CN117222434A - 缀合寡核苷酸和碳水化合物的新组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的组合物和用于寡核苷酸与配体缀合的连接构型，用于寡核苷酸的体内靶向递送。本发明还提供所得化合物及其药物组合物在制备有效治疗疾病或病症的药物中的用途。

Description

缀合寡核苷酸和碳水化合物的新组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月18日提交的共同待决的序列号为63/151,060的美国临时申请的优先权和利益，该申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及新组合物和可用于将碳水化合物配体与用于生物医学用途的寡核苷酸缀合的方法。
背景技术
基因调节，尤其是基因沉默寡核苷酸一直是许多研究和开发工作的重点，因为这一连串的核苷酸在治疗或预防许多疾病以及调节生理情况方面具有巨大的前景。这些寡核苷酸的实例包括短/小干扰RNA(siRNA)、不对称短/小干扰RNA(aiRNA)、反义寡核苷酸(ASO)和微小RNA(miRNA)。
RNA干扰(RNAi)通过短双链RNA(dsRNA)双链体(称为siRNA)以基因特异性方式在许多生物体中起作用。siRNA具有明确的对称短(通常为20-24个碱基对)dsRNA双链体结构，其具有磷酸化的5'末端和羟基化的3'末端，形成两个相等长度的3'突出端。基因调节通过多蛋白RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导，该复合物结合、解旋并掺入来自siRNA双链体的反义siRNA链，然后识别并靶向互补的信使RNA(mRNA)进行切割，从而以转录后的方式减少其基因表达。
相对较新的场景下，开发了为克服由对称构型的标准siRNA的正义链以及siRNA的其他脱靶机制介导的脱靶效应的aiRNA(参见PCT专利出版物WO2009029688)。aiRNAs被设计为包含短RNA双链体，其中两条RNA链的长度不相等，因此被称为“不对称”。例如，aiRNA可以包括长度为18-23个核苷酸的第一条链和长度为12-17个核苷酸的第二条链，从而形成第一条链可能有1-9个核苷酸的3’突出端和0-8个核苷酸的5’突出端的双链体。aiRNA技术可用于当前siRNA或短发夹RNA(shRNA)正在应用的所有领域，包括生物学研究、生物技术和制药行业的研究与开发(R&D)、以及基于RNAi的治疗。
反义技术是一种高选择性的基因沉默技术，其基于最初于1978年提出的概念(Zamecnik P.C.et al.,1978)。通常，ASO技术背后的原理是反义寡核苷酸与靶核酸杂交，并通过转录后机制调节基因表达。其机制大致可分为：(1)仅占位而不促进RNA降解，其中ASO的结合导致翻译停滞、剪接抑制或诱导可变剪接变体，或(2)占位诱导的失稳，其中ASO的结合促进通过内源性酶降解RNA，如核糖核酸酶H1(RNase H1)；和(3)提高翻译：ASO可以阻断在5’UTR区域的上游开放阅读框(uORFs)或其他抑制性元件，以提高翻译效率(StanleyT.Crooke et al.,2008；C.Frank Bennett,2010；Richard G.Lee,2013；StanleyT.Crooke,2017)。ASO的典型结构是具有硫化学修饰(称为硫代磷酸酯)的单链脱氧核苷酸序列。经过40年的研究，通过对单链寡核苷酸的各种化学修饰，使得反义技术得到了提高。
miRNA分子通常来源于RNA转录物的非编码区，这些转录物的非编码区会折叠到自身上形成发夹。在通过各种细胞机制将其前体加工后，在植物、动物和一些病毒中发现的成熟miRNA是一种小(约22个核苷酸)RNA分子，通过转录后沉默来调节基因表达。
基于这些和其他核酸的疗法为多种疾病提供了有希望的治疗方案，包括非成药靶点。然而，尽管寡核苷酸和寡核苷酸类似物作为治疗方案的应用取得了进展，但仍然存在着增强这些治疗性寡核苷酸的关键药理学性质的巨大需求，例如在血清稳定性、向预期器官或细胞群体的递送以及跨细胞膜的摄取等领域。
将治疗性寡核苷酸优选地递送到体内细胞，例如哺乳动物体内，如人体内，需要特定的靶向性和免受体内细胞外环境包括血清中蛋白质影响的保护。研究人员用来实现特定的靶向性的一种方法是将靶向部分与寡核苷酸缀合，以将治疗性寡核苷酸靶向所需的靶位点。
提高递送特异性的一种方法是利用体内已经存在的受体介导的内吞活动。摄取机制包括与细胞膜受体结合的分子通过膜结构的内陷或通过递送系统与细胞膜的融合，以跨膜运动进入细胞。这一过程是通过特定配体与受体结合后，激活细胞表面受体或膜受体来启动的。因此，通过将候选药物与靶向此类细胞表面受体的靶向部分缀合，可以有效地借用先天性内吞途径进行药物递送。已知并研究了许多受体介导的内吞系统，包括识别糖类的受体介导的内吞系统，包括半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、肽和蛋白质，如转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白、维生素B12、胰岛素和表皮生长因子(EGF)。特别是，去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R，Asialoglycoprotein receptor)是肝细胞上一种高度丰富的受体。ASGP-R对N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc，N-Acetyl-D-Galactosylamine)的亲和力比对D-Gal的亲和力高50倍。然而，据报道，在使用这种缀合系统时，连接体结构设计和连接体部分的各种化学属性对决定所缀合的寡核苷酸的整体递送效率、有效性和安全性，以及对各种治疗性寡核苷酸的稳定性和制造挑战的影响至关重要。
因此，迫切需要为各种生物医学应用设计新的和有效的受体特异性、配体缀合的核酸复合物。
发明概述
第一方面，本发明涉及一种作为治疗剂的化合物，其中寡核苷酸与至少一个配体缀合，例如碳水化合物配体，例如单糖、双糖、三糖、四糖、低聚糖、多糖或其衍生物，它可以将化合物靶向肝脏中的受体细胞，从而促进如上所述的内吞摄取。
这些配体缀合化合物靶向一种或多种器官或细胞类型，例如，人类肝脏的实质细胞。在一个实施方案中，该化合物包括一个以上的碳水化合物配体，优选两个或三个。在另一个实施方案中，本发明化合物包括至少一个(例如，一个、两个或三个或更多个)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc，N-Acetyl-Galactosamine)、N-乙酰-葡萄糖胺(GluNAc，N-Ac-Glucosamine)、半乳糖、乳糖或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸)。在又一个实施方案中，本发明化合物包括至少一个(例如，一个、两个或三个或更多个)配体，其中配体选自由以下组成的组：GalNAc、胆固醇、生育酚、生物素、菁染料、叶酸、RGDp、转铁蛋白、茴香酰胺、乳糖酸、cRGD、透明质酸、低分子量鱼精蛋白、脂质衍生物、肽、环肽和杂环。
第二方面，本发明提供了具有新颖结构的配体缀合化合物：
项1，一种化合物，具有结构式(G-H1)：
其中：
R111、R112、R113对于每次出现各自独立地为H、或R119A；且R111、R112、R113中的至少一个为R119A；
R119A包含至少一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R114、R117、R118选自由以下组成的组中的一个或多个：H、或烷基、芳基、杂芳基、卤代烷基、-O烷基、-O烷基苯基、-烷基-OH、-O卤代烷基、-S烷基、-S烷基苯基、-烷基SH、-S卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-烷基-NH2、-N(烷基)(烷基)、-NH(烷基)、-N(烷基)(烷基苯基)、-NH(烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O烷基、-CON(烷基)(烷基)、-CONH(烷基)、-CONH2、-NHC(O)(烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(烷基)C(O)(烷基)、-N(烷基)C(O)(苯基)、-C(O)烷基、-C(O)烷基苯基、-C(O)卤代烷基、-OC(O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(卤代烷基)、-SO2 NH2、-SO2NH(烷基)、-SO2 NH(苯基)、-NHSO2(烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(卤代烷基)；
R115、R116对于每次出现各自独立地为OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、固相载体、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R119B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、或寡核苷酸；
J111、J112、R119B对于每次出现各自独立地为间隔体(spacer)；
Z'、Z"、Z'"和Z""对于每次出现各自独立地为O或S；
n111、n112对于每次出现各自独立地为1、2、3、4、5或6；
所述寡核苷酸包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷。
项2，项1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-01)：
其中：
J112A选自由以下组成的组：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2；
J112B选自1至10个碳原子的亚烷基；
R115A为固相载体或H；
R116选自由以下组成的组：OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R119B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、或寡核苷酸；
可选地，J112B选自1至10个碳原子的直链亚烷基。
项3，项1或项2所述的化合物，其中n112为1。
项4，项1-3任一项所述的化合物，其中R116包含寡核苷酸。
项5，项4所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-02)：
项6，项4所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-03)：
项7，项4所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-04)：
其中：
R119C选自-C(O)-C5–C8的直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-；
R119L独立地选自能够与细胞表面受体对接的配体；
n111L选自1、2、3、4或5。
项8，项7所述的化合物，其中：
J111、J112、R119B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R119B可选地不被取代或被R119D取代；
R114、R117、R118、R119D选自由以下组成的组中的一个或多个：H、或C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)OC1-C10烷基、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2 NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
n111L选自1、2、3、4或5。
项9，项1-8任一项所述的化合物，其中所述间隔体为1至10个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2，和其中所述间隔体可选地不被取代或被选自下组中的至少一个基团取代：H、或C1-C5烷基、-OC1-C5烷基。
项10，项7所述的化合物，其中所述分支基团(branching group)选自由以下组成的组：
其中每个n独立地为1至20；和
m为2至6。
项11，项7所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
项12，项7所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
其中每个A1独立地为O、S、C＝O，或NH；和
每个n独立地为1至20。
项13，项7所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
项14，项1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-05)或(G-H1-06)：
其中：
每个X’独立地选自表1；每个Z’独立地选自表2；
表2
表1
R119C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
项15，项14所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-07)或(G-H1-08)：
/>
其中：
R、R’独立地选自由以下组成的组：固相载体、包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
D选自表3；
每个E独立地选自表4；
表3
Z’独立地选自表2；和
每个L独立地包含一种能够与细胞表面受体对接的配体部分。
表4
项16，项15所述的化合物，其中D选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
项17，项14所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-09)或(G-H1-10)：
其中：
R、R’独立地选自由以下组成的组：包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
A独立地为O或S；
X’独立地选自表1；
Z’独立地选自表2；
每个D选自表3；
每个E独立地选自表4；和
每个L独立地包含一种能够与细胞表面受体对接的配体部分。
项18，项17所述的化合物，其中A为O。
项19，项17所述的化合物，其中A为S。
项20，项1-19任一项所述的化合物，其中每个配体独立地选自由以下组成的组：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、胆固醇、生育酚、生物素、菁染料、叶酸、RGDp、转铁蛋白、茴香酰胺、乳糖酸、cRGD、透明质酸、低分子量鱼精蛋白、脂质衍生物、肽、环肽和杂环。
项21，项1-20任一项所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-11)：
其中：
R112B具有如下所示结构：
-branching group-(R119B-R119L)n 111L；
R119L独立地选自一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R119B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R119B可选地不被取代或被R119C取代；
R114、R117、R118、R119C选自由以下组成的组中的一个或多个：H、或C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)OC1-C10烷基、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
R、R’独立地选自由以下组成的组：固相载体、包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
n111L选自1、2、3、4或5。
项22，项4所述的化合物，具有结构式HC-1至HC-8：
/>
项23，项4所述的化合物，具有结构式HC-9：
项24，项4所述的化合物，具有结构式HC-5：
项25，项1-24任一项所述的化合物，其中寡核苷酸通过其5’末端和/或3’末端与所述化合物的其它部分相连。
项26，项25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含小干扰RNA(siRNA)双链体。
项27，项25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含不对称干扰RNA(aiRNA)双链体。
项28，项27所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和0-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
项29，项28所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和1-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
项30，项28所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和5'平末端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
项31，项25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含反义寡核苷酸(ASO)。
项32，项25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含微小RNA(miRNA)。
项33，一种化合物，具有结构式(G-G1)：
其中：
R127包含至少一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R123、R124、R125、R126选自由以下组成的组中的一个或多个：H、烷基、芳基、杂芳基、卤代烷基、-O烷基、-O烷基苯基、-烷基-OH、-O卤代烷基、-S烷基、-S烷基苯基、-烷基SH、-S卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-烷基-NH2、-N(烷基)(烷基)、-NH(烷基)、-N(烷基)(烷基苯基)、-NH(烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O烷基、-CON(烷基)(烷基)、-CONH(烷基)、-CONH2、-NHC(O)(烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(烷基)C(O)(烷基)、-N(烷基)C(O)(苯基)、-C(O)烷基、-C(O)烷基苯基、-C(O)卤代烷基、-OC(O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(卤代烷基)；
R121、R122对于每次出现各自独立地为OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、固相载体、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R128B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、或寡核苷酸；
J121、J122、R128B对于每次出现各自独立地为间隔体；
Z'、Z"、Z'"和Z""对于每次出现各自独立地为O或S；
n121、n122对于每次出现各自独立地为1、2、3、4、5或6；
所述寡核苷酸包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷。
项34，项33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-01)：
J122A选自由以下组成的组：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2；
J122B选自1至10个碳原子的亚烷基；
R121A选自由以下组成的组：H和固相载体；
R122选自由以下组成的组：OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、固相载体、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R128B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、和寡核苷酸；
可选地，J122B选自1至10个碳原子的直链亚烷基。
项35，项33或项34所述的化合物，其中n122为1。
项36，项33-35任一项所述的化合物，R122包含寡核苷酸。
项37，项36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-02)：
项38，项36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-03)：
项39，项36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-04)：
其中：
J123A选自由以下组成的组：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2；
R128A具有如下所示结构：
-R128C-branching group-(R128B-R128L)n 121L、或-R128B-R128L；
R128L独立地选自一种能够对接细胞表面受体的配体；
R128B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R128B可选地不被取代或被R128C取代；
R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-；
n121L选自1、2、3、4或5；
R128L独立地选自一种能够与细胞表面受体对接的配体；
n111L选自1、2、3、4或5；
n121为2；
可选地，R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
项40，项33-39任一项所述的化合物，其中所述间隔体为1至10个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2，和其中所述间隔体可选地不被取代或被选自下组中的至少一个基团取代：H、或C1-C5烷基、-OC1-C5烷基。
项41，项40所述的化合物，其中所述分支基团(branching group)选自由以下组成的组：
/>
其中每个n独立地为1至20；和
m为2至6。
项42，项40所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
/>
项43，项40所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
其中每个A1独立地为O、S、C＝O，或NH；和
每个n独立地为1至20。
项44，项40所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
项45，项33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-05)或(G-G1-06)：
其中：
X’独立地选自表1；Z’独立地选自表2；
R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
项46，项33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-07)或(G-G1-08)：
/>
其中：
R、R’独立地选自包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
Z’独立地选自表2；
R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
项47，项33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-09)或(G-G1-10)：
其中：
R、R’独立地选自包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
A为O或S；
D’选自表9；
每个E选自表4；
X’独立地选自表1；
Z’独立地选自表2；
每个L独立地包含一种能够与细胞表面受体对接的配体部分；和n4独立地选自1、2、3和4。
表9
项48，项47所述的化合物，其中A为O。
项49，项47所述的化合物，其中A为S。
项50，项33-49任一项所述的化合物，其中每个配体独立地选自由以下组成的组：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、胆固醇、生育酚、生物素、菁染料、叶酸、RGDp、转铁蛋白、茴香酰胺、乳糖酸、cRGD、透明质酸、低分子量鱼精蛋白、脂质衍生物、肽、环肽和杂环。
项51，项33所述的化合物，具有结构式
/>
其中：
R129具有如下所示结构：
-branching group-(R128B-R128L)n 121L；
R128L独立地选自一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R128B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R128B可选地不被取代或被R128C取代；
R、R’独立地选自由以下组成的组：固相载体、包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
n121L选自1、2、3、4或5。
项52，项36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式GC-1至GC-8：
/>
项53，项36所述的化合物，具有结构式GC-9
项54，项36所述的化合物，具有结构式GC-5
项55，项33-54任一项所述的化合物，其中寡核苷酸通过其5’末端和/或3’末端与所述化合物的其它部分相连。
项56，项55所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含小干扰RNA(siRNA)双链体。
项57，项33-54任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含不对称干扰RNA(aiRNA)双链体。
项58，项57所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和0-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
项59，项58所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和1-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
项60，项58所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和5'平末端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。.
项61，项33-54任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含反义寡核苷酸(ASO)。
项62，项33-54任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含微小RNA(miRNA)。
项63，一种小干扰RNA(siRNA)剂包含项1-55任一项所述的结构式。
项64，一种不对称干扰RNA(aiRNA)剂包含项1-55任一项所述的结构式。
项65，一种反义寡核苷酸(ASO)剂包含项1-55任一项所述的结构式。
项66，一种微小RNA(miRNA)剂包含项1-55任一项所述的结构式。
项67，一种药物组合物包含项1-60任一项所述的化合物或项63-66任一项所述的剂和一种药学上可接受的赋形剂、载体、或稀释剂。
项1-60任一项所述的化合物或项63-66任一项所述的剂在制备有效治疗疾病或病症的药物中的用途。
在第三方面，本发明的特征在于，如上文第二方面所述，包含碳水化合物配体的化合物，并且碳水化合物配体的存在可增强化合物向靶器官(例如肝脏)的递送。因此，包含碳水化合物配体的化合物可用于在靶器官中靶向与疾病或不希望的病症相关的基因。例如本发明的化合物包含碳水化合物配体可靶向由肝炎病毒表达的核酸。在其他实例中，靶基因可选自由下组组成的组：Factor VII、Eg5、PCSK9、APOC3、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFbeta基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erkl/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-I基因，β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因中的突变、p21(WAFl/CIPl)基因中的突变、p27(KIPl)基因中的突变、PPMlD基因中的突变、RAS基因中的突变、小窝蛋白I基因中的突变、MIB I基因中的突变、MTAI基因中的突变、M68基因中的突变、肿瘤抑制基因中的突变和p53肿瘤抑制基因中的突变。
在进一步地方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述任何方面中提供的本发明化合物和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
在另一个方面，本发明的特征在于，一种用于将化合物递送至受试者体内的特定靶点以实现治疗或诊断目的的方法。因此，本发明提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，其中该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含本发明化合物的药物组合物。通过部分或全部沉默疾病基因来治疗或预防疾病。疾病基因可能是患者自身的基因，也可能是来自外界的微生物基因，如病毒。
根据以下描述和权利要求，本发明的上述和其他目的、方面、特征和优点将变得更加显而易见。
附图简述
参考下述附图和权利要求书，可以更好地理解本发明的目的和特征。附图示出了本发明的核心思想，但不一定总结了所有可能的变化。在附图中，相似的数字用于指示各个视图中的相似部分。
图1示出了寡核苷酸-配体缀合物(Oligonucleotide-Ligand Conjugation)的示例性结构。一种缀合的干扰RNA双链体分子包括反义链和正义链。在一些实施方案中，寡核苷酸是干扰RNA双链体分子，并且配体可以缀合在正义链的3'末端(例如结构1.1-1.3、中间型aiRNA、平末端型aiRNA和siRNA)，在反义链的3'末端(结构2)，在正义链的5'末端(结构3)或在正义链的两个末端(结构5)，或在反义链的两个末端(结构4)，在反义链的3'末端和正义链的5'末端(结构6)，在正义链的3'末端和反义链的3'末端(结构7)，或在正义链的3'末端、反义链的3'末端和正义链的5'末端。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)，并且配体可以缀合在反义链的3'末端或/和5'末端。
图2示出了通过QPCR测试的体外摄取β-Catenin aiRNA的结果。“Non-GalNAc”是没有缀合的aiRNA。“GalNAc”是与“His-Cluster”缀合的aiRNA。
图3示出了分别与“His-cluster(3GalNAc)”、和“Glu-cluster(3GalNAc)”缀合的mCat12 aiRNA在原代肝细胞中的体外摄取效果。
图4示出了分别与“His-cluster(3GalNAc)”、和“Glu-cluster(3GalNAc)”缀合的mCat12 aiRNA在体内的摄取效果。所述aiRNA以20mg/Kg的剂量皮下(s.c.)给药。
图5示出了分别与“His-cluster(3GalNAc)”、和“Glu-cluster(3GalNAc)”缀合的mCat12 aiRNA在体内的摄取效果。所述aiRNA以2mg/Kg的剂量皮下(s.c.)给药。
图6示出了通过QPCR测试的体外摄取β-Catenin aiRNA的结果。aiRNA与“His-Cluster”缀合。SS-中间型代表反义链具有5’突出端的aiRNA#1。SS-3’平末端型代表在正义链的3’末端和反义链的5’末端为平末端的aiRNA#2。
图7示出了体内摄取β-Catenin aiRNA的结果。SS-中间型代表反义链具有3’突出端和5’突出端的aiRNA#1。SS-3’平末端型代表在正义链的3’末端和反义链的5’末端为平末端的aiRNA#2。
发明详述
I.定义
除非另外说明，技术术语根据常规用法使用。分子生物学中的常见术语定义可在，例如，由Jones and Bartlett Learning出版的J.Krebs et al.(eds.)编著的Lewin’sGenes XII(2017(ISBN 9781284104493))；由Anmol Publications Pvt.Ltd出版的RobertA.Meyers(ed.)编著的Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference(2011(ISBN 9788126531783))；和其他相似的技术参考资料中找到。
如说明书和权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”，“一种”或“该”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。进一步指出的是，权利要求可以撰写排除任何可选元素。对此而言，本声明旨在作为对权利要求中叙述排他性术语的支持，诸如“仅有”、“只有”以及有关权利要求要素叙述的类似用词，或使用“否定”限制，例如“其中[特定特征或元素]是不存在的”，或“除了[特定特征或元素]，”或“其中[特定特征或元素]不存在(被包括，等等)…”
当本文给出一个部件的维度测量值时，除非上下文中明确说明或清楚说明，否则该值旨在描述该部件的必要部分的平均值，即为所述目的所需要的部件的部分的平均值。任何附加或多余的部分都不应该包含在该值的计算中。
如本文所使用的，对变量的数字范围的描述旨在表明本发明可以采用等于该范围内的任何值的变量来实施。因此，对于本质上离散的变量而言，变量可以等于数值范围内的任何整数值，包括范围的端点。类似地，对于本质上连续的变量而言，变量可以等于数值范围内的任何实际值，包括范围的端点。作为一个例子，并不作为限制，被描述为具有介于0和2之间的值的变量，如果变量本质上是离散的，则可以取值0，1或2，如果变量本质上是连续的，则可以取值0.0、0.1、0.01、0.001或任何其他>0和<2的实际值。
如本文所使用的，“约”是指正负10％之内。例如，“约1”表示“0.9至1.1”，“约2％”表示“1.8％至2.2％”，“约2％至3％”表示“1.8％至3.3％”，以及“约3％至约4％”表示“2.7％至4.4％”。
如本文所使用的，术语“间隔体(spacer)”、“连接体(linker)”和“连接子(linkage)”用于连接化合物的两部分，例如1至10个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子任选被由以下组成的组的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2，1至10个碳原子的亚烷基是未被取代的或被选自由以下组成的组的至少一个取代基取代：H、C1-C5烷基、和-OC1-C5烷基。
各种羟基保护基团可以在本公开中使用。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在不显著破坏分子的其余部分下，保护基团可以附加到分子的官能团上和从官能上脱除该保护基团。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greene and Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，Chapter 2,2d ed，John Wiley&Sons，New York，1991中，每一个通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方案中，本文可使用的羟基保护基团的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)是用于指示取代基连接点的位置。例如：-C1-C10烷基-NH2是通过C1-C10烷基连接的。
如本文所使用的，“可选的(optional)”或“可选地(optionally)”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且所述描述包括事件或情况发生的实例和不发生的实例。例如，“可选地被取代的烷基”包括下文定义的“烷基”和“被取代的烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或内在不稳定的任何取代或取代形式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定碳原子数目的直链和支链，所述碳原子数目通常为1到20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链烷基和支链烷基。当命名具有特定碳原子数目烷基残基时，旨在涵盖具有该碳原子数目的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基基团，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一个氢分子而得到。该基团双键可以处于顺式(cis)或反式(trans)构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方案中，烯基基团具有2到20个碳原子，在其他实施方案中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基基团，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两个氢分子而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方案中，炔基基团具有2到20个碳原子，在其他实施方案中，具有2至10、2至8或2至6个碳。亚炔基是炔基的一个子集，指与炔基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的具有指定碳原子数目的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基基团通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而形成的衍生自芳香族单环或多环烃环系统的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，其根据Hückel理论包含环状、离域的(4n+2)π-电子系统。芳基基团包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的一个子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香碳环，通常具有3至7个环碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥接和笼状基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基(halo)”或“卤素(halogen)”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素(halogen)”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指具有特定碳原子数目的如上述所定义的烷基，被一个或多个、以至最大允许数量的卤素原子取代。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3至18元非芳香族环基团，其包含2-12个碳原子和1-6个选自氮、氧和硫的杂原子。除非说明书中另有说明，否则杂环基是单环、双环、三环或四环体系，可包括稠环或桥环体系。杂环基中的杂原子可以可选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)可选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环上任何原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1-dioxo-thiomorpholinyl)。
“杂芳基”指由3至18元芳香环基衍生而成的基团，其包含2个至17个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环体系，其中环体系中的至少一个环是完全不饱和的，即，根据Hückel理论，其包含环状、离域的(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环体系。杂芳基中的杂原子可被可选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)可选地被季铵化。杂芳基通过环上的任何原子连接至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、
5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、
5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
如本文所使用的，术语“固相载体”包含用于寡核苷酸合成的固相载体，例如CPG。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”，“寡核苷酸(oligonucleotides)”指包含多个连接着的核苷的化合物。在某些实施方案中，“寡核苷酸”是短的单链或双链DNA或RNA分子，包括反义寡核苷酸(ASO)、RNA干扰(RNAi)和适配体RNA(aptamer RNAs)。在某些实施方案中，所述多个核苷中的一个或多个是经修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(如RNA中)和/或脱氧核糖核苷(如DNA中)。在一些实施方案中，寡核苷酸是单链寡核苷酸。在一些其他实施例中，寡核苷酸是双链干扰RNA，例如siRNA、aiRNA、shRNA。在一些实施方案中，寡核苷酸为环状RNA(circRNA)。在一些实施方案中，寡核苷酸为mRNA。
如本文所用，术语“aiRNA”是一种不对称干扰RNA双链体分子，包含反义链和正义链，其中反义链比正义链长，由19-27个核苷酸组成，并包括至少一个核苷酸的3'突出端和0-8个核苷酸的5'末端；其中所述反义链与靶mRNA至少70％互补；其中，所述正义链由10-26个核苷酸组成，与所述反义链形成包括0、1或2个错配对的双链区。US2009/0208564中描述了aiRNA的示例性结构，通过引用将其整体并入本文。
如本文所使用的，术语“中间型(middle type)”是指包括反义链和正义链的干扰RNA双链体分子，其中反义链比正义链长，并且反义链的3'突出端和5'突出端都包含至少一个核苷酸。
如本文所使用的，术语“平末端型(blunt type)”是指包括反义链和正义链的干扰RNA双链体分子，其中RNA双链体分子具有至少一个平末端，优选在正义链的3'端或在反义链的5'端具有一个平末端。
如本文所使用的，术语“修饰的寡核苷酸”是指包含至少一个修饰的核苷酸的寡核苷酸。
如本文所使用的，术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸具有至少一个修饰的糖部分，修饰的核苷间键和/或修饰的核碱基。
如本文所使用的，术语“修饰的核苷”是指核苷具有至少一个修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。
如本文所使用的，术语“天然存在的核苷间键”是指3’至5’磷酸二酯键。
如本文所使用的，术语“修饰的核苷间键”是指来自天然存在的核苷间键的取代或任何改变。例如，硫代磷酸酯键是一种修饰的核苷间键。
如本文所使用的，术语“天然的糖部分”是指在DNA(2-H)或RNA(2-OH)中发现的糖。
如本文所使用的，术语“修饰的糖部分”是指来自天然糖的取代或改变。例如，2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
如本文所使用的，术语“双环糖”是指通过桥连两个非双环原子而修饰的呋喃糖基环(furosyl ring)。双环糖是修饰的糖。
如本文所使用的，术语“修饰的核碱基”是指除腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸苷或尿嘧啶以外的任何核碱基。例如，5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
如本文所使用的，“预防(prevention)”和“预防(preventing)”可以互换使用。这些术语指的是获得有益或期望结果的方法，包括但不限于预防获益。为了“预防获益”，可将所述缀合物或组合物施用于具有发展特定疾病风险的患者，或施用于报告了疾病的一个或多个生理症状的患者，即使可能尚未做出该疾病的诊断。
如本文所使用的，术语活性剂的“有效量”是指足以引发所需的生物反应的量。如本领域普通技术人员所理解的，本发明化合物的有效量可根据诸如所需生物学的终点、化合物的药代动力学、正在治疗的疾病、给药方式和患者等因素而变化。
如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”疾病或紊乱是指在疾病或紊乱发生之前或之后减轻、延迟或改善这种状况的方法。治疗可针对疾病和/或潜在病理学的一种或多种影响或症状。治疗可以是任何减轻，可以是但不限于完全消除疾病或疾病症状。与同等未经治疗的对照组相比，这种减轻或预防程度至少为5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％(通过任何标准技术测量)。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物等，它们将是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”可以互换使用。如本文所使用的，“药物组合物”包括药理有效量的dsRNA和药学上可接受的载体。如本文所使用的，“药理有效量”、“治疗有效量”或简单地“有效量”是指有效产生预期药理、治疗或预防结果的RNA量。例如，如果当与疾病或障碍相关的可测量参数至少减少25％视为给定的临床治疗被认为有效时，则用于治疗该疾病或障碍的药物的治疗有效量是使该参数至少减少25％所需的量。
术语“药学上可接受的载体”是指用于施用治疗剂的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。该术语明确排除了细胞培养基。对于口服药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂(如有)通常为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可涂有例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料，以延迟在人体胃肠道的吸收。
化合物构型
本发明化合物及其盐可以互变异构形式存在(例如，为酰胺或亚氨基醚)。所有此类互变异构形式视为本发明的一部分。
本发明化合物的所有立体异构体(例如，由于各种取代基上不对称的碳而可能存在的立体异构体)，包括对映体形式和非对映体形式，都在本发明的范围内。例如，本发明化合物的单个立体异构体可以基本上不含其他异构体(例如，作为具有特定活性的纯或基本上纯的光学异构体)，或者可以例如作为外消旋体或与所有其他或其他选定的立体异构体混合。本发明的手性中心可以具有根据IUPAC 1974建议中定义的S构型或R构型。外消旋形式可以通过物理方法来解析，例如分步结晶(fractional crystallization)、非对映异构衍生物的分离或结晶，或通过手性柱色谱分离。可以通过任何合适的方法从外消旋体中获得单独的光学异构体，包括但不限于常规方法，例如，与光学活性的酸形成盐，然后结晶。。
本发明化合物在制备后，优选地分离和纯化以获得含有按重量计等于或大于95％的量的组合物(例如，“基本上纯的”化合物I)，然后按照本文所述使用或配制该组合物。在某些实施例中，本发明的化合物纯度超过99％。
本发明化合物的所有构型异构体或为预期的混合物，或为预期的纯或基本纯形式。本发明化合物的定义包括顺式(Z)和反式(E)烯烃异构体，以及环状烃或杂环的顺式和反式异构体。
D-氨基酸/L-氨基酸
本文所述肽或多肽中包含的氨基酸将被理解为L-构型或D-构型。
II.实施方案
本发明提供了具有新型连接体部分的新型化合物，其中连接体用于连接化合物的各种组分。该化合物将寡核苷酸与一个或多个靶向配体缀合。寡核苷酸可以是天然存在的(从自然界分离，或在实验室合成)或在至少一个亚单位中进行化学修饰的。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸是化学修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，化学修饰的寡核苷酸包括主链修饰(或核苷间键修饰，例如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰、碱基修饰。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有至少一个硫代磷酸酯核苷间键，或至少一个甲基膦酸酯核苷间键，或至少一个其他修饰核苷间键，例如：
在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有至少一个经化学修饰的核苷酸具有核糖修饰。在某些实施方案中，修饰的核糖部分的2′位被选自以下的基团取代：OR、R、卤素取代基、SH、SR、NH2、NHR、NR2、或CN，其中每个R独立地为C1-C6烷基、烯基或炔基，其中卤素取代基为F、Cl、Br或I。在一些实施例中，修饰的核糖部分的2′位被选自以下的基团取代：烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)、或O-CH2-C(＝O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中每个Rl、Rm和Rn独立地为H或为被取代的或不被取代的C1-C10烷基。在一些实施方案中，修饰的核糖部分具有选自下组的取代基基团：5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2’-O(CH2)2OCH3。在一些实施方案中，修饰的核糖部分被选自下组的双环糖取代：4′-(CH2)—O-2′(LNA)、4′-(CH2)—S-2、4′-(CH2)2—O-2′(ENA)、4′-CH(CH3)—O-2′(cEt)和4′-CH(CH2OCH3)—O-2′、4′-C(CH3)(CH3)—O-2′、4′-CH2—N(OCH3)-2′、4′-CH2—O—N(CH3)-2′、4′-CH2—N(R)—O-2′(其中R为H、C1-C12烷基、或保护基团)、4′-CH2—C(H)(CH3)-2′、和4′-CH2—C—(═CH2)-2′。在一些实施方案中，修饰的核糖部分是选自下组：2’-O-甲氧基乙基修饰的糖(MOE)、4′-(CH2)—O-2′双环糖(LNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖(FANA)、和甲基(亚甲基氧基)(4′-CH(CH3)—O-2)双环糖(cEt)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸具有选自由以下组成的组：2’-甲氧基乙基、2’-OCH3和2’-氟的化学修饰的核苷酸。
所述寡核苷酸可在寡核苷酸的5'末端和/或3'末端被缀合到化合物的其余部分或化合物的“主链”。所述被缀合的寡核苷酸可作为单链被递送或与基本上互补的寡核苷酸杂交作为双链体的一部分被递送。所述基本上互补的寡核苷酸可以被类似地缀合或不缀合。
在一个实施方案中，被缀合的寡核苷酸形成siRNA双链体的一部分(正义链或反义链，或两者)。在优选实施方案中，被缀合的寡核苷酸形成aiRNA双链体的一部分(正义链或反义链，或两者)。在另一个实施方案中，根据本发明原理被缀合的寡核苷酸用作反义寡核苷酸(ASO)。在又一个实施方案中，根据本发明原理被缀合的寡核苷酸用作微小RNA(miRNA)分子。被缀合寡核苷酸的一些示例性实施方案如图1所示。对于双链体RNA分子，优选地，寡核苷酸可在正义链的3’末端被缀合到化合物的其余部分或化合物的“主链”。
实施方案1
在第一个特征中，寡核苷酸被缀合到含有多个组分的主链上，其中主链包括具有一个以上(如2-8个，最好是3个)配体(如GalNAc)的簇(cluster)的末端，所述末端直接地或通过一个或多个中间连接体，在由衍生自组氨酸残基的残基提供的连接点处连接到主链。
在一个实施方案中，本发明的化合物具有如(G-H1)、(G-H1-01)-(G-H1-11)所示的结构示。
在一个实施方案中，本发明提供的化合物具有如HC-1至HC-9所示的结构。
在一个实施方案中，可选地，化合物的构型为R异构体或其混合物。在一个实施例中，化合物的构型是指结构式中所示的手性碳原子的异构体。
在本发明化合物中，天然存在或化学修饰的寡核苷酸通过其5'端和/或3'端与化合物的其余部分相连接。
实施方案2
在第二个特征中，寡核苷酸被缀合到包含多个成分的主链上，其中主链包括具有一个以上(例如2-8个，优选3个)配体(例如GalNAc)的簇的末端，所述末端直接地或通过一个或多个中间连接体，在由衍生自谷氨酸残基的部分提供的连接点处连接到主链。
在一个实施方案中，本发明的化合物具有如(G-G1)、(G-G1-01)-(G-G1-10)所示的结构式。
在一个实施方案中，本发明提供的化合物具有如GC-1至GC-9所示的结构。
在一个实施方案中，可选地，化合物的构型为R异构体或其混合物。在一个实施例方案，化合物的构型是指结构式中所示的手性碳原子的异构体。
III.实施例
合成
在一些实施方案中，如式G-H1、G-H1-01～G-H1-11、G-G1和G-G1-01～G-H1-10所示的化合物，其中化合物具有缀合在包含多个组分的主链的寡核苷酸，其中主链包含具有一个以上(如2-8个)配体(例如GalNAc)的簇的末端，通过由包含三个或多个反应性部分的簇骨架(cluster backbone)与配体和寡核苷酸反应合成。
实施例1 GC-05(Glu(R)-簇GalNAc)的合成
GC-05(Glu(R)-簇GalNAc)的合成方法如以下的5个步骤所示：
步骤1：中间体N-2的合成路线。
30g N-1溶于420mL的2M NaOH中，加入30mL THF。冰水降温至0-5℃，缓慢滴加35gCbzCl。滴毕，室温搅拌1h，通过UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱)监控反应完全。反应溶液用MTBE(200mL*3)洗涤，分取水相加入EA，降温后用3M HCl调pH至4，萃取分取EA相，水相用300mL EA再萃取一次，合并有机相，饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，浓缩干，得51.58g化合物N-2。MS(ESI)m/z 278.05([M-H]-)。
步骤2：中间体M-3的合成路线。
合成化合物M-2
氮气保护下，20g M-1((R)-3-羟基-甲基丁酸酯)溶于200mL DCM中，加入18g咪唑，滴加56.2g TBDPSCl。滴毕，室温反应2h。采用TLC监控反应完全，加入饱和氯化铵200mL淬灭，分取DCM层，饱和氯化钠洗1次，无水硫酸钠干燥，浓缩干，得到73g M-2粗品。MS(ESI)m/z357.10([M+H]+)。
合成化合物M-3
13.6g氢氧化钠溶于80mL水制备氢氧化钠水溶液，73g M-2粗品溶于500mL甲醇后，加入上述氢氧化钠水溶液。35℃搅拌15h，采用TLC监控反应完全。40℃浓缩除去甲醇，加入500mL乙酸乙酯(EA)，用2M HCl调pH＝3，分取EA层，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化(PE:EA＝50:1-10:1)，浓缩产物部分得到47.8g M-3。MS(ESI)m/z341.10([M-H]-).1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66-7.69(m,4H),7.35-7.45(m,6H),4.23-4.30(m,1H),2.43-2.56(m,2H),1.14(d,3H),8.77(s,9H)。
步骤3：中间体S-04的合成路线。
合成化合物S-02
氮气保护下，将250g S-01溶于2L无水DCM，冰浴条件下滴加158g TMSOTf，滴加完毕后升温至40℃搅拌2h，采用TLC监控反应完全。冰浴降温，滴加1.7L饱和碳酸氢钠水溶液，分取有机相用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得211g黄色油状物S-02，ESI-MS m/z:[M
+H]+＝430.12。
合成化合物S-03
氮气保护下，将169g S-02溶于1.2L无水DCM中，加入56.6g5-己烯-1醇，冰水浴中滴加57.38g TMSOTf，滴毕后室温反应过夜。采用TLC监控反应完全，冰水浴降温，滴加饱和NaHCO3调节PH至7-8后萃取分离有机相，有机相分别用饱和NaCl洗涤1次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩干，柱层析纯化，DCM：MeOH＝80:1-40:1，收集产物洗脱液，浓缩干得94g油状物S-03，ESI-MS m/z:[M+H]+＝430.23。
合成化合物S-04
称取82g S-03，加入410mL乙腈，410mL DCM和573mL H2O搅拌溶解，冰浴降温至5-10℃，向反应体系中加入163g NaIO4和2.37gRuCl3。室温搅拌2h后采用TLC监控反应完全，将反应液用硅藻土过滤，合并滤液，萃取分离出水层，有机相再用饱和NaHSO3洗涤三次(200mLx3)。合并水相，加入DCM 600mL，用2M HCl调pH为2-3，萃取分取DCM层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得76g灰色固体S-04，ESI-MS m/z:[M-H]-＝446.17，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):d 11.97(s,1H,COOH)；7.79(d,1H,NH)；5.20(d,1H),4.95(dd,1H)；4.48(d,1H)；4.05-3.98(m,3H)；3.86(dt,1H)；3.74-3.65(m,1H,-OCH2-CH2)；3.45-3.37(m,1H,-OCH2-CH2)；2.19(t,2H,-CH2-COOH)；2.09(s,3H,-COCH3)；1.99(s,3H,-COCH3)；1.88(s,3H,-COCH3)；1.76(s,3H,-COCH3)；1.55-1.45(m,4H,2x(-CH2))。
步骤4：中间体G-6的合成。
合成化合物G-2
G-1((S)-N-Boc-谷氨酸甲酯)50g溶于500mL THF中，冰水浴下滴加25.2mL NMM，搅拌5min后滴加26.6mL氯甲酸异丁酯，滴毕，继续搅拌1h。抽滤，收集滤液，滤液在冰水浴下加入8.73g NaBH4。加毕后继续反应2h，取样通过TLC监控反应完全，加入250mL水，500mL EA萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到45.35g油状物G-2。MS(ESI)m/z248.19([M+H]+)。
合成化合物G-3
45.35g化合物G-2溶于500mL DCM中，加入31.2g咪唑，滴加91.1g TBDPSCl，滴毕，室温反应2h，采用TLC监控反应完全。向反应液中加入150mL水，萃取分取DCM层，用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物。硅胶柱层析纯化，PE:EA＝40:1-10:1梯度洗脱，浓缩产物得36.7g无色透明油状物G-3。MS(ESI)m/z 486.66([M+H]+)。
合成化合物G-4
将46.15g化合物G-3溶于500mL DCM中，冰浴下滴加70mL TFA(三氟乙酸)。滴毕，室温下搅拌反应4h。TLC监测反应完全，减压浓缩，向残留物中加入500mL DCM，滴加饱和碳酸氢钠溶液调pH至8，萃取分取DCM层，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩干得36.7g淡黄色油状物G-4。MS(ESI)m/z 386.51([M+H]+)。
合成化合物G-5
31.9g M-3溶于300mL DMF中，加入42g HBTU和23mL DIEA，室温搅拌10分钟，然后加入35g G-4，移至室温搅拌1h。采用TLC监控反应完全，向反应液中加入600mL饱和碳酸氢钠和400mL EA进行萃取，分取EA层并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物。粗产物通过柱层析分离(PE:EA＝20:1-8:1)纯化，得到41g白色固体物G-5。MS(ESI),m/z710.33([M+H]+)。
合成化合物G-6
将33.3g化合物G-5加入到100mL MeOH，100mL THF和100mL水的混合溶剂中，加入一水合氢氧化锂5.92g，室温反应8h。采用TLC监控反应完全，反应混合物进行减压浓缩，向浓缩残留物中加入400mL乙酸乙酯，稀盐酸溶液调pH至4-5，萃取分离有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得33.8g无色透明油状物G-6。MS(ESI)m/z:694.35([M+H]+)。
步骤5:化合物GC-05的合成路线。
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合成化合物HC-02
将100g HC-01(三羟甲基氨基甲烷)溶于250mL DMSO，然后加入16.5mL 5M NaOH。冰水浴下缓慢滴加400g丙烯酸叔丁酯。滴毕，室温搅拌18h后反应完全。向反应液中加入2L饱和氯化钠和500mL乙酸乙酯，搅拌后分取有机相。有机相用饱和氯化钠洗2次，无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩干得到HC-02粗品。硅胶柱层析纯化，石油醚:乙酸乙酯＝10:1-1:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩干得到260g HC-02。MS(ESI)m/z 506.35([M+H]+)。
合成化合物HC-03
将23.24g中间体N-2溶于200mL DMF，然后加入16g DIPEA和38g HBTU，室温搅拌20分钟后，缓慢滴加用50mL DMF溶解的50.47gHC-02。滴毕，混合物在室温下搅拌1小时，TLC监控反应完全。向反应液中加入600mL饱和碳酸氢钠，用乙酸乙酯300mL萃取，分取有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化，石油醚:乙酸乙酯＝8:1-4:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩干得到43g浅黄色油状物HC-03。MS(ESI)m/z 767.51([M+H]+)。
合成化合物HC-04
向160g HC-03中加入1280mL甲酸，室温搅拌6小时，TLC监控反应完全，减压蒸去甲酸，得浅黄色油状物。向残留物中加入300mL甲苯，减压蒸去甲苯得111.85g油状物HC-04。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.18(brs,3H),7.37-7.30(m,5H),7.20(t,1H),7.92(s,1H),5.00(s,2H),3.58-3.55(m,12H),2.97(q,2H),2.37-2.47(m,6H),2.04(t,2H),1.46-1.36(m,4H),1.17-1.29(m,4H).MS(ESI)m/z 597.29([M-H]-)
合成化合物HC-05
向110.72g HC-04中加入800mL DMF使其溶解，加入107.48gDIPEA和253.28gHBTU。混合物在室温下搅拌20分钟后，缓慢滴加用200mL DMF溶解的101.3g的N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺，滴毕，混合物在室温下搅拌1h，TLC监控反应完全。向反应液中加入2L饱和碳酸氢钠水溶液，用800mL乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析纯化，二氯甲烷:甲醇＝80:1-20:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩干得到得220g油状物HC-05。pMS(ESI)m/z 1067.70([M+H]+)。
合成化合物HC-06
将79.68g HC-05溶于880mL DCM，冰水浴降温，滴加190g三氟乙酸，滴毕，混合物在室温下搅拌4小时，UPLC-MS监控反应完全，减压蒸去DCM，加入甲苯600mL，浓缩干得121.6g油状物HC-06。MS(ESI)m/z
767.61([M+H]+)。
合成化合物HC-07
90g S-04溶于265mL DMF中，加入72g DIPEA，加入52gHBTU，搅拌20分钟后滴加62g化合物HC-06的250mL DMF溶液及72gDIPEA溶液。向反应液中加入1000mL饱和碳酸氢钠，加入500mL乙酸乙酯，萃取分取EA层，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化，二氯甲烷:甲醇＝50:1-10:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩干得75g白色固体HC-07。MS(ESI)m/z 1028.46([(M+2)/2]+)。
合成化合物HC-08
10g HC-07溶于80mL甲醇，加入1g 10％Pd/C，氢气置换3次后室温搅拌8h反应完全。滤除钯碳。浓缩干滤液得到8.5g灰白色固体HC-08。MS(ESI)m/z 961.37([(M+2)/2]+)。
合成化合物GC-01
2.0g中间体G-6溶于30mL DMF，加入1.41g HBTU和557mg DIEA，氮气保护下室温搅拌20分钟，加入6.62g HC-08。室温搅拌1h后，取样TLC监控反应完全。向反应液中加入200mL饱和碳酸氢钠和100mL乙酸乙酯，萃取分取有机层。有机相用饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩后进行柱层析纯化，DCM:MeOH＝30:1 -10:1梯度洗脱，收集产物部分，浓缩干，得到4.93g白色固体GC-01。MS(ESI)m/z 866.72([(M+3)/3]+)。
合成化合物GC-02
20.4g GC-01溶于200mL THF，加入25mL的1M TBAF-THF溶液(四丁基氟化铵)，混合物在室温下搅拌过夜。反应液浓缩后进行柱层析纯化，DCM:MeOH＝50:1 2L-10:1梯度洗脱，浓缩产物洗脱液得10.39g白色固体GC-02。MS(ESI)m/z 1061.55([(M+2)/2]+)。
合成化合物GC-03
氮气保护下，5.14g GC-02溶于40mL无水吡啶，加入4.43gDMTrCl。室温反应0.5h后，取样TLC监测反应完全，加入甲醇10mL淬灭反应。浓缩反应液，浓缩后进行柱层析纯化，DCM:MeOH＝50:1 -10:1梯度洗脱，最终得到4.54g白色固体GC-3。MS(ESI)m/z 1061.59([(M-302)+2)/2]+)。
合成化合物GC-04
氮气保护下，3.5g GC-03溶于30mL无水吡啶，加入10mg DMAP和1.57g丁二酸酐，化合物在室温下搅拌72h，TLC监控反应完全。浓缩吡啶得粗品，经硅胶柱纯化，DCM:MeOH＝50:1 -10:1梯度洗脱，浓缩产物淋洗液得到3.61g白色固体GC-04。MS(ESI)m/z 1111.50([(M-302)+2)/2]+)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89-7.82(m,6H),7.76-7.74(m,4H),7.38-7.36(m,2H),7.31-7.27(m,2H),7.24-7.16(m,5H),6.99(s,1H),6.88-6.81(m,4H),5.21(d,2H),4.98-4.95(m,3H),4.50-4.47(m,3H),4.04-4.01(m,10H),3.91-3.86(m,6H),3.73-3.69(m,12H),3.54-3.52(m,12H),3.41-3.39(m,4H),3.04-3.02(m,12H),2.68-2.63(m,9H),2.29-2.26(m,8H),2.10(s,9H),2.06-2.02(m,8H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.52-1.44(m,18H),1.11(d,3H)。
合成化合物GC-05
将246mg GC-04溶于10mL无水乙腈，加入46mg HATU和27mg DIPEA，摇床振荡10分钟。向上述反应液中加入800mg LCAA-CPG(100μmol/g)，室温条件下摇床振荡过夜。次日，将反应液过滤，用乙腈洗涤滤饼。向滤饼中加入5mL CapA(20％NMI-80％ACN)和5mL CapB(20％AC2O-30％lutidine-50％CAN)，室温条件摇床继续振荡2h，将反应液过滤，将滤饼用乙腈洗涤，室温真空干燥2h，得到780mg化合物GC-05，测得载量为45μmol/g。
实施例2 HC-13(His(R)-簇GalNAc)的合成
HC-13(His(R)-簇GalNAc)以如下所述的2个步骤合成：
步骤1：化合物H-09的合成路线
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合成化合物H-02
38.4g氢氧化钠溶于400mL水，加入400mL THF，混合物在冰水浴中降温，加入50gH-01(L-组氨酸)搅拌溶解。加入175g二碳酸二叔丁酯，加毕，室温搅拌反应4h。TLC监控反应完全后，反应混合物进行抽滤，浓缩滤液，向浓缩残留物中加入200mL MTBE共洗涤萃取3次。分取水层，加入500mL乙酸乙酯后用3M盐酸调至pH2～4，分取EA层，饱和氯化钠洗涤。无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩干得到98g白色固体。MS(ESI)m/z 356.25([M+H]+)。
合成化合物H-03
氮气保护下将110g H-02溶于880mL无水THF中。冰浴降温至0-5℃，向反应液中缓慢滴加1.1L硼烷四氢呋喃溶液(1M)。滴毕，室温搅拌1h，TLC监控反应完全。冰水浴降温至0-10℃后，缓慢滴加230mL甲醇淬灭反应。浓缩THF，向残留物中加入乙酸乙酯800mL和饱和食盐水300mL萃取分液，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩干得到106g H-03粗品，MS(ESI)m/z 342.40([M+H]+),1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.69(s,1H),7.37(s,1H),6.68(d,1H),4.82(s,1H),3.68-3.82(m,1H),3.29-3.43(m,2H),2.89(dd,1H),2.54(d,1H),1.57(s,9H),1.34(s,9H)。
合成化合物H-04
106g H-03溶于1L二氯甲烷，加入38g咪唑，向反应液中滴加128g TBDPSCl。滴毕，室温反应1h，TLC监控反应完全。向反应液中加入400mL饱和氯化钠，萃取分取DCM层，饱和氯化钠洗涤，硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化，石油醚:乙酸乙酯＝100:1-20:1梯度洗脱。收集产物洗脱液，浓缩干得到106g白色固体。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.71(s,1H),7.63-7.65(m,4H),7.41-7.48(m,6H),6.85(d,1H),3.91-4.02(m,1H),3.61(d,2H),3.04(dd,1H),2.57-2.63(m,1H),1.58(s,9H),1.35(s,9H),1.01(s,9H)。
合成化合物H-05
80g H-04溶于240mL冰醋酸，80℃搅拌反应过夜。TLC监控反应完全后，混合物进行冰水浴降温，然后加入400mL乙酸乙酯，滴加4M氢氧化钠调pH至8-9，分取有机相，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩干得到66g白色固体。MS(ESI)m/z 480.27([M+H]+)。
合成化合物H-06
氮气保护下，37.8g H-05溶于250mL DMF，加入33.4g碳酸铯，室温搅拌30min。滴加14.5g溴乙酸甲酯的40mL DMF溶液。滴毕，室温搅拌0.5h，UPLC-MS监控基本反应完全。向反应液中加入300mL EA和250mL饱和氯化铵，分取EA层，饱和氯化钠洗1次，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析，DCM:MeOH＝100:1-50:1梯度洗脱。收集产物洗脱液，浓缩干得到35g固体。MS(ESI)m/z 552.36([M+H]+)。
合成化合物H-07
26g H-06溶于260mL DCM，溶液冰水浴降温，滴加45mL三氟乙酸。滴毕，升温至室温搅拌1h，UPLC-MS监控反应完全。浓缩TFA，向残留物中加入200mL DCM，滴加饱和碳酸氢钠调pH至8-9，分取DCM层，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩干得到21.89g油状物。MS(ESI)m/z
452.30([M+H]+)。
合成化合物H-08
17.53g M-3溶于105mL DMF中，氮气保护下加入21.21g HBTU、12.2mL DIEA，室温搅拌30min。然后滴加21g H-07的100mL DMF溶液，20min滴毕，室温搅拌1h取样TLC监控反应完全。加入200mL EA和500mL饱和氯化钠，分取有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析，PE:EA＝10:1-3:1梯度洗脱。收集产物洗脱液，浓缩干得到20.2g油状物。MS(ESI)m/z 776.50([M+H]+)。
合成化合物H-09
19.66g H-08溶于50mL THF，加入100mL甲醇，室温搅拌溶解，加入3.2g氢氧化锂，室温搅拌2h，TLC监控反应完全。减压浓缩甲醇和THF，向浓缩残留物中加入100mL乙酸乙酯，2M HCl调节体系pH至3～4，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩干得13g白色固体化合物H-09。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.85(d,1H),7.52-7.65(m,9H),7.34-7.47(m,12H),6.77(s,1H),4.72(s,2H),4.20-4.24(m,1H),4.09-4.14(m,1H),3.53-3.59(m,2H),2.80(dd,1H),2.63(dd,1H),2.39(dd,1H),2.24(dd,1H),9.67(d,21H).MS(ESI)m/z 762.40([M+H]+)。
步骤2：化合物HC-13的合成路线
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HC-02～HC-08的合成参照GC-05(Glu(R)-簇GalNAc)中的合成步骤。
合成化合物HC-09
将3.9g H-09溶于40mL DMF，加入2.92g HBTU和2g DIPEA，室温搅拌15分钟。将11.5g中间体HC-08溶于100mL DMF，然后将该溶液缓慢滴加到上述搅拌体系，室温搅拌30分钟，TLC监控反应完全。向反应液中加入100mL乙酸乙酯和100mL饱和碳酸氢钠，萃取分取EA层，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-10:1)，收集产物洗脱液，浓缩干得到10.5g白色固体。MS(ESI)m/z 889.44([(M+3)/3]+)。
合成化合物HC-10
将10.1g HC-09溶于150mL THF，加入11.4mL TBAF(1M的THF溶液)，室温搅拌过夜，LC-MS监控反应完全。减压蒸去溶剂，粗品用硅胶柱层析，二氯甲烷:甲醇＝50:1-10:1梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩干得到7.53g白色固体。MS(ESI)m/z 1094.94([(M+2)/2]+)。
合成化合物HC-11
将3.9g HC-10溶于33mL无水吡啶，搅拌下加入1.03g DMTrCl，室温搅拌10分钟后，TLC监控反应完全。用12mL甲醇淬灭反应，减压蒸去溶剂，湿法上样，硅胶柱层析纯化，二氯甲烷:甲醇＝50:1-20:1梯度洗脱。收集产物洗脱液，浓缩干得到3.62g淡黄色固体。MS(ESI)m/z 1094.95([(M-302)+2)/2]+)。
合成化合物HC-12
将3.6g HC-11溶于36mL无水吡啶，加入20mg DMAP和2.9g丁二酸酐，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监控反应完全。减压蒸去吡啶，硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1-10:1)，收集产物洗脱液，浓缩干得到2g白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02-7.92(m,10H),7.43-7.38(m,3H),7.31-7.20(m,8H),7.06(s,1H),6.88-6.86(m,4H),6.64(s,1H),5.20(d,3H),4.98(dd,3H),4.55-4.49(m,5H),4.20-4.15(m,2H),4.05-3.97(m,8H),3.87(q,3H),3.73(s,6H),3.68-3.73(m,3H),3.55-3.52(m,12H),3.41-3.39(m,4H),3.04-3.01(m,14H),2.90(d,2H),2.77-2.59(m,4H),2.30-2.26(m,8H),2.10(s,9H),2.06-2.03(m,8H),1.99(s,9H),1.88(s,9H),1.77(s,9H),1.52-1.43(m,20H),1.27-1.20(m,9H),1.11(d,3H),MS(ESI)m/z 1145.05([(M-302)+2)/2]+)。
合成化合物HC-13
将236mg HC-12溶于10mL乙腈，加入49.6mg HATU和29.8mg DIPEA，混合物在摇床中振荡10分钟。向上述反应液中加入800mg LCAA-CPG(96μmol/g)，摇床振荡过夜。次日，将反应液过滤，用乙腈洗涤滤饼。向滤饼中加入5mL CapA(20％NMI-80％CAN)和5mL CapB(20％AC2O-30％lutidine-50％CAN)，混合物在室温条件下摇床继续振荡2h，将反应液过滤，将滤饼用乙腈洗涤，室温真空干燥2h，得到780mg化合物HC-13，载量46μmol/g。
实施例3 B-9(His(R)-簇GalNAc)的合成
化合物B-9(His(R)-簇GalNAc)以如下所示的2个步骤合成：
步骤1：化合物Y-03的合成路线
合成化合物Y-01
氮气保护下，将169g S-02溶于1.2L无水DCM中，加入83.6g1-苄氧基乙醇，滴加57.38g TMSOTf，滴毕后室温反应过夜。TLC监控反应完全，冰水浴降温，滴加饱和NaHCO3调节PH至7-8后萃取分离有机相，有机相分别用饱和NaCl洗涤1次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩干，柱层析纯化得到182g化合物Y-01。MS(ESI)m/z 482.16([M+H]+)。
合成化合物Y-02
80g Y-01溶于600mL甲醇，加入8g 10％Pd/C，氢气置换3次后室温搅拌10h反应完全。滤除钯碳，浓缩干滤液，浓缩干得到59.86g灰白色固体。MS(ESI)m/z 392.19([M+H]+)。
合成化合物Y-03
氮气保护下，将50.0g化合物Y-02溶于500mL无水二氯甲烷中，然后加入45mLDIPEA，加入40g N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温搅拌反应2h。TLC监控反应结束后，浓缩，柱层析快速分离，得到46.02g化合物Y-03。MS(ESI)m/z 509.19([M+H]+)。
步骤2：化合物B-9的合成路线
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合成化合物B-2
将20.24g SM-2(采购自南京药石科技有限公司)溶于200mL DMF，然后加入15.26gDIPEA和30.13g HBTU，室温搅拌20分钟后，缓慢滴加用50mL DMF溶解的20.02g B-1(采购自南京药石科技有限公司)。滴毕，室温搅拌1小时，TLC监控反应完全。加入600mL饱和碳酸氢钠，然后用300mL乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩干得到33.20g化合物B-2。MS(ESI)m/z738.40([M+H]+)。
合成化合物B-3
将33g B-2溶于400mL 50％CH2Cl2/乙腈中，往体系中加入180mL活化试剂(1M 4,5-二氰基咪唑/1％N-甲基咪唑)，滴加90g Y-03的100mL乙腈溶液，室温搅拌30min，往体系中加入160mL叔丁基过氧化氢/乙腈/水(10:87:3)，TLC监控反应完全，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析纯化，得到化合物77.45g B-3。MS(ESI)m/z 1128.79([(M+2)/2]+)。
合成化合物B-4
60g B-3溶于600mL甲醇，加入6g 10％Pd/C，氢气置换3次后室温搅拌8h反应完全。滤除钯碳，浓缩干滤液，得到51.54g灰白色固体。。MS(ESI)m/z MS(ESI)m/z 1061.74([(M+2)/2]+)。
合成化合物B-5
将16g H-09溶于160mL DMF，加入11.6g HBTU，5.9gDIPEA，室温搅拌15分钟。将46g中间体B-4溶于400mL DMF，然后将该溶液缓慢滴加到上述搅拌体系，室温搅拌30分钟，UPLC-MS监控反应完全。向反应液中加入400mL乙酸乙酯，400mL饱和碳酸氢钠，萃取分取EA层，饱和氯化钠洗涤，硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化，收集产物洗脱液，浓缩干得到42.1g白色固体。MS(ESI)m/z 956.20([(M+3)/3]+)。
合成化合物B-6
将40.0g中间体B-5溶于600mL无水THF，室温搅拌下加入45.6mL TBAF(1M的THF溶液)，搅拌过夜，UPLC-MS监控反应完全。减压蒸去溶剂，粗品用硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，收集产物洗脱液，浓缩干得到23.10g白色固体。MS(ESI)m/z 797.28([(M+3)/3]+)。
合成化合物B-7
氮气保护下，将30.0g化合物B-6溶于300mL无水吡啶中，加入6.2g DMTrCl，室温搅拌反应30min。TLC监控反应结束后，浓缩，硅胶柱层析分离，得到23.02g白色晶状固体，MS(ESI)m/z 797.38([(M-302+3)/3]+)。
合成化合物B-8
氮气保护下，10g B-7溶于100mL无水吡啶，加入100mg DMAP和5.6g丁二酸酐，室温搅拌72h，反应结束，浓缩吡啶，硅胶柱层析纯化得到7.46g产物B-8。MS(ESI)m/z 830.33([(M-302+3)/3]+)。
合成化合物B-9
3g B-8溶于30mL乙腈，加入650mg HATU、300mg DIEA室温振荡10min，加入10gCPG-NH2(96μmol/g)继续振荡过夜，过滤，乙腈淋洗，滤饼中加入50mL cap A、50mL capB继续振荡2h，过滤，乙腈淋洗，真空干燥3h，得到11.2g化合物B-9，载量45μmol/g。
实施例4：SC-13(His(R)-簇GalNAc)的合成
化合物SC-13(His(R)-簇GalNAc)以如下所示的步骤合成：
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合成化合物SC-02
将起始原料换成3-氨基3-(2-羟乙基)-1,5-戊二醇，合成方法同HC-02制备。MS(ESI)m/z 548.35([M+H]+)。
合成化合物SC-03
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-03合成。
MS(ESI)m/z 809.66([M+H]+)。
合成化合物SC-04
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-04合成。
MS(ESI)m/z 639.30([M-H]-)。
合成化合物SC-05
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-05合成。
MS(ESI)m/z 1109.16([M+H]+)。
合成化合物SC-06
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-06合成。
MS(ESI)m/z809.47([M+H]+)。
合成化合物SC-07
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-07合成。
MS(ESI)m/z1049.23([(M+2)/2]+)。
合成化合物SC-08
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-08合成。
MS(ESI)m/z982.09([(M+2)/2]+)。
合成化合物SC-09
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-09合成。
MS(ESI)m/z902.62([(M+3)/3]+)。
合成化合物SC-10
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-10合成。
MS(ESI)m/z1115.52([(M+2)/2]+)。
合成化合物SC-11
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-11合成。
MS(ESI)m/z1115.56([(M-302)+2)/2]+)。
合成SC-12
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-12合成。
MS(ESI)m/z1165.62([(M-302)+2)/2]+).
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01-7.88(m,10H),7.40-7.34(m,3H),7.29-7.18(m,8H),7.06(s,1H),6.78-6.82(m,4H),6.60(s,1H),5.18(d,3H),4.96(dd,3H),4.54-4.46(m,5H),4.20-4.15(m,2H),4.05-3.93(m,8H),3.82(q,3H),3.70(s,6H),3.65-3.71(m,3H),3.55-3.50(m,12H),3.41-3.34(m,4H),3.04-3.01(m,14H),2.87(d,2H),2.77-2.56(m,4H),2.30-2.26(m,8H),2.10(s,9H),2.06-2.01(m,8H),1.96(s,9H),1.94-1.90(m,6H),1.85(s,9H),1.75(s,9H),1.52-1.43(m,20H),1.27-1.20(m,9H),1.11(d,3H),MS(ESI)m/z 1145.05([(M-302)+2)/2]+)。
合成化合物SC-13
合成方法同His(R)-簇GalNAc合成路线中的HC-13合成。
实施例5本发明提供的缀合寡核苷酸的合成
天然存在或化学修饰的寡核苷酸采用固相合成等通用方法合成。并且通过如下所示的示例性方法合成化合物缀合的寡核苷酸：
Oligo缀合GC-05(Glu-R-簇GalNAc)的制备
固相合成步骤
通过本领域已知的亚磷酰胺固相合成方法，以GC-05作为固相合成载体，通过MerMade192固相合成仪按照序列顺序以3’到5’的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体包括脱保护、偶联、加帽和氧化四个步骤，上述步骤的标准程序是本领域普通技术人员已知的，并且所有单体溶液均配置成0.1M的乙腈溶液。
固相合成试剂配置如下：
洗涤剂：乙腈
解离剂(Deblock)：3％二氯乙酸的二氯甲烷溶液
活性剂:0.25M 5-乙硫基-1H-四唑的乙腈溶液
加帽试剂A：THF/二甲基吡啶/乙酸酐(8:1:1)
加帽试剂B：15％NMI/THF，GL38 finish
氧化剂：0.02M I2 in THF/吡啶/H2O
硫化剂：0.10M DDTT溶液
以1μmol合成规模为例的固相合成条件如下：
/>
裂解和脱保护步骤
将上述固相合成步骤中得到的Oligo-support加入至1mL离心管中，加入50～100μl浓氨水，50-60℃孵育10h，离心吸取上清液，向上清液中加入2倍体积的丙酮-乙醇(80：20)溶剂，析出白色沉淀，10,000g离心去除上清液得到沉淀产品，将沉淀复溶于0.2M乙酸钠溶液中。
纯化、脱盐和冻干步骤
利用1mL体积的离子色谱柱(装载填料Nano Q 30)，在Avant150纯化设备上进行纯化。
具体条件为：
Buffer A：20mM磷酸钠-10％乙腈-水缓冲溶液(pH7.5)，
Buffer B：2.0M NaCl-20mM磷酸钠-乙腈-水缓冲溶液(pH7.5)；
洗脱梯度：Buffer B 0～50％，Buffer A 100～50％
收集产品洗脱液后合并，最后采用G25葡聚糖凝胶柱进行脱盐处理；脱盐后的产品溶液测定OD260浓度值，计算产品含量，最终放入离心管中进行冻干得到白色冻干品。
检测：采用反相UPLC-MS串联质谱进行检测，纯度在90％以上，质谱表现为m/z[M-7/7]-、[M-8/8]-、[M-9/]-特征离子峰。AS-Oligo的合成实施例参见GC-05-OLIGO，以Unylinker-CPG(采购自Glen Research)为固相合成载体进行合成。
Oligo缀合His-R-簇GalNAc合成实施例参见GC-05-OLIGO，以HC-13作为固相合成载体进行合成。
Oligo缀合His-R-簇GalNAc合成实施例参见GC-05-OLIGO，以SC-13作为固相合成载体进行合成。
Oligo缀合His-R-簇GalNAc合成实施例参见GC-05-OLIGO，以B-9作为固相合成载体进行合成。
siRNA-GalNAc缀合物或者aiRNA-GalNAc缀合物的制备是将上述得到的Oligo-GalNAc缀合物与互补序列反义链以1：1的摩尔比进行退火，即得到双链产物。
活性测试
材料和方法
合成的用于测试的缀合aiRNA：
我们设计的化合物HC-5是基于组氨酸连接子的三簇GalNAc，缀合在双链体RNA(例如aiRNA或siRNA)的正义链3’末端，在以下实施例中使用和描述时采用代码“His-cluster”表示。
我们设计的化合物GC-5是基于谷氨酸连接子的三簇GalNAc，缀合在双链体RNA(例如aiRNA或siRNA)的正义链3’末端，在以下实施例中使用和描述时采用代码“Glu-cluster”表示。
合成并用于活性测试实施例的寡核苷酸(aiRNA和siRNA)的序列和结构如下表所示：
测试的aiRNA序列
AGCU表示2’OMe修饰的RNA，agcu表示2’F修饰的RNA，*＝PS，-L表示缀合的GalNAc缀合物
本发明中的缀合物的体外递送效率在肝细胞上通过RT-qPCR测试。原代小鼠肝细胞分离的步骤如下：
A部分：灌注
(1)用缓冲液A灌注
(2)用缓冲液B灌注
(3)解剖肝脏，放入缓冲液C中
缓冲液A：向500mL HBSS中加入93mg EDTA(0.5mM)
缓冲液B：向500mL DMEM中加入400mg I型胶原酶(0.8mg/mL)
(注：灌注时加入胶原酶)
缓冲液C：向100mL DMEM中加入2mg BSA(2％)
B部分：分离
·灌注后，将肝脏放入10厘米TC盘中，打开肝脏袋，用镊子摇动组织帮助解离。
·通过70微米过滤器过滤；用缓冲液C洗涤过滤器，4℃离心50g 5分钟。
·弃去上清液，在50ml缓冲液C中轻轻重悬(洗涤1)，并在4℃下以50g离心5分钟。
·弃去上清液，在50ml缓冲液C中轻轻重悬(洗涤2)，并在4℃下以50g离心5分钟。
·弃去上清液，在50ml缓冲液C中轻轻重悬(洗涤3)，并在4℃下以50g离心5分钟。
·丢弃上清液，重悬于解冻/平板培养基中。
·用台盼蓝计数以评估活力/产量。
·使用小鼠原代肝细胞解冻培养基(thermos fisher，CM3000)将细胞接种在胶原酶包被的平板(thermos fisher，A1142802)上。较好的是以1毫升/孔接种在24孔板上。
·3-4小时后，培养基替换为原代肝细胞维持培养基(thermofisher，CM4000)。
在不使用转染剂的情况下进行体外自递送试验(在12孔板中测试，100,000个细胞/孔，48小时孵育)。测试的Oligo GalNAc缀合物的浓度在以下的每个实施例中标注。“mock”样本的Oligo GalNAc缀合物的浓度为0nm。通过RT-q PCR检测靶向的mRNA的表达水平。
对于体内测试，所有动物在研究开始之前至少在室内适应48小时。从CharlesRiver实验室(Charles River Laboratorie)获得6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，并随机分配到每组。所有动物均按照IACUC方案处理。在不同的实施例中，对小鼠以20mg/Kg或2mg/Kg的剂量皮下注射aiRNA双链体或对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。取肝脏进行疗效分析。
实施例6肝细胞对缀合/不缀合的aiRNA的体外摄取
“His-cluster”缀合的mβ-Catenin aiRNA(aiRNA#1)与不缀合的aiRNA相比，在100nM、10nM甚至1nM下的体外自递送试验中显示出显著的基因沉默活性，证明了本发明提供的GalNAc缀合物具有递送如aiRNA的双链体RNAi剂的巨大效力。QPCR测试结果如图2所示。
实施例7肝脏对与GalNac缀合物缀合的aiRNA的体外摄取
mβ-Catenin aiRNA(aiRNA#1)与本发明提供的两种不同的GalNAc缀合物缀合，二者分别在10nM浓度下与分离的小鼠肝细胞共培养24小时。Glu-cluster(3GalNAc)和His-cluster(3GalNAc)在体外自递送中都显示出非常有效的基因沉默。本发明提供的GalNAc缀合物对于递送双链体RNAi剂(例如aiRNA)有很大的效力。
实施例8与GalNAc缀合物缀合的aiRNA的体内递送效力
以20mg/kg向C57BL/6J小鼠皮下注射aiRNA缀合物(mβ-Catenin aiRNA(aiRNA#1)分别与“His-cluster”和“Glu-cluster”缀合)。在注射后第2天采集肝脏样本，分析catenin蛋白的表达水平。如图4所示，His-cluster缀合物和Glu-cluster缀合物在体内诱导了有效的基因沉默活性。与之前收集的体外数据类似，在本试验中Glu-cluster缀合物在递送所述aiRNA方面似乎比His-cluster缀合物更有效。在以2mg/kg的剂量注射靶向beta-catenin的缀合的aiRNA后的第2天、第14天和第28天，分析了肝脏中的基因表达。如图5所示，与His-cluster或Glu-cluster缀合的aiRNA在体内诱导了有效且持久的基因沉默活性，这表明本发明提供的GalNAc缀合物可以在体内高效递送双链体RNAi剂。
实施例9与GalNAc缀合物缀合的aiRNA的体外摄取和体内递送效率
按照上述方法，对具有SS中间位置结构的aiRNA(aiRNA#1)和具有SS 3'平末端结构的aiRNA(aiRNA#2)进行了体外和体内测试。SS中间位置aiRNA是示例性的中间型干扰RNA双链体分子，SS 3'平末端aiRNA是示例性的平末端型干扰RNA双链体分子。通过本发明组合物缀合的两种类型的aiRNAs在100nM、10nM甚至1nM浓度下的体外自递送试验中，以及在体内试验中(单剂量23mg/kg皮下给药(s.c.)后4h，与对照组相比)，显示出强大的基因沉默活性。通过QPCR进行测试，结果如图6和图7所示。同样令人惊讶的是，在体外和体内试验中，中间型aiRNA都显示出比平末端型aiRNA更有效的活性。这些数据表明，本发明提供的新型连接体组合物可用于将GalNac缀合到不同的双链体RNA结构。此外，通过与本发明提供的组合物缀合的中间型干扰RNA双链体/aiRNA-GalNAc复合物可进一步提高基因沉默效率。
实施例5-9中的这些结果清楚地表明，基于本发明设计的GalNAc缀合物可以显著提高寡核苷酸在体外和体内的递送效率，实现靶向肝细胞中不同基因的巨大基因沉默效力。此外，本发明中提供的连接体组合物是基于我们身体的氨基酸，其消除了GalNAc缀合物中使用的其他类型连接体的安全风险。
对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和变化。对本领域技术人员而言，参考本发明公开的说明书和实践，本发明的其它实施方案是显而易见的。我们希望说明书和实施例只是被认为是示例性的，以下的权利要求书会对本发明的真正的范围和精神进行阐述。
贯穿本申请，为更全面地描述和本发明有关的现有技术的情况，参考了不同的出版物、专利、和/或专利申请。这些出版物、专利、和/或专利申请的公开在本文中以其整体作为参考并入，就如同每一个单独的出版物、专利、和/或专利申请专门地、单个地被指出通过参考并入。

Claims (68)

1.一种化合物，具有结构式(G-H1)：
其中：
R111、R112、R113对于每次出现各自独立地为H、或R119A；且R111、R112、R113中的至少一个为R119A；
R119A包含至少一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R114、R117、R118选自由以下组成的组中的一个或多个：H、或烷基、芳基、杂芳基、卤代烷基、-O烷基、-O烷基苯基、-烷基-OH、-O卤代烷基、-S烷基、-S烷基苯基、-烷基SH、-S卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-烷基-NH2、-N(烷基)(烷基)、-NH(烷基)、-N(烷基)(烷基苯基)、-NH(烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O烷基、-CON(烷基)(烷基)、-CONH(烷基)、-CONH2、-NHC(O)(烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(烷基)C(O)(烷基)、-N(烷基)C(O)(苯基)、-C(O)烷基、-C(O)烷基苯基、-C(O)卤代烷基、-OC(O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(卤代烷基)；
R115、R116对于每次出现各自独立地为OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸酯基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、固相载体、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R119B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、或寡核苷酸；
J111、J112、R119B对于每次出现各自独立地为间隔体；
Z'、Z"、Z'"和Z""对于每次出现各自独立地为O或S；
n111、n112对于每次出现各自独立地为1、2、3、4、5或6；
所述寡核苷酸包含天然存在的或化学修饰的核苷酸/核苷。
2.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-01)：
其中：
J112A选自由以下组成的组：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2；
J112B选自1至10个碳原子的亚烷基；
R115A为固相载体或H；
R116选自由以下组成的组：OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R119B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、或寡核苷酸；
可选地，J112B选自1至10个碳原子的直链亚烷基。
3.权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中n112为1。
4.权利要求1-3任一项所述的化合物，其中R116包含寡核苷酸。
5.权利要求4所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-02)：
6.权利要求4所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-03)：
7.权利要求4所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-04)：
其中：
R119C选自–C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或–C(O)-C8–C11直链亚烷基-；R119L独立地选自能够与细胞表面受体对接的配体；
n111L选自1、2、3、4或5。
8.权利要求7所述的化合物，其中：
J111、J112、R119B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R119B可选地不被取代或被R119D取代；
R114、R117、R118、R119D选自由以下组成的组中的一个或多个：H、或C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)OC1-C10烷基、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
n111L选自1、2、3、4或5。
9.权利要求1-8任一项所述的化合物，其中所述间隔体为1至10个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2，和其中所述间隔体可选地不被取代或被选自下组中的至少一个基团取代：H、或C1-C5烷基、-OC1-C5烷基。
10.权利要求7所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
其中每个n独立地为1至20；和
m为2至6。
11.权利要求7所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
12.权利要求7所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
其中每个A1独立地为O、S、C＝O，或NH；和
每个n独立地为1至20。
13.权利要求7所述的化合物，其中所述分支基团是：
14.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-05)或(G-
H1-06)：
其中：
每个X’独立地选自表1；每个Z’独立地选自表2；
R119C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
15.权利要求14所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-07)或(G-
H1-08)：
其中：
R、R’独立地选自由以下组成的组：固相载体、包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷组成的寡核苷酸；
D选自表3；
每个E独立地选自表4；
Z’独立地选自表2；和
每个L独立地包含一种能够与细胞表面受体对接的配体部分。
16.权利要求15所述的化合物，其中D选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-
CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
17.权利要求14所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-09)或(G-H1-10)：
其中：
R、R’独立地选自由以下组成的组：包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
A独立地为O或S；
X’独立地选自表1；
Z’独立地选自表2；
每个D选自表3；
每个E独立地选自表4；和
每个L独立地包含一种能够与细胞表面受体对接的配体部分。
18.权利要求17所述的化合物，其中A为O。
19.权利要求17所述的化合物，其中A为S。
20.权利要求1-19任一项所述的化合物，其中每个配体独立地选自由以下组
成的组：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、胆固醇、生育酚、生物素、菁染料、叶酸、RGDp、转铁蛋白、茴香酰胺、乳糖酸、cRGD、透明质酸、
低分子量鱼精蛋白、脂质衍生物、肽、环肽和杂环。
21.权利要求1-20任一项所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-H1-11)：
其中：
R112B具有如下所示结构：
-branching group-(R119B-R119L)n 111L；
R119L独立地选自一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R119B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R119B可选地不被取代或被R119C取代；
R114、R117、R118、R119C选自由以下组成的组中的一个或多个：H、或C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)OC1-C10烷基、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
R、R’独立地选自由以下组成的组：固相载体、包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
n111L选自1、2、3、4或5。
22.权利要求4所述的化合物，具有结构式HC-1至HC-8：
/>
/>
。
23.权利要求4所述的化合物，具有结构式HC-9：
24.权利要求4所述的化合物，具有结构式HC-5：
25.权利要求1-24任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸通过其5’末端和/或3’末端与所述化合物的其它部分相连。
26.权利要求25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含小干扰RNA
(siRNA)双链体。
27.权利要求25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含不对称干扰RNA
(aiRNA)双链体。
28.权利要求27所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、
23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链体时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和0-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
29.权利要求28所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、
23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链体时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和1-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
30.权利要求28所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、
23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链体时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和5'平末端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
31.权利要求25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含反义寡核苷酸(ASO)。
32.权利要求25所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含微小RNA(miRNA)。
33.一种化合物，具有结构式(G-G1)：
其中：
R127包含至少一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R123、R124、R125、R126选自由以下组成的组中的一个或多个：H、烷基、芳基、杂芳基、卤代烷基、-O烷基、-O烷基苯基、-烷基-OH、-O卤代烷基、-S烷基、-S烷基苯基、-烷基SH、-S卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-烷基-NH2、-N(烷基)(烷基)、-NH(烷基)、-N(烷基)(烷基苯基)、-NH(烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O烷基、-CON(烷基)(烷基)、-CONH(烷基)、-CONH2、-NHC(O)(烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(烷基)C(O)(烷基)、-N(烷基)C(O)(苯基)、-C(O)烷基、-C(O)烷基苯基、-C(O)卤代烷基、-OC(O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(烷基)、-NHSO2(苯基)、和-NHSO2(卤代烷基)；
R121、R122对于每次出现各自独立地为OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸酯基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、固相载体、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R128B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、或寡核苷酸；
J121、J122、R128B对于每次出现各自独立地为间隔体；
Z'、Z"、Z'"和Z""对于每次出现各自独立地为O或S；
n121、n122对于每次出现各自独立地为1、2、3、4、5或6；
所述寡核苷酸包含天然存在的或化学修饰的核苷酸/核苷。
34.权利要求33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-01)：
J122A选自由以下组成的组：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2；
J122B选自1至10个碳原子的亚烷基；
R121A选自由以下组成的组：H和固相载体；
R122选自由以下组成的组：OH、OH的保护基团、磷酸基团、磷酸二酯基团、活化磷酸酯基团、活化亚磷酸酯基团、亚磷酰胺、固相载体、-OP(Z')(Z")O-核苷、-OP(Z')(Z")O-寡核苷酸、脂质、PEG、甾体、聚合物、-O-核苷酸、核苷、-OP(Z')(Z")O-R128B-OP(Z'")(Z"")O-寡核苷酸、或寡核苷酸；
可选地，J122B选自1至10个碳原子的直链亚烷基。
35.权利要求33或权利要求34所述的化合物，其中n122为1。
36.权利要求33-35任一项所述的化合物，R122包含寡核苷酸。
37.权利要求36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-02)：
38.权利要求36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-03)：
39.权利要求36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-04)：
其中：
J123A选自由以下组成的组：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和S(O)2；
R128A具有如下所示结构：
-R128C-branching group-(R128B-R128L)n 121L、或-R128B-R128L；
R128L独立地选自一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R128B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R128B可选地不被取代或被R128C取代；
R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-；
n121L选自1、2、3、4或5；
R128L独立地选自一种能够与细胞表面受体对接的配体部分；
n111L选自1、2、3、4或5；
n121为2；
可选地，R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
40.权利要求33-39任一项所述的化合物，其中所述间隔体为1至10个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一
个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N和
S(O)2，和其中所述间隔体可选地不被取代或被选自下组中的至少一个基团取代：H、或C1-C5烷基、-OC1-C5烷基。
41.权利要求40所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
/>
其中每个n独立地为1至20；和
m为2至6。
42.权利要求40所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
/>
43.权利要求40所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
其中每个A1独立地为O、S、C＝O，或NH；和
每个n独立地为1至20。
44.权利要求40所述的化合物，其中所述分支基团选自由以下组成的组：
45.权利要求33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-05)或
(G-G1-06)：
其中：
每个X’独立地选自表1；每个Z’独立地选自表2；
R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
46.权利要求33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-07)或
(G-G1-08)：
/>
其中：
R、R’独立地选自包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
Z’独立地选自表2；
R128C选自-C(O)-C5–C8直链亚烷基-NHCO-CH2-、或-C(O)-C8–C11直链亚烷基-。
47.权利要求33所述的化合物，其中所述化合物具有结构式(G-G1-09)或
(G-G1-10)：
其中：
R、R’独立地选自天然存在的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含天然存在的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
A为O或S；
D’选自表9；
每个E选自表4；
X’独立地选自表1；
Z’独立地选自表2；
每个L独立地包含一种能够与细胞表面受体对接的配体部分；和
n4独立地选自1、2、3和4。
48.权利要求47所述的化合物，其中A为O。
49.权利要求47所述的化合物，其中A为S。
50.权利要求33-49任一项所述的化合物，其中每个配体独立地选自由以下组成的组：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、胆固醇、生育酚、生物素、菁染料、叶酸、RGDp、转铁蛋白、茴香酰胺、乳糖酸、cRGD、透明质酸、低分子量鱼精蛋白、脂质衍生物、肽、环肽和杂环。
51.权利要求33所述的化合物，具有结构式
其中：
R129具有如下所示结构：
-branching group-(R128B-R128L)n 121L；
R128L独立地选自一种能够与细胞表面受体对接的配体；
R128B独立地选自1至30个碳原子的亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被由以下组成的组中的任意一个或多个取代基替代：C(O)、NH、O、S、OP(O)O、OP(S)O、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18杂亚环基、和C5-C10杂亚芳基，和其中R128B可选地不被取代或被R128C取代；
R、R’独立地选自由以下组成的组：固相载体、包含天然的或化学修饰的核苷酸/核苷的寡核苷酸、H和保护基团；
R和R’中的至少一个包含由天然存在的和/或化学修饰的核苷酸/核苷形成的寡核苷酸；
n121L选自1、2、3、4或5。
52.权利要求36所述的化合物，其中所述化合物具有结构式GC-1至GC-8：
/>
/>
/>
53.权利要求36所述的化合物，具有结构式GC-9
54.权利要求36所述的化合物，具有结构式GC-5
55.权利要求33-54任一项所述的化合物，其中寡核苷酸通过其5’末端和/或3’末端与所述化合物的其它部分相连。
56.权利要求55所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含小干扰RNA(siRNA)双链体。
57.权利要求33-54任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含不对称干扰RNA(aiRNA)体。
58.权利要求57所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、
23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链体时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和0-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
59.权利要求58所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、
23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链体时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和1-8个核苷酸的5'突出端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
60.权利要求58所述的化合物，其中所述aiRNA包含反义链和正义链，其中所述反义链比所述正义链长，所述反义链的长度为19、20、21、22、
23、24、25、26或27个核苷酸，以及当与所述正义链形成双链体时所述反义链包括1-9个核苷酸的3'突出端和5'平末端；
其中所述正义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸，且与所述反义链形成双链区。
61.权利要求33-54任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含反义寡核苷酸(ASO)。
62.权利要求33-54任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含微小RNA(miRNA)。
63.一种小干扰RNA(siRNA)剂包含权利要求1-55任一项所述的结构式。
64.一种不对称干扰RNA(aiRNA)剂包含权利要求1-55任一项所述的结构式。
65.一种反义寡核苷酸(ASO)剂包含权利要求1-55任一项所述的结构式。
66.一种微小RNA(miRNA)剂包含权利要求1-55任一项所述的结构式。
67.一种药物组合物包含权利要求1-60任一项所述的化合物或权利要求63-66任一项所述的剂和一种药学上可接受的赋形剂、载体、或稀释剂。
68.权利要求1-60任一项所述的化合物或权利要求63-66任一项所述的剂在制备有效治疗疾病或病症的药物中的用途。
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