BR122022020181B1 - Compostos oligoméricos com grupos de conjugado, composições compreendendo os referidos compostos e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

São fornecidos aqui compostos oligoméricos com grupos de conjugado que se direcionam à apolipoproteína C-III (ApoCIII). Em de-terminadas modalidades, os compostos oligoméricos que se direcionam à ApoCIII estão conjugados à N-Acetilgalactosamina. Também são divulgados aqui compostos conj

Description

Listagem de Sequência

[001] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequência em formato eletrônico. A Listagem de Sequência é fornecida como um arquivo intitulado BIOL0249WOSEQ_ST25.txt criado em 1° de maio de 2013, que tem 68 Kb de tamanho. As informações no formato eletrônico da listagem sequência são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O princípio por trás da tecnologia antissenso é que um com posto antissenso se hibridiza em um ácido nucleico alvo e modula a quantidade, atividade e/ou a função do ácido nucleico alvo. Por exemplo em certos casos, compostos antissensos resultam na transcrição alterada ou tradução de um alvo. Tal modulação da expressão pode ser conseguida, por exemplo, a degradação do mRNA alvo ou inibição baseada na ocupação. Um exemplo de modulação da função alvo de RNA pela degradação é a degradação à base de RNase H do RNA alvo mediante hibridação com um composto antissenso semelhante ao DNA. Outro exemplo de modulação da expressão gênica pela degradação do alvo é o RNA de interferência (RNAi). RNAi refere-se ao silenciamento de genes mediado por antissenso através de um mecanismo que utiliza o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Um exemplo adicional de modulação da função alvo do RNA é através de um mecanismo baseado em ocupação, tal como empregado naturalmente pelo microRNA. MicroRNAs são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão de RNAs codificantes de proteínas. A ligação de um composto antissenso para um microRNA impede que o microRNA se ligue a seus alvos de RNA mensageiro e, portanto, interfere com a função do microRNA. Mímicos de MicroRNA podem melhorar a função nativa do microRNA. Certos compostos antissenso alteram a junção do pré-mRNA. Independentemente do mecanismo específico, a especificidade da sequência torna compostos antissenso atraentes como ferramentas para validação de alvo e funcionalização do gene, bem como terapêutica para modular seletivamente a expressão dos genes envolvidos na patogênese das doenças.

[003] A tecnologia antissenso é um meio eficaz para modular a ex pressão de um ou mais produtos de genes específicos e, portanto, pode revelar-se excepcionalmente útil em um número de diagnósticos, terapêuticos e aplicações de pesquisa. Nucleosídeos modificados quimicamente podem ser incorporados em compostos antissenso para melhorar uma ou mais propriedades, como resistência à nuclease, farmacoci- nética ou afinidade por um alvo do ácido nucleico. Em 1998, o composto antissenso, Vitravene® (fomivirsen; desenvolvido pela Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, CA) foi o primeiro fármaco antissenso de conseguir liberação de comercialização dos U.S. Food and Drug Administration (FDA), e atualmente é um tratamento da retinite induzida por citomega- lovírus (CMV) em pacientes com AIDS.

[004] Novas modificações químicas melhoraram a potência e efi cácia de compostos antissenso, descobrindo o potencial para a distribuição oral, bem como potencializando a administração subcutânea, diminuindo o potencial de efeitos colaterais, e levando a melhorias do conforto do paciente. Modificações químicas, aumentando a potência de compostos antissenso permitem a administração de doses mais baixas, o que reduz o potencial de toxicidade, bem como diminuindo o custo total da terapia. Modificações aumentando a resistência à degradação resultam em depuração mais lenta do corpo, permitindo uma dosagem menos frequente. Diferentes tipos de modificações químicas podem ser combinados em um composto para otimizar ainda mais a eficácia do composto.

[005] A apolipoproteína C-III (também chamada APOC3, APOC- III, ApoCIII e APO C-III) é um constituinte de HDL e de lipoproteínas ricas em triglicerídeos (TG). Níveis elevados de ApoCIII estão associados a níveis elevados de TG e a doenças como doenças cardiovasculares,síndrome metabólica, obesidade e diabetes (Chan et al., Int J Clin- Pract, 2008, 62:799-809; Onat et at., Atherosclerosis, 2003, 168:81-89; Mendivil et al., Circulation, 2011, 124:2065-2072; Mauger et al., J. Lipid Res, 2006. 47: 1212-1218; Chan et al., Clin. Chem, 2002. 278-283; Ooi et al., Clin. Sci, 2008. 114: 611-624; Davidsson et al., J. Lipid Res. 2005. 46: 1999-2006; Sacks et al., Circulation, 2000. 102. 1886-1892; Lee et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003. 23: 853-858). ApoCIII retarda a clearance de lipoproteínas ricas em TG pela inibição de lipólise por meio da inibição da lipoproteína lipase (LPL) e por meio da interferência com a lipoproteína que se liga à matriz de glicosaminoglicano da superfície celular (Shachter, Curr. Opin. Lipidol, 2001, 12, 297-304).

[006] A tecnologia antissenso está emergindo como um meio efi caz para reduzir a expressão de determinados produtos do gene e, portanto, pode vir a ser bem útil em uma série de aplicações terapêuticas, de diagnóstico, e de pesquisa para a modulação de ApoCIII. Compostos antissenso que direcionam a ApoCIII e métodos associados para inibição da ApoCIII foram divulgados anteriormente (ver, por exemplo, PatenteU.S. N° 7.598.227, Patente U.S. N° 7.750.141, publicação PCT WO 2004/093783, publicação PCT WO 2012/149495 e PCT/US14/016546, todos incorporados por referência aqui). Um composto antissenso que direciona a ApoCIII, ISIS-APOCIIIRx foi testado em uma Fase I e em ensaios clínicos II. No entanto, nenhum composto an- tissenso que direciona a ApoCIII foi aprovado para uso comercial, portanto, ainda há uma necessidade de oferecer aos pacientes opções de tratamento adicionais e mais potentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for nece compostos antissenso conjugados. Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece compostos antissenso conjugados, compreendendo o oligonucleotídeo antissenso complementar a um transcrito de ácido nucleico. Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece métodos que compreendem o contato de uma célula com um composto antissenso conjugado compreendendo um oligonu- cleotídeo antissenso complementar a um transcrito de ácido nucleico. Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece métodos que compreendem o contato de uma célula com um composto antis- senso conjugado compreendendo um oligonucleotídeo antissenso e reduzindo a quantidade ou a atividade de um transcrito de ácido nucleico em uma célula.

[008] O receptor da asialoglicoproteína (ASGP-R) foi descrito an teriormente. Ver, por exemplo, Park et al., PNAS vol. 102, No. 47, pp 17125-17129 (2005). Esses receptores são expressos em células do fígado, particularmente hepatócitos. Além disso, verificou-se que compostos composto por aglomerados de três ligantes N-acetilgalactosa- mina (GalNAc) são capazes de vinculação ao ASGP-r, resultando em absorção do composto para a célula. Ver, por exemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, pp 5216-5231 (maio de 2008). Nesse sentido, os conjugados compreendendo esses agrupamentos de GalNAc têm sido utilizado para facilitar a absorção de certos compostos nas células do fígado, especificamente nos hepatócitos. Por exemplo, foi mostrado que certos conjugados contendo GalNAc aumentam a atividade de compostos de siRNA duplex nas células do fígado in vivo. Em tais casos, o conjugado contendo GalNAc está normalmente ligado à fita senso do siRNA duplex. Uma vez que a fita senso é descartada antes que a fita antissenso se hibridize, enfim, no ácido nucleico alvo, há pouca preocupação de que o conjugado interfira na atividade. Normalmente, o conjugado é ligado à extremidade 3' da fita senso do siRNA. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 8.106.022. Certos grupos de conjugados descritos aqui são mais ativos e/ou mais fáceis de sintetizar do que os grupos de conjugados descritos anteriormente.

[009] Em determinadas modalidades da presente invenção, os conjugados são ligados aos compostos antissenso de fita única, incluindo, mas não se limitando a compostos antissenso baseados em RNase H e compostos antissenso que alteram a junção de um ácido nucleico alvo de pré-mRNA. Em tais modalidades, o conjugado deve permanecer ligado ao composto antissenso tempo suficiente para fornecer o benefício (absorção melhorada nas células) mas em seguida deve ser clivado, ou de outra forma para não interferir nas etapas sub-sequentesnecessárias para a atividade, tais como a hibridização de um ácido nucleico alvo e a interação com a RNase H ou com enzimas associadasà junção ou à modulação por splice. Esse equilíbrio de propriedadesé mais importante na configuração dos compostos antissenso de fiar única do que nos compostos de siRNA, onde o conjugado pode simplesmente estar ligado à fita senso. Divulgados aqui estão os compostos antissenso de fita única conjugados tendo potência melhorada nas células do fígado in vivo em comparação com o mesmo composto antissenso em que falta o conjugado. Dado o equilíbrio necessário das propriedades para esses compostos, tal potência melhorada é surpreendente.

[0010] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado compreendem aqui uma porção clivável. Como observado, sem querer estar vinculado pelo mecanismo, é lógico que o conjugado deve permanecer no composto tempo suficiente para proporcionar melhoria na absorção, mas após isso, é desejável que uma alguma parte ou, idealmente, a totalidade do conjugado seja clivada, liberando o composto de origem (por exemplo, composto antissenso) em sua forma mais ativa. Em determinadas modalidades, a porção clivável é um nucleosídeo cli- vável. Tais modalidades tiram proveito de nucleases endógenas na célula, ligando o resto do conjugado (o agrupamento) ao oligonucleotídeo antissenso através de um nucleosídeo através de uma ou mais ligações cliváveis, tais como aquelas de uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o agrupamento está ligado ao nucleosídeo clivável através de uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o nucleosídeo clivável está ligado ao oligonucleotídeo antissenso (composto antissenso) por uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o grupo do conjugado pode compreender dois ou três nucleo- sídeos cliváveis. Em tais modalidades, tais nucleosídeos cliváveis estão ligados um ao outro, ao composto antissenso e/ou ao agrupamento por meio de ligações cliváveis (tais como aquelas de uma ligação fosfodié- ster). Certos conjugados aqui não compreendem um nucleosídeo clivá- vel e, em vez disso, compreendem uma ligação clivável. É mostrado que a clivagem suficiente do conjugado a partir do oligonucleotídeo é pro-porcionada por pelo menos uma ligação que é vulnerável à clivagem na célula (uma ligação clivável).

[0011] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são profármacos. Tais profármacos são administrados a um animal e são, enfim, metabolizados numa forma mais ativa. Por exemplo, os compostos antissenso conjugados são clivados para remover a totalidade ou parte do conjugado resultando na forma ativa (ou mais ativa) do composto antissenso em que falta a totalidade ou uma parte do conjugado.

[0012] Em determinadas modalidades, os conjugados são ligados na extremidade 5' de um oligonucleotídeo. Alguns desses conjugados 5'são clivados mais eficientemente do que as contrapartes tendo um grupo de conjugado semelhante liagdo à extremidade 3'. Em determi-nadas modalidades, a atividade melhorada pode se correlacionar com a clivagem melhorada. Em determinadas modalidades, os oligonucleo- tídeos compreendendo um conjugado na extremidade 5' tem maior efi-cácia do que os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado na extremidade 3' (ver, por exemplo, Exemplos, 56, 81, 83 e 84). Além disso, a ligação em 5' permite uma síntese mais simples do oligonucle- otídeo. Normalmente, os oligonucleotídeos são sintetizados em um su-portesólido na direção 3' para 5'. Para fazer o oligonucleotídeo conjugado em 3', normalmente, liga-se um nucleosídeo pré-conjugado 3' ao suporte sólido e então monta-se o oligonucleotídeo como de costume. No entanto, a ligação desse nucleosídeo conjugado ao suporte sólido adiciona uma complicação à síntese. Além disso, usando essa aborda-gem, o conjugado está então presente em toda a síntese do oligonucle- otídeo e pode tornar-se degradado durante as etapas subsequentes ou pode limitar os tipos de reações e reagentes que podem ser usados. Usando as estruturas e as técnicas descritas aqui para oligonucleotí- deos conjugados em 5', podemos sintetizar o oligonucleotídeo usando técnicas padrão automatizadas e introduzir o conjugado com o nucleo- sídeo (mais extremo em 5') final ou depois do oligonucleotídeo ter sido clivado do suporte sólido.

[0013] Tendo em vista a técnica e a presente divulgação, um ver sado na técnica pode facilmente fabricar qualquer um dos conjugados e oligonucleotídeos conjugados aqui. Além disso, a síntese de tais conjugados e oligonucleotídeos conjugados divulgados aqui é mais fácil e/ou requer algumas etapas, e é, portanto, menos caro do que a dos conjugados anteriormente divulgados, oferecendo vantagens na fabricação. Por exemplo, a síntese de certos grupos de conjugado consiste em menos etapas sintéticas, resultando em aumento de rendimento, em relação aos grupos de conjugado descritos anteriormente. Os grupos de conjugado, tais como GalNAc3-10 no Exemplo 46 e GalNAc3-7 no Exemplo 48 são muito mais simples do os conjugados descritos anteriormente, tais como os descritos em U.S. 8.106.022 ou U.S. 7.262.177 que exigem o conjunto de mais intermediários químicos. Por conseguinte, esses e outros conjugados descritos aqui têm vantagens sobre os compostos descritos anteriormente para uso com qualquer oligonu- cleotídeo, incluindo oligonucleotídeos de fita única e qualquer fita de oli- gonucleotídeos de fita dupla (por exemplo, siRNA).

[0014] De forma semelhante, são divulgados aqui grupos de conju gado tendo apenas um ou dois ligantes de GalNAc. Como mostrado, tais grupos de conjugados melhoram a atividade dos compostos antis- senso. Tais compostos são mais fáceis de preparar do que os conjugados compreendendo três ligantes de GalNAc. Os grupos de conjugado que compreendem um ou dois ligantes de GalNAc podem estar ligados a quaisquer compostos antissenso, incluindo oligonucleotídeos de fita única e qualquer fita de oligonucleotídeos de fita dupla (por exemplo, siRNA).

[0015] Em determinadas modalidades, os conjugados aqui não al teram substancialmente certas medidas de tolerabilidade. Por exemplo, é mostrado aqui que os compostos antissenso conjugados não são mais imunogênicos do que os compostos de origem não conjugados. Uma vez que a potência é melhorada, as modalidades, em que a tolerabili- dade permanece a mesma (ou de fato, mesmo se a tolerabilidade piorar apenas ligeiramente em comparação com os ganhos de potência), têm propriedades melhoradas para a terapia.

[0016] Em determinadas modalidades, a conjugação permite alterar os compostos antissenso de formas a ter consequências menos atraentes na ausência de conjugação. Por exemplo, em determinadas modalidades, a substituição de uma ou mais ligações de fosforotioato de um composto antissenso totalmente de fosforotioato com ligações fosfodié- ster resulta na melhoria de algumas medidas de tolerabilidade. Por exemplo, em certos casos, tais compostos antissenso, que têm um ou mais fosfodiéster, são menos imunogênicos do que o mesmo composto, em que cada ligação é um fosforotioato. No entanto, em certos casos, conforme mostrado no Exemplo 26, essa mesma substituição de uma ou mais ligações fosforotioato com ligações fosfodiéster também resulta numa absorção celular reduzida e/ou perda de potência. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados descritos aqui toleram tal mudança em ligações com pouca ou nenhuma perda na absorção e potência quando comparados com a contraparte de fosforotio- ato inteira conjugada. Na verdade, em determinadas modalidades, por exemplo, nos Exemplos 44, 57, 59 e 86, os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado e, pelo menos, uma ligação internuclesídica de fosfodiéster, na verdade, exibem um aumento de potência in vivo, até mesmo em relação a uma contraparte de fosforotioato completo compreendendotambém o mesmo conjugado. Além disso, uma vez que conjugação resulta em aumentos substanciais na absorção/potência uma pequena perda em que o ganho substancial pode ser aceitável para alcançar tolerância melhorada. Por conseguinte, em determinadas modalidades, compostos antissenso conjugados compreendem pelo menos uma ligação fosfodiéster.

[0017] Em determinadas modalidades, a conjugação de compostos antissenso resulta, aqui, em maior distribuição, absorção e atividade nos hepatócitos. Assim, mais composto é distribuído para o tecido hepático. No entanto, em determinadas modalidades, a distribuição aumentada sozinha não explica o aumento todo na atividade. Em algumas dessas modalidades, mais compostos entram nos hepatócitos. Em determinadas modalidades, mesmo que o aumento da absorção de hepatócitos não explique o aumento total na atividade. Em tais modalidades, a absorção produtiva do composto conjugado é aumentada. Por exemplo, como mostrado no Exemplo 102, determinadas modalidades dos conjugados contendo GalNAc aumentam o enriquecimento dos oligonucleo- tídeos antissenso em hepatócitos versus células não parenquimatosas. Este enriquecimento é benéfico para os oligonucleotídeos que se dire-cionam aos genes que são expressos nos hepatócitos.

[0018] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados aqui resultam na exposição reduzida do rim. Por exemplo, como mostrado no Exemplo 20, as concentrações dos oligonucleotí- deos antissenso compreendendo determinadas modalidades de conjugados contendo GalNAc são inferiores no rim do que a dos oligonucle- otídeos antissenso sem um conjugado contendo GalNAc. Há várias implicações terapêuticas benéficas. Para indicações terapêuticas em que não se busca a atividade no rim, a exposição do rim arrisca a toxicidade renal, sem benefício correspondente. Além disso, a alta concentração no rim geralmente resulta na perda do composto na urina resultando em uma depuração mais rápida. Nesse sentido, para alvos não renais, o acúmulo renal é indesejado.

[0019] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for nece compostos antissenso conjugados representados pela fórmula: em que

[0020] A é o oligonucleotídeo antissenso;

[0021] B é a porção clivável

[0022] C é o ligador do conjugado

[0023] D é o grupo de ramificação

[0024] cada E é uma corrente;

[0025] cada F é um ligante; e

[0026] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[0027] No diagrama acima e nos diagramas similares contidos aqui, o grupo de ramificação "D" ramifica-se tantas vezes quanto for necessário para acomodar o número dos grupos (E-F), conforme indicado por "q". Assim, onde q = 1, a fórmula é:

[0028] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são fornecidos tendo a estrutura:

[0029] Em determinadas modalidades, os compostos antissensoconjugados são fornecidos tendo a estrutura:

[0030] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são fornecidos tendo a estrutura:

[0031] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são fornecidos tendo a estrutura:

[0032] A presente divulgação fornece as seguintes modalidades não limitantes:

[0033] Em modalidades que têm mais de uma variável específica (por exemplo, mais de um "m" ou "n"), salvo indicação em contrário, cada uma dessa variável específica é selecionada independentemente. Assim, para uma estrutura que tem mais de um n, cada n é selecionado de forma independente assim, eles podem ser iguais ou diferentes uns dos outros.

[0034] Certas modalidades fornecem um composto compreen dendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende: Em certas modalidades, o oli- gonucleotídeo modificado com o grupo de conjugado consiste em 20 nucleosídeos ligados.

[0035] Certas modalidades fornecem um composto compreen dendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende uma sequência de nucleobase complementar a uma parte do comprimento equivalente de nucleobases 3533 a 3552 da SEQ ID NO: 3, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80% complementar à SEQ ID NO: 3.

[0036] Certas modalidades fornecem um composto compreen dendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende uma sequência de nucleobase complementar a uma parte do comprimento equivalente de nucleobases 3514 a 3558 da SEQ ID NO: 3, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80% complementar à SEQ ID NO: 3.

[0037] Certas modalidades fornecem um composto compreen dendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase de quaisquer sequências de nucleobases da SEQ ID NOs: 19-96, 209-221. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado conjugado tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 8 nucleo- bases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobase de SEQ ID NOs: 19-96, 209-221. Em determinadas modalidades, o com-posto consiste em qualquer SEQ ID NOs: 19-96, 209-221 e um grupo conjugado.

[0038] Determinadas modalidades fornecem um composto que compreende um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase de SEQ ID NO: 87. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado com o grupo de conjugado tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleo- base de SEQ ID NO: 87. Em determinadas modalidades, o composto consiste em SEQ ID NO: 87 e um grupo conjugado.

[0039] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for nece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso com-preende o oligonucleotídeo modificado ISIS 304801 com 5'-X, onde X é um grupo de conjugado que compreende GalNAc. Em determinadas modalidades, o composto antissenso consiste no oligonucleotídeo mo-dificado ISIS 304801 com 5'-X, onde X é um grupo de conjugado que compreende GalNAc.

[0040] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for nece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso com-preende o oligonucleotídeo modificado conjugado ISIS 678354. Em de-terminadas modalidades, o composto antissenso consiste no oligonu- cleotídeo modificado conjugado ISIS 678354.

[0041] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for nece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso com-preende o oligonucleotídeo modificado conjugado ISIS 678357. Em de-terminadas modalidades, o composto antissenso consiste no oligonu- cleotídeo modificado conjugado ISIS 678357.

[0042] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for nece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso com-preende um oligonucleotídeo modificado com a sequência de nucleo- base de SEQ ID NO: 87 com 5'-GalNAc com variabilidade no mods de açúcar das asas. Em determinadas modalidades, o composto antis- senso consiste em um oligonucleotídeo modificado com a sequência de nucleobase de SEQ ID NO: 87 com 5'-GalNAc com variabilidade no mods de açúcar das asas.

[0043] onde R1é -OCH2CH2OCH3 (MOE) e R2é H; ou R1e R2jun tos formam uma ponte, onde R1é -O- e R2é -CH2-, -CH(CH3)-, ou -CH2CH2-, e R1e R2estão diretamente conectados de modo que a ponte resultante seja selecionada a partir de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, e -O- CH2CH2-;

[0044] e para cada par de R3e R4no mesmo anel, independente mente para cada anel: qualquer R3seja selecionado de H e -OCH2CH2OCH3 e R4seja H; ou R3e R4, juntos, formem uma ponte, em que R3é -O-, e R4é -CH2-, -CH(CH3)-, ou -CH2CH2- e R3e R4estão diretamente conectados, tal que a ponte resultante seja selecionada de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, e -O-CH2CH2-;

[0045] e R5seja selecionado de H e -CH3;

[0046] e Z seja selecionado de S- e O-.

[0047] A presente divulgação fornece as seguintes modalidades não limitantes numeradas:

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0048] Deve ser compreendido que tanto a descrição geral acima quanto a seguinte descrição detalhada são exemplares e explicativas apenas e não são restritivas da divulgação. Aqui, o uso do singular inclui o plural, a menos que especificamente indicado o contrário. Como usado aqui, o uso de "ou" significa "e/ou", a menos que indicado o contrário. Além disso, o uso do termo "incluindo", bem como outras formas, tais como "inclui" e "incluído", não são limitantes. Além disso, termos tais como "elemento" ou "componente" abrangem elementos e componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais de uma subunidade, a menos que especificamente indicado o contrário.

[0049] Os títulos da seção usados aqui são para fins organizacio nais apenas e não devem ser interpretados como limitantes do tema descrito. Todos os documentos, ou partes de documentos, citados neste pedido, incluindo, mas não se limitando a, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, e tratados, são expressamente incorporados por meio deste em sua totalidade por referência para qualquer finalidade.

Definições

[0050] A menos que definições específicas sejam fornecidas, a no menclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética, e químicas farmacêutica e medicinal descritos aqui são aquelas bem conhecidas e comu- mente usadas na técnica. Técnicas padrão podem ser usadas para a síntese química e análise química. Determinadas técnicas e procedimentos podem ser encontrados por exemplo em "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", editado por Sangvi e Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21a edição, 2005; e "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications", editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; e Sam- brook et al.,"Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, que são incorporados por refe-rência por meio deste para qualquer finalidade. Quando permitido, todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações e outros dados mencionados toda a divulgação são incorporados por referência aqui na sua totalidade.

[0051] Salvo indicado em contrário, os seguintes termos têm os se guintes significados:

[0052] Como usado aqui, "nucleosídeo"se refere a um composto que compreende uma porção de nucleobase e uma porção de açúcar. Os nucleosídeos incluem, mas não estão limitados a, nucleosídeos de ocorrência natural (como encontrado no DNA e RNA) e nucleosídeos modificados. Os nucleosídeos podem estar ligados a uma porção de fosfato.

[0053] Como usado aqui, o termo "modificação química"significa uma diferença química em um composto quando comparado a uma con- traparte de ocorrência natural. As modificações químicas dos oligonu- cleotídeos incluem modificações de nucleosídeos (incluindo modificações da porção de açúcar e modificações da nucleobase) e modificações da ligação internucleosídica. Em referência a um oligonucleotídeo, a modificação química não inclui diferenças apenas na sequência de nucleobase.

[0054] Como usado aqui, o termo "furanosil" refere-se a uma estru tura que compreende um anel de 5 membros compreendendo quatro átomos de carbono e um átomo de oxigênio.

[0055] Como usado aqui, "porção de açúcar de ocorrência natural" se refere a um ribofuranosil como é encontrado no RNA de ocorrência natural ou a um desoxirribofuranosil como é encontrado no DNA de ocorrência natural.

[0056] Como usado aqui, "porção de açúcar"significa uma porção de açúcar de ocorrência natural ou a uma porção de açúcar modificada de um nucleosídeo.

[0057] Como usado aqui, a expressão "porção de açúcar modifi cado" se refere a uma porção de açúcar substituída ou a um substituto do açúcar.

[0058] Como usado aqui, "porção de açúcar substituída"significa um furanosil que não é uma porção de açúcar de ocorrência natural. As frações de açúcar substituídas incluem, mas não estão limitadas a fura-nosis que compreendem substituintes na posição 2', posição 3', posição 5' e/ou posição 4'. Determinadas frações de açúcar substituídas são fra-ções de açúcar bicíclico.

[0059] Como usado aqui, a expressão "porção de açúcar substitu ída em 2'" se refere a um furanosil que compreende um substituinte na posição 2' diferente de H ou OH. Salvo indicação em contrário, uma por-ção de açúcar substituída em 2'não é uma porção de açúcar bicíclica (isto é, substituinte em 2' de uma porção de açúcar substituída em 2'não forma uma ponte para outro átomo do anel de furanosil).

[0060] Como usado aqui, "MOE" se refere a -OCH2CH2OCH3.

[0061] Conforme usado aqui, "nucleosídeo 2'-F" se refere a um nu- cleosídeo que compreende um açúcar compreendendo um flúor na po-sição 2'. Salvo indicação em contrário, o flúor em um nucleosídeo 2'-F está na posição ribo (substituindo o OH de uma ribose natural).

[0062] Como usado aqui, o termo "substituto de açúcar"significa uma estrutura que não compreende um furanosil e que é capaz de subs-tituir a porção de açúcar de ocorrência natural de um nucleosídeo, tal que as subunidades do nucleosídeo resultantes sejam capazes de se ligar e/ou de se ligar a outros nucleosídeos para formar um composto oligomérico que seja capaz de se hibridizar em um composto oligomé- rico complementar. Essas estruturas incluem anéis que compreendem um número diferente de átomos do que o furanosil (por exemplo, anéis com 4, 6 ou 7 membros); substituição do oxigênio de um furanosil por um átomo de não oxigênio (por exemplo, carbono, enxofre ou nitrogênio); ou uma mudança no número de átomos e uma substituição do oxigênio. Essas estruturas também podem compreender substituições cor-respondentesàquelas descritas para frações de açúcar substituídas (por exemplo, substitutos de açúcar bicíclico carbocíclico de 6 membros compreendendo opcionalmente substituintes adicionais). Substitutos do açúcar também incluem substituições de açúcar mais complexo (por exemplo, sistemas de não anel do ácido nucleico do peptídeo). Os subs-titutos do açúcar incluem, sem limitação, morfolino, ciclohexenila e ci- clohexitol.

[0063] Como usado aqui, a expressão "porção de açúcar bicíclico" significa uma porção de açúcar modificada compreendendo um anel de 4 a 7 membros (incluindo, mas não se limitando a um furanosil) compre-endendo uma ponte que conecta dois átomos do anel de 4 a 7 membros para formar um segundo anel, resultando numa estrutura bicíclica. Em determinadas modalidades, o anel de 4 a 7 membros é um anel de açú-car. Em determinadas modalidades, o anel de 4 a 7 membros é um fu-ranosil. Em certas modalidades, a ponte conecta o carbono 2' e o car-bono 4' do furanosil.

[0064] Como usado aqui, o termo "nucleotídeo"se refere a um nu- cleosídeo compreende ainda um grupo de ligação do fosfato. Como usado aqui, "nucleosídeos ligados" podem ou não estar ligados por li-gações fosfato e, assim, incluem, mas não estão limitados a, "nucleotí- deos ligados". Como usado aqui, "nucleosídeos ligados"são nucleosí- deos que estão conectados a uma sequência contínua (isto é, nenhum nucleosídeo adicional está presente entre aqueles que estão ligados).

[0065] Como usado aqui, o termo "ácido nucleico" refere-se a mo léculas compostas por nucleotídeos monoméricos. Um ácido nucleico inclui ácidos ribonucleicos (RNA), ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos nucleicos de fita única (ssDNA), ácidos nucleicos de fita dupla (dsDNA), pequenos ácidos ribonucleicos de interferência (siRNA), e mi- croRNAs (miRNA). Um ácido nucleico também pode compreender qual-quercombinação destes elementos em uma única molécula.

[0066] Como usado aqui, o termo "nucleotídeo"se refere a um nu- cleosídeo compreende ainda um grupo de ligação do fosfato. Como usado aqui, "nucleosídeos ligados" podem ou não estar ligados por li-gações fosfato e, assim, incluem, mas não estão limitados a, "nucleotí- deos ligados". Como usado aqui, "nucleosídeos ligados"são nucleosí- deos que estão conectados a uma sequência contínua (isto é, nenhum nucleosídeo adicional está presente entre aqueles que estão ligados).

[0067] Como usado aqui, o termo "nucleobase" se refere a um grupo de átomos que pode estar ligado a uma porção de açúcar para criar um nucleosídeo que é capaz de se incorporar a um oligonucleotí- deo e em que o grupo de átomos é capaz de se ligar a uma nucleobase de ocorrência natural complementar de outro oligonucleotídeo ou ácido nucleico. As nucleobases podem ocorrer naturalmente ou podem ser modificadas. Como usado aqui, o termo "sequência de nucleobases" significa a ordem de nucleobases contíguas independente de qualquer açúcar, ligação ou modificação de nucleobase.

[0068] Como usados aqui, "nucleobase não modificada" ou "nucleo- base de ocorrência natural" significam nucleobases heterocíclicas de ocorrência natural do RNA ou DNA: as bases purínicas adenina (A) e guanina (G), e as bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) (incluindo 5-metil C) e uracila (U).

[0069] Como usado aqui, o termo "nucleobase modificada" se refere a qualquer nucleobase que não tenha ocorrência natural.

[0070] Como usado aqui, o termo "nucleosídeo modificado" se re fere a um nucleosídeo que consiste em pelo menos uma modificação química em comparação com os nucleosídeos do RNA ou DNA de ocor-rência natural. Os nucleosídeos modificados compõem uma porção de açúcar modificada e/ou uma nucleobase modificada.

[0071] Como usado aqui, "nucleosídeo bicíclico"ou "BNA" se refere a um nucleosídeo que consiste em uma porção de açúcar bicíclica.

[0072] Como usado aqui, "nucleosídeo de etila restrito" ou "cEt"re fere-se a um nucleosídeo que compreende uma porção de açúcar bicí- clico compreendendo uma ponte de 4’-CH(CH3)-O-2’.

[0073] Como usado aqui, o termo "nucleosídeo de ácido nucleico bloqueado" ou "LNA" se refere a um nucleosídeo que compreende uma porção de açúcar bicíclico compreendendo uma ponte de CH 4'2-O-2'.

[0074] Como usado aqui, "nucleosídeo substituído em 2'" significa a um nucleosídeo que compreende um substituinte na posição 2'diferente de H ou OH. Salvo indicação em contrário, um nucleosídeo substituído em 2'não é um nucleosídeo bicíclico.

[0075] Como usado aqui, "desoxirribonucleosídeo"significa um nu- cleosídeo que compreende uma porção de açúcar de furanosil 2'-H, como encontrado nos desoxirribonucleosídeos de ocorrência natural (DNA). Em determinadas modalidades, um 2-desoxinucleosídeo pode compreender uma nucleobase modificada ou pode compreender uma nucleobase de RNA (por exemplo, uracila).

[0076] Conforme usado aqui, "oligonucleotídeo"significa um com posto compreendendo uma pluralidade de nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo compreende um ou mais ribo- nucleosídeos (RNA) não modificados e/ou desoxirribonucleosídeos (DNA) não modificados e/ou um ou mais nucleosídeos modificados.

[0077] Como usado aqui, "oligonucleosídeo"se refere a um oligonu- cleotídeo em que nenhuma das ligações de internucleosídeo contém um átomo de fósforo. Como usado aqui, oligonucleotídeos incluem oligonu- cleosídeos.

[0078] Como usado aqui, "oligonucleotídeo modificado" se refere a um oligonucleotídeo que consiste em pelo menos um nucleosídeo mo-dificado e/ou pelo menos uma ligação de internucleosídeo modificado.

[0079] Como usado aqui, "ligação"ou "grupo de ligação"significa um grupo de átomos que se ligam a dois ou mais grupos de átomos.

[0080] Como usado aqui, "ligação internucleosídica"significa uma ligação covalente entre nucleosídeos adjacentes em um oligonucleotí- deo.

[0081] Como usado aqui, "ligação internucleosídica de ocorrência natural" significa uma ligação fosfodiéster 3' a 5'.

[0082] Como usado aqui, "ligação internucleosídica modificada"sig nifica qualquer ligação internucleosídica diferente da ligação internu- cleosídica de ocorrência natural.

[0083] Como usado aqui, "ligação internucleosídica terminal"signi fica a ligação entre os últimos dois nucleosídeos de um oligonucleotídeo ou da respectiva região definida.

[0084] Como usado aqui, o "grupo de ligação de fósforo"significa um grupo de ligação que consiste em um átomo de fósforo. Grupos de ligação de fósforo incluem, sem limitação, grupos que têm a fórmula: em que:

[0085] Ra e Rd são cada um, independentemente, O, S, CH2, NH, ou NJ1 em que J1 é alquila C1-C6 ou alquila C1-C6 substituída;

[0086] Rb é O ou S;

[0087] Rc é OH, SH, alquila C1-C6, alquila substituída C1-C6, alcóxi C1-C6, alcóxi, alcóxi substituído, amina ou amina substituída C1-C6; e

[0088] J1 is Rb é O ou S.

[0089] Os grupos de ligação de fósforo incluem, sem limitação, fos- fodiéster, fosforotioato, fosforodiotioato, fosfonato, fosforoamidato, fos- forotioamidato, tionoalquil-fosfonato, fosfotriésteres, tionoalquilfosfotri- éster e boranofosfato.

[0090] Como usado aqui, "grupo de ligação de fósforo"siginfica um grupo de ligação de fósforo que liga diretamente dois nucleosídeos.

[0091] Como usado aqui, "grupo de ligação fósforo não internucleo- sídeo"se refere a um grupo de ligação fósforo que não se liga direta-mente a dois nucleosídeos. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação fósforo não internucleosídeo liga um nucleosídeo a um grupo diferente de um nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação fósforo não internucleosídeo liga dois grupos, sendo que ne-nhum deles é um nucleosídeo.

[0092] Como usado aqui, "grupo de ligação neutro" se refere a um grupo de ligação não é carregado. Os grupos de ligação neutros incluem, entre outros, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (- CH2-N (CH3) - O-), 3-amida (-CH2-C(=O)-N(H)-), 4-amida (-CH2-N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) e tioformacetal (-S-CH2-O-). Outros grupos de ligação neutros incluem ligações não iônicas, compreendendo siloxano (dialqui- lsiloxano), éster carboxilato, carboxamidas, sulfeto, éster sulfonato e amidas (ver, por exemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Re-search; Y.S. Sanghvi e P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 e 4, (pp. 40-65)). Outros grupos de ligação neutros incluem ligações não iônicas, compreendendo partes do componente N, O, S e CH2 misturadas.

[0093] Como usado aqui, "grupo de ligação neutro de internucleosí- deo" se refere a um grupo de ligação neutro que liga diretamente dois nucleosídeos.

[0094] Como usado aqui, "grupo de ligação neutro de não internu- cleosídeo"se refere a um grupo de ligação neutro que não se liga dire-tamente a dois nucleosídeos. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação neutro de não internucleosídeo liga um nucleosídeo a um grupo diferente de um nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um grupo de ligação neutro de não internucleosídeo liga dois grupos, sendo que nenhum deles é um nucleosídeo.

[0095] Como usado aqui, "composto oligomérico"se refere a uma estrutura polimérica que compreende duas ou mais subestruturas. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico compreende um oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, um composto oligo- mérico compreende um ou mais grupos conjugados e/ou grupos termi-nais. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico consiste em um oligonucleotídeo. Compostos oligoméricos incluem também áci-dos nucleicos de ocorrência natural. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico compreende uma estrutura principal de uma ou mais subunidades monoméricas ligadas onde cada subunidade mono- mérica está direta ou indiretamente afixada a uma porção de base he- terocíclica. Em determinadas modalidades, os compostos oligoméricos também podem incluir subunidades monoméricas que não estão ligadas a uma porção de base heterocíclica fornecendo, assim, sítios abásicos. Em determinadas modalidades, as ligações juntam subunidades mono- méricas, frações ou substitutos de açúcar e as frações de base hetero- cíclica podem ser independentemente modificadas. Em determinadas modalidades, a unidade de açúcar de ligação, que pode ou não incluir uma base heterocíclica, pode ser substituída por um mimético como mo- nômeros em ácidos nucleicos de peptídeo.

[0096] Como usado aqui, "grupo terminal" se refere a um ou mais átomo incorporado à extremidade 3' ou à extremidade 5' ou a ambas extremidades de um oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, um grupo terminal é um grupo conjugado. Em determinadas modalidades, um grupo terminal compreende um ou mais nucleosídeos do grupo terminal.

[0097] Como usado aqui, "conjugado" ou "grupo conjugado" se re fere a um átomo ou grupo de átomos ligados a um oligonucleotídeo ou composto oligomérico. Em geral, grupos conjugados modificam uma ou mais propriedades do composto ao qual estão afixados, incluindo, entre outros, propriedades de farmacodinâmica, farmacocinética, absorção, distribuição celular, absorção celular, carga e/ou depuração.

[0098] Como usado aqui, "ligador conjugado" ou "ligador" no con texto de um grupo de conjugado representa uma parte de um grupo de conjugado que consiste em qualquer átomo ou grupo de átomos e que liga covalentemente (1) um oligonucleotídeo a outra parte do grupo de conjugado ou (2) duas ou mais partes do grupo conjugado.

[0099] Os grupos conjugados são mostrados aqui como radicais, fornecendo uma ligação para a formação de ligação covalente com um composto oligomérico como um oligonucleotídeo antissenso. Em deter-minadas modalidades, o ponto de ligação em um composto oligomérico é o átomo de oxigênio 3' do grupo 3'-hidroxila do nucleosídeo terminal 3' do composto oligomérico. Em determinadas modalidades, o ponto de ligação ao composto oligomérico é o átomo de oxigênio 5' do grupo 5'- hidroxila do nucleosídeo terminal 5' do composto oligomérico. Em determinadas modalidades, a ligação para a formação da ligação com um composto oligomérico é uma ligação clivável. Em determinadas modalidades, essa ligação clivável constitui toda ou parte de uma porção cli- vável.

[00100] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados com-preendem uma porção clivável (por exemplo, uma ligação clivável ou um nucleosídeo clivável) e uma parte do agrupamento de carboidrato, como uma parte do agrupamento GalNAc. Essa parte do agrupamento do carboidrato compreende: uma porção de direcionamento e, opcional-mente, um ligador de conjugado. Em determinadas modalidades, a parte do agrupamento de carboidrato é identificada pelo número e identidade do ligante. Por exemplo, em determinadas modalidades, a parte do agrupamento do carboidrato compreende 3 grupos GalNAc e é de-signada"GalNAc3". Em determinadas modalidades, a parte do agrupa-mento de carboidrato compreende 4 grupos GalNAc e é designada "Gal- NAc4". Partes do agrupamento de carboidrato específicas (tendo ligante específico, grupos de ramificação e conjugados) são descritas aqui e designadas pelo numeral romano seguido por subscrito "a". Portanto, "GalNac3-1um" se refere a uma parte do agrupamento de carboidrato específico de um grupo de conjugado tendo 3 grupos GalNac e ligante identificado especificamente grupos de ramificação e grupos de ligação. Esse fragmento de agrupamento do carboidrato está afixado a um com-postooligomérico via porção clivável, como uma ligação clivável ou nu- cleosídeo clivável.

[00101] Como usado aqui, "porção clivável"se refere a uma ligação ou grupo que é capaz de ser quebrado em condições fisiológicas. Em determinadas modalidades, uma porção clivável está no interior de com-partimentos celulares ou subcelulares, como um lisossomo. Em deter-minadas modalidades, uma porção clicável é clivada por enzimas endó-genas, como as nucleases. Em determinadas modalidades, uma porção clivável compreende um grupo de átomos com um, dois, três, quatro ou mais de quatro ligações cliváveis.

[00102] Como usado aqui, "ligação clivável"se refere a qualquer ligação química capaz de ser quebrada. Em determinadas modalidades, a ligação clivável é selecionada dentre: uma amida, uma poliamida, um éster, um éter, um ou ambos ésteres de um fosfodiéster, um éster de fosfato, um carbamato, um dissulfeto ou um peptídeo.

[00103] Como usado aqui, "agrupamento de carboidrato" se refere a um composto que tem um ou mais resíduos de carboidrato afixados a um grupo andaime ou a um grupo ligador. (ver, por exemplo, Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, que está incorporado aqui por referência em sua to-talidade, ou Rensen et al, "Design and Synthesis of Novel N-Acetylga- lactosamine-Terminated Glycolipids forTargeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, para exemplos de agrupamentos conjugados de carboidrato).

[00104] Como usado aqui, "carboidrato modificado" se refere a qualquer carboidrato que tem uma ou mais modificações químicas relativas a carboidratos de ocorrência natural.

[00105] Como usado aqui, "derivado de carboidrato" se refere a qualquer composto que pode ser sintetizado usando um carboidrato como matéria-prima ou intermediário.

[00106] Como usado aqui, "carboidrato" se refere a um carboidrato de ocorrência natural, um carboidrato modificado ou um derivado do carboidrato.

[00107] Como usado aqui, "grupo de proteção"se refere a qualquer composto ou grupo de proteção conhecido pelos versados na técnica. Exemplos não limitantes de grupos de proteção podem ser encontrados em "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, P. G. M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Nova York, o qual está incorporado a este documento por referência na íntegra.

[00108] Como usado aqui, "de fita única"se refere a um composto oligomérico que não é hibridizado ao seu complemento e que não possui autocomplementaridade suficiente para formar um duplex auto-estável.

[00109] Como usado aqui, "de fita dupla" se refere a um par de compostos oligoméricos que são hibridizados a um outro ou um com-postooligomérico autocomplementar único que forma uma estrutura hairpin. Em determinadas modalidades, um composto oligomérico de fita dupla compreende um primeiro e um segundo composto oligomé- rico.

[00110] Como usado aqui, "composto antissenso" se refere a um composto que compreende ou que consiste em um oligonucleotídeo, sendo que, pelo menos uma parte dele é complementar ao ácido nu- cleico alvo que é capaz de hibridizar, resultando em pelo menos uma atividade antissenso.

[00111] Como usado aqui, "atividade antissenso" se refere a qualquer atividade detectável e/ou mudança mensurável atribuível à hibridi- zação de um composto antissenso para seu ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, a atividade antissenso inclui modulação da quantidade ou atividade de uma transcrição do ácido nucleico alvo (por exemplo, mRNA). Em determinadas modalidades, a atividade antis- senso inclui modulação da junção do pré-mRNA.

[00112] Como usado aqui, "composto antissenso à base de RNase H" se refere a um composto antissenso em que pelo menos alguma atividade antissenso do composto antissenso é atribuível à hibridação do composto antissenso para um ácido nucléico alvo e clivagem subsequente do ácido nucleico alvo pela RNase H.

[00113] Como usado aqui, "composto antissenso à base de RISC" se refere a um composto antissenso em que pelo menos alguma atividade antissenso do composto antissenso é atribuída ao Complexo de Silen- ciamento Induzido do RNA (RISC).

[00114] Como usado aqui, "detectar" ou "medir" significa que um teste ou ensaio para detecção ou medição é realizado. Essa detecção e/ou medição pode resulta em um valor zero. Assim, se um teste para detecção ou medição resultar na constatação de nenhuma atividade (atividade zero), a etapa de detecção ou medição da atividade, no en-tanto, foi realizada.

[00115] Como usado aqui, "atividade detectável e/ou mensurável"se refere a uma atividade estatisticamente significativa que não seja equi-valente a zero.

[00116] Como usado aqui, "essencialmente inalterado" se refere a pouca ou nenhuma alteração em um determinado parâmetro, especificamente em relação a outro parâmetro que muda muito mais. Em determinadas modalidades, um parâmetro é essencialmente inalterado quando muda em menos de 5%. Em determinadas modalidades, um parâmetro é essencialmente inalterado se ele muda menos de duas vezes enquanto outro parâmetro muda pelo menos dez vezes. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma atividade antissenso é uma mudança na quantidade de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, a quantidade de ácido nucleico não alvo é essencialmente inalterada se ela muda muito menos do que o ácido nucleico alvo, mas a mudança não precisa ser zero.

[00117] Como usado aqui, "expressão"se refere ao processo pelo qual um gene resulta, em última análise, em uma proteína. Expressão inclui, entre outros, transcrição, modificação pós-transcricional (por exemplo, junção, poliadenilação, adição de 5'-cap) e tradução.

[00118] Como usado aqui, "ácido nucleico alvo" se refere a uma molécula de ácido nucleico à qual um composto antissenso destina-se a hibridizar para resultar em uma atividade antissenso desejada. Oligonu- cleotídeos antissenso têm complementaridade suficiente para seus ácidos nucleicos alvo para permitir a hibridação em condições fisiológicas.

[00119] Como usado aqui, "complementaridade da nucleobase" ou "complementaridade" quando em referência às nucleobases se refere a uma nucleobase capaz de se emparelhar com outra nucleobase. Por exemplo, no DNA, a adenina (A) é complementar à timina (T). Por exemplo, no RNA, a adenina (A) é complementar à uracila (U). Em certas modalidades, nucleobase complementar se refere a uma nucleo- base de um composto antissenso que é capaz de se emparelhar com uma nucleobase do seu ácido nucleico alvo. Por exemplo, se uma nu- cleobase em uma determinada posição de um composto antissenso for capaz de fazer ligação de hidrogênio com uma nucleobase em uma de-terminadaposição de um ácido nucleico alvo, então a posição da ligação de hidrogênio entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo são considerados complementares nesse par de nucleobase. As nucleoba- ses que compreendem determinadas modificações podem manter a ca-pacidade de se emparelhar com uma nucleobase equivalente e, assim, são ainda capazes da complementaridade de base.

[00120] Como usado aqui, "não complementar", em relação às nu- cleobases, se refere a um par de nucleobases que não forma ligações de hidrogênio com outro.

[00121] Como usado aqui, "complementar", em relação aos compos-tosoligoméricos (por exemplo, nucleosídeos ligados, oligonucleotídeos ou ácidos nucleicos) se refere à capacidade desses compostos oligo- méricos ou suas regiões para hibridização para um outro composto oli- gomérico ou sua região através da complementaridade da nucleobase. Compostos oligoméricos complementares não precisam apresentar complementaridade de nucleobase em cada nucleosídeo. Pelo contrário, algumas incompatibilidades são toleradas. Em determinadas moda-lidades, compostos oligoméricos complementares ou regiões são com-plementares em 70% das nucleobases (70% complementares). Em de-terminadas modalidades, compostos oligoméricos complementares ou regiões são 80% complementares. Em determinadas modalidades, compostos oligoméricos complementares ou regiões são 90% comple-mentares. Em determinadas modalidades, compostos oligoméricos complementares ou regiões são 95% complementares. Em determi- nadas modalidades, compostos oligoméricos complementares ou regiões são 100% complementares.

[00122] Como usado aqui, "incompatibilidade" se refere a uma nu- cleobase de um primeiro composto oligomérico que não é capaz de se emparelhar com uma nucleobase em uma posição correspondente de um segundo composto oligomérico, quando o primeiro e o segundo composto oligomérico estão alinhados. Um ou ambos do primeiro e se-gundo compostos oligoméricos podem ser oligonucleotídeos.

[00123] Como usado aqui, "hibridização"se refere ao emparelha- mento de compostos oligoméricos complementares (por exemplo, um composto antissenso e seu ácido nucleico alvo). Enquanto não houver limitação a um mecanismo específico, o mecanismo mais comum de emparelhamento envolve a ligação de hidrogênio, que pode ser ligação de hidrogênio Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa entre nu- cleobases complementares.

[00124] Como usado aqui, "hibridiza especificamente" se refere à ca-pacidade de um composto oligomérico de hibridizar em um sítio de ácido nucleico com maior afinidade do que hibridizar em outro sítio de ácido nucleico.

[00125] Como usado aqui, "totalmente complementar", em relação a um oligonucleotídeo ou à porção do mesmo, significa que cada base do oligonucleotídeo ou da porção do mesmo é capaz de se emparelhar com uma nucleobase de um ácido nucleico complementar ou porção contígua do mesmo. Assim, uma região totalmente complementar não compreende incompatibilidades nem nucleobases não hibridizadas em qualquer fita.

[00126] Como usado aqui, "complementaridade percentual" se refere à porcentagem de nucleobases de um composto oligomérico que seja complementar a uma parte de comprimento equivalente de ácido nu- cleico alvo. a complementaridade percentual é calculada pela divisão do número de nucleobases do composto oligomérico que seja complemen-taràs nucleobases nas posições correspondentes no ácido nucleico alvo pelo comprimento total do composto oligomérico.

[00127] Como usado aqui, "identidade percentual" se refere ao número de nucleobases em um primeiro ácido nucleico que é do mesmo tipo (independente de modificação química) que as nucleobases nas posições correspondentes em um segundo ácido nucleico, dividido pelo número total de nucleobases no primeiro ácido nucleico.

[00128] Como usado aqui, "modulação"se refere a uma mudança da quantidade ou qualidade de uma molécula, função ou atividade, em comparação com a quantidade ou qualidade de uma molécula, função ou atividade antes da modulação. Por exemplo, a modulação inclui a mudança, ou o aumento (estímulo ou indução) ou a diminuição (inibição ou redução) da expressão gênica. Como outro exemplo, a modulação da expressão pode incluir uma alteração na seleção do sítio de splice do processamento de pré-mRNA, resultando em uma alteração na quantidade absoluta ou relativa de um determinado variante de splice em comparação com a quantidade na ausência de modulação.

[00129] Como usado aqui, "motivo químico"se refere a um padrão de modificações químicas em um oligonucleotídeo ou em uma região do mesmo. Os motivos podem ser definidos pelas modificações em de-terminadosnucleosídeos e/ou certos grupos de ligação de um oligonu- cleotídeo.

[00130] Como usado aqui, "motivo do nucleosídeo"se refere a um padrão de modificações do nucleosídeo em um oligonucleotídeo ou em uma região do mesmo. As ligações desse oligonucleotídeo podem ser modificadas ou não modificadas. Salvo indicação em contrário, os mo-tivos descritos aqui apenas nucleosídeos destinados a serem motivos de nucleosídeos. Assim, nesses casos, as ligações não são limitadas.

[00131] Como usado aqui, "motivo do açúcar"se refere a um padrão de modificações do açúcar em um oligonucleotídeo ou em uma região do mesmo.

[00132] Como usado aqui, "motivo da ligação"se refere a um padrão de modificações da ligação em um oligonucleotídeo ou em uma região do mesmo. Os nucleosídeos desse oligonucleotídeo podem ser modificados ou não modificados. Salvo indicação em contrário, os motivos descritos aqui são apenas ligações destinadas a serem motivos de ligação. Assim, nesses casos, os nucleosídeos não são limitados.

[00133] Como usado aqui, "motivo de modificação da nucleobase" se refere a um padrão de modificações de nucleobases ao longo de um oligonucleotídeo. Salvo indicação em contrário, um motivo de modifica-ção da nucleobase é independente da sequência de nucleobase.

[00134] Como usado aqui, "motivo de sequência"se refere a um padrão de nucleobases dispostos ao longo de um oligonucleotídeo ou parte do mesmo. Salvo indicação em contrário, um motivo de sequência é independente de modificações químicas e, portanto, pode ter qualquer combinação de modificações químicas, inclusive não ter modificações químicas.

[00135] Como usado aqui, "tipo de modificação", em relação a um nucleosídeo ou um nucleosídeo de um "tipo" se refere à modificação química de um nucleosídeo e inclui nucleosídeos modificados e não mo-dificados. Portanto, salvo indicação em contrário, um "nucleosídeo com uma modificação do primeiro tipo" pode ser um nucleosídeo não modi-ficado.

[00136] Como usado aqui, "diferentemente modificado" se refere às modificações químicas ou substituintes químicos que são diferentes uns dos outros, incluindo ausência de modificações. Assim, por exemplo, um nucleosídeo MOE e um nucleosídeo de DNA não modificado são "diferentemente modificados", embora o nucleosídeo do DNA não seja modificado. Da mesma forma, DNA e RNA são "diferentemente modifi- cados", embora ambos sejam nucleosídeos não modificados de ocor-rência natural. Os nucleosídeos que são os mesmos, mas por compre-enderem nucleobases diferentes não são diferentemente modificados. Por exemplo, um nucleosídeo que compreende um açúcar modificado 2'-OMe e uma nucleobase adenina não modificada e um nucleosídeo compreendendo um açúcar modificado 2'-OMe e uma nucleobase timina não modificada não são diferentemente modificados.

[00137] Como usado aqui, "o mesmo tipo de modificações"se refere às modificações que são iguais entre elas, incluindo a ausência de mo-dificações. Assim, por exemplo, dois nucleosídeos de DNA não modifi-cadostêm "o mesmo tipo de modificação", embora o nucleosídeo de DNA não seja modificado. Esses nucleosídeos que têm o mesmo tipo de modificação podem incluir nucleobases diferentes.

[00138] Como usado aqui, "regiões separadas" se refere às partes de um oligonucleotídeo em que as modificações químicas ou o motivo das modificações químicas de quaisquer partes vizinhas incluem pelo menos uma diferença para permitir que regiões separadas se distin- guam uma da outra.

[00139] Como usado aqui, "transportadora ou diluente farmaceutica- mente aceitável"se refere a qualquer substância apropriada para uso na administração de um animal. Em determinadas modalidades, uma transportadora ou diluente farmaceuticamente aceitável é uma solução salina estéril. Em determinadas modalidades, essa solução salina é uma solução salina de qualidade farmacêutica.

[00140] Como usado aqui, o termo "distúrbio metabólico"se refere a uma doença ou condição caracterizada principalmente pela desregula- ção do metabolismo - o conjunto complexo de reações químicas associadasà degradação de alimentos para produzir energia.

[00141] Como usado aqui, o termo "distúrbio cardiovascular" se refere a uma doença ou condição caracterizada principalmente pela função prejudicada do coração ou dos vasos sanguíneos.

[00142] Como usado aqui, o termo "sistema de anel mono ou policí- clico" deve incluir todos os sistemas de anel selecionados a partir de sistemas de anel de radical simples ou policíclico em que os anéis são fundidos ou ligados e deve incluir também sistemas de anel simples e mistos individualmente selecionados a partir de arila alifática, alicíclico, heteroarila, aralquila, arilalquila, heterocíclico, heteroarila, heteroaromá- tico e heteroarilalquila. Essas estruturas mono e policíclicas podem con-teranéis tendo o mesmo nível de saturação ou tendo cada um, de ma-neira independente, diferentes graus de saturação incluindo totalmente saturados, parcialmente saturados ou totalmente insaturados. Cada anel pode compreender átomos do anel selecionados a partir de C, N, O e S para dar origem a anéis heterocíclicos, bem como anéis que com-preendem apenas anel apenas com átomos de C que podem estar pre-sentes em um motivo misto, como por exemplo, benzimidazol, em que um anel tem apenas átomos de carbono anel e o anel fundido tem dois átomos de nitrogênio. O sistema de anel mono ou policíclico pode ser ainda substituído por grupos substituintes, como por exemplo, ftalimida que tem dois grupos =O afixados a um dos anéis. Os sistemas de anel mono ou policíclico podem ser afixados a moléculas de origem usando várias estratégias como diretamente através de um átomo do anel, fun-dido através de vários átomos do anel, através de um grupo substituinte ou através de uma porção de ligação bifuncional.

[00143] Como usado aqui, "profármaco"se refere a uma forma menos ativa ou inativa de um composto que, quando administrado a um assunto, é metabolizado para formar o composto ativo ou mais ativo (por exemplo, fármacos).

[00144] Como usado aqui, "substituinte" e "grupo substituinte" se refere a um átomo ou grupo que substitui o átomo ou grupo de um composto nomeado de origem. Por exemplo, um substituinte de um nucleosídeo modificado é qualquer átomo ou grupo que difere do átomo ou do grupo encontrado em um nucleosídeo de ocorrência natural (por exemplo, um substituinte 2' modificado é qualquer átomo ou grupo na posição 2' de um nucleosídeo diferente de H ou OH). Os grupos substi- tuintes podem ser protegidos ou desprotegidos. Em determinadas mo-dalidades, os compostos de presente divulgação têm substituintes em uma ou em mais de uma posição do composto de origem. Os substituin- tes também podem ser substituídos ainda por outros grupos substituin- tes e podem ser afixados diretamente ou através de um grupo de ligação como um grupo alquila ou hidrocarbila a um composto de origem.

[00145] Da mesma forma, como usado aqui, "substituinte", em relação a um grupo funcional químico, se refere a um átomo ou grupo de átomos que difere do átomo ou do grupo de átomos normalmente presente no grupo funcional mencionado. Em determinadas modalidades, um substituinte substitui um átomo de hidrogênio do grupo funcional (por exemplo, em determinadas incorporações, o substituinte de um grupo metila substituído é um átomo ou grupo diferente do hidrogênio que substitui um dos átomos de hidrogênio de um grupo metila não substi-tuído). A menos que indicado o contrário, os grupos passíveis para uso como substituintes incluem, sem limitação, halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, acila (-C(O)Raa), carboxila (-C(O)O-Raa), grupos ali- fáticos, grupos alicíclicos, alcóxi, óxi substituído (-O-Raa), arila, aralquila, radical heterocíclico, heteroarila, heteroarilalquila, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido (-C(O)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(O) ORaa), ureído (-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureído (-N(Rbb)C(S)N (Rbb)(Rcc)), guanidinila (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinila (- C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinila (- S(O)Rbb), sulfonila (-S(O)2Rbb) e sulfonamidila (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) ou - N(Rbb)S(O)2Rbb). Onde cada Raa, Rbb e Rcc são, de forma independente, H, e um grupo funcional químico opcionalmente ligado ou um outro grupo substituinte por uma lista preferencial incluindo, entre outros, alquila, alquenila, alquinila, alifático, alcóxi, acila, arila, aralquila, hetero- arila, alicíclico, heterocíclico e heteroarilalaquila. Os substituintes sele-cionados nos compostos descritos aqui estão presentes em grau recur-sivo.

[00146] Como usado aqui, "alquila" se refere um radical hidrocarbo- neto saturado linear ou ramificado que contém até vinte e quatro átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila incluem, entre outros, metila, etila, propila, butila, isopropila, n-hexila, octila, decila, dodecila e similares. Os grupos alquila incluem tipicamente de 1 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a cerca de 12 átomos de carbono (alquila C1- C12 ), sendo que de 1 a cerca de 6 átomos de carbono é mais preferencial.

[00147] Como usado aqui, "alquenil" se refere a um radical de uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que contém até vinte e quatro átomos de carbono e que tem pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono. Exemplos de grupos alquenila incluem, entre outros, etenila, propenila, butenila, 1-metil-2-buten-1-ila, dienos como 1,3-buta- dieno e afins. Os grupos alquenil incluem tipicamente de 2 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a cerca de 12 átomos de carbono, sendo que de 2 a cerca de 6 átomos de carbono é mais prefe-rencial. Grupos alquenila usados aqui podem incluir ainda, opcional-mente, um ou mais grupos substituintes.

[00148] Como usado aqui, "alquinila" se refere a um radical de uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que contém até vinte e quatro átomos de carbono e que tem pelo menos uma ligação tripla de carbono-carbono. Exemplos de grupos alquinila incluem, entre outros, etinila, 1-propinila, 1-butinila e similares. Os grupos alquinila incluem ti-picamente de 2 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a cerca de 12 átomos de carbono, sendo que de 2 a cerca de 6 átomos de carbono é mais preferencial. Grupos alquinila usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.

[00149] Como usado aqui, "acila" se refere a um radical formado pela remoção de um grupo hidroxila de um ácido orgânico e que tem fórmula geral -C(O)-X onde X é normalmente alifático, alicíclico ou aromático. Os exemplos incluem carbonilas alifáticas, carbonilas aromáticas, sulfonilas alifáticas, sulfinilas aromáticas, sulfinilas alifáticas, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos e similares. Grupos acila usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.

[00150] Como usado aqui, "alicíclico"se refere a um sistema de anel cíclico, em que o anel é alifático. O sistema de anel pode compreender um ou mais anéis, em que pelo menos um anel é alifático. Alicíclicos preferenciais incluem anéis com cerca de 5 a cerca de 9 átomos de car-bono no anel. Alicíclicos usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.

[00151] Como usado aqui, "alifático"se refere a um radical de hidro- carboneto linear ou ramificado contendo até vinte e quatro átomos de carbono, em que a saturação entre quaisquer dois átomos de carbono é uma ligação simples, dupla ou tripla. O grupo alifático contém, prefe-rencialmente, de 1 a cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a cerca de 12 átomos de carbono, sendo que de 1 a cerca de 6 átomos de carbono é mais preferencial. A cadeia linear ou ramificada de um grupo alifático pode ser interrompida por um ou mais heteroáto- mos que incluem nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Esses grupos alifáticos interrompidos por heteroátomos incluem, entre outros, poli- alcóxis, como polialcaleno glicóis, poliaminas e poliminas. Grupos alifá- ticos usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.

[00152] Como usado aqui, "alcóxi"se refere a um radical formado entre um grupo alquila e um átomo de oxigênio, em que o átomo de oxigênio é usado para afixar o grupo alcóxi a uma molécula de origem. Exemplos de grupos alcóxi incluem, sem limitação, metóxi, etóxi, n-pro- póxi, isopropóxi, n-butóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, n-pentóxi, neopentóxi, n-hexóxi e similares. Grupos alcóxi usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.

[00153] Como usado aqui, "aminoalquila" se refere um radical alquila C1-C12 substituído por amina. A parte da alquila do radical forma uma ligação covalente com uma molécula de origem. O grupo amina pode estar localizado em qualquer posição e o grupo de aminoalquila pode ser substituído por um grupo substituinte nas partes alquila e/ou amina.

[00154] Como usado aqui, "aralquila" e "arilalquila" se refere a um grupo aromático que é ligado covalentemente a um radical alquila C1C12 . A parte do radical alquila do grupo aralquila (ou arilalquila) resultante forma uma ligação covalente com uma molécula de origem. Os exemplos incluem, entre outros, benzila, fenetila e similares Os grupos aralquila usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, grupos subs- tituintes afixados a alquila, arila ou a ambos os grupos que formam o grupo radical.

[00155] Como usado aqui, "arila" e "aromático"se refere a radicais de um sistema de anel carboxílico mono ou policíclico com um ou mais anéis aromáticos. Os exemplos de grupos arila incluem, entre outros, fenila, naftila, tetra-hidronaftila, indanila, indenila e similares. Os sistemas de anel arila preferenciais têm cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono em um ou mais anéis. Grupos arila usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.

[00156] Como usados aqui, os termos "halo" e "halogênio"se referem a um átomo selecionado do flúor, cloro, bromo e iodo.

[00157] Como usado aqui, "heteroarila" e "heteroaromático"se referem a um radical que compreende um sistema de anel aromático mono ou policíclico, um sistema de anel ou um sistema de anel fundido em que pelo menos um dos anéis seja aromático e inclua um ou mais hete- roátomos. Heteroarila também deve incluir sistemas de anel fundidos incluindo sistemas em que um ou mais anéis fundidos não contêm he- teroátomos. Os grupos heteroarila incluem tipicamente um átomo do anel selecionado do enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Exemplos de grupos de heteroarila incluem, entre outros, piridinila, pirazinila, pirimidinila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, oxazolila, iso-oxazolila, tiadi- azolila, oxadiazolila, tiofenila, furanila, quinolinila, isoquinolinila, benzi- midazolila, benzo-oxazolila, quinoxalinila e similares. Os radicais hete- roarila podem ser afixados a uma molécula de origem diretamente ou através de uma porção de ligação como um grupo alifático ou heteroá- tomo. Grupos heteroarila usados aqui podem incluir ainda, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes.

[00158] Como usado aqui, "composto conjugado" se refere a quais-querátomos, grupo de átomos ou grupo de átomos ligados adequados para serem usados como um grupo conjugado. Em determinadas mo-dalidades, os compostos conjugados podem possuir ou conferir uma ou mais propriedades do composto ao qual estão afixados, incluindo, entre outros, propriedades de farmacodinâmica, farmacocinética, absorção, distribuição celular, absorção celular, carga e/ou depuração.

[00159] Como usado aqui, salvo se indicado ou modificado de outro modo, o termo "de fita dupla" se refere a dois compostos oligoméricos separados que são hibridizados a outro. Esses compostos de fita dupla podem ter um ou mais nucleosídeos não hibridizantes em uma ou ambas as extremidades de uma ou ambas as fitas (overhangs) e/ou um ou mais nucleosídeos não hibridizantes internos (incompatibilidades) desde que exista complementaridade suficiente para manter a hibridiza- ção em condições fisiologicamente relevantes.

[00160] Como usado aqui, o termo "sítio alvo 5'" refere-se ao nucleo- tídeo de um ácido nucleico alvo que é complementar ao nucleotídeo mais extremo em 5' de um composto antissenso específico.

[00161] Como usado aqui, o termo "cerca de" se refere a dentro de ± 10% de um valor. Por exemplo, se é afirmado, "um marcador pode ser aumentado em cerca de 50%", está implícito que o marcador pode ser aumentado entre 45%-55%.

[00162] Como usado aqui, "administrado concomitantemente"refere-seà coadministração de dois agentes de qualquer forma na qual os efeitos farmacológicos de ambos são manifestados no paciente ao mesmo tempo. A administração concomitante não exige que os ambos os agentes sejam administrados numa única composição farmacêutica, na mesma forma de dosagem, ou pela mesma via de administração. Os efeitos de ambos os agentes não precisam se manisfestar ao mesmo tempo. Os efeitos precisam apenas ser sobrepostos por um período de tempo e não precisam ser coextensivos.

[00163] Como usado aqui, "administrar" ou "administração"significa fornecer um agente farmacêutico a um indivíduo, e inclui, mas não está limitado a, administração por um médico e autoadministração. A admi-nistração de um agente farmacêutico a um indivíduo pode ser contínua, crônica, curta ou intermitente. A administração pode ser parenteral ou não parenteral.

[00164] Como usado aqui, "agente" significa uma substância ativa que pode fornecer um benefício terapêutico quando administrado a um animal. "Primeiro agente" significa um composto terapêutico da invenção. Por exemplo, um primeiro agente pode ser um oligonucleotídeo an- tissenso que direciona apoCIII. "Segundo agente" significa um segundo composto terapêutico da invenção (por exemplo, um segundo oligonu- cleotídeo antissenso que direciona apoCIII) e/ou um composto terapêu-tico de não apoCIII.

[00165] Como usado aqui, "melhora" ou "melhorar" ou "melhorando" se refere a uma diminuição de pelo menos um indicador, sinal, ou sin-toma de uma doença, distúrbio, ou condição associada. A gravidade dos indicadores pode ser determinada por medidas subjetivas ou objetivas, que são conhecidas pelos versados na técnica.

[00166] Como usado aqui, "animal" refere-se a um humano ou animal não humano, incluindo, mas não limitado a, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e primatas não humanos, incluindo, mas não se limitando a, macacos e chimpanzés.

[00167] Como usado aqui, "ApoCIII", "Apoliproteína C-III" ou "ApoC3" significa qualquer sequência de ácido nucleico ou de proteína que codifica ApoCIII. Por exemplo, em certas modalidades, a apo(a) inclui uma sequência de DNA que codifica ApoCIII, uma sequência de RNA transcrita a partir do DNA que codifica ApoCIII (incluindo o DNA genômico, compreendendo os íntrons e éxons), e uma sequência de mRNA que codifica ApoCIII ou uma sequência de peptídeo que codifica ApoCIII.

[00168] Como usado aqui, "ácido nucleico de ApoCIII" significa qual-querácido nucleico que codifica ApoCIII. Por exemplo, em certas mo-dalidades, um ácido nucleico de ApoCIII inclui uma sequência de DNA que codifica ApoCIII, uma sequência de RNA transcrita a partir do DNA que codifica ApoCIII (incluindo o DNA genômico, compreendendo os ín- trons e éxons), e uma sequência de mRNA que codifica ApoCIII.

[00169] Como usado aqui, "inibidor específico de ApoCIII" refere-se a qualquer agente capaz de inibir especificamente a expressão do mRNA de ApoCIII e/ou a expressão ou a atividade da proteína ApoCIII a nível molecular. Por exemplo, os inibidores específicos de ApoCIII in-cluemácidos nucleicos (incluindo compostos antissenso), peptídeos, anticorpos, moléculas pequenas, e outros agentes capazes de inibir a expressão do mRNA de ApoCIII e/ou da proteína de ApoCIII. Em certas modalidades, o ácido nucleico é um composto antissenso. Em certas modalidades, o composto antissenso é um oligonucleotídeo que direciona ApoCIII. Em determinadas modalidades, o oligonucleotide que direciona ApoCIII é um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo que direciona Apo- CIII é um oligonucleotídoe modificado que direciona ApoCIII com um grupo conjugado. Em determinadas modalidades, o oligonucleotide que direciona ApoCIII tem uma sequência, conforme indicado em SEQ ID NOs:19-96, 209-221 ou outra sequência (por exemplo, como aquelas divulgadas na Publicação PCT WO 2004/093783 ou Publicação PCT WO 2012/149495, todas incorporadas por referência a este documento). Em determinadas modalidades, pela modulação específica do nível de mRNA de ApoCIII e/ou expressão da proteína de ApoCIII, os inibidores específicos de ApoCIII podem afetar componentes da via li- pogência ou glicogênica. De forma similar, em certas modalidades, os inibidores específicos de ApoCIII podem afetar outros processos moleculares em um animal.

[00170] Como usado aqui, "mRNA de ApoCIII" significa um mRNA que codifica uma proteína de ApoCIII.

[00171] Como usado aqui, "proteína de ApoCIII" significa qualquer sequência de proteína que codifica ApoCIII.

[00172] Como usado aqui, "aterosclerose" significa um endurecimento das artérias que afetam artérias de tamanho médio e grande e é caracterizada pela presença de depósitos graxos. Os depósitos graxos são denominados "ateromas" ou "placas", que consistem principalmente em colesterol e outras gorduras, cálcio e tecido da cicatriz, e danificam o forro das artérias.

[00173] Como usado aqui, "doença cardíaca coronariana (CHD)"significa estreitar os vasos sanguíneos pequenos que fornecem sangue e oxigênio ao coração, que é frequentemente um resultado da ateroscle- rose.

[00174] Como usado aqui, "diabetes mellitus" ou "diabetes"é uma síndrome caracterizada por metabolismo desordenado e teor de açúcar no sangue altamente elevado (hiperglicemia) resultantes de níveis insu-ficientes de insulina ou sensibilidade à insulina reduzida. Os sintomas característicos são produção excessiva de urina (poliúria) devido aos altos níveis de glicose sanguínea, sede excessiva e maior ingestão de líquidos (polidipsia) que tenta compensar a urinação aumentada, visão turva devido aos efeitos de glicose sanguínea elevada na óptica ocular, perda de peso inexplicada e letargia.

[00175] Como usado aqui, "dislipidemia diabética"ou "diabetes tipo 2 com dislipidemia" significa uma condição caracterizada pelo diabetes tipo 2, HDL-C reduzido, triglicerídeos elevados, e pequenas partículas de LDL densas elevadas.

[00176] Como usado aqui, "diluente" significa um ingrediente em uma composição que não tem atividade farmacológica, mas é farma- ceuticamente necessário ou desejável. Por exemplo, o diluente em uma composição injetada pode ser um líquido, por exemplo, solução salina.

[00177] Como usado aqui, "dislipidemia" refere-se a um distúrbio do metabolismo lipídico e/ou de lipoproteína, incluindo a superprodução ou deficiência de lipídios e/ou de lipoproteína. As dislipidemias podem se manifestar pela elevação de lipídios tais como quilomícron, colesterol e triglicerídeos, bem como lipoproteínas, tal como colesterol da lipoprote- ína de baixa densidade (LDL).

[00178] Como usado aqui, "unidade de dosagem" significa uma forma na qual um agente farmacêutico é fornecido, por exemplo, pílula, comprimido, ou outra unidade de dosagem conhecida na técnica. Em determinadas modalidades, uma unidade de dosagem é um frasco que contém o oligonucleotídeo antissenso liofilizado. Em determinadas mo-dalidades, uma unidade de dosagem é um frasco que contém o oligo- nucleotídeo antissenso reconstituído.

[00179] Como usado aqui, "dose" significa uma quantidade especificada de um agente farmacêutico fornecido numa administração única, ou num período de empo especificado. Em determinadas modalidades, uma dose pode ser administrada em um, dois ou mais bolus, comprimidos ou injeções. Por exemplo, em determinadas modalidades onde a administração subcutânea é desejada, a dose desejada requer um vo-lume não facilmente acomodado por uma única injeção, portanto, duas ou mais injeções podem ser usadas para obter a dose desejada. Em determinadas modalidades, o agente farmacêutico é administrado por infusão durante um período de tempo estendido ou continuamente. As doses podem ser indicadas como a quantidade de agente farmacêutico por hora, dia, semana ou mês. As doses podem também ser indicadas como mg/kg ou g/kg.

[00180] Como usado aqui, "quantidade eficaz" ou "quantidade tera- peuticamente eficaz" significa a quantidade de agente farmacêutico ativo suficiente para efetuar um resultado fisiológico desejado em um indivíduo em necessidade do agente. A quantidade eficaz pode varia dentre os indivíduos, dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, a formulação da composição, avaliação da condição médica do indivíduo, e outros fatores relevantes.

[00181] Como usado aqui, o termo "Fredrickson Tipo I"também é conhecido como "deficiência de lipoproteína lipase", "LPLD", "Síndrome de Quilomicronemia Familiar" ou "FCS" e existe em várias formas: Tipo 1a (também conhecida como síndrome de Buerger-Gruestz) é uma de-ficiência de lipoproteína lipase comumente devido a uma deficiência de LPL ou ApoC-II alterada; Tipo Ib (também conhecido como deficiência de apoproteína CII familiar) é uma condição causada pela falta da apo- proteína CII do ativador de lipoproteína lipase; e Tipo Ic é uma quilomi- cronemia que se deve à circulação do inibidor da lipoproteína lipase. O Tipo I é uma doença rara que se apresenta, geralmente, na infância. É caracterizada por elevações severas em quilomícrons e níveis de TG extremamente elevados (que sempre fica bem acima de 1000 mg/dL e que, não raro, sobe para 10.000 mg/dL ou mais) com episódios de dor abdominal, pancreatite aguda recorrente, xantomas cutâneos eruptivos e hepatoesplenomegalia. Os pacientes raramente desenvolvem ateros- clerose, talvez porque suas partículas de lipoproteína do plasma são muito grandes para que entrem na íntima arterial (Nordestgaard et al., J LipidRes, 1988, 29:1491-1500; Nordestgaard et al., Arteriosclerosis, 1988, 8:421-428). O Tipo I é, geralmente, causado por mutações do gene LPL ou da ApoC-II do cofator do gene, resultando na incapacidade de indivíduos afetados de produzir LPL funcionalmente ativa insuficiente. Os pacientes são homozigotos para essas mutações ou heterozi- gotos compostos. Fredrickson Tipo I também pode ser devido a mutações no GPIHBP1, APOA5, LMF1 ou outros genes que acarretam em LPL disfuncional. Brunzell, In: Pagon RA, Adam MP, Bird TD, Dolan CR, Fong CT, Stephens K, editores. GeneReviews™ [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2013.12 Out 1999 [atualizado em 15 Dez 2011]. Além disso, Fredrickson Tipo I, em alguns casos, pode ser devido à presença de inibidores da LPL (por exemplo, anticorpos anti-LPL) em um indivíduo causando LPL disfuncional. A prevalência de Fredrickson Tipo I é aproximadamente 1 em 1.000.000 na população em geral e é muito mais elevada na África do Sul e leste de Quebec como resultado de um efeito fundador. Os pacientes respondem minimamente ou não respondem de maneira nenhuma a fármacos que diminuem o TG (Tremblay et al., J Clin Lipiodol, 2011, 5:37-44; Brisson et al., Pharmacogenet Genom, 2010, 20:742-747) e, portanto, a restrição de gordura na dieta em 20 gramas/dia ou menos é usada para controlar os sintomas deste distúrbio raro.

[00182] Como usado aqui, "totalmente complementar" ou "100% complementar" significa que cada nucleobase de uma sequência de nu- cleobase de um primeiro ácido nucleico tem uma nucleobase comple-mentar numa segunda sequência de nucleobase de um segundo ácido nucleico. Em certas modalidades, um primeiro ácido nucleico é um com-posto antissenso e um segundo ácido nucleico é um ácido nucleico alvo.

[00183] Como usado aqui, "glicose"é um monossacarídeo usado pe-lascélulas como uma fonte de energia e intermediário inflamatório. "Gli-coseplasmática"refere-se à glicose presente no plasma.

[00184] Como usado aqui, "lipoproteína-C de alta densidade" ou "HDL-C" significa colesterol associado a partículas de lipoproteína de alta densidade. A concentração de HDL-C no soro (ou plasma) é normalmente quantificada em mg/dL ou nmol/L. "HDL-C do soro" e "HDL- C do plasma" significam HDL-C no soro e no plasma, respectivamente.

[00185] Como usado aqui, "inibidor da HMG-CoA redutase" significa um agente que age através da inibição da enzima HMG-CoA redutase, tal como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravas- tatina e sinvastatina.

[00186] Como usado aqui, "hipercolesterolemia" significa uma condição caracterizada pelo colesterol elevado ou colesterol circulante (do plasma), LDL-colesterol e VLDL-colesterol, como por diretrizes do Re-latório de Painel Perito do Programa Educacional de Colesterol Nacional (NCEP) de Detecção, Avaliação do Tratamento de colesterol alto em adultos (vide, Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).

[00187] Como usado aqui, "hiperlipidemia" ou "hiperlipidemia"é uma condição caracterizada por lipídios séricos elevados ou lipídios circulan-tes (plasma). Esta condição manifesta uma concentração anormalmente alta de gorduras. As frações de lipídio no sangue circulante são colesterol, lipoproteínas de baixa densidade, lipoproteínas de densidade muito baixa, quilomícrons e triglicerídeos. A classificação de Fredrickson de hiperlipidemias é baseada no padrão de TG e partículas de lipoproteína rica em colesterol, conforme medido por eletroforese ou ul- tracentrifugação e é comumente usada para caracterizar causas primá-rias de hiperlipidemias tal como hipertrigliceridemia (Fredrickson and Lee, Circulation, 1965, 31:321-327; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967, 276 (1): 34-42).

[00188] Como usado aqui, "hipertrigliceridemia" significa uma condição caracterizada por níveis elevados de triglicérides. Hipertrigliceride- mia é uma consequência do aumento da produção e/ou da redução ou demora do catabolismo de lipoproteínas ricas em triglicerídeo (TG): VLDL e, em menor medida, quilomícrons (CM). Sua etiologia inclui fatoresprimários (ou seja, causas genéticas) e secundários (outras causas subjacentes tais como diabetes, síndrome metabólica/resistência à insulina, obesidade, inatividade física, fumar cigarro, álcool adicional e uma dieta muito alta em carboidratos) ou, o mais frequentemente, uma combinação de ambos (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176:1113-1120). Hi- pertrigliceridemia é um traço clínico comum associado ao aumento do risco de doença cardiometabólica (Hegele et al. 2009, Hum Mol Genet, 18: 4189-4194; Hegele and Pollex 2009, Mol Cell Biochem, 326: 35-43), bem como da ocorrência de pancreatite aguda nas formas mais graves (Toskes 1990, Gastroenterol Clin North Am, 19: 783-791; Gaudet et al. 2010, Atherosclerosis Supplements, 11: 55-60; Catapano et al. 2011, Atherosclerosis, 217S: S1-S44; Tremblay et al. 2011, J Clin Lipidol, 5: 37-44). Exemplos de doença cardiometabólica incluem, entre outros, di-abetes, síndrome metabólica/resistência à insulina e distúrbios genéticos como síndrome de quilomicronemia familiar (FCS), hiperlipidemia combinada familiar e hipertrigliceridemia familiar. Os níveis de TG ele-vadoslimítrofes (150-199 mg/dL) são comumente encontrados na po-pulação geral e são um componente comum dos estados da síndrome metabólica/resistência à insulina. O mesmo é verdadeiro para níveis ele-vados de TG (200-499 mg/dL), exceto que já que os níveis plasmáticos de TG aumentam, os fatores genéticos subjacentes desempenham um papel etiológico cada vez mais importante. Níveis muito elevados de TG (>500 mg/dL) são mais frequentemente associados a níveis de CM tam-bém elevados, e são acompanhados pelo aumento do risco para pan-creatite aguda. O risco de pancreatite é considerado clinicamente signi-ficativo se os níveis de TG excederem 880 mg/dL (> 10 mmol) e as di-retrizes de 2011 da European Atherosclerosis Society/European Soci- etyof Cardiology (EAS/ESC) afirmam que as ações necessárias para prevenir a pancreatite aguda são obrigatórias (Catapano et al. 2011, Atherosclerosis, 217S: S1-S44). De acordo com as diretrizes da EAS/ ESC 2011, a hipertrigliceridemia é a causa de aproximadamente 10% dos casos de pancreatite e o desenvolvimento de pancreatite pode ocorrer em níveis de TG entre 440-880 mg/dL. Com base em evidências de estudos clínicos que demonstram que níveis elevados de TG são um fator de risco independente para CVD aterosclerótica, as diretrizes do III Painel de Tratamento de Adultos do Programa de Educação de Colesterol Nacional (NCEP 2002, Circulation, 106: 3143-421) e da Associação Americana de Diabetes (ADA 2008, Diabetes Care, 31: S12-S54.) recomendam um nível de TG alvo de menos de 150 mg/dL para reduzir o risco cardiovascular.

[00189] Como usado aqui, "identificar" ou "selecionar um animal com doença metabólica ou cardiovascular", significa identificar ou selecionar um indivíduo propenso a ou que foi diagnosticado com uma doença me-tabólica, uma doença cardiovascular, ou uma síndrome metabólica; ou identificar ou selecionar um indivíduo que tem qualquer sintoma de uma doença metabólica, doença cardiovascular, ou síndrome metabólica in-cluindo, mas não limitado a, hipercolesterolemia, hiperglicemia, hiperli- pidemia, hipertrigliceridemia, resistência à insulina aumentada pela hi-pertensão, sensibilidade à insulina reduzida, peso corporal acima do normal, e/ou teor de gordura corporal acima do normal ou qualquer combinação dos mesmos. Essa identificação pode ser realizada por qualquer método, incluindo mas não limitado a, testes ou avaliações clí-nicaspadrão, tais como medição do soro ou colesterol circulante (plasma), medição do soro ou glicose no sangue circulante (plasma), medição do soro ou triglicerídeos circulantes (plasma), medição da pres-são arterial, medição do teor de gordura corporal, medição do peso cor-poral, e similares.

[00190] Como usado aqui, "resultado cardiovascular melhorado"significa uma redução na ocorrência de eventos cardiovasculares adversos, ou o risco da mesma. Exemplos de eventos cardiovasculares adversos incluem, sem limitação, morte, reinfarto, derrame, choque cardi- ogênico, edema pulmonar, parada cardíaca, e disritmia atrial.

[00191] Como usado aqui, "imediatamente adjacente" significa que não há elementos intermediários entre os elementos imediatamente ad-jacentes, por exemplo, entre regiões, segmentos, nucleotídeos e/ou nu- cleosídeos.

[00192] Como usado aqui, "aumento de HDL" ou "elevação de HDL" significa o aumento do nível de HDL em um animal após a administração pelo menos um composto da invenção, em comparação com o nível de HDL em um animal não administrado com nenhum composto.

[00193] Como usado aqui, "indivíduo"ou "indivíduo"ou "animal"significa um animal humano ou não humano selecionado para tratamento ou terapia.

[00194] Como usado aqui, "indivíduo em necessidade do mesmo" se refere a um animal humano ou um animal não humano selecionado para tratamento ou terapia que esteja em necessidade de tal tratamento ou terapia.

[00195] Como usado aqui, "induzir", "inibir", "potencializar", "elevar", "aumentar", "diminuir", "reduzir" ou similares denotam diferenças quan-titativas entre dois estados. Por exemplo, "uma quantidade eficaz para inibir a atividade ou a expressão de apoCIII" significa que o nível de atividade ou expressão de apoCIII em uma amostra tratada diferirá a partir do nível de atividade ou expressão de apoCIII em uma amostra não tratada. Tais termos são aplicados a, por exemplo, níveis de expressão, e níveis de atividade.

[00196] Como usado aqui, "condição inflamatória"se refere a uma doença, estado de doença, síndrome, ou outra condição resultando na inflamação. Por exemplo, a artrite reumatoide e a fibrose hepática são condições inflamatórias. Outros exemplos de condições inflamatórias in-cluem sepse, isquemia do miocárdio/lesão de reperfusão, síndrome de desconforto respiratório do adulto, nefrite, rejeição ao enxerto, doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, arteriosclerose, aterosclerose e vasculite.

[00197] Como usado aqui, "inibição da expressão ou atividade"refere-se a uma redução ou bloqueio da expressão ou atividade de um RNA ou proteína e não necessariamente indica uma eliminação total da expressão ou atividade.

[00198] Como usado aqui, "resistência à insulina"é definida como a condição na qual quantidades normais de insulina são inadequadas para produzir uma resposta normal à insulina a partir das células de gordura, do músculo e do fígado. Resistência à insulina nas células de gordura resulta na hidrólise dos triglicérides armazenados, o que eleva os ácidos graxos livres no plasma sanguíneo. A resistência à insulina no músculo reduz a absorção de glicose, enquanto a resistência à insulina no fígado reduz o armazenamento de glicose, com ambos os efeitos servindo para elevar a glicose sanguínea. Altos níveis plasmáticos de insulina e glicose devido à resistência à insulina frequentemente levam à síndrome metabólica e a diabetes tipo 2.

[00199] Como usado aqui, "sensibilidade à insulina"é uma medida do quão eficazmente um indivíduo processa a glicose. Um indivíduo tendo alta sensibilidade à insulina processa eficazmente a glicose, en-quanto que um indivíduo com baixa sensibilidade à insulina não processa eficazmente a glicose.

[00200] Como usado aqui, "redução de lipídios"significa uma redução em um ou mais lipídios (por exemplo, LDL, VLDL) em um indivíduo. "Elevação de lipídios"significa um aumento em um lipídio (por exemplo, HDL) em um indivíduo. A redução de lipídios ou a elevação de lipídios pode ocorrer com uma ou mais doses ao longo do tempo.

[00201] Como usado aqui, "terapia de redução lipídica"ou "agente redutor de lipídios"significa um regime terapêutico fornecido a um indivíduo para reduzir um ou mais lipídios em um indivíduo. Em certas modalidades, uma terapia de redução de lipídios é fornecida para reduzir uma ou mais de apo(a), apoCIII, CETP, apoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, não HDL-C, triglicerídeos, pequenas partículas densas de LDL, e LP(a) em um indivíduo. Exemplos de terapia de redução de lipídios incluem, mas não estão limitados a, inibidores de apoB, estati- nas, fibratos e inibidores de MTP.

[00202] Como usado aqui, "lipoproteína", tais como VLDL, LDL e HDL, se refere a um grupo de proteínas encontradas no soro, no plasma e no linfonodo e é importante para o transporte do lipídio. A composição química de cada lipoproteína difere, por exemplo, em que a HDL tem uma proporção mais alta de proteína versus lipídio, considerando que a VLDL tem uma proporção mais baixa de proteína versus lipídio.

[00203] Como usado aqui, "Lipoproteína Lipase" ou "LPL" refere-se a uma enzima que hidrolisa os TGs encontrados em lipoproteínas, como CM ou VLDL, em ácidos graxos livres e monoacilgliceróis. LPL requer apo C-II como um cofator para funcionar na hidrólise de TGs. A LPL é produzida principalmente no músculo esquelético, tecido adiposo e músculo cardíaco. A hidrólise e a remoção de TG de CM e VLDL protege normalmente contra o aumento pós-prandial excessivo na massa de CM e TG.

[00204] Como usado aqui, os termos "deficiente de lipoproteína lipase", "deficiência de lipoproteína lipase" ou "deficiência de LPL" ou "LPLD"também são conhecidos como "Dislipidemia Fredrickson Tipo I", "quilomicronemia", "Síndrome de Quilomicronemia Familiar" ou "FCS". Embora indivíduos com LPLD geralmente não apresentem LPL ou ativi-dade de LPL necessária para a degradação efetiva de ácidos graxos como TGs, esses indivíduos ainda podem ter uma atividade de LPL mí-nima ou expressar um nível mínimo de LPL. Em alguns casos, um indi-víduo com LPLD pode expressar LPL ou ter atividade de LPL de até cerca ou no máximo 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de atividade. Em outros casos, o indivíduo com LPLD não tem LPL mensurável ou ativi-dade de LPL. Uma modalidade de LPLD engloba indivíduos com "hiper- lipoproteinemiatipo Ia" (também conhecido como "Fredrickson Tipo Ia") e refere-se à incapacidade dos indivíduos para produzir enzimas lipo- proteína lipase funcionais suficientes e necessárias para a degradação eficaz de ácidos graxos como TGs. A incapacidade de degradação de TGs acarreta em hipertrigliceridemia no indivíduo e, muitas vezes, mais de 12 horas após as refeições, hyierTG e quilomicronemia estão ainda presentes e visíveis como lipemia. O Tipo Ia é comumente causado por uma ou mais mutações no gene da LPL. Conforme divulgado aqui, LPLD também engloba indivíduos que têm lipoproteína lipase disfunci- onal como aqueles indivíduos com "hiperlipoproteinemia tipo Ib" (também conhecida como "Fredrickson Tipo Ib") e "hiperlipoproteinemia tipo Ic" (também conhecida como "Fredrickson tipo Ic"). O Tipo Ib é causado pela falta de apoproteína C-II do ativador da lipoproteína lipase. O Tipo Ic é devido a um inibidor circulante da lipoproteína lipase. Assim como indivíduos com o Tipo 1a, indivíduos com o Tipo 1b/1c sofrem de uma incapacidade de degradar TGs acarretando em hipertrigliceridemia e hiperTG e quilomicronemia que estão presentes e são visíveis como li- pemia, muitas vezes, mais de 12 horas após as refeições. Em determi-nadas modalidades, LPLD está associada a pelo menos uma mutação no gene da LPL como P207L, G188L ou D9N ou outras mutações que afetam a LPL (Brunzell, In: Pagon RA, Adam MP, Bird TD, Dolan CR, Fong CT, Stephens K, editores. GeneReviews™ [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2013.12 Out 1999 [atualizado em 15 Dez 2011].

[00205] Como usado aqui, "lipoproteína-colesterol de baixa densidade (LDL-C)" significa colesterol transportado em partículas de lipopro- teína de baixa densidade. A concentração de LDL-C no soro (ou plasma) é normalmente quantificada em mg/dL ou nmol/L. "LDL-C do soro" e "LDL-C do plasma" significam LDL-C no soro e no plasma, respectivamente.

[00206] Como usado aqui, "principais fatores de risco" referem-se aos fatores que contribuem para um alto risco de uma doença ou condição específica. Em certas modalidades, os principais fatores de risco para doença cardíaca coronariana incluem, sem limitação, tabagismo, hipertensão, LDL alta, HDL-C baixa, histórico familiar de doença cardíaca coronariana, idade, e outros fatores divulgados aqui.

[00207] Como usado aqui, "distúrbio metabólico"ou "doença meta bólica"se refere a uma condição caracterizada por uma alteração ou distúrbio na função metabólica. "Metabólico"e "metabolismo"são termos bem conhecidos na técnica e geralmente incluem a gama inteira de processos bioquímicos que ocorrem dentro de um organismo vivo. Distúrbios metabólicos incluem, mas não estão limitados a, hiperglice- mia, pré-diabetes, diabetes (tipo 1 e tipo 2), obesidade, resistência à insulina, síndrome metabólica e dislipidemia devido ao diabetes tipo 2.

[00208] Como usado aqui, "síndrome metabólica"significa uma condição caracterizada por um agrupamento de lipídios e fatores de risco cardiovasculares não lipídicos de origem metabólica. Em determinadas modalidades, a síndrome metabólica é identificada pela presença de quaisquer 3 dos seguintes fatores: circunferência da cintura maior que 102 cm em homens ou maior que 88 cm em mulheres; triglicérides séri- cos de pelo menos 150 mg/dL; HDL-C menor que 40 mg/dL em homens ou menor que 50 mg/dL em mulheres; pressão sanguínea de pelo menos 130/85 mmHg; e glicose em jejum de pelo menos 110 mg/dL. Esses determinantes podem ser facilmente medidos na prática clínica (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).

[00209] "Administração parentérica"significa administração através de injeção ou infusão. A administração parentérica inclui administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intra-arterial, administração intraperitoneal, ou adminis-tração intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou intracere- broventricular. A administração pode ser contínua, crônica, curta ou in-termitente.

[00210] Como usado aqui, "peptídeo"significa uma molécula formada pela ligação de pelo menos dois aminoácidos por ligações de amida. Peptídeo refere-se a polipeptídeos e proteínas.

[00211] Como usado aqui, "agente farmacêutico"significa uma substância que proporciona um benefício terapêutico quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, em certas modalidades, um oligonucleotí- deo antissenso direcionado à apoCIII é um agente farmacêutico ativo.

[00212] Como usado aqui, "composição farmacêutica"ou "composi-ção"significa uma mistura de substâncias adequadas para a adminis-tração a um indivíduo. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais agentes ativos e um veículo farmacêutico, por exemplo, uma solução aquosa estéril.

[00213] Como usado aqui, "derivado farmaceuticamente aceitável"engloba derivados dos compostos descritos aqui tais como solvatos, hidratos, ésteres, profármacos, polimorfos, isômeros, variantes isotipi- camente marcadas, sais farmaceuticamente aceitáveis e outros deriva-dos conhecidos na técnica.

[00214] Como usado aqui, "sais farmaceuticamente aceitáveis" significa sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis de compostos antissenso, ou seja, sais que mantêm a atividade biológica desejada do composto pai e não transmitem efeitos toxicológicos indesejáveis aos mesmos. O termo "sal farmaceuticamente aceitável"ou "sal" inclui um sal preparado a partir de ácidos ou bases não tóxicos farmaceutica- mente aceitáveis, incluindo ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. "Sais farmaceuticamente aceitáveis"dos compostos descritos aqui podem ser preparados por métodos bem conhecidos na técnica. Para uma revisão dos sais farmaceuticamente aceitáveis, vide Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002). Os sais de sódio dos oligonu- cleotídeos antissenso são úteis e são bem aceitos para a administração terapêutica em seres humanos. Nesse sentido, em uma modalidade, os compostos descritos aqui estão sob a forma de um sal de sódio.

[00215] Como usado aqui, "porção"significa um número definido de nucleobases contíguas (isto é, ligadas) de um ácido nucleico. Em deter-minadas modalidades, uma porção é um número definido de nucleoba- ses contíguas de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um composto antissenso.

[00216] Como usado aqui, "prevenir" ou "prevenção"se refere ao re-tardamento ou prevenção do aparecimento ou do desenvolvimento de uma doença, distúrbio, ou condição por um período de tempo de minutos a indefinidamente. Prevenir também significa reduzir o risco de de-senvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição.

[00217] Como usado aqui, "elevar" significa aumentar em quanti- dade. Por exemplo, elevar níveis de HDL do plasma significa aumentar a quantidade de HDL no plasma.

[00218] Como usado aqui, "reduzir" significa reduzir a uma extensão, tamanho, quantidade, ou número menor. Por exemplo, reduzir os níveis de triglicerídeo do plasma significa reduzir a quantidade de triglicerídeo no plasma.

[00219] Como usado aqui, "região"ou "região alvo"é definida como uma porção do ácido nucleico alvo que tem pelo menos uma estrutura, função, ou característica identificável. Por exemplo, uma região alvo pode abranger uma 3' UTR, uma 5' UTR, um éxon, um íntron, uma junção éxon/íntron, uma região de codificação, uma região de iniciação da tradução, região de terminação da tradução, ou outra região de ácido nucleico definida. As regiões estruturalmente definidas para apoCIII po-dem ser obtidas pelo número de acesso de bancos de dados de sequên-cia tal como NCBI e tais informações são incorporadas aqui por referên-cia. Em certas modalidades, uma região alvo pode abranger a sequência de um sítio alvo 5' de um segmento alvo dentro da região alvo para um sítio alvo 3' de outro segmento alvo dentro da região alvo.

[00220] Como usado aqui, "segundo agente" ou "segundo agente te-rapêutico"significa um agente que pode ser usado em combinação com um "primeiro agente". Um segundo agente terapêutico pode incluir, mas não está limitado a, oligonucleotídeos antissenso que direcionam apo(a) ou apoCIII. Um segundo agente pode também incluir anticorpos anti- apoCIII, inibidores de peptídeo de apoCIII, agentes redutores de coles-terol, agentes redutores de lipídio, agentes redutores de glicose e agen-tesanti-inflamatórios.

[00221] Como usado aqui, "segmentos"são definidos como subpor- ções menores de regiões dentro de um ácido nucleico. Por exemplo, um "segmento alvo" significa a sequência de nucleotídeos de um ácido nu- cleico alvo à qual um ou mais compostos antissenso são direcionados. "Sítio alvo 5'" refere-se ao nucleotídeo mais extremo em 5' de um seg-mento alvo. "Sítio alvo 3'" se refere ao nucleotídeo 3'-terminal de um segmento alvo. Alternativamente, um "sítio de iniciação"pode se referir ao nucleotídeo 5'-terminal de um segmento alvo e um "sítio de parada" se refere ao nucleotídeo 3'-terminal de um segmento alvo. Um segmento alvo pode também começar no "sítio de iniciação"de uma sequência e extremidade no "sítio de parada" de outra sequência.

[00222] Como usado aqui, "estatina" significa um agente que inibe a atividade da HMG-CoA redutase.

[00223] Como usado aqui, "administração subcutânea"significa a administração logo abaixo da pele.

[00224] Como usado aqui, "indivíduo"significa um animal humano ou não humano selecionado para tratamento ou terapia.

[00225] Como usado aqui, "sintoma de doença ou distúrbio cardio-vascular" significa um fenômeno que se eleva a partir de e acompanha a doença ou distúrbio cardiovascular e serve como uma indicação deste. Por exemplo, angina; dor no peito; falta de fôlego; palpitações; fraqueza; tonturas; náuseas; sudorese; taquicardia; bradicardia; arritmia; fibrilação atrial; inchaço nas extremidades inferiores; cianose; cansaço; desmaio; dormência da face; dormência dos membros; claudicação ou cólicas dos músculos; inchaço do abdômen; ou febre são sintomas de doença ou distúrbio cardiovascular.

[00226] Como usado aqui, "direcionamento" ou "direcionado"significa o processo de projeto e seleção de um composto antissenso que se hibridizará em um ácido nucleico alvo e induzir um efeito desejado.

[00227] Como usado aqui, "quantidade terapeuticamente eficaz"significa uma quantidade de um agente farmacêutico que fornece um benefício terapêutico a um indivíduo.

[00228] Como usado aqui, "mudança terapêutica do estilo de vida" significa mudanças na dieta e no estilo de vida pretendidas para diminuir a massa de gordura/tecido adiposo e/ou o colesterol. Essa mudança pode reduzir o risco de desenvolver doença cardíaca e pode incluir re-comendações para a ingestão na dieta de calorias diárias totais, gordura total, gordura saturada, gordura poli-insaturada, gordura monoinsatu- rada, carboidrato, proteína, colesterol, fibra insolúvel, bem como reco-mendações de atividade física.

[00229] Como usado aqui, "tratar" ou "tratamento" se refere à admi-nistração de um composto descrito aqui para efetuar uma alteração ou melhora de uma doença, distúrbio, ou condição.

[00230] Como usado aqui, "triglicéride"ou "TG" significa um lipídio ou gordura neutra consistindo em glicerol combinado com três moléculas de ácido graxo.

[00231] Como usado aqui, "diabetes tipo 2,"(também conhecido como "diabetes mellitus tipo 2", "diabetes mellitus, tipo 2", "diabetes não dependente de insulina, NIDDM", "diabetes relacionado à obesidade", ou "diabetes do adulto") é um distúrbio metabólico que é principalmente caracterizado por resistência à insulina, deficiência de insulina relativa, e hiperglicemia.

Determinadas Modalidades

[00232] Certas modalidades fornecem compostos e métodos que di-minuem a expressão de mRNA de ApoCIII e expressão de proteína. Em certas modalidades, o composto é um inibidor específico de ApoCIII para tratar, prevenir, ou melhorar uma doença associada à ApoCIII. Em certas modalidades, o composto antissenso é um oligonucleotídeo an- tissenso que direciona ApoCIII. Em determinadas modalidades, o composto é um oligonucleotídeo que direciona ApoCIII e um grupo conjugado.

[00233] Em determinadas modalidades, um composto compreende um siRNA ou oligonucleotídeo antissenso direcionado à Apoliproteína C-III (ApoC-III) conhecida na técnica e um grupo de conjugado aqui descrito. Exemplos de oligonucleotídeos antissenso direcionados à ApoC-III adequados para conjugação incluem, entre outros, aqueles di-vulgados na Publicação do Pedido de Patente US N° 2013/0317085, a qual é incorporada por referência na sua totalidade. Em determinadas modalidades, um composto compreende um oligonucleotídeo antis- senso que possui uma sequência de nucleobases de quaisquer SEQ ID NOs 19-96 e 209-221 divulgadas em US 2013/0317085 e um grupo de conjugado aqui descrito. As sequências de nucleobases de todas as SEQ ID NOs referenciadas anteriormente estão incorporadas por refe-rência aqui.

[00234] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado com o grupo de conjugado tem uma sequência de nucleobase que compreende pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência selecionada a partir de qualquer sequência divulgada em Patente U.S. 7.598.227, Patente U.S. 7.750.141 Publicação PCT WO 2004/093783 ou Publicação PCT WO 2012/149495, todas incorporadas por referência aqui. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência selecionada a partir de qualquer sequência divulgada em Patente U.S. 7.598.227, Patente U.S. 7.750.141, Publicação PCT WO 2004/093783 ou Publicação PCT WO 2012/149495, todas incorporadas por referência aqui.

[00235] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende: Em certas modalidades, o oli- gonucleotídeo modificado com o grupo de conjugado consiste em 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25 nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado com o grupo de conjugado compreende pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29 ou 30 nucleosídeos ligados. Em certas mo-dalidades, o oligonucleotídeo modificado com o grupo de conjugado consiste em 20 nucleosídeos ligados.

[00236] Determinadas modalidades fornecem um composto que compreende oligonucleotídeo modificado com um grupo de conjugado que direciona ApoCIII e tem uma sequência complementar a quaisquer sequências estabelecidas no Acesso GENBANK N° NM_000040.1 (in-corporado a este documento como SEQ ID NO: 1; Acesso GENBANK NT_033899 truncado a partir de nucleotídeos 20262640 a 20266603 (in-corporados aqui como SEQ ID NO: 2) e/ou N° de Acesso GENBANK NT_035088 trucado a partir dos nucleotídeos 6238608 a 6242565 (in-corporado a este documento como SEQ ID NO: 3). Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 100% complementar a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, 17, pelo menos, pelo menos 18, pelo menos 19 ou 20 nu- cleobases contíguas complementares a uma porção de comprimento equivalente de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3. Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que direciona segmento de ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, 17, pelo menos, pelo menos 18, pelo menos 19 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de quaisquer segmentos alvo mostrados nas Tabelas 121 e 124. Nas tabelas, "Sítio de Iniciação"se refere ao nucleotídeo 5'-terminal de um segmento alvo e um "Sítio de Parada" se refere ao nucleotídeo 3'- terminal de um segmento alvo. Um segmento alvo pode variar do sítio de iniciação ao sítio de parada de casa sequência listada nas tabelas. Alternativamente, o segmento alvo pode variar a partir do sítio de inici-ação de uma sequência e extremidade no sítio de parada de outra se-quência. Por exemplo, como mostrado nas tabelas, um segmento alvo pode variar de 3533 a 3522 o sítio de iniciação para o sítio de parada de SEQ ID NO: 87. Em outro exemplo, como mostrado nas tabelas, um segmento alvo pode variar de 3514 a 3558 o sítio de iniciação de SEQ ID NO: 83 para o sítio de parada de SEQ ID NO: 88. Em determinadas modalidades, o composto antissenso compreende pelo menos 8 nucleo- bases da sequência de SEQ ID NO: 87. Em determinadas modalidades, o composto antissenso compreende a sequência de SEQ ID NO: 87. Em determinadas modalidades, o composto antissenso consiste na se-quência de SEQ ID NO: 87. Em determinadas modalidades, o composto antissenso é ISIS 304801.

[00237] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotí- deo modificado é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% complementar a alguma das SEQ ID NO: 13. Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oli- gonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% complementar a algum dos segmentos alvo divulgados aqui.

[00238] Certas modalidades fornecem um composto compreen- dendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende uma sequência de nucleobase compreendendo uma porção de pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de comprimento igual das nucleobases 3533 a 3552 da SEQ NO: 3, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80% complementar à SEQ ID NO: 3.

[00239] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo consiste em 12 a 30 nu- cleosídeos ligados e compreendendo uma sequência de nucleobase compreendendo uma porção de pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29 ou 30 nucleobases contíguas complementares a uma porção de comprimento igual das nucleobases 3514 a 3558 de SEQ NO: 3, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80% complementar à SEQ ID NO: 3.

[00240] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende uma sequência de nucleobase compreendendo uma porção de pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou 20 nucleobases contíguas de quaisquer sequências de nucleobase da SEQ NOs: 19-96, 209-221. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado conjugado tem uma sequência de nucleo- base compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobase de SEQ ID NOs: 19-96, 209-221. Em determinadas modalidades, o composto consiste em quaisquer SEQ ID NOs: 19-96, 209-221 e um grupo conjugado.

[00241] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende uma sequência de nucleobase compreendendo uma porção de pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou 20 nucleobases contíguas de quaisquer sequências de nucleobase da SEQ NO: 87. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado com o grupo de conjugado tem uma sequência de nucleo- base compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas da sequência de nucleobase de SEQ ID NO: 87. Em determinadas modalidades, o composto consiste em SEQ ID NO: 87 e um grupo conjugado.

[00242] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso compreende um oligonucleotídeo modificado ISIS 304801 com 5'-X, onde X é um grupo de conjugado que compreende GalNAc. Em determinadas modalidades, o composto antissenso consiste em um oligonucleotídeo modificado com ISIS 304801 com 5'-X, onde X é um grupo de conjugado que compreende GalNAc.

[00243] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for- nece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso com- preende o oligonucleotídeo modificado conjugado ISIS 678354. Em de- terminadas modalidades, o composto antissenso consiste no oligonu- cleotídeo modificado conjugado ISIS 678354.

[00244] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso compreende o oligonucleotídeo modificado conjugado ISIS 678357. Em determinadas modalidades, o composto antissenso consiste no oligonu- cleotídeo modificado conjugado ISIS 678357.

[00245] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece compostos antissenso conjugados representados pela seguinte estrutura. Em determinadas modalidades, o composto antissenso compreende um oligonucleotídeo modificado com a sequência de nucleo- base de SEQ ID NO: 87 com 5'-GalNAc com variabilidade no mods de açúcar das asas. Em determinadas modalidades, o composto antis- senso consiste em um oligonucleotídeo modificado com a sequência de nucleobase de SEQ ID NO: 87 com 5'-GalNAc com variabilidade no mods de açúcar das asas.

[00246] onde R1é -OCH2CH2OCH3 (MOE) e R2é H; ou R1e R2juntos formam uma ponte, onde R1é -O- eR2é -CH2-, -CH(CH3)-, ou - CH2CH2-, e R1e R2estão diretamente conectados de modo que a ponte resultante seja selecionada a partir de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, e -O- CH2CH2-;

[00247] e para cada par de R3e R4no mesmo anel, independentemente para cada anel: qualquer R3seja selecionado de H e - OCH2CH2OCH3 e R4seja H; ou R3e R4, juntos, formem uma ponte, em que R3é -O-, e R4é -CH2-, -CH(CH3)-, ou -CH2CH2- e R3e R4estão diretamente conectados, tal que a ponte resultante seja selecionada de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, e -O-CH2CH2-;

[00248] e R5 seja selecionado de H e -CH3;

[00249] e Z seja selecionado de S- e O-.

[00250] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado tem fita simples.

[00251] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo de conjugado em que pelo menos uma ligação internucleosídeos é uma ligação internucleosídea modificada. Em certas modalidades, a ligação internucleosídea modificada é uma ligação internucleosídea de fosforotioato. Em determinadas modalidades, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, 6, pelo menos, pelo menos 7, 8, pelo menos, pelo menos 9 ou pelo menos 10 ligações internu- cleosídeas do referido oligonucleotídeo modificado são ligações inter- nucleosídeas de fosforotioato. Em certas modalidades, cada ligação in- ternucleosídeos é uma ligação internucleosídeos de fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, 6, pelo menos, pelo menos 7, 8, pelo menos, pelo menos 9 ou pelo menos 10 ligações internucleosídeas do referido oligonucleotídeo modi-ficadosão ligações internucleosídeas de fosforo fosforotioato. Em de-terminadas modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucle- otídeo modificado é selecionada de uma ligação internucleosídica de fosfodiéster e uma ligação internucleosídica de fosforotioato.

[00252] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo de conjugado em que pelo menos um nucleosídeo compreende uma ligação internucleosídea modificada. Em certas modalidades, a nu- cleobase modificada é uma 5-metilcitosina.

[00253] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos um açúcar modificado. Em certas modalidades, o açúcar modificado é um açúcar bicíclico. Em certas modalidades, o açúcar modificado compreende uma 2'-O-metoxietila, uma etila restrita, um 3'-flúor-HNA ou uma ponte de 4'-(CH2)n-O-2', em que n é 1 ou 2.

[00254] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e compreende: (a) um segmento de lacuna consistindo em desoxinucleosídeos ligados; (b) um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; (c) um segmento de asa 3'consistindo em nucleosídeos ligados; e em que o segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado.

[00255] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados e compreende: (a) um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucleosídeos ligados; (b) um segmento de asa 5' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; (c) um segmento de asa 3' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; e em que o segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar de 2'-O-metoxietila, em que cada ligação internucleosídeos é uma ligação de fosforotioato e em que cada resíduo de citosina é uma 5-metilcitosina.

[00256] Certas modalidades fornecem um composto compreen- dendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreen-dendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19-96, 209-221, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: (a) um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucleosí- deos ligados; (b) um segmento de asa 5' consistindo em cinco nucleo- sídeos ligados; (c) um segmento de asa 3' consistindo em cinco nucleo- sídeos ligados; e em que o segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar de 2'-O-metoxietila, em que cada ligação internucleosídeos é uma ligação de fosforotioato e em que cada resíduo de citosina é uma 5-metilcitosina.

[00257] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados e tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das SEQ ID NO: 87, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: (a) um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucleosídeos ligados; (b) um segmento de asa 5' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; (c) um segmento de asa 3' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; e em que o segmento de lacuna é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar de 2'-O-metoxietila, em que cada ligação internucleosídeos é uma ligação de fosforotioato e em que cada resíduo de citosina é uma 5-metilcitosina.

[00258] Certas modalidades fornecem um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, em que o oligonu- cleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados com a sequência de nucleobase de SEQ ID NO: 87, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: (a) um segmento de lacuna consistindo em dez desoxinucleosídeos ligados; (b) um segmento de asa 5' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; (c) um segmento de asa 3' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; e em que o segmento de lacuna é posicio-nado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar de 2'-O- metoxietila, em que cada ligação internucleosídeos é uma ligação de fosforotioato e em que cada resíduo de citosina é uma 5-metilcitosina.

[00259] Em certas modalidades, o grupo de conjugado está ligado ao oligonucleotídeo modificado na extremidade 5' do oligonucleotídeo mo-dificado. Em certas modalidades, o grupo de conjugado está ligado ao oligonucleotídeo modificado na extremidade 3' do oligonucleotídeo mo-dificado.

[00260] Em certas modalidades, o grupo de conjugado compreende exatamente um ligante. Em determinadas modalidades, um grupo de conjugado compreende um ou mais ligantes. Em certas modalidades, o grupo de conjugado compreende exatamente dois ligantes. Em deter-minadas modalidades, um grupo de conjugado compreende dois ou mais ligantes. Em determinadas modalidades, um grupo de conjugado compreende três ou mais ligantes. Em certas modalidades, o grupo de conjugado compreende exatamente três ligantes. Em certas modalida-des, cada ligante é selecionado dentre: um polissacarídeo, polissacarí- deo modificado, manose, galactose, um derivado de manose, um deri-vado de galactose, D-manopiranose, L-Manopiranose, D-Arabinose, L- Galactose, D-xilofuranose, L-xilofuranose, D-glicose, L-glicose, D-Ga- lactose, L-Galactose, α-D-Manofuranose, β-D-Manofuranose, α-D-Ma- nopiranose, β-D-Manopiranose, α-D-Glicopiranose, β-D-Glicopiranose, α-D-Glicofuranose, β-D-Glicofuranose, α-D-fructofuranose, α-D-fruc- topiranose, α-D-Galactopiranose, β -D-Galactopiranose, α-D-Galacto- furanose, β -D-Galactofuranose, glicosamina, ácido siálico, α-D-galac- tosamina, N-Acetilgalactosamina, 2-Amino-3-O- [(R)-1-carboxietil]-2-de- soxi-β-D-glicopiranose, 2-Desoxi-2-metilamino-L-glicopiranose, 4,6-Di- desoxi-4-formamido-2,3-di-O-metil-D-manopiranose, 2-Desoxi-2-sulfoa- mino-D-glicopiranose, ácido N-Glicoloil-α-neuraminico, 5-tio-β-D-glico- piranose, 2,3,4-tri-O-acetil-1-tio-6-O-tritil-α-D-glicopiranosideo de me- tila, 4-Tio-β-D-galactopiranose, 3,4,6,7-tetra-O-acetil-2-desoxi-1,5-ditio- α-D-glico-heptopiranosideo de etila, 2,5-Anidro-D-alononitrila, ribose, D- ribose, D-4-tiorribose, L-ribose, L-4-tiorribose. Em determinadas moda-lidades, cada ligante é N-acetil galactosamina.

[00261] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00262] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00263] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00264] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00265] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com- preende:

[00266] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com- preende pelo menos um grupo de ligação fósforo ou grupo de ligação neutro.

[00267] Em determinadas modalidades, um grupo de conjugado compreende uma estrutura selecionada entre os itens a seguir:

[00268] onde n é de 1 a 12; e

[00269] onde m é de 1 a 12.

[00270] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado tem um fixador com uma estrutura selecionada entre:

[00271] onde L é um grupo de ligação de fósforo ou um grupo de ligação neutro;

[00272] Z1 é C(=O)O-R2;

[00273] Z2 é alquila H, C1- C6 ou alquila substituída C1- C6;

[00274] R2 é H, C1- C6 ou alquila substituída C1- C6; e

[00275] cada m1 é, independentemente, de 0 a 20, em que pelo menos um m1 é maior que 0 para cada corrente.

[00276] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado tem um fixador com uma estrutura selecionada entre:

[00277] em que Z2 é H ou CH3; e

[00278] cada m1 é, independentemente, de 0 a 20, em que pelo menos um m1 é maior que 0 para cada corrente.

[00279] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado tem um fixador com uma estrutura selecionada entre:

[00280] em que n é de 1 a 12; e

[00281] em que m é de 1 a 12.

[00282] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado está covalentemente anexado ao oligonucleotídeo modificado.

[00283] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que

[00284] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00285] B é a porção clivável

[00286] C é o ligador do conjugado

[00287] D é o grupo de ramificação

[00288] cada E é uma corrente;

[00289] cada F é um ligante; e

[00290] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00291] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que:

[00292] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00293] B é a porção clivável

[00294] C é o ligador do conjugado

[00295] D é o grupo de ramificação

[00296] cada E é uma corrente;

[00297] cada F é um ligante;

[00298] cada n é, independentemente, 0 ou 1; e

[00299] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00300] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que

[00301] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00302] B é a porção clivável;

[00303] C é o ligador do conjugado;

[00304] cada E é uma corrente;

[00305] cada F é um ligante; e

[00306] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00307] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que

[00308] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00309] C é o ligador do conjugado;

[00310] D é o grupo de ramificação;

[00311] cada E é uma corrente;

[00312] cada F é um ligante; e

[00313] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00314] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que

[00315] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00316] C é o ligador do conjugado;

[00317] cada E é uma corrente;

[00318] cada F é um ligante; e

[00319] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00320] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que

[00321] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00322] B é a porção clivável;

[00323] D é o grupo de ramificação;

[00324] cada E é uma corrente;

[00325] cada F é um ligante; e

[00326] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00327] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que

[00328] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00329] B é a porção clivável;

[00330] cada E é uma corrente;

[00331] cada F é um ligante; e

[00332] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00333] Em determinadas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula: em que

[00334] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00335] D é o grupo de ramificação;

[00336] cada E é uma corrente;

[00337] cada F é um ligante; e

[00338] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00339] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00340] onde cada L é, independentemente, um grupo ligante fósforo ou um grupo ligante neutro; e

[00341] cada n é, independentemente, de 1 a 20.

[00342] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00343] Em determinadas modalidades, o ligador do conjugado tem a seguinte estrutura:

[00344] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00345] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00346] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00347] Em determinadas modalidades, ligador de conjugado com-preende uma pirrolidina. Em determinadas modalidades, o ligador do conjugado não compreende uma pirrolidina.

[00348] Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado compreende um PEG.

[00349] Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado compreende uma amida. Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado compreende pelo menos duas amidas. Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado não compreende uma amida. Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado compreende uma poliamida.

[00350] Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado com-preende uma amina.

[00351] Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado com-preende uma ou mais ligações de bissulfeto.

[00352] Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado com-preende uma porção ligante de proteínas. Em determinadas modalidades, uma porção ligante de proteína compreende um lipídio. Em determinadas modalidades, a porção ligante de proteínas é selecionada dentre: colesterol, ácido cólico, ácido acético de adamantano, ácido 1-pi- reno butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecil, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)lito- cólico , ácido O3-(oleoil) colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina), uma vi-tamina (por exemplo, folato, vitamina A, vitamina E, biotina, piridoxal), um peptídeo, um carboidrato (por exemplo, monossacarídeo, dissacarí- deo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo, polissacarídeo), um componente endossomolítico, um esteroide (por exemplo, uvaol, he- cigenina, diosgenina), um terpeno (por exemplo, triterpeno, por exemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado de epifrie- delanol) ou um lipídio catiônico. Em determinadas modalidades, a porção ligante de proteínas é selecionada entre: um ácido graxo saturado ou insaturado de cadeia longa de C16 a C22, colesterol, ácido cólico, vitamina E, adamantano ou 1-pentafluoropropila.

[00353] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre: em que cada n é, independentemente, de 1 a 20; e p é de 1 a 6.

[00354] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre: em que n é, independentemente, de 1 a 20.

[00355] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00356] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00357] em que n é de 1 a 20.

[00358] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado

[00359] tem uma estrutura selecionada entre:

[00360] Em determinadas modalidades, um ligador do conjugado tem uma estrutura selecionada entre:

[00361] onde cada n é independentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.

[00362] Em determinadas modalidades, o ligador de conjugado tem a seguinte estrutura:

[00363] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem uma das seguintes estruturas:

[00364] em que cada A1 é, independentemente, O, S, C=O ou NH; e

[00365] cada n é, independentemente, de 1 a 20.

[00366] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem uma das seguintes estruturas:

[00367] em que cada A1 é, independentemente, O, S, C=O ou NH; e

[00368] cada n é, independentemente, de 1 a 20.

[00369] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem a seguinte estrutura:

[00370] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem a seguinte estrutura:

[00371] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem a seguinte estrutura:

[00372] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem a seguinte estrutura:

[00373] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende um éter.

[00374] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem a seguinte estrutura:

[00375] cada n é, independentemente, de 1 a 20; e

[00376] m é de 2 a 6.

[00377] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem a seguinte estrutura:

[00378] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação tem a seguinte estrutura:

[00379] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende:

[00380] em que cada j é um número inteiro de 1 a 3; e

[00381] em que cada n é um número inteiro de 1 a 20.

[00382] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende:

[00383] Em determinadas modalidades, cada fixador é selecionado entre: em que L é selecionado a partir de um grupo de ligação de fósforo e um grupo de ligação neutro;

[00384] Z1 é C(=O)O-R2;

[00385] Z2 é H, alquila C1-C6 ou alquila C1-C6 substituída;

[00386] R2 é H, C1- C6 ou alquila substituída C1- C6; e

[00387] cada m1 é, independentemente, de 0 a 20, em que pelo me nos um m1 é maior que 0 para cada corrente.

[00388] Em determinadas modalidades, cada fixador é selecionado entre:

[00389] em que Z2 é H ou CH3; e

[00390] cada m2 é, independentemente, de 0 a 20, em que pelo me nos um m2 é maior que 0 para cada corrente.

[00391] Em determinadas modalidades, cada fixador é selecionado entre:

[00392] em que n é de 1 a 12; e

[00393] em que m é de 1 a 12.

[00394] Em determinadas modalidades, pelo menos um fixador compreende etilenoglicol.

[00395] Em determinadas modalidades, cada fixador compreende uma amida. Em determinadas modalidades, pelo menos um fixador compreende uma poliamida.

[00396] Em determinadas modalidades, cada fixador compreende uma amina.

[00397] Em determinadas modalidades, pelo menos dois fixadores são diferentes um do outro. Em determinadas modalidades, todos os fixadores são os mesmos.

[00398] Em determinadas modalidades, cada fixador é selecionado entre: em que n é, independentemente, de 1 a 20; e

[00399] cada p é de 1 a cerca de 6.

[00400] Em determinadas modalidades, cada fixador é selecionado entre:

[00401] Em determinadas modalidades, cada fixador tem a seguinte estrutura:

[00402] Em determinadas modalidades, cada fixador tem a seguinte estrutura:

[00403] Em determinadas modalidades, o fixador tem uma estrutura selecionada entre: em que cada n é, independentemente, 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7.

[00404] Em determinadas modalidades, o fixador tem uma estrutura selecionada entre:

[00405] Em determinadas modalidades, o ligante é a galactose.

[00406] Em determinadas modalidades, o ligante é manose-6-fosfato.

[00407] Em determinadas modalidades, cada ligante é selecionado entre: em que cada R1 é selecionado de OH e NHCOOH.

[00408] Em determinadas modalidades, cada ligante é selecionado ntre:

[00409] Em determinadas modalidades, cada ligante tem a seguinte estrutura:

[00410] Em determinadas modalidades, cada ligante tem a seguinte estrutura:

[00411] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com- preende uma porção de direcionamento de célula.

[00412] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende uma porção de direcionado de célula com a seguinte estrutura: em que n é, independentemente, de 1 a 20.

[00413] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula tem a seguinte estrutura:

[00414] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula tem a seguinte estrutura: em que n é, independentemente, de 1 a 20.

[00415] Em determinadas modalidades, a porção de direciona- mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00416] Em determinadas modalidades, a porção de direciona- mento de célula compreende:

[00417] Em determinadas modalidades, a porção de direciona- mento de célula compreende:

[00418] Em determinadas modalidades, a porção de direciona- mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00419] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00420] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula compreende:

[00421] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00422] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula compreende:

[00423] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula compreende:

[00424] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula compreende:

[00425] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00426] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00427] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00428] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00429] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula tem a seguinte estrutura:

[00430] Em determinadas modalidades, a porção de mento de célula compreende:

[00431] Em determinadas modalidades, a porção de direciona- mento de célula compreende:

[00432] Em determinadas modalidades, a porção de direciona- mento de célula compreende:

[00433] Em determinadas modalidades, a porção de direciona- mento de célula compreende:

[00434] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula tem a seguinte estrutura:

[00435] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula compreende:

[00436] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula tem a seguinte estrutura:

[00437] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula compreende:

[00438] em que cada Y é selecionado de O, S, uma alquila C1-C10 substituída ou não substituída, amino, amino substituído, azido, alque- nila ou alquinila.

[00439] preende:

[00440] em que cada Y é selecionado de O, S, uma alquila C1-C10 substituída ou não substituída, amino, amino substituído, azido, alquenila ou alquinila.

[00441] Em determinadas modalidades, a porção de direcionamento de célula tem a seguinte estrutura:

[00442] em que cada Y é selecionado de O, S, uma alquila C1-C10 substituída ou não substituída, amino, amino substituído, azido, alque- nila ou alquinila.

[00443] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00444] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00445] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00446] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende:

[00447] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende uma porção clivável selecionada entre: um fosfodiéster, uma amida ou um éster.

[00448] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende uma porção clivável de fosfodiéster.

[00449] Em determinadas modalidades, o grupo do conjugado não compreende uma porção clivável, e em que o grupo do conjugado com-preende uma ligação de fosforotioato entre o grupo do conjugado e o oligonucleotídeo.

[00450] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende uma porção clivável de amida.

[00451] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende uma porção clivável de éster.

[00452] Em determinadas modalidades, um composto tem a seguinte estrutura: NHAc em que n é, independentemente, de 1 a 20;

[00453] Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00454] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00455] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00456] Em determinadas modalidades, um composto tem a se- guinte estrutura:

[00457] em que n é, independentemente, de 1 a 20;

[00458] Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00459] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00460] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00461] Em determinadas modalidades, um composto tem a se- guinte estrutura: em que n é, independentemente, de 1 a 20;

[00462] Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00463] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00464] Z é H ou um suporte sólido ligado; e

[00465] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00466] Em determinadas modalidades, um composto tem a se- guinte estrutura: em que n é, independentemente, de 1 a 20;

[00467] Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00468] A é o oligonucleotídeo modificado;

[00469] Z é H ou um suporte sólido ligado; e

[00470] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00471] Em determinadas modalidades, o composto tem a seguinte estrutura: A em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00472] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00473] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00474] Em determinadas modalidades, um composto tem a seguinte estrutura:

[00475] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00476] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00477] Em determinadas modalidades, um composto tem a seguinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00478] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00479] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00480] Em determinadas modalidades, um composto tem a se- guinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00481] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00482] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00483] Em determinadas modalidades, um composto tem a se- guinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00484] A é o oligonucleotídeo

[00485] em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00486] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00487] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00488] Em determinadas modalidades, um composto tem a seguinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00489] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00490] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00491] Em determinadas modalidades, um composto tem a seguinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00492] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00493] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00494] Em determinadas modalidades, um composto tem a se- guinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00495] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00496] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00497] Em determinadas modalidades, um composto tem a se- guinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00498] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00499] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00500] Em determinadas modalidades, um composto tem a seguinte estrutura: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3; em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00501] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00502] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00503] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00504] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00505] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00506] Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado com-preende: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00507] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00508] Bx é uma porção de base heterocíclica. Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado compreende: em que Q13 é H ou O(CH2)2-OCH3;

[00509] A é o oligonucleotídeo modificado; e

[00510] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00511] Em determinadas modalidades, Bx é selecionado entre ade- nina, guanina, timina, uracila ou citosina, ou 5-metil-citosina. Em certas modalidades, Bx é adenina. Em certas modalidades, Bx é timina. Em determinadas modalidades, Q13 é O(CH2)2- OCH3. Em determinadas modalidades, Q13 é H.

[00512] Certas modalidades da invenção fornecem um profármaco que compreende composições ou compostos divulgados aqui.

[00513] Em certas modalidades, o composto está em uma forma de sal. Em modalidades adicionais, o composto adicionalmente compreen- de um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em certas mo-dalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado, ou um sal do mesmo, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[00514] Determinadas modalidades fornecem composições e métodos que compreendem a administração a um animal de um composto antissenso conjugado ou composição divulgada aqui. Em determinadas modalidades, a administração do composto antissenso conjugado pre-vine, trata, melhora ou retarda a progressão de uma doença cardiovas-cular, metabólica e/ou inflamatória.

[00515] Certas modalidades fornecem composições e métodos para uso na terapia para tratar uma doença, distúrbio ou condição relacionada a ApoCIII. Em determinadas modalidades, os níveis de ApoCIII são elevados em um animal. Em certas modalidades, a composição é um composto que compreende um inibidor específico de ApoCIII. Em certas modalidades, o inibidor específico de ApoCIII é um ácido nu- cleico. Em certas modalidades, o ácido nucleico é um composto antis- senso. Em certas modalidades, o composto antissenso é um oligonu- cleotídeo modificado que direciona ApoCIII. Em determinadas modalidades, o composto antissenso é um oligonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII e um grupo conjugado. Em certas modalidades, o oli- gonucleotídeo modificado que direciona ApoCIII com o grupo de conju-gadoé usado no tratamento, prevenção, retardo da progressão, melhora de uma doença, distúrbio ou condição inflamatória, cardiovascular e/ou metabólica. Em certas modalidades, as composições e os métodos para a terapia incluem a administração de um inibidor específico de Apo- CIII a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00516] Certas modalidades fornecem compostos antissenso conjugados e composições e métodos para reduzir níveis de ApoCIII. Em de-terminadas modalidades, os níveis de ApoCIII são reduzidos no fígado, tecido adiposo, coração, músculo esquelético ou intestino delgado.

[00517] Em determinadas modalidades, a redução dos níveis de ApoCIII em um tecido, órgão ou indivíduo aumenta os níveis de HDL. Em determinadas modalidades, os níveis de HDL aumentaram em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, pelo menos 15%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% do nível de HDL de referência.

[00518] Em determinadas modalidades, a redução dos níveis de ApoCIII em um tecido, órgão ou indivíduo reduz os níveis de TG. Em determinadas modalidades, o indivíduo tem um nível de triglicerídeo > 100 mg/dL, > 200 mg/dL, > 300 mg/dL, > 400 mg/dL, > 440 mg/dL, > 500 mg/dL, > 600 mg/dL, > 700 mg/dL, > 800 mg/dL, > 880 mg/dL, > 900 mg/dL, > 1000 mg/dL, > 1100 mg/dL , > 1200 mg/dL, > 1300 mg/dL, > 1400 mg/dL, > 1500 mg/dL, > 1600 mg/dL, > 1700 mg/dL, > 1800 mg/dL, > 1900 mg/dL, > 2000 mg/dL.

[00519] Em determinadas modalidades, os níveis de TG (pós-pran- dial ou jejum) diminuem em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, pelo menos 15%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% do nível de TG de referência. Em determinadas modalidades, o nível de TG (pós-prandial ou jejum) diminuiu para <1900mg/dL, <1800mg/dL, <1700mg/dL, <1600mg/dL, <1500mg/dL, <1400mg/dL, <1300mg/dL, <1200mg/dL, <1100mg/dL, <1000mg/dL, <900mg/dL, <800mg/dL, <750mg/dL, <700mg/dL, <650mg/dL, <600mg/dL, <550mg/dL, <500mg/dL, <450mg/dL, <400mg/dL, <350mg/dL, <300mg/dL, <250mg/dL, <200mg/dL, <150mg/dL ou <100mg/dL.

[00520] Em certas modalidades, reduzir níveis de ApoCIII em um tecido, órgão ou indivíduo melhora a razão entre LDL e HDL ou a razão entre TG e HDL.

[00521] Em determinadas modalidades, a redução dos níveis de ApoCIII em um tecido, órgão ou indivíduo melhora a sensibilidade à insulina.

[00522] Em determinadas modalidades, a redução dos níveis de ApoCIII em um tecido, órgão ou indivíduo aumenta a depuração de qui- lomícron.

[00523] Determinadas modalidades fornecem composições e méto dos para reduzir o mRNA da ApoCIII ou a expressão da proteína em um animal compreendendo a administração ao animal de um um composto antissenso conjugado ou composição divulgada aqui para reduzir mRNA da ApoCIII ou expressão da proteína no animal.

[00524] Certas modalidades fornecem compostos antissenso conjugados e composições e métodos para prevenir, tratar, retardar, reduzir a progressão e/ou melhorar doenças, distúrbios, e condições relaciona-dasà ApoCIII em um indivíduo em necessidade dos mesmos. Em certas modalidades, tais doenças, distúrbios, e condições incluem doenças, distúrbios, e condições inflamatórias, cardiovasculares e/ou metabólicas. Algumas dessas doenças, distúrbios ou condições cardiovasculares incluem, mas não estão limitadas a, quilomicronemia, hipertrigliceri- demia, esteanose aórtica, aneurisma (por exemplo, aneurisma da aorta abdominal), angina, arritmia, aterosclerose, doença cerebrovascular, doença arterial coronariana, doença cardíaca coronariana, dislipidemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, hipertensão, infarto do miocárdio, doença vascular periférica (por exemplo, doença arterial periférica, do-ença oclusiva arterial periférica), dislipidemia tipo I, FCS, deficiência de LPL, oclusão vascular retinal ou derrame. Algumas dessas doenças, distúrbios ou condições metabólicas incluem, mas não estão limitadas a, hiperglicemia, pré-diabetes, diabetes (tipo I e tipo II), obesidade, re-sistência à insulina, síndrome metabólica e dislipidemia diabética. Certas doenças, distúrbios ou condições inflamatórias incluem, mas não estão limitadas a, pancreatite, estenose aórtica, doença arterial corona- riana (CAD), mal de Alzheimer e doenças, distúrbios ou condições trom- boembólicas. Certas doenças, distúrbios ou condições tromboembóli- cas incluem, mas não estão limitadas a, derrame, trombose, (por exem-plo, tromboembolismo venoso), infarto do miocárdio e doença vascular periférica. Certas modalidades fornecem compostos antissenso conju-gados e composições e métodos para prevenir, tratar, retardar, reduzir a progressão e/ou melhorar a hipertrigliceridemia. Certas modalidades fornecem compostos antissenso conjugados e composições e métodos para prevenir, tratar, retardar, reduzir a progressão e/ou melhorar a qui- lomicronemia. Certas modalidades fornecem compostos antissenso conjugados e composições e métodos para prevenir, tratar, retardar, re-duzir a progressão e/ou melhorar a pancreatite.

[00525] Certas modalidades fornecem um método de redução de pelo menos um sintoma de uma doença, distúrbio ou condição cardiovascular. Em certas modalidades, os sintomas incluem, mas não estão limitados a, angina, dor no peito, falta de fôlego, palpitações, fraqueza, tonturas, náuseas, sudorese, taquicardia, bradicardia, arritmia, fibrilação atrial, inchaço nas extremidades inferiores, cianose, cansaço, desmaio, dormência da face, dormência dos membros, claudicação ou cólicas dos músculos, inchaço do abdômen, e febre. Em determinadas modalidades, os sintomas de uma doença, distúrbio ou condição incluem, mas não estão limitados a, micção frequente, sede incomum, fome extrema, perda de peso incomum, fadiga extrema, irritabilidade, infecções fre-quentes,visão turva, cortes/feridas que demoram a sarar, formiga- mento/dormência nas mãos/pés e infecções de pele, gengiva ou bexiga recorrentes. Determinadas modalidades fornecem um método para re-duzir pelo menos um sintoma de hipertrigliceridemia. Determinadas mo-dalidades fornecem um método de redução de pelo menos um sintoma de quilomicronemia. Determinadas modalidades fornecem um método para reduzir pelo menos um sintoma da pancreatite.

[00526] Em certas modalidades, a modulação da expressão de Apo- CIII ocorre em uma célula, tecido ou órgão. Em certas modalidades, as modulações ocorrem em uma célula, tecido ou órgão em um animal. Em certas modalidades, a modulação é uma redução no nível de mRNA de ApoCIII. Em certas modalidades, a modulação é uma redução no nível de proteína ApoCIII. Em certas modalidades, ambos os níveis do mRNA e da proteína de ApoCIII são reduzidos. Essa redução pode ocorrer em uma forma dependente do tempo e em uma forma dependente da dose.

[00527] Em certas modalidades, o indivíduo ou animal é um ser humano.

[00528] Em certas modalidades, o composto é administrado paren- teralmente. Em modalidades adicionais, a administração parenteral é subcutânea.

[00529] Em certas modalidades, o composto antissenso conjugado ou composição é coadministrada com um segundo agente ou terapia. Em determinadas modalidades, o composto antissenso conjugado ou composição e o segundo agente são administrados concomitantemente.

[00530] Em certas modalidades, o segundo agente é um agente redutor de glicose. Em certas modalidades, o segundo agente é um agente redutor de LDL, TG ou colesterol. Em certas modalidades, o segundo agente é um agente anti-inflamatório. Em certas modalidades, o segundo agente é um fármaco de doença de Alzheimer. Em certas modalidades, o segundo agente pode estar, mas não está limitado a, um fármaco anti-inflamatório não esteroidal (NSAID, por exemplo, aspirina), niacina (por exemplo, Niaspan), ácido nicotínico, um inibidor de apoB (por exemplo, Mipomersen), um inibidor de CETP (por exemplo, Anace- trapib), um inibidor de apo (a), um análogo de hormônio da tiroide (por exemplo, Eprotirome), um inibidor de HMG-CoA redutase (por exemplo, uma estatina), um fibrato (por exemplo, Gemfibrozil) e um inibidor de proteína de transferência de triglicerídeo microsomal (por exemplo, Lo- mitapide). As terapias ou agentes podem ser coadministrados ou admi-nistrados concomitantemente. Agentes ou terapias podem ser adminis-trados sequencialmente ou subsequentemente.

[00531] Determinadas modalidades fornecem o uso das composições e compostos antissenso conjugados descritos aqui direcionados a ApoCIII para diminuir os níveis de ApoCIII em um animal. Certas modalidades fornecem o uso de um composto direcionado à ApoCIII para di-minuirníveis de ApoCIII em um animal. Certas modalidades fornecem o uso de um composto direcionado à ApoCIII para aumentar os níveis de HDL em um animal. Determinadas modalidades fornecem o uso de um composto direcionado à ApoCIII para o aumento da depuração de qui- lomícron de HDL em um animal. Certas modalidades fornecem o uso de um composto direcionado à ApoCIII para tratamento, prevenção, ou me-lhora de uma doença, distúrbio, ou condição associada à ApoCIII. De-terminadas modalidades fornecem o uso de um composto direcionado à ApoCIII para o tratamento, prevenção ou melhoria de hipertrigliceride- mia. Determinadas modalidades fornecem o uso de um composto dire-cionadoà ApoCIII para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma quilomicronemia (por exemplo, FCS e/ou LPLD). Determinadas modali-dades fornecem o uso de um composto direcionado à ApoCIII para o tratamento, prevenção ou melhoria de pancreatite.

[00532] Determinadas modalidades fornecem o uso das composições e compostos antissenso conjugados descritos aqui direcionados a ApoCIII no preparo de um medicamento para diminuir os níveis de Apo- CIII em um animal. Certas modalidades fornecem o uso de composições e compostos para a preparação de um medicamento para tratamento, prevenção ou melhora de uma doença, distúrbio, ou condição associada à ApoCIII.

[00533] Determinadas modalidades fornecem o uso de composições e compostos antissenso conjugados conforme descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento, melhora, retardo ou prevenção de uma ou mais doenças relacionadas à ApoCIII.

[00534] Certas modalidades fornecem um kit para tratar, prevenir, ou melhorar uma doença, distúrbio ou condição conforme descrito aqui em que o kit compreende: (i) um inibidor específico de ApoCIII como descrito aqui; e opcionalmente (ii) um segundo agente ou terapia como descrito aqui.

[00535] Um kit da presente invenção pode adicionalmente incluir ins-truções para usar o kit para tratar, prevenir, ou melhorar uma doença, distúrbio ou condição conforme descrito aqui pela terapia de combinação conforme descrito aqui.

Determinados Compostos

[00536] Em determinadas modalidades, a invenção fornece compostos antissenso conjugados que compreendem oligonucleotídeos an- tissenso e um conjugado.

Determinados oligonucleotídeos Antissenso

[00537] Em determinadas modalidades, a invenção fornece oligonu- cleotídeos antissenso. Esses oligonucleotídeos antissenso compreen-dem nucleosídeos ligados, sendo que cada nucleosídeo compreende uma porção de açúcar e uma nucleobase. A estrutura desses oligonu- cleotídeos antissenso pode ser considerada, em termos de característi-cas químicas, (por exemplo, modificações e padrões de modificações) e sequência de nucleobase (por exemplo, sequência de oligonucleotí- deo antissenso, identidade e sequência do ácido nucleico alvo).

Determinadas Características de Química

[00538] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antis- senso compreende uma ou mais modificações. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos antissenso compreendem um ou mais nucleosídeos modificados e/ou ligações de internucleosídeo modificado. Em determinadas modalidades, os nucleosídeos modificados compreendem uma porção de açúcar modificada e/ou uma nucleobase modificada.

Determinadas Frações de Açúcar

[00539] Em determinadas modalidades, os compostos da divulgação compreendem um ou mais nucleosídeos modificados que consistem em uma porção de açúcar modificado. Esses compostos que compreendem um ou mais nucleosídeos modificados de açúcar podem ter propriedades desejáveis, como melhor estabilidade da nuclease ou aumento da afinidade da ligação com um ácido nucleico alvo em relação a um oligonucleotídeo que consiste apenas em nucleosídeos compostos por frações de açúcar de ocorrência natural. Em determinadas modalidades, as frações de açúcar modificadas são frações de açúcar substituídas. Em determinadas modalidades, frações de açúcar modificadas são substitutos do açúcar. Esses substitutos do açúcar podem compreender uma ou mais substituições que correspondem às frações de açúcar substituídas.

[00540] Em determinadas modalidades, as frações de açúcar modi-ficadas são frações de açúcar substituídas que compreendem um ou mais substituintes de açúcar sem ponte incluindo, entre outros, substi- tuintes nas posições 2' e/ou 5'. Os exemplos de substituintes de açúcar apropriados para a posição 2' incluem, entre outros: 2’-F, 2'-OCH3 ("OMe" ou "O-metil"), e 2'-O(CH2)2OCH3("MOE"). Em determinadas modalidades, os substituintes do açúcar na posição 2' são selecionados de alila, amino, azida, tio, O-alila, alquila O-C1-C10, alquila substituída O- C1-C10; OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e O-CH2-C(=O)- N(Rm)(Rn), onde Rm e Rn são, independentemente, H ou alquila C1-C10substituída ou não substituída. Os exemplos de substituintes de açúcar na posição 5' incluem, entre outros: 5'-metila (R ou S); 5'-vinila e 5'-metóxi. Em determinadas modalidades, os açúcares substituídos compreendem mais de um substituinte de açúcar sem ponte, por exem-plo,frações de açúcar 2'-F-5'-metila (ver, por exemplo, pedido Interna-cional PCT WO 2008/101157, para frações de açúcar substituídas por 5' adicional, 2'bls).

[00541] Os nucleosídeos que compreendem frações de açúcar substituídas em 2'são denominados nucleosídeos substituídos em 2'. Em determinadas modalidades, um nucleosídeo substituído em 2'compreende um grupo substituinte em 2' selecionado a partir de halo, alila, amina, azida, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S, ou N(Rm)-alquila; O, S, ou N(Rm)-alquenila; O, S ou N(Rm)-alquinila; O-alquilenil-O-alquila, al- quinila, alcarila, aralquila, O-alcarila, O-aralquila, O(CH2)2SCH3, O- (CH2)2-O-N(Rm)(Rn) ou O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), onde cRm e Rn são, in-dependentemente, H, um grupo de proteção amina alquila C1-C10 subs-tituída ou não substituída. Estes grupos substituintes em 2' podem ser substituídos ainda por um ou mais grupos substituintes independente-mente selecionados a partir da hidroxila, amina, alcóxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro (NO2), tiol, tioalcóxi (S-alquila), halogênio, alquila, arila, al- quenila e alquinila.

[00542] Em determinadas modalidades, um nucleosídeo substituído em 2' compreende um grupo substituinte em 2' selecionado a partir de F, NH2, N3, OCF3, O-CH3, O(CH2)3NH2, CH2-CH=CH2, O-CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O(CH2)2° (CH2)2 N(CH3)2, e acetamida substituída em N (O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) onde Rm e Rn são, de forma independente, H, um grupo de proteção amina ou alquila C1-C10 substituída ou não substituída.

[00543] Em determinadas modalidades, um nucleosídeo substituído em 2' compreende uma porção de açúcar que consiste em um grupo substituinte em 2' selecionado a partir de F, OCF3, O-CH3, OCH2CH2 OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(CH3)2, -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, e O-CH2-C(=O)-N(H)CH3

[00544] Em determinadas modalidades, um nucleosídeo substituído em 2' compreende uma porção de açúcar que consiste em um grupo substituinte em 2' selecionado a partir de F, O-CH3, e OCH2CH2OCH3.

[00545] Certas frações de açúcar modificadas compreendem um substituinte de açúcar de ponte que forma um segundo anel resultando em uma porção de açúcar bicíclica. Em algumas dessas modalidades, a porção de açúcar bicíclica compreende uma ponte entre os átomos do anel de furanose em 4' e 2'. Exemplos desses substituintes de açúcar em 4' a 2' incluem, entre outros: - [C(Ra)(Rb)]n-, - [C(Ra)(Rb)]n-O-, - C(RaRb)-N(R)-O- ou, -C(RaRb)-O-N(R)-; 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'- (CH2)3-2',. 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'- CH(CH3)-O-2' (cEt) e 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', e análogos dos mesmos (ver, por exemplo, Patente U.S. 7.399.845, emitida em 15 de julho de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' e análogos dos mesmos, (ver, por exemplo, WO2009/006478, publicado em 8 de janeiro de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)- 2' e análogos dos mesmos (ver, por exemplo, WO2008/150729, publicado em 11 de dezembro de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver, por exemplo, US2004/0171570, publicado em 2 de setembro de 2004 ); 4'-CH2- O-N(R)-2', e 4'-CH2-N(R)-O-2'-, em que cada Ré, independentemente, H, um grupo protetor, ou alquila C1-C12; 4'-CH2-N(R)-O-2', em que R é H, alquila C1-C12, ou um grupo protetor (ver, Patente U.S. 7.427.672, emitida em 23 de setembro de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver, por exemplo, Chattopadhyaya, et al., J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134); e 4'-CH2-C(=CH2)-2', e seus análogos (ver, Pedido Internacional PCT pu-blicado WO 2008/154401, publicado em 8 de dezembro de 2008).

[00546] Em determinadas modalidades, essas pontes 4' a 2'com-preendem independentemente de 1 para 4 grupos ligados independen-temente selecionados a partir de - [C (Ra) (Rb)]n-, - c (Ra) = C(Rb)-, - c (Ra) = N, -C(=NRa), C(=O)-, - C(=S), - O-, -Si (Ra)2-,-S(=O)x-, e -N(Ra)-;

[00547] em que:

[00548] x é 0, 1 ou 2;

[00549] n é 1, 2, 3 ou 4;

[00550] cada Ra e Rb é, independentemente, H, um grupo protetor, hidroxila, alquila C1-C12, alquila C1-C12 substituída, alquenila C2-C12, al- quenila C2-C12 substituída, alquinila C2-C12, alquinila C2-C12 substituída, arila C5-C20, arila C5-C20 substituída, radical heterociclo, radical hetero- ciclo substituído, heteroarila, heteroarila substituída, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 substituído, halogênio, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acila (C(=O)-H), acila substituída, CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ou sulfoxil (S(=O)-J1); e

[00551] cada J1 e J2 é, independentemente, H, alquila C1-C12, al-quilasubstituída C1-C12, alquenila C2-C12, alquenila substituída C2-C12, alquinila C2-C12, alquinila substituída C2-C12, arila C5-C20, arila substitu-ída C5-C20, acila (C(=O)-H), acila substituída, um radical heterocíclico, um radical heterocíclico substituído, aminoalquila C1-C12, aminoalquila substituído C1-C12, ou um grupo de proteção.

[00552] Os nucleosídeos que compreendem frações de açúcar bicí- clicas são chamados nucleosídeos bicíclicos ou BNAs. Nucleosídeos bi- cíclicos incluem, entre outros, (A) a-L-metilenóxi (4'-CH2-O-2‘) BNA, (B) β-D-Metilen0xi (4'-CH2-O-2‘) BNA (também denominado ácido nucleico bloqueado ou LNA), (C) Etilenóxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) Amino-óxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) Oxiamina (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) Me- til(metilenóxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA (também denominado etila restrita ou cEt), (G) metileno-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metileno-amina (4'-CH2- N(R)-2') BNA, (I) metil carboxílico (4'-CH2-CH (CH3)-2') BNA e (J) propi- leno carboxílico (4'-(CH2)3-2 ') BNA como descrito abaixo.

[00553]onde Bx é uma porção de nucleobase e R é, independentemente, H, um grupo de proteção ou alquila C1-C12.

[00554] As frações de açúcar bicíclicas adicionais são conhecidos na técnica, por exemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bio- org. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (4 de julho de 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patente U.S. Nos U.S. 6.670.461, 7.053.207, 6.268.490, 6.770.748, 6.794.499, 7.034.133, 6.525.191, 7.399.845; Pedidos Internacionais PCT publicados WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570, e WO 2007/134181; Publicação de Patente U.S. Nos. US2004/0171570, US2007/0287831, e US2008/0039618; e Patente U.S. Nos. de Série 12/129.154, 60/989.574, 61/026.995, 61/026.998, 61/056.564, 61/086.231, 61/ 097.787, e 61/099.844; e Pedidos Internacionais PCT Nos. PCT/ US2008/ z064591, PCT/US2008/066154, e PCT/US2008/ 068922.

[00555] Em determinadas modalidades, as frações de açúcar bicícli- cas e os nucleosídeos que incorporam essas frações de açúcar bicícli- cas são definidas ainda pela configuração isomérica. Por exemplo, um nucleosídeo compreendendo uma ponte de 4’-2’ metileno-oxi, pode estar na configuração α-L ou na configuração β-D. Anteriormente, nucleo- sídeos bicíclicos de a-L-metileno-óxi (4'-CH2-O-2‘) foram incorporados aos oligonucleotídeos antissenso que mostraram atividade antissenso (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

[00556] Em determinadas modalidades, as frações de açúcar substi-tuídas compreendem um ou mais substituintes de açúcar sem ponte e um ou mais substituinte de açúcar com ponte (por exemplo, açúcares com ponte substituídos em 5' ou em 4'-2'). (ver, Pedido Internacional PCT WO 2007/134181, publicado em 22/11/07, em que LNA é substituído, por exemplo, por um grupo 5'-metila ou 5'-vinila).

[00557] Em determinadas modalidades, frações de açúcar modificadas são substitutos do açúcar. Em algumas dessas modalidades, o átomo de oxigênio do açúcar de ocorrência natural é substituído, por exemplo, por um átomo átomo de enxofre, carbono ou nitrogênio. Em algumas dessas modalidades, essa porção de açúcar modificada também compreende substituintes com e/ou sem ponte conforme descrito acima. Por exemplo, alguns substitutos do açúcar compreendem um átomo 4'-enxofre e uma substituição na posição 2' (ver, por exemplo, Pedido de Patente US N° 2005/0130923, publicado em 16 de junho de 2005) e/ou na posição 5'. A título de exemplo adicional, os nucleosídeos bicíclicos carboxílicos com uma ponte 4'-2' foram descritos (ver, por exemplo, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 e Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740).

[00558] Em determinadas modalidades, os substitutos de açúcar compreendem anéis com mais de 5 átomos. Por exemplo, em determi-nadas modalidades, um substituto do açúcar compreende um morfolino. Os compostos de morfolino e seu uso em compostos oligoméricos foram mencionados em várias patentes e artigos publicados (ver, por exemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; e Patentes US N° 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; e 5.034.506). Como usado aqui, o termo "morfolino" se refere a um substituto de açúcar com a seguinte estrutura:

[00559] Em determinadas modalidades, os morfolinos podem ser modificados, por exemplo, pelo acréscimo ou alteração de vários grupos substituintes da estrutura do morfolino acima. Esses substitutos do açú-carsão mencionados aqui como "morfolinos modificados"

[00560] Em outro exemplo, em determinadas modalidades, um substituto do açúcar compreende um tetra-hidropirano de seis membros. Esses tetra-hidropiranos podem ser ainda modificados ou substituídos. Os nucleosídeos que compreendem esses tetra-hidropiranos modificados incluem, entre outros, hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), flúor HNA (F-HNA), ou aqueles compostos com a Fórmula VI:

[00561] em que independentemente para cada um do referido pelo menos um análogo de nucleosídeo de tetra-hidropirano de Fórmula VI:

[00562] Bx é uma porção de nucleobase;

[00563] T3 e T4 são cada um, independentemente, um grupo de ligação internucleosídica que liga o análogo de nucleosídeo de tetra-hhidropi- rano ao composto antissenso ou um de T3 e T4 é um grupo de ligação internucleosídica que liga o análogo de nucleosídeo de tetra-hidropirano ao composto antissenso e o outro de T3 e T4 é H, um grupo protetor de hidroxila, um grupo de conjugado ligado, ou um grupo terminal 5' ou 3';

[00564] q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 são cada um, independentemente, H, alquila C1-C6, alquila substituída C1-C6, alquenila C2-C6, alquenila substituída C2-C6, alquinila C2-C6, ou alquinila substituída C2-C6; e

[00565] R1 e R2 é independentemente selecionado dentre: hidrogê-nio,halogênio, alcóxi substituído ou não substituído, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2, e CN, em que X é O, S, ou NJ1, e cada J1, J2, e J3 é, independentemente, H ou alquila C1-C6.

[00566] Em determinadas modalidades, os nucleosídeos THP modi-ficados da Fórmula VI são fornecidos, em que q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 são, cada um, H. Em determinadas modalidades, pelo menos um de q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 é diferente de H. Em determinadas modalidade, pelo menos um de q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 é metila. Em determinadas modalidades, os nucleosídeos THP da Fórmula VI são fornecidos, em que um de R1 e R2 é F. Em determinadas modalidades, R1 é fluoro e R2 é H, R1 é metóxi e R2 é H, e R1 é metoxietóxi e R2 é H.

[00567] Muitos outros sistemas de anel de substituto de açúcar bici- clo e triciclo também são conhecidos na técnica e podem ser usados para modificar nucleosídeos para a incorporação nos compostos antis- senso (ver, por exemplo, artigo de revisão: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).

[00568] As combinações das modificações também são fornecidas, sem limitação, como nucleosídeos 2'-F-5'-metila substituídos (vide, Pedido Internacional PCT WO 2008/101157, publicado em 21/08/08 para outros nucleosídeos 5',2'-bis substituídos divulgados) e substituição do átomo de oxigênio do anel ribosil por S e outra substituição adicional na posição 2' (vide, Pedido de Patente U.S. publicado US2005- 0130923, publicado em 16 de junho de 2005), ou alternativamente, substituição 5' de um ácido nucleico bicíclico (vide, Pedido Internacional PCT WO 2007/134181, publicado em 22/11/07, em que o nucleosideo bicíclico 4'-CH2-O-2'é ainda substituído na posição 5' por um grupo 5'- metila ou 5'-vinila). A síntese e preparação de nucleosídeos bicíclicos carbocíclicos juntamente com seus estudos bioquímicos e de oligome- rização também foram descritos (ver, por exemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).

[00569] Em determinadas modalidades, a presente divulgação for-neceoligonucleotídeos que compreendem nucleosídeos modificados. Os nucleotídeos modificados podem incluir açúcares modificados, nu- cleobases modificadas, e/ou ligações modificadas. As modificações es-pecíficas são selecionadas de modo que os oligonucleotídeos resultantes possuam características desejáveis. Em certas modalidades, os oli- gonucleotídeos compreendem um ou mais nucleosídeos similares ao RNA. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem um ou mais nucleotídeos similares ao DNA.

Determinadas Modificações da Nucleobase

[00570] Em determinadas modalidades, os nucleosídeos da presente divulgação compreendem uma ou mais nucleobases não modificadas. Em determinadas modalidades, os nucleosídeos da presente divulgação compreendem uma ou mais nucleobases modificadas.

[00571] Em determinadas modalidades, as nucleobases modificadas são selecionados a partir de: bases universais, bases hidrofóbicas, bases promíscuas, bases expansoras de tamanho e bases fluoradas definidas aqui. 5-pirimidinas substituídas, 6-azapirimidinas e purinas substituídas em N-2, N-6 e O-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-pro- piniluracila; 5-propinilcitosina; 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxan- tina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados da alquila da adenina ou da guanina, 2-propila e outros derivados de alquila da adenina e da guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinila (-C=C-CH3) uracila e citosina e outros derivados de alquinil das bases pirimidínicas, 6-azo-uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseu- douracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amina, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo especialmente 5- bromo, 5-trifluormetila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-me- tilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-aza-gua- nina e 8-aza-adenina, 7-deaza-guanina e 7-deaza-adenina, 3-deasa- guanina e 3-deaza-adenina, bases universais, bases hidrofóbicas, bases promíscuas, bases expansoras de tamanho e bases fluoradas definidas aqui. Mais nucleobases modificadas incluem pirimidinas tricíclicas como fenoxazina citidina ( [5,4-b] [1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotia- zina citidina (1H-pirimido [5,4-b] [1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), G-grampos como fenoxazina citidina substituída (por exemplo, 9-(2-aminoetóxi)-H- pirimido [5,4-b] [1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-piri- mido [4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido [3',2':4,5]pirrolo [2,3- d]pirimidin-2-ona). As nucleobases modificadas também podem incluir aquelas em que a base purina ou pirimidina é substituída por outros heterocíclicos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2- aminopiridina e 2-piridona. As nucleobases incluem ainda aquelas divul-gadasna Patente Estados Unidos N° 3.687.808, aquelas divulgadas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,Kros- chwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; aquelas divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613; e aquelas divulgadas por Sanghvi, Y.S., Capítulo 15, Antisense Re-search and Applications, Crooke, S.T. e Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288.

[00572] Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de determinadas nucleobases modificadas mencionadas acima, bem como outras nucleobases modificadas incluem, sem limita-ção, US 3.687.808; 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.681.941; 5.750.692; 5.763.588; 5.830.653 e 6.005.096, sendo que algumas delas são comumente pertencentes ao pedido imediato, e cada uma delas é incorporada a este instrumento por referência na sua totalidade.

Determinadas Ligações do Internucleosídeo

[00573] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece oligonucleotídeos que compreendem nucleosídeos ligados. Nessas modalidades, os nucleosídeos podem estar ligados usando qualquer ligação do internucleosídeo. As duas classes principais dos grupos de ligação do internucleosideo são definidas pela presença ou ausência de um átomo de fósforo. Ligações de internucleosídeos representativas contendo fósforo incluem, mas não estão limitadas a, fosfodiésteres (PO), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato, e fosforotioatos. Grupos de ligação de internculeosídeo representativos contendo não fósforo incluem, entre outros, metilenometilimina (-CH2-N (CH3) - O - CH2-), tiodiéster (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2-O-); e N,N'-dimetil-hidrazina (-CH2-N(CH3) - N(CH3)-). Ligações modificadas, em comparação com as ligações na-turais de fosfodiéster, podem ser usadas para alterar, normalmente au-mentar, a resistência de nuclease do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, as ligações de internucleosídeo com um átomo quiral podem ser preparadas como uma mistura racêmica ou como enantiô- meros separados. As ligações quirais representativas incluem, entre outros, alquilfosfonatos e fosforotioatos. Os métodos de preparação das ligações de internucleosídeo contendo fósforo e não fósforo são bem conhecidas pelos versados na técnica.

[00574] Os oligonucleotídeos descritos aqui contêm um ou mais cen-trosassimétricos e, assim, dão origem a enantiômeros, diastereômeros e outras configurações estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R) ou (S) ou como anômeros de açúcar, ou como (D) ou (L) como aminoácidos, etc. Todos os isôme- ros possíveis, bem como suas formas racêmicas e opticamente puras estão incluídos nos compostos antissenso.

[00575] As ligação de internucleosídeos neutros incluem, entre ou-tros,fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), 3- amida (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), 4-amida (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5') e tioformacetal (3'-S-CH2-O-5'). Outras ligações de internucleosídeo neutro incluem ligações não iônicas, compreendendo siloxano (dialquilsiloxano), éster carboxilato, carboxamidas, sulfeto, éster sulfonato e amidas (ver, por exemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi e P.D. Cook, Eds., ACS Symposium Série 580; Capítulos 3 e 4, 40-65). Outras ligações de internucleosídeo neutro incluem ligações não iônicas, compreendendo partes do compo-nente N, O, S e CH2 misturadas.

Determinados Motivos

[00576] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos antis- senso compreendem um ou mais nucleosídeo modificado (por exemplo, nucleosídeo que consiste em açúcar modificado e/ou nucleobase modi-ficada) e/ou uma ou mais ligações de internucleosídeo modificado. O padrão dessas modificações em um oligonucleotídeo é referido aqui como um motivo. Em determinadas modalidades, os motivos de açúcar, nucleobase e ligação são independentes uns dos outros.

Determinados motivos de açúcar

[00577] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos com-preendem um ou mais tipos de frações de açúcar modificadas e/ou fra-ções de açúcar de ocorrência natural dispostas ao longo do oligonucle- otídeo ou da sua região em um padrão definido ou motivo de modificação do açúcar. Esses motivos podem incluir qualquer uma das modificações de açúcar discutidas aqui e/ou outras modificações de açúcar conhecidas.

[00578] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos com-preendem ou consistem em uma região que tem um motivo de açúcar de gapmer, que compreende duas regiões externas ou "asas" e uma região central ou interna ou "lacuna". As três regiões de um motivo de açúcar de gapmer (5'-asa, lacuna e 3'-asa) formam uma sequência contígua de nucleosídeos em que pelo menos algumas frações de açúcar dos nucleosídeos de cada uma das asas diferem de pelo menos algu-masfrações de açúcar dos nucleosídeos da lacuna. Especificamente, pelo menos as frações de açúcar dos nucleosídeos de cada asa que estão mais próximas da lacuna (o nucleosídeo mais próximo de 3' de 5'- asa e o nucleosídeo mais próximo de 5' de 3'-asa) diferem da porção de açúcar dos nucleosídeos da lacuna vizinha definindo, assim, o limite en-tre as asas e a lacuna. Em determinadas modalidades, as frações de açúcar dentro da lacuna são as mesmas. Em determinadas modalidades, a lacuna inclui um ou mais nucleosídeos com uma porção de açúcar que difere da porção de açúcar de um ou mais nucleosídeos da lacuna. Em determinadas modalidades, os motivos de açúcar das duas asas são os mesmos da outra (gapmer de açúcar simétrico). Em determinadas modalidades, os motivos de açúcar de 5'-asa difere do motivo de açúcar de 3'-asa (gapmer de açúcar assimétrico).

Determinadas 5'-asas

[00579] Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 1 a 8 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'- asa de um gapmer consiste em 1 a 7 nucleosídeos ligados. Em deter-minadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 1 a 6 nucleo- sídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 1 a 5 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 2 a 5 nucleosídeos ligados. Em de-terminadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 3 a 5 nu- cleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um ga- pmer consiste em 4 ou 5 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 1 a 4 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 1 a 3 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um ga- pmer consiste em 1 ou 2 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 2 a 4 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 2 ou 3 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 3 ou 4 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 1 nucleosídeo ligado. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 2 nucleo- sídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 3 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 5'- asa de um gapmer consiste em 4 nucleosídeos ligados. Em determina-das modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 5 nucleosídeos li-gados. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em 6 nucleosídeos ligados.

[00580] Em determinadas modalidades, 5-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos dois nucleosí- deos bicíclicos. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos três nucleosídeos bicíclicos. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos quatro nucleosídeos bicíclicos. Em determinadas modalidades, 5-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita. Em determinadas modalidades, 5-asa de um gapmer compreende pelo me-nos um nucleosídeo LNA. Em determinadas modalidades, cada nucleo- sídeo de 5'-asa de um gapmer é um nucleosídeo bicíclico. Em determi-nadas modalidades, 5'-asa de um gapmer consiste em um nucleosídeo de etila restrita. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 5'- asa de um gapmer é um nucleosídeo LNA.

[00581] Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo modificado não bicíclico. Em de-terminadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo me-nos um nucleosídeo 2'-OMe. Em determinadas modalidades, cada nu- cleosídeo de 5'-asa de um gapmer é um nucleosídeo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 5'-asa de um gapmer é um nucleosídeo 2'-substituído. Em determinadas modali-dades, cada nucleosídeo de 5'-asa de um gapmer é um nucleosídeo 2'- MOE. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 5'-asa de um gapmer é um nucleosídeo 2'-OMe.

[00582] Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um 2-desoxinucleosídeo. Em determinadas moda-lidades, cada nucleosídeo de 5'-asa de um gapmer é um 2’-desoxinu- cleosídeo. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um ribonucleosídeo. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 5'-asa de um gapmer é um ribonucleosídeo. Em determinadas modalidades, um, mais de um ou cada nucleosídeo de 5'-asa é um nucleosídeo similar ao RNA.

[00583] Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um nu- cleosídeo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, 5'- asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído. Em determinadas modalida-des, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bi- cíclico e pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas moda-lidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe. Em determinadas mo-dalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosí- deo bicíclico e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo.

[00584] Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo de etila restrito e pelo menos um nucleosídeo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita e pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleo- sídeo de etila restrita e pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE. Em deter-minadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita e pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe. Em determinadas modalidades, 5'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita e pelo menos um 2'-desoxinu- cleosídeo.

Determinadas 3'-asas

[00585] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 1 a 8 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'- asa de um gapmer consiste em 1 a 7 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 1 a 6 nucleo- sídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 1 a 5 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 2 a 5 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 3 a 5 nu- cleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um ga- pmer consiste em 4 ou 5 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 1 a 4 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 1 a 3 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um ga- pmer consiste em 1 ou 2 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 2 a 4 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 2 ou 3 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 3 ou 4 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 1 nucleosídeo. Em deter-minadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 2 nucleosí- deos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer con-siste em 3 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 4 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 5 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em 6 nu- cleosídeos ligados.

[00586] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo bicíclico. Em determinadas moda-lidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA. Em determinadas mo-dalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um nucleosídeo bicíclico. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer consiste em um nucleosídeo de etila restrita. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um nucleosídeo LNA.

[00587] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo me-nos dois nucleosídeos modificados não bicíclicos. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos três nu- cleosídeos modificados não bicíclicos. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos quatro nucleosídeos mo-dificadosnão bicíclicos. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído. Em de-terminadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe. Em determi-nadas modalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um nucleosídeo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um nucleosídeo 2'-substi- tuído. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um nucleosídeo 2'-OMe.

[00588] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um 2-desoxinucleosídeo. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um 2’-desoxinu- cleosídeo. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um ribonucleosídeo. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo de 3'-asa de um gapmer é um ribonucleosídeo. Em determinadas modalidades, um, mais de um ou cada nucleosídeo de 5'-asa é um nucleosídeo similar ao RNA.

[00589] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um nucleo- sídeo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo.

[00590] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita e pelo menos um nucleosídeo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita e pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleo- sídeo bicíclico e pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleo- sídeo de etila restrita e pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe. Em deter-minadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo bicíclico e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo.

[00591] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo LNA e pelo menos um nucleosí- deo modificado não bicíclico. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA e pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA e pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA e pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo.

[00592] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo bicíclico, pelo menos um nucleo- sídeo modificado não bicíclico e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita, pelo menos um nucleosídeo mo-dificadonão bicílico e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em deter-minadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, pelo menos um nucleosídeo modificado não bicí- clico e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo.

[00593] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo bicíclico, pelo menos um nucleo- sídeo 2'-substituído e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em deter-minadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo de etila restrita, pelo menos um nucleosídeo 2'-substi- tuído e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, pelo menos um nucleosídeo 2'-substituído e pelo menos um 2'- desoxinucleosídeo.

[00594] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo bicíclico, pelo menos um nucleo- sídeo 2'-MOE e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleo- sídeo de etila restrita, pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, pelo menos um nucleosídeo 2'-MOE e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo.

[00595] Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer com-preende pelo menos um nucleosídeo bicíclico, pelo menos um nucleo- sídeo 2'-OMe e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleo- sídeo de etila restrita, pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo. Em determinadas modalidades, 3'-asa de um gapmer compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, pelo menos um nucleosídeo 2'-OMe e pelo menos um 2'-desoxinucleosídeo.

Certas Regiões Centrais (lacunas)

[00596] Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 a 20 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 a 15 nucleosídeos ligados. Em de-terminadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 a 12 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 a 10 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 a 9 nucleosídeos liga-dos. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 a 8 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 ou 7 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 7 a 10 nucleosí- deos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 7 a 9 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 7 ou 8 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 8 a 10 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 8 ou 9 nucleosídeos ligados. Em determinadas mo-dalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 6 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 7 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 8 nucleosídeos ligados. Em determinadas modali-dades, a lacuna de um gapmer consiste em 9 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um gapmer consiste em 10 nu- cleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, a lacuna de um ga- pmer consiste em 11 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalida-des, a lacuna de um gapmer consiste em 12 nucleosídeos ligados.

[00597] Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo da lacuna de um gapmer é um 2’-desoxinucleosídeo. Em certas modalidades, a lacuna compreende um ou mais nucleosídeos modificados. Em deter-minadas modalidades, cada nucleosídeo da lacuna de um gapmer é um 2’-desoxinucleosídeo ou é um nucleosídeo modificado que é "similar ao DNA". Em tais modalidades, "similar ao DNA" significa que o nucleosí- deo tem características semelhantes ao DNA, de forma que um duplex compreendendo o gapmer e uma molécula de RNA é capaz de ativar a RNase H. Por exemplo, sob certas condições, 2'-(ara)-F tem demons-trado suportar a ativação de RNase H e, assim, é similar ao DNA. Em determinadas modalidades, um ou mais nucleosídeos da lacuna de um gapmer não é um 2’-desoxinucleosídeo e não é similar ao DNA. Em al-gumas dessas modalidades, o gapmer, no entanto, suporta a ativação RNase H (por exemplo, devido ao número ou a colocação dos nucleo- sídeos não DNA).

[00598] Em determinadas modalidades, as lacunas compreendem um trecho de não modificado de 2’-desoxinucleosídeo interrompido por um ou mais nucleosídeos modificados, resultando assim em três sub- regiões (dois trechos de um ou mais 2’-desoxinucleosídeo e um trecho de um ou mais nucleosídeos modificados interruptores). Em determinadas modalidades, nenhum trecho de 2’-desoxinucleosídeos não modificados tem mais do que 5, 6 ou 7 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, tais trechos curtos são obtidos usando as regiões lacuna curta. Em determinadas modalidades, os trechos curtos são obtidos através da interrupção de uma região de lacuna mais comprida.

[00599] Em determinadas modalidades, a lacuna compreende um ou mais nucleosídeos modificados. Em determinadas modalidades, a lacuna compreende um ou mais nucleosídeos modificados, selecionados dentre cEt, FHNA, LNA, e 2-tio-timidina. Em determinadas modalidades, a lacuna compreende um nucleosídeo modificado. Em determinadas modalidades, a lacuna compreende uma porção de açúcar 5’-substitu- ída selecionada dentre 5’-Me e 5'-(R)-Me. Em determinadas modalidades, a lacuna compreende dois nucleosídeos modificados. Em determinadas modalidades, a lacuna compreende três nucleosídeos modificados. Em determinadas modalidades, a lacuna compreende quatro nucleosídeos modificados. Em determinadas modalidades, a la-cuna compreende dois ou mais nucleosídeos modificados e cada nu- cleosídeo modificado é o mesmo. Em determinadas modalidades, a la-cuna compreende dois ou mais nucleosídeos modificados e cada nu- cleosídeo modificado é diferente.

[00600] Em determinadas modalidades, a lacuna compreende uma ou mais ligações modificadas. Em determinadas modalidades, a lacuna compreende uma ou mais ligações de fosfonato de metil. Em determi-nadas modalidades, a lacuna compreende duas ou mais ligações modi-ficadas. Em certas modalidades, a lacuna compreende uma ou mais li-gações modificadas e um ou mais nucleosídeos modificados. Em deter-minadas modalidades, a lacuna compreende uma ligação modificada e um nucleosídeo modificado. Em certas modalidades, a lacuna compre-ende duas ligações modificadas e dois ou mais nucleosídeos modifica-dos.

Determinadas Motivos de Ligação Internucleosídica

[00601] Em determinadas modalidades, oligonucleotídeos compõem ligações de internucleosídeo modificado dispostas ao longo do oligonu- cleotídeo, ou região do mesmo, em um padrão definido ou motivo de ligação de internucleosídeo modificado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma região com um motivo de liga-ção de internucleosídeo alternado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos da presente divulgação compreendem uma região de ligações de internucleosídeo uniformemente modificado. Em algumas dessas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma região que é uniformemente ligada por ligações de internucleosídeo de fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo é uniformemente ligado por ligações de internucleosídeo de fosforotioato. Em determina-das modalidades, cada ligação de internucleosídeo do oligonucleotídeo é selecionada de fosfodiéster e fosforotioato. Em determinadas modali-dades, cada liagação de internucleosídeo do oligonucleotídeo é seleci-onado de fosfodiéster e fosforotioato e pelo menos uma ligação de in- ternucleosídeo é fosforotioato.

[00602] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 6 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em de-terminadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 7 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalida-des, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 8 ligações de internu- cleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotí- deo compreende pelo menos 9 ligações de internucleosídeo fosforotio- ato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 10 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 11 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 12 ligações de internu- cleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotí- deo compreende pelo menos 13 ligações de internucleosídeo fosforoti- oato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 14 ligações de internucleosídeo fosforotioato.

[00603] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 6 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligo- nucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 7 liga-ções consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 8 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 9 ligações consecutivas de internu- cleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotí- deo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 10 ligações con-secutivas de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modali-dades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 12 ligações consecutivas de internucleosídeo fosforotioato. Nestas determinadas modalidades, pelo menos um destes blocos está localizado na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Nestas determinadas modalidades, pelo menos um destes blocos está localizado dentro de 3 nucleosídeos da extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende menos de 15 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligo- nucleotídeo compreende menos do que 14 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo com-preende menos do que 13 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende menos do que 12 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende menos do que 11 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oli- gonucleotídeo compreende menos do que 10 ligações de internucleosí- deo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende menos do que 9 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende menos do que 8 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende menos do que 7 ligações de internucleosídeo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oli- gonucleotídeo compreende menos do que 6 ligações de internucleosí- deo fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende menos do que 5 ligações de internucleosídeo fosforotioato.

Determinados Motivos de Modificação da Nucleobase

[00604] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos com-preendemmodificações químicas da nucleobase dispostas ao longo do oligonucleotídeo, ou região do mesmo, em um padrão definido ou motivo de modificação de nucleobases. Em determinadas modalidades, as modificações de nucleobase são dispostas em um motivo de gapmer. Em determinadas modalidades, as modificações de nucleobase são dis-postas em um motivo alternado. Em certas modalidades, cada nucleo- base é modificada. Em determinadas modalidades, nenhuma das nu- cleobases é quimicamente modificada.

[00605] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos com-preendem um bloco de nucleobases modificadas. Nestas determinadas modalidades, o bloco está na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades o bloco está dentro de 3 nucleotídeos da ex-tremidade 3’ do oligonucleotídeo. Nestas determinadas modalidades, o bloco está na extremidade 5' do oligonucleotídeo. Em determinadas mo-dalidades o bloco está dentro de 3 nucleotídeos da extremidade 5’ do oligonucleotídeo.

[00606] Em determinadas modalidades, as modificações de nucleo- base são uma função da base natural em uma posição específica do oligonucleotídeo. Por exemplo, em determinadas modalidades cada pu- rina ou cada pirimidina em um oligonucleotídeo é modificada. Em certas modalidades, cada adenina é modificada. Em certas modalidades, cada guanina é modificada. Em certas modalidades, cada timina é modificada. Em certas modalidades, cada citosina é modificada. Em certas modalidades, cada uracila é modificada.

[00607] Em determinadas modalidades, algumas, todas, ou nenhuma das frações de citosina em um oligonucleotídeo são frações de 5-metilcitosina . Aqui, 5-metilcitosina não é uma "nucleobase modificada." Nesse sentido, a menos que indicado de outra forma, as nucleo- bases sem modificações incluem ambos os resíduos de citosina com uma 5-metila e aqueles que faltando uma 5-metila. Em determinadas modalidades, o estado de metilação de todas ou algumas nucleobases da citosina é especificado.

[00608] Em determinadas modalidades, modificações químicas das nucleobases compreendem a fixação de determinados grupos de con-jugado de nucleobases. Em determinadas modalidades, cada purina ou cada pirimidina em um oligonucleotídeo pode ser modificada, opcional-mente, para compreender um grupo conjugado.

Determinados Comprimentos Totais

[00609] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece oligonucleotídeos de qualquer dentre uma variedade de intervalos de comprimentos. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos consistem em nucleosídeos ligados de X a Y, onde X representa o menor número de nucleosídeos no intervalo e Y representa o maior número de nucleosídeos no intervalo. Em determinadas dessas modalidades, X e Y são cada um, independentemente, selecionados de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50; desde que X<Y. Por exemplo, em determinadas modalidades, o oligo- nucleotídeo pode consistir em 8 a 9, 8 a 10, 8 a 11, 8 a 12, 8 a 13, 8 a 14, 8 a 15, 8 a 16, 8 a 17, 8 a 18, 8 a 19, 8 a 20, 8 a 21, 8 a 22, 8 a 23, 8 a 24, 8 a 25, 8 a 26, 8 a 27, 8 a 28, 8 a 29, 8 a 30, 9 a 10, 9 a 11, 9 a 12, 9 a 13, 9 a 14, 9 a 15, 9 a 16, 9 a 17, 9 a 18, 9 a 19, 9 a 20, 9 a 21, 9 a 22, 9 a 23, 9 a 24, 9 a 25, 9 a 26, 9 a 27, 9 a 28, 9 a 29, 9 a 30, 10 a 11, 10 a 12, 10 a 13, 10 a 14, 10 a 15, 10 a 16, 10 a 17, 10 a 18, 10 a 19, 10 a 20, 10 a 21, 10 a 22, 10 a 23, 10 a 24, 10 a 25, 10 a 26, 10 a 27, 10 a 28, 10 a 29, 10 a 30, 11 a 12, 11 a 13, 11 a 14, 11 a 15, 11 a 16, 11 a 17, 11 a 18, 11 a 19, 11 a 20, 11 a 21, 11 a 22, 11 a 23, 11 a 24, 11 a 25, 11 a 26, 11 a 27, 11 a 28, 11 a 29, 11 a 30, 12 a 13, 12 a 14, 12 a 15, 12 a 16, 12 a 17, 12 a 18, 12 a 19, 12 a 20, 12 a 21, 12 a 30, ou 29 a 30 nucleosídeos ligados. Em modalidades onde o número de nucleosídeos do oligonucleotídeo de um composto é limitado, seja para um intervalo ou para um número específico, o composto pode, no entanto, compreender adicionalmente outros substituintes adicionais. Por exemplo, um oligonucleotídeo compreendendo de 8-30 nucleosí- deos exclui os oligonucleotídeos com 31 nucleosídeos, mas, salvo indicação em contrário, este um oligonucleotídeo pode ainda incluir, por exemplo, um ou mais grupos de conjugado, grupos terminais ou outros substituintes.

[00610] Além disso, onde um oligonucleotídeo é descrito por um intervalo de comprimento total e por regiões com comprimentos especí-ficos, e onde a soma dos comprimentos especificados das regiões é menor que o limite superior do intervalo do comprimento total, podendo o oligonucleotídeo ter nucleosídeos adicionais, além daqueles das regiões determinadas, desde que o número total de nucleosídeos não exceda o limite superior do intervalo do comprimento total.

Determinados Motivos Químicos do Oligonucleotídeo Antissenso

[00611] Em determinadas modalidades, as características estruturais químicas dos oligonucleotídeos antissenso caracterizam-se por seu motivo de açúcar, motivo de ligação internucleosídeo, motivo de modificação de nucleobase e comprimento total. Em determinadas modalidades, estes parâmetros são independentes um do outro. Assim, cada ligação de internucleosídeo do oligonucleotídeo tendo um motivo de açúcar de gapmer pode ser modificada ou não modificada e pode ou não seguir o padrão de modificação de gapmer das modificações de açúcar. Assim, as ligações de internucleosídeo dentro das regiões asa de um açúcar-gapmer podem ser as mesmas ou podem ser diferentes uma da outra e podem ser as mesmas ou diferentes das ligações de internu- cleosídeo da região de lacuna. Da mesma forma, estes oligonucleotí- deos de açúcar-gapmer podem incluir uma ou mais nucleobase modifi-cada independente do padrão gapmer das modificações de açúcar. Al-guém versado na técnica observará que estes motivos podem ser com-binados para criar uma variedade de oligonucleotídeos.

[00612] Em determinadas modalidades, a seleção da ligação de in- ternucleosídeo e modificação de nucleosídeos não são independentes uma da outra.

Determinadas Sequências e Alvos

[00613] Em determinadas modalidades, a invenção fornece oligonu- cleotídeos antissenso tendo uma sequência complementar a um ácido nucleico alvo. Estes compostos antissenso são capazes de hibridar a um ácido nucleico alvo, resultando em, pelo menos, uma atividade an- tissenso. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso hi- bridizam especificamente a um ou mais ácido nucleico alvo. Em deter-minadas modalidades, um composto antissenso hibridizante especifica-mente tem uma sequência de nucleobase compreendendo uma região com complementaridade suficiente para que um ácido nucleico alvo per-mita a hibridação e resulte em atividade antissenso e complementaridade insuficiente para qualquer não alvo, para evitar ou reduzir a hibri- dação inespecífica das sequências de ácidos nucleicos não alvo nas condições em que a hibridação específica é desejada (por exemplo, sob condições fisiológicas para in vivo ou usos terapêuticos, e em condições em que os ensaios são realizados em caso de ensaios in vitro). Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos são selecionados entre um alvo e não alvo, apesar de ambos alvo e não alvo compreenderem a sequência alvo. Nestas modalidades, a seletividade pode resultar da acessibilidade relativa da região alvo de uma molécula de ácido nucleico em comparação com o outro.

[00614] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornece compostos antissenso compreendendo os oligonucleotídeos que são totalmente complementares ao ácido nucleico alvo em toda a extensão do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, os oligonu- cleotídeos são 99% complementares ao ácido nucleico alvo. Em deter-minadas modalidades, os oligonucleotídeos são 95% complementares ao ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, estes oligonu- cleotídeos são 90% complementares ao ácido nucleico alvo.

[00615] Em determinadas modalidades, estes oligonucleotídeos são 85% complementares ao ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, estes oligonucleotídeos são 80% complementares ao ácido nu- cleico alvo. Em determinadas modalidades, um composto antissenso compreende uma região que é totalmente complementar ao ácido nucleico alvo e é, pelo menos, 80% complementar ao ácido nucleico alvo em todo o comprimento do oligonucleotídeo. Nestas determinadas modalidades, a região de complementaridade plena é de 6 a 14 nucleo- bases de comprimento.

[00616] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos com-preendem uma região hibridizante e uma terminal. Nestas determinadas modalidades, a região hibridizante consiste em 12-30 nucleosídeos li-gados e é totalmente complementar ao ácido nucleico alvo. Em deter-minadas modalidades, a região hibridizante inclui uma incompatibilidade em relação ao ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, a região hibridizante inclui duas incompatibilidades em relação ao ácido nu- cleico alvo. Em determinadas modalidades, a região hibridizante inclui três incompatibilidades em relação ao ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidade, a região terminal consiste em 1-4 nucleosídeos terminais. Em determinadas modalidades, os nucleosídeos terminais estão na extremidade 3'. Em determinadas modalidades, um ou mais dos nucleosídeos terminais não são complementares ao ácido nucleico alvo.

[00617] Os mecanismos antissenso incluem qualquer mecanismo que envolva a hibridação de um oligonucleotídeo com ácido nucleico alvo, em que a hibridização resulta em um efeito biológico. Em determinadas modalidades, esses resultados de hibridação na degradação do ácido nucleico alvo ou na ocupação com inibição ou estimulação concomitantes da maquinaria celular envolvendo, por exemplo, translação, transcrição ou junção do ácido nucleico alvo.

[00618] Um tipo de mecanismo antissenso envolvendo a degradação do RNA alvo é antissenso mediado por RNase H. RNase H é uma en-donuclease celular que cliva a fita de RNA de um duplex de DNA. É conhecido na técnica que os compostos antissenso de fita única que são "similares ao DNA" eliciam atividade de RNase H nas células de mamíferos. A ativação de RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA alvo, aumentando, assim, a eficiência da inibição mediada por oli- gonucleotídeo similar ao DNA da expressão do gene.

[00619] Em determinadas modalidades, um grupo de conjugado compreende uma porção clivável. Em determinadas modalidades, um grupo de conjugado compreende uma ou mais ligação clivável. Em de-terminadas modalidades, um grupo de conjugado compreende um li- gante. Em determinadas modalidades, um ligante compreende uma por-ção ligante de proteínas. Em determinadas modalidades, um grupo de conjugado compreende uma porção de direcionamento de célula (também referido como um grupo de direcionamento de célula). Em determinadas modalidades uma porção de direcionamento de célula compreende um grupo ramificado. Em determinadas modalidades, uma porção de direcionamento de célula compreende uma ou mais correntes. Em determinadas modalidades, uma porção de direcionamento de célula compreende um carboidrato ou agrupamento de carboidratos. Determinadas Frações Cliváveis

[00620] Em determinadas modalidades, uma porção clivável é uma ligação clivável. Em determinadas modalidades, uma porção clivável compreende uma ligação clivável. Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado compreende uma porção clivável. Nestas determi-nadas modalidades, a porção clivável é afixada ao oligonucleotídeo an- tissenso. Nestas determinadas modalidades, a porção clivável é afixada diretamente a porção de direcionamento de célula. Nestas determinadas modalidades, a porção clivável é afixada ao ligante conjugado. Em determinadas modalidades, a porção compreende um fosfato ou fosfo- diéster. Em determinadas modalidades, a porção clivável é um nucleo- sídeo clivável ou nucleosídeo análogo. Em determinadas modalidades, o nucleosídeo ou nucleosídeo análogo compreende uma base heterocí- clica opcionalmente protegida, selecionada a partir de uma purina, pu- rina substituída, pirimidina ou pirimidina substituída. Em determinadas modalidades, a porção clivável é um nucleosídeo que compreende uma base heterocíclica opcionalmente protegida selecionada de uracil, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metil- citosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina e 2-N-isobutirilguanina. Em determinadas modalidades, a porção clivável é 2'-desoxinucleosí- deo que é afixado à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso por uma ligação fosfodiéster e é afixado ao ligante por uma ligação de fosfodié- ster ou fosforotioato. Em determinadas modalidades, a porção clivável é 2'-desoxi adenosina que é afixada à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso por uma ligação de fosfodiéster e é afixada ao ligante por uma ligação fosfodiéster ou fosforotioato. Em determinadas modalidades, a porção clivável é 2'-desoxi adenosina que é afixado à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso por uma ligação de fosfodiéster e é afixado ao ligante por uma ligação de fosfodiéster.

[00621] Em determinadas modalidades, a porção clivável é afixada à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso. Nestas determinadas moda-lidades, a porção clivável é afixada à posição 5' do oligonucleotídeo an- tissenso. Em determinadas modalidades, a porção clivável é afixada à posição 2' do oligonucleotídeo antissenso. Em determinadas modalida-des, a porção clivável é anexado ao oligonucleotídeo antissenso por uma ligação fosfodiéster. Em determinadas modalidades, a porção cli- vável é afixada ao ligante por uma ligação fosforotioato ou um fosfodié- ster. Em determinadas modalidades, a porção clivável é afixado ao li- gante por uma ligação de fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado não inclui uma porção clivável.

[00622] Em determinadas modalidades, a porção clivável é clivada depois que o complexo foi administrado a um animal somente após ser interiorizado por uma célula alvo. Dentro da célula a porção clivável é cli-vada liberando, desta forma, o oligonucleotídeo antissenso ativo. Embora não seja destinado a ser limitado pela teoria, acredita-se que a porção clivável é clivada por uma ou mais nucleases dentro da célula. Em deter-minadas modalidades, a uma ou mais nucleases clivam a ligação de fos- fodiéster entre a porção clivável e o ligante. Em determinadas modalida-des, a porção clivável tem uma estrutura selecionada dentre os seguin-tes:

[00623] em que cada um dos Bx, Bx1, Bx2, e Bx3 é independentemente uma porção de heterocíclica. Em determinadas modalidades, a porção clivável tem uma estrutura selecionada dentre os seguintes:

Determinados Ligantes

[00624] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado compreendem um ligante. Em algumas dessas modalidades, o ligante está covalentemente ligado à porção clivável. Em algumas dessas moda-lidades, o ligante está covalentemente ligado ao oligonucleotídeo antis- senso. Em determinadas modalidades, o ligante está covalentemente li-gado a uma porção direcionadora da célula. Em determinadas moda- lidades, o ligante compreende ainda uma ligação covalente com um su-portesólido. Em determinadas modalidades, o ligante compreende ainda uma ligação covalente com uma porção de ligação de proteínas. Em de-terminadas modalidades, o ligante compreende ainda uma ligação cova-lente com um suporte sólido e compreende ainda uma porção de ligação de proteínas. Em determinadas modalidades, o ligante inclui várias posi-ções para anexação dos ligantes fixados. Em determinadas modalidades, o ligante inclui várias posições para anexação dos ligantes fixados e não está anexado a um grupo de ramificação. Em determinadas modalidades, o ligante compreende ainda uma ou mais ligação clivável. Em determina-das modalidades, o grupo de conjugado não inclui um ligante.

[00625] Em determinadas modalidades, o ligante inclui pelo menos um grupo linear compreendendo grupos selecionados de grupos alquila, amida, dissulfeto, polietilenoglicol, éter, tioéter (-S-) e hidroxilamino (-O- N(H)-). Em determinadas modalidades, o grupo linear compreende gru-pos selecionados a partir de grupos alquila, amida e éter. Em determi-nadas modalidades, o grupo linear compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila e éter. Em determinadas modalidades, o grupo linear compreende pelo menos um grupo de ligação fósforo. Em deter-minadas modalidades, o grupo linear compreende pelo menos um grupo fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o grupo linear inclui pelo menos um grupo ligante neutro. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado à porção de célula-alvo e à porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalente- mente anexado à porção de célula-alvo e ao oligonucleotídeo antis- senso. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalente- mente anexado à porção de célula-alvo, à porção clivável e a um su-portesólido. Em determinadas modalidades, o grupo linear está cova- lentemente anexado à porção de célula-alvo, à porção clivável, a um suporte sólido a uma porção ligante de proteína. Em determinadas modalidades, o grupo linear inclui uma ou mais ligações cliváveis.

[00626] Em determinadas modalidades, o ligante inclui o grupo linear covalentemente anexado a um grupo andaime (scaffold). Em determi-nadas modalidades, o andaime inclui um grupo alifático ramificado com-preendendo grupos selecionados de alquil amida, bissulfeto, polietileno- glicol, éter, grupos tioéter e hidroxilamina. Em determinadas modalida-des, o andaime inclui um grupo alifático ramificado compreendendo gru-pos selecionados a partir de grupos alquila, amida e éter. Em determi-nadas modalidades, o andaime inclui pelo menos um sistema de anéis mono ou policíclico. Em determinadas modalidades, o andaime inclui pelo menos dois sistemas de anel mono ou policíclico. Em determinadas modalidades, o grupo linear é covalentemente anexado ao grupo andaime e o grupo andaime é covalentemente anexado à porção clivável e ao li- gante. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado ao grupo andaime e o grupo andaime está covalentemente anexadoà porção clivável, ao ligante e ao suporte sólido. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente anexado ao grupo andaime e o grupo andaime está covalentemente anexado à porção e a um grupo ligante de proteína. Em determinadas modalidades, o grupo linear está covalentemente ligado ao grupo andaime e o grupo andaime está covalentemente anexado à porção clivável, ao ligante, à porção ligante de proteína e a um suporte sólido. Em determinadas modalidades, o grupo linear inclui uma ou mais ligações cliváveis.

[00627] Em determinadas modalidades, o ligante inclui uma porção ligante de proteínas. Em determinadas modalidades, a porção ligante de proteínas é um lipídio como, por exemplo, incluindo, entre outros, colesterol, ácido cólico, ácido acético de adamantano, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo gera- niloxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecil, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico , ácido O3-(oleoil) colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina), uma vitamina (por exemplo, folato, vitamina A, vitamina E, biotina, piridoxal), um pep- tídeo, um carboidrato (por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, tris- sacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo, polissacarídeo), um com-ponenteendossomolítico, um esteroide (por exemplo, uvaol, hecige- nina, diosgenina), um terpeno (por exemplo, triterpeno, por exemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado de epifriedela- nol) ou um lipídio catiônico. Em determinadas modalidades, a porção ligante de proteínas é um ácido graxo saturado ou insaturado de cadeia longa de C16 a C22, colesterol, ácido cólico, vitamina E, adamantano ou 1-pentafluoropropila.

[00628] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estrutura selecionada entre: onde cada n é, independentemente, de 1 a 20; e p é de 1 a 6.

[00629] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estru-tura selecionada entre: em que n é, independentemente, de 1 a 20.

[00630] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre: em que n é de 1 a 20.

[00631] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre: onde cada L é, independentemente, um grupo ligante fósforo ou um grupo ligante neutro; e

[00632] cada n é, independentemente, de 1 a 20.

[00633] Em determinadas modalidades, um ligante tem uma estru- tura selecionada entre:

[00634] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estru-tura selecionada entre:

[00635] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estru tura selecionada entre:

[00636] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre:

[00637] em que n é de 1 a 20.

[00638] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre:

[00639] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre:

[00640] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre:

[00641] Em determinadas modalidades, o ligador do conjugado tem a estrutura:

[00642] Em determinadas modalidades, o ligador do conjugado tem a estrutura:

[00643] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre:

[00644] Em determinadas modalidades, um ligador tem uma estrutura selecionada entre: onde cada n é independentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.

Determinadas Frações Direcionadas a Células

[00645] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado compreendem frações direcionadas a células. Determinadas dessas frações direcionadas a células aumentam a absorção de compostos an- tissenso. Em determinadas modalidades, as frações direcionadas a cé-lulas compreendem um grupo de ramificação, um ou mais fixador e um ou mais ligante. Em determinadas modalidades, frações direcionadas a células compreendem um grupo de ramificação, um ou mais ligantes e uma ou mais ligação clivável.

Determinados Grupos de Ramificação

[00646] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado compreendem uma porção direcionada que compreende um grupo de ramificação e pelo menos dois ligantes fixados. Em determinadas mo-dalidades, o grupo de ramificação anexa o ligante conjugado. Em deter-minadas modalidades, o grupo de ramificação anexa a porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação anexa o oligo- nucleotídeo antissenso. Em determinadas modalidades, o grupo de ra-mificação está covalentemente anexado ao vinculador e aos ligantes fi-xados. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compre-ende um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados de alquila, amida, bissulfeto, polietilenoglicol, éter, grupos tioéter e hidroxilamina. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila, amida e éter. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila e éter. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende um sistema de anéis mono ou policíclicos. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende uma ou mais ligação clivável. Em determinadas modalidades, o grupo de conjugado não inclui um grupo de ramificação.

[00647] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:em que n é, independentemente, de 1 a 20.

[00648] j é de 1 a 3; e

[00649] m é de 2 a 6.

[00650] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre: em que n é, independentemente, de 1 a 20; e

[00651] m é de 2 a 6.

[00652] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:

[0653] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre: em que cada A1 é, independentemente, O, S, C=O ou NH; e

[00654] cada n é, independentemente, de 1 a 20.

[00655] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre: em que cada A1 é, independentemente, O, S, C=O ou NH; e

[00656] cada n é, independentemente, de 1 a 20.

[00657] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre: em que A1 é O, S, C=O ou NH; e

[00658] cada n é, independentemente, de 1 a 20.

[00659] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:

[00660] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:

[00661] Em determinadas modalidades, um grupo de ramificação tem uma estrutura selecionada entre:

Determinados Fixadores

[00662] Em determinadas modalidades, os grupos conjugados com-preendem um ou mais fixadores covalentemente anexados ao grupo de ramificação. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados compreendem um ou mais fixadores covalentemente anexados ao grupo de ligação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo alifático linear, compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, éter, tioéter, bissulfeto, amida e grupos de polietilenoglicol em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo linear, compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, éter, tioéter, bissulfeto, amida, fosfodiéster e grupos de polietile- noglicol em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo linear, compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, éter e amida em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila, fosfodiéster, éter e grupos amida em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos selecionados de alquila e fosfodiéster em qualquer combinação. Em determinadas modalidades, cada fixador compreende pelo menos um grupo de ligação fósforo ou grupo de ligação neutro.

[00663] Em determinadas modalidades, o fixador inclui uma ou mais ligações cliváveis. Em determinadas modalidades, a corrente é anexada ao grupo de ramificação através de ou uma amida ou um grupo éter. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao grupo ramificação por meio de um grupo fosfodiéster. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao grupo de ramificação por meio de um grupo de ligação fósforo ou grupo de ligação neutro. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao grupo ramificação por meio de um um grupo éter. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao ligante por meio de um um grupo amida ou éter. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao ligante por meio de um grupo éter. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao ligante por meio de um um grupo amida ou éter. Em determinadas modalidades, o fixador é anexado ao ligante por meio de um grupo éter.

[00664] Em determinadas modalidades, cada fixador compreende de cerca de 8 a cerca de 20 átomos no comprimento da cadeia entre o ligante e o grupo de ramificação. Em determinadas modalidades, cada grupo fixador compreende de cerca de 10 a cerca de 18 átomos no com-primento da cadeia entre o ligante e o grupo de ramificação. Em deter-minadas modalidades, cada grupo fixador compreende de cerca de 13 átomos no comprimento da cadeia.

[00665] Em determinadas modalidades, um fixador tem uma estrutura selecionada entre: em que n é, independentemente, de 1 a 20; e

[00666] cada p é de 1 a cerca de 6.

[00667] Em determinadas modalidades, um fixador tem uma estru-tura selecionada entre:

[00668] Em determinadas modalidades, um fixador tem uma estrutura selecionada entre: em que n é, independentemente, de 1 a 20.

[00669] Em determinadas modalidades, um fixador tem uma estrutura selecionada entre:

[00670] em que L é um grupo de ligação de fósforo ou um grupo de ligação neutro;

[00671] Z1 é C(=O)O-R2;

[00672] Z2 é H, alquila C1-C6 ou alquila C1-C6 substituída;

[00673] R2 é H, C1- C6 ou alquila substituída C1- C6; e

[00674] cada m1 é, independentemente, de 0 a 20, em que pelo menos um m1 é maior que 0 para cada corrente.

[00675] Em determinadas modalidades, um fixador tem uma estrutura selecionada entre:

[00676] Em determinadas modalidades, um fixador tem uma estrutura selecionada entre: em que Z2 é H ou CH3; e

[00677] cada m1 é, independentemente, de 0 a 20, em que pelo menos um m1 é maior que 0 para cada corrente.

[00678] Em determinadas modalidades, um fixador tem uma estrutura selecionada entre: em que cada n é, independentemente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.

[00679] Em determinadas modalidades, uma corrente compreende um grupo de ligação de fósforo. Em determinadas modalidades, uma corrente não compreende nenhuma ligação amida. Em determinadas modalidades, uma corrente compreende um grupo de ligação de fósforo e não compreende nenhuma ligação amida.

Certos Ligantes

[00680] Em determinadas modalidades, a presente divulgação provê ligantes em que cada ligante é anexado covalentemente a uma corrente. Em determinadas modalidades, cada ligante é selecionado para ter uma afinidade para pelo menos um tipo de receptor em uma célula-alvo. Em determinadas modalidades, os ligantes são selecionados para que te-nham afinidade para pelo menos um tipo de receptor na superfície de uma célula hepática de mamífero. Em determinadas modalidades, os ligantes são selecionados para que tenham afinidade para pelo menos um receptor hepático de asialoglicoproteína. Em determinadas modali-dades, cada ligante é um carboidrato. Em determinadas modalidades, cada ligante é, selecionados independentemente da galactose, N-acetil galactosamina, manose, glicose, glicosamina e fucose. Em determina-das modalidades, cada ligante é N-acetil galactosamina (GalNAc). Em determinadas modalidades, a porção-alvo compreende 2 a 6 ligantes. Em determinadas modalidades, a porção-alvo compreende 3 ligantes. Em determinadas modalidades, a porção-alvo compreende 3 ligantes N-acetil galactosamina.

[00681] Em determinadas modalidades, o ligante é um carboidrato, derivado de carboidrato, carboidrato modificado, agrupamento de car-boidrato multivalente, polissacarídeo, polissacarídeo modificado ou de-rivado de polissacarídeo. Em determinadas modalidades, o ligante é um açúcar aminado ou açúcar tio. Por exemplo, açúcares de amino podem ser selecionados de qualquer número de compostos conhecidos na téc-nica, por exemplo, glicosamina, ácido siálico, α-D-galactosamina, N- Acetilgalactosamina, 2-acetamido-2-desoxi-D-galactopiranose (GalNAc), 2-Amino-3-O- [(R)-1-carboxietil]-2-desoxi-β-D-glicopiranose (ácido e-murâmico), 2-Desoxi-2-metilamino-L-glicopiranose, 4,6-Dide- soxi-4-formamido-2,3-di-O-metil-D-manopiranose, 2-Desoxi-2-sulfoa- mino-D-glicopiranose e N-sulfo-D-glicosamina, e ácido N-Glicoloil-α- neuramínico. Por exemplo, açúcares tio podem ser selecionados do grupo consistindo em 5-Tio-β-D-glicopiranose, Metil 2,3,4-tri-O-acetil-1- tio—6—O—tritil—α—D—glicopiranosideo, 4-Tio-β-D-galactopiranose, e etil 3,4,6,7-tetra-O-acetil-2-desoxi-1,5-ditio-a-D-glico-heptopiranosídeo.

[00682] Em determinadas modalidades, "GalNac" ou "Gal-NAc" se refere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranose, comumente referida na literatura como N-acetil galactosamina. Em determinadas moda-lidades,"N-acetil galactosamina" se refere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi- D-galactopiranose. Em determinadas modalidades, "GalNac" ou "Gal- NAc" se refere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranose. Em deter-minadas modalidades, "GalNac" ou "Gal-NAc" se refere a 2-(Acetila- mino)-2-desoxi-D-galactopiranose, que inclui a forma β: 2-(Acetilamino)- 2-Desoxi-β-D-galactopiranose e forma α: 2-(Acetilamino)-2-Desoxi-D- galactopiranose. Em determinadas modalidades, a forma β: 2-(Acetila- mino)-2-Desoxi-β-D-galactopiranose e forma α: 2-(Acetilamino)-2-de- soxi-D-galactopiranose pode ser usado de forma intercambiável. Por-tanto, nas estruturas em que uma forma é retratada, essas estruturas destinam-se a incluir a outra forma também. Por exemplo, se a estrutura para a forma α: 2-(Acetilamino)-2-Desoxi-D-galactopiranose é mostrado, esta estrutura destina-se a incluir a outra forma também. Em de-terminadas modalidades, em determinadas modalidades preferenciais, a forma β 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranose é a modalidade preferencial.

[00683] 2-(Acetilamina)-2-des0xi-β-D-galactopiranose.

[00684] 2-(Acetilamina)-2-desóxi-a-D-galactopiranose.

[00685] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre: em que cada R1 é selecionado de OH e NHCOOH.

[00686] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre:

[00687] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre:

[00688] Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes têm uma estrutura selecionada entre:

Certos Conjugados

[00689] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado compreendem as características estruturais acima. Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura: em que n é, independentemente, de 1 a 20.

[00690] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00691] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura: em que n é, independentemente, de 1 a 20;

[00692] Z é H ou um suporte sólido ligante;

[00693] Q é um composto antissenso;

[00694] X é O ou S; e

[00695] Bx é uma porção de base heterocíclica.

[00696] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00697] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00698] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00699] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00700] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00701] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00702] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00703] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00704] Em determinadas modalidades, os conjugados não compre- endem uma pirrolidina.

[00705] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00706] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00707] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00708] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00709] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00710] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00711] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00712] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00713] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00714] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00715] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado têm a seguinte estrutura:

[00716] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura:

[00717] onde X é uma corrente substituída ou não substituída de seis a onze átomos consecutivamente ligados.

[00718] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura:

[00719] onde X é uma corrente substituída ou não substituída de dez átomos consecutivamente ligados.

[00720] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura:

[00721] onde X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a onze átomos consecutivamente ligados e em que a corrente compreende exatamente uma ligação amida.

[00722] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura:

[00723] em que Y e Z são independentemente selecionados de um grupo alquila, alquenila ou alquinila substituído ou não substituído C1C12 ou um grupo compreendendo um éter, uma cetona, uma amida, um éster, um carbamato, uma amina, uma piperidina, um fosfato, uma fos- fodiéster, um fosforotioato, um triazol, uma pirrolidina, um dissulfeto ou um tioéter.

[00724] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura:

[00725] em que Y e Z são independentemente selecionados de um grupo alquila substituído ou não substituído C1-C12, ou um grupo com-preendendo exatamente um éter ou exatamente dois éteres, uma amida, uma amina, uma piperidina, um fosfato, um fosfodiéster ou um fosforotioato.

[00726] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: em que Y e Z são selecionados independentemente de um grupo alquila C1-C12 substituído ou não substituído.

[00727] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura:

[00728] em que m e n são selecionados independentemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12

[00729] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: onde m é 4, 5, 6, 7 ou 8, e n é 1, 2, 3 ou 4.

[00730] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: onde X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a treze átomos ligados consecutivamente, e onde X não compreende um grupo éter.

[00731] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: onde X é uma corrente substituída ou não substituída de oito átomos consecutivamente ligados, e onde X não compreende um grupo éter.

[00732] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: onde X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a treze átomos consecutivamente ligados e em que a corrente compreende exatamente uma ligação amida, e onde X não compreende um grupo éter.

[00733] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: em que X é uma corrente substituída ou não substituída de quatro a treze átomos ligados consecutivamente e em que a corrente consiste em uma ligação amida e um grupo alquila C2-C11 substituído ou não substituído.

[00734] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: em que Y e Z são independentemente selecionados de um grupo alquila, alquenila ou alquinila C1-C12 substituído ou não substituído ou um grupo compreendendo um éter, uma cetona, uma amida, um éster, um carbamato, uma amina, uma piperidina, um fosfato, uma fosfodiéster, um fosforotioato, um triazol, uma pirrolidina, um dissulfeto ou um tioéter.

[00735] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: em que Y é selecionado a partir de um grupo alquila C1-C12 substituído ou não substituído, ou um grupo compreendendo um éter, uma amina, uma piperidina, um fosfato, um fosfodiéster ou um fosforotioato.

[00736] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: em que Y é selecionado de um grupo alquila C1-C12 substituído ou não substituído.

[00737] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

[00738] Em determinadas modalidades, a porção direcionada a células do grupo de conjugado tem a seguinte estrutura: em que n é 4, 5, 6, 7 ou 8.

Certos compostos antissenso conjugados

[00739] Em determinadas modalidades, os conjugados estão liga- dos a um nucleosídeo do oligonucleotídeo antissenso nas posições 2', 3', 5' do nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um composto an- tissenso conjugado tem a seguinte estrutura: em que

[00740] A é o oligonucleotídeo antissenso;

[00741] B é a porção clivável

[00742] C é o ligador do conjugado

[00743] D é o grupo de ramificação

[00744] cada E é uma corrente;

[00745] cada F é um ligante; e

[00746] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00747] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura: em que

[00748] A é o oligonucleotídeo antissenso;

[00749] C é o ligador do conjugado

[00750] D é o grupo de ramificação

[00751] cada E é uma corrente;

[00752] cada F é um ligante; e

[00753] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00754] Em determinadas modalidades, o ligador conjugado compreende pelo menos uma ligação clivável.

[00755] Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação com-preende pelo menos uma ligação clivável.

[00756] Em determinadas modalidades, cada corrente compreende pelo menos uma ligação clivável.

[00757] Em determinadas modalidades, os conjugados estão ligados a um nucleosídeo do oligonucleotídeo antissenso nas posições 2', 3', 5' do nucleosídeo.

[00758] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura: em que

[00759] A é o oligonucleotídeo antissenso;

[00760] B é a porção clivável

[00761] C é o ligador do conjugado

[00762] cada E é uma corrente;

[00763] cada F é um ligante; e

[00764] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00765] Em determinadas modalidades, os conjugados estão ligados a um nucleosídeo do oligonucleotídeo antissenso nas posições 2', 3', 5' do nucleosídeo. Em determinadas modalidades, um composto an- tissenso conjugado tem a seguinte estrutura: em que

[00766] A é o oligonucleotídeo antissenso;

[00767] C é o ligador do conjugado

[00768] cada E é uma corrente;

[00769] cada F é um ligante; e

[00770] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00771] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura: em que

[00772] A é o oligonucleotídeo antissenso;

[00773] B é a porção clivável

[00774] D é o grupo de ramificação

[00775] cada E é uma corrente;

[00776] cada F é um ligante; e

[00777] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00778] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura: em que

[00779] A é o oligonucleotídeo antissenso;

[00780] D é o grupo de ramificação

[00781] cada E é uma corrente;

[00782] cada F é um ligante; e

[00783] q é um número inteiro entre 1 e 5.

[00784] Em determinadas modalidades, o ligador conjugado compreende pelo menos uma ligação clivável.

[00785] Em determinadas modalidades, cada corrente compreende pelo menos uma ligação clivável.

[00786] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem uma estrutura selecionada entre os itens a seguir:

[00787] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem uma estrutura selecionada entre os itens a seguir: conjugado tem uma estrutura selecionada entre os itens a seguir:

[00788] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem uma estrutura selecionada entre os itens a seguir:

[00789] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado tem a seguinte estrutura:

[00790] Patentes Representativas dos Estados Unidos, publicações de pedido de patente dos Estados Unidos e publicações de pedido de patente internacionais que ensinam a preparação de determinados conjugados observados acima, compostos antissenso conjugados, correntes, ligadores, grupos de ramificação, ligantes, frações cliváveis, bem como outras modificações , incluem, sem limitação, US 5.994.517, US 6.300.319, US 6.660.720, US 6.906.182, US 7.262.177, US 7.491.805, US 8.106.022, US 7.723.509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 e WO 2012/037254, cada uma das quais está incorporada aqui em sua totalidade por referência.

[00791] Publicações representativas que ensinam a preparação de determinados conjugados observados acima, compostos antissenso conjugados, correntes, ligadores, grupos de ramificação, ligantes, frações cliváveis, bem como outras modificações, incluem, sem limitação, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-lig- ands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioor- ganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, e Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770, cada um dos quais está incorporado aqui em sua totalidade por referência.

[00792] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados compreendem um oligonucleotídeo à base de RNase H (tal como um gapmer) ou um oligonucleotídeo modulador de splice (tal como um oligonucleotídeo totalmente modificado) e qualquer grupo de conjugado compreendendo pelo menos um, dois ou três grupos Gal- NAc. Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado compreende qualquer grupo de conjugado encontrado em qualquer uma das seguintes referências: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31,2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Ren- sen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 4346; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798- 5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayapra- kash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 52755281; Pedidos internacionais WO1998/013381; WO2011/038356; WO2013/165816; Patentes U.S. 4.751.219; 8.552.163; 6.908.903; 7.262.177; 5.994.517; 6.300.319; 8.106.022; 7.491.805; 7.491.805; 7.582.744; 8.137.695; 6.383.812; 6.525.031; 6.660.720; 7.723.509; 8.541.548; 8.344.125; 8.313.772; 8.349.308; 8.450.467; 8.501.930; 8.158.601; 7.262.177; 6.906.182; 6.620.916; 8.435.491; 8.404.862; 7.851.615; Publicações de Pedido de Patente U.S. Publicados US2009/0203132; cada um dos quais está incorporado aqui em sua to- talidade por referência.

Certos Usos e Recursos

[00793] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados exibem potente redução de RNA alvo in vivo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso não conjugados se acu-mulam nos rins. Em determinadas modalidades, os compostos antis- senso conjugados se acumulam no fígado. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são bem tolerados. Essas propriedades rendem compostos antissenso conjugados particularmente úteis para inibição de muitos RNAs alvo, incluindo, entre outros, aqueles envolvidos em doenças metabólicas, cardiovasculares e outras doença, distúrbios ou condições. Assim, aqui são apresentados métodos de tratamento dessas doenças, distúrbios ou condições contactando tecidos do fígado com os compostos antissenso conjugados direcionados aos RNAs associados a essas doenças, distúrbios ou condições. Assim, são também apresentados métodos para atenuar qualquer variedade de doenças metabólicas, cardiovasculares e outras doenças ou condições com os compostos antissenso conjugados da presente invenção.

[00794] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são mais potentes do que a contraparte não conjugada em uma concentração de tecido específica. Sem querer se vincular a qual-quer teoria ou mecanismo, em determinadas modalidades, o conjugado pode permitir que o composto antissenso conjugado entre na célula de maneira mais eficiente ou entre na célula de forma mais produtiva. Por exemplo, em determinadas modalidades os compostos antissenso conjugados podem apresentar uma redução-alvo maior em comparação com a sua contraparte não conjugada, em que o composto antissenso conjugado e sua contraparte não conjugada estão presentes no tecido nas mesmas concentrações. Por exemplo, em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados podem apresentar redução- alvo maior em comparação com a sua contraparte não conjugada, em que o composto antissenso conjugado e sua contraparte não conjugada estão presentes no fígado nas mesmas concentrações.

[00795] A absorção produtiva e não produtiva de oligonucleotídeos foi discutida anteriormente (ver, por exemplo, Geary, R. S., E. Wance- wicz, et al. (2009). "Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptake and Pharmacologic Activity of a 2'-Methoxyethyl Modified Chimeric Antisense Oligonucleotide Targeting PTEN." Biochem. Pharmacol. 78(3): 284-91; & Koller, E., T. M. Vincent, et al. (2011). "Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified antissenso oligonucleotide accumulation in hepatocytes." Nucleic Acids Res. 39(11): 4795807). Os grupos conjugados aqui descritos podem melhorar a absorção produtiva.

[00796] Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado descritos aqui podem melhorar ainda mais a potência, aumentando a afinidade do composto antissenso conjugado por um tipo específico de célula ou tecido. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados aqui descritos podem melhorar ainda mais a potência aumentando o reconhecimento do composto antissenso conjugado por um ou mais receptores de superfície da célula. Em determinadas modalidades, os grupos de conjugado descritos aqui podem melhorar ainda mais a potência, facilitando a endocitose do composto antissenso conjugado.

[00797] Em determinadas modalidades, a porção clivável pode melhorar ainda mais a potência, permitindo que o conjugado seja clivado a partir do oligoucleotídeo antissenso após o composto antissenso conjugado ter entrado na célula. Nesse sentido, em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados podem ser administrados em doses menores do que seria necessário para os oligonucleotídeos an- tissenso não conjugados.

[00798] Ligações fosforotioato foram incorporadas nos oligonucleotí- dos antissenso anteriormente. Tais ligações fosforotioato são resistentesàs nucleases e assim melhoram a estabilidade do oligonucleotídeo. Além disso, as ligações de fosforotioato também ligam certas proteínas, o que resulta em acúmulo de oligonucleotídeo no fígado. Oligonucleotí- deos com mesnos ligações fosforotioato se acumulam menos no fígado e mais nos rins (ver, por exemplo, Geary, R., "Pharmacokinetic Properties of 2’-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats," Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 296, No. 3, 890-897; & Pharmacological Properties of 2’-O-Methoxyethyl Modified Oligonucleotides in Antisense a Drug Technology, Capítulo 10, Crooke, S.T., ed., 2008). Em determinadas modalidades, os oligonucelotídeos com menos ligações internucleosídicas fosforotioato e mais ligações internucleosídicas fosfodiéster se acumulam menos no fígado e mais nos rins. Ao tratar doenças no fígado, não é desejável, por vários motivos (1) que menos fármacos entrem no sítio de ação desejado (fígado); (2) que o fármaco saia na urina; e (3) que os rins sejam expostos a uma concentração relativamente alta de fármacos que pode resultar em toxicidade nos rins. Assim, para doenças do fígado, as ligações fosforotio- ato fornecem benefícios importantes.

[00799] Em determinadas modalidades, entretanto, a administração de oligonucleotídeos uniformemente ligados por ligações internucleosí- dicas fosforotioato induz uma ou mais reações pró-inflamatórias. (ver, por exemplo: J Lab Clin Med. setembro de 1996;128(3):329-38. "Amplification of antibody production by phosphorothioate oligodeoxynucleotides". Branda et al.; e ver também, por exemplo: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Capítulo 12, páginas 342-351, Crooke, S.T., ed., 2008). Em determinadas modalidades, a administração de oli- gonucleotídeos em que a maioria das ligações internucleosídicas compreendemligações internucleosídicas fosforotioato induz uma ou mais reações pró-inflamatórias.

[00800] Em determinadas modalidades, o grau de efeito pró-inflamatóriopode depender de várias variáveis (por exemplo, modificação da estrutura principal, efeitos fora do alvo, modificações nucleobásicas e/ou modificações nucleosídeas) ver, por exemplo: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Capítulo 12, páginas 342-351, Cro- oke, S.T., ed., 2008). Em determinadas modalidades, o grau de efeito pró-inflamatório pode ser atenuado pelo ajuste de uma ou mais variáveis. Por exemplo, o grau de efeito pró-inflamatório de um determinado oligonucleotídeo pode ser mitigado pela substituição de qualquer número de ligações internucleosídeas de fosfotioato com ligações internu- cleosídeas de fosfodiéster reduzindo, assim, o número total de ligações internucleosídeas de fosforotioato.

[00801] Em determinadas modalidades, seria desejável reduzir o número de ligações fosforotioato, se isso pudesse ser feito sem perder a estabilidade e sem mudar a distribuição do fígado para os rins. Por exemplo, em determinadas modalidades, o número de ligações fosforo- tioato pode ser reduzido, substituindo-se as ligações fosforotioato com ligações fosfodiéster. Em uma modalidade, o composto antissenso tendo menos ligações fosforotioato e mais ligações fosfodiéster pode induzir menos reações pró-inflamatórias ou nenhuma reação pró-inflamatória.Embora o composto antissenso tenha menos ligações fosforo- tioato e mais ligações fosfodiéster, ele pode induzir menos reações pró- inflamatórias, o composto antissenso tendo menos ligações fosforotio- ato e mais ligações fosfodiéster pode não se acumular no fígado e pode ser menos eficaz na mesma dose ou na dose igual , em comparação a um composto antissenso tendo mais ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades é, portanto, desejável projetar um composto antis- senso que tenha várias ligações fosfodiéster e várias ligações fosforoti- oato, mas que possua também estabilidade e boa distribuição no fígado.

[00802] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados se acumulam mais no fígado e menos nos rins do que as contrapartes não conjugadas, até mesmo quando algumas ligações fos- forotioato são substituídas por menos ligações internucleosídicas fosfo- diéster pró-inflamatórias. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados se acumulam mais no fígado e não são tão excretados na urina em comparação com suas contrapartes não conjugadas,até mesmo quando algumas das ligações fosforotioato são substituídas por menos ligações internucleosídicas fosfodiéster pró-inflamatórias. Em determinadas modalidades, o uso de um conjugado permite a concepção de fármacos antissenso mais potentes e melhor tolerados. Com efeito, em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados têm índices terapêuticos maiores do que as contrapartes não conjugadas. Isso permite que o composto antissenso conjugado seja administrado em uma dose absoluta maior, porque há um risco menor de uma resposta pró-inflmatória e menor risco de toxicidade renal. Esta dose maior, permite que a dose tenha uma frequência menor, já que espera-se que o clearance (metabolismo) seja semelhante. Além disso, porque o composto é mais potente, como descrito acima, a concentração pode diminuir antes da próxima dose sem perder a atividade terapêutica, permitindo até mesmo períodos mais longos entre dosagem.

[00803] Em determinadas modalidades, a inclusão de algumas ligações fosforotioato permanece desejável. Por exemplo, as ligações terminaissão vulneráveis às exonucleases e assim, em determinadas modalidades, essas ligações são fosforotioato ou outra ligação modificada. As ligações internucleosídicas que ligam dois desoxinucleosídeos são vulneráveis às endonucleases e assim, em determinadas modalidades, essas ligações são fosforotioato ou outra ligação modificada. As ligações internucleosídicas entre um nucleosídeo modificado e um desoxi- nucleosídeo onde o desoxinucleosídeo está no lado 5' dos desoxinu- cleosídeos da ligação são vulneráveis às endonucleases e assim, em determinadas modalidades, essas ligações são fosforotioato ou outra ligação modificada. As ligações internucleosídicas entre dois nucleosí- deos modificados de determinados tipos e entre um desoxinucleosídeo e um nucleosídeo modificado de deterinado tipo onde o nucleosídeo modificado está no lado 5' da ligação são suficientemente resistentes à digestão pela nuclease, que a ligação pode ser fofodiéster.

[00804] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antis- senso de um composto antissenso conjugado compreende menos de 16 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucle- otídeo antissenso de um composto compreende menos que 15 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso de um composto antissenso conjugado compreende menos de 14 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonu- cleotídeo antissenso de um composto compreende menos que 13 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso de um composto antissenso conjugado compreende menos de 12 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonu- cleotídeo antissenso de um composto antissenso conjugado compreende menos de 11 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso de um composto antissenso conjugado compreende menos de 10 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso de um composto antis- senso conjugado compreende menos de 9 ligações fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso de um composto antissenso conjugado compreende menos de 8 ligações fosforo- tioato.

[00805] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compreendendo um ou mais grupos conjugados descritos aqui aumentaram a atividade e/ou potência e/ou tolerabilidade em comparação com um composto antissenso em que falta um ou mais grupo conjugado. Nesse sentido, em determinadas modalidades, a anexação desses grupos conjugados a um oligonucleotídeo é desejável. Esses grupos conjugados podem ser anexados às extremidades 5'-, e/ou 3' de um oligo- nucleotídeo. Em certos casos, a anexação na extremidade 5'é sinteticamentedesejável. Normalmente, os oligonucleotídeos são sintetizados pela anexação do nucleosídeo terminal 3' a um suporte sólido e acoplamento sequencial de nucleosídeos de 3' a 5' usando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Nesse sentido, se um grupo de conjugado é desejado no terminal 3', é possível (1) anexar o grupo de conjugado ao nucleosídeo do terminal 3' e anexar esse nucleosídeo conjugado ao suporte sólido para preparação subsequente do oligonucleotídeo ou (2) anexar o grupo de conjugado ao nucleosídeo do terminal 3' de um nu- cleosídeo completo após a síntese. Nenhuma dessas abordagens é muito eficiente e, portanto, ambas são caras. Em particular, a anexação do nucleosídeo conjugado ao suporte sólido, demonstrada nos Exemplos deste documento, é um processo ineficiente. Em determinadas modalidades, anexar um grupo de conjugado ao nucleosídeo do terminal 5'é sinteticamente mais fácil do que a anexação na extremidade 3'. É possível anexar um nucleosídeo do terminal 3'não conjugado ao suportesólido e preparar o oligonucleotídeo usando reações padrão e bem caracterizadas. Assim, é necessário apenas anexar um nucleosídeo 5' tendo um grupo de conjugado na etapa final de acoplamento. Em determinadas modalidades, isto é mais eficiente do que a anexação direta de um nucleosídeo conjugado ao suporte sólido, como normalmente é feito para preparar o oligonucleotídeo conjugado em 3'. Os exemplos aqui demonstram anexação na extremidade 5'. Além disso, certos grupos conjugados têm vantagens sintéticas. Por exemplo, certos grupos conjugados compreendendo grupos de ligação de fósforo são sinteticamente mais simples e mais eficientemente preparados do que outros grupos conjugados, incluindo grupos conjugados relatados anteriormente (por exemplo, WO/2012/037254).

[00806] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são administrados a um indivíduo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compreendendo um ou mais grupos conjugados descritos aqui aumentaram a atividade e/ou potência e/ou tolerabilidade em comparação com um composto antissenso sem um ou mais grupo conjugado. Sem vinculação ao mecanismo, acredita-se que o grupo de conjugado ajuda com a distribuição, entrega e/ou absorção em uma célula ou tecido alvo. Em determinadas modalidades, assim que estiver na célula ou tecido alvo, é desejável que todo ou parte do grupo de conjugado seja clivado para liberar o oligonucleotídeo ativo. Em determinadas modalidades, não é necessário que o grupo de conjugado inteiro seja clivado a partir do oligonucleotídeo. Por exemplo, no Exemplo 20, um oligonucleotídeo conjugado foi administrado a camundongos e várias espécies químicas diferentes, sendo que cada uma compreende uma parte diferente do grupo de conjugado restante no oli- gonucleotídeo, foram detectadas (Tabela 23a). Este composto antis- senso conjugado demonstrou boa potência (Tabela 23). Assim, em determinadas modalidades, esse perfil metabólito de várias clivagens parciais do grupo de conjugado não interfere na atividade/potência. No entanto, em determinadas modalidades, é desejável que um profármaco (oligonucleotídeo conjugados) produza um composto ativo único. Em certos casos, se várias formas do composto ativo forem encontradas, pode ser necessário determinar quantidades relativas e atividades para cada um. Em determinadas modalidades em que a revisão da regulamentação é necessária (por exemplo, USFDA ou análogo) é desejável ter uma espécie ativa única (ou predominantemente única). Em determinadas modalidades, é desejável que espécies ativas únicas sejam o oligonucleotídeo antissenso desprovido de qualquer parte do grupo conjugado. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados na extremidade 5'são mais propensos a resultar em metabolismo completo do grupo conjugado. Sem vinculação ao mecanismo, pode ser que as enzimasendógenas responsáveis pelo metabolismo na extremidade 5' (por exemplo, nucleases 5') sejam mais ativas/eficientes do que as con- trapartes 3'. Em determinadas modalidades, os grupos conjugados específicos são mais receptivos a metabolismo de uma espécie ativa única. Em determinadas modalidades, certos grupos conjugados são mais receptivos ao metabolismo do oligonucleotídeo.

D. Antissenso

[00807] Em determinadas modalidades, os compostos oligoméricos da presente invenção são compostos antissenso. Nessas modalidades, o composto oligomérico é complementar ao ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, um ácido nucleico alvo é um RNA. Em determinadas modalidades, um ácido nucleico alvo é um RNA não codifi- cante. Em determinadas modalidades, um ácido nucleico alvo codifica uma proteína. Em determinadas modalidades, um ácido nucleico alvo é selecionado a partir de um mRNA, um pré-mRNA, um microRNA, um RNA não codificante, incluindo um RNA não codificante pequeno e um RNA direcionado pelo promotor. Em determinadas modalidades, os compostos oligoméricos são pelo menos parcialmente complementares a mais de um ácido nucleico alvo. Por exemplo, compostos oligoméricos da presente invenção podem ser imitações de microRNA, que normalmente se ligam a vários alvos.

[00808] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compreendem uma parte tendo uma sequência nucleobásica pelo menos 70% complementar à sequência de nucleobases de um ácido nu- cleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compreendem uma parte que tem uma sequência de nucleobase pelo menos 80% complementar à sequência de nucleobases de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compreendem uma parte que tem uma sequência de nucleobase pelo menos 90% complementar à sequência de nucleobases de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compõem uma parte tendo uma sequência de nucleobase pelo menos 95% complementar à sequência de nucleobases de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compreendem uma parte que tem uma sequência de nucleobase pelo menos 98% complementar à sequência de nucleobases de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso compreendem uma parte que tem uma sequência de nucleobase que é 100% complementar à sequência de nucleobases de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 100% complementares à sequência de nucleobases de um ácido nucleico alvo em todo o comprimento do composto antissenso.

[00809] Os mecanismos antissenso incluem qualquer mecanismo que envolva a hibridação de um composto oligoméricos com ácido nu- cleico alvo, em que a hibridização resulta em um efeito biológico. Em determinadas modalidades, esses resultados de hibridação na degradação do ácido nucleico alvo ou na ocupação com inibição ou estimulação concomitantes da maquinaria celular envolvendo, por exemplo, tradução, transcrição ou poliadenilação do ácido nucleico alvo ou de um ácido nucleico com o qual o ácido nucleico alvo pode, de outro modo, interagir.

[00810] Um tipo de mecanismo antissenso envolvendo a degradação do RNA alvo é antissenso mediado por RNase H. RNase H é uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um duplex de DNA. É conhecido na técnica que os compostos antissenso de fita única que são "similares ao DNA" eliciam atividade de RNase H nas células de mamíferos. A ativação de RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA alvo, aumentando, assim, a eficiência da inibição mediada por oli- gonucleotídeo similar ao DNA da expressão do gene.

[00811] Os mecanismos antissenso também incluem, sem limiação, mecanismos de RNAi, que utilizam a via RISC. Esses mecanismos de RNAi incluem, sem limitação, mecanismos de siRNA, ssRNA e mi- croRNA. Esses mecanismos incluem a criação de um mímico de mi- croRNA e/ou anti-microRNA.

[00812] Mecanismos antissenso incluem também, sem limitação, mecanismos que hibridizam ou mímico de RNA não codificante diferente do microRNA ou mRNA. Esse RNA não codificante inclui, entre outros, RNA direcionado ao promotor e RNA curto e longo que dar efeito à transcrição ou tradução de um ou mais ácidos nucleicos.

[00813] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem conjugados aqui descritos são compostos de RNAi. Em determinadas modalidades, oligonucleotídeos oligoméricos que compreendem conjugados aqui descritos são compostos de ssRNA. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem conjugados aqui descritos são emparelhados com um segundo composto oligomérico para formar um siRNA. Em algumas dessas modalidades, o segundo composto oligomérico também compreende um conjugado. Em determinadas modalidades, o segundo composto oligomérico é qualquer ácido nucleico modificado ou não modificado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem conjugados aqui descritos são uma fita antissenso em um composto de siRNA. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem os conjugados aqui descritos são uma fita senso em um composto de siRNA. Em modalidades em que o composto oligomérico conjugado é siRNA de fita dupla, o conjugado pode estar na fita senso, na fita antis- senso ou na fita senso e na fita antissenso.

Apolipoproteína C-III (apoCIII)

[00814] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados se direcionam a qualquer ácido nucleico de ApoCIII. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico alvo codifica uma proteína alvo ApoCIII que é clinicamente relevante. Nessas modalidades, a modulação do ácido nucleico alvo resulta em benefício clínico.

[00815] O processo de direcionamento inclui, geralmente, determinação de pelo menos uma região, segmento ou sítio alvo no ácido nucleico alvo para que a interação antissenso ocorra de modo que resulte no efeito desejado.

[00816] Em determinadas modalidades, uma região alvo é uma região estruturalmente definida do ácido nucleico. Por exemplo, nessas modalidades, uma região alvo pode abranger UTR 3', UTR 5', um éxon, um íntron, uma região codificante, uma região de iniciação da tradução, região de término de tradução ou outra região ou definida de ácido nu- cleico ou segmento alvo.

[00817] Em determinadas modalidades, um segmento alvo é pelo menos uma parte de cerca de 8 nucleobases de uma região alvo ao qual o composto antissenso conjugado se direciona. Os segmentos-alvo podem incluir sequências de DNA ou RNA que compreendem pelo menos 8 nucleobases consecutivas do terminal 5' de um dos segmentos-alvo (sendo que as nucleobases remanescentes são um trecho consecutivo do mesmo DNA ou RNA iniciando imediatamente a montante do terminal 5' do segmento-alvo e continuando até o DNA ou o RNA que compreende cerca de 8 a cerca de 30 nucleobases). Segmentos-alvo também são representados por sequências de DNA ou RNA que compre-endem pelo menos 8 nucleobases consecutivos de terminal 3' de um dos segmentos-alvo (sendo que as nucleobases remanescentes são um trecho consecutivo do mesmo DNA ou RNA iniciando imediatamente a jusante do terminal 3' do segmento-alvo e continuando até o DNA ou o RNA que compreende cerca de 8 a 30 nucleobases). Segmentos-alvo também são representados por sequências de DNA ou RNA que compreendem pelo menos 8 nucleobases consecutivas de uma parte interna da sequência de um segmento-alvo e pode se estender em ambas as direções até o composto antissenso conjugado que compreende cerca de 8 a 30 nucleobases.

[00818] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso direcionados ao ácido nucleico de ApoCIII podem ser modificados conforme descrito aqui. Em determinadas modalidades, os compostos an- tissenso podem ter uma porção de açúcar modificado, uma porção de açúcar não modificado ou uma mistura de frações de açúcar modificado e não modificado conforme descrito aqui. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso podem ter uma ligação de inter- nucleosídeo modificado, uma ligação de internucleosídeo não modificado ou uma ligação de internucleosídeo modificado e não modificado conforme descrito aqui. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso podem ter uma nucleobase modificada, uma nucleobase não modificada ou uma mistura de nucleobases modificadas e não modificadas conforme descrito aqui. Em determinadas modalidades, os compostos antissenso podem ter um motivo, conforme descrito aqui.

[00819] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso direcionados aos ácidos nucleicos de ApoCIII podem ser conjugados conforme descrito aqui.

[00820] ApoCIII é um constituinte do HDL e de lipoproteínas ricas em triglicerídeos (TG). Níveis elevados de ApoCIII estão associados a níveis de TG elevados e a doenças como doença cardiovascular, sín- drome metabólica, obesidade e diabetes. Os níveis de TG elevados estão associados à pancreatite. ApoCIII retarda a clearance de lipoproteí- nas ricas em TG pela inibição de lipólise por meio da inibição da lipo- proteína lipase (LPL) e por meio da interferência com a lipoproteína que se liga à matriz de glicosaminoglicano da superfície celular. Compostos antissenso que direcionam a ApoCIII foram previamente divulgados em WO2004/093783 e WO2012/149495, incorporados a este documento por referência na sua totalidade.

Certos Compostos Antissenso Conjugados Direcionados a um Ácido Nucleico da ApoCIII

[00821] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados são direcionados a um ácido nucleico de ApoCIII tendo sequência do N° de Acesso GENBANK® NM_000040.1 (incorporado a este documento como SEQ ID NO: 1); Acesso GENBANK NT_033899.8 truncado a partir de nucleotídeos 20262640 a 20266603 (incorporados aqui como SEQ ID NO: 2); e N° de Acesso GENBANK NT_035088.1 trucado a partir dos nucleotídeos 6238608 a 6242565 (incorporado a este documento como SEQ ID NO: 3). Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado é pelo menos 90%, pelo menos, 95% ou 100% complementar à SEQ ID NOs: 1-3.

[00822] Em determinadas modalidades, um composto antissenso conjugado direcionado à SEQ ID NO: 1 compreende uma sequência de pelo menos 8 nucleobases consecutivas da SEQ ID NO: 87. Em deter-minadas modalidades, um composto antissenso conjugado direcionado à SEQ ID NO: 1 compreende uma sequência de nucleobase da SEQ ID NO: 87. Tabela A: Compostos Antissenso direcionados à SEQ ID NO da ApoCIII: 1

Indicações Terapêuticas da ApoCIII

[00823] Em determinadas modalidades, a invenção provê métodos para o uso de um composto antissenso conjugado direcionado a um ácido nucleico da ApoCIII para modular a expressão da ApoB em um indivíduo. Em determinadas modalidades, a expressão da ApoCIII é reduzida.

[00824] Em determinadas modalidades, a invenção provê métodos para o uso de um composto antissenso conjugado direcionado a um ácido nucleico da ApoCIII em uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo. Em determinadas modalidades, o indivíduo tem doença, distúrbio ou condição cardiovascular e/ou metabólica. Em determinadas modalidades, o indivíduo tem hipertrigliceridemia, hiper- trigliceridemia não familiar, hipertrigliceridemia familiar, hipertrigliceride- mia familiar heterozigótica, hipertrigliceridemia familiar homozigótica, dislipidemia mista, aterosclerose, risco de desenvolver aterosclerose, doença coronariana, histórico de doença coronariana, início precoce de doença coronariana, um ou mais fatores de risco para doença coronari- ana, diabetes tipo II, diabetes tipo II com dislipidemia, dislipidemia, hi- pertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperacidemia, esteatose hepática, esteatose hepática não alcoólica e/ou doença hepática gordurosa não alcoólica.

[00825] Em determinadas modalidades, a invenção provê métodos para o uso de um composto antissenso conjugado direcionado a um ácido nucleico da ApoCIII na preparação de um medicamento.

Certos Conjugados GalNAc de Ácido Nucleico

[00826] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso conjugados compreendem compostos antissenso com sequência de nu- cleobases e modificações químicas dos compostos antissenso na Ta-bela abaixo anexada ao conjugado de GalNAc. Todas as ligações inter- nucleosídeas são ligações internucleosídeas de fosforotioato, salvo indicação em contrário. Um subscrito 'l" indica um nucleosídeo bicíclico de LNA. Um subscrito "d" indica um nucleosídeo 2'-desóxi. Um subscrito "e" indica um nucleosídeo modificado 2'-MOE. Um "V" indica 2-amino- 2'-desoxiadenosina. Tabela B

F. Certas Composições Farmacêuticas

[00827] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornececomposições farmacêuticas que compreendem um ou mais compostos antissenso. Em determinadas modalidades, essa composição farmacêutica compreende um diluente ou transportador farmaceutica- mente aceitável adequado. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma solução salina estéril e um ou mais compostos antissenso. Em determinadas modalidades, essa composição farmacêutica consiste em uma solução salina estéril e em um ou mais compostos antissenso. Em determinadas modalidades, a solução salina é uma solução salina de qualidade farmacêutica. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais compostos antissenso e água estéril. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica consiste em um ou mais compostos antis- senso e em água estéril. Em determinadas modalidades, a solução salina estéril é uma solução salina de qualidade farmacêutica. Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um ou mais compostos antissenso e solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica consiste em um ou mais compostos antissenso e solução salina tampo- nada com fosfato (PBS). Em determinadas modalidades, a solução salina estéril é uma PBS de qualidade farmacêutica.

[00828] Em determinadas modalidades, os compostos antissenso podem ser misturados com substâncias ativas e/ou inertes farmaceuti- camente aceitáveis para a preparação de composições e formulações farmacêuticas. As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas irão depender de vários critérios, incluindo, entre outros, via de administração, extensão da doença, ou dose a ser administrada.

[00829] As composições farmacêuticas que compreendem compostos antissenso englobam quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres ou sais desses ésteres. Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas que compreendem compostos antissenso compreendem um ou mais oligonucleotídeos que, após administração a um animal, incluindo um ser humano, são capazes de proporcionar (direta ou indiretamente) o metabólito biologicamente ativo ou seu resíduo. Assim, por exemplo, a divulgação é concebida também para sais farma- ceuticamente aceitáveis dos compostos antissenso, profármacos, sais farmaceuticamente aceitáveis desses profármacos e outros bioequiva- lentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, entre outros, sais de sódio e de potássio.

[00830] Um profármaco pode incluir a incorporação de nucleosídeos adicionais em uma ou em ambas as extremidades de um oligonucleotí- deo que são clivados por nucleases endógenas dentro do corpo, para formar o oligonucleotídeo antissenso ativo.

[00831] Frações lipídicas estão sendo utilizadas em terapias de ácido nucleico em vários métodos. Em alguns desses métodos, o ácido nu- cleico é introduzido em lipossomas pré-formados ou lipoplexos feitos de misturas de lípidos catiônicos e lípidos neutros. Em determinados métodos, os complexos de DNA com lipídios mono ou policatiônicos são formados sem a presença de um lípido neutro. Em determinadas modalidades, uma porção lipídica é selecionada para aumentar a distribuição de um agente farmacêutico para uma célula ou tecido específico. Em determinadas modalidades, uma porção lipídica é selecionada para aumentar a distribuição de um agente farmacêutico para um tecido adiposo. Em determinadas modalidades, uma porção lipídica é selecionada para aumentar a distribuição de um agente farmacêutico para um tecido muscular.

[00832] Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas aqui previstas compreendem um ou mais oligonucleotídeos modificados e um ou mais excipientes. Em determinadas modalidades, os excipientes são selecionados a partir da água, soluções salinas, álcool, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilase, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose e polivinilpir- rolidona.

[00833] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica aqui prevista compreende um sistema de distribuição. Exemplos de sistemas de entrega incluem, entre outros, lipossomas e emulsões. Certos sistemas de entrega são úteis para a preparação de certas composições farmacêuticas, incluindo aquelas que compreendem compostos hidrofóbicos. Em determinadas modalidades, certos solventes orgânicos, como dimetilsulfóxido são usados.

[00834] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica aqui prevista compreende uma ou mais moléculas de entrega específicas do tecido destinadas a entregar um ou mais agentes farmacêuti-cos da presente divulgação aos tecidos ou aos tipos de células específicas. Por exemplo, em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas incluem lipossomas revestidos com um anticorpo específico para o tecido.

[00835] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica aqui prevista compreende um sistema de co-solvente. Alguns desses sistemas de cossolvente compreendem, por exemplo, álcool benzí- lico, um surfactante não polar, um polímero orgânico miscível em água e uma fase aquosa. Em determinadas modalidades, estes sistemas cos- solventes são utilizados para compostos hidrofóbicos. Um exemplo não limitante desse sistema cossolvente é o sistema cossolvente VPD, o qual é uma solução absoluta de etanol compreendendo 3% w/v de álcoolbenzílico, 8% w/v de surfactante não polar Polissorbato 80™ e 65 % w/v de polietilenoglicol 300. As proporções desses sistemas co-sol- ventes podem variar consideravelmente sem alterar significativamente as suas características de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade dos componentes co-solventes pode variar: por exemplo, outros surfactantes podem ser utilizados ao invés do Polissorbato 80™; o tamanho da porção de polietilenoglicol pode variar; outros polímeros bi- ocompatíveis podem substituir o polietilenoglicol, por exemplo, polivinil pirrolidona; e outros açúcares ou polissacáridos podem substituir a dextrose.

[00836] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica aqui prevista é preparada para administração oral. Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas são preparadas para administração bucal.

[00837] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêuticaé preparada para administração por injeção (por exemplo, intravenosa,subcutânea, intramuscular, etc.). Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um transportador e é formulada em solução aquosa, como água ou tampões fisiologicamente compatíveis como solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão de solução salina fisiológica. Em determinadas modalidades, são incluídos outros ingredientes (por exemplo, ingredientes que ajudam na solubilidade ou que servem de conservantes). Em determinadas modalidades, as suspensões injetáveis são preparadas usando transportadores líquidos apropriados, agentes de suspensão e similares. São apresentadas certas composições farmacêuticas para injeção em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas. Certas composições farmacêuticas para injeção são suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alguns solventes adequados para utilização em composições farmacêuticas para injeção incluem, entre outros, solventes lipofí- licos e óleos graxos, como óleo de sésamo, ésteres de ácidos graxos sintéticos, como oleato de etila ou triglicerídeos e lipossomas. As suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, essas suspensões também podem conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos agentes farmacêuticos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00838] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêuticaé preparada para administração transmucosa. Em determinadas modalidades, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[00839] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica aqui prevista compreende um oligonucleotídeo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em determinadas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas de uma doença ou prolongar a sobrevivência do indivíduo a ser tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficazestá bem dentro da capacidade dos versados na técnica.

[00840] Em determinadas modalidades, um ou mais oligonucleotí- deos modificados aqui previstos são formulados como um profármaco. Em determinadas modalidades, mediante administração in vivo, um pro- fármaco é quimicamente convertido em uma forma biologicamente, far- maceuticamente ou terapeuticamente mais ativa de um oligonucleotí- deo. Em determinadas modalidades, os profármacos são úteis porque são mais fáceis de serem administrados do que a forma ativa correspondente. Por exemplo, em alguns casos, um profármaco pode ser mais biodisponível (por exemplo, através de administração por via oral) do que a forma ativa correspondente. Em certos casos, um profármaco pode ter solubilidade melhorada em comparação com a forma ativa correspondente. Em determinadas modalidades, os profármacos são menos solúveis em água do que a forma ativa correspondente. Em certos casos, esses profármacos possuem transmissão superior, através das membranas celulares, onde a solubilidade em água é prejudicial para a mobilidade. Em determinadas modalidades, um profármaco é um éster. Em algumas dessas modalidades, o éster é metabolicamente hi- drolisado em ácido carboxílico após administração. Em certos casos, o ácido carboxílico que contém composto é a forma ativa correspondente. Em determinadas modalidades, um profármaco compreende um peptí- deo curto (poliaminoácido) ligado a um grupo ácido. Em determinadas modalidades, o peptídeo é clivado após a administração de modo a formar a forma ativa correspondente.

[00841] Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece composições e métodos para reduzir a quantidade ou a atividade de um ácido nucleico alvo numa célula. Em determinadas modalidades, a cé-lulaestá em um animal. Em determinadas modalidades, o animal é um mamífero. Em determinadas modalidades, o animal é um roedor. Em determinadas modalidades, o animal é um primata. Em determinadas modalidades, o animal é um primata não humano. Em determinadas modalidades, o animal é um ser humano.

[00842] Em determinadas modalidades, a presente divulgação fornecemétodos de administração de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo da presente divulgação a um animal. Vias de administração adequadas incluem, entre outras, oral, retal, transmucosa, intestinal, entérica, tópica, por supositório, através de inalação, por via intratecal, intracerebroventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intratumoral, e parentérica (por exemplo, intravenosa, intramuscular, intramedular, e subcutânea). Em determinadas modalidades, intratecais farmacêuticas são administradas para atingir exposições locais ao invés de sistêmicas. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser injetadas diretamente na área de efeito desejado (por exemplo, no fígado).

Divulgação não limitante e incorporação por referência

[00843] Enquanto determinados compostos, composições e métodos descritos aqui foram descritos com especificidade em conformidade com determinadas modalidades, os exemplos a seguir servem apenas para ilustrar os compostos descritos aqui e não se destinam a limitar o mesmo. Cada referência, número de acesso GenBank, e similares, citados no presente pedido de patente, são incorporados por referência na sua totalidade.

[00844] Embora a listagem de sequências que acompanha este depósito identifique cada sequência como "RNA" ou "DNA" conforme necessário, na realidade, essas sequências podem ser modificadas com qualquer combinação de modificações químicas. Os versados na técnica apreciarão de imediato que essa designação "RNA" ou "DNA" para descrever oligonucleotídeos modificados é, em certos casos, arbitrária. Por exemplo, um oligonucleotídeo que compreende um nucleosídeo compreendendo uma porção de açúcar 2'-OH e uma base timina poderia ser descrito como um DNA que possui um açúcar modificado (2'-OH para 2'-H natural do DNA) ou como um RNA que possui uma base modificada (timina (uracila metilada) para uracila natural do RNA).

[00845] Por conseguinte, as sequências de ácido nucleico aqui providas, incluindo, entre outros, aquelas na listagem de sequência, destinam-se a englobar ácidos nucleicos com qualquer combinação de RNA e/ou DNA natural ou modificada, incluindo, entre outros, esses ácidos nucleicos modificados com nucleobases modificadas. A título de exemplo e sem limitação, um oligonucleotídeo com uma sequência de nu- cleobases "ATCGATCG" engloba quaisquer oligonucleotídeos com essa sequência de nucleobases, modificada ou não modificada, incluindo, entre outros, esses compostos que compreendem bases do RNA, como aquelas com uma sequência "AUCGAUCG "e aquelas que possuem algumas bases de DNA e algumas bases de RNA, como "AUCGATCG " e oligonucleotídeos com outras bases modificadas, como "ATmeCGAUCG," onde meC indica uma base de citosina que com-preende um grupo metila na posição 5.

EXEMPLOS

[00846] Os exemplos a seguir ilustram determinadas modalidades da presente divulgação e não são limitantes. Além disso, se modalidadesespecíficas forem providas, os inventores contemplaram um pedido genérico dessas modalidades específicas. Por exemplo, a divulgação de um oligonucleotídeo que tem um motivo específico provê suporte razoável para oligonucleotídeos adicionais que têm o mesmo motivo ou motivo semelhante. E, por exemplo, se uma modificação específica de alta afinidade surgir em uma posição específica, outras modificações de alta afinidade na mesma posição são consideradas adequadas, salvo indicação contrária. Exemplo 1: Método Geral para a Preparação de Fosforamiditos, Compostos 1, 1a e 2

[00847] Os compostos 1, 1a e 2 foram preparados de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica, descritos na especificação aqui contida (ver Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554).; e também publicado nos Pedidos Internacionais PCT (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 e WO 2007/090071) e patente US N° 7569686). Exemplo 2: Preparação do Composto 7

[00848] Os compostos 3 (2-acetamida-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-desó- xi-β-Dgalactopiranose ou galactosamina pentaacetato) estão comercialmentedisponíveis. O composto 5 foi preparado de acordo com procedimentos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692). Exemplo 3: Preparação do Composto 11

[00849] Os compostos 8 e 9 estão comercialmente disponíveis. Exemplo 4: Preparação do Composto 18

[00850] O composto 11 foi preparado de acordo com os procedi- mentos ilustrados no Exemplo 3. O composto 14 está comercialmente disponível. O composto 17 foi preparado usando procedimentos simila- res relatados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808. Exemplo 5: Preparação do Composto 23

[00851] Os compostos 19 e 21 estão comercialmente disponíveis. Exemplo 6: Preparação do Composto 24

[00852] Os compostos 18 e 23 foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 4 e 5. Exemplo 7: Preparação do Composto 25

[00853] O composto 11 foi preparado de acordo com os procedi- mentos ilustrados no Exemplo 6. Exemplo 8: Preparação do Composto 26 O composto 24 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 6. Exemplo 9: Preparação geral de ASOs conjugados compreendendo GalNAc3-1 no terminal 3', Composto 29

[00854] onde GalNAc3-1 protegida tem a estrutura:

[00855] A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-1 (GalNAc3-1a) pode ser combinada com qualquer porção cli- vável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Onde Gal- NAc3-1um tem a fórmula:

[00856] O suporte sólido ligou GalNAc3-1 protegida, Composto 25, foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 7. Composto 29 oligomérico compreendendo GalNAc3-1 no terminal 3' foi preparado utilizando procedimentos padrão em síntese de DNA/RNA automatizado (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Blocos de construção de fosforamidita, Compostos 1 e 1a foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 1. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pre-tendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforami- dita podem ser utilizados para preparar compostos oligoméricos com uma sequência e composição predeterminada. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos com lacunas como descrito aqui. Esses compostos oligoméricos lacunados podem ter uma composição predeterminada e uma sequência de base mencionada por um determi-nado alvo.

[00857] Exemplo 10: Preparação geral de ASOs conjugados

[00858] O UnylinkerTM 30 encontra-se disponível comercialmente. Composto Oligomérico 34 compreendendo um agrupamento GalNAc3- 1 no terminal 5'é preparado utilizando procedimentos padrão em síntese de DNA/RNA automatizado (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Blocos de construção de fosforamidita, Compostos 1 e 1a foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 1. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamidita podem ser utilizados para preparar compostos oligoméricos com uma sequência e composição predeterminada. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos com lacunas como descrito aqui. Esses compostos oligoméricos lacunados podem ter uma composição predeterminada e uma sequência de base mencionada por um determinado alvo. Exemplo 11: Preparação do Composto 39

[00859] Os compostos 4, 13 e 23 foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 2, 4 e 5. Composto 35 é pre-parado utilizando processos semelhantes publicados em Rouchaud et al., Eur. J. Org. Chem., 2011, 12, 2346-2353. Exemplo 12: Preparação do Composto 40

[00860] O composto 38 é preparado de acordo com os procedimen- tos ilustrados no Exemplo 11.

[00861] Exemplo 13: Preparação do Composto 44

[00862] Os compostos 23 e 36 são preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos exemplos 5 e 11. Composto 41 é preparado utilizando processos semelhantes publicados em WO 2009082607. Exemplo 14: Preparação do Composto 45

[00863] O composto 43 é preparado de acordo com os procedimen- tos ilustrados no Exemplo 13. Exemplo 15: Preparação do Composto 47

[00864] O composto 14 está comercialmente disponível. Exemplo 16: Preparação do Composto 53

[00865] Os compostos 48 e 49 estão comercialmente disponíveis. Os compostos 17 e 47 são preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 4 e 15. Exemplo 17: Preparação do Composto 54

[00866] O composto 53 é preparado de acordo com os procedimen- tos ilustrados no Exemplo 16. Exemplo 18: Preparação do Composto 55

[00867] O compsto 53 é preparado procedimentos ilustrados no Exemplo 16.

Exemplo 19: Método geral para a preparação de ASOs conjugados compreendendo GalNAc3-1 na posição 3' por meio de técnicas em fase sólida (preparação de ISIS 647535, 647536 e 651900)

[00868] Salvo indicação em contrário, todos os reagentes e soluções utilizadas para a síntese dos compostos oligoméricos são adquiridas de fontes comerciais. Blocos de construção de fosforamidita padrão e suporte sólido são usados para a incorporação de resíduos de nucleo- sídeos que incluem, por exemplo, T, A, G, e resíduos mC. Uma solução de fosforamidita a 0,1 M em anidro acetonitrila foi utilizada para β-D-2'- desoxirribonucleosídeo e 2'-MOE.

[00869] As sínteses ASO foram realizadas em sintetizador ABI 394 (escala de 1-2 μmol) ou em sintetizador oligopiloto GE Healthcare Bioscience ÃKTA (escala de 40-200 μmol) pelo método de acoplamento de fosforamidita em suporte sólido VIMAD carregado de GalNAc3-1 (110 μmol/g, Guzaev et al., 2003) empacotada na coluna. Para a etapa de acoplamento, as fosforamiditas foram entregues 4 vezes em excesso sobre a carga sobre o suporte sólido e a condensação de fosforamidita foi realizada por 10 min. Todas as outras etapas seguiram os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante. Uma solução de ácido dicloroacético a 6% em tolueno foi utilizada para remover o grupo de dimetoxitritilo (DMT) do grupo 5'-hidroxila do nucleotídeo. 4,5-Dicianoimidazol (0,7 M) em anidro CH3CN foi usado como ativador passo durante a etapa de acoplamento. As ligações de fosforotioato foram introduzidas por sulfu- rização com solução a 0,1 M de hidreto de xantano em piridina/CH3CN 1:1 para um tempo de contato de 3 minutos. Uma solução de 20% terc- butilhidroperóxido em CH3CN contendo 6% de água foi utilizada como um agente oxidante para prover ligações internucleosídeas de fosfodié- ster com um tempo de contato de 12 minutos.

[00870] Depois da sequência desejada foi montada, os grupos prote- tores de cianoetil fosfato foram desprotegidos utilizando uma mistura 1:1 (v/v) de uma mistura de trietilamina e acetonitrila, com um tempo de contato de 45 minutos. ASOs de ligação de suporte sólido foram suspensos em amônia aquosa (28-30% em peso) e aquecidos a 55°C por 6 h.

[00871] Os ASOs não ligados foram então filtrados e a amônia foi fervida. O resíduo foi purificado por cromatografia líquida de alta pressão numa coluna de troca aniônica forte (GE Healthcare Bioscience, Fonte 30Q, 30 μm, com 2,54 x 8 cm, A = 100 mM acetato de amônia em 30% de CH3CN aquoso, B = 1,5 M de NaBr, em A, 0-40% de B em 60 min, fluxo 14 mL min-1, À = 260 nm). O resíduo foi dessalinizado por HPLC numa coluna de fase inversa para produzir ASOs desejados com um rendimento isolado de 15-30% com base na carga inicial sobre o suporte sólido. ASOs foram caracterizados pela análise MS acoplado íon-par-HPLC com sistema Agilent 1100 MSD.

[00872] Os oligonucleotídeos antissenso que não compreendem um conjugado foram sintetizados utilizando procedimentos de síntese de oligonucleotídeos convencionais bem conhecidos na técnica.

[00873] Usando esses métodos, três compostos antissenso separados que direcionam à ApoC III estavam preparados. Como resumido na Tabela 17 abaixo, três compostos antissenso que direcionam à ApoC III tinham a mesma sequência de nucleobases; ISIS 304801 é um gapmer 5-10-5 MOE com todas as ligações de fósforotioato; ISIS 647535 é o mesmo que ISIS 304801, salvo se tinha GalNAc3-1 conjugada na extremidade 3'; e ISIS 647536 é o mesmo que ISIS 647535 salvo se determinadas ligações internucleosídeas desse composto forem ligações de fosfodiéster. Como resumido ainda na Tabela 17, dois compostos antis- senso separados que direcionam SRB-1 foram sintetizados. ISIS 440762 foi um gapmer 2-10-2 cEt com todas as ligações internucleosídeas de fósforotioato; ISIS 651900 é o mesmo que ISIS 440762, exceto que se incluiu uma GalNAc3-1 na sua extremidade 3'. Tabela 17 ASO Modificado direcionando ApoC III e SRB-1

[00874] Subscritos: "e" indica nucleosídeo modificado de 2’-MOE; "d" indica β-D-2’-desoxirribosenucleosideo; "k" indica 6’-(S) -CH3 nucleo- sídeo bicíclico (por exemplo cEt); "s" indica ligações de internucleosídeo de fosforotioato (PS); "o" indica ligações de internucleosídeo de fosfodi- éster (PO); e "o’" indica -O-P(=O)(OH)-. Subscrito "m" indica 5-metilci- tosinas. "GalNAc3-1" indica um grupo de conjugado tendo a estrutura mostrada anteriormente em Exemplo 9. Observar que GalNAc2-1 compreende uma adenosina clivável que liga a ASO para o restante do conjugado que é nomeado 'GalNAc3-1a."Esta nomenclatura é usada na tabela acima, para mostrar a sequência de nucleobases completo, incluindo a adenosina, que faz parte do conjugado. Sendo assim, na tabela acima, as sequências também poderiam ser listadas como terminando com "GalNAc3-1"com o "Ado"omitido. Esta convenção de uso do subscrito "a" para indicar a parte de um grupo de conjugado desprovido de nucleosídeo clivável ou porção clivável é usada nesses Exemplos. Esta parte de um grupo de conjugado desprovido de porção clivá- vel é denominada "agrupamento" ou "agrupamento conjugado" ou agrupamento "GalNAc3". Em determinados casos, é conveniente descrever um grupo de conjugado apresentando, separadamente, seu agrupamento e sua porção clivável.

Exemplo 20: Inibição antissenso dependente de dose de ApoC III humana em camundongos transgênicos huApoC III

[00875] ISIS 304801 e ISIS 647535, cada um direcionando ApoC III humana e descrita acima, foram testados separadamente e avaliados em um estudo dependente da dose para sua capacidade de inibir ApoC III humana em camundongos transgênicos ApoC III humana.

Tratamento

[00876] Camundongos transgênicos ApocIII humana foram mantidos num ciclo de luz/escuro de 12 horas e foram alimentados ad libitum Teklad lab Chow. Os animais foram aclimatados por pelo menos 7 dias no centro de investigação antes do início do experimento. ASOs foram preparados em PBS e esterilizados pela filtração através de um filtro de 0,2 mícron. ASOs foram dissolvidos em PBS 0,9% para injeção.

[00877] ApoC III humana de camundongos transgênicos foram injetada por via intraperitoneal uma vez por semana por duas semanas com ISIS 304801 ou 647535 em 0,08, 0,25, 0,75, 2,25 ou 6,75 μmol/kg ou com PBS como controle. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Quarenta e oito horas após a administração da última dose, foi retirado sangue de cada camundongo e os camundongos foram sacrificados e os tecidos foram coletados.

Análise de ApoC III mRNA

[00878] Os níveis de mRNA de ApoC III nos fígados dos camundongos foram determinados usando PCR em tempo real e reagente de quantificação RIBOGREEN® RNA (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de ApoC III foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de ApoC III para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS". A metade da dosagem máxima eficaz (ED50) de cada ASO é também apresentada na Tabela 18, abaixo.

[00879] Como ilustrado, ambos os compostos antissenso reduziram o RNA da ApoC III em relação ao controle com PBS. Adicionalmente, o composto antisenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 647535) foi signifi- cativamente mais pontente do que o composto antisenso que não possui o conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Tabela 18 Efeito do tratamento de ASO nos níveis de mRNA de ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana

Análise da Proteína ApoC III (Ensaio Turbidométrico)

[00880] Análise da proteína ApoC III do plasma foi determinada usando procedimentos relatados por Graham et al, Circulation Research, publicado online antes da impressão em 29 de março de 2013.

[00881] Cerca de 100 μl de plasma isolado de camundongos foram analisados sem diluição, usando um Analisador Clínico Olympus e um ensaio de ApoC III turbidométrico comercialmente disponível (Kamiya, Cat N° KAI-006, Kamiya biomédica, Seattle, WA). O protocolo do ensaio foi realizado como descrito pelo fornecedor.

[00882] Como mostrado na Tabela 19 abaixo, ambos os compostos antissenso reduziram a proteína ApoC III em relação ao controle com PBS. Adicionalmente, o composto antisenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 647535) foi significativamente mais pontente do que o composto antisenso que não possui o conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Tabela 19 Efeito do tratamento de ASO nos níveis da proteína do plasma ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana

[00883] Triglicerídeos e colesterol do plasma foram extraídos pelo método de Bligh e Dyer (Bligh, E.G. e Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol 37: 911-917, 1959)(Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959)(Bligh, E and Dyer, W, Can J Biochem Physiol, 37, 911-917, 1959) e medidos pelo uso do analisador clínico Beckmann Coulter e reagentes comercialmente disponíveis.

[00884] Os níveis de triglicerídeo foram medidos em relação aos camundongos injetados com PBS e são indicadas como "% PBS". Os resultadossão apresentados na Tabela 20. Como ilustrado, ambos os compostos antissenso reduziram os níveis de triglicerídeo. Adicionalmente, o composto antisenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 647535) foi significativamente mais pontente do que o composto antisenso que não possui o conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Tabela 20 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de triglicerídeo em camundongos transgênicos

[00885] As amostras de plasma foram analisadas por HPLC para determinar a quantidade de colesterol total e as diferentes frações de colesterol (HDL e LDL). Os resultados são apresentados nas Tabelas 21 e 22. Como ilustrado, ambos os compostos antissenso reduziram os níveis de colesterol total; ambos reduziram o LDL; e ambos aumentaram o HDL. Adicionalmente, o composto antisenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 647535) foi significativamente mais pontente do que o composto antisenso que não possui o conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Um aumento nos níveis de HDL e uma diminuição nos níveis de LDL é um efeito benéfico cardiovascular de inibição antissenso de ApoC III. Tabela 21 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de colesterol total em camun dongos transgênicos Tabela 22 Efeito do tratamento de ASO em níveis de colesterol HDL e LDL em camundongos transgênicos

Análise Farmacocinética (PK)

[00886] A PK do ASO também foi avaliada. As amostras de fígado e de rim foram picadas e extraídas utilizando protocolos convencionais. As amostras foram analisadas em MSD1 utilizando IP-HPLC-MS. O nível do tecido (μg/g) de comprimento total e ISIS 304801 e 647535 foi medido e os resultados estão apresentados na Tabela 23. Como ilustrado, as concentrações do fígado dos compostos antissenso totais de comprimento completo eram semelhantes para os dois compostos an- tissenso. Assim, mesmo que o composto antissenso conjugado de <g id="5841">GalNAc<g id="5842">3</g>-1</g> seja mais ativo no fígado (como demonstrado pelos dados do RNA e da proteína acima), ele não está presente em concentrações substancialmente elevadas no fígado. De fato, o EC50 calculado (apresentado na Tabela 23) confirma que o aumento observado na potência do composto conjugado não pode ser inteiramente atribuído ao aumento do acúmulo. Este resultado sugere que o conjugado melhorou a potência por um mecanismo diferente da acumulação no fígado sozinho, possivelmente pela melhoria da absorção produtiva do composto antissenso nas células.

[00887] Os resultados também mostram que a concentração do composto antissenso conjugado GalNAc3-1no rim é menor do que o do composto antissenso desprovido do conjugado de GalNAc. Há várias implicações terapêuticas benéficas. Para indicações terapêuticas em que não se busca a atividade no rim, a exposição do rim arrisca a toxi-cidade renal, sem benefício correspondente. Além disso, a alta concentração no rim geralmente resulta na perda do composto na urina resultando em uma depuração mais rápida Portanto, para alvos não renais, o acúmulo no rim não é desejado. Estes conjugados sugerem que a conjugação GalNAc3-1 reduz a acumulação nos rins. Tabela 23 Análise PK do tratamento com ASO em camundongos transgênicos

[00888] Os metabólitos de ISIS 647535 também foram identificados e suas massas foram confirmadas pela análise de espectrometria de massa de alta resolução. Os locais de clivagem e as estruturas dos me- tabólitos observados são mostrados abaixo. % relativa de ASO de comprimento completo foi calculado utilizando procedimentos convencionais e os resultados são apresentados na Tabela 23a. O metabólito principal de ISIS 647535 foi ASO de comprimento completo desprovido do conjugado inteiro (ou seja, ISIS 304.801), que resulta da clivagem no sítio de clivagem A, mostrado abaixo. Além disso, metabólitos adicionais resultantes de outros sítios de clivagem também foram observados. Estes resultados sugerem que a introdução de outras ligações cliváveis como ésteres, peptídeos, dissulfuretos, fosforamidatos ou acil-hidrazonas entre o açúcar GalNAc3-1 e ASO, que podem ser clivados pelas enzimas dentro da célula, ou que podem clivar no ambiente redutivo do citosol, ou que são lábeis ao pH ácido no interior dos endossomos e lisossomos também pode ser úteis. Tabela 23a Metabólitos de comprimento completo de ISIS 647535

Exemplo 21: Inibição antissenso da ApoC III humana em camundongos transgênicos ApoC III humana em estudo de administração única

[00889] ISIS 304801, 647535 e 647536 cada direcionando ApoC III humana e descrito na Tabela 17, foram ainda avaliados num estudo de administração única pela sua capacidade de inibir a ApoC III humana em camundongos transgênicos ApoC III humana.

Tratamento

[00890] Camundongos transgênicos APOCIII humana foram mantidos num ciclo de luz/escuro de 12 horas e foram alimentados ad libitum Teklad lab Chow. Os animais foram aclimatados por pelo menos 7 dias no centro de investigação antes do início do experimento. ASOs foram preparados em PBS e esterilizados pela filtração através de um filtro de 0,2 mícron. ASOs foram dissolvidos em PBS 0,9% para injeção.

[00891] ApoC III humana de Camundongos transgênicos foram injetados por via intraperitoneal em uma dosagem mostrada abaixo com ISIS 304801, 647535 ou 647536 (descritas abaixo) ou com controle tra-tado com PBS. O grupo de tratamento consistiu em 3 animais e o grupo controle consistiu em 4 animais. Antes do tratamento, bem como após a última dose, o sangue foi retirado de cada camundongo e as amostras de plasma foram analisadas. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a última administração.

[00892] As amostras foram coletadas e analisadas para determinar o mRNA da ApoC III e os níveis proteicos no fígado; triglicerídeos plasmá- ticos; e colesterol, incluindo as frações HDL e LDL foram avaliadas como descrito acima (Exemplo 20). Os dados dessas análises são apresentados nas Tabelas 24-28 abaixo. Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando pro-tocolospadrão. A níveis de ALT e AST mostrou que os compostos an- tissenso foram bem tolerados em todas as doses administradas.

[00893] Estes resultados mostram melhoria na potência para compostos antissenso compreendendo um conjugado GalNAc3-1 no terminal 3’ (ISIS 647535 e 647536) comparado ao composto antisenso com ausência de conjugado GalNAc3-1 (ISIS 304801). Adicionalmente, ISIS 647536, que compreende um conjugado GalNAc3-1 e algumas liga- ççoes de fosfodiéster foi tão potente como o ISIS 647535, que compreende o mesmo conjugado e todas as ligações de internucleosídeos dentro do ASO são fosforotioato. Tabela 24 Efeito do tratamento de ASO nos níveis de mRNA de ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana Tabela 25 Efeito do tratamento de ASO nos níveis da proteína do plasma ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana Tabela 26 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de triglicerídeo em camundongos transgênicos Tabela 27 Efeito do tratamento com ASO nos níveis de colesterol total em camundongos transgênicos Tabela 28 Efeito do tratamento de ASO em níveis de colesterol HDL e LDL em camundongos transgênicos

[00894] Estes resultados confirmam que o conjugado de GalNAc3-1 melhora a potência de um composto antissenso. Os resultados também mostram uma potência igual de compostos antissenso conjugado Gal- NAc3-1 onde os oligonucleótidos antissenso misturaram ligações (ISIS 647536 que tem seis ligações fosfodiéster) e uma versão completa de fósforotioato versão do mesmo composto antissenso (ISIS 647535).

[00895] As ligações fosforotioato proveem várias propriedades para compostos antissenso. Por exemplo, elas resistem à digestão da nuclease e ligam proteínas resultando no acúmulo do composto no fígado, em vez de no rim/urina. Estas são as propriedades desejáveis, especialmente quando tratam de uma indicação no fígado. No entanto, as ligações de fósforotioato também foram associadas a uma resposta inflamatória.Por conseguinte, a redução do número de ligações fósforoti- oato em um composto é esperada para reduzir o risco de inflamação, mas também para diminuir a concentração do composto no fígado, aumentar a concentração na urina e rim, diminuir a estabilidade na presença de nucleases, e reduzir a potência global. Os resultados presentes mostram que um composto antissenso de conjugado GalNAc3-1 onde determinadas ligações de fosforotioato foram substituídas com ligações de fosfodiéster é tão potente contra um alvo no fígado como um equivalente tendo ligações completas de fosforotioato. Espera-se que esses sejam menos pró-inflamatórios (ver Exemplo 24 que descreve uma experiência que mostra a redução de resultados PS no efeito inflamatórioreduzido).

Exemplo 22: Efeito de conjugado GalNAc3-1 modificado de ASO direcionando SRB-1 in vivo

[00896] ISIS 440762 e 651900, cada um direcionando SRB-1 e descritos na Tabela 17, foram avaliados num estudo dependente da dose quanto à sua capacidade de inibir a SRB-1 em camundongos Balb/c.

Tratamento

[00897] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Laboratório Jackson, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 440762, 651900 ou com controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 48 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS".

[00898] Como ilustrado na Tabela 29, ambos os compostos antis- senso reduziram os níveis de mRNA do SRB-1. Adicionalmente, o composto antisenso conjugado a GalNAc3-1 (ISIS 651900) foi significativa-mente mais pontente do que o composto antisenso que não possui o conjugado GalNAc3-1 (ISIS 440762). Estes resultados demonstram que o benefício da potência dos conjugados deGalNAc3-1é observado utilizando oligonucleotídeos antissenso complementares a um alvo diferente e com nucleosídeos quimicamente diferentes, neste caso nucleo- sídeos modificados compreendem frações de açúcar etílico (uma porção de açúcar bicíclico). Tabela 29 Efeito do tratamento com ASO sobre os níveis de mRNA de SRB-1 em camundongos Balb/c

Exemplo 23: Protocolo do Ensaio de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano (hPBMC)

[00899] O ensaio de hPBMC foi realizado utilizando o método do BD Vautainer CPT. Uma amostra de todo o sangue de doadores voluntários com consentimento informado na clínica US HealthWorks (Faraday & El Camino Real, Carlsbad) foi obtida e recolhidos em tubos 4-15 BD Vacutainer CPT 8 ml (VWR Cat. N° BD362753 O volume de sangue total inicial aproximado de sangue total nos tubos CPT para cada doador foi registrado utilizando a ficha de dados de ensaio PBMC.

[00900] A amostra de sangue foi misturada novamente imediatamente antes da centrifugação, invertendo suavemente os tubos de 8-10 vezes. Tubos CPT foram centrifugados à temperatura ambiente (18-25 oC) em um rotor horizontal (swing-out) por 30 min. em 1500-1800 RCF com pausa (2700 RPM Beckman Allegra 6R). As células foram recuperadas a partir da interface buffy coat (entre Ficoll e camadas de gel de polímero); transferidas para um tubo cônico estéril de 50 ml e reunidos em tubos 5 CPT/50 ml tubo/doador cônico. As células foram então lavadas duas vezes com PBS (Ca++, Mg++livre; GIBCO). Os tubos foram enchidos até 50 ml e misturados pela inversão diversas vezes. A amostra foi então centrifugada em 330 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente (1215 rpm, em Beckman Allegra 6R) e foram aspirados sobre- nadantes tanto quanto possíveis, sem perturbar o sedimento. O sedimento celular foi desalojado por agitação suave do tubo e as células foram ressuspensas em RPMI+10% FBS+pen/strep (~1 ml/10 ml volumede sangue total inicial). Uma amostra de 60 μl foi pipetada em um recipiente de amostra (Beckman Coulter) com 600 μl de reagente Ver- saLyse (Beckman Coulter Cat N° A09777) e foi suavemente turbilhonada por 10-15 seg. A amostra foi incubada por 10 min em temperatura ambiente, sendo misturada novamente antes da contagem. A suspensão de células foi contada no analisador de viabilidade da célula Vicell XR (Beckman Coulter), utilizando o tipo de célula PBMC (fator de diluição de 1:11 foi armazenado com outros parâmetros). Foi registrada a célula viva/ml e a viabilidade. A suspensão de células foi diluída para 1 x 17PBMC vivo/ml em RPMI+10% FBS+pen/strep.

[00901] As células foram plaqueadas a 5 x 105em 50 uL/poço placa de cultura do tecido de 96 poços (Falcon Microtest). 50 μl/poço de 2x concentraçãode oligos/controles diluídos em RPMI+10% FBS+pen/strep foramadicionados conforme modelo experimental (100 μl/poço total). As placas foram colocadas no agitador e foram deixadas para misturar por aprox. 1 min. Após serem incubadas por 24 horas a 37 oC; 5% de CO2, as placas foram centrifugadas a 400 x g por 10 minutos antes da remoçãodo sobrenadante para o ensaio de citocina MSD (ou seja, IL-6, IL- 10, IL-8 e MCP-1 humana).

Exemplo 24: Avaliação dos Efeitos Pró-Inflamatórios em Ensaio hPBMC para conjugado de GalNAc3-1 ASOs

[00902] Os oligonucleotídeos antissenso (ASOs) listados na Tabela 30 foram avaliados quanto ao efeito pró-inflamatório no ensaio de hPBMC utilizando o protocolo descrito no Exemplo 23. ISIS 353512 é um padrão interno conhecido por ser um respondedor elevado para liberaçãode IL-6 no ensaio. Os hPBMCs foram isolados de doadores novos e voluntários e foram tratados com ASO em concentrações de 0, 0,0128, 0,064, 0,32, 1,6, 8, 40 e 200 μM. Após um tratamento de 24 horas, os níveis de citocinas foram medidos.

[00903] Os níveis de IL-6 foram utilizados como leitura primária. O EC50 e Emax foi calculado usando procedimentos padrão. Os resultados são expressos como a razão média de Emax/EC50 a partir de dois doadores e é mencionado como "Emax/EC50." A menor razão indica uma diminuição relativa na resposta pró-inflamatória e a maior razão indica uma aumento relativo na resposta pró-inflamatória.

[00904] No que diz respeito aos compostos de teste, o composto menos pró-inflamatório foi o ASO ligado ao PS/PO (ISIS 616468). O ASO conjugadoGalNAc3-1 ISIS 647535 era ligeiramente menos pró-in-flamatóriodo que sua contraparte não conjugada ISIS 304801. Estes resultados indicam que a incorporação de algumas ligações PO reduz a reação pró-inflamatória e adição de um conjugado GalNAc3-1 não torna um composto mais pró-inflamatório e pode reduzir a resposta pró-infla-matória.Consequentemente, pode-se esperar que um composto antis- senso compreendendo tantos ligações PS/PO mistas e um conjugado GalNAc3-1 produziria respostas pró-inflamatórias menores em relação a compostos totais antissenso ligados a PS com ou sem um conjugado GalNAc3-1. Estes resultados mostram que os compostos de antissenso de conjugados GalNAc3-1 , particularmente aqueles com conteúdo reduzido de PS, são menos pró-inflamatórios.

[00905] Juntos, estes resultados sugerem que um composto conjugado de GalNAc3-1 particularmente com um conteúdo reduzido de PS, pode ser administrado em uma dose maior do que um composto total antissenso de PS equivalente com ausência de um conjugado GalNAc3- 1. Uma vez que não se espera que a meia-vida seja substancialmente diferente para estes compostos, essa administração resultaria em uma dosagem menos frequente. Na verdade essa administração poderia ser ainda menos frequente, porque os compostos conjugados GalNAc3-1 são mais potentes (Ver Exemplos 20-22) e a nova dosagem é necessária uma vez que a concentração de um composto ficou abaixo de um nível desejado, onde esse nível desejado se baseia na potência. Tabela 30 ASOs Modificados

[00906] Subscritos: "e" indicam nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica β-D-2'-desoxirribonucleosideo; "k" indica nucleosídeo bicíclico 6'- (S)-CH3 (por exemplo, cEt); "s" indica ligações internucleosídeas de fos- forotioato (PS); "o" indica ligações internucleosídeas de fosfodiéster (PO); e "o" indica -O-P(=O)(OH)-. O subscrito "m" indica 5-metilcitosi- nas. "Ado’-GalNAc3-1a" indica um conjugado tendo a estrutura GalNAc3- 1 mostrada no Exemplo 9 ligada ao terminal 3’ do oligonucleotídeo an- tisenso, conforme indicado. Tabela 31 Efeito de Pró-inflamatório dos ASOs direcionando ApoC III no ensaio de hPBMC

Exemplo 25: Efeito do conjugado GalNAc3-1 modificado ASO direcionando ApoC III humano in vitro

[00907] ISIS 304801 e 647535 descritos acima foram testados in vitro. As células de hepatócitos primários de camundongos transgênicos em uma densidade de 25.000 células por poço, foram tratados com concentrações de 0,03,0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 e 20 μM de oligonucleo- tídeos modificados. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA foram medidos por PCR em tempo real e os níveis de mRNA de hApoC III foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA total, conforme medido por RIBOGREEN®.

[00908] A IC50 foi calculada usando métodos padrão e os resultados são apresentados na Tabela 32. Como ilustrado, uma potência comparável foi observada em células tratadas com ISIS 647535 em comparação com o controle, ISIS 304801. Tabela 32 ASO Modificado direcionando ApoC III humano em hepatócitos primários

[00909] Neste experimento, os benefícios de grande potência da conjugação de GalNAc3-1 observados in vivo não foram observados in vitro. Experimentos de absorção livres subsequentes em hepatócitos primários in vitro mostraram aumento da potência de oligonucletoídeos compreendendo vários conjugados GalNAc relativos aos oligonucleotí- deos desprovidos do conjugado GalNAc. (ver Exemplos 60, 82 e 92)

Exemplo 26: Efeito das ligações PO/PS na Atividade do ASO da ApoC III

[00910] Camundongos transgênicos ApoC III humana foram injetados por via intraperitoneal uma vez em 25 mg/kg de ISIS 304801 ou 616468 (descritos acima) ou com controle tratado com PBS uma vez por semana por duas semanas. O grupo de tratamento consistiu em 3 animais e o grupo controle consistiu em 4 animais. Antes do tratamento, bem como após a última dose, o sangue foi retirado de cada camun-dongo e as amostras de plasma foram analisadas. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a última administração.

[00911] As amostras foram coletadas e analisadas para determinar os níveis da proteína ApoC III no fígado descritos acima (Exemplo 20). Os dados dessas análises são apresentados na Tabela 33 abaixo.

[00912] Estes resultados mostram redução na potência de compostos antissenso com PO/PS (ISIS 616468) nas asas relativas ao PS completo (ISIS 304801). Tabela 33 Efeito do tratamento com ASO nos níveis da proteína ApoC III em camundongos transgênicos ApoC III humana

[00913] Composto 56 está comercialmente disponível de Glen Research, ou pode ser preparados de acordo com procedimentos publica- dos relatados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454. Exemplo 28: Preparação do Composto 60

[00914] O composto 4 foi preparado de acordo com os procedimen- tos ilustrados no Exemplo 2. O composto 57 está comercialmente dis- ponível. Composto 60 foi confirmado por análise estrutural.

[00915] Composto 57 destina-se a ser representativo e não destina- se a ser limitante como outros dióis de alquila substituídos ou não subs-tituídos monoprotegidos incluindo, entre outros, aqueles apresentados na especificação aqui contida podem ser utilizados para preparar fosfo- ramiditas com uma composição predeterminada. Exemplo 29: Preparação do Composto 63

[00916] Os composto compostos 61 e 62 são preparados utilizando procedimentos semelhantes aos relatados por Tober et al., Eur. J. Org. Chem., 2013, 3, 566-577; and Jiang et al., Tetrahedron, 2007, 63(19), 3982-3988.

[00917] Alternativamente, o Composto 63 é preparado utilizando procedimentos semelhantes aos relatados na literatura científica e de patentes por Kim et al., Synlett, 2003, 12, 1838-1840; e Ki et al., , Pedido Internacional PCT publicado, WO 2004063208. Exemplo 30: Preparação do Composto 63b

[00918] Composto 63a é preparado utilizando procedimentos seme- lhantes aos relatados por Hanessian et al., Canadian Journal of Che-mistry, 1996, 74(9), 1731-1737. Exemplo 31: Preparação do Composto 63d

[00919] Composto 63c é preparado utilizando procedimentos seme-lhantes aos relatados por Chen et al., Chinese Chemical Letters, 1998, 9(5), 451-453. Exemplo 32: Preparação do Composto 67

[00920] O Composto 64 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 2. Composto 65 é preparado uti-lizando procedimentos semelhantes aos relatados por Oret al., Pedido Internacional PCT publicado, WO 2009003009. Os grupos protetores utilizados para o Composto 65 são destinados a serem representativos e não pretendem ser limitantes como outros grupos protetores, incluindo, entre outros, aqueles apresentados na especificação aqui contida podem ser utilizados. Exemplo 33: Preparação do Composto 70

[00921] O Composto 64 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 2. O composto 57 está comercialmente disponível. Os grupos protetores utilizados para o Composto 68 são destinados a serem representativos e não pretendem ser limitantes como outros grupos protetores, incluindo, entre outros, aqueles apresentados na especificação aqui contida podem ser utilizados. Exemplo 34: Preparação do Composto 75ª

[00922] Composto 75 é preparado de acordo com os procedimentos publicados relatados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454. Exemplo 35: Preparação do Composto 79

[00923] Composto 76 foi preparado de acordo com os procedimentos publicados relatados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454. Exemplo 36: Preparação do Composto 79ª

[00924] O composto 77 é preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 35. Exemplo 37: Método geral para a preparação do com-postooligomérico conjugado 82 compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5 'via suporte sólidoonde GalNAc GalNAc3-2 tem a estrutura:

[00925] A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-2 (GalNAc3-2a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. em que GalNAc3-2a possui a fórmula:

[00926] Composto oligomérico ligado ao VIMAD 79b foi preparado utilizando procedimentos padrão para síntese de DNA/RNA automatizado (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Os compostos de fosforamidita 56 e 60 foram preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 27 e 28, respectivamente. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fos- foramiditas, incluindo, entre outros, aquelas apresentadas na especificação aqui contida podem ser usadas para preparar compostos oligo- méricos com um grupo de conjugado ligado do fosfodiéster no terminal 5'. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos descritos aqui com qualquer sequência ou composição predeterminada. Exemplo 38: Método alternativo para a preparação do composto oligomérico 82 compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5'(Método II)

[00927] Composto oligomérico ligado ao VIMAD 79b foi preparado utilizando procedimentos padrão para síntese de DNA/RNA automatizado (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Fosforamidita do agrupamento GalNAc3-2, Composto 79 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 35. Este método alternativo permite uma instalação de uma etapa do do conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster para o composto oligomérico na etapa final da síntese. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representa-tivas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamiditas, incluindo, entre outros, aquelas apresentadas na es-pecificação aqui contida podem ser usadas para preparar compostos oligoméricos com um grupo de conjugado ligado do fosfodiéster no ter-minal 5'. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao su-portesólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos descritos aqui com qualquer sequência ou composição predeterminada. Exemplo 39: Método geral para a preparação de com-postooligomérico de 83h compreendendo Conjugado GalNAc3-3 no Terminal 5' (GalNAc3-1 modificado para anexação da extremidade 5') via Suporte Sólido

[00928] O composto 18 foi preparado de acordo com os procedimentos ilustrados no Exemplo 4. Os compostos 83a e 83b estão disponíveis comercialmente. O composto oligomérico 83e, compreendendo uma hexilamina ligada ao fosfodiéster foi preparada usando procedimentos de síntese de oligonucleotídeo padrão. O tratamento do compostooligomérico protegido com amônia aquosa forneceu composto oli- gomérico conjugado 5'-GalNAc3(83h).

[00929] Onde GalNAc3-3 tem a estrutura:

[00930] A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. em que GalNAc3-3a possui a fórmula: NHAc Exemplo 40: Método geral para a preparação do composto oligo- mérico conjugado 89 compreendendo um conjugado GalNAc3-4 ligado ao fosfodiéster no terminal 3'via suporte sólido

[00931] Onde GalNAc3-4 tem a estrutura:

[00932] Onde CM é uma porção clivável. Em determinadas modalidades, a porção clivável é:

[00933] A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-4 (GalNAc3-4a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. em que GalNAc3-4a possui a fórmula:

[00934] O Composto 30 do suporte sólido funcionalizado do Unylin- ker 30 protegido está comercialmente disponível. O Composto 84 é preparado usando procedimentos semelhantes aos relatados na literatura (ver SShchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22),44474454; Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1999, 27, 3035-3041; e Hornet et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25,4842-4849).

[00935] Os blocos de construção de fosforamidita, Compostos 60 e 79a são preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos 28 e 36. As fosforamiditas ilustradas pretendem ser representativas e não pretendem ser limitantes como outros blocos de construção de fosforamiditas podem ser utilizados para preparar compostos oli- goméricos com um conjugado ligado ao fosfodiéster no terminal 3' com uma sequência e composição predeterminadas. A ordem e quantidade de fosforamiditas adicionadas ao suporte sólido podem ser ajustadas para preparar compostos oligoméricos descritos aqui com qualquer sequência ou composição predeterminada.

Exemplo 41: Método geral para a preparação de ASOs compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster (ver Exemplo 37, Bx é adenina) na posição 5'viatécnicas de fase sólida (pre-paração de ISIS 661134)

[00936] Salvo indicação em contrário, todos os reagentes e solu- ções utilizadas para a síntese dos compostos oligoméricos são adquiridas de fontes comerciais. Blocos de construção de fosforamidita padrão e suporte sólido são usados para a incorporação de resíduos de nucleo- sídeos que incluem, por exemplo, T, A, G, e mResíduos C. Compostos de fosforamidita 56 e 60 foram utilizados para sintetizar o conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5'. Uma solução de fosfo- ramidita a 0,1 M em anidro acetonitrila foi utilizada para β -D-2'-desoxin- bonucleosídeo e 2'-MOE.

[00937] As sínteses ASO foram realizadas em sintetizador ABI 394 (escala de 1-2 μmol) ou em sintetizador oligopiloto GE Healthcare Bioscience ÃKTA (escala de 40-200 μmol) pelo método de acoplamento de fosforamidita em suporte sólido VIMAD (110 μmol/g, Guzaev et al., 2003) empacotada na coluna. Para a etapa de acoplamento, as fosfora- miditas foram entregues 4 vezes em excesso sobre a carga sobre a carga inicial do suporte sólido e acoplamento da fosforamidita foi realizada por 10 min. Todas as outras etapas seguiram os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante. Uma solução de ácido dicloroacético a 6% em tolueno foi utilizada para remover o grupo de dimetoxitritila (DMT) dos grupos 5'-hidroxila do nucleotídeo. 4,5-Dicianoimidazol (0,7 M) em anidro CH3CN foi usado como ativador passo durante a etapa de acoplamento. As ligações de fosforotioato foram introduzidas por sulfuriza- ção com solução a 0,1 M de hidreto de xantano em piridina/CH3CN 1:1 para um tempo de contato de 3 minutos. Uma solução de 20% terc-butil hidroperóxido em CH3CN contendo 6% de água foi utilizada como um agente oxidante para prover ligações internucleosídeas de fosfodiéster com um tempo de contato de 12 minutos.

[00938] Depois da sequência desejada ter sido montada, os grupos protetores de cianoetil fosfato foram desprotegidos usando uma dietila- mina a 20% em tolueno (v/v) com um tempo de contato de 45 minutos. ASOs de ligação de suporte sólido foram suspensos em amônia aquosa (28-30% em peso) e aquecidos a a 55 oC por 6 h.

[00939] Os ASOs não ligados foram então filtrados e a amônia foi fervida. O resíduo foi purificado por cromatografia líquida de alta pressão numa coluna de troca aniônica forte (GE Healthcare Bioscience, Fonte 30Q, 30 μm, com 2,54 x 8 cm, A = 100 mM acetato de amônia em 30% de CH 3CN aquoso, B = 1,5 M de NaBr, em A, 0-40% de B em 60 min, fluxo 14 mL min-1, À = 260 nm). O resíduo foi dessalinizado por HPLC numa coluna de fase inversa para produzir ASOs desejados com um rendimento isolado de 15-30% com base na carga inicial sobre o suporte sólido. ASOs foram caracterizados pela análise MS acoplado íon-par-HPLC com sistema Agilent 1100 MSD. Tabela 34 ASO compreendendo um conjugado GalNAc3-2 ligado ao fosfodié- ster na posição 5' direcionando SRB-1

[00940] Subscritos: "e" indicam nucleosídeo 2'-MOE modificado; "d" indica e-D-2'-desoxirribonucleosídeo; "k" indica nucleosídeo bicíclico 6'- (S)-CH3 (por exemplo, cEt); "s" indica ligações internucleosídeas de fos- forotioato (PS); "o" indica ligações internucleosídeas de fosfodiéster (PO); e "o" indica -O-P(=O)(OH)-. Sobrescrito "m" indica 5-metilcitosi- nas. A estrutura de GalNAc3-2um é mostrada no Exemplo 37.

Exemplo 42: Método geral para a preparação de ASOs compreendendo conjugado GalNAc3-3 na posição 5' por meio de técnicas em fase sólida (preparação de ISIS 661166)

[00941] A síntese para ISIS 661.166 foi realizada usando procedimentos semelhantes ilustrados nos Exemplos 39 e 41.

[00942] ISIS 661166 é um gapmer 5-10-5 MOE, em que a posição 5' compreende um conjugado GalNAc3-3. ASO foi caracterizado pela análise MS acoplado íon-par-HPLC com sistema Agilent 1100 MSD. Tabela 34a ASO compreendendo um conjugado GalNAc3-3 na posição 5' via ligação de fosfodiéster hexilamino direcionando Malat-1

[00943] Subscritos: "e" indica o nucleosídeo 2’-MOE modificado; "d"indica o β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica as ligações internu- cleosídeos de fosforotioato (PS); "o" indica as ligações internucleosí- deos de fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O-P(=O)(OH)-. O subscrito "m" indica 5-metilcitosinas. A estrutura de "5’-GalNAc3-3a" é mostrada no Exemplo 39.

Exemplo 43: Estudo dependente de dose de GalNAc3-2 ligado a fos- fodiéster (ver os exemplos 37 e 41, Bx é adenina)no terminal 5’ que direciona o SRB-1 in vivo.

[00944] ISIS 661134 (ver o Exemplo 41) que compreende um conjugado GalNAc3-2 ligado a fosfodiéster no terminal 5’ fio testado em um estudo dependente de dose para a inbição antissenso de SRB-1 em camundongos. O ISIS 440762 e 651900 não conjugados (GalNAc3-1 conjugado no terminal 3’, ver o Exemplo 9) foram incluídos no estudo para comparação e são descritos anteriormente na Tabela 17.

Tratamento

[00945] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Laboratório Jackson, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 440762, 651900 ou com controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a ad-ministração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS". Os ED50s foram medidos usando métodos semelhantes, conforme descrito anteriormente e são apresentados a seguir.

[00946] Conforme ilustrado na Tabela 35, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso reduziu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. De fato, os oligonucleotídeos antissenso que compreendem os conjugados de GalNAc3-2 ligados ao fosfodiéster no terminal 35 (ISIS 661134) ou o conjugado de GalNAc3-1 ligado no teminal 3’ (ISIS 6519005) mostraram melhora substancial de potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 440762). Além disso, ISIS 661134, que compreende o conjugado GalNA3<2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5’ foi equipotente em comparação ao ISIS 651900, que compreende o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3’. Tabela 35 ASOs contendo GalNAc3-1 ou GalNAc3-2 direcionando SRB-1

[00947] As estruturas para 3’ GalNAc3-1 e 5’ GalNAc3-2 foram descritas anteriormente nos Exemplos 9 e 37.

Análise Farmacocinética (PK)

[00948] A PK dos ASOs do grupo de dose alta (7 mg/kg) foi examinada e avaliada da mesma forma como ilustrado no Exemplo 20. A amostra de fígado foi cortada e extraída usando protocolos padrão. O comprimento total dos metabólitos de 661134 (5’ GalNAc3-2) e ISIS 651900 (3’ GalNAc3-1) foram identificados e suas massas foram confirmadas por análise de espectrometria de massa de alta resolução. Os resultados mostraram que o maior metabólito detectado para o ASO compreendendo um conjugado de GalNAc3-2 ligado ao fosfodiéster no terminal 5’ (ISIS 661134) foi ISIS 440762 (dados não mostrados). Nenhummetabólito adicional, num nível detectável, foi observado. Ao contrário de sua contraparte, os metabólitos adicionais semelhantes àqueles relatados anteriormente na Tabela 23a foram observados para o ASO endo o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3’ (ISIS 651900). Esses resultados sugerem que ter o conjugado de GalNAc3-1 ou GalNAc3-2 pode melhorar o perfil da PK dos ASOs sem comprometer sua potência.

Exemplo 44: Efeito de ligações de PO/PS na inibição antissenso de ASOs compreendendo o conjugado de GalNAc3-1 (ver o Exemplo 9) no terminal 3’ que se direciona ao SRB-1

[00949] ISIS 655861 e 655862 compreendendo um conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3’, cada um se direcionando ao SRB-1, foram testados num estudo de administração única para sua capacidade em inibir o SRB-1 em camundongos. O composto não conjugado de origem, ISIS 353382 foi incluído no estudo para comparação.

[00950] Os ASOs são gapmeros 5-10-5 MOE, em que a região de lacuna compreende dez 2’-desoxirribonucleosídeos e cada região de asa compreende cinco nucleosídeos 2’-MOE modificados. Os ASOs foram preparados usando métodos semelhantes conforme ilustrado anteriormente no Exemplo 19 e são descritos na Tabela 36 abaixo. Tabela 36 Os ASOs modificados compreendendo o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3’ direcionando ao SRB-1 Subscritos: "e" indica o nucleosídeo 2’-MOE modificado; "d" indica o β- D-2’-desoxirribonucleosídeo; "s" indica as ligações internucleosídeos de fosforotioato (PS); "o" indica as ligações internucleosídeos de fosfodié- ster (PO); e "o’" indica -O-P(=O)(OH)-. O subscrito "m" indica 5-metilci- tosinas. A estrutura de "GalNAc3-1"é mostrada no Exemplo 9.

Tratamento

[00951] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 655861, 655862 ou com controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Antes do tratamento, bem como após a última dose, o sangue foi retirado de cada camundongo e as amostras de plasma foram analisadas. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB- 1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados em relação ao RNA total (usando Ribogreen), antes da normalização para controle tratado com PBS. Os resultados abaixo são apresentados como a média percentual dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizado para o controle tratado com PBS e é indicado como "% PBS". Os ED50s foram medidos usando métodos semelhantes, conforme descrito anteriormente e são apresentados a seguir.

[00952] Conforme ilustrado na Tabela 37, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso reduziu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente de dose em comparação ao controle tratado com PBS. De fato, os oligonucleotídeos antissenso que compreendem o conjugado de GalNAc3-1 no terminal 3’ (ISIS 655861 e 655862) mostraram melhora substancial de potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 353382). Além disso, o ISIS 655862 com ligações de PS/PO mistas mostrou uma melhora na potência em relação ao PS completo (ISIS 655861). Tabela 37 Efeito de ligações de PO/PS na inibição antissenso de ASOs com-preendendo o conjugado GalNAc3-1 no terminal 3’ direcionando ao SRB-1

[00953] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Os pesos dos órgãos também foram avaliados. Os resultados demonstraram que não foi observada nenhuma elevação nos níveis de transaminase (Tabela 38) ou pesos dos órgãos (dados não mostrados) em camundongos tratados com ASOs em comparação ao controle com PBS. Além disso, o ASO com ligações de PS/PO mistas (ISIS 655862) mostraram níveis de transaminase semelhantes em comparação ao P completo (ISIS 655861). Tabela 38 Efeito de ligações de PO/PS sobre os níveis de transaminase de ASOs compreendendo o conjugado GalNAc3-1 no terminal 3’ direcionando ao SRB-1

[00954] O composto 4 (9,5g, 28,8 mmoles) foi tratado com composto 103a ou 103b (38 mmoles), individualmente, e TMSOTf (0,5 eq.) e peneires moleculares em diclorometano (200 mL), a agitadas por 16 horas em temperatura ambiente. Nesse tempo, a camada orgânicas foi filtrada através de celite, em seguida lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em sílica-gel(2%-->10% meta- nol/diclorometano) para gerar os compostos 104a e 104b em >80% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00955] Os compostos 104a e 104b foram tratados nas mesmas condições como para os compostos 100a-d (Exemplo 47), para gerar os compostos 105a e 105b em >90% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00956] Os compostos 105a e 105b fora tratados, individualmente, com o composto 90 sob as mesmas condições que os compostos 901a- d, para gerar os compostos 106a (80%) e 106b (20%). LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00957] Os compostos 106a e 106b foram tratados nas mesmas condições que os compostos 96a-d (Exemplo 47), para gerar o 107a (60%) e 107b (20%). LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00958] Os compostos 107a e 107b foram tratados nas mesmas condições que os compostos 97a-d (Exemplo 47), para gerar os compostos 108a e 108b em 40-60% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00959] Os compostos 108a (60%) e 108b (40%) foram tratados nas mesmas condições para os compostos 100a-d (Exemplo 47), para gerar os compostos 109a e 109b em >80% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00960] O composto 109a foi tratado nas mesmas condições que os compostos 101a-d (Exemplo 47), para gerar o Composto 110a em 3060% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura. Alternativamente, o Composto 110b pode ser preparado de forma semelhante, começando com o Composto 109b.

Exemplo 46: Procedimento Geral para Conjugação com Ésteres de PFP (Oligonucleotídeo 111); Preparação de ISIS 666881 (GalNAc3- 10)

[00961] Um oligonucleotídeo modificado 5’-hexilamina foi sintetizado e purificado usando procedimentos de oligonucleotídeo de fase sólida padrão. O oligonucleotídeo modificado 5’-hexilamino foi dissolvido em tetraborato de sódio 0,1 M, pH 8,5 (200 μL) e 3 equivalentes de um cluster de GalNAc3 esterificado com PFP selecionado dissolvido em DMSO (50 μL) foi adicionado. Se o éster de PFP precipitou após a adição na solução de ASO, DMSO foi adicionado até que todo o éster de PFP estivesse na solução. A reação foi concluída após cerca de 16 h de mistura à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com água a 12 mL e, em seguida, rotacionada em 3000 rpm em um filtro de rotação com um limite de massa de 3000 Da. Este processo foi repetido duas vezes para remover as impurezas de pequenas moléculas. A solução foi então liofilizada à secura e redissolvida em amônia aquosa concentrada e misturada à temperatura ambiente por 2,5 h seguido por concentração in vacuo para remover a maior parte da amônia. O oligo- nucleotídeo conjugado foi purificado e dessalinizado por RP-HPLC e li- ofilizado para fornecer o oligonucleotídeo conjugado a GalNAc3.

[00962] O oligonucleotídeo 111 é conjugado com GalNAc3-10. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-10 (GalNAc3-10a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)- conforme mostrada no oligonucleotídeo (ISIS 666881) sintetizado com GalNAc3- 10 abaixo. A estrutura de GalNAc3-10 (GalNAc3-10a-CM-) é mostrada abaixo:

[00963] Após este procedimento geral, o ISIS 666881 foi preparado. O oligonucleotídeo modificado 5’-hexilamino, ISIS 660254, foi sintetizado e purificado usando procedimentos de oligonucleotídeo de fase sólida padrão. O ISIS 660254 (40 mg, 5,2 μmol) foi dissolvido em tetraborate de sódio 0,1 M, pH 8,5 (200 μL) e 3 equivalentes, foi adicionado éster de PFP (Composto 110a) dissolvido em DMSO (50 μL). O éster de PFP precipitou após a adição na solução de ASO, exigindo DMSO adicional (600 μL) para dissolver completamente o éster de PFP. A reação foi concluída após cerca de 16 h de mistura à temperatura ambiente. A solução resultante foi diluída com água a 12 mL de volume total e rotacionada em 3000 rpm em um filtro de rotação com um limite de massa de 3000 Da. Este processo foi repetido duas vezes para remover as impurezas de pequenas moléculas. A solução foi liofilizada à secura e redissolvido em amônina aquosa concentrada com mistura à temperatura ambiente por 2,5 h seguido por concentração ub vacuo para remover a maior parte da amônia. O oligonucleotídeo conjugado foi purificado e dessalinizado por RP-HPLC e liofilizado para gerar o ISIS 666881 em 90% de rendimento em peso (42 mg, 4,7 μmol). Oligonucleotídeo conjugado GalNAc3-10

[00964] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonu- cleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica - O-P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito. Exemplo 47: Preparação do Oligonucleotídeo 102 Compreendendo GalNAc3-8

[00965] O triácido 90 (4 g, 14,43 mmol) foi dissolvido em DMF (120 mL) e N,N-Di-isopropiletilamina (12,35 mL, 72 mmoles). Trifluoroacetato de pentafluorofenila (8,9 mL, 52 mmoles) foi adicionado em gotas, sob argônio, e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por 30 minutos. Boc-diamina 91a ou 91b (68,87 mmoles) foi adicionada, junta-mente com N,N--Di-isopropiletilamina (12,35 mL, 72 mmoles), e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromato- grafia em sílica-gel(2%-->10% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 92a e 92b em um rendimento de aproximadamente 80%. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00966] O composto 92a ou 92b (6,7 mmoles) foi tratado com 20 mL de diclorometano e 20 mL de ácido trifluoroacético à temperatura ambiente por 16 horas. A solução resultante foi evaporada e, em seguida, dissolvida em metanol e tratada com resina DOWEX-OH por 30 minutos. A solução resultante foi filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida para gerar 85-90% de rendimento dos compostos 93a e 93b.

[00967] O composto 7 ou 64 (9,6 mmoles) foram tratados com HBTU (3,7 g, 9,6 mmoles) e N,N-Di-isopropiletilamina (5 mL) em DMF (20 mL) por 15 minutos. A isto foi adicionado qualquer um do composto 93a ou 93b (3 mmoles), e deixado agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em sílica-gel(5%-->20% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 96a-d em 20-40% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00968] Os compostos 96a-d (0,75 mmoles), individualmente, foram hidrogenados com Níquel de Raney por 3 horas em Etanol (75 mL). Nesse tempo, o catalisador foi removido por filtração através de celite, e o etanol removido sob pressão reduzida para gerar os compostos 97a- d em 80-90% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00969] O composto 23 (0,32 g, 0,53 mmoles) foi tratado com HBTU (0,2 g, 0,53 mmoles) e N,N-Di-isopropiletilamina (0,19 mL, 1,14 mmoles) em DMF (30mL) por 15 minutos. A isto foram adicionados os compostos 97a-d (0,38 mmoles), individualmente, e deixados agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorome- tano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em sílica-gel(2%-->20% meta- nol/diclorometano) para gerar os compostos 98a-d em 30-40% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00970] O composto 99 (0,17 g, 0,76 mmoles) foi tratado com HBTU (0,29 g, 0,76 mmoles) e N,N-Di-isopropiletilamina (0,35 mL, 2,0 mmoles) em DMF (50mL) por 15 minutos. A isto foram adicionados os compostos 97a-d (0,51 mmoles), individualmente, e deixados agitar à temperatura ambiente por 16 horas. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em sílica-gel(5%-->20% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 100a-d em 40-60% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00971] Os compostos 100a-d (0,16 mmoles), individualmente, foram hidrogenados com 10% Pd(OH)2/C por 3 horas em metanol/acetato de etil (1:1, 50 mL). Nesse tempo, o catalisador foi removido por filtração através de celite, e os compostos orgânicos removidos sob pressão reduzida para gerar os compostos 101a-d em 80-90% de rendimento. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00972] Os compostos 101a-d (0,15 mmoles), individualmente, foram dissolvidos em DMF (15 mL) e piridina (0,016 mL, 0,2 mmoles). Trifluoroacetato de pentafluorofenila (0,034 mL, 0,2 mmoles) foi adicionado em gotas, sob argônio, e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por 30 minutos. Nesse tempo, o DMF foi reduzido em >75% sob pressão reduzida e, em seguida, a mistura foi dissolvida em diclo- rometano. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio, água e salmoura. A camada orgânica foi então separada e seca com sulfato de sódio, filtrada e reduzida a um óleo sob pressão reduzida. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em sílica-gel(2%-->5% metanol/diclorometano) para gerar os compostos 102a-d num rendimento aproximado de 80%. LCMS e RMN de prótons foram consistentes com a estrutura.

[00973] O Composto Oligomérico 102, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-8, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-8 (GalNAc3-8a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma modalidade preferencial, a porção clivável é - P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-.

[00974] A estrutura de GalNAc3-8 (GalNAc3-8a-CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 48: Preparação do Oligonucleotídeo 119 Compreendendo GalNAc3-7

[00975] O composto 112 foi sintetizado após o procedimento descrito na literatura (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).

[00976] O composto 112 (5 g, 8,6 mmol) foi dissolvido em 1:1 de metanol/acetato de etil (22 mL/22 mL). Foi adicionado hidróxido de paládio em carbono (0,5 g). A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente sob hidrogênio por 12 h. A mistura da reação foi filtrada através de uma almofada de celite e lavada a almofada com 1:1 meta- nol/acetato de etila. O filtrado e as lavagens foram combinadas e concentradasà secura para produzir o Compostos 105a (quantitativo). A estrutura foi confirmada por LCMS.

[00977] O composto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) e DIEA (2,8 mL, 16,2 mmol) foram dissolvidos em DMF (17 mL) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 min. A isto, uma solução do Composto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) em DMF anidro (20 mL) foi adicionada. A reação foi agitada em temperatura ambiente por 6 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida para obter um óleo. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com solução de NaHCO3 saturada aquosa (100 mL) e salmoura (100 mL). A fase orgânica foi separada, seca (Na2SO4), filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluído com MeOH 10 a 20 % em diclorometano para produzir o Composto 114 (1,45 g, 30%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.

[00978] O composto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) foi dissolvido em 1:1 de metanol/acetato de etila (4 mL/4 mL). Foi adicionado paládio em carbono (úmido, 0,14 g). A mistura da reação foi lavada com hidrogênio e agitada em temperatura ambiente sob hidrogênio por 12 h. A mistura da reação foi filtrada através de uma almofada de celite. A camada de celite foi lavada com metanol/acetato de etil (1:1). O filtrado e as lavagens foram combinadas e evaporadas sob pressão reduzida para produzir o Composto 115 (quantitativo). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.

[00979] O composto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) e DIEA (0,26 mL, 1,5 mmol) foram dissolvidos em DMF anidro (5 mL) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 min. A isto, foi adicionada uma solução do Composto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) em DMF e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 6 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em CH2Cl2. A camada orgânica foi lavada com solução de NaHCO3 aquosa saturada e salmoura e foi seca com Na2SO4 anidro e filtrada. A camada orgânica foi concentrada à secura e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluído com MeOH 3 a 15% em diclorometano para produzir o Composto 116 (0,84 g, 61%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.

[00980] O composto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) foi dissolvido em 1:1 de metanol/acetato de etila (5 mL/5 mL). Foi adicionado paládio em carbono (úmido, 0,074 g). A mistura da reação foi lavada com hidrogênio e agitada em temperatura ambiente sob hidrogênio por 12 h. A mistura da reação foi filtrada através de uma almofada de celite. A camada de celite foi lavada com metanol/acetato de etila (1:1). O filtrado e as lavagens foram combinadas e evaporadas sob pressão reduzida para produzir o composto 117 (0,73 g, 98%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN.

[00981] O composto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (3 mL). A esta solução, N, N -Di-isopropiletilamina (70 μL, 0,4 mmol) e trifuloroacetato de pentafluorofenila (72 μL, 0,42 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 12 h e vertida numa solução de NaHCO3 aquosa saturada. A mistura foi extraída com diclorometano, lavada com salmoura e seca sobre Na2SO4 anídrico. A solução de diclorometano foi concentrada à secura e purificada com cromatografia de coluna em sílica-gel e eluída com MeOH 5 a 10% em diclorometano para produzir o composto 118 (0,51 g, 79%). A estrutura foi confirmada por LCMS e1H e 1H e19F RMN.

[00982] O Composto Oligomérico 119, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-7 foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-.

[00983] A estrutura de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 49: Preparação do Oligonucleotídeo 132 Compreendendo GalNAc3-5

[00984] O composto 120 (14,01 g, 40 mmol) e HBTU (14,06 g, 37 mmol) foram dissolvidos em DMF anidro (80 mL). Trietilamina (11,2 mL, 80,35 mmol) foi adicionada e agitada por 5 min. A mistura de reação foi resfriada em banho gelado e uma solução do composto 121 (10 g, mmol) em DMF anidro (20 mL) foi adicionada. Trietilamina adicional (4,5 mL, 32,28 mmol) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada por 18 h sob atmosfera de argônio. A reação foi monitorada por TLC (acetato de etil:hexano; 1:1; Rf = 0,47). O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi absorvido em EtOAc (300 mL) e lavado com 1M NaHSO4 ( 3 x 150 mL), solução de NaHCO3 aquosa saturada (3 x 150 mL) e salmoura (2 x 100 mL). A camada orgânica foi seca com Na2SO4. O agente de secagem foi removido por filtração e a camada orgânica foi concentrada por evaporação giratória. A mistura crua foi purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluída, usando-se EtOAc 35 - 50% em hexano para produzir um composto 122 (15,50 g, 78,13%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 1H RMN. Massa m/z 589,3 [M + H]+.

[00985] Uma solução de LiOH (92,15 mmol) em água (20 mL) e THF (10 mL) foi adicionada a uma solução resfriada do Composto 122 (7,75 g, 13,16 mmol) dissolvido em metanol (15 mL). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 45 min e monitorada por TLC (EtOAc:hexano; 1:1). A mistura de reação foi concentrada à metade do volume sob pressão reduzida. A solução restante foi resfriada em banho gelado e neutralizado, adicionando-se HCl concentrado. A mistura de reação foi diluída, extraída com EtOAc (120 mL) e lavada com salmoura (100 mL). Uma emulsão foi formada e limpa durante a noite. A camada orgânica foi separada, seca (Na2SO4), filtrada e evaporada para produzir o Composto 123 (8,42 g). O sal residual é a causa provável de excesso de massa. LCMS é consistente com a estrutura. O produto foi usado sem nenhuma purificação adicional. M.W.cal:574.36; M.W.fd:575,3 [M + H]+.

[00986] O composto 126 foi sintetizado após o procedimento descrito na literatura (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 958-963).

[00987] O composto 123 (7,419 g, 12,91 mmol), HOBt (3,49 g, 25,82 mmol) e o composto 126 (6,33 g, 16,14 mmol) foram dissolvidos em DMF (40 mL) e a mistura de reação resultante foi resfriada em banho gelado. A isto, N,N-Di-isopropiletilamina (4,42 mL, 25,82 mmol), PyBop (8,7 g, 16,7 mmol) seguido por agente de acoplamento Bop (1,17 g, 2,66 mmol) foram adicionados sob uma atomosfera de argônio. O banho gelado foi removido e a solução foi deixada aquecer à temperatura ambiente. A reação foi concluída depois de 1 h, como determinado por TLC (DCM:MeOH:AA; 89:10:1). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (200 mL) e lavado com 1 M NaHSO4 (3x100 mL), NaHCO3 saturada aquosa (3x100 mL) e salmoura (2x100 mL). A fase orgânica foi separada, seca (Na2SO4), fil-trada e concentrada. O resídui foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel com um gradiente de 50% hexanos/EtOAC a 100% EtOAc para produzir o Composto 127 (9,4 g) como uma espuma branca. LCMS e 1H RMN foram consistentes com a estrutura. Massa m/z 778,4 [M + H]+.

[00988] Ácido trifluoroacético (12 mL) foi adicionado a uma solução do composto 127 (1,57 g, 2,02 mmol) em diclorometano (12 mL) e agitadoà temperatura ambiente por 1 h. A mistura da reação foi co-evapo- rada com tolueno (30 mL) sob pressão reduzida à secura. O resíduo obtido foi coevaporado duas vezes com acetonitrila (30 mL) e tolueno (40 mL) para produzir o Composto 128 (1,67 g) como sal de trifluoro acetato para a etapa seguinte sem purificação adicional. LCMS e 1HRMN foram consistentes com a estrutura. Massa m/z 478,2 [M + H]+.

[00989] O composto 7 (0,43 g, 0,963 mmol), HATU (0,35 g, 0,91 mmol), e HOAt (0,035 g, 0,26 mmol) foram combinados e secos por 4 h com P2O5 sob pressão reduzida em um frasco de fundo redondo e, em seguida, dissolvidos em DMF anidro (1 mL) e agitados por 5 min. A isto, uma solução do composto 128 (0,20 g, 0,26 mmol) em DMF anidro (0,2 mL) e N,N-Di-isopropiletilamina (0,2 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob uma atmosfera de argô- nio. A reação foi concluída após 30 min como determinado por LCMS e TLC (7% MeOH/DCM). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em DCM (30 mL) e lavado com 1 M NaHSO4 (3x20 mL), NaHCO3 saturada aquosa (3x20 mL) e salmoura (3x20 mL). A fase orgânica foi separada, seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel usando 5-15% de MeOH em diclorometano para produzir o Composto 129 (96,6 mg). LCMS e1H RMN são consistentes com a es-trutura. Massa m/z 883,4 [M + 2H]+.

[00990] O composto 129 (0,09 g, 0,051 mmol) foi dissolvido em metanol (5 mL) em 20 mL de frasco de cintilação. A isto, foi adicionada uma pequena quantidade de 10% Pd/C (0,015 mg) e o recipiente de reação foi carregado com gás H2. A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente sob atmosfera de H2 por 18 h. A mistura da reação foi filtrada através de uma almofada de celite e lavada a almofada com metanol. As lavagens do filtrado foram agrupadas e concentradas sob pressão reduzida para produzir o Composto 130 (0,08 g). LCMS e 1H RMN foram consistentes com a estrutura. O produto foi usado sem nenhuma purificação adicional. Massa m/z 838,3 [M + 2H]+.

[00991] A um frasco de fundo redondo pontudo de 10 mL foram adi-cionados o composto 130 (75,8 mg, 0,046 mmol), 0,37 M de piri- dina/DMF (200 μL) e uma barra de agitação. A esta solução, foi adicio-nada 0,7 M de trifluoroacetato de pentafluorofenil/DMF (100 μL) em gotas com agitação. A reação foi concluída após 1h conforme determinado pela LC MS. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em CHCl3 (~ 10 mL). A camada orgânica foi particionada contra NaHSO4 (1 M, 10 mL), NaHCO3 aquosa saturada (10 mL) e sal-moura (10 mL) três vezes cada. A fase orgânica foi separada e seca com Na2SO4, filtrada e concentrada para produzir o Composto 131 (77,7 mg). LCMS é consistente com a estrutura. Usado sem purificação adici- onal. Massa m/z 921,3 [M + 2H]+.

[00992] O Composto Oligomérico 132, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-5, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-5 (GalNAc3-5a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-.

[00993] A estrutura de GalNAc3<-5 (GalNAc3-5a-CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 50: Preparação do Oligonucleotídeo 144 Compreendendo GalNAc4-11

[00994] Síntese do Composto 134. A um frasco de Merrifield foi adi-cionadaresina de aminometil VIMAD (2,5 g, 450 μmol/g) que foi lavada com acetonitrila, dimetilformamida, diclorometano e acetonitrila. A resina foi inchada em acetonitrila (4 mL). O composto 133 foi pré-ativado em um frasco de fundo redondo de 100 mL, adicionando-se 20 (1,0 mmol, 0,747 g), TBTU (1,0 mmol, 0,321 g), acetonitrila (5 mL) e DIEA (3,0 mmol, 0,5 mL). Esta solução foi deixada agitar por 5 min e foi então adicionada ao frasco de Merrifield com agitação. A suspensão foi agitada por 3h. A mistura da reação foi drenada e a resina foi lavada com acetonitrila, DMF e DCM. Um novo carregamento de resina foi quantificado, medindo-se a absorbância do cátion de DMT em 500 nm (coeficiente de extinção = 76000) em DCM e determinado para ser 238 μmol/g. A resina foi revestida, suspendendo-se em uma solução de anidrido acético por dez minutos três vezes.

[00995] O composto ligado ao suporte sólido 141 foi sintetizado usando métodos iterativos de síntese de peptídeo de fase sólida à base de Fmoc. Uma quantidade pequena de suporte sólido foi extraída e sus-pendida em amônia aquosa (28-30% em peso) por 6h. O composto clivado foi analisado por LC-MS e a massa observada estava consistente com a estrutura. Massa m/z 1063,8 [M + 2H]+.

[00996] O composto ligado ao suporte sólido 142 foi sintetizado usando os métodos de síntese de peptídeo de fase sólida.

[00997] O composto ligado ao suporte sólido 143 foi sintetizado usando síntese de fase sólida padrão em um sintetizador de DNA.

[00998] O composto ligado ao suporte sólido 143 foi suspenso em amônia aquosa (28-30% em peso) e aquecido a 55°C por 16 h. A solução foi resfriada e o suporte sólido foi filtrado. O filtrado foi concentrado e o resíduo dissolvido em água e purificado por HPLC numa coluna de troca de ânion forte. As frações contendo o composto de comprimento total 144 foram agrupadas e dessalinizadas. O composto oligomérico conjugado a GalNAc4-11 foi analisado por LC-MS e a massa observada foi consistente com a estrutura.

[00999] A parte do agrupamento de GalNAc4 do grupo de conjugado GalNAc4-11 (GalNAc4-11a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-.

[001000] A estrutura de GalNAc4-11 (GalNAc4-11a-CM) é mostrada abaixo: Exemplo 51: Preparação do Oligonucleotídeo 155 Compreendendo GalNAc3-6

[001001] O composto 146 foi sintetizado conforme descrito na literatura (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).

[001002] O composto 4 (15 g, 45,55 mmol) e o composto 35b (14,3 gramas, 57 mmol) foram dissolvidos em CH2Cl2 (200 ml). Peneiras mo-lecularesativadas (4 Â. 2 g, em pó) foram adicionadas, e a reação foi deixada agitar por 30 minutos sob atmosfera de nitrogênio. TMS-OTf fio adicionado (4,1 ml, 22,77 mmol) e a reação foi deixada agitar à tempe-ratura ambiente durante a noite. Após conclusão, a reação foi extinta vertendo-se numa solução de NaHCO3 aquosa saturada (500 ml) e gelo esmagado (~150 g). A camada orgânica foi separada, lavada com sal-moura, seca com MgSO4 filtrada, e foi concentrada em um óleo laranja sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluído com 2-10 % MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 112 (16,53 g, 63%). LCMS e 1H RMN foram con-sistentes com o composto esperado.

[001003] O composto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (40 ml). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidróxido de paládio em carbono, 400 mg) foi adicionado, e o gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em CH2Cl2, e LCMS), o catalisador foi removido por filtração através de uma camada de celite. O filtrado foi concentrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 105a (3,28 g). LCMS e RMN 1H foram consistentes com o produto desejado.

[001004] O composto 147 (2,31 g, 11 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (100 mL). N,N-Di-isopropiletilamina (DIEA, 3,9 mL, 22 mmol) foi adicionada, seguido por HBTU (4 g, 10,5 mmol). A mistura de reação foi deixada agitar por ~15 minutos sob nitrogênio. A isto, uma solução do composto 105a (3,3 g, 7,4 mmol) em DMF seco foi adicionada e agitada por 2 h sob atmosfera de nitrogênio. A ração foi diluída com EtOAc e lavada com NaHCO3 aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi separada, seca (MgSO4<), filtrada e concentrada em um xarope laranja. O material bruto foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluído com 2-5% MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 148(3,44 g, 73%). LCMS e 1H RMN foram consistentes com o produto esperado.

[001005] O composto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (75 ml). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidróxido de paládio em carbono) foi adicionado (350 mg). O gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em DCM, e LCMS), o catalisador foi re-movido por filtração através de uma camada de celite. O filtrado foi con-centrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 149 (2,6 g). A LCMS foi consistente com o produto desejado. O resíduo foi dissolvido em DMF seco (10 ml) e foi usado imediatamente na etapa seguinte.

[001006] O composto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) foi dissolvido em DMF seco (20 ml). Para este DIEA (450 μL, 2,6 mmol, 1,5 eq.) e HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi deixada agitar por 15 minutos à temperatura ambiente sob nitrogênio. Uma solução do composto 149 (2,6 g) em DMF anidro (10 mL) foi adicionada. O pH da reação foi ajustado para pH = 9-10 pela adição de DIEA (se necessário). A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente sob nitrogênio por 2h. Após conclusão, a reação foi diluída com EtOAc (100 mL) e lavada com NaHCO3 saturado aquoso, seguido por salmoura. A fase orgânica foi separada, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluído com 2-10 % MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 150 (0,62 g, 20%). LCMS e RMN 1H foram consistentes com o produto desejado.

[001007] O composto 150 (0,62 g) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (5 L). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidró-xido de paládio em carbono) foi adicionado (60 mg). O gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em DCM, e LCMS), o catalisador foi removido por filtração (filtro de Teflon da ponta na seringa, 0,45 μm). O filtrado foi concentrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 151 (0,57 g). A LCMS foi consistente com o produto desejado. O produto foi dissolvido em 4 mL de DMF seco e foi usado imediatamente na etapa seguinte.

[001008] O composto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (5 mL) e N,N-Di-isopropiletilamina (75 μL, 1 mmol) e PFP-TFA (90 μL, 0,76 mmol) foram adicionados. A mistura de reação se tornou magenta após o contato, e se torou gradualmente laranja durante os próximos 30 minutos. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão (formação de éster de PFP), uma solução do composto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) em DMF foi adicionada. O pH da reação foi ajustado para pH = 9-10 pela adição de N,N-Di-isopro- piletilamina (se necessário). A mistura de reação foi agitada sob nitro-gênio por ~30 min. Após a conclusão, a maior parte do solvente foi re-movida sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com CH2Cl2 e lavado com NaHCO3 saturado aquoso, seguido por salmoura. A fase orgânica foi separada, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada em um xarope laranja. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica- gel(2-10 % MeOH em CH2Cl2) para produzir o Composto 152 (0,35 g, 55%). LCMS e RMN 1H foram consistentes com o produto desejado.

[001009] O composto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) foi dissolvido em 1:1 MeOH/EtOAc (10 mL). A mistura de reação foi purgada, ebulindo-se um fluxo de argônio através da solução por 15 minutos. Um catalisador de Pearlman (hidróxido de paládio em carbono) foi adicionado (35 mg). O gás hidrogênio foi ebulido através da solução por 30 minutos. Após a conclusão (TLC 10% de MeOH em DCM, e LCMS), o catalisador foi re-movido por filtração (filtro de Teflon da ponta na seringa, 0,45 μm). O filtrado foi concentrado por evaporação giratória, e foi seco brevemente sob alto vácuo para produzir o Composto 153 (0,33 g, quantitativo). A LCMS foi consistente com o produto desejado.

[001010] O composto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (5 mL) com agitação sob nitogênio. A isto, N,N-Di-isopropiletila- mina (65 μL, 0,37 mmol) e PFP-TFA (35 μL, 0,28 mmol) foram adicio-nados. A mistura de reação foi agitada sob nitrogênio por ~30 min. A mistura de reação se tornou magenta após o contato, e gradualmente se tornou laranja. O pH da mistura de reação foi mantida em pH = 9-10, adicionando-se mais N,N-Di-isopropiletilamina. O progresso da reação foi monitorado por TLC e LCMS. Após a conclusão, a maior parte do solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com CH2Cl2 (50 mL) e lavado com NaHCO3 saturado aquoso, seguido por salmoura. A camada orgânica foi seca com MgSO4, filtrada e concen-trada num xarope laranja. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna e eluído com 2-10 % MeOH em CH2Cl2 para produzir o Composto 154 (0,29 g, 79%). LCMS e RMN 1H foram consistentes com o produto desejado.

[001011] O Composto Oligomérico 155, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-6, foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-6 (GalNAc3-6a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-.

[001012] A estrutura de GalNAc3-6 (GalNAc3-6-a-CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 52: Preparação do Oligonucleotídeo 160 Compreendendo GalNAc3-9

[001013] O composto 156 foi sintetizado após o procedimento descrito na literatura (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).

[001014] O composto 156, (18,60 g, 29,28 mmol) foi dissolvido em metanol (200 mL). Paládio em carbono (6,15 g, 10% em peso, carrega-mento (base seca), pó de carbono de matriz, úmido) foi adicionado. A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente sob hidrogênio por 18 h. A mistura da reação foi filtrada através de uma almofada de celite e lavada a almofada plenamente com metanol. O filtrado combi-nado foi lavado e concentrado à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluído com 5-10% de metanol em diclorometano para produzir o Composto 157 (14,26 g, 89%). Massa m/z 544.1 [M + H]+.

[001015] O composto 157 (5 g, 9,17 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (30 mL). HBTU (3,65 g, 9,61 mmol) e N,N-Di-isopropiletilamina (13,73 mL, 78,81 mmol) foram adicionados e a mistura d ereação foi agitada à temperatura ambiente por 5 minutos. A isto, foi adicionada uma solução do composto 47 (2,96 g, 7,04 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 8 h. A mistura da reação foi derramada em uma solução aquosa de NaHCO3. A mistura foi extraída com acetato de etil e a camada orgânica foi lavada com salmoura e seca (Na2SO4), filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel e eluído com 50% de acetato de etil em hexano para produzir o Composto 158 (8,25g, 73,3%). A estrutura foi confirmada por MS e análise 1H RMN.

[001016] O composto 158 (7,2 g, 7,61 mmol) foi seco com P2O5 sob pressão reduzida. O composto seco foi dissolvido em DMF anidro (50 mL). Para este 1H-tetrazol (0,43 g, 6,09 mmol) e N-metilimidazol (0,3 mL, 3,81 mmol) e 2-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropil fosforodiamidita (3,65 mL, 11,50 mmol) foram adicionados. A mistura da reação foi agitada t sob uma atmosfera de argônio por 4h. A mistura da reação foi diluída com acetato de etila (200 mL). A mistura de reação foi lavada com NaHCO3saturado e salmoura. A fase orgânica foi separada, seca (Na2SO4), filtrada e evaporada. O resíduo obtido foi purificado por cro- matografia em coluna de sílica gel e eluído com 50-90% de acetato de etilo em hexano para produzir Composto 159 (7,82 g, 80,5%). A estrutura foi confirmada por LCMS e análise 31P RMN.

[001017] Composto Oligomérico 160, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-9, foi preparado usando procedimentos padrão de síntese de oligonucleotídeo. Três unidades do composto 159 foram acopladas ao suporte sólido, seguido por fosforamiditas nucleotídicas. O tratamento do composto oligomérico protegido com amônia aquosa pro-duziu o composto 160. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-9 (GalNAc3-9a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O) (OH)-. A estrutura de GalNAc3-9 (GalNAc3-9a-CM) é mostrada abaixo: Exemplo 53: Alternam o procedimento para a preparação dos com- postos 18 (GalNAc3-1a e GalNAc3-3a)

[001018] Lactona 161 foi reagida com diamino propano (3-5 eq) ou diamino propano protegido por Mono-Boc (1 eq) para fornecer álcool 162a ou 162b. Quado a propanodiamina não protegida foi usada para a reação acima, o excesso de diamina foi removido por evaporação sob alto vácuo e o grupo amino livre em 162a foi protegido usando CbzCl para fornecer o 162b como um sólido branco após a purificação por cro- matografia de coluna. O álcool 162b foi também reagido com o composto 4 na presença de TMSOTf para fornecer o 163a que foi convertido em 163b pela remoção do grupo Cbz usando hidrogenação catalítica. O éster de pentafluorofenil (PFP) 164 foi preparado reagindo-se o triácido 113 (ver o Exemplo 48) com PFPTFA (3,5 eq) e piridina (3,5 eq) em DMF (0,1 a 0,5 M). O triéster 164 foi diretamente reagido com a amina 163b (3-4 eq) e DIPEA (3-4 eq) para fornecer o Composto 18. O método acima facilita grandemente a purificação dos intermediários e minimiza a formação de subprodutos que são formados usando o procedimento descrito no Exemplo 4. Exemplo 54: Alternam o procedimento para a preparação dos com-postos 18 (GalNAc3-1a e GalNAc3-3a)

[001019] O éster triPFP 164 foi preparado a partir do ácido 113 usando o procedimento delineado no exemplo 53 acima e reagido com diamina protegida por mono-Boc para fornecer o 165 num rendimento essencialmente quantitativo. Os grupos Boc foram removidos com ácido clorídrico ou ácido trifluoroacético para fornecer a triamina que foi rea-gida com o ácido ativado por PFP 166 na presença de uma base ade-quada, tal como DIPEA para fornecer o Composto 18.

[001020] O ácido 166 Gal-NAc protegido por PFP foi preparado a partir do ácido correspondente pelo tratamento com PFPTFA (1-1,2 eq) e piridina (1-1,2 eq) em DMF. O ácido precursor, por sua vez, foi preparado a partir do álcool correspondente por oxidação usando TEMPO (0,2 eq) e BAIB em acetonitrila e água. O álcool precursor foi preparado a partir do intermediário de açúcar 4 pela reação com 1,6- hexanodiol (ou 1,5-pentanodiol ou outro diol para outros n valores) (2-4 eq) e TMSOTf usando as condições descritas anteriormente no exemplo 47.

Exemplo 55: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo grupos conjugados em 3' ou 5'(comparação de GalNAc3-1, 3, 8 and 9) mirando SRB-1 in vivo

[001021] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. ISIS 353382 não conjugado foi incluído como um padrão. Cada um dos diversos grupos conjugados de GalNAc3 foi ligado tanto ao terminal 3' quanto ao 5' do oligonucleotídeos respectivo por um nucleosí- deo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster (porção clivável). Tabela 39 ASO modificado que se direciona ao SRB-1

[001022] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleo- sídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O- P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito.

[001023] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-9 foi mostrada anteriormente no Exemplo 52. A estrutura de GalNAc3-3 foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-8 foi mostrada anteriormente no Exemplo 47.

Tratamento

[001024] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutâ-nea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 655861, 664078, 661161, 665001 ou com solução salina. Cada grupo de trata-mento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.

[001025] Conforme ilustrado na Tabela 40, tratamento com oligonu- cleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. De fato, os oligonucleotídeos antissenso que compreendem os conjugados de GalNAc3-1 e GalNAc3-9 ligados ao fosfodiéster no terminal 3’ (ISIS 655861 e ISIS 664078 ) ou os conjuga-dos de GalNAc3-3 e GalNAc3-8 ligados no teminal 5’ (ISIS 661161 e ISIS 665001) mostraram melhora substancial de potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 353382). Além disso, ISIS 664078, compreende um GalNAc3-9 conjugado no terminal 3' foi essencialmente equipotentes comparado a ISIS 655861, que compreende um GalNAc3-1 conjugado no terminal 3'. Os oligonucleotídeos antissenso conjugados em 5', ISIS 661161 e ISIS 665001, que compreendem um GalNAc3-3 ou GalNAc3-9, respectivamente, tiveram maior potência em comparação aos oligonucleotídeos antissenso conjugados em 3' (ISIS 655861 e ISIS 664078). Tabela 40 ASOs contendo GalNAc3-1, 3, 8 ou 9 que se direciona ao SRB-1 001026] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na tabela abaixo. Tabela 41

Exemplo 56: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo grupos de conjugados em 3' e em 5'(comparação de GalNAc3-1, 2, 3, 5, 6, 7 e 10) direcionando ao SRB-1 in vivo

[001027] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em ca-mundongos. ISIS 353382 não conjugado foi incluído como um padrão. Cada um dos diversos grupos de conjugado de GalNAc3 foi ligado ao ter-minal 5' do respectivo oligonucleotídeo por um nucleosídeo de 2'-desoxia- denosina ligado a fosfodiéster (porção clivável), exceto pelo ISIS 655861 que teve o grupo de conjugado de GalNAc3 ligado no terminal 3'. Tabela 42 ASO modificado que se direciona ao SRB-1

[001028] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleo- sídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O- P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito.

[001029] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-2a foi mostrada anteriormente no Exemplo 37. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-5a foi mostrada anteriormente no Exemplo 49. A estrutura de GalNAc3-6a foi mostrada anteriormente no Exemplo 51. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada anteriormente no Exemplo 46 Tratamento

[001030] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados uma vez na do-sagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 ou com solução salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.

[001031] Conforme ilustrado na Tabela 43, o tratamento com oligonu- cleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. De fato, os oligonucleotídeos antissenso mostraram melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotí- deo antissenso não conjugado (ISIS 353382). Os oligonucleotídeos antis- senso conjugados em 5' mostraram um ligeiro aumento na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso conjugado em 3'. Tabela 43

[001032] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 44 abaixo. Tabela 44

Exemplo 57: Duração do estudo de ação de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado em 3' que se direciona a ApoC III in vivo

[001033] Camundongos foram injetados uma vez que as doses indicadas abaixo e monitorados durante o curso de 42 dias para os níveis de ApoC-III e de triglicerídeos plasmáticos (TG plasmático). O estudo foi realizado usando 3 camundongos transgênicos que expressam a APOC-III humana em cada grupo. Tabela 45 ASO modificado que se direciona à ApoC III

[001034] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleo- sídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O- P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito.

[001035] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. Tabela 46 Níveis de mRNA de ApoC III (% de Salina no Dia 1) e TG Plasmático (% de Salina no Dia 1)

[001036] Como pode ser visto na tabela acima, a duração da ação aumentou com a adição do grupo de conjugado em 3' em comparação ao oligonucleotídeo não conjugado. Houver um aumento adicional na duração da ação para o oligonucleotídeo de PO/PS misto conjugado 647536 em comparação ao oligonucleotídeo PS completo conjugado 647535.

Exemplo 58: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo grupos de conjugados em 3'(comparação de Gal- NAc3-1 e GalNAc4-11) direcionando ao SRB-1 in vivo

[001037] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. ISIS 440762 não conjugado foi incluído como um padrão não conjugado. Cada um dos grupos de conjugado foi ligado no terminal 3' do respectivo oligonucleotídeo por uma porção clivável do nucleosí- deo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster

[001038] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-11a foi mostrada anteriormente no Exemplo 50.

Tratamento

[001039] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutâ-nea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 440762, 651900, 663748 ou com solução salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a admi-nistração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBO-GREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protoco-lospadrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcenta-gemmédia dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de trata-mento, normalizados para o controle com salina.

[001040] Conforme ilustrado na Tabela 47, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos antisensos, compre-endendo o fosfodiéster ligado GalNAc3-1 e GalNAc4-11 conjugados no terminal 3' (ISIS 651900 e ISIS 663748) mostraram melhoria substancial na potência em comparação com o antisenso não conjugado do oligo- nucleotídeo (ISIS 440762). Os dois oligonucleotídeos conjugados, Gal- NAc3-1 e GalNAc4-11, foram equipotentes. Tabela 47 ASO modificado que se direciona ao SRB-1 Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleo- sídeo 2’-MOE modificado; "k" indica um nucleosídeo bicíclico 6’-(S)- CHs; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleo- sídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos conju-gados estão em negrito.

[001041] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 48 abaixo. Tabela 48

Exemplo 59: Efeitos do conjugado GalNAc3-1 direcionando FXI in vivo

[001042] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo de doses múltiplas para a inibição antissenso de FXI em camun-dongos. ISIS 404071 foi incluído como um padrão não conjugado. Cada um dos grupos de conjugado foi ligado no terminal 3' do respectivo oli- gonucleotídeo por uma porção clivável de nucleosídeo de 2'-desoxiade- nosina ligado a fosfodiéster. Tabela 49 ASOs modificados direcionados ao FXI

[001043] Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleo- sídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O- P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito.

[001044] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9.

Tratamento

[001045] Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutâ-nea duas vezes por semana por 3 semanas na dosagem mostrada abaixo com ISIS 404071, 656172, 656173 ou controle tratado com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de FXI no fígado usando PCR em tempo real e rea-gente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis da proteína FXI plasmáticos também foram medidos usando ELISA. Os níveis de mRNA de FXI foram determinados em relação ao RNA total (usando RI-BOGREEN®), antes da normalização para controles tratados com PBS. Os resultados são apresentados a seguir como a porcentagem média dos níveis de mRNA de FXI para cada grupo de tratamento. Os dados foram normalizados para os controles tratados com PBS e é denotado como "% de PBS". Os ED50s foram medidos usando métodos semelhantes, conforme descrito anteriormente e são apresentados a seguir. Tabela 50 mRNA do Fator XI (% de Salina)

[001046] Conforme ilustrado na Tabela 50, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de FXI de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de 3'-GalNAc3-1 mostraram melhoria substancial na potência em comparação com o antissenso não conjugado do oligo- nucleotídeo (ISIS 404071). Entre os dois oligonucleotídeos conjugados, uma melhora na potência foi ainda fornecida, substituindo-se algumas das ligações PS por PO (ISIS 656173).

[001047] Conforme ilustrado na Tabela 50a, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de da proteína FXI de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de 3'-GalNAc3-1 mostraram melhoria substancial na potência em comparação com o antissenso não conjugado do oligo- nucleotídeo (ISIS 404071). Entre os dois oligonucleotídeos conjugados, uma melhora na potência foi ainda fornecida, substituindo-se algumas das ligações PS por PO (ISIS 656173). Tabela 50a Proteína Fator XI (% de Salina)

[001048] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Bilirrubina total, albumina total, CRE e BUN também foram ava-liados. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alte-ração significativa do grupo com salina. Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na tabela abaixo. Tabela 51

Exemplo 60: Efeitos de ASOs conjugados que se direcionam ao SRB-1 in vitro

[001049] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo de doses múltiplas para inibição antissenso de SRB-1 em hepa- tócitos de camundongo primários. ISIS 353382 foi incluído como um pa-drão não conjugado. Cada um dos grupos de conjugado foi ligado no terminal 3' ou 5' do respectivo oligonucleotídeo por uma porção clivável de nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster. Tabela 52 ASO modificado que se direciona ao SRB-1 Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleosídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonu- cleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica - O-P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito.

[001050] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-8a foi mostrada anteriormente no Exemplo 47. A estrutura de GalNAc3-9a foi mostrada anteriormente no Exemplo 52. A estrutura de GalNAc3-6a foi mostrada anteriormente no Exemplo 51. A estrutura de GalNAc3-2a foi mostrada anteriormente no Exemplo 37. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada anteriormente no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-5a foi mostrada anteriormente no Exemplo 49. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.

Tratamento

[001051] Os oligonucleotídeos listados acima foram testados in vitro em células hepatócitos primários de camundongo colocadas numa densidade de 25.000 células por poço e tratadas com 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 ou 20 nM de oligonucleotídeo modificado. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA foram medidos por PCR em tempo rea quantitativa e os níveis de mRNA de SRB-1 foram ajustados de acordo com o conteúdo total de RNA, conforme medido por RIBOGREEN®.

[001052] A IC50 foi calculada usando métodos padrão e os resultados são apresentados na Tabela 53. Os resultados mostram que, sob condições de absorção livre nas quais nenhum reagente ou nenhuma técnica de eletroporação são usados para promover artificialmente a entrada dos oligonucleotídeos nas células, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc foram significativamente mais potentes nos hepatócitos do que o oligonucleotídeo de origem (ISIS 353382) que não compreende um conjugado de GalNAc. Tabela 53 aMédia de múltiplas execuções. Exemplo 61: Preparação do composto oligomérico 175, compreen- dendo GalNAc3-12

[001053] Composto 169 está disponível comercialmente. O composto 172 foi preparado pela adição de benzil (perfluorofenil) glutarato ao composto 171. O benzil (perfluorofenil) glutarato foi preparado, adi-cionando-se PFP-TFA e DIEA ao ácido 5-(benziloxi)-5-oxopentanoico em DMF. O Composto Oligomérico 175, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-12 foi preparado a partir do composto 174 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-12 (GalNAc3- 12a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3- 12 (GalNAc3-12a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 62: Preparação do composto oligomérico 180 compreen-dendo GalNAc3-13

[001054] Composto 176 foi preparado usando o procedimento geral mostrado no Exemplo 2. O Composto Oligomérico 180, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-13, foi preparado a partir do com-posto 177 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 49. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-13 (GalNAc3-13a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modali-dades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-13 (GalNAc3-13a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 63: Preparação do composto oligomérico 188, compreen- dendo GalNAc3-14

[001055] Compostos 181 e 185 estão disponíveis comercialmente. O Composto Oligomérico 188, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-14 foi preparado a partir do composto 187 usando os procedi-mentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-14 (GalNAc3-14a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-14 (GalNAc3-14a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 64: Preparação do composto oligomérico 197, compreendendo GalNAc3-15

[001056] Composto 189 está disponível comercialmente. O com posto 195 foi preparado usando o procedimento geral mostrado no Exemplo 31. O composto oligomérico 197, que compreende um grupo de conjugado de GalNAc3-15, foi preparado a partir dos compostos 194 e 195 usando procedimentos de síntese de oligonucleotídeo padrão. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-15 (GalNAc3-15a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-15 (GalNAc3-15a- CM-) é mostrada abaixo:

Exemplo 65: Estudo dependente de dose de oligonucleotídeos compreendendo grupos de conjugados em 5'(comparação de Gal- NAc3-3, 12, 13, 14 e 15) direcionando ao SRB-1 in vivo

[001057] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. ISIS 353382 não conjugado foi incluído como um padrão. Cada um dos grupos conjugados GalNAc3 foi ligado no terminal 5' do respectivo oligonucleotídeo por uma porção clivável de nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster (porção clivável). Tabela 54 ASOs modificados direcionados a SRB-1 Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleo- sídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O- P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito.

[001058] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-12a foi mostrada anteriormente no Exemplo 61. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada anteriormente no Exemplo 62. A estrutura de GalNAc3-14a foi mostrada anteriormente no Exemplo 63. A estrutura de GalNAc3-15a foi mostrada anteriormente no Exemplo 64.

Tratamento

[001059] Camundongos C57bl6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma ou duas vezes na dosagem mostrada abaixo com ISIS 353382, 661161, 671144, 670061, 671261, 671262, ou com solução salina. Os camundongos que foram dosados duas vezes receberam a segunda dose três dias após a primeira dose. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a ad-ministração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a por-centagemmédia dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.

[001060] Conforme ilustrado na Tabela 55, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Nenhuma diferença significativa no knockdown alvo foi observada entre os animais que receberam uma dose única e os animais que receberam duas doses (ver ISIS 353382, dosagens 30 e 2 x 15 mg/kg; e ISIS 661161 dosagens 5 e 2 x 2,5 mg/kg). Os oligonucleotídeos que compreendem os conjugados de GalNAc3-3,12, 13, 14 e 15 ligados a fosfodiéster mostraram melhora substancial na potência em comparação ao oligonucleotídeo antissenso não conjugado (ISIS 335382). Tabela 55 mRNA de SRB-1 (% de Salina)

[001061] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. As alterações dos pesos corporais foram avaliadas sem nenhuma diferença significativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 56 abaixo. Tabela 56 Exemplo 66: Efeito de diversas frações cliváveis sobre a inibição antissenso in vivo pelo oligonucleotídeos que se direcionam ao SRB-1 compreendendo um agrupamento de 5’-GalNAc3

[001062] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. Cada um dos grupo de conjugado GalNAc3 foi ligado no terminal 5' do respectivo oligonucleotídeo por uma porção clivável de nucleosídeo de 2'-desoxiadenosina ligado a fosfodiéster (porção clivá- vel) (CM). Tabela 57 ASOs modificados direcionados a SRB-1 Letras maiúsculas indicam a nucleobase para cada nucleo- sídeo e mC indica uma 5-metilcitosina. Subscritos: "e" indica um nucleo- sídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O- P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em negrito.

[001063] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada anteriormente no Exemplo 62.

Tratamento

[001064] Camundongos C57bl6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subscu- tânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com ISIS 661161, 670699, 670700, 670701, 671165, ou com solução salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 no fígado usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.

[001065] Conforme ilustrado na Tabela 58, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos antissenso compreen-dendo diversas frações cliváveis todos mostraram potências semelhan- tes. Tabela 58 mRNA de SRB-1 (% de Salina)

[001066] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. As altera- ções dos pesos corporais foram avaliadas sem nenhuma diferença sig- nificativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 56 abaixo. Tabela 59 Exemplo 67: Preparação do composto oligomérico 199, compreendendo GalNAc3-16

[001067] Composto Oligomérico 199, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-16 foi preparado usando os procedimentos gerais ilustrados nos Exemplos 7 e 9. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-16 (GalNAc3-16a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em determinadas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-16 (GalNAc3-16a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 68: Preparação dos compostos oligoméricos 200, compreendendo GalNAc3-17

[001068] Composto Oligomérico 200, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-17, foi preparado usando os procedimentos ge-rais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-17 (GalNAc3-17a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura do GalNAc3-17 (GalNAc3-17a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 69: Preparação do composto oligomérico 201, compreen- dendo GalNAc3-19

[001069] Composto Oligomérico 201, compreendendo<um grupo de conjugado de GalNAc3-18, foi preparado usando os procedimentos ge-rais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-18 (GalNAc3-18a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura do GalNAc3-18 (GalNAc3-18a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 70: Preparação do composto oligomérico 204, compreen- dendo GalNAc3-19

[001070] Composto Oligomérico 204, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-19 foi preparado a partir do composto 64 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 52. A parte do agrupa-mento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-19 (GalNAc3-19a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura do GalNAc3-19 (Gal- NAc3-19a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 71: Preparação dos compostos oligoméricos 210, com- preendendo GalNAc3-20

[001071] Composto 20 foi preparado, adicionando-se PFP-TFA e DIEA ao ácido 6-(2,2,2-trifluoroacetamido)hexanoico em acetonitrila , que foi preparada pela adição de anidrido tríflico ao ácido 6-aminohexa- noico. A mistura de ração foi aquecida a 80 oC, em seguida baixada para temperatura ambiente. O Composto Oligomérico 210, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-20 foi preparado a partir do composto 208 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 52. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-20 (GalNAc3-20a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-20 (GalNAc3-20a- CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 72: Preparação do composto oligomérico 215, compre- ende GalNAc3-21

[001072] Composto 211 está disponível comercialmente. O Com-postoOligomérico 215, compreendendo um grupo de conjugado de Gal- NAc3-21 foi preparado a partir do composto 213 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 52. O agrupamento de GalNAc3 parte do grupo de conjugado GalNAc3-21 (GalNAc3-21a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-21 (GalNAc3-21a-CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 73: Preparação do composto oligomérico 221, compreendendo GalNAc3-22

[001073] Composto 220 foi preparado a partir do composto 219 usando tetrazolida de di-isopropilamônio. O Composto Oligomérico 221, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-21, é preparado a partir do composto 220 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 52. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-22 (GalNAc3-22a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em uma certas modalidades, a porção clivável é -P(=O) (OH)-ad- P(=O)(OH)-. A estrutura de GalNAc3-22 (GalNAc3-22a-CM-) é mostrada abaixo: Exemplo 74: Efeito de diversas frações cliváveis sobre a inibição antissenso in vivo pelo oligonucleotídeos que se direcionam ao SRB-1 compreendendo um agrupamentode 5’-GalNAc3.

[001074] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. Cada um dos grupos de conjugado de GalNAc3 foi ligado no terminal 5' do respectivo oligonucleotídeo. Tabela 60 ASOs modificados direcionados a SRB-1

[001075] Em todas as tabelas, as letras maiúsculas indicam a nu- cleobase para cada nucleosídeo e mC indica uma 5-metil citosina. Subs-critos:"e" indica um nucleosídeo 2’-MOE modificado; "d" indica um β-D- 2’-desoxirribonucleosídeo; "s" indica uma ligação internucleosídica fosforotioato (PS); "o" indica uma ligação internucleosídica fosfodiéster (PO); e "o’" indica -O-P(=O)(OH)-. Os grupos conjugados estão em ne-grito.

[001076] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-17a foi mostrada anteriormente no Exemplo 68 e a estrutura de GalNAc3-18a foi mostrada no Exemplo 69.

Tratamento

[001077] Camundongos C57BL/6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por vis subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com um oligonucleotídeo listad na Tabela 60 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a ad-ministração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.

[001078] Conforme ilustrado na Tabela 61, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos antissenso que com-preendem um conjugado de GalNAc mostraram potências semelhantes e foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que faltava um conjugado de GalNAc. Tabela 61 mRNA de SRB-1 (% de Salina)

[001079] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro foram medidos em relação aos camundongos injetados com salina usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirrubina total e BUN. A alteração nos pesos corporais foi avaliada sem nenhuma alteração significativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mostrados na Tabela 62 abaixo. Tabela 62:

Exemplo 75: Análise farmacocinética de oligonucleotídeos com- prendendo um grupo de conjugado em 5’

[001080] A PK dos ASOs nas Tabelas 54, 57 e 60 acima foi avaliada usando amostras de fígado que foram obtidas após os procedimentos de tratamento descritos nos Exemplos 65, 66 e 74. As amostras de fígado foram cortadas e extraídas usando protocolos padrão e analisadas por IP-HPLC-MS juntamente com um padrão interno. O nível de tecido combinado (μg/g) de todos os metabólitos foi medido pela integração dos picos de UV apropriados, e o nível de tecido do ASO de comprimento total em que faltava o conjugado ("de origem", que tem N° Isis 353382 neste caso) foi medido usando os cromatogramas de íon extraído apropriados (EIC). Tabela 63 Análise PK no Fígado

[001081] Os resultados na Tabela 63 acima mostram que houve mai- ores níveis de tecido hepático dos oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3 do que do oligonucleotídeo de origem que não compreende um grupo de conjugado de GalNAc3 (ISIS 353382) 72 horas após a administração do oligonucleotídeo, particularmente ao levar em consideração as diferenças na dosagem entre os oligonucleotídeos com e sem um grupo de conjugado de GalNAc3. Além disso, em 72 horas, 40-98% de cada oligonucleotídeo compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3 foram metabolizados no composto de origem, indicando que os grupos de conjugado de GalNAc3 foram clivados a partir dos oligonucleotídeos. Exemplo 76: Preparação do composto oligomérico 230, compreendendo GalNAc3-23

[001082] O composto 222 está disponível comercialmente. 44,48 ml (0,33 mol) do composto 222 foram tratados com cloreto de tosila (25,39 g, 0,13 mol) em piridina (500mL) por 16 horas. A reação foi então evaporada para um óleo, dissolvida em EtOAc e lavada com água, NaHCO3 saturado, salmoura e foi seca sobre Na2SO4. O acetato de etila foi concentradoaté a secura e purificado por cromatografia em coluna, eluído com EtOAc/hexanos (1:1) seguidos de 10% de metanol em CH2Cl2 para render o composto 223 como um óleo incolor. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. 10 g (32,86 mmol) de 1-Tosiltrietileno glicol (composto 223) foi tratado com azida sódica (10,68 g, 164,28 mmol) em DMSO (100 mL) à temperatura ambiente por 17 horas. A mistura de reação foi então vertida em água, e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água três vezes e seca sobre Na2SO4. A camada orgânica foi concentrada até a secura para render 5,3 g do composto 224 (92%). LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. 1-Azido- trietileno glicol (composto 224, 5,53 g, 23,69 mmol) e composto 4 (6 g, 18,22 mmol) foram tratados com peneiras moleculares 4A (5 g), e TMSOTf (1,65 ml, 9,11 mmol) em diclorometano (100 mL) sob uma atmosfera inerte. Após 14 horas, a reação foi filtrada para remover as peneiras, e a camada orgânica foi lavada com sal. NAHCO3 saturado, água, salmoura e foi seca sobre Na2SO4. A camada orgânica foi concentradaà secura e purificada por cromatografia de coluna, eluída com um gradiente de metanol 2 a 4% em diclorometano para gerar o composto 225. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O com-posto 225 (11,9 g, 23,59 mmol) foi hidrogenado em EtOAc/Metanol (4:1, 250 mL) com catalisador de Pearlman. Após 8 horas, o catalisador foi removido por filtração e os solventes removidos à secura para gerar o composto 226. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura.

[001083] A fim de gerar o composto 227, uma solução de ácido nitro- metanotrispropiônico (4,17 g, 15,04 mmol) e base de Hunig (10,3 ml, 60,17 mmol) em DMF (100 mL) foram tratados em gotas com acetato de pentaflourotrifluoro (9,05 ml, 52,65 mmol). Após 30 minutos, a reação foi despejada em água gelada e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água, salmoura e seca sobre Na2SO4. A camada orgânica foi concentrada à secura e, em seguida, recristalizada a partir do heptano para render o composto 227 como um sólido branco. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 227 (1,5 g, 1,93 mmol) e o composto 226 (3,7 g, 7,74 mmol) foram agitados à temperatura ambiente em acetonitrila (15 mL) por 2 horas. A reação foi então evaporada à secura e purificada por cromatografia de coluna, eluindo- se com um gradiente de metanol 2 a 10% em diclorometano para gerar o composto 228. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 228 (1,7 g, 1,02 mmol) foi tratado com níquel de Raney (cerca de 2 g úmido) em etanol (100mL) numa atmosfera de hidrogênio. Após 12 horas, o catalisador foi removido por filtração e a camada orgânica foi evaporada a um sólido que foi usado diretamente na etapa seguinte. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. Este sólido (0,87 g, 0,53 mmol) foi tratado com ácido benzilglutárico (0,18 g, 0,8 mmol), HBTU (0,3 g, 0,8 mmol) e DIEA (273,7 μl, 1,6 mmol) em DMF (5 mL). Após 16 horas, o DMF foi removido sob pressão reduzida a 65°C a um óleo, e o óleo foi dissolvido em diclorometano. A camada orgânica foi lavada com solução de sal. NaHCO3, salmoura e seca sobre Na2SO4. Após a evaporação da camada orgânica, o composto foi purificado por cromatografia de coluna e eluído com um gradiente de metanol 2 a 20% em diclorometano para gerar o produto acoplado. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O éster benzílico foi desprotegido com catalisador de Pearlman sob uma atmosfera de hidrogênio por 1 hora. O catalisador foi então removido por filtração e os solventes removidos à secura para gerar o ácido. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O ácido (486 mg, 0,27 mmol) foi dissolvido em DMF seco (3 mL). Piridina (53,61 μl, 0,66 mmol) foi adicionada e a reação foi purgada com argônio. Acetato de pentaflourotriflouro (46,39 μl, 0,4 mmol) foi len-tamente adicionado à mistura de reação. A cor da reação mudou de amarelo pálido para vinho, e gerou uma fumaça clara que foi dissipada com um fluxo de argônio. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente por uma hora (a conclusão da reação foi confirmada por LCMS). O solvente foi removido sob pressão reduzida (rotovap) a 70°C. O resíduo foi diluído com DCM e lavado com 1N NaHSO4, salmoura, bicarbonato de sódio saturado e salmoura novamente. Os produtos orgânicos foram secos com Na2SO4, filtrados, e foram concentrados à secura para gerar 225 mg do composto 229 como uma espuma amarela frágil. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura.

[001084] Composto Oligomérico 230, compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3-23 foi preparado a partir do composto 229 usando os procedimentos gerais ilustrados no Exemplo 46. A parte do agrupamento de GalNAc3 do grupo de conjugado GalNAc3-23 (GalNAc3- 23a) pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. A estrutura de GalNAc3-23 (Gal- NAc3-23a-CM) é mostrada abaixo:

Exemplo 77: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que direcionam SRB-1 compreendendo conjugado GalNAc3

[001085] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB-1 em camundongos. Tabela 64 ASOs modificados direcionados a SRB-1

[001086] A estrutura GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39, GalNAc3-9a foi mostrada no Exemplo 52, GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46, GalNAc3-20a foi mostrada no Exemplo 71, e GalNAc3-23a foi mostrada no Exemplo 76.

Tratamento

[001087] Camundongos C57BL/6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez numa dosagem mostrada abaixo com um oligonu- cleotídeo listado na Tabela 64 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB- 1 usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.

[001088] Conforme ilustrado na Tabela 65, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Tabela 65 mRNA de SRB-1 (% de Salina)

[001089] Os níveis de transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas no soro também foram medidos usando protocolos padrão. Também foram avaliadas a bilirru- bina total e BUN. As alterações dos pesos corporais foram avaliadas sem nenhuma diferença significativa do grupo com salina (dados não mostrados). Os valores de ALTs, ASTs, bilirrubina total e BUN são mos-trados na Tabela 66 abaixo. Tabela 66

Exemplo 78: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que direcionam Angiotensinogênio compreendendo conjugado Gal- NAc3

[001090] Os oligonucleotídeos listados abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para inibição antissenso do Angiotensino- gênio (AGT) em ratos Sprague Dawley normotensos. Tabela 67 ASOs modificados direcionados a AGT

[001091] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9.

Tratamento

[001092] Camundongos Sprague Dawley machos de seis semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana numa dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonculeotídeo listado na Tabela 67 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a dose final. Os níveis de mRNA hepáticos de AGT foram medidos usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis plasmáticos da proteína AGT foram medidos usando o ELISA de Angiotensinogênio Total (Catálogo # JP27412, IBL International, Toronto, ON) com plasma diluído 1:20.000. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de AGT no fígado ou níveis da proteína AGT no plasma para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com PBS.

[001093] Conforme ilustrado no Tabela 68, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático de AGT de uma forma dependente da dose, e o oligo- nucleotídeo compreendendo um conjugado de GalNAc foi significativamente mais potente do que o oligonucleotídeo de origem em que faltava um conjugado de GalNAc. Tabela 68 Níveis da proteína plasmáticos e do mRNA hepático de AGT

[001094] Os níveis da transaminase, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) hepáticas, no plasma e os pesos corporais também foram medidos no momento do sacrifício usando pro-tocolospadrão. Os resultados são mostrados na Tabela 69 abaixo. Tabela 69 Níveis de transaminase hepática e pesos corporais dos ratos

Exemplo 79: Duração do estudo de ação in vivo de oligonucleotí- deos que direcionam APOC-III compreendendo um conjugado Gal- NAc3

[001095] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 70 abaixo foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em camundongos. Tabela 70 ASOs modificados que se direcionam a APOC-III

[001096] A estrutura GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46, GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62.

Tratamento

[001097] Camundongos transgênicos de seis a oito semanas de idade que expressam APOC-III humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 70 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais. O sangue foi retirado antes da dosagem para determinar a base de referência e em 72 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas e 6 semanas após a dose. Os níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III foram medidos conforme descrito no Exemplo 20. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de triglicérides plasmáticos e de APOC-III para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência, mostrando que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc exibiam uma duração mais longa de ação do que o oligonucleotídeo de origem sem um grupo de conjugado (ISIS 304801), mesmo com a dosagem do original sendo três vezes a dosagem dos oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de Gal- NAc. Tabela 71 Níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III em ca- mundongos trangênicos Exemplo 80: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que direcionam Alfa-1-Antitripsina (A1AT) compreendendo conjugado GalNAc3

[001098] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 72 abaixo foram testados em um estudo para a inibição dependente de dose de A1AT em camundongos. Tabela 72 ASOs modificados direcionados à A1AT

[001099] A estrutura GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46, GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62.

Tratamento

[001100] Camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana numa dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo listado na Tabela 72 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os níveis de mRNA hepáticos de A1AT foram medidos usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis da proteína plasmática A1AT foram determinados usando o ELISA de Alfa-1 Antitripsina de Camundongo (catálogo # 41-A1AMS- E01, Alpco, Salem, NH). Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático de A1AT para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com PBS.

[001101] Conforme ilustrado na Tabela 73, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu os níveis da proteína plasmática A1AT e do mRNA hepático de A1AT de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc foram sig-nificativamente mais potentes do que o original (ISIS 476366). Tabela 73 Níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático de A1AT

[001102] Níveis de BUN e transaminase hepática no plasma foram medidos no momento de sacrifício usando protocolos padrão. Os pesos corporais e os pesos dos órgãos também foram medidos. Os resultados são mostrados na Tabela 74 abaixo. O peso corporal é mostrado como % em relação à base de referência. Os pesos dos órgãos são mostrados como % de peso corporal em relação ao grupo controle com PBS. Tabela 74

Exemplo 81: Duração do estudo de ação in vivo de oligonucleotí- deos que direcionam A1AT compreendendo um agrupamento Gal- NAc3

[001103] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 72 foram testados em um estudo de dose única para duração da ação em camundongos.

Tratamento

[001104] Os camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 72 ou com PBS. Cada grupo de tra-tamento consistiu em 4 animais. O sangue foi retirado No dia antes da dosagem para determinar a base de referência e em 5, 12, 19 e 25 dias após a dose. Os níveis da proteína A1AT plasmática foram medidos através de ELISA (ver o Exemplo 80). Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína A1AT plas- mática para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc eram mais potentes e tinham maior duração de ação do que o original em que faltava um conjugado de GalNAc (ISIS 476366). Além disso, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383 e 678384) eram geralmente ainda mais potentes com maior duração de ação do que o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de 3’-GalNAc (ISIS 656326). Tabela 75 Níveis da proteína A1AT plasmática em camundongos

Example 82: Inibição antissenso in vitro por oligonucleotídeos que direcionam SRB-1 compreendendo conjugado GalNAc3

[001105] Os hepatócitos primários de fígado de camundongo foram semeados em placas de 96 poços em 15.000 células/poço 2 horas antes do tratamento. Os oligonucleotídeos listados na Tabela 76 foram adicionados em 2, 10, 50 ou 250 nM em meio Williams E e as células foram incubadas durante a noite a 37 oC em 5% de CO2. As células foram lisadas 16 horas após a adição do oligonucleotídeo, e o RNA total foi purificado usando RNease 3000 BioRobot (Qiagen). Os níveis de mRNA de SRB-1 foram determinados usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Valores de IC50 foram determinados usando o software Prism 4 (GraphPad). Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem uma variedade de diferentes grupos de conjugado de GalNAc e uma variedade de diferentes frações cliváveis são significativamente mais potentes em um experimento de absorção livre in vitro do que os oligonucleotídeos de origem em que faltam um grupo de conjugado de GalNAc (ISIS 353382 e 666841). Tabela 76 Inibição da expressão de SRB-1 in vitro

[001106] A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39, Gal- NAc3-5a foi mostrada anteriormente no Exemplo 49, GalNAc3-6a foi mostrada anteriormente no Exemplo 51, GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48, GalNAc3-8a foi mostrada anteriormente no Exemplo 47, GalNAc3-9a foi mostrada anteriormente no Exemplo 52, GalNAc3- 10a foi mostrada anteriormente no Exemplo 46, GalNAc3-12a foi mostrada anteriormente no Exemplo 61, GalNAc3-13a foi mostrada anteriormente no Exemplo 62, GalNAc3-14a foi mostrada anteriormente no Exemplo 63, GalNAc3-15a foi mostrada anteriormente no Exemplo 64, GalNAc3-17a foi mostrada anteriormente no Exemplo 68, GalNAc3-18a foi mostrada anteriormente no Exemplo 69, GalNAc3-19a foi mostrada anteriormente no Exemplo 70, GalNAc3-20a foi mostrada anteriormente no Exemplo 71 e GalNAc3-23a foi mostrada anteriormente no Exemplo 76. Exemplo 83: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que se direcionam ao Fator XI compreendendo um agrupamento GalNAc3

[001107] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 77 abaixo foram testados em um estudo para inibição dependente de dose do Fator XI em camundongos. Tabela 77 Oligonucleotídeos modificados que se direcionam ao Fator XI

[001108] A estrutura GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46, GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62.

Tratamento

[001109] Camundongos de seis a oito semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana numa dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo listado abaixo ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a dose final. Os níveis de mRNA hepático do Fator XI foram medidos usando PCR em tempo real e normalizados para ciclofilina de acordo com protocolos padrão. Transaminases hepáticas, BUN e bilirrubina também foram medidos. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com PBS.

[001110] Conforme ilustrado na Tabela 78, o tratamento com oligo- nucleotídeos antissenso diminuiu o mRNA hepático do Fator XI de uma forma dependente da dose. Os resultados mostram que os oligonucleo- tídeos compreendendo um conjugado de GalNAc foi mais potente do que o original em que falta um conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Além disso, os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de 5’- GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 e 678349) foram ainda mais po-tentes do que o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de 3’- GalNAc (ISIS 656173). 2 8 43 63 21 0,14 6 2 28 41 20 0,14 Exemplo 84: Duração do estudo de ação in vivo de oligonucleotí- deos que direcionam Fator XI compreendendo um conjugado Gal- NAc3

[001111] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 77 foram testados em um estudo de dose única para duração da ação em camundongos.

Tratamento

[001112] Camundongos de seis a oito semanas foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 77 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Sangue foi retirado por sangramentos da cauda no dia antes da dosagem para determinar a base de referência e em 3, 10 e 17 dias após a dose. Os níveis da proteína do Fator XI plasmático foram medidos por ELISA usando anticorpos de captura do Fator XI e de detecção biotinilados da R & D Systems, Minneapolis, MN (catálogo # AF2460 e # BAF2460, respectivamente) e o Conjunto B do Reagente OptEIA (Catálogo # 550534, BD Biosciences, San Jose, CA). Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína Fator XI plasmático para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc eram mais potentes com maior duração de ação do que o original em que faltava um conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Além disso, os oligonu- cleotídeos que compreendem um conjugado de 5’-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 e 678349) foram ainda mais potentes com uma maior duração de ação do que o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de 3’-GalNAc (ISIS 656173). Tabela 79 Níveis da proteína Fator XI plasmático em camundongos

Example 85: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que direcionam SRB-1 compreendendo conjugado GalNAc3

[001113] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 76 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos.

Tratamento

[001114] Camundongos de seis a oito semanas de idade C57BL/6 foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana numa dosagem mostrada abaixo, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo listado na Tabela 76 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 48 horas após a administração final para determinar os níveis de mRNA de SRB-1 usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 hepáticos para cada grupo de tratamento, normalizados para o controle com salina.

[001115] Conforme ilustrado nas Tabela 80 e 841, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis do mRNA de SRB-1 de uma forma dependente da dose. Tabela 80 mRNA de SRB-1 no fígado Tabela 81 mRNA de SRB-1 no fígado

[001116] Os níveis de transaminases hepáticas, bilirrubina total,BUN, e pesos corporais também foram medidos usando protocolos padrão. Os valores médios para cada grupo de tratamento são mostrados na Tabela 82 abaixo. Tabela 82 Exemplo 86 Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos quese direcionam à TTR compreendendo um agrupamento GalNAc3

[001117] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 83 abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso da transtirretina humana (TTR) em camundongos transgênicos que expressam o gene da TTR humano.

Tratamento

[001118] Camundongos transgênicos para TTR de oito semanas de idade foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana por três semanas, para um total de três doses, com um oligo- nucleotídeo e dosagem listados nas tabelas abaixo ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os sangramentos da cauda foram realizados em vários momentos por todo o experimento, e os níveis plasmáticos de proteína TTR, ALT e AST foram medidos e relatados nas Tabelas 85-87. Após os animais serem sacrificados, os níveis plasmáticos de ALT, AST e TTR humana foram medidos, assim como os pesos corporais, pesos dos órgãos, e níveis hepáticos de mRNA de TTR humana. Os níveis da proteína TTR foram medidos usando um analisador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA). PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) Foram usados de acordo com protocolospadrão para determinar os níveis hepáticos de mRNA de TTR humana. Os resultados apresentados nas Tabelas 84-87 são os valores médios para cada grupo de tratamento. Os níveis de mRNA são os valoresmédios relativos à média para o grupo com PBS. Os níveis plas- máticos da proteína são os valores médios relativos ao valor médio para o grupo com PBS na base de referência. Os pesos corporais são a mudança de peso percentual média da base de referência até o sacrifício para cada grupo de tratamento individual. Os pesos dos órgãos mostradossão normalizados para o peso do corpo do animal, e o peso do órgão normalizado médio para cada grupo de tratamento é então apresentado em relação ao peso do órgão normalizado médio para o grupo com PBS.

[001119] Nas Tabelas 84-87, "BL" indica base de referência, as medições que foram tomadas imediatamente antes da primeira dose. Conforme ilustrado nas Tabelas 84 e 85, o tratamento com oligonucleotí- deos antissenso diminuiu o nível de expressão de TTR de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc foram mais potentes que o de origem em que faltava o conjugado de GalNAc (ISIS 420915). Além disso, os oligonu- cleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc e ligações in- ternucleosídicas PS/PO mistas foram ainda mais potentes que o oligo- nucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc e ligações PS totais. Tabela 83 Oligonucleotídeos direcionados à TTR humana

[001120] A legenda para a Tabela 85 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-1 foi mostrada no Exemplo 9. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62. A estrutura de GalNAc3-19a foi mostrada no Exemplo 70. Tabela 84 Inibição antissenso de TTR humana in vivo Tabela 85 Inibição antissenso de TTR humana in vivo Tabela 86 Níveis de transaminases, alterações do peso corporal e peso dos órgãos relativos Continuação Tabela 87 Níveis de transaminases, alterações do peso corporal e peso dos órgãos relativos Continuação

Exemplo 87: Duração da ação in vivo por doses únicas de oligonu- cleotídeos direcionados à TTR compreendendo um agrupamento de GalNAc3

[001121] Os números ISIS 420915 e 660261 (vide Tabela 83) foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em ca-mundongos. Os números ISIS 420915, 682883 e 682885 (ver a Tabela 83) também foram testados em um estudo de dose única para duração da ação em camundongos.

Tratamento

[001122] Camundongos transgênicos machos de oito semanas de idade que expressam TTR humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com 100 mg/kg de N°. ISIS 420915 ou 13,5 mg/kg de N°. ISIS 660261. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os sangramentos da cauda foram realizados antes da dosagem para determinar a base de referência e nos dias 3, 7, 10, 17, 24 e 39 após a dose. Os níveis plasmáticos da proteína TTR foram medidos conforme descrito no Exemplo 86. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis plasmáticos da proteína TTR para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Tabela 88 Níveis plasmáticos da proteína TTR

Tratamento

[001123] Camundongos transgênicos fêmeas que expressam a TTR humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com 100 mg/kg de N°. ISIS 420915, 10,0 mg/kg de N°. ISIS 682883, ou 10,0 mg/kg de 682885. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os sangramentos da cauda foram realizados antes da dosagem para determinar a base de referência e nos dias 3, 7, 10, 17, 24 e 39 após a dose. Os níveis plasmáticos da proteína TTR foram medidos conforme descrito no Exemplo 86. Os resultados abaixo são apresentados como a porcentagem média dos níveis plasmáticos da proteína TTR para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Tabela 89 Níveis plasmáticos da proteína TTR

[001124] Os resultados na Tabela 88 e 89 mostram que os oligonu- cleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc são mais potentes com uma duração de ação maior que o oligonucleotídeo de origem e que falta um conjugado (ISIS 420915). Exemplo 88: Modulação de Junção in vivo por oligonucleotídeos que direcionam à SMN compreendendo um conjugado GalNAc3

[001125] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 90 foram testados para a modulação por junção da Sobrevivência do Neurônio Motor (SMN) em camundongos. Tabela 90 ASOs modificados direcionados a SMN

[001126] A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48. "X" indica uma amina primária 5' gerada por Gene Tools (Philomath, OR), e GalNAc3-7b indica a estrutura de GalNAc3-7a sem a parte -NH-C6-O do ligador como mostrado abaixo:

[001127] Os números ISIS 703421 e 703422 são oligonucleotídeos de morfolino, em que cada nucleotídeo dos dois oligonucleotídeos é um nucleotídeo de morfolino.

Tratamento

[001128] Camundongos transgênicos de seis semanas de idade que expressam SMN humana foram injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 91 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 2 machos e 2 fêmeas. Os camundongos foram sacrificados 3 dias após a dose para determinar os níveis hepáticos de mRNA de SMN humana com e sem o éxon 7 usando PCR em tempo real, de acordo com protocolos padrão. O RNA total foi medido usando o reagente Ribogreen. Os níveis de mRNA da SMN foram normalizados para mRNA total, e normalizados ainda para as médias para o grupo tratado com salina. As razões médias resultantes entre mRNA de SMN incluindo o éxon 7 e mRNA de SMN faltando o éxon 7 são mostradas na Tabela 91. Os resultados mostram que os oligonucle- otídeos totalmente modificados que modulam a junção e compreendem um conjugado de GalNAc são significativamente mais potentes em alterar a junção no fígado do que os oligonucleotídeos de origem em que falta o conjugado de GalNAc. Ademais, essa tendência é mantida para várias químicas de modificação, incluindo 2'-MOE e oligonucleotídeos modificados por morfolino. Tabela 91 Efeito de oligonucleotídeos direcionados à SMN humana in vivo

Exemplo 89: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados à Apolipoproteína A (Apo(A)) compreendendo um conjugadode GalNAc3

[001129] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 92 abaixo foram testados em um estudo para a inibição dependente de dose de Apo(a) em camundongos transgênicos. Tabela 92 ASOs modificados direcionados à Apo(a)

[001130] A estrutura GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48.

Tratamento

[001131] Camundongos C57BL/6 fêmeas de oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana numa dosagem mostrada abaixo, para um total de seis doses, com um oligonucleotídeo listado na Tabela 92 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3-4 animais. Os sangramentos da cauda foram realizados no dia anterior à primeira dose e semanalmente após cada dose para determinar os níveis plasmáticos da proteína Apo(a). Os camundongos foram sacrificados dois dias após a administração final. Os níveis de mRNA hepáticos de Apo(a) foram determinados usando PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acordo com protocolos padrão. Os níveis plasmáticos da proteína Apo(a) foram determinados usando ELISA, e os níveis hepáticos da transaminase foram determinados. Os resultados da proteína plasmática e do mRNA na Tabela 93 são apresentados como a porcentagem média do grupo de tratamento em relação ao grupo tratado com PBS. Os níveis da proteína plasmática foram ainda normalizados para o valor de base de referência (BL) para o grupo com PBS. Os níveis de transaminase absolutos médios e os pesos corporais (% em relação às médias de base de referência) são relatados na Tabela 94.

[001132] Como ilustrado na Tabela 93, o tratamento com os oligonu- cleotídeos diminuiu os níveis da proteína plasmática e do mRNA hepático da Apo(a) de uma forma dependente de dose. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende o conjugado de GalNAc foi significa-tivamente mais potente com uma duração maior de ação do que o oli- gonucleotídeo de origem em que falta o conjugado de GalNAc. Como ilustrado na Tabela 94, os níveis de transaminase e os pesos corporais não foram afetados pelo oligonucleotídeos, indicando que os oligonu- cleotídeos foram bem tolerados. Tabela 93 Níveis de proteína plasmática e de mRNA hepático de Apo(a) Tabela 94

Exemplo 90: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos quese direcionam à TTR compreendendo um agrupamento GalNAc3

[001133] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 95 abaixo foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso da transtirretina humana (TTR) em camundongos transgênicos que expressam o gene da TTR humano.

Tratamento

[001134] Camundongos transgênicos para TTR foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana por três semanas, para um total de três doses, com um oligonucleotídeo e dosagem listados na Tabela 96 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Antes da primeira dose, um sangramento da cauda foi realizado para determinar os níveis plasmáticos da proteína TTR na base de re-ferência (BL). Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a ad-ministração final. Os níveis da proteína TTR foram medidos usando um analisador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA). PCR em tempo real e reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) Foram usados de acordo com protocolos padrão para determinar os níveis hepáticos de mRNA de TTR humana. Os resultados apresentados na Tabela 96 são os valores médios para cada grupo de tratamento. Os níveis de mRNA são os valores médios relativos à média para o grupo com PBS. Os níveis plasmáticos da proteína são os valores médios relativos ao valor médio para o grupo com PBS na base de referência. "BL" indica base de referência, as medições que foram tomadas imediatamente antes da primeira dose. Conforme ilustrado na Tabela 96, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de FXI de uma forma dependente da dose.deexpressão de TTR de uma forma dependente da dose. Os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc foram mais potentes do que o de origem em que falta um conjugado de GalNAc (ISIS 420915), e os oligonucleotídeos que compreendem uma porção clivável de fosfo- diéster ou desoxiadenosina mostraram melhoras significativas na potência em comparação ao de origem em que falta um conjugado (ver os números ISIS 682883 e 666943 vs 420915 e ver os Exemplo 86 e 87). Tabela 95 Oligonucleotídeos direcionados à TTR humana

[001135] A legenda para a Tabela 95 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62. Tabela 96 Inibição antissenso de TTR humana in vivo

Exemplo 91: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos di- recionados ao Fator VII compreendendo um conjugado de GalNAc3 em primatas não humanos

[001136] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 97 abaixo foram testados em um estudo de aumento de dose não terminal para a inibição antissenso do Fator VII em macacos.

Tratamento

[001137] Macacos expostos (não virgens) foram, cada um, injetados por via subcutânea nos dias 0, 15 e 29 com doses crescentes de um oligonucleotídeo listado na Tabela 97 ou com PBS. Cada grupo de tra-tamento consistiu em 4 machos e 1 fêmea. Antes da primeira dose e em vários momentos após isso, as retiradas de sangue foram realizadas para determinar os níveis plasmáticos da proteína Fator VII. Os níveis da proteína Fator VII foram medidos por ELISA. Os resultados apresentados na Tabela 98 são os valores médios para cada grupo de tratamento em relação ao valor médio para o grupo com PBS na base de referência (BL), as medidas tomadas imediatamente antes da primeira dose. Como ilustrado na Tabela 98, o tratamento com oligonucle- otídeos antissenso diminuiu os níveis de expressão do Fator VII de uma forma dependente de dose, e o oligonucleotídeo compreendnedo o conjugado de GalNAc foi significativamente mais potente em macacos em comparação ao oligonucleotídeo em que falta um conjugado de GalNAc. Tabela 97 Oligonucleotídeos direcionados ao Factor VII

[001138] A legenda para a Tabela 97 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. Tabela 98 Níveis plasmáticos da proteína Fator VII

Exemplo 92: Inibição antissenso em hepatócitos primários por oli- gonucleotídeos antissenso direcionados à Apo-CIII compreen-dendo um conjugado de GalNAc3

[001139] Os hepatócitos primários de camundongo foram semeados em placas de 96 poços em 15.000 células por poço, e os oligonucleotí- deos listados na Tabela 99, direcionados à ApoC-III, foram adicionados em 0,46, 1,37, 4,12, ou 12,35, 37,04, 111,11, ou 333,33 nM ou 1,00 μM. Após a incubação com os oligonucleotídeos por 24 horas, as células foram lisadas e o RNA total foi purificado usando RNeasy (Qiagen). Os níveis de mRNA da apoC-III foram determinados usando PCR em tempo real e um reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc.). de acordo com protocolos padrão. Valores de IC50 foram determinados usando o software Prism 4 (GraphPad). Os resultados mostram que independentemente de se a porção clivável era um fosfo- diéster ou uma adenosina ligada a fosfodiéster, os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de GalNAc foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que falta um conjugado. Tabela 99 Inibição da expressão de APOC-III de camundongo em hepatócitos primários de camundongo

[001140] A estrutura GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39, GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48, GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46, GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62, GalNAc3-19a foi mostrada no Exemplo 70.

Exemplo 93: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que direcionam SRB-1 compreendendo asas misturadas e um conjugado 5’-GalNAc3

[001141] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 100 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos. Tabela 100 ASOs modificados direcionados a SRB

[001142] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39, e a estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48. Subscritos: "e" indica o nucleosídeo modificado por 2’- MOE; "d" indica β-D-2’-desoxirribonucleosideo; "k" indica nucleosídeo bicíclico 6’-(S)-CH3 (cEt); "s" indica ligações internucleosídicas de fosfo- rotioato (PS); "o" indica ligações internucleosídicas de fosfodiéster (PO). O sobrescrito "m" indica 5-metilcitosinas.

Tratamento

[001143] Camundongos C57BL/6 de seis a oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez na dosagem mostrada abaixo com um oligonucleotídeo listado na Tabela 100 ou com salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os níveis hepáticos de mRNA de SRB-1 foram medidos usando PCR em tempo real. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram normalizados para os níveis de mRNA de ciclofilina, de acordo com protocolos padrão. Os resultados são apresentados como a porcentagem média dos níveis de mRNA de SRB-1 para cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle com salina. Como ilustrado na Tabela 101, o tratamento com oligonucleotídeos antissenso diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente de dose, e os oligonucleo- tídeos do gapmer que compreendem um conjugado de GalNAc e têm asas que eram modificações de cEt total ou de açúcar misto foram sig-nificativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que falta um conjugado e que compreende asas modificadas por cEt total.

[001144] Os pesos corporais, transaminases hepáticas, bilirrubina total, e BUN também foram medidos, e os valores médios para cada grupo de tratamento são mostrados na Tabela 101. O peso corporal é mostrado como o peso corporal percentual médio relativo ao peso do corpo de base de referência (% BL) medido imediatamente antes da dose de oligonucleotídeo. Tabela 101 Níveis de mRNA de SRB-1, ALT, AST, BUN e bilirrubina total e pe- sos corporais

Exemplo 94: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que direcionam SRB-1 compreendendo modificações de 2'-açúcar e um conjugado 5’-GalNAc3

[001145] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 102 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos. Tabela 102 ASOs modificados direcionados a SRB-1

[001146] O subscrito "m" indica um nucleosídeo modificado por 2’-O- metil. Ver o Exemplo 74 para a legenda completa da tabela. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39, e a estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.

Tratamento

[001147] O estudo foi completado usando o protocolo descrito no Exemplo 93. Os resultados são mostrados na Tabela 103 abaixo e mostram que os oligonucleotídeos modificados por 2’-MOE e 2’-OMe compreendendo um conjugado de GalNAc foram significativamente mais potentes do que os respectivos oligonucleotídeos de origem em que faltam um conjugado. Os resultados das medições de pesos corporais, transaminases hepáticas, bilirrubina total, e BUN indicam que os compostos foram todos bem tolerados. Tabela 103 mRNA de SRB-1

Exemplo 95: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos que direcionam SRB-1 compreendendo nucleosídeos bicílicos e um conjugado 5’-GalNAc3

[001148] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 104 foram testados em um estudo dependente de dose para a inibição antissenso de SRB- 1 em camundongos. Tabela 104 ASOs modificados direcionados a SRB-1

[001149] O subscrito "g" indica um nucleosídeo de fluoro-HNA, o subscrito "l" indica um nucleosídeo bloqueado compreendendo uma ponte de 2’-O-C2-4' Veja a legenda da tabela do Exemplo 74 para outras abreviações. A estrutura de GalNAc3-1a foi mostrada anteriormente no Exemplo 9, e a estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39 e a estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.

Tratamento

[001150] O estudo foi completado usando o protocolo descrito no Exemplo 93. Os resultados são mostrados na Tabela 105 abaixo e mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um conjugado de Gal- NAc e várias modificações de nucleosídeo bicíclico foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo de origem em que falta um conjugado e que compreende modificações de nucleosídeo bicí- clico. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc e modificações de fluoro-HNA foi significativamente mais potente do que o de origem em que falta um conjugado e que compreende modificações de fluoro-HNA. Os resultados das medições de pesos corporais, transaminases hepáticas, bilirrubina total, e BUN indicam que os compostos foram todos bem tolerados. Tabela 105 Níveis de mRNA de SRB-1, ALT, AST, BUN e bilirrubina total e pesos corporais

Exemplo 96: Ligação de proteína plasmática de oligonucleotídeos antissenso compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc3

[001151] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 70 direcionados à ApoC-III e os oligonucleotídeos na Tabela 106 direcionados à Apo(a) foram testados em um ensaio de ultra-filtração a fim de avaliar a ligação da proteína plasmática. Tabela 106 Oligonucleotídeos modificados direcionados à Apo(a)

[001152] Veja o Exemplo 74 para a legenda da tabela. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada anteriormente no Exemplo 48.

[001153] Unidades de ultrafiltração Ultrafree-MC (30.000 NMWL, membrana de celulose regenerada de baixa ligação, Millipore, Bedford, MA) foram pré-condicionadas com 300 μL de 0,5% de Tween 80 e cen-trifugadas a 2000 g por 10 minutos, em seguida com 300μL de uma solução de 300 μg/mL de um oligonucleotídeo controle em H2O e cen-trifugadas em 2000 g por 16 minutos. A fim de avaliar a ligação não específica aos filtros de cada oligonucleotídeo de teste das Tabelas 70 e 106 a serem usados nos estudos, 300 μL de uma solução de 250 ng/mL de oligonucleotídeo em H2O em pH 7,4 foram colocados nos filtrospré-condicionados e centrifugados a 2000 g por 16 minutos. As amostras não filtradas e filtradas foram analisadas por um ensaio ELISA para determinar as concentrações do oligonucleotídeo. Três réplicas foram usadas para se obter uma concentração média para cada amostra. A concentração da amostra filtrada em relação à amostra não filtrada é usada para determinar a porcentagem de oligonucleotídeo que é recuperadaatravés do filtro na ausência de plasma (% de recuperação).

[001154] Amostras de plasma inteiras congeladas coletadas em K3- EDTA de voluntários humanos sem fármacos normais, macacos cyno- molgus e camundongos CD-1 foram compradas da Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Os oligonucleotídeos de teste foram adicionados a alíquotas de 1,2 mL de plasma em duas concentrações (5 e 150 μg/mL). Uma alíquota (300 μL) de cada amostra de plasma enriquecida foi colocada em uma unidade de filtro pré-condicionada e incubada a 37°C por 30 minutos, imediatamente após por centrifugação a 2000 g por 16 minutos. As alíquotas das amostras de plasma enriquecidas filtrada e não filtrada foram analisadas por ELISA para determinar a concentração de oligonucleotídeo em cada amostra. Três replicatas por concentração fo-ram usadas para determinar a porcentagem média de oligonucleotídeo ligado e não ligado em cada amostra. A concentração média da amostra filtrada em relação à concentração da amostra não filtrada é usada é usada para determinar a porcentagem de oligonucleotídeo no plasma que não tá ligada às proteínas plasmáticas (% não ligado). Os valores de oligonucleotídeo não ligado final são corrigidos para a ligação não específica, dividindo-se o % não ligado pelo % de recuperação para cada oligonucleotídeo. Os valores de % de oligonucleotídeo ligado final são determinados, subtraindo-se os valores de % não ligado de 100. Os resultados são mostrados na Tabela 107 para as duas concentrações de oligonucleotídeo testadas (5 e 150 μg/mL) em cada espécie de plasma. Os resultados mostram que os grupos de conjugados de Gal- NAc não têm um impacto significativo sobre a ligação às proteínas plas- máticas. Além disso, os oligonucleotídeos com ligações internucleosídi- cas PS totais e ligações PO/PS mistas ligam proteínas plasmáticas, e aqueles com ligações PS totais ligam proteínas plasmáticas em um grau um pouco maior do que aqueles com ligações PO/PS mistas. Tabela 107 Porcentagem de oligonucleotídeo modificado ligado às proteínas plasmáticas

Exemplo 97: Oligonucleotídeos modificados que direcionam a TTR compreendendo um grupo de conjugado GalNAc3

[001155] Os oligonucleotídeos mostrados na Tabela 108 que compreendem um conjugado de GalNAc foram projetados para se direcionar à TTR. Tabela 108 Oligonucleotídeos modificados direcionados à TTR

[001156] A legenda para a Tabela 108 pode ser encontrada no Exemplo 74. A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada no Exemplo 39. A estrutura de GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48. A estrutura de GalNAc3-10a foi mostrada no Exemplo 46. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada no Exemplo 62. A estrutura de GalNAc3-19a foi mostrada no Exemplo 70.

Example 98: Avaliação dos efeitos pro-inflamatórios de oligonucle- otídeos compreendendo um conjugado de GalNAc no ensaio hPMBC

[001157] Os oligonucleotídeos são listados na Tabela 109 e foram testados para os efeitos pró-inflamatórios em um ensaio hPMBC conforme descrito nos Exemplos 23 e 24. (Veja as Tabelas 30, 83, 95 e 108 para descrições dos oligonucleotídeos.) ISIS 353512 é um alto respon- dedor usado como um controle positivo, e os outros oligonucleotídeos são descritos nas Tabelas 83, 95 e 108. Os resultados mostrados na Tabela 109 foram obtidos usando sangue de um doador voluntário. Os resultados mostram que os oligonculeotídeos que compreendem ligações internucleosídicas PO/PS mistas produziram respostas pró-inflamatóriassignificativamente menores em comparação aos mesmos oli- gonucleotídeos com ligações PS totais. Além disso, o grupo de conjugado de GalNAc não teve um efeito significativo neste ensaio. Tabela 109 Exemplo 99: Afinidades de ligação dos oligonucleotídeos que com-preendem um conjugado de GalNAc para o receptor de asialoglicoproteína

[001158] As afinidades de ligação dos oligonucleotídeos listados na Tabela 110 (ver a Tabela 76 para as descrições dos oligonucleotídeos) para o receptor de asialoglicoproteína foram testadas em um ensaio de ligação de receptor competitivo. O ligante competidor, al-glicoproteína ácida (AGP), foi incubada em 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5) com 1 U de neuraminidase-agarose por 16 horas em 37°C, e > 90% de desialilação foram confirmados pelo ensaio de ácido siálico ou cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). Monocloreto de iodo foi usado para iodar o AGP de acordo com o mesmo procedimento por At- sma et al. (vide J Lipid Res. 1991 Jan; 32(1):173-81.) Neste método, a a1-glicoproteína ácida desialilatada (de-AGP) foi adicionada a 10 mM de cloreto de iodo, Na125I e 1 M de glicinaem NaOH 0,25 M. Após a incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, de-AGP rotulado por 125II foi separado de125I livre, concentrando-se a mistura duas vezes utilizando uma coluna de giro 3 KDMWCO. A proteína foi testada para eficiência de marcação e pureza em um sistema de HPLC equipado com uma coluna Agilent SEC-3 (7,8x300mm) e um contador β-RAM. Experimentos de competição utilizando de-AGP rotulado por 125I e vários agrupamentos de GalNAc contendo ASOs foram realizados conforme se segue. Células HepG2 humanas (106células/ml) foram colocadas em placas de 6 poços em 2 ml de meio de crescimento apropriado. Foram usados o meio MEM complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM de L-Glutamina e 10mM de HEPES. As células foram incubadas 16-20 horas em 37°C com 5% e 10% de CO2, respectivamente. As células foram lavadas com meio sem FBS antes do experimento. As células foram incubadas por 30 min em 37°C com 1 ml de mix de competição contendo meio de crescimento apropriado com 2% de FBS, 10-8M 125de- AGP e agrupamento de GalNAc contendo ASOs em concentrações variando de 10-11a 10-5M. Ligações não específicas foram determinadas na presença de 10-2M de açúcar de GalNAc. As células foram lavadas duas vezes com meio sem FBS para remover o de-AGP marcado por 125I não ligado e o competidor ASO de GalNAc. As células foram lisadas usando um tampão RLT da Qiagen contendo 1% de β-mercaptoetanol. Os lisados foram transferidos para tubos de ensaio de fundo redondo após um breve ciclo de congelamento/descongelamento de 10 min e analisados em um contador y. As ligações não específicas foram subtraídas antes de dividir as contagens de proteína com 125I pelo valor das contagens de concentração mais baixas de GalNAc-ASO. As curvas de inibição foram ajustadas para uma única equação de ligação de competição de sítio usando um algoritmo de regressão não linear para calcular as afinidades de ligação (KD’s).

[001159] Os resultados na Tabela 110 foram obtidos a partir de ex-perimentos realizados em cinco dias diferentes. Os resultados para os oligonucleotídeos marcados com sobrescrito "a" são a média dos expe-rimentos realizados em dois dias diferentes. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de Gal- NAc na extremidade 5’ ligavam-se ao receptor de asialoglicoproteína nas células HepG2 humanas com afinidade 1,5 a 16 vezes maior do que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de Gal- NAc na extremidade 3’. Tabela 110 Resultados do ensaio de ligação ao receptor de asialoglicoproteína Exemplo 100: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc direcionados à Apo(a) in vivo

[001160] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 111a abaixo foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em ca-mundongos. Tabela 111a ASOs modificados direcionados à APO(a)

[001161] A estrutura GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48.

Tratamento

[001162] Camundongos transgênicos fêmeas que expressam a Apo(a) humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez por semana, por um total de 6 doses, com um oligonucleotídeo e a dosagem listada na Tabela 111b ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais. O sangue foi retirado no dia antes da dosagem para determinar os níveis de base de referência da proteína Apo(a) no plasma e em 72 horas, 1 semana e 2 semanas após a primeira dose. Retiradas adicionais de sangue ocorrerão em 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas e 6 semanas após a primeira dose. Os níveis da proteína Apo(a) foram medidos usando um ELISA. Os resultados na Tabela 111b são apresentados como a porcentagem média dos níveis da proteína Apo(a) no plasma para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência (% BL). Os resultados mostram que os oli- gonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc exibiam potente redução na expressão de Apo(a). Este potente efeito foi observado para o oligonucleotídeo que compreende ligações inter- nucleosídicas PS totais e para o oligonucleotídeo que compreende ligações PO e PS mistas. Tabela 111b Níveis plasmáticos da proteína Apo(a)

Exemplo 101: Inibição antissenso por oligonucleotídeos compreendendo um cluster de GalNAc ligado através de uma porção estável

[001163] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 112 foram testados para a inibição da expressão de APOC-III de camundongos in vivo. Camundongos C57Bl/6 foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 112 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Cada camundongo tratado com ISIS 440670 recebeu uma dose de 2, 6, 20, ou 60 mg/kg. Cada camundongo tratado com ISIS 680772 ou 696847 recebeu 0,6, 2, 6 ou 20 mg/kg. O grupo de conjugado de GalNAc de ISIS 696847 é ligado através de uma porção estável, uma ligação fosforotioato em vez de uma ligação contendo fosfodiéster facilmente clivável. Os animais foram sacrificados 72 horas após a dose. Os níveis hepáticos de mRNA de APOC-III foram medidos usando PCR em tempo real. Os níveis de mRNA de APOC-III foram normalizados para os níveis de mRNA de ci- clofilina, de acordo com protocolos padrão. Os resultados são apresentados na Tabela 112 como a porcentagem média dos níveis de mRNA de APOC-III para cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle com salina. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAC foram significativamente mais potentes do que o oligonucleotídeo em que falta um grupo de conjugado. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende um grupo de conjugado de GalNAc ligado ao oligonucleotídeo através de uma porção clivável(ISIS 680772) foi até mais potente do que o oligo- nucleotídeo que compreende um grupo de conjugado de GalNAc ligado ao oligonucleotídeo através de uma porção estável (ISIS 696847). Tabela 112 Oligonucleotídeos modificados direcionados à APOC-III de camun-dongo

[001164] A estrutura GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48.

Exemplo 102: Distribuição no fígado de oligonucleótidos antis- senso compreendendo um conjugado de GalNAc

[001165] A distribuição no fígado de ISIS 353382 (ver a Tabela 36) que não compreende um conjugado de GalNAc e ISIS 655861 (ver a Tabela 36) que compreende um conjugado de GalNAc foi avaliada. Camundongos balb/c machos foram injetados por via subcutânea uma vez com ISIS 353382 ou 655861 numa dosagem listada na Tabela 113. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais, exceto para o grupo de 18 mg/kg para ISIS 655861, que consistiu em 2 animais. Os animais foram sacrificados 48 horas após a dose para determinar a distribuição no fígado dos oligonucleotídeos. A fim de medir o número de moléculas de oligonucleotídeo antissenso por célula, um marcador de tris-bipiridina de rutênio(II) (MSD TAG, Meso Scale Discovery) foi conjugado a uma sonda de oligonucleotídeo usada para detectar os oligonucleotídeos an- tissenso. Os resultados apresentados na Tabela 113 são as concentrações médias de oligonucleotídeo para cada grupo de tratamento em unidades de milhões de moléculas de oligonucleotídeo por célula. Os resultados mostram que, em doses equivalentes, o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc esteve presente em concentrações maiores o fígado total e em hepatócitos do que o oligonucleotídeo que não compreende um conjugado de GalNAc. Além disso, o oligonucleotídeo que compreende um conjugado de GalNAc esteve pre-sente em concentrações mais baixas em células hepáticas não paren- quimatosas do que o oligonucleotídeo que não compreende um conjugado de GalNAc. E, embora as concentrações de ISIS 655861 em he- patócitos e em células hepáticas não parenquimatosas sejam semelhantes por célula, o fígado é aproximadamente 80% de hepatócitos em volume. Assim, a maioria do oligonucleotídeo ISIS 655861 que esteve presente no fígado foi encontrada nos hepatócitos, considerando que a maioria do oligonucleotídeo ISIS 353382 que esteve presente no fígado foi encontrada em células hepáticas não parenquimatosas. Tabela 113Example 103: Duração do estudo de ação in vivo de oligonucleotí- deos que direcionam APOC-III compreendendo um conjugado GalNAc3

[001166] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 114 abaixo foram testados em um estudo de dose única para a duração da ação em ca-mundongos. Tabela 114 ASOs modificados que se direcionam a APOC-III

[001167] A estrutura de GalNAc3-3a foi mostrada anteriormente no Exemplo 39, e a estrutura de GalNAc3-19a foi mostrada no Exemplo 70.

Tratamento

[001168] Camundongos transgênicos fêmeas que expressam a APOC-III humana foram, cada um, injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo listado na Tabela 114 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 3 animais. O sangue foi retirado antes da dosagem para determinar a base de referência e em 3, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a dose. Os níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III foram medidos conforme descrito no Exemplo 20. Os resultados na Tabela 115 são apresentados como a percentagem média dos níveis de triglicérides plasmáticos e APOC-III para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência. Uma comparação dos resultados na Tabela 71 do Exemplo 79 com os resultados na Tabela 115 abaixo mostra que os oligonucleotídeos que compreendem uma mistura de ligações internucleosídicas de fosfodiéster e fosforotioato exibiram maior duração de ação do que os oligonucleotí- deos equivalentes que compreendem apenas ligações internucleosídi- cas de fosforotioato. Tabela 115 Níveis de triglicérides plasmáticos e da proteína APOC-III em ca- mundongos trangênicos Exemplo 104: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de 5’-GalNAc2

[001169] O composto 120 está disponível comercialmente, e a síntese do composto 126 é descrita no Exemplo 49. O composto 120 (1 g, 2,89 mmol), HBTU (0,39 g, 2,89 mmol), e HOBt (1,64 g, 4,33 mmol) foram dissolvidos em DMF (10 mL) e N,N-di-isopropiletilamina (1,75 mL, 10,1 mmol) foi adicionada. Após cerca de 5 min, éster benzílico de ácido aminohexanoico (1,36 g, 3,46 mmol) foi adicionado à reação. Após 3 h, a mistura de reação foi vertida em 100 mL de 1 M de NaHSO4 e extraída com 2 x 50 mL de acetato de etil. As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com 3 x 40 mL de NaHCO3 saturado e 2 x de salmoura, secas com Na2SO4, filtradas e concentradas. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 231 (1,34 g, 2,438 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL) e ácido trifluoracético (10 mL) foi adicionado. Após agitação em temperatura ambiente por 2 h, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e co-evaporada com tolueno ( 3 x 10 mL). O resíduo foi seco sob pressão reduzida para produzir o composto 232 como sal de trifluoroacetato. A síntese do composto 166 é descrito no Exemplo 54. O composto 166 (3,39 g, 5,40 mmol) foi dissolvido em DMF (3 mL). Uma solução do composto 232 (1,3 g, 2,25 mmol) foi dissolvida em DMF (3 mL) e N,N-di-isopropiletila- mina (1,55 mL) foi adicionada. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos, em seguida, vertida em água (80 mL) e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (2x100 mL). A fase orgânica foi separada e lavada com sentado. NaHCO aqueous3 (3 x 80 mL), 1 M NaHSO4 (3 x 80 mL) e salmoura (2 x 80 mL), então secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir o composto 233. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O composto 233 (0,59 g, 0,48 mmol) foi dissolvido em metanol (2,2 mL) e acetato de etila (2,2 mL). O paládio no carbono (10 wt% Pd/C, úmido, 0,07 g) foi adicionado, e a mistura de reação foi agitado sob atmosfera de hidrogênio por 3 h. A mistura de reação foi filtrada através de uma capa de Celite e concentrada para render o ácido carboxílico. O ácido carboxílico (1,32 g, 1,15 mmol, ácido sem cluster) foi dissolvido em DMF (3,2 mL). A isto, N,N-di-isopropiletilamina (0,3 mL, 1,73 mmol) e PFPTFA (0,30 mL, 1,73 mmol) foram adicionados. Após 30 min de agitação à temperatura ambiente, a mistura de reação foi vertida em água (40 mL) e extraída com EtOAc (2 x 50 mL). Um acompa-nhamentopadrão foi concluído conforme descrito acima para produzir o composto 234. LCMS e RMN foram consistentes com a estrutura. O oli- gonucleotídeo 235 foi preparado usando o procedimento geral descrito no Exemplo 46. A parte do agrupamento GalNAc2 (GalNAc2-24a) do grupo de conjugado GalNAc2-24 pode ser combinado com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos conjugados. A estrutura de GalNAc2-24 (GalNAc2-24a- CM) é mostrada abaixo: Exemplo 105: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc1-25

[001170] A síntese do composto 166 é descrita no Exemplo 54. O oli- gonucleotídeo 236 foi preparado usando o procedimento geral descrito no Exemplo 46.

[001171] Alternativamente, o oligonucleotídeo 236 foi sintetizado usando o esquema abaixo, e o composto 238 foi usado para formar o oligonucleotídeo 236 usando os procedimentos descritos no Exemplo 10.

[001172] A parte do agrupamento GalNAc1 (GalNAc1-25a) do grupo de conjugado GalNAc1-25 pode ser combinado com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos conjugados. A estrutura de GalNAc1-25 (GalNAc1-25a-CM) é mostrada abaixo:

Exemplo 106: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos direcionados a SRB-1 compreendendo um conjugado de 5’-GalNAc2 ou um conjugado 5’-GalNAc3

[001173] Os oligonucleotídeos listados nas Tabelas 116 e 117 foram testados em estudos dependentes da dose para uma inibição antis- senso de SRB-1 em camundongos.

Tratamento

[001174] Camundongos C57BL/6 machos de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados por via subcutânea uma vez com 2, 7, ou 20 mg/kg de N°. ISIS 440762; ou com 0,2, 0,6, 2, 6, ou 20 mg/kg de N°. ISIS 686221, 686222, ou 708561; ou com solução salina. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a administração final. Os níveis hepáticos de mRNA de SRB-1 foram medidos usando PCR em tempo real. Os níveis de mRNA de SRB-1 foram normalizados para os níveis de mRNA de ciclofilina, de acordo com protocolos padrão. Os oligonucleotídeos antissenso diminuíram os níveis de mRNA de SRB-1 de uma forma dependente de dose, e os resultados de ED50 são apre-sentados nas Tabelas 116 e 117. Embora estudos anteriores mostrem que os oligonucleotídeos conjugados a GalNAc trivalentes foram significativamente mais potentes do que os oligonucleotídeos conjugados a GalNAc, que foram, por sua vez, significativamente mais potentes do que os oligonucleotídeos conjugados a GalNAc monovalentes (ver, por exemplo, Khorev et al., Bioorg. & Med. Chem., Vol. 16, 5216-5231 (2008)), o tratamento com oligonucleotídeos antissenso compreendendo clusters de GalNAc monovalentes, divalentes e trivalentes diminuiu os níveis de mRNA de SRB-1 com potências semelhantes, como mostrado nas Tabelas 116 e 117. Tabela 116 Oligonucleotídeos modificados direcionados a SRB-1

[001175] Veja o Exemplo 93 para a legenda da tabela. A estrutura de GalNAc3-13a foi mostrada anteriormente no Exemplo 62, e a estrutura de GalNAc2-24a foi mostrada no Exemplo 104. Tabela 117 Oligonucleotídeos modificados direcionados a SRB-1

[001176] Veja o Exemplo 93 para a legenda da tabela. A estrutura de GalNAc1-25a foi mostrada no Exemplo 105.

[001177] As concentrações dos oligonucleotídeos nas Tabelas 116 e 117 no fígado também foram avaliadas, usando os procedimentos descritos no Exemplo 75. Os resultados mostrados nas Tabelas 117a e 117b abaixo são os níveis médios totais teciduais do oligonucleotídeo antissenso para cada grupo de tratamento, conforme medido por UV em unidades de μg de oligonucleotídeo por grama de tecido hepático. Os resultados mostram que os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc acumulado no fígado em níveis significativamente mais altos do que a mesma dose do oligonucleotídeo em que falta um grupo de conjugado de GalNAc. Além disso, os oligo- nucleotídeos antissenso que compreendem um, dois ou três ligantes de GalNAc em seus respectivos grupos de conjugado todos se acumularam o fígado em níveis semelhantes. Este resultado é surpreendente em vista da referência da literatura de Khorev et al. citada acima e é consistente com os dados de atividade mostrados nas Tabelas 116 e 117 acima. Tabela 117a Concentrações no fígado de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado GalNAc2 ou GalNAc3 Tabela 117b Concentrações no fígado de oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado GalNAc1 Exemplo 107: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugadode GalNAc1-26 ou GalNAc1-27

[001178] O oligonucleotídeo 239 é sintetizado através do acoplamento do composto 47 (ver o Exemplo 15) ao ácido 64 (ver o Exemplo 32) usando HBTU e DIEA em DMF. O composto contendo amida resultanteé fosfitilado, em seguida, adicionado à extremidade 5' de um oli- gonucleotídeo usando os procedimentos descritos no Exemplo 10. A parte do agrupamento GalNAc1 (GalNAc1-26a) do grupo de conjugado GalNAc1-26 pode ser combinado com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos conjugados. A estrutura de GalNAc1-26 (GalNAc1-26a-CM) é mostrada abaixo:

[001179] A fim de adicionar o grupo de conjugado de GalNAc1 à ex-tremidade 3’ de um oligonucleotídeo, a amida formada a partir da reação dos compostos 47 e 64 é adicionada a um suporte sólido usando os procedimentos descritos no Exemplo 7. A síntese do oligonucleotídeo é então concluída usando os procedimentos descritos no Exemplo 9 a fim de formar o oligonucleotídeo 240.

[001180] A parte do agrupamento GalNAc1 (GalNAc1-27a) do grupo de conjugado GalNAc1-27 pode ser combinado com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos conjugados. A estrutura de GalNAc1-27 (GalNAc1-27a-CM) é mostrada abaixo:

Exemplo 108: Inibição antissenso in vivo por oligonucleotídeos compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc direcionados à Apo(a) in vivo

[001181] Os oligonucleotídeos listados na Tabela 118 abaixo foram testados em um estudo de dose única em camundongos. Tabela 118 ASOs modificados direcionados à APO(a)

[001182] A estrutura GalNAc3-7a foi mostrada no Exemplo 48.

Tratamento

[001183] Camundongos transgênicos machos que expressam a Apo(a) humana foram, cada um injetados por via subcutânea uma vez com um oligonucleotídeo e dosagem listados na Tabela 119 ou com PBS. Cada grupo de tratamento consistiu em 4 animais. O sangue foi retirado no dia antes da dosagem para determinar os níveis de base de referência da proteína Apo(a) no plasma e em 1 semana após a primeira dose. Retiradas adicionais de sangue ocorrerão semanalmente por aproximadamente 8 semanas. Os níveis da proteína Apo(a) foram medidos usando um ELISA. Os resultados na Tabela 119 são apresen-tados como a porcentagem média dos níveis da proteína Apo(a) plas- mática para cada grupo de tratamento, normalizados para os níveis de base de referência (% BL). Os resultados mostram que os oligonucleo- tídeos antissenso reduziram a expressão da proteína Apo(a). Além disso, os oligonucleotídeos que compreendem um grupo de conjugado de GalNAc exibiram uma redução até mais potente da expressão de Apo(a) do que os oligonucleotídeos que não compreendem um grupo de conjugado. Tabela 119 Níveis plasmáticos da proteína Apo(a) Exemplo 109: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc1-28 ou GalNAc1-29

[001184] O oligonucleotídeo 241 é sintetizado usando procedimentos semelhantes àqueles descritos no Exemplo 71 para formar o intermediário fosforamidita, seguido pelos procedimentos descritos no Exemplo 10 para sintetizar o oligonucleotídeo. A parte do agrupamento Gal- NAc1(GalNAc1-28a) do grupo de conjugado GalNAc1-28 pode ser combinado com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos conjugados. A estrutura de GalNAc1- 28 (GalNAc1-28a-CM) é mostrada abaixo:

[001185] A fim de adicionar o grupo de conjugado de GalNAc1 à ex- tremidade 3' de um oligonucleotídeo, procedimentos semelhantes àqueles descritos no Exemplo 71 são usados para formar o intermediário hi- droxila, que é então adicionado ao suporte sólido usando os procedi-mentos descritos no Exemplo 7. A síntese do oligonucleotídeo é então concluída usando os procedimentos descritos no Exemplo 9 a fim de formar o oligonucleotídeo 242.

[001186] A parte do agrupamento GalNAc1 (GalNAc1-29a) do grupo de conjugado GalNAc1-29 pode ser combinado com qualquer porção clivável presente no oligonucleotídeo para fornecer uma variedade de grupos conjugados. A estrutura de GalNAc1-29 (GalNAc1-29a-CM) é mostrada abaixo: Exemplo 110: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc1-30 2

[001187] O oligonucleotídeo 246 compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc1-30, em que Y é selecionado de O, S, uma alquila C1C10 substituída ou não substituída, amina, amina substituída, azido, al- quenila ou alquinila, é sintetizado como mostrado acima. A parte do agrupamento GalNAc1 (GalNAc1-30a) do grupo de conjugado GalNAc1- 30 pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em determinadas modalidades, o símbolo Y é parte da porção clivável. Em determinadas modalidades, Y é parte de uma porção estável, e a porção clivável está presente no oligonucleotídeo. A estrutura de GalNAc1-30a é mostrada abaixo: Exemplo 111: Síntese de oligonucleotídeos compreendendo um conjugado de GalNAc2-31 ou GalNAc2-32

[001188] O oligonucleotídeo 250 compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc2-31, em que Y é selecionado de O, S, um alquila C1-C10substituída ou não substituída, amina, amina substituída, azido, al- quenila ou alquinila, é sintetizado como mostrado acima. A parte do agrupamento GalNAc2 (GalNAc2-31a) do grupo de conjugado GalNAc1- 30 pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonu- cleotídeo é parte da porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonu- cleotídeo é parte de uma porção estável, e a porção clivável está presente no oligonucleotídeo. A estrutura de GalNAc2-31a é mostrada abaixo:

[001189] A síntese de um oligonucleotídeo compreendendo um conjugado de GalNAc2-32 é mostrada abaixo.

[001190] O oligonucleotídeo 252 compreendendo um grupo de conjugado de GalNAc2-32, em que Y é selecionado de O, S, um alquila C1C10 substituído ou não substituído, amina, amina substituída, azido, al- quenila ou alquinila, é sintetizado como mostrado acima. A parte do agrupamento GalNAc2 (GalNAc2-32a) do grupo de conjugado GalNAc2- 32 pode ser combinado com qualquer porção clivável para fornecer uma variedade de grupos conjugados. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonu- cleotídeo é parte da porção clivável. Em determinadas modalidades, o grupo contendo Y diretamente adjacente à extremidade 5' do oligonu- cleotídeo é parte de uma porção estável, e a porção clivável está presente no oligonucleotídeo. A estrutura de GalNAc2-32a é mostrada abaixo:

Exemplo 112: Oligonucleotídeo modificados compreendendo um conjugado GalNAc1

[001191] Os oligonucleotídeos na Tabela 120 direcionados a SRB-1 foram sintetizados com um grupo de conjugado de GalNAc1 a fim de testar ainda mais a potência dos oligonucleotídeos que compreendem grupos de conjugado que contêm um ligante de GalNAc. Tabela 120

Exemplo 113: Projeto e seleção dos compostos antissenso dupli- cados direcionados à apolipoproteína C-III

[001192] De acordo com a presente invenção, uma série dos ácidos nucleicos duplicados que compreendem os compostos antissenso da presente invenção e seus complementos são projetados para direcionar-seà apolipoproteína C-III. A sequência da nucleobase do filamento do antissenso do duplicado compreende pelo menos uma porção de um oligonucleotídeo na Tabela 121. As extremidades dos filamentos podem ser modificadas pela adição de ou mais nucleobases naturais ou modi-ficadas para formar uma saliência. O filamento sense do dsRNA é então projetado e sintetizado como o complemento do filamento antissenso e também pode conter modificações ou adições a ambos os terminais. Por exemplo, em uma modalidade, ambos os filamentos do duplicado de dsRNA seriam complementares nas nucleobases centrais, cada um contendo saliências em um ou nos dois terminais.

[001193] Por exemplo, um duplicado compreendendo um filamento antissenso com a sequência CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ ID NO: 12) e com uma saliência de duas nucleobases de deóxitimidina (dT) teria a seguinte estrutura (Antissenso de SEQ ID NO 13, Complemento de SEQ ID NO: 14): cgagaggcggacgggaccgTT Filamento do Antissenso (SEQ ID NO: 13) TTgctctccgcctgccctggc Complemento (SEQ ID NO: 14)

[001194] Em outra modalidade, um duplicado compreendendo um fi-lamento antissenso com a mesma sequência CGAGAGGCGGACGG- GACCG (SEQ ID NO: 12) pode ser preparado com extremidades cegas (nenhuma saliência de filamento simples) conforme mostrado (Antis- senso de SEQ ID NO: 15, Complemento de SEQ ID NO: 16): cgagaggcggacgggaccg Filamento do Antissenso (SEQ ID NO: 15) gctctccgcctgccctggc Complemento (SEQ ID NO: 16)

[001195] Os filamentos de RNA do duplicado podem ser sintetizados pelos métodos divulgados aqui ou comprado na Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO). Uma vez sintetizados, os filamentos complemen-taressão anelados. Os filamentos simples aliquotados e diluídos a uma concentração de 50 μM. Uma vez diluído, 30 μL 30 de cada filamento é combinado com 15 μL de uma solução de 5X do tampão de anelação. A concentração final de amortecedor mencionado é de 100mM de acetato de potássio, 30 mM de HEPES-KOH de pH 7,4 e acetato de magnésio de 2mM. O volume final é de 75 μL. Esta solução é incubada por 1 minuto a 90°C e então centrifugada por 15 segundos. O tubo é deixado em repouso por 1 hora a 37°C, período durante o qual os duplicados de dsRNA são usados na experimentação. A concentração final do duplicado de dsRNA é de 20 μM. Esta solução pode ser armazenada congelada (- 20°C) e descongelada por até 5 vezes.

[001196] Uma vez preparados, os compostos antissenso duplicados são avaliados quanto à sua capacidade de modular a expressão da apo- lipoproteína C-III.

[001197] Quando as células atingem 80% de confluência, elas são tratadas com os compostos antissenso duplicados da invenção. Para as células cultivadas em placas de 96 poços, os poços são lavados por uma vez com meio de soro reduzido OPTI-MEM-1TM(Gibco BRL) de 200 μL e então tratados com meio de 130 μL de OPTI-MEM-1TMcontendo reagente de LIPOFECTINTMde 12 μg/mL (Gibco BRL) e então o composto antissenso duplicado desejado a uma concentração final de 200 nM. Após 5 horas do tratamento, o meio é substituído por um meio novo. As células são colhidas 16 horas após o tratamento, período em que o RNA é isolado e a redução alvo é medida por RT-PCR.

Exemplo 114: Inibição de antissenso de expressão da apolipopro- teína C-III humana por oligonucleotídeos de fosforotioato quimérico com asas de 2'-MOE e um intervalo deóxi

[001198] De acordo com a presente invenção, uma série de compostos antissenso foram projetados para ser direcionada a diferentes regiões da apolipoproteína C-III RNA humana, utilizando sequências pu-blicadas(nucleotídeos de 6238608 a 6242565 de número de acesso GenBank NT_035088,1, representando uma sequência genômica, in-corporada aqui como SEQ ID NO: 3, e o número de acesso GenBank NM_000040,1, incorporado aqui como SEQ ID NO: 1). Os compostos são mostrados na Tabela 121. O "local alvo" indica o primeiro número de nucleotídeo (mais extremo em 5’) na sequência alvo específica a que o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 121 são oligonucle- otídeos quiméricos (gapmers) com 20 nucleotídeos de extensão, com-postos de uma região de "intervalo" central consistindo em dez 2'-deoxi- nucleotídeos, a qual é ladeada em ambos os lados (direções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleotídeos. As asas são compostas de 2’-O-(2-meto- xietil)nucleotídeos, também conhecidos como (2’-MOE) nucleotídeos. As ligações internucleosídeos (estrutura) são fosforotioato (P=S) ao longo de todo o oligonucleotídeo. Todos os resíduos da citidina são 5- metilcitidinas. Os compostos foram analisados quanto a seu efeito em níveis humanos de mRNA da apolipoproteína C-III por PCR quantitativo em tempo real, conforme descrito em outros exemplos aqui. Os dados apresentam médias de três experimentos em que células HepG2 foram tratadas com os oligonucleotídeos antissenso da presente invenção. O controle positivo para cada ponto de dado é identificado na tabela pelo número de ID em sequência. Se presente, "N.D." indica "nenhum dado". Tabela 121 - Inibição de níveis de mRNA da apolipoproteína C-III humana por oligonucleotídeos de fosforotioato quiméricos com asas de 2'-MOE e um intervalo deóxi.

[001199] Como mostrado na tabela acima, SEQ ID NOs 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 e 96 apresentaram pelo menos 45% de inibição da expressão da apolipoproteína humana C-III nessa análise e são preferíveis, portanto. Os SEQ ID NOs mais preferí-veissão 75, 86 e 85. As regiões alvo a que essas sequências preferíveis são complementares são referidos aqui como "segmentos alvo preferí-veis" e são, portanto, preferíveis para o direcionamento pelos compostos da presente invenção. Esses segmentos preferíveis são mostrados em uma Tabela 123 abaixo. As sequências representam o complemento reverso dos compostos preferíveis do antissenso mostrados na tabela acima. O "local alvo" indica o primeiro número de nucleotídeo (mais ex-tremo em 5’) no ácido nucleico alvo a que o oligonucleotídeo se liga. Também apresenta-se na Tabela 123 a espécie em que cada um dos segmentos alvos preferíveis foi encontrado.

Exemplo 115 A inibição de antissenso da expressão da apolipopro- teína C-III em ratos por oligonucleotídeos de fosforotioato quimérico com asas 2'MOE e um intervalo deóxi.

[001200] De acordo com a presente invenção, uma segunda série de compostos antissenso foram projetados para ser direcionada a diferen-tesregiões da apolipoproteína C-III RNA de ratos, utilizando sequências publicadas (número de acesso GenBank L04150,1, incorporado aqui como SEQ ID NO: 11). Os compostos são mostrados na Tabela 2. O "local alvo" indica o primeiro número de nucleotídeo (mais extremo em 5’) no ácido nucleico alvo específico a que o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 2 são oligonucleotídeos quiméricos (gapmers) com 20 nucleotídeos de extensão, compostos de uma região de "intervalo" central consistindo em dez 2'-deoxinucleotídeos, a qual é ladeada em ambos os lados (direções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleotídeos. As asas são compostas de 2’-O-(2-metoxietil) nucleotídeos, também co-nhecidos como (2’-MOE)nucleotídeos. As ligações internucleosídeos (estrutura) são fosforotioato (P=S) ao longo de todo o oligonucleotídeo. Todos os resíduos da citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados quanto a seu efeito em níveis de mRNA da apolipoproteína C-III em ratos por PCR quantitativo em tempo real, conforme descrito em outros exemplos aqui. Os dados apresentam média de três experimentos em que células hepatócitas primárias de ratos foram tratadas com os oligonucleotídeos antissenso da presente invenção. Se presente, "N.D." indica "nenhum dado". Tabela 122 - Inibição de níveis de mRNA da apolipoproteína C-III em ratos por oligonucleotídeos de fosforotioato quiméricos com asas de 2'-MOE e um intervalo deóxi.

[001201] Como mostrado na tabela acima, SEQ ID NOs 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 114, 115, 116 e 117 demonstraram pelo menos 45% de inibição da expressão da apoli- poproteína C-III em ratos nesse experimento e são, portanto, preferíveis. Os SEQ ID NOs mais preferíveis são 117, 116 e 100. As regiões alvo a que essas sequências preferíveis são complementares são referidos aqui como "segmentos alvo preferíveis"e são, portanto, preferíveis para o direcionamento pelos compostos da presente invenção. Esses segmentos preferíveis são mostrados na tabela abaixo. As sequências representam o complemento reverso dos compostos preferíveis do an- tissenso mostrados na tabela acima. Essas sequências são mostradas para conter timina (T), mas alguém versado na técnica perceberá que a timina (T) é geralmente substituída por uracil (U) nas sequências de RNA. O "local alvo" indica o primeiro número de nucleotídeo (mais extremo em 5’) no ácido nucleico alvo a que o oligonucleotídeo se liga. Também apresenta-se na Tabela 3 a espécie em que cada um dos segmentos alvos preferíveis foi encontrado. Tabela 123 - Sequência e posição dos segmentos alvo preferíveis identificados na apolipoproteína C-III.

[001202] Visto que esses "segmentos alvo preferíveis"foram encon- trados por experimento para serem abertos a, e acessíveis para, hibri- dização com os compostos antissenso da presente invenção, alguém versado na técnica reconhecerá ou estará apto a verificar, utilizando nada além do que experimentos rotineiros, outras modalidades da invenção que abarcam outros compostos que hibidrizam especificamente para esses segmentos alvos preferíveis e, consequentemente, inibem a expressão da apolipoproteína C-III.

[001203] De acordo com a presente invenção, os compostos antis- senso incluem compostos oligoméricos antissenso, oligonucleotídeos antissenso, ribozimas, oligonucleotídeos de sequência de guia externa (EGS), dispositivos de colagem alternados, iniciadores, sondas e outros compostos oligoméricos curtos que hibridizem pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo.

Exemplo 116: Inibição de antissenso de expressão da apolipopro- teína C-III humana por oligonucleotídeos de fosforotioato quimérico com asas de 2'-MOE e um intervalo deóxi - compostos antis- senso adicionais

[001204] De acordo com a presente invenção, uma série de compostos antissenso foram projetados para serem direcionados a diferentes regiões da apolipoproteína C-III RNA humana, utilizando sequências pu-blicadas(nucleotídeos de 6238608 a 6242565 da sequência com número de acesso GenBank NT_035088,1, representando uma sequência genômica, incorporada aqui como SEQ ID NO: 3, e o número de acesso GenBank NM_000040,1, incorporado aqui como SEQ ID NO: 1). Os compostos são mostrados na Tabela 124. O "local alvo" indica o pri-meironúmero de nucleotídeo (mais extremo em 5’) na sequência alvo específica a que o composto se liga. Todos os compostos na Tabela 124 são oligonucleotídeos quiméricos (gapmers) com 20 nucleotídeos de extensão, compostos de uma região de "intervalo" central consistindo em dez 2'-deoxinucleotídeos, a qual é ladeada em ambos os lados (direções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleotídeos. As asas são compostas de 2’-O-(2-metoxietil)nucleotídeos, também conhecidos como (2’- MOE)nucleotídeos. As ligações internucleosídeos (estrutura) são fosfo- rotioato (P=S) ao longo de todo o oligonucleotídeo. Todos os resíduos da citidina são 5-metilcitidinas. Os compostos foram analisados quanto a seu efeito em níveis humanos de mRNA da apolipoproteína C-III por PCR quantitativo em tempo real, conforme descrito em outros exemplos aqui. Os dados representam médias de três experiências em que

[001205] Células HepG2 foram tratadas com oligonucleotídeos antis- senso da presente invenção. Se presente, "N.D." indica "nenhum dado". Tabela 124 - Inibição de níveis de mRNA da apolipopro- teína C-III humana por oligonucleotídeos de fosforotioato quiméricos com asas de 2'-MOE e um intervalo deóxi.

Exemplo 117: Inibição antissenso de expressão da apolipoproteína C-III humana por oligonucleotídeos de fosforotioato quimérico com asas de 2'-MOE e um intervalo deóxi: estudo de resposta à dose em células HepG2

[001206] De acordo com a presente invenção, um subconjunto dos oligonucleotídeos antissenso dos Exemplos 15 e 17 foi investigado adi-cionalmente em um estudo de resposta a dose. Doses do tratamento de ISIS 167842 (SEQ ID NO: 214), ISIS 167844 (SEQ ID NO: 215), ISIS 167846 (SEQ ID NO: 22), ISIS 167837 (SEQ ID NO: 21), ISIS 304789 (SEQ ID NO: 75), ISIS 304799 (SEQ ID NO: 85) e ISIS 304800 (SEQ ID: 86) eram de 50, 150 e 300 nM. Os compostos foram analisados quanto a seu efeito em níveis humanos de mRNA da apolipoproteína CIII em células de HepG2 por PCR quantitativo em tempo real, conforme descrito em outros exemplos aqui. Os dados representam médias de duas experiências e são mostrados na tabela abaixo. Tabela 125 - Inibição de níveis de mRNA da apolipopro- teína C-III humana por oligonucleotídeos de fosforotioato quiméricos com asas de 2'-MOE e um intervalo deóxi.

[001207] Esses dados demonstram que a expressão da apolipopro- teína C-III é inibida de uma maneira dependende de dose a partir do tratamento das células com os compostos antissenso direcionados à apolipoproteína C-III. Esses compostos foram analisados adicionalmente em células Hep3B quanto à sua capacidade de diminuir os níveis de mRNA em células Hep3B e foi determinado que ISIS167842 e 167837 inibiram a expressão da apolipoproteína C-III de uma maneira dependende de dose também nessa linha celular.

Exemplo 118: Inibição de antissenso da apolipoproteína C-III em hepatócitos primários de macaco Cynomolgus

[001208] Em outra modalidade, os compostos antissenso direcionadosà apolipoproteína C-III humana foram testados para seus efeitos na expressão da apolipoproteína C-III em hepatócitos primários de macacos Cynomolgus. Os hepatócitos de macacos Cynomolgus primários p're-plaqueados foram comprados da InVitro Technologies (Baltimore, MD). As células foram cultivadas em DMEM rica em glicose (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) complementada com 10% de soro bovino fetal (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), 100 unidades/mL e 100 μg/mL de estreptomicina (Invitrogen Life Technolo-gies, Carlsbad, CA).

[001209] As células numa densidade de 80.000 células por poço numa placa de 24 poços foram tratadas com 10, 50, 150 e 300 nM de ISIS 304789 (SEQ ID NO: 75), ISIS 304799 (SEQ ID NO: 85) ou ISIS 304800 (SEQ ID NO: 86). ISIS 113529 (CTCTTACTGTGCTGTGGACA, SEQ ID NO: 17) serviu como do oligonucleotídeo controle. ISIS 113529 é um oligonucleotídeo quimérico ("gapmer") com 20 nucleotídeos de extensão, compostos de uma região de "lacuna" central consistindo em dez 2'-desoxinucleotídeos, a qual é flanqueada em ambos os lados (direções 5' e 3') por "asas" de cinco nucleotídeos. As asas são compostas de 2’-O-(2-metoxietil)nucleotídeos, também conhecidos como (2’- MOE)nucleotídeos. As ligações internucleosídeos (estrutura) são fosfo- rotioato (P=S) ao longo de todo o oligonucleotídeo. Todos os resíduos da citidina são 5-metilcitidinas.

[001210] Após 24 horas de tratamento com os oligonucleotídeos an- tissenso, o mRNA da apolipoproteína C-III foi medido por PCR em tempo real, como descrito pelos outros exemplo aqui, usando os iniciadores e a sonda projetada para a sequência da apolipoproteína C-III humana (iniciador forward: TCAGCTTCATGCAGGGTTACAT (SEQ ID NO: 5) iniciador reverse: ACGCTGCTCAGTGCATCCT (SEQ ID NO: 6) e a sonda de PCR foi FAM-AAGCACGCCACCAAGACCGCC-TAMRA (SEQ ID NO: 7)) para medir o mRNA da apolipoproteína C-III de macaco Cynomolgous. Os iniciadores e a sonda projetados para o GAPDH hu-mano (iniciador forward: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 8) iniciador reverse: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 9) e a sonda de PCR foi 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3' (SEQ ID NO: 10)) foram usados para medir a expressão de mRNA de GAPDH de macacos Cynomolgus para fins de normalização da quanti-dades alvo do gene obtidas pelo PCR em tempo real. As células não tratadas serviram como o controle aos quais os dados foram normaliza-dos. Os dados são a média dos três experimentos e são apresentados a tabela abaixo. Tabela 126 - Inibição de antissenso da apolipoproteína C-III em he- patócitos primários de macaco Cynomolgus

Exemplo 119: Sequência da apolipoproteína C-III de macaco Cyno- molgus

[001211] Em outra modalidade, uma parte do gene da apolipoprote- ína C-III de macaco Cynomolgus foi sequenciada. As posições 8 a 476 da sequência de mRNA da apolipoproteína C-III humana (incorporada em sua totalidade aqui como SEQ ID NO: 1) contém o segmento alvo no qual ISIS 304789 se hibridiza. A região correspodente do mRNA da apolipoproteína C-III de macao Cynomolgus foi sequenciada. O RNA foi isolado e purificado a partir de hepatócitos de macaco Cynomolgus primários (InVitro Technologies, Gaithersburg, MD) e foi submetido a uma reação da transcriptase reversa (kit da Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). o cDNA resultante foi o substrato para 40 ciclos de amplificação por PCR, usando iniciadores 5' e 3' projetados para as posições 8 e 476, respectivamente, do mRNA da apolipoproteína C-III humana (Amplitaq PCR kit, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Após a purificação em gel do fragmento de 468 bp resultante, as reações de sequenciamento forward e reverse para cada produto foram realizadas por Retrogen (San Diego, CA). Esta sequência de macaco Cynomolgus está incorporada aqui como SEQ ID NO: 223 e é 92% idênticaàs posições 8 a 476 do mRNA da apolipoproteína C-III humana. Exemplo 120: Oligonucleotídeo de fosforotioato quimérico tendo asas de 2’-MOE e uma lacuna desóxi, direcionada à apolipoprote- ína C-III de macaco Cynomolgus

[001212] Em outra modalidade, a sequência da apoliproteína C-III de macaco Cynomolgus incorporada aqui como SEQ ID NO: 223 foi usada para projetar um oligonucleotídeo antissenso tendo 100% de comple- mentariedade ao mRNA da apolipoproteína de Cynomolgus ISIS 340340 (GGCAGCCCTGGAGGCTGCAG; incorporada aqui como SEQ ID NO: 18) que se direciona ao nucleotídeo 397 da SEQ ID NO: 223, dentro de uma região correspondente à 3’ UTR da apolipoproteína C-III humana na qual ISIS 304789 se hibridiza. ISIS 340340 é um oligonucle- otídeo quimérico ("gapmer") com 20 nucleotídeos de extensão, compostos de uma região de "lacuna" central consistindo em 2'-desoxinucleotí- deos, a qual é flanqueada em ambos os lados (direções 5' e 3') por "asas" de 5 nucleotídeos. As asas são compostas de nucleotídeos 2’me- toxietil (2'-MOE). As ligações internucleosídeos (estrutura principal) são o fosforotioato (P=S) ao longo de todo o oligonucleotídeo. Todos os re-síduos da citidina são 5-metilcitidinas.

Claims (24)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado e um grupo conjugado, em que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e possui uma sequência de nucleobases comple-tamente complementar a uma porção de comprimento igual de nucleo- bases de ácido nucleico ApoCIII de SEQ ID NO: 3; em que o grupo conjugado compreende: em que cada n é, independentemente, de 1 a 20; e em que: (i) o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases de pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou 20 nucleobases complementares contíguas a uma porção de comprimento igual das nucleobases 3533 a 3552 da SEQ ID NO:3; (ii) o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases de pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29 ou 30 nucleobases complementares contíguas a uma porção de comprimento igual das nucleobases 3514 a 3558 da SEQ NO: 3; ou (iii) o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nu- cleobases de pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou 20 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nu- cleobase da SEQ NOs: 19-96, 209-221.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (i) o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados; (ii) o oligonucleotídeo modificado tem fita simples; (iii) o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos um açúcar modificado; (iv) pelo menos um nucleosídeo compreende uma nucleobase modificada, e/ou (v) o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma ligação internucleosídea modificada.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicí- clico.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o açúcar bicíclico é uma etila restrita ou um açúcar compreendendo uma ponte de 4'-(CH2)n-O-2', em que n é 1 ou 2.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um açúcar modificado compreende uma 2'-O-metoxietila, ou é um 3'-flúor-HNA.

6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina.

7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a ligação de internucleosídeo modificado é uma ligação de internucleosídeo fosforo- tioato.

8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que: (i) o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de intervalo consistindo em desoxinucleosí- deos ligados; um segmento de asa 5' consistindo em nucleosídeos ligados; um segmento de asa 3' consistindo em nucleosídeos ligados; em que o segmento de intervalo está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado; ou (ii) o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de intervalo constituído por dez desoxinucleo- sídeos ligados; 1. segmento de asa 5'constituído por cinco nucleosídeos ligados; 2. segmento de asa 3'constituído por cinco nucleosídeos ligados; em que o segmento de intervalo é posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietila, e em que cada resíduo de citosina é uma 5-metilcitosina.

9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que cada ligação inter- nucleosídica do oligonucleotídeo modificado é uma ligação de fosforoti- oato.

10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados com uma sequência de nucleo- base de SEQ ID NO: 87, em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de intervalo constituído por dez desoxinucleo- sídeos ligados; um segmento de asa 5'constituído por cinco nucleosídeos ligados; um segmento de asa 3'constituído por cinco nucleosídeos ligados; em que o segmento de intervalo é posicionado entre o seg-mento de asa 5' e o segmento de asa 3'; em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2’-O-metoxietil, em que cada ligação internucleosídica é uma ligação de fosforotioato e em que cada resíduo de citosina é uma 5-metilcitosina.

11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o grupo conjugado compre-ende um conjugado ligado tendo uma estrutura selecionada dentre: . em que cada L é, independentemente, um grupo de ligação de fósforo ou um grupo de ligação neutro; e cada n é, independentemente, de 1 a 20; (ii) em que cada L é, independentemente, um grupo de ligação de fósforo ou um grupo de ligação neutro; e cada n é, independentemente, de 1 a 20; (ii) em que cada n é, independentemente, de 1 a 20; e p é de 1 a 6, (ix)em que cada n é, independentemente, de 1 a 20, (x)em que n é de 1 a 20,em que cada n é independentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7, e (xiv)

12. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o grupo conjugado: (i) comprende:(ii) compreende: (iii) está ligado ao oligonucleotídeo modificado na extremi-dade 5' do oligonucleotídeo modificado ou na extremidade 3' do oligo- nucleotídeo modificado por um ligante conjugado; (iv) compreende uma porção clivável, em que a porção clivá- vel: (a) compreende um fosfato ou fosfodiéster; (b) é selecionada dentre: um fosfodiéster, uma amida, ou um éster; (c) é um nucleosídeo clivável ou nucleosídeo análogo; (d) é um nucleosídeo compreendendo uma base heterocí- clica selecionada dentre uracil, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5- metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina e 2-N-isobutirilguanina; (e) é 2'-desoxinucleosídeo que é afixado à posição 3' do oli- gonucleotídeo antissenso por uma ligação fosfodiéster e é afixado ao ligante por uma ligação de fosfodiéster ou fosforotioato; (f) é 2'-desoxi adenosina que é afixada à posição 3' do oligo- nucleotídeo antissenso por uma ligação de fosfodiéster e é afixada ao ligante por uma ligação fosfodiéster ou fosforotioato; e/ou (g) é 2'-desoxi adenosina que é afixado à posição 3' do oli- gonucleotídeo antissenso por uma ligação de fosfodiéster e é afixado ao ligante por uma ligação de fosfodiéster.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, caracteri-zado pelo fato de que o grupo conjugado de (i) compreende um ligante conjugado tendo a seguinte estrutura:

14. Composto, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, ca-racterizado pelo fato de que o nucleosídeo ou nucleosídeo análogo com-preende uma base heterocíclica selecionada dentre uma purina, purina substituída, pirimidina ou pirimidina substituída.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, caracteri-zado pelo fato de que a base heterocíclica é protegida.

16. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 12 a 15, caracterizado pelo fato de que a base heterocíclica sele-cionada de uracil, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina e 2- N-isobutirilguanina é protegida.

17. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 12 a 16, caracterizado pelo fato de que a porção clivável é afixada: (i) à posição 3' do oligonucleotídeo antissenso; ou (ii) à posição 5' do oligonucleotídeo antissenso.

18. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o composto está na forma de um sal.

19. Composto, de acordo com a reivindicação 18, caracteri-zado pelo fato de que o composto está na forma de um sal de sódio e/ou sal de potássio.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

21. Uso do composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica ou de um medicamento.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica ou o medicamento é para tratar, prevenir ou diminuir a progressão de uma doença relacionada ao ApoCIII elevado em um animal.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica ou o medicamento é para: (i) prevenir, tratar, melhorar ou reduzir a progressão de uma doença, distúrbio ou condição cardiovascular, metabólica e/ou inflamatória; (ii) reduzir o nível de triglicerídeo no animal; e/ou (iii) aumentar os níveis de HDL no animal.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o animal tem, ou está em risco de ter, um ou mais de hipertrigliceridemia, dislipidemia Fredrickson Tipo I, FCS, LPLD, pancreatite, diabetes, resistência à insulina, quilomicrone- mia e dislipidemia.