EA036584B1 - Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr - Google Patents

Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr Download PDF

Info

Publication number
EA036584B1
EA036584B1 EA201891479A EA201891479A EA036584B1 EA 036584 B1 EA036584 B1 EA 036584B1 EA 201891479 A EA201891479 A EA 201891479A EA 201891479 A EA201891479 A EA 201891479A EA 036584 B1 EA036584 B1 EA 036584B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
modified
compound according
modified oligonucleotide
nucleoside
Prior art date
Application number
EA201891479A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201891479A1 (ru
Inventor
Тхажа П. Пракаш
Пунит П. Сет
Эрик Е. Свейз
Original Assignee
Ионис Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51843959&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA036584(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ионис Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Ионис Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201891479A1 publication Critical patent/EA201891479A1/ru
Publication of EA036584B1 publication Critical patent/EA036584B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3511—Conjugate intercalating or cleaving agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)

Abstract

В документе предложены олигомерные соединения с конъюгированными группами. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения конъюгированы с N-ацетилгалактозамином.

Description

Настоящее изобретение зарегистрировано вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием BIOL0248WOSEQ_ST25.txt, созданного 1 мая 2014 г., размером 16 кб. Информация о перечне последовательностей в электронном формате в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки.
Уровень техники
Принцип, лежащий в основе антисмысловой технологии, заключается в том, что антисмысловое соединение гибридизуется с целевой нуклеиновой кислотой и модулирует количество, активность и/или функцию целевой нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых случаях антисмысловые соединения приводят к изменению транскрипции или трансляции мишени. Такое модулирование экспрессии может быть достигнуто, например, разрушением целевой мРНК или ингибированием по механизму замещения. Пример модулирования целевой функции РНК за счет разрушения представляет собой разрушение за счет РНКазы H целевой РНК при гибридизации с ДНК-подобным антисмысловым соединением. Другой пример модулирования генной экспрессии за счет направленного разрушения представляет собой РНКинтерференция (РНКи). РНКи относится к антисмысловому сайленсингу гена по механизму, в котором применяется РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC). Дополнительный пример модулирования целевой функции РНК представляет собой механизм замещения, такой как использует в естественных условиях микроРНК. МикроРНК представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию РНК, кодирующих белки. Связывание антисмыслового соединения с микроРНК препятствует связыванию микроРНК с ее матричными РНК мишенями и, следовательно, затрудняет функцию микроРНК. МикроРНК-миметики могут усиливать естественную функцию микроРНК. Некоторые антисмысловые соединения изменяют сплайсинг пре-мРНК. Независимо от конкретного механизма специфичность в отношении последовательностей делает антисмысловые соединения перспективными в качестве средств для подтверждения наличия цели и функционализации генов, а также в качестве терапевтических средств для селективного модулирования экспрессии генов, участвующих в патогенезе заболеваний.
Антисмысловая технология представляет собой эффективный способ модулирования экспрессии одного или более специфических генных продуктов и, следовательно, может быть признана исключительно подходящей в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений. Химически модифицированные нуклеозиды могут быть внедрены в антисмысловые соединения для усиления одного или более свойств, таких как устойчивость к нуклеазе, фармакокинетика или аффинность к целевой нуклеиновой кислоте. В 1998 г. антисмысловое соединение Vitravene® (фомивирсен; разработанный компанией Isis Pharmaceuticals Inc., Карлсбад, штат Калифорния) стал первым антисмысловым лекарством, получившим разрешение на продажу от Администрации США по пищевым продуктам и лекарственным веществам (FDA), и в настоящее время представляет собой средство для лечения вызванного цитомегалогенвирусом (CMV) ретинита у пациентов со СПИДом.
Новые химические модификации обладают улучшенной активностью и эффективностью антисмысловых соединений, раскрывая потенциал для пероральной доставки, а также для усовершенствования подкожного введения, снижения возможных побочных эффектов, и приводят к улучшению удобства для пациента. Химические модификации, усиливающие активность антисмысловых соединений, позволяют осуществлять введение более низких доз, что снижает возможность токсичности, а также уменьшает общую стоимость лечения. Модификации, увеличивающие устойчивость к разрушению, приводят к более медленному выведению из организма, обеспечивая возможность менее частого введения доз. Различные типы химических модификаций могут быть комбинированы в одном соединении для дальнейшей оптимизации эффективности соединения.
Сущность изобретения
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения. В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения, содержащие антисмысловый олигонуклеотид, комплементарный транскрипту нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены способы, включающие контакт клетки с конъюгированным антисмысловым соединением, содержащим антисмысловый олигонуклеотид, комплементарный транскрипту нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены способы, включающие контакт клетки с конъюгированным антисмысловым соединением, содержащим антисмысловой олигонуклеотид, и уменьшение количества или активности транскрипта нуклеиновой кислоты в клетке.
Ранее был описан асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R). См., например, Park et al., PNAS, т. 102, № 47, cc. 17125-17129 (2005). Такие рецепторы экспрессируются на клетках печени, в частности гепатоцитах. Кроме того, было показано, что соединения, содержащие кластеры трех Nацетилгалактозаминовых (GalNAc) лигандов, способны связываться с ASGP-R, приводя к захвату указанного соединения в клетку. См., например, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, cc. 5216-5231 (май, 2008). Соответственно, конъюгаты, содержащие такие кластеры GalNAc, применяли для облегчения захвата некоторых соединений в клетки печени, в частности гепатоциты. Например, было показано, что некоторые GalNAc-содержащие конъюгаты увеличивают активность дуплексных миРНК
- 1 036584 соединений в клетках печени in vivo. В таких случаях GalNAc-содержащий конъюгат, как правило, прикрепляется к смысловой спирали дуплекса миРНК. Поскольку смысловая спираль отбрасывается перед окончательной гибридизацией антисмысловой спирали с целевой нуклеиновой кислотой, то маловероятно, что такой конъюгат будет влиять на активность. Как правило, конъюгат присоединяется к 3'-концу смысловой спирали миРНК. См., например, патент США 8106022. Некоторые конъюгирующие группы, описанные в настоящем документе, более активны и/или синтезируются легче, чем конъюгирующие группы, описанные ранее.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения конъюгаты присоединяются к одноцепочечным антисмысловым соединениям, включая, но не ограничиваясь ими, антисмысловые соединения на основе РНКазы H и антисмысловые соединения, которые изменяют сплайсинг целевой нуклеиновой кислоты пре-мРНК. В таких вариантах реализации изобретения конъюгат должен оставаться присоединенным к антисмысловому соединению достаточно долго для обеспечения преимущества (улучшенного захвата в клетки), но затем он должен либо расщепляться, либо иным образом не препятствовать последующим стадиям, необходимым для активности, таким как гибридизация с целевой нуклеиновой кислотой и взаимодействие с РНКазой H или ферментами, связанными со сплайсингом или модулированием сплайсинга. Такой баланс свойств более важен при подготовке одноцепочечных антисмысловых соединений, чем соединений миРНК, где конъюгат может быть просто присоединен к смысловой спирали. В настоящем документе описаны одноцепочечные антисмысловые соединения, обладающие улучшенной активностью в клетках печени in vivo, по сравнению с таким же антисмысловым соединением, не имеющим конъюгата. Учитывая необходимый баланс свойств для этих соединений, такая улучшенная активность является неожиданной.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы по настоящему документу содержат расщепляемый фрагмент. Как было отмечено, не ограничиваясь каким-либо механизмом, логично, что конъюгат должен сохраняться у соединения достаточно долго для обеспечения усиления захвата, но после этого желательно, чтобы некоторая его часть или, в идеале, весь конъюгат расщеплялся, выделяя исходное соединение (например, антисмысловое соединение) в его наиболее активной форме. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый нуклеозид. Такие варианты реализации изобретения используют эндогенные нуклеазы в клетке за счет присоединения остальной части конъюгата (кластера) к антисмысловому олигонуклеотиду через нуклеозид при помощи одной или более расщепляемых связей, таких как фосфодиэфирные связи. В некоторых вариантах реализации изобретения кластер связан с расщепляемым нуклеозидом через фосфодиэфирную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый нуклеозид присоединен к антисмысловому олигонуклеотиду (антисмысловому соединению) фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа может содержать два или три расщепляемых нуклеозида. В таких вариантах реализации изобретения указанные расщепляемые нуклеозиды связаны друг с другом, с антисмысловым соединением и/или с кластером посредством расщепляемых связей (таких как фосфодиэфирная связь). Некоторые конъюгаты по настоящему документу не содержат расщепляемый нуклеозид, а вместо этого содержат расщепляемую связь. Показано, что достаточное расщепление конъюгата из олигонуклеотида обеспечивается, по меньшей мере, за счет одной связи, которая легко поддается расщеплению в клетке (расщепляемая связь).
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения представляют собой пролекарства. Такие пролекарства вводят животному, и они в конечном итоге метаболизируются до более активной формы. Например, конъюгированные антисмысловые соединения расщепляются с удалением всего или части конъюгата, приводя к активной (или более активной) форме антисмыслового соединения, не содержащего всего или части конъюгата.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгаты присоединены на 5'-конце олигонуклеотида. Некоторые такие 5'-конъюгаты расщепляются более эффективно, чем аналоги, имеющие такую же конъюгирующую группу, присоединенную на 3'-конце.
В некоторых вариантах реализации изобретения улучшенная активность может коррелировать с улучшенным расщеплением. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды, содержащие конъюгат на 5'-конце, обладают более высокой эффективностью, чем олигонуклеотиды, содержащие конъюгат на 3'-конце (см., например, примеры 56, 81, 83 и 84). Кроме того, 5'-присоединение обеспечивает более простой синтез олигонуклеотида. Как правило, олигонуклеотиды синтезируют на твердой подложке в направлении от 3' к 5'. Для получения 3'-конъюгированного олигонуклеотида, как правило, присоединяют предварительно конъюгированный 3'-нуклеозид к твердой подложке, а затем обычным путем создают олигонуклеотид. Однако присоединение такого конъюгированного нуклеозида к твердой подложке усложняет синтез. Кроме того, применяя такой подход, конъюгат затем присутствует в ходе всего синтеза олигонуклеотида и может разрушаться во время последующих стадий или может ограничивать типы реакций и реагентов, которые можно применять. Применяя структуры и методики, описанные в настоящем документе для 5'-конъюгированных олигонуклеотидов, можно синтезировать олигонуклеотид при помощи стандартных автоматизированных методик и внедрять конъюгат вместе с последним (5'-крайний) нуклеозидом или после отделения олигонуклеотида от твердой подложки.
- 2 036584
С учетом известного уровня техники и настоящего описания специалисты в данной области техники могут легко получить любые из конъюгатов и конъюгированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе. Кроме того, синтез некоторых таких конъюгатов и конъюгированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе, проще и/или требует меньше стадий и, следовательно, менее дорогой, чем синтез ранее описанных конъюгатов, что дает преимущество при производстве. Например, синтез некоторых конъюгирующих групп состоит из меньшего количества синтетических стадий, что приводит к увеличению выхода, по сравнению с ранее описанными группами конъюгата. Конъюгирующие группы, такие как GalNAc3-10 в примере 46 и GalNAc3-7 в примере 48, гораздо проще, чем ранее описанные конъюгаты, такие как описаны в публикациях US 8106022 или US 7262177, для которых необходима сборка большего количества химических промежуточных соединений. Соответственно, эти и другие конъюгаты, описанные в настоящем документе, обладают преимуществом по сравнению с ранее описанными соединениями для применения с любым олигонуклеотидом, включая одноцепочечные олигонуклеотиды и любую спираль двухцепочечных олигонуклеотидов (например, миРНК).
Точно также в настоящем документе описаны конъюгирующие группы, имеющие ровно один или два лиганда GalNAc. Как показано, такие конъюгированные группы усиливают активность антисмысловых соединений. Такие соединения гораздо проще получить, чем конъюгаты, содержащие три лиганда GalNAc. Конъюгирующие группы, содержащие один или два лиганда GalNAc, могут быть присоединены к любым антисмысловым соединениям, включая одноцепочечные олигонуклеотиды и любую спираль двухцепочечных олигонуклеотидов (например, миРНК).
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгаты, описанные в настоящем документе, существенно не изменяют некоторые показатели переносимости. Например, в настоящем документе показано, что конъюгированные антисмысловые соединения являются не более иммуногенными, чем не конъюгированные исходные соединения. Поскольку активность улучшается, то варианты реализации, в которых переносимость остается такой же (или, в действительности, если даже переносимость ухудшается лишь незначительно, по сравнению с приростом активности), обладают улучшенными характеристиками для терапии.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгация позволяет изменять антисмысловые соединения так, чтобы они обладали менее выраженными последствиями в отсутствие конъюгации. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения замена одной или более тиофосфатных связей полностью тиофосфатного антисмыслового соединения на фосфодиэфирные связи приводит к улучшению некоторых показателей переносимости. Например, в некоторых случаях такие антисмысловые соединения, имеющие один или более фосфодиэфиров, являются менее иммуногенными, чем такие же соединения, в которых каждая связь представляет собой тиофосфат. Однако в некоторых случаях, как показано в примере 26, такое же замещение одной или более тиофсофатных связей на фосфодиэфирные связи приводит также к снижению клеточного захвата и/или к снижению активности. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения, описанные в настоящем документе, допускают такое изменение связей с небольшим снижением или без снижения захвата и активности, по сравнению с конъюгированным полностью тиофосфатным аналогом. В действительности, в некоторых вариантах реализации, например в примерах 44, 57, 59 и 86, олигонуклеотиды, содержащие конъюгат и по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь, фактически демонстрируют повышенную активность in vivo даже по сравнению с полностью тиофосфатным аналогом, также содержащим такой же конъюгат. Более того, поскольку конъюгация приводит к значительному увеличению захвата/активности, то небольшое снижение такого существенного прироста может быть приемлемым для достижения улучшенной переносимости. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгация антисмысловых соединений по настоящему документу приводит к улучшенной доставке, захвату и активности в гепатоцитах. Следовательно, в ткань печени доставляется большее количество соединения. Однако в некоторых вариантах реализации изобретения такая улучшенная доставка сама по себе не объясняет общего увеличения активности. В некоторых таких вариантах реализации изобретения большее количество соединения поступает в гепатоциты. В некоторых вариантах реализации изобретения даже такой улучшенный захват гепатоцитов сам по себе не объясняет общего увеличения активности. В таких вариантах реализации изобретения увеличивается продуктивный захват конъюгированного соединения. Например, как показано в примере 102, некоторые варианты реализации GalNAc-содержащих конъюгатов увеличивают обогащение антисмысловых олигонуклеотидов в гепатоцитах по сравнению с не паренхимальными клетками. Такое обогащение преимущественно для олигонуклеотидов, которые нацелены на гены, экспрессируемые в гепатоцитах.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения по настоящему документу приводят к уменьшению воздействия на почки. Например, как показано в примере 20, концентрации антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих некоторые варианты реализации GalNAc-содержащих конъюгатов, в почках ниже, чем концентрации антисмысловых олигонуклеотидов, не имеющих GalNAc-содержащего конъюгата. Это имеет несколько благоприятных терапевтических
- 3 036584 эффектов. Для терапевтических показаний, в которых не требуется проявление активности в почках, воздействие на почки подвергает их риску токсичности без соответствующей пользы. Более того, высокая концентрация в почках обычно приводит к выводу соединения с мочой, обеспечивая более быстрое выведение. Соответственно, для внепочечных мишеней накопление в почках является нежелательным.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные формулой
где A представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд;
q представляет собой целое число от 1 до 5.
На приведенной выше схеме и в аналогичных схемах в настоящем документе группа ветвления D разветвляется такое количество раз, которое необходимо для соответствия количеству групп (E-F), указанному количеством q. Так, если q = 1, то формула представляет собой
А----В----С----D----Е---F если q = 2, то формула представляет собой
E---F
E----F
А----В
если q = 3, то формула представляет собой если q = 4, то формула представляет собой если q = 5, то формула представляет собой
В некоторых вариантах реализации изобретения приведены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру
- 4 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения приведены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру
В некоторых вариантах реализации изобретения приведены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру
В некоторых вариантах реализации изобретения приведены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру
- 5 036584
Фрагмент, нацеливающий на клетку
В вариантах реализации, имеющих более одной конкретной переменной (например, более одного m или n), если не указано иное, каждая такая конкретная переменная выбрана независимо. Следовательно, для структуры, имеющей более одного n, каждый n выбран независимо, так что они могут быть или не быть одинаковыми между собой.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что и приведенное выше общее описание, и следующее подробное описание являются лишь иллюстративными и пояснительными, и они не ограничивают настоящее описание. В настоящем документе использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. При использовании в настоящем документе термин или означает и/или, если не указано иное. Кроме того, использование термина включая, а также других форм, таких как включает и включенный, не является ограничивающим. Также такие термины как элемент или компонент охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если специально не указано иное.
Названия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены лишь для организационных целей, и их не следует толковать как ограничение описанного объекта изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и монографии, в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.
A. Определения.
При отсутствии конкретных определений номенклатура, используемая в связи с ними, а также в связи с приемами и методиками аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описанная в настоящем документе, является общеизвестной и общепринятой в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методики. Некоторые такие методики и приемы приведены, например, в публикациях Carbohydrate Modifications in Antisense Research под редакцией Sangvi и Cook, American Chemical Society, федеральный округ Вашингтон, 1994; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания, 21-е изд., 2005; и Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications под редакцией Stanley Т. Crooke, CRC Press, Бока-Ратон, штат Флорида; а также в книге Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, которые включены в настоящий документ посредством ссылки для всех целей. Если это допустимо, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, а также другие данные, упоминаемые в тексте настоящего описания, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения.
При использовании в настоящем документе нуклеозид означает соединение, содержащее фрагмент азотистые основания и сахарный фрагмент. Нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, природные нуклеозиды (которые находятся в ДНК и РНК) и модифицированные нуклеозиды. Нуклеозиды могут быть связаны с фосфатным фрагментом.
При использовании в настоящем документе химическая модификация означает химическое отличие в соединении по сравнению с природным аналогом. Химические модификации олигонуклеотидов включают нуклеозидные модификации (включая модификации сахарного фрагмента и модификации азотистые основания) и модификации межнуклеозидных связей. В отношении олигонуклеотида химическая модификация включает не только отличия в последовательности азотистых оснований.
- 6 036584
При использовании в настоящем документе фуранозил означает структуру, содержащую 5членное кольцо, содержащее четыре атома углерода и один атом кислорода.
При использовании в настоящем документе природный сахарный фрагмент означает рибофуранозил, встречающийся в природной РНК, или дезоксирибофуранозил, встречающийся в природной ДНК.
При использовании в настоящем документе сахарный фрагмент означает природный сахарный фрагмент или модифицированный сахарный фрагмент нуклеозида.
При использовании в настоящем документе модифицированный сахарный фрагмент означает замещенный сахарный фрагмент или заменитель сахара.
При использовании в настоящем документе замещенный сахарный фрагмент означает фуранозил, который не является природным сахарным фрагментом. Замещенные сахарные фрагменты включают, но не ограничиваются ими, фуранозилы, содержащие заместители в 2' положении, 3' положении, 5' положении и/или 4' положении. Некоторые замещенные сахарные фрагменты представляют собой бициклические сахарные фрагменты.
При использовании в настоящем документе 2'-замещенный сахарный фрагмент означает фуранозил, содержащий заместитель в 2' положении, отличный от H или OH. Если не указано иное, то 2'-замещенный сахарный фрагмент не является бициклическим сахарным фрагментом (т.е. 2'-заместитель 2'-замещенного сахарного фрагмента не образует мостик с другим атомом радикала фуранозного кольца).
При использовании в настоящем документе MOE означает -OCH2CH2OCH3.
При использовании в настоящем документе 2'-F нуклеозид относится к нуклеозиду, содержащему сахар, который содержит фтор в 2' положении. Если не указано иное, то фтор в 2'-F нуклеозиде находится в рибо-положении (заменяя OH природной рибозы).
При использовании в настоящем документе термин заменитель сахара означает структуру, которая не содержит фуранозил и способна заменять природный сахарный фрагмент нуклеозида так, что образующиеся нуклеозидные субъединицы могут связываться вместе и/или связываться с другими нуклеозидами с образованием олигомерного соединения, которое может гибридизоваться с комплементарным олигомерным соединением. Такие структуры включают кольца, содержащие другое количество атомов, чем фуранозил (например, 4-, 6- или 7-членные кольца); замену кислорода фуранозила некислородным атомом (например, углеродом, серой или азотом); или одновременное изменение количества атомов и замену кислорода. Такие структуры также могут содержать замещения, соответствующие замещениям, описанным для замещенных сахарных фрагментов (например, 6-членные карбоциклические бициклические заменители сахара, необязательно содержащие дополнительные заместители). Заменители сахара включают также более сложные сахарные заместители (например, некольцевые системы пептидной нуклеиновой кислоты). Заменители сахара включают, без ограничения, морфолино, циклогексенилы и циклогекситолы.
При использовании в настоящем документе бициклический сахарный фрагмент означает модифицированный сахарный фрагмент, содержащий 4-7-членное кольцо (включая, но не ограничиваясь фуранозилом), содержащее мостик, связывающий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что приводит к получению бициклической структуры. В некоторых вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо представляет собой сахарное кольцо. В некоторых вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В некоторых таких вариантах реализации изобретения мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила.
При использовании в настоящем документе нуклеотид означает нуклеозид, дополнительно содержащий фосфатную связывающую группу. При использовании в настоящем документе «связанные нуклеозиды могут быть или не быть связаны фосфатными связями и, следовательно, включают, но не ограничиваются ими, связанные нуклеотиды. При использовании в настоящем документе связанные нуклеозиды представляют собой нуклеозиды, которые связаны в непрерывную последовательность (т.е. между связанными нуклеозидами нет дополнительных нуклеозидов).
При использовании в настоящем документе азотистое основание означает группу атомов, которая может быть связана с сахарным фрагментом с образованием нуклеозида, который может быть внедрен в олигонуклеотид, и при этом указанная группа атомов может связываться с комплементарным природным азотистым основанием другого олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты. Азотистые основания могут быть природными или могут быть модифицированными.
При использовании в настоящем документе термины немодифицированное азотистое основание или природное азотистое основание означают природные гетероциклические азотистые основания РНК или ДНК: пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) (включая 5-метил C) и урацил (U).
При использовании в настоящем документе модифицированное азотистое основание означает любое азотистое основание, которое не является природным азотистым основанием.
При использовании в настоящем документе модифицированный нуклеозид означает нуклеозид, содержащий по меньшей мере одну химическую модификацию, по сравнению с природными нуклеозидами РНК или ДНК. Модифицированные нуклеозиды содержат модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное азотистое основание.
- 7 036584
При использовании в настоящем документе бициклический нуклеозид или BNA означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент.
При использовании в настоящем документе стерически затрудненный этил-нуклеозид или cEt означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, который содержит мостик 4'CH(CH3)-O-2'.
При использовании в настоящем документе нуклеозид закрытой нуклеиновой кислоты или «LNA означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, который содержит мостик 4'-CH2-O-2'.
При использовании в настоящем документе 2'-замещенный нуклеозид означает нуклеозид, содержащий заместитель в 2' положении, отличный от H или OH. Если не указано иное, то 2'-замещенный нуклеозид не является бициклическим нуклеозидом.
При использовании в настоящем документе дезоксинуклеозид означает нуклеозид, содержащий 2'-H фуранозный сахарный фрагмент, находящийся в природных дезоксирибонуклеозидах (ДНК). В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-дезоксинуклеозид может содержать модифицированное азотистое основание или может содержать азотистое основание РНК (например, урацил).
При использовании в настоящем документе олигонуклеотид означает соединение, содержащее множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит один или более немодифицированных рибонуклеозидов (РНК), и/или немодифицированных дезоксирибонуклеозидов (ДНА), и/или один или более модифицированных нуклеозидов.
При использовании в настоящем документе олигонуклеозид означает олигонуклеотид, в котором ни один из межнуклеозидных связей не содержит атом фосфора. При использовании в настоящем документе олигонуклеотиды включают олигонуклеозиды.
При использовании в настоящем документе модифицированный олигонуклеотид означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и/или по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
При использовании в настоящем документе связь или связывающая группа означает группу атомов, которая связывает вместе две или более других групп атомов.
При использовании в настоящем документе межнуклеозидная связь означает ковалентную связь между соседними нуклеозидами в олигонуклеотиде.
При использовании в настоящем документе природная межнуклеозидная связь означает фосфодиэфирную связь 3' с 5'.
При использовании в настоящем документе модифицированная межнуклеозидная связь означает любую межнуклеозидную связь, отличную от природной межнуклеозидной связи.
При использовании в настоящем документе концевая межнуклеозидная связь означает связь между последними двумя нуклеозидами олигонуклеотида или его определенной области.
При использовании в настоящем документе фосфорная связывающая группа означает связывающую группу, содержащую атом фосфора. Фосфорные связывающие группы включают, без ограничения, группы, имеющие формулу ч/vw
I Ra Rb=P_R c
Rd I ч/VW где Ra и Rd, каждый независимо, представляют собой O, S, CH2, NH или NJ1, где J1 представляет собой Ц-С^алкил или замещенный Ц-С^алкил;
Rb представляет собой O или S;
Rc представляет собой OH, SH, С1-С6-алкил, замещенный С1-С6-алкил, С1-С6-алкокси, замещенный С1-С6-алкокси, амино или замещенный амино; и
J1 представляет собой Rb, представляет собой O или S.
Фосфорные связывающие группы включают, без ограничения, фосфодиэфир, тиофосфат, дитиофосфат, фосфонат, фосфорамидат, фосфортиоамидат, тионоалкилфосфонат, фосфотриэфиры, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфат.
При использовании в настоящем документе межнуклеозидная фосфорная связывающая группа означает фосфорную связывающую группу, которая напрямую связывает два нуклеозида.
При использовании в настоящем документе не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа означает фосфорную связывающую группу, которая не связывает напрямую два нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа связывает нуклеозид с группой, отличной от нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа связывает две группы, ни одна из которых не является нуклеозидом.
- 8 036584
При использовании в настоящем документе нейтральная связывающая группа означает связывающую группу, которая не имеет заряда. Нейтральные связывающие группы включают, без ограничения, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), амид-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), амид-4 (CH2-N(H)-C(=O)-), формацеталь (-O-CH2-O-) и тиоформацеталь (-S-CH2-O-). Дополнительные нейтральные связывающие группы включают неионные связи, содержащие силоксан (диалкилсилоксан), карбоновый сложный эфир, карбоксамид, сульфид, сульфоновый сложный эфир и амиды (см., например, Carbohydrate Modifications in Antisense Research; под ред. Y.S. Sanghvi и P.D. Cook, ACS Symposium, серия 580; гл. 3 и 4 (сс. 40-65)). Дополнительные нейтральные связывающие группы включают неионные связи, содержащие смешанные составные части N, O, S и CH2.
При использовании в настоящем документе межнуклеозидная нейтральная связывающая группа означает нейтральную связывающую группу, которая напрямую связывает два нуклеозида.
При использовании в настоящем документе не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа означает нейтральную связывающую группу, которая не связывает напрямую два нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа связывает нуклеозид с группой, отличной от нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа связывает две группы, ни одна из которых не является нуклеозидом.
При использовании в настоящем документе олигомерное соединение означает полимерную структуру, содержащую две или более субструктур. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерное соединение содержит олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерное соединение содержит одну или более конъюгированных групп и/или концевых групп. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерное соединение состоит из олигонуклеотида. Олигомерные соединения включают также природные нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерное соединение содержит скелет одной или более связанных мономерных субъединиц, при этом каждая связанная мономерная субъединица прямо или косвенно присоединена к гетероциклическому основному фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения могут содержать также мономерные субъединицы, которые не связаны с гетероциклическим основным фрагментом, обеспечивая таким образом сайты с удаленными основаниями. В некоторых вариантах реализации изобретения связи, соединяющие мономерные субъединицы, сахарные фрагменты или заменители и гетероциклические основные фрагменты, могут быть независимо модифицированы. В некоторых вариантах реализации изобретения единица связь-сахар, которая может содержать или не содержать гетероциклическое основание, может быть замещена миметиком, таким как мономеры в пептидных нуклеиновых кислотах.
При использовании в настоящем документе концевая группа означает один или более атомов, присоединенных к любому или к обоим 3'- или 5'-концам олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения концевая группа представляет собой конъюгирующую группу. В некоторых вариантах реализации изобретения концевая группа содержит один или более нуклеозидов концевой группы.
При использовании в настоящем документе конъюгат или конъюгирующая группа означает атом или группу атомов, связанную с олигонуклеотидом или олигомерным соединением. Как правило, конъюгирующие группы модифицируют одно или более свойств соединения, к которому они присоединены, включая, но не ограничиваясь ими, свойства фармакодинамики, фармакокинетики, связывания, поглощения, клеточного распределения, клеточного захвата, заряда и/или выведения.
При использовании в настоящем документе линкер конъюгата или линкер в контексте конъюгирующие группы означает часть конъюгирующих групп, содержащую любой атом или группу атомов и ковалентно связывающую (1) олигонуклеотид с другой частью конъюгирующих групп или (2) две или более частей конъюгирующих групп.
Конъюгирующие группы показаны в настоящем документе как радикалы, обеспечивающие связь для образования ковалентного присоединения к олигомерному соединению, такому как антисмысловый олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения точка присоединения у олигомерного соединения представляет собой 3'-атом кислорода 3'-гидроксильной группы 3'-концевого нуклеозида олигомерного соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения точка присоединения у олигомерного соединения представляет собой 5'-атом кислорода 5'-гидроксильной группы 5'-концевого нуклеозида олигомерного соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения связь для образования присоединения к олигомерному соединению представляет собой расщепляемую связь. В некоторых таких вариантах реализации изобретения такая расщепляемая связь составляет весь или часть расщепляемого фрагмента.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы содержат расщепляемый фрагмент (например, расщепляемую связь или расщепляемый нуклеозид) и часть углеводного кластера, такую как часть кластера GalNAc. Такая часть углеводного кластера содержит: нацеливающий фрагмент и, необязательно, линкер конъюгата. В некоторых вариантах реализации изобретения часть углеводного кластера определяют по количеству и сущности лиганда. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения часть углеводного кластера содержит три группы GalNAc и обозначена GalNAc3. В неко
- 9 036584 торых вариантах реализации изобретения часть углеводного кластера содержит 4 группы GalNAc и обозначена GalNAc4. Конкретные части углеводных кластеров (имеющие конкретную связку, группы ветвления и линкера конъюгата) описаны в настоящем документе и обозначены римской цифрой с последующим нижним индексом a. Соответственно, GalNac3-1a относится к конкретной части углеводного кластера конъюгирующей группы, имеющей 3 группы GalNac и конкретно определенную связку, группы ветвления и линкера. Такой фрагмент углеводного кластера присоединен к олигомерному соединению через расщепляемый фрагмент, такой как расщепляемая связь или расщепляемый нуклеозид.
При использовании в настоящем документе расщепляемый фрагмент означает связь или группу, которая может быть расщеплена при физиологических условиях. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент расщепляется внутри клетки или во внутриклеточных отделах, таких как лизосома. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент расщепляется эндогенными ферментами, такими как нуклеазы. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент содержит группу атомов, имеющую один, два, три, четыре или более четырех расщепляемых связей.
При использовании в настоящем документе расщепляемая связь означает любую химическую связь, которая может быть расщеплена. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемая связь выбрана из амида, полиамида, сложного эфира, эфира, одного или обоих сложных эфиров фосфодиэфира, фосфатного сложного эфира, карбамата, дисульфида или пептида.
При использовании в настоящем документе углеводный кластер означает соединение, имеющее один или более углеводных остатков, присоединенных к скелету или связывающей группе (см., например, публикацию Maier et al., Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting, Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки, или Rensen et al., Design and Synthesis of Novel NAcetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor, J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, где приведены примеры углеводных конъюгированных кластеров).
При использовании в настоящем документе производное углевода» означает любое соединение, которое может быть синтезировано с применением углевода в качестве исходного материала или промежуточного соединения.
При использовании в настоящем документе углевод означает природный углевод, модифицированный углевод или производное углевода.
При использовании в настоящем документе защитная группа означает любое соединение или защитную группу, известную специалистам в данной области техники. Неограничивающие примеры защитных групп представлены в публикации Protective Groups in Organic Chemistry, T.W. Greene, P.G.M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Нью-Йорк, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
При использовании в настоящем документе одноцепочечное означает олигомерное соединение, которое не гибридизовано с его комплементом и которое не имеет достаточной самокомплементарности для образования усточивого собственного дуплекса.
При использовании в настоящем документе двухцепочечное означает пару олигомерных соединений, которые гибридизованы друг с другом, или одно самокомплементарное олигомерное соединение, которое образует шпилечную структуру. В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечное олигомерное соединение содержит первое и второе олигомерное соединение.
При использовании в настоящем документе антисмысловое соединение означает соединение, содержащее или состоящее из олигонуклеотида, по меньшей мере часть которого комплементарна целевой нуклеиновой кислоте, с которой возможна его гибридизация, что приводит к получению по меньшей мере одной антисмысловой активности.
При использовании в настоящем документе антисмысловая активность означает любое обнаруживаемое и/или измеримое изменение, обусловленное гибридизацией антисмыслового соединения с его целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловая активность включает модулирование количества или активности транскрипта целевой нуклеиновой кислоты (например, мРНК). В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловая активность включает модулирование сплайсинга пре-мРНК.
При использовании в настоящем документе антисмысловое соединение на основе РНКазы Н означает антисмысловое соединение, в котором по меньшей мере часть антисмысловой активности антисмыслового соединения обусловлена гибридизацией антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой и последующим расщеплением целевой нуклеиновой кислоты под действием РНКазы H.
При использовании в настоящем документе антисмысловое соединение на основе RISC означает антисмысловое соединение, в котором по меньшей мере часть антисмысловой активности антисмыслового соединения обусловлена РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC).
При использовании в настоящем документе обнаружение или измерение означает, что выполнено испытание или анализ для обнаружения или измерения. Такое обнаружение и/или измерение может
- 10 036584 приводить к результату с нулевым значением. Следовательно, даже если испытание для обнаружения или измерения приводит к обнаружению отсутствия активности (нулевой активности), то стадия обнаружения или измерения активности была выполнена.
При использовании в настоящем документе обнаруживаемая и/или измеримая активность означает статистически значимую активность, которая не является нулевой.
При использовании в настоящем документе по существу, не измененный означает небольшое или отсутствие изменения конкретного параметра, в частности, по сравнению с другим параметром, который изменился гораздо больше. В некоторых вариантах реализации изобретения параметр является, по существу, не измененным, если его изменение составило менее 5%. В некоторых вариантах реализации изобретения параметр является, по существу, не измененным, если его изменение составило менее двух раз, тогда как изменение другого параметра составило по меньшей мере десять раз. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловая активность представляет собой изменение количества целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых таких вариантах реализации изобретения количество нецелевой нуклеиновой кислоты является, по существу, не измененным, если оно изменяется гораздо меньше, чем изменяется количество целевой нуклеиновой кислоты, но это изменение не обязательно должно быть нулевым.
При использовании в настоящем документе экспрессия означает процесс, посредством которого ген в конечном итоге преобразуется в белок. Экспрессия включает, но не ограничивается этим, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию (например, сплайсинг, полиаденилирование, добавление 5'-кэпа) и трансляцию.
При использовании в настоящем документе целевая нуклеиновая кислота означает молекулу нуклеиновой кислоты, с которой предполагается гибридизация антисмыслового соединения с получением желаемой антисмысловой активности. Антисмысловые олигонуклеотиды обладают достаточной комплементарностью их целевым нуклеиновым кислотам для обеспечения гибридизации при физиологических условиях.
При использовании в настоящем документе комплементарность азотистых оснований или комплементарность в отношении азотистых оснований означает азотистое основание, которое способно к спариванию оснований с другим азотистым основанием. Например, в ДНК аденин (A) комплементарен тимину (T). Например, в РНК аденин (A) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарное азотистое основание означает азотистое основание антисмыслового соединения, которое способно к спариванию оснований с азотистым основанием его целевой нуклеиновой кислоты. Например, если азотистое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к водородному связыванию с азотистым основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, то это положение водородного связывания между олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой считается комплементарным по этой паре азотистых оснований. Азотистые основания, содержащие определенные модификации, могут сохранять способность к спариванию с противоположным азотистым основанием и, следовательно, все еще могут обладать комплементарностью азотистых оснований.
При использовании в настоящем документе не комплементарные в отношении азотистых оснований означает пару азотистых оснований, которые не образуют водородные связи друг с другом.
При использовании в настоящем документе комплементарные в отношении олигомерных соединений (например, связанных нуклеозидов, олигонуклеотидов или нуклеиновых кислот) означает способность таких олигомерных соединений или их областей к гибридизации с другим олигомерным соединением или его областью за счет комплементарности азотистых оснований. Комплементарные олигомерные соединения не обязательно должны обладать комплементарностью азотистых оснований в каждом нуклеозиде. До некоторой степени допустимы некоторые несоответствия. В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны по 70% азотистых оснований (комплементарность 70%). В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 80%. В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 90%. В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 95%. В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 100%.
При использовании в настоящем документе несоответствие означает азотистое основание первого олигомерного соединения, которое не способно спариваться с азотистым основанием в соответствующем положении второго олигомерного соединения при выравнивании первого и второго олигомерного соединения. Любое или оба, первое и второе, олигомерных соединения могут быть олигонуклеотидами.
При использовании в настоящем документе гибридизация означает спаривание комплементарных олигомерных соединений (например, антисмыслового соединения и его целевой нуклеиновой кислоты). Не ограничиваясь конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм спаривания включает водородное связывание, которое может представлять собой уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское водородное связывание между комплементарными азотистыми основаниями.
- 11 036584
При использовании в настоящем документе специфически гибридизуется означает способность олигомерного соединения гибридизоваться с одним сайтом нуклеиновой кислоты с большей аффинностью, чем оно гибридизуется с другим сайтом нуклеиновой кислоты.
При использовании в настоящем документе полностью комплементарный в отношении олигонуклеотида или его части означает, что каждое азотистое основание олигонуклеотида или его части способно к спариванию с азотистым основанием комплементарной нуклеиновой кислоты или ее непрерывной частью. Следовательно, полностью комплементарная область не содержит несоответствий или не гибридизованных азотистых оснований в обеих спиралях.
При использовании в настоящем документе процент комплементарности означает процент азотистых оснований олигомерного соединения, которые комплементарны равной по длине части целевой нуклеиновой кислоты. Процент комплементарности рассчитывают делением количества азотистых оснований олигомерного соединения, которые комплементарны азотистым основаниям в соответствующих положениях целевой нуклеиновой кислоты, на общую длину олигомерного соединения.
При использовании в настоящем документе процент идентичности означает количество азотистых оснований в первой нуклеиновой кислоте, которые относятся к тому же типу (независимо от химической модификации), что и азотистые основания в соответствующих положениях второй нуклеиновой кислоты, деленное на общее количество азотистых оснований в первой нуклеиновой кислоте.
При использовании в настоящем документе модулирование означает изменение количества или качества молекулы, функции или активности по сравнению с количеством или качеством молекулы, функции или активности до модулирования. Например, модулирование включает изменение, как увеличение (стимуляцию или индукцию), так и снижение (ингибирование или уменьшение) генной экспрессии. В качестве дополнительного примера модулирование экспрессии может включать изменение выбора сайта сплайсинга при процессинге пре-мРНК, что приводит к изменению абсолютного или относительного количества определенного сплайс-варианта, по сравнению с его количеством в отсутствие модулирования.
При использовании в настоящем документе химический мотив означает характерный участок химических модификаций в олигонуклеотиде или его области. Мотивы могут быть определены по модификациям в определенных нуклеозидах и/или в определенных связывающих группах олигонуклеотида.
При использовании в настоящем документе нуклеозидный мотив означает характерный участок нуклеозидных модификаций в олигонуклеотиде или его области. Связи такого олигонуклеотида могут быть модифицированными или немодифицированными. Если не указано иное, мотивы, описывающие в настоящем документе только нуклеозиды, представляют собой нуклеозидные мотивы. Следовательно, в таких случаях связи не ограничены.
При использовании в настоящем документе сахарный мотив означает характерный участок сахарных модификаций в олигонуклеотиде или его области.
При использовании в настоящем документе связывающий мотив означает характерный участок связывающих модификаций в олигонуклеотиде или его области. Нуклеозиды такого олигонуклеотида могут быть модифицированными или немодифицированными. Если не указано иное, мотивы, описывающие в настоящем документе только связи, представляют собой связывающие мотивы. Следовательно, в таких случаях нуклеозиды не ограничены.
При использовании в настоящем документе мотив модификации азотистых оснований означает характерный участок модификаций азотистых оснований вдоль олигонуклеотида. Если не указано иное, то мотив модификации азотистых оснований не зависит от последовательности азотистых оснований.
При использовании в настоящем документе мотив последовательности означает характерный участок азотистых оснований, расположенных вдоль олигонуклеотида или его части. Если не указано иное, то мотив последовательности не зависит от химических модификаций и, следовательно, может иметь любую комбинацию химических модификаций, включая отсутствие химических модификаций.
При использовании в настоящем документе тип модификации в отношении нуклеозида или нуклеозида определенного типа означает химическую модификацию нуклеозида и включает модифицированные и немодифицированные нуклеозиды. Соответственно, если не указано иное, нуклеозид, имеющий модификацию первого типа может быть немодифицированным нуклеозидом.
При использовании в настоящем документе по-разному модифицированные означает химические модификации или химические заместители, которые отличны друг от друга, включая их отсутствие или модификации. Так, например, MOE нуклеозид и немодифицированный нуклеозид ДНК являются поразному модифицированными, даже несмотря на то, что нуклеозид ДНК является немодифицированным. Точно также ДНК и РНК являются по-разному модифицированными, даже несмотря на то, что оба представляют собой природные немодифицированные нуклеозиды. Нуклеозиды, которые являются одинаковыми, но содержат различные азотистые основания, не являются по-разному модифицированными. Например, нуклеозид, содержащий 2'-OMe модифицированный сахар и немодифицированное адениновое нуклеоснование, и нуклеозид, содержащий 2'-OMe модифицированный сахар и немодифицированное тиминовое азотистое основание, не являются по-разному модифицированными.
При использовании в настоящем документе модификации одного типа относится к модификаци- 12 036584 ям, которые являются одинаковыми друг относительно друга, включая отсутствие модификаций. Так, например, два немодифицированных нуклеозида ДНК имеют модификацию одного типа, даже несмотря на то, что нуклеозид ДНК является немодифицированным. Такие нуклеозиды, имеющие модификацию одного типа, могут содержать различные азотистые основания.
При использовании в настоящем документе отдельные области означает части олигонуклеотида, в которых химические модификации или мотив химических модификаций любой из соседних частей содержит по меньшей мере одно отличие для обеспечения возможности различать области друг от друга.
При использовании в настоящем документе фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель означает любое вещество, подходящее для применения при введении животному. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель представляет собой стерильный солевой раствор.
В некоторых вариантах реализации изобретения такой стерильный солевой раствор представляет собой солевой раствор фармацевтической марки.
При использовании в настоящем документе термин метаболическое расстройство означает заболевание или патологическое состояние, которое характеризуется, прежде всего, дисрегуляцией метаболизма - сложного набора химических реакций, связанных с расщеплением пищи с выработкой энергии.
При использовании в настоящем документе термин сердечно-сосудистое расстройство означает заболевание или патологическое состояние, которое характеризуется, прежде всего, ухудшенной функцией сердца или кровеносных сосудов.
При использовании в настоящем документе термин моно- или полициклическая кольцевая система включает все кольцевые системы, выбранные из одиночных или полициклических радикальных кольцевых систем, в которых указанные кольца конденсированы или связаны, и включает одиночные или смешанные кольцевые системы, индивидуально выбранные из алифатических, алициклических, арильных, гетероарильных, аралкильных, арилалкильных, гетероциклических, гетероарильных, гетероароматических и гетероарилалкильных. Такие моно- и полициклические структуры могут содержать кольца, каждое из которых имеет одинаковую степень насыщенности, или каждое независимо имеет переменные степени насыщенности, включая полностью насыщенные, частично насыщенные или полностью ненасыщенные. Каждое кольцо может содержать кольцевые атомы, выбранные из C, N, O и S с образованием гетероциклических колец, а также колец, содержащих только кольцевые атомы C, которые могут быть представлены в смешанном мотиве, как, например, в бензимидазоле, в котором одно кольцо имеет только кольцевые атомы углерода, а конденсированное кольцо имеет два атома азота. Моно- или полициклическая кольцевая система может быть дополнительно замещена группами заместителей, как, например, фталимид, который имеет две группы =O, присоединенные к одному из колец. Моно- или полициклические кольцевые системы могут быть присоединены к исходным молекулам при помощи различных способов, таких как непосредственно через кольцевой атом, путем конденсации через несколько кольцевых атомов, через группу заместителя или через бифункциональный связывающий фрагмент.
При использовании в настоящем документе пролекарство означает неактивную или менее активную форму соединения, которая при введении субъекту метаболизируется с образованием активного или более активного соединения (например, лекарства).
При использовании в настоящем документе заместитель и группа заместителя означает атом или группу, которая вытесняет атом или группу указанного исходного соединения. Например, заместитель модифицированного нуклеозида представляет собой любой атом или группу, которая отлична от атома или группы, находящейся в природном нуклеозиде (например, модифицированный 2'-заместитель представляет собой любой атом или группу в 2' положении нуклеозида, отличную от H или OH). Группы заместителей могут быть защищенными или не защищенными. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения настоящего описания имеют заместители в одном или более чем в одном положении исходного соединения. Заместители также могут быть дополнительно замещены другими группами заместителей и могут быть присоединены напрямую или через связывающую группу, такую как алкильная или углеводородная группа, к исходному соединению.
Точно также при использовании в настоящем документе заместитель в отношении химической функциональной группы означает атом или группу атомов, которая отлична от атома или группы атомов, обычно содержащихся в указанной функциональной группе. В некоторых вариантах реализации изобретения заместитель вытесняет атом водорода функциональной группы (например, в некоторых вариантах реализации изобретения заместитель замещенной метильной группы представляет собой атом или группу, отличную от водорода, которая вытесняет один или более атомов водорода незамещенной метильной группы). Если не указано иное, группы, которые могут быть использованы в качестве заместителей, включают, без ограничения, галоген, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, ацил (-C(O)Raa), карбоксил (-C(O)O-Raa), алифатические группы, алициклические группы, алкокси, замещенный окси (-O-Raa), арил, аралкил, гетероциклический радикал, гетероарил, гетероарилалкил, амино (-N(Rbb)(Rcc)), имино (=NRbb), амидо (-C(O)N(Rbb)(Rcc) или -N(Rbb)C(O)Raa), азидо (-N3), нитро (-NO2), циано (-CN), карбамидо (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) или -N(Rbb)C(O)ORaa), уреидо (-N(Rbb)C(O)-N(Rbb)(Rcc)), тиоуреидо (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), гуанидинил (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), амидинил (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) или
- 13 036584
-N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), тиол (-SRbb), сульфинил (-S(O)Rbb), сульфонил (-S(O)2Rbb) и сульфонамидил (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) или -N(Rbb)S-(O)2Rbb). Где каждый Raa, Rbb и Rcc независимо представляет собой H, необязательно связанную химическую функциональную группу или дополнительную группу заместителя, при этом предпочтительный перечень включает, без ограничения, алкил, алкенил, алкинил, алифатические, алококси, ацил, арил, аралкил, гетероарил, алициклические, гетероциклические и гетероарилалкил. Выбранные заместители с соединениями, описанными в настоящем документе, находятся в рекурсивной степени.
При использовании в настоящем документе алкил, используемый в настоящем документе, означает насыщенный прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до 24 атомов углерода. Примеры алкильных групп включают, без ограничения, метил, этил, пропил, бутил, изопропил, нгексил, октил, децил, додецил и т.п. Алкильные группы обычно содержат от 1 до около 24 атомов углерода, более часто от 1 до около 12 атомов углерода (Q-C^-алкил), при этом более предпочтительно от 1 до около 6 атомов углерода.
При использовании в настоящем документе алкенил означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до 24 атомов углерода и имеющий по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь. Примеры алкенильных групп включают, без ограничения, этенил, пропенил, бутенил, 1-метил-2-бутен-1-ил, диены, такие как 1,3-бутадиен и т.п. Алкенильные группы обычно содержат от 2 до около 24 атомов углерода, более часто от 2 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 2 до около 6 атомов углерода. Алкенильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать одну или более дополнительных групп заместителей.
При использовании в настоящем документе алкинил означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до 24 атомов углерода и имеющий по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь. Примеры алкинильных групп включают, без ограничения, этинил, 1-пропинил, 1-бутинил и т.п. Алкинильные группы обычно содержат от 2 до около 24 атомов углерода, более часто от 2 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 2 до около 6 атомов углерода. Алкинильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать одну или более дополнительных групп заместителей.
При использовании в настоящем документе ацил означает радикал, образованный за счет удаления гидроксильной группы от органической кислоты, и имеет общую формулу -C(O)-X, где X обычно является алифатическим, алициклическим или ароматическим. Примеры включают алифатические карбонилы, ароматические карбонилы, алифатические сульфонилы, ароматические сульфинилы, алифатические сульфинилы, ароматические фосфаты, алифатические фосфаты и т.п. Ацильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.
При использовании в настоящем документе алициклическая означает циклическую кольцевую систему, в которой кольцо является алифатическим. Кольцевая система может содержать одно или более колец, при этом по меньшей мере одно кольцо является алифатическим. Предпочтительные алициклические системы включают кольца, имеющие от около 5 до около 9 атомов углерода в кольце. Алициклические группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.
При использовании в настоящем документе алифатический означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до 24 атомов углерода, в котором насыщенность между любыми двумя атомами углерода представляет собой одинарную, двойную или тройную связь. Алифатическая группа предпочтительно содержит от 1 до около 24 атомов углерода, более часто от 1 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 1 до около 6 атомов углерода. Прямая или разветвленная цепь алифатической группы может быть прервана одним или более гетероатомами, которые включают азот, кислород, серу и фосфор. Такие алифатические группы, прерванные гетероатомами, включают, без ограничения, полиалкокси, такие как полиалкиленгликоли, полиамины и полиимины. Алифатические группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.
При использовании в настоящем документе алкокси означает радикал, образованный между алкильной группой и атомом кислорода, при этом атом кислорода применяется для присоединения алкоксигруппы к исходной молекуле. Примеры алкоксигрупп включают, без ограничения, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, неопентокси, н-гексокси и т.п. Алкоксигруппы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.
При использовании в настоящем документе аминоалкил означает аминозамещенный C1-C12алкильный радикал. Алкильная часть указанного радикала образует ковалентную связь с исходной молекулой. Аминогруппа может быть расположена в любом положении, и аминоалкильная группа может быть замещена дополнительной группой заместителя в алкильной и/или аминочасти.
При использовании в настоящем документе аралкил и арилалкил означает ароматическую группу, которая ковалентно связана с C1-C12-алкильным радикалом. Часть алкильного радикала образовавшейся аралкильной (или арилалкильной) группы образует ковалентную связь с исходной молекулой.
- 14 036584
Примеры включают, без ограничения, бензил, фенетил и т.п. Аралкильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей, присоединенные к алкильной, арильной или к обеим группам, которые образуют указанную радикальную группу.
При использовании в настоящем документе арил и ароматический означает радикалы моно- или полициклической карбоциклической кольцевой системы, имеющие одно или более ароматических колец. Примеры арильных групп включают, без ограничения, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, инденил и т.п. Предпочтительные арильные кольцевые системы имеют от около 5 до около 20 атомов углерода в одном или более кольцах. Арильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.
При использовании в настоящем документе галоген и галоген означает атом, выбранный из фтора, хлора, брома и йода.
При использовании в настоящем документе гетероарил и гетероароматический означает радикал, содержащий моно- или полициклическое ароматическое кольцо, кольцевую систему или конденсированную кольцевую систему, в котором по меньшей мере одно из колец является ароматическим и содержит один или более гетероатомов. Гетероарил включает также конденсированные кольцевые системы, включая системы, в которых одно или более из конденсированных колец не содержат гетероатомов. Гетероарильные группы, как правило, содержат один кольцевой атом, выбранный из серы, азота или кислорода. Примеры гетероарильных групп включают, без ограничения, пиридинил, пиразинил, пиримидинил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тиазолил, оксазолил, изооксазолил, тиадиазолил, оксадиазолил, тиофенил, фуранил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензоксазолил, хиноксалинил и т.п. Гетероарильные радикалы могут быть присоединены к исходной молекуле напрямую или через связывающий фрагмент, такой как алифатическая группа или гетероатом. Гетероарильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.
При использовзании в настоящем документе конъюгированное соединение означает любые атомы, группы атомов или группу связанных атомов, подходящую для применения в качестве конъюгирующей группы. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные соединения могут обладать или влиять на одно или более свойств, включая, но не ограничиваясь этим, свойства фармакодинамики, фармакокинетики, связывания, адсорбции, клеточного распределения, клеточного захвата, заряда и/или выведения.
При использовании в настоящем документе, если не указано или немодифицировано иным образом, двухцепочечные относится к двум отдельным олигомерным соединениям, которые гибридизованы друг с другом. Такие двухцепочечные соединения могут иметь один или более негибридизованных нуклеозидов у одного или обоих концов одной или обеих спиралей (выступы) и/или один или более внутренних негибридизованных нуклеозидов (несоответствий), при условии, что существует достаточная комплементарность для сохранения гибридизации при физиологически релевантных условиях.
B. Некоторые соединения.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены конъюгированные антисмысловые соединения, содержащие антисмысловые олигонуклеотиды и конъюгат.
a) Некоторые антисмысловые олигонуклеотиды.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены антисмысловые олигонуклеотиды. Такие антисмысловые олигонуклеотиды содержат связанные нуклеозиды, и каждый нуклеозид содержит сахарный фрагмент и азотистое основание. Структура таких антисмысловых олигонуклеотидов может быть рассмотрена с точки зрения химических особенностей (например, модификаций и характерных участков модификаций) и последовательности азотистых оснований (например, последовательность антисмыслового олигонуклеотида, сущность и последовательность целевой нуклеиновой кислоты).
i) Некоторые химические особенности.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид содержит одну или более модификаций. В некоторых таких вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных нуклеозидов и/или модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные нуклеозиды содержат модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное азотистое основание.
1. Некоторые сахарные фрагменты.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединения настоящего описания содержат один или более модифицированных нуклеозидов, содержащих модифицированный сахарный фрагмент. Такие соединения, содержащие один или более модифицированных по сахару нуклеозидов, могут обладать желаемыми свойствами, такими как улучшенная стабильность к нуклеазе или увеличенная связывающая аффинность к целевой нуклеиновой кислоте, по сравнению с олигонуклеотидом, содержащим только нуклеозиды, которые содержат природные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные сахарные фрагменты представляют собой замещенные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные сахарные фрагменты представляют собой заменители сахара. Такие заменители сахара могут содержать одно или более замещений, соответствующих замещениям замещенных сахарных фрагментов.
- 15 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные сахарные фрагменты представляют собой замещенные сахарные фрагменты, содержащие один или более немостиковых сахарных заместителей, включая, но не ограничиваясь этим, заместители в 2' и/или 5' положениях. Примеры заместителей сахара, подходящих для 2' положения, включают, но не ограничиваются ими, 2'-F, 2'-OCH3 (OMe или O-метил») и 2'-O(CH2)2OCH3 (MOE). В некоторых вариантах реализации изобретения заместитель сахара в 2' положении выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C1-C10-алкила, O-C1-C10замещенного алкила; OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) и O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный С^С^-алкил. Примеры заместителей сахара в 5' положении включают, но не ограничиваются ими, 5'-метил (R или S), 5'-винил и 5'-метокси. В некоторых вариантах реализации изобретения замещенные сахара содержат более одного немостикового сахарного заместителя, например 2'-Е-5'-метил-сахарные фрагменты (см., например, международную заявку PCT WO 2008/101157, где приведены дополнительные 5',2'-бис-замещенные сахарные фрагменты и нуклеозиды).
Нуклеозиды, содержащие 2'-замещенные сахарные фрагменты, упоминаются как 2'-замещенные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-замещенный нуклеозид содержит 2'группу заместителя, выбранную из галогена, аллила, амино, азидо, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S или N(Rm)-алкила; O, S или N(Rm)-алкенила; O, S или N^^^K^raa; O-алкиленил-О-алкила, алкинила, алкарила, аралкила, O-алкарила, O-аралкила, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) или O-CH2-C(=O)N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой H, аминозащитную группу или замещенный или незамещенный С1-С10-алкил. Эти 2'-группы заместителей могут быть дополнительно замещены одной или более группами заместителей, независимо выбранными из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро (NO2), тиола, тиоалкокси (S-алкила), галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-замещенный нуклеозид содержит 2'-группу заместителя, выбранную из F, NH2, N3, OCF3, O-CH3, O(CH;);\H, CH2-CH=CH2, O-CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2 и N-замещенного ацетамида (O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой H, аминозащитную группу или замещенный или незамещенный С1-С10-алкил.
В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-замещенный нуклеозид содержит сахарный фрагмент, содержащий 2'-группу заместителя, выбранную из F, OCF3, O-CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(CH3)2, -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2 и O-CH2-C(=O)-N(H)CH3.
В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-замещенный нуклеозид содержит сахарный фрагмент, содержащий 2'-группу заместителя, выбранную из F, O-CH3 и OCH2CH2OCH3.
Некоторые модифицированные сахарные фрагменты содержат мостиковый сахарный заместитель, который образует второе кольцо, что приводит к получению бициклического сахарного фрагмента. В некоторых таких вариантах реализации изобретения бициклический сахарный фрагмент содержит мостик между 4' и 2' атомами фуранозного кольца. Примеры таких 4'-2' сахарных заместителей включают, но не ограничиваются ими, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- или -C(RRb)-O-N(R)-; 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt) и 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', и его аналоги (см., например, патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 г.); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' и его аналоги (см., например, WO 2009/006478, опубликованный 8 января 2009 г.); 4'-CH2-N(OCH3)-2' и его аналоги (см., например, WO 2008/150729, опубликованный 11 декабря 2008 г.); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (см., например, US 2004/0171570, опубликованный 2 сентября 2004 г.); 4'-CH2-ON(R)-2' и 4'-CH2-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой H, защитную группу или C1С12-алкил; 4'-CH2-N(R)-O-2', где R представляет собой H, С1-С12-алкил или защитную группу (см., например, патент США 7427672, выданный 23 сентября 2008 г.); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (см., например, Chattopadhyaya, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-CH2-C(=CH2)-2' и его аналоги (см. опубликованную международную заявку PCT WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 г.).
В некоторых вариантах реализации изобретения такие мостики 4'-2' независимо содержат от 1 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- и -N(Ra)-;
где x равен 0, 1 или 2;
n равен 1, 2, 3 или 4;
каждый Ra и Rb независимо представляет собой H, защитную группу, гидроксил, С1-С12-алкил, замещенный С1-С12-алкил, С2-С12-алкенил, замещенный С2-С12-алкенил, С2-С12-алкинил, замещенный C2С12-алкинил, С5-С20-арил, замещенный С5-С20-арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С5-С7-алициклический радикал, замещенный C5С7-алициклический радикал, галоген, OJ1, NJ1J2, S1, N3, COOL, ацил (C(=O)-H), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)2-J1) или сульфоксил (S(=O)-J1); и каждый J1 и J2 независимо представляет собой H, С1-С12-алкил, замещенный С1-С12-алкил, C2-C12алкенил, замещенный С2-С12-алкенил, С2-С12-алкинил, замещенный С2-С12-алкинил, С5-С20-арил, замещенный С5-С20-арил, ацил (C(=O)-H), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гете- 16 036584 роциклический радикал, С1-С12-аминоалкил, замещенный С1-С12-аминоалкил или защитную группу.
Нуклеозиды, содержащие бициклические сахарные фрагменты, упоминаются как бициклические нуклеозиды или BNA. Бициклические нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, (A) α-Lметиленокси (4'-CH2-O-2') BNA, (B) e-D-метиленокси (4'-CH2-O-2') BNA (также упоминаемый как закрытая нуклеиновая кислота или LNA), (C) этиленокси (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) аминоокси (4'-CH2-O-N(R)2') BNA, (E) оксиамино (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) метил(метиленокси) (4'-CH(CH3)-O-25) BNA (также упоминаемый как стерически затрудненный этил или cEt), (G) метилен-тио (4'-CH2-S-2') BNA, (H) метилен-амино (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) метил-карбоциклический (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA и (J) пропилен карбоциклический (4'-(CH2)3-2') BNA, как показано ниже
где Bx представляет собой фрагмент азотистого основания, а R независимо представляет собой H, защитную группу или C1-C12-алкил.
В данной области техники известны дополнительные бициклические сахарные фрагменты, например Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (4 июля 2007 г.); Elayadi et al., Curr. Opinion Inverts. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №№ 7053207, 6268490, 6770748, 6794499, 7034133, 6525191, 6670461 и 7399845; WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570 и WO 2007/134181; публикации патентов США №№ US 2004/0171570, US 2007/0287831 и US 2008/0039618; патенты США с серийными номерами 12/129154, 60/989574, 61/026995, 61/026998, 61/056564, 61/086231, 61/097787 и 61/099844 и международные заявки PCT №№ PCT/US 2008/064591, PCT/US 2008/066154 и PCT/US 2008/068922.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические сахарные фрагменты и нуклеозиды, содержащие такие бициклические сахарные фрагменты, дополнительно определяют по изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, содержащий мостик 4'-2'-метиленокси, может быть в α-L конфигурации или в β-D конфигурации. Ранее a-L-метиленокси (4'-CH2-O-2') бициклические нуклеозиды были внедрены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые обладают антисмысловой активностью (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
В некоторых вариантах реализации изобретения замещенные сахарные фрагменты содержат один или более немостиковых сахарных заместителей и один или более мостиковых сахарных заместителей (например, 5'-замещенные и 4'-2'-мостиковые сахара), (см., например, международную заявку PCT WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой LNA замещена, например, 5'-метильной или 5'виниловой группой).
В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные сахарные фрагменты представляют собой заменители сахара. В некоторых таких вариантах реализации изобретения атом кислорода природного сахара является замещенным, например, атомом серы, углерода или азота. В некоторых таких вариантах реализации изобретения такой модифицированный сахарный фрагмент содержит также мостиковые и/или немостиковые заместители, как описано выше. Например, некоторые заменители сахара содержат 4'-атом серы и замещение в 2' положении (см., например, опубликованную патентную за- 17 036584 явку США US 2005/0130923, опубликованную 16 июня 2005 г.) и/или 5' положении. В качестве дополнительного примера были описаны карбоциклические бициклические нуклеозиды, имеющие мостик 4'-2' (см., например, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem.,
2006, 71, 7731-7740).
В некоторых вариантах реализации изобретения заменители сахара содержат кольца, имеющие не 5 атомов. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения заменитель сахара содержит морфолино. Морфолиносоединения и их применение в олигомерных соединениях были описаны в многочисленных патентах и опубликованных статьях (см., например, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 45034510; и патенты США 5698685; 5166315; 5185444 и 5034506). При использовании в настоящем документе термин морфолино означает заменитель сахара, имеющий следующую структуру:
N
В некоторых вариантах реализации изобретения морфолино могут быть модифицированными, например, добавлением или изменением различных групп заместителей в представленной выше структуре морфолино. Такие заменители сахара упомянуты в настоящем документе как модифицированные морфолино.
В качестве другого примера в некоторых вариантах реализации изобретения заменитель сахара содержит шестичленный тетрагидропиран. Такие тетрагидропираны могут быть дополнительно модифицированы или замещены. Нуклеозиды, содержащие такие модифицированные тетрагидропираны, включают, но не ограничиваются ими, гекситоловую нуклеиновую кислоту (HNA), анитоловую нуклеиновую кислоту (ANA), манитоловую нуклеиновую кислоту (MNA) (см. Leumann, C.J. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), фтор-HNA (F-HNA) и соединения, имеющие формулу VI
VI где независимо для каждого из указанного по меньшей мере одного тетрагидропиранового нуклеозидного аналога формулы VI
Bx представляет собой фрагмент азотистого основания;
T3 и T4, каждый независимо, представляют собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из T3 и T4 представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из T3 и T4 представляет собой H, гидроксилзащитную группу, связанную конъюгирующую группу или 5'- или 3'-концевую группу;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7, каждый независимо, представляют собой H, C1-C6-алкил, замещенный C1-C6алкил, C2-C6-алкенил, замещенный C2-C6-алкенил, C2-C6-алкинил или замещенный C2-C6-алкинил; и каждый из R1 и R2 независимо выбран из: водорода, галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJJ2, SJi, N3, OC(=X)Ji, OC(=X)NJiJ2, NJ3C(=X)NJiJ2 и CN, где X представляет собой O, S или NJb и каждый J1, J2 и J3 независимо представляет собой H или ^-^-алкил.
В некоторых вариантах реализации изобретения приведены модифицированные ТНР нуклеозиды формулы VI, в которых каждый q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 представляет собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 отличен от H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q1, q2, q3, q4, q5, q6 и q7 представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения приведены ТНР нуклеозиды формулы VI, в которых один из R1 и R2 представляет собой F. В некоторых вариантах реализации изобретения R1 представляет собой фтор, a R2 представляет собой H, R1 представляет собой метокси, a R2 представляет собой H, и R1 представляет собой метоксиэтокси, a R2 представляет собой H.
В данной области техники известны также многие другие бициклические и трициклические кольцевые системы заменителей сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для внедрения в антисмысловые соединеия (см., например, обзорную статью Leumann, J.C., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
Без ограничения приведены также комбинации модификаций, такие как 2'-Р-5'-метил-замещенные нуклеозиды (см. международную заявку PCT WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где описаны
- 18 036584 другие 5',2'-бис-замещенные нуклеозиды) и замена атома кислорода рибозильного кольца на S и дополнительное замещение в 2' положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 г.) или, альтернативно, 5'-замещение бициклической нуклеиновой кислоты (см. международную заявку PCT WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой 4'-CH2-O-2' бициклический нуклеозид дополнительно замещен в 5' положении 5'-метильной или 5'-виниловой группой). Был описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (см., например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены олигонуклеотиды, содержащие модифицированные нуклеозиды. Такие модифицированные нуклеотиды могут содержать модифицированные сахара, модифицированные азотистые основания и/или модифицированные связи. Конкретные модификации выбирают так, чтобы полученные олигонуклеотиды обладали желаемыми характеристиками. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат один или более РНК-подобных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат один или более ДНК-подобных нуклеотидов.
2. Некоторые модификации азотистых оснований.
В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды настоящего описания содержат одно или более немодифицированных азотистых оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды настоящего описания содержат одно или более модифицированных азотистых оснований.
В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные азотистые основания выбраны из универсальных оснований, гидрофобных оснований, смещанных оснований, увеличенных в размере оснований и фторированных оснований, описанных в настоящем документе. 5-Замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5пропинилурацил; 5-пропинилцитозин; 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-C.=C-CH) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-Е-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, 2-деазагуанин и 3деазааденин, универсальные основания, гидрофобные основания, смешанные основания, увеличенные в размере основания и фторированные основания, описанные в настоящем документе. Дополнительные модифицированные азотистые основания включают трициклические пиримидины, такие как феноксазина цитидин ([5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3H)-он), фенотиазина цитидин (1H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензотиазин-2(ЗН)-он), так называемые G-clamp, такие как замещенный феноксазина цитидин (например, 9-(2аминоэтокси)-H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3H)-он), карбазола цитидин (2Н-пиримидо[4,5Ь]индол-2-он), пиридоиндола цитидин (Н-пиридо[3',2':4,5]пирроло[2,3^]пиримидин-2-он). Модифицированные азотистые основания также могут включать азотистые основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Дополнительные азотистые основания включают азотистые основания, описанные в патенте США № 3687808, описанные в публикации The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., ред., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; описанные авторами Englisch et al., Angewandte Chemie, международное издание, 1991, 30, 613; и описанные в публикации Sanghvi, Y.S., гл. 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. и Lebleu, В., ред., CRC Press, 1993, 273-288.
Иллюстративные патенты США, в которых описано получение некоторых из вышеупомянутых модифицированных азотистых оснований, а также других модифицированных азотистых оснований, включают, без ограничения, US 3687808; 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 5681941; 5750692; 5763588; 5830653 и 6005096, некоторые из которых находятся на рассмотрении одновременно с настоящей заявкой, и каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
3. Некоторые межнуклеозидные связи.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены олигонуклеотиды, содержащие связанные нуклеозиды. В таких вариантах реализации изобретения нуклеозиды могут быть связаны вместе при помощи любой межнуклеозидной связи. Два основных класса межнуклеозидных связывающих групп определяются по наличию или отсутствию атома фосфора. Иллюстративные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, но не ограничиваются ими, фосфодиэфиры (PO), фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и тиофосфаты (PS). Иллюстративные не содержащие фосфора межнуклеозидные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, метиленметилимино (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), тиодиэфир (-O-C(O)-S-), тионокарбамат (-O-C(O)(NH)-S-); силоксан (-O-Si(H)2-O-) и
- 19 036584
Ν,Ν'-диметилгидразин (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Модифицированные связи в сравнении с природными фосфодиэфирными связями могут быть использованы для изменения, обычно увеличения устойчивости олигонуклеотида к нуклеазе. В некоторых вариантах реализации изобретения межнуклеозидные связи, имеющие хиральный атом, могут быть получены в виде рацемической смеси или в виде отдельных энантиомеров. Иллюстративные хиральные связи включают, но не ограничиваются ими, алкилфосфонаты и тиофосфаты. Способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфора межнуклеозидных связей хорошо известны специалистам в данной области техники.
Олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, содержат один или более асимметричных центров и, следовательно, могут образовывать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные конфигурации, которые в соответствии с абсолютной стереохимией могут быть определены как (R) или (S), или как для аномеров сахара, или как (D) или (L), как для аминокислот и т.д. В антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, включены все такие возможные изомеры, а также их рацемические и оптически чистые формы.
Нейтральные связывающие линкеры включают, без ограничения, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), амид-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), амид-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), формацеталь (3'-O-CH2-O-5') и тиоформацеталь (3'-S-CH2-O-5'). Дополнительные нейтральные межнуклеозидные связи включают неионные связи, содержащие силоксан (диалкилсилоксан), карбоновый сложный эфир, карбоксамид, сульфид, сульфоновый сложный эфир и амиды (см., например, Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi и P.D. Cook, ред., ACS Symposium Series 580; гл. 3 и 4, 40-65). Дополнительные нейтральные межнуклеозидные связи включают неионные связи, содержащие смешанные составные части N, O, S и CH2.
4. Некоторые мотивы.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных нуклеозидов (например, нуклеозид, содержащий модифицированный сахар и/или модифицированное азотистое основание) и/или один или более модифицированных межнуклеозидных связей. Характерный участок таких модификаций в олигонуклеотиде упоминается в настоящем документе как мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения мотивы сахара, азотистые основания и линкера не зависят друг от друга.
а) Некоторые сахарные мотивы.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат один или более типов модифицированных сахарных фрагментов и/или природных сахарных фрагментов, расположенных вдоль олигонуклеотида или его области определенным образом или в виде мотива сахарной модификации. Такие мотивы могут содержать любые сахарные модификации, рассмотренные в настоящем документе и/или другие известные модификации сахара.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат или состоят из области, имеющей сахарный мотив гэпмера, который содержит две внешних области или крыла и центральную или внутреннюю область, или гэп. Эти три области сахарного мотива гэпмера (5'-крыло, гэп и 3'крыло) образуют непрерывную последовательность азотистых оснований, в которой, по меньшей мере, некоторые из сахарных фрагментов нуклеозидов в каждом крыле отличаются, по меньшей мере, от некоторых сахарных фрагментов нуклеозидов в гэпе. В частности, по меньшей мере, те сахарные фрагменты нуклеозидов каждого крыла, которые расположены ближе всего к гэпу (3'-ближайший нуклеозид 5'крыла и 5'-ближайший нуклеозид 3'-крыла), отличаются от сахарного фрагмента соседних нуклеозидов в гэпе, определяя, таким образом, границу между крыльями и гэпом. В некоторых вариантах реализации изобретения сахарные фрагменты в гэпе являются одинаковыми между собой. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит один или более нуклеозидов, имеющих сахарный фрагмент, который отличается от сахарного фрагмента одного или более других нуклеозидов в гэпе. В некоторых вариантах реализации изобретения сахарные мотивы двух крыльев являются одинаковыми между собой (симметричный сахарный гэпмер). В некоторых вариантах реализации изобретения сахарные мотивы 5'крыла отличаются от сахарного мотива 3'-крыла (асимметричный сахарный гэпмер).
i) Некоторые 5'-крылья.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1-8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1-7 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1-6 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 2-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 3-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 4 или 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1-3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1 или 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 2-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит
- 20 036584 из 2 или 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 3 или 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 1 нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера состоит из 6 связанных нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере два бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'крыло гэпмера содержит по меньшей мере три бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере четыре бициклических нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой LNA нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-OMe нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 5'-крыла гэпмера представляет собой рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения один, более одного или каждый из нуклеозидов 5'-крыла представляет собой РНКподобный нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
ii) Некоторые 3'-крылья.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1-8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1-7 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1-6 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1-5 связанных
- 21 036584 нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения З'-крыло гэпмера состоит из 2-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 3-5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 4 или 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1-3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1 или 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 2-4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 2 или 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 3 или 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 1 нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 2 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 3 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 4 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 5 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера состоит из 6 связанных нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой бициклический нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой стерически затрудненный этил-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой LNA нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'крыло гэпмера содержит по меньшей мере два не бициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере три не бициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере четыре не бициклических модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'-OMe нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид 3'-крыла гэпмера представляет собой рибонуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения один, более одного или каждый из нуклеозидов 5' -крыла представляет собой РНКподобный нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный
- 22 036584 этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения З'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения З'крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один не бициклический модифицированный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид и по меньшей мере один 2'дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения З'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения З'крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид и по меньшей мере один 2'дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения З'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один 2'-MOE нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид, по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид и по меньшей мере один 2'дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения З'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один стерически затрудненный этил-нуклеозид, по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения 3'-крыло гэпмера содержит по меньшей мере один LNA нуклеозид, по меньшей мере один 2'-OMe нуклеозид и по меньшей мере один 2'-дезоксинуклеозид.
iii) Некоторые центральные области (гэпы).
В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6-20 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6-15 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6-12 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6-10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6-9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6-8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6 или 7 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 7-10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 7-9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 7 или 8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 8-10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 8 или 9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 6 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 7 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 8 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 11 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп гэпмера состоит из 12 связанных нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид гэпа гэпмера представляет со- 23 036584 бой 2'-дезоксинуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид гэпа гэпмера представляет собой 2'-дезоксинуклеозид или представляет собой модифицированный ДНК-подобный нуклеозид. В таких вариантах реализации изобретения ДНК-подобный означает, что нуклеозид имеет такие же характеристики, что и ДНК, т.е. что дуплекс, содержащий гэпмер и молекулу РНК, может активировать РНКазу H. Например, было показано, что при некоторых условиях 2'-(ara)-F поддерживает активацию РНКазы H и, следовательно, является ДНК-подобным. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более нуклеозидов гэпа гэпмера не представляет собой 2'дезоксинуклеозид и не является ДНК-подобным. В некоторых таких вариантах реализации изобретения гэпмер тем не менее поддерживает активацию РНКазы H (например, за счет количества или положения не-ДНК нуклеозидов).
В некоторых вариантах реализации изобретения гэпы содержат участок немодифицированного 2'дезоксинуклеозида, прерванный одним или более модифицированными нуклеозидами, что приводит к образованию трех субрайонов (двух участков одного или более 2'-дезоксинуклеозидов и участка одного или более прерывающих модифицированных нуклеозидов). В некоторых вариантах реализации изобретения ни один участок немодифицированных 2'-дезоксинуклеозидов не длиннее 5, 6 или 7 нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения такие короткие участки образуются за счет применения коротких гэп-областей. В некоторых вариантах реализации изобретения короткие участки образуются за счет прерывания более длинной области гэп.
В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит один или более модифицированных нуклеозидов, выбранных из cEt, FHNA, LNA и 2-тиотимидина. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит один модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит 5'-замещенный сахарный фрагмент, выбранный из 5'-Me и 5'-(R)-Me. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит два модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит три модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит четыре модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит два или более модифицированных нуклеозидов, и каждый модифицированный нуклеозид является таким же. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит два или более модифицированных нуклеозидов, и каждый модифицированный нуклеозид является другим.
В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит одну или более модифицированных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит одну или более метилфосфонатных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит две или более модифицированных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит одну или более модифицированных связей и один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит одну модифицированную связь и один модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп содержит две модифицированных связи и два или более модифицированных нуклеозидов.
b) Некоторые мотивы межнуклеозидных связей.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат модифицированные межнуклеозидные связи, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области определенным образом или в виде мотива модифицированной межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область, имеющую мотив чередующихся межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды по настоящему описанию содержат область одинаково модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит область, которая равномерно связана тиофосфатными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид равномерно связан тиофосфатными межнулеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфира и тиофосфата. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфира и тиофосфата, и по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфат.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 7 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 9 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 11 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 12 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид со- 24 036584 держит по меньшей мере 13 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 14 тиофосфатных межнуклеозидных связей.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 6 смежных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 7 смежных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 8 смежных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 9 смежных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 10 смежных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 12 смежных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации изобретения по меньшей мере один такой блок расположен на 3 '-конце олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации изобретения по меньшей мере один такой блок расположен в пределах 3 нуклеозидов 3'конца олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 15 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 14 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 13 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 12 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 11 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 10 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 9 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 8 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 7 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 6 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит менее 5 тиофосфатных межнуклеозидных связей.
c) Некоторые мотивы модификаций азотистых оснований.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат химические модификации азотистых оснований, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области определенным образом или в виде мотива модификации азотистых оснований. В некоторых таких вариантах реализации изобретения модификации азотистых оснований расположены в разорванном мотиве. В некоторых вариантах реализации изобретения модификации азотистых оснований расположены в чередующемся мотиве. В некоторых вариантах реализации изобретения каждое азотистое основание является модифицированным. В некоторых вариантах реализации изобретения ни одно из азотистых оснований не является химически модифицированным.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат блок модифицированных азотистых оснований. В некоторых таких вариантах реализации изобретения блок находится на 3'конце олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения блок находится в пределах 3 нуклеотидов 3'-конца олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации изобретения блок находится на 5'-конце олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения блок находится в пределах 3 нуклеотидов 5'-конца олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации изобретения модификации азотистых оснований зависят от природного основания в конкретном положении олигонуклеотида. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения каждый пурин или каждый пиримидин в олигонуклеотиде является модифицированным. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированным является каждый аденин. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированным является каждый гуанин. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированным является каждый тимин. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированным является каждый цитозин. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированным является каждый урацил.
В некоторых вариантах реализации изобретения некоторые, все или никакие из цитозиновых фрагментов в олигонуклеотиде не представляют собой 5-метилцитозиновые фрагменты. В настоящем документе 5-метилцитозин не является модифицированным азотистым основанием. Соответственно, если не указано иное, то немодифицированные азотистые основания включают как цитозиновые остатки, содержащие 5-метил, так и те, которые не содержат 5-метил. В некоторых вариантах реализации изобретения оговорено состояние метилирования всех или некоторых цитозиновых азотистых оснований.
В некоторых вариантах реализации изобретения химические модификации азотистых оснований включают присоединение некоторых конъюгирующих групп к азотистым основаниям. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый пурин или каждый пиримидин в олигонуклеотиде может быть необязательно модифицирован так, чтобы он содержал конъюгирующую группу.
- 25 036584
d) Некоторые общие длины.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены олигонуклеотиды любого из различных диапазонов длин. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат от X до Y связанных нуклеозидов, где X представляет собой наименьшее количество нуклеозидов в диапазоне, a Y представляет собой наибольшее количество нуклеозидов в диапазоне. В некоторых таких вариантах реализации изобретения каждый X и Y независимо выбран из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50; при условии, что X<Y. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид может состоять из 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 8-21, 8-22, 823, 8-24, 8-25, 8-26, 8-27, 8-28, 8-29, 8-30, 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 921, 9-22, 9-23, 9-24, 9-25, 9-26, 9-27, 9-28, 9-29, 9-30, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 10-21, 10-22, 10-23, 10-24, 10-25, 10-26, 10-27, 10-28, 10-29, 10-30, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15,
11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 11-21, 11-22, 11-23, 11-24, 11-25, 11-26, 11-27, 11-28, 11-29, 11-30, 12-13,
12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 12-21, 12-22, 12-23, 12-24, 12-25, 12-26, 12-27, 12-28, 12-29,
12-30, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 13-21, 13-22, 13-23, 13-24, 13-25, 13-26, 13-27, 13-28,
13-29, 13-30, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20, 14-21, 14-22, 14-23, 14-24, 14-25, 14-26, 14-27, 14-28,
14-29, 14-30, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 15-21, 15-22, 15-23, 15-24, 15-25, 15-26, 15-27, 15-28, 15-29,
15-30, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 16-21, 16-22, 16-23, 16-24, 16-25, 16-26, 16-27, 16-28, 16-29, 16-30, 17-18,
17-19, 17-20, 17-21, 17-22, 17-23, 17-24, 17-25, 17-26, 17-27, 17-28, 17-29, 17-30, 18-19, 18-20, 18-21, 18-22,
18-23, 18-24, 18-25, 18-26, 18-27, 18-28, 18-29, 18-30, 19-20, 19-21, 19-22, 19-23, 19-24, 19-25, 19-26, 19-29,
19-28, 19-29, 19-30, 20-21, 20-22, 20-23, 20-24, 20-25, 20-26, 20-27, 20-28, 20-29, 20-30, 21-22, 21-23, 21-24,
21-25, 21-26, 21-27, 21-28, 21-29, 21-30, 22-23, 22-24, 22-25, 22-26, 22-27, 22-28, 22-29, 22-30, 23-24, 23-25,
23-26, 23-27, 23-28, 23-29, 23-30, 24-25, 24-26, 24-27, 24-28, 24-29, 24-30, 25-26, 25-27, 25-28, 25-29, 25-30,
26-27, 26-28, 26-29, 26-30, 27-28, 27-29, 27-30, 28-29, 28-30 или 29-30 связанных нуклеозидов. В тех вариантах реализации, в которых количество нуклеозидов в олигонуклеотиде соединения является ограниченным, либо до диапазона, либо до определенного числа, то соединение может, тем не менее, дополнительно содержать другие дополнительные заместители. Например, олигонуклеотид, содержащий 8-30 нуклеозидов, исключает олигонуклеотиды, имеющие 31 нуклеозид, но, если не указано иное, такой олигонуклеотид может дополнительно содержать, например, одну или более конъюгирующих групп, концевых групп или других заместителей.
Более того, если олигонуклеотид описан общим диапазоном длины и областями, имеющими определенную длину, и если сумма указанных длин областей меньше, чем верхняя граница диапазона общей длины, то олигонуклеотид может иметь дополнительные нуклеозиды, помимо тех, которые находятся в указанных областях, при условии, что общее количество нуклеозидов не превышает верхнюю границу диапазона общей длины.
5. Некоторые химические мотивы антисмысловых олигонуклеотидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения химические структурные особенности антисмысловых олигонуклеотидов описываются их сахарным мотивом, мотивом межнуклеозидной связи, мотивом модификации азотистые основания и общей длиной. В некоторых вариантах реализации изобретения такие параметры не зависят друг от друга. Так, каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида, имеющий сахарный мотив гэпмера, может быть модифицированным или немодифицированным и может повторять или не повторять характер модификации сахарных модификаций гэпмера. Следовательно, межнуклеозидные связи в областях крыльев сахара-гэпмера могут быть одинаковыми или отличными друг от друга и могут быть одинаковыми или отличными от межнуклеозидных связей области гэп. Точно так же, такие сахар-гэпмерные олигонуклеотиды могут содержать одно или более модифицированных азотистых оснований, независимо от характера сахарных модификаций гэпмера. Специалистам в данной области техники понятно, что такие мотивы могут быть комбинированы с получением множества олигонуклеотидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения выбор межнуклеозидной связи и модификации нуклеозида не зависят друг от друга.
i) Некоторые последовательности и мишени.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие последовательность, комплементарную целевой нуклеиновой кислоте. Такие антисмысловые соединения могут гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой с получением по меньшей мере одной антисмысловой активности. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения специфически гибридизуются с одной или более целевыми нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах реализации изобретения специфически гибридизующееся антисмысловое соединение имеет последовательность азотистых оснований, содержащую область с достаточной комплементарностью целевой нуклеиновой кислоте для обеспечения возможности гибридизации и получению антисмысловой активности, и недостаточной комплементарностью любой нецелевой нуклеиновой кислоте для предотвращения или снижения неспецифической гибридизации с последовательностями нецелевых нуклеиновых кислот в условиях, в которых необходима специфическая гибридизация (напри
- 26 036584 мер, в физиологических условиях для in vivo или терапевтических применений и в условиях выполнения анализов - в случае in vitro анализов). В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды являются селективными между мишенью и не мишенью, даже если мишень и не мишень содержат целевую последовательность. В таких вариантах реализации изобретения селективность может быть результатом относительной доступности целевой области одной молекулы нуклеиновой кислоты, по сравнению с другой.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены антисмысловые соединения, содержащие олигонуклеотиды, которые полностью комплементарны целевой нуклеиновой кислоте по всей длине олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды на 99% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды на 95% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения такие олигонуклеотиды на 90% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения такие олигонуклеотиды на 85% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения такие олигонуклеотиды на 80% комплементарны целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит область, которая полностью комплементарна целевой нуклеиновой кислоте, и по меньшей мере на 80% комплементарно целевой нуклеиновой кислоте по всей длине олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации изобретения область полной комплементарности имеет от 6 до 14 нуклеозидов в длину.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область гибридизации и концевую область. В некоторых таких вариантах реализации изобретения область гибридизации состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и полностью комплементарна целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения область гибридизации содержит одно несоответствие в сравнении с целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации изобретения область гибридизации содержит два несоответствия в сравнении с целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации изобретения область гибридизации содержит три несоответствия в сравнении с целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации изобретения концевая область состоит из 1-4 концевых нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения концевые нуклеозиды находятся на 3'-конце. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более концевых нуклеозидов не комплементарны целевой нуклеиновой кислоте.
Антисмысловые механизмы включают любой механизм, затрагивающий гибридизацию олигонуклеотида с целевой нуклеиновой кислотой, при этом гибридизация приводит к биологическому эффекту. В некоторых вариантах реализации изобретения такая гибридизация приводит либо к разрушению, либо к применению целевой нуклеиновой кислоты с сопутствующим подавлением или стимулированием клеточного механизма, затрагивающего, например, трансляцию, транскрипцию или сплайсинг целевой нуклеиновой кислоты.
Один из типов антисмыслового механизма, затрагивающий разрушение целевой РНК, представляет собой антисмысл, опосредованный РНКазой H. РНКаза H представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет спираль РНК дуплекса РНК:ДНК. В данной области техники известно, что одноцепочечные антисмысловые соединения, которые являются ДНК-подобными, вызывают активность РНКазы H в клетках млекопитающих. Следовательно, активация РНКазы H приводит к расщеплению РНК-мишени, посредством этого в значительной степени усиливая эффективность подавления генной экспрессии, опосредованного ДНК-подобным олигонуклеотидом.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит линкер. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит фрагмент, связывающий белки. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку (упоминаемый также как группа, нацеливающая на клетку). В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит группу ветвления. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит одну или более связок. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит углевод или углеводный кластер.
ii) Некоторые расщепляемые фрагменты.
В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемую связь. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент содержит расщепляемую связь. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит расщепляемый фрагмент. В некоторых таких вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединяется к антисмысловому олигонуклеотиду. В некоторых таких вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединяется непосредственно к фрагменту, нацеливающему на клетку. В некоторых таких вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединяется к линкеру конъюгата. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент содер
- 27 036584 жит фосфат или фосфодиэфир. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый нуклеозид или нуклеозидный аналог. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозид или нуклеозидный аналог содержит необязательно защищенное гетероциклическое основание, выбранное из пурина, замещенного пурина, пиримидина или замещенного пиримидина. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой нуклеозид, содержащий необязательно защищенное гетероциклическое основание, выбранное из урацила, тимина, цитозина, 4-№бензоилцитозина, 5-метилцитозина, 4-№бензоил-5-метилцитозина, аденина, 6-N бензоиладенина, гуанина и 2-№изобутирилгуанина. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, который присоединен к 3' положению антисмыслового олигонуклеотида фосфодиэфирной связью и присоединен к линкеру фосфодиэфирной или тиофосфатной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой 2'-дезоксиаденозин, который присоединен к 3' положению антисмыслового олигонуклеотида фосфодиэфирной связью и присоединен к линкеру фосфодиэфирной или тиофосфатной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой 2'дезоксиаденозин, который присоединен к 3' положению антисмыслового олигонуклеотида фосфодиэфирной связью и присоединен к линкеру фосфодиэфирной связью.
В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединен к 3' положению антисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединен к 5' положению антисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединен к 2' положению антисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединен к антисмысловому олигонуклеотиду фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединен к указанному линкеру либо фосфодиэфирной, либо тиофосфатной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент присоединен к указанному линкеру фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа не содержит расщепляемый фрагмент.
В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент расщепляется после вве дения указанного комплекса в организм животного только после его поглощения целевой клеткой. Внутри клетки расщепляемый фрагмент расщепляется, высвобождая таким образом активный антисмысловый олигонуклеотид. Не ограничиваясь теорией, предполагается, что расщепляемый фрагмент расщепляется под действием одной или более нуклеаз внутри клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более нуклеаз расщепляют фосфодиэфирную связь между расщепляемым фрагментом и линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент имеет структуру, выбранную из следующих:
где каждый из Bx, Bx1, Bx2 и Bx3 независимо представляет собой гетероциклический основной фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент имеет структуру, выбранную из следующих:
- 28 036584
ό
Ο=ρ-ΟΗ I iii) Некоторые линкеры.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы содержат линкер. В некоторых таких вариантах реализации изобретения линкер ковалентно связан с расщепляемым фрагментом. В некоторых таких вариантах реализации изобретения линкер ковалентно связан с антисмысловым олигонуклеотидом. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер ковалентно связан с фрагментом, нацеливающим на клетку. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер дополнительно содержит ковалентное присоединение к твердой подложке. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер дополнительно содержит ковалентное присоединение к белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер дополнительно содержит ковалентное присоединение к твердой подложке и дополнительно содержит ковалентное присоединение к белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит несколько положений для присоединения связанных лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит несколько положений для присоединения связанных лигандов и не присоединен к группе ветвления. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер дополнительно содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа не содержит линкер.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит по меньшей мере одну линейную группу, содержащую группы, выбранные из алкильных, амидных, дисульфидных, полиэтиленгликолевых, тиоэфирных (-S-) и гидроксиламино (-O-N(H)-) групп. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа содержит группы, выбранные из алкильных, амидных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа содержит группы, выбранные из алкильных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа содержит по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа содержит по меньшей мере одну нейтральную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку, и к расщепляемому фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку, и к антисмысловому олигонуклеотиду. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку, к расщепляемому фрагменту и к твердой подложке. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к фрагменту, нацеливающему на клетку, к расщепляемому фрагменту, к твердой подложке и к белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа содержит одну или более расщепляемых связей.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит линейную группу, ковалентно присоединенную к группе скелета. В некоторых вариантах реализации изобретения скелет содержит разветвленную алифатическую группу, которая содержит группы, выбранные из алкильных, амидных, дисульфидных, полиэтиленгликолевых, простых эфирных, тиоэфирных и гидроксиламиногрупп. В некоторых вариантах реализации изобретения скелет содержит разветвленную алифатическую группу, которая содержит группы, выбранные из алкильных, амидных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации изобретения скелет содержит по меньшей мере одну моно- или полициклическую кольцевую систему. В некоторых вариантах реализации изобретения скелет содержит по меньшей мере две моноили полициклические кольцевые системы. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту и линкеру. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту, линкеру и твердой подложке. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту, линкеру и белковому связывающему фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения линейная группа ковалентно присоединена к группе скелета, а группа скелета ковалентно присоединена к расщепляемому фрагменту, линкеру, белковому связывающему фрагменту и твердой подложке. В некоторых вариантах реализации изобретения группа скелета содержит одну или более расщепляемых связей.
- 29 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер содержит фрагмент, связывающий белки. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, связывающий белки, представляет собой липид, такой как, например, включая, но не ограничиваясь ими, холестерин, холевая кислота, адамантануксусная кислота, 1-пирен-масляная кислота, дигидротестостерон, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерин, геранилоксигексиловая группа, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадециловая группа, пальмитиновая кислота, миристиновая кислота, O3-(олеоил)литохолевая кислота, O3(олеоил)холеновая кислота, диметокситритил или феноксазин, витамин (например, фолат, витамин A, витамин E, биотин, пиридоксаль), пептид, углевод (например, моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид, полисахарид), эндосомолитический компонент, стероид (например, уваол, гецигенин, диосгенин), терпен (например, тритерпен, например сарсасапогенин, фриделин, литохолевая кислота, дериватизованная эпифриделанолом) или катионный липид. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, связывающий белки, представляет собой насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту с длиной цепи от C16 до C22, холестерин, холевую кислоту, витамин E, адамантан или 1пентафторпропил.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
I Q.
где каждый n независимо равен от 1 до 20; и p равен от 1 до 6.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
- 30 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
- 31 036584
где n равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
где каждый L независимо представляет собой фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
- 32 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
- 33 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
- 34 036584
о о
-Р-0
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
где n равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер конъюгата имеет структуру
- 35 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер конъюгата имеет структуру о о м
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из 00 И ' с»? .
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер имеет структуру, выбранную из Ir. vA-v· где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
iv) Некоторые фрагменты, нацеливающие на клетку.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы содержат фрагменты, нацеливающие на клетку. Некоторые такие фрагменты, нацеливающие на клетку, увеличивают клеточный захват антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты, нацеливающие на клетку, содержат группу ветвления, одну или более связок и один или более лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты, нацеливающие на клетку, содержат группу ветвления, одну или более связок, один или более лигандов и одну или более расщепляемых связей.
1. Некоторые группы ветвления.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы содержат нацеливающий фрагмент, содержащий группу ветвления и по меньшей мере два связанных лиганда. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления присоединяет линкер конъюгата. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления присоединяет расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления присоединяет антисмысловый олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления ковалентно присоединена к линкеру и каждому из связанных лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления содержит разветвленную алифатическую группу, которая содержит группы, выбранные из алкильных, амидных, дисульфидных, полиэтиленгликолевых, простых эфирных, тиоэфирных и гидроксиламино-групп. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления содержит группы, выбранные из алкильных, амидных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления содержит группы, выбранные из алкильных и простых эфирных групп. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления содержит моно- или полициклическую кольцевую систему. В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа не содержит группу ветвления.
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
- 36 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20; j равен от 1 до 3; и m равен от 2 до 6.
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
- 37 036584
/uV*
где каждый n независимо равен от 1 до 20; и m равен от 2 до 6.
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
- 38 036584
где каждый A1 независимо представляет собой O, S, C=O или NH; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
где каждый A1 независимо представляет собой O, S, C=O или NH; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
где A1 представляет собой O, S, C=O или NH; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет структуру, выбранную из
2. Некоторые связки.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы содержат одну или более связок, ковалентно присоединенных к группе ветвления. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы содержат одну или более связок, ковалентно присоединенных к связывающей группе. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, простых эфирных, тиоэфирных, дисульфидных, амидных и полиэтиленгликолевых групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, замещенных алкильных, простых эфирных, тиоэфирных, дисульфидных, амидных, фосфодиэфирных и полиэтиленгликолевых групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, простых эфирных и амидных групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкильных, замещенных алкильных, фосфодиэфирных, простых эфирных и амидных групп в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка представляет собой линейную алифатическую группу, содержащую одну или более групп, выбранных из алкила и фосфодиэфира в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка содержит
- 39 036584 по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу.
В некоторых вариантах реализации изобретения связка содержит одну или более расщепляемых связей. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к группе ветвления через амидную или простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к группе ветвления через фосфордиэфирную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к группе ветвления через фосфорную связывающую группу или через нейтральную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к группе ветвления через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к лиганду либо через амидную, либо через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к лиганду через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к лиганду либо через амидную, либо через простую эфирную группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка присоединена к лиганду через простую эфирную группу.
В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка имеет длину от около 8 до около 20 атомов в цепи между лигандом и группой ветвления. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка имеет длину от около 10 до около 18 атомов в цепи между лигандом и группой ветвления. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка имеет длину около 13 атомов в цепи.
В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из о ОО 00н : т1 : и
Η П где каждый n независимо равен от 1 до 20; и каждый p равен от 1 до около 6.
В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из
О нο
В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из с НН zUvNHn NY4^ о о где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из С Z, '’Ч-ЛН'4 ΛΗΛΝ-Λγι-Ηλ· ^2 где L представляет собой либо фосфорную связывающую группу, либо нейтральную связывающую группу;
Z1 представляет собой C(=O)O-R2;
Z2 представляет собой H, ^^-алкил или замещенный C1-C6-алкил;
R2 представляет собой H, C1-C6-алкил или замещенный C1-C6-алкил; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из
- 40 036584
о о .
В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из
где Z2 представляет собой H или CH3; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из
О О
где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
В некоторых вариантах реализации изобретения связка содержит фосфорную связывающую группу. В некоторых вариантах реализации изобретения связка не содержит ни одной амидной связи. В некоторых вариантах реализации изобретения связка содержит фосфорную связывающую группу и не содержит ни одной амидной связи.
3. Некоторые лиганды.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены лиганды, при этом каждый лиганд ковалентно присоединен к связке. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый лиганд выбран так, чтобы он обладал аффинностью по меньшей мере к одному типу рецептора на клеткемишени. В некоторых вариантах реализации изобретения лиганды выбраны так, чтобы они обладали аффинностью по меньшей мере к одному типу рецептора на поверхности клетки печени млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения лиганды выбраны так, чтобы они обладали аффинностью к печеночному асиалогликопротеиновому рецептору (ASGP-R). В некоторых вариантах реализации изобретения каждый лиганд представляет собой углевод. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый лиганд независимо выбран из галактозы, N-ацетилгалактозамина, маннозы, глюкозы, глюкозамина и фукозы. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый лиганд представляет собой Nацетилгалактозамин (GalNAc). В некоторых вариантах реализации изобретения нацеливающий фрагмент содержит 2-6 лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения нацеливающий фрагмент содержит 3 лиганда. В некоторых вариантах реализации изобретения нацеливающий фрагмент содержит 3 N-ацетилгалактозаминовых лиганда.
В некоторых вариантах реализации изобретения лиганд представляет собой углевод, углеводное производное, модифицированный углевод, поливалентный углеводный кластер, полисахарид, модифицированный полисахарид или полисахаридное производное. В некоторых вариантах реализации изобретения лиганд представляет собой аминосахар или тиосахар. Например, аминосахара могут быть выбраны из любого количества соединений, известных в данной области техники, например глюкозамина, сиаловой кислоты, a-D-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, 2-ацетамидо-2-дезокси^-галактопиранозы (GalNAc), 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы (β-мурамовой кислоты), 2дезокси-2-метиламино^-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-О-метил-О-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино^-глюкопиранозы и №сульфо^-глюкозамина и N-гликолоил-а-нейраминовой кислоты. Например, тиосахара могут быть выбраны из группы, состоящей из 5-тио-в-Оглюкопиранозы, метил 2,3,4-три-О-ацетил-1-тио-6-О-тритил-а-О-глюкопиранозида, 4-тио-в-0-галактопиранозы и этил 3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида.
В некоторых вариантах реализации изобретения GalNac или Gal-NAc относится к 2-(ацетиламино)2-дезокси^-галактопиранозе, обычно упоминаемой в литературе как N-ацетилгалактозамин. В некоторых вариантах реализации изобретения N-ацетилгалактозамин относится к 2-(ацетиламино)-2-дезоксиD-галактопиранозе. В некоторых вариантах реализации изобретения GalNac или Gal-NAc относится к 2(ацетиламино)-2-дезокси^-галактопиранозе. В некоторых вариантах реализации изобретения GalNac или Gal-NAc относится к 2-(ацетиламино)-2-дезокси^-галактопиранозе, которая включает и β-форму 2(ацетиламино)-2-дезокси-в-О-галактопиранозу, и α-форму 2-(ацетиламино)-2-дезокси-О-галактопиранозу. В некоторых вариантах реализации изобретения обе формы, β-форма 2-(ацетиламино)-2дезокси-в^-галактопираноза, и α-форма 2-(ацетиламино)-2-дезокси^-галактопираноза, могут быть применены взаимозаменяемо. Соответственно, в структурах, в которых изображена одна форма, подразумевается, что эти структуры включают также и другую форму. Например, если показана структура для α-формы 2-(ацетиламино)-2-дезокси^-галактопиранозы, то подразумевается, что эта структура включа- 41 036584 ет также и другую форму. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения β-форма 2(ацетиламино)-2-дезокси^-галактопиранозы является предпочтительным вариантом реализации.
В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из
2-(Ацетиламино)-2-дезокси-а-О-галактопираноза
где каждый R1 выбран из OH и NHCOOH.
В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из
- 42 036584
В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из НООН
Н
НО
NHAc .
В некоторых вариантах один или более лигандов имеют структуру, выбранную из
НООН
НО о, NHAc
i) Некоторые конъюгаты.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы содержат структурные особенности, представленные выше. В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
но он
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
- 43 036584
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Z представляет собой H или связанную твердую подложку;
Q представляет собой антисмысловое соединение;
X представляет собой O или S; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
- 44 036584
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
о но ноон
NHAc .
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
- 45 036584
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгаты не содержат пирролидин.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
- 46 036584
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
но
Η •Ν, но Рн но^^о.
AcHN
NHAc .
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
- 47 036584
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
он он НОЛ^О
О anh
AcHN
AcHN
QHOH HO.
NHAc .
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
- 48 036584
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы имеют следующую структуру:
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из 6-11 последовательно связанных атомов.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
- 49 036584 где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из десяти последовательно свя-
занных атомов.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из 4-11 последовательно связан ных атомов, и при этом указанная связка содержит только одну амидную связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где Y и Z независимо выбраны из Q-Cn-замещенной или незамещенной алкильной, алкенильной или алкинильной группы или группы, содержащей эфир, кетон, амид, сложный эфир, карбамат, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир, тиофосфат, триазол, пирролидин, дисульфид или тиоэфир.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где Y и Z независимо выбраны из Q-Cn-замещенной или незамещенной алкильной группы или группы, содержащей ровно один эфир или ровно два эфира, амид, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир или тиофосфат.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
- 50 036584
AcHN где Y и Z независимо выбраны из С1-С12-замещенной или незамещенной алкильной группы.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где m и n независимо выбраны из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где m равен 4, 5, 6, 7 или 8, и n равен 1, 2, 3 или 4.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из 4-13 последовательно связанных атомов, и при этом X не содержит эфирную группу.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из восьми последовательно связанных атомов, и при этом X не содержит эфирную группу.
- 51 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из 4-13 последовательно связанных атомов, и при этом указанная связка содержит только одну амидную связь, а X не содержит эфирную группу.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где X представляет собой замещенную или незамещенную связку из 4-13 последовательно связанных атомов, и при этом указанная связка состоит из амидной связи и замещенной или незамещенной С2Сц-алкильной группы.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где Y выбран из С1-С12-замещенной или незамещенной алкильной, алкенильной или алкинильной группы или группы, содержащей эфир, кетон, амид, сложный эфир, карбамат, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир, тиофосфат, триазол, пирролидин, дисульфид или тиоэфир.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN где Y выбран из С1-С12-замещенной или незамещенной алкильной группы или группы, содержащей эфир, амин, пиперидин, фосфат, фосфодиэфир или тиофосфат.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
- 52 036584 где Y выбран из С1-С12-замещенной или незамещенной алкильной группы.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN
AcHN где n равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения фрагмент конъюгирующие группы, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
нпОН ,,
AcHN где n равен 4, 5, 6, 7 или 8.
b) Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгаты связаны с нуклеозидом антисмыслового олигонуклеотида в 2', 3' или 5' положении нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобрете ния конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:
где A представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:
где A представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
- 53 036584
В некоторых таких вариантах реализации изобретения линкер конъюгата содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения группа ветвления содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгаты связаны с нуклеозидом антисмыслового олигонуклеотида в 2', 3' или 5' положении нуклеозида.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:
где A представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгаты связаны с нуклеозидом антисмыслового олигонуклеотида в 2', 3' или 5' положении нуклеозида. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:
где A представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;
C представляет собой линкер конъюгата;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:
где A представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет следующую структуру:
где A представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В некоторых таких вариантах реализации изобретения линкер конъюгата содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка содержит по меньшей мере одну расщепляемую связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет структуру, выбранную из следующих:
- 54 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет структуру, выбранную из следующих:
Фраг moil нацеливающий на клетку
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение имеет структуру, выбранную из следующих:
Иллюстративные патенты США, публикации патентных заявок США и публикации международных патентных заявок, в которых описано получение некоторых из указанных выше конъюгатов, конъюгированных антисмысловых соединений, связок, линкеров, групп ветвления, лигандов, расщепляемых фрагментов, а также других модификаций, включают, без ограничения, US 5994517, US 6300319, US 6660720, US 6906182, US 7262177, US 7491805, US 8106022, US 7723509, US 2006/0148740,
- 55 036584
US 2011/0123520, WO 2013/033230 и WO 2012/037254, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
Иллюстративные публикации, в которых описано получение некоторых из указанных выше конъюгатов, конъюгированных антисмысловых соединений, связок, линкеров, групп ветвления, лигандов, расщепляемых фрагментов, а также других модификаций, включают, без ограничения, BIESSEN et al., The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor J. Med. Chem. (1999) 42:609-618 и Valentijn et al., Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения содержат олигонуклеотид на основе РНКазы H (такой как гэпмер) или сплайс-модулирующий олигонуклеотид (такой как полностью модифицированный олигонуклеотид) и любую конъюгирующую группу, содержащую по меньшей мере одну, две или три группы GalNAc. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение содержит любую конъюгирующую группу, приведенную в следующих ссылках: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J. Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J., 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J., 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int. Ed Engl., 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J. Org. Chem., 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J., 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org. Lett., 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 5275-5281; международные заявки WO 1998/013381; WO 2011/038356; WO 1997/046098; WO 2008/098788; WO 2004/101619; WO 2012/037254; WO 2011/120053; WO 2011/100131; WO 2011/163121;
WO 2012/177947; WO 2013/033230; WO 2013/075035; WO 2012/083185; WO 2012/083046;
WO 2009/082607; WO 2009/134487; WO 2010/144740; WO 2010/148013; WO 1997/020563;
WO 2010/088537; WO 2002/043771; WO 2010/129709; WO 2012/068187; WO 2009/126933;
WO 2004/024757; WO 2010/054406; WO 2012/089352; WO 2012/089602; WO 2013/166121;
WO 2013/165816; патенты США 4751219; 8552163; 6908903; 7262177; 5994517; 6300319; 8106022;
7491805; 7491805; 7582744; 8137695; 6383812; 6525031; 6660720; 7723509; 8541548; 8344125; 8313772;
8349308; 8450467; 8501930; 8158601; 7262177; 6906182; 6620916; 8435491; 8404862; 7851615; опубликованные заявки на патент США US 2011/0097264; US 2011/0097265; US 2013/0004427; US 2005/0164235; US 2006/0148740; US 2008/0281044; US 2010/0240730; US 2003/0119724; US 2006/0183886;
US 2008/0206869; US 2011/0269814; US 2009/0286973; US 2011/0207799; US 2012/0136042;
US 2012/0165393; US 2008/0281041; US 2009/0203135; US 2012/0035115; US 2012/0095075;
US 2012/0101148; US 2012/0128760; US 2012/0157509; US 2012/0230938; US 2013/0109817;
US 2013/0121954; US 2013/0178512; US 2013/0236968; US 2011/0123520; US 2003/0077829;
US 2008/0108801; и US 2009/0203132; каждая из которых включена посредством ссылки в полном объеме.
C. Некоторые применения и особенности.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения демонстрируют эффективное снижение целевой РНК in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения неконъюгированные антисмысловые соединения накапливаются в почках. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения накапливаются в печени. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения являются хоро
- 56 036584 шо переносимыми. Такие свойства делают конъюгированные антисмысловые соединения особенно пригодными для ингибирования многих целевых РНК, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые участвуют в метаболических, сердечно-сосудистых и других заболеваниях, расстройствах или патологических состояниях. Таким образом, в настоящем документе приведены способы лечения таких заболеваний, расстройств или патологических состояний приведением тканей печени в контакт с конъюгированными антисмысловыми соединениями, нацеленными на РНК, связанные с такими заболеваниями, расстройствами или патологическими состояниями. Следовательно, приведены также способы улучшения любых из множества метаболических, сердечно-сосудистых и других заболеваний, расстройств или патологических состояний при помощи конъюгированных антисмысловых соединений настоящего изобретения.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения являются более эффективными, чем неконъюгированные аналоги при определенной концентрации в ткани. Не ограничиваясь какой-либо теорией или механизмом в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгат может обеспечивать возможность более эффективного вхождения конъюгированного антисмыслового соединения в клетку или возможность более продуктивного вхождения в клетку. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения могут демонстрировать более значительное снижение мишени, по сравнению с неконъюгированным аналогом, при этом и конъюгированное антисмысловое соединение, и его неконъюгированный аналог находятся в ткани в одинаковых концентрациях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения могут демонстрировать более значительное снижение мишени по сравнению с их неконъюгированными аналогами, при этом и конъюгированное антисмысловое соединение, и его неконъюгированный аналог находятся в печени в одинаковых концентрациях.
Ранее был рассмотрен продуктивный и непродуктивный захват олигонуклеотидов (см., например, Geary, R.S., E. Wancewicz, et al. (2009). Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptake and Pharmacologic Activity of a 2'-Methoxyethyl Modified Chimeric Antisense Oligonucleotide Targeting PTEN. Biochem. Pharmacol. 78(3): 284-91; и Koller, E., T.M. Vincent, et al. (2011). Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified antisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes. Nucleic Acids Res. 39(11): 4795-807). Конъюгирующие группы, описанные в настоящем документе, могут улучшать продуктивный захват.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы, описанные в настоящем документе, могут дополнительно усиливать эффективность за счет увеличения аффинности конъюгированного антисмыслового соединения к конкретному типу клетки или ткани. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы, описанные в настоящем документе, могут дополнительно усиливать эффективность за счет увеличения распознавания конъюгированного антисмыслового соединения одним или более рецепторами клеточной поверхности. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы, описанные в настоящем документе, могут дополнительно усиливать эффективность за счет облегчения эндоцитоза конъюгированного антисмыслового соединения.
В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент может дополнительно усиливать эффективность за счет обеспечения возможности расщепления конъюгата из антисмыслового олигонуклеотида после попадания конъюгированного антисмыслового соединения в клетку. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения могут быть введены в более низких дозах, чем необходимы для неконъюгированных антисмысловых олигонуклеотидов.
Ранее в антисмысловые олигонуклеотиды уже были внедрены тиофосфатные связи. Такие тиофосфатные связи являются устойчивыми к нуклеазам и за счет этого улучшают стабильность олигонуклеотида. Кроме того, тиофосфатные связи связывают также некоторые белки, что приводит к накоплению антисмыслового олигонуклеотида в печени. Олигонуклеотиды с меньшим количеством тиофосфатных связей меньше накапливаются в печени и больше - в почках (см., например, Geary, R., Pharmacokinetic Properties of 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, т. 296, № 3, 890-897; и Pharmacological Properties of 2'-O-Methoxyethyl Modified Oligonucleotides in Antisense a Drug Technology, гл. 10, Crooke, S.T., ред., 2008). В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды с меньшим количеством тиофсофатных межнуклеозидных связей и с большим количеством фосфодиэфирных межнуклеозидных связей меньше накапливаются в печени и больше - в почках. При лечении заболеваний печени это нежелательно по нескольким причинам: (1) меньше лекарства попадает в центр желаемого действия (печень); (2) лекарство выводится с мочой; (3) почки подвергаются воздействию относительно высокой концентрации лекарства, что может приводить к токсичности в почках. Следовательно, для заболеваний печени тиофсофатные связи обеспечивают важное преимущество.
Однако в некоторых вариантах реализации изобретения введение олигонуклеотидов, равномерно связанных тиофсофатными межнуклеозидными связями, вызывает одну или более провоспалительных реакций (см., например, J. Lab. Clin. Med. 1996 Sep; 128(3):329-38. Amplification of antibody production by phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Branda et al.; и см. также, например, Toxicologic Properties in An- 57 036584 tisense a Drug Technology, гл. 12, стр. 342-351, Crooke, S.T., ред., 2008). В некоторых вариантах реализации изобретения введение олигонуклеотидов, в которых большая часть межнуклеозидных связей содержит тиофосфатные межнуклеозидные связи, вызывает одну или более провоспалительных реакций.
В некоторых вариантах реализации изобретения степень провоспалительного эффекта может зависеть от нескольких переменных (например, модификация скелета, нецелевое действие, модификации азотистых оснований и/или модификации нуклеозида), см., например, Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, гл. 12, стр. 342-351, Crooke, S.T., ред., 2008). В некоторых вариантах реализации изобретения степень провоспалительного эффекта может быть ослаблена за счет подбора одной или более переменных. Например, степень провоспалительного эффекта данного олигонуклеотида может быть ослаблена за счет замены любого количества тиофосфатных межнуклеозидных связей на фосфодиэфирные межнуклеозидные связи с уменьшением посредством этого общего количества тиофосфатных межнуклеозидных связей.
В некоторых вариантах реализации изобретения может быть желательно снизить количество тиофосфатных связей, если это может быть выполнено без потери стабильности и без сдвига распределения из печени в почки. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения количество тиофосфатных связей может быть уменьшено за счет замены тиофосфатных связей на фосфодиэфирные связи. В таком варианте реализации изобретения антисмысловое соединение, имеющее меньшее количество тиофосфатных связей и большее количество фосфодиэфирных связей, может вызывать меньшее количество провоспалительных реакций или не вызывать провоспалительных реакций. Хотя антисмысловое соединение, имеющее меньшее количество тиофосфатных связей и большее количество фосфодиэфирных связей, может вызывать меньшее количество провоспалительных реакций, антисмысловое соединение, имеющее меньшее количество тиофосфатных связей и большее количество фосфодиэфирных связей, может не накапливаться в печени и может быть менее эффективным в такой же или аналогичной дозе по сравнению с антисмысловым соединением, имеющим большее количество тиофосфатных связей. Поэтому в некоторых вариантах реализации изобретения желательно разработать антисмысловое соединение, которое имеет множество фосфодиэфирных связей и множество тиофосфатных связей, но которое при этом обладает также стабильностью и хорошим распределением в печени.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения больше накапливаются в печени и меньше в почках, чем неконъюгированные аналоги, даже если некоторые тиофосфатные связи заменены менее провоспалительными фосфодиэфирными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения больше накапливаются в печени и не так сильно выводятся с мочой, как их неконъюгированные аналоги, даже если некоторые тиофосфатные связи заменены менее провоспалительными фосфодиэфирными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения применение конъюгата обеспечивает возможность разрабатывать более эффективные и лучше переносимые антисмысловые лекарства. Действительно, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения имеют более широкий терапевтический индекс, чем неконъюгированные аналоги. Это позволяет вводить конъюгированное антисмысловое соединение в более высокой абсолютной дозе благодаря меньшему риску провоспалительной реакции и меньшему риску токсичности для почек. Такая более высокая доза дает возможность вводить дозу реже, поскольку ожидается такой же коэффициент очищения (метаболизм).
Кроме того, поскольку соединение является более эффективным, как описано выше, то можно допускать снижение концентрации перед введением следующей дозы, без потери терапевтической активности, что обеспечивает еще более продолжительные периоды между введениями доз.
В некоторых вариантах реализации изобретения сохраняется необходимость во внедрении некоторого количества тиофосфатных связей. Например, концевые связи легко подвергаются действию экзонуклеаз, и поэтому в некоторых вариантах реализации изобретения эти связи представляют собой тиофосфатные или другие модифицированные связи. Межнуклеозидные связи, соединяющие два дезоксинуклеозида, легко подвергаются действию эндонуклеаз, и поэтому в некоторых вариантах реализации изобретения эти связи представляют собой тиофосфатные или другие модифицированные связи. Межнуклеозидные связи между модифицированным нуклеозидом и дезоксинуклеозидом, где дезоксинуклеозид расположен на 5'-стороне связывающего дезоксинуклеозида, легко подвергаются действию эндонуклеаз, и поэтому в некоторых вариантах реализации изобретения эти связи представляют собой тиофосфатные или другие модифицированные связи. Межнуклеозидные связи между двумя модифицированными нуклеозидами определенных типов и между дезоксинуклеозидом и модифицированным нуклеозидом определенного типа, где модифицированный нуклеозид расположен на 5'-стороне линкера, являются достаточно устойчивыми к нуклеазному расщеплению, поэтому связь может быть фосфодиэфиром.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 16 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 15 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 14 тиофосфатных свя- 58 036584 зей. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 13 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 12 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 11 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 10 тиофосфатных связей.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 9 тиофосфатных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид конъюгированного антисмыслового соединения содержит менее 8 тиофосфатных связей.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, содержащие одну или более конъюгирующих групп, описанных в настоящем документе, обладают повышенной активностью и/или эффективностью, и/или переносимостью, по сравнению с исходным антисмысловым соединением, не имеющим такой одной или нескольких конъюгирующих групп. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения присоединение таких конъюгирующих групп к олигонуклеотиду является желательным. Такие конъюгирующие группы могут быть присоединены у 5'- и/или 3'-конца олигонуклеотида. В некоторых случаях синтетически желательно присоединение на 5'-конце. Как правило, олигонуклеотиды синтезируют присоединением 3'-концевого нуклеозида к твердой подложке с последующим связыванием нуклеозидов от 3' к 5' при помощи методик, общеизвестных в данной области техники. Соответственно, если конъюгирующая группа необходима на 3'-конце, то можно (1) присоединить конъюгирующую группу к 3'-концевому нуклеозиду и присоединить этот конъюгированный нуклеозид к твердой подложке для последующего получения олигонуклеотида или (2) присоединить конъюгирующую группу к 3'-концевому нуклеозиду готового олигонуклеотида после синтеза. Ни один из этих подходов не является особенно эффективным, и поэтому оба они затратны. В частности, присоединение конъюгированного нуклеозида к твердой подложке, хотя и приведено в настоящем документе в разделе Примеры, не является эффективным способом. В некоторых вариантах реализации изобретения присоединение конъюгирующие группы к 5'-концевому нуклеозиду синтетически проще, чем присоединение к 3'концу. Можно присоединить неконъюгированный 3'-концевой нуклеозид к твердой подложке и получить олигонуклеотид по стандартным и хорошо описанным реакциям. Затем нужно лишь присоединить 5'нуклеозид, имеющий конъюгирующую группу, на последней стадии связывания. В некоторых вариантах реализации изобретения это более эффективно, чем присоединение конъюгированного нуклеозида непосредственно к твердой подложке, как это обычно делают для получения 3'-конъюгированного олигонуклеотида. В представленных в настоящем документе примерах показано присоединение к 5'-концу. Кроме того, некоторые конъюгирующие группы имеют синтетические преимущества. Например, некоторые конъюгирующие группы, содержащие фосфорные связывающие группы, получают синтетически проще и более эффективно, чем другие конъюгирующие группы, включая конъюгирующие группы, описанные ранее (например, WO 2012/037254).
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения вводят субъекту. В таких вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, содержащие одну или более конъюгирующих групп, описанных в настоящем документе, обладают повышенной активностью, и/или эффективностью, и/или переносимостью по сравнению с исходным антисмысловым соединением, не имеющим такой одной или нескольких конъюгирующих групп. Не ограничиваясь механизмом, предполагается, что конъюгирующая группа способствует распределению, доставке и/или поглощению в целевой клетке или ткани. В некоторых вариантах реализации после попадания в целевую клетку или ткань желательно, чтобы вся или часть конъюгирующей группы расщеплялась с высвобождением активного олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения не обязательно, чтобы из олигонуклеотида расщеплялась вся конъюгирующая группа. Например, в примере 20a конъюгированный олигонуклеотид вводили мышам и обнаруживали множество различных химических частиц, каждая из которых содержала различные части конъюгирующих групп, оставшиеся на олигонуклеотиде (табл. 10a). Это конъюгированное антисмысловое соединение показало хорошую эффективность (табл. 10). Так, в некоторых вариантах реализации изобретения такой метаболитный профиль многократного частичного расщепления конъюгирующих групп не влияет на активность/эффективность. Тем не менее, в некоторых вариантах реализации изобретения желательно, чтобы пролекарство (конъюгированный олигонуклеотид) давало одно активное соединение. В некоторых случаях при обнаружении многочисленных форм активного соединения, может быть необходимо определить относительные количества и действие для каждой из них. В некоторых вариантах реализации при необходимости регуляционного тестирования (например, FDA США или другого органа), желательно иметь одну (или преимущественно одну) активную частицу. В некоторых таких вариантах реализации изобретения желательно, чтобы такая одна активная частица представляла собой антисмысловый олигонуклеотид, не содержащий никаких частей конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующие группы на 5'конце более вероятно приводят к полному метаболизму конъюгирующих групп. Не ограничиваясь меха- 59 036584 низмом может быть, что эндогенные ферменты, отвечающие за метаболизм на 5'-конце (например, 5'нуклеазы), более активны/эффективны, чем 3'-аналоги. В некоторых вариантах реализации изобретения определенные конъюгирующие группы более подвержены метаболизму до одной активной частицы. В некоторых вариантах реализации изобретения некоторые конъюгирующие группы более подвержены метаболизму до олигонуклеотида.
D. Антисенс.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения настоящего изобретения представляют собой антисмысловые соединения. В таких вариантах реализации изобретения олигомерное соединение комплементарно целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения целевая нуклеиновая кислота представляет собой РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения целевая нуклеиновая кислота представляет собой некодирующую РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения целевая нуклеиновая кислота кодирует белок. В некоторых вариантах реализации изобретения целевая нуклеиновая кислота выбрана из мРНК, пре-мРНК, микроРНК, некодирующей РНК, включая малую некодирующую РНК, и промотор-нацеливаемой РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения, по меньшей мере частично, комплементарны более чем одной целевой нуклеиновой кислоте. Например, олигомерные соединения настоящего изобретения могут представлять собой миметики микроРНК, которые обычно связываются с несколькими мишенями.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 70% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 80% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 90% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 95% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая по меньшей мере на 98% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат часть, имеющую последовательность азотистых оснований, которая на 100% комплементарна последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения по меньшей мере на 70, 80, 90, 95, 98 или 100% комплементарны последовательности азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты по всей длине антисмыслового соединения.
Антисмысловые механизмы включают любой механизм, затрагивающий гибридизацию олигомерного соединения с целевой нуклеиновой кислотой, при этом гибридизация приводит к биологическому эффекту. В некоторых вариантах реализации изобретения такая гибридизация приводит либо к разрушению, либо к применению целевой нуклеиновой кислоты с сопутствующим подавлением или стимулированием клеточного механизма, затрагивающего, например, трансляцию, транскрипцию или полиаденилирование целевой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты, с которой целевая кислота может взаимодействовать иным образом.
Один из типов антисмыслового механизма, затрагивающий разрушение целевой РНК, представляет собой антисмысл, опосредованный РНКазой H. РНКаза H представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет спираль РНК дуплекса РНК:ДНК. В данной области техники известно, что одноцепочечные антисмысловые соединения, которые являются ДНК-подобными, вызывают активность РНКазы H в клетках млекопитающих. Следовательно, активация РНКазы H приводит к расщеплению РНК-мишени, посредством этого в значительной степени усиливая эффективность подавления генной экспрессии, опосредованного ДНК-подобным олигонуклеотидом.
Антисмысловые механизмы включают также, без ограничения, РНКи механизмы, в которых применяется путь RISC. Такие РНКи механизмы включают, без ограничения, миРНК, оцРНК и микроРНК механизмы. Такие механизмы включают создание миметика микроРНК и/или антимикроРНК.
Антисмысловые механизмы включают также, без ограничения, механизмы, которые гибридизуют или имитируют некодирующую РНК, отличную от микроРНК или мРНК. Такие некодирующие РНК включают, но не ограничиваются ими, промотор-нацеленную РНК и малую и длинную РНК, которая влияет на транскрипцию или трансляцию одной или более нуклеиновых кислот.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой РНКи соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой оцРНК соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, спарены со вторым олигомер- 60 036584 ным соединением с образованием миРНК. В некоторых таких вариантах реализации изобретения второе олигомерное соединение также содержит конъюгат. В некоторых вариантах реализации изобретения второе олигомерное соединение представляет собой любую модифицированную или немодифицированную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой антисмысловую цепь в миРНК соединении. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды, содержащие описанные в настоящем документе конъюгаты, представляют собой смысловую цепь в миРНК соединении. В тех вариантах реализации, в которых конъюгированное олигомерное соединение представляет собой двухцепочечную миРНК, конъюгат может находиться на смысловой цепи, антисмысловой цепи или и на смысловой цепи, и на антисмысловой цепи.
D. Целевые нуклеиновые кислоты, области и сегменты.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на любую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения целевая нуклеиновая кислота кодирует белок-мишень, который является клинически значимым. В таких вариантах реализации изобретения модулирование целевой нуклеиновой кислоты приводит к благоприятному клиническому эффекту. Некоторые целевые нуклеиновые кислоты включают, но не ограничиваются ими, целевые нуклеиновые кислоты, представленные в табл. 1.
Таблица 1
Некоторые целевые нуклеиновые кислоты
Мишень Виды Номер доступа GENBANK® SEQ ID NO
HBV Человек U95551.1 1
Транстиретин (TTR) Человек NM_000371.3 2
Процесс таргетинга обычно включает определение по меньшей мере одной целевой области, сегмента или сайта в целевой нуклеиновой кислоте для антисмыслового взаимодействия с возникновением в результате такого желаемого эффекта.
В некоторых вариантах реализации изобретения целевая область представляет собой структурно определенную область нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых таких вариантах реализации изобретения целевая область может охватывать 3' UTR, 5' UTR, экзон, интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область или целевой сегмент нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах реализации изобретения целевой сегмент представляет собой часть целевой области по меньшей мере из около 8 азотистых оснований, на которую нацелено конъюгированное антисмысловое соединение. Целевые сегменты могут содержать последовательности ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований от 5'-конца одного из целевых сегментов (остальные азотистые основания тянутся друг за другом из той же ДНК или РНК, начинаясь сразу перед 5'-концом целевого сегмента и продолжаясь до момента, когда ДНК или РНК будет содержать от около 8 до около 30 азотистых оснований). Целевые сегменты представлены также последовательностми ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований от 3'-конца одного из целевых сегментов (остальные азотистые основания тянутся друг за другом из той же ДНК или РНК, начинаясь сразу после 3'-конца целевого сегмента и продолжаясь до момента, когда ДНК или РНК будет содержать от около 8 до около 30 азотистых оснований). Целевые сегменты также могут быть представлены последовательностями ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований из внутренней части последовательности целевого сегмента и могут тянуться в любом или в обоих направлениях до момента, когда конъюгированное антисмысловое соединение будет содержать от около 8 до около 30 азотистых оснований.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновые кислоты, перечисленные в табл. 1, могут быть модифицированы так, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения могут иметь модифицированный сахарный фрагмент, немодифицированный сахарный фрагмент или смесь модифицированных и немодифицированных сахарных фрагментов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения могут иметь модифицированную межнуклеозидную связь, немодифицированную межнуклеозидную связь или смесь модифицированных и немодифицированных межнуклеозидных связей, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения могут иметь модифицированное азотистое основание, немодифицированное азотистое основание или смесь модифицированных и немодифицированных азотистых оснований, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения могут иметь мотив, описанный в настоящем документе.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нук- 61 036584 леиновые кислоты, перечисленные в табл. 1, могут быть конъюгированы так, как описано в настоящем документе.
1. Гепатит B (HBV).
Гепатит B представляет собой вирусное заболевание, передающееся парентерально через зараженный материал, такой как кровь и продукты крови, загрязненные иглы, половым путем и вертикально от инфицированной или несущей вирус матери к ее потомству. По оценкам Всемирной организации изобретения здравоохранения, во всем мире инфицировано более 2 млрд людей, при этом ежегодно происходит около 4 млн острых случаев, 1 млн смертей в год и 350-400 млн хронических носителей (Всемирная организация здравоохранения: Geographic Prevalence of Hepatitis В Prevalence, 2004. http://www.who.int/vaccines-surveillance/graphics/htmls/hepbprev.htm).
Вирус HBV представляет собой двухцепочечный гепатотропный вирус, который инфицирует только людей и человекоподобных приматов. Вирусная репликация происходит преимущественно в печени и в меньшей степени в почках, поджелудочной железе, костном мозге и селезенке (Hepatitis В virus biology. Microbiol Mol Biol Rev. 64: 2000; 51-68.). Вирусные и иммунные маркеры могут быть обнаружены в крови и являются характеристическими профилями антигенов-антител, развивающимися с течением времени. Первый обнаруживаемый вирусный маркер представляет собой HBsAg, за ним следует антиген гепатита B (HBeAg) и ДНК HBV. В инкубационном периоде титры могут быть высокими, но уровни ДНК и HBeAg HBV начинают резко снижаться в начале заболевания и могут не быть обнаруживаемыми на пике клинической болезни (Hepatitis В vims infection-natural history and clinical consequences. N. Engl. J. Med. 350: 2004; 1118-1129). HBeAg представляет собой вирусный маркер, обнаруживаемый в крови, который коррелирует с активной вирусной репликацией и, следовательно, высокой вирусной нагрузкой и инфективностью (Hepatitis В antigen-the dangerous end game of hepatitis B. N Engl J. Med. 347: 2002; 208-210). Наличие анти-HBsAb и анти-HBcAb (IgG) указывает на выздоровление и иммунитет у ранее инфицированного индивидуума.
В настоящее время терапии для хронической инфекции HBV, рекомендованные Американской ассоциацией по изучению заболеваний печени (AASLD) и Европейской ассоциацией по изучению печени (EASL), включают интерферон-альфа (INFa), пегилированный интерферон-α2a (Peg-IFN2a), энтекавир и тенофовир. Терапии нуклеозидами и азотистыми основаниями, энтекавир и тенофовир, являются успешными для снижения вирусной нагрузки, но скорости сероконверсии HBeAg и снижения HBsAg даже ниже, чем скорости, достижимые при помощи IFNa терапии. Применяют также другие аналогичные терапии, включая ламивудин (3TC), телбивудин (LdT) и адефовир, но терапевтическая эффективность терапий с нуклеозидами/азотистыми основаниями в целом ограничена появлением резистентности.
Следовательно, в данной области техники существует необходимость в открытии и разработке новых противовирусных терапий. Кроме того, существует необходимость в новых анти-HBV терапиях, способных увеличивать скорости сероконверсии HBeAg и HBsAg. В недавних клинических исследованиях была обнаружена корреляция между сероконверсией и снижением HBeAg (Fried et al. (2008) Hepatology 47:428), и снижением HBsAg (Moucari et al. (2009) Hepatology 49:1151). Снижение уровней антигенов может обеспечивать возможность иммунологического контроля инфекции HBV, поскольку предполагается, что высокие уровни антигенов вызывают иммунологическую толерантность. Существующие нуклеозидные терапии для HBV могут значительно снижать уровни HBV в сыворотке, но мало влияют на уровни HBeAg и HBsAg.
Антисмысловые соединения, нацеленные на HBV, были описаны ранее в WO 2011/047312, WO 2012/145674 и WO 2012/145697, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Запланированы клинические исследования для оценки влияния антисмысловых соединений, нацеленных на HBV, на пациентов. Однако все еще существует необходимость в обеспечении пациентов дополнительными и более эффективными возможностями лечения.
Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту HBV.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту HBV, имеющую последовательность с номером доступа GENBANK® U95551.1, которая включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 1. В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое
- 62 036584 соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID
NO: 4.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 11.
Таблица 2 _____Антисмысловые соединения, нацеленные на HBV SEQ ID NO: 1______
ISIS № Сайтмишен ь инициа ции Последовательность (5’-3’) Мотив SEQ ID NO
505358 1583 GCAGAGGTGAAGCGAAGTG eeeeeddddddddddeeeee 3
- 63 036584
С
509934 1780 CCAATTTATGCCTACAGCCT eeeeeddddddddddeeeee 4
510100 411 GGCATAGCAGCAGGATG eeeddddddddddeeee 5
552023 1266 AGGAGTTCCGCAGTATGGAT eeeeeeddddddddddeeee 6
552024 1577 GTGAAGCGAAGTGCACACG G eeeeeeddddddddddeeee 7
552032 1585 GTGCAGAGGTGAAGCGAAG Т eeeeeeddddddddddeeee 8
552859 1583 AGGTGAAGCGAAGTGC ekkddddddddddkke 9
552925 1264 TCCGCAGTATGGATCG ekddddddddddkeke 10
577119 1780 AATTTATGCCTACAGCCT kdkdkddddddddeeeee 11
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 505358 и конъюгирующие группы. ISIS 505358 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Ges mCes Aes Ges Aes Gds Gds Tds Gds Ads Ads Gds mCds Gds Ads Aes Ges Tes Ges mCe, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-О-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 509934 и конъюгирующие группы. ISIS 509934 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу mCes mCes Aes Aes Tes Tds Tds Ads Tds Gds mCds mCds Tds Ads mCds Aes Ges mCes mCes Te, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 510100 и конъюгирующие группы. ISIS 510100 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Ges Ges mCes Ads Tds Ads Gds mCds Ads Gds mCds Ads Gds Ges Aes Tes Ge, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 552023 и конъюгирующие группы. ISIS 552023 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Aes Ges Ges Aes Ges Tes Tds mCds mCds Gds mCds Ads Gds Tds Ads Tds Ges Ges Aes Te, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и
- 64 036584 s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 552024 и конъюгирующие группы. ISIS 552024 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Ges Tes Ges Aes Aes Ges mCds Gds Ads Ads Gds Tds Gds mCds Ads mCds Aes mCes Ges Ge, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 552032 и конъюгирующие группы. ISIS 552032 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Ges Tes Ges mCes Aes Ges Ads Gds Gds Tds Gds Ads Ads Gds mCds Gds Aes Aes Ges Te, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 552859 и конъюгирующие группы. ISIS 552859 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Aes Gks Gks Tds Gds Ads Ads Gds mCds Gds Ads Ads Gds Tks Gks mCe, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, k = cEt-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 552925 и конъюгирующие группы. ISIS 552925 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Tes mCks mCds Gds mCds Ads Gds Tds Ads Tds Gds Gds Aks Tes mCks Ge, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, k = cEt-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 577119 и конъюгирующие группы. ISIS 577119 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Aks Ads Tks Tds Tks Ads Tds Gds mCds mCds Tds Ads mCds Aes Ges mCes mCes Te, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, k = cEt-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение, имеющее следующую химическую структуру, содержит или состоит из ISIS 505358 с 5'-X, где X представляет собой конъюгирующую груп- 65 036584 пу, описанную в настоящем документе
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 712408, имеющего следующую химическую структуру:
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 695324, имеющего следующую химическую структуру:
- 66 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из SEQ ID NO: 3, 5'-GalNAc и химических модификаций и представлено следующей химической структурой:
- 67 036584 где любой R1 представляет собой -OCH2CH2OCH3 (MOE), a R2 представляет собой H; или R1 и R2 вместе образуют мостик, при этом R1 представляет собой -O-, a R2 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)или -CH2CH2-, и R1 и R2 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из -O-CH2-, -OCH(CH3)- и -O-CH2CH2-;
и для каждой пары из R3 и R4 у одного кольца, независимо для каждого кольца, любой R3 выбран из H и -OCH2CH2OCH3, a R4 представляет собой H; или R3 и R4 вместе образуют мостик, при этом R3 представляет собой -O-, a R4 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)- или -CH2CH2-, и R3 и R4 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из -O-CH2-, -O-CH(CH3)- и -O-CH2CH2-;
R5 выбран из H и -CH3;
a Z выбран из S- и О-.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в публикации WO 2012/145697, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 и 1379, описанных в WO 2012/145697, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в публикации WO 2011/047312, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 14-22, описанных в WO 2011/047312, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в публикации WO 2012/145674, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 18-35, описанных в WO 2012/145674. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит двухцепочечный олигонуклеотид, описанный в публикации WO 2013/159109, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит двухцепочечный олигонуклеотид, в котором одна спираль имеет последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 30-125, описанных в WO 2013/159109. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых ссылочных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.
Терапевтические показания для HBV.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту HBV, для модулирования экспрессии HBV у субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессия HBV снижена.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту HBV, в фармацевтической композиции для лечения субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает патологическим состоянием, связанным с HBV. В некоторых вариантах реализации изобретения патологическое состояние, связанное с HBV, включает, но не ограничивается ими, хроническую HBV инфекцию, воспаление, фиброз, цирроз, рак печени, сывороточный гепатит, разлитие желчи, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, сывороточный гепатит и HBV виремию. В некоторых вариантах реализации изобретения патологическое состояние, связанное с hBV, может характеризоваться симптомами, которые могут включать любой или все из следующих признаков: гриппоподобное заболевание, слабость, боль, головная боль, лихорадка, потеря аппетита, диарея, разлитие желчи, тошнота и рвота, боль в области печени, стул глинистого или серого цвета, общий зуд и моча темного цвета, в сочетании с положительным тестом на наличие вируса гепатита B, вирусного антигена гепатита B или положительным тестом на наличие антитела, специфичного к вирусному антигену гепатита B. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет риск патологического состояния, связанного с HBV. Сюда входят субъекты, имеющие один или более факторов риска для развития патологического состояния, связанного с HBV, включая половой контакт с индивидуумом, инифицированным вирусом гепатита B, проживание в одном доме с индивидуумом с пожизненной инфекцией вируса гепатита B, воздействие крови человека, инфицированного вирусом гепатита B, инъекция запрещенных веществ субъектом с гемофилией и посещение мест распространения гепатита B. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта идентифицирована необходимость лечения патологического состояния, связанного с HBV.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения уровней ДНК HBV
- 68 036584 и/или антигенов HBV у животного, инфицированного HBV, включающий введение указанному животному конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту HBV. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляет собой HBsAG или HBeAG. В некоторых вариантах реализации изобретения количество антигена HBV может быть существенно снижено, что приводит к сероконверсии.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту HBV, для производства лекарственного средства.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту HBV, или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложено конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту HBV, для применения при лечении патологического состояния, связанного с HBV. Патологическое состояние, связанное с HBV, включает, но не ограничивается ими, хроническую HBV инфекцию, воспаление, фиброз, цирроз, рак печени, сывороточный гепатит, разлитие желчи, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, сывороточный гепатит и HBV виремию.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложено конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту HBV, для применения для снижения уровней ДНК HBV и/или антигена HBV у животного, инфицированного HBV, включающего введение указанному животному конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту HBV. В некоторых вариантах рализации изобретения антиген представляет собой HBsAG или HBeAG. В некоторых вариантах реализации изобретения количество антигена HBV может быть существенно снижено, что приводит к сероконверсии.
Следует понимать, что любое из описанных в настоящем документе соединений можно применять в вышеупомянутых способах и применениях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту HBV, в вышеупомянутых способах и применениях может включать, но не органичиваясь ими, конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, которое содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 3-11; конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 1, которое содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 3-11; соединение, содержащее или состоящее из ISIS 505358, ISIS 509934, ISIS 510100, ISIS 552023, ISIS 552024, ISIS 552032, ISIS 552859, ISIS 552925, или ISIS 577119 и конъюгирующие группы; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, описанный в публикации WO 2012/145697, полное описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, и конъюгирующую группу; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 и 1379, описанных в WO 2012/145697, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 14-22, описанных в WO 2011/047312, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 18-35, описанных в WO 2012/145674; или соединение, содержащее двухцепочечный олигонуклеотид, в котором одна спираль имеет последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 30-125, описанных в WO 2013/159109.
2. Транстиретин (TTR).
TTR (также известный как преальбумин, гипертироксинемия, диспреальбуминемическая, тироксин; старческий системный амилоидоз, амилоидная полиневропатия, амилоидоз I, PALB; дистранстиретинемическая, HST2651; TBPA; диспреальбуминемическая эутиреоидная гипертироксинемия) представляет собой белок сыворотки/плазмы и спинномозговой жидкости, отвечающий за транспорт тироксина и ретинола (Sakaki et al., Mol. Biol. Med. 1989, 6:161-8). Структурно TTR представляет собой гомотетрамер; точечные мутации и неправильное скручивание белка приводит к отложению амилоидных фибрилл и сопровождается такими расстройствами, как старческий системный амилоидоз (SSA), семейная амилоидная полиневропатия (FAP) и семейная амилоидная кардиопатия (FAC).
TTR синтезируется, в основном, печенью и хориоидным сплетением головного мозга, а также, в меньшей степени, сетчаткой глаза у людей (Palha, Clin. Chem. Lab. Med., 2002, 40, 1292-1300). Транстиретин, который синтезирован в печени, секретируется в кровь, тогда как транстиретин из хориоидного сплетения предназначен для спинно-мозговой жидкости (CSF). Синтез транстиретина в хориоидном сплетении составляет около 20% от общего локального синтеза белка и целых 25% от общего белка CSF (Dickson et al., J. Biol. Chem., 1986, 261, 3475-3478).
Благодаря возможности выполнения генетических и иммуногистохимических диагностических тестов, были обнаружены пациенты с TTR амилоидозом у многих народов мира. Недавние исследования
- 69 036584 показали, что TTR амилоидоз представляет собой не редкое эндемическое заболевание, как считалось ранее, и может поражать не менее 25% взрослого населения (Tanskanen et al., Ann. Med. 2008; 40(3):232-9).
На биохимическом уровне TTR был определен как основной белковый компонент в амилоидных отложениях пациентов с FAP (Costa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, 75:4499-4503), а позже было обнаружено, что замена метионина на валин в положении 30 этого белка представляет собой наиболее распространенный молекулярный дефект, вызывающий это заболевание (Saraiva et al., J. Clin. Invest. 1984, 74: 104-119). При FAP происходит повсеместное системное внеклеточное отложение скоплений TTR, и амилоидные фибриллы возникают по всей соединительной ткани, особенно в периферической нервной системе (Sousa and Saraiva, Prog. Neurobiol. 2003, 71: 385-400). После отложения TTR происходит аксонная дегенерация, берущая начало в немиелинизированных и миелинизированных волокнах малого диаметра, что в конечном итоге приводит к потере нейронов в ганглионарных центрах.
Антисмысловые соединения, нацеленные на TTR, были описаны ранее в US 2005/0244869, WO 2010/017509 и WO 2011/139917, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Антисмысловое олигоазотистое основание, нацеленное на TTR, ISIS-TTRRx, в настоящее время проходит 2/3 фазу клинических испытаний для исследования его эффективности при лечении субъектов, страдающих семейной амилоидной полиневропатией. Однако все еще существует необходимость в обеспечении пациентов дополнительными и более эффективными возможностями лечения.
Некоторые конъюгированные антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту TTR.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированные антисмысловые соединения нацелены на нуклеиновую кислоту TTR, имеющую последовательность с номером доступа GENBANK® NM_000371.3, которая включена в настоящий документ как SEQ ID NO: 2. В некоторых таких вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарно SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 14.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 15.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 16, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 16, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 78.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последователь- 70 036584 ности SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID
NO: 18.
В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, содержит последовательность азотистых оснований SEQ ID NO: 19.
Таблица 3
Антисмысловые соединения, нацеленные на TTR SEQ ID NO: 2
ISIS № Сайтмишень инициации Последовательность (5’-3’) Мотив SEQ ID NO
420915 508 TCTTGGTTACATGAAATC СС eeeeeddddddddddeee ее 12
304299 507 CTTGGTTACATGAAATCC СА eeeeeddddddddddeee ее 13
420921 515 GGAATACTCTTGGTTACA TG eeeeeddddddddddeee ее 14
420922 516 TGGAATACTCTTGGTTAC АТ eeeeeddddddddddeee ее 15
420950 580 TTTTATTGTCTCTGCCTGG А eeeeeddddddddddeee ее 16
420955 585 GAATGTTTTATTGTCTCTG С eeeeeddddddddddeee ее 17
420957 587 AGGAATGTTTTATTGTCT СТ eeeeeddddddddddeee ее 18
420959 589 ACAGGAATGTTTTATTGT СТ eeeeeddddddddddeee ее 19
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420915 и конъюгирующие группы. ISIS 420915 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Tes mCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds Ads mCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes Tes mCes mCes mCe, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 304299 и конъюгирующие группы. ISIS 304299 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу mCes Tes Tes Ges Ges Tds Tds Ads mCds Ads Tds Gds Ads Ads Ads Tes mCes mCes mCes Ae, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420921 и конъюгирующие группы. ISIS 420921 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Ges Ges Aes Aes Tes Ads mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds Tds Tds Aes mCes Aes Tes Ge, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин, G = гуанин, T = тимин,
- 71 036584 e = 2'-О-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420922 и конъюгирующие группы. ISIS 420922 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Tes Ges Ges Aes Aes Tds Ads mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds Tds Tes Aes mCes Aes Te, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420950 и конъюгирующие группы. ISIS 420950 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Tes Tes Tes Tes Aes Tds Tds Gds Tds mCds Tds mCds Tds Gds mCds mCes Tes Ges Ges Ae, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420955 и конъюгирующие группы. ISIS 420955 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Ges Aes Aes Tes Ges Tds Tds Tds Tds Ads Tds Tds Gds Tds mCds Tes mCes Tes Ges mCe, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420957 и конъюгирующие группы. ISIS 420957 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Aes Ges Ges Aes Aes Tds Gds Tds Tds Tds Tds Ads Tds Tds Gds Tes mCes Tes mCes Te, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 420959 и конъюгирующие группы. ISIS 420959 представляет собой модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу
Aes mCes Aes Ges Ges Ads Ads Tds Gds Tds Tds Tds Tds Ads Tds Tes Ges Tes mCes Te, где A = аденин, mC = 5'-метилцитозин,
G = гуанин,
T = тимин, e = 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид, d = 2'-дезоксинуклеозид и s = тиофосфатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение, имеющее следующую химическую структуру, содержит или состоит из ISIS 420915 с 5'-X, где X представляет собой конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе
- 72 036584
О
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 682877, имеющего следующую химическую структуру:
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из ISIS 682884, имеющего следующую химическую структуру:
- 73 036584
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит или состоит из SEQ ID NO: 12, 5'-GalNAc и химических модификаций и представлено следующей химической структурой:
- 74 036584 где любой R1 представляет собой -OCH2CH2OCH3 (MOE), a R2 представляет собой H; или R1 и R2 вместе образуют мостик, при этом R1 представляет собой -O-, a R2 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)или -CH2CH2-, и R1 и R2 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из -O-CH2-, -OCH(CH3)- и -O-CH2CH2-;
и для каждой пары из R3 и R4 у одного кольца, независимо для каждого кольца, любой R3 выбран из H и -OCH2CH2OCH3, a R4 представляет собой H; или R3 и R4 вместе образуют мостик, при этом R3 представляет собой -O-, a R4 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)- или -CH2CH2-, и R3 и R4 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из -O-CH2-, -O-CH(CH3)- и -O-CH2CH2-;
R5 выбран из H и -CH3;
a Z выбран из S- и О-.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, описанный в публикации WO 2011/139917 или US 8101743, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки, и конъюгирующую группу. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 8-160, 170-177, описанных в WO 2011/139917, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 12-89, описанных в US 8101743, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований, комплементарную предпочтительному целевому сегменту любой из SEQ ID NO 90-133, описанных в US 8101743, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых справочных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах изобретение относится к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 880 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, по меньшей мере на 85, 90, 95 или 100% комплементарную SEQ ID NO: 2, кодирующей транстиретин (TTR).
При этом последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна азотистым основаниям 507-608 в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 85, 90, 95 или 100% комплементарен SEQ ID NO: 2.
В следующем варианте последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна азотистыми основаниями 507-526, 508-527, 515-534, 516-535, 580-599, 585-604, 587-606 или 589-608 в SEQ ID NO: 2, и при этом указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 85, 90, 95 или 100% комплементарен SEQ ID NO: 2.
В следующем варианте изобретение модифицированный олигонуклеотид состоит из 10-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность азотистых оснований, содержащую последовательность, перечисленную в SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность азотистых оснований, состоящую из последовательности, перечисленной в SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный сахар.
При этом в одном из вариантов модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар.
В следующем варианте изобретения бициклический сахар выбран из группы, состоящей из 4'-(CH2)O-2' (LNA); 4'-(CH2)2-O-2' (ENA) и 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt).
В следующем варианте изобретения модифицированный сахар представляет собой 2'-Oметоксиэтил.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одно модифицированное азотистое основание.
При этом в одном из вариантов модифицированное азотистое основание представляет собой 5метилцитозин.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность азотистых оснований, состоящую из последовательности, перечисленной в SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит
- 75 036584 сегмент гэпа, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;
при этом сегмент гэпа расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла; и каждый нуклеозид сегмента 5'-крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар; и каждый нуклеозид сегмента 3'-крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар; и каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь; и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В следующем варианте изобретения соединение является одноцепочечным.
В следующем варианте изобретения соединение является двухцепочечным.
В другом варианте модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 2 фосфодиэфирные межнуклеозидные связи.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 3 фосфодиэфирные межнуклеозидные связи.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 4 фосфодиэфирные межнуклеозидные связи.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 5 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей.
В следующем варианте изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 7 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей.
В следующем варианте изобретения каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной межнуклеозидной связи и тиофосфатной межнуклеозидной связи.
В следующем варианте изобретения каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 304299 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 420915 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 420921 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 420922 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 420950 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 420955 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 420957 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение состоит из ISIS 420959 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения у соединения конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида.
В следующем варианте изобретения у соединения конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида.
В следующем варианте изобретения у соединения конъюгирующая группа содержит ровно один лиганд.
В следующем варианте изобретения у соединения конъюгирующая группа содержит ровно два лиганда.
В следующем варианте изобретения у соединения конъюгирующая группа содержит три или более лигандов.
В следующем варианте изобретения у соединения конъюгирующая группа содержит ровно три лиганда.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого каждый лиганд выбран из полисахарида, модифицированного полисахарида, маннозы, галактозы, производного маннозы, производного галактозы, D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, L-галактозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, a-D-маннофуранозы, β-Dманнофуранозы, a-D-маннопиранозы, e-D-маннопиранозы, a-D-глюкопиранозы, e-D-глюкопиранозы, αD-глюкофуранозы, e-D-глюкофуранозы, a-D-фруктофуранозы, a-D-фруктопиранозы, a-Dгалактопиранозы, e-D-галактопиранозы, a-D-галактофуранозы, e-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, a-D-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2дезокси-в^-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-Е-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино^-глюкопиранозы, N-гликолоил-а- 76 036584 нейраминовой кислоты, 5-тио-в^-глюкопиранозы, метил 2,3,4-три-0)-а11ети..л-1-тио-6-0)-трити..л-(х-1)глюкопиранозида, 4-тио-в-0-галактопиранозы, этил 3,4,6,7-тетра-О-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-а^глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро^-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4тиорибозы.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого каждый лиганд представляет собой N-ацетилгалактозамин.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит
AcHN
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит
- 77 036584
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит структуру, выбранную из
где n равен от 1 до 12; и где m равен от 1 до 12.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит связку, имеющую структуру, выбранную из
где L представляет собой либо фосфорную связывающую группу, либо нейтральную связывающую группу;
Z1 представляет собой C(=O)O-R2;
Z2 представляет собой H, С1-С6-алкил или замещенный С1-С6-алкил;
R2 представляет собой H, С1-С6-алкил или замещенный С1-С6-алкил; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит связку, имеющую структуру, выбранную из
где Z2 представляет собой H или CH3; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа содержит связку, имеющую структуру, выбранную из
- 78 036584
где n равен от 1 до 12; и где m равен от 1 до 12.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, у которого конъюгирующая группа ковалентно присоединена к модифицированному олигонуклеотиду.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, которое имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте соединение имеет структуру, представленную формулой ftc7tD7TE—7 n2 П] n3' 'q где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд;
каждый n независимо равен 0 или 1; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте соединение имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте соединение имеет структуру, представленную формулой
А----С---D Е---F1 ' q где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте соединение имеет структуру, представленную формулой
- 79 036584
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
C представляет собой линкер конъюгата;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте соединение имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте соединение имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте соединение имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
- 80 036584
где каждый L независимо представляет собой фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
- 81 036584
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет следующую структуру:
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
- 82 036584
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит пирролидин.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата не содержит пирролидин.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата содержит
ПЭГ.
В следующем варианте изобретения у Соединения по изобретению линкер конъюгата содержит амид.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата содержит по меньшей мере два амида.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата не содержит амид.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата содержит полиамид.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата содержит амин.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата содержит одну или более дисульфидных связей.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата содержит фрагмент, связывающий белки.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению фрагмент, связывающий белки, содержит липид.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению фрагмент, связывающий белки, выбран из холестерина, холевой кислоты, адамантан-уксусной кислоты, 1-пирен-масляной кислоты, дигидротестостерона, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерина, геранилоксигексиловой группы, гексадецилглицерина, борнеола, ментола, 1,3-пропандиола, гептадециловой группы, пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, O3-(олеоил)литохолевой кислоты, O3-(олеоил)холеновой кислоты, диметокситритила или феноксазина, витамина (например, фолата, витамина A, витамина E, биотина, пиридоксаля), пептида, углевода (например, моносахарида, дисахарида, трисахарида, тетрасахарида, олигосахарида, полисахарида), эндосомолитического компонента, стероида (например, уваола, гецигенина, диосгенина), терпена (например, тритерпена, например, сарсасапогенина, фриделина, литохолевой кислоты, дериватизованной эпифриделанолом) или катионного липида.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению фрагмент, связывающий белки, выбран из: C16-C22 длинноцепочечной насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты, холестерина, холевой кислоты, витамина E, адамантана или 1-пентафторпропила.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
- 83 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20; и p равен от 1 до 6.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
- 84 036584 где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
где n равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из 00 II ' ι' :;
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
- 85 036584
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению линкер конъюгата имеет следующую структуру:
из
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению группа ветвления имеет одну следующих структур:
где каждый A1 независимо представляет собой O, S, C=O или NH; и каждый n независимо равен 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению группа ветвления имеет одну следующих структур:
от из
где каждый A1 независимо представляет собой O, S, C=O или NH; и каждый n независимо равен 1 до 20.
от
В следующем дующую структуру:
варианте изобретения изобретению группа ветвления имеет слеВ следующем дующую структуру:
варианте изобретения у соединения по
изобретению группа ветвления имеет слеВ следующем дующую структуру:
варианте изобретения у соединения по
изобретению группа ветвления имеет слеВ следующем дующую структуру:
варианте изобретения у соединения по
изобретению группа ветвления имеет слеу соединения по
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению группа ветвления содержит простой эфир.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению группа ветвления имеет следующую структуру:
- 86 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20; и m равен от 2 до 6.
группа ветвления имеет слеизобретению соединения по
В следующем варианте изобретения у дующую структуру:
изобретения у соединения по изобретению группа ветвления имеет слеварианте
В следующем дующую структуру:
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению группа ветвления содержит
- 87 036584
где каждый j представляет собой целое число от 1 до 3; и где каждый n представляет собой целое число от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению группа ветвления содержит
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждая связка выбрана из
где L выбран из фосфорной связывающей группы и нейтральной связывающей группы;
Z1 представляет собой C(=O)O-R2;
Z2 представляет собой H, C1-C6-αлкил или замещенный C1-C6-aлкил;
R2 представляет собой H, C1-C6-алкил или замещенный C1-C6-aлкил; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждая связка выбрана из
где Z2 представляет собой H или CH3; и каждый m2 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m2 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению связка выбрана из
- 88 036584
где n равен от 1 до 12; и где m равен от 1 до 12.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению по меньшей мере одна связка содержит этиленгликоль.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению по меньшей мере одна связка содержит амид.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению по меньшей мере одна связка содержит полиамид.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению по меньшей мере одна связка содержит амин.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению по меньшей мере две связки отличаются друг от друга.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению все связки являются одинаковыми.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждая связка выбрана из
где каждый n независимо равен от 1 до 20; и каждый p равен от 1 до около 6.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждая связка выбрана из
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждая связка имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждая связка имеет следующую структуру:
О О .
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению связка имеет структуру, выбран- 89 036584 где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению связка имеет структуру, выбранную из ную из
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению лиганд представляет собой галактозу.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению лиганд представляет собой маннозу-6-фосфат.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждый лиганд выбран из
где каждый R1 выбран из OH и NHCOOH.
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждый лиганд выбран из он но.
ноон но но но \он
; и
В следующем варианте изобретения у соединения по изобретению каждый лиганд имеет следующую структуру:
ноон но
NHAc е .
В следующем варианте изобретение относится к конъюгированному антисмысловому соединению, у которого каждый лиганд имеет следующую структуру:
НООН но
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку.
В следующем варианте конъюгированная группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку, имеющий следующую структуру:
- 90 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру: норн о
но
Η0-Λ^ί<^0.
NHAc .
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
- 91 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
J k-Ι м ACHN η\^°
AcHN hoQh ( '4 H AcHN
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
- 92 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
- 93 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит он он
NHAc
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
NHAc
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN .
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
- 94 036584
AcHN
В следующем варианте фрагмент нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
- 95 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
где каждый Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного C1-C10-алкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит
- 96 036584 где каждый Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного Ч-Чо-алкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
где каждый Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного Ч-Чо-алкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила.
следующем варианте конъюгирующая группа содержит
следующем варианте конъюгирующая группа содержит следующем варианте конъюгирующая группа содержит следующем варианте конъюгирующая группа содержит
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит расщепляемый фрагмент, выбранный из фосфодиэфира, амида, дезоксинуклеозида или сложного эфира.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит фосфодиэфирный расщепляемый фрагмент.
В следующем варианте конъюгирующая группа не содержит расщепляемый фрагмент, и при этом конъюгирующая группа содержит тиофосфатную связь между конъюгирующей группой и олигонуклеотидом.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит амидный расщепляемый фрагмент.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит сложноэфирный расщепляемый фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
- 97 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
Z представляет собой H или связанную твердую подложку; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
- 98 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
Z представляет собой H или связанную твердую подложку; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или О(СН2)2-ОСН3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру: ОН.он
где Q13 представляет собой H или О(СН2)2-ОСН3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
- 99 036584
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
- 100 036584
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
- 101 036584
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению конъюгирующая группа содержит:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению конъюгирующая группа содержит
- 102 036584
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению конъюгирующая группа содержит
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению Bx выбран из аденина, гуанина, тимина, урацила или цитозина, или 5-метилцитозина.
В следующем варианте у соединения по изобретению Bx представляет собой аденин.
В следующем варианте у соединения по изобретению Bx представляет собой тимин.
В следующем варианте у соединения по изобретению Q13 представляет собой O(CH2)2-OCH3.
В следующем варианте у соединения по изобретению Q13 представляет собой H.
В следующем варианте изобретение относится к композиции, содержащей соединение, как указано выше, или его соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В следующем варианте изобретение относится к пролекарству, содержащему соединение, как указано выше.
В следующем варианте изобретение относится к способу, который включает введение животному соединения, как указано выше, или композиции, как указано выше, или пролекарства, как указано выше.
При этом животное может представлять собой человека.
В следующем варианте изобретения способ введения соединения предупреждает, лечит, облегчает или замедляет прогрессирование транстиретинового амилоидоза.
В следующем варианте изобретения способ включает совместное введение указанного соединения или композиции и второго агента.
В следующем варианте изобретения соединение или композицию и второй агент вводят одновременно.
В следующем варианте изобретения способ введение осуществляют в хориоидное сплетение.
В следующем варианте изобретение относится к способу снижения экспрессии мРНК или белка транстиретина у животного, включающему введение указанному животному соединения, как указано выше, композиции, как указано выше, или пролекарства, как указано выше, для снижения, таким образом, экспрессии мРНК или белка транстиретина у животного.
В следующем варианте изобретения в способе животное представляет собой человека.
В следующем варианте изобретения в способе снижение экспрессии мРНК или белка транстиретина предупреждает, лечит, облегчает или замедляет прогрессирование транстиретинового амилоидоза.
В следующем варианте изобретения в способе предусмотрено совместное введение указанного соединения или композиции и второго агента.
В следующем варианте изобретения в способе предусмотрено одновременное введение соединения или композиции и второго агента.
В следующем варианте изобретения в способе указанное соединение или композицию вводят в хо- 103 036584 риоидное сплетение.
В следующем варианте изобретение предусматривает способ лечения транстиретинового амилоидоза у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, как указано выше, композиции, как указано выше, или пролекарства, как указано выше.
При этом введение указанного соединения или композиции уменьшает по меньшей мере один симптом, связанный с транстиретиновым амилоидозом, выбранный из группы, состоящей из беспокойства, отсутствия координации, нистагма, спастического парапареза, отсутствия мышечной координации, нарушения зрения, бессонницы, необычных ощущений, миоклонуса, слепоты, потери речи, кистевого туннельного синдрома, судорог, субарахноидального кровоизлияния, инсульта и кровоизлияния в мозг, гидроцефалии, атаксии и спастического паралича, комы, сенсорной нейропатии, парестезии, гипестезии, моторной нейропатии, автономной нейропатии, ортостатической гипотензии, периодического запора, периодической диареи, тошноты, рвоты, снижения потоотделения, импотенции, задержки опорожнения желудка, задержки мочеиспускания, недержания мочи, прогрессивной кардиопатии, усталости, одышки, потери веса, отсутствия аппетита, онемения, покалывания, слабости, увеличения языка, нефротического синдрома, застойной сердечной недостаточности, одышки при физической нагрузке, периферических отеков, аритмии, учащенного сердцебиения, головокружения, обморока, постуральной гипотонии, заболеваний периферической нервной системы, сенсомоторных нарушений, невропатии нижних конечностей, невропатии верхних конечностей, гипералгезии, изменения ощущения температуры, слабости в нижних конечностях, кахексии, периферических отеков, гепатомегалии, пурпуры, диастолической дисфункции, преждевременных желудочковых сокращений, черепной невропатии, снижения глубоких сухожильных рефлексов, депозидов амилоида в стекловидном теле, помутнения стекловидного тела, сухости глаз, глаукомы, зубчатого внешнего вида зрачка и отеков ног из-за задержки жидкости в организме.
В следующем варианте изобретение предусматривает совместное введение указанного соединения или композиции и второго агента.
В следующем варианте изобретения в способе указанное соединение или композицию и второй агент вводят одновременно.
В следующем варианте изобретения в способе указанное соединение или композицию вводят в хориоидное сплетение.
В следующем варианте изобретения в способе субъект представляет собой человека.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 880 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, по меньшей мере на 85, 90, 95 или 100% комплементарную SEQ ID NO: 1, кодирующую вирус гепатита B (HBV).
В следующем варианте изобретения у соединения последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна азотистым основаниям 1583-1602, 1780-1799, 411-427, 1266-1285, 1577-1596, 1585-1604, 1583-1598, 1264-1279 или 1780-1797 в SEQ ID NO: 1, и при этом указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 85, 90, 95 или 100% комплементарен SEQ ID NO: 1.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид состоит из 10-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность азотистых оснований, содержащую последовательность, перечисленную в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность азотистых оснований, состоящую из последовательности, перечисленной в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит сегмент гэпа, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; и сегмент 3' -крыла, состоящий из связанных нуклеозидов;
при этом сегмент гэпа расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла; и каждый нуклеозид сегмента 5'-крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар; и каждый нуклеозид сегмента 3'-крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар; и каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь; и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит сегмент гэпа, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; и сегмент 3' -крыла, состоящий из связанных нуклеозидов;
при этом сегмент гэпа расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла; и каждый нуклеозид сегмента 5'-крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар или стерически затрудненный этил-сахар; и
- 104 036584 каждый нуклеозид сегмента З'-крыла содержит 2'-О-метоксиэтил-сахар или стерически затрудненный этил-сахар; и каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь; и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В следующем варианте изобретения соединение является одноцепочечным.
В следующем варианте изобретения соединение является двухцепочечным.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 2 фосфодиэфирные межнуклеозидные связи.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 3 фосфодиэфирные межнуклеозидные связи.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 4 фосфодиэфирные межнуклеозидные связи.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 5 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей.
В следующем варианте изобретения у соединения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 7 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей.
В следующем варианте изобретения у соединения каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной межнуклеозидной связи и тиофосфатной межнуклеозидной связи.
В следующем варианте изобретения у соединения каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 505358 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 509934 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 510100 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 552023 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 552024 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 552032 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 552859 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 552925 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения соединение, состоит из ISIS 577119 и конъюгирующей группы.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит ровно один лиганд.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит ровно два лиганда.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит три или более лигандов.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит ровно три лиганда.
В следующем варианте изобретения лиганд выбран из: полисахарида, модифицированного полисахарида, маннозы, галактозы, производндого маннозы, производндого галактозы, D-маннопиранозы, Lманнопиранозы, D-арабинозы, L-галактозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, Lглюкозы, D-галактозы, L-галактозы, a-D-маннофуранозы, e-D-маннофуранозы, a-D-маннопиранозы, βD-маннопиранозы, a-D-глюкопиранозы, e-D-глюкопиранозы, a-D-глюкофуранозы, e-D-глюкофуранозы, a-D-фруктофуранозы, a-D-фруктопиранозы, a-D-галактопиранозы, e-D-галактопиранозы, a-Dгалактофуранозы, e-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, a-D-галактозамина, Nацетилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2метиламино-Ь-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамиgо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2дезокси-2-сульфоамино-О-глюкопиранозы, N-гликолоил-а-нейраминовой кислоты, 5-тио-в-Э-глюкопиранозы, метил 2,3,4-три-О-ацетил-1-тио-6-О-тритил-а-О-глюкопиранозида, 4-тио-в-О-галактопиранозы, этил 3,4,6,7-тетра-О-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-а-О-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-Эаллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4-тиорибозы.
В следующем варианте изобретения каждый лиганд представляет собой N-ацетилгалактозамин.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит
- 105 036584
NHAc
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит
AcHN
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит
AcHN
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит
NHAc
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит
- 106 036584
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит структуру, выбранную из
где n равен от 1 до 12; и где m равен от 1 до 12.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит связку, имеющую структуру, выбранную из
где L представляет собой либо фосфорную связывающую группу, либо нейтральную связывающую группу;
Z1 представляет собой C(=O)O-R2;
Z2 представляет собой H, ^-^-алкил или замещенный ^-^-алкил;
R2 представляет собой H, СцС^лкил или замещенный ^-^-алкил; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит связку, имеющую структуру, выбранную из
где Z2 представляет собой H или CH3; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа содержит связку, имеющую структуру, выбранную из
- 107 036584
где n равен от 1 до 12; и где m равен от 1 до 12.
В следующем варианте изобретения конъюгирующая группа ковалентно присоединена к модифицированному олигонуклеотиду.
В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд;
каждый n независимо равен 0 или 1; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой
А----В---С
q где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
C представляет собой линкер конъюгата;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой
А----С----D Е---F1 1 q где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
C представляет собой линкер конъюгата;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой
где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
- 108 036584
C представляет собой линкер конъюгата;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой |а---в---D—Не---f] ' ' q где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5. В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой
А---В--НЕ--Я где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
B представляет собой расщепляемый фрагмент;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения соединение имеет структуру, представленную формулой |А-----D--НЕ---Fj ' 'q где A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
D представляет собой группу ветвления;
каждый E представляет собой связку;
каждый F представляет собой лиганд; и q представляет собой целое число от 1 до 5.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из оо о о н о
где каждый L независимо представляет собой фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
- 109 036584
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
о о
о оо
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет следующую структуру:
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из он он о / о о К
О-Ρ-Ο-^^Ο^^Λ^Ογ^Ο-Ρ-Ο—и Ο-β-O-^^O^X^O^vO^j он ' '3 ЭОН ОН ' Э ' '3
В следующем варианте изобретения у Соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит пирролидин.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата не содержит пирролидин.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит ПЭГ.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит амид.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит по меньшей мере два
- 110 036584 амида.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата не содержит амид.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит полиамид.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит амин.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит одну или более дисульфидных связей.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата содержит фрагмент, связывающий белки.
В следующем варианте изобретения у соединения фрагмент, связывающий белки, содержит липид.
В следующем варианте изобретения у соединения фрагмент, связывающий белки, выбран из: холестерина, холевой кислоты, адамантан-уксусной кислоты, 1-пирен-масляной кислоты, дигидротестостерона, 1,3-бис-О(гексадецил)глицерина, геранилоксигексиловой группы, гексадецилглицерина, борнеола, ментола, 1,3-пропандиола, гептадециловой группы, пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, O3(олеоил)литохолевой кислоты, O3-(олеоил)холеновой кислоты, диметокситритила или феноксазина, витамина (например, фолата, витамина A, витамина E, биотина, пиридоксаля), пептида, углевода (например, моносахарида, дисахарида, трисахарида, тетрасахарида, олигосахарида, полисахарида), эндосомолитического компонента, стероида (например, уваола, гецигенина, диосгенина), терпена (например, тритерпена, например сарсасапогенина, фриделина, литохолевой кислоты, дериватизованной эпифриделанолом) или катионного липида.
В следующем варианте изобретения у соединения фрагмент, связывающий белки, выбран из: C16C22 длинноцепочечной насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты, холестерина, холевой кислоты, витамина E, адамантана или 1-пентафторпропила.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
где каждый n независимо равен от 1 до 20; и p равен от 1 до 6.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
- 111 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
- 112 036584
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
где n равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет структуру, выбранную из
где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
В следующем варианте изобретения у соединения линкер конъюгата имеет следующую структуру:
О О
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет одну из следующих структур:
где каждый A1 независимо представляет собой O, S, C=O или NH; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет одну из следующих структур:
где каждый A1 независимо представляет собой O, S, C=O или NH; и каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет следующую структуру:
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет следующую структуру:
d
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет следующую структуру:
- 113 036584
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет следующую структуру:
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления содержит простой эфир.
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет следующую структуру:
каждый n независимо равен от 1 до 20; и m равен от 2 до 6.
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет следующую структуру:
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления имеет следующую структуру:
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления содержит
- 114 036584
где каждый j представляет собой целое число от 1 до 3; и где каждый n представляет собой целое число от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения у соединения группа ветвления содержит
В следующем варианте изобретения у соединения каждая связка выбрана из
где L выбран из фосфорной связывающей группы и нейтральной связывающей группы;
Z1 представляет собой C(=O)O-R2;
Z2 представляет собой H, C1-C6-αлкил или замещенный C1-C6-aлкил;
R2 представляет собой H, ^-^-алкил или замещенный C1-C6-aлкил; и каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретения у соединения каждая связка выбрана из
где Z2 представляет собой H или CH3; и каждый m2 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m2 больше 0 для каждой связки.
В следующем варианте изобретения у соединения каждая связка выбрана из
- 115 036584
где n равен от 1 до 12; и где m равен от 1 до 12.
В следующем варианте изобретения у соединения по меньшей мере одна связка содержит этиленгликоль.
В следующем варианте изобретения у соединения по меньшей мере одна связка содержит амид.
При этом, возможно, что по меньшей мере одна связка содержит полиамид.
При этом, возможно, что что по меньшей мере одна связка содержит амин.
При этом, возможно, что по меньшей мере две связки отличаются друг от друга.
При этом, возможно, что все связки являются одинаковыми.
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение у которого каждая связка выбрана из
; Α'Τ^ΑυΆ ;
о ОО \ 0 /2 lp 00 оо : НН1 ; где каждый n независимо равен от 1 до 20; и каждый p равен от 1 до около 6.
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение, у которого каждая связка выбрана из О н, t А А w N·..чхчч ;
V N О - ’ V ’П ’ но
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение, у которого каждая связка имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение, у которого каждая связка имеет следующую структуру:
о о .
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение, у которого связка имеет структуру, выбранную из
- 116 036584 где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение, у которого лиганд представляет собой галактозу.
При этом возможно лиганд представляет собой маннозу-6-фосфат.
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение, у которого каждый лиганд выбран из
где каждый R1 выбран из OH и NHCOOH.
В следующем варианте изобретения предусмотрено соединение, у которого каждый лиганд выбран из
В следующем варианте каждый лиганд имеет следующую структуру:
НООН
НО
В следующем варианте изобретения предусмотрено конъюгированное антисмысловое соединение как указано выше, отличающееся тем, что каждый лиганд имеет следующую структуру:
НООН
НО
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку, имеющий следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
- 117 036584
где каждый n независимо равен от 1 до 20.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
- 118 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN
- 119 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит но он
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
- 120 036584
NHAc
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
AcHN
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
- 121 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
- 122 036584
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
ОН он
НО
AcHN .
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит
где каждый Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного C1-C10-αлкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит
где каждый Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного C1-C10-αлкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила.
В следующем варианте фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:
где каждый Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного C1-C10-αлкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит
- 123 036584
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит расщепляемый фрагмент, выбранный из фосфодиэфира, амида, дезоксинуклеозида или сложного эфира.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит фосфодиэфирный расщепляемый фрагмент.
В следующем варианте конъюгирующая группа не содержит расщепляемый фрагмент, и при этом конъюгирующая группа содержит тиофосфатную связь между конъюгирующей группой и олигонуклеотидом.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит амидный расщепляемый фрагмент.
В следующем варианте конъюгирующая группа содержит сложноэфирный расщепляемый фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
- 124 036584
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
Z представляет собой H или связанную твердую подложку; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где каждый n независимо равен от 1 до 20;
Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид;
Z представляет собой H или связанную твердую подложку; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
- 125 036584
где Q13 представляет собой H или О(СН2)2-ОСН3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или О(СН2)2-ОСН3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или О(СН2)2-ОСН3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или О(СН2)2-ОСН3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
- 126 036584
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
- 127 036584 где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте соединение по изобретению имеет следующую структуру:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
- 128 036584
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению конъюгирующая группа содержит:
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению конъюгирующая группа содержит
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и
Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению конъюгирующая группа содержит
где Q13 представляет собой H или O(CH2)2-OCH3;
A представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и Bx представляет собой гетероциклический основной фрагмент.
В следующем варианте у соединения по изобретению Bx выбран из аденина, гуанина, тимина, ура цила или цитозина, или 5-метилцитозина.
В следующем варианте у соединения по изобретению Bx представляет собой аденин.
В следующем варианте у соединения по изобретению Bx представляет собой тимин.
В следующем варианте у соединения по изобретению Q13 представляет собой O(CH2)2-OCH3.
В следующем варианте у соединения по изобретению Q13 представляет собой H.
В следующем варианте изобретение относится к композиции, содержащей соединение, как указано выше, или его соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В следующем варианте изобретение относится к пролекарству, содержащему соединение, как ука зано выше.
В следующем варианте изобретение относится к способу лечения у субъекта заболевания, расстройства или патологического состояния, связанного с HBV, включающему введение указанному субъекту соединения, как указано выше, композиции, как указано выше, или пролекарства, как указано выше, при этом заболевание, расстройство или патологическое состояние представляет собой разлитие желчи,
- 129 036584 воспаление печени, фиброз печени, воспаление, цирроз печени, печеночную недостаточность, рак печени, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, сывороточный гепатат, HBV виремию или трансплантацию, связанную с заболеванием печени.
В следующем варианте изобретение относится к способу снижения уровней антигена HBV в организме субъекта, инифицированного HBV, включающий введение указанному субъекту соединения по любому из пп.202-376, композиции по п.377 или пролекарства по п.378, снижая, таким образом, уровни антигена HBV в организме субъекта.
При этом антиген HBV может представлять собой HBsAG.
В другом варианте антиген HBV представляет собой HBeAG.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
где X представляет собой конъюгирующую группу, содержащую GalNAc.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
- 130 036584
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
- 131 036584
где либо R1 представляет собой -OCH2CH2OCH3 (MOE), a R2 представляет собой H; или R1 и R2 вместе образуют мостик, при этом R1 представляет собой -O-, a R2 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)или -CH2CH2-, и R1 и R2 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из: -O-CH2-, -OСН(СНз)- и -O-CH2CH2-;
и для каждой пары из R3 и R4 у одного кольца, независимо для каждого кольца, либо R3 выбран из H и -OCH2CH2OCH3, a R4 представляет собой H; или R3 и R4 вместе образуют мостик, при этом R3 представляет собой -O-, a R4 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)- или -CH2CH2-, и R3 и R4 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- и -O-CH2CH2-;
и R5 выбран из H и -CH3;
a Z выбран из S- и О-.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
- 132 036584 о
где X представляет собой конъюгирующую группу, содержащую GalNAc.
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
- 133 036584
В следующем варианте изобретение относится к соединению, содержащему следующую структуру:
где либо R1 представляет собой -OCH2CH2OCH3 (MOE), a R2 представляет собой H; или R1 и R2
- 134 036584 вместе образуют мостик, при этом R1 представляет собой -O-, a R2 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)или -CH2CH2-, и R1 и R2 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из: -O-CH2-, -OCH(CH3)- и -O-CH2CH2-;
и для каждой пары из R3 и R4 у одного кольца, независимо для каждого кольца, либо R3 выбран из H и -OCH2CH2OCH3, a R4 представляет собой H; или R3 и R4 вместе образуют мостик, при этом R3 представляет собой -O-, a R4 представляет собой -CH2-, -CH(CH3)- или -CH2CH2-, и R3 и R4 напрямую связаны так, что образующийся мостик выбран из -O-CH2-, -O-CH(CH3)- и -O-CH2CH2-;
R5 выбран из H и -CH3;
a Z выбран из S- и О-.
Терапевтические показания для TTR.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту TTR, для модулирования экспрессии TTR у субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессия TTR снижена.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту TTR, в фармацевтической композиции для лечения субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает заболеванием, расстройством или патологическим состоянием, связанным с транстиретином, или его симптомом. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние, связанное с транстиретином, представляет собой транстиретиновый амилоидоз. Амилоидоз, связанный с транстиретином, или транстиретиновый амилоидоз, или транстиретиновое амилоидное заболевание при использовании в настоящем документе представляет собой любую патологию или заболевание, связанное с дисфункцией или дисрегуляцией транстиретина, которая приводит к образованию содержащих транстиретин амилоидных фибрилл. Транстиретиновый амилоидоз включает, но не ограничивается ими, наследственный TTR амилоидоз, лептоменингеальный амилоидоз, семейную амилоидную полиневропатию (FAP), семейную амилоидную кардиомиопатию, семейный окулолептоменингеальный амилоидоз, старческий амилоидоз сердца или старческий системный амилоидоз.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения приведены способы применения конъюгированного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту TTR, для производства лекарственного средства.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту TTR, или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложено конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту TTR, для применения при лечении заболевания, расстройства, патологического состояния или его симптома, связанного с транстиретином. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние, связанное с транстиретином, представляет собой транстиретиновый амилоидоз.
Следует понимать, что любое из описанных в настоящем документе соединений можно применять в вышеупомянутых способах и применениях. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту TTR, в вышеупомянутых способах и применениях может включать, но не органичиваясь ими, конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, которое содержит по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19; конъюгированное антисмысловое соединение, нацеленное на SEQ ID NO: 2, которое содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 1219; соединение, содержащее или состоящее из ISIS 420915, ISIS 304299, ISIS 420921, ISIS 420922, ISIS 420950, ISIS 420955, ISIS 420957 или ISIS 420959 и конъюгирующие группы; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, описанный в WO 2011/139917 или US 8101743, полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки, и конъюгирующую группу; соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 8-160, 170-177, описанных в WO 2011/139917, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе; антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 12-89, описанных в US 8101743, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе; или соединение, содержащее антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований, комплементарную предпочтительному целевому сегменту любой из SEQ ID NO 90-133, описанных в US 8101743, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых справочных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.
E. Некоторые фармацевтические композиции.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены фармацевтические композиции, содержащие одно или более антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации изобретения такая фармацевтическая композиция содержит подходящий фармацевтически приемлемый раз- 135 036584 бавитель или носитель. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит стерильный солевой раствор и одно или более антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации изобретения такая фармацевтическая композиция состоит из стерильного солевого раствора и одного или более антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации изобретения стерильный солевой раствор представляет собой солевой раствор фармацевтической марки. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит одно или более антисмысловых соединений и стерильную воду. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция состоит из одного или более антисмысловых соединений и стерильной воды. В некоторых вариантах реализации изобретения стерильный солевой раствор представляет собой воду фармацевтической марки. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит одно или более антисмысловых соединений и фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция состоит из одного или более антисмысловых соединений и фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). В некоторых вариантах реализации изобретения стерильный солевой раствор представляет собой PBS фармацевтической марки.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными и/или инертными веществами для получения фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от множества критериев, включая, но не ограничиваясь этим, способ введения, тяжесть заболевания или дозу, подлежащую введению.
Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, содержат один или более олигонуклеотидов, которые при введении млекопитающему, включая человека, могут обеспечивать (прямо или косвенно) его биологически активный метаболит или остаток.
Соответственно, например, настоящее описание относится также к фармацевтически приемлемым солям антисмысловых соединений, пролекарствам, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и к другим биоэквивалентам. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соли натрия и калия.
Пролекарство может включать внедрение дополнительных нуклеозидов у одного или обоих концов олигонуклеотида, которые расщепляются в организме под действием эндогенных нуклеаз с образованием активного антисмыслового олигонуклеотида.
В многочисленных способах в терапиях с нуклеиновыми кислотами были применены липидные фрагменты. В некоторых таких способах нуклеиновую кислоту вводят в предварительно сформированные липосомы или липоплексы, полученные из смесей катионных липидов и нейтральных липидов. В некоторых способах получают ДНК комплексы с моно- или поликатионными липидами без участия нейтрального липида. В некоторых вариантах реализации изобретения липидный фрагмент выбран для улучшения распределения фармацевтического агента в определенной клетке или ткани. В некоторых вариантах реализации изобретения липидный фрагмент выбран для улучшения распределения фармацевтического агента в жировой ткани. В некоторых вариантах реализации изобретения липидный фрагмент выбран для улучшения распределения фармацевтического агента в мышечной ткани.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, представленные в настоящем документе, содержат один или более модифицированных олигонуклеотидов и одно или более вспомогательных веществ. В некоторых таких вариантах реализации изобретения вспомогательные вещества выбраны из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит систему доставки. Примеры систем доставки включают, но не ограничиваются ими, липосомы и эмульсии. Некоторые системы доставки подходят для получения некоторых фармацевтических композиций, включая композиции, содержащие гидрофобные соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют некоторые органические растворители, такие как диметилсульфоксид.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит одну или более тканеспецифичных молекул доставки, предназначенных для доставки одного или более фармацевтических агентов настоящего описания в определенную ткань или типы клеток. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифичным антителом.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит систему совместного растворителя. Некоторые такие системы совместных растворителей содержат, например, бензиловый спирт, неполярное поверхностно-активное вещество, смешиваемый с водой органический полимер и водную фазу. В некоторых вариантах реализации изобретения такие системы совместных растворителей применяют для гидрофобных соединений. Не ог
- 136 036584 раничивающий пример такой системы совместных растворителей представляет собой система совместных растворителей VPD, которая представляет собой раствор абсолютного этанола, содержащего 3% мас./об. бензилового спирта, 8% мас./об. неполярного поверхностно-активного вещества Polysorbate 80™ и 65% мас./об. полиэтиленгликоля 300. Пропорции таких систем совместных растворителей могут существенно варьироваться без значительного изменения их характеристик растворимости и токсичности. Кроме того, может варьироваться сущность компонентов совместных растворителей: например, вместо Polysorbate 80™ могут быть применены другие поверхностно-активные вещества; может варьироваться размер фракции полиэтиленгликоля; вместо полиэтиленгликоля могут быть применены другие биосовместимые полимеры, например поливинилпирролидон; и вместо декстрозы могут быть применены другие сахара или полисахариды.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию, представленную в настоящем документе, получают для перорального введения. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции получают для буккального введения.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию получают для введения инъекцией (например, внутривенной, подкожной, внутримышечной и т.д.). В некоторых таких вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит носитель и составлена в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. В некоторых вариантах реализации изобретения включены другие ингредиенты (например, ингредиенты, улучшающие растворимость или служащие консервантами). В некоторых вариантах реализации изобретения суспензии для инъекций получают при помощи подходящих жидких носителей, суспендирующих агентов и т.п. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представлены в форме разовой дозы, например, в ампулах, или в многодозовых контейнерах. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представляют собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных жидких носителях, и они могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Некоторые растворители, подходящие для применения в фармацевтических композициях для инъекций, включают, но не ограничиваются ими, липофильные растворители и жирные масла, такие как кунжутное масло, синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, и липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Такие суспензии могут также необязательно содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость фармацевтических агентов с обеспечением возможности получения высококонцентрированных растворов.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическую композицию получают для трансмукозального введения. В некоторых таких вариантах реализации изобретения в составе применяют пенетранты, соответствующие барьеру, через который необходимо проникнуть. Такие пенетранты общеизвестны в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержит олигонуклеотид в терапевтически эффективном количестве. В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтически эффективное количество является достаточным для предотвращения, облегчения или облегчения симптомов заболевания или для увеличения продолжительности жизни субъекта, подлежащего лечению. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах возможностей специалистов в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения один или более модифицированных олигонуклеотидов, представленных в настоящем документе, составляют в виде пролекарства. В некоторых вариантах реализации изобретения при введении in vivo пролекарство химически превращается в биологически, фармацевтически или терапевтически более активную форму олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения пролекарства пригодны благодаря тому, что их проще вводить, чем соответствующую активную форму. Например, в некоторых случаях пролекарство может быть более биодоступным (например, при пероральном введении), чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях пролекарство может обладать улучшенной растворимостью, по сравнению с соответствующей активной формой. В некоторых вариантах реализации изобретения пролекарства менее растворимы в воде, чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях такие пролекарства обладают превосходной передачей через клеточные мембраны, при этом растворимость в воде ухудшает их подвижность. В некоторых вариантах реализации изобретения пролекарство представляет собой сложный эфир. В некоторых таких вариантах реализации изобретения сложный эфир при введении метаболически гидролизуется до карбоновой кислоты. В некоторых случаях соединение, содержащее карбоновую кислоту, представляет собой соответствующую активную форму. В некоторых вариантах реализации изобретения пролекарство содержит короткий пептид (полиаминокислоту), связанный с кислотной группой. В некоторых таких вариантах реализации изобретения пептид расщепляется при введении с образованием соответствующей активной формы.
- 137 036584
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены композиции и способы снижения количества или активности целевой нуклеиновой кислоты в клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка находится в организме животного. В некоторых вариантах реализации изобретения животное представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах реализации изобретения животное представляет собой грызуна. В некоторых вариантах реализации изобретения животное представляет собой примата. В некоторых вариантах реализации изобретения животное представляет собой примата, не являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации изобретения животное представляет собой человека.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены способы введения животному фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид настоящего описания. Подходящие способы введения включают, но не ограничиваются ими, пероральный, ректальный, трансмукозальный, интестинальный, энтеральный, местный, суппозитории, через ингаляции, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутрибрюшинный, интраназальный, интраокулярный, внутриопухолевый и парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, интрамедуллярный и подкожный). В некоторых вариантах реализации изобретения вводят фармацевтические интратекальные средства для достижения местного, а не системного воздействия. Например, фармацевтические композиции могут быть введены инъекцией непосредственно в область желаемого эффекта (например, в печень).
Неограничивающее описание и включение посредством ссылки.
Несмотря на то, что некоторые соединения, композиции и способы, описанные в настоящем документе, были подробно описаны в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, следующие примеры служат лишь для иллюстрации соединений, описанных в настоящем документе, и их не следует считать их ограничением. Каждая из ссылок, номера доступа GenBank и подобные ссылки, упоминаемые в настоящей заявке, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
Некоторые соединения, композиции и способы в настоящем документе описаны как содержащие точно или содержащие только определенное количество конкретных элементов или характеристик. Такие описания использованы для обозначения того, что хотя соединение, композиция или способ может включать другие дополнительные элементы, количество конкретного элемента или характеристики представляет собой определенное число. Например, конъюгат, содержащий ровно один GalNAc представляет собой конъюгат, который содержит один и ровно один GalNAc, хотя он может содержать другие элементы, помимо указанного одного GalNAc.
Несмотря на то, что перечень последовательностей, сопровождающий этот файл, указывает каждую последовательность либо как РНК, либо как ДНК, по необходимости, в действительности эти последовательности могут быть модифицированы любой комбинацией химических модификаций. Специалистам в данной области техники понятно, что такое обозначение, как РНК или ДНК для описания модифицированных олигонуклеотидов, является в некоторых случаях произвольным. Например, олигонуклеотид, содержащий нуклеозид, содержащий 2'-OH сахарный фрагмент и тиминовое основание, может быть описан как ДНК, имеющая модифицированный сахар (2'-OH вместо природного 2'-H в ДНК) или как РНК, имеющая модифицированное основание (тимин (метилированный урацил) вместо природного урацила в РНК).
Соответственно, последовательности нуклеиновых кислот, представленные в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь ими, последовательности в перечне последовательностей, предназначены для охвата нуклеиновых кислот, содержащих любую комбинацию природных или модифицированных РНК и/или ДНК, включая, но не ограничиваясь ими, такие нуклеиновые кислоты, которые содержат модифицированные азотистые основания. В качестве дополнительного примера и без ограничения, олигонуклеотид, содержащий последовательность азотистых оснований ATCGATCG, охватывает любые олигонуклеотиды, имеющие такую последовательность азотистых оснований, модифицированных или немодифицированных, включая, но не ограничиваясь ими, такие соединения, которые содержат РНК основания, такие как те, которые имеют последовательность AUCGAUCG, и те, которые имеют некоторые ДНК основания и некоторые РНК основания, такие как AUCGATCG, а также олигонуклеотиды, имеющие другие модифицированные основания, такие как ATmeCGAUCG, где meC означает цитозиновое основание, содержащее метиловую группу в 5 положении.
Примеры
Следующие примеры иллюстрируют некоторые варианты реализации настоящего описания и не являются ограничивающими. Более того, если приведены конкретные варианты реализации, авторы изобретения подразумевают общее применение указанных конкретных вариантов реализации. Например, описание олигонуклеотида, содержащего конкретный мотив, дает обоснованное основание для дополнительных олигонуклеотидов, содержащих такой же или похожий мотив. И, например, если конкретная высокоаффинная модификация возникает в определенном положении, то в этом же положении считаются подходящими другие высокоаффинные модификации, если не указано иное.
Пример 1. Общий способ получения фосфорамидитов соединений 1, 1a и 2
- 138 036584
Bx представляет собой гетероциклическое основание.
Соединения 1, 1a и 2 получили по методикам, общеизвестным в данной области техники, описан ным в данном описании (см. Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010,
75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); и см. также опубликованные ме ждународные заявки PCT (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2009/143369, WO
2009/006478 и WO 2007/090071) и патент США 7569686).
Пример 2. Получение соединения 7
Соединение 3 (2-ацетамидо-1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-дезокси-β-D-галактопираноза или галактозамина пентаацетат) имеется в продаже. Соединение 5 получили по опубликованным методикам (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).
Пример 3. Получение соединения 11
Соединения 8 и 9 имеются в продаже.
Пример 4. Получение соединения 18
- 139 036584
Соединение 11 получили по способам, описанным в примере 3. Соединение 14 имеется в продаже.
Соединение 17 получили по такому же способу, как описан в публикации Rensen et al., J. Med. Chem.,
2004, 47, 5798-5808.
Пример 5. Получение соединения 23 но
1. TBDM SCI, ДМФА, имидазол, комн, т-ра (95 %} 19 он
О О 1 НзСО^^ОН 21
HBTU. DIEA
ДМФА, комн, т-ра (65%} но
2. Pd/C, Н;. МеОН. комн, т-ра 87%
2. TE.A.3HF, TEA, ТГФ (72%)
DM ТО
О
О
1. DMTQ, руг.
комн. т-ра (75%)
2. LiOH, диоксан (97%) о
20 0TBDM3
он он i 22 ОН
Соединения 19 и 21 имеются в продаже.
Пример 6. Получение соединения 24
АсООАс
АсО
Соединения 18 и 23 получили так, как описано в способах в примерах 4 и 5.
Пример 7. Получение соединения 25
А сО ОА с
- 140 036584
Соединение 24 получили по способам, представленным в примере 6.
Пример 8. Получение соединения 26
АсО ОАс
Соединение 24 получили по способам, представленным в примере 6.
Пример 9. Общее получение конъюгированных ASO, содержащих GalNAc3-1 на 3'-конце, соединения 29
- 141 036584
где защищенный GalNAc3-1 имеет структуру
Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-1 (GalNAc3-1a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc3-1a имеет формулу
Твердую подложку, связывающую защищенный GalNAc3-1, соединение 25, получили по способам, представленным в примере 7. Олигомерное соединение 29, содержащее GalNAc3-1 на 3'-конце, получили по стандартным методикам в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. ред., 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамидитные строительные блоки, соединения 1 и 1a, получили по способам, представленным в примере 1. Изображенные фосфорамидиты являются иллюстративными и не предназначены для ограничения, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки для получения олигомерных соединений, имеющих желаемую последовательность и состав. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения разорванных олигомерных соединений, описанных в настоящем документе. Такие разорванные олигомерные соединения могут иметь желаемый состав и последовательность оснований, продиктованную любой данной мишенью.
Пример 10. Общее получение конъюгированных ASO, содержащих GalNAc3-1 на 5'-конце, соединения 34
- 142 036584
Unylinker™ 30 имеется в продаже. Олигомерное соединение 34, содержащее кластер GalNAc3-1 на 5'-конце, получили по стандартным способам в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed, 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамидитные строительные блоки, соединения 1 и 1a, получили по способам, представленным в примере 1. Изображенные фосфорамидиты являются иллюстративными и не предназначены для ограничения, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки для получения олигомерного соединения, имеющего желаемую последовательность и состав. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения разорванных олигомерных соединений, описанных в настоящем документе. Такие разорванные олигомерные соединения могут иметь желаемый состав и последовательность оснований, продиктованную любой данной мишенью.
- 143 036584
Пример 11. Получение соединения 39
Соединения 4, 13 и 23 получили по способам, описанным в примерах 2, 4 и 5. Соединение 35 получили по таким же способам, как описаны в публикации Rouchaud et al., Em. J. Org. Chem., 2011, 12, 23462353.
Пример 12. Получение соединения 40
AcO OAc
Соединение 38 получили по способам, представленным в примере 11.
- 144 036584
Пример 13. Получение соединения 44
AcHN
Соединения 23 и 36 получили по способам, представленным в примерах 5 и 11. Соединение 41 получили по таким же способам, как описаны в публикации WO 2009082607.
- 145 036584
1. Н2. Pd/C.MeOH
Пример 14. Получение соединения 45
АсО ОАс
2. HBTU. DIEA. ДМФА Соединение 23
__...ODMT
Соединение 43 получили по способам, представленным в примере 13.
Пример 15. Получение соединения 47
Соединение 46 имеется в продаже.
Пример 16. Получение соединения 53
- 146 036584
Соединения 48 и 49 имеются в продаже. Соединения 17 и 47 получили так, как описано в способах в примерах 4 и 15.
Пример 17. Получение соединения 54
Тиофосф орилированне
Соединение 53 получили по способам, представленным в примере 16.
Пример 18. Получение соединения 55
Соединение 53 получили по способам, представленным в примере 16.
Пример 19. Общий способ получения конъюгированных ASO, содержащих GalNAc3-1 в 3'положении, при помощи твердофазных методик (получение ISIS 647535, 647536 и 651900).
Если не указано иное, все реагенты и растворы, применяемые для синтеза олигомерных соединений, приобретены у коммерческих поставщиков. Стандартные фосфорамидитные строительные блоки и твердую подложку применили для внедрения нуклеозидных остатков, которые включают, например, остатки T, A, G и mC. 0,1 М раствор фосфорамидита в безводном ацетонитриле применили для β-Ο-2'дезоксирибонуклеозида и 2'-MOE.
Синтез антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) выполнили на синтезаторе ABI 394 (в масштабе 12 мкмоль) или на синтезаторе АКТА Oligopilot производства GE Healthcare Bioscience (в масштабе 40200 мкмоль) по способу фосфорамидитного связывания на твердой подложке VIMAD, наполненной GalNAc3-1 (110 мкмоль/г, Guzaev et al., 2003), упакованной в колонку. Для стадии связывания фосфора- 147 036584 мидиты вводили в 4-кратном избытке по сравнению с загрузкой на твердой подложке, а конденсацию фосфорамидита выполняли в течение 10 мин. Все остальные стадии выполняли по протоколам, предоставленным производителем. Для удаления диметокситритильной (DMT) группы с 5'-гидроксильной группы нуклеотида применили 6% раствор дихлоруксусной кислоты в толуоле. На стадии связывания в качестве активатора применили 4,5-дицианоимидазол (0,7М) в безводном CH3CN. Тиофосфатные связи внедряли сульфированием при помощи 0,1М раствора гидрида ксантана в 1:1 смеси пиридина/CH3CN в течение 3 мин времени контакта. В качестве окислительного агента для обеспечения фосфодиэфирных межнуклеозидных связей применили 20% раствор трет-бутилгидропероксида в CH3CN, содержащий 6% воды, в течение 12 мин времени контакта.
После сборки желаемой последовательности цианоэтилфосфатные защитные группы снимали при помощи 1:1 (об./об.) смеси триэтиламина и ацетонитрила в течение 45 мин времени контакта. Связанные с твердой подложкой ASO суспендировали в водном растворе аммиака (28-30 мас.%) и нагревали при 55°С в течение 6 ч.
Затем отфильтровывали не связанные ASO и выпаривали аммиак кипячением. Остаток очищали жидкостной хроматографией высокого давления на сильной анионообменной колонке (GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 мкм, 2,54x8 см, A = 100 мМ ацетата аммония в 30% водном CH3CN, В = 1,5 М NaBr в А, 0-40% В за 60 мин, скорость потока 14 мл-мин-1, λ = 260 нм). Остаток обессоливали при помощи ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с получением желаемых ASO с выделенным выходом 15-30% относительно первоначальной загрузки на твердую подложку. ASO характеризовали при помощи ионпарной ВЭЖХ, совмещенной с МС-анализом на системе Agilent 1100 MSD.
Антисмысловые олигонуклеотиды, не содержащие конъюгат, синтезировали по стандартным способам синтеза олигонуклеотидов, общеизвестным в данной области техники.
Применяя эти способы, получили три отдельных антисмысловых соединения, нацеленных на ApoC III. Как показано ниже в табл. 4, каждое из трех антисмысловых соединений, нацеленных на ApoC III, имеет одну и ту же последовательность азотистых оснований. ISIS 304801 представляет собой 5-10-5 MOE гэпмер, содержащий только тиофосфатные связи; ISIS 647535 является таким же, как ISIS 304801, за исключением того, что он содержит GalNAc3-1, конъюгированный у его 3'-конца; и ISIS 647536 является таким же, как ISIS 647535, за исключением того, что некоторые межнуклеозидные связи этого соединения представляют собой фосфодиэфирные связи. Как дополнительно показано в табл. 4, были синтезированы два отдельных антисмысловых соединения, нацеленных на SRB-1. ISIS 440762 представляет собой 2-10-2 cEt гэпмер, содержащий только тиофосфатные межнуклеозидные связи; ISIS 651900 является таким же, как ISIS 440762, за исключением того, что он содержит GalNAc3-1 у его 3'-конца.
Таблица 4
Модифицированные ASO, нацеленные на ApoC III и SRB-1
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Мише нь Расчеты ая масса Наблюдае мая масса SE Q ID No.
ISIS 3048 01 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCdsAdsGdsmCds TesTesTesAesTe ApoC III 7165,4 7164,4 20
ISIS 6475 35 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCdsAdsGdsmCdsTesTes Tes AgsT eo Ado’-GalNAc3-1 a ApoC III 9239,5 9237,8 21
ISIS 6475 36 AesGeomCeoTeoTeomCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCdsAdsGdsmCdsTeoTe oTesAesTeoAdo’- GalNAc3-la ApoC III 9142,9 9140,8 21
ISIS 4407 62 TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTksmCk SRB-1 4647,0 4646,4 22
ISIS 6519 00 TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTks mCkoAdo’GalNAc3-la SRB-1 6721,1 6719,4 23
Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает e-D-2'дезоксирибонуклеозид; k означает 6'-(S)-CH3 бициклический нуклеозид (например, cEt); s означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); o означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Верхний индекс m означает 5-метилцитозины. GalNAc3-1 означает конъюгирующую группу, имеющую структуру, изображенную ранее в примере 9. Следует отметить, что GalNAc3-1 содержит расщепляемый аденозин, который связывает ASO с остальной частью конъюгата, который обозначен как GalNAc3-1a. Номенклатура, используемая в представленной выше таблице, показывает полную последовательность азотистых оснований, включая аденозин, который является частью конъюгата. Следовательно, в представленной выше таблице последовательности также могут быть перечислены с окончанием GalNAc3-1, без Ad0. Такое условное применение нижнего индекса a для обозначения части конъюгирующей группы, не содержащей расщепляемого нуклеозида
- 148 036584 или расщепляемого фрагмента, применяется во всех представленных примерах. Эта часть конъюгирующей группы, не содержащая расщепляемого фрагмента, упоминается в настоящем документе как кластер или кластер конъюгата или кластер GalNAc3. В некоторых случаях конъюгирующая группа для удобства описана путем отдельного представления ее кластера и ее расщепляемого фрагмента.
Пример 20. Дозозависимое антисмысловое ингибирование человеческого ApoC III у huApoC III трансгенных мышей.
ISIS 304801 и ISIS 647535, каждый из которых нацелен на человеческий ApoC III и описан выше, отдельно испытывали и оценивали в дозозависимом исследовании на их способность ингибировать человеческий ApoC III у трансгенных мышей с человеческим ApoC III.
Лечение.
Трансгенных мышей с человеческим ApoC III выдерживали при 12-часовом цикле освещения/темноты и обеспечивали свободный доступ к пище Teklad lab. До начала эксперимента животных акклиматизировали по меньшей мере в течение 7 дней в исследовательской лаборатории. Приготовили ASO в PBS и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 мкм. ASO растворили в 0,9% PBS для инъекций.
Трансгенным мышам с человеческим ApoC III один раз в неделю в течение двух недель внутрибрюшинно вводили инъекции ISIS 304801 или 647535 при 0,08, 0,25, 0,75, 2,25 или 6,75 мкмоль/кг или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Через 48 ч после введения последней дозы каждую мышь обескровили, умертвили и собрали ткани.
Анализ мРНК ApoC III.
Уровни мРНК ApoC III в печени мышей определили при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК ApoC III определяли относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК ApoC III для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и обозначены как % PBS. Ниже в табл. 5 представлена также полумаксимальная эффективная доза (ED50) для каждого ASO.
Показано, что оба антисмысловых соединения снижают РНК ApoC III по сравнению с контрольным образцом, обработанным PBS. Кроме того, антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc3-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc3-1 (ISIS 304801).
Таблица 5
Влияние ASO лечения на уровни мРНК ApoC III у трансгенных мышей с человеческим ApoC III
ASO Доза (мкмоль/кг) % PBS ED50 (мкмоль/кг) 3 ’ -конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQ ГО NO.
PBS 0 100 — - —
ISIS 304801 0,08 95 0,77 Нет PS/20 20
0,75 42
2,25 32
6,75 19
ISIS 647535 0,08 50 0,074 GalNAc3-l PS/20 21
0,75 15
2,25 17
6,75 8
Анализ белка ApoC III (турбидиметрический анализ).
Анализ белка ApoC III в плазме выполнили по способам, описанным в работе Graham et al., Circulation Research, до печати, опубликованной онлайн 29 марта 2013 г.
Около 100 мкл плазмы, выделенной из мышей, анализировали без разбавления, применяя клинический анализатор Olympus и имеющийся в продаже турбидиметрический аналитический набор ApoC III (Kamiya, кат. № KAI-006, Kamiya Biomedical, Сиэтл, штат Вашингтон). Протокол анализа выполняли по описанию поставщика.
Как показано ниже в табл. 6, оба антисмысловых соединения снижают белок ApoC III по сравнению с PBS контрольным образцом. Кроме того, антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc3-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc3-1 (ISIS 304801).
- 149 036584
Таблица 6
Влияние ASO лечения на уровни белка ApoC III в плазме у трансгенных мышей .с человеческим ApoC III
ASO Доза (мкмоль/кг) % PBS EDso (мкмоль/кг) 3’- конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQID NO.
PBS 0 100 — — —
ISIS 304801 0,08 86 0,73 Нет PS/20 20
0,75 51
2,25 23
6,75 13
ISIS 647535 0,08 72 0,19 GalNAc3-l PS/20 21
0,75 14
2,25 12
6,75 И
Триглицериды и холестерин плазмы выделили по способу Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) (Bligh, E. and Dyer, W., Can. J. Biochem. Physiol, 37, 911-917, 1959) (Bligh, E. and Dyer, W., Can. J. Biochem. Physiol, 37, 911-917, 1959) и измерили при помощи клинического анализатора Beckmann Coulter и имеющихся в продаже реагентов.
Уровни триглицеридов измерили относительно мышей, инъецированных PBS, и выразили как % PBS. Результаты представлены в табл. 7. Показано, что оба антисмысловых соединения снижают уровни триглицеридов. Кроме того, антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc3-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc3-1 (ISIS 304801).
Таблица 7
Влияние ASO лечения на уровни триглицеридов у трансгенных мышей
ASO Доза (мкмоль/кг) % PBS ED50 (мкмоль/кг) 3’- конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQ ID NO.
PBS 0 100 - - -
ISIS 304801 0,08 87 0,63 Нет PS/20 20
0,75 46
2,25 21
6,75 12
ISIS 647535 0,08 65 0,13 GalNAc31 PS/20 21
0,75 9
2,25 8
6,75 9
Образцы плазмы анализировали при помощи ВЭЖХ для определения количества общего холестерина и различных фракций холестерина (HDL и LDL). Результаты представлены в табл. 8 и 9. Показано, что оба антисмысловых соединения снижают общие уровни холестерина; оба снижают LDL; и оба повышают HDL. Кроме того, антисмысловое соединение, конъюгированное с GalNAc3-1 (ISIS 647535), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc3-1 (ISIS 304801). Увеличение уровней HDL и снижение уровней LDL представляет собой благоприятный сердечно-сосудистый эффект антисмыслового ингибирования ApoC III.
- 150 036584
Таблица 8
Влияние ASO , лечения на уровни общего холестерина у трансгенных мышей
ASO Доза (мкмоль/кг) Общий холестерин (мг/дл) 3’- конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQ ID NO.
PBS 0 257 — —
ISIS 304801 0,08 226 Нет PS/20 20
0,75 164
2,25 110
6,75 82
ISIS 647535 0,08 230 GalNAcs1 PS/20 21
0,75 82
2,25 86
6,75 99
Таблица 9
Влияние ASO лечения на уровни HDL и LDL холестерина у трансгенных . мышей
ASO Доза (мкмоль/кг) HDL (мг/дл) LDL (мг/дл) 3’- конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQ ID NO.
PBS 0 17 28 — —
ISIS 304801 0,08 17 23 Нет PS/20 32
0,75 27 12
2,25 50 4
6,75 45 2
ISIS 647535 0,08 21 21 GalNAcs1 PS/20 111
0,75 44 2
2,25 50 2
6,75 58 2
Фармакокинетический анализ (ФК).
Оценили также ФК ASO. Образцы печени и почек измельчили и экстрагировали по стандартным протоколам. Образцы анализировали на MSD1 при помощи ИП-ВЭЖХ-МС. Определили содержание (мкг/г) в ткани ISIS 304801 и 647535 полной длины, результаты представлены в табл. 10. Показано, что концентрации в печени антисмысловых соединений полной длины были схожими для двух антисмысловых соединений. Следовательно, даже несмотря на то, что GalNAc3-1-конъюгированное антисмысловое соединение является более активным в печени (как показано по данным РНК и белка, представленным выше), его содержание в печени не намного выше. Действительно, рассчитанное значение EC50 (представленное в табл. 10) подтверждает, что наблюдаемое увеличение эффективности конъюгированного соединения не может быть приписано исключительно повышенному накоплению. Такой результат позволяет предположить, что конъюгат улучшает эффективность по другому механизму, чем простое нако пление в печени, возможно за счет увеличения продуктивного захвата антисмыслового соединения в клетки.
Эти результаты показывают также, что концентрация GalNAc3-1-конъюгированного антисмыслового соединения в почках ниже, чем концентрация антисмыслового соединения, не содержащего конъюгат GalNAc. Это имеет несколько благоприятных терапевтических эффектов. Для терапевтических показаний, в которых не требуется проявление активности в почках, воздействие на почки подвергает их риску токсичности без соответствующей пользы. Более того, высокая концентрация в почках обычно приводит к выводу соединения с мочой, обеспечивая более быстрое выведение. Соответственно, для внепочечных мишеней накопление в почках является нежелательным. Эти данные позволяют предположить, что конъюгирование с GalNAc3-1 снижает накопление в почках.
- 151 036584
Таблица 10
ФК анализ ASO лечения у трансгенных мышей
ASO ISIS 304801 Доза (мкмоль/кг) θ,ι 0,8 2,3 Печень (мкг/г) 5,2 62,8 142,3 Почки (мкг/г) 2,1 119,6 191,5 ЕС 50 в печени (мкг/г) 53 3’конъюгат Нет Межнуклеозидная связь/длина PS/20 SEQ ID NO. 20
6,8 202,3 337,7
ISIS 647535 ο,ι 3,8 0,7 3,8 GalNAcj1 PS/20 21
0,8 72,7 34,3
2,3 106,8 111,4
6,8 237,2 179,3
Идентифицировали также метаболиты ISIS 647535 и подтвердили их массы при помощи массспектрометрического анализа высокого разрешения. Сайты расщепления и структуры наблюдаемых метаболитов представлены ниже. Относительный % от общей длины ASO рассчитали по стандартным приемам, а результаты представлены в табл. 10a. Основной метаболит ISIS 647535 представляет собой ASO полной длины без всего конъюгата (т.е. ISIS 304801), который образуется в результате расщепления по сайту расщепления A, представленному ниже. Кроме того, наблюдали также дополнительные метаболиты, образующиеся из других сайтов расщепления. Эти результаты позволяют предположить, что может быть пригодным также внедрение других расщепляемых связей, таких как сложные эфиры, пептиды, дисульфиды, фосфорамидаты или ацил-гидразоны, между сахаром GalNAc3-1 и ASO, которые могут расщепляться под действием ферментов внутри клетки, или которые могут расщепляться в восстановительной среде цитозоля, или которые лабильны в кислотном pH внутри эндосом и лизосом.
Таблица 10a
Наблюдаемые метаболиты полной длины ISIS 647535
Метаболит ASO Сайт расщепления Относительный %
1 ISIS 304801 А 36,1
2 ISIS 304801 +dA В 10,5
3 ISIS 647535 минус [3 GalNAc] С 16,1
ISIS 647535 минус
4 [3 GalNAc + 1 связка 5-гидрокси-пентановой кислоты] D 17,6
ISIS 647535 минус
5 [2 GalNAc + 2 связки 5-гидроксипентановой кислоты] D 9,9
ISIS 647535 минус D
6 [3 GalNAc + 3 связки 5-гидроксипентановой кислоты] 9,8
- 152 036584
Сайты расщепления.
153 036584
Пример 21. Антисмысловое ингибирование человеческого ApoC III у трансгенных мышей с ApoC
III в исследовании одного введения.
ISIS 304801, 647535 и 647536, каждый из которых нацелен на человеческий ApoC III и описан в табл. 4, дополнительно оценивали в исследовании однократного введения на их способность ингибировать человеческий ApoC III у трансгенных мышей с человеческим ApoC III.
Лечение.
Трансгенных мышей с человеческим ApoC III выдерживали при 12-часовом цикле освещения/темноты и обеспечивали свободный доступ к пище Teklad lab. До начала эксперимента животных акклиматизировали по меньшей мере в течение 7 дней в исследовательской лаборатории. Приготовили ASO в PBS и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 мкм. ASO растворили в 0,9% PBS для инъекций.
Трансгенным мышам с человеческим ApoC III внутрибрюшинно ввели однократную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 304801, 647535 или 647536 (описанных выше), или PBS в качестве контрольного образца. Экспериментальная группа состояла из 3 животных, а контрольная группа состояла из 4 животных. Перед лечением, а также после последней дозы у каждой мыши брали кровь и анализировали образцы плазмы. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения.
Образцы собрали и анализировали для определения уровней мРНК ApoC III и белка в печени; триглицеридов в плазме и холестерина, включая фракции HDL и LDL, которые анализировали так, как описано выше (пример 20). Данные этих анализов представлены ниже в табл. 11-15. Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Уровни ALT и AST показали, что антисмысловые соединения хорошо переносятся при всех введенных дозах.
Эти результаты демонстрируют усиление эффективности антисмысловых соединений, содержащих конъюгат GalNAc3-1 на 3'-конце (ISIS 647535 и 647536), по сравнению с антисмысловым соединением, не содержащим конъюгат GalNAc3-1 (ISIS 304801). Кроме того, ISIS 647536, который содержит конъюгат GalNAc3-1 и несколько фосфодиэфирных связей, был таким же эффективным, как ISIS 647535, который содержит тот же конъюгат, и все межнуклеозидные связи в этом ASO являются тиофосфатными.
Таблица 11
Влияние ASO лечения на уровни мРНК ApoC III .у трансгенных мышей с человеческим ApoC III
ASO Доза (мг/кг) %PBS ED50 (мг/кг) 3’- конъюгат Межнуклеози дная связь/длина SEQ ГО NO.
PBS 0 99 — - —
1 104
ISIS 304801 3 10 92 71 13,2 Нет PS/20 20
30 40
о,з 98
ISIS 1 70 1,9 GalNAcs- PS/20 21
647535 3 33 1
10 20
о,з 103
ISIS 1 60 1,7 GalNAcs- PS/PO/20 0 1
647536 3 31 1 21
10 21
- 154 036584
Таблица 12
Влияние ASO лечения на уровни белка ApoC III в плазме у трансгенных мышей с человеческим ApoC III
ASO Доза % ED50 3’- Межнуклеозидная SEQ ГО
(мг/кг) PBS (мг/кг) конъюгат связь/длина NO.
PBS 0 99 - - -
1 104 23,2
ISIS 3 92 Нет PS/20 20
304801 10 71
30 40
ОД 98 2,1
ISIS 1 70 GalNAcs- PS/20 21
647535 3 33 1
10 20
о,з 103 1,8
ISIS 1 60 GalNAcs- PS/PO/20 21
647536 1
3 31
10 21
Таблица 13
Влияние . ASO лечения на . уровни триглицеридов у трансгенных мышей
ASO Доза (мг/кг) % PBS ED50 (мг/кг) конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQ ГО NO.
PBS 0 98 - - -
ISIS 304801 1 80 29,1 Нет PS/20 20
3 92
10 70
30 47
ISIS 647535 о,з 100 2,2 GalNAc3- 1 PS/20 21
1 70
3 34
10 23
ISIS 647536 0,3 95 1,9 GalNAcs1 PS/PO/20 21
1 66
3 31
10 23
- 155 036584
Таблица 14
Влияние ASO лечения на . уровни общего холестерина у трансгенных мышей
ASO Доза (мг/кг) %PBS 3’- конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQID NO.
PBS 0 96 — —
ISIS 304801 1 104 Нет PS/20 20
3 96
10 86
30 72
ISIS 0,3 93 GalNAc3-l PS/20 21
647535 1 85
3 61
10 53
ISIS 647536 0,3 115 GalNAc3-l PS/PO/20 21
1 79
3 51
10 54
Таблица 15
Влияние ASO лечения на уровни HDL и LDL холестерина у трансгенных мышей
Эти результаты подтверждают, что конъюгат GalNAc3-1 улучшает эффективность антисмыслового соединения. Эти результаты показывают также равную эффективность GalNAc3-1-конъюгированных антисмысловых соединений, в которых антисмысловые олигонуклеотиды имеют смешанные связи (ISIS 647536, который имеет шесть фосфодиэфирных связей), и полностью тиофосфатной версии того же антисмыслового соединения (ISIS 647535).
Тиофосфатные связи обеспечивают несколько свойств антисмысловых соединений. Например, они устойчивы к нуклеазному расщеплению и связываются с белками, что приводит к накоплению соединения в печени, а не в почках/моче. Эти свойства являются желательными, особенно при лечении показаний в печени. Однако тиофосфатные связи связаны также с воспалительной реакцией. Соответственно, уменьшение количества тиофосфатных связей в соединении предположительно снижает риск воспаления, но снижает также концентрацию соединения в печени, повышает концентрацию в почках и моче, снижает стабильность в присутствии нуклеаз и уменьшает общую эффективность. Представленные результаты демонстрируют, что GalNAc3-1-конъюгированное антисмысловое соединение, в котором некоторые тиофосфатные связи заменены фосфодиэфирными связями, настолько же эффективно против ми- 156 036584 шени в печени, как и аналог, содержащий только тиофосфатные связи. Такие соединения предположительно являются менее провоспалительными (см. пример 24, в котором описан эксперимент, демонстрирующий, что уменьшение тиофосфатов (PS) приводит к снижению воспалительного действия).
Пример 22. Влияние модифицированного GalNAc3-1-конъюгированного ASO, нацеленного на SRB1, in vivo.
ISIS 440762 и 651900, каждый из которых нацелен на SRB-1 и описан в табл. 4, оценили в дозозависимом исследовании на их способность ингибировать SRB-1 у Balb/c мышей.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 440762, 651900 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 48 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК SRB-1 определяли относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и обозначены как % PBS.
Как показано в табл. 16, оба антисмысловых соединения снижают уровни мРНК SRB-1. Кроме того, антисмысловое соединение, содержащее конъюгат GalNAc3-1 (ISIS 651900), было значительно более эффективным, чем антисмысловое соединение, не содержащее конъюгат GalNAc3-1 (ISIS 440762). Эти результаты демонстрируют, что преимущество эффективности конъюгатов GalNAc3-1 наблюдается при применении антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных различным мишеням и имеющих различные химически модифицированные нуклеозиды, в этом случае модифицированные нуклеозиды содержат стерически затрудненные этил-сахарные фрагменты (бициклический сахарный фрагмент).
Таблица 16
Влияние ASO лечения на уровни мРНК SRB-1 у мышей Balb/c
ASO Доза (мг/кг) Пече нь % PBS ED50 (мг/кг) 3’конъюгат Межнуклео зидная связь/длина SEQ ГО NO.
PBS 0 100 - —
ISIS 440762 0,7 85 2,2 Нет PS/14 22
2 55
7 12
20 3
ISIS 651900 0,07 98 о,з GalNAc3-l PS/14 23
0,2 63
0,7 20
2 6
7 5
Пример 23. Протокол анализа человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (hPBMC).
Анализ hPBMC выполнили при помощи пробирочного способа BD Vautainer CPT.
Получили образец цельной крови, полученной от доноров-добровольцев, давших информированное согласие в Медицинской клинике США (Faraday & El Camino Real, Карлсбад), и собрали его в 4-15 пробирки BD Vacutainer CPT по 8 мл (VWR, кат. № BD362753). Приблизительный исходный общий объем цельной крови в пробирках CPT для каждого донора записали в формуляре анализа PBMC.
Перед центрифугированием образец крови незамедлительно повторно перемешали, осторожно переворачивая пробирки 8-10 раз. Пробирки CPT центрифугировали при комнатной температуре (18-25°С) в горизонтальном (с избыточной поворачиваемостью) роторе в течение 30 мин с фактором разделения (RCF) 1500-1800 с затормаживанием (2700 об/мин Beckman Allegra 6R). Клетки сняли с лейкоцитарной поверхности раздела (между слоями фиколла и полимерного геля); перенесли в стерильную 50 мл коническую пробирку и сгруппировали по 5 CPT пробирок/50 мл коническая пробирка/донор. Затем клетки дважды промыли PBS (без Ca++, Mg++; GIBCO). Пробирки пополнили до 50 мл и перемешали, переворачивая несколько раз. Затем образец центрифугировали при 330xg в течение 15 мин при комнатной температуре (1215 об/мин в Beckman Allegra 6R) и аспирировали максимальное количество надосадочной жидкости, не нарушая осадок. Клеточный осадок сняли, осторожно поворачивая пробирку, и повторно суспендировали клетки в RPMI+10% FBS+пенициллин/стрептомицин (~1 мл/10 мл исходного объема цельной крови). Пипеткой взяли 600 мкл образца и поместили во флакон с пробой (Beckman Coulter),
- 157 036584 содержащий 600 мкл реагента VersaLyse (Beckman Coulter, кат. № A09777), и осторожно перемешивали на вортексе в течение 10-15 с. Образец оставили инкубироваться в течение 10 мин при комнатной температуре и снова перемешали перед подсчетом. Суспензию клеток считывали на анализаторе жизнеспособности клеток Vicell XR (Beckman Coulter), используя клетки типа PBMC (сохранили фактор разбавления 1:11 с другими параметрами). Записали количество живых клеток/мл и жизнеспособность. Клеточную суспензию разбавили до 1 х 107 живых PBMC/мл в RPMI+10% FBS+пенициллин/стрептомицин.
Клетки поместили на планшет при 5х105 в 50 мкл/лунку 96-луночного тканевого культурального планшета (Falcon Microtest). 50 мкл/лунку 2х концентрации олигомеров/контроля, разбавленных в RPMI+10% FBS+пенициллин/стрептомицин, добавили в соответствии с экспериментальной матрицей (в целом 100 мкл/лунку). Планшеты поместили на шейкер и оставили перемешиваться приблизительно на 1 мин. После инкубации в течение 24 ч при 37°С; 5% CO2, планшеты центрифугировали при 400xg в течение 10 мин, затем удалили надосадочную жидкость для анализа цитокинов MSD (т.е. человеческих IL-6, IL-10, IL-8 и MCP-1).
Пример 24. Оценка провоспалительных эффектов в анализе hPBMC для GalNAc3-1конъюгированных ASO.
Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), перечисленные в табл. 17, оценили на провоспалительное действие в анализе hPBMC, используя протокол, описанный в примере 23. ISIS 353512 представляет собой внутренний стандарт, который, как известно, обладает высоким ответом на высвобождение IL-6 в этом анализе. hPBMC выделили из свежых образцов, полученных от доноров-добровольцев, и обработали ASO в концентрациях 0, 0,0128, 0,064, 0,32, 1,6, 8, 40 и 200 мкМ. Через 24 ч обработки измерили уровни цитокинов.
Уровни IL-6 применили в качестве первичного показания. EC50 и Emax рассчитали по стандартным способам. Результаты выразили как среднее отношение Emax/EC50 для двух доноров и обозначили как Emax/EC50. Более низкое соотношение означает относительное снижение провоспалительного ответа, а более высокое соотношение означает относительное увеличение провоспалительного ответа.
В отношении исследуемых соединений наименее провоспалительным соединением было ASO, соединенное при помощи PS/PO (ISIS 616468). GalNAc3-1-конъюгированное ASO, ISIS 647535, было немного менее провоспалительным, чем его неконъюгированный аналог, ISIS 304801. Эти результаты показывают, что внедрение нескольких PO связей снижает провоспалительную реакцию, а добавление конъюгата GalNAc3-1 не делает соединение более провоспалительным и может снижать провоспалительную реакцию. Соответственно, можно ожидать, что антисмысловое соединение, содержащее смешанные PS/PO связи и конъюгат GalNAc3-1, может вызывать более слабые провоспалительные реакции по сравнению с антисмысловым соединением, связанным только посредством PS, с конъюгатом GalNAc3-1 или без него. Эти результаты показывают, что GalNAc3-1-конъюгированные антисмысловые соединения, в частности соединения, имеющие меньшее содержание PS, являются менее провоспалительными.
В целом, эти результаты позволяют предположить, что GalNAc3-1-конъюгированное соединение, в частности соединение со сниженным содержанием PS, может быть введено в более высокой дозе, чем аналогичное полностью PS антисмысловое соединение без конъюгата GalNAc3-1. Поскольку не ожидается, что период полувыведения для этих соединений будет существенно различаться, то такое введение в более высокой дозе обусловит менее частое введение доз. В действительности, такое введение может быть еще более редким, поскольку GalNAc3-1-конъюгированные соединения являются более эффективными (см. примеры 20-22), а повторное введение дозы необходимо только при снижении концентрации соединения ниже желаемого уровня, при этом такой желаемый уровень обусловлен эффективностью.
Таблица 17
Модифицированные ASO
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Мишень SEQ ID NO.
ISIS 104838 GesmCesT esGes AesTdsT ds AdsGds AdsGds AdsGdsAdsGdsGesTesmCesmCesmCe TNFD 24
ISIS 353512 TesmCesmCesmCdsAdsTdsTdsTdsmCds AdsGds GdsAdsGdsAdsmCdsmCdsTesGesGe CRP 25
ISIS 304801 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTds mCdsmCdsAdsGdsmCds TesTesTesAesTe ApoC III 20
ISIS 647535 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTds mCdsmCdsAdsGdsmCdsTesTesTesAesTeoAdo’-GalNAc3-la ApoC III 21
ISIS 616468 AeSGeomCeoT eo T eomCdsTdsT dsGdsT ds mCdsmCds AdsGds mCdsT eoT eoT es AesTe ApoC III 20
Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-ϋ-2'дезоксирибонуклеозид; k означает 6'-(S)-CH3 бициклический нуклеозид (например, cEt); s означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); o означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи
- 158 036584 (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Верхний индекс m означает 5-метилцитозины. Ad0‘-GalNAc3-1a означает конъюгат, имеющий структуру GalNAc3-1, представленную в примере 9, присоединенный к 3'концу указанного антисмыслового олигонуклеотида.
Таблица 18
Провоспалительное действие ASO, нацеленных на ApoC III, в анализе hPBMC
ASO ЕС50 Emax Emax/ECso 3’- конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQ ГО No.
(мкМ) (мкМ)
ISIS 353512 (с высоким ответом) 0,01 265,9 26,590 Нет PS/20 25
ISIS 304801 0,07 106,55 1,522 Нет PS/20 20
ISIS 647535 0,12 138 1,150 GalNAcs- 1 PS/20 21
ISIS 616468 0,32 71,52 224 Нет PS/PO/20 20
Пример 25. Влияние модифицированного GalNAc3-1-конъюгированного ASO, нацеленного на человеческий ApoC III, in vitro.
ISIS 304801 и 647535, описанные выше, испытали in vitro. Первичные гепатоцитарные клетки трансгенных мышей при плотности 25000 клеток на лунку обработали концентрациями 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 и 20 мкМ модифицированных олигонуклеотидов. После обработки в течение около 16 ч из клеток выделили РНК и измерили уровни мРНК при помощи количественной ПЦР в реальном времени, а уровни мРНК hApoC III скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным при помощи RIBOGREEN.
IC50 рассчитали по стандартным способам, а результаты представлены в табл. 19. Показано, что наблюдали сравнимую эффективность в клетках, обработанных ISIS 647535, по сравнению с контрольным образцом, ISIS 304801.
Таблица 19
Модифицированные ASO, нацеленные на человеческие ApoC III, в .первичных гепатоцитах
ASO 1С50(мкМ) 3’-конъюгат Межнуклеозидная связь/длина SEQID NO.
ISIS 0,44 Нет PS/20 20
В этом эксперименте in vitro не наблюдали такого большого преимущества эффективности конъюгирования с GalNAc3-1, как наблюдали in vivo. Последующие эксперименты свободного захвата в первичных гепатоцитах in vitro не показали повышенной эффективности олигонуклеотидов, содержащих различные конъюгаты GalNAc, по сравнению с олигонуклеотидами, не содержащими конъюгаты GalNAc (см. примеры 60, 82 и 92).
Пример 26. Влияние связей PO/PS на кативность ASO в отношении ApoC III.
Трансгенным мышам с человеческим ApoC III внутрибрюшинной инъекцией вводили 25 мг/кг ISIS 304801 или ISIS 616468 (оба описаны выше) или PBS в качестве контрольного образца, один раз в неделю в течение двух недель. Экспериментальная группа состояла из 3 животных, а контрольная группа состояла из 4 животных. Перед лечением, а также после последней дозы у каждой мыши брали кровь и анализировали образцы плазмы. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения.
Образцы собрали и анализировали для определения уровней белка ApoC III в печени, как описано выше (пример 20). Данные этих анализов представлены ниже в табл. 20.
Эти результаты демонстрируют снижение эффективности антисмысловых соединений с PO/PS
- 159 036584 (ISIS 616468) в крыльях по сравнению с соединениями, содержащими только PS (ISIS 304801).
Таблица 20
Влияние ASO лечения на уровни белка ApoC III у трансгенных мышей с человеческим ApoC III
ASO Доза (мг/кг) %PBS 3’конъюгат Межнуклеози дная связь/длина SEQ Ш NO.
PBS 0 99 - —
ISIS 304801 25 мг/кг/нед. в течение 2 нед. 24 Нет Полностью PS 20
ISIS 616468 25 мг/кг/нед. в течение 2 нед. 40 Нет 14 PS/6 РО 20
N(/Pr)2
Пример 27. Соединение 56 DMT°^/^O
Соединение 56 имеется в продаже у компании Glen Research или может быть получено по опубликованным методикам, описанным авторами Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 44474454.
Пример 28. Получение соединения 60
Соединение 4 получили по способам, описанным в примере 2. Соединение 57 имеется в продаже. Соединение 60 подтвердили структурным анализом.
Соединение 57 является иллюстративным, и его не следует считать ограничивающим, поскольку могут быть применены другие монозащищенные замещенные или незамещенные алкилдиолы, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании, для получения фосфорамидитов, имеющих желаемый состав.
Пример 29. Получение соединения 63
CN
1. DMTC1. руг
2. PdC;Hi
3. Гиофосфорипирование
2. КОН ДМСО, Вп0
3. HCL МеОН
4. ХаНСО,
QH
Соединения 61 и 62 получили по таким же способам, как описаны авторами Tober et al., Eur. J. Org. Chem., 2013, 3, 566-577; и Jiang et al., Tetrahedron, 2007, 63(19), 3982-3988.
Альтернативно, соединение 63 получили по таким же способам, как описаны в научной и патентной литературе авторами Kim et al., Synlett, 2003, 12, 1838-1840; и Kim et al., в опубликованной международной заявке PCT WO 2004063208.
- 160 036584
Пример 30. Получение соединения 63b
Соединение 63a получили по таким же способам, как описаны авторами Hanessian et al., Canadian Journal of Chemistry, 1996, 74(9), 1731-1737.
Пример 31. Получение соединения 63d
Соединение 63 с получили по таким же способам, как описаны авторами Chen et al., Chinese Chemical Letters, 1998, 9(5), 451-453.
Пример 32. Получение соединения 67
Соединение 64 получили по способам, представленным в примере 2. Соединение 65 получили по таким же способам, как описаны авторами Or et al., в опубликованной международной заявке PCT WO 2009003009. Защитные группы, применяемые для соединения 65, являются иллюстративными, и их не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие защитные группы, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании.
Пример 33. Получение соединения 70
l.PdC.H; '
2. Тиофосфорнлнрованнг
Соединение 64 получили по способам, описанным в примере 2. Соединение 68 имеется в продаже. Защитная группа, примененная для соединения 68, является иллюстративной, и ее не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие защитные группы, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании.
Пример 34. Получение соединения 75a
Соединение 75 получили по опубликованным методикам, описанным авторами Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.
- 161 036584
Пример 35. Получение соединения 79
Соединение 76 получили по опубликованным методикам, описанным авторами Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.
Пример 36. Получение соединения 79a ρ FmocCl. рут H0 2. PdC:Hi
D 3. Тиофосфорипирование ?? ?9a
Соединение 77 получили по способам, представленным в примере 35. Пример 37. Общий способ получения конъюгированного олигомерного соединения 82, содержащего фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 на 5'-конце, на твердой подложке (способ I)
- 162 036584
где GalNAc3-2 имеет структуру
Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-2 (GalNAc3-2a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc3-2a имеет формулу
- 163 036584
VIMAD-связанное олигомерное соединение 79b получили по стандартным способам в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Фосфорамидитные соединения 56 и 60 получили так, как описано в способах в примерах 27 и 28 соответственно. Изображенные фософорамидиты являются иллюстративными, и их не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании, для получения олигомерного соединения, содержащего фосфодиэфир-связанную конъюгирующую группу на 5'-конце. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения олигомерных соединений, описанных в настоящем документе, которые имеют любую желаемую последовательность и состав.
Пример 38. Альтернативный способ получения олигомерного соединения 82, содержащего фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 на 5'-конце (способ II)
l.DCAs ДХМ
X = 8'или О'
2. DCL KML АСК Фосфорамидит 79 Автоматичккий синтгзатор ДНК РНК
NHAc
CN
1. Кэширование
2. t-BuOOH
3. Et3N:CH3CN(l:l об./об.)
4. NEL· 55 °C
Олигомерное соединение 82
VIMAD-связанное олигомерное соединение 79b получили по стандартным способам в автоматическом синтезаторе ДНК/РНК (см. Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). GalNAc3-2кластерный фосфорамидит, соединение 79, получили по способам, представленным в примере 35. Альтернативный способ обеспечивает возможность одностадийной установки фосфодиэфир-связанного GalNAc3-2 конъюгата на олигомерное соединение на последней стадии синтеза. Изображенные фосфорамидиты являются иллюстративными, и их не следует считать ограничением, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые представлены в данном описании, для получения олигомерных соединений, содержащих фосфодиэфирный конъюгат на 5'-конце. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подлож- 164 036584 ке, может быть подобрано для получения олигомерных соединений, описанных в настоящем документе, которые имеют любую желаемую последовательность и состав.
Пример 39. Общий способ получения олигомерного соединения 83h, содержащего конъюгат GalNAc3-3 на 5'-конце (GalNAc3-1, модифицированный для 5'-концевого присоединения), на твердой подложке
Соединение 18 получили по способам, описанным в примере 4. Соединения 83a и 83b имеются в продаже. Олигомерное соединение 83e, содержащее связанный через фосфодиэфир гексиламин, получили по стандартным способам синтеза олигонуклеотидов. В результате обработки защищенного олигомерного соединения водным раствором аммиака получили 5'-GalNAc3-3 конъюгированное олигомерное соединение (83h), где GalNAc3-3 имеет структуру
- 165 036584
Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc3-3a имеет формулу
Пример 40. Общий способ получения олигомерного соединения 89, содержащего фосфодиэфирсвязанный конъюгат GalNAc3-4 на 3'-конце, на твердой подложке
- 166 036584
где GalNAc3-4 имеет структуру
где CM представляет собой расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобрете ния расщепляемый фрагмент представляет собой
Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-4 (GalNAc3-4a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. При этом GalNAc3-4a имеет формулу
- 167 036584
Защищенное соединение 30 на функционализированной твердой подложке Unylinker имеется в продаже. Соединение 84 получили по таким же способам, как описаны в литературе (см. Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454; Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1999, 27, 3035-3041; и Hornet et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4842-4849).
Фосфорамидитные строительные блоки, соединения 60 и 79a, получили по способам, представленным в примерах 28 и 36. Изображенные фосфорамидиты являются иллюстративными и не предназначены для ограничения, поскольку могут быть применены другие фосфорамидитные строительные блоки для получения олигомерного соединения, имеющего фосфодиэфир-связанный конъюгат на 3'-конце, которое имеет желаемую последовательность и состав. Порядок и количество фосфорамидитов, добавляемых к твердой подложке, может быть подобрано для получения олигомерных соединений, описанных в настоящем документе, которые имеют любую желаемую последовательность и состав.
Пример 41. Общий способ получения ASO, содержащих фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 (см. пример 37, Bx представляет собой аденин) в 5' положении, по твердофазному способу (получение ISIS 661134).
Если не указано иное, все реагенты и растворы, примененные для синтеза олигомерных соединений, приобретены у коммерческих поставщиков. Стандартные фосфорамидитные строительные блоки и твердую подложку применили для внедрения нуклеозидных остатков, которые включают, например, остатки T, A, G и mC. Фосфорамидитные соединения 56 и 60 применили для синтеза фосфодиэфирсвязанного конъюгата GalNAc3-2 на 5'-конце. 0,1М раствор фосфорамидита в безводном ацетонитриле применили для в-О-2'-дезоксирибонуклеозида и 2'-MOE.
Синтез антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) выполнили на синтезаторе ABI 394 (в масштабе 12 мкмоль) или на синтезаторе AKTA Oligopilot производства GE Healthcare Bioscience (в масштабе 40200 мкмоль) по способу фосфорамидитного связывания на твердой подложке VIMAD (110 мкмоль/г, Guzaev et al., 2003), упакованной в колонку. Для стадии связывания фосфорамидиты вводили в 4-кратном избытке по сравнению с первоначальной загрузкой на твердой подложке, а связывание фосфорамидита выполняли в течение 10 мин. Все остальные стадии выполняли по протоколам, предоставленным производителем. Для удаления диметокситритильных (DMT) групп с 5'-гидроксильных групп нуклеотида применили 6% раствор дихлоруксусной кислоты в толуоле. На стадии связывания в качестве активатора применили 4,5-дицианоимидазол (0,7М) в безводном CH3CN. Тиофосфатные связи внедряли сульфированием при помощи 0,1М раствора гидрида ксантана в 1:1 смеси пиридина/CH3CN в течение 3 мин времени контакта. В качестве окислительного агента для обеспечения фосфодиэфирных межнуклеозидных связей применили 20% раствор трет-бутилгидропероксида в CH3CN, содержащий 6% воды, в течение 12 мин времени контакта.
После сборки желаемой последовательности цианоэтил-фосфатные защитные группы снимали при помощи 20% диэтиламина в толуоле (об./об.) в течение 45 мин времени контакта. Связанные с твердой подложкой ASO суспендировали в водном растворе аммиака (28-30 мас.%) и нагревали при 55°С в течение 6 ч.
Затем отфильтровывали не связанные ASO и выпаривали аммиак кипячением. Остаток очищали жидкостной хроматографией высокого давления на сильной анионообменной колонке (GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 мкм, 2,54x8 см, A = 100 мМ ацетата аммония в 30% водном CH3CN, B = 1,5М NaBr в A, 0-40% B за 60 мин, скорость потока 14 мл-мин-1, λ = 260 нм). Остаток обессоливали при помощи ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с получением желаемых ASO с выделенным выходом 15-30% относительно первоначальной загрузки на твердую подложку. ASO характеризовали при помощи ионпарной ВЭЖХ, совмещенной с МС-анализом на системе Agilent 1100 MSD.
- 168 036584
Таблица 21
ASO, содержащие фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 в 5' положении, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Расчетная масса Наблюдаемая масса SEQ TDNO.
661134 GaiNAc3-2a- oAdoTksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTds Gds AdsmCdsTdsTksmCk 6482,2 6481,6 26
Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает в-1)-2'-дезоксирибонуклеозид; k означает 6'-(S)-CH3 бициклический нуклеозид (например, cEt); s означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); o означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Верхний индекс m означает 5-метилцитозины. Структура GalNAc3-2a представлена в примере 37.
Пример 42. Общий способ получения ASO, содержащих конъюгат GalNAc3-3 в 5' положении, по твердофазным методикам (получение ISIS 661166).
Синтез ISIS 661166 выполнили по таким же способам, как представлены в примерах 39 и 41.
ISIS 661166 представляет собой 5-10-5 MOE гэпмер, в котором 5' положение содержит конъюгат GalNAc3-3. Это ASO характеризовали при помощи ион-парной ВЭЖХ, совмещенной с МС-анализом на системе Agilent 1100 MSD.
Таблица 21a
ASO, содержащее конъюгат GalNAc3-3 в 5' положении через гексиламинофосфодиэфирную связь, нацеленное на Malat-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Конъюгат Расчетная масса Наблюдаемая масса SEQ ID NO.
661166 5 ’ -GalNAc3-3a-o’mCesGesGesTesGes mCds Ads AdsGdsGdsmCdsT dsT ds AdsGds GesAesAes TesTe 5’GalNAc3-3 8992,16 8990,51 27
Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает в-1)-2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); o означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Верхний индекс m означает 5метилцитозины. Структура 5'-GalNAc3-3a представлена в примере 39.
Пример 43 Дозозависимое исследование фосфодиэфир-связанного GalNAc3-2 (см. примеры 37 и 41, Bx представляет собой аденин) на 5'-конце, нацеленного на SRB-1, in vivo.
ISIS 661134 (см. пример 41), содержащий фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 на 5'-конце, испытывали в дозозависимом исследовании на антисмысловое ингибирование SRB-1 у мышей. Неконъюгированные ISIS 440762 и 651900 (конъюгат GalNAc3-1 у 3'-коца, см. пример 9) включены в исследование для сравнения и описаны ранее в табл. 4.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 440762, 651900, 661134 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК SRB-1 определяли относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и обозначены как % PBS. ED50 измеряли по таким же способам, как описаны ранее, и они представлены ниже.
Как показано в табл. 22, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом. Действительно, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 на 5'-конце (ISIS 661134) или конъюгат GalNAc3-1, связанный на 3'конце (ISIS 651900), демонстрируют значительное улучшение эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 440762). Кроме того, ISIS 661134, который содержит фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 на 5'-конце, был настолько же эффективным, как ISIS 651900, который содержит конъюгат GalNAc3-1 на 3'-конце.
- 169 036584
Таблица 22
ASO, содержащие GalNAc3-1 или GalNAc3-2, нацеленные на SRB-1
ISIS № Доза (мг/кг) Уровни мРНК SRB-1 (% PBS) EDso (мг/кг) Конъюгат SEQ Ш NO.
PBS 0 100 — __
440762 0,2 116 2,58 Без конъюгата 22
0,7 91
2 69
7 22
20 5
651900 0,07 95 0,26 3’ GalNAc3-l 23
0,2 77
0,7 28
2 11
7 8
661134 0,07 107 0,25 5’ GalNAc3-2 26
0,2 86
0,7 28
2 10
7 6
Структуры 3' GalNAc3-1 и 5' GalNAc3-2 описаны ранее в примерах 9 и 37.
Фармакокинетический анализ (ФК).
ФК для ASO из группы высокой дозы (7 мг/кг) исследовали и оценили таким же образом, как описано в примере 20. Образцы печени измельчили и экстрагировали по стандартным протоколам. Идентифицировали метаболиты полной длины 661134 (5' GalNAc3-2) и ISIS 651900 (3' GalNAc3-1) и подтвердили их массы при помощи масс-спектрометрического анализа высокого разрешения. Результаты показали, что основной метаболит, обнаруженный для ASO, содержащего фосфодиэфир-связанный конъюгат GalNAc3-2 на 5'-конце (ISIS 661134), представлял собой ISIS 440762 (данные не показаны). Не наблюдали никаких дополнительных метаболитов в обнаруживаемом количестве. В отличие от него, для ASO, содержащего конъюгат GalNAc3-1 на 3'-конце (ISIS 651900), наблюдали дополнительные метаболиты, аналогичные тем, которые описаны ранее в табл. 10a. Эти результаты позволяют предположить, что наличие фосфодиэфир-связанного конъюгата GalNAc3-1 или GalNAc3-2 может улучшать ФК профиль ASO без ухудшения их эффективности.
Пример 44. Влияние PO/PS связей на антисмысловое ингибирование ASO, содержащих конъюгат GalNAc3-1 (см. пример 9) на 3'-конце, нацеленных на SRB-1 ISIS 655861 и 655862, содержащие конъюгат GalNAc3-1 на 3'-конце, каждый из которых нацелен на SRB-1, испытали в исследовании однократного введения на их способность ингибировать SRB-1 у мышей. Исходное неконъюгированное соединение, ISIS 353382, включили в исследование для сравнения.
Эти ASO представляют собой 5-10-5 MOE гэпмеры, в которых гэп-область содержит десять 2'дезоксирибонуклеозидов, и каждая область крыльев содержит пять 2'-MOE модифицированных нуклеозидов. Эти ASO получили по таким же способам, как показаны ранее в примере 19, и они описаны ниже в табл. 23.
Таблица 23
Модифицированные ASO, содержащие конъюгат GalNAc3-1 на 3'-конце, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Химизм SE Q ID NO.
353382 (исходное ) GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTesmCesmCesTesTe Только PS, без конъюгата 28
655861 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTeoAdo -GalNAc3-la Только PS с конъюгато м GalNAc31 29
655862 GesmCeoTeoTeomCeoAdsGdsTdsmCds AdsTdsGds Ads mCdsTdsTeomCeomCesTesTeoAdo'-GalNAc3-la Смешанные PS/PO с конъюгато м GalNAc31 29
Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-ϋ-2'- 170 036584 дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); о означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Верхний индекс m означает 5метилцитозины. Структура GalNAc3-1 представлена в примере 9.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 353382, 655861, 655862 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Перед лечением, а также после последней дозы у каждой мыши брали кровь и анализировали образцы плазмы. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни мРНК SRB-1 определяли относительно общей РНК (при помощи Ribogreen), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному PBS, и обозначены как % PBS. ED50 измеряли по таким же способам, как описаны ранее, и они представлены ниже.
Как показано в табл. 24, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом по сравнению с контрольным образцом, обработанным PBS. Действительно, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc3-1 на 3'-конце (ISIS 655861 и 655862), демонстрируют значительное усиление эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 353382). Кроме того, ISIS 655862 со смешанными PS/PO связями демонстрирует усиление эффективности, по сравнению с соединением, содержащим только PS (ISIS 655861).
Таблица 24
Влияние PO/PS связей на антисмысловое ингибирование ASO, содержащих конъюгат _____________GalNAc3-l на 3'-конце, нацеленных на SRB-1_____________
ISIS № Доза (мг/кг) Уровни мРНК SRB1 (% PBS) EDso (мг/кг) Химизм SEQ Ш NO.
PBS 0 100 — —
353382 (исходное) 3 76,65 10,4 Только PS, без конъюгата 28
10 52,40
30 24,95
655861 0,5 81,22 2,2 Только PS с конъюгатом GalNAc3-l 29
1,5 63,51
5 24,61
15 14,80
655862 0,5 69,57 1,3 Смешанные PS/PO с конъюгатом 29
1,5 45,78
5 19,70 GalNAc3-l
15 12,90
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также массу органов. Результаты показывают, что не наблюдали какоголибо увеличения уровней трансаминазы (табл. 25) или массы органов (данные не показаны) у мышей, обработанных ASO, по сравнению с PBS контролем. Кроме того, ASO со смешанными PS/PO связями (ISIS 655862) демонстрирует схожие уровни трансаминазы, по сравнению с соединением, содержащим только PS (ISIS 655861).
- 171 036584
Таблица 25
Влияние PO/PS связей на уровни трансаминазы ASO, содержащих конъюгат GalNAc3-1 _____________на 3'-конце, нацеленных на SRB-1______________
ISIS № Доза (мг/кг) ALT (ед./л) AST (ед./л) Химизм SEQ Ш NO.
PBS 0 28,5 65 —
353382 (исходное) 3 50,25 89 Только PS, без конъюгата 28
10 27,5 79,3
30 27,3 97
655861 0,5 28 55,7 Только PS с GalNAcs-l 29
1,5 30 78
5 29 63,5
15 28,8 67,8
655862 0,5 50 75,5 Смешанные PS/PO с GalNAc3-l 29
1,5 21,7 58,5
5 29,3 69
15 22 61
Пример 45. Получение PFP эфира соединения 110a
О.Ас
АсО С^ОАс
A CH N7-j-o о
ОАс ОАс . А-А·1, >ih2 AcHN 105а; п=1 105b: п= 7 ОАс АсО АснА'··’ ОАс ОАс Ra-Ni, Н2 l-А η ----------А СО Л - МеОН. EtOAc AcHN ОАс АсоХА .AcHN ОАс АсО А<у0Ас AcHN7'··'1·—О. О.Ас о.Ас А40ч η АсО Л/-т-Д..--'-1 AcHN 'Π - ОАс ОАс AcoiS^L-O'X'V'' AcHN 108a: n=1 108b: n= 7 OAc o.Ac ’V’nN—Д PFP-ТФК U-.Zo H '·-—. ---ΑϋΟΛ^^υ^^^^^ ДМФА, руг AcHN 1 < π Соединение 90 _. OX ОАс ОАс [ Ac0.y_-r-7...---Q Λη ·--· ' AcHN 106a; n=1 106b; n= 7 ~O.Ac Η V HBTU, DIEA, ДМФА -ΟΑ,ο ° [ H02C^-E^-0xBn 4 0-^xM^-x^HN Ao V 2 99 107a; n=1 107b; n= 7 ,0 W H A 0 Q
- 172 036584
Соединение 4 (9,5 г, 28,8 ммоль) обработали по отдельности соединением 103a или 103b (38 ммоль) и TMSOTf (0,5 экв.) и молекулярными ситами в дихлорметане (200 мл), перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем органический слой отфильтровали через целит, затем промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%->10% метанол/дихлорметан) с получением соединений 104a и 104b с выходом >80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 104a и 104b обработали в тех же условиях, что и соединения 100a-d (пример 47), с получением соединений 105a и 105b с выходом >90%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 105a и 105b по отдельности обработали соединением 90 при тех же условиях, что и соединения 901a-d, с получением соединений 106a (80%) и 106b (20%). Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 106a и 106b обработали в тех же условиях, что и соединения 96a-d (пример 47), с получением соединения 107a (60%) и 107b (20%). Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 107a и 107b обработали в тех же условиях, что и соединения 97a-d (пример 47), с получением соединений 108a и 108b с выходом 40-60%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 108a (60%) и 108b (40%) обработали в тех же условиях, что и соединения 100a-d (пример 47), с получением соединений 109a и 109b с выходом >80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединение 109a обработали в тех же условиях, что и соединения 101a-d (пример 47), с получением соединения 110a с выходом 30-60%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой. Альтернативно, соединение 110b может быть получено таким же образом, исходя из соединения 109b.
Пример 46. Общий способ конъюгирования с PFP эфирами (олигонуклеотид 111); получение ISIS 666881 (GalNAc3-10).
Синтезировали и очистили 5'-гексиламиномодифицированный олигонуклеотид по стандартным способам твердофазного получения олигонуклеотидов. 5'-Гексиламиномодифицированный олигонуклеотид растворили в 0,1М растворе тетрабората натрия, pH 8,5 (200 мкл) и добавили 3 экв. выбранного PFPэстерифицированного кластера GalNAc3, растворенного в ДМСО (50 мкл). Если при добавлении раствора ASO эфир PFP выпадал в осадок, то добавляли ДМСО до перехода всего эфира PFP в раствор. Реакция была завершена через около 16 ч перемешивания при комнатной температуре. Полученный раствор разбавили водой до 12 мл, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в центробежном фильтре с отсечением по массе 3000 Да. Этот прием повторили два раза для удаления низкомолекулярных примесей. Затем раствор лиофилизировали досуха и повторно растворили в концентрированном водном растворе аммиака
- 173 036584
и перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 ч, затем концентрировали in vacuo для удаления большей части аммиака. Конъюгированный олигонуклеотид очистили и обессолили при помощи
ОФ-ВЭЖХ, и лиофилизировали с получением GalNAc3 конъюгированного олигонуклеотида.
о83е
3'____________5||
[ OLIGO )-0-Р-0 -(CH2fe-NH2 110а . Боратный буфер, ДМСО, pH 8,5. комн.
- МН3(вадн.> коин- Т-Ра
[oligo]—[СМ~]— О N н
111
Олигонуклеотид 111 конъюгирован с GalNAc3-10. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-10 (GalNAc3-10a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-, как показано ниже в олигонуклеотиде (ISIS 666881), синтезированном с GalNAc3-10. Структура GalNAc3-10 (GalNAc3-10a-CM-) представлена ниже
AcHN
По указанному общему способу получили ISIS 666881. Синтезировали и очистили 5'-гексиламиномодифицированный олигонуклеотид, ISIS 660254, по стандартным способам твердофазного получения олигонуклеотидов. ISIS 660254 (40 мг, 5,2 мкмоль) растворили в 0,1М растворе тетрабората натрия, pH 8,5 (200 мкл) и добавили 3 экв. PFP эфира (соединения 110a), растворенного в ДМСО (50 мкл). Эфир PFP выпал в осадок при добавлении раствора ASO, поэтому потребовалось добавление дополнительного количества ДМСО (600 мкл) для полного растворения PFP эфира.
Реакция была завершена через 16 ч перемешивания при комнатной температуре. Раствор разбавили водой до общего объема 12 мл, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в центробежном фильтре с отсечением по массе 3000 Да. Этот прием повторили два раза для удаления низкомолекулярных примесей. Раствор лиофилизировали досуха и повторно растворили в концентрированном водном растворе аммиака, перемешивая при комнатной температуре в течение 2,5 ч, затем концентрировали in vacuo для удаления большей части аммиака. Конъюгированный олигонуклеотид очистили и обессолили при помощи ОФ-ВЭЖХ и лиофилизировали с получением ISIS 666881 с выходом 90% по массе (42 мг, 4,7 мкмоль).
GalNAc3-10-конъюгированный олигонуклеотид
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) 5’-группа SSEQ ID No.
ISIS 660254 NH2(CH2)6-oAdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe Г ексиламин 30
ISIS 666881 GalNAc3-10a_o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe GalNAc3-10 30
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Пример 47. Получение олигонуклеотида 102, содержащего GalNAc3-8
- 174 036584
- 175 036584
OAc
Трехкислотное соединение 90 (4 г, 14,43 ммоль) растворили в ДМФА (120 мл) и N,Nдиизопропилэтиламине (12,35 мл, 72 ммоль). По каплям добавили пентафторфенила трифторацетат (8,9 мл, 52 ммоль) в атмосфере аргона и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавили Вос-диамин 91a или 91b (68,87 ммоль) вместе с N,Nдиизопропилэтиламином (12,35 мл, 72 ммоль) и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%-->10% метанол/дихлорметан) с получением соединений 92a и 92b с приблизительным выходом 80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединение 92a или 92b (6,7 ммоль) обрабатывали 20 мл дихлорметана и 20 мл трифторуксусной кислоты при комнатной температуре в течение 16 ч. Полученный раствор выпарили, а затем растворили в метаноле и обрабатывали смолой DOWEX-OH в течение 30 мин. Полученный раствор отфильтровали и упарили до маслянистого вещества под пониженным давлением с получением 85-90% выхода соединений 93a и 93b.
Соединения 7 или 64 (9,6 ммоль) обрабатывали HBTU (3,7 г, 9,6 ммоль) и Ν,Ν-диизопропилэтиламином (5 мл) в ДМФА (20 мл) в течение 15 мин. К смеси добавили либо соединение 93a, либо 93b (3 ммоль) и оставили перемешиваться при комнатной температуре на 16 ч. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (5%->20% метанол/дихлорметан) с получением соединений 96a-d с выходом 20-40%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 96a-d (0,75 ммоль) по отдельности гидрировали на никеле Ренея в течение 3 ч в этаноле (75 мл). Затем катализатор удалили фильтрованием через целит, а этанол удалили под пониженным давлением с получением соединений 97a-d с выходом 80-90%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединение 23 (0,32 г, 0,53 ммоль) обрабатывали HBTU (0,2 г, 0,53 ммоль) и Ν,Ν-диизопропилэтиламином (0,19 мл, 1,14 ммоль) в ДМФА (30 мл) в течение 15 мин. К смеси по отдельности добавили соединения 97a-d (0,38 ммоль) и оставили перемешиваться при комнатной температуре на 16 ч. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%-->20% метанол/дихлорметан) с получением соединений 98a-d с выходом 30-40%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
- 176 036584
Соединение 99 (0,17 г, 0,76 ммоль) обрабатывали HBTU (0,29 г, 0,76 ммоль) и Ν,Ν-диизопропилэтиламином (0,35 мл, 2,0 ммоль) в ДМФА (50 мл) в течение 15 мин. К смеси по отдельности добавили соединения 97a-d (0,51 ммоль) и оставили перемешиваться при комнатной температуре на 16 ч. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (5%-->20% метанол/дихлорметан) с получением соединений 100a-d с выходом 40-60%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 100a-d (0,16 ммоль) по отдельности гидрировали на 10% Pd(OH)2/C в течение 3 ч в метаноле/этилацетате (1:1, 50 мл). Затем катализатор удалили фильтрованием через целит, а органические растворители удалили под пониженным давлением с получением соединений 101a-d с выходом 80-90%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
Соединения 101a-d (0,15 ммоль) по отдельности растворили в ДМФА (15 мл) и пиридине (0,016 мл, 0,2 ммоль). По каплям добавили пентафторфенила трифторацетат (0,034 мл, 0,2 ммоль) в атмосфере аргона и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем упарили ДМФА на >75% под пониженным давлением, а затем растворили смесь в дихлорметане. Органический слой промыли бикарбонатом натрия, водой и насыщенным солевым раствором. Затем отделили органический слой и высушили над сульфатом натрия, отфильтровали и упарили под пониженным давлением до маслянистого остатка. Полученное маслянистое вещество очистили силикагелевой хроматографией (2%-->5% метанол/дихлорметан) с получением соединений 102a-d с приблизительным выходом 80%. Данные ЖХМС и протонного ЯМР согласовались с указанной структурой.
R 0 ЕЗЕ
[ oligo EQ-PO-iCH^NH, 6н
Береты ьй буфер, ДМСО, pH В.Е-, кемн. т-ре
D2d -------------------------------------ь- . бздн. зммиек. клин, т-ре
Олигомерное соединение 102, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-8, получили по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-8 (GalNAc3-8a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В предпочтительном варианте реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
Структура GalNAc3-8 (GalNAc3-8a-CM-) представлена ниже
AcHN
- 177 036584
Пример 48. Получение олигонуклеотида 119, содержащего GalNAc3-7
HBTU. DIE.A
Pd/C, Но,
Соединение 112 синтезировали по способу, описанному в литературе (J. Med. Chem. 2004, 47, 57985808).
Соединение 112 (5 г, 8,6 ммоль) растворили в 1:1 смеси метанола/этилацетата (22 мл/22 мл). Добавили гидроксид палладия на углероде (0,5 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 12 ч. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и промыли этот слой 1:1 смесью метанола/этилацетата. Фильтрат и промывочные растворы объединили и концентрировали досуха с получением соединения 105a (количественно). Структуру подтвердили по ЖХМС.
Соединение 113 (1,25 г, 2,7 ммоль), HBTU (3,2 г, 8,4 ммоль) и DIEA (2,8 мл, 16,2 ммоль) растворили в безводном ДМФА (17 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. К этой смеси добавили раствор соединения 105a (3,77 г, 8,4 ммоль) в безводном ДМФА (20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч. Растворитель удалили под пониженным давлением с получением маслянистого вещества. Остаток растворили в CH2Cl2 (100 мл) и
- 178 036584 промыли насыщенным водным раствором NaHCO3 (100 мл) и насыщенным солевым раствором (100 мл).
Органическую фазу отделили, высушили (Na2SO4), отфильтровали и выпарили. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали от 10 до 20% MeOH в дихлорметане с получением соединения 114 (1,45 г, 30%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и 1H ЯМР.
Соединение 114 (1,43 г, 0,8 ммоль) растворили в 1:1 смеси метанола/этилацетата (4 мл/4 мл). Добавили палладий на углероде (влажный, 0,14 г). Реакционную смесь продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 12 ч. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита. Слой целита промыли метанолом/этилацетатом (1:1). Фильтрат и промывочные растворы объединили и выпарили под пониженным давлением с получением соединения 115 (количественно). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и 1H ЯМР.
Соединение 83a (0,17 г, 0,75 ммоль), HBTU (0,31 г, 0,83 ммоль) и DIEA (0,26 мл, 1,5 ммоль) растворили в безводном ДМФА (5 мл) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. К этой смеси добавили раствор соединения 115 (1,22 г, 0,75 ммоль) в безводном ДМФА и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 6 ч. Растворитель удалили под пониженным давлением, а остаток растворили в CH2Cl2. Органический слой промыли насыщенным водным раствором NaHCO3 и насыщенным солевым раствором и высушили над безводным Na2SO4, отфильтровали. Органический слой концентрировали досуха, а полученный остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали от 3 до 15% MeOH в дихлорметане с получением соединения 116 (0,84 г, 61%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и 1H ЯМР.
АсО ОАс
AcHN
АсО 0Ас
Соединение 116 (0,74 г, 0,4 ммоль) растворили в 1:1 смеси метанола/этилацетата (5 мл/5 мл). Добавили палладий на углероде (влажный, 0,074 г). Реакционную смесь продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 12 ч. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита. Слой целита промыли метанолом/этилацетатом (1:1). Фильтрат и промывочные растворы объединили и выпарили под пониженным давлением с получением соединения 117 (0,73 г, 98%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и 1H ЯМР.
Соединение 117 (0,63 г, 0,36 ммоль) растворили в безводном ДМФА (3 мл). К этому раствору добавили ^^диизопропилэтиламин (70 мкл, 0,4 ммоль) и пентафторфенила трифторацетат (72 мкл, 0,42 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч и вылили в насыщенный водный раствор NaHCO3. Смесь экстрагировали дихлорметаном, промыли насыщенным солевым раствором и высушили над безводным Na2SO4. Дихлорметановый раствор концентрировали досуха и очистили силикагелевой колоночной хроматографией, элюировали от 5 до 10% MeOH в дихлорметане с получением соединения 118 (0,51 г, 79%). Структуру подтвердили по ЖХМС и 1H, а также 1H и 19F ЯМР.
- 179 036584
Олигомерное соединение 119, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-7, получили по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
Структура GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) представлена ниже
AcHN
Пример 49. Получение олигонуклеотида 132, содержащего GalNAc3-5
Соединение 120 (14,01 г, 40 ммоль) и HBTU (14,06 г, 37 ммоль) растворили в безводном ДМФА (80 мл). Добавили триэтиламин (11,2 мл, 80,35 ммоль) и перемешивали в течение 5 мин. Реакционную смесь охладили на ледяной бане и добавили раствор соединения 121 (10 г, ммоль) в безводном ДМФА (20 мл). Добавили дополнительное количество триэтиламина (4,5 мл, 32,28 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в течение 18 ч в атмосфере аргона. Реакцию контролировали по ТСХ (этилацетат:гексан; 1:1; Rf = 0,47). Растворитель удалили под пониженным давлением. Остаток растворили в EtOAc (300 мл) и про мыли 1М раствором NaHSO4 (3x150 мл), насыщенным водным раствором NaHCO3 (3x150 мл) и насыщенным солевым раствором (2x100 мл). Органический слой высушили при помощи Na2SO4. Высушивающий агент удалили фильтрованием, а органический слой концентрировали на ротационном испарителе. Неочищенную смесь очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали при помощи 35-50% EtOAc в гексане с получением соедиения 122 (15,50 г, 78,13%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и 1H ЯМР. Масса m/z 589,3 [М+Н]+.
К охлажденному раствору соединения 122 (7,75 г, 13,16 ммоль), растворенного в метаноле (15 мл), добавили раствор LiOH (92,15 ммоль) в воде (20 мл) и ТГФ (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин и контролировали по ТСХ (EtOAc: гексан; 1:1). Реакционную смесь концентрировали до половины объема под пониженным давлением. Оставшийся раствор ох- 180 036584 ладили на ледяной бане и нейтрализовали добавлением концентрированной HCl. Реакционную смесь разбавили, экстрагировали EtOAc (120 мл) и промыли насыщенным солевым раствором (100 мл). При стоянии в течение ночи образовалась и осветлилась эмульсия.
Органический слой отделили, высушили (Na2SO4), отфильтровали и выпарили с получением соединения 123 (8,42 г). Избыточную массу вероятно обусловливает остаточная соль. ЖХМС согласовался со структурой. Продукт применили без какой-либо дополнительной очистки. Мол. масса, расчетная: 574,36%, мол. масса, найденная: 575,3 [М+Н]+.
124 125 99.6% 126
Соединение 126 синтезировали по способу, описанному в литературе (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 958-963).
.-Вос HN V 123 ____B0C-N-LYN HOBt.DIEA. H О РуВор. Вор. ДМФА [ HN-B СВзСОО- ®Нз 1 н LI CF3C00' ® Й H ' q CF3COO' ® NH3 128 AcO OAc л AcO - AcHN \ NH V AcO OAc I n „ЬчД U AcHN 0 J AcO OAc Г Ц^-0 n .NH AcO -ЗС-рД...--1-1 AcHN O 0 CFsCOOH-^ J H 3 Й CH2CI2 127 oc AcO OAc <4 a n _ .--. 0 H П 1 AcO— :i ~·-4ί:ί AcHN 7 0 HATU.HOAt. DIEA. ДМФА 129
- 181 036584
131
Соединение 123 (7,419 г, 12,91 ммоль), HOBt (3,49 г, 25,82 ммоль) и соединение 126 (6,33 г, 16,14 ммоль) растворили в ДМФА (40 мл), а полученную реакционную смесь охладили на ледяной бане. К этой смеси добавили ХХ-диизонронилэтиламин (4,42 мл, 25,82 ммоль), PyBop (8,7 г, 16,7 ммоль), затем связывающий агент Bop (1,17 г, 2,66 ммоль) в атмосфере аргона. Ледяную баню убрали, а раствор оставили нагреваться до комнатной температуры. Реакция завершилась через 1 ч, что определили по ТСХ (ДХМ/MeOH: AA; 89:10:1). Реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением. Остаток растворили в EtOAc (200 мл) и промыли 1М раствором NaHSO4 (3x100 тмл), насыщенным водным раствором NaHCO3 (3x100 мл) и насыщенным солевым раствором (2x100 мл). Органическую фазу отделили, высушили (Na2SO4), отфильтровали и концентрировали. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией с градиентом от 50% гексанов в EtOAc до 100% EtOAc с получением соединения 127 (9,4 г) в виде белого пенистого вещества. ЖХМС и 1Н ЯМР согласовались со структурой. Масса m/z 778,4 [М+Н]+.
Трифторуксусную кислоту (12 мл) добавили к раствору соединения 127 (1,57 г, 2,02 ммоль) в дихлорметане (12 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь выпарили совместно с толуолом (30 мл) под пониженным давлением досуха. Полученный остаток два раза совместно выпарили с ацетонитрилом (30 мл) и толуолом (40 мл) с получением соединения 128 (1,67 г) в виде трифторацетатной соли и применили его на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХМС и 1H ЯМР согласовались со структурой. Масса m/z 478,2 [М+Н]+.
Соединение 7 (0,43 г, 0,963 ммоль), HATU (0,35 г, 0,91 ммоль) и HOAt (0,035 г, 0,26 ммоль) смешали вместе и высушивали в течение 4 ч над P2O5 под пониженным давлением в круглодонной колбе, а затем растворили в безводном ДМФА (1 мл) и перемешивали в течение 5 мин. К этой смеси добавили раствор соединения 128 (0,20 г, 0,26 ммоль) в безводном ДМФА (0,2 мл) и добавили Ν,Ν-диизопропилэтиламин (0,2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакция завершилась через 30 мин, что определили по ЖХМС и ТСХ (7% MeOH/ДХМ). Реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением. Остаток растворили в ДХМ (30 мл) и промыли 1М раствором NaHSO4 (3x20 мл), насыщенным водным раствором NaHCO3 (3x20 мл) и насыщенным солевым раствором (3x20 мл). Органическую фазу отделили, высушили над Na2SO4, отфильтровали и концентрировали. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией, применив 5-15% MeOH в дихлорметане, с получением соединения 129 (96,6 мг). ЖХМС и 1H ЯМР согласовались со структурой. Масса m/z 883,4 [М+2Н]+.
Соединение 129 (0,09 г, 0,051 ммоль) растворили в метаноле (5 мл) в 20 мл сцинтилляционной пробирке. К нему добавили небольшое количество 10% Pd/C (0,015 мг) и продували реакционный сосуд газообразным H2. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере H2 в течение
- 182 036584
ч. Реакционную смесь отфильтровали через слой Целита, а слой Целита промыли метанолом. Фильтрат и промывочные растворы слили вместе и концентрировали под пониженным давлением с получением соединения 130 (0,08 г). ЖХМС и 1Н ЯМР согласовались со структурой. Продукт применили без дополнительной очистки. Масса m/z 838,3 [М+2Н]+.
В 10 мл мерную круглодонную колбу добавили соединение 130 (75,8 мг, 0,046 ммоль), 0,37М раствор пиридина в ДМФА (200 мкл) и установили мешалку. К этому раствору по каплям добавили 0,7М раствор пентафторфенила трифторацетата в ДМФА (100 мкл) при перемешивании. Реакция завершилась через 1 ч, что определили по ЖХМС. Растворитель удалили под пониженным давлением, а остаток растворили в CHCl3 (~10 мл). Органический слой обработали NaHSO4 (1M, 10 мл), насыщенным водным раствором NaHCO3 (10 мл) и насыщенным солевым раствором (10 мл), каждый по три раза. Органическую фазу отделили и высушили над Na2SO4, отфильтровали и концентрировали с получением соединения 131 (77,7 мг). ЖХМС согласовался со структурой. Применили без дополнительной очистки. Масса m/z 921,3 [М+2Н]+.
НО ОН
132
Олигомерное соединение 132, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-5, получили по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-5 (GalNAc3-5a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
Структура GalNAc3-5 (GalNAc3-5a-CM-) представлена ниже но он
AcHN Т
NH
- 183 036584
Пример 50. Получение олигонуклеотида 144, содержащего GalNAc4-11
142
Синтез соединения 134.
В колбу Меррифилда добавили аминометиловую смолу VIMAD (2,5 г, 450 мкмоль/г), которую промыли ацетонитрилом, диметилформамидом, дихлорметаном и ацетонитрилом. Смолу оставили набухать в ацетонитриле (4 мл). Соединение 133 предварительно активировали в 100 мл кругло донной колбе путем добавления 20 (1,0 ммоль, 0,747 г), TBTU (1,0 ммоль, 0,321 г), ацетонитрила (5 мл) и DIEA (3,0 ммоль, 0,5 мл). Этот раствор оставили перемешиваться на 5 мин, а затем добавили в колбу Меррифилда при встряхивании. Суспензию оставили встряхиваться на 3 ч. Реакционную смесь слили, а смолу промы- 184 036584 ли ацетонитрилом, ДМФА и ДХМ. Заполнение новой смолы количественно определили по измерению абсорбции DMT катиона при 500 нм (коэффициент экстинкции = 76000) в ДХМ, которое составило 238 мкмоль/г. Смолу кэпировали трехкратным суспендированием в растворе уксусного ангидрида в течение мин.
Соединение 141, связанное с твердой подложкой, синтезировали многократным повторением способов твердофазного синтеза пептидов при помощи Fmoc. Взяли небольшое количество твердой подложки и суспендировали в водном растворе аммиака (28-30 мас.%) в течение 6 ч. Расщепленное соединение анализировали по ЖХ-МС и наблюдали, что масса согласуется со структурой. Масса m/z 1063,8 [М+2Н]+.
Соединение 142, связанное с твердой подложкой, синтезировали по способам твердофазного синтеза пептидов.
Соединение 143, связанное с твердой подложкой, синтезировали при помощи стандартного твердофазного синтеза на ДНК синтезаторе.
Соединение 143, связанное с твердой подложкой, суспендировали в водном аммиаке (28-30 мас.%) и нагревали при 55°С в течение 16 ч. Раствор охладили, а твердую подложку отфильтровали. Фильтрат концентрировали, а остаток растворили в воде и очистили при помощи ВЭЖХ на сильной анионообменной колонке. Фракции, содержащие соединение 144 полной длины, слили вместе и обессолили. Полученное GalNAc^H-конъюгированное олигомерное соединение анализировали при помощи ЖХ-МС и наблюдали, что масса согласуется со структурой.
Кластерная часть GalNAc4 конъюгирующей группы GalNAc4-11 (GalNAc4-11a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
Структура GalNAc4-11 (GalNAc4-11a-CM) представлена ниже
- 185 036584
60).
Пример 51. Получение олигонуклеотида 155, содержащего GalNAc3-6
Соединение 146 синтезировали так, как описано в литературе (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-
Н2. Pd(0H)2/C. EtOAc/MeOH
АсО ОАс
Ас О ОАс
AcHN Η
149
Соединение 4 (15 г, 45,55 ммоль) и соединение 35b (14,3 г, 57 ммоль) растворили в CH2Cl2 (200 мл). Добавили активированные молекулярные сита (4 А, 2 г, порошкообразные) и оставили реакционную смесь перемешиваться в течение 30 мин в атмосфере азота. Добавили TMS-OTf (4,1 мл, 22,77 ммоль) и оставили реакционную смесь перемешиваться при комнатной температуре в течение ночи. После завершения реакции смесь погасили, вылив в насыщенный водный раствор NaHCO3 (500 мл) с дробленым льдом (~150 г). Органический слой отделили, промыли насыщенным солевым раствором, высушили над MgSO4, отфильтровали и концентрировали до оранжевого маслянистого вещества под пониженным давлением. Неочищенный материал очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 210% MeOH в CH2C12 с получением соединения 112 (16,53 г, 63%). Данные ЖХМС и 1H ЯМР согласовались с предполагаемым соединением.
Соединение 112 (4,27 г, 7,35 ммоль) растворили в 1:1 MeOH/EtOAc (40 мл). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 мин. Добавили катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде, 400 мг) и пропускали через раствор газообразный водород в течение 30 мин. После завершения (ТСХ, 10% MeOH в CH2C12, и ЖХМС), катализатор удалили фильтрованием через слой целита. Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высо
- 186 036584 ким вакуумом с получением соединения 105a (3,28 г). Данные ЖХМС и 1H ЯМР согласовались с желаемым продуктом.
Соединение 147 (2,31 г, 11 ммоль) растворили в безводном ДМФА (100 мл). Добавили N,Nдиизопропилэтиламин (DIEA, 3,9 мл, 22 ммоль), затем HBTU (4 г, 10,5 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться в течение ~15 мин в атмосфере азота. К этой смеси добавили раствор соединения 105a (3,3 г, 7,4 ммоль) в сухом ДМФА и перемешивали в течение 2 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавили EtOAc и промыли насыщенным водным раствором NaHCO3 и насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили (MgSO4), отфильтровали и концентрировали до оранжевого сиропообразного вещества. Неочищенный материал очистили колоночной хроматографией с 2-5% MeOH в CH2Cl2 с получением соединения 148 (3,44 г, 73%). Данные ЖХМС и 1Н ЯМР согласова лись с предполагаемым продуктом.
Соединение 148 (3,3 г, 5,2 ммоль) растворили в 1:1 MeOH/EtOAc (75 мл). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 мин. Добавили катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде (350 мг). Через раствор продували газообразный водород в течение 30 мин. После завершения (ТСХ, 10% MeOH в ДХМ и ЖХМС), катализатор удалили фильтрованием через слой целита. Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высоким вакуумом с получением соединения 149 (2,6 г). Данные ЖХМС согласовались с желаемым продуктом. Остаток растворили в сухом ДМФА (10 мл) и сразу применили на следующей стадии.
150
АсО ОАс
151
Соединение 146 (0,68 г, 1,73 ммоль) растворили в сухом ДМФА (20 мл). К нему добавили DIEA (450 мкл, 2,6 ммоль, 1,5 экв.) и HBTU (1,96 г, 0,52 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться в течение 15 мин при комнатной температуре в атмосфере азота. Добавили раствор соединения 149 (2,6 г) в безводном ДМФА (10 мл). pH реакционной смеси довели до pH 9-10 добавлением DIEA (при необходимости). Реакционную смесь оставили перемешиваться при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 2 ч. После завершения реакции смесь разбавили EtOAc (100 мл) и промыли насыщенным водным раствором NaHCO3, затем насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили над MgSO4, отфильтровали и концентрировали. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 2-10% MeOH в CH2Cl2 с получением соединения 150 (0,62 г, 20%). Данные ЖХМС и 1H ЯМР согласовались с желаемым продуктом.
Соединение 150 (0,62 г) растворили в 1:1 MeOH/EtOAc (5 л). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 мин. Добавили катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде (60 мг). Через раствор продували газообразный водород в течение 30 мин. После завершения (ТСХ, 10% MeOH в ДХМ, и ЖХМС) катализатор удалили фильтрованием (тефлоновый фильтр с переходной канюлей шприца, 0,45 мкм). Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высоким вакуумом с получением соединения 151 (0,57 г). Данные ЖХМС согласовались с желаемым продуктом. Продукт растворили в 4 мл сухого ДМФА и сразу применили на следующей стадии.
- 187 036584
154
Соединение 83a (0,11 г, 0,33 ммоль) растворили в безводном ДМФА (5 мл) и добавили N,Nдиизопропилэтиламин (75 мкл, 1 ммоль) и PFP-ТФК (90 мкл, 0,76 ммоль). При соприкосновении реакционная смесь стала пурпурной и постепенно изменила цвет на оранжевый в течение следующих 30 мин. Ход реакции контролировали по ТСХ и ЖХМС. После завершения (образования эфира PFP) добавили раствор соединения 151 (0,57 г, 0,33 ммоль) в ДМФА. pH реакционной смеси довели до pH 9-10 добавлением ^^диизопропилэтиламина (при необходимости). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение ~30 мин. После завершения реакции большую часть растворителя удалили под пониженным давлением. Остаток разбавили CH2Cl2 и промыли насыщенным водным раствором NaHCO3, затем насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили над MgSO4, отфильтровали и концентрировали до оранжевого сиропообразного вещества. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией (2-10% MeOH в CH2Cl2) с получением соединения 152 (0,35 г, 55%). Данные ЖХМС и 1H ЯМР согласовались с желаемым продуктом.
Соединение 152 (0,35 г, 0,182 ммоль) растворили в 1:1 MeOH/EtOAc (10 мл). Реакционную смесь очистили пропусканием потока аргона через раствор в течение 15 мин. Добавили катализатор Перлмана (гидроксид палладия на углероде (35 мг). Через раствор продували газообразный водород в течение 30 мин. После завершения (ТСХ, 10% MeOH в ДХМ и ЖХМС) катализатор удалили фильтрованием (тефлоновый фильтр с переходной канюлей шприца, 0,45 мкм). Фильтрат концентрировали на ротационном испарителе и быстро высушили под высоким вакуумом с получением соединения 153 (0,33 г, количественно). Данные ЖХМС согласовались с желаемым продуктом.
Соединение 153 (0,33 г, 0,18 ммоль) растворили в безводном ДМФА (5 мл) при перемешивании в атмосфере азота. К нему добавили ^^диизопропилэтиламин (65 мкл, 0,37 ммоль) и PFP-ТФК (35 мкл, 0,28 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение ~30 мин. При соприкосновении реакционная смесь стала пурпурной и постепенно изменила цвет на оранжевый. pH реакционной смеси поддерживали при pH 9-10 добавлением дополнительного количества ^^диизопропилэтиламина. Ход реакции контролировали по ТСХ и ЖХМС. После завершения реакции большую часть растворителя удалили под пониженным давлением. Остаток разбавили CH2Cl2 (50 мл) и промыли насыщенным водным раствором NaHCO3, затем насыщенным солевым раствором. Органический слой отделили, высушили над MgSO4, отфильтровали и концентрировали до оранжевого сиропообразного вещества. Остаток очистили колоночной хроматографией и элюировали 2-10% MeOH в CH2Cl2 с получением соединения
- 188 036584
154 (0,29 г, 79%). Данные ЖХМС и 1H ЯМР согласовались с желаемым продуктом.
Олигомерное соединение 155, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-6, получили по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-6 (GalNAc3-6a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
Структура GalNAc3-6 (GalNAc3-6a-CM-) представлена ниже
AcHN
Пример 52. Получение олигонуклеотида 160, содержащего GalNAc3-9
Соединение 156 синтезировали по способу, описанному в литературе (J. Med. Chem. 2004, 47, 57985808).
Соединение 156 (18,60 г, 29,28 ммоль) растворили в метаноле (200 мл). Добавили палладий на углероде (6,15 г, загрузка 10 мас.% (в пересчете на сухое вещество), матрица из порошкообразного углерода, влажный). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 18 ч. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и тщательно промыли слой целита метанолом. Объединенный фильтрат промыли и концентрировали досуха. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 5-10% метанола в дихлорметане с получением соединения 157 (14,26 г, 89%). Масса m/z 544,1 [M-Н]-.
- 189 036584
Соединение 157 (5 г, 9,17 ммоль) растворили в безводном ДМФА (30 мл). Добавили HBTU (3,65 г, 9,61 ммоль) и Х,Х-диизопропилэтиламин (13,73 мл, 78,81 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. К нему добавили раствор соединения 47 (2,96 г, 7,04 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 8 ч. Реакционную смесь вылили в насыщенный водный раствор NaHCO3. Смесь экстрагировали этилацетатом, а органический слой промыли насыщенным солевым раствором и высушили (Na2SO4), отфильтровали и выпарили. Полученный остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 50% этилацетатом в гексане с получением Соединения 158 (8,25 г, 73,3%). Структуру подтвердили анализом МС и 1H ЯМР.
Соединение 158 (7,2 г, 7,61 ммоль) высушили над P2O5 под пониженным давлением. Высушенное соединение растворили в безводном ДМФА (50 мл). К нему добавили Ш-тетразол (0,43 г, 6,09 ммоль), N-метилимидазол (0,3 мл, 3,81 ммоль) и цианоэтил-ННК,К-тетраизопропил-фосфородиамидит (3,65 мл, 11,50 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавили этилацетатом (200 мл). Реакционную смесь промыли насыщенным раствором NaHCO3 и насыщенным солевым раствором. Органическую фазу отделили, высушили (Na2SO4), отфильтровали и выпарили. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией и элюировали 50-90% этилацетатом в гексане с получением соединения 159 (7,82 г, 80,5%). Структуру подтвердили анализом ЖХМС и 31P ЯМР.
160
Олигомерное соединение 160, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-9, получили по стандартным способам синтеза олигонуклеотидов. Три единицы соединения 159 связали с твердой подложкой, затем с фосфорамидитами нуклеотидов. В результате обработки защищенного олигомерного соединения водным аммиаком получили соединение 160. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-9 (GalNAc3-9a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-9 (GalNAc3-9a-CM) пред ставлена ниже рн
- 190 036584
Пример 53. Альтернативный способ получения соединения 18 (GalNAc3-1a и GalNAc3-3a)
Выполнили реакцию лактона 161 с диаминопропаном (3-5 экв.) или моно-Вос-защищинным диаминопропаном (1 экв.) с получением спирта 162a или 162b. При применении для описанной выше реакции незащищенного пропандиамина, избыток диамина удалили выпариванием под высоким вакуумом, а свободную аминогруппу в 162a защитили при помощи CbzCl с получением 162b в виде белого твердого вещества после очистки колоночной хроматографией. Спирт 162b затем взаимодействовал с соединением 4 в присутствии TMSOTf с получением 163a, которое преобразовали в 163b путем снятия Cbz группы при помощи каталитического гидрирования. Пентафторфениловый (PFP) эфир 164 получили взаимодействием трехкислотного соединения 113 (см. пример 48) с PFP-ТФК (3,5 экв.) и пиридином (3,5 экв.) в ДМФА (от 0,1 до 0,5М). Триэфир 164 непосредственно взаимодействовал с амином 163b (3-4 экв.) и DIPEA (3-4 экв.) с получением соединения 18. Представленный выше способ значительно облегчает очистку промежуточных соединений и минимизирует образование побочных продуктов, которые образуются при применении способа, описанного в примере 4.
Пример 54. Альтернативный способ получения соединения 18 (GalNAc3-1a и GalNAc3-3a)
- 191 036584
Три-PFP эфир 164 получили из кислоты 113 по способу, приведенному выше в примере 53, выполнили реакцию этого эфира с моно-Вос-защищенным диамином с получением 165 практически с количественным выходом. Boc -группы сняли хлористоводородной кислотой или трифторуксусной кислотой с получением триамина, который взаимодействовал с активированной кислотой PFP 166 в присутствии подходящего основания, такого как DIPEA, с получением соединения 18.
PFP-защищенную кислоту Gal-NAc 166 получили из соответствующей кислоты обработкой PFPТФК (1-1,2 экв.) и пиридином (1-1,2 экв.) в ДМФА. Кислоту-предшественник, в свою очередь, получили из соответствующего спирта окислением с применением TEMPO (0,2 экв.) и BAIB в ацетонитриле и воде. Спирт-предшественник получили из сахарного промежуточного соединения 4 взаимодействием с 1,6гександиолом (или 1,5-гександиолом или другим диолом для других значений n) (2-4 экв.) и TMSOTf, применив условия, описанные ранее в примере 47.
Пример 55. Дозозависимое исследование олигонуклеотидов, содержащих либо 3'-, либо 5'конъюгирующую группу (сравнение GalNAc3-1, 3, 8 и 9), нацеленных на SRB-1, in vivo.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Неконъюгированный ISIS 353382 включили в качестве стандарта. Каждая из различных конъюгирующих групп GalNAc3 была присоединена либо к 3'-, либо к 5'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида (расщепляемый фрагмент).
Таблица 26
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Мотив Конъюгат SEQ ID NO.
ISIS 353382 (исходное) GeS mCeSTeSTeSmCeSAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTeS mCeSmCeSTeSTe 5/10/5 нет 28
ISIS 655861 GeS mCeSTeSTeSmCeSAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTeS mCeSmCeSTeSTeoAdo’-GalNAC3-la 5/10/5 GalNAcs-l 29
ISIS 664078 GeS mCeSTesTesmCeSAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTes mCeSmCeSTeSTeoAdo’-GalNAc39a 5/10/5 GalNAc3-9 29
ISIS 661161 GalNAc3-3a-o’Ado GeS mCeSTesTeSmCeSAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTeS mCeSmCeSTesTe 5/10/5 GalNAc3-3 30
ISIS 665001 GalNAc3-8a-o’Ado GeS mCeSTeSTeSmCeSAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTeS mCeSmCeSTesTe 5/10/5 GalNAc3-8 30
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9. Структура GalNAc3-9 показана ранее в примере 52. Структура GalNAc3-3 показана ранее в примере 39. Структура GalNAc3-8 показана ранее в примере 47.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 353382, 655861, 664078, 661161, 665001 или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 27, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом. Действительно, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфир-связанные конъюгаты GalNAc3-1 и GalNAc3-9 на 3'-конце (ISIS 655861 и ISIS 664078), а также конъюгаты GalNAc3-3 и GalNAc3-8, связанные на 5'-конце (ISIS 661161 и ISIS 665001), демонстрируют существенное улучшение эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 353382). Кроме того, ISIS 664078, содержащий конъюгат GalNAc3-9 на 3'-конце, был, по существу, настолько же эффективным, как ISIS 655861, который содержит конъюгат GalNAc3-1 на 3'конце. 5'-Конъюгированные антисмысловые олигонуклеотиды, ISIS 661161 и ISIS 665001, содержащие GalNAc3-3 или GalNAc3-9 соответственно, обладают повышенной эффективностью по сравнению с 3'конъюгированными антисмысловыми соединениями (ISIS 655861 и ISIS 664078).
- 192 036584
Таблица 27
ASO, содержащие GalNAc3-1, 3, 8 или 9, нацеленные на SRB-1
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB1 (% от солевого раствора) Конъюгат
Солевой раствор Н.д. 100
353382 3 88 нет
10 68
30 36
655861 0,5 98 GalNac3 -1 (3 )
1,5 76
5 31
15 20
664078 0,5 88 GalNac3-9 (3 )
1,5 85
5 46
15 20
661161 0,5 92 GalNac3-3 (5 )
1,5 59
5 19
15 И
665001 0,5 100 GalNac3-8 (5 )
1,5 73
5 29
15 13
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в таблице.
Таблица 28
ISIS № Доза мг/кг ALT AST Общий билирубин АМК Конъюгат
Солевой раствор 24 59 0,1 37,52
353382 3 21 66 0,2 34,65 нет
10 22 54 0,2 34,2
30 22 49 0,2 33,72
655861 0,5 25 62 0,2 30,65 GalNac3-l (3 )
1,5 23 48 0,2 30,97
5 28 49 0,1 32,92
15 40 97 0,1 31,62
664078 0,5 40 74 0,1 35,3 GalNac3-9 (3 )
1,5 47 104 0,1 32,75
5 20 43 0,1 30,62
15 38 92 0,1 26,2
661161 0,5 101 162 0,1 34,17 GalNac3-3 (5 )
1,5 г 42 100 0,1 33,37
5 г 23 99 0,1 34,97
15 53 83 0,1 34,8
665001 0,5 28 54 0,1 31,32 GalNac3-8 (5 )
1,5 42 75 0,1 32,32
5 24 42 0,1 31,85
15 32 67 0,1 31,
Пример 56. Дозозависимое исследование олигонуклеотидов, содержащих либо 3'-, либо 5'конъюгирующую группу (сравнение GalNAc3-1, 2, 3, 5, 6, 7 и 10), нацеленных на SRB-1, in vivo.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Неконъюгированный ISIS 353382 включили в качестве стандарта. Каждая из различных конъюгирующих групп GalNAc3 была присоединена к 5'-концу соответствующего олигонуклеотида фосфодиэфир-связанным 2'-дезоксиаденозиновым нуклеозидом (расщепляемый фрагмент), за исключением ISIS 655861, в котором конъюгирующая группа GalNAc3 присоединена к 3'-концу.
- 193 036584
Таблица 29
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Мотив Конъюгат SEQ ID NO.
ISIS 353382 (исходное) GeS mCeSTesTeSmCeSAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTes У-es 'CesTesTe 5/10/5 Без конъюгата 28
ISIS 655861 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTes GalNAc3-la mr V-es mCesTesTeoAdo’_ 5/10/5 GalNAcs-l 29
ISIS 664507 GalNAC3-2a-o’A<loGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTes mCeSmCeSTesTe 5/10/5 GalNAc3-2 30
ISIS 661161 GalNAc3-3a-o’Ado Ges mCeSTeSTeSmCeSAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTes mr У-es 'CesTesTe 5/10/5 GalNAc3-3 30
ISIS 666224 GalNAC3-5a-o’A<loGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTes mCeSmCeSTesTe 5/10/5 GalNAc3-5 30
ISIS 666961 GalNAC3-6a-o’A<loGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTes mCeSmCeSTesTe 5/10/5 GalNAc3-6 30
ISIS 666981 GalNAC3-7a-o’A<loGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCeSmCeSTesTe 5/10/5 GalNAc3-7 30
ISIS 666881 GalNAC3-10a-o’A<loGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTes mCeSmCeSTesTe 5/10/5 GalNAcs-lO 30
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9. Структура GalNAc3-2a показана ранее в примере 37. Структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39. Структура GalNAc3-5a показана ранее в примере 49. Структура GalNAc3-6a показана ранее в примере 51. Структура GalNAc3-7a показана ранее в примере 48. Структура GalNAc3-10a показана ранее в примере 46.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 30, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом. Действительно, конъюгированные антисмысловые олигонуклеотиды демонстрируют значительное усиление эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 353382). 5'-конъюгированные антисмысловые олигонуклеотиды демонстрируют небольшое усиление эффективности по сравнению с 3'-конъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом.
- 194 036584
Таблица 30
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB1 (% от солевого раствора) Конъюгат
Солевой раствор Н.д. 100,0
353382 3 96,0 нет
10 73,1
30 36,1
655861 0,5 99,4 GalNac3-l (3 )
1,5 81,2
5 33,9
15 15,2
664507 0,5 102,0 GalNac3-2 (5 )
1,5 73,2
5 31,3
15 10,8
661161 0,5 90,7 GalNac3-3 (5 )
1,5 67,6
5 24,3
15 И,5
666224 0,5 96,1 GalNac3-5 (5 )
1,5 61,6
5 25,6
15 И,7
666961 0,5 85,5 GalNAc3-6 (5 )
1,5 56,3
5 34,2
15 13,1
666981 0,5 84,7 GalNAc3-7 (5')
1,5 59,9
5 24,9
15 8,5
666881 0,5 100,0 GalNAc3-10 (5 )
1,5 65,8
5 26,0
15 13,0
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в табл. 31.
- 195 036584
ISIS № Солевой Доза мг/кг ALT AST Общий билирубин 0,2 АМК Конъюгат
26 57 27
раствор 3 25 92 0,2 27
353382 10 23 40 0,2 25 нет
30 29 54 ОД 28
0,5 25 71 0,2 34
1 5 28 60 02 26
655861 5 26 63 0,2 28 GalNac3-l (3 )
15 25 61 0,2 28
0,5 25 62 0,2 25
1,5 5 24 49 0,2 0,2 26
664507 21 50 26 GalNac3-2 (5 )
15 59 84 ОД 22
0,5 20 42 0,2 29
15г 37 74 02 25
661161 5 г 28 61 0,2 29 GalNac3-3 (5 )
15 21 41 0,2 25
0,5 34 48 0,2 21
1 5 23 46 02 26
666224 5 24 47 0,2 23 GalNac3-5 (5 )
15 32 49 ОД 26
0,5 17 63 0,2 26
1 5 23 68 02 26
666961 5 25 66 0,2 26 GalNAc3-6 (5 )
15 29 107 0,2 28
0,5 24 48 0,2 26
666981 1,5 30 55 0,2 24 GalNAc3-7 (5')
5 46 74 ОД 24
15 29 58 ОД 26
0,5 20 65 0,2 27
666881 1,5 23 59 0,2 24 GalNAc3-10
5 45 70 0,2 26 (5')
15 21 57 0,2 24
Таблица 31
Пример 57. Исследование продолжительности действия олигонуклеотидов, содержащих 3'конъюгирующую группу, нацеленных на ApoC III, in vivo.
Мышам однократно ввели инъекцию дозы, указанной ниже, и в течение 42 дней наблюдали уровни ApoC-III и триглицеридов в плазме (TG в плазме). Исследование выполнили, используя в каждой группе 3 трансгенных мышей, которые экспрессируют человеческий APOC-III.
Таблица 32
Модифицированные ASO, нацеленные на ApoC III
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Связи SEQ ID NO.
ISIS 304801 AeSGeS mCeSTeSTesmCdSTdsTdsGdsTds rnCdsmCdsAdsGdsmCdsTesTesTesAesTe PS 20
ISIS 647535 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCds AdsGdsmCdsTesTesTesAesTeoAdo’_GalNAC3_ la PS 21
ISIS 647536 AesGeomCeoTeoTeomCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCds AdsGdsmCdsTeoTeoTesAesTeoAdo’_GalNAc3_ la PO/PS 21
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9.
- 196 036584
Таблица 33 мРНК ApoC III (% от солевого раствора на 1-й день) и уровни TG в плазме (% от солевого раствора на 1-й день)
ASO Доза Мишень 3-й день 7-й день 14-й день 35-й день 42-й день
Солевой раствор 0 мг/кг АроС-П1 98 100 100 95 116
ISIS 304801 30 мг/кг АроС-Ш 28 30 41 65 74
ISIS 647535 10 мг/кг АроС-П1 16 19 25 74 94
ISIS 647536 10 мг/кг АроС-Ш 18 16 17 35 51
Солевой раствор 0 мг/кг TGb плазме 121 130 123 105 109
ISIS 304801 30 мг/кг TGb плазме 34 37 50 69 69
ISIS 647535 10 мг/кг TGb плазме 18 14 24 18 71
ISIS 647536 10 мг/кг TGb плазме 21 19 15 32 35
Как можно видеть в представленной выше таблице, продолжительность действия увеличивается при добавлении 3'-конъюгирующие группы, по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. Дополнительное увеличение продолжительности действия наблюдали для смешанного конъюгированного PO/PS олигонуклеотида 647536 по сравнению с конъюгированным олигонуклеотидом 647535, содержащим только PS.
Пример 58. Дозозависимое исследование олигонуклеотидов, содержащих 3'-конъюгирующую группу (сравнение GalNAc3-1 и GalNAc4-11), нацеленных на SRB-1, in vivo.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Неконъюгированный ISIS 440762 включили в качестве неконъюгированного стандарта. Каждая из конъюгирующих групп была присоединена к 3'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи расщепляемого фрагмента фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида.
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9. Структура GalNAc3-11a показана ранее в примере 50.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 440762, 651900, 663748 или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 34, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом. Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфир-связанные конъюгаты GalNAc3-1 и GalNAc4-11 на 3'-конце (ISIS 651900 и ISIS 663748), демонстрируют значительное усиление эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 440762). Эти два конъюгированных олигонуклеотида, GalNAc3-1 и GalNAc4-11, были одинаково эффективными.
Таблица 34
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Доза, мг/кг % от контроля с солевым раствором SEQ Ш NO.
Солевой раствор 100
ISIS 440762 Tks CksAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTksmCk 0,6 73,45 22
2 59,66
6 23,50
ISIS 651900 TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTksmCkoAdo'-GalNAc3-la 0,2 62,75 23
0,6 29,14
2 8,61
6 5,62
ISIS 663748 TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTksmCkoAdo'-GalNAc4-l la 0,2 63,99 23
0,6 33,53
2 7,58
6 5,52
- 197 036584
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; k означает 6'-(S)CH3 бициклический нуклеозид; d означает в-О-2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); o означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в табл. 35.
_________________________________________________________________ Т аблица 3 5
ISIS № Доза ALT AST Общий АМК Конъюгат
Солевой мг/кг 30 76 билирубин 0,2 40
раствор
0,60 32 70 0,1 35
440762 2 26 57 ОД 35 нет
6 31 48 0,1 39
0,2 32 115 0,2 39
0,6 2 33 61 0,1 0,1 35
651900 30 50 37 GalNac3-l (3 )
6 34 52 0,1 36
0,2 28 56 0,2 36
663748 0,6 34 60 ОД 35 GalNac4-ll
2 44 62 0,1 36 (3')
6 38 71 0,1 33
Пример 59. Действие GalNAc3-1-конъюгированных ASO, нацеленных на FXI, in vivo.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в исследовании действия многократных нарастающих доз на антисмысловое ингибирование FXI у мышей. ISIS 404071 включили в качестве неконъюгированного стандарта. Каждая из конъюгирующих групп была присоединена к 3'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи расщепляемого фрагмента фосфодиэфир-связанного 2'дезоксиаденозинового нуклеозида.
Таблица 36
Модифицированные ASO, нацеленные на FXI
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Связи SEQ ID NO
ISIS 404071 TesGesGesTesAesAdsTdsmCdsmCdsAdsmCds TdsTdsTdsmCdsAesGesAesGesGe PS 31
ISIS 656172 TesGesGesTesAesAdsTdsmCdsmCdsAdsmCds TdsTdsTdsmCdsAesGesAesGesGeoAdo’_ GalNAc3-la PS 32
ISIS 656173 TesGeoGeoTeoAeoAdsTdsmCdsmCdsAdsmCds TdsTdsTdsmCdsAeoGeoAesGesGeoAdo’_ GaINAc3-la PO/PS 32
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей Balb/c (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) дважды в неделю в течение 3 недель вводили подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 404071, 656172, 656173 или PBS в качестве контрольного образца. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК FXI в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Измерили также уровни белка FXI в плазме при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. Уровни мРНК FXI определяли относительно общей РНК (при помощи RIBOGREEN®), затем нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК FXI для каждой экспериментальной группы. Данные нормализовали к контрольному образцу, обработанному PBS, и обозначили как % PBS. ED50s измеряли по таким же способам, как описаны ранее, и они представлены ниже.
- 198 036584
Таблица 37 мРНК фактора XI (% от солевого раствора)
ASO Доза, мг/кг % от контрольного образца Конъюгат Связи
Солевой раствор 100 нет
ISIS 404071 3 92 нет PS
10 40
30 15
ISIS 656172 0,7 74 GalNAc3-l PS
2 33
6 9
ISIS 656173 0,7 49 GalNAc3-l PO/PS
2 22
6 1
Как показано в табл. 37, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК FXI дозозависимым образом. Олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу 3'-GalNAc3-1, демонстрируют значительное усиление эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 404071). Между эти двумя конъюгированными олигонуклеотидами дополнительное усиление эффективности было обеспечено за счет замены некоторых PS связей на PO (ISIS 656173).
Как показано в табл. 37a, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни белка FXI дозозависимым образом. Олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу 3'-GalNAc3-1, демонстрируют значительное усиление эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 404071). Между эти двумя конъюгированными олигонуклеотидами дополнительное усиление эффективности было обеспечено за счет замены некоторых PS связей на PO (ISIS 656173).
Таблица 37a
Белок фактора XI (% от солевого раствора)
ASO Доза, мг/кг Белок (% от контрольного образца) Конъюгат Связи
Солевой раствор 100 нет
ISIS 404071 3 127 нет PS
10 32
30 3
ISIS 656172 0,7 70 GalNAcs-l PS
2 23
6 1
ISIS 656173 0,7 45 GalNAcs-l PO/PS
2 6
6 0
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин, общий альбумин, CRE и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором. Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в таблице.
Таблица 38
ISIS № Доза мг/кг ALT AST Общий альбумин Общий билирубин CRE АМК Конъюгат
Солевой раствор 71,8 84,0 3,1 0,2 0,2 22,9
404071 3 152,8 176,0 3,1 о,з 0,2 23,0 нет
10 73,3 121,5 3,0 0,2 0,2 21,4
30 82,5 92,3 3,0 0,2 0,2 23,0
656172 0,7 62,5 111,5 3,1 0,2 0,2 23,8 GalNac3-l (3')
2 33,0 51,8 2,9 0,2 0,2 22,0
6 65,0 71,5 3,2 0,2 0,2 23,9
656173 0,7 54,8 90,5 3,0 0,2 0,2 24,9 GalNac3-l (3')
2 85,8 71,5 3,2 0,2 0,2 21,0
6 114,0 101,8 3.3 0,2 0,2 22,7
Пример 60. Действие конъюгированных ASO, нацеленных на SRB-1, in vitro.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в исследовании действия многократных нарастающих доз на антисмысловое ингибирование SRB-1 в первичных гепатоцитах мышей. ISIS 353382
- 199 036584 включили в качестве неконъюгированного стандарта. Каждая из конъюгирующих групп была присоединена к 3'- или 5'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи расщепляемого фрагмента фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида.
Таблица 39
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ASO Последовательность (от 5’ к 3’) Моти в Конъюг ат SE Q ID NO.
ISIS 35338 2 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesT esTe 5/10/5 нет 28
ISIS 65586 1 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesT esTeoAdo'-GalNAc3-la 5/10/5 GalNAcs -1 29
ISIS 65586 2 GesmCeoTeoTeomCeoAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTeomCeomCesTesTeoAdo'-GalNAc3-la 5/10/5 GalNAcs -1 29
ISIS 66116 1 GalNAc3-3a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGds T dsmCds AdsT dsGds AdsmCdsT dsT esmCesmCesT esTe 5/10/5 GalNAcs -3 30
ISIS 66500 1 GalNAc3-8a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGds TdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 5/10/5 GalNAcs -8 30
ISIS 66407 8 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesT esTeoAdo'-GalNAc3-9a 5/10/5 GalNAcs -9 29
ISIS 66696 1 GalNAc3-6a_o’A(loGesmCesTesTesmCesAdsGds T dsmCds AdsT dsGds Ads mCdsT dsT esmCesmCesT esTe 5/10/5 GalNAcs -6 30
ISIS 66450 7 GalNAc3-2a-o’A(loGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 5/10/5 GalNAcs -2 30
ISIS 66688 1 GalNAc3-10a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 5/10/5 GalNAcs -10 30
ISIS 66622 4 GalNAc3-5a-o’A(loGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 5/10/5 GalNAcs -5 30
ISIS 66698 1 GalNAc3-7a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 5/10/5 GalNAcs -7 30
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); о означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9. Структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39. Структура GalNAc3-8a показана ранее в примере 47. Структура GalNAc3-9a показана ранее в примере 52. Структура GalNAc3-6a показана ранее в примере 51. Структура GalNAc3-2a показана ранее в примере 37. Структура GalNAc3-10a показана ранее в примере 46. Структура GalNAc3-5a показана ранее в примере 49. Структура GalNAc3-7a показана ранее в примере 48.
Лечение.
Олигонуклеотиды, перечисленные выше, испытывали in vitro в первичных гепатоцитарных клетках мышей, помещенных на планшеты при плотности 25000 клеток на лунку и обработанных 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 или 20 нМ модифицированного олигонуклеотида. После обработки в течение около 16 ч из клеток выделили РНК и измерили уровни мРНК при помощи количественной ПЦР в реальном времени, а уровни мРНК SRB-1 III скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным при помощи RIBOGREEN®.
IC50 рассчитали по стандартным способам, а результаты представлены в табл. 40. Результаты показывают, что при условиях свободного поглощения, в которых не применяли никакие реагенты или электроимпульсные приемы для искусственного ускорения входа олигонуклеотидов в клетки, олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были существенно более эффективными в гепатоцитах, чем исходный олигонуклеотид (ISIS 353382), который не содержит конъюгат GalNAc.
Таблица 40
ASO ICso(hM) Межнуклеозидные связи Конъюгат SEQID NO.
ISIS 353382 190a PS нет 28
ISIS 655861 lla PS GalNAc3-l 29
ISIS 655862 3 PO/PS GalNAc3-l 29
- 200 036584
ISIS 661161 15a PS GalNAc3-3 30
ISIS 665001 20 PS GalNAc3-8 30
ISIS 664078 55 PS GalNAc3-9 29
ISIS 666961 22a PS GalNAc3-6 30
ISIS 664507 30 PS GalNAc3-2 30
ISIS 666881 30 PS GalNAc3-10 30
ISIS 666224 30a PS GalNAc3-5 30
ISIS 666981 40 PS GalNAc3-7 30
a Среднее для нескольких повторов.
Пример 61. Получение олигомерного соединения 175, содержащего GalNAc3-12
172
- 201 036584
Риган hi с . н2
MeOH 1 EtOAc
I. Бзсэтнь и буфер, ДМ CD, pH B.E·, кэмн.т-рв
Соединение 169 имеется в продаже. Соединение 172 получили добавлением бензил(перфторфенил)глутарата к соединению 171. Бензил(перфторфенил)глутарат получили добавлением PFP-ТФК и DIEA к 5-(бензилокси)-5-оксопентановой кислоте в ДМФА. Олигомерное соединение 175, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-12, получили из соединения 174 по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-12 (GalNAc3-12a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-12 (GalNAc3-12a-CM-) представлена ниже
- 202 036584
Пример 62. Получение олигомерного соединения 180, содержащего GalNAc3-13
- 203 036584
Соединение 176 получили по общему способу, представленному в примере 2. Олигомерное соединение 180, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-13, получили из соединения 177 по общим способам, представленным в примере 49. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc313 (GalNAc3-13a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-13 (GalNAc3-13a-CM-) представлена ниже
Пример 63. Получение олигомерного соединения 188, содержащего GalNAc3-14
Соединения 181 и 185 имеются продаже. Олигомерное соединение 188, содержащее конъюгив
1. Pd/c, н2
2. РРР.ТФК, руг pH 8.5, комн, т-ра
[ OLIGOEO -Ρ -α-(CH2fe-Nн2
1. Боратный буфер. ДМСО,
- 204 036584 рующую группу GalNAc3-14, получили из соединения 187 по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-14 (GalNAc3-14a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-14 (GalNAc3-14a-CM-) представлена ниже
Пример 64. Получение олигомерного соединения 197, содержащего GalNAc3-15
Соединение 189 имеется в продаже. Соединение 195 получили по общему способу, представленному в примере 31. Олигомерное соединение 197, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-15, полуАсО ОАс
- 205 036584 чили из соединений 194 и 195, применив стандартные способы синтеза олигонуклеотидов. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-15 (GalNAc3-15a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-15 (GalNAc3-15a-CM-) представлена ниже
NHAc
Пример 65. Дозозависимое исследование олигонуклеотидов, содержащих 5'-конъюгирующую группу (сравнение GalNAc3-3, 12, 13, 14 и 15), нацеленных на SRB-1, in vivo.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Неконъюгированный ISIS 353382 включили в качестве стандарта. Каждая из конъюгирующих групп GalNAc3 была присоединена к 5'-концу соответствующего олигонуклеотида при помощи расщепляемого фрагмента фосфодиэфир-связанного 2'-дезоксиаденозинового нуклеозида.
Таблица 41
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Конъюгат SEQ ID NO.
35338 2 Ges CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTdsTes Ces CesT esTe нет 28
66116 1 GalNAc3-3a- o’AdoGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds TesmCesmCesTesTe GalNAc3-3 30
67114 4 GalNAc3-12a- o’AdoGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds TesmCesmCesTesTe GalNAc3-12 30
67006 1 GalNAc3-13a- o’AdoGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds TesmCesmCesTesTe GalNAc3-13 30
67126 1 GalNAc3-14a- o’AdoGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds TesmCesmCesTesTe GalNAc3-14 30
67126 2 GalNAc3-15a- o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTds TesmCesmCesTesTe GalNAc3-15 30
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39. Структура GalNAc3-12a показана ранее в примере 61. Структура GalNAc3-13a показана ранее в примере 62. Структура GalNAc3-14a показана ранее в примере 63. Структура GalNAc3-15a показана ранее в примере 64.
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам C57bl6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) один или два раза ввели подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 353382, 661161, 671144, 670061, 671261, 671262 или солевого раствора. Мыши, которым вводили дозу два раза, вторую дозу вводили через три дня после первой дозы. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы,
- 206 036584 нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 42, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом. Не наблюдали значительной разницы нокдауна мишени между животными, получавшими одну дозу, и животными, получавшими две дозы (см. ISIS 353382 в дозах 30 и 2x15 мг/кг; и ISIS 661161 в дозах 5 и 2x2,5 мг/кг). Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирсвязанные конъюгаты GalNAc3-3, 12, 13, 14 и 15, демонстрируют существенное усиление эффективности по сравнению с неконъюгированным антисмысловым олигонуклеотидом (ISIS 335382).
Таблица 42 мРНК SRB-1 (% от солевого раствора)
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% от солевого раствора) EDso (мг/кг) Конъюгат
Солевой раствор н.д. 100,0 Н.д. н.д.
353382 3 85,0 22,4 нет
10 69,2
30 34,2
2x15 36,0
661161 0,5 87,4 2,2 GalNAc3-3
1,5 59,0
5 25,6
2x2,5 27,5
15 17,4
671144 0,5 101,2 3,4 GalNAc3-12
1,5 76,1
5 32,0
15 17,6
670061 0,5 94,8 2,1 GalNAc3-13
1,5 57,8
5 20,7
15 13,3
671261 0,5 110,7 4,1 GalNAc3-14
1,5 81,9
5 39,8
15 14,1
671262 0,5 109,4 9,8 GalNAc3-15
1,5 99,5
5 69,2
15 36,1
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором (данные не показаны). Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в табл. 43.
______________________________________________________________ Таблица 43
ISIS № Доза (мг/кг) ALT (ед./л) AST (ед./л) Общий билирубин (мг/дл) АМК (мг/дл) Конъюгат
Солевой раствор Н.д. 28 60 ОД 39 н.д.
353382 3 30 77 0,2 36 нет
10 25 78 0,2 36
30 28 62 0,2 35
2х 15 22 59 0,2 33
661161 0,5 39 72 0,2 34 GalNAc3-3
1,5 26 50 0,2 33
5 41 80 0,2 32
2x2,5 24 72 0,2 28
15 32 69 0,2 36
671144 0,5 25 39 0,2 34 GalNAc312
1,5 26 55 0,2 28
5 48 82 0,2 34
15 23 46 0,2 32
670061 0,5 27 53 0,2 33 GalNAc313
1,5 24 45 0,2 35
5 23 58 ОД 34
15 24 72 ОД 31
671261 0,5 69 99 ОД 33 GalNAcs14
1,5 34 62 ОД 33
5 43 73 ОД 32
15 32 53 0,2 30
671262 0,5 24 51 0,2 29 GalNAc315
1,5 32 62 ОД 31
5 30 76 0,2 32
15 31 64 ОД 32
Пример 66. Влияние различных расщепляемых фрагментов на антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих кластер 5'-GalNAc3.
- 207 036584
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Каждая из конъюгирующих групп GalNAc3 была присоединена к 5'концу соответствующего олигонуклеотида при помощи фосфодиэфир-связанного нуклеозида (расщепляемый фрагмент (CM)).
Таблица 44
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID NO.
66116 1 GalNAc3-3a-o’AdoGes mCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAds TdsGdsAdsmCdsTdsTes mCesmCesTesTe GalNAc3-3a Ad 30
67069 9 GalNAc3-3a- o’TdoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAds mCdsTdsTeomCeomCesTesTe GalNAc3-3a Td 33
67070 0 GalNAc3-3a- o’AeoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAds mCdsTdsTeomCeomCesTesTe GalNAc3-3a 30
67070 1 GalNAc3-3a- o’TeoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAds mCdsTdsTeomCeomCesTesTe GalNAc3-3a Te 33
67116 5 GalNAc3-13a- oAdoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAds mCdsTdsTeomCeomCesTesTe GalNAc3-13a Ad 30
Заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-D2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39. Структура GalNAc3-13a показана ранее в примере 62.
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам C57bl6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, соединения ISIS 661161, 670699, 670700, 670701, 671165 или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 45, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом. Все антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие различные расщепляемые фрагменты, демонстрируют одинаковую эффективность.
Таблица 45 мРНК SRB-1 (% от солевого раствора)
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% от солевого раствора) Кластер GalNAc3 CM
Солевой раствор Н.Д. 100,0 Н.Д. Н.Д.
661161 0,5 87,8 GalNAc3-3a Ad
1,5 61,3
5 33,8
15 14,0
670699 0,5 89,4 GalNAc3-3a Td
1,5 59,4
5 31,3
15 17,1
670700 0,5 79,0 GalNAc3-3a Ae
1,5 63,3
5 32,8
15 17,9
670701 0,5 79,1 GalNAc3-3a Te
1,5 59,2
5 35,8
15 17,7
671165 0,5 76,4 GalNAc3-13a Ad
1,5 43,2
5 22,6
15 10,0
- 208 036584
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором (данные не показаны). Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в табл. 46.
Таблица 46
ISIS № Солевой раствор 661161 Доза (мг/кг) Н.Д. 0,5 1,5 5 15 ALT (ед./л) 24 25 24 26 27 AST (ед./л) 64 64 50 55 52 Общий билируб ин (мг/дл) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 АМК (мг/дл) 31 31 32 28 31 Кластер GalNAcs Н.Д. GalNAc3-3a CM Н.Д. Ad
670699 0,5 42 83 0,2 31 GalNAc3-3a Td
1,5 33 58 0,2 32
5 26 70 0,2 29
15 25 67 0,2 29
670700 0,5 40 74 0,2 27 GalNAc3-3a Ae
1,5 23 62 0,2 27
5 24 49 0,2 29
15 25 87 0,1 25
670701 0,5 30 77 0,2 27 GalNAc3-3a Te
1,5 22 55 0,2 30
5 81 101 0,2 25
15 31 82 0,2 24
671165 0,5 44 84 0,2 26 GalNAc313a Ad
1,5 47 71 ОД 24
5 33 91 0,2 26
15 33 56 0,2 29
Пример 67. Получение олигомерного соединения 199, содержащего GalNAc3-16
ОАс
98d
АсО ОАс
НО ОН
Олигомерное соединение 199, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-16, получили по общим способам, представленным в примерах 7 и 9. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы
- 209 036584
GalNAc3-16 (GalNAc3-16a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-16 (GalNAc3-16a-CM-) представлена ниже
Пример 68. Получение олигомерного соединения 200, содержащего GalNAc3-17
Олигомерное соединение 200, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-17, получили по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-17 (GalNAc3-17a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-17 (GalNAc3-17a-CM-) представлена ниже
Пример 69. Получение олигомерного соединения 201, содержащего GalNAc3-18.
Олигомерное соединение 201, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-18, получили по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-18 (GalNAc3-18a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-18 (GalNAc3-18a-CM-) представлена ниже
AcHN
- 210 036584
Пример 70. Получение олигомерного соединения 204, содержащего GalNAc3-19
Олигомерное соединение 204, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-19, получили из соединения 64 по общим способам, представленным в примере 52. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-19 (GalNAc3-19a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-19 (GalNAc3-19a-CM-) представлена ниже
Пример 71. Получение олигомерного соединения 210, содержащего GalNAc3-20
- 211 036584
1. ДНК синтезатор
2. водн. NHj
Соединение 205 получили добавлением PFP-ТФК и DIEA к 6-(2,2,2-трифторацетамидо)гексановой кислоте в ацетонитриле, которую получили добавлением трифторуксусного ангидрида к 6аминогексановой кислоте. Реакционную смесь нагрели до 80°С, затем охладили до комнатной температуры. Олигомерное соединение 210, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-20, получили из соединения 208 по общим способам, представленным в примере 52. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-20 (GalNAc3-20a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-20 (GalNAc3-20a-CM-) представлена ниже
- 212 036584
Пример 72. Получение олигомерного соединения 215, содержащего GalNAc3-21
215
Соединение 211 имеется в продаже. Олигомерное соединение 215, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-21, получили из соединения 213 по общим способам, представленным в примере 52. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-21 (GalNAc3-21a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-AdP(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-21 (GalNAc3-21a-CM-) представлена ниже
- 213 036584
Пример 73. Получение олигомерного соединения 221, содержащего GalNAc3-22
Соединение 220 получили из соединения 219, применив тетразолид диизопропиламмония. Олигомерное соединение 221, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-21, получили из соединения 220 по общему способу, представленному в примере 52. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-22 (GalNAc3-22a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-. Структура GalNAc3-22 (GalNAc3-22a-CM-) представлена ниже
- 214 036584
Пример 74. Влияние различных расщепляемых фрагментов на антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих конъюгат 5'-GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей. Каждая из конъюгирующих групп GalNAc3 была присоединена к 5'концу соответствующего олигонуклеотида.
Таблица 47
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 C M SEQ ID NO.
35338 2 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAds mcesmcesTesTe н.д. н.д 28
66116 1 GalNAc3-3a-0-Ad0Ges mCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTds GdSAdsmCdsTdsTes mCesmCesTesTe GalNAc3-3a Ad 30
66690 4 GalNAc3-3a-o’Ges mCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAdsmCdsTdsTes mCesmCesTesTe GalNAc3-3a PO 28
67544 1 GalNAc3-17a-o’AdoGes mCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAdsmCdsTdsTes mCesmCesTesTe GalNAc3-17a Ad 30
67544 2 GalNAc3-18a-o’AdoGes mCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAdsmCdsTdsTes mCesmCesTesTe GalNAc3-18a Ad 30
Во всех таблицах заглавные буквы указывают азотистое основание для каждого нуклеозида, а mC означает 5-метилцитозин. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает в-О-2'-дезоксирибонуклеозид; s означает тиофосфатную межнуклеозидную связь (PS); o означает фосфодиэфирную межнуклеозидную связь (PO); и o' означает -O-P(=O)(OH)-. Конъюгирующие группы выделены жирным шрифтом.
Структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39. Структура GalNAc3-17a показана ранее в примере 68, а структура GalNAc3-18a показана ранее в примере 69.
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам C57bl6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, олигонуклеотида, перечисленного в табл. 47, или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 48, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB1 дозозависимым образом. Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, демонстрируют равные эффективности и являются значительно более эффективными, чем исходный олигонуклеотид, не имеющий конъюгата GalNAc.
- 215 036584
Таблица 48 мРНК SRB-1 (% от солевого раствора)
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% от солевого раствора) Кластер GalNAc3 CM
Солевой раствор н.д. 100,0 н.д. н.д.
353382 3 79,38 н.д. Н.д.
10 68,67
30 40,70
661161 0,5 79,18 GalNAc3-3a Ad
1,5 75,96
5 30,53
15 12,52
666904 0,5 91,30 GalNAc3-3a PO
1,5 57,88
5 21,22
15 16,49
675441 0,5 76,71 GalNAc3-17a Ad
1,5 63,63
5 29,57
15 13,49
675442 0,5 95,03 GalNAc3-18a Ad
1,5 60,06
5 31,04
15 19,40
Уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли относительно мышей, инъецированных солевым раствором, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором (данные не показаны). Значения ALT, AST, общего билирубина и АМК представлены ниже в табл. 49.
_____________________________________________________________ Таблица 49
ISIS № Доза (мг/кг) ALT (ед ./л) AST (ед./л) Общий билируб ин (мг/дл) АМК (мг/дл) Кластер GalNAcs CM
Солевой раствор н.д. 26 59 0,16 42 н.д. н.д.
353382 3 23 58 0,18 39 н.д. Н.д.
10 28 58 0,16 43
30 20 48 0,12 34
661161 0,5 30 47 0,13 35 GalNAc3-3a Ad
1,5 23 53 0,14 37
5 26 48 0,15 39
15 32 57 0,15 42
666904 0,5 24 73 0,13 36 GalNAc3-3a РО
1,5 21 48 0,12 32
5 19 49 0,14 33
15 20 52 0,15 26
675441 0,5 42 148 0,21 36 GalNAc317а Ad
1,5 60 95 0,16 34
5 27 75 0,14 37
15 24 61 0,14 36
675442 0,5 26 65 0,15 37 GalNAc318а Ad
1,5 25 64 0,15 43
5 27 69 0,15 37
15 30 84 0,14 37
Пример 75. Фармакокинетический анализ олигонуклеотидов, содержащих 5'-конъюгирующую группу.
ФК ASO, представленные выше в табл. 41, 44 и 47, оценили с применением образцов печени, которые получили после выполнения способов лечения, описанных в примерах 65, 66 и 74. Образцы печени измельчили и экстрагировали по стандартным протоколам и анализировали при помощи ИП-ВЭЖХ-МС вместе с внутренним стандартом. Суммарный уровень (мкг/г) всех метаболитов в ткани измерили интегрированием соответствующих УФ-пиков, а уровни в ткани ASO полной длины, не содержащие конъюгата (исходное, в данном случае Isis № 353382), измерили с применением подходящих ионэкстракционных хроматограмм (EIC).
- 216 036584
Таблица 50
ФК анализ в печени
ISIS № Доза (мг/кг) Общий уровень в печени по УФ (мкг/г) Уровень исходного ASO в печени по EIC (мкг/г) Кластер GalNAc3 CM
353382 3 8,9 8,6 н.д. н.д.
10 22,4 21,0
30 54,2 44,2
661161 5 32,4 20,7 GalNAc3-3a Ad
15 63,2 44,1
671144 5 20,5 19,2 GalNAc3-12a Ad
15 48,6 41,5
670061 5 31,6 28,0 GalNAc3-13a Ad
15 67,6 55,5
671261 5 19,8 16,8 GalNAc3-14a Ad
15 64,7 49,1
671262 5 18,5 7,4 GalNAc3-15a Ad
15 52,3 24,2
670699 5 16,4 10,4 GalNAc3-3a Td
15 31,5 22,5
670700 5 19,3 10,9 GalNAc3-3a Ae
15 38,1 20,0
670701 5 21,8 8,8 GalNAc3-3a Те
15 35,2 16,1
671165 5 27,1 26,5 GalNAc3-13a Ad
15 48,3 44,3
666904 5 30,8 24,0 GalNAc3-3a PO
15 52,6 37,6
675441 5 25,4 19,0 GalNAc3-17a Ad
15 54,2 42,1
675442 5 22,2 20,7 GalNAc3-18a Ad
15 39,6 29,0
Результаты, представленные выше в табл. 50, демонстрируют, что наблюдали более высокие уровни в печени олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующую группу GalNAc3, чем исходного олигонуклеотида, не содержащего конъюгирующую группу GalNAc3 (ISIS 353382) через 72 ч после введения олигонуклеотида, особенно с учетом введения различных доз для олигонуклеотидов с группой конъюгата GalNAc3 и без нее. Кроме того, через 72 ч 40-98% каждого олигонуклеотида, содержащего конъюгирующую группу GalNAc3, было метаболизировано до исходного соединения, что указывает на то, что конъюгирующие группы GalNAc3 расщепляются в указанных олигонуклеотидах.
- 217 036584
Пример 76. Получение олигомерного соединения 230, содержащего GalNAc3-23
Соединение 222 имеется в продаже. 44,48 мл (0,33 моль) соединения 222 обрабатывали тозилхлоридом (25,39 г, 0,13 моль) в пиридине (500 мл) в течение 16 ч. Затем реакционную смесь выпарили до маслянистого вещества, растворили в EtOAc и промыли водой, насыщенным раствором NaHCO3, насыщенным солевым раствором и высушили над Na2SO4. Этилацетат концентрировали досуха и очистили колоночной хроматографией, элюировали EtOAc в гексанах (1:1), затем 10% метанола в CH2Cl2 с получением соединения 223 в виде бесцветного маслянистого вещества. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались с указанной структурой. 10 г (32,86 ммоль) 1-тозилтриэтиленгликоля (соединение 223) обрабатывали азидом натрия (10,68 г, 164,28 ммоль) в ДМСО (100 мл) при комнатной температуре в течение 17 ч. Затем реакционную смесь вылили в воду и экстрагировали EtOAc. Органический слой три раза промыли
- 218 036584 водой и высушили над Na2SO4. Органический слой концентрировали досуха с получением 5,3 г соединения 224 (92%). Данные ЖХМС и ЯМР согласовались с указанной структурой. 1-Азидотриэтиленгликоль (соединение 224, 5,53 г, 23,69 ммоль) и соединение 4 (6 г, 18,22 ммоль) обработали 4А молекулярными ситами (5 г) и TMSOTf (1,65 мл, 9,11 ммоль) в дихлорметане (100 мл) под инертной атмосферой. Через 14 ч реакционную смесь отфильтровали для удаления сит, а органический слой промыли насыщенным раствором NaHCO3, водой, насыщенным солевым раствором и высушили над Na2SO4. Органический слой концентрировали досуха и очистили колоночной хроматографией, элюировали градиентом от 2 до 4% метанола в дихлорметане с получением соединения 225. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались со структурой. Соединение 225 (11,9 г, 23,59 ммоль) гидрировали в EtOAc/метаноле (4:1, 250 мл) на катализаторе Перлмана. Через 8 ч катализатор удалили фильтрованием, а растворители удалили досуха с получением соединения 226. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались со структурой.
Для получения соединения 227 раствор нитрометантриспропионовой кислоты (4,17 г, 15,04 ммоль) и основание Хюнига (10,3 мл, 60,17 ммоль) в ДМФА (100 мл) по каплям обработали пентафтортрифторацетатом (9,05 мл, 52,65 ммоль). Через 30 мин реакционную смесь вылили в ледяную воду и экстрагировали EtOAc. Органический слой промыли водой, насыщенным солевым раствором и высушили над Na2SO4. Органический слой концентрировали досуха, а затем перекристаллизовали из гептана с получением соединения 227 в виде белого твердого вещества. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались с указанной структурой. Соединение 227 (1,5 г, 1,93 ммоль) и соединение 226 (3,7 г, 7,74 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в ацетонитриле (15 мл) в течение 2 ч. Затем реакционную смесь выпарили досуха и очистили колоночной хроматографией, элюируя градиентом от 2 до 10% метанола в дихлорметане с получением соединения 228. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались со структурой. Соединение 228 (1,7 г, 1,02 ммоль) обработали никелем Ренея (около 2 г, влажный) в этаноле (100 мл) в атмосфере водорода. Через 12 ч катализатор удалили фильтрованием, а органический слой выпарили до твердого вещества, которое применили непосредственно на следующей стадии. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались с указанной структурой. Это твердое вещество (0,87 г, 0,53 ммоль) обработали бензилглутаровой кислотой (0,18 г, 0,8 ммоль), HBTU (0,3 г, 0,8 ммоль) и DIEA (273,7 мкл, 1,6 ммоль) в ДМФА (5 мл). Через 16 ч ДМФА удалили под пониженным давлением при 65°С до маслянистого вещества, и это маслянистое вещество растворили в дихлорметане. Органический слой промыли насыщенным раствором NaHCO3, насыщенным солевым раствором и высушили над Na2SO4. После выпаривания органического слоя соединение очистили колоночной хроматографией и элюировали градиентом от 2 до 20% метанола в дихлорметане с получением связанного продукта. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались с указанной структурой. С бензилового эфира сняли защиту на катализаторе Перлмана в атмосфере водорода в течение 1 ч. Затем катализатор удалили фильтрованием, а растворители удалили досуха с получением кислоты. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались с указанной структурой. Эту кислоту (486 мг, 0,27 ммоль) растворили в сухом ДМФА (3 мл). Добавили пиридин (53,61 мкл, 0,66 ммоль) и продули реакционную смесь аргоном. К реакционной смеси медленно добавили пентафтортрифторацетат (46,39 мкл, 0,4 ммоль). Цвет реакционной смеси изменился с бледно-желтого на винный, и появился легкий дымок, который улетучился с потоком аргона. Реакционную смесь оставили перемешиваться при комнатной температуре на 1 ч (завершение реакции подтвердили по ЖХМС). Растворитель удалили под пониженным давлением (ротационный испаритель) при 70°С. Остаток разбавили ДХМ и промыли 1н. NaHSO4, насыщенным солевым раствором, насыщенным раствором бикарбоната натрия и снова насыщенным солевым раствором. Органический слой высушили над Na2SO4, отфильтровали и концентрировали досуха с получением 225 мг соединения 229 в виде хрупкой желтой пены. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались с указанной структурой.
Олигомерное соединение 230, содержащее конъюгирующую группу GalNAc3-23, получили из соединения 229 по общим способам, представленным в примере 46. Кластерная часть GalNAc3 конъюгирующей группы GalNAc3-23 (GalNAc3-23a) может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом для получения различных конъюгирующих групп. Структура GalNAc3-23 (GalNAc3-23a-CM) представлена ниже
NHAc ОН?Н
Пример 77. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей.
- 219 036584
Таблица 51
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ Ш NO.
66116 1 GalNAc3-3a- GdsAds mCdsTdsTes mCesmCesTesTe GalNAc3-3a Ad 30
66690 4 GalNAc3-3a-O’Ges mCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAdsmCdsTdsTes mCesmCesTesTe GalNAc3-3a PO 28
67350 2 GalNAc3-10ao’AdoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTds p A Τ T Ά Τ T Missels ''ds 1 ds 1 co v'co v'cs 1 cs 1 c GalNAc3-10a Ad 30
67784 4 GalNAc3-9a- o’AdoGes mCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTds F А тГ Τ T Ά Τ T ΆίδΆδ ''ds'dscs V'cs ees1es1e GalNAc3-9a Ad 30
67784 3 GalNAc3-23a- o’AdoGes mCesTesTesmCesAdSGdSTdS mCdsAdsTds p А тС Τ T тС Τ T ^ds^ds ’'ds'dscs v'cs ^cs'cs'c GalNAc3-23a Ad 30
65586 1 Ges mCeSTesTesmCesAdSGdSTdS mCdsAdsTdsGdsAdSmCdsTdsTe m m s ^'cs ^'cs 1 es coA(|o’-GalNAc3_la GalNAc3-la Ad 29
67784 1 GeS mCeSTesTesmCesAdSGdSTdS mCdSAdsTdSGdSAdSmCdSTdSTe s Ges CesTesTeoA(iO’-GalNAC3-19a GalNAc3-19a Ad 29
67784 2 Ges mCesTesTesmCeSAdSGdSTds mCdSAdSTds GdgAds 0'dsTdgTcs Cgs GesTesTeoAdo,_Gi|INAc3_20a GalNAc3-20a Ad 29
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9, GalNAc3-3a показана в примере 39, GalNAc3-9a показана в примере 52, GalNAc3-10a показана в примере 46, GalNAc3-19a показана в примере 70, GalNAc3-20a показана в примере 71, и GalNAc3-23a показана в примере 76.
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам C57bl6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, олигонуклеотида, перечисленного в табл. 51, или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 52, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом.
Таблица 52 мРНК SRB-1 (% от солевого раствора)
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% от солевого раствора) Кластер GalNAc3 CM
Солевой раствор Н.Д. 100,0 Н.Д. Н.Д.
661161 0,5 89,18 GalNAc3-3a Ad
1,5 77,02
5 29,10
15 12,64
666904 0,5 93,11 GalNAc3-3a PO
1,5 55,85
5 21,29
15 13,43
673502 0,5 77,75 GalNAc3-10a Ad
1,5 41,05
5 19,27
15 14,41
677844 0,5 87,65 GalNAc3-9a Ad
1,5 93,04
5 40,77
15 16,95
677843 0,5 102,28 GalNAc3-23a Ad
1,5 70,51
5 30,68
15 13,26
655861 0,5 79,72 GalNAc3-la Ad
1,5 55,48
5 26,99
15 17,58
677841 0,5 67,43 GalNAc3-19a Ad
1,5 45,13
5 27,02
15 12,41
677842 0,5 64,13 GalNAc3-20a Ad
1,5 53,56
5 20,47
15 10,23
- 220 036584
Измерили также уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке, применяя стандартные протоколы. Оценили также общий билирубин и азот мочевины крови (АМК). Проверили изменение массы тела, которое существенно не отличалось от группы с солевым раствором (данные не показаны). Значения ALT, AST, общего билирубина и
АМК представлены ниже в табл. 53.
Таблица 53
ISIS № Доза (мг/кг) ALT (ед./л) AST (ед./л) Общий билируб ин (мг/дл) АМК (мг/дл) Кластер GalNAc3 CM
Солевой раствор н.д. 21 45 0,13 34 н.д. н.д.
661161 0,5 28 51 0,14 39 GalNAc3-3a Ad
1,5 23 42 0,13 39
5 22 59 0,13 37
15 21 56 0,15 35
666904 0,5 24 56 0,14 37 GalNAc3-3a PO
1,5 26 68 0,15 35
5 23 77 0,14 34
15 24 60 0,13 35
673502 0,5 24 59 0,16 34 GalNAc310а Ad
1,5 20 46 0,17 32
5 24 45 0,12 31
15 24 47 0,13 34
677844 0,5 25 61 0,14 37 GalNAc3-9a Ad
1,5 23 64 0,17 33
5 25 58 0,13 35
15 22 65 0,14 34
677843 0,5 53 53 0,13 35 GalNAc323a Ad
1,5 25 54 0,13 34
5 21 60 0,15 34
15 22 43 0,12 38
655861 0,5 21 48 0,15 33 GalNAc3-la Ad
1,5 28 54 0,12 35
5 22 60 0,13 36
15 21 55 0,17 30
677841 0,5 32 54 0,13 34 GalNAc319a Ad
1,5 24 56 0,14 34
5 23 92 0,18 31
15 24 58 0,15 31
677842 0,5 23 61 0,15 35 GalNAc320a Ad
1,5 24 57 0,14 34
5 41 62 0,15 35
15 24 37 0,14 32
Пример 78. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на ангиотензиноген, содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования ангиотензиногена (AGT) у нормотензивных мышей Спрага-Доули.
Таблица 54
Модифицированные ASO, нацеленные на AGT
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID NO.
55266 8 mCesAesmCesTesGesAdsTdsTdsTdsTdsTdsGdsmCdsmCdsmCdsA esGes GesAesTe н.д. н.д. 34
66950 9 mCesAesmCesTesGesAdsTdsTdsTdsTdsTdsGdsmCdsmCdsmCdsA esGes GesAesTeoAdo’“GalNAc3“la GalNAc3-la Ad 35
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9.
Лечение.
Шестинедельным самцам крыс Спрага-Доули один раз в неделю вводили подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, в целом три дозы олигонуклеотида, перечисленного в табл. 54, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Крыс умертвили через 72 ч после последней дозы. Уровни мРНК AGT в печени измерили при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни белка AGT в плазме измерили при помощи твердофазного иммуноферментного анализа для определения общего ангиотензиногена (кат. № JP27412, IBL International, Торонто, штат Онтарио) с разбавлением плазмы 1:20000. Результаты, показанные ниже, представлены как средний про- 221 036584 цент от уровней мРНК AGT в печени или от уровней белка AGT в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу с PBS.
Как показано в табл. 55, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК AGT в печени и уровни белка в плазме дозозависимым образом, и олигонуклеотид, содержащий конъюгат GalNAc, был значительно более эффективным, чем исходный олигонуклеотид, не содержащий конъюгата GalNAc.
Таблица 55
Уровни мРНК AGT в печени и белка в плазме
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК AGT в печени (% PBS) Белок AGT в плазме (% PBS) Кластер GalNAc3 СМ
PBS н.д. 100 100 н.д. Н.д.
552668 3 95 122 Н.д. Н.д.
10 85 97
30 46 79
90 8 11
669509 0,3 95 70 GalNAc3-la Аа
1 95 129
3 62 97
10 9 23
Измерили также уровни трансаминазы в печени, аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в плазме, а также массу тела в момент умерщвления, применяя стандартные протоколы. Результаты представлены ниже в табл. 56.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 57, испытали в исследовании однократной дозы на продолжительность действия у мышей.
Таблица 57
Модифицированные ASO, нацеленные на APOC-III
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID NO.
30480 1 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCdsAdsGdsmCdsT esTes TesAesTe н.д. н.д. 20
64753 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCdsAdsGdsmCdsT GalNAc3-la Ad 21
5 esTes TesAesTeoAdo’-GalNAc3-la
66308 3 GalNAc3-3ao’Ado AesGesmCesTesT esmCdsT dsTdsGdsT dsmCds mCdsAdsGdsmCdsTesTes TesAesTe GalNAc3-3a Ad 36
67444 9 GalNAc3-7ao’Ado AesGesmCesTesT esmCdsT dsTdsGdsT dsmCds mCdsAdsGdsmCdsTesTes TesAesTe GalNAc3-7a Ad 36
67445 0 GalNAc3-10ao’Ado AesGesmCesTesT esmCdsT dsTdsGdsT dsmCds mCdsAdsGdsmCdsTesTes TesAesTe GalNAc3-10a Ad 36
67445 1 GalNAc3-13ao’Ado AesGesmCesTesT esmCdsT dsTdsGdsT dsmCds mCdsAdsGdsmCdsTesTes TesAesTe GalNAc3-13a Ad 36
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9, GalNAc3-3a показана в примере 39, GalNAc3-7a
- 222 036584 показана в примере 48, GalNAc3-10a показана в примере 46, и GalNAc3-13a показана в примере 62.
Лечение.
Шести-восьминедельным трансгенным мышам, экспрессирующим человеческий APOC-III, ввели однократную подкожную инъекцию олигонуклеотида, перечисленного в табл. 57, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 3 животных. Образцы крови брали до введения дозы для определения исходного значения, а также через 72 ч, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель и 6 недель после введения дозы. Уровни триглицеридов и белка APOC-III в плазме измерили так, как описано в примере 20. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент от уровней триглицеридов и APOC-III в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных и исходным значениям, и они демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу GalNAc, обладают более продолжительным действием, чем исходный олигонуклеотид, не содержащий конъюгирующую группу (ISIS 304801), даже несмотря на то, что доза исходного соединения была в три раза выше, чем доза олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующую группу GalNAc.
Таблица 58
Уровни триглицеридов и белка APOC-III в плазме трансгенных мышей
ISIS № Доза (мг/кг) Временные точки(дни после введения дозы) Триглицериды (% от исходного значения) Белок APOC-III (% от исходного значения) Кластер GalNAc3 CM
PBS н.д. 3 97 102 н.д. н.д.
7 101 98
14 108 98
21 107 107
28 94 91
35 88 90
42 91 105
304801 30 40 34 н.д. Н.Д.
7 41 37
14 50 57
21 50 50
28 57 73
35 68 70
42 75 93
647535 10 36 37 GalNAc3-la Ad
7 39 47
14 40 45
21 41 41
28 42 62
35 69 69
42 85 102
663083 10 24 18 GalNAc3-3a Ad
7 28 23
14 25 27
21 28 28
28 37 44
35 55 57
42 60 78
674449 10 3 29 26 GalNAc3-7a Ad
7 32 31
14 38 41
21 44 44
28 53 63
35 69 77
42 78 99
674450 10 3 33 30 GalNAc310a Ad
7 35 34
14 31 34
21 44 44
28 56 61
35 68 70
42 83 95
674451 10 3 35 33 GalNAc313a Ad
7 24 32
14 40 34
21 48 48
28 54 67
35 65 75
42 74 97
Пример 80. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на а1-антитрипсин (A1AT), содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 59, испытали в исследовании дозозависимого ингибирования A1AT у мышей.
- 223 036584
Таблица 59
Модифицированные ASO, нацеленные на A1AT
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAcs CM SEQ ID NO.
476366 AesmCesmCesmCesAesAdsTdsTdsmCdsAdsGdsAdsAdsGdsGdsAesAes GesGesAe н.д. н.д. 37
656326 AesmCesmCesmCesAesAdsTdsTdsmCdsAdsGdsAdsAdsGdsGdsAesAes GesGesAeoAdo’-GalNAc3-la GalNAc3la Ad 38
678381 GalNAc3-3ao’AdoAesmCesmCesmCesAesAdsTdsTdsmCdsAdsGdsAds AdsGdsGdsAesAes GesGesAe GalNAc33a Ad 39
678382 GalNAc3-7ao’AdoAesmCesmCesmCesAesAdsTdsTdsmCdsAdsGdsAds AdsGdsGdsAesAes GesGesAe GalNAc37a Ad 39
678383 GalNAc3-10a_o’Ado AesmCesmCesmCes Aes AdsT dsT dsmCds AdsGds AdsAdsGdsGdsAesAes GesGesAe GalNAc310a Ad 39
678384 GalNAc3-13a-o’AdoAesmCesmCesmCesAesAdsTdsTdsmCdsAdsGds AdsAdsGdsGdsAesAes GesGesAe GalNAc313a Ad 39
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9, GalNAc3-3a показана в примере 39, GalNAc3-7a показана в примере 48, GalNAc3-10a показана в примере 46, и GalNAc3-13a показана в примере 62.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей C57BL/6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) один раз в неделю вводили подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, в целом три дозы олигонуклеотида, перечисленного в табл. 59, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения. Уровни мРНК A1AT в печени определили при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни белка A1AT в плазме определили при помощи твердофазного иммуноферментного анализа для определения мышиного α1антитрипсина (кат. № 41-A1AMS-E01, Alpco, Салем, штат Нью-Гэмпшир). Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК A1AT в печени и белка в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу с PBS.
Как показано в табл. 60, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК A1AT в печени и уровни белка A1AT в плазме дозозависимым образом. Олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были значительно более эффективными, чем исходное соединение (ISIS 476366).
Таблица 60
Уровни мРНК A1AT в печени и белка в плазме
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК А1АТ в печени (% PBS) Белок Al АТ в плазме (% PBS) Кластер GalNAc3 CM
PBS н.д. 100 100 н.д. н.д.
476366 5 86 78 н.д. Н.д.
15 73 61
45 30 38
656326 0,6 99 90 GalNAcs-la Ad
2 61 70
6 15 30
18 6 10
678381 0,6 105 90 GalNAc3-3a Ad
2 53 60
6 16 20
18 7 13
678382 0,6 90 79 GalNAc3-7a Ad
2 49 57
6 21 27
18 8 11
678383 0,6 94 84 GalNAc3-10a Ad
2 44 53
6 13 24
18 6 10
678384 0,6 106 91 GalNAc3-13a Ad
2 65 59
6 26 31
18 11 15
Во время умерщвления измерили уровни трансаминазы в печени и АМК в плазме по стандартным протоколам. Измерили также массы тела и массы органов. Результаты представлены ниже в табл. 61. Масса тела представлена как % относительно исходного значения. Массы органов представлены как % от массы тела относительно контрольной группы с PBS.
- 224 036584
ISIS № Доза (мг/кг) ALT (ед./ л) AST (ед./ л) АМК (мг/дл) Масса тела(% от исходного значения) Масса печени (% отн. массы тела) Масса почек(% отн. массы тела) Масса селезенки (% отн. массы тела)
PBS н.д. 25 51 37 119 100 100 100
47636 6 5 34 68 35 116 91 98 106
15 37 74 30 122 92 101 128
45 30 47 31 118 99 108 123
65632 6 0,6 29 57 40 123 100 103 119
2 36 75 39 114 98 111 106
6 32 67 39 125 99 97 122
18 46 77 36 116 102 109 101
67838 1 0,6 26 57 32 117 93 109 110
2 26 52 33 121 96 106 125
6 40 78 32 124 92 106 126
18 31 54 28 118 94 103 120
67838 2 0,6 26 42 35 114 100 103 103
2 25 50 31 117 91 104 117
6 30 79 29 117 89 102 107
18 65 112 31 120 89 104 ИЗ
67838 3 0,6 30 67 38 121 91 100 123
2 33 53 33 118 98 102 121
6 32 63 32 117 97 105 105
18 36 68 31 118 99 103 108
67838 4 0,6 36 63 31 118 98 103 98
2 32 61 32 119 93 102 114
6 34 69 34 122 100 100 96
18 28 54 30 117 98 101 104
Таблица 61
Пример 81. Продолжительность действия in vivo олигонуклеотидов, нацеленных на A1AT, содержащих кластер GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 59, испытали в исследовании однократной дозы на продолжительность действия у мышей.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей C57BL/6 ввели однократную подкожную инъекцию олигонуклеотида, перечисленного в табл. 59, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Образцы крови брали за день до введения дозы для определения исходного значения, а также на 5, 12, 19 и 25 день после введения дозы. Уровни белка A1AT в плазме измерили при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (см. пример 80). Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней белка A1AT в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к исходным уровням. Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были более эффективными и имели более продолжительное действие, чем исходное соединение без конъюгата GalNAc (ISIS 476366). Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие 5'-GalNAc конъюгат (ISIS 678381, 678382, 678383 и 678384), были, в целом, еще более эффективными с еще более продолжительным действием, чем олигонуклеотид, содержащий 3'-GalNAc конъюгат (ISIS 656326).
- 225 036584
Таблица 62
Уровни белка A1AT в плазме мышей
ISIS № Доза (мг/кг) Временные точки (дни после введения дозы) А1АТ (% от исходного значения) Кластер GalNAc3 CM
PBS н.д. 5 93 н.д. н.д.
12 93
19 90
25 97
476366 100 5 38 Н.д. н.д.
12 46
19 62
25 77
656326 18 5 33 GalNAc3-la Ad
12 36
19 51
25 72
678381 18 5 21 GalNAc3-3a Ad
12 21
19 35
25 48
678382 18 5 21 GalNAc3-7a Ad
12 21
19 39
25 60
678383 18 5 24 GalNAc310a Ad
12 21
19 45
25 73
678384 18 5 29 GalNAc313a Ad
12 34
19 57
25 76
Пример 82. Антисмысловое ингибирование in vitro под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих конъюгат GalNAc3.
Первичные гепатоциты печени мышей высеивали в 96-луночные планшеты при 15000 клеток на лунку за 2 ч до обработки. Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 63, добавили в концентрации 2, 10, 50 или 250 нМ в среде Уильяма Е, и инкубировали клетки в течение ночи при 37°С в 5% CO2. Клетки лизировали через 16 ч после добавления олигонуклеотида, а общую РНК очистили при помощи RNease 3000 BioRobot (Qiagen). Уровни мРНК SRB-1 определили при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Значения IC50 определили при помощи программы Prism 4 (GraphPad). Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие множество различных конъюгирующих групп GalNAc и множество различных расщепляемых фрагментов, являются значительно более эффективными в in vitro эксперименте свободного поглощения, чем исходные олигонуклеотиды, не содержащие конъюгирующую группу GalNAc (ISIS 353382 и 666841).
Таблица 63
Ингибирование экспрессии SRB-1 in vitro
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Свя ЗИ Кластер GalNAc CM IC50 (hM) SEQ ID NO.
35338 2 Ges CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTdsTes Ces CesTesTe PS н.д. н.д. 250 28
65586 1 GesmCesT esT esmCes AdsGds T dsmCds AdsT dsGds Ads mCdsTdsTesmCesmCesTesTeoAdo’-GalNAc3-la PS GalNAc 3-la Ad 40 29
66116 1 GalNAc3-3a-o’A(loGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-3a Ad 40 30
- 226 036584
66116 GalNAc3-3a-o’A(loGes CeoTeoTeo CeoAdsGdsTds РО/ GalNAc Дд Q 90
2 CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Teo Сео CesTesTe PS 3-3a A4 о
66407 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmC ds AdsTdsGds Ads PS GalNAc A j 20
8 mCdsTdsTesmCesmCesTesTeoAdo’-GalNAc3-9a з-9а Ad Zy
66500 GalNAc3-8a_o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds PS GalNAc Ад 70 90
1 mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 3-8a A4
66622 GalNAc3-5a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds PS GalNAc Дд RO
4 mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 3-5a Ad oU JU
66684 1 GesmCeoTeoTeomCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds “CdsTds TeomCeomCesTesTe РО/ PS Н.Д. Н.Д. >250 28
66688 GalNAc3-10a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds PS GalNAc Дд 90 90
1 mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe з-Юа A4 JU
66690 4 GalNAc3-3a-o’Ges CesTesTes CesAdsGdsTds Cds AdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-3a PO 9 28
66692 4 GalNAc3-3a-o’TdoGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-3a Td 15 33
66696 GalNAc3-6a_o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds PS GalNAc Дд 1
1 mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTesmCesmCesTesTe 3-6a Ad 1 jU JU
66698 GalNAc3-7a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds PS GalNAc Дд 20
1 mC ds AdsT dsGds AdsmC dsTdsTesmC esmC esT esTe 3-7a Ai JU
67006 1 GalNAc3-13a-o’AdoGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-13a Ad 30 30
67069 9 GalNAc3-3a-o’TdoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdSTeomCeomCesTesTe РО/ PS GalNAc 3-3a Td 15 33
67070 0 GalNAc3-3a-o’AeoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAds mCdsTdsTeomCeomCesTesT РО/ PS GalNAc 3-3a Ae 30 30
67070 GalNAc3-3a-o’TeoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds РО/ GalNAc T
1 mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTeomCeomCesTesTe PS 3-3a le Zj J J
67114 4 GalNAc3-12a-o’A(loGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-12a Ad 40 30
GalNAc3-13a-
67116 5 oAdoGes mCeoTeoTeomCeoAdsGdsTds mCdsAdsTds GdsAdsmCdsTdsTeomCeomCesTesT РО/ PS GalNAc з-13а Ad 8 30
67126 1 GalNAc3-14a-o’A(loGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-14a Ad >250 30
67126 2 GalNAc3-15a-o’A(loGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-15a Ad >250 30
67350 1 GalNAc3-7a-o’A(loGes CeoTeoTeo CeoAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTdsTeo Ceo CesTesTe РО/ PS GalNAc 3-7a Ad 30 30
67350 2 GalNAc3-10a- o’AdoGes CeoTeoTeo CeoAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Teo Ceo CesTesTe РО/ PS GalNAc з-Юа Ad 8 30
67544 1 GalNAc3-17a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds PS GalNAc 3-17a Ad 30 30
CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe
67544 2 GalNAc3-18a-o’A(loGes CesTesTes CesAdsGdsTds CdsAdsTdsGdsAds CdsTds Tes Ces CesTesTe PS GalNAc 3-18a Ad 20 30
67784 GesmCesT esT esmCes AdsGdsT dsmCds AdsT dsGds Ads PS GalNAc Дд 40 90
1 mCdsTdsTesmCesmCesTesTeoAdo’-GalNAc3-19a 3-19a Ad zy
67784 GesmCesT esT esmCes AdsGdsT dsmCds AdsT dsGds Ads PS GalNAc Δ д 90
2 mCdsTdsTesmCesmCesTesTeoAdo’-GalNAc3-20a 3-20a Ad JU zy
67784 3 GalNAc3-23a-o’AdoGesmCesTesTesmCesAdsGdsTds mCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTds TesmCesmCesTesTe PS GalNAc 3-23a Ad 40 30
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9, GalNAc3-3a показана в примере 39, GalNAc3-5a показана в примере 49, GalNAc3-6a показана в примере 51, GalNAc3-7a показана в примере 48, GalNAc3-8a показана в примере 47, GalNAc3-9a показана в примере 52, GalNAc3-10a показана в примере 46, GalNAc312a показана в примере 61, GalNAc3-13a показана в примере 62, GalNAc3-14a показана в примере 63, GalNAc3-15a показана в примере 64, GalNAc3-17a показана в примере 68, GalNAc3-18a показана в примере 69, GalNAc3-19a показана в примере 70, GalNAc3-20a показана в примере 71, и GalNAc3-23a показана в примере 76.
Пример 83. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на фактор XI, содержащих кластер GalNAc3.
- 227 036584
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 64, испытали в исследовании дозозависимого ингибирования фактора XI у мышей.
Таблица 64
Модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на фактор XI
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc CM SEQ ID NO.
40407 TesGesGesTesAesAdsTdsmCdsmCdsAdsmCdsTdsTdsTdsmCdsAesG 31
1 es AesGesGe Н.Д. Н.Д.
65617 3 TesGeoGeoTeoAeoAdsTdsmCdsmCdsAdsmCdsTdsTdsTdsmCdsAeo Geo AesGesGeoAdo’-GalNAC3-la GalNAc3-la Ad 32
66308 GalNAc3-3a- o’AdoTesGeoGeoTeoAeoAdsTdsmCdsmCdsAdsmC dsTds GalNAc3-3a Ad 40
О TdsTdsmCdsAeoGeoAesGesGe
67834 GalNAc3-7a-
7 o’AdoTesGeoGeoTeoAeoAdsTdsmCdsmCdsAdsmC dsTds GalNAc3-7a Ad 40
TdsTdsmCdsAeoGeoAesGesGe
67834 Q GalNAc3-10a- o’AdoTesGeoGeoTeoAeoAdsTdsmCdsmCdsAdsmCds GalNAc31 П Ad 40
О TdsTdsTdsmCdsAeoGeo AesGesGe 1 Ua
67834 GalNAc3-13a- GalNAc3- Δ .
9 o’AdoTesGeoGeoTeoAeoAdsTdsmCdsmCdsAdsmCds 13a H-U
TdsTdsTdsmCdsAeoGeo AesGesGe
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9, GalNAc3-3a показана в примере 39, GalNAc3-7a показана в примере 48, GalNAc3-10a показана в примере 46, и GalNAc3-13a показана в примере 62.
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам один раз в неделю вводили подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, в целом три дозы олигонуклеотида, перечисленного ниже, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последней дозы. Уровни мРНК фактора XI в печени измерили при помощи ПЦР в реальном времени и нормализовали к циклофилину по стандартным протоколам. Измерили также трансаминазы в печени, АМК и билирубин. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент для каждой экспериментальной группы, нормализованный к контролю с PBS.
Как показано в табл. 65, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК фактора XI в печени дозозависимым образом. Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были более эффективными, чем исходное соединение без конъюгата GalNAc (ISIS 404071). Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие 5'-GalNAc конъюгат (ISIS 663086, 678347, 678348 и 678349), были еще более эффективными, чем олигонуклеотид, содержащий 3'-GalNAc конъюгат (ISIS 656173).
Таблица 65
Уровни мРНК фактора XI в печени, трансаминазы в печени, АМК и билирубина
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК фактора XI (% от PBS) ALT (ед./л ) AST (ед./л ) АМК (мг/дл) Билиру бин (мг/дл) Кластер GalNAc3 SEQ ID NO.
PBS Н.Д. 100 63 70 21 0,18 Н.Д. Н.Д.
40407 1 3 65 41 58 21 0,15 Н.Д. 31
10 33 49 53 23 0,15
30 17 43 57 22 0,14
65617 3 0,7 43 90 89 21 0,16 GalNAc3-la 32
2 9 36 58 26 0,17
6 3 50 63 25 0,15
66308 6 0,7 33 91 169 25 0,16 GalNAc3-3a 40
2 7 38 55 21 0,16
6 1 34 40 23 0,14
67834 7 0,7 35 28 49 20 0,14 GalNAc3-7a 40
2 10 180 149 21 0,18
6 1 44 76 19 0,15
67834 0,7 39 43 54 21 0,16 GalNAc3- 40
8 2 5 38 55 22 0,17 10a
6 2 25 38 20 0,14
67834 9 0,7 34 39 46 20 0,16 GalNAc313a 40
2 8 43 63 21 0,14
6 2 28 41 20 0,14
Пример 84. Продолжительность действия in vivo олигонуклеотидов, нацеленных на фактор XI, содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 64, испытали в исследовании однократной дозы на продолжительность действия у мышей.
- 228 036584
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам ввели однократную подкожную инъекцию олигонуклеотида, перечисленного в табл. 64, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Образцы крови брали из хвостовой вены за день до введения дозы для определения исходного значения, а также на 3, 10 и 17 день после введения дозы. Уровни белка фактора XI в плазме определяли твердофазным иммуноферментным анализом, применяя иммобилизованные и биотинилированные детекторные антитела для фактора XI производства R & D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота (кат. № AF2460 и № BAF2460 соответственно), а также реагент OptEIA, набор B (кат. № 550534, BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния). Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней белка фактора XI в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованной к исходным уровням. Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были более эффективными и имели более продолжительное действие, чем исходное соединение без конъюгата GalNAc (ISIS 404071). Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие 5'-GalNAc конъюгат (ISIS 663086, 678347, 678348 и 678349), были еще более эффективными с еще более продолжительным действием, чем олигонуклеотид, содержащий 3'-GalNAc конъюгат (ISIS 656173).
Таблица 66
Уровни белка фактора XI в плазме мышей
ISIS № Доза (мг/кг) Временные точки(дни после введения дозы) Фактор XI (% от исходного значения) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID NO.
PBS н.д. 3 123 н.д. н.д. н.д.
10 56
17 100
404071 30 3 И н.д. Н.Д. 31
10 47
17 52
656173 6 3 1 GalNAc3-la Ad 32
10 3
17 21
663086 6 3 1 GalNAc3-3a Ad 40
10 2
17 9
678347 6 3 1 GalNAc3-7a Ad 40
10 1
17 8
678348 6 3 1 GalNAc3-10a Ad 40
10 1
17 6
678349 6 3 1 GalNAc3-13a Ad 40
10 1
17 5
Пример 85. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 63, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей.
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам C57BL/6 один раз в неделю вводили подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, в целом три дозы олигонуклеотида, перечисленного в табл. 63, или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 48 ч после последнего введения для определения уровней мРНК SRB-1 в печени при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 в печени для каждой экспериментальной группы, нормализованных к контрольному образцу, обработанному солевым раствором.
Как показано в табл. 67 и 68, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом.
- 229 036584 мРНК SRB-1 в печени
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% от солевого раствора) Кластер GalNAc3 CM
Солевой раствор н.д. 100 н.д. н.д.
655861 ОД 94 GalNAc3-la Ad
о,з 119
1 68
3 32
661161 0,1 120 GalNAc3-3a Ad
0,3 107
1 68
3 26
666881 0,1 107 GalNAc3-10a Ad
0,3 107
1 69
3 27
666981 0,1 120 GalNAc3-7a Ad
0,3 103
1 54
3 21
670061 0,1 118 GalNAc3-13a Ad
0,3 89
1 52
3 18
677842 0,1 119 GalNAc3-20a Ad
0,3 96
1 65
3 23
Таблица 67
Таблица 68 мРНК SRB-1 в печени
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% от солевого раствора) Кластер GalNAc3 CM
661161 ο,ι 107 GalNAc3-3a Ad
о,з 95
1 53
3 18
677841 0,1 110 GalNAc3-19a Ad
0,3 88
1 52
3 25
Измерили также уровни трансаминазы в печени, общего билирубина, АМК и массы тела по стандартным протоколам. Средние значения для каждой экспериментальной группы представлены ниже в табл. 69.
- 230 036584
ISIS № Доза (мг/к г) ALT (ед./ л) AST (ед./л ) Билиру бин (мг/дл) АМК (мг/дл) Масса тела (% от исходного значения) Кластер GalNAc3 CM
Солевой раствор Н.д. 19 39 0,17 26 118 н.д. н.д.
655861 ОД 25 47 0,17 27 114 GalNAc3-la Ad
о,з 29 56 0,15 27 118
1 20 32 0,14 24 112
3 27 54 0,14 24 115
661161 0,1 35 83 0,13 24 ИЗ GalNAc3-3a Ad
0,3 42 61 0,15 23 117
1 34 60 0,18 22 116
3 29 52 0,13 25 117
666881 0,1 30 51 0,15 23 118 GalNAc3-10a Ad
0,3 49 82 0,16 25 119
1 23 45 0,14 24 117
3 20 38 0,15 21 112
666981 0,1 21 41 0,14 22 ИЗ GalNAc3-7a Ad
0,3 29 49 0,16 24 112
1 19 34 0,15 22 111
3 77 78 0,18 25 115
670061 0,1 20 63 0,18 24 111 GalNAc3-13a Ad
0,3 20 57 0,15 21 115
1 20 35 0,14 20 115
3 27 42 0,12 20 116
677842 0,1 20 38 0,17 24 114 GalNAc3-20a Ad
0,3 31 46 0,17 21 117
1 22 34 0,15 21 119
3 41 57 0,14 23 118
Таблица 69
Пример 86. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на TTR, содержащих кластер GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 70, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования человеческого транстиретина (TTR) у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий TTR ген.
Лечение.
Восьминедельным TTR трансгенным мышам один раз в неделю в течение трех недель, в целом три дозы, вводили подкожную инъекцию олигонуклеотида и дозы, перечисленные в представленных ниже таблицах, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения. В течение эксперимента в различных временных точках брали образцы крови из хвостовой вены и измеряли уровни белка TTR в плазме, ALT и AST, которые представлены в табл. 72-74. После умерщвления животных измерили уровни ALT, AST и человеческого TTR в плазме, а также массы тела, массы органов и уровни мРНК человечкского TTR в печени. Уровни белка TTR измерили при помощи клинического анализатора (AU480, Beckman Coulter, штат Калифорния). ПЦР в реальном времени и реагент для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) применяли по стандартным протоколам для определения уровней мРНК человеческого TTR в печени. Результаты, показанные в табл. 71-74, представляют собой средние значения для каждой экспериментальной группы. Уровни мРНК представляют собой средние значения относительно среднего значения для PBS группы. Уровни белка в плазме представляют собой средние значения относительно среднего значения для PBS группы в исходном состоянии. Массы тела представляют собой среднее процентное изменение массы от исходного значения до умерщвления для каждой отдельной экспериментальной группы. Представленные массы органов нормализованы к массе тела животного, а затем представлена средняя нормализованная масса органов для каждой экспериментальной группы относительно средней нормализованной массы органов для PBS группы.
В табл. 71-74 «BL означает исходное значение измерений, выполненных непосредственно перед введением первой дозы. Как показано в табл. 71 и 72, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни экспрессии TTR дозозависимым образом. Олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были более эффективными, чем исходное соединение без конъюгата GalNAc (ISIS 420915). Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc и смешанные PS/PO межнуклеозидные связи, были еще более эффективными, чем олигонуклеотид, содержащий конъюгат GalNAc и только PS связи.
- 231 036584
Таблица 70
Олигонуклеотиды, нацеленные на человеческий TTR
Isis № Последовательность от 5’ к 3’ Связи Кластер GalNAc CM SEQ ID NO.
42091 Т esmCesT esTesGesGdsTdsT ds AdsmCds AdsT dsGds Ads PS н.д. н.д.
5 Ads AesTesmCesmCesmCe
66026 1 T esmCesT esTesGesGdsTdsT ds AdsmCds AdsT dsGds Ads Ads AesTesmCesmCesmCeoAdo’-GalNAc3-la PS GalNAc3-la Ad 42
68288 GalNAc3-3a- o’TesmCeoTeoT eoGeoGdsT dsTds AdsmCdsAds PS/PO GalNAc3-3a PO 74
T dsGds Ads Ads AeoT eomCesmCesmCe
68288 Λ GalNAc3-7a- o’TesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAdsmCdsAds PS/PO GalNAc3-7a PO 41
T dsGds Ads Ads AeoTeomCesmCesmCe
68288 С GalNAc3-10a- o’TesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAdsmCds PS/PO GalNAc310a PO 41
AdsTdsGdsAdsAdsAeoTeomCesmCesmCe
68288 Ζζ GalNAc3-13a- o’TesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAdsmCds PS/PO GalNAc3- 1 Qa PO 41
AdsTdsGdsAdsAdsAeoTeomCesmCesmCe
68405 TesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAdsmCdsAdsTdsGdsAd PS/PO GalNAc3- /10
7 sAdsAeoTeomCesmCesmCeoAdo’-GalNAc3-19a 19a Ad
Легенда для табл. 72 представлена в примере 74. Структура GalNAc3-1 показана в примере 9. Структура GalNAc3-3a показана в примере 39. Структура GalNAc3-7a показана в примере 48. Структура GalNAc3-10a показана в примере 46. Структура GalNAc3-13a показана в примере 62. Структура GalNAc319a показана в примере 70.
Таблица 71
Антисмысловое ингибирование человеческого TTR in vivo
Isis № Доза (мг/кг) мРНК TTR (% PBS) Белок TTR в плазме (% PBS) Кластер GalNAc СМ SEQ ГО NO.
PBS н.д. 100 100 н.д. н.д.
420915 6 99 95 н.д. н.д. 41
20 48 65
60 18 28
660261 0,6 ИЗ 87 GalNAc3-la Ad 42
2 40 56
6 20 27
20 9 И
Таблица 72
Антисмысловое ингибирование человеческого TTR in vivo
Isis № Доза (мг/кг) мРНК TTR (% PBS) Белок TTR в плазме (% PBS при BL) Кластер GalNAc СМ SEQ ГО NO.
BL 3-й день 10-й день 17-й день (после умерщвления)
PBS н.д. 100 100 96 90 114 н.д. н.д.
420915 6 74 106 86 76 83 Н.д. Н.д. 41
20 43 102 66 61 58
60 24 92 43 29 32
682883 0,6 60 88 73 63 68 GalNAc3За РО 41
2 18 75 38 23 23
6 10 80 35 И 9
682884 0,6 56 88 78 63 67 GalNAc37а РО 41
2 19 76 44 25 23
6 15 82 35 21 24
682885 0,6 60 92 77 68 76 GalNAc310а РО 41
2 22 93 58 32 32
6 17 85 37 25 20
682886 0,6 57 91 70 64 69 GalNAc313а РО 41
2 21 89 50 31 30
6 18 102 41 24 27
684057 0,6 53 80 69 56 62 GalNAc319а Ad 42
2 21 92 55 34 30
6 И 82 50 18 13
- 232 036584
Таблица 73
Уровни трансаминазы, изменение массы тела и относительные массы органов
Isis № До за (мг /кг) ALT (ед./л) AST (ед./л) Мас са тела (% BL) Печ ень (% PBS ) BL Селе зенка (% PBS) 3 день Поч КН (% PBS) 10 день SE Q ID NO. 17 ден ь
BL 3 де нь 10 де нь 17 де нь BL 3 де нь 10 де нь Da У 17
PBS н.д 33 34 33 24 58 62 67 52 105 100 100 100 Н.д.
420915 6 34 33 27 21 64 59 73 47 115 99 89 91 41
20 34 30 28 19 64 54 56 42 111 97 83 89
60 34 35 31 24 61 58 71 58 ИЗ 102 98 95
660261 0,6 33 38 28 26 70 71 63 59 111 96 99 92 42
2 29 32 31 34 61 60 68 61 118 100 92 90
6 29 29 28 34 58 59 70 90 114 99 97 95
20 33 32 28 33 64 54 68 95 114 101 106 92
Таблица 74
Уровни трансаминазы, изменение массы тела и относительные массы органов
Isis № До за (мг /кг) BL AI (ед 3 де нь ./л) 10 де нь 17 де нь BL А? (ед 3 де нь ST ./л) 10 де нь Da У 17 Мас са тела (% BL) Печ ень (% PBS ) BL Селе зенка (% PBS) 3 день Поч ки (% PBS) 10 день SE Q ID NO. 17 ден ь
PBS Н.д 32 34 37 41 62 78 76 77 104 100 100 100 Н.д.
6 32 30 34 34 61 71 72 66 102 103 102 105
420915 20 41 34 37 33 80 76 63 54 106 107 135 101 41
60 36 30 32 34 58 81 57 60 106 105 104 99
0,6 32 35 38 40 53 81 74 76 104 101 112 95
682883 2 38 39 42 43 71 84 70 1 η 77 107 98 116 99 41
6 35 35 41 38 62 79 1U 65 105 103 143 97
682884 0,6 33 32 35 34 70 74 75 67 101 100 130 99 41
2 31 32 38 38 63 77 66 55 104 103 122 100
6 38 32 36 34 65 85 80 62 99 105 129 95
0,6 39 26 37 35 63 63 77 59 100 109 109 112
682885 2 30 26 38 40 54 56 71 72 102 98 111 102 41
6 27 27 34 35 46 52 56 64 102 98 ИЗ 96
0,6 30 40 34 36 58 87 54 61 104 99 120 101
682886 2 27 26 34 36 51 55 55 69 103 91 105 92
1 п Ч-1
6 40 28 34 37 1U 7 54 61 69 109 100 102 99
0,6 35 26 33 39 56 51 51 69 104 99 110 102
684057 2 33 32 31 40 54 57 56 87 103 100 112 97 42
6 39 33 35 40 67 52 55 92 98 104 121 108
Пример 87. Продолжительность действия in vivo однократных доз олигонуклеотидов, нацеленных на TTR, содержащих кластер GalNAc3.
ISIS № 420915 и 660261 (см. табл. 70) испытали в исследовании однократной дозы на продолжительность действия у мышей. ISIS №№ 420915, 682883 и 682885 (см. табл. 70) также испытали в исследовании однократной дозы на продолжительность действия у мышей.
Лечение.
Восьминедельным самцам трансгенных мышей, которые экспрессируют человеческий TTR, ввели однократную подкожную инъекцию 100 мг/кг ISIS № 420915 или 13,5 мг/кг ISIS № 660261. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Образцы крови из хвостовой вены брали до введения дозы для определения исходных показателей и на 3-й, 7-й, 10-й, 17-й, 24-й и 39-й день после введения дозы. Уровни белка TTR в плазме измеряли так, как описано в примере 86. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней TTR в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к исходным уровням.
- 233 036584
Таблица 75
Уровни белка TTR в плазме
ISIS № Доза (мг/кг) Временные точки(дни после введения дозы) TTR (% от исходного значения) Кластер GalNAc3 CM SEQ ГО NO.
3 30
7 23
420915 100 10 17 35 53 н.д. н.д. 41
24 75
39 100
3 27
7 21
660261 13,5 10 22 GalNAc3- Ad 42
17 36 la
24 48
39 69
Лечение.
Восьминедельным самкам трансгенных мышей, которые экспрессируют человеческий TTR, ввели однократную подкожную инъекцию 100 мг/кг ISIS № 420915, 10,0 мг/кг ISIS № 682883 или 10,0 мг/кг ISIS № 682885. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Образцы крови из хвостовой вены брали до введения дозы для определения исходных показателей и на 3-й, 7-й, 10-й, 17-й, 24-й и 39-й день после введения дозы. Уровни белка TTR в плазме измеряли так, как описано в примере 86. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней TTR в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к исходным уровням.
Таблица 76
Уровни белка TTR в плазме
ISIS № Доза (мг/кг) Временные точки(дни после введения дозы) TTR (% от исходного значения) Кластер GalNAc3 СМ SEQID NO.
420915 100 3 48 н.д. н.д. 41
7 48
10 48
17 66
31 80
682883 10,0 3 45 GalNAc3-3a РО 41
7 37
10 38
17 42
31 65
682885 10,0 3 40 GalNAc310а РО 41
7 33
10 34
17 40
31 64
Результаты в табл. 75 и 76 демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, являются более эффективными и имеют более продолжительное действие, чем исходный олигонуклеотид без конъюгата (ISIS 420915).
Пример 88. Сплайсинг-модулирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SMN, содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 77, испытали на сплайсинг-модулирование человеческих генов выживаемости мотонейронов (SMN) у мышей.
- 234 036584
Таблица 77
ASO, нацеленные на SMN
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAcs CM SEQ ID NO.
38795 4 AesT es Т esmCes AesmCesT esTesT esmCes AesT es Aes AesT esGesmCes TesGes Ge н.д. н.д. 43
69981 9 GalNAc3-7a- o’ AesT esT esmCes AesmCesTesT esT esmCes AesT es Aes Aes TesGesmCesTesGesGe GalNAc37a PO 43
69982 1 GalNAc3-7ao’AesTeoT еоШСео АеоШСеоТ eoT еоТесДСео AeoT eo Aeo AeoT eoGeomCeoT esGesGe GalNAc37a PO 43
70000 0 Δ Τ T mC Δ mC TTT mC Δ Τ Δ Δ Τ (T mC ZA-esies-Les ^es-^-es V/es 1 es 1 es 1 es ^es-^-es i es-^-es-^es 1 esvJes ^es TesGes GeoA(lo’-GalNAc3-la GalNAc3la Ad 44
70342 1 X-ATTmCAmCTTTmCATAATGmCTGG н.д. н.д. 43
70342 2 GalNAc3-7b-X-ATTmCAmCTTTmCATAATGmCTGG GalNAc37b Н.д. 43
Структура GalNAc3-7a показана ранее в примере 48. Х означает 5'-первичный амин, полученный компанией Gene Tools (Филомат, штат Орегон), a GalNAc3-7b означает структуру GalNAc3-7a, не содержащую часть -NH-C6-O связи, как показано ниже
ISIS №№ 703421 и 703422 представляют собой морфолиноолигонуклеотиды, при этом каждый нуклеотид из двух олигонуклеотидов представляет собой морфолинонуклеотид.
Лечение.
Шестинедельным трансгенным мышам, экспрессирующим человеческий SMN, ввели однократную подкожную инъекцию олигонуклеотида, перечисленного в табл. 78, или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 2 самцов и 2 самок. Мышей умертвили через 3 дня после введения дозы для определения уровней мРНК человеческого SMN в печени с экзоном 7 и без него, применив ПЦР в реальном времени по стандартным протоколам. Общую РНК измерили при помощи реагента Ribogreen. Уровни мРНК SMN нормализовали к общей мРНК, а затем нормализовали к средним значениям в группе, обработанной солевым раствором. Полученные средние отношения мРНК SMN, содержащей экзон 7, к мРНК SMN, не содержащей экзон 7, представлены в табл. 78. Результаты демонстрируют, что полностью модифицированные олигонуклеотиды, которые модулируют сплайсинг и содержат конъюгат GalNAc, являются значительно более эффективными для изменения сплайсинга в печени, чем исходные олигонуклеотиды, не содержащие конъюгат GalNAc. Кроме того, эта тенденция сохраняется для химизма многократных модификаций, включая 2'-MOE и морфолиномодифицированные олигонуклеотиды.
Таблица 78
Действие олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий SMN, in vivo
ISIS № Доза (мг/кг) +экзон 7 / -экзон 7 Кластер GalNAc3 CM SEQ ID NO.
Солевой раствор н.д. 1,00 н.д. н.д. Н.д.
387954 32 1,65 н.д. н.д. 43
387954 288 5,00 н.д. н.д. 43
699819 32 7,84 GalNAc37а РО 43
699821 32 7,22 GalNAc37а РО 43
700000 32 6,91 GalNAc31а Ad 44
703421 32 1,27 н.д. н.д. 43
703422 32 4,12 GalNAc37b Н.д. 43
- 235 036584
Пример 89. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на аполипопротеин A (Apo(a)), содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 79, испытали в исследовании дозозависимого ингибирования Apo(a) у трансгенных мышей.
Таблица 79
Модифицированные ASO, нацеленные на Apo(a)
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID NO.
494372 TesGesmCesTesmCesmCdsGdsTdsTdsGdsGdsTdsGdsmCds TdsTesGesTesTesmCe н.д. н.д. 53
681257 GalNAc3-7a-o’TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCds TdsTeoGeoTesTesmCe GalNAc3-7a PO 53
Структура GalNAc3-7a показана в примере 48.
Лечение.
Восьминедельным самкам мышей C57BL/6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) один раз в неделю вводили подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, в целом шесть доз олигонуклеотида, перечисленного в табл. 79, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-4 животных. Образцы крови из хвостовой вены брали за день до введения первой дозы и еженедельно после введения каждой дозы для определения уровней белка Apo(a) в плазме. Мышей умертвили через два дня после последнего введения. Уровни мРНК Apo(a) в печени определили при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) по стандартным протоколам. Уровни белка Apo(a) в плазме определили при помощи твердофазного иммуноферментного анализа и определили уровни трансаминазы в печени. Результаты анализа мРНК и белка в плазме в табл. 80 представлены как среднее процентное значение для экспериментальной группы относительно группы, обработанной PBS. Уровни белка в плазме дополнительно нормализовали к исходному значению (BL) для группы с PBS. Средние абсолютные уровни трансаминазы и массы тела (% относительно среднего исходного значения) представлены в табл. 81.
Как показано в табл. 80, лечение олигонуклеотидами снижает уровни мРНК Apo(a) в печени и уровни белка в плазме дозозависимым образом. Кроме того, олигонуклеотид, содержащий конъюгат GalNAc, был значительно более эффективным с более продолжительным действием, чем исходный олигонуклеотид, не содержащий конъюгат GalNAc. Как показано в табл. 81, представленные олигонуклеотиды не влияют на уровни трансаминазы и массы тела, что указывает на хорошую переносимость олигонуклеотидов.
Таблица 80
Уровни мРНК Apo(a) в печени и белка в плазме
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК Аро(а) (% PBS) Белок Аро(а) в плазме (% PBS)
BL Неделя 1 Неделя 2 Неделя 3 Неделя 4 Неделя 5 Неделя 6
PBS н.д. 100 100 120 119 ИЗ 88 121 97
494372 3 80 84 89 91 98 87 87 79
10 30 87 72 76 71 57 59 46
30 5 92 54 28 10 7 9 7
681257 о,з 75 79 76 89 98 71 94 78
1 19 79 88 66 60 54 32 24
3 2 82 52 17 7 4 6 5
10 2 79 17 6 3 2 4 5
Таблица 81
ISIS № Доза (мг/кг) ALT (ед./л) AST (ед./л) Масса тела (% от исходного значения)
PBS н.д. 37 54 103
494372 3 28 68 106
10 22 55 102
30 19 48 103
681257 0,3 30 80 104
1 26 47 105
3 29 62 102
10 21 52 107
Пример 90. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на TTR, содержащих кластер GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 82, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования человеческого транстиретина (TTR) у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий TTR ген.
- 236 036584
Лечение.
TTR трансгенным мышам один раз в неделю в течение трех недель, в целом три дозы, вводили подкожную инъекцию олигонуклеотида и дозы, перечисленных в табл. 83, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Перед введением первой дозы взяли образец крови из хвостовой вены для определения уровней белка TTR в плазме в исходном состоянии (BL). Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения. Уровни белка TTR измерили при помощи клинического анализатора (AU480, Beckman Coulter, штат Калифорния). ПЦР в реальном времени и реагент для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Юджин, штат Орегон) применяли по стандартным протоколам для определения уровней мРНК человеческого TTR в печени. Результаты, показанные в табл. 83, представляют собой средние значения для каждой экспериментальной группы. Уровни мРНК представляют собой средние значения относительно среднего значения для PBS группы. Уровни белка в плазме представляют собой средние значения относительно среднего значения для PBS группы в исходном состоянии. BL означает исходное значения измерений, выполненных непосредственно перед введением первой дозы. Как показано в табл. 83, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни экспрессии TTR дозозависимым образом. Олигонуклеотид, содержащий конъюгат GalNAc, был более эффективным, чем исходное соединение без конъюгата GalNAc (ISIS 420915), а олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирный или дезоксиаденозиновый расщепляемый фрагмент, демонстрировали значительное усиление эффективности, по сравнению с исходным соединением, не содержащим конъюгат (см. ISIS №№ 682883 и 666943 по сравнению с 420915, а также см. примеры 86 и 87).
Таблица 82
Олигонуклеотиды, нацеленные на человеческий TTR
Isis № Последовательность от 5’ к 3’ Связи Кластер GalNAc CM SEQ ID NO.
42091 5 Т esmCesT esTesGesGdsTdsT ds AdsmCds AdsT dsGds Ads Ads AesTesmCesmCesmCe PS н.д. н.д. 41
68288 3 GalNAc3-3a- o’TesmCeoTeoT eoGeoGdsT dsTds AdsmCdsAds TdsGdsAdsAdsAeoTeomCesmCesmCe PS/PO GalNAc3-3a PO 41
66694 3 GalNAc3-3a- o’AdoTesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAds mCds AdsT dsGds Ads Ads AeoT eomCesmCesmCe PS/PO GalNAc3-3a Ad 45
68288 7 GalNAc3-7a- o’AdoTesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAds mCds AdsT dsGds AdsAds Ae0T eomCesmCesmCe PS/PO GalNAc3-7a Ad 45
68288 8 GalNAc3-10a- o’AdoTesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAds mCds AdsT dsGds AdsAds AeoT eomCesmCesmCe PS/PO GalNAcs10a Ad 45
68288 9 GalNAc3-13a- o’AdoTesmCeoTeoTeoGeoGdsTdsTdsAds mCds AdsT dsGds AdsAds AeoT eomCesmCesmCe PS/PO GalNAcs13a Ad 45
Легенда для табл. 82 представлена в примере 74. Структура GalNAc3-3a показана в примере 39. Структура GalNAc3-7a показана в примере 48. Структура GalNAc3-10a показана в примере 46. Структура GalNAc3-13a показана в примере 62.
- 237 036584
Таблица 83
Антисмысловое ингибирование человеческого TTR in vivo
Isis № Доза (мг/кг) мРНК TTR (% PBS) Белок TTR (% BL) Кластер GalNAc CM
PBS н.д. 100 124 н.д. н.д.
420915 6 69 114 н.д. Н.Д.
20 71 86
60 21 36
682883 0,6 61 73 GalNAc3-3a PO
2 23 36
6 18 23
666943 0,6 74 93 GalNAc3-3a Ad
2 33 57
6 17 22
682887 0,6 60 97 GalNAc3-7a Ad
2 36 49
6 12 19
682888 0,6 65 92 GalNAc3-10a Ad
2 32 46
6 17 22
682889 0,6 72 74 GalNAc3-13a Ad
2 38 45
6 16 18
Пример 91. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на фактор VII, содержащих конъюгат GalNAc3, у приматов, не являющихся человеком.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 84, испытали в нетерминальном исследовании повышения дозы на антисмысловое ингибирование фактора VII у обезьян.
Лечение.
Обезьянам, ранее не подверженным экспериментам, на 0-й, 15-й и 29-й день вводили подкожные инъекции повышающихся доз олигонуклеотидов, перечисленных в табл. 84, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 самцов и 1 самки. Перед введением первой дозы и в различные временные точки после нее брали образцы крови для определения уровней белка фактора VII в плазме. Уровни белка фактора VII определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты, показанные в табл. 85, представляют собой средние значения для каждой экспериментальной группы относительно среднего значения для группы PBS в исходном состоянии (BL), измерения выполнены непосредственно перед введением первой дозы. Как показано в табл. 85, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни экспрессии фактора VII дозозависимым образом, и олигонуклеотид, содержащий конъюгат GalNAc, был значительно более эффективным у обезьян, чем олигонуклеотид, не содержащий конъюгата GalNAc.
Таблица 84
Олигонуклеотиды, нацеленные на фактор VII
Isis № Последовательность от 5’ к 3’ Связи Кластер GalNAc CM SEQ ID NO.
40793 5 AesT esGesmCes AesT dsGdsGdsT dsGds AdsTdsGdsmCd sTds TesmCesTesGesAe PS н.д. н.д. 46
68689 2 GalNAc3-10a- 0’AesTesGesmCesAesTdsGdsGdsTdsGds AdsTdsGdsmCdsTds TesmCesTesGesAe PS GalNAc310a PO 46
Легенда для табл. 84 представлена в примере 74. Структура GalNAc3-10a показана в примере 46.
Таблица 85
Уровни белка фактора VII в плазме
ISIS № День Доза (мг/кг) Фактор VII (% BL)
407935 0 н.д. 100
15 10 87
22 н.д. 92
29 30 77
36 н.д. 46
43 Н.д. 43
686892 0 3 100
15 10 56
22 н.д. 29
29 30 19
36 н.д. 15
43 н.д. И
Пример 92. Антисмысловое ингибирование в первичных гепатоцитах под действием олигонуклео- 238 036584 тидов, нацеленных на Apo-CIII, содержащих конъюгат GalNAc3.
Первичные мышиные гепатоциты высеивали в 96-луночные планшеты при 15000 клеток на лунку и добавляли олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 86, нацеленные на мышиный ApoC-III в концентрации 0,46, 1,37, 4,12 или 12,35, 37,04, 111,11 или 333,33 нМ или 1,00 мкМ. После инкубации с олигонуклеотидами в течение 24 чв клетки лизировали и очистили общую РНК при помощи RNeasy (Qiagen). Уровни мРНК ApoC-III определили при помощи ПЦР в реальном времени и реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc.) по стандартным протоколам. Значения IC50 определили при помощи программы Prism 4 (GraphPad). Результаты демонстрируют, что независимо от того, является ли расщепляемый фрагмент фосфодиэфиром или фосфодиэфир-связанным дезоксиаденозином, олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были значительно более эффективными, чем исходный олигонуклеотид, не содержащий конъюгат.
Таблица 86
Ингибирование экспрессии мышиного APOC-III в первичных гепатоцитах мышей
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) CM IC50 (нМ) SEQ ID NO.
440670 mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTdsAdsGdsGdsGdsAdsmCesAesGesmCesAe н.д. 13,20 47
661180 mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTdsAdsGdsGdsGdsAdsmCes AesGesmCesAeo Ado’_GnlNAc3”la Ad 1,40 48
680771 GalNAc3-3a-o’mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTdsAdsGdsGdsGdsAdsmCes AesGesmCesAe PO 0,70 47
680772 GalNAc3-7a-o’mCes AesGesmCesT esTdsT ds AdsTdsT ds AdsGdsGdsGds AdsmCes AesGesmCesAe PO 1,70 47
680773 GalNAc3-10a-o’mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTdsAdsGdsGdsGdsAdsmCes AesGesmCesAe PO 2,00 47
680774 GalNAc3-13a-o’mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTdsAdsGdsGdsGdsAdsmCes AesGesmCesAe PO 1,50 47
681272 GalNAc3-3a-o’mCesAeoGeomCeoTeoTdsTdsAdsTdsTdsAdsGdsGdsGdsAdsmCeo AeoGesmCesAe PO < 0,46 47
681273 GalNAc3-3a_o’AdomCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTds AdsGdsGdsGds Ads mCesAesGesmCesAe Ad 1,10 49
683733 mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTdsAdsGdsGdsGdsAdsmCes AesGesmCesAeoAdo’-GalNAc3-19a Ad 2,50 48
Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9, GalNAc3-3a показана в примере 39, GalNAc3-7a показана в примере 48, GalNAc3-10a показана в примере 46, и GalNAc3-13a показана в примере 62, и GalNAc3-19a показана в примере 70.
Пример 93. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих смешанные крылья и 5'-GalNAc3 конъюгат.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 87, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей.
Таблица 87
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAcs CM SEQ ID NO.
44909 3 TksTksmCksAdsGdsTdsmCds AdsTds Gds AdsmCdsTdsTksmCksmCk Н.Д. н.д. 50
69980 6 GalNAC3-3a_o’TksTksmCksAdsGdsTdsmCds AdsTds GdsAdsmCds TdsTksmCkS mCk GalNAc33a PO 50
69980 7 GalNAC3-7a_o’TksTksmCksAdsGdsTdsmCds AdsTds GdsAdsmCds TdsTks mCksmCk GalNAcs7a PO 50
69980 9 GalNAC3-7a-o’ TksTksmCksAdsGdsTdsmCds AdsTds Gds AdsmCds TdsTesmCesmCe GalNAcs7a PO 50
69981 1 GalNAC3_7a_o’TesTesmCesAdsGdsTdsmCds AdsTds GdsAdsmCds TdsTksmCksmCk GalNAcs7a PO 50
69981 β GalNAC3-7a-o’TksTdsmCksAdsGdSTdsmCds AdsTds GdsAdsmCds TdsTksmCds mCk GalNAcs7a PO 50
69981 5 GalNAc3-7a-o’TesTks mCksAdsGdsTdsmCds AdsTds GdsAdsmCds TdsTksmCksmCe GalNAcs7a PO 50
Структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39, а структура GalNAc3-7a показана ранее в примере 48. Нижние индексы: e означает 2'-MOE модифицированный нуклеозид; d означает β-ϋ-2'дезоксирибонуклеозид; k означает 6'-(S)-CH3 бициклический нуклеозид (cEt); s означает тиофосфатные межнуклеозидные связи (PS); o означает фосфодиэфирные межнуклеозидные связи (PO). Верхний индекс m означает 5-метилцитозины.
Лечение.
Шести-восьминедельным мышам C57bl6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию дозы, представленной ниже, олигонуклеотида, перечисленного в табл. 87, или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертви
- 239 036584 ли через 72 ч после последнего введения. Уровни мРНК SRB-1 в печени измерили при помощи ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК SRB-1 нормализовали к уровням мРНК циклофилина по стандартным протоколам. Результаты, показанные ниже, представлены как средний процент уровней мРНК SRB-1 для каждой экспериментальной группы по сравнению с контрольной группой, обработанной солевым раствором. Как показано в табл. 88, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами снижает уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом, а гэпмерные олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc и имеющие крылья, которые представляют собой либо полностью cEt, либо смешанные сахарные модификации, были существенно более эффективными, чем исходный олигонуклеотид, не содержащий конъюгат и содержащий полностью cEt модифицированные крылья.
Измерили также массы тела, уровни трансаминазы в печени, общий билирубин и АМК, а средние значения для каждой экспериментальной группы представлены в табл. 88. Масса тела показана как средний процент массы тела относительно исходной массы тела (% BL), измеренный непосредственно перед введением дозы олигонуклеотида.
Таблица 88
Уровни мРНК SRB-1, ALT, AST, АМК и общего билирубина, а также массы тела
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB1 (% PBS) ALT (ед./л) AST (ед./л) Билирубин АМК Масса тела (% BL)
PBS н.д. 100 31 84 0,15 28 102
449093 1 111 18 48 0,17 31 104
3 94 20 43 0,15 26 103
10 36 19 50 0,12 29 104
699806 0,1 114 23 58 0,13 26 107
0,3 59 21 45 0,12 27 108
1 25 30 61 0,12 30 104
699807 0,1 121 19 41 0,14 25 100
0,3 73 23 56 0,13 26 105
1 24 22 69 0,14 25 102
699809 0,1 125 23 57 0,14 26 104
0,3 70 20 49 0,10 25 105
1 33 34 62 0,17 25 107
699811 0,1 123 48 77 0,14 24 106
0,3 94 20 45 0,13 25 101
1 66 57 104 0,14 24 107
699813 0,1 95 20 58 0,13 28 104
0,3 98 22 61 0,17 28 105
1 49 19 47 о,и 27 106
699815 0,1 93 30 79 0,17 25 105
0,3 64 30 61 0,12 26 105
1 24 18 41 0,14 25 106
Пример 94. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих 2'-сахарные модификации и 5'-GalNAc3 конъюгат.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 89, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей.
Таблица 89
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAcs CM SEQ ID NO.
35338 2 GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTesm т/^ τ т V^es V^es 1 es 1 е н.д. н.д. 28
70098 9 GmsCmsUmsUmsCmsAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsUms CmsCmsUmsUm н.д. Н.Д. 51
66690 4 GalNAc3-3a- 0’GesmCesTesTesmCesAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds τ τ m/^ m/^ τ τ ^dsIdsJ-es ^es Ceslesle GalNAc33a PO 28
70099 1 GalNAc3-7a-o’GmsCmsUmsUmsCmsAdsGdsTdsmCds AdsTdsGds AdsmCdsTdsUmsCmsCmsUmsUm GalNAcs7a PO 51
Нижний индекс m означает 2'-O-метил-модифицированный нуклеозид. Полная легенда к таблице представлена в примере 74. Структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39, а структура GalNAc3-7a показана ранее в примере 48.
Лечение.
Исследование выполнили по протоколу, описанному в примере 93. Результаты представлены ниже в табл. 90 и демонстрируют, что и 2'-MOE, и 2'-OMe-модифицированные олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc, были значительно более эффективными, чем соответствующие исходные олигонуклеотиды, не содержащие конъюгат. Результаты измерений массы тела, трансаминазы в печени, общего билирубина и АМК демонстрируют, что эти соединения хорошо переносятся.
- 240 036584
Таблица 90 мРНК SRB-1
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% PBS)
PBS н.д. 100
353382 5 116
15 58
45 27
700989 5 120
15 92
45 46
666904 1 98
3 45
10 17
700991 1 118
3 63
10 14
Пример 95. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих бициклические нуклеозиды и 5'-GalNAc3 конъюгат.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 91, испытали в дозозависимом исследовании антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей.
Таблица 91
Модифицированные ASO, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAcs CM SEQ ID No
440762 TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTks mCk н.д. н.д. 22
666905 GalNAc3-3a-o’TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTksmCk GalNAc3-3a PO 22
699782 GalNAc3-7a-o’TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTksmCk GalNAc3-7a PO 22
699783 GalNAc3-3a-o’Tis mCisAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTis mCi GalNAc3-3a PO 22
653621 TismCisAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsmCdsTdsTis mCioA(io’-GalNAc3-la GalNAc3-la Ad 23
439879 TgsmCgsAdsGdsTdsmCdsAdsTd GdsAdsmCdsTdsTgsmCg н.д. н.д. 22
699789 GalNAc3-3a-o’TgsmCgsAdsGdsTdsmCdsAdsTdGdsAdsmCdsTdsTgsmCg GalNAc3-3a PO 22
Нижний индекс g означает фтор-HNA нуклеозид, нижний индекс l означает закрытый нуклеозид, содержащий мостик 2'-O-CH2-4'. Другие сокращения представлены в легенде таблицы примера 74. Структура GalNAc3-1a показана ранее в примере 9, структура GalNAc3-3a показана ранее в примере 39, а структура GalNAc3-7a показана ранее в примере 48.
Лечение.
Исследование выполнили по протоколу, описанному в примере 93. Результаты представлены ниже в табл. 92 и демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc и различные бициклические нуклеозидные модификации, были значительно более эффективными, чем исходный олигонуклеотид, не содержащий конъюгат и содержащий бициклические нуклеозидные модификации. Кроме того, олигонуклеотид, содержащий конъюгат GalNAc и фтор-HNA модификации, был существенно более эффективным, чем исходное соединение, не содержащее конъюгат и содержащее фтор-HNA модификации. Результаты измерений массы тела, трансаминазы в печени, общего билирубина и АМК демонстрируют, что эти соединения хорошо переносятся.
Таблица 92
Уровни мРНК SRB-1, ALT, AST, АМК и общего билирубина, а также массы тела
ISIS № Доза (мг/кг) мРНК SRB-1 (% PBS)
PBS н.д. 100
440762 1 104
3 65
10 35
666905 ОД 105
0,3 56
1 18
699782 ОД 93
о,з 63
1 15
699783 ОД 105
о,з 53
1 12
653621 0,1 109
0,3 82
1 27
439879 1 96
3 77
10 37
699789 0,1 82
0,3 69
1 26
- 241 036584
Пример 96. Связывание белка плазмы антисмысловыми олигонуклеотидами, содержащими конъюгирующую группу GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 57, нацеленные на ApoC-III, и олигонуклеотиды в табл.
93, нацеленные на Apo(a), испытали в анализе ультрафильтрации для оценки связывания белка в плазме.
Таблица 93
Модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на Apo(a)
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID No
494372 TesGesmCesTesmCesmCdsGdsTdsTdsGdsGdsTdsGdsmCdsTdsTesGesTes Т т/^ les н.д. н.д. 53
693401 TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGdsTdsGdsmCdsTdsTeoGeoTes TesmCe н.д. Н.Д. 53
681251 GalNAc3-7a-o’TesGesmCesTesmCesmCdsGdsTdsTdsGdsGdsTdsGdsmCds TdsTesGesTesT esmCe GalNAc37a PO 53
681257 GalNAc3-7a-o’TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGdsTdsGdsmCds TdsTeoGeoTesTesmCe GalNAcs7a PO 53
Легенда таблицы представлена в примере 74. Структура GalNAc3-7a показана ранее в примере 48.
Элементы для ультрафильтрации Ultrafree-MC (номинальное ограничение молекулярной массы 30000, слабосвязывающая регенерированная целлюлозная мембрана, Millipore, Бедфорд, штат Массачусетс) предварительно кондиционировали с 300 мкл 0,5% Tween 80 и центрифугировали при 2000 g в течение 10 мин, затем с 300 мкл 300 мкг/мл раствора контрольного олигонуклеотида в H2O и центрифугировали при 2000 g в течение 16 мин. Для оценки неспецифического связывания с фильтрами каждого исследуемого олигонуклеотида из табл. 57 и 93, применяемых в испытаниях, 300 мкл 250 нг/мл раствора олигонуклеотида при pH 7,4 поместили в предварительно кондиционированные фильтры и центрифугировали при 2000 г в течение 16 мин. Нефильтрованные и фильтрованные образцы анализировали твердофазным иммуноферментным анализом для определения концентраций олигонуклеотидов. Для получения средней концентрации для каждого образца применяли три экземпляра. Среднюю концентрацию фильтрованного образца относительно нефильтрованного образца применяли для определения процента олигонуклеотида, прошедшего через фильтр без плазмы (% выделения).
Замороженные образцы цельной плазмы, собранные в КЗ-ЭДТК и полученные от здоровых, не принимающих лекарства людей-добровольцев, яванских макак и мышей CD-1, приобрели у компании Bioreclamation LLC (Вестбери, штат Нью-Йорк). Исследуемые олигонуклеотиды добавляли к 1,2 мл аликвотам плазмы в двух концентрациях (5 и 150 мкг/мл). Аликвоту (300 мкл) каждого маркированного образца плазмы поместили на предварительно кондиционированный фильтровальный элемент и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, затем сразу выполнили центрифугирование при 2000 g в течение 16 мин. Аликвоты фильтрованных и нефильтрованных маркированных образцов плазмы анализировали твердофазным иммуноферментным анализом для определения концентрации олигонуклеотида в каждом образце. Применили три экземпляра каждой концентрации для определения среднего процента связанного и несвязанного олигонуклеотида в каждом образце. Среднюю концентрацию фильтрованного образца относительно концентрации нефильтрованного образца применили для определения процента олигонуклеотида в плазме, не связанного с белками плазмы (% несвязанного). Окончательные значения несвязанного олигонуклеотида корректировали на неспецифическое связывание путем деления % несвязанного на % выделения для каждого олигонуклеотида. Окончательные значения % связанного олигонуклеотида определили вычитанием окончательных значений % несвязанного из 100. Результаты показаны в табл. 94 для двух концентраций испытанного олигонуклеотида (5 и 150 мкг/мл) в плазме каждого вида. Результаты демонстрируют, что конъюгирующие группы GalNAc не оказывают существенного влияния на связывание белка плазмы. Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие только PS межнуклеозидные связи и смешанные PO/PS связи, оба варианта связывают белки плазмы, при этом олигонуклеотиды, содержащие только PS связи, связывают белки плазмы в несколько большей степени, чем олигонуклеотиды, содержащие смешанные PO/PS связи.
Таблица 94
Процент модифицированного олигонуклеотида, связанного с белками плазмы
ISIS № Плазма человека Плазма обезьян Плазма мышей
5 мкг/мл 150 мкг/мл 5 мкг/мл 150 мкг/мл 5 мкг/мл 150 мкг/мл
304801 99,2 98,0 99,8 99,5 98,1 97,2
663083 97,8 90,9 99,3 99,3 96,5 93,0
674450 96,2 97,0 98,6 94,4 94,6 89,3
494372 94,1 89,3 98,9 97,5 97,2 93,6
693401 93,6 89,9 96,7 92,0 94,6 90,2
681251 95,4 93,9 99,1 98,2 97,8 96,1
681257 93,4 90,5 97,6 93,7 95,6 92,7
Пример 97. Модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на TTR, содержащие конъюгирующую группу GalNAc3.
- 242 036584
Олигонуклеотиды, представленные в табл. 95, содержащие конъюгат GalNAc, предназначены для воздействия на TTR.
Таблица 95
Модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на TTR
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID No
666941 GalNAc3-3a-o’A(lo TesmCes Tgs Tes Ges Gds Tds Tds AdsmCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-3 Ad 45
666942 TesmCeo Teo Teo Geo Gds Tds Tds AdsmCds Ads Tds Gds Ads Ads Aeo TeomCesmCesmCeoAdo’-GalNAC3-3a GalNAc3-l Ad 42
682876 GalNAc3-3a-o’TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds Ads mCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-3 PO 41
682877 GalNAc3-7a-o’TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds AdsmCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-7 PO 41
682878 GalNAc3-10a-o’TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds Ads mCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-10 PO 41
682879 GalNAc3-13a-o’TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds Ads mCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-13 PO 41
682880 GalNAc3-7a-o’Ado TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds AdsmCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-7 Ad 45
682881 GalNAc3-10a-o’Ado TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds AdsmCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-10 Ad 45
682882 GalNAc3-13a-o’Ado TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds AdsmCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCe GalNAc3-13 Ad 45
684056 TesmCes Tes Tes Ges Gds Tds Tds AdsmCds Ads Tds Gds Ads Ads Aes TesmCesmCesmCeoAdo’-GalNAc3-19a GalNAc3-19 Ad 42
Легенда для табл. 95 представлена в примере 74. Структура GalNAc3-1 показана в примере 9. Структура GalNAc3-3a показана в примере 39. Структура GalNAc3-7a показана в примере 48. Структура GalNAc3-10a показана в примере 46. Структура GalNAc3-13a показана в примере 62. Структура GalNAc319a показана в примере 70.
Пример 98. Оценка провоспалительного действия олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc, в анализе hPMBC.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 96, исследовали на провоспалительное действие в анализе hPMBC, описанном в примерах 23 и 24 (см. табл. 17, 70, 82 и 95, где представлено описание олигонуклеотидов). ISIS 353512 обладает высоким ответом, и его применяли в качестве положительного контроля, а другие олигонуклеотиды описаны в табл. 70, 82 и 95. Результаты, представленные в табл. 96, получены с применением крови, полученной от одного донора-добровольца. Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие смешанные PO/PS межнуклеозидные связи, вызывают значительно более слабые провоспалительные реакции по сравнению с теми же олигонуклеотидами, содержащими только PS связи. Кроме того, в этом анализе конъюгирующая группа GalNAc не оказывает существенного влияния.
Таблица 96
ISIS № E max/EC 50 Кластер GalNAc3 Связи CM
353512 3630 Н.Д. PS н.д.
420915 802 Н.д. PS н.д.
682881 1311 GalNAc3-10 PS Ad
682888 0,26 GalNAc3-10 PO/PS Ad
684057 1,03 GalNAc3-19 PO/PS Ad
Пример 99. Связывающие аффинности олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc, в отношении асиалогликопротеинового рецептора.
Связывающие аффинности олигонуклеотидов, перечисленных в табл. 97 (см. табл. 63, в которой представлено описание олигонуклеотидов), в отношении асиалогликопротеинового рецептора испытали в анализе конкурентного связывания рецепторов. Конкурирующий лиганд, а1-кислый гликопротеин (AGP), инкубировали в 50 мМ ацетатно-натриевом буфере (pH 5) с 1 ед. нейраминидазы-агарозы в течение 16 ч при 37°С, а >90% дезалилирование подтвердили анализом с сиаловой кислотой или эксклюзионной хроматографией (SEC). Для йодирования АГФ применили монохлорид йода по способу, описанному авторами Atsma et al. (см. J. Lipid Res. январь 1991 г.; 32(1): 173-81). В этом способе дезалилированный а1-кислый гликопротеин (de-AGP) добавляли к 10 мМ хлориду йода, Na125I и 1М глицина в 0,25М NaOH. После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре, 1251-меченный de-AGP отделили от свободного 125I двукратным концентрированием смеси с применением спин-колонки с номинальным отсечением по молекулярной массе 3 кД. Белок испытали на эффективность мечения и чистоту на системе ВЭЖХ, оснащенной колонкой Agilent SEC-3 (7,8x300 мм) и счетчиком β-RAM. Конкуретные исследования с применением 1251-меченного de-AGP и ASO, содержащих различные GalNAc-кластеры, выполнили следующим образом. Человеческие клетки HepG2 (106 клеток/мл) поместили на 6-луночные
- 243 036584 планшеты в 2 мл соответствующей питательной среды. Применяли среду MEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES. Клетки выращивали в течение 1620 ч при 37°С с 5% и 10% CO2 соответственно. Перед экспериментом клетки промыли средой без FBS. Клетки выращивали в течение 30 мин при 37°С с 1 мл конкурентной смеси, содержащей соответствующую питательную среду с 2% FBS, 10-8 М '^-меченным de-AGP и ASO, содержащим GalNAc-кластер в концентрациях в диапазоне от 10-11 до 10-5 М. Неспецифическое связывание определили в присутствии 10-2 М GalNAc сахара. Клетки дважды промыли средой без FBS для удаления несвязанного 125Iмеченного de-AGP и конкурирующего GalNAc ASO. Клетки лизировали с применением буфера RLT производства компании Qiagen, содержащего 1% β-меркаптоэтанола. Лизаты перенесли в круглодонные аналитические пробирки после быстрого 10-минутного цикла замораживания/оттаивания и анализировали на γ-счетчике. Неспецифическое связывание вычли, а затем разделили импульсы белка 125I на значение импульсов при самой низкой концентрации GalNAc-ASO. Кривые ингибирования построили по уравнению моносайтового конкурентного связывания, применив алгоритм нелинейной регрессии для расчета связывающей аффиности (KD).
Результаты в табл. 97 были получены в экспериментах, выполненных в пять разных дней. Результаты для олигонуклеотидов, отмеченных верхним индексом a, представляют собой средние значения экспериментов, выполненных в два разных дня. Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу GalNAc на 5'-конце, связывают асиалогликопротеиновый рецептор человеческих клеток HepG2 с аффинностью, которая в 1,5-16 раз больше, чем для олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующую группу GalNAc на 3'-конце.
Таблица 97
Результаты анализа связывания асиалогликопротеинового рецептора
ISIS № Конъюгат GalNAc Конец олигонуклеотида, к которому присоединен конъюгат GalNAc KD (нМ)
661161а GalNAc3-3 5’ 3,7
666881а GalNAc3-10 5’ 7,6
666981 GalNAc3-7 5’ 6,0
670061 GalNAc3-13 5’ 7,4
655861я GalNAc3-l 3’ И,6
677841я GalNAc3-19 3’ 60,8
Пример 100. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующую группу GalNAc, нацеленных на Apo(a), in vivo.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 98a, испытали в исследовании однократной дозы на продолжительность действия у мышей.
Таблица 98a
Модифицированные ASO, нацеленные на Apo(a)
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAcs CM SEQ ID NO.
68125 1 GalNAc3-7a-o’TesGesmCesTesmCesmCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTesGes TesTesmCe GalNAc3-7a PO 53
68125 7 GalNAc3-7a-o’TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTeoGeo TesTesmCe GalNAc3-7a PO 53
Структура GalNAc3-7a показана в Примере 48.
Лечение.
Каждой самке трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий Apo(a), один раз в неделю, в целом 6 доз, вводили подкожную инъъекцию олигонуклеотида и доз, перечисленных в табл. 98b, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 3 животных. Образцы крови брали за день до введения дозы для определения исходных уровней белка Apo(a) в плазме, а также через 72 ч, 1 неделю и 2 недели после введения первой дозы. Дополнительные пробы крови брали через 3 недели, 4 недели, 5 недель и 6 недель после введения первой дозы. Уровни белка Apo(a) в плазме измеряли при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты в табл. 98b представлены как средний процент от уровней белка Apo(a) в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к исходным уровням (% BL). Результаты показывают, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу GalNAc, демонстрируют эффективное снижение экспрессии Apo(a). Этот мощный эффект наблюдали для олигонуклеотида, содержащего только PS межнуклеозидные связи, и для олигонуклеотида, содержащего смешанные PO и PS связи.
- 244 036584
Таблица 98b
Уровни белка Apo(a) в плазме ________________
ISIS № Доза (мг/кг) Аро(а) через 72 часа (% BL) Аро(а) через 1 неделю (% BL) Аро(а) через 3 недели (% BL)
PBS н.д. 116 104 107
681251 θ,3 97 108 93
ι,ο 85 77 57
з,о 54 49 11
10,0 23 15 4
681257 0,3 114 138 104
1,0 91 98 54
3,0 69 40 6
10,0 30 21 4
Пример 101. Антисмысловое ингибирование олигонуклеотидами, содержащими кластер GalNAc, связанный через стабильный фрагмент.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 99, испытали на ингибирование экспрессии мышиного APOC-III in vivo. Мышам C57Bl/6 ввели однократную подкожную инъекцию олигонуклеотида, перечисленного в табл. 99, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Каждой мыши, обработанной соединением ISIS 440670, вели дозу 2, 6, 20 или 60 мг/кг. Каждой мыши, обработанной соединением ISIS 680772 или 696847, ввели 0,6, 2, 6 или 20 мг/кг. Конъюгирующая группа GalNAc в ISIS 696847 связана через стабильный фрагмент, тиофосфатную связь вместо легко расщепляемого фосфодиэфирсодержащей связи. Животных умертвили через 72 ч после введения дозы. Уровни мРНК APOC-III в печени измерили при помощи ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК APOC-III нормализовали к уровням мРНК циклофилина по стандартным протоколам. Результаты представлены в табл. 99 как средний процент уровней мРНК APOC-III для каждой экспериментальной группы по сравнению с контрольной группой, обработанной солевым раствором. Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу GalNAc, были существенно более эффективными, чем олигонуклеотид, не содержащий конъюгирующую группу. Кроме того, олигонуклеотид, содержащий конъюгирующую группу GalNAc, связанную с олигонуклеотидом через расщепляемый фрагмент (ISIS 680772), был еще более эффективным, чем олигонуклеотид, содержащий конъюгирующую группу GalNAc, связанную с олигонуклеотидом через стабильный фрагмент (ISIS 696847).
Таблица 99
Модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на мышиный APOC-III
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) c M Доза (мг/кг) мРНК APOC-III (% PBS) SEQ ID NO.
440670 mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTdsTdsAds GdsGdsGdsAdsmCes AesGes mCesAe Н.Д 2 92 47
6 86
20 59
60 37
680772 GalNAc3-7a-o’mCesAesGesmCesTesTdsTdsAds TdsTdsAdsGds GdsGdsAdsmCes AesGesmCesAe PO 0,6 79 47
2 58
6 31
20 13
696847 GalNAc3-7a-s’mCesAesGesmCesTesTdsTdsAdsTds TdsAdsGdsGdsGdsAdsmCes AesGesmCesAe Н.Д (PS ) 0,6 83 47
2 73
6 40
20 28
Структура GalNAc3-7a показана в примере 48.
Пример 102. Распределение в печени антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc.
Оценили распределение в печени ISIS 353382 (см. табл. 23), который не содержит конъюгат GalNAc, и ISIS 655861 (см. табл. 23), который содержит конъюгат GalNAc. Самцам мышей balb/c ввели однократную подкожную инъекцию ISIS 353382 или 655861 в дозе, перечисленной в табл. 100. Каждая экспериментальная группа состояла из 3 животных, за исключением группы с дозой 18 мг/кг для ISIS 655861, которая состояла из 2 животных. Животных умертвили через 48 ч после введения дозы для определения распределения олигонуклеотидов в печени. Для измерения количества молекул антисмыслового олигонуклеотида на клетку метку трис-бипиридина рутения(П) (MSD TAG, Meso Scale Discovery) конъюгировали с олигонуклеотидным образцом, применяемым для обнаружения антисмысловых олигонуклеотидов. Результаты, представленные в табл. 100, представляют собой средние концентрации олигонуклеотида для каждой экспериментальной группы в единицах измерения миллионов молекул олигонуклеотида на клетку. Результаты демонстрируют, что при равных дозах олигонуклеотид, содержащий конъюгат GalNAc, содержался в более высоких концентрациях в целом в печени и в гепатоцитах, чем олигонуклеотид, не содержащий конъюгата GalNAc. Кроме того, олигонуклеотид, содержащий конъюгат Gal
- 245 036584
NAc, содержался в более низких концентрациях в непаренхиматозных клетках печени, чем олигонуклеотид, не содержащий конъюгат GalNAc. И тогда как концентрации ISIS 655861 в гепатоцитах и непаренхиматозных клетках печени были одинаковыми в расчете на одну клетку, содержание гепатоцитов в печени составляет около 80 об.%. Следовательно, основная часть олигонуклеотида ISIS 655861, содержащегося в печени, находилась в гепатоцитах, тогда как основная часть олигонуклеотида ISIS 353382, содержащегося в печени, находилась в непаренхиматозных клетках печени.
Таблица 100
ISIS № Доза (мг/кг) Концентрация в печени в целом (молекул*10л60 на клетку) Концентрация в гепатоцитах (молекул* 10Л60 на клетку) Концентрация в непаренхиматозных клетках печени (молекул* 10Л60 на клетку)
353382 3 9,7 1,2 37,2
10 17,3 4,5 34,0
20 23,6 6,6 65,6
30 29,1 И,7 80,0
60 73,4 14,8 98,0
90 89,6 18,5 119,9
655861 0.5 2,6 2,9 3,2
1 6,2 7,0 8,8
3 19,1 25,1 28,5
6 44,1 48,7 55,0
18 76,6 82,3 77,1
Пример 103. Продолжительность действия in vivo олигонуклеотидов, нацеленных на APOC-III, содержащих конъюгат GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 101, испытали в исследовании однократной дозы на продолжительность действия у мышей.
Таблица 101
Модифицированные ASO, нацеленные на APOC-III
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc3 CM SEQ ID NO.
30480 1 AesGesmCesTesTesmCdsTdsTdsGdsTdsmCdsmCdsAdsGdsrnCdsTes Tes TesAesTe Н.Д. Н.Д. 20
66308 4 GalNAc3-3a-o’AdoAesGeomCeoTeoTeomCdsTdsTdsGdsTdsmCds mCdsAdsGdsmCdsTeoTeo TesAesTe GalNAc3-3a Ad 36
67924 1 AesGeomCeoTeoTeomCdsTdsTdsGdsTds mCdsmCdsAdsGdsmCdsTeo Teo TesAesTeoAdo’-GalNAc3-19a GalNAcs19a Ad 21
Структура GalNAc3-3a показана в примере 39, a GalNAc3-19a показана в примере 70.
Лечение.
Самкам трансгенных мышей, экспрессирующим человеческий APOC-III, ввели однократную подкожную инъекцию олигонуклеотида, перечисленного в табл. 101, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 3 животных. Образцы крови брали до введения дозы для определения исходных показателей и на 3-й, 7-й, 14-й, 21-й, 28-й, 35-й и 42-й день после введения дозы. Уровни триглицеридов и белка APOC-III в плазме измеряли так, как описано в примере 20. Результаты в табл. 102 представлены как средний процент уровней триглицеридов и APOC-III в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к исходным уровням. Сравнение результатов в табл. 58 примера 79 с результатами, представленными ниже в табл. 102, демонстрирует, что олигонуклеотиды, содержащие смесь фосфодиэфирных и тиофосфатных межнуклеозидных связей, обладают увеличенной продолжительностью действия, чем эквивалентные олигонуклеотиды, содержащие только тиофосфатные межнуклеозидные связи.
- 246 036584
Таблица 102
Уровни триглицеридов и белка APOC-III в плазме трансгенных мышей
ISIS № PBS 304801 663084 Доза (мг/кг) н.д. 30 10 Временные точки(дни после введения дозы) 7 14 21 28 35 42 7 14 21 28 35 42 3 7 14 21 28 35 42 Триглицериды (% от исходного значения) 96 88 91 69 83 65 72 42 42 59 67 79 72 82 35 23 23 23 30 32 37 Белок АРОС-Ш (% от исходного значения) 101 98 103 92 81 86 88 46 51 69 81 76 95 92 28 24 26 29 22 36 47 Кластер GalNAcs н.д. н.д. GalNAc3За СМ н.д. Н.д. Ad
679241 10 3 38 30 GalNAc319а Ad
7 31 28
14 30 22
21 36 34
28 48 34
35 50 45
42 72 64
Пример 104. Синтез олигонуклеотидов, содержащих конъюгат 5'-GalNAc2.
ТФК
ДХМ
Соединение 120 имеется в продаже, а синтез соединения 126 описан в примере 49. Соединение 120 (1 г, 2,89 ммоль), HBTU (0,39 г, 2,89 ммоль) и HOBt (1,64 г, 4,33 ммоль) растворили в ДМФА (10 мл) и добавили Н^диизопропилэтиламин (1,75 мл, 10,1 ммоль). Примерно через 5 мин в реакционную смесь добавили бензиловый эфир аминогексановой кислоты (1,36 г, 3,46 ммоль). Через 3 ч реакционную смесь вылили в 100 мл 1М раствора NaHSO4 и экстрагировали 2x50 мл этилацетата. Органические слои объединили и промыли 3x40 мл насыщенного раствора NaHCO3 и 2х насыщенным солевым раствором, высушили при помощи Na2SO4, отфильтровали и концентрировали. Продукт очистили силикагелевой коло
- 247 036584 ночной хроматографией (ДХМ:ЕА:гексаны, 1:1:1) с получением соединения 231. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались со структурой. Соединение 231 (1,34 г, 2,438 ммоль) растворили в дихлорметане (10 мл) и добавили трифторуксусную кислоту (10 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 ч реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением и выпарили вместе с толуолом (3x10 мл). Остаток высушили под пониженным давлением с получением соединения 232 в виде трифторацетатной соли. Синтез соединения 166 описан в примере 54. Соединение 166 (3,39 г, 5,40 ммоль) растворили в ДМФА (3 мл). Раствор соединения 232 (1,3 г, 2,25 ммоль) растворили в ДМФА (3 мл) и добавили Н^диизопропилэтиламин (1,55 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной тем пературе в течение 30 мин, затем вылили в воду (80 мл), а водный слой экстрагировали EtOAc (2x100 мл). Органическую фазу отделили и промыли насыщенным водным раствором NaHCO3 (3x80 ил), 1М NaHSO4 (3x80 мл) и насыщенным солевым раствором (2x80 мл), затем высушили (Na2SO4), отфильтровали и концентрировали. Остаток очистили силикагелевой колоночной хроматографией с получением соединения 233. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались со структурой. Соединение 233 (0,59 г, 0,48 ммоль) растворили в метаноле (2,2 мл) и этилацетате (2,2 мл). Добавили палладий на углероде (10 мас.% Pd/C, влажный, 0,07 г) и перемешивали реакционную смесь в атмосфере водорода в течение 3 ч. Реакционную смесь отфильтровали через слой целита и концентрировали с получением карбоновой кислоты. Карбоновую кислоту (1,32 г, 1,15 ммоль, не содержащая кластера кислота) растворили в ДМФА (3,2 мл). К ней добавили добавили Н^диизопропилэтиламин (0,3 мл, 1,73 ммоль) и PFP-ТФК (0,30 мл, 1,73 ммоль). Через 30 мин перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь вылили в воду (40 мл) и экстрагировали EtOAc (2x50 мл). Выполнили стандартную процедуру выделения продукта, как описано выше, с получением соединения 234. Данные ЖХМС и ЯМР согласовались со структурой. Олигонуклеотид 235 получили по общему способу, описанному в примере 46. Кластерная часть GalNAc2 (GalNAc2-24a) конъюгирующей группы GalNAc2-24 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом, содержащимся в олигонуклеотиде, с получением различных конъюгирующих групп. Структура GalNAc2-24 (GalNAc2-24a-CM) представлена ниже
Пример 105. Синтез олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc1-25
он ОН но
О 8 Зе з;_____________||
С QLIGQ %О-Р-ОДСНЭе-ННг
ОН
1. Боратный буфер. ДМСО. pH 8.5. комн.т-ра
И
2. водн. аммиак комн, т-ра
-О
AcHN oligo ]
Η 6
238
Синтез соединения 166 описан в примере 54. Олигонуклеотид 236 получили по общему способу, описанному в примере 46.
Альтернативно, олигонуклеотид 236 синтезировали по схеме, изображенной ниже, а соединение 238 применяли для получения олигонуклеотида 236 по способам, описанным в примере 10.
ОАрОАс
-О АсОА..----т.-О ...
NHAc + PFP-ТФК
ОН тетразол, 1-металимидазол, ДМФА h2n^-239
АсО О
NHAc
TEA, ацетонитрил о
237 Н .ОН
2-цианоэтилтетраизопропилфосфородиамидит
- 248 036584
Кластерная часть GalNAc1 (GalNAc1-25a) конъюгирующей группы GalNAc1-25 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом, содержащемся в олигонуклеотиде, с получением различных конъюгирующих групп. Структура GalNAc1-25 (GalNAc1-25a-CM) представлена ниже
Пример 106. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, нацеленных на SRB-1, содержащих конъюгат 5'-GalNAc2 или 5'-GalNAc3.
Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 103 и 104, испытали в дозозависимых исследованиях антисмыслового ингибирования SRB-1 у мышей.
Лечение.
Шестинедельным самцам мышей C57BL/6 (Jackson Laboratory, Бар-Харбор, штат Мэн) ввели однократную подкожную инъекцию 2, 7 или 20 мг/кг ISIS № 440762; или 0,2, 0,6, 2, 6 или 20 мг/кг ISIS №№ 686221, 686222 или 708561; или солевого раствора. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Мышей умертвили через 72 ч после последнего введения. Уровни мРНК SRB-1 в печени измерили при помощи ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК SRB-1 нормализовали к уровням мРНК циклофилина по стандартным протоколам. Антисмысловые олигонуклеотиды снижают уровни мРНК SRB-1 дозозависимым образом, а результаты ED5o представлены в табл. 103 и 104. Хотя в предыдущих исследованиях показано, что тривалентные GalNAc-конъюгированные олигонуклеотиды существенно более эффективны, чем двухвалентные GalNAc-конъюгированные олигонуклеотиды, которые, в свою очередь, существенно более эффективны, чем одновалентные GalNAc-конъюгированные олигонуклеотиды (см., например, Khorev et al., Bioorg. & Med. Chem., т. 16, 5216-5231 (2008)), обработка антисмысловыми олигонуклеотидами, содержащими одновалентные, двухвалентные и тривалентные кластеры GalNAc, приводит к снижению уровней мРНК SRB-1 с одинаковой эффективностью, как показано в табл. 103 и 104.
Таблица 103
Модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc ED50 (мг/кг) SEQ ID No
44076 2 TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTksmCk н.д. 4,7 22
68622 1 GalNAc2-24a-o’A(ioTksmCksA(isG(isT(ismC(isA(isT(isG(isA(is “CdsTdsTkTCk GalNAc2 -24a 0,39 26
68622 2 GalNAc3-13a-o’A(ioTksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTksmCk GalNAc3 -13a 0,41 26
Легенда к таблице представлена в примере 93. Структура GalNAc3-13a показана в примере 62, а структура GalNAc2-24a показана в примере 104.
Таблица 104
Модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на SRB-1
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc ED 50 (мг/кг) SEQ ID No
44076 2 TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTksmCk н.д. 5 22
70856 1 GalNAci-25a-o’TksmCksAdsGdsTdsmCdsAdsTdsGdsAds mCdsTdsTksmCk GalNAc 1 -25a 0,4 22
Легенда к таблице представлена в примере 93. Структура GalNAc1-25a показана в примере 105.
Оценили также концентрации олигонуклеотидов, представленных в табл. 103 и 104, в печени, применив способы, описанные в примере 75. Результаты, показанные ниже в табл. 104a и 104b, представляют собой средние значения общего содержания антисмысловых олигонуклеотидов в тканях для каждой экспериментальной группы, измеренные по УФ, в единицах измерения мкг олигонуклеотида на грамм ткани печени. Результаты демонстрируют, что олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу GalNAc, накапливаются в печени в существенно более высоких количествах, чем при той же дозе олигонуклеотида, не содержащего конъюгирующую группу GalNAc. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие один, два или три лиганда GalNAc в своих соответствующих группах конъюгата, накапливаются в печени в равных количествах. Этот результат является неожиданным с учетом данных, представленных выше в литературном источнике Khorev et al., и он согласуется с данными активности, представленными выше в табл. 103 и 104.
- 249 036584
Таблица 104a
Концентрации в печени олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующую группу GalNAc2 или GalNAc3
ISIS № Доза (мг/кг) [Антисмысловый олигонуклеотид] (мкг/г) Кластер GalNAc CM
2 2,1
440762 7 13,1 н.д. н.д.
20 31,1
0,2 0,9
686221 0,6 2 2,7 12,0 GalNAc2-24a Ad
6 26,5
686222 0,2 0,5 GalNAc3-13a Ad
0,6 1,6
2 И,6
6 19,8
Таблица 104b
Концентрации в печени олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующую группу GalNAc1
ISIS № Доза (мг/кг) [Антисмысловый олигонуклеотид] (мкг/г) Кластер GalNAc СМ
440762 2 2,3 н.д. н.д.
7 8,9
20 23,7
708561 0,2 0,4 GalNAci-25a РО
0,6 1,1
2 5,9
6 23,7
20 53,9
Пример 107. Синтез олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc1-26 или GalNAc1-27.
Олигонуклеотид 239 синтезировали связыванием соединения 47 (см. пример 15) с кислотой 64 (см. пример 32), применяя HBTU и DIEA в ДМФА. Полученное амидсодержащее соединение тиофосфорилировали, затем присоединили к 5'-концу олигонуклеотида по способам, описанным в примере 10. Кластерная часть GalNAc1 (GalNAc1-26a) конъюгирующей группы GalNAc1-26 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом, содержащимся в олигонуклеотиде, с получением различных конъюгирующих групп. Структура GalNAc1-26 (GalNAc1-26a-CM) представлена ниже
Для присоединения конъюгирующие группы GalNAc1 к 3'-концу олигонуклеотида амид, образованный по реакции соединений 47 и 64, присоединили к твердой подложке по способам, описанным в примере 7. Затем выполнили синтез олигонуклеотида по способам, описанным в примере 9, с получением олигонуклеотида 240.
Кластерная часть GalNAc1 (GalNAc1-27a) конъюгирующей группы GalNAc1-27 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом, содержащемся в олигонуклеотиде, с получением различных конъюгирующих групп. Структура GalNAc1-27 (GalNAc1-27a-CM) представлена ниже
- 250 036584
Пример 108. Антисмысловое ингибирование in vivo под действием олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующую группу GalNAc, нацеленных на Apo(a), in vivo.
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 105, испытали в исследовании однократной дозы на
мышах.
Таблица 105
Модифицированные ASO, нацеленные на Apo(a)
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAcs CM SEQ ID NO.
49437 2 TesGesmCesTesmCesmCdsGdsTdsTdsGdsGdsTdsGdsmCds TdsT esGesTesT esmCe Н.Д. Н.Д. 53
68125 1 GalNAc3-7a-o’TesGesmCesTesmCesmCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTesGes TesTesmCe GalNAc3-7a PO 53
68125 5 GalNAc3-3a-o’TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTeoGeo TesTesmCe GalNAc3-3a PO 53
68125 6 GalNAc3-10a-o’TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTeoGeo TesTesmCe GalNAc3-10a PO 53
68125 7 GalNAc3-7a-o’TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTeoGeo TesTesmCe GalNAc3-7a PO 53
68125 8 GalNAc3-13a-o’TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTeoGeo TesTesmCe GalNAc3-13a PO 53
68126 0 TesGeomCeoTeomCeomCdsGdsTdsTdsGdsGds TdsGdsmCdsTdsTeoGeo TesTesmCeoAdo’-GalNAc3-l 9 GalNAc3-19a Ad 52
Структура GalNAc3-7a показана в примере 48.
Лечение.
Самцам трансгенных мышей, экспрессирующим человеческий Apo(a), ввели однократную подкожную инъекцию олигонуклеотида и дозы, перечисленные в табл. 106, или PBS. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 животных. Образцы крови брали за день до введения дозы для определения исходных уровней белка Apo(a) в плазме, а также через 1 неделю после введения первой дозы. Образцы крови брали дополнительно еженедельно в течение около 8 недель. Уровни белка Apo(a) в плазме измеряли при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты в табл. 106 представлены как средний процент от уровней белка Apo(a) в плазме для каждой экспериментальной группы, нормализованных к исходным уровням (% BL). Результаты показывают, что антисмысловые олигонуклеотиды снижают экспрессию белка Apo(a). Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу GalNAc, демонстрируют еще более эффективное снижение экспрессии Apo(a), чем олигонуклеотид, не содержащий конъюгирующую группу.
Таблица 106
Уровни белка Apo(a) в плазме
Пример 109. Синтез олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc1-28 или GalNAc1-29.
Олигонуклеотид 241 синтезировали по таким же способам, как описаны в примере 71, с получением фосфорамидитного промежуточного соединения, после чего выполнили приемы, описанные в примере 10, для синтеза олигонуклеотида. Кластерная часть GalNAc1 (GalNAc1-28a) конъюгирующей группы GalNAc1-28 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом, содержащимся в олиго- 251 036584 нуклеотиде, с получением различных конъюгирующих групп. Структура GalNAc1-28 (GalNAc1-28a-CM) представлена ниже
Для присоединения конъюгирующие группы GalNAc1 к 3'-концу олигонуклеотида применяли такие же способы, как описаны в примере 71, с получением гидроксильного промежуточного соединения, которое затем присоединили к твердой подложке по способам, описанным в примере 7. Затем выполнили синтез олигонуклеотида по способам, описанным в примере 9, с получением олигонуклеотида 242.
Кластерная часть GalNAc1 (GalNAc1-29a) конъюгирующей группы GalNAc1-29 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом, содержащимся в олигонуклеотиде, с получением различных конъюгирующих групп. Структура GalNAc1-29 (GalNAc1-29a-CM) представлена ниже
Пример 110. Синтез олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc1-30
О Ас
О
AcO A
N
Λ 0 /
НО·-·-- ·χ.-·--TMSOTf
OAc AcO / OTBDPS lA_O
AcO-VAcHN .OTBDPS
243
NH^MeOH 2. DMTrCI 3. Ас20. руг
ODMTr
0 n
AcO -i--U AcHN
1.TBAF
OTBDPS Тиофосфорилирование
ODMTr
0 n
AcO -i--U AcHN
ОН
НО AcHN
246
244 ^°T^0CE
245 N(iPr)2
1. Связывание с 5'-концом ΑΞΟ
2. Снятие защиты и очистка ΑΞΟ при помощи способов очистки □ МТ-оп
5'
3'
Олигонуклеотид 246, содержащий конъюгирующую группу GalNAc1-30, где Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного C1-C10-αлкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила, синтезировали так, как показано выше. Кластерная часть GalNAc1 (GalNAc1-30a) конъюгирующей группы GalNAc1-30 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения Y представляет собой часть расщепляемого фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения Y представляет собой часть стабильного фрагмента, а расщепляемый фрагмент находится в олигонуклеотиде. Структура GalNAc1-30a представлена ниже
Пример 111. Синтез олигонуклеотидов, содержащих конъюгат GalNAc2-31 или GalNAc2-32
- 252 036584 □СЕ Связывание с б'-концом ΑΞΟ
-О-Р'
N(iPr)2
248
1. DMTrCI
НО
2. Тиоф осф орилирование
1. Снятие групп ОМТг
2. Связывание амидита 245
3. Снятие защиты и очистка ΑΞΟ при помощи способов очистки DMT-оп
Олигонуклеотид 250, содержащий конъюгирующую группу GalNAc2-31, где Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного C1-C10-алкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила, синтезировали так, как показано выше. Кластерная часть GalNAc2 (GalNAc2-31a) конъюгирующей группы GalNAc2-31 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения Y-содержащая группа, которая находится непосредственно возле 5' -конца олигонуклеотида, представляет собой часть расщепляемого фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения Y-содержащая группа, которая находится непосредственно возле 5'-конца олигонуклеотида, представляет собой часть стабильного фрагмента, а расщепляемый фрагмент находится в олигонуклеотиде. Структура GalNAc2-31a представлена ниже но /он
НО ...
AcHN
о.
°Х° о' Υ —о
ОН но I
о.
h9\cHN
Синтез олигонуклеотида, содержащего конъюгат GalNAc2-32, представлен ниже но.
он но
247 но/он
AcHN
1. DMTrCI
2. Аллил бромид
3. 0s04. МаЮ4 РМТгО.
4. NaBH4
5. Тиоф осф орили- DMTr0 рование 'рЛ о'
Г-X
I — о
251
1. Связывание с 5’-концом ΑΞΟ
2. Снятие групп DMTr
3. Связывание амидита 245
-ч 4. Снятие защиты и очистка ΑΞΟ
P-N(iPr)2 при помощи способов очистки
СЕО DMT-οπ
Os / / .
o' Y он но( о Р252 Н0 NHAc
Олигонуклеотид 252, содержащий конъюгирующую группу GalNAc2-32, где Y выбран из O, S, замещенного или незамещенного C1-C10-алкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила, синтезировали так, как показано выше. Кластерная часть GalNAc2 (GalNAc2-32a) конъюгирующей группы GalNAc2-32 может быть комбинирована с любым расщепляемым фрагментом с получением различных конъюгирующих групп. В некоторых вариантах реализации изобретения Y-содержащая группа, ко- 253 036584 торая находится непосредственно возле 5'-конца олигонуклеотида, представляет собой часть расщепляемого фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения Y-содержащая группа, которая находится непосредственно возле 5'-конца олигонуклеотида, представляет собой часть стабильного фрагмента, а расщепляемый фрагмент находится в олигонуклеотиде. Структура GalNAc2-32a представлена ниже
Пример 112. Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие конъюгат GalNAc1.
Олигонуклеотиды в табл. 107, нацеленные на SRB-1, были синтезированы с группой конъюгата GalNAc1 для дополнительной проверки эффективности олигонуклеотидов, содержащих конъюгирующие группы, которые содержат лиганд GalNAc.
Таблица 107
ISIS № Последовательность (от 5’ к 3’) Кластер GalNAc CM SEQ ID NO.
711461 GalNAci-25a-o’Ado GesmCes Tes TesmCes Ads Gds Tds mCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Te GalNAci25a Ad 30
711462 GalNAci-25a-o’GesmCes Tes TesmCes Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Te GalNAci25a PO 28
711463 711465 711466 711467 711468 GalNAci-25a-o’GesmCeo Teo ТеоШСео Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TeomCeomCes Tes Te GalNAci-26a-o’Ado GesmCes Tes Tes mCes Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Te GalNAci-26a-o’GesmCes Tes TesmCes Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Te GalNAci-26a-o’GesmCeo Teo TeomCeo Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TeomCeomCes Tes Te GalNAci-28a-o’Ado GesmCes Tes TesmCes Ads Gds Tds mCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Te GalNAci25a GalNAci26a GalNAci26a GalNAci26a GalNAci28a PO Ad PO PO Ad 28 30 28 28 30
711469 GalNAci-28a-o’GesmCes Tes TesmCes Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Te GalNAci28a PO 28
711470 GalNAci-28a-o’GesmCeo Teo TeomCeo Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TeomCeomCes Tes Te GalNAci 28a PO 28
713844 GesmCes Tes TesmCes Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Teo’-GalNAci-27a GalNAci27a PO 28
713845 GesmCeo Teo ТеоШСео Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TeomCeomCes Tes Teo’-GalNAci-27a GalNAci 27a PO 28
713846 GesmCeo Teo ТеоШСео Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TeomCeomCes Tes Teo Ado’-GalNAci-27a GalNAci 27a Ad 29
713847 GesmCes Tes TesmCes Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes Teo’-GalNAci-29a GalNAci29a PO 28
713848 GesmCeo Teo ТеоШСео Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TeomCeomCes Tes Teo’-GalNAci-29a GalNAci 29a PO 28
713849 GesmCes Tes TesmCes Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TesmCesmCes Tes TeoAdo’-GalNAci-29a GalNAci29a Ad 29
713850 GesmCeo Teo ТеоШСео Ads Gds TdsmCds Ads Tds Gds AdsmCds Tds TeomCeomCes Tes TeoAdo’-GalNAci-29a GalNAci 29a Ad 29
Пример 113. Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие конъюгирующую группу GalNAc, нацеленные на вирус гепатита B (HBV).
Олигонуклеотиды, перечисленные ниже в табл. 108, предназначены для воздействия на HBV. В некоторых вариантах реализации изобретения расщепляемый фрагмент представляет собой фосфодиэфирную связь.
- 254 036584
Таблица 108
Последовательность (от 5’ к 3’) SEQ ID No.
GalNAc3-3-GesmCesAesGesAesGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGtisAdsAesGesTesGesmCe 3
GalNAc3-3-GesmCeoAeoGeoAeoGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAeoGeoTesGesmCe 3
GalNAc3-7-GesmCesAesGesAesGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAesGesTesGesmCe 3
GalNAc3-7-GesmCeoAeoGeoAeoGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAeoGeoTesGesmCe 3
GalNAc3-10-GesmCesAesGesAesGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAesGesTesGesmCe 3
GalNAc3-10-GesmCeoAeoGeoAeoGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAeoGeoTesGesmCe 3
GalNAc3-13-GesmCesAesGesAesGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAesGesTesGesmCe 3
GalNAc3-13-GesmCeoAeoGeoAeoGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAeoGeoTesGesmCe 3
GesmCes AesGes AesGdsGdsT dsGdsAds AdsGdsmCdsGdsAds AesGesT esGesmCe-GalNAc3-19 3
GesmCeoAeoGeoAeoGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAeoGeoTesGesmCe-GalNAc3-19 3
GalNAc3-24-GesmCesAesGesAesGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAesGesTesGesmCe 3
GalNAc3-24-GesmCeoAeoGeoAeoGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAeoGeoTesGesmCe 3
GalNAc3-25-GesmCesAesGesAesGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAesGesTesGesmCe 3
GalNAc3-25-GesmCeoAeoGeoAeoGdsGdsTdsGdsAdsAdsGdsmCdsGdsAdsAeoGeoTesGesmCe 3
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (40)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение, способное ингибировать экспрессию транстиретина, содержащее модифицированный олигонуклеотид и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и содержит последовательность азотистых оснований, включающую часть по меньшей мере из 8 смежных азотистых оснований, комплементарную равной по длине части SEQ ID NO: 2, при этом последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% комплементарна SEQ ID NO: 2, и при этом конъюгирующая группа содержит
  2. 2. Соединение по п.1, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный сахар.
  3. 3. Соединение по п.2, у которого по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар.
  4. 4. Соединение по любому из пп.2, 3, у которого по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтил, стерически затрудненный этил, З'-фтор-HNA или 4'-(CH2)n-O-2' мостик, где n равно 1 или 2.
  5. 5. Соединение по п.2, у которого по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой 2'-O-метоксиэтил.
  6. 6. Соединение по любому из пп.1-5, у которого по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное азотистое основание.
  7. 7. Соединение по п.6, у которого модифицированное азотистое основание представляет собой 5метилцитозин.
  8. 8. Соединение по любому из пп.1-7, у которого конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида.
  9. 9. Соединение по любому из пп.1-7, у которого конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида.
  10. 10. Соединение по любому из пп.1-9, у которого конъюгирующая группа содержит:
    - 255 036584 (a)
    где расщепляемый фрагмент (CM) означает связь или группу, которая может быть расщеплена при физиологических условиях; и/или (b)
  11. 11. Соединение по любому из пп.1-9, у которого каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной межнуклеозидной связи и тиофосфатной межнуклеозидной связи.
  12. 12. Соединение по п.11, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере две фосфодиэфирные межнуклеозидные связи, необязательно, где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 5 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей.
  13. 13. Соединение по п.11 или 12, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере две тиофосфатные межнуклеозидные связи.
  14. 14. Соединение по любому из пп.11-13, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит менее 14 тиофосфатных связей, необязательно, где модифицированный олигонуклеотид содержит менее 13 тиофосфатных связей.
  15. 15. Соединение по любому из пп.1-14, у которого модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
  16. 16. Соединение по любому из пп.1-14, у которого модифицированный олигонуклеотид является двухцепочечным.
  17. 17. Соединение по любому из пп. 1-16, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит сегмент гэп, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
    сегмент 5'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; и сегмент 3'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов;
    при этом сегмент гэп расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла; и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит модифицированный сахар.
  18. 18. Соединение по п.17, у которого каждая межнуклеозидная связь в сегменте гэп модифицированного олигонуклеотида представляет собой тиофосфатную связь.
  19. 19. Соединение по п.18, у которого модифицированный олигонуклеотид дополнительно содержит по меньшей мере одну тиофосфатную межнуклеозидную связь в каждом сегменте крыла.
  20. 20. Соединение по любому из пп.1-19, у которого последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна SEQ ID NO: 2.
  21. 21. Соединение по любому из пп.1-19, у которого последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 95% комплементарна SEQ ID NO: 2.
  22. 22. Соединение по любому из пп.1-19, у которого последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна SEQ ID NO: 2.
  23. 23. Соединение по любому из пп.1-22, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19.
  24. 24. Соединение по любому из пп.1-22, у которого модифицированный олигонуклеотид состоит из связанных нуклеозидов, состоящих из последовательности азотистых оснований любой из SEQ ID NO: 12-19.
  25. 25. Соединение по п.1, у которого модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность азотистых оснований, состоящую из SEQ ID NO: 12, и при
    - 256 036584 этом модифицированный олигонуклеотид содержит сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
    сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;
    при этом сегмент гэп расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла; и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар, и при этом каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
  26. 26. Соединение по п.1, у которого модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность азотистых оснований, состоящую из любой из SEQ ID NO: 13-19, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит сегмент гэп, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов;
    сегмент 5'-крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; и сегмент 3'-крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов;
    при этом сегмент гэп расположен между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла; и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар, и при этом каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
  27. 27. Соединение по п.25 или 26, у которого конъюгирующая группа содержит:
    (a)
    AcHN · где расщепляемый фрагмент (CM) означает связь или группу, которая может быть расщеплена при физиологических условиях; и/или (b)
    AcHN
  28. 28. Соединение по любому из пп.25-27, у которого каждая межнуклеозидная связь в модифицированном нуклеотиде выбрана из фосфодиэфирной межнуклеозидной связи и тиофосфатной межнуклеозидной связи.
  29. 29. Соединение по любому из пп.25-28, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 2 фосфодиэфирные межнуклеозидные связи.
  30. 30. Соединение по любому из пп.25-29, у которого модифицированный олигонуклеотид содержит менее 14 тиофосфатных связей, необязательно, где модифицированный олигонуклеотид содержит менее 13 тиофосфатных связей.
  31. 31. Соединение по любому из пп.25-30, у которого каждая межнуклеозидная связь в сегменте гэп модифицированного олигонуклеотида представляет собой тиофосфатную связь.
  32. 32. Соединение по п.31, у которого модифицированный олигонуклеотид дополнительно содержит по меньшей мере одну тиофосфатную межнуклеозидную связь в каждом сегменте крыла.
  33. 33. Соединение по любому из пп.25-27, у которого каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой тиофосфатную связь.
  34. 34. Соединение по любому из пп.25-33, у которого модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
  35. 35. Соединение по п.1, которое имеет следующую формулу:
    - 257 036584
    или его фармацевтически приемлемая соль.
  36. 36. Соединение по п.1, которое имеет следующую формулу:
    или его фармацевтически приемлемая соль.
    - 258 036584
  37. 37. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-36 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
  38. 38. Применение соединения по любому из пп.1-36 для производства лекарственного средства для лечения транстиретинового амилоидоза.
  39. 39. Применение композиции по п.37 для производства лекарственного средства для лечения транстиретинового амилоидоза.
  40. 40. Применение по любому из пп.38, 39, где транстиретиновый амилоидоз представляет собой старческий системный амилоидоз (SSA), семейную амилоидную полиневропатию (FAP) или семейную амилоидную кардиомиопатию (FAC).
EA201891479A 2013-05-01 2014-05-01 Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr EA036584B1 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361818442P 2013-05-01 2013-05-01
US201361823826P 2013-05-15 2013-05-15
US201361843887P 2013-07-08 2013-07-08
US201361871673P 2013-08-29 2013-08-29
US201361880790P 2013-09-20 2013-09-20
US201461976991P 2014-04-08 2014-04-08
US201461986867P 2014-04-30 2014-04-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201891479A1 EA201891479A1 (ru) 2018-11-30
EA036584B1 true EA036584B1 (ru) 2020-11-26

Family

ID=51843959

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891479A EA036584B1 (ru) 2013-05-01 2014-05-01 Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr
EA201592093A EA031393B1 (ru) 2013-05-01 2014-05-01 Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201592093A EA031393B1 (ru) 2013-05-01 2014-05-01 Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr

Country Status (35)

Country Link
US (23) US9714421B2 (ru)
EP (11) EP2992009B1 (ru)
JP (20) JP6216444B2 (ru)
KR (16) KR101857707B1 (ru)
CN (12) CN110079524A (ru)
AU (19) AU2014259759B2 (ru)
BR (6) BR112015027321A8 (ru)
CA (5) CA2921509A1 (ru)
CL (2) CL2015003217A1 (ru)
CR (2) CR20190269A (ru)
CY (2) CY1121879T1 (ru)
DK (4) DK2992098T3 (ru)
DO (3) DOP2015000268A (ru)
EA (2) EA036584B1 (ru)
ES (4) ES2885174T3 (ru)
HK (5) HK1221485A1 (ru)
HR (2) HRP20190987T1 (ru)
HU (2) HUE043697T2 (ru)
IL (18) IL296543A (ru)
LT (2) LT2992009T (ru)
ME (1) ME03390B (ru)
MX (11) MX2015015263A (ru)
MY (2) MY198359A (ru)
NZ (6) NZ631537A (ru)
PE (2) PE20152002A1 (ru)
PH (3) PH12015502493B1 (ru)
PL (2) PL2992098T3 (ru)
PT (3) PT2992098T (ru)
RS (2) RS60796B1 (ru)
RU (8) RU2019124314A (ru)
SG (5) SG10201801507RA (ru)
SI (2) SI2992098T1 (ru)
UA (2) UA120287C2 (ru)
WO (5) WO2014179626A2 (ru)
ZA (2) ZA201507216B (ru)

Families Citing this family (426)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO2379084T3 (ru) 2008-10-15 2018-04-21
SG171914A1 (en) 2008-12-02 2011-07-28 Chiralgen Ltd Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
CA2817960C (en) 2010-11-17 2020-06-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of alpha synuclein expression
DK2734208T3 (en) 2011-07-19 2017-06-19 Wave Life Sciences Ltd PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS
DK2751270T3 (en) 2011-08-29 2018-10-29 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER-CONJUGATE COMPLEXES AND THEIR USE
JP6492003B2 (ja) 2012-03-30 2019-03-27 ワシントン・ユニバーシティＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 発作を減少させるためおよび神経変性症候群を改質するためにタウ発現を調節する方法
EP2839006B1 (en) * 2012-04-20 2018-01-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US9574193B2 (en) 2012-05-17 2017-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating apolipoprotein (a) expression
WO2013173789A2 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
CA3185392A1 (en) * 2012-05-24 2013-11-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating apolipoprotein(a) expression
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
JP6246121B2 (ja) 2012-07-13 2017-12-13 株式会社新日本科学 キラル核酸アジュバント
US9598458B2 (en) 2012-07-13 2017-03-21 Wave Life Sciences Japan, Inc. Asymmetric auxiliary group
CN104884618A (zh) 2012-11-15 2015-09-02 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合物
CA2893801A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
CA3170716A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein c-iii (apociii) expression in lipoprotein lipase deficient (lpld) populations
PT2992098T (pt) 2013-05-01 2019-07-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para modular a expressão de hbv e ttr
AU2014259953B2 (en) 2013-05-01 2020-07-02 Regulus Therapeutics Inc. Compounds and methods for enhanced cellular uptake
CN105378080A (zh) 2013-05-01 2016-03-02 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于调节mir-122的微小rna化合物和方法
LT3013959T (lt) * 2013-06-27 2020-03-10 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Priešprasmiai oligomerai ir konjugatai, nukreirti į pcsk9
DK3019200T3 (da) * 2013-07-11 2022-06-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc Oligonukleotid-ligand-konjugater og fremgangsmåde til fremstiling deraf
US10077236B2 (en) 2013-07-15 2018-09-18 The Regents Of The University Of California Azacyclic constrained analogs of FTY720
TWI772856B (zh) 2013-07-19 2022-08-01 美商百健Ｍａ公司 用於調節τ蛋白表現之組合物
WO2015042447A1 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutic nucleosides and their use
CA2925107A1 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
EP3060664B1 (en) * 2013-10-25 2021-07-07 Sanofi Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
CA2928349A1 (en) * 2013-11-14 2015-05-21 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Apob antisense conjugate compounds
JP6482475B2 (ja) * 2014-01-07 2019-03-13 レナセラピューティクス株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP3095460A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
US10160969B2 (en) 2014-01-16 2018-12-25 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
WO2015123264A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
US10006027B2 (en) 2014-03-19 2018-06-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating Ataxin 2 expression
JP6902869B2 (ja) 2014-03-19 2021-07-14 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． アタキシン２の発現を調節するための組成物
DK3757214T3 (da) 2014-04-01 2022-07-04 Biogen Ma Inc Sammensætninger til modulering af sod-1-ekspression
US10098959B2 (en) * 2014-05-01 2018-10-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method for synthesis of reactive conjugate clusters
SI3137605T1 (sl) 2014-05-01 2021-02-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in metode za modulacijo ekspresije angiopoetin 3-podobnega
PE20170010A1 (es) * 2014-05-01 2017-03-04 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion del factor b del complemento
CA2942570A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression
BR112016022855B1 (pt) 2014-05-01 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos e composições para modular a expressão de pkk e seus usos
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
EP3146049B1 (en) 2014-05-22 2020-02-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
US9487783B2 (en) 2014-08-07 2016-11-08 Regulus Therapeutics Inc. Targeting microRNAs for metabolic disorders
WO2016040748A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for detection of smn protein in a subject and treatment of a subject
AU2015327836B2 (en) 2014-10-03 2021-07-01 Cold Spring Harbor Laboratory Targeted augmentation of nuclear gene output
AU2015329974B2 (en) * 2014-10-10 2019-06-20 F. Hoffmann-La Roche Ag GaINAc phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
EP3207138B1 (en) * 2014-10-17 2020-07-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting aminolevulinic acid synthase-1 (alas1) and uses thereof
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
WO2016081444A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
WO2016112132A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
WO2016115490A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of dux4
WO2016130806A2 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
CN107466323A (zh) 2015-02-15 2017-12-12 阿克丘勒斯治疗公司 酰基‑氨基‑lna和/或烃基‑氨基‑lna寡核苷酸
US11129844B2 (en) 2015-03-03 2021-09-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
CN107429250B (zh) * 2015-04-03 2022-03-01 Ionis制药公司 用于调节tmprss6表达的化合物和方法
MX2017012610A (es) 2015-04-08 2018-03-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion del gen lect2.
US10407678B2 (en) 2015-04-16 2019-09-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
US11249071B2 (en) 2015-04-24 2022-02-15 California Institute Of Technology Reactivation of x chromosome genes
EP3310918B1 (en) 2015-06-18 2020-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
SG10202006563PA (en) 2015-07-10 2020-08-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of diacyglycerol acyltransferase 2 (dgat2)
US10494632B2 (en) 2015-07-10 2019-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (IGFALS) compositions and methods of use thereof
JPWO2017010575A1 (ja) * 2015-07-16 2018-04-26 協和発酵キリン株式会社 β２ＧＰＩ遺伝子発現抑制核酸複合体
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
EP3331892B1 (en) 2015-08-06 2019-07-03 F.Hoffmann-La Roche Ag Processes for the preparation of galnac acid derivatives
CN105111119B (zh) * 2015-08-14 2017-04-12 天津小新医药科技有限公司 一类卤代苯l‑薄荷醇类p2y12受体拮抗剂及其用途
CN105111118B (zh) * 2015-08-14 2017-04-12 天津小新医药科技有限公司 L‑薄荷醇类p2y12受体拮抗剂、制备方法及其用途
DK3341479T3 (da) 2015-08-24 2020-02-24 Roche Innovation Ct Copenhagen As LNA-G-Proces
WO2017040078A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PROGRAMMED CELL DEATH 1 LIGAND 1 (PD-L1) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
KR20180051626A (ko) 2015-09-24 2018-05-16 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Kras 발현의 조절제
WO2017053990A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 The Regents Of The University Of California Synthetic sphingolipid-like molecules, drugs, methods of their synthesis and methods of treatment
PT3353303T (pt) 2015-09-25 2023-10-10 Academisch Ziekenhuis Leiden Composições e métodos para modulação da expressão de ataxina 3
WO2017053720A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Tarveda Therapeutics, Inc. RNAi CONJUGATES, PARTICLES AND FORMULATIONS THEREOF
EP3353305A4 (en) * 2015-09-25 2019-09-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
WO2017053999A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
JOP20210043A1 (ar) * 2015-10-01 2017-06-16 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
US10577388B2 (en) 2015-10-02 2020-03-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process
KR20220105174A (ko) 2015-10-09 2022-07-26 유니버시티 오브 사우스앰톤 유전자 발현의 조절 및 탈조절된 단백질 발현의 스크리닝
EP3394258B1 (en) 2015-10-22 2021-09-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S In vitro toxicity screening assay
WO2017068087A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide detection method
WO2017079745A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
AU2016349625B2 (en) * 2015-11-06 2022-07-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulating apolipoprotein (a) expression
ES2848122T3 (es) 2015-11-16 2021-08-05 Hoffmann La Roche Fosforamidita de agrupación de GalNAc
US11058709B1 (en) 2015-12-04 2021-07-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating breast cancer
CN109312343B (zh) 2015-12-14 2022-09-27 冷泉港实验室 用于治疗常染色体显性精神发育迟滞5型和Dravet综合征的反义寡聚体
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
EP3400300A4 (en) 2016-01-05 2019-08-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. METHODS FOR REDUCING LRRK2 EXPRESSION
JP2019503176A (ja) 2016-01-12 2019-02-07 インターロイキン ジェネティクス， インコーポレイテッド 処置に対する応答を予測するための方法
BR112018015164A2 (pt) 2016-01-26 2018-12-26 Nissan Chemical Corp oligonucleotídeo de fita simples
US10745700B2 (en) 2016-01-29 2020-08-18 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid conjugate
EP3408391A4 (en) * 2016-01-31 2019-08-28 University of Massachusetts BRANCHED OLIGONUCLEOTIDES
UY37146A (es) 2016-03-07 2017-09-29 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Ligandos de direccionamiento para compuestos terapéuticos
CA3013797A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibiting pmp22 expression
KR102417646B1 (ko) 2016-03-14 2022-07-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-l1 발현의 감소를 위한 올리고뉴클레오티드
WO2017161172A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating keap1
US10577607B2 (en) 2016-03-16 2020-03-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of DYRK1B expression
EP3228326A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
MA45478A (fr) * 2016-04-11 2019-02-20 Arbutus Biopharma Corp Compositions de conjugués d'acides nucléiques ciblés
US20190142856A1 (en) 2016-04-13 2019-05-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing c9orf72 expression
KR102468177B1 (ko) 2016-04-14 2022-11-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 트리틸-모노-GalNAc 화합물 및 이의 용도
MA45295A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser
WO2017188898A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Nanyang Technological University G-quadruplex-containing antisense oligonucleotides
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
CN109475568A (zh) 2016-05-06 2019-03-15 Ionis制药公司 Glp-1受体配体部分缀合的寡核苷酸及其用途
WO2017216340A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro nephrotoxicity screening assay
US11479818B2 (en) 2016-06-17 2022-10-25 Hoffmann-La Roche Inc. In vitro nephrotoxicity screening assay
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
WO2017219017A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of gys1 expression
AU2017281497B2 (en) 2016-06-22 2023-04-06 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
JP7022687B2 (ja) * 2016-06-30 2022-02-18 協和キリン株式会社 核酸複合体
US11253601B2 (en) 2016-07-11 2022-02-22 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
IL291323B2 (en) 2016-07-15 2023-09-01 Am Chemicals Llc Solid non-nucleoside supports and phosphoramidite building blocks for oligonucleotide synthesis
SG11201900238UA (en) 2016-07-15 2019-02-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulation of smn2
WO2018031933A2 (en) 2016-08-12 2018-02-15 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
KR20190058477A (ko) 2016-08-17 2019-05-29 솔스티스 바이올로직스, 리미티드 폴리뉴클레오티드 구축물
SG11201901841TA (en) * 2016-09-02 2019-03-28 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Targeting ligands
JOP20190065A1 (ar) 2016-09-29 2019-03-28 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن tau
KR20190065341A (ko) * 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
US11197881B2 (en) 2016-10-27 2021-12-14 California Institute Of Technology HDAC inhibitor compositions for reactivation of the X chromosome
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
US20180179542A1 (en) * 2016-11-11 2018-06-28 Alios Biopharma, Inc. OLIGONUCLEOTIDE TARGETING STRATEGY FOR cccDNA
TWI788312B (zh) 2016-11-23 2023-01-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
WO2018102745A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Cold Spring Harbor Laboratory Modulation of lnc05 expression
JP6811338B2 (ja) * 2016-12-13 2021-01-13 エーエム サイエンシーズ インコーポレイテッド Ｂ型肝炎の予防または治療用医薬組成物
KR20230166146A (ko) 2016-12-16 2023-12-06 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물을 사용하여 TTR-관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법
CN108239644B (zh) * 2016-12-23 2021-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
US10337070B2 (en) 2017-01-12 2019-07-02 Cardioforecast Ltd. Methods and kits for treating cardiovascular disease
EP3568481A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating relb expression
US20190367920A1 (en) 2017-01-13 2019-12-05 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb1 expression
US20190345495A1 (en) 2017-01-13 2019-11-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb2 expression
WO2018130582A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rel expression
EP3568477A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rela expression
EP3584319A4 (en) 2017-02-06 2021-04-14 Nissan Chemical Corporation SINGLE-STRAND OLIGONUCLEOTIDE
WO2018165564A1 (en) * 2017-03-09 2018-09-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Morpholino modified oligomeric compounds
EP3594346A4 (en) 2017-03-10 2020-12-16 National Center For Child Health And Development ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF GLYCOGEN STORAGE DISEASE TYPE IA
JOP20190215A1 (ar) * 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
EP3385272A1 (en) * 2017-04-05 2018-10-10 Silence Therapeutics GmbH Further novel oligonucleotide-ligand conjugates
FI3607069T3 (fi) * 2017-04-05 2023-01-13 Tuotteita ja koostumuksia
BR112019021359A2 (pt) 2017-04-11 2020-05-05 Arbutus Biopharma Corp moléculas, composições, compostos, métodos para administrar um sirna, para preparar um composto e para tratar uma infecção, composto ou sal, conjugado de galnac e uso de um composto
TWI801377B (zh) 2017-04-18 2023-05-11 美商阿尼拉製藥公司 治療具有ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）感染之個體之方法
WO2018215049A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
US11273222B2 (en) * 2017-05-26 2022-03-15 National Cerebral And Cardiovascular Center Antisense nucleic acid targeting PCSK9
JP2020522510A (ja) 2017-06-02 2020-07-30 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法
US11401519B2 (en) 2017-06-07 2022-08-02 University Of Massachusetts Anti-ADAM33 oligonucleotides and related methods
CA3069868A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Lactate dehydrogenase a (ldha) irna compositions and methods of use thereof
BR112020001430A2 (pt) 2017-07-26 2020-07-28 Nissan Chemical Corporation oligonucleotídeo de fita simples
TW201909925A (zh) * 2017-08-02 2019-03-16 日商協和醱酵麒麟有限公司 核酸複合體
TW201920668A (zh) * 2017-08-02 2019-06-01 日商協和醱酵麒麟有限公司 核酸複合體
WO2019030313A2 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF UBE3C EXPRESSION
EP3668981A4 (en) 2017-08-17 2021-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ADJUSTABLE REVERSIRTM COMPOUNDS
AU2018318231A1 (en) 2017-08-18 2020-02-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of the notch signaling pathway for treatment of respiratory disorders
WO2019038228A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF TOM1 EXPRESSION
RS65031B1 (sr) 2017-08-25 2024-02-29 Stoke Therapeutics Inc Antisens oligomeri za lečenje stanja i bolesti
WO2019051173A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODULATORS OF SMAD7 EXPRESSION
EP3682007A2 (en) * 2017-09-14 2020-07-22 Janssen BioPharma, Inc. Galnac derivatives
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
JP2021500864A (ja) 2017-09-29 2021-01-14 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｔｔｒ遺伝子編集およびａｔｔｒアミロイドーシスの治療用の組成物および方法
EP3694995A1 (en) 2017-10-13 2020-08-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Methods for identifying improved stereodefined phosphorothioate oligonucleotide variants of antisense oligonucleotides utilising sub-libraries of partially stereodefined oligonucleotides
KR102585898B1 (ko) 2017-10-16 2023-10-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 B형 간염 감염을 치료하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 감소용 핵산 분자
US11866701B2 (en) 2017-11-01 2024-01-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component C3 iRNA compositions and methods of use thereof
TWI809004B (zh) 2017-11-09 2023-07-21 美商Ionis製藥公司 用於降低snca表現之化合物及方法
WO2019099610A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Kisspeptin 1 (kiss1) irna compositions and methods of use thereof
WO2019100039A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
WO2019105403A1 (zh) * 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
WO2019105404A1 (zh) * 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
US20220395526A1 (en) * 2017-12-01 2022-12-15 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing same, and preparation method and use
EP3719128A4 (en) 2017-12-01 2021-10-27 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF AND USE THEREOF
JP7365052B2 (ja) * 2017-12-01 2023-10-19 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
EP3719126A4 (en) 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID, ASSOCIATED PREPARATION PROCESS AND USE
CN110944675B (zh) * 2017-12-01 2024-06-04 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
JP2021505175A (ja) 2017-12-11 2021-02-18 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Ｆｎｄｃ３ｂの発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
WO2019115417A2 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating rb1 expression
US11725208B2 (en) 2017-12-14 2023-08-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
KR20200110655A (ko) 2017-12-18 2020-09-24 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 고이동성 그룹 박스-1 (hmgb1) irna 조성물 및 이의 사용 방법
AU2018390167A1 (en) 2017-12-21 2020-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Companion diagnostic for HTRA1 RNA antagonists
WO2019126641A2 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
KR20200104347A (ko) 2017-12-22 2020-09-03 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 포스포로디티오에이트 인터뉴클레오시드 연결을 포함하는 갭머 올리고뉴클레오티드
EP3728590A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel thiophosphoramidites
US20200339982A1 (en) 2017-12-22 2020-10-29 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
CN109957566B (zh) * 2017-12-26 2023-08-25 广州市锐博生物科技有限公司 修饰的寡核苷酸和可用于合成修饰的寡核苷酸的化合物
JP7011080B2 (ja) * 2017-12-26 2022-02-10 クワンチョウ リボバイオ カンパニー リミテッド 修飾オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの合成に使用可能な化合物
CN116375774A (zh) 2017-12-29 2023-07-04 苏州瑞博生物技术股份有限公司 缀合物及其制备方法和用途
US20210052706A1 (en) * 2018-01-10 2021-02-25 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for facilitating delivery of synthetic nucleic acids to cells
EP3737758A1 (en) 2018-01-10 2020-11-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating pias4 expression
WO2019140231A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
EA202091693A1 (ru) 2018-01-12 2021-04-14 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антисмысловые олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на альфа-синуклеин, и их применения
CA3085964A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Alpha-synuclein antisense oligonucleotides and uses thereof
US20210095275A1 (en) 2018-01-12 2021-04-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating gsk3b expression
AU2019206731A1 (en) 2018-01-15 2020-07-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of DNM2 expression
JP2021510525A (ja) 2018-01-17 2021-04-30 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Ｅｒｃ１発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
US20210095277A1 (en) 2018-01-18 2021-04-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting srebp1
WO2019145386A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating csnk1d expression
JP7317029B2 (ja) 2018-02-12 2023-07-28 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 修飾化合物及びその使用
WO2019161105A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Deep Genomics Incorporated Oligonucleotide therapy for wilson disease
CA3091789A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Bristol-Myers Squibb Company Camk2d antisense oligonucleotides and uses thereof
WO2019169243A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the modulation of amyloid-beta precursor protein
PE20210109A1 (es) 2018-03-02 2021-01-19 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de irf4
WO2019172286A1 (ja) * 2018-03-09 2019-09-12 第一三共株式会社 糖原病Ｉａ型治療薬
WO2019183440A1 (en) 2018-03-22 2019-09-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating fmr1 expression
MA52661A (fr) 2018-04-05 2021-02-17 Centre Leon Berard Utilisation d'inhibiteurs de fubp1 dans le traitement d'une infection par le virus de l'hépatite b
MX2020010721A (es) 2018-04-11 2020-11-06 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de ezh2.
US20210071247A1 (en) 2018-05-07 2021-03-11 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Massively parallel discovery methods for oligonucleotide therapeutics
CN112400020A (zh) 2018-05-08 2021-02-23 莱古路斯治疗法股份有限公司 作为具有hcv抗病毒活性与降低的高胆红素血症副作用的mir-122抑制剂的galnac缀合的经修饰的寡核苷酸
EA202092500A1 (ru) 2018-05-09 2021-03-01 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Соединения и способы для снижения экспрессии atxn3
US20210355497A1 (en) * 2018-05-09 2021-11-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing fxi expression
TW202016304A (zh) 2018-05-14 2020-05-01 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP3807411A4 (en) 2018-06-14 2022-08-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR ENHANCING STMN2 EXPRESSION
TWI833770B (zh) 2018-06-27 2024-03-01 美商Ionis製藥公司 用於減少 lrrk2 表現之化合物及方法
CN112567033A (zh) 2018-07-03 2021-03-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节Tau表达之寡核苷酸
WO2020007826A1 (en) 2018-07-05 2020-01-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting mbtps1
WO2020011744A2 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting cers5
WO2020011745A2 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting cers6
CN112534055A (zh) 2018-07-13 2021-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节rtel1表达的寡核苷酸
CA3106986A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing atxn2 expression
MX2020013270A (es) 2018-07-31 2021-02-18 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligonucleotidos que comprenden enlace internucleosidico de fosforotritioato.
ES2924362T3 (es) 2018-07-31 2022-10-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligonucleótidos que comprenden un enlace internucleosídico fosforotritioato
EP3833397A4 (en) 2018-08-08 2023-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND AGENTS AGAINST NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS
MX2021001590A (es) 2018-08-10 2021-07-02 Univ Massachusetts Oligonucleótidos modificados dirigidos a snp.
US11492623B2 (en) 2018-08-13 2022-11-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis B virus (HBV) dsRNA agent compositions and methods of use thereof
EP3842534A4 (en) 2018-08-21 2022-07-06 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID AND METHOD OF USE THEREOF
EP3844274A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Neoantigen engineering using splice modulating compounds
CN112424355A (zh) 2018-09-18 2021-02-26 阿尔尼拉姆医药品有限公司 己酮糖激酶(KHK)iRNA组合物及其使用方法
TW202023573A (zh) 2018-09-19 2020-07-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
WO2020063198A1 (zh) 2018-09-30 2020-04-02 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途
AU2019362923A1 (en) * 2018-10-18 2021-05-13 Perron Institute for Neurological and Translational Science Limited Antisense therapy for PTP1B related conditions
US10913951B2 (en) 2018-10-31 2021-02-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure
WO2020095274A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Novartis Ag Method for reducing the risk of a cardiovascular event with conjugated antisense compounds targeting apo(a)
TW202028222A (zh) 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
US11208650B2 (en) 2018-11-15 2021-12-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of IRF5 expression
MX2021005886A (es) 2018-11-21 2021-06-23 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para reducir la expresion de priones.
WO2020104649A2 (en) 2018-11-23 2020-05-28 Sanofi Novel rna compositions and methods for inhibiting angptl8
CN113286600A (zh) 2018-11-30 2021-08-20 协和麒麟株式会社 核酸复合物
JP2022515744A (ja) 2018-12-20 2022-02-22 プラクシス プレシジョン メディシンズ， インコーポレイテッド Ｋｃｎｔ１関連障害の治療のための組成物及び方法
GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
US20220062427A1 (en) * 2018-12-28 2022-03-03 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing nucleic acid, preparation method therefor and use thereof
CN111377985B (zh) * 2018-12-29 2023-11-10 苏州瑞博生物技术股份有限公司 化合物和缀合物及其制备方法和用途
WO2020147847A1 (zh) * 2019-01-18 2020-07-23 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
SG11202107399WA (en) 2019-01-31 2021-08-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of yap1 expression
WO2020169696A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel phosphoramidites
TW202102516A (zh) 2019-02-20 2021-01-16 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 膦醯基乙酸酯間隙子寡核苷酸
CN109799330B (zh) * 2019-02-22 2021-03-02 华中科技大学同济医学院附属同济医院 神经氨酸及神经氨酸酶抑制剂在慢性心力衰竭中的应用
CN113474633A (zh) 2019-02-26 2021-10-01 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸配制方法
CA3131700A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of malat1 expression
CA3128577A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 Jovanka BOGOJESKI Ligand clusters and methods of their use and preparation
MX2021011916A (es) 2019-03-29 2021-10-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular ube3a-ats.
WO2020201144A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for immunotherapy
WO2020206115A2 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Bristol-Myers Squibb Company Angptl2 antisense oligonucleotides and uses thereof
US20240200076A1 (en) 2019-05-22 2024-06-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition, conjugate, preparation method, and use
TW202111118A (zh) 2019-05-22 2021-03-16 大陸商蘇州瑞博生物技術股份有限公司 核酸、藥物組合物與綴合物及製備方法和用途
JP2022533421A (ja) 2019-05-22 2022-07-22 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
CA3139195A1 (en) * 2019-05-22 2020-11-26 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition, conjugate, preparation method, and use
WO2020238766A1 (zh) 2019-05-24 2020-12-03 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
KR20220012284A (ko) 2019-05-24 2022-02-03 쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드 핵산, 약학 조성물, 컨쥬게이트와 이의 제조 방법 및 용도
WO2020238758A1 (zh) 2019-05-24 2020-12-03 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
US20220243203A1 (en) 2019-05-28 2022-08-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing fus expression
SG11202112741XA (en) 2019-05-31 2021-12-30 Aligos Therapeutics Inc Modified gapmer oligonucleotides and methods of use
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
EP3990465A1 (en) 2019-06-25 2022-05-04 Amgen Inc. Purification methods for carbohydrate-linked oligonucleotides
EP3956450A4 (en) 2019-07-26 2022-11-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATION OF GFAP
WO2021022109A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SERPIN FAMILY F MEMBER 2 (SERPINF2) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP4007811A2 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carboxypeptidase b2 (cpb2) irna compositions and methods of use thereof
BR112022002307A2 (pt) 2019-08-09 2022-06-28 Univ Massachusetts Oligonucleotídeos quimicamente modificados que têm como alvo snps
EP4013870A1 (en) 2019-08-13 2022-06-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Small ribosomal protein subunit 25 (rps25) irna agent compositions and methods of use thereof
JP2022544587A (ja) * 2019-08-15 2022-10-19 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 結合修飾オリゴマー化合物及びその使用
CN115176011A (zh) 2019-08-27 2022-10-11 赛诺菲 用于抑制pcsk9的组合物和方法
JP2022546055A (ja) 2019-08-29 2022-11-02 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 化合物、薬物複合体及びその調製方法と使用
WO2021041884A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
US20210060168A1 (en) 2019-09-03 2021-03-04 Arcturus Therapeutics, Inc. Asialoglycoprotein receptor mediated delivery of therapeutically active conjugates
CN114616332A (zh) * 2019-09-10 2022-06-10 第一三共株式会社 用于递送至肝脏的GalNAc-寡核苷酸偶联物及其制备方法
US20220370447A1 (en) 2019-09-20 2022-11-24 Hoffmann-La Roche Inc. Method of treating hbv infection using a core protein allosteric modulator
CN114728017A (zh) 2019-10-14 2022-07-08 阿斯利康(瑞典)有限公司 Pnpla3表达的调节剂
US20240141358A1 (en) 2019-10-18 2024-05-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Solute carrier family member irna compositions and methods of use thereof
BR112022007540A2 (pt) 2019-10-22 2022-07-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de componente complementar c3 e métodos de uso das mesmas
WO2021087036A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. HUNTINGTIN (HTT) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
TW202132568A (zh) 2019-11-13 2021-09-01 美商阿尼拉製藥公司 用於治療血管收縮素原相關病症之方法及組成物
US20230056569A1 (en) 2019-11-22 2023-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ataxin3 (atxn3) rnai agent compositions and methods of use thereof
CN112876534B (zh) * 2019-11-29 2024-02-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 肝靶向化合物及缀合物
IL293824A (en) 2019-12-13 2022-08-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions of RNA material (c9orf72) human chromosome 9 open reading frame 72 and methods of using them
TW202138559A (zh) 2019-12-16 2021-10-16 美商阿尼拉製藥公司 含類ＰＡＴＡＴＩＮ磷脂酶結構域３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
CN111041025B (zh) 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN114829601A (zh) 2019-12-19 2022-07-29 豪夫迈·罗氏有限公司 Sbds抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
EP4077671A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of saraf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122869A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of scamp3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077670A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
CN114901821A (zh) 2019-12-19 2022-08-12 豪夫迈·罗氏有限公司 Sept9抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
EP4081639A1 (en) 2019-12-24 2022-11-02 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combination of a therapeutic oligonucleotide targeting hbv and a tlr7 agonist for treatment of hbv
CN114828852A (zh) 2019-12-24 2022-07-29 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗hbv的靶向hbv的抗病毒药剂和/或免疫调节剂的药物组合
JP2023509869A (ja) 2019-12-24 2023-03-10 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｔｌｒ７アゴニストを用いたウイルス感染症の処置方法
JPWO2021153687A1 (ru) * 2020-01-30 2021-08-05
IL295445A (en) 2020-02-10 2022-10-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Preparations and methods for silencing vegf-a expression
WO2021167841A1 (en) 2020-02-18 2021-08-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
US20220064638A1 (en) 2020-02-28 2022-03-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating smn2
EP4114947A1 (en) 2020-03-05 2023-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
JP2023516748A (ja) 2020-03-06 2023-04-20 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ｔｔｒ）の発現を阻害するための組成物および方法
EP4114948A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
EP4121534A1 (en) 2020-03-18 2023-01-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
WO2021194999A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Amgen Inc. Monoclonal antibodies to chemically-modified nucleic acids and uses thereof
CN115485381A (zh) * 2020-03-26 2022-12-16 国立研究开发法人国立循环器病研究中心 以apoc3为靶点的反义核酸
EP4127168A1 (en) 2020-03-26 2023-02-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coronavirus irna compositions and methods of use thereof
WO2021207167A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing myoc expression
WO2021206922A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
CA3179678A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing scn9a expression
EP4133076A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensin-converting enzyme 2 (ace2) irna compositions and methods of use thereof
CA3181400A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein e (apoe) irna agent compositions and methods of use thereof
CN111575279A (zh) * 2020-04-27 2020-08-25 江苏为真生物医药技术股份有限公司 利用asgpr小分子配体特异性捕获肝细胞外囊泡或循环肿瘤细胞的方法
IL297680A (en) 2020-04-30 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc IRNA compounds complement factor b (cfb) and methods of using them
CA3181546A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating atxn1
WO2021231107A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Stoke Therapeutics, Inc. Opa1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
WO2021231675A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate synthetase (ass1)
WO2021231673A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2)
EP4150078A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate lyase (asl)
WO2021231685A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of transmembrane channel-like protein 1 (tmc1)
WO2021231691A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of retinoschisin 1 (rsi)
WO2021231679A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of gap junction protein beta 2 (gjb2)
WO2021231692A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of otoferlin (otof)
EP4150076A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
AR122534A1 (es) 2020-06-03 2022-09-21 Triplet Therapeutics Inc Métodos para el tratamiento de los trastornos de expansión por repetición de nucleótidos asociados con la actividad de msh3
WO2021252557A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
CN115702006A (zh) * 2020-06-10 2023-02-14 南京明德新药研发有限公司 缀合基团及其缀合物
TW202214856A (zh) 2020-06-18 2022-04-16 美商阿尼拉製藥公司 黃嘌呤脫氫酶（ＸＤＨ）ｉＲＮＡ組成物及其使用之方法
AR122731A1 (es) 2020-06-26 2022-10-05 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos mejorados para modular la expresión de fubp1
MX2022016338A (es) 2020-06-29 2023-01-24 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular la plp1.
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
JP2023540429A (ja) 2020-07-10 2023-09-25 アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） てんかんを治療するための方法及び組成物
AU2021326521A1 (en) * 2020-08-13 2023-03-09 Amgen Inc. RNAi constructs and methods for inhibiting MARC1 expression
JP2023538630A (ja) 2020-08-21 2023-09-08 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのａ１ｃｆ阻害剤の使用
EP4217489A1 (en) 2020-09-24 2023-08-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) irna compositions and methods of use thereof
JP2023544413A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｇタンパク質共役受容体７５（ＧＰＲ７５）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
CN116490195A (zh) 2020-10-16 2023-07-25 赛诺菲 用于抑制脂蛋白(a)的RNA组合物和方法
WO2022079222A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Sanofi Novel rna compositions and methods for inhibiting angptl3
EP4232582A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin 5b (muc5b) irna compositions and methods of use thereof
JP2023549500A (ja) 2020-11-13 2023-11-27 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 凝固第Ｖ因子（Ｆ５）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
KR20230108728A (ko) 2020-11-18 2023-07-18 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 앤지오텐시노겐 발현을 조절하기 위한 화합물 및 방법
WO2022106695A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 Alpha Anomeric Sas Nucleic acid duplexes
EP4259795A1 (en) 2020-12-08 2023-10-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coagulation factor x (f10) irna compositions and methods of use thereof
GB2603454A (en) 2020-12-09 2022-08-10 Ucl Business Ltd Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
AU2021401424A1 (en) 2020-12-18 2023-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating factor xii
JP2024500035A (ja) 2020-12-23 2024-01-04 アルゴノート アールエヌエー リミテッド 心血管疾患の治療
WO2022143531A1 (zh) 2020-12-29 2022-07-07 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
WO2022150260A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT 9 (C9) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CA3204317A1 (en) * 2021-01-30 2022-08-04 Ahmad Ali MORTAZAVI Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
WO2022162161A1 (en) * 2021-01-30 2022-08-04 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
AU2022214281A1 (en) * 2021-01-30 2023-07-27 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
WO2022162157A1 (en) * 2021-01-30 2022-08-04 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
BR112023015761A2 (pt) 2021-02-12 2023-11-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc Superóxido dismutase 1 (sod1) composições de irna e métodos de uso das mesmas para tratar ou prevenir doenças neurodegenerativas associadas a superóxido dismutase 1 (sod1)
EP4294449A1 (en) * 2021-02-18 2023-12-27 Oneglobe Holdings Limited Compositions for conjugating oligonucleotides and carbohydrates
JP2024509783A (ja) 2021-02-25 2024-03-05 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド プリオンタンパク質（ｐｒｎｐ）ｉｒｎａ組成物およびその使用方法
CA3211059A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
WO2022187435A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
AU2022234522A1 (en) 2021-03-08 2023-10-26 Les Laboratoires Servier Antisense oligonucleotides for inhibiting alpha-synuclein expression
WO2022189861A1 (en) 2021-03-08 2022-09-15 Tollys Carbohydrate conjugates of tlr3 ligands and uses thereof
EP4305169A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
CN117203336A (zh) 2021-03-29 2023-12-08 阿尔尼拉姆医药品有限公司 亨廷顿蛋白(HTT)iRNA药剂组合物以及其使用方法
WO2022212153A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
JP2024517686A (ja) 2021-04-26 2024-04-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 膜貫通プロテアーゼ、セリン６（ＴＭＰＲＳＳ６）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP4330396A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (stat6) irna compositions and methods of use thereof
WO2022232650A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing agt expression
WO2022245583A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
EP4341405A1 (en) 2021-05-20 2024-03-27 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
WO2022256283A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
EP4347823A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
AU2022283796A1 (en) 2021-06-04 2023-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. HUMAN CHROMOSOME 9 OPEN READING FRAME 72 (C9ORF72) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
JP2024523000A (ja) 2021-06-08 2024-06-25 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド シュタルガルト病及び／又は網膜結合タンパク質４（ｒｂｐ４）関連障害を治療又は予防するための組成物及び方法
BR112023026050A2 (pt) 2021-06-18 2024-03-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para reduzir expressão de ifnar1
JP2024523509A (ja) 2021-06-23 2024-06-28 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 子癇前症及び他の血管新生障害の治療のために最適化された抗ｆｌｔ１オリゴヌクレオチド化合物
IL309411A (en) * 2021-06-24 2024-02-01 Lilly Co Eli RNA treatments and their uses
CR20240003A (es) * 2021-06-24 2024-01-25 Lilly Co Eli Restos de administración terapéutica novedosos y usos de estos
EP4363574A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
US20230194709A9 (en) 2021-06-29 2023-06-22 Seagate Technology Llc Range information detection using coherent pulse sets with selected waveform characteristics
IL309296A (en) 2021-06-30 2024-02-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Methods and compositions for the treatment of angiotensinogen-related disorder (AGT-)
AU2022304946A1 (en) * 2021-07-02 2024-02-15 Tuojie Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Nucleic acid ligand and conjugate thereof, and preparation method therefor and use thereof
CA3225573A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Precipitation suppressing agent
WO2023282344A1 (ja) 2021-07-08 2023-01-12 日本新薬株式会社 腎毒性軽減剤
WO2023282345A1 (ja) 2021-07-08 2023-01-12 日本新薬株式会社 腎毒性軽減剤
TW202333748A (zh) 2021-07-19 2023-09-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 用於處置具有或有風險發展非原發性高草酸鹽尿疾病或病症的個體的方法及組成物
TW202325312A (zh) 2021-07-23 2023-07-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 β－鏈蛋白（ＣＴＮＮＢ１）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP4377458A1 (en) 2021-07-29 2024-06-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa reductase (hmgcr) irna compositions and methods of use thereof
EP4381067A1 (en) 2021-08-03 2024-06-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof
EP4380576A2 (en) * 2021-08-03 2024-06-12 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted rna delivery
EP4381071A1 (en) 2021-08-04 2024-06-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing angiotensinogen (agt)
IL310407A (en) 2021-08-13 2024-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Factor XII (F12) IRNA compositions and methods of using them
CA3229020A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Stella Khan Treatment of cardiovascular disease
WO2023044370A2 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing complement component 3 (c3)
AU2022348141A1 (en) * 2021-09-18 2024-04-04 Genoval Therapeutics Co., Ltd. Lpa inhibitor and use thereof
CA3232420A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Inhibin subunit beta e (inhbe) modulator compositions and methods of use thereof
KR20240082358A (ko) * 2021-09-23 2024-06-10 상하이 아르고 바이오파마슈티칼 씨오., 엘티디. 치료제의 표적화된 전달을 위한 디아민 스캐폴드를 갖는 다가 리간드 클러스터
WO2023069603A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for disrupting nrf2-keap1 protein interaction by adar mediated rna editing
CN118302525A (zh) 2021-10-29 2024-07-05 阿尔尼拉姆医药品有限公司 补体因子B（CFB）iRNA组合物及其使用方法
WO2023076450A2 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. HUNTINGTIN (HTT) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CN118284695A (zh) 2021-11-11 2024-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗hbv的药物组合
CA3241316A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 Quralis Corporation Gapmer antisense oligonucleotides with modified backbone chemistries
GB202117758D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Ucl Business Ltd Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2023109945A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其制备方法及应用
TW202340465A (zh) * 2021-12-16 2023-10-16 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司 靶向ｌｐａ的ｓｉｒｎａ及綴合物
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
TW202340469A (zh) * 2022-01-20 2023-10-16 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司 一種ｄｓｒｎａ、其應用及製備方法
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
TW202345865A (zh) * 2022-01-24 2023-12-01 大陸商上海舶望製藥有限公司 抑制LPA(Apo(a))蛋白表達的組合物和方法
CN116917477B (zh) * 2022-01-30 2024-04-09 大睿生物医药科技(上海)有限公司 含有n-乙酰半乳糖胺的靶向配体
US20240167040A1 (en) 2022-02-21 2024-05-23 Hoffmann-La Roche Inc. Antisense oligonucleotide
CN114703184B (zh) * 2022-03-11 2024-06-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 Lpa抑制剂及其用途
TW202400787A (zh) 2022-03-16 2024-01-01 美商安彼瑞可股份有限公司 改良siRNA生物可利用性之GalNAc組合物
CN115028670B (zh) * 2022-06-24 2023-07-28 四川大学华西医院 一种n-乙酰基-d-半乳糖胺三聚体前体的制备方法
WO2024001172A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Ractigen Therapeutics Oligonucleotide modulators activating complement factor h expression
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing
CN116814621A (zh) * 2022-08-05 2023-09-29 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制apoc3基因表达的rna抑制剂及其应用
WO2024039776A2 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Universal non-targeting sirna compositions and methods of use thereof
WO2024059165A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (hsd17b13) irna compositions and methods of use thereof
WO2024098061A2 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Genkardia Inc. Oligonucleotide-based therapeutics targeting cyclin d2 for the treatment of heart failure
WO2024108217A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Genkardia Inc. Methods and compositions for preventing, treating, or reversing cardiac diastolic dysfunction
WO2024106539A1 (ja) * 2022-11-18 2024-05-23 株式会社ボナック リガンドコンジュゲート物質及びそれを含む核酸並びにその用途
WO2024114776A1 (zh) * 2022-12-02 2024-06-06 上海舶望制药有限公司 双环脱碱基核酸类似物以及由它们制备的寡聚化合物
WO2024137729A1 (en) * 2022-12-21 2024-06-27 Eli Lilly And Company NOVEL FAS RNAi THERAPEUTICS AND USES THEREOF
CN116925160B (zh) * 2023-09-15 2023-12-08 天津全和诚科技有限责任公司 一种GalNAc含糖环中间体及其制备方法
CN117568313B (zh) * 2024-01-15 2024-04-26 上海贝斯昂科生物科技有限公司 基因编辑组合物及其用途
CN118146284A (zh) * 2024-05-08 2024-06-07 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种GalNAc化合物、其与寡核苷酸缀合物及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009073809A2 (en) * 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
WO2011139917A1 (en) * 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
US20120225927A1 (en) * 2008-10-20 2012-09-06 Dinah Wen-Yee Sah Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
US20130035366A1 (en) * 2011-04-21 2013-02-07 Swayze Eric E Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression

Family Cites Families (372)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
USRE34036E (en) 1984-06-06 1992-08-18 National Research Development Corporation Data transmission using a transparent tone-in band system
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US4751219A (en) 1985-02-05 1988-06-14 Nederlandse Centrale Organisatie Voor Toegepast-Natuur-Wetenschappelijk Onderzoek Synthetic glycolipides, a process for the preparation thereof and several uses for these synthetic glycolipides
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
GB8712540D0 (en) * 1987-05-28 1987-07-01 Ucb Sa Expression of human proapolipoprotein a-i
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
WO1989005358A1 (en) 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US7101993B1 (en) 1990-01-11 2006-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5859221A (en) 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
DE69115702T2 (de) 1990-08-03 1996-06-13 Sterling Winthrop Inc Verbindungen und verfahren zur unterdrückung der genexpression
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5948903A (en) 1991-01-11 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3-deazapurines
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
ATE515510T1 (de) * 1991-12-24 2011-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Durch dna-abschnitte unterbrochene modifizierte oligonukleotide
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
AU678769B2 (en) 1992-07-27 1997-06-12 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
EP0673559A1 (en) 1992-12-14 1995-09-27 Honeywell Inc. Motor system with individually controlled redundant windings
ES2086997T3 (es) 1993-01-25 1996-07-01 Hybridon Inc Oligonucleotido-alquilfosfonatos y -alquilfosfonotioatos.
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
CA2178729A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Eric B. Kmiec Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5728518A (en) 1994-01-12 1998-03-17 The Immune Response Corporation Antiviral poly-and oligonucleotides
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5599706A (en) 1994-09-23 1997-02-04 Stinchcomb; Dan T. Ribozymes targeted to apo(a) mRNA
US5681940A (en) * 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US6908903B1 (en) 1994-12-07 2005-06-21 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Cluster clearing agents
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US20030119724A1 (en) 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
CN1120707C (zh) 1995-11-22 2003-09-10 约翰斯·霍普金斯大学 增强生物分子的细胞摄取的配体
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US6620916B1 (en) 1996-09-26 2003-09-16 Ajinomoto Co., Inc. Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US20040171564A1 (en) 1997-11-20 2004-09-02 Honkanen Richard E. Antisense oligonucleotide modulation of human serine/threonine protein phosphatase gene expression
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
PL346645A1 (en) * 1998-08-19 2002-02-25 North American Vaccine IMMUNOGENIC β-PROPIONAMIDO-LINKED POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE USEFUL AS A VACCINE PRODUCED USING AN N-ACRYLOYLATED POLYSACCHARIDE
EP1109576B1 (en) 1998-08-19 2009-10-21 Baxter Healthcare SA Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an n-acryloylated polysaccharide
US6166239A (en) 1998-09-04 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide protecting groups
CZ296576B6 (cs) 1999-02-12 2006-04-12 Sankyo Company Limited Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
US6159694A (en) 1999-04-08 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of stat3 expression
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
KR20010112944A (ko) 1999-04-21 2001-12-22 이곤 이 버그 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 방법 및조성물
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6383812B1 (en) 1999-05-28 2002-05-07 Academia Sinica Anti liver disease drug R-YEEE and method of synthesizing branched galactose-terminal glycoproteins
US8541548B2 (en) 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
WO2001005825A2 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Hyseq, Inc. Nucleic acid sequences encoding putative angiopoietin proteins
JP4151751B2 (ja) 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
DE19935303A1 (de) 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
US20020082227A1 (en) 1999-09-30 2002-06-27 Scott Henry Use of oligonucleotides for inhibition of complement activation
US20050112118A1 (en) 1999-12-02 2005-05-26 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating inflammatory disorders
RU2002115295A (ru) 1999-12-09 2004-01-10 Санкио Компани, Лимитед (Jp) Способ испытания терапевтического или профилактического средства от гиперлипидемии
JP2003519231A (ja) 1999-12-30 2003-06-17 カー・ユ・ルーベン・リサーチ・アンド・ディベロップメント シクロヘキセン核酸
US7179796B2 (en) 2000-01-18 2007-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US6602857B1 (en) 2000-01-18 2003-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2001060860A2 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
AU2001282522A1 (en) 2000-08-29 2002-03-13 Takeshi Imanishi Novel nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
US6426220B1 (en) 2000-10-30 2002-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
KR20030074637A (ko) 2000-12-01 2003-09-19 셀 웍스 인크. 글리코실화/갈락토실화된 펩티드, 이관능기적 링커 , 및뉴클레오티드성 단량성/중합체의 접합체, 및 관련 조성물및 사용 방법
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
EP1403367A4 (en) 2001-06-08 2005-08-17 Sankyo Co A MEDICAMENT TEST METHOD FOR TREATING OR PREVENTING DISEASES SUCH AS HYPERLIPEMIA
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030175906A1 (en) 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
WO2003004602A2 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US7227014B2 (en) * 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
WO2003014397A1 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Biomedlab Corporation Probe for detection of enteric virus detection kit and method for enteric virus with the same
CA2459347C (en) 2001-09-04 2012-10-09 Exiqon A/S Locked nucleic acid (lna) compositions and uses thereof
US7439043B2 (en) 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
CN101905024A (zh) 2001-11-16 2010-12-08 杰南技术公司 含有血管生成素-样蛋白质3angptl3的组合物及其使用方法
US20100240730A1 (en) 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
AU2003274906A1 (en) 2002-07-31 2004-02-16 Nucleonics, Inc. Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
US8729036B2 (en) 2002-08-07 2014-05-20 University Of Massachusetts Compositions for RNA interference and methods of use thereof
WO2004024757A2 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
EP1572964A4 (en) 2002-10-18 2007-08-08 Nucleonics Inc STRUCTURES AND CONSTRUCTIONS OF DOUBLE STRANDED RNA AND METHODS FOR THEIR GENERATION AND USE
EP1562971B1 (en) 2002-11-05 2014-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
US7511131B2 (en) 2002-11-13 2009-03-31 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
CA2505801A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rosanne Crooke Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US20060009410A1 (en) 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
WO2004058052A2 (en) 2002-12-20 2004-07-15 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof
US6673661B1 (en) 2002-12-20 2004-01-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Self-aligned method for forming dual gate thin film transistor (TFT) device
WO2004063208A1 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Postech Foundation New phosphoramidite compounds
WO2004072046A2 (en) 2003-02-12 2004-08-26 Carex S.A. Quinoline derivatives and their use for modulation of lxr activity
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
EP2239329A1 (en) 2003-03-07 2010-10-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
CA2488224A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna conjugates
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US7750142B2 (en) 2003-04-28 2010-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
WO2004101619A1 (ja) 2003-05-15 2004-11-25 Shionogi Co., Ltd. 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
AU2004274942B2 (en) 2003-09-18 2008-02-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E expression
AU2004274021B2 (en) 2003-09-18 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
WO2005038013A1 (en) * 2003-10-07 2005-04-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Artisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
US7959919B2 (en) 2003-11-19 2011-06-14 Novelmed Therapeutics, Inc. Method of inhibiting factor B-mediated complement activation
WO2005065686A1 (en) 2004-01-07 2005-07-21 Adipogen Pharmaceuticals Pty Limited Differentiation modulating agents and uses therefor
JP2007520222A (ja) 2004-01-20 2007-07-26 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド グルココルチコイドレセプター発現の調節
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
JPWO2005097155A1 (ja) 2004-04-08 2008-02-28 タカラバイオ株式会社 神経突起伸長誘導剤
WO2005116204A1 (ja) 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
WO2005121372A2 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
DK1781698T3 (en) 2004-07-20 2016-10-03 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE USE OF Angiopoietin-like-4-PROTEIN
PL1771474T3 (pl) 2004-07-20 2010-07-30 Genentech Inc Inhibitory białka angiopoetyno-4-podobnego, kombinacje i ich zastosowanie
DK1786472T3 (da) 2004-08-10 2013-04-15 Genzyme Corp Antisense-modulering af apolipoprotein B-ekspression
JP5192234B2 (ja) 2004-08-10 2013-05-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 化学修飾オリゴヌクレオチド
US20090203132A1 (en) 2004-09-09 2009-08-13 Swayze Eric E Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
EP1807093A2 (en) 2004-10-13 2007-07-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of ptp1b expression
US20080261905A1 (en) 2004-11-08 2008-10-23 K.U. Leuven Research And Development Modified Nucleosides for Rna Interference
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
EP1841867A1 (en) 2005-01-24 2007-10-10 Avaris AB COMPLEX CONTAINING SiRNA, ShRNA OR ANTISENSE MOLECULE AND FUNCTIONAL ENTITY, FOR IMPROVED SPECIFICITY AND DELIVERY
US20090118213A1 (en) * 2005-09-15 2009-05-07 Henrik Frydenlund Hansen Rna antagonist compounds for the inhibition of apo-b100 expression
EA200800869A1 (ru) 2005-09-19 2008-10-30 ДЖОНСОН ЭНД ДЖОНСОН ФАРМАСЬЮТИКАЛ РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ, Эл. Эл. Си. Модуляция экспрессии рецептора глюкагона
WO2007035759A1 (en) 2005-09-19 2007-03-29 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development L.L.C. Modulation of glucocorticoid receptor expression
PL2161038T3 (pl) 2006-01-26 2014-06-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Kompozycje i ich zastosowanie ukierunkowane na huntingtynę
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007258117B2 (en) 2006-05-05 2013-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gene expression
CN101489565A (zh) * 2006-05-05 2009-07-22 Isis药物公司 调节pcsk9表达的化合物和方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
DK2066684T3 (da) 2006-05-11 2012-10-22 Isis Pharmaceuticals Inc 5´-Modificerede bicycliske nukleinsyreanaloge
CA2660052A1 (en) 2006-08-04 2008-02-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of jnk proteins
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
CN101500548A (zh) 2006-08-18 2009-08-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
CA2663601C (en) 2006-09-22 2014-11-25 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
ATE540118T1 (de) 2006-10-18 2012-01-15 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense-verbindungen
JP2010510807A (ja) 2006-11-27 2010-04-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 高コレステロール血症を治療するための方法
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
HUE033960T2 (en) 2006-12-08 2018-01-29 Lexicon Pharmaceuticals Inc Monoclonal Antibodies to ANGPTL3
CA2839162A1 (en) * 2006-12-20 2008-06-26 Xoma Technology Ltd. Methods for the treatment of il-1-.beta. related diseases
EP2125852B1 (en) 2007-02-15 2016-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2604284A1 (en) 2007-02-16 2013-06-19 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor And Antigen Targeted Prodrug
US20100120665A1 (en) 2007-03-01 2010-05-13 Advanced Vision Therapies, Inc. Treatment of diseases characterized by inflammation
JP2010519911A (ja) 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｍｙｃ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
AU2008242583B2 (en) 2007-04-23 2013-10-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of RNA interference agents
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
WO2009003009A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Substituted pyrrolidine as anti-infectives
CA2692579C (en) 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
JP5572090B2 (ja) 2007-08-15 2014-08-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド テトラヒドロピラン核酸類似体
CA2701128A1 (en) * 2007-10-01 2009-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
AU2008323970B2 (en) 2007-11-09 2014-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of Factor 7 expression
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
EP3673910B1 (en) * 2007-12-27 2023-11-22 Stelic Institute & Co., Inc. Sugar chain-related gene and use thereof
WO2009134487A2 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
US8530640B2 (en) 2008-02-07 2013-09-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
US20110130440A1 (en) 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009143369A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing nucleosides and analogs thereof without using chromatography
WO2009148605A2 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
EP2310525B1 (en) 2008-07-09 2014-02-26 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
WO2010017509A1 (en) 2008-08-07 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
EP3587434A1 (en) 2008-09-23 2020-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with click components for conjugation with ligands
DK2361256T3 (da) 2008-09-24 2013-07-01 Isis Pharmaceuticals Inc Cyclohexenyl-nukleinsyreanaloger
US8501805B2 (en) 2008-09-24 2013-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-L-bicyclic nucleosides
NO2379084T3 (ru) 2008-10-15 2018-04-21
CN102264374B (zh) 2008-10-24 2015-01-07 Isis制药公司 5′和2′双取代的核苷和由其制备的低聚化合物
EP2358398A2 (en) 2008-10-24 2011-08-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
KR102344392B1 (ko) 2008-11-10 2021-12-28 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
US9023820B2 (en) 2009-01-26 2015-05-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein C-III expression
AU2010208035B2 (en) 2009-01-29 2016-06-23 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
US8975389B2 (en) 2009-03-02 2015-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
FR2943060B1 (fr) 2009-03-13 2013-01-04 Commissariat Energie Atomique Agents chelatants d'ions metalliques, leurs procedes de preparation et leurs applications
RU2011146158A (ru) 2009-04-15 2013-05-27 АйЭсАйЭс ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. Модуляция воспалительных реакций фактором хi
NZ621981A (en) * 2009-05-05 2015-09-25 Tekmira Pharmaceuticals Corp Lipid compositions
CA2764158A1 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
EA201791744A3 (ru) 2009-06-10 2018-07-31 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Улучшенная липидная композиция
US8273869B2 (en) 2009-06-15 2012-09-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsRNA targeting the PCSK9 gene
US20140099666A1 (en) 2009-07-06 2014-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing production of a biological product
WO2011005860A2 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5' phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP2454369A4 (en) 2009-07-16 2013-07-03 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF FACTOR 7 EXPRESSION
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
WO2011038356A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Johns Hopkins University Novel liver-targeting agents and their synthesis
AU2010306639B2 (en) 2009-10-16 2017-02-16 Glaxo Group Limited HBV antisense inhibitors
TWI388338B (zh) 2009-10-26 2013-03-11 Iner Aec Executive Yuan 對聚合醣鏈進行放射標誌以作為肝受體造影劑之方法
TWI391144B (zh) 2009-10-26 2013-04-01 Iner Aec Executive Yuan 一種定量肝殘餘功能的檢驗方法與其新穎肝受體造影檢驗藥劑
JP5723378B2 (ja) * 2009-11-03 2015-05-27 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法
WO2011072290A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Regents Of The University Of Michigan Targeted dendrimer-drug conjugates
JP5822845B2 (ja) 2010-01-08 2015-11-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド アンジオポエチン様３発現の調節
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
EP3023495B1 (en) * 2010-02-24 2019-05-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Compositions for targeted delivery of sirna
WO2011115818A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
JP2013528665A (ja) 2010-03-26 2013-07-11 メルサナ セラピューティックス， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドの送達のための修飾ポリマー、その製造方法、およびその使用方法
US20130109817A1 (en) 2010-03-26 2013-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Modified Polymers for Delivery of Polynucleotides, Method of Manufacture, and Methods of Use Thereof
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
WO2011133871A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
JP6005628B2 (ja) 2010-04-28 2016-10-12 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、その類似体、およびこれらから調製されるオリゴマー化合物
US9127033B2 (en) 2010-04-28 2015-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′ modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20130236968A1 (en) 2010-06-21 2013-09-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
US9290760B2 (en) 2010-09-15 2016-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
US8603994B2 (en) 2010-11-11 2013-12-10 Valted, Llc Transcriptional repression leading to Parkinson's disease
WO2012068187A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
MX346144B (es) 2010-12-17 2017-03-09 Arrowhead Res Corp * Porcion activadora del modulador farmacocinetico del agregado de galactosa para arnsi.
CA3131967A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 F. Hoffman-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
EP3467109A1 (en) 2011-02-08 2019-04-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
PL2697243T3 (pl) 2011-04-01 2019-05-31 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulacja ekspresji przekaźnika sygnału i aktywatora transkrypcji 3 (stat3)
KR101839177B1 (ko) * 2011-04-13 2018-03-15 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Ｐｔｐｉｂ 발현의 안티센스 조절
TW201303013A (zh) 2011-04-21 2013-01-16 Isis Pharmaceuticals Inc Ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）表現之調節
ES2663635T3 (es) 2011-04-27 2018-04-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulación de la expresión de apolipoproteína CIII (APOCIII)
WO2012174154A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of inflammatory responses by factor vii
WO2012174476A2 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
RU2631805C2 (ru) 2011-06-21 2017-09-26 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы ингибирования экспрессии генов аполипопротеина с-iii (арос3)
CN112961855A (zh) 2011-06-21 2021-06-15 阿尔尼拉姆医药品有限公司 血管生成素样3(ANGPTL3)iRNA组合物及其使用方法
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
US20130017250A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods For High Density Lipoprotein Cholesterol Regulation
US8932572B2 (en) 2011-08-26 2015-01-13 Arrowhead Madison Inc. Poly(vinyl ester) polymers for in vivo nucleic acid delivery
DK2751270T3 (en) 2011-08-29 2018-10-29 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER-CONJUGATE COMPLEXES AND THEIR USE
CN103814132B (zh) * 2011-09-20 2018-06-05 苏州瑞博生物技术有限公司 Gcgr表达的反义调节
IN2014CN03749A (ru) 2011-10-25 2015-09-25 Isis Pharmaceuticals Inc
SI3301177T1 (sl) 2011-11-18 2020-07-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sredstva RNAi, sestavki in postopki njihove uporabe za zdravljenje s transtiretinom (TTR) povezanih bolezni
WO2013119979A1 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating factor vii expression
US9340784B2 (en) 2012-03-19 2016-05-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating alpha-1-antitrypsin expression
WO2013142571A2 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Cornell University Assays for the identification of compounds that modulate lipid homeostasis
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
EP2839006B1 (en) 2012-04-20 2018-01-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
EP2844261B1 (en) 2012-05-02 2018-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
TWI595885B (zh) 2012-05-02 2017-08-21 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
WO2013173789A2 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
US9574193B2 (en) 2012-05-17 2017-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating apolipoprotein (a) expression
CA3185392A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating apolipoprotein(a) expression
WO2013192233A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and method for improved cellular uptake of antisense compounds
JP2015525797A (ja) 2012-08-06 2015-09-07 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 糖質コンジュゲートｒｎａ剤およびその調製方法
EP2906699A4 (en) 2012-10-11 2016-06-08 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER COMPOUNDS WITH BICYCLIC NUCLEOSIDES AND USES THEREOF
CN104884618A (zh) 2012-11-15 2015-09-02 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合物
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
CA2893801A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
PT2992098T (pt) 2013-05-01 2019-07-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para modular a expressão de hbv e ttr
AU2013389474B2 (en) 2013-05-16 2018-11-15 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Transplantation adjuvant in cell therapy using neural progenitor cells
US20160122761A1 (en) 2013-06-21 2016-05-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of target nucleic acids
LT3013959T (lt) 2013-06-27 2020-03-10 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Priešprasmiai oligomerai ir konjugatai, nukreirti į pcsk9
ES2787600T3 (es) 2013-07-02 2020-10-16 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores del receptor de la hormona del crecimiento
DK3019200T3 (da) 2013-07-11 2022-06-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc Oligonukleotid-ligand-konjugater og fremgangsmåde til fremstiling deraf
EP3043827B1 (en) 2013-09-13 2019-07-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement factor b
WO2015042447A1 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted therapeutic nucleosides and their use
CA2928349A1 (en) 2013-11-14 2015-05-21 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Apob antisense conjugate compounds
US10150965B2 (en) 2013-12-06 2018-12-11 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of transthyretin (TTR) by double-stranded RNA
BR112016022855B1 (pt) 2014-05-01 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos e composições para modular a expressão de pkk e seus usos
CA2942570A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression
SI3137605T1 (sl) 2014-05-01 2021-02-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in metode za modulacijo ekspresije angiopoetin 3-podobnega
PE20170010A1 (es) 2014-05-01 2017-03-04 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion del factor b del complemento
US10098959B2 (en) 2014-05-01 2018-10-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method for synthesis of reactive conjugate clusters
US10570169B2 (en) 2014-05-22 2020-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
US20170145424A1 (en) 2014-06-06 2017-05-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
WO2017079745A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
AU2016349625B2 (en) * 2015-11-06 2022-07-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulating apolipoprotein (a) expression

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009073809A2 (en) * 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
US20120225927A1 (en) * 2008-10-20 2012-09-06 Dinah Wen-Yee Sah Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
WO2011139917A1 (en) * 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
US20130035366A1 (en) * 2011-04-21 2013-02-07 Swayze Eric E Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUROSAWA et al. "Selective silencing of a mutant transthyretin allele by small interfering RNAs", Biochemical and Biophysical Research Communications, 25 November 2005 (25.11.2005), Vol. 337, Iss. 3, Pgs, 1012-1018, entire document *
MACHIDA et al. "Postmortem findings in a patient with cerebral amyloid angiopathy actively treated with corticosteroid", Amyloid, 21 April 2012 (21.04.2012), Vol. 19, Pgs. 47-49, entire document *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ740338A (en) 2022-04-29
RU2015151203A (ru) 2017-06-02
AU2014259756B2 (en) 2017-02-23
DK2992098T3 (da) 2019-06-17
ZA201507218B (en) 2023-09-27
US10683499B2 (en) 2020-06-16
WO2014179620A1 (en) 2014-11-06
CN113293163A (zh) 2021-08-24
EP2992097A2 (en) 2016-03-09
EP3633039A1 (en) 2020-04-08
WO2014179625A1 (en) 2014-11-06
MX2021008899A (es) 2021-08-19
CN110079524A (zh) 2019-08-02
CL2015003217A1 (es) 2016-07-08
US20150126720A1 (en) 2015-05-07
AU2022202770A1 (en) 2022-05-19
AU2019204784C1 (en) 2022-11-03
KR102235678B1 (ko) 2021-04-05
WO2014179626A2 (en) 2014-11-06
US20200224198A1 (en) 2020-07-16
PH12019501191A1 (en) 2021-03-01
DOP2016000287A (es) 2017-02-15
JP6216444B2 (ja) 2017-10-18
IL242124B (en) 2019-02-28
UA121017C2 (uk) 2020-03-25
RU2650510C2 (ru) 2018-04-16
US20230151365A1 (en) 2023-05-18
KR20210151260A (ko) 2021-12-13
HRP20190987T1 (hr) 2019-09-20
CN105378085A (zh) 2016-03-02
RU2699985C2 (ru) 2019-09-11
US11299736B1 (en) 2022-04-12
BR112015027377B1 (pt) 2023-01-10
PL2992098T3 (pl) 2019-09-30
KR20230006933A (ko) 2023-01-11
US9932580B2 (en) 2018-04-03
CY1121879T1 (el) 2020-10-14
US20160076030A1 (en) 2016-03-17
WO2014179629A2 (en) 2014-11-06
CA2921518A1 (en) 2014-11-06
US20160090595A1 (en) 2016-03-31
US9932581B2 (en) 2018-04-03
EA201891479A1 (ru) 2018-11-30
IL273312A (en) 2020-04-30
RU2015151199A3 (ru) 2018-03-27
IL296543A (en) 2022-11-01
CN110042098A (zh) 2019-07-23
US20150176007A1 (en) 2015-06-25
SG11201508800WA (en) 2015-11-27
LT2992098T (lt) 2019-07-10
AU2020233603A1 (en) 2020-10-01
CN112921036A (zh) 2021-06-08
KR20200090966A (ko) 2020-07-29
IL264580B (en) 2020-04-30
EP2991656A4 (en) 2017-02-22
RU2015151202A3 (ru) 2018-03-27
HK1221475A1 (zh) 2017-06-02
EP3524680A1 (en) 2019-08-14
MX2015015239A (es) 2016-10-03
IL283660A (en) 2021-07-29
HK1221485A1 (zh) 2017-06-02
JP2023113843A (ja) 2023-08-16
RU2670614C9 (ru) 2018-11-23
CR20150612A (es) 2016-03-03
US9714421B2 (en) 2017-07-25
MX2019010443A (es) 2019-10-17
JP2016522817A (ja) 2016-08-04
US9163239B2 (en) 2015-10-20
CA2921514C (en) 2023-10-24
BR112015027319A2 (pt) 2017-09-26
JP7429103B2 (ja) 2024-02-07
RU2018136140A (ru) 2018-12-17
JP6592486B2 (ja) 2019-10-16
AU2019203674A1 (en) 2019-06-27
AU2019200820A1 (en) 2019-02-28
IL264580A (en) 2019-02-28
US9145558B2 (en) 2015-09-29
AU2014259757A1 (en) 2015-10-22
AU2014259759B2 (en) 2020-06-18
MY178929A (en) 2020-10-23
JP2021074021A (ja) 2021-05-20
US9181549B2 (en) 2015-11-10
RU2686080C2 (ru) 2019-04-24
AU2020207820A1 (en) 2020-08-06
AU2014259755A1 (en) 2015-10-22
EP2991661A4 (en) 2017-02-15
ES2778442T3 (es) 2020-08-10
MX2021008901A (es) 2021-08-19
DK2991656T3 (da) 2020-03-23
PH12015502493A1 (en) 2016-02-22
NZ725538A (en) 2021-02-26
KR101857707B1 (ko) 2018-05-14
CN105378082B (zh) 2020-06-09
CN111593051A (zh) 2020-08-28
AU2014259757B2 (en) 2017-03-02
RS60796B1 (sr) 2020-10-30
RU2018136140A3 (ru) 2022-04-27
PT2992098T (pt) 2019-07-05
EP2992098A2 (en) 2016-03-09
US9181550B2 (en) 2015-11-10
JP6456362B2 (ja) 2019-01-23
EP2992009A1 (en) 2016-03-09
BR112015027322A2 (pt) 2017-09-26
BR112015027321A2 (pt) 2017-09-26
HUE050394T2 (hu) 2020-11-30
KR20160002976A (ko) 2016-01-08
US20210087566A1 (en) 2021-03-25
JP2021020901A (ja) 2021-02-18
WO2014179626A3 (en) 2015-02-26
EP2991656A2 (en) 2016-03-09
KR20230113835A (ko) 2023-08-01
IL264241A (en) 2019-02-28
EA031393B1 (ru) 2018-12-28
JP6866459B2 (ja) 2021-04-28
PH12015502493B1 (en) 2016-02-22
US20160076032A1 (en) 2016-03-17
KR20160002977A (ko) 2016-01-08
BR112015027377A8 (pt) 2017-10-03
AU2014259756A1 (en) 2015-10-22
IL273205A (en) 2020-04-30
US20180273953A1 (en) 2018-09-27
IL270464B (en) 2021-07-29
US10883104B2 (en) 2021-01-05
US20150126719A1 (en) 2015-05-07
RU2015151202A (ru) 2017-06-06
CN105378082A (zh) 2016-03-02
JP6769866B2 (ja) 2020-10-14
CN110066795A (zh) 2019-07-30
AU2018267625B2 (en) 2020-09-10
BR122018009831B1 (pt) 2021-12-21
EP2991661B1 (en) 2019-03-13
CN110042098B (zh) 2023-02-24
AU2014259750A1 (en) 2015-10-22
IL274064B (en) 2021-06-30
US20180273952A1 (en) 2018-09-27
AU2017200365C1 (en) 2019-04-18
NZ728517A (en) 2021-12-24
MX2015015234A (es) 2016-10-03
AU2024200296A1 (en) 2024-02-08
IL284593A (en) 2021-08-31
CN108064162A (zh) 2018-05-22
AU2021204244B2 (en) 2023-10-19
AU2014259750B2 (en) 2019-02-28
JP2023012548A (ja) 2023-01-25
IL242132B (en) 2018-10-31
JP2020039355A (ja) 2020-03-19
MX2020002184A (es) 2020-07-14
US20160017323A1 (en) 2016-01-21
CN108064162B (zh) 2021-12-03
HK1221486A1 (zh) 2017-06-02
JP2020074787A (ja) 2020-05-21
US20190055554A1 (en) 2019-02-21
JP2018183184A (ja) 2018-11-22
IL273184A (en) 2020-04-30
KR102482890B1 (ko) 2022-12-30
ES2730015T3 (es) 2019-11-07
JP7177127B2 (ja) 2022-11-22
BR112015027319A8 (pt) 2018-01-02
IL263843A (en) 2019-01-31
SG10201801813YA (en) 2018-04-27
KR20160002975A (ko) 2016-01-08
AU2019202598A1 (en) 2019-05-02
IL284593B (en) 2022-10-01
AU2014259755B2 (en) 2018-08-30
US10844379B2 (en) 2020-11-24
US10927372B2 (en) 2021-02-23
US20210395734A1 (en) 2021-12-23
BR112015027369A8 (pt) 2018-01-02
EP2992098A4 (en) 2017-01-11
KR102315836B1 (ko) 2021-10-22
JP2020058370A (ja) 2020-04-16
IL272617A (en) 2020-03-31
DK2992009T3 (da) 2020-09-14
IL284000A (en) 2021-07-29
EP3524680B1 (en) 2020-11-11
RU2015151199A (ru) 2017-06-05
EP4155403A1 (en) 2023-03-29
JP2016523515A (ja) 2016-08-12
AU2021204244A1 (en) 2021-07-22
JP2019056001A (ja) 2019-04-11
PT3524680T (pt) 2021-01-04
KR20180051678A (ko) 2018-05-16
ME03390B (me) 2020-01-20
BR112015027369A2 (pt) 2017-09-26
AU2019200820B2 (en) 2020-04-30
EP3690049A1 (en) 2020-08-05
LT2992009T (lt) 2020-11-10
UA120287C2 (uk) 2019-11-11
EP2992097B1 (en) 2019-11-06
EP2992009B1 (en) 2020-06-24
US20210024923A1 (en) 2021-01-28
AU2017203436A1 (en) 2017-06-08
JP6387084B2 (ja) 2018-09-05
HK1221403A1 (zh) 2017-06-02
IL242125B (en) 2019-02-28
IL273184B (en) 2021-07-29
CL2016002262A1 (es) 2017-06-09
MX2019010441A (es) 2019-10-17
KR102138781B1 (ko) 2020-07-28
DOP2021000095A (es) 2021-09-15
BR112015027369B1 (pt) 2021-06-08
JP2018027091A (ja) 2018-02-22
RU2015151200A3 (ru) 2019-01-14
KR20190084138A (ko) 2019-07-15
KR20220108195A (ko) 2022-08-02
AU2014259759A1 (en) 2015-10-22
AU2017203436B2 (en) 2018-10-18
RU2697152C2 (ru) 2019-08-12
AU2017200950B2 (en) 2019-01-17
NZ631512A (en) 2016-10-28
US20220275365A9 (en) 2022-09-01
WO2014179629A8 (en) 2016-06-02
KR20210014758A (ko) 2021-02-09
SI2992009T1 (sl) 2020-10-30
BR112015027321A8 (pt) 2018-01-02
HUE043697T2 (hu) 2019-09-30
WO2014179629A3 (en) 2015-01-22
HK1221404A1 (zh) 2017-06-02
AU2019204784B2 (en) 2022-01-27
NZ753018A (en) 2022-01-28
JP2022017514A (ja) 2022-01-25
KR20210037752A (ko) 2021-04-06
CN105392488B (zh) 2021-04-30
RU2015151204A3 (ru) 2018-03-27
CY1123369T1 (el) 2021-12-31
KR102558571B1 (ko) 2023-07-21
BR112015027377A2 (pt) 2017-08-29
CN105378085B (zh) 2019-02-15
US20140343123A1 (en) 2014-11-20
JP7339294B2 (ja) 2023-09-05
US20180002693A1 (en) 2018-01-04
SI2992098T1 (sl) 2019-06-28
DOP2015000268A (es) 2015-11-30
BR112015027322A8 (pt) 2018-01-02
MX2015015263A (es) 2016-12-16
SG10201906382QA (en) 2019-08-27
NZ631537A (en) 2017-05-26
US20180044676A1 (en) 2018-02-15
RU2015151200A (ru) 2019-01-14
PE20152002A1 (es) 2016-01-21
CA2921514A1 (en) 2014-11-06
JP2016522683A (ja) 2016-08-04
IL284593B2 (en) 2023-02-01
CN114058617A (zh) 2022-02-18
RU2019124314A (ru) 2019-08-21
KR20160003723A (ko) 2016-01-11
EP2992097A4 (en) 2017-01-04
CA2921162A1 (en) 2014-11-06
JP2024010070A (ja) 2024-01-23
US11851655B2 (en) 2023-12-26
EP2992098B1 (en) 2019-03-27
EA201592093A1 (ru) 2016-06-30
CR20190269A (es) 2019-09-13
SG10201801507RA (en) 2018-03-28
RU2670614C2 (ru) 2018-10-24
EP2991661A1 (en) 2016-03-09
EP3828275A1 (en) 2021-06-02
IL274064A (en) 2020-06-30
MX2020004209A (es) 2020-08-13
KR102651423B1 (ko) 2024-03-27
KR20210129257A (ko) 2021-10-27
CA2921167A1 (en) 2014-11-06
IL261901B (en) 2020-05-31
HRP20201378T1 (hr) 2020-11-27
CN105377887B (zh) 2020-11-03
MX2015015220A (es) 2016-01-12
MY198359A (en) 2023-08-28
WO2014179627A9 (en) 2015-02-26
AU2019203674B2 (en) 2021-03-25
CN105377887A (zh) 2016-03-02
ES2885174T3 (es) 2021-12-13
IL261901A (en) 2018-10-31
AU2017200365B2 (en) 2018-11-08
PL2992009T3 (pl) 2020-11-30
RU2018112167A (ru) 2019-03-07
EP2991656B1 (en) 2019-12-18
NZ631552A (en) 2017-02-24
JP6995478B2 (ja) 2022-01-14
MX2015015264A (es) 2016-08-12
JP2020039354A (ja) 2020-03-19
ZA201507216B (en) 2017-08-30
ES2819213T3 (es) 2021-04-15
PH12018501963A1 (en) 2020-07-20
IL263843B (en) 2020-03-31
AU2019204784A1 (en) 2019-07-25
US20210130823A1 (en) 2021-05-06
US20150126718A1 (en) 2015-05-07
US9957504B2 (en) 2018-05-01
IL264241B (en) 2020-04-30
EP2992009A4 (en) 2016-12-28
US20190367914A1 (en) 2019-12-05
KR102212275B1 (ko) 2021-02-05
JP6652602B2 (ja) 2020-02-26
JP6639629B2 (ja) 2020-02-05
AU2017200365A1 (en) 2017-02-23
CN105392488A (zh) 2016-03-09
WO2014179627A3 (en) 2015-04-16
JP2016526874A (ja) 2016-09-08
US9127276B2 (en) 2015-09-08
PE20161430A1 (es) 2017-01-06
RU2019110030A (ru) 2019-05-06
JP2021107408A (ja) 2021-07-29
IL242126B (en) 2019-01-31
RS58981B1 (sr) 2019-08-30
AU2017200950A1 (en) 2017-03-02
AU2018267625A1 (en) 2018-12-13
US20160090596A1 (en) 2016-03-31
CA2921509A1 (en) 2014-11-06
AU2020217347A1 (en) 2020-08-27
NZ712737A (en) 2021-08-27
PT2992009T (pt) 2020-09-21
KR20240042220A (ko) 2024-04-01
WO2014179627A2 (en) 2014-11-06
RU2015151204A (ru) 2017-06-02
KR102424855B1 (ko) 2022-07-26
KR20160002974A (ko) 2016-01-08
JP2016526018A (ja) 2016-09-01
JP2020007361A (ja) 2020-01-16
DK3524680T3 (da) 2020-12-14
EP3546579A1 (en) 2019-10-02
SG11201508870VA (en) 2015-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7339294B2 (ja) Ｈｂｖおよびｔｔｒ発現を調節するための組成物および方法
RU2782034C2 (ru) Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr
EA046363B1 (ru) Олигомерные соединения для модулирования экспрессии ttr