EA037115B1 - Композиции и способы, предназначенные для ингибирования экспрессии гена hao1 (оксидазы 1 гидроксикислот (гликолат-оксидазы)) - Google Patents

Композиции и способы, предназначенные для ингибирования экспрессии гена hao1 (оксидазы 1 гидроксикислот (гликолат-оксидазы)) Download PDF

Info

Publication number
EA037115B1
EA037115B1 EA201790789A EA201790789A EA037115B1 EA 037115 B1 EA037115 B1 EA 037115B1 EA 201790789 A EA201790789 A EA 201790789A EA 201790789 A EA201790789 A EA 201790789A EA 037115 B1 EA037115 B1 EA 037115B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleotides
nucleotide
rnai agent
strand
hao1
Prior art date
Application number
EA201790789A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201790789A1 (ru
Inventor
Уилльям Куэрбс
Кевин Фитцжеральд
Брайан Беттенкорт
Эбигейл Лайебоу
Дэвид В. Эрбе
Original Assignee
Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201790789A1 publication Critical patent/EA201790789A1/ru
Publication of EA037115B1 publication Critical patent/EA037115B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03015—(S)-2-Hydroxy-acid oxidase (1.1.3.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к средствам для RNAi, например двухнитевым средствам для RNAi, целенаправленно воздействующим на ген HAO1, и к способам применения таких средств для RNAi для ингибирования экспрессии HAO1, и к способам лечения субъектов, например, с PH1. В данном документе описаны двухнитевые средства для RNAi, которые ингибируют экспрессию гена HAO1 в клетке, такой как клетка в организме субъекта, например млекопитающего, как, например, человека с ассоциированным с HAO1 нарушением, и применения таких двухнитевых средств для RNAi. В определенных аспектах настоящего изобретения практически все нуклеотиды iRNA согласно настоящему изобретению являются модифицированными.

Description

(54) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА НАО1 (ОКСИДАЗЫ 1 ГИДРОКСИКИСЛОТ (ГЛИКОЛАТОКСИДАЗЫ))
(31) 62/062,751; 62/147,976; 62/214,602 (56) US-A1-20140288158
(32) (33) 2014.10.10; 2015.04.15; 2015.09.04 US US-A1-20110287974 US-A1-20140221465 WO-A2-2013074974
(43) 2017.08.31 WO-A2-2012023 960
(86) PCT/US2015/054881 (87) WO 2016/057893 2016.04.14 (71 )(73) Заявитель и патентовладелец: US-A1-20110301229
ЭЛНИЛЭМ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US) (72) Изобретатель:
Куэрбс Уилльям, Фитцжеральд Кевин, Беттенкорт Брайан, Лайебоу Эбигейл, Эрбе Дэвид В. (US) (74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
037115 В1
037115 Bl (57) Изобретение относится к средствам для RNAi, например двухнитевым средствам для RNAi, целенаправленно воздействующим на ген НАО1, и к способам применения таких средств для RNAi для ингибирования экспрессии НАО1, и к способам лечения субъектов, например, с РН1. В данном документе описаны двухнитевые средства для RNAi, которые ингибируют экспрессию гена НАО 1 в клетке, такой как клетка в организме субъекта, например млекопитающего, как, например, человека с ассоциированным с НАО1 нарушением, и применения таких двухнитевых средств для RNAi. В определенных аспектах настоящего изобретения практически все нуклеотиды iRNA согласно настоящему изобретению являются модифицированными.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/062751, поданной 10 октября 2014 г., и предварительной заявки на патент США № 62/147976, поданной 15 апреля 2015 г., и предварительной заявки на патент США № 62/214602, поданной 4 сентября 2015 г., каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
Перечень последовательностей
Заявка на данное изобретение включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате с кодировкой ASCII и настоящим включен в данный документ при помощи ссылки в полном объеме. Указанная копия файла с кодировкой ASCII, созданная 8 октября 2015 г., имеет название 30864PCT_CRF_sequencelisting. txt, и ее размер составляет 735705 байт.
Уровень техники
Первичная гипероксалурия 1 типа (РН1) представляет собой нарушение метаболизма глиоксилата с аутосомно-рецессивным типом наследования. Детоксикация глиоксилата в печени нарушена вследствие мутации гена AGXT, который кодирует пероксисомальный фермент печени - аланин-глиоксилатаминотрансферазу (AGT). AGT1 является конечным ферментом в метаболическом расщеплении гидроксипролина. Потеря функции AGT перерабатывать промежуточный метаболит глиоксилат в глицин вызывает накопление и превращение глиоксилата в гликолат, который окисляется до оксалата при помощи фермента гликолат-оксидазы (GO), также известной как оксидаза гидроксикислот (НАО1).
Регуляция уровня глиоксилата, главного предшественника оксалата, происходит в нескольких участках клетки, в том числе митохондриях, пероксисоме и цитозоле. Избыточный оксалат у пациентов с РН1 не может быть полностью выведен почками, что приводит к образованию и отложению кристаллов оксалата кальция в почках и мочевыводящих путях. Повреждение почек вызвано сочетанием тубулярной токсичности от оксалата, нефрокальциноза и обструкции почек из-за камней. Более 30% пациентов достигают терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD).
Ген НАО1 кодирует фермент оксидазу 1 гидроксикислот, также известную как гликолат-оксидаза (GO). Белок НАО1 экспрессируется преимущественно в печени и представляет собой оксидазу 2-гидроксикислот, наиболее активную в отношении гликолата.
В мышиной модели РН1, в которой удален ген AGT1, уровни оксалатов в моче снижаются при удалении гена НАО1.
PH1, AGXT и НАО1 описаны в следующих источниках: Angel L. Реу, Armando Albert, и Eduardo Salido, Protein Homeostasis Defects of Alanine-Glyoxylate Aminotransferase: New Therapeutic Strategies in Primary Hyperoxaluria Type I, BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 687658, 15 pages, 2013. doi:10.1155/2013/687658; Cochat и Rumsby (2013), NEJM 369:7; Salido et al. (2006), PNAS 103:18249; Baker et al. (2004), American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology, опубликовано 1 октября 2004 г, Vol. 287 No. 4, H1771-H1779DOI: 10.1152/ajpheart.00234.2004.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает композиции, содержащие средства для RNAi, например средства на основе двухнитевой iRNA, целенаправленно воздействующие на НАО1. Настоящее изобретение также предусматривает способы, в которых применяют композиции согласно настоящему изобретению для ингибирования экспрессии НАО1 и для лечения ассоциированных с НАО1 нарушений, например РН1.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показана нуклеотидная последовательность мРНК НАО1 Homo sapiens (SEQ ID NO: 1).
На фиг. 2 показана нуклеотидная последовательность мРНК НАО1 Mus musculus (SEQ ID NO: 2).
Фиг. 3А представляет собой график, на котором показаны результаты отбора in vitro конъюгатов GalNac-siRNA для GO (HAO) в первичных гепатоцитах макака-крабоеда.
Фиг. 3В представляет собой график, на котором показана кривая зависимости доза-эффект конъюгата GalNac-siRNA для GO (HAO) в первичных гепатоцитах макака-крабоеда.
Фиг. 4А представляет собой график, на котором показаны результаты оценки in vivo конъюгатов GalNac-siRNA для GO (HAO) у мышей линии С57В6 после однократной дозы.
Фиг. 4В представляет собой график, на котором показаны результаты оценки in vivo конъюгатов GalNac-siRNA для GO (HAO) у мышей линии С57В6 после повторной дозы.
Фиг. 5А представляет собой график, на котором показаны уровни оксалатов в моче у нокаутных (KO) по AGXT мышей после лечения при помощи конъюгатов GalNac-siRNA для GO (HAO).
Фиг. 5В представляет собой график, на котором показаны уровни гликолата в моче у KO по AGXT мышей после лечения при помощи конъюгатов GalNac-siRNA для GO (HAO).
Фиг. 6А представляет собой график, на котором показаны уровни мРНК AGXT в крысиной модели РН1 через 72 ч после однократной дозы siRNA AGXT.
Фиг. 6В представляет собой график, на котором показаны уровни оксалатов в моче в крысиной модели РН1 через 72 ч после лечения при помощи конъюгата GalNac-siRNA для GO (HAO).
- 1 037115
Фиг. 6C представляет собой график, на котором показаны уровни оксалатов в моче в крысиной модели РН1, наблюдаемые в течение 49 дней с продолжающимся еженедельным введением доз на 14 и 21 дни как AF-011-63102, так и AD-62994 и сборами мочи за 24 ч, как показано.
Фиг. 6D представляет собой график, на котором показана продолжительность нокдауна HAO1 у крыс. Показаны уровни мРНК либо через одну неделю, либо через четыре недели после последней из 4 доз (что соответствует 28 и 49 дням на фиг. 6C) и приведены относительно уровней, наблюдаемых у крыс, которых лечили при помощи PBS.
На фиг. 7 показана обратная комплементарная последовательность нуклеотидной последовательности мРНК HAO1 Homo sapiens (SEQ ID NO: 3).
На фиг. 8 показана обратная комплементарная последовательность нуклеотидной последовательности мРНК HAO1 Mus musculus (SEQ ID NO: 4).
На фиг. 9 показана нуклеотидная последовательность мРНК HAO1 Масаса fascicularis (SEQ ID NO: 5).
На фиг. 10 показана нуклеотидная последовательность мРНК HAO1 Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 6).
На фиг. 11 показана обратная комплементарная последовательность нуклеотидной последовательности мРНК HAO1 Масаса fascicularis (SEQ ID NO: 7).
На фиг. 12 показана обратная комплементарная последовательность нуклеотидной последовательности мРНК HAO1 Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 8).
На фиг. 13 показан отбор in vivo конъюгатов GalNAc для GO.
Фиг. 14 представляет собой график, на котором показана оценка in vivo конъюгатов GO-GalNAc у мышей.
Фиг. 15 представляет собой график, на котором показана оценка эффекта дозы конъюгатов GO-GalNAc у мышей.
Фиг. 16 представляет собой график, на котором показана оценка эффекта дозы конъюгатов GO-GalNAc у мышей.
Фиг. 17 представляет собой график, на котором показана оценка эффекта дозы у мышей.
Фиг. 18 представляет собой два графика, на которых показана взаимосвязь нокдауна мРНК с уровнями гликолата в сыворотке крови у мышей.
Фиг. 19 представляет собой два графика, на которых показана взаимосвязь нокдауна мРНК с уровнями гликолата в сыворотке крови у крыс.
Фиг. 20 представляет собой график, на котором показано дозозависимое ингибирование мРНК HAO1 при помощи ALN-65585 в первичных гепатоцитах яванского макака.
Фиг. 21 представляет собой два графика, на которых показаны уровни мРНК HAO1 и гликолата в сыворотке крови после лечения при помощи однократной дозы ALN-GO1 у мышей.
Фиг. 22 представляет собой график, на котором показана продолжительность сайленсинга мРНК HAO1 после лечения при помощи однократной дозы ALN-GO1 у мышей.
Фиг. 23 представляет собой график, на котором показаны уровни мРНК HAO1 и гликолата в сыворотке крови после лечения при помощи однократной дозы ALN-GO1 у крыс.
Фиг. 24 представляет собой два графика, на которых показаны уровни оксалатов и гликолата в моче в мышиной модели первичной гипероксалурии I типа после однократной дозы ALN-GO1.
Фиг. 25А представляет собой график, на котором показаны уровни мРНК HAO1 в крысиной модели первичной гипероксалурии I типа после однократной дозы ALN-GO1.
Фиг. 25В представляет собой график, на котором показаны уровни оксалатов в моче в крысиной модели первичной гипероксалурии I типа после однократной дозы ALN-GO1.
Фиг. 26 представляет собой два графика, на которых показаны уровни мРНК HAO1 и оксалатов в моче в крысиной модели первичной гипероксалурии I типа после повторного введения дозы ALN-GO1.
Фиг. 27 представляет собой два графика, на которых показаны уровни мРНК HAO1 и гликолата в сыворотке крови после повторного введения дозы отличным от человека приматам.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает композиции, содержащие средства для RNAi, например двухнитевые средства для RNAi, целенаправленно воздействующие на HAO1. Настоящее изобретение также предусматривает способы, в которых применяют композиции согласно настоящему изобретению для ингибирования экспрессии HAO1 и для лечения ассоциированных с HAO1 нарушений.
I. Определения.
Для того чтобы настоящее изобретение можно было более легко понять, вначале даны определения некоторым терминам. Кроме того, следует отметить, что во всех случаях перечисления значения или диапазона значений параметра подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.
Форму единственного числа используют в данном документе для обозначения одного или нескольких (т.е. по меньшей мере одного) грамматических объектов данного изобретения. В качестве примера элемент означает один элемент или несколько элементов, например множество элементов.
- 2 037115
Термин включающий используют в данном документе для обозначения фразы включающий без ограничения и используют взаимозаменяемо с ней.
Термин или используют в данном документе для обозначения термина и/или и используют взаимозаменяемо с ним, если контекст явно не указывает иное.
Используемый в данном документе HAO1 относится к гену, кодирующему фермент оксидазу 1 гидроксикислот. Другие названия гена включают в себя GO, GOX, GOX1 и НАОХ1. Белок также известен как гликолат-оксидаза и оксидаза (S)-2-гидроксикислот. Номером доступа в GenBank для мРНК HAO1 человека является NM_017545.2; мРНК НАО1 макака-крабоеда (Масаса fascicularis) является ХМ_005568381.1; мРНК НАО1 мыши (Mus musculus) является NM_010403.2; мРНК НАО1 крысы (Rattus norvegicus) является ХМ_006235096.1.
Термин НАО1, используемый в данном документе, также относится к встречающимся в природе вариантам последовательности ДНК гена НАО1, например единичному нуклеотидному полиморфизму (SNP) в гене НАО1. Иллюстративные SNP можно найти в dbSNP, базе данных коротких генетических вариаций, в NCBI, доступной на www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP.
Используемая в данном документе целевая последовательность относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованной в процессе транскрипции гена НАО1, в том числе к мРНК, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции.
Используемый в данном документе термин нить, содержащая последовательность относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая описывается последовательностью, обозначаемой с использованием стандартной номенклатуры нуклеотидов.
Каждое из G, С, А и U, как правило, означает нуклеотид, который содержит соответственно гуанин, цитозин, аденин и урацил в качестве основания. Т и ''dT'' используют в данном документе взаимозаменяемо, и они относятся к дезоксирибонуклеотиду, где нуклеиновым основанием является тимин, например дезоксириботимину, 2'-дезокситимидину или тимидину. Однако будет понятно, что термин ''рибонуклеотид'', или ''нуклеотид'', или ''дезоксирибонуклеотид'' также может относиться к модифицированному нуклеотиду, который подробнее описан ниже, или имитирующему нуклеотид заменяющему фрагменту. Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть замещены другими фрагментами без значительного изменения свойств в отношении спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий фрагмент. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пару оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть замещены в нуклеотидных последовательностях согласно настоящему изобретению нуклеотидами, содержащими, например, инозин. Последовательности, содержащие такие заменяющие фрагменты, являются вариантами осуществления настоящего изобретения.
Термины ''iRNA'', ''средство для RNAi'', ''средство на основе iRNA'', ''средство для РНКинтерференции'', используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к средству, которое содержит РНК в том значении, в котором этот термин определен в данном документе, и которое опосредует целенаправленное расщепление РНК-транскрипта посредством пути с участием РНКиндуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). iRNA управляет специфичным в отношении последовательности разрушением мРНК посредством такого процесса, как РНК-интерференция (RNAi). iRNA модулирует, например ингибирует, экспрессию HAO1 в клетке, например в клетке в организме субъекта, как, например, субъекта-млекопитающего.
В одном варианте осуществления средство для RNAi согласно настоящему изобретению включает однонитевую РНК, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК, например целевой последовательностью мРНК HAO1, управляя расщеплением целевой РНК. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, предполагают, что длинная двухнитевая РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной как Dicer (Sharp et al. (2001), Genes Dev. 15:485). Dicer, фермент, подобный рибонуклеазе III типа, обеспечивает процессинг dsRNA до коротких интерферирующих РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-выступами из двух оснований (Bernstein, et al., (2001), Nature, 409:363). siRNA затем включаются в РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной антисмысловой нити управлять распознаванием мишени (Nykanen, et al., (2001), Cell, 107:309). После связывания с соответствующей целевой мРНК одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень для индукции сайленсинга (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к однонитевой РНК (siRNA), образованной внутри клетки, и которая способствует образованию RISC-комплекса для осуществления сайленсинга целевого гена, т.е. гена НАО1. Соответственно, термин ''siRNA'' также используют в данном документе для обозначения RNAi, описанной выше.
В другом варианте осуществления средство для RNAi может быть однонитевой siRNA, которую вводят в клетку или организм для ингибирования целевой мРНК. Однонитевые средства для RNAi связываются с Argonaute 2 комплекса RISC, обладающим эндонуклеазной активностью, который затем расщепляет целевую мРНК. Однонитевые siRNA, как правило, содержат 15-30 нуклеотидов и являются хи- 3 037115 мически модифицированными. Конструирование и тестирование однонитевых siRNA описаны в патенте США № 8101348 и в Lima et al., (2012), Cell, 150:883-894, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ при помощи ссылки. Любые антисмысловые нуклеотидные последовательности, описанные в данном документе, можно использовать в качестве однонитевой siRNA, которая описана в данном документе или которая химически модифицирована способами, описанными в Lima et al., (2012), Cell, 150:883-894.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает молекулы однонитевого антисмыслового олигонуклеотида, целенаправленно воздействующего на НАО1. ''Молекула однонитевого антисмыслового олигонуклеотида'' является комплементарной последовательности в целевой мРНК (т.е. НАО1). Молекулы однонитевого антисмыслового олигонуклеотида могут ингибировать трансляцию стехиометрическим образом путем спаривания оснований с мРНК и физического нарушения механизма трансляции, см. Dias, N. et al., (2002), Mol. Cancer. Ther. 1:347-355. В качестве альтернативы молекулы однонитевого антисмыслового олигонуклеотида ингибируют целевую мРНК путем гибридизации с мишенью и расщепления мишени посредством явления расщепления с помощью RNaseH. Молекула однонитевого антисмыслового олигонуклеотида может иметь длину от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов и иметь последовательность, комплементарную целевой последовательности. Например, молекула однонитевого антисмыслового олигонуклеотида может содержать последовательность, которая включает в себя по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из любой из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, например последовательностей, представленных в любой из табл. 1 или 2 или связывающихся с любым из целевых сайтов, описанных в данном документе. Молекулы однонитевого антисмыслового олигонуклеотида могут предусматривать модифицированную РНК, ДНК или их комбинацию.
В другом варианте осуществления iRNA для применения в композициях, путях применения и способах согласно настоящему изобретению является двухнитевой РНК, и в данном документе ее называют двухнитевым средством для RNAi, молекулой двухнитевой РНК (dsRNA), средством на основе dsRNA или dsRNA. Термин ''dsRNA'' относится к комплексу молекул рибонуклеиновой кислоты с дуплексной структурой, содержащему две антипараллельные и практически комплементарные нити нуклеиновой кислоты, рассматриваемые как имеющие ''смысловую'' и ''антисмысловую'' ориентации по отношению к целевой РНК, т.е. гену НАО1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения двухнитевая РНК (dsRNA) запускает разрушение целевой РНК, например мРНК, через посттранскрипционный механизм сайленсинга генов, называемый в данном документе РНК-интерференцией или RNAi.
Как правило, большинство нуклеотидов каждой нити молекулы dsRNA являются рибонуклеотидами, но, как подробно описано в данном документе, каждая нить или обе нити могут также содержать один или несколько нуклеотидов, не являющихся рибонуклеотидами, например дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, используемое в данном описании ''средство для RNAi'' может включать рибонуклеотиды с химическими модификациями; средство для RNAi может включать значительные модификации множества нуклеотидов. Такие модификации могут включать все типы модификаций, раскрытых в данном документе или известных в уровне техники. Любые такие модификации, которые используются в молекуле типа siRNA, охвачены термином средство для RNAi в контексте данных описания и формулы изобретения.
Две нити, образующие дуплексную структуру, могут быть различными частями одной большей молекулы РНК или они могут быть отдельными молекулами РНК. В тех случаях, если две нити являются частью одной большей молекулы и, следовательно, соединены непрерывающейся цепью нуклеотидов от 3'-конца одной нити к 5'-концу соответствующей другой нити, образующих дуплексную структуру, соединительную цепь РНК называют петлей шпилькой. В тех случаях, если две нити соединены ковалентно иным образом, нежели непрерывающейся цепью нуклеотидов от 3'-конца одной нити к 5'-концу соответствующей другой нити, образующих дуплексную структуру, соединительную структуру называют линкером. Нити РНК могут иметь одинаковое или разное число нуклеотидов. Максимальное количество пар оснований является количеством нуклеотидов в самой короткой нити dsRNA за вычетом любых выступов, которые присутствуют в дуплексе. Помимо дуплексной структуры средство для RNAi может предусматривать один или несколько нуклеотидных выступов.
В одном варианте осуществления средство для RNAi согласно настоящему изобретению представляет собой dsRNA из 24-30 нуклеотидов, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК, например с целевой последовательностью мРНК НАО1, управляя расщеплением целевой РНК. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, длинная двухнитевая РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной как Dicer (Sharp et al. (2001), Genes Dev. 15:485). Dicer, фермент, подобный рибонуклеазе III типа, обеспечивает процессинг dsRNA до коротких интерферирующих РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-выступами из двух оснований (Bernstein, et al., (2001), Nature, 409:363). siRNA затем включаются в РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной ан- 4 037115 тисмысловой нити управлять распознаванием мишени (Nykanen, et al., (2001), Cell, 107:309). После связывания с соответствующей целевой мРНК одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень для индукции сайленсинга (Elbashir, et al., (2001), Genes Dev. 15:188).
Используемый в данном документе ''нуклеотидный выступ'' относится к неспаренным нуклеотиду или нуклеотидам, которые выпячиваются из дуплексной структуры средства для RNAi, когда 3'-конец одной нити средства для RNAi выходит за пределы 5'-конца другой нити или vice versa. ''Затупленный конец'' или ''тупой конец'' означает, что на конце двухнитевого средства для RNAi нет неспаренных нуклеотидов, т.е. нет нуклеотидного выступа. Средство для RNAi ''с тупыми концами'' представляет собой dsRNA, которая является двухнитевой по всей длине, т.е. не имеет нуклеотидного выступа на любом конце молекулы. Средства для RNAi согласно настоящему изобретению включают в себя средства для RNAi с нуклеотидным выступом на одном конце (т.е. средства с одним выступом и одним тупым концом) или с нуклеотидными выступами на обоих концах.
Термин ''антисмысловая нить'' относится к нити двухнитевого средства для RNAi, включающего участок, который, по сути, комплементарен целевой последовательности (например, мРНК HAO1 человека). Используемый в данном документе термин ''участок, комплементарный части мРНК, кодирующей HAO1'' относится к участку антисмысловой нити, который, по сути, комплементарен части последовательности мРНК HAO1. В тех случаях, когда участок комплементарности не полностью комплементарен целевой последовательности, тогда ошибочные спаривания наиболее допустимы в концевых участках и, если присутствуют, как правило, встречаются в концевом участке или концевых участках, например в пределах 6, 5, 4, 3 или 2 нуклеотидов от 5'-конца и/или 3'-конца.
Термин ''смысловая нить'', используемый в данном документе, относится к нити dsRNA, которая включает участок, который, по сути, комплементарен участку антисмысловой нити.
Используемый в данном документе термин участок расщепления относится к участку, который непосредственно прилегает к сайту расщепления. Сайт расщепления является сайтом мишени, по которому происходит расщепление. В некоторых вариантах осуществления участок расщепления содержит три основания на любом из концов сайта расщепления, который непосредственно прилегает к нему. В некоторых вариантах осуществления участок расщепления содержит два основания на любом из концов сайта расщепления, который непосредственно прилегает к нему. В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления, в частности, находится в сайте, граничащем с нуклеотидами 10 и 11 антисмысловой нити, и участок расщепления содержит нуклеотиды 11, 12 и 13.
Используемый в данном документе термин комплементарный, если не указано иное, при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклеотидной последовательности относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизироваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как будет понятно специалисту в данной области. Такие условия, например, могут представлять собой жесткие условия, где жесткие условия могут включать 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES, рН 6,4, 1 мМ EDTA, 50°С или 70°С в течение 12-16 ч с последующим отмыванием. Можно применять другие условия, такие как физиологически соответствующие условия, характерные для организма. Например, комплементарная последовательность является удовлетворительной для обеспечения выполнения соответствующей функции нуклеиновой кислоты, например RNAi. Специалист в данной области сможет определить набор условий, наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизированных нуклеотидов.
Последовательности могут быть ''полностью комплементарными'' по отношению к любой, когда присутствует спаривание оснований нуклеотидов первой нуклеотидной последовательности с нуклеотидами второй нуклеотидной последовательности по всей длине первой и второй нуклеотидных последовательностей. Однако когда первую последовательность в данном документе обозначают как ''по сути, комплементарную'' по отношению ко второй последовательности, тогда две последовательности могут быть полностью комплементарными или в них может иметь место ошибочное спаривание одной или нескольких, но, как правило, не более 4, 3 или 2 пар оснований при гибридизации, с сохранением при этом способности гибридизоваться при условиях, наиболее соответствующих их конечному применению. Однако если два олигонуклеотида предназначены образовывать при гибридизации один или несколько однонитевых выступов, то такие выступы не будут считаться ошибочными спариваниями применительно к определению комплементарности. Например, dsRNA, содержащая один олигонуклеотид из 21 нуклеотида в длину и другой олигонуклеотид из 23 нуклеотидов в длину, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может быть указана как полностью комплементарная для целей, описанных в данном документе.
''Комплементарные'' последовательности, используемые в данном документе, могут также включать или могут быть образованы полностью из пар оснований, образованных не по модели Уотсона-Крика, и/или пар оснований, образованных из не встречающихся в природе и модифицированных нуклеотидов, в такой степени, при которой выполняются вышеуказанные требования по отношению к их способности
- 5 037115 гибридизоваться. Такие пары оснований, образованные не по модели Уотсона-Крика, включают без ограничения неоднозначное или хугстиновское спаривание оснований G:U.
Термины комплементарный, ''полностью комплементарный'' и ''по сути, комплементарный'' в данном документе можно использовать по отношению к совпадению оснований между смысловой нитью и антисмысловой нитью dsRNA или между антисмысловой нитью dsRNA и целевой последовательностью, как будет понятно из контекста их использования.
Используемый в данном документе полинуклеотид, который по сути, комплементарен по меньшей мере части'' матричной РНК (мРНК), относится к полинуклеотиду, который, по сути, комплементарен непрерывной части мРНК, представляющей интерес, (например, мРНК, кодирующей HAO1), в том числе 5'-UTR, открытой рамке считывания (ORF) или 3'-UTR. Например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части мРНК HAO1, если последовательность, по сути, комплементарна непрерывающейся части мРНК, кодирующей HAO1.
Термин ингибирование, используемый в данном документе, используют взаимозаменяемо со снижением, сайленсингом, подавлением, супрессией и другими подобными терминами, и он включает любой уровень ингибирования.
Фраза ''ингибирование экспрессии HAO1'', используемая в данном документе, включает ингибирование экспрессии любого гена HAO1 (такого как, например, ген HAO1 мыши, ген HAO1 крысы, ген HAO1 обезьяны или ген HAO1 человека), а также вариантов (например, встречающихся в природе вариантов) или мутантов гена HAO1. Таким образом, ген HAO1 может быть геном HAO1 дикого типа, мутантным геном HAO1 или трансгенным геном HAO1 в контексте клетки, группы клеток или организма, подвергнутых генетической манипуляции.
''Ингибирование экспрессии гена HAO1'' предусматривает любой уровень ингибирования гена HAO1, например по меньшей мере частичную супрессию экспрессии гена HAO1, такую как ингибирова-
ние по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%,
по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%,
по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%,
по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%,
по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%,
по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%,
по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%,
по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%,
по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%,
по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%,
по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%,
по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%,
по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или
по меньшей мере приблизительно на 99%.
Экспрессию гена НАО1 можно оценивать, исходя из уровня любой переменной, ассоциированной с экспрессией гена НАО1, например уровня мРНК НАО1 или уровня белка НАО1, например, в тканях и/или уровней оксалатов в моче. Ингибирование можно оценивать по снижению абсолютного или относительного уровня одной или нескольких из этих переменных по сравнению с контрольным уровнем. Контрольным уровнем может быть любой тип контрольного уровня, который используют в данной области, например исходный уровень до введения дозы или уровень, определенный у сходных субъекта, клетки или образца, которые не обработаны или обработаны контролем (таким как, например, контроль только с буфером или контроль с неактивным средством).
Фраза ''приведение клетки в контакт с двухнитевым средством для RNAi'', используемая в данном документе, включает приведение клетки в контакт любым возможным способом. Приведение клетки в контакт с двухнитевым средством для RNAi предусматривает приведение клетки в контакт со средством для RNAi in vitro или приведение клетки в контакт со средством для RNAi in vivo. Приведение в контакт можно осуществлять непосредственно или опосредованно. Таким образом, например, средство для RNAi можно приводить в физический контакт с клеткой путем отдельного осуществления способа или, в качестве альтернативы, средство для RNAi можно поместить в обстановку, которая позволит средству прийти в контакт с клеткой или послужит причиной этому.
Приведение клетки в контакт in vitro можно выполнять, например, путем инкубирования клетки со средством для RNAi. Приведение клетки в контакт in vivo можно выполнять, например, путем введения инъекцией средства для RNAi в ткань, в которой находится клетка, или рядом с ней или путем введения инъекцией средства для RNAi в другую область, кровоток или подкожное пространство так, что средство будет впоследствии достигать ткани, в которой находится клетка, которую необходимо привести в контакт со средством. Например, средство для RNAi может содержать лиганд, например лиганд, представляющий собой GalNAc3, который направляет средство для RNAi к месту, представляющему интерес, например к печени, и/или может быть связано с ним. Также возможны комбинации in vitro и in vivo способов приведения в контакт. По отношению к способам согласно настоящему изобретению клетку также
- 6 037115 можно приводить в контакт со средством для RNAi in vitro и в дальнейшем пересаживать субъекту.
Используемый в данном документе термин субъект включает человека или отличного от человека животного, предпочтительно позвоночного и более предпочтительно млекопитающего. Субъект может включать трансгенный организм. Наиболее предпочтительно субъектом является человек, как, например, человек, страдающий ассоциированным с HAO1 нарушением или предрасположенный к его развитию.
Термин пациент или субъект, используемый в данном документе, подразумевает как включающее либо человека, либо отличного от человека животного, предпочтительно млекопитающего, например человека или обезьяну. Наиболее предпочтительно субъектом или пациентом является человек.
Термин ''ассоциированное с HAO1 нарушение'', используемый в данном документе, предназначен включать любое нарушение, которое можно лечить или предупреждать, или симптомы которого можно облегчать, при помощи ингибирования экспрессии HAO1. Примеры включают в себя без ограничения первичную гипероксалурию 1 (РН1).
Терапевтически эффективное количество, используемое в данном документе, подразумевают как включающее количество средства для RNAi, которого, при введении пациенту для лечения ассоциированного с HAO1 заболевания, достаточно для эффективного лечения заболевания (например, путем уменьшения, ослабления или поддержания существующего заболевания или одного или нескольких симптомов заболевания). Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от средства для RNAi, пути введения средства, заболевания и его тяжести и анамнеза заболевания, возраста, веса, семейного анамнеза, генетического строения, стадии патологических процессов, опосредованных экспрессией HAO1, типов предшествующего или сопутствующего лечения, при наличии такового, и других индивидуальных особенностей пациента, который подлежит лечению.
''Профилактически эффективное количество'', используемое в данном документе, подразумевают как включающее количество средства для RNAi, которого, при введении субъекту, у которого еще не возникли или не проявились симптомы HAO1-ассоциированного заболевания, но у которого может иметься предрасположенность к заболеванию, достаточно для предупреждения или ослабления заболевания или одного или нескольких симптомов заболевания. Ослабление заболевания включает замедление течения болезни или снижение тяжести заболевания, которое разовьется позже. Профилактически эффективное количество может варьировать в зависимости от средства для RNAi, пути введения средства, степени риска развития заболевания и анамнеза заболевания, возраста, веса, семейного анамнеза, генетического строения, типов предшествующего или сопутствующего лечения, при наличии такового, и других индивидуальных особенностей пациента, который подлежит лечению.
Терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество также включает количество средства для RNAi, которое вызывает некоторый желательный локальный или системный эффект при приемлемом соотношении польза/риск, принятом по отношению к любому лечению. Средства для RNAi, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, можно вводить в количестве, достаточном для получения приемлемого соотношения польза/риск, принятого по отношению к такому лечению.
Термин образец, используемый в данном документе, предусматривает совокупность сходных жидкостей, клеток или тканей, выделенных из организма субъекта, а также жидкостей, клеток или тканей, присутствующих в организме субъекта. Примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку крови и серозные жидкости, плазму крови, спинномозговую жидкость, внутриглазные жидкости, лимфу, мочу, слюну и т. п. Образцы тканей могут включать образцы из тканей, органов или локальных участков. Например, образцы можно получить из конкретных органов, частей органов или жидкостей или клеток в этих органах. В определенных вариантах осуществления образцы можно получить из печени (например, всей печени, или определенных сегментов печени, или определенных типов клеток в печени, таких как, например, гепатоциты). В некоторых вариантах осуществления образец, полученный из организма субъекта относится к крови или плазме крови, взятым из организма субъекта. В дополнительных вариантах осуществления образец, полученный из организма субъекта относится к ткани печени (или ее составляющим), полученным из организма субъекта.
II. Средства на основе iRNA, представляющие собой dsRNA, согласно настоящему изобретению.
В данном документе описаны двухнитевые средства для RNAi, которые ингибируют экспрессию гена HAO1 в клетке, такой как клетка в организме субъекта, например млекопитающего, как, например, человека с ассоциированным с HAO1 нарушением, и применения таких двухнитевых средств для RNAi.
Соответственно, настоящее изобретение предусматривает двухнитевые средства для RNAi с химическими модификациями, способные ингибировать экспрессию целевого гена (т.е. гена HAO1) in vivo.
Как описано более подробно ниже, в определенных аспектах настоящего изобретения практически все нуклеотиды iRNA согласно настоящему изобретению являются модифицированными. В других вариантах осуществления настоящего изобретения все нуклеотиды в iRNA согласно настоящему изобретению являются модифицированными. iRNA согласно настоящему изобретению, в которых практически все нуклеотиды являются модифицированными, являются в значительной степени, но не полностью модифицированными и могут содержать не более 5, 4, 3, 2 или 1 немодифицированного нуклеотида.
- 7 037115
Средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить. Каждая нить средства для RNAi в длину может варьироваться от 12 до 30 нуклеотидов. Например, каждая нить может составлять 14-30 нуклеотидов в длину, 17-30 нуклеотидов в длину, 19-30 нуклеотидов в длину, 25-30 нуклеотидов в длину, 27-30 нуклеотидов в длину, 17-23 нуклеотида в длину, 17-21 нуклеотид в длину, 17-19 нуклеотидов в длину, 19-25 нуклеотидов в длину, 19-23 нуклеотида в длину, 19-21 нуклеотид в длину, 21-25 нуклеотидов в длину или 21-23 нуклеотида в длину.
Каждая нить может составлять 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в длину. Каждая нить средства для RNAi может иметь такую же длину или может иметь другую длину.
Смысловая нить и антисмысловая нить, как правило, образуют двухнитевой РНК-дуплекс (dsRNA), также называемый в данном документе как ''средство для RNAi''. Дуплексный участок средства для RNAi может составлять 12-30 пар нуклеотидов в длину. Например, дуплексный участок может составлять 14-30 пар нуклеотидов в длину, 17-30 пар нуклеотидов в длину, 27-30 пар нуклеотидов в длину, 17-23 пары нуклеотидов в длину, 17-21 пару нуклеотидов в длину, 17-19 пар нуклеотидов в длину, 19-25 пар нуклеотидов в длину, 19-23 пары нуклеотидов в длину, 19-21 пару нуклеотидов в длину, 21-25 пар нуклеотидов в длину или 21-23 пары нуклеотидов в длину. В другом примере длина дуплексного участка выбрана из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 и 27 пар нуклеотидов.
В одном варианте осуществления средство для RNAi может содержать один или несколько выступающих участков и/или блокирующих групп на 3'-конце, 5'-конце или обоих концах одной или обеих нитей. Выступ может составлять 1-6 нуклеотидов в длину, например 2-6 нуклеотидов в длину, 1-5 нуклеотидов в длину, 2-5 нуклеотидов в длину, 1-4 нуклеотида в длину, 2-4 нуклеотида в длину, 1-3 нуклеотида в длину, 2-3 нуклеотида в длину или 1-2 нуклеотида в длину. Выступы могут быть обусловлены тем, что одна нить длиннее другой, или могут быть обусловлены тем, что две нити одинаковой длины расположены со сдвигом. Выступ может образовывать ошибочное спаривание с целевой мРНК или он может быть комплементарным целевым последовательностям генов или может иметь другую последовательность. Первая и вторая нити также могут быть соединены, например, дополнительными основаниями с образованием шпильки или при помощи других не содержащих основания линкеров.
В одном варианте осуществления каждый из нуклеотидов в выступающем участке средства для RNAi независимо может быть модифицированным или немодифицированным нуклеотидом, в том числе без ограничения с сахаром с 2'-модификацией, такой как 2-F, 2'-О-метил, тимидин (Т), 2-О-метоксиэтил5-метилуридин (Тео), 2'-О-метоксиэтиладенозин (Аео), 2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидин (m5Сео) и любые их комбинации. Например, последовательность выступа на обоих концах каждой нити может быть ТТ. Выступ может образовывать ошибочное спаривание с целевой мРНК или он может быть комплементарным целевым последовательностям генов или может иметь другую последовательность.
5'- или 3'-выступы смысловой нити, антисмысловой нити или обеих нитей средства для RNAi могут быть фосфорилированы. В некоторых вариантах осуществления выступающий(ие) участок(и) содержит(ат) два нуклеотида с фосфотиоатом между двумя нуклеотидами, при этом два нуклеотида могут быть одинаковыми или различными. В одном варианте осуществления выступ присутствует на 3'-конце смысловой нити, антисмысловой нити или обеих нитей. В одном варианте осуществления этот 3'-выступ присутствует в антисмысловой нити. В одном варианте осуществления этот 3'-выступ присутствует в смысловой нити.
Средство для RNAi может предусматривать только один выступ, который может повышать интерферирующую активность RNAi без воздействия на его общую стабильность. Например, однонитевой выступ может быть расположен на 3'-конце смысловой нити или в качестве альтернативы на 3'-конце антисмысловой нити. RNAi также может иметь тупой конец, расположенный на 5'-конце антисмысловой нити (или 3'-конце смысловой нити) или vice versa. Как правило, антисмысловая нить RNAi имеет нуклеотидный выступ на 3'-конце, а 5'-конец является тупым. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что асимметричный тупой конец на 5'-конце антисмысловой нити и 3'-концевой выступ антисмысловой нити способствуют включению направляющей нити в процесс с участием RISC.
Синтез и модификации.
Любая из нуклеиновых кислот, например RNAi, описанных в настоящем изобретении, может быть синтезирована и/или модифицирована способами, хорошо известными из уровня техники, такими как описанные в Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, который настоящим включен в данный документ при помощи ссылки. Модификации включают в себя, например, концевые модификации, например модификации 5'-конца (фосфорилирование, конъюгирование, инвертированные связи) или модификации 3'-конца (конъюгирование, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи и т.д.); модификации оснований, например замену стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые образуют пару оснований с расширенным репертуаром партнеров, удаление оснований (лишенные азотистого основания нуклеотиды) или конъюгирование оснований; модификации сахаров (например, в 2'-положении или 4'-положении) или замену сахара и/или модификации остова, в том числе модификацию или замену фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры соединений iRNA, применимых в описанных в данном до
- 8 037115 кументе вариантах осуществления, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или неприродные межнуклеозидные связи. РНК с модифицированными остовами включают, среди прочего, такие, которые не содержат атом фосфора в остове. В контексте данного описания и как иногда упоминается в данной области, модифицированные РНК, не содержащие атом фосфора в их межнуклеозидном остове, также могут считаться олигонуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления модифицированная iRNA будет содержать атом фосфора в своем межнуклеозидном остове.
Модифицированные остовы РНК включают, например, фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфодитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, в том числе 3'-алкиленфосфонаты, и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты с нормальными 3'-5'-связями, их аналоги с 2'-5'-связями, а также таковые с инвертированной полярностью, где соседние пары нуклеозидных звеньев соединены 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты.
Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения вышеуказанных фосфорсодержащих связей, включают без ограничения патенты США № 3687808; 4469863; 4476301; 5023243;
5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233;
5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5625050; 6028188;
6124445; 6160109; 6169170; 6172209; 6 239265; 6277603; 6326199; 6346614; 6444423; 6531590; 6534639;
6608035; 6683167; 6858715; 6867294; 6878805; 7015315; 7041816; 7273933; 7321029 и патент США № RE39464, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ при помощи ссылки.
Модифицированные остовы РНК, которые не содержат атом фосфора в своем составе, включают остовы, образованные короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (частично образованные из сахарной части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, содержащие смесь составляющих частей N, О, S и СН2.
Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения вышеуказанных олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США № 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240;5608046;5610289;5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ при помощи ссылки.
В других вариантах осуществления рассматриваются подходящие миметики РНК для применения в iRNA, в которых как сахар, так и межнуклеозидная связь, т.е. остов нуклеотидных звеньев, заменены новыми группами. Единицы оснований сохраняются для гибридизации с соответствующим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, который, как было показано, обладает превосходными свойствами гибридизации, называется пептидной нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA сахарный остов РНК заменен амидсодержащим остовом, в частности аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания сохраняются и соединяются непосредственно или опосредованно с атомами азота азагруппы амидной части остова.
Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения соединений PNA, включают без ограничения патенты США № 5539082; 5714331 и 5719262, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ при помощи ссылки. Дополнительные соединения PNA, подходящие для применения в iRNA согласно настоящему изобретению, описаны, например, в Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем изобретении, предусматривают РНК с фосфотиоатными остовами и олигонуклеозиды с гетероатомными остовами и, в частности, -CH2-NH-CH2-, -CH2-N (CH3)-O-CH2- [известный как метилен (метилиминовый) или MMI остов], -CH2-O-N(CH3)-СН2-, -СН2-N(CH3)-N(CH3)-СН2- и -N(CH3)-СН2-СН2-,[где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -О-Р-О-СН2-] согласно вышеупомянутому патенту США № 5489677 и амидные остовы согласно вышеупомянутому патенту США № 5602240. В некоторых вариантах осуществления РНК, представленные в данном документе, имеют морфолиновые структуры остова согласно вышеупомянутому патенту США № 5034506.
Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько замещенных сахарных фрагментов. iRNA, например dsRNA, представленные в данном документе, могут содержать одно из следующего в 2'-положении: ОН; F; О-, S- или N-алкила; О-, S-или N-алкенила; О-, S- или N-алкинила или О-алкил-O-алкила, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными
- 9 037115
С1-С10-алкилом или С2-С10-алкенилом и алкинилом. Иллюстративные пригодные модификации включают О[(ОДпО]тСНз, О(СН2)пОСНз, O(CH2)nNH2, О(СЩ)пСНз, O(CH2)nONH2 и O(CH;)nO\|(CH;)nCH;)|, где п и т равняются от 1 до приблизительно 10. В других вариантах осуществления dsRNA содержат одно из следующего в 2'-положении: низшего С1-С10-алкила, замещенного низшего алкила, алкарила, аралкила, О-алкарила или О-аралкила, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила, расщепляющей РНК группы, репортерной группы, интеркалятора, группы для улучшения фармакокинетических свойств iRNA или группы для улучшения фармакодинамических свойств iRNA и других заместителей с аналогичными свойствами. В некоторых вариантах осуществления модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-O-CH2CH2OCH3, также известный как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) т.е. алкокси-алкоксигруппу. Другой иллюстративной модификацией является 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. группа O(CH2)2ON(CH3)2, также известная как 2'-DMAOE, описанная в примерах в данном документе ниже, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известная в уровне техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-О-СН2-О-СН2-К(СН2)2.
Другие модификации включают 2'-метокси (2'-ОСН3), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Подобные модификации также могут быть осуществлены в других положениях в РНК iRNA, в частности в 3'-положении сахара в 3'-концевом нуклеотиде или в dsRNA с 2'-5'-связями и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. iRNA также могут содержать миметики сахаров, такие как циклобутиловые фрагменты, вместо пентофуранозильного сахара. Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения таких модифицированных сахарных структур, включают без ограничения патенты США № 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, некоторые из которых имеют общего заявителя с настоящей заявкой. Полное содержание каждого из вышеупомянутых источников настоящим включено в данный документ при помощи ссылки.
iRNA также может содержать модификации или замещения нуклеотидного основания (часто называемого в данной области просто как основание). Используемые в данном документе немодифицированные или природные нуклеотидные основания включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотидные основания включают в себя другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как дезокситимин (dT), 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкил-производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, а также 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
Дополнительные нуклеотидные основания включают раскрытые в патенте США № 3687808, таковые, раскрытые в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; таковые, раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.L., ed. John Wiley & Sons, 1990, таковые, раскрытые в Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, и таковые, раскрытые в Sanghvi, Y.S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. и Lebleu, В., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидных оснований особенно пригодны для повышения аффинности связывания олигомерных соединений, представленных в настоящем изобретении. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и -О6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. и Lebleu, В., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, p. 276-278) и представляют собой иллюстративные замещения оснований, еще более конкретно в сочетании с 2'-О-метоксиэтиловыми модификациями сахаров.
Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения некоторых из вышеуказанных модифицированных нуклеотидных оснований, а также других модифицированных нуклеотидных оснований, включают без ограничения вышеуказанные патенты США № 3687808, 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121, 5596091; 5614617; 5681941; 5750692; 6015886; 6147200; 6166197; 6222025; 6235887; 6380368; 6528640; 6639062; 6617438; 7045610; 7427672 и 7495088, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ при помощи ссылки.
РНК iRNA также может быть модифицирована таким образом, что включает одну или несколько запертых нуклеиновых кислот (LNA). Запертая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид, содержащий модифицированный рибозный фрагмент, где рибозный фрагмент содержит дополнительный
- 10 037115 мостик, соединяющий 2'- и 4'-атомы углерода. Эта структура эффективно запирает рибозу в структурной конформации 3'-эндо. Было показано, что добавление запертых нуклеиновых кислот в siRNA повышает стабильность siRNA в сыворотке крови и снижает нецелевые эффекты (Elmen, J. et al., (2005),
Nucleic Acids Research, 33(1):439-447; Mook, O.R. et al., (2007), Mol. Canc. Ther. 6(3):833-843;
Grunweller, A. et al., (2003), Nucleic Acids Research, 31(12):3185-3193).
Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения нуклеотидов запертых нуклеиновых кислот, включают в себя без ограничения следующие патенты США № 6268490; 6670461; 6794499; 6998484; 7053207; 7084125 и 7399845, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ при помощи ссылки.
Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать N-(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Нур-С6-NHAc), N-капроил-4-гидроксипролинол (Нур-С6), N-ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-О-дезокситимидин (эфир), N-(аминокапроил)-4-гидроксипролинол (Нур-С6-амино), 2-докозаноилуридин-3-фосфат, инвертированное основание dT (idT) и др. Раскрытие этой модификации можно найти в публикации согласно РСТ № WO 2011/005861.
Модифицированные iRNA, содержащие мотивы согласно настоящему изобретению.
В определенных аспектах настоящего изобретения двухнитевые средства для RNAi согласно настоящему изобретению включают средства с химическими модификациями, которые раскрыты, например, в предварительной заявке на патент США № 61/561710, поданной 18 ноября 2011 г., или в PCT/US2012/065691, поданной 16 ноября 2012 г. и опубликованной как WO 2013/075035 А1, полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки.
Как показано в данном документе и в предварительной заявке № 61/561710, превосходный результат может быть получен путем введения одного или нескольких мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в смысловую нить и/или антисмысловую нить средства для RNAi, в частности, в сайт расщепления или рядом с ним. В некоторых вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить средства для RNAi могут быть полностью модифицированы иным способом. Введение таких мотивов нарушает паттерн модификаций, если он имеется, смысловой и/или антисмысловой нити. Средство для RNAi, к примеру смысловая нить, может быть необязательно конъюгировано с лигандом, представляющим собой производное GalNAc. Полученные в результате средства для RNAi характеризуются превосходной активностью в отношении сайленсинга генов.
Более конкретно, неожиданно было обнаружено, что в тех случаях, когда смысловая нить и антисмысловая нить двухнитевого средства для RNAi модифицированы так, что содержат один или несколько мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления по меньшей мере одной нити средства для RNAi или рядом с ним, тогда активность средства для RNAi в отношении сайленсинга генов была наилучшим образом повышена.
В одном варианте осуществления средство для RNAi представляет собой олигонуклеотид с обоими тупыми концами, составляющий 19 нуклеотидов в длину, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-Б-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 7, 8, 9 от 5'-конца.
Антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.
В другом варианте осуществления средство для RNAi представляет собой олигонуклеотид с обоими тупыми концами, составляющий 20 нуклеотидов в длину, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-Б-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 8, 9, 10 от 5'-конца. Антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.
В еще одном варианте осуществления средство для RNAi представляет собой олигонуклеотид с обоими тупыми концами, составляющий 21 нуклеотид в длину, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-Б-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца. Антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метилмодификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.
В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит смысловую нить из 21 нуклеотида и антисмысловую нить из 23 нуклеотидов, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-Б-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца; антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца, где один конец средства для RNAi тупой, в то время как другой конец предусматривает выступ из 2 нуклеотидов. Предпочтительно выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой нити. В тех случаях, когда выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой нити, между тремя концевыми нуклеотидами могут быть две фосфотиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов являются выступающими нуклеотидами, а третий нуклеотид является спаренным нуклеотидом, следующим за выступающим нуклеотидом. В одном варианте осуществления средство для RNAi дополнительно содержит две фосфотиоат- 11 037115 ные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами как на 5'-конце смысловой нити, так и на 5'-конце антисмысловой нити. В одном варианте осуществления каждый нуклеотид в смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi, в том числе нуклеотиды, которые являются частью мотивов, является модифицированным нуклеотидом. В одном варианте осуществления каждый остаток независимо модифицирован 2'-O-метилом или 3'-фтором, например в чередующемся мотиве. Необязательно средство для RNAi дополнительно содержит лиганд (предпочтительно, GalNAc3).
В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит смысловую и антисмысловую нити, где средство для RNAi содержит первую нить с длиной, которая составляет по меньшей мере 25 и самое большее 29 нуклеотидов, и вторую нить с длиной, которая составляет самое большее 30 нуклеотидов, по меньшей мере с одним мотивом из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положении 11, 12, 13 от 5'-конца; где 3'-конец первой нити и 5'-конец второй нити образуют тупой конец, а вторая нить на своем 3'-конце на 1-4 нуклеотида длиннее, чем первая нить, где дуплексный участок составляет по меньшей мере 25 нуклеотидов в длину, а вторая нить в достаточной степени комплементарна целевой мРНК на протяжении по меньшей мере 19 нуклеотидов длины второй нити, для снижения экспрессии целевого гена, где средство для RNAi вводят в клетку млекопитающего и где расщепление средства для RNAi при помощи dicer предпочтительно дает в результате siRNA, предусматривающую 3'-конец второй нити, за счет чего снижается экспрессия целевого гена у млекопитающего. Необязательно, средство для RNAi дополнительно содержит лиганд.
В одном варианте осуществления смысловая нить средства для RNAi содержит по меньшей мере один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов, где один из мотивов находится в сайте расщепления в смысловой нити.
В одном варианте осуществления антисмысловая нить средства для RNAi может также содержать по меньшей мере один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов, где один из мотивов находится в сайте расщепления в смысловой нити или рядом с ним.
Для средства для RNAi с дуплексным участком, составляющим 17-23 нуклеотида в длину, сайт расщепления антисмысловой нити находится обычно около положений 10, 11 и 12 от 5'-конца. Таким образом, мотивы с тремя одинаковыми модификациями могут находиться в положениях 9, 10, 11; положениях 10, 11, 12; положениях 11, 12, 13; положениях 12, 13, 14 или положениях 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца антисмысловой нити, или отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой нити. Сайт расщепления в антисмысловой нити может также изменяться в соответствии с длиной дуплексного участка RNAi от 5'-конца.
Смысловая нить средства для RNAi может содержать по меньшей мере один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления нити; а антисмысловая нить может характеризоваться по меньшей мере одним мотивом с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления нити или рядом с ним. В тех случаях, когда смысловая нить и антисмысловая нить образуют дуплекс dsRNA, смысловая нить и антисмысловая нить могут быть выровнены так, что один мотив из трех нуклеотидов в смысловой нити и один мотив из трех нуклеотидов в антисмысловой нити имеют перекрытие по меньшей мере в один нуклеотид, т.е. по меньшей мере один из трех нуклеотидов мотива в смысловой нити образует пару оснований по меньшей мере с одним из трех нуклеотидов мотива в антисмысловой нити. В качестве альтернативы по меньшей мере два нуклеотида могут перекрываться или все три нуклеотида могут перекрываться.
В одном варианте осуществления смысловая нить средства для RNAi может содержать несколько мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов. Первый мотив может находиться в сайте расщепления нити или рядом с ним, а другие мотивы могут представлять собой фланкирующую модификацию. Термин фланкирующая модификация в данном документе относится к мотиву, находящемуся в другой части нити, который отделен от мотива в сайте расщепления той же нити или рядом с ним. Фланкирующая модификация либо прилегает к первому мотиву, либо отделена по меньшей мере одним или несколькими нуклеотидами. В тех случаях, когда мотивы непосредственно прилегают друг к другу, тогда химическая структура мотивов отличается друг от друга, а когда мотивы разделены одним или несколькими нуклеотидами, тогда химические структуры могут быть одинаковыми или разными. Могут присутствовать две или более фланкирующие модификации. Например, если присутствуют две фланкирующие модификации, то каждая фланкирующая модификация может встречаться на одном конце относительно первого мотива, который находится в сайте расщепления или рядом с ним, или с обеих сторон основного мотива.
Подобно смысловой нити, антисмысловая нить средства для RNAi может содержать несколько мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов, при этом по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления нити или рядом с ним. Данная антисмысловая нить может также содержать одну или несколько фланкирующих модификаций, при выравнивании подобных фланкирующим модификациям, которые могут присутствовать в смысловой нити.
В одном варианте осуществления фланкирующая модификация в смысловой нити или антисмысловой нити средства для RNAi обычно не включает первый один или первые два концевых нуклеотида на
- 12 037115
З'-конце, 5'-конце или на обоих концах нити.
В другом варианте осуществления фланкирующая модификация в смысловой нити или антисмысловой нити средства для RNAi обычно не включает первый один или первые два спаренных нуклеотида в дуплексном участке на 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах нити.
В тех случаях, если каждая из смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi содержит по меньшей мере одну фланкирующую модификацию, то фланкирующие модификации могут попадать на один и тот же конец дуплексного участка и иметь перекрытие в один, два или три нуклеотида.
В тех случаях, если каждая из смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi содержит по меньшей мере две фланкирующие модификации, то смысловая нить и антисмысловая нить могут быть выравнены так, что две модификации, каждая от одной нити, попадают на один конец дуплексного участка с перекрытием в один, два или три нуклеотида; две модификации, каждая от одной нити, попадают на другой конец дуплексного участка с перекрытием в один, два или три нуклеотида; две модификации одной нити попадают по обе стороны от ведущего мотива с перекрытием в один, два или три нуклеотида в дуплексном участке.
В одном варианте осуществления каждый нуклеотид в смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi, в том числе нуклеотиды, которые являются частью мотивов, может быть модифицирован. Каждый нуклеотид может быть модифицированным одинаковыми или разными модификациями, которые могут включать одно или несколько изменений одного или обоих несвязанных с фосфатом атомов кислорода и/или одного или нескольких связанных с фосфатом атомов кислорода; изменение компонента рибозного сахара, например 2'-гидроксила в рибозном сахаре; полную замену фосфатного фрагмента дефосфоризованными линкерами; модификацию или замену встречающегося в природе основания и замену или модификацию рибозофосфатного остова.
Поскольку нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры из субъединиц, то многие модификации встречаются в положении, которое повторяется в пределах нуклеиновой кислоте, например модификация основания, или фосфатного фрагмента, или не образующего связь атома О фосфатного фрагмента. В некоторых случаях модификация будет встречаться во всех рассматриваемых положениях в нуклеиновой кислоте, но во многих случаях не будет. В качестве примера модификация может встречаться только в 3'- или 5'-концевом положении, может встречаться только в концевом участке, например в положении концевого нуклеотида или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах нити. Модификация может встречаться в двухнитевом участке, в однонитевом участке или в обоих. Модификация может встречаться только в двухнитевом участке РНК или может встречаться только в однонитевом участке РНК. Например, фосфотиоатная модификация в положении не образующего связь атома О может встречаться только на одном или обоих концах, может встречаться только в концевом участке, например в положении концевого нуклеотида или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах нити или может встречаться в двухнитевом и однонитевом участках, в частности на концах. 5'-конец или концы могут быть фосфорилированы.
Это создает возможность, например, для повышения стабильности, для включения конкретных оснований в выступы, или для включения модифицированных нуклеотидов или имитаторов нуклеотидов, в однонитевые выступы, например в 5'- или 3'-выступ или в оба. Например, может быть желательно включить пуриновые нуклеотиды в выступы. В некоторых вариантах осуществления все или некоторые основания в 3'- или 5'-выступе могут быть модифицированы, например, с помощью модификации, описанной в данном документе. Модификации могут предусматривать, например, применение модификаций в 2'-положении рибозного сахара с помощью модификаций, известных из уровня техники, например применение дезоксирибонуклеотидов, 2'-дезокси-2'-фтор-(2'-Е)- или 2'-O-метил-модификаций вместо рибозного сахара нуклеинового основания, а также модификаций фосфатной группы, например фосфотиоатных модификаций. Выступы необязательно должны быть гомологичными целевой последовательности.
В одном варианте осуществления каждый остаток смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-О-цдлилом, 2'-С-аллилом, 2'-дезокси, 2'-гидроксилом или 2'-фтором. Нити могут содержать более одной модификации. В одном варианте осуществления каждый остаток смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован с помощью 2'-O-метила или 2'-фтора.
По меньшей мере две различные модификации, как правило, присутствуют в смысловой нити и антисмысловой нити. Эти две модификации могут быть 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификациями или другими.
В одном варианте осуществления Na и/или Nb имеет модификации чередующегося паттерна. Термин чередующийся мотив, используемый в данном документе, относится к мотиву с одной или несколькими модификациями, при этом каждая модификация встречается у чередующихся нуклеотидов одной нити. Чередующийся нуклеотид может относиться к каждому второму нуклеотиду или к каждому третьему нуклеотиду или аналогичному паттерну. Например, если каждый из А, В и С представляет собой один тип модификации нуклеотида, то чередующийся мотив может представлять собой АВАВАВАВАВАВ..., АВВААВВААВВ..., ААВААВААВААВ , АААВАААВАААВ..., АААВВВАААВВВ... или АВСАВСАВСАВС... и т.д.
- 13 037115
Тип модификаций, содержащихся в чередующемся мотиве, может быть одинаковым или разным. Например, если каждый из А, В, С, D представляет собой один тип модификации нуклеотида, то чередующийся паттерн, т.е. модификации каждого второго нуклеотида, может быть одинаковым, но каждая из смысловой нити или антисмысловой нити может быть выбрана из нескольких возможных модификаций в чередующемся мотиве, как, например, АВАВАВ..., аСаСАС..., BDBDBD... или CDCdCd... и т.д.
В одном варианте осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению содержит паттерн модификаций для чередующегося мотива смысловой нити, сдвинутый относительно паттерна модификации для чередующегося мотива антисмысловой нити. Сдвиг может быть таким, что модифицированная группа нуклеотидов смысловой нити соответствует модифицированной другим способом группе нуклеотидов антисмысловой нити и vice versa. Например, при спаривании смысловой нити с антисмысловой нитью в дуплексе dsRNA чередующийся мотив в смысловой нити может начинаться с АВАВАВ от 5'- к 3'-концу нити, а чередующийся мотив в антисмысловой нити может начинаться с ВАВАВА от 5'- к 3'-концу нити в дуплексном участке. В качестве другого примера чередующийся мотив в смысловой нити может начинаться с ААВВААВВ в направлении от 5'- к 3'-концу нити, а чередующийся мотив в антисмысловой нити может начинаться с ВВААВВАА в направлении от 5'- к 3'-концу нити в пределах дуплексного участка, так что между смысловой нитью и антисмысловой нитью имеется полный или частичный сдвиг паттернов модификаций.
В одном варианте осуществления средство для RNAi, содержащее паттерн чередующегося мотива 2'-О-метил-модификации и 2'-Б-модификации в смысловой нити, первоначально имеет сдвиг в отношении паттерна чередующегося мотива 2' -О-метил-модификации и 2'-Б-модификации в антисмысловой нити, т.е. 2'-О-метил-модифицированный нуклеотид в парах оснований смысловой нити с 2'-Е-модифицированным нуклеотидом в антисмысловой нити и vice versa. 1 положение в смысловой нити может начинаться с 2'-Б-модификации, а 1 положение в антисмысловой нити может начинаться с 2'-О-метил-модификации.
Введение одного или нескольких мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в смысловую нить и/или антисмысловую нить нарушает первоначальный паттерн модификаций, присутствующий в смысловой нити и/или антисмысловой нити. Такое нарушение паттерна модификаций смысловой и/или антисмысловой нити путем введения одного или нескольких мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в смысловую и/или антисмысловую нить неожиданно повышает активность сайленсинга генов в отношении целевого гена.
В одном варианте осуществления в тех случаях, если мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов вводят в любую из нитей, модификация нуклеотида, следующего за мотивом, является модификацией, отличной от модификации мотива. Например, часть последовательности, содержащей мотив, представляет собой ...NaYYYNb..., где Y представляет собой модификацию мотива с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов, a Na и Nb представляют собой модификацию нуклеотида, следующего за мотивом YYY, которая отличается от модификации Y, и где Na и Nb могут быть одинаковыми или разными модификациями. В качестве альтернативы Na и/или Nb могут присутствовать или отсутствовать в случае, если присутствует фланкирующая модификация.
Средство для RNAi может дополнительно содержать по меньшей мере одну фосфотиоатную или метилфосфонатую межнуклеотидную связь. Модификация фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи может встречаться у любого нуклеотида смысловой нити или антисмысловой нити или обеих нитей в любом положении нити. Например, модификация межнуклеотидной связи может встречаться у каждого нуклеотида смысловой нити и/или антисмысловой нити; при этом каждая модификация межнуклеотидной связи может встречаться в чередующемся паттерне в смысловой нити и/или антисмысловой нити; или смысловая нить или антисмысловая нить могут содержать обе модификации межнуклеотидной связи в чередующемся паттерне. Чередующийся паттерн модификаций межнуклеотидной связи в смысловой нити может быть таким же, как у антисмысловой нити, или отличным от него, и чередующийся паттерн модификаций межнуклеотидной связи в смысловой нити может иметь сдвиг относительно чередующегося паттерна модификаций межнуклеотидной связи в антисмысловой нити.
В одном варианте осуществления RNAi содержит модификацию фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в выступающем участке. Например, выступающий участок может содержать два нуклеотида с фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связью между двумя нуклеотидами. Модификации межнуклеотидной связи также могут быть выполнены для соединения выступающих нуклеотидов с концевыми спаренными нуклеотидами в дуплексном участке. Например, по меньшей мере 2, 3, 4 или все выступающие нуклеотиды могут быть связаны посредством фосфотиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи и, необязательно, могут присутствовать дополнительные фосфотиоатные или метилфосфонатные межнуклеотидные связи, соединяющие выступающий нуклеотид со спаренным нуклеотидом, который следует за выступающим нуклеотидом. Например, между тремя концевыми нуклеотидами могут присутствовать по меньшей мере две фосфотиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов представляют собой выступающие нуклеотиды, а третий явля- 14 037115 ется спаренным нуклеотидом, следующим за выступающим нуклеотидом. Эти три концевые нуклеотида могут быть на 3'-конце антисмысловой нити, 3'-конце смысловой нити, 5'-конце антисмысловой нити и/или 5'-конце антисмысловой нити.
В одном варианте осуществления выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой нити и между тремя концевыми нуклеотидами присутствуют две фосфотиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов являются выступающими нуклеотидами, а третий нуклеотид является спаренным нуклеотидом, следующим за выступающим нуклеотидом. Необязательно, средство для RNAi может дополнительно иметь две фосфотиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами как на 5'-конце смысловой нити, так и на 5'-конце антисмысловой нити.
В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит ошибочное(ые) спаривание(ия) с мишенью, в дуплексе или их комбинации. Ошибочное спаривание может встречаться в выступающем участке или дуплексном участке. Пары оснований можно выстраивать на основании их способности содействовать диссоциации или плавлению (например, по свободной энергии ассоциации или диссоциации определенного спаривания, при этом наиболее простым подходом является изучение пар по отдельности для каждой пары оснований, однако также можно применять анализ ближайшего соседа или подобный). С точки зрения содействия диссоциации: A:U более предпочтительна, чем G:C; G:U более предпочтительна, чем G:C; a Т:С более предпочтительна, чем G:C (I = инозин). Ошибочные спаривания, например неканонические или отличные от канонических типы спаривания (описанные в других местах данного документа), предпочтительнее канонических типов спаривания (А:Т, A:U, G:C); и типы спаривания, которые включают универсальное основание, предпочтительнее канонических типов спаривания.
В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит по меньшей мере одну из первых 1, 2, 3, 4 или 5 пар оснований в дуплексных участках от 5'-конца антисмысловой нити, независимо выбранную из группы, состоящей из: A:U, G:U, I:C и ошибочно спаренных пар, например неканонических, или отличных от канонических типов спаривания, или типов спаривания, которые включают универсальное основание, для содействия диссоциации антисмысловой нити на 5'-конце дуплекса.
В одном варианте осуществления нуклеотид в положении 1 в пределах дуплексного участка, в направлении от 5'-конца антисмысловой нити, выбран из группы, состоящей из A, dA, dU, U и dT. В качестве альтернативы по меньшей мере одна из первых 1, 2 или 3 пар оснований в пределах дуплексного участка, в направлении от 5'-конца антисмысловой нити, представляет собой пару оснований AU. Например, первая пара оснований в пределах дуплексного участка, в направлении от 5'-конца антисмысловой нити, представляет собой пару оснований AU.
В одном варианте осуществления последовательность смысловой нити может быть представлена формулой (I)
5' np-Na-(X X X )a-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Ζ Ζ ) :-Na-nq 3' (I) где каждый из i и j независимо равняется 0 или 1;
каждый из р и q независимо равняется 0-6;
каждый Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;
каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждый np и nq независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
где Nb и Y имеют неодинаковую модификацию;
каждый из XXX, YYY и ZZZ независимо представляет собой один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов.
Предпочтительно в YYY все нуклеотиды 2'-F-модифицированы.
В одном варианте осуществления Na и/или Nb содержит модификации чередующегося паттерна.
В одном варианте осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит дуплексный участок из 17-23 нуклеотидов в длину, то мотив YYY может находиться в сайте расщепления или около него (например, может находиться в положениях 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 или 11, 12, 13) в смысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.
В одном варианте осуществления i равняется 1, a j равняется 0, или i равняется 0, a j равняется 1, или как i, так и j равняются 1. Смысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib) ;
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (1с); или
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id).
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ib), тогда Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нук- 15 037115 леотидов. Каждый Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ic), тогда Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Id), тогда каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждый Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждый из X, Y и Z может быть одинаковым или отличным от остальных.
В других вариантах осуществления i равняется 0, a j равняется 0, и смысловая нить может быть представлена формулой
5’ np-Na-YYY- Na-nq 3’ (la).
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ia), тогда каждый Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В одном варианте осуществления последовательность антисмысловой нити RNAi может быть представлена формулой (II)
5' nq.-Na'-( Ζ ' Ζ ' Z ' ) k_Nb '-Υ Ύ Ύ '-Nb ' - (X'X'X ' ) i~N'a-np ' 3’ (II) где каждый из k и l независимо равняется 0 или 1;
каждый из р' и q' независимо равняется 0-6;
каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;
каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждый np' и nq' независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
где Nb' и Y' имеют неодинаковую модификацию;
каждый из Х'Х'Х', ΥΎΎ1 и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов.
В одном варианте осуществления Na' и/или Nb' содержит модификации чередующегося паттерна.
Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления антисмысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит дуплексный участок, составляющий 17-23 нуклеотида в длину, то мотив Y'Y'Y' может находиться в положениях 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; или 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.
В одном варианте осуществления в мотиве Y'Y'Y' все нуклеотиды 2'-ОМе-модифицированы.
В одном варианте осуществления k равняется 1, а l равняется 0, или k равняется 0, а l равняется 1, или как k, так и l равняются 1.
Антисмысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5’ nq.-Na'-Z 'Ζ 'Z '-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np. 3’ (I lb) ;
5’ nq.-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np. 3’ (lie); или
5’ nq.-Na'- Ζ ' Ζ ' Z '-Nb '-Y ' Y ' Y '-Nb ' - X'X'X '-Na '-np. 3’ (lid).
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIb), тогда Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIc), тогда Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IId), тогда каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В других вариантах осуществления k равняется 0, а l равняется 0, и антисмысловая нить может быть представлена формулой
- 16 037115
5’ np--Na,-Υ ’ Υ ’ Υ ’ - Na<-nq. 3’ (la) .
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIa), тогда каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждый из X', Y' и Z' может быть одинаковым или отличным от остальных.
Каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо может быть модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-О-метилом, 2'-О-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-гидроксилом или 2'-фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован 2'-О-метилом или 2'-фтором. Каждый X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-О-метил-модификацию или 2'-фтор-модификацию.
В одном варианте осуществления смысловая нить средства для RNAi может содержать мотив YYY, находящийся в положениях 9, 10 и 11 нити, в тех случаях, когда дуплексный участок составляет 21 нуклеотид, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'-F-модификацию. Смысловая нить может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.
В одном варианте осуществления антисмысловая нить может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-O-метил-модификацию. Антисмысловая нить может дополнительно содержать мотив Х'Х'Х' или мотивы Z'Z'Z' в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из Х'Х'Х' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.
Смысловая нить, представленная любой из вышеприведенных формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), образует дуплекс с антисмысловой нитью, представленной любой из формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId) соответственно.
Соответственно, средства для RNAi для применения в способах согласно настоящему изобретению могут содержать смысловую нить и антисмысловую нить, при этом каждая нить содержит 14-30 нуклеотидов, дуплекс для RNAi, представленный формулой (III) смысловая нить: 5' np -Na-(X X Х)± -Nb- YYY -Nb - (Ζ Ζ Z):-Nanq 3’ антисмысловая нить: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'( Ζ ' Ζ ' Ζ ' ) b-Na'-nq' 5’, (III) где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;
каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждый np', np, nq' и nq, каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид; и каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов.
В одном варианте осуществления i равняется 0 и j равняется 0; или i равняется 1, a j равняется 0; или i равняется 0, a j равняется 1; или как i, так и j равняются 0; или как i, так и j равняются 1. В другом варианте осуществления k равняется 0 и l равняется 0; или k равняется 1, а l равняется 0; k равняется 0, а l равняется 1; или как k, так и l равняются 0; или как k, так и l равняются 1.
- 17 037115
Иллюстративные комбинации смысловой нити и антисмысловой нити, образующих дуплекс RNAi, включают формулы, приведенные ниже:
5' пр - Na -Y Y Y -Na-nq 3’
3’ np'-Na'-Y ' Y ' Υ ' -Na'nq' 5’ (Ша)
5’ ηρ -Na -Y Y Y -Nb -Ζ Ζ Ζ -Na-nq 3’
3’ ηρ'-Na'-Υ ' Υ ' Υ '-Nb'-Ζ ' Ζ ' Ζ '-Na'nq' 5’ (11Ib)
5’ np-Na- XXX -Nb -Υ Υ Υ - Na-nq 3’
3’ np'-Na'-X 'X 'X '-Nb'-Y Ύ Ύ '-Na'-nq' 5’ (IIIc)
5’ np -Na -XXX -Nb-Y Y Y -Nb- Ζ Ζ Z -Na-nq 3’
3’ np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y Ύ Ύ'-Nb'-Z 'Ζ 'Z '-Na-nq' 5’ (IIId)
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), тогда каждый Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb), тогда каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждый Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIc), тогда каждый Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), тогда каждый Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na, Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждый из Na, Na', Nb и Nb' независимо содержит модификации чередующегося паттерна.
Каждый из X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) может быть одинаковым или отличным от остальных.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), тогда по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Y'. В качестве альтернативы по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y' или все три из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb) или (IIId), тогда по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. В качестве альтернативы по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z; или все три из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIc) или (IIId), тогда по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. В качестве альтернативы по меньшей мере два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X; или все три из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.
В одном варианте осуществления модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z', и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.
В одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), тогда модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации. В другом варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), тогда модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, и np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи. В еще одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), тогда модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0 и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеоти- 18 037115 дом посредством фосфотиоатной связи, а смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. В другом варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), тогда модификациями Na являются 2'-О-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0 и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
В одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), тогда модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0 и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
В одном варианте осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим по меньшей мере два дуплекса, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
В одном варианте осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или более дуплексов, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
В одном варианте осуществления два средства для RNAi, представленные формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), соединены друг с другом на 5'-конце и один или оба 3'-конца необязательно конъюгированы с лигандом. Каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген или на два различных гена или каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
В различных публикациях описаны мультимерные средства для RNAi, которые можно применять в способах согласно настоящему изобретению. Такие публикации включают WO 2007/091269, патент США № 7858769, WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 и WO 2011/031520, полное содержание которых настоящим включено в данный документ при помощи ссылки.
Средство для RNAi, содержащее один или нескольких углеводных фрагментов, конъюгированных со средством для RNAi, может улучшать одно или несколько свойств средства для RNAi. Во многих случаях углеводный фрагмент будет присоединен к модифицированной субъединице средства для RNAi. Например, рибозный сахар одной или нескольких рибонуклеотидных субъединиц средства на основе dsRNA можно заменять другими фрагментами, например отличным от углевода (предпочтительно циклическим) носителем, к которому присоединен углеводный лиганд. Рибонуклеотидную субъединицу, в которой рибозный сахар субъединицы был заменен таким образом, называют в данном документе субъединицей с модификацией путем замены рибозы (RRMS). Циклический носитель может быть карбоциклической кольцевой системой, т.е. все атомы в кольце являются атомами углерода, или гетероциклической кольцевой системой, т.е. один или несколько атомов в кольце могут быть гетероатомами, например азотом, кислородом, серой. Циклический носитель может быть моноциклической кольцевой системой или может содержать два или более колец, например конденсированных колец. Циклический носитель может представлять собой полностью насыщенную кольцевую систему, или он может содержать одну или несколько двойных связей.
Лиганд может быть присоединен к полинуклеотиду посредством носителя. Носители включают (i) по меньшей мере одну точку присоединения к остову, предпочтительно две точки присоединения к остову, и (ii) по меньшей мере одну связывающую точку присоединения. Точка присоединения к остову, используемая в данном документе, относится к функциональной группе, например гидроксильной группе, или, как правило, связи, доступной для введения носителя в остов, например фосфатный или модифицированный фосфатный, например серосодержащий, остов, и которая подходит для этого, рибонуклеиновой кислоты. Связывающая точка присоединения (ТАР) в некоторых вариантах осуществления относится к входящему в кольцо атому циклического носителя, например атому углерода или гетероатому (отличному от атома, который обеспечивает точку присоединения к остову), с которым связывается выбранный фрагмент. Фрагмент может быть, например, углеводом, например моносахаридом, дисахаридом, трисахаридом, тетрасахаридом, олигосахаридом и полисахаридом. Необязательно, выбранный фрагмент присоединен посредством промежуточного связывающего фрагмента к циклическому носителю. Таким образом, циклический носитель будет часто включать функциональную группу, например
- 19 037115 аминогруппу, или, как правило, обеспечивать связь, подходящую для введения или связывания другого химического структурного элемента, например лиганда, в состав кольца.
Средства для RNAi можно конъюгировать с лигандом через носитель, где носитель может быть циклической группой или ациклической группой; предпочтительно, циклическая группа выбрана из пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, пиперидинила, пиперазинила, [1,3]-диоксолана, оксазолидинила, изоксазолидинила, морфолинила, тиазолидинила, изотиазолидинила, хиноксалинила, пиридазинонила, тетрагидрофурила и декалина; предпочтительно ациклическая группа выбрана из остова, представляющего собой серинол, или остова, представляющего собой диэтаноламин.
В определенных конкретных вариантах осуществления средство для RNAi для применения в способах согласно настоящему изобретению представляет собой средство, выбранное из группы средств, приведенных в любой из табл. 1 и 2. В одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство представляет собой средство, приведенное в табл. 1, тогда у средства может отсутствовать концевой dT.
Настоящее изобретение дополнительно включает двухнитевые средства для RNAi, содержащие любую из последовательностей, приведенных в любой из табл. 1 или 2, которые содержат 5'-фосфат или миметик фосфата в антисмысловой нити (см., например, публикацию согласно РСТ № WO 2011005860). Дополнительно, настоящее изобретение включает двухнитевые средства для RNAi, содержащие любую из последовательностей, приведенных в одной из табл. 1 или 2, которые включают 2'-фтор-группу вместо 2'-ОМе-группы на 5'-конце смысловой нити.
Дополнительные мотивы.
В определенных аспектах двухнитевые средства для RNAi, описанные в данном документе, содержат смысловую нить и антисмысловую нить, при этом указанные смысловая нить и антисмысловая нить содержат меньше одиннадцати, десяти, девяти, восьми, семи, шести или пяти 2'-дезоксифтормодификаций.
В определенных аспектах двухнитевые средства для RNAi, описанные в данном документе, содержат смысловую нить и антисмысловую нить, при этом указанные смысловая нить и антисмысловая нить содержат меньше десяти, девяти, восьми, семи, шести, пяти, четырех фосфотиоатных межнуклеотидных связей.
В определенных аспектах двухнитевые средства для RNAi, описанные в данном документе, содержат смысловую нить и антисмысловую нить, при этом указанные смысловая нить и антисмысловая нить содержат меньше десяти 2'-дезоксифтор-модификаций и меньше шести фосфотиоатных межнуклеотидных связей.
В определенных аспектах двухнитевые средства для RNAi, описанные в данном документе, содержат смысловую нить и антисмысловую нить, при этом указанные смысловая нить и антисмысловая нить содержат меньше восьми 2'-дезоксифтор-модификаций и меньше шести фосфотиоатных межнуклеотидных связей.
В определенных аспектах двухнитевые средства для RNAi, описанные в данном документе, содержат смысловую нить и антисмысловую нить, при этом указанные смысловая нить и антисмысловая нить содержат меньше девяти 2'-дезоксифтор-модификаций и меньше шести фосфотиоатных межнуклеотидных связей.
Лиганды.
Двухнитевые средства для RNAi согласно настоящему изобретению необязательно могут быть конъюгированы с одним или несколькими лигандами. Лиганд может быть присоединен к смысловой нити, антисмысловой нити или к обеим нитям на 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах. К примеру, лиганд может быть конъюгирован со смысловой нитью. В некоторых вариантах осуществления лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой нити. В одном варианте осуществления лигандом является лиганд GalNAc. Особенно в некоторых вариантах осуществления лигандом является GalNAc3. Лиганды соединены, предпочтительно ковалентно, либо непосредственно, либо опосредованно через промежуточный связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления лиганд меняет распределение, нацеливание или время жизни молекулы, в которую он введен. В некоторых вариантах осуществления лиганд обеспечивает повышенную аффинность в отношении выбранной мишени, например молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, рецептора, например компартмента клетки или органа, ткани, органа или участка тела, например, по сравнению с молекулой, у которой отсутствует такой лиганд. Лиганды, обеспечивающие повышенную аффинность в отношении выбранной мишени, также называют нацеливающими лигандами.
Некоторые лиганды могут обладать эндосомолитическими свойствами. Эндосомолитические лиганды способствуют лизису эндосомы и/или транспорту композиции согласно настоящему изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Эндосомолитический лиганд может представлять собой полианионный пептид или пептидомиметик, который проявляет рН-зависимую мембранную активность и фузогенность. В одном варианте осуществления эндосомолитический лиганд принимает свою активную конформацию при значении рН эндосомы. Активной конформацией является такая конфор- 20 037115 мация, при которой эндосомолитический лиганд способствует лизису эндосомы и/или транспорту композиции согласно настоящему изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Иллюстративные эндосомолитические лиганды включают пептид GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26:2964-2972), пептид EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118:1581-1586) и их производные (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559:56-68). В одном варианте осуществления эндосомолитический компонент может содержать химическую группу (например, аминокислоту), которая будет претерпевать изменения в заряде или протонировании в ответ на изменения рН. Эндосомолитический компонент может быть линейным или разветвленным.
Лиганды могут улучшать транспортировку, гибридизацию и свойства специфичности и могут также улучшать устойчивость к нуклеазам у полученного естественного или модифицированного олигорибонуклеотида или полимерной молекулы, содержащей любую комбинацию мономеров, описанных в данном документе, и/или естественных или модифицированных рибонуклеотидов.
Лиганды, как правило, могут включать терапевтические модификаторы, например, для повышения поглощения; диагностические соединения или репортерные группы, например, для отслеживания распределения; перекрестно сшивающие средства и придающие устойчивость к нуклеазам фрагменты. Общие примеры включают липиды, стероиды, витамины, сахара, белки, пептиды, полиамины и миметики пептидов.
Лиганды могут включать вещество, встречающееся в природе, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL), липопротеин высокой плотности (HDL) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновая кислота) или липид. Лиганд также может быть рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например синтетическая полиаминокислота, олигонуклеотид (например, аптамер). Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, представляющую собой полилизин (PLL), поли-Ь-аспарагиновую кислоту, поли-Ь-глутаминовую кислоту, сополимер стирола и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер L-лактида и гликолида, сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, N-(2-гидроксиnропил)метакриламидный сополимер (НМРА), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, полиамин-псевдопептид, полиаминпептидомиметик, полиамин-дендример, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или альфа-спиральный пептид.
Лиганды также могут включают нацеливающие группы, например нацеливающее на клетку или ткань средство, например лектин, гликопротеин, липид или белок, например антитело, которое связывается с определенным типом клеток, например клеткой почки. Нацеливающей группой могут быть тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный белок А, углевод-муцин, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентная манноза, поливалентная фукоза, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентная галактоза, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчная кислота, фолат, витамин В12, биотин, RGD-пептид, миметик RGD-пептида или аптамер.
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие средства (например, акридины), сшивающие средства (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы или хелатор (например, EDTA), липофильные молекулы, например холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-О-(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецил-глицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, О3-(олеоил)литохолевую кислоту, О3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, пептид antennapedia, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, PEG (например, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченные радиоизотопом маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), помощники транспорта/всасывания (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплекс Eu3+ тетраазамакроциклов), динитрофенил, HRP или АР.
Лигандами могут быть белки, например гликопротеины, или пептиды, например молекулы со специфической аффинностью в отношении ко-лиганда, или антитела, например антитело, которое связывается с определенным типом клеток, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды могут также включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать отличные от пептидов виды молекул, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу или аптамеры. Например, лигандом может быть липополисахарид, активатор МАР-киназы р38 или активатор NF-кВ.
- 21 037115
Лигандом может быть вещество, например лекарственное средство, которое может увеличивать поглощение средства на основе iRNA клеткой, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например путем разрушения микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов клетки. Лекарственным средством, например, может быть таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, латрункулин А, фаллоидин, свинхолид А, инданоцин или миосервин.
Лиганд может увеличивать поглощение олигонуклеотида клеткой, например, путем активации воспалительной реакции. Иллюстративные лиганды, которые будут обладать таким эффектом, включают фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа), интерлейкин-1-бета или гамма интерферон.
В одном аспекте лиганд представляет собой липидную молекулу или молекулу на основе липида. Такая липидная молекула или молекула на основе липида предпочтительно связываются с сывороточным белком, например сывороточным альбумином человека (HSA). Связывающийся с HSA лиганд обеспечивает распределение конъюгата в целевой ткани, например отличной от ткани почек целевой ткани организма. Например, целевой тканью может быть печень, в том числе паренхиматозные клетки печени. Также в качестве лигандов можно использовать другие молекулы, которые могут связывать HSA. Например, можно использовать напроксен или аспирин. Липидный лиганд или лиганд на основе липида может (а) повышать устойчивость к разрушению конъюгата, (b) повышать нацеливающую способность или транспорт в целевую клетку или клеточную мембрану и/или (с) может быть использован для корректировки связывания с сывороточным белком, например HSA.
Лиганд на основе липида можно применять для модулирования, например регулирования связывания конъюгата с целевой тканью. Например, липидный лиганд или лиганд на основе липида, который связывается с HSA более сильно, с меньшей вероятностью будет нацеливаться на почки и, следовательно, с меньшей вероятностью будет выводиться из организма. Липидный лиганд или лиганд на основе липида, который связывается с HSA менее сильно, можно применять для нацеливания конъюгата на почки.
В одном варианте осуществления лиганд на основе липида связывает HSA. Предпочтительно он связывает HSA с аффинностью, достаточной для того, чтобы конъюгат предпочтительно распределялся в ткань, отличную от ткани почек. В одном варианте осуществления аффинность является такой, что связывание HSA-лиганд может быть обратимым. В другом варианте осуществления лиганд на основе липида слабо связывает HSA или не связывает вообще, так что конъюгат будет предпочтительно распределяться в почку. Другие фрагменты, которые нацеливаются на клетки почки, также можно использовать вместо или в дополнение к лиганду на основе липида.
В другом аспекте лигандом является фрагмент, например витамин, который поглощается целевой клеткой, например пролиферирующей клеткой. Такие варианты являются особенно пригодными для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например злокачественного или доброкачественного типа, например раковых клеток. Иллюстративные витамины включают витамин А, Е и K. Другие иллюстративные витамины включают витамины группы В, например фолиевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль, или другие витамины или питательные вещества, поглощаемые раковыми клетками. Также включены HAS, липопротеин низкой плотности (LDL) и липопротеин высокой плотности (HDL).
В другом аспекте лигандом является средство, обеспечивающее проникновение в клетку, предпочтительно спиральное средство, обеспечивающее проникновение в клетку. Предпочтительно средство является амфипатическим. Иллюстративным средством является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, то он может быть модифицированным, в том числе пептидилмиметик, инвертомеры, отличные от пептидных или псевдопептидные связи, и также в нем могут использоваться D-аминокислоты. Спиральное средство предпочтительно представляет собой альфаспиральное средство, которое предпочтительно характеризуется липофильной и липофобной фазами.
Лигандом может быть пептид или пептидомиметик.
Пептидомиметик (также называемый в данном документе олигопептидомиметиком) является молекулой, способной сворачиваться в определенную трехмерную структуру, аналогичную естественному пептиду. Длина пептидного фрагмента или фрагмента-пептидомиметика может составлять приблизительно 5-50 аминокислот, например приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот. Пептидом или пептидомиметиком, например, может быть пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий преимущественно из Tyr, Trp или Phe). Пептидным фрагментом может быть пептид-дендример, конформационно затрудненный пептид или перекрестно сшитый пептид. В другом альтернативном варианте пептидный фрагмент может включать гидрофобную последовательность, контролирующую перенос через мембрану (MTS). Иллюстративным содержащим гидрофобную MTS пептидом является RFGF с аминокислотной последовательностью AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 9). Аналог RFGF (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10)), содержащий гидрофобную MTS, также может быть нацеливающим фрагментом. Пептидный фрагмент может представлять собой доставляющий пептид, который может переносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды, олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны. Например, как было обнаружено, последователь- 22 037115 ности Tat-белка HIV (GRKKRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO: 11) и белка Antennapedia Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK) (SEQ ID NO: 12) способны функционировать в качестве доставляющих пептидов. Пептид или пептидомиметик может кодироваться случайной последовательностью ДНК, как, например, пептид, идентифицированный из библиотеки фагового дисплея или комбинаторной библиотеки одна гранула-одно соединение (ОВОС) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Предпочтительно пептид или пептидомиметик, связанный со средством на основе iRNA, посредством введенной мономерной единицы, представляет собой нацеливающий на клетку пептид, такой как содержащий аргинин-глицинаспарагиновую кислоту (RGD) пептид или RGD-миметик. Пептидный фрагмент может варьироваться по длине от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислот. Пептидные фрагменты могут иметь структурную модификацию, как, например, для повышения стабильности или управления конформационными свойствами. Можно использовать любую из структурных модификаций, описанных ниже. Фрагмент, представляющий собой RGD-пептид, можно применять для нацеливания на опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или опухолевая клетка рака молочной железы (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD-пептид может способствовать нацеливанию средства на основе iRNA на опухоли ряда других тканей, в том числе легкого, почки, селезенки или печени (Aoki et al., Cancer Gene Therapy, 8:783-787, 2001). Предпочтительно RGD-пептид будет способствовать нацеливанию средства на основе iRNA на почку. RGD-пептид может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например гликозилированным или метилированным, для способствования нацеливанию на конкретные ткани. Например, гликозилированный RGD-пептид может доставлять средство на основе iRNA к опухолевой клетке, экспрессирующей aVe3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Можно использовать пептиды, которые нацеливаются на маркеры, которыми обогащены пролиферирующие клетки. Например, содержащие RGD пептиды и пептидомиметики могут быть нацелены на раковые клетки, в частности клетки, на поверхности которых присутствует интегрин. Таким образом, можно применять RGD-пептиды, циклические пептиды, содержащие RGD, RGD-пептиды, которые включают D-аминокислоты, а также синтетические RGD-миметики. В дополнение к RGD можно применять другие фрагменты, которые нацеливаются на лиганд интегрин. Как правило, такие лиганды можно использовать для контроля пролиферации клеток и ангиогенеза. Некоторые конъюгаты с таким типом лиганда нацелены на РЕСАМ-1, VEGF или другой раковый ген, например раковый ген, описанный в данном документе.
Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку позволяет проникать в клетку, например микробную клетку, такую как бактериальная или грибная клетка, или в клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептидом, проникающим в микробную клетку, например, может быть α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или Ceropin P1), содержащий дисульфидную связь пептид (например, α-дефенсин, β-дефенсин или бактенецин), или петид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, также может включать клеточный сигнал внутриядерной локализации (NLS). Например, пептидом, обеспечивающим проникновение в клетку, может быть двухкомпонентный амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из домена пептида слияния gp41 HIV-1 и NLS из большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
В одном варианте осуществления нацеливающим пептидом может быть амфипатический α-спиральный пептид. Иллюстративные амфипатические α-спиральные пептиды включают без ограничений цекропины, ликотоксины, парадаксины, буфорин, CPF, бомбинин-подобный пептид (BLP), кателицидины, цератотоксины, пептиды S. clava, кишечные антимикробные пептиды миксины (HFIAP), магаинины, бревинины-2, дермасептины, меллитины, плевроцидины, пептиды Н2А, пептиды Xenopus, эскулентины-1 и церины. Предпочтительно целый ряд факторов будет рассматриваться в связи с поддержанием целостности и стабильности спирали. Например, будут использовать максимальное количество стабилизирующих спираль остатков (например, leu, ala или lys) и будут использовать минимальное количество дестабилизирующих спираль остатков (например, пролин или циклические мономерные единицы). Будет рассматриваться кэпирующий остаток (например, Gly, представляет собой иллюстративный N-кэпирующий остаток) и/или может использоваться С-концевое амидирование для обеспечения дополнительной Н-связи для стабилизации спирали. Стабильность может обеспечивать образование солевых мостиков между остатками с противоположными зарядами, разделенными i±3 или i±4 положениями. Например, катионные остатки, такие как лизин, аргинин, гомоаргинин, орнитин или гистидин, могут образовывать солевые мостики с анионными остатками, глутаматом или аспартатом.
Лиганды, представляющие собой пептиды и пептидомиметики, включают те пептиды, которые имеют природное происхождение, или модифицированные пептиды, например D- или L- пептиды; α-, βили γ-пептиды; пептиды с N-метилом; азапептиды; пептиды с одним или несколькими амидами, т.е. пептиды со связями, замененными одной или несколькими мочевинными, тиомочевинными, карбаматными или сульфонилмочевинными связями; или циклические пептиды.
Нацеливающим лигандом может быть любой лиганд, который способен нацеливаться на конкретный рецептор. Примерами являются: фолат, GalNAc, галактоза, манноза, манноза-6Р, кластеры сахаров,
- 23 037115 такие как кластер GalNAc, маннозный кластер, галактозный кластер, или аптамер. Кластер представляет собой комбинацию двух или более единиц сахара. Нацеливающие лиганды также включают лиганды рецепгора-интегрина, лиганды хемокинового рецептора, трансферрин, биотин, лиганды серотонинового рецептора, PSMA, эндотелин, GCPII, соматостатин, лиганды LDL и HDL. Основу лигандов также может составлять нуклеиновая кислота, например в случае аптамера. Аптамер может быть немодифицированным или может иметь любую комбинацию модификаций, раскрытых в данном документе.
Эндосомальные высвобождающие средства включают имидазолы, поли- или олигоимидазолы, PEI, пептиды, фузогенные пептиды, поликарбоксилаты, полиакатионы, скрытые олиго- или поликатионы или анионы, ацетали, полиацетали, кетали/поликетали, ортоэфиры, полимеры со скрытыми или не скрытыми катионными или анионными зарядами, дендримеры со скрытыми или не скрытыми катионными или анионными зарядами.
PK-модулятор означает модулятор фармакокинетических параметров. PK-модуляторы включает липофилы, желчные кислоты, стероиды, фосфолипидные аналоги, пептиды, белок-связывающие средства, PEG, витамины и т.д. Иллюстративные PK-модуляторы включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицерид, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т.д. Олигонуклеотиды, которые содержат некоторое количество фосфотиоатных связей, также, как известно, связываются с сывороточным белком, таким образом короткие олигонуклеотиды, например олигонуклеотиды из приблизительно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие множество фосфотиоатных связей в остове, также пригодны в настоящем изобретении в качестве лигандов (например, в качестве РКмодулирующих лигандов).
Кроме того, аптамеры, которые связывают сывороточные компоненты (например, сывороточные белки) также пригодны в настоящем изобретении в качестве PK-модулирующих лигандов.
Другие конъюгаты, представляющие собой лиганды, пригодные в настоящем изобретении, описаны в заявках на выдачу патентов США USSN: 10/916185, поданной 10 августа 2004 г.; USSN: 10/946873, поданной 21 сентября 2004 г.; USSN: 10/833934, поданной 3 августа 2007 г.; USSN: 11/115989, поданной 27 апреля 2005 г., и USSN: 11/944227, поданной 21 ноября 2007 г., которые включены посредством ссылки в полном объеме для всех целей.
В тех случаях, когда присутствуют два или более лиганда, тогда все лиганды могут обладать одинаковыми свойствами, могут обладать различными свойствами или некоторые лиганды обладают одинаковыми свойствами, в то время как другие обладают различными свойствами. Например, лиганд может обладать нацеливающими свойствами, обладать эндосомолитической активностью или обладать PK-модулирующими свойствами. В одном варианте осуществления все лиганды обладают различными свойствами.
Лиганды могут быть присоединены к олигонуклеотидам в разных местах, например на 3'-конце, 5'-конце и/или во внутреннем положении. В некоторых вариантах осуществления лиганд присоединен к олигонуклеотидам через промежуточный связывающий фрагмент, например, носитель, описанный в данном документе. Лиганд или связанный лиганд могут присутствовать на мономере в тех случаях, когда мономер введен в растущую нить. В некоторых вариантах осуществления лиганд может быть введен посредством связывания с мономером-'предшественником после того, как мономер-предшественник был введен в растущую нить. Например, мономер, содержащий, например, связывающий фрагмент с аминогруппой на конце (т.е. без ассоциированного лиганда), например TAP-(CH2)nNH2, может быть введен в растущую нить олигонуклеотидов. На следующей стадии, т.е. после введения мономерапредшественника в нить, лиганд с электрофильной группой, например группой сложного пентафторфенилэфира или альдегидной группой, затем можно присоединить к мономеру-предшественнику путем связывания электрофильной группы лиганда с концевой нуклеофильной группой связывающего фрагмента мономера-предшественника.
В другом примере может быть введен мономер с химической группой, пригодной для участия в реакциях клик-химии, например связывающий фрагмент/линкер с азидом или алкином на конце. На последующей стадии, т.е. после введения мономера-предшественника в нить, лиганд с комплементарной химической группой, например алкин или азид, может быть присоединен к мономеру-предшественнику путем связывания алкина и азида вместе.
В некоторых вариантах осуществления лиганд может быть конъюгирован с нуклеиновыми основаниями, сахарными фрагментами или межнуклеозидными связями в молекулах нуклеиновой кислоты. Конъюгация с пуриновыми нуклеиновыми основаниями или их производными может происходить в любом положении, в том числе по атомам внутри кольца и вне кольца. В некоторых вариантах осуществления к 2-, 6-, 7- или 8-положениям пуринового нуклеинового основания присоединен конъюгатный фрагмент. Конъюгация с пиримидиновыми нуклеиновыми основаниями или их производными также может происходить в любом положении. В некоторых вариантах осуществления 2-, 5- и 6-положения пиримидинового нуклеинового основания могут быть замещены конъюгатным фрагментом. Конъюгация с сахарными фрагментами нуклеозидов может происходить при любом атоме углерода. Примеры атомов углерода в сахарном фрагменте, к которым может быть присоединен конъюгатный фрагмент, включают
- 24 037115
2', 3' и 5' атомы углерода. К положению 1' также может быть присоединен конъюгатный фрагмент, как, например, в остатке, с удаленным азотистым основанием. Межнуклеозидные связи также могут нести конъюгатные фрагменты. Что касается фосфорсодержащих связей (например, фосфодиэфирной, фосфотиоатной, фосфодитиоатной, фосфорамидатной и т.п.), то конъюгатный фрагмент может быть присоединен непосредственно к атому фосфора или к атому О, N или S, связанному с атомом фосфора. Что касается амин- или амид-содержащих межнуклеозидных связей (например, PNA), то конъюгатный фрагмент может быть присоединен к атому азота амина или амида или к смежному атому углерода.
Лиганды GalNAc и линкеры.
В некотором варианте осуществления siRNA, целенаправленно воздействующая на ген HAO1, конъюгирована с углеводом, например, моносахаридом (таким как GalNAc), дисахаридом, трисахаридом, тетрасахаридом, полисахаридом. В некоторых вариантах осуществления siRNA конъюгирована с лигандом N-ацетилгалактозамином (GalNAc). Повышения эффективности доставки в гепатоциты после подкожного введения. Способы конъюгирования углеводов, например N-ацетилгалактозамина, например, с siRNA хорошо известны специалисту в данной области. Примеры могут быть найдены в US 8106022 и WO 2014/025805.
В некоторых вариантах осуществления siRNA, целенаправленно воздействующая на ген HAO1, конъюгирована с лигандом, например с GalNac, посредством линкера. Например, лигандом может быть одно или несколько производных GalNAc (N-ацетилглюкозамина), присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
В одном варианте осуществления dsRNA согласно настоящему изобретению конъюгирована с двухвалентными и трехвалентными разветвленными линкерами, включающими структуры, показанные в
ряющиеся единицы могут быть одинаковыми или различными;
каждый из P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH или СН2О;
Q2A, q2b, q3a, q3b, q4a, q4b, q5a, qSB, q5c независимо в каждом случая отсутствуют, представляют собой алкилен, замещенный алкилен, где одна или несколько метиленовых групп могут прерываться или
- 25 037115 оканчиваться одним или несколькими из О, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R''), С=С или С(О);
каждый из R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5c независимо в каждом случае отсутствует, представляет собой NH, О, S, СН2, С(О)О, C(O)NH, NHCH(Ra)С(О), -С(О)СН(Ra)-NH-, СО, CH=N-O, о
или гетероциклил;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B и L5C представляют собой лиганд, т.е. каждый независимо для каждого случая представляет собой моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасаха рид, олигосахарид или полисахарид; и
Ra представляет собой Н или боковую цепь аминокислоты.
В случае средств для RNAi, служащих для ингибирования экспрессии целевого гена, особенно при менимы трехвалентные линкеры, посредством которых конъюгируют производные GalNAc, такие как линкеры формулы (VII)
где L5A, L5B и L5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.
Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, посредством которых конъюгируют производные GalNAc, включают без ограничения следующие соединения:
- 26 037115
- 27 037115
Дополнительные лиганды.
В некоторых вариантах осуществления лиганд выбран из одного из следующих:
- 28 037115
III. Доставка iRNA согласно настоящему изобретению.
Доставку средства на основе iRNA согласно настоящему изобретению к клетке, например клетке в организме субъекта, таком как субъект-человек (например, субъект, нуждающийся в этом, такой как субъект с ассоциированным с HAO1 нарушением), можно осуществлять различными путями. Например, доставку можно осуществлять путем приведения клетки в контакт с iRNA согласно настоящему изобретению либо in vitro, либо in vivo. Доставку in vivo также можно осуществлять непосредственно путем введения субъекту композиции, содержащей iRNA, например dsRNA. В качестве альтернативы доставку in vivo можно осуществлять опосредованно путем введения одного или нескольких векторов, которые кодируют iRNA и управляют ее экспрессией. Такие альтернативные случаи дополнительно описаны ниже.
Как правило, любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты (in vitro или in vivo) может быть адаптирован для применения с iRNA согласно настоящему изобретению (см., например, Akhtar S. and Julian R.L. (1992), Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 и WO 94/02595, которые включены в данный документ при помощи ссылки в полном их объеме). Что касается доставки in vivo, факторы, которые учитывают в контексте доставки молекулы iRNA, включают, например, биологическую стабильность доставляемой молекулы, предупреждение неспецифических эффектов и накопление доставляемой молекулы в целевой ткани.
Неспецифические эффекты iRNA могут быть сведены к минимуму путем локального введения, например путем прямой инъекции или вживления в ткань, или местного введения препарата. Локальное введение в место обработки максимально увеличивает локальную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на системные ткани, которые в ином случае могут быть повреждены средством или которые могут разрушить средство, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы iRNA. Из результатов нескольких исследований виден эффективный нокдаун генных продуктов при введении iRNA локально. Например, было показано, что внутриглазная доставка dsRNA к VEGF как путем инъекции в стекловидное тело макаков-крабоедов (Tolentino, M.J., et al. (2004), Retina 24:132-138), так и субретинальных инъекций мышам (Reich, S.J., et al. (2003), Mol. Vis. 9:210-216) предупреждает неоваскуляризацию в экспериментальной модели возрастной макулярной дистрофии. Кроме того, непосредственная внутриопухолевая инъекция dsRNA мышам уменьшает размер опухоли (Pille, J., et al. (2005), Mol. Ther. 11:267-274) и может продлевать время жизни мышей с опухолями (Kim, W.J., et al. (2006), Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al. (2007), Mol. Ther. 15:515-523). Было показано, что РНК-интерференция также успешна при локальной доставке к CNS путем непосредственной инъекции (Dorn, G., et al. (2004), Nucleic Acids, 32:e49; Tan, P.H., et al. (2005), Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002), BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, G.T., et al. (2004), Neuroscience 129:521-528; Thakker, E.R., et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y., et al. (2005), J. Neurophysiol. 93:594-602) и к легким путем интраназального введения (Howard, К.А., et al. (2006), Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al. (2004), J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005), Nat. Med. 11:50-55). Что касается системного введения iRNA для лечения заболевания, то РНК может быть модифицирована или, альтернативно, доставлена при помощи системы доставки лекарственного средства; оба способа служат для предупреждения быстрого разрушения dsRNA эндо- и экзонуклеазами in vivo. Модификация РНК или фармацевтический носитель также могут делать возможным нацеливание композиции с iRNA на целевую ткань, и с их помощью можно избежать нежелательных нецелевых эффектов. Молекулы iRNA можно модифицировать при помощи химического конъюгирования с липофильными группами, такими как холестерин, для повышения поглощения клеткой и предупреждения разрушения. Например, направленную против АроВ iRNA, конъюгированную с липофильным фрагментом, представляющим собой холестерин, системно вводили мышам, что приводило к нокдауну мРНК ароВ как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al. (2004), Nature, 432:173-178). Как было показано, конъюгация iRNA с аптамером ингибирует рост опухоли и опосредует регресс опухоли на мышиных моделях рака предстательной железы (McNamara, J.O., et al. (2006), Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). В альтернативном варианте осуществления iRNA можно доставлять с помощью систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер,
- 29 037115 липосомы или катионная система доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы iRNA (отрицательно заряженной), а также увеличивают взаимодействия на отрицательно заряженной клеточной мембране с обеспечением эффективного поглощения iRNA клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут быть либо связанными с iRNA, либо на них воздействуют для образования пузырька или мицеллы (см., например, Kim S.H., et al. (2008), Journal of Controlled Release 129(2):107-116), которые заключают в себя iRNA. Образование везикул или мицелл также предупреждает разрушение iRNA при системном введении. Способы получения и введения катионных комплексов с iRNA находятся в пределах квалификации специалистов в данной области (см., например, Sorensen, D.R., et al. (2003), J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, U.N., et al. (2003), Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, A.S. et al. (2007), J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в данный документ при помощи ссылки в полном их объеме). Некоторые неограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, пригодных для системной доставки iRNA, включают DOTAP (Sorensen, D.R., et al. (2003), выше; Verma, U.N., et al. (2003), выше), олигофектамин, твердые частицы с нуклеиновой кислотой-липидом (Zimmermann, T.S., et al. (2006), Nature, 441:111-114), кардиолипин (Chien, P.Y., et al. (2005), Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al. (2005), Int. J. Oncol. 26:1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet M.E., et al. (2008), Pharm. Res. электронная публикация перед печатью 16 августа; Aigner, A. (2006), J. Biomed. Biotechnol. 71659), содержащие Arg-Gly-Asp (RGD) пептиды (Liu, S. (2006), Mol. Pharm. 3:472-487) и полиамидоамины (Tomalia, D.A., et al. (2007), Biochem. Soc. Trans. 35:6167; Yoo, H., et al. (1999), Pharm. Res. 16:1799-1804). В некоторых вариантах осуществления iRNA образует комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции с iRNA и циклодекстринами можно найти в патенте США № 7427605, который включен в данный документ при помощи ссылки в полном его объеме. Кодируемые вектором iRNA согласно настоящему изобретению iRNA, целенаправленно воздействующая на ген НАО1, может экспрессироваться из транскрипционных единиц, вставленных в ДНК-или РНК-векторы (см., например, Couture, A., et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., международную публикацию согласно PCT № WO 00/22113, Conrad, международную публикацию согласно РСТ № WO 00/22114 и Conrad, патент США № 6054299). Экспрессия может быть временной (приблизительно от часов до недель) или длительной (от недель до месяцев или дольше) в зависимости от конкретной применяемой конструкции и целевых ткани или типа клеток. Такие трансгены можно вводить в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может быть интегрирующим или неинтегрирующим вектором. Трансгены также могут быть сконструированы с возможностью наследования их в виде экстрахромосомной плазмиды (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), 92:1292).
Отдельные нить или нити iRNA могут транскрибироваться с промотора вектора экспрессии. В целевую клетку можно совместно вводить два отдельных вектора экспрессии (например, путем трансфекции или инфицирования) для экспрессии двух отдельных нитей с получением, например, dsRNA. В альтернативном случае, каждая отдельная нить dsRNA может транскрибироваться с участием промоторов, оба из которых расположены в одной и той же плазмиде экспрессии. В одном варианте осуществления dsRNA экспрессируется в виде полинуклеотидов с инвертированным повтором, соединенных линкерной полинуклеотидной последовательностью так, что dsRNA имеет структуру типа стебель-петля.
Векторы экспрессии iRNA, как правило, являются ДНК-плазмидами или вирусными векторами. Векторы экспрессии, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно совместимые с клетками позвоночных, можно использовать для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии iRNA, которая описана в данном документе. Векторы экспрессии для эукариотических клеток хорошо известны в уровне техники и доступны из ряда коммерческих источников. Как правило, предусмотрено, что такие векторы содержат удобные сайты рестрикции для вставки необходимого сегмента нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих iRNA, может быть системной, как, например, путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные от пациента, с последующим обратным введением пациенту или путем любого другого способа, который обеспечивает возможность введения в необходимую целевую клетку.
Целевые клетки можно трансфицировать плазмидами экспрессии iRNA в виде комплекса с носителями-катионными липидами (например, олигофектамином) или носителями на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO™). В настоящем изобретением также рассматриваются множественные трансфекции при помощи липидов для типов iRNA-опосредованного нокдауна, нацеленных на различные участки целевой РНК, на протяжении недели или более. Успешное введение векторов в клеткихозяева можно контролировать при помощи разнообразных известных способов. Например, временную трансфекцию можно выявить при помощи репортера, такого как флуоресцентный маркер, например зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может быть подтверждена с применением маркеров, которые обеспечивают устойчивость трансфицированной клетки к определенным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), как, например, устойчивость к гигромицину В.
Системы вирусных векторов, которые можно использовать со способами и композициями, описанными в данном документе, включают без ограничения (а) аденовирусные векторы; (b) ретровирусные
- 30 037115 векторы, в том числе без ограничения лентивирусные векторы, вирус мышиного лейкоза Молони и т.д.; (с) векторы на основе аденоассоциированного вируса; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (е) векторы на основе SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) векторы на основе пикорнавируса; (i) векторы на основе поксвируса, такого как ортопокс, например векторы на основе вируса осповакцины, или авипокс, например канарипокс или оспы кур; и (j) хелпер-зависимый или слабый аденовирус. Также преимущественными могут быть вирусы с нарушенной репликацией. Различные векторы будут встраиваться в геном клеток или не будут встраиваться в геном клеток. При необходимости, конструкции могут включать последовательности вирусов для трансфекции. В качестве альтернативы конструкция может быть включена в векторы, способные к эписомальной репликации, например векторы на основе EPV и EBV. В конструкциях для рекомбинантной экспрессии iRNA, как правило, будут необходимы регуляторные элементы, например промоторы, энхансеры и т. д., для обеспечения экспрессии iRNA в целевых клетках. Другие аспекты, учитываемые в отношении векторов и конструкций, дополнительно описаны ниже.
Векторы, пригодные для доставки iRNA, будут включать регуляторные элементы (промотор, энхансер и т. д.), достаточные для экспрессии iRNA в необходимой целевой клетке или ткани. Регуляторные элементы можно выбирать для получения либо конститутивной, либо регулируемой/индуцибельной экспрессии.
Экспрессия iRNA может быть точно регулируемой, например, путем использования индуцибельной регуляторной последовательности, которая чувствительна к определенным физиологическим регуляторам, например уровням глюкозы в крови или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцибельные экспрессирующие системы, подходящие для управления экспрессией dsRNA в клетках или у млекопитающих, включают, например, регулирование при помощи экдизона, при помощи эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изопропил-бета-Э1тиогалактопиранозида (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность, опираясь на предполагаемое использование трансгена iRNA.
Можно использовать вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA.
Например, можно использовать ретровирусный вектор (см. Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Данные ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA, клонируют в один или несколько векторов, которые облегчают доставку нуклеиновой кислоты пациенту. Более подробное описание ретровирусных векторов можно найти, например, в Boesen et al., Biotherapy, 6:291-302 (1994), в котором описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 к гемопоэтическим стволовым клеткам для придания стволовым клеткам лучшей устойчивости к химиотерапии. Другими источниками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); и Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предусматриваемые для применения, включают, например, векторы на основе HIV, описанные в патентах США № 6143520; 5665557 и 5981276, которые включены в данный документ при помощи ссылки.
Также для применения в доставке iRNA согласно настоящему изобретению предусматриваются аденовирусы. Аденовирусы представляют собой особенно перспективные проводники, например, для доставки генов в респираторный эпителий. Аденовирусы естественным образом инфицируют респираторный эпителий, где они вызывают заболевание с легким течением. Другими мишенями для систем доставки на основе аденовирусов являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышца. Аденовирусы обладают преимуществом в том, что способны инфицировать неделящиеся клетки. В Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) представлена обзорная статья о генной терапии на основе аденовирусов. В Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) было показано применение аденовирусных векторов для переноса генов в респираторный эпителий макакрезус. Другие примеры применения аденовирусов в генной терапии можно найти в Rosenfeld et al., Science, 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); публикации согласно PCT WO 94/12649; и Wang, et al., Gene Therapy, 2:775-783 (1995). Подходящий AV-вектор для экспрессии iRNA, описанной в настоящем изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV-вектора и способ доставки вектора в целевые клетки описаны в Xia H. et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010.
Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) также можно использовать для доставки iRNA согласно настоящему изобретению (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); патент США № 5436146). В одном варианте осуществления iRNA может экспрессироваться в виде двух отдельных комплементарных однонитевых молекул РНК при помощи рекомбинантного AAV-вектора, например, либо с РНК-промоторами, U6 или H1, либо с промотором цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии dsRNA, описанной в настоящем изобретении, способы конструирования рекомбинантного AAV-вектора и способы доставки векторов в целевые клетки описаны в
- 31 037115
Samulski R. et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher K.J. et al. (1996), J. Virol, 70:520-532; Samulski R. et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; патенте США № 5252479; патенте США № 5139941; международной заявке на патент № WO 94/13788 и международной заявке на патент № WO 93/24641, полное раскрытие которых включено в данный документ при помощи ссылки.
Другой вирусный вектор, подходящий для доставки iRNA согласно настоящему изобретению, представляет собой поксвирус, такой как вирус осповакцины, например аттенуированный вирус осповакцины, как, например, модифицированный вирус Анкара (MVA) или NYVAC, авипокс, как, например, оспа кур или канарипокс.
В случае необходимости тропизм вирусных векторов может быть модифицирован путем псевдотипирования векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов или путем замещения различных вирусных капсидных белков. Например, лентивирусные векторы можно подвергать псевдотипированию поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. AAV-векторы можно получать для нацеливания на различные клетки путем построения векторов так, чтобы они экспрессировали различные серотипы капсидных белков; см., например, Rabinowitz J.E. et al. (2002), J. Virol. 76:791-801, полное раскрытие которого включено в данный документ при помощи ссылки.
Фармацевтический препарат на основе вектора может включать вектор в приемлемом разбавителе или может включать матрицу замедленного высвобождения, в которую включено средство доставки генов. В качестве альтернативы в случае, когда вектор доставки целого гена может вырабатываться нативно рекомбинантными клетками, например ретровирусными векторами, тогда фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые вырабатывают систему доставки генов.
IV. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению
Настоящее изобретение также включает фармацевтические композици.и и составы, которые включают iRNA согласно настоящему изобретению. В одном варианте осуществления в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие iRNA, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие iRNA, являются применимыми для лечения ассоциированного с НАО1 заболевания или нарушения. Такие фармацевтические композиции составляют в зависимости от способа доставки.
Фармацевтические композиции, содержащие средства для RNAi согласно настоящему изобретению, могут быть, например, растворами с буфером или без него или композициями, содержащими фармацевтически приемлемые носители. Такие композиции включают, например, водные или кристаллические композиции, липосомные составы, мицеллярные составы, эмульсии и векторы для генной терапии.
В способах согласно настоящему изобретению средство для RNAi можно вводить в растворе. Свободное средство для RNAi можно вводить в небуферном растворе, например в солевом растворе или в воде. В качестве альтернативы свободную siRNA также можно вводить в подходящем буферном растворе. Буферный раствор может предусматривать ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой забуференный фосфатом солевой раствор (PBS). рН и осмолярность буферного раствора, содержащего средство для RNAi, можно корректировать, с тем чтобы он подходил для введения субъекту.
В некоторых вариантах осуществления буферный раствор дополнительно содержит средство для регулирования осмолярности раствора, так что осмолярность поддерживается при необходимом значении, например при физиологических значениях плазмы крови человека. Растворенные вещества, которые можно добавлять к буферному раствору для регулирования осмолярности, включают без ограничения белки, пептиды, аминокислоты, не поддающиеся метаболизму полимеры, витамины, ионы, сахара, метаболиты, органические кислоты, липиды или соли. В некоторых вариантах осуществления средство для регулирования осмолярности раствора представляет собой соль. В определенных вариантах осуществления средство для регулирования осмолярности раствора представляет собой хлорид натрия или хлорид калия.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии гена HAO1.
Дозы.
Как правило, приемлемая доза iRNA согласно настоящему изобретению будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 200,0 мг/кг веса тела реципиента в сутки, как правило, в диапазоне от приблизительно 0,1 до 10 или от 1 до 50 мг/кг веса тела в сутки. Например, dsRNA можно вводить в количестве приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,05 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг или приблизительно 50 мг/кг за однократную дозу.
В другом варианте осуществления средство для RNAi, например dsRNA, вводят в дозе от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 50 мг/кг,
- 32 037115 от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 45 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг или от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.
К примеру, средство для RNAi, например dsRNA, можно вводить в дозе приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7,
1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3,
4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9,
7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5,
9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.
- 33 037115
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, например, если двухнитевое средство для RNAi предусматривает модификации (например, один или несколько мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов, в том числе один такой мотив в сайте расщепления средства или рядом с ним), шесть фосфотиоатных связей и лиганд, то такое средство вводят в дозе от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,08 мг/кг или от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,07 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к вышеупомянтым значениям, также являются частью настоящего изобретения, например средство для RNAi можно вводить субъекту в дозе, составляющей от приблизительно 0,015 до приблизительно 0,45 мг/кг.
К примеру, средство для RNAi, например средство для RNAi в фармацевтической композиции, можно вводить в дозе, составляющей приблизительно 0,01, 0,0125, 0,015, 0,0175, 0,02, 0,0225, 0,025, 0,0275, 0,03, 0,0325, 0,035, 0,0375, 0,04, 0,0425, 0,045, 0,0475, 0,05, 0,0525, 0,055, 0,0575, 0,06, 0,0625, 0,065, 0,0675, 0,07, 0,0725, 0,075, 0,0775, 0,08, 0,0825, 0,085, 0,0875, 0,09, 0,0925, 0,095, 0,0975, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475 или приблизительно 0,5 мг/кг. Значения, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также являются частью настоящего изобретения.
Схемы лечения.
Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в день или iRNA можно вводить в виде двух, трех или более частей дозы через определенные интервалы на протяжении дня или даже при помощи непрерывной инфузии или доставки посредством состава с контролируемым высвобождением. В таком случае количество iRNA, содержащееся в каждой части дозы, должно быть соответственно меньше, чтобы обеспечить общую суточную дозу. Единица дозирования также может быть составлена для доставки в течение нескольких дней, например, при помощи традиционного состава с замедленным высвобождением, который предусматривает замедленное высвобождение iRNA в течение периода в несколько дней. Составы с замедленным высвобождением хорошо известны из уровня техники и особенно пригодны для доставки средств в определенный участок, например, их можно применять со средствами согласно настоящему изобретению. В данном варианте осуществления единица дозирования содержит соответствующее количество суточной дозы.
В других вариантах осуществления однократная доза фармацевтических композиций может быть длительного действия, так что последующие дозы вводят с интервалами не более 3, 4 или 5 дней или с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения однократную дозу фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению вводят один раз в неделю. В других вариантах осуществления настоящего изобретения однократную дозу фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению вводят каждые две недели.
Специалисту в данной области будет понятно, что определенные факторы могут влиять на дозу и временные рамки, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе без ограничения тяжесть заболевания или нарушения, типы предшествующего лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать один период лечения или серию периодов лече- 34 037115 ния. Расчеты эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных iRNA, охваченных настоящим изобретением, можно проводить с применением традиционных методик.
Расчеты эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных iRNA, охваченных настоящим изобретением, также можно проводить на основании тестирования in vivo с применением соответствующей животной модели. К примеру, достижения в области генетики мышей обеспечили ряд мышиных моделей для изучения различных заболеваний человека, как, например, нарушения, ассоциированного с экспрессией HAO1. Такие модели можно использовать для проведения тестирования iRNA in vivo, а также для определения терапевтически эффективной дозы. Подходящие мышиные модели известны в данной области и включают, например, животные модели, описанные в данном документе.
Способы введения.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, необходимо ли локальное или же системное лечение, и от области, подлежащей обработке. Введение может быть местным (например, при помощи трансдермального пластыря), легочным, например путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе при помощи ингалятора; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например посредством вживленного устройства; или интракраниальное, например интрапаренхиматозное, подоболочечное или интравентрикулярное введение.
iRNA можно доставлять таким образом, чтобы происходило нацеливание на конкретную ткань, такую как печень.
Составы.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают без ограничения растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Такие композиции могут быть получены из ряда компонентов, который включает без ограничения предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.
Фармацевтические составы согласно настоящему изобретению, которые в целях удобства могут находиться в виде единичной лекарственной формы, можно получать согласно традиционным техникам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие техники включают стадию приведения активных ингредиентов во взаимодействие с фармацевтическим(ми) носителем(ями) или наполнителем(ями). Как правило, составы получают путем равномерного и тщательного приведения активных ингредиентов во взаимодействие с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или и теми, и другими, а затем, при необходимости, придания продукту формы.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены в любой из многих возможных лекарственных форм, как, например, без ограничения таблеток, капсул, желатиновых капсул, жидких сиропов, пластичных гелей, суппозиториев и клизм. Композиции согласно настоящему изобретению также могут быть составлены в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии дополнительно могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены для перорального введения; парентерального, интрапаренхиматозного (в головной мозг), подоболочечного, интравентрикулярного или внутрипеченочного введения и/или местного введения.
Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, желатиновые капсулы, пакетики с порошком для приготовления раствора, таблетки или мини-таблетки. Необходимыми могут быть загустители, ароматизирующие вещества, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связующие вещества. В некоторых вариантах осуществления составы для перорального введения являются такими, в которых dsRNA, описанные в настоящем изобретении, вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующие проникновению, поверхностно-активными вещества и хелаторами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли желчных кислот включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюкохолевую кислоту, гликохолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидро-фузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящие жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). В некоторых вариантах осуществления используют комбинации веществ, способствующих проникновению, например жирные
- 35 037115 кислоты/соли жирных кислот в комбинации с желчными кислотами/солями желчных кислот. Одной иллюстративной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. dsRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть доставлены перорально, в форме гранул, в том числе частиц, высушенных распылением, или в комплексе с образованием микро- или наночастиц. Комплексообразующие средства для dsRNA включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные виды желатина, альбумины, виды крахмала, акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и виды крахмала; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-производные полиимины, поллуланы, виды целлюлозы и виды крахмала. Подходящие комплексообразующие средства включают хитозан, N-триметилхитозан, поли-Ь-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен (PTDAE), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочную кислоту), сополимер DL-молочной и гликолевой кислот (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Составы для перорального введения для dsRNA и их получение описаны подробно в патенте США № 6887906, публикации США № 20030027780 и патенте США № 6747014, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интрапаренхиматозного (в головной мозг), подоболочечного, интравентрикулярного или внутрипеченочного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие соответствующие добавки, такие как без ограничения вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Фармацевтические композиции и составы для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, распыляемые растворы, жидкости и порошки. Могут быть необходимы или желательны традиционные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. Также могут быть пригодными презервативы, перчатки с покрытием и т.п. Подходящие составы для местного введения включают составы, в которых iRNA, описанные в настоящем изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дистеароилфосфатидилхолин), отрицательные (например, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG)) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOTMA)). iRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности с катионными липосомами. В качестве альтернативы iRNA могут образовывать комплексы с липидами, в частности с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают без ограничения арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2он, ацилкарнитин, ацилхолин или сложные С1-20алкиловые эфиры (например, изопропилмиристат (IPM)), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль. Составы для местного введения подробно описаны в патенте США № 6747014, который включен в данный документ при помощи ссылки.
Составы с iRNA, содержащие мембранные молекулярные ансамбли.
iRNA для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению могут быть составлены для доставки в мембранном молекулярном ансамбле, например липосоме или мицелле. Используемый в данном документе термин липосома относится к везикуле, состоящей из амфифильных липидов, расположенных в виде по меньшей мере одного бислоя, например одного бислоя или множества бислоев. Липосомы включают однослойные и многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водную внутреннюю среду. Водная часть содержит композицию с iRNA. Липофильный материал отделяет водную внутреннюю среду от водной внешней среды, которая, как правило, не включает композицию с iRNA, хотя в некоторых примерах может включать. Липосомы пригодны для переноса и доставки активных ингредиентов к участку их действия. Благодаря тому, что мембрана липосомы структурно подобна биологическим мембранам, в случае введения липосом в ткань бислой липосомы сливается с бислоем клеточных мембран. По мере того как идет слияние липосомы и клетки внутреннее водное содержимое, которое включает iRNA, доставляется в клетку, где iRNA может специфически связываться с целевой РНК и может опосредовать RNAi. В некоторых случаях липосомы также являются специфически нацеленными, например, для направления iRNA в конкретные типы клеток.
- 36 037115
Липосомы, содержащие средство для RNAi, могут быть получены рядом способов. В одном примере липидный компонент липосомы растворяют в детергенте для образования мицелл из липидного компонента. Например, липидный компонент может представлять собой амфипатический катионный липид или липидный конъюгат. Детергент может характеризоваться высокой критической концентрацией мицеллообразования и может быть неионным. Иллюстративные детергенты включают холат, CHAPS, октилглюкозид, дезоксихолат и лауроилсаркозин. Препарат средства для RNAi затем добавляют к мицеллам, которые включают липидный компонент. Катионные группы липида взаимодействуют со средством для RNAi и конденсируются вокруг средства для RNAi с образованием липосомы. После конденсации детергент удаляют, например путем диализа, с получением липосомного препарата средства для RNAi.
При необходимости соединение-носитель, которое содействует конденсации, можно добавлять во время реакции конденсации, например, путем контролируемого добавления. Например, соединениеноситель может быть полимером, отличным от нуклеиновой кислоты (например, спермином или спермидином). Также можно корректировать рН для содействия конденсации.
Способы получения стабильных средств доставки полинуклеотидов, которые включают комплекс полинуклеотида/катионного липида в качестве структурных компонентов средств доставки, дополнительно описаны, например, в WO 96/37194, полное содержание которой включено в данный документ при помощи ссылки. Образование липосом может также включать один или несколько аспектов иллюстративных способов, описанных в Feigner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:7413-7417, 1987; патенте США № 4897355; патенте США № 5171678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; и Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Широко применяемые методики получения липидных агрегатов с размером, подходящим для использования в качестве средств доставки, включают обработку ультразвуком и замораживание-оттаивание с экструзией (см., например, Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta, 858:161, 1986). Микрофлюидизацию можно использовать в тех случаях, когда необходимы стабильно малые (от 50 до 200 нм) и относительно однородные агрегаты (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta, 775:169, 1984). Такие способы легко адаптировать для упаковки препаратов средства для RNAi в липосомы.
Липосомы делятся на два больших класса. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот с образованием стабильных комплексов. Положительно заряженный комплекс нуклеиновой кислоты/липосомы связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализируется в эндосому. Вследствие того, что внутри эндосомы кислый рН, липосомы разрываются, высвобождая свое содержимое в клеточную цитоплазму (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980985).
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно-заряженными, захватывают нуклеиновые кислоты вместо образования комплекса с ними. Поскольку как нуклеиновая кислота, так и липид имеют одинаковый заряд, то происходит отталкивание вместо образования комплекса. Тем не менее, некоторая часть нуклеиновых кислот захватывается водной внутренней средой этих липосом. рНчувствительные липосомы использовали для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих ген тимидинкиназы, в монослои клеток в культуре. Экспрессию экзогенного гена выявляли в целевых клетках (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Один основной тип липосомных композиций включает фосфолипиды, отличные от фосфатидилхолина природного происхождения. Композиции для нейтральных липосом, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Композиции для анионных липосом, как правило, образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы образованы преимущественно из диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомных композиций образован из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип образован из смесей фосфолипида, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.
Примеры других способов для введения липосом в клетки in vitro и in vivo включают патенты США № 5283185; 5171678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Feigner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; и Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
Также исследовали неионогенные липосомные системы для определения их пригодности в доставке лекарственных средств в кожу, в частности системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные составы, содержащие Novasome™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки циклоспорина-А в слой дермы кожи мышей. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы были эффективны в обеспечении депонирования циклоспорина А в различных слоях кожи (Hu et al. S.Т.P. Pharma. Sci., 1994, 4(6):466).
- 37 037115
Липосомы также включают пространственно стабилизированные липосомы, термин, используемый в данном документе, относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению времени жизни в кровотоке по сравнению с липосомами, у которых отсутствуют такие специальные липиды. Примерами пространственно стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть образующей везикулу липидной составляющей липосомы (А) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GM1, или (В) получена из одного или нескольких гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, в области техники полагают, что по меньшей мере для пространственно стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или PEG-производные липиды, увеличенное время полужизни в кровотоке этих пространственно стабилизированных липосом является следствием сниженной степени поглощения клетками ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны в уровне техники. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) описали способность моносиалоганглиозида GM1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Эти полученные данные были прокомментированы Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патенте США № 4837028 и WO 88/04924, оба из которых принадлежат Allen et al., раскрыты липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 или сложные эфиры сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (Webb et al.) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn- димиристоилфосфатидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim et al).
В одном варианте осуществления применяют катионные липосомы. Преимущество катионных липосом состоит в том, что они способны сливаться с клеточной мембраной. Некатионные липосомы, несмотря на то, что они не могут сливаться настолько эффективно с плазматической мембраной, поглощаются макрофагами in vivo, и их можно использовать для доставки средств для RNAi к макрофагам.
Дополнительные преимущества липосом включают следующее: липосомы, полученные из натуральных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биоразрушаемыми; липосомы могут включать широкий диапазон водо- и липидорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные средства для RNAi во своих внутренних отделениях от метаболизма и разрушения (Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Важными факторами, которые необходимо учитывать при получении липосомных составов, являются поверхностный заряд липида, размер везикулы и водный объем липосом.
Положительно заряженный синтетический катионный липид, хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), можно использовать для образования малых липосом, которые самопроизвольно взаимодействуют с нуклеиновой кислотой с образованием комплексов липиднуклеиновая кислота, которые способны сливаться с отрицательно заряженными липидами клеточных мембран клеток культуры тканей, что приводит к доставке средства для RNAi (см., например, Feigner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:7413-7417, 1987 и патент США № 4897355 касательно описания DOTMA и его применения с ДНК).
Аналог DOTMA, 1,2-бис-(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропан (DOTAP), можно применять в комбинации с фосфолипидом с образованием везикул, образующих комплекс с ДНК. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Гейтерсберг, Мэриленд) представляет собой эффективное средство для доставки сильно анионных нуклеиновых кислот в живые клетки культуры тканей, которое содержит положительно заряженные DOTMA-липосомы, которые самопроизвольно взаимодействуют с отрицательно заряженными полинуклеотидами с образованием комплексов. Суммарный заряд полученных комплексов является также положительным в тех случаях, когда используют липосомы с достаточным положительным зарядом. Положительно заряженные комплексы, полученные таким способом, самопроизвольно присоединяются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям, сливаются с плазматической мембраной и эффективно доставляют функциональные нуклеиновые кислоты, например, в клетки культуры тканей. Другой коммерчески доступный катионный липид, 1,2-бис-(олеоилокси)-3,3(триметиламмоний)пропан (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Индианаполис, Индиана), отличается от DOTMA тем, что олеиловые фрагменты связаны сложноэфирными, а не простыми эфирными связями.
Другие опубликованные соединения с катионными липидами включают такие соединения, которые были конъюгированы с рядом фрагментов, в том числе, например, карбоксиспермин, который был конъюгирован с одним из двух типов липидов и включает такие соединения, как 5-карбоксиспермилглициндиоктаолеоиламид (DOGS) (Transfectam™, Promega, Мэдисон, Висконсин) и дипальмитоилфосфатидилэтаноламина 5-карбоксиспермил-амид (DPPES) (см., например, патент США № 5171678).
Другой конъюгат с катионным липидом предусматривает получение производных липида с помощью холестерина (DC-Chol), которые были составлены в виде липосом в комбинации с DOPE (см.,
- 38 037115
Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Сообщалось, что липополилизин, полученный путем конъюгирования полилизина с DOPE, является эффективным для трансфекции в присутствии сыворотки крови (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1065:8, 1991). Сообщается, что в случае определенных клеточных линий такие липосомы, содержащие конъюгированные катионные липиды, проявляют более низкую токсичность и обеспечивают более эффективную трансфекцию, чем DOTMAсодержащие композиции. Другие коммерчески доступные продукты с катионными липидами включают DMRIE и DMRIE-HP (Vical, Ла-Хойя, Калифорния) и Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд). Другие катионные липиды, подходящие для доставки олигонуклеотидов, описаны в WO 98/39359 и WO 96/37194.
Липосомные составы особенно подходят для местного введения, при этом липосомы обладают некоторыми преимуществами по сравнению с другими составами. Такие преимущества включают сниженное побочное действие по отношению к высокой системной абсорбции введенного лекарственного средства, повышенное накопление введенного лекарственного средства в необходимой мишени и возможность вводить средство для RNAi в кожу. В некоторых вариантах осуществления липосомы используют для доставки средства для RNAi к эпидермальным клеткам и также для повышения проникновения средства для RNAi в дермальные ткани, например в кожу. Например, липосомы можно вводить местно. Была описана местная доставка лекарственных средств, составленных в виде липосом, в кожу (см., например, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 и du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R.J. и Fould-Fogerite, S., Biotechniques, 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene, 56:267-276, 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R.M. и Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C.Y. и Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7851-7855, 1987).
Также исследовали неионогенные липосомные системы для определения их пригодности в доставке лекарственных средств в кожу, в частности системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные составы, содержащие Novasome I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки лекарственного средства в слой дермы кожи мышей. Такие составы со средством для RNAi пригодны для лечения дерматологического нарушения.
Липосомы, которые включают iRNA, могут быть получены с высокой способностью к деформации. Такая деформируемость может позволить липосомам проникать через пору, которая меньше среднего радиуса липосомы. К примеру, типом деформируемых липосом являются трансферосомы. Трансферосомы можно получать путем добавления поверхностных пограничных активаторов, обычно поверхностноактивных веществ, к стандартной липосомной композиции. Трансферосомы, которые включают средство для RNAi, можно доставлять, например, подкожно путем инъекции для доставки средства для RNAi к кератиноцитам в коже. Для того, чтобы пройти через неповрежденную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны проникнуть через ряд мелких пор, каждая с диаметром менее 50 нм, под воздействием подходящего трансдермального градиента. Кроме того, благодаря свойствам липидов, такие трансферосомы могут быть самооптимизирующимися (приспосабливающимися к форме пор, например, в коже), самовосстанавливающимися, и, зачастую, могут достигать свои мишени без разделения на фрагменты, и часто могут быть самозагружающимися.
Другие составы, пригодные в настоящем изобретении, описаны в предварительных заявках США с серийными № 61/018616, поданной 2 января 2008 г.; 61/018611, поданной 2 января 2008 г.; 61/039748, поданной 26 марта 2008 г.; 61/047087, поданной 22 апреля 2008 г., и 61/051528, поданной 8 мая 2008 г. В заявке согласно РСТ с № PCT/US2007/080331, поданной 3 октября 2007 г., также описаны составы, применимые в настоящем изобретении.
Трансферосомы представляют собой еще один тип липосом и представляют собой липидные агрегаты с высокой способностью к деформации, они являются перспективными кандидатами в качестве средств доставки лекарственных средств. Трансферосомы могут быть описаны как липидные капельки, которые обладают настолько высокой способностью к деформации, что они легко могут проникать через поры, меньшие, чем капельки. Трансферосомы являются приспосабливающимися к окружающей среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (приспосабливающимися к форме пор кожи), самовосстанавливающимися, зачастую достигают мишеней без разделения на фрагменты и часто могут быть самозагружающимися. Для получения трансферосом можно добавлять поверхностные пограничные активаторы, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферосомы использовали для доставки сывороточного альбумина в кожу. Как было показано, опосредованная трансферосомами доставка сывороточного альбумина была такой же эффективной, как подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.
Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классифицирования и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ, как естественных, так и синтетических, является применение гидрофильно-липофильного баланса (HLB). Природа гидрофильной группы (также известной как головка) предоставляет наиболее эффективное средство для распре- 39 037115 деления по категориям различных поверхностно-активных веществ, применяемых в составах (Rieger, в
Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизирована, то ее классифицируют как неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах, и они применимы при широком диапазоне значений рН. Обычно их значения HLB находятся в диапазоне от 2 до приблизительно 18, в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, сложные глицериловые эфиры, сложные полиглицериловые эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионогенные алканоамиды и простые эфиры, как, например, этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блок-сополимеры, также включены в данный класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее распространенными представителями класса неионогенных поверхностно-активных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, как, например, омыляющие вещества, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты, и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и омыляющие вещества.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают соли четвертичного аммония и этоксилированные амины. Соли четвертичного аммония являются наиболее используемыми представителями данного класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести как положительный, так и отрицательный заряд, то поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.
Было рассмотрено использование поверхностно-активных веществ в готовых лекарственных формах, составах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
iRNA для применения в способах согласно настоящему изобретению может также предусматриваться в виде мицеллярных составов. Мицеллы в данном документе определены как конкретный тип молекулярного ансамбля, в котором амфипатические молекулы расположены в виде сферической структуры, так что все гидрофобные части молекул направлены вовнутрь, оставляя гидрофильные части в контакте с окружающей водной фазой. Противоположное расположение имеет место, если окружающая среда гидрофобная.
Смешанный мицеллярный состав, подходящий для доставки через трансдермальные мембраны, может быть получен путем смешивания водного раствора композиции с siRNA, С8-С22-алкилсульфата щелочного металла и мицеллообразующих соединений. Иллюстративные мицеллообразующие соединения включают лецитин, гиалуроновую кислоту, фармацевтически приемлемые соли гиалуроновой кислоты, гликолевую кислоту, молочную кислоту, вытяжку из ромашки, вытяжку из огурца, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, моноолеин, моноолеаты, монолаураты, масло бурачника, масло первоцвета вечернего, ментол, тригидроксиоксохоланил-глицин и его фармацевтически приемлемые соли, глицерин, полиглицерин, лизин, полилизин, триолеин, простые эфиры полиоксиэтилена и их аналоги, простые полидоканол-алкиловые эфиры и их аналоги, хенодезоксихолат, дезоксихолат и их смеси. Мицеллообразующие соединения можно добавлять одновременно или после добавления алкилсульфата щелочного металла. Смешанные мицеллы будут формироваться практически при любом типе смешивания ингредиентов, но для получения мицелл с меньшим размером требуется интенсивное перемешивание.
В одном способе получают первую мицеллярную композицию, которая содержит композицию с siRNA и по меньшей мере алкилсульфат щелочного металла. Первую мицеллярную композицию затем смешивают по меньшей мере с тремя мицеллообразующими соединениями с образованием смешанной мицеллярной композиции. В другом способе мицеллярную композицию получают путем смешивания композиции с siRNA, алкилсульфата щелочного металла и по меньшей мере одного из мицеллообразующих соединений с последующим добавлением оставшихся мицеллообразующих соединений при интенсивном перемешивании.
Фенол и/или м-крезол можно добавлять к смешанной мицеллярной композиции для стабилизации состава и защиты от роста бактерий. В качестве альтернативы фенол и/или м-крезол можно добавлять с мицеллообразующими ингредиентами.
- 40 037115
Изотоническое средство, такое как глицерин, также можно добавлять после образования смешанной мицеллярной композиции.
Для доставки мицеллярного состава в виде распыляемого раствора состав можно поместить в аэрозольный распылитель и распылитель зарядить газомвытеснителем. Г аз-вытеснитель, который пребывает под давлением, находится в жидкой форме в распылителе. Соотношения ингредиентов корректируют так, что водная фаза и фаза газа-вытеснителя становятся единым целым, т.е. присутствует одна фаза. Если присутствуют две фазы, то необходимо встряхнуть распылитель перед распылением порции содержимого, например, через дозирующий клапан. Распыляемая доза фармацевтического средства вытесняется из дозирующего клапана в виде мелкодисперсного распыляемого раствора.
Газы-вытеснители могут включать водородсодержащие хлорфторуглероды, водородсодержащие фторуглероды, простой диметиловый эфир и простой диэтиловый эфир. В определенных вариантах осуществления можно применять HFA 134а (1,1,1,2-тетрафторэтан).
Конкретные концентрации основных ингредиентов могут быть определены при помощи проведения относительно простых экспериментов. Для абсорбции через ротовую полость часто требуется увеличить, например по меньшей мере удвоить или утроить, дозу, предназначенную для инъекции или введения через желудочно-кишечный тракт.
Липидные частицы.
iRNA, например dsRNA, согласно настоящему изобретению могут быть полностью инкапсулированы в липидном составе, например LNP или другой частице нуклеиновая кислота-липид.
Используемый в данном документе термин LNP относится к стабильной частице нуклеиновой кислоты-липида. LNP содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предупреждает агрегацию частиц (например, конъюгат PEG-липид). LNP весьма пригодны для системных применений, поскольку они характеризуются длительным временем жизни в кровотоке после внутривенной (i.v.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от места введения). LNP включают pSPLP, которая включает инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который изложен в РСТ публикации № WO 00/03683. Частицы согласно настоящему изобретению обычно имеют средний диаметр от приблизительно 50 до приблизительно 150 нм, чаще от приблизительно 60 до приблизительно 130 нм, чаще от приблизительно 70 до приблизительно 110 нм, наиболее часто от приблизительно 70 до приблизительно 90 нм, и они являются практически нетоксичными. Кроме того, нуклеиновые кислоты, когда присутствуют в частицах нуклеиновой кислоты-липида согласно настоящему изобретению, тогда устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получения раскрыты, например, в патентах США №№ 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; публикации США № 2010/0324120 и публикации согласно РСТ № WO 96/40964.
В одном варианте осуществления соотношение липида и лекарственного средства (соотношение вес/вес) (например, соотношение липида и dsRNA) будет находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1. Диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.
Катионный липид может представлять собой, например:
хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(I-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(I-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA),
1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA),
1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA),
1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3 -диметиламинопропан (DLin-C-DAP),
1,2-дилинолеилокси-3 -(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC),
1,2-дилинолеилокси-3 -морфолинопропан (DLin-MA),
1,2-дилинолеоил-3 -диметиламинопропан(DLinDAP),
1,2-дилинолеилтио-3 -диметиламинопропан (DLin-S-DMA),
-линолеоил-2-линолеилокси-3 -диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлористую соль 1,2-дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-TMA-Cl), хлористую соль 1,2-дилинолеоил-3-триметиламинопропана (DLin-TAP-Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP),
- 41 037115
1,2-дилинолеилоксо-3 -(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA),
1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA),
2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или его аналоги, (3αR,5s,6αS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октαдека-9,12-диенил)тетрагидро-3αНциклопента[d] [ 1,3]-диоксол-5 -амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гентатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (МС3),
1,1 '-(2-(4-(2-((2-(бис-(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1 ил)этилазандиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь.
Катионный липид может содержать от приблизительно 20 до приблизительно 50 мол.% или приблизительно 40 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
В другом варианте осуществления можно использовать соединение 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан для получения наночастиц на основе липида-siRNA. Синтез 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в международной заявке № PCT/US2009/061897, опубликованной как WO 2010/048536, которая включена в данный документ при помощи ссылки.
В одном варианте осуществления частица на основе липида-siRNA включает 40% 2,2-дилинолеил4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана: 10% DSPC: 40% холестерина: 10% PEG-C-DOMG (мольный процент) с размером частиц, составляющим 63,0±20 нм, и соотношением siRNA/липид, составляющим 0,027.
Ионизируемый/некатионный липид может представлять собой анионный липид или нейтральный липид, в том числе без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 16-O-монометил-РЕ, 16-O-диметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 90, приблизительно 10 или приблизительно 58 мол.%, если холестерин включен, от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Конъюгированный липид, который препятствует агрегации частиц, может представлять собой, например, конъюгат полиэтиленгликоль (PEG)-липид, в том числе без ограничения PEG-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Cer) или их смесь. Конъюгат PEG-DAA может представлять собой, например, PEG-дилаурилоксипропил (Ci2), PEG-димиристоилоксипропил (Ci4), PEG-дипальмитилоксипропил (Ci6) или PEG-дистеарилоксипропил (Ci8). Конъюгированный липид, который предупреждает агрегацию частиц, может составлять от 0 до приблизительно 20 или приблизительно 2 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
В некоторых вариантах осуществления частица на основе нуклеиновой кислоты-липида дополнительно включает холестерин в количестве, например, от приблизительно 10 до приблизительно 60 или приблизительно 48 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
В одном варианте осуществления липидоид ND98-4HCl (MW 1487) (см. заявку на выдачу патента США № 12/056230, поданную 26 марта 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид С16 (Avanti Polar Lipids) можно использовать для получения наночастиц на основе липида-dsRNA (т.е. частиц LNP01). Маточные растворы каждого в этаноле могут быть получены следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, PEG-церамид С16, 100 мг/мл. Маточные растворы ND98, холестерина и PEG-церамида С16 можно затем объединять, например, в молярном соотношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор можно смешивать с водным раствором dsRNA (например, в ацетате натрия, рН 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла приблизительно 35-45%, а конечная концентрация ацетата натрия составляла приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы на основе липида-dsRNA обычно образуются самопроизвольно при смешивании. В зависимости от необходимого распределения частиц по размеру, полученную смесь наночастиц можно продавливать через поликарбонатную мембрану (например, с отсечением по размеру в 100 нм) с использованием, например, экструдера с термоцилиндром, как, например, Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадию экструзии можно пропустить. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, при помощи диализа или тангенциальной поточной фильтрации. Буфер можно заменить, например, забуференным фосфатом солевым раствором (PBS) с рН, составляющим приблизительно 7, например рН, составляющим приблизительно 6,9, рН, составляющим приблизительно 7,0, рН, составляющим приблизительно 7,1, рН, составляющим приблизительно 7,2, рН, составляющим приблизительно 7,3, или рН, составляющим приблизительно 7,4. Составы LNP01 описаны, например, в публикации международной заявки № WO 2008/042973, которая настоящим включена при помощи ссылки.
- 42 037115
Дополнительные иллюстративные составы на основе липида-dsRNA описаны в табл. А.
Таблица А
Иллюстративные составы на основе липида-dsRNA
Ионизируемый/катионный липид Катионный липид/некатионный липид/холестерин/конъюгат PEG- липид Соотношение липид:siRNA
DLinDMA/DPPC/холестерин/PEG-eDMA
LNP DL 1,2-дилиноленилокси-И,N-
(57,1/7,1/34,4/1,4)
inDMA диметиламинопропан (DLinDMA) липид:siRNA ~ 7:1
2,2-дилинолеил-4- ХТС/0РРС/холестерин/РЕ6-с0МА
2-ХТС диметиламиноэтил-[1,3]- 57,1/7,1/34,4/1,4
диоксолан (ХТС) липид:siRNA ~ 7:1
2,2-дилинолеил-4- XTC/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP05 диметиламиноэтил-[1,3]- 57,5/7,5/31,5/3,5
диоксолан (ХТС) липид:siRNA ~ 6:1
2,2-дилинолеил-4- XTC/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP06 диметиламиноэтил-[1,3]- 57,5/7,5/31,5/3,5
диоксолан (ХТС) липид:siRNA ~ 11:1
2,2-дилинолеил-4- XTC/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP07 диметиламиноэтил-[1,3]- 60/7,5/31/1,5
диоксолан (ХТС) липид:siRNA ~ 6:1
2,2-дилинолеил-4- XTC/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP08 диметиламиноэтил-[1,3]- 60/7,5/31/1,5
диоксолан (ХТС) липид:siRNA ~ 11:1
2,2-дилинолеил-4- XTC/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP09 диметиламиноэтил-[1,3]- 50/10/38,5/1,5
диоксолан (ХТС) (3aR, 5s,6aS)-Ν,Ν-диметил-2,2- липид:siRNA 10:1
ди ( ( 9Ζ ,12Ζ)-октадека-9,12- ALN100/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP10 диенил)тетрагидро-ЗаН- 50/10/38,5/1,5
циклопента[d][1,3]диоксол-5амин (ALN100) липид:siRNA 10:1
(6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта- MC-3/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP11 6,9,28,31-тетраен-19-ил-4- 50/10/38,5/1,5
(диметиламино)бутаноат (МСЗ) 1,1' - (2-(4-(2-( (2-(бис(2гидроксидодецил)амино)этил)(2гидроксидодецил)амино)этил)пипе липид:siRNA 10:1 Tech Gl/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG
LNP12 разин-1- ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (С12-200) 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA 10:1 XTC/DSPC/хол/PEG-DMG
LNP13 ХТС 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 33:1 MC3/DSPC/xon/PEG-DMG
LNP14 МСЗ 40/15/40/5 липид:siRNA: 11:1 МСЗ/ОЗРС/хол/PEG-DSG/GalNAc-PEG-
LNP15 МСЗ DSG 50/10/35/4,5/0,5
- 43 037115
липид:siRNA: 11:1
LNP16 МСЗ МСЗ/DSPC/хол/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1
LNP17 МСЗ МСЗ/DSPC/хол/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 10:1
LNP18 МСЗ МСЗ/DSPC/хол/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липид:s i RNA: 12:1
LNP19 МСЗ МСЗ/DSPC/хол/PEG-DMG 50/10/35/5 липид:siRNA: 8:1
LNP2 0 МСЗ МСЗ/DSPC/хол/PEG-DPG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 10:1
LNP21 С12-200 C12-200/DSPC/xon/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1
LNP22 ХТС ХТС/DSPC/хол/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 10:1
Сокращения в табл. А включают следующее: DSPC: дистеароилфосфатидилхолин; DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин; PEG-DMG: PEG-дидимиристоилглицерин (C14-PEG или PEG-C14) (PEG со средней молекулярной массой 2000); PEG-DSG: PEG-дистирилглицерин (C18-PEG или PEG-C18) (PEG со средней молекулярной массой 2000); PEG-cDMA: PEG-карбамоил-1,2-димиристоилоксипропиламин (PEG со средней молекулярной массой 2000).
Составы, содержащие DLinDMA (1,2-дилиноленилокси-ЫП-диметиламинопропан) описаны в международной публикации № WO2009/127060, поданной 15 апреля 2009 г., которая настоящим включена при помощи ссылки.
Составы, содержащие ХТС, описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/148366, поданной 29 января 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/156851, поданной 2 марта 2009 г.; предварительной заявке США с серийным №, поданной 10 июня 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/228373, поданной 24 июля 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/239686, поданной 3 сентября 2009 г., и международной заявке № PCT/US2010/022614, поданной 29 января 2010 г., которые настоящим включены при помощи ссылки.
Составы, содержащие МС3, описаны, например, в публикации США № 2010/0324120, поданной 10 июня 2010 г., полное содержание которой настоящим включено при помощи ссылки.
Составы, содержащие ALNY-100, описаны, например, в международной заявке на выдачу патента с номером PCT/US09/63933, поданной 10 ноября 2009 г., которая настоящим включена при помощи ссылки.
Составы, содержащие С12-200, описаны в предварительной заявке США с серийным № 61/175770, поданной 5 мая 2009 г., и международной заявке № PCT/US10/33777, поданной 5 мая 2010 г., которые настоящим включены при помощи ссылки.
Дополнительные составы.
(i) Эмульсии.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены и составлены в виде эмульсий. Эмульсии, как правило, являются гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой в форме капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., и Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две
- 44 037115 несмешиваемые жидкие фазы, тщательно перемешанные и диспрегированные одна в другой. Как правило, эмульсии могут быть эмульсиями по типу либо вода в масле (w/o), либо масло в воде (o/w). В тех случаях, когда водная фаза является мелкораспыленной в общем объеме масляной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу вода в масле (w/o). В качестве альтернативы, в тех случаях, когда масляная фаза является мелкораспыленной в общем объеме водной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу масло в воде (o/w). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты вдобавок к диспергированным фазам и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора либо в водной фазе, масляной фазе либо как таковое в качестве отдельной фазы. Фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты, могут присутствовать в эмульсиях при необходимости. Фармацевтические эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят более чем из двух фаз, такие как, например, в случае эмульсий по типу масло в воде в масле (o/w/o) и вода в масле в воде (w/o/w). Такие сложные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двухкомпонентные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии по типу o/w включают маленькие водные капельки, составляют эмульсию по типу w/o/w. Аналогично этому система масляных капелек, заключенная в каплях воды, стабилизированных в масляной диспергирующей фазе, обеспечивает эмульсию по типу o/w/o.
Эмульсии характеризуются малой термодинамической стабильностью либо ее отсутствием. Часто диспергированная или дисперсная фаза эмульсии хорошо диспергирована в дисперсионной или диспергирующей фазе и поддерживается в такой форме при помощи эмульгаторов или вязкости состава. Любая фаза эмульсии может быть полутвердой или твердой, как и в случае подобных эмульсии мазевых основ и кремов. Другие способы стабилизации эмульсий охватывают применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы в целом могут быть разделены на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные основы и тонкодисперсные твердые вещества (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., и Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как сурфактанты, нашли широкое применение в составе эмульсий, и их рассматривали в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., и Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную части. Соотношение гидрофильной и гидрофобной природы поверхностно-активного вещества называют гидрофильно-липофильным балансом (HLB), и оно является ценным инструментом в распределении на категории и выборе поверхностно-активных веществ при получении составов. Поверхностно-активные вещества можно разделить на различные классы, исходя из природы гидрофильной группы: неионная, анионная, катионная и амфотерная (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., и Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
Встречающиеся в природе эмульгаторы, используемые в составах эмульсий, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбционные основы, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин, обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий по типу w/o, при этом сохраняя свою полутвердую консистенцию. Мелкоизмельченные твердые вещества также использовали в качестве подходящих эмульгаторов, в особенности в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, неразбухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерила тристеарат.
Большое разнообразие неэмульгирующих материалов также включают в составы эмульсий, и они содействуют свойствам эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновую кислоту, карра- 45 037115 генан, гуаровую камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии путем образования крепких межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы и путем повышения вязкости дисперсионной фазы.
Поскольку эмульсии часто содержат некоторое количество ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут легко поддерживать рост микробов, то такие составы часто включают консерванты. Широко используемые консерванты, включенные в составы эмульсий, включают метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные соли аммония, бензалкония хлорид, сложные эфиры пгидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также обычно добавляют к составам эмульсий для предупреждения ухудшения качества состава. Используемые антиоксиданты могут быть ловушками свободных радикалов, как, например, токоферолы, алкил галлаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, илит восстановителями, такими как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергистами антиоксидантов, такими как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
Применение составов эмульсий посредством дерматологического, перорального и парентерального путей и способы их получения были рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., и Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Составы эмульсий для пероральной доставки очень широко применяют из-за удобства составления, а также с точки зрения эффективности при абсорбции и биодоступности (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., и Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные средства на основе минеральных масел, жирорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира находятся в числе материалов, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий по типу o/w.
(ii) Микроэмульсии.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции iRNA и нуклеиновых кислот составлены в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система воды, масла и амфифильного вещества, которая является отдельным оптически изотропным и термодинамически стабильным жидким раствором (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., и Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Обычно микроэмульсии представляют собой системы, которые получают путем сперва диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, а затем добавления достаточного количества четвертого компонента, как правило, спирта со средней длиной цепи, с получением прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также были описаны как термодинамически стабильные, изотропически чистые дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung и Shah, в Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Является ли микроэмульсия микроэмульсией по типу вода в масле (w/o) или масло в воде (o/w), зависит от свойств используемых масла и поверхностно-активного вещества и от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностноактивного вещества (Schott, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
Активно изучается феноменологический подход с использованием фазовых диаграмм, и с его помощью специалистами в данной области были получены обширные данные о том, как составлять микроэмульсии (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., и Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению с традиционными эмульсиями микроэмульсии имеют преимущество солюбилизации водонерастворимых лекарственных средств в составе термодинамически стабильных капелек, которые образуются самопроизвольно.
Поверхностно-активные вещества, используемые в получении микроэмульсий, включают без ограничения ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Brij 96, полиокиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, тетраглицерина монолаурат (ML310), тетраглицерина моноолеат (МО310), гексаглицерина моноолеат (РО310), гексаглице- 46 037115 рина пентаолеат (РО500), декаглицерина монокапрат (МСА750), декаглицерина моноолеат (МО750), декаглицерина секвиолеат (SO750), декаглицерина декаолеат (DAO750) отдельно или в комбинации с вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно являющееся спиртом с короткой цепью, таким как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести путем проникновения в пленку из поверхностно-активного вещества и соответственно создания неупорядоченной пленки из-за пустого пространства, образующегося среди молекул поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без использования вторичных поверхностно-активных веществ, и в области техники известны самоэмульгирующиеся системы микроэмульсий без спирта. Водной фазой, как правило, без ограничения может быть вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, PEG300, PEG400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может предусматривать без ограничения материалы, такие как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (C8-C12) моно-, ди- и триглицериды, полиоксиэтилированные сложные эфиры жирных кислот и глицерила, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10-глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения растворимости лекарственного средства и повышенной абсорбции лекарственных средств. Липидные микроэмульсии (по типу как o/w, так и w/o) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (см., например, патенты США № 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества в виде улучшенной растворимости лекарственного средства, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного увеличения абсорбции лекарственного средства за счет индуцированных поверхностно-активным веществом изменений текучести мембран и проницаемости, удобства получения, удобства перорального введения по сравнению с твердой лекарственной формой, улучшенной клинической действенности и пониженной токсичности (см., например, патенты США № 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться самопроизвольно, когда их компоненты объединяют при температуре окружающей среды. Это может быть в особенности преимущественным, когда составляют термолабильные лекарственные средства, пептиды или iRNA. Микроэмульсии также были эффективными при трансдермальной доставке активных компонентов как при косметических, так и при фармацевтических применениях. Предполагается, что композиции и составы микроэмульсий согласно настоящему изобретению будут способствовать повышенной системной абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот из желудочнокишечного тракта, а также улучшать локальное клеточное поглощение iRNA и нуклеиновых кислот.
Микроэмульсии согласно настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), Labrasol и вещества, способствующие проникновению, для улучшения свойств состава и для повышения абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Вещества, способствующие проникновению, используемые в микроэмульсиях согласно настоящему изобретению, могут быть классифицированы, как принадлежащие к одной из пяти основных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатирующие вещества, отличные от поверхностно-активных веществ (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов рассмотрен выше.
(iii) Микрочастицы.
Средство для RNAi согласно настоящему изобретению может быть включено в частицу, например микрочастицу. Микрочастицы можно получать при помощи сушки распылением, но также можно получать другими способами, в том числе лиофилизацией, выпариванием, сушкой в псевдоожиженном слое, сушкой в вакууме или при помощи комбинации этих методик.
(iv) . Вещества, способствующие проникновению.
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении применяют разнообразные вещества, способствующие проникновению, для воздействия на эффективную доставку нуклеиновых кислот, в частности iRNA, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной, так и в неионизированной форме. Однако, как правило, только жирорастворимые или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было установлено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрана, через которую необходимо пройти, обработана веществом, способствующим проникновению. Вдобавок к способствованию диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны вещества, способствующие проникновению, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.
Вещества, способствующие проникновению, могут быть классифицированы, как принадлежащие к одной из пяти основных категорий, т.е. поверхностно-активным веществам, жирным кислотам, солям желчных кислот, хелатирующим средствам и нехелатирующим веществам, отличным от поверхностно- 47 037115 активных веществ (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health
Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из вышеуказанных классов веществ, способствующих проникновению, описан ниже более подробно.
Поверхностно-активные вещества (или сурфактанты) являются химическими структурными единицами, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего повышается абсорбция iRNA через слизистую. Помимо солей желчных кислот и жирных кислот, эти вещества, способствующие проникновению, включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфорированные эмульсии, такие как FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Разнообразные жирные кислоты и их производные, которые действуют как вещества, способствующие проникновению, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рацглицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин 1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их C1-20алкиловые сложные эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (см., например, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Физиологическая роль желчи включает содействие в распределении и абсорбции липидов и жирорастворимых витаминов (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 в Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, p. 934-935). Разные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как вещества, способствующие проникновению. Таким образом, термин соли желчных кислот включает любые встречающиеся в природе компоненты желчи, а также любые из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюкохолевую кислоту (глюкохолат натрия), гликохолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (STDHF), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 в: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Хелатирующие средства, используемые применительно к настоящему изобретению, можно определить как соединения, которые удаляют ионы металла из раствора путем образования комплексов с ними, в результате чего повышается абсорбция iRNA через слизистую. В отношении их применения в качестве веществ, способствующих проникновению, в настоящем изобретении хелатирующие средства обладают дополнительным преимуществом, также выступая в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку большинство охарактеризованных ДНК-нуклеаз требуют двухвалентный ион металла для катализа и, таким образом, ингибируются хелатирующими средствами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатирующие средства включают без ограничения двунатриевый этилендиаминтетраацетат (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомовалинат), N-ацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацилпроизводные бета-дикетонов (енамины) (см., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Используемые в данном документе нехелатирующие соединения, отличные от поверхностноактивных веществ, способствующие проникновению, могут быть определены как соединения, которые проявляют небольшую активность в качестве хелатирующих средств или в качестве поверхностноактивных веществ, но которые тем не менее повышают абсорбцию iRNA через слизистую пищеварительного тракта (см., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7,
- 48 037115
1-33). Этот класс веществ, способствующих проникновению, включает, например, ненасыщенные цикломочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазацикло-алканона (Lee et al., Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39,
621-626).
Средства, которые повышают поглощение iRNA на клеточном уровне, также можно добавлять к фармацевтическим и другим композициям согласно настоящему изобретению. Например, катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al, патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка согласна РСТ WO 97/30731), также, как известно, повышают степень клеточного захвата dsRNA. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции включают среди прочего, например, Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), 293fectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Cellfectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), DMRIE-C™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Freestyle™ MAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), RNAiMAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Oligofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Optifect™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), реагент для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOTAP (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Грензахерштрассе, Швейцария) или Fugene (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент Transfectam® (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-20 (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-50 (Promega; Мэдисон, Висконсин), DreamFect™ (OZ Biosciences; Марсель, Франция), EcoTransfect (OZ Biosciences; Марсель, Франция), реагент для трансфекции TransPassa D1 (New England Biolabs; Ипсвич, Массачусетс, США), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; СанДиего, Калифорния, США), реагент для трансфекции Cytofectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), RiboFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), PlasFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), UniFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США), SureFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США) или HiFect™ (B-Bridge International, Маунтин-Вью, Калифорния, США).
Для повышения проникновения введенных нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, в том числе гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.
(v) Носители.
Определенные композиции согласно настоящему изобретению также содержат в составе соединения-носители. Используемый в данном документе термин соединение-носитель или носитель может относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, которые являются инертными (т.е. не обладают биологической активностью per se), но распознаются в качестве нуклеиновой кислоты in vivo процессами, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты с биологической активностью, например, путем разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или путем содействия ее удалению из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может привести к существенному сокращению количества нуклеиновой кислоты, перерабатываемой печенью, почками или другими внесосудистыми депо, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, переработка частично фосфотиоатной dsRNA тканью печени может быть сокращена при ее совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'изотиоциано-стильбен-2,2'-дисульфокислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
(vi) Наполнители.
В отличие от соединения-носителя фармацевтический носитель или наполнитель представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любую другую фармакологически инертное средство для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Наполнитель может быть жидким или твердым веществом, и его выбирают с учетом предполагаемого способа введения с тем, чтобы обеспечить необходимый объем, консистенцию и т.д., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие средства (например, прежелатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, жела- 49 037115 тин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или вторичный кислый фосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); разрыхлители (например, крахмал, натрия крахмалгликолат и т.д.) и смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).
Также для составления композиций согласно настоящему изобретению можно применять фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения воду, растворы солей, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
Составы для местного введения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Можно использовать фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами.
Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают без ограничения воду, растворы солей, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
(vii) Другие компоненты.
Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно встречающиеся в фармацевтических композициях, при уровнях применения, установленных в уровне техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, пригодные для физического составления композиций согласно настоящему изобретению в различных лекарственных формах, такие как красители, ароматизирующие вещества, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении не должны чрезмерно вступать в конфликт с биологическими активностями компонентов композиций согласно настоящему изобретению. Составы могут быть стерильными, и, при необходимости, их можно смешивать со вспомогательными средствами, например смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями для оказания влияния на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, ароматизаторами и/или отдушками и т.п., которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновой(ыми) кислотой(ами) состава.
Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например,ткарбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают (а) одно или несколько соединений, представляющих собой iRNA, и (b) одно или несколько средств, которые действуют по механизму, отличному от RNAi, и которые пригодны в лечении, например, РН1.
Тестирование композиций.
Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между токсичным и терапевтическим эффектами является терапевтическим индексом, и его можно выражать как соотношение LD50/ED50. Предпочтительными являются соединения, которые характеризуются высоким терапевтическим индексом.
Данные, полученные при анализах с клеточными культурами и исследованиях на животных, можно использовать при составлении ряда доз для применения у людей. В настоящем изобретении доза композиций, описанных в данном документе, как правило, находится в диапазоне циркулирующих концентраций, который включают ED50 с малой токсичностью или без таковой. Доза может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, применяемого в способах, описанных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно первоначально установить по результатам анализов с клеточными культурами. Доза может быть составлена для животных моделей для получения диапазона концентрации циркулирующего в плазме соединения или, при необходимости, полипептидного продукта целевой последовательности (например, достижения уменьшенной концентрации полипептида), что включает IC50 (т.е. концентрацию тестового соединения, при помощи которой достигают полумаксимальное ингибирование симптомов), которую устанавливают в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для
- 50 037115 более точного определения пригодной дозы у людей. Уровни в плазме можно измерять, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В дополнение к их введению, рассматриваемому выше, iRNA, описанные в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с другими известными средствами, эффективными в лечении патологических процессов, которые опосредованы перегрузкой железом и которые можно лечить путем ингибирования экспрессии HAO1. В любом случае, курирующий врач может корректировать количество и временные рамки введения iRNA, исходя из результатов, наблюдаемых при использовании стандартных средств измерения эффективности, известных в уровне техники или описанных в данном документе.
V. Способы ингибирования экспрессии HAO1.
Настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии HAO1 (оксидазы 1 гидроксикислот) в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством для RNAi, например двухнитевым средством для RNAi, в количестве, эффективном для ингибирования экспрессии HAO1 в клетке, за счет чего осуществляется ингибирование экспрессии HAO1 в клетке.
Приведение клетки в контакт с двухнитевым средством для RNAi можно выполнять in vitro или in vivo. In vivo приведение клетки в контакт со средством для RNAi включает приведение клетки или группы клеток в организме субъекта, например субъекта-человека, в контакт со средством для RNAi. Также возможны комбинации in vitro и in vivo способов приведения в контакт. Приведение в контакт может быть непосредственным или опосредованным, как рассматривалось выше. Более того, приведение в контакт клетки можно выполнять посредством нацеливающего лиганда, в том числе любого лиганда, описанного в данном документе или известного в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой углеводный фрагмент, например лиганд, представляющий собой GalNAc3, или любой другой лиганд, который направляет средство для RNAi к месту, представляющему интерес, например, печени субъекта.
Термин ингибирование, используемый в данном документе, используют взаимозаменяемо с сокращением, сайленсингом, понижающей регуляцией и другими подобными терминами, и он включает любой уровень ингибирования.
Подразумевают, что фраза ингибирование экспрессии HAO1 относится к ингибированию экспрессии любого гена HAO1 (такого как, например, ген HAO1 мыши, ген HAO1 крысы, ген HAO1 обезьяны или ген HAO1 человека), а также вариантов или мутантов гена HAO1. Таким образом, ген HAO1 может быть геном HAO1 дикого типа, мутантным геном HAO1 или трансгенным геном HAO1 в контексте клетки, группы клеток или организма, подвергнутых генетической манипуляции.
Ингибирование экспрессии гена HAO1 включает любой уровень ингибирования гена HAO1, например по меньшей мере частичную супрессию экспрессии гена HAO1. Экспрессию гена HAO1 можно оценивать исходя из уровня или изменения уровня любой переменной, связанной с экспрессией гена HAO1, например уровня мРНК HAO1, уровня белка HAO1. Данный уровень можно оценивать в отдельной клетке или в группе клеток, в том числе, например, образце, полученном из организма субъекта.
Ингибирование можно оценивать по снижению абсолютного или относительного уровня одной или нескольких переменных, которые связаны с экспрессией HAO1, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольным уровнем может быть любой тип контрольного уровня, который используют в данной области, например исходный уровень до введения дозы или уровень, определенный у подобного субъекта, клетки или образца, которые не обработаны или обработаны контролем (таким как, например, контроль только с буфером или контроль с неактивным средством).
В некоторых вариантах осуществления способов согласно настоящему изобретению экспрессия гена HAO1 ингибируется по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере на приблизительно
10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%,
по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%,
по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%,
по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%,
по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%,
по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%,
по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%,
по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%,
по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%,
по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%,
по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%,
по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или
по меньшей мере приблизительно на 99%.
Доказательством ингибирования экспрессии гена НАО1 может служить снижение количества мРНК, экспрессируемого первой клеткой или первой группой клеток (такие клетки могут присутствовать, например, в образце, полученном из организма субъекта), в которых транскрибируется ген НАО1 и которую или которые обрабатывали (например, посредством приведения клетки или клеток в контакт со средством для RNAi согласно настоящему изобретению или посредством введения средства для RNAi
- 51 037115 согласно настоящему изобретению субъекту, в организме которого клетки находятся или находились), так что экспрессия гена НАО1 ингибируется по сравнению со второй клеткой или второй группой клеток, по сути, идентичных первой клетке или группе клеток, но которую или которые не обрабатывали (контрольная(ые) клетка(и)). В некоторых вариантах осуществления ингибирование оценивают посредством выражения уровня мРНК в обработанных клетках как процент от уровня мРНК в контрольных клетках с помощью следующей формулы:
|(мРНК в контрольных клетках) - (мРНК в обработанных клетках) ----------------------------------------------·100 % (мРНК в контрольных клетках)
В качестве альтернативы ингибирование экспрессии гена HAO1 можно оценивать по снижению параметра, который функционально связан с экспрессией гена HAO1, например экспрессией белка HAO1. Сайленсинг гена HAO1 можно выявить в любой клетке, экспрессирующей НАО1 либо конститутивно, либо при помощи генной инженерии, и с помощью любого анализа, известного в уровне техники. Печень является основным местом экспрессии НАО1. Другие важные места экспрессии включают почки и матку.
Доказательством ингибирования экспрессии белка HAO1 может служить снижение уровня белка HAO1, который экспрессируется клеткой или группой клеток (например, уровня белка, экспрессируемого в образце, полученном из организма субъекта). Как объяснялось выше в отношении оценки супрессии мРНК, ингибирование уровней экспрессии белка в обработанной клетке или обработанной группе клеток можно аналогично выражать как процент от уровня белка в контрольной клетке или группе контрольных клеток.
Контрольная клетка или контрольная группа клеток, которую можно использовать для оценки ингибирования экспрессии гена HAO1, включают клетку или группу клеток, которая еще не была в контакте со средством для RNAi согласно настоящему изобретению. Например, контрольная клетка или контрольная группа клеток может быть получена от отдельного субъекта (например, субъекта-человека или субъекта-животного) перед лечением субъекта средством для RNAi.
Уровень мРНК HAO1, который экспрессируется клеткой или группой клеток, можно определять при помощи любого способа, известного в уровне техники, для оценки экспрессии мРНК. В одном варианте осуществления уровень экспрессии HAO1 в образце определяют путем выявления транскрибируемого полинуклеотида или его части, например мРНК гена HAO1. РНК можно извлекать из клеток при помощи методик извлечения РНК, включая, например, извлечение с помощью кислого фенола/гуанидинизотиоцианата (RNAzol B; Biogenesis), наборы для получения РНК RNeasy (Qiagen) или PAXgene (PreAnalytix, Швейцария). Типичные форматы анализов, в которых используют гибридизацию рибонуклеиновых кислот, включают ядерные run-on анализы, RT-PCR, анализы защиты от РНКаз (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), нозерн-блоттинг, гибридизацию in situ и микроматричные анализы.
В одном варианте осуществления уровень экспрессии НАО1 определяют при помощи зонда для нуклеиновой кислоты. Термин зонд, используемый в данном документе, относится к любой молекуле, которая способна селективно связываться с конкретным НАО1. Зонды могут быть синтезированы специалистом в данной области или получены из соответствующих биологических препаратов. Могут быть специально сконструированы зонды, содержащие метку. Примеры молекул, которые можно использовать в качестве зондов, включают без ограничения РНК, ДНК, белки, антитела и органические молекулы.
Выделенные мРНК можно использовать при анализах на основе гибридизации или амплификации, которые включают без ограничения анализы, представляющие собой саузерн- или нозерн-блоттинг, анализы, представляющие собой полимеразную цепную реакцию (PCR), и матрицы с зондами. Один способ определения уровней мРНК включает приведение выделенной мРНК в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК НАО1. В одном варианте осуществления мРНК иммобилизуют на твердой поверхности и приводят в контакт с зондом, например, путем пропускания выделенной мРНК через агарозный гель и переноса мРНК из геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза. В альтернативном варианте осуществления зонд(ы) иммобилизуют на твердой поверхности и мРНК приводят в контакт с зондом(ами), например на генном микрочипе Affymetrix. Специалист в данной области может легко адаптировать известные способы обнаружения мРНК для применения в определении уровня мРНК НАО1.
Альтернативный способ определения уровня экспрессии НАО1 в образце включает способ амплификации нуклеиновой кислоты и/или обратной транскрипции (с получением кДНК), например, мРНК в образце, например при помощи RT-PCR (экспериментальный вариант осуществления изложен в Mullis, 1987, патенте США № 4683202), лигазной цепной реакции (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), самоподдерживающейся репликации последовательности (Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), системы транскрипционной амплификации (Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), репликазы Q-бета (Lizardi et al. (1988), Bio/Technology 6:1197), репликации по типу катящегося кольца (Lizardi et al., патент США № 5854033) или любой другой способ амплификации нуклеиновой кислоты, за которым следует обнаружение амплифицированных молекул при помо- 52 037115 щи методик, хорошо известных специалисту в данной области. Такие схемы обнаружения особенно пригодны для обнаружения молекул нуклеиновой кислоты, если такие молекулы присутствуют в очень малых количествах. В конкретных аспектах согласно настоящему изобретению уровни экспрессии HAO1 определяют при помощи количественной флуорогенной RT-PCR (т.е. системы TaqMan™).
Уровни экспрессии мРНК HAO1 можно контролировать при помощи мембранного блота (как, например, используемого при анализе гибридизации, такого как нозерн, саузерн, дот и т.п.) или микролунок, опытных пробирок, гелей, гранул или волокон (или любой твердой подложки, содержащей связанную нуклеиновую кислоту). См. патенты США № 5770722, 5874219, 5744305, 5677195 и 5445934, которые включены в данный документ при помощи ссылки. Определение уровня экспрессии НАО1 также может включать использование зондов для нуклеиновой кислоты в растворе.
В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии мРНК оценивают с использованием анализов с разветвленной ДНК (bDNA) или PCR в режиме реального времени (qPCR). Применение таких способов описано и проиллюстрировано в разделе Примеры, представленном в данном документе.
Уровень экспрессии белка НАО1 можно определить, используя любой способ, известный в уровне техники для измерения уровней белка. Такие способы включают, например, электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), тонкослойную хроматографию (TLC), гипердиффузионную хроматографию, реакции преципитации в жидкости или геле, абсорбционную спектроскопию, колориметрические анализы, спектрофотометрические анализы, проточную цитометрию, иммунодиффузию (одиночную или двойную), иммуноэлектрофорез, вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммунофлюоресцентные анализы, электрохемилюминисцентные анализы и т.п.
Термин образец, используемый в данном документе, относится к отбору схожих жидкостей, клеток или тканей, выделенных из организма субъекта, а также жидкостей, клеток или тканей, присутствующих в организме субъекта. Примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку крови и серозные жидкости, плазму крови, лимфу, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, внутриглазные жидкости и т.п. Образцы тканей могут включать образцы из тканей, органов или локальных участков. Например, образцы можно получить из конкретных органов, частей органов или жидкостей или клеток в этих органах. В определенных вариантах осуществления образцы можно получить из печени (например, всей печени, или определенных сегментов печени, или определенных типов клеток в печени, таких как, например, гепатоциты). В некоторых вариантах осуществления образец, полученный из организма субъекта относится к крови или плазме крови, взятым из организма субъекта. В дополнительных вариантах осуществления образец, полученный из организма субъекта относится к ткани печени, полученной из организма субъекта.
В некоторых вариантах осуществления способов согласно настоящему изобретению средство для RNAi вводят субъекту так, что средство для RNAi доставляется к конкретному месту в организме субъекта. Ингибирование экспрессии HAO1 можно оценивать при помощи измерений уровня или изменения уровня мРНК HAO1 или белка HAO1 в образце, полученном из жидкости или ткани из конкретного места в организме субъекта. В некоторых вариантах осуществления местом является печень. Местом также может быть подразделение или подгруппа клеток из любого из указанных выше мест. Место также может включать клетки, которые экспрессируют конкретный тип рецептора.
VI. Способы лечения или предупреждения ассоциированного с HAO1 нарушения.
Настоящее изобретение также предусматривает способы лечения или предупреждения заболеваний и состояний, на которые можно воздействовать при помощи экспрессии гена HAO1. Например, композиции, описанные в данном документе, можно применять для лечения любого нарушения, ассоциированного с РН1.
Эффективность лечения или предупреждения заболевания можно оценивать, например, путем измерения прогрессировани заболевания, ремиссии заболевания, тяжести симптомов, уменьшения боли, качества жизни, дозы лекарственного препарата, необходимой для поддержания эффекта лечения, уровня маркера заболевания или любого другого измеряемого параметра, соответствующего данному заболеванию, лечение которого осуществляют или предупреждение которого предусматривают. Контролирование эффективности лечения или предупреждения путем измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров находится в компетенции специалиста в данной области.
Лечебный или предупредительный эффект является очевидным, когда наблюдается статистически значимое улучшение одного или нескольких параметров болезненного состояния, или по отсутствию усугубления или развития симптомов в тех случаях, когда их, при иных обстоятельствах, прогнозировали. В качестве примера благоприятное изменение измеряемого параметра заболевания по меньшей мере на 10% и предпочтительно по меньшей мере на 20, на 30, на 40, на 50% или более может служить показателем эффективного лечения. Об эффективности данного лекарственного средства на основе iRNA или состава с таким лекарственным средством можно также судить при помощи экспериментальной животной модели данного заболевания, которая известна в уровне техники. При использовании экспериментальной животной модели эффективность лечения доказана, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера или ослабление симптома.
- 53 037115
В качестве альтернативы эффективность можно измерять по уменьшению тяжести заболевания, которое определено специалистом в области техники, связанной с диагностикой, исходя из принятой в клинической практике шкалы оценивания тяжести заболевания.
В некоторых вариантах осуществления способов согласно настоящему изобретению, экспрессия HAO1 снижается в течение длительного отрезка времени, например по меньшей мере одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель, или дольше. Например, в некоторых случаях экспрессия гена HAO1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 100% путем введения средства на основе iRNA, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления ген НАО1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 60, 70 или 80% путем введения средства на основе iRNA. В некоторых вариантах осуществления ген НАО1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 85, 90 или 95% путем введения двухнитевого олигонуклеотида. В другом варианте осуществления ген НАО1 остается подавленным в течение 7 дней, 10 дней, 20 дней, 30 дней или дольше после введения.
Введение.
Средства для RNAi согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту при помощи любого способа введения, известного в уровне техники, в том числе без ограничения подкожного, внутривенного, внутримышечного, внутриглазного, внутрибронхиального, внутриплеврального, внутрибрюшинного, внутриартериального, лимфатического, спинномозгового и любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления средства вводят подкожно.
В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством инъекции депопрепарата. Инъекция депо-препарата может высвобождать средство для RNAi устойчивым образом в течение длительного периода времени. Таким образом, инъекция депо-препарата может снижать частоту введения доз, необходимых для получения необходимого эффекта, например необходимого ингибирования HAO1 или терапевтического или профилактического эффекта. Инъекция депо-препарата может также предусматривать более устойчивые концентрации в сыворотке крови. Инъекции депо-препарата могут предусматривать подкожные инъекции или внутримышечные инъекции. В некоторых вариантах осуществления инъекция депо-препарата является подкожной инъекцией.
В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством насоса. Насос может быть внешним насосом или имплантированным хирургическим путем насосом. В определенных вариантах осуществления насос является подкожно имплантированным осмотическим насосом. В других вариантах осуществления насос является инфузионным насосом. Инфузионный насос можно применять для внутривенных, подкожных, артериальных или эпидуральных инфузий. В некоторых вариантах осуществления инфузионный насос является подкожным инфузионным насосом. В других вариантах осуществления насос является имплантированным хирургическим путем насосом, который доставляет средство для RNAi в печень.
Другие способы введения включают эпидуральное, внутрицеребральное, интрацеребровентрикулярное, назальное введение, внутриартериальное, внутрисердечное, внутрикостную инфузию, подоболочечное, и интравитреальное, и легочное. Способ введения можно выбрать, исходя из того, необходимо местное или системное лечение, и исходя из области, которая подлежит лечению. Путь и место введения можно выбрать для усиления целенаправленного воздействия.
Способ включает введение средства на основе iRNA, например дозы, достаточной для понижения уровней мРНК HAO1 в течение по меньшей мере 5, более предпочтительно 7, 10, 14, 21, 25, 30 или 40 дней; и необязательно введение второй однократной дозы dsRNA, где вторую однократную дозу вводят по меньшей мере через 5, более предпочтительно через 7, 10, 14, 21, 25, 30 или 40 дней после введения первой однократной дозы, за счет чего осуществляется ингибирование экспрессии гена НАО1 у субъекта.
В одном варианте осуществления дозы средства на основе iRNA согласно настоящему изобретению вводят не более одного раза каждые четыре недели, не более одного раза каждые три недели, не более одного раза каждые две недели или не более одного раза каждую неделю. В другом варианте осуществления введения могут продолжаться в течение одного, двух, трех или шести месяцев, или одного года, или дольше. В другом варианте осуществления дозы средства на основе iRNA согласно настоящему изобретению вводят один раз в неделю в течение трех недель.
Как правило, средство на основе iRNA не активизирует иммунную систему, например оно не повышает уровни цитокинов, как, например, уровни TNF-альфа или IFN-альфа. Например, при измерении при помощи анализов, таких как анализ РВМС in vitro, как, например, описано в данном документе, повышение уровней TNF-альфа или IFN-альфа составляет менее 30, 20 или 10% от уровня в контрольных клетках, обработанных контрольной dsRNA, такой как dsRNA, которая не оказывает целенаправленного воздействия на НАО1.
Например, субъекту можно вводить терапевтическое количество средства на основе iRNA, как, например, 0,3, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 или 3 мг/кг dsRNA. Средство на основе iRNA можно вводить путем внутривенной инфузии в течение некоторого периода времени, как, например, в течение периода, составляющего 5, 10, 15, 20 или 25 мин. Введение повторяют, например, регулярно, как, например, раз в
- 54 037115 две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного, двух, трех, четырех месяцев или дольше. После осуществления режима первичного лечения лекарственные препараты можно вводить менее часто. Например, после введения раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев или года или дольше. Введение средства на основе iRNA может снижать уровни НАО1, например, в клетке, ткани, крови, моче или другой части организма пациента по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% или более.
Перед введением полной дозы средства на основе iRNA пациентам можно вводить меньшую дозу, как, например, дозу, приводящую к менее чем 5% инфузионной реакции, и наблюдать их в отношении нежелательных явлений, как, например, аллергических реакций, или в отношении повышенных уровней липидов или кровяного давления. В другом примере пациента можно наблюдать в отношении нежелательных иммуностимулирующих эффектов, как, например, повышенных уровней цитокина (например, TNF-альфа или INF-альфа).
Пациенты, нуждающиеся в средстве для RNAi к HAO1, могут быть идентифицированы путем сбора семейного анамнеза. Медицинский работник, такой как врач, медицинская сестра, или член семьи могут принять во внимание семейный анамнез перед назначением или введением dsRNA для HAO1. Также можно выполнять ДНК-тест в отношении пациента для идентификации мутации в гене AGT1 перед введением пациенту средства для RNAi к HAO1. Диагноз РН1 может быть подтвержден при помощи любого теста, хорошо известного специалисту в данной области.
Лечебный или предупредительный эффект является очевидным, когда наблюдается статистически значимое улучшение одного или нескольких параметров болезненного состояния, или по отсутствию усугубления или развития симптомов в тех случаях, когда их, при иных обстоятельствах, прогнозировали. В качестве примера благоприятное изменение измеряемого параметра заболевания по меньшей мере на 10% и предпочтительно по меньшей мере на 20, на 30, на 40, на 50% или более может служить показателем эффективного лечения. Об эффективности для данного средства на основе iRNA согласно настоящему изобретению или состава такого средства на основе iRNA можно также судить при помощи экспериментальной животной модели для данного заболевания, которая известна в уровне техники. При использовании экспериментальной животной модели, эффективность лечения доказана, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера или ослабление симптома.
Доза средства для RNAi, которую вводят субъекту, может быть подобрана с уравновешиванием риска и пользы определенной дозы, например, для достижения необходимого уровня супрессии гена НАО1 (который определяют, например, исходя из супрессии мРНК НАО1, экспрессии белка НАО1 или снижения уровней оксалатов) или необходимого терапевтического или профилактического эффекта, вместе с тем одновременно избегая нежелательного побочного действия.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi вводят при помощи двух или более доз. При необходимости облегчить проведение повторяющихся или частых инфузий может быть целесообразной имплантация устройства для доставки, например насоса, полупостоянного стента (например, внутривенного, внутрибрюшинного, интрацистернального или внутрисуставного) или емкости. В некоторых вариантах осуществления число или количество последовательных доз зависит от достижения необходимого эффекта, например супрессии гена HAO1, или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например уменьшения перегрузки железом. В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi вводят в соответствии со схемой. Например, средство для RNAi можно вводить один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или пять раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления схема предусматривает введения с равными интервалами, например ежечасно, каждые 4, каждые 6, каждые 8, каждые 12 ч, ежедневно, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц. В других вариантах осуществления схема предусматривает введения с небольшим интервалом с последующим более длительным периодом времени, в течение которого средство не вводят. Например, схема может включать первичный набор доз, которые вводят в течение относительно короткого периода времени (например, приблизительно каждые 6 ч, приблизительно каждые 12 ч, приблизительно каждые 24 ч, приблизительно каждые 48 ч или приблизительно каждые 72 ч) с последующим более длительным периодом времени (например, приблизительно 1 неделя, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недель, приблизительно 6 недель, приблизительно 7 недель или приблизительно 8 недель), в течение которого средство для RNAi не вводят. В одном варианте осуществления средство для RNAi первоначально вводят каждый час, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, раз в день, раз в неделю, раз в две недели или раз в месяц). В другом варианте осуществления средство для RNAi первоначально вводят ежедневно, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, раз в неделю, раз в две недели или раз в месяц). В определенных вариантах осуществления более длительный интервал увеличивается со временем, или его определяют на основе достижения необходимого эффекта. В конкретном варианте осуществления средство для RNAi вводят один раз в день в течение первой недели с последующим введением доз раз в неделю, начиная с восьмого дня введения. В
- 55 037115 другом конкретном варианте осуществления средство для RNAi вводят через день в течение первой недели с последующим введением доз раз в неделю, начиная с восьмого дня введения.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi вводят при режиме дозирования, который включает фазу насыщения'' из введений с небольшими интервалами, за которой может следовать ''фаза поддержания'', в которой средство для RNAi вводят с более длительными интервалами. В одном варианте осуществления фаза насыщения включает пять ежедневных введений средства для RNAi в течение первой недели. В другом варианте осуществления фаза поддержания включает введения средства для RNAi один или два раза в неделю. В дополнительном варианте осуществления фаза поддержания длится 5 недель.
Любую из этих схем необязательно можно повторять с обеспечением одного или нескольких повторов. Число повторов может зависеть от достижения необходимого эффекта, например супрессии гена HAO1, и/или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например снижения уровней оксалатов или уменьшения симптома РН1.
В другом аспекте в настоящем изобретении описан способ инструктирования конечного пользователя, например лица, осуществляющего уход или лечение, или субъекта, в отношении того, как вводить средство на основе iRNA, описанное в данном документе. Способ включает, необязательно, предоставление конечному пользователю одной или нескольких доз средства на основе iRNA и инструктирование конечного пользователя по введению средства на основе iRNA в режиме, описанном в данном документе, таким образом, инструктируя конечного пользователя.
VII. Наборы.
Настоящее изобретение также предусматривает наборы для применения любого из средств на основе iRNA и/или осуществления любого из способов согласно настоящему изобретению. Такие наборы включают одно или несколько средств для RNAi и инструкции по применению, например инструкции для ингибирования экспрессии HAO1 в клетке путем приведения клетки в контакт со средством(ами) для RNAi в количестве, эффективном для ингибирования экспрессии HAO1. Наборы могут необязательно дополнительно содержать средства для приведения клетки в контакт со средством для RNAi (например, устройство для инъекции) или средства для определения степени ингибирования HAO1 (например, средства для определения степени ингибирования мРНК или белка HAO1). Такие средства для определения степени ингибирования HAO1 могут предусматривать средства для получения образца из организма субъекта, например образец плазмы крови. Наборы согласно настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать средства для введения средства(средств) для RNAi субъекту или средства для определения терапевтически эффективного или профилактически эффективного количества.
VIII. Диагностические маркеры для РН1 и родственных состояний/
Также в данном документе описаны маркеры и способы для диагностики болезненных состояний, вызванных сверхсинтезом оксалатов, в частности РН1 и родственных состояний, а также средства для лечения указанных состояний.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения РН1-состояния у субъекта (заболеваний с образованием камней, в особенности РН1). Диагностический способ включает стадии (а) осуществления нокдауна экспрессии HAO1 у субъекта, (b) получения биологической сыворотки крови из организма указанного субъекта и (b) определения уровня гликолата в указанной сыворотке крови. Следует принимать во внимание, что повышенный уровень гликолата в сыворотке крови по сравнению с отрицательным контролем указывает на ингибирование способности фермента гликолатоксидазы предотвращать образование оксалатов, что является причиной РН1-состояний.
В одном варианте осуществления в данном документе описан набор для диагностики PH1состояния, причем указанный набор включает следующее: (а) средство для определения присутствия представляющего интерес аналита в сыворотке крови, где указанным представляющим интерес аналитом является один из гликолатов; и (b) средства градуирования. Например, указанным представляющим интерес аналитом является гликолат, при этом указанным средством является siRNA, целенаправленно воздействующая на HAO1.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или тестировании iRNA и способов, описанных в настоящем изобретении, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие литературные источники, которые упоминаются в данном документе, включены при помощи ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие.
- 56 037115
Примеры
Материалы и способы.
Следующие материалы и способы использовали в примерах. Используемые в данном документе НАО и GO используют взаимозаменяемо.
Синтез siRNA.
Однонитевые РНК получали при помощи твердофазного синтеза в масштабе, составляющем 1 мкмоль, с использованием синтезирующего устройства Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Дармштадт, Германия) и стекла с контролируемым размером пор (CPG, 500А, Proligo Biochemie GmbH, Гамбург, Германия) в качестве твердой подложки. РНК и содержащую 2'-О-метилнуклеотиды РНК получали при помощи твердофазного синтеза с использованием соответствующих фосфорамидатов и 2'-О-метил-фосфорамидатов соответственно (Proligo Biochemie GmbH, Гамбург, Германия). Эти структурные блоки встраивали в выбранные места в пределах последовательности олигорибонуклеотидной цепи при помощи общепринятой фосфорамидитной химии нуклеозидов, как, например, описанной в Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA. Фосфотиоатные связи вводили путем замены окисляющего йодного раствора раствором реагента Beaucage (Chruachem Ltd, Глазго, Великобритания) в ацетонитриле (1%). Далее вспомогательные реагенты получали от Mallinckrodt Baker (Грисхайм, Германия).
Снятие защиты и очистку неочищенных олигорибонуклеотидов выполняли при помощи анионообменной HPLC согласно установленным процедурам. Выходы и концентрации определяли по УФ-поглощению раствора соответствующей РНК при длине волны, составляющей 260 нм, при помощи спектрального фотометра (DU 640В, Beckman Coulter GmbH, Унтершлайсхайм, Германия).
Двухнитевую РНК получали при помощи смешивания эквимолярного раствора комплементарных нитей в буфере для гибридизации (20 мМ фосфата натрия, рН 6,8; 100 мМ хлорида натрия), затем нагревали на водяной бане при 85-90°С в течение 3 мин и охлаждали до комнатной температуры в течение периода, составляющего 3-4 ч. Раствор с гибридизированной РНК хранили при -20°С до момента использования.
В некоторых случаях дуплекс (dsRNA) синтезировали неоднократно. Разные партии помечали разными добавочными номерами. К примеру, AD-62933.1 и AD-62933.2 представляют собой разные партии одного и того же дуплекса.
Культура клеток и трансфекции.
Использовали первичные гепатоциты макака-крабоеда (РСН) и первичные гепатоциты мыши (РМН). PCH (Celsis, № М003055, серия СВТ) или РМН (выделенные непосредственно перед процедурой) трансфицировали путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл дуплексов siRNA на лунку в 96-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем к смеси siRNA добавляли 80 мкл сред для клеток крыс in vitro GRO CP (in vitro Technologies), содержащих ~2x 104 клеток РСН или РМН. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты с использованием однократной дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса, составляющей 10 или 20 нМ и 0,1 или 0,2 нМ, и эксперименты для определения эффекта дозы проводили в диапазоне доз с конечной концентрацией дуплекса, составляющей от 10 нМ до 36 фМ, с использованием 86-кратных разведений.
Выделение общей РНК.
Общую РНК выделяли при помощи набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit (Invitrogen, № по кат. 610-12). Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем перемешивали в течение 5 мин при 850 об/мин с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость перемешивания была одинаковой на всем протяжении процесса). 10 мкл магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и перемешивали в течение 1 мин. Магнитные гранулы удерживали при помощи магнитной установки и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и перемешивали в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и перемешивали в течение 1 мин. Гранулы вновь удерживали и супернатант удаляли. Затем гранулы промывали 150 мкл промывочного буфера В, удерживали и супернатант удаляли. На следующей стадии гранулы промывали 150 мкл элюирующего буфера, удерживали и супернатант удаляли. Гранулы оставляли высыхать в течение 2 мин. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и перемешивали в течение 5 мин при 70°С. Гранулы удерживали с помощью магнита в течение 5 мин. Удаляли 40 мкл супернатанта и вносили в другой 96-луночный планшет.
Синтез кДНК.
Синтез кДНК осуществляли с использованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813) Мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н2О на реакцию добавляли в 10 мкл общей РНК. кДНК получали с использованием термоциклера Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, Калифорния) посредством следующих стадий: 25°С
- 57 037115 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с, хранение при 4°С.
ПЦР в режиме реального времени.
мкл кДНК добавляли к мастер-миксу, содержащему 0,5 мкл зондов TaqMan для GAPDH мыши (№ по кат. 4352339Е, Life Technologies) или специально разработанных зондов TaqMan для GAPDH макака-крабоеда: F - GCATCCTGGGCTACACTGA (SEQ ID NO: 13), R - TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC (SEQ ID NO: 14), зонд - CCAGGTGGTCTCCTCC (SEQ ID NO: 15)), 0,5 мкл НАО1 человека или мыши (HS00213909_M1, который является перекрестнореагирующим с НОА1 макака-крабоеда, Mm 00439249_m1 для анализов с мышиным, life technologies) и 5 мкл мастер-микса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по кат. 04887301001) на лунку в 50 384-луночных планшетах (Roche, № по кат. 04887301001). ПЦР в режиме реального времени выполняли в системе для ПЦР в режиме реального времени LightCycler480 (Roche) с применением ΔΔCt (RQ)-анαлиза. Каждый дуплекс тестировали при двух независимых трансфекциях и каждую трансфекцию оценивали в двух повторностях, если не указано иное в итоговых таблицах.
Для расчета относительного кратного изменения данные в реальном времени анализировали с использованием способа ΔΔCt и нормализовали относительно анализов, выполненных с клетками, трансфицированными с помощью 10 нМ AD-1955, или ложно-трансфицированными клетками. Значения IC50 рассчитывали с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с данными для клеток, трансфицированных AD-1955, или интактных клеток.
Смысловая и антисмысловая последовательности AD-1955 представляют собой:
СМЫСЛОВАЯ: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' (SEQ ID NO: 16) и
АНТИСМЫСЛОВАЯ: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (SEQ ID NO: 17).
Таблица В
Сокращения нуклеотидных мономеров, используемые в представлении последовательности нуклеиновой кислоты
Сокращение Нуклеотид(ы)
А Аденозин-3'-фосфат
АЬ Бета-Ь-аденозин-З'-фосфат
Af 2'-Фтораденозин-3'-фосфат
Afs 2'-Фтораденозин-3'-фосфотиоат
As Аденозин-3'-фосфотиоат
С Цитидин-3'-фосфат
Cb Бета-Ь-цитидин-З'-фосфат
Cf 2'-Фторцитидин-3'-фосфат
Cfs 2'-Фторцитидин-3'-фосфотиоат
Cs Цитидин-3'-фосфотиоат
G Гуанозин-3'-фосфат
Gb Бета-Ц-гуанозин-З'-фосфат
Gbs Бета-Ь-гуанозин-З'-фосфотиоат
Gf 2'-Фторгуанозин-3'-фосфат
Gf s 2'-Фторгуанозин-3'-фосфотиоат
Gs Гуанозин-3'-фосфотиоат
T 5'-Метилуридин-3'-фосфат
Tf 2'-Фтор-5-метилуридин-З'-фосфат
Tfs 2'-Фтор-5-метилуридин-З'-фосфотиоат
Ts 5-Метилуридин-З'-фосфотиоат
U Уридин-3'-фосфат
Uf 2'-Фторуридин-3'-фосфат
Ufs 2'-Фторуридин-3'-фосфотиоат
Us Уридин-3'-фосфотиоат
N Любой нуклеотид (G, А, С, Т или U)
a 2'-0-Метиладенозин-З'-фосфат
as 2'-0-Метиладенозин-З'-фосфотиоат
c 2'-О-Метилцитидин-3'-фосфат
cs 2'-О-Метилцитидин-3'-фосфотиоат
g 2'-0-Метилгуанозин-З'-фосфат
gs 2'-0-Метилгуанозин-З'-фосфотиоат
- 58 037115
t 2'-О-Метил-5-метилуридин-З'-фосфат
ts 2'-О-Метил-5-метилуридин-З'-фосфотиоат
U 2'-О-Метилуридин-3'-фосфат
US 2'-О-Метилуридин-3'-фосфотиоат
dT 2'-Дезокситимидин
dTs 2'-Дезокситимидин-3'-фосфотиоат
dU 2'-Дезоксиуридин
s Фосфотиоатная связь
L96 N-[Трис(GalNAc-алкил)амидодеканоил)]-4гидроксипролинол-Нур-(GalNAc-алкил)3
(Aeo) 2'-0-Метоксиэтиладенозин-З'-фосфат
(Aeos ) 2'-0-Метоксиэтиладенозин-З'-фосфотиоат
(Geo) 2'-0-Метоксиэтилгуанозин-З'-фосфат
(Geos ) 2'-0-Метоксиэтилгуанозин-З'-фосфотиоат
(Teo) 2'-О-Метоксиэтил-5-метилуридин-З'-фосфат
(Teos ) 2'-О-Метоксиэтил-5-метилуридин-З'-фосфотиоат
(m5Ceo) 2'-О-Метоксиэтил-5-метилцитидин-З'-фосфат
(m5Ceos) 2'-О-Метоксиэтил-5-метилцитидин-З'-фосфотиоат
(A3m) 3'-О-Метиладенозин-2'-фосфат
(A3mx) 3'-О-Метилксилофуранозиладенозин-2'-фосфат
(G3m) 3'-О-Метилгуанозин-2'-фосфат
(G3mx) 3'-О-Метилксилофуранозилгуанозин-2'-фосфат
(C3m) 3'-О-Метилцитидин-2'-фосфат
(C3mx) 3'-О-Метилксилофуранозилцитидин-2'-фосфат
(U3m) 3'-О-Метилуридин-2'-фосфат
(U 3mx) 3'-О-Метилксилоуридин-2'-фосфат
(Chd) 2'-О-Гексадецилцитидин-3'-фосфат
(pshe) Гидроксиэтилфосфоротиоат
(Uhd) 2'-О-Гексадецилуридин-3'-фосфат
(Tgn) Тимидин-гликоль-нуклеиновая кислота (GNA), 3-изомер
(Cgn) Цитидин-гликоль-нуклеиновая кислота (GNA)
(Chd) 2'-О-Гексадецилцитидин-3'-фосфат
(Ggn) 2'-О-Гексадецилцитидин-3'-фосфат
(Agn) Аденозин-гликоль-нуклеиновая кислота (GNA)
P 5'-Фосфат
(m5Cam) 2'-0-(N-Метилацетамид)-5-метилцитидин-З'-фосфат
(m5Cams) 2'-0-(N-Метилацетамид)-5-метилцитидин-З'-фосфоротиоат
(Tam) 2'-0-(N-Метилацетамид)тимидин-3'-фосфат
(Tams ) 2'-0-(N-Метилацетамид)тимидин-3'-фосфоротиоат
(Aam) 2'-0-(N-Метилацетамид)аденозин-3'-фосфат
(Aams) 2'-0-(N-Метилацетамид)аденозин-3'-фосфоротиоат
(Gam) 2'-0-(N-Метилацетамид)гуанозин-3'-фосфат
(Gams ) 2'-0-(N-Метилацетамид)гуанозин-3'-фосфоротиоат
Y34 Лишенный азотистого основания 2'-0-метил
Y44 2-Гидроксиметилтетрагидрофуран-5-фосфат
Пример 1. Конструирование, специфичность и прогнозирование эффективности siRNA.
Конструирование siRNA выполняли для идентификации siRNA, целенаправленно воздействующих на транскрипты HAO1 человека, макака-крабоеда, мыши и крысы, аннотированные в базе данных генов N CBI (http: //www.ncbi. nlm.nih.gov/gene/).
При конструировании использовали следующие транскрипты из коллекции эталонных последовательностей NCBI: мРНК HAO1 человека (Homo sapiens) представляет собой NM_017545.2; мРНК HAO1 макака-крабоеда (Масаса fascicularis) представляет собой ХМ_005568381.1; мРНК HAO1 мыши (Mus musculus) представляет собой NM 010403.2; мРНК HAO1 крысы (Rattus norvegicus) представляет собой ХМ_006235096.1.
- 59 037115
Вследствие высокого расхождения последовательностей примат/грызун дуплексы siRNA конструировали в нескольких отдельных партиях, в том числе без ограничения партиях, содержащих дуплексы, соответствующие только транскриптам человека и яванского макака; только транскриптам человека, яванского макака, мыши и крысы и только транскриптам мыши и крысы. Все дуплексы siRNA конструировали так, чтобы они имели 100% идентичность с приведенными транскриптом человека и транскриптами других видов, рассмотренными в каждой партии конструирования (выше).
Специфичность всех возможных олигонуклеотидов из 19 нуклеотидов прогнозировали исходя из каждой последовательности. Затем отбирали кандидатные олигомеры из 19 нуклеотидов, у которых отсутствовали повторения длиннее 7 нуклеотидов. Эти siRNA, 1069 кандидатных человека/яванского макака, 184 человека/яванского макака/мыши/крысы и 579 мыши/крысы, использовали при обширных поисках в отношении соответствующих транскриптом (определенные как набор из записей NM и ХМ в пределах наборов эталонных последовательностей человека, яванского макака, мыши или крысы в NCBI) с применением исчерпывающего алгоритма грубой силы, включенного в скрипт на питоне BruteForce.ру. Далее скрипт разбирал выравнивания транскрипт-олигонуклеотид с получением балла, основанного на положении и количестве ошибочных спариваний между siRNA и любым потенциальным нецелевым транскриптом. Нецелевой' балл взвешивали для выделения различий в затравочном участке siRNA в положениях 2-9 от 5'-конца молекулы. Каждой паре олигонуклеотид-транскрипт из поиска грубой силы присваивали балл для ошибочного спаривания путем суммирования отдельных баллов для ошибочного спаривания; ошибочные спаривания в положениях 2-9 определяли как 2,8, ошибочные спаривания в положениях сайта расщепления 10-11 определяли как 1,2 и ошибочные спаривания в участке 12-19 определяли как 1,0. Дополнительное нецелевое прогнозирование выполняли путем сравнения встречаемости гептамеров и октамеров, полученных из трех отличных полученных из затравки гексамеров каждого олигонуклеотида. Гексамеры из положений 2-7 по отношению к 5'-началу использовали для создания 2 гептамеров и одного октамера. Гептамер1 создавали путем добавления А на 3'-конец гексамера; гептамер2 создавали путем добавления А на 5'-конец гексамера; октамер создавали путем добавления А как на 5'-конец, так и на 3'-конец гексамера. Предварительно рассчитывали встречаемость октамеров и гептамеров в 3'UTRome человека, яванского макака, мыши или крысы (определенные как подпоследовательности транскриптом из базы данных эталонных последовательностей в NCBI, где конец кодирующего участка, CDS, является четко определенным). Встречаемость октамеров нормализовали по отношению к встречаемости гептамеров с использованием медианного значения из диапазона встречаемостей октамеров. Затем рассчитывали mirSeedScore путем вычисления суммы ((3 х нормализованное подсчитанное число для октамеров) + (2 х подсчитанное число для гептамера 2) + (1 х подсчитанное число для гептамера 1)).
Обоим нитям siRNA присваивали категорию специфичности согласно рассчитанным баллам: балл выше 3 квалифицировали как высокоспецифичная, равный 3 как специфичная и от 2,2 до 2,8 квалифицировали как умеренно специфичная. siRNA упорядочивали по специфичности антисмысловой нити. Затем отбирали дуплексы из наборов вариантов человека/яванского макака и мыши/крысы, у антисмысловых олигонуклеотидов которых отсутствовала GC в первом положении, отсутствовал G в обоих положениях 13 и 14, и присутствовали 3 или более U или А в затравочном участке (характеристики дуплексов с высокой прогнозированной эффективностью). Подобным образом отбирали дуплексы из наборов вариантов человека/яванского макака/мыши и человека/яванского макака/мыши/крысы, в которых присутствовали 3 или более U или А в затравочном участке.
Кандидатные коньюгированные с GalNAc дуплексы, 21 и 23 нуклеотида в длину для смысловой и антисмысловой нитей соответственно, конструировали путем удлинения антисмысловых олигонуклеотидов из 19 нуклеотидов 4 дополнительными нуклеотидами в 3'-направлении (сохраняя полную комплиментарность с целевым транскриптом). Смысловую нить описывали как обратную комплементарную последовательность первых 21 нуклеотида антисмыслового олигомера из 23 нуклеотидов. Выбирали такие дуплексы, которые сохраняли полные соответствия ко всем выбранным транскриптам видов на протяжении всех 23 нуклеотидов.
Антисмысловые нити, которые содержали С или G в первом положении с 5'-конца, модифицировали так, чтобы они имели U в первом положении с 5'-конца, если только осуществление этого не приводило к ряду из 4 или более смежных U (5А3'), в таком случае их модифицировали так, чтобы они имели А в первом положении с 5'-конца. Смысловые нити, подлежащие спариванию в дуплексы с этими антисмысловыми нитями с UA заменой, соответственно модифицировали для сохранения комплементарности. Примеры, описанные ниже, включают в себя AD-62989 и AD-62993.
Синтезировали олигонуклеотиды из 21/23 нуклеотидов, являющиеся в общей сложности 31 смысловой и 31 антисмысловой нитями, полученными из транскрипта человека/яванского макака, 19 смысловыми и 19 антисмысловыми нитями, полученными из транскрипта человека/яванского макака/мыши/крысы, и 48 смысловыми и 48 антисмысловыми нитями, полученными из транскрипта мыши/крысы, и составляли в коньюгированные с GalNAc дуплексы.
- 60 037115
Последовательности смысловой и антисмысловой нитей модифицированных дуплексов показаны в табл. 1, а последовательности смысловой и антисмысловой нитей немодифицированных дуплексов показаны в табл. 2.
Таблица 1а
Модифицированные последовательности HAO1
Название дуплекса Последовательность смысловой нити SEQ ID NO: Последовательность антисмысловой нити SEQ ID NO: Вид
AD-62933 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuC faUfcGfaCfaAfL96 18 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuUfс AfcAfuUfcsusg 89 Hs/Mm
AD-62939 UfsusUfuCfaAfuGfGfGfuG fuCfcUfaGfgAfL96 19 usCfscUfaGfgAfcAfcccAfu UfgAfaAfasgsu 90 Hs/Mm
AD-62944 GfsasAfaGfuCfaUfCfGfaC faAfgAfcAfuUfL96 20 asAfsuGfuCfuUfgUfcgaUfg Af cUfuUfcsasc 91 Hs/Mm
AD-62949 UfscsAfuCfgAfcAfAfGfaC faUfuGfgUfgAfL96 21 usCfsaCfcAfaUfgUfcuuGfu CfgAfuGfascsu 92 Hs/Mm
AD-62954 UfsusUfcAfaUfgGfGfUfgU fcCfuAfgGfaAfL96 22 usUfscCfuAfgGfaCfaccCfa UfuGfaAfasasg 93 Hs/Mm
AD-62959 AfsasUfgGfgUfgUfCfCfuA fgGfaAfcCfuUfL96 23 asAf sgGfuUfcCfuAfggaCfa CfcCfaUfusgsa 94 Hs/Mm
AD-62964 GfsasCfaGfuGfcAfCfAfaU faUfuUfuCfcAfL96 24 usGfsgAfaAfaUfaUfuguGfc Af cUfgUfcsasg 95 Hs/Mm
AD-62 9 69 AfscsUfuUfuCfaAfUfGfgG fuGfuCfcUfaAfL96 25 usUfsaGfgAfcAfcCfcauUfg AfaAfaGfuscsa 96 Hs/Mm
AD-62934 AfsasGfuCfaUfcGfAfCfaA fgAfcAfuUfgAfL96 26 usCfsaAfuGfuCfuUfgucGfa UfgAfcUfususc 97 Hs/Mm
AD-62940 AfsusCfgAfcAfaGfAfCfaU fuGfgUfgAfgAfL96 27 usCfsuCfaCfcAfaUfgucUfu GfuCfgAfusgsa 98 Hs/Mm
AD-62945 GfsgsGfaGfaAfaGfGfUfgU fuCfaAfgAfuAfL96 28 usAfsuCfuUfgAfaCfaccUfu UfcUfcCfcscsc 99 Hs/Mm
AD-62950 CfsusUfuUfcAfaUfGfGfgU fgUfcCfuAfgAfL96 29 usCfsuAfgGfaCfaCfccaUfu GfaAfaAfgsusc 100 Hs/Mm
AD-62 955 UfscsAfaUfgGfgUfGfUfcC fuAfgGfaAfcAfL96 30 usGfsuUfcCfuAfgGfacaCfc CfaUfuGfasasa 101 Hs/Mm
- 61 037115
AD-62 9 60 UfsusGfaCfuUfuUfCfAfaU fgGfgUfgUfcAfL96 31 usGfsaCfaCfcCfaUfugaAfa AfgUfcAfasasa 102 Hs/Mm
AD-62 9 65 AfsasAfgUfcAfuCfGfAfcA faGfaCfaUfuAfL96 32 usAf saUfgUfcUfuGfucgAfu GfaCfuUfuscsa 103 Hs/Mm
AD-62970 CfsasGfgGfgGfaGfAfAfaG fgUfgUfuCfaAfL96 33 usUfsgAfaCfaCfcUfuucUfc CfcCfcUfgsgsa 104 Hs/Mm
AD-62935 CfsasUfuGfgUfgAfGfGfaA faAfaUfcCfuUfL96 34 asAfsgGfaUfuUfuUfccuCfa CfcAfaUfgsusc 105 Hs/Mm
AD-62941 AfscsAfuUfgGfuGfAfGfgA faAfaAfuCfcUfL96 35 asGfsgAfuUfuUfuCfcucAfc CfaAfuGfuscsu 106 Hs/Mm
AD-62946 Af sgsGfgGfgAfgAfAfAfgG fuGfuUfcAfaAfL 9 6 36 usUfsuGfaAfcAfcCfuuuCfu CfcCfcCfusgsg 107 Hs/Mm
AD-62951 AfsusGfgUfgGfuAfAfUfuU fgUfgAfuU fuU fL 9 6 37 asAfsaAfuCfaCfaAfauuAfc CfaCfcAfuscsc 108 Hs
AD-62 95 6 GfsasCfuUfgCfaUfCfCfuG fgAfaAfuAfuAfL96 38 usAfsuAfuU fuCfcAfggaUfg CfaAfgUfcscsa 109 Hs
AD-62961 GfsgsAfaGfgGfaAfGfGfuA fgAfaGfuCfuUfL96 39 asAfsgAfcUfuCfuAfccuUfc CfcUfuCfcsasc 110 Hs
AD-62 9 66 UfsgsUfcUfuCfuGfUfUfuA fgAfuUfuCfcUfL96 40 asGfsgAfaAfuCfuAfaacAfg Af aGfaCfasgsg 111 Hs
AD-62971 CfsusUfuGfgCfuGfU fUfuC fcAfaGfaUfcUfL96 41 asGfsaUfcUfuGfgAfaacAfg CfcAfaAfgsgsa 112 Hs
AD-62 93 6 AfsasUfgUfgUfuUfGfGfgC faAfcGfuCfaUfL96 42 asUfsgAfcGfuUfgCfccaAfa CfaCfaUfususu 113 Hs
AD-62942 UfsgsUfgAfcUfgUfGfGfaC faCfcCfcUfuAfL96 43 usAfsaGfgGfgUfgUfccaCfa GfuCfaCfasasa 114 Hs
AD-62947 GfsasUfgGfgGfuGfCfCfaG fcUfaCfuAfuUfL96 44 asAfsuAfgUfaGfcUfggcAfc CfcCfaUfcscsa 115 Hs
AD-62952 GfsasAfaAfuGfuGfUfUfuG fgGfcAfaCfgUfL96 45 asCfsgUfuGfcCfcAfaacAfc AfuUfuUfcsasa 116 Hs
AD-62957 GfsgsCfuGfuUfuCfCfAfaG faUfcUfgAfcAfL96 46 usGfsuCfaGfaUfcUfuggAfa AfcAfgCfcsasa 117 Hs
AD-62962 UfscsCfaAfcAfaAfAfUfaG fcCfaCfcCfcUfL96 47 asGfsgGfgUfgGfcUfauuUfu GfuUfgGfasasa 118 Hs
AD-62 967 GfsusCfuUfcUfgUfUfUfaG faUfuUfcCfuUfL96 48 asAfsgGfaAfaUfcUfaaaCfa GfaAfgAfcsasg 119 Hs
AD-62972 UfsgsGfaAfgGfgAfAfGfgU faGfaAfgUfcUfL96 49 asGfsaCfuUfcUfaCfcuuCfc CfuUfcCfascsa 120 Hs
AD-62937 UfscsCfuUfuGfgCfUfGfuU fuCfcAfaGfaUfL96 50 asUfscUfuGfgAfaAfcagCfc AfaAfgGfasusu 121 Hs
AD-62943 CfsasUfcUfcUfcAfGfCfuG fgGfaUfgAfuAfL96 51 usAfsuCfaUfcCfcAfgcuGfa GfaGfaUfgsgsg 122 Hs
- 62 037115
AD-62948 GfsgsGfgUfgCfcAfGfCfuA fcUfaUfuGfaUfL96 52 asUfscAfaUfaGfuAfgcuGfg CfaCfcCfcsasu 123 Hs
AD-62953 Af susGfuGfuUfuGfGfGf cA faCfgUfcAfuAfL96 53 usAfsuGfaCfgUfuGfcccAfa AfcAfcAfususu 124 Hs
AD-62958 CfsusGfuUfuAfgAfUfUfuC fcUfuAfaGfaAfL96 54 usUfscUfuAfaGfgAfaauCfu AfaAfcAfgsasa 125 Hs
AD-62 9 63 Af sgsAfaAfgAfaAfUfGfgA fcUfuGfcAfuAfL96 55 usAfsuGfcAfaGfuCfcauUfu CfuUfuCfusasg 126 Hs
AD-62 9 68 GfscsAfuCfcUfgGfAfAfaU faUfaUfuAfaAfL96 56 usUfsuAfaUfaUfaUfuucCfa GfgAfuGfcsasa 127 Hs
AD-62973 CfscsUfgUfcAfgAfCfCfaU fgGfgAfaCfuAfL96 57 usAf sgUfuCfcCfaUfgguCfu GfaCfaGfgscsu 128 Hs
AD-62938 Af sasAfcAfuGfgUfGfUfgG faUfgGfgAfuAfL96 58 usAfsuCfcCfaUfcCfacaCfc AfuGfuUfusasa 129 Hs
AD-62974 CfsusCfaGfgAfuGfAfAfaA faUfuUfuGfaAfL96 59 usUfscAfaAfaUfuUfuucAfu CfcUfgAfgsusu 130 Hs
AD-62978 CfsasGfcAfuGfuAfUfUfaC fuUfgAfcAfaAfL96 60 usUfsuGfuCfaAfgUfaauAfc AfuGfcUfgsasa 131 Hs
AD-62982 UfsasUfgAfaCfaAfCfAfuG fcUfaAfaUfcAfL96 61 usGfsaUfuUfaGfcAfuguUfg UfuCfaUfasasu 132 Hs
AD-62986 AfsusAfuAfuCfcAfAfAfuG fuUfuUfaGfgAfL96 62 usCfscUfaAfaAfcAfuuuGfg AfuAfuAfususc 133 Hs
AD-62990 CfscsAfgAfuGfgAfAfGfcU fgUfaUfcCfaAfL96 63 usUfsgGfaUfaCfaGfcuuCfc AfuCfuGfgsasa 134 Hs
AD-62994 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuG fgAfaAfuAfuAfL96 64 usAfsuAfuUfuCfcAfggaUfg AfaAfgUfcscsa 135 Hs
AD-62998 CfscsCfcGfgCfuAfAfUfuU fgUfaUfcAfaUfL96 65 asUfsuGfaUfaCfaAfauuAfg CfcGfgGfgsgsa 136 Hs
AD-63002 UfsusAfaAfcAfuGfGfCfuU fgAfaUfgGfgAfL96 66 usCfscCfaUfuCfaAfgccAfu GfuUfuAfascsa 137 Hs
AD-62975 AfsasUfgUfgUfuUfAfGfaC faAfcGfuCfaUfL96 67 asUfsgAfcGfuUfgUfcuaAfa CfaCfaUfususu 138 Mm
AD-62979 AfscsUfaAfaGfgAfAfGfaA fuUfcCfgGfuUfL96 68 asAfscCfgGfaAfuUfcuuCfc UfuUfaGfusasu 139 Mm
AD-62983 UfsasUfaUfcCfaAfAfUfgU fuUfuAfgGfaUfL96 69 asUfscCfuAfaAfaCfauuUfg GfaUfaUfasusu 140 Mm
AD-62987 GfsusGfcGfgAfaAfGfGfcA fcUfgAfuGfuUfL96 70 asAfscAfuCfaGfuGfccuUfu CfcGfcAfcsasc 141 Mm
AD-62991 UfsasAfaAfcAfgUfGfGfuU fcUfuAfaAfuUfL96 71 asAfsuUfuAfaGfaAfccaCfu GfuUfuUfasasa 142 Mm
AD-62995 AfsusGfaAfaAfaUfUfUfuG faAfaCfcAfgUfL96 72 asCfsuGfgUfuUfcAfaaaUfu UfuUfcAfuscsc 143 Mm
- 63 037115
AD-62999 Af sasCfaAfaAfuAfGfCfaA fuCfcCfuUfuUfL96 73 asAfsaAfgGfgAfuUfgcuAfu UfuUfgUfusgsg 144 Mm
AD-63003 CfsusGfaAfaCfaGfAfUfcU fgUfcGfaCfuUfL96 74 asAfsgUfcGfaCfaGfaucUfg UfuUfcAfgscsa 145 Mm
AD-62 97 6 UfsusGfuUfgCfaAfAfGfgG fcAfuUfuUfgAfL96 75 usCfsaAfaAfuGfcCfcuuUfg CfaAfcAfasusu 146 Mm
AD-62980 CfsusCfaUfuGfuUfUfAfuU faAf cCfuGfuAfL96 76 usAfscAfgGfuUfaAfuaaAfc AfaUfgAfgsasu 147 Mm
AD-62984 CfsasAfcAfaAfaUfAfGfcA faUfcCfcUfuUfL96 77 asAfsaGfgGfaUfuGfcuaUfu UfuGfuUfgsgsa 148 Mm
AD-62992 CfsasUfuGfuUfuAfUfUfaA fcCfuGfuAfuUfL96 78 asAfsuAfcAfgGfuUfaauAfa AfcAfaUfgsasg 149 Mm
AD-62 9 9 6 UfsasUfcAfgCfuGfGfGf aA fgAfuAfuCfaAfL96 79 usUfsgAfuAfuCfuUfcccAfg CfuGfaUfasgsa 150 Mm
AD-63000 UfsgsUfcCfuAfgGfAfAfcC fuUfuUfaGfaAfL96 80 usUfscUfaAfaAfgGfuucCfu AfgGfaCfascsc 151 Mm
AD-63004 UfscsCfaAfcAfaAfAfUfaG fcAfaUfcCfcUfL96 81 asGfsgGfaUfuGfcUfauuUfu GfuUfgGfasasa 152 Mm
AD-62977 GfsgsUfgUfgCfgGfAfAfaG fgCfaCfuGfaUfL96 82 asUfscAfgUfgCfcUfuucCfg CfaCfaCfcscsc 153 Mm
AD-62981 UfsusGfaAfaCfcAfGfUfaC fuUfuAfuCfaUfL96 83 asUfsgAfuAfaAfgUfacuGfg UfuUfcAfasasa 154 Mm
AD-62985 UfsasCfuUfcCfaAfAfGfuC fuAfuAfuAfuAfL96 84 usAfsuAfuAfuAfgAfcuuUfg GfaAfgUfascsu 155 Mm
AD-62989 UfscsCfuAfgGfaAfCfCfuU fuUfaGfaAfaUfL96 85 asUfsuUfcUfaAfaAfgguUfc CfuAfgGfascsa 156 Mm
AD-62993 CfsusCfcUfgAfgGfAfAfaA fuUfuUfgGfaAfL96 86 usUfscCfaAfaAfuUfuucCfu CfaGfgAfgsasa 157 Mm
AD-62997 GfscsUfcCfgGfaAfUfGfuU fgCfuGfaAfaUfL96 87 asUfsuUfcAfgCfaAfcauUfc CfgGfaGfcsasu 158 Mm
AD-63001 GfsusGfuUfuGfuGfGfGf gA fgAf cCfaAfuAfL96 88 usAfsuUfgGfuCfuCfcccAfc AfaAfcAfcsasg 159 Mm
Таблица 1b
Дополнительные модифицированные последовательности HAO1
Название дуплекса Последовательность смысловой нити SEQ ID NO: Последовательность антисмысловой нити SEQ ID NO: Вид
AD- GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU Hs/M
62933.2 aUfcGfaCfaAfL96 18 fcAfcAfuUfcsusg 89 m
AD- UfsusUfuCfaAfuGfGfGfuGf usCfscUfaGfgAfcAfcccA Hs/M
62939.2 uCfcUfaGfgAfL96 19 fuUfgAfaAfasgsu 90 m
- 64 037115
AD- 62944.2 GfsasAfaGfuCfaUfCfGfaCf aAfgAfcAfuUfL96 20 asAfsuGfuCfuUfgUfcgaU fgAfcUfuUfcsasc 91 Hs/M m
AD- 62949.2 UfscsAfuCfgAfcAfAfGfaCf aUfuGfgUfgAfL96 21 usCfsaCfcAfaUfgUfcuuG fuCfgAfuGfascsu 92 Hs/M m
AD- 62954.2 UfsusUfcAfaUfgGfGfUfgUf cCfuAfgGfaAfL96 22 usUfscCfuAfgGfaCfaccC faUfuGfaAfasasg 93 Hs/M m
AD- 62959.2 Af sasUfgGfgUfgUfCfCfuAf gGfaAfcCfuUfL96 23 asAf sgGfuUfcCfuAfggaC faCfcCfaUfusgsa 94 Hs/M m
AD- 62964.2 GfsasCfaGfuGfcAfCfAfaUf aUfuUfuCfcAfL96 24 usGfsgAfaAfaUfaUfuguG fcAfcUfgUfcsasg 95 Hs/M m
AD- 62969.2 Af scsUfuUfuCfaAfUfGfgGf uGfuCfcUfaAfL96 25 usUfsaGfgAfcAfcCfcauU fgAfaAfaGfuscsa 96 Hs/M m
AD- 62934.2 Af sasGfuCfaUfcGfAfCfaAf gAfcAfuUfgAfL96 26 usCfsaAfuGfuCfuUfgucG faUfgAfcUfususc 97 Hs/M m
AD- 62940.2 AfsusCfgAfcAfaGfAfCfaU f uGfgUfgAfgAfL96 27 usCfsuCfaCfcAfaUfgucU fuGfuCfgAfusgsa 98 Hs/M m
AD- 62945.2 GfsgsGfaGfaAfaGfGfUfgUf uCfaAfgAfuAfL96 28 usAf suCfuUfgAfaCfaccU fuUfcUfcCfcscsc 99 Hs/M m
AD- 62950.2 CfsusUfuUfcAfaUfGfGfgUf gUfcCfuAfgAfL96 29 usCfsuAfgGfaCfaCfccaU fuGfaAfaAfgsusc 100 Hs/M m
AD- 62955.2 UfscsAfaUfgGfgUfGfUfcCf uAfgGfaAfcAfL96 30 usGfsuUfcCfuAfgGfacaC fcCfaUfuGfasasa 101 Hs/M m
AD- 62960.2 UfsusGfaCfuUfuUfCfAfaUf gGfgUfgUfcAfL96 31 usGfsaCfaCfcCfaUfugaA faAfgUf cAfasasa 102 Hs/M m
AD- 62965.2 AfsasAfgUfcAfuCfGfAfcAf aGfaCfaUfuAfL96 32 usAfsaUfgUfcUfuGfucgA fuGfaCfuUfuscsa 103 Hs/M m
AD- 62970.2 CfsasGfgGfgGfaGfAfAfaGf gUfgUfuCfaAfL96 33 usUfsgAfaCfaCfcUfuucU fcCfcCfcUfgsgsa 104 Hs/M m
AD- 62935.2 CfsasUfuGfgUfgAfGfGfaAf aAfaUfcCfuUfL96 34 asAfsgGfaUfuUfuUfccuC faCfcAfaUfgsusc 105 Hs/M m
AD- 62941.2 AfscsAfuUfgGfuGfAfGf gAf aAfaAfuCfcUfL96 35 asGfsgAfuUfuUfuCfcucA fcCfaAfuGfusesu 106 Hs/M m
AD- 62946.2 AfsgsGfgGfgAfgAfAfAfgGf uGfuUfcAfaAfL96 36 usUfsuGfaAfcAfcCfuuuC fuCfcCfcCfusgsg 107 Hs/M m
AD- 62951.2 Af susGfgUfgGfuAfAfUfuUf gUfgAfuUfuUfL96 37 asAfsaAfuCfaCfaAfauuA fcCfaCfcAfuscsc 108 Hs
AD- 62956.2 GfsasCfuUfgCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 38 usAfsuAfuUfuCf cAfggaU fgCfaAfgUfesesa 109 Hs
AD- 62961.2 GfsgsAfaGfgGfaAfGfGfuAf gAfaGfuCfuUfL96 39 asAfsgAfcUfuCfuAfccuU fcCfcUfuCfcsasc 110 Hs
AD- 62966.2 UfsgsUfcUfuCfuGfUfUfuAf gAfuUfuCfcUfL96 40 asGfsgAfaAfuCfuAfaacA fgAfaGfaCfasgsg 111 Hs
- 65 037115
AD- 62971.2 CfsusUfuGfgCfuGfUfUfuCf cAfaGfaUfcUfL96 41 asGfsaUfcUfuGfgAfaacA fgCfcAfaAfgsgsa 112 Hs
AD- 62936.2 Af sasUfgUfgUfuUfGfGfgCf aAfcGfuCfaUfL96 42 asUfsgAfcGfuUfgCfccaA faCfaCfaUfususu 113 Hs
AD- 62942.2 UfsgsUfgAfcUfgUfGfGfaCf aCfcCfcUfuAfL96 43 usAfsaGfgGfgUfgUfccaC faGfuCfaCfasasa 114 Hs
AD- 62947.2 GfsasUfgGfgGfuGfCfCfaGf cUfaCfuAfuUfL96 44 asAfsuAfgUfaGfcUfggcA fcCfcCfaUfcscsa 115 Hs
AD- 62952.2 GfsasAfaAfuGfuGfUfUfuGf gGfcAfaCfgUfL96 45 asCfsgUfuGfcCfcAfaacA fcAfuUfuUfcsasa 116 Hs
AD- 62957.2 GfsgsCfuGfuUfuCfCfAfaGf aUfcUfgAfcAfL96 46 usGfsuCfaGfaUfcUfuggA faAfcAfgCfcsasa 117 Hs
AD- 62962.2 UfscsCfaAfcAfaAfAfUfaGf cCfaCfcCfcUfL96 47 asGfsgGfgUfgGfcUfauuU fuGfuUfgGfasasa 118 Hs
AD- 62967.2 GfsusCfuUfcUfgUfUfUfaGf aUfuUfcCfuUfL96 48 asAfsgGfaAfaUfcUfaaaC faGfaAfgAfcsasg 119 Hs
AD- 62972.2 UfsgsGfaAfgGfgAfAfGfgUf aGfaAfgUfcUfL96 49 asGfsaCfuUfcUfaCfcuuC fcCfuUfcCfascsa 120 Hs
AD- 62937.2 UfscsCfuUfuGfgCfUfGfuUf uCfcAfaGfaUfL96 50 asUfscUfuGfgAfaAfcagC fcAfaAfgGfasusu 121 Hs
AD- 62943.2 CfsasUfcUfcUfcAfGfCfuGf gGfaUfgAfuAfL96 51 usAfsuCfaUfcCfcAfgcuG faGfaGfaUfgsgsg 122 Hs
AD- 62948.2 GfsgsGfgUfgCfcAfGfCfuAf cUfaUfuGfaUfL96 52 asUfscAfaUfaGfuAfgcuG fgCfaCfcCfcsasu 123 Hs
AD- 62953.2 AfsusGfuGfuUfuGfGfGfcAf aCfgUfcAfuAfL96 53 usAfsuGfaCfgUfuGfcccA faAfcAfcAfususu 124 Hs
AD- 62958.2 CfsusGfuUfuAfgAfUfUfuCf cUfuAfaGfaAfL96 54 usUfscUfuAfaGfgAfaauC fuAfaAfcAfgsasa 125 Hs
AD- 62963.2 AfsgsAfaAfgAfaAfUfGfgAf cUfuGfcAfuAfL96 55 usAfsuGfeAfaGfuCfcauU fuCfuUfuCfusasg 126 Hs
AD- 62968.2 GfscsAfuCfcUfgGfAfAfaUf aUfaUfuAfaAfL96 56 usUfsuAfaUfaUfaUfuucC faGfgAfuGfcsasa 127 Hs
AD- 62973.2 CfscsUfgUfcAfgAfCfCfaUf gGfgAfaCfuAfL96 57 usAfsgUfuCfcCfaUfgguC fuGfaCfaGfgscsu 128 Hs
AD- 62938.2 AfsasAfcAfuGfgUfGfUfgGf aUfgGfgAfuAfL96 58 usAfsuCfcCfaUfcCfacaC fcAfuGfuUfusasa 129 Hs
AD- 62974.2 CfsusCfaGfgAfuGfAfAfaAf aUfuUfuGfaAfL96 59 usUfscAfaAfaUfuUfuucA fuCfcUfgAfgsusu 130 Hs
AD- 62978.2 CfsasGfcAfuGfuAfUfUfaCf uUfgAfcAfaAfL96 60 usUfsuGfuCfaAfgUfaauA feAfuGfeUfgsasa 131 Hs
AD- 62982.2 UfsasUfgAfaCfaAfCfAfuGf cUfaAfaUfcAfL96 61 usGfsaUfuUfaGfcAfuguU fgUfuCfaUfasasu 132 Hs
- 66 037115
AD- 62986.2 AfsusAfuAfuCfcAfAfAfuGf uUfuUfaGfgAfL96 62 usCfscUfaAfaAfcAfuuuG fgAfuAfuAfususc 133 Hs
AD- 62990.2 CfscsAfgAfuGfgAfAfGfcUf gUfaUfcCfaAfL96 63 usUfsgGfaUfaCfaGfcuuC fcAfuCfuGfgsasa 134 Hs
AD- 62994.2 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 64 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 135 Hs
AD- 62998.2 CfscsCfcGfgCfuAfAfUfuUf gUfaUfcAfaUfL96 65 asUfsuGfaUfaCfaAfauuA fgCfcGfgGfgsgsa 136 Hs
AD- 63002.2 UfsusAfaAfcAfuGfGfCfuUf gAfaUfgGfgAfL96 66 usCfscCfaUfuCfaAfgccA fuGfuUfuAfascsa 137 Hs
AD- 62975.2 Af sasUfgUfgUfuUfAfGfaCf aAfcGfuCfaUfL96 67 asUfsgAfcGfuUfgUfcuaA faCfaCfaUfususu 138 Mm
AD- 62979.2 AfscsUfaAfaGfgAfAfGfaAf uUfcCfgGfuUfL96 68 asAf scCfgGfaAfuUfcuuC fcUfuUfaGfusasu 139 Mm
AD- 62983.2 UfsasUfaUfcCfaAfAfUfgUf uUfuAfgGfaUfL96 69 asUfscCfuAfaAfaCfauuU fgGfaUfaUfasusu 140 Mm
AD- 62987.2 GfsusGfcGfgAfaAfGfGf cAf cUfgAfuGfuUfL96 70 asAfscAfuCfaGfuGfccuU fuCfcGfcAfcsasc 141 Mm
AD- 62991.2 UfsasAfaAfcAfgUfGfGfuUf cUfuAfaAfuUfL96 71 asAfsuUfuAfaGfaAfccaC fuGfuUfuUfasasa 142 Mm
AD- 62995.2 AfsusGfaAfaAfaUfUfUfuGf aAfaCfcAfgUfL96 72 asCfsuGfgUfuUfcAfaaaU fuUfuUfcAfuscsc 143 Mm
AD- 62999.2 AfsasCfaAfaAfuAfGfCfaAf uCfcCfuUfuUfL96 73 asAfsaAfgGfgAfuUfgcuA fuUfuUfgUfusgsg 144 Mm
AD- 63003.2 CfsusGfaAfaCfaGfAfUfcUf gUfcGfaCfuUfL96 74 asAfsgUfcGfaCfaGfaucU fgUfuUfcAfgscsa 145 Mm
AD- 62976.2 UfsusGfuUfgCfaAfAfGfgGf cAfuUfuUfgAfL96 75 usCfsaAfaAfuGfcCfcuuU fgCfaAfcAfasusu 146 Mm
AD- 62980.2 CfsusCfaUfuGfuUfUfAfuUf aAf cCfuGfuAfL9 6 76 usAfscAfgGfuUfaAfuaaA fcAfaUfgAfgsasu 147 Mm
AD- 62984.2 CfsasAfcAfaAfaUfAfGf cAf aUfcCfcUfuUfL96 77 asAfsaGfgGfaUfuGfcuaU fuUfuGfuUfgsgsa 148 Mm
AD- 62992.2 CfsasUfuGfuUfuAfUfUfaAf cCfuGfuAfuUfL96 78 asAfsuAfcAfgGfuUfaauA faAfcAfaUfgsasg 149 Mm
AD- 62996.2 UfsasUfcAfgCfuGfGfGf aAf gAfuAfuCfaAfL96 79 usUfsgAfuAfuCfuUfcccA fgCfuGfaUfasgsa 150 Mm
AD- 63000.2 UfsgsUfcCfuAfgGfAfAfcCf uUfuUfaGfaAfL96 80 usUfscUfaAfaAfgGfuucC fuAfgGfaCfascsc 151 Mm
AD- 63004.2 UfscsCfaAfcAfaAfAfUfaGf cAfaUfcCfcUfL96 81 asGfsgGfaUfuGfcUfauuU fuGfuUfgGfasasa 152 Mm
AD- 62977.2 GfsgsUfgUfgCfgGfAfAfaGf gCfaCfuGfaUfL96 82 asUfscAfgUfgCfcUfuucC fgCfaCfaCfcscsc 153 Mm
- 67 037115
AD- 62981.2 UfsusGfaAfaCfcAfGfUfaCf uUfuAfuCfaUfL96 83 asUfsgAfuAfaAfgUfacuG fgUfuUfcAfasasa 154 Mm
AD- 62985.2 UfsasCfuUfcCfaAfAfGfuCf uAfuAfuAfuAfL96 84 usAfsuAfuAfuAfgAfcuuU fgGfaAfgUfascsu 155 Mm
AD- 62989.2 UfscsCfuAfgGfaAfCfCfuUf uUfaGfaAfaUfL96 85 asUfsuUfcUfaAfaAfgguU fcCfuAfgGfascsa 156 Mm
AD- 62993.2 GfsusCfcUfgAfgGfAfAfaAf uUfuUfgGfaAfL96 86 usUfscCfaAfaAfuUfuucC fuCfaGfgAfgsasa 157 Mm
AD- 62997.2 GfscsUfcCfgGfaAfUfGfuUf gCfuGfaAfaUfL96 87 asUfsuUfcAfgCfaAfcauU fcCfgGfaGfcsasu 158 Mm
AD- 63001.2 GfsusGfuUfuGfuGfGfGfgAf gAfcCfaAfuAfL96 88 usAfsuUfgGfuCfuCfcccA fcAfaAfcAfcsasg 159 Mm
AD- 62933.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 160 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 277
AD- 65630.1 Y44gsasAfuGfuGfaAfAfGfu CfaUfcGfaCfaAfL96 161 PusUfsgUfcGfaUfgAfcuu UfcAfcAfuUfcsusg 278
AD- 65636.1 gsasauguGfaAfAfGfucauCf gacaaL96 162 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 279
AD- 65642.1 gsasauguGfaAfAfGfucaucg acaaL96 163 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 280
AD- 65647.1 gsasauguGfaaAfGfucaucga caaL96 164 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 281
AD- 65652.1 gsasauguGfaaaGfucaucGfa caaL96 165 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 282
AD- 65657.1 gsasaugugaaaGfucaucGfac aaL96 166 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 283
AD- 65662.1 gsasauguGfaaaGfucaucgac aaL96 167 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 284
AD- 65625.1 Af susGfuGfaAfAfGfuCfaUf cGfaCfaAfL96 168 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfususc 285
AD- 65631.1 asusguGfaAfAfGfucaucgac aaL96 169 usUfsgucGfaugacuuUfcA fcaususc 286
AD- 65637.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 170 usUfsgucGfaUfgAfcuuUf cAfcauucsusg 287
AD- 65643.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 171 usUfsgucGfaUfGfacuuUf cAfcauucsusg 288
AD- 65648.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 172 usUfsgucGfaugacuuUfcA fcauucsusg 289
AD- 65653.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 173 usUfsgucGfaugacuuUfca cauucsusg 290
AD- 65658.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 174 usUfsgucgaugacuuUfcac auucsusg 291
- 68 037115
AD- 65663.1 gsasauguGfaAfAfGfucaucg acaaL96 175 usUfsgucGfaUfgAfcuuUf cAfcauucsusg 292
AD- 65626.1 gsasauguGfaAfAfGfucaucg acaaL96 176 usUfsgucGfaUfGfacuuUf cAfcauucsusg 293
AD- 65638.1 gsasauguGfaaAfGfucaucga caaL96 177 usUfsgucGfaUfgAfcuuUf cAfcauucsusg 294
AD- 65644.1 gsasauguGfaaAfGfucaucga caaL96 178 usUfsgucGfaUfGfacuuUf cAfcauucsusg 295
AD- 65649.1 gsasauguGfaaAfGfucaucga caaL96 179 usUfsgucGfaugacuuUf cA fcauucsusg 296
AD- 65654.1 gsasaugugaaagucau(Cgn)g acaaL96 180 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 297
AD- 65659.1 gsasaugdTgaaagucau(Cgn) gacaaL96 181 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 298
AD- 65627.1 gsasaudGugaaadGucau(Cgn )gacaaL96 182 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 299
AD- 65633.1 gsasaugdTgaaadGucau(Cgn )gacaaL96 183 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 300
AD- 65639.1 gsasaugudGaaadGucau(Cgn )gacaaL96 184 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 301
AD- 65645.1 gsasaugugaaadGucaucdGac aaL96 185 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 302
AD- 65650.1 gsasaugugaaadGucaucdTac aaL96 186 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 303
AD- 65655.1 gsasaugugaaadGucaucY34a caaL96 187 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 304
AD- 65660.1 gsasaugugaaadGucadTcdTa caaL96 188 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 305
AD- 65665.1 gsasaugugaaadGucaucdGad CaaL96 189 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 306
AD- 65628.1 gsasaugugaaadGucaucdTad CaaL96 190 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 307
AD- 65634.1 gsasaugugaaadGucaucY34a dCaaL96 191 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuU fcAfcAfuUfcsusg 308
AD- 65646.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 192 usdTsgucgaugdAcuudTca cauucsusg 309
AD- 65656.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 193 usUsgucgaugacuudTcaca uucsusg 310
AD- 65661.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 194 usdTsgucdGaugacuudTca cauucsusg 311
AD- 65666.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 195 usUsgucdGaugacuudTcac auucsusg 312
- 69 037115
AD- 65629.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 196 usdTsgucgaugacuudTcdA cauucsusg 313
AD- 65635.1 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCf aUfcGfaCfaAfL96 197 usdTsgucdGaugacuudTcd Acauucsusg 314
AD- 65641.1 gsasaugugaaadGucau(Cgn) gacaaL96 198 usdTsgucgaugdAcuudTca cauucsusg 315
AD- 62994.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 199 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 316
AD- 65595.1 gsascuuuCfaUfCfCfuggaAf auauaL96 200 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 317
AD- 65600.1 gsascuuuCfaUfCfCfuggaaa uauaL96 201 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 318
AD- 65610.1 gsascuuuCfaucCfuggaaAfu auaL96 202 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 319
AD- 65615.1 gsascuuucaucCfuggaaAfua uaL96 203 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 320
AD- 65620.1 gsascuuuCfaucCfuggaaaua uaL96 204 usAfsuAfuUfuCf cAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 321
AD- 65584.1 CfsusUfuCfaUfCfCfuGfgAf aAfuAfuAfL96 205 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgsusc 322
AD- 65590.1 csusuuCfaUfCfCfuggaaaua uaL96 206 usAfsuauUfuccaggaUfgA faagsusc 323
AD- 65596.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 207 usAfsuauUfuCfcAfggaUf gAfaagucscsa 324
AD- 65601.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 208 usAfsuauUfuCfCfaggaUf gAfaagucscsa 325
AD- 65606.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 209 usAfsuauUfuccaggaUfgA faagucscsa 326
AD- 65611.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 210 usAfsuauUfuccaggaUfga aagucscsa 327
AD- 65616.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 211 usAfsuauuuccaggaUfgaa agucscsa 328
AD- 65621.1 gsascuuuCfaUfCfCfuggaaa uauaL96 212 usAfsuauUfuCfcAfggaUf gAfaagucscsa 329
AD- 65585.1 gsascuuuCfaUfCfCfuggaaa uauaL96 213 usAfsuauUfuCfCfaggaUf gAfaagucscsa 330
AD- 65591.1 gsascuuuCfaUfCfCfuggaaa uauaL96 214 usAfsuauUfuccaggaUfgA faagucscsa 331
AD- 65597.1 gsascuuuCfauCfCfuggaaau auaL96 215 usAfsuauUfuCfcAfggaUf gAfaagucscsa 332
AD- 65602.1 gsascuuuCfauCfCfuggaaau auaL96 216 usAfsuauUfuCfCfaggaUf gAfaagucscsa 333
- 70 037115
AD- 65607.1 gsascuuuCfauCfCfuggaaau auaL96 217 usAfsuauUfuccaggaUfgA faagucscsa 334
AD- 65612.1 gsascuuucauccuggaa(Agn) uauaL96 218 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 335
AD- 65622.1 gsascuuucaucdCuggaa (Agn )uauaL96 219 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 336
AD- 65586.1 gsascudTucaucdCuggaa(Ag n)uauaL96 220 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 337
AD- 65592.1 gsascuudTcaucdCuggaa(Ag n)uauaL96 221 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 338
AD- 65598.1 gsascuuudCaucdCuggaa(Ag n)uauaL96 222 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 339
AD- 65603.1 gsascuuucaucdCuggaadAua uaL96 223 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 340
AD65608.1 gsascuuucaucdCuggaadTua uaL96 224 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 341
AD- 65613.1 gsascuuucaucdCuggaaY34u auaL96 225 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 342
AD- 65618.1 gsascuuucaucdCuggdAadTu auaL96 226 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 343
AD- 65623.1 gsascuuucaucdCuggaadTud AuaL96 227 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 344
AD- 65587.1 gsascuuucaucdCuggaa (Agn )udAuaL96 228 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 345
AD- 65593.1 gsascuudTcaucdCuggaadAu dAuaL96 229 usAfsuAfuUfuCfcAfggaU fgAfaAfgUfcscsa 346
AD- 65599.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 230 usdAsuau.uuccdAggadTga aagucscsa 347
AD- 65604.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 231 usdAsuauuuccaggadTgaa agucscsa 348
AD- 65609.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 232 usAsuauuuccaggadTgaaa gucscsa 349
AD- 65614.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 233 usdAsuaudTuccaggadTga aagucscsa 350
AD- 65619.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 234 usAsuaudTuccaggadTgaa agucscsa 351
AD- 65624.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 235 usdAsuauuuccaggadTgdA aagucscsa 352
AD65588.1 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGf gAfaAfuAfuAfL96 236 usdAsuaudTuccaggadTgd Aaagucscsa 353
AD- 65594.1 gsascuuucaucdCuggaa(Agn )uauaL96 237 usdAsuauuuccdAggadTga aagucscsa 354
- 71 037115
AD68309.1 asgsaaagGfuGfUfUfcaagau gucaL96 238 usGfsacaUfcUfUfgaacAf cCfuuucuscsc 355
AD68303.1 csasuccuGfgAfAfAfuauauu aacuL96 239 asGfsuuaAfuAfUfauuuCf cAfggaugsasa 356
AD65626.5 gsasauguGfaAfAfGfucaucg acaaL96 240 usUfsgucGfaUfGfacuuUf cAfcauucsusg 357
AD68295.1 asgsugcaCfaAfUfAfuuuucc cauaL96 241 usAfsuggGfaAfAfauauUf gUfgcacusgsu 358
AD68273.1 gsasaaguCfaUfCfGfacaaga cauuL96 242 asAfsuguCfuUfGfucgaUf gAfcuuucsasc 359
AD68297.1 asasugugAfaAfGfUfcaucga caaaL96 243 usUfsuguCfgAfUfgacuUf uCfacauuscsu 360
AD68287.1 csusggaaAfuAfUfAfuuaacu guuaL96 244 usAfsacaGfuUfAfauauAf uUfuccagsgsa 361
AD- 68300.1 asusuuucCfcAfUfCfuguauu auuuL96 245 asAf sauaAfuAfCfagauGf gGfaaaausasu 362
AD- 68306.1 usgsucguUfcUfUfUfuccaac aaaaL96 246 usUfsuugUfuGfGfaaaaGf aAfcgacascsc 363
AD68292.1 asusccugGfaAfAfUfauauua acuaL96 247 usAfsguuAfaUfAfuauuUf cCfaggausgsa 364
AD68298.1 gscsauuuUfgAfGfAfggugau gauaL96 248 usAfsucaUfcAfCfcucuCf aAfaaugcscsc 365
AD68277.1 csasggggGfaGfAfAfaggugu ucaaL96 249 usUfsgaaCfaCfCfuuucUf cCfcccugsgsa 366
AD68289.1 gsgsaaauAfuAfUfUfaacugu uaaaL96 250 usUfsuaaCfaGfUfuaauAf uAfuuuccsasg 367
AD68272.1 csasuuggUfgAfGfGfaaaaau ccuuL96 251 asAfsggaUfuUfUfuccuCf aCfcaaugsusc 368
AD- 68282.1 gsgsgagaAfaGfGfUfguucaa gauaL96 252 usAfsucuUfgAfAfcaccUf uUfcucccscsc 369
AD68285.1 gsgscauuUfuGfAfGfagguga ugauL96 253 asUfscauCfaCfCfucucAf aAfaugccscsu 370
AD68290.1 usascaaaGfgGfUfGfucguuc uuuuL96 254 asAfsaagAfaCfGfасаcCf cUfuuguasusu 371
AD68296.1 usgsggauCfuUfGfGfugucga aucaL96 255 usGfsauuCfgAfCfaccaAf gAfucccasusu 372
AD- 68288.1 csusgacaGfuGfCfAfcaauau uuuaL96 256 usAfsaaaUfaUfUfgugcAf cUfgucagsasu 373
AD68299.1 csasgugcAfcAfAfUfauuuuc ccauL96 257 asUfsgggAfaAfAfuauuGf uGfcacugsusc 374
AD68275.1 ascsuuuuCfaAfUfGfgguguc cuaaL96 258 usUfsaggAfcAfCfccauUf gAfaaaguscsa 375
- 72 037115
AD68274.1 ascsauugGfuGfAfGfgaaaaa uccuL96 259 asGfsgauUfuUfUfccucAf cCfaauguscsu 376
AD68294.1 ususgcuuUfuGfAfCfuuuuca augaL96 260 usCfsauuGfaAfAfagucAf aAfagcaasusg 377
AD68302.1 csasuuuuGfaGfAfGfgugaug augaL96 261 usCfsaucAfuCfAfccucUf cAfaaaugscsc 378
AD68279.1 ususgacuUfuUfCfAfaugggu gucaL96 262 usGfsacaCfcCfAfuugaAf aAfgucaasasa 379
AD68304.1 csgsacuuCfuGfUfUfuuagga cagaL96 263 usCfsuguCfcUfAfaaacAf gAfagucgsasc 380
AD- 68286.1 csuscugaGfuGfGfGfugccag aauaL96 264 usAfsuucUfgGfCfacccAf cUfcagagscsc 381
AD68291.1 gsgsgugcCfaGfAfAfugugaa aguaL96 265 usAfscuuUfcAfCfauucUf gGfcacccsasc 382
AD68283.1 uscsaaugGfgUfGfUfccuagg aacaL96 266 usGfsuucCfuAfGfgacaCf cCfauugasasa 383
AD- 68280.1 asasagucAfuCfGfAfcaagac auuaL96 267 usAf saugUfcUfUfgucgAf uGfacuuuscsa 384
AD68293.1 asusuuugAfgAfGfGfugauga ugcaL96 268 usGfscauCfaUfCfaccuCf uCfaaaausgsc 385
AD68276.1 asuscgacAfaGfAfCfauuggu gagaL96 269 usCfsucaCfcAfAfugucUf uGfucgausgsa 386
AD- 68308.1 gsgsugccAfgAfAfUfgugaaa gucaL96 270 usGfsacuUfuCfAfcauuCf uGfgcaccscsa 387
AD68278.1 gsascaguGfcAfCfAfauauuu uccaL96 271 usGfsgaaAfaUfAfuuguGf cAfcugucsasg 388
AD68307.1 ascsaaagAfgAfGfAfcugugc agaaL96 272 usUfscugCfaCfAfguguCf uCfuuuguscsa 389
AD68284.1 ususuucaAfuGfGfGfuguccu aggaL96 273 usCfscuaGfgAfCfacccAf uUfgaaaasgsu 390
AD68301.1 cscsguuuCfcAfAfGfaucuga caguL96 274 asCfsuguCfaGfAfucuuGf gAfaacggscsc 391
AD68281.1 asgsggggAfgAfAfAfgguguu caaaL96 275 usUfsugaAfcAfCfcuuuCf uCfccccusgsg 392
AD68305.1 asgsucauCfgAfGfAfagacau ugguL96 276 asCfscaaUfgUfCfuuguCf gAfugacususu 393
- 73 037115
Таблица 2а
Немодифицированные последовательности HAO1 (человека и человека/мыши)
Название дуплекса SEQ ID NO: Последователь- ность смысловой нити SEQ ID NO: Последовательность антисмысловой нити Положение в NM_017545.2
AD-62933 394 GAAU GU GAAAGU СAU С GACAA 443 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD-62939 395 UUUUCAAUGGGUGUCC UAGGA 444 U C CUAGGACAC C CAUU GA AAAGU 1302-1324
AD-62944 396 GAAAGU СAU С GACAAG ACAUU 445 AAU GU CUU GU C GAU GACU UUCAC 1078-1100
AD-62949 397 U CAU С GACAAGACAUU GGUGA 446 U CAC CAAU GU CUU GU C GA UGACU 1083-1105
AD-62954 398 UUUCAAUGGGUGUCCU AGGAA 447 UUCCUAGGACACCCAUUG AAAAG 1303-1325
AD-62959 399 AAUGGGUGUCCUAGGA ACCUU 448 AAGGUU C CUAG GACAC С C AUUGA 1307-1329
AD-62964 400 GACAGUGCACAAUAUU UUCCA 449 UGGAAAAUAUUGUGCACU GUCAG 1134- 1156_C21A
AD-62 969 401 ACUUUUCAAUGGGUGU CCUAA 450 UUAGGACAC C CAUU GAAA AGUCA 1300- 1322_G21A
AD-62934 402 AAGU СAU С GACAAGAC AUUGA 451 U CAAU GU CUU GU C GAU GA CUUUC 1080- 1102_G21A
AD-62940 403 AUСGACAAGACAUUGG U GAGA 452 U CU CAC CAAU GU CUU GU C GAU GA 1085- 1107_G21A
AD-62945 404 GGGAGAAAGGUGUUCA AGAUA 453 UAUCUUGAACACCUUUCU CCCCC 996- 1018_G21A
AD-62950 405 CUUUUCAAUGGGUGUC CUAGA 454 U CUAGGACAC C CAUU GAA AAGUC 1301- 1323_G21A
AD-62 955 406 UCAAUGGGUGUCCUAG GAACA 455 U GUU C CUAGGACAC C CAU UGAAA 1305- 1327_C21A
AD-62 960 407 UUGACUUUUCAAUGGG UGUCA 456 U GACAC C CAUU GAAAAGU CAAAA 1297- 1319_C21A
AD-62 9 65 408 AAAGU CAU С GACAAGA CAUUA 457 UAAU GU CUU GU C GAU GAC UUUCA 1079- 1101_G21A
AD-62970 409 CAGGGGGAGAAAGGUG UUCAA 458 UUGAACACCUUUCUCCCC CUGGA 992-1014
AD-62935 410 CAUUGGUGAGGAAAAA UCCUU 459 AAGGAUUUUUCCUCACCA AUGUC 1095-1117
AD-62941 411 ACAUUGGUGAGGAAAA AU C CU 460 AGGAUUUUUCCUCACCAA UGUCU 1094-1116
AD-62946 412 AGGGGGAGAAAGGUGU U C AAA 461 UUUGAACACCUUUCUCCC CCUGG 993- 1015_G21A
AD-62974 413 CUCAGGAUGAAAAAUU UUGAA 462 UU CAAAAUUUUU CAU C CU GAGUU 563-585
AD-62978 414 CAGCAU GUAUUACUU G ACAAA 463 UUU GU CAAGUAAUACAU G CUGAA 1173-1195
- 74 037115
AD-62982 415 UAUGAACAACAUGCUA AAUCA 464 UGAUUUAGCAUGUUGUUC AUAAU 53-75
AD-62 9 8 6 416 AUAUAU C CAAAU GUUU UAGGA 465 U C CUAAAACAUUU GGAUA UAUUC 1679-1701
AD-62990 417 CCAGAUGGAAGCUGUA UCCAA 466 UUGGAUACAGCUUCCAUC UGGAA 156-178
AD-62994 418 GACUUUCAUCCUGGAA AUAUA 467 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD-62998 419 CCCCGGCUAAUUUGUA UCAAU 468 AUU GAUACAAAUUAGC C G GGGGA 29-51
AD-63002 420 UUAAACAUGGCUUGAA UGGGA 469 U С C CAUU CAAGC CAU GUU UAACA 765-787
AD-62975 421 AAU GU GUUUAGACAAC GUCAU 470 AU GAC GUU GU CUAAACAC AUUUU 1388-1410
AD-62979 422 ACUAAAGGAAGAAUUC CGGUU 471 AACCGGAAUUCUUCCUUU AGUAU 1027-1049
AD-62983 423 UAUAU C CAAAU GUUUU AGGAU 472 AU C CUAAAACAUUU GGAU AUAUU 1680-1702
AD-62987 424 GUGCGGAAAGGCACUG AUGUU 473 AACAU CAGU GC CUUU С C G CACAC 902-924
AD-62991 425 UAAAACAGUGGUUCUU AAAUU 474 AAUUUAAGAACCACUGUU UUAAA 1521-1543
AD-62995 426 AU GAAAAAUUUU GAAA CCAGU 475 ACUGGUUUCAAAAUUUUU CAUCC 569-591
AD-62999 427 AACAAAAUAGCAAUСC CUUUU 476 AAAAGGGAUUGCUAUUUU GUUGG 1264-1286
AD-63003 428 CU GAAACAGAU CU GU C GACUU 477 AAGU C GACAGAU CU GUUU CAGCA 195-217
AD-62 97 6 429 UUGUUGCAAAGGGCAU UUUGA 478 UCAAAAUGCCCUUUGCAA CAAUU 720-742
AD-62980 430 CUCAUUGUUUAUUAAC CUGUA 479 UACAGGUUAAUAAACAAU GAGAU 1483-1505
AD-62984 431 CAACAAAAUAGCAAUC CCUUU 480 AAAGGGAUUGCUAUUUUG UUGGA 1263-1285
AD-62992 432 CAUUGUUUAUUAACCU GUAUU 481 AAUACAGGUUAAUAAACA AU GAG 1485-1507
AD-62 9 9 6 433 UAUCAGCUGGGAAGAU AUCAA 482 UU GAUAU CUU С C CAGCU G AUAGA 670-692
AD-63000 434 UGUCCUAGGAACCUUU UAGAA 483 UUCUAAAAGGUUCCUAGG AC ACC 1313-1335
AD-63004 435 UСCAACAAAAUAGCAA UCCCU 484 AGGGAUUGCUAUUUUGUU GGAAA 1261-1283
- 75 037115
AD-62977 436 GGUGUGCGGAAAGGCA CUGAU 485 AUCAGUGCCUUUCCGCAC АСССС 899-921
UU GAAAC CAGUACUUU AU GAUAAAGUACU GGUUU
AD-62981 437 AUCAU 486 САААА 579-601
UACUU С CAAAGU CUAU UAUAUAUAGACUUUGGAA
AD-62985 438 AUAUA 487 GUACU 75-97_G21A
UCCUAGGAACCUUUUA AUUUCUAAAAGGUUСCUA 1315-
AD-62989 439 GAAAU 488 GGACA 1337_G21U
CUСCUGAGGAAAAUUU UUСCAAAAUUUUСCUCAG
AD-62993 440 UGGAA 489 GAGAA 603-625_G21A
GCUCCGGAAUGUUGCU AUUUCAGCAACAUUCCGG
AD-62997 441 GAAAU 490 AGCAU 181-203_C21U
GUGUUUGUGGGGAGAC UAUUGGUCUССССАСААА
AD-63001 442 CAAUA 491 CACAG 953-975_C21A
Таблица 2b
Немодифицированные последовательности HAO1 (мыши)
Название дуплекса SEQ ID NO: Последовательно сть смысловой нити SEQ ID NO: Последовательность антисмысловой нити Положение в NM_010403. 2
AD-62951 492 AUGGUGGUAAUUUGUG AUUUU 514 AAAAU CACAAAUUAC САС CAUCC 1642-1664
AD-62 956 493 GACUUGCAUCCUGGAA AUAUA 515 UAUAUUUCCAGGAUGCAA GUCCA 1338-1360
AD-62961 494 GGAAGGGAAGGUAGAA GUCUU 516 AAGACUU CUAC CUU С C CU UCCAC 864-886
AD-62 9 66 495 UGUCUUCUGUUUAGAU UUCCU 517 AGGAAAUCUAAACAGAAG ACAGG 1506-1528
AD-62971 496 CUUUGGCUGUUUCCAA GAUCU 518 AGAUCUUGGAAACAGCCA AAGGA 1109-1131
AD-62 9 3 6 497 AAUGUGUUUGGGCAAC GUCAU 519 AU GAC GUU GC С CAAACAC AUUUU 1385-1407
AD-62942 498 U GU GACU GU G GACAC C CCUUA 520 UAAGGGGUGUCCACAGUC ACAAA 486-508
AD-62947 499 GAUGGGGUGCCAGCUA CUAUU 521 AAUAGUAGCUGGCACCCC AU CCA 814-836
AD-62952 500 GAAAAUGUGUUUGGGC AACGU 522 AC GUU GC C CAAACACAUU UUCAA 1382-1404
AD-62957 501 GGCUGUUUCCAAGAUC UGACA 523 UGUCAGAUCUUGGAAACA GCCAA 1113-1135
AD-62962 502 UССAACAAAAUAGСCA 524 AGGGGUGGCUAUUUUGUU 1258-1280
- 76 037115
CCCCU GGAAA
AD-62 9 67 503 GU CUU CU GUUUAGAUU UCCUU 525 AAGGAAAUCUAAACAGAA GACAG 1507-1529
AD-62972 504 UGGAAGGGAAGGUAGA AGUCU 526 AGACUU CUAC CUUCCCUU С САСА 863-885
AD-62937 505 UCCUUUGGCUGUUUCC AAGAU 527 AUCUUGGAAACAGCCAAA GGAUU 1107-1129
AD-62943 506 CAUCUCUCAGCUGGGA UGAUA 528 U AU С AU С С С AG CU GAGAG AUGGG 662-684
AD-62948 507 GGGGUGCCAGCUACUA UUGAU 529 AUCAAUAGUAGCUGGCAC CCCAU 817-839
AD-62953 508 AUGUGUUUGGGCAACG UCAUA 530 UAU GACGUUGCC САААСА CAUUU 1386- 1408_С21А
AD-62958 509 CUGUUUAGAUUUCCUU AAGAA 531 UUCUUAAGGAAAUCUAAA CAGAA 1512- 1534_С21А
AD-62 9 63 510 AGAAAGAAAU G GACUU GCAUA 532 UAUGCAAGUСCAUUUCUU UCUAG 1327- 1349_С21А
AD-62 9 68 511 GCAUCCUGGAAAUAUA UUAAA 533 UUUAAUAUAUUU С CAGGA UGCAA 1343- 1365_С21А
AD-62973 512 CCUGUCAGACCAUGGG AACUA 534 UAGUU С С CAU GGU CU GAC AGGCU 308- 330_G21A
AD-62938 513 AAACAUGGUGUGGAUG GGAUA 535 U AU С С С AU С С АС АС С AU G UUUAA 763- 785_С21А
Таблица 2с
Дополнительные немодифицированные последовательности HAO1
Название дуплекса SEQ ID NO: Последовательность смысловой нити SEQ ID NO: Последовательность антисмысловой нити Положение в NM_017545.2
AD- 62933.2 394 GAAU GU GAAAGU СAU С GA САА 443 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 62939.2 395 UUUUCAAUGGGUGUCCUA GGA 444 U C CUAGGACAC C CAUU GA AAAGU 1302-1324
AD- 62944.2 396 GAAAGU CAU С GACAAGAC AUU 445 AAU GU CUU GU C GAU GACU UUCAC 1078-1100
AD- 62949.2 397 U CAU С GACAAGACAUU G G UGA 446 U CAC CAAU GU CUU GU C GA UGACU 1083-1105
AD- 62954.2 398 UUUCAAUGGGUGUCCUAG GAA 447 UU C CUAGGACAC C CAUU G AAAAG 1303-1325
AD- 62959.2 399 AAUGGGUGUCCUAGGAAC CUU 448 AAGGUUCCUAGGACACCC AUU GA 1307-1329
AD- 400 GACAGUGCACAAUAUUUU 449 UGGAAAAUAUUGUGCACU 1134-
- 77 037115
62964.2 CCA GUCAG 1156_C21A
AD- 62969.2 401 ACUUUUCAAUGGGUGUCC UAA 450 UUAGGACAC C CAUU GAAA AGUCA 1300- 1322_G21A
AD- 62934.2 402 AAGU CAU C GACAAGACAU UGA 451 U CAAU GU CUU GU C GAU GA CUUUC 1080- 1102_G21A
AD- 62940.2 403 AU C GACAAGACAUU G GU G AGA 452 U CU CAC CAAU GU CUU GU C GAU GA 1085- 1107_G21A
AD- 62945.2 404 GGGAGAAAGGUGUUCAAG AUA 453 UAUCUUGAACACCUUUCU CCCCC 996- 1018_G21A
AD- 62950.2 405 CUUUUCAAUGGGUGUCCU AGA 454 U CUAGGACAC C CAUU GAA AAGUC 1301- 1323_G21A
AD- 62955.2 406 UCAAUGGGUGUCCUAGGA АСА 455 U GUU C CUAGGACAC C CAU UGAAA 1305- 1327_C21A
AD- 62960.2 407 UUGACUUUUCAAUGGGUG UCA 456 U GACAC C CAUU GAAAAGU CAAAA 1297- 1319_C21A
AD- 62965.2 408 AAAGU CAU C GACAAGACA UUA 457 UAAU GU CUU GU C GAU GAC UUUCA 1079- 1101_G21A
AD- 62970.2 409 CAGGGGGAGAAAGGUGUU CAA 458 UUGAACACCUUUCUCCCC CUGGA 992-1014
AD- 62935.2 410 CAUUGGUGAGGAAAAAUC CUU 459 AAGGAUUUUUCCUCACCA AUGUC 1095-1117
AD- 62941.2 411 ACAUUGGUGAGGAAAAAU CCU 460 AGGAUUUUUCCUCACCAA UGUCU 1094-1116
AD- 62946.2 412 AGGGGGAGAAAGGUGUUC AAA 461 UUUGAACACCUUUCUCCC CCUGG 993- 1015_G21A
AD- 62974.2 413 CU CAGGAU GAAAAAUUUU GAA 462 UU CAAAAUUUUU CAU CCU GAGUU 563-585
AD- 62978.2 414 CAGCAU GUAUUACUU GAC AAA 463 UUU GU CAAGUAAUACAU G CUGAA 1173-1195
AD- 62982.2 415 UAUGAACAACAUGCUAAA UCA 464 UGAUUUAGCAUGUUGUUC AUAAU 53-75
AD- 62986.2 416 AUAUAU C CAAAU GUUUUA GGA 465 U C CUAAAACAUUU GGAUA UAUUC 1679-1701
AD- 62990.2 417 CCAGAUGGAAGCUGUAUC CAA 466 UUGGAUACAGCUUCCAUC UGGAA 156-178
AD- 62994.2 418 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 467 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 62998.2 419 CCCCGGCUAAUUUGUAUC AAU 468 AUU GAUACAAAUUAGC C G GGGGA 29-51
AD- 63002.2 420 UUAAACAUGGCUUGAAUG GGA 469 U С C CAUU CAAGC CAU GUU UAACA 765-787
AD- 421 AAU GU GUUUAGACAAC GU 470 AU GAC GUU GU CUAAACAC 1388-1410
- 78 037115
62975.2 CAU AUUUU
AD- 62979.2 422 ACUAAAGGAAGAAUUСCG GUU 471 AACCGGAAUUCUUCCUUU AGUAU 1027-1049
AD- 62983.2 423 UAUAU C CAAAU GUUUUAG GAU 472 AU C CUAAAACAUUU GGAU AUAUU 1680-1702
AD- 62987.2 424 GUGCGGAAAGGCACUGAU GUU 473 AACAU CAGU GC CUUU С C G CACAC 902-924
AD- 62991.2 425 UAAAACAGU GGUU CUUAA AUU 474 AAUUUAAGAACCACUGUU UUAAA 1521-1543
AD- 62995.2 426 AU GAAAAAUUUU GAAAC C AGU 475 ACUGGUUUCAAAAUUUUU CAUCC 569-591
AD- 62999.2 427 AACAAAAUAGCAAUСCCU UUU 476 AAAAGGGAUUGCUAUUUU GUUGG 1264-1286
AD- 63003.2 428 CU GAAACAGAU CU GU C GA CUU 477 AAGU C GACAGAU CU GUUU CAGCA 195-217
AD- 62976.2 429 UUGUUGCAAAGGGCAUUU UGA 478 UCAAAAUGCCCUUUGCAA CAAUU 720-742
AD- 62980.2 430 CUCAUUGUUUAUUAACCU GUA 479 UACAGGUUAAUAAACAAU GAGAU 1483-1505
AD- 62984.2 431 CAACAAAAUAGCAAUССC UUU 480 AAAGGGAUUGCUAUUUUG UUGGA 1263-1285
AD- 62992.2 432 CAUUGUUUAUUAACCUGU AUU 481 AAUACAGGUUAAUAAACA AU GAG 1485-1507
AD- 62996.2 433 UAUCAGCUGGGAAGAUAU CAA 482 UU GAUAU CUU С C CAGCU G AUAGA 670-692
AD- 63000.2 434 U GU C CUAGGAAC CUUUUA GAA 483 UUCUAAAAGGUUCCUAGG AC ACC 1313-1335
AD- 63004.2 435 UСCAACAAAAUAGCAAUC CCU 484 AGGGAUUGCUAUUUUGUU GGAAA 1261-1283
AD- 62977.2 436 GGUGUGCGGAAAGGCACU GAU 485 AUCAGUGCCUUUCCGCAC ACCCC 899-921
AD- 62981.2 437 UU GAAAC CAGUACUUUAU CAU 486 AU GAUAAAGUACU GGUUU CAAAA 579-601
AD- 62985.2 438 UACUU C CAAAGU CUAUAU AUA 487 UAUAUAUAGACUUUGGAA GUACU 75-97_G21A
AD- 62989.2 439 UCCUAGGAACCUUUUAGA AAU 488 AUUUCUAAAAGGUUCCUA GGACA 1315- 1337_G21U
AD- 62993.2 440 CU C CU GAGGAAAAUUUU G GAA 489 UUCCAAAAUUUUCCUCAG GAGAA 603- 625_G21A
AD- 62997.2 441 GCUCCGGAAUGUUGCUGA AAU 490 AUUUCAGCAACAUUCCGG AGCAU 181- 203_C21U
AD- 442 GUGUUUGUGGGGAGACCA 491 UAUUGGUCUСССCACAAA 953-
- 79 037115
63001.2 AUA CACAG 975_C21A
AD- 62951.2 492 AUGGUGGUAAUUUGUGAU UUU 514 AAAAU CACAAAUUAC CAC CAUCC 1642-1664
AD- 62956.2 493 GACUUGCAUCCUGGAAAU AUA 515 UAUAUUUCCAGGAUGCAA GUCCA 1338-1360
AD- 62961.2 494 GGAAGGGAAGGUAGAAGU CUU 516 AAGACUU CUAC CUU С C CU UCCAC 864-886
AD- 62966.2 495 U GU CUU CU GUUUAGAUUU CCU 517 AGGAAAUCUAAACAGAAG ACAGG 1506-1528
AD- 62971.2 496 CUUUGGCUGUUUCCAAGA UCU 518 AGAUCUUGGAAACAGCCA AAGGA 1109-1131
AD- 62936.2 497 AAUGUGUUUGGGCAACGU CAU 519 AUGACGUUGCC СAAACAC AUUUU 1385-1407
AD- 62942.2 498 UGUGACUGUGGACACCCC UUA 520 UAAGGGGUGUCCACAGUC ACAAA 486-508
AD- 62947.2 499 GAUGGGGUGCCAGCUACU AUU 521 AAUAGUAGCUGGCACCCC AU CCA 814-836
AD- 62952.2 500 GAAAAUGUGUUUGGGCAA CGU 522 AC GUU GC C CAAACACAUU UUCAA 1382-1404
AD- 62957.2 501 GGCUGUUUCCAAGAUCUG АСА 523 U GU CAGAU CUU GGAAACA GCCAA 1113-1135
AD- 62962.2 502 U С СAACAAAAUAG С СAC C CCU 524 AGGGGUGGCUAUUUUGUU GGAAA 1258-1280
AD- 62967.2 503 GU CUU CU GUUUAGAUUU C CUU 525 AAGGAAAUCUAAACAGAA GACAG 1507-1529
AD- 62972.2 504 UGGAAGGGAAGGUAGAAG UCU 526 AGACUU CUAC CUUCCCUU CCACA 863-885
AD- 62937.2 505 UCCUUUGGCUGUUUCCAA GAU 527 AUCUUGGAAACAGCCAAA GGAUU 1107-1129
AD- 62943.2 506 CAUCUCUCAGCUGGGAUG AUA 528 UAU CAU С С CAG CU GAGAG AUGGG 662-684
AD- 62948.2 507 GGGGUGCCAGCUACUAUU GAU 529 AUCAAUAGUAGCUGGCAC CCCAU 817-839
AD- 62953.2 508 AUGUGUUUGGGCAACGUC AUA 530 UAU GACGUUGCC CAAACA CAUUU 1386- 1408_C21A
AD- 62958.2 509 CUGUUUAGAUUUCCUUAA GAA 531 UUCUUAAGGAAAUCUAAA CAGAA 1512- 1534_C21A
AD- 62963.2 510 AGAAAGAAAUGGACUUGC AUA 532 UAUGCAAGUCCAUUUCUU UCUAG 1327- 1349_C21A
AD- 62968.2 511 GCAUCCUGGAAAUAUAUU AAA 533 UUUAAUAUAUUU C CAGGA UGCAA 1343- 1365_C21A
AD- 512 CCUGUCAGACCAUGGGAA 534 UAGUU С C CAU GGU CU GAC 308-
- 80 037115
62973.2 CUA AGGCU 330_G21A
AD- 62938.2 513 AAACAUGGUGUGGAUGGG AUA 535 U AU С С C AU С С AC AC C AU G UUUAA 763- 785_C21A
AD- 62933.1 536 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 653 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65630.1 537 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 654 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65636.1 538 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 655 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65642.1 539 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 656 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65647.1 540 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 657 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65652.1 541 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 658 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65657.1 542 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 659 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65662.1 543 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 660 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65625.1 544 AU GU GAAAGU CAU C GACA A 661 UU GU C GAU GACUUU CACA UUC 1072-1094
AD- 65631.1 545 AU GU GAAAGU CAU C GACA A 662 UU GU C GAU GACUUU CACA UUC 1072-1094
AD- 65637.1 546 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 663 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65643.1 547 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 664 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65648.1 548 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 665 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65653.1 549 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 666 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65658.1 550 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 667 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65663.1 551 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 668 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65626.1 552 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 669 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65638.1 553 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 670 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 65644.1 554 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 671 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 555 GAAU GU GAAAGU CAU C GA 672 UU GU C GAU GACUUU CACA 1072-1094
- 81 037115
65649.1 CAA UUCUG
AD- 65654.1 556 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 673 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65659.1 557 GAAU GT GAAAGU GAU C GA CAA 674 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65627.1 558 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 675 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65633.1 559 GAAU GT GAAAGU GAU C GA CAA 676 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65639.1 560 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 677 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65645.1 561 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 678 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65650.1 562 GAAUGUGAAAGUGAUCTA CAA 679 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65655.1 563 GAAU GU GAAAGU GAU GAG AA 680 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65660.1 564 GAAUGUGAAAGUCATCTA CAA 681 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65665.1 565 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 682 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65628.1 566 GAAUGUGAAAGUGAUCTA CAA 683 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65634.1 567 GAAU GU GAAAGU GAU GAG AA 684 UU GU C GAU GACUUU GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65646.1 568 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 685 UTGUCGAUGACUUTCACA UUCUG 1072-1094
AD- 65656.1 569 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 686 UU GU C GAU GACUUT GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65661.1 570 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 687 UTGUCGAUGACUUTCACA UUCUG 1072-1094
AD- 65666.1 571 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 688 UU GU C GAU GACUUT GAGA UUCUG 1072-1094
AD- 65629.1 572 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 689 UTGUCGAUGACUUTCACA UUCUG 1072-1094
AD- 65635.1 573 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 690 UTGUCGAUGACUUTCACA UUCUG 1072-1094
AD- 65641.1 574 GAAU GU GAAAGU GAU C GA CAA 691 UTGUCGAUGACUUTCACA UUCUG 1072-1094
AD- 62994.1 575 GACUUU GAU C GU GGAAAU AUA 692 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 576 GACUUU GAU C GU GGAAAU 693 UAUAUUU C CAGGAU GAAA 1341-1363
- 82 037115
65595.1 AUA GUCCA
AD- 65600.1 577 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 694 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65610.1 578 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 695 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65615.1 579 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 696 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65620.1 580 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 697 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65584.1 581 CUUU CAU C CU GGAAAUAU A 698 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUC 1341-1361
AD- 65590.1 582 CUUU CAU C CU GGAAAUAU A 699 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUC 1341-1361
AD- 65596.1 583 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 700 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65601.1 584 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 701 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65606.1 585 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 702 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65611.1 586 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 703 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65616.1 587 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 704 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65621.1 588 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 705 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65585.1 589 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 706 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65591.1 590 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 707 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65597.1 591 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 708 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65602.1 592 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 709 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65607.1 593 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 710 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65612.1 594 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 711 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65622.1 595 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 712 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65586.1 596 GACUTUCAUCCUGGAAAU AUA 713 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 597 GACUUTCAUCCUGGAAAU 714 UAUAUUU C CAGGAU GAAA 1341-1363
- 83 037115
65592.1 AUA GUCCA
AD- 65598.1 598 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 715 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65603.1 599 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 716 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65608.1 600 GACUUUCAUCCUGGAATU AUA 717 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65613.1 601 GACUUU CAU C CU GGAAUA UA 718 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65618.1 602 GACUUUCAUCCUGGAATU AUA 719 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65623.1 603 GACUUUCAUCCUGGAATU AUA 720 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65587.1 604 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 721 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65593.1 605 GACUUTCAUCCUGGAAAU AUA 722 UAUAUUU C CAGGAU GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65599.1 606 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 723 UAUAUUU C CAGGAT GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65604.1 607 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 724 UAUAUUU C CAGGAT GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65609.1 608 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 725 UAUAUUU C CAGGAT GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65614.1 609 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 726 UAUAUTUCCAGGATGAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65619.1 610 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 727 UAUAUTUCCAGGATGAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65624.1 611 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 728 UAUAUUU C CAGGAT GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65588.1 612 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 729 UAUAUTUCCAGGATGAAA GUCCA 1341-1363
AD- 65594.1 613 GACUUU CAU C CU GGAAAU AUA 730 UAUAUUU C CAGGAT GAAA GUCCA 1341-1363
AD- 68309.1 614 AGAAAGGUGUUCAAGAUG UCA 731 U GACAU CUU GAACAC CUU UCUCC 1001- 1022_C21A
AD- 68303.1 615 CAU C CU GGAAAUAUAUUA ACU 732 AGUUAAUAUAUUU C CAGG AUGAA 1349-1370
AD- 65626.5 616 GAAU GU GAAAGU CAU C GA CAA 733 UU GU C GAU GACUUU CACA UUCUG 1072-1094
AD- 68295.1 617 AGU GCACAAUAUUUU С С C AUA 734 UAUGGGAAAAUAUUGUGC ACUGU 1139- 1160_C21A
AD- 618 GAAAGU CAU C GACAAGAC 735 AAU GU CUU GU C GAU GACU 1080-1100
- 84 037115
68273.1 AUU UUCAC
AD- 68297.1 619 AAU GU GAAAGU CAU C GAC AAA 736 UUUGUCGAUGACUUUCAC AUUCU 1075- 1096_G21A
AD- 68287.1 620 CUGGAAAUAUAUUAACUG UUA 737 UAACAGUUAAUAUAUUU C CAGGA 1353-1374
AD- 68300.1 621 AUUUU С C CAU CU GUAUUA UUU 738 AAAUAAUACAGAUGGGAA AAUAU 1149-1170
AD- 68306.1 622 UGUCGUUCUUUUC CAACA AAA 739 UUUU GUU GGAAAAGAAC G AC ACC 1252-1273
AD- 68292.1 623 AUCCUGGAAAUAUAUUAA CUA 740 UAGUUAAUAUAUUU C CAG GAU GA 1350- 1371_G21A
AD- 68298.1 624 GCAUUUUGAGAGGUGAUG AUA 741 UAU CAU CAC CU CU CAAAA UGCCC 734- 755_G21A
AD- 68277.1 625 CAGGGGGAGAAAGGUGUU CAA 742 UUGAACACCUUUCUCCCC CUGGA 994-1014
AD- 68289.1 626 GGAAAUAUAUUAACUGUU AAA 743 UUUAACAGUUAAUAUAUU UCCAG 1355-1376
AD- 68272.1 627 CAUUGGUGAGGAAAAAUC CUU 744 AAGGAUUUUUCCUCACCA AUGUC 1097-1117
AD- 68282.1 628 GGGAGAAAGGUGUUCAAG AUA 745 UAUCUUGAACACCUUUCU CCCCC 998- 1018_G21A
AD- 68285.1 629 GGCAUUUUGAGAGGUGAU GAU 746 AU CAU CAC CU CU CAAAAU GCCCU 733-754
AD- 68290.1 630 UACAAAGGGUGUCGUUCU UUU 747 AAAAGAAC GACAC C CUUU GUAUU 1243-1264
AD- 68296.1 631 UGGGAUCUUGGUGUCGAA UCA 748 U GAUU C GACAC CAAGAU C CCAUU 783-804
AD- 68288.1 632 CU GACAGU GCACAAUAUU UUA 749 UAAAAUAUU GU GCACU GU CAGAU 1134- 1155_C21A
AD- 68299.1 633 CAGU GCACAAUAUUUU С C CAU 750 AUGGGAAAAUAUUGUGCA CUGUC 1138-1159
AD- 68275.1 634 ACUUUUCAAUGGGUGUCC UAA 751 UUAGGACAC C CAUU GAAA AGUCA 1302- 1322_G21A
AD- 68274.1 635 ACAUUGGUGAGGAAAAAU CCU 752 AGGAUUUUUCCUCACCAA UGUCU 1096-1116
AD- 68294.1 636 UUGCUUUUGACUUUUCAA UGA 753 U CAUU GAAAAGU CAAAAG CAAUG 1293- 1314_G21A
AD- 68302.1 637 CAUUUU GAGAGGU GAU GA UGA 754 U CAU CAU CAC CU CU CAAA AUGCC 735- 756_C21A
AD- 68279.1 638 UUGACUUUUCAAUGGGUG UCA 755 U GACAC C CAUU GAAAAGU CAAAA 1299- 1319_C21A
AD- 639 C GACUU CU GUUUUAGGAC 756 U CU GU C CUAAAACAGAAG 212-233
- 85 037115
68304.1 AGA UCGAC
AD- CUCUGAGUGGGUGCCAGA UAUUCUGGCACCCACUCA 1058-
68286.1 640 AUA 757 GAGCC 1079_G21A
AD- GGGUGCCAGAAUGUGAAA UACUUUCACAUUCUGGCA 1066-
68291.1 641 GUA 758 CCCAC 1087_C21A
AD- UCAAUGGGUGUCCUAGGA U GUU C CUAGGACAC C CAU 1307-
68283.1 642 АСА 759 UGAAA 1327_C21A
AD- AAAGU СAU С GACAAGACА UAAU GU CUU GU C GAU GAC 1081-
68280.1 643 UUA 760 UUUCA 1101_G21A
AD- AUUUU GAGAGGU GAU GAU U GCAU CAU CAC CU CU CAA 736-
68293.1 644 GCA 761 AAUGC 757_C21A
AD- AU С GACAAGACAUU G GU G U CU CAC CAAU GU CUU GU C 1087-
68276.1 645 AGA 762 GAU GA 1107_G21A
AD- GGUGCCAGAAUGUGAAAG UGACUUUCACAUUCUGGC
68308.1 646 UCA 763 AC CCA 1067-1088
AD- GACAGUGCACAAUAUUUU UGGAAAAUAUUGUGCACU 1136-
68278.1 647 CCA 764 GUCAG 1156_C21A
AD- ACAAAGAGACACU GU G CA UU CU GCACAGU GU CU CUU 1191-
68307.1 648 GAA 765 UGUCA 1212_G21A
AD- UUUUCAAUGGGUGUCCUA U C CUAGGACAC C CAUU GA
68284.1 649 GGA 766 AAAGU 1304-1324
AD- С C GUUU C CAAGAU CU GAC ACU GU CAGAU CUU GGAAA
68301.1 650 AGU 767 CGGCC 1121-1142
AD- AGGGGGAGAAAGGUGUUC UUUGAACACCUUUCUCCC 995-
68281.1 651 AAA 768 CCUGG 1015_G21A
AD- AGU CAU C GACAAGACAUU AC CAAU GU CUU GU C GAU G
68305.1 652 GGU 769 ACUUU 1083-1104
Пример 2. Скрининг в отношении однократной дозы in vitro с использованием первичных гепатоцитов обезьяны.
Модифицированные и конъюгированные дуплексы siRNA для HAO1 оценивали на эффективность с помощью анализов с трансфекцией с использованием первичных гепатоцитов обезьяны. siRNA для HAO1 трансфицировали в двух дозах, 10 и 0,1 нМ. Результаты этих анализов показаны в табл. 3, и данные выражены как доля оставшегося количества транскрипта в клетках, трансфицированных siRNA, целенаправленно воздействующими на НАО1, по отношению к клеткам, трансфицированным отрицательным по siRNA контролем, AD-1955, ± среднее квадратичное отклонение (SD).
Результаты показаны на фиг. 3А. На фиг. 3В показан эффект дозы с использованием одного из наиболее активных конъюгатов (№ 31) (AD-62933) по результатам скрининга первичных двух доз; значение IC50 составляло ~19 пМ.
- 86 037115
Таблица 3 а
Скрининг в отношении однократной дозы для HAO1 с использованием гепатоцитов обезьяны
ID дуплекса Вид 10 нМ PCH 0,1 нМ PCH SD 10 нМ PCH SD 0,1 нМ PCH
AD-62974 Hs 5,3 29,8 1,87 11,11
AD-62975 Hs 7,6 31,3 0,34 1,99
AD-62976 Hs 4,7 35,5 0,34 13,90
AD-62977 Hs 29,2 66, 9 8,32 43,88
AD-62978 Hs 3,8 8,9 0,15 4,29
AD-62979 Hs 27,5 80,7 1,35 19,58
AD-62980 Hs 7,4 32,2 1,26 1,42
AD-62981 Hs 18,7 49,9 3,46 12,83
AD-62982 Hs 2,2 8,5 0,10 7,71
AD-62983 Hs 19,4 41,0 11,19 6, 60
AD-62984 Hs 6, 7 13,3 1,05 2,60
AD-62985 Hs 2,3 8,3 0,24 2,68
AD-62986 Hs 39,0 57,2 3,82 16, 31
AD-62987 Hs 11,5 17,8 14,62 15,39
AD-62989 Hs 10,6 34,2 2,23 2,68
AD-62990 Hs 12,0 18,4 9,11 5,23
AD-62991 Hs 7,2 14,2 1,30 2,96
AD-62992 Hs 3,9 16, 0 1,15 1,80
AD-62993 Hs 22,3 58,4 9,91 6,28
AD-62994 Hs 3,2 10,8 1,21 1,69
AD-62995 Hs 5,5 17,6 4,58 3,25
AD-62996 Hs 3,4 20,7 2,16 3,73
AD-62997 Hs 4,5 24,2 0,67 3,32
AD-62998 Hs 4,3 14,7 0,49 0,29
AD-62999 Hs 11,4 15,5 1,23 2,50
AD-63000 Hs 45,5 90,6 13,41 43,49
AD-63001 Hs 13,3 31,0 0,20 2,13
AD-63002 Hs 6, 6 22,0 0,26 5,75
AD-63003 Hs 36, 8 5,1 47,09 0,60
AD-63004 Hs 12,7 35,4 1,55 9,42
AD-62933 Hs/Mm 5,8 13,4 0,71 0,13
AD-62934 Hs/Mm 52,2 35,9 6, 64 5,08
AD-62935 Hs/Mm 7,7 22,7 1,53 4,97
AD-62939 Hs/Mm 25,1 49,0 9,48 2,88
- 87 037115
AD-62940 Hs/Mm 11,9 50,4 4,12 13,91
AD-62941 Hs/Mm 9,6 30,3 7,28 3,11
AD-62944 Hs/Mm 8,0 18,5 1,40 5,63
AD-62945 Hs/Mm 22,9 36,5 17,16 13,81
AD-62946 Hs/Mm 19,3 29,5 15,29 1,74
AD-62949 Hs/Mm 34,1 84,2 18,11 18,42
AD-62950 Hs/Mm 12,7 36,2 5,69 6, 54
AD-62954 Hs/Mm 46, 0 53,2 37,57 10,61
AD-62955 Hs/Mm 24,6 36, 0 0,97 16,36
AD-62959 Hs/Mm 32,3 37,4 12,49 12,08
AD-62960 Hs/Mm 18,1 37,5 2,12 3,12
AD-62964 Hs/Mm 16,2 52,4 5,59 22,40
AD-62965 Hs/Mm 18,5 34,5 3,77 22,38
AD-62969 Hs/Mm 11,7 34,0 0,17 12,55
AD-62970 Hs/Mm 13,6 21,2 1,13 5,85
AD-62936 Mm 91,3 55,6 16, 03 0,27
AD-62937 Mm 45,8 77,7 22,77 47,01
AD-62938 Mm 78,3 55,1 8,81 2,70
AD-62942 Mm 18,8 21,7 7,34 8,00
AD-62943 Mm 6,7 31,0 0,79 7,22
AD-62947 Mm 27,9 82,0 14,01 2,01
AD-62948 Mm 21,9 52,5 6,56 21,01
AD-62951 Mm 40,1 77,4 8,76 3,03
AD-62952 Mm 33,7 69,9 17,76 1,71
AD-62953 Mm 79,9 65,1 96, 61 22,79
AD-62956 Mm 7,6 16,4 1,01 12,39
AD-62957 Mm 6,7 21,3 0,99 3,02
AD-62958 Mm 38,9 54,4 21,66 29,39
AD-62961 Mm 35,3 66, 0 0,35 24,65
AD-62962 Mm 70,7 63,7 21,17 26, 36
AD-62963 Mm 35,1 66,5 35,49 9,42
AD-62966 Mm 69,0 100,3 17,07 3,44
AD-62967 Mm 90,7 116, 7 22,01 47,77
AD-62968 Mm 46,3 72,2 28,37 67,08
AD-62971 Mm 17,9 46, 3 1,23 23,41
AD-62972 Mm 75,6 122,9 24,75 18,00
AD-62973 Mm 102,8 73,9 22,49 14,39
- 88 037115
Таблица 3b
Дополнительный скрининг в отношении однократной дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов обезьяны
ID дуплекса Вид 10 нМ PCH 0,1 нМ PCH SD 10 нМ PCH SD 0,1 нМ PCH
AD-62974.2 Hs 5,3 29,8 1,87 11,11
AD-62975.2 Hs 7,6 31,3 0,34 1,99
AD-62976.2 Hs 4,7 35,5 0,34 13,90
AD-62977.2 Hs 29,2 66, 9 8,32 43,88
AD-62978.2 Hs 3,8 8,9 0,15 4,29
AD-62979.2 Hs 27,5 80,7 1,35 19,58
AD-62980.2 Hs 7,4 32,2 1,26 1,42
AD-62981.2 Hs 18,7 49,9 3,46 12,83
AD-62982.2 Hs 2,2 8,5 0,10 7,71
AD-62983.2 Hs 19,4 41,0 11,19 6, 60
AD-62984.2 Hs 6,7 13,3 1,05 2,60
AD-62985.2 Hs 2,3 8,3 0,24 2,68
AD-62986.2 Hs 39,0 57,2 3,82 16, 31
AD-62987.2 Hs 11,5 17,8 14,62 15,39
AD-62989.2 Hs 10,6 34,2 2,23 2,68
AD-62990.2 Hs 12,0 18,4 9, 11 5,23
AD-62991.2 Hs 7,2 14,2 1,30 2,96
AD-62992.2 Hs 3,9 16, 0 1,15 1,80
AD-62993.2 Hs 22,3 58,4 9,91 6,28
AD-62994.2 Hs 3,2 10,8 1,21 1,69
AD-62995.2 Hs 5,5 17,6 4,58 3,25
AD-62996.2 Hs 3,4 20,7 2,16 3,73
AD-62997.2 Hs 4,5 24,2 0,67 3,32
AD-62998.2 Hs 4,3 14,7 0,49 0,29
AD-62999.2 Hs 11,4 15,5 1,23 2,50
AD-63000.2 Hs 45,5 90,6 13,41 43,49
AD-63001.2 Hs 13,3 31,0 0,20 2,13
AD-63002.2 Hs 6, 6 22,0 0,26 5,75
AD-63003.2 Hs 36, 8 5,1 47,09 0,60
AD-63004.2 Hs 12,7 35,4 1,55 9,42
AD-62933.2 Hs/Mm 5,8 13,4 0,71 0,13
AD-62934.2 Hs/Mm 52,2 35,9 6, 64 5,08
AD-62935.2 Hs/Mm 7,7 22,7 1,53 4,97
AD-62939.2 Hs/Mm 25,1 49,0 9,48 2,88
AD-62940.2 Hs/Mm 11,9 50,4 4,12 13,91
AD-62941.2 Hs/Mm 9,6 30,3 7,28 3,11
AD-62944.2 Hs/Mm 8,0 18,5 1,40 5,63
AD-62945.2 Hs/Mm 22,9 36, 5 17,16 13,81
AD-62946.2 Hs/Mm 19,3 29,5 15,29 1,74
- 89 037115
AD-62949.2 Hs/Mm 34,1 84,2 18,11 18,42
AD-62950.2 Hs/Mm 12,7 36,2 5,69 6, 54
AD-62954.2 Hs/Mm 46, 0 53,2 37,57 10,61
AD-62955.2 Hs/Mm 24,6 36, 0 0,97 16, 36
AD-62959.2 Hs/Mm 32,3 37,4 12,49 12,08
AD-62960.2 Hs/Mm 18,1 37,5 2,12 3,12
AD-62964.2 Hs/Mm 16,2 52,4 5,59 22,40
AD-62965.2 Hs/Mm 18,5 34,5 3,77 22,38
AD-62969.2 Hs/Mm 11,7 34,0 0,17 12,55
AD-62970.2 Hs/Mm 13,6 21,2 1,13 5,85
AD-62936.2 Mm 91,3 55, 6 16, 03 0,27
AD-62937.2 Mm 45,8 77,7 22,77 47,01
AD-62938.2 Mm 78,3 55,1 8,81 2,70
AD-62942.2 Mm 18,8 21,7 7,34 8,00
AD-62943.2 Mm 6, 7 31,0 0,79 7,22
AD-62947.2 Mm 27,9 82,0 14,01 2,01
AD-62948.2 Mm 21,9 52,5 6,56 21,01
AD-62951.2 Mm 40,1 77,4 8,76 3,03
AD-62952.2 Mm 33,7 69,9 17,76 1,71
AD-62953.2 Mm 79,9 65,1 96, 61 22,79
AD-62956.2 Mm 7,6 16, 4 1,01 12,39
AD-62957.2 Mm 6,7 21,3 0,99 3,02
AD-62958.2 Mm 38,9 54,4 21,66 29,39
AD-62961.2 Mm 35,3 66, 0 0,35 24,65
AD-62962.2 Mm 70,7 63,7 21,17 26, 36
AD-62963.2 Mm 35,1 66,5 35,49 9,42
AD-62966.2 Mm 69,0 100,3 17,07 3,44
AD-62967.2 Mm 90,7 116, 7 22,01 47,77
AD-62968.2 Mm 46, 3 72,2 28,37 67,08
AD-62971.2 Mm 17,9 46, 3 1,23 23,41
AD-62972.2 Mm 75,6 122,9 24,75 18,00
AD-62973.2 Mm 102,8 73,9 22,49 14,39
Пример 3. Скрининг в отношении однократной дозы in vitro с использованием первичных гепатоцитов мыши.
Модифицированные и конъюгированные дуплексы siRNA для HAO1 оценивали на эффективность с помощью анализов с трансфекцией с использованием первичных гепатоцитов мыши. siRNA для HAO1 трансфицировали в двух дозах, 20 и 0,2 нМ. Результаты этих анализов показаны в табл. 4, и данные выражены как доля оставшегося количества транскрипта в клетках, трансфицированных siRNA, целенаправленно воздействующими на HAO1, по отношению к клеткам, трансфицированным отрицательным по siRNA контролем, AD-1955, ± среднее квадратичное отклонение (SD).
- 90 037115
Таблица 4а
Скрининг в отношении однократной дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов мыши
ID дуплекса Вид 20 нМ PMH 0,2 нМ PMH SD 20 нМ PMH SD 0,2 нМ PMH
AD-62974 Hs 1,5 11,5 0,3 8,5
AD-62975 Hs 6,2 24,5 1,9 19,4
AD-62976 Hs 8,3 60,0 3,9 7, 9
AD-62977 Hs 69,1 106, 9 44,8 18,3
AD-62978 Hs 30,0 46, 3 26, 0 27,3
AD-62979 Hs 50,7 59,5 45,6 43,4
AD-62980 Hs 65,4 89,5 68,9 29,3
AD-62981 Hs 65,8 83,3 31,9 23,7
AD-62982 Hs 86, 6 67,0 92,1 65,5
AD-62983 Hs 81,5 103, 6 61,3 68,0
AD-62984 Hs 13,5 51,8 1,2 37,7
AD-62985 Hs 53,8 37,7 38,1 26,3
AD-62986 Hs 138,5 153,4 140,7 119,6
AD-62987 Hs 39,0 99,6 44,9 110,7
AD-62989 Hs 17,1 2,2 23,1 1, 6
AD-62990 Hs 4,3 46,3 4,6 46,4
AD-62991 Hs 125,2 102,6 111,9 92,9
AD-62992 Hs 64,7 65,6 67,8 55,8
AD-62993 Hs 83,8 79,0 63,0 22,2
AD-62994 Hs 1,9 5,4 1,5 0,2
AD-62995 Hs 2,9 17,4 1,8 13,8
AD-62996 Hs 49,3 61,4 43,6 49,9
AD-62997 Hs 60,2 83,4 19,1 45,7
AD-62998 Hs 73,5 86, 7 71,5 69,4
AD-62999 Hs 38,7 50,0 29,5 22,7
AD-63000 Hs 27,3 56, 6 26, 1 41,4
AD-63001 Hs 56, 6 83,8 52,9 13,5
AD-63002 Hs 81,6 74,2 67,4 70,5
AD-63003 Hs 46,4 47,7 42,4 21,4
AD-63004 Hs 28,6 64,5 17,0 44,5
AD-62933 Hs/Mm 1,1 4,6 0,5 4, 0
AD-62934 Hs/Mm 7,6 43,4 0,6 32,6
AD-62935 Hs/Mm 1,3 7,0 0,3 3,4
- 91 037115
AD-62939 Hs/Mm 6,1 21,4 2,2 14,5
AD-62940 Hs/Mm 6, 0 16, 9 1,4 3,8
AD-62941 Hs/Mm 5,6 8,5 3,9 6, 3
AD-62944 Hs/Mm 3,3 4,3 2,9 4,5
AD-62945 Hs/Mm 6, 4 7,0 1,0 7,2
AD-62946 Hs/Mm 18,3 21,4 19,2 21,1
AD-62949 Hs/Mm 11,4 43,7 8,9 38,3
AD-62950 Hs/Mm 9,9 21,9 4,7 20,8
AD-62954 Hs/Mm 9,4 65,5 0,2 64,3
AD-62955 Hs/Mm 5,8 21,8 5,5 5,8
AD-62959 Hs/Mm 4,2 9, 6 1,8 5, 3
AD-62960 Hs/Mm 5,4 10,1 3,8 2,5
AD-62964 Hs/Mm 3,7 21,2 0,9 12,7
AD-62965 Hs/Mm 8,0 20,8 5,3 23,5
AD-62969 Hs/Mm 6, 4 4,7 3,8 5,1
AD-62970 Hs/Mm 19,6 5,2 14,6 6, 1
AD-62936 Mm 7,0 17,5 0,1 9,9
AD-62937 Mm 4,0 16, 9 0,8 10,2
AD-62938 Mm 4,0 49,1 0,7 42,4
AD-62942 Mm 3,4 4,9 1,2 5,3
AD-62943 Mm 3,8 14,9 2,2 10,6
AD-62947 Mm 10,9 6, 4 9,6 1,6
AD-62948 Mm 6, 7 18,7 6, 9 15,8
AD-62951 Mm 8,1 11,8 8,6 14,5
AD-62952 Mm 9,4 23,2 10,1 29,2
AD-62953 Mm 11,3 10,3 13,7 12,1
AD-62956 Mm 2,2 3,9 1,8 1,6
AD-62957 Mm 3,2 22,5 3,1 20,0
AD-62958 Mm 7,5 16, 0 5,8 13,2
AD-62961 Mm 4,3 6, 9 2,8 5,6
AD-62962 Mm 17,1 42,4 14,2 49,5
AD-62963 Mm 2,3 10,8 0,6 8,3
AD-62966 Mm 5,7 11,6 5,8 5,6
AD-62967 Mm 3,8 21,7 2,0 23,0
AD-62968 Mm 3,5 9,4 0,3 9,0
AD-62971 Mm 4,6 3,1 5,0 2,7
AD-62972 Mm 13,8 22,7 17,0 24,9
AD-62973 Mm 19,3 51,9 19,7 21,9
- 92 037115
Т аблица 4b
Дополнительный скрининг в отношении однократной дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов мыши
ID дуплекса Вид Название смыслового олигонуклеотида 20 нМ PMH 0,2 нМ PMH SD 20 нМ PMH SD 0,2 нМ PMH
AD-62974.2 Hs A-126176.1 1,5 11,5 0,3 8,5
AD-62975.2 Hs A-126192.1 6,2 24,5 1,9 19,4
AD-62 976.2 Hs A-126208.1 8,3 60,0 3,9 7,9
AD-62977.2 Hs A-126224.1 69,1 106, 9 44,8 18,3
AD-62978.2 Hs A-126178.1 30,0 46, 3 26, 0 27,3
AD-62979.2 Hs A-126194.1 50,7 59,5 45,6 43,4
AD-62980.2 Hs A-126210.1 65,4 89,5 68,9 29,3
AD-62981.2 Hs A-126226.1 65,8 83,3 31,9 23,7
AD-62982.2 Hs A-126180.1 86, 6 67,0 92,1 65,5
AD-62983.2 Hs A-126196.1 81,5 103,6 61,3 68,0
AD-62984.2 Hs A-126212.1 13,5 51,8 1,2 37,7
AD-62985.2 Hs A-126228.1 53,8 37,7 38,1 26, 3
AD-62986.2 Hs A-126182.1 138,5 153,4 140,7 119,6
AD-62987.2 Hs A-126198.1 39,0 99,6 44,9 110,7
AD-62989.2 Hs A-126230.1 17,1 2,2 23,1 1,6
AD-62990.2 Hs A-126184.1 4,3 46, 3 4,6 46, 4
AD-62991.2 Hs A-126200.1 125,2 102,6 111,9 92,9
AD-62992.2 Hs A-126216.1 64,7 65,6 67,8 55,8
AD-62993.2 Hs A-126232.1 83,8 79,0 63,0 22,2
AD-62994.2 Hs A-126186.1 1,9 5,4 1,5 0,2
AD-62995.2 Hs A-126202.1 2,9 17,4 1,8 13,8
AD-62996.2 Hs A-126218.1 49,3 61,4 43,6 49,9
AD-62997.2 Hs A-126234.1 60,2 83,4 19,1 45,7
AD-62998.2 Hs A-126188.1 73,5 86, 7 71,5 69,4
AD-62999.2 Hs A-126204.1 38,7 50,0 29,5 22,7
AD-63000.2 Hs A-126220.1 27,3 56, 6 26, 1 41,4
AD-63001.2 Hs A-126236.1 56, 6 83,8 52,9 13,5
AD-63002.2 Hs A-126190.1 81,6 74,2 67,4 70,5
AD-63003.2 Hs A-126206.1 46, 4 47,7 42,4 21,4
AD-63004.2 Hs A-126222.1 28,6 64,5 17,0 44,5
AD-62933.2 Hs/Mm A-126094.1 1,1 4,6 0,5 4,0
AD-62934.2 Hs/Mm A-126110.1 7,6 43,4 0,6 32,6
AD-62935.2 Hs/Mm A-126126.1 1,3 7,0 0,3 3,4
AD-62939.2 Hs/Mm A-126096.1 6, 1 21,4 2,2 14,5
AD-62940.2 Hs/Mm A-126112.1 6, 0 16, 9 1,4 3,8
- 93 037115
AD-62941.2 Hs/Mm A-126128.1 5,6 8,5 3,9 6, 3
AD-62944.2 Hs/Mm A-126098.1 3,3 4,3 2,9 4,5
AD-62945.2 Hs/Mm A-126114.1 6, 4 7,0 1,0 7,2
AD-62946.2 Hs/Mm A-126130.1 18,3 21,4 19,2 21,1
AD-62949.2 Hs/Mm A-126100.1 11,4 43,7 8,9 38,3
AD-62950.2 Hs/Mm A-126116.1 9,9 21,9 4,7 20,8
AD-62954.2 Hs/Mm A-126102.1 9,4 65,5 0,2 64,3
AD-62 955.2 Hs/Mm A-126118.1 5,8 21,8 5,5 5,8
AD-62959.2 Hs/Mm A-126104.1 4,2 9,6 1,8 5,3
AD-62960.2 Hs/Mm A-126120.1 5,4 10,1 3,8 2,5
AD-62964.2 Hs/Mm A-126106.1 3,7 21,2 0,9 12,7
AD-62 9 65.2 Hs/Mm A-126122.1 8,0 20,8 5,3 23,5
AD-62969.2 Hs/Mm A-126108.1 6, 4 4,7 3,8 5,1
AD-62970.2 Hs/Mm A-126124.1 19,6 5,2 14,6 6, 1
AD-62936.2 Mm A-126142.1 7,0 17,5 0,1 9,9
AD-62937.2 Mm A-126158.1 4,0 16, 9 0,8 10,2
AD-62938.2 Mm A-126174.1 4,0 49,1 0,7 42,4
AD-62942.2 Mm A-126144.1 3,4 4,9 1,2 5,3
AD-62943.2 Mm A-126160.1 3,8 14,9 2,2 10,6
AD-62947.2 Mm A-126146.1 10,9 6, 4 9,6 1,6
AD-62948.2 Mm A-126162.1 6, 7 18,7 6, 9 15,8
AD-62951.2 Mm A-126132.1 8,1 11,8 8,6 14,5
AD-62952.2 Mm A-126148.1 9,4 23,2 10,1 29,2
AD-62953.2 Mm A-126164.1 11,3 10,3 13,7 12,1
AD-62 95 6.2 Mm A-126134.1 2,2 3,9 1,8 1,6
AD-62957.2 Mm A-126150.1 3,2 22,5 3,1 20,0
AD-62958.2 Mm A-126166.1 7,5 16, 0 5,8 13,2
AD-62961.2 Mm A-126136.1 4,3 6, 9 2,8 5,6
AD-62962.2 Mm A-126152.1 17,1 42,4 14,2 49,5
AD-62963.2 Mm A-126168.1 2,3 10,8 0,6 8,3
AD-62 9 66.2 Mm A-126138.1 5,7 11,6 5,8 5,6
AD-62 9 67.2 Mm A-126154.1 3,8 21,7 2,0 23,0
AD-62968.2 Mm A-126170.1 3,5 9,4 0,3 9,0
AD-62971.2 Mm A-126140.1 4,6 3,1 5,0 2,7
AD-62972.2 Mm A-126156.1 13,8 22,7 17,0 24,9
AD-62973.2 Mm A-126172.1 19,3 51,9 19,7 21,9
Пример 4. Скрининг в отношении эффекта дозы с использованием первичных гепатоцитов обезьяны.
Значения IC50 модифицированных и конъюгированных дуплексов siRNA для HAO1 определяли с использованием первичных гепатоцитов обезьяны. siRNA для HAO1 трансфицировали в пределах диапазона доз с конечной концентрацией дуплекса, составляющей от 10 нМ до 36 фМ, с использованием 86-кратных разведений. Результаты этих анализов показаны в табл. 5.
- 94 037115
Таблица 5 а
Скрининг в отношении эффекта дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов мыши
ID дуплекса Вид IC50 PCH (нМ)
AD-62984 Hs 0,017
AD-62994 Hs 0,029
AD-62989 Hs 0,175
AD-62974 Hs 0,288
AD-62975 Hs 0,399
AD-62933 Hs/Mm 0,019
AD-62944 Hs/Mm 0,027
AD-62935 Hs/Mm 0,137
AD-62965 Hs/Mm 0,155
AD-62941 Hs/Mm 0,245
AD-62940 Hs/Mm 0,927
Таблица 5 b
Дополнительный скрининг в отношении эффекта дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов мыши
ID дуплекса Вид IC50 PCH (нМ)
AD-62984.2 Hs 0,017
AD-62994.2 Hs 0,029
AD-62989.2 Hs 0,175
AD-62974.2 Hs 0,288
AD-62975.2 Hs 0,399
AD-62933.2 Hs/Mm 0,019
AD-62944.2 Hs/Mm 0,027
AD-62935.2 Hs/Mm 0,137
AD-62965.2 Hs/Mm 0,155
AD-62941.2 Hs/Mm 0,245
AD-62940.2 Hs/Mm 0,927
Пример 5. Скрининг в отношении эффекта дозы с использованием первичных гепатоцитов мыши.
Значения IC50 модифицированных и конъюгированных дуплексов siRNA для HAO1 определяли с использованием первичных гепатоцитов мыши. siRNA для НАО1 трансфицировали в пределах диапазона доз с конечной концентрацией дуплекса, составляющей от 10 нМ до 36 фМ, с использованием 86-кратных разведений. Результаты этих анализов показаны в табл. 6.
Таблица 6а
Скрининг в отношении эффекта дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов мыши
ID дуплекса Вид IC50 РМН (нМ)
AD-62989 Hs 0, 003
AD-62994 Hs 0, 006
AD-62975 Hs 0, 059
AD-62974 Hs 0, 122
AD-62984 Hs 0,264
AD-62944 Hs/Mm 0, 002
AD-62935 Hs/Mm 0, 007
AD-62965 Hs/Mm 0, 008
AD-62933 Hs/Mm 0, 008
AD-62941 Hs/Mm 0, 087
AD-62940 Hs/Mm 0, 090
- 95 037115
Таблица 6b Дополнительный скрининг в отношении эффекта дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов мыши
ID дуплекса Вид IC50 PMH (нМ)
AD-62989.2 Hs 0,003
AD-62994.2 Hs 0,006
AD-62975.2 Hs 0,059
AD-62974.2 Hs 0,122
AD-62984.2 Hs 0,264
AD-62944.2 Hs/Mm 0,002
AD-62935.2 Hs/Mm 0,007
AD-62965.2 Hs/Mm 0,008
AD-62933.2 Hs/Mm 0,008
AD-62941.2 Hs/Mm 0,087
AD-62940.2 Hs/Mm 0,090
Таблица 7
Дополнительный скрининг в отношении однократной дозы для HAO1 с использованием первичных гепатоцитов яванского макака и мыши
ID дуплекса 10 нМ PCH 0,1 нМ PCH SD 10 нМ PCH SD 0, 1 нМ PCH 10 нМ PMH 0,1 нМ PMH SD 10 нМ PMH SD 0,1 нМ PMH
AD- 62933. 1 26, 1 22,8 17,0 6, 0 9,0 26,3 6, 0 7,6
AD- 65584 . 1 12,9 28,0 5, 1 6, 0 3,8 12,3 0,7 7,3
AD- 65585.1 9, 8 21, 0 4,1 1,0 6, 8 11,6 4,5 5,7
- 96 037115
AD- 65586.1 24,3 24,2 10,9 2,7 16, 7 19,0 5,1 1,8
AD- 65587.1 24,7 31,7 10,2 21,9 13,6 27,1 5,7 10,3
AD- 65588.1 39,2 33,0 35,6 5,6 27,1 33,5 11,0 8,3
AD- 65590.1 5,6 15,4 0, 4 6, 6 4,2 8,7 1,1 0,5
AD- 65591.1 13,9 20,4 5, 0 4,9 7,6 18,4 0,1 2,9
AD- 65592.1 15,6 24,3 7,4 3,7 10,1 24,5 3,1 1,0
AD- 65593.1 30,8 37,5 4,4 8,7 38,4 41,3 5,2 10,4
AD- 65594.1 18,0 21,8 5, 6 2,6 24,7 25,3 0,5 7,6
AD- 65595.1 19,9 31,9 0, 1 11,3 9,1 12,2 5,0 5,7
AD- 65596.1 12,3 19,2 0, 6 1,6 10,0 19,9 1,0 1,9
AD- 65597.1 10,2 34,8 2,8 10,1 22,8 32,0 6,2 5,7
AD- 65598.1 14,4 21,2 3,2 8,6 10,8 22,0 2,6 8,8
AD- 65599.1 15,0 28,3 2,5 21,3 18,0 25,4 1,7 8,3
AD- 65600.1 11,8 13,7 5, 6 0,3 6, 4 14,5 5,7 6, 8
AD- 65601.1 15,4 20,5 0, 5 1,6 5,5 17,2 0,3 3,9
AD- 65602.1 12,9 23,3 0, 8 12,0 11,0 25,4 2,6 2,6
AD- 65603.1 33,8 41,0 2,2 6, 8 37,4 58,6 3,0 10,5
AD- 65604.1 10,4 18,7 1, 3 2,3 12,9 24,5 0,9 9,2
AD- 65606.1 14,3 12,3 0,2 3,1 4,8 14,0 2,0 4,2
AD- 65607.1 9,2 18,5 2,1 3, 6 14,4 32,8 1,9 1,6
AD- 65608.1 36, 6 31,1 7,9 11,6 27,5 29,8 8,5 4,6
- 97 037115
AD- 65609.1 14,2 19,8 5, 1 0,8 14,6 23,6 5,3 1,5
AD- 65610.1 59,1 59,6 15, 0 13,3 35,0 70,9 10,0 0,1
AD- 65611.1 12,9 14,2 5, 4 1,8 4,5 17,3 0,6 2,2
AD- 65612.1 19,3 20,5 1, 5 9,0 16,2 23,3 3,8 1,7
AD- 65613.1 20,0 19,3 5, 7 0,7 11,0 23,9 1,0 5,4
AD- 65614.1 12,4 27,1 2,2 0,5 14,2 16, 7 3,8 11,9
AD- 65615.1 53,1 60,3 1, 4 7,7 48,2 80,9 9,9 39,4
AD- 65616.1 21,7 12,5 17, 8 5,5 5,3 13,3 0,5 7,2
AD- 65618.1 19,4 67,6 3, 4 35,9 16, 7 21,6 4,2 4,8
AD- 65619.1 17,0 27,2 0, 5 12,4 12,5 26, 3 3,2 2,3
AD- 65620.1 58,0 70,5 21, 8 2,8 37,9 54,8 0,4 12,7
AD- 65621.1 12,3 17,5 4,6 2,3 3,8 11,3 1,3 0,3
AD- 65622.1 17,7 20,4 6, 1 0,9 10,8 13,9 6, 3 3,1
AD- 65623.1 44,4 32,9 7,9 H. Д. 37,7 20,6 28,5 0,9
AD- 65624.1 13,0 23,3 5, 0 9,8 9,2 7,9 2,8 0,4
AD- 65625.1 9,8 13,3 0, 6 1,5 10,0 19,2 4,6 1,6
AD- 65626.1 7,7 15,0 1, 1 4,9 8,6 14,7 3,6 2,4
AD- 65627.1 18,8 24,8 7,8 1,8 19,7 18,5 8,1 12,0
AD- 65628.1 27,3 31,7 4,9 3,9 29,7 43,4 6, 4 19,6
AD- 65629.1 12,8 20,8 1, o 8,1 18,9 23,2 3,2 13,9
AD- 65630.1 7,2 14,0 0, 3 5,3 6, 1 8,5 1,3 2,1
- 98 037115
AD- 65631.1 6, 7 17,2 0, 7 5,7 12,0 23,1 4,0 0,9
AD- 65633.1 13,8 28,6 3, 4 5,4 17,0 26,2 1,2 3,9
AD- 65634.1 12,2 23,6 6, 6 1,2 21,6 35,2 1,4 8,2
AD- 65635.1 11,7 27,7 5, 7 4,7 18,5 38,4 2,5 6, 5
AD- 65636.1 13,1 29,4 0, 6 12,9 21,3 35,6 3,1 13,1
AD- 65637.1 16, 0 22,8 5, 1 9,6 8,3 18,5 0,6 0,4
AD- 65638.1 11,5 15,9 4,3 2,1 20,8 31,8 3,5 3,2
AD- 65639.1 14,6 28,3 7,4 5,5 18,6 35,2 0,2 0,3
AD- 65641.1 32,3 49,3 3, 4 8,9 29,1 34,0 4,8 8,8
AD- 65642.1 10,4 23,0 0, 1 4,7 10,1 21,3 1,0 6, 5
AD- 65643.1 12,6 13,7 0, 3 2,5 5,3 20,6 1,8 6, 8
AD- 65644.1 8,1 13,5 0, 1 0,3 16, 4 24,1 3,4 4,2
AD- 65645.1 69,5 88,7 6, 3 26, 6 81,8 75,5 13,6 5,8
AD- 65646.1 8,9 47,0 o, 9 15,6 26, 5 37,7 3,7 4,7
AD- 65647.1 11,0 14,0 2,9 0,3 16, 6 23,7 2,6 0,7
AD- 65648.1 7,3 25,4 3, 3 2,9 5,9 13,9 2,1 0,9
AD- 65649.1 11,6 23,0 1, 9 3,4 20,7 29,8 2,1 3,6
AD- 65650.1 27,9 40,6 13,1 14,0 27,6 30,6 9,7 6, 8
AD- 65652.1 73,4 72,2 5,2 1,8 47,6 59,7 7,5 21,4
AD- 65653.1 9,6 32,4 2,7 4,7 5,9 24,3 0,0 6, 7
AD- 65654.1 41,6 45,5 10,4 11,7 22,8 35,7 2,9 3,1
- 99 037115
AD- 65655.1 19,2 18,3 0, 1 4,8 17,8 18,8 3,8 3,9
AD- 65656.1 10,8 16, 1 4,7 3,1 6,2 13,8 1,6 1,8
AD- 65657.1 107,8 114,5 8,7 6, 7 36, 3 51,2 1,6 14,1
AD- 65658.1 9,6 13,5 0, 7 1,3 4,8 11,7 0,2 3,3
AD- 65659.1 17,5 39,8 1, 1 1,4 13,0 24,6 3,5 3,3
AD- 65660.1 21,5 33,1 5, 4 1,6 14,6 29,0 0,5 4,1
AD- 65661.1 13,9 40,1 2,2 12,8 13,2 27,3 6, 8 7,1
AD- 65662.1 111,2 242,2 29,9 179,6 42,5 47,9 4,6 1,6
AD- 65663.1 11,5 28,2 3, 8 н. д. 5,5 7,6 1,4 0,1
AD- 65665.1 104,8 141,7 13,0 26, 9 39,4 44,2 13,1 5,3
AD- 65666.1 14,4 28,1 6, 9 1,8 3,8 12,7 0,3 4,8
Таблица 8
Дополнительный скрининг в отношении однократной дозы с использованием первичных гепатоцитов яванского макака
Дуплекс 10 нМ РСН 10 нМ РСН SD 0,1 нМ РСН 0,1 нМ РСН SD
AD-65626.5 7,1 0,7 23,5 3,7
AD-68272.1 10,1 1, 9 39,5 10,3
AD-68273.1 6, 8 2,2 29,7 10,1
AD-68274.1 15,7 4,7 49,4 12,1
AD-68275.1 15,5 2,7 47,4 10,4
AD-68276.1 22,3 8,1 83, 0 21,7
AD-68277.1 14,2 1, 1 25,2 7,9
AD-68278.1 18,6 3,2 97,5 25,4
AD-68279.1 14,7 3, 8 62,5 19,6
AD-68280.1 24,9 2,6 54,7 8, 1
AD-68281.1 38,3 18,6 70,7 8, 8
AD-68282.1 11,3 3,1 35, 9 3, 6
AD-68283.1 14,4 3, 6 79, 9 26, 5
AD-68284.1 25,1 4,7 82,3 8,2
AD-68285.1 10,4 1,3 39,3 10,3
- 100 037115
AD-68286.1 14,7 4,5 71,9 18,3
AD-68287.1 8,0 2,3 28,4 3,5
AD-68288.1 14,8 3, 5 31,7 6, 3
AD-68289.1 11,8 2,5 30,8 3,5
AD-68290.1 11,5 4,9 40,3 8,4
AD-68291.1 15,8 6, 3 69,9 6, 6
AD-68292.1 9,8 3, 0 37,3 20,7
AD-68293.1 20,2 6, 1 85,2 20,8
AD-68294.1 12,9 5, 0 68,7 21,6
AD-68295.1 7,5 1, 4 22,6 3,9
AD-68296.1 8,5 1, 1 51,3 7,0
AD-68297.1 8,2 2,4 27,4 4,0
AD-68298.1 10,1 2,8 35,6 10,4
AD-68299.1 11,8 2,4 47,7 16,2
AD-68300.1 7,2 1, 7 33,8 4,6
AD-68301.1 34,2 14,3 78,3 25,8
AD-68302.1 15,6 5, 8 57,1 10,0
AD-68303.1 7,0 2,0 23,9 4,5
AD-68304.1 14,8 2,4 64,2 12,1
AD-68305.1 25,3 3, 8 106, 5 23,8
AD-68306.1 12,4 2,0 19,8 1,8
AD-68307.1 22,2 8,9 93,1 22,6
AD-68308.1 22,2 4,0 79,6 7,8
AD-68309.1 8,0 2,7 19,9 3,7
Пример 6. Оценка in vivo конъюгатов GO-GalNAc у мышей линии С57В6.
Конъюгаты GO-GalNAc вводили дозами подкожно мышам линии С57В6 в концентрации, составляющей 10, 5, 2,5 или 1,25 мг/кг, и при помощи qPCR оценивали степень нокдауна мРНК в печени через 72 ч после введения доз. Значения ED50 для однократной дозы составляют примерно 1,25 и 2,5 мг/кг для соединения A (AD-62994) и соединения В (AD-62933) соответственно. При исследованиях с повторной дозой конъюгаты вводили дозами подкожно еженедельно (QW) в течение 4 недель и оценивали уровни мРНК GO в печени через 72 ч после 4-ой дозы. Значения ED50 повторной дозы составляли ~0,3 мг/кг для обоих соединений. Результаты показаны на фиг. 4.
Пример 7. Оценка in vivo степени нокдауна GO и влияния на уровни оксалатов у KO по AGXT мышей.
siRNA для GO (AD-40257) в липидных наночастицах (LNP) вводили дозами внутривенно KO по AGXT мышам (Salido et al. (2006) PNAS 103:18249) в концентрации, составляющей 1 мг/кг. Уровни оксалатов или гликолата в моче измеряли на 15-й день при помощи ионообменной хроматографии/массспектроскопии. Результаты показаны на фиг. 5. Данные выражали относительно показателей до введения доз и нормализовали по отношению к уровню креатинина (Cr) для регулирования разбавления мочи. N=4 мышей на группу и планки погрешностей представляют среднее квадратичное отклонение.
Пример 8. Оценка in vivo конъюгатов GO-GalNAc на крысиной модели с нокдауном по AGXT.
Для получения крысиной модели PH1 siRNA для AGXT (AD-63102) в LNP (AF-011-63102) вводили дозами в концентрации, составляющей 1 мг/кг, внутривенно самкам крыс линии Sprague Dawley на 1-й день и на 7-й день для поддержания нокдауна AGXT в печени крыс и 1% этиленгликоля добавляли к питьевой воде для дополнительной стимуляции образования оксалатов. На 0-й день и 7-й день некоторым крысам также вводили дозами конъюгат GalNAc-siRNA для GO (AD-62994) или PBS-контроль. Результаты показаны на фиг. 6. На фиг. 6А показана количественная оценка уровней мРНК AGXT в печени через 72 ч после однократной дозы siRNA для AGXT в LNP, составляющей 1 мг/кг. На фиг. 6В, уровни оксалатов в моче количественно определяли с помощью собранной за 24 ч мочи, собранной с -1-го дня по 0-й день, с 3-го дня по 4-й день, с 5-го дня по 6-й день и с 7-го дня по 8-й день. Данные нормализовали по отношению к уровню креатинина для регулирования разбавления мочи. N=3 для групп AGXT и N=2 для группы PBS-контроля. На фиг. 6С, за этими же крысами (что и на фиг. 6В) далее наблюдали до 49-го дня с продолжающимся еженедельным введением доз на 14 и 21 дни как AF-011-63102, так и AD-62994 и сборами мочи за 24 ч, как показано. Этиленгликоль продолжали добавлять в питьевую воду до 28-го дня. На фиг. 6D продолжительность нокдауна HAO1 у крыс показана при помощи измерения уровней мРНК
- 101 037115 либо через одну неделю, либо через четыре недели после последней из 4 доз (что соответствует 28 и 49 дням на фиг. 6С) и приведены относительно уровней, наблюдаемых у крыс, которых лечили при помощи
PBS. Планки погрешностей представляют среднее квадратичное отклонение везде, где используются.
Название дуплекса Мишень Название смысловой целевой нити
AD-40257.1 HAO1 NM_017545,2_1306-1324_s
AD-40257.2 HAO1 NM_017545,2_1306-1324_s
AD-63102.1 AGXT NM_016702,3_1109-1127_s
AD-63102.2 AGXT NM_016702,3_1109-1127_s
AD-63102.3 AGXT NM_016702,3_1109-1127_s
Название дуплекса Модифицированная последовательность смысловой нити Немодифицированная последовательность смысловой нити SEQ ID NO:
AD-40257.1 uucAAuGGGuGuccuAGGAdTsdT UU CAAU G G GU GU С CUAGGA 770 и 771
AD-40257.2 uucAAuGGGuGuccuAGGAdTsdT UU CAAU G G GU GU C CUAGGA 770 и 771
AD-63102.1 AcAAcuGGAGGGAcAu с GudT s dT ACAACUGGAGGGACAUCGU 772 и 773
AD-63102.2 AcAAcuGGAGGGAcAu cGudT s dT ACAACUGGAGGGACAUCGU 772 и 773
AD-63102.3 AcAAcuGGAGGGAcAu c GudT s dT ACAACUGGAGGGACAUCGU 772 и 773
Название дуплекса Модифицированная последовательность антисмысловой нити Немодифицированная последовательность антисмысловой нити SEQ ID NO:
AD-40257.1 и С CuAG GAcAC С cAUU GAAdT s dT и С CUAGGACAC С CAUU GAA 774 и 775
AD-40257.2 U C CuAG GAcAC C cAUU GAAdT s dT U С CUAGGACAC С CAUU GAA 774 и 775
AD-63102.1 ACGAUGUCCCUCcAGUUGUdTsdT ACGAUGUCCCUCCAGUUGU 776 и 777
AD-63102.2 ACGAUGUCCCUCcAGUUGUdTsdT ACGAUGUCCCUCCAGUUGU 776 и 777
AD-63102.3 ACGAUGUCCCUCcAGUUGUdTsdT ACGAUGUCCCUCCAGUUGU 776 и 777
Пример 9. Оценка in vivo конъюгатов GO-GalNAc.
Самкам мышей линии C57BL/6 возрастом 6-8 недель вводили однократную подкожную дозу конъюгатов siRNA-GalNac для GO, в табл. 9. Мышей выводили из эксперимента через 72 ч и печень анализировали в отношении мРНК НАО при помощи анализа с bDNA. Результаты показаны на фиг. 13.
Таблица 9
Конъюгаты siRNA-GalNac для GO (НАО)
Название дуплекса Модифицированная последовательность смысловой нити SEQ ID NO:
AD-62989.2 UfscsCfuAfgGfaAfCfCfuUfuUfaGfaAfaUfL96 778
AD-62994.2 GfsasCfuUfuCfaUfCfCfuGfgAfaAfuAfuAfL96 779
AD-62933.2 GfsasAfuGfuGfaAfAfGfuCfaUfcGfaCfaAfL9 6 780
AD-62935.2 CfsasUfuGfgUfgAfGfGfaAfaAfaUfcCfuUfL96 781
AD-62940.2 AfsusCfgAfcAfaGfAfCfaUfuGfgUfgAfgAfL96 782
AD-62941.2 AfscsAfuUfgGfuGfAfGfgAfaAfaAfuCfcUfL96 783
AD-62944.2 GfsasAfaGfuCfaUfCfGfaCfaAfgAfcAfuUfL96 784
AD-62965.2 AfsasAfgUfcAfuCfGfAfcAfaGfaCfaUfuAfL96 785
Название дуплекса Модифицированная антисмысловая нить SEQ ID NO:
AD-62989.2 asUfsuUfcUfaAfaAfgguUfcCfuAfgGfascsa 786
AD-62994.2 usAfsuAfuUfuCfcAfggaUfgAfaAfgUfcscsa 787
AD-62933.2 usUfsgUfcGfaUfgAfcuuUfcAfcAfuUfcsusg 788
AD-62935.2 asAfsgGfaUfuUfuUfccuCfaCfcAfaUfgsusc 789
AD-62940.2 usCfsuCfaCfcAfaUfgucUfuGfuCfgAfusgsa 790
AD-62941.2 asGfsgAfuUfuUfuCfcucAfcCfaAfuGfusesu 791
AD-62944.2 asAfsuGfuCfuUfgUfcgaUfgAfcUfuUfcsasc 792
AD-62965.2 usAfsaUfgUfcUfuGfucgAfuGfaCfuUfuscsa 793
- 102 037115
Название дуплекса Перекрестная реактивность Морской свинки? ММ к мыши ММ к GP
AD-62989.2 Hs да пол. 8
AD-62994.2 Hs нет пол. 16 пол. 2, 12, 16
AD-62933.2 Hs/Mm да
AD-62935.2 Hs/Mm да
AD-62940.2 Hs/Mm да
AD-62941.2 Hs/Mm да
AD-62944.2 Hs/Mm да
AD-62 9 65.2 Hs/Mm да
Пример 10. Оценка in vivo конъюгатов GO-GalNAc у мышей.
Самкам мышей линии С57 BL/6 вводили однократную подкожную дозу, составляющую 3 мг/кг, ряда конъюгатов siRNA-GalNAc для GO, описанных в данном документе, или PBS-контроль. Мышей выводили из эксперимента через 72 ч и при помощи qPCR оценивали степень нокдауна мРНК НАО1 в печени. Результаты показаны на фиг. 14, выраженные относительно PBS-контроля.
Пример 11. Оценка эффекта дозы конъюгатов GO-GalNAc у мышей.
Самкам мышей линии С57 BL/6 вводили однократную подкожную дозу, составляющую либо 1, либо 3 мг/кг, одного из конъюгатов siRNA-GalNAc для GO, соединения A (AD-62994), соединения В (AD-62933), соединения С (AD-65644), соединения D (AD-65626), соединения Е (AD-65590), соединения F (AD-65585) или PBS-контроля. Через десять дней мышей выводили из эксперимента и при помощи qPCR оценивали степень нокдауна мРНК НАО1 в печени. При исследованиях с повторной дозой соединения С, D, F или PBS-контроль вводили дозами подкожно еженедельно (QW) в течение 4 недель и уровни мРНК HAO1 в печени оценивали через 10 дней после последней дозы. Результаты экспериментов с использованием однократной дозы показаны на фиг. 15 и экспериментов с использованием повторной дозы показаны на фиг. 16, выраженные относительно PBS-контроля. Из этих данных видна улучшенная действенность соединений AD-65644 и AD-65626 относительно AD-62933 и соединений AD-65590 и AD-65585 относительно AD-62994.
Пример 12. Оценка эффекта дозы соединения D у мышей.
Самкам мышей линии С57 BL/6 вводили однократную подкожную дозу AD-65626 или PBS-контроля, составляющую 0,1, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг. Через десять дней мышей выводили из эксперимента и при помощи qPCR оценивали степень нокдауна мРНК НАО1 в печени, при этом результаты выражали относительно PBS-контроля, как показано на фиг. 17. Из этих результатов видно более чем 3-кратное улучшение действенности по сравнению с соединением AD-62933.
Пример 13. Взаимосвязь нокдауна мРНК с уровнями гликолата в сыворотке крови у мышей.
Самкам мышей линии С57 BL/6 вводили однократную подкожную дозу AD-65585 или PBS-контроля, составляющую 0,1, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг. Через десять дней мышей выводили из эксперимента и при помощи qPCR оценивали степень нокдауна мРНК НАО1 в печени, при этом результаты выражали относительно PBS-контроля. Уровни гликолата в образцах сыворотки крови от этих же самых мышей количественно определяли при помощи ионообменной хроматографии совместно с массспектроскопией, как описано ранее (Knight et al., Anal. Biochem. 1 Февраля 2012 г; 421(1): 121-124). Результаты для этих экспериментов показаны на фиг. 18.
Из этих результатов видно, что AD-65585 является таким же действенным, как и AD-65626, оба характеризуются значением ED50 однократной дозы, составляющим ~0,3 мг/кг, у мышей WT. Кроме того, сайленсинг мРНК HAO1 приводит к зависимым от дозы повышениям уровня гликолата в сыворотке крови, составляющим до 4 раз (примерно 200 мкМ), при двух наивысших дозах.
Пример 14. Взаимосвязь нокдауна мРНК с уровнями гликолата в сыворотке крови у крыс.
Самцам крыс линии Sprague Dawley вводили однократную подкожную дозу AD-65626 или PBS-контроля, составляющую 1, 3 или 10 мг/кг. Через четырнадцать дней крыс выводили из эксперимента и при помощи qPCR оценивали степень нокдауна мРНК НАО1 в печени, при этом результаты выражали относительно PBS-контроля. Уровни гликолата в образцах сыворотки крови от этих же самых крыс, собранные как перед введением доз, так и на 14-й день, количественно определяли при помощи ионообменной хроматографии совместно с масс-спектроскопией, и в этом случае также как описано (Knight et al., Anal. Biochem. 1 Февраля 2012 г; 421(1):121-124). Результаты для этих экспериментов показаны на фиг. 19.
Согласно результатам наблюдений за мышами дикого типа из этих результатов также видно, что сайленсинг мРНК НАО1 у крыс линии Sprague Dawley приводит к зависимым от дозы повышениям уровня гликолата в сыворотке крови, составляющим до 12 раз (примерно 140 мкМ), при двух наивысших дозах.
- 103 037115
Пример 15. Исследование фармакологических свойств ALN-65585.
Ингибирование HAO1 в гепатоцитах.
Первичные гепатоциты яванского макака трансфицировали с помощью RNAimax (Invitrogen) серийно разведенным AD-65585 (ALN-65585, ALN-GO1) или контролем, представляющим собой ненацеливающуюся мРНК с люциферазой (AD1955), в концентрации, составляющей 10 нМ. Относительные уровни мРНК НАО1 определяли путем нормализации в отношении уровней мРНК GAPDH, которые количественно определяли при помощи RT-PCR в режиме реального времени. Данные наносили на график с расчетом показателя IC50, составляющего 10 пМ. Результаты показаны на фиг. 20.
Трансфекция in vitro AD-65585 показала значение ED50, составляющее примерно 10 пМ, на первичных гепатоцитах яванского макака.
Фармакологические свойства однократной дозы у мыши.
Фармакологические свойства ALN-GO1 оценивали у мышей путем количественного определения уровней мРНК HAO1 в печени и гликолата в сыворотке крови (фиг. 21). Однократная SC доза ALN-GO1 приводила к дозозависимой супрессии мРНК HAO1 в дозе, составляющей 10 мг/кг, приводящей к сайленсингу со значением ED90. Установили, что доза со значением ED50 для сайленсинга GO1 у мыши составляет 0,3 мг/кг. Уровни гликолата в сыворотке крови повышались зависимым от дозы образом, при этом максимальный уровень составлял примерно в 4 раза выше от исходных уровней. Результаты показаны на фигуре 21, на которой показаны уровни мРНК НАО1 в печени и гликолата в сыворотке крови через 10 дней после однократной подкожной дозы ALN-65585 у мышей линии C57BL/6. Столбики представляют среднее значение, полученное от 3 или 4 животных, и планки погрешностей отображают среднее квадратичное отклонение.
Продолжительность действия однократной дозы у мыши.
Сайленсинг GO1 был долговременным и обратимым после однократной SC дозы (фиг. 22). Однократная SC доза ALN-GO1 у мышей в концентрации, составляющей 3 мг/кг, приводила к >70% сайленсингу мРНК в течение примерно 6 недель, после чего уровни мРНК возвращались к исходным уровням через 12 недель после введения дозы. Результаты показаны на фиг. 22: уровни мРНК НАО1 в печени в многочисленные моменты времени после однократной подкожной дозы ALN-65585 у мышей линии C57BL/6. Каждая точка измерения представляет среднее значение, полученное от 3 животных, и планки погрешностей отображают среднее квадратичное отклонение.
Фармакологические свойства однократной дозы у крысы Фармакологические свойства ALN-GO1 оценивали у крыс путем количественного определения уровней мРНК НАО1 в печени (фиг. 23). Однократное SC введение ALN-GO1 самцам крыс линии Sprague Dawley приводило к дозозависимой супрессии мРНК HAO1 в дозе, составляющей >3 мг/кг, приводящей к сайленсингу со значением ED90. Результаты показаны на фиг. 23: уровни мРНК HAO1 в печени через 10 дней после однократной подкожной дозы ALN-65585 у крыс линии Sprague Dawley. Столбики представляют среднее значение, полученное от 3 животных, и планки погрешностей отображают среднее квадратичное отклонение. Установили, что доза со значением ED50 для сайленсинга GO1 у крысы составляет 0,3 мг/кг.
Фармакологические свойства однократной дозы у KO по AGXT мыши.
Влияние ALN-GO1 на уровни оксалатов оценивали на КО по AGXT мышиной модели РН1. Результаты показаны на фиг. 24. Выделение оксалатов (вверху) и гликолата (внизу) с мочой за 24 ч KO по AGXT мышей после однократной подкожной дозы ALN-65585. Разные буквы означают значимое различие между 3 группами доз на каждой конкретной неделе (n=3 на дозу). Выделение с мочой с течением времени существенно не изменяется у животных с PBS-контролем (n=1).
Уровни оксалатов в моче показали дозозависимые сокращения количества после однократной дозы ALN-GO1 с наибольшим примерно 50% снижением количества оксалатов при дозе, составляющей 3 мг/кг, которое длилось в течение >3 недель перед возвращением к уровням до введения дозы. Уровни гликолата в моче показали дозозависимые повышения после однократной дозы ALN-GO1 с наибольшими примерно 5-кратными повышениями при дозе, составляющей 3 мг/кг, которые длились в течение >4 недель.
Фармакологические свойства однократной дозы на индуцированной крысиной модели РН1.
ALN-GO1 оценивали на второй модели РН1 на грызунах, при которой у крыс с использованием siRNA ингибировали AGXT в печени и уровни оксалатов стимулировали этиленгликолем (фиг. 25А и 25В). Уровни мРНК НАО1 в печени и оксалатов в моче за 24 ч количественно определяли для определения степени снижения НАО1, необходимой для наибольшего сокращения количества оксалатов. Результаты показаны на фиг. 25А и 25В: уровни мРНК НАО1 в печени у крысиной индуцированной модели РН1 через 14 дней после однократной подкожной дозы ALN-65585 и еженедельного введения доз siRNA AF-011-AGXT (2 дозы, составляющие 1 мг/кг). Уровни оксалатов в моче за 24 ч, нормализованные к уровням креатинина в моче. Столбики представляют среднее значение, полученное от 3 животных, и планки погрешностей отображают среднее квадратичное отклонение. Корреляционное поле снижения уровней мРНК и оксалатов представляет отдельных животных из множества экспериментов.
- 104 037115
Однократная доза ALN-GO1 в этой модели показала дозозависимое снижение уровней мРНК и оксалатов в моче с примерно 85% наибольшим сокращением количества мРНК и примерно 90% наибольшим сокращением количества оксалатов в моче, наблюдаемые при наивысших дозах ALN-GO1 (фиг. 25А и 25В). В этой индуцированной крысиной модели РН1 сокращения количеств мРНК и оксалатов в моче привели к соотношению 1:1.
Фармакологические свойства многократных доз на индуцированной крысиной модели РН1.
Действенность ALN-GO1 оценивали в исследованиях на нормальных крысах с ингибированной активностью AGXT и этиленгликолем (индуцированная модель РН1) путем количественного определения уровней мРНК НАО1 в печени и оксалатов в моче за 24 ч. Результаты показаны на фиг. 26: уровни мРНК НАО1 в печени у крысиной индуцированной модели РН1 через 28 дней после повторного подкожного введения дозы ALN-65585 и повторного iv введения дозы siRNA AF-011-AGXT (четыре дозы, составляющие 1 мг/кг). Уровни оксалатов в моче за 24 ч, нормализованные к уровням креатинина в моче. Столбики представляют среднее значение, полученное от 2 или 3 животных, и планки погрешностей отображают среднее квадратичное отклонение.
Лечение с помощью ALN-GO1 приводило к устойчивым сокращениям количества оксалатов в моче у всех групп лечения в течение примерно 3 недель. На 28-й день после повторного введения дозы ALN-GO1 (и четырех доз AF-011-AGXT) во всех группах присутствует >95% сокращение количества мРНК, >85% снижение уровней оксалатов в моче.
Фармакологические свойства многократных доз у NHP.
Фармакологические свойства ALN-GO1 оценивали у макаков-крабоедов (отличный от человека примат (NHP)) путем количественного определения уровней мРНК HAO1 при биопсии печени и гликолата в сыворотке крови. В следующей ниже таблице показан план исследования фармакологических свойств с использованием NHP с подробным изображением уровня доз и режима введения доз.
№ группы Тестируемый Уровень дозы Частота введения
объект (мг/кг) ДОЗЫ
1 PBS н. д. QM х 6
2 AD-65585 0,25 QM х 8
3 AD-65585 1 QM х 8
4 AD-65585 1 QM х 6
5 AD-65585 2 QM х 6
6 AD-65585 4 QM х 6
7 AD-65585 2 -> 1 QM х 4 -> QM х 5
Результаты показаны на фиг. 27. Уровни гликолата в сыворотке крови у NHP для всех групп до 85го дня, данные представляют групповые средние величины, полученные от 3 животных на группу, линии представляют среднее квадратичное отклонение. Количество мРНК HAO1 при биопсии печени на 29-й день, линии представляют групповые средние величины, символы представляют уровни мРНК отдельных животных относительно PBS-контроля на 29-й день.
После первого месяца введения доз (29-й день) дозозависимый сайленсинг мРНК наблюдали во всех группах с сайленсингом мРНК до 99% в группах 6 и 7, которым вводили дозы, составляющие 4 мг/кг ежемесячно или 2 мг/кг еженедельно. Наибольшие повышенные уровни гликолата в сыворотке крови, составляющие примерно 70 мкМ, сохранялись в течение по меньшей мере 3 недель в группе 6, которой ежемесячно вводили дозу, составляющую 4 мг/кг. Промежуточный уровень гликолата в сыворотке крови.
Пример 16. Дополнительные последовательности siRNA.
Конструирование дополнительных siRNA выполняли для идентификации siRNA, целенаправленно воздействующих на HAO1, NM_017545.2.
- 105 037115
Немодифицированная последовательность SEQ ID NO: Модифицированная последовательность SEQ ID NO: Нить Длина
AUGUAUGUUACUUCUU AGAGA 794 asusguauGfuUfAfCfu ucuuagagaL96 1890 смысловая 21
U CU CUAAGAAGUAACA UACAUCC 795 usCfsucuAfaGfAfagu aAfcAfuacausesc 1891 антисмысловая 23
U GUAU GUUACUU CUUA GAGAG 796 usgsuaugUfuAfCfUfu cuuagagagL96 1892 смысловая 21
CUCU CUAAGAAGUAAC AUACAUC 797 csUfscucUfaAfGfaag uAfaCfauacasusc 1893 антисмысловая 23
UAGGAU GUAU GUUACU UCUUA 798 usasggauGfuAfUfGfu uacuucuuaL96 1894 смысловая 21
UAAGAAGUAACAUACA UCCUAAA 799 usAfsagaAfgUfAfаса uAfcAfuccuasasa 1895 антисмысловая 23
UUAGGAU GUAU GUUAC UUCUU 800 ususaggaUfgUfAfUfg uuacuucuuL96 1896 смысловая 21
AAGAAGUAACAUACAU CCUAAAA 801 asAfsgaaGfuAfAfcau aCfaUfccuaasasa 1897 антисмысловая 23
AGAAAGGUGUUСAAGA UGUCC 802 asgsaaagGfuGfUfUfc aagauguccL96 1898 смысловая 21
GGACAUCUUGAACACС UUUCUCC 803 gsGfsacaUfcUfUfgaa cAfcCfuuucuscsc 1899 антисмысловая 23
GAAAGGUGUUСAAGAU GUCCU 804 gsasaaggUfgUfUfCfa agauguccuL96 1900 смысловая 21
AGGACAUCUUGAACAC CUUUCUC 805 asGfsgacAfuCfUfuga aCfaCfcuuucsusc 1901 антисмысловая 23
GGGGAGAAAGGUGUUC AAGAU 806 gsgsggagAfaAfGfGfu guucaagauL96 1902 смысловая 21
AU CUUGAACACCUUUС UCCCCCU 807 asUfscuuGfaAfCfacc uUfuCfuccccscsu 1903 антисмысловая 23
GGGGGAGAAAGGUGUU CAAGA 808 gsgsgggaGfaAfAfGfg uguucaagaL96 1904 смысловая 21
UCUUGAACACCUUUCU CCCCCUG 809 usCfsuugAfaCfAfccu uUfcUfcccccsusg 1905 антисмысловая 23
AGAAACUUUGGCUGAU AAUAU 810 asgsaaacUfuUfGfGfc ugauaauauL96 1906 смысловая 21
AUAUUAUCAGСCAAAG UUUCUUC 811 asUfsauuAfuCfAfgcc aAfaGfuuucususc 1907 антисмысловая 23
GAAACUUUGGCUGAUA AUAUU 812 gsasaacuUfuGfGfCfu gauaauauuL96 1908 смысловая 21
- 106 037115
AAUAUUAUCAGCCAAA GUUUCUU 813 asAfsuauUfaUfCfage cAfaAfguuucsusu 1909 антисмысловая 23
AUGAAGAAACUUUGGC UGAUA 814 asusgaagAfaAfCfUfu uggcugauaL96 1910 смысловая 21
UAUCAGCCAAAGUUUC UUCAUCA 815 usAfsucaGfcCfAfaag uUfuCfuucauscsa 1911 антисмысловая 23
GAUGAAGAAACUUUGG CUGAU 816 gsasugaaGfaAfAfCfu uuggcugauL96 1912 смысловая 21
AUCAGCCAAAGUUUCU U CAU CAU 817 asUfscagCfcAfAfagu uUfcUfucaucsasu 1913 антисмысловая 23
AAGGCACUGAUGUUCU GAAAG 818 asasggcaCfuGfAfUfg uucugaaagL96 1914 смысловая 21
CUUU CAGAACAU CAGU GCCUUUC 819 esUfsuucAfgAfAfcau cAfgUfgccuususc 1915 антисмысловая 23
AGGCACUGAUGUUCUG AAAGC 820 asgsgcacUfgAfUfGfu ucugaaagcL96 1916 смысловая 21
GCUUUCAGAACAUCAG UGCCUUU 821 gsCfsuuuCfaGfAfаса uCfaGfugccususu 1917 антисмысловая 23
CGGAAAGGCACUGAUG UUCUG 822 esgsgaaaGfgCfAfCfu gauguucugL96 1918 смысловая 21
CAGAACAUCAGUGCCU UUCCGCA 823 csAfsgaaCfaUfCfagu gCfcUfuuccgscsa 1919 антисмысловая 23
GCGGAAAGGCACUGAU GUUCU 824 gscsggaaAfgGfCfAfc ugauguucuL96 1920 смысловая 21
AGAACAUCAGUGCCUU UCCGCAC 825 asGfsaacAfuCfAfgug cCfuUfuccgcsasc 1921 антисмысловая 23
AGAAGACU GACAU CAU UGCCA 826 asgsaagaCfuGfAfCfa ucauugccaL96 1922 смысловая 21
UGGCAAUGAUGUCAGU CUUCUCA 827 usGfsgcaAfuGfAfugu cAfgUfcuucuscsa 1923 антисмысловая 23
GAAGACU GACAU CAUU GCCAA 828 gsasagacUfgAfCfAfu cauugccaaL96 1924 смысловая 21
UUGGCAAUGAUGUCAG UCUUCUC 829 usUfsggcAfaUfGfaug uCfaGfucuucsusc 1925 антисмысловая 23
GCUGAGAAGACUGACA UCAUU 830 gscsugagAfaGfAfCfu gacaucauuL96 1926 смысловая 21
AAU GAU GU CAGU CUUC UCAGCCA 831 asAfsugaUfgUfCfagu cUfuCfucagcscsa 1927 антисмысловая 23
- 107 037115
GGCUGAGAAGACUGAC AU CAU 832 gsgscugaGfaAfGfAfc ugacaucauL96 1928 смысловая 21
AU GAU GU CAGU CUU CU CAGCCAU 833 asUfsgauGfuCfAfguc uUfcUfcagccsasu 1929 антисмысловая 23
UAAUGCCUGAUUCACA ACUUU 834 usasaugcCfuGfAfUfu cacaacuuuL96 1930 смысловая 21
AAAGUUGUGAAUCAGG CAUUACC 835 asAfsaguUfgUfGfaau cAfgGfcauuascsc 1931 антисмысловая 23
AAUGCCUGAUUCACAA CUUUG 836 asasugccUfgAfUfUfc acaacuuugL96 1932 смысловая 21
CAAAGUU GU GAAU CAG GCAUUAC 837 csAf saagUfuGfUfgaa uCfaGfgcauusasc 1933 антисмысловая 23
UUGGUAAUGCCUGAUU CACAA 838 ususgguaAfuGfCfCfu gauucacaaL96 1934 смысловая 21
UUGUGAAUCAGGCAUU ACCAACA 839 usUfsgugAfaUfCfagg cAfuUfaccaascsa 1935 антисмысловая 23
GUUGGUAAUGCCUGAU UCACA 840 gsusugguAfaUfGfCfc ugauucacaL96 1936 смысловая 21
UGUGAAUCAGGCAUUA CCAACAC 841 usGfsugaAfuCfAfggc aUfuAfccaacsasc 1937 антисмысловая 23
UAUCAAAUGGCUGAGA AGACU 842 usasucaaAfuGfGfCfu gagaagacuL96 1938 смысловая 21
AGU CUU CU CAGC CAUU UGAUAUC 843 asGfsucuUfcUfCfagc cAfuUfugauasusc 1939 антисмысловая 23
AUCAAAUGGCUGAGAA GACUG 844 asuscaaaUfgGfCfUfg agaagacugL96 1940 смысловая 21
CAGU CUU CU CAGCCAU UUGAUAU 845 csAf sgucUfuCfUfcag cCfaUfuugausasu 1941 антисмысловая 23
AAGAUAUCAAAUGGCU GAGAA 846 asasgauaUfcAfAfAfu ggcugagaaL96 1942 смысловая 21
UU CU CAGC CAUUU GAU AUCUUCC 847 usUfscucAfgCfCfauu uGfaUfaucuuscsc 1943 антисмысловая 23
GAAGAUAUCAAAUGGC UGAGA 848 gsasagauAfuCfAfAfa uggcugagaL96 1944 смысловая 21
U CU CAGC CAUUU GAUA UCUUCCC 849 usCfsucaGfcCfAfuuu gAfuAfucuucs cs c 1945 антисмысловая 23
UCUGACAGUGCACAAU AUUUU 850 uscsugacAfgUfGfCfa caauauuuuL96 1946 смысловая 21
- 108 037115
AAAAUAUUGUGCACUG UCAGAUC 851 asAfsaauAfuUfGfugc aCfuGfucagasusc 1947 антисмысловая 23
CUGACAGUGCACAAUA UUUUC 852 csusgacaGfuGfCfAfc aauauuuucL96 1948 смысловая 21
GAAAAUAUUGUGCACU GUCAGAU 853 gsAfsaaaUfaUfUfgug cAfcUfgucagsasu 1949 антисмысловая 23
AAGAUCUGACAGUGCA CAAUA 854 asasgaucUfgAfCfAfg ugcacaauaL96 1950 смысловая 21
UAUU GU GCACU GU CAG AUCUUGG 855 usAf suugUfgCfAfcug uCfaGfaucuusgsg 1951 антисмысловая 23
CAAGAUCUGACAGUGC ACAAU 856 csasagauCfuGfAfCfa gugcacaauL96 1952 смысловая 21
AUUGUGCACUGUCAGA UCUUGGA 857 asUfsuguGfcAfCfugu cAfgAfucuugsgsa 1953 антисмысловая 23
ACUGAUGUUCUGAAAG CUCUG 858 ascsugauGfuUfCfUfg aaagcucugL96 1954 смысловая 21
CAGAGCUUUCAGAACA UCAGUGC 859 csAf sgagCfuUfUfcag aAfcAfucagusgs c 1955 антисмысловая 23
CUGAUGUUCUGAAAGC UCUGG 860 csusgaugUfuCfUfGfa aagcucuggL96 1956 смысловая 21
CCAGAGCUUUCAGAAC AUCAGUG 861 csCfsagaGfcUfUfuca gAfaCfaucagsusg 1957 антисмысловая 23
AGGCACUGAUGUUCUG AAAGC 862 asgsgcacUfgAfU fGfu ucugaaagcL96 1958 смысловая 21
GCUUUCAGAACAUCAG UGCCUUU 863 gsCfsuuuCfaGfAfаса uCfaGfugccususu 1959 антисмысловая 23
AAGGCACUGAUGUUCU GAAAG 864 asasggcaCfuGfAfUfg uucugaaagL96 1960 смысловая 21
CUUUCAGAACAUCAGU GCCUUUC 865 csUfsuucAfgAfAfcau cAfgUfgccuususc 1961 антисмысловая 23
AACAACAUGCUAAAUC AGUAC 866 asascaacAfuGfCfUfa aaucaguacL96 1962 смысловая 21
GUACU GAUUUAGCAU G UUGUUCA 867 gsUfsacuGfaUfUfuag cAfuGfuuguuscsa 1963 антисмысловая 23
ACAACAUGCUAAAUCA GUACU 868 ascsaacaUfgCfUfAfa aucaguacuL96 1964 смысловая 21
AGUACUGAUUUAGCAU GUUGUUC 869 asGfsuacUfgAfUfuua gCfaUfguugususc 1965 антисмысловая 23
- 109 037115
UAUGAACААСAUGCUA AAUCA 870 usasugaaCfaAfCfAfu gcuaaaucaL96 1966 смысловая 21
U GAUUUAGCAU GUU GU UCAUAAU 871 usGfsauuUfaGfCfaug uUfgUfucauasasu 1967 антисмысловая 23
UUAUGAACAACAUGCU AAAUC 872 ususaugaAfcAfAfCfa ugcuaaaucL96 1968 смысловая 21
GAUUUAGCAUGUUGUU CAUAAUC 873 gsAfsuuuAfgCfAfugu uGfuUfcauaasusc 1969 антисмысловая 23
UCUUUAGUGUCUGAAU AU AUC 874 uscsuuuaGfuGfUfCfu gaauauaucL96 1970 смысловая 21
GAUAUAUU CAGACACU AAAGAUG 875 gsAfsuauAfuUfCfaga cAfcUfaaagasusg 1971 антисмысловая 23
CUUUAGUGUCUGAAUA UAUCC 876 csusuuagUfgUfCfUfg aauauauccL96 1972 смысловая 21
GGAUAUAUUCAGACAC UAAAGAU 877 gsGfsauaUfaUfUfcag aCfaCfuaaagsasu 1973 антисмысловая 23
CACAU CUUUAGU GU CU GAAUA 878 csascaucUfuUfAfGfu gucugaauaL96 1974 смысловая 21
UAUU CAGACACUAAAG AUGUGAU 879 usAfsuucAfgAfCfacu aAfaGfaugugsasu 1975 антисмысловая 23
U CACAU CUUUAGU GU C UGAAU 880 uscsacauCfuUfUfAfg ugucugaauL96 1976 смысловая 21
AUU CAGACACUAAAGA UGUGAUU 881 asUfsucaGfaCfAfcua aAfgAfugugasusu 1977 антисмысловая 23
U GAUACUU CUUU GAAU GUAGA 882 usgsauacUfuCfUfUfu gaauguagaL96 1978 смысловая 21
U CUACAUU CAAAGAAG UAUCACC 883 usCfsuacAfuUfCfaaa gAfaGfuaucascsc 1979 антисмысловая 23
GAUACUU CUUU GAAU G UAGAU 884 gsasuacuUfcUfUfUfg aauguagauL96 1980 смысловая 21
AU CUACAUU CAAAGAA GUAUCAC 885 asUfscuaCfaUfUfcaa aGfaAfguaucsasc 1981 антисмысловая 23
UUGGUGAUACUUCUUU GAAUG 886 ususggugAfuAfCfUfu cuuugaaugL96 1982 смысловая 21
CAUU CAAAGAAGUAU C ACCAAUU 887 csAfsuucAfaAfGfaag uAfuCfaccaasusu 1983 антисмысловая 23
AUUGGUGAUACUUCUU UGAAU 888 asusugguGfaUfAfCfu ucuuugaauL96 1984 смысловая 21
- 110 037115
AUU CAAAGAAGUAU CA CCAAUUA 889 asUfsucaAfaGfAfagu aUfcAfccaaususa 1985 антисмысловая 23
AAUAAC CU GU GAAAAU GCUCC 890 asasuaacCfuGfUfGfa aaaugcuccL96 1986 смысловая 21
GGAGCAUUUUCACAGG UUAUUGC 891 gsGfsagcAfuUfUfuca cAfgGfuuauusgsc 1987 антисмысловая 23
AUAAC CU GU GAAAAU G CUCCC 892 asusaaccUfgUfGfAfa aaugcucccL96 1988 смысловая 21
GGGAGCAUUUUCACAG GUUAUUG 893 gsGfsgagCfaUfUfuuc aCfaGfguuaususg 1989 антисмысловая 23
UAGCAAUAACCUGUGA AAAUG 894 usasgcaaUfaAfCfCfu gugaaaaugL96 1990 смысловая 21
CAUUUUCACAGGUUAU UGCUAUC 895 csAf suuuUfcAfCfagg uUfaUfugcuasusc 1991 антисмысловая 23
AUAGCAAUAACCUGUG AAAAU 896 asusagcaAfuAfAfCfc ugugaaaauL96 1992 смысловая 21
AUUUUCACAGGUUAUU GCUAUCC 897 asUfsuuuCfaCfAfggu uAfuUfgcuauscsc 1993 антисмысловая 23
AAU CACAU CUUUAGU G UCUGA 898 asasucacAfuCfUfUfu agugucugaL96 1994 смысловая 21
U CAGACACUAAAGAU G UGAUUGG 899 usCfsagaCfaCfUfaaa gAfuGfugauusgsg 1995 антисмысловая 23
AU CACAU CUUUAGU GU CUGAA 900 asuscacaUfcUfUfUfa gugucugaaL96 1996 смысловая 21
UU CAGACACUAAAGAU GUGAUUG 901 usUfscagAfcAfCfuaa aGfaUfgugaususg 1997 антисмысловая 23
UUCCAAUCACAUCUUU AGUGU 902 ususccaaUfcAfCfAfu cuuuaguguL96 1998 смысловая 21
ACACUAAAGAU GU GAU UGGAAAU 903 asCfsacuAfaAfGfaug uGfaUfuggaasasu 1999 антисмысловая 23
UUUCCAAUCACAUCUU UAGUG 904 ususuccaAfuCfAfCfa ucuuuagugL96 2000 смысловая 21
CACUAAAGAU GU GAUU GGAAAUC 905 csAfscuaAfaGfAfugu gAfuUfggaaasusc 2001 антисмысловая 23
ACGGGCAUGAUGUUGA GUUCC 906 ascsgggcAfuGfAfUfg uugaguuccL96 2002 смысловая 21
GGAACUСAACAUCAUG CCCGUUC 907 gsGfsaacUfcAfAfcau cAfuGfcccgususc 2003 антисмысловая 23
- 111 037115
CGGGCAUGAUGUUGAG UUCCU 908 csgsggcaUfgAfUfGfu ugaguuccuL96 2004 смысловая 21
AGGAACUСAACAUCAU GCCCGUU 909 asGfsgaaCfuCfAfаса uCfaUfgcccgsusu 2005 антисмысловая 23
GGGAACGGGCAUGAUG UUGAG 910 gsgsgaacGfgGfCfAfu gauguugagL96 2006 смысловая 21
GUCAACAUGAUGGСCG UUCCCAG 911 csUfscaaCfaUfCfaug cCfcGfuucccsasg 2007 антисмысловая 23
UGGGAACGGGCAUGAU GUUGA 912 usgsggaaCfgGfGfCfa ugauguugaL96 2008 смысловая 21
UCAACAUGAUGССCGU UCCCAGG 913 usCfsaacAfuCfAfugc cCfgUfucccasgsg 2009 антисмысловая 23
ACUAAGGUGAAAAGAU AAUGA 914 ascsuaagGfuGfAfAfa agauaaugaL96 2010 смысловая 21
UCAUUAUCUUUUCACC UUAGUGU 915 usCfsauuAfuCfUfuuu cAfcCfuuagusgsu 2011 антисмысловая 23
CUAAGGUGAAAAGAUA AU GAU 916 csusaaggUfgAfAfAfa gauaaugauL96 2012 смысловая 21
AU CAUUAU CUUUU GAG CUUAGUG 917 asUfscauUfaUfCfuuu uCfaCfcuuagsusg 2013 антисмысловая 23
AAACACUAAGGUGAAA AGAUA 918 asasacacUfaAfGfGfu gaaaagauaL96 2014 смысловая 21
UAU CUUUU GAG CUUAG UGUUUGC 919 usAfsucuUfuUfCfacc uUfaGfuguuusgsc 2015 антисмысловая 23
CAAACACUAAGGUGAA AAGAU 920 csasaacaCfuAfAfGfg ugaaaagauL96 2016 смысловая 21
AU CUUUU CAC CUUAGU GUUUGCU 921 asUfs cuuU fuCfAfccu uAfgUfguuugscsu 2017 антисмысловая 23
AGGUAGCACUGGAGAG AAUUG 922 asgsguagCfaCfUfGfg agagaauugL96 2018 смысловая 21
CAAUUCUGUCCAGUGG UACCUUC 923 csAfsauuCfuCfUfcca gUfgCfuaccususc 2019 антисмысловая 23
GGUAGCACUGGAGAGA AUUGG 924 gsgsuagcAfcUfGfGfa gagaauuggL96 2020 смысловая 21
CCAAUUCUCUCCAGUG CUACCUU 925 csCfsaauUfcUfCfucc aGfuGfcuaccsusu 2021 антисмысловая 23
GAGAAGGUAGCACUGG AGAGA 926 gsasgaagGfuAfGfCfa cuggagagaL96 2022 смысловая 21
- 112 037115
U CU CU C CAGU GCUAC C UUCUCAA 927 usCfsucuCfcAfGfugc uAfcCfuucucsasa 2023 антисмысловая 23
UGAGAAGGUAGCACUG GAGAG 928 usgsagaaGfgUfAfGfc acuggagagL96 2024 смысловая 21
CU CU C CAGU GCUAC CU UCUCAAA 929 esUfscucCfaGfUfgcu aCfcUfucucasasa 2025 антисмысловая 23
AGUGGACUUGCUGCAU AUGUG 930 asgsuggaCfuUfGfCfu gcauaugugL96 2026 смысловая 21
CACAUAUGCAGCAAGU CCACUGU 931 csAfscauAfuGfCfage aAfgUfccacusgsu 2027 антисмысловая 23
GUGGACUUGCUGCAUA UGUGG 932 gsusggacUfuGfCfUfg cauauguggL96 2028 смысловая 21
CCACAUAUGCAGCAAG UCCACUG 933 csCfsacaUfaUfGfcag cAfaGfuccacsusg 2029 антисмысловая 23
CGACAGUGGACUUGCU GCAUA 934 csgsacagUfgGfAfCfu ugcugcauaL96 2030 смысловая 21
UAUGCAGCAAGUCCAC UGUCGUC 935 usAfsugcAfgCfAfagu cCfaCfugucgsusc 2031 антисмысловая 23
ACGACAGUGGACUUGC UGCAU 936 ascsgacaGfuGfGfAfc uugcugcauL96 2032 смысловая 21
AUGCAGCAAGUCCACU GUCGUCU 937 asUfsgcaGfcAfAfguc cAfcUfgucguscsu 2033 антисмысловая 23
AAGGUGUUCAAGAUGU CCUCG 938 asasggugUfuCfAfAfg auguccucgL96 2034 смысловая 21
CGAGGACAUCUUGAAC ACCUUUC 939 esGfsaggAfcAfUfcuu gAfaCfaccuususc 2035 антисмысловая 23
AGGUGUUCAAGAUGUC CUC GA 940 asgsguguUfcAfAfGfa uguccucgaL96 2036 смысловая 21
UCGAGGACAUCUUGAA CACCUUU 941 usCfsgagGfaCfAfucu uGfaAfcaccususu 2037 антисмысловая 23
GAGAAAGGUGUUCAAG AUGUC 942 gsasgaaaGfgUfGfUfu caagaugucL96 2038 смысловая 21
GACAU CUU GAACAC CU UUCUCCC 943 gsAfscauCfuUfGfaac aCfcUfuucucscsc 2039 антисмысловая 23
GGAGAAAGGUGUUCAA GAUGU 944 gsgsagaaAfgGfUfGfu ucaagauguL96 2040 смысловая 21
ACAUCUUGAACACCUU UCUCCCC 945 asCfsaucUfuGfAfаса cCfuUfucuccscsc 2041 антисмысловая 23
- 113 037115
ААСCGUCUGGAUGAUG UGCGU 946 asasccguCfuGfGfAfu gaugugcguL96 2042 смысловая 21
AC G CACAU CAU С CAGA CGGUUGC 947 asCfsgcaCfaUfCfauc cAfgAfcgguusgsc 2043 антисмысловая 23
ACCGUCUG GAU GAU GU GCGUA 948 ascscgucUfgGfAfUfg augugcguaL96 2044 смысловая 21
UAC G CACAU CAU С CAG ACGGUUG 949 usAfscgcAfcAfUfcau cCfaGfacggususg 2045 антисмысловая 23
GGGCAACCGUCUGGAU GAUGU 950 gsgsgcaaCfcGfUfCfu ggaugauguL96 2046 смысловая 21
ACAU CAU С CAGAC G GU UGCCCAG 951 asCfsaucAfuCfCfaga cGfgUfugcccsasg 2047 антисмысловая 23
UGGGCAACCGUCUGGA UGAUG 952 usgsggcaAfcCfGfUfc uggaugaugL96 2048 смысловая 21
CAU CAU C CAGAC GGUU GCCCAGG 953 csAf sucaUfcCfAfgac gGfuUfgcccasgsg 2049 антисмысловая 23
GAAACUUUGGCUGAUA AUAUU 954 gsasaacuUfuGfGfCfu gauaauauuL96 2050 смысловая 21
AAUAUUAU CAGC CAAA GUUUCUU 955 asAf suauUfaUfCfage cAfaAfguuucsusu 2051 антисмысловая 23
AAACUUUGGCUGAUAA UAUUG 956 asasacuuUfgGfCfUfg auaauauugL96 2052 смысловая 21
CAAUAUUAUCAGCCAA AGUUUCU 957 csAf sauaUfuAfUfcag cCfaAfaguuuscsu 2053 антисмысловая 23
UGAAGAAACUUUGGCU GAUAA 958 usgsaagaAfaCfUfUfu ggcugauaaL96 2054 смысловая 21
UUAUCAGCCAAAGUUU CUUCAUC 959 usUfsaucAfgCfCfaaa gUfuUfcuucasusc 2055 антисмысловая 23
AUGAAGAAACUUUGGC UGAUA 960 asusgaagAfaAfCfUfu uggcugauaL96 2056 смысловая 21
UAUCAGCCAAAGUUUC UUCAUCA 961 usAf sucaGfcCfAfaag uUfuCfuucauscsa 2057 антисмысловая 23
AAAGGUGUUCAAGAUG UCCUC 962 asasagguGfuUfCfAfa gauguccucL96 2058 смысловая 21
GAGGACAUCUUGAACA CCUUUCU 963 gsAfsggaCfaUfCfuug aAfcAfccuuuscsu 2059 антисмысловая 23
AAGGUGUUCAAGAUGU CCUCG 964 asasggugUfuCfAfAfg auguccucgL96 2060 смысловая 21
- 114 037115
CGAGGACAUCUUGAAC ACCUUUC 965 csGfsaggAfcAfUfcuu gAfaCfaccuususc 2061 антисмысловая 23
GGAGAAAGGUGUUCAA GAUGU 966 gsgsagaaAfgGfUfGfu ucaagauguL96 2062 смысловая 21
ACAUCUUGAACACCUU UCUCCCC 967 asCfsaucUfuGfAfаса cCfuUfucuccscsc 2063 антисмысловая 23
GGGAGAAAGGUGUUCA AGAUG 968 gsgsgagaAfaGfGfUfg uucaagaugL96 2064 смысловая 21
CAUCUUGAACACCUUU CUCCCCC 969 csAfsucuUfgAfAfcac cUfuUfcucccscsc 2065 антисмысловая 23
AAAU CAGUACUU С CAA AGUCU 970 asasaucaGfuAfCfUfu ccaaagucuL96 2066 смысловая 21
AGACUUUGGAAGUACU GAUUUAG 971 asGfsacuUfuGfGfaag uAfcUfgauuusasg 2067 антисмысловая 23
AAU CAGUACUU С CAAA GUCUA 972 asasucagUfaCfUfUfc caaagucuaL96 2068 смысловая 21
UAGACUUUGGAAGUAC UGAUUUA 973 usAf sgacUfuUfGfgaa gUfaCfugauususa 2069 антисмысловая 23
UGCUAAAUCAGUACUU CCAAA 974 usgscuaaAfuCfAfGfu acuuccaaaL96 2070 смысловая 21
UUUGGAAGUACUGAUU UAGCAUG 975 usUfsuggAfaGfUfacu gAfuUfuagcasusg 2071 антисмысловая 23
AUGCUAAAUCAGUACU UCCAA 976 asusgcuaAfaUfCfAfg uacuuccaaL96 2072 смысловая 21
UUGGAAGUACUGAUUU AGCAUGU 977 usUfsggaAfgUfAfcug aUfuUfagcausgsu 2073 антисмысловая 23
ACAU CUUUAGU GU CU G AAUAU 978 ascsaucuUfuAfGfUfg ucugaauauL96 2074 смысловая 21
AUAUU CAGACACUAAA GAUGUGA 979 asUfsauuCfaGfAfcac uAfaAfgaugusgsa 2075 антисмысловая 23
CAUCUUUAGUGUCUGA AUAUA 980 csasucuuUfaGfUfGfu cugaauauaL96 2076 смысловая 21
UAUAUU CAGACACUAA AGAUGUG 981 usAfsuauUfcAfGfаса cUfaAfagaugsusg 2077 антисмысловая 23
AAU CACAU CUUUAGU G UCUGA 982 asasucacAfuCfUfUfu agugucugaL96 2078 смысловая 21
U CAGACACUAAAGAU G UGAUUGG 983 usCfsagaCfaCfUfaaa gAfuGfugauusgsg 2079 антисмысловая 23
- 115 037115
CAAU CACAU CUUUAGU GUCUG 984 csasaucaCfaUfCfUfu uagugucugL96 2080 смысловая 21
CAGACACUAAAGAU GU GAUUGGA 985 csAf sgacAfcUfAfaag aUfgUfgauugsgsa 2081 антисмысловая 23
GCAU GUAUUACUU GAG AAAGA 986 gscsauguAfuUfAfCfu ugacaaagaL96 2082 смысловая 21
U CUUU GU CAAGUAAUA CAUGCUG 987 usCfsuuuGfuCfAfagu aAfuAfGaugesusg 2083 антисмысловая 23
CAU GUAUUACUU GACA AAGAG 988 csasuguaUfuAfCfUfu gacaaagagL96 2084 смысловая 21
CUCUUUGUCAAGUAAU ACAUGCU 989 esUfscuuUfgUfCfaag uAfaUfacaugscsu 2085 антисмысловая 23
UU CAGCAU GUAUUACU UGACA 990 ususcagcAfuGfUfAfu uacuugacaL96 2086 смысловая 21
U GU CAAGUAAUACAU G CUGAAAA 991 usGfsucaAfgUfAfaua cAfuGfcugaasasa 2087 антисмысловая 23
UUU CAGCAU GUAUUAC UUGAC 992 ususucagCfaUfGfUfa uuacuugacL96 2088 смысловая 21
GUCAAGUAAUACAUGC UGAAAAA 993 gsUfscaaGfuAfAfuac aUfgCfugaaasasa 2089 антисмысловая 23
AU GUUACUU CUUAGAG AGAAA 994 asusguuaCfuUfCfUfu agagagaaaL96 2090 смысловая 21
UUU CU CU CUAAGAAGU AACAUAC 995 usUfsucuCfuCfUfaag aAfgUfaacausasc 2091 антисмысловая 23
U GUUACUU CUUAGAGA GAAAU 996 usgsuuacUfuCfUfUfa gagagaaauL96 2092 смысловая 21
AUUUCUCUCUAAGAAG UAACAUA 997 asUfsuucUfcUfCfuaa gAfaGfuaacasusa 2093 антисмысловая 23
AUGUAUGUUACUUCUU AGAGA 998 asusguauGfuUfAfCfu ucuuagagaL96 2094 смысловая 21
U CU CUAAGAAGUAACA UACAUCC 999 usCfsucuAfaGfAfagu aAfcAfuacausesc 2095 антисмысловая 23
GAU GUAU GUUACUU CU UAGAG 1000 gsasuguaUfgUfUfAfc uucuuagagL96 2096 смысловая 21
CU CUAAGAAGUAACAU ACAUCCU 1001 esUfscuaAfgAfAfgua aCfaUfacaucscsu 2097 антисмысловая 23
ACAACUUUGAGAAGGU AGCAC 1002 ascsaacuUfuGfAfGfa agguagcacL96 2098 смысловая 21
- 116 037115
GUGCUACCUUCUCAAA GUUGUGA 1003 gsUfsgcuAfcCfUfucu cAfaAfguugusgsa 2099 антисмысловая 23
CAACUUUGAGAAGGUA GCACU 1004 csasacuuUfgAfGfAfa gguagcacuL96 2100 смысловая 21
AGUGCUACCUUCUCAA AGUUGUG 1005 asGfsugcUfaCfCfuuc uCfaAfaguugsusg 2101 антисмысловая 23
AUU CACAACUUU GAGA AGGUA 1006 asusucacAfaCfUfUfu gagaagguaL96 2102 смысловая 21
UAC CUU CU CAAAGUU G UGAAUCA 1007 usAf sccuUfcUfCfaaa gUfuGfugaauscsa 2103 антисмысловая 23
GAUU CACAACUUU GAG AAGGU 1008 gsasuucaCfaAfCfUfu ugagaagguL96 2104 смысловая 21
AC CUU CU CAAAGUU GU GAAUCAG 1009 asCfscuuCfuCfAfaag uUfgUfgaaucsasg 2105 антисмысловая 23
AACAUGCUAAAUCAGU ACUUC 1010 asascaugCfuAfAfAfu caguacuucL96 2106 смысловая 21
GAAGUACUGAUUUAGC AUGUUGU 1011 gsAfsaguAfcUfGfauu uAfgCfauguusgsu 2107 антисмысловая 23
ACAUGCUAAAUCAGUA CUUCC 1012 ascsaugcUfaAfAfUfc aguacuuccL96 2108 смысловая 21
GGAAGUACUGAUUUAG CAUGUUG 1013 gsGfsaagUfaCfUfgau uUfaGfcaugususg 2109 антисмысловая 23
GAACAACAUGCUAAAU CAGUA 1014 gsasacaaCfaUfGfCfu aaaucaguaL96 2110 смысловая 21
UACU GAUUUAGCAU GU UGUUCAU 1015 usAfscugAfuUfUfage aUfgUfuguucsasu 2111 антисмысловая 23
UGAACAACAUGCUAAA UCAGU 1016 usgsaacaAfcAfUfGfc uaaaucaguL96 2112 смысловая 21
ACUGAUUUAGCAUGUU GUUCAUA 1017 asCfsugaUfuUfAfgea uGfuUfguucasusa 2113 антисмысловая 23
AAAC CAGUACUUUAU C AUUUU 1018 asasaccaGfuAfCfUfu uaucauuuuL96 2114 смысловая 21
AAAAU GAUAAAGUACU GGUUUCA 1019 asAf saauGfaUfAfaag uAfcUfgguuuscsa 2115 антисмысловая 23
AAC CAGUACUUUAU CA UUUUC 1020 asasccagUfaCfUfUfu aucauuuucL96 2116 смысловая 21
GAAAAU GAUAAAGUAC UGGUUUC 1021 gsAf saaaUfgAfUfaaa gUfaCfugguususc 2117 антисмысловая 23
- 117 037115
UUU GAAAC CAGUACUU UAUCA 1022 ususugaaAfcCfAfGfu acuuuaucaL96 2118 смысловая 21
UGAUAAAGUACUGGUU UGAAAAU 1023 usGfsauaAfaGfUfacu gGfuUfucaaasasu 2119 антисмысловая 23
UUUU GAAAC CAGUACU UUAUC 1024 ususuugaAfaCfCfAfg uacuuuaucL96 2120 смысловая 21
GAUAAAGUACUGGUUU CAAAAUU 1025 gsAfsuaaAfgUfAfcug gUfuUfcaaaasusu 2121 антисмысловая 23
GAGAAGAUGGGCUACA AGGCC 1026 gsasgaagAfuGfGfGfc uacaaggccL96 2122 смысловая 21
GGCCUUGUAGCCCAUC UUCUCUG 1027 gsGfsccuUfgUfAfgcc cAfuCfuucucsusg 2123 антисмысловая 23
AGAAGAUGGGCUACAA GGCCA 1028 asgsaagaUfgGfGfCfu acaaggccaL96 2124 смысловая 21
UGGCCUUGUAGCCCAU CUUCUCU 1029 usGfsgccUfuGfUfagc cCfaUfcuucuscsu 2125 антисмысловая 23
GGCAGAGAAGAUGGGC UACAA 1030 gsgscagaGfaAfGfAfu gggcuacaaL96 2126 смысловая 21
UU GUAGC C CAU CUU CU CUGCCUG 1031 usUfsguaGfcCfCfauc uUfcUfcugccsusg 2127 антисмысловая 23
AGGCAGAGAAGAUGGG CUACA 1032 asgsgcagAfgAfAfGfa ugggcuacaL96 2128 смысловая 21
UGUAGCCCAUCUUCUC UGCCUGC 1033 usGfsuagCfcCfAfucu uCfuCfugccusgsc 2129 антисмысловая 23
AACGGGCAUGAUGUUG AGUUC 1034 asascgggCfaUfGfAfu guugaguucL96 2130 смысловая 21
GAACUCAACAUCAUGC CCGUUCC 1035 gsAf sacuCfaAfCfauc aUfgCfccguuscsc 2131 антисмысловая 23
ACGGGCAUGAUGUUGA GUUCC 1036 ascsgggcAfuGfAfUfg uugaguuccL96 2132 смысловая 21
GGAACUCAACAUCAUG CCCGUUC 1037 gsGfsaacUfcAfAfcau cAfuGfcccgususc 2133 антисмысловая 23
UGGGAACGGGCAUGAU GUU GA 1038 usgsggaaCfgGfGfCfa ugauguugaL96 2134 смысловая 21
UCAACAUCAUGССCGU UCCCAGG 1039 usCfsaacAfuCfAfugc cCfgUfucccasgsg 2135 антисмысловая 23
CUGGGAACGGGCAUGA UGUUG 1040 csusgggaAfcGfGfGfc augauguugL96 2136 смысловая 21
- 118 037115
CAACAUCAUGСCCGUU CCCAGGG 1041 csAfsacaUfcAfUfgcc cGfuUfcccagsgsg 2137 антисмысловая 23
AUGUGGCUAAAGCAAU AGACC 1042 asusguggCfuAfAfAfg caauagaccL96 2138 смысловая 21
GGUCUAUUGCUUUAGC CACAUAU 1043 gsGfsucuAfuUfGfcuu uAfgCfcacausasu 2139 антисмысловая 23
UGUGGCUAAAGCAAUA GACCC 1044 usgsuggcUfaAfAfGfc aauagacccL96 2140 смысловая 21
GGGUCUAUUGCUUUAG CCACAUA 1045 gsGfsgucUfaUfUfgcu uUfaGfccacasusa 2141 антисмысловая 23
GCAUAUGUGGCUAAAG CAAUA 1046 gscsauauGfuGfGfCfu aaagcaauaL96 2142 смысловая 21
UAUUGCUUUAGCCACA UAUGCAG 1047 usAfsuugCfuUfUfage cAfcAfuaugcsasg 2143 антисмысловая 23
UGCAUAUGUGGCUAAA GCAAU 1048 usgscauaUfgUfGfGfc uaaagcaauL96 2144 смысловая 21
AUUGCUUUAGCCACAU AUGCAGC 1049 asUfsugcUfuUfAfgcc aCfaUfaugcasgsc 2145 антисмысловая 23
AGGAUGCUCCGGAAUG UUGCU 1050 asgsgaugCfuCfCfGfg aauguugcuL96 2146 смысловая 21
AGCAACAUUCCGGAGC AUCCUUG 1051 asGfscaaCfaUfUfccg gAfgCfauccususg 2147 антисмысловая 23
GGAUGCUCCGGAAUGU UGCUG 1052 gsgsaugcUfcCfGfGfa auguugcugL96 2148 смысловая 21
CAGCAACAUUCCGGAG CAUCCUU 1053 csAfsgcaAfcAfUfucc gGfaGfcauccsusu 2149 антисмысловая 23
UCCAAGGAUGCUCCGG AAUGU 1054 uscscaagGfaUfGfCfu ccggaauguL96 2150 смысловая 21
ACAUUCCGGAGCAUCC UUGGAUA 1055 asCfsauuCfcGfGfage aUfcCfuuggasusa 2151 антисмысловая 23
AUCCAAGGAUGCUCCG GAAUG 1056 asusccaaGfgAfUfGfc uccggaaugL96 2152 смысловая 21
CAUUCCGGAGCAUCCU UGGAUAC 1057 csAfsuucCfgGf Afgea uCfcUfuggausasc 2153 антисмысловая 23
U CACAU CUUUAGU GU C UGAAU 1058 uscsacauCfuUfUfAfg ugucugaauL96 2154 смысловая 21
AUU CAGACACUAAAGA UGUGAUU 1059 asUfsucaGfaCfAfcua aAfgAfugugasusu 2155 антисмысловая 23
- 119 037115
CACAU CUUUAGU GU CU GAAUA 1060 csascaucUfuUfAfGfu gucugaauaL96 2156 смысловая 21
UAUU CAGACACUAAAG AUGUGAU 1061 usAfsuucAfgAfCfacu aAfaGfaugugsasu 2157 антисмысловая 23
C CAAU CACAU CUUUAG UGUCU 1062 cscsaaucAfcAfUfCfu uuagugucuL96 2158 смысловая 21
AGACACUAAAGAU GU G AUUGGAA 1063 asGfsacaCfuAfAfaga uGfuGfauuggsasa 2159 антисмысловая 23
U C CAAU CACAU CUUUA GUGUC 1064 uscscaauCfaCfAfUfc uuuagugucL96 2160 смысловая 21
GACACUAAAGAU GU GA UUGGAAA 1065 gsAfscacUfaAfAfgau gUfgAfuuggasasa 2161 антисмысловая 23
AAAUGUGUUUAGACAA CGUCA 1066 asasauguGfuUfUfAfg acaacgucaL96 2162 смысловая 21
U GAC GUU GU CUAAACA CAUUUUC 1067 usGfsacgUfuGfUfcua aAfcAfcauuususc 2163 антисмысловая 23
AAU GU GUUUAGACAAC GUCAU 1068 asasugugUfuUfAfGfa caacgucauL96 2164 смысловая 21
AU GAC GUU GU CUAAAC ACAUUUU 1069 asUfsgacGfuUfGfucu aAfaCfacauususu 2165 антисмысловая 23
UU GAAAAU GU GUUUAG ACAAC 1070 ususgaaaAfuGfUfGfu uuagacaacL96 2166 смысловая 21
GUU GU CUAAACACAUU UUCAAUG 1071 gsUfsuguCfuAfAfаса cAfuUfuucaasusg 2167 антисмысловая 23
AUU GAAAAU GU GUUUA GACAA 1072 asusugaaAfaUfGfUfg uuuagacaaL96 2168 смысловая 21
UU GU CUAAACACAUUU UCAAUGU 1073 usUfsgucUfaAfAfcac aUfuUfucaausgsu 2169 антисмысловая 23
UACUAAAGGAAGAAUU CCGGU 1074 usascuaaAfgGfAfAfg aauuccgguL96 2170 смысловая 21
ACCGGAAUUCUUCCUU UAGUAUC 1075 asCfscggAfaUfUfcuu cCfuUfuaguasusc 2171 антисмысловая 23
ACUAAAGGAAGAAUUC CGGUU 1076 ascsuaaaGfgAfAfGfa auuccgguuL96 2172 смысловая 21
AACCGGAAUUCUUCCU UUAGUAU 1077 asAfsccgGfaAfUfucu uCfcUfuuagusasu 2173 антисмысловая 23
GAGAUACUAAAGGAAG AAUUC 1078 gsasgauaCfuAfAfAfg gaagaauucL96 2174 смысловая 21
- 120 037115
GAAUUCUUCCUUUAGU AU CUCGA 1079 gsAfsauuCfuUfCfcuu uAfgUfaucucsgsa 2175 антисмысловая 23
CGAGAUACUAAAGGAA GAAUU 1080 esgsagauAfcUfAfAfa ggaagaauuL96 2176 смысловая 21
AAUUCUUCCUUUAGUA UCUCGAG 1081 asAfsuucUfuCfCfuuu aGfuAfucucgsasg 2177 антисмысловая 23
AACUUUGGCUGAUAAU AUUGC 1082 asascuuuGfgCfUfGfa uaauauugcL96 2178 смысловая 21
GCAAUAUUAUCAGCCA AAGUUUC 1083 gsCfsaauAfuUfAfuca gCfcAfaaguususc 2179 антисмысловая 23
ACUUUGGCUGAUAAUA UUGCA 1084 ascsuuugGfcUfGfAfu aauauugcaL96 2180 смысловая 21
UGCAAUAUUAUCAGCC AAAGUUU 1085 usGfscaaUfaUfUfauc aGfcCfaaagususu 2181 антисмысловая 23
AAGAAACUUUGGCUGA UAAUA 1086 asasgaaaCfuUfUfGfg cugauaauaL96 2182 смысловая 21
UAUUAUCAGСCAAAGU UUCUUCA 1087 usAfsuuaUfcAfGfcca aAfgUfuucuuscsa 2183 антисмысловая 23
GAAGAAACUUUGGCUG AUAAU 1088 gsasagaaAfcUfUfUfg gcugauaauL96 2184 смысловая 21
AUUAUCAGCCAAAGUU U CUU CAU 1089 asUfsuauCfaGfCfcaa aGfuUfucuucsasu 2185 антисмысловая 23
AAAUGGCUGAGAAGAC UGACA 1090 asasauggCfuGfAfGfa agacugacaL96 2186 смысловая 21
U GU CAGU CUU CU CAGC CAUUUGA 1091 usGfsucaGfuCfUfucu cAfgCfcauuusgsa 2187 антисмысловая 23
AAUGGCUGAGAAGACU GACAU 1092 asasuggcUfgAfGfAfa gacugacauL96 2188 смысловая 21
AU GU CAGU CUU CU CAG CCAUUUG 1093 asUfsgucAfgUfCfuuc uCfaGfccauususg 2189 антисмысловая 23
UAUCAAAUGGCUGAGA AGACU 1094 usasucaaAfuGfGfCfu gagaagacuL96 2190 смысловая 21
AGU CUU CU CAGC CAUU UGAUAUC 1095 asGfsucuUfcUfCfagc cAfuUfugauasusc 2191 антисмысловая 23
AUAUCAAAUGGCUGAG AAGAC 1096 asusaucaAfaUfGfGfc ugagaagacL96 2192 смысловая 21
GU CUU CU CAGC CAUUU GAUAUCU 1097 gsUfscuuCfuCfAfgcc aUfuUfgauauscsu 2193 антисмысловая 23
- 121 037115
GUGGUUCUUAAAUUGU AAGCU 1098 gsusgguuCfuUfAfAfa uuguaagcuL96 2194 смысловая 21
AGCUUACAAUUUAAGA ACCACUG 1099 asGfscuuAfcAfAfuuu aAfgAfaccacsusg 2195 антисмысловая 23
UGGUUCUUAAAUUGUA AGCUC 1100 usgsguucUfuAfAfAfu uguaagcucL96 2196 смысловая 21
GAGCUUACAAUUUAAG AACCACU 1101 gsAf sgcuUfaCfAfauu uAfaGfaaccascsu 2197 антисмысловая 23
AACAGUGGUUCUUAAA UUGUA 1102 asascaguGfgUfUfCfu uaaauuguaL96 2198 смысловая 21
UACAAUUUAAGAAC CA CUGUUUU 1103 usAf scaaUfuUfAfaga aCfcAfcuguususu 2199 антисмысловая 23
AAACAGUGGUUCUUAA AUUGU 1104 asasacagUfgGfUfUfc uuaaauuguL96 2200 смысловая 21
ACAAUUUAAGAAC CAC UGUUUUA 1105 asCfsaauUfuAfAfgaa cCfaCfuguuususa 2201 антисмысловая 23
AAGU CAU C GACAAGAC AUUGG 1106 asasgucaUfcGfAfCfa agacauuggL96 2202 смысловая 21
C CAAU GU CUU GU C GAU GACUUUC 1107 csCfsaauGfuCfUfugu cGfaUfgacuususc 2203 антисмысловая 23
AGU CAU C GACAAGACA UUGGU 1108 asgsucauCfgAfCfAfa gacauugguL96 2204 смысловая 21
AC CAAU GU CUU GU C GA UGACUUU 1109 asCfscaaUfgUfCfuug uCfgAfugacususu 2205 антисмысловая 23
GU GAAAGU CAU C GACA AGACA 1110 gsusgaaaGfuCfAfUfc gacaagacaL96 2206 смысловая 21
U GU CUU GU C GAU GACU UUCACAU 1111 usGfsucuUfgUfCfgau gAfcUfuucacsasu 2207 антисмысловая 23
U GU GAAAGU CAU C GAC AAGAC 1112 usgsugaaAfgUfCfAfu cgacaagacL96 2208 смысловая 21
GUCUUGUCGAUGACUU UCACAUU 1113 gsUfscuuGfuCfGfaug aCfuUfucacasusu 2209 антисмысловая 23
GAUAAUAUUGCAGCAU UUUCC 1114 gsasuaauAfuUfGfCfa gcauuuuccL96 2210 смысловая 21
GGAAAAUGCUGCAAUA UUAUCAG 1115 gsGfsaaaAfuGfCfugc aAfuAfuuaucsasg 2211 антисмысловая 23
AUAAUAUUGCAGCAUU UUCCA 1116 asusaauaUfuGfCfAfg cauuuuccaL96 2212 смысловая 21
- 122 037115
UGGAAAAUGCUGCAAU AUUAUCA 1117 usGfsgaaAfaUfGfcug cAfaUfauuauscsa 2213 антисмысловая 23
GGCUGAUAAUAUUGCA GCAUU 1118 gs gs cugaUfaAfU fAfu ugcagcauuL96 2214 смысловая 21
AAUGCUGCAAUAUUAU CAGCCAA 1119 asAfsugcUfgCfAfaua uUfaUfcagccsasa 2215 антисмысловая 23
UGGCUGAUAAUAUUGC AGCAU 1120 usgsgcugAfuAfAfUfa uugcagcauL96 2216 смысловая 21
AUGCUGCAAUAUUAUC AGCCAAA 1121 asUfsgcuGfcAfAfuau uAfuCfagccasasa 2217 антисмысловая 23
GCUAAUUUGUAUCAAU GAUUA 1122 gscsuaauUfuGfUfAfu caaugauuaL96 2218 смысловая 21
UAAU CAUU GAUACAAA UUAGCCG 1123 usAfsaucAfuUfGfaua cAfaAfuuagcscsg 2219 антисмысловая 23
CUAAUUU GUAU CAAU G AUUAU 1124 csusaauuUfgUfAfUfc aaugauuauL96 2220 смысловая 21
AUAAU CAUU GAUACAA AUUAGCC 1125 asUfsaauCfaUfUfgau aCfaAfauuagscsc 2221 антисмысловая 23
CCCGGCUAAUUUGUAU CAAUG 1126 cs cs cggcUfaAfU fU fu guaucaaugL96 2222 смысловая 21
CAUU GAUACAAAUUAG CCGGGGG 1127 csAfsuugAfuAfCfaaa uUfaGfccgggsgsg 2223 антисмысловая 23
CCCCGGCUAAUUUGUA UCAAU 1128 cscsccggCfuAfAfUfu uguaucaauL96 2224 смысловая 21
AUUGAUACAAAUUAGC CGGGGGA 1129 asUfsugaUfaCfAfaau uAfgCfcggggsgsa 2225 антисмысловая 23
UAAUUGGUGAUACUUC UUUGA 1130 usasauugGfuGfAfUfa cuucuuugaL96 2226 смысловая 21
U CAAAGAAGUAU СAC C AAUUACC 1131 usCfsaaaGfaAfGfuau cAfcCfaauuascsc 2227 антисмысловая 23
AAUUGGUGAUACUUCU UUGAA 1132 asasuuggUfgAfUfAfc uucuuugaaL96 2228 смысловая 21
UU CAAAGAAGUAU CAC CAAUUAC 1133 usUfscaaAfgAfAfgua uCfaCfcaauusasc 2229 антисмысловая 23
GCGGUAAUUGGUGAUA CUUCU 1134 gscsgguaAfuUfGfGfu gauacuucuL96 2230 смысловая 21
AGAAGUAU CAC CAAUU ACCGCCA 1135 asGfsaagUfaUfCfacc aAfuUfaccgcscsa 2231 антисмысловая 23
- 123 037115
GGCGGUAAUUGGUGAU ACUUC 1136 gsgscgguAfaUfUfGfg ugauacuucL96 2232 смысловая 21
GAAGUAU CAC CAAUUA CCGCCAC 1137 gsAfsaguAfuCfAfcca aUfuAfccgccsasc 2233 антисмысловая 23
CAGUGGUUCUUAAAUU GUAAG 1138 csasguggUfuCfUfUfa aauuguaagL96 2234 смысловая 21
CUUACAAUUUAAGAAC CACUGUU 1139 csUfsuacAfaUfUfuaa gAfaCfcacugsusu 2235 антисмысловая 23
AGUGGUUCUUAAAUUG UAAGC 1140 asgsugguUfcUfUfAfa auuguaagcL96 2236 смысловая 21
GCUUACAAUUUAAGAA CCACUGU 1141 gsCfsuuaCfaAfUfuua aGfaAfccacusgsu 2237 антисмысловая 23
AAAACAGUGGUUCUUA AAUUG 1142 asasaacaGfuGfGfUfu cuuaaauugL96 2238 смысловая 21
CAAUUUAAGAAC CACU GUUUUAA 1143 csAfsauuUfaAfGfaac cAfcUfguuuusasa 2239 антисмысловая 23
UAAAACAGUGGUUCUU AAAUU 1144 usasaaacAfgUfGfGfu ucuuaaauuL96 2240 смысловая 21
AAUUUAAGAACCACUG UUUUAAA 1145 asAfsuuuAfaGfAfacc aCfuGfuuuuasasa 2241 антисмысловая 23
AC CU GUAUU CU GUUUA CAUGU 1146 ascscuguAfuUfCfUfg uuuacauguL96 2242 смысловая 21
ACAU GUAAACAGAAUA CAGGUUA 1147 asCfsaugUfaAfAfcag aAfuAfcaggususa 2243 антисмысловая 23
C CU GUAUU CU GUUUAC AUGUC 1148 cscsuguaUfuCfUfGfu uuacaugucL96 2244 смысловая 21
GACAU GUAAACAGAAU ACAGGUU 1149 gsAf scauGfuAfAfаса gAfaUfacaggsusu 2245 антисмысловая 23
AUUAACCUGUAUUCUG UUUAC 1150 asusuaacCfuGfUfAfu ucuguuuacL96 2246 смысловая 21
GUAAACAGAAUACAGG UUAAUAA 1151 gsUfsaaaCfaGfAfaua cAfgGfuuaausasa 2247 антисмысловая 23
UAUUAACCUGUAUUCU GUUUA 1152 usasuuaaCfcUfGfUfa uucuguuuaL96 2248 смысловая 21
UAAACAGAAUACAGGU UAAUAAA 1153 usAf saacAfgAfAfuac aGfgUfuaauasasa 2249 антисмысловая 23
AAGAAACUUUGGCUGA UAAUA 1154 asasgaaaCfuUfUfGfg cugauaauaL96 2250 смысловая 21
- 124 037115
UAUUAUCAGCCAAAGU UUCUUCA 1155 usAfsuuaUfcAfGfcca aAfgUfuucuuscsa 2251 антисмысловая 23
AGAAACUUUGGCUGAU AAUAU 1156 asgsaaacUfuUfGfGfc ugauaauauL96 2252 смысловая 21
AUAUUAUCAGСCAAAG UUUCUUC 1157 asUfsauuAfuCfAfgcc aAfaGfuuucususc 2253 антисмысловая 23
GAUGAAGAAACUUUGG CUGAU 1158 gsasugaaGfaAfAfCfu uuggcugauL96 2254 смысловая 21
AUCAGCCAAAGUUUCU U CAU CAU 1159 asUfscagCfcAfAfagu uUfcUfucaucsasu 2255 антисмысловая 23
U GAU GAAGAAACUUU G GCUGA 1160 usgsaugaAfgAfAfAfc uuuggcugaL96 2256 смысловая 21
UCAGCCAAAGUUUCUU CAU CAUU 1161 usCfsagcCfaAfAfguu uCfuUfCaucasusu 2257 антисмысловая 23
GAAAGGUGUUCAAGAU GUCCU 1162 gsasaaggUfgUfUfCfa agauguccuL96 2258 смысловая 21
AGGACAUCUUGAACAC CUUUCUC 1163 asGfsgacAfuCfUfuga aCfaCfcuuucsusc 2259 антисмысловая 23
AAAGGUGUUCAAGAUG UCCUC 1164 asasagguGfuUfCfAfa gauguccucL96 2260 смысловая 21
GAGGACAUCUUGAACA CCUUUCU 1165 gsAfsggaCfaUfCfuug aAfcAfccuuuscsu 2261 антисмысловая 23
GGGAGAAAGGUGUUCA AGAUG 1166 gsgsgagaAfaGfGfUfg uucaagaugL96 2262 смысловая 21
CAUCUUGAACACCUUU CUCCCCC 1167 csAfsucuUfgAfAfcac cUfuUfcucccscsc 2263 антисмысловая 23
GGGGAGAAAGGUGUUC AAGAU 1168 gsgsggagAfaAfGfGfu guucaagauL96 2264 смысловая 21
AUCUUGAACACCUUUC UCCCCCU 1169 asUfscuuGfaAfCfacc uUfuCfuccccscsu 2265 антисмысловая 23
AUCUUGGUGUCGAAUC AUGGG 1170 asuscuugGfuGfUfCfg aaucaugggL96 2266 смысловая 21
С C CAU GAUU C GACAC C AAGAUCC 1171 csCfscauGfaUfUfcga cAfcCfaagauscsc 2267 антисмысловая 23
UCUUGGUGUCGAAUCA UGGGG 1172 uscsuuggUfgUfCfGfa aucauggggL96 2268 смысловая 21
С С C CAU GAUU C GACAC CAAGAUC 1173 csCfsccaUfgAfUfucg aCfaCfcaagasusc 2269 антисмысловая 23
- 125 037115
UGGGAUCUUGGUGUCG AAU GA 1174 usgsggauCfuUfGfGfu gucgaaucaL96 2270 смысловая 21
U GAUU C GACAC CAAGA UCCCAUU 1175 usGfsauuCfgAfCfacc aAfgAfucccasusu 2271 антисмысловая 23
AUGGGAUCUUGGUGUC GAAUC 1176 asusgggaUfcUfUfGfg ugucgaaucL96 2272 смысловая 21
GAUU C GACAC CAAGAU CCCAUUC 1177 gsAfsuucGfaCfAfcca aGfaUfcccaususc 2273 антисмысловая 23
GCUACAAGGCCAUAUU UGUGA 1178 gscsuacaAfgGfCfCfa uauuugugaL96 2274 смысловая 21
UCACAAAUAUGGCCUU GUAGCCC 1179 usCfsacaAfaUfAfugg cCfuUfguagcscsc 2275 антисмысловая 23
CUACAAGGCCAUAUUU GUGAC 1180 csusacaaGfgCfCfAfu auuugugacL96 2276 смысловая 21
GUCACAAAUAUGGCCU UGUAGCC 1181 gsUfscacAfaAfUfaug gCfcUfuguagscsc 2277 антисмысловая 23
AUGGGCUACAAGGCCA UAUUU 1182 asusgggcUfaCfAfAfg gccauauuuL96 2278 смысловая 21
AAAUAUGGCCUUGUAG CCCAUCU 1183 asAfsauaUfgGfCfcuu gUfaGfcccauscsu 2279 антисмысловая 23
GAUGGGCUACAAGGCC AUAUU 1184 gsasugggCfuAfCfAfa ggccauauuL96 2280 смысловая 21
AAUAUGGCCUUGUAGC CCAUCUU 1185 asAfsuauGfgCfCfuug uAfgCfccaucsusu 2281 антисмысловая 23
ACUGGAGAGAAUUGGA AUGGG 1186 ascsuggaGfaGfAfAfu uggaaugggL96 2282 смысловая 21
СCCAUUCCAAUUCUCU CCAGUGC 1187 csCfscauUfcCfAfauu cUfcUfccagusgsc 2283 антисмысловая 23
CUGGAGAGAAUUGGAA UGGGU 1188 csusggagAfgAfAfUfu ggaauggguL96 2284 смысловая 21
AC C CAUU C CAAUU CU C UCCAGUG 1189 asCfsccaUfuCfCfaau uCfuCfuccagsusg 2285 антисмысловая 23
UAGCACUGGAGAGAAU UGGAA 1190 usasgcacUfgGfAfGfa gaauuggaaL96 2286 смысловая 21
UUCCAAUUCUCUCCAG UGCUACC 1191 usUfsccaAfuUfCfucu cCfaGfugcuascsc 2287 антисмысловая 23
GUAGCACUGGAGAGAA UUGGA 1192 gsusagcaCfuGfGfAfg agaauuggaL96 2288 смысловая 21
- 126 037115
UCCAAUUCUCUCCAGU GCUACCU 1193 usCfscaaUfuCfUfcue cAfgUfgcuacscsu 2289 антисмысловая 23
ACAGU GGACACAC CUU ACCUG 1194 ascsagugGfaCfAfCfa ccuuaccugL96 2290 смысловая 21
CAGGUAAGGUGUGUCC ACUGUCA 1195 csAfsgguAfaGfGfugu gUfcCfacuguscsa 2291 антисмысловая 23
CAGU GGACACAC CUUA CCUGG 1196 csasguggAfcAfCfAfc cuuaccuggL96 2292 смысловая 21
CCAGGUAAGGUGUGUC CACUGUC 1197 csCfsaggUfaAfGfgug uGfuCfcacugsusc 2293 антисмысловая 23
U GU GACAGU G GACACA CCUUA 1198 usgsugacAfgUfGfGfa cacaccuuaL96 2294 смысловая 21
UAAGGUGUGUСCACUG UCACAAA 1199 usAfsaggUfgUfGfucc aCfuGfucacasasa 2295 антисмысловая 23
UU GU GACAGU G GACAC ACCUU 1200 ususgugaCfaGfUfGfg acacaccuuL96 2296 смысловая 21
AAGGUGUGUСCACUGU CACAAAU 1201 asAfsgguGfuGfUfcca cUfgUfcacaasasu 2297 антисмысловая 23
GAAGACU GACAU CAUU GCCAA 1202 gsasagacUfgAfCfAfu cauugccaaL96 2298 смысловая 21
UUGGCAAUGAUGUCAG UCUUCUC 1203 usUfsggcAfaUfGfaug uCfaGfucuucsusc 2299 антисмысловая 23
AAGACU GACAU CAUU G CCAAU 1204 asasgacuGfaCfAfUfc auugccaauL96 2300 смысловая 21
AUUGGCAAUGAUGUCA GUCUUCU 1205 asUfsuggCfaAfUfgau gUfcAfgucuuscsu 2301 антисмысловая 23
CU GAGAAGACU GACAU CAUUG 1206 esusgagaAfgAfCfUfg acaucauugL96 2302 смысловая 21
CAAU GAU GU CAGU CUU CUCAGCC 1207 csAfsaugAfuGfUfcag uCfuUfcucagscsc 2303 антисмысловая 23
GCUGAGAAGACUGACA UCAUU 1208 gscsugagAfaGfAfCfu gacaucauuL96 2304 смысловая 21
AAU GAU GU CAGU CUU C UCAGCCA 1209 asAfsugaUfgUfCfagu cUfuCfucagcscsa 2305 антисмысловая 23
GCUCAGGUUCAAAGUG UUGGU 1210 gscsucagGfuUfCfAfa aguguugguL96 2306 смысловая 21
AC CAACACUUU GAAC C UGAGCUU 1211 asCfscaaCfaCfUfuug aAfcCfugagesusu 2307 антисмысловая 23
- 127 037115
CUCAGGUUCAAAGUGU UGGUA 1212 csuscaggUfuCfAfAfa guguugguaL96 2308 смысловая 21
UAC CAACACUUU GAAC CUGAGCU 1213 usAfsccaAfcAfCfuuu gAfaCfcugagscsu 2309 антисмысловая 23
GUAAGCUCAGGUUCAA AGUGU 1214 gsusaagcUfcAfGfGfu ucaaaguguL96 2310 смысловая 21
ACACUUUGAACCUGAG CUUACAA 1215 asCfsacuUfuGfAfacc uGfaGfcuuacsasa 2311 антисмысловая 23
UGUAAGCUCAGGUUCA AAGUG 1216 usgsuaagCfuCfAfGfg uucaaagugL96 2312 смысловая 21
CACUUUGAACCUGAGC UUACAAU 1217 csAf scuuUfgAfAfccu gAfgCfuuacasasu 2313 антисмысловая 23
AU GUAUUACUU GACAA AGAGA 1218 asusguauUfaCfUfUfg acaaagagaL96 2314 смысловая 21
UCUCUUUGU CAAGUAA UACAUGC 1219 usCfsucuUfuGfUfcaa gUfaAfuacausgsc 2315 антисмысловая 23
U GUAUUACUU GACAAA GAGAC 1220 usgsuauuAfcUfUfGfa caaagagacL96 2316 смысловая 21
GU CU CUUU GU CAAGUA AUACAUG 1221 gsUfscucUfuUfGfuca aGfuAfauacasusg 2317 антисмысловая 23
CAGCAU GUAUUACUU G ACAAA 1222 csasgcauGfuAfUfUfa cuugacaaaL96 2318 смысловая 21
UUU GU CAAGUAAUACA UGCUGAA 1223 usUfsuguCfaAfGfuaa uAfcAfugcugsasa 2319 антисмысловая 23
U CAGCAU GUAUUACUU GACAA 1224 uscsagcaUfgUfAfUfu acuugacaaL96 2320 смысловая 21
UU GU CAAGUAAUACAU GCUGAAA 1225 usUfsgucAfaGfUfaau aCfaUfgcugasasa 2321 антисмысловая 23
CUGCAACUGUAUAUCU ACAAG 1226 csusgcaaCfuGfUfAfu aucuacaagL96 2322 смысловая 21
CUU GUAGAUAUACAGU UGCAGCC 1227 csUfsuguAfgAfUfaua cAfgUfugcagscsc 2323 антисмысловая 23
UGCAACUGUAUAUCUA CAAGG 1228 usgscaacUfgUfAfUfa ucuacaaggL96 2324 смысловая 21
C CUU GUAGAUAUACAG UUGCAGC 1229 csCfsuugUfaGfAfuau aCfaGfuugcasgsc 2325 антисмысловая 23
UUGGCUGCAACUGUAU AU CUA 1230 ususggcuGfcAfAfCfu guauaucuaL96 2326 смысловая 21
- 128 037115
UAGAUAUACAGUUGCA GCCAACG 1231 usAfsgauAfuAfCfagu uGfcAfgccaascsg 2327 антисмысловая 23
GUUGGCUGCAACUGUA UAUCU 1232 gsusuggcUfgCfAfAfc uguauaucuL96 2328 смысловая 21
AGAUAUACAGUUGCAG CCAACGA 1233 asGfsauaUfaCfAfguu gCfaGfccaacsgsa 2329 антисмысловая 23
CAAAU GAU GAAGAAAC UUUGG 1234 csasaaugAfuGfAfAfg aaacuuuggL96 2330 смысловая 21
CCAAAGUUUCUUCAUC AUUUGCC 1235 csCfsaaaGfuUfUfcuu cAfuCfauuugscsc 2331 антисмысловая 23
AAAU GAU GAAGAAACU UUGGC 1236 asasaugaUfgAfAfGfa aacuuuggcL9 6 2332 смысловая 21
GCCAAAGUUUCUUCAU CAUUUGC 1237 gsCfscaaAfgUfUfucu uCfaUfcauuusgsc 2333 антисмысловая 23
GGGGCAAAUGAUGAAG AAACU 1238 gsgsggcaAfaUfGfAfu gaagaaacuL96 2334 смысловая 21
AGUUUCUUCAUCAUUU GCCCCAG 1239 asGfsuuuCfuUfCfauc aUfuUfgccccsasg 2335 антисмысловая 23
UGGGGCAAAUGAUGAA GAAAC 1240 usgsgggcAfaAfUfGfa ugaagaaacL96 2336 смысловая 21
GUUUCUUCAUCAUUUG CCCCAGA 1241 gsUfsuucUfuCfAfuca uUfuGfccccasgsa 2337 антисмысловая 23
CAAAGGGUGUCGUUCU UUUCC 1242 csasaaggGfuGfUfCfg uucuuuuccL96 2338 смысловая 21
GGAAAAGAACGACACC CUUUGUA 1243 gsGfsaaaAfgAfAfcga cAfcCfcuuugsusa 2339 антисмысловая 23
AAAGGGUGUCGUUCUU UUCCA 1244 asasagggUfgUfCfGfu ucuuuuccaL96 2340 смысловая 21
UGGAAAAGAACGACAC CCUUUGU 1245 usGfsgaaAfaGfAfaeg aCfaCfccuuusgsu 2341 антисмысловая 23
AAUACAAAGGGUGUCG UUCUU 1246 asasuacaAfaGfGfGfu gucguucuuL96 2342 смысловая 21
AAGAACGACACCCUUU GUAUUGA 1247 asAf sgaaCfgAfCfacc cUfuUfguauusgsa 2343 антисмысловая 23
CAAUACAAAGGGUGUC GUUCU 1248 csasauacAfaAfGfGfg ugucguucuL96 2344 смысловая 21
AGAACGACACCCUUUG UAUUGAA 1249 asGfsaacGfaCfAfccc uUfuGfuauugsasa 2345 антисмысловая 23
- 129 037115
AAAGGCACUGAUGUUC U GAAA 1250 asasaggcAfcUfGfAfu guucugaaaL96 2346 смысловая 21
UUU CAGAACAU CAGU G CCUUUCC 1251 usUfsucaGfaAfCfauc aGfuGfccuuuscsc 2347 антисмысловая 23
AAGGCACUGAUGUUCU GAAAG 1252 asasggcaCfuGfAfUfg uucugaaagL96 2348 смысловая 21
CUUU CAGAACAU CAGU GCCUUUC 1253 csUfsuucAfgAfAfcau cAfgUfgccuususc 2349 антисмысловая 23
GCGGAAAGGCACUGAU GUUCU 1254 gscsggaaAfgGfCfAfc ugauguucuL96 2350 смысловая 21
AGAACAUCAGUGCCUU UCCGCAC 1255 asGfsaacAfuCfAfgug cCfuUfuccgcsasc 2351 антисмысловая 23
UGCGGAAAGGCACUGA UGUUC 1256 usgscggaAfaGfGfCfa cugauguucL96 2352 смысловая 21
GAACAUCAGUGCCUUU CCGCACA 1257 gsAf sacaUfcAfGfugc cUfuUfccgcascsa 2353 антисмысловая 23
AAGGAUGCUCCGGAAU GUUGC 1258 asasggauGfcUfCfCfg gaauguugcL96 2354 смысловая 21
GCAACAUUCCGGAGCA UCCUUGG 1259 gsCfsaacAfuUfCfegg aGfcAfuccuusgsg 2355 антисмысловая 23
AGGAUGCUCCGGAAUG UUGCU 1260 asgsgaugCfuCfCfGfg aauguugcuL96 2356 смысловая 21
AGCAACAUUCCGGAGC AUGCUUG 1261 asGfscaaCfaUfUfccg gAfgCfauccususg 2357 антисмысловая 23
AUCCAAGGAUGCUCCG GAAUG 1262 asusccaaGfgAfUfGfc uccggaaugL96 2358 смысловая 21
CAUUCCGGAGCAUCCU UGGAUAC 1263 csAfsuucCfgGfAfgca uCfcUfuggausasc 2359 антисмысловая 23
UAUCCAAGGAUGCUCC GGAAU 1264 usasuccaAfgGfAfUfg cuccggaauL96 2360 смысловая 21
AUUCCGGAGCAUCCUU GGAUACA 1265 asUfsuccGfgAfGfcau cCfuUfggauascsa 2361 антисмысловая 23
AAUGGGUGGCGGUAAU UGGUG 1266 asasugggUfgGfCfGfg uaauuggugL96 2362 смысловая 21
CACCAAUUACCGCCAC CCAUUCC 1267 csAfsccaAfuUfAfccg cCfaCfccauuscsc 2363 антисмысловая 23
AUGGGUGGCGGUAAUU GGUGA 1268 asusggguGfgCfGfGfu aauuggugaL96 2364 смысловая 21
- 130 037115
UCACCAAUUACCGCCA ССCAUUС 1269 usCfsaccAfaUfUfacc gCfcAfcccaususc 2365 антисмысловая 23
UUGGAAUGGGUGGCGG UAAUU 1270 ususggaaUfgGfGfUfg gcgguaauuL96 2366 смысловая 21
AAUUАССGССАСССAU UCCAAUU 1271 asAfsuuaCfcGfCfcac cCfaUfuccaasusu 2367 антисмысловая 23
AUUGGAAUGGGUGGCG GUAAU 1272 asusuggaAfuGfGfGfu ggcgguaauL96 2368 смысловая 21
AUUAC С GC САС С CAUU CCAAUUC 1273 asUfsuacCfgCfCfacc cAfuUfccaaususc 2369 антисмысловая 23
GGAAAGGCACUGAUGU U CU GA 1274 gsgsaaagGfcAfCfUfg auguucugaL96 2370 смысловая 21
UСAGAACAUСAGUGСС UUUCCGC 1275 usCfsagaAfcAfUfcag uGfcCfuuuccsgsc 2371 антисмысловая 23
GAAAGGCACUGAUGUU CUGAA 1276 gsasaaggCfaCfUfGfa uguucugaaL96 2372 смысловая 21
UUСAGAACAUСAGUGС CUUUCCG 1277 usUfscagAfaCfAfuca gUfgCfcuuucscsg 2373 антисмысловая 23
GUGCGGAAAGGCACUG AUGUU 1278 gsusgcggAfaAfGfGfc acugauguuL96 2374 смысловая 21
AACAUCAGUGCCUUUC CGCACAC 1279 asAfscauCfaGfUfgcc uUfuCfcgcacsasc 2375 антисмысловая 23
UGUGCGGAAAGGCACU GAUGU 1280 usgsugcgGfaAfAfGfg cacugauguL96 2376 смысловая 21
ACAU CAGU GC CUUU С С GCACACC 1281 asCfsaucAfgUfGfccu uUfcCfgcacasesc 2377 антисмысловая 23
AAUUGUAAGCUCAGGU UCAAA 1282 asasuuguAfaGfCfUfc agguucaaaL96 2378 смысловая 21
UUUGAACCUGAGCUUA CAAUUUA 1283 usUfsugaAfcCfUfgag cUfuAfcaauususa 2379 антисмысловая 23
AUUGUAAGCUCAGGUU CAAAG 1284 asusuguaAfgCfUfCfa gguucaaagL96 2380 смысловая 21
CUUUGAACCUGAGCUU ACAAUUU 1285 esUfsuugAfaCfCfuga gCfuUfacaaususu 2381 антисмысловая 23
CUUAAAUUGUAAGCUС AGGUU 1286 csusuaaaUfuGfUf Afa gcucagguuL96 2382 смысловая 21
ААСCUGAGCUUACAAU UUAAGAA 1287 asAf sccuGfaGfCfuua cAfaUfuuaagsasa 2383 антисмысловая 23
- 131 037115
UCUUAAAUUGUAAGCU CAGGU 1288 uscsuuaaAfuUfGfUfa agcucagguL96 2384 смысловая 21
ACCUGAGCUUACAAUU UAAGAAC 1289 asCfscugAfgCfUfuac aAfuUfuaagasasc 2385 антисмысловая 23
GCAAACACUAAGGUGA AAAGA 1290 gscsaaacAfcUfAfAfg gugaaaagaL96 2386 смысловая 21
U CUUUU GAG CUUAGU G UUUGCUA 1291 usCfsuuuUfcAfCfcuu aGfuGfuuugcsusa 2387 антисмысловая 23
CAAACACUAAGGUGAA AAGAU 1292 csasaacaCfuAfAfGfg ugaaaagauL96 2388 смысловая 21
AU CUUUU CAC CUUAGU GUUUGCU 1293 asUfscuuUfuCfAfccu uAfgUfguuugscsu 2389 антисмысловая 23
GGUAGCAAACACUAAG GUGAA 1294 gsgsuagcAfaAfCfAfc uaaggugaaL96 2390 смысловая 21
UU CAC CUUAGU GUUU G CUACCUC 1295 usUfscacCfuUfAfgug uUfuGfcuaccsusc 2391 антисмысловая 23
AGGUAGCAAACACUAA GGUGA 1296 asgsguagCfaAfAfCfa cuaaggugaL96 2392 смысловая 21
U CAC CUUAGU GUUU GC UACCUCC 1297 usCfsaccUfuAfGfugu uUfgCfuaccuscsc 2393 антисмысловая 23
AGGUAGCAAACACUAA GGUGA 1298 asgsguagCfaAfAfCfa cuaaggugaL96 2394 смысловая 21
U CAC CUUAGU GUUU GC UACCUCC 1299 usCfsaccUfuAfGfugu uUfgCfuaccuscsc 2395 антисмысловая 23
GGUAGCAAACACUAAG GUGAA 1300 gsgsuagcAfaAfCfAfc uaaggugaaL96 2396 смысловая 21
UU CAC CUUAGU GUUU G CUACCUC 1301 usUfscacCfuUfAfgug uUfuGfcuaccsusc 2397 антисмысловая 23
UUGGAGGUAGCAAACA CUAAG 1302 ususggagGfuAfGfCfa aacacuaagL96 2398 смысловая 21
CUUAGU GUUU GCUAC C UCCAAUU 1303 csUfsuagUfgUfUfugc uAf cCfuccaasusu 2399 антисмысловая 23
AUUGGAGGUAGCAAAC ACUAA 1304 asusuggaGfgUfAfGfc aaacacuaaL96 2400 смысловая 21
UUAGU GUUU GCUAC CU CCAAUUU 1305 usUfsaguGfuUfUfgcu aCfcUfccaaususu 2401 антисмысловая 23
UAAAGUGCUGUAUCCU UUAGU 1306 usasaaguGfcUfGfUfa uccuuuaguL96 2402 смысловая 21
- 132 037115
ACUAAAGGAUACAGCA CUUUAGC 1307 asCfsuaaAfgGfAfuac aGfcAfcuuuasgsc 2403 антисмысловая 23
AAAGUGCUGUAUCCUU UAGUA 1308 asasagugCfuGfUfAfu ccuuuaguaL96 2404 смысловая 21
UACUAAAGGAUACAGC ACUUUAG 1309 usAfscuaAfaGfGfaua cAfgCfacuuusasg 2405 антисмысловая 23
AGGCUAAAGUGCUGUA UCCUU 1310 asgsgeuaAfaGfUfGfc uguauccuuL96 2406 смысловая 21
AAGGAUACAGCACUUU AGCCUGC 1311 asAfsggaUfaCfAfgca cUfuUfagccusgsc 2407 антисмысловая 23
CAGGCUAAAGUGCUGU AUCCU 1312 csasggcuAfaAfGfUfg cuguauccuL96 2408 смысловая 21
AGGAUACAGCACUUUA GCCUGCC 1313 asGfsgauAfcAfGfcac uUfuAfgccugscsc 2409 антисмысловая 23
AAGACAUUGGUGAGGA AAAAU 1314 asasgacaUfuGfGfUfg aggaaaaauL96 2410 смысловая 21
AUUUUUCCUCACCAAU GUCUUGU 1315 asUfsuuuUfcCfUfcac cAfaUfgucuusgsu 2411 антисмысловая 23
AGACAUUGGUGAGGAA AAAUC 1316 asgsacauUfgGfUfGfa ggaaaaaucL96 2412 смысловая 21
GAUUUUUCCUCACCAA UGUCUUG 1317 gsAf suuuUfuCfCfuca cCfaAfugucususg 2413 антисмысловая 23
CGACAAGACAUUGGUG AGGAA 1318 csgsacaaGfaCfAfUfu ggugaggaaL96 2414 смысловая 21
UUCCUCACCAAUGUCU UGUCGAU 1319 usUfsccuCfaCfCfaau gUfcUfugucgsasu 2415 антисмысловая 23
UCGACAAGACAUUGGU GAGGA 1320 uscsgacaAfgAfCfAfu uggugaggaL96 2416 смысловая 21
UCCUCACCAAUGUCUU GUCGAUG 1321 usCfscucAfcCfAfaug uCfuUfgucgasusg 2417 антисмысловая 23
AAGAU GU C CU C GAGAU ACUAA 1322 asasgaugUfcCfUfCfg agauacuaaL96 2418 смысловая 21
UUAGUAU CUC GAGGAC AUCUUGA 1323 usUfsaguAfuCfUfega gGfaCfaucuusgsa 2419 антисмысловая 23
AGAU GU C CU C GAGAUA CUAAA 1324 asgsauguCfcUfCfGfa gauacuaaaL96 2420 смысловая 21
UUUAGUAU CUC GAGGA CAUCUUG 1325 usUfsuagUfaUfCfucg aGfgAfcaucususg 2421 антисмысловая 23
- 133 037115
GUU CAAGAU GU C CU C G AGAUA 1326 gsusucaaGfaUfGfUfc cucgagauaL96 2422 смысловая 21
UAU CUC GAGGACAU CU UGAACAC 1327 usAf sucuCfgAfGfgac aUfcUfugaacsasc 2423 антисмысловая 23
U GUU CAAGAU GU C CU C GAGAU 1328 usgsuucaAfgAfUfGfu ccucgagauL96 2424 смысловая 21
AU CU C GAGGACAU CUU GAACACC 1329 asUfscucGfaGfGfaca uCfuUfgaacascsc 2425 антисмысловая 23
GAGAAAGGUGUUCAAG AUGUC 1330 gsasgaaaGfgUfGfUfu caagaugucL96 2426 смысловая 21
GACAU CUU GAACAC CU UUCUCCC 1331 gsAf scauCfuUfGfaac aCfcUfuucucscsc 2427 антисмысловая 23
AGAAAGGUGUU C AAGA UGUCC 1332 asgsaaagGfuGfUfUfc aagauguccL96 2428 смысловая 21
GGACAUCUUGAACACC UUUCUCC 1333 gsGfsacaUfcUfUfgaa cAfcCfuuucuscsc 2429 антисмысловая 23
GGGGGAGAAAGGUGUU CAAGA 1334 gsgsgggaGfaAfAfGfg uguucaagaL96 2430 смысловая 21
UCUUGAACACCUUUCU CCCCCUG 1335 usCfsuugAfaCfAfecu uUfcUfcccccsusg 2431 антисмысловая 23
AGGGGGAGAAAGGUGU UCAAG 1336 asgsggggAfgAfAfAfg guguucaagL96 2432 смысловая 21
CUUGAACACCUUUCUC CCCCUGG 1337 esUfsugaAfcAfCfcuu uCfuCfccccusgsg 2433 антисмысловая 23
GCUGGGAAGAUAUCAA AUGGC 1338 gscsugggAfaGfAfUfa ucaaauggcL96 2434 смысловая 21
GC CAUUU GAU AU CUU C CCAGCUG 1339 gsCfscauUfuGfAfuau cUfuCfccagcsusg 2435 антисмысловая 23
CUGGGAAGAUAUCAAA UGGCU 1340 csusgggaAfgAfUfAfu caaauggcuL96 2436 смысловая 21
AGC CAUUU GAUAU CUU CCCAGCU 1341 asGfsccaUfuUfGfaua uCfuUfcccagscsu 2437 антисмысловая 23
AUCAGCUGGGAAGAUA UCAAA 1342 asuscagcUfgGfGfAfa gauaucaaaL96 2438 смысловая 21
UUU GAUAU CUU С C CAG CUGAUAG 1343 usUfsugaUfaUfCfuuc cCfaGfcugausasg 2439 антисмысловая 23
UAUCAGCUGGGAAGAU AUCAA 1344 usasucagCfuGfGfGfa agauaucaaL96 2440 смысловая 21
- 134 037115
UU GAUAU CUU С C CAGC UGAUAGA 1345 usUfsgauAfuCfUfucc cAf gCfugauasgsa 2441 антисмысловая 23
U CU GU C GACUU CU GUU UUAGG 1346 uscsugucGfaCfUfUfc uguuuuaggL96 2442 смысловая 21
C CUAAAACAGAAGU C G ACAGAUC 1347 csCfsuaaAfaCfAfgaa gUfcGfacagasusc 2443 антисмысловая 23
CU GU C GACUU CU GUUU UAGGA 1348 csusgucgAfcUfUfCfu guuuuaggaL96 2444 смысловая 21
UСCUAAAACAGAAGUC GACAGAU 1349 usCfscuaAfaAfCfaga aGfuCfgacagsasu 2445 антисмысловая 23
CAGAU CU GU C GACUU C UGUUU 1350 csasgaucUfgUfCfGfa cuucuguuuL96 2446 смысловая 21
AAACAGAAGU C GACAG AUCUGUU 1351 asAf sacaGfaAfGfucg aCfaGfaucugsusu 2447 антисмысловая 23
ACAGAU CU GU C GACUU CUGUU 1352 ascsagauCfuGfUfCfg acuucuguuL96 2448 смысловая 21
AACAGAAGU C GACAGA UCUGUUU 1353 asAf scagAfaGfUfcga cAfgAfucugususu 2449 антисмысловая 23
UACUUCUUUGAAUGUA GAUUU 1354 usascuucUfuUfGfAfa uguagauuuL96 2450 смысловая 21
AAAU CUACAUU CAAAG AAGUAUC 1355 asAfsaucUfaCfAfuuc aAfaGfaaguasusc 2451 антисмысловая 23
ACUUCUUUGAAUGUAG AUUUC 1356 ascsuucuUfuGfAfAfu guagauuucL96 2452 смысловая 21
GAAAU CUACAUU CAAA GAAGUAU 1357 gsAf saauCfuAfCfauu cAfaAfgaagusasu 2453 антисмысловая 23
GUGAUACUUCUUUGAA UGUAG 1358 gsusgauaCfuUfCfUfu ugaauguagL96 2454 смысловая 21
CUACAUU CAAAGAAGU AUСАССА 1359 csUfsacaUfuCfAfaag aAfgUfaucacscsa 2455 антисмысловая 23
GGUGAUACUUCUUUGA AUGUA 1360 gsgsugauAfcUfUfCfu uugaauguaL96 2456 смысловая 21
UACAUU CAAAGAAGUA UCACCAA 1361 usAfscauUfcAfAfaga aGfuAfucaccsasa 2457 антисмысловая 23
UGGGAAGAUAUCAAAU GGCUG 1362 usgsggaaGfaUfAfUfc aaauggcugL96 2458 смысловая 21
CAG C CAUUU GAUAU CU UCCCAGC 1363 csAfsgccAfuUfUfgau aUfcUfucccasgsc 2459 антисмысловая 23
- 135 037115
GGGAAGAUAUCAAAUG GCUGA 1364 gsgsgaagAfuAfUfCfa aauggcugaL96 2460 смысловая 21
U CAGC CAUUU GAUAU C UUCCCAG 1365 usCfsagcCfaUfUfuga uAfuCfuucccsasg 2461 антисмысловая 23
CAGCUGGGAAGAUAUC AAAUG 1366 csasgcugGfgAfAfGfa uaucaaaugL96 2462 смысловая 21
CAUUU GAU AU CUU С С C AGCUGAU 1367 csAfsuuuGfaUfAfucu uCfcCfagcugsasu 2463 антисмысловая 23
UCAGCUGGGAAGAUAU CAAAU 1368 uscsagcuGfgGfAfAfg auaucaaauL96 2464 смысловая 21
AUUU GAU AU CUU С C CA GCUGAUA 1369 asUfsuugAfuAfUfcuu cCfcAfgcugasusa 2465 антисмысловая 23
U C CAAAGU CUAUAUAU GACUA 1370 uscscaaaGfuCfUfAfu auaugacuaL96 2466 смысловая 21
UAGU CAUAUAUAGACU UUGGAAG 1371 usAfsgucAfuAfUfaua gAfcUfuuggasasg 2467 антисмысловая 23
C CAAAGU CUAUAUAU G ACUAU 1372 cscsaaagUfcUfAfUfa uaugacuauL96 2468 смысловая 21
AUAGU CAUAUAUAGAC UUUGGAA 1373 asUfsaguCfaUfAfuau aGfaCfuuuggsasa 2469 антисмысловая 23
UACUU C CAAAGU CUAU AU AUG 1374 usascuucCfaAfAfGfu cuauauaugL96 2470 смысловая 21
CAUAUAUAGACUUUGG AAGUACU 1375 csAfsuauAfuAfGfacu uUfgGfaaguascsu 2471 антисмысловая 23
GUACUU C CAAAGU CUA UAUAU 1376 gsusacuuCfcAfAfAfg ucuauauauL96 2472 смысловая 21
AUAUAUAGACUUUGGA AGUACUG 1377 asUfsauaUfaGfAfcuu uGfgAfaguacsusg 2473 антисмысловая 23
UUAUGAACAACAUGCU AAAUC 1378 ususaugaAfcAfAfCfa ugcuaaaucL96 2474 смысловая 21
GAUUUAGCAUGUUGUU CAUAAUC 1379 gsAfsuuuAfgCfAfugu uGfuUfcauaasusc 2475 антисмысловая 23
UAUGAACAACAUGCUA AAUCA 1380 usasugaaCfaAfCfAfu gcuaaaucaL96 2476 смысловая 21
U GAUUUAGCAU GUU GU UCAUAAU 1381 usGfsauuUfaGfCfaug uUfgUfucauasasu 2477 антисмысловая 23
AU GAUUAU GAACAACA UGCUA 1382 asusgauuAfuGfAfAfc aacaugcuaL96 2478 смысловая 21
- 136 037115
UAGCAU GUU GUU CAUA AUCAUUG 1383 usAfsgcaUfgUfUfguu cAfuAfaucaususg 2479 антисмысловая 23
AAU GAUUAU GAACAAC AUGCU 1384 asasugauUfaUfGfAfa caacaugcuL96 2480 смысловая 21
AGCAUGUUGUUCAUAA U CAUU GA 1385 asGfscauGfuUfGfuuc aUfaAfucauusgsa 2481 антисмысловая 23
AAUU С С C CACUU CAAU ACAAA 1386 asasuuccCfcAfCfUfu caauacaaaL96 2482 смысловая 21
UUUGUAUUGAAGUGGG GAAUUAC 1387 usUfsuguAfuUfGfaag uGfgGfgaauusasc 2483 антисмысловая 23
AUU С С C CACUU CAAUA CAAAG 1388 asusucccCfaCfUfUfc aauacaaagL96 2484 смысловая 21
CUUUGUAUUGAAGUGG GGAAUUA 1389 esUfsuugUfaU fUfgaa gUfgGfggaaususa 2485 антисмысловая 23
CUGUAAUUCCCCACUU CAAUA 1390 csusguaaUfuCfCfCfc acuucaauaL96 2486 смысловая 21
UAUUGAAGUGGGGAAU UACAGAC 1391 usAf suugAfaGfUfggg gAfaUfuacagsasc 2487 антисмысловая 23
UCUGUAAUUССCCACU UCAAU 1392 uscsuguaAfuUfCfCfc cacuucaauL96 2488 смысловая 21
AUUGAAGUGGGGAAUU ACAGACU 1393 asUfsugaAfgUfGfggg aAfuUfacagascsu 2489 антисмысловая 23
UGAUGUGCGUAACAGA UUCAA 1394 usgsauguGfcGfUfAfa cagauucaaL96 2490 смысловая 21
UUGAAUCUGUUACGCA CAU CAU C 1395 usUfsgaaUfcUfGfuua cGfcAfCaucasusc 2491 антисмысловая 23
GAU GUGCGUAACAGAU UCAAA 1396 gsasugugCfgUfAfAfc agauucaaaL96 2492 смысловая 21
UUUGAAUCUGUUACGC AC AU CAU 1397 usUfsugaAfuCfUfguu aCfgCfacaucsasu 2493 антисмысловая 23
UGGAUGAUGUGCGUAA CAGAU 1398 usgsgaugAfuGfUfGfc guaacagauL96 2494 смысловая 21
AU CU GUUAC GCACAU C AUCCAGA 1399 asUfscugUfuAfCfgca cAfuCfauccasgsa 2495 антисмысловая 23
CUGGAUGAUGUGCGUA ACAGA 1400 csusggauGfaUfGfUfg cguaacagaL96 2496 смысловая 21
U CU GUUAC GCACAU CA UCCAGAC 1401 usCfsuguUfaCfGfcac aUfcAfuccagsasc 2497 антисмысловая 23
- 137 037115
GAAUGGGUGGCGGUAA UUGGU 1402 gsasauggGfuGfGfCfg guaauugguL96 2498 смысловая 21
ACCAAUUACCGCCACC CAUUCCA 1403 asCfscaaUfuAfCfcgc cAfcCfcauucscsa 2499 антисмысловая 23
AAUGGGUGGCGGUAAU UGGUG 1404 asasugggUfgGfCfGfg uaauuggugL96 2500 смысловая 21
СACCAAUUACCGСCAC CCAUUCC 1405 csAfsccaAfuUfAfccg cCfaCfccauuscsc 2501 антисмысловая 23
AUUGGAAUGGGUGGCG GUAAU 1406 asusuggaAfuGfGfGfu ggcgguaauL96 2502 смысловая 21
AUUAC C GC САС C CAUU CCAAUUC 1407 asUfsuacCfgCfCfacc cAfuUfccaaususc 2503 антисмысловая 23
AAUUGGAAUGGGUGGC GGUAA 1408 asasuuggAfaUfGfGfg uggcgguaaL96 2504 смысловая 21
UUACCGCCACCCAUUC CAAUUCU 1409 usUfsaccGfcCfAfccc aUfuCfcaauuscsu 2505 антисмысловая 23
UCCGGAAUGUUGCUGA AACAG 1410 uscscggaAfuGfUfUfg cugaaacagL96 2506 смысловая 21
CUGUUUCAGCAACAUU CCGGAGC 1411 csUfsguuUfcAfGfcaa cAfuUfccggasgsc 2507 антисмысловая 23
CCGGAAUGUUGCUGAA ACAGA 1412 cscsggaaUfgUfUfGfc ugaaacagaL96 2508 смысловая 21
UCUGUUUCAGCAACAU UCCGGAG 1413 usCfsuguUfuCfAfgca aCfaUfuccggsasg 2509 антисмысловая 23
AUGCUCCGGAAUGUUG CUGAA 1414 asusgcucCfgGfAfAfu guugcugaaL96 2510 смысловая 21
UUCAGCAACAUUCCGG AGCAUCC 1415 usUfscagCfaAfCfauu cCfgGfagcauscsc 2511 антисмысловая 23
GAUGCUCCGGAAUGUU GCUGA 1416 gsasugcuCfcGfGfAfa uguugcugaL96 2512 смысловая 21
UCAGCAACAUUCCGGA GCAUCCU 1417 usCfsagcAfaCfAfuuc cGfgAfgcaucscsu 2513 антисмысловая 23
U GU C CU C GAGAUACUA AAGGA 1418 usgsuccuCfgAfGfAfu acuaaaggaL96 2514 смысловая 21
UCCUUUAGUAUCUCGA GGACAUC 1419 usCfscuuUfaGfUfauc uCfgAfggacasusc 2515 антисмысловая 23
GU C CU C GAGAUACUAA AGGAA 1420 gsusccucGfaGfAfUfa cuaaaggaaL96 2516 смысловая 21
- 138 037115
UU C CUUUAGUAU CU C G AGGACAU 1421 usUfsccuUfuAfGfuau cUfcGfaggacsasu 2517 антисмысловая 23
AAGAU GU C CU C GAGAU ACUAA 1422 asasgaugUfcCfUfCfg agauacuaaL96 2518 смысловая 21
UUAGUAU CUC GAGGAC AUCUUGA 1423 usUfsaguAfuCfUfega gGfaCfaucuusgsa 2519 антисмысловая 23
CAAGAU GU C CU C GAGA UACUA 1424 csasagauGfuCfCfUfc gagauacuaL96 2520 смысловая 21
UAGUAU CU C GAG GACA UCUUGAA 1425 usAf sguaUfcUfCfgag gAfcAfucuugsasa 2521 антисмысловая 23
ACAACAUGCUAAAUCA GUACU 1426 ascsaacaUfgCfUfAfa aucaguacuL96 2522 смысловая 21
AGUACUGAUUUAGCAU GUUGUUC 1427 asGfsuacUfgAfUfuua gCfaUfguugususc 2523 антисмысловая 23
CAACAUGCUAAAUCAG UACUU 1428 csasacauGfcUfAfAfa ucaguacuuL96 2524 смысловая 21
AAGUACUGAUUUAGCA UGUUGUU 1429 asAf sguaCfuGfAfuuu aGfcAfuguugsusu 2525 антисмысловая 23
AUGAACAACAUGCUAA AUG AG 1430 asusgaacAf aCfAfUfg cuaaaucagL96 2526 смысловая 21
CUGAUUUAGCAUGUUG UUCAUAA 1431 esUfsgauUfuAfGfcau gUfuGfuucausasa 2527 антисмысловая 23
UAUGAACAACAUGCUA AAUCA 1432 usasugaaCfaAfCfAfu gcuaaaucaL96 2528 смысловая 21
U GAUUUAGCAU GUU GU UCAUAAU 1433 usGfsauuUfaGfCfaug uUfgUfucauasasu 2529 антисмысловая 23
GCCAAGGCUGUGUUUG UGGGG 1434 gscscaagGfcUfGfUfg uuuguggggL96 2530 смысловая 21
СССCACAAACACAGСC UUGGCGC 1435 csCfsccaCfaAfAfcac aGfcCfuuggcsgsc 2531 антисмысловая 23
CCAAGGCUGUGUUUGU GGGGA 1436 cscsaaggCfuGfUfGfu uuguggggaL96 2532 смысловая 21
UСССCACAAACACAGC CUUGGCG 1437 usCfscccAfcAfAfаса cAfgCfcuuggscsg 2533 антисмысловая 23
UGGCGCCAAGGCUGUG UUUGU 1438 usgsgcgcCfaAfGfGfc uguguuuguL96 2534 смысловая 21
ACAAACACAGCCUUGG CGCCAAG 1439 asCfsaaaCfaCfAfgee uUfgGfcgccasasg 2535 антисмысловая 23
- 139 037115
UUGGCGCCAAGGCUGU GUUUG 1440 ususggcgCfcAfAfGfg cuguguuugL96 2536 смысловая 21
CAAACACAGCCUUGGC GCCAAGA 1441 csAfsaacAfcAfGfccu uGfgCfgccaasgsa 2537 антисмысловая 23
UGAAAGCUCUGGCUCU UGGCG 1442 usgsaaagCfuCfUfGfg cucuuggcgL96 2538 смысловая 21
CGCCAAGAGCCAGAGC UUUCAGA 1443 csGfsccaAfgAfGfcca gAfgCfuuucasgsa 2539 антисмысловая 23
GAAAGCUCUGGCUCUU GGCGC 1444 gsasaagcUfcUfGfGfc ucuuggcgcL96 2540 смысловая 21
GCGCCAAGAGCCAGAG CUUUCAG 1445 gsCfsgccAfaGfAfgcc aGfaGfcuuucsasg 2541 антисмысловая 23
GUUCUGAAAGCUCUGG CUCUU 1446 gsusucugAfaAfGfCfu cuggcucuuL96 2542 смысловая 21
AAGAGCCAGAGCUUUC AGAACAU 1447 asAf sgagCfcAfGfage uUfuCfagaacsasu 2543 антисмысловая 23
UGUUCUGAAAGCUCUG GCUCU 1448 usgsuucuGfaAfAfGfc ucuggcucuL96 2544 смысловая 21
AGAGCCAGAGCUUUCA GAACAUC 1449 asGfsagcCfaGfAfgcu uUfcAfgaacasusc 2545 антисмысловая 23
CAGC CACUAUU GAU GU UCUGC 1450 csasgccaCfuAfUfUfg auguucugcL96 2546 смысловая 21
GCAGAACAUCAAUAGU GGCUGGC 1451 gsCfsagaAfcAfUfcaa uAfgUfggcugsgsc 2547 антисмысловая 23
AGC CACUAUU GAU GUU CUGCC 1452 asgsccacUfaUfUfGfa uguucugccL96 2548 смысловая 21
GGCAGAACAUCAAUAG UGGCUGG 1453 gsGfscagAfaCfAfuca aUfaGfuggcusgsg 2549 антисмысловая 23
GUGCCAGCCACUAUUG AU GUU 1454 gsusgccaGfcCfAfCfu auugauguuL96 2550 смысловая 21
AACAUCAAUAGUGGCU GGCACCC 1455 asAfscauCfaAfUfagu gGfcUfggcacscsc 2551 антисмысловая 23
GGUGCCAGCCACUAUU GAUGU 1456 gsgsugccAfgCfCfAfc uauugauguL96 2552 смысловая 21
ACAUCAAUAGUGGCUG GCACCCC 1457 asCfsaucAfaUfAfgug gCfuGfgcaccscsc 2553 антисмысловая 23
ACAAGGACCGAGAAGU САССА 1458 ascsaaggAfcCfGfAfg aagucaccaL96 2554 смысловая 21
- 140 037115
UGGUGACUUCUCGGUC CUUGUAG 1459 usGfsgugAfcUfUfcue gGfuCfcuugusasg 2555 антисмысловая 23
CAAGGACCGAGAAGUC AC CAA 1460 csasaggaCfcGfAfGfa agucaccaaL96 2556 смысловая 21
UUGGUGACUUCUCGGU CCUUGUA 1461 usUfsgguGfaCfUfucu cGfgUfccuugsusa 2557 антисмысловая 23
AUCUACAAGGACC GAG AAGUC 1462 asuscuacAfaGfGfAfc cgagaagucL96 2558 смысловая 21
GACUUCUCGGUCCUUG UAGAUAU 1463 gsAfscuuCfuCfGfguc cUfuGfuagausasu 2559 антисмысловая 23
UAUCUACAAGGACCGA GAAGU 1464 usasucuaCfaAfGfGfa ccgagaaguL96 2560 смысловая 21
ACUUCUCGGUCCUUGU AGAUAUA 1465 asCfsuucUfcGfGfucc uUfgUfagauasusa 2561 антисмысловая 23
CAGAAU GU GAAAGU CA UCGAC 1466 csasgaauGfuGfAfAfa gucaucgacL96 2562 смысловая 21
GU C GAU GACUUU CACA UUCUGGC 1467 gsUfscgaUfgAfCfuuu cAfcAfuucugsgsc 2563 антисмысловая 23
AGAAU GU GAAAGU CAU CGACA 1468 asgsaaugUfgAfAfAfg ucaucgacaL96 2564 смысловая 21
U GU C GAU GACUUU CAC AUUCUGG 1469 usGfsuegAfuGfAfcuu uCfaCfauucusgsg 2565 антисмысловая 23
GUGСCAGAAUGUGAAA GUCAU 1470 gsusgccaGfaAfUfGfu gaaagucauL96 2566 смысловая 21
AUGACUUUCACAUUCU GGCACCC 1471 asUfsgacUfuUfCfaca uUfcUfggcacscsc 2567 антисмысловая 23
GGUGCCAGAAUGUGAA AGUCA 1472 gsgsugccAfgAfAfUfg ugaaagucaL96 2568 смысловая 21
UGACUUUCACAUUCUG GCACCCA 1473 usGfsacuUfuCfAfcau uCfuGfgcaccscsa 2569 антисмысловая 23
AGAU GU C CU C GAGAUA CUAAA 1474 asgsauguCfcUfCfGfa gauacuaaaL96 2570 смысловая 21
UUUAGUAU CUC GAGGA CAUCUUG 1475 usUfsuagUfaUfCfucg aGfgAfcaucususg 2571 антисмысловая 23
GAU GU C CU C GAGAUAC UAAAG 1476 gsasugucCfuCfGfAfg auacuaaagL96 2572 смысловая 21
CUUUAGUAUCUCGAGG ACAUCUU 1477 esUfsuuaGfuAfUfcue gAfgGfacaucsusu 2573 антисмысловая 23
- 141 037115
UU CAAGAU GU C CU C GA GAUAC 1478 ususcaagAfuGfUfCfc ucgagauacL96 2574 смысловая 21
GUAU CU C GAG GACAU C UUGAACA 1479 gsUfsaucUfcGfAfgga cAfuCfuugaascsa 2575 антисмысловая 23
GUU CAAGAU GU C CU C G AGAUA 1480 gsusucaaGfaUfGfUfc cucgagauaL96 2576 смысловая 21
UAU CUC GAGGACAU CU UGAACAC 1481 usAfsucuCfgAfGfgac aUfcUfugaacsasc 2577 антисмысловая 23
GUGGACUUGCUGCAUA UGUGG 1482 gsusggacUfuGfCfUfg cauauguggL96 2578 смысловая 21
CCACAUAUGCAGCAAG UCCACUG 1483 csCfsacaUfaUfGfcag cAfaGfuccacsusg 2579 антисмысловая 23
UGGACUUGCUGCAUAU GUGGC 1484 usgsgacuUfgCfUfGfc auauguggcL96 2580 смысловая 21
GCCACAUAUGCAGCAA GUCCACU 1485 gsCfscacAfuAfUfgca gCfaAfguccascsu 2581 антисмысловая 23
GACAGUGGACUUGCUG CAUAU 1486 gsascaguGfgAfCfUfu gcugcauauL96 2582 смысловая 21
AUAUGCAGCAAGUCCA CUGUCGU 1487 asUfsaugCfaGfCfaag uCfcAfcugucsgsu 2583 антисмысловая 23
CGACAGUGGACUUGCU GCAUA 1488 csgsacagUfgGfAfCfu ugcugcauaL96 2584 смысловая 21
UAUGCAGCAAGUCCAC UGUCGUC 1489 usAfsugcAfgCfAfagu cCfaCfugucgsusc 2585 антисмысловая 23
AAC CAGUACUUUAU CA UUUUC 1490 asasccagUfaCfUfUfu aucauuuucL96 2586 смысловая 21
GAAAAU GAUAAAGUAC UGGUUUC 1491 gsAfsaaaUfgAfUfaaa gUfaCfugguususc 2587 антисмысловая 23
AC CAGUACUUUAU CAU UUUCU 1492 ascscaguAfcUfUfUfa ucauuuucuL96 2588 смысловая 21
AGAAAAU GAUAAAGUA CUGGUUU 1493 asGfsaaaAfuGfAfuaa aGfuAfcuggususu 2589 антисмысловая 23
UU GAAAC CAGUACUUU AU CAU 1494 ususgaaaCfcAfGfUfa cuuuaucauL96 2590 смысловая 21
AUGAUAAAGUACUGGU UUCAAAA 1495 asUfsgauAfaAfGfuac uGfgUfuucaasasa 2591 антисмысловая 23
UUU GAAAC CAGUACUU UAUCA 1496 ususugaaAfcCfAfGfu acuuuaucaL96 2592 смысловая 21
- 142 037115
UGAUAAAGUACUGGUU U GAAAAU 1497 usGfsauaAfaGfUfacu gGfuUfucaaasasu 2593 антисмысловая 23
C GAGAAGU CAC CAAGA AGCUA 1498 csgsagaaGfuCfAfCfc aagaagcuaL96 2594 смысловая 21
UAGCUUCUUGGUGACU UCUCGGU 1499 usAf sgcuUfcUfUfggu gAfcUfucucgsgsu 2595 антисмысловая 23
GAGAAGU CAC CAAGAA GCUAG 1500 gsasgaagUfcAfCfCfa agaagcuagL96 2596 смысловая 21
CUAGCUUCUUGGUGAC UUCUCGG 1501 csUfsagcUfuCfUfugg uGfaCfuucucsgsg 2597 антисмысловая 23
GGACCGAGAAGUCACC AAGAA 1502 gsgsaccgAfgAfAfGfu caccaagaaL96 2598 смысловая 21
UUCUUGGUGACUUCUC GGUCCUU 1503 usUfscuuGfgUfGfacu uCfuCfgguccsusu 2599 антисмысловая 23
AGGACCGAGAAGUCAC CAAGA 1504 asgsgaccGfaGfAfAfg ucaccaagaL96 2600 смысловая 21
UCUUGGUGACUUCUCG GUCCUUG 1505 usCfsuugGfuGfAfcuu cUfcGfguccususg 2601 антисмысловая 23
UCAAAGUGUUGGUAAU GCCUG 1506 uscsaaagUfgUfUfGfg uaaugccugL96 2602 смысловая 21
CAGGCAUUACCAACAC UUUGAAC 1507 csAfsggcAfuUfAfcca aCfaCfuuugasasc 2603 антисмысловая 23
CAAAGUGUUGGUAAUG CCUGA 1508 csasaaguGfuUfGfGfu aaugccugaL96 2604 смысловая 21
UCAGGCAUUACCAACA CUUUGAA 1509 usCfsaggCfaUfUfacc aAfcAfcuuugsasa 2605 антисмысловая 23
AGGUUCAAAGUGUUGG UAAUG 1510 asgsguucAfaAfGfUfg uugguaaugL96 2606 смысловая 21
CAUUAC CAACACUUU G AACCUGA 1511 csAfsuuaCfcAfAfcac uUfuGfaaccusgsa 2607 антисмысловая 23
CAGGUUCAAAGUGUUG GUAAU 1512 csasgguuCfaAfAfGfu guugguaauL96 2608 смысловая 21
AUUACCAACACUUUGA ACCUGAG 1513 asUfsuacCfaAfCfacu uUfgAfaccugsasg 2609 антисмысловая 23
UAUUACUU GACAAAGA GACAC 1514 usasuuacUfuGfAfCfa aagagacacL96 2610 смысловая 21
GU GU CU CUUU GU CAAG UAAUACA 1515 gsUfsgucUfcUfUfugu cAfaGfuaauascsa 2611 антисмысловая 23
- 143 037115
AUUACUU GACAAAGAG ACACU 1516 asusuacuUfgAfCfAfa agagacacuL96 2612 смысловая 21
AGU GU CU CUUU GU CAA GUAAUAC 1517 asGfsuguCfuCfUfuug uCfaAfguaausasc 2613 антисмысловая 23
CAU GUAUUACUU GACA AAGAG 1518 csasuguaUfuAfCfUfu gacaaagagL96 2614 смысловая 21
CUCUUUGUCAAGUAAU ACAUGCU 1519 csUfscuuUfgUfCfaag uAfaUfacaugscsu 2615 антисмысловая 23
GCAU GU AUUACUU GAC AAAGA 1520 gscsauguAfuUfAfCfu ugacaaagaL96 2616 смысловая 21
U CUUU GU CAAGUAAUA CAUGCUG 1521 usCfsuuuGfuCfAfagu aAfuAfGaugesusg 2617 антисмысловая 23
AAAGU CAU C GACAAGA CAUUG 1522 asasagucAfuCfGfAfc aagacauugL96 2618 смысловая 21
CAAU GU CUU GU C GAU G ACUUUCA 1523 csAfsaugUfcUfUfguc gAfuGfacuuuscsa 2619 антисмысловая 23
AAGU CAU C GACAAGAC AUUGG 1524 asasgucaUfcGfAfCfa agacauuggL96 2620 смысловая 21
C CAAU GU CUU GU C GAU GACUUUC 1525 csCfsaauGfuCfUfugu cGfaUfgacuususc 2621 антисмысловая 23
U GU GAAAGU CAU C GAC AAGAC 1526 usgsugaaAfgUfCfAfu cgacaagacL96 2622 смысловая 21
GUCUUGUCGAUGACUU UCACAUU 1527 gsUfscuuGfuCfGfaug aCfuUfucacasusu 2623 антисмысловая 23
AU GU GAAAGU CAU C GA CAAGA 1528 asusgugaAfaGfUfCfa ucgacaagaL96 2624 смысловая 21
UCUUGUCGAUGACUUU CACAUUC 1529 usCfsuugUfcGfAfuga cUfuUfcacaususc 2625 антисмысловая 23
AUAUGUGGCUAAAGCA AUAGA 1530 asusauguGfgCfUfAfa agcaauagaL96 2626 смысловая 21
UCUAUUGCUUUAGCCA CAUAUGC 1531 usCfsuauUfgCfUfuua gCfcAfcauausgsc 2627 антисмысловая 23
UAUGUGGCUAAAGCAA UAGAC 1532 usasugugGfcUfAfAfa gcaauagacL96 2628 смысловая 21
GUCUAUUGCUUUAGCC ACAUAUG 1533 gsUfscuaUfuGfCfuuu aGfcCfacauasusg 2629 антисмысловая 23
CUGCAUAUGUGGCUAA AGCAA 1534 esusgeauAfuGfUfGfg cuaaagcaaL96 2630 смысловая 21
- 144 037115
UUGCUUUAGCCACAUA UGCAGCA 1535 usUfsgcuUfuAfGfcca cAfuAfugcagscsa 2631 антисмысловая 23
GCUGCAUAUGUGGCUA AAGCA 1536 gscsugcaUfaUfGfUfg gcuaaagcaL96 2632 смысловая 21
UGCUUUAGCCACAUAU GCAGCAA 1537 usGfscuuUfaGfCfcac aUfaUfgcagcsasa 2633 антисмысловая 23
AGAC GACAGU GGACUU GCUGC 1538 asgsacgaCfaGfUfGfg acuugcugcL96 2634 смысловая 21
GCAGCAAGUCCACUGU CGUCUCC 1539 gsCfsagcAfaGfUfcca cUfgUfcgucuscsc 2635 антисмысловая 23
GAC GACAGU GGACUU G CUGCA 1540 gsascgacAfgUfGfGfa cuugcugcaL96 2636 смысловая 21
UGCAGCAAGUCCACUG UCGUCUC 1541 usGfscagCfaAfGfucc aCfuGfucgucsusc 2637 антисмысловая 23
UUGGAGACGACAGUGG ACUUG 1542 ususggagAfcGfAfCfa guggacuugL96 2638 смысловая 21
CAAGU C CACU GU C GU C UCCAAAA 1543 csAfsaguCfcAfCfugu cGfuCfuccaasasa 2639 антисмысловая 23
UUU GGAGAC GACAGU G GACUU 1544 ususuggaGfaCfGfAfc aguggacuuL96 2640 смысловая 21
AAGU C CACU GU C GU CU CCAAAAU 1545 asAfsgucCfaCfUfguc gUfcUfccaaasasu 2641 антисмысловая 23
GGCCACCUCCUCAAUU GAAGA 1546 gsgsccacCfuCfCfUfc aauugaagaL96 2642 смысловая 21
UCUUCAAUUGAGGAGG UGGCCCA 1547 usCfsuucAfaUfUfgag gAfgGfuggccscsa 2643 антисмысловая 23
GCCACCUCCUCAAUUG AAGAA 1548 gscscaccUfcCfUfCfa auugaagaaL96 2644 смысловая 21
UUCUUCAAUUGAGGAG GUGGCCC 1549 usUfscuuCfaAfUfuga gGfaGfguggcscsc 2645 антисмысловая 23
CCUGGGCCACCUCCUC AAUUG 1550 cscsugggCfcAfCfCfu ccucaauugL96 2646 смысловая 21
CAAUUGAGGAGGUGGC CCAGGAA 1551 csAfsauuGfaGfGfagg uGfgCfccaggsasa 2647 антисмысловая 23
UCCUGGGCCACCUCCU CAAUU 1552 uscscuggGfcCfAfCfc uccucaauuL96 2648 смысловая 21
AAUUGAGGAGGUGGCC CAGGAAC 1553 asAfsuugAfgGfAfggu gGfcCfcaggasasc 2649 антисмысловая 23
- 145 037115
U GUAU GUUACUU CUUA GAGAG 1554 usgsuaugUfuAfCfUfu cuuagagagL96 2650 смысловая 21
CU CU CUAAGAAGUAAC AUACAUG 1555 esUfscucUfaAfGfaag uAfaCfauacasusc 2651 антисмысловая 23
GUAU GUUACUU CUUAG AGAGA 1556 gsusauguUfaCfUfUfc uuagagagaL96 2652 смысловая 21
U CU CU CUAAGAAGUAA CAUACAU 1557 usCfsucuCfuAfAfgaa gUfaAfcauacsasu 2653 антисмысловая 23
AGGAU GUAU GUUACUU CUUAG 1558 asgsgaugUfaUfGfUfu acuucuuagL96 2654 смысловая 21
CUAAGAAGUAACAUAC AUCCUAA 1559 esUfsaagAfaGfUfaac aUfaCfauccusasa 2655 антисмысловая 23
UAGGAU GUAU GUUACU UCUUA 1560 usasggauGfuAfUfGfu uacuucuuaL96 2656 смысловая 21
UAAGAAGUAACAUACA UCCUAAA 1561 usAfsagaAfgUfAfаса uAfcAfuccuasasa 2657 антисмысловая 23
AAAUGUUUUAGGAUGU AU GUU 1562 asasauguUfuUfAfGfg auguauguuL96 2658 смысловая 21
AACAUACAU C CUAAAA CAUUUGG 1563 asAfscauAfcAfUfccu aAfaAfcauuusgsg 2659 антисмысловая 23
AAUGUUUUAGGAUGUA UGUUA 1564 asasuguuUfuAfGfGfa uguauguuaL96 2660 смысловая 21
UAACAUACAU C CUAAA ACAUUUG 1565 usAfsacaUfaCfAfucc uAfaAfacauususg 2661 антисмысловая 23
AUCCAAAUGUUUUAGG AU GUA 1566 asusccaaAfuGfUfUfu uaggauguaL96 2662 смысловая 21
UACAU C CUAAAACAUU UGGAUAU 1567 usAfscauCfcUfAfaaa cAfuUfuggausasu 2663 антисмысловая 23
UAU C CAAAU GUUUUAG GAUGU 1568 usasuccaAfaUfGfUfu uuaggauguL96 2664 смысловая 21
ACAU C CUAAAACAUUU GGAUAUA 1569 asCfsaucCfuAfAfaac aUfuUfggauasusa 2665 антисмысловая 23
AUGGGUGGCGGUAAUU GGUGA 1570 asusggguGfgCfGfGfu aauuggugaL96 2666 смысловая 21
UСACCAAUUACCGСCA CCCAUUC 1571 usCfsaccAfaUfUfacc gCfcAfcccaususc 2667 антисмысловая 23
UGGGUGGCGGUAAUUG GUGAU 1572 usgsggugGfcGfGfUfa auuggugauL96 2668 смысловая 21
- 146 037115
AUCACCAAUUACCGCC ACCCAUU 1573 asUfseacCfaAfUfuac cGfcCfacccasusu 2669 антисмысловая 23
UGGAAUGGGUGGCGGU AAUUG 1574 usgsgaauGfgGfUfGfg cgguaauugL96 2670 смысловая 21
CAAUUACCGССACСCA UUCCAAU 1575 csAf sauuAfcCfGfoca cCfcAfuuccasasu 2671 антисмысловая 23
UUGGAAUGGGUGGCGG UAAUU 1576 ususggaaUfgGfGfUfg gcgguaauuL96 2672 смысловая 21
AAUUACCGССACСCAU UCCAAUU 1577 asAfsuuaCfcGfCfcac cCfaUfuccaasusu 2673 антисмысловая 23
UUCAAAGUGUUGGUAA UGCCU 1578 ususcaaaGfuGfUfUfg guaaugccuL96 2674 смысловая 21
AGGCAUUACCAACACU UUGAACC 1579 asGfsgcaUfuAfCfcaa cAfcUfuugaascsc 2675 антисмысловая 23
UCAAAGUGUUGGUAAU GCCUG 1580 uscsaaagUfgUfUfGfg uaaugccugL96 2676 смысловая 21
CAGGCAUUACCAACAC UUUGAAC 1581 csAfsggcAfuUfAfcca aCfaCfuuugasasc 2677 антисмысловая 23
CAGGUUCAAAGUGUUG GUAAU 1582 csasgguuCfaAfAfGfu guugguaauL96 2678 смысловая 21
AUUACCAACACUUUGA ACCUGAG 1583 asUfsuacCfaAfCfacu uUfgAfaccugsasg 2679 антисмысловая 23
UCAGGUUCAAAGUGUU GGUAA 1584 uscsagguUfcAfAfAfg uguugguaaL96 2680 смысловая 21
UUAC CAACACUUU GAA CCUGAGC 1585 usUfsaccAfaCfAfcuu uGfaAfccugasgsc 2681 антисмысловая 23
С CAC CU C CU CAAUU GA AGAAG 1586 cscsaccuCfcUfCfAfa uugaagaagL96 2682 смысловая 21
CUUCUUCAAUUGAGGA GGUGGCC 1587 esUfsucuUfcAfAfuug aGfgAfgguggscsc 2683 антисмысловая 23
CAC CU C CU CAAUU GAA GAAGU 1588 csasccucCfuCfAfAfu ugaagaaguL96 2684 смысловая 21
ACUUCUUCAAUUGAGG AGGUGGC 1589 asCfsuucUfuCfAfauu gAfgGfaggugsgsc 2685 антисмысловая 23
UGGGCCACCUCCUCAA UUGAA 1590 usgsggccAfcCfUfCfc ucaauugaaL96 2686 смысловая 21
UUCAAUUGAGGAGGUG GCCCAGG 1591 usUfscaaUfuGfAfgga gGfuGfgcccasgsg 2687 антисмысловая 23
- 147 037115
CUGGGCCACCUCCUCA AUUGA 1592 csusgggcCfaCfCfUfc cucaauugaL96 2688 смысловая 21
UCAAUUGAGGAGGUGG CCCAGGA 1593 usCfsaauUfgAfGfgag gUfgGfcccagsgsa 2689 антисмысловая 23
GAGUGGGUGCCAGAAU GUGAA 1594 gsasguggGfuGfCfCfa gaaugugaaL96 2690 смысловая 21
UUCACAUUCUGGCACC CACUGAG 1595 usUfscacAfuUfCfugg cAfcCfcacucsasg 2691 антисмысловая 23
AGUGGGUGCCAGAAUG UGAAA 1596 asgsugggUfgCfCfAfg aaugugaaaL96 2692 смысловая 21
UUUCACAUUCUGGCAC CCACUCA 1597 usUfsucaCfaUfUfcug gCfaCfccacuscsa 2693 антисмысловая 23
CUCUGAGUGGGUGCCA GAAUG 1598 csuscugaGfuGfGfGfu gccagaaugL96 2694 смысловая 21
CAUUCUGGCACCCACU CAGAGCC 1599 csAfsuucUfgGfCfacc cAfcUfcagagscsc 2695 антисмысловая 23
GCUCUGAGUGGGUGCC AGAAU 1600 gscsucugAfgUfGfGfg ugccagaauL96 2696 смысловая 21
AUUCUGGCACCCACUC AGAGCCA 1601 asUfsucuGfgCfAfccc aCfuCfagagescsa 2697 антисмысловая 23
GCACUGAUGUUCUGAA AGCUC 1602 gscsacugAfuGfUfUfc ugaaagcucL96 2698 смысловая 21
GAGCUUUCAGAACAUC AGUGCCU 1603 gsAfsgcuUfuCfAfgaa cAfuCfagugcscsu 2699 антисмысловая 23
CACU GAU GUU CU GAAA GCUCU 1604 csascugaUfgUfUfCfu gaaagcucuL96 2700 смысловая 21
AGAGCUUUCAGAACAU CAGUGCC 1605 asGfsagcUfuUfCfaga aCfaUfcagugscsc 2701 антисмысловая 23
AAAGGCACUGAUGUUC UGAAA 1606 asasaggcAfcUfGfAfu guucugaaaL96 2702 смысловая 21
UUU CAGAACAU CAGU G CCUUUCC 1607 usUfsucaGfaAfCfauc aGfuGfccuuuscsc 2703 антисмысловая 23
GAAAGGCACUGAUGUU CUGAA 1608 gsasaaggCfaCfUfGfa uguucugaaL96 2704 смысловая 21
UUCAGAACAUCAGUGC CUUUCCG 1609 usUfscagAfaCfAfuca gUfgCfcuuucscsg 2705 антисмысловая 23
GGGAAGGUGGAAGUCU UCCUG 1610 gsgsgaagGfuGfGfAfa gucuuccugL96 2706 смысловая 21
- 148 037115
CAGGAAGACUUCCACC UUCCCUU 1611 csAfsggaAfgAfCfuuc cAfcCfuucccsusu 2707 антисмысловая 23
GGAAGGUGGAAGUCUU CCUGG 1612 gsgsaaggUfgGfAfAfg ucuuccuggL96 2708 смысловая 21
СCAGGAAGACUUС САС CUUCCCU 1613 csCfsaggAfaGfAfcuu cCfaCfcuuccscsu 2709 антисмысловая 23
GGAAGGGAAGGUGGAA GUCUU 1614 gsgsaaggGfaAfGfGfu ggaagucuuL96 2710 смысловая 21
AAGACUUCCACCUUCC CUUССАС 1615 asAfsgacUfuCfCfacc uUfcCfcuuccsasc 2711 антисмысловая 23
UGGAAGGGAAGGUGGA AGUCU 1616 usgsgaagGfgAfAfGfg uggaagucuL96 2712 смысловая 21
AGACUU С САС CUU С С С UUCCACA 1617 asGfsacuUfcCfAfccu uCfcCfuuccascsa 2713 антисмысловая 23
UGCUAAAUCAGUACUU ССААА 1618 usgscuaaAfuCfAfGfu acuuccaaaL96 2714 смысловая 21
UUUGGAAGUACUGAUU UAGCAUG 1619 usUfsuggAfaGfUfacu gAfuUfuagcasusg 2715 антисмысловая 23
GCUAAAUCAGUACUUС CAAAG 1620 gscsuaaaUfcAfGfUfa cuuccaaagL96 2716 смысловая 21
CUUUGGAAGUACUGAU UUAGCAU 1621 csUfsuugGfaAfGfuac uGfaUfuuagcsasu 2717 антисмысловая 23
AACAUGCUAAAUСAGU ACUUC 1622 asascaugCfuAfAfAfu caguacuucL96 2718 смысловая 21
GAAGUACUGAUUUAGC AUGUUGU 1623 gsAfsaguAfcUfGfauu uAfgCfauguusgsu 2719 антисмысловая 23
СAACAUGCUAAAUСAG UACUU 1624 csasacauGfcUfAfAfa ucaguacuuL96 2720 смысловая 21
AAGUACUGAUUUAGCA UGUUGUU 1625 asAf sguaCfuGfAfuuu aGfcAfuguugsusu 2721 антисмысловая 23
CCACAACUCAGGAUGA AAAAU 1626 cscsacaaCfuCfAfGfg augaaaaauL96 2722 смысловая 21
AUUUUUCAUCCUGAGU UGUGGCG 1627 asUfsuuuUfcAfUfccu gAfgUfuguggscsg 2723 антисмысловая 23
СACAACUСAGGAUGAA AAAUU 1628 csascaacUfcAfGfGfa ugaaaaauuL96 2724 смысловая 21
AAUUUUUCAUСCUGAG UUGUGGC 1629 asAfsuuuUfuCfAfucc uGfaGfuugugsgsc 2725 антисмысловая 23
- 149 037115
GCCGCCACAACUCAGG AUGAA 1630 gscscgccAfcAfAfCfu caggaugaaL96 2726 смысловая 21
UUCAUCCUGAGUUGUG GCGGCAG 1631 usUfscauCfcUfGfagu uGfuGfgcggcsasg 2727 антисмысловая 23
UGCCGCCACAACUCAG GAU GA 1632 usgsccgcCfaCfAfAfc ucaggaugaL96 2728 смысловая 21
UCAUCCUGAGUUGUGG CGGCAGU 1633 usCfsaucCfuGfAfguu gUfgGfcggcasgsu 2729 антисмысловая 23
GCAACCGUCUGGAUGA UGUGC 1634 gscsaaccGfuCfUfGfg augaugugcL96 2730 смысловая 21
G GAGAU CAU С CAGAC G GUUGCCC 1635 gsCfsacaUfcAfUfcca gAfcGfguugcscsc 2731 антисмысловая 23
CAACCGUCUGGAUGAU GUGCG 1636 csasaccgUfcUfGfGfa ugaugugcgL96 2732 смысловая 21
C G CACAU CAU С CAGAC GGUUGCC 1637 csGfscacAfuCfAfucc aGfaCfgguugscsc 2733 антисмысловая 23
CUGGGCAACCGUCUGG AU GAU 1638 csusgggcAfaCfCfGfu cuggaugauL96 2734 смысловая 21
AU CAU CCAGACGGUUG CCCAGGU 1639 asUfscauCfcAfGfacg gUfuGfcccagsgsu 2735 антисмысловая 23
CCUGGGCAACCGUCUG GAU GA 1640 cscsugggCfaAfCfCfg ucuggaugaL96 2736 смысловая 21
UCAUCCAGACGGUUGC CCAGGUA 1641 usCfsaucCfaGfAfegg uUfgCfccaggsusa 2737 антисмысловая 23
GCAAAUGAUGAAGAAA CUUUG 1642 gscsaaauGfaUfGfAfa gaaacuuugL96 2738 смысловая 21
CAAAGUUUCUUCAUCA UUUGCCC 1643 csAfsaagUfuUfCfuuc aUfcAfuuugcscsc 2739 антисмысловая 23
CAAAU GAU GAAGAAAC UUUGG 1644 csasaaugAfuGfAfAfg aaacuuuggL96 2740 смысловая 21
CCAAAGUUUCUUCAUC AUUUGCC 1645 csCfsaaaGfuUfUfcuu cAfuCfauuugscsc 2741 антисмысловая 23
UGGGGCAAAUGAUGAA GAAAC 1646 usgsgggcAfaAfUfGfa ugaagaaacL96 2742 смысловая 21
GUUUCUUCAUCAUUUG CCCCAGA 1647 gsUfsuucUfuCfAfuca uUfuGfccccasgsa 2743 антисмысловая 23
CUGGGGCAAAUGAUGA AGAAA 1648 csusggggCfaAfAfUfg augaagaaaL96 2744 смысловая 21
- 150 037115
UUUCUUCAUCAUUUGC CCCAGAC 1649 usUfsucuUfcAfUfcau uUfgCfcccagsasc 2745 антисмысловая 23
CCAAGGCUGUGUUUGU GGGGA 1650 cscsaaggCfuGfUfGfu uuguggggaL96 2746 смысловая 21
UССССACAAAGACAGC CUUGGCG 1651 usCfscccAfcAfAfаса cAfgCfcuuggscsg 2747 антисмысловая 23
CAAGGCUGUGUUUGUG GGGAG 1652 csasaggcUfgUfGfUfu uguggggagL96 2748 смысловая 21
CU С С C CACAAACACAG CCUUGGC 1653 csUfscccCfaCfAfaac aCfaGfccuugsgsc 2749 антисмысловая 23
GGCGCCAAGGCUGUGU UUGUG 1654 gsgscgccAfaGfGfCfu guguuugugL96 2750 смысловая 21
CACAAACACAGCCUUG GCGCCAA 1655 csAfscaaAfcAfCfage cUfuGfgcgccsasa 2751 антисмысловая 23
UGGCGCCAAGGCUGUG UUUGU 1656 usgsgcgcCfaAfGfGfc uguguuuguL96 2752 смысловая 21
ACAAACACAGCCUUGG CGCCAAG 1657 asCfsaaaCfaCfAfgee uUfgGfcgccasasg 2753 антисмысловая 23
ACUGCCGCCACAACUC AGGAU 1658 asesugeeGfcCfAfCfa acucaggauL96 2754 смысловая 21
AUCCUGAGUUGUGGCG GCAGUUU 1659 asUfsccuGfaGfUfugu gGfcGfgcagususu 2755 антисмысловая 23
CUGCCGCCACAACUCA GGAUG 1660 csusgccgCfcAfCfAfa cucaggaugL96 2756 смысловая 21
CAUCCUGAGUUGUGGC GGCAGUU 1661 csAf succUfgAfGfuug uGfgCfggcagsusu 2757 антисмысловая 23
UCAAACUGCCGCCACA ACUCA 1662 uscsaaacUfgCfCfGfc cacaacucaL96 2758 смысловая 21
UGAGUUGUGGCGGCAG UUUGAAU 1663 usGfsaguUfgUfGfgcg gCfaGfuuugasasu 2759 антисмысловая 23
UUCAAACUGCCGCCAC AACUC 1664 ususcaaaCfuGfCfCfg ccacaacucL96 2760 смысловая 21
GAGUUGUGGCGGCAGU UUGAAUC 1665 gsAfsguuGfuGfGfegg cAfgUfuugaasusc 2761 антисмысловая 23
GGGAAGAUAUCAAAUG GCUGA 1666 gsgsgaagAfuAfUfCfa aauggcugaL96 2762 смысловая 21
U CAGC CAUUU GAUAU C UUCCCAG 1667 usCfsagcCfaUfUfuga uAfuCfuucccsasg 2763 антисмысловая 23
- 151 037115
GGAAGAUAUCAAAUGG CUGAG 1668 gsgsaagaUfaUfCfAfa auggcugagL96 2764 смысловая 21
CU CAGC CAUUU GAUAU CUUCCCA 1669 csUfscagCfcAfUfuug aUfaUfcuuccscsa 2765 антисмысловая 23
AGCUGGGAAGAUAUCA AAUGG 1670 asgscuggGfaAfGfAfu aucaaauggL96 2766 смысловая 21
C CAUUU GAU AU CUU С C CAGCUGA 1671 csCfsauuUfgAfUfauc uUfcCfcagcusgsa 2767 антисмысловая 23
CAGCUGGGAAGAUAUC AAAUG 1672 csasgcugGfgAfAfGfa uaucaaaugL96 2768 смысловая 21
CAUUU GAU AU CUU С С C AGCUGAU 1673 csAfsuuuGfaUfAfucu uCfcCfagcugsasu 2769 антисмысловая 23
AAU CAGUACUU С CAAA GUCUA 1674 asasucagUfaCfUfUfc caaagucuaL96 2770 смысловая 21
UAGACUUUGGAAGUAC UGAUUUA 1675 usAfsgacUfuUfGfgaa gUfaCfugauususa 2771 антисмысловая 23
AU CAGUACUU C CAAAG UCUAU 1676 asuscaguAfcUfUfCfc aaagucuauL96 2772 смысловая 21
AUAGACUUUGGAAGUA CUGAUUU 1677 asUfsagaCfuUfUfgga aGfuAfcugaususu 2773 антисмысловая 23
GCUAAAUCAGUACUUC CAAAG 1678 gscsuaaaUfcAfGfUfa cuuccaaagL96 2774 смысловая 21
CUUUGGAAGUACUGAU UUAGCAU 1679 csUfsuugGfaAfGfuac uGfaUfuuagcsasu 2775 антисмысловая 23
UGCUAAAUCAGUACUU CCAAA 1680 usgscuaaAfuCfAfGfu acuuccaaaL96 2776 смысловая 21
UUUGGAAGUACUGAUU UAGCAUG 1681 usUfsuggAfaGfUfacu gAfuUfuagcasusg 2777 антисмысловая 23
UCAGCAUGCCAAUAUG UGUGG 1682 uscsagcaUfgCfCfAfa uauguguggL9 6 2778 смысловая 21
CCACACAUAUUGGCAU GCUGACC 1683 csCfsacaCfaUfAfuug gCfaUfgcugascsc 2779 антисмысловая 23
CAGCAUGCCAAUAUGU GUGGG 1684 csasgcauGfcCfAfAfu augugugggL96 2780 смысловая 21
CCCACACAUAUUGGCA UGCUGAC 1685 csCfscacAfcAfUfauu gGfcAfugcugsasc 2781 антисмысловая 23
AGGGUCAGCAUGCCAA UAUGU 1686 asgsggucAfgCfAfUfg ccaauauguL96 2782 смысловая 21
- 152 037115
ACAUAUUGGCAUGCUG ACCCUCU 1687 asCfsauaUfuGfGfcau gCfuGfacccuscsu 2783 антисмысловая 23
GAGGGUCAGCAUGCCA AU AUG 1688 gsasggguCfaGfCfAfu gccaauaugL96 2784 смысловая 21
CAUAUUGGCAUGCUGA CCCUCUG 1689 csAfsuauUfgGfCfaug cUfgAfcccucsusg 2785 антисмысловая 23
GCAUAUGUGGCUAAAG CAAUA 1690 gscsauauGfuGfGfCfu aaagcaauaL96 2786 смысловая 21
UAUUGCUUUAGCCACA UAUGCAG 1691 usAfsuugCfuUfUfage cAfcAfuaugcsasg 2787 антисмысловая 23
CAUAUGUGGCUAAAGC AAUAG 1692 csasuaugUfgGfCfUfa aagcaauagL96 2788 смысловая 21
CUAUUGCUUUAGCCAC AUAUGCA 1693 esUfsauuGfeUfUfuag cCfaCfauaugscsa 2789 антисмысловая 23
UGCUGCAUAUGUGGCU AAAGC 1694 usgscugcAfuAfUfGfu ggcuaaagcL96 2790 смысловая 21
GCUUUAGCCACAUAUG CAGCAAG 1695 gsCfsuuuAfgCfCfаса uAfuGfcagcasasg 2791 антисмысловая 23
UUGCUGCAUAUGUGGC UAAAG 1696 ususgcugCfaUfAfUfg uggcuaaagL96 2792 смысловая 21
CUUUAGCCACAUAUGC AGCAAGU 1697 esUfsuuaGfcCfAfcau aUfgCfagcaasgsu 2793 антисмысловая 23
AAAU GAU GAAGAAACU UUGGC 1698 asasaugaUfgAfAfGfa aacuuuggcL96 2794 смысловая 21
GCCAAAGUUUCUUCAU CAUUUGC 1699 gsCfscaaAfgUfUfucu uCfaUfcauuusgsc 2795 антисмысловая 23
AAU GAU GAAGAAACUU UGGCU 1700 asasugauGfaAfGfAfa acuuuggcuL96 2796 смысловая 21
AGCCAAAGUUUCUUCA UCAUUUG 1701 asGfsccaAfaGfUfuuc uUfcAfucauususg 2797 антисмысловая 23
GGGCAAAUGAUGAAGA AACUU 1702 gsgsgcaaAfuGfAfUfg aagaaacuuL96 2798 смысловая 21
AAGUUUCUUCAUCAUU UGCCCCA 1703 asAfsguuUfcUfUfcau cAfuUfugcccscsa 2799 антисмысловая 23
GGGGCAAAUGAUGAAG AAACU 1704 gsgsggcaAfaUfGfAfu gaagaaacuL96 2800 смысловая 21
AGUUUCUUCAUCAUUU GCCCCAG 1705 asGfsuuuCfuUfCfauc aUfuUfgccccsasg 2801 антисмысловая 23
- 153 037115
GAGAUACUAAAGGAAG AAUUC 1706 gsasgauaCfuAfAfAfg gaagaauucL96 2802 смысловая 21
GAAUUCUUCCUUUAGU AUCUCGA 1707 gsAfsauuCfuUfCfcuu uAfgUfaucucsgsa 2803 антисмысловая 23
AGAUACUAAAGGAAGA AUUCC 1708 asgsauacUfaAfAfGfg aagaauuccL96 2804 смысловая 21
GGAAUUCUUCCUUUAG UAUCUCG 1709 gsGfsaauUfcUfUfccu uUfaGfuaucuscsg 2805 антисмысловая 23
C CU C GAGAUACUAAAG GAAGA 1710 cscsucgaGfaUfAfCfu aaaggaagaL96 2806 смысловая 21
UCUUCCUUUAGUAUCU CGAGGAC 1711 usCfsuucCfuUfUfagu aUfcUfcgaggsasc 2807 антисмысловая 23
U C CU C GAGAUACUAAA GGAAG 1712 us cs cucgAfgAfU fAfc uaaaggaagL96 2808 смысловая 21
CUUCCUUUAGUAUCUC GAGGACA 1713 csUfsuccUfuUfAfgua uCfuCfgaggascsa 2809 антисмысловая 23
ACAACUCAGGAUGAAA AAUUU 1714 ascsaacuCfaGfGfAfu gaaaaauuuL96 2810 смысловая 21
AAAUUUUU CAU C CU GA GUUGUGG 1715 asAfsauuUfuUfCfauc cUfgAfguugusgsg 2811 антисмысловая 23
CAACUCAGGAUGAAAA AUUUU 1716 csasacucAfgGfAfUfg aaaaauuuuL96 2812 смысловая 21
AAAAUUUUU CAU C CU G AGUUGUG 1717 asAfsaauUfuUfUfcau cCfuGfaguugsusg 2813 антисмысловая 23
CGCCACAACUCAGGAU GAAAA 1718 csgsccacAfaCfUfCfa ggaugaaaaL96 2814 смысловая 21
UUUUCAUCCUGAGUUG UGGCGGC 1719 usUfsuucAfuCfCfuga gUfuGfuggcgsgsc 2815 антисмысловая 23
CCGCCACAACUCAGGA UGAAA 1720 cscsgccaCfaAfCfUfc aggaugaaaL96 2816 смысловая 21
UUUCAUCCUGAGUUGU GGCGGCA 1721 usUfsucaUfcCfUfgag uUfgUfggcggscsa 2817 антисмысловая 23
AGGGAAGGUGGAAGUC UUCCU 1722 asgsggaaGfgUfGfGfa agucuuccuL96 2818 смысловая 21
AGGAAGACUUCCACCU UCCCUUC 1723 asGfsgaaGfaCfUfucc aCfcUfucccususc 2819 антисмысловая 23
GGGAAGGUGGAAGUCU UCCUG 1724 gsgsgaagGfuGfGfAfa gucuuccugL96 2820 смысловая 21
- 154 037115
CAGGAAGACUUCCACC UUCCCUU 1725 csAfsggaAfgAfCfuuc cAfcCfuucccsusu 2821 антисмысловая 23
UGGAAGGGAAGGUGGA AGUCU 1726 usgsgaagGfgAfAfGfg uggaagucuL96 2822 смысловая 21
AGACUU C CAC CUU С С C UUCCACA 1727 asGfsacuUfcCfAfecu uCfcCfuuccascsa 2823 антисмысловая 23
GUGGAAGGGAAGGUGG AAGUC 1728 gsusggaaGfgGfAfAfg guggaagucL96 2824 смысловая 21
GACUUCCACCUUCCCU UCCACAG 1729 gsAfscuuCfcAfCfcuu cCfcUfuccacsasg 2825 антисмысловая 23
GGCGAGCUUGCCACUG UGAGA 1730 gsgscgagCfuUfGfCfc acugugagaL96 2826 смысловая 21
UCUCACAGUGGCAAGC UCGCCGU 1731 usCfsucaCfaGfUfggc aAfgCfucgccsgsu 2827 антисмысловая 23
GCGAGCUUGCCACUGU GAGAG 1732 gscsgagcUfuGfCfCfa cugugagagL96 2828 смысловая 21
CUCUCACAGUGGCAAG CUCGCCG 1733 csUfscucAfcAfGfugg cAfaGfcucgcscsg 2829 антисмысловая 23
GGACGGCGAGCUUGCC ACUGU 1734 gsgsacggCfgAfGfCfu ugccacuguL96 2830 смысловая 21
ACAGUGGCAAGCUCGC CGUCCAC 1735 asCfsaguGfgCfAfage uCfgCfcguccsasc 2831 антисмысловая 23
UGGACGGCGAGCUUGC CACUG 1736 usgsgaegGfcGfAfGfc uugccacugL96 2832 смысловая 21
CAGUGGCAAGCUCGCC GUCCACA 1737 csAfsgugGfcAfAfgcu cGfcCfguccascsa 2833 антисмысловая 23
AUGUGCGUAACAGAUU CAAAC 1738 asusgugeGfuAfAfCfa gauucaaacL96 2834 смысловая 21
GUUUGAAUCUGUUACG CACAUCA 1739 gsUfsuugAfaUfCfugu uAfeGfeacausesa 2835 антисмысловая 23
U GU G C GUAACAGAUU C AAACU 1740 usgsugegUfaAfCfAfg auucaaacuL96 2836 смысловая 21
AGUUUGAAUCUGUUAC GCACAUC 1741 asGfsuuuGfaAfUfcug uUfaCfgcacasusc 2837 антисмысловая 23
GAUGAUGUGCGUAACA GAUUC 1742 gsasugauGfuGfCfGfu aacagauucL96 2838 смысловая 21
GAAUCUGUUACGCACA U CAU CCA 1743 gsAfsaucUfgUfUfacg cAfcAfucaucscsa 2839 антисмысловая 23
- 155 037115
GGAUGAUGUGCGUAAC AGAUU 1744 gsgsaugaUfgUfGfCfg uaacagauuL96 2840 смысловая 21
AAUCUGUUACGCACAU CAUCCAG 1745 asAf sucuGfuUfAfege aCfaUfcauccsasg 2841 антисмысловая 23
GGGUCAGCAUGCCAAU AUGUG 1746 gsgsgucaGfcAfUfGfc caauaugugL96 2842 смысловая 21
CACAUAUUGGCAUGCU GACCCUC 1747 csAf scauAfuUfGfgca uGfcUfgacccsusc 2843 антисмысловая 23
GGUCAGCAUGCCAAUA UGUGU 1748 gsgsucagCfaUfGfCfc aauauguguL96 2844 смысловая 21
ACACAUAUUGGCAUGC UGACCCU 1749 asCfsacaUfaUfUfggc aUfgCfugaccscsu 2845 антисмысловая 23
CAGAGGGUCAGCAUGC CAAUA 1750 csasgaggGfuCfAfGfc augccaauaL96 2846 смысловая 21
UAUUGGCAUGCUGACC CUCUGUC 1751 usAf suugGfcAfUfgcu gAfcCfcucugsusc 2847 антисмысловая 23
ACAGAGGGUCAGCAUG CCAAU 1752 ascsagagGfgUfCfAfg caugccaauL96 2848 смысловая 21
AUUGGCAUGCUGACCC UCUGUCC 1753 asUfsuggCfaUfGfcug aCfcCfucuguscsc 2849 антисмысловая 23
GCUUGAAUGGGAUCUU GGUGU 1754 gscsuugaAfuGfGfGfa ucuugguguL96 2850 смысловая 21
ACAC CAAGAU С C CAUU CAAGCCA 1755 asCfsaccAfaGfAfucc cAfuUfcaagcscsa 2851 антисмысловая 23
CUUGAAUGGGAUCUUG GUGUC 1756 esusugaaUfgGfGfAfu cuuggugucL96 2852 смысловая 21
GACAC CAAGAU С C CAU UCAAGCC 1757 gsAf scacCfaAfGfauc cCfaUfucaagscsc 2853 антисмысловая 23
CAUGGCUUGAAUGGGA UCUUG 1758 csasuggcUfuGfAfAfu gggaucuugL96 2854 смысловая 21
CAAGAU С C CAUU CAAG CCAUGUU 1759 csAf sagaUfcCfCfauu cAfaGfccaugsusu 2855 антисмысловая 23
ACAUGGCUUGAAUGGG AU CUU 1760 ascsauggCfuUfGfAfa ugggaucuuL96 2856 смысловая 21
AAGAUСCCAUUCAAGC CAUGUUU 1761 asAfsgauCfcCfAfuuc aAfgCfcaugususu 2857 антисмысловая 23
UCAAAUGGCUGAGAAG ACUGA 1762 uscsaaauGfgCfUfGfa gaagacugaL96 2858 смысловая 21
- 156 037115
U CAGU CUU CU CAGC CA UUUGAUA 1763 usCfsaguCfuUfCfuca gCfcAfuuugasusa 2859 антисмысловая 23
CAAAUGGCUGAGAAGA CUGAC 1764 csasaaugGfcUfGfAfg aagacugacL96 2860 смысловая 21
GU CAGU CUU CU CAGC C AUUUGAU 1765 gsUfscagUfcUfUfcue aGfcCfauuugsasu 2861 антисмысловая 23
GAUAUCAAAUGGCUGA GAAGA 1766 gsasuaucAfaAfUfGfg cugagaagaL96 2862 смысловая 21
UCUUCUCAGCCAUUUG AU AU CUU 1767 usCfsuucUfcAfGfcca uUfuGfauauesusu 2863 антисмысловая 23
AGAUAUCAAAUGGCUG AGAAG 1768 asgsauauCfaAfAfUfg gcugagaagL96 2864 смысловая 21
CUUCUCAGCCAUUUGA UAUCUUC 1769 esUfsucuCfaGfCfcau uUfgAfuaucususc 2865 антисмысловая 23
GAAAGU CAU C GACAAG ACAUU 1770 gsasaaguCfaUfCfGfa caagacauuL96 2866 смысловая 21
AAU GU CUU GU C GAU GA CUUUCAC 1771 asAfsuguCfuUfGfucg aUfgAfcuuucsasc 2867 антисмысловая 23
AAAGU CAU C GACAAGA CAUUG 1772 asasagucAfuCfGfAfc aagacauugL96 2868 смысловая 21
CAAU GU CUU GU C GAU G ACUUUCA 1773 csAfsaugUfcUfUfguc gAfuGfacuuuscsa 2869 антисмысловая 23
AU GU GAAAGU CAU C GA CAAGA 1774 asusgugaAfaGfUfCfa ucgacaagaL96 2870 смысловая 21
UCUUGUCGAUGACUUU CACAUUC 1775 usCfsuugUfcGfAfuga cUfuUfcacaususc 2871 антисмысловая 23
AAU GU GAAAGU CAU C G ACAAG 1776 asasugugAfaAfGfUfc aucgacaagL96 2872 смысловая 21
CUUGUCGAUGACUUUC ACAUUCU 1777 esUfsuguCfgAfUfgac uUfuCfacauuscsu 2873 антисмысловая 23
GGCUAAUUUGUAUCAA UGAUU 1778 gsgscuaaUfuUfGfUfa ucaaugauuL96 2874 смысловая 21
AAU CAUU GAUACAAAU UAGCCGG 1779 asAf sucaUfuGfAfuac aAfaUfuagccsgsg 2875 антисмысловая 23
GCUAAUUUGUAUCAAU GAUUA 1780 gscsuaauUfuGfUfAfu caaugauuaL96 2876 смысловая 21
UAAU CAUU GAUACAAA UUAGCCG 1781 usAfsaucAfuUfGfaua cAfaAfuuagcscsg 2877 антисмысловая 23
- 157 037115
CCCCGGCUAAUUUGUA U C AAU 1782 cscsccggCfuAfAfUfu uguaucaauL96 2878 смысловая 21
AUUGAUACAAAUUAGC CGGGGGA 1783 asUfsugaUfaCfAfaau uAfgCfcggggsgsa 2879 антисмысловая 23
CCCCCGGCUAAUUUGU AUCAA 1784 cscscccgGfcUfAfAfu uuguaucaaL96 2880 смысловая 21
UUGAUACAAAUUAGCC GGGGGAG 1785 usUfsgauAfcAfAfauu aGfcCfgggggsasg 2881 антисмысловая 23
U GU C GACUU CU GUUUU AGGAC 1786 usgsucgaCfuUfCfUfg uuuuaggacL96 2882 смысловая 21
GU C CUAAAACAGAAGU CGACAGA 1787 gsUfsccuAfaAfAfcag aAfgUfcgacasgsa 2883 антисмысловая 23
GU C GACUU CU GUUUUA GGACA 1788 gsuscgacUfuCfUfGfu uuuaggacaL96 2884 смысловая 21
U GU C CUAAAACAGAAG UCGACAG 1789 usGf succUfaAfAfаса gAf aGfucgacsasg 2885 антисмысловая 23
GAUCUGUCGACUUCUG UUUUA 1790 gsasucugUfcGfAfCfu ucuguuuuaL96 2886 смысловая 21
UAAAACAGAAGU C GAC AGAUCUG 1791 usAf saaaCfaGfAfagu cGfaCfagaucsusg 2887 антисмысловая 23
AGAUCUGUCGACUUCU GUUUU 1792 asgsaucuGfuCfGfAfc uucuguuuuL96 2888 смысловая 21
AAAACAGAAGU C GACA GAUCUGU 1793 asAf saacAfgAfAfguc gAfcAfgaucusgsu 2889 антисмысловая 23
С C GAGAAGU CAC CAAG AAGCU 1794 cscsgagaAfgUfCfAfc caagaagcuL96 2890 смысловая 21
AGCUUCUUGGUGACUU CUCGGUC 1795 asGfscuuCfuUfGfgug aCfuUfcucggsusc 2891 антисмысловая 23
C GAGAAGU CAC CAAGA AGCUA 1796 csgsagaaGfuCfAfCfc aagaagcuaL96 2892 смысловая 21
UAGCUUCUUGGUGACU UCUCGGU 1797 usAf sgcuUfcUfUfggu gAfcUfucucgsgsu 2893 антисмысловая 23
AGGACCGAGAAGUCAC CAAGA 1798 asgsgaccGfaGfAfAfg ucaccaagaL96 2894 смысловая 21
UCUUGGUGACUUCUCG GUCCUUG 1799 usCfsuugGfuGfAfcuu cUfcGfguccususg 2895 антисмысловая 23
AAGGACCGAGAAGUCA CCAAG 1800 asasggacCfgAfGfAfa gucaccaagL96 2896 смысловая 21
- 158 037115
CUUGGUGACUUCUCGG UCCUUGU 1801 csUfsuggUfgAfCfuuc uCfgGfuccuusgsu 2897 антисмысловая 23
AAACAUGGCUUGAAUG GGAUC 1802 asasacauGfgCfUfUfg aaugggaucL96 2898 смысловая 21
GAUСCCAUUCAAGCCA UGUUUAA 1803 gsAfsuccCfaUfUfcaa gCfcAfuguuusasa 2899 антисмысловая 23
AACAUGGCUUGAAUGG GAUCU 1804 asascaugGfcUfUfGfa augggaucuL96 2900 смысловая 21
AGAUССCAUUCAAGСC AUGUUUA 1805 asGfsaucCfcAfUfuca aGfcCfauguususa 2901 антисмысловая 23
UGUUAAACAUGGCUUG AAUGG 1806 usgsuuaaAfcAfUfGfg cuugaauggL96 2902 смысловая 21
CCAUUCAAGCCAUGUU UAACAGC 1807 csCfsauuCfaAfGfcca uGfuUfuaacasgsc 2903 антисмысловая 23
CUGUUAAACAUGGCUU GAAUG 1808 csusguuaAfaCfAfUfg gcuugaaugL96 2904 смысловая 21
CAUUCAAGCCAUGUUU AACAGCC 1809 csAfsuucAfaGfCfcau gUfuUfaacagscsc 2905 антисмысловая 23
GACUUGCUGCAUAUGU GGCUA 1810 gsascuugCfuGfCfAfu auguggcuaL96 2906 смысловая 21
UAGCCACAUAUGCAGC AAGUCCA 1811 usAfsgccAfcAfUfaug cAfgCfaagucscsa 2907 антисмысловая 23
ACUUGCUGCAUAUGUG GCUAA 1812 ascsuugcUfgCfAfUfa uguggcuaaL96 2908 смысловая 21
UUAGCCACAUAUGCAG CAAGUCC 1813 usUfsagcCfaCfAfuau gCfaGfcaaguscsc 2909 антисмысловая 23
AGUGGACUUGCUGCAU AUGUG 1814 asgsuggaCfuUfGfCfu gcauaugugL96 2910 смысловая 21
CACAUAUGCAGCAAGU CCACUGU 1815 csAfscauAfuGfCfage aAfgUfccacusgsu 2911 антисмысловая 23
CAGUGGACUUGCUGCA UAUGU 1816 csasguggAfcUfUfGfc ugcauauguL96 2912 смысловая 21
ACAUAUGCAGCAAGUC CACUGUC 1817 asCfsauaUfgCfAfgca aGfuCfcacugsusc 2913 антисмысловая 23
UAAAU CAGUACUU C CA AAGUC 1818 usasaaucAfgUfAfCfu uccaaagucL96 2914 смысловая 21
GACUUUGGAAGUACUG AUUUAGC 1819 gsAf scuuUfgGfAfagu aCfuGfauuuasgsc 2915 антисмысловая 23
- 159 037115
AAAU CAGUACUU С CAA AGUCU 1820 asasaucaGfuAfCfUfu ccaaagucuL96 2916 смысловая 21
AGACUUUGGAAGUACU GAUUUAG 1821 asGfsacuUfuGfGfaag uAfcUfgauuusasg 2917 антисмысловая 23
AU GCUAAAUCAGUACU UCCAA 1822 asusgeuaAfaUfCfAfg uacuuccaaL96 2918 смысловая 21
UUGGAAGUACUGAUUU AGCAUGU 1823 usUfsggaAfgUfAfcug aUfuUfagcausgsu 2919 антисмысловая 23
CAUGCUAAAUCAGUAC UUCCA 1824 csasugcuAfaAfUfCfa guacuuccaL96 2920 смысловая 21
UGGAAGUACUGAUUUA GCAUGUU 1825 usGfsgaaGfuAfCfuga uUfuAfgeaugsusu 2921 антисмысловая 23
U C CU CAAUU GAAGAAG UGGCG 1826 uscscucaAfuUfGfAfa gaaguggcgL96 2922 смысловая 21
CGCCACUUCUUCAAUU GAGGAGG 1827 esGfsccaCfuUfCfuuc aAfuUfgaggasgsg 2923 антисмысловая 23
C CU CAAUU GAAGAAGU GGCGG 1828 cscsucaaUfuGfAfAfg aaguggcggL96 2924 смысловая 21
CCGCCACUUCUUCAAU UGAGGAG 1829 csCfsgccAfcUfUfcuu cAfaUfugaggsasg 2925 антисмысловая 23
CAC CU C CU CAAUU GAA GAAGU 1830 csasccucCfuCfAfAfu ugaagaaguL96 2926 смысловая 21
ACUUCUUCAAUUGAGG AGGUGGC 1831 asCfsuucUfuCfAfauu gAfgGfaggugsgsc 2927 антисмысловая 23
C CAC CU C CU CAAUU GA AGAAG 1832 cscsaccuCfcUfCfAfa uugaagaagL96 2928 смысловая 21
CUUCUUCAAUUGAGGA GGUGGCC 1833 esUfsucuUfcAfAfuug aGfgAfgguggscsc 2929 антисмысловая 23
CAAGAU GU C CU C GAGA UACUA 1834 csasagauGfuCfCfUfc gagauacuaL96 2930 смысловая 21
UAGUAU CU C GAG GACA UCUUGAA 1835 usAfsguaUfcUfCfgag gAfcAfucuugsasa 2931 антисмысловая 23
AAGAU GU C CU C GAGAU ACUAA 1836 asasgaugUfcCfUfCfg agauacuaaL96 2932 смысловая 21
UUAGUAU CUC GAGGAC AUCUUGA 1837 usUfsaguAfuCfUfega gGfaCfaucuusgsa 2933 антисмысловая 23
U GUU CAAGAU GU C CU C GAGAU 1838 usgsuucaAfgAfUfGfu ccucgagauL96 2934 смысловая 21
- 160 037115
AU CU C GAGGACAU CUU GAACACС 1839 asUfscucGfaGfGfaca uCfuUfgaacascsc 2935 антисмысловая 23
GU GUU CAAGAU GU C CU CGAGA 1840 gsusguucAfaGfAfUfg uccucgagaL96 2936 смысловая 21
U CU C GAGGACAU CUU G AACACCU 1841 usCfsucgAfgGfAfcau cUfuGfaacacscsu 2937 антисмысловая 23
ACAUGCUAAAUCAGUA CUUCC 1842 ascsaugcUfaAfAfUfc aguacuuccL96 2938 смысловая 21
GGAAGUACUGAUUUAG CAUGUUG 1843 gsGfsaagUfaCfUfgau uUfaGfcaugususg 2939 антисмысловая 23
CAUGCUAAAUCAGUAC UUCCA 1844 csasugcuAfaAfUfCfa guacuuccaL96 2940 смысловая 21
UGGAAGUACUGAUUUA GCAUGUU 1845 usGfsgaaGfuAfCfuga uUfuAfgcaugsusu 2941 антисмысловая 23
AACAACAUGCUAAAUC AGUAC 1846 asascaacAfuGfCfUfa aaucaguacL96 2942 смысловая 21
GUACU GAUUUAGCAU G UUGUUCA 1847 gsUfsacuGfaUfUfuag cAfuGfuuguuscsa 2943 антисмысловая 23
GAACAACAUGCUAAAU CAGUA 1848 gsasacaaCfaUfGfCfu aaaucaguaL96 2944 смысловая 21
UACU GAUUUAGCAU GU UGUUCAU 1849 usAfscugAfuUfUfage aUfgUfuguucsasu 2945 антисмысловая 23
GAAAGGCACUGAUGUU CUGAA 1850 gsasaaggCfaCfUfGfa uguucugaaL96 2946 смысловая 21
UUCAGAACAUCAGUGC CUUUCCG 1851 usUfscagAfaCfAfuca gUfgCfcuuucscsg 2947 антисмысловая 23
AAAGGCACUGAUGUUC UGAAA 1852 asasaggcAfcUfGfAfu guucugaaaL96 2948 смысловая 21
UUU CAGAACAU CAGU G CCUUUCC 1853 usUfsucaGfaAfCfauc aGfuGfccuuuscsc 2949 антисмысловая 23
UGCGGAAAGGCACUGA UGUUC 1854 usgseggaAfaGfGfCfa cugauguucL96 2950 смысловая 21
GAACAUCAGUGCCUUU CCGCACA 1855 gsAf sacaUfcAfGfugc cUfuUfccgcascsa 2951 антисмысловая 23
GUGCGGAAAGGCACUG AU GUU 1856 gsusgcggAfaAfGfGfc acugauguuL96 2952 смысловая 21
AACAUCAGUGCCUUUC CGCACAC 1857 asAf scauCfaGfUfgee uUfuCfcgcacsasc 2953 антисмысловая 23
- 161 037115
GUCAGCAUGCCAAUAU GUGUG 1858 gsuscagcAfuGfCfCfa auaugugugL96 2954 смысловая 21
CACACAUAUUGGCAUG CUGACCC 1859 csAfscacAfuAfUfugg cAfuGfcugacscsc 2955 антисмысловая 23
UCAGCAUGCCAAUAUG UGUGG 1860 uscsagcaUfgCfCfAfa uauguguggL96 2956 смысловая 21
CCACACAUAUUGGCAU GCUGACC 1861 csCfsacaCfaUfAfuug gCfaUfgcugascsc 2957 антисмысловая 23
GAGGGUCAGCAUGCCA AU AUG 1862 gsasggguCfaGfCfAfu gccaauaugL96 2958 смысловая 21
CAUAUUGGCAUGCUGA CCCUCUG 1863 csAfsuauUfgGfCfaug cUfgAfcccucsusg 2959 антисмысловая 23
AGAGGGUCAGCAUGCC AAUAU 1864 asgsagggUfcAfGfCfa ugccaauauL96 2960 смысловая 21
AUAUUGGCAUGCUGAC CCUCUGU 1865 asUfsauuGfgCfAfugc uGfaCfccucusgsu 2961 антисмысловая 23
GAUGCUCCGGAAUGUU GCUGA 1866 gsasugcuCfcGfGfAfa uguugcugaL96 2962 смысловая 21
UCAGCAACAUUCCGGA GCAUCCU 1867 usCfsagcAfaCfAfuuc cGfgAfgcaucscsu 2963 антисмысловая 23
AUGCUCCGGAAUGUUG CUGAA 1868 asusgcucCfgGfAfAfu guugcugaaL96 2964 смысловая 21
UUCAGCAACAUUCCGG AGCAUCC 1869 usUfscagCfaAfCfauu cCfgGfagcauscsc 2965 антисмысловая 23
CAAGGAUGCUCCGGAA UGUUG 1870 csasaggaUfgCfUfCfc ggaauguugL96 2966 смысловая 21
CAACAUUCCGGAGCAU CCUUGGA 1871 csAfsacaUfuCfCfgga gCfaUfccuugsgsa 2967 антисмысловая 23
CCAAGGAUGCUCCGGA AU GUU 1872 cscsaaggAfuGfCfUfc cggaauguuL96 2968 смысловая 21
AACAUUCCGGAGCAUC CUUGGAU 1873 asAfscauUfcCfGfgag cAfuCfcuuggsasu 2969 антисмысловая 23
GCGUAACAGAUUCAAA CUGCC 1874 gscsguaaCfaGfAfUfu caaacugccL96 2970 смысловая 21
GGCAGUUUGAAUCUGU UACGCAC 1875 gsGfscagUfuUfGfaau cUfgUfuacgcsasc 2971 антисмысловая 23
C GUAACAGAUU CAAAC UGCCG 1876 csgsuaacAfgAfUfUfc aaacugccgL96 2972 смысловая 21
- 162 037115
CGGCAGUUUGAAUCUG UUACGCA 1877 csGfsgcaGfuUfUfgaa uCfuGfuuacgscsa 2973 антисмысловая 23
AUGUGСGUААСAGAUU САААС 1878 asusgugcGfuAfAfCfа gauucaaacL96 2974 смысловая 21
GUUUGAAUCUGUUACG CACAUCA 1879 gsUfsuugAfaUfCfugu uAfcGfcacausesa 2975 антисмысловая 23
GAUGUGСGUААСAGAU UCAAA 1880 gsasugugCfgUfAfAfc agauucaaaL96 2976 смысловая 21
UUUGAAUCUGUUACGC ACAUCAU 1881 usUfsugaAfuCfUfguu aCfgCfacaucsasu 2977 антисмысловая 23
AGAGAAGAUGGGCUAC AAGGC 1882 asgsagaaGfaUfGfGfg cuacaaggcL96 2978 смысловая 21
GCCUUGUAGCCCAUCU UCUCUGC 1883 gsCfscuuGfuAfGfccc aUfcUfucucusgsc 2979 антисмысловая 23
GAGAAGAUGGGCUACA AGGCC 1884 gsasgaagAfuGfGfGfc uacaaggccL96 2980 смысловая 21
GGCCUUGUAGCCCAUC UUCUCUG 1885 gsGfsccuUfgUfAfgcc cAfuCfuucucsusg 2981 антисмысловая 23
AGGCAGAGAAGAUGGG CUACA 1886 asgsgcagAfgAfAfGfa ugggcuacaL96 2982 смысловая 21
UGUAGCCCAUCUUCUC UGCCUGC 1887 usGfsuagCfcCfAfucu uCfuCfugccusgsc 2983 антисмысловая 23
CAGGCAGAGAAGAUGG GCUAC 1888 csasggcaGfaGfAfAfg augggcuacL96 2984 смысловая 21
GUAGC С CAU CUU CU CU GCCUGCC 1889 gsUfsagcCfcAfUfcuu cUfcUfgccugscsc 2985 антисмысловая 23
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (31)

1. Конъюгат, способный ингибировать экспрессию HAO1 в клетке, который содержит двухнитевое средство RNAi, содержащее смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, причем указанная смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из нуклеотидных последовательностей:
GAAUGUGAAAGUCAUCGACAA,
GAAAGUCAUCGACAAGACAUU или
GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA, и указанная антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеоитдов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из нуклеотидных последовательностей:
UUGUCGAUGACUUUCACAUUCUG,
AAUGUCUUGUCGAUGACUUUCAC или
UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA, причем практически все нуклеотиды указанной смысловой нити и практически все нуклеотиды указанной антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и причем указанная смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными через разветвленный бивалентный или тривалентный линкер на 3'-конце.
2. Конъюгат по п.1, в котором все нуклеотиды указанной смысловой нити и все нуклеотиды указанной антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами.
3. Конъюгат по п.1, в котором указанная смысловая нить и указанная антисмысловая нить содержат участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из антисмысловых последовательностей, приведенных в табл. 2.
4. Конъюгат по любому из пп.1-3, причем по меньшей мере один из указанных модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 3'-концевого дезокситиминового (dT) нуклеотида, 2'-О-метил-модифицированного нуклеотида, 2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, лишенного азотистого основания нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата, нуклеотида, содержащего неприродное основание, нуклеотида, содержаще-
- 163 037115 го 5'-фосфотиоатную группу, нуклеотида, содержащего 5'-фосфат или миметик 5'-фосфата, и концевого нуклеотида, связанного с холестериловым производным или бис-дециламидной группой додекановой кислоты.
5. Конъюгат по п.1, в котором по меньшей мере одна нить содержит 3'-выступ, состоящий по меньшей мере из одного нуклеотида.
6. Конъюгат по п.1, в котором по меньшей мере одна нить содержит 3'-выступ, состоящий по меньшей мере из двух нуклеотидов.
7. Конъюгат по п.1, в котором лигандом является
8. Конъюгат по п.1, в котором лиганд присоединен к З'-концу смысловой нити.
9. Конъюгат по п.8, в котором средство RNAi конъюгировано с лигандом, как показано на следующей схеме:
где X представляет собой О или S.
10. Конъюгат по п.1, в котором указанное средство дополнительно содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную или метилфосфонатную межнуклеотидную связь.
11. Конъюгат по п.10, в котором фосфотиоатная или метилфосфонатная межнуклеотидная связь находится на 3'-конце одной нити.
12. Конъюгат по п.10, в котором указанное средство RNAi содержит 6-8 фосфотиоатных межнуклеотидных связей.
13. Конъюгат по п.12, в котором антисмысловая нить содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце и две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце, а смысловая нить содержит по меньшей мере две фосфотиоатные межнуклеотидные связи либо на 5'-конце, либо на 3'-конце.
14. Конъюгат по п.1, в котором парой оснований в положении 1 от 5'-конца антисмысловой нити дуплекса является пара оснований AU.
15. Конъюгат по п.1, в котором средство RNAi выбрано из группы, состоящей из AD-62994, AD-62933, AD-65585 и AD-62944.
16. Конъюгат, способный ингибировать экспрессию НАО1 в клетке, который содержит двухнитевое средство RNAi, содержащее смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, причем указанная смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из нуклеотидных последовательностей:
GAAUGUGAAAGUCAUCGACAA,
GAAAGUCAUCGACAAGACAUU или
GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA, и указанная антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из нуклеотидных последовательностей:
UUGUCGAUGACUUUCACAUUCUG,
AAUGUCUUGUCGAUGACUUUCAC или
UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA, причем практически все нуклеотиды указанной смысловой нити содержат модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2'-O-метил-модификации и 2'-фтор-модификации, причем указанная смысловая нить содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце, причем практически все нуклеотиды указанной антисмысловой нити содержат модификацию, вы- 164 037115 бранную из группы, состоящей из 2'-О-метил-модификации и 2'-фтор-модификации, причем указанная антисмысловая нить содержит две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на
5'-конце и две фосфотиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце, и причем указанная смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством разветвленного двухвалентного или трехвалентного линкера на 3'-конце.
17. Конъюгат по п.16, где все нуклеотиды указанной смысловой нити и все нуклеотиды указанной антисмысловой нити содержат модификацию.
18. Средство RNAi, выбранное из группы средств RNAi, приведенных в табл. 1 или 2.
19. Средство RNAi по п.16, где средство RNAi выбрано из группы, состоящей из AD-62994, AD-62933, AD-65585 и AD-62944.
20. Способ лечения индивида с расстройством, связанным с HAO1, включающий подкожное введение индивиду терапевтически эффективного количества конъюгата по любому из пп.1-17, благодаря чему осуществляется лечение индивида.
21. Способ по п.20, в котором все нуклеотиды указанной смысловой нити и все нуклеотиды указанной антисмысловой нити содержат модификацию.
22. Способ по п.20, в котором индивидом является человек.
23. Способ по п.22, в котором у человека имеется РН1.
24. Способ по п.20, в котором двухнитевое средство RNAi вводят в дозе, составляющей от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг.
25. Способ по п.24, в котором двухнитевое средство RNAi вводят в дозе, составляющей приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 1,0 мг/кг или приблизительно 3,0 мг/кг.
26. Способ по п.24, в котором двухнитевое средство RNAi вводят в дозе, составляющей от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг.
27. Способ по п.24, в котором двухнитевое средство RNAi вводят подкожно.
28. Способ по п.24, в котором двухнитевое средство RNAi вводят внутривенно.
29. Способ по п.24, в котором указанное средство RNAi вводят двумя или более дозами.
30. Способ по п.29, в котором указанное средство RNAi вводят с интервалами, выбранными из группы, состоящей из одного раза приблизительно каждые 12 ч, одного раза приблизительно каждые 24 ч, одного раза приблизительно каждые 48 ч, одного раза приблизительно каждые 72 ч и одного раза приблизительно каждые 96 ч.
31. Способ по п.29, в котором указанное средство RNAi вводят один раз в неделю в течение периода длительностью до 2 недель, до 3 недель, до 4 недель, до 5 недель или дольше.
(SEQ ID NO:1).
>gi j 111842321 ref | w 017545.21 оксидаза 1 гидрокси кислот Homo sapiens (гликолат-оксидаза) (HAO1), мРНК CTGGGATAGCAATAACCTGTGAAAATGCTCCCCCGGCTAATTTGTATCAATGATTATGAACAACATGCTA
AATCAGTACTTCCAAACTCTATATATGACTATTACAGGTCTGGGGCAAATGATGAAGAAACTTTGGCTGA TAATATTGCAGCATTTTCCAGATGGAAGCTGTATCCAAGGATGCTCCGGAATGTTGCTGAAACAGATCTG TCGACTTCTGTTTTAGGACAGAGGGTCAGCATGCCAATATGTGTGGGGGCTACGGCCATGCAGCGCATGG CTCATGTGGACGGCGAGCTTGCCACTGTGAGAGCCTGTCAGTCCCTGGGAACGGGCATGATGTTGAGTTC CTGGGCCACCTCCTCAATTGAAGAAGTGGCGGAAGCTGGTCCTGAGGCACTTCGTTGGCTGCAACTGTAT
ATCTACAMGACCG№AAGT£^CAAGAAGCTAGTGC№CAGGCAGAGAAGATi^GCTACAAGGCCATAT ttgtgacagtggacacaccttacctgggcaaccgtctggatgatgtgcgtaacagattcaaactgccgcc ACAACTCAGGATGAAAAATTTTGAAACCAGTACTTTATCATTTTCTCXTGAGGAAAATTTTGGAGAGGAC AGTGGACTTGCTGCMATGTGGCTAAAGCAATAGACCCATCTATCAGCTGGGAAGATATCAAATGGCTGA GAMACIGACATCATTGCCAATTGTTGCAAASGGCATTTTGA<aGGTGATGATGCClGGGAfiGCTGTTAA ACATGGCTTGAATGGGATCTTGGTGTCGAATCATGGGGCTCGACAACTCGATGGeGTGCCAGCCACTATT GATGTTCTGCCAGAAATTGTGC^GCTGTGGAAGGGAAGGTGGAAGTCTTCCTGGACGGGGGTGTGCGGA AAGGCACTGATGTTCTGAAAGCTGTGGCTCTTGGCGCCAAGGCTGTGTTTGTGGGGAGACCAATCGTTTG GGGCTTAGCTTTCCAGGGGGAGAAAGGTGTTCAAGATGTCCTCGAGATACTAAAGGAAGAATTCCGGTTG GCCATG(KTCTGAGTGGGTGCCAGM.TGTGAAAGTCATCGAaiAfiACATT№TGM CCGTTTCCAAGATCTGACAGTGCACAATATTTTCCCATCTGTATTATTTTTTTTCAGCATGTATTACTTG ACAAAGAGACACTGTGCAGAGGGTGACCACAGTCTGTAATTCCCCACTKAATACAAAGGGTGTCGTTCT TTTCCAACAAAATAGCAAICCCTTTTATTTCATTGCTTTTGACTITTCAATGGGTGTCCTAGGAACCTTT TAGAAAGAAATGGACTTTCATCCTGGAAATATATTAACTGTTAAAAAGAAAACATTGAAAATGTGTTTAG ACAACGTCATCCCCTGGCAGGCTAAAGTGCTGTATCCTTTAGTAAAATTGGAGGTAGCAAACACTAAGGT GAAAAGATAATGATCTCATTGrTTATTAACCTGTATTCTGTTTACATGrCTrTAAAACAGTGGTTCTTAA attgtaaggtcaggttcaaagtgttggtaatgcctgattcacaactttgagaaggtagcactggagagaa TTGGAATGGGTGGCGGTAATTGGTGATACTTCTTTGAATGTAGATTTCCAATCACATCTTTAGTGTCTGA ATATATCCAAATGTTTTAGGATGTATGTTACTTCTTAGAGAGAAATAAAGCATTTTTGGGAAGAAT
Фиг. 1
- 165 037115 (S1Q ID NO:2) >gi11338931661ref|NM 010403.21 оксидаза 1 гидроксикислот Mus musculus, печень {НАО1|, мРНК GGTTGCCCTACCCTGCCACAATGTTGCC^CGACTGGTCTGCATCAGTGATTATGAACAGCAWTCCGATC AGTGCTTCAGAAGTCAGTGTATGACTATTACAGGTCTGGGGCAAATGATCAGGAGACGTTAGCTGATAAC ATCCXAGCATTTTCTAGATGGAAGCTCTATCCACGGATGCTTa^AAC^^ CTTCTGTTTTAGGACAGAGAGTCAGCATGCCAATATGTGTTGGGGCTACTGCCATGCAGTGCATGOZTCA CGTGGACGGGGAGCTGGCCACTGTGCGAGCCTGTCAGACCATGGGAACTGGCATGATGCTGAGTTCTTGG GCTACCTCCTCAATAGAAGAAGTGGCAGAAGCTGGCCCAGAGGCACTTCGCTGGATGCAACTGTACATCT AmAAGACCGTGAGATCA^^ACA^TAGTGA^CO^CTGAiGAAGCAGGGTTACAAG^CATATlTGT GACTGTGGACACCCCTTACCTGGGCAACCGCATTGATGACGTGCGGAACAGGTTCAAGCTGCCACCACAA C’R^GGATGAJUUU^TTTGAAACCAATGATTiR^CATTTTCTCCTAAGGGAAATTTTGGAGACAACAGTG GACTTGCTGAATATGTGGCACAAGCTATAGACCCATCTCTCAGCTGGGATGATATTACATGGCTCAGACG attgacatcactgcctattgttgtaaagggcattttgagaggtgatgatgccaaggaagctgttaaacat GGTGTGGATGGGATCTTGGTGTCGAATCATGGGGCGCGACAACTGGATGGGGTGCCAGCTACTATTGATG tcctgccagagattgttgaggctgtggaagggaaggtagaagtcttcctggatgggggagtaaggaaagg TACTGA.TGTTCTCAAAGCTCTGGCCCTAGGA.GCC.AAGGCCGTTTTTGTGGGAAGACCCATCATCTGGGGC TTGGCTTTCCAGGGGGAGAAAGGTTTCAAGATGTCCTCGAGATATTGAAGGAAGAATTCCGACTGGCCA
TGGCTCTGAGTGGGTGCCAGAATGTGGAAAGTCATCGACAAGACATTGGTGAGGAAAAATCCTTTGGCTGT TTCCAMiATCTGACAGTGCACAATATTTTCCCATCTGTATTATTTTTTTTCCAGCGTGGATTACTTGACA AAGAGACACTGTGCAGAGGGTGACCACAGACTGTAACTCCCCACTTCTATACAAAGGGTGTCGTTCTTT’r ccaacaaaatagccaccccttttccttcatto:ttttgacttttcaatgggtgtcctaggaaccttctag AAAGAAATG^CTTGCATCCTGGAAATATATTAACTGTTAAAAAGAAAACATTGAAAATGTGTTTGGGCA ACGTCATCCCCTG^AGGCTAAAGT^TGGGGAACAAAAGArAT<XTCTGGTGMATTGCAGGlA®:ATG CTGAAGUGAAAGATACTGACCTCACICTICATTAACCTGTCTTCTGTTTAGATITCCTTAAGACAGTGGC TCTTACA^TTTGCACTTGGCTTTGAAATGCTGGAAATGCCCAGAGAAACATGAGGTTTGGATTTGCCATG TTGAGAAAATAGCACCAGGTAGAATTGAAATGGATGGTGGTAATTTGTGATTTTTTTTCTAGAAACTTTT САТТТТТТААСАСССГАТТТТТТТбААбеТАСАТТТТТАССТАТАТАТСАСАССТСТвААТАТСТСТСбА TGTTTTGTffiCACTCATTGCATTTGAAAGaSAtGTGTCTAGTCCAGTTGGGACCACATGGA^TATTTTT ACTTTTGAACTTTGTCTCCTCATTCTCATTTTAAAATAAGTGTTGACTTCCTAATTCCTCTTGAATCTTT? TTTGATTTTCTCACTTTTCXTCATTrATAGTCACATTCAGTGTAAAGTACATATTTTGTGGGGTCCGTGA TGAATAAAGATTTGAAATTCTTGTTCAGAAGGAAGGCAAAAAAAAAAAAAAGTCTTTCCTTTTATCACA
EA201790789A 2014-10-10 2015-10-09 Композиции и способы, предназначенные для ингибирования экспрессии гена hao1 (оксидазы 1 гидроксикислот (гликолат-оксидазы)) EA037115B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462062751P 2014-10-10 2014-10-10
US201562147976P 2015-04-15 2015-04-15
US201562214602P 2015-09-04 2015-09-04
PCT/US2015/054881 WO2016057893A1 (en) 2014-10-10 2015-10-09 Compositions and methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201790789A1 EA201790789A1 (ru) 2017-08-31
EA037115B1 true EA037115B1 (ru) 2021-02-08

Family

ID=55653836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790789A EA037115B1 (ru) 2014-10-10 2015-10-09 Композиции и способы, предназначенные для ингибирования экспрессии гена hao1 (оксидазы 1 гидроксикислот (гликолат-оксидазы))

Country Status (38)

Country Link
US (3) US10478500B2 (ru)
EP (2) EP3204015B1 (ru)
JP (3) JP6836988B2 (ru)
KR (2) KR20230113654A (ru)
CN (2) CN108064154B (ru)
AU (2) AU2015330726B9 (ru)
BR (1) BR112017006469A2 (ru)
CA (2) CA3187050A1 (ru)
CO (1) CO2017004728A2 (ru)
CR (1) CR20170190A (ru)
CY (2) CY1125364T1 (ru)
DK (1) DK3204015T3 (ru)
DO (1) DOP2017000094A (ru)
EA (1) EA037115B1 (ru)
EC (1) ECSP17028310A (ru)
ES (1) ES2905889T3 (ru)
HR (1) HRP20211971T1 (ru)
HU (2) HUE057327T2 (ru)
IL (3) IL310466A (ru)
JO (2) JOP20200115A1 (ru)
LT (2) LT3204015T (ru)
MX (2) MX2017004634A (ru)
MY (1) MY192926A (ru)
NO (1) NO2022009I1 (ru)
NZ (1) NZ730404A (ru)
PE (1) PE20171763A1 (ru)
PH (1) PH12017500669A1 (ru)
PL (1) PL3204015T3 (ru)
PT (1) PT3204015T (ru)
RS (1) RS62854B1 (ru)
SG (2) SG10201913756QA (ru)
SI (1) SI3204015T1 (ru)
TN (1) TN2017000125A1 (ru)
TW (3) TW202342749A (ru)
UA (1) UA126266C2 (ru)
UY (1) UY36357A (ru)
WO (1) WO2016057893A1 (ru)
ZA (1) ZA201702071B (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6165723B2 (ja) 2011-06-30 2017-07-19 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための組成物および方法
PT3581654T (pt) * 2013-12-27 2021-06-02 Dicerna Pharmaceuticals Inc Métodos e composições para a inibição específica de glicolato oxidase (hao1) por rna de cadeia dupla
JOP20200115A1 (ar) 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
WO2016205323A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
AU2016306275A1 (en) 2015-08-07 2018-02-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi therapy for Hepatitis B virus infection
JOP20170161A1 (ar) 2016-08-04 2019-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
ES2639863B1 (es) 2017-03-10 2018-09-20 Universidad De Granada Compuestos para el tratamiento de enfermedades causadas por la acumulación de oxalato
WO2018191278A2 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Arbutus Biopharma Corporation Targeted compositions
US11261447B2 (en) 2017-07-13 2022-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibition of HAO1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
AU2018301477A1 (en) 2017-07-13 2020-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Lactate dehydrogenase a (LDHA) iRNA compositions and methods of use thereof
CN118685406A (zh) * 2018-05-14 2024-09-24 阿尔尼拉姆医药品有限公司 血管紧张素原(AGT)iRNA组合物及其使用方法
TW202039844A (zh) * 2018-12-19 2020-11-01 美商阿尼拉製藥公司 類澱粉前驅蛋白（ＡＰＰ）ＲＮＡｉ劑組成物及其使用方法
US20220090047A1 (en) * 2018-12-21 2022-03-24 Precision Biosciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
JP7439248B2 (ja) 2019-11-01 2024-02-27 ライラック セラピューティクス， インク． グリコール酸オキシダーゼ阻害剤としてのヘテロ環式カルボキシレート化合物
JP2023503644A (ja) * 2019-11-27 2023-01-31 ディー・ティー・エックス・ファーマ・インコーポレイテッド デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための化合物および方法
EP4121534A1 (en) * 2020-03-18 2023-01-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
WO2022087041A1 (en) 2020-10-21 2022-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria
WO2022104062A1 (en) 2020-11-12 2022-05-19 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases having specificity for recognition sequences in the dystrophin gene
WO2022119873A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
WO2022212153A1 (en) * 2021-04-01 2022-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
CN117642505A (zh) 2021-06-04 2024-03-01 神经微核糖核酸治疗有限公司 靶向腺苷激酶的反义寡核苷酸
EP4373934A1 (en) 2021-07-19 2024-05-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating subjects having or at risk of developing a non-primary hyperoxaluria disease or disorder

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110287974A1 (en) * 2010-05-24 2011-11-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent
US20110301229A1 (en) * 2004-03-15 2011-12-08 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
WO2012023960A2 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Transalgae (Israel) Ltd Transgenically mitigating the establishment and spread of transgenic algae in natural ecosystems by suppressing the activity of a carbon concentrating mechanism
WO2013074974A2 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
US20140221465A1 (en) * 2012-04-02 2014-08-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for treating galactosylceramidase protein deficiency

Family Cites Families (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
ATE190981T1 (de) 1989-10-24 2000-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte nukleotide
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
ATE241426T1 (de) 1991-11-22 2003-06-15 Affymetrix Inc A Delaware Corp Verfahren zur herstellung von polymerarrays
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
DE69233599T2 (de) 1991-12-24 2006-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Unterbrochene 2'-modifizierte Oligonukleotide
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
AU4769893A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
EP0685234B1 (en) 1993-02-19 2000-05-10 Nippon Shinyaku Company, Limited Drug composition containing nucleic acid copolymer
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
KR960705837A (ko) 1993-11-16 1996-11-08 라이오넬 엔. 사이몬 비포스포네이트 뉴클레오시드간 연결기와 혼합된 비대칭적으로 순수한 포스포네이트 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 합성 올리고머(Synthetic Oligomers Having Chirally Pure Phosphonate Internucleosidyl Linkages Mixed with Non-Phosphonate Internucleosidyl Linkages)
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
AU5359496A (en) 1995-03-06 1996-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
WO1996037194A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
EP0832271B8 (en) 1995-06-07 2005-03-02 INEX Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
DE69634606D1 (de) 1995-10-16 2005-05-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Neue expressionsvektoren und verfahren zu deren verwendung
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
CA2335393C (en) 1998-07-20 2008-09-23 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU6298899A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
AU6430599A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Cytogenix, Inc. Enzymatic synthesis of ssdna
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
WO2000050050A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001053307A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
US6998484B2 (en) 2000-10-04 2006-02-14 Santaris Pharma A/S Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
US20050176025A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of B-cell CLL/Lymphoma-2 (BCL-2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003015698A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
JP2005528082A (ja) * 2001-12-18 2005-09-22 モンドバイオテック・ラボラトリーズ・アンスタルト 間質性肺疾患の治療を向上させるためのインターフェロンγ又はパーフェニドンと分子診断薬との新規医薬組成物
EP2314690A1 (en) 2002-07-10 2011-04-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
US7956176B2 (en) * 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
WO2004090108A2 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals Irna conjugates
EP3450559A1 (en) 2003-03-07 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
WO2005014782A2 (en) 2003-06-13 2005-02-17 Alnylam Europe Ag., Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
JP4731324B2 (ja) 2003-08-28 2011-07-20 武 今西 Ｎ−ｏ結合性架橋構造型新規人工核酸
CA2554212A1 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sina)
US7642348B2 (en) * 2004-10-04 2010-01-05 Rosetta Genomics Ltd Prostate cancer-related nucleic acids
TWI335352B (en) 2005-03-31 2011-01-01 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
US8362229B2 (en) 2006-02-08 2013-01-29 Quark Pharmaceuticals, Inc. Tandem siRNAS
NZ571568A (en) 2006-03-31 2010-11-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded RNA molecule compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene
JP5761911B2 (ja) 2006-04-07 2015-08-12 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｔｌｒ７およびｔｌｒ８に対する安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
JP5570806B2 (ja) 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
WO2009014887A2 (en) 2007-07-09 2009-01-29 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory rna (simra) compounds
CA3043911A1 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
PT2279254T (pt) 2008-04-15 2017-09-04 Protiva Biotherapeutics Inc Novas formulações lipídicas para entrega de ácido nucleico
EP2298359A1 (en) * 2008-06-04 2011-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Nucleic acid capable of controlling degranulation of mast cell
EP2169071A1 (en) * 2008-09-29 2010-03-31 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rodent cancer model for human FGFR4 Arg388 polymorphism
WO2010048536A2 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Processes for preparing lipids
CA2764158A1 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US8431544B1 (en) 2009-08-27 2013-04-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
PT2539451E (pt) * 2010-02-24 2016-03-28 Arrowhead Res Corp Composições para entrega de arnsi dirigida ao alvo
AR080364A1 (es) * 2010-03-26 2012-04-04 Danisco Us Inc Tratamiento de fibras queratinosas con una enzima que tiene actividad perhidrolasa
KR102395085B1 (ko) * 2011-06-21 2022-05-09 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) iRNA 조성물 및 그 사용 방법
US9228188B2 (en) * 2011-06-21 2016-01-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and method for inhibiting hepcidin antimicrobial peptide (HAMP) or HAMP-related gene expression
PE20142362A1 (es) * 2011-11-18 2015-01-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de iarn, composiciones y metodos de uso de los mismos para tratar enfermedades asociadas con transtiretina (ttr)
US9133461B2 (en) * 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
AU2013299717B2 (en) 2012-08-06 2018-06-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugated RNA agents and process for their preparation
RS56783B9 (sr) * 2012-12-05 2021-12-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Sastavi pcsk9 irnk i postupci njihovih primena
CA2904654C (en) 2013-03-14 2023-12-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
AU2014236250B2 (en) * 2013-03-14 2019-01-03 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Process for formulating an anionic agent
PT3581654T (pt) * 2013-12-27 2021-06-02 Dicerna Pharmaceuticals Inc Métodos e composições para a inibição específica de glicolato oxidase (hao1) por rna de cadeia dupla
JOP20200115A1 (ar) 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
WO2016205323A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
WO2017001623A1 (en) 2015-06-30 2017-01-05 British Telecommunications Public Limited Company Energy management in a network
US11261447B2 (en) 2017-07-13 2022-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibition of HAO1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
CN111845757A (zh) 2019-04-30 2020-10-30 通用汽车环球科技运作有限责任公司 分心驾驶消除系统
CN110649043B (zh) 2019-09-30 2021-11-19 厦门天马微电子有限公司 阵列基板、显示面板、显示装置及阵列基板的制备方法
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110301229A1 (en) * 2004-03-15 2011-12-08 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
US20110287974A1 (en) * 2010-05-24 2011-11-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent
WO2012023960A2 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Transalgae (Israel) Ltd Transgenically mitigating the establishment and spread of transgenic algae in natural ecosystems by suppressing the activity of a carbon concentrating mechanism
WO2013074974A2 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
US20140288158A1 (en) * 2011-11-18 2014-09-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED RNAi AGENTS
US20140221465A1 (en) * 2012-04-02 2014-08-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for treating galactosylceramidase protein deficiency

Also Published As

Publication number Publication date
JOP20200115A1 (ar) 2017-06-16
CR20170190A (es) 2017-07-26
CN108064154A (zh) 2018-05-22
PL3204015T3 (pl) 2022-02-21
AU2015330726B9 (en) 2021-09-16
SI3204015T1 (sl) 2022-04-29
SG11201702836PA (en) 2017-05-30
US10478500B2 (en) 2019-11-19
JP7404212B2 (ja) 2023-12-25
HUE057327T2 (hu) 2022-05-28
EP3204015A1 (en) 2017-08-16
US20200316201A1 (en) 2020-10-08
CY2022008I2 (el) 2023-01-05
ES2905889T3 (es) 2022-04-12
HRP20211971T1 (hr) 2022-03-18
MX2021005224A (es) 2021-06-18
JP2017532038A (ja) 2017-11-02
PE20171763A1 (es) 2017-12-21
MX2017004634A (es) 2017-09-19
EP3204015B1 (en) 2021-12-08
TN2017000125A1 (en) 2018-10-19
PT3204015T (pt) 2022-02-09
US20230121944A1 (en) 2023-04-20
WO2016057893A9 (en) 2016-05-19
KR20170083042A (ko) 2017-07-17
JP2021019609A (ja) 2021-02-18
IL310466A (en) 2024-03-01
AU2021269372B2 (en) 2024-07-11
US20170304446A1 (en) 2017-10-26
AU2015330726A1 (en) 2017-05-11
LT3204015T (lt) 2022-01-10
CN108064154B (zh) 2021-08-27
HUS2200011I1 (hu) 2022-04-28
WO2016057893A1 (en) 2016-04-14
CA3187050A1 (en) 2016-04-14
DOP2017000094A (es) 2017-07-15
CN113599389A (zh) 2021-11-05
NZ730404A (en) 2023-09-29
JP2024037855A (ja) 2024-03-19
LTPA2022004I1 (ru) 2022-04-25
IL251276B (en) 2022-07-01
NO2022009I1 (no) 2022-04-05
TW201619382A (zh) 2016-06-01
CY1125364T1 (el) 2023-01-05
DK3204015T3 (da) 2022-01-17
IL293229B1 (en) 2024-03-01
EP4039809A1 (en) 2022-08-10
SG10201913756QA (en) 2020-03-30
KR102558604B1 (ko) 2023-07-26
UY36357A (es) 2016-11-30
ZA201702071B (en) 2019-06-26
CO2017004728A2 (es) 2017-09-29
AU2021269372A1 (en) 2021-12-16
CA2963843A1 (en) 2016-04-14
EA201790789A1 (ru) 2017-08-31
CY2022008I1 (el) 2023-01-05
TWI755351B (zh) 2022-02-21
JO3558B1 (ar) 2020-07-05
CA2963843C (en) 2023-03-21
UA126266C2 (uk) 2022-09-14
MY192926A (en) 2022-09-15
IL293229A (en) 2022-07-01
ECSP17028310A (es) 2018-03-31
KR20230113654A (ko) 2023-07-31
JP6836988B2 (ja) 2021-03-03
US11446380B2 (en) 2022-09-20
IL293229B2 (en) 2024-07-01
IL251276A0 (en) 2017-05-29
EP3204015A4 (en) 2018-06-20
RS62854B1 (sr) 2022-02-28
TW202342749A (zh) 2023-11-01
BR112017006469A2 (pt) 2017-12-12
AU2015330726B2 (en) 2021-09-02
PH12017500669A1 (en) 2017-10-09
TW202223090A (zh) 2022-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7404212B2 (ja) Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子の発現の阻害のための組成物および方法
JP2023061967A (ja) Ｔｍｐｒｓｓ６ ｉｒｎａ組成物及びその使用方法
JP7337044B2 (ja) Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子発現の阻害方法
EA038792B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ RNAi Serpina1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US20230407312A1 (en) Methods and compositions for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
US20230392155A1 (en) Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria
EA042137B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA TMPRSS6 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ