ES2905889T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen HAO1 (hidroxiácido-oxidasa 1 (glicolato-oxidasa)) - Google Patents

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Abstract

Un agente de iARN bicatenario capaz de inhibir la expresión de HAO1 en una célula, en donde dicho agente de iARN bicatenario comprende una hebra sentido y una hebra antisentido que forman una región bicatenaria, donde dicha hebra sentido y dicha hebra antisentido comprenden una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos respecto de la secuencia antisentido de la SEQ ID NO:706; donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra antisentido son nucleótidos modificados, y donde dicha hebra sentido está conjugada con un ligando unido al extremo 3'.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen HAO1 (hidroxiácido-oxidasa 1 (glicolato-oxidasa)) Antecedentes
La hiperoxaluria primaria de tipo 1 (PH1, por sus siglas en inglés) es un trastorno recesivo autosómico del metabolismo del glioxilato. La detoxificación hepática del glioxilato es deficiente debido a la mutación del gen AGXT, que codifica la enzima peroxisómica hepática (alanina-glioxilato)-aminotransferasa (AGT, por sus siglas en inglés). La AGT1 es la enzima final en la degradación metabólica de la hidroxiprolina. La pérdida de la función AGT para convertir el metabolito intermedio glioxilato en glicina provoca la acumulación y reducción del glioxilato en glicolato, el cual es oxidado a oxalato por la enzima glicolato-oxidasa (GO), también conocida como hidroxiácido-oxidasa (HAO1).
La regulación del glioxilato, el precursor clave del oxalato, tiene lugar en múltiples sitios celulares incluida la mitocondria, el peroxisoma y el citosol. En los pacientes con PH1, los riñones no son capaces de excretar totalmente el exceso de oxalato, lo que conlleva la formación de depósitos de cristales de oxalato de calcio en los riñones y las vías urinarias. El daño renal está causado por una combinación de la toxicidad tubular del oxalato, la nefrocalcinosis y la obstrucción renal por parte de las piedras. Más de un 30% de los pacientes desarrollan una insuficiencia renal terminal (ESRD, por sus siglas en inglés).
El gen HAO1 codifica la enzima hidroxiácido-oxidasa 1, también conocida como glicolato-oxidasa (“GO"). La proteína HAO1 se expresa principalmente en el hígado y es una 2-hidroxiácido-oxidasa activa principalmente sobre el glicolato. En un modelo en ratones de PH1, donde se elimina el gen AGT1, el nivel de oxalato urinario se reduce cuando se elimina el gen HAO1.
La PH1, AGXT y HAO1 se describen en las siguientes referencias: Angel L. Pey, Armando Albert, y Eduardo Salido, "Protein Homeostasis Defects of Alanine-Glyoxylate Aminotransferase: New Therapeutic Strategies in Primary Hyperoxaluria Type I," BioMed Research International, volumen 2013, ID del artículo 687658, 15 páginas, 2013. doi:10.1155/2013/687658; Cochat y Rumsby (2013) NEJM 369:7; Salido et al. (2006) PNAS 103:18249; Baker et al. (2004) American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology Publicado el 1 de octubre de 2004 Volumen 287 no.4, H1771-H1779DOI: 10.1152/ajpheart.00234.2004. Se describen las estrategias anteriores para el tratamiento de PH1 en Salido et al., Biochim Biophys Acta (2012); 1822(9): 1453-64.
Compendio
La presente invención está definida por las reivinidicaciones. Por lo general se describen en la presente composiciones que comprenden agentes de iARN, por ejemplo, agentes de ARNi bicatenario, dirigidos contra HAO1. También se describen en la presente métodos para utilizar las composiciones de la divulgación con el fin de inhibir la expresión de la HAO1 y tratar trastornos asociados con la HAO1, por ejemplo, la PH1.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de HAO1 de Homo sapiens (SEQ ID NO:1).
En la figura 2 se muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de HAO1 de Mus musculus (SEQ ID NO:2).
La figura 3A es un gráfico con los resultados de un cribado in vitro de conjugados GalNAc-ARNip contra GO (HAO) en hepatocitos primarios de mono cinomolgo.
La figura 3B es un gráfico con la curva de respuesta a la dosis del conjugado GalNAc-ARNip contra GO (HAO) en hepatocitos primarios de mono cinomolgo.
La figura 4A es un gráfico con los resultados de una evaluación in vivo de conjugados de GalNAc-ARNip contra GO (HAO) en ratones C57B6 después de una única dosis.
La figura 4B es un gráfico con los resultados de una evaluación in vivo de conjugados de GalNAc-ARNip contra GO (HAO) en ratones C57B6 después de dosis repetidas.
La figura 5A es un gráfico en el que se muestra el nivel de oxalato urinario en ratones con AGXT inactivado (KO) después del tratamiento con conjugados de GalNAc-ARNip contra GO (HAO).
La figura 5B es un gráfico en el que se muestra el nivel de glicolato urinario en ratones KO respecto a AGXT después del tratamiento con conjugados de GalNAc-ARNip contra GO (HAO).
La figura 6A es un gráfico en el que se muestra el nivel de ARNm de AGXT en un modelo en ratas de PH1 72 h después de una única dosis de un ARNip contra AGXT.
La figura 6B es un gráfico en el que se muestra el nivel de oxalato urinario en ratas de PH1 72 h después del tratamiento con un conjugado de GalNAc-ARNip contra GO (HAO).
La figura 6C es un gráfico en el que se muestra el nivel de oxalato urinario en un modelo en ratas de PH1 durante 49 días con una dosificación semanal en los días 14 y 21 tanto de AF-011 -63102 como de AD-62994 y recogidas de orina de 24 h tal como se muestra.
La figura 6D es un gráfico en el que se muestra la duración de la inactivación de HAO1 en ratas. Se muestra el nivel de ARNm una semana o cuatro semanas después de las 4 últimas dosis (que corresponden a los días 28 y 49 en la figura 6C) y expresada respecto al nivel observado en ratas tratadas con PBS.
En la figura 7 se muestra la secuencia de nucleótidos complementaria inversa del ARNm de HAO1 de Homo sapiens (SEQ ID NO:3).
En la figura 8 se muestra la secuencia de nucleótidos complementaria inversa del ARNm de HAO1 de Mus musculus (SEQ ID NO:4).
En la figura 9 se muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de HAO1 de Macaca fascicularis (SEQ ID NO:5). En la figura 10 se muestra la secuencia de nucleótidos del ARNm de HAO1 de Rattus norvegicus (SEQ ID NO:6). En la figura 11 se muestra la secuencia de nucleótidos complementaria inversa del ARNm de HAO1 de Macaca fascicularis (SEQ ID NO:7).
En la figura 12 se muestra la secuencia de nucleótidos complementaria inversa del ARNm de HAO1 de Rattus norvegicus (SEQ ID NO:8).
En la figura 13 se muestra el cribado in vivo de los conjugados de GalNAc contra GO.
La figura 14 es un gráfico en el que se muestra una evaluación in vivo de los conjugados GO-GalNAc en ratones. La figura 15 es un gráfico en el que se muestra una evaluación dosis-respuesta de los conjugados GO-GalNAc en ratones.
La figura 16 es un gráfico en el que se muestra una evaluación dosis-respuesta de los conjugados GO-GalNAc en ratones.
La figura 17 es un gráfico en el que se muestra una evaluación de respuesta a la dosis en ratones.
La figura 18 está compuesta por dos gráficos en los que se muestra la relación entre la disminución del ARNm y el nivel de glicolato sérico en los ratones.
La figura 19 está compuesta por dos gráficos en los que se muestra la relación entre la disminución del ARNm y el nivel de glicolato sérico en las ratas.
La figura 20 es un gráfico en el que se muestra la inhibición dependiente de la dosis del ARNm de HAO1 por parte de ALN-65585 en hepatocitos primarios cino.
La figura 21 está compuesta por dos gráficos en los que se muestra el nivel de ARNm de HAO1 y de glicolato sérico tras un tratamiento con una única dosis de ALN-GO1 en los ratones.
La figura 22 es un gráfico en el que se muestra la duración del silenciamiento del ARNm de HAO1 tras un tratamiento con una única dosis de ALN-GO1 en los ratones.
La figura 23 es un gráfico en el que se muestra el nivel de ARNm de HAO1 y de glicolato sérico tras un tratamiento con una única dosis de ALN-GO1 en las ratas.
La figura 24 está compuesta por dos gráficos en los que se muestra el nivel de oxalato y glicolato urinarios en un modelo en ratones de la hiperoxaluria primaria de tipo I tras una única dosis de ALN-GO1.
La figura 25A es un gráfico en el que se muestra el nivel de ARNm de HAO1 en un modelo en ratas de la hiperoxaluria primaria de tipo I tras una única dosis de ALN-GO1.
La figura 25B es un gráfico en el que se muestra el nivel de oxalato urinario en un modelo en ratas de la hiperoxaluria primaria de tipo I tras una única dosis de ALN-GO1.
La figura 26 está compuesta por dos gráficos en los que se muestra el nivel de ARNm de HAO1 y de oxalato urinario en un modelo en ratas de la hiperoxaluria primaria de tipo I tras una dosificación repetida de ALN-GO1.
La figura 27 está compuesta por dos gráficos en los que se muestra el nivel de ARNm de HAO1 y de glicolato sérico tras una dosificación repetida en primates no humanos.
Descripción detallada
La presente invención está definida por las reivindicaciones. En consecuencia, en una realización, la presente invención proporciona un agente de iARN bicatenario capaz de inhibir la expresión de HAO1 en una célula, donde dicho agente de iARN bicatenario comprende una hebra sentido y una hebra antisentido que forman una región bicatenaria, donde dicha hebra sentido y dicha hebra antisentido comprenden una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia antisentido de la SEQ ID NO: 706; donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra antisentido son nucleótidos modificados y donde dicha hebra sentido está conjugada con un ligando incorporado en el extremo 3’.
También se proporcionan en la presente composiciones que comprenden agentes de iARN, por ejemplo, agentes bicatenarios de iARN, dirigidos contra HAO1. La presente divulgación también proporciona métodos para utilizar las composiciones de la divulgación con el fin de inhibir la expresión de la HAO1 y tratar trastornos asociados con la HAO1.
I. Definiciones
Con el fin de poder entender la presente divulgación más fácilmente, se definen en primer lugar ciertos términos. Además, cabe señalar que siempre que se cite un valor o intervalo de valores de un parámetro, se pretende que valores e intervalos intermedios respecto a los valores citados también sean parte de la presente divulgación.
Los artículos "un" y "uno" se utilizan en la presente para referirse a uno o a más de uno (es decir, por lo menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" se refiere a un elemento o a más de un elemento, por ejemplo, una pluralidad de elementos.
La expresión “que incluye” se usa en la presente con el significado de la expresión “que incluye, pero sin carácter limitante” y se utiliza indistintamente con ella.
El término “o” se utiliza en la presente con el significado del término “y/o”, y se utiliza indistintamente con él, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El término “HAO1”, tal como se utiliza en la presente, se refiere el gen que codifica la enzima hidroxiácido-oxidasa 1. Otros nombres del gen incluyen GO, GOX, GOX1 y HAOX1. La proteína también se conoce como glicolato-oxidasa y (S)-2-hidroxiácido-oxidasa. El número de acceso GenBank del ARNm de HAO1 humano es NM_017545.2; el del ARNm de HAO1 de mono cinomolgo (Macaca fascicularis) es XM_005568381.1; el del ARNm de HAO1 de ratón (Mus musculus) es NM_010403.2; el del ARNm de HAO1 de rata (Rattus norvegicus) es XM_006235096.1.
El término “HAO1 ”, tal como se utiliza en la presente, también se refiere a variaciones de la secuencia de ADN del gen HAO1 que se producen de manera natural, tal como un polimorfismo mononucleotídico (SNP, por sus siglas en inglés) en el gen HAO1. Se pueden consultar SNP a modo de ejemplo en la base de datos de Variaciones Genéticas Cortas dbSNP de NCBI a la que se puede acceder en www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP.
La expresión “secuencia diana”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen HAO1, que incluye ARNm que es un producto del procesamiento del ARN de un producto de transcripción primario.
La expresión “hebra que comprende una secuencia”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia utilizando la nomenclatura estándar de nucleótidos.
Por lo general, “G”, “C”, “A” y “U” representan cada uno un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como base, respectivamente. “T” y “dT” se utilizan indistintamente en la presente y se refieren a un desoxirribonucleótido en el que la nucleobase es timina, por ejemplo, desoxirribotimina, 2’-desoxitimidina o timidina. Sin embargo, se sobreentenderá que el término “ribonucleótido” o “nucleótido” o “desoxirribonucleótido” también se puede referir a un nucleótido modificado, como se detalla adicionalmente más adelante, o un resto de sustitución sustituto. El experto es consciente de que la guanina, citosina, adenina y uracilo pueden sustituirse con otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que porta tal resto de sustitución. Por ejemplo, sin carácter limitante, un nucleótido que comprende inosina como su base puede emparejar bases con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Así pues, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina pueden ser sustituidos en las secuencias de nucleótidos de la divulgación por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. También se divulgan en la presente secuencias que comprenden tales restos de sustitución.
Las expresiones "ARNi", "agente de iARN", "agente de ARNi", "agente de interferencia por ARN" que se utilizan indistintamente en la presente, se refieren a un agente que contiene ARN según esa expresión se defina en la presente y que media en la escisión dirigida de un transcrito de ARN mediante una ruta con un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés). El ARNi dirige la degradación de ARNm específica de la secuencia mediante un proceso conocido como interferencia por ARN (iARN). El ARNi modula, por ejemplo, inhibe, la expresión de HAO1 en una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto mamífero.
Un agente de iARN de la divulgación incluye un ARN monocatenario que interacciona con una secuencia de ARN diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm diana de HAO1, para dirigir la escisión del ARN diana. Sin desear ceñirse a teoría alguna, se cree que el ARN bicatenario largo introducido en las células es degradado en ARNip por una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa-NI, procesa el ARNbc en ARN interferentes pequeños de 19-23 pares de bases con protuberancias características en 3’ de dos bases (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). A continuación, los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) en el que una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNip y permiten que la hebra antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Tras la unión al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas en el RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere a un ARN monocatenario (ARNip) generado en una célula y que promueve la formación de un complejo RISC para efectuar el silenciamiento del gen diana, es decir, un gen HAO1. Por consiguiente, el término "ARNip" también se utiliza en la presente para referirse a una iARN tal como se describió anteriormente.
El agente de iARN puede ser un ARNip monocatenario que se introduce en una célula u organismo para inhibir un ARNm diana. Los agentes de iARN monocatenarios se unen a la endonucleasa del RISC Argonaute 2, que escinde a continuación el ARNm diana. Los ARNip monocatenarios tienen por lo general 15-30 nucleótidos y están modificados químicamente. El diseño y estudio de los ARNip monocatenarios se ha descrito en la patente de eE. UU. N.° 8.101.348 y en Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos antisentido descritas en la presente se pueden utilizar como ARNip monocatenario tal como se describe en la presente o como modificado químicamente según los métodos descritos en Lima et al., (2012) Cell 150;:883-894.
La presente divulgación proporciona moléculas oligonucleotídicas antisentido monocatenarias dirigidas contra HAO1. Una “molécula oligonucleotídica antisentido monocatenaria” es complementaria respecto a una secuencia en el ARNm diana (es decir, HAO1). Las moléculas oligonucleotídicas antisentido monocatenarias pueden inhibir la traducción de un modo estequiométrico apareando sus bases con el ARNm y obstruyendo físicamente a la maquinaria de traducción, remítase a Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Como alternativa, las moléculas oligonucleotídicas antisentido monocatenarias inhiben un ARNm diana hibridándose con la diana y escindiendo la diana mediante un evento de escisión de tipo RNasaH. La molécula oligonucleotídica antisentido monocatenaria puede tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos y tener una secuencia que es complementaria a una secuencia diana. Por ejemplo, la molécula oligonucleotídica antisentido monocatenaria puede comprender una secuencia que tenga al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias de nucleótidos antisentido descritas en la presente, por ejemplo, las secuencias proporcionadas en cualquiera de las tablas 1 o 2, o unirse a cualquiera de los sitios diana descritos en la presente. Las moléculas oligonucleotídicas antisentido monocatenarias pueden comprender ADN, ARN modificados o una combinación de estos.
Un "ARNi" para su uso en las composiciones, usos y métodos de la divulgación puede ser un ARN bicatenario y en la presente se denomina un "agente de ARNi bicatenario", "molécula de ARN bicatenario (ARNbc)", "agente de ARNbc" o "ARNbc". El término "ARNbc" se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico que tienen una estructura dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias de las que se dice que tienen orientaciones “sentido” y "antisentido" con respecto a un ARN diana, es decir, un gen de HAO1. Un ARN bicatenario (ARNbc) puede desencadenar la degradación de un ARN diana, por ejemplo, un ARNm, mediante un mecanismo de silenciamiento de genes postranscripcional denominado en la presente interferencia por ARN o iARN.
En el documento WO se describen estrategias para la inhibición de la expresión génica utilizando ARN de interferencia
En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra de una molécula de ARNbc son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle en la presente, cada una o ambas hebras también puede incluir uno o más nucleótidos que no son ribonucleótidos, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva, un "agente de iARN" puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas; un agente de iARN puede incluir modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos. Tales modificaciones pueden incluir todos los tipos de modificaciones divulgados en la presente o conocidos en la técnica. Cualesquiera de tales modificaciones, tal como se utilizan en una molécula de tipo ARNip, están incluidas en el "agente de ARNi" para los objetivos de la presente divulgación.
Las dos hebras que forman la estructura dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN mayor, o pueden ser moléculas de ARN independientes. Cuando las dos hebras forman parte de una molécula más grande, y por lo tanto están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3’ de una hebra y el extremo 5’ de la otra hebra respectiva que forma la estructura dúplex, la cadena de ARN conectora se conoce como “bucle en horquilla”. Cuando las dos hebras están conectadas de manera covalente pero por un medio distinto de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3’ de una hebra y el extremo 5’ de la otra hebra respectiva que forma la estructura dúplex, la estructura conectora se conoce como un “conector”. Las hebras de ARN pueden tener el mismo número o un número diferente de nucleótidos. El máximo número de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNbc menos cualquier protuberancia que esté presente en el dúplex. Además de la estructura dúplex, un agente de iARN puede comprender una o más protuberancias de nucleótidos.
Un agente de iARN de la divulgación puede ser un ARNbc de 24-30 nucleótidos que interacciona con una secuencia de ARN diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm diana de HAO1, para dirigir la escisión del ARN diana. Sin desear ceñirse a teoría alguna, el ARN bicatenario largo introducido en células es degradado en ARNip por una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa-III, procesa el ARNbc en ARN interferentes pequeños de 19-23 pares de bases con protuberancias características en 3’ de dos bases (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). A continuación, los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) en el que una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNip y permiten que la hebra antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Tras la unión al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas en el RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).
La expresión una “protuberancia de nucleótidos”, tal como se utiliza en la presente, se refiere al nucleótido o los nucleótidos no emparejados que sobresalen de la estructura de dúplex de un agente de iARN cuando un extremo 3’ de una hebra del agente de iARN se extiende más allá del extremo 5’ de la otra hebra, o viceversa. “Romo” o “extremo romo” significa que no hay nucleótidos no emparejados en el extremo del agente de iARN bicatenario, es decir, ninguna protuberancia de nucleótidos. Un agente de iARN “de extremos romos” es un ARNbc que es bicatenario en toda su longitud, es decir, ninguna protuberancia de nucleótidos en ningún extremo de la molécula. Los agentes de iARN de la divulgación incluyen agentes de iARN con protuberancias de nucleótidos en un extremo (es decir, agentes con una protuberancia y un extremo romo) o con protuberancias de nucleótidos en ambos extremos.
El término “hebra antisentido” se refiere a la hebra de un agente de iARN bicatenario que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana (por ejemplo, un ARNm de HAO1 humano). La expresión “región complementaria a parte de un ARNm que codifica HAO1”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una región en la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria a parte de una secuencia de ARNm de HAO1. Si la región de complementariedad no es totalmente complementaria a la secuencia diana, los emparejamientos erróneos son más tolerados en las regiones terminales y, si están presentes, están generalmente en una región o regiones terminales, por ejemplo, en los 6, 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5’ y/o 3’.
La expresión “hebra sentido”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra antisentido.
La expresión "región de escisión", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una región que está ubicada inmediatamente adyacente al sitio de escisión. El sitio de escisión es el sitio sobre la diana en el que se produce la escisión. La región de escisión puede comprender tres bases en cualquier extremo del sitio de escisión e inmediatamente adyacente a este. La región de escisión puede comprender dos bases en cualquier extremo del sitio de escisión e inmediatamente adyacente a este. El sitio de escisión se puede producir específicamente en el sitio unido por los nucleótidos 10 y 11 de la hebra antisentido, y la región de escisión puede comprender los nucleótidos 11, 12 y 13.
El término “complementario”, tal como se utiliza en la presente y a menos que se indique lo contrario, cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos con relación a una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende a la primera secuencia de nucleótidos de hibridizarse y formar una estructura en dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende a la segunda secuencia de nucleótidos, como comprenderá el experto en la técnica. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, pudiendo incluir las condiciones rigurosas: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM de pH 6.4, EDTA 1 mM, 50 oC o 70 oC durante 12-16 h y a continuación un lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, tales como condiciones relevantes desde un punto de vista fisiológico como las que pueden encontrarse dentro de un organismo. Por ejemplo, una secuencia complementaria es suficiente para permitir que se lleve a cabo la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, iARN. El experto será capaz de determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación definitiva de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias pueden ser “totalmente complementarias” entre sí cuando hay emparejamiento de bases de los nucleótidos de la primera secuencia de nucleótidos con los nucleótidos de la segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de toda la longitud de la primera y segunda secuencias de nucleótidos. Sin embargo, si en la presente se dice que una primera secuencia es “sustancialmente complementaria” con respecto a una segunda secuencia, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias, o pueden formar uno o más, pero por lo general no más de 4, 3 o 2 emparejamientos de bases erróneos tras la hibridación, a la vez que retienen la capacidad para hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación definitiva. Sin embargo, si se diseñan dos oligonucleótidos para formar, tras la hibridación, una o más protuberancias monocatenarias, tales protuberancias no deben considerarse emparejamientos erróneos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido con una longitud de 21 nucleótidos y otro oligonucleótido con una longitud de 23 nucleótidos, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es totalmente complementaria al oligonucleótido más corto, todavía se puede denominar “totalmente complementario” para los fines descritos en la presente.
Tal como se utiliza en la presente, las secuencias “complementarias” también pueden incluir, o estar formadas completamente a partir de, pares de bases que no son de Watson-Crick y/o pares de bases formados a partir de nucleótidos no naturales y modificados, en tanto que se cumplan todos los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse. Tales pares de bases que no son de Watson-Crick incluyen, sin carácter limitante, emparejamiento de bases de Wobble o Hoogstein G:U.
En la presente, las expresiones “complementaria”, “totalmente complementaria” y “sustancialmente complementaria” se pueden utilizar con respecto al emparejamiento de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNbc, o entre la hebra antisentido de un ARNbc y una secuencia diana, como se entenderá a partir del contexto de su uso.
Tal como se utiliza en la presente, un polinucleótido que es “sustancialmente complementario a al menos parte de” un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica HAO1) que incluye una 5’ UTR, un marco de lectura abierto (ORF) o una 3’ UTR. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de HAO1 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica HAO1.
El término “inhibir”, tal como se utiliza en el presente documento, se usa indistintamente con “reducir”, “silenciar”, “disminuir de manera regulada”, “suprimir” y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
La frase “inhibir la expresión de HAO1”, tal como se utiliza en la presente, incluye la inhibición de la expresión de cualquier gen HAO1 (tal como, por ejemplo, un gen HAO1 de ratón, un gen HAO1 de rata, un gen HAO1 de mono o un gen HAO1 humano) así como también variantes (por ejemplo, variantes que se producen de manera natural) o mutantes de un gen HAO1. Por consiguiente, el gen HAO1 puede ser un gen HAO1 natural, un gen HAO1 mutante o un gen HAO1 transgénico en el contexto de una célula, grupo de células u organismo modificados genéticamente.
La expresión “inhibir la expresión de un gen HAO1 ” incluye cualquier nivel de inhibición de un gen HAO1, por ejemplo, la supresión al menos parcial de la expresión de un gen HAO1, tal como una inhibición de al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98% o al menos aproximadamente un 99%.
La expresión de un gen HAO1 se puede evaluar en función del nivel de cualquier variable asociada con la expresión del gen HAO1, por ejemplo, el nivel de ARNm de HAO1, el nivel de proteína HAO1 en, por ejemplo, los tejidos y/o el nivel urinario de oxalato. La inhibición se puede evaluar por una disminución en un nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utilice en la materia, por ejemplo, un nivel inicial predosis, o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula o muestra similar que no esté tratado o tratado con un control (tal como, por ejemplo, control solo con tampón o control con un agente inactivo).
La expresión “poner en contacto una célula con un agente de iARN bicatenario”, tal como se utiliza en la presente, incluye poner en contacto una célula por cualquier medio posible. Poner en contacto una célula con un agente de iARN bicatenario incluye poner en contacto una célula in vitro con el agente de iARN o poner en contacto una célula in vivo con el agente de iARN. La puesta en contacto se puede llevar a cabo directa o indirectamente. Así, por ejemplo, el agente de iARN se puede poner en contacto físico con la célula llevando a cabo de manera individual el método, o como alternativa, el agente de iARN se puede poner en una situación que permita o haga que posteriormente entre en contacto con la célula.
La puesta en contacto de una célula in vitro se puede llevar a cabo, por ejemplo, incubando la célula con el agente de iARN. La puesta en contacto de una célula in vivo se puede llevar a cabo, por ejemplo, inyectando el agente de iARN en el tejido en el que se ubica la célula o cerca de este, o inyectando el agente de iARN en otro área, el torrente sanguíneo o el espacio subcutáneo, de forma que el agente alcance posteriormente al tejido en el que se ubica la célula con la que se va a poner en contacto. Por ejemplo, el agente de iARN puede contener y/o acoplarse a un ligando, por ejemplo, un ligando de GalNAc3, que dirige el agente de iARN a un sitio de interés, por ejemplo, el hígado. También son posibles combinaciones de métodos in vitro e in vivo de puesta en contacto. A propósito de los métodos de la divulgación, una célula también podría ponerse en contacto in vitro con un agente de iARN y posteriormente trasplantarse a un sujeto.
El término “sujeto”, tal como se utiliza en la presente, incluye un animal humano o no humano, preferentemente un vertebrado, y más preferentemente un mamífero. Un sujeto puede incluir un organismo transgénico. De la manera más preferible, el sujeto es un ser humano, tal como un ser humano que padece o predispuesto a desarrollar un trastorno asociado a HAO1.
El término “paciente” o “sujeto”, tal como se utiliza en la presente, se pretende que incluya tanto a un animal humano como no humano, preferentemente un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un mono. De la manera más preferible, el sujeto o paciente es un ser humano.
La expresión “trastorno asociado a HAO1”, tal como se utiliza en la presente, se pretende que incluya cualquier trastorno que se puede tratar o prevenir, o del cual se pueden aliviar los síntomas, inhibiendo la expresión de HAO1. Los ejemplos incluyen, sin carácter limitante, la hiperoxaluria primaria 1 (PH1).
La expresión “cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico”, tal como se utiliza en la presente, se pretende que incluya la cantidad de un agente de iARN que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad asociada con HAO1, sea suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, disminuyendo, mejorando o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de la enfermedad). La “cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico” puede variar dependiendo del agente de iARN, de cómo se administra el agente, de la enfermedad y su gravedad y los antecedentes, edad, peso, antecedentes familiares, constitución genética, fase de los procesos patológicos mediados por la expresión de HAO1, los tipos de tratamientos anteriores o simultáneos, si los hay, y otras características individuales del paciente que se va a tratar.
La “cantidad eficaz desde un punto de vista profiláctico”, tal como se utiliza en la presente, se pretende que incluya la cantidad de un agente de iARN que, cuando se administra a un sujeto que todavía no experimenta o muestra los síntomas de una enfermedad asociada con HAO1, pero que puede tener predisposición a la enfermedad, es suficiente para prevenir o mejorar la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. La mejora de la enfermedad incluye la ralentización de la evolución de la enfermedad o la reducción de la gravedad de la enfermedad que se desarrollará después. La “cantidad eficaz desde un punto de vista profiláctico” puede variar dependiendo del agente de iARN, de cómo se administra el agente, del grado de riesgo de la enfermedad y los antecedentes, edad, peso, antecedentes familiares, constitución genética, los tipos de tratamientos anteriores o simultáneos, si los hay, y otras características individuales del paciente que se va a tratar.
Una “cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico” o “cantidad eficaz desde un punto de vista profiláctico” también incluye una cantidad de un agente de iARN que produce algún efecto local o sistémico deseado con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. Los agentes de iARN empleados en los métodos de la presente divulgación se pueden administrar en una cantidad suficiente para producir una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a tal tratamiento.
El término “muestra” tal como se utiliza en la presente, incluye una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como también fluidos, células o tejidos presentes en un sujeto. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen la sangre, suero y fluidos serosos, plasma, líquido cefalorraquídeo, fluidos oculares, linfa, orina, saliva y similares. Las muestras de tejido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras se pueden obtener de órganos, partes de órganos, o fluidos o células particulares dentro de aquellos órganos. Las muestras se pueden obtener del hígado (por ejemplo, hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado tales como, por ejemplo, los hepatocitos). Una “muestra obtenida de un sujeto” se puede referir a la sangre o plasma extraídos del sujeto. En casos adicionales, una “muestra obtenida de un sujeto” se refiere a tejido hepático (o subcomponentes de este) procedente del sujeto.
II. Agentes de ARNi de ARNbc
En la presente se describen agentes bicatenarios de iARN que inhiben la expresión de un gen HAO1 en una célula, tal como una célula en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano que tiene un trastorno asociado con HAO1 y usos de tales agentes bicatenarios de iARN.
Por consiguiente, la invención proporciona agentes bicatenarios de iARN con modificaciones químicas capaces de inhibir la expresión de un gen diana (es decir, un gen HAO1) in vivo.
Tal como se describe más detalladamente a continuación, en ciertos aspectos de la invención, sustancialmente todos los nucleótidos de un RNAi de la invención están modificados. En otras realizaciones de la invención, todos los nucleótidos de un ARNi de la invención están modificados. Los ARNi de la invención en los cuales “sustancialmente todos los nucleótidos están modificados” están bastante pero no completamente modificados y pueden incluir no más de 5, 4, 3, 2, o 1 nucleótidos no modificados.
El agente de iARN comprende una hebra sentido y una hebra antisentido. Cada hebra del agente de iARN puede tener una longitud de 12-30 nucleótidos. Por ejemplo, cada hebra puede tener una longitud de entre 14-30 nucleótidos, una longitud de entre 17-30 nucleótidos, una longitud de entre 19-30 nucleótidos, una longitud de entre 25-30 nucleótidos, una longitud de entre 27-30 nucleótidos, una longitud de entre 17-23 nucleótidos, una longitud de entre 17-21 nucleótidos, una longitud de entre 17-19 nucleótidos, una longitud de entre 19-25 nucleótidos, una longitud de entre 19-23 nucleótidos, una longitud de entre 19-21 nucleótidos, una longitud de entre 21-25 nucleótidos o una longitud de entre 21-23 nucleótidos.
Cada hebra puede tener una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos. Cada hebra del agente de iARN puede tener la misma longitud o puede tener una longitud diferente.
La hebra sentido y la hebra antisentido normalmente forman un ARN dúplex bicatenario (“ARNbc”), también denominado en la presente un “agente de iARN”. La región de dúplex de un agente de iARN puede tener una longitud de 12-30 pares de nucleótidos. Por ejemplo, la región dúplex puede tener una longitud de 14-30 pares de nucleótidos, una longitud de 17-30 pares de nucleótidos, una longitud de 27-30 pares de nucleótidos, una longitud de 17-23 pares de nucleótidos, una longitud de 17-21 pares de nucleótidos, una longitud de 17-19 pares de nucleótidos, una longitud de 19-25 pares de nucleótidos, una longitud de 19-23 pares de nucleótidos, una longitud de 19-21 pares de nucleótidos, una longitud de 21-25 pares de nucleótidos, o una longitud de 21-23 pares de nucleótidos. En otro ejemplo, la región dúplex se selecciona con una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 27 pares de nucleótidos.
El agente de iARN puede contener una o más regiones protuberantes y/o grupos de tipo caperuza en el extremo 3’, el extremo 5’ o en ambos extremos de una o ambas hebras. La protuberancia puede tener una longitud de 1-6 nucleótidos, por ejemplo, una longitud de 2-6 nucleótidos, una longitud de 1-5 nucleótidos, una longitud de 2-5 nucleótidos, una longitud de 1-4 nucleótidos, una longitud de 2-4 nucleótidos, una longitud de 1-3 nucleótidos, una longitud de 2-3 nucleótidos, o una longitud de 1-2 nucleótidos. Las protuberancias pueden ser el resultado de que una cadena sea más larga que la otra o el resultado de dos cadenas de la misma longitud sometidas a un corte desigual. La protuberancia puede formar un emparejamiento erróneo con el ARNm diana o puede ser complementario a las secuencias de genes elegidas como diana o puede ser otra secuencia. La primera y segunda hebras también pueden estar unidas, por ejemplo, mediante bases adicionales para formar una horquilla, o mediante otros conectores sin bases.
Los nucleótidos en la región protuberante del agente de iARN pueden ser cada uno de forma independiente un nucleótido modificado o no modificado que incluyen, pero sin carácter limitante, un azúcar modificado en 2’, tal como, 2-F, 2’-0-metilo, timidina (T), 2'-0-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-0-metoxietiladenosina (Aeo), 2'-0-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) y cualquier combinación de estos. Por ejemplo, el TT puede ser una secuencia protuberante para cualquier extremo en cualquier hebra. La protuberancia puede formar un emparejamiento erróneo con el ARNm diana o puede ser complementario a las secuencias de genes elegidas como diana o puede ser otra secuencia.
Las protuberancias en 5’ o 3’ en la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras del agente de iARN pueden estar fosforiladas. La región o las regiones protuberantes pueden contener dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre los dos nucleótidos, en las que los dos nucleótidos pueden ser iguales o diferentes. En un caso, la protuberancia está presente en el extremo 3’ de la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras. En un caso, esta protuberancia en 3’ está presente en la hebra antisentido. En un caso, esta protuberancia en 3’ está presente en la hebra sentido.
El agente de iARN puede contener únicamente una única protuberancia, que puede fortalecer la actividad de interferencia del iARN, sin afectar su estabilidad global. Por ejemplo, la protuberancia monocatenaria puede estar ubicada en el extremo 3’ de la hebra sentido o, como alternativa, en el extremo 3’ de la hebra antisentido. El iARN también puede tener un extremo romo, ubicado en el extremo 5’ de la hebra antisentido (o el extremo 3’ de la hebra sentido) o viceversa. Por lo general, la hebra antisentido del iARN tiene una protuberancia nucleotídica en el extremo 3’ y el extremo 5’ es romo. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, el extremo romo asimétrico en el extremo 5’ de la hebra antisentido y la protuberancia del extremo 3’ de la hebra antisentido favorecen la introducción de la hebra guía en el proceso RISC.
Síntesis y modificaciones
Cualquiera de los ácidos nucleicos, por ejemplo, iARN, que se divulgan en la presente se pueden sintetizar y/o modificar mediante métodos muy establecidos en la técnica tales como los que se describen en "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, EE. UU. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de los extremos, por ejemplo, modificaciones del extremo 5’ (fosforilación, conjugación, uniones invertidas) o modificaciones del extremo 3’ (conjugación, nucleótidos de ADN, uniones invertidas, etc.); modificaciones de bases, por ejemplo, reemplazo por bases estabilizantes, bases desestabilizantes o bases que se emparejan con un repertorio expandido de miembros, eliminación de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas; modificaciones del azúcar (por ejemplo, en la posición 2’ o en la posición 4’) o reemplazo del azúcar; y/o modificaciones del esqueleto, incluida la modificación o el reemplazo de las uniones fosfodiéster. Los ejemplos específicos de compuestos de ARNi útiles en los casos que se describen en la presente incluyen, sin carácter limitante, los ARN que contienen esqueletos modificados o uniones internucleosídicas no naturales. Los ARN que tienen esqueletos modificados incluyen, entre otros, aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. A los efectos de esta memoria descriptiva, y como en ocasiones se menciona en la técnica, los ARN modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto internucleosídico también se pueden considerar oligonucleósidos. En algunos casos, el ARNi modificado tendrá un átomo de fósforo en su esqueleto internucleosídico.
Los esqueletos de ARN modificados incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil- y otros alquilfosfonatos incluidos los 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluidos el 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen uniones 3'-5' normales, análogos unidos en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen una polaridad invertida, en donde los pares adyacentes de unidades nucleosídicas están unidos de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres.
Las Patentes de EE.UU. representativas que describen la preparación de las uniones anteriores que contienen fósforo incluyen, sin carácter limitante, las Patentes de EE.UU. N.os: 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6, 239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; y la patente de EE. UU. RE39464.
Los esqueletos de ARN modificados que no incluyen un átomo de fósforo en ellos son esqueletos formados por uniones internucleosídicas de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo, o una o más uniones internucleosídicas heteroatómicas o heterocíclicas de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen uniones morfolino (formadas en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
Las Patentes de EE.UU. representativas que describen la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, sin carácter limitante, las Patentes de EE.UU. N.os: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y, 5.677.439.
En otros casos, se contemplan miméticos de ARN adecuados para su uso en los ARNi, en donde tanto el azúcar como el enlace internucleosídico, es decir, el esqueleto, de las unidades nucleotídicas se reemplazan por grupos novedosos. Las unidades de bases se mantienen para su hibridación con un compuesto diana de tipo ácido nucleico apropiado. Un compuesto oligomérico de este tipo, un mimético de ARN que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se conoce como un ácido peptidonucleico (PNA, por sus siglas en inglés). En los compuestos de tipo PNA, el esqueleto de azúcar de un ARN es reemplazado por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen de manera directa o indirecta a los átomos de nitrógeno aza de la porción amida del esqueleto. Las Patentes de EE.UU. representativas que describen la preparación de compuestos de tipo PNA incluyen, sin carácter limitante, las Patentes de EE.uU. N.os: 5.539.082; 5.714.331 y 5.719.262. Otros compuestos de tipo PNA adecuados para su uso en los ARNi de la divulgación se describen, por ejemplo, en Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497-1500.
Algunos casos de la presente divulgación incluyen ARN con esqueletos de fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos de heteroátomos y, en particular, --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[conocido como un esqueleto de metileno (metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- y --N(CH3)--CH2--CH2--[donde el esqueleto fosfodiéster natural está representado como --O--P--O--CH2--] de la Patente de EE.UU. N.°: 5.489.677 mencionada anteriormente, y los esqueletos de amida de la Patente de EE.UU. N.°: 5.602.240 mencionada anteriormente. En algunos casos, los ARN tienen las estructuras de esqueletos de morfolino de la Patente de los EE.UU. N.°: 5.034.506 mencionada anteriormente.
Los ARN modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNi, por ejemplo, los ARNbc, descritos en la presente pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, el alquenilo y el alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Las modificaciones adecuadas ilustrativas incluyen O[(CH2)nO] mCH3, O(CHa).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCHa, O(CHa)nONHa y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otros casos, los ARNbc incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, cN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo que escinde ARN, un grupo indicador, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNi y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunos casos, la modificación incluye un grupo 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ilustrativa es el grupo 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe más adelante en los ejemplos de la presente, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden efectuar modificaciones similares en otras posiciones del ARN de un ARNi, en particular en la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en ARNbc unidos en 2'-5' y en la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los ARNi también pueden contener miméticos de azúcar, tales como restos ciclobutilo, en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de tales estructuras con azúcares modificados incluyen, sin cáracter limitante, las patentes de EE. UU. N.os 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
Un ARNi también puede incluir modificaciones o substituciones de la nucleobase (a menudo denominada simplemente “base” en la técnica). Tal como se utiliza en la presente, las nucleobases “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases de purina, adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina, timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como desoxitimina (dT), 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6 -metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2 -propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2 -tiouracilo, 2 -tiotimina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6 -azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8 -halo, 8 -amino, 8 -tiol, 8 -tioalquilo, 8 -hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en la posición 8 , 5-halo, en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en la posición 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8 -azaguanina y 8 -azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Algunas nucleobases adicionales incluyen las divulgadas en la patente de Ee. UU. N.° 3.687.808, las divulgadas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, las divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y las divulgadas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Ciertas de estas nucleobases son de particular utilidad para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos divulgados en la presente. Estas incluyen pirimidinas sustituidas en la posición 5, 6 -azapirimidinas y purinas sustituidas en las posiciones N-2, N-6 y 0-6, incluidas la 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sutituciones de tipo 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0.6-1.2 °C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, páginas 276-278) y son sustituciones de bases ilustrativas, aún más especialmente cuando se combinan con modificaciones de azúcares de tipo 2'-O-metoxietilo.
Las Patentes de EE.UU. representativas que describen la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente así como también de otras nucleobases modificadas incluyen, sin carácter limitante, las Patentes de EE.UU. N os: 3.687.808, 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; y 7.495.088 mencionadas anteriormente.
El ARN de un ARNi también se puede modificar para que incluya uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que contiene un resto de ribosa modificado, en el cual el resto de ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Esta estructura "bloquea” de manera eficaz la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha demostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNip incrementa la estabilidad del ARNip en el suero y reduce los efectos colaterales (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12):3185-3193).
Las Patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados incluyen, sin carácter limitante, las siguientes: Patentes de eE. UU. N.os 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; y 7.399.845.
Las modificaciones potencialmente estabilizantes de los extremos de las moléculas de ARN pueden incluir N-(acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hip-C6 -NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hip-C6 ), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hip-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hip-C6 -amino), 2-docosanoiluridina-3"-fosfato, base dT(idT) invertida y otras. La divulgación de esta modificación se puede consultar en la publicación PCT N.°: WO 2011/005861.
ARNi modificados que comprenden motivos
En ciertos aspectos de la divulgación, los agentes de ARNi bicatenarios de la divulgación incluyen agentes con modificaciones químicas como las divulgadas, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de EE.UU N.° 61/561.710, presentada el 18 de noviembre de 2011, o en PCT/US2012/065691, presentada el 16 de noviembre de 2012 y publicada como WO2013075035 A 1 ; o en PCT/US2014/025882, presentada el 13 de marzo de 2014 y publicada como WO2014160129; o en PCT/US2012/065601, presentada el 16 de noviembre de 2012 y publicada como WO2013074974.
Como se muestra en la presente y en la Solicitud Provisional N.° 61/561.710, se puede obtener un resultado superior introduciendo uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una hebra sentido y/o hebra antisentido de un agente de iARN, especialemnte en el sitio de escisión o cerca de este. En algunos casos, la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN pueden modificarse completamente. La introducción de estos motivos interrumpe el patrón de modificación, si está presente, de la hebra sentido y/o antisentido. De manera opcional, el agente de iARN puede estar conjugado con un ligando derivado de GalNAc, por ejemplo, en la hebra sentido. Los agentes de iARN resultantes presentan una actividad de silenciamiento génico superior.
Más específicamente, ha resultado sorprendente descubrir que cuando la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN bicatenario se modifican para tener uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión, o cerca de este, de al menos una hebra de un agente de iARN, la actividad de silenciamiento génico del agente de iARN se potenció de manera excelente.
En un caso, el agente de ARNi es un romómero de doble extremo con una longitud de 19 nucleótidos, donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 7, 8 y 9 desde el extremo 5’. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 desde el extremo 5’.
En otro caso, el agente de ARNi es un romómero de doble extremo con una longitud de 20 nucleótidos, donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 8, 9 y 10 desde el extremo 5’. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 desde el extremo 5’.
En otro caso más, el agente de ARNi es un romómero de doble extremo con una longitud de 21 nucleótidos, donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10 y 11 del extremo 5’. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 desde el extremo 5’.
En un caso, el agente de ARNi comprende una hebra sentido de 21 nucleótidos y una hebra antisentido de 23 nucleótidos, donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10 y 11 desde el extremo 5’; la hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 desde el extremo 5’, donde un extremo del agente de iARN es romo, mientras que el otro extremo comprende una protuberancia de 2 nucleótidos. Preferentemente, la protuberancia de 2 nucleótidos está en el extremo 3’ de la hebra antisentido. Cuando la protuberancia de 2 nucleótidos está en el extremo 3’ de la hebra antisentido, puede haber dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos protuberantes, y el tercer nucleótido es un nucleótido emparejado junto al nucleótido protuberante. En un caso, el agente de iARN tiene adicionalmente dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5’ de la hebra sentido como en el extremo 5’ de la hebra antisentido. En un caso, cada nucleótido en la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN, incluidos los nucleótidos que son parte de los motivos, son nucleótidos modificados. En un caso, cada residuo está modificado en forma independiente con un 2’-0-metilo o 3’-fluoro, por ejemplo, en un motivo alternante. De manera opcional, el agente de iARN comprende además un ligando (preferentemente GalNAcs).
En un caso, el agente de iARN comprende hebras sentido y antisentido, donde el agente de iARN comprende una primera hebra que tiene una longitud que es de al menos 25 y como máximo 29 nucleótidos y una segunda hebra que tiene una longitud que es como máximo de 30 nucleótidos con al menos un motivo de tres modificaciones de tipo 2’-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 del extremo 5’; donde el extremo 3’ de la primera hebra y el extremo 5’ de la segunda hebra forman un extremo romo y la segunda hebra es 1-4 nucleótidos más larga en su extremo 3’ que la primera hebra, donde la región dúplex que tiene una longitud de al menos 25 nucleótidos, y la segunda hebra es lo suficientemente complementaria a un ARNm diana a lo largo de al menos 19 nucleótidos de la longitud de la segunda hebra para reducir la expresión del gen diana cuando el agente de iARN se introduce en una célula de mamífero, y donde la escisión con Dicer del agente de iARN produce preferentemente un ARNip que comprende el extremo 3’ de la segunda hebra, para reducir de esta manera la expresión del gen diana en el mamífero. De manera opcional, el agente de iARN comprende además un ligando.
En un caso, la hebra sentido del agente de iARN contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos se produce en el sitio de escisión en la hebra sentido.
En un caso, la hebra antisentido del agente de iARN también puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos se produce en el sitio de escisión en la hebra antisentido o cerca de este.
Para un agente de iARN que tiene una región dúplex con una longitud de 17-23 nucleótidos, el sitio de escisión de la hebra antisentido normalmente está cerca de las posiciones 10, 11 y 12 desde el extremo 5’. Por lo tanto, los motivos de tres modificaciones idénticas pueden encontrarse en las posiciones 9, 10 y 11; posiciones 10, 11 y 12; posiciones 11, 12 y 13; posiciones 12, 13 y 14; o posiciones 13, 14 y 15 de la hebra antisentido, empezando a contar en el 1.er nucleótido desde el extremo 5’ de la hebra antisentido, o, empezando a contar en el 1.er nucleótido emparejado dentro de la región dúplex desde el extremo 5’ de la hebra antisentido. El sitio de escisión en la hebra antisentido también puede cambiar de acuerdo con la longitud de la región dúplex del iARN desde el extremo 5’.
La hebra sentido del agente de iARN puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la hebra; y la hebra antisentido puede tener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la hebra o cerca de este. Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido forman un dúplex de ARNbc, la hebra sentido y la hebra antisentido se pueden alinear de forma que un motivo de los tres nucleótidos en la hebra sentido y un motivo de los tres nucleótidos en la hebra antisentido tengan al menos un solapamiento con un nucleótido, es decir, al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra sentido forma un par de bases con al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra antisentido. Como alternativa, se pueden solapar al menos dos nucleótidos o se pueden solapar los tres nucleótidos.
En un caso, la hebra sentido del agente de iARN puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El primer motivo se puede encontrar en el sitio de escisión de la hebra o cerca de este y los otros motivos pueden ser una modificación lateral. La expresión “modificación lateral” en la presente se refiere a un motivo que se encuentra en otra porción de la hebra que está separado del motivo en el sitio de escisión de la misma hebra o cerca de este. La modificación lateral es adayacente al primer motivo o está separada por al menos uno o más nucleótidos. Cuando los motivos son inmediatamente adyacentes entre sí, entonces la química de los motivos es diferente entre sí y cuando los motivos están separados por uno o más nucleótidos, entonces la química puede ser la misma o diferente. Pueden estar presentes dos o más modificaciones laterales. Por ejemplo, cuando están presentes dos modificaciones laterales, cada modificación lateral puede producirse en un extremo con respecto al primer motivo que está en el sitio de escisión, o cerca de este, o en cualquier lado del motivo principal.
Al igual que la hebra sentido, la hebra antisentido del agente de iARN puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose al menos uno de los motivos en el sitio de escisión de la hebra o cerca de este. Esta hebra antisentido también puede contener una o más modificaciones laterales en una alineación similar a las modificaciones laterales que pueden estar presentes en la hebra sentido.
En un caso, la modificación lateral en la hebra sentido o hebra antisentido del agente de iARN normalmente no incluye el primer nucleótido o los dos primeros nucleótidos terminales en el extremo 3’, en el extremo 5’ o en ambos extremos de la hebra.
En otro caso, la modificación lateral en la hebra sentido o hebra antisentido del agente de iARN normalmente no incluye el primero o los dos primeros nucleótidos emparejados dentro de la región dúplex en el extremo 3’, en el extremo 5’ o en ambos extremos de la hebra.
Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN contienen cada una al menos una modificación lateral, las modificaciones laterales pueden encontrarse en el mismo extremo de la región dúplex, y tener un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos.
Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN contienen cada una al menos dos modificaciones laterales, la hebra sentido y la hebra antisentido pueden alinearse de forma que dos modificaciones, cada una de una hebra, se encuentren en un extremo de la región dúplex, y tengan un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones, cada una de una hebra, se encuentren en el otro extremo de la región dúplex, y tengan un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones, cada una de una hebra, se encuentren en cada lado del motivo principal, y tengan un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos en la región dúplex.
En un caso, cada nucleótido en la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de iARN, incluidos los nucleótidos que son parte de los motivos, puede estar modificado. Cada nucleótido puede estar modificado por la misma modificación o una diferente que puede incluir una o más alteraciones en uno o ambos oxígenos del fosfato que no hacen de unión y/o de uno o más oxígenos del fosfato de unión; la alteración de un componente del azúcar ribosa, por ejemplo, del 2,-hidroxilo en el azúcar ribosa; reemplazo total del resto fosfato por conectores “desfosfo”; la modificación o reemplazo de una base de origen natural; y el reemplazo o modificación del esqueleto ribosa-fosfato.
Ya que los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades, muchas de las modificaciones se producen en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, por ejemplo, una modificación de una base, o un resto fosfato, o un O que no hace de unión de un resto fosfato. En algunos casos la modificación se producirá en todas las posiciones objeto en el ácido nucleico pero en muchos casos no lo hará. A modo de ejemplo, una modificación puede que se produzca únicamente en una posición terminal 3’ o 5’, puede que se produzca únicamente en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5, o 10 nucleótidos de una hebra. Se puede producir una modificación en una región bicatenaria, una región monocatenaria o en ambas. Puede que se produzca una modificación únicamente en la región bicatenaria de un ARN o puede que se produzca únicamente en una región monocatenaria de un ARN. Por ejemplo, una modificación de fosforotioato en una posición de un O que no hace de unión puede que se produzca únicamente en uno o ambos extremos, puede que se produzca únicamente en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 de la hebra, o puede que se produzca en regiones bicatenarias y monocatenarias, especialmente en los extremos. El extremo o los extremos 5’ pueden estar fosforilados.
Puede ser posible, por ejemplo, mejorar la estabilidad, para incluir bases particulares en protuberancias, o para incluir nucleótidos modificados o nucleótidos sustitutos, en protuberancias monocatenarias, por ejemplo, en una protuberancia en 5’ o 3’, o en ambas. Por ejemplo, se puede desear incluir nucleótidos de purina en las protuberancias. En algunos casos todas o algunas de las bases en una protuberancia en 3’ o 5’ pueden estar modificadas, por ejemplo, con una modificación descrita en la presente. Las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, el uso de modificaciones en la posición 2’ del azúcar ribosa con modificaciones que son conocidas en la técnica, por ejemplo, el uso de desoxirribonucleótidos, 2’-desoxi-2’-fluoro (2’-F) o 2’-0-metilo modificado en lugar del riboazúcar de la nucleobase, y modificaciones en el grupo fosfato, por ejemplo, modificaciones de fosforotioato. No es necesario que las protuberancias sean homólogas respecto a la secuencia diana.
En un caso, cada residuo de la hebra sentido y hebra antisentido está modificado de forma independiente con LNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietilo, 2’-O-metilo, 2’-O-alilo, 2’-C-alilo, 2’-desoxi, 2’-hidroxilo o 2’-fluoro. Las hebras pueden contener más de una modificación. En un caso, cada residuo de la hebra sentido y la hebra antisentido está modificado de forma independiente con 2’-O-metilo o 2’-fluoro.
Al menos dos modificaciones diferentes están presentes normalmente en la hebra sentido y la hebra antisentido. Tales dos modificaciones pueden ser las modificaciones 2’-O-metilo o 2’-fluoro u otras.
En un caso, Na y/o Nb comprenden modificaciones de un patrón alternante. La expresión “motivo alternante”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, produciéndose cada modificación en nucleótidos alternantes de una hebra. El nucleótido alternante se puede referir a uno de cada dos nucleótidos o a uno de cada tres nucleótidos, o a un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada uno un tipo de modificación respecto al nucleótido, el motivo alternante puede ser "aBabAbABABAB...," "AABBAABBAaBb...," "AABAABAABAAB...," "AAABAAABAAAB...," "AAABBBAAABBB...," o "ABCABCABCABC...," etc.
El tipo de modificaciones contenidas en el motivo alternante puede ser el mismo o diferente. Por ejemplo, si cada uno de A, B, C, D representa un tipo de modificación en el nucleótido, el patrón alternante, es decir, las modificaciones cada dos nucleótidos, puede ser el mismo, pero cada una de la hebra sentido o hebra antisentido se puede seleccionar entre varias posibilidades de modificaciones dentro del motivo alternante tales como "ABABAB...", "ACACAC..." "BDBDBD..." o "CDCDCD...," etc.
En un caso, el agente de iARN comprende el patrón de modificación para el motivo alternante en la hebra sentido con respecto al patrón de modificación para el motivo alternante en la hebra antisentido desplazado. El desplazamiento puede ser tal que el grupo de nucleótidos modificado de la hebra sentido corresponda a un grupo de nucleótidos modificado de manera diferente de la hebra antisentido y viceversa. Por ejemplo, la hebra sentido cuando está emparejada con la hebra antisentido en el dúplex ARNbc, el motivo alternante en la hebra sentido puede comenzar con “ABABAB” desde 5’-3’ de la hebra y el motivo alternante en la hebra antisentido puede comenzar con “BABABA” desde 5’-3’ de la hebra dentro de la región dúplex. Como otro ejemplo, el motivo alternante en la hebra sentido puede comenzar con "AABBAABB” desde 5'-3' de la hebra y el motivo alternante en la hebra antisentido puede comenzar con "BBAABBAA” desde 5'-3’ de la hebra dentro de la región dúplex, de modo que hay un desplazamiento completo o parcial de los patrones de modificación entre la hebra sentido y la hebra antisentido.
En un caso, el agente de iARN comprende el patrón del motivo alternante de la modificación 2'-0-metilo y la modificación 2’-F en la hebra sentido inicialmente tiene un desplazamiento relativo al patrón del motivo alternante de la modificación 2'-0-metilo y la modificación 2’-F en la hebra antisentido inicialmente, es decir, el nucleótido modificado con 2’-0-metilo en los pares de bases de la hebra sentido con un nucleótido modificado con 2'-F en la hebra antisentido y viceversa. La posición 1 de la hebra sentido puede comenzar con la modificación 2’-F y la posición 1 de la hebra antisentido puede comenzar con la modificación 2’-O-metilo.
La introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la hebra sentido y/o hebra antisentido interrumpe el patrón de modificación inicial presente en la hebra sentido y/o hebra antisentido. Esta interrupción del patrón de modificación de la hebra sentido y/o antisentido introduciendo uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la hebra sentido y/o antisentido potencia de manera sorprendente la actividad de silenciamiento génico del gen diana.
En un caso, cuando el motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos se introduce en cualquiera de las hebras, la modificación del nucleótido siguiente al motivo es una modificación distinta de la modificación del motivo. Por ejemplo, la porción de la secuencia que contiene el motivo es “...NaYYYNb...”, donde “Y” representa la modificación del motivo de las tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y “Na” y “Nb” representan una modificación en el nucleótido junto al motivo “YYY” que es diferente de la modificación de Y, y donde Na y Nb pueden ser las mismas modificaciones o diferentes. Como alternativa, Na y/o Nb pueden estar presentes o ausentes cuando está presente una modificación lateral.
El agente de iARN puede comprender además al menos una unión internucleotídica de tipo fosforotioato o metilfosfonato. La modificación de la unión internucleotídica de tipo fosforotioato o metilfosfonato se puede producir en cualquier nucleótido de la hebra sentido o hebra antisentido o en ambas hebras en cualquier posición de la hebra. Por ejemplo, la modificación de la unión internucleotídica se puede producir en cada nucleótido en la hebra sentido y/o hebra antisentido; cada modificación de la unión internucleotídica se puede producir en un patrón alternante en la hebra sentido y/o hebra antisentido; o la hebra sentido o hebra antisentido puede contener ambas modificaciones de la unión internucleotídica en un patrón alternante. El patrón alternante de la modificación de la unión internucleótida en la hebra sentido puede ser igual o diferente de la hebra antisentido, y el patrón alternante de la modificación de la unión internucleótida en la hebra sentido puede tener un desplazamiento con respecto al patrón alternante de la modificación de la unión internucleótida en la hebra antisentido.
En un caso, la iARN comprende una modificación de la unión internucleotídica de tipo fosforotioato o metilfosfonato en la región protuberante. Por ejemplo, la región protuberante puede contener dos nucleótidos que tienen una unión internucleotídica de tipo fosforotioato o metilfosfonato entre los dos nucleótidos. También pueden hacerse modificaciones de la unión internucleotídica para unir los nucleótidos protuberantes con los nucleótidos emparejados terminales dentro de la región dúplex. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4, o todos los nucleótidos protuberantes se pueden unir a través de la unión internucleotídica de tipo fosforotioato o metilfosfonato y, opcionalmente, puede haber uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato o metilfosfonato adicionales que unen el nucleótido protuberante con un nucleótido emparejado que está junto al nucleótido protuberante. Por ejemplo, puede haber al menos dos uniones internucletídicas de tipo fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los que dos de los tres nucleótidos son nucleótidos protuberantes, y el tercero es un nucleótido emparejado junto al nucleótido protuberante. Estos tres nucleótidos terminales pueden estar en el extremo 3’ de la hebra antisentido, el extremo 3’ de la hebra sentido, el extremo 5’ de la hebra antisentido, y/o el extremo 5’ de la hebra antisentido.
En un caso, la protuberancia de 2 nucleótidos está en el extremo 3’ de la hebra antisentido, y hay dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos protuberantes, y el tercer nucleótido es un nucleótido emparejado junto al nucleótido protuberante. De manera opcional, el agente de iARN puede tener además dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5’ de la hebra sentido como en el extremo 5’ de la hebra antisentido.
En un caso, el agente de iARN comprende uno o más emparejamientos erróneos con la diana, dentro del dúplex, o combinaciones de estos. El emparejamiento erróneo se puede producir en la región protuberante o la región dúplex. El par de bases puede clasificarse en función de su tendencia a promover la disociación o fusión (por ejemplo, en la energía libre de asociación o disociación de un emparejamiento particular, el enfoque más simple es examinar los pares en un par de bases individual, aunque también se puede utilizar el vecino siguiente o análisis similares). En lo que se refiere a promover la disociación: A:U se prefiere sobre G:C; G:U se prefiere sobre G:C; e I:C se prefiere sobre G:C (I=inosina). Los emparejamientos erróneos, por ejemplo, no canónicos u otros diferentes de los emparejamientos canónicos (como se describe en otro punto en la presente) se prefieren sobre los emparejamientos canónicos (A:T, A:U, G:C); y los emparejamientos que incluyen una base universal se prefieren sobre los emparejamientos canónicos.
En un caso, el agente de iARN comprende al menos uno de los primeros 1, 2, 3, 4, o 5 pares de bases dentro de las regiones dúplex desde el extremo 5’ de la hebra antisentido seleccionados independientemente a partir del grupo de: A:U, G:U, I:C, y emparejamientos erróneos, por ejemplo, no canónicos u otros distintos de los emparejamientos canónicos o emparejamientos que incluyen una base universal, para promover la disociación de la hebra antisentido en el extremo 5’ del dúplex.
En un caso, el nucleótido en la posición 1 dentro de la región dúplex desde el extremo 5’ en la hebra antisentido se selecciona a partir del grupo constituido por A, dA, dU, U, y dT. Como alternativa, al menos uno de los primeros 1,2 o 3 pares de bases dentro de la región dúplex desde el extremo 5’ de la hebra antisentido es un par de bases AU. Por ejemplo, el primer par de bases dentro de la región dúplex desde el extremo 5’ de la hebra antisentido es un par de bases AU.
En un caso, la secuencia de la hebra sentido se puede representar por la fórmula (I):
5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq 3' (I)
donde:
i y j son cada uno independientemente 0 o 1;
p y q son cada uno independientemente 0-6;
cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np y nq representan independientemente un nucleótido protuberante;
donde Nb e Y no tienen la misma modificación; y
XXX, YYY y ZZZ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. Preferentemente YYY son todos nucleótidos 2’-F modificados.
En un caso, Na y/o Nb comprenden modificaciones de patrón alternante.
En un caso, el motivo YYY se produce en el sitio de escisión de la hebra sentido o cerca de este. Por ejemplo, cuando el agente de iARN tiene una región dúplex con una longitud de 17-23 nucleótidos, el motivo YYY se puede producir en el sitio de escisión, o en las proximidades, (por ejemplo: se puede producir en las posiciones 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 u 11, 12, 13) de - la hebra sentido, empezando a contar desde el 1.er nucleótido, desde el extremo 5’; u opcionalmente, empezando a contar en el 1.er nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5’.
En un caso, i es 1 y j es 0, o i es 0 y j es 1, o tanto i como j son 1. Por lo tanto, la hebra sentido se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); o
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
Cuando la hebra sentido se representa mediante la fórmula (Ib), Nb representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra sentido se representa como la fórmula (Ic), Nb representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cuando la hebra sentido se representa como la fórmula (Id), cada Nb representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Preferentemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Cada Na puede representar independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2­ 15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X, Y y Z puede ser igual o diferente de los demás.
En otros casos, i es 0 y j es 0, y la hebra sentido se puede representar mediante la fórmula:
5' np-Na-YYY- Na-nq 3' (Ia).
Cuando la hebra sentido se representa mediante la fórmula (Ia), cada Na puede representar independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
En un caso, la secuencia de la hebra antisentido de la iARN se puede representar mediante la fórmula (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
donde:
k y l son cada uno independientemente 0 o 1;
p’ y q’ son cada uno independientemente 0-6;
cada Na’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np’ y nq’ representan independientemente un nucleótido protuberante;
donde Nb’ e Y’ no tienen la misma modificación;
y
X 'XX, Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En un caso, Na’ y/o Nb’ comprenden modificaciones de patrón alternante.
El motivo Y'Y'Y' se produce en el sitio de escisión de la hebra antisentido o cerca de este. Por ejemplo, si el agente de iARN tiene una región dúplex con una longitud de 17-23 nucleótidos, el motivo Y'Y'Y' se puede producir en las posiciones 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 ; o 13, 14, 15 de la hebra antisentido, donde se empieza a contar desde el 1.er nucleótido, desde el extremo 5’; u opcionalmente, empezando a contar en el 1.er nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5’. Preferentemente, el motivo Y'Y'Y' se produce en las posiciones 11, 12 y 13.
En un caso, el motivo Y'Y'Y' son todos nucleótidos con una modificación 2’-OMe.
En un caso, k es 1 y l es 0, o k es 0 y l es 1, o tanto k como l son 1.
Por lo tanto, la hebra antisentido se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5' nq-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np 3' (Ilb);
5' nq-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (llc); o
5' nq-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np 3' (lld).
Cuando la hebra antisentido se representa mediante la fórmula (llb), Nb’ representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende entre 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (llc), Nb’ representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende entre 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (lld), cada Nb’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende entre 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Preferentemente, Nb es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6.
En otros casos, k es 0 y l es 0 y la hebra antisentido se puede representar mediante la fórmula:
5' np-Na-Y'Y'Y'- Na'-nq' 3' (la).
Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (lla), cada Na’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X', Y' y Z' puede ser igual o diferente de los demás.
Cada nucleótido de la hebra sentido y hebra antisentido puede estar modificado independientemente con LNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietilo, 2’-0-metilo, 2’-O-alilo, 2’-C-alilo, 2’-hidroxilo o 2’-fluoro. Por ejemplo, cada nucleótido de la hebra sentido y hebra antisentido está modificado independientemente con 2’-O-metilo o 2’-fluoro. Cada X, Y, Z, X', Y' y Z', en particular, puede representar una modificación de tipo 2’-O-metilo o una modificación de tipo 2’-fluoro.
En un caso, la hebra sentido del agente de iARN puede contener un motivo YYY que se encuentre en las posiciones 9, 10 y 11 de la hebra cuando la región dúplex tiene 21 nt, empezando a contar a partir del 1.er nucleótido desde el extremo 5' u, opcionalmente, empezando a contar en el 1.er nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5'; e Y representa una modificación de tipo 2’-F. La hebra sentido puede contener adicionalmente un motivo XXX o motivos ZZZ como modificaciones laterales en el extremo opuesto a la región dúplex; y cada motivo XXX y ZZZ representa independientemente una modificación de tipo 2’-OMe o una modificación de tipo 2’-F.
En un caso, la hebra antisentido puede contener un motivo Y'Y'Y' que se encuentra en las posiciones 11, 12 y 13 de la hebra, empezando a contar desde el 1.er nucleótido desde el extremo 5’, u opcionalmente, empezando a contar desde el 1.er nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5’; e Y' representa una modificación de tipo 2’-O-metilo. La hebra antisentido además puede contener un motivo X'X'X' o motivos Z'Z'Z' como modificaciones laterales en el extremo opuesto a la región dúplex; y X'X'X' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente una modificación de tipo 2’-OMe o una modificación de tipo 2’-F.
La hebra sentido representada por una cualquiera de las fórmulas (la), (Ib), (Ic) y (Id) anteriores forma un dúplex con una hebra antisentido que se representa mediante una cualquiera de las fórmulas (lla), (llb), (llc) y (lld), respectivamente.
Por consiguiente, los agentes de iARN para su uso en los métodos de la divulgación pueden comprender una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra de 14 a 30 nucleótidos, estando el dúplex de iARN representado por la fórmula (lll):
sentido: 5' np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3'
antisentido: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'
(lll)
donde:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 o 1;
p, p', q y q' son cada uno independientemente 0-6;
cada Na y Na’ representan independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de manera diferente;
cada Nb y Nb’ representan independientemente una secuencia oligionucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
donde
cada np’, np, nq’ y nq, pudiendo estar cada uno de los cuales presente o no, representan independientemente un nucleótido protuberante; y
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En un caso, i es 0 y j es 0; o i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 0; o tanto i como j son 1. En otro caso, k es 0 y l es 0; o k es 1 y l es 0; k es 0 y l es 1; o tanto k como l son 0; o tanto k como l son 1.
Las combinaciones ilustrativas de la hebra sentido y la hebra antisentido que forman un dúplex de iARN incluyen las siguientes fórmulas:
5' np - Na -Y Y Y -Na-nq 3'
3' np'-Na'-Y'Y'Y' -Na'nq' 5'
(llla)
5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3'
3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5'
(IIIb)
5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3'
3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'
(IIIc)
5' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3'
3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5'
(IIId)
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIa), cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIb), cada Nb representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 1-10, 1-7, 1-5 o 1-4 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende entre 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (IIIc), cada Nb y Nb’ representan independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende entre 2-10, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (IIId), cada Nb y Nb’ representan independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na y Na’ representan independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de Na, Na’, Nb y Nb’ comprende independientemente modificaciones de un patrón alternante.
Cada uno de X, Y y Z en las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) puede ser igual o diferente de los demás.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y'. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes; o los tres nucleótidos Y forman todos pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIb) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z'. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes; o los tres nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes.
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (IIIc) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X'. Como alternativa, al menos dos de los X nucleótidos forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes; o los tres nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes.
En un caso, la modificación en el nucleótido Y es diferente de la modificación en el nucleótido Y’, la modificación en el nucleótido Z es diferente de la modificación en el nucleótido Z’ y/o la modificación en el nucleótido X es diferente de la modificación en el nucleótido X’.
En un caso, cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2,-O-metilo o 2'-fluoro. En otro caso, cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2,-O-metilo o 2'-fluoro y np' >0 y al menos un np' está unido a un nucleótido vecino mediante una unión de tipo fosforotioato. En otro caso más, cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2,-O-metilo o 2'-fluoro, np' >0 y al menos un np' está unido a un nucleótido vecino mediante una unión de tipo fosforotioato, y la hebra sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente. En otro caso, cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2,-O-metilo o 2'-fluoro, np' >0 y al menos un np' está unido a un nucleótido vecino mediante una unión de tipo fosforotioato, la hebra sentido comprende al menos una unión de tipo fosforotioato y la hebra sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIa), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2,-O-metilo o 2'-fluoro, np' >0 y al menos un np' está unido a un nucleótido vecino mediante una unión de tipo fosforotioato, la hebra sentido comprende al menos una unión de tipo fosforotioato y la hebra sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, el agente de iARN es un multímero que contiene al menos dos dúplex representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), donde los dúplex están conectados mediante un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En un caso, el agente de iARN es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dúplex representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), donde los dúplex están conectados por un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En un caso, dos agentes de iARN representados mediante la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) se unen entre sí en el extremo 5’, y uno o ambos de los extremos 3’ y se conjugan opcionalmente a un ligando. Cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
Diversas publicaciones describen agentes de iARN multiméricos que se pueden utilizar en los métodos de la divulgación. Tales publicaciones incluyen el documento WO2007/091269, las Patentes de EE.UU. N.os 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 y WO2011 /031520.
El agente de iARN que contiene conjugaciones de uno o más restos de carbohidrato con un agente de iARN puede optimizar una o más propiedades del agente de iARN. En muchos casos, el resto de carbohidrato se unirá a una subunidad modificada del agente de iARN. Por ejemplo, el azúcar de ribosa de una o más subunidades ribonucleotídicas de un agente de ARNbc puede sustituirse por otro resto, por ejemplo, un portador que no es un carbohidrato (preferentemente cíclico) al cual se une un ligando de tipo hidrato de carbono. Una subunidad ribonucleotídica en la que se ha reemplazado de esta manera el azúcar ribosa de la subunidad se denomina en la presente una subunidad de modificación con reemplazo de ribosa (RRMS). Un portador cíclico puede ser un sistema anular carbocíclico, es decir, todos los átomos anulares son átomos de carbono, o un sistema anular heterocíclico, es decir, uno o más de los átomos anulares pueden ser un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno o azufre. El portador cíclico puede ser un sistema anular monocíclico, o puede contener dos o más anillos, por ejemplo anillos condensados. El portador cíclico puede ser un sistema anular completamente saturado o puede contener uno o más dobles enlaces.
El ligando se puede unir al polinucleótido mediante un portador. Los portadores incluyen a (i) al menos un “punto de unión al esqueleto” preferentemente dos “puntos de unión al esqueleto” y (ii) al menos un “punto de anclaje.” Un “punto de unión al esqueleto”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo funcional, por ejemplo, un grupo hidroxilo o, en general, un enlace disponible para incorporar el portador al esqueleto, y que es adecuado para ello, por ejemplo, el fosfato, o fosfato modificado, por ejemplo, el esqueleto que contiene azufre de un ácido ribonucleico. Un “punto de anclaje” (TAP, por sus siglas en inglés) en algunos casos se refiere a un átomo anular constitutivo del portador cíclico, por ejemplo, un átomo de carbono o un heteroátomo (distinto de un átomo que proporciona un punto de unión al esqueleto), que conecta un resto seleccionado. El resto puede ser, por ejemplo, un carbohidrato, por ejemplo, monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido y polisacárido. Opcionalmente, el resto seleccionado se conecta mediante un anclaje intermedio al portador cíclico. Por lo tanto, el portador cíclico frecuentemente incluirá un grupo funcional, por ejemplo, un grupo amino, o generalmente, proporcionará un enlace, que es adecuado para incorporar o anclar otra entidad química, por ejemplo, un ligando al anillo constitutivo.
Los agentes de iARN se pueden conjugar con un ligando mediante un portador, donde el portador puede ser un grupo cíclico o un grupo acíclico; preferentemente, el grupo cíclico se selecciona entre pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, [1,3]dioxolano, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y decalino; preferentemente, el grupo acíclico se selecciona entre un esqueleto de serinol o un esqueleto de dietanolamina.
En ciertos casos específicos, el agente de iARN para utilizar en los métodos de la divulgación es un agente seleccionado a partir del grupo de agentes enumerado en cualquiera de las tablas 1 y 2. En un caso, cuando el agente es un agente enumerado en la tabla 1, el agente puede carecer de una dT terminal.
En la presente divulgación además se incluyen agentes de iARN bicatenarios que comprenden cualquiera de las secuencias enumeradas en cualquiera de las tablas 1 o 2 que comprenden en 5’ un fosfato o un mimétido de fosfato en la hebra antisentido (remítase, por ejemplo, a la publicación PCT N.° WO 2011005860). Además, en la presente divulgación se incluyen agentes de iARN bicatenarios que comprenden cualquiera de las secuencias enumeradas en cualquiera de las tablas 1 o 2 que incluyen un grupo 2’-fluoro en lugar de un grupo 2'-OMe en el extremo 5’ de la hebra sentido.
Motivos adicionales
En ciertos aspectos, los agentes de iARN bicatenarios descritos en la presente comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, donde dicha hebra sentido y hebra antisentido comprenden menos de once, diez, nueve, ocho, siete, seis o cinco 2’-desoxifluoro.
En ciertos aspectos, los agentes de iARN bicatenarios descritos en la presente comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, donde dicha hebra sentido y hebra antisentido comprenden menos de diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco o cuatro uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato.
En ciertos aspectos, los agentes de iARN bicatenarios descritos en la presente comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, donde dicha hebra sentido y hebra antisentido comprenden menos de diez 2’-desoxifluoro y menos de seis uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato.
En ciertos aspectos, los agentes de iARN bicatenarios descritos en la presente comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, donde dicha hebra sentido y hebra antisentido comprenden menos de ocho 2’-desoxifluoro y menos de seis uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato.
En ciertos aspectos, los agentes de iARN bicatenarios descritos en la presente comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, donde dicha hebra sentido y hebra antisentido comprenden menos de nueve 2’-desoxifluoro y menos de seis uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato.
Ligandos
Los agentes de iARN bicatenarios de la divulgación pueden estar conjugados de manera opcional con uno o más ligandos. El ligando puede estar unido a la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras, en el extremo 3', extremo 5' o en ambos extremos. Por ejemplo, el ligando puede estar conjugado con la hebra sentido. De acuerdo con la invención, el ligando está conjugado con el extremo 3’ de la hebra sentido. En un caso, el ligando es un ligando de GalNAc. Especialmente, en algunos casos, el ligando es GalNAc3. Los ligandos se acoplan, preferentemente, de manera covalente ya sea directa o indirectamente mediante un anclaje intermedio.
En algunos casos, un ligando altera la distribución, direccionamiento o vida útil de la molécula a la cual se incorpora. En algunos casos, un ligando proporciona una mayor afinidad por una diana seleccionada, por ejemplo, molécula, célula o tipo celular, compartimento, receptor, por ejemplo, un compartimento celular o de un órgano, tejido, órgano o región del cuerpo en comparación, por ejemplo, con una especie que carezca de tal ligando. Los ligandos que proporcionan una mayor afinidad por una diana seleccionada también se denominan ligandos dirigidos.
Algunos ligandos pueden tener propiedades endosomolíticas. Los ligandos endosomolíticos promueven la lisis del endosoma y/o transporte de la composición de la divulgación, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. El ligando endosomolítico puede ser un péptido polianiónico o peptidomimético que muestra actividad de membrana dependiente del pH y fusogenicidad. En un caso, el ligando endosomolítico asume su conformación activa al pH endosomal. La conformación "activa" es esa conformación en la que el ligando endosomolítico promueve la lisis del endosoma y/o el transporte de la composición de la divulgación, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. Los ligandos endosomolíticos ilustrativos incluyen el péptido GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), el péptido EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586) y sus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). En un caso, el componente endosomolítico puede contener un grupo químico (por ejemplo, un aminoácido) que experimentará un cambio en la carga o protonación en respuesta a un cambio en el pH. El componente endosomolítico puede ser lineal o ramificado.
Los ligandos pueden mejorar el transporte, hibridación, y propiedades de especificidad y también pueden mejorar la resistencia de la nucleasa del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descrita en la presente y/o ribonucleótidos naturales o modificados.
Los ligandos pueden incluir en general modificadores terapéuticos, por ejemplo, para potenciar la captación; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores, por ejemplo, para monitorizar la distribución; agentes de reticulación; y restos que confieren resistencia a nucleasas. Los ejemplos generales incluyen lípidos, esteroides, vitaminas, azúcares, proteínas, péptidos, poliaminas, y péptidomiméticos.
Los ligandos pueden incluir una sustancia de origen natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); un hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido.
El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen un poliaminoácido que es una polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli L-glutámico, copolímero de estirenoanhídrido del ácido maleico, copolímero de poli(L-láctido-co-glicólido), copolímero de éter divinílico-anhídrido maleico, copolímero de W-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli(2-etilacrílico), polímeros de W-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrimérica, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento a una célula o tejido, por ejemplo, una lectina, glucoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular especificado tal como una célula renal. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glucoproteína, proteína A surfactante, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, W-acetilgalactosamina, W-acetilglucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glucosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un peptidomimético de RGD o un aptámero.
Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas), reticulantes (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirinas), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales o un quelante (por ejemplo, EDTA), moléculas lipófilas, por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantanoacético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-0(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil)litocólico, ácido 03-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina)y conjugados de péptidos (por ejemplo, péptido de antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2 , poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores del transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupaciones de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complejos de Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glucoproteínas, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica para un coligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un tipo celular especificado tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, W-acetilgalactosamina, W-acetilglucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 MAP cinasa, o un activador de NF-kB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, una droga, que puede aumentar la captación del agente de iARN por parte de la célula, por ejemplo, mediante la alteración del citoesqueleto celular, por ejemplo, mediante la alteración de los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios celulares. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, falloidina, swinholida A, indanocina, o mioservina.
El ligando puede aumentar la captación del oligonucleótido por parte de la célula, por ejemplo, activando una respuesta inflamatoria. Los ligandos ilustrativos que tendrían un efecto de este tipo incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), interleucina-1 beta o interferón gamma.
En un aspecto, el ligando es un lípido o molécula con base lipídica. Tal lípido o molécula con base lipídica se une, preferentemente, a la proteína sérica, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido diana, por ejemplo, un tejido diana que no es renal del cuerpo. Por ejemplo, el tejido diana puede ser el hígado, incluidas las células parenquimatosas del hígado. También se pueden utilizar como ligandos otras moléculas que se unen a HSA. Por ejemplo, se puede usar naproxeno o aspirina. Un ligando lipídico o con base lipídica puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o transporte al interior de una célula diana o membrana celular, y/o (c) se puede utilizar para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA.
Se puede utilizar un ligando con base lipídica para modular, por ejemplo, controlar la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un ligando lipídico o con base lipídica que se une a HSA de manera más potente será menos probable que se dirija al riñón y, por lo tanto, será menos probable que se elimine del cuerpo. Un ligando lipídico o con base lipídica que se une a HSA de manera menos potente se puede utilizar para dirigir el conjugado al riñón.
En un caso, el ligando con base lipídica se une a HSA. Preferentemente, se une a HSA con una afinidad que es suficiente para que el conjugado se distribuya preferentemente en un tejido que no es renal. En un caso, la afinidad es tal que la unión HSA-ligando se puede revertir. En otro caso, el ligando con base lipídica se une a HSA de manera débil o nada en absoluto, de modo que el conjugado se distribuirá preferentemente al riñón. También se pueden utilizar otros restos que se dirigen a las células renales en lugar del ligando con base lipídica o además de este.
En otro aspecto, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina, que es captada por una célula diana, por ejemplo, una célula proliferativa. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación celular no deseada, por ejemplo, de tipo maligno o no maligno, por ejemplo, las células cancerosas. Las vitaminas ilustrativas incluyen la vitamina A, E y K. Otras vitaminas ilustrativas incluyen las vitaminas B, por ejemplo, el ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por las células cancerosas. También se incluyen la HAS, lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL).
En otro aspecto, el ligando es un agente de penetración en células, preferiblemente un agente de penetración en células helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente ilustrativo es un péptido tal como tat o antennopedia. Si el agente es un péptido, puede estar modificado, incluidos un peptidilmimético, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos, y uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferentemente un agente helicoidal alfa, que prefentemente tiene una fase lipófila y lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en la presente un oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. El resto peptídico o peptidomimético puede tener una longitud de aproximadamente 5-50 aminoácidos, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos. Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de penetración en células, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (por ejemplo, constituido principalmente por Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un péptido dendrimérico, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS). Un péptido que contiene MTS hidrófoba ilustrativo es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVa Ll Pa Vl LALlAp (s Eq ID NO: 9). Un análogo de RFGF (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10)) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto de direccionamiento. El resto peptídico puede ser un péptido de “suministro”, que puede portar grandes moléculas polares incluidos péptidos, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha observado que las secuencias de la proteína Tat del HIV (GRKKRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO: 11) y la proteína antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK) (SEQ ID N°: 12) son capaces de actuar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede estar codificado por una secuencia aleatoria de ADN, tal como un péptido identificado a partir de una colección de presentación en fagos o una colección combinatoria de unamicroesfera-un-compuesto (OBOC, por sus siglas en inglés) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Preferentemente, el péptido o peptidomimético anclado a un agente de ARNi mediante una unidad monomérica incorporada es un péptido dirigido a una célula tal como un péptido de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) o un mimético de RGD. La longitud de un resto peptídico puede variar de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden tener una modificación estructural, por ejemplo, para aumentar la estabilidad o dirigir las propiedades conformacionales. Se puede utilizar cualquiera de las modificaciones estructurales que se describen a continuación. Se puede utilizar un resto peptídico de tipo RGD para dirigirse a una célula tumoral, tal como una célula tumoral endotelial o una célula tumoral de cáncer de mama (Zitzmann et al., Cáncer Res., 62:5139-43, 2002). Un péptido RGD puede facilitar el direccionamiento de un agente de ARNi a tumores de varios tejidos diferentes, incluidos el pulmón, riñón, bazo o hígado (Aoki et al., Cáncer Gene Therapy 8:783-787, 2001) Preferentemente, el péptido de tipo RGD facilitará el direccionamiento de un agente de ARNi al riñón. El péptido de RGD puede ser lineal o cíclico, y puede estar modificado, por ejemplo, glucosilado o metilado para facilitar el direccionamiento a tejidos específicos. Por ejemplo, un péptido de RGD glucosilado puede suministrar un agente de ARNi a una célula tumoral que exprese avB3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Se pueden usar los péptidos que se dirigen a marcadores enriquecidos en las células proliferantes. Por ejemplo, los péptidos y peptidomiméticos que contienen RGD pueden dirigirse a células cancerosas, en particular células que presentan una integrina. Por lo tanto, se podrían utilizar los péptidos RGD, péptidos cíclicos que contienen RGD, péptidos RGD que incluyen D-aminoácidos, así como miméticos sintéticos de RGD. Además de RGD, se pueden utilizar otros restos que se dirigen al ligando integrina. En general, tales ligandos se pueden utilizar para controlar las células proliferativas y la angiogénesis. Algunos conjugados de este tipo de ligando se dirigen a PECAM-1, VEGF, u otro gen canceroso, por ejemplo, un gen canceroso descrito en la presente.
Un "péptido de penetración en células" es capaz de penetrar en una célula, por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido que penetra en células microbianas puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropin P1), un péptido que contiene enlaces disulfuros (por ejemplo, a -defensina, p-defensina o bactenecina), o un péptido que contiene solo uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo, PR-39 o indolicidina). Un péptido de penetración en células también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS). Por ejemplo, un péptido de penetración en células puede ser un péptido anfipático bipartito, tal como MPG, que se deriva del dominio de péptido de fusión de gp41 del HIV-1 y el n Ls del antígeno T grande de SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
En un caso, un péptido de direccionamiento puede ser un péptido a-helicoidal anfipático. Los péptidos a-helicoidales anfipáticos ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforina, CPF, péptido de tipo bombinina (BLP), catelicidinas, ceratotoxinas, péptidos S. clava, péptidos antimicrobianos intestinales del pez bruja (HFIAP), magaininas, brevininas-2, dermaseptinas, melitinas, pleurocidina, péptidos de H2A, péptidos de Xenopus, esculentinis-1 y caerinas. Preferentemente, se tendrán en cuenta varios factores para mantener la integridad de la estabilidad de la hélice. Por ejemplo, se utilizará un número máximo de residuos de estabilización de la hélice (por ejemplo, leu, ala o lys) y se utilizará un número mínimo de residuos de desestabilización de la hélice (por ejemplo, prolina, o unidades monoméricas cíclicas). Se tendrá en cuenta el residuo de caperuza (por ejemplo Gly es un residuo de caperuza en N ilustrativo) y/o se puede utilizar la amidación C-terminal para proporcionar un enlace de H extra para estabilizar la hélice. La formación de puentes salinos entre residuos con cargas opuestas, separados por i ± 3 o i ± 4 posiciones pueden proporcionar estabilidad. Por ejemplo, los residuos catiónicos tales como lisina, arginina, homoarginina, ornitina o histidina pueden formar puentes salinos con los residuos aniónicos glutamato o aspartato.
Los ligandos peptídicos y peptidomiméticos incluyen los que tienen péptidos de origen natural o modificados, por ejemplo, péptidos D o L; péptidos a, p o y ; péptidos W-metilo; azapéptidos; péptidos que tienen una o más amidas, es decir, uniones peptídicas remplazadas con uno o más de: uniones urea, tiourea, carbamato, o sulfonilurea; o péptidos cíclicos.
El ligando de direccionamiento puede ser cualquier ligando que sea capaz de dirigirse a un receptor específico. Ejemplos son: folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, agrupamientos de azúcares tales como agrupamiento de GalNAc, agrupamiento de manosa, agrupamiento de galactosa o un aptámero. Un agrupamiento es una combinación de dos o más unidades de azúcar. Los ligandos de direccionamiento también incluyen ligandos del receptor integrina, ligandos del receptor de quimiocinas, transferrina, biotina, ligandos del receptor de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligandos de tipo LDL y HDL. Los ligandos también pueden tener como base un ácido nucleico, por ejemplo, un aptámero. El aptámero puede estar sin modificar o tener cualquier combinación de modificaciones divulgadas en la presente.
Los agentes de liberación endosómica incluyen los imidazoles, poli u oligoimidazoles, PEI, péptidos, péptidos fusogénicos, policaboxilatos, policationes, oligo o policationes o aniones enmascarados, acetales, poliacetales, cetales/policetales, ortoésteres, polímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o desenmascaradas, dendrímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o desenmascaradas.
Modulador PK significa modulador farmacocinético. Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores PK ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicérido, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También existe constancia de que los oligonucleótidos que comprenden varias uniones de tipo fosforotioato se unen a la proteína sérica, así pues, los oligonucleótidos cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples uniones de tipo fosforotioato en el esqueleto también son aceptables en la presente divulgación como ligandos (por ejemplo, como ligandos de modulación PK).
Además, los aptámeros que se unen a componentes séricos (por ejemplo, proteínas séricas) también son aceptables en la presente divulgación como ligandos de modulación PK.
Otros conjugados de ligandos aceptables en la divulgación se describen en las Solicitudes de Patente de EE. UU USSN: 10/916.185, presentada el 10 de agosto de 2004; USSN: 10/946.873, presentada el 21 de septiembre de 2004; USSN: 10/833.934, presentada el 3 de agosto de 2007; USSN: 11/115.989 presentada el 27 de abril de 2005 y USSN: 11/944.227 presentada el 21 de noviembre de 2007.
Cuando están presentes dos o más ligandos, todos los ligandos pueden tener las mismas propiedades, todos tienen propiedades diferentes o algunos ligandos tienen las mismas propiedades mientras que otros tienen propiedades diferentes. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de direccionamiento, tener actividad endosomolítica o tener propiedades de modulación PK. En un caso, todos los ligandos tienen propiedades diferentes.
Los ligandos se pueden acoplar a los oligonucleótidos en varios lugares, por ejemplo, el extremo 3', el extremo 5', y/o en una posición interna. En algunos casos, el ligando se une a los oligonucleótidos mediante un anclaje intermedio, por ejemplo, un portador descrito en la presente. El ligando o ligando anclado puede estar presente en un monómero cuando el monómero se incorpora a la hebra en crecimiento. En algunos casos, el ligando se puede incorporar mediante el acoplamiento con un monómero “precursor” después de que el monómero “precursor” se haya incorporado a la hebra en crecimiento. Por ejemplo, un monómero que tiene, por ejemplo, un anclaje que termina en amino (es decir, que no tiene un ligando asociado), por ejemplo, TAP-(CH2)nNH2 se puede incorporar a la cadena oligonucleotídica creciente. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor a la cadena, un ligando que tiene un grupo electrófilo, por ejemplo, un éster de pentafluorofenilo o un grupo aldehído, se puede unir posteriormente al monómero precursor acoplando el grupo electrófilo del ligando con el grupo nucleófilo terminal del anclaje del monómero precursor.
En otro ejemplo, se puede incorporar un monómero que tiene un grupo químico adecuado para tomar parte en la reacción de química click, por ejemplo, una anclaje/conector que termina en azida o alquino. En una operación posterior, es decir, después de incorporar el monómero precursor a la hebra, se puede unir un ligando que tiene grupo químico complementario, por ejemplo, un alquino o azida, al monómero precursor acoplando juntos el alquino y la azida.
En algunos casos, el ligando se puede conjugar con nucleobases, restos de azúcar o enlaces internucleosídicos de moléculas de ácido nucleico. La conjugación a nucleobases de purina o derivados de estas se puede producir en cualquier posición incluidos los átomos endocíclicos y exocíclicos. En algunos casos, las posiciones 2, 6, 7 u 8 de una nucleobase de purina están unidas a un resto conjugado. La conjugación a las nucleobases de pirimidina o derivados de estas también se puede producir en cualquier posición. En algunos casos, las posiciones 2, 5 y 6 de una nucleobase de pirimidina pueden estar sustituidas con un resto conjugado. La conjugación con restos de azúcar de los nucleósidos se puede producir en cualquier átomo de carbono. Los ejemplos de átomos de carbono de un resto de azúcar que pueden estar unidos a un resto conjugado incluyen los átomos de carbono 2', 3' y 5'. La posición 1' también puede estar unida a un resto conjugado, tal como en un residuo abásico. Las uniones internucleosídicas también pueden portar restos conjugados. Para las uniones que contienen fósforo (por ejemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoamidato y similares), el resto conjugado se puede unir directamente al átomo de fósforo o a un átomo de O, N o S unido al átomo de fósforo. Para las uniones internucleosídicas que contienen amina o amida (por ejemplo, PNA), el resto conjugado se puede unir al átomo de nitrógeno de la amina o amida o a un átomo de carbono adyacente.
Ligandos de GalNAc y conectores
En algunos casos, un ARNip dirigido contra un gen HAO1 se conjuga con un carbohidrato, por ejemplo, un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido o polisacárido. En algunos casos, el ARNip se conjuga con un ligando de tipo W-acetilgalactosamina (GalNAc). Esto mejora el suministro eficaz a los hepatocitos tras la administración subcutánea. El experto en la técnica estará familiarizado con los métodos de conjugación de carbohidratos, por ejemplo, W-acetilgalactosamina a, por ejemplo, un ARNip. Se pueden consultar ejemplos en los documentos US8.106.022 y WO2014/025805.
En algunos casos, un ARNip dirigido contra un gen HAO1 se conjuga con un ligando, por ejemplo, con GalNAc, mediante un conector. Por ejemplo, el ligando puede ser uno o más derivados de GalNAc (W-acetilgalactosamina) unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, el ARNbc de la divulgación se conjuga con conectores ramificados bivalentes y trivalentes que incluyen las estructuras que se muestran en cualquiera de las fórmulas (IV) - (VII):
Figure imgf000025_0001
Fórmula (VI)
o
Figure imgf000026_0001
donde:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C, cada vez que se presentan, representan independientemente 0-20 y donde la unidad repetitiva puede ser igual o diferente;
T4A, T4B, independientemente están cada uno ausentes o son cada uno CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH o CH2O;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C, cada vez que se presentan e independientemente están ausentes o son alquileno, alquileno sustituido donde uno o más metilenos se pueden interrumpir o terminar mediante uno o más de
O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), CeC o C(O);
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C cada vez que se presentan e independientemente están cada uno ausentes
Figure imgf000026_0003
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando; cada vez que se presentan e independientemente cada uno representa un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido, o polisacárido; y
Ra es H o cadena lateral de aminoácido.
Los derivados de GalNAc de conjugación trivalente son particularmente útiles para su uso con los agentes de iARN para inhibir la expresión de un gen diana, tales como los de fórmula (VII):
Figure imgf000026_0002
donde L5A, L5B y L5C representan un monosacárido, tal como derivado de GalNAc.
Los ejemplos de grupos conectores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que conjugan derivados de GalNAc incluyen, sin carácter limitante, los siguientes compuestos:
Figure imgf000029_0001
Ligandos adicionales
En algunos casos el ligando se selecciona entre uno de los siguientes:
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Figure imgf000031_0001
III. Suministro de un ARNi
El suministro de un agente de ARNi de la divulgación a una célula, por ejemplo, una célula en un sujeto, tal como un sujeto humano (por ejemplo, un sujeto que lo necesite, tal como un sujeto que padece un trastorno asociado con HAO1) se puede lograr de varias maneras diferentes. Por ejemplo, el suministro se puede realizar poniendo en contacto una célula con un ARNi de la divulgación tanto in vitro como in vivo. El suministro in vivo también se puede realizar directamente administrando una composición que comprende un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, a un sujeto. Como alternativa, el suministro in vivo puede realizarse indirectamente administrando uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del ARNi. Estas alternativas se tratan adicionalmente más adelante.
En general, puede adaptarse cualquier método de suministro de una molécula de ácido nucleico (in vitro o in vivo) para su uso con un ARNi de la divulgación (remítase, por ejemplo, a Akhtar S. y Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol.
2(5):139-144 y WO94/02595). Para el suministro in vivo, los factores que se han de tener en cuenta con el fin de suministrar una molécula de ARNi incluyen, por ejemplo, estabilidad biológica de la molécula suministrada, prevención de efectos no específicos y acumulación de la molécula suministrada en el tejido diana. Los efectos no específicos de un ARNi se pueden minimizar mediante el suministro local, por ejemplo, mediante inyección directa o implantación en un tejido o administrando tópicamente la preparación. La administración local a un sitio de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limita la exposición del agente a tejidos sistémicos que pueden de otro modo ser dañados por el agente o que pueden degradar el agente, y permite administrar una menor dosis total de la molécula de ARNi. Se ha mostrado en varios estudios la disminución satisfactoria de productos génicos cuando se administra localmente un ARNi. Por ejemplo, se ha demostrado que el suministro intraocular de un ARNbc de VEGF tanto mediante inyección intravitreal en monos cinomolgos (Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138) como mediante inyecciones subretinales en ratones (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216) previene la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular relacionada con al edad. Además, con la inyección intratumoral directa de un ARNbc en ratones se reduce el volumen tumoral (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274) y se puede prolongar la supervivencia de los ratones portadores del tumor (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et a l (2007) Mol. Ther. 15:515-523). También se ha demostrado que la interferencia por ARN tiene éxito en un suministro local al CNS mediante inyección directa (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) y a los pulmones mediante administración intranasal (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther.
14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administrar un ARNi por vía sistémica para el tratamiento de una enfermedad, el ARN se puede modificar o, como alternativa, suministrar utilizando un sistema de suministro farmacológico; ambos métodos actúan previniendo la rápida degradación del ARNbc por parte de endo- y exo-nucleasas in vivo. La modificación del ARN o el portador farmacéutico también puede permitir dirigir la composición de ARNi al tejido diana y evitar efectos colaterales no deseables. Las moléculas de ARNi se pueden modificar mediante conjugación química con grupos lipófilos tales como colesterol para mejorar la captación celular y prevenir la degradación. Por ejemplo, se inyectó un ARNi dirigido contra ApoB conjugado con un resto de colesterol lipófilo por vía sistémica en ratones, lo que provocó la disminución del ARNm de apoB tanto en el hígado como en el yeyuno (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Se ha demostrado que la conjugación de un ARNi con un aptámero inhibe el crecimiento tumoral y media la regresión tumoral en un modelo de cáncer de próstata en ratón (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). En un caso alternativo, el ARNi se puede suministrar utilizando sistemas de suministro farmacológico tales como una nanopartícula, un dendrímero, un polímero, liposomas o un sistema de suministro catiónico. Los sistemas de suministro catiónicos cargados positivamente facilitan la unión de una molécula de ARNi (cargada negativamente) y también potencian las interacciones en la membrana celular cargada negativamente para permitir la captación eficaz de un ARNi por la célula. Los lípidos catiónicos, dendrímeros o polímeros pueden estar unidos a un ARNi o se puede inducir que formen una vesícula o micela (remítase, por ejemplo, a Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que rodee un ARNi. La formación de vesículas o micelas previene además la degradación del ARNi cuando se administra por vía sistémica. Los métodos para generar y administrar complejos catiónicos de ARNi están dentro de las competencias de un experto en la técnica (remítase, por ejemplo, a Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens.
25:197-205). Algunos ejemplos no limitantes de sistemas de suministro farmacológico útiles para el suministro por vía sistémica de ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra), Oligofectamine, "partículas lipídicas de ácido nucleico sólidas" (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietileneimina (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. 16 de agosto publicación electrónica previa a la impresión; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptides (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), y poliamidoaminas (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res.
16:1799-1804). En algunos casos, un ARNi forma un complejo con ciclodextrina para la administración sistémica. Métodos para la administración y las composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas se pueden consultar en la patente de EE.UU. N.° 7.427.605.
Divulgación de ARNi codificados por vectores
El ARNi dirigido contra el gen HAO1 se puede expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (remítase a, por ejemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicación PCT Internacional N.° WO 00/22113, Conrad, Publicación PCT Internacional N.° WO 00/22114, y Conrad, Patente de EE.UU. N.° 6.054.299). La expresión puede ser transitoria (del orden de horas a semanas) o sostenida (semanas a meses o más), dependiendo del constructo específico utilizado y el tejido diana o tipo celular. Estos transgenes se pueden introducir como un constructo lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede ser un vector integrante o no integrante. El transgén también se puede construir para permitir que sea heredado como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa (1995) 92:1292).
La hebra o hebras individuales de un ARNi se pueden transcribir a partir de un promotor en un vector de expresión. Cuando se van a expresar dos hebras separadas para generar, por ejemplo, un ARNbc, se pueden introducir conjuntamente dos vectores de expresión separados (por ejemplo, mediante transfección o infección) en una célula diana. Como alternativa, cada hebra individual de un ARNbc puede ser transcrita mediante promotores ambos de los cuales están ubicados en el mismo plásmido de expresión. En un caso, un ARNbc se expresa como polinucleótidos de repetición invertida unidos por una secuencia de polinucleótidos conectora de forma que el ARNbc tenga una estructura de tallo y bucle.
Los vectores de expresión de ARNi son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden utilizar vectores de expresión compatibles con células eucariotas, preferentemente aquellos compatibles con células de vertebrado, para producir constructos recombinantes para la expresión de un ARNi tal como se describe en la presente. Los vectores de expresión en células eucariotas son muy conocidos en la técnica y están disponibles de varias fuentes comerciales. Normalmente, se proporcionan vectores tales que contengan sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ácido nucleico deseado. El suministro de vectores que expresan ARNi puede ser sistémico, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células diana explantadas del paciente con la posterior reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.
Los plásmidos de expresión de ARNi se pueden utilizar para transfectar células diana como un complejo con portadores de lípidos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamine) o portadores con base lipídica no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKOTM). En la divulgación también se contemplan múltiples transfecciones de lípidos para inactivaciones mediadas por ARNi dirigidas a diferentes regiones de un ARN diana durante un periodo de una semana o más. La introducción satisfactoria de vectores en células hospedadoras se puede monitorizar utilizando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalizar con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde (GFP). La transfección estable de células ex vivo se puede garantizar utilizando marcadores que proporcionen a la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tales como resistencia a la higromicina B.
Los sistemas de vectores virales que se pueden utilizar con los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen, sin carácter limitante, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, que incluyen, sin carácter limitante, vectores lentivirales, virus de la leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adeno-asociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores del SV 40; (f) vectores del virus del polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores del virus de la viruela tales como un ortopox, por ejemplo, vectores del virus de la variolovacuna o avipox, por ejemplo, viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de un auxiliar o vacío (gutless). También pueden ser convenientes los virus defectuosos en la replicación. Los diferentes vectores se incorporarán, o no, al genoma de la célula. Si se desea, los constructos pueden incluir secuencias virales para la transfección. Como alternativa, el constructo se puede incorporar a vectores capaces de replicación episómica, por ejemplo, vectores de EPV y EBV. Los constructos para la expresión recombinante de un ARNi requerirán por lo general elementos reguladores, por ejemplo, promotores, potenciadores, etc., para garantizar la expresión del ARNi en las células diana. Otros aspectos que se han de considerar para los vectores y construcciones se describen adicionalmente más adelante.
Los vectores útiles para el suministro de un ARNi incluirán los elementos reguladores (promotor, potenciador, etc.) suficientes para la expresión del ARNi en la célula o tejido diana deseado. Los elementos reguladores se pueden elegir para proporcionar tanto expresión constitutiva como regulada/inducible.
La expresión del ARNi se puede regular de forma exacta, por ejemplo, utilizando una secuencia reguladora inducible que sea sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, la concentración de glucosa circulante u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de ARNbc en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de la dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (IPTG). Un experto en la técnica sería capaz de elegir la secuencia reguladora/promotora apropiada basándose en el uso previsto del transgén de ARNi.
Se pueden utilizar vectores virales que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican un ARNi. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (remítase a Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento correcto del genoma viral y la integración en el ADN de la célula hospedadora. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un ARNi se clonan en uno o más vectores, que facilitan el suministro del ácido nucleico a un paciente. Se pueden consultar más detalles sobre los vectores retrovirales, por ejemplo, en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdr1 a células madre hematopoyéticas con el fin de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Los vectores lentivirales contemplados para su uso incluyen, por ejemplo, los vectores basados en e1HIV descritos en las Patentes de EE.UU. N.os 6.143.520; 5.665.557; y 5.981.276.
También se contemplan los adenovirus para su uso en el suministro de ARNi de la divulgación. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos, por ejemplo, para suministrar genes a los epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de manera natural los epitelios respiratorios en los que producen una enfermedad leve. Otras dianas para los sistemas de suministro basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) presentan un artículo de revisión de la terapia génica con adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron la utilización de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Se pueden consultar otros casos de utilización de adenovirus en la terapia génica en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); publicación Pc T WO94/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). En Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010 se describe un vector de AV adecuado para expresar un ARNi de la divulgación, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para suministrar el vector a células diana.
También se pueden usar vectores de virus adeno-asociados (AAV) para suministrar un ARNi de la divulgación (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); Patente de EE. UU. N.° 5.436.146). En un caso, el ARNi se puede expresar como dos moléculas de ARN monocatenario complementarias separadas de un vector de AAV recombinante que tiene, por ejemplo, tanto los promotores de ARN U6 o H1 como el promotor del citomegalovirus (CMV). Se describen vectores de AAV adecuados para expresar del ARNbc de la divulgación, métodos para construir el vector de AV recombinante y métodos para suministrar los vectores a las células diana en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; la Patente de EE. UU. N.° 5.252.479; la Patente de e E. UU. N.° 5.139.941; la Solicitud de Patente Internacional N.° WO 94/13788; y la Solicitud de Patente Internacional N.° WO 93/24641.
Otro vector viral adecuado para el suministro de un ARNi de la divulgación es un virus de la viruela tal como un virus de la variolovacuna, por ejemplo, una variolovacuna atenuada tal como el virus de Ankara modificado (MVA) o NYVAC, un avipox tal como la viruela aviar o la viruela del canario.
El tropismo de vectores virales se puede modificar pseudotipando los vectores con proteínas de la envoltura u otros antígenos superficiales de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápside viral, según convenga. Por ejemplo, se pueden pseudotipar vectores lentivirales con proteínas superficiales del virus de la estomatitis vesicular (VSV), rabia, Ébola, Mokola y similares. Se puede hacer que los vectores de AAV se dirijan a diferentes células modificando los vectores para que expresen proteínas de la cápside de diferentes serotipos; remítase, por ejemplo, a Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801.
La preparación farmacéutica de un vector puede incluir el vector en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en la cual está incorporada el vehículo de suministro del gen. Como alternativa, si el vector de suministro del gen completo se puede producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro del gen.
IV. Divulgación de composiciones farmacéuticas
La presente divulgación también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los ARNi de la divulgación. En un caso, en la presente se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen un ARNi, tal como se describe en la presente, y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticamente aceptables que contienen el ARNi son útiles para tratar una enfermedad o trastorno asociado con HAO1. Tales composiciones farmacéuticas se formulan en función del modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes de iARN de la divulgación pueden ser, por ejemplo, soluciones con o sin un tampón, o composiciones que contienen portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen, por ejemplo, composiciones acuosas o cristalinas, formulaciones liposómicas, formulaciones micelares, emulsiones y vectores de terapia génica.
En los métodos de la divulgación, el agente de iARN se puede administrar en una solución. Se puede administrar un agente de iARN libre en una solución no tamponada, por ejemplo, en solución salina o en agua. Como alternativa, el ARNip libre también se puede administrar en una solución de tampón adecuada. La solución de tampón puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de estos. En un caso, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS). El pH y osmolaridad de la solución de tampón que contiene el agente de iARN se puede ajustar de forma que sea adecuada para administración a un sujeto.
En algunos casos, la solución de tampón comprende además un agente para controlar la osmolaridad de la solución, de forma que la osmolaridad se mantenga en un valor deseado, por ejemplo, a los valores fisiológicos del plasma humano. Los solutos que se pueden añadir a la disolución de tampón para controlar la osmolaridad incluyen, sin carácter limitante, proteínas, péptidos, aminoácidos, polímeros no metabolizados, vitaminas, iones, azúcares, metabolitos, ácidos orgánicos, lípidos o sales. En algunos casos, el agente para controlar la osmolaridad de la solución es una sal. En ciertos casos, el agente para controlar la osmolaridad de la solución es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden administrar en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión de un gen HAO1.
Dosificaciones
Por lo general, una dosis adecuada de un ARNi de la divulgación estará comprendida en el intervalo de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, por lo general en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 10 o 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, el ARNbc se puede administrar a aproximadamente 0.01 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg por dosis individual.
En otro caso, el agente de iARN, por ejemplo, el ARNbc, se administra con una dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 50 mg/kb, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg. Valores e intervalos intermedios respecto a los valores citados también se pretende que sean parte de esta divulgación.
Por ejemplo, el agente de iARN, por ejemplo, el ARNbc, se puede administrar con una dosis de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1,2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1,3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1,5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1,6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 7.0, 7.1,7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1,8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1,9.2, 9.3, 9.4, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21,21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31,32, 33, 34, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Valores e intervalos intermedios respecto a los valores citados también se pretende que sean parte de esta divulgación.
En ciertos casos de la divulgación, por ejemplo, cuando un agente de iARN bicatenario incluye modificaciones (por ejemplo, uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, incluido un motivo de este tipo en el sitio de escisión del agente o cerca de este), seis uniones de tipo fosforotioato y un ligando, tal agente se administra con una dosis de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente
0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente
0.02 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente
0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente
0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente
0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente
0.03 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg o de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios respecto a los valores citados anteriormente también se pretende que formen parte de esta divulgación, por ejemplo, el agente de iARN se puede administrar al sujeto a una dosis de aproximadamente 0.015 mg/kg a aproximadamente 0.45 mg/kg.
Por ejemplo, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN en una composición farmacéutica, se puede administrar con una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg, 0.0125 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.0175 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.0225 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.0275 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.0325 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.0375 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.0425 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.0475 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.0525 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.0575 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.0625 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.0675 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.0725 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.0775 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.0825 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.0875 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.0925 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.0975 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.125 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.175 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.225 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.275 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.325 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.375 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.425 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.475 mg/kg o aproximadamente 0.5 mg/kg. Los valores intermedios respecto a los valores citados anteriormente también se pretende que sean parte de esta divulgación.
Patrones de tratamiento
La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día, o el ARNi se puede administrar como dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso utilizando la infusión continua o administración mediante una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNi contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño con el fin de lograr la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también se puede calcular para la administración durante varios días, por ejemplo, utilizando una formulación de liberación sostenida tradicional que proporciona una liberación sostenida del ARNi durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son muy conocidas en la técnica y son particularmente útiles para el suministro de agentes en un sitio particular, tal como el que podría utilizarse con los agentes de la presente divulgación. En esto caso, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
En otros casos, una dosis única de las composiciones farmacéuticas puede ser de larga duración, de modo que las dosis posteriores se administren en intervalos de no más de 3, 4 o 5 días, o en intervalos de no más de 1, 2, 3 o 4 semanas. En algunos casos de la divulgación, una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la divulgación se administra una vez a la semana. En otros casos de la divulgación, una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la divulgación se administra dos veces al mes.
El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y momento adecuado requerido para tratar de manera eficaz a un sujeto, que incluyen, sin carácter limitante, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, el estado de salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico de una composición puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos. Se pueden realizar estimaciones de dosificaciones eficaces y semividas in vivo para los ARNi individuales que abarca la divulgación utilizando metologías tradicionales.
También se pueden hacer estimaciones de las dosificaciones eficaces y semividas in vivo para los ARNi individuales englobados por la divulgación basándose en pruebas in vivo utilizando un modelo animal apropiado. Por ejemplo, con los avances en la genética del ratón se han generado varios modelos en ratón para estudiar diversas enfermedades humanas, tales como un trastorno asociado con la expresión de HAO1. Tales modelos se pueden utilizar para las pruebas in vivo del ARNi, además de para determinar una dosis eficaz desde un punto de vista terapéutico. En la técnica existe constancia de modelos en ratón adecuados e incluyen, por ejemplo, los modelos en animales descritos en la presente.
Métodos de administración
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar de varias formas que dependen de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área que se va a tratar. La administración puede ser tópica (por ejemplo, mediante un parche transdérmico), pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluye mediante un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye la infusión o inyección intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; subdérmica, por ejemplo, mediante un dispositivo implantado; o intracraneal, por ejemplo, mediante administración intraparenquimatosa, intratecal o intraventricular.
El ARNi se puede suministrar de modo que se dirija a un tejido particular tal como el hígado.
Formulaciones
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen, sin carácter limitante, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de varios componentes que incluyen, sin carácter limitante, líquidos preformados, sólidos auto-emulsionantes y semisólidos auto-emulsionantes.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación, que se pueden presentar de manera conveniente en una forma farmacéutica unitaria, se pueden preparar según técnicas tradicionales muy conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el o los portadores o el o los excipientes farmacéuticamente aceptables. Por lo general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si fuera necesario, moldeando el producto.
Las composiciones de la presente divulgación se pueden formular en cualquiera de las muchas posibles formas farmacéuticas tales como, sin carácter limitante, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgación también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Las composiciones de la presente divulgación se pueden formular para la administración oral; la administración parenteral, intraparenquimatosa (en el cerebro), intrateca, intraventricular o intrahepática y/o la administración tópica.
Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables los espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes. En algunos casos, las formulaciones orales son aquellas en las que los ARNbc de la divulgación se administran conjuntamente con uno o más quelantes y surfactantes potenciadores de la penetración. Los surfactantes adecuados incluyen los ácidos grasos y/o ésteres o sales de estos, ácidos biliares y/o sales de estos. Los ácidos biliares/sales adecuados incluyen el ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen el ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de estos (por ejemplo, de sodio). En algunos casos, se utilizan combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales combinados con ácidos biliares/sales. Una combinación a modo de ejemplo es la sal de sodio del ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Los potenciadores de la penetración adicionales incluyen el éter polioxietilen-9-laurílico y el éter polioxietilen-20-cetílico. Los ARNbc de la divulgación se pueden suministrar por vía oral, en forma granulada que incluye partículas secadas por pulverización, o complejados para formar micro o nanopartículas. Los agentes de complejación de ARNbc incluyen los poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; poli(acrilatos de alquilo), polioxetanos, poli(cianoacrilatos de alquilo); gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; poli(cianoacrilatos de alquilo); poliiminas derivatizadas con DEAE, polulanos, celulosas y almidones. Los agentes complejantes adecuados incluyen el quitosano, W-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino), poli(cianoacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(cianoacrilato de isohexilo), DEAE-metacrilato, DEAE-acrilato de hexilo, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de hexilo), poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG). Se describen detalladamente formulaciones orales para ARNbc y su preparación en la Patente de EE. UU. 6.887.906, la Publicación de EE. UU. N ° 20030027780 y la Patente de EE. UU. N.° 6.747.014.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimatosa (en el cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, sin carácter limitante, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprays, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos tradicionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las que los ARNi de la divulgación están mezclados con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y surfactantes. Los lípidos y liposomas adecuados incluyen los neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina), negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA). Los ARNi de la divulgación pueden estar encapsulados dentro de liposomas o pueden formar complejos con estos, en particular con liposomas catiónicos. Como alternativa, los ARNi pueden estar complejados con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, sin carácter limitante, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un éster de alquilo C1-20 (por ejemplo, miristato de isopropilo IPM), monoglicérido, diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de estos). Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la patente de EE.UU. n° 6.747.014.
Formulaciones de ARNi que comprenden ensamblajes moleculares membranosos
Un ARNi para su uso en las composiciones y métodos de la divulgación se puede formular para el suministro en un ensamblaje molecular membranoso, por ejemplo, un liposoma o una micela. Según se utiliza en la presente, el término “liposoma” se refiere a una vesícula compuesta por lípidos amfifílicos dispuestos en al menos una bicapa, por ejemplo, una bicapa o varias bicapas. Los liposomas incluyen vesículas unilaminares y multilaminares que tienen una membrana formada de un material lipófilo y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición de ARNi. El material lipófilo aísla el interior acuoso de un exterior acuoso, que normalmente no incluye la composición de ARNi, aunque en algunos ejemplos puede que sí lo haga. Los liposomas son útiles para transferir y suministrar principios activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican los liposomas a un tejido, la bicapa liposomal se fusiona con la bicapa de las membranas celulares. A medida que progresa la fusión del liposoma y la célula, se suministra el contenido acuoso interno que incluye el ARNi a la célula en la que el ARNi puede unirse específicamente a un ARN diana y puede mediar en la iARN. En algunos casos, los liposomas también son elegidos como diana de manera específica, por ejemplo, para dirigir el ARNi a tipos de células particulares.
Un liposoma que contiene un agente de iARN puede prepararse mediante varios métodos. En un ejemplo, el componente lipídico de un liposoma se disuelve en un detergente de modo que se forman micelas con el componente lipídico. Por ejemplo, el componente lipídico puede ser un lípido anfipático catiónico o un conjugado lipídico. El detergente puede tener una concentración micelar crítica elevada y puede ser no iónico. Los detergentes ilustrativos incluyen el colato, CHAPS, octilglucósido, desoxicolato y lauroil sarcosina. A continuación, se añade la preparación del agente de iARN a las micelas que incluyen el componente lipídico. Los grupos catiónicos en el lípido interaccionan con el agente de iARN y condensan alrededor del agente de iARN para formar un liposoma. Después de la condensación, el detergente se elimina, por ejemplo, por diálisis, y se obtiene una preparación liposómica de agente de iARN.
En caso de ser necesario se puede añadir un compuesto portador que ayuda en la condensación durante la reacción de condensación, por ejemplo, por adición controlada. Por ejemplo, el compuesto portador puede ser un polímero distinto de un ácido nucleico (por ejemplo, espermina o espermidina). También se puede ajustar el pH para favorecer la condensación.
Los métodos para producir vehículos de suministro de polinucleótidos estables, que incorporan un complejo de polinucleótido/lípido catiónico como componentes estructurales del vehículo de suministro, se describen adicionalmente en, por ejemplo, el documento WO 96/37194. La formación de liposomas también puede incluir uno o más aspectos de los métodos ilustrativos descritos en Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; la Patente de EE. UU. N.° 4.897.355; la Patente de EE. UU. N.° 5.171.678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; y Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Las técnicas utilizadas normalmente para preparar agregados lipídicos de tamaño apropiado para su uso como vehículos de suministro incluyen la sonicación y congelación-descongelación más extrusión (remítase, por ejemplo, a Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Se puede utilizar la microfluidización cuando se deseen agregados sistemáticamente pequeños (de 50 a 200 nm) y relativamente uniformes (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Estos métodos se adaptan fácilmente para envasar preparados del agente de iARN en los liposomas.
Los liposomas se clasifican en dos clases amplias. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que interaccionan con las moléculas de ácido nucleico cargadas para formar un complejo estable. El complejo de ácido nucleico/liposoma cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido del interior del endosoma, los liposomas se fracturan y liberan sus contenidos en el citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o que están cargados negativamente atrapan ácidos nucleicos en vez de formar complejos con ellos. Ya que tanto el ácido nucleico como el lípido están cargados de manera similar, se produce repulsión en vez de formación de complejos. No obstante, algo del ácido nucleico queda atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Se han utilizado liposomas sensibles al pH para suministrar ácidos nucleicos que codifican el gen timidina-cinasa a monocapas de células en cultivo. Se detectó la expresión del gen exógeno en las células diana (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos que no son la fosfatidilcolina obtenida de manera natural. Las composiciones liposomales neutras, por ejemplo, se pueden formar a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos en general se forman a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, mientras los liposomas aniónicos fusógenos se forman principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soya y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Los ejemplos de otros métodos para introducir liposomas en las células in vitro e in vivo incluyen la Patente de EE. UU. N.25.283.185; la Patente de EE. UU. N.25.171.678; y los documentos WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; y Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden un surfactante no iónico y colesterol. Se utilizaron formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) y Novasome™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) para suministrar ciclosporina A a la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposomales no iónicos fueron eficaces para facilitar el depósito de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu etal. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estéricamente”, una expresión que, según se utiliza en la presente, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado un aumento de la vida media en circulación con relación a los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica que forma la vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como monosialogangliósido Gm1, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Sin pretender ceñirse a ninguna teoría particular, en la técnica se cree que, al menos para los liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivatizados con PEG, el aumento de la semivida en circulación de estos liposomas estabilizados estéricamente se debe a una reducción de la captación por parte de las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
En la técnica existe constancia de diversos liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) han descrito la capacidad del monosialogangliósido Gm1, el sulfato de galactocerebrósido y el fosfatidilinositol para mejorar las semividas en sangre de los liposomas. Estos descubrimientos fueron descritos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La Patente de EE.UU. N.° 4.837.028 y el documento WO 88/04924, ambos de Allen et al., describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gm1 o un éster de tipo sulfato de galactocerebrósido. La Patente de EE. UU. N.° 5.543.152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. En el documento WO 97/13499 (Lim et al.) se describen liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina.
En un caso, se utilizan liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse con la membrana celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficazmente con la membrana plasmática, son capatados por los macrófagos in vivo y pueden utilizarse para suministrar agentes de iARN a los macrófagos.
Las ventajas adicionales de los liposomas incluyen: los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en lípidos y agua; los liposomas pueden proteger los agentes de iARN encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, volumen 1, página 245). Son consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas la carga de la superficie del lípido, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Se puede utilizar un lípido catiónico sintético cargado positivamente, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), para formar liposomas pequeños que interactúan de manera espontánea con el ácido nucleico para formar complejos de lípido-ácido nucleico que son capaces de fusionarse con los lípidos cargados negativamente de las membranas celulares de células en cultivo de tejido, lo que da como resultado el suministro del agente de iARN (remítase, por ejemplo, a Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 y la Patente de EE. UU. N.° 4.897.355 para consultar una descripción de DOTMA y su uso con el ADN).
Se puede utilizar el análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonico)propano (DOTAP) con un fosfolípido para formar vesículas que complejan ADN. Lipofectin™ Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) es un agente eficaz para el suministro de ácidos nucleicos sumamente aniónicos a células en cultivo de tejido vivo que comprenden liposomas de DOTMA cargados positivamente que interactúan de manera espontánea con polinucleótidos cargados negativamente para formar complejos. Cuando se utilizan liposomas con una carga positiva suficiente, la carga neta de los complejos resultantes también es positiva. Los complejos cargados positivamente preparados de este modo se unen de manera espontánea a las superficies celulares cargadas negativamente, se fusionan con la membrana plasmática, y suministran de manera eficaz ácidos nucleicos funcionales a, por ejemplo, células en cultivo de tejido. Otro lípido catiónico comercializado, 1,2-bi(oleoiloxi)-3,3-(trimetilamoniaco)propano (“DOTAP”) (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana) difiere de DOTMA en que los restos oleoílo están unidos por enlaces de tipo éster, en lugar de tipo éter.
Otros compuestos de lípidos catiónicos descritos incluyen aquellos que se han conjugado con diferentes restos que incluyen, por ejemplo, la carboxiespermina que se ha conjugado con uno de los dos tipos de lípidos e incluye compuestos tales como la dioctaoleoilamida de 5-carboxiespermilglicina (“DOGS”) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) y 5-carboxiespermilamida de dipalmitoilfosfatidiletanolamina (“DPPES”) (remítase, por ejemplo, a la Patente de EE.UU. N.° 5.171.678).
Otros conjugados de lípidos catiónicos incluyen la derivatización del lípido con el colesterol ("DC-Chol") que ha sido formulado en liposomas combinado con DOPE (remítase a Gao, X. y Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun.
179:280, 1991). Se ha descrito que la lipopolilisina, formada al conjugar polilisina con DOPE, es eficaz para la transfección en presencia de suero (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Para ciertas líneas celulares, se considera que estos liposomas que contienen lípidos catiónicos conjugados exhiben menor toxicidad y proporcionan una transfección más eficaz que las composiciones que contienen DOTMA. Otros productos de lípidos catiónicos comercializados incluyen DMRIE y DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) y Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). En los documentos WO 98/39359 y WO 96/37194 se describen otros lípidos catiónicos adecuados para el suministro de oligonucleótidos.
Las formulaciones liposomales son particularmente adecuadas para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Tales ventajas incluyen una reducción de los efectos secundarios relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en la diana deseada y la capacidad de administrar el agente de iARN a la piel. En algunas implementaciones, los liposomas se usan para suministrar agente de iARN a las células epidérmicas y también para potenciar la penetración de agente de iARN en tejidos dérmicos, por ejemplo, en piel. Por ejemplo, los liposomas se pueden aplicar por vía tópica. Se ha documentado el suministro tópico de los fármacos formulados como liposomas a la piel (remítase, por ejemplo, a Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2.405-410 y du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. y Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276.
1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. y Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. y Huang, L., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
También se han examinado los sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden un surfactante no iónico y colesterol. Se utilizaron formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) y Novasome II (diestearato de glicerilo/ colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) para suministrar un fármaco a la dermis de la piel de ratón. Tales formulaciones con un agente de iARN son útiles para tratar un trastorno dermatológico.
Los liposomas que incluyen ARNi se pueden hacer sumamente deformables. Tal deformabilidad puede permitir que los liposomas penetren a través de poros que son más pequeños que el radio promedio del liposoma. Por ejemplo, los transferosomas son un tipo de liposomas deformables. Se pueden preparar transferosomas añadiendo activadores del borde superficial, normalmente surfactantes, a una composición liposómica estándar. Los transferosomas que incluyen el agente de iARN se pueden suministrar, por ejemplo, por vía subcutánea por infección para suministrar el agente de iARN a los queratinocitos de la piel. Para cruzar la piel intacta de un mamífero, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro inferior a 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Además, debido a las propiedades del lípido, estos transferosomas pueden ser autooptimizantes (adaptables a la forma de los poros, por ejemplo, en la piel), autorreparadores y con frecuencia pueden alcanzar sus dianas sin fragmentarse, y con frecuencia se autocargan.
Otras formulaciones adecuadas para la presente divulgación se describen en las solicitudes provisionales de Estados Unidos con N.os de serie 61/018.616, presentada el 2 de enero de 2008; 61/018.611, presentada el 2 de enero de 2008; 61/039.748, presentada el 26 de marzo de 2008; 61/047.087, presentada el 22 de abril de 2008 y 61/051.528, presentada el 8 de mayo de 2008. La solicitud PCT N.° PCT/US2007/080331, presentada el 3 de octubre de 2007 también describe formulaciones que son adecuadas para la presente divulgación.
Los transferosomas son otro tipo más de liposomas, y son agregados lipídicos sumamente deformables que son candidatos atractivos como vehículos de suministro de fármacos. Los transfersomas se pueden describir como microgotas lipídicas que son tan sumamente deformables que son capaces de penetrar con facilidad a través de poros que son más pequeños que la microgota. Los transferosomas son adaptables al entorno en el que se usan, por ejemplo, son autooptimizantes (adaptables a la forma de los poros en la piel), autorreparadores, con frecuencia alcanzan sus dianas sin fragmentarse y con frecuencia se autocargan. Para preparar transferosomas es posible añadir activadores del borde superficial, normalmente surfactantes, a una composición liposómica estándar. Se han utilizado transferosomas para suministrar albúmina sérica a la piel. Se ha demostrado que el suministro mediado por transferosomas de albúmina sérica es tan eficaz como la inyección subcutánea de una disolución que contiene albúmina sérica.
Los surfactantes encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluidas las microemulsiones) y los liposomas. El modo más común de clasificar y categorizar las propiedades de la gran cantidad de tipos diferentes de surfactantes, tanto naturales como sintéticos, es utilizando el equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB, por sus siglas en inglés). La naturaleza del grupo hidrófilo (también conocido como la “cabeza”) proporciona el medio más útil para clasificar los diferentes surfactantes utilizados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, pág. 285).
Si la molécula de surfactante no está ionizada, se clasifica como un surfactante no iónico. Los surfactantes no iónicos encuentran una amplia aplicación en los productos farmacéuticos y cosméticos y se pueden utilizar con un amplio intervalo de valores de pH. En general sus valores de HLB varían de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los surfactantes no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas no iónicas y los éteres tales como etoxilados de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados y polímeros de bloque etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los surfactantes de polioxietileno son los elementos más populares de la clase de surfactantes no iónicos.
Si la molécula de surfactante porta una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como aniónico. Los surfactantes aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, acillactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como alquilsulfatos y alquilsulfatos etoxilados, sulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos, acilisetionatos, aciltauratos y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los elementos más importantes de la clase de surfactantes aniónicos son los alquilsulfatos y los jabones.
Si la molécula de surfactante porta una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como catiónico. Los surfactantes catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más utilizados de esta clase.
Si la molécula de surfactante tiene la capacidad de portar una carga positiva o negativa, el surfactante se clasifica como anfótero. Los surfactantes anfóteros incluyen los derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
El uso de surfactantes en los productos farmacológicos, formulaciones y en emulsiones ha sido objeto de un artículo de revisión (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, pág. 285).
También se puede proporcionar el uso de ARNi como formulaciones micelares en los métodos de la divulgación. Las “micelas” se definen en la presente como un tipo particular de ensamblaje molecular en el cual se disponen las moléculas anfipáticas en una estructura esférica de manera que todas las porciones hidrófobas de las moléculas estén dirigidas hacia dentro, lo que deja las porciones hidrófilas en contacto con la fase acuosa circundante. Existe la disposición contraria si el entorno es hidrófobo.
Una formulación micelar mezclada adecuada para suministro a través de las membranas transdérmicas se puede preparar mezclando una solución acuosa de la composición de ARNip, un (alquil Cs a C22)sulfato de un metal alcalino y compuestos formadores de micela. Los compuestos formadores de micelas ilustrativos incluyen la lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables del ácido hialurónico, ácido gliólico, ácido láctico, extracto de camomila, extracto de pepino, ácido oléico, ácido linoléico, ácido linolénico, monooleína, monooleatos, monolauratos, aceite de borraja, aceite de Oenothera, mentol, trihidroxioxocolanilglicina y sales farmacéuticamente aceptables de estos, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno y análogos de estos, éteres de polidocanolalquilo y análogos de estos, quenodesoxicolato, desoxicolato y mezclas de estos. Los compuestos formadores de micelas se pueden añadir a la vez o después de añadir el alquilsulfato del metal alcalino. Se formarán micelas mezcladas con sustancialmente cualquier tipo de mezclado de los ingredientes pero un mezclado vigoroso proporciona micelas con un tamaño menor.
En un método se prepara una primera composición micelar que contiene la composición de ARNip y al menos alquilsulfato del metal alcalino. La primera composición micelar se mezcla a continuación con al menos tres compuestos formadores de micelas para formar una composición micelar mezclada. En otro método, la composición micelar se prepara mezclando la composición de ARNip, el alquilsulfato del metal alcalino y al menos uno de los compuestos formadores de micela y añadiendo después los compuestos formadores de micelas restantes a la vez que se mezcla vigorosamente.
Se puede añadir fenol y/o m-cresol a la composición micelar mezclada para estabilizar la formulación y protegerla contra crecimiento bacteriano. Como alternativa, se puede agregar fenol y/o m-cresol con los ingredientes formadores de micelas. También se puede añadir un agente isotónico tal como glicerina después de la formación de la composición micelar mezclada.
Para el suministro de la formulación micelar como un espray, la formulación se puede colocar en un dispensador de aerosol y el dispensador se carga con un propulsor. El propulsor, que está a presión, está en forma líquida en el dispensador. Las proporciones de los ingredientes se ajustan de modo que las fases acuosa y de propulsor se vuelven una, es decir, hay una fase. Si hay dos fases, es necesario agitar el dispensador antes de dispensar una porción del contenido, por ejemplo, a través de una válvula dosificadora. La dosis dispensada de agente farmacéutico se expulsa de la válvula dosificadora en un espray fino.
Los propulsores pueden incluir clorofluorocarburos que contienen hidrógeno, fluorocarburos que contienen hidrógeno, éter dimetílico y éter dietílico. En ciertos casos, se puede utilizar HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano).
Las concentraciones específicas de los ingredientes esenciales se pueden determinar mediante una experimentación relativamente directa. Para la absorción a través de la cavidad oral, a menudo es deseable aumentar, por ejemplo, al menos al doble o triple, la dosificación para la inyección o administración a través del tubo gastrointestinal.
Partículas lipídicas
Los ARNi, por ejemplo, ARNbc de la divulgación pueden estar completamente encapsulados en una formulación lipídica, por ejemplo, una LNP, u otra partícula de ácido nucleico-lípido.
Tal como se utiliza en la presente, el término “LNP” se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido estable. Las LNP contienen un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que previene la agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado de PEG-lípido). Las LNP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que presentan vidas medias en circulación prolongadas tras la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (por ejemplo, sitios separados físicamente del sitio de administración). Las LNP incluyen las "pSPLP”, que incluyen un complejo de agente de condensación-ácido nucleico encapsulado como el descrito en la publicación PCT N.° WO 00/03683. Las partículas de la presente divulgación tienen normalmente un diámetro medio comprendido entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 150 nm, más habitualmente entre aproximadamente 60 nm y aproximadamente 130 nm, más habitualmente entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 110 nm, de la forma más habitual entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 90 nm y son sustancialmente atóxicas. Además, los ácidos nucleicos, cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente divulgación, son resistentes en solución acuosa a la degradación con una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se divulgan en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.os 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; la Publicación de EE. UU. N.22010/0324120 y la Publicación PCT N.2 WO 96/40964.
En un caso, la relación entre el lípido y el fármaco (relación masa/masa) (por ejemplo, la relación entre el lípido y el ARNbc) se encuentra en el intervalo de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 50:1, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 25:1, entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 15:1, entre aproximadamente 4:1 y aproximadamente 10:1, entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 9:1 o entre aproximadamente 6:1 y aproximadamente 9:1. También se contemplan como parte de la divulgación los intervalos intermedios respecto a los intervalos citados anteriormente.
El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3- dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (d OTm A), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DOd Ma ), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMACl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAPCl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), o 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodiol (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de estos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1), o una mezcla de estos. El lípido catiónico puede comprender de aproximadamente un 20% mol a aproximadamente un 50% mol o aproximadamente un 40% mol de los lípidos totales presentes en la partícula.
En otro caso, el compuesto 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se puede utilizar para preparar nanopartículas de lípido-ARNip. La síntesis de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se describe en la Solicitud Internacional N.° PCT/US2009/061897, publicada como WO/2010/048536.
En un caso, la partícula de lípido-ARNip incluye un 40% de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10% de DSPC: 40% de colesterol: 10% de PEG-C-DOMG (porcentaje molar) con un tamaño de partícula de 63.0 ± 20 nm y una relación ARNip/lípido de 0.027.
El lípido ionizable/no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro que incluye, sin carácter limitante, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil-PE, 16-O-dimetil-PE, 18-1 -trans-PE, 1 -estearoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de estos. El lípido no catiónico puede ser de aproximadamente un 5% molar a aproximadamente un 90% molar, de aproximadamente un 10% molar, o de aproximadamente un 58% molar si se incluye el colesterol, del contenido lipídico total de la partícula.
El lípido conjugado que inhibe la agregación de las partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido que incluye, sin carácter limitante, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolípido, una PEG-ceramida (Cer) o una mezcla de estos. El conjugado PEG-DAa puede ser, por ejemplo, un PEG-dilauriloxipropilo (Ci2), un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6) o un PEG- diesteariloxipropilo (C]8). El lípido conjugado que previene la agregación de las partículas puede ser de un 0% molar a aproximadamente un 20% molar o aproximadamente un 2% molar del lípido total presente en la partícula.
En algunos casos, la partícula de ácido nucleico-lípido incluye además colesterol, por ejemplo, de aproximadamente un 10% molar a aproximadamente un 60% molar o aproximadamente un 48% molar del lípido total presente en la partícula.
En un caso, se pueden utilizar el lipidoide ND984HCl (MW 1487) (remítase a la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 12/056.230, presentada el 26/03/2008), colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) para preparar nanopartículas de lípido-ARNbc (es decir, partículas de LNP01). Se pueden preparar soluciones madre de cada uno en etanol del siguiente modo: ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramida C16, 100 mg/ml. Las soluciones madre de ND98, colesterol y PEG-ceramida C16 se pueden combinar después con una relación molar, por ejemplo, de 42:48:10. La solución lipídica combinada se puede mezclar con ARNbc acuoso (por ejemplo, en acetato sódico a pH 5) de forma que la concentración de etanol final sea de aproximadamente un 35-45% y la concentración de acetato de sodio final sea aproximadamente 100-300 mM. Las nanopartículas de lípido-ARNbc normalmente se forman espontáneamente tras la mezcla. Dependiendo de la distribución deseada del tamaño de partícula, la mezcla de nanopartículas resultante puede extruirse a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo, corte de 100 nm) utilizando, por ejemplo, una extrusora de cilindro térmico, tal como la extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). En algunos casos, puede omitirse la etapa de extrusión. La eliminación de etanol y el intercambio de tampón simultáneo pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón se puede intercambiar, por ejemplo, por una solución salina tamponada de fosfato (PBS) a aproximadamente pH 7, por ejemplo, a aproximadamente pH 6.9, a aproximadamente pH 7.0, a aproximadamente pH 7.1, a aproximadamente pH 7.2, a aproximadamente pH 7.3 o a aproximadamente pH 7.4. Las formulaciones de LNP01 se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud Internacional N.°: WO 2008/042973.
En la tabla A se describen formulaciones de lípido-ARNbc ilustrativas adicionales.
Tabla A. Formulaciones de lípido ARNbc ilustrativas
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Las abreviaturas de la tabla A incluyen las siguientes: DSPC: distearoilfosfatidilcolina; DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina; PEG-DMG: PEG-didimiristoilglicerol (C14-PEG o PEG-C14) (PEG con un peso molecular promedio de 2000); PEG-DSG: PEG-diestirilglicerol (C18-PEG o PEG-C18) (PEG con peso molecular promedio de 2000); PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG con peso molecular promedio de 2000).
Las formulaciones que comprenden DLinDMA (1,2-dilinoleniloxi-W,W-dimetilaminopropano) se describen en la Publicación Internacional N.°: WO2009/127060, presentada el 15 de abril de 2009.
Las formulaciones que comprenden XTC se describen, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de EE.UU. Con N.° de serie 61/148.366, presentada el 29 de enero de 2009; la Solicitud Provisional de EE.UU. con N.° de serie 61/156.851, presentada el 2 de marzo de 2009; la Solicitud Provisional de EE.UU. con N.° de serie presentada el 10 de junio 2009; la Solicitud Provisional de EE.UU. con N.° de serie 61/228.373, presentada el 24 de julio de 2009; la Solicitud Provisional de EE.UU. con N.° de serie 61/239.686, presentada el 3 de septiembre de 2009 y la Solicitud Internacional N.° PCT/US2010/022614, presentada el 29 de enero de 2010.
Las formulaciones que comprenden MC3 se describen, por ejemplo, en la Publicación de EE.UU. N.° 2010/0324120, presentada el 10 de junio de 2010.
Las formulaciones que comprenden ALNY-100 se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional número PCT/US09/63933, presentada el 10 de noviembre de 2009.
Las formulaciones que comprenden C12-200 se describen en la Solicitud Provisional de EE.UU. con N.° de serie 61/175.770, presentada el 5 de mayo de 2009, y la Solicitud Internacional N.°: PCT/US10/33777, presentada el 5 de mayo de 2010.
Formulaciones adicionales
i. Emulsiones
Las composiciones de la presente divulgación se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de microgotas con un diámetro que normalmente excede los 0.1 pm (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volumen 1, pág. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). A menudo, las emulsiones son sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas de manera íntima y dispersadas entre sí. Por lo general, las emulsiones pueden ser de tipo agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa se divide finamente en microgotas ínfimas y se dispersa en forma de estas en una fase aceitosa a granel, la composición resultante se denomina una emulsión de agua en aceite (w/o). Como alternativa, cuando una fase oleosa se divide finamente en microgotas ínfimas y se dispersa en forma de estas en una fase acuosa a granel, la composición resultante se denomina una emulsión de aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas, y el fármaco activo que puede estar presente como una solución en la fase acuosa, la fase aceitosa o como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizadores, tintes y antioxidantes también pueden estar presentes en emulsiones según se necesite. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que comprenden más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Tales formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que no tienen las emulsiones binarias simples. Las emulsiones múltiples en las que las microgotas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran pequeñas microgotas de agua constituyen una emulsión w/o/w. Asimismo, un sistema de microgotas de aceite confinadas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa proporciona una emulsión o/w/o.
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. Con frecuencia, la fase dispersada o discontinua de la emulsión está bien dispersada en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma mediante emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de las cremas y bases de pomada de tipo emulsión. Otros medios para estabilizar emulsiones conllevan el uso de emulsionantes que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar ampliamente en cuatro categorías: surfactantes sintéticos, emulsionantes de origen natural, bases de absorción y sólidos finamente dispersados (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel Hc ., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Se ha descubierto que los surfactantes sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos tienen una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y han sido objeto de artículos de revisión en la bibliografía (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199). Los surfactantes normalmente son anfifílicos y comprenden una porción hidrófila y una hidrófoba. La relación entre la naturaleza hidrófila y la hidrófoba del surfactante se ha denominado el equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una valiosa herramienta al clasificar y seleccionar surfactantes en la preparación de formulaciones. Los surfactantes se pueden clasificar en diferentes clases en función de la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfóteros (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel Hc ., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285).
Los emulsionantes de origen natural utilizados en las formulaciones en emulsión incluyen la lanolina, cera de abeja, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción poseen propiedades hidrófilas de forma que puedan absorber agua para formar emulsiones w/o que todavía mantienen su consistencia semisólida, tales como lanolina anhidra y la vaselina hidrófila. También se han utilizado sólidos finamente divididos como buenos emulsionantes, especialmente combinados con surfactantes y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas no hinchables tales como la bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de magnesio y aluminio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbón o triestearato de glicerilo.
También están incluidos en las formulaciones en emulsión una gran variedad de materiales no emulsionantes y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los coloides hidrófilos o hidrocoloides incluyen gomas de origen natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando fuertes películas interfaciales alrededor de las microgotas de fase dispersada y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Ya que las emulsiones contienen a menudo varios ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteroles y fosfátidos que pueden fomentar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan conservantes. Los conservantes utilizados habitualmente incluidos en las formulaciones en emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido phidroxibenzoico y ácido bórico. También se añaden habitualmente antioxidantes a las formulaciones en emulsión para prevenir el deterioro de la formulación. Los antioxidantes utilizados pueden ser secuestradores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como el ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y componentes sinérgicos de antioxidantes tales como el ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
La aplicación de las formulaciones en emulsión mediante vía dermatológica, oral y parental y los métodos para su producción ha sido objeto de artículos de revisión en la bibliografía (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Las formulaciones en emulsión para el suministro oral se han utilizado ampliamente debido a su facilidad de formulación, así como también a la eficacia desde el punto de vista de la absorción y la biodisponibilidad (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Los laxantes con base de aceite mineral, las vitaminas liposolubles y las preparaciones nutritivas ricas en grasas están entre los materiales que se han administrado habitualmente por vía oral como emulsiones o/w.
ii. Microemulsiones
En un caso de la presente divulgación, las composiciones de los ARNi y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Se puede definir una microemulsión como un sistema de agua, aceite y un componente anfifílico que es una solución líquida única ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Anse1HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando en primer lugar un aceite en una solución acuosa de un surfactante y a continuación añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, por lo general un alcohol con una longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por tanto, también se han descrito microemulsiones como dispersiones isotrópicamente transparentes y termodinámicamente estables de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan habitualmente mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, surfactante, cosurfactante y electrolito. El que la microemulsión sea de tipo agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y surfactante utilizados y de la estructura y el empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburo de las moléculas de surfactante (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 271).
La estrategia fenomenológica que utiliza diagramas de fase se ha estudiado de forma exhaustiva y ha proporcionado un conocimiento profundo, para el experto en la técnica, sobre cómo formular microemulsiones (remítase, por ejemplo, a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Anse1HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335). En comparación con las emulsiones tradicionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de microgotas termodinámicamente estables que se forman de manera espontánea.
Los surfactantes utilizados en la preparación de las microemulsiones incluyen, sin carácter limitante, los surfactantes iónicos, surfactantes no iónicos, Brij 96, éteres de polioxietilenoleilo, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750) solos o combinados con cosurfactantes. El cosurfactante, normalmente un alcohol de cadena corta, tal como el etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la película del surfactante y, por consiguiente, crear una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de surfactante. Sin embargo, las microemulsiones se pueden preparar sin el uso de cosurfactantes y se conocen en la técnica sistemas de microemulsiones autoemulsionantes exentos de alcohol. La fase acuosa puede normalmente ser, sin carácter limitante, agua, una disolución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, sin carácter limitante, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di, y triglicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son de especial de interés desde el punto de vista de la solubilización del fármaco y la absorción mejorada de fármacos. Se ha propuesto que las microemulsiones con base lipídica (tanto o/w como w/o) mejoran la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluidos los péptidos (remítase, por ejemplo, a las Patentes de EE. UU. N.os 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan las ventajas de una mejor solubilización del fármaco, protección del fármaco frente a la hidrólisis enzimática, posible mejora de la absorción del fármaco debido a las alteraciones inducidas por el surfactante en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral respecto a las formas farmacéuticas sólidas, mejor potencia clíncia y menor toxicidad (remítase, por ejemplo, a las patentes de EE. UU. Nos 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138­ 143). A menudo, se pueden formar microemulsiones de manera espontánea cuando sus componentes se ponen en contacto a la temperatura ambiente. Esto puede ser especialmente conveniente cuando se formulan ARNi, péptidos o fármacos termolábiles. Las microemulsiones también han sido eficaces para el suministro transdérmico de componentes activos en tanto aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Cabe esperar que las composiciones y formulaciones en microemulsión de la presente divulgación faciliten una mayor absorción sistémica de los ARNi y ácidos nucleicos a partir del tubo gastrointestinal, así como también la mejora de la captación celular local de los ARNi y ácidos nucleicos.
Las microemulsiones de la presente divulgación también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para potenciar la absorción de los ARNi y ácidos nucleicos de la presente divulgación. Los potenciadores de la penetración utilizados en las microemulsiones de la presente divulgación se pueden clasificar por pertenecer a una de cinco amplias categorías --surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no surfactantes no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de estas clases se ha tratado anteriormente.
iii. Micropartículas
Un agente de iARN de la divulgación se puede incorporar en una partícula, por ejemplo, una micropartícula. Las micropartículas se pueden producir mediante secado por aspersión, pero también se pueden producir mediante otros métodos que incluyen la liofilización, evaporación, secado en lecho fluido, secado al vacío, o una combinación de estas técnicas.
iv. Potenciadores de la penetración
En un caso, la presente divulgación emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar el suministro eficaz de ácidos nucleicos, especialmente ARNi, a la piel de los animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto formas ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, normalmente solo los fármacos liposolubles o lipófilos cruzan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden cruzar membranas celulares si la membrana que se va a cruzar se trata con un potenciador de la penetración. Además de ayudar en la difusión de los fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos.
Los potenciadores de la penetración se pueden clasificar por pertenecer a una de cinco amplias categorías, es decir, surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no surfactantes ni quelantes (remítase, por ejemplo, a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee etal., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág.92). Cada una de las clases mencionadas anteriormente de potenciadores de la penetración se describe a continuación en mayor detalle.
Los surfactantes (o “agentes tensioactivos”) son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de los ARNi a través de la mucosa. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, el laurilsulfato de sodio, éter polioxietilen-9-laurílico y éter polioxietilen-20-cetílico) (remítase, por ejemplo, a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, Ny , 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág.92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Los diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, el ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-mono-oleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C1-20 de estos (por ejemplo, de metilo, isopropilo y t-butilo), y mono- y diglicéridos de estos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (remítase, por ejemplo, a Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; E1Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
La función fisiológica de la bilis incluye facilitar la dispersión y absorción de los lípidos y vitaminas liposolubles (remítase, por ejemplo, a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, Ny , 2002; Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, págs. 934-935). Las diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de la penetración. Por lo tanto, el término “sales biliares” incluye cualquiera de los componentes de origen natural de la bilis, así como también cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, el ácido cólico (o su sal sódica farmacéuticamente aceptable, el colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio éter polioxietilen-9-laurílico (POE) (remítase, por ejemplo, a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci, 1990, 79, 579-583).
Los agentes quelantes, tal como se utilizan en relación con la presente divulgación, se pueden definir como compuestos que eliminan iones metálicos de la disolución formando complejos con ellos, con el resultado de que se potencia la absorción de los ARNi a través de la mucosa. En lo que respecta a su uso como potenciadores de la penetración en la presente divulgación, los agentes quelantes presentan la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de la DNasa, ya que la mayoría de ADN-nucleasas caracterizadas requieren un ion metálico bivalente para la catálisis y, por lo tanto, son inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes adecuados incluyen, sin carácter limitante, el etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados de W-acilo del colágeno, laureth-9 y derivados de W-aminoacilo de las beta-dicetonas (enaminas) (remítase, por ejemplo, a Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Los compuestos potenciadores de la penetración no surfactantes ni quelantes, tal como se utilizan en la presente, se pueden definir como compuestos que presentan una actividad insignificante como agentes quelantes o como surfactantes pero que, a pesar de ello, potencian la absorción de los ARNi a través de la mucosa alimentaria (remítase, por ejemplo, a Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluye, por ejemplo, las ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1 -alquil- y 1-alquenilazacicloalcanona (Lee etal., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroides tales como el diclofenaco de sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
También se pueden añadir a las composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente divulgación agentes que potencian la captación de los ARNi en el nivel celular. Por ejemplo, también se sabe que los lípidos catiónicos, tales como la lipofectina (Junichi et al., Patente de EE.UU. n° 5.705.188), los derivados de glicerol catiónicos y las moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731) potencian la captación celular de ARNbc. Los ejemplos de reactivos de transfección comercializados incluyen, por ejemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, c A), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Reactivo de Transfección X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiza), Reactivo de Transfección Liposomal DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiza), Reactivo de Transfección Liposomal DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiza), o Fugene (Grenzacherstrasse, Suiza), Reactivo Transfectam® (Promega; Madison, WI), Reactivo de Transfección TransFast™ (Promega; Madison, W i), Reactivo Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), Reactivo Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marsella, Francia), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marsella, Francia), Reactivo de Transfección TransPass8 D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EE. UU.), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EE. UU.), Reactivo de Transfección PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), Reactivo de Transfección NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), Reactivo de Transfección GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), Reactivo de Transfección GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), Reactivo de Transfección Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), Reactivo de Transfección BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), Reactivo de Transfección TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.) o HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EE. UU.), entre otros.
Se pueden utilizar otros agentes para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, que incluyen los glicoles tales como el etilenglicol y el propilenglicol, los pirroles tales como el 2-pirrol, las azonas y los terpenos tales como el limoneno y la mentona.
v. Portadores
Ciertas composiciones de la presente divulgación también incorporan compuestos portadores en la formulación. La expresión “compuesto portador” o “portador”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un ácido nucleico, o un análogo de este, que es inerte (es decir, que no tiene actividad biológica per se) pero que es reconocido como un ácido nucleico por los procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, normalmente con un exceso de la última sustancia, puede producir una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperada en el hígado, riñón u otros depósitos extracirculatorios, supuestamente debido a la competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente con fosforotioato en tejido hepático se puede reducir cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4’-isotiocianoestilbeno-2-2’-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Excipientes
A diferencia de un compuesto portador, un “portador farmacéutico” o “excipiente” es un disolvente, agente de suspensión o cualquier otro portador inerte desde un punto de vista farmacológico, farmacéuticamente aceptable para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta el modo previsto de administración, de manera que se proporcione el volumen, consistencia, etc. deseados, cuando se combine con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, sin carácter limitante, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); materiales de relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).
También se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos para formular las composiciones de la presente divulgación. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin carácter limitante, el agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para la administración tópica de los ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases de aceite líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin carácter limitante, el agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
vii. Otros componentes
Las composiciones de la presente divulgación pueden contener además otros componentes auxiliares que se encuentran tradicionalmente en las composiciones farmacéuticas, con sus niveles de uso establecidos en la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles, adicionales tales como, por ejemplo, antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas farmacéuticas de las composiciones de la presente divulgación, tales como tintes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir excesivamente con la actividad biológica de los componentes de las composiciones de la presente divulgación. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interaccionan de manera perjudicial con el ácido o los ácidos nucleicos de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, la carboximetilcelulosa de sodio, el sorbitol y/o el dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen (a) uno o más compuestos de ARNi y (b) uno o más agentes que actúan mediante un mecanismo que no es iARN y que son útiles para tratar, por ejemplo, PH1.
Estudio de las composiciones
La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis eficaz desde un punto de vista terapéutico en el 50% de la población). La relación posológica entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que presentan altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de composiciones que se describen en la presente se encuentra por lo general dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos descritos en la presente, la dosis eficaz desde un punto de vista terapéutico se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos en animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando convenga, del producto polipeptídico de una secuencia diana (por ejemplo, logrando una menor concentración del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) como se ha determinado en el cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar con más exactitud dosis útiles en los seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Además de su administración, como se ha analizado previamente, los ARNi descritos en la divulgación se pueden administrar combinados con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por una sobrecarga de hierro y que se pueden tratar inhibiendo la expresión de HAO1. En cualquier caso, el médico a cargo de la administración puede ajustar la cantidad y el momento exacto de la administración de ARNi en función de los resultados observados utilizando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en la presente.
V. Métodos para inhibir la expresión de HAO1
La presente divulgación proporciona métodos para inhibir la expresión de HAO1 (hidroxiácido-oxidasa 1) en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de HAO1 en la célula, para inhibir de este modo la expresión de HAO1 en la célula.
La puesta en contacto de una célula con un agente de iARN bicatenario se puede realizar in vitro o in vivo. La puesta en contacto de una célula in vivo con el agente de iARN incluye poner en contacto una célula o grupo de células dentro de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, con el agente de iARN. También son posibles combinaciones in vitro e in vivo de métodos de puesta en contacto. La puesta en contacto puede ser directa o indirecta, como se analizado anteriormente. Además, la puesta en contacto de una célula se puede lograr mediante un ligando de direccionamiento, que incluye cualquier ligando descrito en la presente o conocido en la técnica. En algunos casos, el ligando de direccionamiento es un resto de carbohidrato, por ejemplo, un ligando de GalNAc3, o cualquier otro ligando que dirige el agente de iARN a un sitio de interés, por ejemplo, el hígado de un sujeto.
El término “inhibir,” tal como se utiliza en la presente, se utiliza indistintamente con “reducir,” “silenciar,” “disminuir de manera regulada” y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
La frase “inhibir la expresión de un HAO1” pretende referirse a la inhibición de la expresión de cualquier gen HAO1 (tal como, por ejemplo, un gen de HAO1 de ratón, un gen de HAO1 de rata, un gen de HAO1 de mono o un gen de HAO1 humano) así como también de variantes o mutantes de un gen HAO1. Por consiguiente, el gen HAO1 puede ser un gen HAO1 natural, un gen HAO1 mutante o un gen HAO1 transgénico en el contexto de una célula, grupo de células u organismo modificados genéticamente.
La expresión “inhibir la expresión de un gen HAO1” incluye cualquier nivel de inhibición de un gen de HAO1, por ejemplo, al menos una supresión parcial de la expresión de un gen de HAO1. La expresión del gen HAO1 se puede evaluar en función del nivel, o el cambio del nivel, de cualquier variable asociada con la expresión del gen HAO1, por ejemplo, el nivel de ARNm de HAO1 o el nivel de la proteína HAO1. Este nivel se puede evaluar en una célula individual o en un grupo de células, que incluyen, por ejemplo, una muestra obtenida a partir de un sujeto.
La inhibición se puede evaluar por una disminución en un nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables que están asociadas a la expresión de HAO1 en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utilice en la técnica, por ejemplo, un nivel inicial predosis, o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula o muestra similar que no esté tratado o tratado con un control (tal como, por ejemplo, control solo con tampón o control con un agente inactivo).
En algunos casos de los métodos de la divulgación, la expresión de un gen de HAO1 se inhibe en al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98% o al menos aproximadamente un 99%.
La inhibición de la expresión de un gen HAO1 se puede manifestar por una reducción de la cantidad de ARNm expresado por una primera célula o grupo de células (tales células pueden estar presentes, por ejemplo, en una muestra obtenida a partir de un sujeto) en las que un gen HAO1 se transcribe y que ha sido tratada o han sido tratadas (por ejemplo, poniendo en contacto la célula o células con un agente de iARN de la divulgación o administrando un agente de iARN de la divulgación a un sujeto en el que las células están o estaban presentes) de forma que se inhiba la expresión de un gen HAO1, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células, pero que no se ha tratado o no se han tratado así (célula o células de control). En algunos casos, la inhibición se evalúa expresando el nivel de ARNm en las células tratadas como un porcentaje del nivel de ARNm en las células de control, usando la siguiente fórmula:
(ARNm en las células ele control) (ARNm en las células tratadas)
--------------------------------------------------------— ---------------------------------------------------- - • 100 %
(ARNm en las células ele control)
Como alternativa, la inhibición de la expresión de un gen HAO1 se puede evaluar en función de una reducción de un parámetro que está ligado desde un punto de vista funcional a la expresión del gen HAO1, por ejemplo, la expresión de la proteína HAO1. El silenciamiento del gen HAO1 se puede determinar en cualquier célula que exprese HAO1, tanto de manera constitutiva como por ingeniería genómica, y mediante cualquier ensayo conocido en la técnica. El hígado es el principal sitio de expresión de HAO1. Otros sitios de expresión significativos incluyen los riñones y el útero.
La inhibición de la expresión de una proteína HAO1 se puede manifestar mediante una reducción del nivel de la proteína HAO1 que es expresada por parte de una célula o grupo de células (por ejemplo, el nivel de la proteína expresada en una muestra obtenida a partir de un sujeto). Tal como se ha explicado anteriormente para la evaluación de la supresión de ARNm, la inhibición del nivel de expresión de la proteína en una célula o grupo de células tratadas se puede expresar de manera similar como un porcentaje del nivel de la proteína en una célula o grupo de células de control.
Una célula o grupo de células de control que se puede utilizar para evaluar la inhibición de la expresión de un gen HAO1 incluye una célula o grupo de células que aún no se ha puesto en contacto con un agente de iARN de la divulgación. Por ejemplo, la célula o grupo de células de control se puede obtener a partir de un sujeto individual (por ejemplo, un sujeto humano o animal) antes del tratamiento del sujeto con un agente de iARN.
El nivel de ARNm de HAO1 que es expresado por una célula o grupo de células se puede determinar utilizando cualquier método conocido en la técnica para evaluar la expresión de ARNm. En un caso, el nivel de expresión de HAO1 en una muestra se determina detectando un polinucleótido transcrito, o porción de este, por ejemplo, el ARNm del gen HAO1. El ARN se puede extraer de las células utilizando técnicas de extracción de ARN que incluyen, por ejemplo, la utilización de la extracción con fenol ácido/isotiocianato de guanidina (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparación de ARN RNeasy (Qiagen) o PAXgene (PreAnalytix, Suiza). Los formatos de ensayo normales que utilizan la hibridación del ácido ribonucleico incluyen los ensayos de transcripción nuclear, RT-PCR, ensayos de protección de RNasa (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), transferencia Northern, hibridación in situ y análisis de micromatrices.
En un caso, el nivel de expresión de HAO1 se determina utilizando una sonda de ácido nucleico. El término “sonda”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier molécula que es capaz de unirse de manera selectiva a un HAO1 específico. Las sondas pueden ser sintetizadas por un experto en la técnica u obtenerse a partir de preparados biológicos apropiados. Las sondas se pueden diseñar específicamente para ser marcadas. Los ejemplos de moléculas que se pueden utilizar como sondas incluyen, sin carácter limitante, el ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas.
Se puede utilizar ARNm aislado en los ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, sin carácter limitante, análisis de Southern o Northern, análisis mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y matrices de sondas. Un método para determinar el nivel de ARNm conlleva poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se puede hibridar con ARNm de HAO1. En un caso, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, migrando el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En un caso alternativo, la sonda o sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la sonda o sondas, por ejemplo, en un matriz de genochips Affymetrix. Un experto puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm conocidos para su uso en la determinación del nivel de ARNm de HAO1.
Un método alternativo para determinar el nivel de expresión de HAO1 en una muestra conlleva el proceso de amplificar el ácido nucleico y/o utilizar una transcriptasa inversa (para preparar el ADNc) con, por ejemplo, el ARNm en la muestra, por ejemplo, mediante RT-PCR (el caso experimental expuesta en Mullis, 1987, Patente de EE. UU. N.° 4.683.202), la reacción en cadena de la ligasa (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), la replicación de la secuencia autosuficiente (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), el sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), la replicasa Q-Beta (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), la replicación en círculo rodante (Lizardi et al., Patente de Ee . UU. N.° 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para detectar moléculas de ácidos nucleicos si tales moléculas están presentes en números muy bajos. En aspectos particulares de la divulgación, el nivel de expresión de HAO1 se determina mediante RT-PCR fluorogénica cuantitativa (es decir, el sistema TaqMan™).
El nivel de expresión de ARNm de HAO1 se puede monitorizar utilizando una transferencia en membrana (tal como se utiliza en los análisis de hibridación tales como Northern, Southern, en puntos y similares) o micropocillos, tubos de muestra, geles, microesferas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos unidos). Remítase a las Patentes de EE. UU. N.os 5.770.722, 5.874.219, 5.744.305, 5.677.195 y 5.445.934. La determinación del nivel de expresión de HAO1 también puede comprender la utilización de sondas de ácido nucleico en solución.
En algunos casos, el nivel de expresión de ARNm se evalúa utilizando ensayos de ADN ramificado (ADNr) o PCR en tiempo real (qPCR). El uso de estos métodos se describe y ejemplifica en los ejemplos presentados en este documento.
El nivel de la expresión de proteínas HAO1 se puede determinar utilizando cualquier método conocido en la técnica para medir los niveles de proteínas. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía de hiperdifusión, reacciones con precipitina fluida o en gel, espectroscopía de absorción, ensayos colorimétricos, ensayos espectrofotométricos, citometría de flujo, inmunodifusión (individual o doble), inmunoelectroforesis, inmunoelectrotransferencia, radioinmunoensayo (RIA), ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, ensayos electroquimioluminiscentes y similares.
El término “muestra”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una colección de fluidos, células, o tejidos similares aislados de un sujeto, así como también a fluidos, células, o tejidos presentes en un sujeto. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen la sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, fluidos oculares y similares. Las muestras de tejido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras se pueden obtener de órganos, partes de órganos, o fluidos o células particulares dentro de aquellos órganos. En ciertos casos, las muestras se pueden obtener a partir del hígado (por ejemplo, hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células del hígado tales como, por ejemplo, los hepatocitos). En algunos casos, una “muestra obtenida de un sujeto” se refiere a la sangre o plasma extraídos del sujeto. En casos adicionales, una “muestra que se obtiene a partir de un sujeto” se refiere a tejido hepático obtenido a partir del sujeto.
En algunos casos de los métodos de la divulgación, el agente de iARN se administra a un sujeto de manera que el agente de iARN se suministre a un sitio específico en el sujeto. La inhibición de la expresión de HAO1 se puede evaluar utilizando mediciones del nivel o cambio en el nivel del ARNm de HAO1 o proteína HAO1 en una muestra obtenida a partir de fluido o tejido del sitio específico en el sujeto. En algunos casos, el sitio es el hígado. El sitio también puede ser una subsección o subgrupo de células de cualquiera de los sitios mencionados anteriormente. El sitio también puede incluir células que expresan un tipo particular de receptor.
VI. Métodos para tratar o prevenir un trastorno asociado a HAO1
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades y afecciones que se pueden modular con la expresión del gen HAO1. Por ejemplo, las composiciones descritas en la presente se pueden utilizar para tratar cualquier trastorno asociado con PH1.
La eficacia del tratamiento o de la prevención de la enfermedad se puede evaluar, por ejemplo, midiendo el progreso de la enfermedad, la remisión de la enfermedad, la gravedad de los síntomas, la reducción del dolor, la calidad de vida, la dosis de la medicación requerida para conservar el efecto del tratamiento, el nivel de un marcador de la enfermedad o cualquier otro parámetro medible apropiado para una enfermedad dada que se está tratando o que se intenta prevenir. Está comprendido en las competencias del experto en la técnica monitorizar la eficacia del tratamiento o de la prevención midiendo cualquiera de tales parámetros o cualquier combinación de los parámetros.
Un efecto preventivo o del tratamiento es evidente cuando hay una mejora significativa desde un punto de vista estadístico en uno o más parámetros del estado de la enfermedad, o por una imposibilidad de empeorar o desarrollar síntomas que se anticiparían de otro modo. A modo de ejemplo, un cambio favorable de al menos un 10% en un parámetro medible de la enfermedad, y preferentemente al menos un 20%, 30%, 40%, 50% o más, puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia de un fármaco de ARNi dado o de la formulación de dicho fármaco también se puede juzgar utilizando un modelo experimental en animales para la enfermedad dada, tal como se sabe en la técnica. Si se utiliza un modelo experimental en animales, la eficacia del tratamiento se prueba cuando se observa una reducción significativa desde un punto de vista estadístico en un marcador o síntoma.
Como alternativa, la eficacia se puede medir teniendo en cuenta una reducción en la gravedad de la enfermedad según puede determinar un experto en la técnica del diagnóstico en función de una escala graduada de la gravedad de la enfermedad clínicamente aceptada.
En algunos casos de los métodos de la divulgación, la expresión de HAO1 disminuye durante una duración prolongada, por ejemplo, al menos una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas o más. Por ejemplo, en ciertos casos, la expresión del gen HAO1 se suprime en al menos aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o un 100% administrando un agente de ARNi descrito en la presente. En algunos casos, el gen HAO1 se suprime en al menos aproximadamente un 60%, 70% u 80% admnistando el agente de ARNi. En algunos casos, el gen HAO1 se suprime al menos aproximadamente un 85%, 90% o 95% administrando el oligonucleótido bicatenario. En otro caso, el gen HAO1 se mantiene suprimido durante 7 días, 10 días, 20 días, 30 días o más tras la administración.
Administración
Los agentes de iARN de la divulgación se pueden administrar a un sujeto utilizando cualquier modo de administración conocido en la técnica, que incluye, sin carácter limitante, la subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraocular, intrabronquial, intrapleural, intraperitoneal, intraarterial, linfática, cerebroespinal y cualquier combinación de estas. En algunos casos, los agentes se administran por vía subcutánea.
En algunos casos, la administración es mediante una inyección de liberación prolongada. Una inyección de liberación prolongada puede liberar el agente de iARN de una forma constante durante un periodo de tiempo prolongado. Por lo tanto, una inyección de liberación prolongada puede reducir la frecuencia de dosificación necesaria para obtener un efecto deseado, por ejemplo, una inhibición deseada de HAO1, o un efecto terapéutico o profiláctico. Una inyección de liberación prolongada puede también proporcionar concentraciones más constantes en el suero. Las inyecciones de liberación prolongada pueden incluir inyecciones subcutáneas o inyecciones intramusculares. En algunos casos, la inyección de liberación prolongada es una inyección subcutánea.
En algunos casos, la administración es mediante una bomba. La bomba puede ser una bomba externa o una bomba implantada mediante cirugía. En ciertos casos, la bomba es una bomba osmótica implantada de manera subcutánea. En otros casos, la bomba es una bomba de infusión. Se puede utilizar una bomba de infusión para infusiones intravenosas, subcutáneas, arteriales o epidurales. En algunos casos, la bomba de infusión es una bomba de infusión subcutánea. En otros casos, la bomba es una bomba implantada mediante cirugía que administra el agente de iARN al hígado.
Otros modos de administración incluyen la administración epidural, intracerebral, intracerebroventricular, nasal, intraarterial, intracardiaca, infusión intraósea, intratecal e intravítrea, y pulmonar. El modo de administración se puede elegir basándose en si se desea tratamiento local o sistémico y basándose en el área que se va a tratar. Se pueden elegir la ruta y sitio de administración para mejorar el direccionamiento.
El método incluye administrar un agente de ARNi, por ejemplo, una dosis suficiente para disminuir el nivel de ARNm de HAO1 durante al menos 5, más preferentemente 7, 10, 14, 21,25, 30 o 40 días; y opcionalmente, administrar una segunda dosis única de ARNbc, donde la segunda dosis única se administra al menos 5, más preferentemente 7, 10, 14, 21,25, 30 o 40 días después de administrar la primera dosis única, y se inhibe así la expresión del gen HAO1 en un sujeto.
En un caso, la dosis del agente de ARNi de la divulgación se administra no más de una vez cada cuatro semanas, no más de una vez cada tres semanas, no más de una vez cada dos semanas o no más de una vez a la semana. En otro caso, las administraciones se pueden mantener durante uno, dos, tres o seis meses, o un año o más. En otra realización, las dosis del agente de ARNi de la invención se administran una vez a la semana durante tres semanas.
Por lo general, el agente de ARNi no activa el sistema inmunitario, por ejemplo, no aumenta el nivel de citocinas, tales como nivel de TNF-alfa o IFN-alfa. Por ejemplo, cuando se mide mediante un ensayo, tal como un ensayo de PBMC in vitro, tal como se describe en la presente, el aumento en los niveles de TNF-alfa o IFN-alfa es inferior a un 30%, 20% o un 10% de las células de control tratadas con un ARNbc de control, tal como un ARNbc que no tiene como diana HAO1.
Por ejemplo, se puede administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de un agente de ARNi, tal como 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg o 3 mg/kg de ARNbc. El agente de ARNi se puede administrar mediante infusión intravenosa durante un periodo de tiempo, tal como durante un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos o 25 minutos. La administración se repite, por ejemplo, regularmente, tal como a las dos semanas (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de un patrón de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar con menos frecuencia. Por ejemplo, después de la administración cada dos semanas durante tres meses, la administración se puede repetir una vez al mes, durante seis meses o un año o más. La administración del agente de ARNi puede reducir los niveles de HAO1, por ejemplo, en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimento del paciente en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% o más.
Antes de administrar una dosis completa del agente de ARNi, se puede administrar a los pacientes una dosis más pequeña, tal como una dosis que resulte en una reacción de infusión inferior a un 5%, y monitorizar para detectar efectos adversos, tales como una reacción alérgica o niveles de lípidos o tensión arterial elevados. En otro ejemplo, se puede monitorizar al paciente para detectar efectos inmunoestimulantes indeseados, tales como un aumento en los niveles de citocinas (por ejemplo, TNF-alfa o INF-alfa).
Se puede identificar a un paciente que necesite un agente de iARN para HAO1 recopilando los antecedentes familiares. Un profesional sanitario, tal como un médico, enfermera o miembro de la familia, puede recopilar los antecedentes familiares antes de recetar o administrar un ARNbc de HAO1. También se puede llevar a cabo una prueba de ADN en el paciente para identificar una mutación en el gen AGT1, antes de administrar un agente de iARN para HAO1 al paciente. El diagnóstico de PH1 se puede confirmar mediante cualquier prueba conocida por el experto en la técnica.
Un efecto preventivo o del tratamiento es evidente cuando hay una mejora significativa desde un punto de vista estadístico en uno o más parámetros del estado de la enfermedad, o por una imposibilidad de empeorar o desarrollar síntomas que se anticiparían de otro modo. A modo de ejemplo, un cambio favorable de al menos un 10% en un parámetro medible de la enfermedad, y preferentemente al menos un 20%, 30%, 40%, 50% o más, puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia para un agente de ARNi dado de la divulgación o formulación de ese agente de ARNi también se puede determinar utilizando un modelo experimental en animales para la enfermedad dada tal como se sabe en la técnica. Si se utiliza un modelo experimetnal en animales, la eficacia del tratamiento se prueba cuando se observa una reducción significativa desde un punto de vista estadístico en un marcador o síntoma.
La dosis de un agente de iARN que se administra a un sujeto se puede adaptar para equilibrar los riesgos y beneficios de una dosis particular, por ejemplo, para lograr un nivel deseado de supresión del gen HAO1 (como se evalúa, por ejemplo, en función de la supresión de ARNm de HAO1, la expresión de proteína HAO1 o una reducción del nivel de oxalato) o un efecto terapéutico o profiláctico deseado, a la vez que se evitan los efectos secundarios no deseables.
En algunas realizaciones, el agente de iARN se administra en dos o más dosis. Si se desea facilitar infusiones repetidas o frecuentes, puede ser recomendable implantar un dispositivo de suministro, por ejemplo, una bomba, prótesis endovascular semipermanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o un depósito. En algunos casos, el número o cantidad de dosis posteriores depende de si se logra un efecto deseado, por ejemplo, la supresión de un gen HAO1, o de si se logra un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, reducir la sobrecarga de hierro. En algunos casos, el agente de iARN se administra según una programación. Por ejemplo, el agente de iARN puede administrarse una vez a la semana semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana o cinco veces a la semana. En algunos casos, la programación conlleva administraciones separadas de manera regular, por ejemplo, cada hora, cada cuatro horas, cada seis horas, cada ocho horas, cada doce horas, diariamente, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente. En otros casos, el programa conlleva administraciones con una separación pequeña, seguidas de un periodo de tiempo más prolongado durante el cual no se administra el agente. Por ejemplo, la programación puede conllevar un conjunto inicial de dosis que se administran en un periodo de tiempo relativamente corto (por ejemplo, aproximadamente cada 6 horas, aproximadamente cada 12 horas, aproximadamente cada 24 horas, aproximadamente cada 48 horas o aproximadamente cada 72 horas), seguido de un periodo de tiempo más prolongado (por ejemplo, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas o aproximadamente 8 semanas) durante el cual el agente de iARN no se administra. En un caso, el agente de iARN se administra al principio cada hora y después se administra con un intervalo mayor (por ejemplo, diariamente, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente). En otro caso, el agente de iARN se administra al principio diariamente y después se administra con un intervalo mayor (por ejemplo, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente). En ciertos casos, el intervalo más largo aumenta con el tiempo o se determina en función de si se logra un efecto deseado. En un caso específico, el agente de iARN se administra una vez al día durante una primera semana, seguido de la dosificación semanal que comienza al octavo día de la administración. En otro caso específico, el agente de iARN se administra cada dos días durante una primera semana, seguido de dosificación semanal que comienza al octavo día de la administración.
En algunos casos, el agente de iARN se administra con un patrón posológico que incluye una “fase de carga” de administraciones con una separación pequeña que puede ir seguida de una “fase de mantenimiento”, en la que el agente de iARN se administra con intervalos más separados. En un caso, la fase de carga comprende cinco administraciones diarias del agente de iARN durante la primera semana. En otro caso, la fase de mantenimiento comprende una o dos administraciones semanales del agente de iARN. En un caso adicional, la fase de mantenimiento dura 5 semanas.
Cualquiera de estas programaciones se puede repetir de manera opcional durante una o más iteraciones. El número de iteraciones puede depender del logro de un efecto deseado, por ejemplo, la supresión de un gen HAO1, y/o el logro de un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, reducir el nivel de oxalato o reducir un síntoma de PH1.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para enseñar al usuario final, por ejemplo, un cuidador o un sujeto, a administrar un agente de ARNi descrito en la presente. El método incluye, de manera opcional, proporcionar al usuario final una o más dosis del agente de ARNi, y enseñar al usuario final a administrar el agente de ARNi con un patrón descrito en la presente, para enseñar de esta manera al usuario final.
VII. Kits
La presente divulgación también proporciona kits para utilizar cualquiera de los agentes de ARNi y/o llevar a la práctica cualquiera de los métodos de la divulgación. Tales kits incluyen uno o más agentes de iARN e instrucciones para su uso, por ejemplo, instrucciones para inhibir la expresión de un HAO1 en una célula poniendo en contacto la célula con el agente o los agentes de iARN en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de1HAO1. De manera opcional, los kits pueden comprender además medios para poner en contacto la célula con el agente de iARN (por ejemplo, un dispositivo de inyección) o medios para medir la inhibición de HAO1 (por ejemplo, medios para medir la inhibición de ARNm de HAO1 o proteína HAO1). Tales medios para medir la inhibición de HAO1 pueden comprender un medio para obtener una muestra de un sujeto, tal como, por ejemplo, una muestra de plasma. De manera opcional, los kits de la divulgación pueden comprender además medios para administrar el agente o los agentes de iARN a un sujeto o medios para determinar la cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico o eficaz desde un punto de vista profiláctico.
VII. Marcadores diagnósticos para PH1 y afecciones relacionadas
También se describen en la presente marcadores y métodos para diagnosticar afecciones patológicas provocadas por la sobreproducción de oxalato, especialmente PH1 y afecciones relacionadas, así como también agentes para tratar dichas afecciones.
De acuerdo con otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para tratar una afección de PH1 en un sujeto (enfermedades que forman piedras, especialmente PH1). El método diagnóstico comprende las etapas de: (a) reducir la expresión de HAO1 en un sujeto (b) obtener suero biológico de dicho sujeto; y (b) determinar el nivel de glicolato en dicho suero. Cabe señalar que el nivel elevado de glicolato en el suero, en comparación con un control negativo, indica la inhibición de la enzima glicolato-oxidasa para prevenir la producción de oxalato provocada en las afecciones de PH1.
También se describe en la presente un kit para diagnosticar una afección de PH1, incluyendo dicho kit lo siguiente: (a) un agente para determinar la presencia de un analito de interés en el suero, donde dicho analito de interés es uno de glicolato; y (b) medios de calibración. Por ejemplo, dicho analito de interés es glicolato y dicho agente es un ARNip que tiene como diana HAO1.
Ejemplos
Materiales y métodos
Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en los Ejemplos. Los términos “HAO” y “GO”, tal como se utilizan en la presente, se utilizan indistintamente.
Síntesis de ARNip
Se produjeron ARN monocatenarios mediante síntesis en fase sólida en una escala de 1 pmol utilizando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darm-stadt, Alemania) y vidrio de poro controlado (CPG, 500Á, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. Se generó ARN y ARN que contenía nucleótidos de tipo 2’-0-metilo mediante síntesis en fase sólida empleando, respectivamente, los fosforamiditos y 2’-0-metilfosforamiditos correspondientes (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Se incorporaron los componentes básicos en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena oligorribonucleotídica utilizando la química habitual de los fosforamiditos de los nucleósidos tal como se describe en Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE. UU. Se introdujeron las uniones de tipo fosforotioato reemplazando la solución oxidante de yodo por una solución de reactivo Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, UK) en acetonitrilo (1%). Se obtuvieron reactivos auxiliares adicionales de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).
La desprotección y purificación de los oligonucleótidos crudos por HPLC de intercambio aniónico se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Se determinaron los rendimientos y concentraciones mediante la absorción de UV de una solución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm utilizando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, UnterschleiBheim, Alemania).
Se generó ARN bicatenario mezclando una solución equimolar de hebras complementarias en tampón de hibridación (fosfato de sodio 20 mM, pH 6.8; cloruro de sodio 100 mM), calentando en un baño de agua a 85 - 90 °C durante 3 minutos y enfriando hasta la temperatura ambiente durante un periodo de 3 - 4 horas. La solución de ARN hibridado se almacenó a -20 °C hasta el momento de uso.
En algunos casos, se sintetizó un dúplex (ARNbc) más de una vez. Se marcaron los diferentes lotes con diferentes extensiones. Por ejemplo, AD-62933.1 y AD-62933.2 son diferentes lotes del mismo dúplex.
Cultivo celular y transfecciones
Se utilizaron hepatocitos primarios de mono cinomolgo (PCH) y hepatocitos primarios de ratón (PMH). Se transfectaron PCH (Celsis n.° M003055, lote CBT) o PMH (recién aislados) añadiendo 14.8pL de Opti-MEM más 0.2pL de Lipofectamine RNAiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA. n.° de cat. 13778-150) a 5pL de dúplex de ARNip por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 80pL de medio InVitroGRO CP para ratas (InVitro Technologies) que contenían ~2 x104 de células PCH o PMH a la mezcla del ARNip. Las células se incubaron durante 24 horas antes de la purificación del ARN. Se realizaron experimentos con una única dosis con una concentración del dúplex de 10 o 20 nM y 0.1 o 0.2 nM y los experimentos de respuesta a la dosis se realizaron en un intervalo de dosis que comprendía concentraciones del dúplex desde 10 nM hasta 36 fM con diluciones con un factor de 8 y 6.
Aislam iento del ARN total
Se aisló el ARN total utilizando el kit de aislamiento del ARNm DYNABEADS (Invitrogen, parte n.°: 610-12). Se recolectaron las células y se lisaron en 150 pL de tampón de lisis/unión, a continuación se mezclaron durante 5 minutos a 850 rpm usando una mezcladora térmica de Eppendorf (la velocidad de mezcla fue la misma durante todo el proceso). Se añadieron diez microlitros de microesferas magnéticas y 80 pL de mezcla de tampón de lisis/unión a una placa de fondo redondo y se mezclaron durante 1 minuto. Se capturaron las perlas magnéticas usando un soporte magnético y se retiró el sobrenadante sin alterar las microesferas. Después de retirar el sobrenadante, las células lisadas se añadieron a las microesferas restantes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, las microesferas magnéticas se lavaron 2 veces con 150 pL de tampón de lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Se capturaron las microesferas de nuevo y se retiró el sobrenadante. A continuación, las microesferas se lavaron con 150 pL de tampón de lavado B, se capturaron y se retiró el sobrenadante. A continuación, las microesferas se lavaron con 150 pL de tampón de elución, se capturaron y se retiró el sobrenadante. Las microesferas se dejaron secar durante 2 minutos. Después del secado, se añadieron 50 pL de tampón de elución y se mezclaron durante 5 minutos a 70 °C. Las microesferas se capturaron con un imán durante 5 minutos. Se retiraron 40 pL de sobrenadante y se añadieron a otra placa de 96 pocillos.
Síntesis del ADNc
La síntesis del ADNc se llevó a cabo uitilizando el kit de transcripción inversa de ADNc ultrarrápido ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, n.° cat. 4368813).
Para cada reacción, se añadió una mezcla maestra de 2 pL de un tampón 10X, 0.8 pL de dNTP 25X, 2 pL de cebadores aleatorios, 1 pL de una Transcriptasa Inversa, 1 pL de un inhibidor de ARNasa y 3.2 pL de H2O, a 10 pL de ARN total. El ADNc se generó usando un ciclador térmico C-1000 o S-1000 de Bio-Rad (Hercules, CA), siguiendo las siguientes etapas: 25 oC 10 min, 37 oC 120 min, 85 oC 5 s, mantener a 4oC.
PCR en tiempo real
Se añadieron 2 pL de ADNc a una mezcla maestra que contenía 0.5 pL de GAPDH de ratón (n.° de cat. 4352339E Life Technologies) o Sondas TaqMan para GAPDH de mono cinomolgo diseñadas de manera personalizada: (F-GCATCCTGGGCTACACTGA, (SEQ ID NO: 13) R- TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC (SEQ ID NO: 14), Sonda-CCAGGTGGTCTCCTCC (SEQ ID NO: 15)), 0.5 pL de HAO1 humano o de ratón (HS00213909_M1- que presenta reactividad cruzada con HOA1 de mono cinomolgo, Mm 00439249_m1 para los ensayos con ratón, Life Technologies) y 5 pL de la mezcla maestra de la sonda Lightcycler 480 (Roche n.° cat. 04887301001) por pocillo en 50 placas de 384 pocillos (Roche n.° cat. 04887301001). Se llevó a cabo la PCR en tiempo real en un sistema de PCR en tiempo real LightCycler480 (Roche) utilizando el ensayo AACt(RQ). Se estudió cada dúplex en dos transfecciones independientes, y cada transfección se sometió a ensayo por duplicado, a menos que se indique de otro modo en las tablas de resumen.
Para calcular las veces de cambio relativo, se analizaron datos en tiempo real usando el método de AACt y se normalizó respecto a los ensayos realizados con células transfectadas con AD-1955 10nM, o células sometidas a una transfección simulada. Se calcularon los valores de CI50 utilizando un modelo de ajuste de 4 parámetros utilizando XLFit y se normalizaron respecto a las células transfectadas con AD-1955 o células vírgenes.
Las secuencias sentido y antisentido de AD-1955 son: SENTIDO: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' (SEQ ID NO: 16); y ANTISENTIDO: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (SEQ ID NO: 17).
Tabla B: Abreviaturas de monómeros de nucleótido usados en la representación de secuencias de ácidos nucleicos.
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Ejemplo 1. Diseño, especificidad y predicción de la eficacia del ARNip
Se llevó a cabo un diseño de ARNip para identificar ARNip que tuvieran como diana transcritos de HAO1 humanos, de mono cinomolgo, ratón y rata registrados en la base de datos de genes del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).
En el diseño se utilizaron los siguientes transcritos de la colección RefSeq del NCBI: el ARNm de HAO1 humano (Homo sapiens) es NM_017545.2; el ARNm de HAO1 de mono cinomolgo (Macaca fascicularis) es XM_005568381.1; el ARNm de h Ao 1 de ratón (Mus musculus) es NM_010403.2; y el ARNm de HAO1 de rata (Rattus norvegicus) es XM_006235096.1.
Debido a la elevada divergencia de las secuencias de primate/roedor, se diseñaron los dúplex de ARNip en varios lotes separados, que incluyeron, sin carácter limitante, lotes que contenían dúplex que coincidían con transcritos humanos y de cino únicamente; transcritos humanos, de cino, ratón y rata únicamente; y transcritos de ratón y rata únicamente. Se diseñaron todos los dúplex de ARNip de manera que presentaran una identidad de un 100% con el transcripto humano y con los transcriptos de otras especies mencionados que se consideraron en cada lote de diseño (anteriormente).
Se predijo la especificidad de todos los posibles nonadecámeros a partir de cada secuencia. A continuación, se seleccionaron los nonadecámeros candidato que carecían de repeticiones mayores de 7 nucleótidos. Estos 1069 ARNip candidato humano/cino, 184 humanos/cino/ratón/rata y 579 de ratón/rata se utilizaron en búsquedas exhaustivas frente a transcriptomas adecuados (definidos como el conjunto de registros NM_ y XM_ dentro de los conjuntos de Refseq del NCBI de seres humanos, de cino, de ratón o rata) utilizando un algoritmo exhaustivo de "fuerza bruta" implementado en el script Python ‘BruteForce.py’. A continuación, con el script se analizaron las alineaciones de transcrito-oligo para generar una calificación basada en la posición y número de emparejamientos erróneos entre el ARNip y cualquier transcrito “diferente del objetivo” potencial. La puntuación de la diferencia respecto a la diana se pondera para enfatizar las diferencias en la región "seminal" de los ARNip, en las posiciones 2-9 desde del extremo 5' de la molécula. A cada par de oligo-transcrito de la búsqueda de fuerza bruta se le asignó una calificación de los emparejamientos erróneos sumando las calificaciones individuales de los emparejamientos erróneos; los emparejamientos erróneos en las posiciones 2-9 se contaron como 2.8, los emparejamientos erróneos en las posiciones 10-11 del sitio de escisión se contaron como 1.2 y los emparejamientos erróneos en la región 12-19 contó como 1.0. Se realizó una predicción adicional de los transcritos diferentes del objetivo comparando la frencuencia de los heptámeros y octámeros derivados de 3 hexámeros diferentes derivados de la semilla de cada oligo. Se usaron los hexámeros de las posiciones 2-7 respecto al inicio 5' para crear 2 heptámeros y un octámero. Se creó el heptámero 1 añadiendo una A en 3’ al hexámero; se creó el heptámero 2 añadiendo una en 5' al hexámero; se creó el octámero añadiendo una A a ambos extremos 5' y 3' del hexámero. Se precalculó la frecuencia de los octámeros y heptámeros en 3'UTRome humana, de cino, ratón o rata (que se define como la subsecuencia del transcriptoma de la base de datos de Refseq del NCBI donde el extremo de la región codificante, la "CDS", está claramente definido). Se normalizó la frecuencia de los octámeros se normalizó respecto a la frecuencia de los heptámeros utilizando el valor mediano del intervalo de frecuencias de los octámeros. A continuación, se calculó una “calificación de siembra mir” ("mirSeedScore") calculando la suma de ((3 X recuento de octámeros normalizado) (2 X recuento del heptámero 2) (1 X recuento del heptámero 1)).
Se distribuyeron ambas hebras de ARNip en una categoría de especificidad en función de las calificaciones calculadas: una calificación superior a 3 se consideró sumamente específica, igual a 3, específica y entre 2.2 y 2.8 se consideró moderadamente específica. Se clasificaron los ARNip según la especificidad de la hebra antisentido. A continuación, se seleccionaron los dúplex de los conjuntos humano/cino y ratón/rata cuyos oligos antisentido carecían de GC en la primera posición, carecían de G en las posiciones 13 y 14 y tenían 3 o más U o A en la región seminal (características de dúplex con una eficacia predicha elevada). De manera similar, se seleccionaron los dúplex de los conjuntos humano/cino/ratón y humano/cino/ratón/rata que tenían 3 o más U o A en la región seminal.
Se diseñaron dúplex candidato conjugados con GalNAc, con una longitud de 21 y 23 nucleótidos de las hebras sentido y antisentido, respectivamente, extendiendo los nonadecámeros antisentido 4 nucleótidos adicionales en la dirección 3' (conservando una complementariedad perfecta con el transcrito diana). Se especificó la hebra sentido como la complementaria inversa de los primeros 21 nucleótidos del fragmento de 23 monómeros antisentido. Se seleccionaron los dúplex que conservaron apareamientos perfectos en todos los transcritos de las especies seleccionadas en los 23 nucleótidos.
Las hebras antisentido que contuvieron C o G en la primera posición en 5’ se modificaron para que tuvieran U en la primera posición en 5’, a menos que al hacerlo se introdujera una secuencia de 4 o más U contiguos (5' ^ 3'), en cuyo caso se modificaron para que tuvieran una A en la primera posición en 5’. Las hebras sentido que se iban a emparejar para formar dúplex con estas hebras antisentido con “cambios a UA” se modificaron de la manera correspondiente para mantener la complementariedad. Los ejemplos descritos a continuación incluyen AD-62989 y AD-62993.
Se sintetizaron oligómeros de 21/23 unidades derivados de un total de 31 hebras sentido y 31 hebras antisentido de humano/cino, 19 hebras sentido y 19 hebras antisentido de humano/cino/ratón/rata y 48 hebras sentido y 48 hebras antisentido de ratón/rata y con ellos se formaron dúplex conjugados con GalNAc.
Las secuencias de las hebras sentido y antisentido de los dúplex modificados se muestran en la tabla 1 y las secuencias de las hebras sentido y antisentido de los dúplex no modificados se muestran en la tabla 2.
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Ejemplo 2. Cribado de dosis única in vitro en hepatocitos prim arios de mono
Se evaluaron los dúplex de ARNip contra HAO1 modificados y conjugados para determinar la eficacia mediante ensayos de transfección en hepatocitos primarios de mono. Se realizaron transfecciones con los ARNip contra HAO1 con dos dosis, 10 nM y 0.1 nM. Los resultados de estos ensayos se muestran en la tabla 3 y los datos se expresan como una fracción del mensaje que permanece en las células transfectadas con ARNip que tienen como diana HAO1, respecto a las células transfectadas con un ARNip de control negativo, AD-1955 ± la desviación estándar (DE). Los resultados se muestran en la figura 3A. En la figura 3B se ilustra la respuesta a la dosis con uno de los conjugados más activos (n.° 31) (AD-62933) del cribado inicial con dos dosis; la CI50 fue ~19pM.
Tabla 3a. Cribado de dosis única de HAO1 en hepatocitos de mono
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(continuación)
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Tabla 3b. Cribado de dosis única de HAO1 adicional en hepatocitos primarios de mono
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(continuación)
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(continuación)
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Ejemplo 3. Cribado de dosis única in vitro en hepatocitos prim arios de ratón
Se evaluaron los dúplex de ARNip contra HAO1 modificados y conjugados para determinar la eficacia mediante ensayos de transfección en hepatocitos primarios de ratón. Se realizaron transfecciones con los ARNip contra HAO1 con dos dosis, 20 nM y 0.2 nM. Los resultados de estos ensayos se muestran en la tabla 4 y los datos se expresan como una fracción del mensaje que permanece en las células transfectadas con ARNip que tienen como diana HAO1, respecto a las células transfectadas con un ARNip de control negativo, AD-1955 ± la desviación estándar (DE).
Tabla 4a. Cribado de dosis única de HAO1 en hepatocitos primarios de ratón
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Tabla 4b. Cribado de dosis única de HAO1 adicional en hepatocitos primarios de ratón
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(continuación)
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(continuación)
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Ejemplo 4. Cribado de respuesta a la dosis en hepatocitos prim arios de mono.
Se determinaron las IC50 de los ARNip contra HAO1 modificados y conjugados en hepatocitos primarios de mono. Se realizaron transfecciones con ARNip contra HAO1 en un intervalo de dosis con concentraciones finales del dúplex entre 10 nM y 36 fM con diluciones con un factor de 8 y 6. Los resultados de estos ensayos se muestran en la tabla 5.
Tabla 5a. Cribado de respuesta a la dosis de HAO1 en hepatocitos primarios de ratón.
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(continuación)
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Tabla 5b. Cribado de respuesta a la dosis de HAO1 adicional en hepatocitos primarios de ratón.
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Ejemplo 5. Cribado de respuesta a la dosis en hepatocitos prim arios de ratón.
Se determinaron las IC50 de los ARNip contra HAO1 modificados y conjugados en hepatocitos primarios de ratón. Se realizaron transfecciones con ARNip contra HAO1 en un intervalo de dosis con concentraciones finales del dúplex entre 10 nM y 36 fM con diluciones con un factor de 8 y 6. Los resultados de estos ensayos se muestran en la tabla 6.
Tabla 6a. Cribado de respuesta a la dosis de HAO1 en hepatocitos primarios de ratón.
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(continuación)
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Tabla 6b. Cribado de respuesta a la dosis de HAO1 adicional en hepatocitos primarios de ratón.
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Tabla 7. Cribado de dosis única de HAO1 adicional en hepatocitos primarios de cino y ratón
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(continuación)
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Tabla 8. Cribado de dosis única adicional en hepatocitos primarios de cino
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(continuación)
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Ejemplo 6. Evaluación in vivo de los conjugados GO-GalNAc en ratones C57B6
Se administraron dosis de 10, 5, 2.5 o 1.25 mg/kg por vía subcutánea de los conjugados GO-GalNAc a ratones C57B6 y se evaluó la disminución del ARNm en el hígado 72 horas después de la dosis utilizando qPCR. Las DE50 de dosis única fueron de aproximadamente 1.25 y 2.5 mg/kg para el compuesto A (AD-62994) y el compuesto B (AD-62933), respectivamente. En estudios de dosis repetida, se administraron dosis por vía subcutánea de los conjugados semanalmente (QW) durante 4 semanas y se evaluó el nivel de ARNm de GO 72 horas después de la 4.a dosis. Las DE50 de dosis repetida fueron ~0.3 mg/kg para ambos compuestos. Los resultados se muestran en la figura 4.
Ejemplo 7. Evaluación in vivo de la inactivación génica de GO e impacto en el n ive l de oxalato en ratones con una inactivación génica de AGXT
Se administró una dosis por vía intravenosa de 1 mg/kg de ARNip contra GO (AD-40257) en una nanopartícula lipídica a ratones con una inactivación génica de AGXT (Salido et al (2006) PNAS 103:18249). Se midió el nivel urinario de oxalato o glicolato en el día 15 utilizando cromatografía iónica/espectroscopía de masas. Los resultados se muestran en la figura 5. Se expresan los datos respecto a los valores previos a la dosis y se normalizaron respecto a la creatinina (Cr) para controlar la dilución de la orina. N = 4 ratones por grupo y las barras de error representan la desviación estándar.
Ejemplo 8. Evaluación in vivo de los conjugados de GO-GalNAc en un modelo en ratas de inactivación génica de AGXT.
Para generar un modelo de PH1 en ratas, se administró una dosis de 1 mg/kg por vía intravenosa de un ARNip contra AGXT (AD-63102) en una LNP (AF-011 -63102) a ratas hembra Sprague Dawley en el día 1 y el día 7 para mantener la inactivación génica de AGXT en el hígado de la rata y se añadió un 1% de etilenglicol al agua de bebida para estimular aún más la producción de oxalato. En el día 0 y el día 7 también se administraron dosis a algunas ratas de un conjugado de GalNAc-ARNip contra GO (AD-62994) o control de PBS. Los resultados se muestran en la figura 6. En la figura 6A se muestra la cuantificación del nivel de ARNm de AGXT en el hígado 72 horas después de una única dosis de 1 mg/kg de ARNip contra AGXT en una LNP. En la figura 6B, se cuantificó el nivel urinario de oxalato a partir de orina de 24 horas recogida desde el día -1 al 0, del día 3 al 4, del día 5 al 6, y del día 7 al 8. Los datos se normalizaron respecto a la creatinina para controlar la dilución de la orina. N = 3 para los grupos de AGXT y N = 2 para el grupo de control con PBS. En la figura 6C, se controlaron esas mismas ratas (como en la figura 6B) hasta 49 días con una dosificación semanal en los días 14 y 21 tanto de AF-011-63102 como de AD-62994 y recogidas de orina de 24 h tal como se muestra. El etilenglicol siguió estando presente en el agua de bebida hasta el día 28. En la figura 6D, se muestra la duración de la inactivación génica de HAO1 en las ratas midiendo el nivel de ARNm una semana o cuatro semanas después de las 4 últimas dosis (que corresponden a los días 28 y 49 en la figura 6C) y expresada respecto al nivel observado en ratas tratadas con PBS. De principio a fin, las barras de error representan la desviación estándar.
Nombre del
dúplex Diana SentidoWksNombre
AD-40257.1 HAO1 NM_017545.2_1306-1324_s
AD-40257.2 HAO1 NM_017545.2_1306-1324_s
AD-63102.1 AGXT NM_016702.3_1109-1127_s
AD-63102.2 AGXT NM_016702.3_1109-1127_s
AD-63102.3 AGXT NM 016702.3 1109-1127 s
Nombre del Secuencia de la hebra sentido Secuencia de la hebra sentido SEQ ID dúplex modificada no modificada NO:
UUCAAUGGGUGUCCUAGG 770 & 771 AD-40257.1 uucAAuGGGuGuccuAGGAdTsdT A
UUCAAUGGGUGUCCUAGG 770 & 771 AD-40257.2 uucAAuGGGuGuccuAGGAdTsdT A
AD-63102.1 AcAAcuGGAGGGAcAucGudTsdT ACAACUGGAGGGACAUCGU 772 & 773 AD-63102.2 AcAAcuGGAGGGAcAucGudTsdT ACAACUGGAGGGACAUCGU 772 & 773 AD-63102.3 AcAAcuGGAGGGAcAucGudTsdT ACAACUGGAGGGACAUCGU 772 & 773
Nombre del Secuencia de la hebra antisentido Secuencia de la hebra SEQ ID NO: dúplex modificada antisentido no modificada UCCuAGGAcACCcAUUGAAdTsd UCCUAGGACACCCAUUGA 774 & 775 AD-40257.1 T A
UCCuAGGAcACCcAUUGAAdTsd UCCUAGGACACCCAUUGA 774 & 775 AD-40257.2 T A
ACGAUGUCCCUCcAGUUGUdTs ACGAUGUCCCUCCAGUU 776 & 777 AD-63102.1 dT GU
ACGAUGUCCCUCcAGUUGUdTs ACGAUGUCCCUCCAGUU 776 & 777 AD-63102.2 dT GU
ACGAUGUCCCUCcAGUUGUdTs ACGAUGUCCCUCCAGUU 776 & 777 AD-63102.3 dT GU
EJEMPLO 9: Evaluación in vivo de los conjugados GO-GalNAc
En la tabla 7 se administró una única dosis subcutánea de los conjugados ARNip contra GO-GalNAc a ratones hembra C57BL/6 con una edad de 6-8 semanas. Los ratones se sacrificaron después de 72 horas y se sometió el hígado a ensayo para determinar el ARNm de HAO mediante análisis de ADNr. Los resultados se muestran en la figura 13.
Tabla 7: Conjugados de ARNip contra GO (HAO)-GalNAc
Nombre del SEQ ID NO: dúplex Secuencia de la hebra sentido modificada
AD-62989.2 UfscsCfuAfgGfaAfCfCfuUfuUfaGfaAfaUfL96 778
AD-62994.2 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGfgAfaAfuAfuAfL96 779
AD-62933.2 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCfaUfcGfaCfaAfL96 780
AD-62935.2 CfsasUfuGfgUfgAfGfGfaAfaAfaUfcCfuUfL96 781
AD-62940.2 AfsusCfgAfcAfaGfAfCfaUfuGfgUfgAfgAfL96 782
AD-62941.2 AfscsAfuUfgGfuGfAfGfgAfaAfaAfuCfcUfL96 783
AD-62944.2 GfsasAfaGfuCfaUfCfGfaCfaAfgAfcAfuUfL96 784
AD-62965.2 AfsasAfgUfcAfuCfGfAfcAfaGfaCfaUfuAfL96 785
Nombre del dúplex Hebra antisentido modificada SEQ ID NO AD-62989.2 asUfsuUfcUfaAfaAfgguUfcCfuAfgGfascsa 786
AD-62994.2 usAfsuAfuUfuCfcAfggaUfgAfaAfgUfcscsa 787
AD-62933.2 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuUfcAfcAfuUfcsusg 788
AD-62935.2 asAfsgGfaUfuUfuUfccuCfaCfcAfaUfgsusc 789
AD-62940.2 usCfsuCfaCfcAfaUfgucUfuGfuCfgAfusgsa 790
AD-62941.2 asGfsgAfuUfuUfuCfcucAfcCfaAfuGfuscsu 791
AD-62944.2 asAfsuGfuCfuUfgUfcgaUfgAfcUfuUfcsasc 792
AD-62965.2 usAfsaUfgUfcUfuGfucgAfuGfaCfuUfuscsa 793
Nombre del Conejillo de MM respecto dúplex Reactividad cruzada Indias? MM respecto a ratón a GP AD-62989.2 Hs sí pos8
AD-62994.2 Hs no pos16 pos2,12,16 AD-62933.2 Hs/Mm sí
AD-62935.2 Hs/Mm sí
AD-62940.2 Hs/Mm sí
AD-62941.2 Hs/Mm sí
AD-62944.2 Hs/Mm sí
AD-62965.2 Hs/Mm sí
EJEMPLO 10: Evaluación in vivo de los conjugados GO-GalNAc en ratones
Se administró una única dosis subcutánea de 3 mg/kg de varios conjugados de ARNip contra GO-GalNAc descritos en la presente o un control de PBS a ratones hembra C57 BL/6. Los ratones se sacrificaron después de 72 horas y se evaluó la disminución del ARNm de HAO1 en el hígado utilizando qPCR. Los resultados se muestran en la figura 14, expresados respecto al control de PBS.
EJEMPLO 11: Evaluación de la respuesta a la dosis de los conjugados GO-GalNAc en ratones
Se administró una única dosis subcutánea de 1 o 3 mg/kg de uno de los conjugados de ARNip contra GO-GalNAc: compuesto A (AD-62994), compuesto B (AD-62933), compuesto C (a D-65644), compuesto D (AD-65626), compuesto E (AD-65590), compuesto F (AD-65585) o control de PBS a ratones hembra C57 BL/6. Los ratones se sacrificaron diez días después y se evaluó la disminución del ARNm de HAO1 en el hígado utilizando qPCR. En los estudios de dosis repetida, se administraron dosis semanales (QW) por vía subcutánea de los compuestos C, D, F o PBS durante 4 semanas y se evaluó el nivel de ARNm de HAO1 en el hígado 10 días después de la última dosis. Los resultados de la dosis única se muestran en la figura 15 y los experimentos de dosis repetida se muestran en la figura 16, expresados respecto al control de PBS. Estos datos muestran una mejor potencia de los compuestos AD-65644 y AD-65626 respecto a AD-62933, y de los compuestos AD-65590 y AD-65585 respecto a AD-62994.
EJEMPLO 12: Evaluación de la respuesta a la dosis de l com puesto D en ratones
Se administró una única dosis subcutánea de 0.1, 0.3, 1, 3 o 10 mg/kg de AD-65626 o control de PBS a ratones C57 BL/6 hembra. Los ratones se sacrificaron diez días después y se evaluó la disminución del ARNm de HAO1 en el hígado utilizando qPCR; los resultados expresados respecto al control de PBS se muestran en la figura 17. Con estos resultados se demuestra una mejora de la potencia superior al triple en comparación con el compuesto AD-62933.
EJEMPLO 13: Relación de la d ism inución del ARNm respecto a l n ive l de g lico la to en suero en ratones
Se administró una única dosis subcutánea de 0.1, 0.3, 1, 3 o 10 mg/kg de AD-65585 o control de PBS a ratones C57 BL/6 hembra. Los ratones se sacrificaron diez días después y se evaluó la disminución del ARNm de HAO1 en el hígado utilizando qPCR; los resultados se expresan respecto al control de PBS. El nivel de glicolato en las muestras de suero de esos mismos ratones se cuantificaron utilizando cromatografía iónica acoplada a espectroscopía de masas, tal como se ha descrito previamente (Knight et al., Anal. Biochem. 1 de febrero de 2012; 421(1): 121-124). Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 18.
Con estos resultados se demuestra que AD-65585 es tan potente como AD-65626, teniendo ambos una DE50 de dosis única de ~0.3 mg/kg en ratones WT. Además, el silenciamiento del ARNm de HAO1 resulta en un aumento de glicolato en suero sensible a la dosis de hasta 4 veces (aproximadamente 200 gM) con las dos dosis más elevadas.
EJEMPLO 14: Relación de la d ism inución del ARNm respecto a l n ive l de g lico la to en suero en ratas
Se administró una única dosis subcutánea de 1, 3 o 10 mg/kg de AD-65626 o control de PBS a ratas Sprague Dawley macho. Las ratas se sacrificaron catorce días después y se evaluó la disminución del ARNm de HAO1 en el hígado utilizando qPCR; los resultados se expresan respecto al control de PBS. El nivel de glicolato en las muestras de suero de las mismas ratas extraídas antes de la dosificación y en el día 14 se cuantificó utilizando cromatografía iónica acoplada con espectrometría de masas, de nuevo tal como se ha descrito (Knight et al., Anal. Biochem. 1 de febrero de 2012; 421 (1): 121-124). Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 19.
Tal como se observó en los ratones no modificados, con estos resultados se demuestra que el silenciamiento del ARNm de HAO1 en ratas Sprague Dawley da como resultado un aumento del glicolato en suero sensible a la dosis de hasta 12 veces (aproximadamente 140 gM) con la dosis más elevada.
EJEMPLO 15: Estudios farm acológicos con ALN-65585
Inhib ición de HAO1 en los hepatocitos.
Se transfectaron hepatocitos primarios de cino con RNAimax (Invitrogen) con diluciones en serie de AD-65585 (ALN-65585, "ALN-GO1") o un control de Luciferasa ARNm sin diana (AD1955) 10 nM. El nivel relativo del ARNm de HAO1 se determinó normalizando respecto al nivel del ARNm de GAPDH, cuantificado según RT-PCR en tiempo real. Los datos se representaron gráficamente para calcular el valor de CI50 de 10 pM. Los resultados se muestran en la figura 20.
La transfección in vitro de AD-65585 demuestra una DE50 de aproximadamente 10 pM en hepatocitos primarios de cinomolgo.
Farmacología con una única dosis en ratón
Se evaluó la farmacología de ALN-GO1 en ratones cuantificando el nivel de ARNm de HAO1 hepático y el nivel de glicolato en suero (figura 21). Una dosis SC única de ALN-GO1 dio como resultado una supresión dependiente de la dosis del ARNm de HAO1 con una dosis de 10 mg/kg, que dio como resultado un silenciamiento de DE90. Se estimó que la dosis de DE50 para silenciar GO1 en el ratón era de 0.3 mg/kg. El nivel de glicolato en suero aumentó en función de la dosis con un nivel máximo de aproximadamente 4 veces por encima del valor inicial. Los resultados se muestran en la figura 21, e ilustran el nivel de ARNm de HAO1 hepático y de glicolato en suero 10 días después de una única dosis subcutánea de ALN-65585 en ratones C57BL/6. Las barras representan la media de 3 o 4 animales y las barras de error representan la desviación estándar.
Duración de una única dosis en ratón
El silenciamiento de GO1 fue duradero y reversible después de una única dosis SC (figura 22). Una única dosis SC de 3 mg/kg de ALN-GO1 en ratones dio como resultado un silenciamiento del ARNm >70% durante aproximadamente 6 semanas, tras lo cual el nivel de ARNm volvió al nivel inicial en las 12 semanas posteriores a la dosis. Los resultados se muestran en la figura 22: Nivel de ARNm de HAO1 hepático en múltiples puntos temporales tras una única dosis subcutánea de ALN-65585 en ratones C57BL/6. Cada punto temporal representa la media de 3 animales y las barras de error representan la desviación estándar.
Farmacología con una única dosis en rata
Se evaluó la farmacología de ALN-GO1 en ratas cuantificando el nivel de ARNm de HAO1 hepático (figura 23). Una dosis SC única de ALN-GO1 a ratas Sprague Dawley macho dio como resultado una supresión dependiente de la dosis del ARNm de HAO1 con una dosis de >3 mg/kg, que dio como resultado un silenciamiento de DE90. Los resultados se muestran en la figura 23: Nivel de ARNm de HAO1 hepático 10 días después de una única dosis subcutánea de ALN-65585 en ratas Sprague Dawley. Las barras representan la media de 3 animales y las barras de error representan la desviación estándar. Se estimó que la dosis de DE50 para silenciar GO1 en la rata era de 0.3 mg/kg.
Farmacología con una única dosis en ratón con una inactivación génica de AGXT
Se evaluó el impacto de ALN-GO1 en el nivel de oxalato en un modelo de PH1 en ratones con una inactivación génica de AGXT. Los resultados se muestran en la figura 24: Excreción urinaria de 24 h de oxalato (parte superior) y glicolato (parte inferior) de ratones con una inactivación génica de Agxt tras una única dosis subcutánea de ALN-65585. Las letras diferentes se refieren a una diferencia significativa entre los 3 grupos de dosis en cada semana específica (n = 3 por dosis). La excreción urinaria en el tiempo no cambió de manera significativamente en el animal de control con PBS (n = 1).
Se observó una reducción dependiente de la dosis del nivel urinario de oxalato después de una única dosis de ALN-GO1 con un máximo de aproximadamente un 50% de disminución de oxalato con la dosis de 3 mg/kg que duró >3 semanas antes de volver al nivel anterior a la dosis. Se observó un aumento dependiente de la dosis del nivel urinario de glicolato después de una única dosis de ALN-GO1 con un incremento máximo de aproximadamente 5 veces con la dosis de 3 mg/kg que duró >4 semanas.
Farmacología de dosis única en un modelo en ratas de inducción de PH1
Se evaluó ALN-GO1 en un segundo modelo en roedores de PH1 donde se inhibió la AGXT hepática en las ratas utilizando ARNip y se estimuló el nivel de oxalato con etilenglicol (figura 25A y figura 25B). Se cuantificó el ARNm de HAO1 hepático y el oxalato urinario de 24 h para determinar el grado de reducción de HAO1 requerido para una reducción de oxalato máxima. Los resultados se muestran en la figura 25A y la figura 25B: Nivel de ARNm de HAO1 hepático en un modelo en ratas de inducción de PH1 14 días después de una única dosis subcutánea de ALN-65585 y una dosificación semanal de AF-011 -ARNip contra AGXT (2 dosis de 1 mg/kg). Oxalato urinario de 24 h normalizado respecto a la creatinina urinaria. Las barras representan la media de 3 animales y las barras de error representan la desviación estándar. El gráfico de correlación entre la reducción de ARNm y oxalato representa animales individuales de múltiples experimentos.
Con una única dosis de ALN-GO1 en este modelo se demostró una reducción de ARNm y de oxalato urinario sensible a la dosis, con una reducción máxima de ARNm de aproximadamente un 85% y una reducción máxima de oxalato urinario de aproximadamente un 90% observadas con la dosis más elevada de ALN-GO1 (figura 25A y figura 25B). En este modelo en ratas de inducción de PH1, las reducciones de ARNm y oxalato urinario dieron como resultado una correlación 1:1.
Farmacología de dosis m últip le en un modelo en ratas de inducción de PH1
Se evaluó la potencia de ALN-GO1 en estudios en ratas normales con una actividad de AGXT inhibida y etilenglicol (un modelo de inducción de PH1) cuantificando el ARNm de HAO1 hepático y el oxalato urinario de 24 h. Los resultados se muestran en la figura 26: Nivel de ARNm de HAO1 hepático en un modelo en ratas de inducción de PH1 28 días después de una dosificación subcutánea repetida de ALN-65585 y una dosificación IV repetida de AF-011-ARNip contra AGXT (4 dosis de 1 mg/kg). Oxalato urinario de 24 h normalizado respecto a la creatinina urinaria. Las barras representan la media de 2 o 3 animales y las barras de error representan la desviación estándar.
El tratamiento con ALN-GO1 dio como resultado reducciones sostenidas de oxalato urinario en todos los grupos de tratamiento durante aproximadamente 3 semanas. En el día 28 después de la dosificación repetida de ALN-GO1 (y cuatro dosis de AF-011-AGXT) se observó en todos los grupos una reducción del ARNm >95% y una disminución del oxalato urinario >85%.
Farmacología m ultidosis en NHP
Se evaluó la farmacología de ALN-GO1 en monos cinomolgo (primate no humano (NHP, por sus siglas en inglés)) cuantificando el ARNm de HAO1 en una biopsia hepática y el nivel del glicolato en suero. En la siguiente tabla se muestra el resumen del estudio de Farmacología en NHP, en el que se detallan la cantidad de la dosis y el patrón posológico.
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Los resultados se muestran en la figura 27. Nivel de glicolato en suero en NHP para todos los grupos en el día 85, los datos representan los promedios de grupo de 3 animales por grupo, las líneas representan la desviación estándar. ARNm de HAO1 de la biopsia hepática en el día 29, las líneas representan los promedios del grupo, los símbolos representan el nivel de ARNm de animales individuales respecto a un control de PBS el día 29.
Después del primer mes de dosificación (día 29), se observó un silenciamiento del ARNm sensible a la dosis en todos los grupos, con un silenciamiento del ARNm de hasta un 99% en los grupos 6 y 7, a los que se les administró mensualmente dosis de 4 mg/kg o semanalmente dosis de 2 mg/kg. El nivel elevado máximo de glicolato en suero de aproximadamente 70 pM se mantuvo durante al menos 3 semanas en el grupo 6 al que se le administró mensualmente dosis de 4 mg/kg. Glicolato en suero intermedio
EJEMPLO 16: Secuencias de ARNip adicionales
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Se llevó a cabo un diseño de ARNip adicional para identificar ARNip que tenían como diana HAO1 NM_017545.2.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un agente de iARN bicatenario capaz de inhibir la expresión de HAO1 en una célula, en donde dicho agente de iARN bicatenario comprende una hebra sentido y una hebra antisentido que forman una región bicatenaria, donde dicha hebra sentido y dicha hebra antisentido comprenden una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos respecto de la secuencia antisentido de la SEQ ID NO:706; donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra antisentido son nucleótidos modificados, y
donde dicha hebra sentido está conjugada con un ligando unido al extremo 3’.
2. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, donde todos los nucleótidos de dicha hebra sentido y todos los nucleótidos de dicha hebra antisentido son nucleótidos modificados.
3. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1 o 2, donde al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona a partir del grupo constituido por un nucleótido de tipo desoxitimidina (dT) 3’ terminal, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-0-metilo, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-fluoro, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-amino, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido que comprende un 5’-fosfato o un mimétido de 5’-fosfato y un nucleótido terminal unido a un derivado colesterilo o un grupo de tipo bisdecilamida del ácido dodecanoico.
4. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, donde al menos una hebra comprende una protuberancia en 3' de al menos 1 nucleótido.
5. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, donde al menos una hebra comprende una protuberancia en 3' de al menos 2 nucleótidos.
6. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, donde el ligando es
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7. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, donde dicho agente de iARN comprende 6 a 8 uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato.
8. El iARN bicatenario de la reivindicación 7, donde la hebra antisentido comprende dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato en el extremo 5’ y dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato en el extremo 3’, y la hebra sentido comprende al menos dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato en el extremo 5’ o en el extremo 3’.
9. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, donde el par de bases en la posición 1 del extremo 5’ de la hebra antisentido del dúplex es un par de bases AU.
10. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, donde el agente de iARN es el agente que comprende la secuencia de la hebra sentido gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauauaL96 (SEQ ID N0:213) y la secuencia de la hebra antisentido usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa (SEQ ID N0:330) (AD-65585), donde L96 es W-[tris(GalNAcalquil)amidodecanoil]-4-hidroxiprolinol (Hyp-(GalNAc-alquilo)3), Af es 2'-fluoroadenosin-3'-fosfato, Cf es 2'-fluorocitidin-3'-fosfato, Uf es 2'-fluorouridin-3'-fosfato, a es 2'-0-metiladenosin-3'-fosfato, c es 2'-0-metilcitidin-3'-fosfato, g es 2'-0-metilguanosin-3'-fosfato, u es 2'-0-metiluridin-3'-fosfato y s es una unión de tipo fosforotioato.
11. El agente de iARN bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra sentido comprenden una modificación seleccionada a partir del grupo constituido por una modificación de tipo 2’-0-metilo y una modificación de tipo 2’-fluoro,
donde dicha hebra sentido comprende dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato en el extremo 5’, donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha hebra antisentido comprenden una modificación seleccionada a partir del grupo constituido por una modificación de tipo 2’-0-metilo y una modificación de tipo 2’-fluoro,
donde dicha hebra antisentido comprende dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato en el extremo 5’ y dos uniones internucleotídicas de tipo fosforotioato en el extremo 3’, y
donde dicha hebra sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente en el extremo 3’.
12. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 11 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno asociado a HAO1, donde dicho agente de iARN se administará por vía subcutánea a un sujeto.
13. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 12, donde todos los nucleótidos de dicha hebra sentido y todos los nucleótidos de dicha hebra antisentido comprenden una modificación.
14. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 12, donde el sujeto es un ser humano.
15. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 14, donde el ser humano tiene hiperoxaluria primaria de tipo 1 (PH1).
16. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 12, donde el agente de iARN bicatenario se administrará con una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg.
17. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 16, donde el agente de iARN bicatenario se administrará con una dosis de aproximadamente 0.1 mg/kg, aproximadamente 1.0 mg/kg o aproximadamente 3.0 mg/kg.
18. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 16, donde dicho agente de iARN se administrará en dos o más dosis.
19. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 18, donde dicho agente de iARN se administrará a intervalos seleccionados a partir del grupo constituido por: una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas y una vez cada aproximadamente 96 horas.
20. El agente de iARN para su uso de la reivindicación 18, donde dicho agente de iARN se administrará una vez a la semana durante hasta 2 semanas, hasta 3 semanas, hasta 4 semanas, hasta 5 semanas o más tiempo.
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