CN116925160B - 一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及有机合成化学技术领域，提供一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法，制备步骤只需要2步，将N‑[3‑[(5‑羟基‑1‑氧代戊基)氨基]丙基]‑氨基甲酸苯甲酯替换为N‑[3‑[(5‑羟基‑1‑氧代戊基)氨基]丙基]‑氨基甲酸叔丁酯，简单可控，而且避免了使用易燃易爆高刺激性的物料，安全稳定，不但降低了成本，还得到了高收率、高纯度的GalNAc含糖环中间体，不会产生明显的杂质，后续纯化步骤简单，适合用于工业放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及有机合成化学技术领域，尤其涉及一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法。
背景技术
GalNAc含糖环中间体（成盐或游离）是合成GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶联修饰药物的重要中间体。而GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）是去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的配体，ASGPR是一种内吞性受体，在肝细胞的膜表面上高度特异性地表达，而在其他细胞中几乎不表达。ASGPR和网格蛋白介导的内吞作用可以有效地将GalNAc从细胞表面转运至细胞质。GalNAc可用于制备ASO药物或者siRNA药物，是迄今为止最有效的核酸药物递送系统。
现有制备GalNAc含糖环中间体步骤繁杂，不但收率较低，而且在制备过程中会产生大量的杂质，纯化操作困难，最后得到的产物纯度较低。
专利CN107109405A提供了一种的制备工艺，发明人将专利CN107109405A中的内容进行总结，获得如图7所示的制备步骤，其合成步骤长达七步（step1~step7），按照图7所示的制备步骤进行制备，最后得到的产物收率只有4.3%，并且反应过程中会产生大量的杂质IMP-1/>和IMP-2，后续进行柱层析纯化困难，得到的产物收率较低，还会产生大量的三废，耗时耗工。
专利CN105377887A提供了一种的制备工艺，发明人将专利CN105377887A中的内容进行总结，获得如图8所示的制备步骤，其合成步骤长达五步（step1~step5），按照图8所示的制备步骤进行制备。其中，在制备过程中需要添加/>（N-[3-[(5-羟基-1-氧代戊基)氨基]丙基]-氨基甲酸苯甲酯，CAS号为1637413-93-4），/>是一种极难合成的中间产物，而且价格高昂，并且在制备过程中会产生大量的杂质IMP-3和杂质IMP-4/>，后期纯化成本过高，不适用于工业化放大生产。
因此，开发出一种快速高效低成本含糖环中间体方法，来助力整个肝递送核酸药物研发生产中产能的瓶颈显得急迫而需要。
发明内容
本发明旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，包括如下步骤：
S1：将和/>进行反应，获得；
S2：将和/>采用一锅法进行反应，获得/>。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S1步骤包括如下操作步骤：
S11：将、/>和对甲苯磺酸一水合物置于甲苯中，进行搅拌，获得第一混合溶液；
S12：在惰性气体气氛下，将所述第一混合溶液加热至90~95℃，搅拌12~18h后进行减压浓缩，获得第二混合溶液；
S13：将甲基叔丁基醚滴加至所述第二混合溶液中，进行搅拌10~12h，获得第三混合溶液，将所述第三混合溶液进行过滤，获得滤饼，用甲基叔丁基醚对所述滤饼进行淋洗，获得。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S2步骤包括如下操作步骤：
S21：将置于DCE中，进行搅拌，获得第四混合溶液，在所述第四混合溶液中滴加TMSOTf，加热至50~60℃，进行搅拌，获得第五混合溶液；
S22：将加入至所述第五混合溶液中，加热至50~60℃，进行搅拌12~18h，获得第六混合溶液；
S23：将所述第六混合溶液置于水中进行淬灭反应，获得水相溶液，将所述水相溶液进行冻干，获得。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S1步骤中获得的为白色固体，收率为90~100%。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S2步骤中获得的为泡沫状白色固体，收率为90~100%。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述第五混合溶液包括。
本发明还提供一种GalNAc含糖环中间体，由如上所述的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法制备获得。
本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果之一：
1、本发明提供一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法，制备步骤只需要2步，简单可控，而且避免了使用易燃易爆高刺激性的物料，安全稳定，使GalNAc含糖环中间体的收率达到90~100%，适合用于工业放大生产。
2、本发明提供一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法，将替换为/>，不但降低了成本，还得到了高收率、高纯度的/>，不需要后续额外进行脱Cbz处理，避免对收率产生影响，而且还不会产生IMP-1、IMP-2、IMP-3或IMP-4等难以分离的杂质。
3、本发明提供一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法，将初步活化后直接进行反应，不需要将/>再次进行活化处理后进行使用，后续纯化步骤简单，产生的三废较现有工艺计算，减少近90%，更符合绿色环保。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的LCMS质谱图。
图2是本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的核磁氢谱图。
图3是对比例1中制备的单Cbz保护的GalNAc含糖环中间体的LCMS质谱图。
图4是对比例2中制备的单Cbz保护的GalNAc含糖环中间体的LCMS质谱图。
图5是对比例3中制备的GalNAc含糖环中间体的LCMS质谱图。
图6是本发明提供的一种N-[3-[(5-羟基-1-氧代戊基)氨基]丙基]-氨基甲酸叔丁酯的核磁氢谱图。
图7是根据专利CN107109405A提供的内容获得的GalNAc含糖环中间体的制备步骤。
图8是根据专利CN105377887A提供的内容获得的GalNAc含糖环中间体的制备步骤。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明实施例的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
本发明提供一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，包括如下步骤：
S1：将和/>进行反应，获得；
S2：将和/>采用一锅法进行反应，获得/>。
进一步地，S1的反应方程式如下所示：；
S2的反应方程式如下所示：
。
其中，是指GalNAc含糖环中间体成三氟甲磺酸盐。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S1步骤包括如下操作步骤：
S11：将、/>和对甲苯磺酸一水合物置于甲苯中，进行搅拌，获得第一混合溶液；
S12：在惰性气体气氛下，将所述第一混合溶液加热至90~95℃，搅拌12~18h后进行减压浓缩，获得第二混合溶液；
S13：将甲基叔丁基醚滴加至所述第二混合溶液中，进行搅拌10~12h，获得第三混合溶液，将所述第三混合溶液进行过滤，获得滤饼，用甲基叔丁基醚对所述滤饼进行淋洗，获得（N-[3-[(5-羟基-1-氧代戊基)氨基]丙基]-氨基甲酸叔丁酯）。
在一个实施例中，在24℃下，向干燥反应瓶中加入甲苯500 mL，进行搅拌，再向干燥反应瓶中加入（50 g，0.5 mol），/>(83.6 g，0.48 mol)，对甲苯磺酸一水合物（0.83 g，4.8 mmol），在氮气气氛下，加热至90℃，继续搅拌12h。
其中，检测反应完全的方法有两种：
（1）TLC检测：在玻璃板上蘸取上述反应液，用KMnO4进行显色，无荧光点显出，则反应完全；
（2）LCMS检测：LCMS检测结果无对应峰，则/>反应完全。
反应完全后，进行减压浓缩，使反应液中多余的甲苯蒸出，在剩余的甲苯相中滴加入100 mL甲基叔丁基醚，这时会有大量固体开始析出，搅拌10 h后进行过滤，获得的滤饼用甲基叔丁基醚进行淋洗，干燥后得到130 g白色固体，收率为97.3%，如图6所示，氢谱核磁确认目标化合物为/>（N-[3-[(5-羟基-1-氧代戊基)氨基]丙基]-氨基甲酸叔丁酯），且无其他杂质生成。
采用替代现有技术中使用的（N-[3-[(5-羟基-1-氧代戊基)氨基]丙基]-氨基甲酸苯甲酯）进行制备/>，主要的原因是反应后得到的产物需要过柱纯化才能拿到，而反应完毕后会析出固体，直接过滤即可得到收率较高的，而且纯度高，无IMP-3和IMP-4/>等杂质产生。
另外，目前市售价格是的50倍，成本差距巨大，本发明采用不但效果优异且成本低，操作步骤简易，适合工业放大生产。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S2步骤包括如下操作步骤：
S21：将置于DCE中，进行搅拌，获得第四混合溶液，在所述第四混合溶液中滴加TMSOTf，加热至50~60℃，进行搅拌，获得第五混合溶液；
S22：将加入至所述第五混合溶液中，加热至50~60℃，进行搅拌12~18h，获得第六混合溶液；
S23：将所述第六混合溶液置于水中进行淬灭反应，获得水相溶液，将所述水相溶液进行冻干，获得。
其中，第五混合液中主要物质为粗品，是一种高活化合物，性质不稳定，保质期短。
在一个实施例中，在24℃下，向干燥反应瓶中加入DCE 310 mL，（31 g，0.1 mol），进行搅拌，然后向反应液中滴加TMSOTf (24.4 g，0.11 mol)，体系中没有升温现象，这时反应液呈白色浑浊体系。将反应液加热至50℃，搅拌4 h后，再向反应液中分三批次加入/>(27.2 g，0.099 mol)，在50℃下继续搅拌13h，反应液呈淡黄色澄清液体。
进一步地，如图1所示，LCMS检测显示只有一根的质谱流（2.0min处质谱流），表明反应完全，且没有明显杂质产生。
进一步地，将反应液倒入300 mL 水中进行淬灭反应，进行分液，其中主要富集在水相溶液中，将水相溶液进行冻干，获得泡沫状白色固体64.6 g，利用核磁进行检测，如图2所示，核磁氢谱干净，只有，成三氟甲磺酸盐收率为98.7%。
其中，在使用前需要进行活化，活化后的/>是一个高活化合物，保质期较短，容易失活，需要控制处理时长，不适合应用于工业放大生产中。
而本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，无需对进行纯化，可将活化后的/>粗品和直接采用一锅法进行反应，就可以生成高收率、高纯度的，制备步骤简便，更适用于工业放大生产中。
进一步地，现有技术中通常在制备过程中会使用易燃易爆高刺激性的物料，而本发明无需使用易燃易爆高刺激性的物料就可以得到高纯高产率的。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S1步骤中获得的为白色固体，收率为90~100%。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述S2步骤中获得的为泡沫状白色固体，收率为90~100%。
根据本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，所述第五混合溶液包括。
本发明还提供一种GalNAc含糖环中间体，由如上所述的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法制备获得。
下面根据对比例1-3与本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法制备的GalNAc含糖环中间体进行对比。
对比例1
本对比例为根据图8所示的制备方法进行制备GalNAc含糖环中间体，具体操作步骤如下：
在氮气保护下，在100 mL干燥三口瓶中加入DCE 25 mL和(5g，12.8 mmol)，形成白色悬浊液。在氮气保护下降三口瓶中温度降至0℃，在0~5℃下缓慢滴加TMSOTf（3.4 g，15.4 mmol），出现升温的现象。降温至室温后搅拌16 h，利用LCMS进行检测，没有/>的质谱流，说明反应完毕。再将反应液缓慢加入50 mL 0~5℃的饱和碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭反应，静置分液。收集有机相，并用饱和食盐水25 mL对有机相进行清洗，进行萃取，继续收集有机相，用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩后得到粗品。
进一步地，需要对粗品再次进行活化处理：粗品/>用25 mL DCE进行溶解，加入4A 分子筛5 g和纯化后的/>(3.9 g，12.8 mmol)，在氮气保护下，降温至0℃。然后在0~5℃下缓慢滴加TMSOTf（3.4 g，15.4 mmol），略有升温，15 min 后滴加完毕。室温搅拌16 h后，LCMS检测后只有约30%产物，质谱图杂乱，如图3所示，说明剩余的原料无法再进行反应。
对比例2
本对比例为将和/>反应采用一锅法直接进行反应，具体操作步骤如下：
在氮气保护下，在100 mL干燥三口瓶中加入DCE 25 mL、(5 g，12.8 mmol)和纯化后的/>(5 g，16.2 mmol)，形成白色悬浊液。在氮气保护下降三口瓶中温度降至0℃，在0~5℃下缓慢滴加TMSOTf（3.4 g，15.4mmol），出现升温的现象。降温至室温后搅拌16 h，利用LCMS进行检测，反应完全，/>还有少量剩余未反应。再将反应液缓慢加入50 mL 0~5℃的饱和碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭反应，静置分液。收集有机相，并用饱和食盐水25 mL对有机相进行清洗，进行萃取，继续收集有机相，用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩后得到粗品/>，根据图4所示，LCMS检测后的质谱图除了/>的主峰（2.6min处质谱流），还明显存在一个杂质峰，需要进一步对粗品/>进行纯化处理。
进一步地，将粗品过柱层析（200-300目硅胶，DCM:MeOH = 99:1 ~95:5）得到淡黄色糖泡产品8.9 g，收率为86%。
对比例3
本对比例将替换为按照对比例1中的制备方法进行反应，具体操作步骤如下：
在氮气保护下，在100 mL干燥三口瓶中加入DCE 25 mL和(5 g，12.8 mmol)，形成白色悬浊液。在氮气保护下降三口瓶中温度降至0℃，在0~5℃下缓慢滴加TMSOTf（3.4 g，15.4 mmol），出现升温的现象。降温至室温后搅拌16 h，利用LCMS进行检测，没有/>的质谱流，说明反应完毕。再将反应液缓慢加入50 mL 0~5℃的饱和碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭反应，静置分液。收集有机相，并用饱和食盐水25 mL对有机相进行清洗，进行萃取，继续收集有机相，用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩后得到粗品/>。
进一步地，对粗品再次进行活化处理：粗品/>用25mL DCE进行溶解，加入4A 分子筛5 g和/>(3.9 g，12.8 mmol)，在氮气保护下，降温至0℃。然后在0~5℃下缓慢滴加TMSOTf（3.4 g，15.4 mmol），略有升温，15 min 后滴加完毕。室温搅拌16 h后，进行LCMS检测，如图5所示，只有约30%产物（1.9min处质谱流），剩余的（1.37min处质谱流）无法再进行反应。
将对比例1-3制备的GalNAc含糖环中间体和本发明制备的GalNAc含糖环中间体进行性能对比，具体如表1所示：
表1对比例1-3和本发明制备的GalNAc含糖环中间体性能对比表
根据表1可以看出，本发明制备的GalNAc含糖环中间体收率明显高于对比例2，纯度明显优于对比例1和对比例3。
根据图3和图4对比，其中，2.6min为质谱流，发现分两步进行制备没有合并一锅法反应高效干净。对比例2中将采用一锅法进行制备，虽然相对于对比例1相对干净很多，但是后续处理需要进行纯化，进而导致收率较低，而且还需要进一步对进行脱Cbz反应，才能得到。/>
根据图5可知，进一步证明了对进行两次活化处理制备的（1.9min处质谱流）纯度较低，还存在有未反应的/>（1.37min处质谱流）。
综上所述，本发明提供的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，无需对进行纯化，可将活化后的/>粗品和直接采用一锅法进行反应，就可以生成高收率、高纯度的，制备步骤简便，更适用于工业放大生产中。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将和/>进行反应，获得；
S2：将和/>采用一锅法进行反应，获得/>；
所述S1步骤包括如下操作步骤：
S11：将、/>和对甲苯磺酸一水合物置于甲苯中，进行搅拌，获得第一混合溶液；
S12：在惰性气体气氛下，将所述第一混合溶液加热至90~95℃，搅拌12~18h后进行减压浓缩，获得第二混合溶液；
S13：将甲基叔丁基醚滴加至所述第二混合溶液中，进行搅拌10~12h，获得第三混合溶液，将所述第三混合溶液进行过滤，获得滤饼，用甲基叔丁基醚对所述滤饼进行淋洗，获得；
所述S2步骤包括如下操作步骤：
S21：将置于DCE中，进行搅拌，获得第四混合溶液，在所述第四混合溶液中滴加TMSOTf，加热至50~60℃，进行搅拌，获得第五混合溶液所述第五混合溶液包括；
S22：将加入至所述第五混合溶液中，加热至50~60℃，进行搅拌12~18h，获得第六混合溶液；
S23：将所述第六混合溶液置于水中进行淬灭反应，获得水相溶液，将所述水相溶液进行冻干，获得。
2.根据权利要求1所述的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中获得的为白色固体，收率为90~100%。
3.根据权利要求1所述的一种GalNAc含糖环中间体的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中获得的为泡沫状白色固体，收率为90~100%。
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Non-Patent Citations (1)
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| A new approach to the synthesis of ligands of asialoglycoprotein receptor for targeted delivery of oligonucleotides to hepatocytes;S. Yu. Maklakova，et al.;《Russ.Chem.Bull., Int.Ed.》;第64卷(第7期);1655-1662 * |
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