TW202449152A - Ｒｅｖｅｒｓｉｒ分子及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi干擾活性的REVERSIR化合物及其使用方法。
Description
相關申請案之交互引用
本申請主張2023年2月9日提交的美國臨時專利申請No.63/444,375的優先權，其全部內容經引用併入本文。
本揭露係關於一種REVERSIR分子及其使用方法。
RNA干擾(RNAi)係一種進化上保守的機制，其中內源(microRNA)或外源(siRNA、shRNA)短非編碼RNA以序列依賴性方式下調mRNA轉錄物的基因表現。作為一種利用有效細胞催化機制的天然途徑，RNAi可用於實現標靶基因轉錄物的穩健、持久和特異性靜默。近年來，幾種基於RNAi的藥物已在臨床研究中成功得到驗證，與其他基因靜默策略相比，低劑量和用藥(少至6個月)的劑量已被證明具有益處。新穎的遞送解決方案以及高度化學修飾的siRNA提高效力、持久性和安全性，從而極大地擴大RNAi治療的範圍，最終產生四種已獲批准的藥物和其他幾種處於臨床開發中的藥物。在肝臟中，不頻繁地遞送與N-半乳糖胺
(GalNAc)結合的代謝穩定的siRNA導致有效的基因靜默，這種靜默在人體中持續數月，具有良好的安全性和耐受性。由於作用時間持久，RNAi療法可以受益於能夠快速逆轉靜默活性且提供對RNAi藥理學的訂製化調控的技術，此為個人化精準醫療的理想屬性。
然而，在某些情況下，個體可能對dsRNA劑的治療反應不佳或接受過高的劑量。在這種情況下，可以施用逆轉dsRNA劑的iRNA靜默活性的化合物以至少部分降低dsRNA劑的RNAi活性。在其他情況下，dsRNA的長期作用使得等待該作用經由自然清除緩慢減弱成為一種不吸引人的選擇。
因此，本領域需要提供對RNAi藥理學之訂製化調控的組成物和方法，並因此提供基於siRNA之治療劑的體內治療活性及/或副作用。
本發明提供抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性(REVERSIR)的寡核苷酸。本發明亦提供使用此類寡核苷酸以抑制個體中反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑之RNAi活性的方法，如有需要的個體，例如接受過高劑量之dsRNA劑或正經歷因施用dsRNA劑的副作用的個體。
本發明至少部分基於以下發現：REVERSIR的活性，當先前證明被REVERSIR抑制的dsRNA劑的反義股中包括熱不穩定核苷酸時，逆轉用於調控和訂製RNAi藥理學之dsRNA劑的iRNA靜默活性的寡核苷酸就被廢除。本發明亦至少部分基於REVERSIR的發現，該REVERSIR
抑制dsRNA劑的RNAi干擾活性，該dsRNA劑的反義股包含熱不穩定核苷酸。
因此，一方面，本發明提供用於抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑之RNAi活性的單股寡核苷酸該雙股核糖核酸。單股寡核苷酸包括與dsRNA劑之反義股實質上互補的核苷酸序列，其中該單股寡核苷酸長度為16-30個核苷酸，其中該單股寡核苷酸的實質上所有核苷酸都包含核苷酸修飾，且其中至少三個核苷酸修飾係高親和力核苷酸修飾。
在一個實施方案中，實質上所有核苷酸都包含選自由下述所組成群組之核苷酸修飾：2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代的烷基修飾、2’-鹵基修飾、去氧核苷酸修飾、鎖核酸(LNA)修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、橋接核酸(2',4'-BNA)、2'-O-乙基(cEt)及2'-O-甲基修飾。
在另一個實施方案中，所有核苷酸包含選自由下述所組成群組之核苷酸修飾2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代的烷基修飾、2’-鹵基修飾、去氧核苷酸修飾、鎖核酸(LNA)修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、橋接核酸(2',4'-BNA)、2'-O-乙基(cEt)及2'-O-甲基修飾。
在一個實施方案中，至少四個或五個，例如4個、5個或6個核苷酸修飾可以係高親和力核苷酸修飾。
在一個實施方案中，至少兩個高親和力核苷酸修飾位於位置2和6；位置2和5；位置2和7；位置2和8；位置2和9；位置2和14；位置2和15；及/或位置2和16，從寡核苷酸的3'-端計數。
在一個實施方案中，該高親和力核苷酸修飾位於位置2、6、8和14；2、4、5、6和7；2、4、6、8和13；2、4、6、8和14；2、4、6、8和15；2、4、6、8和16；2、8、10和14；2、4、6、8和14；或2、8、12和14，從寡核苷酸的3'-端計數。
在一個實施方案中，包含高親和力核苷酸修飾的至少一種核苷酸係與dsRNA劑的反義股中包含熱不穩定核苷酸的核苷酸鹼基配對。
在一個實施方案中，該高親和力修飾係鎖核酸(LNA)修飾。
在一個實施方案中，該高親和力修飾係限制性乙基核酸(cEtNA)修飾。
在一個實施方案中，該高親和力修飾係橋接核酸(BNA)修飾。
該單股寡核苷酸可復包含至少五個，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個硫代磷酸酯核苷酸間修飾。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸綴合至至少一種配體。
在一個實施方案中，該配體係N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一個實施方案中，該配體係經由一價、二價或三價支化連接子附接的一種或多種GalNAc衍生物。
在一個實施方案中，該配體係
在一個實施方案中，該配體綴合至單股寡核苷酸中包含去氧糖的核苷。
在一個實施方案中，該去氧糖係2'-去氧核糖。
在一個實施方案中，該配體綴合至單股寡核苷酸的3’-終端。
另一方面，本發明提供用於抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑之RNAi活性的單股寡核苷酸，
其中該單股寡核苷酸包含與dsRNA劑的反義股實質上互補的核苷酸序列，
其中該單股寡核苷酸為18-24個核苷酸長度，
其中，該單股寡核苷酸包含至少五個硫代磷酸酯核苷酸間修飾並由式(I)表示：
其中：
B1、B2和B3各自獨立地表示包含核苷酸修飾的核苷酸，該核苷酸修飾獨立地選自由下述所組成之群組：2'-去氧、2'-核糖、2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代的烷氧基烷基修飾、2'-取代的烷基修飾及2'-鹵基修飾；
T1、T2和T3各自獨立地表示包含核苷酸修飾的核苷酸，該核苷酸修飾選自由下述所組成之群組：去氧核苷酸修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、cEt修飾、或不同的BNA修飾、2'-去氧-2'-氟及2'-O-甲基修飾；
q1,q3及q5各自獨立地為3-12個核苷酸長度；
q2,q4及q6獨立為1-6個核苷酸長度；以及
其中該單股寡核苷酸綴合至至少一種配體。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸包含5-15個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-14個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-13個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-12個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-11個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-10個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-9個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-8個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-7個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；或5-6個硫代磷酸酯核苷酸間修飾。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸包含6-14個硫代磷酸酯核苷酸間修飾。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸為18-22或18-20個核苷酸長度。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸與dsRNA劑之反義股的全長至少約90%互補。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸與dsRNA劑之反義股核苷酸2-16為90%互補。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸與dsRNA劑的反義股完全互補。
在一個實施方案中，該dsRNA劑之反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5'-UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA-3'。
在一個實施方案中，該熱不穩定核苷酸修飾選自由下述所組成之群組：無鹼基修飾；與雙股體中相反核苷酸的錯配；不穩定的糖修飾、2’-去氧修飾、無環核苷酸、解鎖核酸(UNA)及甘油核酸(GNA)。
在一個實施方案中，該dsRNA劑之反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3’。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸的核苷酸序列與表6中任一未修飾之核苷酸序列的整個核苷酸序列具有至少90%的同一性。
在一個實施方案中，該配體係-乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一個實施方案中，該配體係經由一價、二價或三價支化連接子附接的一種或多種GalNAc衍生物。
在一個實施方案中，該配體係
在一個實施方案中，該配體綴合至單股寡核苷酸中包含去氧糖的核苷。
在一個實施方案中，該去氧糖係2'-去氧核糖。
在一個實施方案中，該配體綴合至單股寡核苷酸的3’-終端。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸包含與表6中的任一修飾核苷酸序列相差不超過4個修飾核苷酸的修飾核苷酸序列。
本發明亦提供細胞及醫藥組成物，例如，包含緩衝液(例如，乙酸鹽、檸檬酸鹽、谷醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽，或其任何組合)或未緩衝的(例如，鹽水或水)溶液，包含本發明的單股寡核苷酸。
一方面，本發明提供在個體中改善dsRNA劑之副作用的方法，該dsRNA劑抑制標靶基因的表現並且包含在反義股中的熱不穩定核苷酸修飾。此方法包括向個體施用有效量之本發明的單股寡核苷酸或醫藥組成物，從而改善dsRNA劑在個體中的副作用。
一方面，本發明提供抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑之RNAi抑制活性的方法。此方法包括使dsRNA劑與本發明之單股寡核苷酸或醫藥組成物接觸，從而抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi抑制活性。
在一個實施方案中，該dsRNA劑在細胞中。
在一個實施方案中，該細胞在人類個體內。
另一方面，本發明提供治療有需要的個體的方法。此方法包括向個體施用治療有效量之本發明的單股寡核苷酸或醫藥組成物，從而治療個體。
在一個實施方案中，有需要的個體係先前施用雙股RNAi劑，該雙股RNAi劑抑制標靶基因的表現並且在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾。
在一個實施方案中，該標靶基因係血管收縮素原(AGT)。
在一個實施方案中，該有需要的個體患有低血壓。
在一個實施方案中，該有需要的個體患有高血鉀症。
在一個實施方案中，該有需要的個體患有腎功能障礙。
在一個實施方案中，該方法復包括向個體施用選自由下述所組成群組之附加療法或治療劑：增加飲食流體/鹽、氟氫可的松/米多君治
療、靜脈輸液、血管加壓藥物、減量或中斷伴隨的抗高血壓藥物、低鉀飲食、噻嗪類利尿劑/環形利尿劑藥物、口服鉀結合劑、鈣、葡萄糖、胰島素和血液透析或其組合。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物係皮下施用於個體。
在一個實施方案中，將該單股寡核苷酸或醫藥組成物係靜脈施用於個體。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：1、2：1或3：1。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：1。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：2。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：3。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：4。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：5。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：10。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約2：1。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約3：1。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約5：1。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於個體之dsRNA劑的劑量的比例為約10：1。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成三個劑量並以24小時的間隔施用於個體。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成兩個劑量並以24小時的間隔施用於個體。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成三個劑量並以12小時的間隔施用於個體。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成兩個劑量並以12小時的間隔施用於個體。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成三個劑量並以8小時的間隔施用於個體。
在一個實施方案中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成兩個劑量並且以8小時的間隔施用於個體。
圖1A係描繪小鼠中REVERSIR對靶向TTR並綴合至GalNAc配體之dsRNA劑的靜默的抑制的圖。
圖1B係描繪小鼠中REVERSIR對靶向TTR並綴合至GalNAc配體之dsRNA劑的靜默的抑制的圖。
圖1C係描繪先前證明的REVERSIR不能抑制綴合至GalNAc配體(圖1A及1B中之dsRNA劑)之dsRNA劑的靜默以抑制靶向mRNA之相同區域的dsRNA劑的靜默的圖，並且包含相同的核苷酸序列和實質上相同的核苷酸修飾，除在小鼠中包含熱不穩定的核苷酸修飾。
圖2係描繪延長REVERSIR與施用比靶向非不穩定dsRNA之REVERSIR高100倍的劑量對抑制包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑靜默之能力的影響的圖，與小鼠體內的GalNAc配體綴合。該圖亦描繪在施用REVERSIR劑後30天及恢復時成功重新給藥GalNAc dsRNA劑。該成功重新給藥意味著RNAi藥理學的恢復，與小鼠中的對照組(無REVERSIR)相似。
圖3A係描繪靜脈施用在LNP中配製之0.3mg/kg REVERSIR對在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi靜默活性的影響的圖，以及在小鼠中皮下施用3mg/kg之GalNAc綴合的REVERSIR對小鼠中在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi靜默活性的影響。
圖3B係描繪在小鼠中皮下施用3mg/kg之GalNAc綴合的REVERSIR對在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi靜默活性的影響的圖。
圖4A係描繪當用REVERSIR轉染細胞所示REVERSIR對AD-85481的RNAi靜默活性的體外影響的圖。
圖4B係描繪當藉由細胞中的自由攝取評估REVERSIR時所示REVERSIR對AD-85481的RNAi靜默活性的體外影響的圖。
圖5係顯示REVERSIR A-515518、A-515556、A-515559、A-515586及A-515589之體外活性的表。
圖6A係描繪靜脈施用0.3mg/kg的在LNP中配製的所示REVERSIR對小鼠中AD-85481的RNAi靜默活性的影響的圖。
圖6B係描繪在小鼠中皮下施用3mg/kg所示GalNAc綴合的REVERSIR對AD-85481的RNAi靜默活性的影響的圖。
圖7A示意性地描繪A-762636、A-762655、A-762680、A-762689、A-762722及A-762645之修飾的核苷酸序列。
圖7B係描繪在皮下施用單次3mg/kg劑量的AD-85481及單次3mg/kg所示GalNAc綴合REVERSIR的劑量之後，在指定時間點施用編碼人AGT的AAV的小鼠中人AGT mRNA水平的圖。
圖8A示意性地描繪A-762689、A-762722及A-762645之修飾的核苷酸序列。
圖8B係描繪在皮下施用單次3mg/kg劑量的AD-85481及單次1mg/kg或3mg/kg所示REVERSIR的劑量後，在指定時間點施用編碼人AGT的AAV的小鼠中人AGT mRNA水平的圖。
圖9示意性地描繪用於在非人靈長類動物中評估A-762722和A-762645以及A-762722和A-762645之修飾核苷酸序列的研究設計。
圖10A係描繪在非人靈長類動物中皮下施用1mg/kg或3mg/kg所示GalNAc綴合的REVERSIR對AD-85481的RNAi靜默活性的影響的圖。
圖10B係描繪在非人靈長類動物中靜脈施用0.3mg/kg的LNP中配製的所示REVERSIR對AD-85481的RNAi靜默活性的影響的圖。
圖11A示意性地描繪A-762645、A-809917、A809918、A-809919、A-809920、A-809921、A-809922、A-809923、A-809921、A-809922、A-809923、A-809924、A-92809925的核苷酸序列。
圖11B係描繪在皮下施用單次3mg/kg劑量的AD-85481和單次3mg/kg所示REVERSIR劑量後，在指定時間點施用編碼人AGT的AAV的小鼠中的人AGT mRNA水平的圖。
圖12A示意性地描繪A-762645、A809918、A-809925、A2423818或A2423819的修飾的核苷酸序列。
圖12B係描繪在皮下施用單次3mg/kg劑量的AD-85481和單次3mg/kg所示REVERSIR劑量後，在指定時間點施用編碼人AGT的AAV的小鼠中的人AGT mRNA水平的圖。
圖12C係描繪在皮下施用單次3mg/kg劑量的AD-85481和單次3mg/kg所示REVERSIR劑量後，在指定時間點施用編碼人AGT的AAV的小鼠中的人AGT mRNA水平的圖。
圖13A係描繪在非人靈長類動物中皮下施用3mg/kg所示REVERSIR對AD-85481之RNAi靜默活性的影響的圖。
圖13B係描繪在非人靈長類動物中皮下施用3mg/kg所示REVERSIR對AD-85481之RNAi靜默活性的逆轉作用的圖。
圖13C係描繪在非人靈長類動物中皮下施用3mg/kg所示REVERSIR對AD-85481之RNAi靜默活性的影響的表。
圖14A係描繪在稀釋的人類全血轉染測定(24小時溫育)中所示REVERSIR對IL-6、IL-8、II1B及TNFα水平的影響的圖。
圖14B係描繪在6小時人類全血測定中所示REVERSIR對IL-8和MCP-1水準的影響的圖。
圖14C係描繪所示REVERSIR對非人靈長類血小板計數和全血球計數的影響的圖。
圖15A係描繪在非人靈長類動物中使用不同的RVR/dsRNA比率以及GalNAc綴合和LNP製劑的AGT剩餘百分比和AGT靜默逆轉的圖。
圖15B係描繪在非人靈長類動物中用藥AD-85481(Zilebesiran)後REVERSIR A-762645產生有效且持久的藥理學的圖。
圖15C係描繪不同劑量水平的所示REVERSIR的皮下或靜脈內遞送後剩餘的%AGT的圖。
圖16A係描繪在用10mg/kg的AD-85481預處理的hAGT-AAV小鼠模型中皮下施用不同劑量水平的所示REVERSIR後保持歸一化至給藥前的%AGT的圖。對於hAGT-AAV小鼠模型，藉由肝臟特異性AAV8病毒轉導，在小鼠肝細胞中表現人類AGT基因。
圖16B係描繪在用3mg/kg的AD-85481預處理的hAGT-AAV小鼠模型中皮下施用REVERSIR後剩餘的%AGT的圖。對於hAGT-AAV小鼠模型，藉由肝臟特異性AAV8病毒轉導，在小鼠肝細胞中表現人類AGT基因。
圖17係描繪在用10mg/kg的AD-85481預處理的hAGT轉基因小鼠模型中皮下施用REVERSIR A-762645後剩餘的%AGT的圖。對於hAGT-AAV小鼠模型，人類AGT基因被隨機插入小鼠基因組的多個區域(在胚胎幹細胞階段產生)。
圖18係描繪在用10mg/kg的AD-85481預處理的PXB小鼠模型中皮下施用GalNAc綴合的REVERSIR A-762645後剩餘的%AGT的圖。
圖19A係描繪在大鼠施用不同比例的REVERSIR與dsRNA後剩餘的%AGT的圖。
圖19B係描繪施用不同的AD-85481 dsRNA負載後剩餘的%AGT的圖。
圖19C係描繪用LNP製劑中的REVERSIR和GalNac配體的REVERSIR皮下施用至大鼠的逆轉AGT減弱的圖。
圖19D係描繪REVERSIR A-762645的推注靜脈施用和皮下施用後剩餘的%AGT的圖。
圖20示意性地描繪REVERSIR A-3903617、A-3903618、A-3903619、A-3903620、A-3903621、A-3903622、A-3903623、A-3903624、
A-3903625、A-3903626、A-3903627、A-3903628、A-3903629、A-3903630及A-3903631修飾核苷酸序列。
圖21係描繪在用3mg/kg或10mg/kg的AD-85481預處理的hAGT-AAV小鼠模型中皮下施用所示的GalNAc綴合的REVERSIR後剩餘的%AGT的圖。對於hAGT-AAV小鼠模型，藉由肝臟特異性AAV8病毒轉導，在小鼠肝細胞中表現人類AGT基因。
圖22係描繪在用3mg/kg或10mg/kg的AD-85481預處理的hAGT-AAV小鼠模型中皮下施用所示GalNAc綴合的REVERSIR後剩餘的%AGT的圖。對於hAGT-AAV小鼠模型，藉由肝臟特異性AAV8病毒轉導，在小鼠肝細胞中表現人類AGT基因。
圖23係描繪在用3mg/kg或10mg/kg的AD-85481預處理的hAGT-AAV小鼠模型中皮下施用所示GalNAc綴合的REVERSIR後剩餘的%AGT的圖。對於hAGT-AAV小鼠模型，藉由肝臟特異性AAV8病毒轉導，在小鼠肝細胞中表現人類AGT基因。
本發明提供單股寡核苷酸(REVERSIR)，其抑制反義股中包含熱不穩定核苷酸之雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性。本發明亦提供使用此類寡核苷酸以抑制個體中反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑之RNAi活性的方法，如有需要的個體，例如接受過高劑量之dsRNA劑或正經歷因施用dsRNA劑的副作用的個體。
本發明至少部分基於以下發現：REVERSIR的活性，當先前證明被REVERSIR抑制之dsRNA劑的反義股中包括熱不穩定核苷酸時，逆轉用於調控和訂製RNAi藥理學之dsRNA劑的iRNA靜默活性的寡核苷酸就被廢除。
本發明亦至少部分基於REVERSIR的鑑定，該REVERSIR能夠抑制反義股中包含熱不穩定核苷酸之一類dsRNA劑的RNAi活性。這類新的REVERSIR的特徵在於結構特性的組合，例如長度、硫代磷酸酯(PS)含量及高親和力核苷酸修飾的特定位置的組合，例如鎖核酸(LNA)修飾，相對於dsRNA劑反義股中的熱不穩定核苷酸。
以下詳細描述如何製備及使用抑制反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性的寡核苷酸，以及用於治療有需要的個體的用途及方法。
I.定義
為更容易理解本發明，首先定義某些術語。另外，應注意，無論何時敘述參數的值或值範圍，都旨在所敘述的值中間的值及範圍亦旨在成為本發明的一部分。
本文使用冠詞「一」和「一個」來指稱冠詞的一個或多於一個(即，至少一個)的語法物件。舉例來說，「一個元件」係指一個元件或多於一個元件，例如多個元件。
術語「包括」在本文中用於表示短語「包括但不限於」並且可與短語「包括但不限於」互換使用。
術語「或」在本文中用於表示術語「及/或」，並且可與術語「及/或」互換使用，除非上下文清楚地另有說明。例如，「有義股或反義股」被理解為「有義股或反義股或有義股及反義股」。
術語「約」在本文中用來表示在本領域的典型公差範圍內。例如，「約」可以理解為與平均值的約2個標準差。在某些實施方案中，約係指+10%。在某些實施方案中，約係指+5%。當約出現在一系列數字或範圍之前時，應理解「約」可以修飾該系列或範圍中的每個數字。
在一個數字或一系列數字之前的術語「至少」、「不少於」或「或更多」應理解為包括與術語「至少」相鄰的數字，以及所有後續的數字或整數從邏輯上看，這可以被包括在內，並從上下文中可以清楚地看出。例如，核酸分子中核苷酸的數量必須係整數。例如，「21個核苷酸的核酸分子的至少19個核苷酸」係指19、20或21個核苷酸具有指定的性質。當至少出現在一系列數字或範圍之前時，應理解「至少」可以修飾該系列或範圍中的每個數字。
如本文所用，「不多於」或「或更少」被理解為與該短語相鄰的值以及邏輯較低值或整數，如從上下文邏輯上看，為零。例如，具有「不多於2個核苷酸」突出的雙股體具有2、1或0個核苷酸突出。當「不多於」出現在一系列數字或範圍之前時，應理解「不多於」可以修飾該系列或範圍中的每個數字。如本文所用，範圍包括上限和下限。
如果指定的標靶位點與有義股或反義股的核苷酸序列之間發生衝突，則指定的序列優先。
如果序列與其在轉錄物或其他序列上的指定位點之間發生衝突，則以說明書中記載的核苷酸序列為準。
如本文所用，術語「核苷」係指包含核鹼基和糖的糖基胺。核苷包括但不限於天然存在的核苷、無鹼基核苷、修飾核苷和具有模擬鹼基和/或糖基的核苷。
如本文所用，術語「核苷酸」係指包含核鹼基和具有與糖共價連接的磷酸基的糖的糖胺。該核苷酸可以用多種取代基中的任一種進行修飾。
如本文所用，術語「核鹼基」係指核苷或核苷酸的鹼基部分。該核鹼基可包含任何能夠與另一核酸的鹼基形成氫鍵的原子或原子團。
如本文所用，術語「雜環鹼基部分」係指包含雜環的核鹼基。
如本文所用，術語「寡聚化合物」係指包含兩個或更多子結構並且能夠與核酸分子的區域雜交的聚合結構。在某些實施方案中，寡聚化合物係寡核苷。在某些實施方案中，寡聚化合物係寡核苷酸。在某些實施方案中，寡聚化合物係反義化合物。在某些實施方案中，寡聚化合物係REVERSIR化合物。在某些實施方案中，寡聚化合物包含綴合物基。
如本文所用，「寡核苷」係指其中核苷間連接不含磷原子的寡核苷酸。
如本文所用，術語「寡核苷酸」係指包含多個連接的核苷的寡聚化合物。在某些實施方案中，該寡核苷酸的一個或多個核苷酸被修飾。在某些實施方案中，寡核苷酸包含核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)。
在某些實施方案中，該寡核苷酸由天然及/或非天然存在的核鹼基、糖和共價核苷間連接組成，並且可更包括非核酸綴合物。
如本文所用，術語「REVERSIR化合物」或「REVERSIR」係指單股寡聚化合物，例如單股寡核苷酸，其與在反義股中包含熱不穩定核苷酸的dsRNA劑之至少一股互補並且能夠雜交(靶向)。在沒有限制的情況下，REVERSIR化合物不僅阻斷非預期的靶藥效(PD)效應，還阻斷dsRNA劑(例如綴合的或未綴合的dsRNA劑)可能發生的任何潛在的脫靶活性。REVERSIR經由無唾液酸糖蛋白受體(ASPGR)結合及內化到細胞，且不可逆地與功能性RISC複合物中dsRNA劑的反義股結合。REVERSIR的結合消除dsRNA劑雜交引發的mRNA標靶識別和切割。
如本文所用，術語「REVERSIR活性」係指可歸因於REVERSIR化合物與dsRNA股之一雜交的任何dsRNA活性的強度及/或持久性的任何降低。
本文所揭露的REVERSIR化合物在減低反義股中含有熱不穩定核苷酸的dsRNA的活性方面特別有效。例如，本文所揭露的REVERSIR化合物可以在24小時至7天內將dsRNA的活性減低至少約20%或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約97%、或至少約99%或高達並包括100%的降低(即，與參考樣本相比沒有水平)，或與參考水準相比20-100%或50-100%之間的任何降低。參考水平可以係不存在REVERSIR化合物時的dsRNA活性。
在一些實施方案中，本文所述的REVERSIR化合物可將dsRNA的活性減低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%，例如5%、10%、15%%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，且高達並包括dsRNA活性的完全減低或抑制，在少於七次(例如，六天、五天、四天、三天、兩天或一天內)施用或使用REVERSIR化合物。
在一些實施方案中，REVERSIR化合物可以在施用或使用REVERSIR化合物的四天內完全減低dsRNA活性。dsRNA活性的完全減低係指dsRNA活性相對於參考水平降低至少80%。
本文可互換使用的術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」係指含有如本文所定義之術語的RNA並且透過RNA誘導靜默複合物(RISC)途徑介導RNA轉錄物之靶向切割的劑。該iRNA經由稱為RNA干擾(RNAi)引導mRNA的序列特異性降解。iRNA調節(例如抑制)標靶mRNA序列的表現，例如在細胞中，例如個體(例如哺乳動物個體)內的細胞。
在某些實施方案中，用於本發明之組成物、用途及方法中的「iRNA」係雙股RNA並且在本文中稱為「雙股RNA劑」、「雙股RNA(dsRNA)」分子」、「dsRNA試劑」或「dsRNA」。術語“dsRNA”係指核糖核酸分子的複合物，其具有包含兩條反平行且實質上互補的核酸股的雙股體結構，稱為相對於標靶RNA具有“有義”和“反義”方向。在本發明的一些實施方案中，雙股RNA(dsRNA)經由本文稱為RNA干擾或RNAi的轉錄後基因靜默機制觸發標靶RNA例如mRNA的降解。
術語「反義股」或「引導股」係指iRNA(例如dsRNA)的股，其包括與標靶序列實質上互補的區域。
本文所用的術語「有義股」或「過客股」係指包括與本文所定義的反義股的區域實質上互補的區域的iRNA股。
術語「熱不穩定修飾」包括將導致dsRNA具有比不具有這種修飾之dsRNA的Tm更低的總融解溫度(Tm)的修飾。例如，熱不穩定修飾可以將dsRNA的Tm降低1至4℃，例如1、2、3或4攝氏度。並且，術語「熱不穩定核苷酸」係指含有一種或多種熱不穩定修飾的核苷酸。
例示性之熱不穩定修飾包括無鹼基修飾；與雙股體中相反的核苷酸錯配；及糖修飾，例如2'-去氧修飾或無環核苷酸，例如未鎖核酸(UNA)或二醇核酸(GNA)，或2'-5'-連接核糖核苷酸(“3'-RNA”)。
如本文所用，術語「檢測dsRNA活性」或「測量dsRNA活性」係指在特定樣本進行用於檢測或測量dsRNA活性的測試並與對照樣本的測試進行比較。這種檢測及/或測量可以包括零值。因此，如果用於檢測dsRNA活性的測試結果發現沒有dsRNA活性(dsRNA活性為零)，則仍執行「檢測dsRNA活性」的步驟。
如本文所用，術語「對照樣本」係指尚未與寡聚化合物接觸的樣本。
如本文所用，術語「基序」係指寡聚化合物中未修飾和修飾的核苷酸的模式。
如本文所用，「核苷間連接」係指相鄰核苷之間的共價連接。
如本文所用，「天然存在的核苷間連接」係指3'至5'磷酸二酯連接。
如本文所用，術語「嵌合寡聚物」係指具有至少一個糖、核鹼基或核苷間連接的寡聚化合物，與同一寡聚化合物內的至少一種其他糖、核鹼基或核苷間連接相比，此糖、核鹼基或核苷間連接係經差異性修飾。其餘的糖、核鹼基及核苷間連接可以獨立地修飾或未修飾、相同或不同。
如本文所用，術語「嵌合寡核苷酸」係指具有至少一個糖、核鹼基或核苷間連接的寡核苷酸，與同一寡核苷酸內的至少一種其他糖、核鹼基或核苷間連接相比，此糖、核鹼基或核苷間連接係經差異性修飾。其餘的糖、核鹼基及核苷間連接可以獨立地修飾或未修飾、相同或不同
如本文所用，術語「混合主股寡聚化合物」係指一種寡聚化合物，其中該寡聚化合物的至少一個核苷間連接不同於該寡聚化合物的至少一個其他核苷間連接。
如本文所用，術語「標靶蛋白」係指需要對其進行調節的蛋白質。例如，標靶蛋白係血管收縮素原(AGT)。
如本文所用，術語「標靶基因」係指編碼標靶蛋白的基因。例如，標靶基因係血管收縮素原(AGT)。
如本文所用，術語「標靶核酸」係指其表現或活性能夠被綴合或未綴合的dsRNA化合物調節的任何核酸分子。標靶核酸包括但不限於從編碼標靶蛋白之DNA轉錄的RNA(包括但不限於前mRNA和mRNA或其部分)，以及衍生自此類RNA的cDNA，及miRNA。例如，標靶核酸
可以係其表現與特定病症或疾病狀態關聯的細胞基因(或從該基因轉錄的mRNA)，或來自傳染原的核酸分子。
如本文所用，術語「標靶siRNA」及「標靶dsRNA」係指被REVERSIR化合物靶向的化合物。
如本文所用，術語「靶向」或「靶向於」係指dsRNA的反義股與特定標靶核酸分子或標靶核酸分子內核苷酸的特定區域的關聯。
如本文所用，術語「核鹼基互補性」係指能夠與另一核鹼基進行鹼基配對的核鹼基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)互補。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)與尿嘧啶(U)互補。在某些實施方案中，互補核鹼基係指能夠與其目標核酸的核鹼基進行鹼基配對的反義化合物的核鹼基。例如，如果反義化合物的某個位置的核鹼基能夠與目標核酸的某個位置的核鹼基形成氫鍵，則寡核苷酸與目標核酸之間的氫鍵位置被認為係該核鹼基對互補。
如本文所用，術語「非互補核鹼基」係指彼此不形成氫鍵或以其他方式支持雜交的一對核鹼基。
如本文所用，術語「互補」係指寡聚化合物經由核鹼基互補性與另一寡聚化合物或核酸雜交的能力。在某些實施方案中，當每個分子中足夠數量的相應位置被可以彼此鍵合以允許反義化合物及靶標之間穩定綴合的核鹼基佔據時，寡聚化合物及其靶標彼此互補。本發明所屬技術領域中具有通常知識者認識到，在不消除寡聚化合物保持關聯的能力的情況下包含錯配係可能者。因此，本文描述的係可包含高達約20%錯配(即，與標靶的相應核苷酸不互補的核鹼基)的核苷酸的寡聚化合物。較佳地，寡聚
化合物含有不超過約15%、更佳係不超過約10%、最佳係選不超過5%或沒有錯配。剩餘的核苷酸係核鹼基互補的或不會破壞雜交(例如，通用鹼基)。本發明所屬技術領域中具有通常知識者將認識到本文提供的化合物與目標核酸互補至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
本文中的術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可以針對兩個寡核苷酸或多核苷酸之間的鹼基匹配來使用，例如雙股RNA劑及REVERSIR的反義股，正如從它們的使用上下文中可以理解的那樣。
如本文所用，「雜交」係指互補寡聚化合物(例如，dsRNA的反義股與其標靶核酸或REVERSIR與其標靶dsRNA)的配對。雖然不限於特定機制，但最常見的配對機制涉及互補核苷或核苷酸鹼基(核鹼基)之間的氫鍵，其可以係沃森-克里克、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氫鍵。例如，天然鹼基腺嘌呤係與天然核鹼基胸苷和尿嘧啶互補的核鹼基，經由形成氫鍵配對。該天然鹼基鳥嘌呤係與天然鹼基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶互補的核鹼基。雜交可以在多種的情況下發生。
如本文所用，術語「特異性雜交」係指寡聚化合物以比與另一核酸位點雜交更大的親和力與一個核酸位點雜交的能力。在某些實施方案中，dsRNA的反義股與多於一個標靶位點特異性雜交。
如本文所用，術語「調節」係指與調節前的功能或活性水平相比時對功能或活性的擾動。例如，調節包括基因表現的增加(刺激或誘導)或減少(抑制或減少)的變化。作為進一步的例子，表現的調節可以包括擾動前mRNA加工的剪接位點選擇。
如本文所用，術語「表現」係指將基因的編碼訊息轉化為細胞中存在並運行的結構的所有功能和步驟。此類結構包括但不限於轉錄及轉譯的產物。
如本文所用，「變異體」係指可以由DNA的相同基因組區域產生的替代RNA轉錄物。該變異體包括但不限於“前mRNA變體”，其係由相同基因組DNA產生的轉錄物，其在起始位置或終止位置不同於由相同基因組DNA產生的其他轉錄物，並且包含內含子和外顯子序列。變異體還包括但不限於具有替代剪接點或替代起始及終止密碼子的變異體。
如本文所用，「高親和力核苷酸修飾」係指與天然存在的核苷酸相比，具有至少一個修飾的核鹼基、核苷間連接或糖部分體的核苷酸，使得此修飾增加反義化合物的親和力，該反義化合物包含對其標靶核酸進行高親和力修飾的核苷酸。高親和力修飾包括但不限於包含2'-修飾的糖的核苷酸。
如本文所用，術語「2'-修飾的」或「2'-取代的」係指在2'位置包含除H或OH之外的取代基的糖。2'-修飾的單體包括但不限於BNA及具有2'-取代基的單體(例如核苷和核苷酸)，例如烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烯丙基、OC1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(=O))-N(Rm)(Rn)，其中每個Rm和Rn獨立地為H或取代或未取代的C1-C10烷基。在某些實施方案中，寡聚化合物包含不具有式2'-O(CH2)nH的2'修飾單體，其中n為1至6。在某些實施方案中，寡聚化合物包含不具有式2'-OCH3的2'修飾單體。在某些
實施方案中，寡聚化合物包含不具有下式的2'修飾單體，或替代地，2'-O(CH2)2OCH3。
如本文所用，術語「鎖核酸」或「LNA」或「鎖核苷」或「鎖核苷酸」係指核苷或核苷酸，其中核苷的呋喃糖部分包括連接呋喃糖環的兩個碳原子的橋，從而形成雙環系統。所核酸意指稱為雙環核酸(BNA)。
如本文所用，除非另有說明，術語「亞甲氧基LNA」單獨指β-D-亞甲氧基LNA。
如本文所用，術語「MOE」係指2'-O-甲氧基乙基取代基。
如本文所用，術語「藥學上可接受的鹽」係指活性化合物的鹽，其保留活性化合物的所需生物活性並且不賦予其不期望的毒理學作用。
如本文所用，術語「帽結構」或「終端帽部分體」係指已併入反義化合物任一終端的化學修飾。
如本文所用，「接觸細胞」一詞，例如使細胞與REVERSIR接觸，包括藉由任何可能的方式接觸細胞。接觸細胞包括體外接觸細胞或體內接觸細胞。此接觸可以直接或間接進行。因此，例如，可以由執行該方法的個體將REVERSIR置於與細胞物理接觸，或者可替代地，可以將REVERSIR置於將允許或導致其隨後與細胞接觸的情況。
體外接觸細胞可以藉由例如將細胞與REVERSIR一起孵育來進行。體內接觸細胞可以例如將REVERSIR注射到細胞所在的組織或附近，或將REVERSIR注射到另一個區域，例如血流或皮下空間，使得該劑隨後將到達待接觸細胞所在的組織。體外和體內接觸方法的組合亦係可能者。例如，細胞亦可以在體外與REVERSIR接觸並隨後移植到個體。
在某些實施方案中，使細胞與REVERSIR接觸包括藉由促進或影響細胞的攝取或吸收來「引入」或「遞送REVERSIR至細胞中」。REVERSIR的吸收或攝取可以經由無輔助擴散或活性細胞過程或藉由輔劑或裝置發生。將REVERSIR引入細胞可以在體外或體內進行。例如，對於體內引入，REVERSIR可以注射到組織部位或全身施用。體外引入細胞包括本領域已知的方法，例如電穿孔和脂轉染。進一步的方法在下文中描述或係本領域已知者
術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」係包含封裝藥物活性分子的脂質層的囊泡，例如核酸分子，例如iRNA或轉錄iRNA的質粒。LNP描述於例如美國專利號6,858,225、6,815,432、8,158,601及8,058,069中，其全部內容經引用併入本文。在一些實施方案中，抑制本文所述雙股核糖核酸(dsRNA)劑之RNAi活性的一種或多種寡核苷酸(REVERSIR)被封裝在LNP中。
本文所使用的「治療有效量」意在包括當給予個體時足以實現疾病治療(例如，藉由減少、改善或維持現有疾病或疾病的一種或多種症狀)的REVERSIR的量。「治療有效量」可以根據REVERSIR、REVERSIR的給藥方式、疾病及其嚴重程度和待治療個體的病史、年齡、體重、家族史、基因組成、先前或伴隨治療的類型(如果有)以及其他個別特徵而變化。
「治療有效量」亦包括以適用於任何治療的合理效益/風險比產生一些期望效果的REVERSIR的量。本發明方法中所採用的REVERSIR可以以足夠的量施用以產生適用於此類治療的合理的益處/風險比。
如本文所用，「施用」係指向動物個體例如人類提供RNAi劑及/或REVERSIR，並且包括但不限於由醫學專業人員施用和自我施用。
如本文所用，術語「共同施用」係指向個體(例如人類個體)提供RNAi劑和REVERSIR。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR一起施用。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR分開施用。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR同時施用。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR在不同時間施用。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR經由相同的施用途徑施用。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR經由不同的施用途徑施用。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR包含在同一藥物製劑中。在某些實施方案中，RNAi劑和REVERSIR處於單獨的製劑中。
本文所使用「藥學上可接受的」一詞係指那些化合物、材料(包括鹽)、組成物或劑型，其係在合理的醫學判斷範圍內，適合與人類個體和動物個體的組織接觸，沒有過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，並具有合理的效益/風險比。
本文所使用的「藥學上可接受的載體」一詞係指藥學上可接受的材料、組成物或媒劑，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(如潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅、或硬脂酸)或溶劑封裝材料，涉及將主題化合物從一個器官或身體的一部分攜帶或運輸至另一個器官或身體的一部分。每種載體必須係「可接受的」，即與製劑的其他成分相容並且不會對所治療的個體經濟造成傷害。此類載體係本領域已知者。藥學上可接受的載體包括用於注射給藥的載體。
如本文所用，術語「體外」係指在人工環境中發生的情形，例如在試管或反應容器中、在細胞培養物中等，而不係在有機體(例如動物或植物)內。如本文所用，術語「離體」係指從活有機體取出並在有機體外部(例如，在試管中)培養的細胞。如本文所用，術語「體內」係指在有機體(例如動物、植物和/或微生物)內發生的情形。
如本文所用，「個體」係動物，例如表現通用目標序列的哺乳動物，包括靈長類動物(例如人類、非人類靈長類動物，例如猴子和黑猩猩)、非靈長類動物(例如例如牛、豬、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠或小鼠)或鳥，內源性或異源性。在一個實施方案中，該個體係人類。在一些實施方案中，該個體係女性人類。在其他實施方案中，該個體為男性。在一個實施方案中，該個體係成年個體。在另一個實施方案中，該個體係兒科個體。
在禁止對人體實施之方法申請專利的司法管轄區，向人類個體「施用」組成物的含義應限於處方人類個體將藉由任何技術自行施用的受管制物質。(例如，口服、吸入、局部施用、注射、插入等)。旨在與定義可專利標的之法律或法規一致的最廣泛的合理解釋。在不禁止對在人體上實施之方法申請專利的司法管轄區，組成物的「施用」包括在人體上實施的方法以及前述活動。
如本文所用，術語「腸胃外施用」係指經由注射或輸注施用。腸胃外施用包括但不限於皮下施用、靜脈注射或肌肉施用。
如本文所用，術語「皮下施用」係指正好在皮膚下方施用。「靜脈內施用」係指施用到靜脈。
如本文所用，術語「劑量」係指單次施用中提供的藥劑的指定量。在某些實施方案中，劑量可以以兩次或更多次推注、片劑或注射施用。例如，在某些實施方案中，當需要皮下施用時，所需劑量需要單次注射不容易容納的體積。在這樣的實施方案中，可以使用兩次或更多次注射來實現期望的劑量。在某些實施方案中，可以在兩次或更多次注射中施用劑量以最小化個體中的注射部位反應。
如本文所用，術語「劑量單位」係指提供RNAi劑和/或REVERSIR的形式。在某些實施方案中，劑量單位係包含冷凍乾燥RNAi劑及/或REVERSIR的小瓶。在某些實施方案中，劑量單位係包含重構的RNAi劑及/或REVERSIR的小瓶。
如本文所用，術語「活性藥物成分」係指醫藥組成物中提供期望效果的物質。
如本文所使用的，術語「副作用」係指可歸因於除期望效果之外的治療的生理反應。在某些實施方案中，副作用包括但不限於注射部位反應、肝功能檢查異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常和肌肉病變。例如，血清中轉胺酶水平升高可能表示肝毒性或肝功能異常。例如，膽紅素升高可能表示肝毒性或肝功能異常。
如本文所用，術語「樣本」包括從個體分離的類似流體、細胞或組織的集合，以及個體體內存在的流體、細胞或組織。生物流體的例子包括血液、血清和漿膜液、血漿、腦脊髓液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域的樣本。例如，樣本可以源自特定器官、器官的部分、或此等器官內的液體或細胞。在某些實施方
案中，樣本可源自肝臟(例如，整個肝臟或肝臟的某些節段或肝臟中的某些類型的細胞，例如肝細胞)。在一些實施方案中，「源自個體的樣本」係指從個體獲得的尿液。「源自個體的樣本」可以指來自個體的血液或源自血液的血清或血漿。
如本文所用，術語「烷基」係指含有多至二十四個碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基。烷基的實例包括但不限於甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至約24個碳原子，更通常1至約12個碳原子(C1-C12烷基)，更佳1至約6個碳原子。本文所使用的術語「低級烷基」包括1至約6個碳原子。本文所用的烷基可視需要地包括一個或多個另外的取代基。
如本文所用，術語「烯基」係指含有多至二十四個碳原子並具有至少一個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴鏈基團。烯基的實例包括但不限於乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯例如1,3-丁二烯等。烯基通常包含2至約24個碳原子，更通常包含2至約12個碳原子，更佳2至約6個碳原子。本文所使用的烯基可視需要地包括一個或多個另外的取代基。
如本文所用，術語「炔基」係指含有多至二十四個碳原子並具有至少一個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴基。炔基的實例包括但不限於乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基通常包含2至約24個碳原子，更通常包含2至約12個碳原子，更佳2至約6個碳原子。本文所使用的炔基可視需要地包括一個或多個另外的取代基。
如本文所用，術語「胺基烷基」係指胺基取代的烷基。該術語意在包括在任何位置具有胺基取代基的C1-C12烷基，並且其中該烷基將胺基烷基附接至母體分子。胺基烷基的烷基及/或胺基部分可以進一步被取代基取代。
如本文所用，術語「脂族」係指含有多至二十四個碳原子的直鏈或支鏈烴基，其中任何兩個碳原子之間的飽和度係單鍵、雙鍵或三鍵。脂族基團較佳含有1至約24個碳原子，更通常含有1至約12個碳原子，更佳含有1至約6個碳原子。脂族基團的直鏈或支鏈可以被一個或多個包括氮、氧、硫和磷的雜原子中斷。這種被雜原子間隔的脂族基團包括但不限於聚烷氧基，例如聚伸烷基二醇、聚胺和聚亞胺。本文所使用的脂族基團可以視需要地包括另外的取代基。
如本文所用，術語「脂環族」或「脂環基」係指環狀環系統，其中環係脂族者。環系統可包含一個或多個環，其中至少一個環係脂族者。較佳的脂環族化合物包括環中約5至約9個碳原子的環。本文所使用的脂環族可視需要地包括另外的取代基。本文所使用的術語「烷氧基」係指在烷基和氧原子之間形成的基團，其中氧原子用於將烷氧基附接至母體分子。烷氧基的例子包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、二級丁氧基、三級丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。本文所用的烷氧基可以視需要地包括另外的取代基。本文所使用的術語「鹵基」和「鹵素」係指選自氟、氯、溴和碘的原子。
本文所使用的術語「芳基」和「芳香族」係指具有一個或多個芳香環的單環或多環碳環系統基團。芳基的實例包括但不限於苯基、萘基、
四氫萘基、茚滿基、茚基等。較佳的芳基環系統在一個或多個環中具有約5至約20個碳原子。本文所使用的芳基可視需要地包括另外的取代基。
本文所使用的術語「芳烷基」和「芳基烷基」係指在烷基和芳基之間形成的基團，其中烷基用於將芳烷基附接至母體分子。實例包括但不限於芐基、苯乙基等。本文所使用的芳烷基可視需要地包括附接至形成自由基基團的烷基、芳基或這兩個基團的另外的取代基。
本文所使用的術語「雜環基團」係指包括至少一個雜原子且係不飽和、部分飽和或完全飽和的單環或多環系統的基團，從而包括雜芳基基團。雜環亦意在包括稠合環系統，其中一個或多個稠合環含有至少一個雜原子並且其他環可含有一個或多個雜原子或視需要地不含有雜原子。雜環基團通常包括至少一種選自硫、氮或氧的原子。雜環基團的例子包括[1,3]二氧雜環戊烷、吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌
基、噁唑烷基、異噁唑烷基、
啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、喹喔啉基、噠
基、四氫呋喃基等。本文所使用的雜環基團可視需要地包括另外的取代基。本文所使用的術語「雜芳基」和「雜芳族」係指包含單環或多環芳環、環系統或稠合環系統的基團，其中至少一個環係芳香族的並且包括一個或多個雜原子。雜芳基亦意在包括稠合環系統，包括其中一個或多個稠合環不含雜原子的系統。雜芳基通常包括一個選自硫、氮或氧的環原子。雜芳基的實例包括但不限於吡啶基、吡
基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔
啉基等。雜芳基可以直接或經由連接部分體例如脂族基團或雜原子附接至母體分子。本文所使用的雜芳基可視需要地包括另外的取代基。
如本文所用，術語「雜芳基烷基」係指如先前定義的雜芳基，其具有可將雜芳基烷基附接至母體分子的烷基。實例包括但不限於吡啶基甲基、嘧啶基乙基、萘啶基丙基等。本文所使用的雜芳基烷基可視需要地在雜芳基或烷基部分之一或二者包括另外的取代基。
如本文所用，術語「單環或多環結構」包括具有稠合或連接的環的單環或多環的所有環系統，並且意在包括各自選自脂肪族、脂環族、芳基、雜芳基、芳烷基、芳基烷基、雜環基、雜芳基、雜芳香族、雜芳基烷基的單環系統和混合環系統。此類單環和多環結構可含有均勻的環或不同飽和度的環，包括完全飽和、部分飽和或完全不飽和。每個環可包含選自C、N、O和S的環原子以產生雜環以及可存在於混合基序中的僅包含C環原子的環，例如苯并咪唑，其中一個環僅具有碳環原子且稠合環具有兩個氮原子。單環或多環結構可進一步被取代基取代，例如鄰苯二甲醯亞胺，其具有附接至環之一者的兩個=O基。另一方面，單環或多環結構可以直接經由環原子、經由取代基或雙官能連接部分體附接至母體分子。
本文所使用的術語「醯基」係指從有機酸除去羥基而形成的基團，並且具有通式-C(O)-X，其中X通常係脂族、脂環族或芳香族。實例包括脂肪族羰基、芳香族羰基、脂肪族磺醯基、芳香族亞磺醯基、脂肪族亞磺醯基、芳香族磷酸酯、脂肪族磷酸酯等。本文所使用的醯基可視需要地包括另外的取代基。
如本文所用，術語「烴基」包括包含C、O和H的基團。包括具有任何飽和度的直鏈、支鏈和環狀基團。此類烴基可包含一或多個選自N、O和S的雜原子且可進一步被一或多個取代基單或多取代。
如本文所用，術語「取代基」和「取代基團」包括通常添加至其他基團或母體化合物以增強所需性質或產生所需效果的基團。取代基可以係受保護的或未受保護的，並且可以被添加到母體化合物中的一個或多個可用位點。取代基亦可以進一步被其他取代基取代，並且可以直接或透過連接基團例如烷基或烴基連接至母體化合物。此類基團包括但不限於鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、醯基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂族基團、脂環族基、烷氧基、取代的側氧(-O-Raa)、芳基、芳烷基、雜環、雜芳基、雜芳基烷基、胺基(-NRbbRcc)、亞胺基(=NRbb)、醯胺基(-C(O)N-RbbRcc或-N(Rbb)C(O)Raa)，疊氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、脲基(carbamido)(-OC(O)NRbbRcc或-N(Rbb)C(O)ORaa)、脲基(ureido)(-N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、硫脲基(-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、胍基(-N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc)、脒基(-C(=NRbb)-NRbbRcc或-N(Rbb)C(NRbb)Raa)、硫醇(-SRbb)、亞磺醯基(-S(O)Rbb)、磺醯基(-S(O)2Rbb)、磺醯胺基(-S(O)2NRbbRcc或-N(Rbb)S(O)2Rbb)及綴合基。其中每個Raa、Rbb和Rcc獨立地係H、視需要連接的化學官能基或另外的取代基，較佳清單包括但不限於H、烷基、烯基、炔基、脂族基、烷氧基、醯基、芳基、芳烷基、雜芳基、脂環族、雜環族及雜芳基烷基。
II.本發明的REVERSIR化合物
本發明提供抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi抑制活性的REVERSIR化合物。
一般而言，本發明的REVERSIR化合物係16-30個核苷酸長度，例如16-24、18-22或18-20個核苷酸長度的單股寡核苷酸(寡聚物)。單股寡核苷酸包含與包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的反義股實質上互補的核苷酸序列。寡核苷酸的核苷酸序列可以與該dsRNA劑的反義股之整個核苷酸序列至少約90%，例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補。
在某些實施方案中，相較於天然存在的寡聚物例如DNA或RNA，REVERSIR化合物係化學修飾的寡聚化合物。
因此，在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種修飾的核苷酸，即，至少一種修飾的單體。
在其他實施方案中，寡核苷酸的實質上所有核苷酸都係修飾的核苷酸，例如，不多於5、4、3、2或1個核苷酸係未修飾的核苷酸，例如，實質上所有核苷酸都包含核苷酸修飾選自2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代的烷基修飾、2'-鹵基修飾、去氧核苷酸修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、橋接核酸(2',4'-BNA)、2'-O-乙基(cEt)及2'-O-甲基修飾。
在另一個實施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都係修飾的核苷酸，例如，所有核苷酸都包含選自由下述所組成群組之核苷酸修飾：2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代烷基修飾、2'-鹵基修飾、去氧
核苷酸修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、橋接核酸(2',4'-BNA)、2'-O-乙基(cEt)及2'-O-甲基修飾。
在某些此類實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種高親和力修飾。在一個實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含四種高親和力修飾。在一種實施方式中，本發明的REVERSIR化合物包含五種高親和力修飾。
在某些實施方案中，這種高親和力修飾選自包含2'-修飾糖的修飾(例如，核苷和核苷酸)，包括但不限於：BNA和具有2'-取代基的修飾(例如核苷和核苷酸)，該取代基係例如烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)，其中每個Rm和Rn獨立地為H或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種β-D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA修飾。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種α-D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA修飾。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種(S)-cEt修飾。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種高親和力修飾，條件係該化合物不包含含有2'-O(CH2)nH的核苷酸，其中n為1至6。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種高親和力修飾，條件係該化合物不包含含有2'-OCH3或2'-O(CH2)2OCH3的核苷酸。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)高親和力修飾，條件係該化合物不包含α-L-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種高親和力修飾，條件係該化合物不包含β-D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含一種或多種高親和力修飾，條件係該化合物不包含α-L-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA或β-D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA。
在一些實施方案中，包含高親和力核苷酸修飾的核苷酸中的至少一種與dsRNA劑的反義股中包含熱不穩定核苷酸的核苷酸鹼基配對。
在一些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少兩個高親和力核苷酸修飾，例如LNA。在一些實施方案中，至少兩個高親和力核苷酸修飾例如LNA位於位置2和6；位置2和5；位置2和7；位置2和8；位置2和9；位置2和14；位置2和15；及/或位置2和16，從寡核苷酸的3'-端計數。
在一個實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含四種高親和力修飾，例如四種LNA。在一個實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含五種高親和力修飾，例如五種LNA。
在某些實施方案中，高親和力核苷酸修飾例如LNA位於位置2、6、8和14；2、4、5、6和7；2、4、6、8和13；2、4、6、8和14；2、4、6、8和15；2、4、6、8和16；2、8、10和14；2、4、6、8和14；或2、8、12和14，從寡核苷酸的3'-端計數。
核苷的天然存在的鹼基部分通常係雜環鹼基。此類雜環鹼基的兩類最常見的類型係嘌呤和嘧啶。對於包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸基團可以連接至糖的2'、3'或5'羥基部分。在形成寡核苷酸時，那些磷酸基將相鄰的核苷彼此共價連接以形成線性聚合化合物。在寡核苷酸內，磷酸基通常被稱為形成寡核苷酸的核苷間或核苷酸間主鏈。RNA和DNA天然存在的連接或主鏈係3'至5'磷酸二酯連接。
除「未修飾的」或「天然的」核鹼基如嘌呤核鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)以及嘧啶核鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)之外，許多修飾本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的核鹼基或核鹼基模擬物適用於本文所述的化合物。未修飾的或天然的核鹼基可以被修飾或替換以提供具有改進的特性的寡核苷酸。例如，核酸酶抗性寡核苷酸可以用此等鹼基或用合成和天然核鹼基(例如肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、9-(β-D-呋喃核糖)嘌呤(nebularine)、異鳥苷或結核菌素)和本文所述的任何一種寡聚物修飾來製備。替代地，可以使用任何上述鹼基和「通用鹼基」的取代或修飾的類似物。當天然鹼基被非天然及/或通用鹼基取代時，本文稱核苷酸包
含修飾的核鹼基及/或核鹼基修飾。修飾的核鹼基及/或核鹼基修飾還包括天然、非天然和通用鹼基，其包含綴合部分體，例如，本文所描述的配體。用於與核鹼基綴合的較佳綴合部分體包括陽離子胺基，其可透過適當的烷基、烯基或具有醯胺鍵的連接子與核鹼基綴合。
如本文所述的REVERSIR化合物亦可以包括核鹼基(在本領域中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文所用，「未修飾的」或「天然的」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。示例性的修飾核鹼基包括但不限於其他合成和天然核鹼基，例如肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、9-(β-D-呋喃核糖)嘌呤、異鳥苷、結核菌素、2-(鹵基)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(胺基)腺嘌呤、2-(胺基烷基)腺嘌呤、2-(胺基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)-N6-(異戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(脫氮雜)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(胺基)腺嘌呤、8-(鹵基)腺嘌呤、8-(羥基)腺嘌呤、8-(硫烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6-(異戊基)腺嘌呤、N6-(甲基)腺嘌呤、N6,N6-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鳥嘌呤、2-(丙基)鳥嘌呤、6-(烷基)鳥嘌呤、6-(甲基)鳥嘌呤、7-(烷基)鳥嘌呤、7-(甲基)鳥嘌呤、7-(脫氮雜)鳥嘌呤、8-(烷基)鳥嘌呤、8-(烯基)鳥嘌呤、8-(炔基)鳥嘌呤、8-(胺基)鳥嘌呤、8-(鹵基)鳥嘌呤、8-(羥基)鳥嘌呤、8-(硫烷基)鳥嘌呤、8-(硫醇)鳥嘌呤、N-(甲基)鳥嘌呤、2-(硫基)胞嘧啶、3(脫氮雜)-5-(氮雜)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(鹵基)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4-(乙醯基)胞嘧啶、3-(3-
胺基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基胺基甲基)-2(硫基)尿嘧啶、4-(硫代基)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基胺基甲基)-4(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(甲基胺基甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶，5-(烯丙胺基)尿嘧啶、5-(胺基烯丙基)尿嘧啶、5-(胺基烷基)尿嘧啶、5(胍基烷基)尿嘧啶、5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基胺基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基胺基烷基)尿嘧啶、5-(鹵基)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮)尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N3-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即假尿嘧啶)、2-(硫基)假尿嘧啶、4-(硫基)假尿嘧啶、2,4-(二硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4(二硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4(二硫基)假尿嘧啶、1-取代的假尿嘧啶、1-取代的2(硫基)-假尿嘧啶、1-取代的4-(硫基)假尿嘧啶、1-取代的2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-(胺基烷基胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(胺基烷基胺基-羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(胺基烷基胺基羰基乙烯基))-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(胺基烷基胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-吩噁
-1-基、1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噁
-1-基、1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-
吩噻
-1-基、1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噻
-1-基、7-取代的1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-吩噁
-1-基、7-取代的1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噁
-1-基、7-取代的1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-吩噻
-1-基、7-取代的1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噻
-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-吩噁
-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噁
-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-吩噻
-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噻
-1-基、7-(胍烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-吩噁
-1-基、7-(胍烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噁
-1-基、7-(胍烷基-羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧)-吩噻
-1-基、7-(胍烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-吩噻
-1-基、1,3,5-(三氮雜)-2,6-(二氧雜)-萘、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、9-(β-D-呋喃核糖)嘌呤、結核菌素、異鳥苷、肌苷基、2-氮雜-肌苷基、7-脫氮雜-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、胺基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)異喹啉基、5-(甲基)異喹啉基、3-(甲基)-7-(丙炔基)異喹啉基、7-(氮雜)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮雜)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡
基、異喹啉基、7-(丙炔基)異喹啉基、丙炔基-7-(氮雜)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、稠四苯基、稠五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮雜)嘧啶、2-(胺基)嘌呤、2,6-(二胺基)嘌呤、5-取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、O6-取代的嘌呤、取代的1,2,4-三唑、吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、對位取代的
-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、鄰位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、雙-鄰位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、對-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、鄰-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、雙-鄰-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-側氧-7-胺基-吡啶并嘧啶-3-基、2-側氧-吡啶并嘧啶-3-基、或其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。替代地，可以使用任何上述鹼基和「通用鹼基」的取代或修飾的類似物。
如本文所用，通用核鹼基係可以與所有四種天然存在的核鹼基鹼基配對而實質上不影響寡核苷酸雙股體的融解行為、胞內酶的識別或活性的任何核鹼基。一些示例性的通用核鹼基包括但不限於2,4-二氟甲苯、硝基吡咯基、硝基吲哚基、8-氮雜-7-脫氮雜腺嘌呤、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基異喹啉酮基、5-甲基異喹啉酮基、3-甲基-7-丙炔基異喹啉酮基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡
基、異喹啉酮基、7-丙炔基異喹啉酮基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、稠四苯基、稠五苯基及其結構衍生物(參見例如Loakes,2001,Nucleic Acids Research,29,2437-2447)。
其他核鹼基包括在美國專利第3,687,808號中所公開者；2009年3月26日提交的國際申請號PCT/US09/038425中所公開者；Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley & Sons,1990中所公開者；由English等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613
所公開者；Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijin,P.Ed.Wiley-VCH,2008中所公開者；由Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,CRC Press,1993所公開者。上述所有內容均藉由引用併入本文。
在某些實施方案中，修飾的核鹼基係在結構上與親代核鹼基相當相似的核鹼基，例如7-脫氮雜嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G-夾。在某些實施方案中，核鹼基模擬物包括更複雜的結構，例如三環吩噁
核鹼基模擬物。用於製備上述修飾核鹼基的方法係本發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知者。
在一些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)選自以下的G-夾核鹼基：
其中，n為0、1、2、3、4、5或6。
本文提供的REVERSIR化合物可以包含一種或多種具有修飾的糖部分的單體，包括核苷或核苷酸。例如，核苷的呋喃糖環可以多種方式修飾，包括但不限於添加取代基、橋接兩個非孿生環原子以形成鎖核酸或雙環核酸。在某些實施方案中，化合物包含一種或多種LNA單體。
在鎖核酸的一些實施方案中，呋喃糖基的2’位置藉由獨立地選自以下的連接子連接至4’位置：-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-[C(R1)(R2)]n-N(R1)-、-[C(R1)(R2)]n-N(R1)-O-、-[C(R1R2)]n-O-N(R1)-、-C(R1)=C(R2)-O-、-C(R1)=N-、-C(R1)=N-O-、-C(=NR1)-、-C(=NR1)-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=S)-、-C(=S)O-、-C(=S)S-、-O-、-Si(R1)2-、-S(=O)x-及-N(R1)-；
其中：
x為0、1或2；
n為1、2、3或4；
每個R1和R2獨立地為H、保護基、羥基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、雜環基、取代的雜環基、雜芳基、取代的雜芳基、C5-C7脂環基、取代的C5-C7脂環基、鹵素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、醯基(C(=O)-H)、取代的醯基、CN、磺醯基(S(=O)2-J1)或磺醯基(S(=O)-J1)；以及
J1和J2各自獨立地為H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳
基、取代的C5-C20芳基、醯基(C(=O)-H)、取代的醯基、雜環基、取代的雜環基、C1-C12胺基烷基、取代的C1-C12胺基烷基或保護基。
在一個實施方案中，LNA化合物的每個連接子獨立地為-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-。在另一個實施方案中，每個該連接子獨立地為4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R1)-2'和4'-CH2-N(R1)-O-2'-，其中每個R1獨立地為H、保護基或C1-C12烷基。
某些LNA已被製備並在專利文獻以及科學文獻中公開(Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；WO 94/14226；WO 2005/021570；Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；揭露LNA的已公告的美國專利及已公開的申請的範例包括，例如美國專利第7,053,207號；第6,268,490號；第6,770,748號；第6,794,499號；第7,034,133號及第6,525,191號；以及，美國預先核准公開第2004-0171570號；第2004-0219565號；第2004-0014959號；第2003-0207841號；第2004-0143114號；及第20030082807號。
本文亦提供LNA，其中核糖基糖環的2'-羥基與糖環的4'碳原子連接，從而形成亞甲氧基(4'-CH2-O-2')連接，形成雙環糖部分體(評論於Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch
等人，Chem.Biol.,2001,81-7；及Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；亦參酌美國專利第6,268,490號及第6,670,461號)。連接可以係橋接2'氧原子和4'碳原子的亞甲基(-CH2-)基團，其中術語亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA用於表示雙環部分體；如果該位置有伸乙基，則使用術語伸乙基氧基(4'-CH2CH2-O-2')LNA(Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456：Morita等人，Bioorganic Medicinal Chemistry,2003,11,2211-2226)。亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA和其他雙環糖類似物與互補DNA和RNA顯示出非常高的雙股體熱穩定性(Tm=+3至+10℃)、對3'-核酸外切降解的穩定性及良好的溶解性能。包含BNA的有效且無毒的反義寡核苷酸已被描述(Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638)。
亦討論過的亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA的異構體係α-L-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA，已被證明具有優異的穩定性對抗3'-核酸外切酶。α-L-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA被摻入反義缺口聚體和嵌合體中，顯示出有效的反義活性(Frieden等人，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA單體腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和製備及其寡聚化和核酸辨識特性已被描述(Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。BNA及其製備亦描述於WO 98/39352和WO 99/14226中。
亦製備亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA、硫代磷酸酯-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA和2'-硫基-LNA的類似物(Kumar等人，Bioorg.Med.
Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。亦描述包含寡去氧核糖核苷酸雙股體作為核酸聚合酶基質的鎖核苷類似物的製備(Wengel等人，WO 99/14226)。此外，本領域已經描述2'-胺基-LNA，一種新穎的構象限制的高親和力寡核苷酸類似物的合成(Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。此外，還製備2'-胺基-和2'-甲胺基-LNA，並且先前已報告它們與具有互補RNA和DNA股的雙股體的熱穩定性。
修飾的糖部分體係眾所周知的並且可用於改變、通常增加反義化合物對其標靶的親和力和/或增加核酸酶抗性。較佳的修飾糖的代表性清單包括但不限於雙環修飾糖，包括亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA和伸乙氧基(4'-(CH2)2-O-2 '橋)ENA；取代的糖，特別係具有2'-F、2'-OCH3或2'-O(CH2)2-OCH3取代基的2'-取代的糖；和4'-硫基修飾的糖。糖亦可以被糖模擬基團等取代。製備修飾糖的方法係本發明所屬技術領域中具有通常知識者眾所周知者。教示此類修飾糖的製備的一些代表性專利和出版物包括但不限於美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；第5,792,747號；第5,700,920號；第6,531,584號及第6,600,032號；以及WO 2005/121371。
「氧基」-2’羥基修飾的實例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R=H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，
O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，n=1-50；「鎖」核酸(LNA)，其中核苷的呋喃糖部分包括連接呋喃糖環的兩個碳原子的橋，從而形成雙環系統；O-胺或O-(CH2)nAMINE(n=1-10、AMINE=NH2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基、乙二胺或多胺基)；及O-CH2CH2(NCH2CH2NMe2)2。
「去氧」修飾包括氫(即去氧核糖，其與單股突出特別相關)；鹵基(例如氟)；胺基(例如NH2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE=NH2；烷基胺基、二烷基胺基，雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基)；-NHC(O)R(R=烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫基烷氧基；硫基烷基；烷基；環烷基；芳基；烯基和炔基，其可視需要地被例如胺基官能基取代。
其他適當的2’-修飾，例如修飾的MOE，描述於美國專利申請公開第20130130378號，其內容經引用併入本文。
2'位置的修飾可以存在於阿拉伯糖構型中。術語「阿拉伯糖構型」係指在核糖的C2’放置取代基，其構型與阿拉伯糖中的2’-OH相同。
糖可以在糖中的相同碳包含兩種不同的修飾，例如孿生修飾。糖基還可以含有一個或多個具有與核糖中相應碳相反的立體化學構型的碳。因此，REVERSIR化合物可以包括一種或多種含有例如阿拉伯糖作為糖的單體。單體可以在糖的1’位置具有α連接，例如α-核苷。單體亦可以
在4'-位具有相反的構型，例如C5'和H4'或取代它們的取代基彼此互換。當C5'和H4'或取代它們的取代基彼此互換時，糖被稱為在4'位被修飾。
本發明的REVERSIR化合物還可以包括無鹼基糖，即在C-1’處缺乏核鹼基或具有其他化學基團代替C1'處的核鹼基的糖。參見例如美國專利第5,998,203號，其內容全部併入本文。此等無鹼基糖還可為進一步含有在一個或多個組成糖原子的修飾。REVERSIR化合物還可以含有一種或多種L異構體糖，例如L-核苷。糖基團的修飾亦可以包括用硫、視需要取代的氮或CH2基取代4'-O。在一些實施方案中，C1'和核鹼基之間的連接呈α構型
糖修飾亦可包括無環核苷酸，其中核糖碳之間的C-C鍵(例如，C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'、C1'-O4')不存在和/或核糖碳或氧中的至少一個(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)獨立地或組合地不存在於核苷酸。在一些實施方案中，無環核苷酸係
、
、
、
或
，其中B為修飾或未修飾的核鹼基，R1和R2獨立地為H、鹵素、OR3或烷基；且R3為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。
在一些實施方案中，糖修飾選自由下述所組成之群組：2'-H、2'-O-Me(2'-O-甲基)、2'-O-MOE(2'-O-甲氧基乙基)、2'-F,2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧乙基](2'-O-NMA)、2'-S-甲基、2'-O-CH2-(4'-C)(LNA)、2'-O-
CH2CH2-(4'-C)(ENA)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)和gem(孿生)2'-OMe/2'F，其中阿拉伯糖構型帶有2'-O-Me。
應理解，當特定核苷酸經由其2’-位連接到下一個核苷酸時，本文所描述的糖修飾可以置於該特定核苷酸的糖的3’-位處，例如，經由其2'-位連接的核苷酸。木糖構型中可以存在3'-位的修飾。術語「木糖構型」係指以與木糖中的3’-OH相同的構型在核糖的C3’放置取代基。
附接至C4'和/或C1'的氫可以被直鏈或支鏈視需要取代的烷基、視需要取代的烯基、視需要取代的炔基替代，其中烷基、烯基和炔基的主鏈可以含有一個或多個O、S、S(O)、SO2、N(R')、C(O)、N(R')C(O)O、OC(O)N(R')、CH(Z')、含磷連接、視需要取代的芳基、視需要取代的雜芳基、視需要取代的雜環或視需要取代的環烷基，其中R'為氫、醯基或視需要取代的脂族基，Z'為選自由下述所組成之群組：OR11、COR11、CO2R11、
、
、
、
、NR21R31、CONR21R31、CON(H)NR21R31、ONR21R31、CON(H)N=CR41R51、N(R21)C(=NR31)NR21R31、N(R21)C(O)NR21R31、N(R21)C(S)NR21R31、OC(O)NR21R31、SC(O)NR21R31、N(R21)C(S)OR11、N(R21)C(O)OR11、N(R21)C(O)SR11、N(R21)N=CR41R51、ON=CR41R51、SO2R11、SOR11、SR11及取代或未取代的雜環；R21和R31每次出現時獨立地為氫、醯基、未取代或取代的脂族、芳基、雜芳基、雜環、OR11、COR11、CO2R11或NR11R11'；或R21和R31與它們所附接的原子一
起形成雜環；R41和R51每次出現時獨立地係氫、醯基、未取代或取代的脂族基、芳基、雜芳基、雜環、OR11、COR11或CO2R11、或NR11R11'；且R11和R11'獨立地為氫、脂族基、取代的脂族基、芳基、雜芳基或雜環基。在一些實施方案中，附接至5'終端核苷酸的C4'的氫被替換。
在一些實施方案中，C4'和C5'一起形成視需要取代的雜環，較佳包含至少一個-PX(Y)-，其中X係H、OH、OM、SH、視需要取代的烷基、視需要取代的烷氧基、視需要取代的烷硫基、視需要取代的烷基胺基或視需要取代的二烷基胺基，其中M每次出現時獨立地為總電荷為+1的鹼金屬或過渡金屬；且Y為O、S或NR'，其中R'為氫，視需要取代的脂族基。較佳該修飾位於寡核苷酸的5終端。
在某些實施方案中，LNA包括具有下式的雙環核苷酸：
其中：
Bx為雜環鹼基部分；
T1為H或羥基保護基；
T2為H、羥基保護基或反應性磷基；
Z為C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、醯基、取代的醯基或取代的醯胺。
在一個實施方案中，每個取代基團獨立地被視需要保護的取代基單或多取代，該取代基獨立地選自鹵素、側氧、羥基、OJ1、NJ1J2、
SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2和CN，其中J1、J2和J3各自獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1。
在某些此類實施方案中，每個取代基團獨立地被取代基單或多取代，該取代基獨立地選自鹵素、側氧、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1，和NJ3C(=X)NJ1J2，其中J1、J2和J3各自獨立地為H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，且X為O或NJ1。
在某些實施方案中，Z基團為被一個或多個Xx取代的C1-C6烷基，其中每個Xx獨立地為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2或CN；其中每個J1、J2和J3獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施方案中，Z基團為被一個或多個Xx取代的C1-C6烷基，其中每個Xx獨立地為鹵基(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH3O-)、取代的烷氧基或疊氮基。
在某些實施方案中，Z基團為-CH2Xx，其中Xx為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2或CN；其中每個J1、J2和J3獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施方案中，Z基團為-CH2Xx，其中Xx為鹵基(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH3O-)或疊氮基。
在某些此類實施方案中，Z基團呈(R)-構型：
在某些此類實施方案中，Z基團呈(S)-構型：
在某些實施方案中，每個T1和T2為羥基保護基。羥基保護基的較佳清單包括芐基、苯甲醯基、2,6-二氯芐基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基二苯基矽基、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(對-甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。在某些實施方案中，T1為選自乙醯基、芐基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基二苯基矽基和二甲氧基三苯甲基的羥基保護基，其中較佳羥基保護基係T1為4,4'-二甲氧基三苯甲基。
在某些實施方案中，T2為反應性磷基團，其中較佳的反應性磷基團包括二異丙基氰基乙氧基亞磷醯胺和H-膦酸酯。在某些實施方案中，T1為4,4'-二甲氧基三苯甲基且T2為二異丙基氰基乙氧基亞磷醯胺。
在某些實施方案中，REVERSIR化合物具有至少一種下式的單體：
或下述式：
或下述式：
其中：
Bx為雜環鹼基部分體；
T3為H、羥基保護基、附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物的連接的綴合物基團或核苷間連接基團；
T4為H、羥基保護基、附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物的連接綴合物基團或核苷間連接基團；
其中T3和T4中的至少一個為附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體亞基或寡聚化合物的核苷間連接基團；並且
Z為C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、醯基、取代的醯基或取代的醯胺。
在一個實施方案中，每個取代基團被獨立地選自以下視需要經保護的取代基獨立地單或多取代：鹵素、側氧、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2和CN，其中每個J1、J2和J3獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1
在一個實施方案中，每個取代基團被獨立地選自以下的取代基獨立地單或多取代：鹵素、側氧、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1和NJ3C(=X)NJ1J2，其中每個J1、J2和J3獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O或NJ1。
在某些此類實施方案中，至少一個Z為C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實施方案中，每個Z獨立地為C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實施方案中，至少一個Z為C1-C6烷基。在某些實施方案中，每個Z獨立地為C1-C6烷基。在某些實施方案中，至少一個Z為甲基。在某些實施方案中，每個Z為甲基。在某些實施方案中，至少一個Z為乙基。在某些實施方案中，每個Z為乙基。在某些實施方案中，至少一個Z為取代的C1-C6烷基。在某些實施方案中，每個Z獨立地係取代的C1-C6烷基。在某些實施方案中，至少一個Z為取代的甲基。在某些實施方案中，每個Z為取代的甲基。在某些實施方案中，至少一個Z為取代的乙基。在某些實施方案中，每個Z為取代的乙基。
在某些實施方案中，至少一個取代基為C1-C6烷氧基(例如，至少一個Z為被一個或多個C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基)。在另一個實施方案中，每個取代基獨立地為C1-C6烷氧基(例如，每個Z獨立地為被一個或多個C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基)。
在某些實施方案中，至少一個C1-C6烷氧基取代基為CH3O-(例如，至少一個Z為CH3OCH2-)。在另一個實施方案中，每個C1-C6烷氧基取代基為CH3O-(例如，每個Z為CH3OCH2-)。
在某些實施方案中，至少一個取代基為鹵素(例如，至少一個Z為被一個或多個鹵素取代的C1-C6烷基)。在某些實施方案中，每個取代基獨立地為鹵素(例如，每個Z獨立地為被一個或多個鹵素取代的C1-C6烷基)。在某些實施方案中，至少一個鹵素取代基為氟(例如，至少一個Z為
CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。在某些實施方案中，每個鹵素取代基為氟(例如，每個Z獨立地為CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。
在某些實施方案中，至少一個取代基為羥基(例如，至少一個Z為被一個或多個羥基取代的C1-C6烷基)。在某些實施方案中，每個取代基獨立地為羥基(例如，每個Z獨立地為被一個或多個羥基取代的C1-C6烷基)。在某些實施方案中，至少一個Z係HOCH2-。在另一個實施方案中，每個Z為HOCH2-。
在某些實施方案中，至少一個Z為CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。在某些實施方案中，每個Z獨立地為CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。
在某些實施方案中，至少一個Z基團為被一個或多個Xx取代的C1-C6烷基，其中每個Xx獨立地為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X))NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2或CN；其中J1、J2和J3各自獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1。在另一實施方案中，至少一個Z基團為被一個或多個Xx取代的C1-C6烷基，其中每個Xx獨立地為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3O-)或疊氮基。
在某些實施方案中，每個Z基團獨立地係被一個或多個Xx取代的C1-C6烷基，其中每個Xx獨立地係OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2或CN；其中J1、J2和J3各自獨立地為H或C1-C6烷基，X為O、S或NJ1。在另一個實施方案中，每個Z基團獨立地為被一個或多個Xx取代的C1-C6烷基，其中每個Xx獨立地為鹵基(例如，氟)、羥基、烷氧基(例如，CH3O-)或疊氮基。
在某些實施方案中，至少一個Z基團為-CH2Xx，其中Xx為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2或CN；其中每個J1、J2和J3獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1。在某些實施方案中，至少一個Z基團為-CH2Xx，其中Xx為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3O-)或疊氮基。
在某些實施方案中，每個Z基團獨立地為-CH2Xx，其中每個Xx獨立地為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X))NJ1J2或CN；其中J1、J2和J3各自獨立地為H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施方案中，每個Z基團獨立地為-CH2Xx，其中每個Xx獨立地為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3O-)或疊氮基。
在某些實施方案中，至少一個Z為CH3-。在另一個實施方案中，每個Z為CH3。
在某些實施方案中，至少有一種單體的Z基團呈現下式表示的(R)-構型：
或下述式：
或下述式：
在某些實施方案中，下式各單體的Z基團呈(R)-構型。
在某些實施方案中，至少一種單體的Z基團呈下式表示的(S)-構型：
或下述式：
或下述式：
在某些實施方案中，式的每個單體的Z基團呈(S)-構型。
在某些實施方案中，T3為H或羥基保護基。在某些實施方案中，T4為H或羥基保護基。在另一個實施方案中，T3為附接至核苷、核苷酸或單體亞基的核苷間連接基。在某些實施方案中，T4為附接至核苷、核苷酸或單體亞基的核苷間連接基。在某些實施方案中，T3為附接至寡核苷或寡核苷酸的核苷間連接基。在某些實施方案中，T4為附接至寡核苷或寡核苷酸的核苷間連接基。在某些實施方案中，T3為附接至寡聚化合物的核
苷間連接基。在某些實施方案中，T4為附接至寡聚化合物的核苷間連接基。在某些實施方案中，T3和T4的至少一個包含選自磷酸二酯或硫代磷酸酯的核苷酸間連接基。
在某些實施方案中，REVERSIR化合物具有至少一個具有下式的至少兩個連續單體的區域：
或下述式：
或下述式：
在某些此類實施方案中，LNA包括但不限於(A)α-L-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA、(B)β-D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA、(C)伸乙氧基(4'-(CH2)2-O-2')LNA、(D)胺氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')LNA和(E)氧胺基(4'-CH2-N(R)-O-2')LNA，如下所示：
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含上式的至少兩個連續單體的至少兩個區域。在某些實施方案中，化合物包含有缺口的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含約8至約14個連續β-D-2'-去氧呋喃核糖基核苷的至少一個區域。在某些實施方案中，化合物包含約9至約12個連續β-D-2'-去氧呋喃核糖基核苷的至少一個區域。
在某些實施方案中，REVERSIR化合物包含至少一個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個)S-cEt單體，其結構式為：
其中Bx為雜環鹼基部分。
在一些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)選自以下的核苷酸：
其中B為A-001至A-026，以及n為0至6(例如，0、1、2、3、4、5或6)。
在某些實施方案中，單體包括糖模擬物。在某些此類實施方案中，使用模擬物代替糖或糖-核苷間連接組合，並且維持核鹼基用於與選定標靶雜交。糖模擬物的代表性實例包括但不限於環己烯基或N-
啉基。糖-核苷間鍵結組合的模擬物的代表性實例包括但不限於藉由不帶電荷的非手性連接進行連接的胜肽核酸(PNA)和N-
啉基團。在某些情況下，使用模擬物代替核鹼基。代表性的核鹼基模擬物係本領域公知的，並且包括但不限於三環吩噁
類似物和通用鹼基(Berger等人，Nuc Acid Res.2000,28：2911-14，藉由引用併入本文)。糖、核苷、核苷酸和核鹼基模擬物的合成方法係本發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知者。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種為LNA的單體和至少一種G-夾核鹼基。例如，REVERSIR化合物可包含為LNA的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多單體，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個G夾核鹼基。
在一些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)肽核酸單體。在某些實施方案中，REVERSIR化合物包含至少一種LNA單體和至少一種PNA單體。例如，REVERSIR化合物可包含為LNA的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多單體，為PNA的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多單體。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種PNA單體和至少一種G-夾核鹼基。例如，REVERSIR化合物可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個PNA單體和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個G夾核鹼基。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種LNA單體、至少一種PNA單體和至少一種G-夾核鹼基。例如，REVERSIR化合物可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個LNA單體；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多PNA單體和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個G夾核鹼基。
本文描述的連接基團，係將單體(包括但不限於修飾的和未修飾的核苷和核苷酸)連接在一起，從而形成寡聚化合物，即包含寡核苷酸的REVERSIR化合物。此類連接基團亦稱為糖間連接。兩類主要的連接基團由磷原子的存在或不存在來定義。代表性的含磷連接包括但不限於磷酸二酯(P=O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯和硫代磷酸酯(P=S)。代表性的不含磷的連接基團包括但不限於亞甲基甲基亞胺基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代胺基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；矽氧烷(-O-Si(H)2-O-)；和N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。具有非磷連接基的寡聚化合物稱為寡核苷。相較於天然磷酸二酯連接，修飾的連接可用於改變、通常增加寡聚化合物的核酸酶抗性。在某些實施方案中，具有手性原子的連接可以製備為外消旋混合物，作為單獨的對映體。代表性的
手性連接包括但不限於烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷和不含磷連接的製備方法係本發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知者。
連接基團中的磷酸基團可以用不同的取代基取代其中一個氧來修飾。這種修飾的一個結果可以係增加寡核苷酸對溶核分解的抵抗力。修飾的磷酸基團的實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸鹽、硼烷磷酸酯、磷酸氫酯、醯胺磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在一些實施方案中，連接中的非橋接磷酸根氧原子之一可以被以下任一種替代：S、Se、BR3(R為氫、烷基、芳基)、C(即烷基、芳基等)、H、NR2(R為氫、視需要取代的烷基、芳基)或OR(R為視需要取代的烷基或芳基)。未修飾的磷酸基團中的磷原子為非手性者。然而，以上述原子或原子團之一者替代非橋接氧之一者使磷原子具有手性；換句話說，以這種方式修飾的磷酸基團中的磷原子係立構中心。立構磷原子可具有「R」構型(本文為Rp)或「S」構型(本文為Sp)。
二硫代磷酸酯的兩個非橋接氧都被硫替代。二硫代磷酸酯中的磷中心係非手性的，這阻止寡核苷酸非對映體的形成。因此，儘管不希望受到理論的束縛，對兩個非橋接氧的修飾可消除手性中心，例如二硫代磷酸酯的形成可能係理想的，因為它們不能產生非對映異構體混合物。因此，非橋接氧可以獨立地為O、S、Se、B、C、H、N或OR(R為烷基或芳基)中的任何一種。
亦可以用氮(橋接的胺基磷酸酯)、硫(橋接的硫代磷酸酯)和碳(橋接的亞甲基膦酸酯)替代橋接氧(即，將磷酸酯連接至單體的糖的氧)來修飾磷酸酯連接子。替代可發生在任一連接氧處或兩個連接氧處。當橋接氧
為核苷的3'-氧時，較佳為用碳替代。當橋接氧為核苷的5'-氧時，較佳為用氮替代。
修飾的磷酸酯連接，其中與磷酸酯連接的至少一個氧已被替代或磷酸基團已被非磷基團替代，亦稱為“非磷酸二酯糖間連接”或“非磷酸二酯連接子”。
在某些實施方案中，磷酸基團可以被不含磷的連接子取代，例如，去磷酸連接子。去磷酸連接子在本文中亦稱為非磷酸二酯連接子。儘管不希望受理論束縛，但據信，由於帶電磷酸二酯基團係溶核降解中的反應中心，因此用中性結構模擬物替代它應賦予增強的核酸酶穩定性。再次，儘管不希望受理論束縛，但在一些實施方案中，可能期望引入其中帶電磷酸基團被中性部分體替代的改變。
可替代磷酸基團的部分體的實例包括但不限於醯胺(例如醯胺-3(3'-CH2-C(=O)-N(H)-5')和醯胺-4(3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'))、羥胺基、矽氧烷(二烷基矽氧烷)、甲醯胺、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、羧酸酯、硫醚、環氧乙烷連接子、硫化物、磺酸酯、磺醯胺、磺酸酯、硫代甲縮醛(3'-S-CH2-O-5')、甲縮醛(3'-O-CH2-O-5')、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基羰基胺基、亞甲基甲基亞胺基(MMI,3'-CH2)-N(CH3)-O-5')、亞甲基肼基、亞甲基二甲基肼基、亞甲基二甲基亞胺基、醚類(C3'-O-C5')、硫醚類(C3'-S-C5')、硫代乙醯胺基(C3'-N(H)-C(=O)-CH2-S-C5',C3'-O-P(O)-O-SS-C5',C3'-CH2-NH-NH-C5',3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'和3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'以及含有混合N、O、S和CH2組成部分的非離子連接。參見例如Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi and P.D.
Cook Eds.ACS Symposium Series 580；Chapters 3 and 4,(pp.40-65)。較佳的實施方案包括亞甲基甲基亞胺基(MMI)、亞甲基羰基胺基、醯胺、胺基甲酸酯和環氧乙烷連接子。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者熟知，在某些情況下，非橋接氧的替代可導致相鄰2'-OH對糖間連接的增強裂解，因此在許多情況下，非橋接氧的修飾可能需要對2'-OH進行修飾，例如不參與相鄰糖間連接(例如阿拉伯糖、2'-O-烷基、2'-F、LNA和ENA)裂解的修飾。
較佳的非磷酸二酯糖間連接包括硫代磷酸酯，硫代磷酸酯具有至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多對映體過量的Sp異構體，硫代磷酸酯具有至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多對映異構體過量的Rp異構體、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如膦酸甲酯)、硒代磷酸酯、胺基磷酸酯(例如N-烷基胺基磷酸酯)和硼烷膦酸酯。
在一些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多直至包括所有)修飾的或非磷酸二酯連接。在一個實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少一種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多以上，且包括所有)硫代磷酸酯連接。
在一些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含至少五個硫代磷酸酯核苷酸間修飾。在其他實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含5-15個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-14個硫代磷酸酯核苷酸間
修飾；5-13個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-12個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-11個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-10個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-9個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-8個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-7個硫代磷酸酯核苷酸間修飾；或5-6個硫代磷酸酯核苷酸間修飾。在其他實施方案中，本發明的REVERSIR化合物包含6-14個硫代磷酸酯核苷酸間修飾。
在一些實施方案中，反向化合物中的所有核苷酸間連接都係硫代磷酸酯(PS)核苷酸間連接。在某些實施方案中，REVERSIR化合物包含至少一個硫代磷酸酯(PS)核苷酸間連接，但並非該REVERSIR化合物中的所有核苷酸間連接都係硫代磷酸酯連接。換句話說，在一些實施方案中，小於100%(例如，95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%或更少)的核苷酸間連接係硫代磷酸酯連接。
在一些實施方案中，REVERSIR化合物包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間連接和至少一種非硫代磷酸酯的核苷間或核苷酸間連接。例如，REVERSIR化合物包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間連接和至少一種磷酸二酯核苷酸間連接。在一些實施方案中，非硫代磷酸酯核苷酸間連接位於終端和倒數第二個核苷酸之間。
在一些實施方案中，REVERSIR化合物的3'-終端的核鹼基與REVERSIR化合物的其餘部分之間的核苷酸間連接係磷酸二酯連接。在一些實施方案中，REVERSIR化合物中的所有核苷酸間連接都係硫代磷酸酯，除REVERSIR化合物3'-終端的核苷酸與REVERSIR化合物的其餘部分之間的核苷酸間連接。
亦可以建構REVERSIR化合物，其中磷酸連接子和糖被核酸酶抗性核苷、核苷酸或核苷酸替代物替代。儘管不希望受理論的束縛，但據信重複帶電主鏈的缺乏減少與識別聚陰離子的蛋白質(例如核酸酶)的結合。再次，雖然不希望受理論束縛，但在一些實施方案中可能需要引入其中鹼基由中性替代主鏈束縛的改變。實例包括-
啉基、環丁基、吡咯啶、胜肽核酸(PNA)、胺乙基甘胺醯PNA(aegPNA)和主鏈延伸的吡咯啶PNA(bepPNA)核苷替代物。較佳的替代物為PNA替代物。
本文所述的REVERSIR化合物可含有一個或多個不對稱中心，並因此產生對映異構體、非對映異構體和其他立體異構構型，其可在絕對立體化學方面定義為(R)或(S)，例如對於糖端基異構體，或作為(D)或(L)，例如對於胺基酸等。本文提供的反義化合物包括所有此類可能的異構體，以及它們的外消旋形式和光學純形式。
本發明的REVERSIR化合物的端可以被修飾。這種修飾可以在一端或兩端。例如，寡核苷酸的3'和/或5'端可以綴合至其他功能性分子實體，例如標記部分，例如螢光團(例如芘、TAMRA、螢光素、Cy3或Cy5染料)或保護基團(基於例如，硫、矽、硼或酯)。功能性分子實體可以經由磷酸基團和/或連接子附接至糖。連接子的終端原子可以連結或替代糖的磷酸基或C-3'或C-5'O、N、S或C基團的連接原子。或者，連接子可以連結或替代核苷酸替代物(例如，PNA)的終端原子。
當連接子/磷酸官能分子實體-連接子/磷酸陣列插入雙股寡聚化合物的兩條鏈之間時，此陣列可以取代髮夾型化合物中的髮夾環。
用於調節活性的終端修飾包括用磷酸鹽或磷酸鹽類似物修飾化合物的5'端。在某些實施方案中，化合物的5’端被磷酸化或包括磷醯基類似物。示例性5'-磷酸修飾包括與RISC介導的基因靜默相容的那些。5’終端的修飾亦可用於刺激或抑制個體的免疫系統。在一些實施方案中，化合物的5'-端包含下述修飾，
其中W、X和Y各自獨立地選自由下述所組成之群組：O、OR(R為氫、烷基、芳基)、S、Se、BR3(R為氫、烷基、芳基)、BH3-、C(即烷基、芳基等)、H、NR2(R為氫、烷基、芳基)或OR(R係氫、烷基或芳基)；A和Z每次出現時各自獨立地為O、S、CH2、NR(R為氫、烷基、芳基)或視需要取代的亞(伸)烷基，其中亞(伸)烷基的主鏈內部及/或端可包含O、S、SS和NR(R為氫、烷基、芳基)；n為0-2。在一些實施方案中，n為1或2。據瞭解，A替代與糖5'碳連接的氧。當n為0時，W和Y與它們所連接的P一起可以形成視需要取代的5-8員雜環，其中W和Y各自獨立地為O、S、NR’或亞(伸)烷基。較佳地，雜環被芳基或雜芳基取代。在一些實施方案中，5’-終端核苷酸的C5’的一個或兩個氫被鹵素(例如，F)取代。
例示性5’-修飾包括但不限於5’-單磷酸((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯)；(HO)2(S)P-O-5')；5'-單二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')，5'-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5')；5'-α-硫代三磷酸酯；5'-β-硫代三磷酸酯；5'-γ-硫代
三磷酸酯；5'-胺基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')。其他5'-修飾包括5'-烷基膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5'，R=烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丙基等…)、5'-烷基醚膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5'，R=烷基醚，例如甲氧基甲基(CH2OMe)、乙氧基甲基等)。其他示例性5'-修飾包括其中Z為視需要取代的烷基至少一次，例如((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'、((HO)2(X)P-[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'；二烷基終端磷酸鹽和磷酸鹽模擬物：HO[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、H2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、H[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、Me2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、HO[-(CH2)a-P(X))(OH)-O]b-5'、H2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'、H[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'、Me2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'，其中a和b各自獨立地為1-10。其他實施方案包括以BH3、BH3-及/或Se替代氧及/或硫。
終端修飾還可用於監測分佈，並且在這種情況下，待添加的較佳基團包括螢光團，例如螢光素或Alexa染料，例如Alexa 488。終端修飾還可用於增強攝取，可用於對此的修飾包括靶向配體。終端修飾亦可用於將寡核苷酸與另一部分體交聯；對此有用的修飾包括絲裂黴素C、補骨脂素及其衍生物。
在某些實施方案中，本發明的REVERSIR化合物為嵌合寡聚化合物，即嵌合寡核苷酸。在某些此類實施方案中，嵌合寡核苷酸包含不同修飾的核苷酸。在某些實施方案中，嵌合寡核苷酸係混合主鏈反義寡核苷酸。
一般來說，嵌合寡聚化合物將具有修飾的核苷，該修飾的核苷可以位於分離的位置或在將限定特定基序的區域中組合在一起。修飾及/或模擬基團的任何組合可包含本文所述的嵌合寡聚化合物。
在某些實施方案中，嵌合寡聚化合物通常包含至少一個經修飾的區域，以便賦予對核酸酶降解的增加的抗性、增加的細胞攝取和/或對靶核酸的增加的結合親和力。在某些實施方案中，寡聚化合物的額外區域可以充當能夠切割RNA：DNA或RNA：RNA雜合體的酵素的基質。
在某些實施方案中，嵌合寡聚化合物為缺口聚體(gapmer)。在某些此類實施方案中，混合主鏈寡聚化合物在一個或兩個側翼具有一種類型的核苷酸間連接，並且在缺口具有不同類型的核苷間連接。在某些此類實施方案中，混合主鏈寡核苷酸在翼具有磷酸二酯鍵，在缺口具有硫代磷酸酯連接。在翼的核苷酸間連接不同於缺口的核苷酸間連接的某些實施方案中，橋接該翼和缺口的核苷酸間連接與翼的核苷酸間連接相同。在翼的核苷酸間連接不同於缺口的核苷酸間連接的某些實施方案中，橋接該翼和缺口的核苷酸間連接與缺口的核苷酸間連接相同。
在某些實施方案中，本發明提供具有多種長度範圍中的任一個的REVERSIR化合物。在某些實施方案中，本發明提供由16-30個，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸組成的化合物。例如，在某些實施方案中，本發明提供的化合物包含：16-17、16-18、16-19、16-25、16-21、16-22、16-23、16-24、16-25、16-26、16-27、16-28、16-29、16-30、17-18、17-19、17-20、17-21、17-22、17-23、17-24、17-25、17-26、17-27、17-28、17-29、17-30、18-19、
18-20、18-21、18-22、18-23、18-24、18-25、18-26、18-27、18-28、18-29、18-30、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-29、19-28、19-29、19-30、20-21、20-22、20-23、20-24、20-25、20-26、20-27、20-28、20-29、20-30、21-22、21-23、21-24、21-25、21-26、21-27、21-28、21-29、21-30、22-23、22-24、22-25、22-26、22-27、22-28、22-29、22-30、23-24、23-25、23-26、23-27、23-28、23-29、23-30、24-25、24-26、24-27、24-28、24-29、24-30、25-26、25-27、25-28、25-29、25-30、26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30或29-30個連接的核苷酸。
如上所述，REVERSIR化合物可以為任何長度。例如，在一些實施方案中，REVERSIR化合物由16-30個核苷酸組成的修飾寡核苷酸。例如，REVERSIR化合物可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連接的核鹼基組成。在一些實施方案中，REVERSIR化合物由16-24、16-22或18-20個連接的核鹼基組成。
如本文所討論的，REVERSIR化合物為寡核苷酸，例如修飾的寡核苷酸，其與在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾得dsRNA劑的反義股實質上互補。現在不希望受理論的束縛，REVERSIR化合物與dsRNA的反義股的種子區實質上互補(即，在反義股的5’端的位置2-8或2-9)在減低dsRNA活性方面特別有效。因此，在許多實施方案中，REVERSIR化合物與本文所述的dsRNA劑的反義股的核苷酸2-8、2-9、2-10、2-11、2-
12、2-13、2-14、2-15或2-16實質上互補。在本文中，實質上互補係指至少90%、較佳至少95%、更佳完全互補的互補性。
A.包含本發明基序的修飾的REVERSIR化合物
本發明還包括18-24個核苷酸長度的寡聚化合物，其包含與dsRNA劑的反義股實質上互補的核苷酸序列。此類寡聚化合物通常包括至少五個硫代磷酸酯核苷酸間修飾並由式(I)表示：
其中：
B1、B2和B3各自獨立地表示包含核苷酸修飾的核苷酸，該核苷酸修飾獨立地選自由下述所組成之群組：2'-去氧、2'-核糖、2'-O-烷基修飾、2'-取代烷氧基修飾、2'-取代烷氧基烷基修飾、2'-取代烷基修飾、2'-鹵機修飾；
T1、T2和T3各自獨立地表示包含核苷酸修飾的核苷酸，該核苷酸修飾選自由下述所組成之群組：去氧核苷酸修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、cEt修飾、或不同的BNA修飾、2'-去氧-2'-氟和2'-O-甲基修飾；q1、q3和q5各自獨立地為3-12個核苷酸長度；q2、q4和q6獨立地為1-6個核苷酸的長度。
在其他實施方案中，本發明提供為嵌合寡聚化合物的寡聚化合物，即嵌合REVERSIR化合物。在本發明的脈絡中，「嵌合」寡聚化合物或「嵌合體」係含有兩個或更多個化學上不同的區域的寡聚化合物，每個區域由至少一個單體單元組成，即，在核苷酸的情況為修飾或未修飾的
核苷酸。嵌合寡聚化合物可被描述為具有特定基序。在一些實施方案中，基序包括但不限於交替基序、有缺口的基序、半聚體基序、均勻完全修飾的基序和位置修飾的基序。如本文所用，「化學上不同的區域」一詞係指藉由具有寡聚化合物中其他地方不存在的修飾或藉由不具有寡聚化合物中其他地方存在的修飾而不同於其他區域的寡聚區域。寡聚化合物可以包含兩個或更多個化學上不同的區域。如本文所使用的，不包含修飾的區域亦被認為係化學上不同者。
化學上不同的區域可以在寡聚化合物內重複。因此，可以實現寡聚化合物中化學上不同的區域的模式，使得第一化學上不同的區域之後為一個或多個第二化學上不同的區域。這一化學上不同的區域的序列可以重複一次或多次。較佳地，該序列重複一次以上。雙股寡聚化合物的兩股均可包含此等序列。每個化學上不同的區域實際上可以包含少至單一單體，例如核苷酸。在一些實施方案中，每個化學上不同的區域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個單體，例如核苷酸。
在一些實施方案中，交替的核苷酸包含相同的修飾，例如股中的所有奇數核苷酸具有與第一股相同的修飾及/或股中的所有偶數核苷酸具有與第一股相似的修飾。在一些實施方案中，寡聚化合物中的所有奇數核苷酸具有相同的修飾，且所有偶數核苷酸具有奇數核苷酸中不存在的修飾，反之亦然。
在一些實施方案中，寡核苷酸包含兩個化學上不同的區域，其中每個區域為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長度。
在其他實施方案中，寡聚化合物包含三個化學上不同的區域。中間區域為約5-15個(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)個核苷酸長度，並且每個側翼或翼區獨立地為1-10個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個核苷酸長度。所有三個區域可以具有不同的修飾，或者翼區域可以彼此類似地修飾。在一些實施方案中，翼區具有相等的長度，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長。
如本文所用，術語「交替基序」係指包含連接的單體亞基的連續序列的寡聚化合物，其中單體亞基具有兩種不同類型的糖基團，其實質上交替存在於寡聚化合物的整個序列中。具有交替基序的寡聚化合物可以用下式描述：5'-A(-L-B-L-A)n(-L-B)nn-3'，其中A和B為具有不同糖基團的單體亞基，每個L為核苷間連接基團，n為約4至約12且nn為0或1。這允許為約9至約26個單體亞單元長度的交替寡聚化合物。此長度範圍並不意味著限制，因為較長和較短的寡聚化合物亦適用於本發明。在一個實施方案中，A和B之一為本文提供的2’-修飾核苷。
如本文所用，關於核苷或「類型」的核苷的「修飾類型」係指核苷的修飾並且包括修飾的和未修飾的核苷。因此，除非另有說明，「具有第一類型修飾的核苷」可以為未修飾的核苷。
如本文所用，「類型區域」係指寡聚化合物的一部分，其中該區域內的核苷和核苷間連接均包含相同類型的修飾；並且任何相鄰部分的核苷及/或核苷間連接包括至少一種不同類型的修飾。如本文所用，術語「均勻完全修飾的基序」係指包含各自具有相同類型的糖基團的連接單體亞基的連續序列的寡核苷酸。在一個實施方案中，均勻完全修飾的基序包括本
發明的核苷的連續序列。在一個實施方案中，本文提供的核苷的連續序列的3'和5'-端之一或兩者包含終端基團，例如一種或多種未修飾的核苷。
如本文所用，術語「半聚體基序」係指具有單體亞基的短連續序列的寡聚化合物，該單體亞基具有位於5'或3'端的一種類型的糖基團，其中單體亞基的其餘部分具有不同類型的糖基。一般而言，半聚體係均勻糖基團的寡聚化合物，其進一步包含具有均勻但不同糖基團且位於寡聚化合物的3'或5'端的短區域(1、2、3、4或約5個單體亞基)。在一個實施方案中，半聚體基序包含約10至約28個一種類型的單體亞基和位於終端之一的1至5個或2至約5個第二類型的單體亞基的連續序列。在一個實施方案中，半聚體係約8至約20個β-D-2'-去氧核糖核苷的連續序列，其具有位於終端之一的1-12個本發明的連續核苷。在一個實施方案中，半聚體係約8至約20個β-D-2'-去氧核糖核苷的連續序列，其具有位於終端之一的本發明的1-5個連續核苷。在一個實施方案中，半聚體係約12至約18個β-D-2'-去氧核糖核苷的連續序列，其具有位於終端之一的本發明的1-3個連續核苷。在一個實施方案中，半聚體係約10至約14個β-D-2'-去氧核糖核苷的連續序列，其具有位於終端之一的本發明的1-3個連續核苷。
如本文所用，術語「嵌段基序」係指包含單體亞基的其他連續序列的寡核苷酸，其中除具有不同類型糖基團的連續單體亞基的間斷內部嵌段之外，每個單體亞基的糖基團係相同的。嵌段聚體在定義上與間隙聚體有些重疊，但通常只有嵌段中的單體亞基在嵌段聚體中具有非天然存在的糖基團，並且只有外部區域中的單體亞基在間隙聚體中具有非天然存在的糖基團，其中阻斷體或間隙體中的剩餘單體亞基係β-D-2'-去氧核糖核
苷或β-D-核糖核苷。在一個實施方案中，本文提供阻斷劑寡核苷酸，其中所有單體亞基均包含非天然存在的糖基團。
如本文所用，術語「位置修飾基序」意在包括具有一種類型的糖基團的單體亞基的另外的連續序列，其被具有另一種類型的糖基團的1至約5個連續單體亞基的兩個或更多個區域間斷。1至約5個連續單體亞基的兩個或更多個區域中的每一個均獨立地、一致地修飾糖基團的類型。在一個實施方案中，兩個或更多區域中的每一個具有相同類型的糖基團。在一個實施方案中，兩個或更多區域中的每一個具有不同類型的糖基團。在一個實施方案中，提供位置修飾的寡核苷酸，其包含8至20個β-D-2'-去氧核糖核苷的序列，其進一步包括本發明的2個至約5個連續核苷的兩個或三個區域。位置修飾的寡核苷酸與缺口基序、半聚體基序、阻斷基序和交替基序不同，因為由任何位置基序定義的區域取代模式不符合本文為此等其他基序之一提供的定義。術語「位置修飾的寡聚化合物」包括許多不同的特定取代模式。
如本文所用，術語「缺口聚體」或「有缺口的寡聚化合物」係指具有兩個外部區域或翼以及內部區域或缺口的寡聚化合物。這三個區域形成單體亞基的連續序列，外部區域的糖基團與內部區域的糖基團不同，並且其中特定區域內的每個單體亞基的糖基團係相同者。當外部區域的糖基團相同時，缺口聚體係對稱缺口聚體，並且當5'-外部區域中使用的糖基團與3'-外部區域中使用的糖基團不同時，此缺口聚體係不對稱的缺口聚體。在一個實施方案中，外部區域較小(各自獨立地1、2、3、4或約5個單體亞基)且單體亞基包含非天然存在的糖基團，而內部區域包含β-D-2'-
去氧核糖核苷。在一個實施方案中，外部區域各自獨立地包含1至約5個具有非天然存在的糖基團的單體亞基，並且內部區域包含6至18個未修飾的核苷。內部區域或缺口通常包含β-D-2'-去氧核糖核苷，但可以包含非天然存在的糖基團。
在一個實施方案中，有缺口的寡聚化合物包含β-D-2'-去氧核糖核苷的內部區域和包含本發明的核苷的外部區域之一。在一個實施方案中，有缺口的寡核苷酸包含β-D-2'-去氧核糖核苷的內部區域，且兩個外部區域均包含本發明的核苷。在一個實施方案中，有缺口的寡核苷酸包含β-D-2'-去氧核糖核苷的內部區域，且兩個外部區域均包含本發明的核苷。在一個實施方案中，本文提供帶有缺口的寡核苷酸，其中所有單體亞基均包含非天然存在的糖基團。在一個實施方案中，提供一個有缺口的寡核苷酸，其包含在5'-端的一個或兩個本發明的核苷、在3'-端的兩個或三個本發明的核苷以及10至16個β-D-2的內部區域'-去氧核糖核苷。在一個實施方案中，提供一個有缺口的寡核苷酸，其包含在5'-末端的一個本發明的核苷、在3'-端的兩個本發明的核苷和10至16個β-D-2'-去氧核糖核苷的內部區域。在一個實施方案中，提供帶缺口的寡核苷酸，其包含在5'-端的兩個本發明的核苷、在3'-端的兩個本發明的核苷和10至14個β-D-2'-去氧核糖核苷的內部區域。在一個實施方案中，提供為約10至約21個單體亞基長度的帶缺口的寡核苷酸。在一個實施方案中，提供為約12至約16個單體亞基長度的帶缺口的寡核苷酸。在一個實施方案中，提供為約12至約14個單體亞基長度的帶缺口的寡核苷酸。
在某些實施方案中，本發明的寡聚化合物的5'-終端單體在5'-端包含磷部分。在某些實施方案中，5'-終端單體包含2'-修飾。在某些此類實施方案中，5'-終端單體的2'-修飾係陽離子修飾。在某些實施方案中，5'-終端單體包含5'-修飾。在某些實施方案中，5’-終端單體包含2’-修飾和5’-修飾。在某些實施方案中，5'-終端單體係5'-穩定核苷。在某些實施方案中，5'-終端單體的修飾穩定5'-磷酸。在某些實施方案中，包含5'-終端單體修飾的寡聚化合物對外切核酸酶具有抗性。在某些實施方案中，包含5'-終端單體修飾的寡聚化合物具有改善的REVERSIR性質。在某些此類實施方案中，包含5'-終端單體修飾的寡聚化合物具有改善的與dsRNA鏈的綴合。
在某些實施方案中，5'終端單體藉由修飾的連接附接至寡聚化合物的其餘部分。在某些此類實施方案中，5'終端單體藉由硫代磷酸酯連接附接至寡聚化合物的其餘部分。
在某些實施方案中，本發明的寡聚化合物包含一個或多個交替修飾的區域。在某些實施方案中，寡聚化合物包含一個或多個交替核苷修飾的區域。在某些實施方案中，寡聚化合物包含一個或多個交替連接修飾的區域。在某些實施方案中，寡聚化合物包含一個或多個交替核苷和連接修飾的區域。
在某些實施方案中，本發明的寡聚化合物包含交替的2'-F修飾核苷和2'-O-Me修飾核苷的一個或多個區域。在某些此類實施方案中，此類交替2'F修飾和2'O-Me修飾核苷的區域亦包含交替連接。在某些此類
實施方案中，2'-F修飾核苷的3'端的連接係硫代磷酸酯連接。在某些此類實施方案中，2'O-Me核苷3'端的連接係磷酸二酯連接。
在某些實施方案中，這樣的交替區域係：
(2’-F)-(PS)-(2’-OMe)-(PO)
在某些實施方案中，寡聚化合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個這樣的交替區域。此類區域可以係連續的或可以被不同修飾的核苷或連接中斷。
在某些實施方案中，交替基序中的一個或多個交替區域包括多於一個類型的核苷。例如，本發明的寡聚化合物可以包括任何下述核苷基序的一個或多個區域：
ABA；
ABBA；
AABA；
AABBAA；
ABBABB；
AABAAB；
ABBABAABB；
ABABAA；
AABABAB；
ABABAA；
ABBAABBABABAA；
BABBAABBABABAA；或
ABABBAABBABABAA；
其中A係第一類型的核苷且B係第二類型的核苷。在某些實施方案中，A和B各自選自2’-F、2’-OMe、LNA、DNA和MOE。
在某些實施方案中，A係DNA。在某些實施方案中，B係DNA。在一些實施方案中，A係4’-CH2O-2’-LNA。在某些實施方案中，B係4’-CH2O-2’-LNA。在某些實施方案中，A係DNA且B係4’-CH2O-2’-LNA。在某些實施方案中，A係4’-CH2O-2’-LNA且B係DNA。
在某些實施方案中，A係2'-OMe。在某些實施方案中，B係2'-OMe。在某些實施方案中，A係2’-OMe且B係4’-CH2O-2’-LNA。在某些實施方案中，A係4’-CH2O-2’-LNA且B係2’-OMe。在某些實施方案中，A係2’-OMe且B係DNA。在某些實施方案中，A係DNA且B係2'-OMe。
在某些實施方案中，A係(S)-cEt。在一些實施方案中，B係(S)-cEt。在某些實施方案中，A係2’-OMe且B係(S)-cEt。在某些實施方案中，A係(S)-cEt且B係2’-OMe。在某些實施方案中，A係DNA且B係(S)-cEt。在某些實施方案中，A係(S)-cEt且B係DNA。
在某些實施方案中，A係2'-F。在某些實施方案中，B係2'-F。在某些實施方案中，A係2’-F且B係4’-CH2O-2’-LNA。在某些實施方案中，A係4’-CH2O-2’-LNA且B係2’-F。在某些實施方案中，A係2’-F且B係(S)-cEt。在某些實施方案中，A係(S)-cEt且B係2’-F。在某些實施方案中，A係2'-F且B係DNA。在某些實施方案中，A係DNA且B係
2'-F。在某些實施方案中，A係2’-OMe且B係2’-F。在某些實施方案中，A係DNA且B係2'-OMe。在某些實施方案中，A係2’-OMe且B係DNA。
在某些實施方案中，具有此類交替基序的寡聚化合物亦包含含有磷酸鹽穩定修飾的5’終端核苷。在某些實施方案中，具有此類交替基序的寡聚化合物還包含含有2’-陽離子修飾的5’終端核苷。在某些實施方案中，具有此類交替基序的寡聚化合物亦包含5’終端修飾。
在某些實施方案中，本發明的寡聚化合物包含具有2-2-3基序的區域。此等區域包含以下基序：
5’-(E)w-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-(D)z
其中：A為第一類修飾核苷；
B、C、D和E為與A不同修飾的核苷，然而，B、C、D和E可以彼此具有相同或不同的修飾；
w和z為0至15；
x和y為1至15。
在某些實施方案中，A係2'-OMe修飾的核苷。在某些實施方案中，B、C、D和E都係2'-F修飾的核苷。在某些實施方案中，A係2'-OMe修飾的核苷且B、C、D和E都係2'-F修飾的核苷。
在某些實施方案中，2-2-3基序的連接都係修飾的連接。在某些實施方案中，連接都係硫代磷酸酯連接。在某些實施方案中，第一類型的每個修飾的3'-端的連接係磷酸二酯。
在某些實施方案中，Z係0。在此類實施方案中，第一型的三個核苷的區域位於寡核苷酸的3’端。在某些實施方案中，此類區域位於寡
聚化合物的3’端，沒有附加基團附接至第一型的三個核苷區域的3’端。在某些實施方案中，包含Z係0的寡核苷酸的寡聚化合物可以包含附接至3'-終端核苷的終端基團。此類終端基團可以包括額外的核苷。此類另外的核苷通常係非雜交核苷。
在某些實施方案中，Z係1-3。在某些實施方案中，Z係2。在某些實施方案中，Z的核苷係2'-MOE核苷。在某些實施方案中，Z代表非雜交核苷。為避免混淆，需要注意的係，此類非雜交核苷亦可能被描述為Z=0的3'終端基團。
應理解，某些上述基序和修飾可以組合。由於基序可僅包含幾個核苷，因此特定的寡聚化合物可包含兩個或更多基序。作為非限制性實例，在某些實施方案中，寡聚化合物可以具有兩個或更多選自LNA、硫代磷酸酯連接、2'-OMe、綴合配體的核苷酸基序。
具有本文所述的各種核苷基序的任一種的寡聚化合物亦可以具有任何連接基序。例如，在寡聚化合物中，5'-端的前1、2、3、4或5個糖間連接可被修飾，且3'-端的前4、5、6、7或8個糖間連接可被修飾糖間連接。這種修飾的寡聚化合物的中心區域可以具有基於本文描述的任何其他基序的任一種的糖間連接，例如均勻、交替、半聚體、缺口聚體等。在一些實施方案中，寡聚化合物在5'-終端包含第一和第二單體之間的硫代磷酸酯連接、在中心區域中的交替硫代磷酸酯/磷酸二酯連接以及在3'-終端的6、7或8個硫代磷酸酯連接。
應注意，由核苷基序限定的區域的長度和連接基序的長度不需要相同。
在一些實施方案中，單股寡聚化合物包括以下基序中的至少一種：
(a)5’-硫代磷酸酯或5’-二硫代磷酸酯；
(b)5'終端核苷酸1和2的陽離子修飾，其中該陽離子修飾係在嘧啶的C5位置和嘌呤的C2、C6、C8、環外N2或環外N6；
(c)至少一個G夾核苷酸在5'端的前兩個終端核苷酸且另一核苷酸具有陽離子修飾，其中該陽離子修飾係在嘧啶的C5位置或嘌呤的C2、C6、C8、環外N2或環外N6位置；
(d)至少一個包含核鹼基修飾的2’-F修飾核苷酸；
(e)至少一個包含核鹼基修飾的gem-2’-O-甲基/2’-F修飾的核苷酸，較佳甲基取代基處於向上構型，例如在阿拉伯糖構型；
(f)3'終端的5'-PuPu-3'二核苷酸，其中兩個核苷酸在2'-位置均包含修飾的MOE，如美國專利申請公開號20130130378中所述，其內容藉由引用併入本文整體，
(g)5’終端的5’-PuPu-3’二核苷酸，其中兩個核苷酸在2’-位置均包含修飾的MOE，如美國專利申請公開第20130130378號所述；
(h)核苷酸在5'終端在2'-位置具有修飾的MOE，如美國專利申請公開第20130130378號所述；
(i)核苷酸在5'終端具有3'-F修飾；
(j)5'終端核苷酸包含4'-取代基；
(k)5'終端核苷酸包含O4'修飾；
(l)3'終端核苷酸包含4'-取代基；及
(m)其組合。
提供上述實例僅係為說明如何組合使用所描述的基序，並且不旨在將本發明限制於特定組合或用於說明組合的特定修改。此外，本文的具體實例旨在涵蓋更通用的實施方案。本說明書中的所有實例都考慮這種一般解釋。
亦值得注意的係寡聚化合物的長度可以藉由延長或縮短一個或多個所描述的區域而容易地調控，而不破壞基序。
在一些實施方案中，寡聚化合物包含兩個或更多個化學上不同的區域並且具有如2009年3月26日提交的國際申請號PCT/US09/038433中描述的結構，該申請的內容以其全部內容併入本文。
III.本發明的配體
在某些實施方案中，寡聚化合物藉由一個或多個綴合基團的共價附接進行修飾。一般而言，綴合基團修飾所附接的寡聚化合物的一種或多種性質，包括但不限於藥效學、藥物動力學、結合、吸收、細胞分佈、細胞攝取、電荷和清除。綴合基團通常用於化學領域，並且直接或經由視需要的連接部分體或連接基團連接至母體化合物，例如寡聚化合物。綴合基團的較佳清單包括但不限於嵌入劑、報導子分子(reporter molecule)、多胺、聚醯胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、膽固醇、硫代膽固醇、膽酸部分體、葉酸、脂質、磷脂質、生物素、吩
、菲啶、蒽醌、金剛烷、吖啶、螢光素、羅丹明、香豆素和染料。
適用於本發明的較佳綴合基團包括脂質部分體，例如膽固醇部分體(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)；膽酸
(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765)；硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20,533)；脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.,1991,10,111；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259,327；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75,49)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨-1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea等人，《核酸研究》，1990,18,3777)；多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides,1995,14,969)；金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651)；棕櫚基部分體(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)；或十八胺或己胺基-羰基-氧基膽固醇部分體(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923)。
一般而言，多種實體，例如配體，可以與本文所述的寡聚化合物偶聯。配體可包括天然存在的分子、或重組或合成的分子。例示性配體包括但不限於聚賴胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-谷胺酸、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、聚磷
、聚乙烯亞胺、陽離子基團、
精胺、亞精胺、多胺、偽肽多胺、擬肽多胺、樹枝狀聚合物多胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多胺季鹽、促甲狀腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、界面活性蛋白A、黏蛋白、糖基化聚胺基酸、轉鐵蛋白、雙磷酸鹽、聚谷胺酸、聚天門冬胺酸、適體、脫唾液酸胎球蛋白、透明質酸、前膠原蛋白、免疫球蛋白(如抗體)、胰島素、轉鐵蛋白、白蛋白、糖-白蛋白綴合物、嵌入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(例如TPPC4、泰克薩菲林、沙菲林)、多環芳烴(例如吩
、二氫吩
)、人工核酸內切酶(例如EDTA)、親脂性分子(例如，類固醇、膽汁酸、膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉荳蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁
)，胜肽(例如，α螺旋胜肽、兩親性胜肽、RGD胜肽、細胞滲透胜肽、內體溶解/融合胜肽)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、多胺基、烷基、取代的烷基、放射性標記標記、酵素、半抗原(例如生物素)、轉運/吸收促進劑(例如萘普生、阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇、吖啶-咪唑綴合物、四氮雜大環的Eu3+複合物)、二硝基苯基、HRP、AP、抗體、荷爾蒙和荷爾蒙受體、凝集素、碳水化合物、多價碳水化合物、維生素(例如維生素A、維生素E、維生素K、維生素B，如葉酸、B12、核黃素、生物素和吡哆醛)、維生素輔因子、脂多糖、p38 MAP激酶活化劑、NF-κB活化劑、頭孢曲松(taxon)、長春新鹼、長春花鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、茉莉喹內酯(jasplakinolide)、紅海海綿蛋白(latrunculin A)、鬼筆環肽、海洋苔蘚素(swinholide A)、茚滿辛、邁
爾素、腫瘤壞死因子α(TNFα)、白血球介素-1β、γ干擾素、天然或重組低密度脂蛋白(LDL)、天然或重組高密度脂蛋白(HDL)和細胞滲透劑(例如，a.螺旋細胞滲透劑)。
例示性的陽離子基團包括但不限於質子化的胺基，其衍生自例如O-AMINE(AMINE=NH2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺、多胺基)；胺基烷氧基，例如O(CH2)nAMINE，(例如AMINE=NH2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、或二雜芳基胺基、乙二胺、多胺基；胺基(例如NH2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE=NH2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基)。
如本文所用，術語「靶向配體」係指對所選標靶提供增強的親和力的任何分子，例如，細胞、細胞類型、組織、器官、身體區域或區室，例如細胞、組織或器官區室。一些示例性靶向配體包括但不限於抗體、抗原、葉酸鹽、受體配體、碳水化合物、適體、整聯蛋白受體配體、趨化因子受體配體、轉鐵蛋白、生物素、血清素受體配體、PSMA、內皮素、GCPII、生長抑素、LDL和HDL配體。
以碳水化合物為基礎的靶向配體包括但不限於D-半乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-D-半乳糖(GalNAc)、多價GalNAc，例如GalNAc2和GalNAc3；D-甘露糖、多價甘露糖、多價乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺、多價岩藻糖、糖基化聚胺基酸和凝集素。術語多價表示存
在多於一個的單糖單元。此類單糖亞單元可以經由糖苷連接彼此連接或連接至支架分子。
如本文所用，術語「PK調節配體」和「PK調節劑」係指可以調節本發明組成物的藥物動力學的分子。一些示例性PK調節劑包括但不限於親脂性分子、膽汁酸、固醇、磷脂質類似物、胜肽、蛋白質結合劑、維生素、脂肪酸、吩噁
、阿斯匹靈、萘普生、布洛芬、舒洛芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、PEG、生物素和轉甲狀腺素結合配體(例如四碘甲狀腺乙酸、2,4,6-三碘苯酚和氟芬那酸)。亦已知包含許多硫代磷酸酯糖間連接的寡聚化合物與血清蛋白結合，因此短寡聚化合物，例如包含約5至30個核苷酸(例如，5至25個核苷酸，較佳5至20個核苷酸，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸)，以及在主鏈中包含多個硫代磷酸酯連接的化合物亦適合於本發明作為配體(例如作為PK調節配體)。PK調節寡核苷酸可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接。在一些實施方案中，PK調節寡核苷酸中的所有核苷酸間連接都係硫代磷酸酯及/或二硫代磷酸酯連接。另外，結合血清成分(例如血清蛋白)的適體亦適合本發明作為PK調節配體。與血清成分(例如血清蛋白)的結合可以由白蛋白結合測定來預測，如Oravcova等人，Journal of Chromatography B(1996)，677：1-27所描述者。
當存在兩個或更多個配體時，配體可以全部具有相同的性質、全部具有不同的性質或一些配體具有相同的性質而其他配體具有不同的性
質。例如，配體可以具有靶向特性、具有內涵體溶解活性或具有PK調節特性。在較佳的實施方案中，所有配體具有不同的性質。
如本文所用，當配體連接至多個寡聚股時，寡聚化合物的附接點可以係配體本身的原子或配體本身所附接的載體分子的原子。
配體可以在不同位置與寡聚化合物偶聯，例如，3'-端、5'-端和/或在內部位置。當存在兩個或更多個配體時，配體可以位於寡聚化合物的相對端。在較佳的實施方案中，配體透過插入的繫鏈/連接子附接至寡聚化合物。當該單體併入生長股時，配體或繫鏈配體可以存在於單體。在一些實施方案中，在該「前體」單體已經併入生長股之後，可以透過與「前體」單體偶聯來併入配體。例如，具有例如胺基封端的繫鏈(即，不具有綴合的配體)，例如單體-連接子-NH2的單體可以併入正在生長的寡聚化合物股。在隨後的操作中，即，在將前體單體併入股之後，具有親電基團(例如五氟苯基酯或醛基)的配體隨後可以藉由將配體的親電基團與前體單體繫鏈的終端親核基團偶聯。
在另一個實例中，可以併入具有適合參與點擊化學反應的化學基團的單體，例如疊氮化物或炔封端的繫鏈/連接子。在隨後的操作中，即，在將前體單體併入股之後，具有互補化學基團的配體，例如，藉由將炔烴和疊氮化物偶聯在一起，可以將炔烴或疊氮化物附接至前驅單體。
在一些實施方案中，配體可以綴合至寡聚化合物的核鹼基、糖部分體或核苷間連接。與嘌呤核鹼基或其衍生物的綴合可以發生在任何位置，包括環內和環外原子。在一些實施方案中，嘌呤核鹼基的2-、6-、7-或8-位置係附接至綴合物部分體。與嘧啶核鹼基或其衍生物的綴合亦可
以發生在任何位置。在一些實施方案中，嘧啶核鹼基的2-、5-和6-位置可以被綴合部分體取代。當配體與核鹼基綴合時，較佳的位置係不干擾雜交的位置，即不干擾鹼基配對所需的氫鍵相互作用。
與核苷的糖部分體的綴合可以發生在任何碳原子處。可附接至綴合部分的糖部分體的實例碳原子包括2'、3'和5'碳原子。1'位置亦可以附接至綴合部分體，例如在無鹼基殘基。核苷間連接亦可以載有綴合部分體。對於含磷連接(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等)，綴合部分體可以直接附接至磷原子或附接至與磷原子結合的O、N或S原子。對於含胺或醯胺的核苷間連接(例如，PNA)，綴合部分體可以附接至胺或醯胺的氮原子或附接至相鄰的碳原子。
在一些實施方案中，REVERSIR化合物與配體綴合。
雖然可用來將REVERSIR化合物遞送至預期的作用位點，但與REVERSIR化合物綴合的配體可負面影響REVERSIR化合物減低dsRNA活性的能力。因此，在一些實施方案中，配體和REVERSIR化合物之間的連接可設計成在REVERSIR化合物到達所需的作用位點後進行裂解。這可以藉由多種方式來實現。例如，將REVERSIR化合物連接至配體的連接子可以係可裂解的連接子。
在一些實施方案中，與配體綴合的核苷包含去氧糖，例如2'-去氧糖。
在本文所揭露的各個面向的一些實施方案中，配體附接至REVERSIR化合物的3’-終端處的核苷。在一些實施方案中，配體綴合的
核苷酸透過可裂解的核苷酸間連接附接至REVERSIR化合物的其餘部分。在一些實施方案中，可裂解的核苷酸間連接係磷酸二酯核苷酸間連接。
在一些實施方案中，配體綴合的核苷酸包含去氧糖並且透過可裂解的核苷酸間連接以連接至REVERSIR化合物的其餘部分。在一些進一步的實施方案中，可裂解的核苷酸間連接係磷酸二酯連接。
在一些實施方案中，配體綴合的核苷酸包含去氧糖並且透過不為磷酸二酯連接的核苷酸間連接以連接至REVERSIR化合物的其餘部分。
在一些實施方案中，配體綴合至REVERSIR化合物的3'-終端的核苷酸。
在一些實施方案中，配體綴合在REVERSIR化合物的5’-終端。在一些實施方案中，第一配體綴合在REVERSIR化合物的5'-終端，且第二配體綴合至第一配體。
存在多種製備寡聚化合物綴合物的方法。一般而言，藉由使寡聚化合物的反應性基團(例如，OH、SH、胺、羧基、醛等)與綴合部分體的反應性基團接觸，將寡聚化合物連接至綴合部分體。在一些實施方案中，一個反應基團係親電子性的，而另一個反應基團係親核性的。
例如，親電子基團可以係含羰基的官能基並且親核基團可以係胺或硫醇。用於綴合具有和不具有連接基團的核酸和相關寡聚化合物的方法在文獻中有詳細描述，例如在Manoharan in Antisense Research and Applications,Crooke and LeBleu,eds.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,Chapter 17中，其全部內容藉由引用併入本文。
教導寡聚化合物例如寡核苷酸的綴合物的製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717號；第5,580,731號；第5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,149,782號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號；第5,672,662號；第5,688,941號；第5,714,166號；第6,153,737號；第6,172,208號；第6,300,319號；第6,335,434號；第6,335,437號；第6,395,437號；第6,444,806號；第6,486,308號；第6,525,031號；第6,528,631號；第6,559,279號；其內容藉由引用整體併入本文。
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含具有如下所示結構的配體：
其中：
LG每次出現時獨立地為配體，例如碳水化合物，例如單糖、雙糖、三糖、四糖、多糖；以及
Z’,Z”,Z”’和Z''''對於每次出現的O或S各自獨立。
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含式(II)、(III)、(IV)或(V)的配體：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C每次出現時獨立地表示0-20且其中重複單元可以相同或不同；
Q和Q’每次出現時獨立地為不存在、-(P7-Q7-R7)p-T7-或-T7-Q7-T7’-B-T8’-Q8-T8；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、P7、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C、T7、T7’、T8和T8’為每次出現時各自獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
B為-CH2-N(BL)-CH2-；
BL為-TB-QB-TB’-Rx；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C、Q7、Q8和QB為每次出現時獨立地為不存在、亞(伸)烷基、取代的亞(伸)烷基，且其中一個或多個亞甲基可以被一個或多個O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’)、C≡C或C(O)中斷或終止；
TB和TB'為每次出現時獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、OC(O)O、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、CH2、CH2NH或CH2O；
Rx係親脂劑(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉荳蔻酸、O3-(油醯)石膽酸、O3-(油醯)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁
)、維生素(例如，葉酸、維生素A、維生素E、生物素、吡哆醛)、胜肽、碳水化合物(例如，單糖、雙糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、內涵體溶解成分、類固醇(例如，烏蘇醇、山藥皂苷元、薯蕷皂苷元)、萜烯(例如，三萜，例如，菝葜皂苷元、無羈萜(Friedelin)、表弗里德醇衍生的石膽酸)，或陽離子脂質；
R1、R2、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C、R7每次出現時各自獨立地為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、
NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
、
、
、
、
或雜環基；
L1、L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C每次出現時各自獨立地為碳水化合物，例如單糖、雙糖、三糖、四糖、寡糖和多糖；
R’和R”各自獨立地為H、C1-C6烷基、OH、SH或N(RN)2；
RN每次出現時獨立地為H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或芐基；
Ra為H或胺基酸側鏈；
Z’、Z”、Z”’和Z''''每次出現時各自獨立地為O或S；
p每次出現獨立地表示0-20。
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的配體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的配體：
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在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
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在一些實施方案中，L2A和L2B都係不同者。
在一些較佳的實施方案中，L3A和L3B都係相同者。
在一些實施方案中，L3A和L3B都係不同者。
在一些較佳的實施方案中，L4A和L4B都係相同者。
在一些實施方案中，L4A和L4B都係不同者。
在一些較佳的實施方案中，L5A、L5B和L5C全部相同。
在一些實施方案中，L5A、L5B和L5C中的兩者係相同者。
在一些實施方案中，L5A和L5B係相同者。
在一些實施方案中，L5A和L5C係相同者。
在一些實施方案中，L5B和L5C係相同者。
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含下列結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含下列結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含選自下組的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的單體：
在上述單體中，X和Y每次出現時各自獨立地為H、保護基團、磷酸基團、磷酸二酯基團、活化磷酸基團、活化亞磷酸酯基團、亞磷醯胺、固體支撐物、-P(Z')(Z”)O-核苷、-P(Z')(Z”)O-寡核苷酸、脂質、PEG、類固醇、聚合物、核苷酸、核苷或寡核苷酸；和Z'和Z”每次出現時各自獨立地為O或S。
在某些實施方案中，REVERSIR化合物與具有以下結構的配體綴合：
在某些實施方案中，綴合的dsRNA包含以下結構的配體：
在某些實施方案中，REVERSIR化合物包含以下結構的單體：
上述配體和單體的合成描述於例如美國專利第8,106,022號中，其內容藉由引用整體併入本文。
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含以下結構的配體：
在某些實施方案中，本文所述的寡聚化合物，包括但不限於REVERSIR化合物，包含來自Prakash等人的美國專利第9,181,549號中描述的那些配體，該專利的內容藉由引用整體並入本文。
諸如本領域已知的那些連接基團或雙功能連接部分體適用於本文提供的化合物。連接基團有用於將化學官能基、綴合基團、報導基團和其他基團附接至母體化合物(例如寡聚化合物)的選擇性位點。一般而言，雙官能連接部分體包含具有兩個官能基的烴基部分體。選擇官能基之一來結合至母體分子或感興趣的化合物，選擇另一個官能基來結合實質上任何選定的基團，例如化學官能基或綴合基團。在一些實施方案中，連接子包含例如乙二醇或胺基酸單元之重複單元的鏈結構或寡聚物。雙官能連接部分體中常規使用的官能基的實例包括但不限於用於與親核基團反應的親電子試劑和用於與親電子基團反應的親核試劑。在一些實施方案中，雙官能連接部分體包括胺基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和度(例如雙鍵或三鍵)等。雙官能連接部分體的一些非限制性實例包括8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)和6-胺基己酸(AHEX或AHA)。其他連接基團包括但不限於取代的C1-
C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基或取代或未取代的C2-C10炔基，其中較佳取代基的非限制性清單包括羥基、胺基、烷氧基、羧基、芐基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些實施方案中，配體透過連接子與寡聚化合物綴合。
如本文所用，術語「連接子」係指連結化合物的兩個部分的有機部分體。連接基通常包含直接鍵或原子例如氧或硫、單元例如NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子鏈例如取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基，烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一個或多個亞甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、可裂解連接基團、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環中斷或封端；其中R1為氫、醯基、脂族基或取代的脂族基。
在一個實施方案中，連接子為-[(P-Q”-R)q-X-(P'-Q''''-R')q”]q”-T-，其中：
P、R、T、P’、R’和T每次出現時各自獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O；NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CH=N-O、
、
、
、
、
或雜環基；
Q”和Q'''每次出現時各自獨立地不存在、-(CH2)n-、-C(R1)(R2)(CH2)n-、-(CH2)nC(R1)(R2)-、-(CH2CH2O)mCH2CH2-或-(CH2CH2O)mCH2 CH2NH-；
X為不存在或可裂解的連接基團；
Ra為H或胺基酸側鏈；
R1和R2每次出現時各自獨立地為H、CH3、OH、SH或N(RN)2；
RN每次出現時獨立地為H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或芐基；
q、q’和q每次出現時各自獨立地為0-20且其中重複單元可以相同或不同；
n每次出現時獨立地為1-20；且
m對於每次出現獨立地為0-50。
在一些實施方案中，連接子包含至少一個可裂解的連接基團。
在一些實施方案中，連接子為分支化連接子。支化連接子的分支點可以係至少三價的，但可以係四價、五價或六價原子，或呈現此類
多價的基團。在一些實施方案中，分支點係-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C、或-N(Q)C(O)O-C；其中Q每次出現時獨立地為H或視需要取代的烷基。在一些實施方案中，分支點係甘油或其衍生物。
可裂解的連接基團係一種在細胞外足夠穩定的連接基團，但在進入標靶細胞後被裂解以釋放連接子結合在一起的兩個部分。在較佳的實施方案中，可裂解的連接基團在標靶細胞中或在第一參考條件(其可以例如被選擇來模擬或代表細胞內條件)下，比在個體的血液或血清中或在第二參考條件(例如，可以選擇其來模擬或代表在血液或血清中發現的條件)下，被裂解快至少10倍或更多，較佳至少100倍。
可裂解的連接基團對裂解劑敏感，例如pH、氧化還原電位或降解分子的存在。一般來說，細胞內的裂解劑比血清或血液中更普遍，或其水平或活性更高。此類降解劑的實例包括：針對特定基質選擇的氧化還原劑或不具有基質特異性的氧化還原劑，包括例如存在於細胞中的氧化或還原酶或還原劑例如硫醇，其可藉由以下方式降解氧化還原可裂解連接基團：還原；酯酶；醯胺酶；可產生酸性環境的內體或試劑，例如導致pH為5或更低的那些；可藉由充當一般酸來水解或降解酸可裂解連接基團的酵素、胜肽酶(其可以係基質特異性的)和蛋白酶和磷酸酶。
連接子可包括可被特定酵素裂解的可裂解連接基團。摻入連接子中的可裂解連接基團的類型可以取決於待靶向的細胞。例如，肝臟靶向配體可以經由包括酯基的連接子連接至陽離子脂質。肝細胞富含酯酶，
因此連接子在肝細胞中比在不富含酯酶的細胞類型中更有效地裂解。其他富含酯酶的細胞類型包括肺細胞、腎皮質細胞和睪丸細胞。
當靶向富含肽酶的細胞類型例如肝細胞和滑膜細胞時，可以使用含有肽鍵的連接子。
在一些實施方案中，可裂解的連接基團在細胞中(或在選擇模擬的體外條件下)，與血液或血清(或在選擇模擬細胞外條件的體外條件下)相比，裂解至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、10、25、50或100倍(或在選擇模擬細胞內條件的體外條件下)。在一些實施方案中，可裂解的連接基團在血液中(或選擇模擬細胞外條件的體外條件)，與細胞內(或選擇模擬細胞內條件的體外條件下)相比，被裂解小於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%。
例示性的可裂解連接基團包括但不限於氧化還原可裂解連接基團(例如，-S-S-和-C(R)2-S-S-，其中R為H或C1-C6烷基並且至少一個R為C1-C6烷基，例如CH3或CH2CH3)；基於磷酸的可裂解連接基團(例如，-O-P(O)(OR)-O-、-O-P(S)(OR)-O-、-O-P(S)(SR)-O-、-S-P(O)(OR)-O-、-O-P(O)(OR)-S-、-S-P(O)(OR)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(OR)-O-、-O-P(O)(R)-O-、-O-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-O-、-S-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-S-、-O-P(S)(R)-S-、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-，其中R為視需要取代的直鏈或支鏈C1-C10烷基)；酸可裂解連接基團(例如腙、酯和
胺基酸酯、-C=NN-和-OC(O)-)；基於酯的可裂解連接基團(例如，-C(O)O-)；基於胜肽的可裂解連接基團，(例如，被細胞中的肽酶和蛋白酶等酶裂解的連接基團，例如，-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB為兩個相鄰胺基酸的R基團)。基於胜肽的可裂解連接基團包含兩個或更多個胺基酸。在一些實施方案中，基於胜肽的可裂解連接包含作為細胞中發現的肽酶或蛋白酶的基質的胺基酸序列。
在一些實施方案中，酸可裂解的連接基團可在pH約6.5或更低(例如，約6.-、5.5、5.0或更低)的酸性環境中裂解，或藉由諸如可充當一般酸的酵素的試劑裂解。
在一些實施方案中，該連接子為寡核苷酸連接子，包括但不限於(N)n；其中N獨立地為修飾的或未修飾的核苷酸且n為1-23。在一些實施方案中，n為1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，寡核苷酸連接子選自由GNRA、(G)4、(U)4和(dT)4所組成之群組，其中N為修飾的或未修飾的核苷酸且R為修飾的或未修飾的嘌呤核苷酸。連接子中的一些核苷酸可以參與與連接子中其他核苷酸的鹼基對相互作用。本發明所屬技術領域中具有通常知識者應理解，本文所述的任何寡核苷酸化學修飾或變化都可用於寡核苷酸連接子中。在某些實施方案中，連接子為dA。
IV.本發明的REVERSIR的合成、純化與分析
修飾和未修飾的核苷和核苷酸的寡聚可以根據DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Ed.Agrawal(1993),Humana Press)和/或RNA(Scaringe,Methods(2001),23,206-217.Gait等人，
Applications of Chemically synthesized RNA in RNA：Protein Interactions,Ed.Smith(1998),1-36.Gallo等人，Tetrahedron(2001),57,5707-5713)的文獻程序常規進行。
本文提供的寡聚化合物可以藉由公知的固相合成技術方便且常規地製備。用於這種合成的設備由多個供應商出售，包括例如Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。可以另外或替代地使用本領域已知的任何其他用於此類合成的方法。眾所周知，使用類似的技術來製備寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。本發明不受反義化合物合成方法的限制。
寡聚化合物的純化和分析方法係本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知者。分析方法包括毛細管電泳(CE)和電噴灑質譜法。這種合成和分析方法可以在多孔板中進行。本發明的方法不受寡聚物純化方法的限制。
本發明的寡聚化合物可以使用溶液相或固相有機合成來製備，或藉由本領域已知的方法以酵素來製備。有機合成提供的優點係可以容易地製備包含非天然或修飾的核苷酸的寡聚股。可以另外或替代地使用本領域已知的任何其他用於此類合成的方法。亦已知使用類似的技術來製備其他寡聚化合物，例如包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和糖間鍵的烷基化衍生物的那些。本發明的雙股寡聚化合物可以使用兩步驟程序來製備。首先，分別製備雙股分子的各個股。然後，將成分股低溫黏合。
無論合成方法為何，寡聚化合物可以在適合配製的溶液(例如，水性和/或有機溶液)中製備。例如，可以將寡聚製劑沉澱並重新溶解在
純雙蒸水中，然後冷凍乾燥。然後可以將乾燥的寡聚化合物重新懸浮在適合於預期配製過程的溶液中。
關於特定改性寡聚化合物的合成的教導可以在以下美國專利或待審專利申請中找到：美國專利第5,138,045號及第5,218,105號，涉及多胺綴合的寡核苷酸；美國專利第5,212,295號，涉及用於製備具有手性磷連接的寡核苷酸的單體；美國專利第5,378,825號和5,541,307號，涉及具有修飾主鏈的寡核苷酸；美國專利第5,386,023號，涉及主鏈修飾的寡核苷酸及其經由還原偶聯的製備；美國專利第5,457,191號，涉及基於3-脫氮嘌呤環系統的修飾核鹼基及其合成方法；美國專利第5,459,255號，涉及基於N-2個取代的嘌呤的修飾核鹼基；美國專利第5,521,302號，涉及具有手性磷連接的寡核苷酸的製備方法；美國專利第5,539,082號，涉及胜肽核酸；美國專利第5,554,746號，涉及具有β-內醯胺主鏈的寡核苷酸；美國專利第5,554,746號，涉及具有β-內醯胺主鏈的寡核苷酸；美國專利第5,571,902號，涉及寡核苷酸的合成方法和材料；美國專利第5,578,718號，涉及具有烷硫基的核苷，其中此類基團可以用作與在核苷的多個位置中的任意位置附接的其他部分的連接子；美國專利第5,587,361號和第5,599,797號，涉及具有高手性純度的硫代磷酸酯連接的寡核苷酸；美國專利第5,506,351號，涉及2'-O-烷基鳥苷及相關化合物的製備方法，包括2,6-二胺基嘌呤化合物的製備方法；美國專利第5,587,469號，涉及具有N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美國專利第5,587,470號，涉及具有3-脫氮嘌呤的寡核苷酸；美國專利第5,223,168號和美國專利第5,608,046號，皆涉及綴合的4'-去甲基核苷類似物；美國專利第5,602,240號及第
5,610,289號，涉及主鏈修飾的寡核苷酸類似物；以及美國專利第6,262,241號和第5,459,255號尤其涉及合成2'-氟寡核苷酸的方法。
V.本發明的醫藥組成物
寡聚化合物可以與藥學上可接受的活性和/或惰性物質混合以製備醫藥組成物或製劑。組成物和用於配製醫藥組成物的方法取決於許多標準，包括但不限於施用途徑、疾病程度或待施用的劑量。
寡聚化合物，包括REVERSIR化合物，可藉由將此類寡聚化合物與合適的藥學上可接受的稀釋劑或載體組合而用於醫藥組成物中。藥學上可接受的稀釋劑包括磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。PBS係適合用於腸胃外送的組成物的稀釋劑。因此，在一個實施方案中，本文所述的方法中採用的係包含REVERSIR化合物和藥學上可接受的稀釋劑的醫藥組成物。在某些實施方案中，藥學上可接受的稀釋劑係PBS。
包含寡聚化合物的醫藥組成物涵蓋任何藥學上可接受的鹽、酯或此類酯的鹽。在某些實施方案中，包含寡聚化合物的醫藥組成物包含一種或多種寡核苷酸，其在施用於動物(包括人類)時能夠(直接或間接)提供其生物活性代謝物或其殘基。因此，例如，本揭露亦涉及反義化合物的藥學上可接受的鹽、前藥、此類前藥的藥學上可接受的鹽和其他生物等效物。適當的藥學上可接受的鹽包括但不限於鈉鹽和鉀鹽。
前藥可包括在寡聚化合物的一端或兩端摻入額外的核苷，該核苷被體內的內源性核酸酶切割，以形成活性寡聚化合物。
本發明的醫藥組成物可以多種方式施用，這取決於是否需要局部或全身治療以及待治療的區域。施用可以係局部(例如，藉由皮膚貼
片)、肺部，例如，藉由吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括藉由噴霧器；氣管內、鼻內、表皮和透皮、口服或腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉注射或輸注；皮下施用，例如透過植入裝置；或顱內施用，例如藉由腦實質內、鞘內或心臟室內施用。
寡聚化合物可以以靶向特定組織例如肝臟(例如肝臟的肝細胞)的方式遞送。
用於局部施用的醫藥組成物和製劑可以包括透皮貼片、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體劑和粉末劑。常規的藥物載體、水性、粉末或油性基質、增稠劑等可能係必要的或期望者。帶塗層的軟片袋、手套等亦可能有用。適當的局部製劑包括其中本發明特徵的iRNA與局部遞送劑例如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和界面活性劑混合的製劑。適當的脂質和脂質體包括中性(例如，二油醯磷脂醯DOPE乙醇胺、二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼DMPC、二硬脂醯磷脂醯膽鹼)、陰性(例如，二肉荳蔻醯磷脂醯甘油DMPG)和陽離子(例如，二油醯四甲基胺基丙基DOTAP和二油醯磷脂醯乙醇胺DOTMA)。本發明所鑑定的iRNA可被封裝在脂質體內或可與其形成複合物，特別係與陽離子脂質體。替代地，iRNA可以與脂質複合，特別係與陽離子脂質複合。適當的脂肪酸和酯包括但不限於花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸、三癸酸、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或C1-20烷基酯(例如肉荳蔻酸異丙酯IPM)、
甘油單酯、甘油二酯或其藥學上可接受的鹽。局部製劑詳細描述於美國專利第6,747,014號中，該專利藉由引用併入本文。
除已研究並用於藥物配製的微乳液之外，還有許多有組織的界面活性劑結構。此等包括單層、微胞、雙層和囊泡。囊泡，例如脂質體，由於其特異性和從藥物遞送的角度提供的作用持續時間而引起極大的興趣。如本發明所使用的，術語「脂質體」係指由排列成一個或多個球形雙層的兩親性脂質組成的囊泡。
脂質體係單層或多層囊泡，其具有由親脂性材料形成的膜和水性內部。水性部分含有待遞送的組成物。陽離子脂質體具有能夠與細胞壁融合的優點。非陽離子脂質體雖然無法有效地與細胞壁融合，但在體內被巨噬細胞吸收。
脂質體的進一步優點包括；由天然磷脂獲得的脂質體具有生物相容性和可生物降解性；脂質體可以摻入多種水溶性和脂溶性藥物；脂質體可以保護其內部隔間中的封裝藥物免受代謝和降解(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。製備脂質體製劑時重要的考量因素係脂質表面電荷、囊泡大小和脂質體的水體積。
脂質體有用於將活性成分轉移和遞送至作用位點。由於脂質體膜在結構上與生物膜相似，當脂質體應用於組織時，脂質體開始與細胞膜融合，並且隨著脂質體和細胞融合的進行，脂質體內容物被排空到活性劑可以作用的細胞。
脂質體製劑作為許多藥物的遞送方式已成為廣泛研究的焦點。越來越多的證據表明，對於局部施用，脂質體比其他製劑具有多種優勢。此等優點包括減少與所施用藥物的高全身吸收相關的副作用、增加所施用藥物在所需標靶的積累、以及能夠將多種親水性和疏水性藥物施用到皮膚中。
一些報告詳細描述脂質體將包括高分子量DNA的試劑遞送到皮膚中的能力。包括止痛劑、抗體、荷爾蒙和高分子量DNA在內的化合物已被注射到皮膚。大多數應用都針對上表皮。
脂質體分為兩大類。陽離子脂質體係帶正電荷的脂質體，與帶負電荷的DNA分子相互作用形成穩定的複合物。帶正電荷的DNA/脂質體複合物與帶負電荷的細胞表面結合併內化於核內體。由於內體內的酸性pH，脂質體破裂，將其內容物釋放到細胞質中(Wang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
pH-敏感或帶負電荷的脂質體捕獲DNA而不係與其複合。由於DNA和脂質都帶有類似的電荷，因此會發生排斥而不係形成複合物。然而，有些DNA被截留在此等脂質體的水性內部。pH-敏感脂質體已用於將編碼胸苷激酶基因的DNA遞送至培養中的單層細胞。檢測標靶細胞中外源基因的表現(Zhou等人，Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
脂質體組成物的一個主要類型包括天然來源的磷脂醯膽鹼之外的磷脂質。中性脂質體組成物例如可以由二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)或二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)形成。陰離子脂質體組成物通常由
二肉荳蔻醯磷脂醯甘油形成，而陰離子融合脂質體則主要由二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。另一種類型的脂質體組成物由磷脂醯膽鹼(PC)形成，例如大豆PC和蛋PC。另一種類型係由磷脂質和/或磷脂醯膽鹼和/或膽固醇的混合物形成。
多項研究評估脂質體藥物製劑向皮膚的局部遞送。將含有干擾素的脂質體應用於豚鼠皮膚可減少皮膚皰疹，而藉由其他方式(例如溶液或乳液)輸送干擾素則無效(Weiner等人，Journal of Drug Targeting,1992,2,405-410)。此外，另一項研究測試作為脂質體製劑的一部分施用的干擾素與使用水性系統施用干擾素的功效，並得出結論，脂質體製劑優於水性施用(du Plessis等人，Antiviral Research,1992,18,259-265)。
亦檢查非離子脂質體系統以確定其在將藥物遞送至皮膚中的效用，特別係包含非離子界面活性劑和膽固醇的系統。使用含有NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)和NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)的非離子脂質體製劑將環孢菌素-A遞送至小鼠皮膚真皮中。結果表明，這種非離子脂質體系統可有效促進環孢菌素-A沉積到皮膚的不同層(Hu等人，S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466)。
脂質體還包括「空間穩定」的脂質體，該術語在本文中使用時係指包含一種或多種特化脂質的脂質體，當摻入脂質體中時，相對於缺乏此類特化脂質的脂質體，導致循環壽命延長。空間穩定的脂質體的實例係其中脂質體的囊泡形成脂質部分的一部分(A)包含一種或多種糖脂，例如單唾液酸神經節苷脂GM1，或(B)用一種或多種親水性聚合物衍生化的脂
質體，例如聚乙二醇(PEG)部分。儘管不希望受任何特定理論的束縛，但本領域認為，至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂或PEG衍生脂質的空間穩定的脂質體，此等空間穩定的脂質體的循環半衰期的延長源自以下因素：網狀內皮系統(RES)細胞的攝取減少(Allen等人，FEBS Letters,1987,223,42；Wu等人，Cancer Research,1993,53,3765)。
包含一種或多種糖脂的各種脂質體係本領域已知者。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)報告單唾液酸神經節苷脂GM1、硫酸半乳糖腦苷脂和磷脂醯肌醇改善脂質體血液半衰期的能力。Gabizon等人闡述此等發現(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)。Allen等人的美國專利第4,837,028號和WO 88/04924公開包含(1)鞘磷脂和(2)神經節苷脂GM1或半乳糖腦苷脂硫酸酯的脂質體。美國專利第5,543,152號(Webb等人)公開包含鞘磷脂的脂質體。包含1，2-sn-二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼的脂質體公開於WO 97/13499(Lim等人)。
許多包含用一種或多種親水性聚合物衍生的脂質的脂質體及其製備方法係本領域已知者。Sunamoto等人(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778)描述包含非離子去污劑2C1215G的脂質體，其含有PEG部分。Illum等人(FEBS Lett.,1984,167,79)指出，聚苯乙烯顆粒與聚合二醇的親水性塗層可顯著延長血液半衰期。Sears描述連接聚亞(伸)烷基二醇(例如PEG)的羧基而修飾的合成磷脂(美國專利號第4,426,330號和第4,534,899號)。Klibanov等人(FEBS Lett.,1990,268,235)描述證明包含PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂醯乙醇胺(PE)的脂質體具有顯著增加的血液循環半衰期的實驗。Blume等人(Biochimica et Biophysicala Acta,
1990,1029,91)將這種觀察擴展到其他PEG衍生的磷脂，例如由二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)和PEG組合形成的DSPE-PEG。在Fisher的歐洲專利第EP 0 445 131 B1號和WO 90/04384中描述在其外表面上具有共價結合的PEG部分的脂質體。Woodle等人(美國專利第5,013,556號和第5,356,633號)及Martin等人(美國專利第5,213,804號和歐洲專利第EP 0 496 813 B1號)描述含有1-20莫耳%的用PEG衍生的PE的脂質體組成物及其使用方法。包含許多其他脂質-聚合物綴合物的脂質體公開於WO 91/05545和美國專利第5,225,212號(皆屬於Martin等人)及WO 94/20073(Zalipsky等人)。包含PEG修飾的神經醯胺脂質的脂質體描述於WO 96/10391(Choi等人)中。美國專利第5,540,935號(Miyazaki等人)及美國專利第5,556,948號(Tagawa等人)描述含有PEG的脂質體，其可以在其表面上用功能部分進一步衍生化。
許多包含核酸的脂質體係本領域已知者。Thierry等人的WO 96/40062公開將高分子量核酸封裝在脂質體中的方法。Takawa等人的美國專利第5,264,221號公開蛋白質結合的脂質體，並斷言此類脂質體的內容物可能包括dsRNA。Rahman等人的美國專利第5,665,710號描述將寡去氧核苷酸封裝在脂質體中的某些方法。Love等人的WO 97/04787公開包含標靶raf基因的dsRNA的脂質體。
傳遞體係另一種類型的脂質體，並且係高度可變形的脂質聚集體，其係藥物遞送載體的有吸引力的候選者。傳遞體可以被描述為脂滴，其高度可變形，以至於它們能夠容易地穿透比脂滴小的孔。傳遞體能夠適應其使用環境，例如，它們能夠自我優化(適應皮膚毛孔的形狀)、自我修復、
經常達到目標而不破碎，並且經常自我加載。為製備傳遞體，可以將表面邊緣活化劑，通常係表面活性劑，添加到標準脂質體組成物中。傳遞體已用於將血清白蛋白遞送至皮膚。轉體介導的血清白蛋白遞送已被證明與皮下注射含有血清白蛋白的溶液一樣有效。
脂質體組成物可以藉由本領域已知的多種方法來製備。參見美國專利第4,235,871號；第4,737,323號；第4,897,355號和第5,171,678號；公開於國際專利申請WO 96/14057和WO 96/37194；Felgner,P.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA(1987)8：7413-7417、Bangham，等人，M.Mol.Biol.(1965)23：238、Olson，等人，Biochim.Biophys.Acta(1979)557：9、Szoka，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1978)75：4194、Mayhew，等人，Biochim.Biophys.Acta(1984)775：169、Kim，等人Biochim.Biophys.Acta(1983)728：339，以及Fukunaga，等人，Endocrinol.(1984)115：757。
界面活性劑在如乳液(包括微乳液)和脂質體等製劑中有著廣泛的應用。對許多不同類型的天然和合成界面活性劑的特性進行分類和排序的最常見方法係使用親水/親油平衡(HLB)。親水基團(亦稱為「頭」)的性質提供對製劑中使用的不同界面活性劑進行分類的最有用的方法(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果界面活性劑分子未離子化，則其分類為非離子界面活性劑。非離子界面活性劑在藥品和化妝品中有著廣泛的應用，並且可在廣泛的pH值範圍內使用。一般來說，它們的HLB值範圍為2至18左右，具體取決於其結構。非離子界面活性劑包括非離子酯，如乙二醇酯、丙二醇
酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非離子鏈烷醇醯胺和醚例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物亦包括在此類中。聚氧乙烯界面活性劑係非離子界面活性劑類別中最受歡迎的成員。
如果界面活性劑分子在溶解或分散在水中時帶有負電荷，則界面活性劑被分類為陰離子型。陰離子界面活性劑包括羧酸鹽，例如皂、醯基乳酸鹽、胺基酸的醯基醯胺；硫酸酯，例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯；磺酸酯，例如烷基苯磺酸酯、醯基羥乙基磺酸酯、醯基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯；以及磷酸酯。陰離子界面活性劑類別中最重要的成員係烷基硫酸酯和肥皂。
如果界面活性劑分子在溶解或分散在水中時帶有正電荷，則界面活性劑被分類為陽離子型。陽離子界面活性劑包括季銨鹽和乙氧基化胺。季銨鹽係這類中最常使用的成員。
如果界面活性劑分子具有攜帶正電荷或負電荷的能力，則該界面活性劑被分類為兩性界面活性劑。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的烷基醯胺、N-烷基甜菜鹼和磷脂質。
界面活性劑在藥物產品、製劑和乳液中的使用已被綜述(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
A.脂質顆粒
在一些實施方案中，REVERSIR可以完全封裝在脂質製劑中，例如LNP或其他核酸-脂質顆粒。封裝在脂質製劑中的REVERSIR可以係未綴合的或與配體綴合的(即綴合的REVERSIR)。
如本文所用，術語「LNP」係指穩定的核酸-脂質顆粒。LNP含有陽離子脂質、非陽離子脂質和防止顆粒聚集的脂質(例如PEG-脂質綴合物)。LNP對於全身性應用非常有用，因為它們在靜脈(i.v)注射後表現出延長的循環壽命，並在遠端部位(例如與給藥部位物理分離的部位)積聚。LNP包括「pSPLP」，其包括封裝的縮合劑-核酸複合物，如PCT公開號WO 00/03683所述。本發明的顆粒通常具有約50nm至約150nm、更通常約60nm至約130nm、更通常約70nm至約110nm、最通常約70nm至約90nm的平均直徑，並且實質上無毒。另外，當存在於本發明的核酸-脂質顆粒中時，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂質顆粒及其製備方法公開於例如美國專利第5,976,567號；第5,981,501號；第6,534,484號；第6,586,410號；第6,815,432號；美國公開2010/0324120和PCT公開WO 00/03683。
在一些實施方案中，脂質與藥物的比例(質量/質量比)(例如，脂質與REVERSIR的比例)將在約1：1至約50：1、約1：1至約25：1、約3：1至約15：1、約4：1至約10：1、約5：1至約9：1、或約6：1至約9：1的範圍內。上述範圍中間的範圍亦被認為係本發明的一部分。
陽離子脂質可以係，例如，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(I-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油醯氧基)丙基)-
N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油醯氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亞麻油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亞麻油基胺基甲醯氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞麻油醯基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞麻油醯氧基-3-N-
啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞麻油醯基-3-二甲胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞麻油醯硫基-3-二甲胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞麻油醯基-2-亞麻油醯氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞麻油醯氧基-3-三甲胺基丙烷氯化鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞麻油醯基-3-三甲胺基丙烷氯化鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞麻醯氧基-3-(N-甲基哌
基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亞麻油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二酸(DOAP)、1,2-二亞麻油基側氧-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊并[d][1,3]二氧雜環戊-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-七十三烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲胺基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌
-1-基)乙基氮烷二基)雙十二烷-2-醇或其混合物。陽離子脂質可佔顆粒中存在的總脂質的約20mol%至約50mol%或約40mol%。
在一些實施方案中，化合物2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷可用於製備脂質-REVERSIR奈米顆粒。2,2-二亞麻
油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷的合成描述於國際申請PCT/US2009/061897，公開為WO/2010/048536，並經引用併入本文。
在一些實施方案中，脂質-REVERSIR顆粒包含40% 2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷：10% DSPC：40%膽固醇：10% PEG-C-DOMG(莫耳%)，粒徑為63.0±20nm，REVERSIR/脂質比為0.027。
可離子化/非陽離子脂質可以係陰離子脂質或中性脂質，包括但不限於，二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯基醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉荳蔻醯磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、膽固醇或其混合物。非陽離子脂質，若包括膽固醇，可以係顆粒中存在的總脂質的約5mol%至約90mol%、約10mol%或約58mol%。
抑制顆粒聚集的綴合脂質可以係例如聚乙二醇(PEG)-脂質，包括但不限於，PEG-二醯基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂質、PEG-神經醯胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA綴合物可以係例如PEG-二月桂醯氧基丙基(C12)、PEG-二肉荳蔻醯氧基丙基(C14)、PEG-二棕
櫚醯氧基丙基(C16)或PEG-二硬脂醯氧基丙基(C18)。防止顆粒聚集的綴合脂質可以係顆粒中存在的總脂質的0mol%至約20mol%或約2mol%。
在一些實施方案中，核酸-脂質顆粒亦包含佔顆粒中存在的總脂質的例如約10mol%至約60mol%或約48mol%的膽固醇。
另外的示範性脂質-REVERSIR製劑描述於下表。
示範性脂質REVERSIR的配方
*REVERSIR可以係未綴合的或與配體綴合的(即綴合的REVERSIR)。
上表的縮寫包括以下：DSPC：二硬脂醯磷脂醯膽鹼；DPPC：二棕櫚醯磷脂醯膽鹼；PEG-DMG：PEG-二肉荳蔻醯甘油(C14-PEG或PEG-C14)(平均分子量為2000的PEG)；PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(平均分子量為2000的PEG)；PEG-cDMA：PEG-胺基甲醯基-1,2-二肉荳蔻醯氧基丙胺(平均分子量為2000的PEG)。
包含DLinDMA(1,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷)的製劑描述於2009年4月15日提交的國際專利公開號WO2009/127060中，該文獻據此以引用方式併入。
包含XTC的製劑描述於例如：2009年1月29日提交的美國臨時專利申請第61/148,366號；2009年3月2日提交的美國臨時專利申請第61/156,851號；2009年6月10日提交的美國臨時專利申請；2009年7月24日提交的美國臨時專利申請第61/228,373號；2009年9月3日提
交的美國臨時專利申請第61/239,686號，以及2010年1月29日提交的國際專利申請PCT/US2010/022614，其藉由引用併入本文。
包含MC3的製劑描述於例如2010年6月10日提交的美國專利公開號2010/0324120中，其全部內容藉由引用併入本文。
包含生物可降解脂質的製劑描述於例如2011年6月3日提交的PCT公開號WO2011/153493和2012年12月7日提交的WO/2013/086354，其全部內容經引用併入本文。
包含(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳六烯-13,16-二烯-1-胺的製劑描述於例如9月20日提交的在PCT公開號WO/2012/040184中，2011年，其全部內容經引用併入本文。
本發明的寡聚化合物可以製備並配製為微胞。如本文所用，「微胞」係一種特殊類型的分子組裝體，其中兩親性分子排列成球形結構，使得分子上的所有疏水部分都向內，留下親水部分與周圍的水相接觸。如果環境係疏水性的，則存在相反的排列。
在一些實施方案中，製劑包含由本發明的寡核苷酸和至少一種兩親載體形成的微胞，其中微胞較佳具有小於約100nm的平均直徑。更佳的實施方案提供平均直徑小於約50nm的微胞，又更佳的實施方案提供平均直徑小於約30nm、或甚至小於約20nm的微胞。
微胞製劑可以藉由混合寡核苷酸組成物的水溶液、鹼金屬C8至C22烷基硫酸鹽和兩親載體來製備。兩親載體可以在添加鹼金屬烷基硫酸鹽的同時或之後添加。微胞將藉由實質上任何類型的成分混合而形成，但劇烈混合以提供更小尺寸的微胞。
本發明的寡聚化合物可以製備並配製為乳液。如本文所用，「乳液」係一種液體以液滴形式分散在另一種液體中的異質系統。
乳液通常係包含彼此緊密混合和分散的兩種不混溶液相的雙相繫統。一般來說，乳液可以係油包水(w/o)或水包油(o/w)類型。當水相細分為微小液滴並分散到大量油相時，所得組合稱為油包水(w/o)乳液。替代地，當油相細分為微小液滴並分散到本體水相時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。除分散相之外，乳劑還可以含有另外的成分，活性藥物可以作為溶液存在於水相、油相中或其本身作為單獨的相。根據需要，乳液中還可以存在藥物賦形劑，例如乳化劑、穩定劑、染料和抗氧化劑。藥物乳液還可以係由多於兩相組成的多重乳液，例如，在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情況下。這種複雜的配方通常具有簡單二元乳液所沒有的某些優點。多重乳液，其中o/w乳液的單一油滴包圍小水滴，構成w/o/w乳液。同樣，封閉在穩定在油性連續相中的水滴中的油滴系統提供o/w/o乳液。
乳液的特徵在於很少或沒有熱力學穩定性。通常，乳液的分散相或不連續相很好地分散到外相或連續相中，並經由乳化劑或製劑的黏度保持這種形式。乳液的任一相可以係半固體或固體，如乳液型軟膏基質和霜劑的情況。穩定乳液的其他方法需要使用可摻入乳液的任一相中的乳化劑。乳化劑大致可分為四大類：合成界面活性劑、天然乳化劑、吸收基質、精細分散固體(Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑，亦稱為界面活性劑，已在乳液配製中發現廣泛的適用性，並且已在文獻中進行綜述(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑通常係兩親性的並且包含親水性部分和疏水部分。界面活性劑的親水性與疏水性的比率被稱為親水/親油平衡(HLB)，並且係在製劑製備中對界面活性劑進行分類和選擇的有價值的工具。根據親水基團的性質，界面活性劑可分為不同類別：非離子型、陰離子型、陽離子型和兩性型(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液製劑中使用的天然存在的乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂質、卵磷脂和阿拉伯膠。吸收基質具有親水性，因此它們可以吸收水形成w/o乳液，同時保持其半固體稠度，例如無水羊毛脂和親水性凡士林。細碎的固體亦被用作良好的乳化劑，特別係與界面活性劑組合和在黏性製劑中。此等包括極性無機固體，例如重金屬氫氧化物，非溶脹黏土，如膨潤土、綠坡縷石、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁和膠體矽酸鎂鋁，顏料和非極性固體，如碳或三硬脂酸甘油酯。
多種非乳化材料亦包含在乳液製劑中並且有助於乳液的性質。此等包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水性膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,
Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
親水性膠體或親水膠體包括天然存在的樹膠和合成聚合物，例如多糖(例如，阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、角叉菜膠、瓜爾膠、刺梧桐膠和黃蓍膠)、纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)和合成聚合物(例如卡波姆、纖維素醚和羧乙烯基聚合物)。它們在水中分散或膨脹形成膠體溶液，藉由在分散相液滴周圍形成堅固的界面膜並增加外相的黏度來穩定乳液。
由於乳劑通常含有多種可容易支持微生物生長的成分，例如碳水化合物、蛋白質、甾醇和磷脂，因此此等製劑通常摻入防腐劑。乳液製劑中常用的防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、季銨鹽、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸酯和硼酸。乳液製劑中通常亦會添加抗氧化劑以防止製劑變質。所使用的抗氧化劑可以係自由基清除劑，例如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯，或還原劑，例如抗壞血酸和焦亞硫酸鈉，以及抗氧化劑增效劑，如檸檬酸、酒石酸和卵磷脂。
在一些實施方案中，組成物被配製為微乳液。如本文所用，「微乳液」係指水、油和兩親物的體系，其係單一光學各向同性且熱力學穩定的液體溶液。微乳液還包括兩種不混溶液體的熱力學穩定、各向同性透明分散體，藉由表面活性分子的界面膜進行穩定。
微乳液可以定義為水、油和兩親物的系統，其係單一光學各向同性且熱力學穩定的液體溶液(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。通常，微乳液係藉由先將油分散在界面活性劑水溶液中，然後添加足夠量的第四組分(通常係中等鏈長的醇)以形成透明體系而製備的系統。因此，微乳液亦被描述為兩種不混溶液體的熱力學穩定、各向同性透明分散體，藉由表面活性分子的界面膜進行穩定(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。微乳液通常由三到五種成分組合製備，包括油、水、界面活性劑、助表面活性劑和電解質。微乳液係油包水型(w/o)或水包油型(o/w)取決於所使用的油和界面活性劑的性質以及界面活性劑分子的極性頭和烴尾的幾何堆積。(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相圖的現象學方法已被廣泛研究，並為本發明所屬技術領域中具有通常知識者提供瞭如何配製微乳液的全面知識(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。與傳統乳劑相比，微乳劑具有將不溶於水的藥物溶解在自發形成的熱力學穩定液滴製劑中的優點。
用於製備微乳液的界面活性劑包括但不限於：離子界面活性劑、非離子界面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)，單獨或與輔助界面活性劑組合。助界面活性劑通常係短鏈醇，例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，藉由滲透到界面活性劑膜中並由於表面活性劑分子之間產生的空隙空間而產生無序膜，從而增加界面流動性。然而，可以在不使用輔助界面活性劑的情況下製備微乳液，且無醇自乳化微乳液系統係本領域已知的。水相通常可以係但不限於水、藥物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可包括但不限於材料諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中鏈(C8-C12)甘油單酯、二甘油酯和三甘油酯、聚氧乙烯化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、飽和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油及矽油。
從藥物溶解和增強藥物吸收的角度來看，微乳液特別令人感興趣。已提出基於脂質的微乳液(o/w和w/o)來增強藥物(包括胜肽)的口服生物利用度(Constantinides等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳劑具有以下優點：改善藥物溶解度、保護藥物免受酵素水解、由於界面活性劑誘導的膜流動性和滲透性改變而可能增強藥物吸收、易於製備、比固體劑型更容易口服給藥、改善臨床效力以及降低毒性(Constantinides
等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。通常，當微乳液的組成在環境溫度下聚集在一起時，微乳液可以自發性形成。當配製不耐熱藥物、胜肽或dsRNA時，這可能特別有利。微乳液在化妝品和藥物應用中的活性成分的透皮遞送方面亦很有效。預期本發明的微乳液組成物和製劑將促進增加dsRNA和核酸從胃腸道的全身吸收，以及改善dsRNA和核酸的局部細胞攝取。
本發明的微乳液還可以含有另外的組分和添加劑，例如脫水山梨醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和滲透促進劑，以改善製劑的性質並增強本發明的dsRNA和核酸的吸收發明。本發明的微乳液中所使用的滲透促進劑可分類為屬於五大類之一-界面活性劑、脂肪酸、膽鹽、螯合劑和非螯合非界面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上面已經討論每個類別。
乳劑製劑藉由皮膚病學、口服和腸胃外途徑的應用及其製造方法已經在文獻中進行綜述，例如參見Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；以及Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335，其內容藉由引用整體併入本文。
本發明的寡聚化合物可以製備並配製為脂質顆粒，例如配製的脂質顆粒(FLiP)，其包含(a)本發明的寡核苷酸，其中該寡核苷酸已綴合
至親脂劑和(b)至少一種脂質成分，例如，乳液、脂質體、分離的脂蛋白、重建的脂蛋白或磷脂，其中綴合的寡核苷酸已聚集、混合或締合。寡核苷酸與脂質組成的化學計量可以係1：1。或者，化學計量可以係1：許多、許多：1或許多：許多，其中許多係兩個或更多。
FLiP可包含三酸甘油脂、磷脂質、甘油和一種或多種脂質結合蛋白，其透過親脂性接頭分子與寡核苷酸聚集、混合或締合。令人驚訝地，已發現由於該一種或多種脂質結合蛋白與上述脂質的組合，FLiP顯示出對肝、腸、腎、類固醇生成器官、心臟、肺和/或肌肉組織的親和力。因此，此等FLiP可以作為寡核苷酸運送到此等組織的載體。例如，脂質綴合的寡核苷酸，例如膽固醇綴合的寡核苷酸，與HDL和LDL脂蛋白顆粒結合，其在與其各自的受體結合後介導細胞攝取，從而引導寡核苷酸遞送至肝臟、腸道、腎臟及類固醇生成器官，參見Wolfrum等人，Nature Biotech.(2007),25：1145-1157。
FLiP可以係包含15-25%三醯基甘油、約0.5-2%磷脂和1-3%甘油以及一種或多種脂質結合蛋白的脂質顆粒。FLiP可以係具有約15-25%三醯基甘油、約1-2%磷脂、約2-3%甘油和一種或多種脂質結合蛋白的脂質顆粒。在一些實施方案中，脂質顆粒包含約20%三醯基甘油、約1.2%磷脂和約2.25%甘油、以及一種或多種脂質結合蛋白。
另一種適合FLiP的脂質成分係脂蛋白，例如分離的脂蛋白或更佳重建的脂蛋白。例示性脂蛋白包括乳糜微粒、VLDL(極低密度脂蛋白)、IDL(中密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)和HDL(高密度脂蛋白)。產生重建脂蛋白的方法係本領域已知的，例如參見A.Jones,Experimental Lung
Res.6,255-270(1984)、美國專利第4,643,988號和第5128318號、PCT公開號WO87/02062、加拿大專利第2,138,925號。生產重構脂蛋白，尤其係載脂蛋白A-I、A-II、A-IV、apoC和apoE的其他方法已經描述於A.Jonas,Methods in Enzymology 128,553-582(1986)和G.Franceschini等人，J.Biol.Chem.,260(30),16321-25(1985)。
FLiP的一種較佳脂質組分係英脫利匹特(Intralipid)。Intralipid®係第一個供人類使用的安全脂肪乳劑的品牌名稱。Intralipid® 20%(20%靜脈脂肪乳)由20%大豆油、1.2%蛋黃磷脂、2.25%甘油和注射用水組成。進一步在本發明的範圍內的係，其他合適的油，例如紅花油，可以用於產生FLiP的脂質組分。
FLiP的尺寸範圍可以為約20-50nm或約30-50nm，例如約35nm或約40nm。在一些實施方案中，FLiP具有至少約100nm的粒度。或者，FLiP可以在約100-150nm之間，例如約110nm、約120nm、約130nm或約140nm，無論其特徵係基於脂質體還係基於乳液。多個FLiP亦可以聚合並一起交付，因此尺寸可以大於100nm。
製備脂質顆粒的方法包括以下步驟：(a)將脂質組分與一種或多種可化學修飾的親脂劑(例如膽固醇)綴合的寡核苷酸混合；和(b)分級分離該混合物。在一些實施方案中，此方法包括選擇顆粒尺寸為30-50nm、較佳粒度為約40nm尺寸的附加步驟。
一些適用於本發明的示例性脂質顆粒製劑描述於2009年3月26日提交的美國專利第12/412,206號中，其內容藉由引用整體併入本文。
在一些實施方案中，寡聚化合物可以配製在酵母細胞壁顆粒(「YCWP」)中。酵母細胞壁顆粒包含萃取的酵母細胞壁外部和核心，此核心包含有效負載(例如，寡核苷酸)。顆粒的外部包含酵母葡聚糖(例如β-葡聚糖、β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖)、酵母甘露聚糖或其組合。酵母細胞壁顆粒通常係直徑約1-4μm的球形顆粒。
酵母細胞壁顆粒的製備在本領域中係已知的，並且描述於例如美國專利第4,992,540號；第5,082,936號；第5,028,703號；第5,032,401號；第5,322,841號；第5,401,727號；第5,504,079號；第5,607,677號；第5,741,495號；第5,830,463號；第5,968,811號；第6,444,448號；和第6,476,003號，美國專利申請公開號2003/0216346和2004/0014715，以及國際專利申請公開號WO 2002/12348，其內容藉由引用整體併入本文。酵母細胞樣顆粒在藥物傳遞的應用描述於例如美國專利第5,032,401號；第5,607,677號；第5,741,495號；和第5,830,463號，以及美國專利申請公開號2005/0281781和2008/0044438，其內容藉由引用整體併入本文。美國專利申請公開號2009/0226528，其內容經引用併入本文，描述核酸與酵母細胞壁顆粒的配製用於將寡核苷酸遞送至細胞。
寡聚化合物的示例性製劑描述於美國專利第4,897,355號；第4,394,448號；第4,235,871號；第4,231,877號；第4,224,179號；第4,753,788號；第4,673,567號；第4,247,411號；第4,814,270號；第5,567,434號；第5,552,157號；第5,565,213號；第5,738,868號；第5,795,587號；第5,922,859號；第6,077,663號；第7,906,484號；和第8,642,076號；PCT公開號WO2009/132131，以及美國專利申請公開號
2006/0240093、2007/0135372、2011/0117125、2009/0291131、2012/0316220、2009/0163705和2013/0129785，其全部引用藉由本文完整引用。Behr(1994)Bioconjugate Chem.5：382-389，以及Lewis等人(1996)PNAS 93：3176-3181亦描述適用於本發明的寡核苷酸的製劑，其內容藉由引用整體併入本文。
VI.REVERSIR靶向的dsRNA
本發明提供抑制dsRNA劑活性的REVERSIRTM，其在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾。
在具體實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾選自由下述所組成之群組：無鹼基修飾；與雙股體中相對核苷酸的錯配；不穩定的糖修飾、2’-去氧修飾、無環核苷酸、未鎖核酸(UNA)和甘油核酸(GNA)。
在一些實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾係無鹼基修飾。在一些實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾係與雙股體中相對核苷酸的錯配。在一些實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾係去穩定糖修飾。在一些實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾係2’-去氧修飾。在一些實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾係無環核苷酸。在一些實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾係未鎖核酸(UNA)。在一些實施方案中，熱不穩定核苷酸修飾係甘油核酸(GNA)。
在一些實施方案中，dsRNA劑包含本文所述的至少一種、至少兩種、至少三種、至少五種或至少十種熱不穩定核苷酸修飾。
如上所述，術語「dsRNA」係指介導RNA轉錄物的標靶切割的試劑。此等藥物與稱為RNAi誘導靜默複合物(RISC)的細胞質多蛋白複
合物結合。有效誘導RNA干擾的試劑在本文中亦稱為siRNA、RNAi試劑、或iRNA劑、或dsRNA劑。
如本文所用，術語「dsRNA活性」、「siRNA活性」和「RNAi活性」係指adsRNA劑的基因靜默或RNAi干擾。
如本文所用，RNA干擾分子的「基因靜默」係指細胞中目標基因的mRNA量降低至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%、高達並包括100%，以及在不存在miRNA或RNA干擾分子的情況下細胞中發現的mRNA水平之間的任何整數。在一個較佳的實施方案中，mRNA水平降低至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%、高達並包括100%，以及任何整數在5%到100%之間。
如本文所用，術語「調節基因表現」係指基因的表現或編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的RNA分子或等同RNA分子的水平被上調或下調，使得表現、水平、或者活性大於或小於在不存在調節劑的情況下觀察到的活性。例如，術語“調節”可以意味著“抑制”，但係詞語“調節”的使用不限於該定義。
如本文所用，當編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的基因表現或RNA分子或等同RNA分子的水平與在不存在dsRNA(例如RNAi劑)的情況下觀察到的水平有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍或更多不同時，發生基因表現調節，可以相對於對照或非對照計算%和/或倍數差異，例如，
[有dsRNA的表現-無dsRNA的表現]
%差異=--------------------------------------------------------------------
無dsRNA的表現
如本文所用，與基因表現相關的術語「抑制」、「下調」或「減低」係指基因的表現或編碼一種或多種的RNA分子或等效RNA分子的水平蛋白質或蛋白質亞基、或一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的活性降低至低於不存在調節劑時觀察到的水平。當基因的表現、或編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的活性相對於相應的非調節對照降低至少10%時，且較佳至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或最佳100%(即，沒有基因表現)時，基因表現下調。
如本文所用，與基因表現相關的術語「增加」或「上調」係指基因的表現、或編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的活性增加至高於在不存在調節劑的情況下觀察到的水平。當基因的表現、或編碼一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一種或多種蛋白質或蛋白質亞基的活性相對於相應的非調節對照增加至少10%時，且較佳至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、100%、1.1倍、1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多時，基因表現上調。
本文所使用的術語「增加」或「增加」通常係指靜態顯著量的增加；為了避免任何疑問，「增加」係指與參考水準相比至少10%的增加，
例如，與參考水準相比，增加至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少90%左右、或高達並包括100%的增加、或10-100%之間的任何增加，或者與參考水準相比，至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約10倍、或2倍至10倍或以上的任何增加。
如本文所用，術語「已減低」或「減低」通常係指統計顯著量的減低。然而，為了避免疑問，「減低」係指與參考水準相比減低至少10%，例如，與參考水平相比，減低至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%，或至少約90%，或高達並包括100%的減少(即與參考樣本相比的缺失水準)、或10-100%之間的任何減低。
本發明的一種或多種REVERSIR靶向的dsRNA劑包括兩條RNA股，其在使用dsRNA的條件下互補並雜交形成雙股體結構。dsRNA的一條股(反義股)包括與通用標靶序列實質上互補並且通常完全互補的互補區域。標靶序列可以源自通用標靶序列表現期間形成的mRNA的序列。另一條股(有義股)包含與反義股互補的區域，使得兩條股在適當的條件下組合時雜交並形成雙股體結構。
通常，雙股體結構為15至30個鹼基對長度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、
20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22個鹼基對長度。在某些實施方案中，雙股體結構係18至25個鹼基對長度，例如，18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-25、21-24、21-23、21-22、22-25、22-24、22-23、23-25、23-24或24-25個鹼基對長度，例如，19-21個鹼基對長度。上述範圍和長度中間的範圍和長度亦被認為係本揭露的一部分。
類似地，與目標序列互補的區域為15至30個核苷酸長度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22個核苷酸長度，例如19-23個核苷酸長度或21-23個核苷酸長度。上述範圍和長度中間的範圍和長度亦被認為係本揭露的一部分。
在一些實施方案中，雙股體結構19至30個鹼基對長度。類似地，與標靶序列互補的區域為19至30個核苷酸長度。
在一些實施方案中，dsRNA為約19至約23個核苷酸長度，或約25至約30個核苷酸長度。一般來說，dsRNA足夠長，可以作為切丁酶的基質。例如，本領域眾所周知，長度長於約21-23個核苷酸的dsRNA可以充當切丁酶的基質。如通常知識者亦將認識到的，用於切割的RNA區
域最通常係較大RNA分子(通常係mRNA分子)的一部分。在相關的情況下，mRNA標靶的「部分」係足夠長度的mRNA標靶的連續序列，以允許其成為RNAi定向切割(即，藉由RISC途徑的切割)的基質。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者亦將認識到雙股體區域係dsRNA的主要功能部分，例如，約19至約30個鹼基對的雙股體區域，例如，約19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22個鹼基對。因此，在一個實施方案中，就其被處理成功能雙股而言，例如，靶向所需RNA進行切割的15-30個鹼基對，具有大於30個鹼基對的雙股體區域的RNA分子或RNA分子複合物係dsRNA。因此，通常知識者將認識到，在一個實施方案中，miRNA係dsRNA。在另一個實施方案中，dsRNA不係天然存在的miRNA。在另一個實施方案中，可用於靶向通用目標序列的表現的iRNA劑不係藉由較大dsRNA的切割在目標細胞中產生者。
如本文所述的dsRNA還可包括一個或多個單股核苷酸突出，例如1-4、2-4、1-3、2-3、1、2、3或4個核苷酸。具有至少一個核苷酸突出的dsRNA相對於其平端對應物具有優異的抑制特性。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。突出端可以位於有義股、反義股或其任意組合上。此外，突出的核苷酸可以存在於dsRNA的反義股或有義股的5'-端、3'-端或兩端。
dsRNA可以藉由本領域已知的標準方法合成。本發明的雙股RNAi化合物可以使用兩步驟程序來製備。首先，分別製備雙股RNA分子的各個股。然後，將成分股線低溫黏合。dsRNA化合物的各個股可以使用溶液相或固相有機合成或兩者來製備。有機合成提供的優點係可以輕鬆製備包含非天然或修飾的核苷酸的寡核苷酸股。類似地，本發明的單股寡核苷酸可以使用溶液相或固相有機合成或兩者來製備。
在一個方面，本發明的dsRNA包括至少兩個核苷酸序列，有義序列和反義序列。在這個方面，兩個序列之一與兩個序列中的另一個互補，其中一個序列與通用目標序列的表現中產生的mRNA的序列實質上互補。
在某些實施方案中，dsRNA的實質上互補的序列包含在單獨的寡核苷酸。在其他實施方案中，dsRNA的實質上互補的序列包含在單一寡核苷酸。
在一些實施方案中，dsRNA劑抑制血管張力素原(AGT)的表現，其中dsRNA劑包含形成雙股區的有義股和反義股。
在一些實施方案中，dsRNA劑的反義股的核苷酸序列包含含有SEQ ID NO：9的核苷酸序列UGUACUUCAUUGUGGAUGACGA的至少19個、至少20個、至少21個或至少22個連續核苷酸的核苷酸序列。在一些實施方案中，dsRNA劑的有義股的核苷酸序列包含含有SEQ ID NO：10的核苷酸序列GUCAUCCACAAUGAGAGUACA的至少19個、至少20個、至少21個或至少22個連續核苷酸的核苷酸序列。
在一些實施方案中，dsRNA劑的反義股包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列UGUACUCUAUUGUGGAUGACGA。
在一些實施方案中，dsRNA劑的有義股包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列GUCAUCCACAAUGAGAGUACA。
在一些實施方案中，dsRNA劑的反義股包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA，且dsRNA劑的有義股包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列GUCAUCCACAAUGAGAGUACA。
在一些實施方案中，dsRNA劑的反義股由SEQ ID NO：9的核苷酸序列UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA組成，並且dsRNA劑的有義股由SEQ ID NO：10的核苷酸序列GUCAUCCACAAUGAGAGUACA組成。
在一些實施方案中，dsRNA劑為AD-85481，亦稱為Zilebesiran®。
AD-85481包含形成雙股區的有義股和反義股，其中有義股包含核苷酸序列5'-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3'，且反義股包含核苷酸序列5'-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3'，其中a、g、c和u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf分別為2'-氟A、G、C和U；s為硫代磷酸酯連接；(Tgn)為胸苷-乙二醇核酸(GNA)S-異構體；且其中有義股的3’端與配體綴合，如下方式所示
其中X為O。
此外，dsRNA劑的藥學上可接受的鹽形式包括藥學上可接受的任何鹽，例如dsRNA劑的鈉鹽。在一些實施方案中，dsRNA的藥學上可接受的鹽具有以下結構：
本發明的一種或多種REVERSIR靶向的另外的dsRNA劑描述於國際PCT公開號WO 2015/179724和WO 2019/222166中，其各自的完整內容經引用併入本文。
技術人員熟知，具有約20至23個鹼基對(例如21個鹼基對)的雙股體結構的dsRNA已被譽為在誘導RNA干擾中特別有效(Elbashir等人，EMBO 2001,20：6877-6888)。然而，其他人發現更短或更長的RNA雙股體結構亦可以係有效的(Chu和Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim等人(2005)Nat Biotech 23：222-226)。在上述實施方案中，本文所述的dsRNA可包括至少為21個核苷酸長度的至少一條股。可以合理地預期，與上述dsRNA相比，在一端或兩端僅減去幾個核苷酸的較短雙股體可以具有類似的效果。因此，具有至少19、20或更多個連續核苷酸的序列的dsRNA，且它們抑制通用標靶序列表現的能力不同，與包含完整序列的dsRNA相比，抑制不超過約5%、10%、15%、20%、25%或30%，認為此等都在本發明的範圍內。
此外，RNA辨識通用標靶序列轉錄物中易受RISC介導的裂解影響的位點。因此，本發明進一步以靶向此等位點之一的iRNA為特徵。如本文所用，如果iRNA促進轉錄物在特定位點內任何地方的裂解，則稱iRNA靶向RNA轉錄物的特定位點內。這樣的iRNA通常將包括與附加核苷酸序列偶聯的至少約19個連續核苷酸，該附加核苷酸序列取自通用目標序列中與所選序列相鄰的區域。
在某些實施方案中，本發明的通用iRNA例如dsRNA係未修飾的，且不包含例如本領域已知的和本文所述的化學修飾或綴合。在其他
實施方案中，本發明的通用iRNA，例如dsRNA，被化學修飾以增強穩定性或其他有益特性。在本發明的某些實施方案中，本發明的通用iRNA的實質上所有核苷酸都被修飾，即，iRNA股中存在不超過5、4、3、2或1個未修飾的核苷酸。在本發明的其他實施方案中，通用iRNA的所有核苷酸都被修飾。
本發明所表徵的核酸可以藉由本領域中充分建立的方法來合成或修飾，例如“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA中所描述的那些，其藉由引用併入本文。修飾包括例如端修飾，例如5’-端修飾(磷酸化、綴合、反向連接)或3’-端修飾(綴合、DNA核苷酸、反向連接等)；鹼基修飾，例如，以穩定鹼基、去穩定鹼基、或與擴展的配偶體庫鹼基配對的鹼基替換、去除鹼基(無鹼基核苷酸)或綴合鹼基；糖修飾(例如，在2'-位或4'-位)或糖的取代；或主鏈修飾，包括磷酸二酯鍵的修飾或替換。可用於本文所述實施方案的iRNA化合物的具體實例包括但不限於含有修飾主鏈或不含天然核苷間連接的RNA。具有修飾主鏈的RNA包括主鏈中不具有磷原子的RNA等。為了本說明書的目的，並且如本領域有時所引用的，在其核苷間主鏈中不具有磷原子的修飾的RNA亦可以被認為係寡核苷。在一些實施方案中，修飾的iRNA將在其核苷間主鏈中具有磷原子。
修飾的RNA主鏈包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3'-亞(伸)烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、胺基磷酸酯，包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基磷酸
酯、硫代烷基磷酸三酯，和正常3'-5'連接的硼烷磷酸鹽，此等的2'-5'連接類似物，以及具有反轉極性的那些，其中相鄰的核苷單元對以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。亦包括各種鹽、混合鹽和遊離酸形式。在本發明的一些實施方案中，本發明的dsRNA劑係遊離酸形式。在本發明的其他實施方案中，本發明的dsRNA劑係鹽形式。在一個實施方案中，本發明的dsRNA劑係鈉鹽形式。在某些實施方案中，當本發明的dsRNA劑呈現鈉鹽形式時，鈉離子存在於試劑中作為試劑中存在的實質上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基團的抗衡離子。其中實質上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯連接均具有鈉抗衡離子的試劑包括不超過5、4、3、2或1個不具有鈉抗衡離子的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯連接。在一些實施方案中，當本發明的dsRNA劑呈現鈉鹽形式時，鈉離子存在於試劑中作為試劑中存在的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基團的抗衡離子。
教導上述含磷鍵的製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第4,476,301號；第5,023,243號；第5,177,195號；第5,188,897號；第5,264,423號；第5,276,019號；第5,278,302號；第5,286,717號；第5,321,131號；第5,399,676號；第5,405,939號；第5,453,496號；第5,455,233號；第5,466,677號；第5,476,925號；第5,519,126號；第5,536,821號；第5,541,316號；第5,550,111號；第5,563,253號；第5,571,799號；第5,587,361號；第5,625,050號；第6,028,188號；第6,124,445號；第6,160,109號；第6,169,170號；第6,172,209號；第6,239,265號；第6,277,603號；第6,326,199號；第6,346,614號；第6,444,423號；第6,531,590號；第
6,534,639號；第6,608,035號；第6,683,167號；第6,858,715號；第6,867,294號；第6,878,805號；第7,015,315號；第7,041,816號；第7,273,933號；第7,321,029號；和美國專利RE39464，每個專利的全部內容均藉由引用併入本文。
其中不包括磷原子的修飾的RNA主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間連接、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間連接、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間連接結形成的主鏈。此等包括具有
啉代鍵(部分由核苷的糖部分形成)的那些；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸和碸主鏈；甲醯基和硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基和硫代甲醯基主鏈；含烯烴的主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸鹽和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2組分部分的其他骨架。
教導上述寡核苷的製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,64,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號；和第5,677,439號，每一篇專利全部內容均藉由引用併入本文。
適當的RNA模擬物預期用於本文提供的iRNA中，其中核苷酸單元的糖和核苷間鍵結(即主鏈)均被新基團取代。維持鹼基單位用於與適當的核酸標靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物稱為胜肽核酸(PNA)，
其中RNA模擬物已被證明具有優異的雜交特性。在PNA化合物中，RNA的糖主鏈被含有醯胺的主鏈、特別係胺基乙基甘胺酸主鏈取代。核鹼基被保留並直接或間接結合至主鏈醯胺部分的氮雜氮原子。教導PNA化合物的製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號和第5,719,262號，其各自的全部內容藉由引用併入本文。適合用於本發明的iRNA中的另外的PNA化合物描述於例如Nielsen等人，Science,1991,254,1497-1500中。
本發明特徵的一些實施例包括具有硫代磷酸酯主鏈的RNA和具有雜原子主鏈的寡核苷，並且特別係上述美國專利第5,489,677號的-CH2--NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-N(CH3)-CH2-CH2-，以及上述美國專利第5,602,240號的醯胺主鏈。在一些實施方案中，本文所鑑定的RNA具有上述美國專利第5,034,506號的N-
啉主鏈結構。天然磷酸二酯主鏈可表示為O-P(O)(OH)-OCH2-。
修飾的RNA還可以含有一個或多個取代的糖部分。本文所表徵的iRNA，例如dsRNA，可以在2'-位置包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基和炔基可以係取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的適當修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2,，其中n和m為1至約10。在其他實施方案中，dsRNA在2'位置包括以下之一：C1至C10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基
或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、取代矽基、RNA裂解基團、報島子基團、嵌入劑、用於改善iRNA的藥物動力學性質的基團、或用於改善iRNA的藥效學性質的基團，以及其他具有類似性質的取代基。在一些實施方案中，修飾包括2'甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，即烷氧基-烷氧基。另一種示例性修飾係2'-二甲胺基乙氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述，和2'-二甲胺基乙氧基乙氧基(本領域又稱為2'-O-二甲胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。進一步的示例性修飾包括：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-去氧核苷酸(這三個家族中的R和S異構體)；2'-烷氧基烷基；和2'-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH NH2)和2'-氟(2'-F)。類似的修飾亦可以在iRNA的RNA上的其他位置進行，特別係3'終端核苷酸或2'-5'連接的dsRNA上的糖的3'位置以及5'終端核苷酸的5'位置。iRNA亦可以具有糖模擬物，例如代替呋喃戊糖的環丁基部分。教導此類修飾糖結構的製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第
5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；和第5,700,920號，其中某些與本申請共同擁有。前述每一篇專利的全部內容經引用併入本文。
通用iRNA還可以包括核鹼基(在本領域中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文所用，「未修飾的」或「天然的」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核鹼基包括其他合成和天然核鹼基，如去氧胸苷(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、6-甲基以及其他腺嘌呤和鳥嘌呤的烷基衍生物、2-丙基和腺嘌呤和鳥嘌呤的其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基醛基、其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代、特別係5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤和7-氮雜腺嘌呤以及3-去氮鳥嘌呤和3-去氮腺嘌呤。另外的核鹼基包括美國專利第3,687,808號中所揭露的，Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中所揭露的；由Englisch等人在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990中所揭露的；Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613，以及由Sanghvi,Y S.在Chapter 15,dsRNA Research and
Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993中所揭露者。此等核鹼基中的某些特別可用於增加本發明所鑑定的寡聚化合物的結合親和力。此等包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已被證明可將核酸雙股體穩定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)，並且係示例性鹼基取代，甚至更特別係當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時。
教導某些上述修飾核鹼基以及其他修飾核鹼基的製備的代表性美國專利包括但不限於，上述美國專利第3,687,808號；第4,845,205號；第5,130,30號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號；第5,552,540號；第5,587,469號；第5,594,121號；第5,596,091號；第5,614,617號；第5,681,941號；第5,750,692號；第6,015,886號；第6,147,200號；第6,166,197號；第6,222,025號；第6,235,887號；第6,380,368號；第6,528,640號；第6,639,062號；第6,617,438號；第7,045,610號；第7,427,672號；和第7,495,088號，每一篇專利的全部內容均藉由引用併入本文。
在一些實施方案中，本揭露的RNAi劑還可被修飾以包含一個或多個雙環糖部分。「雙環糖」係由兩個碳(無論相鄰或不相鄰)橋接形成的環修飾的呋喃糖基環。「雙環核苷」(“BNA”)係具有糖部分的核苷，該糖
部分包含藉由橋接糖環的兩個碳(無論相鄰或不相鄰)形成的環，從而形成雙環系統。在某些實施方案中，橋視需要地藉由2'-無環氧原子連接糖環的4'-碳和2'-碳。因此，在一些實施方案中，本發明的試劑可以包括一種或多種鎖核酸(LNA)。鎖核酸係具有修飾的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含連接2'和4'碳的額外橋。換句話說，LNA係包含雙環糖部分的核苷酸，該雙環糖部分包含4'-CH2-O-2'橋。此結構有效地將核糖「鎖定」在3'-endo結構構像中。已證明在dsRNA添加鎖核酸可增加血清中dsRNA的穩定性，並減少脫靶效應(Elmen,J.等人，(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人，(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本發明的多核苷酸的雙環核苷的實例包括但不限於包含4'和2'核糖基環原子之間的橋的核苷。在某些實施方案中，本發明的反義多核苷酸劑包括一種或多種包含4'至2'橋的雙環核苷。
鎖核苷可以由以下結構表示(省略立體化學)，
其中B係核鹼基或修飾的核鹼基且L係將核糖環的2’-碳連接到4’-碳的連接基團。此類4'至2'橋接雙環核苷的實例包括但不限於，4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’(亦稱為「受限乙基」或「cEt」)及4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其類似物；參見例
如美國專利第7,399,845號)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其類似物；參見例如美國專利第8,278,283號)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(及其類似物；參見例如美國專利第8,278,425號)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(參見例如美國專利公開號2004/0171570)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R為H、C1-C12烷基或氮保護基(參見例如U.S.Patent No.7,427,672)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(參見例如Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4’-CH2-C(=CH2)-2’(及其類似物；參見例如美國專利第8,278,426)。前述每一篇的全部內容經引用併入本文。
教導鎖核酸核苷酸的製備的其他代表性美國專利和美國專利公開包括但不限於以下：美國專利第6,268,490號；第6,525,191號；第6,670,461號；第6,770,748號；第6,794,499號；第6,998,484號；第7,053,207號；第7,034,133號；第7,084,125號；第7,399,845號；第7,427,672號；第7,569,686號；第7,741,457號；第8,022,193號；第8,030,467號；第8,278,425號；第8,278,426號；第8,278,283號；US 2008/0039618；和US 2009/0012281，每一篇的全部內容均藉由引用併入本文。
可以製備任何具有一種或多種立體化學糖構型的前述雙環核苷，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(參見WO 99/14226)。
本發明的iRNA還可以被修飾以包括一種或多種受限乙基核苷酸。如本文所用，「受限乙基核苷酸」或「cEt」係包含雙環糖部分的鎖核酸，該雙環糖部分包含4'-CH(CH3)-O-2'橋(即前述結構中的L)。在一個實施方案中，受限乙基核苷酸呈現S構象，在本文中稱為「S-cEt」。
本發明的iRNA還可以包括一種或多種「構象限制核苷酸」(“CRN”)。CRN係核苷酸類似物，具有連接核糖的C2'和C4'碳或核糖的C3和-C5'碳的連接子。CRN將核糖環鎖定為穩定構象並增加與mRNA的雜交親和力。連接子具有足夠的長度，可將氧置於穩定性和親和力的最佳位置，從而減少核糖環褶皺。
教導某些上述CRN的製備的代表性出版物包括但不限於，美國專利公開號2013/0190383；和PCT公開號WO2013/036868，其各自的全部內容特此公開藉由引用併入本文。
在一些實施方案中，本發明的dsRNA包含一種或多種為UNA(未鎖核酸)核苷酸的修飾。UNA係解鎖的無環核酸，其中任何糖鍵已被去除，形成解鎖的「糖」殘基。在一個實施方案中，UNA亦涵蓋C1'-C4'之間的鍵已被移除的單體(即C1'和C4'碳之間的共價碳-氧-碳鍵)。在另一個實施方案中，糖的C2'-C3'鍵(即C2'和C3'碳之間的共價碳-碳鍵)已被去除(參見Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039，於此經引用併入)。
教導製備UNA的代表性美國出版物包括但不限於，美國專利第8,314,227號；和美國專利公開號2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，每個的全部內容其藉由引用併入本文。
在某些實施方案中，本揭露的組成物和方法包括如本文所述的RNAi劑的膦酸乙烯酯(VP)修飾。在示範性實施方案中，本揭露內容的5'乙烯基膦酸酯修飾的核苷酸具有以下結構：
其中X為O或S；
R為氫、羥基、氟或C1-20烷氧基(例如甲氧基或正十六烷氧基)；
R5’為=C(H)-P(O)(OH)2且C5’碳與R5’之間的雙鍵為E或Z取向(例如E取向)；且
B為核鹼基或修飾的核鹼基，視需要地其中B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
本揭露的乙烯基膦酸酯可以連接至本揭露的dsRNA的反義股或有義股。在某些實施方案中，本揭露的乙烯基膦酸酯附著至dsRNA的反義股，視需要地在dsRNA的反義股的5’端。
乙烯基膦酸酯修飾亦被考慮用於本揭露的組成物和方法。例示性乙烯基膦酸酯結構包括前述結構，其中R5'係=C(H)-OP(O)(OH)2並且C5'碳和R5'之間的雙鍵處於E或Z取向(例如，E取向)。
對RNA分子末端的潛在穩定修飾可以包括N-(乙醯胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二烷醯基-尿苷-3'-磷酸，反向2'-去氧修飾的核糖核苷酸，例如反向dT(idT)、反向dA(idA)和反向無鹼
基2’-去氧核糖核苷酸(iAb)等。這種修改的公開可以在WO 2011/005861中獲尋。
在一個實例中，寡核苷酸的3'或5'終端連接至反向2'-去氧修飾核糖核苷酸，例如反向dT(idT)、反向dA(idA)或反向無鹼基2'-去氧核糖核苷酸(iAb)。在一個具體實例中，反向2'-去氧修飾的核糖核苷酸連接至寡核苷酸的3'端，例如本文所述的有義股的3'-端，其中該連接係透過3'-3'磷酸二酯鍵或3'-3'-硫代磷酸酯連接。
在另一個實例中，有義股的3'-端透過3'-3'-硫代磷酸酯連接而連接至反向無鹼基核糖核苷酸(iAb)。在另一個例子中，有義股的3'-端透過3'-3'-硫代磷酸連接而連接至反向dA(idA)。
在一個實例中，反向2'-去氧修飾核糖核苷酸連接至寡核苷酸的3'端，例如本文所述的有義股的3'-端，其中該連接係透過3'-3'磷酸二酯連接或3'-3'-硫代磷酸酯連接。
在另一個實例中，有義股的3'-終端核苷酸係反向dA(idA)並且透過3'-3'-連接(例如，3'-3'-硫代磷酸連接)與前面的核苷酸連接。
本發明的iRNA的核苷酸的其他修飾包括5’磷酸鹽或5’磷酸鹽模擬物，例如iRNA反義股的5’-終端磷酸鹽或磷酸鹽模擬物。合適的磷酸鹽模擬物公開於例如美國專利公開號2012/0157511中，其全部內容藉由引用併入本文。
VII.本發明的遞送方法
將核酸分子(即，如本文所述的dsRNA和/或REVERSIR化合物)遞送至細胞，例如個體，例如人類個體(例如，需要其的個體)內的細
胞，可以以多種不同的方式實現。例如，可以藉由使細胞與本文所述的dsRNA劑或REVERSIR化合物在體外或體內接觸來進行遞送。體內遞送亦可以藉由向個體施用包含本文所述的dsRNA和/或REVERSIR化合物的組成物來直接進行。或者，體內遞送可藉由施用編碼並指導dsRNA劑和/或REVERSIR化合物的表現的一種或多種載體來間接進行。以下進一步討論此等實施例。
為了遞送核酸分子，例如REVERSIR和dsRNA劑，一般來說，任何遞送核酸分子的方法(體外或體內)都可以適用於本發明(參見例如，Akhtar S.和Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144和WO94/02595，其係藉由引用整體併入本文)。對於體內遞送，要考慮的因素包括例如所遞送分子的生物穩定性、非特異性效應的預防以及所遞送分子在目標組織中的積累。RNA干擾亦已成功藉由直接注射局部遞送至中樞神經系統(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)。RNA或藥物載體的修飾還可以允許iRNA靶向目標組織並避免不良的脫靶效應。iRNA分子可以藉由與膽固醇等親脂基團化學綴合來修飾，以增強細胞攝取並防止降解。例如，將與親脂性膽固醇部分綴合的針對ApoB的iRNA全身注射到小鼠體內，並導致肝臟和空腸中apoB mRNA的減弱(Soutschek,J.，等人(2004)Nature 432：173-178)。
在一個替代實施方案中，遞送可包括使用藥物遞送系統，例如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子遞送系統。帶正電荷的陽離子遞送系統促進核酸分子(帶負電荷)的結合，並且還增強帶負電荷的細胞膜處的相互作用以允許細胞有效攝取。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可以與核酸結合，或被誘導形成包裹iRNA的囊泡或膠束(參見例如Kim SH等人(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。當全身施用時，囊泡或膠束的形成進一步防止核酸的降解。製備和施用陽離子-核酸複合物的方法完全在本發明所屬技術領域中具有通常知識者的能力範圍之內(參見例如Sorensen,DR等人(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN等人(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS等人(2007)J.Hypertens.25：197-205，其全部內容經引用併入本文)。可用於iRNA的全身遞送的藥物遞送系統的一些非限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.等人(2003),supra；Verma,UN等人(2003),supra),"solid nucleic acid lipid particles"(Zimmermann,TS,et al(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY等人(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A等人(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亞胺(Bonnet ME等人(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659),Arg-Gly-Asp(RGD)peptides(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)，以及聚醯胺胺(Tomalia,DA等人(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.等人(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。在一些實施方案中，核酸與環糊精形成複合物用於全身施
用。核酸和環糊精的施用方法和醫藥組成物可以在美國專利第7,427,605號中獲尋，該專利藉由引用整體併入本文。
VII.本發明的方法
本發明亦提供使用本發明的REVERSIR化合物的方法。
例如，在某些情況下，需要抑制dsRNA劑的RNAi干擾活性，從而恢復目標mRNA/蛋白質的表現。特別地，某些dsRNA劑已用於治療並且係長效。在某些情況下，由於其便利性，這種長效dsRNA劑係理想。然而，在這種情況下，亦可能需要有一種方法來逆轉dsRNA劑的活性。例如，患者可能對治療反應不佳或接受過高劑量。在這種情況下，REVERSIR化合物可以作為例如前藥施用，以至少部分降低dsRNA劑的RNAi活性。在某些實施方案中，dsRNA劑的持久作用使得等待該作用藉由自然清除緩慢減弱成為不具吸引力的選擇。
舉例來說，並且不限制本發明，某些dsRNA可用於抑制凝血因子(例如，因子II(凝血酶原)、因子VII、因子IX等)。此類dsRNA具有作為抗凝血劑的治療潛力。長半衰期使此類dsRNA特別有吸引力，然而，如果患者接受過高劑量、進行手術(不希望抗凝血)或以其他方式希望降低抗凝血作用，則可施用抗凝血dsRNA的REVERSIR化合物。與簡單地等待dsRNA自然清除相比，此類REVERSIR化合物將更快恢復凝血功能。提供此範例係為了說明目者。許多dsRNA被設計用於大量靶標，包括但不限於大量信使RNA(mRNA)標靶和前mRNA靶標，以及大量非編碼RNA標靶。本文提供的REVERSIR化合物適用於任何dsRNA，無論dsRNA化合物的標靶或機制為何。
在某些實施方案中，本發明提供針對標靶mRNA的dsRNA的REVERSIR化合物。在某些此類實施方案中，目標mRNA編碼參與代謝的蛋白質。在某些此類實施方案中，標靶mRNA編碼參與心臟功能的蛋白質。在某些實施方案中，標靶mRNA編碼參與血液凝固的蛋白質。標靶多種標靶蛋白中任一種的示例性dsRNA化合物係本領域已知者。此外，製備針對目標基因的dsRNA的方法係本領域眾所周知且對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言係容易獲得者。
dsRNA的目標基因非限制性地包括但不限於，促進不需要的細胞增殖的基因、生長因子基因、生長因子受體基因、表現激酶的基因、銜接蛋白基因、編碼G蛋白超家族分子的基因、編碼轉錄因子的基因、介導血管新生的基因、病毒基因、病毒複製所需的基因、介導病毒功能的細胞基因、細菌病原體的基因、阿米巴病原體的基因、寄生病原體的基因、真菌病原體、介導不必要的免疫反應的基因、介導疼痛處理的基因、介導神經系統疾病的基因、在以雜合性缺失為特徵的細胞中發現的一種等位基因、或多態性基因的一個等位基因。
dsRNA的具體示例性標靶基因包括但不限於，AT3、AGT、ALAS1、TMPR、HAO1、AGT、C5、CCR-5、PDGF β基因；Erb-B基因、Src基因；CRK基因；GRB2基因；RAS基因；MEKK基因；JNK基因；RAF基因；Erk1/2基因；PCNA(p21)基因；MYB基因；c-MYC基因；JUN基因；FOS基因；BCL-2基因；Cyclin D基因；VEGF基因；EGFR基因；Cyclin A基因；Cyclin E基因；WNT-1基因；beta-連環蛋白(catenin)基因；c-MET基因；PKC基因；NFKB基因；STAT3基因；生存素基因；
Her2/Neu基因；拓樸異構酶I基因；拓樸異構酶IIα基因；p73基因；p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因；PPM1D基因；窖蛋白(caveolin)I基因；MIB I基因；MTAI基因；M68基因；腫瘤抑制基因；p53基因；DN-p63基因；pRb抑癌基因；APC1抑癌基因；BRCA1抑癌基因；PTEN抑癌基因；MLL融合基因，如MLL-AF9、BCR/ABL融合基因；TEL/AML1融合基因；EWS/FLI1融合基因；TLS/FUS1融合基因；PAX3/FKHR融合基因；AML1/ETO融合基因；αv-整合素基因；Flt-1受體基因；微管蛋白基因；人類乳突病毒基因、人類乳突病毒複製所需的基因、人類免疫缺陷病毒基因、人類免疫缺陷病毒複製所需的基因、A型肝炎病毒基因、A型肝炎病毒複製所需的基因、B型肝炎病毒基因、B型肝炎病毒複製所需的基因、C型肝炎病毒基因、C型肝炎病毒複製所需的基因複製、D型肝炎病毒基因、D型肝炎病毒複製所需的基因、E型肝炎病毒基因、E型肝炎病毒複製所需的基因、C型肝炎病毒基因、C型肝炎病毒複製所需的基因、F型肝炎病毒基因、F型肝炎病毒複製所需的基因、G型肝炎病毒基因、G型肝炎病毒複製所需的基因、H型肝炎病毒基因、H型肝炎病毒複製所需的基因、呼吸道合胞病毒基因、呼吸道合胞病毒複製所需的基因、單純皰疹病毒基因、單純皰疹病毒複製所需的基因、皰疹巨細胞病毒基因、皰疹巨細胞病毒複製所需的基因、EB皰疹病毒基因、EB皰疹病毒複製所需的基因、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒基因、卡波西肉瘤相關皰疹病毒複製所需的基因、JC病毒基因、JC病毒複製所需的人類基因、黏病毒基因、黏病毒基因複製所需的基因、鼻病毒基因、鼻病毒基因複製所需的基因、冠狀病毒基因、冠狀病毒複製所需的基因、西尼羅河病毒基因、西尼羅河病毒複製所
需的基因、聖路易斯腦炎基因、聖路易斯腦炎複製所需的基因、蜱傳腦炎病毒基因、蜱傳腦炎病毒複製所需的基因、墨累谷腦炎病毒基因、墨累谷腦炎病毒複製所需的基因、登革熱病毒基因、登革熱病毒所需的基因基因複製、猿病毒40基因、猿病毒40複製所需的基因、人類T細胞嗜淋巴細胞病毒基因、人類T細胞嗜淋巴細胞病毒複製所需的基因、莫洛尼鼠白血病病毒基因、莫洛尼鼠白血病病毒複製所需的基因、腦心肌炎病毒基因、腦心肌炎病毒複製所需的基因、麻疹病毒基因、麻疹病毒複製所需的基因、斑疹病毒基因、斑疹病毒複製所需的基因、腺病毒基因、腺病毒複製所需的基因、黃熱病病毒基因、黃熱病病毒複製所需的基因、脊髓灰質炎病毒基因、脊髓灰質炎病毒複製所需的基因、痘病毒基因、痘病毒複製所需的基因、瘧原蟲基因、瘧原蟲基因複製所需的基因、潰瘍分枝桿菌基因、潰瘍分枝桿菌複製所需的基因、結核分枝桿菌基因、結核分枝桿菌複製所需的基因、麻風分枝桿菌基因、麻風分枝桿菌複製所需的基因、金黃色葡萄球菌基因、金黃色葡萄球菌複製所需的基因、肺炎鏈球菌基因、肺炎鏈球菌複製所需的基因、化膿性鏈球菌基因、化膿性鏈球菌複製所需的基因、肺炎衣原體基因、肺炎衣原體複製所需的基因、肺炎支原體基因、肺炎支原體複製所需的基因、整合素基因、選擇素基因、補體系統基因、趨化因子基因、趨化因子受體基因、GCSF基因、Gro1基因、Gro2基因、Gro3基因、PF4基因、MIG基因、前血小板鹼性蛋白基因、MIP-1I基因、MIP-1J基因、RANTES基因、MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、CMBKR1基因、CMBKR2基因、CMBKR3基因、CMBKR5v、AIF-1基因、I-309基因、離子通道成分基因、神經傳導物質受體、神經傳導物質配體基因、澱
粉樣蛋白家族基因、早老素基因、HD基因、DRPLA基因、SCA1基因、SCA2基因、MJD1基因、CACNL1A4基因、SCA7基因、SCA8基因、雜合性缺失細胞中發現的等位基因(LOH)、多態性基因的一種等位基因及其組合。
一方面，本發明提供抑制dsRNA劑的RNAi抑制活性的方法，該dsRNA劑在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾。此方法包括使dsRNA劑與本發明的單股寡核苷酸或本發明的醫藥組成物接觸，從而抑制反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑的RNAi抑制活性。
細胞的接觸可以在體外或體內進行。體內接觸細胞包括接觸個體(例如人類個體)體內的細胞或細胞群。接觸細胞的體外和體內方法的組合亦係可能。如上所述，接觸細胞可以係直接的或間接。此外，接觸細胞可以藉由標靶配體完成，包括本文所描述的或本領域已知的任何配體。在一些實施方案中，標靶配體係碳水化合物部分，例如GalNAc3配體，或將RNAi劑和/或REVERSIR化合物引導至感興趣位點的任何其他配體。
dsRNA劑的RNAi干擾活性的抑制可以藉由與第一細胞實質上相同的第二細胞或細胞組相比，第一細胞或細胞組表現的mRNA量的減少來證明或細胞群。
在其他實施方案中，dsRNA劑的RNAi干擾活性的抑制可以根據與目標mRNA表現功能性相關的參數(例如來自個體的血液或血清中的蛋白質水平)的降低來評估。可以藉由本領域已知的任何測定法測定任何細胞中的表現。
蛋白質的抑制可以藉由細胞或細胞群或個體樣本中表現的蛋白質水平的降低來體現(例如，源自個體的血液樣本中的蛋白質水平)。如上所述，為了評估mRNA抑制，處理細胞或細胞組中蛋白質表現量的抑制可類似地表示為對照細胞或細胞組中蛋白質水平的百分比，或個體樣本例如源自其的血液或血清中的蛋白質水平。
可以使用本領域已知的任何用於評估mRNA表現的方法來測定細胞或細胞組表現的mRNA水平。在一個實施方案中，樣本中的表現量係藉由檢測轉錄的多核苷酸或其部分例如mRNA來確定。可以使用RNA萃取技術從細胞中萃取RNA，包括例如使用酸性酚/異硫氰酸胍萃取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套件(Qiagen®)或PAXgeneTM(PreAnalytixTM，瑞士)。利用核糖核酸雜交的典型測定形式包括核連續測定、RT-PCR、RNase保護測定、Northern印跡、原位雜交和微陣列分析。
在一些實施方案中，使用核酸探針測定表現量。如本文所用，術語「探針」係指能夠選擇性結合特定轉基因的任何分子。探針可以由本發明所屬技術領域中具有通常知識者合成，或衍生自適當的生物製品。探針可以專門設計用於標記。可用作探針的分子的實例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體和有機分子。
分離的mRNA可用於雜交或擴增測定，包括但不限於Southern或Northern分析、聚合酶鏈反應(PCR)分析和探針陣列。一種測定mRNA水平的方法涉及將分離的mRNA與可與轉基因mRNA雜交的核酸分子(探針)接觸。在一個實施方案中，將mRNA固定在固體表面上並與
探針接觸，例如藉由在瓊脂糖凝膠上運行分離的mRNA並將mRNA從凝膠轉移至膜(例如硝化纖維素)。在替代實施方案中，探針被固定在固體表面上並且mRNA與探針接觸，例如在Affymetrix基因晶片陣列中。通常知識者可以容易地採用已知的mRNA檢測方法來用於確定轉基因mRNA的水平。
用於確定樣品中表現水平的替代方法涉及樣品中例如mRNA的核酸擴增或逆轉錄酶(以製備cDNA)的過程，例如，藉由RT-PCR(Mullis，1987，美國專利第4,683,202號中闡述的實驗實施方案)、連接酶鏈反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自我維持序列複製(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-Beta複製酶(Lizardi等(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環複製(Lizardi等人，美國專利第5,854,033號)或任何其他核酸擴增方法，隨後使用本發明所屬技術領域中具有通常知識者熟知的技術檢測擴增的分子。如果核酸分子以非常低的數量存在，則此等檢測方案對於檢測核酸分子特別有用。在本發明的特定方面，藉由定量螢光RT-PCR(即TaqManTM系統)測定表現量。
mRNA的表現量可以使用膜印跡(例如用於雜交分析如Northern、Southern、dot等)或微孔、樣品管、凝膠、珠粒或纖維(或包含結合的核酸的任何固體支撐物)來監測。參見美國專利第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號和第5,445,934號，並經引用併入本文。轉基因表現量的測定還可以包括使用溶液中的核酸探針。
在一些實施方案中，使用分支DNA(bDNA)測定或即時PCR(qPCR)評估mRNA表現量。此等方法的使用在本文提供的實施方案中進行描述和舉例說明。
可使用本領域已知的任何用於測量蛋白質水平的方法來測定蛋白質表現量。此類方法包括例如電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析、流體或凝膠沉澱反應、吸收光譜、比色測定、分光光度測定、流式細胞術、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、蛋白質印跡、放射免疫測定(RIA)、酵素連結免疫吸附測定(ELISA)、免疫螢光測定、電化學發光測定等。
在一些實施方案中，本發明方法的功效藉由mRNA或蛋白質水平(例如，在肝臟活檢中)的降低來評估。
在另一個方面，本發明提供治療有需要的個體的方法。此方法包括向個體施用治療有效量的本發明的單股寡核苷酸或本發明的醫藥組成物，從而治療個體。
在一些實施方案中，先前向需要其的個體施用雙股RNAi劑，該雙股RNAi劑抑制標靶基因的表現並且在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾。
有需要的個體可能已經施用過高劑量的dsRNA劑和/或正在經歷脫靶效應。因此，向個體施用REVERSIR將作為解毒劑以逆轉dsRNA劑對目標基因的抑制。
在一種實施方式中，標靶基因係血管緊張素原(AGT)。有需要的個體可能已施用過高劑量的dsRNA劑並且患有低血壓、高血鉀和/或腎
功能障礙。在某些實施方案中，該方法還可以包括給予個體選自下組的附加療法或治療劑：增加膳食液體/鹽類、氟氫可的松/米多君治療、靜脈輸液、升壓藥物、減量或中斷伴隨的抗高血壓藥物、低鉀飲食、噻
類/袢利尿劑藥物、口服鉀結合劑、鈣、葡萄糖、胰島素和血液透析，或其組合。
在另一個方面，本發明提供在個體中改善dsRNA劑的副作用的方法，該dsRNA劑抑制目標基因的表現並且包含反義股中的熱不穩定核苷酸修飾，例如脫去-dsRNA劑施用的目標效應和/或過敏反應和/或免疫刺激效應。此方法包括向個體施用有效量的本發明的單股寡核苷酸或本發明的醫藥組成物，從而改善dsRNA劑在個體中的副作用。
本發明的體內方法可以包括藉由本領域已知的任何方式向個體施用組成物，包括但不限於口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，心室內、實質內和鞘內)、靜脈內、肌肉內、皮下、經皮、氣道(氣霧劑)、鼻、直腸和局部(包括頰和舌下)施用。在某些實施方案中，組成物藉由靜脈輸注或注射施用。在某些實施方案中，組成物藉由皮下注射施用。在某些實施方案中，組成物藉由肌肉注射施用。
本發明的組成物可作為「遊離iRNA」或「遊離REVERSIR化合物」施用。遊離iRNA或遊離REVERSIR化合物在不存在醫藥組成物的情況下施用。裸iRNA或裸REVERSIR化合物可以在適當的緩衝溶液中。緩衝溶液可包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、穀醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽、或其任何組合。在一種實施方案中，緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。可以調節緩衝溶液的pH和滲透壓，使得其適合施用於個體。
或者，本發明的組成物可以作為醫藥組成物施用，例如脂質體製劑。
IX.本發明的套件
在某些方面，本公開提供了套件，其包括：含有單股寡核苷酸的合適容器，用於抑制雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性，其在反義股中包含熱不穩定核苷酸或單股寡核苷酸的藥物製劑，並用於抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性。
此類套件包括一種或多種單股寡核苷酸和使用說明，例如，施用預防或治療有效量的單股寡核苷酸以抑制雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性的說明書，係在反義股中包含熱不穩定核苷酸或單股寡核苷酸的藥物製劑，並用於抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性。單股寡核苷酸或醫藥組成物可以在小瓶或預填充注射器中。套件可以視需要地還包含雙股RNAi劑，其抑制標靶基因的表現並且在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾，包含雙股RNAi劑的醫藥組成物，該雙股RNAi劑抑制標靶基因的表現並且在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾，和/或用於施用單股寡核苷酸、醫藥組成物和/或雙股RNAi劑的裝置(例如，注射裝置，諸如預填充注射器)，或用於測量反義股中包含熱不穩定核苷酸的雙股核糖核酸(dsRNA)劑的RNAi活性的抑制的裝置(例如，用於測量標靶基因mRNA、標靶基因蛋白和/或標靶基因活性的抑制的裝置)。此類用於測量RNAi活性的抑制的裝置可以包括用於從個體獲得樣本(例如血漿樣本)的裝置。本發明的套件亦可視需要地包含用於確定治療有效量或預防有效量的裝置。
在某些實施例中，藥物製劑的各個組分可以提供在一個容器中，例如小瓶或預填充注射器。或者，可能需要在兩個或更多個容器中分別提供藥物製劑的組分，例如，一個容器用於單股寡核苷酸和/或dsRNA化合物製劑，而至少另一個容器用於載體化合物。該套件可以以多種不同的配置來包裝，例如在單個盒子中的一個或多個容器。例如，可以根據套件提供的說明來組合不同的組件。可以根據本文描述的方法組合組分，例如以製備和施用醫藥組成物。該套件還可以包括輸送裝置。
本發明藉由以下實施例進一步說明，但不應視為限制。本申請全文引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的全部內容以及非正式序列表和附圖均藉由引用併入本文。
[實施例]
材料與方法
在下列實施例中使用下列材料和方法。
當本文沒有具體給出試劑的來源時，此類試劑可以以分子生物學應用的品質/純度標準從分子生物學試劑的任何供應商獲得。
應理解，在整個申請中，不帶小數點的寡核苷酸名稱等同於帶小數點的寡核苷酸名稱，其僅引用寡核苷酸的批次號。例如，A-959917相當於A-959917.1。
寡核苷酸合成
使用本領域已知的方法設計、合成和製備寡核苷酸。
簡言之，使用Mermade 192合成儀(BioAutomation)以亞磷醯胺化學在固相支撐物上合成1μmol規模的寡核苷酸。固相支撐物係裝有
訂製化GalNAc配體(3'-GalNAc綴合物)、通用固相支撐物(AM Chemicals)或第一個感興趣的核苷酸的可控孔徑玻璃(500-1000Å)。輔助合成試劑與標準2-氰乙基亞磷醯胺單體(2'-去氧-2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、RNA、DNA、LNA)購自Thermo-Fisher(密爾瓦基，WI)、Hongene(中國)或Chemgenes(美國麻薩諸塞州威爾明頓)。其他亞磷醯胺單體購自商業供應商、內部製備或使用各種CMO的訂製化合成獲得。在乙腈或9：1乙腈：DMF中製備濃度為100mM的亞磷醯胺，並使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，乙腈中0.25M)進行偶聯，反應時間為400秒。使用100mM 3-((二甲基胺基亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，從Chemgenes(Wilmington，MA，USA)獲得)在無水溶劑中的溶液產生硫代磷酸酯連接。乙腈/吡啶(9：1 v/v)。氧化時間為5分鐘。所有序列均在最終去除DMT基團(“DMT-Off”)的情況下合成。
固相合成完成後，在室溫下在96孔板中用300μL甲胺(40%水溶液)處理固相支持的寡核糖核苷酸約2小時，以從固相支持物上裂解並隨後去除所有額外的鹼不穩定保護基團。對於含有受三級丁基二甲基矽基(TBDMS)基團保護的任何天然核糖核苷酸鍵(2'-OH)的序列，使用TEA.3HF(三乙胺三氫氟酸)進行第二個脫保護步驟。在甲胺水溶液中的每個寡核苷酸溶液中加入200μL二甲基亞碸(DMSO)和300μL TEA.3HF，並將溶液在60℃下孵育約30分鐘。溫育後，使板達到室溫，並藉由添加1mL 9：1乙腈：乙醇或1：1乙醇：異丙醇沉澱粗寡核苷酸。然後將板在4℃下離心45分鐘，並藉助多通道移液器小心地倒出上清液。將寡核苷酸沉澱重懸於20mM NaOAc中，接著使用配備自動進樣器、UV偵測器、
電導計和餾分收集器的安捷倫液相層析系統上的HiTrap尺寸排阻管柱(5mL，GE Healthcare)進行脫鹽。將脫鹽樣品收集在96孔板中，然後藉由LC-MS和紫外光譜法進行分析，分別確認身份並量化材料的量。
在MerMade-12 DNA/RNA合成儀上以50-200μmol的規模合成更大規模的寡核苷酸。來自Glen Research的純溶劑/試劑、來自Prime Synthesis的500-Å可控孔徑玻璃(CPG)固體支撐物、來自Thermo的2'-去氧3'-亞磷醯胺、以及2'-OMe和2'-F核苷和LNA 3'-來自Hongene的亞磷醯胺全部按原樣使用。GalNAc CPG支撐物的製備和使用如前所述(Nair等人，JACS 2014)。低含水量乙腈購自EMD Chemicals。使用0.6M 5-(S-乙硫基)-1H-四唑的乙腈溶液作為活化劑。亞磷醯胺溶液係0.15M的無水乙腈溶液，含有15% DMF作為2’-OMe尿苷和胞苷的共溶劑。氧化劑係0.02M I 2的THF/吡啶/水溶液。N,N-二甲基-N’-(3-硫基-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲醯亞胺(DDTT)(0.09M吡啶溶液)作為硫化劑。脫三苯甲基化試劑係二氯甲烷(DCM)中的3%二氯乙酸(DCA)。
固相合成完成後，用5%(v/v)哌啶的無水乙腈溶液洗滌CPG固體支撐物3次，每次流動後保持5分鐘。然後用無水乙腈洗滌載具並用氬氣乾燥。然後將寡核苷酸與28-30%(w/v)NH4OH在35℃下孵育20小時。藉由過濾收集溶劑，並在分析前用水沖洗支撐物。使用約1 OD260單位/mL的寡核苷酸溶液對粗製品進行分析，並注入30-50μL溶液。LC/ESI-MS在Agilent 6130單四極桿LC/MS系統上使用XBridge C8色譜管柱(2.1×50mm,2.5μm)在60℃下進行。緩衝液A由200mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇和16.3mM三乙胺水溶液組成，緩衝液B為100%甲醇。緩
衝液B的梯度在10分鐘內從0%到40%，然後以0.70mL/min的流速進行清洗和重新校準。柱溫為75℃(補充資料)。所有寡核苷酸均使用先前報導的方法進行純化和脫鹽(Nair等人，JACS，2014)。
原代食蟹猴肝細胞(PCH)的體外篩選。
dsRNA轉染，然後進行REVERSIR自由攝取。
首先將4.9μL Opti-MEM加0.1μL Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)加入384孔Biocoat Collagen I-coated plate(Corning)中每孔5μL 10nM dsRNA中，以dsRNA轉染PCH。室溫孵育15分鐘後，將40μL含有5×103個細胞的William’s E Medium(Life Tech)加入dsRNA-Lipofectamine混合物中(1nM dsRNA最終濃度)。接著將細胞孵育4小時，然後進行單次PBS清洗、更換培養基，並將5μL REVERSIR分子直接添加到45μL William培養基中(最終劑量範圍為100nM-50pM)。孵育48小時後，裂解細胞並進行RNA分離、cDNA合成和定量PCR分析。
dsRNA和REVERSIR的共轉染。
藉由在384孔Biocoat Collagen I-coated plate中每孔混合4.8μl Opti-MEM、0.2μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)、5μL dsRNA和5μL REVERSIR，將PCH與dsRNA和REVERSIR共轉染。室溫孵育15分鐘後，將35μL含有5×103個細胞的William’s E Medium(Life Tech)加入dsRNA-REVERSIR-Lipofectamine混合物中(1nM dsRNA和100-0.4pM REVERSIR終濃度)。孵育24小時後，裂解細胞並進行RNA分離、cDNA合成和定量PCR分析。
轉染
藉由將14.8μL Opti-MEM加0.2μL Lipofectamine RNAiMax每孔(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)加入96孔板中的單一孔中的5μL每種寡核苷酸中來進行轉染。然後將混合物在室溫下溫育15分鐘。然後將80μL不含抗生素且含有~2x104個細胞的完全生長培養基添加到dsRNA混合物中。RNA純化前將細胞孵育24小時。
使用DYNABEADS mRNA分離套件(Invitrogen TM ,part #：610-12)分離總RNA
將細胞在每孔含有3μL珠粒的75μL裂解/結合緩衝液中裂解，並在靜電搖動器上混合10分鐘。使用磁性板支撐在Biotek EL406上自動執行洗滌步驟。將珠粒在緩衝液A中洗滌(在90μL中)一次，在緩衝液B中洗滌一次，在緩衝液E中洗滌兩次，中間有抽吸步驟。最後一次抽吸後，將完整的10μL RT混合物加入每個孔中，如下所述。
使用ABI高容量cDNA逆轉錄套件進行cDNA合成(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)
每個反應孔中加入1μL 10X緩衝液、0.4μL 25X dNTP、1μL隨機引子、0.5μL逆轉錄酶、0.5μL RNase抑制劑和6.6μL H2O的預混液。將板密封，在靜電搖動器攪拌10分鐘，然後在37℃培養2小時。隨後，將板子在80℃攪拌8分鐘。
即時PCR
將2微升(μl)cDNA加入384孔板(Roche cat # 04887301001)中每孔含有0.5μl人類GAPDH TaqMan探針(4326317E)、
0.5μl人類PNPLA3、2μl無核酸酶水和5μl Lightcycler 480探針主混合物(Roche Cat # 04887301001)的主混合物中。即時PCR在LightCycler480即時PCR系統(Roche)中進行。
小鼠AAV研究
以表現人類AGT(hAGT)的AAV血清型8轉導小鼠。轉導後14天，即研究第0天，藉由皮下注射以3mg/kg或10mg/kg的劑量向小鼠施用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或AD-85481。在第7天，以皮下注射向小鼠施用3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或A-762645.12。在第0、7、9、11、14和21天收集血清樣本。以ELISA測定血清AGT蛋白。
REVERSIR化合物在非人靈長類(NHP)的評估
該研究的目的係確定對猴子施用AD-85481後逆轉劑A-762645和A-762722的藥效學。
該研究係根據適當的方案和修正案進行。
雄性食蟹猴在給藥開始時年齡為2.5至2.7歲且體重在2.1至2.6kg之間。
AD-85481，在0.9%氯化鈉(生理食鹽水)中製備劑量製劑以達到預期濃度。在第一天藉由皮下注射將製劑施用於適當的動物。A-762645、A-762722、AF011-762645和AF-011-762722劑量製劑在0.9%氯化鈉(生理食鹽水)中製備，以達到預期濃度。第22天藉由皮下或靜脈注射將製劑施用於適當的動物。
含有AD-85481、A-762645和A-762722的給藥溶液與目標濃度的誤差在±15%內，並證實給藥溶液含有處於期望濃度範圍內的測試製品。所有給藥溶液的滲透壓值均在注射的正常範圍內。
從給藥後第-1天到第99天收集血液樣本以測定血清中的血管張力素原(AGT)濃度。所有動物都存活下來，直到被釋放到測試設施群落。在臨床體徵、體重或食物評估方面沒有與測試物品相關的變化。
AD-85481在第1天以3mg/kg皮下注射單次給藥，隨後在第22天皮下注射1或3mg的A-762645或A-762722或靜脈注射0.3mg/kg的AF011-762645或AF-011-762722在猴子中具有良好的耐受性。AD-85481降低了猴子的循環AGT水平，而逆轉劑(A 762645、A-762722、AF011-762645和AF-011-762722)則恢復了AGT水平。
實施例1. 在dsRNA劑中包含熱不穩定的核苷酸修飾消除REVERSIR
TM
寡核苷酸的抑制活性
近年來，許多研究性臨床研究的安全性和有效性數據已經證明RNA干擾(RNAi)的治療用途。短干擾RNA(dsRNA)劑利用內源性RNAi途徑，有效且特異性地靜默mRNA，從而防止致病蛋白或疾病途徑相關蛋
白質的形成。藉由將化學修飾的dsRNA與三價N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)配體綴合，可將RNAi治療藥物標靶遞送至肝細胞，從而促進脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)介導的組織特異性攝取。與具有增強化學穩定性的GalNAc配體綴合的dsRNA藥物的開發已導致功效和持續時間的顯著改善。在臨床前動物模型以及人類中，dsRNA藥物在單次皮下注射後顯示出令人印象深刻的作用持續時間，有效的靜默作用可持續數月。由於作用時間較長，RNAi療法可以受益於一種能夠快速逆轉靜默活性並提供對RNAi藥理學的訂製化調控的技術，這係個人化精準醫療的理想屬性。
然而，在某些情況下，個體可能對dsRNA劑的治療反應不佳或接受過高的劑量。在這種情況下，可以施用逆轉dsRNA劑的iRNA靜默活性的化合物以至少部分降低dsRNA劑的RNAi活性。在其他情況下，dsRNA的長期作用使得等待該作用藉由自然清除緩慢減弱成為一種不吸引人的選擇。
美國專利公開號US 2017/0369872和PCT公開號WO 2016/100716和WO 2019/036612(各自的全部內容藉由引用併入本文)，描述寡核苷酸的設計原理，無論目標mRNA如何，該寡核苷酸都可以逆轉dsRNA劑的iRNA靜默活性。此等稱為REVERSIR的寡核苷酸已被證明可以在體外和體內逆轉與GalNAc配體綴合的dsRNA劑的iRNA靜默活性，從而能夠調控和訂製RNAi藥理學。
GalNAc-REVERSIR經由脫唾液酸糖蛋白受體(ASPGR)結合並內化到細胞中，並且不可逆地結合功能性RISC複合物中的dsRNA劑的反義股。REVERSIR的結合消除dsRNA劑的mRNA標靶識別和裂解。
然而，當用靶向mRNA相同區域並且包含實質上相同的核苷酸修飾[例如，無鹼基核苷酸、2'-去氧核苷酸、無環核苷酸(例如，未鎖核酸(UNA)、二醇核酸(GNA)或(S)-二醇核酸(S-GNA))、2'-5'連接的核苷酸(3'-RNA)、蘇糖核苷酸(TNA)、2'gem Me/F核苷酸或與另一股中的相對核苷酸的錯配，例如，與種子區域相對的反義股中的反義股(即，從反義股5'-端算起的位置2-8或2-9)](除了包含熱不穩定核苷酸修飾之外)的dsRNA劑來評估此等已被證明可抑制與GalNAc配體綴合的dsRNA劑的靜默REVERSIR的活性時，REVERSIR的活性被廢除(圖1A-1C)。只有當REVERSIR被延長，例如至約18個核苷酸長度，並且以比靶向非不穩定dsRNA的REVERSIR高100倍的劑量施用時，REVERSIR才能夠抑制包含熱不穩定核苷酸修飾並綴合至GalNAc配體的dsRNA劑的靜默(圖2)。儘管如此，即使在最佳狀態下，當dsRNA劑上存在熱不穩定核苷酸修飾時，與dsRNA劑上不存在熱不穩定核苷酸修飾時最佳REVERSIR的靜默活性的抑制相比，REVERSIR靜默活性的抑制效果亦會減弱約30-100倍。
鑑於需要更高的劑量以及REVERSIR具有更長的長度和大量的硫代磷酸酯連接和LNA，以便抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑的RNAi靜默活性，而評估REVERSIR的反義寡核苷酸(ASO)，例如細胞激素和趨化因子的刺激(例如IL-6、IL-8、MCP-1)潛在的免疫刺激作用、升高的C反應蛋白(CRP)水平、升高的IgM水平以及免疫細胞向器官的浸潤。
為了降低REVERSIR的劑量，將寡核苷酸配製為脂質奈米顆粒LNP，用於以較低劑量靜脈內施用，或重新設計以包含較少的LNA和/
或硫代磷酸酯連接並配製為LNP。如圖3A所示，靜脈注射0.3mg/kg配製在LNP中的REVERSIR，對反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑的RNAi靜默活性具有與皮下施用包含GalNAc配體的相同REVERSIR 3mg/kg具有實質上相同的抑制作用。如圖3B所示，儘管REVERSIR係在LNP中製定，然而減少LNA和/或硫代磷酸酯連接並不能為REVERSIR提供足夠的代謝穩定性以有效抑制反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑的RNAi靜默活性。
實施例2. 抑制反義股中含有熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑的RNAi活性的寡核苷酸的鑑定
如上所述，已證明在dsRNA劑的反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾可消除REVERSIR寡核苷酸的抑制活性。
目前正在用於治療高血壓的II/III期臨床試驗中研究有效且持久地抑制血管緊張素原(AGT),AD-85481(Zilebesiran；亦稱為AGT-01)表現的dsRNA劑。AD-85481在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾。雙股體AD-85481的未修飾的和修飾的有義股和反義股核苷酸序列如下表所示。
雙股體AD-85481的未修飾與修飾核苷酸序列
化學修飾定義如下：a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸、c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸、g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸、u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸、Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸、Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸、Gf為2’-氟鳥苷-3’-磷酸、Uf為2’-氟尿苷-3’-磷酸、(Ggn)為鳥苷-乙二醇核酸(GNA)、s為硫代磷酸酯連接。有義股的3'端與配體綴合，如下方式所示
鑑於AD-85481的效力和作用持續時間長，即使使用常規干預措施來治療低血壓，例如，增加膳食液體/鹽、氟氫可的松/米多君治療、靜脈輸液、血管加壓藥物和/或降低或中斷伴隨的抗高血壓藥物一些接受AD-85481治療的個體亦可能會復發性、症狀性和持續性低血壓。即使使用常規干預措施來治療高血鉀症，例如，低鉀飲食、噻
類/袢利尿劑藥物、口服鉀結合劑、鈣、葡萄糖、胰島素和/或血液透析，一些接受AD-85481治療的個體亦可能會出現高血鉀症。此外，有些個體亦可能會出現腎功能障礙。
鑑於AD-85481施用的此等潛在安全性影響，逆轉AD-85481對AGT的RNAi抑制的治療，例如AD-85481的REVERSIR，將係有益的。
因此，並使用AD-85481作為在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑的模型系統，使用標準方法設計AD-85481的REVERSIR，並藉由終濃度100nM或1000nM的自由攝取以及終濃度1nM或10nM的原代食蟹猴肝細胞轉染來評估其體外活性(下面簡要描述)。表2-5提供REVERSIR的修飾核苷酸序列和體外分析的結果。
從表2-5可知，儘管藉由自由攝取評估時，REVERSIR的效力有所損失，許多包含2 LNA修飾的22-單體單元REVERSIR在體外抑制AD-85481的RNAi靜默活性。對於包含2 LNA修飾的18-單體單元REVERSIR，與22-單體單元REVERSIR相比，此等總體上係效力較低的抑制劑(表3)，與22-單體單元或18-單體單元REVERSIR相比，16-單體單元REVERSIR係效力較低的抑制劑(表4)。
另外，數據表明，22-單體單元REVERSIR中位置2(從REVERSIR的3'-端計數)的LNA與位置6或位置14-16(從REVERSIR的3'-端計數)的第二個LNA組合可有效抑制AD-85481的活性(表2)。使用18-單體單元REVERSIR觀察到類似的結果，儘管位置2(從REVERSIR的3'端計數)的LNA與位置8或9(從REVERSIR的3'端計數)的第二個LNA組合係最有效的18-單體單元REVERSIR(表3)。對於16-單體單元REVERSIR，與18-單體單元REVERSIR類似，位置2(從REVERSIR的3'-端計數)的LNA修飾與位置8、9、13或14(從REVERSIR的3'-端計數)的第二個LNA組合係最有效的(表4)。對於包含5 LNA修飾的REVERSIR，如表5可見，對REVERSIR的抑制活性有明顯的長度依賴性。
分析表明，與位置2和5或2和7(從寡核苷酸的3’端開始計算)相比，在位置2和6(從寡核苷酸的3’-端計數)包含LNA修飾對AD-85481的RNAi抑制活性具有良好的抑制活性。在某些情況下，例如18-單體單元REVERSIR，位置2和8以及2和9顯示出良好的抑制活性。其他位置，2和14、2和15、或2和16亦具有良好的抑制活性。
此外，對於22-單體單元、18-單體單元和16-單體單元寡核苷酸，維持REVERSIR的抑制活性，儘管18-單體單元和16-單體單元REVERSIR不如22-單體單元REVERSIR有效。另外，包含3或4個LNA修飾的18-單體單元和16-單體單元REVERSIR具有與包含5個LNA修飾的18-單體單元和16-單體單元REVERSIR相當的活性(圖4A和4B)。此外，已證明包含4個或3個LNA修飾的12-單體單元和9-單體單元REVERSIR沒有抑制活性。
選擇來自體外分析的前5個抑制性REVERSIR，A-515518、A-515556、A-515559、A-515586和A-515589並評估體內活性(圖5)。簡言之，在給藥前第-21天，經由靜脈注射2×1011個編碼人類AGT的腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒轉導野生型小鼠(C57BL/6)。第0天，小鼠皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。第7天，每組三隻小鼠皮下注射單次3mg/kg劑量的A-515518、A-515556、A-515559、A-515586或A-515589，與GalNAc配體形成雙股體，或靜脈注射LNP配製的REVERSIR A-515518、A-515556、A-515559、A-515586或A-515589，或PBS對照。
在第0、7、9、11和14天收集血清樣本。第14天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。
將人類AGT mRNA水平與持家基因GAPDH進行比較，如圖1和圖2所示。如圖6A和6B所示，GalNAc綴合的REVERSIR和LNP配製的REVERSIR均有效抑制AD-85481的RNAi抑制活性，其中22-單體單元REVERSIR(A-515518)具有最有效的活性。此外，觀察到LNP配製的REVERSIR和GalNAc綴合的REVERSIR具有快速起效的作用，然而，LNP配製的REVERSIR的耐久性低於GalNAc綴合的REVERSIR。
實施例3. 抑制反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑的RNAi活性的另外的REVERSIR
如實施例2所述，設計、合成抑制在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的dsRNA劑(即AD-85481)的RNAi干擾活性的REVERSIR，並評估體外和體內活性。然而，值得注意的係，儘管REVERSIR藉由轉染表現出良好的活性，但此等藉由自由攝取表現出較差的活性。
因此，設計、合成額外九十七個包含4或5個LNA修飾的15-單體單元、16-單體單元和18-單體單元REVERSIR，並評估體外活性，以抑制RNAi干擾活性使用標準方法在原代食蟹猴肝細胞中以100nM或1000nM的終濃度自由攝取並以1nM或10nM的終濃度轉染AD-85481。
結果表明，與實施例2中設計、合成和測定的REVERSIR相比，顯著更多的REVERSIR具有轉染活性和自由攝取活性。
如實施例3所述評估從體外分析鑑定的表現最好的REVERSIR A-762636、A-762655、A-762680、A-762689、A-762722和A-762645的體內活性。圖7A和表6提供此等REVERSIR的修飾的核苷酸序列。
簡言之，在給藥前第-21天，經由靜脈注射用2×1010個編碼人AGT的腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒轉導野生型小鼠(C57BL/6)。第0天，小鼠皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。在第7天，每組三隻小鼠皮下注射單次3mg/kg劑量的A-762636、A-762655、A-762680、A-762689、A-762722和A-762645(GalNAc綴合雙股體)，或PBS對照。
在第0、7、9、11和14天，收集血清樣本。第14天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。
將人類AGT mRNA水平與持家基因GAPDH進行比較，並且如圖7B所示，REVERSIR有效抑制AD-85481的RNAi抑制活性。
在一組單獨的體內實驗中，在給藥前第-21天，以編碼人類AGT的腺相關病毒8(AAV8)載體的2 x 1010個病毒顆粒轉導野生型小鼠(C57BL/6)經由靜脈注射。第0天，小鼠皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。在第7天，每組三隻小鼠皮下施用單次1mg/kg或3mg/kg劑量的REVERSIR A-762645、A-762689或A-762722(GalNAc綴合的雙股體)(如圖8A和表6所示)，或PBS對照。
在第0、7、9、11和14天收集血清樣本。第14天，犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。
將人類AGT mRNA水平與持家基因GAPDH進行比較，並且如圖8B所示，15-單體單元、16-單體單元和18-單體單元REVERSIR有效抑制AD-85481的RNAi抑制活性，其中15-單體單元和18-單體單元REVERSIR、A-762722和A-762645具有最有效的活性。
鑑於前述結果，評估A-762722和A-762645在非人靈長類動物中的活性。研究設計如圖9所示。簡言之，非人類靈長類動物在第0天皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。在第22天，每組3隻動物皮下施用單次1mg/kg或3mg/kg劑量的A-762722或A-762645(GalNAc綴
合雙股體)，或靜脈注射單次0.3mg/kg劑量的LNP配製的A-762722或A-762645，或PBS對照。在指定的時間間隔，收集血清樣本並藉由RT-QPCR方法分析AGT mRNA的水平。
如圖10A和10B所示，18-單體單元A-762645有效逆轉AD-85481的RNAi抑制活性。如同在小鼠中觀察到，靜脈施用的LNP配製的REVERSIR和皮下施用的GalNAc綴合的REVERSIR均具有快速起效，然而，LNP配製的REVERSIR的持久性低於皮下施用的GalNAc綴合的REVERSIR。此外，如在小鼠中觀察到般，A-762645與1：1劑量的REVERSIR：AD-85481一起使用亦有效。
設計並合成比已鑑定的最有效且持久的REVERSIR A-762645具有更少硫代磷酸酯連接之另外的18-單體單元REVERSIR，以便最小化安全性差的風險。此等REVERSIR的子集的修飾核苷酸序列提供於圖11A並顯示於表6中。
如上所述在體內測定此等REVERSIR。
在給藥前第-21天，經由靜脈注射用2×1010個編碼人類AGT的腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒轉導野生型小鼠(C57BL/6)。第0天，小鼠皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。在第7天，每組三隻小鼠皮下施用單次1mg/kg或3mg/kg劑量的REVERSIR A-762645、A-809917、A809918、A-809919、A-809920、A-809921、A-809922、A-809923、A-809924、A809924或A-809925(GalNAc綴合雙股體)或PBS對照。
在第0、7、9、11和14天收集血清樣本。第21天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA，並以RT-QPCR方法分析人類AGT mRNA量。
將人類AGT mRNA水平與持家基因GAPDH進行比較，並且證明所有REVERSIR在抑制AD-85481的RNAi抑制活性方面在所有測試的小鼠組內和之間都同樣有效(圖11B)。
在單獨的實驗組中，藉由靜脈注射用編碼人類AGT的腺相關病毒8(AAV8)載體的2×1011個病毒顆粒轉導小鼠。第0天，小鼠皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。在第7天，每組三隻小鼠皮下施用單次1mg/kg或3mg/kg劑量的REVERSIR A-762645、A809918、A-809925、A2423818或A2423819(GalNAc綴合的雙股體)(圖12A)，或PBS對照。
在第0、7、9、11、14和21天收集血清樣本。第21天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。
一組實驗的結果呈現在圖12B中且另一組實驗的結果呈現在圖12C。數據表明，所有評估的REVERSIR都至少實現了一定程度的抑制，AD-85481的RNAi抑制活性，對於包含14或10個硫代磷酸酯連接的18-單體單元REVERSIR，AD-85481的抑制活性幾乎完全逆轉，A-762645和A-809918，以及包含8個硫代磷酸酯連接的22-單體單元REVERSIR，A-2423818。然而，隨著18-單體單元REVERSIR(即A-809925)上硫代磷酸酯連接的減少，逆轉效應會消失，但可以藉由長度的增加來補償，例如，增加到22-單體單元REVERSIR，如22-單體單元
REVERSIR，A-2423818，包含8個硫代磷酸酯連接。數據亦證明每個測定的REVERSIR的劑量反應。
總而言之，能夠完全逆轉小鼠中的AD-85481 RNAi抑制活性的REVERSIR被鑑定並且證明在非人靈長類動物中係有效的。還證明，可以減少這些REVERSIR的硫代磷酸酯連接的數量，而不影響功效，並且使用包含14、10和6個硫代磷酸酯連接的REVERSIR觀察到最有效的逆轉。
實施例4. REVERSIR在非人靈長類動物中的作用以及REVERSIR的安全性和毒性分析
評估REVERSIR在非人靈長類動物的功效，該REVERSIR抑制實施例3所述的AD-85481、A-762645、A-809918、A-809925和A-2423818的RNAi抑制活性。在第0天，雌性非人類靈長類動物皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。第21天，靈長類動物(n=3)皮下注射單次3mg/kg劑量的A-762645、A-809918、A-809925或A-2423818(GalNAc綴合雙股體)。在第-7、-14、0、3、7、14、21、22、23、24、25和28天收集血清樣本。萃取血清mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。
如圖13A至13C所示，所有REVERSIR均逆轉AD-85481與A-762645的抑制，在施用2天後且以1：1的AD-85481：REVERSIR比率實現血清AGT水平的10%逆轉，此乃理想的臨床特徵。
進一步評估A-762645、A-809918、A-809925和A-2423818的安全性和毒性。具體地，在稀釋的人類全血轉染測定(24小時溫育)中，任何REVERSIR都沒有促炎反應(圖14A)，並且在6小時人類全血測定(圖
14B)中對於任何REVERSIR都沒有觀察到反義寡核苷酸樣促炎反應。此外，在非人靈長類動物中，對於所有REVERSIR，在整個上述研究中血小板計數和全血細胞計數均在正常範圍內(圖14C)。
此外，在大鼠毒性研究中，施用單次30mg/kg或100mg/kg劑量的A-762645、A-809918或A-809925沒有導致任何臨床體徵、器官或身體體重變化、整體發現或器官重量變化或臨床病理變化。肝臟、腎臟、給藥部位和腎上腺的組織病理學均在正常範圍內。
實施例5. REVERSIR在非人靈長類動物中的作用以及REVERSIR的藥理學分析
對於REVERSIR A-762645在非人靈長類動物中的功效進行評估。在第0天，雌性非人類靈長類動物(n=3)皮下注射單次3mg/kg劑量的AD-85481。在第22天，以1mg/kg或3mg/kg皮下劑量施用A-762645，或以0.3mg/kg施用靜脈注射劑量AF011-762645(LNP製劑中的A-762645)。在第-7、0、3、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91和98天收集血清樣本。萃取血清mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。
如圖15A所示，使用增加的REVERSIR(RVR)/dsRNA比率或使用LNP製劑已被證明可改善逆轉動力學。LNP配製的REVERSIR實現更快的動力學，但AGT減弱的逆轉不如GalNAc形式的REVERSIR觀察到的那麼持久。此外，如圖13A所示，A-762645表現出逆轉AD-85481(Zilebesiran)介導的AGT減弱的最有利的藥效學特徵。
在進一步的研究中，在第0天，雌性非人靈長類動物皮下施用單次10mg/kg劑量的AD-85481(相當於人類個體的約600mg劑量)。第22天，靈長類動物皮下注射單劑10mg/kg(n=2)；單劑30mg/kg；或分次劑量30mg/kg(分成三劑10mg/kg，每24小時間隔一次)的A-762645-GalNAc綴合的REVERSIR；或PBS作為對照。在第0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91和98天收集血清樣本。萃取血清mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。
如圖15B所示，在非人靈長類動物給予AD-85481(Zilebesiran)後，A-762645產生有效且持久的藥理學。此外，與單劑量相比，最高劑量水平的分次給藥(每24小時間，隔3劑10mg/kg)改善REVERSIR藥效學，而與單劑量相比，較低劑量的分次給藥並沒有改善REVERSIR藥效學(數據未顯示)，表明在高劑量下達到飽和狀態，可能係由於給定時間受體的可用性。
在進一步的研究中，在第22天，靈長類動物皮下施用單次10mg/kg、20mg/kg或30mg/kg劑量的A-762645-GalNAc綴合的REVERSIR或A-762645-LNP靜脈注射製劑。在第22、23、24、25、26、29和36天收集血清樣本。萃取血清mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。如圖15C所示，在所有劑量水平下，皮下遞送REVERSIR表現出相對於靜脈內遞送REVERSIR更好的藥效學特徵。特別係，與靜脈輸注REVERSIR相比，在非人靈長類動物中皮下遞送REVERSIR導致AGT減弱的逆轉更快。
實施例6. REVERSIR A-762645在人源化小鼠模型中的作用
選擇A-762645並評估不同人源化小鼠模型中的體內活性。在第一項研究中，在經AD-85481(Zilebesiran)預處理的hAGT-AAV小鼠模型中評估A-762645的功效。藉由肝臟特異性AAV8病毒轉導，人類AGT基因在小鼠肝細胞中表現。在第0天，小鼠皮下施用單次3mg/kg(圖16A)或10mg/kg(圖16B)劑量的AD-85481。在第7天，每組三隻小鼠皮下施用單次3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg劑量的REVERSIR A-762645-GalNAc綴合物；或PBS對照。
在第0、7、9、11、14和21天收集血清樣本。第21天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。將人類AGT mRNA量與持家基因GAPDH進行比較，並且如圖16A和16B所示，REVERSIR有效抑制AD-85481的RNAi抑制活性。
在第二項研究中，在用AD-85481(Zilebesiran)預處理的hAGT基因轉殖小鼠模型中評估A-762645的功效。簡言之，人類AGT基因被隨機插入小鼠基因組的多個區域(在胚胎幹細胞階段產生)。第0天，小鼠皮下注射單次10mg/kg劑量的AD-85481。在第7天，每組三隻小鼠皮下施用單次1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或30mg/kg劑量的REVERSIR A-762645；或PBS對照。
在第0、7、9、11、14和21天收集血清樣本。第21天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。將人類AGT mRNA量與持家基因GAPDH進行比
較，並且如圖17所示，REVERSIR有效抑制AD-85481的RNAi抑制活性。
在第三項研究中，在用AD-85481(Zilebesiran)預處理的PXB小鼠模型中評估A-762645的功效。簡言之，人類AGT基因被隨機插入小鼠基因組(在胚胎幹細胞階段產生)的多個區域。第0天，小鼠皮下注射單次10mg/kg劑量的AD-85481。第14天，每組三隻小鼠皮下注射單劑量3mg/kg或10mg/kg；或分次劑量3mg/kg x 3(12小時)的REVERSIR A-762645或PBS對照。
在第-5、0、7、14、16、18、21和28天收集血清樣本。第28天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。將人類AGT mRNA量與持家基因GAPDH進行比較，並且如圖18所示，REVERSIR有效抑制AD-85481的RNAi抑制活性。
實施例7. REVERSIR A-762645在大鼠模型中的作用
在AD-85481(Zilebesiran)預處理的大鼠模型中評估A-762645的功效。簡言之，在第0天，對大鼠(n=3)皮下施用單次3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg劑量的AD-85481。在第7天，每組三隻大鼠皮下施用單次3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg劑量的REVERSIR A-762645-GalNAc綴合物，靜脈注射單次10mg/kg劑量的包含GalNAc配體的A-762645，靜脈注射單次1mg/kg劑量的AF-105-516448(LNP製劑中的REVERSIR)；或PBS對照。此外，靜脈內劑量係在大鼠尾靜脈中以推注形式施用。
在第0、3、7、8、9、10、11、14和21天收集血清樣本。第21天犧牲動物，收集肝臟樣本並在液態氮中速凍。萃取血清和肝臟mRNA並以RT-QPCR方法進行分析。將AGT mRNA水平與持家基因GAPDH進行比較。
如圖19A所示，REVERSIR與dsRNA的較高比例增加AGT減弱逆轉的動力學，類似於非人靈長類動物中觀察到的情況。此外，如圖19B所示，AD-85481 dsRNA負載不影響AGT減弱的逆轉。此外，如圖19C所示，相較於以包含GalNAc配體的相同REVERSIR的逆轉，以LNP製劑中的REVERSIR逆轉AGT減弱較快。此外，如圖19D所示，推注靜脈內給藥並未導致比皮下施用REVERSIR更快的動力學。
實施例8. REVERSIR在人源化小鼠模型中的作用
REVERSIR A-3903617、A-3903618、A-3903619、A-3903620、A-3903621、A-3903622、A-3903623、A-3903624、A-36236A-39036246A-396326A-3296 A-3903628、A-3903629、A-3903630和A-3903631(圖20)在用AD-85481(Zilebesiran)預處理的小鼠AAV模型中進行評估。簡言之，以表現人類AGT(hAGT)的AAV血清型8轉導小鼠。研究第0天轉導後14天，藉由皮下注射向小鼠施用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或3mg/kg AD-85481。第7天，以皮下注射給小鼠施用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或3mg/kg的REVERSIR。在第0、7、9、11、14和21天收集血清樣本。藉由ELISA測量血清AGT蛋白。如圖21至圖23所示，REVERSIR有效抑制AD-85481的RNAi抑制活性。
Claims (68)
- 一種用於抑制雙股核糖核酸(dsRNA)劑之RNAi活性的單股寡核苷酸，其在反義股中包含熱不穩定核苷酸，其中，該單股寡核苷酸包含與該dsRNA劑的反義股實質上互補的核苷酸序列，其中，該單股寡核苷酸為16-30個核苷酸長度，其中，該單股寡核苷酸的實質上所有核苷酸都包含核苷酸修飾，以及其中，至少三個該核苷酸修飾係高親和力核苷酸修飾。
- 如請求項1所述之單股寡核苷酸，其中，實質上所有該核苷酸都包含選自由下述所組成群組之核苷酸修飾：2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代的烷基修飾、2'-鹵修飾、去氧核苷酸修飾、鎖核酸(LNA)修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、橋接核酸(2',4'-BNA)、2'-O-乙基(cEt)及2'-O-甲基修飾。
- 如請求項1或2所述之單股寡核苷酸，其中，所有該核苷酸都包含選自由下述所組成群組之核苷酸修飾：2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代的烷基修飾、2'-鹵素修飾、去氧核苷酸修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、橋接核酸(2',4'-BNA)、2'-O-乙基(cEt)及2'-O-甲基修飾。
- 如請求項1至3中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，至少四個該核苷酸修飾係高親和力核苷酸修飾。
- 如請求項1至4中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，至少五個該核苷酸修飾係高親和力核苷酸修飾。
- 如請求項1至5中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，至少兩個該高親和力核苷酸修飾位於位置2和位置6；位置2和5；位置2和7；位置2和8；位置2和9；位置2和14；位置2和15；及/或位置2和16，從寡核苷酸的3'-端計數。
- 如請求項6所述之單股寡核苷酸，其中，該高親和力核苷酸修飾位於位置2、6、8和14；2、4、5、6和7；2、4、6、8和13；2、4、6、8和14；2、4、6、8和15；2、4、6、8和16；2、8、10和14；2、4、6、8和14；或2、8、12和14，從寡核苷酸的3'-端計數。
- 如請求項1至7中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，包含高親和力核苷酸修飾的核苷酸中的至少一個與該dsRNA劑的反義股中包含熱不穩定核苷酸的核苷酸鹼基配對。
- 如請求項8所述之單股寡核苷酸，其中，該高親和力修飾選自由下述所組成之群組：鎖核酸(LNA)修飾、限制性乙基核酸(cEtNA)修飾及橋接核酸(BNA)修飾。
- 如請求項1至9中任一項所述之單股寡核苷酸，復包含至少五個硫代磷酸酯核苷酸間修飾。
- 如請求項1至10中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該單股寡核苷酸綴合至至少一個配體。
- 如請求項11所述之單股寡核苷酸，其中，該配體係N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
- 如請求項11所述之單股寡核苷酸，其中，該配體係藉由單價、二價或三價分支連接子連接的一種或多種GalNAc衍生物。
- 如請求項13所述之單股寡核苷酸，其中，該配體係
- 如請求項11至13中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該配體綴合至該單股寡核苷酸中的包含去氧糖的核苷。
- 如請求項15所述之單股寡核苷酸，其中，該去氧糖係2’-去氧核糖。
- 如請求項11至16中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該配體綴合至該單股寡核苷酸的3’-終端。
- 一種用於抑制雙股核糖核酸(dsRNA)劑之RNAi活性的單股寡核苷酸，其在反義股中包含熱不穩定核苷酸，其中，該單股寡核苷酸包含與該dsRNA劑的反義股實質上互補的核苷酸序列，其中，該單股寡核苷酸為18-24個核苷酸長度，其中，該單股寡核苷酸包含至少五個硫代磷酸酯核苷酸間修飾並且由式(I)表示：
其中：B1、B2及B3各自獨立表示包含核苷酸修飾的核苷酸，該核苷酸修飾獨立地選自由下述所組成之群組：2'-去氧、2'-核糖、2'-O-烷基修飾、2'-取代的烷氧基修飾、2'-取代的烷氧基烷基修飾、2'-取代的烷基修飾及2'-鹵素修飾；T1、T2及T3各自獨立表示包含選自由下述所組成之群組：去氧核苷酸修飾、D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')鎖核酸(LNA)修飾、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、橋接核酸(2',4'-BNA)修飾、2'-O-乙基(cEt)修飾、2'-去氧-2'-氟及2'-O-甲基修飾；q1、q3及q5各自獨立地為3-12個核苷酸長度；q2、q4及q6獨立地為1-6個核苷酸長度；以及其中，該單股寡核苷酸綴合至至少一種配體。 - 如請求項1至18中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該單股寡核苷酸包含：5-15硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-14硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-13硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-12硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-11硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-10硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-9 硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-8硫代磷酸酯核苷酸間修飾；5-7硫代磷酸酯核苷酸間修飾；或5-6硫代磷酸酯核苷酸間修飾。
- 如請求項19所述之單股寡核苷酸，其中，該單股寡核苷酸包含6-14硫代磷酸酯核苷酸間修飾。
- 如請求項1至20中任一項所述之單股寡核苷酸，其為18-22或18-20個核苷酸長度。
- 如請求項1至21中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該單股寡核苷酸與該dsRNA劑的反義股的全長至少約90%互補。
- 如請求項1至22中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該單股寡核苷酸與該dsRNA劑的反義股的核苷酸2-16為90%互補。
- 如請求項1至23中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該單股寡核苷酸與該dsRNA劑的反義股完全互補。
- 如請求項1至24中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該dsRNA劑的反義股的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列5'-UGUACUUCAUUGUGGAUGACGA-3'。
- 如請求項1至25中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該熱不穩定核苷酸修飾選自由下述所組成之群組：無鹼基修飾；與雙股體中相反的核苷酸錯配；不穩定的糖修飾、2’-去氧修飾、無環核苷酸、未鎖核酸(UNA)及甘油核酸(GNA)。
- 如請求項26所述之單股寡核苷酸，其中，該dsRNA劑之反義股的核苷酸序列包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列5'-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3'，其中，a、c、g及u分別為2'- O-甲基腺苷-3'-磷酸、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸、2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸及2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸；Af、Cf、Gf及Uf分別為2'-O-氟腺苷-3'-磷酸、2'-O-氟胞苷-3'-磷酸、2'-O-氟鳥苷-3'-磷酸及2'-O-氟尿苷-3'-磷酸；dT為去氧胸腺嘧啶；s為硫代磷酸酯連接；(Tgn)為胸苷-乙二醇核酸(GNA)S-異構體。
- 如請求項1至27中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該單股寡核苷酸的核苷酸序列與表6中任一未修飾之核苷酸序列的整個核苷酸序列具有至少90%的同一性。
- 如請求項12至28中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該配體係N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
- 如請求項12至-29中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該配體係經由單價、二價或三價分支連接子連接的一種或多種GalNAc衍生物。
- 如請求項30所述之單股寡核苷酸，其中，該配體係
- 如請求項18至31中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該配體綴合至該單股寡核苷酸的包含去氧糖的核苷。
- 如請求項32所述之單股寡核苷酸，其中，該去氧糖係2’-去氧核糖。
- 如請求項18至33中任一項所述之單股寡核苷酸，其中，該配體綴合至該單股寡核苷酸的3’-終端。
- 如請求項1至34中任一項所述之單股寡核苷酸，其包含與表6中的任一修飾核苷酸序列相差不超過4個修飾核苷酸的修飾核苷酸序列。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至35中任一項所述之單股寡核苷酸。
- 如請求項36所述之醫藥組成物，其中，該單股寡核苷酸係於非緩衝溶液中。
- 如請求項37所述之醫藥組成物，其中，該非緩衝溶液係鹽水或水。
- 如請求項36所述之醫藥組成物，其中，該單股寡核苷酸係於緩衝溶液中。
- 如請求項39所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、穀醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其任意組合。
- 一種分離的細胞，其包含如請求項1至35中任一項所述之單股寡核苷酸或如請求項36至40中任一項所述之醫藥組成物。
- 一種抑制反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi抑制活性之方法，該方法包括：使該dsRNA劑與如請求項1至35中任一項所述之單股寡核苷酸或如請求項36至40中任一項所述之醫藥組成物接觸，以抑制該反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾之dsRNA劑的RNAi抑制活性。
- 如請求項42所述之方法，其中，該dsRNA劑係在細胞中。
- 如請求項43所述之方法，其中，該細胞係在人類個體內。
- 一種治療有需要的個體之方法，該方法包括向該個體施用治療有效量的如請求項1至35中任一項所述之單股寡核苷酸或如請求項36至40中任一項所述之醫藥組成物，從而治療該個體。
- 如請求項45所述之方法，其中，該有需要的個體預先施用雙股RNAi劑，該雙股RNAi劑抑制標靶基因的表現並且在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾。
- 如請求項46所述之方法，其中，該標靶基因係血管收縮素原(AGT)。
- 如請求項47所述之方法，其中，該有需要的個體患有低血壓。
- 如請求項47所述之方法，其中，該有需要的個體患有高血鉀症。
- 如請求項47所述之方法，其中，該有需要的個體患有腎功能障礙。
- 如請求項45至50中任一項所述之方法，復包括向該個體施用選自由下述所組成群組的附加療法或治療劑：增加膳食液體/鹽類、氟氫可的松/米多君治療、靜脈輸液、升壓藥物、減量或中斷伴隨的抗高血壓藥物、低鉀飲食、利尿劑/袢利尿劑藥物、口服鉀結合劑、鈣、葡萄糖、胰島素及血液透析，或其組合。
- 如請求項45至51中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物皮下施用於該個體。
- 如請求項45至51中任一項所述之方法，其中，將該單股寡核苷酸或醫藥組成物靜脈內施用於該個體。
- 如請求項45至53中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於該個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：1、2：1或3：1。
- 一種在個體中改善dsRNA劑之副作用之方法，該dsRNA劑抑制標靶基因的表現並包含反義股中的熱不穩定核苷酸修飾，其中，該方法包括：向該個體施用有效量的如請求項1至35中任一項所述之單股寡核苷酸或如請求項36至40中任一項所述之醫藥組成物，從而改善該dsRNA劑在該個體中的副作用。
- 如請求項55所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於該個體之dsRNA劑的劑量的比例為約1：1。
- 如請求項55或56所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於該個體之dsRNA劑的劑量的比例為約2：1。
- 如請求項55至57中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量與先前施用於該個體之dsRNA劑的劑量的比例為約3：1。
- 如請求項55至58中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成三個劑量並以24小時的間隔施用於該個體。
- 如請求項55至58中任一項之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成兩個劑量並以24小時的間隔施用於該個體。
- 如請求項55至58中任一項所述之法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成三個劑量並以12小時的間隔施用於該個體。
- 如請求項55至58中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成兩個劑量並以12小時的間隔施用於該個體。
- 如請求項55至58中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成三個劑量並以8小時的間隔施用於該個體。
- 如請求項55至58中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物的劑量被分成兩個劑量並以8小時的間隔施用於該個體。
- 如請求項55至64中任一項所述之方法，其中，該單股寡核苷酸或醫藥組成物皮下施用於該個體。
- 如請求項55至64中任一項所述之方法，其中，將該單股寡核苷酸或醫藥組成物靜脈內施用於該個體。
- 一種套件，其包含如請求項1至35中任一項所述之單股寡核苷酸或如請求項36至40中任一項所述之醫藥組成物，及使用說明書，以及視需要地，用於施用該單股寡核苷酸或醫藥組成物的工具。
- 如請求項67所述之套件，復包含抑制標靶基因表現並在反義股中包含熱不穩定核苷酸修飾的雙股RNAi劑，以及視需要地，用於施用該雙股RNA劑的工具。
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