RS62854B1 - Kompozicije i postupci za inhibiciju ekspresije gena hao1 (oksidaza 1 hidroksilne kiseline (glikolat oksidaza)) - Google Patents

Kompozicije i postupci za inhibiciju ekspresije gena hao1 (oksidaza 1 hidroksilne kiseline (glikolat oksidaza))

Info

Publication number
RS62854B1
RS62854B1 RS20220081A RSP20220081A RS62854B1 RS 62854 B1 RS62854 B1 RS 62854B1 RS 20220081 A RS20220081 A RS 20220081A RS P20220081 A RSP20220081 A RS P20220081A RS 62854 B1 RS62854 B1 RS 62854B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rnai agent
nucleotides
double
mrna
hao1
Prior art date
Application number
RS20220081A
Other languages
English (en)
Inventor
William Querbes
Kevin Fitzgerald
Brian Bettencourt
Abigail Liebow
David V Erbe
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of RS62854B1 publication Critical patent/RS62854B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03015—(S)-2-Hydroxy-acid oxidase (1.1.3.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Pozadina pronalaska
[0001] Primarna hiperoksalurija tip 1 (PHI) je autozomni recesivni poremećaj metabolizma glioksilata. Detoksikacija glioksilata u jetri je oslabljena usled mutacije gena AGXT koji kodira enzim peroksizomne alanin-glioksilat aminotransferaze (AGT) jetre. AGT1 je krajnji enzim u metaboličkoj razgradnji hidroksiprolina. Gubitak funkcije AGT za konvertovanje intermedijernog metabolita glioksilata u glicin uzrokuje akumulaciju i redukciju glioksilata u glikolat koji se oksidiše u oksalat pomoću enzima glikolat oksidaze (GO), koji je poznat i kao oksidaza hidroksilne kiseline (HAO1).
[0002] Regulacija glioksilata, koji je ključni prekursor oksalata, odvija se na više mesta u ćeliji, uključujući mitohondrije, peroksizom i citozol. Višak oksalata kod pacijenata sa PH1 ne može u potpunosti da se izluči putem bubrega, što dovodi do nastanka i taloženja kristala kalcijum oksalata u bubrezima i urinarnom traktu. Oštećenje bubrega je uzrokovano kombinacijom tubularne toksičnosti oksalata, nefrokalcinoze i bubrežne opstrukcije putem kamenja. Više od 30% pacijenata napreduje do krajnjeg stadijuma bolesti bubrega (ESRD).
[0003] HAO1 gen kodira enzim oksidazu 1 hidroksilne kiseline, poznat i kao glikolat oksidaza („GO“). HAO1 protein se primarno eksprimira u jetri, i to je oksidaza 2-hidroksilne kiseline koja je najaktivnija na glikolatu.
[0004] Na mišjem modelu PHI, u kome je gen AGT1 izbrisan, nivoi oksalata u urinu su sniženi kada je gen HAO1 izbrisan.
[0005] PHI, AGXT i HAO1 su opisani u sledećim delima: Angel L. Pey, Armando Albert, i Eduardo Salido, "Protein Homeostasis Defects of Alanine-Glyoxylate Aminotransferase: New Therapeutic Strategies in Primary Hyperoxaluria Type I," BioMed Research International, sveska 2013, ID članka 687658, 15 strana, 2013. doi:10.1155/2013/687658; Cochat i Rumsby (2013) NEJM 369:7; Salido et al (2006) PNAS 103:18249; Baker et al (2004) American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology Published 1 October 2004 sveska 287 br. 4, H1771-H1779DOI: 10.1152/ajpheart.00234.2004. Prethodne strategije za lečenje PH1 su opisane u Salido et al., Biochim Biophys Acta. (2012);1822(9):1453-64.
Sažetak
[0006] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Ovde su uopšteno opisane kompozicije koje sadrže agense RNKi, npr. agense dvolančane iRNK, koji ciljaju HAO1. Ovde su takođe opisani postupci koji koriste kompozicije iz otkrića za inhibiciju ekspresije HAO1 i za lečenje bolesti povezanih sa HAO1, npr. PH1.
Kratak opis slika
[0007]
Slika 1 prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens HAO1 mRNK (SEQ ID NO:1).
Slika 2 prikazuje nukleotidnu sekvencu Mus musculus HAO1 mRNK (SEQ ID NO:2).
Slika 3A je grafikon sa rezultatima in vitro skrininga GO (HAO) GalNac-siRNK konjugata u primarnim hepatocitima majmuna cinomolgusa.
Slika 3B je grafikon sa krivom doznog odgovora GO (HAO) GalNac-siRNK konjugata u primarnim hepatocitima majmuna cinomolgusa.
Slika 4A je grafikon sa rezultatima in vivo procene GO (HAO) GalNAc-siRNK konjugata kod C57B6 miševa nakon jedne doze.
Slika 4B je grafikon sa rezultatima in vivo procene GO (HAO) GalNAc-siRNK konjugata kod C57B6 miševa nakon ponovljene doze.
Slika 5A je grafikon koji pokazuje nivoe oksalata u urinu AGXT nokaut (KO) miševa nakon lečenja GO (HAO) GalNAc-siRNK konjugatima.
Slika 5B je grafikon koji pokazuje nivoe glikolata u urinu AGXT KO miševa nakon lečenja GO (HAO) GalNAc-siRNK konjugatima.
Slika 6A je grafikon koji prikazuje nivoe AGXT mRNK na modelu pacova PH172 sata nakon jedne doze AGXT siRNK.
Slika 6B je grafikon koji pokazuje nivoe oksalata u urinu na modelu pacova PH172 sata nakon lečenja GO (HAO) GalNAc-siRNK konjugatom.
Slika 6C je grafikon koji prikazuje nivoe oksalata u urinu na modelu pacova PH1 praćenom tokom 49 dana uz neprekidno nedeljno doziranje 14. i 21. dana sa AF-011-63102 i AD-62994 i 24-časovno prikupljanje urina, kako je prikazano.
Slika 6D je grafikon koji prikazuje trajanje izbacivanja HAO1 kod pacova. Prikazani su nivoi mRNK nedelju dana ili četiri nedelje nakon poslednje od 4 doze (što odgovara 28. i 49. danu na slici 6C) i eksprimirani su u odnosu na nivoe koji su uočeni kod pacova lečenih PBS-om
Slika 7 prikazuje obrnuti komplement nukleotidne sekvence Homo sapiens HAO1 mRNK (SEQ ID NO:3).
Slika 8 prikazuje obrnuti komplement nukleotidne sekvence Mus musculus HAO1 mRNK (SEQ ID NO:4).
Slika 9 prikazuje nukleotidnu sekvencu Macaca fascicularis HAO1 mRNK (SEQ ID NO:5).
Slika 10 prikazuje nukleotidnu sekvencu Rattus norvegicus HAO1 mRNK (SEQ ID NO:6).
Slika 11 prikazuje obrnuti komplement nukleotidne sekvence Macaca fascicularis HAO1 mRNK (SEQ ID NO:7).
Slika 12 prikazuje obrnuti komplement nukleotidne sekvence Rattus norvegicus HAO1 mRNK (SEQ ID NO:8).
Slika 13 prikazuje in vivo skrining GO GalNAc konjugata.
Slika 14 je grafikon koji prikazuje in vivo procenu GO-GalNAc konjugata kod miševa.
Slika 15 je grafikon koji prikazuje procenu doznog odgovora za GO-GalNAc konjugate kod miševa.
Slika 16 je grafikon koji prikazuje procenu doznog odgovora za GO-GalNAc konjugate kod miševa.
Slika 17 je grafikon koji prikazuje procenu doznog odgovora kod miševa.
Slika 18 predstavlja dva grafikona koja prikazuju odnos izbacivanja mRNK i nivoa glikolata u serumu miševa.
Slika 19 predstavlja dva grafikona koja prikazuju odnos izbacivanja mRNK i nivoa glikolata u serumu pacova.
Slika 20 je grafikon koji prikazuje dozno zavisnu inhibiciju HAO1 mRNK putem ALN-65585 u primarnim hepatocitima cinomolgusa.
Slika 21 predstavlja dva grafikona koja prikazuju nivoe HAO1 mRNK i glikolata u serumu nakon lečenja jednom dozom ALN-GO1 kod miševa.
Slika 22 je grafikon koji prikazuje trajanje utišavanja HAO1 mRNK nakon lečenja jednom dozom ALN-GO1 kod miševa.
Slika 23 je grafikon koji prikazuje nivoe HAO1 mRNK i glikolata u serumu nakon lečenja jednom dozom ALN-GO1 kod pacova.
Slika 24 predstavlja dva grafikona koja prikazuju nivoe oksalata i glikolata u urinu na mišjem modelu primarne hiperoksalurije tip I nakon jedne doze ALN-GO1.
Slika 25A je grafikon koji prikazuje nivoe HAO1 mRNK na pacovskom modelu primarne huperoksalurije tip I nakon jedne doze ALN-GO1.
Slika 25B je grafikon koji prikazuje urinarne nivoe oksalata na pacovskom modelu primarne hiperoksalurije tip I nakon jedne doze ALN-GO1.
Slika 26 predstavlja dva grafikona koja prikazuju nivoe HAO1 mRNK i oksalata u urinu na pacovskom modelu primarne hiperoksalurije tip I nakon ponovljene doze ALN-GO1.
Slika 27 predstavlja dva grafikona koji prikazuju nivoe HAO1 mRNK i glikolata u serumu nakon ponovljene doze kod nehumanih primata.
Detaljan opis
[0008] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Shodno tome, u jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje agens dvolančane RNKi koji može da inhibira ekspresiju HAO1 u ćeliji, pri čemu navedeni agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac i antisens lanac koji grade dvolančani region, pri čemu navedeni sens lanac i navedeni antisens lanac sadrže region komplementarnosti koji sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se razlikuju za najviše 3 nukleotida od antisens sekvence SEQ ID NO:706; pri čemu su suštinski svi nukleotidi navedenog sens lanca i suštinski svi nukleotidi navedenog antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je navedeni sens lanac konjugovan sa ligandom vezanim na 3'-terminusu.
[0009] Ovde su takođe obezbeđene kompozicije koje sadrže agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi, koji ciljaju HAO1. Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke koji koriste kompozicije iz otkrića za inhibiciju ekspresije HAO1 i za lečenje poremećaja povezanih sa HAO1.
I. Definicije
[0010] Kako bi se predmetno otkriće lakše razumelo, prvo se definišu određeni pojmovi. Pored toga, treba imati u vidu da svaki put kada se navodi vrednost ili raspon vrednosti za parametar, namera je da vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe budu deo ovog otkrića.
[0011] Odrednice za jedninu se ovde koriste da se označi jedan ili više od jednog (tj. najmanje jedan) gramatičkih predmeta odrednice. Na primer, „element“ znači jedan element ili više od jednog elementa, npr. množina elemenata.
[0012] Termin „uključujući“ se ovde koristi u značenju „uključujući, ali bez ograničenja“, i koristi se naizmenično sa ovom frazom.
[0013] Termin „ili“ se ovde koristi u značenju „i/ili“, i koristi se naizmenično sa ovim terminom, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0014] Kako se ovde koristi, „HAO1“ označava gen koji kodira enzim oksidazu 1 hidroksilne kiseline. Drugi nazivi gena uključuju GO, GOX, GOX1 i HAOX1. Protein je takođe poznat kao glikolat oksidaza i oksidaza (S)-2-hidroksilne kiseline. GenBank pristupni broj za mRNK humanog HAO1 je NM_017545.2; za mRNK HOA1 majmuna cinomolgusa (Macaca fascicularis) je XM_005568381.1; za mRNK mišjeg (Mus musculus) HAO1 je NM_010403.2; za mRNK pacovskog (Rattus norvegicus) HAO1 je XM_006235096.1.
[0015] Termin „HAO1“, kako se ovde koristi, takođe se odnosi na varijacije DNK sekvence gena HAO1 koje se javljaju u prirodi, kao što je jednonukleotidni polimorfizam (SNP) u genu HAO1. Primeri za SNP mogu se naći u NCBI dbSNP bazi podataka kratkih genetskih varijacija koja je dostupna na www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP.
[0016] Kako se ovde koristi, „ciljna sekvenca“ se odnosi na susedni deo nukleotidne sekvence mRNK molekula formiran tokom transkripcije gena HAO1, uključujući mRNK koja je proizvod obrade RNK primarnog proizvoda transkripcije.
[0017] Kako se ovde koristi, termin „lanac koja sadrži sekvencu“ odnosi se na oligonukleotid koji sadrži niz nukleotida koji je opisan sekvencom označenom korišćenjem standardne nomenklature nukleotida.
[0018] „G“, „C“, „A“ i „U“ generalno označavaju nukleotid koji sadrži guanin, citozin, adenin, odnosno uracil kao bazu. „T“ i „dT“ se ovde koriste naizmenično i označavaju dezoksiribonukleotid, pri čemu je nukleobaza timin, npr. dezoksiribotimin, 2'-dezoksitimidin ili timidin. Međutim, treba razumeti da termin „ribonukleotid“ ili „nukleotid“ ili „dezoksiribonukleotid“ takođe može da označava modifikovani nukleotid, kako je detaljnije prikazano u nastavku, ili surogatni zamenski ostatak. Stručna osoba zna da se guanin, citozin, adenin i uracil mogu zameniti drugim ostacima bez značajne promene svojstava baznog para oligonukleotida koji sadrži nukleotid sa takvim zamenskim ostatkom. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji sadrži inozin kao bazu može se bazno uparivati sa nukleotidima koji sadrže adenin, citozin ili uracil. Stoga, nukleotidi koji sadrže uracil, guanin ili adenin mogu se zameniti u nukleotidnoj sekvenci iz otkrića nukleotidom koji sadrži, na primer, inozin. Sekvence koje sadrže takve zamenske ostatke su takođe otkrivene u ovom tekstu.
[0019] Termini „iRNK“, „agens RNKi“, „agens RNK interferencije“, koji se ovde naizmenično koriste, označavaju agens koji sadrži RNK, kako je taj pojam ovde definisan, i koji posreduje u ciljanom cepanju transkripta RNK putem puta RNK-indukovanog utišavajućeg kompleksa (RISC). iRNK usmerava degradaciju mRNK specifičnu za sekvencu putem procesa koji je poznat kao RNK interferencija (RNKi). iRNK moduliše, npr. inhibira, ekspresiju HAO1 u ćeliji, npr. ćeliji u ispitaniku, kao što je ispitanik sisar.
[0020] Agens RNKi iz otkrića uključuje jednolančanu RNK koja interaguje sa ciljnom sekvencom RNK, npr. ciljnom sekvencom mRNK HAO1, radi usmeravanja cepanja ciljne RNK. Bez ograničavanja na teoriju, veruje se da se dugačka dvolančana RNK uvedena u ćelije razbija na siRNK putem endonukleaze tipa III poznate kao dajser (Sharp i sar. (2001) Genes Dev. 15:485). Dajser, enzim sličan ribonukleazi III, obrađuje ove dsRNK u kratke interferirajuće RNK od 19-23 bazna para sa karakterističnim 3' prepustima od dve baze (Bernstein, i sar. (2001) Nature 409:363). Ove siRNK se zatim inkorporiraju u RNK-indukovani utišavajući kompleks (RISC) gde jedna ili više helikaza raspliće dvojnu spiralu siRNK, što omogućava komplementarnom antisens lancu da navodi prepoznavanje cilja (Nykanen, i sar. (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza u RISC cepa cilj radi indukovanja utišavanja (Elbashir, i sar. (2001) Genes Dev.15:188). Tako, u jednom aspektu, otkriće se odnosi na jednolančanu RNK (siRNK) nastalu u ćeliji, koja promoviše nastanak RISC kompleksa radi utišavanja ciljnog gena, tj. gena HAO1. Shodno tome, termin „siRNK“ se ovde takođe koristi da označi RNKi kako je prethodno opisana.
[0021] Agens RNKi može biti jednolančana siRNK koja se uvodi u ćeliju ili organizam da inhibira ciljnu mRNK. Jednolančani agensi RNKi se vezuju za RISC endonukleazu argonaut 2, koja zatim cepa ciljnu mRNK. Jednolančane siRNK su uopšteno 15-30 nukleotida, i hemijski su modifikovane. Konstruisanje i testiranje jednolančanih siRNK je opisano u U.S. patentu br.
8,101,348, i u Lima i sar. (2012) Cell 150: 883-894. Bilo koja od sekvenci antisens nukleotida koja je ovde opisana može se koristiti kao jednolančana siRNK kako je ovde opisano, ili kao hemijski modifikovana postupcima opisanim u Lima i sar. (2012) Cell 150;:883-894.
[0022] Predmetno otkriće obezbeđuje molekule jednolančanog antisens oligonukleotida koji ciljaju HAO1. „Molekul jednolančanog antisens oligonukleotida“ je komplementaran sa sekvencom u ciljnoj mRNK (tj. HAO1). Molekuli jednolančanog antisens oligonukleotida mogu da inhibiraju translaciju na stehiometrijski način putem sparivanja baza sa mRNK i fizičkog ometanja translacionog aparata, vidite Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Alternativno, molekuli jednolančanog antisens oligonukleotida inhibiraju ciljnu mRNK putem hibridizacije sa ciljem i cepanja cilja kroz događaj cepanja pomoću RNazeH. Molekul jednolančanog antisens oligonukleotida može biti dužine od oko 10 do oko 30 nukleotida, i može imati sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom. Na primer, molekul jednolančanog antisens oligonukleotida može da sadrži sekvencu koja je najmanje oko 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više uzastopnih nukleotida od bilo koje od ovde opisanih sekvenci antisens nukleotida, npr. sekvence obezbeđene u Tabeli 1 ili 2, ili vezuju bilo koje ovde opisano ciljno mesto. Molekuli jednolančanog antisens oligonukleotida mogu da sadrže modifikovanu RNK, DNK, ili njihovu kombinaciju.
[0023] „iRNK“ za upotrebu u kompozicijama, primenama i postupcima iz otkrića može biti dvolančana RNK, i ovde se naziva „agens dvolančane RNKi“, „molekul dvolančane RNK (dsRNK)“, „agens dsRNK“ ili „dsRNK“. Termin „dsRNK“ označava kompleks molekula ribonukleinske kiseline koji ima strukturu dvojne spirale koja sadrži dva antiparalelna i u velikoj meri komplementarna lanca nukleinske kiseline, za koje se kaže da imaju „sens“ i „antisens“ orijentaciju u odnosu na ciljnu RNK, tj. gen HAO1. Dvolančana RNK (dsRNK) može da pokreće degradaciju ciljne RNK, npr. mRNK, putem mehanizma posttranskripcionog utišavanja gena koji se ovde naziva RNK interferencija ili RNKi.
Pristupi za inhibiciju ekspresije gena koristeći interferirajuće RNK opisani su u WO [0024] Uopšteno, većina nukleotida svakog lanca molekula dsRNK su ribonukleotidi, ali kao što je ovde detaljno opisano, svaki pojedinačni ili oba lanca mogu takođe da uključuju jedan ili više nukleotida koji nisu ribonukleotidi, npr. dezoksiribonukleotid i/ili modifikovani nukleotid. Dodatno, kako se koristi u ovoj specifikaciji, „agens RNKi“ može da uključuje ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; agens RNKi može da sadrži značajne modifikacije više nukleotida. Takve modifikacije mogu da uključuju sve vrste modifikacija koje su ovde otkrivene ili su poznate u struci. Sve takve modifikacije, kako se koriste u molekulu tipa siRNK, u svrhe predmetnog otkrića su obuhvaćene sa „agens RNKi“.
[0025] Dva lanca koja formiraju strukturu dvojne spirale mogu biti različiti delovi jednog većeg molekula RNK, ili mogu biti odvojeni molekuli RNK. Kada su dva lanca deo jednog većeg molekula, i stoga su povezani neprekinutim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira strukturu dvojne spirale, povezujući lanac RNK se naziva „petlja ukosnice“. Kada su dva lanca povezana kovalentno drugim načinom sem neprekinutog lanca nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira strukturu dvojne spirale, povezujuća struktura se naziva „linker“. Lanci RNK mogu imati isti ili različiti broj nukleotida. Maksimalni broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem lancu dsRNK umanjen za prepuste koji su prisutni u dvojnoj spirali. Pored strukturu dvojne spirale, agens RNKi može da sadrži jedan ili više nukleotidnih prepusta.
[0026] Agens RNKi iz otkrića može biti dsRNK dužine 24-30 nukleotida, koja interaguje sa ciljnom sekvencom RNK, npr. ciljnom sekvencom mRNK HAO1, radi usmeravanja cepanja ciljne RNK. Bez želje da se ograničimo teorijom, dugačka dvolančana RNK uvedena u ćelije se razbija na siRNK putem endonukleaze tipa III poznate kao dajser (Sharp i sar. (2001) Genes Dev. 15:485). Dajser, enzim sličan ribonukleazi III, obrađuje ove dsRNK u kratke interferirajuće RNK od 19-23 bazna para sa karakterističnim 3' prepustima od dve baze (Bernstein, i sar. (2001) Nature 409:363). Ove siRNK se zatim inkorporiraju u RNK-indukovani utišavajući kompleks (RISC) gde jedna ili više helikaza raspliće dvojnu spiralu siRNK, što omogućava komplementarnom antisens lancu da navodi prepoznavanje cilja (Nykanen, i sar. (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza u RISC cepa cilj radi indukovanja utišavanja (Elbashir, i sar. (2001) Genes Dev. 15:188).
1
[0027] Kako se ovde koristi, „nukleotidni prepust“ se odnosi na neupareni nukleotid ili nukleotide koji štrče iz strukture dvojne spirale agensa RNKi kada se 3'-kraj jednog lanca agensa RNKi proteže dalje od 5'-kraja drugog lanca, ili obrnuto. „Tup“ ili „tupi kraj“ znači da nema neuparenih nukleotida na tom kraju dvolančanog agensa RNKi, tj. nema nukleotidnog prepusta. Agens RNKi sa „tupim krajem“ je dsRNK koja je dvolančana celom svojom dužinom, tj. nema nukleotidnog prepusta ni na jednom kraju molekula. Agensi RNKi iz otkrića uključuju agense RNKi sa nukleotidnim prepustima na jednom kraju (tj. agense sa jednim prepustom i jednim tupim krajem) ili sa nukleotidnim prepustima na oba kraja.
[0028] Termin „antisens lanac“ odnosi se na lanac dvolančanog agensa RNKi koji obuhvata region koji je u velikoj meri komplementaran ciljnoj sekvenci (npr. mRNK humanog HAO1). Kako se ovde koristi, termin „komplementarnost regiona sa delom mRNK koji kodira HAO1“ odnosi se na region antisens lanca koji je suštinski komplementaran delu mRNK sekvence HAO1. Kada region komplementarnosti nije u potpunosti komplementaran sa ciljnom sekvencom, pogrešno uparivanje se najviše toleriše u terminalnim regionima i, ukoliko je prisutno, generalno je u terminalnom regionu ili regionima, npr. 6, 5, 4, 3 ili 2 nukleotida 5' i/ili 3' terminusa.
[0029] Termin „sens lanac“, kako se ovde koristi, odnosi se na lanac dsRNK koji uključuje region koji je suštinski komplementaran regionu antisens lanca.
[0030] Kako se ovde koristi, termin „region cepanja“ odnosi se na region koji se nalazi odmah pored mesta cepanja. Mesto cepanja je mesto na cilju na kome dolazi do cepanja. Region cepanja može da sadrži tri baze na bilo kom kraju mesta cepanja, i neposredno pored njega. Region cepanja može da sadrži dve baze na bilo kom kraju mesta cepanja, i neposredno pored njega. Mesto cepanja može specifično da nastane na mestu koje je vezano nukleotidima 10 i 11 antisens lanca, i region cepanja može da sadrži nukleotide 11, 12 i 13.
[0031] Kako se ovde koristi, i ako nije drugačije naznačeno, termin „komplementarna“, kada se koristi da opiše prvu sekvencu nukleotida u odnosu na drugu sekvencu nukleotida, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu sekvencu nukleotida da se hibridizuje i u određenim uslovima gradi strukturu dvojne spirale sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu sekvencu nukleotida, kao što će biti jasno stručnjaku. Takvi uslovi, na primer, mogu biti strogi uslovi, gde strogi uslovi mogu da uključuju: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50°C ili 70°C tokom 12-16 sati, zatim ispiranje. Mogu da se primenjuju drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi kakvi se mogu susresti u organizmu. Na primer, komplementarna sekvenca je dovoljna da omogući nastavak relevantne funkcije nukleinske kiseline, npr. RNKi. Stručna osoba će znati da odredi set uslova koji su najpogodniji za test komplementarnosti dve sekvence u skladu sa krajnjom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0032] Sekvence mogu biti „potpuno komplementarne“ jedna u odnosu na drugu kada postoji bazno sparivanje nukleotida prve sekvence nukleotida sa nukleotidima druge sekvence nukleotida celom dužinom prve i druge sekvence nukleotida. Međutim, kada se za prvu sekvencu kaže da je „suštinski komplementarna“ u odnosu na drugu sekvencu datu ovde, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili može biti jedan ili više, ali generalno ne više od 4, 3 ili 2 neusklađena bazna para nakon hibridizacije, pri čemu zadržavaju sposobnost da se hibridizuju u uslovima koji su najrelevantniji za njihovu krajnju primenu. Međutim, kada su dva oligonukleotida konstruisana da grade, nakon hibridizacije, jedan ili više jednolančanih prepusta, takvi prepusti će se posmatrati kao neusklađeni parovi kada se utvrđuje komplementarnost. Na primer, dsRNK koja sadrži jedan oligonukleotid dužine 21 nukleotid i drugi oligonukleotid dužine 23 nukleotida, pri čemu duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je potpuno komplementarna sa kraćim oligonukleotidom, može se i dalje nazvati „potpuno komplementarnom“ za ovde opisane svrhe.
[0033] „Komplementarne“ sekvence, kako se ovde koristi, mogu takođe da obuhvataju, ili da budu u potpunosti izgrađene od, baznih parova različitih od Votson-Krikovih i/ili baznih parova nastalih od neprirodnih i modifikovanih nukleotida, sve dok su ispunjeni prethodni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti hibridizacije. Takvi bazni parovi različiti od Votson-Krikovih uključuju, ali nisu ograničeni na, kolebljivo ili Hugštajnovo bazno sparivanje G:U.
[0034] Termini „komplementarno“, „potpuno komplementarno“ i „suštinski komplementarno“ ovde mogu da se koriste u pogledu baznog sparivanja između sens lanca i antisens lanca dsRNK, ili između antisens lanca dsRNK i ciljne sekvence, što će biti jasno iz konteksta njihove upotrebe.
[0035] Kako se ovde koristi, polinukleotid koji je „suštinski komplementaran najmanje delu“ informacione RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je suštinski komplementaran susednom delu željene mRNK (npr. mRNK koja kodira HAO1), uključujući 5' UTR, otvoreni okvir za čitanje (ORF) ili 3' UTR. Na primer, polinukleotid je komplementaran najmanje delu mRNK HAO1 ako je sekvenca suštinski komplementarna neprekinutom delu mRNK koja kodira HAO1.
[0036] Termin „inhibira“, kako se ovde koristi, koristi se naizmenično sa „smanjuje“, „utišava“, „nishodno reguliše“, „suzbija“ i drugim sličnim terminima, i obuhvata bilo koji nivo inhibicije.
[0037] Fraza „inhibira ekspresiju HAO1“, kako se ovde koristi, uključuje inhibiciju ekspresije bilo kog gena HAO1 (poput, na primer, gena HAO1 miša, gena HAO1 pacova, gena HAO1 majmuna ili humanog gena HAO1), kao i varijanti (npr. prirodne varijante) ili mutanata gena HAO1. Tako, gen HAO1 može biti gen HAO1 divljeg tipa, mutantni gen HAO1 ili transgeni gen HAO1 u kontekstu genetski manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0038] „Inhibicija ekspresije gena HAO1“ uključuje bilo koji nivo inhibicije gena HAO1, npr. najmanje delimično suzbijanje ekspresije gena HAO1, kao što je inhibicija od najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%. najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%.
[0039] Ekspresija gena HAO1 može da se proceni na osnovu nivoa bilo koje promenljive povezane sa ekspresijom gena HAO1, npr. nivoa mRNK HAO1 ili nivoa HAO1 proteina, npr. u, tkivima i/ili nivoa oksalata u urinu. Inhibicija može biti procenjena na osnovu smanjenja apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više ovih promenljivih u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koja vrsta kontrolnog nivoa koja se koristi u struci, npr. početni nivo pre doze ili nivo određen kod sličnog ispitanika, ćelije ili uzorka koji nije tretiran ili je tretiran kontrolom (kao što je, npr. kontrola samo sa puferom ili kontrola sa neaktivnim agensom).
1
[0040] Fraza „dovođenje ćelije u kontakt sa agensom dvolančane RNKi“, kako se ovde koristi, uključuje dovođenje ćelije u kontakt bilo kojim mogućim putem. Dovođenje ćelije u kontakt sa agensom dvolančane RNKi uključuje dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi in vitro ili dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi in vivo. Dovođenje u kontakt se može obaviti direktno ili indirektno. Tako, na primer, agens RNKi se može dovesti u fizički kontakt sa ćelijom putem pojedinačnog obavljanja postupka, ili alternativno, agens RNKi se može dovesti u situaciju koja će omogućiti ili izazvati da on nakon toga dođe u kontakt sa ćelijom.
[0041] Dovođenje ćelije u kontakt in vitro može se obaviti, na primer, inkubacijom ćelije sa agensom RNKi. Dovođenje ćelije u kontakt in vivo može se obaviti, na primer, injektovanjem agensa RNKi u tkivo u kome se nalazi ćelija ili blizu njega, ili injektovanjem agensa RNKi u drugu oblast, npr. krvotok ili supkutani prostor, tako da će agens nakon toga stići do tkiva u kome se nalazi ćelija koja treba da se dovede u kontakt. Na primer, agens RNKi može da sadrži ligand i/ili da bude kuplovan sa ligandom, npr. GalNAc3ligandom, koji usmerava agens RNKi do željenog mesta, npr. jetre. Takođe su moguće kombinacije in vitro i in vivo postupaka dovođenja u kontakt. U vezi sa postupcima iz otkrića, ćelija takođe može biti dovedena u kontakt sa agensom RNKi in vitro i naknadno transplantirana u ispitanika.
[0042] Kako se ovde koristi, „ispitanik“ obuhvata čoveka ili životinju koja nije čovek, poželjno kičmenjaka, poželjnije sisara. Ispitanik može da uključuje transgeni organizam. Najpoželjnije, ispitanik je čovek, kao što je čovek koji boluje, ili je podložan razvoju poremećaja povezanog sa HAO1.
[0043] „Pacijent“ ili „ispitanik“, kako se ovde koristi, treba da uključi čoveka ili životinju koja nije čovek, poželjno sisara, npr. čoveka ili majmuna. Najpoželjnije, ispitanik ili pacijent je čovek.
[0044] „Poremećaj povezan sa HAO1“, kako se ovde koristi, treba da obuhvata svaki poremećaj koji može da se leči ili da se spreči, ili čiji simptomi mogu da se ublaže, putem inhibicije ekspresije HAO1. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, primernu hiperoksaluriju 1 (PHI).
[0045] „Terapeutski delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na pacijentu za lečenje bolesti povezane sa HAO1, dovoljna da se ostvari lečenje bolesti (npr. smanjivanjem, ublažavanjem ili održavanjem postojeće bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti). „Terapeutski delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, bolesti i njene ozbiljnosti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, stadijuma patoloških procesa posredovanih sa HAO1, vrste prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i svih drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
[0046] „Profilaktički delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na ispitaniku koji još nije doživeo ili ispoljio simptome bolesti povezane sa HAO1, ali koji možda ima predispozicije za bolest, dovoljna za prevenciju ili ublažavanje bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti. Ublažavanje bolesti uključuje usporavanje toka bolesti ili smanjenje ozbiljnosti kasnije nastale bolesti. „Profilaktički delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, stepena rizika od bolesti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, vrsta prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
[0047] „Terapeutski delotvorna količina“ ili „profilaktički delotvorna količina“ takođe uključuje količinu agensa RNKi koja proizvodi izvesno željeno lokalno ili sistemsko dejstvo sa prihvatljivim odnosom koristi/rizika primenljivim za svako lečenje. Agensi RNKi upotrebljeni u postupcima predmetnog otkrića mogu se primeniti u dovoljnoj količini da daju prihvatljiv odnos koristi/rizika primenljiv za takvo lečenje.
[0048] Termin „uzorak“, kako se ovde koristi, uključuje skup sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od ispitanika, kao i tečnosti, ćelija ili tkiva prisutnih u ispitaniku. Primeri za biološke tečnosti uključuju krv, serum i serumske fluide, plazmu, cerebrospinalnu tečnost, očnu tečnost, limfu, urin, pljuvačku, i slično. Uzorci tkiva mogu da uključuju uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regiona. Na primer, uzorci mogu biti dobijeni od pojedinačnih organa, delova organa, ili tečnosti ili ćelija u tim organima. Uzorci mogu biti dobijeni iz jetre (npr. cele jetre ili određenih segmenata jetre ili određenih vrsta ćelija u jetri, kao što su, npr. hepatociti). „Uzorak dobijen od ispitanika“ može da se odnosi na krv ili plazmu uzetu od ispitanika. U daljim slučajevima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na tkivo jetre (ili njegove potkomponente) dobijeno od ispitanika.
1
II. Agensi iRNk dsRNK
[0049] Ovde su opisani agensi dvolančane RNKi koji inhibiraju ekspresiju gena HAO1 u ćeliji, kao što je ćelija u ispitaniku, npr. sisaru, kao što je čovek koji ima poremećaj povezan sa HAO1, i upotrebe takvih agensa dvolančane RNKi.
[0050] Shodno tome, pronalazak obezbeđuje agense dvolančane RNKi sa hemijskim modifikacijama koji su sposobni da inhibiraju ekspresiju ciljnog gena (tj. gena HAO1) in vivo.
[0051] Kao što je detaljnije opisano u nastavku, u određenim aspektima pronalaska, suštinski svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani. U drugim otelotvorenjima pronalaska, svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani. iRNK iz pronalaska u kojima su „suštinski svi nukleotidi modifikovani“ su u velikoj meri, ali ne u potpunosti modifikovane, i mogu da uključuju najviše 5, 4, 3, 2 ili 1 nemodifikovani nukleotid.
[0052] Agens RNKi sadrži sens lanac i antisens lanac. Svaki lanac agensa RNKi može imati dužinu u rasponu od 12-30 nukleotida. Na primer, svaki lanac može imati dužinu od 14-30 nukleotida, dužinu 17-30 nukleotida, dužinu 19-30 nukleotida, dužinu 25-30 nukleotida, dužinu 27-30 nukleotida, dužinu 17-23 nukleotida, dužinu 17-21 nukleotida, dužinu 17-19 nukleotida, dužinu 19-25 nukleotida, dužinu 19-23 nukleotida, dužinu 19-21 nukleotida, dužinu 21-25 nukleotida ili dužinu 21-23 nukleotida.
[0053] Svaki lanac može imati dužinu od 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida. Oba lanca agensa RNKi mogu biti iste dužine ili mogu imati različite dužine.
[0054] Sens lanac i antisens lanac uobičajeno grade dvojnu dvolančanu RNK („dsRNK“), koja se ovde naziva i „ agens RNKi“. Region dvojne spirale agensa RNKi može imati dužinu 12-30 parova nukleotida. Na primer, region dvojne spirale može biti dužine od 14-30 parova nukleotida, dužine 17-30 parova nukleotida, dužine 27-30 parova nukleotida, dužine 17-23 parova nukleotida, dužine 17-21 parova nukleotida, dužine 17-19 parova nukleotida, dužine 19-25 parova nukleotida, dužine 19-23 parova nukleotida, dužine 19- 21 parova nukleotida, dužine 21-25 parova nukleotida, ili dužine 21-23 parova nukleotida. U drugom primeru, region dvojne spirale je odabran od dužine od 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 i 27 parova nukleotida.
1
[0055] Agens RNKi može da sadrži jedan ili više regiona prepusta i/ili grupa za ograničavanje na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja jednog ili oba lanca. Prepust može biti dužine 1-6 nukleotida, na primer dužine 2-6 nukleotida, dužine 1-5 nukleotida, dužine 2-5 nukleotida, dužine 1-4 nukleotida, dužine 2-4 nukleotida, dužine 1-3 nukleotida, dužine 2-3 nukleotida, ili dužine 1-2 nukleotida. Prepusti mogu biti posledica toga što je jedan lanac duži od drugog, ili posledica toga što su dva lanca iste dužine raspoređena. Prepust može da gradi neusklađeni par sa ciljnom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencom gena koja se cilja ili može biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanac takođe mogu biti spojeni, npr. putem dodatnih baza kako bi gradile ukosnicu, ili putem drugih nebaznih linkera.
[0056] Nukleotidi u regionu prepusta agensa RNKi mogu svaki nezavisno biti modifikovani ili nemodifikovani nukleotid uključujući, ali ne ograničavajući se na modifikacije 2'-šećera, kao što su, 2-F, 2'-O-metil, timidin (T), 2'-O-metoksietil-5-metiluridin (Teo), 2'-O-metoksietiladenozin (Aeo), 2'-O-metoksietil-5-metilcitidin (m5Ceo), i bilo koje njihove kombinacije. Na primer, TT može biti sekvenca prepusta za bilo koji kraj na bilo kojem lancu. Prepust može da gradi neusklađeni par sa ciljnom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencom gena koja se cilja ili može biti druga sekvenca.
[0057] 5' ili 3' prepusti na sens lancu, antisens lancu ili oba lanca agensa RNKi mogu biti fosforilovani. Regioni prepusta mogu da sadrže dva nukleotida koji imaju fosforotioat između dva nukleotida, pri čemu dva nukleotida mogu biti isti ili različiti. U jednom slučaju, prepust je prisutan na 3'-kraju sens lanca, antisens lanca ili oba lanca. U jednom slučaju, ovaj 3' prepust je prisutan u antisens lancu. U jednom slučaju, ovaj 3' prepust je prisutan u sens lancu.
[0058] Agens RNKi može da sadrži samo jedan prepust, koji može da ojača ometajuću aktivnost RNKi, bez uticaja na njegovu sveukupnu stabilnost. Na primer, jednolančani prepust može biti lociran na 3'-terminalnom kraju sens lanca ili, alternativno, na 3'-terminalnom kraju antisens lanca. RNKi takođe može da ima tup kraj, lociran na 5'-kraju antisens lanca (ili na 3'-kraju sens lanca) ili obrnuto. Uopšteno, antisens lanac RNKi ima nukleotidni prepust na 3' kraju, a 5' kraj je tup. Ne želeći da se ograničimo teorijom, asimetrični tupi kraj na 5'-kraju antisens lanca i prepust na 3'-kraju antisens lanca pogoduju vodećem lancu koji se unosi u proces RISC.
1
Sinteza i modifikacije
[0059] Bilo koja od nukleinskih kiselina, npr. RNKi, koja je ovde otkrivena može da se sintetiše i/ili modifikuje postupcima koji su dobro poznati u struci, kao što su oni opisani u "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (izdav.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, SAD. Modifikacije uključuju, na primer, modifikacije krajeva, npr. modifikacije 5'-kraja (fosforilacija, konjugacija, invertovane veze) ili modifikacije 3'-kraja (konjugacija, DNK nukleotidi, invertovane veze, itd.); modifikacije baza, npr. zamena stabilizujućim bazama, destabilizujućim bazama ili bazama koje se bazno sparuju sa proširenim repertoarom partnera, uklanjanje baza (abazni nukleotidi) ili konjugovane baze; modifikacije šećera (npr. na 2'-poziciji ili 4'-poziciji) ili zamena šećera; i/ili modifikacije skeleta, uključujući modifikaciju ili zamenu fosfodiestarskih veza. Specifični primeri jedinjenja iRNK koja su korisna u ovde opisanim slučajevima uključuju, ali nisu ograničena na, RNK koje sadrže modifikovane skelete ili nemaju prirodne internukleozidne veze. RNK koje imaju modifikovane skelete uključuju, između ostalog, one koje nemaju atom fosfora u skeletu. Za svrhe ove specifikacije, i kao što se nekad nazivaju u struci, modifikovane RNK koje nemaju atom fosfora u svom internukleozidnom skeletu takođe mogu da se smatraju oligonukleozidima. U nekim slučajevima, modifikovane iRNK će imati atom fosfora u svom internukleozidnom skeletu.
[0060] Skeleti modifikovane RNK uključuju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3'-amino fosforamidate i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, njihove 2'-5'-povezane analoge, i one koji imaju obrnutu polarnost, pri čemu su susedni parovi jedinica nukleozida povezani 3'-5' sa 5'-3' ili 2'-5' sa 5'-2'. Takođe su uključene različite soli, mešovite soli i slobodni kiseli oblici.
[0061] Primeri za U.S. patente koji objašnjavaju pripremu prethodnih veza koje sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. patente br.3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590;
1
6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; i US Pat RE39464.
[0062] Modifikovani skeleti RNK koji u sebi ne sadrže atom fosfora imaju skelete koji su nastali od internukleozidnih veza alkila ili cikloalkila kratkog lanca, mešovitih heteroatoma i alkil ili cikloalkil internukleozidnih veza, ili jedne ili više heteroatomskih ili heterocikličnih internukleozidnih veza kratkog lanca. To uključuje one koji imaju morfolino veze (delimično nastale od šećernog dela nukleozida), siloksanske skelete, sulfidne, sulfoksidne i sulfonske skelete, formacetilne i tioformacetilne skelete; metilen formacetilne i tioformacetilne skelete; skelete koji sadrže alken; sulfamatne skelete; metilenimino i metilenhidrazino skelete; sulfonatne i sulfonamidne skelete; amidne skelete; i druge koji imaju mešovite N, O, S i CH2sastavne delove.
[0063] Primeri za U.S. patente koji objašnjavaju pripremu prethodnih oligonukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. patente br.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; i 5,677,439.
[0064] U drugim slučajevima, razmatrani su odgovarajući mimetici RNK za upotrebu u iRNK, gde su i šećer i internukleozidna veza, tj. skelet, jedinica nukleotida zamenjeni novim grupama. Bazne jedinice se održavaju za hibridizaciju sa odgovarajućim jedinjenjem ciljne nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, mimetik RNK za koji je pokazano da ima izvrsna svojstva hibridizacije, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNK). U jedinjenjima PNK, šećerni skelet RNK je zamenjen skeletom koji sadrži amid, naročito aminoetilglicinskim skeletom. Nukleobaze su zadržane i vezuju se neposredno ili posredno za aza atome azota amidnog dela skeleta. Primeri za U.S. patente koji objašnjavaju pripremu jedinjenja PNK uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. patente br.5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dodatna jedinjenja PNK koja su pogodna za upotrebu u iRNK iz otkrića opisana su, na primer, u Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0065] Neki slučajevi predmetnog otkrića uključuju RNK sa fosforotioatnim skeletima i oligonukleozide sa heteroatomskim skeletima, a naročito --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[poznat kao metilenski (metilimino) ili MMI skelet], --CH2--O-N(CH3)--CH2--, --
1
CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- i -N(CH3)-CH2-CH2-[pri čemu je nativni fosfodiestarski skelet predstavljen kao --O--P--O--CH2--] iz prethodno navedenog U.S. patenta br. 5,489,677 i amidne skelete iz prethodno navedenog U.S. patenta br.5,602,240. U nekim slučajevima, RNK imaju morfolino strukturu skeleta iz prethodno navedenog U.S. patenta br.5,034,506.
[0066] Modifikovane RNK takođe mogu da sadrže jedan ili više ostataka supstituisanog šećera. Te ovde opisane iRNK, npr. dsRNK, mogu da uključuju jedno od sledećeg na 2'-poziciji: OH; F; O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, pri čemu alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2do C10alkenil i alkinil. Primeri za odgovarajuće modifikacije uključuju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)aON[(CH2)nCH3)]2, pri čemu su n i m od 1 do oko 10. U drugim slučajevima, dsRNK uključuju jedno od sledećeg na 2' poziciji: C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, RNK cepajuću grupu, reportersku grupu, interkalator, grupu za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava iRNK, ili grupu za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava iRNK i druge supstituente koji imaju slična svojstva. U nekim slučajevima, modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O--CH2CH2OCH3, poznat i kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj. alkoksi-alkoksi grupu. Još jedan primer modifikacije je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj. O(CH2)2ON(CH3)2grupa, poznata i kao 2'-DMAOE, kao što je ovde opisano u primerima u nastavku, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (u struci poznat i kao 2'-O-dimetilaminoetoksietil ili 2'-DMAEOE), tj.2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
[0067] Druge modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2) i 2'-fluor (2'-F). Slične modifikacije takođe mogu da se načine na drugim pozicijama na RNK iz iRNK, naročito 3' poziciji šećera na 3' terminalnom nukleotidu ili u 2'-5' povezanim dsRNK i 5' poziciji 5' terminalnog nukleotida. iRNK takođe mogu da imaju mimetike šećera kao što su ciklobutil ostaci na mestu pentofuranozil šećera. Primeri za U.S. patente koji objašnjavaju pripremu takvih modifikovanih struktura šećera uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. pat. br.4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920.
2
[0068] iRNK takođe može da uključuje modifikacije ili supstitucije nukleobaze (u struci se često naziva samo „baza“). Kako se ovde koristi, „nemodifikovane“ ili „prirodne nukleobaze“ uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G) i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su dezoksi timin (dT), 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-propil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo, naročito 5-brom, 5-trifluormetil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje nukleobaze uključuju one opisane u U.S. pat. br.3,687,808, one opisane u Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; one opisane u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, strane 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, one opisane u Englisch i sar. Angewandte Chemie, međunarodno izdanje, 1991, 30, 613, i one opisane u Sanghvi, Y S., poglavlje 15, dsRNA Research and Applications, strane 289-302, Crooke, S. T. i Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Neke od tih nukleobaza su naročito korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja koja su ovde otkrivena. One uključuju 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i 0-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin. Pokazalo se da 5-metilcitozinske supstitucije povećavaju stabilnost dvojne spirale nukleinske kiseline za 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. i Lebleu, B., izdav., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, str. 276-278) i predstavljaju primer baznih supstitucija, još i više kada se kombinuju sa 2'-O-metoksietil modifikacijama šećera.
[0069] Primeri za U.S. patente koji objašnjavaju pripremu nekih od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza kao i drugih modifikovanih nukleobaza uključuju, ali nisu ograničeni na, prethodno navedene U.S. patente br.3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; i 7,495,088.
[0070] RNK iz iRNK takođe može da se modifikuje da uključuje jednu ili više zaključanih nukleinskih kiselina (LNA). Zaključana nukleinska kiselina je nukleotid koji ima ostatak modifikovane riboze u kome ostatak riboze sadrži dodatni most koji povezuje 2' i 4' ugljenike. Ta struktura suštinski „zaključava“ ribozu u 3'-endo strukturnoj konformaciji. Pokazalo se da dodatak zaključanih nukleinskih kiselina u siRNK povećava stabilnost siRNK u serumu i da smanjuje dejstvo van cilja (Elmen, J. i sar. (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. i sar. (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. i sar. (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[0071] Primeri za U.S. patente koji objašnjavaju pripremu nukleotida zaključane nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: U.S. patente br. 6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; i 7,399,845.
[0072] Potencijalno stabilizujuće modifikacije krajeva molekula RNK mogu da uključuju N-(acetilaminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(kaproil-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroksiprolinol (Hyp-NHAc), timidin-2'-0-dezoksitimidin (etar), N-(aminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-dokozanoil-uridin-3"-fosfat, invertovanu bazu dT (idT) i druge. Otkriće ovih modifikacija može se naći u PCT publikaciji br. WO 2011/005861.
Modifikovane iRNK koje sadrže motive
[0073] U određenim aspektima otkrića, agensi dvolančane RNKi iz otkrića uključuju agense sa hemijskim modifikacijama koje su otkrivene, na primer, u U.S. privremenoj prijavi br.
61/561,710, koja je podneta 18. novembra 2011, ili u PCT/US2012/065691, koja je podneta 16 novembra. 2012, i objavljena kao WO2013075035 A1; ili u PCT/US2014/025882, koja je podneta 13. marta 2014, i objavljena kao WO2014160129; ili u PCT/US2012/065601, koja je podneta 16. novembra 2012, i objavljena kao WO2013074974.
[0074] Ovde i u Privremenoj prijavi br.61/561,710 pokazano je da poboljšan rezultat može biti dobijen uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens lancu i/ili antisens lancu agensa RNKi, naročito na mestu cepanja ili blizu njega. U nekim slučajevima, sens lanac i antisens lanac agensa RNKi inače mogu biti potpuno modifikovani. Uvođenje ovih motiva prekida šablon modifikacije, ako je prisutan, sens i/ili antisens lanca. Agens RNKi može takođe biti opciono konjugovan sa derivatnim ligandom GalNAc, na primer na sens lancu. Dobijeni agensi RNKi pokazuju superiornu aktivnost utišavanja gena.
[0075] Specifičnije, iznenađujuće je otkriveno da, kada su sens lanac i antisens lanac agensa dvolančane RNKi modifikovani da imaju jedan ili više motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja najmanje jednog lanca agensa RNKi ili blizu njega, aktivnost utišavanja gena agensa RNKi je superiorno pojačana.
[0076] U jednom slučaju, agens RNKi je dvostrani blantmer dužine 19 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 7, 8, 9 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0077] U drugom slučaju, agens RNKi je dvostrani blantmer dužine 20 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 8, 9, 10 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0078] U još jednom slučaju, agens RNKi je dvostrani blantmer dužine 21 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0079] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži sens lanac od 21 nukleotida i antisens lanac od 23 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5'-kraja; antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5'-kraja, pri čemu je jedan kraj agensa RNKi tup, dok drugi kraj sadrži prepust od 2 nukleotida. Poželjno, prepust od 2 nukleotida je na 3'-kraju antisens lanca. Kada je prepust od 2 nukleotida na 3'-kraju antisens lanca, može biti dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći nukleotid je spareni nukleotid pored nukleotida prepusta. U jednom slučaju, agens RNKi dodatno ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca. U jednom slučaju, svaki nukleotid u sens lancu i antisens
2
lancu agensa RNKi, uključujući nukleotide koji su deo motiva, je modifikovani nukleotid. U jednom slučaju, svaki ostatak je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 3'-fluor, npr. u naizmeničnom motivu. Opciono, agens RNKi dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc3).
[0080] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži sens i antisens lanac, pri čemu agens RNKi sadrži prvi lanac koja ima dužinu od najmanje 25 i najviše 29 nukleotida i drugi lanac koja ima dužinu od najviše 30 nukleotida sa najmanje jednim motivom od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na poziciji 11, 12, 13 od 5' kraja; pri čemu 3' kraj prvog lanca i 5' kraj drugog lanca grade tupi kraj, a drugi lanac je 1-4 nukleotida duži na svom 3' kraju od prvog lanca, pri čemu je region dvoje spirale dužine najmanje 25 nukleotida, i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa ciljnom mRNK duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog lanca radi smanjivanja ekspresije ciljnog gena kada se agens RNKi uvede u ćeliju sisara, i pri čemu cepanje dajserom agensa RNKi poželjno daje siRNK koja sadrži 3' kraj drugog lanca, čime se smanjuje ekspresija ciljnog gena u sisaru. Opciono, agens RNKi dalje sadrži ligand.
[0081] U jednom slučaju, sens lanac agensa RNKi sadrži najmanje jedan motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u sens lancu.
[0082] U jednom slučaju, antisens lanac agensa RNKi može takođe da sadrži najmanje jedan motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u antisens lancu ili blizu njega
[0083] Za agens RNKi koji ima region dupleksa dužine 17-23 nukleotida, mesto cepanja antisens lanca je obično oko pozicija 10, 11 i 12 od 5' kraja. Tako, motivi od tri identične modifikacije mogu da se jave na pozicijama 9, 10, 11; pozicijama 10, 11, 12; pozicijama 11, 12, 13; pozicijama 12, 13, 14; ili pozicijama 13, 14, 15 na antisens lancu, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja antisens lanca, ili, brojanje počinje od 1. uparenog nukleotida u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca. Mesto cepanja u antisens lancu se takođe može promeniti u skladu sa dužinom regiona dvojne spirale RNKi od 5' kraja.
[0084] Sens lanac agensa RNKi može da sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca; a antisens lanac može da ima najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca ili blizu njega. Kada sens lanac i antisens lanac grade dvojnu spiralu dsRNK, sens lanac i antisens lanac mogu biti poravnati tako da jedan motiv od tri nukleotida na sens lancu i jedan motiv od tri nukleotida na antisens lancu imaju bar jedan nukleotid preklapanja, tj. najmanje jedan od tri nukleotida motiva u sens lancu gradi bazni par sa najmanje jednim od tri nukleotida motiva u antisens lancu. Alternativno, najmanje dva nukleotida mogu da se preklapaju, ili sva tri nukleotida mogu da se preklapaju.
[0085] U jednom slučaju, sens lanac agensa RNKi može da sadrži više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Prvi motiv može da se javi na mestu cepanja lanca ili blizu njega, a drugi motivi mogu biti bočna modifikacija. Termin „bočna modifikacija“ ovde se odnosi na motiv koji se javlja na drugom delu lanca koji je odvojen od motiva na mestu cepanja ili blizu njega u istom lancu. Bočna modifikacija je susedna prvom motivu, ili je odvojena sa najmanje jednim ili više nukleotida. Kada su motivi neposredno susedni jedan drugom, hemija motiva je različita, a kada su motivi razdvojeni sa jednim ili više nukleotida, hemija onda može biti ista ili različita. Može biti prisutno dve ili više bočnih modifikacija. Na primer, kada su prisutne dve bočne modifikacije, svaka bočna modifikacija može se javiti na jednom kraju u odnosu na prvi motiv koji je na mestu cepanja ili blizu njega, ili sa bilo koje strane glavnog motiva.
[0086] Poput sens lanca, antisens lanac agensa RNKi može da sadrži više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se najmanje jedan motiv javlja na mestu cepanja lanca ili blizu njega. Ovaj antisens lanac takođe može da sadrži jednu ili više bočnih modifikacija u rasporedu sličnom bočnim modifikacijama koje mogu biti prisutne u sens lancu.
[0087] U jednom slučaju, bočna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu agensa RNKi obično ne uključuje prvi terminalni nukleotid ili prva dva terminalna nukleotida na 3' kraju, 5' kraju, ili na oba kraja lanca.
[0088] U drugom slučaju, bočna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu agensa RNKi obično ne uključuje prvi ili prva dva uparena nukleotida u regionu dvojne spirale na 3' kraju, 5' kraju, ili na oba kraja lanca.
2
[0089] Kada i sens lanac i antisens lanac agensa RNKi imaju najmanje jednu bočnu modifikaciju, bočna modifikacija može biti na istom kraju regiona dvojne spirale, i može imati preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida.
[0090] Kada i sens lanac i antisens lanac agensa RNKi imaju najmanje dve bočne modifikacije, sens lanac i antisens lanac mogu biti poravnati tako da dve modifikacije iz jednog lanca budu na jednom kraju regiona dvojne spirale, uz preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije iz jednog lanca da budu na drugom kraju regiona dvojne spirale, uz preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije jednog lanca da budu sa obe strane glavnog motiva, uz preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida u regionu dvojne spirale.
[0091] U jednom slučaju, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu agensa RNKi, uključujući nukleotide koji su deo motiva, može biti modifikovan. Svaki nukleotid može biti modifikovan sa istom ili različitom modifikacijom koja može da uključuje jednu ili više izmena jednog ili oba nevezujuća fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezujućih fosfatnih kiseonika; izmenu sastavnog dela šećera riboze, npr. 2' hidroksila na šećeru ribozi; potpunu zamenu fosfatnog ostatka „defosfo“ linkerima; modifkaciju ili zamenu baze koja se javlja u prirodi; i zamenu ili modifikaciju skeleta riboza-fosfat.
[0092] Pošto su nukleinske kiseline polimeri podjedinica, mnoge modifikacije se javljaju na poziciji koja se ponavlja u nukleinskoj kiselini, npr. modifikacija baze, ili fosfatnog ostatka, ili nevezujućeg O fosfatnog ostatka. U nekim slučajevima, modifikacije će se javiti na svim podložnim pozicijama u nukleinskoj kiselini, ali u mnogim slučajevima neće. Na primer, modifikacija se može javiti samo na 3' ili 5' terminalnoj poziciji, može se javiti samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili kod poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija se može javiti u dvolančanom regionu, jednolančanom regionu, ili u oba. Modifikacija se može javiti samo u dvolančanom regionu RNK ili se može javiti samo u jednolančanom regionu RNK. Na primer, modifikacija fosforotioata na nevezujućoj O poziciji može se javiti samo na jednom ili oba terminusa, može se javiti samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili na poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca, ili se može javiti u dvolančanim ili jednolančanim regionima, naročito na terminusima. 5' kraj ili krajevi mogu biti fosforilovani.
2
[0093] Može biti moguće, npr., da bi se povećala stabilnost, da se u prepuste uključe određene baze, ili da se uključe modifikovani nukleotidi ili surogati nukleotida u jednolančane prepuste, npr. u 5' ili 3' prepust, ili u oba. Na primer, može biti poželjno da se purinski nukleotidi uključe u prepuste. U nekim slučajevima, sve baze ili neke od baza u 5' ili 3' prepustu mogu biti modifikovane, npr. sa ovde opisanom modifikacijom. Modifikacije mogu da uključuju, npr. upotrebu modifikacija na 2' poziciji šećera riboze sa modifikacijama koje su poznate u struci, npr. upotreba dezoksiribonukleotida, 2'-dezoksi-2'-fluor (2'-F) ili 2'-O-metil modifikovanih umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacija u fosfatnoj grupi, npr. fosforotioatne modifikacije. Prepusti ne moraju da budu homologi sa ciljnom sekvencom.
[0094] U jednom slučaju, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa LNK, HNK, CeNK, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil, ili 2'-fluor. Lanci mogu da sadrže više od jedne modifikacije. U jednom slučaju, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluor.
[0095] Najmanje dve različite modifikacije su obično prisutne u sens lancu i antisens lancu. Te dve modifikacije mogu biti 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacija, ili druge.
[0096] U jednom slučaju, Nai/ili Nbsadrže modifikacije sa naizmeničnim šablonom. Termin „naizmenični motiv“, kako se ovde koristi, odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, pri čemu se svaka modifikacija javlja na naizmeničnim nukleotidima jednog lanca. Naizmenični nukleotid može da se odnosi na jedan na svaka dva nukleotida ili na jedan na svaka tri nukleotida, ili na sličan šablon. Na primer, ako A, B i C predstavljaju jedan tip modifikacije nukleotida, naizmenični motiv može biti „ABABABABABAB...“, „AABBAABBAABB...“, „AABAABAABAAB...“, „AAABAAABAAAB...“, „AAABBBAAABBB...“, ili „ABCABCABCABC...“, itd.
[0097] Vrste modifikacija u naizmeničnom motivu mogu biti iste ili različite. Na primer, ako svaki A, B, C, D predstavlja jednu vrstu modifikacije na nukleotidu, naizmenični obrazac, tj. modifikacije na svakom drugom nukleotidu, može biti isti, ali svaki od sens lanca ili antisens lanca može biti odabran od nekoliko mogućih modifikacija u naizmeničnom motivu poput „ABABAB...“, „ACACAC...“ „BDBDBD...“ ili „CDCDCD“, itd.
2
[0098] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži šablon modifikacije za naizmenični motiv na sens lancu u odnosu na šablon modifikacije za naizmenični motiv na antisens lancu koji je pomeren. Pomeranje može biti takvo da modifikovana grupa nukleotida sens lanca odgovara različito modifikovanoj grupi nukleotida antisens lanca i obrnuto. Na primer, kada je sens lanac uparen sa antisens lancem u dvojnoj spirali dsRNK, naizmenični motiv sens lanca može početi sa „ABABAB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv antisens lanca može početi sa „BABABA“ od 5'-3' lanca u regionu dvojne spirale. Kao drugi primer, naizmenični motiv sens lanca može početi sa „AABBAABB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv antisens lanca može početi sa „BBAABBAA“ od 5'-3' lanca u regionu dvojne spirale, tako da dođe do potpunog ili delimičnog pomeranja šablona modifikacije između sens i antisens lanca.
[0099] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na sens lancu, i inicijalno ima pomak u odnosu na obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na antisens lancu, tj. 2'-O-metil modifikovani nukleotid na sens lancu formira bazni par sa 2'-F modifikovanim nukleotidom na antisens lancu, i obrnuto. Pozicija 1 sens lanca može početi sa 2'-F modifikacijom, a pozicija 1 antisens lanca može početi sa 2'-O-metil modifikacijom.
[0100] Uvođenje jednog ili više motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na sens lanac i/ili antisens lanac prekida prvobitni obrazac modifikacije prisutan u sens lancu i/ili antisens lancu. Ovo prekidanje šablona modifikacije na sens i/ili antisens lancu uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens i/ili antisens lancu iznenađujuće je pojačalo aktivnost utišavanja ciljnog gena.
[0101] U jednom slučaju, kada je motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uveden u bilo koji lanac, modifikacija nukleotida koji je pored motiva je različita modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koji sadrži motiv je „...NaYYYNb...“, gde Y predstavlja modifikaciju motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, a „Na“ i „Nb“ predstavljaju modifikaciju nukleotida koji je pored motiva „YYY“ koja je različita od modifikacije Y, i pri čemu Nai Nbmogu biti različite ili iste modifikacije. Alternativno, Nai/ili Nbmogu biti prisutni ili odsutni kada je prisutna bočna modifikacija.
2
[0102] Agens RNKi može dalje da sadrži najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu. Modifikacija fosforotioatne ili metilfosfonatne veze može da se javi na bilo kom nukleotidu sens lanca ili antisens lanca ili oba lanca na bilo kojoj poziciji lanca. Na primer, modifikacija internukleotidne veze može da se javi na svakom nukleotidu na sens lancu i/ili antisens lancu; svaka modifikacija internukleotidne veze može da se javi u naizmeničnom obrascu na sens lancu i/ili antisens lancu; ili sens lanac ili antisens lanac mogu da sadrže obe modifikacije internukleotidne veze u naizmeničnom obrascu. Naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može biti isti ili različit od onog na antisens lancu, i naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može imati pomeranje u odnosu na naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na antisens lancu.
[0103] U jednom slučaju, RNKi sadrži modifikaciju fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze u regionu prepusta. Na primer, region prepusta može da sadrži dva nukleotida sa fosforotioatnom ili metilfosfonatnom internukleotidnom vezom između dva nukleotida. Modifikacije internukleotidne veze takođe mogu da se načine da povežu nukleotide prepusta sa terminalno sparenim nukleotidima u regionu dvojne spirale. Na primer, najmanje 2, 3, 4 ili svi nukleotidi prepusta mogu biti povezani putem fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze, i opciono mogu postojati dodatne fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze koje povezuju nukleotid prepusta sa sparenim nukleotidom koji se nalazi pored nukleotida prepusta. Na primer, može biti najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, gde su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći je spareni nukleotid pored nukleotida prepusta. Ta tri terminalna nukleotida mogu biti na 3'-kraju antisens lanca, 3'-kraju sens lanca, 5'-kraju antisens lanca i/ili 5' kraju antisens lanca.
[0104] U jednom slučaju, prepust od 2 nukleotida je na 3'-kraju antisens lanca, i ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći nukleotid je spareni nukleotid pored nukleotida prepusta. Opciono, agens RNKi može dodatno da ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca.
[0105] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži neusklađeni par (ili parove) sa ciljem, u dvojnoj spirali, ili kombinaciju navedenog. Neusklađeni par može da se javi u regionu prepusta ili regionu dvojne spirale. Bazni par može da se rangira na bazi njihove sklonosti da promovišu disocijaciju ili topljenje (npr. na slobodnoj energiji asocijacije ili disocijacije konkretnog para,
2
najjednostavniji pristup je da se ispitaju parovi na osnovu pojedinačnog para, mada se može koristiti analiza najbližeg suseda ili slična). Što se tiče promovisanja disocijacije: A:U je poželjno u odnosu na G:C; G:U je poželjno u odnosu na G:C; a I:C je poželjno u odnosu na G:C (I=inozin). Neusklađeni parovi, npr. nekanonski, ili parovi osim kanonskih (kao što je ovde opisano na drugim mestima) poželjniji su u odnosu na kanonske (A:T, A:U, G:C) parove, i parovi koji uključuju univerzalnu bazu su poželjniji u odnosu na kanonske parove.
[0106] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži najmanje jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih parova u regionima dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca nezavisno odabranih iz grupe: A:U, G:U, I:C i neusklađenih parova, npr. nekanonskih, ili parova osim kanonskih, ili parova koji uključuju univerzalnu bazu, radi promovisanja disocijacije antisens lanca na 5'-kraju dvojne spirale.
[0107] U jednom slučaju, nukleotid na poziciji 1 u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca izabran je iz grupe koja se sastoji od A, dA, dU, U i dT. Alternativno, najmanje jedan od prvih 1, 2, ili 3 baznih parova u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca je bazni par AU. Na primer, prvi bazni bar u regionu dvojne spirale od 5'-kraja antisens lanca je bazni par AU.
[0108] U jednom slučaju, sekvenca sens lanca može biti predstavljena formulom (I):
5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3' (I)
pri čemu:
i i j su svaki nezavisno 0 ili 1;
p i q su svaki nezavisno 0-6;
svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svako Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida;
svako npi nqnezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
pri čemu Nb i Y nemaju istu modifikaciju; i
XXX, YYY i ZZZ nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Poželjno, YYY su svi 2'-F modifikovani nukleotidi.
[0109] U jednom slučaju, Nai/ili Nbsadrže modifikacije sa naizmeničnim šablonom.
[0110] U jednom slučaju, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega. Na primer, kada agens RNKi ima region dvojne spirale dužine 17-23 nukleotida, YYY motiv može da se javi na mestu cepanja ili u njegovoj blizini (npr. može da se javi na pozicijama 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 ili 11, 12, 13) sens lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja; ili opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne spirale od 5'-kraja.
[0111] U jednom slučaju, i je 1 i j je 0, ili i je 0 i j je 1; ili i i j su oba 1. Sens lanac stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ic);
ili
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Id).
[0112] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ib), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
1
[0113] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Ic), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0114] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Id), svako Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Poželjno, svako Naje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0115] X, Y i Z mogu biti isti ili međusobno različiti.
[0116] U drugim slučajevima, i je 0 i j je 0, a sens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np-Na-YYY-Na-nq3' (Ia).
[0117] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ia), svaki Nanezavisno može da predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0118] U jednom slučaju, sekvenca antisens lanca RNKi može biti predstavljena formulom (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
pri čemu:
k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p' i q' su svaki nezavisno 0-6;
svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
2
svako Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida;
svako np' i nq' nezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
pri čemu Nb' i Y' nemaju istu modifikaciju;
i
X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0119] U jednom slučaju, Na' i/ili Nb' sadrže modifikacije sa naizmeničnim šablonom.
[0120] Motiv Y'Y'Y' se javlja na mestu cepanja antisens lanca ili blizu njega. Na primer, kada agens RNKi ima region dvojne spirale dužine 17-23 nukleotida, motiv Y'Y'Y' može da se javi na pozicijama 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ili 13, 14, 15 antisens lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja; ili, opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne spirale od 5'-kraja. Poželjno, motiv Y'Y'Y' se javlja na pozicijama 11, 12, 13.
[0121] U jednom slučaju, motiv Y'Y'Y' su svi 2'-OMe modifikovani nukleotidi.
[0122] U jednom slučaju, k je 1 i 1 je 0, ili k je 0 i 1 je 1, ili k i 1 su oba 1.
[0123] Antisens lanac stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc);
ili
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np'.3' (IId).
[0124] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIb), Nb' predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0125] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIc), Nb' predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0126] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IId), svaki Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Poželjno, Nbje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0127] U drugim slučajevima, k je 0 i l je 0 i antisens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3' (Ia).
[0128] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IIa), svaki Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0129] X', Y' i Z' mogu biti isti ili međusobno različiti.
[0130] Svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca može biti nezavisno modifikovan sa LNK, HNK, CeNK, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C- alil, 2'-hidroksi ili 2'-fluor. Na primer, svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluor. Svaki X, Y, Z, X', Y' i Z', naročito, može da predstavlja 2'-O-metil modifikaciju ili 2'-fluor modifikaciju.
[0131] U jednom slučaju, sens lanac agensa RNKi može da sadrži YYY motiv koji se javlja na pozicijama 9, 10 i 11 lanca kada region dvojne spirale ima 21 nt, brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja, ili, opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne
4
spirale, od 5'-kraja; a Y predstavlja 2'-F modifikaciju. Sens lanac može dodatno da sadrži motiv XXX ili motiv ZZZ kao bočne modifikacije na suprotnom kraju regiona dupleksa, a XXX i ZZZ svaki nezavisno predstavljaju 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0132] U jednom slučaju, antisens lanac može da sadrži Y'Y'Y' motiv koji se javlja na pozicijama 11, 12, 13 lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja, ili, opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dvojne spirale od 5'-kraja; a Y' predstavlja 2'-O-metil modifikaciju. Antisens lanac može dodatno da sadrži motiv X'X'X' ili motiv Z'Z'Z' kao bočne modifikacije na suprotnom kraju regiona dupleksa, a X'X'X' i Z'Z'Z' nezavisno predstavljaju 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0133] Sens lanac predstavljen bilo kojom od prethodnih formula (Ia), (Ib), (Ic) i (Id) gradi dvojnu spiralu sa antisens lancem koji je predstavljen bilo kojom od formula (IIa), (IIb), (IIc), odnosno (IId).
[0134] Shodno tome, agensi RNKi za upotrebu u postupcima iz otkrića mogu da sadrže sens lanac i antisens lanac, od kojih svaki ima 14 do 30 nukleotida, dvojna spirala RNKi je predstavljena formulom (III):
sens: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3' antisens: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
pri čemu:
i, j, k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
svako Nai Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svako Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida;
pri čemu
svaki np', np, nq' i nq, od kojih svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja nukleotid prepusta; i
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0135] U jednom slučaju, i je 0 i j je 0; ili i je 1 i j je 0; ili i je 0 i j je 1; ili su i i j oba 0; ili su i i j oba 1. U drugom slučaju, k je 0 i 1 je 0; ili k je 1 i l je 0; k je 0 i 1 je 1; ili su i k i 1 oba 0; ili su i k i 1 oba 1.
[0136] Primeri za kombinacije sens lanca i antisens lanca koje formiraju dvojnu spiralu RNKi uključuju sledeće formule:
5' np-Na-YYY-Na-nq3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'nq' 5' (IIIa)
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5' (IIIb)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIc)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5' (IIId)
[0137] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIa), svaki Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0138] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIb), svaki Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 1-10, 1-7, 1-5 ili 1-4 modifikovanih nukleotida. Svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0139] Kada je agens RNKi predstavljen kao formula (IIIc), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0140] Kada je agens RNKi predstavljen kao formula (IIId), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na, Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svako Na, Na', Nbi Nb' nezavisno sadrži modifikaciju naizmeničnih šablona.
[0141] Svako X, Y i Z u formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId) može biti isto ili međusobno različito.
[0142] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId), najmanje jedan od Y nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od Y' nukleotida. Alternativno, najmanje dva Y nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima, ili sva tri Y nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima.
[0143] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIb) ili (IIId), najmanje jedan od Z nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od Z' nukleotida. Alternativno, najmanje dva Z nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima; ili sva tri Z nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima.
[0144] Kada je agens RNKi predstavljen kao formula (IIIc) ili (IIId), najmanje jedan od X nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od X' nukleotida. Alternativno, najmanje dva X nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima, ili sva tri X nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima.
[0145] U jednom slučaju, modifikacija na Y nukleotidu je različita od modifikacije na Y' nukleotidu, modifikacija na Z nukleotidu je različita od modifikacije na Z' nukleotidu i/ili je modifikacija na X nukleotidu različita od modifikacije na X' nukleotidu.
[0146] U jednom slučaju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije. U drugom slučaju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije i np' >0, a najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze. U još jednom slučaju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije, np' >0, i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze, i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom. U drugom slučaju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIId); Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije, np' >0, i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze, sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu, i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom.
[0147] U jednom slučaju, kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIa), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacije, np' >0 i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze, sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu, i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više derivata GalNAc povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom.
[0148] U jednom slučaju, agens RNKi je multimer koji sadrži najmanje dve dvojne spirale predstavljene formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId), pri čemu su dvojne spirale povezane linkerom. Linker može biti linker koji može da se cepa ili koji ne može da se cepa. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaki dupleks može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki dupleks može da cilja isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0149] U jednom slučaju, agens RNKi je multimer koji sadrži tri, četiri, pet, šest ili više dvojnih spirala predstavljenih formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) ili (IIId), pri čemu su dvojne spirale povezane linkerom. Linker može biti linker koji može da se cepa ili koji ne može da se cepa. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaka dvojna spirala može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaka dvojna spirala može da cilja isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0150] U jednom slučaju, dva agensa RNKi predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId) su međusobno povezana na 5' kraju, a jedan ili oba 3' kraja su opciono konjugovana sa ligandom. Svaki agens može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki agens može da cilja isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0151] Različite publikacije opisuju multimerne agense RNKi koji mogu da se koriste u postupcima iz otkrića. Takve publikacije uključuju WO2007/091269, US Patent br.7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 i WO2011/031520.
[0152] Agens RNKi koji sadrži konjugacije jednog ili više ostataka ugljenih hidrata sa agensom RNKi može da optimizuje jedno ili više svojstava agensa RNKi. U mnogim slučajevima, ostatak ugljenog hidrata će biti vezan za modifikovanu podjedinicu agensa RNKi. Na primer, šećer riboza iz jedne ili više podjedinica ribonukleotida agensa dsRNK može biti zamenjen drugim ostatkom, npr. neugljovodoničnim (poželjno cikličnim) nosačem za koji je vezan ugljovodonični ligand. Ribonukleotidna podjedinica u kojoj je šećer riboza podjedinice tako zamenjen ovde se naziva podjedinica sa modifikacijom zamene riboze (ribose replacement modification subunit, RRMS). Ciklični nosač može biti karbociklični sistem prstena, tj. svi atomi prstena su atomi ugljenika, ili heterociklični sistem prstena, tj. jedan ili više atoma prstena može biti heteroatom, npr. azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklični sistem prstena ili može da sadrži dva ili više prstenova, npr. kondenzovanih prstenova. Ciklični nosač može biti potpuno zasićeni sistem prstena, ili može da sadrži jednu ili više dvostrukih veza.
[0153] Ligand može biti vezan za polinukleotid putem nosača. Nosači uključuju (i) najmanje jednu „tačku vezivanja skeleta“, poželjno dve „tačke vezivanja skeleta“ i (ii) najmanje jednu „vezujuću tačku kačenja“. „Tačka vezivanja skeleta“, kako se ovde koristi, odnosi se na funkcionalnu grupu, npr. hidroksilnu grupu, ili generalno vezu koja je dostupna i koja je pogodna za uključivanje nosača u skelet, npr. fosfata ili modifikovanog fosfata, npr. koji sadrži sumpor, skeleta, ribonukleinske kiseline. „Vezujuća tačka kačenja“ (tethering attachment point, TAP) u nekim slučajevima ukazuje na sastavni atom prstena cikličnog nosača, npr. atom ugljenika ili heteroatom (različit od atoma koji obezbeđuje tačku vezivanja skeleta) koji povezuje odabrani ostatak. Ostatak može biti, npr. ugljeni hidrat, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid i polisaharid. Opciono, izabrani ostatak je povezan interventnom vezom sa cikličnim nosačem. Tako, ciklični nosač će često uključivati funkcionalnu grupu, npr. amino grupu, ili uopšteno, obezbeđivati vezu koja je pogodna za inkorporisanje ili vezivanje drugog hemijskog entiteta, npr. ligand za sastavni prsten.
[0154] Agensi RNKi mogu biti konjugovani sa ligandom putem nosača, pri čemu nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; poželjno, ciklična grupa je izabrana od pirolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioksolana, oksazolidinila, izoksazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, izotiazolidinila, hinoksalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila i dekalina; poželjno, aciklična grupa je izabrana od serinolskog skeleta ili dietanolaminskog skeleta.
[0155] U određenim specifičnim slučajevima, agens RNKi za upotrebu u postupcima iz otkrića je agens izabran iz grupe agensa navedenih u Tabeli 1 i 2. U jednom slučaju, kada je agens naveden u Tabeli 1, agensu može da nedostaje terminalni dT.
[0156] Kada predmetno otkriće dalje uključuje agense dvolančane RNKi koji sadrže bilo koju od sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili 2 koje sadrže 5' fosfat ili fosfatni mimetik na antisens lancu (vidite, npr. PCT publikaciju br. WO 2011005860). Nadalje, predmetno otkriće uključuje agense dvolančane RNKi koji sadrže bilo koju od sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili 2 koje uključuju 2' fluor grupu umesto 2'-OMe grupe na 5' kraju sens lanca.
Dodatni motivi
[0157] U određenim aspektima, agensi dvolančane RNKi koji su ovde opisani sadrže sens lanac i antisens lanac, pri čemu navedeni sens lanac i antisens lanac sadrže manje od jedanaest, deset, devet, osam, sedam, šest ili pet 2'-dezoksfluora.
[0158] U određenim aspektima, agensi dvolančane RNKi koji su ovde opisani sadrže sens lanac i antisens lanac, pri čemu navedeni sens lanac i antisens lanac sadrže manje od deset, devet, osam, sedam, šest, pet, četiri fosforotioatne internukleotidne veze.
[0159] U određenim aspektima, agensi dvolančane RNKi koji su ovde opisani sadrže sens lanac i antisens lanac, pri čemu navedeni sens lanac i antisens lanac sadrže manje od deset 2'-dezoksifluor i manje od šest fosforotioatnih internukleotidnih veza.
[0160] U određenim aspektima, agensi dvolančane RNKi koji su ovde opisani sadrže sens lanac i antisens lanac, pri čemu navedeni sens lanac i antisens lanac sadrže manje od osam 2'-dezoksifluor i manje od šest fosforotioatnih internukleotidnih veza.
4
[0161] U određenim aspektima, agensi dvolančane RNKi koji su ovde opisani sadrže sens lanac i antisens lanac, pri čemu navedeni sens lanac i antisens lanac sadrže manje od osam 2'-dezoksifluor i manje od šest fosforotioatnih internukleotidnih veza.
Ligandi
[0162] Agensi dvolančane RNKi iz otkrića mogu opciono biti konjugovani sa jednim ili više liganada. Ligand može biti vezan za sens lanac, antisens lanac ili oba lanca, na 3' kraju, 5' kraju ili na oba kraja. Na primer, ligand može biti konjugovan sa sens lancem. U skladu sa pronalaskom, ligand je konjugovan sa 3'-krajem sens lanca. U jednom slučaju, ligand je GalNAc ligand. U nekim slučajevima, ligand je naročito GalNAc3. Ligandi su vezani, poželjno kovalentno, direktno ili indirektno putem interventne veze.
[0163] U nekim slučajevima, ligand menja distribuciju, ciljanje ili životni vek molekula u koji je inkorporisan. U nekim slučajevima, ligand pruža povećani afinitet prema odabranom cilju, npr. molekulu, ćeliji ili vrsti ćelije, odeljku, receptoru, npr., odeljku ćelije ili organa, tkivu, organu ili regionu tela, u poređenju, npr., sa vrstom koja nema takav ligand. Ligandi koji obezbeđuju pojačani afinitet prema odabranom cilju nazivaju se i ciljni ligandi.
[0164] Neki ligandi mogu da imaju endozomolitička svojstva. Endozomolitički ligandi promovišu lizu endozoma i/ili transport kompozicije iz otkrića, ili njenih komponenata, iz endozoma u citoplazmu ćelije. Endozomolitički ligand može biti polianjonski peptid ili peptidomimetik koji pokazuje aktivnost membrane zavisnu od pH i fuzogenost. U jednom slučaju, endozomolitički ligand poprima svoju aktivnu konformaciju pri endozomskom pH. „Aktivna“ konformacija je konformacija u kojoj endozomolitički ligand promoviše lizu endozoma i/ili transport kompozicije iz otkrića, ili njenih komponenata, iz endozoma u citoplazmu ćelije. Primeri za endozomolitičke ligande uključuju GALA peptid (Subbarao i sar. Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA peptide (Vogel i sar J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586) i njihove derivate (Turk i sar. Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). U jednom slučaju, endozomolitička komponenta može da sadrži hemijsku grupu (npr. aminokiselinu) koja će pretrpeti promenu naelektrisanja ili protonovanja kao odgovor na promenu pH. Endozomolitička komponenta može biti linearna ili razgranata.
[0165] Ligandi mogu da unaprede transport, hibridizaciju i specifična svojstva, i mogu takođe da unaprede otpornost nukleaze dobijenog prirodnog ili modifikovanog oligoribonukleotida, ili polimernog molekula koji sadrži bilo koju kombinaciju ovde opisanih monomera i/ili prirodnih ili modifikovanih ribonukleotida.
[0166] Ligandi uopšteno mogu da uključuju terapeutske modifikatore, npr. za poboljšanje unosa; dijagnostička jedinjenja ili reporterske grupe, npr. za praćenje distribucije; agense za unakrsno vezivanje; i ostatke koji daju otpornost na nukleaze. Uopšteni primeri uključuju lipide, steroide, vitamine, šećere, proteine, peptide, poliamine i imitacije peptida.
[0167] Ligand može da uključuje prirodnu supstancu, kao što je protein (npr. humani serumski albumin (HSA), lipoprotein male gustine (LDL), lipoprotein velike gustine (HDL) ili globulin); ugljeni hidrat (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronsku kiselinu); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr. sintetička poliaminokiselina, oligonukleotid (npr. aptamer). Primeri za poliaminokiseline uključuju polilizin (PLL), poli L-asparaginsku kiselinu, poli L-glutaminsku kiselinu, kopolimer stiren-anhidrid maleinske kiseline, poli(L-laktid-koglikolizovani) kopolimer, kopolimer divinil etar-anhidrid maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilnu kiselinu), polimere N-izopropilakrilamida, ili polifosfazin. Primeri za poliamin uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetski poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternernu so poliamina, ili alfa heliksni peptid.
[0168] Ligandi takođe mogu da uključuju ciljajuće grupe, npr. agens za ciljanje ćelije ili tkiva, npr. lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr. antitelo koje se vezuje za naznačenu vrstu ćelije, kao što je bubrežna ćelija. Grupa za ciljanje može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktantski protein A, mucinski ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-gulukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilovane poliaminokiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, RGD peptid, RGD peptidni mimetik ili aptamer.
[0169] Drugi primeri za ligande uključuju boje, interkalirajuće agense (npr. akridine), kroslinkere (npr. psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, Sapfirin), policiklične aromatične ugljene hidrate (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze ili helator (npr. EDTA), lipofilne molekule, npr. holesterol, holnu kiselinu, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, 1,3-bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupu, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupu, palmitinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, O3-(oleoil)litoholnu kiselinu, O3-(oleoil)holensku kiselinu, dimetoksitritil ili fenoksazin) i peptidne konjugate (npr. antennapedia peptid, Tat peptid), alkilujuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radiološki obeležene markere, enzime, haptene (npr. biotin), facilitatore transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr. imidazol, bisimidazol, histamin, klasteri imidazola, konjugati akridinimidazol, Eu3+ kompleksi tetraazamakrocikala), dinitrofenil, HRP ili AP.
[0170] Ligandi mogu biti proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet prema koligandu, ili antitela, npr. antitelo koje se vezuje za određenu vrstu ćelija, kao što je ćelija kancera, ćelija endotela ili koštana ćelija. Ligandi mogu takođe da uključuju hormone i hormonske receptore. Takođe mogu da uključuju i nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, N-acetil-gulukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, ili aptameri. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze ili aktivator NF-κB.
[0171] Ligand može biti supstanca, npr. lek, koja može da povećava preuzimanje agensa iRNK u ćeliju, na primer, ometanjem ćelijskog citoskeleta, npr. ometanjem ćelijskih mikrotubula, mikrofilamenata i/ili intermedijernih filamenata. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0172] Ligand može da poveća unos oligonukleotida u ćeliju na primer, putem, aktivacije inflamatornog odgovora. Primeri za ligande koji bi imali takvo dejstvo uključuju faktor nekroze tumora alfa (TNFalfa), interleukin-1 beta ili gama interferon.
4
[0173] U jednom aspektu, ligand je lipid ili molekul na bazi lipida. Takav lipid ili molekul na bazi lipida poželjno vezuje serumski protein, npr. albumin iz ljudskog seruma (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata do ciljnog tkiva, npr. ciljnog tkiva organizma koje se ne nalazi u bubregu. Na primer, ciljno tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Drugi molekuli koji mogu da vezuju HSA takođe mogu da se koriste kao ligandi. Na primer, mogu se koristiti i naproksen ili aspirin. Lipid ili ligand na bazi lipida može (a) da poveća otpornost na razgradnju konjugata, (b) da poveća ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu i/ili (c) da se koristi da se podesi vezivanje za serumski protein, npr. HSA.
[0174] Ligand na bazi lipida može se koristiti da modulira, npr. kontroliše vezivanje konjugata za ciljno tkivo. Na primer, za lipid ili ligand na bazi lipida koji se snažnije vezuje za HSA biće manje verovatno da cilja bubreg, i stoga manje verovatno da se brzo ukloni iz organizma. Lipid ili ligand na bazi lipida koji se snažno vezuje za HSA može da se koristi za ciljanje konjugata prema bubregu.
[0175] U jednom slučaju, ligand na bazi lipida vezuje HSA. On poželjno vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će konjugat poželjno biti distribuiran u nebubrežno tkivo. U jednom slučaju, afinitet je takav da vezivanje HSA ligandom može da se preokrene. U drugom slučaju, ligand na bazi lipida vezuje HSA slabo ili uopšte ne vezuje, tako da će konjugat poželjno biti distribuiran bubregu. Drugi ostaci koji ciljaju ćelije bubrega takođe mogu da se koriste umesto liganda na bazi lipida, ili kao dodatak njemu.
[0176] U drugom aspektu, ligand je ostatak, npr. vitamin, koji preuzima ciljna ćelija, npr. proliferativna ćelija. Oni su naročito korisni za lečenje poremećaja koje karakteriše neželjena ćelijska proliferacija, npr. maligne ili nemaligne vrste, npr. ćelije kancera. Primeri za vitamine uključuju vitamin A, E i K. Drugi primeri za vitamine uključuju B vitamine, npr. folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili druge vitamine ili hranljive materije preuzete u ćelije kancera. Takođe su uključeni HAS, lipoprotein male gustine (LDL) i lipoprotein velike gustine (HDL).
[0177] U drugom aspektu, ligand je agens za ćelijsku permeaciju, poželjno spiralni agens za ćelijsku permeaciju. Poželjno, agens je amfipatički. Primer za agens je peptid, kao što je tat ili antenopedija. Ako je agens peptid, on može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetik, invertomere, nepeptidne ili pseudopeptidne veze, i korišćenje D-aminokiselina. Spiralni agens je poželjno alfa-heliksni agens, koji poželjno ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0178] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (ovde se takođe naziva oligopeptidomimetik) je molekul sposoban da se presavija u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Peptid ili peptidomimetički ostatak mogu biti dužine oko 5-50 aminokiselina, npr. dužine oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina. Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid za ćelijsku permeaciju, katjonski peptid, amfipatični peptid ili hidrofobni peptid (npr. koji se sastoji pretežno od Tyr, Trp ili Phe). Peptidni ostatak može biti peptidni dendrimer, ograničeni peptid ili unakrsno vezani peptid. U drugoj alternativi, peptidni ostatak može da uključuje hidrofobnu sekvencu translokacije membrane (MTS). Primer peptida koji sadrži hidrofobnu MTS je RFGF koji ima aminokiselinsku sekvencu AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 9). Analog RFGF (npr. aminokiselinska sekvenca AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10)) koji sadrži hidrofobnu MTS takođe može biti ciljajući ostatak. Peptidni ostatak može biti peptid za „isporuku“ koji može da prenosi velike polarne molekule, uključujući peptide, oligonukleotide i proteine, kroz ćelijske membrane. Na primer, za sekvence iz Tat proteina HIV (GRKKRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO: 11) i proteina Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK) (SEQ ID NO: 12) otkriveno je da mogu da funkcionišu kao peptidi za isporuku. Peptid ili peptidomimetik može biti kodiran nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke displeja faga, ili iz kombinatorne biblioteke jedna-perlica-jedno-jedinjenje (one-bead-onecompound, OBOC) (Lam i sar. Nature, 354:82-84, 1991). Poželjno, peptid ili peptidomimetik vezan za agens iRNK putem inkorporisane jedinice monomera je peptid koji cilja ćeliju kao što je arginin-glicin-asparaginska kiselina (RGD)-peptid, ili RGD mimetik. Peptidni ostatak može imati dužinu u rasponu od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina. Peptidni ostaci mogu imati strukturnu modifikaciju, recimo radi poboljšanja stabilnosti ili direktnih konformacionih svojstava. Može da se koristi bilo koja od strukturnih modifikacija opisanih u nastavku. RGD peptidni ostatak može da se koristi da cilja ćeliju tumora, kao što je ćelija endotelnog tumora ili ćelija tumora kancera dojke (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD peptid može da olakša ciljanje agensa iRNK ka tumorima brojnih drugih tkiva, uključujući pluća, bubreg, slezinu ili jetru (Aoki i sar. Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Poželjno, RGD peptid će olakšati ciljanje agensa iRNK ka bubregu. RGD peptid može biti linearan ili cikličan, i može biti modifikovan, npr. glikozilovan ili metilovan da olakša ciljanje specifičnih tkiva. Na primer, glikozilovani RGD peptid može da isporuči agens iRNK u
4
tumorsku ćeliju koja eksprimira αVβ3(Haubner i sar. Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Mogu se koristiti peptidi koji ciljaju markere obogaćene proliferativnim ćelijama. Na primer, peptidi i peptidomimetici koji sadrže RGD mogu da ciljaju ćelije kancera, posebno ćelije koje izlažu integrin. Tako, mogu se koristiti RGD peptidi, ciklični peptidi koji sadrže RGD, RGD peptidi koji sadrže D-aminokiseline, kao i sintetički RGD mimetici. Pored RGD, mogu se koristiti drugi ostaci koji ciljaju integrinski ligand. Uopšteno, takvi ligandi se mogu koristiti da kontrolišu proliferativne ćelije i angiogenezu. Neki konjugati ove vrste liganda ciljaju PECAM-1, VEGF ili druge gene kancera, npr. ovde opisane gene kancera.
[0179] „Peptid za ćelijsku permeaciju“ sposoban je da prodre u ćeliju, npr. ćeliju mikroba, kao što je bakterijska ili gljivična ćelija, ili ćeliju sisara, kao što je ljudska ćelija. Peptid koji prodire u mikrobnu ćeliju može biti, na primer, α-heliksni linearni peptid (npr. LL-37 ili Ceropin P1), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr. α-defensin, β-defensin ili baktenecin) ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr. PR-39 ili indolicidin). Peptid za ćelijsku permeaciju takođe može da uključuje nuklearni lokalizacioni signal (NLS). Na primer, peptid za ćelijsku permeaciju može biti dvodelni amfipatični peptid, kao što je MPG, koji je dobijen iz fuzije peptidnog domena HIV-1 gp41 i NLS SV40 velikog T antigena (Simeoni i sar. Nucl. Acids Res.31:2717-2724, 2003).
[0180] U jednom slučaju, peptid za ciljanje može biti amfipatični α-heliksni peptid. Primeri za amfipatične α-heliksne peptide uključuju, ali nisu ograničeni na, cekropine, likotoksine, paradaksine, buforin, CPF, peptid sličan bombininu (BLP), katelicidine, ceratotoksine, peptide S. clava, antimikrobne crevne proteine slepulje (hagfish intestinal antimicrobial peptides, HFIAP), magainine, brevinine-2, dermaseptine, melitine, pleurocidin, H2A peptide, peptide žabe Xenopus, eskulentinis-1 i kaerine. Brojni faktori će poželjno biti razmotreni kako bi se održao integritet stabilnosti heliksa. Na primer, biće korišćen maksimalan broj ostataka za stabilizaciju heliksa (npr. leu, ala ili lys), i biće korišćen minimalan broj ostataka za destabilizaciju heliksa (npr. prolin ili jedinice cikličnog monomera. Završni ostatak će se uzeti u razmatranje (na primer, Gly je primer N-završnog ostatka i/ili C-terminalna amidacija može da se koristi da se obezbedi dodatna H-veza koja stabilizuje heliks. Nastajanje sonih mostova između ostataka sa suprotnim naelektrisanjima, razdvojenih sa i ± 3 ili i ± 4 pozicija može da obezbedi stabilnost. Na primer, katjonski ostaci, kao što je lizin, arginin, homo-arginin, ornitin ili histidin, mogu da grade sone mostove sa anjonskim ostacima glutamatom ili aspartatom.
4
[0181] Peptid i peptidomimetski ligandi uključuju one koji imaju prirodne ili modifikovane peptide, npr. D ili L peptide, α, β ili γ peptide; N-metil peptide; azapeptide; peptide koji imaju jednu ili više amidnih, tj. peptidnih, veza zamenjenih sa jednom ili više veza sa ureom, tioureom, karbamatom ili sulfonil ureom; ili ciklične peptide.
[0182] Ciljani ligand može biti svaki ligand koji je sposoban da cilja specifični receptor. Primeri su folat, GalNAc, galaktoza, manoza, manoza-6P, klasteri šećera kao što je GalNAc klaster, klaster manoze, klaster galaktoze ili aptamer. Klaster je kombinacija dve ili više jedinica šećera. Ciljani ligandi takođe uključuju ligande integrinskog receptora, ligande receptora hemokina, transferin, biotin, ligande receptora serotonina, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL i HDL ligande. Ligandi takođe mogu biti na bazi nukleinske kiseline, npr. aptamer. Aptamer može biti nemodifikovan ili imati bilo koju kombinaciju ovde otkrivenih modifikacija.
[0183] Agensi za endozomsko otpuštanje uključuju imidazole, poli ili oligoimidazole, PEI, peptide, fuzogene peptide, polikaboksilate, poliakatjone, maskirane oligo ili poli katjone ili anjone, acetale, poliacetale, ketale/poliketale, ortoestre, polimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjem, dendrimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjem.
[0184] PK modulator označava farmakokinetički modulator. PK modulatori uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, analoge fosfolipida, peptide, agense koji vezuju protein, PEG, vitamine, itd. Primeri za PK modulatore uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, holnu kiselinu, litoholnu kiselinu, dialkilgliceride, diacilglicerid, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin, itd. Takođe je poznato da se oligonukleotidi koji sadrže određeni broj fosforotioatnih veza vezuju za serumski protein, te su kratki oligonukleotidi, npr. oligonukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koji sadrže više fosforotioatnih veza u skeletu, takođe pogodni za predmetno otkriće kao ligandi (npr. kao PK modulišući ligandi).
[0185] Dodatno, aptameri koji vezuju komponente seruma (npr. serumske proteine) takođe spadaju u predmetni pronalazak kao PK modulišući ligandi.
4
[0186] Drugi konjugati liganda koji spadaju u otkriće opisani su u U.S. patentnim prijavama USSN: 10/916,185, podneta 10. avgusta 2004; USSN: 10/946,873, podneta 21. septembra 2004; USSN: 10/833,934, podneta 3. avgusta 2007; USSN: 11/115,989, podneta 27. aprila 2005; i USSN: 11/944,227, podneta 21. novembra 2007.
[0187] Kada je prisutno dva ili više liganda, svi ligandi mogu da imaju ista svojstva, svi mogu da imaju različita svojstva, ili neki ligandi mogu da imaju ista svojstva dok drugi mogu da imaju različita svojstva. Na primer, ligand može da ima svojstva ciljanja, da ima endozomolitičku aktivnost ili da ima PK modulišuća svojstva. U jednom slučaju, svi ligandi imaju različita svojstva.
[0188] Ligandi mogu biti kuplovani sa oligonukleotidima na različitim mestima, na primer, 3'-kraju, 5'-kraju i/ili na internoj poziciji. U nekim slučajevima, ligand je povezan sa oligonukleotidima putem interventne veze, npr. ovde opisanog nosača. Ligand ili vezani ligand mogu biti prisutni na monomeru kada je monomer inkorporisan u rastući lanac. U nekim slučajevima, ligand može biti inkorporisan putem kuplovanja za „prekursorski“ monomer nakon što je „prekursorski“ monomer inkorporisan u rastući lanac. Na primer, monomer koji ima, npr. vezu sa amino-krajem (tj. nema povezani ligand), npr. TAP-(CH2)nNH2može biti inkorporisan u rastući oligonukleotidni lanac. U sledećoj operaciji, tj. nakon inkorporisanja prekursorskog monomera u lanac, ligand koji ima elektrofilnu grupu, npr. pentafluorfenil estar ili aldehidnu grupu, može naknadno da se zakači za prekursorski monomer putem kuplovanja elektrofilne grupe liganda sa terminalnom nukleofilnom grupom veze prekursorskog monomera.
[0189] U drugom primeru, može biti inkorporisan monomer koji ima hemijsku grupu pogodnu za učešće u reakciji klik hemije, npr. veza/linker sa azidnim ili alkinskim krajem. U sledećoj operaciji, tj. nakon uključivanja prekursorskog monomera u lanac, ligand koji ima komplementarnu hemijsku grupu, npr. alkin ili azid, može biti vezan za prekursorski monomer putem kuplovanja alkina i azida jedan za drugi.
[0190] U nekim slučajevima, ligand može biti konjugovan sa nukleobazama, ostacima šećera ili internukleozidnim vezama molekula nukleinske kiseline. Do konjugacije sa purinskim neurobazama ili njihovim derivatima može doći na bilo kojoj poziciji, uključujući endociklične i egzociklične atome. U nekim slučajevima, 2-, 6-, 7- ili 8- pozicije purinske nukleobaze su
4
vezane za ostatak konjugata. Do konjugacije sa pirimidinskim nukleobazama ili njihovim derivatima takođe može doći na bilo kojoj poziciji. U nekim slučajevima, 2-, 5- ili 6- pozicije pirimidinske nukleobaze su supstituisane ostatkom konjugata. Do konjugacije sa ostacima šećera nukleozida može doći na bilo kom atomu ugljenika. Primeri za atome ugljenika ostatka šećera koji se mogu zakačiti za ostatak konjugata uključuju 2', 3' i 5' atome ugljenika. Pozicija 1' takođe može biti vezana za ostatak konjugata, kao u nebaznom ostatku. Internukleozidne veze takođe mogu da nose ostatke konjugata. Kod veza koje sadrže fosfor (npr. fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, fosforoamidat, i slično), ostatak konjugata može biti vezan direktno za atom fosfora ili za O, N ili S atom vezan za atom fosfora. Kod internukleozidnih veza koje sadrže amin ili amid (npr. PNK), ostatak konjugata može biti vezan za atom azota amina ili amida, ili za susedni atom ugljenika.
GalNAc ligandi i linkeri
[0191] U nekom slučaju, siRNK koja cilja HAO1 gen je konjugovana sa ugljenim hidratom, npr. monosaharidom (kao što je GalNAc), disaharidom, trisaharidom, tetrasaharidom, polisaharidom. U nekim slučajevima, siRNK je konjugovana sa N-acetilgalaktozaminskim (GalNAc) ligandom. To povećava delotvornu isporuku u hepatocite nakon supkutane primene. Postupci konjugovanja ugljenih hidrata, npr., N-acetilgalaktozamina, sa, npr. siRNK, dobro su poznati stručnjaku. Primeri se mogu naći u US8,106,022 i WO2014/025805.
[0192] U nekim slučajevima, siRNK koja cilja HAO1 gen je konjugovana sa ligandom, npr. sa GalNAc, putem linkera. Na primer, ligand može biti jedan ili više derivata GalNAc (N-acetilgalaktozamina) povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom.
[0193] U jednom slučaju, dsRNK iz otkrića konjugovana sa dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerima uključuje strukture prikazane u bilo kojoj od formula (IV) - (VII):
4
pri čemu:
q<2A>, q<2B>, q<3A>, q<3B>, q<4A>, q<4B>, q<5A>, q<5B>i q<5C>nezavisno predstavljaju u svakom slučaju 0-20, i pri čemu ponavljajuća jedinica može biti ista ili različita;
P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>su nezavisno u svakom slučaju odsutni, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ili CH2O;
Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>su nezavisno u svakom slučaju odsutni, alkilen, supstituisani alkilen, pri čemu jedan ili više metilena može biti prekinuto ili završeno sa jednim ili više od O, S, S(O), SO2, N(R<N>), C(R')=C(R"), C=C ili C(O); R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>su svaki nezavisno u svakom slučaju odsutni, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(R<a>)C(O), -C(O)-CH(R<a>)-NH-,
ili heterociklil;
L<2A>, L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju ligand, tj. svaki nezavisno u svakom slučaju monosaharid (poput GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid ili polisaharid; i
R<a>je H ili bočni lanac aminokiseline.
[0194] Trovalentni konjugujući derivati GalNAc su posebno korisni za upotrebu sa agensima RNKi za inhibiranje ekspresije ciljnog gena, poput onih iz formule (VII):
pri čemu L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je derivat GalNAc.
[0195] Primeri za pogodne dvovalentne i trovalentne grupe razgranatih linkera koje konjuguju derivate GalNAc uključuju, bez ograničenja, sledeća jedinjenja:
1
�
ili
Dodatni ligandi
[0196] U nekim slučajevima, ligand je izabran od jednog od sledećih:
4
III. Isporuka iRNK
[0197] Isporuka agensa iRNK iz otkrića u ćeliju, npr. ćeliju u ispitaniku, kao što je ljudski ispitanik (npr. ispitanik kome je to potrebno, kao što je ispitanik koji ima poremećaj povezan sa HAO1) može se postići na više različitih načina. Na primer, isporuka može da se obavi dovođenjem ćelije u kontakt sa iRNK iz otkrića, bilo in vitro ili in vivo. In vivo isporuka takođe može da se obavi neposredno primenom kompozicije koja sadrži iRNK, npr. dsRNK, na ispitaniku. Alternativno, in vivo isporuka može da se obavi posredno primenom jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju ekspresiju iRNK. Te alternative su dalje razmotrene u nastavku.
[0198] Uopšteno, svaki postupak za isporuku molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može da se prilagodi za upotrebu sa iRNK iz otkrića (vidite, npr. Akhtar S. i Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 i WO94/02595). Kod in vivo isporuke, faktori koje treba razmotriti da bi se molekul iRNK isporučio uključuju, na primer, biološku stabilnost isporučenog molekula, prevenciju nespecifičnih dejstava i akumulaciju isporučenog molekula u ciljnom tkivu. Nespecifična dejstva iRNK mogu da se minimizuju lokalnom primenom, na primer, direktnim ubrizgavanjem ili implantacijom u tkivo ili topikalnom primenom preparata. Lokalna primena na mesto lečenja maksimalno povećava lokalnu koncentraciju agensa, ograničava izloženost agensa sistemskim tkivima koja bi agens inače mogao da ošteti ili koja mogu da razgrade agens, i omogućava manju ukupnu dozu molekula iRNK koja se primenjuje. Nekoliko studija je pokazalo uspešan nokdaun genskih proizvoda kada se iRNK primenjuje lokalno. Na primer, pokazalo se da intraokularna isporuka VEGF dsRNK intravitrealnom injekcijom kod majmuna cinomolgusa (Tolentino, MJ., i sar. (2004) Retina 24:132-138) i subretinalnim injekcijama kod miševa (Reich, SJ., i sar. (2003) Mol. Vis.9:210-216) sprečava neovaskularizaciju na eksperimentalnom modelu starosne degeneracije makule. Pored toga, neposredna intratumorska injekcija dsRNK kod miševa smanjuje zapreminu tumora (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274) i može da produži preživljavanje miševa sa tumorom (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., i sar. (2007) Mol. Ther. 15:515-523). RNK interferencija se takođe pokazala uspešnom sa lokalnom isporukom u CNS neposrednom injekcijom (Dorn, G., i sar. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., i sar. (2005) Gene Ther.
12:59-66; Makimura, H., i sar. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., i sar. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., i sar. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
101:17270-17275; Akaneya,Y., i sar. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) i u pluća intranazalnom primenom (Howard, KA., i sar. (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X., i sar. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., i sar. (2005) Nat. Med. 11:50-55). Kod primene iRNK sistemski za lečenje bolesti, RNK može da se modifikuje ili alternativno isporuči koristeći sistem za isporuku leka; oba postupka deluju na sprečavanje brze razgradnje dsRNK putem endo- i egzonukleaza in vivo. Modifikacija RNK ili farmaceutskog nosača takođe može da omogući usmeravanje kompozicije iRNK na ciljno tkivo i izbegavanje neželjenih dejstava van cilja. Molekuli iRNK mogu da se modifikuju hemijskom konjugacijom sa lipofilnim grupama, kao što je holesterol, radi poboljšanja ćelijskog unosa i sprečavanja razgradnje. Na primer, iRNK usmerena na ApoB konjugovan sa lipofilnim ostatkom holesterola je sistemski injektovana u miševe, i dovela je do nokdauna mRNK apoB u jetri i jejunumu (Soutschek, J., i sar. (2004) Nature 432:173-178). Pokazalo se da konjugacija iRNK sa aptamerom inhibira rast tumora i posreduje u regresiji tumora na mišjem modelu raka prostate (McNamara, JO., i sar. (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). U alternativnom slučaju, iRNK može da se isporuči koristeći sisteme za isporuku lekova kao što su nanočestica, dendrimer, polimer, lipozomi ili katjonski sistem za isporuku. Pozitivno naelektrisani katjonski sistemi za isporuku olakšavaju vezivanje molekula iRNK (negativno naelektrisan) i takođe pojačavaju interakcije na negativno naelektrisanoj ćelijskoj membrani kako bi omogućili efikasno preuzimanje iRNK od strane ćelije. Katjonski lipidi, dendrimeri ili polimeri mogu ili da se vežu za iRNK ili se indukuju da grade vezikulu ili micelu (vidite, npr. Kim SH., i sar. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) koja obuhvata iRNK. Nastanak vezikula ili micela dalje sprečava razgradnju iRNK kada se sistemski primenjuje. Postupci za pripremanje i primenu kompleksa katjonske iRNK su jednostavni za osobu sa veštinama u struci (vidite, npr. Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205). Neki neograničavajući primeri sistema za isporuku leka korisni za sistemsku isporuku iRNK uključuju DOTAP (Sorensen, DR., i sar. (2003), supra; Verma, UN., i sar. (2003), supra), oligofektamin, „čvrste lipidne čestice nukleinske kiseline“ (Zimmermann, TS., i sar. (2006) Nature 441:111-114), kardiolipin (Chien, PY., i sar. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimin (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. 16. avgust elektronska publikacija pre štampane; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptide (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) i poliamidoamine (Tomalia, DA., i sar. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., i sar. (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). U nekim slučajevima, iRNK gradi kompleks sa ciklodekstrinom za sistemsku primenu. Postupci za primenu i farmaceutske kompozicije iRNK i ciklodekstrina mogu se naći u U.S. patentu br.7,427,605.
iRNK kodirane vektorom iz otkrića
[0199] iRNK koja cilja gen HAO1 može da se eksprimira iz transkripcionih jedinica ubačenih u vektore DNK ili RNK (vidite, npr. Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., i sar. Međunarodna PCT publikacija br. WO 00/22113, Conrad, Međunarodna PCT publikacija br. WO 00/22114, i Conrad, U.S. Pat. br. 6,054,299). Ekspresija može biti prolazna (trajanje u časovima ili nedeljama) ili produžena (nedelje ili meseci ili duže) u zavisnosti od specifičnih konstrukata koji se koriste i vrste ciljnog tkiva ili ćelije. Ovi transgeni mogu da se uvedu kao linearni konstrukt, cirkularni plazmid ili virusni vektor, koji može biti integrišući ili neintegrišući vektor. Transgen takođe može biti konstruisan da omogući da se nasledi kao ekstrahromozomski plazmid (Gassmann, i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[0200] Pojedinačni lanac ili lanci iRNK mogu da se transkribuju iz promotera na ekspresionom vektoru. Kada treba eksprimirati dva zasebna lanca radi stvaranja, na primer, dsRNK, dva zasebna ekspresiona vektora mogu zajedno da se uvedu (npr. transfekcijom ili infekcijom) u ciljnu ćeliju. Alternativno, svaki zasebni lanac dsRNK može da se transkribuje promoterima, pri čemu su oba promotera locirana na istom ekspresionom plazmidu. U jednom slučaju, dsRNK je eksprimirana kao invertovani ponavljajući polinukleotidi povezani sekvencom polinukleotida linkera tako da dsRNK ima strukturu drške i petlje.
[0201] Ekspresioni vektori iRNK su uopšteno DNK plazmidi ili virusni vektori. Ekspresioni vektori kompatibilni sa eukariotskim ćelijama, poželjno oni koji su kompatibilni sa ćelijama kičmenjaka, mogu da se koriste za proizvodnju rekombinantnih konstrukata za ekspresiju iRNK kako je ovde opisano. Ekspresioni vektori eukariotskih ćelija su dobro poznati u struci, i dostupni su iz brojnih komercijalnih izvora. Obično su obezbeđeni takvi vektori sa pogodnim restrikcionim mestima za ubacivanje segmenta željene nukleinske kiseline. Isporuka vektora koji eksprimiraju iRNK može biti sistemska, recimo intravenskom ili intramuskularnom primenom, primenom na ciljnim ćelijama koje su prenete iz pacijenta nakon čega se ponovo uvode u pacijenta, ili drugim putevima koji omogućavaju uvođenje u željenu ciljnu ćeliju.
[0202] Ekspresioni plazmidi iRNK mogu da se transficiraju u ciljne ćelije kao kompleks sa katjonskim lipidnim nosačima (npr. oligofektamin) ili nekatjonskim nosačima na bazi lipida (npr. Transit-TKO<™>). Višestruke lipidne transfekcije za iRNK-posredovani nokdaun koji cilja različite regione ciljne RNK tokom nedelju dana ili više, takođe su razmatrane otkrićem. Uspešno uvođenje vektora u ćelije domaćine može da se prati koristeći različite poznate postupke. Na primer, prolazna transfekcija može da se signalizira reporterom, kao što je fluorescentni marker, kao što je zeleni fluorescentni protein (Green Fluorescent Protein, GFP). Stabilna transfekcija ćelija ex vivo može da se obezbedi koristeći markere koji transficiranoj ćeliji daju otpornost na specifične faktore okruženja (npr. antibiotike ili lekove), kao što je otpornost na higromicin B.
[0203] Sistemi virusnih vektora koji mogu da se koriste sa ovde opisanim postupcima i kompozicijama uključuju, ali nisu ograničeni na, (a) vektore adenovirusa; (b) vektore retrovirusa, uključujući, bez ograničenja, lentivirusne vektore, Molonijev virus leukemije miševa, itd.; (c) vektore adenoasociranih virusa; (d) vektore virusa herpes simpleks; (e) vektore SV 40; (f) vektore polioma virusa; (G) vektore papiloma virusa; (h) vektore pikornavirusa; (i) vektore virusa boginja kao što su ortopoks, npr. vektori vakcinija virusa ili avipoks, npr. virus boginja kanarinaca ili virus boginja živine; i (j) adenovirus zavisan od pomoćnika ili lišen regiona za kodiranje virusa. Virusi sa oštećenom replikacijom takođe mogu biti korisni. Različiti vektori će biti ili neće biti inkorporisani u genom ćelija. Konstrukti po želji mogu da uključuju virusne sekvence za transfekciju. Alternativno, konstrukt može da bude inkorporisan u vektore koji su sposobni za epizomsku replikaciju, npr. EPV i EBV vektori. Konstrukti za rekombinantnu ekspresiju iRNK će uopšteno zahtevati regulatorne elemente, npr. promotere, pojačivače, itd., radi obezbeđivanja ekspresije iRNK u ciljnim ćelijama. Drugi aspekti koje treba razmotriti za vektore i konstrukte su dalje opisani u nastavku.
[0204] Vektori korisni za isporuku iRNK će uključivati regulatorne elemente (promotere, pojačivače, itd.) dovoljne za ekspresiju iRNK u željenoj ciljnoj ćeliji ili tkivu. Regulatorni elementi mogu da se odaberu da pružaju konstitutivnu ili regulisanu/inducibilnu ekspresiju.
[0205] Ekspresija iRNK može precizno da se reguliše, na primer, koristeći inducibilnu regulatornu sekvencu koja je senzitivna na određene fiziološke regulatore, npr. nivoe glukoze u krvotoku ili hormone (Docherty i sar.1994, FASEB J.8:20-24). Takvi inducibilni ekspresioni sistemi pogodni za kontrolu ekspresije dsRNK u ćelijama ili sisarima uključuju, na primer, regulisanje putem ekdizona, estrogena, progesterona, tetraciklina, hemijskih induktora dimerizacije, i izopropil-beta-DI-tiogalaktopiranozida (IPTG). Stručna osoba je sposobna da izabere odgovarajuću regulatornu/promotersku sekvencu na osnovu nameravane upotrebe transgena iRNK.
[0206] Mogu da se koriste virusni vektori koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK. Na primer, može da se koristi retrovirusni vektor (vidite Miller i sar. Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Ti retrovirusni vektori sadrže komponente neophodne za ispravno pakovanje virusnog genoma i integrisanje u DNK ćelije domaćina. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK su klonirane u jedan ili više vektora, što olakšava isporuku nukleinske kiseline u pacijenta. Još informacija o retrovirusnim vektorima može se naći, na primer, u Boesen i sar. Biotherapy 6:291-302 (1994), gde je opisana upotreba retrovirusnog vektora za isporuku mdr1 gena u hematopoetske matične ćelije kako bi matične ćelije postale otpornije na hemoterapiju. Druge reference koje ilustruju upotrebu retrovirusnih vektora u genskoj terapiji su: Clowes i sar. J. Clin. Invest.93:644-651 (1994); Kiem i sar. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons i Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); i Grossman i Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel.3:110-114 (1993). Lentivirusni vektori razmatrani za upotrebu uključuju, na primer, vektore na bazi HIV opisane u U.S. patentima br.
6,143,520; 5,665,557; i 5,981,276.
[0207] Adenovirusi su takođe razmatrani za upotrebu u isporuci iRNK iz otkrića. Adenovirusi su posebno primamljivi nosači, npr. za isporuku gena u respiratorni epitel. Adenovirusi prirodno inficiraju respiratorni epitel u kome izazivaju blagu bolest. Drugi ciljevi za sisteme isporuke na bazi adenovirusa su jetra, centralni nervni sistem, endotelne ćelije i mišić. Prednost adenovirusa je što mogu da inficiraju ćelije koje se ne dele. Kozarsky i Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) daju pregled genske terapije na bazi adenovirusa. Bout i sar. Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) pokazali su upotrebu vektora adenovirusa za transfer gena u respiratorni epitel rezus majmuna. Drugi primeri upotrebe adenovirusa u genskoj terapiji mogu se naći u Rosenfeld i sar. Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld i sar. Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli i sar. J. Clin. Invest.91:225-234 (1993); PCT publikaciji WO94/12649; i Wang, i sar. Gene Therapy 2:775-783 (1995). Odgovarajući vektor AV za ekspresiju iRNK iz otkrića, postupak za konstruisanje rekombinantnog vektora AV i postupak za isporuku vektora u ciljne ćelije prikazani su u Xia H i sar. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
[0208] Vektori adenoasociranog virusa (AAV) takođe mogu da se koriste za isporuku iRNK iz otkrića (Walsh i sar. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993); U.S. pat. br.5,436,146). U jednom slučaju, iRNK može da se eksprimira kao dva zasebna komplementarna molekula jednolančane RNK iz rekombinantnog vektora AAV koji ima, na primer, U6 ili H1 RNK promotere, ili promoter citomegalovirusa (CMV). Odgovarajući vektori AAV za ekspresiju dsRNK iz otkrića, postupci za konstruisanje rekombinantnog vektora AV i postupci za isporuku vektora u ciljne ćelije opisani su u Samulski R i sar. (1987), J. Virol.61: 3096-3101; Fisher K J i sar. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R i sar. (1989), J. Virol. 63: 38223826; U.S. Pat. br.5,252,479; U.S. Pat. br.5,139,941; Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 94/13788; i Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 93/24641.
[0209] Još jedan virusni vektor pogodan za isporuku iRNK iz otkrića je virus boginja, kao što je vakcinija virus, na primer, oslabljena vakcinija kao što je modifikovani Ankara virus (MVA) ili NYVAC, avipoks kao što je virus boginja živine ili virus boginja kanarinaca.
[0210] Tropizam virusnih vektora može da se modifikuje pseudotipizacijom vektora proteinima omotača ili drugim površinskim antigenima iz drugih virusa, ili supstitucijom različitih proteina virusnih kapsida, po potrebi. Na primer, lentivirusni vektori mogu biti pseudotipizovani površinskim proteinima iz virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), besnila, ebole, mokola virusa, i slično. Vektori AAV mogu da se naprave tako da ciljaju različite ćelije putem inženjeringa vektora, da eksprimiraju serotipove različitih proteina kapsida; vidite, npr. Rabinowitz J E i sar. (2002), J Virol 76:791-801.
[0211] Farmaceutska priprema vektora može da uključuje vektor u prihvatljivom razblaživaču, ili može da uključuje matricu sa sporim otpuštanjem u koju je umetnut nosač za isporuku gena. Alternativno, kada ceo vektor za isporuku gena može netaknut da se proizvede iz rekombinantnih ćelija, npr. retrovirusnih vektora, farmaceutski preparat može da uključuje jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za isporuku gena.
IV. Farmaceutske kompozicije iz otkrića
[0212] Predmetno otkriće takođe uključuje farmaceutske kompozicije i formulacije koje uključuju iRNK iz otkrića. U jednom slučaju, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže iRNK, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije koje sadrže iRNK su korisne za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa HAO1. Takve farmaceutske kompozicije su formulisane na osnovu načina isporuke.
[0213] Farmaceutske kompozicije koje sadrže agens RNKi iz otkrića mogu biti, na primer, rastvori sa puferom ili bez njega, ili kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljive nosače. Takve kompozicije uključuju, na primer, vodene ili kristalne kompozicije, lipozomske formulacije, micelarne formulacije, emulzije i vektore genske terapije.
1
[0214] U postupcima iz otkrića, agens RNKi može da se primenjuje u rastvoru. Slobodni agens RNKi može da se primenjuje u nepuferovanom rastvoru, npr. u fiziološkom rastvoru ili vodi. Alternativno, slobodna siRNK može da se primenjuje u pogodnom puferskom rastvoru. Puferski rastvor može da sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom slučaju, puferovani rastvor je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS). pH i osmolaritet puferovanog rastvora koji sadrži agens RNKi mogu se prilagoditi tako da bude pogodan za primenu na ispitaniku.
[0215] U nekim slučajevima, puferovani rastvor dalje sadrži agens za kontrolisanje osmolariteta rastvora, tako da se osmolaritet održava na željenoj vrednosti, npr. fiziološkim vrednostima za ljudsku plazmu. Rastvorljive supstance koje mogu da se dodaju u puferski rastvor radi kontrole osmolariteta uključuju, ali nisu ograničene na, proteine, peptide, aminokiseline, nemetabolizovane polimere, vitamine, jone, šećere, metabolite, organske kiseline, lipide ili soli. U nekim slučajevima, agens za kontrolisanje osmolariteta rastvora je so. U određenim slučajevima, agens za kontrolisanje osmolariteta rastvora je natrijum hlorid ili kalijum hlorid.
[0216] Farmaceutske kompozicije iz otkrića mogu da se primenjuju u dozama koje su dovoljne za inhibiciju ekspresije gena HAO1.
Doze
[0217] Uopšteno, odgovarajuća doza iRNK iz otkrića će biti u rasponu od oko 0,001 do oko 200,0 miligrama po kilogramu telesne težine primaoca dnevno, obično u rasponu od oko 0,1 do 10 ili 1 do 50 mg po kilogramu telesne težine dnevno. Na primer, dsRNK može da se primenjuje sa oko 0,01 mg/kg, oko 0,05 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg oko 10 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 40 mg/kg, ili oko 50 mg/kg po jednoj dozi.
[0218] U drugom slučaju, agens RNKi, npr. dsRNK, primenjuje se u dozi od oko 0,1 do oko 50 mg/kg, od 0,25 do oko 50 mg/kg, od 0,5 do oko 50 mg/kg, od 0,75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1,5 do oko 50 mg/kg, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2,5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3,5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4,5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7,5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do
2
oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0,1 do oko 45 mg/kg, oko 0,25 do oko 45 mg/kg, oko 0,5 do oko 45 mg/kg, oko 0,75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1,5 do oko 45 mg/kg, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2,5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3,5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4,5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7,5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0,1 do oko 40 mg/kg, oko 0,25 do oko 40 mg/kg, oko 0,5 do oko 40 mg/kg, oko 0,75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1,5 do oko 40 mg/kg, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2,5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3,5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4,5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7,5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0,1 do oko 30 mg/kg, oko 0,25 do oko 30 mg/kg, oko 0,5 do oko 30 mg/kg, oko 0,75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1,5 do oko 30 mg/kg, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2,5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3,5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4,5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7,5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0,1 do oko 20 mg/kg, oko 0,25 do oko 20 mg/kg, oko 0,5 do oko 20 mg/kg, oko 0,75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1,5 do oko 20 mg/kg, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2,5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3,5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4,5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7,5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0219] Na primer, agens RNKi, npr. dsRNK, može da se primenjuje u dozi od oko 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili oko 50 mg/kg. Vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
[0220] U određenim slučajevima otkrića, na primer, kada agens dvolančane RNKi uključuje modifikacije (npr. jedan ili više motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na mestu cepanja agensa ili blizu njega), šest fosforotioatnih veza i ligand, takav agens se primenjuje u dozi od oko 0,01 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, ili oko 0,05 mg/kg do oko 0,07 mg/kg. Takođe je predviđeno da vrednosti i rasponi oko prethodno navedenih vrednosti budu deo ovog otkrića, npr. agens RNKi može da se primeni na ispitaniku u dozi od oko 0,015 mg/kg do oko 0,45 mg/kg.
[0221] Na primer, agens RNKi, npr. agens RNKi u farmaceutskoj kompoziciji, može da se primenjuje u dozi od oko 0,01 mg/kg, 0,0125 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,0175 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,0225 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,0275 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,0325 mg/kg, 0,035 mg/kg, 0,0375 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,0425 mg/kg, 0,045 mg/kg, 0,0475 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0525 mg/kg, 0,055 mg/kg, 0,0575 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,0625 mg/kg, 0,065 mg/kg, 0,0675 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,0725 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,0775 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,0825 mg/kg, 0,085 mg/kg, 0,0875 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,0925 mg/kg, 0,095 mg/kg, 0,0975 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,125 mg/kg,
4
0,15 mg/kg, 0,175 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg ili oko 0,5 mg/kg. Vrednosti između prethodno navedenih vrednosti takođe treba da budu deo ovog otkrića.
Režimi lečenja
[0222] Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju jednom dnevno, ili iRNK može da se primenjuje kao dve, tri ili više subdoza u odgovarajućim intervalima tokom dana, ili čak koristeći kontinualnu infuziju ili isporuku putem formulacije sa kontrolisanim otpuštanjem. U tom slučaju, iRNK sadržana u svakoj subdozi mora biti shodno tome manja kako bi se dostigla ukupna dnevna doza. Dozna jedinica takođe može da bude načinjena za isporuku tokom nekoliko dana, npr. koristeći uobičajenu formulaciju sa produženim otpuštanjem koja obezbeđuje kontrolisano otpuštanje iRNK u periodu od nekoliko dana. Formulacije sa produženim otpuštanjem su dobro poznate u struci i naročito su korisne za isporuku agensa na konkretno mesto, tako da bi mogle da se koriste sa agensima iz predmetnog otkrića. U ovom slučaju, dozna jedinica sadrži odgovarajuće višestruke dnevne doze.
[0223] U drugim slučajevima, jedna doza farmaceutskih kompozicija može biti dugotrajna, tako da se sledeće doze primenjuju u intervalima ne većim od 3, 4 ili 5 dana, ili ne većim od 1, 2, 3 ili 4 nedelje. U nekim slučajevima otkrića, jedna doza farmaceutskih kompozicija iz otkrića se primenjuje jednom nedeljno. U drugim slučajevima otkrića, jedna doza farmaceutskih kompozicija iz otkrića se primenjuje na dva meseca.
[0224] Stručnjaku će biti jasno da određeni faktori mogu da utiču na dozu i termin potreban za delotvorno lečenje ispitanika, uključujući, bez ograničenja, težinu bolesti ili poremećaja, prethodna lečenja, opšte zdravstveno stanje i/ili starost ispitanika i druge postojeće bolesti. Štaviše, lečenje ispitanika terapeutski delotvornom količinom kompozicije može da obuhvata jedno lečenje ili niz lečenja. Procene za delotvorne doze i in vivo poluživot za pojedinačne iRNK obuhvaćene otkrićem mogu da se načine koristeći uobičajenu metodologiju.
[0225] Procene delotvornih doza i in vivo poluživota za pojedinačne iRNK obuhvaćene otkrićem takođe mogu da se načine na osnovu in vivo testiranja koristeći odgovarajući životinjski model. Na primer, napredak na polju mišje genetike je doveo do brojnih mišjih modela za ispitivanje različitih ljudskih bolesti, kao što je poremećaj povezan sa ekspresijom HAO1. Takvi modeli mogu da se koriste za in vivo testiranje iRNK, kao i za određivanje terapeutski delotvorne doze. Odgovarajući mišji modeli su poznati u struci i uključuju, na primer, životinjske modele koji su ovde opisani.
Postupci primene
[0226] Farmaceutske kompozicije iz predmetnog otkrića mogu da se primenjuju na brojne načine u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje, i od oblasti koja se leči. Primena može biti topikalna (npr. putem transdermalnog flastera), pulmonarna, npr. inhalacijom ili uduvavanjem prahova ili aerosola, uključujući primenu putem nebulizatora; intratrahealnu, intranazalnu, epidermalnu ili transdermalnu, oralnu ili parenteralnu. Parenteralna primena uključuje intravensku, intraarterijsku, supkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; potkožnu, npr. putem implantiranog sredstva; ili intrakranijalnu, npr. putem intraparenhimske, intratekalne ili intraventrikularne primene
[0227] Agens RNKi može da se isporuči na način koji cilja određeno tkivo, kao što je jetra.
Formulacije
[0228] Farmaceutske kompozicije iz predmetnog otkrića uključuju, ali nisu ograničene na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozome. Ove kompozicije mogu da se stvore iz različitih komponenata koje uključuju, ali nisu ograničene na, prethodno formirane tečnosti, samoemulgujuće čvrste supstance i samoemulgujuće polučvrste supstance.
[0229] Farmaceutske formulacije iz predmetnog otkrića, koje pogodno mogu da se predstave u jediničnim doznim oblicima, mogu da se pripreme u skladu sa uobičajenim tehnikama koje su dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike uključuju korak povezivanja aktivnih sastojaka sa farmaceutskim nosačima ili ekscipijensima. Uopšteno, formulacije se pripremaju uniformnim i bliskim povezivanjem aktivnih sastojaka sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba, a zatim, po potrebi, oblikovanjem proizvoda.
[0230] Kompozicije iz predmetnog otkrića mogu da se formulišu u bilo koji od mnogih mogućih doznih oblika kao što su, bez ograničenja, tablete, kapsule, gel kapsule, tečni sirupi, meki gelovi, supozitorije i klistiri. Kompozicije iz predmetnog otkrića takođe mogu da se formulišu kao suspenzije u vodenim, nevodenim ili mešovitim medijumima. Vodene suspenzije dalje mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore.
[0231] Kompozicije iz predmetnog otkrića mogu da se formulišu za oralnu primenu; parenteralnu, intraparenhimsku (u mozak), intratekalnu, intravensku ili intrahepatičnu primenu i/ili topikalnu primenu.
[0232] Kompozicije i formulacije za oralnu primenu uključuju praškove ili granule, mikročestice, nanočestice, suspenzije ili rastvore u vodi ili nevodenim medijumima, kapsule, gel kapsule, vrećice, tablete ili minitablete. Sredstva za zgušnjavanje, arome, razblaživači, emulgatori, sredstva za raspršivanje ili veziva takođe mogu biti poželjni. U nekim slučajevima, oralne formulacije su one u kojima se dsRNK iz otkrića primenjuju zajedno sa jednim ili više surfaktanata i helatora za pojačavanje penetracije. Odgovarajući surfaktanti uključuju masne kiseline i/ili njihove estre ili soli, žučne kiseline i/ili njihove soli. Odgovarajuće žučne kiseline/soli uključuju henodezoksiholnu kiselinu (CDCA) i ursodezoksihenodezoksiholnu kiselinu (UDCA), holnu kiselinu, dehidroholnu kiselinu, dezoksiholnu kiselinu, glukolnu kiselinu, glikolnu kiselinu, glikodezoksiholnu kiselinu, tauroholnu kiselinu, taurodezoksiholnu kiselinu, natrijum tauro-24,25-dihidrofusidat i natrijum glikodihidrofusidat. Odgovarajuće masne kiseline uključuju arahidonsku kiselinu, undekansku kiselinu, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin, ili monoglicerid, diglicerid ili njihove farmaceutski prihvatljive soli (npr. natrijumove). U nekim slučajevima, koristi se kombinacija pojačivača penetracije, na primer, masne kiseline/soli u kombinaciji sa žučnim kiselinama/solima. Jedan primer kombinacije je natrijumova so laurinske kiseline, kaprinska kiselina i UDCA. Dalji pojačivači penetracije uključuju polioksietilen-9-lauril etar, polioksietilen-20-cetil etar. dsRNK iz otkrića mogu da se isporučuju oralno, u granulisanom obliku, uključujući raspršene suve čestice, ili u kompleksu koji gradi mikro ili nanočestice. Agensi za stvaranje kompleksa dsRNK uključuju poliaminokiseline; poliimine; poliakrilate; polialkilakrilate, polioksetane, polialkilcijanoakrilate; katjonizovane želatine, albumine, skrobove, akrilate, polietilenglikole (PEG) i skrobove; polialkilcijanoakrilate; DEAE-derivatizovane poliimine, pululane, celuloze i skrobove. Odgovarajući agensi za stvaranje kompleksa uključuju hitozan, N-trimetilhitozan, poli-L-lizin, polihistidin, poliornitin, polispermine, protamin, polivinilpiridin, politiodietilaminometiletilen P(TDAE), poliaminostiren (npr. p-amino), poli(metilcijanoakrilat), poli(etilcijanoakrilat), poli(butilcijanoakrilat), poli(izobutilcijanoakrilat), poli(izoheksilcijanoakrilat), DEAE-metakrilat, DEAE-heksilakrilat, DEAE-akrilamid, DEAE-albumin i DEAE-dekstran, polimetilakrilat, poliheksilakrilat, poli(D,L-mlečnu kiselinu), poli(DL-mlečnu-koglikolnu kiselinu (PLGA), alginat i polietilenglikol (PEG). Oralne formulacije za dsRNK i njihova priprema su detaljno opisane u U.S. patentu 6,887,906, US publ. br.20030027780, i U.S. patentu br.6,747,014.
[0233] Kompozicije i formulacije za parenteralnu, intraparenhimsku (u mozak), intratekalnu, intraventrikularnu ili intrahepatičku primenu mogu da uključuju sterilne vodene rastvore koji takođe mogu da sadrže pufere, razblaživače i druge pogodne aditive kao što su, bez ograničenja, pojačivači penetracije, jedinjenja nosači i drugi farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi.
[0234] Farmaceutske kompozicije i formulacije za topikalnu primenu mogu da uključuju transdermalne flastere, meleme, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorije, sprejeve, tečnosti i praškove. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodene, praškaste ili uljane baze, ugušćivači i slično mogu biti potrebni ili poželjni. Obloženi kondomi, rukavice i slično takođe mogu biti korisni. Odgovarajuće topikalne formulacije uključuju one u kojima su iRNK iz otkrića u mešavini sa agensom za topikalnu primenu poput lipida, lipozoma, masnih kiselina, estara masnih kiselina, steroida, helirajućih agenasa i surfaktanata. Odgovarajući lipidi i lipozomi uključuju neutralne (npr. dioleoilfosfatidil DOPE etanolamin, dimiristoilfosfatidil holin DMPC, distearoilfosfatidil holin), negativne (npr. dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) i katjonske (npr. dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP i dioleoilfosfatidil etanolamin DOTMA). iRNK iz otkrića mogu da budu enkapsulirane u lipozomima ili mogu da grade komplekse sa njima, naročito sa katjonskim lipozomima. Alternativno, iRNK mogu da grade kompleks sa lipidima, naročito sa katjonskim lipidima. Odgovarajuće masne kiseline i estri uključuju, ali nisu ograničeni na, arahidonsku kiselinu, oleinsku kiselinu, ikosansku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin ili C1-20alkil estar (npr. izopropil miristat IPM), monoglicerid, diglicerid ili njihove farmaceutski prihvatljive soli). Topikalne formulacije su detaljno opisane u U.S. patentu br.6,747,014.
Formulacije iRNK koje sadrže membranske molekulske sklopove
[0235] iRNK za upotrebu u kompozicijama i postupcima iz otkrića može da se formuliše za isporuku u membranskom molekulskom sklopu, npr. lipozomu ili miceli. Kako se ovde koristi, termin „lipozom“ označava vezikulu sastavljenu od amfifilnih lipida raspoređenih u najmanje jedan dvojni sloj, npr. jedan dvojni sloj ili više dvojnih slojeva. Lipozomi uključuju unilamelarne i multilamelarne vezikule koje imaju membranu sačinjenu od lipofilne supstance i vodenu unutrašnjost. Vodeni deo sadrži kompoziciju iRNK. Lipofilna supstanca izoluje vodenu unutrašnjost od vodene spoljašnjosti, koja obično ne obuhvata kompoziciju iRNK, mada u nekim slučajevima može. Lipozomi su korisni za transfer i isporuku aktivnih sastojaka na mesto delovanja. Pošto je struktura lipozomske membrane strukturno slična biološkim membranama, kada se lipozomi primene na tkivo, lipozomski dvojni sloj se fuzioniše sa dvojnim slojem ćelijskih membrana. Sa napredovanjem spajanja lipozoma i ćelije, unutrašnji vodeni sadržaj koji obuhvata iRNK se isporučuje u ćeliju gde iRNK može specifično da se veže za ciljnu RNK i da indukuje RNKi. U nekim slučajevima, lipozomi su takođe posebno ciljani, npr. da usmeravaju iRNK na određene vrste ćelija.
[0236] Lipozom koji sadrži agens RNKi može se pripremiti različitim postupcima. U jednom primeru, lipidna komponenta lipozoma se rastvara u deterdžentu kako bi se micele formirale sa lipidnom komponentom. Na primer, lipidna komponenta može biti amfipatični katjonski lipid ili lipidni konjugat. Deterdžent može imati visoku koncentraciju kritičnih micela i može biti nejonski. Primeri deterdženata uključuju holat, CHAPS, oktilglukozid, dezoksiholat i lauroil sarkozin. Preparat agensa RNKi se zatim dodaje micelama koje sadrže lipidnu komponentu. Katjonske grupe na lipidu interaguju sa agensom RNKi i kondenzuju se oko agensa RNKi kako bi nastao lipozom. Nakon zgušnjavanja, deterdžent se uklanja, npr. dijalizom, radi dobijanja lipozomskog preparata agensa RNKi.
[0237] Po potrebi, jedinjenje nosač koje pomaže u kondenzaciji može da se doda tokom reakcije kondenzacije, npr. kontrolisanim dodavanjem. Na primer, jedinjenje nosač može biti polimer koji nije nukleinska kiselina (npr. spermin ili spermidin). pH takođe može da se podesi da pogoduje kondenzaciji.
[0238] Postupci za proizvodnju stabilnih polinukleotidnih vehikuluma za isporuku, koji obuhvataju lipidni kompleks polinukleotid/katjon kao strukturne komponente vehikuluma za isporuku, dalje su opisani, npr. u WO 96/37194. Nastanak lipozoma takođe može da uključuje jedan ili više aspekata primera postupaka opisanih u Felgner, P. L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; U.S. Pat. br.4,897,355; U.S. Pat. br.5,171,678; Bangham, i sar. M. Mol. Biol.23:238, 1965; Olson, i sar. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, i sar. Proc. Natl. Acad. Sci.75: 4194, 1978; Mayhew, i sar. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, i sar. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; i Fukunaga, i sar. Endocrinol. 115:757, 1984. Uobičajeno korišćene tehnike za pripremu lipidnih agregata odgovarajuće veličine za korišćenje kao vehikuluma za isporuku uključuju sonikaciju i zamrzavanje-otapanje plus istiskivanje (vidite, npr. Mayer, i sar. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Mikrofluidizacija može da se koristi kada su poželjni konzistentno mali (50 do 200 nm) i relativno uniformni agregati (Mayhew, i sar. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Ovi postupci se lako prilagođavaju za pakovanje preparata agenasa RNKi u lipozome.
[0239] Lipozomi se dele u dve široke klase. Katjonski lipozomi su pozitivno naelektrisani lipozomi koji interaguju sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinske kiseline gradeći stabilan kompleks. Kompleks pozitivno naelektrisana nukleinska kiselina/lipozom vezuje se za negativno naelektrisanu ćelijsku površinu i internalizuje se u endozomu. Usled kiselog pH u endozomu, lipozomi pucaju, oslobađajući svoj sadržaj u citoplazmu ćelije (Wang i sar. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[0240] Lipozomi koji su osetljivi na pH ili negativno naelektrisani zarobljavaju nukleinske kiseline pre nego da grade komplekse sa njima. Pošto su i nukleinska kiselina i lipid slično naelektrisani, dolazi do odbijanja, a ne do nastanka kompleksa. Bez obzira na to, izvesna količina nukleinske kiseline je zarobljena u vodenoj unutrašnjosti ovih lipozoma. Lipozomi osetljivi na pH se koriste da isporuče nukleinske kiseline koje kodiraju gen timidin kinaze u ćelijske monoslojeve u kulturi. Ekspresija egzogenog gena je detektovana u ciljnim ćelijama (Zhou i sar. Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[0241] Jedna značajna vrsta lipozomskih kompozicija obuhvata fosfolipide koji nisu prirodno dobijeni fosfatidilholin. Neutralne lipozomske kompozicije, na primer, mogu se formirati od dimiristoil fosfatidilholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonske lipozomske kompozicije se uopšteno grade od dimiristoil fosfatidilglicerola, dok se anjonski fuzogeni lipozomi grade prevashodno od dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Druga vrsta lipozomskih kompozicija nastaje od fosfatidilholina (PC) poput, na primer, sojinog PC i PC iz jaja. Druga vrsta nastaje iz smeša fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili holesterola.
[0242] Primeri drugih postupaka za uvođenje lipozoma u ćelije in vitro i in vivo uključuju U.S. Pat. br. 5,283,185; U.S. Pat. br. 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther.3:649, 1992; Gershon, Biochem.32:7143, 1993; i Strauss EMBO J.11:417, 1992.
[0243] Nejonski lipozomski sistemi su takođe ispitani kako bi se utvrdila njihova korisnost u isporuci lekova na kožu, naročito sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže Novasome<™>I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) i Novasome<™>II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) korišćene su za isporuku ciklosporina-A u dermis kože miša. Rezultati su pokazali da su takvi nejonski lipozomski sistemi delotvorni u olakšavanju taloženja ciklosporina A u različitim slojevima kože (Hu et al. S. T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
[0244] Lipozomi takođe uključuju „sterno stabilizovane“ lipozome, termin koji, kako se ovde koristi, označava lipozome koji sadrže jedan ili više specijalizovanih lipida koji, kada se inkorporiraju u lipozome, dovode do poboljšanog životnog veka u krvotoku u poređenju sa lipozomima koji nemaju takve specijalizovane lipide. Primeri sterno stabilizovanih lipozoma su oni u kojima deo lipidnog dela lipozoma koji gradi vezikulu (A) sadrži jedan ili više glikolipida, kao što je monosijalogangliozid GM1, ili (B) derivatizuje se sa jednim ili više hidrofilnih polimera, kao što je ostatak polietilen glikola (PEG). Ne želeći da se ograničimo bilo kojom određenom teorijom, u struci se smatra da, barem za sterno stabilizovane lipozome koji sadrže gangliozide, sfingomijelin ili PEG-derivatizovane lipide, poboljšani poluživot u krvotoku tih sterno stabilizovanih lipozoma proizilazi iz smanjenog unosa u ćelije retikuloendotelnog sistema (RES) (Allen i sar. FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu i sar., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[0245] Različiti lipozomi koji sadrže jedan ili više glikolipida su poznati u struci. Papahadjopoulos i sar. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) izvestili su o sposobnosti monosijalogangliozida GM1, galaktocerebrozid sulfata i fosfatidilinozitola da poboljšaju poluživot lipozoma u krvi. Na ova otkrića su se nadovezali Gabizon i sar. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). U.S. pat. br.4,837,028 i WO 88/04924, oba Allen i sar. otkrivaju
1
lipozome koji sadrže (1) sfingomijelin i (2) gangliozid GM1ili galaktocerebrozid sulfat estar. U.S. pat. br.5,543,152 (Webb i sar.) otkriva lipozome koji sadrže sfingomijelin. Lipozomi koji sadrže 1,2-sn-dimiristoil fosfatidilholin opisani su u WO 97/13499 (Lim i sar.).
[0246] U jednom slučaju, koriste se katjonski lipozomi. Katjonski lipozomi imaju prednost što su sposobni da se fuzionišu sa ćelijskom membranom. Nekatjonske lipozome, iako nisu sposobni da se podjednako efikasno fuzionišu sa membranom plazme, preuzimaju makrofagi in vivo, i mogu se koristiti za isporuku agensa RNKi u makrofage.
[0247] Dalje prednosti lipozoma uključuju sledeće: lipozomi dobijeni od prirodnih fosfolipida su biokompatibilni i biorazgradivi; lipozomi mogu da inkorporiraju širok raspon lekova koji se rastvaraju u vodi i lipidima; lipozomi mogu da štite enkapsulirane agense RNKi u njihovim internim odeljcima od metabolizma i razgradnje (Rosoff, u „Pharmaceutical Dosage Forms“, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, sveska 1, str.245). Prilikom pripreme lipozomskih formulacija, važno je uzeti u obzir naelektrisanje površine lipida, veličinu vezikule i vodenu zapreminu lipozoma.
[0248] Pozitivno naelektrisani sintetički katjonski lipid, N-[1-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA) može da se koristi da gradi male lipozome koji spontano interaguju sa nukleinskom kiselinom radi nastanka kompleksa lipid-nukleinska kiselina koji su sposobni da se fuzionišu sa negativno naelektrisanim lipidima ćelijskih membrana ćelija kulture tkiva, što dovodi do isporuke agensa RNKi (vidite, npr. Felgner, P. L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 i U.S. pat. br. 4,897,355 za opis DOTMA i njegovog korišćenja sa DNK).
[0249] Analog DOTMA, 1,2-bis(oleoiloksi)-3-(trimetilamonijum)propan (DOTAP) može da se koristi u kombinaciji sa fosfolipidom da gradi DNK-kompleksirajuće vezikule. Lipofectin<™>Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) je delotvoran agens za isporuku veoma anjonskih nukleinskih kiselina u žive ćelije kulture tkiva koje sadrže pozitivno naelektrisane DOTMA lipozome koji spontano interaguju sa negativno naelektrisanim polinukleotidima radi nastanka kompleksa. Kada se koristi dovoljno pozitivno naelektrisanih lipozoma, ukupno naelektrisanje dobijenih kompleksa je takođe pozitivno. Pozitivno naelektrisani kompleksi pripremljeni na ovaj način spontano se kače za negativno naelektrisane ćelijske površine, fuzionišu sa membranom plazme i efikasno isporučuju funkcionalne nukleinske kiseline, na
2
primer, u ćelije kulture tkiva. Drugi komercijalno dostupni katjonski lipid, 1,2-bis(oleoiloksi)-3,3-(trimetilamonijum)propan („DOTAP“) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) razlikuje se od DOTMA po tome što su ostaci oleila vezani estarskim, a ne etarskim vezama.
[0250] Druga objavljena jedinjenja katjonskog lipida uključuju ona koja su konjugovana sa različitim ostacima uključujući, na primer, karboksispermin koji je konjugovan sa jednom od dve vrste lipida i uključuje jedinjenja poput 5-karboksispermilglicin dioktaoleoil amida („DOGS“) (Transfectam<™>, Promega, Madison, Wisconsin) i dipalmitoil fosfatidil etanolamin 5-karboksispermil amida („DPPES“) (vidite, npr. U.S. pat. br.5,171,678).
[0251] Drugi konjugat katjonskog lipida uključuje derivatizaciju lipida sa holesterolom („DC-Chol“) koji je formulisan u lipozome u kombinaciji sa DOPE (vidite, Gao, X. i Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Objavljeno je da je lipopolilizin, nastao konjugacijom polilizina sa DOPE, delotvoran za transfekciju u prisustvu seruma (Zhou, X. i sar. Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Za određene ćelijske linije, za ove lipozome koji sadrže konjugovane katjonske lipide je uočeno da ispoljavaju manju toksičnost i pružaju efikasniju transfekciju nego kompozicije koje sadrže DOTMA. Drugi komercijalno dostupni proizvodi katjonskih lipida uključuju DMRIE i DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) i Lipofektamin (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Drugi katjonski lipidi pogodni za isporuku oligonukleotida su opisani u WO 98/39359 i WO 96/37194.
[0252] Lipozomske formulacije su naročito pogodne za topikalnu primenu, lipozomi imaju nekoliko prednosti u odnosu na druge formulacije. Takve prednosti uključuju smanjena neželjena dejstva vezana za veliku sistemsku apsorpciju primenjenog leka, povećanu akumulaciju primenjenog leka na željenom cilju i mogućnost da se agens RNKi primeni u koži. U nekim implementacijama, lipozomi se koriste za isporuku agensa RNKi do epidermalnih ćelija, i takođe da poboljšaju penetraciju agensa RNKi u dermalno tkivo, npr. u kožu. Na primer, lipozomi se mogu primeniti topikalno. Topikalna isporuka na kožu lekova formulisanih kao lipozomi je dokumentovana (vidite, npr. Weiner i sar. Journal of Drug Targeting, 1992, vol.
2,405-410 i du Plessis i sar. Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. i Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. i sar. Gene 56:267-276.1987; Nicolau, C.i sar. Meth. Enz.149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. i Papahadjopoulos, D. Meth. Enz.
101:512-527, 1983; Wang, C. Y. i Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
[0253] Nejonski lipozomski sistemi su takođe ispitani kako bi se utvrdila njihova korisnost u isporuci lekova na kožu, naročito sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže novazom I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) i novazom II (gliceril distearat/ holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) korišćene su za isporuku leka u dermis kože miša. Takve formulacije sa agensom RNKi su korisne za lečenje dermatološkog poremećaja.
[0254] Lipozomi koji sadrže iRNK mogu da se načine da budu veoma deformabilni. Takva deformabilnost može da omogući lipozomima da se probiju kroz pore koje su manje od prosečnog poluprečnika lipozoma. Na primer, transferozomi su vrsta deformabilnih lipozoma. Transferozomi se mogu napraviti dodavanjem površinskih aktivatora ivice, obično surfaktanata, u standardnu lipozomsku kompoziciju. Transferozomi koji obuhvataju agens RNKi mogu da se isporuče, na primer, supkutano putem infekcije kako bi se agens RNKi isporučio keratinocitima u koži. Kako bi netaknute prošle kožu sisara, lipidne vezikule moraju proći kroz niz finih pora, od kojih svaka ima prečnik manji od 50 nm, pod uticajem pogodnog transdermalnog gradijenta. Pored toga, usled lipidnih svojstava, ovi transferozomi mogu biti samooptimizujući (prilagodljivi na oblik pora, npr. u koži), samopopravljajući, i često mogu dostići svoje mete bez fragmentisanja, i često su samoelektrišući.
[0255] Druge formulacije obuhvaćene predmetnim otkrićem opisane su u US privremenoj prijavi serijski br.61/018,616, podnetoj 2. januara 2008; 61/018,611, podnetoj 2. januara 2008; 61/039,748, podnetoj 26. marta 2008; 61/047,087, podnetoj 22. aprila 2008 i 61/051,528, podnetoj 8. maja 2008. PCT prijava br. PCT/US2007/080331, podneta 3. oktobra 2007. takođe opisuje formulacije koje su obuhvaćene predmetnim otkrićem.
[0256] Transferozomi su još jedna vrsta lipozoma, i veoma su deformabilni lipidni agregati koji su atraktivni kandidati za vehikulume za isporuku leka. Transferozomi mogu da se opišu kao lipidne kapljice koje su toliko deformabilne da lako mogu da se probiju kroz pore koje su manje od kapljica. Transferozomi se prilagođavaju na okruženje u kome se koriste, npr. oni su samooptimizujući (prilagodljivi na oblik pora u koži), samopopravljajući, često stižu do svojih meta bez fragmentisanja, i često su samoelektrišući. Da bi se napravili transferozomi, moguće je dodati površinske aktivatore ivice, obično surfaktante, standardnim lipozomskim kompozicijama. Transferozomi su korišćeni za isporuku serumskog albumina do kože.
4
Pokazalo se da je transferozomski posredovana isporuka serumskog albumina delotvorna koliko i supkutana injekcija rastvora koji sadrži serumski albumin.
[0257] Surfaktanti imaju široku primenu u formulacijama kao što su emulzije (uključujući mikroemulzije) i lipozomi. Najčešći način klasifikovanja i rangiranja svojstava mnogih brojnih različitih vrsta surfaktanata, i prirodnih i sintetičkih, je korišćenjem hidrofilnog/lipofilnog balansa (HLB). Priroda hidrofilne grupe (poznate i kao „glava“) daje najkorisniji način za kategorizaciju različitih surfaktanata koji se koriste u formulacijama (Rieger, u „Pharmaceutical Dosage Forms“, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, str.285).
[0258] Ako molekul surfaktanta nije jonizovan, klasifikuje se kao nejonski surfaktant. Nejonski surfaktanti imaju široku primenu u farmaceutskim i kozmetičkim proizvodima, i mogu da se koriste u širokom rasponu pH vrednosti. Uopšteno, njihove HLB vrednosti su u rasponu od 2 do oko 18 u zavisnosti od njihove strukture. Nejonski surfaktanti uključuju nejonske estre, kao što su estri etilen glikola, estri propilen glikola, gliceril estri, poligliceril estri, sorbitanski estri, saharozni estri i etoksilovani estri. Nejonski alkanolamidi i etri, kao što su etoksilati masnih alkohola, propoksilovani alkoholi i etoksilovani/propoksilovani blok polimeri takođe su uključeni u ovu klasu. Polioksietilenski surfaktanti su najpopularniji članovi klase nejonskih surfaktanata.
[0259] Ako molekul surfaktanta ima negativno naelektrisanje kada se rastvori ili disperguje u vodi, surfaktant se klasifikuje kao anjonski. Anjonski surfaktanti uključuju karboksilate, kao što su sapuni, acil laktilati, acil amidi aminokiselina, estri sumporne kiseline, kao što su alkil sulfati i etoksilovani alkil sulfati, sulfonati kao što su alkil benzen sulfonati, acil izetionati, acil taurati i sulfosukcinati, i fosfati. Najvažniji članovi klase anjonskih surfaktanata su alkil sulfati i sapuni.
[0260] Ako molekul surfaktanta nosi pozitivno naelektrisanje kada se rastvori ili disperguje u vodi, surfaktant se klasifikuje kao katjonski. Katjonski surfaktanti uključuju kvaternerne amonijumove soli i etoksilovane amine. Kvaternerne amonijumove soli su najčešće korišćeni članovi ove klase.
[0261] Ako je molekul surfaktanta sposoban da nosi bilo pozitivno ili negativno naelektrisanje, surfaktant se klasifikuje kao amfoterni. Amfoterni surfaktanti uključuju derivate akrilne kiseline, supstituisane alkilamide, N-alkilbetaine i fosfatide.
[0262] Dat je pregled korišćenja surfaktanata u lekovitim proizvodima, formulacijama i u emulzijama (Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, str.285).
[0263] iRNK za upotrebu u postupcima iz otkrića takođe može da se obezbedi kao micelarna formulacija. „Micele“ su ovde definisane kao posebna vrsta molekulskog sklopa u kojem su amfipatični molekuli organizovani u sfernoj strukturi tako da su svi hidrofobni delovi molekula okrenuti ka unutra, što ostavlja hidrofilne delove u kontaktu sa okružujućom vodenom fazom. Suprotno uređenje postoji kada je okruženje hidrofobno.
[0264] Mešovita micelarna formulacija pogodna za isporuku kroz transdermalne membrane može se pripremiti mešanjem vodenog rastvora kompozicije siRNK, alkil sulfata C8do C22alkalnog metala i jedinjenja koja grade micele. Primeri za jedinjenja koja grade micele uključuju lecitin, hijaluronsku kiselinu, farmaceutski prihvatljive soli hijaluronske kiseline, glikolnu kiselinu, mlečnu kiselinu, ekstrakt kamilice, ekstrakt krastavca, oleinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, monoolein, monooleate, monolaurate, ulje borača, ulje žutog noćurka, mentol, trihidroksi okso holanil glicin i njegove farmaceutski prihvatljive soli, glicerin, poliglicerin, lizin, polilizin, triolein, polioksietilen etre i njihove analoge, polidokanol alkil etre i njihove analoge, henodezoksiholat, dezoksiholat i njihove smeše. Jedinjenja koja grade micele mogu se dodati u isto vreme ili nakon dodavanja alkil sulfata alkalnog metala. Mešovite micele će nastati uz suštinski bilo koje mešanje sastojaka, ali žustro mešanje daje manje micele.
[0265] U jednom postupku, priprema se prva micelarna kompozicija koja sadrži kompoziciju siRNK i barem alkil sulfat alkalnog metala. Prva micelarna kompozicija se zatim meša sa najmanje tri jedinjenja koja grade micele kako bi nastala mešovita micelarna kompozicija. U drugom postupku, micelarna kompozicija se priprema mešanjem kompozicije siRNK, alkil sulfata alkalnog metala i najmanje jednog jedinjenja koje gradi micele, nakon čega sledi dodavanje ostalih jedinjenja koja grade micele, uz žustro mešanje.
[0266] Fenol i/ili m-krezol se mogu dodati u mešovitu micelarnu kompoziciju kako bi se formulacija stabilizovala i zaštitila od bakterijskog rasta. Alternativno, fenol i/ili m-krezol se mogu dodati uz sastojke koji grade micele. Izotonični agens, kao što je glicerin, takođe se može dodati nakon nastanka mešovite micelarne kompozicije.
[0267] Radi isporuke micelarne formulacije u vidu spreja, formulacija se može staviti u aerosolni dozator i dozator se puni propelantom. Propelant, koji se nalazi pod pritiskom, u dozatoru se nalazi u tečnom obliku. Odnos sastojaka je podešen tako da vodena i pogonska faza postanu jedno, tj. postoji jedna faza. Ako postoji dve faze, neophodno je promućkati dozator pre ispuštanja dela sadržaja, npr. putem doznog ventila. Ispuštena doza farmaceutskog agensa se izbacuje kroz dozni ventil u vidu finog spreja.
[0268] Propelanti mogu da uključuju hlorfluorugljenike koji sadrže vodonik, fluorugljenike koji sadrže vodonik, dimetil etar i dietil etar. U određenim slučajevima, može se koristiti HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoretan).
[0269] Specifične koncentracije ključnih sastojaka mogu se odrediti relativno jednostavnim eksperimentisanjem. Kod apsorpcije kroz oralnu šupljinu, često je poželjno da se doza poveća, npr. najmanje dvostruko ili trostruko, za injekciju ili primenu kroz gastrointestinalni trakt.
Lipidne čestice
[0270] iRNK, npr. dsRNK, iz otkrića mogu biti potpuno enkapsulirane u lipidnoj formulaciju, npr. LNP, ili drugoj lipidnoj čestici nukleinske kiseline.
[0271] Kako se ovde koristi, termin „LNP“ označava stabilnu lipidnu česticu nukleinske kiseline. LNP sadrže katjonski lipid, nekatjonski lipid i lipid koji sprečava agregaciju čestice (npr. konjugata PEG-lipid). LNP su izuzetno korisni za sistemske primene, pošto pokazuju produženi životni vek u krvotoku nakon intravenske (i.v.) injekcije i akumuliraju se na distalnim mestima (npr. mestima koja su fizički razdvojena od mesta primene). LNP uključuju „pSPLP“ koji uključuju enkapsulirani kompleks kondenzujući agens-nukleinska kiselina kao što je prikazano u PCT publikaciji br. WO 00/03683. Čestice iz predmetnog otkrića obično imaju srednji prečnik od oko 50 nm do oko 150 nm, uobičajenije oko 60 nm do oko 130 nm, uobičajenije oko 70 nm do oko 110 nm, najuobičajenije oko 70 nm do oko 90 nm, i suštinski nisu toksične. Pored toga, nukleinske kiseline, kada su prisutne u česticama nukleinska kiselina-lipid iz predmetnog otkrića, u vodenom rastvoru su otporne na razgradnju nukleazom. Lipidne čestice nukleinske kiseline i postupci za njihovu primenu opisani su npr. u U.S. patentima br. 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; U.S. publikaciji br.
2010/0324120 i PCT publikaciji br. WO 96/40964.
[0272] U jednom slučaju, odnos lipida i leka (odnos masa/masa) (npr. odnos lipida prema dsRNK) biće u opsegu od oko 1:1 do oko 50:1, od oko 1:1 do oko 25:1, od oko 3:1 do oko 15:1, od oko 4:1 do oko 10:1, od oko 5:1 do oko 9:1 ili od oko 6:1 do oko 9:1. Opsezi između prethodno navedenih opsega će takođe biti razmatrani kao deo otkrića.
[0273] Katjonski lipid može biti, na primer, N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid (DODAC), N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid (DDAB), N-(I -(2,3-dioleoiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTAP), N-(I -(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloksi)propilamin (DODMA), 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLenDMA), 1,2-dilinoleilkarbamoiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleioksi-3-(dimetilamino)acetoksipropan (DLin-DAC), 1,2-dilinoleioksi-3-morfolinopropan (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropan (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropan (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-2-DMAP), so 1,2-dilinoleiloksi-3-trimetilaminopropan hlorid (DLin-TMA.Cl), so 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropan hlorid (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloksi-3-(N-metilpiperazino)propan (DLin-MPZ), ili 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propandiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propandio (DOAP), 1,2-dilinoleilokso-3-(2-N,N-dimetilamino)etoksipropan (DLin-EG-DMA), 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan (DLin-K-DMA) ili njihovi analozi, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciklopenta[d][1,3]dioksol-5-amin (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoat (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroksidodecil)amino)etil)(2-hidroksidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazandiil)didodekan-2-ol (Tech G1), ili njihova smeša. Katjonski lipid može da čini od oko 20 mol % do oko 50 mol % ili oko 40 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0274] U drugom slučaju, jedinjenje 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan može da se koristi da se pripreme lipidne nanočestice siRNK. Sinteza 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil
[1,3]-dioksolana opisana je u Međunarodnoj prijavi br. PCT/US2009/061897, koja je objavljena kao WO/2010/048536.
[0275] U jednom slučaju, lipidna čestica siRNK sadrži 40% 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana: 10% DSPC: 40% holesterola: 10% PEG-C-DOMG (molski procenat) sa veličinom čestice od 63,0 ± 20 nm i odnosom siRNK/lipid od 0,027.
[0276] Jonizujući/nekatjonski lipid može biti anjonski lipid ili neutralni lipid uključujući, bez ograničenja, distearoilfosfatidilholin (DSPC), dioleoilfosfatidilholin (DOPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamin (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilholin (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamin (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksilat (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamin (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamin (DMPE), distearoilfosfatidil-etanolamin (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-stearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamin (SOPE), holesterol, ili njihovu smešu. Nekatjonski lipid može biti od oko 5 mol % do oko 90 mol %, oko 10 mol % ili oko 58 mol %, ako je uključen holesterol, ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0277] Konjugovani lipid koji inhibira agregaciju čestica može biti, na primer, polietilenglikol (PEG)-lipid uključujući, bez ograničenja, PEG-diacilglicerol (DAG), PEG-dialkiloksipropil (DAA), PEG-fosfolipid, PEG-ceramid (Cer) ili njihovu smešu. Konjugat PEG-DAA može biti, na primer, PEG-dilauriloksipropil (Ci2), PEG-dimiristiloksipropil (Ci4), PEG-dipalmitiloksipropil (Ci6) ili PEG-disteariloksipropil (C]8). Konjugovani lipid koji sprečava agregaciju čestica može biti od oko 0 mol % do oko 20 mol % ili oko 2 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0278] U nekim slučajevima, lipidna čestica nukleinske kiseline dalje uključuje holesterol, npr. pri oko 10 mol % do oko 60 mol % ili oko 48 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0279] U jednom slučaju, lipidoid ND98·4HCl (MW 1487) (vidite U.S. patentnu prijavu br.
12/056,230, podnetu 26.3.2008.), holesterol (Sigma-Aldrich) i PEG-ceramid C16 (Avanti Polar Lipids) mogu da se koriste za pripremu lipidnih nanočestica dsRNK (tj. LNP01 čestica). Osnovni rastvori svakog od njih u etanolu mogu da se pripreme na sledeći način: ND98, 133 mg/ml; holesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramid C16, 100 mg/ml. Osnovni rastvori ND98, holesterola i PEG-ceramida C16 zatim mogu da se kombinuju npr. u molskom odnosu 42:48:10. Kombinovani lipidni rastvor može da se meša sa vodenim rastvorom dsRNK (npr. u natrijum acetatu pH 5) tako da je konačna koncentracija etanola oko 35-45%, a konačna koncentracija natrijum acetata je oko 100-300 mM. Lipidne nanočestice dsRNK obično spontano nastaju nakon mešanja. U zavisnosti od željene distribucije veličine čestica, dobijena smeša nanočestica može da se istisne kroz polikarbonatnu membranu (npr. presek 100 nm) koristeći, na primer, ekstruder sa termalnim rezervoarom, kao što je Lipex ekstruder (Northern Lipids, Inc). U nekim slučajevima, korak istiskivanja može da se preskoči. Uklanjanje etanola i simultana razmena pufera mogu da se postignu, na primer, dijalizom ili filtracijom tangencijalnog protoka. Pufer može da se zameni, na primer, fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) oko pH 7, npr. oko pH 6,9, oko pH 7,0, oko pH 7,1, oko pH 7,2, oko pH 7,3 ili oko pH 7,4. Formulacije LNP01 su opisane, npr. u Publikaciji međunarodne prijave br. WO 2008/042973.
[0280] Dodatni primeri formulacija lipid-dsRNK su opisani u Tabeli A.
Tabela A. Primeri za formulaciju lipidne dsRNK
1
[0281] Skraćenice u tabeli A uključuju sledeće: DSPC:
distearoilfosfatidilholin; DPPC: dipalmitoilfosfatidilholin; PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14-PEG ili PEG-C14) (PEG sa prosečnom mol masom od 2000); PEG-DSG: PEG-distiril glicerol (C18-PEG ili PEG-C18) (PEG sa prosečnom mol masom od 2000); PEG-cDMA: PEG-karbamoil-1,2-dimiristiloksipropilamin (PEG sa prosečnom mol masom od 2000).
[0282] Formulacije koje sadrže DLinDMA (1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan) opisane su u Međunarodnoj publikaciji br. WO2009/127060, podnetoj 15. aprila 2009.
[0283] Formulacije koje sadrže XTC su opisane, npr. u U.S. privremenoj prijavi serijski br.
61/148,366, podnetoj 29. januara 2009.; U.S. privremenoj prijavi serijski br. 61/156,851, podnetoj 2. marta 2009.; U.S. privremenoj prijavi serijski br. podnetoj 10. juna 2009.; U.S.
2
privremenoj prijavi serijski br. 61/228,373, podnetoj 24. jula 2009.; U.S. privremenoj prijavi serijski br. 61/239,686, podnetoj 3. septembra 2009. i Međunarodnoj prijavi br. PCT/US2010/022614, podnetoj 29. januara 2010.
[0284] Formulacije koje sadrže MC3 su opisane, npr. u U.S. publikaciji br. 2010/0324120, podnetoj 10. juna 2010.
[0285] Formulacije koje sadrže ALNY-100 su opisane, npr. u Međunarodnoj patentnoj prijavi broj PCT/US09/63933, podnetoj 10. novembra 2009.
[0286] Formulacije koje sadrže C12-200 su opisane u U.S. privremenoj prijavi serijski br.
61/175,770, podnetoj 5. maja 2009. i Međunarodnoj prijavi br. PCT/US10/33777, podnetoj 5. maja 2010.
Dodatne formulacije
i. Emulzije
[0287] Kompozicije iz predmetnog otkrića mogu da se pripreme i formulišu kao emulzije. Emulzije su obično heterogeni sistemi jedne tečnosti dispergovane u drugoj u vidu kapljica koje obično imaju prečnik veći od 0,1 µm (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str. 199; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str. 245; Block u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 2, str.335; Higuchi i sar. u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, str. 301). Emulzije su često dvofazni sistemi koji sadrže dve nemešljive tečne faze koje su blisko pomešane i dispergovane zajedno. Uopšteno, emulzije mogu biti vrste voda u ulju (V/U) ili ulje u vodi (U/V). Kada je vodena faza fino podeljena i dispergovana kao sitne kapljice u glavnoj uljanoj fazi, dobijena kompozicija se naziva emulzija voda u ulju (V/U). Alternativno, kada je uljana faza fino podeljena i dispergovana kao sitne kapljice u glavnoj vodenoj fazi, dobijena kompozicija se naziva emulzija ulje u vodi (U/V). Emulzije mogu da sadrže dodatne komponente osim dispergovanih faza, i aktivni lek koji može biti prisutan kao rastvor u vodenoj fazi, uljanoj fazi ili sam po sebi kao odvojena faza. Farmaceutski ekscipijensi kao što su emulgatori, stabilizatori, boje i antioksidansi takođe mogu biti prisutni u emulzijama po potrebi. Farmaceutske emulzije takođe mogu biti višestruke emulzije koje su sačinjene od više od dve faze kao što su, na primer, emulzije ulje u vodi u ulju (U/V/U) i voda u ulju u vodi (V/U/V). Takve složene formulacije često pružaju određene prednosti koje proste binarne emulzije nemaju. Višestruke emulzije u kojima pojedinačne kapljice ulja emulzije U/V obuhvataju male kapljice vode čine emulziju V/U/V. Slično tome, sistem kapljica ulja obuhvaćenih globulama vode stabilizovanim u uljanoj neprekidnoj fazi daje emulziju U/V/U.
[0288] Emulzije karakteriše mala termodinamička stabilnost ili njen izostanak. Često je dispergovana ili diskontinualna faza emulzije dobro dispergovana u spoljašnjoj ili kontinualnoj fazi i održava se u ovom obliku pomoću emulgatora ili viskoznosti formulacije. Bilo koja od faza emulzije može biti polučvrsta ili čvrsta supstanca, kao što je slučaj kod emulzionih baza melema i krema. Druga sredstva za stabilizaciju emulzija obuhvataju upotrebu emulgatora koji mogu biti inkorporisani u bilo koju fazu emulzije. Emulgatori uopšteno mogu da se svrstaju u četiri kategorije: sintetičke surfaktante, emulgatore koji se javljaju u prirodi, apsorpcione baze i fino dispergovane čvrste supstance (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.199).
[0289] Sintetički surfaktanti, poznati i kao površinski aktivni agensi, imaju veliku primenljivost u formulaciji emulzija, i njihov pregled je dat u literaturi (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.285; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, sveska 1, str.199). Surfaktanti su obično amfifilni i sadrže hidrofilni i hidrofobni deo. Odnos hidrofilne i hidrofobne prirode surfaktanta se naziva hidrofilni/lipofilni balans (HLB) i predstavlja koristan alat u kategorizaciji i odabiru surfaktanata u pripremi formulacija. Surfaktanti mogu da se podele u različite klase na osnovu prirode hidrofilne grupe: nejonski, anjonski, katjonski i amfoterni (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY Rieger, u Pharmaceutical
4
Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.285).
[0290] Prirodni emulgatori koji se koriste u formulacijama emulzija uključuju lanolin, pčelinji vosak, fosfatide, lecitin i akaciju. Apsorpcione baze imaju hidrofilna svojstva tako da mogu da upiju vodu i grade emulzije V/U, a ipak zadržavaju svoju polučvrstu konzistenciju, poput anhidrovanog lanolina i hidrofilnog mekog parafina Fino podeljene čvrste supstance se takođe koriste kao dobri emulgatori, naročito u kombinaciji sa surfaktantima u viskoznim preparatima. To uključuje polarne neorganske čvrste supstance, kao što su hidroksidi teških metala, nebubreće gline, kao što su bentonit, atapulgit, hektorit, kaolin, monmorijonit, koloidni aluminijum silikat i koloidni magnezijum aluminijum silikat, pigmente i nepolarne čvrste supstance, kao što su ugljenik ili gliceril tristearat.
[0291] Širok dijapazon neemulgujućih supstanci je takođe uključen u formulacije emulzija i doprinosi svojstvima emulzija. To uključuje masti, ulja, voskove, masne kiseline, masne alkohole, masne estre, humektante, hidrofilne koloide, konzervanse i antioksidanse (Block, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.335; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.199).
[0292] Hidrofilni koloidi ili hidrokoloidi uključuju prirodne gume i sintetičke polimere, kao što su polisaharidi (na primer, akacija, agar, alginatna kiselina, karagenan, guar guma, karaja guma i tragakant), derivate celuloze (na primer, karboksimetilcelulozu i karboksipropilcelulozu) i sintetičke polimere (na primer, karbomere, etre celuloze i karboksivinil polimere). Oni se disperguju ili bubre u vodi gradeći koloidne rastvore koji stabilizuju emulzije formiranjem snažnih međufaznih filmova oko kapljica dispergovane faze i povećavanjem viskoznosti spoljašnje faze.
[0293] Pošto emulzije često sadrže brojne sastojke kao što su ugljovodonici, proteini, steroli i fosfatidi koji lako mogu da podržavaju rast mikroba, ove formulacije često sadrže konzervanse. Uobičajeno korišćeni konzervansi sadržani u formulacijama emulzije uključuju metil paraben, propil paraben, kvaternerne amonijumove soli, benzalkonijum hlorid, estre phidroksibenzojeve kiseline i bornu kiselinu. Antioksidansi se često dodaju formulacijama emulzija kako bi se sprečilo propadanje formulacije. Korišćeni antioksidansi mogu biti čistači slobodnih radikala, kao što su tokoferoli, alkil galati, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, ili redukujući agensi kao što su askorbinska kiselina i natrijum metabisulfit, i antioksidanti sinergisti kao što su limunska kiselina, vinska kiselina i lecitin.
[0294] U literaturi je dat pregled primene formulacija emulzija dermatološkim, oralnim i parenteralnim putem i postupaka za njihovu proizvodnju (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str. 199). Formulacije emulzija za oralnu primenu se veoma mnogo koriste zbog lakoće formulisanja, kao i delotvornosti sa gledišta apsorpcije i bioraspoloživosti (vidite npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.245; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str. 199). Laksativi na bazi mineralnog ulja, vitamini rastvorljivi u ulju i hranljivi preparati sa visokim sadržajem masti spadaju u supstance koje se uobičajeno primenjuju oralno kao emulzije U/V.
ii. Mikroemulzije
[0295] U jednom slučaju predmetnog otkrića, kompozicije iRNK i nukleinske kiseline su formulisane kao mikroemulzije. Mikroemulzija može da se definiše kao sistem vode, ulja i amfifila koji je jedan optički izotropan i termodinamički stabilan tečni rastvor (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.245). Mikroemulzije su obično sistemi koji se pripremaju početnim dispergovanjem ulja u vodenom rastvoru surfaktanta, a zatim dodavanjem dovoljne količine četvrte komponente, uopšteno alkohola sa lancem srednje dužine radi nastanka transparentnog sistema. Stoga, mikroemulzije se takođe opisuju kao termodinamički stabilne, izotropski čiste disperzije dve nemešljive tečnosti koje su stabilizovane međufaznim filmovima površinski aktivnih molekula (Leung i Shah, u: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, strane 185-215). Mikroemulzije se obično pripremaju kombinovanjem tri do pet komponenata koje uključuju ulje, vodu, surfaktant, kosurfaktant i elektrolit. Da li je mikroemulzija vrste voda u ulju (V/U) ili ulje u vodi (U/V) zavisi od svojstava ulja i surfaktanta koji se koriste i od strukture i geometrijskog pakovanja polarnih glava i ugljovodoničnih repova molekula surfaktanata (Schott, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, str.
271).
[0296] Fenomenološki pristup koji koristi fazne dijagrame je temeljno proučen, i daje stručnjaku opširno znanje za formulisanje mikroemulzija (vidite, npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izd.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.245; Block, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (izdav.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., sveska 1, str.335). U poređenju sa uobičajenim emulzijama, mikroemulzije pružaju prednost solubilizacije lekova nerastvorljivih u vodi u formulaciji termodinamički stabilnih kapljica koje spontano nastaju.
[0297] Surfaktanti koji se koriste u pripremi mikroemulzija uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske surfaktante, nejonske surfaktante, Brij 96, polioksietilen oleil etre, poliglicerolske estre masnih kiselina, tetraglicerol monolaurat (ML310), tetraglicerol monooleat (MO310), heksaglicerol monooleat (PO310), heksaglicerol pentaoleat (PO500), dekaglicerol monokaprat (MCA750), dekaglicerol monooleat (MO750), dekaglicerol sekvioleat (SO750), dekaglicerol dekaoleat (DAO750), samostalno ili u kombinaciji sa kosurfaktantima. Kosurfaktant, obično alkohol kratkog lanca kao što je etanol, 1-propanol i 1-butanol, služi za povećanje međufazne fluidnosti tako što prodire u film surfaktanta i posledično stvara neorganizovani film zbog praznog prostora nastalog između molekula surfaktanta. Međutim, mikroemulzije mogu da se pripreme bez upotrebe kosurfaktanata, i samoemulgujući sistemi mikroemulzije bez alkohola su poznati u struci. Vodena faza može obično biti, bez ograničenja, voda, vodeni rastvor leka, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroli, propilen glikoli i derivati etilen glikola. Uljana faza može da uključuje, bez ograničenja, supstance kao što je Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, estri masne kiseline, mono, di i trigliceridi srednje dužine lanca (C8-C12), estri polioksietilovanih gliceril masnih kiselina, masni alkoholi, poliglikozilovani gliceridi, zasićeni poliglikozilovani C8-C10 gliceridi, biljna ulja i silikonsko ulje.
[0298] Mikroemulzije su naročito zanimljive sa tačke gledišta rastvorljivosti leka i pojačane apsorpcije lekova. Mikroemulzije na bazi lipida (i U/V i V/U) predložene su za poboljšanje oralne bioraspoloživosti lekova, uključujući peptide (vidite, npr. U.S. patente br. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i sar. Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Mikroemulzije pružaju prednosti poboljšane solubilizacije leka, zaštite leka od enzimske hidrolize, moguće poboljšanje apsorpcije leka usled promena fluidnosti i propustljivosti membrane indukovanih surfaktantom, lakoće pripreme, lakoće oralne primene u čvrstim doznim oblicima, poboljšane kliničke potentnosti i smanjene toksičnosti (vidite, npr. U.S. patente br.6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i sar. Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho i sar. J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Mikroemulzije često mogu da nastanu spontano kada se njihove komponente dovedu u kontakt na sobnoj temperaturi. To može biti naročito korisno prilikom formulisanja termolabilnih lekova, peptida ili iRNK. Mikroemulzije su takođe delotvorne u transdermalnoj isporuci aktivnih komponenata u kozmetičkoj i farmaceutskoj primeni. Očekuje se da će kompozicije i formulacije mikroemulzija iz predmetnog otkrića olakšati povećanu sistemsku apsorpciju iRNK i nukleinskih kiselina iz gastrointestinalnog trakta, i poboljšati lokalni ćelijski unos iRNK i nukleinskih kiselina.
[0299] Mikroemulzije iz predmetnog otkrića takođe mogu da sadrže dodatne komponente i aditive, kao što su sorbitan monostearat (Grill 3), Labrasol i pojačivači penetracije radi unapređenja svojstava formulacije i poboljšanja apsorpcije iRNK i nukleinskih kiselina iz predmetnog pronalaska. Pojačivači penetracije koji se koriste u mikroemulzijama iz predmetnog otkrića mogu da se klasifikuju u jednu od pet opštih kategorija-surfaktanti, masne kiseline, soli žučne kiseline, helatori i nehelirajući nesurfaktanti (Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str.92). Svaka od ovih klasa je prethodno razmotrena.
iii. Mikročestice
[0300] Agens RNKi iz otkrića može biti inkorporiran u česticu, npr. mikročesticu. Mikročestice se mogu proizvesti putem sušenja raspršivanjem, ali se takođe mogu proizvesti drugim postupcima, uključujući liofilizaciju, uparavanje, sušenje fluidnog sloja, vakuum sušenje ili kombinaciju ovih tehnika.
iv. Pojačivači penetracije
[0301] U jednom slučaju, predmetno otkriće koristi različite pojačivače penetracije radi postizanja delotvorne isporuke nukleinskih kiselina, naročito iRNK, u kožu životinje. Većina lekova je prisutna u rastvoru u jonizovanim i nejonizovanim oblicima. Međutim, obično samo lekovi rastvorljivi u lipidima ili lipofilni lekovi lako prolaze kroz ćelijske membrane. Otkriveno je da čak i nelipofilni lekovi mogu da prođu kroz ćelijske membrane ako je membrana koja treba da se pređe tretirana pojačivačem penetracije. Osim što pomažu u difuziji nelipofilnih lekova kroz ćelijske membrane, pojačivači penetracije takođe poboljšavaju propustljivost lipofilnih lekova.
[0302] Pojačivači penetracije mogu da se klasifikuju u jednu od pet opštih širokih kategorija, tj. surfaktanti, masne kiseline, soli žučnih kiselina, helatori i nehelirajući nesurfaktanti (vidite, npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str. 92). Svaka od prethodno navedenih klasa pojačivača penetracije je detaljnije opisana u nastavku.
[0303] Surfaktanti (ili „površinski aktivni agensi“) su hemijski entiteti koji, kada se rastvore u vodenom rastvoru, smanjuju površinski napon rastvora ili međufazni napon između vodenog rastvora i druge tečnosti, što dovodi do toga da je apsorpcija iRNK kroz sluzokožu pojačana. Pored soli žučnih kiselina i masnih kiselina, ovi pojačivači penetracije uključuju, na primer, natrijum lauril sulfat, polioksietilen-9-lauril etar i polioksietilen-20-cetil etar) (vidite, npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str. 92); i perfluorhemijske emulzije, poput FC-43. Takahashi i sar. J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0304] Različite masne kiseline i njihovi derivati koji deluju kao pojačivači penetracije uključuju, na primer, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprinsku kiselinu (n-dekansku kiselinu), miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurin, kaprilnu kiselinu, arahidonsku kiselinu, glicerol 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitine, acilholine, njihove C1-20alkil estre (npr. metil, izopropil i t-butil) i njihove monoi digliceride (tj. oleat, laurat, kaprat, miristat, palmitat, stearat, linoleat, itd.) (vidite, npr. Touitou, E., i sar. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri i sar. J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[0305] Fiziološka uloga žuči uključuje olakšavanje disperzije i apsorpcije lipida i vitamina koji se rastvaraju u mastima (vidite, npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, poglavlje 38 u: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9. izd., Hardman i sar. izdav., McGraw-Hill, New York, 1996, str. 934-935). Različite prirodne soli žučne kiseline i njihovi sintetički derivati deluju kao pojačivači penetracije. Tako, termin „soli žučne kiseline“ uključuje bilo koje od komponenata žuči koje se javljaju u prirodi, kao i bilo koje njihove sintetičke derivate. Pogodne soli žučne kiseline uključuju, na primer, holnu kiselinu (ili njenu farmaceutski prihvatljivu natrijumovu so, natrijum holat), dehidroholnu kiselinu (natrijum dehidroholat), dezoksiholnu kiselinu (natrijum dezoksiholat), glikolnu kiselinu (natrijum glikoholat), glikolnu kiselinu (natrijum glikoholat), glikodezoksiholnu kiselinu (natrijum glikodezoksiholat), tauroholnu kiselinu (natrijum tauroholat), taurodezoksiholnu kiselinu (natrijum taurodezoksiholat), henodezoksiholnu kiselinu (natrijum henodezoksiholat), ursodezoksiholnu kiselinu (UDCA), natrijum tauro-24,25-dihidro-fusidat (STDHF), natrijum glikodihidrofusidat i polioksietilen-9-lauril etar (POE) (vidite, npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92; Swinyard, poglavlje 39 u: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, strane 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto i sar. J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita i sar. J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[0306] Helatori, kako se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom, mogu se definisati kao jedinjenja koja uklanjaju jone metala iz rastvora formiranjem kompleksa sa njima, a rezultat je povećana apsorpcija iRNK kroz sluzokožu. U pogledu njihove upotrebe kao pojačivača penetracije u predmetnom otkriću, helatori imaju dodatnu prednost što takođe služe kao inhibitori DNaze, pošto većina okarakterisanih DNK nukleaza zahteva dvovalentni jon metala za katalizu te su stoga inhibirane helatorima (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Odgovarajući helatori uključuju, ali nisu ograničeni na, dinatrijum etilendiamin tetraacetat (EDTA), limunsku kiselinu, salicilate (npr. natrijum salicilat, 5-metoksisalicilat i homovanilat), N-acil derivate kolagena, lauret-9 i N-amino acil derivate beta-diketona (enamine)(vidite, npr. Katdare, A. i sar. Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur i sar. J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[0307] Kako se ovde koriste, nehelirajuća nesurfaktantska jedinjenja koja pojačavaju penetraciju mogu da se definišu kao jedinjenja koja pokazuju beznačajnu aktivnost kao helatori ili kao surfaktanti, ali svejedno pojačavaju apsorpciju iRNK kroz sluzokožu alimentarnog trakta (vidite, npr. Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Ova klasa pojačivača penetracije uključuje, na primer, nezasićene ciklične uree, 1-alkili 1-alkenilazaciklo-alkanonske derivate (Lee i sar. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92); i nesteroidne antiinflamatorne agense poput diklofenak natrijuma, indometacina i fenilbutazona (Yamashita i sar. J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0308] Agensi koji pojačavaju unos iRNK na ćelijskom nivou takođe se mogu dodati farmaceutskim i drugim kompozicijama predmetnog otkrića. Na primer, takođe je poznato da katjonski lipidi, kao što je lipofektin (Junichi i sar. U.S. pat. br.5,705,188), katjonski derivati glicerola i polikatjonski molekuli, kao što je polilizin (Lollo i sar. PCT prijava WO 97/30731) pojačavaju ćelijski unos dsRNK. Primeri komercijalno dostupnih transfekcionih reagensa uključuju, na primer, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 transfekcioni reagens (Roche; Grenzacherstrasse, Švajcarska), DOTAP lipozomski transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Švajcarska), DOSPER lipozomski transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Švajcarska) ili Fugene (Grenzacherstrasse, Švajcarska), Transfectam<®>reagens (Promega; Madison, WI), TransFast™ transfekcioni reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-20 reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-50 reagens (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, Francuska), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, Francuska), TransPass<a>D1 transfekcioni reagens (New England Biolabs; Ipswich, MA, SAD), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, SAD), PerFectin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), NeuroPORTER
1
transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), GenePORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), GenePORTER 2 transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), Cytofectin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), BaculoPORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), TroganPORTER™ transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, SAD), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, SAD), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, SAD), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, SAD), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, SAD), ili HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, SAD), između ostalog.
[0309] Drugi agensi mogu da se koriste za pojačavanje penetracije primenjenih nukleinskih kiselina, uključujući glikole kao što su etilen glikol i propilen glikol, pirole kao što je 2-pirol, azone i terpene kao što su limonen i menton.
v. Nosači
[0310] Određene kompozicije iz predmetnog otkrića takođe uključuju jedinjenja nosače u formulaciji. Kako se ovde koristi, „jedinjenja nosač“ ili „nosač“ može da se odnosi na nukleinsku kiselinu, ili njen analog, koja je inertna (tj. nema biološku aktivnost sama po sebi) ali je prepoznata kao nukleinska kiselina u in vivo procesima koji smanjuju bioraspoloživost nukleinske kiseline koja ima biološku aktivnost, na primer, razgradnjom biološki aktivne nukleinske kiseline ili promovisanjem njenog uklanjanja iz krvotoka. Zajednička primena nukleinske kiseline i jedinjenja nosača, obično sa viškom druge supstance, može dovesti do značajnog smanjenja nukleinske kiseline izolovane u jetri, bubregu ili drugim rezervoarima van cirkulacije, verovatno usled nadmetanja između jedinjenja nosača i nukleinske kiseline za zajednički receptor. Na primer, izolovanje delimično fosforotioatne dsRNK u tkivu jetre može se smanjiti kada se primenjuje zajedno sa poliinozinskom kiselinom, dekstran sulfatom, policitidinskom kiselinom ili 4-acetamido-4'izotiocijano-stilben-2,2'-disulfonskom kiselinom (Miyao i sar. DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura i sar. DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Ekscipijensi
[0311] Nasuprot jedinjenju nosaču, „farmaceutski nosač“ ili „ekscipijens“ je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, suspendujući agens ili bilo koji drugi farmaceutski inertan vehikulum za isporuku jedne ili više nukleinskih kiselina životinji. Ekscipijens može biti tečnost ili čvrsta supstanca i bira se, uzimajući u obzir planirani način primene, tako da obezbedi željenu masu,
2
konzistenciju, itd. kada se kombinuje sa nukleinskom kiselinom i drugim komponentama date farmaceutske kompozicije. Uobičajeni farmaceutski nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, vezujuće agense (npr. prethodno želatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza, itd.); punioce (npr. laktoza i drugi šećeri, mikrokristalna celuloza, pektin, želatin, kalcijum sulfat, etil celuloza, poliakrilati ili kalcijum hidrogen fosfat, itd.); lubrikanse (npr. magnezijum stearat, talk, silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, stearinska kiselina, metalni stearati, hidrogenovana biljna ulja, kukuruzni skrob, polietilen glikoli, natrijum benzoat, natrijum acetate, itd.); dezintegrante (npr. skrob, natrijum skrob glikolat, itd.); i kvašljivce (npr. natrijum lauril sulfat, itd.).
[0312] Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu koji ne deluju štetno na nukleinske kiseline takođe mogu da se koriste za formulisanje kompozicija iz predmetnog pronalaska. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumovu kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidone, i slično.
[0313] Formulacije za topikalnu primenu nukleinskih kiselina mogu da uključuju sterilne i nesterilne vodene rastvore, nevodene rastvore u uobičajenim rastvaračima kao što je alkohol, ili rastvore nukleinskih kiselina u tečnim ili čvrstim uljanim bazama. Rastvor takođe može da sadrži pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Mogu da se koriste farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama.
[0314] Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumovu kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidone, i slično.
vii. Druge komponente
[0315] Kompozicije iz predmetnog otkrića mogu dalje da sadrže druge dodatne komponente koje se pogodno mogu naći u farmaceutskim kompozicijama, pri njihovim nivoima upotrebe koji su ustanovljeni u struci. Tako, na primer, kompozicije mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne supstance kao što su, na primer, antipruritici, adstringensi, lokalni anestetici ili antiinflamatorni agensi, ili može da sadrži dodatne supstance koje su korisne u fizičkom formulisanju različitih doznih oblika kompozicija iz predmetnog pronalaska, kao što su boje, arome, konzervansi, antioksidansi, zamućivači, agensi za zgušnjavanje i stabilizatori. Međutim, takve supstance, kada se dodaju, ne treba nepotrebno da ometaju biološke aktivnosti komponenata kompozicija iz predmetnog otkrića. Formulacije mogu biti sterilisane i, po želji, pomešane sa pomoćnim agensima, npr. lubrikansima, konzervansima, stabilizatorima, kvašljivcima, emulgatorima, solima za izmenu osmotskog pritiska, puferima, bojama, aromama i/ili aromatičnim supstancama i slično, koje nemaju štetnu interakciju sa nukleinskim kiselinama iz formulacije.
[0316] Vodene suspenzije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore.
[0317] U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije iz otkrića uključuju (a) jedno ili više jedinjenja iRNK i (b) jedan ili više agensa koji deluju putem mehanizma koji nije preko iRNK i koji su korisni u lečenju, npr. PH1.
Testiranje kompozicija
[0318] Toksičnost i terapeutska delotvornost takvih jedinjenja može da se odredi standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili na eksperimentalnim životinjama, npr. za utvrđivanje LD50 (doza koja je letalna za 50% populacije) i ED50 (doza koja je terapeutski delotvorna kod 50% populacije). Dozni odnos između toksičnog i terapeutskog dejstva je terapeutski indeks, i on može da se prikaže kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju visoke terapeutske indikacije.
[0319] Podaci dobijeni iz testova ćelijske kulture i životinjskih studija mogu da se koriste u formulisanju opsega doze za upotrebu kod ljudi. Doza kompozicija koje su ovde opisane uopšteno se nalazi u opsegu koncentracija u krvotoku koje uključuju ED50 sa neznatnom ili nepostojećom toksičnošću. Doza može da varira u ovom opsegu u zavisnosti od doznog oblika koji se koristi i upotrebljenog načina primene. Za bilo koje jedinjenje koje se koristi u ovde opisanim postupcima, terapeutski delotvorna doza može prvobitno da se proceni iz testa ćelijske kulture. Doza može da se formuliše na životinjskim modelima kako bi se postigao opseg cirkulišuće koncentracije jedinjenja u plazmi ili, po potrebi, polipeptidnog proizvoda ciljne sekvence (npr. postizanje smanjene koncentracije polipeptida) koji uključuje IC50(tj.
4
koncentracija ispitivanog jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije simptoma) kako je utvrđeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu da se koriste da se preciznije utvrde korisne doze za ljude. Nivoi u plazmi mogu da se mere, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.
[0320] Pored njihove primene, kako je prethodno razmatrano, iRNK opisane u otkriću mogu da se primenjuju u kombinaciji sa drugim poznatim agensima delotvornim u lečenju patoloških procesa koji su posredovani prezasićenjem gvožđem i mogu da se leče inhibicijom ekspresije HAO1. U svakom slučaju, lekar koji daje lek može da prilagodi količinu i termin primene iRNK na osnovu rezultata koji su uočeni koristeći standardne mere delotvornosti koje su poznate u struci ili ovde opisane.
V. Postupci za inhibiciju ekspresije HAO1
[0321] Predmetno otkriće takođe pruža postupke za inhibiciju ekspresije HAO1 (oksidaze 1 hidroksilne kiseline) u ćeliji. Postupci obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. agensom dvolančane RNKi, u količini koja je delotvorna za inhibiciju ekspresije HAO1 u ćeliji, čime se inhibira ekspresija HAO1 u ćeliji.
[0322] Dovođenje ćelije u kontakt sa agensom dvolančane RNKi može se obaviti in vitro ili in vivo. Dovođenje u kontakt ćelije in vivo sa agensom RNKi uključuje dovođenje u kontakt ćelije ili grupe ćelija u ispitaniku, npr. ljudskom ispitaniku, sa agensom RNKi. Takođe su moguće i kombinacije in vitro i in vivo postupaka kontaktiranja. Kontakt može biti direktan ili indirektan, kao što je prethodno razmotreno. Nadalje, kontakt sa ćelijom se može ostvariti putem ciljajućeg liganda, uključujući svaki ligand koji je ovde opisan ili poznat u struci. U nekim slučajevima, ciljajući ligand je ugljovodonični ostatak, npr. GalNAc3ligand, ili bilo koji drugi ligand koji usmerava agens RNKi na željeno mesto, npr. jetru ispitanika.
[0323] Termin „inhibira“, kako se ovde koristi, koristi se naizmenično sa „smanjuje“, „utišava“, „nishodno reguliše“, i drugim sličnim terminima, i obuhvata bilo koji nivo inhibicije.
[0324] Fraza „inhibira ekspresiju HAO1“ treba da se odnosi na inhibiciju ekspresije bilo kog gena HAO1 (kao što je, npr. gen HAO1 miša, gen HAO1 pacova, gen HAO1 majmuna ili gen HAO1 čoveka) kao i varijanti ili mutanata gena HAO1. Tako, gen HAO1 može biti gen HAO1 divljeg tipa, mutantni gen HAO1 ili transgeni gen HAO1 u kontekstu genetski manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0325] „Inhibicija ekspresije gena HAO1“ obuhvata bilo koji nivo inhibicije gena HAO1, npr. najmanje delimično suzbijanje ekspresije gena HAO1. Ekspresija gena HAO1 može da se proceni na osnovu nivoa, ili promene nivoa, bilo koje promenljive povezane sa ekspresijom gena HAO1, npr. nivo mRNK TTR, nivo proteina HAO1. Taj nivo može biti procenjen u pojedinačnoj ćeliji ili u grupi ćelija, uključujući, na primer, uzorak dobijen od ispitanika.
[0326] Inhibicija može biti procenjena na osnovu smanjenja apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više promenljivih povezanih sa ekspresijom HAO1 u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koja vrsta kontrolnog nivoa koja se koristi u struci, npr. početni nivo pre doze ili nivo određen kod sličnog ispitanika, ćelije ili uzorka koji nije tretiran ili je tretiran kontrolom (kao što je, npr. kontrola samo sa puferom ili kontrola sa neaktivnim agensom).
[0327] U nekim slučajevima postupaka iz otkrića, ekspresija gena HAO1 je inhibirana najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%. najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%.
[0328] Inhibicija ekspresije gena HAO1 može da se manifestuje kao smanjenje količine mRNK koju eksprimira prva ćelija ili grupa ćelija (takve ćelije mogu biti prisutne, na primer, u uzorku dobijenom od ispitanika) u kojoj je gen HAO1 transkribovan i koja je tretirana (npr. dovođenjem ćelije ili ćelija u kontakt sa agensom RNKi iz otkrića, ili primenom agensa RNKi iz otkrića na ispitanika u kome su ćelije prisutne) tako da je ekspresija gena HAO1 inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija suštinski identičnom sa prvom ćelijom ili grupom ćelija ali koja nije, ili nije bila, tako tretirana (kontrolne ćelije). U nekim slučajevima, inhibicija je procenjena izražavanjem nivoa mRNK u tretiranim ćelijama kao procenta nivoa mRNK u kontrolnim ćelijama, korišćenjem sledeće formule:
[0329] Alternativno, inhibicija ekspresije gena HAO1 se može proceniti u pogledu smanjenja parametra koji je funkcionalno povezan sa ekspresijom gena HAO1, npr. ekspresije proteina HAO1. Utišavanje gena HAO1 se može utvrditi u bilo kojoj ćeliji koja eksprimira HAO1, bilo konstitutivno ili pomoću genomskog inženjerstva, i putem bilo kog testa poznatog u struci. Jetra je značajno mesto ekspresije HAO1. Druga bitna mesta ekspresije uključuju bubrege i matericu.
[0330] Inhibicija ekspresije proteina HAO1 može da se manifestuje smanjenjem nivoa proteina HAO1 koji eksprimira ćelija ili grupa ćelija (npr. nivo proteina eksprimiranog u uzorku dobijenom od ispitanika). Kao što je prethodno objašnjeno za procenu supresije mRNK, inhibicija nivoa ekspresije proteina u tretiranoj ćeliji ili grupi ćelija može na sličan način da se prikaže kao procenat nivoa proteina u kontrolnoj ćeliji ili grupi ćelija.
[0331] Kontrolna ćelija ili grupa ćelija koja može da se koristi za procenu inhibicije gena HAO1 uključuje ćeliju ili grupu ćelija koja još nije dovedena u kontakt sa agensom RNKi iz pronalaska. Na primer, kontrolna ćelija ili grupa ćelija može da se dobije od pojedinačnog ispitanika (npr. ljudskog ili životinjskog ispitanika) pre lečenja ispitanika agensom RNKi.
[0332] Nivo mRNK HAO1 koji eksprimira ćelija ili grupa ćelija može se odrediti korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci za određivanje ekspresije mRNK. U jednom slučaju, nivo ekspresije HAO1 u uzorku se određuje detekcijom transkribovanog polinukleotida, ili njegovog dela, npr. mRNK HAO1 gena. RNK može da se ekstrahuje iz ćelija korišćenjem tehnika za ekstrakciju RNK uključujući, na primer, korišćenje kisele ekstrakcije fenolom/guanidin izotiocijanatom (RNKzol B, Biogenesis), kompleta za pripremu RNK RNeasy (Qiagen) ili PAXgene (PreAnalytix, Švajcarska). Tipični formati testa koji koristi hibridizaciju ribonukleinske kiseline uključuju testove nuklearnog ciklusa, testove protekcije RT-PCR, RNaze (Melton et al., Nuc. Acids Res.12:7035), nortern blot, in situ hibridizaciju i analizu pomoću mikročipa.
[0333] U jednom slučaju, nivo ekspresije HAO1 je određen korišćenjem sonde nukleinske kiseline. Termin „sonda“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki molekul koji je sposoban za selektivno vezivanje za specifični HAO1. Osoba sa znanjem u oblasti može da sintetiše sonde, ili one mogu biti dobijene iz odgovarajućih bioloških preparata. Sonde se mogu specifično konstruisati da budu obeležene. Primeri za molekule koji se mogu koristiti kao sonde uključuju, ali nisu ograničeni na, RNK, DNK, proteine, antitela i organske molekule.
[0334] Izolovana mRNK može da se koristi u testovima hibridizacije ili amplifikacije koji uključuju, ali nisu ograničeni na, sautern ili nortern analize, analizu lančane reakcije polimeraze (PCR) i nizove sondi. Jedan postupak za određivanje nivoa mRNK uključuje dovođenje u kontakt izolovane mRNK sa molekulom nukleinske kiseline (sonda) koji može da se hibridizuje u mRNK HAO1. U jednom slučaju, mRNK je imobilisana na čvrstoj površini i dovodi se u kontakt sa sondom, na primer, propuštanjem izolovane mRNK na agaroznom gelu i prenošenjem mRNK sa gela na membranu, kao što je nitroceluloza. U alternativnom slučaju, sonde su imobilisane na čvrstoj površini, i mRNK je dovedena u kontakt sa sondama, na primer, na genskom mikročipu Affymetrix. Stručnjak može lako da prilagodi poznate postupke za detekciju mRNK za primenu u određivanju nivoa mRNK HAO1.
[0335] Alternativni postupak za određivanje nivoa ekspresije HAO1 u uzorku obuhvata proces amplifikacije nukleinske kiseline i/ili reversne transkriptaze (radi pripreme kDNK), na primer mRNK u uzorku, npr. pomoću RT-PCR (eksperimentalni slučaj iznet u Mullis, 1987, U.S. pat. br. 4,683,202), lančane reakcije ligaze (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), samoodržive replikacije sekvence (Guatelli i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transkripcionog sistema amplifikacije (Kwoh i sar. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replikaze (Lizardi i sar. (1988) Bio/Technology 6:1197), kružne replikacije (Lizardi i sar., U.S. pat. No.5,854,033), ili bilo kog drugog postupka amplifikacije nukleinske kiseline, praćenog detekcijom amplifikovanih molekula pomoću tehnika dobro poznatih stručnjacima. Te šeme detekcije su posebno korisne za detekciju molekula nukleinske kiseline, ako su takvi molekuli prisutni u veoma malom broju. U konkretnim aspektima otkrića, nivo ekspresije HAO1 je utvrđen kvantitativnom fluorogenom RT-PCR (tj. sistem TaqMan™).
[0336] Ekspresioni nivoi mRNK HAO1 se mogu pratiti koristeći membransko nanošenje (kao što se koristi u hibridizacionoj analizi, kao što je nortern, sautern, dot blot, i slično), ili mikrobunarčiće, epruvete za uzorke, gelove, perlice ili vlakna (ili bilo koji čvrsti nosač koji uključuje vezane nukleinske kiseline). Vidite U.S. Pat. br. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 i 5,445,934. Određivanje nivoa ekspresije HAO1 takođe može da obuhvata korišćenje sondi nukleinske kiseline u rastvoru.
[0337] U nekim slučajevima, nivo ekspresije mRNK se procenjuje korišćenjem testova razgranate DNK (bDNK) ili PCR u realnom vremenu (qPCR). Upotreba ovih postupaka je opisana i prikazana u primerima datim u ovom tekstu.
[0338] Nivo ekspresije proteina HAO1 može da se odredi korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci za merenje nivoa proteina. Takvi postupci uključuju, na primer, elektroforezu, kapilarnu elektroforezu, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), tankoslojnu hromatografiju (TLC), hiperdifuzionu hromatografiju, tečne ili gel precipitinske reakcije, apsorpcionu spektroskopiju, kolorimetrijske testove, spektrofotometrijske testove, protočnu citometriju, imunodifuziju (jednostruku ili dvostruku), imunoelektroforezu, vestern blot, radioimunološki test (RIA), testove sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), imunofluorescentne testove, testove elektrohemiluminescencije, i slično.
[0339] Termin „uzorak“, kako se ovde koristi, odnosi se na skup sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od ispitanika, kao i tečnosti, ćelija ili tkiva prisutnih u ispitaniku. Primeri za biološke tečnosti uključuju krv, serum i serumski fluid, plazmu, limfu, urin, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, očnu tečnost, i slično. Uzorci tkiva mogu da uključuju uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regiona. Na primer, uzorci mogu biti dobijeni od pojedinačnih organa, delova organa, ili tečnosti ili ćelija u tim organima. U određenim slučajevima, uzorci mogu biti dobijeni iz jetre (npr. cele jetre ili određenih segmenata jetre ili određenih vrsta ćelija u jetri, kao što su, npr., hepatociti). U nekim slučajevima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na krv ili plazmu uzetu od ispitanika. U daljim slučajevima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na tkivo jetre dobijeno od ispitanika.
[0340] U nekim slučajevima postupaka iz otkrića, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku tako da se agens RNKi isporučuje na specifično mesto u ispitaniku. Inhibicija ekspresije HAO1 može se proceniti putem merenja nivoa ili promene nivoa mRNK HAO1 ili HAO1 proteina u uzorku dobijenom od tečnosti ili tkiva sa specifičnog mesta u ispitaniku. U nekim slučajevima, mesto je jetra. Mesto takođe može biti podsekcija ili podgrupa ćelija iz bilo kog od prethodno navedenih mesta. Mesto takođe može da uključuje ćelije koje eksprimiraju određenu vrstu receptora.
VI. Postupci za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanog sa HAO1
[0341] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju bolesti i stanja koja mogu da se moduliraju ekspresijom HAO1 gena. Na primer, ovde opisana kompozicija može da se koristi za lečenje bilo kog poremećaja povezanog sa PH1.
[0342] Delotvornost lečenja ili prevencije bolesti može da se proceni, na primer, određivanjem progresije bolesti, remisije bolesti, težine simptoma, smanjenja bola, kvaliteta života, doze leka koja je potrebna za produženo dejstvo lečenja, nivoa markera bolesti, ili bilo kog drugog merljivog parametra koji je prikladan za datu bolest koja se leči ili na koju se cilja radi prevencije. Stručnjaku neće biti teško da prati delotvornost lečenja ili prevencije pomoću merenja bilo kog od tih parametara, ili bilo koje kombinacije parametara.
[0343] Lekovito ili preventivno dejstvo je očigledno kada postoji statistički značajno poboljšanje jednog ili više parametara stanja bolesti, ili izostanak pogoršanja ili razvoja simptoma kada bi to inače moglo da se očekuje. Na primer, povoljna promena od najmanje 10% za merljivi parametar bolesti, a poželjno najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više može biti indikator delotvornog lečenja. Delotvornost datog leka iRNK ili formulacije tog leka takođe može da se proceni koristeći eksperimentalni životinjski model za datu bolest, kao što je poznato u struci. Kada se koristi eksperimentalni životinjski model, delotvornost lečenja je potvrđena kada je uočeno statistički značajno smanjenje markera ili simptoma.
[0344] Alternativno, delotvornost može da se izmeri smanjenjem težine bolesti, na osnovu procene stručnjaka u oblasti dijagnoze na bazi klinički prihvatljive skale za ocenu težine bolesti.
[0345] U nekim slučajevima postupaka iz otkrića, ekspresija HAO1 je smanjena u dužem periodu, npr., najmanje jednu nedelju, dve nedelje, tri nedelje ili četiri nedelje, ili duže. Na primer, u određenim slučajevima, ekspresija gena HAO1 je suzbijena za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 100% pomoću primene ovde opisanog agensa iRNK. U nekim slučajevima, gen HAO1 je suzbijen za najmanje oko 60%, 70% ili 80% pomoću primene agensa iRNK. U nekim slučajevima, gen HAO1 je suzbijen za najmanje oko 85%, 90% ili 95% pomoću primene
1
dvolančanog oligonukleotida. U drugom slučaju, HAO1 gen ostaje suzbijen tokom 7 dana, 10 dana, 20 dana, 30 dana ili više nakon primene.
Primena
[0346] Agensi RNKi iz otkrića mogu se primenjivati na ispitaniku korišćenjem bilo kog načina primene poznatog u struci, uključujući, bez ograničenja, supkutani, intravenski, intramuskularni, intraokularni, intrabronhijalni, intrapleuralni, intraperitonealni, intraarterijski, limfni, cerebrospinalni, i svaku njihovu kombinaciju. U nekim slučajevima, agensi se primenjuju supkutano.
[0347] U nekim slučajevima, primena je putem depo injekcije. Depo injekcija može da otpušta agens RNKi na dosledan način tokom produženog vremenskog perioda. Tako, depo injekcija može da smanji potrebnu frekvenciju doziranja kako bi se dobilo željeno dejstvo, npr. željena inhibicija HAO1, ili terapeutsko ili profilaktičko dejstvo. Depo injekcija može takođe da obezbedi doslednije serumske koncentracije. Depo injekcije mogu da uključuju supkutane injekcije ili intramuskularne injekcije. U nekim slučajevima, depo injekcija je supkutana injekcija.
[0348] U nekim slučajevima, primena je putem pumpe. Pumpa može biti eksterna pumpa ili pumpa implantirana hirurškim putem. U određenim slučajevima, pumpa je supkutano implantirana osmotska pumpa. U drugim slučajevima, pumpa je infuziona pumpa. Infuziona pumpa može se koristiti za intravenske, supkutane, arterijske ili epiduralne infuzije. U nekim slučajevima, infuziona pumpa je supkutana infuziona pumpa. U drugim slučajevima, pumpa je hirurški implantirana pumpa koja isporučuje agens RNKi u jetru.
[0349] Drugi putevi primene uključuju epiduralnu, intracerebralnu, intracerebroventrikularnu, nazalnu primenu, intraarterijsku, intrakardijalnu, intraosealnu infuziju, intratekalnu i intravitrealnu i pulmonarnu. Način primene se može odabrati na osnovu toga da li se želi lokalno ili sistemsko lečenje, i na osnovu oblasti koja se leči. Način i mesto primene se mogu izabrati da pojačaju ciljanje.
[0350] Postupak obuhvata primenu agensa iRNK, npr. doze koja je dovoljna za smanjenje nivoa mRNK HAO1 tokom najmanje 5, poželjnije 7, 10, 14, 21, 25, 30 ili 40 dana; i, opciono, primenu druge pojedinačne doze dsRNK, pri čemu se druga pojedinačna doza primenjuje
1 1
najmanje 5, poželjnije 7, 10, 14, 21, 25, 30 ili 40 dana nakon što je prva pojedinačna doza primenjena, čime se inhibira ekspresija gena HAO1 kod ispitanika.
[0351] U jednom slučaju, doze agensa iRNK iz otkrića primenjuju se najviše jednom na svake četiri nedelje, najviše jednom na svake tri nedelje, najviše jednom na svake dve nedelje ili najviše jednom nedeljno. U drugom slučaju, primena može da se nastavi tokom jednog, dva, tri ili šest meseci, ili jedne godine ili duže. U drugom otelotvorenju, doze agensa iRNK iz pronalaska se primenjuju jednom nedeljno tokom tri nedelje.
[0352] Uopšteno, agens iRNK ne aktivira imunski sistem, npr. ne povećava nivoe citokina, kao što su nivoi TNF-alfa ili IFN-alfa. Na primer, kada se meri pomoću testa, kao što je in vitro test PBMC, kako je ovde opisano, porast nivoa TNF-alfa ili IFN-alfa je manji od 30%, 20% ili 10% kontrolnih ćelija koje su tretirane kontrolnom dsRNK, kao što je dsRNK koja ne cilja HAO1.
[0353] Na primer, na ispitaniku može da se primenu terapeutska količina agensa iRNK, kao što je 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg ili 3 mg/kg dsRNA. Agens iRNK može da se primeni putem intravenske infuzije u određenom vremenskom periodu, recimo periodu od 5 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta ili 25 minuta. Primena se ponavlja, na primer, na redovnoj osnovi, recimo na dve nedelje (tj. svake dve nedelje) tokom jednog meseca. dva meseca, tri meseca, četiri meseca ili duže. Nakon početnog režima lečenja, lečenja mogu da se primenjuju na manje čestoj osnovi. Na primer, nakon dvonedeljne primene tokom tri meseca, primena može da se ponavlja jednom mesečno, tokom šest meseci ili godinu dana ili duže. Primena agensa iRNK može da smanji nivoe HAO1, npr. u ćeliji, tkivu, krvi, urinu ili drugom delu pacijenta za najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%. najmanje 80% ili najmanje 90% ili više.
[0354] Pre primene cele doze agensa iRNK, pacijentu može biti data manja doza, kao što je doza koja dovodi do manje od 5% infuzione reakcije, i da se prate neželjena dejstva, kao što je alergijska reakcija ili povišeni nivo lipida ili krvni pritisak. U drugom primeru, mogu da se posmatraju neželjeni imunostimulatorni efekti kod pacijenta, kao što su povećani nivoi citokina (npr. TNF-alfa ili INF-alfa).
1 2
[0355] Pacijent kome je potreban agens HAO1 RNKi može da se identifikuje proverom porodične istorije. Pružalac zdravstvene nege, kao što je lekar, medicinska sestra ili član porodice, mogu da provere porodičnu istoriju pre propisivanja ili primene dsRNK HAO1. Na pacijentu takođe može da se obavi DNK test kako bi se identifikovala mutacija gena AGT1, pre nego što se agens RNKi HAO1 primeni na pacijentu. Dijagnoza PH1 može da se potvrdi pomoću bilo kog testa koji je poznat stručnjaku.
[0356] Lekovito ili preventivno dejstvo je očigledno kada postoji statistički značajno poboljšanje jednog ili više parametara stanja bolesti, ili izostanak pogoršanja ili razvoja simptoma kada bi to inače moglo da se očekuje. Na primer, povoljna promena od najmanje 10% za merljivi parametar bolesti, a poželjno najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više može biti indikator delotvornog lečenja. Delotvornost datog agensa iRNK iz otkrića ili formulacije tog agensa iRNK takođe može da se proceni koristeći eksperimentalni životinjski model za datu bolest, kao što je poznato u struci. Kada se koristi eksperimentalni životinjski model, delotvornost lečenja je potvrđena kada je uočeno statistički značajno smanjenje markera ili simptoma.
[0357] Doza agensa RNKi koja se primenjuje na ispitaniku može biti prilagođena da uravnoteži rizike i koristi od konkretne doze, na primer, da se postigne željeni nivo supresije gena HAO1 (kako je procenjeno, npr. na osnovu supresije mRNK HAO1, ekspresije proteina HAO1 ili smanjenja nivoa oksalata) ili željeno terapeutsko ili profilaktičko dejstvo, uz istovremeno izbegavanje neželjenih dejstava.
[0358] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje u dve ili više doza. Ako je poželjno da se olakšaju ponovljene ili česte infuzije, može biti preporučljiva implantacija sredstva za isporuku, npr. pumpe, polutrajnog stenta (npr. intravenskog, intraperitonealnog, intracisternalnog ili intrakapsularnog) ili rezervoara. U nekim slučajevima, broj ili količina kasnijih doza zavisi od postizanja željenog dejstva, npr. supresije gena HAO1, ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog dejstva, npr. smanjenja prezasićenja gvožđem. U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje prema rasporedu. Na primer, agens RNKi može da se primenjuje jednom nedeljno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno ili pet puta nedeljno. U nekim slučajevima, raspored obuhvata redovno raspoređene primene, npr. svakog sata, na svaka četiri sata, na svakih šest sati, svakih osam sati, svakih dvanaest sati, svakodnevno, na svaka 2 dana, svaka 3 dana, svaka 4 dana, svakih 5 dana, nedeljno, na dve
1
nedelje ili mesečno. U drugim slučajevima, raspored obuhvata bliske primene praćene dužim vremenskim periodom tokom kog se agens ne primenjuje. Na primer, raspored može da obuhvati inicijalni set doza koje se primenjuju u relativno kratkom vremenskom periodu (npr. na oko svakih 6 sati, na oko svakih 12 sati, na oko svaka 24 sata, na oko svakih 48 sati, ili na oko svaka 72 sata), što je praćeno dužim vremenskim periodom (npr. oko 1 nedelja, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 5 nedelja, oko 6 nedelja, oko 7 nedelja ili oko 8 nedelja) tokom koga se agens RNKi ne primenjuje. U jednom slučaju, agens RNKi se inicijalno primenjuje svakog sata, a kasnije se primenjuje u dužim intervalima (npr. dnevno, nedeljno, dvonedeljno ili mesečno). U drugom slučaju, agens RNKi se inicijalno primenjuje dnevno, a kasnije se primenjuje u dužim intervalima (npr. nedeljno, dvonedeljno ili mesečno). U određenim slučajevima, duži interval se povećava tokom vremena, ili se određuje na osnovu postizanja željenog dejstva. U specifičnom slučaju, agens RNKi se primenjuje jednom dnevno tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši sa osmim danom primene. U drugom specifičnom slučaju, agens RNKi se primenjuje svakog drugog dana tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši sa osmim danom primene.
[0359] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje sa doznim režimom koji obuhvata „početnu fazu“ sa blisko razdvojenim primenama koja može biti praćena „fazom održavanja“, kada se agens RNKi primenjuje u dužim vremenskim intervalima. U jednom slučaju, početna faza obuhvata pet dnevnih primena agensa RNKi tokom prve nedelje. U drugom slučaju, faza održavanja obuhvata jednu ili dve nedeljne primene agensa RNKi. U daljem slučaju, faza održavanja traje 5 nedelja.
[0360] Bilo koji od ovih rasporeda se može opciono ponoviti za jednu ili više iteracija. Broj iteracija zavisi od postizanja željenog dejstva, npr. supresije gena HAO1 i/ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog dejstva, npr. smanjenja nivoa oksalata ili smanjenja simptoma PH1.
[0361] U drugom aspektu, otkriće sadrži postupak za upućivanje krajnjeg korisnika, npr. negovatelja ili ispitanika, kako da primeni ovde opisani agens iRNK. Postupak uključuje, opciono, pružanje krajnjem ispitaniku jedne ili više doza agensa iRNK i davanje instrukcija krajnjem korisniku o primeni agensa iRNK u ovde opisanom režimu, čime se krajnjem korisniku daju uputstva.
1 4
VII. Kompleti
[0362] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje komplete za upotrebu bilo kog od agensa iRNK i/ili obavljanje bilo kojih postupaka iz otkrića. Takvi kompleti uključuju jedan ili više agensa RNKi i uputstvo za upotrebu, npr. uputstvo za inhibiciju ekspresije HAO1 u ćeliji putem dovođenja ćelije u kontakt sa agensima RNKi u količini koja je delotvorna za inhibiciju ekspresije HAO1. Kompleti mogu dalje opciono da sadrže sredstva za dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi (npr. sredstvo za ubrizgavanje), ili sredstva za merenje inhibicije HAO1 (npr. sredstva za merenje inhibicije mRNK HAO1 ili proteina HAO1). Takva sredstva za merenje inhibicije HAO1 mogu da obuhvataju sredstva za uzimanje uzorka od ispitanika, kao što je, npr. uzorak plazme. Kompleti iz otkrića mogu opciono dalje da sadrže sredstva za primenu agensa RNKi na ispitaniku ili sredstva za utvrđivanje terapeutski delotvorne ili profilaktički delotvorne količine.
VII. Dijagnostički markeri za PH1 i povezana stanja
[0363] Ovde su takođe opisani markeri i postupci za dijagnostikovanje ovih stanja uzrokovanih prekomernom proizvodnjom oksalata, naročito PH1 i srodnih stanja, kao i agensi za lečenje navedenih stanja.
[0364] Prema drugom aspektu, otkriće se odnosi na postupak za lečenje stanja PH1 kod ispitanika (bolesti nastanka kamenja, naročito PH1). Dijagnostički postupak obuhvata korake: (a) smanjenja ekspresije HAO1 kod ispitanika (b) dobijanja biološkog seruma od navedenog ispitanika; i (b) određivanja nivoa glikolata u navedenom serumu. Biće jasno da povišeni nivo glikolata u serumu, u poređenju sa negativnom kontrolom, ukazuje na inhibiciju enzima glikolat oksidaze kako bi se sprečila proizvodnja oksalata koja je uzrokovana stanjem PH1.
[0365] Ovde je takođe opisan komplet za dijagnostikovanje stanja PH2, pri čemu navedeni komplet sadrži sledeće: (a) agens za utvrđivanje prisustva određenog analita u serumu, pri čemu je pomenuti određeni analit jedan od glikolata; i (b) sredstvo za kalibraciju. Na primer, pomenuti određeni analit je glikolat, pomenuti agens je siRNK koja cilja HAO1.
PRIMERI
Supstance i postupci
[0366] U primerima su korišćene sledeće supstance i postupci. Kako se ovde koriste, „HAO“ i „GO“ se koriste naizmenično.
1
Sinteza siRNK
[0367] Jednolančane RNK su proizvedene sintezom u čvrstoj fazi u obimu od 1 µmol koristeći sintetizator Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darm-stadt, Nemačka) i staklo sa kontrolisanim porama (CPG, 500Å, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Nemačka) kao čvrstu podlogu. RNK i RNK koja sadrži 2'-O-metil nukleotide generisane su sintezom u čvrstoj fazi koristeći odgovarajuće fosforamidite, odnosno 2'-O-metil fosforamidite (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Nemačka). Ovi gradivni blokovi su inkorporisani na izabranim mestima u sekvenci lanca oligonukleotida koristeći standardnu nukleozidnu fosforamiditnu hemiju, kao što je opisano u Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (izdav.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, SAD. Fosforotioatne veze su uvedene zamenom rastvora oksidansa joda rastvorom Bokažovog reagensa (Chruachem Ltd, Glasgow, UK) u acetonitrilu (1%). Dalji pomoćni reagensi su nabavljeni od kompanije Mallinckrodt Baker (Griesheim, Nemačka).
[0368] Deprotekcija i prečišćavanje sirovih oligonukleotida pomoću anjonsko izmenjivačke HPLC izvršeni su u skladu sa utvrđenim procedurama. Prinosi i koncentracije su utvrđeni UV apsorpcijom rastvora odgovarajuće RNK pri talasnoj dužini od 260 nm koristeći spektrofotometar (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleißheim, Nemačka).
[0369] Dvolančana RNK je stvorena mešanjem ekvimolarnog rastvora komplementarnih lanaca u puferu za komplementarno vezivanje prajmera (20 mM natrijum fosfat, pH 6,8; 100 mM natrijum hlorid), zagrejan u vodenom kupatilu na 85 - 90°C tokom 3 minuta i ohlađen na sobnu temperaturu u periodu od 3 - 4 sata. Rastvor komplementarno vezane RNK je čuvan na -20°C do upotrebe.
[0370] U nekim slučajevima, dvojna spirala (dsRNK) sintetisana je više od jednom. Različite šarže su obeležene različitim ekstenzijama. Na primer, AD-62933.1 i AD-62933.2 su različite šarže iste dvojne spirale.
Ćelijska kultura i transfekcije
[0371] Korišćeni su primarni hepatociti majmuna cinomolgusa (PCH) i primarni mišji hepatociti (PMH). PCH (Celsis br. M003055, serija CBT) ili PMH (sveže izolovani) transficirani su dodatkom 14,8 µl Opti-MEM sa 0,2 µl Lipofectamine RNAiMax po bunarčiću
1
(Invitrogen, Carlsbad CA. kat. br. 13778-150) u 5 µl dvojne spirale siRNK po bunarčiću, na ploču sa 96 bunarčića, i inkubacijom na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. 80 µl InVitroGRO pacovskog medijuma (InVitro Technologies) sa ∼2 x10<4>PCH ili PMH ćelija je zatim dodato u smešu siRNK. Ćelije su inkubirane 24 sata pre prečišćavanja RNK. Eksperimenti sa jednom dozom su obavljeni sa finalnim koncentracijama dvojne spirale od 10 ili 20 nM i 0,1 ili 0,2 nM, i eksperimenti doznog odgovora su obavljeni za dozne opsege od 10 nM do 36 fM finalne koncentracije dvojne spirale za 8, 6-struka razblaženja.
Izolovanje potpune RNK
[0372] Potpuna RNK je izolovana korišćenjem kompleta za izolovanje mRNK DYNABEADS (Invitrogen, deo br: 610-12). Ćelije su sakupljene i lizirane u 150 µl pufera za lizu/vezujućeg pufera, a zatim mešane tokom 5 minuta na 850 o/min pomoću uređaja Eppendorf Thermomixer (brzina mešanja je bila ista tokom celog procesa). Deset mikrolitara magnetnih perlica i 80 µl smeše pufera za lizu/vezujućeg pufera dodato je na ploču sa okruglim dnom i mešano 1 minut. Magnetne perlice su uhvaćene korišćenjem magnetnog postolja, i supernatant je uklonjen bez remećenja perlica. Nakon uklanjanja supernatanta, lizirane ćelije su dodate preostalim perlicama i mešane tokom 5 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, magnentne perlice su isprane 2 puta sa 150 µl pufera za ispiranje A i mešane 1 minut. Perlice su ponovo uhvaćene, i supernatant je uklonjen. Perlice su zatim isprane sa 150 µl pufera za ispiranje B, uhvaćene, i supernatant je uklonjen. Perlice su zatim isprane sa 150 µl pufera za eluiranje, uhvaćene, i supernatant je uklonjen. Perlice su ostavljene da se suše tokom 2 minuta. Nakon sušenja, 50 µl pufera za eluiranje je dodato i mešano tokom 5 minuta na 70°C. Perlice su uhvaćene na magnetu tokom 5 minuta. 40 µl supernatanta je uklonjeno i dodato na drugu ploču sa 96 bunarčića.
Sinteza cDNK
Sinteza cDNK je obavljena pomoću kompleta za reversnu transkripciju cDNK velikog kapaciteta ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, kat. br.4368813).
[0374] Osnovna smeša od 2 µl 10X pufera, 0,8 µl 25X dNTP, 2 µl nasumičnih prajmera (Random primers), 1 µl reversne transkriptaze, 1 µl inhibitora RNaze i 3,2 µl H2O po reakciji dodato je u 10 µl ukupne RNK. cDNK je dobijena koristeći toplotni ciklizator Bio-Rad C-1000 ili S-1000 (Hercules, CA) u sledećim koracima: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 s, 4°C zadržavanje.
1
PCR u realnom vremenu
[0375] 2 µl cDNK je dodato u osnovnu smešu koja sadrži 0,5 µl mišjeg GAPDH (kat. br.
4352339E Life Technologies) ili posebno napravljenih GAPDH majmuna cinomolgusa TaqMan sonde: (F- GCATCCTGGGCTACACTGA, (SEQ ID NO: 13) R-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC (SEQ ID NO: 14), sonda- CCAGGTGGTCTCCTCC (SEQ ID NO: 15)), 0,5µl humanog ili mišjeg HAO1 (HS00213909_M1- koji je unakrsno reaktivan sa HOA1 majmuna cinomolgusa, Mm 00439249_m1 za mišje testove, life technologies) i 5 µl Lightcycler 480 sonde osnovne smeše (Roche kat. br.04887301001) po bunarčiću na 50 ploča sa 384 bunarčića (Roche kat. br. 04887301001). PCR u realnom vremenu je obavljena na LightCycler480 sistemu PCR u realnom vremenu (Roche) koristeći test ΔΔCt(RQ). Svaka dvojna spirala je ispitana u dve nezavisne transfekcije, i svaka transfekcija je ispitana u duplikatu, ako nije drugačije naznačeno u tabelama sa rezimiranim rezultatima.
[0376] Da bi se izračunao umnožak relativne promene, podaci u stvarnom vremenu su analizirani koristeći postupak ΔΔCt i normalizovani su na testove izvedene sa ćelijama transficiranim sa 10 nM AD-1955, ili lažno transficiranim ćelijama. Vrednosti IC50s su izračunate koristeći model podešavanja 4 parametra, koristeći XLFit, i normalizovane su na ćelije transficirane sa AD-1955 ili naivne ćelije.
[0377] Sens i antisens sekvence AD-1955 su: SENS: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' (SEQ ID NO: 16); i ANTISENS: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (SEQ ID NO: 17).
Tabela B: Skraćenice nukleotidnih monomera korišćenih u prikazu sekvenci nukleinskih kiselina.
1
1
11
Primer 1. Dizajn, specifičnost i procena delotvornosti siRNK
[0378] Dizajn siRNK je izveden radi identifikacije siRNK koje ciljaju HAO1 transkripte čoveka, majmuna cinomolgusa, miša i pacova navedene u NCBI Gene bazi podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).
[0379] Dizajn je koristio sledeće transkripte iz NCBI RefSeq kolekcije: mRNK HAO1 čoveka (Homo sapiens) je NM_017545.2; mRNK HAO1 majmuna cinomolgusa (Macaca fascicularis) je XM_005568381.1; mRNK HAO1 miša (Mus musculus) je NM_010403.2; mRNK HAO1 pacova (Rattus norvegicus) je XM_006235096.1.
[0380] Usled velikog neslaganja sekvenci primata/glodara, dvojne spirale siRNK su dizajnirane u nekoliko odvojenih šarži, uključujući, bez ograničenja, šarže koje sadrže dvojne spirale koji odgovaraju samo humanim i cinomolgusovim transkriptima; samo humane, cinomolgusove, mišje i pacovske transkripte; i samo mišje i pacovske transkripte. Sve dvojne spirale siRNK su dizajnirane da dele 100% identičnosti sa navedenim humanim transkriptom i transkriptima drugih vrsta koji se razmatraju u dizajnu svake šarže (iznad).
[0381] Specifičnost svih mogućih 19mera je predviđena iz svake sekvence. Kandidati za 19mere koji nisu imali ponavljanja duža od 7 nukleotida su onda izabrani. Tih 1069 kandidata za humane/cino, 184 za humane/cino/mišje/pacovske i 579 za mišje/pacovske siRNK su korišćeni u sveobuhvatnim pretragama naspram odgovarajućih transkriptoma (definisani kao skup NM_ i XM_ zapisa u humanim, cino, mišjim ili pacovskim NCBI Refeseq skupovima) koristeći iscrpni „nasilni“ algoritam implementiran u python kod 'BruteForce.py'. Kod je zatim raščlanio poravnanja transkript-oligo kako bi se dobio rezultat na osnovu pozicije i broja neusklađenih parova između siRNK i bilo kog potencijalno transkripta „van okvira“. Rezultat van okvira je ponderisan kako bi se naglasile razlike između regiona „klice“ siRNK, na pozicijama 2-9 od 5' kraja molekula. Svakom paru oligo-transkript iz nasilne pretrage data je ocena neusklađenih parova sabiranjem pojedinačnih rezultata neusklađenih parova; neusklađeni parovi na poziciji 2-9 su računati kao 2,8, neusklađeni parovi na pozicijama mesta cepanja 10-11 su računati kao 1,2, a neusklađeni parovi u regionu 12-19 su računati kao 1,0. Dodatno predviđanje van okvira je obavljeno putem poređenja učestalosti heptamera i oktomera dobijenih od 3 različita heksamera, dobijena od klice svakog oligo. Heksameri sa pozicija 2-7 u odnosu na 5' početak korišćeni su da se dobiju 2 heptamera i jedan oktomer. Heptamer1 je dobijen dodavanjem 3' A heksameru; heptamer2 je dobijen dodavanjem 5' A heksameru, oktomer je dobijen dodavanjem A na 5' i 3' krajeve heksamera. Prethodno je izračunata učestalost oktomera i heptamera u humanom, cino, mišjem ili pacovskom 3'UTRomu (definisan kao podsekvenca transkriptoma iz NCBI Refseq baze podataka u kojoj je kraj kodirajućeg regiona, „CDS“, jasno definisan). Učestalost oktomera je normalizovana na učestalost heptamera koristeći vrednost medijane iz raspona učestalosti oktomera. „mirSeedScore“ rezultat je zatim izračunat računanjem zbira ((3 X normalizovani broj oktomera) (2 X broj heptamera2) (1 X broj heptamera1)).
[0382] Oba lanca siRNK su raspoređena u kategoriju specifičnosti u skladu sa izračunatim rezultatima: rezultat veći od 3 se klasifikuje kao veoma specifičan, jednak 3 kao specifičan, a između 2,2 i 2,8 se klasifikuje kao umereno specifičan. siRNK su razvrstane na osnovu specifičnosti antisens lanca. Zatim su izabrane dvojne spirale iz humanih/cino i mišjih/pacovskih skupova čiji antisens oligo nisu imali GC na prvoj poziciji, nisu imali G na pozicijama 13 i 14, i imali su 3 ili više U ili A u regionu klice (karakteristike dvojne spirale sa velikom predviđenom efikasnošću). Slično tome, izabrane su dvojne spirale iz humanih/cino/mišjih i humanih/cino/mišjih/pacovskih skupova koje su imale 3 ili više U ili A u regionu klice.
[0383] Kandidati za GalNAc konjugovane dvojne spirale, dugačke 21 i 23 nukleotida na sens, odnosno antisens lancu, konstruisani su produžavanjem antisens 19mera za 4 nukleotida u 3' smeru (uz očuvanje savršene komplementarnosti sa ciljnim transkriptom). Sens lanac je naznačen kao obrnuti komplement prvih 21 nukleotida antisens 23mera. Odabrane su dvostruke spirale koje održavaju savršeno sparivanje sa transkriptima svih izabranih vrsta duž svih 23 nukleotida.
[0384] Antisens lanci koji su sadržali C ili G na prvoj 5' poziciji su modifikovani da imaju U na prvoj 5' poziciji, osim ako to ne bi dovelo do niza od 4 ili više uzastopnih U (5' → 3'), u kom slučaju su modifikovani da imaju A na prvoj 5' poziciji. Sens lanci koji treba da se spare u dvojne spirale sa ovim „UA razmenjenim“ antisens lancima su modifikovani na odgovarajući način kako bi se održala komplementarnost. Primeri koji su opisani u nastavku uključuju AD-62989 i AD-62993.
[0385] Ukupno 31 sens i 31 antisens dobijenih humanih/cino, 19 sens i 19 antisens dobijenih humanih/cino/mišjih/pacovskih i 48 sens i 48 antisens dobijenih mišjih/pacovskih 21/23mer oligo je sintetisano i formirano u GalNAc konjugovane dvojne spirale.
11
[0386] Sekvence sens i antisens lanaca modifikovanih dvojnih spirala su prikazane u Tabeli 1, a sekvence sens i antisens lanaca nemodifikovanih dvojnih spirala su prikazane u Tabeli 2. Tabela 1a. HAO1 modifikovane sekvence
a
11
11 a
11
11
11
12
a
a
12
12
12 a
12
12
12 N v d e s e
A
6 1
A
6 5
A
6 9
A
6 3
A
6 6
A
6 0
A
6 4
A
6 2
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
Tabela 2a. HAO1 nemodifikovane sekvence (humana i humana/mišja)
14
Nazi SE Sekvenca sens lanca SE Sekvenca antisens lanca Pozicija u
14
Nazi SE Sekvenca sens lanca SE Sekvenca antisens lanca Pozicija u
14
Nazi SE Sekvenca sens lanca SE Sekvenca antisens lanca Pozicija u
14
Nazi SE Sekvenca sens lanca SE Sekvenca antisens lanca Pozicija u
1
Nazi SE Sekvenca sens lanca SE Sekvenca antisens lanca Pozicija u
1 1
Nazi SE Sekvenca sens lanca SE Sekvenca antisens lanca Pozicija u
1 2
T
1
14
1
Nazi SE Sekvenca sens lanca SE Sekvenca antisens lanca Pozicija u
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1 Primer 2. In vitro ispitivanje jedne doze u primarnim hepatocitima majmuna.
[0387] Delotvornost modifikovanih i konjugovanih dvojnih spirala siRNK HAO1 procenjena je testovima transfekcije u primarnim hepatocitima majmuna. siRNK HAO1 su transficirane u dve doze, 10 nM i 0,1 nM. Rezultati ovih testova su prikazani u Tabeli 3, i podaci su izraženi kao frakcija poruke koja ostaje u ćelijama transficiranim sa siRNK koje ciljaju HAO1, u poređenju sa ćelijama transficiranim sa siRNK za negativnu kontrolu, AD-1955 ± standardna devijacija (SD).
[0388] Rezultati su takođe prikazani na slici 3A. Slika 3B ilustruje dozni odgovor sa jednim od najaktivnijih konjugata (br. 31) (AD-62933) u primarnom skriningu sa dve doze; IC50 je ∼19 pM.
Tabela 3a. Ispitivanje jedne doze HAO1 u hepatocitima majmuna.
1
11
12
Tabela 3b. Dodatno ispitivanje jedne doze HAO1 u primarnim hepatocitima majmuna.
1
14
1 I
S
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Primer 3. In vitro ispitivanje jedne doze u primarnim hepatocitima miša.
[0389] Delotvornost modifikovanih i konjugovanih dvojnih spirala siRNK HAO1 procenjena je testovima transfekcije u primarnim hepatocitima miša. siRNK HAO1 su transficirane u dve doze, 20 nM i 0,2 nM. Rezultati ovih testova su prikazani u Tabeli 4, i podaci su izraženi kao frakcija poruke koja ostaje u ćelijama transficiranim sa siRNK koje ciljaju HAO1, u poređenju sa ćelijama transficiranim sa siRNK za negativnu kontrolu, AD-1955 ± standardna devijacija (SD).
Tabela 4a. Ispitivanje jedne doze HAO1 u primarnim hepatocitima miša.
1
1
1 ID DVOJNE Vrsta 20 nM 0,2 nM SD 20 nM SD 0,2 nM
Tabela 4b. Dodatno ispitivanje jedne doze HAO1 u primarnim hepatocitima miša.
1
1
11 2
12
ID DVOJNE Vrsta sensOligoNaziv 20 nM 0,2 nM SD 20 SD 0,2
Primer 4. Ispitivanje doznog odgovora u primarnim hepatocitima majmuna.
[0390] Vrednosti IC50 modifikovanih i konjugovanih dvojnih spirala siRNK HAO1 određene su u primarnim hepatocitima majmuna. siRNK HAO1 su transficirane u rasponu doza od 10 nM do 36 fM, finalna koncentracija dvojne spirale preko 8, 6-struka razblaženja. Rezultati ovih testova prikazani su u Tabeli 5.
Tabela 5a. Ispitivanje odgovora na dozu HAO1 u primarnim hepatocitima miša.
Tabela 5b. Dodatno ispitivanje odgovora na dozu HAO1 u primarnim hepatocitima miša.
1
Primer 5. ispitivanje doznog odgovora u primarnim hepatocitima miša.
[0391] Vrednosti IC50 modifikovanih i konjugovanih dvojnih spirala siRNK HAO1 određene su u primarnim hepatocitima miša. siRNK HAO1 su transficirane u rasponu doza od 10 nM do 36 fM, finalna koncentracija dvojne spirale preko 8, 6-struka razblaženja. Rezultati ovih testova prikazani su u Tabeli 6.
Tabela 6a. Ispitivanje odgovora na dozu HAO1 u primarnim hepatocitima miša.
1 4
Tabela 6b. Dodatno ispitivanje odgovora na dozu HAO1 u primarnim hepatocitima miša.
Tabela 7. Dodatno ispitivanje jedne doze HAO1 u primarnim hepatocitima cino majmuna i miša
1
1
1
1
1
2 ID dvojne 10 nM 0,1 nM SD 10 SD 0,1 10 nM 0,1 nM SD 10 SD 0,1
Tabela 8. Dodatno ispitivanje jedne doze u primarnim hepatocitima cino majmuna.
2 1
22
Primer 6. In vivo procena konjugata GO-GalNAc kod C57B6 miševa
[0392] Konjugati GO-GalNAc su supkutano dozirani kod C57B6 miševa sa 10, 5, 2,5 ili 1,25 mg/kg, i obaranje mRNK u jetri je procenjeno nakon 72 sata posle doze koristeći qPCR. ED50 za jednu dozu su bile približno 1,25 i 2,5 mg/kg za jedinjenje A (AD-62994), odnosno jedinjenje B (AD-62933). U studijama sa ponovljenom dozom, konjugati su supkutano dozirani na nedeljnom nivou (QW) tokom 4 nedelje, i nivoi GO mRNK u jetri su procenjeni 72 sata nakon 4. doze. ED50 za ponovljenu dozu je bila ~0,3 mg/kg za oba jedinjenja. Rezultati su prikazani na slici 4.
Primer 7. In vivo procena obaranja GO i uticaj na nivoe oksalata kod AGXT KO miševa.
2
[0393] siRNK GO (AD-40257) u lipidnoj nanočestici (LNP) dozirana je intravenski AGXT KO miševima (Salido et al (2006) PNAS 103:18249) sa 1 mg/kg. Nivoi urinarnog oksalata i glikolata su izmereni 15. dana koristeći jonsku hromatografiju/masenu spektroskopiju. Rezultati su prikazani na slici 5. Podaci su prikazani u odnosu na vrednosti pre doze i normalizovani su na kreatinin (Cr) radi kontrole razvodnjenosti urina. N=4 miševa po grupi, i intervali greške predstavljaju standardnu devijaciju.
Primer 8. In vivo procena konjugata GO-GalNAc na modelu obaranja AGXT pacova.
[0394] Kako bi se stvorio pacovski model PH1, siRNK AGXT (AD-63102) u LNP (AF-011-63102) intravenski je dozirana sa 1 mg/kg ženkama pacova tipa Sprag-Doli 1. dana i 7. dana kako bi se održalo smanjenje AGXT u jetri pacova, i 1% etilen glikol je dodat u pijaću vodu kako bi se dodatno stimulisala proizvodnja oksalata. 0. dana i 7. dana, nekim pacovima je takođe doziran konjugat GOGalNAc-siRNK (AD-62994) ili PBS kontrola. Rezultati su prikazani na slici 6. Slika 6A prikazuje kvantifikaciju nivoa mRNK AGXT u jetri 72 sata nakon jedne doze od 1 mg/kg siRNK AGXT u LNP. Na slici 6B, nivoi urinarnog oksalata su kvantifikovani od 24-časovnog urina prikupljenog -1. do 0. dana, 3. do 4. dana, 5. do 6. dana i 7. do 8. dana. Podaci su normalizovani na kreatinin radi kontrole razblaženosti urina. N=3 za AGXT grupe i N=2 za PBS kontrolnu grupu. Na slici 6C, isti ti pacovi (kao na slici 6B) praćeni su tokom 49 dana uz neprekinuto nedeljno doziranje 14. i 21. dana sa AF-011-63102 i AD-62994 i 24-časovno sakupljanje urina, kako je prikazano. Etilen glikol je ostao u pijaćoj vodi do 28. dana. Na slici 6D, prikazani je trajanje obaranja HAO1 kod pacova putem merenja nivoa mRNK nakon jedne nedelje ili četiri nedelje nakon poslednje od 4 doze (što odgovara 28. i 49. danu na slici 6C) i eksprimirani su u odnosu na nivoe koji su uočeni kod pacova lečenih PBS-om. Intervali greške svuda predstavljaju standardnu devijaciju.
2 4
2
Primer 9: In vivo procena konjugata GO-GalNAc
[0395] Ženkama c57BL/6 miševa, starosti 6-8 nedelja, data je jedna supkutana doza konjugata GO siRNK-GalNAc u Tabeli 7. Miševi su žrtvovani nakon 72 sata i jetra je ispitana na mRNK HAO pomoću bDNK analize. Rezultati su prikazani na slici 13.
Tabela 7: Konjugati GO (HAO) siRNK-GalNAc.
2
2 Primer 10: In vivo procena konjugata GO-GalNAc kod miševa
[0396] Ženkama C57 BL/6 miševa data je jedna supkutana doza od 3 mg/kg nekog od brojnih konjugata GO siRNK-GalNAc koji su ovde opisani ili PBS kontrole. Miševi su žrtvovani nakon 72 sata i obaranje mRNK HAO1 u jetri je procenjeno koristeći qPCR. Rezultati su prikazani na slici 14, izraženi u odnosu na PBS kontrolu.
Primer 11: Procena doznog odgovora konjugata GO-GalNAc kod miševa
[0397] Ženkama C57 BL/6 miševa je data jedna supkutana doza od 1 ili 3 mg/kg jednog od konjugata GO siRNK-GalNAc jedinjenja A (AD-62994), jedinjenja B (AD-62933), jedinjenja C (AD-65644), jedinjenja D (AD-65626), jedinjenja E (AD-65590), jedinjenja F (AD-65585) ili PBS kontrole. Deset dana kasnije, miševi su žrtvovani i obaranje mRNK HAO1 u jetri je procenjeno koristeći qPCR. U studijama sa ponovljenom dozom, jedinjenja C, D, F ili PBS kontrola su dozirani supkutano na nedeljnom nivou (QW) tokom 4 nedelje, i nivoi mRNK HAO1 u jetri su procenjeni 10 dana nakon poslednje doze. Rezultati za jednu dozu su prikazani na slici 15, a eksperimenti sa ponovljenom dozom su prikazani na slici 16, izraženi u odnosu na PBS kontrolu. Ovi podaci pokazuju poboljšanu potentnost jedinjenja AD-65644 i AD-65626 u odnosu na AD-62933 i jedinjenja AD-65590 i AD-65585 u odnosu na AD-62994.
Primer 12: Procena doznog odgovora jedinjenja D kod miševa
[0398] Ženkama C57 BL/6 miševa data je jedna supkutana doza od 0,1, 0,3, 1, 3 ili 10 mg/kg AD-65626 ili PBS kontrole. Deset dana kasnije, miševi su žrtvovani, i obaranje mRNK HAO1 u jetri je procenjeno koristeći qPCR, pri čemu su rezultati izraženi u odnosu na PBS kontrolu kako je prikazano na slici 17. Ovi rezultati pokazuju više nego 3-struko poboljšanje potentnosti u poređenju sa jedinjenjem AD-62933.
Primer 13: Odnos obaranja mRNK sa nivoima glikolata u serumu miševa
[0399] Ženkama C57 BL/6 miševa data je jedna supkutana doza od 0,1, 0,3, 1, 3 ili 10 mg/kg AD-65585 ili PBS kontrole. Deset dana kasnije, miševi su žrtvovani, i obaranje mRNK HAO1 u jetri je procenjeno koristeći qPCR, pri čemu su rezultati izraženi u odnosu na PBS kontrolu. Nivoi glikolata u uzorcima seruma ovih istih miševa kvantifikovani su koristeći jonsku hromatografiju kuplovanu sa masenom spektrometrijom, kako je prethodno opisano (Knight et al., Anal. Biochem. 2012 February 1; 421(1): 121-124). Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 18.
2
[0400] Ovi rezultati pokazuju da je AD-65585 podjednako potentan kao AD-65626, i oba imaju ED50 za jednu dozu od ~0,3 mg/kg kod WT miševa. Pored toga, utišavanje mRNK HAO1 dovodi do najviše 4-strukog porasta serumskog glikolata responsivnog na dozu (približno 200 uM) za najviše dve doze.
Primer 14: Odnos obaranja mRNK sa nivoima glikolata u serumu pacova
[0401] Mužjacima pacova tipa Sprag-Doli data je jedna supkutana doza od 1, 3 ili 10 mg/kg AD-65626 ili PBS kontrole. Četrnaest dana kasnije, pacovi su žrtvovani, i obaranje mRNK HAO1 u jetri je procenjeno koristeći qPCR, pri čemu su rezultati izraženi u odnosu na PBS kontrolu. Nivoi glikolata u uzorcima seruma tih istih pacova, koji su sakupljeni pre doziranja i 14. dana, kvantifikovani su koristeći jonsku hromatografiju kuplovanu sa masenom spektrometrijom, ponovo kako je opisano (Knight et al., Anal. Biochem. 2012 February 1; 421(1): 121-124). Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 19.
[0402] Kao što je uočeno kod miševa divljeg tipa, ovi rezultati pokazuju da utišavanje mRNK HAO1 kod pacova tipa Sprag-Doli dovodi najviše do 12-strukog porasta serumskog glikolata responsivnog na dozu (približno 140 µM) pri najvišoj dozi.
Primer 15: Farmakološke studije sa ALN-65585
Inhibicija HAO1 u hepatocitima.
[0403] Primarni hepatociti cino majmuna su transficirani sa RNAimax (Invitrogen) serijski razblaženim AD-65585 (ALN-65585, „ALN-GO1“) ili kontrolnom luciferazom koja ne cilja mRNK (AD 1955) pri 10 nM. Relativni nivoi mRNK HAO1 su utvrđeni normalizacijom na nivoe mRNK GAPDH, kako je kvantifikovano pomoću RT-PCR u realnom vremenu. Podaci su prikazani da se izračuna vrednost IC50 od 10 pM. Rezultati su prikazani na slici 20.
[0404] In vitro transfekcija AD-65585 pokazuje ED50 od približno 1 0 pM: u primarnim hepatocitima cinomolgusa.
Farmakologija jedne doze kod miša
[0405] Farmakologija ALN-GO1 je procenjena kod miša kvantifikacijom mRNK HAO1 u jetri i nivoa glikolata u serumu (slika 21). Jedna s.c. doza ALN-GO1 dovela je do dozno zavisne supresije mRNK HAO1, gde doza od 10 mg/kg dovodi do utišavanja ED90. Procenjeno je da
2
je doza ED50 za utišavanje GO1 kod miša 0,3 mg/kg. Nivoi glikolata u serumu su rasli na način responsivan na dozu, pri čemu je maksimalni nivo približno 4-struko veći od početnih nivoa. Rezultati su prikazani na slici 21, i ilustruju nivoe mRNK HAO1 u jetri i serumskog glikolata 10 dana nakon jedne supkutane doze ALN-65585 kod C57BL/6 miševa. Intervali predstavljaju srednju vrednost za 3 ili 4 životinje, a intervali greške predstavljaju standardnu devijaciju.
Trajanje jedne doze kod miša
[0406] Utišavanje GO1 je bilo dugotrajno i reverzibilno posle jedne s.c. doze (slika 22). Jedna s.c. doza ALN-GO1 kod miševa od 3 mg/kg dovela je do ≥70% utišavanja mRNK tokom približno 6 nedelja, nakon čega su se nivoi mRNK vratili na početne nivoe do 12 nedelja posle doze. Rezultati su prikazani na slici 22: Nivoi mRNK HAO1 u jetri u više termina nakon jedne supkutane doze ALN-65585 kod C57BL/6 miševa. Svaki podatak predstavlja srednju vrednost za 3 životinje, a intervali greške predstavljaju standardnu devijaciju.
Farmakologija jedne doze kod pacova
[0407] Farmakologija ALN-GO1 je takođe procenjena kod pacova kvantifikacijom nivoa mRNK HAO1 u jetri (slika 23). Jedna s.c. primena ALN-GO1 kod mužjaka pacova tipa Sprag-Doli dovela je do dozno zavisne supresije mRNK HAO1, gde doza ≥ 3 mg/kg dovodi do utišavanja ED90. Rezultati su prikazani na slici 23: Nivoi mRNK HAO1 u jetri 10 dana nakon jedne supkutane doze ALN-65585 kod pacova tipa Sprag-Doli. Intervali predstavljaju srednju vrednost za 3 životinje, a intervali greške predstavljaju standardnu devijaciju. Procenjeno je da je ED50 doza za utišavanje GO1 kod pacova 0,3 mg/kg.
Farmakologija jedne doze kod AGXT KO miša
[0408] Dejstvo ALN-GO1 na nivoe oksalata procenjeno je na AGXT KO mišjem modelu PH1. Rezultati su prikazani na slici 24: 24-časovno lučenje urinarnog oksalata (gore) i glikolata (dole) Agxt KO miševa nakon jedne supkutane doze ALN-65585. Različita slova označavaju značajnu razliku između 3 dozne grupe svake specifične nedelje (n=3 po dozi). Urinarno lučenje tokom vremena nije se značajno promenilo kod životinje sa PBS kontrolom (n=1).
[0409] Nivoi urinarnog oksalata pokazali su dozno zavisno smanjenje nakon jedne doze ALN-GO1 sa maksimumom od približno 50% smanjenja oksalata pri dozi od 3 mg/kg koje je trajalo ≥3 nedelje pre povratka na nivoe pre doze. Nivoi urinarnog glikolata pokazali su dozno zavisno
21
povećanje nakon jedne doze ALN-GO1 sa maksimumom od približno 5-strukog povećanja pri dozi od 3 mg/kg koje je trajalo ≥4 nedelje.
Farmakologija jedne doze na pacovskom modelu sa indukovanom PH1
[0410] ALN-GO1 je procenjen na drugom PH1 modelu glodara kada je AGXT u jetri inhibiran kod pacova koristeći siRNK, i nivoi oksalata su stimulisani etilen glikolom (slika 25A i slika 25B). mRNK HAO1 u jetri i 24-časovni urinarni oksalat su kvantifikovani, kako bi se odredio stepen smanjenja HAO1 koji je potreban za maksimalno smanjenje oksalata. Rezultati su prikazani na slici 25A i slici 25B: Nivoi mRNK HAO1 u jetri na pacovskom modelu indukovane PH1 14 dana nakon jedne supkutane doze ALN-65585 i nedeljnog doziranja AF-011-AGXT siRNK (2 doze, l mg/kg).24-časovni urinarni oksalat je normalizovan na urinarni kreatinin. Intervali predstavljaju srednju vrednost za 3 životinje, a intervali greške predstavljaju standardnu devijaciju. Grafikon korelacije mRNK i smanjenja oksalata predstavlja pojedinačne životinje iz više eksperimenata.
[0411] Jedna doza ALN-GO1 je na ovom modelu pokazala smanjenje mRNK i urinarnog oksalata responsivno na dozu sa približno 85% maksimalnim smanjenjem mRNK i približno 90% maksimalnim smanjenjem urinarnog oksalata uočenim pri najvećoj dozi ALN-GO1 (slika 25A i slika 25B). Na ovom pacovskom modelu indukovane PH1, smanjenja mRNK i urinarnog oksalata su dala korelaciju 1:1.
Farmakologija više doza na pacovskom modelu sa indukovanom PH1
[0412] Potentnost ALN-GO1 je ispitana u studijama na normalnim pacovima sa inibiranom aktivnošću AGXT i etilen glikolom (indukovani model PH1) pomoću kvantifikacije mRNK HAO1 u jetri i 24-časovnog urinarnog oksalata. Rezultati su prikazani na slici 26: Nivoi mRNK HAO1 u jetri na pacovskom modelu indukovane PH128 dana nakon više supkutanih doza ALN-65585 i ponovljenog i.v. doziranja AF-011-AGXT siRNK (4 doze, l mg/kg).24-časovni urinarni oksalat je normalizovan na urinarni kreatinin. Intervali predstavljaju srednju vrednost za 2 ili 3 životinje, a intervali greške predstavljaju standardnu devijaciju.
[0413] Lečenje sa ALN-GO1 dovelo je do produženog smanjenja urinarnog oksalata u svim lečenim grupama tokom približno 3 nedelje.28. dana nakon više doza ALN-GO1 (i četiri doze AF-011-AGXT) sve grupe su pokazale smanjenje mRNK >95%, snižavanje urinarnog oksalata >85%.
Farmakologija više doza kod NHP
[0414] Farmakologija ALN-GO1 je procenjena kod majmuna cinomolgusa (nehumani primat (NHP)) pomoću kvantifikacije mRNK HAO1 u biopsiji jetre i nivoa glikolata u serumu. Sledeća tabela pokazuje nacrt farmakološke studije NHP koji prikazuje dozni nivo i režim doziranja.
[0415] Rezultati su prikazani na slici 27. Nivoi glikolata u serumu NHP za sve grupe do 85. dana, podaci predstavljaju prosek za grupe sa 3 životinje po grupi, linije predstavljaju standardnu devijaciju. Biopsija mRNK HAO1 jetre 29. dana, linije predstavljaju prosek za grupu, simboli predstavljaju nivoe mRNK pojedinačne životinje u odnosu na PBS kontrolu 29. dana.
[0416] Nakon prvog meseca doziranja (29. dan), utišavanje mRNK responsivno na dozu je uočeno u svim grupama, sa utišavanjem mRNK do 99% u grupama 6 i 7 koje su dozirane sa 4 mg/kg na mesečnom nivou ili 2 mg/kg na nedeljnom nivou. Nivoi maksimalno povišenog serumskog glikolata od približno 70 µM su održani tokom najmanje 3 nedelje u grupi 6 koja je dozirana sa 4 mg/kg na mesečnom nivou. Srednji serumski glikolat
Primer 16: Dodatne sekvence siRNK.
[0417] Dizajn sa dodatnom siRNK je sproveden kako bi se identifikovale siRNK koje ciljaju HAO1 NM_017545.2.
21
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
21
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
21
21
21 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
21
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22
2
21 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
24 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
24
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
24 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
24
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
24
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
24
24
24 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
21
22 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
24
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 1
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 4
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 1
22 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 4
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 1
22
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 4
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 1
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2 4
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
4 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1
11 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
12
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
14
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1
1 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
21
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
22
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
24
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
2 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
1 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
2
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
4
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
4
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
41
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
42
Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
4
44 Nemodifikovana SEQ ID Modifikovana SEQ ID lanac Dužina
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4

Claims (20)

  1. Patentni zahtevi 1. Agens dvolančane RNKi koji može da inhibira ekspresiju HAO1 u ćeliji, pri čemu pomenuti agens dvolančane RNKi sadrži sens lanac i antisens lanac koji grade dvolančani region, pri čemu pomenuti sens lanac i pomenuti antisens lanac sadrže region komplementarnosti koji sadrži najmanje 15 susednih nukleotida koji se razlikuju za najviše 3 nukleotida od antisens sekvence SEQ ID NO:706; pri čemu, suštinski svi nukleotidi pomenutog sens lanca i suštinski svi nukleotidi pomenutog antisens lanca su modifikovani nukleotidi, i pri čemu je pomenuti sens lanac konjugovan sa ligandom vezanim na 3'-terminusu.
  2. 2. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu, svi nukleotidi pomenutog sens lanca i svi nukleotidi pomenutog antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
  3. 3. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1 ili 2, pri čemu, najmanje jedan od pomenutih modifikovanih nukleotida je izabran iz grupe koja se sastoji od nukleotida 3'-terminalnog dezoksi-timidina (dT), 2'-O-metil modifikovanog nukleotida, 2'-fluor modifikovanog nukleotida, 2'-dezoksi modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abaznog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata, neprirodne baze koja sadrži nukleotid, nukleotida koji sadrži 5'-fosforotioatnu grupu, nukleotida koji sadrži 5' fosfat ili mimetik 5' fosfata, i terminalni nukleotid povezan sa holesteril derivatom ili bisdecilamidnom grupom dodekanoinske kiseline.
  4. 4. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu najmanje jedan lanac sadrži 3' prepust od najmanje 1 nukleotida.
  5. 5. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu najmanje jedan lanac sadrži 3' prepust od najmanje 2 nukleotida.
  6. 6. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu je ligand
  7. 7. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu pomenuti agens RNKi sadrži 6 do 8 fosforotioatnih internukleotidnih veza.
  8. 8. Dvolančana RNKi iz zahteva 7, pri čemu antisens lanac sadrži dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu, i sens lanac sadrži najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu ili 3'-terminusu.
  9. 9. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu, bazni par na poziciji 1 5'-kraja antisens lanca dvojne spirale je bazni par AU.
  10. 10. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 1, pri čemu, agens RNKi je agens koji sadrži sekvencu sens lanca gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauauaL96 (SEQ ID NO:213) i sekvencu antisens lanca usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa (SEQ ID NO:330) (AD-65585), pri čemu, L96 je N-[tris(GalNAc-alkil)-amidodekanoil]-4-hidroksiprolinol (Hyp-(GalNAc-alkil)3), Af je 2'-fluoradenozin-3'-fosfat, Cf je 2'-fluorcitidin-3'-fosfat, Uf je 2'-fluoruridin-3'-fosfat, a je 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, c je 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, g je 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat, u je 2'-O-metiluridin-3'-fosfat i s je fosforotioatna veza.
  11. 11. Agens dvolančane RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 9, pri čemu suštinski svi nukleotidi pomenutog sens lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od 2'-O-metil modifikacije i 2'-fluor modifikacije, pri čemu pomenuti sens lanac sadrži dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu, pri čemu suštinski svi nukleotidi pomenutog antisens lanca sadrže modifikaciju izabranu od grupe koja se sastoji od 2'-O-metil modifikacije i 2'-fluor modifikacije, pri čemu pomenuti antisens lanac sadrži dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu, i pri čemu je pomenuti sens lanac konjugovan sa jednim ili više derivata GalNAc povezanih preko dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera na 3'-terminusu.
  12. 12. Agens dvolančane RNKi iz zahteva 11 za upotrebu u postupku lečenja bolesti povezane sa HAO1, pri čemu se pomenuti agens RNKi supkutano primenjuje na ispitaniku.
  13. 13. Agens RNKi iz zahteva 12, pri čemu svi nukleotidi pomenutog sens lanca i svi nukleotidi pomenutog antisens lanca sadrže modifikaciju.
  14. 14. Agens RNKi za primenu iz zahteva 12, pri čemu je ispitanik čovek.
  15. 15. Agens RNKi za primenu iz zahteva 14, pri čemu čovek ima primarnu hiperoksaluriju tip 1 (PH1).
  16. 16. Agens RNKi za primenu iz zahteva 12, pri čemu će se agens dvolančane RNKi primenjivati u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg.
  17. 17. Agens RNKi za primenu iz zahteva 16, pri čemu će se agens dvolančane RNKi primenjivati u dozi od oko 0,1 mg/kg, oko 1,0 mg/kg ili oko 3,0 mg/kg.
  18. 18. Agens RNKi za primenu iz zahteva 16, pri čemu pomenuti agens RNKi treba da se primenjuje u dve ili više doza.
  19. 19. Agens RNKi za primenu iz zahteva 18, pri čemu će se pomenuti agens RNKi primenjivati u intervalima izabranim iz grupe koja se sastoji od jednom na svakih oko 12 sati, jednom na svakih oko 24 sata, jednom na svakih oko 48 sati, jednom na svakih oko 72 sata i jednom na svakih oko 96 sati.
  20. 20. Agens RNKi za primenu iz zahteva 18, pri čemu navedeni agens RNKi treba da se primenjuje jednom nedeljno u trajanju do 2 nedelje, do 3 nedelje, do 4 nedelje, do 5 nedelja, ili duže.
RS20220081A 2014-10-10 2015-10-09 Kompozicije i postupci za inhibiciju ekspresije gena hao1 (oksidaza 1 hidroksilne kiseline (glikolat oksidaza)) RS62854B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462062751P 2014-10-10 2014-10-10
US201562147976P 2015-04-15 2015-04-15
US201562214602P 2015-09-04 2015-09-04
EP15848512.8A EP3204015B1 (en) 2014-10-10 2015-10-09 Compositions and methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
PCT/US2015/054881 WO2016057893A1 (en) 2014-10-10 2015-10-09 Compositions and methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62854B1 true RS62854B1 (sr) 2022-02-28

Family

ID=55653836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220081A RS62854B1 (sr) 2014-10-10 2015-10-09 Kompozicije i postupci za inhibiciju ekspresije gena hao1 (oksidaza 1 hidroksilne kiseline (glikolat oksidaza))

Country Status (42)

Country Link
US (4) US10478500B2 (sr)
EP (2) EP4039809A1 (sr)
JP (4) JP6836988B2 (sr)
KR (3) KR102558604B1 (sr)
CN (2) CN113599389B (sr)
AU (3) AU2015330726B9 (sr)
BR (1) BR112017006469A2 (sr)
CA (2) CA2963843C (sr)
CO (1) CO2017004728A2 (sr)
CR (1) CR20170190A (sr)
CY (2) CY1125364T1 (sr)
DK (1) DK3204015T3 (sr)
DO (1) DOP2017000094A (sr)
EA (1) EA037115B1 (sr)
EC (1) ECSP17028310A (sr)
ES (1) ES2905889T3 (sr)
FI (1) FIC20220011I1 (sr)
HR (1) HRP20211971T1 (sr)
HU (2) HUE057327T2 (sr)
IL (3) IL293229B2 (sr)
JO (2) JO3558B1 (sr)
LT (2) LT3204015T (sr)
LU (1) LUC00252I2 (sr)
MX (2) MX382225B (sr)
MY (1) MY192926A (sr)
NL (1) NL301167I2 (sr)
NO (1) NO2022009I1 (sr)
NZ (1) NZ730404A (sr)
PE (1) PE20171763A1 (sr)
PH (1) PH12017500669A1 (sr)
PL (1) PL3204015T3 (sr)
PT (1) PT3204015T (sr)
RS (1) RS62854B1 (sr)
SG (2) SG11201702836PA (sr)
SI (1) SI3204015T1 (sr)
SM (1) SMT202200026T1 (sr)
TN (1) TN2017000125A1 (sr)
TW (3) TWI755351B (sr)
UA (1) UA126266C2 (sr)
UY (1) UY36357A (sr)
WO (1) WO2016057893A1 (sr)
ZA (1) ZA201702071B (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG194751A1 (en) 2011-06-30 2013-12-30 Arrowhead Res Corp Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis b virus
RS61892B1 (sr) * 2013-12-27 2021-06-30 Dicerna Pharmaceuticals Inc Postupci i kompozicije za specifičnu inhibiciju glikolat oksidaze (hao1) pomoću dvolančane rnk
TWI755351B (zh) 2014-10-10 2022-02-21 美商艾爾妮蘭製藥公司 用於抑制ｈａｏ１（羥酸氧化酶１（乙醇酸鹽氧化酶））基因表現的組合物及方法
WO2016205323A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
WO2017027350A2 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai therapy for hepatitis b virus infection
JOP20190015A1 (ar) 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
ES2639863B1 (es) 2017-03-10 2018-09-20 Universidad De Granada Compuestos para el tratamiento de enfermedades causadas por la acumulación de oxalato
MA52546A (fr) 2017-04-11 2020-02-19 Arbutus Biopharma Corp Compositions ciblées
AU2018301829B2 (en) * 2017-07-13 2024-08-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibition of HAO1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase) gene expression
JP7277432B2 (ja) 2017-07-13 2023-05-19 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
TWI851574B (zh) * 2018-05-14 2024-08-11 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP3898979A4 (en) * 2018-12-19 2022-10-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amyloid precursor protein (app) rnai agent compositions and methods of use thereof
EP3898661A1 (en) * 2018-12-21 2021-10-27 Precision BioSciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
WO2021086874A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 GyanRx Sciences, Inc. Heterocyclic carboxylate compounds as glycolate oxidase inhibitors
CN115348883B (zh) * 2019-11-27 2024-11-15 诺华股份有限公司 用于治疗杜兴氏肌营养不良症的化合物和方法
WO2021188611A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
CA3198823A1 (en) * 2020-10-21 2022-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria
WO2022104062A1 (en) 2020-11-12 2022-05-19 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases having specificity for recognition sequences in the dystrophin gene
AU2021393417A1 (en) * 2020-12-01 2023-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
WO2022212153A1 (en) * 2021-04-01 2022-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
US20240240188A1 (en) 2021-06-04 2024-07-18 Neumirna Therapeutics Aps Antisense oligonucleotides targeting adenosine kinase
JP2024528659A (ja) 2021-07-19 2024-07-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 非原発性高シュウ酸尿症疾患または障害を有するまたは発症するリスクがある対象を治療するための方法および組成物

Family Cites Families (223)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
EP0497875B1 (en) 1989-10-24 2000-03-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
EP0544824B1 (en) 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
DE69233087T2 (de) 1991-11-22 2003-12-24 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
EP1044987B1 (en) 1991-12-24 2006-02-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2'-modified oligonucleotides
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
WO1994000569A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
JPH08503855A (ja) 1992-12-03 1996-04-30 ジェンザイム・コーポレイション 嚢胞性線維症に対する遺伝子治療
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
EP0685234B1 (en) 1993-02-19 2000-05-10 Nippon Shinyaku Company, Limited Drug composition containing nucleic acid copolymer
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
JPH09507836A (ja) 1993-11-16 1997-08-12 ジンタ・インコーポレイテッド 非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマー
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
ATE327244T1 (de) 1995-03-06 2006-06-15 Isis Pharmaceuticals Inc Verfahren zur synthese von 2'-0-substituierten pyrimidinen und oligomere davon
JPH11508231A (ja) 1995-05-26 1999-07-21 ソマティックス セラピー コーポレイション 安定な脂質／核酸複合体を含む送達ビヒクル
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
EP0857217B1 (en) 1995-10-16 2005-04-13 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
EP1012331B1 (en) 1997-07-01 2006-03-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU6430599A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Cytogenix, Inc. Enzymatic synthesis of ssdna
AU6298899A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
JP2002537343A (ja) 1999-02-23 2002-11-05 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 多重粒子製剤
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001053307A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
ATE325806T1 (de) 2000-10-04 2006-06-15 Santaris Pharma As Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2005078097A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (Multifunctional siNA)
US20050176025A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of B-cell CLL/Lymphoma-2 (BCL-2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003015698A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
JP2005528082A (ja) * 2001-12-18 2005-09-22 モンドバイオテック・ラボラトリーズ・アンスタルト 間質性肺疾患の治療を向上させるためのインターフェロンγ又はパーフェニドンと分子診断薬との新規医薬組成物
US8101348B2 (en) 2002-07-10 2012-01-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2501744C (en) * 2002-10-09 2012-01-03 Central Iowa Health System Antitumor vaccination using allogeneic tumor cells expressing alpha (1,3)-galactosyltransferase
US8090542B2 (en) 2002-11-14 2012-01-03 Dharmacon Inc. Functional and hyperfunctional siRNA
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
AU2004220556B2 (en) 2003-03-07 2009-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
EP1608735A4 (en) 2003-04-03 2008-11-05 Alnylam Pharmaceuticals RNAI CONJUGATES
EP1633770B1 (en) 2003-06-13 2015-04-29 Alnylam Europe AG Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
DK1661905T3 (da) 2003-08-28 2012-07-23 Takeshi Imanishi Hidtil ukendte syntetiske nukleinsyrer af N-O-krydsbindingstype
US8084599B2 (en) * 2004-03-15 2011-12-27 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US7642348B2 (en) * 2004-10-04 2010-01-05 Rosetta Genomics Ltd Prostate cancer-related nucleic acids
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1989307B1 (en) 2006-02-08 2012-08-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
JP5704741B2 (ja) 2006-03-31 2015-04-22 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｅｇ５遺伝子発現の抑制のための組成物および方法
KR101221589B1 (ko) 2006-04-07 2013-01-15 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Ｔｌｒ７ 및 ｔｌｒ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ〔ｓｉｍｒａ〕 화합물
EP2194128B1 (en) * 2006-05-11 2012-08-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
EP2695608B1 (en) 2006-10-03 2016-11-23 Arbutus Biopharma Corporation Lipid containing formulations
JP5737937B2 (ja) 2007-07-09 2015-06-17 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009148137A1 (ja) * 2008-06-04 2009-12-10 協和発酵キリン株式会社 肥満細胞の脱顆粒を制御する核酸
EP2169071A1 (en) * 2008-09-29 2010-03-31 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rodent cancer model for human FGFR4 Arg388 polymorphism
WO2010048536A2 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Processes for preparing lipids
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
CA2764609C (en) 2009-06-10 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved cationic lipid of formula i
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
WO2011005860A2 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5' phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US20110045593A1 (en) 2009-08-19 2011-02-24 TransAlgae (Israel) Ltd. Transgenically mitigating the establishment and spread of transgenic algae in natural ecosystems by suppressing the activity of carbonic anhydrase
HRP20150566T1 (hr) 2009-08-27 2015-07-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Kompozicija za inhibiciju ekspresije gena i njegova upotreba
SG183374A1 (en) * 2010-02-24 2012-09-27 Arrowhead Res Corp Compositions for targeted delivery of sirna
US20130111674A1 (en) * 2010-03-26 2013-05-09 Danisco Us Inc. Treatment of keratinous fibers with an enzyme having perhydrolase activity
US8945847B2 (en) * 2010-05-24 2015-02-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent
CN103890000B (zh) * 2011-06-21 2017-09-01 阿尔尼拉姆医药品有限公司 血管生成素样3(ANGPTL3)iRNA组合物及其使用方法
WO2012177921A2 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for inhibiting hepcidin antimicrobial peptide (hamp) or hamp-related gene expression
WO2013075035A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Alnylam Pharmaceuticals Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
HK1200191A1 (en) * 2011-11-18 2015-07-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
US20130142861A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-06 National Yang Ming University Compositions And Method For Detecting And Treating Abnormal Liver Homeostasis And Hepatocarcinogenesis
EP2834259A4 (en) * 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US9133461B2 (en) * 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
JP2015525797A (ja) 2012-08-06 2015-09-07 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 糖質コンジュゲートｒｎａ剤およびその調製方法
PT2929031T (pt) * 2012-12-05 2018-01-19 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de pcsk9 e métodos de seu uso
KR102205278B1 (ko) 2013-03-14 2021-01-22 다이서나 파마수이티컬, 인크. 음이온성 약제를 제형화하는 방법
CN114015692B (zh) * 2013-03-14 2024-12-31 阿尔尼拉姆医药品有限公司 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法
RS61892B1 (sr) * 2013-12-27 2021-06-30 Dicerna Pharmaceuticals Inc Postupci i kompozicije za specifičnu inhibiciju glikolat oksidaze (hao1) pomoću dvolančane rnk
TWI755351B (zh) * 2014-10-10 2022-02-21 美商艾爾妮蘭製藥公司 用於抑制ｈａｏ１（羥酸氧化酶１（乙醇酸鹽氧化酶））基因表現的組合物及方法
WO2016205323A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
US10833934B2 (en) 2015-06-30 2020-11-10 British Telecommunications Public Limited Company Energy management in a network
AU2018301829B2 (en) 2017-07-13 2024-08-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibition of HAO1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase) gene expression
CN111845757A (zh) 2019-04-30 2020-10-30 通用汽车环球科技运作有限责任公司 分心驾驶消除系统
CN110649043B (zh) 2019-09-30 2021-11-19 厦门天马微电子有限公司 阵列基板、显示面板、显示装置及阵列基板的制备方法
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
TW202342749A (zh) 2023-11-01
IL293229B2 (en) 2024-07-01
MY192926A (en) 2022-09-15
WO2016057893A1 (en) 2016-04-14
JP2017532038A (ja) 2017-11-02
CN108064154A (zh) 2018-05-22
CN113599389B (zh) 2024-12-27
AU2021269372A1 (en) 2021-12-16
PE20171763A1 (es) 2017-12-21
LT3204015T (lt) 2022-01-10
US20250064936A1 (en) 2025-02-27
CO2017004728A2 (es) 2017-09-29
WO2016057893A9 (en) 2016-05-19
TW202223090A (zh) 2022-06-16
MX2021005224A (es) 2021-06-18
MX2017004634A (es) 2017-09-19
IL293229B1 (en) 2024-03-01
JO3558B1 (ar) 2020-07-05
DOP2017000094A (es) 2017-07-15
EP3204015A4 (en) 2018-06-20
US20230121944A1 (en) 2023-04-20
CA2963843C (en) 2023-03-21
AU2015330726A1 (en) 2017-05-11
US20170304446A1 (en) 2017-10-26
CN113599389A (zh) 2021-11-05
LTPA2022004I1 (sr) 2022-04-25
AU2015330726B9 (en) 2021-09-16
KR102558604B1 (ko) 2023-07-26
SMT202200026T1 (it) 2022-03-21
EP3204015A1 (en) 2017-08-16
FIC20220011I1 (fi) 2022-04-06
CA3187050A1 (en) 2016-04-14
KR102922344B1 (ko) 2026-02-06
NL301167I2 (nl) 2025-11-05
CY2022008I1 (el) 2023-01-05
US11446380B2 (en) 2022-09-20
PL3204015T3 (pl) 2022-02-21
CY2022008I2 (el) 2023-01-05
EP3204015B1 (en) 2021-12-08
ES2905889T3 (es) 2022-04-12
EP4039809A1 (en) 2022-08-10
PH12017500669A1 (en) 2017-10-09
SI3204015T1 (sl) 2022-04-29
JP7404212B2 (ja) 2023-12-25
EA037115B1 (ru) 2021-02-08
EA201790789A1 (ru) 2017-08-31
US20200316201A1 (en) 2020-10-08
TWI755351B (zh) 2022-02-21
AU2015330726B2 (en) 2021-09-02
JP2024037855A (ja) 2024-03-19
TW202503057A (zh) 2025-01-16
NO2022009I1 (no) 2022-04-05
CN108064154B (zh) 2021-08-27
CA2963843A1 (en) 2016-04-14
KR20230113654A (ko) 2023-07-31
ECSP17028310A (es) 2018-03-31
IL251276B (en) 2022-07-01
LUC00252I2 (sr) 2025-03-04
HUE057327T2 (hu) 2022-05-28
SG11201702836PA (en) 2017-05-30
CR20170190A (es) 2017-07-26
KR20260020497A (ko) 2026-02-11
CY1125364T1 (el) 2023-01-05
BR112017006469A2 (pt) 2017-12-12
UY36357A (es) 2016-11-30
NZ730404A (en) 2023-09-29
IL310466A (en) 2024-03-01
JOP20200115A1 (ar) 2020-05-18
JP2026041749A (ja) 2026-03-10
ZA201702071B (en) 2019-06-26
SG10201913756QA (en) 2020-03-30
DK3204015T3 (da) 2022-01-17
PT3204015T (pt) 2022-02-09
TWI864340B (zh) 2024-12-01
TW201619382A (zh) 2016-06-01
US10478500B2 (en) 2019-11-19
UA126266C2 (uk) 2022-09-14
AU2024227044A1 (en) 2024-12-19
IL251276A0 (en) 2017-05-29
KR20170083042A (ko) 2017-07-17
TN2017000125A1 (en) 2018-10-19
JP6836988B2 (ja) 2021-03-03
IL293229A (en) 2022-07-01
HRP20211971T1 (hr) 2022-03-18
JP7775271B2 (ja) 2025-11-25
AU2021269372B2 (en) 2024-07-11
MX382225B (es) 2025-03-13
HUS2200011I1 (hu) 2022-04-28
JP2021019609A (ja) 2021-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7775271B2 (ja) Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子の発現の阻害のための組成物および方法
JP2023061967A (ja) Ｔｍｐｒｓｓ６ ｉｒｎａ組成物及びその使用方法
JP7767365B2 (ja) Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子発現の阻害方法
RS57418B1 (sr) Serpina1 irnk sastavi i postupci njihove primene
RS61297B1 (sr) Transtiretinske (ttr) kompozicije irnk i postupci za njihovu primenu u lečenju ili prevenciji bolesti povezanih sa ttr-om
WO2022119873A1 (en) Methods and compositions for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
US20230392155A1 (en) Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria
BR122022024440B1 (pt) Agente irna de fita dupla, ou sal do mesmo, capaz de inibir a expressão de hao1 em uma célula, composição farmacêutica e uso dos mesmos
HK1241287B (en) Compositions and methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression