HU227217B1 - Immunoglobulin variants and uses thereof - Google Patents

Immunoglobulin variants and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
HU227217B1
HU227217B1 HU0500954A HUP0500954A HU227217B1 HU 227217 B1 HU227217 B1 HU 227217B1 HU 0500954 A HU0500954 A HU 0500954A HU P0500954 A HUP0500954 A HU P0500954A HU 227217 B1 HU227217 B1 HU 227217B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
antigen
binding fragment
Prior art date
Application number
HU0500954A
Other languages
English (en)
Inventor
Camellia Adams
Andrew C Chan
Craig W Crowley
Henry B Lowman
Gerald R Nakamura
Leonard G Presta
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32685285&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU227217(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of HUP0500954A2 publication Critical patent/HUP0500954A2/hu
Publication of HU227217B1 publication Critical patent/HU227217B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

A leírás terjedelme 122 oldal (ezen belül 25 lap ábra)
HU 227 217 Β1
A találmány tárgyát anti-CD20 antitestek, valamint azok B-sejttel összefüggő betegségek kezelésére történő alkalmazása képezi. Közelebbről, a találmány tárgyát humán CD20-hoz kötődő humanizált antitest vagy annak antigénkötő fragmense képezi, amely képes a főemlősök B-sejtjei számának csökkentésére. Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti antitestet kódoló nukleinsav; a találmány szerinti antitestet kódoló expressziós vektor; valamint a találmány szerinti nukleinsavat hordozó gazdasejt. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti humanizált antitestet megfelelő hordozóval együtt tartalmazó készítmény, valamint az ilyen készítményt tartályba foglalva tartalmazó gyártmány. Szintén a találmány tárgyához tartozik egy eljárás B-sejtek apoptózisának in vivő indukálására, valamint eljárások CD20-pozitív rák, autoimmun betegségek, illetve reumaszerű ízületi gyulladás kezelésére.
A limfociták a fehérvérsejtek számos csoportjának egyikét alkotják; funkciójuk az idegen antigének specifikus felismerése és az azok ellen irányuló reakció. A limfociták három fő osztálya a B-limfociták (B-sejtek), a T-limfociták (T-sejtek) és a természetes ölősejtek (NK-sejtek). A B-limfociták az antitesttermelésért és a humorális immunitás biztosításáért felelősek. A B-sejtek a csontvelőben érnek, majd a csontvelőt elhagyva felületükön antigénkötő antitestet expresszálnak. Ha egy natív B-sejt első alkalommal találkozik egy olyan antigénnel, amelyre a felületén lévő membránkötött antitest specifikus, gyors osztódásba kezd, és utódsejtjei memória B-sejtekké és effektorsejtekké („plazmasejtekké”) differenciálódnak. A memória B-sejtek hosszabb élettartamúak, és folyamatosan termelik a kiindulási sejt által termelttel azonos specifitású membránkötött antitestet. Ezzel szemben, a plazmasejtek nem a membránkötött antitestet, hanem annak szekretált alakját termelik. Az ilyen szekretált antitestek a humorális immunitás fő effektormolekulái.
A CD20-antigén (más néven humán B-limfocitákra korlátozódó differenciálódási antigén vagy Bp35) hozzávetőleg 35 kD molekulatömegű hidrofób transzmembrán protein, amely a pre-B-sejteken és az érett B-limfocitákon található [Valentiné és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264(19), 11 282 (1989); Einfeld és munkatársai: EMBO J. 7(3), 711 (1988)]. A CD20-antigén termelődését a B-sejtes non-Hodgkin-limfómák (NHL) több, mint 90%-án megfigyelték [lásd Anderson és munkatársai: Blood 63(6), 1424 (1984)], vérképzési őssejteken, pro-B-sejteken, normális plazmasejteken, illetve egyéb normális szöveteken azonban nem mutatták ki [Tedderés munkatársai: J. Immunoi. 135(2), 973 (1985)]. A CD20 vélhetően a sejtciklus beindítását és a differenciálódást aktiváló folyamat korai lépését (lépéseit) szabályozza (Tedder és munkatársai, lásd fentebb), és feltehetően kalciumion-csatornaként funkcionál [Tedderés munkatársai: J. Cell. Biochem. 14D, 195 (1990)].
Minthogy a B-sejt-limfómákon kimutatható a CD20 expressziója, ez az antigén az ilyen típusú limfómák kezelése során hatékony terápiás célba juttató eszközként alkalmazható. Az Egyesült Államokban több mint 300 000 ember szenved B-sejtes non-Hodgkin-limfómában, és évente 56 000 új esetet diagnosztizálnak. Például a kiújuló vagy makacs, alacsony fokú vagy follikuláris CD20-pozitív B-sejtes non-Hodgkinlimfómával diagnosztizált páciensek kezelésére a rituximab-antitestet (Rituxan®) alkalmazzák, amely humán CD20-antigén ellen irányuló, génsebészeti módszerekkel létrehozott kimerikus egér/humán monoklonális antitest [kereskedelmi forgalomban beszerezhető a Genentech Inc.-től (South San Francisco, California, USA)]. A Rituximab az 5 736 137 és 5 776 456 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban „C2B8 néven feltárt antitest. A hatásvizsgálatok során megállapított in vitro mechanizmus azt mutatja, hogy a Rituxan® humán komplementhez kötődik és komplementdependens citotoxicitás (CDC) révén a limfoid B-sejtvonalak lízisét eredményezi [Reff és munkatársai: Blood 83(2), 435 (1994)]. Ezen túlmenően, a Rituxan® jelentős mértékű aktivitást mutat az antitestdependens celluláris citotoxicitási (ADCC) tesztekben is. In vivő preklinikai vizsgálatokban kimutatták, hogy a Rituxan® cynomolgus majmok perifériás véréből, nyirokcsomóiból és csontvelőjéből - feltehetően komplement és sejtközvetítette folyamatokon keresztül - elpusztítja a B-sejteket [Reff és munkatársai: Blood 83(2), 435 (1994)]. A non-Hodgkin-limfómák kezelésére javasolt egyéb anti-CD20 antitestek közé tartozik a radioaktív Y90-izotóphoz kapcsolt egéreredetű Zavalin™ antitest (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, USA), és a Bexxar™, amely egy másik, teljes egészében egéreredetű - l131-izotóphoz konjugált - antitest (Corixa, WA, USA).
Az egéreredetű antitestek humán gyógyászatban történő alkalmazásának legfőbb korlátja a humán antiegér antitest (HAMA) reakció [lásd Miller és munkatársai: Blood 62, 988 (1983); és Schroff és munkatársai: Cancer Rés. 45, 879 (1985)]. Még az olyan kimerikus molekulák is képesek jelentős mértékű immunreakciót (kimerikus antitest elleni humán immunreakció, HACA), amelyekben rágcsálóeredetű antitestek variábilis (V) doménjei vannak humán antitestek konstans régióihoz fuzionálva [lásd Neuberger és munkatársai: Natúré (Lond.) 314, 268 (1985)]. A monoklonális antitestek klinikai felhasználását akadályozó fenti problémák kiküszöbölésére irányuló egyik hatékony megoldás az egéreredetű vagy nem humán antitestek „humanizálása” [Jones és munkatársai: Natúré (Lond.) 321, 522 (1986); Riechman és munkatársai: Natúré (Lond.) 332, 323 (1988)].
Ilyenformán, a CD20-antigén ellen olyan terápiás antitestek létrehozása előnyös, amelyek a betegeknek adagolva (különösen krónikus kezelés során) antigenitást nem (vagy csak minimális mértékben) váltanak ki.
A találmány értelmében CD20-kötő antitesteket és azok funkcionális fragmenseit, továbbá ezek B-sejttel összefüggő betegségek kezelésére történő alkalmazását tárjuk fel. A találmány szerinti antitestek monoklonális antitestek. A találmány speciális megvalósítási módjai értelmében humanizált, illetve kimerikus CD202
HU 227 217 Β1 kötő antitesteket tárunk fel. A humanizált 2H7-antitestváltozatok közé tartoznak a vázrégióban (FR) aminosavszubsztitúciókat hordozó változatok, valamint az átültetett komplementaritást meghatározó régiókban (CDR) módosításokat hordozó úgynevezett affinitásfejlesztett változatok. A komplementaritást meghatározó régió, illetve a vázrégió helyettesített aminosavai nem korlátozódnak a donorantitestben vagy a recipiens antitestben előforduló aminosavakra. További megvalósítási módok értelmében olyan anti-CD20 antitesteket tárunk fel, amelyek az Fc-régióban is hordoznak módosított aminosavakat, miáltal olyan javított effektorfunkciókkal bírnak, mint a fokozott mértékű CDC- és/vagy ADCC-funkciók és B-sejt-ölő funkció. A találmány értelmében olyan anti-CD20 antitesteket is feltárunk, amelyek stabilitásuk javítását eredményező specifikus módosításokat hordoznak. Az egyik speciális megvalósítási mód szerint megnövelt stabilitású humanizált 2H7változatokat tárunk fel (lásd a 6. példát). Más megvalósítási módoknak megfelelően olyan fukózdeficiens antitestváltozatokat tárunk fel, amelyek javított ADCCfunkcióval bírnak. Az egyik megvalósítási mód értelmében a találmány szerinti kimerikus anti-CD20 antitest egéreredetű variábilis (V) régiókat és humán konstans (C) régiót tartalmaz. Az egyik ilyen speciális kimerikus anti-CD20 antitest a Rituxan® (Rituximab®; Genentech, Inc.).
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében a humanizált CD20-kötő antitestként a 2H7.v16-antitestet tárjuk fel, amely a 21. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazó könnyű láncból, illetve a 22. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazó nehéz láncból áll (lásd a 6., illetve 7. ábrát). A 6., 7. és 8. ábrán bemutatott polipeptidszekvenciákat illetően tudni kell, hogy a szekréciós szignálszekvenciát alkotó első körülbelül 19 aminosav hiányzik az érett polipeptidből. A 2H7.v16-változaton alapuló valamennyi antitestváltozat V-régiója a v16-változat aminosavszekvenciáját tartalmazza (a leírásban megadott aminosavszubsztitúciós pozíciók kivételével). Ha másképpen nem jelezzük, a 2H7-változatok könnyű lánca azonos a v16-változatéval.
A találmány értelmében humán CD20 megkötésére képes humanizált antitestet (illetve annak antigénkötő fragmensét) tárjuk fel, mely antitest in vivő hatékony a főemlős-eredetű B-sejtek elpusztításában, és amely nehéz lánc variábilis régiójában (VH) legalább egy humán CD20 elleni antitestből származó - CDR3szekvenciát (12. azonosító számú szekvencia) tartalmaz, és lényegében magában foglalja a humán nehéz lánc III. alcsoportra (VHIII) jellemző humán konszenzus vázrégió- (FR-) aminosavakat. Az egyik megvalósítási mód értelmében feltárt antitest főemlős-eredetű B-sejtekként emberből és cynomolgus majomból származó B-sejtek elpusztítására képes. Egy következő megvalósítási mód szerint az antitest a 10. azonosító számú szekvenciaként bemutatott H-lánc CDR1-szekvenciát és a 11. azonosító számú szekvenciaként bemutatott CDR2-szekvenciát tartalmazza. Egy további megvalósítási mód értelmében a fenti antitest a 4. azonosító számú szekvenciaként bemutatott L-lánc CDR1-szekvenciát; az 5. azonosító számú szekvenciaként bemutatott CDR2-szekvenciát és a 6. azonosító számú szekvenciaként bemutatott CDR3-szekvenciát tartalmazza, és lényegében magában foglalja a humán könnyű lánc κ I. alcsoportra (VkI) jellemző humán konszenzus vázrégió- (FR-) aminosavakat is. Az egyik előnyös megvalósítási mód értelmében a VL-régió vázrégiója (FR) a 46. pozícióban donorantitestből származó aminosavat tartalmaz; egy konkrét megvalósítási mód szerint a VL-régió FR2-régiója LeuL46Pro szubsztitúciót hordoz (a humán kI konszenzusszekvencia leucinja prolinnal van helyettesítve, amely az m2H7 megfelelő pozíciójában helyezkedik el). A VH-régió a vázrégió legalább 49., 71. és 73. pozícióiban a donorantitestből származó aminosavat tartalmaz. Az egyik megvalósítási módban az antitest VH-régiójában a következő humán nehéz lánc III. alcsoportra jellemző FR-pozíciók vannak helyettesítve: AlaH49Gly (FR2-régióban); ArgH71Val és AsnH73Lys (FR3-régióban). További megvalósítási módok értelmében a humanizált antitest CDR-régiói olyan aminosavszubsztitúciókat is tartalmazhatnak, amelyek sem a donor, sem a recipiens antitestben nem találhatók meg.
Az előző megvalósítási módok szerinti antitest a v16-változat 8. azonosító számú szekvenciaként bemutatott VH-szekvenciáját (lásd az 1B. ábrát) tartalmazhatja. Az eddigiek egy további megvalósítási módja értelmében az antitest a v16-változat 2. azonosító számú szekvenciaként bemutatott VL-szekvenciáját (lásd az 1A. ábrát) is tartalmazza.
A találmány további megvalósítási módjai értelmében humanizált antitestként a 2H7.v31-antitestet tárjuk fel, amely a 21. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazó könnyű láncból és a 23. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazó könnyű láncból áll (lásd a 6., illetve a 8. ábrát). A 2H7.v96-változat a v16változat nehéz láncában D56A és N100A szubsztitúciót, míg a v16-változat L-láncában S92A szubsztitúciót hordoz.
A találmány más megvalósítási módjaiban a fenti megvalósítási módok szerinti antitest az Fc-régióban tartalmaz legalább egy aminosavszubsztitúciót is, amely az eredeti vagy kiindulási antitestéhez viszonyítva javított ADCC- és/vagy CDC-aktivitást eredményez (az esetek többségében a v16-antitestéhez, a többi esetben pedig a Rituxanéhoz viszonyítva). Az egyik ilyen, javított aktivitású antitest Fc-régiójában három alaninszubsztitúciót tartalmaz (S298A/E333A/K334A). A S298A/E333A/K334A szubsztitúciókat hordozó egyik antitest a 2H7.v31, amelynek nehéz lánca a 23. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazza. A 2H7.v114- és 2H7.v115-antitest a Rituxanéhoz viszonyítva legalább 10-szeres ADCC-aktivitást kifejtésére képes.
A találmány egy további megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti antitest Fc-régiójában legalább egy olyan aminosavszubsztitúciót is hordoz, amely a kiindulási antitesthez viszonyítva (amely az esetek többségében a v16-antitest) csökkent mértékű
HU 227 217 Β1
CDC-aktivitást eredményez. Az egyik ilyen - v16-antitestéhez viszonyítva csökkentett CDC-aktivitású - antitest nehéz láncában legalább egy K322A szubsztitúciót hordoz. Az egyes antitestek ADCC- és CDC-aktivitása a kísérleti példákban leírtak szerint hasonlítható össze.
Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti antitestek teljes hosszúságú antitestek, amelyekben a VH-régió humán IgG nehéz lánc konstans régiójához van kapcsolva. A találmány előnyös megvalósítási módjai értelmében a teljes hosszúságú antitestek VH-régiója humán IgG 1-ből vagy lgG3-ból származó nehéz lánc konstans régióhoz van kapcsolva.
A találmány egy következő megvalósítási módja szerint citotoxikus hatóanyaghoz konjugált CD20-kötő antitestet tárunk fel. A találmány előnyös megvalósítási módjai értelmében az ilyen antitest citotoxikus hatóanyagként toxinhoz vagy radioaktív izotóphoz van kapcsolva.
A találmány egy másik megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti, terápiás és diagnosztikai célra alkalmas antitestek CHO-sejtekben lettek termeltetve.
A találmány értelmében feltárunk továbbá egy készítményt, amely a fenti megvalósítási módok bármelyike szerinti antitestet és hordozót tartalmaz. Az egyik megvalósítási mód szerint a készítmény hordozóként gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz. A találmány szerinti készítmények gyártmány vagy reagenskészlet formájában állíthatók elő.
A találmány értelmében feltárunk továbbá egy folyadékkészítményt, amely 20 mg/mL humanizált 2H7antitestet, 10 mM hisztidin-szulfátot (pH=5,8), 60 mg/mL (6%) szacharózt és 0,2 mg/mL (0,02%) poliszorbát-20-at tartalmaz.
Feltárunk továbbá egy izolált nukleinsavat, amely találmány szerinti antitestet kódol (ideértve az antitest expresszáltatására alkalmas expressziós vektort is).
A találmány egy következő szempontja értelmében találmány szerinti nukleinsavakat hordozó gazdasejteket, illetve találmány szerinti antitesteket termelő gazdasejteket tárunk fel. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint az antitestet termelő gazdasejt CHO-sejt. Ezen túlmenően, feltárunk egy eljárást a találmány szerinti antitestek előállítására, melynek során az antitestet termelő gazdasejtet tenyésztjük, és a sejttenyészetből kinyerjük a termelődött antitestet.
A találmány egy további szempontja értelmében feltárunk egy gyártmányt, amely egy tartályból és a benne lévő készítményből áll, mely készítmény találmány szerinti antitestet tartalmaz. A találmány szerinti gyártmány - non-Hodgkin-limfóma (NHL) kezelésére történő alkalmazás esetén - tartalmaz egy termékismertetőt is, amelyen fel van tüntetve, hogy a készítmény non-Hodgkin-limfóma kezelésére alkalmazható.
A találmány egy további szempontja értelmében eljárást tárunk fel B-sejtek apoptózisának in vivő történő indukálására, melynek során B-sejteket találmány szerinti antitesttel érintkeztetünk, ami a B-sejtek elpusztítását eredményezi.
A találmány értelmében feltárunk továbbá egy eljárást a későbbiekben ismertetésre kerülő betegségek kezelésére, melynek során egy ilyen betegségben szenvedő emlősnek, például, embernek egy CD20-kötő antitestet vagy annak funkcionális fragmensét adagoljuk. Az autoimmun betegség vagy CD20-pozitív rák kezelésére szolgáló eljárások egyik megvalósítási módja szerint a 2H7.v16-antitestet alkalmazzuk, amely a 21. azonosító számú aminosavszekvenciát (lásd a 6. ábrát) tartalmazó könnyű láncból és a 22. azonosító számú aminosavszekvenciát (lásd a 7. ábrát) tartalmazó nehéz láncból áll. Ilyenformán, a találmány egyik megvalósítási módja értelmében eljárást tárunk fel CD20-pozitív rák kezelésére, melynek során ilyen rákban szenvedő betegnek találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitest terápiás szempontból hatásos mennyiségét adagoljuk. A találmány előnyös megvalósítási módjainak megfelelően ez az eljárás B-sejtes limfóma vagy leukémia - ideértve a non-Hodgkin-limfómát (NHL), a limfocitapredomináns Hodgkin-kórt (LPHD), a krónikus limfocitikus leukémiát (CLL) és az SLL-t - kezelésére alkalmazható. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, B-sejtes limfóma vagy leukémia kezelésére szolgáló eljárás során az antitestet körülbelül 275-375 mg/m2 dózisban adagoljuk. A találmány más megvalósítási módjainak megfelelően, az eljárás során a páciensnek legalább egy kemoterápiás hatóanyagot is adagolunk, amely - nonHodgkin-limfóma kezelése esetén - doxorubicin, ciklofoszfamid, vincristin vagy prednisolon lehet.
A találmány értelmében feltárunk továbbá egy eljárást autoimmun betegség kezelésére, melynek során autoimmun betegségben szenvedő páciensnek találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitest terápiás szempontból hatásos mennyiségét adagoljuk. A szóban forgó eljárás a következő autoimmun betegségek kezelésére alkalmazható: reumaszerű ízületi gyulladás (rheumatoid arthritis), fiatalkori reumaszerű ízületi gyulladás, szisztémás erythemás lupus (SLE), Wegenerkór, gyulladásos bélbetegség, idiopátiás trombocitopeniás purpura (ITP), trombotikus trombocitopeniás purpura (TTP), autoimmun trombocitopenia, sclerosis multiplex, pikkelysömör, IgA nephropátia, IgM polineuropátiák, myasthenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud-szindróma, Sjorgen-szindróma és glomerulonephritis. Reumaszerű ízületi gyulladás kezelése céljából a találmány szerinti antitest adagolását egy másik terápiás hatóanyag (előnyösen methotrexat) adagolásával együtt végezzük.
A találmány szerinti eljárások során a CD20-kötő antitesteket önmagukban vagy más terápiás hatóanyagokkal (például, egy másik antitesttel, kemoterápiás hatóanyaggal vagy immunszuppresszáló hatóanyaggal) együtt adagoljuk. Második antitestként CD20-at vagy másik B-sejt-antigént vagy NK- vagy T-sejt-antigént megkötő antitestet alkalmazhatunk. Az egyik megvalósítási mód értelmében második antitestként radioaktív izotóppal jelölt anti-CD20 antitestet alkalmazunk. A találmány további megvalósítási módjaiban a CD20-kötő antitestet citotoxikus hatóanyaghoz (pél4
HU 227 217 Β1 dául toxinhoz) vagy radioaktív izotóphoz kapcsolva alkalmazzuk.
A találmány egy következő szempontja értelmében eljárást tárunk fel autoimmun betegség [dermatomyositis, Wegner-féle granulomatosis, ANCA, aplasztikus anémia, autoimmun hemolitikus anémia (AIHA), Vili. faktor deficiencia, hemophilia-A, autoimmun neutropenia, Castleman-szindróma, Goodpasture-szindróma, szervátültetés utáni transzplantátum-kilökődés, graftversus-host betegség (GVHD), IgM-közvetítette trombotikus trombocitopeniás purpura (TTP), Hashimotoféle thyroiditis, autoimmun hepatitis, limfoid interstitiális pneumonitis (HÍV), bronchiolitis obliterans (nem transzplantátum) vs. NSIP, Guillain-Barre-szindróma, nagy ereket érintő vasculitis, óriássejtes (Takayasu-féle) arteritis, közepes ereket érintő vasculitis, Kawasakikor, poliarteritis nodosa] kezelésére, melynek során az ilyen betegségben szenvedő páciensnek a hivatkozott CD20-kötő antitest terápiás szempontból hatásos mennyiségét adagoljuk.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1A. ábrán az egéreredetű 2H7-antitest, a humanizált 2H7.v16-változat és a humán kappa I. alcsoportú könnyű lánc VL-régiói (könnyű láncon elhelyezkedő variábilis domének) aminosavszekvenciáinak (1., 2., illetve 3. azonosító számú szekvencia) egymás alá rendezéses összehasonlítását mutatjuk be. A 2H7 és a hu2H7.v16 VL-régiójának komplementaritást meghatározó régiói (CDR) a következők: CDR1 (4. azonosító számú szekvencia), CDR2 (5. azonosító számú szekvencia) és CDR3 (6. azonosító számú szekvencia).
Az 1B. ábrán az egéreredetű 2H7-antitest, a humanizált 2H7.v16-változat és a III. alcsoportú nehéz lánc humán konszenzus szekvencia VH-szekvenciáinak (7., 8., illetve 9. azonosító számú szekvencia) egymás alá rendezéses összehasonlítását mutatjuk be. A 2H7 és hu2H7.v16 komplementaritást meghatározó régiói a következők: CDR1 (10. azonosító számú szekvencia), CDR2 (11. azonosító számú szekvencia) és CDR3 (12. azonosító számú szekvencia).
Az 1A. és 1B. ábrán az 1., 2. és 3. komplementaritást meghatározó régiót mindegyik szekvenciában zárójelbe tettük, s feltüntettük a vázrégiókat is (FR1-FR4). A „2H7” az egéreredetű 2H7-antitestet jelöli. A sorközi csillagok (két egymás alatti szekvencia között) azokat a pozíciókat jelzik, amelyeknél a két szekvenciában eltérő aminosavak helyezkednek el. Az aminosavak számozását Kábát és munkatársai leírása [„Sequences of Immunological Interest”, 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] szerint használjuk, az inszertált aminosavakat pedig kisbetűkkel (a-e) jelöljük.
A 2. ábrán a 2H7-Fab plazmidok létrehozására alkalmazott pVX4-fágemid szekvenciáját (13. azonosító számú szekvencia), valamint az átültetett CDR-t tartalmazó humanizált antiIFN-α antitest Fab fragmense L-láncának és H-láncának aminosavszekvenciáját (14., illetve 15. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.
A 3. ábrán a kimerikus 2H7.v6.8 Fab fragmenst kódoló expressziós plazmid szekvenciáját (16. azonosító számú szekvencia), valamint e Fab fragmens L-láncának és H-láncának aminosavszekvenciáját (17., illetve 18. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.
A 4. ábrán az immunglobulin könnyű láncok expresszáltatására (lásd 1. példa) alkalmazott pDR1-plazmid nukleotidszekvenciáját (19. azonosító számú szekvencia, 5391 bázispár) mutatjuk be. A pDR1-plazmid tartalmaz egy nem a találmány tárgyához tartozó, humanizált anti-CD3 antitest [lásd Shalaby és munkatársai: J. Exp. Med. 175, 217 (1992)] könnyű láncát kódoló szekvenciát, amelynek kezdő és stopkodonját félkövér betűtípussal és aláhúzással jelöltük.
Az 5. ábrán az immunglobulin nehéz láncok expresszáltatására (lásd 1. példa) alkalmazott pDR2-plazmid nukleotidszekvenciáját (20. azonosító számú szekvencia, 6135 bázispár) mutatjuk be. A pDR2-plazmid tartalmaz egy nem a találmány tárgyához tartozó, humanizált anti-CD3 antitest [lásd Shalaby és munkatársai: J. Exp. Med. 175, 217 (1992)] nehéz láncát kódoló szekvenciát, amelynek kezdő és stopkodonját félkövér betűtípussal és aláhúzással jelöltük.
A 6. ábrán a 2H7.v16-antitest teljes L-láncának aminosavszekvenciáját (21. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be. A DIQ előtti első 19 aminosav alkotja a szignálszekvenciát, amely az érett polipeptidláncból hiányzik.
A 7. ábrán a 2H7.v16-antitest teljes H-láncának aminosavszekvenciáját (22. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be. Az EVQ előtti első 19 aminosav alkotja a szignálszekvenciát, amely az érett polipeptidláncból hiányzik. Az 1/B ábrán bemutatott VH-szekvenciát (8. azonosító számú szekvencia) a teljes H-lánc szekvenciájával egymás alá rendezve jól látható, hogy a humán γ1 konstans régió a 22. azonosító számú szekvencia 114. aminosavától 471. aminosaváig terjed.
A 8. ábrán a 2H7.v31-antitest teljes H-láncának aminosavszekvenciáját (23. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be. Az EVQ előtti első 19 aminosav alkotja a szignálszekvenciát, amely az érett polipeptidláncból hiányzik. Az L-lánc azonos a 2H7.v16-antitestével (lásd a 6. ábrát).
HU 227 217 Β1
A 9. ábrán a 2H7.v16 és 2H7.v73 IgG-változatok relatív stabilitását szemléltetjük. A vizsgálati eredményeket az inkubálás előtti értékekhez normalizáltuk, és az inkubálás utáni maradék százalékos arányként ábrázoltuk.
A 10. ábrán az egéreredetű 2H7-antitestben végrehajtott - humanizált antitestváltozatokat (a v75-ig bezárólag) eredményező - aminosavmódosítások folyamatábráját szemléltetjük.
A 11. ábrán az egyes kísérleti csoportokra megállapított átlagos abszolút B-sejt-számot (CD3-/CD40+) szemléltetjük (2H7- és Rituxan-tesztek összefoglalása, lásd a 10. példát).
A 12. ábrán fukózdeficiens 2H7-változatokkal végzett reprezentatív ADCC-teszt (lásd a 11. példát) eredményeit mutatjuk be.
A 13. ábrán az Annexin-V-vel megfestődött sejtek százalékos arányát szemléltetjük (az antitestkoncentráció függvényében). Ramossejteket keresztkötésképző második antitest jelenlétében kontroll lgG1-antitesttel (Herceptin®; az ábrán körökkel jelölve), Rituximab-antitesttel (az ábrán négyzetekkel jelölve) vagy 2H7.v16 rekombináns humanizált monoklonális antitesttel (az ábrán háromszögekkel jelölve) kezeltük, majd FACS-analízist végeztünk. A 13-15. ábrákon a 13. példában leírt kísérletek eredményei láthatók.
A 14. ábrán Annexin-V-vel és propidium-jodiddal végzett kettős festési analízis (antitest-koncentráció függvényében kapott) eredményeit mutatjuk be. Ramos-sejteket keresztkötésképző második antitest jelenlétében kontroll lgG1-antitesttel (Herceptin®; az ábrán körökkel jelölve), Rituximab-antitesttel (az ábrán négyzetekkel jelölve) vagy 2H7.v16 rekombináns humanizált monoklonális antitesttel (az ábrán háromszögekkel jelölve) kezeltük, majd FACS-analízist végeztünk.
A 15. ábrán az élő, nem festődött sejtek - antitestkoncentráció függvényében meghatározott - számát (10 másodperces mérés) szemléltetjük. Ramos-sejteket keresztkötésképző második antitest jelenlétében kontroll lgG1antitesttel (Herceptin®; az ábrán körökkel jelölve), Rituximab-antitesttel (az ábrán négyzetekkel jelölve) vagy 2K7.v16 rekombináns humanizált monoklonális antitesttel (az ábrán háromszögekkel jelölve) kezeltük, majd FACS-analízist végeztünk.
A 16., 17. és 18. ábrán Raji-sejttumor növekedésének szőrtelen egerekben végzett gátlási kísérleteinek eredményeit mutatjuk be (a kísérletek leírását illetően lásd a 14. példát). Az egereket hat héten át hetente egyszer (az ábrákon függőleges nyilakkal jelölve) foszfátpufferelt sóoldattal (PBS, kontroll), illetve Rituxan®-nal vagy 2H7.v16 rekombináns humanizált monoklonális antitesttel (5 mg/kg, 16. ábra; 0,5 mg/kg, 17. ábra; 0,05 mg/kg, 18. ábra) kezeltük.
A 19. ábrán a cynomolgus majom-eredetű CD20 nukleotidszekvenciáját (24. azonosító számú szekvencia) és aminosavszekvenciáját (25. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be (15. példa).
A 20. ábrán cynomolgus majom-eredetű CD20 aminosavszekvenciáját (25. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be. A humán CD20 aminosavszekvenciájától eltérő aminosavakat aláhúzással jelöltük, és a humán szekvencia (26. azonosító számú szekvencia) e pozícióiban elhelyezkedő aminosavakat a majomeredetű szekvencia alatt tüntettük fel. A majomeredetű CD20 feltételezett extracelluláris doménjét félkövér betűtípussal szedve jelöltük.
A 21. ábrán a CD20-at termelő cynomolgus majomsejtek hu2H7.v16, hu2H7.v31 és Rituxanantitestekhez történő kötődését (lásd a 15. példát) szemléltetjük. Az antitesteket cynomolgus-CD20-hoz kötődő FITC-vel konjugált egéreredetű 2H7-antitestet kiszorító képességükre teszteltük.
A 22. ábrán reumaszerű ízületi gyulladás l/ll. fázisú klinikai kísérlet során alkalmazott dózisnövelési sémát mutatunk be.
A 23. ábrán a 2H7.v16-antitest CHO-sejtekben történő expresszáltatására alkalmas vektor térképét mutatjuk be.
A CD20-antigén hozzávetőleg 35 kD molekulatömegű, hidrofób transzmembrán foszfoprotein, amely a perifériás vérből és nyirokszervekből származó B-sejtek több mint 90%-ának felületén megtalálható. A CD20 a korai pre-B-sejtek fejlődése során termelődik, és a plazmasejt-differenciálódásig megmarad; a humán stem-sejteken, a limfoid őssejteken és a normális plazmasejteken azonban nem található meg. A CD20 a normális B-sejteken és a malignáns B-sejteken egyaránt jelen van. A CD20 szakirodalomban ismert egyéb elnevezései közé tartozik a „B-limfocitákra korlátozódó differenciálódási antigén” és a „Bp35”. A CD20-antigén részletes leírását illetően lásd például: Clark és Ledbetter: Adv. Can. Rés. 52, 81 (1989); és Valentiné és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264(19), 11 282 (1989).
A találmány leírásában az „antitest kifejezést legtágabb értelmében használjuk - jelentése kiterjed a monoklonális antitestekre (köztük a teljes hosszúságú monoklonális antitestekre), multispecifikus antitestekre (például bispecifikus antitestekre), valamint az antitestfragmensekre, feltéve, hogy azok rendelkeznek a kívánt biológiai aktivitással vagy funkcióval.
A találmány szerinti CD20-kötő antitestek és humanizált CD20-kötő antitestek biológiai aktivitása legalább az antitest humán CD20-at megkötő képességében,
HU 227 217 Β1 előnyösebben a humán és egyéb főemlős-eredetű (cynomolgus majomból, rhesus majomból vagy csimpánzból származó) CD20-at megkötő képességében nyilvánul meg. Az antitestek CD20-hoz történő kötődésre vonatkozó Kd-értéke legfeljebb 1 χ10-8, előnyösen legfeljebb körülbelül 1 χ 10-9, és - a megfelelő (ilyen antitesttel nem kezelt) kontrolihoz viszonyítva - a B-sejtek számának legalább 20%-os csökkentésére képesek in vivő. A B-sejt elpusztítása az ADCC, CDC, apoptózis vagy más mechanizmusok valamelyikének vagy ezek kombinációjának eredménye lehet. A találmány különféle betegségek kezelésére vonatkozó egyes megvalósítási módjaiban specifikus effektorfunkciók vagy -mechanizmusok előnyösebbek lehetnek másoknál, és a biológiai funkciók (mint például az ADCC) megnyilvánulásához a humanizált 2H7-antitest adott változatai lehetnek előnyösek.
Az „antitestfragmensek” egy intakt antitest részletét (előnyösen antigénkötő vagy variábilis régióját) tartalmazzák. Az antitestfragmensek példái közé tartoznak a következők: Fab fragmens, Fab’ fragmens, F(ab’)2 fragmens, Fv fragmens, diatestek, lineáris antitestek, egyláncú antitestmolekulák és antitestfragmensekből álló multispecifikus antitestek.
Az „Fv fragmens” az a minimális antitestfragmens, amely komplett antigénfelismerő és -kötő helyet tartalmaz. Ez a régió egy nehéz lánc variábilis dómén és egy könnyű lánc variábilis dómén dimere, amelyben a domének nem kovalens kötéssel vannak szorosan egymáshoz kapcsolva. E két dómén összehajtogatódása („folding”) eredményeként hat hipervariábilis hurok (a nehéz és a könnyű láncon három-három) jön létre, amelyek antigénkötő helyek kialakítása révén hozzájárulnak az antigén megkötéséhez. A hat hipervariábilis régió együttesen biztosítja az antitest antigénkötő specifitását, azonban egyetlen variábilis dómén (vagy egy Fv fragmens fele, amely csak három, antigénre specifikus hipervariábilis régiót tartalmaz) is képes az antigén felismerésére és megkötésére (bár kisebb affinitással, mint a teljes kötőhely).
Ahogy a leírásban használjuk, a „monoklonális antitest” kifejezésen lényegében homogén antitestpopulációból származó antitestet értünk, vagyis a populációt alkotó egyes antitestek - az esetlegesen kis mennyiségben előforduló természetes mutációktól eltekintve azonosak. A monoklonális antitestek rendkívül specifikusak: egyetlen antigénhely ellen irányulnak. Ezen túlmenően, ellentétben a hagyományos (poliklonális) antitestkészítményekkel, amelyek különböző determinánsok (epitópok) elleni különböző antitesteket tartalmaznak, minden egyes monoklonális antitest az antigén egyetlen determinánsa ellen irányul. A „monoklonális” jelző az antitest azon sajátságára utal, hogy antitestek lényegében homogén populációjából nyerhető, és nem utal arra, hogy az antitest bármilyen konkrét eljárással lenne előállítható. Például a találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazható monoklonális antitestek az elsőként Kohler és munkatársai [Natúré 256, 495 (1975)] által leírt hibridómaeljárással vagy rekombináns DNS-technikák (lásd például a 4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást) alkalmazásával állíthatók elő. A monoklonális antitestek fág antitestkönyvtárakból is izolálhatok, például, a Clackson és munkatársai [Natúré 352, 624 (1991)] és Marks és munkatársai [J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)] által leírt technikák alkalmazásával.
A találmány szerinti CD20-kötő antitestek „funkcionális fragmensei” olyan fragmensek, amelyek lényegében azonos affinitással kötődnek a CD20-antigénhez, mint az a teljes hosszúságú molekula, amelyből származnak, és in vitro vagy in vivő tesztekkel meghatározható biológiai aktivitás kifejtésére képesek (mint például a B-sejtek elpusztítása).
Az antitestekkel összefüggésben használt „variábilis” kifejezés arra vonatkozik, hogy a variábilis dómén bizonyos szakaszainak aminosavszekvenciája az egyes antitestekben nagymértékben eltér egymástól. A variábilis (V) dómén közvetíti az antigén megkötését és határozza meg egy adott antitest adott antigénre vonatkozó specifitását. Mindazonáltal, a variabilitás a variábilis domének 110 aminosavas hossza mentén nem egyenletesen oszlik meg. A V-régiók viszonylag kevésbé változékony, 15-30 aminosavas szakaszokat foglalnak magukban, melyeket vázrégióknak (FR) nevezünk, és amelyeket rövidebb (9-12 aminosavas), rendkívül változékony „hipervariábilis régiók” kapcsolnak egymáshoz. A natív antitestek nehéz és könnyű láncainak variábilis doménjei egyenként négy vázrégiót tartalmaznak (melyek többnyire β-redős konfigurációt vesznek fel), és ezeket három hipervariábilis régió köti össze, melyek hurkokat képeznek, és ezek a hurkok kapcsolják össze a β-redős struktúrát (és néhány esetben annak részét is képezik). Az egyes láncokban a vázrégiók szorosan összetartják a hipervariábilis régiókat, melyek - a másik láncban lévő hipervariábilis régiókkal együtt - az antitest antigénkötő helyeinek létrehozásában játszanak szerepet [lásd Kábát és munkatársai: NIH Publ. No. 91-3242,1. kötet, 647-669. oldal, (1991)]. A konstans domének közvetlenül nem játszanak közre az antitest antigénhez történő kötődésében, azonban különféle effektorfunkciókat töltenek be - például az antitest részvétele az antitestdependens celluláris citotoxicitásban (ADCC).
Ahogy a leírásban használjuk, a „hipervariábilis régió” kifejezésen egy antitest antigénkötésért felelős aminosavaiból álló régiót értünk. A hipervariábilis régió általában „komplementaritást meghatározó régióból” (CDR) származó aminosavakat tartalmaz - például a könnyű lánc variábilis doménjének 24-34. pozíciói környékén (L1), 50-56. pozíciói környékén (L2) és 89-97. pozíciói környékén (L3) elhelyezkedő aminosavakat, valamint a nehéz lánc variábilis doménjének 31-35. pozíciói környékén (H1), 50-65. pozíciói környékén (H2) és 95-102. pozíciói környékén (H3) elhelyezkedő aminosavakat [lásd Kábát és munkatársai: „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] -, és/vagy „hipervariábilis hurokból származó aminosavakat [például a könnyű lánc variábilis doménjének 26-32. aminosavait(LI), 50-52. aminosa7
HU 227 217 Β1 vait (L2) és 91-96. aminosavait (L3), valamint a nehéz lánc variábilis doménjének 26-32. aminosavait (H1), 52A-55. aminosavait (H2) és 96-101. aminosavait (H3); Chothia és Lesk: J. Mól. Bioi. 196, 901 (1987)] tartalmaz.
Ahogy a leírásban használjuk, a „konszenzus szekvencia” vagy „konszenzus V-domén-szekvencia” kifejezésen ismert humán immunglobulin variábilis régiók szekvenciáinak összehasonlításán alapuló mesterséges szekvenciát értünk. Ilyen összehasonlítások alapján olyan rekombináns nukleinsavakat állítottunk elő, amelyek a humán κ-láncra és a humán H-lánc III. alcsoportra jellemző V-doménekből származó konszenzus-szekvenciákat tartalmazó V-domén aminosavakat kódolnak.
A „kimerikus” antitestek (immunglobulinok) olyan antitestek, amelyekben a nehéz és/vagy könnyű lánc egy része azonos vagy homológ egy adott fajból származó - vagy egy adott antitestosztályhoz vagy -alosztályhoz tartozó - antitestek megfelelő szekvenciáival, míg a lánc(ok) többi része azonos vagy homológ egy másik fajból származó - vagy egy másik antitestosztályba vagy -alosztályba tartozó - antitestek megfelelő szekvenciáival. A monoklonális antitestek közé tartoznak az ilyen kimerikus antitestek fragmensei is, feltéve, hogy képesek a kívánt biológiai aktivitás kifejtésére [4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Morrison és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)]. Ahogy a leírásban használjuk, a humanizált antitestek a kimerikus antitestek részhalmazát képezik.
A nem humán (például egéreredetű) antitestek „humanizált” alakjai olyan kimerikus antitestek, amelyekben a nem humán immunglobulinból származó szekvenciák aránya minimális. A humanizált antitestek többnyire olyan humán immunglobulinok (recipiens vagy akceptor antitest), amelyekben a recipiens antitest hipervariábilis régiójának aminosavai egy nem humán fajból (például egérből, patkányból, nyúlból vagy nem humán főemlősből) származó antitest (donorantitest) kívánt specifitású, affinitású és kapacitású hipervariábilis régiójának aminosavaival vannak helyettesítve. Néhány esetben a humán immunglobulin Fv vázrégiójának (FR) aminosavai nem humán immunglobulin megfelelő aminosavaival vannak helyettesítve. Ezenfelül, a humanizált antitestek olyan aminosavakat is tartalmazhatnak, amelyek nem találhatók meg sem a recipiens antitestben, sem a donorantitestben. Ezek a módosítások az antitest további finomítása és teljesítményének maximalizálása céljából hajthatók végre. A humanizált antitest általában egy - jellemzően két - variábilis dómén lényegében egészét tartalmazza, mely(ek)ben a hipervariábilis hurkok egésze vagy lényegében egésze megfelel egy nem humán immunglobulin hipervariábilis hurkainak, és a vázrégiók egésze vagy lényegében egésze megfelel egy humán immunglobulin-szekvencia vázrégiójának (bár a vázrégiók egy vagy több - kötési affinitást javító - aminosavszubsztitúciót is tartalmazhatnak). A vázrégióban az ilyen aminosavszubsztitúciók száma jellemzően legfeljebb hat (a H-láncban), illetve legfeljebb három (az L-láncban). A humanizált antitest, adott esetben, egy immunglobulin (jellemzően egy humán immunglobulin) konstans régiójának (Fc) legalább egy részét is tartalmazza. További részleteket illetően lásd Jones és munkatársai: Natúré 321, 522 (1986); Reichmann és munkatársai: Natúré 332, 323 (1988); Presta: Curr. Op. Struct. Bioi. 2, 593 (1992).
Egy antitest „effektorfunkciói” kifejezésen az antitestek Fc-régiójának (natív szekvenciájú Fc-régió vagy aminosavszekvencia-változatot tartalmazó Fc-régió) tulajdonítható biológiai aktivitásokat értünk, melyek az antitest izotípusától függően változnak. Az antitest „effektorfunkciók” példáiként említhetők a következők: C1q-kötés és komplementdependens citotoxicitás (CDC); Fc-receptor megkötése; antitestdependens sejtközvetítette citoxicitás (ADCC); fagocitózis; sejtfelületi receptorok (például B-sejt-receptor) gátlása; és B-sejt-aktiválás.
Az „antitestdependens sejtközvetítette citotoxicitás vagy „ADCC” kifejezés a citotoxicitás olyan formájára vonatkozik, amelyre az jellemző, hogy a bizonyos citotoxikus sejteken [például természetes ölősejteken (NKsejtek), neutrofil granulocitákon és makrofágokon] található Fc-receptorokhoz kötődő, szekretált immunglobulin közreműködésével az ilyen citotoxikus effektorsejtek specifikusan egy antigénhordozó célsejthez kötődnek, majd citotoxinokkal elpusztítják a célsejtet. Az antitestek a citotoxikus sejteket „felfegyverzik”, így a célsejtek elpusztítása szempontjából feltétlenül szükség van rájuk. Az ADCC-t közvetítő elsődleges sejtek, az NK-sejtek, csak FcyRIII-at termelnek, míg a monociták az FcyRI-et, Fc/RII-t és FcyRIII-at egyaránt termelik. A vérképzési sejtek FcR-termelését illetően lásd Ravetch és Kínét cikkének [Annu. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991)] 3. táblázatát. Egy adott molekula ADCCaktivitásának értékelésére in vitro ADCC-teszt alkalmazható (lásd például az 5 500 362 és 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást). Az ilyen vizsgálati eljárásokban alkalmazható effektorsejtek közé tartoznak a perifériás vér egymagvú sejtjei (PBMC) és a természetes ölősejtek (NK-sejtek). Más módon - vagy ezen túlmenően - egy adott molekula ADCC-aktivitása in vivő is tesztelhető, például, állatmodell alkalmazásával [lásd Clynes és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95, 652 (1998)].
Az „Fc-receptor” vagy „FcR” kifejezésen egy antitest Fc-régiójához kötődni képes receptort értünk. Az Fc-receptor előnyösen natív szekvenciájú humán FcR. Ezen túlmenően, a találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös Fc-receptor IgG-antitest megkötésére képes (vagyis γ-receptor), mint például az FcyRI, FcyRII és FcyRIII alosztályok tagjai, ideértve ezek allélváltozatait és alternatív „splicing események következtében létrejött alakjait. Az FcyRII-receptorok közé tartozik az FcyRIlA („aktiválóreceptor”), és az FcyRIIB („gátlóreceptor”), melyek hasonló aminosavszekvenciát tartalmaznak - elsősorban citoplazmikus doménjükben térnek el egymástól. Az aktiváló FcyRIIA-receptor citoplazmikus doménjében immunreceptor tirozinalapú
HU 227 217 Β1 aktiválómotívumot (ITAM), míg a gátló FcyRIIB-receptor citoplazmikus doménjében immunreceptor tirozinalapú gátlómotívumot (ITIM) tartalmaz [áttekintést lásd Daéron: Annu. Rév. Immunoi. 15, 203 (1997)]. Az Fc-receptorok áttekintő leírását illetően lásd Ravetch és Kínét: Annu. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991); Capel és munkatársai: Immunomethods 4, 25 (1994); és de Haas és munkatársai: J. Láb. Clin. Med. 126, 330 (1995)]. Az „Fc-receptor” kifejezés magában foglalja az egyéb Fc-receptorokat (ideértve a még azonosításra váró Fc-receptorokat), valamint az újszülöttkori Fc-receptort [FcRn, amely az anyai IgG-molekulák magzatba történő átviteléért felelős; lásd Guyer és munkatársai: J. Immunoi. 117, 587 (1976); és Kim és munkatársai: J. Immunoi. 24, 249 (1994)].
A WO 00/42072 számú nemzetközi közzétételi iratban (melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni) Fc-receptorokhoz megnövelt vagy csökkentett mértékben kötődő antitestváltozatokat tárnak fel [lásd még: Shields és munkatársai: J. Bioi. Chem. 9(2),6591 (2001)].
A „humán effektorsejtek” olyan leukociták, amelyek egy vagy több Fc-receptort termelnek és effektorfunkciókat töltenek be. Az ilyen sejtek előnyösen legalább az FcyRIII-at termelik és ADCC effektorfunkciót töltenek be. Az ADCC-t közvetítő humán leukociták példái közé tartoznak a perifériás vér egymagvú sejtjei (PBMC), a természetes ölősejtek (NK-sejtek), a monociták, a citotoxikus T-sejtek és a neutrofil granulociták, melyek közül a találmány szerinti megoldás szempontjából a PBMC-k és az NK-sejtek előnyösek. Az effektorsejtek természetes forrásukból (például vérből) izolálhatok.
A „komplementdependens citotoxicitás” vagy „CDC” kifejezésen egy célsejt - komplement jelenlétében bekövetkező - lízisét értjük. A klasszikus komplementaktiválási reakcióutat a komplementrendszer első komponensének (C1q) egy közös eredetű antigénhez kapcsolt - megfelelő alosztályba tartozó - antitesthez történő kötődése indítja be. A komplementaktiválás CDC-teszttel analizálható [lásd Gazzano-Santoro és munkatársai: J. Immunoi. Methods 202, 163 (1996)].
A 6 194 551 B1 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és a WO 99/51642 számú nemzetközi közzétételi iratban (melyeket teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni) módosított Fc-régió aminosavszekvenciát tartalmazó és fokozott vagy csökkentett C1q-kötő képességű polipeptidváltozatokat tárnak fel [lásd még: Idusogie és munkatársai: J. Immunoi. 164,4178 (2000)].
Az IgG-molekula N-glikozilációs helye a CH2-domén Asn297 pozíciójában található. A találmány értelmében Fc-régiót hordozó, CD20-kötő humanizált antitestet tartalmazó készítményeket is feltárunk, amelyekben az antitestek körülbelül 80-100%-a (előnyösen 90-99%-a) - a glikoprotein Fc-régiójához kapcsolva fukóz nélküli, érett szénhidrátmag-struktúrát tartalmaz. Az ilyen készítményekről kimutattuk, hogy az FcyRIIIA(F158)-receptorhoz - amely a humán IgG-vel bekövetkező interakcióban nem olyan hatékony, mint az FcyRIIIA(V1 58) - történő kötődés vonatkozásában váratlan javulást mutatnak. Ilyenformán, a találmány szerinti antitestkészítmények várhatóan jobb tulajdonságúak, mint a korábban leírt anti-CD20 antitestkészítmények, különösen olyan emberek kezelésében, akikre az FcyRIIIA(F158) expressziója jellemző. Az FcyRIIIA(F158)-receptor az egészséges afroamerikai és kaukázusi populációban sokkal gyakoribb, mint az FcyRIIIA(V158) [lásd Lehrnbecher és munkatársai: Blood 94, 4220 (1999)]. Találmányunk kidolgozása során bebizonyítottuk, hogy az általunk feltárt glikozilációs változatokat a glikoprotein Fc-régiójában végrehajtott aminosavszekvencia-módosításokkal kombinálva az FcyRIII-kötés és/vagy az ADCC-funkció szinergikus fokozódása érhető el.
Az „izolált” antitest kifejezés egy azonosított és természetes környezetében megtalálható - komponenstől elválasztott és/vagy elkülönített antitestre vonatkozik. A természetes környezetben megtalálható szennyezőkomponensek akadályoznák az antitest diagnosztikai vagy gyógyászati felhasználását; az ilyen komponensek közé tartoznak az enzimek, hormonok és egyéb - proteinszerű vagy nem proteinszerű - oldott anyagok. A találmány előnyös megvalósítási módjai értelmében az antitest tisztításának mértéke a következő: (1) a Lowry-eljárással végzett meghatározás szerint 95 m/m%-nál nagyobb, legelőnyösebben 99 m/m%-nál nagyobb tisztaság; (2) forgócsészés („spinning cup’’) szekvenátor alkalmazásával legalább 15 aminosavas N-terminális vagy belső aminosavszekvencia kinyeréséhez szükséges tisztaság; vagy (3) redukáló- vagy nem redukáló feltételekkel végzett SDSPAGE-analízissel (Coomassie-kék vagy, előnyösen, ezüstfestés alkalmazásával) elérhető homogenitásnak megfelelő tisztaság. Az izolált antitest kifejezés jelentése kiterjed a rekombináns sejtekben in situ megtalálható antitestekre, mivel az ilyen sejtekben a polipeptid természetes környezetének legalább egy komponense hiányzik. Mindazonáltal, az izolált polipeptideket általában legalább egy tisztítási lépést követően kapjuk.
Az „izolált” nukleinsavmolekula kifejezés olyan nukleinsavmolekulára vonatkozik, amely azonosítva van és el van választva legalább egy, az antitestet kódoló nukleinsavval rendszerint együtt előforduló szennyező nukleinsavmolekulától. Az izolált nukleinsavmolekula nem azonos a természetben előforduló alakjával, így azok megkülönböztethetők a természetes sejtekben található nukleinsavmolekuláktól. Mindazonáltal, izolált nukleinsavmolekulának tekintjük az olyan nukleinsavmolekulát is, amely az antitestet egyébként expresszáló sejtben a természetes sejtekre jellemző kromoszomális lokációtól eltérően helyezkedik el.
Az expressziós „szabályozószekvencia” kifejezésen olyan DNS-szekvenciát értünk, amely a hozzá működőképesen kapcsolt kódolószekvencia adott gazdaszervezetben történő expresszáltatásához szükséges. A prokarióta gazdasejtek számára megfelelő szabályozószekvenciák közé tartozik, például a promoter, adott esetben az operátorszekvencia, valamint a riboszómakötő hely, míg az eukarióta sejtek promotereket, polia9
HU 227 217 Β1 denilációs szignálokat és erősítőszekvenciákat alkalmaznak.
Egy nukleinsav akkor van „működőképesen kapcsolva”, ha egy másik nukleinsavszekvenciával funkcionális kapcsolatban van. Például egy preszekvencia vagy szekréciós vezetőszekvencia DNS-e akkor van működőképesen egy polipeptidet kódoló DNS-hez kapcsolva, ha olyan preproteinként expresszálódik, amely részt vesz a polipeptid szekréciójában. Egy promoter vagy egy erősítőszekvencia akkor van működőképesen egy kódolószekvenciához kapcsolva, ha befolyásolja a szekvencia transzkripcióját. Egy riboszómakötő hely akkor van működőképesen egy kódolószekvenciához kapcsolva, ha elősegíti a transzlációt. A „működőképesen kapcsolt” kifejezés általában azt jelenti, hogy az összekapcsolt DNS-szekvenciák egymással határosak, és - szekréciós vezetőszekvencia esetében - egymással határosak és azonos leolvasási fázisban vannak, azonban az erősítőszekvenciáknak nem kell a kapcsolt szekvenciával közvetlenül határosnak lenniük. Az összekapcsolás szokványos restrikciós helyeknél ligálással valósulhat meg. Ha ilyen helyek nem léteznek, az általános gyakorlatnak megfelelően szintetikus oligonukleotidadapterek vagy kapcsolószekvenciák alkalmazhatók.
A „vektor” kifejezésen ingázóvektorokat és expressziós vektorokat értünk. A plazmidok baktériumsejtekben történő replikációjának, illetve szelektálásának elősegítése érdekében a plazmidkonstrukció általában replikációs kezdőhelyet (például ColE1 replikációs kezdőhelyet) és szelektálható markert (például ampicillinvagy tetraciklinrezisztencia-gént) tartalmaz. Az „expressziós vektor” olyan vektor, amely találmány szerinti antitestek (ideértve az antitestfragmenseket is) baktériumsejtekben vagy eukarióta sejtekben történő expresszáltatásához szükséges szabályozószekvenciákat és szabályozóelemeket tartalmaz. A találmány céljaira alkalmas vektorokat a későbbiekben ismertetjük.
A találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitestet termelő sejt baktériumsejt vagy eukarióta sejt lehet, amelyben a szóban forgó antitesteket kódoló nukleinsav lett bejuttatva. A találmány céljaira alkalmas gazdasejteket szintén a későbbiekben ismertetjük.
Ahogy a leírásban használjuk, a „jelölő kifejezésen detektálható vegyületet vagy készítményt értünk, amely közvetve vagy közvetlenül az antitesthez kapcsolható. A jelölő lehet önmaga detektálható (például radioaktív izotópok vagy fluoreszcens jelölők), illetve enzimatikus jelölők esetében - megfelelő szubsztrát (vegyület vagy készítmény) detektálható kémiai változását katalizálhatja.
Az „autoimmun betegség” kifejezés olyan nem malignáns betegségre vagy rendellenességre vonatkozik, amely az egyed saját antigénjei és/vagy szövetei ellen irányul.
Ahogy a találmány leírásában használjuk, a „B-sejtkivonás” kifejezésen a B-sejtek számának állatban vagy emberben valamilyen hatóanyaggal vagy antitesttel végzett kezelés eredményeként bekövetkező (kezelés előtti B-sejt-számhoz viszonyított) csökkentését értjük. A B-sejtek száma szakember számára jól ismert vizsgálati eljárásokkal mérhető (mint például a kísérleti példákban leírt módszerek). A B-sejt-kivonás teljes vagy részleges lehet. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a CD20-at termelő B-sejt-kivonás legalább 25%-os. A B-sejt-kivonás lehetséges mechanizmusai közé tartozik az ADCC, CDC, apoptózis, kalciumáramlás módosítása vagy ezek közül kettő vagy több kombinációja.
Ahogy a leírásban használjuk, a „citotoxikus hatóanyag” kifejezésen olyan anyagot értünk, amely gátolja a sejtek működését és/vagy azok elpusztítását eredményezi. A citotoxikus hatóanyagok közé tartoznak a radioaktív izotópok (például I131, I125, Y90 és Re186); kemoterápiás hatóanyagok, valamint toxinok, például bakteriális, gombaeredetű, növényi vagy állati eredetű, enzimatikus aktivitású toxinok.
A „kemoterápiás hatóanyag” kifejezésen rák kezelésére alkalmas vegyületet értünk. A kemoterápiás hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: alkilezőszerek, például thiotepa és ciklofoszfamid (CYTOXAN™); alkil-szulfonátok, például buszulfán, improszulfán és piposzulfán; aziridinek, például benzodopa, carboquon, meturedopa és uredopa; etiléniminek és metil-amelaminok, például altretamin, trietilén-melamin, trietilén-foszforamid, trietilén-tiofoszforamid és trimetil-olomelamin; nitrogénmustárok, például klór-ambucil, klór-nafazin, cholofoszfamid, esztramusztin, ifoszfamid, meklóretamin, meklóretamin-oxid-hidroklorid, melphalan, novembichin, phenesterin, prednimusztin, trofoszfamid, uracil-mustár; nitrozureák, például carmustin, chlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotikumok, például aclacinomycinek, actinomycin, authramycin, aza-szerin, bleomycinek, cactinomycin, calicheamicin, carabicin, carminomycin, carzinofilin, chromomycinek, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucin, doxorubicin (Adriamycin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycinek, mikofenolsav, nogalamycin, olivomycinek, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolitok, például methotrexát és 5-fluor-uracil (5-FU); folsavanalógok, például denopterin, methotrexát, pteropterin, trimetrexát; purinanalógok, például fludarabin, 6-merkapto-purin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinanalógok, például ancitabin, azacitidin, 6-aza-uridin, carmofur, cytarabin, didezoxiuridin, doxifluridin, enocitabin, floxuridin, 5-FU; androgének, például calusteron, dromostanolon-propionát, epitiostanol, mepitiostán, testolakton; mellékvesehormon elleni hatóanyagok, például amino-glutetimid, mitotan, trilostan; folsavkiegészítők, például frolinsav; aceglaton; aldofoszfamidglikozid; amino-levulinsav; amsacrin; bestrabucil; bisantren; edatraxát; defofamin; demecolcin; diaziquon; elfornitin; elliptinium-acetát; etoglucid; gallium-nitrát; hidroxikarbamid; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoxantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; phenamet; pirarubicin; podofillinsav; 2-etil-hidrazid; prokarbazin; PSK®; razoxán; sizofiran; spirogermánium; tenua10
HU 227 217 Β1 zonsav; triaziquon; 2,2’, 2”-triklór-trietil-amin; uretán; vindezin; dacarbazin; mannomustin; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitozin; arabinozid (Ara-C); ciklofoszfamid; tiotepa; taxoidok, például paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ, USA) és doxataxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Franciaország); klór-ambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; markapto-purin; methotrexát; platinaanalógok, például cisplatin és carboplatin; vinblastin; platina; etoposid (VP-16); ifoszfamid; mitomycin-C; mitoxantron; vincristin; vinorelbin; navelbin; novantron; teniposid; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronát; CPT-11; RFS 2000 topoizomerázinhibitor; difluor-metil-ornitin (DMFO); retinasav; esperamycinek; capecitabin; valamint a felsorolt vegyületek gyógyászati szempontból elfogadható sói, savai és származékai. A kemoterápiás hatóanyagok közé tartoznak az antihormonális hatóanyagok, amelyek a hormonok tumorokra kifejtett hatását szabályozzák vagy gátolják; ilyenek például az antiösztrogének, például a tamoxifen, raloxifen, aromatázgátló 4(5)-imidazolok, 4-hidroxi-tamoxifen, trioxifén, keoxifén, LY117018, onapriston és toremifén (Fareston); és antiandrogének, például flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid és goserelin; valamint a felsoroltak gyógyászati szempontból elfogadható sói, savai és származékai.
Ahogy itt használjuk, a „kezelés” vagy „enyhítés” kifejezésen gyógykezelést és preventív vagy profilaktikus beavatkozást értünk, melynek célja egy adott kóros állapot vagy rendellenesség kialakulásának megelőzése vagy lassítása. Egy páciens CD20-pozitív rák vagy autoimmun betegség elleni kezelése akkor tekinthető sikeresnek, ha a találmány szerinti CD20-kötő antitest terápiás szempontból hatásos mennyiségének találmány szerinti eljárások valamelyikével végzett beadása után a páciensnél a szóban forgó betegség egy vagy több jelének vagy tünetének megfigyelhető és/vagy mérhető csökkenését vagy hiányát észleljük. Például rákos betegség esetén, a kezelés sikerét jelenti a rákos sejtek számának csökkenése vagy a rákos sejtek teljes hiánya; a tumor méretének csökkenése; a tumor metasztázisának gátlása (azaz bizonyos mértékű lassítása, előnyösen blokkolása); a tumor növekedésének bizonyos mértékű gátlása; a betegség kiújulásáig eltelt idő meghosszabbítása; és/vagy az adott rákkal összefüggésben jelentkező egy vagy több tünet bizonyos mértékű enyhítése; a morbiditás és a mortalitás mérséklése; és a páciens életminőségének javulása. A betegség tüneteinek mérséklődését a páciens önmaga is érzékelheti. A kezelés eredményezhet teljes reakciót, ami a rák valamennyi jelének megszűnését jelenti, illetve a kezelés eredményezhet részleges reakciót is, amire a tumor méretének előnyösen több, mint 50%-os, még előnyösebben 75%-os csökkenése utal. A páciens szintén kezeknek tekinthető, ha önmaga a betegség stabilizálódását tapasztalja. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a rákos beteg a kezelés után egy évvel, előnyösen 15 hónappal még mindig progressziómentes. A kezelés sikerességének, illetve a betegség javulásának megítélésére alkalmas fenti paraméterek a kezelőorvos számára jól ismert, rutinszerű eljárásokkal egyszerűen mérhetők.
A „terápiás szempontból hatásos mennyiség” kifejezésen egy antitest vagy hatóanyag azon mennyiségét értjük, amely hatásos egy adott betegség vagy rendellenesség páciensben történő „kezelésére. Rákos betegség esetén a hatóanyag terápiás szempontból hatásos mennyisége: csökkentheti a rákos sejtek számát; csökkentheti a tumor méretét; gátolhatja (azaz bizonyos mértékben lassítja, előnyösen blokkolja) a rákos sejt perifériás szervekbe történő infiltrációját; gátolhatja (azaz bizonyos mértékben lassítja, előnyösen blokkolja) a tumor metasztázisát; gátolhatja (bizonyos mértékben) a tumor növekedését; és/vagy bizonyos mértékben enyhítheti a rákkal összefüggésben jelentkező egy vagy több tünetet (lásd még fentebb a „kezelés” kifejezés definícióját).
A „krónikus” adagolás kifejezés hatóanyagok folyamatos adagolására vonatkozik (ellentétben az „akut” adagolással), melynek célja a kezdeti hatás hosszabb ideig történő fenntartása. A „szakaszos” adagolás megszakításokkal végzett, ciklikus kezelést jelent.
A találmány szerinti készítmények és eljárások
A találmány értelmében humán CD20-antigén (előnyösen egyéb főemlős-eredetű CD20-antigének) megkötésére képes humanizált antitesteket tárunk fel, amelyek H-lánca egy nem emberi eredetű antihumán CD20-kötő antitest (donorantitest) nehéz lánca komplementaritást meghatározó régiói (CDR) közül legalább egyet, előnyösen kettőt vagy valamennyit tartalmazza, továbbá magában foglalja egy humán konszenzus antitest (mint recipiens antitest) vázalkotó aminosavainak lényegében mindegyikét. A donorantitest különféle fajokból származhat, ideértve az egereket, patkányokat, tengerimalacokat, kecskéket, nyulakat, lovakat és főemlősöket, de leggyakrabban egéreredetű antitestet alkalmazunk. E vonatkozásban a vázalkotó aminosavak „lényegében mindegyike” kifejezés azt jelenti, hogy a humanizált antitestben a recipiens vázrégiók egy vagy több olyan aminosavszubsztitúciót is hordozhatnak, amelyekben a humán konszenzus vázrégió-szekvenciában eredetileg nincsenek jelen. A vázrégiót érintő módosítások olyan aminosavak jelenlétét eredményezhetik, amelyek sem a recipiens, sem a donorantitestben nem találhatók meg.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében donorantitestként egéreredetű 2H7-antitestet alkalmazunk, amelynek könnyű, illetve nehéz lánc variábilis doménjét (a komplementaritást meghatározó régiókkal és a vázrégiókkal) az 1A., illetve 1B. ábrán mutatjuk be. Az egyik konkrét megvalósítási mód szerint a humán Fab-vázat alkotó aminosavak megfelelnek a humán Vk I. alcsoport és a VH III. alcsoport konszenzusszekvenciájának (mely konszenzusszekvenciák szintén az 1 A., illetve 1B. ábrán láthatók). A találmány szerinti humanizált 2H7-antitest az egéreredetű donorantitest H-láncában elhelyezkedő komplementaritást meghatározó régiók legalább egyikét tartalmazza. Az egyik megvalósítási mód szerint a humán CD20-at megkötő
HU 227 217 Β1 humanizált 2H7-antitest a donorantitest H- és L-láncának komplementaritást meghatározó régióit egyaránt tartalmazza.
A találmány szerinti, teljes hosszúságú, humanizált CD20-kötő antitest a humanizált V-domént egy humán immunglobulin konstans doménjéhez kapcsolva tartalmazza. Az egyik előnyös megvalósítási mód értelmében a H-lánc konstans doménje humán IgG-ből (előnyösen lgG1-ből vagy lgG3-ból), míg az L-lánc konstans doménje előnyösen humán κ-láncból származik.
Hacsak másképpen nem jelezzük, a találmány szerinti humanizált 2H7-antitestváltozat a 2H7.v16-antitest L-láncának (6. ábra; 21. azonosító számú szekvencia), illetve H-láncának (7. ábra; 22. azonosító számú szekvencia) variábilis és konstans doménjének szekvenciáit tartalmazza (kivéve a későbbiekben leírásra kerülő kísérleti példákban megadott aminosavszubsztitúciós vagy egyéb módosított pozíciókat).
A humanizált CD20-kötő antitestek legalább a humán CD20 megkötésére képesek, de előnyösen egyéb főemlős-eredetű (például, cynomolgus majomból, rhesus majomból vagy csimpánzból származó) CD20 megkötésére is képesek. A cynomolgus-eredetű CD20 szekvenciáját a 15. és 19. ábrán mutatjuk be.
A találmány szerinti CD20-kötő antitestek és humanizált CD20-kötő antitestek biológiai aktivitása legalább az antitest humán CD20-at megkötő képességében, előnyösebben a humán és egyéb főemlős-eredetű (cynomolgus majomból, rhesus majomból vagy csimpánzból származó) CD20-at megkötő képességében nyilvánul meg. Az antitestek CD20-hoz történő kötődésére vonatkozó Kd-értéke legfeljebb 1 *10-8, előnyösen legfeljebb körülbelül 1 *10-9, még előnyösebben legfeljebb 1 χ 10-10, és - az alapszinthez vagy megfelelő (ilyen antitesttel nem kezelt) kontrolihoz viszonyítva - a B-sejtek számának legalább 20%-os csökkentésére képesek in vivő vagy in vitro.
A B-sejt-kivonás kívánt mértéke a kezelendő betegségtől függ. Például CD20-pozitív rák kezelése céljából kívánatos lehet a B-sejtek (melyek a találmány szerinti anti-CD20 antitestek célpontjai) számának maximális csökkentése. Ilyenformán, CD20-pozitív B-sejtes neoplazma kezelése során a B-sejt-kivonásnak elégségesnek kell lennie a betegség progressziójának gátlásához (melynek szintje szakember számára jól ismert módszerekkel mérhető, például a tumornövekedés, a rákos sejttípusok proliferációjának, metasztázisának, illetve az adott ráktípusra jellemző egyéb jelek és tünetek monitorozásával). A B-sejt-kivonás előnyösen olyan mértékű, amely elégséges a betegség progressziójának legalább két hónapra, előnyösen legalább három hónapra, előnyösebben legalább négy hónapra, még előnyösebben legalább hat hónapra vagy még hosszabb időre történő feltartóztatására. A találmány még előnyösebb megvalósítási módjai értelmében a B-sejt-kivonás a betegség kiújulási idejének legalább hat hónappal, előnyösen legalább kilenc hónappal, előnyösebben legalább egy évvel, még előnyösebben legalább két évvel, még előnyösebben legalább három évvel, még előnyösebben legalább öt vagy még több évvel történő meghosszabbításához elégséges mértékű. A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint a B-sejt-kivonás a betegség teljes gyógyításához elégséges mértékű. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban a B-sejt-kivonás rákos páciens esetében - a kezelés előtti alapszinthez viszonyítva - legalább körülbelül 75%-os, előnyösebben 80%-os, 85%-os, 90%-os, 95%-os, 99%-os vagy akár 100%-os mértékű.
Autoimmun betegség kezelése esetén a B-sejt-kivonás mértékét a konkrét betegségtől és/vagy a páciens állapotának súlyosságától függően, a CD20-kötő antitest dózisának beállításával módosíthatjuk, így a B-sejtek számának csökkentése - bár nem szükségszerűen - akár teljes mértékű is lehet. Az antitest adagolása végezhető úgy is, hogy a kezdeti kezeléskor teljes B-sejt-kivonást eredményezzen, a későbbi időszakban azonban a dózisok a részleges kivonásnak megfelelő szintre csökkenthetők. Az egyik megvalósítási mód értelmében a B-sejt-kivonás a kezelés előtti alapszinthez viszonyítva legalább 20%-os, vagyis a kezelés után a CD20-pozitív B-sejtek 80%-a vagy még kisebb hányada marad meg. A B-sejt-kivonás mértéke előnyösen a betegség progressziójának feltartóztatására, még előnyösebben a kezelt betegség jeleinek és tüneteinek enyhítésére, még előnyösebben a betegség teljes gyógyítására elégséges.
A találmány értelmében olyan bispecifikus CD20kötő antitesteket is feltárunk, amelyek egyik karja a találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitest humanizált H- és L-láncát tartalmazza, másik karja pedig egy másik antigénre specifikus V-régiót foglal magában. Bizonyos megvalósítási módok szerint e másik kar CD3-ra, CD64-re, CD32A-ra, CD16-ra, NKG2D-re vagy más NK-aktiváló ligandumokra specifikus V-régiót tartalmaz.
A találmány szerinti v16-antitest - a Rituxanhoz (rituximab) viszonyítva körülbelül 25-ször nagyobb ADCC-aktivitás és körülbelül 3-4-szer kisebb CDC-aktivitás kifejtésére képes.
Antitestek előállítása
Monoklonális antitestek
A monoklonális antitestek az elsőként Kohler és munkatársai [Natúré 256, 495 (1975)] által leírt hibridómaeljárással, valamint rekombináns DNS-technikák (lásd a 4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást) alkalmazásával állíthatók elő.
A hibridómaeljárás során egeret vagy egyéb, alkalmas gazdaállatot (például hörcsögöt) a fentebb leírtak szerint immunizálunk, hogy olyan limfociták termelődését váltsuk ki, amelyek az immunizálásra alkalmazott proteinhez specifikusan kötődő antitesteket termelnek (illetve azok termelésére képesek). Más módon, a limfocitákat in vitro immunizálhatjuk, majd - megfelelő fuzionáltató ágens (például polietilénglikol) alkalmazásával myelomasejtekhez fuzionáltatjuk, miáltal hibridómasejteket kapunk [Goding: „Monodonal Antibodies: Principles and Practice’’, 59-103. oldal, Academic Press (1986)].
Az így létrehozott hibridómasejteket megfelelő tenyésztő tápközegben szaporítjuk, amely előnyösen
HU 227 217 Β1 egy vagy több olyan anyagot tartalmaz, amely a fuzionálatlan kiindulási myelomasejtek (más néven fúziós partner) szaporodását és túlélését gátolja. Például ha a kiindulási myelomasejtekből hiányzik a hipoxanthinguanin-foszforibozil transzferáz enzim (HGPRT vagy HPRT), a hibridómák tenyésztésére rendszerint - a HGPRT-deficiens sejtek szaporodását gátló - hipoxanthint, aminopterint és timidint tartalmazó szelektív tápközeget (HAT-tápközeg) alkalmazunk.
Fúziós partnerként előnyösen olyan myelomasejteket alkalmazunk, amelyek hatékonyan fuzionálhatok; elősegítik a kiválasztott antitesttermelő sejtek stabil és nagymértékű antitesttermelését; és érzékenyek a fuzionálásán kiindulási sejtek elleni szelekciós tápközegre. Fúziós partnerként ezek közül előnyösen egéreredetű myelomasejteket alkalmazunk; ilyenek például a MOPC-21 és MPC-11 egértumorokból származó sejtvonalak (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA) és az SP-2 vagy X63Ag8-653 sejtek (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA). Humán monoklonális antitestek termelésére humán myelomasejtek és egér/humán heteromyelomasejtek alkalmazását is leírták [lásd Kozbor: J. Immunoi. 133, 3001 (1984); Brodeur és munkatársai: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63. oldal, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)].
A hibridómasejtek szaporítására alkalmazott tenyésztő tápközeget az antigén elleni monoklonális antitestek termelődésére teszteljük. A hibridómasejtek által termelt monoklonális antitestek kötési specifitását előnyösen immunprecipitációval vagy in vitro kötési teszttel - például radioimmunteszttel (RIA) vagy enzimkötött immunszorbens vizsgálati eljárással (ELISA) - határozzuk meg.
A monoklonális antitest kötési affinitása, például a Munson és munkatársai [Anal. Biochem. 107, 220 (1980)] által leírt Scatchard-analízissei határozható meg.
A kívánt specifitású, affinitású és/vagy aktivitású antitesteket termelő hibridómasejtek azonosítása után a kiónokat limitálóhígítással szubklónozhatjuk és szokványos eljárásokkal szaporíthatjuk [lásd Goding: „Monoclonal Antibodies: Principles and Practice’’, 59-103. oldal (Academic Press, 1986)]. Az e célra alkalmas tenyésztő tápközegek példái közé tartozik a D-MEM és az RPMI-1640 tápközeg. Más módon, a hibridómasejtek hasűri tumorokként állatokban in vivő is szaporíthatok (például a sejtek egerekbe történő intraperitoneális injektálásával).
A szubklónok által kiválasztott monoklonális antitesteket előnyösen szokványos immunglobulin-tisztítási technikák (például protein-A Sepharose, hidroxilapatit-kromatográfia, gélelektroforézis, dialízis vagy affinitási kromatográfia) alkalmazásával választjuk el a tenyésztő tápközegtől, hasűri folyadéktól vagy szérumtól.
A monoklonális antitesteket kódoló DNS-ek szokványos eljárásokkal egyszerűen izolálhatok és szekvenálhatók (például az egéreredetű antitestek nehéz, illetve könnyű láncát kódoló génekhez specifikusan hibridizáló oligonukleotidpróbák alkalmazásával). Az ilyen DNS-ek előnyös forrásául hibridómasejtek szolgálnak. Izolálás után a DNS-t expressziós vektorokba inszertálhatjuk, és a vektorokkal gazdasejteket - például E. co//-sejteket, majomeredetű COS-sejteket, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket vagy myelomasejteket (melyek antitestproteint egyébként nem termelnek) transzfektálhatunk, miáltal a rekombináns gazdasejtekben monoklonális antitestek termelődését idézzük elő. Az antitesteket kódoló DNS baktériumokban történő rekombináns expresszáltatásának áttekintését illetően lásd Skerra és munkatársai: Curr. Opinion in Immunoi. 5, 256 (1993); Plückthun: Immunoi. Rév. 130, 151 (1992).
Egy további megvalósítási módnak megfelelően, az antitestek vagy antitestfragmensek a McCafferty és munkatársai [Natúré 348, 552 (1990)] által leírt technikák alkalmazásával létrehozott antitest fágkönyvtárakból izolálhatok. Clarkson és munkatársai [Natúré 352, 624 (1991)] és Marks és munkatársai [J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)] egéreredetű, illetve és humán antitestekfágkönyvtárak alkalmazásával történő - izolálását írták le. Később ismertették a nagy (nM nagyságrendű) affinitású humán antitestek lánckombinálási („chain-shuffling) technikával történő előállítását [lásd Marks és munkatársai: Bio/Technology 10, 779 (1992)]. A kombinatorikus infekciót és in vivő rekombinációt, mint a nagyon nagy méretű fágkönyvtárak előállításának stratégiáját írták le [Waterhouse és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 21, 2265 (1993)]. Ilyenformán, ezek a technikák a monoklonális antitestek izolálásának hagyományos hibridómatechnikáinak működőképes alternatívái.
Az antitestet kódoló DNS - kimerikus vagy fúziós antitestpolipeptidek létrehozása céljából - módosítható például oly módon, hogy a humán nehéz és könnyű lánc konstans doménjeinek (CH és CL) kódolószekvenciáival egéreredetű antitestek homológ szekvenciáit helyettesítjük [4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Morrison és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)], vagy az immunglobulin kódolószekvenciájához egy nem immunglobulin-polipeptid (heterológ polipeptid) kódolószekvenciájának egészét vagy részét fuzionáltatjuk. A nem immunglobulin-polipeptid szekvenciákkal rendszerint az antitestek konstans doménjeit helyettesítjük, vagy más módon, egy antitest egyik antigénkombinálódási helyének variábilis doménjeit helyettesítjük velük, hogy olyan kétértékű kimerikus antitestet hozzunk létre, amely két - más-más antigénre specifikus - antigénkombinálódási helyet tartalmaz.
Humanizált antitestek
A nem humán antitestek humanizálási eljárásai szakember számára jól ismertek. A humanizált antitestek általában egy vagy több, nem humán forrásból származó aminosavat tartalmaznak. Ezeket a nem humán aminosavakat gyakran „import aminosavaknak nevezzük, melyek rendszerint egy „import” variábilis doménből származnak. Az antitestek humanizálását lé13
HU 227 217 Β1 nyegében Winter és munkatársai eljárásával hajthatjuk végre [Jones és munkatársai: Natúré 321, 522 (1986); Riechmann és munkatársai: Natúré 332, 323 (1988); Verhoyen és munkatársai: Science 239, 1534 (1988)], oly módon, hogy egy humán antitest megfelelő szekvenciáit rágcsálóeredetű antitestek hipervariábilis régióinak szekvenciáival helyettesítjük. Ennek megfelelően, az ilyen „humanizált” antitestek kimerikus antitestek (lásd a 4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást), amelyekben az antitest - teljes humán variábilis doménnél lényegesen kisebb - része van helyettesítve egy nem humán fajból származó, megfelelő szekvenciával. A gyakorlatban a humanizált antitestek rendszerint olyan humán antitestek, amelyekben a hipervariábilis régió néhány aminosava - és esetleg a vázrégió (FR) néhány aminosava - rágcsálóeredetű antitestek analóg pozícióiból származó aminosavakkal van helyettesítve.
Az antitest humán terápiás felhasználása esetén az antigenitás és a HAMA-reakció (humán antiegér antitest reakció) csökkentése szempontjából nagy jelentősége van a humanizált antitestek létrehozására alkalmazandó (nehéz és könnyű láncból származó) humán variábilis domének kiválasztásának. Az úgynevezett „legjobb egyezés” módszer szerint egy rágcsálóeredetű antitest variábilis doménjének szekvenciáját ismert humán variábilis domének szekvenciáit tartalmazó teljes könyvtárral hasonlítjuk össze. Kiválasztjuk a rágcsálóeredetű szekvenciával legközelebbi egyezést mutató humán V-domén szekvenciát, és az ezen belüli vázrégiót (FR) fogadjuk el a humanizált antitest vázrégiójaként [Sims és munkatársai: J. Immunoi. 151, 2296 (1993); Chothia és munkatársai: J. Mól. Bioi. 196, 901 (1987)]. Egy másik módszer szerint az összes - egy bizonyos alcsoportba tartozó könnyű és nehéz láncot tartalmazó - humán antitest konszenzus-szekvenciájából származó vázrégiót alkalmazunk. Különböző humanizált antitestek esetében ugyanaz a vázrégió használható [Carter és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta és munkatársai: J. Immunoi. 151, 2623 (1993)].
Lényeges továbbá, hogy az antitestek a humanizálást követően is megtartsák antigénre vonatkozó nagy kötési affinitásukat és egyéb kedvező biológiai tulajdonságaikat. Ennek érdekében, az egyik előnyös eljárás szerint, a humanizált antitesteket a kiindulási szekvenciák és a különböző lehetséges humanizált termékek - háromdimenziós modellek felhasználásával végzett - analizálását követően állítjuk elő. Az immunglobulinok háromdimenziós modelljei széleskörűen hozzáférhetők és szakember számára jól ismertek. Számítógépes programok állnak rendelkezésre a kiválasztott lehetséges immunglobulin-szekvenciák valószínű háromdimenziós konformációs struktúráinak illusztrálására és megjelenítésére. Az így megjelenített struktúrák tanulmányozása elősegíti az egyes aminosavaknak a lehetséges immunglobulin-szekvencia működésében betöltött szerepének vizsgálatát, azaz a lehetséges immunglobulin-szekvencia antigénhez kötődő képességét befolyásoló aminosavak vizsgálatát. Ezen a módon kiválaszthatók a vázrégió aminosavai, és a recipiens és import szekvenciákból úgy kombinálhatók, hogy a kívánt antitesttulajdonságokat [például a célantigén(ek)re vonatkozó fokozott affinitást] kapjuk. A komplementaritást meghatározó régió aminosavai általában közvetlenül és jelentős mértékben játszanak szerepet az antigénkötés befolyásolásában.
Humanizált antitestként antitestfragmens (például Fab-fragmens) is alkalmazható, amely, adott esetben, immunkonjugátum létrehozása céljából, egy vagy több citotoxikus hatóanyaggal kombinálható. Más módon, a humanizált antitest teljes antitest, például intakt lgG1 antitest lehet.
Humán antitestek; fágfelületen való megjelenítési technika
Az antitestek humanizálásának alternatíváját jelenti a humán antitestek előállítása. Napjainkban már lehetőség van olyan transzgenikus állatok (például egerek) létrehozására, amelyek immunizálást követően képesek a humán antitestek teljes repertoárjának termelésére anélkül, hogy saját (endogén) immunglobulinokat termelnének. Például leírták, hogy kimerikus és csíravonalmutáns egerekben az antitest nehéz lánc kapcsolódási régiójának (JH) génjében bekövetkezett homozigóta deléció az endogén antitesttermelődés teljes gátlását eredményezi. A humán csíravonal-eredetű immunglobulingének ilyen csíravonalmutáns egerekbe történő bejuttatása - antigénstimulus hatására - humán antitestek termelődését eredményezi [lásd például Jakobovits és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits és munkatársai: Natúré 362, 255 (1993); Bruggemann és munkatársai: Year in Immuno. 7, 33 (1993); 5 545 806, 5 569 825, 5 591 669 és 5 545 807 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások; WO 97/17852 számú nemzetközi közzétételi irat].
Más módon, humán antitestek és antitestfragmensek - immunizálatlan donorokból származó immunglobulin variábilis (V) domént kódoló gének készletéből történő - in vitro előállítására a McCafferty és munkatársai [Natúré 348, 552 (1990)] által leírt fágfelületen való megjelenítési („phage display”) technika is alkalmazható. E technika szerint antitest variábilis domének génjeit - azonos leolvasási fázisban - fonalas bakteriofág (például M13 vagy fd) nagy vagy kis burokproteingénjébe klónoznak, és a fágrészecske felületén működőképes antitestfragmenseket jelenítenek meg. Mivel a fonalas fágrészecske a fág genomjának egyszálú DNS-kópiáját tartalmazza, az antitest funkcionális tulajdonságain alapuló szelekció az e tulajdonságokat mutató antitestet kódoló gén kiválasztását eredményezi. Ilyenformán, a fág a B-sejt bizonyos tulajdonságait utánozza. A fágon való megjelenítési technika különböző formátumokban hajtható végre; összefoglaló áttekintést illetően lásd például Johnson és munkatársai: Current Opinion in Structural Biology 3, 564 (1993). E technikához a V-génszegmensek számos forrása alkalmazható. Clackson és munkatársai [Natúré 352, 624 (1991)] immunizált egerek lépéből származó V-gének kisméretű, random kombinatorikus könyvtárából anti14
HU 227 217 Β1 oxazolon-antitestek diverz sorozatát izolálták. Lényegében Marks és munkatársai [J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)] vagy Griffith és munkatársai [EMBO J. 72, 725 (1993)] által leírt eljárásokkal immunizálatlan emberekből származó V-gének repertoárja állítható elő, illetve antigének (köztük sajátantigének) diverz sorozata elleni antitestek izolálhatok (lásd még az 5 565 332 és 5 573 905 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).
Ahogy fentebb említettük, humán antitestek in vitro aktivált B-sejtek alkalmazásával is előállíthatok (lásd az 5 567 610 és 5 229 275 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).
Antitestfragmensek
Bizonyos esetekben a teljes antitestek helyett előnyösebb antitestfragmenseket alkalmazni, melyek - kisebb méretüknek köszönhetően - gyorsabb „clearance”-t tesznek lehetővé és könnyebben behatolhatnak a kemény tumorokba.
Az antitestfragmensek előállítására különféle technikákat fejlesztettek ki. Ezek a fragmensek hagyományosan intakt antitestek proteolitikus emésztésével hozhatók létre [lásd például Morimoto és munkatársai: Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107 (1992); és Brennan és munkatársai: Science 229, 81 (1985)], azonban az ilyen fragmensek rekombináns gazdasejtek alkalmazásával közvetlenül is előállíthatok. Például a Fab, Fv és scFv fragmensek E. co//val expresszáltathatók és szekretálhatók, ami az ilyen fragmensek nagy mennyiségben történő, egyszerű előállítását teszi lehetővé. Az antitestfragmensek a fentebb leírt antitest-fágkönyvtárakból izolálhatok. Más módon, Fab’-SH fragmensek E. collbó\ közvetlenül kinyerhetők, és kémiai kapcsolással F(ab’)2 fragmensekké alakíthatók [lásd Carter és munkatársai: Bio/Technology 70, 163 (1992)]. Egy másik megközelítési mód szerint az F(ab’)2 fragmensek közvetlenül rekombináns gazdasejtek tenyészetéből izolálhatok. Az 5 869 046 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban - úgynevezett „visszamentő-receptort” („salvage receptor”) kötő epitópot tartalmazó - megnövelt in vivő felezési idejű Fab és F(ab’)2 fragmenst tártak fel. Az antitestfragmensek előállításának egyéb technikái szakember számára jól ismertek. Bizonyos megvalósítási módokban egyláncú Fv fragmenst (scFv) alkalmazhatunk (lásd a WO 93/16185 számú nemzetközi közzétételi iratot és az 5 571 894 és 5 587 458 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). Az Fv és sFv fragmensek az egyedüli antitestfragmensek, amelyek konstans régióktól mentes, ép antigénkombinálódási helyeket tartalmaznak; ilyenformán, in vivő felhasználás során csökkent mértékű nemspecifikus kötődést eredményeznek. Az egyláncú Fv fragmens N- vagy C-terminális végéhez effektorproteint kapcsolva fúziós sFV-proteinek is létrehozhatók („Antibody Engineering”, szerk.: Borrebaeck, lásd fentebb). Antitestfragmensként „lineáris antitestet’’ is alkalmazhatunk (lásd például az 5 641 870 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást), amely mono- vagy bispecifikus lehet.
Bispecifikus antitestek
A bispecifikus antitestek olyan antitestek, amelyek legalább két különböző epitópra specifikusak. A jellemző bispecifikus antitestek a CD20-protein két különböző epitópjához képesek kötődni. Más bispecifikus antitestekben a CD20-kötőhely egy másik proteinre specifikus kötőhellyel van kombinálva. Más módon, egy antiCD20 kart leukocitán elhelyezkedő „trigger”-molekulához kötődő karral kombinálhatunk, miáltal a celluláris védőmechanizmus CD20-at expresszáló sejtre lokalizálható. Az ilyen triggermolekulák példáiként említhetők a következők: T-sejt-receptor-molekula (például CD3), IgG-hez kötődő Fc-receptorok (FcyR), mint például az FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) és FcyRIII (CD16), illetve az NKG2D vagy egyéb, NK-sejt-aktiváló ligandumok. A bispecifikus antitestek citotoxikus hatóanyagok CD20-proteint termelő sejtekhez történő célba juttatására is alkalmasak. Az ilyen antitestek egy CD20-kötő kart és egy másik - citotoxikus hatóanyagot (például szaporint, antiinterferon-a-t, vincaalkaloidot, ricin-A-láncot, methotrexátot vagy radioaktív izotóppal jelölt haptént) megkötő - kart tartalmaznak. A bispecifikus antitestek teljes hosszúságú antitestként vagy antitestfragmensként [például F(ab’)2 bispecifikus antitestként] állíthatók elő.
A WO 96/16673 számú nemzetközi közzétételi iratban bispecifikus anti-ErbB2/anti-FcYRIII antitestet tárnak fel, míg az 5 837 234 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltártak egy anti-ErbB2/antiFcyRI antitestet. A WO 98/02463 számú nemzetközi közzétételi iratban anti-ErbB2/Fca antitestet, az 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban pedig bispecifikus anti-ErbB2/anti-CD3 antitestet tártak fel.
A bispecifikus antitestek előállítási eljárásai szakember számára jól ismertek. A bispecifikus antitestek szokványos előállítási módja két immunglobulin nehéz lánc/könnyű lánc pár együttes expresszáltatásán alapul, ahol is a két lánc különböző specifitású [lásd Millstein és Cuello: Natúré 305, 537 (1983)]. Az immunglobulin nehéz és könnyű láncainak véletlenszerű összetételű készletei miatt e hibridómák (kvadrómák) potenciálisan tíz különböző antitestmolekula elegyét tartalmazzák, melyek közül csupán egy rendelkezik a megfelelő bispecifikus szerkezettel. A megfelelő molekula - általában affinitási kromatográfiával végzett - tisztítása igen munkaigényes, és a kitermelési százaléka is alacsony. Hasonló eljárások tártak fel a WO 93/08829 számú nemzetközi közzétételi iratban, valamint Traunecker és munkatársai: EMBO J. 70, 3655 (1991).
Egy másik megközelítési mód szerint az antitestek kívánt kötési specifitású variábilis doménjeit (antitestantigén kombinálódási helyek) immunglobulin konstans dómén szekvenciákhoz fuzionáljuk. A fúziót előnyösen egy immunglobulin nehéz lánc konstans doménjével valósítjuk meg, amely legalább a csuklórégió részletét, a CH2- és a CH3-régiót tartalmazza. Előnyös, ha legalább az egyik fúziós partner tartalmazza a nehéz lánc első konstans régióját (CH1) is, amely magában foglalja a könnyű lánchoz történő kötődéshez
HU 227 217 Β1 szükséges helyet. Az immunglobulin nehéz lánc fúziókat - és kívánt esetben az immunglobulin könnyű láncot - kódoló DNS-eket külön expressziós vektorokba inszertáljuk, és azokat együttesen megfelelő gazdaorganizmusba transzfektáljuk. Ez nagy rugalmasságot biztosít a három polipeptidfragmens relatív arányának beállításában, azon megvalósítási módokban, ahol a három különböző polipeptidlánc eltérő arányú felhasználása a létrehozni kívánt bispecifikus antitest optimális hozamát eredményezi. Mindazonáltal, lehetőség van arra is, hogy két vagy mindhárom polipeptidlánc kódolószekvenciáját egyazon expressziós vektorba inszertáljuk (olyan esetekben, ha legalább két polipeptidlánc azonos arányban történő expressziója eredményezi a nagy hozamot vagy ha a kívánt lánckombináció hozama szempontjából a láncok relatív arányának nincs különösebb jelentősége).
E megoldás egy előnyös megvalósítási módja értelmében a bispecifikus antitestek - az egyik karon - hibrid immunglobulin nehéz láncból (első kötőspecifitással) és - a másik karon - egy hibrid immunglobulin nehéz lánc/könnyű lánc párból (második kötőspecifitással) állnak. Azt találtuk, hogy ez az aszimmetrikus struktúra elősegíti a kívánt bispecifikus vegyület nemkívánatos immunglobulinlánc-kombinációktól történő elválasztását, mivel az immunglobulin könnyű láncnak a bispecifikus molekula csupán egyik felében való jelenléte egyszerű elkülönítést tesz lehetővé. E megoldás leírását illetően lásd a WO 94/04690 számú nemzetközi közzétételi iratot. A bispecifikus antitestek előállításának további részleteit illetően lásd például Suresh és munkatársai: Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Egy másik megoldás (lásd az 5 731 168 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást) szerint a rekombináns sejttenyészetből kinyerhető heterodimerek százalékos arányának maximalizálása érdekében antitestmolekula-pár közötti határfelület alakítható ki. Az előnyös határfelület egy antitest konstans doménje CH3-doménjének legalább egy részét tartalmazza. Az eljárás során az első antitestmolekula határfelületéből egy vagy több kisméretű aminosav-oldalláncot nagyobb oldallánccal (például tirozin vagy triptofán) helyettesítünk. A második antitestmolekula határfelületén a nagy oldallánc(ok)ével azonos vagy hasonló méretű kompenzáló-„üregeket” hozhatunk létre, oly módon, hogy a nagyobb aminosav-oldalláncokat kisebbekre (például alaninra vagy treoninra) cseréljük. Ez a mechanizmus a heterodimer jobb hozamát biztosítja (a nemkívánatos végtermékekhez, például homodimerekhez viszonyítva).
A bispecifikus antitestek közé tartoznak a keresztkötéses vagy „heterokonjugált” antitestek is. Például a heterokonjugátum egyik antitestje avidinhez, a másik biotinhoz lehet kapcsolva. Az ilyen antitestek alkalmazását például az immunrendszer sejtjeinek nemkívánatos sejtek elleni célba juttatására (lásd a 4 676 980 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást) és HlV-fertőzés kezelésére javasolták (WO 91/00360 és WO 92/200373 számú nemzetközi közzétételi irat és EP03089 számú európai szabadalmi leírás). A heterokonjugált antitestek bármely alkalmas keresztkötésképző eljárással előállíthatok. Az ilyen célra megfelelő keresztkötésképző ágensek jól ismertek (leírásukat illetően - különféle keresztkötési technikákkal együtt lásd a 4 676 980 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
A bispecifikus antitestek antitestfragmensekből történő előállításának technikái az idevonatkozó szakirodalomból szintén jól ismertek. Például bispecifikus antitesteket előállíthatunk kémiai kapcsolás alkalmazásával. Brennan és munkatársai [Science 229, 81 (1985)] eljárásában az intakt antitesteket proteolitikusan emésztve F(ab’)2 fragmenseket hoznak létre, majd ezeket a fragmenseket - a vicinális ditiolok stabilizálása és az intermolekuláris diszulfidképződés megakadályozása érdekében - ditiol komplexálóágens (nátrium-arzenit) jelenlétében redukálják. Az így kapott Fab’ fragmenseket tio-nitro-benzoát (TNB) származékokká alakítják, majd az Fab’-TNB származékok egyikét merkapto-etilaminnal végzett redukcióval visszaalakítják Fab’-tiollá, és azt a másik Fab’-TNB származék ekvimoláris mennyiségével elegyítik, miáltal a bispecifikus antitesthez jutnak. Az így létrehozott bispecifikus antitestek enzimek szelektív immobilizálására alkalmazhatók.
Az utóbbi években lehetővé vált a Fab’-SH fragmensek £ co//-sejtekből történő közvetlen kinyerése. E fragmensek kémiai kapcsolásával bispecifikus antitestek hozhatók létre. Shalaby és munkatársai [J. Exp. Med. 175, 217 (1992)] teljes egészében humanizált bispecifikus F(ab’)2 antitestmolekula előállítását tárták fel. A két Fab’ fragmenst külön-külön E. co/A/al termeltették, és a bispecifikus antitestet irányított in vitro kémiai kapcsolással hozták létre. Az általuk előállított bispecifikus antitest ErbB2-receptort túlzott mennyiségben termelő sejtekhez és normál humán T-sejtekhez képes kötődni, és képes kiváltani a humán citotoxikus limfociták humán emlőtumorsejtek elleni litikus aktivitását.
A bispecifikus antitestek fragmenseinek közvetlenül rekombináns sejttenyészetekben történő előállítására és izolálására különféle eljárásokat tártak fel. Például Kostelny és munkatársai [J. Immunoi. 148(5), 1547 (1992)] leucin-„cipzárak” alkalmazásával bispecifikus antitesteket állítottak elő. Az Fos- és Jun-proteinből származó leucincipzár peptideket génfúzió alkalmazásával két különböző antitest Fab’ fragmenséhez kapcsolták. Az antitesthomodimereket a csuklórégiónál redukálva monomereket kaptak, majd ezeket visszaoxidálva antitestheterodimereket hoztak létre. Ez az eljárás antitesthomodimerek előállítására is alkalmazható. A Hollinger és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444 (1993)] által feltárt „diatest technika a bispecifikus antitestfragmensek előállításának alternatív mechanizmusát reprezentálja. Az ilyen fragmensek egy nehéz lánc variábilis domént (VH) egy könnyű lánc variábilis doménhez (VL) kapcsolva tartalmaznak, olyan kapcsolószekvencián keresztül, amely túl rövid ahhoz, hogy az ugyanazon láncon lévő két dómén között párosodás következzen be. Ennek megfelelően, az egyik fragmens VH- és VL-doménje kényszerítve van, hogy a másik fragmensen lévő komplementer VL16
HU 227 217 Β1 és VH-doménnel alkosson párt, miáltal két antigénkötő hely képződik. A bispecifikus antitestfragmensek előállításának egy másik, egyláncú Fv-dimerek alkalmazásán alapuló módszerét Gruber és munkatársai tárták fel [J. Immunoi. 152, 5368 (1994)].
A kettőnél több értékű antitestek szintén a találmány tárgyához tartoznak. Például előállíthatok trispecifikus antitestek is [lásd Tutt és munkatársai: J. Immunoi. 147, 60 (1991)].
Multivalens antitestek
Egy többértékű (multivalens) antitestet - az antitestnek megfelelő antigént expresszáló - sejt gyorsabban képes internalizálni (és/vagy katabolizálni), mint egy kétértékű antitestet. A találmány szerinti antitestek többértékű - nem IgM-osztályba tartozó - antitestek is lehetnek, melyek három vagy több antigénkötő helyet tartalmaznak (például négyértékű antitestek). Az ilyen antitestek a polipeptidláncaikat kódoló nukleinsavrekombináns módszerekkel történő expresszáltatásával egyszerűen előállíthatok. A többértékű antitest dimerizációs domént és három vagy több antigénkötő helyet tartalmazhat. A dimerizációs dómén, előnyösen, Fc-régiót vagy csukló- (,/?mge’)-régiót tartalmaz (vagy abból áll). E forgatókönyv szerint az antitest Fc-régiót és (az Fc-régiótól N-terminális irányban) három vagy több antigénkötő helyet tartalmaz. A találmány szerinti előnyös, többértékű antitestek körülbelül 3-8 (előnyösen négy) antigénkötő helyet tartalmaz (vagy azokból áll). A többértékű antitest legalább egy (előnyösen két) polipeptidláncot tartalmaz, mely polipeptidláncok két vagy több variábilis domént foglalhatnak magukban. Például a polipeptidlánc (ok) VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc képlettel írhatóik) le, ahol „VD1” az első variábilis dómén; „VD2” a második variábilis dómén; „Fc” egy Fc-régió polipeptidlánca; „X1” és „X2” jelentése: aminosav vagy polipeptid; és „n” értéke: 0 vagy 1. például a polipeptidlánc(ok) a következők lehetnek: VH-CH1-(flexibilis kapcsolókomponens)-VH-CH1 -(Fc-régió) vagy VH-CH1-VH-CH1(Fc-régió). A találmány szerinti multivalens antitest előnyösen legalább két (előnyösen legalább négy) könnyű lánc variábilis dómén polipeptidet is tartalmaz. Például a multivalens antitest körülbelül 2-8 könnyű lánc variábilis dómén polipeptidet tartalmazhat. A könnyű lánc variábilis dómén polipeptidek egy könnyű láncú variábilis domént tartalmaznak, továbbá, adott esetben, tartalmazhatnak egy CL-domént is.
További aminosavszekvencia-módosítások
A találmány értelmében feltárjuk a találmány szerinti CD20-kötő antitestek további aminosavszekvencia módosításait is. Például kívánatos lehet az antitest kötési affinitásának és/vagy egyéb biológiai tulajdonságainak javítása. Az anti-CD20 antitest aminosavszekvencia változatait úgy hozhatjuk létre, hogy az antiCD20 antitestet kódoló nukleinsavba megfelelő nukleotidmódosításokat iktatunk be. Más módon, az ilyen aminosavszekvencia-változatok peptidszintézissel is előállíthatok. Az ilyen módosítások közé tartoznak az anti-CD20 antitest aminosavszekvenciáját érintő deléciók és/vagy inszerciók és/vagy szubsztitúciók. A végső konstrukció létrehozása céljából a deléciók, inszerciók és szubsztitúciók bármely kombinációja alkalmazható, feltéve, hogy a végtermék a kívánt tulajdonságokkal bír. Az aminosavváltoztatások módosíthatják az anti-CD20 antitest poszttranszlációs érési folyamatait is (például a glikozilációs helyek számának vagy pozíciójának változtatása eredményeként).
Az anti-CD20 antitest - mutagenezis helyszíneként előnyös - aminosavai vagy régiói azonosításának egyik hasznos eljárása az „alaninpásztázási” („alanine scanning”) mutagenezis néven ismert technika [lásd Cunningham és Wells: Science 244, 1081 (1989)]. Ezen eljárás szerint azonosítunk egy aminosavat vagy célaminosavak csoportját (például töltéssel bíró aminosavak, például Arg, Asp, His, Lys és Glu), és ez(eke)t semleges vagy negatív töltésű aminosavval (legelőnyösebben alaninnal vagy polialaninnal) helyettesítjük, abból a célból, hogy befolyásoljuk az aminosavak és a CD20-antigén közötti kölcsönhatást. A szubsztitúcióra funkcionális érzékenységet mutató aminosavpozíciók meghatározását ezután úgy finomíthatjuk, hogy a szubsztitúció helyén vagy annak közelében újabb vagy egyéb mutációkat hozunk létre. Ilyenformán, bár az aminosavmódosítások helye előre meghatározott, a mutáció természete önmagában nem előre meghatározott. Például az adott helyen végrehajtott mutáció eredményének vizsgálata céljából a célkodonnál vagy célrégióban alaninpásztázást vagy random mutagenezist végzünk, és az expresszált többértékű antitesteket a kívánt aktivitásra szkríneljük.
Az aminosavszekvencia inszerciói N- és/vagy C-terminális fúziók (amelyek egy aminosavtól száz vagy még több aminosav hosszúságig terjedő polipeptid aminosavszekvenciához történő hozzákapcsolását jelentik), illetve egy vagy több aminosavas, szekvencián belüli inszerciók lehetnek. A láncvégi inszercióval létrehozott változatok példái közé tartoznak az N-terminális metionint tartalmazó antitestek és a citotoxikus polipeptidhez fuzionált antitestek. Az anti-CD20 antitestmolekula további inszerciós változatai közé tartoznak az olyan fúziós termékek, amelyekben az antiCD20 antitest N- vagy C-terminálisa enzimhez (például ADEPT) vagy olyan polipeptidhez van fuzionáltatva, amely a vérsavóban fokozza az antitest felezési idejét.
Az aminosavszekvencia-változatok egy másik típusát reprezentálják az aminosavszubsztitúciós változatok, amelyekben az anti-CD20 antitestmolekula legalább egy aminosava egy másik aminosavval van helyettesítve. Az antitestmolekula szubsztitúciós mutagenezis szempontjából legnagyobb jelentőségű pontjai a hipervariábilis régiók, de a vázrégióban végrehajtott szubsztitúciók is jelentős hatásúak lehetnek. A konzervatív szubsztitúciókat az alábbi táblázat „előnyös szubsztitúciók” oszlopában mutatjuk be. Ha ezek a helyettesítések a biológiai aktivitás megváltozását eredményezik, úgy további, jelentősebb szubsztitúciós módosításokat végezhetünk, melyeket az alábbi táblázat „lehetséges szubsztitúciók oszlopában (illetve később, az aminosavak csoportosítása kapcsán) mutatunk be, és az így létrehozott változatokat szkríneljük.
HU 227 217 Β1
Aminosavszubsztitúciók
Eredeti aminosav Lehetséges szubsztitúciók Előnyös szubsztitúciók
Alá (A) Val, Leu, He Val
Arg (R) Lys, Gin, Asn Lys
Asn (N) Gin, His, Asp, Lys, Arg Gin
Asp (D) Glu, Asn Glu
Cys (C) Ser, Alá Ser
Gin (Q) Asn, Glu Asn
Glu (E) Asp, Gin Asp
Giy(G) Alá Alá
His (H) Asn, Gin, Lys, Arg Arg
lle(l) Leu, Val, Met, Alá, Phe, norleucin Leu
Leu (L) Norleucin, He, Val, Met, Alá, Phe lle
Lys (K) Arg, Gin, Asn Arg
Met (M) Leu, Phe, lle Leu
Phe (F) Leu, Val, lle, Alá, Tyr Tyr
Pro (P) Alá Alá
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp (W) Tyr, Phe Tyr
Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val (V) lle, Leu, Met, Phe, Alá, norleucin Leu
Az antitestek biológiai tulajdonságai szempontjából lényeges módosítások úgy valósíthatók meg, hogy kiválasztjuk azokat a szubsztitúciókat, amelyek a következők tekintetében jelentős mértékben különböznek az eredeti aminosavtól: (a) a szubsztitúció közelében a polipeptidváz szerkezetének fenntartásában (például redős vagy helikális konformáció); (b) a molekula célhelyén a töltés és hidrofóbitás fenntartásában; vagy (c) az oldallánc fizikai kiterjedésének fenntartásában. A természetben előforduló aminosavakat - oldalláncaik tulajdonságai alapján - a következő csoportokba soroljuk:
(1) hidrofób: norleucin, Met, Alá, Val, Leu, He;
(2) semleges, hidrofil: Cys, Ser, Thr;
(3) savas: Asp, Glu;
(4) bázisos: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
(5) láncorientációt befolyásoló aminosavak: Gly, Pro;
(6) aromás: Trp, Tyr, Phe.
Nem konzervatív szubsztitúció esetén az egyik csoportba tartozó aminosav egy másik csoportba tartozó aminosavval van helyettesítve.
A molekula oxidatív stabilitásának javítása és a rendellenes keresztkötés-képződés megakadályozása érdekében az anti-CD20 antitest konformációjának fenntartásában szerepet nem játszó ciszteinek bármelyike helyettesíthető (általában szerinnel). Ezzel szemben, az antitest stabilitásának javítása céljából ciszteinkötés(ek) alakítható(k) ki (különösen olyan esetekben, ha az antitest egy antitestfragmens, például Fv fragmens).
A szubsztitúciós változatok egy különösen előnyös típusa az eredeti antitest (például humanizált vagy humán antitest) hipervariábilis régiója egy vagy több aminosavának szubsztitúcióját foglalja magában. A további javításra kiválasztott változat(ok) az eredeti antitesthez képest javított biológiai tulajdonságú(ak) lesz(nek). Az ilyen szubsztitúciós változatok létrehozásának egyik alkalmas módja a fágfelületen történő megjelenítéssel végzett affinitásfejlesztés. Röviden összefoglalva; a hipervariábilis régió több helyén (például 6-7 helyen) mutagenezist végzünk, hogy mindegyik helyen valamennyi lehetséges aminosavszubsztitúciót létrehozzuk. Az így kapott többértékű antitesteket külön-külön, fonalas fágrészecskéken az M13 - fágrészecskékbe csomagolt - III. géntermékével képzett fúziós proteinekként jelenítjük meg. A fágon megjelenített változatokat biológiai aktivitásukra (például kötési affinitásukra) teszteljük. A hipervariábilis régió módosításra alkalmas helyeinek azonosítása céljából alaninpásztázási mutagenezist végezhetünk, amellyel meghatározható, hogy a hipervariábilis régió mely aminosavai járulnak hozzá jelentős mértékben az antigénkötéshez. Más módon, vagy ezen túlmenően, az antitest és az antigén közötti érintkezési pontok azonosítása céljából előnyös lehet az antigén-antitest komplex kristályszerkezetének vizsgálata. Az ilyen érintkezési (kontakt) aminosavak és az ezekkel szomszédos aminosavak a szóban forgó technikával végzett szubsztitúcióra kiszemelt aminosavakat reprezentálják. Az ilyen változatok létrehozása után a változatok sorozatát az itt ismertetett módon szkríneljük, és további fejlesztésre az egy vagy több releváns tesztben kimagasló tulajdonságúnak bizonyuló antitesteket választjuk ki.
Az antitestek aminosawáltozatainak egy másik típusában az antitest eredeti glikozilációs mintázata módosítva van. A módosításon az antitest egy vagy több szénhidrátgyökének eltávolítását és/vagy egy vagy több glikozilációs hely antitestbe történő beépítését értjük, de idetartozik a glikozilációs mintázat kvalitatív módosítása (a jelen lévő különböző szénhidrátgyökök természetének és arányainak megváltoztatása) is.
Az antitestek glikozilációja jellemzően N- vagy O-kötésű. Az „N-kötésű” glikoziláció azt jelenti, hogy a szénhidrátgyök egy aszparaginsav oldalláncához kapcsolódik. A szénhidrátgyök aszparagin-oldallánchoz történő enzimatikus kapcsolásának felismerési helyéül az aszparagin-X-szerin és aszparagin-X-treonin tripeptidszekvenciák (amelyekben „X” jelentése tetszőleges aminosav, a prolin kivételével) szolgálnak. Ilyenformán, az antitestekben az ilyen tripeptidszekvenciák jelenléte potenciális glikozilációs helyet teremt. Az „O-kötésű” glikoziláció azt jelenti, hogy N-acetil-galaktózamin, galaktóz vagy xilóz valamelyike hidroxi-aminosavhoz (többnyire szerinhez vagy treoninhoz) kötődik, bár 5-hidroxi-prolin vagy 5-hidroxi-lizin is alkalmazható.
HU 227 217 Β1
A glikozilációs helyek antitestbe történő beépítését az aminosavszekvencia módosításával hajthatjuk végre, oly módon, hogy a fentebb említett tripeptidszekvenciák közül egyet vagy többet tartalmazzon (N-kötésű glikozilációs helyek létrehozása céljából), illetve az eredeti antitest szekvenciájában egy vagy több szerin vagy treonin addícióját vagy szubsztitúcióját hajtjuk végre (O-kötésű glikozilációs helyek létrehozása esetén).
Az anti-CD20 antitest aminosavszekvencia változatait kódoló nukleinsavmolekulák különféle, szakember számára jól ismert eljárásokkal állíthatók elő. Az ilyen módszerek közé tartozik, többek között, a természetes forrásból történő izolálás (természetben előforduló aminosavszekvencia-változatok esetében), valamint az anti-CD20 antitest korábban előállított, variáns vagy nem variáns változatának oligonukleotid közvetítette (vagy helyspecifikus) mutagenezise, PCR-mutagenezise vagy kazettamutagenezise.
A találmány szerinti antitestek módosítására effektorfunkciójuk vonatkozásában is szükség lehet, például az antitestdependens sejtközvetített citotoxitás (ADCC) és/vagy a komplementdependens citotoxicitás (CDC) serkentése vagy gátlása céljából. Ez az antitest Fc-régiójában egy vagy több aminosav szubsztitúciójával valósítható meg. Más módon, vagy ezen túlmenően, az Fc-régióba cisztein(eke)t iktathatunk be, elősegítve e régióban a láncok közötti diszulfidkötés-képződést. Az így létrehozott homodimer antitest javított internalizációs képességű és/vagy megnövelt komplement közvetítette sejtölő aktivitású vagy antitestdependens celluláris citotoxicitású (ADCC) lehet [lásd Cáron és munkatársai: J. Exp. Med. 176, 1191 (1992); Shopes: J. Immunoi. 148, 2918 (1992)]. Heterodifunkciós keresztkötés-képzők alkalmazásával megnövelt tumorellenes aktivitású homodimer antitestek is előállíthatok [lásd Wolff és munkatársai: Cancer Research 53, 2560 (1993)]. Más módon, kifejleszthetünk olyan antitestet, amely két Fc-régiót tartalmaz, ezáltal fokozott mértékű komplement közvetítette lízist és ADCC-aktivitást mutat [lásd Stevenson és munkatársai: Anti-Cancer Drug Design 3, 219(1989)].
Az antitest vérsavóban mérhető felezési idejének növelése céljából az antitestbe (előnyösen antitestfragmensbe) visszamentő receptort („salvage receptor”) kötő epitópot (lásd például az 5 739 277 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást) iktathatunk be. A „visszamentő receptort kötő epitóp” kifejezésen egy IgG-molekula (például IgG·,, lgG2, lgG3 vagy lgG4) Fc-régiójának olyan epitópját értjük, amely az IgG-molekula in vivő felezési idejének növeléséért felelős.
Egyéb antitestmódosítások
A találmány értelmében egyéb antitestmódosításokat is feltárunk. Például az antitestet nem proteinjellegű polimerhez (például polietilénglikol, polipropilénglikol vagy polioxi-alkilének, illetve glikol és polipropilénglikol kopolimerei) kapcsolhatjuk. Az antitest - például, koacerválási technikákkal vagy határfelületi polimerizációval előállított - mikrokapszulákba [például hidroximetil-cellulóz- vagy zselatin-, illetve poli(metilmetakrilát)-mikrokapszulákba], továbbá kolloidális hatóanyag-célbajuttató rendszerekbe (például liposzómákba, albuminmikrogömbökbe, mikroemulziókba, nanorészecskékbe és nanokapszulákba) vagy makróemulziókba is foglalható. Az ilyen technikák leírását illetően lásd „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16. kiadás, szerk.: A. Osol (1980).
A kívánt tulajdonságú antitestek kiválasztása
A kívánt biológiai jellemzőkkel bíró antitestek a kísérleti példákban leírtak szerint szelektálhatok.
A találmány szerinti anti-CD20 antitest sejtszaporodást gátló hatásai szakember számára jól ismert eljárásokkal (például CD20-at endogén módon vagy CD20gén transzfekcióját követően expresszáló sejtek alkalmazásával) értékelhetők. Például tumorsejtvonalakat és CD20-génnel transzfektált sejteket találmány szerinti anti-CD20 monoklonális antitest különböző koncentrációi jelenlétében néhány napig (például 2-7 napig) inkubálunk, majd a sejteket kristályibolyával vagy MTTvel festjük vagy más kolorimetriás vizsgálati eljárást végzünk. A sejtproliferáció mérésének egy másik módszere a találmány szerinti anti-CD20 antitest jelenlétében vagy hiányában inkubált sejtek 3H-timidin-felvételének összehasonlításán alapul. E módszer szerint a sejteket az antitesttel végzett kezelést követően betakarítjuk és a DNS-be beépült radioaktivitást szcintillációs számláló alkalmazásával mérjük. Pozitív kontrollként a kiválasztott sejtvonalat olyan antitesttel kezeljük, amelyről ismert, hogy az adott sejtvonalra sejtszaporodást gátló hatást gyakorol.
A sejthalált indukáló antitestek szelektálására a sejtmembrán integritásának - kontrolihoz viszonyított csökkenése is felhasználható, amit például propidiumjodid (Pl), trypan-kék vagy 7AAD sejtek általi felvétele alapján mutathatunk ki. A Pl-felvételi teszt komplement és immun-effektorsejtek hiányában hajtható végre. A CD20-at expresszáló tumorsejteket csak tápközegben, illetve a megfelelő monoklonális antitestet (például körülbelül 10 pg/mL koncentrációban) tartalmazó tápközegben három napig inkubáljuk, majd leöblítjük és az összetapadt sejthalmazok eltávolítása érdekében 1 mL-es aliquotokban - 35 mm-es szűrővel lezárt - 12x75-ös kémcsövekbe helyezzük (kezelési csoportonként három kémcső). Ezt követően a kémcsövekhez hozzáadjuk a propidium-jodidot (10 pg/mL), és a mintákat FACSCAN™ áramlási citométer és FACSCONVERT™ CellQuest szoftver (Becton Dickinson) alkalmazásával analizáltuk. A Pl-felvétel alapján statisztikusan szignifikáns mértékű sejthalált indukáló antitesteket sejthalál-indukáló antitestekként szelektálhatok.
A találmány szerinti antitestek által megkötött CD20 epitópjához kötődni képes antitestek szkrínelésére rutinszerű keresztblokkolási vizsgálati eljárás alkalmazható [lásd például: „Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, szerk.: Harlow és Lane (1988)]. Ez a vizsgálati eljárás annak megállapítására alkalmas, hogy egy tesztelt antitest ugyanahhoz a helyhez vagy epitóphoz kötődik-e, mint egy ta19
HU 227 217 Β1 lálmány szerinti anti-CD20 antitest. Más módon, vagy ezen túlmenően, szakember számára jól ismert eljárásokkal epitóptérképezést végezhetünk. Például az antitest szekvenciáját - a kötődésben részt vevő (kontakt) aminosavak azonosítása céljából - mutagenizáljuk (például alaninpásztázási mutagenezis alkalmazásával). A mutáns antitest - megfelelő hajtogatódásának („folding) ellenőrzése érdekében - először poliklonális antitesttel teszteljük a kötődésre. Egy másik módszer szerint a CD20 különböző régióinak megfelelő peptideket a tesztelt antitestekkel (vagy egy tesztelt antitesttel és egy karakterizált vagy ismert epitóppal bíró antitesttel) kompetíciós tesztben használjuk fel.
Vektorok, gazdasejtek és rekombináns eljárások
A találmány értelmében feltárjuk a találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitestet kódoló izolált nukleinsavat, az ilyen nukleinsavat tartalmazó vektorokat és gazdasejteket, valamint a találmány szerinti antitest előállítására alkalmas rekombináns technikákat is.
Az antitest rekombináns módszerekkel történő előállítása során az antitestet kódoló nukleinsavat izoláljuk és - további klónozás (DNS-amplifikáció) vagy expresszáltatás céljából - replikációra képes vektorba inszertáljuk. A monoklonális antitestet kódoló DNS szokványos eljárásokkal (például az antitest nehéz és könnyű láncát kódoló génekhez specifikusan kötődni képes oligonukleotidpróbák alkalmazásával) könnyen izolálható és szekvenálható. Az inszercióra számos vektor alkalmas; a megfelelő vektor kiválasztása elsősorban az inszertálni kívánt nukleinsav méretétől és a vektorral transzformálni kívánt gazdasejttől függ. A vektorok többek között a következő komponenseket tartalmazhatják: szignálszekvencia, replikációs kezdőhely, egy vagy több markergén, erősítőszekvencia, promoter- és transzkripciós terminációs szekvencia.
(i) Szignálszekvencia komponens
A találmány szerinti CD20-kötő antitest rekombináns módszerekkel nemcsak közvetlenül, de más, heterológ polipeptiddel (előnyösen szignálszekvenciával vagy egyéb, az érett protein vagy polipeptid N-terminálisán specifikus hasítási helyet tartalmazó polipeptiddel) képzett fúziós polipeptidként is előállítható. Heterológ szignálszekvenciaként előnyösen olyan szekvenciát alkalmazunk, amelyet a gazdasejt képes felismerni és feldolgozni (azaz szignálpeptidázzal lehasítani). Prokarióta gazdasejtek esetében a CD20-kötő antitest natív szignálszekvenciáját (mivel azt a prokarióta sejtek nem képesek felismerni és feldolgozni) prokarióta szignálszekvenciával helyettesítjük. Az e célra alkalmas prokarióta szignálszekvenciák közé tartozik az alkalikus foszfatáz, penicillináz, Ipp vagy a hőstabil enterotoxin-ll vezetőszekvenciája. Élesztősejtek általi szekrécióhoz a natív szignálszekvencia, például élesztőeredetű invertáz vezetőszekvenciájával, α-faktor vezetőszekvenciájával (például Saccharomyces cerevisiae vagy Kluyveromyces α-faktor vezetőszekvenciával), savas foszfatáz vezetőszekvenciájával, C. albicans glükoamiláz vezetőszekvenciájával vagy a WO 90/13646 számú nemzetközi közzétételi iratban leírt szignálszekvenciával) helyettesíthető. Emlőseredetű sejtekben történő termeltetés céljából emlőseredetű vagy virális szignálszekvenciák alkalmazhatók (például herpes simplex gD-szignálszekvencia.
A prekurzorrégiót kódoló DNS-t a CD20-kötő antitestet kódoló DNS-sel azonos leolvasási fázisba ligáljuk.
(ii) Replikációs kezdőhely komponens
Mind az expressziós vektorok, mind a klónozóvektorok tartalmaznak olyan nukleinsavszekvenciát, amely lehetővé teszi a vektor egy vagy több kiválasztott gazdasejtben történő replikációját. Klónozóvektorokban az ilyen szekvenciák funkciója, hogy a vektor számára lehetővé tegyék a gazdasejt kromoszomális DNS-étől független replikációt. Az ilyen szekvenciák a különféle baktériumok, élesztők és vírusok esetében jól ismertek. A pBR322-plazmid replikációs kezdőhelye a legtöbb Gram-negatív baktériumban; a 2p-plazmid kezdőhelye élesztőkben, a különböző víruseredetű (SV40, polyoma, adenovírus, VSV vagy BPV) kezdőhelyek pedig emlőseredetű sejtekben használatos klónozóvektorokban alkalmazhatók. Emlőseredetű sejtekben alkalmazott expressziós vektorokban replikációs kezdőhely komponensre általában nincs szükség (az SV40 kezdőhelyét rendszerint azért használjuk, mert korai promotert tartalmaz).
(iii) Szelekciós gén komponens
Az expressziós és klónozóvektorok általában tartalmaznak szelekciós gént (más néven szelektálható markert) is. A jellemző szelekciós gének olyan proteineket kódolnak, amelyek (a) antibiotikumokkal vagy egyéb toxinokkal (például ampicillin, neomicin, methotrexát vagy tetraciklin) szembeni rezisztenciát biztosítanak; (b) auxotróf deficienciákat egészítenek ki; vagy (c) komplex tápközegben nem található, kulcsfontosságú tápanyagokat biztosítanak (például Bacillusok esetében a D-alanin racemáz).
A szelekciós rendszerek egyik példája a gazdasejt szaporodását gátló hatóanyag alkalmazásán alapul. A heterológ génnel sikeresen transzformált sejtek olyan proteint termelnek, amely drogrezisztenciát biztosít, s ezáltal ezek a sejtek a szelekciót követően életben maradnak. Az ilyen domináns szelekció példáiként a neomicin, a mikofenolsav és a higromicin alkalmazása említhető.
Az emlőseredetű sejtek esetében alkalmas szelektálható markerek további példái azok, amelyek lehetővé teszik a CD20-kötő antitestet kódoló nukleinsav felvételét illetően kompetens sejtek azonosítását, mint például a DHFR, timidin-kináz, metallotionein-l és -II (előnyösen főemlős-eredetű metallotioneingének), adenozin dezamináz, ornitin dekarboxiláz stb.
Például a DHFR szelekciós génnel transzformált sejteket először oly módon azonosítjuk, hogy a transzformánsok mindegyikét a DHFR kompetitív antagonistáját, metotrexátot (Mtx) tartalmazó tenyésztő tápközegben tenyésztjük. Vad típusú DHFR-gén alkalmazá20
HU 227 217 Β1 sa esetén alkalmas gazdasejtként DHFR-aktivitás-deficiens CHO-sejtvonal alkalmazható (például ATCC CRL-9096).
Más módon, a CD20-kötő antitestet, vad típusú DHFR-proteint és egy másik, szelektálható markert (például amino-glikozidáz 3’-foszfotranszferázt, APH) kódoló DNS-szekvenciákkal transzfektált gazdasejteket (előnyösen endogén DHFR-gént hordozó vad típusú sejteket) a szelektálható markernek megfelelő szelektálóágenst, például amino-glikozidos antibiotikumot (például kanamicint, neomicint vagy G418-at) tartalmazó tápközegben végzett sejttenyésztéssel szelektálhatjuk (lásd a 4 965 199 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
Élesztőkben az egyik alkalmas szelekciós gén az élesztőeredetű YRp7-plazmidban elhelyezkedő trp1gén [Stinchcomb és munkatársai: Natúré 282, 39 (1979)], amely olyan mutáns élesztőtörzs (például ATCC No. 44076 vagy PEP4-1) szelekciós markerét kódolja, amely triptofán jelenlétében nem képes szaporodni. Az élesztő gazdasejt genomjában a trp1-lézió hatékony környezetet biztosít a sikeres transzformáció - triptofán hiányában tapasztalható sejtszaporodás alapján történő - detektálásához. Hasonlóan, Leu2-deficiens élesztőtörzsek (ATCC 20622 vagy 38626) komplementálására Leu2-gént hordozó ismert plazmidok alkalmazhatók.
Ezenfelül, a Kluyveromyces élesztők transzformálására az 1,6 μίτι cirkuláris pKD1-plazmidból származó vektorok alkalmazhatók. Más módon, Van den Berg [Bio/Technology 8, 135 (1990)] rekombináns borjúkimozin nagy mennyiségben történő termeltetésére alkalmas expressziós rendszert írt le K. lactisra. Fleer és munkatársai [Bio/Technology 9, 968 (1991)] érett, rekombináns humán szérumalbumin ipari célú Kluyveromyces-törzsekkel történő termeltetésére alkalmas, stabil, több kópiás expressziós vektorokat ismertettek.
(ív) Promoter komponens
Az expressziós és klónozóvektorok rendszerint megfelelő promotert is tartalmaznak, amelyet a gazdaorganizmus felismer, és amely a CD20-kötő antitestet kódoló nukleinsavhoz működőképesen kapcsolódik. A prokarióta gazdasejtekben alkalmazható promoterek közé tartozik a phoA-promoter, a β-laktamáz és laktóz promoterrendszerek, az alkalikus foszfatáz promoter, a triptofán (trp) promoterrendszer, valamint a hibrid promoterek, mint például a tac-promoter, azonban egyéb ismert bakteriális promoterek is alkalmazhatók. A bakteriális rendszerekben alkalmazható promoterek - a CD20-kötő antitestet kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolva - Shine-Dalgarno- (S. D.) szekvenciát is tartalmaznak.
Eukarióta sejteknél ismerünk promoterszekvenciákat. Gyakorlatilag valamennyi eukarióta gén tartalmaz adeninben és timinben gazdag régiót, amely a transzkripciós kezdőhelytől 5’-irányban, körülbelül 25-30 bázis távolságban helyezkedik el. A transzkripciós kezdőhelytől 5’-irányban 70-80 bázis távolságban számos génben megtalálható egy CNCAAT-régió (amelyben „N” jelentése: tetszőleges nukleotid). A legtöbb eukarióta gén 3’-végén AATAAA-szekvencia található, amely az úgynevezett poli-A-farok kódolószekvencia 3’-végéhez történő kapcsolásának szignáljaként szolgálhat. Az eukarióta expressziós vektorokba, alkalmas módon, e szekvenciák mindegyike inszertálásra kerül.
Az élesztő gazdasejtek esetében alkalmazható promoterszekvenciák példái közé tartoznak a 3-foszfoglicerát-kináz és más glikolitikus enzimek génjeinek promoterei (ilyen enzimek példái az enoláz, gliceraldehid3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvát-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz).
Az élesztőpromoterek egyéb példáiként olyan indukálható promoterek említhetők, amelyek további előnye a sejtszaporítási feltételek által szabályozott transzkripció. Ezek közé tartoznak a következő enzimek génjeinek promoterrégiói: alkohol dehidrogenáz-2, izocitokróm-C, savfoszfatáz, nitrogén-anyagcserével összefüggő lebontóenzimek, metallotionein, gliceraldehid-3foszfát-dehidrogenáz, valamint a maltóz- és galaktózfelhasználásért felelős enzimek. Az élesztősejtekben történő expresszáltatásra alkalmas vektorok és promoterek részletes leírását illetően lásd a 73 657 számú európai szabadalmi leírást. Az élesztőpromoterekkel együtt előnyösen alkalmazhatók az élesztőeredetű erősítőszekvenciák is.
A CD20-kötő antitest vektorokba inszertált DNSének transzkripcióját, például vírusok genomjából származó promoterek szabályozhatják. Ilyen vírus például a polyomavírus, madárhimlővírus, adenovírus (például adenovírus-2), szarvasmarha-papillomavírus, madársarcomavírus, citomegalovírus, retrovírus, hepatitis-B vírus és - legelőnyösebben - az SV40. A transzkripció szabályozására alkalmazhatók heterológ emlőseredetű promoterek (például aktinpromoter vagy immunglobulin-promoter), hősokkpromoterek, feltéve, hogy ezek kompatibilisek az alkalmazott gazdasejtrendszerrel.
Az SV40-vírus korai és kései promoterei restrikciós SV40-fragmensként egyszerűen kinyerhetők, mely fragmens SV40 replikációs kezdőhelyet is tartalmaz. A humán citomegalovírus azonnali korai promotere Hindlll E restrikciós fragmensként egyszerűen kihasítható. A 4 419 446 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szarvasmarha-papillomavírus vektorként történő alkalmazását tárták fel DNS emlőseredetű gazdasejtekben történő expresszáltatására. E rendszer módosított változatát a 4 601 978 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban tárták fel. Reyes és munkatársai [Natúré 297, 598 (1982)] humán β-interferon-cDNS - herpes simplex vírusból származó timidinkináz promoter szabályozása alatt - egéreredetű sejtekben történő expresszáltatását ismertették. Promoterként alkalmazható a Rous sarcoma vírus hosszú terminális ismétlődő régiója is.
(v) Erősítőszekvencia-komponens
A találmány szerinti CD20-kötő antitestet kódoló DNS magasabb rendű eukariótákban történő transzk21
HU 227 217 Β1 ripciója gyakran fokozható, ha a vektorba erősítőszekvenciát építünk be.
Az emlőseredetű génekhez (globin, elasztáz, albumin, α-fetoprotein és inzulin) napjainkban számos erősítőszekvencia ismeretes, azonban többnyire eukarióta sejteket megtámadó vírusokból származó erősítőszekvenciákat alkalmaznak. A jellemző példák közé tartozik az SV40 erősítőszekvenciája, amely a replikációs kezdőhely (100-270. bázispár) kései oldalán helyezkedik el; a citomegalovírus korai promoterszekvenciája, a polyomavírus - replikációs kezdőhely kései oldalán elhelyezkedő - erősítőszekvenciája; valamint az adenovírus erősítőszekvenciák. Az eukarióta promoterek aktiválására alkalmas erősítőelemek további leírását illetően lásd Yaniv: Natúré 297, 17 (1982)]. Az erősítőszekvenciát a CD20-kötő antitestet kódoló szekvenciától 5’- vagy 3’-irányban illeszthetjük a vektorba (előnyösen a promotertől 5’-irányban).
(vi) Transzkripciós terminációs komponens
Az eukarióta gazdasejtekben (élesztő-, gomba-, rovarsejtek, növényi sejtek, állati sejtek, humán sejtek vagy egyéb többsejtű organizmusból származó magvas sejtek) alkalmazott expressziós vektorok a transzkripció terminációjához és az mRNS stabilizálásához szükséges szekvenciákat is tartalmaznak, melyek általában eukarióta vagy virális DNS-ek vagy cDNS-ek 5’-oldali (esetenként 3’-oldali) nem transzlálódó régióiból nyerhetők. Az ilyen szekvenciák a CD20-kötö antitestet kódoló mRNS nem transzlálódó részletében poliadenilált fragmensekként átíródó nukleotidszegmenseket tartalmaznak. A találmány céljaira alkalmas egyik transzkripciós terminációs komponens a szarvasmarha-eredetű növekedési hormon génjének poliadenilációs régiója.
(vii) Gazdasejtek szelektálása és transzformálása
A találmány szerinti DNS vektorokban történő klónozására vagy expresszáltatására alkalmas gazdasejtek közé a fentebb említett prokarióta sejtek, élesztősejtek vagy magasabb rendű eukarióta sejtek tartoznak. A prokarióták közül a valódi baktériumok, úgymint a Gram-negatív vagy Gram-pozitív organizmusok alkalmazhatók, mint például az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok [például a következő nemzetségekbe tartozó fajok: Escherichia (például E. coli), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (például Salmonella typhimurium), Serratia (például Serratia marcescens) és Shigella], továbbá a Bacillus nemzetségbe tartozó fajok [például B. subtilis és B. licheniformis; például a B. licheniformis 41P-törzs (lásd a 1989 április 12-én közzétett DD 266 710 számú szabadalmi leírást)], Pseudomonas fajok, például P. aeruginosa, valamint Streptomyces fajok. Az egyik előnyös £ coli klónozó gazdasejt az E. coli 294-es törzs (ATCC 31446), de egyéb törzsek is alkalmazhatók, mint például az £. coli B-törzs és az £. coli X1776-törzs (ATCC 31537), illetve az E. coli W3110-törzs (ATCC 27325). A felsorolt példákat csak szemléltetésként említjük; a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során egyéb gazdasejtek is alkalmazhatók.
A találmány értelmében baktériumokban teljes hosszúságú antitestet, antitestfragmenseket és antitestet tartalmazó fúziós proteineket egyaránt termeltethetünk, különösen olyan esetekben, ha a glikozilációs és Fc effektorfunkcióra nincs szükség [például ha a terápiás hatású antitest citotoxikus hatóanyag (például toxinhoz) van konjugálva, és ez az immunkonjugátum önmaga hatékony a tumorsejtek elpusztításában], A teljes hosszúságú antitestekre a keringésben nagyobb felezési idő jellemző. Az antitestek és fragmenseik £. co//'-sejtekben gyorsabban és költségtakarékosabban termeltethetők, mint egyéb gazdasejtekben. Az antitestfragmensek és polipeptidek baktériumsejtekben történő termeltetését illetően lásd például a következő egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat: 5 648 237 (Carter és munkatársai), 5 789 199 (Joly és munkatársai) és 5 840 523 (Simmons és munkatársai), melyekben az expresszió és a szekréció optimalizálására alkalmas transzlációs iniciációs régiót (TIR) és szignálszekvenciákat tárnak fel (e szabadalmi leírásokat teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni). Az expresszáltatás után az antitestet az E. co//-sejtmassza oldható frakciójából izoláljuk, majd - izotípustól függően - protein-A vagy -G oszlopon tisztítjuk. A végső tisztítási lépést, például a CHO-sejtekben termeltetett antitestek tisztítási eljárásához hasonló módon végezhetjük.
A CD20-kötő antitestet kódoló vektorok klónozására és expresszáltatására, a prokarióták mellett, eukarióta mikrobák (például fonalas gombák vagy élesztők) is alkalmazhatók. Az alacsonyabb rendű eukarióta gazdamikroorganizmusok közül a Saccharomyces cerevisiae (közönséges sütőélesztő) a leggyakrabban alkalmazott gazdasejt, azonban a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésére számos egyéb nemzetség, faj és törzs alkalmas, mint például a Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces gazdasejtek, például K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans és K. marxianus; Yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces fajok, például Schwanniomyces occidentalis; és fonalas gombák, például Neurospora, Penicillium, Tolypocladium és Aspergillus fajok (például A. nidulans és A. niger).
A találmány szerinti glikozilált CD20-kötő antitest termeltetésére többsejtes organizmusokból (például növényekből vagy rovarokból) származó gazdasejtek alkalmazhatók. Számos baculovírustörzset és -változatot, valamint ezeknek megfelelő rovarsejteket azonosítottak, például Spodoptera frugiperdában (hernyó), Aedes aegyptiben (szúnyog), Aedes albopictusban (szúnyog), Drosophila melanogasterben (gyümölcslégy) és Bombyx móriban. A transzfekcióhoz számos vírustörzs áll rendelkezésre, mint például, az Autographa californica NPV L-1-változata és a Bombyx móri NPV Bm-5törzse. Ezek a vírusok a találmány gyakorlati kivitelezésére is felhasználhatók, különösen Spodoptera frugiperda sejtek transzfektálására.
HU 227 217 Β1
A fentiek mellett gazdasejtekként gyapotból, kukoricából, burgonyából, szójababból, paradicsomból és dohányból származó növényi sejttenyészetei is alkalmazhatók.
Mindazonáltal, a legnagyobb érdeklődés a gerincesekből származó gazdasejtekre irányul, és a gerinceseredetű sejtek tenyészetben (szövettenyészetben) történő szaporítása rutinszerű eljárássá vált. A találmány céljaira hasznos emlőseredetű gazdasejtek jellemző példái a következők: SV40-vírussal transzformált CV1 majomvese-sejtvonal (COS-7; ATCC CRL 1651); humán embrionális vesesejtvonal [293-as sejtek, illetve szuszpenziós tenyésztéshez szubklónozott 293-as sejtek; lásd Graham és munkatársai: J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]; újszülött hörcsög vesesejtek (BHK-sejtek, ATCC CCL 10); kínai hörcsög petefészeksejtek/-DHFR [CHO-sejtek; lásd Urlaub és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)]; egéreredetű sertolisejtek [TM4; Mather: Bioi. Repród. 23, 243 (1980)]; CV1 majomvesesejtek (ATCC CCL 70); VERO-76-sejtek (ATCC CRL-1587); humán méhnyakcarcinomasejtek (HeLa-sejtek, ATCC CCL 2); kutyavesesejtek (MDCK; ATCC CCL 34); Buffalo patkányvesesejtek (BRL-3A; ATCC CRL 1442); humán tüdősejtek (W318; ATCC CCL 75); humán májsejtek (Hep G2; HB 8065); egér emlőtumorsejtek (MMT 060562, ATCC CCL51), TRI-sejtek [lásd Mather és munkatársai: Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44 (1982)]; MRC-5-sejtek; FS4-sejtek; és Hep G2 humán hepatoma-sejtvonal.
A gazdasejteket a CD20-kötő antitest termeltetésére alkalmas, fentebb leírt klónozó- és expressziós vektorokkal transzformáljuk, és - a promoterek indukálásához, a transzformánsok szelektálásához vagy a kívánt szekvenciákat kódoló gének amplifikálásához megfelelően módosított - szokványos tápközegekben tenyésztjük.
(viii) A gazdasejtek tenyésztése
A találmány szerinti CD20-kötő antitestek termeltetésére alkalmazott gazdasejteket különféle tápközegekben tenyészthetjük. A szóban forgó gazdasejtek tenyésztésére alkalmasak a kereskedelmi forgalomban beszerezhető tápközegek, mint például a Ham-féle F10-tápközeg (Sigma), a Minimál esszenciális tápközeg (MÉM; Sigma), RPMI-1640 (Sigma) és Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg (DMEM), de az alábbi publikációk bármelyikében leírt tápközegek is alkalmazhatók: Ham és munkatársai: Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes és munkatársai: Anal. Biochem. 102, 255 (1980); 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 és 5 122 469 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások; WO 90/03430 és WO 87/00195 számú nemzetközi közzétételi irat; valamint U. S. Patent Re. 30 985. Szükség szerint az említett tápközegek bármelyike kiegészíthető például hormonokkal és/vagy egyéb növekedési faktorokkal (például inzulinnal, transzferrinnel vagy epidermális növekedési faktorral), sókkal (például nátrium-kloriddal, kalcium-, magnézium- vagy foszfátsókkal), pufferekkel (például HEPES), nukleotidokkal (például adenozinnal és timidinnel), antibiotikumokkal (például Gentamycin™-nel), nyomelemekkel (definíció szerint: μΜ végkoncentrációban jelen lévő szervetlen vegyületek) és glükózzal vagy egyenértékű energiaforrással. A tápközegek megfelelő koncentrációban bármely szükséges, szakember számára ismert adalék anyaggal kiegészíthetők. A tenyésztést az expresszáltatásra kiválasztott gazdasejttel általánosan alkalmazott feltételek (például hőmérséklet, pH és hasonlók) mellett, szakember számára jól ismert módon hajtjuk végre.
(ix) Antitest tisztítása
Rekombináns módszerek alkalmazásakor az antitest intracellulárisan, a periplazmikus térbe vagy szekrécióval közvetlenül a tenyésztő tápközegbe termeltethető. Ha az antitestet intracellulárisan termeltetjük, első lépésként a szemcsés üledéket (amely a gazdasejteket vagy emésztett sejttörmeléket tartalmaz) centrifugálással vagy ultracentrifugálással eltávolítjuk. Carter és munkatársai [Bio/Technology 10, 163 (1992)] leírtak egy eljárást £ coli periplazmikus terébe kiválasztott antitestek tisztítására. Ennek során a sejtmasszát nátriumacetát (pH=3,5), EDTA és fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) jelenlétében körülbelül 30 perc alatt felolvasztják, majd a sejtüledéket centrifugálással eltávolítják. Amennyiben az antitest a tápközegbe került kiválasztásra, az ilyen expressziós rendszerek felülúszóit először általában - kereskedelmi forgalomban beszerezhető proteintöményítő szűrő (például Amicon vagy Millipore Pellicon ultrafiltrációs egység) alkalmazásával betöményítik. Az említett lépésekben a proteolízis gátlására proteázinhibitor (például PMSF), az esetleges szennyező mikroorganizmusok szaporodásának megelőzése céljából pedig antibiotikumok alkalmazhatók.
A sejtekből kinyert antitestkészítmény például hidroxilapatit-kromatográfiával, gélelektroforézissel, dialízissel vagy affinitási kromatográfiával tisztítható, melyek közül az utóbbi alkalmazása előnyös. A protein-A alkalmassága affinitási ligandumként attól függ, hogy az adott antitestben jelen lévő Ig-Fc-domén milyen fajból származik és milyen izotípusba tartozik. A protein-A a humán y1m γ2 vagy γ4 nehéz láncokon alapuló antitestek tisztítására alkalmas [Lindmark és munkatársai: J. Immunoi. Meth. 62, 1 (1983)]. A protein-G valamennyi egérizotípushoz és a humán y3-hoz alkalmazható [Guss és munkatársai: EMBO J. 5, 1567 (1986)]. Kromatografálóközegként (amelyhez az affinitási ligandumot kapcsoljuk) többnyire agarózgél használatos, de számos egyéb közeg is alkalmazható. A mechanikailag stabil kromatografálóközegek - mint például a kontrollált pórusméretű üveg vagy poli(sztirol-divinil)-benzol gyorsabb átfolyást és rövidebb feldolgozási időt tesznek lehetővé, mint az agaróz. Ha az antitest CH3-domént tartalmaz, a tisztításra Bakerbond ABX™ gyanta (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) alkalmazható. A kinyerni kívánt antitesttől függően egyéb proteintisztítási technikák is alkalmazhatók, mint például az ioncserélő oszlopon végzett frakcionálás, etanolos precipitáció, reverz fázisú HPLC, szilikagél-kromatográfia, heparin Sepharose™ oszlopon végzett kromatográfia, anionvagy kationcserélő oszlopon (például poliaszparagin23
HU 227 217 Β1 savoszlopon) végzett kromatográfia, kromatofókuszálás, SDS-PAGE vagy ammónium-szulfátos precipitáció.
Az előzetes lépés(ek) után a kívánt antitestet és a szennyeződéseket tartalmazó elegyet kis pH-η hidrofób interakciós kromatográfiának vetjük alá, melynek során alacsony sókoncentráció (p. kb. 0-0,25 M) mellett körülbelül 2,5-4,5 pH-jú elúciós puffért alkalmazunk.
Antitestkonjugátumok
A találmány szerinti antitest citotoxikus hatóanyaghoz, például toxinhoz vagy radioaktív izotóphoz konjugálható. A találmány bizonyos megvalósítási módjai értelmében taxinként a calicheamicin, maytansinoidok, dolastatin, auristatin-E, illetve ezek analógjai vagy származékai alkalmazhatók előnyösen.
A találmány szempontjából előnyös hatóanyagok és toxinok közé tartoznak a DNS-károsító hatóanyagok, a mikrotubuluspolimerizáció vagy -depolimerizáció inhibitorai és az antimetabolitok. A citotoxikus hatóanyagok előnyös csoportjába tartoznak, például az enziminhibitorok (például dihidrofilát-reduktáz-inhibitorok és timidilát-szintetáz-inhibitorok), DNS-interkalátorok, DNS-hasítók, topoizomerázinhibitorok, antraciklin drogcsalád, vincadrogok, mitomicinek, bleomicinek, citotoxikus nukleozidok, pteridin drogcsalád, diinének, podophyllotoxinok és differenciációindukálók. A felsorolt csoportok különösen hasznos tagjai közé tartoznak például az alábbiak: metotrexát, metopterin, diklór-metotrexát, 5-fluor-uracil, 6-merkaptopurin, citoxin arabinozid, melphalan, leurozin, leurozidein, aktinomicin, daunorubicin, doxorubicin, N-(5,5-diacetoxi-pentil)-doxorubicin, morfolino-doxorubicin, 1-(2-klór-etil)-1,2di(metánszulfonil)-hidrazid, N8-acetilspermidin, aminopterin, metopterin, esperamicin, mitomicin-C, mitomicin-A, aktinomicin, bleomicin, carminomicin, aminopterin, tallizomicin, podofillotoxin és podofillotoxinszármazékok, mint például etoposid vagy etoposid-foszfát, vinblastin, vincristin, vindezin, taxol, taxotere, retinasav, vajsav, N8-acetil-spermidin, camptotecin, calicheamicin, bryostatinok, cephalostatinok, ansamitoxin, aktozin, maytansinoidok (például DM-1, maytansin, maytansinol, N-dezmetil-4,5-dezepoximaytansinol, C-19-dezklór-maytansinol, C-20-hidroxi-maytansinol, C-20-dezmetoxi-maytansinol, C-9-SH-maytansinol, C-14-(alkoxi-metil)-maytansinol, C-14-hidroxi- vagy -acetil-oxi-metil-maytansinol, C-15-hidroxi/acetiI-oximaytansinol, C-15-metoxi-maytansinol, C-18-Ndezmetil-maytansinol és 4,5-dezoximaytansinol), auristatinok, például auristatin-E, -Μ, -PHE vagy -PE; dolostatinok, például dolostatin-A, dolostatin-B, dolostatin-C, dolostatin-D, dolostatin-E (20-epi- and 11-epi-), dolostatin-G, dolostatin-H, dolostatin-l, dolostatin 1, dolostatin 2, dolostatin 3, dolostatin 4, dolostatin 5, dolostatin 6, dolostatin 7, dolostatin 8, dolostatin 9, dolostatin 10, deodolostatin 10, dolostatin 11, dolostatin 12, dolostatin 13, dolostatin 14, dolostatin 15, dolostatin 16, dolostatin 17 és dolostatin 18; cephalostatinok, például cephalostatin 1, cephalostatin 2, cephalostatin 3, cephalostatin 4, cephalostatin 5, cephalostatin 6, cephalostatin 7, 25’-epicephalostatin 7, 20-epicephalostatin 7, cephalostatin 8, cephalostatin 9, cephalostatin 10, cephalostatin 11, cephalostatin 12, cephalostatin 13, cephalostatin 14, cephalostatin 15, cephalostatin 16, cephalostatin 17, cephalostatin 18 és cephalostatin 19.
A maytansinoidok olyan mitózisgátlók, amelyek a tubulinpolimerizáció gátlása révén fejtik ki hatásukat. A maytansint elsőként egy kelet-afrikai cserjéből, a Maytenus serratábcA izolálták (lásd a 3 896 111 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást). Később felismerték, hogy bizonyos mikrobák szintén termelnek maytansinoidokat, így például maytansinolt és C-3 maytansinol-észtereket (lásd a 4 151 042 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást). Jól ismertek a szintetikus maytansinol és maytansinolanalógok, melyek leírását illetően lásd a következő egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat: 4 137 230; 4 248 870; 4 256 746; 4 260 608; 4 265 814; 4 294 757; 4 307 016; 4 308 268; 4 308 269; 4 309 428; 4 313 946; 4 315 929; 4 317 821; 4 322 348; 4 331 598; 4 361 650; 4 364 866;
424 219; 4 450 254; 4 362 663; és 4 371 533 (melyeket teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni). A maytansin és maytansinoidok tumorsejtantigénekhez specifikusan kötődni képes antitestekhez konjugálták. A maytansinoidokat tartalmazó immunkonjugátumokat, például az 5 208 020 és 5 416 064 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, illetve az EP 0425235 B1 számon közzétett európai szabadalmi leírásban tárták fel (e forrásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni). Liu és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8618 (1996)] olyan immunkonjugátumot írtak le, amely egy DM1 elnevezésű maytansinoidot humán vastag- és végbélrák ellen irányuló C242 monoklonális antitesthez kapcsolva tartalmaz. Ez a konjugátum tenyészetben tartott vastagbélráksejtekre rendkívül citotoxikusnak bizonyult, és in vivő tumornövekedési tesztben tumorellenes aktivitást mutatott. Chari és munkatársai [Cancer Research 52, 127 (1992)] olyan immunkonjugátumokat tártak fel, melyekben az maytansinoidot diszulfidkötéssel - humán vastagbélrák-sejtvonalakon expresszálódó antigén elleni egéreredetű A7-antitesthez, illetve HER-2/neuonkogént megkötő egéreredetű TA.1 monoklonális antitesthez kapcsolták.
Az antitest-maytansinoid konjugátumok előállítására számos kapcsolócsoport ismeretes, így például az
208 020 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, a 0 425 235 B1 számon közzétett európai szabadalmi leírásban, illetve a Chari és munkatársai [Cancer Research 52, 127 (1992)] által leírt kapcsolócsoportok, melyek diszulfidcsoportok, tioétercsoportok, savbomlékony csoportok, fény hatására bomló csoportok, valamint peptidázzal vagy észterázzal bontható csoportok lehetnek. A találmány céljaira a diszulfid- és tioétercsoportok alkalmazhatók előnyösen.
Az antitestek maytansinoiddal alkotott konjugátumai különféle difunkciós proteinkapcsoló ágensek alkalmazásával hozhatók létre, melyek példáiként a következőket említhetjük: N-szukcinimidil-3-(2-piridil-di24
HU 227 217 Β1 tiol)-propionát (SPDP), szukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciklohexán-1 -karboxilát, iminotiolán (IT), difunkciós imido-észter-származékok (például dimetiladipimidát-HCI), aktív észterek (például diszukcinimidil-szuberát), aldehidek (például glutáraldehid), diazidovegyületek [például di(p-azido-benzoil)-hexán-diamin], bisz-diazonium-származékok [például di(p-diazonium-benzoil)-etilén-diamin], diizocianátok (például toluol-2,6-diizocianát) és difluorvegyületek (például 1,5difluor-2,4-dinitro-benzol). Különösen előnyös kapcsolóágens a diszulfidkötés létrehozására alkalmas N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditiol)-propionát [SPDP; lásd Carlsson és munkatársai: Biochem. J. 173, 723 (1978)] és N-szukcinimidil-4-(2-piridil-tio)-pentanoát (SPP).
A kapcsolócsoportok - a kötés típusától függően különböző pozíciókban kapcsolhatók a maytansinoidmolekulához. Például az észterkötések hidroxilcsoporttal szokványos kapcsolási feltételek mellett végzett reakcióval hozhatók létre. A reakció hidroxilcsoportot tartalmazó C-3 pozícióban, hidroxi-metil-csoporttal módosított C-14 pozícióban, hidroxilcsoporttal módosított C-15 pozícióban, és hidroxilcsoportot tartalmazó C-20 pozícióban következhet be. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a kötést a maytansinol (vagy maytansinolanalóg) C-3 pozíciójában hozzuk létre.
Calicheamicin
A találmány szerinti immunkonjugátumok egy másik csoportjában a CD20-kötő antitest egy vagy több calicheamicinmolekulához van konjugálva. A calicheamicinantibiotikum-család pikomoláris alatti koncentrációkban a kettős szálú DNS szakadásait képes előidézni. A calicheamicinek konjugátumainak előállítását illetően lásd az 5 712 374, 5 714 586, 5 739 116, 5 767 285, 5 770 701, 5 770 710, 5 773 001, 5 877 296 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat (American Cyanamid Company). Az immunkonjugátumok előállítására alkalmas strukturális analógok közé tartoznak, többek között, a következők: γ·/, α2', α3', N-acetil-γ^, PSAG és [lásd Hinman és munkatársai: Cancer Research 53, 3336-3342 (1993), Lode és munkatársai: Cancer Research 58, 2925-2928 (1998), valamint a fentebb említett egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat. A találmány szerinti antitesttel történő konjugálásra alkalmas további tumorellenes hatóanyag a QFA, amely egy antifolát. A calicheamicin és a QFA egyaránt intracelluláris helyeken fejtik ki hatásukat, a plazmamembránon azonban nehezen hatolnak át, így e hatóanyagok antitest közvetítette internalizáción keresztül bekövetkező celluláris felvétele nagymértékben javítja citotoxikus hatásaikat.
Radioaktív izotópok
A tumorok szelektív elpusztítása céljából az antitest nagymértékben radioaktív atomot tartalmazhat. A radiokonjugált anti-CD20 antitestek létrehozására számos radioaktív izotóp alkalmazható, mint például az At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, valamint a lutécium (Lu) radioaktív izotópjai. Amennyiben diagnosztizálásra alkalmazzuk, a konjugátum szcintigráfiás vizsgálatra alkalmas radioaktív atomot (például tc99m vagy I123) vagy mágneses magrezonancia (NMR vagy MRI) képalkotáshoz alkalmas spin-jelölőt tartalmazhat (például, I123, I131, In111, F19, C13, N15, O17, gadolínium, mangán vagy vas).
A radioaktív és egyéb jelölők ismert eljárásokkal építhetők be a konjugátumban. Például a peptidet megfelelő (például hidrogén helyett 19-es fluorizotópot tartalmazó) aminosavprekurzorok alkalmazásával, bioszintézissel vagy kémiai aminosavszintézissel állíthatjuk elő. Az olyan jelölők, mint a tc99m vagy I123, Re185, Re188 és In111, ciszteinek közvetítésével, míg az Y90 lizinnel építhető be a peptidbe. AI123 beépítésére a Fraker és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 80, 49 (1978)] által leírt lODOGEN-eljárás alkalmazható. További eljárások részletes leírását illetően lásd: „Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”, Chatal, CRC Press (1989).
Az antitest citotoxikus hatóanyaggal alkotott konjugátumai különféle difunkciós proteinkapcsoló ágensek alkalmazásával hozhatók létre, melyek jellemző példái közé tartozik az N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditiol)-propionát (SPDP), szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)ciklohexán-1-karboxilát, iminotiolán (IT), difunkciós imido-észter-származékok (például dimetil-apimidát-HCI), aktív észterek (például diszukcinimidil-szuberát), aldehidek (például glutáraldehid), diazidovegyületek [például di(p-azido-benzoil)-hexán-diamin], bisz-diazonium-származékok [például di(p-diazonium-benzoil)etilén-diamin], diizocianátok (például toluol-2,6-diizocianát) és difluorvegyületek (például 1,5-difiuor-2,4-dinitro-benzol). Például ricin-immunotoxin Vitetta és munkatársai [Science 238, 1098 (1987)] leírása szerint állítható elő. A radionukleotid antagonistához történő konjugálására alkalmazható kelátképző szerek egyik jellemző példája a C14-izotóppal jelölt 1-izotiocianátbenzil-3-metil-dietilén-triamin-pentaecetsav (MXDTPA; lásd a WO 94/11026 számú nemzetközi közzétételi iratot). Kapcsolókomponensként „hasítható kapcsolókomponenst” alkalmazhatunk, amely lehetővé a citotoxikus hatóanyag sejtben történő felszabadulását. Az ilyen kapcsolókomponensek savbomlékonyak, peptidázra érzékenyek, fény hatására bomlékonyak, illetve dimetil- vagy diszulfidtartalmú kapcsolók lehetnek [lásd Chari és munkatársai: Cancer Research 52, 127 (1992); 5 208 020 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás],
A CD20-kötő antitestek gyógyászati alkalmazásai
A találmány szerinti CD20-kötő antitestek számos malignáns és nem malignáns betegség kezelésére hasznosak, ideértve az autoimmun betegségeket, az azokkal összefüggő állapotokat, valamint a CD20-pozitív rákokat (például B-sejtes limfómák és leukémiák). A csontvelőben lévő stem-sejtekből (B-sejt őssejtek) hiányzik a CD20-antigén, ami a kezelés után egészséges B-sejtek regenerálódását teszi lehetővé, és a kezelés után néhány hónappal e B-sejtek mennyisége normál szintre áll vissza.
HU 227 217 Β1
Az autoimmun betegségek és az azokkal összefüggő állapotok közé tartoznak a következők: ízületi gyulladás [reumaszerű ízületi gyulladás (rheumatoid arthritis), fiatalkori reumaszerű ízületi gyulladás, osteoarthritis, psoriatikus arthritis], psoriasis, dermatitis (ideértve az atópiás dermatitist), krónikus autoimmun urticaria, polimyositis/dermatomyositis, toxikus epidermális necrolysis, szisztémás scleroderma és sclerosis, gyulladásos bélbetegséggel (IBD) összefüggő reakciók (Crohnkór, fekélyes vastagbélgyulladás), légzési nehézség (distress) tünetegyüttes, felnőttkori légzési distress tünetegyüttes (ARDS), meningitis, allergiás rhinitis, encephalitis, uveitis, colitis, glomerulonephritis, allergiás állapotok, ekcéma, asztma, T-sejtek infiltrációjával és gyulladásos reakciókkal járó állapotok, atherosclerosis, autoimmun myocarditis, leukocitaadhéziós deficiencia, szisztémás erythemás lupus (SLE), lupus (nephritis, nem renális, discoid, alopecia), fiatalkorban kialakuló diabétesz, sclerosis multiplex, allergiás eredetű encephalomyelitis, citokinek és T-limfociták által közvetített akut vagy késleltetett túlérzékenységgel összefüggő immunreakciók, tuberkulózis, sarcoidosis, granulomatosis (ideértve a Wegener-féle granulomatosist), agranulocytosis, vasculitis (ideértve az ANCA-t), aplasztikus anaemia, Coombs-féle pozitív anaemia, Diamond-Blackfan-anaemia, immun hemolitikus anaemia (ideértve az autoimmun hemolitikus anaemiát; AIHA), anaemia perniciosa, tisztán vörösvértestes anaemia (PRCA), Vili. faktor deficiencia, haemophilia-A, autoimmun neutropenia, pancytopenia, leukopenia, leukocita diapedesisszel járó betegségek, központi idegrendszeri gyulladásos rendellenességek, több szervre kiterjedő sérülés-tünetegyüttes, myasthenia gravis, antigén-antitest komplex által közvetített betegségek, antiglomeruláris alapmembrán betegség, antifoszfolipid-antitest szindróma, allergiás neuritis, Bechet-kór, Castlemanszindróma, Goodpasture-szindróma, Lambert-Eatonféle izomgyengeség szindróma, Reynaud-szindróma, Sjorgen-szindróma, Stevens-Johnson-szindróma, kemény szervtranszplantátum-kilökődés (ideértve a nagy panelreaktivitású antitesttiterek elérése érdekében végzett előkezelést, IgA-lerakódás szövetekben stb.). graft-versus-host betegség (GVHD), pemphigoid bullosus, pemphigus (valamennyi fajtája, beleértve a vulgárist és foliatist), autoimmun poliendocrinopathiák, Reiter-kór, Stiff-man szindróma, óriássejtes arteritis, immun komplex nephritis IgA-nephropathia, IgM polineuropathiák vagy IgM-közvetítette neuropathia, idiopathiás trombocytopeniás purpura (ITP), trombotikus trombocitopeniás purpura (TTP), autoimmun trombocitopenia, a here és a petefészek autoimmun betegségei, ideértve az orchitist és az oophoritist, primer hipothyroidismus; autoimmun endokrin betegségek, mint például az autoimmun thyroiditis, krónikus thyroiditis (Hashimoto-féle thyroiditis), szubakut thyroiditis, idiopathiás hipothyroidismus, Addison-kór, Grave-kór, autoimmun több mirigyet érintő szindrómák (vagy poliglandularis endocrinopathiás szindrómák), I. típusú diabétesz (más néven inzulindependens diabetes mellitus, IDDM) és Sheehan-szindróma; autoimmun hepatitis, lymphoid interstitialis pneumonitis (HÍV), bronchiolitis obliterans (nem transzplantátum) vs. NSIP, Guillain-Barre-szindróma, nagy ereket érintő vasculitis [ideértve a polimyalgia rheumaticát és az óriássejtes (Takayasu-féle) arteritist], közepes ereket érintő vasculitis (ideértve a Kawasaki-kórt és a poliarteritis nodosát), ízületmerevséggel járó (rheumatoid) spondylitis, Berger-kór (IgA-neuropathia), gyors progressziójú glomerulonephritis, primer epecirrhosis, hasi sprue (glutén enteropathia), cryoglobulinemia, ALS, koszorúartériabetegség.
A CD20-pozitív rákokra a felületükön CD20-at expresszáló sejtek rendellenes proliferációja jellemző. A CD20-pozitív B-sejtes neoplazmák közé tartoznak a következők: CD20-pozitív Hodgkin-kór, ideértve a limfocitapredomináns Hodgkin-kórt (LPHD); non-Hodgkinlimfóma (NHL), follicularis központi sejtes (FCC) limfómák; akut limfocitikus leukémia (ALL); krónikus limfocitikus leukémia (CLL); szőrös sejtes leukémia. A nonHodgkin-limfómák az alábbi típusok lehetnek: alacsony malignitású („low grade”)/follicularis non-Hodgkin-limfóma (NHL), kis limfocitás limfóma (SLL), közepes malignitású („intermediate grade”)/follicularis NHL, „intermediate grade” diffúz NHL, nagy malignitású („high grade”) immunblasztsejtes NHL, „high grade” limfoblasztikus NHL, „high grade” kis nem hasadt sejtes NHL, plazmocitoid limfocitikus limfóma, köpenysejtes limfóma, AIDS-szel összefüggő limfóma és Waldenstromféle makroblobulinémia. A találmány szerinti eljárások alkalmasak e rákos betegségek kiújult alakjainak kezelésére is. Az LPHD olyan típusú Hodgkin-kór, amely gyakran sugárkezelés és kemoterápia után is hajlamos a kiújulásra, és CD20-pozitív malignáns sejtek jelenlétével jellemezhető. A VLL a leukémia négy fő típusának egyike. Az érett B-sejtek (limfociták) rákos betegsége a sejtek (vérben, csontvelőben és nyirokszövetekben bekövetkező) progresszív felhalmozódásában manifesztálódik.
A találmány specifikus megvalósítási módjai értelmében a humanizált CD20-kötő antitestet és funkcionális fragmenseit a következő rendellenességek kezelésére alkalmazzuk: non-Hodgkin-limfóma (NHL), limfocita-predomináns Hodgkin-kór (LPHD), kis limfocitás limfóma (SLL), krónikus limfocitikus leukémia (CLL), reumaszerű ízületi gyulladás és fiatalkori reumaszerű ízületi gyulladás, szisztémás lupus erythematosus (SLE, ideértve a lupus nephritist), Wegener-kór, gyulladásos bélbetegség, idiopátiás trombocitopeniás purpura (ITP), trombotikus trombocitopeniás purpura (TTP), autoimmun trombocitopenia, sclerosis multiplex, psoriasis, lg A nephropathia, IgM polineuropatiák, myasthenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud-szindróma, Sjorgen-szindróma és glomerulonephritis.
A találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitestek vagy funkcionális származékaik egy hatóanyagos terápiában alkalmazhatók, például kiújuló vagy makacs, „low grade” vagy follicularis, CD20-pozitív B-sejtes non-Hodgkin-limfóma kezelésére, illetve többhatóanyagos terápiaként egyéb hatóanyagokkal együtt adagolhatok.
HU 227 217 Β1
A lassú lefolyású limfóma egy lassan kifejlődő, kezelhetetlen betegség, amelyre (számos átmeneti javulási, illetve súlyosbodás! időszakot követően) hat és tíz év közötti átlagos túlélési idő jellemző. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a humanizált CD20kötő antitesteket vagy funkcionális fragmenseiket lassú lefolyású NHL kezelésére alkalmazzuk.
A daganatok kezelése hatékonyságának és sikerességének értékelésére alkalmas paraméterek az egyes betegségekre szakember számára jól ismertek. A kezelőorvosok általában az adott betegség jeleinek és tüneteinek mérséklődését veszik figyelembe. Az ilyen paraméterek közé tartozik a betegség progressziójának átlagos ideje, illetve a betegség enyhülésének és stabilizálódásának időtartama.
Az alábbi forrásokban limfómákat és krónikus limfocitikus leukémiát (CLL), illetve az ilyen betegségek diagnosztizálását, kezelését és a kezelés hatékonysága mérésének standard módszereit írják le: Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas, W. B. Saunders Company, Philadelphia (1998); van Besien, K. és Cabanillas, F: Clinical „Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin’s Lymphoma”, 70. fejezet, 1293-1338. oldal, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3. kiadás, szerk.: Hoffman és munkatársai, Churchill Livingstone, Philadelphia (2000); és Rai, K. és Patel, D.: „Chronic Lymphocytic Leukémia”, 72. fejezet, 1350-1362. oldal, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3. kiadás, szerk.: Hoffman és munkatársai, Churchill Livingstone, Philadelphia (2000).
Az autoimmun betegségek és az azokkal összefüggő egyéb rendellenességek kezelése hatékonyságának és sikerességének értékelésére alkalmas paraméterek az egyes betegségekre szakember számára jól ismertek. A kezelőorvosok általában az adott betegség jeleinek és tüneteinek mérséklődését veszik figyelembe. A következőket példaként említjük.
Az egyik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti antitestek reumaszerű ízületi gyulladás kezelésére alkalmazhatók. A reumaszerű ízületi gyulladásra több ízület gyulladása, porckopás és csonterózió jellemző, melyek együttesen az ízületek roncsolását és funkciójuk csökkenését eredményezik. Mivel a reumaszerű ízületi gyulladás szisztémás betegség, más szövetekre (tüdőre, szemre és csontvelőre) is káros hatást gyakorolhat. A tíz évnél hosszabb ideig reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő páciensek kevesebb mint 50 százaléka képes folytatni munkáját, illetve szokásos életvitelét.
A találmány szerinti antitestek a reumaszerű ízületi gyulladás korai stádiumában szenvedő páciensek elsődleges [azaz metotrexát (MTX) nélküli] kezelésére, önmagában (monoterápiaként) vagy más hatóanyagokkal - például metotrexáttal vagy ciklofoszfamiddal kombinálva alkalmazható. Más módon, az antitestek másodlagos terápiaként végzett kezelésre alkalmazhatók olyan pácienseknél, akiknél a rheumatoid arthritis a DMARD és/vagy MTX alkalmazásával végzett kezelést követően is tartósnak bizonyult. Ilyen esetekben az antitestet szintén önmagában vagy más hatóanyaggal (például metotrexáttal) kombinálva alkalmazhatjuk. A reumaszerű ízületi gyulladás kezelése során a humanizált CD20-kötő antitestek az ízületek károsodásának megelőzésére vagy szabályozására, a strukturális károsodás késleltetésére, a gyulladással összefüggő fájdalom csökkentésére, valamint a betegség mérsékelt/súlyos stádiumaiban a tünetek általános enyhítésére alkalmasak. A reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő pácienst az ilyen betegség kezelésére alkalmazott egyéb hatóanyagokkal végzett kezelés előtt vagy után (illetve azzal egyidejűleg; lásd később a kombinációs terápiák leírásánál) kezelhetjük a humanizált CD20-kötő antitesttel. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitesttel a reumaellenes hatóanyagokra nem reagáló és/vagy az önmagában alkalmazott metotrexátra elégtelen reakciót adó pácienseket kezelünk. E kezelési eljárás egyik megvalósítási módja szerint a pácienseket 17 napos rendszerben kezeljük: az
1. és 15. napon a betegeknek humanizált CD20-kötő antitestet adunk be (önmagában, 1 g hatóanyag-tartalmú iv. infúzióval); a 3. és 17. napon pedig a CD20-kötő antitestet ciklofoszfamiddal (750 mg hatóanyag-tartalmú iv. infúzió) vagy metotrexáttal együtt adagoljuk.
A reumaszerű ízületi gyulladás kezelési hatékonyságának értékelésére alkalmas egyik módszer az Amerikai Reumatológiai Szakkollégium (ACR) kritériumain alapul. Ezek értelmében, többek között, az érzékeny és duzzadt ízületek állapotának százalékos javulását mérik. A reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő páciens kezelésének eredménye, például, ACR 20, ami 20%-os javulást jelent az antitesttel végzett kezelés előtti állapothoz vagy placebóval végzett kezelés utáni állapothoz viszonyítva. Az antitesttel végzett kezelés hatékonysága értékelésének további módszerei közé tartozik a röntgenvizsgálati pontozás, mint például a Sharp-féle röntgenvizsgálati pontozás, amely a strukturális károsodás (úgymint a csonterózió és az ízületi hézag szűkülése) pontozására alkalmazható. A betegek állapota a mozgáskorlátozottság megelőzése vagy javulása szempontjából egészségértékelési kérdőív („Health Assessment Questionnaire”; HAQ) pontszámai, AlMS-pontozás, SF-36 alapján is értékelhető (a kezelés során vagy azt követően bizonyos időintervallumokban). Az ACR 20 kritérium akkor teljesül, ha az érzékeny (fájdalmas) ízület és a duzzadt ízület eredményében, valamint az alábbi öt értékelési szempont közül legalább háromban 20%-os javulás tapasztalható:
1. a páciens fájdalomértékelése vizuális analóg skálán (VAS);
2. a páciens betegségaktivitásra vonatkozó általános értékelése (VAS);
3. a kezelőorvos betegségaktivitásra vonatkozó általános értékelése (VAS);
4. a páciens mozgáskorlátozottságának önértékelése egészségértékelési kérdőív alapján; és
5. akut fázisú reaktánsok, CRP vagy ESR.
Az ACR50 és ACR70 kritérium hasonló módon definiálható. A találmány szerinti CD20-kötő antitestet elő27
HU 227 217 Β1 nyösen olyan mennyiségben adagoljuk a betegnek, amely legalább ACR20-nak, előnyösen legalább ACR30-nak, előnyösebben legalább ACR50-nek, még előnyösebben legalább ACR70-nek, legelőnyösebben legalább ACR75-nek vagy nagyobb arányú javulásnak megfelelő pontszám elérését teszi lehetővé.
A psoriaticus ízületi gyulladás egyedülálló és jól megkülönböztethető radiográfiás sajátságokat mutat. Ilyen betegségnél az ízületi erózió és az ízületi hézag szűkülése szintén a Sharp-pontozással értékelhető. A találmány szerinti CD20-kötő antitestek az ízület károsodásának megelőzésére, illetve a rendellenesség jeleinek és tüneteinek mérséklésére alkalmazhatók.
A találmány egy további szempontjának megfelelően, eljárást tárunk fel lupus vagy szisztémás erythemás lupus (SLE) kezelésére, melynek során az SLEben szenvedő páciensnek találmány szerinti humanizált CD20-kötő antitest terápiás szempontból hatásos mennyiségét adagoljuk. A SLEDAI-pontszám a betegség aktivitásának numerikus értékelésére alkalmas. A SLEDAI-pontszám 24 (a betegség aktivitásával összhangban lévő) klinikai és laboratóriumi paraméter súlyozott indexe, amely O-tól 103-ig terjedhet [lásd Bryan Gescuk és John Davis: Current Opinion in Rheumatology 14, 515 (2002)]. A kettős szálú DNS elleni antitestek vélhetően veselobbanást és a lupus egyéb manifesztációit okozzák. Az antitesttel kezelt páciensekben ellenőrizhető a vese belobbanásig eltelt idő, ami a szérum kreatinin, vizelet protein vagy a vizeletben lévő vér mennyiségének reprodukálható növekedéseként definiálható. Más módon, vagy ezen túlmenően, a páciensekben ellenőrizhetjük a sejtmag elleni antitestek és a kettős szálú DNS elleni antitestek mennyiségét is. A szisztémás erythemás lupus gyógykezelése nagy dózisú kortikoszteroidok és/vagy ciklofoszfamid (HDCC) adagolásával hajtható végre.
A spondyloarthropathiás betegségek az ízületek rendellenességei, s idetartoznak az ízületmerevséggel járó (rheumatoid) spondylitis, a psoriaticus arthritis és a Crohn-kór. A kezelés sikeressége a páciens és a kezelőorvos validált általános értékelése alapján határozható meg.
A psoriasis kezelésére különféle gyógyszerek állnak rendelkezésre. Az egyes konkrét esetekben a kezelés kiválasztása közvetlenül a betegség súlyosságával áll összefüggésben. A psoriasis enyhébb formáiban szenvedő páciensek rendszerint helyileg alkalmazható (topikus) hatóanyagokkal kezelhetők, így például szteroidok, anthralin, calcipotrien, clobestasol és tazaroten topikus készítményeivel, míg a mérsékelt és súlyos psoriasisban szenvedő betegek szisztémás hatóanyagokkal (methotrexat, retinoidok, ciklosporin, PUVA és UVB) kezelhetők. Kátrányszármazékok szintén alkalmazhatók. Ezek a terápiák biztonsági megfontolások, időigényes kezelési sémák és kényelmetlen kezelési procedúrák kombinációját jelentik. Bizonyos kezelési módok költséges berendezéseket és külön erre a célra kijelölt helyiségeket igényelnek. A szisztémás gyógyszerek súlyos mellékhatásokat okozhatnak, így például magas vérnyomást, megnövekedett vérzsírszintet, csontvelő-szuppressziót, illetve máj-, vese- és bélbetegségeket. Ezenfelül, a fényterápia növelheti a bőrrákok kialakulásának kockázatát. A topikus terápiákkal kapcsolatos kényelmetlenség és diszkomfort mellett a fényterápia és a szisztémás terápia a páciensek kezelésre történő időbeli beosztását és - a mellékhatások miatt - egész életen át tartó megfigyelésüket igényli.
A psoriasis kezelésének hatékonysága a betegség klinikai jeleiben és tüneteiben bekövetkező változások nyomon követésével értékelhető, ideértve a kezelőorvos általános értékelésének („Physician’s Global Assessment”; PGA) változásait, a psoriaticus terület és súlyossági index (PASI) pontokat és a psoriasistünet értékelést (PSA) - az alapszinttel összehasonlítva. A páciens állapota a kezelés során periodikusan a vizuális analóg skálán értékelhető, amely a meghatározott időpontokban tapasztalt viszketés mértékének jelzésére alkalmazható.
A páciensek a terápiás antitest első (infúziós) adagolása során infúziós reakciót vagy infúzióval összefüggő tüneteket tapasztalhatnak. E tünetek súlyossága változó, és gyógyászati beavatkozással általában visszafordíthatok. A szóban forgó tünetek közé tartozik, többek között, az influenzaszerű láz, hidegrázás, nátha, csalánkiütés, fejfájás, hörgőgörcs, érödéma. A találmány szerinti kezelési eljárások szempontjából kívánatos az infúziós reakciók minimálisra csökkentése. Ilyenformán, a találmány egy további szempontjának megfelelően, eljárást tárunk fel a megadott betegségek kezelésére, melynek során olyan humanizált CD20-kötő antitestet adagolunk, amely nem (vagy csökkentett mértékben) fejt ki komplementdependens citotoxicitást és kisebb mértékű infúziós tüneteket okoz, mint a Rituxan®-nal végzett kezelés. Az egyik megvalósítási mód szerint humanizált CD20-kötő antitestként a 2H7.v116-antitestet alkalmazzuk.
Adagolás
A találmány szerinti antitesteket - a kezelni kívánt betegségtől és az adagolásra vonatkozó paraméterektől (melyek szakember számára jól ismertek) függően - az adott betegség kezelésére hatásos, ugyanakkor, a toxicitást és a mellékhatásokat minimális szinten tartó dózisban adagoljuk. CD20-pozitív rák vagy autoimmun betegség kezelése során a terápiás szempontból hatásos dózis körülbelül 250 mg/m2-től körülbelül 400 mg/m2-ig vagy 500 mg/m2-ig terjed, előnyösen körülbelül 250-375 mg/m2. A CD20-pozitív B-sejtes neoplazma kezelésének egyik megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti antitestet 300-375 mg/m2 dózisban adagoljuk. B-sejtes limfóma (például nonHodgkin-limfóma) kezelése céljából a találmány szerinti anti-CD20 antitesteket és humanizált antiCD20 antitesteket, az egyik specifális megvalósítási mód értelmében, 10 mg/kg vagy 375 mg/m2 dózisban adagoljuk egy ilyen betegségben szenvedő embernek. Non-Hodgkin-limfóma kezelése során az antitestkészítményt - az egyik adagolási séma szerint - az első héten egyszeri dózisban adjuk be, majd kéthetes szünet után az antitest második, szintén 10 mg/kg-os dó28
HU 227 217 Β1 zisát adjuk be. A non-Hodgkin-limfómában szenvedő betegek általában évente egyszer vesznek fel ilyen kezelést, de a limfóma kiújulása esetén megismételhető. Egy másik adagolási séma szerint az alacsony malignitású („low grade”) non-Hodgkin-limfómában szenvedő pácienseket négy héten át humanizált 2H7antitestváltozat (előnyösen 2H7.v16-változat) 375 mg/m2 heti dózisával kezeljük, majd az ötödik héten három további antitestdózist adunk be és három cikluson keresztül három hetenként standard CHOP (ciklofoszfamid, doxorubicin, vincristin és prednison) vagy CVP (ciklofoszfamid, vincristin, prednison) kemoterápiát végzünk.
Reumaszerű ízületi gyulladás kezelése céljából a találmány szerinti humanizált antitestet, az egyik megvalósítási mód értelmében, 125 mg/m2-től (ami körülbelül 200 mg/dózisnak felel meg) 600 mg/m2-ig terjedő dózistartományban, két dózisban adagoljuk. Például az első 200 mg-os dózist az első napon, majd a második 200 mg-os dózist a 15. napon adjuk be. Más megvalósítási módok szerint az adagolást dózisonként 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg vagy 600 mg dózisnagysággal végezzük.
Betegség kezelése során a találmány szerinti CD20-kötő antitest adagolása - a kezelőorvos döntése alapján - krónikus vagy szakaszos módon történhet.
Az intravénás infúzióval vagy szubkután injekcióval kezelt páciensek olyan zavaró mellékhatásokat tapasztalhatnak, mint a láz, hidegrázás, égő érzés, gyengeség és fejfájás. Az ilyen zavaró események csillapítása vagy minimalizálása céljából a páciensnek először az antitest kondicionálódózisát vagy -dózisait adjuk be, s csak ezt követi a terápiás dózis. A kondicionálódózis kisebb, mint a terápiás dózis, és célja a páciens szervezetének nagyobb dózisokhoz történő hozzászoktatása.
Adagolási módok
A találmány szerinti CD20-kötő antitesteket embereknek jól ismert módszerekkel adagoljuk, így például intravénás (például bolusinjekcióval vagy meghatározott időtartamú infúzióval), szubkután, intramuszkuláris, intraperitoneális, intracerebrospinalis, intraarticularis, intrasynovialis, intrathecalis vagy inhalációs adagolással. Leggyakoribb az intravénás és a szubkután adagolás.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a humanizált 2H7-antitestet - infúziós hordozóként 0,9%-os nátrium-klorid-oldat alkalmazásával - intravénás infúzióban adagoljuk.
Kombinációs terápia
A fentebb leírt B-sejtes neoplazmák kezelése során a találmány szerinti CD20-kötő antitesteket egy vagy több hatóanyaggal (például kemoterápiás hatóanyagokkal) kombinálva adagolhatjuk. A CD20-kötő antitest a kemoterápiás hatóanyaggal egyidejűleg, azt követően vagy azzal felváltva (vagy a másik terápiára adott reakció hiányát követően) adagolható. A limfómák kezelésének standard kemoterápiája ciklofoszfamid, cytarabin, melphalan és mitoxantron és melphalan adagolását foglalja magában. A non-Hodgkin-limfóma kezelésére a CHOP a legáltalánosabban alkalmazott kemoterápiás séma. A CHOP-sémában a következő hatóanyagokat alkalmazzák: ciklofoszfamid (cytoxan, neosar); adriamicin (doxorubicin/hidroxidoxorubicin); vincristin (Oncovin); és prednisolon (Deltasone vagy Orasone). A találmány konkrét megvalósítási módjai értelmében a CD20-kötő antitestet arra rászoruló páciensnek egy vagy több kemoterápiás hatóanyaggal kombinálva adagolhatjuk, mely kemoterápiás hatóanyagok a következők lehetnek: doxorubicin, ciklofoszfamid, vincristin és prednisolon. Egy speciális megvalósítási mód szerint limfómában (például non-Hodgkinlimfómában) szenvedő páciens találmány szerinti antiCD20 antitesttel végzett kezelését CHOP-terápiával (ciklofoszfamid, doxorubicin, vincristin és prednison) kombinálva végezhetjük. Egy másik megvalósítási módban a páciens találmány szerinti humanizált CD20kötő antitesttel végzett kezelését CVP-kemoterápiával (ciklofoszfamid, vincristin és prednison) kombinálva hajthatjuk végre. Egy speciális megvalósítási mód értelmében CD20-pozitív non-Hodgkin-limfómában szenvedő pácienst CVP-kemoterápiával kombinálva humanizált 2H7.v16-antitesttel kezelünk. A krónikus limfocitikus leukémia (CLL) kezelésének egyik megvalósítási módjában a CD20-kötő antitest adagolását fludarabinnal és/vagy cytoxannal végzett kemoterápiával együtt hajtjuk végre.
A fentebb leírt autoimmun betegségek vagy autoimmun betegséggel összefüggő állapotok kezelése során a páciens találmány szerinti CD20-kötő antitesttel végzett kezelését egy másik terápiás hatóanyag (például immunszuppresszív hatóanyag) adagolásával kombinálva végezzük (például több hatóanyagos adagolási sémában). A CD20-kötő antitest az immunszuppresszív hatóanyaggal egyidejűleg, azt követően vagy azzal felváltva (vagy a másik terápiára adott reakció hiányát követően) adagolható. Az immunszuppresszív hatóanyagot az idevonatkozó szakirodalomban leírtakkal azonos vagy azoknál kisebb dózisokban alkalmazhatjuk. A konkrét immunszuppresszív hatóanyag kiválasztása több tényezőtől függ, így például a kezelni kívánt rendellenesség típusától és a páciens kórtörténetétől.
Ahogy itt használjuk, az „immunszuppresszív hatóanyag” kifejezésen olyan anyagot értünk, amelynek funkciója a páciens immunrendszerének szuppresszálása vagy elfedése. Az ilyen hatóanyagok szuppresszálhatják a citokintermelést, gátolhatják vagy szuppresszálhatják a sajátantigén-expressziót, illetve álcázhatják az MHC-antigéneket. Az immunszuppresszív hatóanyagok jellemző példáiként említhetők szteroidok, mint például a glükokortikoszteroidok (például prednizon, metil-prednizolon és dexametazon); 2-amino-6-aril-5-szubsztituált pirimidinek (lásd a 4 665 077 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást), azatioprin (vagy ciklofoszfamid, ha az azatioprinre zavaró reakció lép fel); bróm-cryptin, glutáraldehid
HU 227 217 Β1 (amely álcázza az MHC-antigéneket; lásd a 4 120 649 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást); MHC-antigének és MHC-fragmensek elleni antiidiotipusos antitestek; ciklosporin-A; citokin vagy citokinreceptor-antagonisták, mint például az antiinterferon-γ, -β vagy -a antitestek; tumornekrózisfaktor-α elleni antitestek; tumornekrózisfaktor-β elleni antitestek; interleukin—2 (IL-2) elleni antitestek és IL-2-receptor elleni antitestek; anti-L3T4 antitestek; heterológ antilimfocita globulin; pan-T antitestek, előnyösen antiCD3 vagy anti-CD4/CD4a antitestek; LFA-3-kötő domént tartalmazó oldékony peptidek (WO 90/08187 számú nemzetközi közzétételi irat); sztreptokináz; TGF-β; sztreptodornáz; gazdából származó RNS vagy DNS; FK506 RS-61443; dezoxispergualin; rapamicin; T-sejtreceptor (lásd az 5 114 721 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást); T-sejt-receptor fragmensek [lásd Offner és munkatársai: Science 251, 430 (1991); WO 90/11294 és WO 91/01133 számú nemzetközi közzétételi irat]; és T-sejt-receptor antitestek (EP 340109), mint például T10B9.
A reumaszerű ízületi gyulladás kezelése céljából a páciensek találmány szerinti CD20-kötő antitesttel végzett kezelést egy vagy több alábbi hatóanyaggal kombinálva végezhetjük: betegségmódosító reumaellenes hatóanyagok (DMARD; például methotrexat); nem szteroid gyulladáscsökkentő hatóanyagok (NSAI vagy NSAID); HUMIRA™ (adalimumab; Abbott Laboratories); ARAVA® (leflunomid); REMICADE® (infliximab; Centocor Inc., Malvern, PA); ENBREL (etanercept; Immunex, WA); és COX-2-inhibitorok. A reumaszerű ízületi gyulladás kezelésére általánosan alkalmazott DMARD-hatóanyagok a következők: hidroxiklorokin, sulfasalazin, methotrexat, leflunomid, etanercept, infliximab, azathioprin, D-penicillamin, Gold (orális), Gold (intramuszkuláris), minociklin, ciklosporin, Staphylococcus-eredetü protein-A immunoadsorption. Az adalimumab egy humán monoklonális antitest, amely a TNF-a-hoz kötődik. Az infliximab egy kimerikus monoklonális antitest, mely szintén a TNF-a-hoz kötődik. Az etanercept egy fúziós protein („immunadhezin”), amely a humán 75 kD-os (p75) tumornekrózisfaktor receptor (TNFR) extracelluláris ligandumkötő részéből és egy humán IgG 1 Fc-fragmenséből áll. A reumaszerű ízületi gyulladás hagyományos kezelési módját illetően lásd például: „Guidelines fór the management of rheumatoid arthritis’’ in: Arthritis & Rheumatism 46(2), 328-346 (2002). A találmány egy specifikus megvalósítási módja értelmében a reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő páciens találmány szerinti CD20-kötő antitesttel végzett kezelését metotrexát (MTX) adagolásával kombinálva végezzük. Az MTX, például, 7,5-25 mg/kg/hét dózisban, orális és szubkután módon adagolható.
Rheumatoid spondylitis, psoriasisos ízületi gyulladás és Crohn-kór kezelése céljából a páciens találmány szerinti CD20-kötő antitesttel végzett kezelését, például Remicade® (infliximab; Centocor Inc., Malvern, PA) vagy ENBREL (etanercept; Immunex, WA) adagolásával kombinálva hajtjuk végre.
A szisztémás erythemás lupus (SLE) kezelése nagy dózisú kortikoszteroidok és/vagy ciklofoszfamid (HDCC) adagolását foglalja magában.
Psoriasis kezelése céljából a páciens CD20-kötő antitesttel végzett kezelését helyi kezelésekkel kombinálva hajtjuk végre, például szteroidok, anthralin, calcipotrien, clobestasol és tazaroten topikus készítményeivel, illetve methotrexat-, retinoidok-, ciklosporin-, PUVA és UVB-terápiákkal. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a psoriasisban szenvedő pácienst ciklosporinnal végzett kezelés után vagy azzal egyidejűleg kezeljük a találmány szerinti CD20-kötő antitesttel.
Gyógyászati készítmények
A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott CD20-kötő antitestek tárolásra alkalmas gyógyászati készítményei a kívánt tisztaságú antitest és adott esetben, fiziológiai szempontból elfogadható hordozók, segédanyagok és stabilizálószerek [lásd Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, szerk.: Osol (1980)] - elegyítésével állíthatók elő (liofilizátum vagy vizes oldat alakjában). Az erre a célra alkalmas hordozók, segédanyagok és stabilizálószerek az alkalmazott dózisokban és koncentrációkban nem lehetnek toxikusak a páciensre. Az ilyen anyagok a következők: pufferek (például foszfát-, citrát- és egyéb szerves savak); antioxidánsok (például aszkorbinsav és metionin); tartósítószerek [például oktadecil-dimetil-benzilammónium-klorid, hexamethonium-klorid, benzalkonium-klorid, benzethonium-klorid, fenol, butil- vagy benzil-alkohol, alkil-parabének (például metil- vagy propil-parabén), catechol, rezorcinol, ciklohexanol, 3-pentanol és m-krezol]; kis molekulatömegű (legfeljebb körülbelül 10 aminosavas) polipeptidek; proteinek (például szérumalbumin, zselatin vagy immunglobulinok); hidrofil polimerek [például poli(vinil-pirrolidon)]; aminosavak (például glicin, glutamin, aszparagin, hisztidin, arginin vagy lizin); monoszacharidok, diszacharidok és egyéb szénhidrátok (például glükóz, mannóz vagy dextrinek); kelátképzők (például EDTA); cukrok (például szacharóz, mannitol, trehalóz vagy szorbitol); sóképző ellenionok (például nátrium); fémkomplexek (például Zn-protein komplexek); és/vagy nemionos felületaktív anyagok [például Tween™, Pluronics™ vagy polietilénglikol (PEG)].
Az anti-CD20 antitestek jellemző készítményeinek leírását illetően lásd a WO 98/56418 számú nemzetközi közzétételi iratot (melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni). További példaként említhető egy többdózisos folyadékkészítmény, amely 40 mg/mL anti-CD20 antitestet, 25 mM acetátot, 150 mM trehalózt, 0,9% benzil-alkoholt, 0,02% poliszorbát-20-at tartalmaz (pH=5,0), és amelynek minimális eltarthatósági ideje 2-8 °C-on két év. Egy másik anti-CD20 antitest készítmény összetétele a következő: 10 mg/mL antitest, 9,0 mg/mL nátrium-klorid, 7,35 mg/mL nátrium-citrát-dihidrát, 0,7 mg/mL poliszorbát-80 és steril injektálható víz (pH=6,5). Egy további vizes gyógyászati készítmény 10-30 mM nátrium-ace30
HU 227 217 Β1 tátot (pH=4,8—5,5, előnyösen 5,5); felületaktív anyagként poliszorbátot (0,01-0,1 V/V%); trehalózt (körülbelül 2-10 m/V%); és tartósítószerként benzil-alkoholt tartalmaz (lásd a 6 171 586 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást). A szubkután adagolásra kifejlesztett liofilizált készítmények leírását illetően lásd a WO 97/04801 számú nemzetközi közzétételi iratot. Az ilyen liofilizált készítmények megfelelő diluendummal nagy proteinkoncentrációban rekonstituálhatók, és a rekonstituált készítmény emlősöknek szubkután adagolható.
A humanizált 2H7-antitestváltozatok egyik készítménye 10 mM hisztidint, 6% szacharózt és 0,02% poliszorbát-20-at tartalmazó oldatban (pH=5,8) 12-14 mg/mL koncentrációjú antitestet tartalmaz.
Az egyik speciális megvalósítási mód értelmében a 2H7-változatokat - közelebbről, a 2H7.v16-változatot tartalmazó készítmények összetétele a következő: 20 mg/mL antitest, 10 mM hisztidin-szulfát, 60 mg/mL szacharóz, 0,2 mg/mL poliszorbát-20 és steril injektálható víz (pH=5,8).
A találmány szerinti készítmények - a kezelni kívánt betegségtől függően - egynél több aktív vegyületet is tartalmazhatnak, előnyösen olyanokat, amelyek egymás hatását károsan nem befolyásoló, komplementeraktivitású vegyületek. Például a készítmény tartalmazhat citotoxikus hatóanyagot, kemoterápiás hatóanyagot, citokint vagy immunszuppresszív hatóanyagot (például, T-sejtekre ható vegyületet, például ciklosporint vagy T-sejtekhez kötődni képes antitestet, például LFA-1-hez kötődni képes antitestet). Az ilyen egyéb hatóanyagok hatásos mennyisége a készítményben lévő antitest mennyiségétől, a kezelni kívánt betegség vagy rendellenesség típusától, a kezelés módjától, illetve a fentebb leírt egyéb faktoroktól függ. A járulékos hatóanyagokat általában az itt leírt dózisokban és adagolási módokon, illetve a korábban alkalmazott dózisaik körülbelül 1-99%-ának megfelelő dózisokban alkalmazhatjuk.
Az aktív összetevők - például koacerválási technikákkal vagy határfelületi polimerizációval előállított mikrokapszulákba [például hidroxi-metil-cellulóz- vagy zselatinmikrokapszulákba, illetve poli(metil-metakrilát)mikrokapszulákba], továbbá kolloidális hatóanyag-célbajuttató rendszerekbe (például liposzómákba, albuminmikrogömbökbe, mikroemulziókba, nanorészecskékbe és nanokapszulákba) vagy makroemulziókba is foglalhatók. Az ilyen technikák leírását illetően lásd „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16. kiadás, szerk.: A. Osol (1980).
A találmány szerinti megoldás értelmében tartós hatóanyag-kibocsátású készítmények is előállíthatok. Az ilyen készítmények jellemző példái közé tartoznak az antagonista vegyületet tartalmazó, szilárd hidrofób polimerekből készített féligáteresztő ágyazóanyagok, amelyek például filmek vagy mikrokapszulák formájában állíthatók elő. A tartós hatóanyag-felszabadulást biztosító ágyazóanyagok példái a következők: poliészterek; hidrogélek, például, poli(2-hidroxi-etil-metakrilát) vagy poli(vinil-alkohol); polilaktidok (3 773 919 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); L-glutaminsav és γ-etil-L-glutamát kopolimerei; lebonthatatlan etilénvinil-acetát kopolimerek; lebontható tejsav-glikolsav kopolimerek (például LUPRON DEPOT™, amely tejsavglikolsav kopolimerből és leuprolid-acetátból álló, injektálható mikrogömbkészítmény); és poli-D-(—)-3-hidroxivajsav.
Az in vivő adagolásra szánt vegyületeknek sterileknek kell lenniük, ami steril szűrőmembránok alkalmazásával végzett szűréssel egyszerűen biztosítható.
Gyártmányok és reagenskészletek
A találmány egy további megvalósítási módja értelmében olyan gyártmányt tárunk fel, amely autoimmun betegségek és autoimmun betegségekkel összefüggő állapotok, illetve CD20-pozitív rákok (például nonHodgkin-limfóma) kezelésére alkalmas anyagokat tartalmaz. A találmány szerinti gyártmány egy tartályból és a tartályra ragasztott címkéből vagy a tartályhoz mellékelt betegtájékoztatóból áll. A tartály lehet például palack, fiola, fecskendő stb., melyek különféle anyagokból (például üvegből vagy műanyagból) készülhetnek. A tartály a kezelni kívánt állapot kezelésére hatásos készítményt tartalmaz, és steril hozzáférési ponttal van ellátva (például a tartály egy intravénás műanyagzsák vagy fiola, amely injekciós tűvel átszúrható dugóval van lezárva. A készítmény legalább egy aktív hatóanyagként találmány szerinti CD20-kötő antitestet tartalmaz. A tartályon lévő címkén (vagy az ahhoz mellékelt betegtájékoztatón) fel van tüntetve, hogy a készítmény milyen állapot kezelésére alkalmazható, továbbá útmutatást nyújt az antitestkészítmény páciensnek történő adagolásáról. A betegtájékoztató a gyógyászati termékekhez hivatalosan mellékelt instrukciók összességét jelenti, melyek az adott termék alkalmazásáról, indikációjáról, dozírozásáról, adagolásáról, a készítmény alkalmazásának ellenjavallatairól és/vagy a készítmény alkalmazásával kapcsolatos figyelmeztetésekről nyújt felvilágosítást. Az egyik megvalósítási mód értelmében a betegtájékoztatón fel van tüntetve, hogy a készítmény non-Hodgkin-limfóma kezelésére alkalmazható.
Ezen túlmenően, a találmány szerinti gyártmány tartalmazhat egy második tárolóedényt is, amely gyógyászati szempontból elfogadható puffért, például bakteriosztatikus injektálható vizet, foszfátpufferelt sóoldatot, Ringer-oldatot és dextrózoldatot tartalmazhat. A találmány szerinti gyártmány tartalmazhat kereskedelmi és felhasználói szempontból kívánatos egyéb anyagokat is, például további puffereket, diluendumokat, szűrőket, tűket és fecskendőket.
A találmány egy következő szempontjának megfelelően reagenskészleteket tárunk fel, melyek különféle célokra alkalmazhatók, így például B-sejt-pusztítási tesztekre, apoptózis tesztek pozitív kontrolljaként, CD20 sejtekből történő tisztítására vagy immunprecipitációjára. A CD20 izolálására és tisztítására alkalmas reagenskészlet hordozóhoz (például Sepharosegyöngyökhöz) kapcsolt anti-CD20 antitestet tartal31
HU 227 217 Β1 máz. Más reagenskészletekben az antitestek a CD20 in vitro detektálására és mennyiségi meghatározására szolgál (például ELISA-tesztben vagy Western-blot-analízisben). Hasonlóan a találmány szerinti gyártmányokhoz, a reagenskészlet szintén tartalmaz egy tartályt, valamint egy azon elhelyezett címkét vagy egy mellékelt termékismertetőt. A tartály legalább egy találmány szerinti anti-CD20 antitestet magában foglaló készítményt tartalmaz. A reagenskészletben további tartályok is lehetnek, amelyek például diluendumokat, puffereket és kontrollantitesteket tartalmazhatnak. A címke vagy termékismertető a készítmény összetételéről, illetve annak in vitro vagy diagnosztikai alkalmazási lehetőségeiről nyújt felvilágosítást.
Cynomolgus majom-eredetű CD20
A találmány értelmében feltárunk egy izolált nukleinsavat is, amely a cynomolgus majom-eredetű CD20 nukleotidszekvenciáját (24. azonosító számú szekvencia; lásd a 19. ábrát) tartalmazza. Az egyik megvalósítási mód szerint a szóban forgó nukleinsav cDNS. Egy további megvalósítási módnak megfelelően, a majomeredetű CD20-at kódoló nukleinsav gazdasejtben történő expresszáltatásra alkalmas expressziós vektor. A vektorban a 24. azonosító számú nukleotidszekvencia működőképesen expressziós szabályozószekvenciához (promoterhez vagy promoterhez és erősítőszekvenciához) van kapcsolva. A vektor expressziós szabályozószekvenciaként a cynomolgus CD20-génnel természetes állapotban kapcsolatban álló natív szekvenciát vagy heterológ szekvenciát tartalmazhat. Feltárunk továbbá egy izolált polipeptidet, amely a cynomolgus-eredetű CD20 aminosavszekvenciáját (25. azonosító számú szekvencia; 19. és 20. ábra) tartalmazza. Feltárjuk továbbá a cynomolguseredetű CD20-at kódoló nukleinsavat hordozó gazdasejteket, melyek a találmány egyik megvalósítási módja értelmében eukarióta sejtek (például CHO-sejtek). Szintén a találmány tárgyához tartoznak a cynomolgus-CD20 aminosavszekvenciát vagy annak fragmenseit tartalmazó fúziós proteinek.
A továbbiakban a találmányt kísérleti példák bemutatásán keresztül szemléltetjük.
1. példa
Egéreredetű 2H7 anti-CD20 monoklonális antitest humanizálása
Az egéreredetű 2H7 antihumán CD20 antitest (rövidítése: m2H7) humanizálását helyspecifikus mutagenizálási lépések sorozatával hoztuk létre. Az egéreredetű 2H7-antitest variábilis régió szekvenciái és az egéreredetű variábilis (V) régiót és humán konstans (C) régiót tartalmazó - kimerikus 2H7-antitest leírását illetően lásd például az 5 846 818 és 6 204 023 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat. A 2H7-antitest komplementaritást meghatározó régiót (CDR) alkotó aminosavait az egéreredetű 2H7-antitest variábilis doménjei - 5 846 818 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltárt - aminosavszekvenciájának ismert antitestek aminosavszekvenciáival [Kábát és munkatársai: „Sequences of Immunological Interest”, 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] történő összehasonlítása alapján azonosítottuk. A könnyű, illetve nehéz lánc CDR-régióit a szekvenciahipervariabilitás (Kábát és munkatársai, lásd fentebb) alapján definiáltuk. E CDRrégiókat az 1 A., illetve 1B. ábrán mutatjuk be. Szintetikus oligonukleotidok (lásd 1. táblázat) alkalmazásával végzett helyspecifikus mutagenezissel [lásd Kunkel: Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 488 (1985)] az egéreredetű 2H7-antitest mind a hat CDR-régióját komplett humán Fab-vázba építettük be [mely Fab-váz a pVX4-plazmidban elhelyezett VKI, VHIII konszenzusszekvenciának (VL kappa I. alcsoport, VH III. alcsoport) felel meg (lásd a 2. ábrát)].
A mutagenezisre és az F(ab) fragmensek E. colisejtekben történő termeltetésére a pVX4-fágemidet (2. ábra) alkalmaztuk. A pVX4 a pb0720-fágemiden alapul, amely a pB0475 [Cunningham és munkatársai: Science 243, 1330 (1989)] származéka. A pVX4 humanizált konszenzus κ I. alcsoportú könnyű láncot (VlkI-Cl) és humanizált konszenzus III. alcsoportú nehéz láncot (VHIII—CH1) tartalmazó anti-IFN-α antitestet kódoló DNS-fragmenst tartalmaz. Ezenfelül, a pVX4 alkalikus foszfatáz promotert és Shine-Dalgarno-szekvenciát is hordoz, melyek egy pUC119-alapú plazmidból, a pAK2-ből [lásd Carter és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992)] származnak. Az F(ab) könnyű és nehéz láncot kódoló DNS-ek közé egyedülálló Spel-felismerési helyet inszertáltunk. Az anti-IFN-α antitest nehéz és könnyű láncának első 23 aminosava egyformán az Stíl szekréciós szignálszekvencia [Chang és munkatársai: Gene 55, 189 (1987)].
A CDR-cserés 2H7-változat (2H7.v2) létrehozása céljából a pVX4 dezoxiuridintartalmú templátján helyspecifikus mutagenezist hajtottunk végre, melynek eredményeként az anti-IFN-α antitest mind a hat komplementaritást meghatározó régióját egéreredetű 2H7-antitest CDR-régiójával helyettesítettük. Az így kapott molekulát humanizált 2H7 2-es változatnak (2H7.v2) vagy a „2H7-antitest CDR-cserés változatának nevezzük. Ez a molekula az m2H7-antitest CDRrégiókat alkotó aminosavait a humán konszenzus vázrégió-aminosavakkal kombinálva tartalmazza (lásd az 1A. és 1B. ábrát). A humanizált 2H7.v2-antitestet további humanizálási folyamatban használtuk fel.
Az 1. táblázatban az egéreredetű 2H7 (m2H7) CDR-régiók H- és L-láncban történő létrehozására alkalmazott oligonukleotidszekvenciákat mutatjuk be. Például a CDR-H1-oligonukleotidot az m2H7 H-lánc CDR1-régiójának kialakítására alkalmaztuk. A CDR-H1, CDR-H2 és CDR-H3 a H-lánc CDR1-, CDR2-, illetve CDR3-régiójára, míg a CDR-L1, CDR-L2 és CDR-L3 az L-lánc CDR1-, CDR2-, illetve CDR3-régiójára vonatkozik. A CDR-H2-ben a szubsztitúciókat két lépésben, a CDR-H2A- és a CDR-H2B-oligonukleotid alkalmazásával hajtottuk végre.
HU 227 217 Β1
1. táblázat
Az egéreredetű 2H7-antitest komplementaritást meghatározó régióinak humán antitestvázba (pVX4plazmidban) történő behelyettesítésére alkalmazott oligonukleotidszekvenciák (az egyes oligonukleotidok által megváltoztatott aminosavaknak megfelelő bázisokat aláhúzással jelöltük)
Szubsztitúció Oligonukleotidszekvencia
CDR-H1 C TAC ACC TTC ACG AGC TAT AAC ATG CAC TGG GTC CG (27. azonosító számú szekvencia)
CDR-H2A G ATT AAT CCT GAC AAC GGC GAC ACG AGC TAT AAC CAG AAG TTC AAG GGC CG (28. azonosító számú szekvencia)
CDR-H2B GAA TGG GTT GCA GCG ATC IÁI CCT GGC AAC GGC GAC AC (29. azonosító számú szekvencia)
CDR-H3 AT TAT TGT GCT CGA GTG GTC TAC TAT AGC AAC AGC TAC TGG
TAC TTC GAC GTC TGG GGT CAA GGA (30. azonosító számú szekvencia)
CDR-L1 C TGC ACA GCC AGC TCT TCT GIC AGC TAT ATG CAT TG (31. azonosító számú szekvencia)
CDR-L2 AA CTA CTG ATT TAC GCT CCA TCG AAC CTC GCG TCT GGA GTC C (32. azonosító számú szekvencia)
CDR-L3 TAT TAC TGT CAA CAG TGG AGC TTC AAT CCG CCC ACA TTT GGA CAG (33. azonosító számú szekvencia)
A humanizált konstrukciókkal történő összehasonlítás céljából, szintetikus oligonukleotidok alkalmazásával végzett helyspecifikus mutagenezissel kimerikus (egéreredetű VL- és VH-domént, illetve humán CL- és CH-domént tartalmazó) 2H7-Fab fragmenst kódoló plazmidot hoztunk létre. Az így előállított plazmidkonstrukció szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. Ez a plazmid a kimerikus 2H7.v6.8 Fab fragmens expresszáltatására alkalmazható. Az Fab mindkét lánca tartalmaz egy 23 aminosavas Stíl szekréciós szignálszekvenciát, melyet a pVX4 bemutatásánál fentebb említettünk (2. ábra).
Az egéreredetű 2H7-antitest vázalkotó aminosavainak humán VKI, VHIII konszenzus vázszekvenciával (1A. és 1B. ábra), illetve korábban humanizált antitestekkel [Carter és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992)] történő összehasonlítása alapján a 2H7.v2-Fab-konstrukcióba - helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával - több vázalkotó aminosavat érintő mutációt iktattunk be. Ezen mutációk eredményeként bizonyos humán konszenzus vázalkotó aminosavakat - a CDR-régiók konformációját vagy az antigénnel való érintkezést befolyásoló pozíciókban egéreredetű 2H7-vázra jellemző aminosavakkal helyettesítettünk. A 3. 2H7-változat (2H7.v3) VH(R71V,
N73K) szubsztitúciókat; a 4. változat VH(R71V) szubsztitúciót; az 5. változat VH(R71V, N73K) és VJL46P) szubsztitúciókat; míg a 6. változat VH(R71V, N73K) és Vl(L46P, L47W) szubsztitúciókat tartalmazott.
Az egéreredetű 2H7-antitest humanizált és kimerikus Fab-változatait az alábbiak szerint, E. co//-sejtekben termeltettük és tisztítottuk. Kettős szálú és egyszálú DNS előállítása céljából a plazmidokkal E. coli „XL-1 Blue” törzset (Stratagene; San Diego, CA) transzformáltunk. Mindegyik változatnál mind a könnyű, mind a nehéz láncot teljes hosszában megszekvenáltuk (didezoxinukleotidos módszerrel; Sequenase, U. S. Biochemical Corp.). A plazmidokkal E. coli 16C9-törzset (amely az MM294 származéka) transzformáltunk, majd a sejteket 5 pg/mL karbenicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztettük, és a protein termelésére kiválasztottunk egy telepet. Ezt a telepet 100 pg/mL karbenicillint tartalmazó 5 mL LB-tápközegben 37 °C-on 5-8 óra hosszat növesztettük. Az 5 mL térfogatú tenyészetet 100 pg/mL karbenicillint tartalmazó 500 mL AP5-tápközeghez adtuk, és terelőlemezzel ellátott 4 literes rázólombikban 37 °C-on 16 óra hosszat tenyésztettük. Az AP5-tápközeg összetétele a következő: 1 liter vízben 1,5 g glükóz; 11,0 Hycase SF; 0,6 g élesztőkivonat (hitelesített); 0,19 g vízmentes magnézium-szulfát; 1,07 g ammónium-klorid; 3,73 g kálium-klorid; 1,2 g nátrium-klorid; 120 mL 1 M trietanol-amin; pH=7,4. A tápközeget 0,1 pm-es Sealkeenfilteren végzett szűréssel sterilizáltuk.
A tenyésztést követően a sejteket 1 literes centrifugáló palackban (Nalgene) 3000xg-vel centrifugálva összegyűjtöttük, a felülúszót eltávolítottuk, majd egy órás fagyasztás után a sejtüledéket 25 mL térfogatú hideg „A” pufferben (10 mM MES+10 mM EDTA, pH=5,0) újraszuszpendáltuk. A sejtszuszpenzióhoz a proteolízis gátlása céljából 250 pL 0,1 M PMSF-et (Sigma), a baktériumsejtfal lebontásának elősegítése érdekében pedig 3,5 mL 10 mg/mL koncentrációjú tyúktojásfehérje-lizozimot (Sigma) adtunk. Jeges fürdőben végzett egy órás óvatos keverés után a mintát 40 000xg-vel 15 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót „A” pufferrel 50 mL-re egészítettük ki és - „A” pufferrel ekviIibrált - 2 mL-es DEAE-oszlopra vittük fel. Az átfolyófrakciót - ugyancsak „A” pufferrel ekvilibrált - protein-G/Sepharose-CL-4B (Pharmacia) oszlopra (0,5 mL ágytérfogat) töltöttük. Ezután az oszlopot 10 mL „A” pufferrel átmostuk és 3 mL 0,3 M glicinnel (pH=3,0) 1,25 mL 1 M Tris-pufferbe (pH=8,0) eluáltuk. Ezt követően az F(ab) fragmenst Centricon-30 (Amicon) alkalmazásával, puffercserével foszfátpufferelt sóoldatba (PBS) vittük át és 0,5 mL végtérfogatra töményítettük. Az egyes F(ab)-változatok tisztaságának megállapítása céljából mindegyik F(ab) fragmenst SDS-PAGE-analízisnek vetettük alá, és molekulatömegüket elektroporlasztásos tömegspektrometriával ellenőriztük.
Sejtes alapú ELISA-tesztekben a Fab fragmensek (köztük a kimerikus 2H7-Fab) CD20-hoz történő kötődését nehéz kimutatni, ezért a 2H7-Fab-változatokat 33
HU 227 217 Β1 tesztelés és további mutagenezis céljából - teljes hosszúságú lgG1-antitestekké alakítottuk át.
A teljes hosszúságú IgG-k expresszáltatására alkalmas plazmidok létrehozása céljából a kimerikus 2H7 (v6.8) Fab, illetve a humanizált Fab-változatok (v2-töl v6-ig) VL és VH doménjeit emlöseredetű sejtekben történő expresszáltatásra alkalmas pRK-vektorokba [lásd Gorman és munkatársai: DNA Prot. Eng. Tech. 2, 3 (1990)] szubklónoztuk. Röviden összefoglalva: mindegyik Fab-konstrukciót EcoRV- és Blpl-endonukleázzal emésztettük, s az így kihasított VL-fragmenst - a teljes könnyű lánc (VL-CL domének) expresszáltatása céljából - pDR1-plazmid (4. ábra) EcoRV-és Blpl-helye közé klónoztuk. Ezenfelül, a Fabkonstrukciókat Pvull- és Apal-endonukleázzal is emésztettük, s az így kihasított VH-fragmenst - a teljes nehéz lánc (VH-CH1-csukló-CH2-CH3 domének) expresszáltatása érdekében - a pDR2-plazmid (5. ábra) pvull- és Apai-helye közé klónoztuk. Mindegyik IgGváltozat esetében átmeneti transzfekciókat végeztünk, melyek során adenovírussal transzformált humán embrionális 293-vesesejteket egy könnyű láncot expresszáló plazmiddal és egy nehéz láncot expresszáló plazmiddal együttesen [Graham és munkatársai: J. Gén. Virol 36, 59 (1977)] transzformáltunk. A 293-sejteket a transzfekciót megelőző napon szétosztottuk és szérumtartalmú tápközegbe helyeztük. A következő napon a sejtekhez - kalcium-foszfátos precipitátumként előállított - kettős szálú DNS-t, majd pAdVAntage™ DNS-t (Promega, Madison, Wl) adtunk, és a sejteket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk. A sejteket szérummentes tápközegben tenyésztettük és négy nap elteltével összegyűjtöttük. Az antitesteket a tenyészeti felülúszóból, protein-A/Sepharose-CL-4B oszlop alkalmazásával tisztítottuk, majd puffercserével 10 mM nátrium-szukcinát és 140 mM NaCI összetételű pufferbe (pH=6,0) vittük át, és Centricon-10 (Amicon) alkalmazásával betöményítettük. A proteinkoncentrációkat kvantitatív aminosavanalízissel határoztuk meg.
A CD20-antigénre vonatkozó relatív kötési affinitás meghatározása céljából sejtes alapú ELISA-tesztet fejlesztettünk ki. Humán B-limfoblasztoid WIL2-S-sejteket (ATCC CRL 8885; American Type Culture Collection, Rockville, MD) RPMI-1640-tápközegben [melyet 2 mM L-glutaminnal, 20 mM HEPES-sel (pH=7,2) és 10% hőinaktivált magzati borjúszérummal (FBS) egészítettünk ki] 5% CO2-ot tartalmazó párásított atmoszférában szaporítottunk. A sejteket 1% magzati borjúszérumot tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal (tesztelőpuffer) leöblítettük és 250-300 000 sejt/üreg mennyiségben 96 üregű, gömbölyű aljú tálcákra (Nunc, Roskilde, Dánia) helyeztük. A tálcákhoz tesztelőpufferben standard antitest kétszeres hígításokkal készített sorozathígításait (15,6-1000 ng/mL 2H7 v6.8 kimerikus IgG) és a minták háromszoros hígításokkal készített sorozathígításait (2,7-2000 ng/mL) adtuk, majd a tálcákat jéggel lefedve 45 percig inkubáltuk. A tálcák üregeihez a nem kötődött antitest eltávolítása érdekében 0,1 mL tesztelőpuffert adtunk. A tálcákat centrifugáltuk, a felülúszókat eltávolítottuk, és az üregekben maradt sejteket
0,2 mL tesztelőpufferrel kétszer leöblítettük. A tálcákhoz kötődött antitestek detektálása érdekében a tálcákhoz peroxidázzal konjugált kecske antihumán Fc-antitestet (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) adtunk. 45 perces inkubálás után a sejteket a fentiek szerint ismét leöblítettük. A tálcákhoz TMB-szubsztrátot (3,3’, 5,5’-tetrametil-benzidin; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) adtunk, majd a reakciót 1 M foszforsav hozzáadásával leállítottuk. A titrálási görbék illesztéséhez négy paraméteres, nem lineáris regressziós görbeközelítési programot („KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA) alkalmaztunk. A titrálási görbe felezőpontjánál meghatároztuk az abszorbanciát (mid-OD), illetve a standard antitest ennek megfelelő koncentrációját, majd ennél a mid-OD értéknél meghatároztuk mindegyik változat koncentrációját. A standard antitest koncentrációját elosztottuk az egyes változatok koncentrációjával, miáltal a kapott értékek az egyes változatok kötődésének standard antitesthez viszonyított arányát mutatják. A relatív affinitás (egyenérték-koncentráció) szórása az egyes kísérletek között általában ±10% volt.
Ahogy a 2. táblázatban látható, a CDR-cserés (v.2) változat CD20-kötő affinitása a kimerikus 2H7(v.6.8) standardhoz viszonyítva sokkal kisebbnek bizonyult, azonban a 3-tól 6-ig terjedő változatok javított kötődési affinitásúak voltak. A kötési affinitás kimerikus 2H7-antitestéhez történő visszaállításához szükséges mutációk minimális számának megállapítása céljából helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával - további mutációkat és mutációkombinációkat hoztunk létre, melyek eredményeként a 7-17. változatokhoz jutottunk (lásd a 2. táblázatot). Közelebbről, ezek a mutációk a VH-domén A49G, F67A, I69L, N73K és L78A mutációi, illetve a VL-domén M4L, M33I és F71Y mutációi voltak. A legjobb relatív kötési affinitást a 16. és 17. változatnál kaptuk; a kimerikus változat kötési affinitásának kétszeresén belüli értékkel. E két változat eredménye között szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk (szórás=±10%). A mutációk számának minimálisra csökkentése érdekében humanizált antitestként további karakterizálásra a 16. változatot választottuk ki, amelyben a humán vázalkotó aminosavak közül csak négy lett egéreredetű antitest vázalkotó aminosavaira cserélve (lásd a 3. táblázatot).
2. táblázat
Humanizált 2H7 IgG-változatok CD20-antigénre vonatkozó relatív kötési affinitása kimerikus 2H7antitestéhez viszonyítva (sejtalapú ELISA-teszttel végzett meghatározás alapján)*
2H7- változat Nehéz lánc (VH) szubsztitúciók Könnyű lánc (VL) szubsztitúciók Relatív kötődés
6.8 (kiméra) (kiméra) 1
2 (CDR-csere) (CDR-csere) 0,01
3 R71V, N73K (CDR-csere) 0,21
4 R71V (CDR-csere) 0,21
HU 227 217 Β1
2. táblázat (folytatás)
2H7- változat Nehéz lánc (VH) szubsztitúciók Könnyű lánc (VL) szubsztitúciók Relatív kötődés
5 R71V, N73K L46P 0,50
6 R71V, N73K L46P, L47W 0,58
7 R71V L46P 0,33
8 R71V, L78A L46P 0,19
9 R71V, F67A L46P 0,07
10 R71V, F67A, I69L L46P 0,12
11 R71V, F67A, L78A L46P 0,19
12 R71V L46P, M4L 0,32
13 R71V L46P, M33I 0,31
14 R71V L46P, F71Y 0,25
15 R71V L46P, M4L, M33I 0,26
16 R71V, N73K, A49G L46P 0,65
17 R71V, N73K, A49G L46P, L47W 0,67
* A relatív kötődést a kimerikus 2H7-antitest és a vizsgált antitestváltozat egyenértékű kötődéshez szükséges koncentrációinak arányaként fejeztük ki (vagyis az egynél kisebb arány a vizsgált változat gyengébb affinitását jelzi). A relatív affinitás meghatározása során a szórás átlagosan ±10% volt. A variábilis doménben a vázalkotó aminosavakat érintő szubsztitúciókat a CDR-cserés változat aminosavszekvenciájára vonatkoztatva adtuk meg [Kábát és munkatársai számozási rendszerének (lásd fentebb) felhasználásával],
3. táblázat
A2H7.v16-változat VH-mutáció (A49G, R71V, N73K) és VL-mutációja (L46P) létrehozására alkalmazott oligonukleotidszekvenciák*
Szubsztitúció Oligonukleotidszekvencia
VH (R71V, N73K) GT TTC ACT ATA AGT GTG GAC AAG TCC AAA AAC ACA TT (34. azonosító számú szekvencia)
VH (A49G) GCCAGGATAGATGGCGC- CAACCCATTCCAGGCC (35. azonosító számú szekvencia)
VL (L46P) AAGCTCCGAAACCACTGATTTACGCT (36. azonosító számú szekvencia)
* A behelyettesített aminosavakat kódoló kodonokat aláhúzással jelöltük. A VH (R71V, N73K) és a VL (L46P) esetében az oligonukleotidokat szensz szálként mutatjuk be, mivel a Fabtemplát mutageneziséhez ezeket használtuk. Ugyanakkor, a VH (A49G) esetében az antiszensz szál oligonukleotid látható, mivel a pRK (IgG nehéz lánc) templáttal ezt használtuk.
A 16-os változat (v16) aminosavszekvenciáját a 6. és 7. ábrán mutatjuk be.
2. példa
A 2H7-antitest antigénkötő determinánsai (paratop)
A 2H7.v16- és 2H7.v17-változatban alaninszubsztitúciókat [lásd Cunninghana és Wells: Science 244, 1081 (1989)] hoztunk létre, hogy teszteljük az antitest különböző oldalláncainak CD20-hoz történő kötődésben játszott szerepét. Az IgG-változatokat 293-sejtekben pDR1-, illetve pDR2-vektorból expresszáltattuk, majd a fentebb leírtak szerint tisztítottuk és vizsgáltuk relatív kötési affinitásukat. Több alaninszubsztitúció csökkentette a WIL-2S-sejteken lévő CD20-hoz történő relatív kötődést (lásd a 4. táblázatot).
[A 4. táblázatban a relatív kötődést a kiindulási 2H7.v16-antitest és a vizsgált antitestváltozat egyenértékű kötődéshez szükséges koncentrációinak arányaként fejeztük ki (az egynél kisebb arány a vizsgált változat gyengébb affinitását, míg az egynél nagyobb arány a vizsgált változat nagyobb affinitását jelzi). A relatív affinitás meghatározása során a szórás átlagosan ±10% volt. A variábilis doménben a vázalkotó aminosavakat érintő szubsztitúciókat a 2H7.v16-változat aminosavszekvenciájára vonatkoztatva adtuk meg, Kábát és munkatársai számozási rendszerének (lásd fentebb) felhasználásával].
4. táblázat
A humanizált 2H7.v16-antitest CDR-régióiban végrehajtott alaninszubsztitúciók sejtalapú ELISAteszttel (WIL2-S-sejtek alkalmazásával) meghatározott hatásai
2H7-vál- tozat CDR-pozíció Nehéz lánc szubszti- túciók Könnyű lánc szubszti- túciók Relatív kötődés
16 - - - 1
140 H1 G26A - 0,63
141 H1 Y27A - 0,47
34 H1 T28A - 0,86
35 H1 F29A - 0,07
36 H1 T30A - 0,81
37 H1 S31A - 0,97
142 H1 Y32A - 0,63
143 H1 N33A - NDK*
144 H1 M34A - 1,2
145 H1 H35A - <0,25
146 H2 A50G - 0,31
147 H2 I51A - 0,65
38 H2 Y52A - 0,01
148 H2 P52aA - 0,66
39 H2 G53A - 0,89
67 H2 N54A - 1,4
40 H2 G55A - 0,79
41 H2 D56A - 2,0
89 H2 T57A - 0,61
HU 227 217 Β1
4. táblázat (folytatás)
2H7-vál- tozat CDR-po- zíció Nehéz lánc szubszti- túciók Könnyű lánc szubszti- túciók Relatív kötődés
90 H2 S58A - 0,92
91 H2 Y59A - 0,74
92 H2 N60A - 0,80
93 H2 Q61A - 0,83
94 H2 K62A - 0,44
95 H2 F63A - 0,51
83 H2 V71A - 0,96
149 H2 K64A - 0,82
150 H2 G65A - 1,2
153 H3 V95A - 0,89
42 H3 V96A - 0,98
43 H3 Y97A - 0,63
44 H3 Y98A - 0,40
45 H3 S99A - 0,84; 0,92
46 H3 N100A - 0,81
47 H3 S100aA - 0,85
48 H3 Y100bA - 0,78
49 H3 W100cA - 0,02
59 H3 Y100dA - 0,98
60 H3 F100eA - NDK*
61 H3 D101A - 0,31
151 H3 V102A - 1,1
117 L1 - R24A 0,85
118 L1 - A25G 0,86
119 L1 - S26A 0,98
120 L1 - S27A 0,98
121 L1 - S28A 1,0
122 L1 - V29A 0,41
50 L1 - S30A 0,96
51 L1 - Y32A 1,0
123 L1 - M33A 1,0
124 L1 - H34A 0,21
125 L2 - A50G 0,92
126 L2 - P51A 0,88
52 L2 - S52A 0,80
53 L2 - N53A 0,76
54 L2 - L54A 0,60
127 L2 - A55G 1,1
128 L2 - S56A 1,1
129 L3 - Q89A 0,46
130 L3 - Q90A <0,22
55 L2 - W91A 0,88
2H7-vál- tozat CDR-pozíció Nehéz lánc szubszti- túciók Könnyű lánc szubszti- túciók Relatív kötődés
56 L3 - S92A 1,1
57 L3 - F93A 0,36
58 L3 - N94A 0,61
131 L3 - P95A NDK*
132 L3 - P96A 0,18
133 L3 - T97A <0,22
* NDK jelentése: nincs detektálható kötődés.
A 45-ös változatra kapott két relatív kötődési érték két független kísérletből származik.
3. példa
A 2H7-CDR-régiókon belül végrehajtott további mutációk
Az alaninpásztázással lényegesként azonosított CDR-pozíciókban további aminosavak szubsztitúcióit, illetve azok kombinációit teszteltük. Több kombinált változat is (különösen a v96) nagyobb kötési affinitást mutatott, mint a kiindulási 2H7.v16-antitest. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.
[Az 5. táblázatban a CD20-hoz történő relatív kötődést a kiindulási 2H7.v16-antitest és a vizsgált antitestváltozat egyenértékű kötődéshez szükséges koncentrációinak arányaként fejeztük ki (az egynél kisebb arány a vizsgált változat gyengébb affinitását, míg az egynél nagyobb arány a vizsgált változat nagyobb affinitását jelzi). A relatív affinitás meghatározása során a szórás átlagosan ±10% volt. A variábilis doménben a vázalkotó aminosavakat érintő szubsztitúciókat a 2H7.v16-változat aminosavszekvenciájára vonatkoztatva adtuk meg, Kábát és munkatársai számozási rendszerének (lásd fentebb) felhasználásával],
5. táblázat
A humanizált 2H7.v16-antitest CDR-régióiban végrehajtott mutációkombinációk, illetve a nem alaninos szubsztitúciók hatásainak sejtalapú ELISAteszttel (WIL2-S-sejtek alkalmazásával) végzett vizsgálatának eredménye
2H7- változat Nehéz lánc szubsztitúciók Könnyű lánc szubsztitúciók Relatív kötődés
16 - - 1
96 D56A, N100A S92A 3,5
97 S99T, N100G, Y100bl - 0,99
98 S99G, N100S, Y100bl - 1,6
99 N100G, Y100bl - 0,80
101 N54S, D56A - 1,7
102 N54K, D56A - 0,48
103 D56A, N100A - 2,1
HU 227 217 Β1
5. táblázat (folytatás)
2H7- változat Nehéz lánc szubsztitúciók Könnyű lánc szubsztitúciók Relatív kötődés
104 S99T, N100G - 0,81
105 S99G, N100S - 1,1
106 N100G - ~1
167 S100aG, Y100bS -
136 D56A, N100A S56A, S92A 2,6
137 D56A, N100A A55G, S92A 2,1
156 D56A, N100A S26A, S56A, S92A 2,1
107 D56A, N100A, YlOObl S92A nem exp- resszál- tattuk
182 Y27W -
183 Y27F -
184 F29Y -
185 F29W -
186 Y32F -
187 Y32W -
188 N33Q -
189 N33D -
190 N33Y -
191 N33S -
208 H35S -
209 A50S -
210 A50R -
211 A50V -
212 A50L -
168 Y52W -
169 Y52F - 0,75
170 N54D - 0,25
171 N54S - 1,2
172 D56K - 1
173 D56R -
174 D56H - 1,5
175 D56E - 1,2
213 D56S -
214 D56G -
215 D56N -
216 D56Y -
176 Y59W -
177 Y59F -
180 K62R -
181 K62D -
178 F63W -
179 F63Y -
2H7- változat Nehéz lánc szubsztitúciók Könnyű lánc szubsztitúciók Relatív kötődés
157 Y97W - 0,64
158 Y97F - 1,2
159 Y98W - 0,64
160 Y98F - 0,88
106 N100G -
161 W100cY - 0,05
162 W100cF - 0,27
163 F100eY - 0,59
164 F100eW - 0,71
165 D101N - 0,64
166 S99G, N100G, S100aD, Y100b deletálva 0,99
217 V102Y - 1,0
207 - H34Y
192 - Q89E
193 - Q89N
194 - Q90E
195 - Q90N
196 - W91Y
197 - W91F
205 - S92N
206 - S92G
198 - F93Y
199 - F93W
204 - F93S, N94Y
200 - P96L
201 - P96Y
202 - P96W
203 - P96R
4. példa
A vázrégió humanizálása során szubsztituált pozíciókban végrehajtott további mutációk
A humanizálás során módosított vázrégió-pozíciókban további aminosavszubsztitúciókat hajtottunk végre, s az így kapott változatokat 2H7.v6-háttérben teszteltük. Közelebbről, olyan alternatív vázrégiószubsztitúciókat teszteltünk, amelyek sem az eredeti, egéreredetű 2H7-antitestben, sem a humán konszenzus antitestvázban nem találhatók meg. Ezek a pozíciók a következők voltak: VL(P46), illetve VH(G49, V71 és K73).
E szubsztitúciók rendszerint csak kevéssé módosították a relatív kötődést (lásd a 6. táblázatot), ami arra utal, hogy az antitestváz e pozícióiban bizonyos szintű rugalmasság tapasztalható. A 6. táblázatban a 2H7.v16-háttérre vonatkoztatott mutációkat hordozó IgG-változatok eredményei láthatók.
HU 227 217 Β1 [A relatív kötődést a 2H7.v6.8-kiméra és a vizsgált antitestváltozat egyenértékű kötődéshez szükséges koncentrációinak arányaként fejeztük ki (az egynél kisebb arány a vizsgált változat gyengébb affinitását, míg az egynél nagyobb arány a vizsgált változat nagyobb affinitását jelzi). A relatív affinitás meghatározása során a szórás átlagosan ±10% volt. A variábilis doménekben a vázalkotó aminosavakat érintő szubsztitúciókat a 2H7.v16-változat aminosavszekvenciájára vonatkoztatva adtuk meg, Kábát és munkatársai számozási rendszerének (lásd fentebb) felhasználásával].
6. táblázat
Az antitestvázban végrehajtott szubsztitúciók relatív kötődésre gyakorolt hatásának vizsgálata sejtalapú (WIL2-S) ELISA-tesztben
2H7- változat Nehéz lánc szubsztitúciók Könnyű lánc szubsztitúciók Relatív kötődés
6.8 (kiméra) (kiméra) 1
16 - - 0,64
78 K73R - 0,72
79 K73H - 0,49
80 K73Q - 0,58
81 V71I - 0,42
82 V71T - 0,58
83 V71A -
84 G49S - 0,32
85 G49L -
86 - P46E 0,22
87 - P46V 0,51
88 - P46T
108 G49A, V71T, K73R S92A, M32L, P46T 0,026*
109 G49A, A49G, V71T, K73R S92A, M32L, P46T 0,026*
110 K73R, D56A, N100A S92A, M32L nem exp.**
111 G49A, V71T, K73R - 0,46*
112 G49A, A50G, V71T, K73R - 0,12*
* Összehasonlító standardként a 2H7.v16-antitesttel tesztelt változatok; a relatív értékeket a kiméra eredményére normalizáltuk.
** Nem expresszáltattuk.
5. példa
Megnövelt effektorfunkciójú humanizált 2H7változatok
Mivel a 2H7-antitest a B-sejtek lízisét komplementdependens citotoxicitási (CDC) és antitestdependens celluláris citotoxicitási (ADCC) aktivitásával egyaránt képes közvetíteni, a humanizált 2H7.v16-antitest olyan változatait kíséreltük meg létrehozni, amelyek javított CDC- és ADCC-aktivitás kifejtésére képesek. Más antitestek Fc-régióiban bizonyos aminosavakat érintő olyan mutációkat ismertettek, amelyek a C1q komplementkomponenshez történő kötődés javítása révén - fokozzák a CDC-aktivitást [lásd Idusogie és munkatársai: J. Immunoi. 166, 2571 (2001)]. Ezenfelül, leírtak olyan mutációkat is, amelyek - aktiváló Fcy-receptorokhoz történő javított IgG-kötődés és gátlóhatású Fcy-receptorokhoz történő csökkentett IgG-kötődés következtében - javítják az ADCC-aktivitást [lásd Shields és munkatársai: J. Bioi. Chem. 276, 6591 (2001); Presta és munkatársai: Biochem. Soc. Trans. 30, 487 (2002)]. A CDC- és ADCC-aktivitás javítására konkrétan három mutációt találtak alkalmasnak: S298A/E333A/K334A (más néven tripla Ala-mutáns vagy -változat); az Fc-régió aminosavainak számozását a Kábát és munkatársai (lásd fentebb) által leírt EU-számozási rendszer szerint használva [lásd Idusogie és munkatársai: J. Immunoi. 166, 2571 (2001); Shields és munkatársai: J. Bioi. Chem. 276, 6591 (2001)].
A 2H7-antitest CDC- és ADCC-aktivitásának növelése céljából a 2H7-antitest Fc-régiójának tripla Alamutánsát hoztuk létre. Korábban előállítottuk az antiHER2 4d5-antitest tripla-Ala mutáns (S298A/E333A/K334A) humanizált változatát, amely 4D5Fc110 néven ismeretes [anti-p185HER2 lgG1(S298A/E333A/K334A); lásd Shields és munkatársai fentebb idézett cikkét]. A 4D5Fc110-antitestet kódoló p4D5Dc110plazmidot (Shields és munkatársai, lásd fentebb) Apalés Hindlll-endonukleázokkal emésztettük, majd az Fc-fragmenst (amely az S298A/E333A/K334A mutációkat tartalmazza) a 2H7-antitest nehéz láncát kódoló pDR2-v16-vektor Apal/HindlII-helyei közé ligáltuk, miáltal a pDR-v31-plazmidot kaptuk. A 31-es változat teljes H-láncának aminosavszekvenciáját a 8. ábrán mutatjuk be (az L-lánc azonos a v16-változatéval).
Bár az lgG1-antitestek Fc-régiójának konstans doménjei egy adott fajon belül viszonylag állandók (konzerváltak), léteznek allélváltozatok [áttekintésüket lásd Lafranc és Lefranc: in „The humán IgG subclasses: Molecular Analysis of Structure, Function and Regulation”, 43-78. oldal, szerk.: F. Shakib, Pergammon Press, Oxford (1990)].
Az Fc-régióban végrehajtott szubsztitúciók CD20kötődésre gyakorolt hatásait a 7. táblázatban foglaljuk össze.
[A CD20-hoz történő relatív kötődés mértékét az antitestváz-szubsztitúciók sejtalapú (WIL2-S) tesztjével határoztuk meg. A 7. táblázatban a 2H7.v16-háttérre vonatkoztatott mutációkat hordozó IgG-változatok eredményei láthatók. A relatív kötődést a 2H7.v6.8-kiméra és a vizsgált antitestváltozat egyenértékű kötődéshez szükséges koncentrációinak arányaként fejeztük ki (az egynél kisebb arány a vizsgált változat gyengébb affinitását jelzi). A relatív affinitás meghatározása során a szórás átlagosan ±10% volt.]
HU 227 217 Β1
7. táblázat
Az Fc-régióban végrehajtott szubsztitúciók CD20kötődésre gyakorolt hatásai
2H7-változat Fc-szubsztitú- ciók* Relatív kötődés
6.8 - 1
16 - 0,65
31 S298A, E333A, K334A 0,62
* Az Fc-mutációk pozícióit az EU-számozás szerint (Kábát és munkatársai, lásd fentebb), a kiindulási 2H7.v16-antitest aminosavaira vonatkoztatva adtuk meg. A 31-es változat (v31) Fc-régiójában a három Ala-szubsztitúció kombinációját „Fc110”-nek nevezzük.
6. példa
Megnövelt stabilitású humanizált 2H7-változatok
Terápiás hatású proteinek kifejlesztéséhez olyan változatok kiválasztására van szükség, amelyek megfelelő pufferben stabilak maradnak az oxidációval, dezaminálódással és egyéb, a termék minőségét érintő folyamatokkal szemben. A 2H7.v16-változatban több olyan aminosavat is azonosítottunk, amelyek a stabilitás szempontjából gyenge pontok lehetnek. Ezek a VL (M32), illetve a VH (M34, N100) pozíciók.
Ennek megfelelően, a v16-változattal történő összehasonlítás céljából e pozíciókban mutációkat hoztunk létre. A 8. táblázatban a stabilitás és/vagy az effektorfunkció fokozására tervezett 2H7-változatok sejtalapú (WIL2-S) teszttel meghatározott relatív CD20-kötési eredményeit mutatjuk be. A táblázatban a 2H7.v16-háttérre vonatkoztatott mutációkat hordozó IgG-változatok eredményei láthatók. A relatív kötődést a 2H7.v6.8-kiméra és a vizsgált antitestváltozat egyenértékű kötődéshez szükséges koncentrációinak arányaként fejeztük ki (az egynél kisebb arány a vizsgált változat gyengébb affinitását jelzi). A relatív affinitás meghatározása során a szórás átlagosan ±10% volt. A variábilis doménekben a vázalkotó aminosavakat érintő szubsztitúciókat a kiindulási 2H7.v16-antitestre vonatkoztatva, a Kabat-féle számozási rendszer szerint, az Fc-mutációk pozícióit az EU-számozás szerint adtuk meg (Kábát és munkatársai, lásd fentebb).
Az effektorfunkciók módosítása vagy növelése céljából, korábban leírt mutációk alapján [lásd Idusogie és munkatársai (2000), Idusogie és munkatársai (2001) és Shields és munkatársai (2001], a stabilitást, illetve az affinitást növelő mutációkkal további Fc-mutációkat kombináltunk. E módosítások a következők: S298, E333A, K334A (5. példa); K322A (CDC-aktivitás csökkentése); D265A (ADCC-aktivitás csökkentése); K326A vagy K326W (CDC-aktivitás növelése); E356D/M358L (az Fc-régióban végrehajtott allotipikus módosítások tesztelésére). E mutációk egyike sem eredményezte a CD20-kötő aktivitás jelentős mértékű megváltozását.
8. táblázat
A stabilitás és/vagy az effektorfunkció növelésére tervezett 2H7-változatok sejtalapú (WIL2-S) teszttel meghatározott relatív CD20-kötési eredményei
2H7- változat Nehéz lánc (VH) mutációk Könnyű lánc (VL) mutációk Fc-mutá- ciók* Relatív kötődés
6.8 (kiméra) (kiméra) - 1
16 - - - 0,65
62 - M32I - 0,46
63 M34I - - 0,49
64 N100A - -
65 N100A L47W - 0,74
66 S99A L47W - 0,62
67 N54A - -
68 - M32I - 0,48
69 - M32L - 0,52
70 N100A S298A, E333A, K334A 0,80
71 N100D S298A, E333A, K334A 0,44
72 N100A M32I - 0,58
73 N100A M32L - 0,53
74 N100A M32I S298A, E333A, K334A 0,61
75 N100A M32L S298A, E333A, K334A 0,60
113 - - E356D, M358L 0,60“
114 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A 1 2**
115 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, E356D, M358L 1 4**
116 D56A, N100A M32L, S92A S298A, K334A, K322A 1 2**
134 D56A, N100A M32L, S92A E356D, M358L, D265A 1,5“
135 D56A, N100A M32L, S92A E356D, M358L, D265A, K326W 0,95“
138 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A 1 2**
HU 227 217 Β1
8. táblázat (folytatás)
2H7- változat Nehéz lánc (VH) mutációk Könnyű lánc (VL) mutációk Fc-mutá- ciók* Relatív kötődés
139 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A, E356N, M358L 1 1 isis
154 - - D265A 0,70“
155 S298A, K322A, K334A 0,70“
* az Fc-mutációk pozícióit az EU-számozás szerint adtuk meg (Kábát és munkatársai, lásd fentebb);
** összehasonlító standardként a 2H7.v16-antitesttel tesztelt változatok; a relatív értékeket a kiméra eredményére normalizáltuk.
A stabilitási mutációknak a protein bomlási sebességére gyakorolt hatásának vizsgálata céljából a 2H7.v16és 2H7.v73-antitestet 10 mM hisztidin, 6% szacharóz és 0,02% poliszorbát-20 (pH=5,8) összetételű oldatban folyadékkészítménybe foglaltuk (12-14 mg/mL antitestkoncentráció), és a mintákat 16 napig 40 °C-on inkubáltuk. Az inkubált mintákat ioncserélő kromatográfiával a töltésváltozatokban bekövetkezett változásokra; méretszelekciós kromatográfiával az aggregációra és fragmentálódásra; és sejtalapú (WIL2-S) teszttel relatív kötődésre vizsgáltuk.
Eredményeink (lásd a 9. ábrát) azt mutatják, hogy gyorsított stabilitási feltételek mellett a 2H.v73-változat - az ioncserélő kromatográfiával kapott fő csúcs frakciójában bekövetkező csökkenés vonatkozásában nagyobb stabilitású, mint a 2H.v16-változat. Az aggregáció, fragmentáció és kötési affinitás tekintetében jelentős különbségeket nem tapasztaltunk.
7. példa
Az antitestek WIL2-S-sejteken elhelyezkedő
CD20-hoz történő kötődésének Scatchardanalízise
A 2H7-lgG-változatok WIL2-S-sejtekhez történő kötődésére - radioaktív izotóppal jelölt 2H7-lgG alkalmazásával - egyensúlyi disszóciációs állandókat (Kd) határoztunk meg. Az IgG-változatokat CHO-sejtekben termeltettük. A humanizált antitestváltozatokkal történő összehasonlításra Rituxan®-t (valamennyi kísérlethez a Genentechtől; San Francisco, CA) és egéreredetű 2H7-antitestet (BD PharMingen, San Diego, CA) alkalmaztunk. Az egéreredetű 2H7-antitest más forgalmazóktól is beszerezhető [például eBioscience és Calbiochem (mindkettő San Diego, CA); Accurate Chemical & Scientific Corp. (Westbury, NY); Ancell (Bayport, MN); és Vinci-Biochem (Vinci, Olaszország)]. A hígítások mindegyikét kötésteszt-pufferben [1% szarvasmarhaszérumalbumint, 25 mM HEPES-t (pH=7,2) és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó DMEM-tápközeg] készítettük. A laktoperoxidázzal jódozott 125l-2H7.v16 aliquotjait (0,025 mL) 0,8 nM koncentrációban V aljú 96 üregű mikrotitertálca üregeibe osztottuk szét, hideg antitest sorozathígításait (0,05 mL) adtuk hozzájuk és az üregek tartalmát összekevertük. Az üregekbe ezután WIL2-S-sejteket (0,025 mL térfogatban 60 000 sejt) adtunk, majd a tálcát lezártuk és 24 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 3500-as percenkénti fordulatszámmal 15 percig centrifugáltuk. A felülúszó leszívása után a sejtüledéket leöblítettük és lecentrifugáltuk. A centrifugálás után kapott felülúszót ismét leszívtuk, majd a sejtüledéket 1 N nátrium-hidroxid-oldatban oldottuk és a gamma-számláláshoz csövekbe helyeztük. Az adatokat - Ligand-program [McPherson: Comput. Programs Biomed. 17, 107 (1983)] alkalmazásával végzett - Schatchard-analízisre [Munson és Rodbard: Anal. Biochem. 107, 220 (1980)]. A 9. táblázatban bemutatott eredmények azt jelzik, hogy a humanizált 2H7-változatok hasonló CD20-kötési affinitást mutattak, mint az egéreredetű 2H7-antitest és a Rituxan®. A fenti, 7. táblázatban látható kötési eredmények alapján várható, hogy a 2H7.v31-változat Kd-értéke nagyon hasonló a v16-változatéhoz.
9. táblázat
2H7-változatok egyensúlyi kötési affinitásának meghatározása Scatchard-analízissei
Antitestváltozat Kd (nM) n
Rituxan 0,99±0,49 3
2H7 (egér) 1,23±0,29 3
2H7.V16 0,84±0,37 4
2H7.v73 1,22±0,39 4
2H7.v75 1,09±0,17 4
8. példa
Komplementdependens citotoxicitási (CDC) teszt
2H7-lgG-változatokat - lényegében Idusogie és munkatársai leírásai [J. Immunoi. 164, 4178 (2000) és J. Immunoi. 166, 2571 (2001)] alapján - CD20-at expresszáló limfoblasztoid B-sejtvonal (WIL2-S) komplementdependens lízisét közvetítő képességükre teszteltünk. Az antitestek 0,1 mg/mL koncentrációjú törzsoldatából 1:3 arányban hígítássorozatot készítettünk. Minden egyes hígítás 0,05 mL-es aliquotját 96 üregű szövettenyésztő tálca - normál humán komplement oldatának (Quidel, San Diego, CA) 0,05 mL-ét tartalmazó - üregeibe helyeztük. Az így kapott elegyhez 50 000 WIL2-S-sejtet adtunk (0,05 mL térfogatban). 37 °C-on végzett két órás inkubálást követően az üregekhez 0,05 mL Alamar-kék oldatot (Accumed International, Westlake, OH) adtunk, és az inkubálást 37 °C-on további 18 óra hosszat folytattuk. A tálcák fedelét eltávolítottuk, majd körpályás keverővei szobahőmérsékleten 15 percig kevertük. 530 nm-es gerjesztési szűrő és 590 nm-es emissziós szűrő alkalmazásával relatív fluoreszcenciaegységeket (RFU) olvastunk le.
HU 227 217 Β1
Az EC50 kiszámításához az RFU-t az egyes antitestek koncentrációjának függvényében ábrázoltuk és „KaleidaGraph” szoftver alkalmazásával görbeillesztést végeztünk.
A 10. táblázatban bemutatott eredmények, meglepő módon, a humanizált 2H7-antitestek komplementdependens citotoxicitást serkentő hatását jelzik. A v73változat relatív aktivitása hasonló a Rituxan®-éhoz; a v75-változat háromszor nagyobb aktivitású, mint a Rituxan®; míg a v16-változat háromszor kisebb aktivitást mutatott, mint a Rituxan®. Az 1-nél nagyobb értékek a tesztelt antitestváltozat kisebb CDC-aktivitását, míg az 1-nél kisebb értékek a tesztelt változat nagyobb CDCaktivitását mutatják (a Rituxan® aktivitásához viszonyítva). Az antitesteket stabil CHO-sejtvonalakkal termeltettük, kivéve a *-gal jelölteket, melyeket átmenetileg transzfektált CHO-sejtek termeltek.
10. táblázat
2H7-antitestváltozatok Rituxan®-hoz viszonyított CDC-aktivitása
Antitestváltozat n EC50 (változat)/EC50 (Rituxan)
Rituxan® 4 1
2H7.V16 4 3,72; 4,08
2H7.V31* 4 2,21
2H7.V73 4 1,05
2H7.V75 4 0,33
2H7.v96* 4 0,956
2H7.v114* 4 0,378
2H7.v115* 4 0,475
2H7.v116* 1 >100
2H7.v135* 2 0,42
9. példa
Antitestdependens celluláris citotoxicitási (ADCC) tesztek
2H7-lgG-változatokat - lényegében Shields és munkatársai [J. Bioi. Chem. 276, 6591 (2001)] leírása szerint, laktát-dehidrogenáz (LDH) leolvasás alkalmazásával - CD20-at expresszáló limfoblasztoid B-sejtvonal (WIL2-S) természetes ölősejtek (NK-sejtek) általi lízisét közvetítő képességükre teszteltük. Az NK-sejteket 100 mL heparinizált vérből (100 mL foszfátpufferelt sóoldattal hígítva) izoláltuk. A vérmintákat-előzetesen FcyRIII-ra [más néven CD16; Koene és munkatársai: Blood 90, 1109 (1997)] izotipizált - egészséges személyektől vettük. Kísérletünkben az NK-sejteket CD16-ra heterozigóta (F158A/158) személyektől származtak. A hígított vért 15 mL limfocitaelválasztó tápközegre (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) rétegeztük és 2000-es percenkénti fordulatszámmal 20 percig centrifugáltuk. A rétegek közötti határfelületen lévő fehérvérsejteket négy tiszta, 50 mL-es csőbe osztottuk szét, melyekbe 15% magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI-tápközeget töltöttünk. A csöveket 1400-as percenkénti fordulatszámmal 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót leöntöttük. A sejtüledéket MACS-pufferben (0,5% szarvasmarha-szérumalbumin, 2 mM EDTA) újraszuszpendáltuk, és az NK-sejteket sejtizoláló gyöngyök (NK-sejt-izoláló reagenskészlet, 130-046-502) alkalmazásával, a gyártó (Miltenyi Biotech.) útmutatásai szerint tisztítottuk. Az NK-sejteket MACS-pufferben hígítottuk (2*10® sejt/mL).
Az antitest tesztelőpufferben [1:1 arányú F12/DMEM, glicin nélkül, 1 mM HEPES-puffer (pH=7,2), penicillin/sztreptomicin (Gibco), glutamin és 1% hőinaktivált magzati borjúszérum] készített sorozathígításait 96 üregű, gömbölyű aljú szövettenyésztő tálcán helyeztük el. A WIL2-S-sejteket tesztelőpufferben hígítottuk (4*105 sejt/mL), és a tálca üregeiben lévő hígított antitesthez adtuk, majd a tálcát - az antitest CD20-hoz történő kötődésének elősegítése érdekében (opszonifikálás) - 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
Az ADCC-reakció beindítása érdekében mindegyik üreghez 0,1 mL NK-sejtszuszpenziót adtunk. A kontroliüregekhez 2% Triton Χ-100-at adtunk. A tálcát 37 °C-on négy óra hosszat inkubáltuk, és a felszabadult LDH mennyiségét citotoxicitás- (LDH) detektáló reagenskészlet (Kit#1644793; Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana) alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint mértük. Mindegyik üreghez 0,1 mL LDH-előhívót adtunk, majd 10 másodperces keverés után a tálcát alufóliával lefedtük és sötétben, szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk. Az inkubálás után 490 nm hullámhossznál leolvastuk az optikai denzitást, és a kapott értéket a kontroliüregekben mért össz-LDH-ra kapott optikai denzitással osztva meghatároztuk a százalékos sejti ízist. A sejti ízist az antitestkoncentráció függvényében ábrázoltuk, és az EC50-koncentrációk meghatározására négy paraméteres görbeillesztést (KaleidaGraph) alkalmaztunk.
A kapott eredmények azt mutatják, hogy a humanizált 2H7-antitestek az ADCC vonatkozásában aktívnak bizonyultak: a v31- és v75-változat relatív aktivitása a Rituxan® aktivitásának 20-szorosa; a v16-változat relatív aktivitása a Rituxan®-énak ötszöröse; míg a v73változaté csaknem négyszerese a Rituxan® aktivitásának.
11. táblázat
A 2H7-antitestek WIL2-S-sejtekre gyakorolt ADCCaktivitása a 2H7.v16-változatéhoz viszonyítva („n” számú kísérlet eredményei alapján)
Antitestváltozat n EC50 (változat)/EC50 (Rituxan)
Rituxan® 4 5,3
2H7.v16 5 1
2H7.v31 1 0,24
2H7.v73 5 1,4
2H7.V75 4 0,25
HU 227 217 Β1 (Az egynél nagyobb értékek a 2H7.v16-változaténál kisebb, míg az egynél kisebb értékek nagyobb ADCC-aktivitást jeleznek).
A 2H7 kombinációs változatainak Rituxan®-nal történő összehasonlítása céljából további ADCC-teszteket végeztünk, melyek eredményei azt jelzik, hogy a 2H7.v114 és a 2H7.v115 több mint tízszer nagyobb ADCC-aktivitású, mint a Rituxan® (lásd a 12. táblázatot).
12. táblázat
A 2H7-antitestek WIL2-S-sejtekre gyakorolt ADCCaktivitása a Rituxan®-éhoz viszonyítva („n” számú kísérlet eredményei alapján)
Antitestváltozat n ECS0 (változat)/EC50 (Rituxan)
Rituxan® 2 1
2H7 v.16 2 0,52
2H7 v.96 2 0,58
2H7.v114 2 0,093
2H7.v115 2 0,083
2H7.V116 2 0,30
(Az egynél nagyobb értékek a Rituxan®-énál kisebb, míg az egynél kisebb értékek a Rituxan®-énál nagyobb ADCC-aktivitást jeleznek.)
10. példa
A 2H7-változatok in vivő hatásai cynomolgus majmokkal végzett előzetes vizsgálatban
A CHO-sejtek átmeneti transzfekciójával termeltetett 2H7-antitestváltozatokat - in vivő aktivitású vizsgálata céljából - normál hím cynomolgus majmokban (Macaca fascicularis) teszteltük. Más anti-CD20 antitestekről - mint például a C2B8-ról (Rituxan®) - normál főemlősökben kimutatták a B-sejtek számát csökkentő („B-sejt-kivonási”) képességüket [lásd Reff és munkatársai: Blood 83, 435 (1994)].
Egyik kísérletünkben humanizált 2H7-változatokat hasonlítottunk össze. Egy párhuzamos kísérletben cynomolgus majmokban a Rituxan®-t is teszteltük. Az öt dóziscsoport mindegyikében négy majmot alkalmaztunk. Az 1. csoportot csak hordozóval; a 2. csoportot 0,05 mg/kg hu2H7.v16-változattal; a 3. csoportot 10 mg/kg hu2H7.v16-változattal; a 4. csoportot 0,05 mg/kg hu2H7.v31-változattal; és az 5. csoportot 10 mg/kg hu2H7.v31-változattal kezeltük. Az antitesteket összesen két dózisban (a kísérlet 1., illetve 8. napján), 0 mg/mL, 0,2 mg/mL vagy 20 mg/mL koncentrációban, intravénásán adtuk be. Az adagolás első napját 1. napnak, az azt megelőző napot -1. napnak tekintjük; a regeneráció első napját (csoportonként két állatnál) pedig a 11. napnak vettük. Vérmintákat a -19., -12., 1. (az adagolás megkezdése előtt), illetve az első dózis beadása után 6, 24 és 72 órával vettünk. További vérmintákat vettünk a 8. napon (a második dózis beadása előtt), a 10. napon (a csoportonként két-két állat leölése előtt), illetve a 36. és a 67. napon (a regenerációra kiválasztott állatok esetében).
A perifériás B-sejt-koncentrációt a CD3-/CD40+ sejteket számláló FACS-analízissei határoztuk meg. A CD3-/CD40+ sejtek össz-limfocitaszámra vonatkoztatott százalékos arányát az alábbi kapuzási stratégia alkalmazásával kaptuk. A limfocitapopulációt - az 1. régió (R1) definiálása céljából - az előszóródási/oldalszóródási szórásdiagramon jelöltük meg. Az R1-ben tapasztalható események felhasználásával a CD40- és CD3-markerre fluoreszcenciaintenzitási pontgrafikonokat ábrázoltunk. A CD40-, illetve CD3-pozitivitás töréspontjának meghatározására fluoreszcensen jelölt izotípuskontrollokat alkalmaztunk.
A kapott eredmények azt mutatják, hogy a 2H7.v16 és 2H7.v31 10 mg/kg dózisban egyaránt képes a perifériás B-sejtek teljes elpusztítására, míg 0,05 mg/kg dózisban a perifériás B-sejtek számának részleges csökkentését eredményezik (lásd a 11. ábrát). Az antitest beadását követő első 72 óra során a B-sejt-kivonás időbeli lefolyása és mértéke mindkét antitest esetében hasonló volt. A regeneráció megfigyelésére kiválasztott állatok későbbi vizsgálatai azt mutatták, hogy a 2H7.v31-antitesttel kezelt állatokban a B-sejtek számának lecsökkentése hosszabb időtartamú volt, mint a 2H7.v16-antitesttel kezelt állatokban. Közelebbről; a 10 mg/kg 2H7.v16-antitesttel kezelt állatokban a B-sejt-regeneráció a 10. és 36. nap közötti időszakban jelentős mértékű volt, míg a 10 mg/kg dózisú 2H7.v31-antitesttel kezelt állatokban a B-sejtek egészen a 36. és 67. nap közötti időszakig nem regenerálódtak (lásd a 11. ábrát). Ez azt jelenti, hogy a 2H7.v31változat B-sejt-kivonó hatása körülbelül egy hónappal hosszabb időtartamú, minta 2H7.v16-antitesté.
A majmokkal végzett kísérletek során toxicitást egyik tesztelt dózisnál nem tapasztaltunk, és az általános patológiai vizsgálatok is normális eredményt mutattak. Más kísérletekben (melyek során cynomolgus majmoknak két hetes különbséggel két iv. dózist adagoltunk) a v16-változat egészen a legnagyobb tesztelt dózisig (100 mg/kgx2=1200 mg/m2x2) jól tolerálhatónak bizonyult.
A 2H7.v16-antitesttel és Rituxan®-nal cynomolgus majmokban végzett kísérletek eredményei arra utalnak, hogy a v16-változat ötször kisebb mértékű CDCaktivitása nem befolyásolja károsan a B-sejt-kivonó hatást. A hatékony ADCC-aktivitású, de csökkent CDCaktivitású antitestek az első infúziót követő reakciók tekintetében biztonságosabbaknak tekinthetők, mind a nagyobb CDC-aktivitásúak.
11. példa
Fokozott effektorfunkciójú fukózdeficiens 2H7antitestváltozatok
A normál CHO- és HEK2983-sejtek az IgG-oligoszacharidhoz nagy mennyiségben (97-98%) adnak fukózt, és a szérumból származó IgG is nagymértékben fukozilált.
Kísérletünkhöz az antitestek termeltetésére fukozilációkompetens DP12-sejtvonalat [amely dihidrofolát
HU 227 217 Β1 reduktáz-negatív (DHFR-) CHO-sejtvonal] és proteinfukoziláció szempontjából deficiens Lec13-sejtvonalat alkalmaztunk. A Pro-Lec13.6a (Lec13) CHO-sejtvonalat Prof. Pamela Stanley-től (Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva Egyetem) kaptuk. E sejtvonal szülői vonalai Pro- (prolin-auxotróf) és Gat- (glicin/adenozin/timidin-auxotróf) sajátságúak. A CHO-DP2-sejtvonal a CHO-K1-sejtvonal (ATCC CCL—61) származéka, amely dihidrofolát reduktázdeficiens és csökkent inzulinigényű. A sejtvonalakat a „Superfect’-eljárás (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával, cDNS-sel transzfektáltuk. A transzfektált antitesteket termelő Lec13sejtek szelektálását 10 pg/mL koncentrációjú puromicin-dihidroklorid (Calbiochem, San Diego, CA) alkalmazásával, L-glutamint, ribonukleozidokat és dezoxiribonukleozidokat tartalmazó MEM-α tápközegben (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) végeztük, melyet 10% inaktivált magzati borjúszérummal (Gibco), 10 mM HEPESpufferrel és 1 *penicillin/sztreptomicinnel (Gibco) egészítettünk ki. A CHO-sejteket hasonlóan szelektáltuk, de GHT nélküli Ham-féle F12-tápközeg és glicin nélküli, NaHCO3-ot tartalmazó, alacsony glükóztartalmú DMEM-tápközeg elegyét alkalmaztuk, melyet 5% magzati borjúszérummal (Gibco), 10 mM HEPES-pufferrel, 2 mM L-glutaminnal, 1*GHT-vel (glicin, hipoxantin, timidin) és 1 xpenicillin/sztreptomicinnel egészítettünk ki.
A sejtkolóniák két-három héten belül kifejlődtek ezeket felszaporításuk és a proteintermeltetés céljából egyesítettük. A sejteket a kis volumenű proteintermeléshez először 3*106 sejt mennyiségben 10 cm-es tálcára oltottuk. 90-95%-os konfluens állapot elérésekor a sejteket szérummentes tápközegre oltottuk át, 3-5 nap elteltével a sejtfelülúszót összegyűjtöttük és Fc-IgG- és intakt IgG-ELISA tesztek alkalmazásával meghatároztuk a protein termelődött mennyiségét. A Lec13- és CHO-sejteket hozzávetőleg 8*106 sejt mennyiségben 15 cm-es tálcára oltottuk, majd a tápközeget - 10 mg/mL rekombináns humán inzulinnal és 1 mg/L nyomelemkeverékkel kiegészített - PS24 termeltető tápközegre cseréltük.
A Led 3- és DP12-sejteket 3-5 napig tartottuk a szérummentes termeltető tápközegben, majd a felülúszókat összegyűjtöttük és - a sejtek és törmelékek eltávolítása céljából - 150 mL-es kúpos centrifugacsövekben végzett centrifugálással derítettük. A felülúszókhoz proteázinhibitorokat (PMSF és aprotinin; Sigma, St. Louis, MO) adtunk, majd keverőcellákon, MWCO30-filterek (Amicon, Beverly, MA) alkalmazásával ötszörös töménységűre koncentráltuk, és közvetlenül ezután protein-G kromatográfiával (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) tisztítottuk. Az összes proteint Centripriep-30 töményítőberendezés (Amicon) alkalmazásával, puffercserével foszfátpufferelt sóoldatba (PBS) vittük át és SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) analizáltuk. A proteinkoncentrációikat 280 nm-nél mért abszorbancia alapján határoztuk meg és aminosav-összetétel analízist végeztünk.
A CHO-sejteket a humanizált 2H7.v16-ot, illetve 2H7.v31-et expresszáló vektorokkal transzfektáltuk és a fentebb leírtak szerint szelektáltuk. A 2H7.v16-antitestben a vad típusú Fc-régió található, míg a v31-változat Fc-régiójában három aminosavszubsztitúciót (S298A, E333A és K334A) hordoz (lásd az 5. példában bemutatott 7. táblázatot), melyek az FcyRIIa-receptorra nagyobb affinitást eredményeznek [Shields és munkatársai: J. Bioi. Chem. 276(9), 6591 (2001)]. Atranszfekciót és szelekciót követően a sejtek különálló kolóniáit izoláltuk, melyekben meghatároztuk a termelődött protein mennyiségét. A proteint legnagyobb mennyiségben termelő kolóniákat elkülönítettük és methotrexátos szelekcióval olyan sejtekre szelektáltuk, amelyekben a plazmid kópiaszáma megsokszorozódott (ami az antitest nagyobb mennyiségben történő termelődését eredményezi). A sejteket szaporítottuk, hét napra szérummentes tápközegbe helyeztük, majd a tápközeget összegyűjtöttük, protein-A oszlopra töltöttük, és az antitestet standard technikák alkalmazásával eluáltuk. Az antitest végkoncentrációját a teljes hosszúságú antitest mérésére alkalmas ELISA-teszttel határoztuk meg. Valamennyi proteint puffercserével, Centripriep-30 töményítőberendezések (Amicon) alkalmazásával foszfátpufferelt sóoldatba vittük át, majd SDS-PAGE-elektroforézissel analizáltuk.
Az aszparaginhoz kötött oligoszacharidok mátrix segítette lézerdeszorpciósZ-ionizációs repülésidő (MALDI-TOF) tömegspektrometriás analízise A rekombináns glikoproteinekről az N-kötött oligoszacharidokat Papac és munkatársai eljárásával [Glycobiology 8, 445 (1998)] szabadítottuk fel. Röviden összefoglalva: 96 üregű, PVDF-fel bevont mikrotitertálca (Millipore, Bedford, MA) üregeit 100 pL metanollal kondicionáltuk, oly módon, hogy a metanolt a tálcára csatlakoztatott „Millipore Multiscreen” vákuum-csőelosztóval létrehozott vákuummal átszívtuk a PVDFmembránokon. A kondicionált PVDF-membránokat háromszor 250 pL vízzel leöblítettük. Az egyes mosási lépések között az üregeket - a csőelosztóra enyhe vákuumot kapcsolva - teljesen kiszárítottuk. A membránokat redukáló- és karboxi-metilező pufferrel (RCM) mostuk, melynek összetétele a következő: 6 M guanidin-hidroklorid, 360 mM Tris, 2 mM EDTA (pH=8,6). Az egyes üregekbe glikoproteinmintákat (50 pg) helyeztünk, melyeket enyhe vákuum alkalmazásával átszívtunk a PVDF-membránokon, és az üregeket 2*50 pL RCM-pufferrel kiöblítettük. Az immobilizált mintákat üregenként 50 pL 0,1 M ditiotreitol (DTT) hozzáadásával redukáltuk, és a mikrotitertálcát 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk. A DTT-t vákuummal eltávolítottuk és az üregeket 4*250 pl vízzel kiöblítettük. A ciszteinek karboxi-metilezése céljából az üregekhez 50 pL 0,1 M jód-ecetsav- (IAA) oldatot adtunk, melyet 1 M nátriumhidroxid-oldatban frissen készítettünk és RCM-pufferben 0,1 M koncentrációra hígítottunk). A karboxi-metilezést környezeti hőmérsékleten, sötétben 30 perces inkubálással hajtottuk végre. Az ΙΑΑ-oldatot vákuum alkalmazásával eltávolítottuk, majd az üregeket 4*250 pL tisztított vízzel kiöblítettük. A PVDF-membránokat 100 pL 1% PVP360 (360 kD molekulatömegű
HU 227 217 Β1 polivinil-pirrolidin; Sigma) hozzáadásával és környezeti hőmérsékleten egy órás inkubálással blokkoltuk. A PVP360-oldatot enyhe vákuum alkalmazásával eltávolítottuk, és az üregeket ismét 4^250 pL vízzel öblítettük. Ezt követően mindegyik üreghez PNG-áz-F (New England Biolabs, Beverly, MA) emésztőoldatot adtunk [10 mM Tris-acetátban (pH=8,4) készített 25 egység/ml koncentrációjú, 25 pL térfogatú oldat], és a tálcát 37 °C-on három óra hosszat inkubáltuk. Az emésztési reakció után a mintákat 500 pL-es Eppendorf-csövekbe helyeztük át és 2,5 pL 1,5 M ecetsavat adtunk hozzájuk. A savanyított mintákat - az oligoszacharidok glikozil-amin-alakból hidroxilalakká történő átalakítása céljából - környezeti hőmérsékleten három órán át inkubáltuk. A MALDI-TOF tömegspektrometriás analízis előtt a felszabadított oligoszacharidokat 0,7 mL kationcserélő gyanta (AG50W-X8-gyanta, hidrogénalakban; Bio-Rad, Hercules, CA) ágyon sótalanítottuk (a gyantát öntőpépként kompakt reakciócsövekbe töltve; US Biochemical, Cleveland, OH).
A minták pozitív módban végzett MALDI-TOF tömegspektrometriás analíziséhez a sótalanított oligoszacharidok 0,5 pL-es aliquotjait 0,5 pL 2,5-dihidroxibenzoesav (sDHB) ágyazóanyaggal együtt a rozsdamentes céltárcsára helyeztük. Az ágyazóanyag előállításához etanol/10 mM nátrium-klorid-oldat 1:1 térfogatarányú elegyében (1 mL) 2 mg 2,5-dihidroxi-benzoesavat 0,1 mg 5-metoxi-szalicilsavval együtt oldottunk fel. A minta/ágyazóanyag elegyet vákuumban megszárítottuk. A negatív módban végzett analízishez a sótalanított N-kötött oligoszacharidok 0,5 pL-es aliquotjait 0,5 pL - acetonitril és 13,3 mM ammónium-citrát-puffer 1:3 térfogatarányú elegyében készített - 2’,4’,6’-trihidroxi-acetofenon (THAP) ágyazóanyaggal együtt helyeztük a rozsdamentes céltárcsára. A minta/ágyazóanyag elegyet vákuumban megszárítottuk, és a vizsgálat előtt a levegő nedvességtartalmának abszorbeálása érdekében állni hagytuk. A felszabadított oligoszacharidok MALDI-TOF analízisét a PerSeptive BioSystems által forgalmazott Voyager-DE tömegspektrométer alkalmazásával végeztük. A tömegspektrométert a pozitív és a negatív módban egyaránt 20 kV feszültséggel, lineáris konfigurációval és késleltetett extrakció alkalmazásával üzemeltettük. Az adatokat 1300-as lézerenergia alkalmazásával - a jel/zaj arány javítása érdekében adatösszegző módban (240-es felbontás) gyűjtöttük. A berendezést standard oligoszacharidok elegyével kalibráltuk, és az adatokat a tömegmegállapítást megelőzően 19 pontos Savitsky-Golay-algoritmus alkalmazásával finomítottuk. A tömegspektrumadatok integrálását Caesar 7.0 adatfeldolgozó szoftvercsomag (SciBridge Software) alkalmazásával végeztük.
Természetes ölősejtes (NK-sejtes) antitestdependens citotoxicitási vizsgálatok Az ADCC-teszteket a 9. példában leírt módon hajtottuk végre. A teszteket négy órán át, 4:1 NK-sejt/célsejt (WIL2-S) arány mellett végeztük, és a toxicitást az előzőekben leírtak szerint, laktóz-dehidrogenáz-teszt alkalmazásával mértük. A célsejteket - az NK-sejtek hozzáadása előtt 30 perccel - a megadott koncentrációjú antitesttel opszonifikáltuk. Az alkalmazott Rituxan®-antitest a Genentechtől (S. San Francisco, CA) származott. Az ADCC-teszt eredményeit a 12. ábrán mutatjuk be.
Eredményeink alapján látható, hogy a kisebb mértékben fukozilált (fukózdeficiens) antitestek az NK-sejtes célsejtölő aktivitást hatékonyabban közvetítik, mint a teljesen fukozilált antitestek. Kísérletünkben a 2H7.v31-antitest (amely a kevésbé fukozilált változatok közé tartozik) közvetítette leghatékonyabban a célsejtölő aktivitást. Ez a változat kis koncentrációkban is hatásos volt, és nagyobb koncentrációknál a célsejtek nagyobb hányadának pusztítását közvetítette, mint a többi antitest. A tesztelt antitestek aktivitása a következők szerint alakult: Lec13-eredetű 2H7.v31>Lec13-eredetű 2H7.v16>Dp12-eredetű 2H7.V31 >Dp12-eredetű 2H7.v16>Rituxan®. A protein- és szénhidrát-módosítások additív hatásúnak bizonyultak. A natív IgG-n, a Lec13-sejtek által termelt IgG-n és a CHO-sejtek által termelt IgG-n található szénhidrátok összehasonlítása alapján a galaktoziláltság mértékében nem volt észrevehető változás, így a kapott eredmények kizárólag a fukóz jelenlétének, illetve hiányának tudhatok be.
12. példa
Megnövelt in vivő ADCC-aktivitású fukózdeficiens
2H7-antitestváltozatok
Ebben a példában a Lec13-sejtekben termeltetett, fukózdeficiens humanizált 2H7-változatok (ideértve a v16- és v31-változatot) és normális mértékben fukozilált, DP12-sejtekben termeltetett megfelelőik in vivő ADCC-aktivitásának - humán CD16-ot (FcyRIII) és humán CD20-at expresszáló - egerekben végzett összehasonlító vizsgálatát ismertetjük.
huCD20Tg+ huCD16Tg+ mCDIőg-^ egerek létrehozása
Humán CD20-BAC-DNS (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával humán CD20-ra nézve transzgenikus egereket hoztunk létre. Az egereket a humán CD20expresszió FACS-analízise alapján szkríneltük. Az így azonosított huCD20Tg+ egereket huCD16Tg+ mCD16g_/_ egerekkel keresztezve huCD20Tg+ huCD16Tg+ mCD16g_/_ egerekhez jutottunk.
In vivő kezelés
A huCD20Tg+ huCD16Tg+ mCD16g_/_ egereknek intraperitoneális injekcióval a 2H7-változatok vagy Rituxan® 10-100 pg-ját adtuk be. A negatív kontrollcsoportnak, hasonló módon, izotípusegyeztetett antitestek azonos mennyiségeit adtuk be.
Egéreredetű limfociták izolálása
Az egéreredetű limfocitákat standard eljárással [lásd „Current Protocols in Immunology”, szerk.: John Coligan, Ada Kruisbeek, Dávid Margulies, Ethan Shevach és Warren Strober (1993)] teljes vérből, lépből, nyirokcsomókból és csontvelőből izoláltuk.
HU 227 217 Β1
FACS-analízis
100 μΙ_ FACS-pufferben (1% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó foszfátpufferelt sóoldat, 5 μΙ_ festő- vagy kontrollantitesttel) 500 000 sejtet mostunk és újraszuszpendáltunk. A festőantitesteket (köztük az izotípuskontrollokat) a PharMingentől (San Diego, CA) szereztük be. A humán CD20 expresszióját Rituxan®nal - második antitestként FITC-vel konjugált antihumán lgG1 antitesttel - történő festődés alapján értékeltük. A FACS-analízist FACScan és Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) alkalmazásával hajtottuk végre. Valamennyi limfocitát elő- és oldalszóródási fényszórásdiagramokon definiáltuk, míg a B-limfocitákat a B220 sejtfelületen történő expressziója alapján határoztuk meg.
A B-sejt-kivonást, illetve a B-sejtek regenerálódását a perifériás B-sejtek számának meghatározásával és lépben, nyirokcsomóban és csontvelőben lévő hCD20+ B-sejtek - az injektálás utáni első héten naponta, majd hetente egyszer végzett - FACS-analízisével értékeltük. A szérumban ellenőriztük az injektált 2H7-antitestváltozat koncentrációját.
Az in vivő vizsgálat eredményei megerősítik a fukózhiányos 2H7-változatok in vitro tesztben tapasztalt
- fukoziláció szempontjából vad típusú glikozilációs megfelelőikhez viszonyított - nagyobb ADCC-aktivitását és B-sejt-kivonó hatását.
13. példa
Apoptózisos aktivitás
A CD20 elleni antitestekről (mind például a Rituxan®) kimutatták, hogy másodlagos antitesttel vagy kémiai módszerrel végzett keresztkötésük esetén in vitro apoptózist indukálnak [lásd Shan és munkatársai: Blood 9, 1644 (1998); Byrd és munkatársai: Blood 99, 1038 (2002); Pederson és munkatársai: Blood 99, 1314 (2002)]. Kémiai úton végzett keresztkötéssel az egéreredetű 2H7-dimerek Daudi-sejtek apoptózisát indukálták [lásd Ghetie és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7509 (1997)]. Az egéreredetű 2H7-antitest másodlagos antitesttel megvalósított keresztkötéssel szintén képes volt apoptózis indukálására [Shan és munkatársai: Blood 9, 1644 (1998)]. Ezen aktivitások fiziológiailag relevánsnak tekinthetők, mivel többféle mechanizmus is eredményezheti a sejtfelületi CD20hoz kötődött anti-CD20 antitestek in vivő keresztkötését.
Az rhuMAb-2H7.v16-antitest (humanizált 2H7.v16antitest; „rhuMab” jelentése: rekombináns humán monoklonális antitest) apoptózisindukáló aktivitását másodlagos keresztkötő antitest alkalmazásával végzett - in vitro apoptózistesztekben a Rituxan® aktivitásával hasonlítottuk össze. Ezen anti-CD20 monoklonális antitestek apoptózisindukáló képességének - negatív kontrollantitestéhez (Trastuzumab; Herceptin®, Genentech, South San Francisco, CA) viszonyítva történő
- meghatározására Ramos-sejteket (CD20-at termelő humán B-limfocita-sejtvonal; CRL-1596; ATCC, Manassas, VA) alkalmaztunk. Az apoptózis mérését Annexin-V-festődés és propidium-jodid festékkizárás alkalmazásával végeztük (Vybrant® „Apoptosis Assay” reagenskészlet; Molecular Probes, Siattle, WA). A Ramos-sejteket 10% magzati borjúszérumot (Biosource International, Camarillo, CA) és 2 mM L-glutamint (Gibco, Rockville, MD) tartalmazó - RPMI-1640-tápközegben (Gibco) tenyésztettük. A tesztelés előtt a sejteket friss tápközeggel kétszer leöblítettük, majd 2*10® sejt/mL sejtsűrűséget állítottunk be. 96 üregű mikrotitertálcák üregeibe (melyek a kontroll lgG1, rhMaAb2H7.v16 vagy Rituximab 150 μΙ_, előre meghatározott koncentrációjú oldatát, valamint humán Fc elleni kecskeeredetű F(ab)’2-t (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) tartalmaztak) a sejtek 150 pL-ét adagoltuk. Az IgGvégkoncentrációk a következők voltak: 100 nM, 10 nM, 1,0 nM, 0,1 nM, 0,01 nM és 0,001 nM. Az F(ab)’2 koncentrációját a megfelelő minta antitestkoncentrációjának kétszeresére állítottuk be. Valamennyi hígítást három ismétléssel teszteltük. 37 °C-on 24 órás inkubálás után a sejteket foszfátpufferelt sóoldattal kétszer lemostuk, majd Annexin-V-vel és propidium-jodiddal - a gyártó útmutatása szerint - festettük. A Ramos-sejtek festődési mintázatát FACScan áramlási citométer (Becton Dickinson, Palo Alto, CA) alkalmazásával végzett áramlási citometriás vizsgálattal analizáltuk, és az adatokat 10 másodperces időtartamokban gyűjtöttük. A kapott adatokat Cellquest Pro szoftver (Becton Dickinson) alkalmazásával tömörítettük. Azokat a Ramossejteket, amelyek pozitívnak bizonyultak (1) az Annexin-V-festődésre; (2) az Annexin-V és propidium-jodidos kettős festődésre; és (3) a nem festődött élő sejtek számára, összeszámoltuk és KaleidaGraph szoftver (Synergy Sofware, Reading, PA) alkalmazásával grafikonon ábrázoltuk.
Az antihumán Fc antitesttel végzett keresztkötés esetén mind az rhuMAb-2H7.v16, mind a Rituximab apoptózist indukált a Ramos-sejtekben (irreleváns lgG1 kontrollantitesttel összehasonlítva; lásd a 13-15. ábrákat). Az rhuMAb-2H7 apoptózisos aktivitása valamivel kisebb volt a Rituximabénál. Az rhuMAb2H7, a Rituximab, illetve a kontroll lgG1 -antitest 10 nM koncentrációjánál az Annexin-V-vel festődött sejtek aránya (sorrendben) 18,5%, 16,5%, illetve 2,5%; a kettős festődést mutató sejtek aránya 29%, 38%, illetve 16%; míg a 10 másodperc alatt megszámlált élő sejtek száma 5200, 3100, illetve 8600 volt.
Ezek az in vitro adatok azt bizonyítják, hogy az apoptózis az in vivő B-sejt-kivonás egyik potenciális mechanizmusa. A sejtfelületi CD20-hoz kötődő rhuMAb-2H7 vagy Rituximab keresztkötése az immunrendszeri effektorsejtek felületén elhelyezkedő Fc/Rreceptor közvetítésével jöhet létre.
14. példa
A tumornövekedés in vivő visszaszorítása
Az rhuMAb-2H7.v16-antitest Raji humán B-sejtek (limfómasejtvonal; ATCC CCL 86) szaporodását gátló képességét csupasz (thymus nélküli) Balb/c egerekben értékeltük. A Raji-sejtek CD20-at termelnek; csupasz egerekben leírták szaporodásukat, ami metasztatikus betegséget okoz. A tumornövekedést a Rituxan® gátol45
HU 227 217 Β1 ja [Clynes és munkatársai: Natúré Medicine 6, 443 (2000)]. Ötvenhat 8-10 hetes csupasz Balb/c egeret hét, egyenként nyolc egérből álló csoportra (A-G) osztottunk. A 0. napon mindegyik egér horpaszába szubkután 5*10® Raji B-limfóma-sejtet injektáltunk, és ugyanezen a napon az egereknek farki vénán keresztül, intravénásán 100 pL negatív kontrolloldatot (foszfátpufferelt sóoldat, PBS), Rituxan®-t vagy 2H7.v16-antitestet adtunk be. Az „A” csoportba tartozó egereknek PBS-t adtunk; a „B”, „C” és „D” csoportba tartozó egereknek a Rituxan® 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg, illetve 0,05 mg/kg dózisát; míg az „E”, „F” és „G” csoportba tartozó egereknek a 2H7.v16-antitest 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg, illetve 0,05 mg/kg dózisát injektáltuk. Az adagolást hat héten át hetente egyszer ismételtük. A kezelés során hetenkénti gyakorisággal az injekciók helyén megvizsgáltuk a tapintható tumorok jelenlétét, és ha jelen voltak, megmértük és regisztráltuk azokat. A 8. héten (két heti kezelésmentes időszak után) egy utolsó vizsgálatot végeztünk.
Kísérletünk eredményei azt mutatták, hogy a szubkután Raji-sejtes tumornövekedés gátlására mind az rhuMAb-2H7.v16, mint a Rituxan® hatásos volt (lásd a 16-18. ábrákat). A foszfátpufferelt sóoldattal kezelt kontrollcsoportban a negyedik héttől kezdődően figyeltünk meg tumornövekedést. A Rituxan®-nal, illetve a 2H7.v16-antitesttel (5 mg/kg vagy 0,5 mg/kg dózisban) kezelt csoportokban a vizsgálat nyolchetes időtartama alatt egyáltalán nem tapasztaltunk tumornövekedést. A kis dózissal (0,05 mg/kg) kezelt csoportok esetében a 2H7 csoportban és a Rituxan® csoportban egy-egy állatban figyeltünk meg tumort (lásd a 18. ábrát).
15. példa
Cynomolgus majom-eredetű CD20 klónozása és az antitest kötődésének vizsgálata A cynomolgus majom (Macaca fascicularis) CD20DNS-szekvenciáját cynomolgus lép cDNS-könyvtárból izolált, CD20-at kódoló cDNS alapján határoztuk meg. A könyvtár létrehozására - némi módosítással - SUPERSCRIPT™ cDNS-szintetizáló és plazmidklónozó plazmidrendszert (katalógusszám: 18248-013; Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmaztunk. A cDNS-köknyvtárat Xhol- és Notl-felismerési helyek felhasználásával pRK5E-vektorba ligáltuk. Az mRNS-t lépszövetből izoláltuk (California Régiónál Research Primate Center, Davis, CA). A CD20-at kódoló cDNS amplifikálására alkalmas láncindító oligonukleotidokat a humán CD20 nem kódoló szekvenciái alapján terveztük meg. A cynomolgus CD20-at kódoló cDNS-polimeráz-láncreakcióval (PCR) történő klónozására az 5’-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3’ szekvenciájú N-terminális láncinditót, illetve az 5’-AAGCTATGAACACTAATG-3’ szekvenciájú C-terminális láncindítót alkalmaztuk. A polimeráz-láncreakciót „Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity” reagenskészlet (Gibco, Rockville, MD) alkalmazásával, a gyártó útmutatásai alapján hajtottuk végre. A PCR-terméket pCR® 2.1-TOPO® vektorba (Invitrogen) szubklónoztuk és XL-1 Blue E. colisejtekbe transzformáltuk. A ligáit PCR-termékeket tartalmazó plazmid-DNS-t az egyedi kiónokból izoláltuk és szekvenáltuk.
A cynomolgus-eredetű CD20 aminosavszekvenciáját a 19. ábrán mutatjuk be. A 20. ábrán a cynomolgus és a humán CD20 aminosavszekvenciáját hasonlítjuk össze. A cynomolgus CD20 aminosavszekvenciája 97,3%-ban azonos a humán CD20-éval: a két szekvencia nyolc aminosavban tér el egymástól. Az extracelluláris doménben egy eltérés (V157A) található, a többi hét aminosav a citoplazmikus régióban, illetve a transzmembrán régióban helyezkedik el.
A humán CD20 elleni antitesteket a CD20-at termelő cynomolgus-sejtekhez kötődő, FITC-vel konjugált egéreredetű 2H7-antitestet kiszorító képességükre teszteltük. Két cynomolgus majomból (California Régiónál Research Primate Center, Davis, CA) nátriumheparinra 20-20 mL vért vettünk és a vérmintákat közvetlenül a Genentech Inc.-hoz szállítottuk. A vérmintákat ugyanezen a napon összeöntöttük és 40 mL foszfátpufferelt sóoldattal 1:1 arányban hígítottuk. A hígított vér 20 mL-ét 50 mL-es kúpos csövekben (katalógusszám: 352098; Falcon, Franklin Lakes, NJ) 4*20 mL Ficoll-Paque™ Plus-ra (Amersham Biosciences, Uppsala, Svédország) rétegeztük, és Sorval 7 (Dupont, Newtown, CT) centrifugában (1300-as percenkénti fordulatszámmal) szobahőmérsékleten 30 percig centrifugáltuk. A PBMC-réteget izoláltuk és foszfátpufferelt sóoldattal mostuk. A vörösvértesteket 0,2%-os NaCI-oldattal feltártuk, azonos térfogatú, 1,6%-os NaCI-oldat hozzáadásával visszaállítottuk az elegy izotonitását, majd 1000-es percenkénti fordulatszámmal 10 perces centrifugálást végeztünk. A PBMC-üledéket 5% magzati borjúszérumot (FBS) tartalmazó RPMI-1640 tápközegben (Gibco, Rockville, MD) újraszuszpendáltuk, majd 10 cm-es szövettenyésztő csészére öntöttük, és 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk. A nem tapadó Bés T-sejtek populációit leszívással eltávolítottuk, centrifugáltuk és számláltuk. Összesen 2,4x107 sejtet gyűjtöttünk össze. Az újraszuszpendált PBMC-sejteket húsz darab 12x75 mm-es tenyésztőcsőbe (katalógusszám: 352053, Falcon) osztottuk szét (minden egyes cső 0,25 mL térfogatban 1χ105 sejtet tartalmazott). A csöveket négy csoportra osztottuk (csoportonként öt cső).
Az egyes csoportokba tartozó csövekhez tápközeget (5% FBS-t tartalmazó RPMI-1640), illetve kontroll humán lgGd-antitest, Rituxan®, 2H7.v16-antitest vagy 2H7.v31-antitest titrált mennyiségeit adtuk. Az antitestek végkoncentrációja 30 nM, 10 nM, 3,3 nM és 1,1 nM volt. Ezenfelül, mindegyik csőbe 20 pL fluoreszceinizotiocianáttal (FITC) konjugált antihumán CD20 antitestet (katalógusszám: 555622; BD Biosciences, San Diego, CA) adtunk. A sejteket óvatosan összekevertük, jégen egy óra hosszat inkubáltuk, majd hideg foszfátpufferelt sóoldattal kétszer mostuk. A sejtfelület festődését Epic XL-MCL készüléken (Coulter, Miami, FL) analizáltuk, a geometriai átlagokat kiszámítottuk, és az antitestkoncentráció függvényében - „KaleidaGraph szoftver (Synergy Software, Reading, PA) alkalmazásával - grafikonon ábrázoltuk.
HU 227 217 Β1
A 21. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a 2H7.v16 és a 2H7.v31 kompetitív módon kiszorította a cynomolgus majom-eredetű sejtekhez kötődő, FITC-vel konjugált egéreredetű 2H7-antitestet. A Rituxan® szintén kiszorította az FITC-vel konjugált egéreredetű 2H7-antitestet, ami azt jelzi, hogy a Rituxan® és a 2H7-antitest a CD20-on átfedő epitóphoz kötődik. Ezen túlmenően, a kapott adatok azt mutatják, hogy a 2H7.v16, 2H7.v31 és a Rituxan® IC50-értéke hasonló, és a 4-6 nM tartományba esik.
16. példa
Az rhuMAb-2H7-antitest (2H7.V16) mérsékelt/súlyos reumaszerű ízületi gyulladás kezelésére történő alkalmazásának l/ll. fázisú vizsgálata
A vizsgálati eljárás áttekintése
Mérsékelt/súlyos reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő - járulékos hatóanyagként metotrexát állandó dózisát szedő - páciensek bevonásával a PRO70769-antitest (rhuMAb-2H7) dózisnövelése biztonságosságának randomizált, placebóval kontrollált, több centrumos, l/ll. fázisú, vakpróbás vizsgálatát hajtottuk végre.
Célkitűzések
Vizsgálatunk elsődleges célja a PRO70769-antitest (rhuMAb-2H7) növekvő intravénás (iv.) dózisai biztonságának és tolerálhatóságának mérsékelt/súlyos reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő páciensek bevonásával történő értékelése.
Vizsgálati eljárás
Kísérletünk során a PRO70769-antitest metotrexáttal (MTX) kombinált, növekvő dózisai biztonságosságát randomizált, placebóval kontrollált, több centrumos, vakpróbás l/ll. fázisú vizsgálatban értékeljük. A kísérlet egy dózisnövelési fázisból és egy második, több páciens bevonásával végzett fázisból áll. A finanszírozó a kezelés kijelölésébe nem avatkozik bele.
A vizsgálatokat olyan, mérsékelt/súlyos reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő páciensek bevonásával végezzük, akik korábban egy-öt antireumatikus hatóanyaggal végzett kezelésre nem reagáltak és akik a kísérlet idején a metotrexáttal végzett kezelésre nem kielégítő klinikai reakciókat adnak.
A pácienseknek a vizsgálat megkezdése előtt legalább 12 héten át heti 10-25 mg dózisú metotrexátot kell kapniuk, és a tesztelt hatóanyag (PRO70769-antitest vagy placebo) kezdődózisának felvétele előtt legalább négy héten át állandó metotrexátdózisokat kell felvenniük. A páciensek orálisan adagolható kortikoszteroidok állandó dózisait (legfeljebb napi 10 mg vagy prednison-egyenérték), valamint nem szteroid jellegű gyulladásgátló hatóanyagok (NSAID-k) állandó dózisait is kaphatják. A pácienseknek a kísérlet 1. és 15. napján intravénás infúzióval a PRO70769-antitest vagy a placebo megadott dózisait adjuk be (lásd a 22. ábrán bemutatott dózisnövelési tervet).
A dózisnövelést speciális kritériumoknak megfelelően (lásd a dózisnövelési szabályokat - „Dose Escalation Rules”) és a biztonsági adatok belső biztonsági adat-felülvizsgáló bizottság által történő ellenőrzését, illetve az egyes kezelési csoportokban az utolsó páciens második infúziós kezelése után 72 órával az akut toxicitás értékelését követően hajtjuk végre. A dózist dózisszintenként 10 páciens kezelése után növeljük (kivéve az 1. szintet, amelynél 5 páciens kezelése után). A dózisnövelési fázist követően (ha az előzőleg alkalmazott dózisokról bebizonyosodott tolerálhatóságuk) a következő dózisokra további negyven pácienst (32 aktív hatóanyag és 8 placebo) jelölünk ki véletlenszerűen: 2x50 mg, 2x200 mg, 2x500 mg és 2x1000 mg. A kísérletbe hozzávetőleg 205 pácienst vonunk be.
Vizsgálatunk során a páciensekben meghatározzuk és regisztráljuk a B-sejtek számát (a vizsgálati értékeléseket illetően lásd a 4.5 szakaszt és az A-1 függeléket). A B-sejtek számát - a hat hónapos hatékonysági vizsgálatot követő - 48 hetes utókövetési időszakban áramlási citometriával értékeljük. A B-sejtek számának csökkenését (a B-sejt-kivonást) nem dóziskorlátozó toxicitásként (DLC), hanem a PRO70769-antitest várt farmakodinamikai következményének tekintjük.
Kísérletünk egy opcionális részében a páciensektől különböző időpontokban vért veszünk (szérum- és RNS-analízishez), illetve vizeletmintát gyűjtünk (lásd a 3.3.3 szakaszt). Ezek a minták olyan biomarkerek azonosítására használhatók, amelyek a mérsékelt/súlyos reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő páciensekben az PRO70769-antitesttel végzett kezelésre adott reakció vonatkozásában prediktívek lehetnek.
Következmények mérése
Vizsgálatunk során elsődleges következményként a PRO70769-antitest biztonságosságát és tolerálhatóságát mérjük mérsékelt/súlyos reumaszerű ízületi gyulladásban szenvedő páciensekben.
Kezelés
Az egyes kezelési csoportokba tartozó pácienseknek a PRO70769-antitest vagy a placebo-egyenérték két iv. infúzióját adjuk be a megadott dózisokkal (a kísérlet 1. és 15. napján), a következő dózisnövelési séma szerint:
- 10 mg PRO70769-antitest vagy placebo-egyenérték: négy páciensnek aktív hatóanyag, egy páciensnek kontroll;
- 50 mg PRO70769-antitest vagy placebo-egyenérték: nyolc páciensnek aktív hatóanyag, két páciensnek kontroll;
- 200 mg PRO70769-antitest vagy placebo-egyenérték: nyolc páciensnek aktív hatóanyag, két páciensnek kontroll;
- 500 mg PRO70769-antitest vagy placebo-egyenérték: nyolc páciensnek aktív hatóanyag, két páciensnek kontroll;
- 1000 mg PRO70769-antitest vagy placeboegyenérték: nyolc páciensnek aktív hatóanyag, két páciensnek kontroll.
HU 227 217 Β1
Hatékonyság
A PRO70769-antitest hatékonyságát ACR-reakciók alapján mértük. Az ACR20-as, ACR50-es és ACR70-es reakciót elérő páciensek százalékos arányát kezelési csoportonként összesítjük, és mindegyik csoportra 95%-os konfidenciaintervallumot határoztunk meg. A szóban forgó reakciók komponenseit és alapszinthez viszonyított változásait a kezelések és vizitek során összegeztük.
Következtetések
A fenti adatok bizonyítják a humanizált - és biológiai tulajdonságaikat eredeti vagy megnövelt szinten megtartó - CD20-kötő antitestek (közelebbről, a humanizált 2H7-antitestváltozatok) sikeres előállítását. A találmány szerinti humanizált 2H7-antitestek hasonló affinitással kötődnek a CD20-hoz, mint az egéreredetű donorantitest és a kimerikus 2H7-antitestek, s főemlősben hatásosnak bizonyultak a B-sejtek elpusztítására (előidézve ezáltal a B-sejtek számának csökkentését). Bizonyos változatok a non-Hodgkin-limfóma (NHL) kezelésére jelenleg alkalmazott kimerikus anti-CD20 antitesthez képest fokozott mértékű ADCC-aktivitás kifejtésére képesek, ami a terápiás antitest kisebb dózisainak alkalmazását teszi lehetővé. Ezen túlmenően, míg az egéreredetű vázrégió-aminosavakat tartalmazó kimerikus antitest esetében - az ellene irányuló antitestes reakció elkerülése érdekében - teljes B-sejt-kivonás előidézésére hatásos dózis adagolására lehet szükség, a találmány szerinti humanizált antitestek részleges vagy teljes B-sejt-kivonást előidéző dózisokban, illetve különböző időtartamokban adagolhatok (az adott betegség, illetve beteg szükségleteinek megfelelően). Ezenfelül, a találmány szerinti antitestek oldatban stabilnak bizonyultak. A felsorolt tulajdonságok a humanizált 2H7-antitesteket ideálissá teszik CD20-pozitív rákok és autoimmun betegségek kezelésében immunterápiás hatóanyagként történő alkalmazásra. Ezek az antitestek emberekben nem immunogének vagy legalább kevésbé immunogének, mint a teljes egészükben egéreredetű vagy a kimerikus anti-CD20 antitestek.
Hivatkozások
A találmány leírásában említett hivatkozásokat (szabadalmi leírásokat, közzétett szabadalmi bejelentéseket és egyéb publikációkat) a kitanítás részének kell tekinteni.
A találmány gyakorlati kivitelezése során - hacsak másképpen nem jelezzük - szokványos molekuláris biológiai technikákat alkalmazunk, amelyek szakember számára jól ismertek. Az ilyen leírások részletes leírá50 sát illetően lásd például a következő forrásokat: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, J. Sambrook és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: F. Ausubel és munkatársai, (1987); „Essential Molecular Biology’’, szerk.: T. Brown, IRL Press (1991); „Gene Expression Technology” szerk.: Goeddel, Academic Press (1991); „Methods fór Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes”, szerk.: A. Bothwell és munkatársai, Bartlett Publ. (1990); „Gene Transfer and Expression” M. Kriegler, Stockton Press (1990); „Recombinant DNA Methodology II” (szerk.: R. Wu és munkatársai, Academic Press (1995); „PCR: A Practical Approach”, M. McPherson és munkatársai, IRL Press at Oxford University Press (1991); „Oligonucleotide Synthesis”, szerk.: M. Gait (1984); „Cell Culture fór Biochemists”, szerk.: R. Adams, Elsevier Science Publishers (1990); „Gene Transfer Vectors fór Mammalian Cells” szerk.: J. Miller és M. Calos (1987); „Mammalian Cell Biotechnology, szerk.: M. Butler (1991); „Animál Cell Culture”, szerk.: J. Pollard és munkatársai, Humana Press (1990); „Culture of Animál Cells”, 2. kiadás, szerk.: R. Freshney és munkatársai, Alán R. Liss (1987); „Flow Cytometry and Sorting”, szerk.: M. Melamed és munkatársai, Wiley-Liss (1990); a „Methods in Enzymology” folyóirat számai (Academic Press, Inc.); Wirth M. és Hauser H. (1993); „Immunochemistry in Practice”, 3. kiadás, A. Johnstone és R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA (1996); „Techniques in Immunocytochemistry”, szerk.: G. Bullock és P. Petrusz, Academic Press (1982,1983,1985, 1989); „Handbook of Experimental Immunology”, szerk.: D. Weir és C. Blackwell; „Current Protocols in Immunology”, szerk.: J. Coligan és munkatársai (1991); „Immunoassay”, szerk.: E. P. Diamandis és T. K. Christopoulos, Academic Press, Inc., (1996); Goding: „Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, 2. kiadás, Academic Press, New York (1986); Ed Harlow és Dávid Lane: „Antibodies: A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988); „Antibody Engineering”, 2. kiadás, szerk.: C. Borrebaeck, Oxford University Press (1995); valamint az „Annual Review of Immunology” és az „Advances in Immunology folyóiratok számai.
A találmány leírásához mellékelt szekvencialistában található kötetlen szövegek fordítása a következő:
Az 1-3., 8., 9., 13., 14-16., 19-23. és 27-38. azonosító számú szekvenciákhoz:
<223> Szintetizált szekvencia.
A 17. és 18. azonosító számú szekvenciákhoz: <223> Kimerikus szekvencia.
Sequence Listing <110> GENENTECH, Inc.
Camellia W. ADAMS Andrew C. CHAN Craig W. CROWLEY Henry B. LOWMAN Gerald R. NAKAMURA Leonard G. PRESTA
HU 227 217 Β1 <120> Immunoglobulin Variants and Uses Thereof <130> 146392006061 <140> HU P0500954 <141> 2003-12-16 <150> PCT/US2003/040426 <151 >2003-12-16 <150> US 60/434,115 <151 >2002-12-16 <150> US 60/526,163 <151 >2003-12-01 <160> 53 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1
Gin 1 Ile Val Leu Ser 5 Gin Ser Pro Alá Ile 10 Leu Ser Alá Ser Pro 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
35 40 45
Trp Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Alá Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Arg Val Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Alá Gly Thr Lys Leu Glu Leu
95 100 105
Lys Arg <210>2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 2
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val 15 10 15
HU 227 217 Β1
Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Alá 25 Ser Ser Ser Val Ser 30
Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105
Lys Arg <21 O>3 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 3
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Alá Ser Val 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Gin Ser Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Alá Alá Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin
80 85 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210>4
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Arg Alá Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
5 10
HU 227 217 Β1 <210>5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400 5
Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser 5 <210>6 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6
Gin Gin Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 5 <210 7 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 7 Gin 5 Gin Ser Gly Alá Glu Leu Val Arg Pro Gly
Gin 1 Alá Tyr Leu
10 15
Alá Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Alá Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
65 70 75
Ser Ser Thr Alá Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
80 85 90
Ser Alá Val Tyr Phe Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser <210 8 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized
HU 227 217 Β1
<400>8 Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá He Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser <21 O>9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220: >
<223: > Sequence is synt hesize id
<400: >9
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Alá Met Ser Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Alá Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Alá Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu
95 100 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
HU 227 217 Β1 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11
Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
Lys Gly <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12
Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 5 10 <210> 13 <211 > 5679 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 13 gaattcaact tctccatact ttggataagg aaatacagac atgaaaaatc 50 tcattgctga gttgttattt aagcttgccc aaaaagaaga agagtcgaat 100 gaactgtgtg cgcaggtaga agctttggag attatcgtca ctgcaatgct 150 tcgcaatatg gcgcaaaatg accaacagcg gttgattgat caggtagagg 200 gggcgctgta cgaggtaaag cccgatgcca gcattcctga cgacgatacg 250 gagctgctgc gcgattacgt aaagaagtta ttgaagcatc ctcgtcagta 300 aaaagttaat cttttcaaca gctgtcataa agttgtcacg gccgagactt 350 atagtcgctt tgtttttatt ttttaatgta tttgtaacta gaattcgagc 400 tcggtacccg gggatcctct agaggttgag gtgattttat gaaaaagaat 450 atcgcatttc ttcttgcatc tatgttcgtt ttttctattg ctacaaacgc 500 gtacgctgat atccagatga cccagtcccc gagctccctg tccgcctctg 550 tgggcgatag ggtcaccatc acctgcagag ccagtcagag cgtgtcgact 600 agctcttata gctatatgca ctggtatcaa cagaaaccag gaaaagctcc 650 gaaactactg atttactatg ctagcaacct cgagtctgga gtcccttctc 700 gcttctctgg atccggttct gggacggatt tcactctgac catcagcagt 750 ctgcagccag aagacttcgc aacttattac tgtcaacact cttggggtat 800 tccgcgcaca tttggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg 850 ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 900 ggaactgctt ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc 950 caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg 1000 agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 1050 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg 1100
HU 227 217 Β1 cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca 1150 ggggagagtg ttaagctgat cctctacgcc ggacgcatcg tggccctagt 1200 acgcaagttc acgtaaaaag ggtatctaga ggttgaggtg attttatgaa 1250 aaagaatatc gcatttcttc ttgcatctat gttcgttttt tctattgcta 1300 caaacgcgta cgctgaggtt cagctggtgg agtctggcgg tggcctggtg 1350 cagccagggg gctcactccg tttgtcctgt gcagcttctg gctacacctt 1400 caccgaatat atcatccact gggtccgtca ggccccgggt aagggcctgg 1450 aatgggttgc atcgattaat cctgactacg acatcacgaa ctataaccag 1500 cgcttcaagg gccgtttcac tataagtcgc gacgattcca aaaacacatt 1550 atacctgcag atgaacagcc tgcgtgctga ggacactgcc gtctattatt 1600 gtgctcgatg gatcagcgat ttcttcgact actggggtca aggaaccctg 1650 gtcaccgtct cctcggcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc 1700 accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg 1750 tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 1800 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact 1850 ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc 1900 agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 1950 aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gaccaccgca 2000 tgcaccagta tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact atggcgtgct 2050 gctagcgccg ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc 2100 atggagccgg gccacctcga cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa 2150 cggattcacc actccaagaa ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg 2200 tgaatgcgca aaccaaccct tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc 2250 tccagcagcc gcacgcggcg catctcgggc agcgttgggt cctggccacg 2300 ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg 2350 gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 2400 agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt 2450 cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2500 gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt 2550 ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat 2600 ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta ccctcacaac 2650 gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc 2700 ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa attccccctt 2750 acacggaggc atcaagtgac caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc 2800 ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc 2850 tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct 2900 gatgagcttt accgcagcat ccggaaattg taaacgttaa tattttgtta 2950 aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc 3000 cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt 3050 tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 3100 tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggctatg gcccactacg 3150 tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac 3200 taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag 3250 ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc 3300 tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg 3350 ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt ccgcatcctg cctcgcgcgt 3400 ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 3450 cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 3500 cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 3550 agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 3600 gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 3650 gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 3700 tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3750 gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 3800 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3850 cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 3900 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 3950 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 4000 ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 4050 agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 4100
HU 227 217 Β1 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4150 gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4200 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 4250 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 4300 tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 4350 ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 4400 tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4450 ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 4500 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 4550 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 4600 cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 4650 atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 4700 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 4750 cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 4800 gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 4850 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 4900 atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc 4950 tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 5000 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 5050 ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 5100 atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 5150 ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 5200 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca 5250 catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 5300 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 5350 ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 5400 gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 5450 gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 5500 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 5550 tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 5600 acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 5650 ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaa 5679 <210> 14 <211 >241 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220: >
<223: > Sequence is synt hesize id
<400: > 14
Met Lys Lys Asn lle Alá Phe Leu Leu Alá Ser Met Phe Val Phe
1 5 10 15
Ser lle Alá Thr Asn Alá Tyr Alá Asp He Gin Met Thr Gin Ser
20 25 30
Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lle Thr
35 40 45
Cys Arg Alá Ser Gin Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met
50 55 60
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Leu Leu lle
65 70 75
Tyr Tyr Alá Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
80 85 90
HU 227 217 Β1
Gly Ser Gly Ser Gly 95 Thr Asp Phe Thr Leu Thr 100 Ile Ser Ser Leu 105
Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Trp Gly
110 115 120
Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
125 130 135
Thr Val Alá Alá Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
140 145 150
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Alá Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
155 160 165
Phe Tyr Pro Arg Glu Alá Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Alá
170 175 180
Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser
185 190 195
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
200 205 210
Alá Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Alá Cys Glu Val Thr His
215 220 225
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
230 235 240
Cys <21O> 15 <211 >248 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220: >
<223: > Sequence is synt hesize id
<400: > 15
Met Lys Lys Asn Ile Alá Phe Leu Leu Alá Ser Met Phe Val Phe
1 5 10 15
Ser Ile Alá Thr Asn Alá Tyr Alá Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
35 40 45
Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His Trp Val
50 55 60
Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Alá Ser Ile Asn
65 70 75
Pro Asp Tyr Asp Ile Thr Asn Tyr Asn Gin Arg Phe Lys Gly Arg
80 85 90
HU 227 217 Β1
Phe Thr Ile Ser Arg 95 Asp Asp Ser Lys Asn Thr 100 Leu Tyr Leu Gin 105
Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá
110 115 120
Arg Trp Ile Ser Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
125 130 135
Val Thr Val Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
140 145 150
Leu Alá Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu
155 160 165
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
170 175 180
Trp Asn Ser Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá
185 190 195
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
200 205 210
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val
215 220 225
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
245
<210> 16 <211 > 5678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Sequence is chimeric <400> 16 gaattcaact tctccatact ttggataagg aaatacagac atgaaaaatc 50 tcattgctga gttgttattt aagcttgccc aaaaagaaga agagtcgaat 100 gaactgtgtg cgcaggtaga agctttggag attatcgtca ctgcaatgct 150 tcgcaatatg gcgcaaaatg accaacagcg gttgattgat caggtagagg 200 gggcgctgta cgaggtaaag cccgatgcca gcattcctga cgacgatacg 250 gagctgctgc gcgattacgt aaagaagtta ttgaagcatc ctcgtcagta 300 aaaagttaat cttttcaaca gctgtcataa agttgtcacg gccgagactt 350 atagtcgctt tgtttttatt ttttaatgta tttgtaacta gaattcgagc 400 tcggtacccg gggatcctct agaggttgag gtgatttatg aaaaagaata 450 tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaacgcg 500 tacgctcaga tagtactgtc ccagtccccg gctatcctgt ccgcctctcc 550 tggcgagaag gtcactatga cctgcagagc cagctcttct gtgagctata 600 tgcattggta tcaacagaaa ccaggaagct ctccgaaacc atggatttac 650 gctccatcga acctcgcgtc tggagtccct gcgcgcttct ctggatccgg 700 ttctgggact agttactctc tgaccatcag cagagtggag gcagaagacg 750 ccgcaactta ttactgtcaa cagtggagct tcaatccgcc cacatttgga 800 gccggcacca agctggagct caaacgaact gtggctgcac catctgtctt 850 catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcttctgttg 900
HU 227 217 Β1 tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 950 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca 1000 ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca 1050 aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 1100 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttaagc 1150 tgatcctcta cgccggacgc atcgtggccc tagtacgcaa gttcacgtaa 1200 aaagggtatc tagaggttga ggtgatttta tgaaaaagaa tatcgcattt 1250 cttcttgcat ctatgttcgt tttttctatt gctacaaacg cgtacgctca 1300 ggcttatctg cagcagtctg gcgccgagct ggtgcggcca ggagctagcg 1350 tcaagatgtc ctgtaaagct tctggctaca ccttcaccag ctataacatg 1400 cattgggtca agcagacacc gaggcaaggc ctggaatgga ttggagcgat 1450 ctatcctggc aacggcgaca cgagctataa ccagaagttc aagggcaagg 1500 ccactctgac tgtggacaag tccagcagta ctgcctacat gcaactgagc 1550 agcctgactt ctgaggacag cgctgtctac ttttgtgctc gcgtggtcta 1600 ctatagcaac agctactggt acttcgacgt ctggggtacc ggaaccacag 1650 tcaccgtctc ctcggcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 1700 ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt 1750 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 1800 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 1850 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca 1900 gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca 1950 agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg accaccgcat 2000 gcaccagtat cgtccattcc gacagcatcg ccagtcacta tggcgtgctg 2050 ctagcgccgc cctatacctt gtctgcctcc ccgcgttgcg tcgcggtgca 2100 tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac 2150 ggattcacca ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt 2200 gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct 2250 ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg 2300 gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg 2350 ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa 2400 gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc 2450 ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg 2500 caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 2550 gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt 2600 tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg 2650 ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc 2700 tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa ttccccctta 2750 cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc 2800 cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 2850 ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg 2900 atgagcttta ccgcagcatc cggaaattgt aaacgttaat attttgttaa 2950 aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 3000 gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt 3050 gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact 3100 ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggctatgg cccactacgt 3150 gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 3200 aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 3250 cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 3300 agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc 3350 cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc cgcatcctgc ctcgcgcgtt 3400 tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 3450 acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 3500 gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta 3550 gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 3600 tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 3650 agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3700 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 3750 taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 3800 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 3850 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3900
HU 227 217 Β1 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 3950 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4000 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 4050 gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 4100 ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 4150 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 4200 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 4250 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 4300 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 4350 gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 4400 gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 4450 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 4500 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 4550 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4600 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 4650 tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 4700 actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 4750 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 4800 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 4850 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 4900 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct 4950 cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 5000 gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 5050 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 5100 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 5150 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 5200 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac 5250 atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 5300 aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 5350 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 5400 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 5450 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5500 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 5550 agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 5600 cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 5650 gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaa 5678 <21O> 17 <211 >236 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is chimeric <400> 17
Met 1 Lys Lys Asn Ile 5 Alá Phe Leu Leu Alá 10 Ser Met Phe Val Phe 15
Ser Ile Alá Thr Asn 20 Alá Tyr Alá Gin Ile 25 Val Leu Ser Gin Ser 30
Pro Alá Ile Leu Ser 35 Alá Ser Pro Gly Glu 40 Lys Val Thr Met Thr 45
Cys Arg Alá Ser Ser 50 Ser Val Ser Tyr Met 55 His Trp Tyr Gin Gin 60
Lys Pro Gly Ser Ser 65 Pro Lys Pro Trp Ile 70 Tyr Alá Pro Ser Asn 75
HU 227 217 Β1
Leu Alá Ser Gly Val 80 Pro Alá Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Alá Glu Asp Alá
95 100 105
Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe
110 115 120
Gly Alá Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Alá Alá Pro
125 130 135
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
140 145 150
Thr Alá Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
155 160 165
Alá Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Alá Leu Gin Ser Gly Asn
170 175 180
Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
185 190 195
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Alá Asp Tyr Glu Lys
200 205 210
His Lys Val Tyr Alá Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
215 220 225
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
230 235 <210> 18 <211 >253 <212> PRT <213> Artificial sequence
<220: >
<223: > Sequence is chimeric
<400: > 18
Met Lys Lys Asn Ile Alá Phe Leu Leu Alá Ser Met Phe Val Phe
1 5 10 15
Ser Ile Alá Thr Asn Alá Tyr Alá Gin Alá Tyr Leu Gin Gin Ser
20 25 30
Gly Alá Glu Leu Val Arg Pro Gly Alá Ser Val Lys Met Ser Cys
35 40 45
Lys Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val
50 55 60
Lys Gin Thr Pro Arg Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Alá Ile Tyr
65 70 75
Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys
80 85 90
HU 227 217 Β1
Alá Thr Leu Thr Val Asp Lys 95 Ser Ser Ser Thr Alá 100 Tyr Met Gin 105
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Alá Val Tyr Phe Cys Alá
110 115 120
Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
125 130 135
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly
140 145 150
Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
155 160 165
Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
170 175 180
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val
185 190 195
His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
200 205 210
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
215 220 225
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
230 235 240
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
245 250
<210> 19 <211 > 5391 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 19 ttcgagctcg cccgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 50 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 100 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 150 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 200 ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 250 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 300 aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 350 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 400 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 450 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 500 aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 550 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 600 ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 650 ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 700 ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga 750 gtctataggc ccaccccctt ggcttcgtta gaacgcggct acaattaata 800 cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac tatagaataa 850 catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc 900
HU 227 217 Β1 acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc 950 tttttctagt agcaactgca actggagtac attcagatat ccagatgacc 1000 cagtccccga gctccctgtc cgcctctgtg ggcgataggg tcaccatcac 1050 ctgccgtgcc agtcaggaca tccgtaatta tttgaactgg tatcaacaga 1100 aaccaggaaa agctccgaaa ctactgattt actatacctc ccgcctggag 1150 tctggagtcc cttctcgctt ctctggttct ggttctggga cggattacac 1200 tctgaccatc agtagtctgc aaccggagga cttcgcaact tattactgtc 1250 agcaaggtaa tactctgccg tggacgttcg gacagggcac caaggtggag 1300 atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga 1350 tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact 1400 tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 1450 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac 1500 ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 1550 acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 1600 acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa gcttggccgc catggcccaa 1650 cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 1700 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1750 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcgatcggg aattaattcg 1800 gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt 1850 accttctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1900 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 1950 tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 2000 agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc 2050 cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 2100 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc 2150 tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 2200 aggcttttgc aaaaagctgt taacagcttg gcactggccg tcgttttaca 2250 acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 2300 cacatccccc cttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 2350 cgcccttccc aacagttgcg tagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg 2400 gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa 2450 gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 2500 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 2550 cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 2600 tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 2650 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg 2700 ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 2750 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 2800 cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 2850 ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 2900 attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 2950 ccgcatagtt aagccaactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg 3000 cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 3050 ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 3100 gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagtattctt 3150 gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 3200 ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 3250 cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 3300 tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 3350 agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 3400 attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 3450 atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 3500 aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 3550 gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgatg 3600 acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 3650 ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 3700 agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 3750 ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 3800 ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 3850 gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgccagcag 3900
HU 227 217 Β1 caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 3950 gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 4000 accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 4050 ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 4100 gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 4150 aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 4200 ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 4250 gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 4300 tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 4350 cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4400 ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 4450 ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 4500 gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 4550 ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 4600 gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 4650 ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4700 tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 4750 cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg 4800 aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 4850 gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 4900 tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 4950 caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5000 ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 5050 ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 5100 ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 5150 gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 5200 ttaatccagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc 5250 gcaacgcaat taatgtgagt tacctcactc attaggcacc ccaggcttta 5300 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 5350 atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgaatta a 5391 <21O> 20 <211 >6135 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 20 attcgagctc gcccgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 50 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 100 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 150 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 200 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 250 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 300 taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 350 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 400 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 450 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 500 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 550 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg 600 tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 650 tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc 700 attggaacgc ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag 750 agtctatagg cccaccccct tggcttcgtt agaacgcggc tacaattaat 800 acataacctt atgtatcata cacatacgat ttaggtgaca ctatagaata 850 acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca ggtccaactg 900 cacctcggtt ctatcgattg aattccacca tgggatggtc atgtatcatc 950 ctttttctag tagcaactgc aactggagta cattcagaag ttcagctggt 1000
HU 227 217 Β1 ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct 1050 gtgcagcttc tggctactcc tttaccggct acactatgaa ctgggtgcgt 1100 caggccccag gtaagggcct ggaatgggtt gcactgatta atccttataa 1150 aggtgttact acctatgccg atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg 1200 tagataaatc caaaaacaca gcctacctgc aaatgaacag cctgcgtgct 1250 gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga agcggatact acggcgatag 1300 cgactggtat tttgacgtct ggggtcaagg aaccctggtc accgtctcct 1350 cggcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 1400 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt 1450 ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg 1500 tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 1550 agcgtggtga ctgtgccctc tagcagcttg ggcacccaga cctacatctg 1600 caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc 1650 ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 1700 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac 1750 cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 1800 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1850 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta 1900 ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca 1950 aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 2000 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac 2050 cctgccccca tcccgggaag agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 2100 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 2150 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc 2200 cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt 2250 ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 2300 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgagtgcg 2350 acggccctag agtcgacctg cagaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 2400 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 2450 acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 2500 catcaatgta tcttatcatg tctggatcga tcgggaatta attcggcgca 2550 gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt 2600 ctgaggcgga aagaaccatc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa 2650 agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 2700 tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 2750 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 2800 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 2850 catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 2900 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct 2950 tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 3000 gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 3050 ccccccttcg ccagttggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 3100 ttcccaacag ttgcgtagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt 3150 ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac 3200 catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt 3250 acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 3300 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 3350 ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 3400 ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc 3450 gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 3500 atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc 3550 tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 3600 aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 3650 cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 3700 tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc 3750 cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 3800 ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 3850 agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagta ttcttgaaga 3900 cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 3950 aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 4000
HU 227 217 Β1 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 4050 agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 4100 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 4150 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 4200 gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 4250 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 4300 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgatgacgcc 4350 gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 4400 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 4450 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 4500 ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 4550 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4600 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc agcagcaatg 4650 gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 4700 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 4750 ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 4800 gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 4850 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 4900 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 4950 cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 5000 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 5050 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 5100 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 5150 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 5200 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 5250 agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 5300 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 5350 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 5400 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 5450 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 5500 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 5550 agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 5600 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 5650 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 5700 gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 5750 ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5800 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 5850 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 5900 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 5950 ccaactggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 6000 gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 6050 tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6100 acacaggaaa cagctatgac catgattacg aatta 6135 <210> 21 <211 >232 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 21
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Alá Thr Alá Thr
1 5 10 15
Gly Val His Ser Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
HU 227 217 Β1
Ser Alá Ser Val Gly 35 Asp Arg Val Thr Ile 40 Thr Cys Arg Alá Ser 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Alá Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly
65 70 75
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
80 85 90
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr
95 100 105
Cys Gin Gin Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr
110 115 120
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Alá Alá Pro Ser Val Phe Ile
125 130 135
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Alá Ser Val
140 145 150
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Alá Lys Val Gin
155 160 165
Trp Lys Val Asp Asn Alá Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser
170 175 180
Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
185 190 195
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Alá Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
200 205 210
Alá Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
215 220 225
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
230 <21O> 22 <211 >471 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized
<400 22 Trp Ser Cys 5 Ile Ile Leu Phe Leu 10 Val Alá Thr Alá Thr 15
Met 1 Gly
Gly Val His Ser Glu 20 Val Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30
Val Gin Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Alá Alá Ser Gly 45
HU 227 217 Β1
Tyr Thr Phe Thr Ser 50 Tyr Asn Met His Trp 55 Val Arg Gin Alá Pro 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
65 70 75
Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
80 85 90
Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
95 100 105
Arg Alá Glu Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr
110 115 120
Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
125 130 135
Leu Val Thr Val Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
140 145 150
Pro Leu Alá Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá
155 160 165
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
170 175 180
Ser Trp Asn Ser Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
185 190 195
Alá Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
200 205 210
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn
215 220 225
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro
305 310 315
Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
320 325 330
Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
335 340 345
HU 227 217 Β1
Lys Val Ser Asn Lys 350 Alá Leu Pro Alá Pro 355 Ile Glu Lys Thr Ile 360
Ser Lys Alá Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
365 370 375
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr
380 385 390
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp
395 400 405
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
410 415 420
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
425 430 435
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
440 445 450
Val Met His Glu Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
455 4 60 465
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
470 <21O> 23 <211 >471 <212> PRT <213> Artificial sequence
<220: >
<223: > Sequence is synt hesize id
<400: >23
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Alá Thr Alá Thr
1 5 10 15
Gly Val His Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
65 70 75
Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
80 85 90
Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
95 100 105
Arg Alá Glu Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr
110 115 120
HU 227 217 Β1
Tyr Ser Asn Ser Tyr 125 Trp Tyr Phe Asp Val 130 Trp Gly Gin Gly Thr 135
Leu Val Thr Val Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
140 145 150
Pro Leu Alá Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá
155 160 165
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
170 175 180
Ser Trp Asn Ser Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
185 190 195
Alá Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
200 205 210
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lle Cys Asn
215 220 225
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Lle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro
305 310 315
Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Alá Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
320 325 330
Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
335 340 345
Lys Val Ser Asn Lys Alá Leu Pro Alá Pro lle Alá Alá Thr lle
350 355 360
Ser Lys Alá Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
365 370 375
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr
380 385 390
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Lle Alá Val Glu Trp
395 400 405
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
410 415 420
HU 227 217 Β1
Val Leu Asp Ser Asp 425 Gly Ser Phe Phe Leu 430 Tyr Ser Lys Leu Thr 435
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
440 445 450
Val Met His Glu Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
455 4 60 465
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
470 <210 24 <211 >891 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400 24 atgacaacac gaaaggccct tgtcttcact gctttggggg gggtcttctg tgtggtaccc ctggcagcaa gataatgaat caatcatgga agtctgaatt tgaaccagct acagcataca gccttcttcc aagaacatgc ct ct ct ct ct ct ct ct CJ ct gaaacatctt ccaagaagag aagatcagga ccagaaattc attgctatgc ggtgggtccc ctgtccagat atgatcccag tctgtgggga cggagaaaaa tcattgagcc catacttaat ttatcagagt aatccctctg atctctgttc aggaacttgt tccagaccca acaagtcatt cccaaccaaa gaagaagaag atcttcacca agtaaatggg aacctggtcc acgcaaagct tatgaatggg cagggatcta ggcattatgt ctccaggaag tctttgctgc attaaaattt tcacacacca agaaaaactc ctgggcattt aatagctggc aatctagcgt gaaataaaag gaatgaagaa aaacagagac atagaaaatg actttcccag aaaaccactc tcttcatgag ctcttccaca tgcacccatc atattatttc tgtttggtca catttctgga cccatttttt tatattaaca tccatctact tgtcagtgat atcgttgaga agttctcctg aagaagtggt gccattgaaa aaactttcca acagctctcc cagagccaat ctcaggagga ggaatctaag ttgccctggg tgtgtgactg cggatcactc aaggaaaaat atgattcttt aaaaatggag tatacaactg caatactgtt gctgatcttt atgaatggag tcagctgaag tgggctaact ttattccaat gaacctcccc t
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
891 <210> 25 <211 >297 <212> PRT <213> Macaca fascicularis
<400> 25 Alá Glu 15
Met 1 Thr Thr Pro Arg Asn 5 Ser Val Asn Gly 10 Thr Phe Pro
Pro Met Lys Gly Pro Ile Alá Met Gin Pro Gly Pro Lys Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gin Ser Phe Phe
35 40 45
Met Arg Glu Ser Lys Alá Leu Gly Alá Val Gin Ile Met Asn Gly
50 55 60
Leu Phe His He Alá Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Alá Gly
65 70 75
He Tyr Alá Pro He Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly
80 85 90
HU 227 217 Β1
Gly Ile Met Tyr Ile 95 Ile Ser Gly Ser Leu 100 Leu Alá Alá Thr Glu 105
Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn
110 115 120
Ser Leu Ser Leu Phe Alá Alá Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile
125 130 135
Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu
140 145 150
Ser Leu Asn Phe Ile Arg Val His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr
155 160 165
Asn Cys Glu Pro Alá Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr
170 175 180
Gin Tyr Cys Tyr Ser Ile Gin Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser
185 190 195
Val Met Leu Ile Phe Alá Phe Phe Gin Glu Leu Val Ile Alá Gly
200 205 210
Ile Val Glu Asn Glu Trp Arg Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser
215 220 225
Ser Val Val Leu Leu Ser Alá Glu Glu Lys Lys Glu Gin Val Ile
230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gin
245 250 255
Pro Lys Asn Glu Glu Alá Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gin Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gin Asp
275 280 285
Gin Glu Ser Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295 <21O> 26 <211 >297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Met 1 Thr Thr Pro Arg 5 Asn Ser Val Asn Gly 10 Thr Phe Pro Alá Glu 15
Pro Met Lys Gly Pro Ile Alá Met Gin Ser Gly Pro Lys Pro Leu
20 25 30
Phe Arg Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gin Ser Phe Phe
35 40 45
Met Arg Glu Ser Lys Alá Leu Gly Alá Val Gin Ile Met Asn Gly
50 55 60
HU 227 217 Β1
Leu Phe His Ile Alá 65 Leu Gly Gly Leu Leu 70 Met Ile Pro Alá Gly 75
Ile Tyr Alá Pro Ile Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly
80 85 90
Gly Ile Met Tyr Ile Ile Ser Gly Ser Leu Leu Alá Alá Thr Glu
95 100 105
Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn
110 115 120
Ser Leu Ser Leu Phe Alá Alá Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile
125 130 135
Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu
140 145 150
Ser Leu Asn Phe Ile Arg Alá His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr
155 160 165
Asn Cys Glu Pro Alá Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr
170 175 180
Gin Tyr Cys Tyr Ser Ile Gin Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser
185 190 195
Val Met Leu Ile Phe Alá Phe Phe Gin Glu Leu Val Ile Alá Gly
200 205 210
Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser
215 220 225
Asn Ile Val Leu Leu Ser Alá Glu Glu Lys Lys Glu Gin Thr Ile
230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gin
245 250 255
Pro Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gin Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gin Asp
275 280 285
Gin Glu Ser Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 27 <211 >36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220 <223> Sequence is synthesized <400 27 ctacaccttc acgagctata acatgcactg ggtccg 36
HU 227 217 Β1 <210> 28 <211 >51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220 <223> Sequence is synthesized <400 28 gattaatcct gacaacggcg acacgagcta taaccagaag ttcaagggcc g <210 29 <211 >38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 29 gaatgggttg cagcgatcta tcctggcaac ggcgacac <210> 30 <211 >65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 30 attattgtgc tcgagtggtc tactatagca acagctactg gtacttcgac gtctggggtc aagga <210> 31 <211 >36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220 <223> Sequence is synthesized <400> 31 ctgcacagcc agctcttctg tcagctatat gcattg <210 32 <211 >42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 32 aactactgat ttacgctcca tcgaacctcg cgtctggagt cc <210 33 <211 >45
HU 227 217 Β1 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 33 tattactgtc aacagtggag cttcaatccg cccacatttg gacag <210> 34 <211 >37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400> 34 gtttcactat aagtgtcgac aagtccaaaa acacatt <210> 35 <211 >33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220 <223> Sequence is synthesized <400> 35 gccaggatag atggcgccaa cccattccag gcc <210> 36 <211 >26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220 <223> Sequence is synthesized <400 36 aagctccgaa accactgatt tacgct <210 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Sequence is synthesized <400 37 agttttgaga gcaaaatg <210 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Sequence is synthesized
HU 227 217 Β1 <400> 38 aagctatgaa cactaatg 18 <210> 39 <211 >452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized
<400> 39
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
HU 227 217 Β1
Gly Gly Pro Ser Val 245 Phe Leu Phe Pro Pro Lys 250 Pro Lys Asp Thr 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys <21O> 40 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized <400> 40
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
HU 227 217 Β1
Tyr Met His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Alá Pro Lys Pro 45
Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg Thr Val Alá Alá Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
110 115 120
Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Alá Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Alá Lys Val Gin Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Alá Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Alá Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Alá Cys Glu Val
185 190 195
Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
200 205 210
Gly Glu Cys
<210> 41 <211 >452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220 <223> sequence is synthesized <400 41
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
HU 227 217 Β1
Asn Gin Lys Phe Lys 65 Gly Arg Phe Thr Lle 70 Ser Val Asp Lys Ser 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Lle Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
Tyr Asn Alá Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Alá Leu Pro Alá Pro Lle Alá Alá Thr Lle Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
HU 227 217 Β1
Glu Glu Met Thr Lys 365 Asn Gin Val Ser Leu 370 Thr Cys Leu Val Lys 375
Gly Phe Tyr Pro Ser 380 Asp He Alá Val Glu 385 Trp Glu Ser Asn Gly 390
Gin Pro Glu Asn Asn 395 Tyr Lys Thr Thr Pro 400 Pro Val Leu Asp Ser 405
Asp Gly Ser Phe Phe 410 Leu Tyr Ser Lys Leu 415 Thr Val Asp Lys Ser 420
Arg Trp Gin Gin Gly 425 Asn Val Phe Ser Cys 430 Ser Val Met His Glu 435
Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys <21O> 42 <211 >452 <212> PRT <213> Artificial sequence
<220: >
<223: > sequ lence i s syntl nesize' d
<400: >42
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Alá Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
HU 227 217 Β1
Val Lys Asp Tyr Phe 155 Pro Glu Pro Val Thr Val 160 Ser Trp Asn Ser 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
Tyr Asn Alá Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Alá Alá Thr Ile Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
HU 227 217 Β1
Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450
Gly Lys <210> 43 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized
<400> 43 Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Alá Ser Val 15
Asp 1 Ile
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg Thr Val Alá Alá Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
110 115 120
Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Alá Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Alá Lys Val Gin Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Alá Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Alá Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Alá Cys Glu Val
185 190 195
Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
200 205 210
Gly Glu Cys
<210> 44 <211 >452
HU 227 217 Β1 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized
<400> 44 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15
Glu 1 Val Gin Leu Val 5
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Alá Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Alá Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
HU 227 217 Β1
Val Ser His Glu Asp 275 Pro Glu Val Lys Phe 280 Asn Trp Tyr Val Asp 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys <21O> 45 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence
<220: >
<223: > sequ lence i s syntl iesiz& d
<400: >45
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
HU 227 217 Β1
Phe Ser Gly Ser Gly 65 Ser Gly Thr Asp Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Alá Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg Thr Val Alá Alá Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
110 115 120
Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Alá Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Alá Lys Val Gin Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Alá Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Alá Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Alá Cys Glu Val
185 190 195
Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
200 205 210
Gly Glu Cys <21O> 46 <211 >452 <212> PRT <213> Artificial sequence
<220: >
<223: > sequ lence i s syntl lesize' d
<400: >46
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Alá Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
HU 227 217 Β1
Thr Alá Val Tyr Tyr 95 Cys Alá Arg Val Val 100 Tyr Tyr Ser Alá Ser 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
Tyr Asn Alá Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Alá Alá Thr Ile Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
HU 227 217 Β1
Gin Pro Glu Asn Asn 395 Tyr Lys Thr Thr Pro 400 Pro Val Leu Asp Ser 405
Asp Gly Ser Phe Phe 410 Leu Tyr Ser Lys Leu 415 Thr Val Asp Lys Ser 420
Arg Trp Gin Gin Gly 425 Asn Val Phe Ser Cys 430 Ser Val Met His Glu 435
Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys <21O> 47 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220 <223> sequence is synthesized <400 47
Asp 1 Lle Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Alá Ser Val 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Alá Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg Thr Val Alá Alá Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
110 115 120
Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Alá Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Alá Lys Val Gin Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Alá Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
HU 227 217 Β1
Ser Lys Alá Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Alá Cys Glu Val 185 190 195
Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 200 205 210
Gly Glu Cys <210> 48 <211 >452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized
<400> 48 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 10 Gin Pro Gly 15
Glu 1 Val Gin Leu Val 5
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Lle Tyr Pro Gly Asn Gly Alá Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Alá Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lle Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
HU 227 217 Β1
Pro Ser Asn Thr Lys 215 Val Asp Lys Lys Val 220 Glu Pro Lys Ser Cys 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
Tyr Asn Alá Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Alá Alá Thr Ile Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys <210> 49 <211 >452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized
HU 227 217 Β1
<400> 49 Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 10 Gin Pro Gly 15
Glu 1 Val Gin
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Gin Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Alá Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Alá Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
HU 227 217 Β1
Tyr Asn Alá Thr Tyr 305 Arg Val Val Ser Val 310 Leu Thr Val Leu His 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Alá Val Ser Asn
320 325 330
Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Glu Alá Thr Ile Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys <21O> 50 <211 >452 <212> PRT <213> Artificial sequence
<220: >
<223: > sequ lence i s syntl lesize' d
<400: > 50
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Alá Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
HU 227 217 Β1
Thr Alá Val Tyr Tyr 95 Cys Alá Arg Val Val 100 Tyr Tyr Ser Alá Ser 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Alá Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Alá Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Alá Alá Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Alá Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Alá Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295 300
Tyr Asn Alá Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Alá Alá Leu Pro Alá Pro He Alá Alá Thr He Ser Lys Alá Lys
335 340 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Alá Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
HU 227 217 Β1
Gin Pro Glu Asn Asn 395 Tyr Lys Thr Thr Pro 400 Pro Val Leu Asp Ser 405
Asp Gly Ser Phe Phe 410 Leu Tyr Ser Lys Leu 415 Thr Val Asp Lys Ser 420
Arg Trp Gin Gin Gly 425 Asn Val Phe Ser Cys 430 Ser Val Met His Glu 435
Alá Leu His Asn His 440 Tyr Thr Gin Lys Ser 445 Leu Ser Leu Ser Pro 450
Gly Lys <210> 51 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220 <223> sequence is synthesized
<400> 51 Gly Gly Leu 10 Val Gin Pro Gly 15
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Alá Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Alá Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Val Val Tyr Tyr Ser Alá Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser <210 52 <211>107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized <400 52
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val 15 10 15
HU 227 217 Β1
Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Alá 25 Ser Ser Ser Val Ser 30
Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Alá Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> sequence is synthesized <400> 53
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Alá Ser Val 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Alá Pro Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp
80 85 90
Alá Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg

Claims (66)

1. Humán CD20-at megkötő humanizált antitest vagy antigénkötő fragmense, mely antitest 8. azonosító számú VH-szekvenciát és 2. azonosító számú VL-szekvenciát tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 22. azonosító számú szekvencia 20—471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló nehéz lánc aminosavszekvenciát és a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló könnyű lánc aminosavszekvenciát tartalmaz.
HU 227 217 Β1
3. Az 1. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 22. azonosító számú szekvencia 20—471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló nehéz lánc aminosavszekvenciát és a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló könnyű lánc aminosavszekvenciát tartalmaz, továbbá S298A/E333A/K334A aminosavszubsztitúciókat tartalmaz, ahol az S298, E333 és K334 aminosavak számozása az EU-számozás szerinti.
4. Az 1. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 22. azonosító számú szekvencia 20—471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló nehéz lánc aminosavszekvenciát és a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló könnyű lánc aminosavszekvenciát tartalmaz, továbbá K326A vagy K326W aminosavszubsztitúciót tartalmaz, ahol a K326 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
5. A 3. igénypont szerinti humanizált antitest, amelyben az Fc-régió a K326A aminosavszubsztitúciót is tartalmazza, ahol a K326 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
6. Az 1. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 22. azonosító számú szekvencia 20—471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló nehéz lánc aminosavszekvenciát és a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló könnyű lánc aminosavszekvenciát tartalmaz, továbbá K322A aminosavszubsztitúciót tartalmaz, ahol a K322 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti humanizált antitest vagy antigénkötő fragmens, amely citotoxikus szerhez van konjugálva.
8. A 7. igénypont szerinti humanizált antitest vagy antigénkötő fragmens, amely citotoxikus szerként radioaktív izotóphoz vagy toxinhoz van konjugálva.
9. Készítmény, amely az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antigénkötő fragmenst és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
10. Folyékony készítmény, amely az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antigénkötő fragmenst 20 mg/ml koncentrációban, 10 mM hisztidinszulfátot (pH=5,8), 60 mg/ml szacharózt és 0,2 mg/ml poliszorbát-20-at tartalmaz.
11. Gyártmány, amely egy tartályt és abban elhelyezett készítményt tartalmaz, mely készítmény az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antigénkötő fragmenst tartalmazza.
12. A 11. igénypont szerinti gyártmány, amely tartalmaz egy termékismertetőt is, amelyen fel van tüntetve, hogy a készítmény alkalmazható non-Hodgkin-limfóma és/vagy rheumatoid arthritis kezelésére.
13. Izolált nukleinsav, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antigénkötő fragmenst kódol.
14. Expressziós vektor, amely a 13. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
15. Gazdasejt, amely a 13. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
16. A 15. igénypont szerinti gazdasejt, amely egy CHO-sejt.
17. Eljárás humanizált antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti antitestet termelő gazdasejtet tenyésztünk, és a sejttenyészetből kivonjuk az antitestet vagy antigénkötő fragmenst.
18. Antitest vagy antigénkötő fragmense, amely a 22. azonosító számú szekvencia 20-471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló nehéz lánc aminosavszekvenciát és a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló könnyű lánc aminosavszekvenciát tartalmazó antitestet vagy annak antigénkötő fragmensét kódoló nukleinsav gazdasejtben történő expresszáltatását, és a gazdasejtben expresszált antitest vagy antigénkötő fragmense kinyerését magában foglaló eljárással van előállítva.
19. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antigénkötő fragmens alkalmazása B-sejtek apoptózisának in vivő indukálására alkalmas gyógyszer előállítására, mely indukálás a B-sejtek antitesttel történő érintkeztetését foglalja magában, ami a B-sejtek elpusztítását eredményezi.
20. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antigénkötő fragmens alkalmazása CD20-pozitív rák kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására, mely kezelés az antitest vagy antigénkötő fragmens terápiásán hatásos mennyiségének rákban szenvedő páciensnek történő adagolását foglalja magában.
21. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet vagy antigénkötő fragmenst olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely CD20-pozitív rákként B-sejt-limfóma vagy leukémia kezelésére alkalmas.
22. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet vagy antigénkötő fragmenst olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely CD20-pozitív rákként non-Hodgkin-limfóma (NHL) vagy limfocita-túlsúlyos Hodgkin-kór (LPHD) kezelésére alkalmas.
23. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely CD20-pozitív rákként krónikus limfocitikus leukémia (CLL) vagy kis limfocitás limfóma (SLL) kezelésére alkalmas.
24. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest vagy antigénkötő fragmens körülbelül 250 mg/m2től körülbelül 500 mg/m2-ig terjedő dózistartományban adagolandó.
25. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest vagy antigénkötő fragmens körülbelül 275 mg/m2től körülbelül 375 mg/m2-ig terjedő dózistartományban adagolandó.
26. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a páciensnek az antitest vagy antigénkötő fragmens legalább két (dózisonként 375 mg/m2 nagyságú) dózisa adagolandó.
27. A 26. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a két dózis egymáshoz képest két hét időkülönbséggel kerül beadásra.
HU 227 217 Β1
28. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a páciensnek legalább egy kemoterápiás hatóanyag is adagolandó.
29. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet vagy antigénkötő fragmenst olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely rákként non-Hodgkinlimfóma (NHL) kezelésére alkalmas, és a kemoterápiás hatóanyag a következőkből álló csoportból van kiválasztva: doxorubicin, ciklofoszfamid, vincristin, prednisolon és CHOP.
30. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antigénkötő fragmens alkalmazása autoimmun betegség kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására, mely kezelés az antitest terápiásán hatásos mennyiségének autoimmun betegségben szenvedő páciensnek történő adagolását foglalja magában.
31. A 30. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet vagy antigénkötő fragmenst olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely autoimmun betegségként a következők közül kiválasztott betegség kezelésére alkalmas: rheumatoid arthritis, fiatalkori rheumatoid arthritis, szisztémás lupus erythematosus (SLE), lupus nephritis, fekélyes vastagbélgyulladás, Wegenerbetegség, gyulladásos bélbetegség, idiopathiás thrombocytopeniás purpura (ITP), thromboticus thrombocytopeniás purpura (TTP), autoimmun thrombocytopenia, sclerosis multiplex, psoriasis, IgA-nephropathia, IgMpolineuropathiák, myasthenia gravis, vasculitis, ANCA vasculitis, transzplantált kemény szerv elleni kilökődési reakció, graft-versus-host betegség, diabetes mellitus, Reynaud-szindróma, Sjorgen-szindróma és glomerulonephritis.
32. A 31. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitestet vagy antigénkötő fragmenst olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely autoimmun betegségként rheumatoid arthritis kezelésére alkalmas.
33. A 32. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a páciens enyhétől súlyos fokúig diagnosztizálható rheumatoid arthritisben szenved, és legalább egy betegségmódosító reumaellenes hatóanyaggal végzett kezelése sikertelen volt.
34. A 32. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a páciensnek egy második terápiás hatóanyag adagolandó.
35. A 34. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a második terápiás hatóanyag egy immunszuppresszív hatóanyag.
36. A 35. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immunszuppresszív hatóanyag a methotrexat.
37. A 32. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest vagy antigénkötő fragmens a következők közül kiválasztott dózissal adagolandó: 2x10 mg, 2x50 mg, 2x200 mg és 2x500 mg.
38. A 37. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest vagy antigénkötő fragmens intravénás infúzióval adagolandó.
39. A 37. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest vagy antigénkötő fragmens szubkután adagolással adagolandó.
40. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antigénkötő fragmens alkalmazása rheumatoid arthritis (RA) emberben történő kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására, ahol az antitest vagy antigénkötő fragmens a következők közül kiválasztott dózisban adagolandó: 2x10 mg, 2x50 mg, 2x200 mg és 2x500 mg.
41. A 40. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a dózis 2x50 mg.
42. A 40. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a dózis 2x200 mg.
43. A 40. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a dózis 2x500 mg.
44. A 40. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rheumatoid arthritis enyhétől súlyos fokúig terjedő rheumatoid arthritis.
45. Humán CD20-at megkötő humanizált antitest, amely a 23. azonosító számú szekvencia 20—471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló nehéz lánc aminosavszekvenciát és a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló könnyű lánc aminosavszekvenciát tartalmazza.
46. Humán CD20-at megkötő humanizált antitest, amely a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló könnyű lánc aminosavszekvenciát és a 23. azonosító számú szekvencia 20-471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló nehéz lánc aminosavszekvenciát tartalmazza, ahol a VH-szekvenciában lévő N100 aminosav alaninnal (A) van helyettesítve, és a VL-szekvenciában lévő M32 aminosav leucinnal (L) van helyettesítve, és ahol az N100 és M32 aminosav számozása a Kabat-féle számozás szerinti.
47. Humán CD20-at megkötő humanizált antitest, amely a 8. azonosító számú VH-szekvenciát és 2. azonosító számú VL-szekvenciát tartalmazza, ahol a VHszekvenciában lévő D56 és N100 aminosav, és a VLszekvenciában lévő S92 aminosav egyaránt alaninnal (A) van helyettesítve, és ahol a D56, N100 és S92 aminosav számozása a Kabat-féle számozás szerinti.
48. A 47. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, S92A szubsztitúciót magában foglaló könnyű lánc aminosavszekvenciát és a 22. azonosító számú szekvencia 20-471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, D56A és N100A aminosavszubsztitúciót magában foglaló nehéz lánc aminosavszekvenciát tartalmazza, ahol az S92, D56 és N100 aminosav számozása a Kabatféle számozás szerinti.
49. Humán CD20-at megkötő humanizált antitest, amely a 8. azonosító számú VH-szekvenciát és 2. azonosító számú VL-szekvenciát tartalmazza, ahol a VHszekvenciában lévő D56 és N100 aminosav, és a VLszekvenciában lévő S92 aminosav egyaránt alaninnal (A) van helyettesítve, és a VL-szekvenciában lévő M32 aminosav leucinnal (L) van helyettesítve, és ahol a D56, N100, S92 és M32 aminosav számozása a Kabat-féle számozás szerinti.
50. A 49. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, M32L és
HU 227 217 Β1
S92A aminosavszubsztitúciót magában foglaló könnyű lánc aminosavszekvenciát, a 22. azonosító számú szekvencia 20-471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, D56A és N100A aminosavszubsztitúciót magában foglaló nehéz lánc aminosavszekvenciát, és az S298A, E333A és K334A aminosavszubsztitúciót magában foglaló Fc-régiót tartalmazza, ahol az M32, S92, D56 és N100 aminosav számozása a Kabat-féle számozás szerinti, és az S298, E333 és K334 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
51. A 49. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, M32L és S92A aminosavszubsztitúciót magában foglaló könnyű lánc aminosavszekvenciát, a 22. azonosító számú szekvencia 20^471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, D56A és N100A aminosavszubsztitúciót magában foglaló nehéz lánc aminosavszekvenciát, és az S298A, E333A, K334A, E356D és M358L aminosavszubsztitúciót magában foglaló Fc-régiót tartalmazza, ahol az M32, S92, D56 és N100 aminosav számozása a Kabat-féle számozás szerinti, és az S298, E333, K334, E356 és M358 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
52. A 49. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, M32L és S92A aminosavszubsztitúciót magában foglaló könnyű lánc aminosavszekvenciát, a 22. azonosító számú szekvencia 20-471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, D56A és N100A aminosavszubsztitúciót magában foglaló nehéz lánc aminosavszekvenciát, és az S298A, K334A és K322A aminosavszubsztitúciót magában foglaló Fc-régiót tartalmazza, ahol az M32, S92, D56 és N100 aminosav számozása a Kabat-féle számozás szerinti, és az S298, K334 és K322 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
53. A 49. igénypont szerinti humanizált antitest, amely a 21. azonosító számú szekvencia 20-232. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, M32L és S92A aminosavszubsztitúciót magában foglaló könnyű lánc aminosavszekvenciát, a 22. azonosító számú szekvencia 20-471. pozícióiban elhelyezkedő aminosavakból álló, D56A és N100A aminosavszubsztitúciót magában foglaló nehéz lánc aminosavszekvenciát, és az S298A, E333A, K334A és K326A aminosavszubsztitúciót magában foglaló Fc-régiót tartalmazza, ahol az M32, S92, D56 és N100 aminosav számozása a Kabat-féle számozás szerinti, és az S298, E333, K334 és K326 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
54. A 49. igénypont szerinti humanizált antitest, amelyben a VH-régió egy humán IgG lánc konstans régiójához kapcsolódik.
55. Az 54. igénypont szerinti humanizált antitest, amelyben a VH-régió humán lgG1 vagy lgG3 lánc konstans régiójához kapcsolódik.
56. Az 54. igénypont szerinti humanizált antitest, amelyben a VH-régió humán IgG 1 lánc konstans régiójához kapcsolódik.
57. Az 54. igénypont szerinti humanizált antitest, amelyben a VH-régió humán IgG 1 lánc konstans régiójához kapcsolódik, és az lgG1 Fc-régió S298A/ /E333A/K334A aminosavszubsztitúciókat tartalmaz, ahol az S298, E333 és K334 aminosav számozása az EU-számozás szerinti.
58. A 45-57. igénypontok bármelyike szerinti humanizált antitest antigénkötő fragmense.
59. Készítmény, amely a 45-57. igénypontok bármelyike szerinti humanizált antitestet vagy az 58. igénypont szerinti antigénkötő fragmenst, és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
60. Izolált nukleinsav, amely a 45-57. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy az 58. igénypont szerinti antigénkötő fragmenst kódolja.
61. Expressziós vektor, amely a 45-57. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy az 58. igénypont szerinti antigénkötő fragmenst kódolja.
62. Gazdasejt, amely a 60. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
63. A 62. igénypont szerinti gazdasejt, amely egy CHO-sejt.
64. Eljárás antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy a 45-57. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy az 58. igénypont szerinti antigénkötő fragmenst termelő sejtet tenyésztjük, és a sejttenyészetből kinyerjük az antitestet vagy az antigénkötő fragmenst.
65. Antitest, amely a következő lépésekből álló eljárással lett előállítva: a 45-57. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy az 58. igénypont szerinti antigénkötő fragmenst kódoló nukleinsav expresszáltatása, és a gazdasejtben expresszált antitest vagy antigénkötő fragmens kinyerése.
66. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti CD20kötő antitest vagy funkcionális fragmense terápiásán hatásos mennyiségének alkalmazása olyan gyógyszer előállítására, amely a következőkből álló csoportból kiválasztott autoimmun betegség kezelésére alkalmas: dermatomyositis, Wegner-féle granulomatosis, ANCA vasculitis, aplasztikus anaemia, autoimmun hemolitikus anaemia (AIHA), Vili. faktor deficiencia, haemophilia-A, autoimmun neutropenia, Castleman-szindróma, Goodpasture-szindróma, transzplantált kemény szerv elleni kilökődési reakció, graft-versus-host betegség (GVHD), IgM-közvetítette thromboticus thrombocytopeniás purpura (TTP), Hashimoto-thyroiditis, autoimmun hepatitis, limfoid interstitialis pneumonitis (HÍV), bronchiolitis obliterans (nem transzplantációval összefüggő) vs. NSIP, Guillain-Barre-szindróma, nagyereket érintő vasculitis, óriássejtes (Takayasu-féle) arteritis, közepes ereket érintő vasculitis, Kawasaki-betegség és poliarteritis nodosa.
HU0500954A 2002-12-16 2003-12-16 Immunoglobulin variants and uses thereof HU227217B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43411502P 2002-12-16 2002-12-16
US52616303P 2003-12-01 2003-12-01
PCT/US2003/040426 WO2004056312A2 (en) 2002-12-16 2003-12-16 Immunoglobulin variants and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0500954A2 HUP0500954A2 (en) 2007-09-28
HU227217B1 true HU227217B1 (en) 2010-11-29

Family

ID=32685285

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUE10179942A HUE035898T2 (hu) 2002-12-16 2003-12-16 Immunglobulin-változatok és alkalmazásaik
HU0500954A HU227217B1 (en) 2002-12-16 2003-12-16 Immunoglobulin variants and uses thereof
HUS1800030C HUS1800030I1 (hu) 2002-12-16 2018-06-27 Immunglobulin variánsok és alkalmazásaik

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUE10179942A HUE035898T2 (hu) 2002-12-16 2003-12-16 Immunglobulin-változatok és alkalmazásaik

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUS1800030C HUS1800030I1 (hu) 2002-12-16 2018-06-27 Immunglobulin variánsok és alkalmazásaik

Country Status (35)

Country Link
US (7) US7799900B2 (hu)
EP (5) EP2301966A1 (hu)
JP (3) JP4351674B2 (hu)
KR (2) KR20070055625A (hu)
CN (1) CN103833854B (hu)
AR (3) AR042485A1 (hu)
AT (1) ATE470675T1 (hu)
AU (1) AU2003301079C1 (hu)
BE (1) BE2018C021I2 (hu)
BR (2) BRPI0316779B8 (hu)
CA (1) CA2507898C (hu)
CL (1) CL2008003323A1 (hu)
CR (2) CR7875A (hu)
CY (2) CY1110759T1 (hu)
DE (1) DE60332957D1 (hu)
DK (2) DK1572744T3 (hu)
ES (2) ES2633311T3 (hu)
FR (1) FR18C1023I2 (hu)
HK (2) HK1074208A1 (hu)
HR (1) HRP20050649B1 (hu)
HU (3) HUE035898T2 (hu)
IL (2) IL168754A (hu)
MA (1) MA27704A1 (hu)
MX (1) MXPA05006511A (hu)
NO (1) NO338402B1 (hu)
NZ (1) NZ566907A (hu)
PL (1) PL212899B1 (hu)
PT (1) PT1572744E (hu)
RS (2) RS51318B (hu)
RU (1) RU2326127C2 (hu)
SG (1) SG2013036975A (hu)
SI (2) SI1572744T1 (hu)
TW (2) TWI335821B (hu)
UA (1) UA89350C2 (hu)
WO (1) WO2004056312A2 (hu)

Families Citing this family (990)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
DE69939939D1 (de) 1998-08-11 2009-01-02 Idec Pharma Corp Kombinationstherapien gegen b-zell-lymphome beinhaltend die verabreichung von anti-cd20-antikörpern
KR20010103655A (ko) 1998-11-09 2001-11-23 케네쓰 제이. 울코트 키메라 항-ｃｄ２０항체를 이용한 순환성 종양세포와관련된 혈액학적 악성종양의 치료법
DE69941903D1 (de) * 1998-11-09 2010-02-25 Biogen Idec Inc Behandlung von patienten die eine knochenmarktransplantation oder eine transplantation peripherer blutstammzellen erhalten mit anti-cd20 antikörpern
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2002544174A (ja) * 1999-05-07 2002-12-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂ細胞表面マーカーに結合するアンタゴニストを用いた自己免疫疾患の治療
NZ516491A (en) * 1999-07-12 2004-11-26 Idec Pharmaceuticals Inc Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to CD20
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
CA2422076A1 (en) * 2000-09-18 2002-03-21 Idec Pharmaceutical Corporation Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using b cell depleting/immunoregulatory antibody combination
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
HUP0600342A3 (en) * 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
DK1495055T3 (da) * 2002-04-18 2013-11-11 Genencor Int Produktion af funktionelle antistoffer i filamentøse svampe
EP2301966A1 (en) * 2002-12-16 2011-03-30 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JP2006522811A (ja) * 2003-04-09 2006-10-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＴＮＦαインヒビターに対して不十分な反応を示す患者の自己免疫疾患治療法
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
ES2537738T3 (es) * 2003-06-05 2015-06-11 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
LT2348051T (lt) 2003-11-05 2019-02-25 Roche Glycart Ag Cd20 antikūnai su padidintu fc receptoriaus prisijungimo giminingumu ir efektorine funkcija
WO2005063815A2 (en) * 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
CA2568336A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-22 Genentech, Inc. Method for treating lupus
CN102512675A (zh) 2004-06-04 2012-06-27 健泰科生物技术公司 用于治疗多发性硬化的方法
US20060019342A1 (en) * 2004-06-25 2006-01-26 Medimmune, Inc. Increasing the production of recombinant antibodies in mammalian cells by site-directed mutagenesis
WO2006085967A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
MX2007000748A (es) * 2004-07-22 2007-03-28 Genentech Inc Metodos para tratar el sindrome de sjogren.
EP2213683B1 (en) 2004-08-04 2013-06-05 Mentrik Biotech, LLC Variant Fc regions
KR20070057839A (ko) * 2004-08-19 2007-06-07 제넨테크, 인크. 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체
BRPI0516297A (pt) * 2004-10-05 2008-09-02 Genentech Inc métodos de tratamento de vasculite e artigos de fabricação
SV2006002258A (es) * 2004-10-08 2006-09-19 Wyeth Corp Inmunoterapia de trastornos autoinmunes
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
AU2005304624B2 (en) 2004-11-12 2010-10-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
FR2879204B1 (fr) * 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
US8993319B2 (en) 2004-12-28 2015-03-31 Innate Pharma S.A. Monoclonal antibodies against NKG2A
GT200600020A (es) * 2005-01-13 2006-11-08 Procedimiento de tratamiento
DOP2006000029A (es) * 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
TW200714289A (en) * 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
AR053579A1 (es) * 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
JP5315489B2 (ja) * 2005-04-26 2013-10-16 アール クレア アンド カンパニー エフェクター機能が増強されたヒトＩｇＧ抗体を作製する方法
AU2006252733A1 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Astrazeneca Ab Antibodies directed to CD20 and uses thereof
EP2298815B1 (en) 2005-07-25 2015-03-11 Emergent Product Development Seattle, LLC B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules
EP1924286A4 (en) * 2005-08-12 2010-01-13 Garvan Inst Med Res PROPHYLACTIC AND / OR THERAPEUTIC METHOD FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
EP1951757B1 (en) 2005-10-06 2014-05-14 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
EP3178850B1 (en) * 2005-10-11 2021-01-13 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
MY149159A (en) * 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
RU2426742C2 (ru) 2005-12-02 2011-08-20 Дженентек, Инк. Составы и способы лечения заболеваний и нарушений, связанных с передачей сигналов цитокинами
KR101589391B1 (ko) 2006-01-05 2016-01-29 제넨테크, 인크. 항-ｅｐｈｂ４ 항체 및 그의 사용 방법
CA2638133A1 (en) 2006-01-20 2007-11-08 Genentech, Inc. Anti-ephrinb2 antibodies and methods using same
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
EP2447282B1 (en) 2006-05-30 2016-01-27 Genentech, Inc. Anti-CD22 Antibodies, their Immunoconjugates and uses thereof
AU2007319672B2 (en) 2006-06-06 2011-06-30 Genentech, Inc. Anti-DLL4 antibodies and methods using same
FR2902799B1 (fr) 2006-06-27 2012-10-26 Millipore Corp Procede et unite de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide
BRPI0712953B8 (pt) 2006-06-30 2021-05-25 Novo Nordisk As anticorpos anti-nkg2a, seu uso, e composição farmacêutica
CA2656620C (en) 2006-07-04 2018-03-13 Genmab A/S Cd20 binding molecules for the treatment of copd
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
WO2008008482A2 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Genentech, Inc. Altered br3-binding polypeptides
WO2008011081A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Wsx-1/p28 as a target for anti-inflammatory responses
PL2059536T3 (pl) 2006-08-14 2014-07-31 Xencor Inc Zoptymalizowane przeciwciała ukierunkowane na CD19
WO2008034076A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 The Johns Hopkins University Cyclophosphamide in combination with immune therapeutics
CA2660795C (en) 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
AR063257A1 (es) 2006-10-12 2009-01-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-linfotoxina alfa
PL2845866T3 (pl) 2006-10-27 2017-10-31 Genentech Inc Przeciwciała i immunokoniugaty oraz ich zastosowanie
EP2097105A4 (en) * 2006-12-01 2010-09-15 Selexys Pharmaceuticals Corp ANTI-P-SELECTINE ANTIBODIES AND METHODS FOR USE IN THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES
WO2008079280A1 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Millipore Corporation Purification of proteins
US8569464B2 (en) 2006-12-21 2013-10-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
US8362217B2 (en) 2006-12-21 2013-01-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
MX2009007632A (es) 2007-01-22 2009-07-24 Genentech Inc Precipitacion de polielectrolito y purificacion de proteinas.
NZ578701A (en) 2007-02-09 2012-02-24 Genentech Inc Anti-robo4 antibodies and uses therefor
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
MX2009013328A (es) * 2007-06-25 2010-06-02 Esbatech An Alcon Biomedical R Metodos para modificar anticuerpos, y anticuerpos modificados con propiedades funcionales mejoradas.
CN101842388B (zh) 2007-09-13 2013-09-04 德勒尼克斯治疗股份公司 针对β淀粉样肽的人源化抗体
GB0718684D0 (en) * 2007-09-24 2007-10-31 Roche Products Ltd Treatment method
SG193868A1 (en) 2007-09-26 2013-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified antibody constant region
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
WO2009051974A1 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 Nuvelo, Inc. Antibodes to cll-1
SI2215117T2 (en) 2007-10-30 2018-04-30 Genentech, Inc. Purification of the antibody by cation exchange chromatography
ES2662845T3 (es) 2007-11-07 2018-04-10 Genentech, Inc. IL-22 para su uso en el tratamiento de trastornos microbianos
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
EP4269443A3 (en) 2007-12-26 2023-12-27 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
CN101952317B (zh) * 2008-01-24 2015-07-22 诺沃-诺迪斯克有限公司 人化抗-人nkg2a单克隆抗体
TWI532498B (zh) 2008-03-17 2016-05-11 巴克斯特保健公司 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
KR101280716B1 (ko) * 2008-03-25 2013-07-01 로슈 글리카트 아게 비-호지킨 림프종의 치료를 위한, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 독소루비신과 조합으로의 증가된 항체 의존성 세포 세포독성 (ａｄｃｃ) 을 갖는 유형 ⅱ 항-ｃｄ20 항체의 용도
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
EP2282769A4 (en) * 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
EP2297209A4 (en) * 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
JP5723769B2 (ja) * 2008-06-03 2015-05-27 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
US8999702B2 (en) 2008-06-11 2015-04-07 Emd Millipore Corporation Stirred tank bioreactor
EP2321422A4 (en) * 2008-07-08 2013-06-19 Abbvie Inc PROSTAGLANDINE E2 VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF
US8680020B2 (en) 2008-07-15 2014-03-25 Academia Sinica Glycan arrays on PTFE-like aluminum coated glass slides and related methods
DK2848625T3 (da) 2008-08-14 2019-10-07 Genentech Inc Fremgangsmåder til fjernelse af en kontaminant under anvendelse af ion bytningsmembrankromatografi med forskydning af naturligt forekommende proteiner
CN103599541A (zh) 2008-09-10 2014-02-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于防止蛋白质氧化降解的组合物和方法
TW201014605A (en) 2008-09-16 2010-04-16 Genentech Inc Methods for treating progressive multiple sclerosis
PE20110707A1 (es) * 2008-10-14 2011-10-11 Genentech Inc Variantes de inmunoglobulinas
AU2009313756B2 (en) * 2008-11-17 2015-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method and formulation for reducing aggregation of a macromolecule under physiological conditions
NZ593641A (en) 2008-12-09 2013-01-25 Halozyme Inc Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
US20100190963A1 (en) 2008-12-16 2010-07-29 Millipore Corporation Stirred Tank Reactor And Method
AU2009335788A1 (en) 2008-12-17 2011-07-07 Genentech, Inc. Hepatitis C virus combination therapy
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
EP3318573A1 (en) 2008-12-23 2018-05-09 F. Hoffmann-La Roche AG Mmunoglobulin variants with altered binding to protein a
CN102439163A (zh) * 2009-02-16 2012-05-02 拜奥雷克斯治疗公司 人源化抗cd20抗体及使用方法
EP2400992B1 (en) 2009-02-27 2015-07-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for protein labelling
MX2011009729A (es) 2009-03-20 2011-10-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-her.
SG174904A1 (en) 2009-03-25 2011-11-28 Genentech Inc Anti-fgfr3 antibodies and methods using same
RU2011142974A (ru) 2009-03-25 2013-04-27 Дженентек, Инк. НОВЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ α5β1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
WO2010115589A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
EP2427479B1 (en) * 2009-05-07 2018-11-21 The Regents of The University of California Antibodies and methods of use thereof
EP2430153A4 (en) * 2009-05-13 2013-02-27 Gliknik Inc PROCESS FOR USE OF IMMOBILIZATION LOBULIN COMPLEXES
US8815242B2 (en) * 2009-05-27 2014-08-26 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
TW201106972A (en) 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2459591B1 (en) 2009-07-31 2014-08-20 Genentech, Inc. Inhibition of tumor metastasis using anti-g-csf-antibodies
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
JP2013501741A (ja) 2009-08-14 2013-01-17 ロシュ グリクアート アーゲー アフコシル化ｃｄ２０抗体とフルダラビン及び／又はミトキサントロンの併用療法
SG178602A1 (en) * 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US9321823B2 (en) 2009-09-02 2016-04-26 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2011028945A1 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
CN102482701B (zh) 2009-09-16 2015-05-13 免疫医疗公司 I类抗-cea抗体及其使用
WO2011034604A2 (en) 2009-09-17 2011-03-24 Baxter Healthcare, S.A. Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof
WO2011047262A2 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AR078716A1 (es) 2009-10-22 2011-11-30 Genentech Inc Anticuerpos antihepsina y metodos para su uso
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
WO2011056494A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011056997A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
SI2496601T1 (sl) 2009-11-05 2017-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Tehnike in sestavek za sekrecijo heterolognih polipeptidov
CN102811736B (zh) * 2009-11-30 2016-01-20 生物测试股份公司 治疗系统性红斑狼疮(sle)的人源化抗il-10抗体
IN2012DN05169A (hu) 2009-12-02 2015-10-23 Acceleron Pharma Inc
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
ES2565208T3 (es) 2009-12-11 2016-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-VEGF-C y métodos de uso de los mismos
CN103068849B (zh) 2009-12-23 2016-04-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗Bv8抗体及其用途
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
WO2011100403A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Immunogen, Inc Cd20 antibodies and uses thereof
CN102892779B (zh) 2010-02-18 2016-12-21 基因泰克公司 神经调节蛋白拮抗剂及其在治疗癌症中的用途
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
EP3513810A1 (en) 2010-03-22 2019-07-24 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods useful for stabilizing protein- containing formulations
AU2011232514A1 (en) 2010-03-24 2012-08-30 Genentech, Inc. Anti-LRP6 antibodies
EP3372617B1 (en) 2010-04-02 2024-07-24 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
CN102844049B (zh) 2010-04-27 2016-06-01 罗切格利卡特公司 无岩藻糖基化CD20抗体与mTOR抑制剂的联合疗法
BR112012027828A2 (pt) 2010-05-03 2016-08-09 Genentech Inc composição de matéria, artigo de fabricação e método de redução da viscosidade de uma formulação contendo proteína e de preparação de uma formulação aquosa contendo proteína
DK2568976T3 (en) 2010-05-10 2016-01-11 Academia Sinica Zanamivir-phosphonate congener with the anti-influenza activity, and determining the sensitivity oseltamivir in influenza viruses
AR081246A1 (es) 2010-05-14 2012-07-18 Abbott Lab Proteinas de union a il-1
BR112012028977B1 (pt) 2010-05-17 2020-05-05 Emd Millipore Corp método de purificação de biomolécula por meio de polímeros estímulo-responsivos
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
EP2577310B1 (en) 2010-06-03 2018-11-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Immuno-pet imaging of antibodies and immunoconjugates and uses therefor
RU2577986C2 (ru) 2010-06-18 2016-03-20 Дженентек, Инк. Антитела против axl и способы их применения
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
MX339666B (es) 2010-06-24 2016-06-03 Genentech Inc * Composiciones y metodos para estabilizar formulaciones que contienen proteinas.
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
RU2571226C2 (ru) 2010-07-09 2015-12-20 Дженентек, Инк. Антитела против нейропилина и способы их применения
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
BR112013002535A2 (pt) 2010-08-03 2019-09-24 Hoffmann La Roche biomarcadores de leucemia linfocítica crônica (cll)
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
CN103209709A (zh) 2010-08-05 2013-07-17 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗mhc抗体抗病毒性细胞因子融合蛋白
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
NZ703653A (en) 2010-08-13 2016-09-30 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
RU2584597C2 (ru) 2010-08-13 2016-05-20 Рош Гликарт Аг Антитела против а2 тенасцина с и способы их применения
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
KR101603001B1 (ko) 2010-08-25 2016-03-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 Il-18r1에 대한 항체 및 그의 용도
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2011295919A1 (en) 2010-08-31 2013-03-07 Genentech, Inc. Biomarkers and methods of treatment
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2813738A1 (en) 2010-10-05 2012-04-12 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2012064627A2 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Genentech, Inc. Subcutaneously administered anti-il-6 receptor antibody
EP2638070B1 (en) 2010-11-10 2016-10-19 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for neural disease immunotherapy
WO2012080389A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mdm2 inhibitor
NZ713202A (en) 2010-12-16 2017-12-22 Genentech Inc Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
EA201790664A1 (ru) 2010-12-20 2017-07-31 Дженентек, Инк. Антитела против мезотелина и иммуноконъюгаты
WO2012088313A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies and methods of use
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
EP2482074A1 (en) * 2011-01-27 2012-08-01 Medizinische Hochschule Hannover Methods and means for diagnosing vasculitis
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
CN103476433A (zh) 2011-02-10 2013-12-25 罗切格利卡特公司 改良的免疫疗法
BR112013021725A2 (pt) 2011-02-28 2016-11-01 Genentech Inc marcadores biológicos e métodos para prever resposta aos antagonistas de células b
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
RU2607038C2 (ru) 2011-02-28 2017-01-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антигенсвязывающие белки
US20120222851A1 (en) * 2011-03-04 2012-09-06 GM Global Technology Operations LLC Hvac system damper
ES2692268T3 (es) 2011-03-29 2018-12-03 Roche Glycart Ag Variantes de Fc de anticuerpo
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
RU2013143358A (ru) 2011-04-07 2015-05-20 Дженентек, Инк. Анти-fgfr4 антитела и способы их применения
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
MX2013013054A (es) 2011-05-12 2014-02-20 Genentech Inc Metodo de monitoreo de lc-ms/ms de reaccion multiple para detectar anticuerpos terapeuticos en muestras de animales utilizando peptidos de firma de estructura.
AU2012255881C1 (en) 2011-05-16 2015-11-26 Genentech, Inc. FGFR1 agonists and methods of use
RS58765B1 (sr) 2011-05-21 2019-06-28 Macrogenics Inc Cd3-vezujući molekuli sposobni za vezivanje za humani i nehumani cd3
RU2013158627A (ru) 2011-06-15 2015-07-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к рецептору человеческого эритропоэтина и способы их применения
AU2012268939B2 (en) 2011-06-17 2017-05-04 Novo Nordisk A/S Selective elimination of erosive cells
US20130011394A1 (en) 2011-06-22 2013-01-10 Hoffmann-La Roche Inc. Complexes comprising mhc class i fusion polypeptides and antigen-specific antibodies and methods of use
CA2835242A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Genentech, Inc. Anti-c-met antibody formulations
JP2014526891A (ja) 2011-08-17 2014-10-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド ニューレグリン抗体とその使用
MX2014001736A (es) 2011-08-17 2014-03-31 Genentech Inc Inhibicion de angiogenesis en tumores refractarios.
RS57744B1 (sr) 2011-08-23 2018-12-31 Roche Glycart Ag Bispecifični antigen vezujući molekuli
US9309306B2 (en) 2011-08-23 2016-04-12 Roche Glycart Ag Anti-MCSP antibodies
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2756300A1 (en) 2011-09-15 2014-07-23 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods of promoting differentiation
CN103930111A (zh) 2011-09-19 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US9663573B2 (en) 2011-10-05 2017-05-30 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using Notch2 antagonists
HUE039133T2 (hu) 2011-10-14 2018-12-28 Hoffmann La Roche Anti-HtrA1 antitestek és felhasználási módszerek
MX2014004426A (es) 2011-10-15 2014-07-09 Genentech Inc Metodos de uso de antagonistas de scd1.
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
KR102196009B1 (ko) 2011-10-25 2021-01-04 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 항체 제형 및 방법
CN104039340B (zh) 2011-10-28 2017-04-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 治疗黑素瘤的方法及治疗剂组合
TR201904882T4 (tr) 2011-11-17 2019-05-21 Gundram Jung Tıbbi kullanım için bispesifik antikorlar.
CA2854477A1 (en) 2011-11-21 2013-05-30 Genentech, Inc. Purification of anti-c-met antibodies
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
EP2788024A1 (en) 2011-12-06 2014-10-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
RU2685867C2 (ru) 2011-12-15 2019-04-23 Алтернатив Инновейтив Текнолоджиз Ллц Гибридные белки и белковые конъюгаты на основе белка теплового шока-70 (БТШ70) и способы их применения (варианты)
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
JP6605202B2 (ja) 2011-12-22 2019-11-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド イオン交換膜クロマトグラフィー
JP2015502165A (ja) 2011-12-22 2015-01-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 発現ベクター構成、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
CA2854249C (en) 2011-12-22 2022-05-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
BR112014013035A2 (pt) 2011-12-22 2018-10-09 Hoffmann La Roche métodos de seleção de células, conjuntos de expressão bicistrônica, células eucarióticas, vetores lentivirais, uso de vetor lentiviral, bibliotecas de ventores lentivirais e de células eucarióticas, métodos de seleção de células, fluxos de trabalho e uso de célula
WO2013096791A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Process for making high concentration protein formulations
EP2797622B1 (en) 2011-12-30 2016-10-12 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
WO2013101771A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Genentech, Inc. Compositions and method for treating autoimmune diseases
US9120870B2 (en) 2011-12-30 2015-09-01 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-13 and IL-17
CA2863224A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 The Scripps Research Institute Ultralong complementarity determining regions and uses thereof
AU2013208007A1 (en) 2012-01-09 2014-07-31 The Scripps Research Institute Humanized antibodies with ultralong CDR3
TW201335187A (zh) 2012-01-18 2013-09-01 Genentech Inc 抗ｌｒｐ５抗體及使用方法
BR112014017626A2 (pt) 2012-01-18 2018-05-22 Genentech Inc métodos para tratar uma doença ou disfunção, métodos de identificação de um indivíduo, método para prever se um indivíduo com uma doença ou disfunção tem mais ou menos probabilidade para desenvolver toxicidade ao tratamento, método para determinar se um indivíduo com uma doença ou disfunção deve continuar ou suspender o tratamento que compreende um modulador de fgf19, método de otimização de eficácia terapêutica e método de ensaio
AU2012366290A1 (en) * 2012-01-19 2014-08-07 Therapeutic Proteins International, LLC Stabilization of the anti-CD20 antibody Rituximab
EP2809684A1 (en) 2012-01-31 2014-12-10 Genentech, Inc. Anti-ig-e m1' antibodies and methods using same
MX366804B (es) 2012-02-11 2019-07-25 Genentech Inc Translocaciones de la r-espondina y sus metodos de uso.
MX360352B (es) 2012-02-15 2018-10-30 Hoffmann La Roche Cromatografia de afinidad basada en receptores fc.
WO2013148315A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
MY171729A (en) 2012-03-27 2019-10-25 Genentech Inc Improved harvest operations for recombinant proteins
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
KR102132041B1 (ko) 2012-04-05 2020-07-09 에이씨 이뮨 에스.에이. 인간화된 타우 항체
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
SG11201407106XA (en) 2012-05-01 2014-11-27 Genentech Inc Anti-pmel17 antibodies and immunoconjugates
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
MX2014014086A (es) 2012-05-23 2015-01-26 Genentech Inc Metodo de seleccion para agentes terapeuticos.
AR091462A1 (es) 2012-06-15 2015-02-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso
RU2017128512A (ru) 2012-07-04 2019-02-15 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к теофиллину и способы их применения
CN104411725B (zh) 2012-07-04 2018-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗生物素抗体及使用方法
CN107973856B (zh) 2012-07-04 2021-11-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 共价连接的抗原-抗体缀合物
ES2647416T3 (es) 2012-07-04 2017-12-21 Rhizen Pharmaceuticals S.A. Inhibidores de PI3K delta selectivos
MX356162B (es) 2012-07-05 2018-05-16 Genentech Inc Sistema de expresion y secrecion.
WO2014011521A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti - cd79b antibodies
JP2015523380A (ja) 2012-07-09 2015-08-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ７９ｂ抗体を含む免疫複合体
US20140030279A1 (en) 2012-07-09 2014-01-30 Spirogen Sarl Anti-cd22 antibodies and immunoconjugates
TW201408696A (zh) 2012-07-09 2014-03-01 Genentech Inc 抗ｃｄ２２抗體及免疫結合物
US9670276B2 (en) 2012-07-12 2017-06-06 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
RS62509B1 (sr) 2012-07-13 2021-11-30 Roche Glycart Ag Bispecifična anti-vegf/anti-ang-2 antitela i njihova upotreba u lečenju očnih vaskularnih bolesti
PL2880170T3 (pl) 2012-08-02 2017-02-28 F.Hoffmann-La Roche Ag SPOSÓB WYTWARZANIA ROZPUSZCZALNEGO FcR JAKO FUZJI Fc Z OBOJĘTNYM REGIONEM Fc IMMUNOGLOBULINY I JEGO ZASTOSOWANIA
SG10201800535XA (en) 2012-08-07 2018-02-27 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
WO2014031498A1 (en) 2012-08-18 2014-02-27 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
CA2883168A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Academia Sinica Benzocyclooctyne compounds and uses thereof
WO2014052713A2 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Her2-and vegf-a-binding proteins with enhanced stability
BR112015009961B1 (pt) 2012-11-01 2020-10-20 Abbvie Inc. proteína de ligação capaz de se ligar a dll4 e vegf, bem como composição que a compreende como composição que a compreende
NZ708249A (en) 2012-11-02 2019-03-29 Tg Therapeutics Inc Combination of anti-cd20 antibody and pi3 kinase selective inhibitor
CA2890207A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
SG11201502538TA (en) 2012-11-08 2015-05-28 Hoffmann La Roche Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
CA2890669A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Genetech, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use
EP2920210B1 (en) 2012-11-19 2017-08-30 Baliopharm AG Recombinant bispecific antibody binding to cd20 and cd95
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
CA2898146C (en) 2012-12-19 2020-12-01 Charles Andrew BOSWELL Methods and compositions for radiohalogen protein labeling
PL2935328T3 (pl) 2012-12-21 2019-02-28 Hoffmann La Roche Połączone wiązaniem dwusiarczkowym wielowartościowe białka wielofunkcyjne zawierające MHC klasy I
US10980804B2 (en) 2013-01-18 2021-04-20 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
WO2014120555A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 The Regents Of The University Of California Antibodies specific for urokinase-type plasminogen activator and methods of use thereof
BR112015018418A2 (pt) 2013-02-22 2017-07-18 Hoffmann La Roche métodos para tratar câncer, para aumentar a eficácia de um tratamento, para adiar e/ou prevenir o desenvolvimento de câncer, para aumentar a sensibilidade a um terapêutico direcionado, para estender o período de sensibilidade, para estender a duração de resposta a um terapêutico direcionado e produto farmacêutico
RU2015140921A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Антитела к mcsp
JP2016510751A (ja) 2013-03-06 2016-04-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗がん剤耐性を治療及び予防する方法
PT2970487T (pt) * 2013-03-12 2020-06-17 Molecular Templates Inc Proteínas citotóxicas compreendendo regiões de ligação de direcionamento para células e regiões de subunidades de toxina a shiga para a morte seletiva de tipos específicos de células
BR112015022210A8 (pt) 2013-03-13 2018-01-23 Genentech Inc formulações de anticorpo
EP3299391B1 (en) 2013-03-14 2019-12-04 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
MX2015010854A (es) 2013-03-14 2016-07-20 Genentech Inc Combinaciones de un compuesto inhibidor de mek con un compuesto inhibidor de her3/egfr y metodos de uso.
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
BR112015022604A2 (pt) 2013-03-14 2017-10-24 Genentech Inc usos de um modulador de modificador de cromatina e um antagonista de egfr
EP2970452A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AC Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
LT2970422T (lt) 2013-03-15 2018-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Il-22 polipeptidai ir il-22 su fc sulieti baltymai bei panaudojimo būdai
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
WO2014144850A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2903596C (en) 2013-03-15 2023-10-03 Genentech, Inc. Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production
MX2015012326A (es) 2013-03-15 2016-03-08 Genentech Inc Anticuerpos anti-crth2 y su uso.
SG10201701380TA (en) 2013-03-15 2017-04-27 Genentech Inc Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
US9550829B2 (en) 2013-03-15 2017-01-24 Genentech, Inc. Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
BR112015027385A2 (pt) 2013-04-29 2017-08-29 Hoffmann La Roche Anticorpos modificados de ligação ao fcrn humano e métodos de uso
CN105164158A (zh) 2013-04-29 2015-12-16 豪夫迈·罗氏有限公司 消除对FcRn-结合的抗-IGF-1R抗体及其在血管性眼病治疗中的用途
JP6618893B2 (ja) 2013-04-29 2019-12-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体結合が変更された非対称抗体および使用方法
CA2908743C (en) 2013-05-20 2024-06-25 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
BR112015029754A2 (pt) 2013-05-31 2017-09-26 Genentech Inc anticorpos anti-teicoico da parede e conjugados
ES2793174T3 (es) 2013-05-31 2020-11-13 Genentech Inc Anticuerpos antiteicoicos de pared y conjugados
WO2014210397A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Academia Sinica Rm2 antigens and use thereof
US9981030B2 (en) 2013-06-27 2018-05-29 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
CN105814074B (zh) 2013-07-18 2020-04-21 图鲁斯生物科学有限责任公司 具有超长互补决定区的人源化抗体
EP3022224A2 (en) 2013-07-18 2016-05-25 Fabrus, Inc. Antibodies with ultralong complementarity determining regions
NZ715201A (en) 2013-08-01 2021-12-24 Five Prime Therapeutics Inc Afucosylated anti-fgfr2iiib antibodies
KR20180021234A (ko) 2013-08-12 2018-02-28 제넨테크, 인크. 보체-연관 상태의 치료를 위한 조성물 및 방법
CA2923579C (en) 2013-09-06 2023-09-05 Academia Sinica Human inkt cell activation using glycolipids with altered glycosyl groups
EP3046940B1 (en) 2013-09-17 2019-07-03 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods of using anti-lgr5 antibodies
CN103524621B (zh) * 2013-09-27 2015-04-01 北京济福霖生物技术有限公司 一种抗人cd20嵌合单克隆抗体
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
BR112016007635A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-12 Genentech Inc inibidores de nsp4 e métodos de uso
ES2960807T3 (es) 2013-10-11 2024-03-06 Us Health Anticuerpos contra TEM8 y su uso
EP3055329B1 (en) 2013-10-11 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
KR20160070136A (ko) 2013-10-18 2016-06-17 제넨테크, 인크. 항-rspo2 및/또는 항-rspo3 항체 및 그의 용도
CA2924873A1 (en) 2013-10-23 2015-04-30 Genentech, Inc. Methods of diagnosing and treating eosinophilic disorders
CN104623637A (zh) 2013-11-07 2015-05-20 健能隆医药技术（上海）有限公司 Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用
RU2697098C1 (ru) 2013-11-21 2019-08-12 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к альфа-синуклеину и способы применения
JP6549143B2 (ja) 2013-12-09 2019-07-24 アラコス インコーポレイテッド 抗シグレック−８抗体およびその使用の方法
CN110590950A (zh) 2013-12-13 2019-12-20 基因泰克公司 抗cd33抗体和免疫缀合物
WO2015095423A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
WO2015095410A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and an anti-cd20 antibody
MX2016007958A (es) 2013-12-17 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso.
KR102447878B1 (ko) 2013-12-17 2022-09-26 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법
ES2778498T3 (es) 2013-12-20 2020-08-10 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-tau(pS422) humanizados y procedimientos de uso
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
PL3089996T3 (pl) 2014-01-03 2021-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste przeciwciała przeciw haptenowi/przeciw receptorowi występującemu w barierze krew-mózg, ich kompleksy i ich zastosowanie jako przenośniki wahadłowe występujące w barierze krew-mózg
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
EP3089759B1 (en) 2014-01-03 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
RU2694981C2 (ru) 2014-01-03 2019-07-18 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Ковалентно связанные конъюгаты хеликар-антитело против хеликара и их применения
CA2932547C (en) 2014-01-06 2023-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent blood brain barrier shuttle modules
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
JP2017507118A (ja) 2014-01-16 2017-03-16 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ がんの処置および検出のための組成物および方法
US20170043034A1 (en) 2014-01-24 2017-02-16 Genentech, Inc. Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
AU2015209063C1 (en) 2014-01-27 2020-06-25 Molecular Templates, Inc. MHC class I epitope delivering polypeptides
JP6736467B2 (ja) 2014-02-04 2020-08-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 平滑化変異体及びその使用方法
TWI769970B (zh) 2014-02-08 2022-07-11 美商建南德克公司 治療阿茲海默症之方法
CN106163548A (zh) 2014-02-08 2016-11-23 健泰科生物技术公司 治疗阿尔茨海默氏病的方法
PE20161335A1 (es) 2014-02-12 2016-12-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-jagged1 y metodos de uso
PE20161171A1 (es) 2014-02-21 2016-11-08 Genentech Inc Anticuerpos bioespecificos anti-il-13/il-17 y sus usos referencia cruzada a solicitudes relacionadas
TWI558399B (zh) 2014-02-26 2016-11-21 美國禮來大藥廠 癌症之組合療法
US10183996B2 (en) 2014-02-28 2019-01-22 Allakos Inc. Methods and compositions for treating Siglec-8 associated diseases
TW201622744A (zh) 2014-03-04 2016-07-01 美國禮來大藥廠 癌症之組合療法
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
MA39746A (fr) 2014-03-14 2021-04-28 Hoffmann La Roche Compositions de sécrétion de polypeptides hétérologues et procédés associés
US20170107294A1 (en) 2014-03-21 2017-04-20 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
MA39776A (fr) 2014-03-24 2017-02-01 Hoffmann La Roche Traitement du cancer avec des antagonistes de c-met et corrélation de ces derniers avec l'expression de hgf
CN106415244B (zh) 2014-03-27 2020-04-24 中央研究院 反应性标记化合物及其用途
EP3632934A1 (en) 2014-03-31 2020-04-08 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-ox40 antibodies and methods of use
AU2015241038A1 (en) 2014-03-31 2016-10-13 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and OX40 binding agonists
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
CA2946662A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Genentech, Inc. Anti-gpc3 antibodies and immunoconjugates
JP2017524371A (ja) 2014-05-23 2017-08-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｍｉｔバイオマーカーとその使用方法
SI3149000T1 (sl) 2014-05-27 2021-09-30 Rhizen Pharmaceuticals S.A. Kristalinična tosilatna sol selektivnega inhibitorja PI3K delta za uporabo v farmacevtskih oblikah
WO2015184004A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-cd20 glycoantibodies and uses thereof
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
JP7062361B2 (ja) 2014-05-27 2022-05-06 アカデミア シニカ 抗ｈｅｒ２糖操作抗体群およびその使用
EP3149045B1 (en) 2014-05-27 2023-01-18 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
CA2950433A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Academia Sinica Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof
ES2919749T3 (es) 2014-06-11 2022-07-28 Molecular Templates Inc Moléculas dirigidas a células citotóxicas resistentes a la escisión por proteasa
CN106459202A (zh) 2014-06-11 2017-02-22 豪夫迈·罗氏有限公司 抗LgR5抗体及其用途
CN107073121A (zh) 2014-06-13 2017-08-18 基因泰克公司 治疗及预防癌症药物抗性的方法
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
RU2705299C2 (ru) 2014-06-26 2019-11-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела против 5-бром-2'-дезоксиуридина и способы применения
JP2017526641A (ja) 2014-07-11 2017-09-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｏｔｃｈ経路阻害
KR102360693B1 (ko) 2014-07-11 2022-02-08 벤타나 메디컬 시스템즈, 인코포레이티드 항-pd-l1 항체 및 이의 진단 용도
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
DK3186284T3 (da) 2014-08-28 2022-05-09 Bioatla Inc Betinget aktive kimæriske antigenreceptorer til modificerede t-celler
WO2016037123A2 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Opexa Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating b cell mediated autoimmune disorders
EP3191500A4 (en) 2014-09-08 2018-04-11 Academia Sinica HUMAN iNKT CELL ACTIVATION USING GLYCOLIPIDS
JP6943760B2 (ja) 2014-09-12 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ４抗体及び免疫複合体
EP3693391B1 (en) 2014-09-12 2024-08-21 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
AU2015314954B2 (en) 2014-09-12 2021-05-13 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibodies and immunoconjugates
AR101844A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
MX2017003121A (es) 2014-09-15 2017-08-02 Genentech Inc Formulaciones de anticuerpos.
KR20170055521A (ko) 2014-09-17 2017-05-19 제넨테크, 인크. 항-her2 항체를 포함하는 면역콘주게이트
PT3262071T (pt) 2014-09-23 2020-06-16 H Hoffnabb La Roche Ag Métodos de utilização de imunoconjugados anti-cd79b
JP2017536102A (ja) 2014-10-16 2017-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法
EP3223865A4 (en) 2014-10-31 2018-10-03 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind b7-h4
US20160161485A1 (en) 2014-11-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Assays for detecting t cell immune subsets and methods of use thereof
JP2017536842A (ja) 2014-11-03 2017-12-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｏｘ４０アゴニスト治療薬の有効性及び評価を予測するための方法及びバイオマーカー
CN107108740B (zh) 2014-11-05 2021-09-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗fgfr2/3抗体及其使用方法
EP3753948A1 (en) 2014-11-05 2020-12-23 Genentech, Inc. Methods of producing two chain proteins in bacteria
CA2966558C (en) 2014-11-05 2024-03-12 Genentech, Inc. Methods of producing two chain proteins in bacteria
BR112017006178A2 (pt) 2014-11-06 2018-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag região fc, anticorpos, formulação farmacêutica e usos dos anticorpos
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
JP6576456B2 (ja) 2014-11-06 2019-09-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 修飾されたＦｃＲｎ結合特性およびプロテインＡ結合特性を有するＦｃ領域変種
AU2015343494A1 (en) 2014-11-06 2017-04-27 Genentech, Inc. Combination therapy comprising OX40 binding agonists and TIGIT inhibitors
JP2018500882A (ja) 2014-11-10 2018-01-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 腎症の動物モデルおよびそれを治療するための薬剤
CN107172879B (zh) 2014-11-10 2021-11-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗白细胞介素-33抗体及其用途
US10160795B2 (en) 2014-11-14 2018-12-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to Ebola virus glycoprotein and their use
CN106999583A (zh) 2014-11-17 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
US10882920B2 (en) 2014-11-19 2021-01-05 Genentech, Inc. Antibodies against BACE1 and use thereof for neural disease immunotherapy
WO2016081640A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
JP6779876B2 (ja) 2014-11-19 2020-11-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トランスフェリン受容体抗体及びその使用方法
EP3789402B1 (en) 2014-11-20 2022-07-13 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
JP6721590B2 (ja) 2014-12-03 2020-07-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性抗体
EP3226911A1 (en) 2014-12-03 2017-10-11 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-staphylococcus aureus antibody rifamycin conjugates and uses thereof
BR112017011478A2 (pt) 2014-12-03 2018-02-27 Genentech, Inc. composto de conjugado anticorpo-antibiótico, conjugado anticorpo-antibiótico, composição farmacêutica, métodos de tratamento de uma infecção bacteriana e para exterminar staph aureus, processo para a preparação do composto, kit e intermediário antibiótico-ligante
DK3227336T3 (da) 2014-12-05 2019-09-16 Hoffmann La Roche Anti-CD79b-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
CN107207591A (zh) 2014-12-10 2017-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 血脑屏障受体抗体及使用方法
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
PL3233921T3 (pl) 2014-12-19 2022-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania
TWI779010B (zh) 2014-12-19 2022-10-01 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Ｆｃ區域之多胜肽及使用方法
EP3233912B1 (en) 2014-12-19 2021-05-19 Regenesance B.V. Antibodies that bind human c6 and uses thereof
US20160200815A1 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
WO2016115559A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
JP2018511557A (ja) 2015-01-22 2018-04-26 中外製薬株式会社 ２種以上の抗ｃ５抗体の組み合わせおよび使用方法
EP3248005B1 (en) 2015-01-24 2020-12-09 Academia Sinica Novel glycan conjugates and methods of use thereof
MX2017009181A (es) * 2015-01-26 2017-11-22 Cellectis Receptores de antigenos quimericos de cadena sencilla especificos de anti-cll1 para inmunoterapia de cancer.
EP3253784B1 (en) 2015-02-04 2020-05-06 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
AU2016215205B2 (en) 2015-02-05 2021-10-21 Molecular Templates, Inc. Multivalent CD20-binding molecules comprising shiga toxin a subunit effector regions and enriched compositions thereof
EP3253778A1 (en) 2015-02-05 2017-12-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
KR20170140180A (ko) 2015-02-24 2017-12-20 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 면역원, 항체 및 그 용도
CA2977285A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of detecting and quantifying il-13 and uses in diagnosing and treating th2-associated diseases
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
SI3271389T1 (sl) 2015-03-20 2020-09-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Nevtralizirajoča protitelesa proti GP120 in njihova uporaba
ES2768784T3 (es) 2015-03-23 2020-06-23 Bayer Pharma AG Anticuerpos anti-CEACAM6 y usos de los mismos
ME03819B (me) 2015-03-23 2021-04-20 Jounce Therapeutics Inc Antitela za icos
EP3274368A1 (en) 2015-03-25 2018-01-31 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by the S Bispecific multivalent fusion proteins
MX2017012352A (es) 2015-04-03 2018-01-26 Eureka Therapeutics Inc Construccion dirigida a complejos de peptido de alfa-fetoproteina/complejo principal de histocompatibilidad (afp/cph) y usos de los mismos.
JP6955445B2 (ja) 2015-04-07 2021-10-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド アゴニスト性の活性を有する抗原結合複合体及びその使用方法
WO2016168771A2 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
EP3286315B1 (en) 2015-04-24 2021-05-26 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of identifying bacteria comprising binding polypeptides
WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
EP3294771A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 H. Hoffnabb-La Roche Ag Compositions and methods of treating lupus nephritis
SI3294770T2 (sl) 2015-05-12 2024-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapevtski in diagnostični postopki za raka
SG10202002131PA (en) 2015-05-21 2020-05-28 Harpoon Therapeutics Inc Trispecific binding proteins and methods of use
EP3302563A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Humanized anti-ebola virus glycoprotein antibodies and methods of use
EP3303619B1 (en) 2015-05-29 2020-06-10 H. Hoffnabb-La Roche Ag Pd-l1 promoter methylation in cancer
ES2789500T5 (es) 2015-05-29 2023-09-20 Hoffmann La Roche Procedimientos terapéuticos y de diagnóstico para el cáncer
LT3303373T (lt) 2015-05-30 2020-07-10 Molecular Templates, Inc. Deimunizuoto shiga toksino a subvieneto karkasai ir juos apimančios ląstelės taikinio molekulės
JP2018516933A (ja) 2015-06-02 2018-06-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−３４抗体を使用して神経学的疾患を治療するための組成物及び方法
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2016196726A1 (en) 2015-06-05 2016-12-08 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
KR20180011839A (ko) 2015-06-08 2018-02-02 제넨테크, 인크. 항-ox40 항체를 이용한 암의 치료 방법
AU2016274584A1 (en) 2015-06-08 2018-01-04 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-OX40 antibodies and PD-1 axis binding antagonists
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3307780A1 (en) 2015-06-15 2018-04-18 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
AR105026A1 (es) 2015-06-16 2017-08-30 Genentech Inc ANTICUERPOS MADURADOS POR AFINIDAD Y HUMANIZADOS PARA FcRH5 Y MÉTODOS PARA SU USO
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
CN107849145B (zh) 2015-06-16 2021-10-26 基因泰克公司 抗cd3抗体及其使用方法
JP6846362B2 (ja) 2015-06-17 2021-03-24 アラコス インコーポレイテッド 線維性疾患を処置するための方法および組成物
JP2018524312A (ja) 2015-06-17 2018-08-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｈｅｒ２抗体及び使用方法
CN107771076A (zh) 2015-06-17 2018-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd‑1轴结合拮抗剂和紫杉烷治疗局部晚期或转移性乳腺癌的方法
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
NZ737205A (en) 2015-06-24 2024-07-26 F Hoffmann La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
JP6619460B2 (ja) 2015-06-24 2019-12-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ヒト化抗タウ（ｐＳ４２２）抗体及び使用法
AU2016285596A1 (en) 2015-06-29 2018-01-18 Genentech, Inc. Type II anti-CD20 antibody for use in organ transplantation
CA3162586A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CA2992306A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Amunix Operating Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
EP3341415B1 (en) 2015-08-28 2021-03-24 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-hypusine antibodies and uses thereof
KR101920175B1 (ko) 2015-09-18 2018-11-19 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8에 결합하는 항체 및 그의 사용
AU2016328357B2 (en) 2015-09-22 2023-03-02 Ventana Medical Systems, Inc. Anti-OX40 antibodies and diagnostic uses thereof
TWI748962B (zh) * 2015-09-23 2021-12-11 美商建南德克公司 抗ｖｅｇｆ抗體之最佳化變異體
RU2757135C2 (ru) 2015-09-24 2021-10-11 АБВИТРО ЭлЭлСи Композиции антител к вич и способы их применения
CN113912724A (zh) 2015-09-25 2022-01-11 豪夫迈·罗氏有限公司 抗tigit抗体和使用方法
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
JP6622392B2 (ja) 2015-10-02 2019-12-18 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ１とｔｉｍ３に特異的な二重特異性抗体
MY192668A (en) 2015-10-02 2022-08-30 Hoffmann La Roche Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
MA43017A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf
PL3356404T3 (pl) 2015-10-02 2022-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała anty-pd1 i sposoby ich stosowania
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
WO2017062682A2 (en) 2015-10-06 2017-04-13 Genentech, Inc. Method for treating multiple sclerosis
AU2016335750B2 (en) 2015-10-07 2023-05-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services IL-7R-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
CN108271377B (zh) 2015-10-07 2021-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 具有针对共刺激性tnf受体的四价的双特异性抗体
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
TW201723190A (zh) 2015-10-22 2017-07-01 永斯醫療股份有限公司 用於測定icos表現之基因印記
US10604577B2 (en) 2015-10-22 2020-03-31 Allakos Inc. Methods and compositions for treating systemic mastocytosis
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
MX2018005036A (es) 2015-10-29 2018-08-01 Hoffmann La Roche Anticuerpos y metodos de uso de anti-regiones de fragmentos cristalizables (fc) variantes.
JP2018534930A (ja) 2015-10-30 2018-11-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｄ因子抗体及びコンジュゲート
US10421821B2 (en) 2015-10-30 2019-09-24 Genentech, Inc. Anti-HtrA1 antibodies and methods of use thereof
CA3003878A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
CN118725134A (zh) 2015-11-08 2024-10-01 豪夫迈·罗氏有限公司 筛选多特异性抗体的方法
CN116327924A (zh) 2015-11-23 2023-06-27 戊瑞治疗有限公司 用于癌症治疗的单独fgfr2抑制剂或与免疫刺激剂的组合
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
IL313608A (en) 2015-12-09 2024-08-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs
FI3390442T3 (fi) 2015-12-18 2023-11-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-C5-vasta-aineita ja käyttömenetelmiä
IL299759A (en) 2015-12-30 2023-03-01 Genentech Inc Formulations with reduced polysorbate dissolution
MX2018008347A (es) 2016-01-08 2018-12-06 Hoffmann La Roche Metodos de tratamiento de canceres positivos para ace utilizando antagonistas de union a eje pd-1 y anticuerpos biespecificos anti-ace/anti-cd3.
CN114019170A (zh) 2016-01-20 2022-02-08 基因泰克公司 用于阿尔茨海默氏病的高剂量治疗
JP2019509721A (ja) 2016-02-04 2019-04-11 キュリス，インコーポレイテッド 突然変異体スムースンド及びその使用方法
CN114395624A (zh) 2016-02-29 2022-04-26 基因泰克公司 用于癌症的治疗和诊断方法
CN108699156A (zh) 2016-03-01 2018-10-23 豪夫迈·罗氏有限公司 具有降低的adcp的奥滨尤妥珠单抗和利妥昔单抗变体
CA3016170A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Academia Sinica Methods for modular synthesis of n-glycans and arrays thereof
WO2017159699A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
WO2017165734A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
KR20190012145A (ko) 2016-03-29 2019-02-08 젤터, 인코포레이티드 주변세포질 부피 대 세포질 부피의 비가 0.5:1 내지 10:1인 그람-음성 박테리아에서의 단백질의 발현
KR101796277B1 (ko) 2016-04-12 2017-11-13 앱클론(주) 안정성이 개선된 ｈｅｒ２에 특이적으로 결합하는 항체
WO2017180864A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
JP2019515670A (ja) 2016-04-15 2019-06-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんをモニタリングし治療するための方法
CN109154613A (zh) 2016-04-15 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于监测和治疗癌症的方法
US11078282B2 (en) 2016-04-15 2021-08-03 Alpine Immune Sciences, Inc. CD80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2017250358B2 (en) 2016-04-15 2023-06-01 Alpine Immune Sciences, Inc. ICOS ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3021086C (en) 2016-04-15 2023-10-17 Bioatla, Llc Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
WO2017181143A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Generon (Shanghai) Corporation, Ltd. Use of il-22 in treating necrotizing enterocolitis
WO2017191101A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The contorsbody - a single chain target binder
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
CN109071640B (zh) 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
TWI844509B (zh) 2016-05-13 2024-06-11 美商拜奧亞特拉公司 抗-ror2抗體、抗體片段、其免疫結合物及其用途
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
AU2017268839A1 (en) 2016-05-27 2018-11-29 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Combination of anti-CD20 antibody, P13 kinase-delta selective inhibitor, and BTK inhibitor to treat B-cell proliferative disorders
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
BR112019022558A2 (pt) 2016-06-02 2020-05-19 Hoffmann La Roche anticorpos, métodos para tratar ou retardar a progressão de uma doença proliferativa e para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, composições farmacêuticas, kit, usos de uma combinação de um anticorpo anti-cd20 e de um anticorpo e invenção
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CN109563160B (zh) 2016-06-24 2023-02-28 豪夫迈·罗氏有限公司 抗聚泛素多特异性抗体
WO2018007314A1 (en) 2016-07-04 2018-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel antibody format
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
CA3032120A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR102591955B1 (ko) 2016-07-29 2023-10-19 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 증강된 fviii 보인자 기능 대체 활성을 갖는 이중특이성 항체
EP3490676A1 (en) 2016-07-29 2019-06-05 Eli Lilly and Company Combination therapy with merestinib and anti-pd-l1 or anti-pd-1 inhibitors for use in the treatment of cancer
MX2019001184A (es) 2016-07-29 2019-09-26 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos anti-idiotípicos y métodos relacionados.
KR102538749B1 (ko) 2016-08-05 2023-06-01 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
JP7250674B2 (ja) 2016-08-08 2023-04-03 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療及び診断方法
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
KR102588027B1 (ko) 2016-08-22 2023-10-12 초 파마 인크. 항체, 결합 단편 및 사용 방법
EP3507305A1 (en) 2016-09-02 2019-07-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating b cell disorders
EP3510046A4 (en) 2016-09-07 2020-05-06 The Regents of the University of California ANTIBODIES AGAINST OXIDATION-SPECIFIC EPITOPES
MX2019002728A (es) 2016-09-09 2019-08-16 Tg Therapeutics Inc Combinacion de un anticuerpo anti-cd20, inhibidor de quinasa pi3-delta, y anticuerpo anti-pd-1 o anti-pd-l1 para el tratamiento hematologico de los canceres.
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
CN109689682B (zh) 2016-09-19 2022-11-29 豪夫迈·罗氏有限公司 基于补体因子的亲和层析
PT3528838T (pt) 2016-09-23 2023-09-04 Hoffmann La Roche Utilizações de antagonistas de il-13 para tratamento de dermatite atópica
AU2017338827B2 (en) 2016-10-03 2023-08-31 Juno Therapeutics, Inc. HPV-specific binding molecules
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
CA3038712A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
JP2019535250A (ja) 2016-10-29 2019-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｍｉｃ抗体及び使用方法
CN110392694B (zh) 2016-11-02 2023-08-04 震动疗法股份有限公司 针对pd-1的抗体及其用途
KR20210117359A (ko) * 2016-11-07 2021-09-28 더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지 라임병에 사용하기 위한 dna 항체 작제물
US11466094B2 (en) 2016-11-15 2022-10-11 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
JP6709340B2 (ja) 2016-11-16 2020-06-10 イーライ リリー アンド カンパニー エクソン１４スキッピング変異（複数可）またはエクソン１４スキッピング表現型を有するがんの併用療法
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
JOP20190100A1 (ar) 2016-11-19 2019-05-01 Potenza Therapeutics Inc بروتينات ربط مولد ضد مضاد لـ gitr وطرق استخدامها
EP4015532A1 (en) 2016-11-21 2022-06-22 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
WO2018106781A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc Anti-tau antibodies and methods of use
IL293710B2 (en) 2016-12-07 2024-10-01 Molecular Templates Inc Shiga toxin A subunit activator polypeptides, Shiga toxin activator scaffolds and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
WO2018106776A2 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
TW201827076A (zh) 2016-12-12 2018-08-01 美商建南德克公司 使用抗pd-l1抗體及抗雄激素治療癌症之方法
ES2847973T3 (es) 2016-12-20 2021-08-04 Hoffmann La Roche Politerapia de anticuerpos biespecíficos anti-CD20/anti-CD3 y agonistas de 4-1BB (CD137)
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
MX2019007795A (es) 2017-01-03 2019-08-16 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb.
TW201825515A (zh) 2017-01-04 2018-07-16 美商伊繆諾金公司 Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途
US11274157B2 (en) 2017-01-12 2022-03-15 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting histone H3 peptide/MHC complexes and uses thereof
US20200024312A1 (en) 2017-01-25 2020-01-23 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
KR20230043247A (ko) 2017-01-31 2023-03-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 C5-관련 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 및 c5-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법
RU2771485C2 (ru) 2017-02-10 2022-05-04 Дженентек, Инк. Антитела против триптазы, их композиции и применения
WO2018148660A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
EP3589754B1 (en) 2017-03-01 2023-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for cancer
JP2020511144A (ja) 2017-03-16 2020-04-16 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｐｄ−ｌ２バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
CA3054068A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3596116B1 (en) 2017-03-16 2023-09-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TWI839327B (zh) 2017-03-22 2024-04-21 美商建南德克公司 用於治療眼部病症之最佳化之抗體組合物
TW201900673A (zh) 2017-03-27 2019-01-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 改良之抗原結合受體
SG10201911225WA (en) 2017-03-28 2020-01-30 Genentech Inc Methods of treating neurodegenerative diseases
JP7196094B2 (ja) 2017-03-29 2022-12-26 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体のための二重特異性抗原結合分子
CN110382542B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
WO2018184966A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to steap-1
RU2766234C2 (ru) 2017-04-04 2022-02-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Новые биспецифические антигенсвязывающие молекулы, обладающие способностью специфически связываться с cd40 и fap
KR102294136B1 (ko) 2017-04-05 2021-08-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-lag3 항체
CA3052532A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
KR20200005540A (ko) 2017-04-14 2020-01-15 제넨테크, 인크. 암의 진단 및 치료 방법
EP3624820A1 (en) 2017-04-21 2020-03-25 H. Hoffnabb-La Roche Ag Use of klk5 antagonists for treatment of a disease
WO2018200586A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
EP3615572A1 (en) 2017-04-27 2020-03-04 Tesaro Inc. Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
EP3618868A4 (en) 2017-05-05 2021-02-24 Allakos Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING ALLERGIC EYE DISEASES
WO2018209298A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
BR112019023898A2 (pt) 2017-05-16 2020-06-09 Five Prime Therapeutics Inc método para tratamento de câncer gástrico, uso de um anticorpo e composição
PE20200013A1 (es) 2017-06-20 2020-01-06 Amgen Inc Metodo para tratar o mejorar trastornos metabolicos con proteinas de union para el receptor peptidico inhibidor gastrico (gipr) en combinacion con agonistas de glp-1
WO2019018757A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Genentech, Inc. THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC METHODS FOR CANCER
US10961318B2 (en) 2017-07-26 2021-03-30 Forty Seven, Inc. Anti-SIRP-α antibodies and related methods
JP2020528061A (ja) 2017-07-26 2020-09-17 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ＢＥＴ阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤及び抗ＣＤ２０抗体を用いた併用療法
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
WO2019059411A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha DOSAGE FOR POLYTHERAPY USING PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS AND GPC3 TARGETING AGENT
US11180541B2 (en) 2017-09-28 2021-11-23 Geltor, Inc. Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof
UA128389C2 (uk) 2017-09-29 2024-07-03 Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся Мультиспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка має активність заміщувати кофакторну функцію фактора коагуляції крові viii (fviii), та фармацевтичний склад, який містить згадану молекулу як активний інгредієнт
JP2020537515A (ja) 2017-10-03 2020-12-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｐｖ特異的結合分子
KR20230020022A (ko) 2017-10-10 2023-02-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
CA3185107A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Immunowake Inc. Vegfr-antibody light chain fusion protein
AU2018346955B2 (en) 2017-10-13 2024-08-29 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
JP2020537655A (ja) 2017-10-17 2020-12-24 ルヒゼン ファーマスティカルズ エスエー 食道癌の処置のためのｃｒａｃチャネルモジュレーター
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
EP3697441B1 (en) 2017-10-20 2023-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Method for generating multispecific antibodies from monospecific antibodies
WO2019082124A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Rhizen Pharmaceuticals Sa COMPOSITION AND METHOD FOR THE TREATMENT OF LARGE B-CELL DIFFUSED LYMPHOMA
BR112020008219A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-27 Rhizen Pharmaceuticals Sa moduladores de canal de cálcio ativado por liberação de cálcio para tratar cânceres hematológicos e sólidos
BR112020007736A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag composição e método de tratamento
WO2019089969A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
MX2020004567A (es) 2017-11-06 2020-08-13 Genentech Inc Metodos diagnosticos y terapeuticos para el cancer.
EP3717516A1 (en) 2017-12-01 2020-10-07 Pfizer Inc Anti-cxcr5 antibodies and compositions and uses thereof
US20200289520A1 (en) 2017-12-06 2020-09-17 Rhizen Pharmaceuticals Sa Composition and method for treating peripheral t-cell lymphoma and cutaneous t-cell lymphoma
AU2018382966A1 (en) 2017-12-14 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of a CEA CD3 bispecific antibody and a PD-1 axis binding antagonist in a dosage regime to treat cancer
EP3724225A1 (en) 2017-12-15 2020-10-21 Juno Therapeutics, Inc. Anti-cct5 binding molecules and methods of use thereof
SG11202005632SA (en) 2017-12-21 2020-07-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to hla-a2/wt1
WO2019126472A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
AU2018389111A1 (en) 2017-12-22 2020-06-18 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to LILRB2
KR20200104333A (ko) 2017-12-28 2020-09-03 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Tigit에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 변이체
CA3078849A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibodies and variants thereof against pd-l1
CN111511400A (zh) 2017-12-29 2020-08-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗vegf抗体及其使用方法
EP3724223A1 (en) 2018-01-02 2020-10-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
WO2019136179A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
KR20200118029A (ko) 2018-01-04 2020-10-14 아이코닉 테라퓨틱스, 인코포레이티드 항-조직 인자 항체, 항체-약물 결합체, 및 관련 방법
WO2019134981A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Ac Immune Sa Misfolded tdp-43 binding molecules
CN111699200B (zh) 2018-01-15 2023-05-26 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-1的单域抗体和其变体
EP3740505A1 (en) 2018-01-16 2020-11-25 Lakepharma Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
JP7349995B2 (ja) 2018-01-26 2023-09-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＩＬ－２２ Ｆｃ融合タンパク質及び使用方法
PL3743088T3 (pl) 2018-01-26 2023-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Kompozycje i sposoby stosowania il-22 fc
WO2019149269A1 (zh) 2018-02-01 2019-08-08 信达生物制药(苏州)有限公司 全人源的抗b细胞成熟抗原(bcma)单链抗体及其应用
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
MX2020008289A (es) 2018-02-08 2020-09-25 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso.
CA3226165A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
JP7350756B2 (ja) 2018-02-14 2023-09-26 アバ セラピューティクス アーゲー 抗ヒトｐｄ－ｌ２抗体
CA3091437A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
RU2020128111A (ru) 2018-02-21 2022-03-21 Дженентек, Инк. ВЕДЕНИЕ БЕЛКОВ СЛИЯНИЯ IL-22 Fc ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
JP7391027B2 (ja) 2018-02-26 2023-12-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ及び抗ｐｄ－ｌ１アンタゴニスト抗体による治療のための投薬
BR112020015568A2 (pt) 2018-03-13 2020-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonista de 4-1bb (cd137), produto farmacêutico, composição farmacêutica, uso de uma combinação de um agonista de 4-1bb e método para tratar ou retardar a progressão do câncer
EP3765522A4 (en) 2018-03-14 2022-05-18 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. ANTI-CLAUDIN 18.2 ANTIBODIES
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
CA3093729A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use
JP2021519073A (ja) 2018-03-29 2021-08-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 哺乳動物細胞におけるラクトジェニック活性の制御
US11958903B2 (en) 2018-03-30 2024-04-16 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies against LAG-3 and uses thereof
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
KR20210019993A (ko) 2018-04-05 2021-02-23 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Τ 세포 수용체 및 이를 발현하는 조작된 세포
CN110612117B (zh) 2018-04-17 2024-04-12 分子模板公司 包含去免疫化的志贺毒素a亚基支架的her2靶向分子
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
CN110464842B (zh) 2018-05-11 2022-10-14 信达生物制药(苏州)有限公司 包含抗pcsk9抗体的制剂及其用途
KR20210021468A (ko) 2018-05-14 2021-02-26 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 활성화가능한 사이토카인 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
AU2019271148B2 (en) 2018-05-14 2023-07-06 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
AU2019275737A1 (en) 2018-06-01 2021-01-21 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and uses thereof for treating disease or condition
US20210238308A1 (en) 2018-06-04 2021-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule showing changed half-life in cytoplasm
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2019288136A1 (en) 2018-06-18 2021-01-07 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (PSMA) and uses thereof
MA52968A (fr) 2018-06-23 2021-04-28 Hoffmann La Roche Méthodes de traitement du cancer du poumon à l'aide d'un antagoniste de liaison à l'axe pd-1, d'un agent de platine et d'un inhibiteur de la topoisomérase ii
TW202035447A (zh) 2018-07-04 2020-10-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 新穎雙特異性促效性4-1bb抗原結合分子
CN112384219A (zh) 2018-07-09 2021-02-19 千禧制药公司 Sumo-激活酶抑制剂和抗cd20抗体的施用
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
EP3823611A1 (en) 2018-07-18 2021-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
US11214619B2 (en) 2018-07-20 2022-01-04 Surface Oncology, Inc. Anti-CD112R compositions and methods
HRP20240823T1 (hr) 2018-08-01 2024-09-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Farmaceutski pripravak, namijenjen upotrebi u liječenju ili sprječavanju bolesti povezane s c5 i postupak liječenja ili sprječavanja bolesti povezane s c5
CA3106829A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
US20200047085A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
US20210324099A1 (en) 2018-08-10 2021-10-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-cd137 antigen-binding molecule and utilization thereof
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
CN112789293B (zh) 2018-09-10 2024-05-10 南京传奇生物科技有限公司 针对cll1的单结构域抗体及其构建体
AU2019345151A1 (en) 2018-09-19 2021-04-29 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant CD80 fusion proteins and related constructs
WO2020061060A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
AU2019342133A1 (en) 2018-09-21 2021-04-22 Genentech, Inc. Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
IL281683B2 (en) 2018-09-25 2023-04-01 Harpoon Therapeutics Inc dll3 binding proteins and methods of use
BR112021005907A2 (pt) 2018-09-27 2021-08-10 Xilio Development, Inc. citocinas mascaradas, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir uma citocina mascarada, para tratar ou prevenir uma doença neoplásica e para tratar ou prevenir uma doença inflamatória ou autoimune neoplásica, composição, composição farmacêutica e kit
JP2022511396A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ４０への三価結合を伴う二重特異性抗原結合分子
MA53806A (fr) 2018-10-01 2022-01-05 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène comprenant un clone anti-fap 212
BR112021005204A2 (pt) 2018-10-05 2021-06-08 Five Prime Therapeutics, Inc. formulações farmacêuticas e método para tratar um tumor sólido
EP3868784A4 (en) 2018-10-15 2022-07-27 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University ANTIBODIES WITH INCREASED PRODUCTIVITY AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CN113196061A (zh) 2018-10-18 2021-07-30 豪夫迈·罗氏有限公司 肉瘤样肾癌的诊断和治疗方法
CA3117856A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Bayer Aktiengesellschaft Reversal agents for neutralizing the therapeutic activity of anti-fxia antibodies
RU2724469C2 (ru) 2018-10-31 2020-06-23 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20
CN113260626B (zh) 2018-11-05 2024-09-13 豪夫迈·罗氏有限公司 在原核宿主细胞中产生双链蛋白质的方法
EP3880714A4 (en) 2018-11-16 2022-07-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center ANTIBODIES TO MUCIN-16 AND METHODS OF USE THEREOF
KR20210096559A (ko) 2018-11-27 2021-08-05 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 항IL-23p19 항체 및 이의 용도
CA3120868A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP2022511502A (ja) 2018-12-05 2022-01-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの免疫療法のための診断方法及び診断用組成物
CA3119798A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Genentech, Inc. Combination therapy of diffuse large b-cell lymphoma comprising an anti-cd79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-cd20 antibody
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
US20220089694A1 (en) 2018-12-20 2022-03-24 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
JP2022514290A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変抗体ｆｃおよび使用方法
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
BR112021012022A2 (pt) 2018-12-21 2021-11-03 Hoffmann La Roche Anticorpo que se liga ao vegf e à il-1beta e métodos de uso
SG11202106116QA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Genentech Inc Methods of producing polypeptides using a cell line resistant to apoptosis
EP3897847A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3
AR123405A1 (es) 2018-12-21 2022-11-30 23Andme Inc Anticuerpos anti-il-36 y métodos de uso de estos
MX2021007769A (es) 2018-12-26 2021-09-23 Xilio Dev Inc Proteínas de unión anti-ctla4 enmascaradas activables.
CN113272327A (zh) 2018-12-30 2021-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗兔cd19抗体及其使用方法
AU2020208193A1 (en) 2019-01-14 2021-07-29 BioNTech SE Methods of treating cancer with a PD-1 axis binding antagonist and an RNA vaccine
CN113330030A (zh) 2019-01-17 2021-08-31 拜耳公司 确定受试者是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂治疗的方法
EP3914291A2 (en) 2019-01-22 2021-12-01 F. Hoffmann-La Roche AG Immunoglobulin a antibodies and methods of production and use
EP3914615A1 (en) 2019-01-23 2021-12-01 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of producing multimeric proteins in eukaryotic host cells
WO2020153467A1 (ja) 2019-01-24 2020-07-30 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
JP2022518925A (ja) 2019-01-29 2022-03-17 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ｒｏｒ１）に特異的な抗体およびキメラ抗原受容体
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
MX2021010313A (es) 2019-02-27 2021-09-23 Genentech Inc Dosificacion para el tratamiento con anticuerpos anti-tigit y anti-cd20 o anti-cd38.
KR20210138588A (ko) 2019-03-08 2021-11-19 제넨테크, 인크. 세포외 소포 상에서 막 관련 단백질을 검출하고 정량하기 위한 방법
SG11202109424RA (en) 2019-03-14 2021-09-29 Genentech Inc Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
AU2020254582A1 (en) 2019-04-01 2021-09-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
EP3953380A4 (en) 2019-04-12 2023-01-25 Geltor, Inc. RECOMBINATION ELASTIN AND ASSOCIATED PRODUCTION
SG11202111033VA (en) 2019-04-17 2021-11-29 Alpine Immune Sciences Inc Methods and uses of variant icos ligand (icosl) fusion proteins
CA3133909A1 (en) 2019-04-18 2020-10-22 Elpida TSIKA Novel molecules for therapy and diagnosis
CA3137397A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chimeric receptor that recognizes engineered site in antibody
CA3134522A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Genentech, Inc. Anti-mertk antibodies and their methods of use
EP3962523A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
EP3962947A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating cancer with an anti-pd-l1 antibody
WO2020232305A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
CA3138045C (en) 2019-05-14 2024-02-20 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat follicular lymphoma
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
AU2020278907A1 (en) 2019-05-23 2022-01-20 Ac Immune Sa Anti-TDP-43 binding molecules and uses thereof
MX2021015007A (es) 2019-06-10 2022-01-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno anti-celulas t para usarse en combinacion con un inhibidor de citocinas.
MX2022000174A (es) 2019-07-02 2022-05-20 Us Health Anticuerpos monoclonales que se enlazan a egfrviii y sus usos.
CN114341187A (zh) 2019-07-12 2022-04-12 中外制药株式会社 抗突变型fgfr3抗体及其用途
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
KR20240001329A (ko) 2019-07-31 2024-01-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-c5 항체 크로발리맙의 사용에 의한 c5-관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 투여량 및 투여 섭생
CN114174338A (zh) 2019-07-31 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
PE20220394A1 (es) 2019-07-31 2022-03-18 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se fijan a gprc5d
KR20210016333A (ko) 2019-07-31 2021-02-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-c5 항체 크로발리맙의 사용에 의한 c5-관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 투여량 및 투여 섭생
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
TWI832183B (zh) 2019-08-06 2024-02-11 香港商新旭生技股份有限公司 結合至病理性tau種類之抗體及其用途
KR20220062304A (ko) 2019-09-12 2022-05-16 제넨테크, 인크. 루푸스 신장염을 치료하는 조성물과 방법
WO2021047599A1 (en) * 2019-09-13 2021-03-18 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. Humanized anti-claudin 18.2 (cldn18.2) antibodies
JP2022549087A (ja) 2019-09-18 2022-11-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体および使用方法
AU2020348393A1 (en) 2019-09-20 2022-02-24 Genentech, Inc. Dosing for anti-tryptase antibodies
EP4424321A2 (en) 2019-09-27 2024-09-04 F. Hoffmann-La Roche AG Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
CN114746119A (zh) 2019-09-27 2022-07-12 詹森生物科技公司 抗-ceacam抗体及其用途
CN114945386A (zh) 2019-10-18 2022-08-26 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法
JP2023501912A (ja) 2019-10-21 2023-01-20 ライゼン ファーマシューティカルズ アーゲー 急性骨髄性白血病の治療のためのｄｈｏｄｈ阻害剤を含む組成物
CN115066613A (zh) 2019-11-06 2022-09-16 基因泰克公司 用于治疗血液癌症的诊断和治疗方法
WO2021097376A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
MX2022006676A (es) 2019-12-04 2022-07-05 Ac Immune Sa Nuevas moleculas para terapia y diagnostico.
EP4069742A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
CN115916817A (zh) 2019-12-06 2023-04-04 朱诺治疗学股份有限公司 针对bcma靶向结合结构域的抗独特型抗体及相关组合物和方法
CN114867494B9 (zh) 2019-12-13 2024-01-12 基因泰克公司 抗ly6g6d抗体及使用方法
AU2020406085A1 (en) 2019-12-18 2022-05-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to HLA-A2/MAGE-A4
PE20221585A1 (es) 2019-12-27 2022-10-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti antigeno-4 asociado al linfocito t citotoxico (ctla-4) y uso del mismo
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
IL294330A (en) 2020-01-06 2022-08-01 Vaccinex Inc Anti-ccr8 antibodies and their uses
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
JP2023512654A (ja) 2020-01-31 2023-03-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ－１軸結合アンタゴニストおよびｒｎａワクチンを用いてネオエピトープ特異的ｔ細胞を誘導する方法
WO2021155295A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 The Cleveland Clinic Foundation Anti-müllerian hormone receptor 2 antibodies and methods of use
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
TWI832035B (zh) 2020-02-14 2024-02-11 美商基利科學股份有限公司 結合ccr8之抗體及融合蛋白及其用途
US20230348568A1 (en) 2020-02-20 2023-11-02 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
JP2023516941A (ja) 2020-02-28 2023-04-21 上海復宏漢霖生物技術股▲フン▼有限公司 抗ｃｄ１３７コンストラクト、多重特異性抗体及びその使用
JP2023516945A (ja) 2020-02-28 2023-04-21 上海復宏漢霖生物技術股▲フン▼有限公司 抗ｃｄ１３７コンストラクト及びその使用
KR20220151195A (ko) 2020-03-06 2022-11-14 오엔에이 테라퓨틱스 에스.엘. 항-cd36 항체 및 암을 치료하기 위한 이의 용도
MX2022011156A (es) 2020-03-13 2022-10-13 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y usos de estos.
IL296427A (en) 2020-03-19 2022-11-01 Genentech Inc Isoform-selective anti-tgf antibodies and methods of use
PE20230414A1 (es) 2020-03-24 2023-03-07 Genentech Inc Agentes de fijacion a tie2 y metodos de uso
CN115315512A (zh) 2020-03-26 2022-11-08 基因泰克公司 具有降低的宿主细胞蛋白质的经修饰的哺乳动物细胞
EP4126940A1 (en) 2020-03-30 2023-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody that binds to vegf and pdgf-b and methods of use
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
WO2021202959A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
EP4139349A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 F. Hoffmann-La Roche AG Enzyme and pathway modulation with sulfhydryl compounds and their derivatives
WO2021217051A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
JP2023523145A (ja) 2020-04-27 2023-06-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア リポ蛋白（ａ）に対するイソ型非依存性抗体
EP4143345A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for non-small cell lung cancer immunotherapy
CN116963782A (zh) 2020-05-03 2023-10-27 联宁（苏州）生物制药有限公司 包含抗trop-2抗体的抗体药物偶联物
TW202208414A (zh) 2020-05-08 2022-03-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 April及baff抑制性免疫調節蛋白及其使用方法
EP4157881A4 (en) 2020-05-27 2024-10-09 Staidson Beijing Biopharmaceuticals Co Ltd ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY RECOGNIZE NERVE GROWTH FACTOR AND THEIR USES
EP4157461A1 (en) 2020-05-29 2023-04-05 23Andme, Inc. Anti-cd200r1 antibodies and methods of use thereof
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
WO2021247769A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-cd93 constructs and uses thereof
IL298302A (en) 2020-06-08 2023-01-01 Hoffmann La Roche Antibodies against hbv and methods of use
EP4165415A1 (en) 2020-06-12 2023-04-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for cancer immunotherapy
IL299039A (en) 2020-06-16 2023-02-01 Genentech Inc Methods and preparations for the treatment of triple-negative breast cancer
KR20230024368A (ko) 2020-06-18 2023-02-20 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 pd-1 축 결합 길항제를 사용한 치료
CA3176579A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
PE20230435A1 (es) 2020-06-19 2023-03-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moleculas de union al antigeno anti-celulas t para usarse en combinacion con un inhibidor de angiogenesis
CR20220637A (es) 2020-06-19 2023-01-31 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y cd19
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
KR20230025673A (ko) 2020-06-19 2023-02-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 CD3 및 FolR1에 결합하는 항체
CN115734972A (zh) 2020-06-22 2023-03-03 信达生物制药(苏州)有限公司 抗cd73抗体及其用途
EP4168443A1 (en) 2020-06-22 2023-04-26 Almirall S.A. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
EP4172192A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
WO2022008519A1 (en) 2020-07-07 2022-01-13 BioNTech SE Therapeutic rna for hpv-positive cancer
IL298921A (en) 2020-07-10 2023-02-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to cancer cells and direct radionuclides to said cells
MX2023000617A (es) 2020-07-17 2023-02-13 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso.
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
AU2021315665A1 (en) 2020-07-29 2023-03-16 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-CD93 constructs and uses thereof
CN116568824A (zh) 2020-08-03 2023-08-08 基因泰克公司 淋巴瘤的诊断和治疗方法
WO2022029660A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
AU2021322239A1 (en) 2020-08-07 2023-02-23 Genentech, Inc. Flt3 ligand fusion proteins and methods of use
WO2022034228A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Ac Immune Sa Humanized anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
EP4196223A1 (en) 2020-08-14 2023-06-21 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for treating multiple sclerosis with ocrelizumab
WO2022043517A2 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Cureab Gmbh Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
WO2022047316A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Sana Biotechnology, Inc. Modified anti-viral binding agents
JP2023539201A (ja) 2020-08-28 2023-09-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 宿主細胞タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マルチプレックスノックアウト
PE20230986A1 (es) 2020-09-04 2023-06-21 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a y ang2, y metodos de uso
JP2023541627A (ja) 2020-09-14 2023-10-03 イシュノス サイエンシズ ソシエテ アノニム Ｉｌ１ｒａｐに結合する抗体及びその使用
MX2023002984A (es) 2020-09-15 2023-04-10 Bayer Ag Nuevos anticuerpos anti-a2ap y usos de los mismos.
AU2021352981A1 (en) 2020-09-30 2023-06-08 Dren Bio, Inc. Anti-cd94 antibodies and methods of use thereof
IL301547A (en) 2020-10-05 2023-05-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-FCRH5/anti-CD3 antibodies
KR20230104617A (ko) 2020-10-07 2023-07-10 드렌 바이오, 인크. 항-덱틴-1 항체 및 이의 사용 방법
EP4229082A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 AC Immune SA Antibodies binding to alpha-synuclein for therapy and diagnosis
WO2022084210A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1 axis binding antagonists and lrrk2 inhitibors
WO2022086957A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Genentech, Inc. Peg-conjugated anti-mertk antibodies and methods of use
AU2021366287A1 (en) 2020-10-20 2023-04-13 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to Gremlin-1 and uses thereof
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
WO2022098628A2 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Genentech, Inc. Subcutaneous dosing of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
JP7402381B2 (ja) 2020-11-04 2023-12-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
AU2021374594A1 (en) 2020-11-04 2023-06-01 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
US20220143026A1 (en) 2020-11-12 2022-05-12 Tg Therapeutics, Inc. Triple combination to treat b-cell malignancies
IL303295A (en) 2020-12-07 2023-07-01 UCB Biopharma SRL Multispecific antibodies and antibody combinations
BR112023008265A2 (pt) 2020-12-07 2024-02-06 UCB Biopharma SRL Anticorpos contra interleucina-22
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
JP7326584B2 (ja) 2020-12-17 2023-08-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｈｌａ－ｇ抗体及びその使用
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
US20240043540A1 (en) 2020-12-23 2024-02-08 Innovent Biologics (Singapore) Pte. Ltd. Anti-b7-h3 antibody and uses thereof
EP4274658A1 (en) 2021-01-06 2023-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
JP2024504931A (ja) 2021-01-12 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体
KR20230131205A (ko) 2021-01-13 2023-09-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 병용 요법
JP2024504493A (ja) 2021-01-28 2024-01-31 ヴァクスィーンヴェント ゲーエムベーハー Ｂ細胞媒介性免疫応答を調節するための方法及び手段
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
MX2023009100A (es) 2021-02-03 2023-09-25 Mozart Therapeutics Inc Agentes aglutinantes y métodos para usar los mismos.
MX2023009244A (es) 2021-02-09 2023-09-11 Us Health Anticuerpos contra la proteina espicular de coronavirus.
WO2022173689A1 (en) 2021-02-09 2022-08-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
WO2022172085A2 (en) 2021-02-15 2022-08-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cell therapy compositions and methods for modulating tgf-b signaling
KR20230150287A (ko) 2021-02-26 2023-10-30 바이엘 악티엔게젤샤프트 비정상적 자궁 출혈의 치료에 사용하기 위한 il-11 또는 il-11ra의 억제제
US20220306743A1 (en) 2021-03-01 2022-09-29 Xilio Development, Inc. Combination of ctla4 and pd1/pdl1 antibodies for treating cancer
US20220340662A1 (en) 2021-03-01 2022-10-27 Xilio Development, Inc. Combination of masked ctla4 and pd1/pdl1 antibodies for treating cancer
EP4301418A1 (en) 2021-03-03 2024-01-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates comprising an anti-bcma antibody
CN117715933A (zh) 2021-03-05 2024-03-15 当康生物技术有限责任公司 抗vista的构建体及其用途
CA3211581A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Ellen WU Immunomodulatory molecules and uses thereof
CN117062839A (zh) 2021-03-12 2023-11-14 基因泰克公司 抗klk7抗体、抗klk5抗体、多特异性抗klk5/klk7抗体和使用方法
BR112023018621A2 (pt) 2021-03-15 2023-10-24 Hoffmann La Roche Métodos para tratar nefrite lúpica, esgotar células b periféricas, kits para tratar nefrite lúpica e anticorpos anti-cd20 tipo ii
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
EP4314049A1 (en) 2021-03-25 2024-02-07 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-igfbp7 constructs and uses thereof
PE20240357A1 (es) 2021-03-30 2024-02-27 Bayer Ag Anticuerpos anti-sema3a y usos de los mismos
CA3215049A1 (en) 2021-04-10 2022-10-13 Baiteng ZHAO Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
IL307501A (en) 2021-04-19 2023-12-01 Hoffmann La Roche Modified mammalian cells
CN117222412A (zh) 2021-04-23 2023-12-12 豪夫迈·罗氏有限公司 Nk细胞接合剂相关的不良反应的预防或减轻
EP4326768A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
WO2022228705A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
MX2023012699A (es) 2021-04-30 2023-11-21 Hoffmann La Roche Dosificacion para el tratamiento con anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3.
EP4334355A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 UCB Biopharma SRL Antibodies
JP2024518410A (ja) 2021-05-07 2024-05-01 ビエラ バイオ インコーポレイテッド 重症筋無力症を治療するための抗ｃｄ１９抗体の使用
CA3216795A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein
KR20240007184A (ko) 2021-05-12 2024-01-16 제넨테크, 인크. 미만성 거대 b세포 림프종을 치료하기 위해 항-cd79b 면역접합체를 사용하는 방법
CA3219425A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Genentech, Inc. Agonists of trem2
CN117651717A (zh) * 2021-05-18 2024-03-05 克里斯蒂安-阿尔伯特基尔大学 共刺激多特异性抗体
WO2022243261A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
EP4341385A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
WO2022255440A1 (en) 2021-06-04 2022-12-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ddr2 antibodies and uses thereof
WO2022258600A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
WO2022262808A1 (en) * 2021-06-16 2022-12-22 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd20 genes
US20240279334A1 (en) 2021-06-17 2024-08-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
EP4361176A1 (en) 2021-06-25 2024-05-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of anti-ctla-4 antibody
TW202317627A (zh) 2021-06-25 2023-05-01 日商中外製藥股份有限公司 抗ctla-4抗體
TW202309078A (zh) 2021-07-02 2023-03-01 美商建南德克公司 治療癌症之方法及組成物
TW202320857A (zh) 2021-07-06 2023-06-01 美商普方生物製藥美國公司 連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法
TW202317633A (zh) 2021-07-08 2023-05-01 美商舒泰神（加州）生物科技有限公司 特異性識別ｔｎｆｒ２的抗體及其用途
JP2024530402A (ja) 2021-07-12 2024-08-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体－リパーゼ結合を減少させるための構造
CA3225254A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
JP2024525769A (ja) 2021-07-14 2024-07-12 舒泰神（北京）生物製薬股フン有限公司 Ｃｄ４０を特異的に認識する抗体およびその使用
IL309856A (en) 2021-07-14 2024-02-01 Genentech Inc Antibodies anti-C-C motif receptor 8 (CCR8) and methods of use
AU2022315528A1 (en) 2021-07-22 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
JP2024526880A (ja) 2021-07-22 2024-07-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 脳標的化組成物及びその使用方法
MX2024001214A (es) 2021-07-28 2024-02-12 Hoffmann La Roche Metodos y composiciones para tratar cancer.
IL309934A (en) 2021-07-30 2024-03-01 Ona Therapeutics S L Anti-CD36 antibodies and their use for cancer treatment
AU2022324406A1 (en) 2021-08-02 2024-03-14 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-cd79b×cd3 bispecific antibody and use thereof
EP4380980A1 (en) 2021-08-03 2024-06-12 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies and methods of use
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
EP4384553A1 (en) 2021-08-13 2024-06-19 Genentech, Inc. Dosing for anti-tryptase antibodies
EP4388014A1 (en) 2021-08-19 2024-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent anti-variant fc-region antibodies and methods of use
GB202111905D0 (en) 2021-08-19 2021-10-06 UCB Biopharma SRL Antibodies
JP2024534265A (ja) 2021-08-23 2024-09-18 イミュニタス セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ１６１抗体及びその使用
AU2022332303A1 (en) 2021-08-27 2024-02-01 Genentech, Inc. Methods of treating tau pathologies
EP4396223A1 (en) 2021-08-30 2024-07-10 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
WO2023044272A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
WO2023056069A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Angiex, Inc. Degrader-antibody conjugates and methods of using same
JPWO2023058723A1 (hu) 2021-10-08 2023-04-13
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
EP4426748A1 (en) 2021-11-05 2024-09-11 American Diagnostics & Therapy, LLC (ADXRX) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
WO2023086807A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
WO2023088959A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
IL312692A (en) 2021-11-16 2024-07-01 Genentech Inc Methods and compositions for the treatment of systemic lupus erythematosus (SLE) with musontuzumab
EP4437006A1 (en) 2021-11-26 2024-10-02 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
EP4445911A1 (en) 2021-12-06 2024-10-16 Beijing SoloBio Genetechnology Co., Ltd. Bispecific antibody that specifically binds to klebsiella pneumoniae o2 and o1 antigens, and composition
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
IL313169A (en) 2021-12-15 2024-07-01 Genentech Inc Stabilized IL-18 polypeptides and their uses
WO2023109900A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
EP4448579A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use
CR20240246A (es) 2021-12-20 2024-07-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos agonistas anti-ltbr y anticuerpos biespecificos que los comprenden
TW202337904A (zh) 2022-01-07 2023-10-01 美商壯生和壯生企業創新公司 ＩＬ－１β結合蛋白之材料及方法
TW202340251A (zh) 2022-01-19 2023-10-16 美商建南德克公司 抗ｎｏｔｃｈ２抗體及結合物及其使用方法
WO2023154678A1 (en) * 2022-02-08 2023-08-17 Amgen Inc. Codon-optimized nucleic acids encoding ocrelizumab
WO2023154824A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
AR128540A1 (es) 2022-02-16 2024-05-22 Ac Immune Sa Moléculas de unión anti-tdp-43 humanizadas y usos de las mismas
TW202342520A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 美商樂天醫藥生技股份有限公司 抗計畫性死亡配體１（ｐｄ—ｌ１）抗體分子、編碼多核苷酸及使用方法
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
AU2023236386A1 (en) 2022-03-18 2024-10-10 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
AU2023240941A1 (en) 2022-03-25 2024-09-19 Shanghai Henlius Biologics Co., Ltd. Anti-msln antibodies and methods of use
WO2023192827A1 (en) 2022-03-26 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023186756A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Interferon gamma variants and antigen binding molecules comprising these
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
AU2023251832A1 (en) 2022-04-13 2024-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023203177A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
TW202406934A (zh) 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途
AR129268A1 (es) 2022-05-11 2024-08-07 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a e il6 y métodos de uso
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
US11814439B1 (en) 2022-06-01 2023-11-14 Tg Therapeutics, Inc. Anti-CD20 antibody compositions
US11884740B1 (en) 2022-06-01 2024-01-30 Tg Therapeutics, Inc. Anti-CD20 antibody compositions
US11965032B1 (en) 2022-06-01 2024-04-23 Tg Therapeutics, Inc. Anti-CD20 antibody compositions
US11807689B1 (en) 2022-06-01 2023-11-07 Tg Therapeutics, Inc. Anti-CD20 antibody compositions
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023239803A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Angiex, Inc. Anti-tm4sf1 antibody-drug conjugates comprising cleavable linkers and methods of using same
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
TW202417042A (zh) 2022-07-13 2024-05-01 美商建南德克公司 用抗ｆｃｒｈ５／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
WO2024020407A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing b- and t-lymphocyte attenuator (btla) and uses thereof
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
TW202417504A (zh) 2022-07-22 2024-05-01 美商建南德克公司 抗ｓｔｅａｐ１抗原結合分子及其用途
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024030956A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Mozart Therapeutics, Inc. Cd39-specific binding agents and methods of using the same
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
TW202417034A (zh) 2022-08-19 2024-05-01 大陸商億一生物醫藥開發（上海）有限公司 包含ｇ—ｃｓｆ之調配物及其用途
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024054929A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024077239A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies
TW202426505A (zh) 2022-10-25 2024-07-01 美商建南德克公司 癌症之治療及診斷方法
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
WO2024097741A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Anticancer therapies using anti-ccr8 antibody, chemo and immunotherapy combinations
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
WO2024108053A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors
WO2024137381A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies for treating sars-cov-2 infection
WO2024145398A1 (en) 2022-12-27 2024-07-04 Yale University Antibody drug conjugates
WO2024155807A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 Genentech, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
WO2024158824A1 (en) 2023-01-23 2024-08-02 Yale University Antibody oligonucleotide conjugates
WO2024156672A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to csf1r and cd3
WO2024163009A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating urothelial bladder cancer
WO2024163494A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating non-small cell lung cancer and triple-negative breast cancer
WO2024173607A2 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Combination of bispecific antibodies and chimeric antigen receptor t cells for treatment
WO2024170756A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Ablynx N.V. Polypeptides binding to the neonatal fc receptor
WO2024184494A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
WO2024191785A1 (en) 2023-03-10 2024-09-19 Genentech, Inc. Fusions with proteases and uses thereof
WO2024188965A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and an hla-g t cell bispecific antibody
WO2024197302A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Yale University Compositions and methods for delivering antibody oligonucleotide conjugates for exon skipping
US20240327522A1 (en) 2023-03-31 2024-10-03 Genentech, Inc. Anti-alpha v beta 8 integrin antibodies and methods of use
WO2024211235A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2024211234A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2024211236A2 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2002128A (en) * 1934-02-19 1935-05-21 Ray A Reidenbaugh Display rack
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
HUT53672A (en) 1988-02-25 1990-11-28 Gen Hospital Corp Quick immunoselective cloning process
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
RU2138512C1 (ru) 1989-03-21 1999-09-27 Дзе Иммюн Риспонз Корпорейшн Вакцина для профилактики или лечения опосредованной т-клетками патологии или нерегулируемой репликации клонами т-клеток, способ выделения вакцины, способ диагностирования или прогнозирования восприимчивости к ревматоидному артриту или рассеянному склерозу, способ профилактики или лечения ревматоидного артрита или рассеянного склероза и содержащий последовательность sgdqggne пептид, являющийся агентом для обнаружения, профилактики или лечения рассеянного склероза
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
NZ234586A (en) 1989-07-19 1993-02-25 Arthur Allen Vandenbark Peptide of a t-cell receptor capable of inducing protection from immune-related disease
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
LU91067I2 (fr) * 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US20010056066A1 (en) 1996-07-26 2001-12-27 Smithkline Beecham Corporation Method of treating immune cell mediated systemic diseases
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
ATE296315T1 (de) 1997-06-24 2005-06-15 Genentech Inc Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
AU8296098A (en) 1997-07-08 1999-02-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
DE69939939D1 (de) 1998-08-11 2009-01-02 Idec Pharma Corp Kombinationstherapien gegen b-zell-lymphome beinhaltend die verabreichung von anti-cd20-antikörpern
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
KR20010103655A (ko) 1998-11-09 2001-11-23 케네쓰 제이. 울코트 키메라 항-ｃｄ２０항체를 이용한 순환성 종양세포와관련된 혈액학적 악성종양의 치료법
DE69941903D1 (de) 1998-11-09 2010-02-25 Biogen Idec Inc Behandlung von patienten die eine knochenmarktransplantation oder eine transplantation peripherer blutstammzellen erhalten mit anti-cd20 antikörpern
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
EP1035172A3 (en) 1999-03-12 2002-11-27 Fuji Photo Film Co., Ltd. Azomethine compound and oily magenta ink
JP2002544174A (ja) 1999-05-07 2002-12-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂ細胞表面マーカーに結合するアンタゴニストを用いた自己免疫疾患の治療
ES2331644T3 (es) 1999-06-09 2010-01-12 Immunomedics, Inc. Inmunoterapia de trastornos autoinmunes usando anticuerpos cuya diana son celulas b.
ITMI991299A1 (it) * 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
DE19930748C2 (de) 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
NZ516491A (en) 1999-07-12 2004-11-26 Idec Pharmaceuticals Inc Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to CD20
US6451284B1 (en) 1999-08-11 2002-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
EP1207906A4 (en) 1999-08-11 2005-07-06 Biogen Idec Inc TREATMENT OF NON-HODGKIN LYMPHOMA PATIENTS WITH BONE MARROW WITH INVOLVEMENT OF ANTI-CD20 ANTIBODIES
AU6929100A (en) * 1999-08-23 2001-03-19 Biocrystal Limited Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion ofa disease condition comprising multiple sclerosis
CA2390412A1 (en) 1999-11-08 2001-05-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of b cell malignancies using anti-cd40l antibodies in combination with anti-cd20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
IL151906A0 (en) 2000-03-24 2003-04-10 Chiron Corp Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibody to cd20 and interleukin-2
US20030185796A1 (en) 2000-03-24 2003-10-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
CN1441677A (zh) 2000-03-31 2003-09-10 Idec药物公司 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗－cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用
DK2857516T3 (en) 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
JP2003531178A (ja) 2000-04-25 2003-10-21 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション 中枢神経系リンパ腫治療用のリツキシマブのクモ膜下投与
AU2001268363B2 (en) 2000-06-20 2006-08-17 Biogen Idec Inc. Treatment of B cell associated diseases
ATE440618T1 (de) 2000-06-22 2009-09-15 Univ Iowa Res Found Kombination von cpg und antikírpern gegen cd19, cd20,cd22 oder cd40 zur prävention oder behandlung von krebs.
IL153764A0 (en) 2000-07-12 2003-07-06 Idec Pharma Corp Treatment of b cell malignancies using combination of b cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
CA2422076A1 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Idec Pharmaceutical Corporation Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using b cell depleting/immunoregulatory antibody combination
WO2002034790A1 (en) 2000-10-20 2002-05-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
EP1345968A2 (en) 2000-12-28 2003-09-24 Altus Biologics Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
JP2005503109A (ja) 2001-01-29 2005-02-03 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション 修飾抗体と使用方法
US20030103971A1 (en) 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
US20030003097A1 (en) 2001-04-02 2003-01-02 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
WO2002078766A2 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Genentech, Inc. Combination therapy
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
WO2002102312A2 (en) 2001-06-14 2002-12-27 Intermune, Inc. Combination therapy of gamma-interferon and b cell specific antibodies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US7718387B2 (en) 2001-09-20 2010-05-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US7127096B2 (en) * 2001-11-20 2006-10-24 Accuimage Diagnostics Corp. Method and software for improving coronary calcium scoring consistency
WO2003049694A2 (en) 2001-12-07 2003-06-19 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003208415B2 (en) 2002-02-14 2009-05-28 Immunomedics, Inc. Anti-CD20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20030180292A1 (en) 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20030219818A1 (en) 2002-05-10 2003-11-27 Bohen Sean P. Methods and compositions for determining neoplastic disease responsiveness to antibody therapy
WO2004032828A2 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
PL218660B1 (pl) 2002-10-17 2015-01-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
EP2301966A1 (en) 2002-12-16 2011-03-30 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
JP2006522811A (ja) * 2003-04-09 2006-10-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＴＮＦαインヒビターに対して不十分な反応を示す患者の自己免疫疾患治療法
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
CN102512675A (zh) 2004-06-04 2012-06-27 健泰科生物技术公司 用于治疗多发性硬化的方法
CA2608835A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-30 Genentech, Inc. Pretreatment of a biological sample from an autoimmune disease subject
US8144978B2 (en) 2007-08-01 2012-03-27 Tandent Vision Science, Inc. System and method for identifying complex tokens in an image
KR101041914B1 (ko) * 2008-06-26 2011-06-15 부산대학교 산학협력단 셀레늄에 의해 탈분화된 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도
TW201014605A (en) 2008-09-16 2010-04-16 Genentech Inc Methods for treating progressive multiple sclerosis

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0316779B1 (pt) 2020-04-28
JP5885457B2 (ja) 2016-03-15
CN103833854A (zh) 2014-06-04
DE60332957D1 (de) 2010-07-22
IL168754A (en) 2011-09-27
US20090155257A1 (en) 2009-06-18
NO20053435L (no) 2005-08-31
RU2326127C2 (ru) 2008-06-10
US20060024300A1 (en) 2006-02-02
TW200501982A (en) 2005-01-16
EP1944320A1 (en) 2008-07-16
BRPI0316779B8 (pt) 2023-02-28
CR7875A (es) 2008-11-07
ES2633311T3 (es) 2017-09-20
SI1572744T1 (sl) 2010-09-30
JP2012044997A (ja) 2012-03-08
AR072523A2 (es) 2010-09-01
CR11367A (es) 2010-07-23
IL214083A0 (en) 2011-08-31
DK2289936T3 (en) 2017-07-31
SI2289936T1 (sl) 2017-10-30
PL212899B1 (pl) 2012-12-31
HUS1800030I1 (hu) 2018-07-30
HRP20050649B1 (hr) 2016-06-17
EP2289936B1 (en) 2017-05-31
TWI335821B (en) 2011-01-11
CA2507898A1 (en) 2004-07-08
KR20050086913A (ko) 2005-08-30
EP1572744A2 (en) 2005-09-14
EP2289936A1 (en) 2011-03-02
CY2018009I2 (el) 2018-06-27
DK1572744T3 (da) 2010-09-20
UA89350C2 (uk) 2010-01-25
RS20050467A (en) 2007-08-03
AU2003301079B2 (en) 2011-06-23
AU2003301079C1 (en) 2018-03-08
US20220002430A1 (en) 2022-01-06
EP3263596A1 (en) 2018-01-03
US7799900B2 (en) 2010-09-21
JP4351674B2 (ja) 2009-10-28
RS20100366A (en) 2011-04-30
KR20070055625A (ko) 2007-05-30
PL377328A1 (pl) 2006-01-23
JP2006517399A (ja) 2006-07-27
BR0316779A (pt) 2005-11-01
AR042485A1 (es) 2005-06-22
CN103833854B (zh) 2017-12-12
EP1572744A4 (en) 2006-07-12
US20140154242A1 (en) 2014-06-05
US20190071511A1 (en) 2019-03-07
BE2018C021I2 (hu) 2023-03-07
EP1572744B1 (en) 2010-06-09
WO2004056312A2 (en) 2004-07-08
US8562992B2 (en) 2013-10-22
NO338402B1 (no) 2016-08-15
MA27704A1 (fr) 2006-01-02
TW201000132A (en) 2010-01-01
ES2347241T3 (es) 2010-10-27
ATE470675T1 (de) 2010-06-15
EP2301966A1 (en) 2011-03-30
CL2008003323A1 (es) 2009-03-06
CY1110759T1 (el) 2015-06-10
HK1074208A1 (en) 2005-11-04
CA2507898C (en) 2014-02-18
NZ566907A (en) 2009-10-30
US20060034835A1 (en) 2006-02-16
US20170158773A1 (en) 2017-06-08
HRP20050649A2 (en) 2005-12-31
HUE035898T2 (hu) 2018-05-28
CY2018009I1 (el) 2018-06-27
AU2003301079A1 (en) 2004-07-14
RS51318B (sr) 2010-12-31
SG2013036975A (en) 2016-07-28
FR18C1023I1 (hu) 2018-07-13
WO2004056312A3 (en) 2005-05-26
RU2005122448A (ru) 2006-03-20
FR18C1023I2 (fr) 2019-05-17
JP2009159950A (ja) 2009-07-23
MXPA05006511A (es) 2006-02-17
KR100910433B1 (ko) 2009-08-04
AR093046A2 (es) 2015-05-13
PT1572744E (pt) 2010-09-07
HUP0500954A2 (en) 2007-09-28
HK1248731A1 (zh) 2018-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2507898C (en) Immunoglobulin variants and uses thereof
KR101245983B1 (ko) 인간화 항-ｔｇｆ-베타 항체
KR101297467B1 (ko) Ｄｒ５ 항체 및 그의 용도
US11136404B2 (en) Anti-OX40 antibodies
US11192953B2 (en) Human monoclonal antibody human CD134 (OX40) and methods of making and using same
KR101809441B1 (ko) 특이적 결합 단백질 및 이의 용도
BR112020014591A2 (pt) anticorpos anticlaudina 18.2
KR20060127409A (ko) 종양 치료 방법 및 스크리닝 검정
KR20140006096A (ko) Masp-2 의존적 보체 활성화를 억제하는 조성물
TW201726716A (zh) 抗體－細胞激素植入組合物及用於免疫調節的方法
JP2023134604A (ja) ＦｃＲｎに対する増大した親和性および少なくとも１つのＦｃフラグメント受容体に対する増大した親和性を有するＦｃフラグメントを伴う変異体
BR112019024544A2 (pt) Proteínas enxertadas com anticorpo-citocina e métodos de uso para distúrbios relacionados à imunidade
TW201249868A (en) Specific binding proteins and uses thereof
US20230257454A1 (en) Antibodies specifically recognizing c5a and uses thereof
CA3145139A1 (en) Antibodies specifically recognizing pseudomonas pcrv and uses thereof
KR20070022045A (ko) 장애의 치료
JP2023552846A (ja) メタニューモウイルスのｆ－タンパク質に結合する抗体およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Erratum