor número de nucleósidos en el rango. En ciertas realizaciones de este tipo, X e Y se seleccionan cada uno independientemente de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; siempre que X < Y. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el oligonucleótido puede consistir en 8 a 9, 8 a 10, 8 a 11,8 a 12, 8 a 13, 8 a 14, 8 a 15, 8 a 16, 8 a 17, 8 a 18, 8 a 19, 8 a 20, 8 a 21,8 a 22, 8 a 23, 8 a 24, 8 a 25, 8 a 26, 8 a 27, 8 a 28, 8 a 29, 8 a 30, 9 a 10, 9 a 11,9 a 12, 9 a 13, 9 a 14, 9 a 15, 9 a 16, 9 a 17, 9 a 18, 9 a 19, 9 a 20, 9 a 21,9 a 22, 9 a 23, 9 a 24, 9 a 25, 9 a 26, 9 a 27, 9 a 28, 9 a 29, 9 a 30, 10 a 11, 10 a 12, 10 a 13, 10 a 14, 10 a 15, 10 a 16, 10 a 17, 10 a 18, 10 a 19, 10 a 20, 10 a 21, 10 a 22, 10 a 23, 10 a 24, 10 a 25, 10 a 26, 10 a 27, 10 a 28, 10 a 29, 10 a 30, 11 a 12, 11 a 13, 11 a 14, 11 a 15, 11 a 16, 11 a 17, 11 a 18, 11 a 19, 11 a 20, 11 a 21, 11 a 22, 11 a 23, 11 a 24, 11 a 25, 11 a 26, 11 a 27, 11 a 28, 11 a 29, 11 a 30, 12 a 13, 12 a 14, 12 a 15, 12 a 16, 12 a 17, 12 a 18, 12 a 19, 12 a 20, 12 a 21, 12 a 22, 12 a 23, 12 a 24, 12 a 25, 12 a 26, 12 a 27, 12 a 28, 12 a 29, 12 a 30, 13 a 14, 13 a 15, 13 a 16, 13 a 17, 13 a 18, 13 a 19, 13 a 20, 13 a 21, 13 a 22, 13 a 23, 13 a 24, 13 a 25, 13 a 26, 13 a 27, 13 a 28, 13 a 29, 13 a 30, 14 a 15, 14 a 16, 14 a 17, 14 a 18, 14 a 19, 14 a 20, 14 a 21, 14 a 22, 14 a 23, 14 a 24, 14 a 25, 14 a 26, 14 a 27, 14 a 28, 14 a 29, 14 a 30, 15 a 16, 15 a 17, 15 a 18, 15 a 19, 15 a 20, 15 a 21, 15 a 22, 15 a 23, 15 a 24, 15 a 25, 15 a 26, 15 a 27, 15 a 28, 15 a 29, 15 a 30, 16 a 17, 16 a 18, 16 a 19, 16 a 20, 16 a 21, 16 a 22, 16 a 23, 16 a 24, 16 a 25, 16 a 26, 16 a 27, 16 a 28, 16 a 29, 16 a 30, 17 a 18, 17 a 19, 17 a 20, 17 a 21, 17 a 22, 17 a 23, 17 a 24, 17 a 25, 17 a 26, 17 a 27, 17 a 28, 17 a 29, 17 a 30, 18 a 19, 18 a 20, 18 a 21, 18 a 22, 18 a 23, 18 a 24, 18 a 25, 18 a 26, 18 a 27, 18 a 28, 18 a 29, 18 a 30, 19 a 20, 19 a 21, 19 a 22, 19 a 23, 19 a 24, 19 a 25, 19 a 26, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 29, 19 a 30, 20 a 21,20 a 22, 20 a 23, 20 a 24, 20 a 25, 20 a 26, 20 a 27, 20 a 28, 20 a 29, 20 a 30, 21 a 22, 21 a 23, 21 a 24, 21 a 25, 21 a 26, 21 a 27, 21 a 28, 21 a 29, 21 a 30, 22 a 23, 22 a 24, 22 a 25, 22 a 26, 22 a 27, 22 a 28, 22 a 29, 22 a 30, 23 a 24, 23 a 25, 23 a 26, 23 a 27, 23 a 28, 23 a 29, 23 a 30, 24 a 25, 24 a 26, 24 a 27, 24 a 28, 24 a 29, 24 a 30, 25 a 26, 25 a 27, 25 a 28, 25 a 29, 25 a 30, 26 a 27, 26 a 28, 26 a 29, 26 a 30, 27 a 28, 27 a 29, 27 a 30, 28 a 29, 28 a 30, o 29 a 30 nucleósidos enlazados. En realizaciones en las que el número de nucleósidos de un oligonucleótido de un compuesto está limitado, ya sea a un rango o a un número específico, el compuesto puede, sin embargo, comprender además otros sustituyentes adicionales. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende 8-30 nucleósidos excluye los oligonucleótidos que tienen 31 nucleósidos, pero, a menos que se indique lo contrario, dicho oligonucleótido puede comprender además, por ejemplo, uno o más grupos conjugados, grupos terminales u otros sustituyentes.
[0333] Además, cuando un oligonucleótido se describe por un rango de longitud total y por regiones que tienen longitudes especificadas, y donde la suma de las longitudes especificadas de las regiones es menor que el límite superior del rango de longitud total, el oligonucleótido puede tener nucleósidos adicionales, más allá de las de las regiones especificadas, siempre que el número total de nucleósidos no exceda el límite superior del rango de longitud total.
5. Ciertos motivos quím icos de oligonucleótidos antisentido
[0334] En ciertas realizaciones, las características estructurales químicas de los oligonucleótidos antisentido se caracterizan por su motivo de azúcar, motivo de enlace internucleosídico, motivo de modificación de nucleobase y longitud total. En ciertas realizaciones, tales parámetros son independientes entre sí. Por lo tanto, cada enlace internucleosídico de un oligonucleótido que tiene un motivo de azúcar gápmero puede modificarse o no modificarse y puede seguir o no el patrón de modificación gápmero de las modificaciones de azúcar. Por lo tanto, los enlaces internucleosídicos dentro de las regiones del ala de un separador de azúcar pueden ser iguales o diferentes entre sí y pueden ser iguales o diferentes de los enlaces internucleosídicos de la región de la brecha. Del mismo modo, dichos oligonucleótidos de separador de azúcar pueden comprender una o más nucleobases modificadas independientemente del patrón de separador de las modificaciones de azúcar. Un experto en la materia apreciará que tales motivos pueden combinarse para crear una variedad de oligonucleótidos.
[0335] En ciertas realizaciones, la selección del enlace internucleosídico y la modificación de nucleósidos no son independientes entre sí.
i. Ciertas secuencias y dianas
[0336] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona oligonucleótidos antisentido que tienen una secuencia complementaria a un ácido nucleico diana. Dichos compuestos antisentido son capaces de hibridarse con un ácido nucleico diana, dando como resultado al menos una actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido hibridan específicamente con uno o más ácidos nucleicos diana. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido que hibrida específicamente tiene una secuencia de nucleobase que comprende una región que tiene suficiente complementariedad con un ácido nucleico diana para permitir la hibridación y producir actividad antisentido y complementariedad insuficiente con cualquier no diana para evitar o reducir la hibridación no específica a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea hibridación específica (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para usos in vivo o terapéuticos, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro). En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos son selectivos entre una diana y no diana, aunque tanto la diana como la no diana comprenden la secuencia diana. En tales realizaciones, la selectividad puede resultar de la accesibilidad relativa de la región diana de una molécula de ácido nucleico en comparación con la otra.
[0337] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona compuestos antisentido que comprenden oligonucleótidos que son completamente complementarios al ácido nucleico diana en toda la longitud del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos son 99% complementarios al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos son 95% complementarios al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, dichos oligonucleótidos son 90% complementarios al ácido nucleico diana.
[0338] En ciertas realizaciones, dichos oligonucleótidos son 85% complementarios al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, dichos oligonucleótidos son 80% complementarios al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido comprende una región que es completamente complementaria a un ácido nucleico diana y es al menos 80% complementaria al ácido nucleico diana en toda la longitud del oligonucleótido. En ciertas realizaciones de este tipo, la región de completa complementariedad tiene una longitud de 6 a 14 nucleobases.
[0339] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de hibridación y una región terminal. En ciertas de tales realizaciones, la región de hibridación consiste en 12-30 nucleósidos enlazados y es completamente complementaria al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la región de hibridación incluye un desajuste con respecto al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la región de hibridación incluye dos desajustes relativos al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la región de hibridación incluye tres desajustes relativos al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la región terminal consiste en 1-4 nucleósidos terminales. En ciertas realizaciones, los nucleósidos terminales están en el extremo 3’. En ciertas realizaciones, uno o más de los nucleósidos terminales no son complementarios al ácido nucleico diana.
[0340] Los mecanismos antisentido incluyen cualquier mecanismo que implique la hibridación de un oligonucleótido con ácido nucleico diana, en donde la hibridación da como resultado un efecto biológico. En ciertas realizaciones, dicha hibridación da como resultado la degradación u ocupación del ácido nucleico diana con la inhibición o estimulación concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, traducción, transcripción o empalme del ácido nucleico diana.
[0341] Un tipo de mecanismo antisentido que implica la degradación del ARN diana es el antisentido mediado por RNasa H. RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena simple que son "similares al ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. La activación de RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión de la diana de ARN, mejorando así en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica mediada por oligonucleótidos de tipo ADN.
[0342] En ciertas realizaciones, un grupo conjugado comprende un resto escindible. En ciertas realizaciones, un grupo conjugado comprende uno o más enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, un grupo conjugado comprende un enlazador. En ciertas realizaciones, un conector comprende un resto de unión a proteínas. En ciertas realizaciones, un grupo conjugado comprende un resto de selección de células (también denominado un grupo de selección de células). En ciertas realizaciones, un resto de direccionamiento celular comprende un grupo ramificado. En ciertas realizaciones, un resto de direccionamiento celular comprende una o más ataduras. En ciertas realizaciones, un resto de direccionamiento celular comprende un hidrato de carbono o grupo de hidratos de carbono.
ii. Ciertos restos escindibles
[0343] En ciertas realizaciones, un resto escindible es un enlace escindible. En ciertas realizaciones, un resto escindible comprende un enlace escindible. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado comprende un resto escindible. En ciertas de tales realizaciones, el resto escindible se une al oligonucleótido antisentido. En ciertas de tales realizaciones, el resto escindible se une directamente al resto dirigido a la célula. En ciertas de tales realizaciones, el resto escindible se une al conector conjugado. En ciertas realizaciones, el resto escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el resto escindible es un nucleósido o análogo de nucleósido escindible. En ciertas realizaciones, el nucleósido o análogo de nucleósido comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de una purina, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En ciertas realizaciones, el resto escindible es un nucleósido que comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoílo-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoíloadenina, guanina y 2-N-isobutirilguanina. En ciertas realizaciones, el resto escindible es nucleósido 2'-desoxi que está unido a la posición 3’ del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y está unido al conector por un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En ciertas realizaciones, el resto escindible es 2'-desoxi adenosina que está unido a la posición 3’ del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y está unido al conector por un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En ciertas realizaciones, el resto escindible es 2'-desoxi adenosina que está unido a la posición 3’ del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y está unido al conector por un enlace fosfodiéster.
[0344] En ciertas realizaciones, el resto escindible está unido a la posición 3’ del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el resto escindible está unido a la posición 5’ del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el resto escindible está unido a una posición 2’ del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el resto escindible se une al oligonucleótido antisentido mediante un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el resto escindible está unido al enlazador mediante un enlace fosfodiéster o un enlace fosforotioato. En ciertas realizaciones, el resto escindible está unido al enlazador por un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado no incluye un resto escindible.
[0345] En ciertas realizaciones, el resto escindible se escinde después de que el complejo se ha administrado a un animal solo después de ser internalizado por una célula diana. Dentro de la célula, el resto escindible se escinde liberando así el oligonucleótido antisentido activo. Aunque no quiere estar atado a la teoría, se cree que el resto escindible es escindido por una o más nucleasas dentro de la célula. En ciertas realizaciones, la una o más nucleasas escinden el enlace fosfodiéster entre el resto escindible y el conector.
iii. Ciertos enlazadores
[0346] El grupo conjugado de la invención comprende un enlazador. En ciertas de tales realizaciones, el enlazador está unido covalentemente al resto escindible. En ciertas realizaciones de este tipo, el conector está unido covalentemente al oligonucleótido antisentido. El enlazador está unido covalentemente a un resto dirigido a la célula.
[0347] El enlazador es un grupo lineal que comprende grupos alquilo, amida y éter. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente al resto que se dirige a la célula y al resto escindible. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente al resto que se dirige a la célula y al oligonucleótido antisentido.
[0348] El enlazador conjugado de la presente invención tiene la estructura:
Figure imgf000047_0001
iv. Ciertos restos d irigidos a células
[0349] El grupo conjugado de la presente invención comprende restos dirigidos a células. Ciertos restos de direccionamiento celular de este tipo aumentan la absorción celular de compuestos antisentido. Los restos dirigidos a células comprenden un grupo ramificado, tres ataduras y tres ligandos.
1. Ciertos grupos de ramificación
[0350] El grupo conjugado de la presente invención comprende un resto de direccionamiento que comprende un grupo de ramificación y tres ligandos unidos. El grupo de ramificación se une al enlazador conjugado. El grupo de ramificación está unido covalentemente al conector y a cada uno de los ligandos atados.
[0351] El grupo de ramificación de la presente invención tiene la estructura:
Figure imgf000047_0002
2. Ciertos anclajes
[0352] El grupo conjugado de la presente invención comprende tres anclajes unidos covalentemente a la grupo de ramificación. El anclaje está unido al grupo de ramificación a través de un grupo éter. El anclaje está unido al ligando a través de un grupo éter.
[0353] El anclaje de la presente invención tiene la estructura:
Figure imgf000048_0001
3. Ciertos ligandos
[0354] Cada ligando de la presente invención se une covalentemente a un anclaje. En ciertas realizaciones, cada ligando es seleccionado para tener una afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En ciertas realizaciones, se seleccionan ligandos que tienen afinidad por al menos un tipo de receptor en la superficie de una célula de hígado de mamífero. En ciertas realizaciones, se seleccionan ligandos que tienen afinidad por el receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R). En ciertas realizaciones de la presente descripción, cada ligando es un hidrato de carbono. Cada ligando de la invención es N-acetilo galactoseamina (GalNAc). En ciertas realizaciones de la presente descripción, el resto de direccionamiento comprende 3 ligandos. El resto de direccionamiento de la presente invención comprende 3 ligandos de N-acetilo galactoseamina.
[0355] En ciertas realizaciones, "GalNac" o "Gal-NAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, comúnmente denominada en la literatura como N-acetilo galactosamina. En ciertas realizaciones, "N-acetilo galactosamina" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. "GalNac" o "Gal-NAc" de la presente invención se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que está en la forma p: 2-(acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa. Además de la presente invención, se describe en la presente memoria la forma a: 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que se representa como referencia a continuación.
Figure imgf000048_0002
2-(Acet¡lam¡no)-2-deox¡-D-galactopiranosa
Figure imgf000048_0003
2-(Acetilamino)-2-deoxi-B-D-galactopiranosa
Figure imgf000048_0004
2-(Acetilamino)-2-deoxi-a-D-galactopiranosa
i. Ciertos conjugados
[0356] En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden las características estructurales anteriores que son consistentes con las reivindicaciones adjuntas.
[0357] En ciertas realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000049_0001
[0358] En ciertas realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000049_0002
b . Ciertos compuestos antisentido conjugados
[0359] En ciertas realizaciones, los conjugados están unidos a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2’, 3', de 5’ del nucleósido. El compuesto antisentido conjugado puede tener la siguiente estructura:
A-B-C-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
[0360] En ciertas realizaciones de la presente descripción, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-C-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el enlazador conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones de este tipo, el conector conjugado comprende al menos un enlace escindible. En ciertas de tales realizaciones, el grupo de ramificación comprende al menos un enlace escindible.
En ciertas realizaciones, cada correa comprende al menos un enlace escindible.
[0361] En ciertas realizaciones, los conjugados están unidos a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2’, 3’, de 5’ del nucleósido.
[0362] En ciertas realizaciones de la presente descripción, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-B-C(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible
C es el conector conjugado
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
[0363] En ciertas realizaciones, los conjugados están unidos a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2’, 3’, de 5’ del nucleósido. En ciertas realizaciones de la presente descripción, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-C(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el enlazador conjugado,
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
[0364] En ciertas realizaciones de la presente descripción, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-B-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible
D es el grupo de ramificación cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
[0365] En ciertas realizaciones de la presente descripción, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-D(E-F)q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
[0366] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000051_0001
[0367] Patentes representativas de Estados Unidos, publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos y publicaciones internacionales de solicitud de patente que enseñan la preparación de algunos de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, ligadores, grupos ramificadores, ligandos, restos escindibles así como otras modificaciones mencionadas anteriormente incluyen, entre otros, los documentos US 5,994,517, US 6,300,319, US 6,660,720, US 6,906,182, US 7,262,177, US 7,491,805, US 8.106.022, US 7.723.509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 y WO 2012/037254.
[0368] Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de algunos de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, ligadores, grupos de ramificación, ligandos, restos escindibles, así como otras modificaciones, mencionados anteriormente incluyen, sin limitación, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem (1995) 38: 1846-1852, BIESs En et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem (1995) 38: 1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19: 2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem (2001) 276 (40): 37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel NAcetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem (2004) 47: 5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem (1999) 42: 609-618, y Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysinebased cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor " Tetrahedron, 1997, 53 (2), 759-770.
[0369] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden un oligonucleótido basado en RNasa H (como un gápmero) o un oligonucleótido modulador de empalme (como un oligonucleótido completamente modificado) y cualquier grupo conjugado que comprende al menos uno, dos o tres grupos GalNAc. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado comprende cualquier grupo conjugado encontrado en cualquiera de las siguientes referencias: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly y col., J Biol Chem, 1982, 257, 939­ 945; Pavia y col., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee y col., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee y col., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen y col., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim y col., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee y col., Bioconjug Chem, 1997, 8 , 762-765; Kato y col., Glycobiol, 2001, 11,821-829; Rensen y col., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind y col., Glycoconj J, 2004, 21,227-241; Lee y col., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16 (19), 5132-5135; Maierhofer y col., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev y col., Bioorg Med Chem, 2008, 1 6 , 5216-5231; Lee y col., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova y col., Analyt Biochem, 2 0 1 2 , 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2 0 1 2 , 51, 7445-7448; Biessen y col., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt y col., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen y col., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen y col., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg y col., Gene Ther, 2004, 11,457-464; Sato y col., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee y col., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASeB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur y col., Bioconjug Chem 1997, 8 , 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2 0 0 0 , 313, 297-321; Maier y col., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29 Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128 Merwin y col., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya y col., Bioorg Med Chem, 2013, 21,5275-5281; Solicitudes internacionales WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098; WO2008/098788; WO2004/101619 WO2012/037254 WO2011/120053 WO2011/100131 WO2011/163121 WO2012/177947; WO2013/033230 WO2013/075035 WO2012/083185 WO2012/083046 WO2009/082607 WO2009/134487; WO2010/144740 WO2010/148013 WO1997/020563 WO2010/088537 WO2002/043771 WO2010/129709; WO2012/068187 WO2009/126933 WO2004/024757 WO2010/054406 WO2012/089352 WO2012/089602; WO2013/166121 WO2013/165816 Patentes de los EE.UU. 4.751.219; 8.552.163; 6,908,903; 7.262.177; 5.994.517; 6.300.319 8.106.022 7.491.805; 7.491.805; 7.582.744; 8.137.695 6.383.812; 6.525.031; 6.660.720; 7.723.509; 8.541.548 8.344.125 8.313.772; 8.349.308; 8.450.467; 8.501.930 8.158.601; 7.262.177; 6.906.182; 6.620.916; 8.435.491 8.404.862 7.851.615; Publicaciones publicadas de solicitud de patente de los EE.UU. US2011/0097264 US2011/0097265 US2013/0004427; US2005/0164235 US2006/0148740 US2008/0281044 US2010/0240730 US2003/0119724 US2006/0183886; US2008/0206869 US2011/0269814 US2009/0286973 US2011/0207799 US2012/0136042 US2012/0165393; US2008/0281041 US2009/0203135 US2012/0035115 US2012/0095075 US2012/0101148 US2012/0128760; US2012/0157509 US2012/0230938 US2013/0109817 US2013/0121954 US2013/0178512 US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; y US2009/0203132.
C. Ciertos usos y características
[0370] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados exhiben una potente reducción de ARN de ApoCIII in vivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido no conjugados se acumulan en el riñón. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se acumulan en el hígado. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son bien tolerados. Dichas propiedades hacen que los compuestos antisentido conjugados sean particularmente útiles para la inhibición de muchos ARN diana, incluidos, entre otros, aquellos implicados en enfermedades, trastornos o afecciones metabólicas, cardiovasculares y de otro tipo. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar tales enfermedades, trastornos o afecciones poniendo en contacto tejidos hepáticos con los compuestos antisentido conjugados dirigidos a los ARN asociados con tales enfermedades, trastornos o afecciones. Por lo tanto, también se proporcionan métodos para mejorar cualquiera de una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones metabólicas, cardiovasculares y de otro tipo con los compuestos antisentido conjugados de la presente invención.
[0371] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son más potentes que la contraparte no conjugada a una concentración de tejido particular. Sin desear estar sujeto a ninguna teoría o mecanismo, en ciertas realizaciones, el conjugado puede permitir que el compuesto antisentido conjugado ingrese a la célula de manera más eficiente o ingrese a la célula de manera más productiva. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados pueden exhibir una mayor reducción de la diana en comparación con su contraparte no conjugada en donde tanto el compuesto antisentido conjugado como su contraparte no conjugada están presentes en el tejido a las mismas concentraciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados pueden exhibir una mayor reducción de la diana en comparación con su contraparte no conjugada en donde tanto el compuesto antisentido conjugado como su contraparte no conjugada están presentes en el hígado a las mismas concentraciones.
[0372] La captación productiva y no productiva de oligonucleótidos se ha discutido previamente (véase, por ejemplo, Geary, R. S., E. Wancewicz, et al. (2009). "Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptake and Pharmacologic Activity of a 2’-Methoxyethyl Modified Chimeric Antisense Oligonucleotide Targeting PTEN”. Biochem. Pharmacol. 78 (3): 284-91; & Koller, E., TM Vincent, et al. (2011). "Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified antisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes". Nucleic Acids Res. 39 (11): 4795-807). Los grupos conjugados descritos aquí pueden mejorar la absorción productiva.
[0373] En ciertas realizaciones, los grupos conjugados descritos en el presente documento pueden mejorar aún más la potencia al aumentar la afinidad del compuesto antisentido conjugado por un tipo particular de célula o tejido. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados descritos en este documento pueden mejorar aún más la potencia aumentando el reconocimiento del compuesto antisentido conjugado por uno o más receptores de la superficie celular. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados descritos en este documento pueden mejorar aún más la potencia al facilitar la endocitosis del conjugado compuesto antisentido.
[0374] En ciertas realizaciones, el resto escindible puede mejorar aún más la potencia al permitir que el conjugado se escinda del oligonucleótido antisentido después de que el compuesto antisentido conjugado haya entrado en la célula. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados pueden administrarse a dosis inferiores a las necesarias para los oligonucleótidos antisentido no conjugados.
[0375] Se han incorporado enlaces de fosforotioato en oligonucleótidos antisentido previamente. Dichos enlaces de fosforotioato son resistentes a las nucleasas y, por lo tanto, mejoran la estabilidad del oligonucleótido. Además, los enlaces de fosforotioato también se unen a ciertas proteínas, lo que resulta en la acumulación de oligonucleótidos antisentido en el hígado. Los oligonucleótidos con menos enlaces de fosforotioato se acumulan menos en el hígado y más en el riñón (véase, por ejemplo, Geary, R., "Pharmacokinetic Properties of 2’-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats," Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 296, No. 3, 890-897; & Pharmacological Properties of 2’-O-Methoxyethyl Modified Oligonucleotides in Antisense a Drug Technology, Capítulo 10, Crooke, ST, ed., 2008) en ciertas realizaciones, los oligonucleótidos con menos enlaces internucleósidos de fosforotioato y más enlaces internucleosídicos de fosfodiéster se acumulan menos en el hígado y más en el riñón. Cuando se tratan enfermedades en el hígado, esto es indecoroso por varias razones (1) menos medicamento llega al sitio de acción deseada (hígado); (2) el fármaco se escapa a la orina; y (3) el riñón está expuesto a una concentración relativamente alta de fármaco que puede provocar toxicidades en el riñón. Por lo tanto, para las enfermedades hepáticas, los enlaces de fosforotioato proporcionan importantes beneficios.
[0376] En ciertas realizaciones, sin embargo, la administración de oligonucleótidos enlazados de manera uniforme por enlaces internucleósidos de fosforotioato induce una o más reacciones proinflamatorias. (ver, por ejemplo: J Lab Clin Med. 1996 sep; 128 (3): 329-38. Amplification of antibody production by phosphorothioate oligodeoxynucleotides". Branda et al.; y ver también, por ejemplo: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Capítulo 12, páginas 342-351, Crooke, ST, ed., 2008). En ciertas realizaciones, la administración de oligonucleótidos en los que la mayoría de los enlaces internucleosídicos comprenden enlaces internucleosídicos de fosforotioato induce una o más reacciones proinflamatorias.
[0377] En ciertas realizaciones, el grado de efecto proinflamatorio puede depender de varias variables (por ejemplo, modificación del esqueleto, efectos fuera de diana, modificaciones de nucleobase y/o modificaciones de nucleósidos), ver por ejemplo: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Capítulo 12, páginas 342-351, Crooke, ST, ed., 2008). En ciertas realizaciones, el grado de efecto proinflamatorio puede mitigarse ajustando una o más variables. Por ejemplo, el grado de efecto proinflamatorio de un oligonucleótido dado puede mitigarse reemplazando cualquier número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato con enlaces internucleosídicos de fosfodiéster y reduciendo así el número total de enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
[0378] En ciertas realizaciones, sería deseable reducir el número de enlaces de fosforotioato, si se pudiera hacer sin perder estabilidad y sin cambiar la distribución del hígado al riñón. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el número de enlaces de fosforotioato puede reducirse reemplazando los enlaces de fosforotioato con enlaces de fosfodiéster. En tal realización, el compuesto antisentido que tiene menos enlaces de fosforotioato y más enlaces de fosfodiéster puede inducir menos reacciones proinflamatorias o ninguna reacción proinflamatoria. Aunque el compuesto antisentido que tiene menos enlaces de fosforotioato y más enlaces fosfodiéster puede inducir menos reacciones proinflamatorias, el compuesto antisentido que tiene menos enlaces fosforotioato y más enlaces fosfodiéster puede no acumularse en el hígado y puede ser menos eficaz a la misma dosis o en una dosis similar en comparación con un compuesto antisentido que tiene más enlaces de fosforotioato. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, es deseable diseñar un compuesto antisentido que tenga una pluralidad de enlaces fosfodiéster y una pluralidad de enlaces fosforotioato pero que también posea estabilidad y buena distribución al hígado.
[0379] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se acumulan más en el hígado y menos en el riñón que sus homólogos no conjugados, incluso cuando algunos de los enlaces de fosporotioato se reemplazan con enlaces internucleósidos de fosfodiéster menos proinflamatorios. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se acumulan más en el hígado y no se excretan tanto en la orina en comparación con sus contrapartes no conjugadas, incluso cuando algunos de los enlaces de fosporotioato se reemplazan con enlaces internucleósidos de fosfodiéster menos proinflamatorios. En ciertas realizaciones, el uso de un conjugado permite diseñar fármacos antisentido más potentes y mejor tolerados. De hecho, en ciertas emociones, los compuestos antisentido conjugados tienen índices terapéuticos más grandes que los equivalentes no conjugados. Esto permite que el compuesto antisentido conjugado se administre a una dosis absoluta más alta, porque hay menos riesgo de respuesta proinflamatoria y menos riesgo de toxicidad renal. Esta dosis más alta permite dosificar con menos frecuencia, ya que se espera que el aclaramiento (metabolismo) sea similar. Además, debido a que el compuesto es más potente, como se describió anteriormente, se puede permitir que la concentración disminuya antes de la siguiente dosis sin perder actividad terapéutica, lo que permite períodos incluso más largos entre la dosificación.
[0380] En ciertas realizaciones, la inclusión de algunos enlaces de fosforotioato sigue siendo deseable. Por ejemplo, los enlaces terminales son vulnerables a las exonucleoasas y, por lo tanto, en ciertas realizaciones, esos enlaces son fosforotioato u otro enlace modificado. Los enlaces internucleosídicos que unen dos desoxinucleósidos son vulnerables a las endonucleasas y, por lo tanto, en ciertas realizaciones, esos enlaces son fosforotioato u otro enlace modificado. Los enlaces internucleosídicos entre un nucleósido modificado y un desoxinucleósido donde el desoxinucleósido está en el lado 5’ del enlace, los desoxinucleósidos son vulnerables a las endonucleasas y, en ciertas realizaciones, esos enlaces son fosforotioato u otro enlace modificado. Los enlaces internucleosídicos entre dos nucleósidos modificados de ciertos tipos y entre un desoxinucleósido y un nucleósido modificado de cierto tipo donde el nucleósido modificado está en el lado 5’ del enlace son suficientemente resistentes a la digestión de la nucleasa, de modo que el enlace puede ser fosfodiéster.
[0381] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 16 enlaces de fosfortioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 15 enlaces fosforioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 14 enlaces fosforioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 13 enlaces fosforioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 12 enlaces fosforioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 11 enlaces fosforioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 10 enlaces fosforioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 9 enlaces fosforioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 8 enlaces fosforioato.
[0382] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que comprenden uno o más grupos conjugados descritos aquí tienen una mayor actividad y/o potencia y/o tolerabilidad en comparación con un compuesto antisentido original que carece de uno o más grupos conjugados. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, es deseable la unión de tales grupos conjugados a un oligonucleótido. Dichos grupos conjugados pueden estar unidos en el extremo 5’ y/o 3' de un oligonucleótido. En ciertos casos, el apego en el extremo 5’ es sintéticamente deseable. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan mediante la unión del nucleósido terminal 3’ a un soporte sólido y el acoplamiento secuencial de nucleósidos de 3' a 5’ usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. En consecuencia, si se diseña un grupo conjugado en el extremo 3’, se puede (1) unir el grupo conjugado al nucleósido terminal 3' y unir ese nucleósido conjugado al soporte sólido para la preparación posterior del oligonucleótido o (2) unir el grupo conjugado al nucleósido terminal 3’ de un oligonucleótido completo después de la síntesis. Ninguno de estos enfoques es muy eficiente y, por lo tanto, ambos son costosos. En particular, la unión del nucleósido conjugado al soporte sólido, aunque se demuestra en los Ejemplos de la presente memoria, es un proceso ineficiente. En ciertas realizaciones, unir un grupo conjugado al nucleósido 5’ terminal es sintéticamente más fácil que la unión en el extremo 3'. Se puede unir un nucleósido terminal 3’ no conjugado al soporte sólido y preparar el oligonucleótido usando condiciones estándar y bien caracterizadas. Entonces solo se necesita unir un nucleósido 5’ que tenga un grupo conjugado en la etapa de acoplamiento final. En ciertas realizaciones, esto es más eficiente que unir un nucleósido conjugado directamente al soporte sólido como se hace típicamente para preparar un oligonucleótido conjugado en 3’. Los ejemplos en este documento demuestran la unión en el extremo 5’. Además, ciertos grupos conjugados tienen ventajas sintéticas. Por ejemplo, ciertos grupos conjugados que comprenden grupos de enlace de fósforo son sintéticamente más simples y se preparan de manera más eficiente que otros grupos conjugados, incluidos los grupos conjugados informados previamente (por ejemplo, WO/2012/037254).
[0383] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se administran a un sujeto. En tales realizaciones, los compuestos antisentido que comprenden uno o más grupos conjugados descritos en este documento tienen una mayor actividad y/o potencia y/o tolerabilidad en comparación con un compuesto antisentido original que carece de uno o más grupos conjugados. Sin estar limitado por un mecanismo, se cree que el grupo conjugado ayuda con la distribución, entrega y/o absorción en una célula o tejido diana. En ciertas realizaciones, una vez dentro de la célula o tejido diana, es deseable que todo o parte del grupo conjugado se corte para liberar el oligonucleótido activo. En ciertas realizaciones, no es necesario que el grupo conjugado completo se escinda del oligonucleótido. Por ejemplo, en el Ejemplo 20 un oligonucleótido conjugado se administró a ratones y un número de diferentes especies químicas, comprendiendo cada uno una porción diferente del grupo conjugado restante en el oligonucleótido, fueron detectados (Tabla 23a). Este compuesto antisentido conjugado demostró una buena potencia (Tabla 23). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, dicho perfil de metabolitos de la escisión parcial múltiple del grupo conjugado no interfiere con la actividad/potencia. Sin embargo, en ciertas realizaciones es deseable que un profármaco (oligonucleótido conjugado) produzca un único compuesto activo. En ciertos casos, si se encuentran múltiples formas del compuesto activo, puede ser necesario determinar cantidades y actividades relativas para cada una. En ciertas realizaciones donde se requiere una revisión regulatoria (por ejemplo, USFDA o contraparte) es deseable tener una sola especie activa (o predominantemente única). En ciertas realizaciones de este tipo, es deseable que tales especies activas únicas sean el oligonucleótido antisentido que carece de cualquier porción del grupo conjugado. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados en el extremo 5’ tienen más probabilidades de dar como resultado un metabolismo completo del grupo conjugado. Sin estar unidos por un mecanismo, puede ser que las enzimas endógenas responsables del metabolismo en el extremo 5’ (p. ej., nucleasas 5') sean más activas/eficientes que las contrapartes 3’. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados específicos son más susceptibles de metabolizar a una sola especie activa. En ciertas realizaciones, ciertos grupos conjugados son más susceptibles de metabolizar al oligonucleótido.
D. Antisentido
[0384] En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos de la presente descripción son compuestos antisentido. En tales realizaciones, el compuesto oligomérico es complementario a un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico diana es un ARN. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico diana es un ARN no codificante. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico diana codifica una proteína. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico diana se selecciona de un ARNm, un ARNm previo, un microARN, un ARN no codificante, que incluye un ARN pequeño no codificante, y un ARN dirigido por el promotor. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son al menos parcialmente complementarios a más de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, los compuestos oligoméricos de la presente invención pueden ser imitadores de microARN, que típicamente se unen a múltiples dianas.
[0385] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una porción que tiene una secuencia de nucleobase al menos 70% complementaria a la secuencia de nucleobase de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una porción que tiene una secuencia de nucleobase al menos 80% complementaria a la secuencia de nucleobase de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una porción que tiene una secuencia de nucleobase al menos 90% complementaria a la secuencia de nucleobase de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una porción que tiene una secuencia de nucleobase al menos 95% complementaria a la secuencia de nucleobase de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una porción que tiene una secuencia de nucleobase al menos 98% complementaria a la secuencia de nucleobase de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una porción que tiene una secuencia de nucleobase que es 100% complementaria a la secuencia de nucleobase de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 100% complementarios a la secuencia de nucleobase de un ácido nucleico diana en toda la longitud del compuesto antisentido.
[0386] Los mecanismos antisentido incluyen cualquier mecanismo que implique la hibridación de un compuesto oligomérico con ácido nucleico diana, en donde la hibridación produce un efecto biológico. En ciertas realizaciones, dicha hibridación da como resultado la degradación u ocupación del ácido nucleico diana con la inhibición o estimulación concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, traducción, transcripción o poliadenilación del ácido nucleico diana o de un ácido nucleico con el que el nucleico diana el ácido puede interactuar de otra manera.
[0387] Un tipo de mecanismo antisentido que implica la degradación del ARN diana es el antisentido mediado por RNasa H. RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena simple que son "similares al ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. La activación de RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión de la diana de ARN, mejorando así en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica mediada por oligonucleótidos de tipo ADN.
[0388] Los mecanismos antisentido también incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNi, que utilizan la ruta RISC. Dichos mecanismos de ARNi incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNss y microARN. Dichos mecanismos incluyen la creación de un imitador de microARN y/o un anti-microARN.
[0389] Los mecanismos antisentido también incluyen, sin limitación, mecanismos que hibridan o imitan ARN no codificantes distintos de microARN o ARNm. Tal ARN no codificante incluye, pero no se limita a ARN dirigido por promotor y ARN corto y largo que efectúa la transcripción o traducción de uno o más ácidos nucleicos.
[0390] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en el presente documento son compuestos de ARNi. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos oligoméricos que comprenden conjugados descritos en el presente documento son compuestos de ARNss. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en el presente documento se combinan con un segundo compuesto oligomérico para formar un ARNip. En ciertas realizaciones de este tipo, el segundo compuesto oligomérico también comprende un conjugado. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto oligomérico es cualquier ácido nucleico modificado o no modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en el presente documento son la cadena antisentido en un compuesto de ARNsi. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en este documento son la cadena sentido en un compuesto de ARNip. En realizaciones en las que el compuesto oligomérico conjugado es ARNip bicatenario, el conjugado puede estar en la cadena sentido, la cadena antisentido o tanto la cadena sentido como la cadena antisentido.
D. Apolipoproteína C-III (apoCIII)
[0391] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se dirigen a cualquier ácido nucleico de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana codifica una proteína diana ApoCIII que es clínicamente relevante. En tales realizaciones, la modulación del ácido nucleico diana da como resultado un beneficio clínico.
[0392] El proceso de direccionamiento usualmente incluye la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para que ocurra la interacción antisentido de modo que se produzca el efecto deseado.
[0393] En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico. Por ejemplo, en ciertas realizaciones de este tipo, una región diana puede abarcar un 3’ UTR, un 5' UTR, un exón, un intrón, una región de codificación, una región de inicio de traducción, una región de terminación de traducción u otra región de ácido nucleico definida o segmento de diana.
[0394] En ciertas realizaciones, un segmento diana es al menos aproximadamente una porción de 8 nucleobases de una región diana a la que se dirige un compuesto antisentido conjugado. Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 nucleobases consecutivas del extremo 5’ de uno de los segmentos diana (las nucleobases restantes son un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente corriente arriba del extremo 5' del segmento diana y continuando hasta que el ADN o ARN comprenda de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases). Los segmentos diana también están representados por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 nucleobases consecutivas desde el extremo 3’ de uno de los segmentos diana (las nucleobases restantes son un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente después del extremo 3' del segmento diana y continúa hasta que el ADN o RNA comprenda de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases). Los segmentos diana también pueden representarse mediante secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 nucleobases consecutivas de una porción interna de la secuencia de un segmento diana, y pueden extenderse en una o ambas direcciones hasta que el compuesto antisentido conjugado comprenda aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases.
[0395] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico ApoCIII pueden modificarse como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener un resto de azúcar modificado, un resto de azúcar no modificado o una mezcla de restos de azúcar modificado y no modificado como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener un enlace internucleosídico modificado, un enlace internucleósido no modificado o una mezcla de enlaces internucleósidos modificados y no modificados como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener una nucleobase modificada, una nucleobase no modificada o una mezcla de nucleobases modificadas y no modificadas como se describe en este documento. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener un motivo como se describe aquí.
[0396] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a los ácidos nucleicos de ApoCIII se pueden conjugar como se describe en el presente documento.
[0397] ApoCIII es un componente de HDL y de lipoproteínas ricas en triglicéridos (TG). Los niveles elevados de ApoCIII están asociados con niveles elevados de TG y enfermedades como enfermedades cardiovasculares, síndrome metabólico, obesidad y diabetes. Los niveles elevados de TG están asociados con pancreatitis. ApoCIII ralentiza el aclaramiento de las lipoproteínas ricas en TG al inhibir la lipólisis mediante la inhibición de la lipoproteína lipasa (LPL) y al interferir con la unión de las lipoproteínas a la matriz de glucosaminoglicanos de la superficie celular. Los compuestos antisentido dirigidos a ApoCIII se han descrito previamente en los documentos WO2004/093783 y WO2012/149495.
Ciertos compuestos antisentido conjugados dirigidos a un ácido nucleico ApoCIII
[0398] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se dirigen a un ácido nucleico ApoCIII que tiene la secuencia de cualquiera de los GENBANK® N° de acceso NM_000040.1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1); N° de acceso de GEn Ba NK NT_033899.8 truncado de los nucleótidos 20262640 a 20266603 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2); y N° de acceso de GenBank NT_035088.1 truncado de los nucleótidos 6238608 a 6242565 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 3). En ciertas de tales realizaciones, un compuesto antisentido conjugado es al menos 90%, al menos 95% o 100% complementario de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3.
[0399] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado dirigido a la SEQ ID NO: 1 comprende al menos 8 secuencias de nucleobase consecutivas de SEQ ID NO: 87. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado dirigido a la SEQ ID NO: 1 comprende una secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87.
Tabla A: Compuestos antisentido d irigidos a ApoCIII SEQ ID NO: 1
Figure imgf000057_0001
Indicaciones terapéuticas de ApoCIII
[0400] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para usar un compuesto antisentido conjugado dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII para modular la expresión de ApoCIII en un sujeto. En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de ApoCIII.
[0401] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para usar un compuesto antisentido conjugado dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII en una composición farmacéutica para tratar a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular y/o metabólica. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene hipertrigliceridemia, hipertrigliceridemia no familiar, hipertrigliceridemia familiar, hipertrigliceridemia familiar heterocigótica, hipertrigliceridemia familiar homocigótica, dislipidemia mixta, aterosclerosis, riesgo de desarrollar aterosclerosis, enfermedad coronaria, antecedentes de enfermedad coronaria, enfermedad coronaria de inicio temprano, uno o más factores de riesgo de enfermedad coronaria, diabetes tipo II, diabetes tipo II con dislipidemia, dislipidemia, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, hiperacetaxia hepática, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica, pancreatitis y/o enfermedad del hígado graso no alcohólico.
[0402] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para usar un compuesto antisentido conjugado dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII en la preparación de un medicamento.
E. Determinados conjugados de ácido nucleico de GalNAc
[0403] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden compuestos antisentido que tienen la secuencia de nucleobase y las modificaciones de los compuestos antisentido en la tabla adjunta a un conjugado GalNAc. Todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídicos de fosforotioato a menos que se indique lo contrario. Un subíndice "l" indica un nucleósido bicíclico de LNA. Un subíndice "d" indica un nucleósido 2'-desoxi. Un subíndice "e" indica un nucleósido modificado con 2'-MOE. Una "V" indica una 2-amino-2'-desoxiadenosina.
Tabla B
Figure imgf000057_0002
(continuación)
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F. Ciertas composiciones farmacéuticas
[0404] En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos antisentido de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, dicha composición farmacéutica comprende un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, dicha composición farmacéutica consiste en una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, la solución salina estéril es solución salina de grado farmacéutico. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En ciertas realizaciones, la solución salina estéril es agua de grado farmacéutico. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos antisentido y solución salina tamponada con fosfato (PBS). En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos antisentido y solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). En ciertas realizaciones, la solución salina estéril es PBS de grado farmacéutico.
[0405] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden mezclarse con sustancias activas y/o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, que incluyen, entre otros, la vía de administración, el alcance de la enfermedad o la dosis a administrar.
[0406] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido comprenden uno o más oligonucleótidos que, tras la administración a un animal, incluido un humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
[0407] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un oligonucleótido que se escinden por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el oligonucleótido antisentido activo.
[0408] Los restos lipídicos se han usado en terapias de ácido nucleico en una variedad de métodos. En ciertos métodos de este tipo, el ácido nucleico se introduce en liposomas o lipoplejos preformados hechos de mezclas de lípidos catiónicos y lípidos neutros. En ciertos métodos, los complejos de ADN con lípidos mono o policationicos se forman sin la presencia de un lípido neutro. En ciertas realizaciones, se selecciona un resto lipídi
distribución de un agente farmacéutico a una célula o tejido particular. En ciertas realizaciones, se selecciona un resto lipídi
[0409] En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento comprenden uno o más oligonucleótidos modificados y uno o más excipientes. En ciertas realizaciones, los excipientes se seleccionan de agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.
[0410] En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en este documento comprende un sistema de administración. Los ejemplos de sistemas de administración incluyen, entre otros, liposomas y emulsiones. Ciertos sistemas de suministro son útiles para preparar ciertas composiciones farmacéuticas que incluyen aquellas que comprenden compuestos hidrófobos. En ciertas realizaciones, se usan ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido.
[0411] En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende una o más moléculas de administración específicas de tejido diseñadas para administrar el uno o más agentes farmacéuticos de la presente divulgación a tejidos o tipos de células específicos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo específico de tejido.
[0412] En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en este documento comprende un sistema codisolvente. Ciertos de dichos sistemas codisolventes comprenden, por ejemplo, alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. En ciertas realizaciones, tales sistemas de codisolventes se usan para compuestos hidrófobos. Un ejemplo no limitativo de dicho sistema codisolvente es el sistema codisolvente VPD, que es una solución de etanol absoluto que comprende 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del tensioactivo no polar Polysorbate 80™ y 65 % p/v de polietilenglicol 300. Las proporciones de dichos sistemas codisolventes pueden variar considerablemente sin alterar significativamente sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes codisolventes puede variar: por ejemplo, se pueden usar otros tensioactivos en lugar de Polysorbate 80™; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variar; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.
[0413] En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en este documento se prepara para administración oral. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se preparan para administración bucal.
[0414] En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración por inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En ciertas de tales realizaciones, una composición farmacéutica comprende un vehículo y se formula en solución acuosa, tal como agua o tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, la solución de Ringer o el tampón salino fisiológico. En ciertas realizaciones, se incluyen otros ingredientes (por ejemplo, ingredientes que ayudan en la solubilidad o sirven como conservantes). En ciertas realizaciones, las suspensiones inyectables se preparan usando vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Ciertos solventes adecuados para su uso en composiciones farmacéuticas para inyección incluyen, pero no se limitan a, solventes lipofílicos y aceites grasos, tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato o triglicéridos de etilo, y liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, tales suspensiones también pueden contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los agentes farmacéuticos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
[0415] En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración transmucosa. En ciertas de tales realizaciones, se usan penetrantes apropiados para la barrera a ser permeada en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
[0416] En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en este documento comprende un oligonucleótido en una cantidad terapéuticamente efectiva. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de los expertos en la materia.
[0417] En ciertas realizaciones, uno o más oligonucleótidos modificados proporcionados aquí se formulan como un profármaco. En ciertas realizaciones, tras la administración in vivo, un profármaco se convierte químicamente en la forma biológicamente, farmacéutica o terapéuticamente más activa de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los profármacos son útiles porque son más fáciles de administrar que la forma activa correspondiente. Por ejemplo, en ciertos casos, un profármaco puede estar más biodisponible (por ejemplo, a través de la administración oral) que la forma activa correspondiente. En ciertos casos, un profármaco puede tener una solubilidad mejorada en comparación con la forma activa correspondiente. En ciertas realizaciones, los profármacos son menos solubles en agua que la forma activa correspondiente. En ciertos casos, tales profármacos poseen una transmisión superior a través de las membranas celulares, donde la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad. En ciertas realizaciones, un profármaco es un éster. En ciertas de tales realizaciones, el éster se hidroliza metabólicamente a ácido carboxílico tras la administración. En ciertos casos, el compuesto que contiene ácido carboxílico es la forma activa correspondiente. En ciertas realizaciones, un profármaco comprende un péptido corto (poliaminoácido) unido a un grupo ácido. En ciertas de tales realizaciones, el péptido se escinde tras la administración para formar la forma activa correspondiente.
[0418] En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones y métodos para reducir la cantidad o actividad de un ácido nucleico diana en una célula. En ciertas realizaciones, la célula está en un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero. En ciertas realizaciones, el animal es un roedor. En ciertas realizaciones, el animal es un primate. En ciertas realizaciones, el animal es un primate no humano. En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
[0419] En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para administrar una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de la presente divulgación a un animal. Las vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a, oral, rectal, transmucosal, intestinal, enteral, tópica, supositorios, por inhalación, intratecal, intracerebroventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intratumoral y parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intramedular y subcutánea). En ciertas realizaciones, los intratecales farmacéuticos se administran para lograr exposiciones locales en lugar de sistémicas. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden inyectarse directamente en el área del efecto deseado (por ejemplo, en el hígado).
EJEMPLOS
[0420] Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente descripción y no son limitantes. Además, cuando se proporcionan realizaciones específicas, los inventores han contemplado la aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un soporte razonable para oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo motivo o un motivo similar. Y, por ejemplo, cuando una modificación particular de alta afinidad aparece en una posición particular, otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición se consideran adecuadas, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1: Método general para la preparación de fosforamiditas, compuestos 1, 1a y 2
[0421]
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[0422] Bx es una base heterocíclica;
Los compuestos 1, 1a y 2 se prepararon según los procedimientos bien conocidos en la técnica tal como se describe en la memoria descriptiva de este documento (véase Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011,21 (4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75 (5), 1569-1581, Serie de simposios de ácidos nucleicos, 2008, 52 (1), 553-554); y también ver las solicitudes internacionales PCT publicadas (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 y WO 2007/090071), y la patente de los Estados Unidos 7.569.686).
Ejemplo 2: Preparación del Compuesto 7
[0423]
Figure imgf000060_0002
[0424] Los compuestos 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-0-acetilo-2-desoxi-p-Dgalactopiranosa o galactosamina pentaacetato) está disponible comercialmente. El compuesto 5 se preparó de acuerdo con procedimientos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991,34, 2692).
Ejemplo 3: Preparación del Compuesto 11
[0425]
Figure imgf000061_0001
[0426] Los Compuestos 8 y 9 están disponibles comercialmente.
Ejemplo 4: Preparación del Compuesto 18
[0427]
Figure imgf000061_0002
[0428] El Compuesto 11 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 3. El Compuesto 14 está disponible comercialmente. El compuesto 17 se preparó usando procedimientos similares informados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Ejemplo 19: Método general para la preparación de ASO conjugados que comprenden GalNAc3-1 en la posición 3’ mediante técnicas de fase sólida (preparación de ISIS 647535, 647536 y 651900)
[0429] A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos y soluciones utilizados para la síntesis de compuestos oligoméricos se adquieren de fuentes comerciales. Bloques de fosforamidita estándar de construcción y soporte sólido se usan para la incorporación de residuos de nucleósidos, que incluyen, por ejemplo, residuos T, A, G, y mC. Se usó una solución 0,1 M de fosforamidita en acetonitrilo anhidro para p-D-2'-desoxirribonucleósido y 2'-MOE.
[0430] Las síntesis ASO se realizaron en el sintetizador ABI 394 (escala de 1 -2 gmol) o en el sintetizador de oligopiloto ÁKTA de GE Healthcare Bioscience (escala de 40-200 gmol) por el método de acoplamiento de fosforamidita en un soporte sólido VIMAD cargado con GalNAc3-1 (110 gmol/g, Guzaev et al., 2003) empaquetado en la columna. Para la etapa de acoplamiento, las fosforamiditas se administraron un exceso de 4 veces sobre la carga en el soporte sólido y la condensación de fosforamiditas se llevó a cabo durante 10 minutos. Todos los demás pasos siguieron los protocolos estándar suministrados por el fabricante. Se usó una solución de ácido dicloroacético al 6% en tolueno para eliminar el grupo dimetoxitritilo (DMT) del grupo 5'-hidroxilo del nucleótido. 4,5-Dicianoimidazol (0,7 gmol) en CH3CN anhidro se utilizó como activador durante la etapa de acoplamiento. Los enlaces de fosforotioato se introdujeron mediante sulfuración con solución 0,1 M de hidruro de xantano en piridina/CH3CN 1:1 durante un tiempo de contacto de 3 minutos. Una solución de 20% de terc-butilhidroperóxido en CH3CN que contiene agua 6% fue usada como un agente oxidante para proporcionar enlaces internucleósidos de fosfodiéster eon un tiempo de contacto de 12 minutos.
[0431] Después de ensamblar la secuencia deseada, los grupos protectores de fosfato de cianoetilo se desprotegieron usando una mezcla 1:1 (v/v) de trietilamina y acetonitrilo con un tiempo de contacto de 45 minutos. Los ASO unidos al soporte sólido se suspendieron en amoniaco acuoso (28-30% en peso) y se calentaron a 55°C durante 6 h.
[0432] Los ASO no unidos se filtraron y el amoniaco se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía líquida de alta presión en una columna de intercambio aniónico fuerte (GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 gm, 2,54 x 8 cm, A = acetato de amonio 100 mM en CH3CN acuoso al 30%, B = 1,5 M NaBr en A, 0-40% de B en 60 min, flujo 14 mL min-1, A = 260 nm). El residuo se desaló por HPLC en una columna de fase inversa para producir los ASO deseados con un rendimiento aislado del 15-30% basado en la carga inicial sobre el soporte sólido. Los ASO se caracterizaron por análisis MS acoplado por ionpair-HPLC con el sistema Agilent 1100 MSD.
[0433] Los oligonucleótidos antisentido que no comprenden un conjugado se sintetizaron usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estándar bien conocidos en la técnica.
[0434] Usando estos métodos, se prepararon tres compuestos antisentido separados dirigidos a ApoC III. Como se resume en la Tabla 17, a continuación, cada uno de los tres compuestos antisentido dirigidos a ApoC III tenía la misma secuencia de nucleobase; ISIS 304801 es un gápmero 5-10-5 MOE que tiene todos los enlaces de fosforotioato; ISIS 647535 es igual a ISIS 304801, excepto que tenía un GalNAc3-1 conjugado en su extremo 3’; e ISIS 647536 es lo mismo que ISIS 647535, excepto que ciertos enlaces internucleosídicos de ese compuesto son enlaces fosfodiéster. Como se resume adicionalmente en la Tabla 17, se sintetizaron dos compuestos antisentido separados dirigidos a SRB-1. ISIS 440762 era un gápmero 2-10-2 cEt con todos los enlaces internucleosídicos de fosforotioato; ISIS 651900 es el mismo que ISIS 440762, excepto que incluyó un GalNAc3-1 en su extremo 3’.
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Subíndices: "e" indica nucleósido modificado 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "k" indica 6'-(Sj-CH3 bicíclico nucleósido (por ejemplo cEt); "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y "o" 'indica -OP(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. "GalNAc3- 1" indica un grupo conjugado que tiene la estructura mostrada anteriormente en el Ejemplo 9. Tenga en cuenta que GalNAc3-1 comprende una adenosina escindible que une el ASO al resto del conjugado, que se denomina " GalNAc3-1 a”. Esta nomenclatura se usa en la tabla anterior para mostrar la secuencia de nucleobase completa, incluida la adenosina, que es parte del conjugado. Por lo tanto, en la tabla anterior, las secuencias también podrían enumerarse como terminando con omisión de "GalNAc3-1" con la "Ado”. Esta convención de usar el subíndice "a" para indicar la porción de un grupo conjugado que carece de un nucleósido escindible o resto escindible se usa en todos estos Ejemplos. Esta porción de un grupo conjugado que carece del resto escindible se denomina en el presente documento un "grupo" o "grupo conjugado" o "grupo GalNAc3”. En ciertos casos, es conveniente describir un grupo conjugado proporcionando por separado su grupo y su resto escindible.
Ejemplo 20: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ApoC III humano en ratones transgénicos huApoC III
[0435] ISIS 304801 e ISIS 647535, cada uno dirigido a ApoC III humano y descrito anteriormente, se probaron y evaluaron por separado en un estudio dependiente de la dosis para determinar su capacidad para inhibir ApoC III humano en ratones transgénicos ApoC III humanos.
Tratamiento
[0436] Los ratones transgénicos ApoCIII humanos se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum Teklad Chow de laboratorio. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Los ASO se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Los ASO se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[0437] Se inyectaron ratones transgénicos ApoC III humanos intraperitonealmente una vez por semana durante dos semanas con ISIS 304801 o 647535 a 0,08, 0,25, 0,75, 2,25 o 6,75 pmol/kg o con PBS como control. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Cuarenta y ocho horas después de la administración de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos.
Análisis de ARNm de ApoC III
[0438] Los niveles de ARNm de ApoC III en los hígados de los ratones se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de ApoC III se determinaron en relación con el ARN total (usando Ribogreen), antes de la normalización al control tratado con PBS. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de ApoC III para cada grupo de tratamiento, normalizado al control tratado con PBS y se denotan como "% PBS". La dosis eficaz media máxima (DE50) de cada ASO también se presenta en la Tabla 18, a continuación.
[0439] Como se ilustra, ambos compuestos antisentido redujeron el ARN de ApoC III en relación con el control de PBS. Además, el compuesto antisentido conjugado con GalNAc3-1 (ISIS 647535) fue sustancialmente más potente que el compuesto antisentido que carece del conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801).
Tabla 18
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Análisis de la proteína ApoC III (ensayo turbidométrico)
[0440] El análisis de la proteína ApoC III en plasma se determinó utilizando los procedimientos informados por Graham et al, Circulation Research, publicados en línea antes de la impresión el 29 de marzo de 2013.
[0441] Aproximadamente 100 pl de plasma aislado de los ratones se analizaron sin dilución usando un analizador clínico Olympus y un ensayo turbidométrico ApoC III comercialmente disponible (Kamiya, Cat n° KAI-006, Kamiya Biomedical, Seattle, WA). El protocolo de ensayo se realizó según lo descrito por el vendedor.
[0442] Como se muestra en la Tabla 19 a continuación, ambos compuestos antisentido redujeron la proteína ApoC III en relación con el control de PBS. Además, el compuesto antisentido conjugado con GalNAc3-1 (ISIS 647535) fue sustancialmente más potente que el compuesto antisentido que carece del conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801).
Tabla 19
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[0443] Los triglicéridos y el colesterol en plasma se extrajeron mediante el método de Bligh y Dyer (Bligh, EG y Dyer, WJ Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) (Bligh, E y Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959) (Bligh, E y Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911 -917, 1959) y se midieron usando un analizador clínico Beckmann Coulter y reactivos disponibles comercialmente.
[0444] Los niveles de triglicéridos se midieron en relación con los ratones inyectados con PBS y se denotan como "% PBS". Los resultados se presentan en la Tabla 20. Como se ilustra, ambos compuestos antisentido redujeron los niveles de triglicéridos. Además, el compuesto antisentido conjugado con GalNAc3-1 (ISIS 647535) fue sustancialmente más potente que el compuesto antisentido que carece del conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801).
Tabla 20
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[0445] Las muestras de plasma se analizaron por HPLC para determinar la cantidad de colesterol total y de diferentes fracciones de colesterol (HDL y LDL). Los resultados se presentan en las Tablas 21 y 22. Como se ilustra, ambos compuestos antisentido redujeron los niveles de colesterol total; ambos bajaron el LDL; y ambos aumentaron el HDL. Además, el compuesto antisentido conjugado con GalNAc3-1 (ISIS 647535) fue sustancialmente más potente que el compuesto antisentido que carece del conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Un aumento en HDL y una disminución en los niveles de LDL es un efecto beneficioso cardiovascular de la inhibición antisentido de ApoC III.
Tabla 21
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Tabla 22
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Análisis farmacocinético (PK)
[0446] También se evaluó la PK de los ASO. Se picaron y extrajeron muestras de hígado y riñón usando protocolos estándar. Las muestras se analizaron en MSD1 utilizando IP-HPLC-MS. Se midió el nivel de tejido (Mg/g) de ISIS 304801 y 647535 de longitud completa y los resultados se proporcionan en la Tabla 23. Como se ilustra, las concentraciones hepáticas de compuestos antisentido de longitud completa total fueron similares para los dos compuestos antisentido. Por lo tanto, aunque el compuesto antisentido conjugado con GalNAc3-1 es más activo en el hígado (como lo demuestran los datos de ARN y proteínas anteriores), no está presente en concentraciones sustancialmente más altas en el hígado. De hecho, la CE50 calculada (proporcionada en la Tabla 23) confirma que el aumento observado en la potencia del compuesto conjugado no puede atribuirse por completo al aumento de la acumulación. Este resultado sugiere que el conjugado mejoró la potencia mediante un mecanismo diferente a la acumulación de hígado solo, posiblemente mejorando la absorción productiva del compuesto antisentido en las células.
[0447] Los resultados también muestran que la concentración del compuesto antisentido conjugado GalNAc3-1 en el riñón es menor que la del compuesto antisentido que carece del conjugado GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para las indicaciones terapéuticas donde no se busca actividad en el riñón, la exposición al riñón corre el riesgo de toxicidad renal sin el beneficio correspondiente. Además, la alta concentración en el riñón generalmente resulta en la pérdida de compuesto en la orina, lo que resulta en un aclaramiento más rápido. En consecuencia, para dianas no renales, la acumulación renal no es deseada. Estos datos sugieren que la conjugación GalNAc3-1 reduce la acumulación de riñón.
Tabla 23
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[0448] También se identificaron los metabolitos de ISIS 647535 y sus masas se confirmaron mediante análisis de espectrometría de masas de alta resolución. Los sitios de escisión y las estructuras de los metabolitos observados se muestran a continuación. El % relativo de ASO de longitud completa se calculó utilizando procedimientos estándar y los resultados se presentan en la Tabla 23a. El metabolito principal de ISIS 647535 era ASO de longitud completa que carecía de todo el conjugado (es decir, ISIS 304801), que resulta de la escisión en el sitio de escisión A, que se muestra a continuación. Además, también se observaron metabolitos adicionales resultantes de otros sitios de escisión. Estos resultados sugieren que la introducción de otros enlaces escindibles como ésteres, péptidos, disulfuros, fosforamidatos o acilhidrazonas entre el azúcar GalNAc3-1 y el ASO, que pueden ser escindidos por enzimas dentro de la célula, o que pueden escindirse en el ambiente reductor del citosol, o que son lábiles al pH ácido dentro de los endosomas y los lizosomas, también pueden ser útiles.
Tabla 23a
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ASO 304801
Sitios de escisión
Sitio de escisión A
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Ejemplo 21: Inhibición antisentido de ApoC III humano en ratones transgénicos ApoC III humanos en un estudio de administración única
[0449] ISIS 304801, 647535 y 647536 cada uno dirigido a ApoC III humano y descritos en la Tabla 17, se evaluaron adicionalmente en un estudio de administración única para su capacidad para inhibir ApoC III humano en ratones transgénicos ApoC III humanos.
Tratamiento
[0450] Los ratones transgénicos ApoCIII humanos se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum Teklad Chow de laboratorio. Los animales se aclimataron durante al menos 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Los ASO se prepararon en PBS y se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0,2 mieras. Los ASO se disolvieron en PBS al 0,9% para inyección.
[0451] Los ratones transgénicos ApoC III humanos se inyectaron intraperitonealmente una vez a la dosis mostrada a continuación con ISIS 304801,647535 o 647536 (descrita anteriormente) o con control tratado con PBS. El grupo de tratamiento consistió en 3 animales y el grupo de control consistió en 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la última administración.
[0452] Se recogieron muestras y se analizaron para determinar la III mARN de ApoC y los niveles de proteína en el hígado; triglicéridos plasmáticos; y el colesterol, incluidas las fracciones de HDL y LDL, se evaluaron como se describe anteriormente (Ejemplo 20). Los datos de esos análisis se presentan en las Tablas 24-28, a continuación. Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron en relación con ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. Los niveles de ALT y AST mostraron que los compuestos antisentido fueron bien tolerados en todas las dosis administradas.
[0453] Estos resultados muestran una mejora en la potencia de los compuestos antisentido que comprenden un conjugado GalNAc3-1 en el extremo 3’ (ISIS 647535 y 647536) en comparación con el compuesto antisentido que carece de un conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Además, ISIS 647536, que comprende un conjugado GalNAc3-1 y algunos enlaces fosfodiéster era tan potente como ISIS 647535, que comprende el mismo conjugado y todos los enlaces internucleosídicos dentro del ASO son fosforotioato.
Tabla 24
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Tabla 25
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(continuación)
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Tabla 26
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Tabla 27
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(Continuación)
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Tabla 28
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[0454] Estos resultados confirman que el conjugado GalNAc3-1 mejora la potencia de un compuesto antisentido. Los resultados también muestran la misma potencia de un compuesto antisentido conjugado GalNAc3-1 donde los oligonucleótidos antisentido tienen enlaces mixtos (ISIS 647536 que tiene seis enlaces fosfodiéster) y una versión de fosforotioato completo del mismo compuesto antisentido (ISIS 647535).
[0455] Enlaces fosforotioato proporcionan varias propiedades a compuestos antisentido. Por ejemplo, resisten la digestión de nucleasas y se unen a las proteínas, lo que resulta en la acumulación de compuestos en el hígado, en lugar de en el riñón/orina. Estas son propiedades deseables, particularmente cuando se trata una indicación en el hígado. Sin embargo, los enlaces de fosforotioato también se han asociado con una respuesta inflamatoria. En consecuencia, se espera que la reducción del número de enlaces de fosforotioato en un compuesto reduzca el riesgo de inflamación, pero también disminuya la concentración del compuesto en el hígado, aumente la concentración en el riñón y la orina, disminuya la estabilidad en presencia de nucleasas y disminuya la potencia general. Los resultados actuales muestran que un compuesto antisentido conjugado GalNAc3-1 donde ciertos enlaces de fosforotioato han sido reemplazados por enlaces de fosfodiéster es tan potente contra una diana en el hígado como una contraparte que tiene enlaces de fosforotioato completo. Se espera que dichos compuestos sean menos proinflamatorios (véase el Ejemplo 24 que describe un experimento que muestra la reducción de los resultados de PS en un efecto inflamatorio reducido).
Ejemplo 23: Protocolo de ensayo de células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMC)
[0456] El ensayo de hPBMC se realizó usando el método de tubo BD Vautainer CPT. Se obtuvo una muestra de sangre completa de donantes voluntarios con consentimiento informado en la clínica US HealthWorks (Faraday & El Camino Real, Carlsbad) y se recogió en 4-15 tubos BD Vacutainer CPT de 8 ml (VWR Cat. n° BD362753). El volumen de sangre total inicial aproximado en los tubos de CPT para cada donante se registró utilizando la hoja de datos del ensayo PBMC.
[0457] La muestra de sangre se mezcló inmediatamente antes de la centrifugación invirtiendo suavemente tubos 8-10 veces. Los tubos de CPT se centrifugaron a temperatura ambiente (18-25°C) en un rotor horizontal (abatible) durante 30 minutos a 1500-1800 RCF con freno apagado (2700 RPM Beckman Allegra 6R). Las células se recuperaron de la interfaz de la capa leucocitaria (entre Ficoll y capas de gel de polímero); transferido a un tubo cónico estéril de 50 ml y agrupado hasta 5 tubos CPT/tubo cónico de 50 ml/donante. Las células se lavaron dos veces con PBS (Ca++, Mg++ libre; GIBCO). Los tubos se rellenaron hasta 50 ml y se mezclaron invirtiendo varias veces. La muestra se centrifugó a 330 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (1215 RPM en Beckman Allegra 6R) y se aspiró la mayor cantidad de sobrenadante posible sin alterar el sedimento. El sedimento celular se desalojó girando suavemente el tubo y resuspendiendo las células en RPMI FBS al 10% pluma/estreptococo (~1 ml/10 ml comenzando el volumen de sangre total). Una muestra de 60 pl se añadió a un vial de muestra (Beckman Coulter) con 600 pl de reactivo VersaLyse (Beckman Coulter Cat n° A09777) y se agitó con vórtex suavemente durante 10-15 seg. La muestra se dejó incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y mezclar nuevamente antes de contar. La suspensión celular se contó en el analizador de viabilidad celular Vicell XR (Beckman Coulter) usando el tipo de célula PBMC (el factor de dilución de 1:11 se almacenó con otros parámetros). Se registraron la célula viva/ml y la viabilidad. La suspensión celular se diluyó a 1 x 107 PBMC vivo/ml en RPMI+ FBS al 10%+pen/estreptococo.
[0458] Las células se sembraron a 5 x 105 en 50 pl/pocillo de placa de cultivo tisular de 96 pocillos (Falcon Microtest).
50 pl/pocillo de 2x concentración de oligos/controles diluidos en RPMI 10% FBS+pen/estreptococo se agregó de acuerdo con la plantilla del experimento (100 pl/pozo total). Las placas se colocaron en el agitador y se dejaron mezclar durante aprox. 1 minuto. Después de incubarse durante 24 horas a 37°C; 5% de CO2 , las placas se centrifugaron a 400 x g durante 10 minutos antes de eliminar el sobrenadante para el ensayo de citocinas MSD (es decir, IL-6, IL-10, IL-8 y MCP-1 humanas).
Ejemplo 24: Evaluación de los efectos proinflamatorios en el ensayo hPBMC para los ASO conjugados con GalNAc3-1
[0459] Los oligonucleótidos antisentido (ASO) enumerados en la Tabla 30 se evaluaron para determinar el efecto proinflamatorio en el ensayo hPBMC usando el protocolo descrito en el Ejemplo 23. ISIS 353512 es un estándar interno que se sabe que es un gran respondedor para la liberación de IL-6 en el ensayo. Los hPBMCs se aislaron de fresco, se ofreció donantes y se trataron con ASO en 0,0,0128,0,064,0,32, 1,6, 8,40 y concentraciones de 200 pM. Después de un tratamiento de 24 horas, se midieron los niveles de citoquinas.
[0460] Los niveles de IL-6 se usaron como la lectura primaria. La CE50 y Emax se calcularon utilizando procedimientos estándar. Los resultados se expresan como la proporción promedio de Emax/CEsü de dos donantes y se denota como "Emax/CE50”. La proporción más baja indica una disminución relativa en la respuesta proinflamatoria y la proporción más alta indica un aumento relativo en la respuesta proinflamatoria.
[0461] Con respecto a los compuestos de prueba, el compuesto menos proinflamatorio fue el ASO unido a PS/PO (ISIS 6 16468). El ASO conjugado GalNAc3-1, ISIS 647535 fue ligeramente menos proinflamatorio que su contraparte no conjugada ISIS 304801. Estos resultados indican que la incorporación de algunos enlaces PO reduce la reacción proinflamatoria y la adición de un conjugado GalNAc3-1 no produce un compuesto más proinflamatorio y puede reducir la respuesta proinflamatoria. En consecuencia, cabría esperar que un compuesto antisentido que comprende enlaces PS/PO mixtos y un conjugado GalNAc3-1 produzca respuestas proinflamatorias más bajas en relación con el compuesto antisentido unido PS completo con o sin un conjugado GalNAc3-1. Estos resultados muestran que los compuestos antisentido conjugados con GalNAc3-1, particularmente aquellos que tienen un contenido reducido de PS, son menos proinflamatorios.
[0462] Juntos, estos resultados sugieren que un compuesto conjugado GalNAc3-1, particularmente uno con contenido reducido de PS, puede administrarse a una dosis más alta que un compuesto antisentido PS completo homólogo que carece de un conjugado GalNAc3-1. Dado que no se espera que la vida media sea sustancialmente diferente para estos compuestos, dicha administración más alta daría como resultado una dosificación menos frecuente. De hecho, dicha administración podría ser incluso menos frecuente, porque los compuestos conjugados de GalNAc3-1 son más potentes (véanse los ejemplos 2 0 -2 2 ) y es necesario volver a dosificar una vez que la concentración de un compuesto ha caído por debajo de un nivel deseado, donde dicho nivel deseado se basa en la potencia.
Tabla 30
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(continuación)
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[0463] Subíndices: "e" indica nucleósido modificado 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "k" indica nucleósido bicíclico 6'-(S)-CH3 (por ejemplo cEt); "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y "o" 'indica-OP(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. "Ado'-GalNAc3-1a" indica un conjugado que tiene la estructura GalNAc3-1 mostrada en el Ejemplo 9 unida al extremo 3' del oligonucleótido antisentido, como se indica.
Tabla 31
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Ejemplo 25: Efecto de ASO modificado conjugado con GalNAc3-1 d irigido a ApoC III humano in vitro
[0464] ISIS 304801 y 647535 descritos anteriormente se probaron in vitro. Las células de hepatocitos primarios de ratones transgénicos a una densidad de 25.000 células por pocillo se trataron con concentraciones de oligonucleótidos modificados de 0,03,0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 y 20 gm. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm mediante PCR cuantitativa en tiempo real y los niveles de ARNm de hApoC III se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN.
[0465] El CI50 se calculó utilizando los métodos estándar y los resultados se presentan en la Tabla 32. Como se ilustra, se observó una potencia comparable en células tratadas con ISIS 647535 en comparación con el control, ISIS 304801.
Tabla 32
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[0466] En este experimento, Los grandes beneficios de potencia de la conjugación GalNAc3-1 que se observan in vivo no se observaron in vitro. Los posteriores experimentos de absorción libre en hepatocitos primarios in vitro mostraron una mayor potencia de oligonucleótidos que comprenden varios conjugados de GalNAc en relación con oligonucleótidos que carecen del conjugado de GalNAc (ver ejemplos 60, 82 y 92)
Ejemplo 26: Efecto de los enlaces PO/PS sobre la actividad ApoC III ASO
[0467] Se inyectaron ratones transgénicos ApoC III humanos una vez por vía intraperitoneal una vez a 25 mg/kg de ISIS 304801 o ISIS 616468 (ambos descritos anteriormente) o con control tratado con PBS una vez por semana durante dos semanas. El grupo de tratamiento consistió en 3 animales y el grupo de control consistió en 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la última administración.
[0468] Se recogieron muestras y se analizaron para determinar los niveles de proteína ApoC III en el hígado como se describe anteriormente (Ejemplo 20). Los datos de esos análisis se presentan en la Tabla 33, a continuación.
[0469] Estos resultados muestran una reducción en la potencia de los compuestos antisentido con PO/PS (ISIS 616468) en las alas en relación con el PS completo (ISIS 304801).
Tabla 33
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Ejemplo 39: Método general para la preparación del compuesto oligom érico 83h que comprende un conjugado GalNAc3-3 en el extremo 5’ (GalNAc3-1 modificado para la unión del extremo 5') mediante soporte sólido [0470]
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[0471] El Compuesto 18 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 4. Los Compuestos 83a y 83b están disponibles comercialmente. El Compuesto oligomérico 83e que comprende una hexilamina unida a fosfodiéster se preparó usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estándar. El tratamiento del compuesto oligomérico protegido con amoniaco acuoso proporcionó el compuesto oligomérico conjugado 5'-GalNAc3-3 (83h).
[0472] En donde GalNAc3-3 tiene la estructura:
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[0473] La porción de clúster de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En donde GalNAc3-3a tiene la fórmula:
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Ejemplo 44: Efecto de los enlaces PO/PS sobre la inhibición antisentido de ASO que comprenden el conjugado GalNAc3-1 (ver Ejemplo 9) en el extremo 3’ d irig ido a SRB-1
[0474] ISIS 655861 y 655862 que comprende un conjugado GalNAc3-1 en el extremo 3’, cada uno dirigido a SRB-1 se evaluaron en un estudio de administración único para determinar su capacidad para inhibir SRB-1 en ratones. El compuesto no conjugado original, ISIS 353382, se incluyó en el estudio para comparación.
[0475] Los ASO son separadores de MOE 5-10-5, en donde la región de separación comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y cada región del ala comprende cinco nucleósidos modificados con 2'-MOE. Los ASO se prepararon usando métodos similares a los ilustrados anteriormente en el Ejemplo 19 y se describen en la Tabla 36, a continuación.
Tabla 36
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[0476] Subíndices: "e" indica nucleósido modificado 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y “o”‘ indica -O-P(=O)(OH)-. La superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. La estructura de "GalNAc3-1" se muestra en el Ejemplo 9.
Tratamiento
[0477] Se inyectaron por vía subcutánea ratones macho Balb/c de seis semanas (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) una vez a la dosis mostrada a continuación con ISIS 353382, 655861, 655862 o con control tratado con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron en relación con el ARN total (usando Ribogreen), antes de la normalización al control tratado con PBS. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizado al control tratado con PBS y se denota como "% PBS". Las DE50 se midieron utilizando métodos similares a los descritos anteriormente y se presentan a continuación.
[0478] Como se ilustra en la Tabla 37, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control tratado con PBS. De hecho, los oligonucleótidos antisentido que comprenden el conjugado GalNAc3- 1 en el extremo 3’ (ISIS 655861 y 655862) mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Además, ISIS 655862 con enlaces PS/PO mixtos mostró una mejora en la potencia en relación con el PS completo (ISIS 655861).
Tabla 37
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[0479] Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron en relación con ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron los pesos de los órganos. Los resultados demostraron que no se observaron elevación en los niveles de transaminasas (Tabla 38) o en los pesos de los órganos (datos no mostrados) en ratones tratados con ASO en comparación con el control de PBS. Además, el ASO con enlaces PS/PO mixtos (ISIS 655862) mostró niveles de transaminasas similares en comparación con el PS completo (ISIS 655861).
Tabla 38
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Ejemplo 45: Preparación de Éster PFP, Compuesto 110a
[0480]
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[0481] El Compuesto 4 (9,5 g, 28,8 mmoles) se trató con el compuesto 103a o 103b (38 mmoles), individualmente, y TMSOTf (0,5 eq.) y tamices moleculares en diclorometano (200 ml), y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. En ese momento, la capa orgánica se filtró a través de celite, luego se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. La capa orgánica se separó luego y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a presión reducida. El aceite resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice (2%--> 10% metanol/diclorometano) para dar los compuestos 104a y 104b con un rendimiento> 80%. LCMS y RMN de protones fueron consistentes con la estructura.
[0482] Los compuestos 104a y 104b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 105a y 105b con >90% de rendimiento. LCMS y RMN de protones fueron consistentes con la estructura.
[0483] Los compuestos 105a y 105b fueron tratados, de forma individual, con el compuesto 90 en las mismas condiciones que para los compuestos 901a-d, para dar compuestos 106a (80%) y 106b (20%). LCMS y RMN de protones fueron consistentes con la estructura.
[0484] Los compuestos 106a y 106b se trataron a las mismas condiciones que para los compuestos 96a-d (Ejemplo 47), para dar 107a (60%) y 107b (20%). LCMS y RMN de protones fueron consistentes con la estructura.
[0485] Los compuestos 107a y 107b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 97a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 108a y 108b con un rendimiento del 40-60%. LCMS y r Mn de protones fueron consistentes con la estructura.
[0486] Los compuestos 108a (60%) y 108b (40%) se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los compuestos 109a y 109b con rendimientos >80%. LCMS y RMN de protones fueron consistentes con la estructura.
[0487] El Compuesto 109a se trató en las mismas condiciones que para los compuestos 101a-d (Ejemplo 47), para dar el Compuesto 110a con un rendimiento del 30-60%. LCMS y RMN de protones fueron consistentes con la estructura. Alternativamente, el Compuesto 110b se puede preparar de manera similar comenzando con el Compuesto 109b.
Ejemplo 48: Preparación del o ligonucleótido 119 que comprende GalNAc3-7
[0488]
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[0489] El compuesto 112 se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en la literatura (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).
[0490] El compuesto 112 (5 g, 8,6 mmoles) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (22 ml/22 ml). Se añadió hidróxido de paladio sobre carbono (0,5 g). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de celite y se lavó con metanol/acetato de etilo 1:1. El filtrado y los lavados se combinaron y se concentraron a sequedad para producir el Compuesto 105a (cuantitativo). La estructura fue confirmada por LCMS.
[0491] El compuesto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) y DIEA (2,8 ml, 16,2 mmol) se disolvieron en DMF anhidro (17 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. min. A esto se añadió una solución del Compuesto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) en DMF anhidro (20 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se eliminó a presión reducida para obtener un aceite. El residuo se disolvió en CH2Cl 2 (100 ml) y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO 3 solución (100 ml) y salmuera (100 ml). La fase orgánica se separó, se secó (Na 2 SO 4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 10 al 20% en diclorometano para producir el Compuesto 114 (1,45 g, 30%). La estructura se confirmó por LCMS y análisis de 1H RMN.
[0492] El compuesto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (4 ml/4 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,14 g). La mezcla de reacción se lavó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron juntos y se evaporaron a presión reducida para producir el Compuesto 115 (cuantitativo). La estructura se confirmó por LCMS y análisis de 1H RMN.
[0493] El compuesto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) y DIEA (0,26 ml, 1,5 mmol) se disolvieron en DMF anhidro (5 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A esto se añadió una solución del Compuesto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) en DMF anhidro y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en CH2Cl2. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 saturado acuoso y salmuera y se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró. La capa orgánica se concentró hasta sequedad y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 3 al 15% en diclorometano para producir el Compuesto 116 (0,84 g, 61%). La estructura fue confirmada por LC MS y análisis de 1H RMN.
Figure imgf000084_0001
[0494] El compuesto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (5 ml/5 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,074 g). La mezcla de reacción se lavó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron y se evaporaron a presión reducida para producir el compuesto 117 (0,73 g, 98%). La estructura se confirmó por LCMS y análisis de 1H RMN.
[0495] El compuesto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) se disolvió en DMF anhidro (3 ml). A esta solución se añadieron N,N-diisopropiletilamina (70 gl, 0,4 mmol) y trifluoroacetato de pentafluorofenilo (72 gl, 0,42 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y se vertió en una solución acuosa saturada de NaHCO3. La mezcla se extrajo con diclorometano, se lavó con salmuera y se secó sobre Na2SO4 anhidro. La solución de diclorometano se concentró hasta sequedad y se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 5 al 10% en diclorometano para producir el compuesto 118 (0,51 g, 79%). La estructura fue confirmada por LCMS y 1H y 1H y 19F RMN.
Figure imgf000084_0002
[0496] Compuesto Oligomérico 119, que comprende un grupo conjugado GalNAc3-7, se preparó utilizando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La GalNAc3porción de clúster del grupo conjugado GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) puede ser combinado con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, el resto escindible es -P(=O)(OH)-A d -P(=O)(OH)-.
[0497] La estructura de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000085_0001
Ejemplo 51: Preparación del o ligonucleótido 155 que comprende GalNAc3-6
[0498]
Figure imgf000085_0002
[0499] El compuesto 146 se sintetizó como se describe en la literatura (Bioquímica analítica 1995, 229, 54-60).
Figure imgf000085_0003
[0500] El compuesto 4 (15 g, 45,55 mmol) y compuesto 35b (14,3 gramos, 57 mmol) se disolvieron en CH2CI2 (200 ml). Se añadieron tamices moleculares activados (4 Á. 2 g, en polvo), y la reacción se dejó agitar durante 30 minutos bajo atmósfera de nitrógeno. Se añadió TMS-OTf (4,1 ml, 22,77 mmol) y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. Tras completarse, la reacción se interrumpió vertiéndola en solución de NaHCO3 acuosa saturada (500 ml) y hielo triturado (~ 150 g). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró hasta un aceite naranja a presión reducida. El material en bruto se purificó por columna de gel de sílice de cromatografía y se eluyó con 2-10% de MeOH en CH2Cl2 para producir el Compuesto 112 (16,53 g, 63%). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el compuesto esperado.
[0501] El compuesto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (40 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono, 400 mg) y se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Al completar (TLC 10% de MeOH en CH2Cl2 , y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria, y se secó brevemente a alto vacío para producir el Compuesto 105a (3,28 g). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto deseado.
[0502] El compuesto 147 (2,31 g, 11 mmol) se disolvió en DMF anhidro (100 ml). Se añadió W,W-diisopropiletilamina (DIEA, 3,9 ml, 22 mmol), seguido de HBTU (4 g, 10,5 mmol). La mezcla de reacción se dejó agitar durante ~ 15 minutos bajo nitrógeno. A esto se añadió una solución del compuesto 105a (3,3 g, 7,4 mmoles) en DMF seco y se agitó durante 2 h en atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 acuosa saturada y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró, y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El producto crudo material se purificó por cromatografía en columna de 2-5% de MeOH en CH2CL para producir el Compuesto 148 (3,44 g, 73%). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto esperado.
[0503] El compuesto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (75 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (350 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completado (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para producir el Compuesto 149 (2,6 g). LCMS fue consistente con el producto deseado. El residuo se disolvió en DMF seco (10 ml) se usó inmediatamente en el siguiente paso.
Figure imgf000086_0001
[0504] El compuesto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) se disolvió en DMF seco (20 ml). A esta DIEA (450 pl, 2,6 mmol, 1,5 eq.) y HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol) se añadieron. La mezcla de reacción se dejó agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se añadió una solución del compuesto 149 (2,6 g) en DMF anhidro (10 ml). El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de DIEA (si es necesario). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 h. Al finalizar la reacción se diluyó con EtOAc (100 ml), y se lavó con solución acuosa de NaHCO3 acuosa saturada, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con 2-10% de MeOH en CH2Cl2 para producir el Compuesto 150 (0,62 g, 20%). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto deseado.
[0505] El compuesto 150 (0,62 g) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (5 l). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (60 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completado (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringa, 0,45 pm). El filtrado se concentró por evaporación rotativa y se secó brevemente a alto vacío para producir el Compuesto 151 (0,57 g). El LCMS fue consistente con el producto deseado. El producto se disolvió en 4 ml de DMF seco y se usó inmediatamente en el siguiente paso.
Figure imgf000087_0001
[0506] El compuesto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) se disolvió en DMF anhidro (5 ml) y se añadieron W,W-diisopropiletilamina (75 pl, 1 mmol) y PFP-TFA (90 pl, 0,76 mmol). La mezcla de reacción se volvió magenta al contacto y gradualmente se volvió naranja durante los siguientes 30 minutos. El progreso de la reacción se controló por TLC y LCMS. Al finalizar (formación del éster PFP), se añadió una solución del compuesto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) en DMF. El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de N,N-diisopropiletilamina (si es necesario). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. Al finalizar, la mayoría del disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2Cl2 y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró hasta un jarabe de naranja. El residuo se purificó por gel de sílice cromatografía en columna (2-10% de MeOH en CH2Cl2) para producir el Compuesto 152 (0,35 g, 55%). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto deseado.
[0507] El compuesto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (10 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió el catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (35 mg). Se burbujeó hidrógeno gaseoso a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completado (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringa, 0,45 gm). El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para producir el Compuesto 153 (0,33 g, cuantitativo). El LCMS fue consistente con el producto deseado.
[0508] El compuesto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) se disolvió en DMF anhidro (5 ml) con agitación bajo nitrógeno. A esto se añadieron N,N-diisopropiletilamina (65 gl, 0,37 mmol) y PFP-TFA (35 gl, 0,28 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. La mezcla de reacción se volvió magenta al contacto y gradualmente se volvió naranja. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a pH = 9-10 añadiendo más N,-Diisopropiletilamina. El progreso de la reacción se controló por TLC y LCMS. Al finalizar, la mayoría del disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2Cl2 (50 ml), y se lavó con NaHCO3 acuosa saturada, seguido de salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró, y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna y se eluyó con 2-10% de MeOH en CH2Cl2 para producir el compuesto 154 (0,29 g, 79%). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto deseado.
Figure imgf000088_0001
[0509] Compuesto Oligomérico 155, que comprende un grupo conjugado GalNAc3-6, se preparó utilizando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La porción de clúster GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-6 (GalNAc3-6a) pueden ser combinados con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, el resto escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
[0510] La estructura de GalNAc3-6 (GalNAc3-6a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000088_0002
Ejemplo 56: Estudio dependiente de la dosis de oligonucleótidos que comprende un grupo conjugado 3’ o 5' (comparación de GalNAc3-1 ,2, 3, 5, 6, 7 y 10) dirigidos a SRB-1 in vivo
[0511] Los oligonucleótidos enumerados a continuación se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones. El ISIS 353382 no conjugado se incluyó como estándar. Cada uno de los diversos grupos conjugados de GalNAc3 se unió en el extremo 5’ del oligonucleótido respectivo mediante un nucleósido de 2'-desoxiadenosina (resto escindible) unido a fosfodiéster, excepto ISIS 655861 que tenía el grupo conjugado GalNAc3 unido en el extremo 3'.
Tabla 42
Figure imgf000089_0002
[0512] Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metilo citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido modificado 2'-MOE; "d" indica un p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico de fosforotioato (PS); "o" indica un enlace internucleosídico de fosfodiéster (PO); y "o" 'indica -O-P(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
[0513] La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-2a se mostró anteriormente en el Ejemplo 37. La estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-5a se mostró previamente en el Ejemplo 49. La estructura de GalNAc3-6a se mostró anteriormente en el Ejemplo 51. La estructura de GalNAc3-7a se mostró anteriormente en el Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se mostró previamente en el Ejemplo 46.
Tratamiento
[0514] Se inyectaron por vía subcutánea ratones macho Balb/c de seis semanas (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) una vez a la dosis mostrada a continuación con ISIS 353382, 655861,664507, 661161,666224, 666961,666981, 666881 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de solución salina.
[0515] Como se ilustra en la Tabla 43, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis. De hecho, los oligonucleótidos antisentido conjugados mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Los oligonucleótidos antisentido conjugados 5’ mostraron un ligero aumento en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido conjugado 3'.
Tabla 43
Figure imgf000089_0001
(continuación)
Figure imgf000090_0002
[0516] Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron en relación con ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron la bilirrubina total y BUN. El cambio en los pesos corporales se evaluó sin un cambio significativo del grupo de solución salina. Los valores de ALT, AST, bilirrubina total y BUN se muestran en la Tabla 44 a continuación.
Tabla 44
Figure imgf000090_0001
(continuación)
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Ejemplo 57: Duración del estudio de acción de oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado 3’ dirigido a ApoC III in v ivo
[0517] A los ratones se les inyectaron una vez las dosis indicadas a continuación y se monitorizaron durante 42 días para detectar ApoCI 1 y niveles de triglicéridos en plasma (Plasma TG). El estudio se realizó con 3 ratones transgénicos que expresan APOC-III humano en cada grupo.
Tabla 45
Figure imgf000091_0002
[0518] Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metilo citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido modificado 2'-MOE; "d" indica un p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico de fosforotioato (PS); "o" indica un enlace internucleosídico de fosfodiéster (PO); y "o" 'indica -O-P(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
[0519] La estructura de GalNAc3-1 a se mostró previamente en el Ejemplo 9.
Tabla 46
Figure imgf000091_0003
[0520] Como se puede ver en la tabla anterior, la duración de la acción aumentó con la adición del grupo conjugado 3’ en comparación con el oligonucleótido no conjugado. Hubo un aumento adicional en la duración de la acción para el oligonucleótido PO/PS mixto conjugado 647536 en comparación con el oligonucleótido PS conjugado completo 647535.
Ejemplo 79: Duración de la acción in v iv o de oligonucleótidos d irigidos a APOC-III que comprende un conjugado GalNAc3
[0521] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 70 a continuación se probaron en un estudio de dosis única para la duración de la acción en ratones.
Tabla 70
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Tratamiento
[0522] Cada uno de los ratones transgénicos de seis a ocho semanas de edad que expresan APOC-III humano se inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido que figura en la Tabla 70 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 3 animales. Se extrajo sangre antes de la dosificación para determinar la línea base y a las 72 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas y 6 semanas después de la dosis. Los niveles de triglicéridos plasmáticos y proteínas APOC-III se midieron como se describe en el Ejemplo 20. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de triglicéridos plasmáticos y APOC-III para cada grupo de tratamiento, normalizados a los niveles basales, lo que demuestra que los oligonucleótidos que comprenden un GalNAc El grupo conjugado exhibió una acción de mayor duración que el oligonucleótido original sin un grupo conjugado (ISIS 304801) a pesar de que la dosis del padre fue tres veces la dosis de los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc.
Tabla 71
Figure imgf000093_0001
Ejemplo 80: Inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos d irigidos a la antitripsina alfa-1 (A1AT) que comprende un conjugado GalNAc3
[0523] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 72 a continuación se probaron en un estudio para la inhibición dependiente de dosis de A1AT en ratones.
Tabla 72
Figure imgf000094_0001
Tratamiento
[0524] Se inyectaron ratones C57BL/6 machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) cada uno por vía subcutánea una vez por semana a una dosis que se muestra a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm de hígado de A1AT se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de proteína plasmática de A1AT se determinaron utilizando el ELISA de alfa 1 -antitripsina de ratón (catálogo n° 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de ARNm de hígado A1AT y los niveles de proteínas plasmáticas para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control de PBS.
[0525] Como se ilustra en la Tabla 73, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm hepático A1AT y de proteína plasmática A1AT de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron significativamente más potentes que el progenitor (ISIS 476366).
Tabla 73
Figure imgf000094_0002
(Continuación)
Figure imgf000095_0001
[0526] Se midieron los niveles de transaminasa de hígado y BUN en plasma en el momento del sacrificio usando protocolos estándar. También se midieron los pesos corporales y de órganos. Los resultados se muestran en la Tabla 74 a continuación. El peso corporal se muestra como % en relación con la línea de base. Los pesos de los órganos se muestran como % del peso corporal en relación con el grupo de control PBS.
Tabla 74
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Ejemplo 81: Duración de la acción in v ivo de oligonucleótidos que hibridan A1AT que comprende un clúster de GalNAc3
[0527] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 72 se ensayaron en un estudio de dosis única para duración de la acción en ratones.
Tratamiento
[0528] Se inyectaron ratones C57BL/6 machos de seis semanas de edad por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido que figura en la Tabla 72 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar la línea base y a los 5, 12, 19 y 25 días después de la dosis. Los niveles de proteína A1AT en plasma se midieron mediante ELISA (véase el Ejemplo 80). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de proteína A1AT en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles basales. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes y tuvieron una mayor duración de acción que el progenitor que carecía de un conjugado GalNAc (ISIS 476366). A demás, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383 y 678384) fueron generalmente incluso más potentes con una duración de acción aún más larga que el oligonucleótido que comprende un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656326).
Tabla 75
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Ejemplo 82: Inhibición antisentido in vitro por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprende un conjugado GalNAc3
[0529] Se sembraron hepatocitos de hígado de ratón primario en placas de 96 pocillos a 15.000 células/pocillo 2 horas antes del tratamiento. Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 76 se agregaron a 2, 10, 50 o 250 nM en medio Williams E y las células se incubaron durante la noche a 37°C en 5% de CO2. Las células se lisaron 16 horas después de la adición de oligonucleótidos, y el ARN total se purificó usando RNeasa 3000 BioRobot (Qiagen). Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los valores de CI50 se determinaron usando el software Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden una variedad de diferentes grupos conjugados de GalNAc y una variedad de restos escindibles diferentes son significativamente más potentes en un experimento de absorción libre in vitro que los oligonucleótidos originales que carecen de un grupo conjugado de GalNAc (ISIS 353382 y 666841).
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Ejemplo 83: Inhibición antisentido in v ivo por o ligonucleótidos que hibridan en Factor XI que comprende un clúster GalNAc3
[0530] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 a continuación se ensayaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis de Factor XI en ratones.
Tabla 77
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Tratamiento
[0531] Cada uno de los ratones de seis a ocho semanas de edad se inyectó por vía subcutánea una vez por semana a una dosis que se muestra a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado a continuación o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la dosis final. Los niveles de ARNm de hígado del factor XI se midieron usando PCR en tiempo real y se normalizaron a ciclofilinA de acuerdo con protocolos estándar. También se midieron las transaminasas hepáticas, BUN y bilirrubina. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio para cada grupo de tratamiento, normalizado para el control PBS.
[0532] Como se ilustra en la Tabla 78, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo el ARNm de hígado de Factor XI de una manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc eran más potentes que el progenitor que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). A demás, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron incluso más potentes que el oligonucleótido que comprende un conjugado 3’-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 78
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Ejemplo 84: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos al Factor XI que comprende un conjugado de GalNAc3
[0533] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 se probaron en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
[0534] Cada uno de los ratones de seis a ocho semanas se inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido que figura en la Tabla 77 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. La sangre se extrajo mediante hemorragias en la cola el día antes de la dosificación para determinar la línea base y a los 3, 10 y 17 días después de la dosis. Los niveles de proteína del Factor XI en plasma se midieron por ELISA usando captura de Factor XI y anticuerpos de detección biotinilados de R & D Systems, Minneapolis, MN (catálogo n° AF2460 y n° BAF2460, respectivamente) y el conjunto B de reactivos OptElA (catálogo n° 550534, BD Biosciences, San José, CA). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de proteína del Factor XI en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizado a los niveles basales. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc fueron más potentes con una mayor duración de acción que el progenitor que carece de un conjugado GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron aún más potentes con una duración de acción aún más larga que el oligonucleótido que comprende un conjugado 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 79
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Ejemplo 92: Inhibición antisentido en hepatocitos primarios por oligonucleótidos antisentido dirigidos a Apo-CIII que comprende un conjugado GalNAc3
[0535] Se sembraron hepatocitos primarios de ratón en placas de 96 pocilios a 15.000 células por pocilio, y los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 99, dirigidos a ratón de ApoC-III, se añadieron a 0,46, 1,37, 4,12 o 12,35, 37,04, 111,11 o 333,33 nM o 1,00 pm. Después de la incubación con los oligonucleótidos durante 24 horas, las células se lisaron y el ARN total se purificó usando RNeasy (Qiagen) Los niveles de ARNm de ApoC-III se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc.) de acuerdo con protocolos estándar. Los valores de CI50 se determinaron usando el software Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que, independientemente de si el resto escindible era un fosfodiéster o unA desoxia densoína unida a fosfodiéster, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc eran significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carece de un conjugado.
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Ejemplo 93: Inhibición antisentido in v ivo por o ligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprende alas mixtas y un conjugado 5'-GalNAc3
[0536] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 100 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 100
Figure imgf000105_0001
Tratamiento
[0537] Se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) una vez a la dosis mostrada a continuación con un oligonucleótido listado en la Tabla 100 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado se midieron usando PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de SRB-1 se normalizaron a los niveles de ARNm de ciclofilina según los protocolos estándar. Los resultados se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento en relación con el grupo de control de solución salina. Como se ilustra en la Tabla 101, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis, y los oligonucleótidos gápmero que comprenden un conjugado GalNAc y que tenían alas que eran modificaciones completas de cEt o azúcar mezclada fueron significativamente más potentes que los padres oligonucleótido que carece de un conjugado y que comprende alas modificadas con cEt completo.
[0538] También se midieron los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y el BUN, y los valores promedio para cada grupo de tratamiento se muestran en la Tabla 101. El peso corporal se muestra como el porcentaje promedio de peso corporal en relación con el peso corporal basal (% BL) medido justo antes de la dosis de oligonucleótido.
Tabla 101
Figure imgf000106_0001
Ejemplo 95: Inhibición antisentido in v ivo por o ligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprende nucleósidos bicíclicos y un conjugado 5'-GalNAc3
[0539] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 104 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 104
Figure imgf000106_0002
Tratamiento
[0540] El estudio se completó utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 93. Los resultados se muestran en la Tabla 105 a continuación y muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc y varias modificaciones de nucleósidos bicíclicos fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carece de un conjugado y que comprende modificaciones de nucleósidos bicíclicos. A demás, el oligonucleótido que comprende un conjugado de GalNAc y modificaciones de fluoro-HNA fue significativamente más potente que el progenitor que carece de un conjugado y que comprende modificaciones de fluoro-HNA. Los resultados de los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y las mediciones de BUN indicaron que todos los compuestos fueron bien tolerados.
Tabla 105
Figure imgf000107_0002
Ejemplo 96: Unión a proteínas plasmáticas de oligonucleótidos antisentido que comprenden un grupo conjugado GalNAc3
[0541] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 70 dirigidos a ApoC-III y los oligonucleótidos en la Tabla 106 dirigidos a Apo (a) se probaron en un ensayo de ultrafiltración para evaluar unión a proteínas plasmáticas.
Tabla 106
Figure imgf000107_0001
(continuación)
Figure imgf000108_0001
[0542] Las unidades de ultrafiltración Ultrafree-MC (30.000 NMWL, membrana de celulosa regenerada de baja unión, Millipore, Bedford, MA) se acondicionaron previamente con 300 gl de Tween 80 al 0,5% y se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos, luego con 300 gl de una solución de 300 gg/ml de un oligonucleótido de control en H2O y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. A fin de evaluar la unión no específica a los filtros de cada oligonucleótido de prueba a partir de las Tablas 70 y 106 para ser utilizado en los estudios, 300 gl de una solución de 250 ng/ml de oligonucleótido en H2O a pH 7,4 se colocó en el filtros preacondicionados y centrifugados a 2000 g durante 16 minutos. Las muestras no filtradas y filtradas se analizaron mediante un ensayo ELISA para determinar las concentraciones de oligonucleótidos. Se utilizaron tres réplicas para obtener una concentración promedio para cada muestra. La concentración promedio de la muestra filtrada con respecto a la muestra no filtrada se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótido que se recupera a través del filtro en ausencia de plasma (% de recuperación).
[0543] Las muestras de plasma entero congelado recogidas en K3-EDTA de voluntarios humanos normales libres de drogas, monos cynomolgus y ratones CD-1, se compraron de Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Los oligonucleótidos de prueba se añadieron a alícuotas de plasma de 1,2 ml a dos concentraciones (5 y 150 gg/ml). Se colocó una alícuota (300 gl) de cada muestra de plasma enriquecida en una unidad de filtro preacondicionada y se incubó a 37°C durante 30 minutos, seguido inmediatamente por centrifugación a 2000 g durante 16 minutos. Se analizaron alícuotas de muestras de plasma enriquecidas filtradas y sin filtrar mediante un ELISA para determinar la concentración de oligonucleótidos en cada muestra. Se usaron tres réplicas por concentración para determinar el porcentaje promedio de oligonucleótido unido y no unido en cada muestra. La concentración promedio de la muestra filtrada en relación con la concentración de la muestra no filtrada se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótidos en el plasma que no está unido a las proteínas plasmáticas (% no unido). Los valores finales de oligonucleótidos no unidos se corrigen para la unión no específica dividiendo el % no unido por el % de recuperación para cada oligonucleótido. Los valores finales de % de oligonucleótidos enlazados se determinan restando los valores finales de % no unidos de 100. Los resultados se muestran en la Tabla 107 para las dos concentraciones de oligonucleótido analizadas (5 y 150 gg/ml) en cada especie de plasma. Los resultados muestran que los grupos conjugados de GalNAc no tienen un impacto significativo en la unión a proteínas plasmáticas. A demás, los oligonucleótidos con enlaces internucleósidos PS completos y enlaces PO/PS mixtos se unen a proteínas plasmáticas, y aquellos con enlaces PS completos se unen a proteínas plasmáticas en un grado algo mayor que aquellos con enlaces PO/PS mixtos.
Tabla 107
Figure imgf000108_0002
Ejemplo 98: Evaluación de los efectos proinflamatorios de los oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc en el ensayo de hPMBC
[0544] Los oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 109 y se analizaron para determinar los efectos proinflamatorios en un ensayo de hPMBC como se describe en los Ejemplos 23 y 24. (Ver Las tablas 30, 83, 95 y 108 para las descripciones de los oligonucleótidos.) ISIS 353512 es un alto respondedor utilizado como control positivo, y los otros oligonucleótidos se describen en las tablas 83, 95 y 108. Los resultados que se muestran en la tabla 109 fueron obtenidos usando sangre de un donante voluntario. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden enlaces internucleósidos de PO/PS mixtos produjeron respuestas proinflamatorias significativamente más bajas en comparación con los mismos oligonucleótidos que tienen enlaces PS completos. A demás, el grupo conjugado GalNAc no tuvo un efecto significativo en este ensayo.
Tabla 109
Figure imgf000109_0002
Ejemplo 99: Afinidades de unión de oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc para el receptor de asialoglicoproteínas
[0545] Las afinidades de unión de los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 110 (ver la Tabla 76 para las descripciones de los oligonucleótidos) para el receptor de asialoglicoproteína se probaron en un ensayo de unión competitiva al receptor. El ligando de la competencia, la glicoproteína ácida a1 (AGP), se incubó en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 horas a 37°C, y el ácido siálico confirmó >90% de desialilación por ensayo o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se usó monocloruro de yodo para yodar el AGP según el procedimiento de Atsma et al. (véase J Lipid Res. 1991 enero; 32 (1): 173-81.) En este método, se añadió glicoproteína ácida a1 desialilada (de-AGP) a cloruro de yodo 10 mM, Na125I y glicina 1 M en NaOH 0,25 M. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, 125I marcado con de-AGP se separó del libre 125I concentrando la mezcla de dos veces utilizando una columna giratoria 3 KDMWCO. Se probó la eficacia y la pureza del etiquetado de la proteína en un sistema HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7,8x300 mm) y un contador de p-RAM. Los experimentos de competición que utilizan de-AGP marcado con 125I y varios ASOs contienen GalNAc-racimo se realizaron como sigue. Las células HepG2 humanas (106 células/ml) se colocaron en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiado. Se usaron medios MEM suplementados con suero bovino fetal al 10% (FBS), L-Glutamina 2 mM y HEPES 10 mM. Las células se incubaron 16-20 horas a 37°C con 5% y 10% de CO2 respectivamente. Las células se lavaron con medios sin FBS antes del experimento. Las células se incubaron durante 30 min a 37°C con 1 ml de competencia de la mezcla que contiene medios de cultivo apropiados con 2% de FBS, 10­ 8 M de-AGP marcado con 125I y cluster de GalNAc que contiene ASOs en concentraciones que van desde 10-11 a 10-5 M. La unión no específica se determinó en presencia de azúcar GalNAc 10-2 M. Las células se lavaron dos veces con medios sin FBS para eliminar el desagregador marcado con 125l no unido y el competidor GalNAc ASO. Las células se lisaron usando tampón RLT de Qiagen que contenía 1% de p-mercaptoetanol. Los lisados se transfirieron a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 minutos y analizado en un contador y. La unión no específica se restó antes de dividir los recuentos de proteínas 125I por el valor de los recuentos de concentración de GalNAc-ASO más bajos. Las curvas de inhibición se ajustaron de acuerdo con una ecuación de unión de competencia de sitio único utilizando un algoritmo de regresión no lineal para calcular las afinidades de unión (Kd's).
[0546] Los resultados en la Tabla 110 se obtuvieron de experimentos realizados en cinco días diferentes. Los resultados para los oligonucleótidos marcados con el superíndice "a" son el promedio de los experimentos realizados en dos días diferentes. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc en el extremo 5’ se unen al receptor de asialoglicoproteína en células HepG2 humanas con una afinidad 1,5 a 16 veces mayor que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc en el extremo 3'.
Tabla 110
Figure imgf000109_0001
Ejemplo 101: Inhibición antisentido por oligonucleótidos que comprende un grupo GalNAc unido a través de un resto estable
[0547] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 112 se analizaron para la inhibición de la expresión de APOC-III de ratón in vivo. Cada uno de los ratones C57BI/6 se inyectó por vía subcutánea una vez con un oligonucleótido listado en la Tabla 112 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Cada ratón tratado con ISIS 440670 recibió una dosis de 2, 6, 20 o 60 mg/kg. Cada ratón tratado con ISIS 680772 o 696847 recibió 0,6, 2, 6 o 20 mg/kg. El grupo conjugado GalNAc de ISIS 696847 está unido a través de un resto estable, un enlace de fosforotioato en lugar de un enlace que contiene fosfodiéster fácilmente escindible. Los animales fueron sacrificados 72 horas después de la dosis. Los niveles de ARNm de APOC-III en el hígado se midieron usando PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de APOC-III se normalizaron a niveles de ARNm de ciclofilinA de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados se presentan en la Tabla 112 como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de APOC-III para cada grupo de tratamiento en relación con el grupo de control de solución salina. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado GalNAc fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido que carece de un grupo conjugado. A demás, el oligonucleótido que comprende un grupo conjugado de GalNAc unido al oligonucleótido a través de un resto escindible (ISIS 680772) fue incluso más potente que el oligonucleótido que comprende un grupo conjugado de GalNAc unido al oligonucleótido a través de un resto estable (ISIS 696847).
Tabla 112
Figure imgf000110_0002
Ejemplo 103: Duración de la acción in v iv o de oligonucleótidos d irigidos a APOC-III que comprende un conjugado GalNAc3
[0548] Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 114 a continuación se probaron en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tabla 114
Figure imgf000110_0001

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobase que comprende 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 3533 a 3552 de SEQ ID NO: 3, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a la SEQ ID NO: 3; y en donde el grupo conjugado comprende:
Figure imgf000164_0001
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde:
(i) el oligonucleótido modificado comprende al menos un azúcar modificado, en donde opcionalmente: (a) al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico, o (b) al menos un azúcar modificado comprende 2’-O-metoxietilo, un constreñido etilo, un extremo 3'-fluoro-HNA o un puente 4’-(CH2)n-O-2', en donde n es 1 o 2, (ii) al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada, opcionalmente en donde la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina, y/o
(iii) el oligonucleótido modificado comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, en donde opcionalmente el enlace internucleósido modificado es un enlace internucleosido de fosforotioato.
3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el oligonucleótido modificado es monocatenario.
4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el grupo conjugado está unido al oligonucleótido modificado en el extremo 5’ del oligonucleótido modificado.
5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el grupo conjugado está unido al oligonucleótido modificado en el extremo 3’ del oligonucleótido modificado.
6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el grupo conjugado comprende:
Figure imgf000164_0002
en donde el resto escindible (CM) es un enlace o grupo que es capaz de dividirse en condiciones fisiológicas.
7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde el grupo conjugado comprende:
Figure imgf000165_0001
8. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5’ que consiste en nucleósidos enlazados;
un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
9. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados;
un segmento de ala 3’ que consta de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2’-O-metoxietilo, y donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
10. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato.
11. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados con la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 87, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5’ que consta de cinco nucleósidos enlazados;
un segmento de ala 3’ que consta de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5’ y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde cada enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato y en donde cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
12. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:
Figure imgf000166_0001
en donde R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente,
en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)-, O-CH2CH2-, y R1 y R2 están conectados directamente de modo que el puente resultante se seleccione entre: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: o bien R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2-, -CH(CH3)-, O-CH2CH2-y R3 y R4 están conectados directamente de manera que el puente resultante se seleccione entre: -O-CH2-, -OCH(CH3)-y -O-CH2CH2-;
y R5 se selecciona entre H y -CH3 ;
y Z se selecciona de S- y O-.
13. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la fórmula:
Figure imgf000167_0001
14. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde el compuesto está en forma de sal, en donde opcionalmente el compuesto está en forma de una sal de sodio y/o potasio.
15. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o una composición de la reivindicación 15, para uso en terapia.
17. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o una composición de la reivindicación 15, para uso en:
a) prevenir, tratar, mejorar o ralentizar la progresión de una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular, metabólica y/o inflamatoria; o
b) tratar, prevenir o retrasar la progresión de hipertrigliceridemia, FCS, pancreatitis, diabetes o dislipidemia.
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