JP2012044997A - 免疫グロブリン変異体とその使用法およびその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】CD20陽性悪性腫瘍および自己免疫性疾患の治療を目的としたヒト化およびキメラ抗CD20抗体を提供する。
【解決手段】ヒトCD20に結合するヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、インビボで霊長類のB細胞を枯渇するのに有効な抗体であり、H鎖の可変領域(VH)に少なくとも一つの抗ヒトCD20抗体のCDR3配列および実質的なヒト重鎖サブグループIII(VHIII)のヒトコンセンサスフレームワーク(FR)残基を含んでなる抗体。
【選択図】なし

Description

(発明の分野)
本発明は、抗CD20抗体、およびB細胞関連疾患の治療におけるその使用に関する。
(発明の背景)
リンパ球は外来の抗原を特異的に認識して、反応する、様々な白血球細胞の一つの集団である。リンパ球の3つの主な分類は、Bリンパ球(B細胞)、Tリンパ球(T細胞)、およびナチュラルキラー(NK)細胞である。Bリンパ球は抗体産生を担い、体液性免疫を供給する細胞である。B細胞は骨髄内で成熟して、その細胞表面上に抗原結合抗体を発現する。B細胞がその膜結合性抗体に特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分離し、その子孫はメモリーB細胞と「プラズマ細胞」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーB細胞は長い寿命を持ち、本来の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現する代わりに、分泌型抗体を産生する。分泌された抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
CD20抗原(ヒトBリンパ球制限分化抗原、Bp35とも呼ばれる)はプレB及び成熟Bリンパ球上に位置するおよそ35kDの分子量の疎水性膜貫通型タンパク質である(Valentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989);及びEinfeldら, EMBO J. 7(3):711-717 (1988))。該抗原はまたB細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)の90%以上に発現されるが(Andersonら, Blood 63(6):1424-1433 (1984))、造血幹細胞、プロB細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない(Tedderら, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985))。CD20は分化及び細胞周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し(上掲のTedderら)、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能する(Tedderら, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990))。
B細胞リンパ腫ではCD20が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫治療の有用な治療標的であった。合衆国ではB細胞NHLの人々は300,000人以上おり、毎年56,000人以上の人々が新しく診断されている。例えば、ヒトCD20抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス/ヒトモノクローナル抗体であるリツキシマブ(rituximab)(リツキサン(RITUXAN)(登録商標))(Genentech, Inc., サウスサンフランシスコ,カリフォルニア, 合衆国より販売)は、再発性または低抵抗性の(refractory low-grade)または濾胞性の(follicular)、CD20陽性、B細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療に有用である。リツキシマブは1998年4月7日に発行された米国特許第5736137号(Andersonら)および米国特許第5776456号において「C2B8」と呼ばれている抗体である。インビトロの作用機序の研究は、リツキサン(登録商標)がヒト補体に結合し補体依存性細胞障害性(CDC)を通してリンパB細胞系を溶解することを実証している(Reffら, Blood 83(2):435-445 (1994))。加えて、その抗体は抗体依存細胞性細胞障害性(ADCC)のアッセイにおいて有意な活性を有している。インビボ前臨床研究では、リツキサン(登録商標)が、おそらく補体および細胞媒介性の過程によって末梢血、リンパ節、およびカニクイザルの骨髄からのB細胞を消耗させることを示した(Reffら. Blood 83(2):435-445 (1994))。NHL治療に必要とされる他の抗CD20抗体には、放射性同位体を結合させたマウス抗体ZevalinTM、Yttrium-90(IDEC Pharmaceuticals、サンフランシスコ、カリフォルニア州), I-131を結合させたもう一つの完全なマウス抗体であるBexxarTM (Corixa、ワシントン州)を含む。
ヒトの治療にマウス抗体を用いる際の主な限界は、ヒト抗マウス抗体(HAMA)反応である(例として、Miller, R.A.ら. “Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma” Blood, 62:988-995, 1983;およびSchroff, R.W.,ら. “Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy” Cancer Res. , 45:879-885, 1985参照)。齧歯類の抗体の可変(V)領域をヒトの定常(C)領域に結合させたキメラ分子でさえ、著しい免疫応答を引き起こしうる (HACA、ヒト抗キメラ抗体) (Neubergerら. Nature (Lond.), 314:268-270, 1985)。モノクローナル抗体を臨床に利用する際のこれらの限界を克服するための有力なアプローチは、マウス抗体または非ヒト種の抗体の「ヒト化」である (Jonesら. Nature (Lond), 321:522-525, 1986;Riechmanら, Nature (Lond), 332:323-327, 1988)。
それゆえ、患者、特に慢性治療のために投与するときに最小限または抗原性をなくしたCD20抗原に対する治療的抗体を生成することが有用である。本発明は、このおよび他のニーズを満たすものである。本発明は、現在の医薬組成物の限界を克服する抗CD20抗体を提供するだけでなく、以下の詳細な説明に明らかなような付加的利点を提案する。
(発明の要約)
本発明は、CD20結合性抗体またはその機能的フラグメント、およびB細胞関連疾患の治療への利用を提供する。この抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、CD20に結合する抗体はヒト化またはキメラである。ヒト化2H7変異体は、FRにアミノ酸置換を持つもの、および移植したCDRに変化を有する類似の成熟変異体を含む。CDRまたはFRの置換したアミノ酸は供与側の抗体または受容側の抗体にあるものに限らない。他の実施態様では、本発明の抗CD20抗体はさらにCDCおよび/またはADCCの亢進機能およびB細胞殺傷(ここではB細胞欠乏も参照)を含めて作動機能の改善を引き起こすFc領域内のアミノ酸残基の変化を含む。他の本発明の抗CD20抗体は安定性を改良する特異的な変化を含む。特定の実施態様では、安定性が増したヒト化2F7変異型は後述の実施例6に示す。インビボで亢進したADCC機能を有するフコースを欠損した変異型も提供する。一実施態様では、キメラ抗CD20抗体はマウスV領域およびヒトC領域を有する。あるそのような特異的なキメラ抗CD20抗体としてリツキサン(登録商標)(リツキシマブ(Rituximab)(登録商標);Genentech, Inc.)がある。
すべての抗体組成物およびこの発明の使用方法の好ましい実施態様では、ヒト化CD20結合抗体は、図6および図7に示すようにそれぞれ配列番号21および22の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v16である。図6、7、および8のポリペプチド配列を参照したとき、分泌シグナル配列を形成する初めの19ほどのアミノ酸は成熟ポリペプチドに存在しないことがわかるであろう。16型を元とした他のすべての変異型のV領域は開示されているアミノ酸置換基の位置を除いてv16のアミノ酸配列を有するであろう。特に示さない限り、2H7変異型はv16と同じL鎖を持つ。
本発明は、ヒトCD20に結合するヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供するものであり、抗体はインビボで霊長類のB細胞を枯渇させる効果があり、H鎖の可変領域(V)に少なくとも一つの抗ヒトCD20抗体の配列番号12のCDR3配列および実質的なヒト重鎖サブグループIII(VIII)のヒトコンセンサスフレームワーク(FR)残基を含んでなる抗体である。一実施態様では、霊長類のB細胞がヒトおよびカニクイザルのものである。一実施態様では、抗体はさらに配列番号10のH鎖CDR1配列および配列番号11のCDR2配列を含む。他の実施態様では、前記抗体はさらに配列番号4のL鎖CDR1配列、配列番号5のCDR2配列、配列番号6のCDR3配列、および実質的にヒトコンセンサスフレームワーク(FR)残基であるヒト軽鎖κサブグループI(VκI)を含む。好ましい実施態様では、VのFR領域は46番目に供与側の抗体残基を有する;特定の実施態様では、VのFR2はleuL46proのアミノ酸置換基を有する(m2H7の一致する位置に存在するプロリンに変化されたヒトκIコンセンサス配列のロイシン)。VH領域はさらにフレームワーク内の少なくとも49、71、および73番目に供与側の抗体アミノ酸残基を含む。一実施態様では、V内のヒト重鎖サブグループIIIの以下に示すFRの位置に置換がある:FR2内のAlaH49Gly; FR3内のArgH71ValおよびAsnH73Lys。他の実施態様では、ヒト化抗体のCDR領域はさらに供与側および受取側のいずれの抗体にもアミノ酸置換基を含まない。
前記実施態様の抗体は、図1Bに示すv16の配列番号8のV配列を含む。更なる前記実施態様では、抗体は図1Aに示すv16の配列番号2のV配列をさらに含む。
一実施態様では、ヒト化抗体は、それぞれ図6および図8に示す配列番号2および23の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v31;図8に示す配列番号23の重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v31;v16のH鎖にD56AとN100AおよびL鎖にS92Aのアミノ酸置換基を有する2H7.v96である。
別の実施態様では、前記実施態様のいずれかの抗体はさらに、多くの場合ではv.16、他の場合ではリツキサン由来であり比較される元の抗体または親抗体よりADCCおよび/またはCDC活性を向上するようにFc領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む。向上した活性を有するある抗体は、Fc領域にS298A/E333A/K334Aの3種類のアラニン置換を含む。S298A/E333A/K334A置換を有するある抗体は、配列番号23の重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v31である。抗体2H7.v114および2H7.v115は、リツキサンと比較して少なくとも10倍のADCC活性向上を示す。
他の実施態様では、抗体はさらに、多くの場合でv16由来となる親抗体と比較してCDC活性を減弱するようにFc領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む。v16と比較してCDC活性が減弱している抗体は少なくともH鎖に置換K322Aを含む。ADCCおよびCDC活性の比較は実施例に示すようなアッセイを行う。
好ましい実施態様では、本発明の抗体はVH領域がヒトIgG重鎖定常領域に結合している全長の抗体である。好ましい実施態様では、IgGはヒトのIgG1またはIgG3である。
一実施態様では、CD20結合抗体は細胞障害性剤に結合している。好ましい実施態様では、細胞障害性剤が放射性同位体または毒素である。
一実施態様では、治療または診断の目的に用いるための本発明の抗体は、CHO細胞で生成される。
また、前記いずれか一つの実施態様に示す抗体、および担体を含んでなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬剤的許容性のある担体である。この組成物は製造品またはキットとして提供されうる。
本発明はまた、20mg/mLのヒト化2H7抗体、pH5.8の10mMヒスチジン硫酸塩、60mg/mlのショ糖(6%)、0.2mg/mlのポリソルベート20(0.02%)を含む液状物を提供する。
本発明はまた、ここで開示するいずれかの抗体をコードし、抗体を発現するための発現ベクターを含む単離した核酸を提供する。
本発明の他の側面は、前記核酸を含む宿主細胞で、抗体を生成する宿主細胞である。後者の好ましい実施態様では、宿主細胞はCHO細胞である。これらの抗体を生成する方法であり、抗体を生成する宿主細胞を培養し、その細胞培地から抗体を回収することを含む方法を提供する。
さらに本発明の他の側面は、容器およびそれに内包される前記実施態様のいずれかの抗体を含む組成物を含んでなる製造品である。NHL治療に使用するためには、製造品はさらに組成物が非ホジキンリンパ腫の治療に用いることが可能であることを示す梱包挿入物を含む。
本発明の更なる側面は、インビボでB細胞にアポトーシスを引き起こす方法において、前記いずれかに記載の抗体をB細胞に作用させ、それによってB細胞を殺すことを含むものである。
本発明はまた、CD20結合抗体またはその機能的フラグメントを疾患に罹患したヒト患者などの哺乳動物に投与することによるここに示す疾患の治療方法を提供するものである。自己免疫性疾患またはCD20陽性癌のいずれの治療方法においても、一実施態様では、抗体は図6および図7に示すようにそれぞれ配列番号21および22の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v16である。故に、一実施態様はCD20陽性癌の治療方法において、本発明のヒト化CD20結合抗体の治療的有効量を癌患者に投与することを含むものである。好ましい実施態様では、CD20陽性癌は、非ホジキンリンパ腫(NHL)または白血球優性ホジキン病(LPHD)を含むB細胞リンパ腫または白血病、慢性白血球性白血病またはSLLであり、抗体は275−375mg/mの用量範囲で投与する。付加的実施態様では、治療方法はさらに少なくとも一つの化学療法剤を患者に投与することを含むものであり、非ホジキンリンパ腫(NHL)の場合は、化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンよりなる群から選択したものである。
また、提供されるのは自己免疫性疾患の治療方法において、前記いずれか一つのヒト化CD20結合抗体の治療的有効量を自己免疫性疾患患者に投与することを含むものである。自己免疫性疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、ウェゲナー肉芽種症、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発神経障害、筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎よりなる群から選択したものである。ここで自己免疫性疾患は関節リウマチであるとき、抗体は第二治療薬、好ましくはメトトレキセートと組み合わせて投与することができる。
これらの治療方法では、CD20結合抗体は単独または第二抗体等の第二治療薬、もしくは化学療法剤や免疫抑制剤と組み合わせて投与されうる。第二抗体は、CD20または異なるB細胞抗原、またはNKやT細胞抗原に結合するものである。一実施態様では、第二抗体は放射性標識した抗CD20抗体である。他の実施態様では、CD20結合抗体は毒素または放射性同位体を含む細胞障害性剤に結合している。
他の側面では、本発明は、皮膚筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、ANCA(血管炎下を含む)再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)、第VIII因子欠損症、血友病A、自己免疫性好中球減少症、カストルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病(GVHD)、IgM媒介、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎(HIV)、閉塞性細気管支炎(非移植性)対NSIP、ギラン-バレー症候群、大血管血管炎、巨細胞(高安)動脈炎、中血管血管炎、川崎病、および結節性多発性動脈炎よりなる群から選択した自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療的有効量のCD20結合抗体を罹患患者に投与することを含む方法を提供する。この方法の一実施態様では、CD20結合抗体はリツキサン(登録商標)である。
本発明はまた、カニクイザルのCD20の配列番号: のヌクレオチド配列(図19に示す)またはこの配列の変性変異型を含む単離した核酸を提供する。一実施態様では、保存的なアミノ酸置換基を有する配列番号: (図20に示す)または配列番号: (図20)のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離した核酸である。他の実施態様では、前記核酸を含むベクターであり、宿主細胞内で発現するための発現ベクターを含んでなる。同様にベクターを含む宿主細胞である。また、カニクイザルのCD20のアミノ酸配列[配列番号 ;図20]を含む単離したポリペプチドを提供する。
(好ましい実施態様の詳細な説明)
「CD20」抗原は、末梢血又はリンパ系器官の90%以上のB細胞の表面で見出されるおよそ35kDaの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。CD20は初期のプレB細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る;ヒトの幹細胞、リンパ球前駆細胞または正常プラズマ細胞にはみられない。CD20は正常なB細胞及び悪性のB細胞の双方に存在する。文献でのCD20の他の名称には「Bリンパ球分化制限抗原」及び「Bp35」がある。CD20抗原は、例えば、ClarkおよびLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)、およびValentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特にモノクローナル抗体(全長のモノクローナル抗体を含む)、多重特異的抗体(例えば、二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物活性または機能を示す限りは抗体断片を包含している。
本願のCD20結合抗体およびヒト化CD20結合抗体の生物活性は、ヒトCD20への抗体結合、より好ましいことにはヒトおよび他の霊長類のCD20(カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーを含む)への結合を少なくとも含むであろう。抗体は、1×10−8より低いKd値、好ましくは1×10−9より低いKd値でCD20に結合し、このような抗体処理をしていない適当なネガティブ対照と比較して少なくとも20%のB細胞をインビボで死滅または枯渇するであろう。B細胞の枯渇はADCC、CDC、アポトーシス、または他のメカニズムの一または複数の結果である。ここで言う疾患治療のある実施態様では、特定の効果的機能またはメカニズムが期待され、ヒト化2H7のある変異がADCCなどの生物学的機能を選択的にもたらす。
「抗体断片」には、全長の抗体の一部、一般的にその抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')及びFv断片;ダイアボディー(diabodies);直鎖状抗体;単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体よりなる。この2つのドメインのフォールディングから6つの高頻度可変性ループ(H鎖およびL鎖のそれぞれから3ループずつ)が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与して抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単鎖可変ドメイン(または抗原特異的なCDRを3つしか含まないFvの半分)でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば米国特許第4816567号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
本発明のCD20結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来する原型の全長分子と同じ十分な親和性でCD20への結合を維持する断片であり、ここで開示するようなインビトロまたはインビボアッセイにより測定されるB細胞を枯渇することを含む生物学的活性を示す。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Vドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定するものである。しかし、可変性は可変ドメインの110アミノ酸長を通して均一に分布しているわけではない。それどころか、V領域は、9−12アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性短領域により区分される15−30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる相対的不可変伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々4つのFR領域を含み、これは主にβ-シート配置をとり、3つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、β-シート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、FR領域の直近に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照のこと)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害(ADCC)における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基(例えば、Vの残基24−34(L1)、50−56(L2)及び89−97(L3)及びVの31−35B(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3);Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び/又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、Vの残基26−32(L1)、50−52(L2)及び91−96(L3)及びVの残基26−32(H1)、52A−55(H2)及び96−101(H3);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。
ここで示すように、「コンセンサス配列」または定常Vドメイン配列は、公知のヒト免疫グロブリン可変領域配列の比較したアミノ酸配列由来の人工の配列である。この比較に基づいて、ヒトκおよびヒトH鎖サブグループIIIVドメイン由来のコンセンサス配列であるVドメインアミノ酸をコードする組み換え核酸配列を調製した。コンセンサスV配列はいずれの抗体結合特異性も親和性も持たない。
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似する重鎖および/または軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似するものである(米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種からの高頻度可変領域の残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエントまたはアクセプター抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、たとえFR領域が結合特性を改善するような一又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでも、全てあるいは実質的に全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。FRのアミノ酸置換数は一般的にH鎖では6個、L鎖では3個にすぎない。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Fc)、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
「抗体依存性細胞障害活性」または「ADCC」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)上にあるFcレセプター(FcR)に結合したIgによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原負荷標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅するという細胞障害性の形態である。抗体は細胞障害性細胞を武装させ(arm)、完全に死滅することが必要とされる。ADCCを媒介する一次細胞であるNK細胞は、FCγRIIIのみを発現する一方、単球はFCγRI、FCγRII及びFCγRIIIを発現する。造血性細胞でのFcRの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の464頁の表3に要約されている。対象分子のADCC活性を評価するためには、米国特許第5500362号又は第5821337号に記載されているようなインビトロADCCアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー細胞(NK)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のADCC活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
「Fcレセプター」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合するレセプターを表す。好適なFcRは、天然配列ヒトFcRである。さらに好適なFcRは、IgG抗体(γレセプター)に結合し、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。FcγRIIレセプターは、FcγRIIA(「活性化レセプター」)及びFcγRIIB(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化FcγRIIAは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ITAM)を有する。阻害レセプターFcγRIIBは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ITAM)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)に概説されている)。FcRはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のFcRが、ここにおける「FcR」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性IgGの移動の原因である新生児レセプター、FcRnもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
WO00/42072 (Presta) にFcRへの結合を向上または減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここには文献として具体的に組み込まれる。Shields ら J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のFcRを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は少なくともFCγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を果たす。ADCCを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞障害性T細胞及び好中球が含まれる;PBMC類及びNK細胞が好まれる。エフェクター細胞は、その天然源、例えば血液から単離することができる。
「補体依存性細胞傷害性」または「CDC」は、補体存在下における標的細胞の溶解に関する。古典的補体経路活性化は、同系の抗原に結合される(適当なサブクラスの)抗体に補体系(C1q)の最初の構成物が結合することによって開始される。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを、例えばGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Fc領域のアミノ酸配列を変更させるような、およびC1q結合能を増強または減弱させるポリペプチドの変異は米国特許第6194551号およびWO99/51642に記載されている。これらの特許文献の内容はここに文献として具体的に組み込まれる。Idusogieら. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照。
IgGのNグリコシル化部位はCH2ドメインのAsn297である。本発明もCD20結合性、Fc領域を有するヒト化抗体の組成物を提供するものであり、組成物中の抗体の約80−100%(好ましくは約90−99%)はフコースを欠損し、糖タンパク質のFc領域に結合した成熟コア炭水化物構造を含む。このような組成物はヒトIgGと相互作用する際にFcγRIIIA(V158)ほど効果的ではないが、FcγRIIIA(F158)への結合を驚くほど改善を示すことがここに証明された。故に、ここでの組成物は特にFcγRIIIA(F158)を発現するヒト患者の治療を目的として前述の抗CD20抗体組成物より優れていることが予想される。FcγRIIIA(F158)は正常で健康なアメリカ黒人および白人にFcγRIIIA(V158)より共通している。Lehrnbecherら. Blood 94:4220 (1999)参照。本願はさらに、糖タンパク質のFc領域においてここで言うグリコシル化変異とアミノ酸配列修飾を兼ね備えることによるFcγRIII結合および/またはADCC機能における相乗的増加をも証明する。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(1)ローリー(Lowry)法により定量して、95重量%の抗体より多くなるほど、最も好ましくは99重量%より多くなるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、N末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも15の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのDNAに作用可能に結合されている;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「ベクター」はシャトルおよび発現ベクターを含む。一般的に、プラスミドコンストラクトも複製起源(例として、ColE1複製起源)および選択マーカー(例として、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性)をそれぞれ細菌内のプラスミドの複製および選択を目的として含むであろう。「発現ベクター」は必要なコントロール配列または本発明の抗体断片を含む抗体の発現の調節因子を細菌または真核細胞内で含むベクターを表す。好適なベクターは以下に示す。
本願のヒト化CD20結合抗体を生成する細胞は抗体をコードする核酸を導入してある細菌および真核生物宿主細胞を含むであろう。好適な宿主細胞を以下に示す。
ここで使用される「標識」なる語句は、抗体に直接的に又は間接的に抱合した検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
ここでの「自己免疫疾患」は、個体自体(自身)の抗原および/または組織から生じるおよびそれらに対する非悪性疾病または疾患である。
ここで用いる「B細胞枯渇」は、処置前のB細胞レベルと比較して薬剤または抗体処置後に動物またはヒトにおいてB細胞レベルが減少することを表す。B細胞レベルは実験的実施例に示したもののような公知なアッセイを用いて測定する。B細胞枯渇は完全または部分的なものであり得る。一実施態様では、B細胞を発現するCD20の枯渇は少なくとも25%である。一のメカニズムに限定するものではなく、B細胞を枯渇しうるメカニズムは、ADCC、CDC、アポトーシス、カルシウム流動の調節または前記二もしくはそれ以上の組み合わせを含む。
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能阻害または阻止およびまたは細胞破壊をもたらす物質を表す。この用語は、放射性同位体(例として、I131、I125、Y90、およびRe186)、化学療法剤、および真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素などの毒素、またはそれらの断片を含むことを意図する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、;ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類;アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類;クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas);アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質;メトトレキセート及び5−フルオロウラシル(5−FU)のような抗-代謝産物;デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体;フルダラビン(fludarabine)、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似物;ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、6-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)、5−FU;カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤;フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン(amsacrine);ベストラブシル(bestrabucil);ビサントレン(bisantrene);エダトラキセート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルシン(demecolcine);ジアジコン(diaziquone);エルフォルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム(elliptinium);エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウム;オキシ尿素;レンチナン;ロニダミン(lonidamine):ミトグアゾン(mitoguazone);ミトキサントロン;モピダモール(mopidamol);ニトラクリン(nitracrine);ペントスタチン;フェナメット(phenamet);ピラルビシン;ポドフィリン酸(podophyllinic acid);2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PKS(登録商標);ラゾキサン(razoxane);シゾフィラン;スピロゲルマニウム(spirogermanium);テニュアゾン酸(tenuazonic acid);トリアジコン(triaziquone);2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカーバジン;マンノムスチン(mannomustine);ミトブロニトール;ミトラクトール(mitolactol);ピポブロマン(pipobroman);ガシトシン(gacytosine);シトシンアラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えばパクリタキセル(タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、及びドキセタキセル(タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);クロランブシル;ゲンシタビン(gemcitabine);6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体;ビンブラスチン;プラチナ;エトポシド(VP−16);イフォスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン(navelbine);ノバントロン(novantron);テニポシド;ダウノマイシン;カルミノマイシン;アミノプテリン;キセローダ(xeloda);イバンドロナート(ibandronate);CTP-11;トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチロールニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラマイシン;カペシタビン(capecitabine);並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、4(5)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston);及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン;プレドニゾロンなどの他の化学療法剤が含まれる。上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
「治療すること」または「処置」または「緩和」は、治療的処置および予防薬または予防対策の両方を表し、この目的は標的とした病態または疾患を予防または衰退(減少)することである。本発明の方法に従って本発明のCD20結合抗体の治療的有効量を取り込んだ後、患者がCD20陽性癌または自己免疫性疾患がうまく「治療」されれば、患者は特定の疾患の一またはそれ以上の兆候および症状が明らかにおよび/または測定可能な程度に減少または消失する。例えば、癌では、癌細胞数の減少または癌細胞の消失;腫瘍の大きさの減少;腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止);ある程度の腫瘍成長の阻害;緩解期の延長、および/または特定の癌が関与する一またはそれ以上の症状のある程度の除去;罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善がある。疾患の兆候または症状の減弱は患者が感じ得るものである。癌のすべての兆候の消失を定義するならば、腫瘍の大きさが好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上減少すると、処置が完全な反応または部分的な反応を達成し得たことになる。患者が疾患の安定を体験するならば、患者も治療されたと考える。好ましい実施態様では、癌患者に1年、好ましくは15か月後に癌の進行がないことである。疾患の改善および治療の成功を評価するこれらのパラメーターは医師などの適切な当業者に知られたお決まりの手法によって簡単に測定可能である。
「治療的有効量」という用語は、対象物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体または薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ;腫瘍の大きさを小さくし;癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し;腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し;腫瘍の成長をある程度阻害し;及び/又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。「治療する」の定義を参照。
「慢性」投与は、長期間初期治療効果(活性)を維持するために、急性の状態とは反対に連続的状態での薬剤投与を表す。「間欠的」投与は中断せずに継続して行わずむしろ自然的周期で行う治療である。
(発明の組成物と方法)
本発明は、ヒトCD20、好ましくは他の霊長類のCD20に同様に結合するヒト化抗体であり、非ヒト種抗ヒトCD20抗体(ドナー抗体)の少なくとも一の、好ましくは二またはすべてのH鎖CDRを有するH鎖、およびレシピエント抗体としてヒトコンセンサス抗体の実質的にすべてのフレームワーク残基を含むヒト化抗体を提供する。ドナー抗体はマウス、ラット、モルモット、ヤギ、ウサギ、ウマ、霊長類を含む様々な非ヒト種由来であるが、最も頻度が高いのはマウス抗体であろう。ここで「実質的にすべて」とは、ヒト化抗体のレシピエントFR領域にはヒトコンセンサスFR配列に元々存在しない一またはそれ以上のアミノ酸置換基を含みうることを意味する。これらのFR変異はレシピエントまたはドナー抗体にはみられない残基を含みうる。
一実施態様では、ドナー抗体はマウス2H7抗体であり、そのV領域は図1Aおよび図1Bに示すH鎖およびL鎖それぞれのCDRおよびFR配列を含む。特定の実施態様では、ヒトVκサブグループIおよびVサブグループIIIのコンセンサス配列と一致したヒトFabフレームワークの残基であるコンセンサス配列を図1Aおよび図1Bにそれぞれ示す。本発明のヒト化2H7抗体はマウスドナー抗体のH鎖内に少なくとも一のCDRを有するであろう。一実施態様では、ヒトCD20に結合するヒト化2H7抗体はドナー抗体のH鎖およびL鎖の両方のCDRを含む。
完全長抗体では、本発明のヒト化CD20結合抗体はヒト免疫グロブリンのCドメインに結合したヒト化Vドメインを含むであろう。好ましい実施態様では、H鎖C領域はヒトIgG、好ましくはIgG1またはIgG3由来である。L鎖Cドメインは好ましくはヒトκ鎖由来である。
特に示さない限り、ここでのヒト化2H7抗体型は、アミノ酸置換基または以下の実験的実施例に示す変異を除く2H7.v16L鎖(図6、配列番号21)およびH鎖(図7、配列番号22)のVおよびCドメインを有するであろう。
ヒト化CD20結合抗体は少なくともヒトCD20および好ましくは他の霊長類CD20、例としてカニクイザルおよびアカゲザルおよびチンパンジーを含むサルのCD20に結合する。カニクイザルのCD20の配列を実施例15および図19に示す。
本発明のCD20結合抗体およびヒト化CD20結合抗体の生物学的活性は、少なくともヒトCD20へ、より好ましくはヒトおよび霊長類(カニクイザルおよびアカゲザルおよびチンパンジーを含む)CD20へ、1×10−8より小さいKd値、好ましくは1×10−9より小さいKd値、より好ましくは1×10−10より小さいKd値で抗体が結合し、インビトロまたはインビボで基準値または抗体処理を施していない適当なネガティブ対照と比較して好ましくは少なくとも20%B細胞を死滅または枯渇することができることである。
所望のB細胞枯渇レベルは疾患に依存する。CD20陽性癌の治療を目的として、本発明の抗CD20抗体の標的であるB細胞を最大限枯渇することを望むであろう。故に、CD20陽性B細胞腫瘍の治療を目的として、腫瘍の成長(大きさ)、腫瘍細胞型の増殖、転移、特定の癌の他の兆候や症状を観察するなどによって当業の医師により評価可能な少なくとも疾患の進行予防に十分なB細胞枯渇であることが望まれる。好ましくは、少なくとも2か月、より好ましくは3か月、さらに好ましくは4か月、より好ましくは5か月、さらに好ましくは6か月またはそれ以上の間疾患の進行を予防するためにB細胞枯渇が十分であることである。さらにより好ましい実施態様では、少なくとも6か月、より好ましくは9か月、より好ましくは1年、より好ましくは2年、より好ましくは3年、さらに好ましくは5年以上の間緩解期間を増やすためにB細胞枯渇が十分であることである。最も好ましい実施態様では、疾患を治癒するためにB細胞枯渇が十分であることである。好ましい実施態様では、癌患者におけるB細胞枯渇は治療前の基準値の少なくとも75%およびより好ましくは80%、85%、90%、95%、99%、および100%であることである。
自己免疫疾患の治療のために、CD20結合抗体の用量を調節することにより個々の患者の疾患および/または重症度に応じてB細胞枯渇の程度を調節することが望まれる。故に、B細胞枯渇は完全である必要はない。もしくは、全B細胞枯渇は続く治療を除いて初期治療の際に望まれ、用量が部分枯渇のみを達するように調節されるであろう。一実施態様では、B細胞枯渇は少なくとも20%、すなわち、80%またはそれ以下のCD20陽性B細胞が治療前の基準値と比較して残っているのである。他の実施態様では、B細胞枯渇は25%、30%、40%、50%、60%、70%またはそれ以上である。好ましくは、疾患の進行休止、より好ましくは治療下にある特定の疾患の兆候や症状の緩和、さらに好ましくは疾患治癒に十分なB細胞枯渇であることである。
本発明はまた、抗体がの一つのアームに本発明のヒト化CD20結合抗体のヒト化H鎖およびL鎖を有し、他のアームに第二抗原特異的に結合するV領域を有する二重特異性CD20結合抗体を提供する。特定の実施態様では、第二抗原は、CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D、または他のNK活性化リガンドからなる群から選択したものである。
リツキサン(リツキシマブ)と比較して、v16はリツキサンより約2から5倍のADCC作用強度、3−4倍以下のCDC減弱を表す。
(抗体生成)
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞(融合パートナーとも表す)の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択培地は、典型的には、HGPRT−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合していない親細胞を選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、USAより入手し得るMOPC−21およびMPC−11マウス腫瘍、及び、SP−2および類縁体、例としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、USAより入手し得るX63−Ag8−653細胞由来のものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されているスカッチャード分析により決定できる。
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、D−MEM又はRPMI−1640培地を包含する。また、そのハイブリドーマ細胞は、例えばマウス内の細胞に腹腔内注入するなどして、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー(例としてプロテインAまたはプロテインGセファロースを用いることによる)、またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などのような常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、DNAを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするDNAの細菌内組み換え発現に関する文献には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) および Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記述している。続く刊行物は鎖シャッフリングによる高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266 (1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
キメラまたは融合抗体ポリペプチドを生成するために抗体をコードするDNAを修飾する、例えば、相同的マウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード化配列(CおよびC)に置換することにより(米国特許第4,816,567号;およびMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチド(非相同ポリペプチド)のコード化配列の全て又は一部を共有結合させることにより、修飾することができる。 このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常部を置換し、又は抗体の1個の抗原結合部位の可変部を置換して、抗原に対する特異性を有する1個の抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
ヒト化抗体
非ヒト抗体のヒト化方法は、当分野で示されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って、ヒト抗体の対応配列を高頻度可変領域配列に置換することにより、実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、未処理のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかの高頻度可変領域残基及びことによると幾つかのFR残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖と重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、ヒト治療の使用を目的とする場合に、抗原性およびHAMA反応(ヒト抗マウス抗体)を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。齧歯類の配列に最も近いヒトVドメイン配列を同定して、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)として受け入れる(Sims等, J.Immunol., 151:2296 (1993);Chothiaら, J.Mol.Biol., 196:901 (1987))。もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285 (1992);Presta等, J.Immunol., 151:2623 (1993))。
更に、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのFR残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
ヒト化抗体は抗体断片、例としてFabであり、免疫複合体を生成するために一またはそれ以上の細胞障害性剤と選択的にコンジュゲートしている。またはヒト化抗体は完全長抗体、例として完全長IgG1抗体であり得る。
ヒト抗体およびファージディスプレイ方法論
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(J)遺伝子の同型接合欠損が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggemannら, Year in Immuno., 7:33 (1993);及び米国特許第5545806号、同5569825号、同5591669号(すべてのGenPharm)、同5545807号、およびWO97/17852を参照されたい。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348:552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばM13またはfdの主要又は少数コートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンし、ファージ粒子の表面において機能的抗体断片として表示される。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはB細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる;例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)を参照のこと。V-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352:624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたV遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗-オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのV遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様な列の抗原(自己抗原を含む)に対する抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12:725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5565332号及び同5573905号を参照のこと。
先に述べたように、ヒト抗体はインビトロで活性化されたB細胞により生成される(米国特許第5567610号および同第5229275号)。
抗体断片
ある状況では抗体全体より抗体断片を用いることに有用性がある。断片がより小さければ早く通過できるので、固形腫瘍へより接近しやすいであろう。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、未処理の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Fab、FvおよびScFv抗体断片はすべて大腸菌で発現して分泌されるので、大量の抗原断片を容易に生成することができる。抗体断片は上述した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。エピトープ残基に結合するサルベージレセプターを含むインビボでの半減期が長いFabおよびF(ab')断片は米国特許第5869046号に述べられている。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開第93/16185号;米国特許第5571894号;及び米国特許第5587458号を参照のこと。FvおよびsFvは定常領域を欠損している無処理の結合部位を有する種のみである;故に、インビボで用いる際に非特異性結合を減らすのに好適である。sFv融合タンパク質はsFvのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合が起こって構築されるものである。上述のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5641870号に記載されているような「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。例示的な二重特異性抗体は二つの異なるCD20タンパク質エピトープに結合しうる。このような他の抗体はCD20結合部位と他のタンパク質の結合部位を併せ持つであろう。または、抗CD20アームはリンパ球上のトリガー分子、例としてT細胞レセプター分子(例として、CD3)、IgGのFcレセプター分子 (FcgR)、例として FcgRI (CD64)、FcgRII (CD32) およびFcgRIII (CD16)、または NKG2D もしくは他のNK細胞活性化リガンドに結合するアームを併せ持ち、CD20発現細胞への細胞性防御機構を局在化する。二重特異性抗体はCD20を発現する細胞へ細胞障害性剤を局在化するために用いることができる。これらの抗体はCD20結合アームおよび細胞障害性剤(例として、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカ・アルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート、または放射性同位体ハプテン)結合アームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')二重特異性抗体)として調製することができる。
WO96/16673では二重特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体を詳述しており、米国特許第5837234では二重特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗体について開示されている。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体はWO98/02463に示されている。米国特許第5821337号は二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体について教示している。
二重特異性抗の作製方法は当分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの該鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第WO 93/08829号及びTraunecker等,EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
異なったアプローチ法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、C2及びC3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常部との融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(C1)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、そして、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、作製に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又は、その比率が特に重要性を持たないときは、2または3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)を含む。二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、WO94/04690に開示されている。二重特異性抗体を作製する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5731168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の境界面を操作することにより組換え細胞培養から回収するヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な境界面は抗体定常ドメインのC3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の境界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロ複合体抗体」もまた含む。例えば、ヘテロ複合体の抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため(米国特許第4,676,980号)、及びHIV感染の治療のため(WO91/00360,WO92/20373, 及びEP03089)に提案された。ヘテロ複合体抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第4676980号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は、無処理の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つを、次にメルカプトエチルアミンによる還元でFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
二重特異性抗体を形成するために科学的に結合して大腸菌からFab'-SH断片を直接回収することが近年の進歩により容易になった。Shalabyら, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)では、完全ヒト化二重特異性抗体F(ab')分子の生成について述べている。それぞれのFab'断片は別々に大腸菌から分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロで科学的に直接結合されやすい。故に、ヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解性活性トリガーと同様に、形成された二重特異性抗体はErbB2レセプターを過剰発現する細胞および正常ヒトT細胞に結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて生成されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの生産にも用いることができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に記載の「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作成するための別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン(V)と結合している重鎖可変ドメイン(V)を含む。従って、一つの断片のV及びVドメインは他の断片の相補的V及びVドメインと強制的に対形成し、それによって二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用によって、二重特異性抗体断片を製造する他の方策も報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により素速く生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)−VD2−(X2)−Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の1つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1−VH−CH1−Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、あるいはCLドメインをさらに有する。
他のアミノ酸修飾
ここに記載するCD20結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体は、抗CD20抗体の核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗CD20抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を有するとするならば、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、その最終コンストラクトに達するまでなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの、抗CD20抗体の翻訳後プロセスを変更しうる。
突然変異誘発の好ましい位置である抗CD20抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)に置換され、アミノ酸とCD20抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗CD20抗体を所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び/又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、N末端メチオニル残基を持つ抗CD20抗体又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗CD20抗体の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばADEPT)又はポリペプチドへの、抗CD20抗体のN又はC末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗CD20抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、FR変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表1に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表1に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
Figure 2012044997
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr、
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro; 及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
抗CD20抗体の適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい(特にここでの抗体は抗体断片、例としてFv断片である)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば6−7部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたM13の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトCD20の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び/又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。O結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(N結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(O-結合グリコシル化部位の場合)。
抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された変異体又は抗CD20抗体の非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞障害性(CDC)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のFc領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Fc領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および/または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害(ADCC)を増強する。Caronら, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のFc領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびADCC能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第5739277号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、IgG分子のインビボ血清半減期延長に関与するIgG分子(例えば、IgG、IgG、IgG又はIgG)のFc領域のエピトープを表す。
他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考えられる。例えば、抗体は様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合されてもよい。抗体はまた例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に)、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中に、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Oslo, A編(1980)に開示されている。
所望の性質を有する抗体のスクリーニング
実験的実施例に示すようにある生物学的特徴を有する抗体を選択する。
本発明の抗CD20抗体の成長阻害効果は当業者に知られた方法、例として、CD20遺伝子を内因性または形質移入して発現する細胞を用いるなどの方法によって評価しうる。例えば、腫瘍細胞株およびCD20形質移入細胞を、様々な濃度の本発明の抗CD20モノクローナル抗体で2、3(例として2−7)日間処理し、クリスタル・バイオレットまたはMTTで染色、または他の比色アッセイ法によって分析した。増殖を測定する他の方法には、本発明の抗CD20抗体存在または非存在下にて処理した細胞によるH-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理後、細胞を回収して、DNA内に取り込まれた放射線量をシンチレーションカウンターで定量した。細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で選択した細胞株を処理して適当な陽性対照とする。
細胞死を誘導する抗体を選択するために、プロピジウムヨウ素化物(PI)、トリファンブルーまたは7AAD取り込みなどにより表される膜の完全性の欠損を対照と相対的に評価した。補体および免疫エフェクター細胞非存在下でPI取り込みアッセイを行う。CD20発現腫瘍細胞を単独培地または例として約10μg/mlの適当なモノクローナル抗体を含む培地で培養する。それぞれの処理後、細胞を洗浄して、細胞塊を除去するために35mm濾過器をかぶせた12×75チューブ(1チューブ当たり1ml、各処理群につき3チューブ)に分注する。その後、PI(10μg/ml)をチューブに加える。試料をFACSCANTMフローサイトメーターおよびFACSCONVERTTMCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)により分析しうる。PI取り込みにより決定されるような統計学上有意なレベルの細胞死を引き起こす抗体を細胞死誘導抗体として選択しうる。
対象の抗体により結合されるCD20上のエピトープに結合する抗体を検索するために、例としてAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に示されているように平凡なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗CD20抗体として同じ部位に結合するかエピトープに結合するかを決定するのに用いられる。代わりにまたは加えて、エピトープマッピングはこの分野でよく知られた方法によって行うことができる。例えば、接触する残基を同定するためにアラニンスキャニングによるように抗体の配列に突然変異が誘発される。変異した抗体は確実にフォールディングされるように初めにポリクローナル抗体との結合を試験する。異なる方法では、CD20の異なる領域に一致するペプチドを用いて、試験抗体の競合アッセイ、または試験抗体と特徴のあるまたは既知のエピトープを持つ抗体の競合アッセイを行うことができる。
(ベクター、宿主細胞及び組換え方法)
本発明はまたヒト化CD20結合抗体をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするDNAは直ぐに単離され、通常の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
(i)シグナル配列成分
この発明のCD20結合抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然CD20結合抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第90/13646号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、好ましくは、多価抗体をコードするDNAに読み枠を一致させて結合される。
(ii)複製開始点
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
(iii)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、CD20結合抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばDHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネインI及びII、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、CD20結合抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979))。trp1遺伝子は、例えば、ATCC第44076号あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Leu2欠陥酵母株(ATCC20622あるいは38626)は、Leu2遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、1.6μmの円形プラスミドpKD1由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がK.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
(iv)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識されCD20結合抗体核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、phoAプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまたCD20結合抗体をコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許73657に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのCD20結合抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンcDNAの発現について、Reyes等, Nature, 297:598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
(v)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明のCD20結合抗体をコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、CD20結合抗体コード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
(vi)転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、CD20結合抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
(vii)宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開された DD266710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌294(ATCC31446)であるが、他の大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31537)及び大腸菌W3110(ATCC27325)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は細菌内で生成することができ、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能は必要でない、例として、治療的抗体が細胞障害性剤(例として、毒素)にコンジュゲートして、その免疫コンジュゲートが腫瘍細胞破壊に効果的である場合など。全長抗体は循環中で半減期が長い。大腸菌での生成がより早くよりコスト効率がよい。大腸菌における抗体断片およびポリペプチドの発現方法について、発現および分泌を最適化する転写開始領域(TIR)およびシグナル配列を記載している米国特許第5,648,237号 (Carterら.)、同第5,789,199号(Jolyら)、および同第5,840,523号 (Simmonsら)を参照のこと。これらの特許文献はここ文献として組み込まれる。発現後、可溶性分画の大腸菌ペーストから抗体を単離し、例としてアイソタイプによるプロテインAまたはGカラムにより精製しうる。例としてCHO細胞での発現抗体精製工程と同様にして最終的精製を行う。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、CD20結合抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ;クルイベロマイセス宿主、例えばK.ラクティス、K.フラギリス(ATCC12424)、K.ブルガリカス(ATCC16045)、K.ウィッケラミイ(ATCC24178)、K.ワルチイ(ATCC56500)、K.ドロソフィラルム(ATCC36906)、K.サーモトレランス、及びK.マルキシアナス;ヤローウィア(EP402226);ピチアパストリス(EP183070);カンジダ;トリコデルマ・リーシア(EP244234);アカパンカビ;シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス;及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
グリコシル化CD20結合抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカNPVのL-1変異体とボンビクス・モリ NPVのBm-5株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34); バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、CD20結合抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
(viii)宿主細胞の培養
本発明の多価抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
(ix)精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンFc領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、γ2、又はγ4重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ3に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がC3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのSEPHAROSETMクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5、好ましくは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。
(抗体コンジュゲート)
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンEおよびその類似体または誘導体が好ましい。
好ましい薬剤/毒素には、DNA阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、DNA干渉物質、DNA切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。好ましい薬剤/毒素には、DNA阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、DNA干渉物質、DNA切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、5フルオロウラシルの、そして、6メルカプトプリンのシトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、N(5、5-ジアセトキシペンチル)ドキソルビシン、モルフォリノ-ドキソルビシン、1(2-クロエチル)-1、2-ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、N8-アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてDM-1、メイタンシン、メイタンシノール、 N-デスメチル-4,5-デセポキシメイタンシノイド、C-19-デクロロメイタンシノイド、C-20-ヒドロキシメイタンシノール、 C-20-デメトキシメイタンシノール、C-9-SH メイタンシノール、C-14-アルコキシメチルメイタンシノール、C-14-ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、C-15-ヒドロキシ/アセチルオキシメイタンシノール、C-15-メトキシメイタンシノール、 C-18-N-デメチルメイタンシノールおよび4,5-デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンE、M、PHEおよびPE;ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチン A、ドロスタチン B、 ドロスタチン C、 ドロスタチン D、 ドロスタチン E (20-epi and 11-epi)、 ドロスタチン G、 ドロスタチン H、 ドロスタチン I、 ドロスタチン 1、 ドロスタチン 2、 ドロスタチン 3、 ドロスタチン 4、 ドロスタチン 5、 ドロスタチン 6、 ドロスタチン 7、 ドロスタチン 8、 ドロスタチン 9、 ドロスタチン 10、 deo-ドロスタチン 10、 ドロスタチン 11、 ドロスタチン 12、 ドロスタチン 13、 ドロスタチン 14、 ドロスタチン 15、 ドロスタチン 16、 ドロスタチン 17、 and ドロスタチン 18;セファロスタチン(cephalostatin)、例として セファロスタチン 1、 セファロスタチン 2、 セファロスタチン 3、 セファロスタチン 4、 セファロスタチン 5、 セファロスタチン 6、 セファロスタチン 7、 25'-epi-セファロスタチン 7、 20-epi-セファロスタチン 7、 セファロスタチン 8、 セファロスタチン 9、 セファロスタチン 10、 セファロスタチン 11、セファロスタチン 12、セファロスタチン 13、セファロスタチン 14、 セファロスタチン 15、セファロスタチン 16、セファロスタチン 17、 セファロスタチン 18、およびセファロスタチン 19を含む。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3,896,111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号;同4,248,870号;同4,256,746号;同4,260,608号;同4,265,814号;同4,294,757号;同4,307,016号;同4,308,268号;同4,308,269号;同4,309,428号;同4,313,946号;同4,315,929号;同4,317,821号;同4,322,348号;同4,331,598号;同4,361,650号;同4,364,866号;同4,424,219号;同4,450,254号;同4,362,663号;及び同4,371,533号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体C242に結合するDM1と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chariら, Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体A7、又はHER-2/neuオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235B1号、及びChari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、上記特許文献に開示されているように、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能価性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能価性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)(Carlsson等, Biochem. J. 173:723-737[1978])およびジスルフィド結合により提供されるN-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノアート(SPP)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、1つ又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗TASK抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ 、α 、α 、N-アセチル-γ 、PSAG及びθ (Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
放射性同位元素
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗TASK抗体を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(MX-DTPA)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992);米国特許第5208020号)。
CD20結合抗体の医薬使用
本発明のCD20結合抗体は、自己免疫疾患および関連症状、B細胞リンパ腫および白血病を含むCD20陽性癌を含む悪性および非悪性疾患の治療に有用である。骨髄中の幹細胞(B細胞前駆細胞)はCD20抗原を欠き、治療後健康なB細胞が生成され、数か月で正常レベルに戻る。
自己免疫疾患又は自己免疫関連症状には、関節炎(リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎)、乾癬、アトピーを含む皮膚炎;慢性の自己免疫性蕁麻疹、多発筋炎/皮膚筋炎、毒性の表皮壊死症、全身性硬皮症、および硬化症、炎症性腸疾患(IBD)(クローン病、潰瘍性大腸炎)関連反応、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、髄膜炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、腎炎、アレルギー症状、湿疹、喘息、T細胞および慢性炎症性応答の浸潤に伴う症状、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、ループス(腎炎、非腎臓性、円形脱毛症)、若年型糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびTリンパ球媒介性急性および遅延性過敏症に関連する免疫反応、結核、サルコイドーシス、ヴェグナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、顆粒球減少症、脈管炎(ANCAを含む)、再生不良性貧血、クームス積極的な貧血、ダイアモンド-ブラックファン(Diamond Blackfan)貧血、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆(PRCA)、第VIII因子欠乏、血友病A、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少、白血球減少症、白血球血管外遊出に伴う病気、CNS炎症性疾病、複数の器官傷害症候群、重症筋無力症、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜病、抗りん脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、カースルマン症候群、グッドパスチュア症候群、ランバート-イートン筋無力症症候群、レーノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス-ジョンソン症候群、固形器官移植臓器拒絶反応(高パネルの反応抗体力価のための前処理、組織におけるIgA沈着症等を含む)、移植片対宿主病(GVHD)、類天疱瘡、天疱瘡(尋常性、落葉状をすべて含む)、自己免疫性多腺性内分泌障害、レイター病、スティフマン症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体性腎炎、IgA腎障害、IgM多発性神経炎又はIgM関連神経障害、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性睾丸炎と卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症;自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)を含む自己免疫性内分泌疾患、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群(または、多腺性内分泌疾患症候群)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)とも言われるI型糖尿病およびシーハン症候群;自己免疫性肝炎、リンパ様間質性肺炎(HIV)、閉塞性細気管支炎(非移植性)対NSIP、ギラン・バレー症候群、大血管脈管炎(リウマチ性多発筋痛と巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中血管血管炎(川崎病および結節性多発性動脈炎を含む)、強直性脊椎炎、バーガー病(IgA腎症)、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、複腔熱帯性下痢(グルテン性腸症)、クリオグロブリン血症、ALS、冠動脈疾患が含まれる。
CD20陽性癌は細胞表面上にCD20を発現する細胞の異常増幅を含むものである。CD20陽性B細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)を含むCD20陽性ホジキン病;非ホジキンリンパ腫(NHL);濾胞性中心細胞リンパ腫(FCC);急性リンパ性白血病(ALL);慢性リンパ球性白血病(CLL);ヘアリー細胞白血病が含まれる。非ホジキンリンパ腫には、低程度/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、中程度/濾胞性NHL、中程度びまん性NHL、高程度免疫芽細胞NHL、高程度リンパ芽球性NHL、高程度小正円形細胞(non-cleaved cell)NHL、厖大な病気のNHL、プラズマ細胞様リンパ球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫およびワルデンストロームマクログロブリン血症が含まれる。これらの癌の再発治療を含む。LPHDは頻回の放射線又は化学療法にもかかわらず再発する傾向にあるホジキン型の疾患であり、CD20陽性悪性細胞の特徴がある。CLLはリンパ球といわれる成熟B細胞の4つの主要な白血病A癌のうちの一つである。CLLは血液、骨髄およびリンパ球組織における細胞の進行性蓄積が顕在化する。
特定の実施態様では、ヒト化CD20結合抗体およびその機能的断片は、非ホジキンリンパ腫(NHL)、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性リンパ球性白血病、リウマチ様関節炎、および若年性関節リウマチ、ループス腎炎を含む全身性紅斑性狼瘡(SLE)、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、抗血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、脈管炎、糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群、および腎炎の治療に使用される。
ヒト化CD20結合抗体またはその機能的断片は、例として再発または難治性低程度または濾胞性、CD20陽性、B細胞NHLのための単剤治療に有用であり、多剤療法の多剤と組み合わせて患者に投与可能である。
治癒の遅いリンパ腫は成長が遅い難病であり、患者は緩解と再発を繰返し6から10年生存するものである。一実施態様では、ヒト化CD20結合抗体またはその機能的断片は治癒の遅いNHLの治療に用いられる。
腫瘍治療の効率または効果を評価するパラメータが適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の失陥の徴候および症状の減弱を求めるであろう。パラメータは疾患の進行の中央値時間、緩解、疾患の安定時間を含む。
以下に示す文献は、リンパ腫およびCLL、その診断、治療および治療効果を評価するための標準的な医療手順について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998、van Besien KおよびCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, 1293-1338頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000、およびRai, KおよびPatel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, 1350-1362頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffmanら(editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫または自己免疫関連疾患の治療の効率および成功率を評価するためのパラメータは、適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の失陥の徴候および症状の減弱を求めるであろう。以下は、実施例の方法による。
一実施態様では、本発明の抗体は、関節リウマチの治療に有用である。RAは多関節の炎症、軟骨の減少、骨侵食により関節の破壊および最終的に関節機能の減退をもたらす特徴がある。加えて、RAは全身性疾患であるため、他の組織、例として肺、眼および骨髄に影響しうる。10年以上患っているRA患者の50%弱は日常を基準として仕事を続けるまたは正常に機能し続けている。
初期RA(すなわち、メトトレキセート(MTX)未処理)患者の一次治療および単剤治療、または例としてMTXもしくはシクロフォスファミドとの組合せとして抗体が利用可能である。もしくは、DMARDおよび/またはMTX抵抗性患者の二次療法、および単剤療法および例としてMTXとの組合せとして治療に抗体が利用できる。ヒト化CD20結合抗体は関節傷害の予防と調節、機能傷害の遅延、RAの炎症に伴う痛みの軽減に有用である。RA治療に用いる多剤での処置の前、後、または同時にRA患者をヒト化CD20抗体で治療する(以下の混合治療参照)。一実施態様では、以前に病気を調整する抗リウマチ薬に失敗した患者および/またはメトトレキセート単独では効果が不十分な患者は本発明のヒト化CD20結合抗体で治療する。この治療の一実施態様では、ヒト化CD20結合抗体単独を17日間の投与計画(第1および15日目に1gを静脈注射);CD20結合抗体+シクロフォスファミド(第3および17日目に750mg静脈投与)、またはCD20結合抗体+メトトレキセートで患者を治療する。
RAの治療効果を評価するある方法は、American College of Rheumatology (ACR)診断基準に基づくものであり、圧痛および腫大した関節の改善の割合を測定するものである。RA患者は、無抗体治療(例として、治療前の基準)またはプラセボ治療と比較して例としてACR20(20パーセントの改善)でスコア付けをする。抗体治療の効果を評価する他の方法は、X線画像、例として骨の侵食および関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられる鋭X線スコアを含む。また、患者は、治療期間中または治療後にHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防または改善の評価をすることができる。ACR20診断基準は、圧痛(痛み)関節数と腫大関節数の両方に20%の改善があり、5つの追加測定のうち少なくとも3つに20%の改善があることを含む。
1.視覚的類似尺度(VAS)による患者の痛み評価
2.疾患活動性の患者の全体評価(VAS)
3.疾患活動性の医師の全体評価(VAS)
4.Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、および
5.急性期反応、CRPまたはESR
ACR50および70も同様に定義する。好ましくは本発明のCD20結合抗体を少なくともACR20のスコア、好ましくは少なくともACR30、より好ましくは少なくともACR50、さらにより好ましくは少なくともACR70、最も好ましくは少なくともACR75より高いスコアに達する用量を患者に投与する。
乾癬性関節炎は特異的で明瞭なX線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の関節侵食および関節腔狭小化も同様にシャープ(sharp)スコアにより評価しうる。本発明のヒト化CD20結合抗体は関節傷害の予防だけでなく疾患の兆候および疾病の症状の減弱に利用可能である。
さらに、本発明の他の側面では、本発明のヒト化CD20結合抗体の治療的有効量をSLE患者に投与することによるループスまたはSLEの治療方法である。SLEDAIスコアでは疾患の活動性を数量で表す。SLEDAIは疾患活動性に相関することが知られている24の臨床および治験の荷重指数であり、0−103の数的範囲である。Bryan Gescuk & John Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照。二本鎖DNAに対する抗体は、血清クレアチニン、尿蛋白、または尿中の血液で顕著に生成され増加することで定義される腎性発赤および他のループスの症状を引き起こすと信じられている。代わりに、または加えて、抗核抗体および二本鎖DNAに対する抗体のレベルで患者をモニターする。SLE治療は高用量の副腎皮質ステロイドおよび/またはシクロホスファミド(HDCC)を含む。
脊椎関節症は関節疾患のグループであり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者および医師の全体的評価測定方法によって決定しうる。
様々な医薬が乾癬治療に用いられる;疾患重症度に関連して治療が異なる。より軽度な感染患者は一般的に局所治療、例として局所ステロイド、アンスラリン(anthralin)、カルシポトリエン(calcipotriene)、クロベタゾール(clobetasol)、およびタザロテン(tazarotene)が、全身的(メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、PUVAおよびUVB)治療を行うと思われる中度および重症乾癬患者では疾患の管理に有効である。タールも利用される。これらの治療は、安全性の考慮、時間のかかる投与計画、または不便な治療過程を複合して有する。さらに、いくつかは高価な設備および設置のための場所を必要とする。全身性医薬は、高血圧、高脂血症、骨髄抑制、肝疾患、腎疾患、および消化器系不調を含む様々な副作用を引き起こしうる。また、光線療法の使用は皮膚癌の発症を増加させうる。局所療法の使用に伴う不便および不快感に加え、光線療法および全身性治療は患者を処置および非処置の周期におき、その副作用のために生涯曝露をモニターする必要がある。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(PGA)変化、および乾癬領域および重症度指数(PASI)スコア、乾癬症状評価(PSA)を含む臨床兆候および疾患の症状の変化をモニターし、基礎となる症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的類似尺度の処置を通して定期的に患者を測定する。
患者は治療的抗体の初期注入時に注入反応または注入関連症状を経験するかもしれない。これらの症状は重症度が様々であり、一般的に医療処置に可逆的なものである。これらの症状はここに限るものではないが、インフルエンザのような熱、寒気/硬直、吐き気、蕁麻疹、頭痛、気管支けいれん、血管性水腫が含まれる。本発明の疾患治療方法には注入反応を最小限にすることが望まれる。ゆえに、本発明の他の側面では、ヒト化CD20結合抗体を投与することによるここに示された疾患の治療方法であり、ここでの抗体は補体依存性の細胞傷害性を減弱または全く持たず、リツキサン(登録商標)で処置したときと比較して侵食関連症状が減弱する結果となる治療方法である。一実施態様では、ヒト化CD20結合抗体は2H7.v116である。
用量
当業の医師によく知られた治療効能および用量に関する因子次第で、毒素および副作用を最小限にする一方で治療効能を有効にする用量で本発明の抗体を投与するであろう。CD20陽性癌または自己免疫疾患の治療のための治療的有効量は、約250mg/m〜約400 mg/mまたは500 mg/m、好ましくは約250〜375mg/mの範囲とする。一実施態様では、用量範囲は、275−375mg/mである。CD20陽性B細胞腫瘍の治療の一実施態様では、抗体は300−375mg/mの範囲で投与する。B細胞リンパ腫、例として非ホジキンリンパ腫患者の治療のための特定の実施態様では、本発明の抗CD20抗体およびヒト化抗CD20抗体は10mg/kgまたは375mg/mの用量で患者に投与するであろう。NHLの治療のある用量投与計画では、治療の初めの1週間は10mg/kgの用量当たり抗体組成物一用量で投与し、2週間の間隔の後、同量の第二用量抗体を投与する。一般に、NHL患者は1年に1度リンパ腫の再発によってこのような治療を受けるが、このような治療は繰り返される。他の用量投与計画では、低程度NHL患者は4週間、ヒト化2H7の型、好ましくはv16(週当たり375mg/m)を、続く5週目には抗体+CHOP(シクロフォスファミド、ドキソルビシン(doxorubicin)、ビンクリスチンおよびプレドニゾン)またはCVP(シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン)化学療法を3追加投与過程、3週ごとに3周期で投与する。
関節リウマチ治療の一実施態様では、ヒト化抗体の用量範囲は2回の用量で125mg/m(約200mg/用量と当量)〜600mg/m、例として第1日目に初期用量200mg、その後第15日目には200mgの第二用量を投与する。異なる実施態様では、用量は1用量当たり250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、 575mg、600mgである。
疾患の治療において、本発明のCD20結合抗体は疾患において医師によって決定されるように慢性的または間欠的に患者に投与する。
静脈注入または皮下中により薬剤を投与している患者は有害事象、例として熱、寒気、灼熱感、無力症、および頭痛を経験する。このような有害事象を軽減または最大限小さくするために、治療的用量に続いて初期調整用量の抗体を患者に投与する。調整用量はより多くの用量に耐えるように治療用量より少ないであろう。
投与経路
CD20結合抗体は公知の方法でヒト患者に投与される。例としてボーラスまたは一定期間中の継続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、または吸入、一般的には静脈内または皮下的投与により患者に投与する。
一実施態様では、ヒト化2H7抗体は注入溶媒として0.9%塩化ナトリウム溶液の静脈注入により投与する。
混合療法
上述のB細胞腫瘍の治療に一またはそれ以上の治療薬、例として多剤投与での化学療法剤と組み合わせて本発明のCD20結合抗体で患者を治療する。CD20結合抗体は連続的、同時、または化学療法剤と交代して、または他の治療に応答しないときに投与しうる。標準的なリンパ腫治療の化学療法は、シクロホスファミド、シタラビン(cytarabine)、メルファラン、ミトキサントロン(mitoxantrone)+メルファランを含む。CHOPは非ホジキンリンパ腫治療の最も一般的な化学療法投与の一つである。CHOP投与に用いられる薬剤は以下のとおりである:シクロホスファミド(ブランド名シトキサン(cytoxan)、ネオサル(neosar)); アドリアマイシン(ドキソルビシン/ヒドロキシドキソルビシン); ビンクリスチン(オンコビン); および、プレドニゾロン(時々デルタゾン(Deltasone)またはオラソン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、CD20結合抗体は以下の化学療法剤、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの一またはそれ以上を組み合わせて必要とする患者に投与する。特定の実施態様では、リンパ腫患者(例として非ホジキンリンパ腫)は本発明の抗CD20抗体をCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)療法と組み合わせて治療する。他の実施態様では、癌患者は本発明のヒト化CD20結合抗体をCVP(シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)化学療法と組み合わせて治療する。特定の実施態様では、CD20陽性NHL患者は、ヒト化2H7.v16をCVPと組み合わせて治療する。CLL治療の特定の実施態様では、CD20結合抗体はフルドラビンおよびシトキサンの一または両方での化学療法と組み合わせて投与する。
上述の自己免疫疾患または自己免疫関連症状の治療に、本発明のCD20結合抗体を第二治療剤、例として免疫抑制剤と組み合わせて、例として多剤投与計画で患者を処置する。CD20結合抗体は連続的、同時、または化学療法剤と交代して、または他の治療に応答しないときに投与しうる。免疫抑制剤は分野常用と同じまたはより少ない用量で投与することが可能である。好適な免疫抑制剤は治療する疾患の型だけでなく患者の病歴を含めて多くの因子によるであろう。
添加剤療法についてここで用いられる「免疫抑制剤」は、患者の免疫系を抑制又はマスクするために作用する物質を意味する。このような薬剤には、サイトカイン生成を抑制する、自己抗原発現を下方制御又は抑制する、あるいはMHC抗原をマスクする物質を含む。このような薬剤の例は、グルココルチコステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドニソロン、及びデキサメタゾンなどのステロイド;2-アミノ-6-アリール-5-置換ピリミジン(米国特許第4665077号参照);アザチオプリン(アザチオプリンに抵抗性の場合はシクロホスファミド)、ブロモクリプチン;グルタルアルデヒド(米国特許第4120649号に記載されているように、MHC抗原をマスクする);MHC抗原及びMHC断片に対する抗イディオタイプ抗体;シクロスポリンA;抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、抗腫瘍壊死因子-α抗体、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン-2抗体及び;抗IL-2レセプター抗体;抗L3T4抗体;異種性抗リンパ球グロブリン;全T抗体、好ましくは抗CD3又は抗CD4/CD4a抗体;LFA-3結合ドメインを持つ可溶性ペプチド(1990年7月26日に公開された国際公開90/08187);ストレプトキナーゼ;TGF-β;ストレプトドルナーゼ;宿主からのRNA又はDNA;FK506;RS-61443;デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin);ラパマイシイン(rapamycin);T細胞レセプター(米国特許第5114721号);T細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251: 430-432 (1991);国際公開90/11294;及び国際公開91/01133);及びT10B9等のT細胞レセプター抗体(欧州特許第340109号)を含む。
関節リウマチ治療に、本発明のCD20結合抗体を以下の薬剤のうちの一またはそれ以上と組み合わせて患者を治療する:DMARDS(疾患変更姓抗リウマチ薬(例として、メトトレキセート))、NSAIまたはNSAID(非ステロイド性抗炎症薬)、HUMIRATM(アダリムマブ(adalimumab);Abbott Laboratories)、ARAVA(登録商標)(レフノミド(leflunomide))、REMICADE(登録商標)(インフリキシマブ(infliximab);Centocor Inc., of Malvern, Pa)、ENBREL(エターナルセプト(etanercept);Immunex, WA)、COX-2阻害剤。一般にRAに用いられるDMARDは、ヒドロキシクロロクイン(hydroxycloroquine)、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、エターナルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Dペニシラミン、ゴールド(Gold)(経口)、ゴールド(筋注)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A免疫吸着である。アダリムマブ(adalimumab)はTNFαに結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブはTNFαに結合するキメラモノクローナル抗体である。エターナルセプトはヒトIgG1のFc領域に結合するヒト75kD(p75)腫瘍壊死因子受容体(TNFR)の細胞外リガンド結合部位からなる「免疫吸着」融合タンパク質である。RAの従来治療は、例として“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、RA患者を本発明のCD20抗体をメトトレキセート(MTX)と組み合わせて治療する。MTXの例示的用量は、約7.5−25mg/kg/wkである。MTXは経口および皮下的ににより投与される。
硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびクローン病の治療には、本発明のCD20結合抗体を、例としてRemicadeR (インフリキシマブ; Centocor Inc., of Malvern, Paより)、ENBREL (エターナルセプト;Immunex, WA)と組み合わせて患者を治療する。
SLEの治療には高用量副腎皮質ステロイドおよび/またはシクロスファミド(HDCC)を含む。
乾癬治療には、CD20結合抗体を局所的治療、例として局所的ステロイド、アンスラリン、カルシポトリエン、およびタザロテン、またはメトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、PUVAおよびUVB治療と組み合わせて患者を治療する。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに続いてまたは同時にCD20結合抗体で治療する。
(治療的剤形)
本発明に使用されるCD20結合抗体の治療的剤形は、所望の純度を有する抗体を選択的に薬剤的許容可能な担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥の剤形または液状溶液の形態の貯蔵に適するものである(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンズアルコニウムクロライド;ベンズエトニウムクロライド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)又はトゥイーン(TWEEN)(商品名)、プルロニクス(PLURONICS)(商品名)、及びポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
例示的抗CD20抗体の剤形はWO98/56418に記載されており、参考としてここに組み込まれる。他の剤形は液状の多用量剤形であり、2−8度で2年間の最小限の貯蔵期間を持つように抗CD20抗体40 mg/mL、25 mM 酢酸塩、150 mMロレハロース、0.9% ベンジルアルコール、pH 5.0の0.02% ポリソルベート20 を含むものである。目的の他の抗CD20剤形は、10mg/mLの抗体、9.0 mg/mL塩化ナトリウム、7.35 mg/mL クエン酸ナトリウム二水和物、0.7mg/mLポリソルベート80、および注入用の滅菌水を含むpH 6.5のものである。さらに、他の液状医薬剤形は、約pH4.8〜約pH5.5、好ましくはpH5.5の10−30mM酢酸ナトリウム、約0.01−0.1%v/v量の界面活性剤としてのポリソルベート、約2−10%w/v量のトレハロース、保存剤としてのベンジルアルコール(米国特許第6171586)を含む。凍結乾燥剤形はWO97/04801に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥剤形は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれない、また再編成された剤形はここで治療される哺乳動物に皮下注射されうる。
ヒト化2H7変異体の一剤形は、pH5.8の10mMヒスチジン、6%ショ糖、0.02%ポリソルベート20中の抗体12−14mg/mLである。
特定の実施態様では、2H7変異体および特に2H7.v16は、pH5.8の10mMヒスチジン硫酸塩、60mg/mlショ糖、0.2mg/mlポリソルベート20、および注入用の滅菌水中の抗体20mg/mLである。
また、ここでの剤形は治療を特異的に示すために必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、さらに細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤(例として、シクロスポリンまたはT細胞結合抗体、例としてLFA-1に結合するもの等のT細胞作用性のもの)を提供することが望まれる。そのような多剤の有効量は剤形が存在する抗体量、疾患または疾病または治療の型、および上述した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量およびここに示した投与経路またはここで用いられる用量の1〜99%量で用いられる。
また、活性成分は、例としてコアセルべーション技術または界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、個々のコロイド状のドラッグデリバリーシステム(例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許3773919), L-グルタミン酸およびエチルLグルタミン酸の共重合体、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸グリコール酸共重合体、例としてLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、およびポリD-(-)-3ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与に用いる剤形は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
(製造品およびキット)
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患および関連症状およびCD20陽性癌、例として非ホジキンリンパ腫の治療に有用な材料を含む製造品である。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のCD20結合抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。さらに、ラベルまたはパッケージ挿入物は抗体組成物の患者への投与についての説明を含むであろう。パッケージ挿入物は治療的製造品の商用パッケージに含まれる慣例的な説明書を示しており、効能、使用法、用量、投与法、禁忌および/または医薬製品に関する警告についての情報を含む。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫の治療に有用である。
加えて、さらに製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例として注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液を含む第二容器を含みうる。さらに、商業的および消費者視点で望まれる他の材料、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを含みうる。
キットもまた様々な目的、例としてB細胞死滅分析に、アポトーシスアッセイのポジティブコントロールとして、細胞からのCD20の精製または免疫沈降に有用である。CD20を単離および精製するために、キットにビーズ(例としてセファロースビーズ)に結合した抗CD20抗体を含めることができる。インビトロでCD20を検出および定量する、例としてELISAまたはウェスタンブロット法のための抗体を含むキットが提供される。製造品として、キットは容器およびラベルまたは容器上または容器に付随したパッケージ挿入物を含む。容器は本発明の少なくとも一の抗CD20抗体を含む組成物を有する。付加的容器には、例として希釈剤および緩衝液、対照抗体を包含しうる。ラベルまたはパッケージ挿入物は組成物の解説と同様にインビトロまたは診断的使用を意図した指示書も含みうる。
(カニクイザルCD20)
本発明は、図19に示すように、カニクイザルCD20の配列番号: のヌクレオチド配列を含んでなる単離した核酸も提供する。一実施態様では、核酸はcDNAである。一実施態様では、カニクイザルCD20をコードする核酸は宿主細胞内で発現するために発現ベクター内にある。発現ベクター内の配列番号:_のヌクレオチド配列は発現コントロール配列、例としてプロモーターまたはプロモーターおよびエンハンサーに作用可能に結合している。発現コントロール配列は、正常にカニクイザルCD20遺伝子を構成している天然配列、または該遺伝子の異種性配列であり得る。また、カニクイザルCD20のアミノ酸配列[配列番号._;図19および20]を含む単離したポリペプチドと同様に、カニクイザルCD20核酸を含む宿主細胞をも提供する。一側面では、宿主細胞は真核細胞、例としてCHO細胞である。カニクイザルCD20アミノ酸配列またはその配列断片を含む融合タンパク質も考慮する。
実施例1
2H7抗CD20マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトCD20抗体の2H7(ここではマウスをmとしてm2H7とも呼ぶ)のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス2H7抗体可変領域配列とマウスVとヒトCのキメラ2H7は開示されており、例えば米国特許第5846818号及び同第6204023号を参照のこと。2H7のCDR残基は、マウス2H7可変ドメインのアミノ酸配列(米国特許第5846818号に開示)を既知の抗体の配列と比較することにより同定された(Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。軽鎖と重鎖のCDR領域は配列高頻度可変性(上掲のKabat等)に基づいて定まり、図1A及び図1Bにそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド(表1)を用いて、部位特異的突然変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985))を使用して、プラスミドpVX4に含まれるコンセンサス配列VI,VIII(VカッパサブグループI,VサブグループIII)に対応する完全ヒトFabフレームワーク中に6つ全てのマウス2H7CDR領域を導入した(図2)。
ファージミドpVX4(図2)を突然変異誘発並びに大腸菌中でのF(ab)の発現に使用した。pB0475の誘導体(Cunningham等, Science 243: 1330-1336 (1989))であるファージミドpb0720に基づいて、pVX4は、ヒト化コンセンサスκ-サブグループI軽鎖(VκI-C)とヒト化コンセンサスIII重鎖(VIII-C1)抗IFN-α(インターフェロンα)抗体をコードするDNA断片を含む。pVX4はまた共に別の過去に開示されたpUC119ベースのプラスミドpAK2(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992))から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャイン-ダルガーノ配列を有している。独特のSpel制限部位をF(ab)軽鎖及び重鎖をコードするDNA間に導入した。抗IFN-α重鎖及び軽鎖双方の最初の23のアミノ酸はStII分泌シグナル配列である(Chang等, Gene 55: 189-196 (1987))。
2H7のCDRスワップ型を構築するために、部位特異的突然変異誘発をpVX4のデオキシウリジン含有鋳型で実施した;抗IFN-αの6つ全てのCDRがマウス2H7CDRに変化した。得られた分子をヒト化2H7型2(2H7.v2)又は2H7の「CDRスワップ型」と呼ぶ;これは図1A及び1Bに示されるコンセンサスヒトFR残基を有するm2H7CDR残基を有する。ヒト化2H7.v2は更なるヒト化に用いた。
表1はH及びL鎖においてマウス2H7(m2H7)CDRのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、CDR-H1オリゴヌクレオチドを使用してm2H7のH鎖を再作製した。CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3はH鎖CDR1、CDR2及びCDR3をそれぞれ意味する;同様に、CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3はL鎖CDRのそれぞれを意味する。CDR-H2における置換はCDR-H2AとCDR-H2Bの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表1.pVX4のヒトフレームワーク中へのマウス2H7CDRのCDRスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
Figure 2012044997
ヒト化コンストラクトとの比較のために、キメラ2H7Fab(マウスV及びVドメイン、及びヒトC及びC1ドメインを含む)を発現するプラスミドを、2H7.v2中にマウスフレームワーク残基を導入するために合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然変異誘発(上掲のKunkel)によって構築した。2H7.v6.8として知られているキメラFabを発現させるための得られたプラスミドコンストラクトの配列を図3に示す。Fabの各コード鎖は上にpVX4(図2)について記載された23のアミノ酸のStII分泌シグナル配列を有している。
ヒトVI,VIIIコンセンサスフレームワーク(図1A及び1B)及び過去のヒト化抗体(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992))とのマウス2H7フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって2H7.v2Fabコンストラクト中に導入した。これらの変異により、CDRコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス2H7フレームワークに見出されたものに変化した。型3はV(R71V,N73K)を、型4はV(R71V)を、型5はV(R71V,N73K)及びV(L46P)を、型6はV(R71V,N73K)及びV(L46P,L47W)を含んでいた。
m2H7抗体のヒト化及びキメラFab型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖DNAの調製のためにプラスミドを大腸菌株XL-1ブルー(Stratagene, San Diego, CA)中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法(Sequenase, U.S. Biochemical Corp.)を使用して完全に配列決定した。プラスミドを、MM294の誘導体である大腸菌株16C9に形質転換し、5μg/mlのカルベニシリンを含むLBプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを37℃で5−8時間、5mlのLB-100μg/mlカルベニシリン中で成長させた。5mlの培養物を500mlのAP5-100μg/mlカルベニシリンに添加して、37℃で4Lの邪魔板振盪フラスコ中で16時間成長させた。AP5培地は1.5gのグルコース、11.0のHycaseSF、0.6gの酵母エキス(保証付き)、0.19gの無水MgSO、1.07gのNHCl、3.73gのKCl、1.2gのNaCl、120mlの1Mトリエタノールアミン、pH7.4からなり、1Lの水に加えた後、0.1μmのSealkeenフィルターを通して滅菌濾過した。
細胞を、3000xgにて1Lの遠心分離瓶(Nalgene)で遠心分離によって収集し、上清を除去した。1時間の凍結後、ペレットを25mlの非放射性10mM MES-10mM EDTA、pH5.0(バッファーA)中に再懸濁させた。250μlの0.1M PMSF(シグマ)を添加してタンパク質分解を阻止し、3.5mlの原液10mg/mlのニワトリの卵の白色リゾチーム(シグマ)を添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で1時間、穏やかに振盪した後、試料を40000xgで15分、遠心分離した。上清をバッファーAを用いて50mlにし、バッファーAで平衡にした2mlのDEAEカラムに充填した。ついで、バッファーAで平衡にしたプロテインGセファロースCL-4B(ファルマシア)カラム(0.5ml床容積)に流通させた。カラムを10mlのバッファーAで洗浄し、1.25mlの1Mトリス、pH8.0に入れた3mlの0.3Mグリシン、pH3.0で溶出させた。ついで、F(ab)をセントリコン-30(アミコン)を使用してPBS中にバッファー交換し、0.5mlの最終容積まで濃縮した。全てのF(ab)のSDS-PAGEゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。
細胞ベースのELISA結合アッセイ(以下に記載)においては、キメラ2H7Fabを含むFabのCD20への結合は検出が難しかった。従って、2H7Fab型をアッセイと更なる突然変異誘発のために完全長IgG1抗体として再形態化した。
完全長IgGの発現のためのプラスミドは、キメラ2H7(v6.8)FabのV及びVドメイン並びにヒト化Fab型2ないし6を、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたpRKベクター(Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990))中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各FabコンストラクトをEcoRV及びBlpIを用いて消化させてV断片を切除し、これを、完全な軽鎖(V-Cドメイン)の発現のためにプラスミドpDR1(図4)のEcoRV/BlpI部位にクローニングした。また、各FabコンストラクトをPvuII及びApaIで消化させてV断片を切除し、これを、完全な重鎖(VH-CH-ヒンジ-CH-CHドメイン)の発現のためにプラスミドpDR2(図5)のPvuII/ApaI部位中にクローニングした。各IgG変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株293(Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977))中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、293細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖DNAと、続いてpAdVAntageTMDNA(Promega, Madison, WI)を添加し、細胞を37℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し4日後に収集した。抗体を、プロテインA-セファロースCL-4Bを使用して培養上清から精製した後、バッファーを10mMコハク酸ナトリウム、140mM NaCl、pH6.0に交換し、セントリコン-10(アミコン)を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
CD20抗原に対する相対的結合親和性を測定するために、細胞ベースのELISAアッセイ法を開発した。ヒトBリンパ芽球腫WIL2-S細胞(ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD)を、加湿した5%COインキュベーターにおいて、2mMのL-グルタミン、20mMのHEPES、pH7.2及び10%の熱不活化仔ウシ血清を補填したRPMI1640中で成長させた。細胞を、1%FBS含有PBS(アッセイバッファー)で洗浄し、96ウェルの丸底プレート(Nunc, Roskilde, Denmark)中で250−300000細胞/ウェルにて播種した。アッセイバッファー中、2倍の連続希釈標準(15.6−1000ng/mlの2H7v6.8キメラIgG)と3倍の連続希釈試料(2.7−2000ng/ml)をプレートに添加した。プレートを氷中に埋設し、45分間、インキュベートした。未結合抗体を除くために、ウェルに0.1mLのアッセイバッファーを添加した。プレートを遠心分離し、上清を除去した。細胞を0.2mLのアッセイバッファーでもう2回洗浄した。プレートに結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトFc抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)をプレートに添加することによって検出した。45分のインキュベーション後、細胞を前に記載したようにして洗浄した。TMB基質(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン;Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)をプレートに添加した。1Mのリン酸を加えて反応を停止させた。滴定曲線を4変数非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いてフィッティングさせた。滴定曲線の中点の吸光度(中央-OD)とその対応する標準濃度を決定した。ついで、この中央-ODでの各変異体の濃度を決定し、標準の濃度を各変異体の濃度で割った。よって、値は、標準に対する各変異体の結合比である。相対親和性の標準偏差(等価濃度)は一般に実験値の+/−10%であった。
表2に示されるように、CDR-スワップ変異体(v.2)の結合はキメラ2H7(v.6.8)と比較すると極めて低減していた。しかしながら、型3ないし6は改善された結合性を示した。キメラ2H7のものに対する結合親和性を回復させるのに必要とされるかも知れない変異の最小数を決定するために、更なる変異及び変異の組み合わせを部位特異的突然変異誘発によって構築して、表3に示される変異体7から17を産生した。特に、これらはV変異A49G、F67A、I69L、N73K、及びL78A;及びV変異M4L、M33I、及びF71Yを含んでいた。型16及び17は、キメラ型の2倍内の、最良の相対的結合親和性を示し、2者間に有意差はなかった(標準偏差=+/−10%)。よって、変異の数を最小にするために、マウスフレームワーク残基に対してヒトフレームワーク残基の4の変異のみを有する型16を、更なる特徴付けのためのヒト化型として選択した。
表2.細胞ベースELISAを使用してキメラ2H7と比較したCD20に対するヒト化2H7IgG変異体の相対的結合親和性。相対的結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対するキメラ2H7の濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat(上掲のKabat等)の番号付けに従ったCDR-スワップ型に対するものである。
Figure 2012044997
表3 ヒト化2H7型16(2H7.v16)における変異V(A49G、R71V、N73K)及びV(L46P)の構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。下線のコドンは示されたアミノ酸置換をコードする。V(R71V、N73K)及びV(L46P)に対して、オリゴは、Fab鋳型での突然変異誘発に使用されたので、センス鎖として示される一方、V(A49G)に対して、オリゴは、pRK(IgG重鎖)鋳型と共に使用されたので、アンチセンス鎖として示される。型16のタンパク質配列は図6及び図7に示す。
Figure 2012044997
実施例2
2H7の抗原結合決定基(パラトープ)
CD20への結合における抗体の個々の側鎖の寄与を試験するために2H7.v16又は2H7.v17においてアラニン置換((Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989))を行った。IgG変異体をpDR1及びpDR2ベクターから293細胞中で発現させ、精製し、上述の相対的結合親和性についてアッセイした。幾つかのアラニン置換は、WIL-2S細胞上のCD20への相対結合性を有意に減少させた(表4)。
表4.細胞ベースELISA(WIL-2S細胞)を使用して測定したヒト化2H7.v16のCDR領域におけるアラニン置換の効果。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v16親の濃度として表す;よって、比>1は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat(上掲のKabat等)の番号付けに従った2H7.v16に対するものである。NBDは検出可能な結合がないことを意味する。型45の二つの数値は別の実験のものである。
Figure 2012044997
Figure 2012044997
Figure 2012044997
実施例3
2H7CDR領域内の更なる変異
Alaスキャニングによって重要であると同定されたCDR位置での更なる残基の置換及び置換の組み合わせをまた試験した。幾つかの組み合わせた変異体、特にv.96はv.16よりもより強固に結合したようであった。
表5.細胞ベースELISA(WIL-2S細胞)を使用して測定したヒト化2H7.v16のCDR領域における変異と非アラニン置換の組み合わせの効果。CD20に対する相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v16親の濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す;比>1は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat(上掲のKabat等)の番号付けに従った2H7.v16に対するものである。
Figure 2012044997
Figure 2012044997
Figure 2012044997
実施例4
フレームワークヒト化置換の部位における変異
ヒト化の間に変化したフレームワーク位置の更なる残基の置換をまた2H7.v16バックグラウンドで試験した。特に、マウス2H7親にもヒトコンセンサスフレームワークの何れにも見出されなかった選択的フレームワーク置換をV(P46)及びV(G49、V71、及びK73)において行った。
これらの置換は一般的に相対的結合性の変化をあまりもたらさず(表6)、これらの位置のフレームワーク残基にある程度の自由度があることを示している。
表6.フレームワーク置換の細胞ベース(WIL-2S)アッセイにおける相対結合性。IgG変異体は2H7.v16バックグラウンドに対する変異で示す。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v6.8キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す;比>1は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat(上掲のKabat等)の番号付けに従った2H7.v16に対するものである。(*)標準コンパレーターとして2H7.v16でアッセイされた変異体;相対値はキメラの値に対して正規化してある。
Figure 2012044997
(*)標準コンパレーターとして2H7.v16でアッセイされた変異体;相対値はキメラの値に対して正規化してある。
実施例5
亢進したエフェクター機能を持つヒト化2H7変異体
2H7は補体依存性細胞傷害性(CDC)と抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の双方を通してB細胞の溶解を媒介できるので、我々は、改善されたCDC及びADCC活性を持つヒト化2H7.v16の変異体を産生しようとした。補体成分C1qへの向上した結合性を介してCDCを改善するために、他の抗体のFc領域内でのある種の残基の変異は記載されている(Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001))。活性化FcγレセプターへのIgG結合性の向上と阻害性FcγレセプターへのIgG結合性の向上によってADCCを改善するための変異もまた記載されている(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta等, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002))。特に、記載されているようにして(上掲のIdusogie等 (2001);上掲のShields等)3の変異がCDC及びADCC活性の改善のために同定されている:S298A/E333A/K334A(ここでは、三重Ala変異又は変異体とも呼ぶ;Fc領域の番号付けはEU番号付け法による;上掲のKabat等)。
2H7のCDC及びADCC活性を向上させるために、2H7Fcの三重Ala変異体を構築した。抗HER2抗体4d5のヒト化変異体は、変異S298A/E333A/K334Aで産生されており、4D5Fc110として知られている(つまり、抗p185HER2IgG1(S298A/E333A/K334A);上掲のShields等)。プラスミドである抗体4D5Fc110をコードするp4D5Fc110(上掲のShields等)をApaIとHindIIIで消化させ、Fc断片(変異S298A/E333A/K334Aを含む)を2H7重鎖ベクターpDR2-v16のApaI/HindIII部位に結合させ、pDR2-v31を産生した。型31の完全H鎖のアミノ酸配列は図8に示す。L鎖はv16のものと同じである。
IgG1抗体のFc領域の定常ドメインは与えられた種内にかなり保存されているが、対立遺伝子変異が存在している(Lefranc及びLefranc, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib編, Pergammon Press, Oxford (1990)に概説)。
表7.CD20結合性に対するFc領域中の置換の効果。CD20への相対結合性は、フレームワーク置換の細胞ベース(WIL2-S)アッセイで測定した。Fc変異(*)はEU番号付け法(上掲のKabat)により、2H7.v16親に対するものである。v.31のFc領域の3つのAla変化の組み合わせは「Fc110」と記載される。IgG変異体は2H7.v16バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v6.8キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。
Figure 2012044997
実施例6
向上した安定性を持つヒト化2H7変異体
治療用タンパク質としての開発のためには、好適な製剤バッファー中で、酸化、脱アミド化、又は生成物の品質に影響を及ぼしうる他のプロセスに対して安定なままである変異体を選択することが望ましい。2H7.v16では、幾つかの残基が不安定性の可能な原因として同定された:VL(M32)及びVH(M34、N100)。従って、v16との比較でこれらの部位に変異を導入した。
表8.細胞ベース(WIL2-S)アッセイにおけるCD20に対する、安定性及び/又はエフェクター機能の向上のために設計された2H7変異体の相対結合性。IgG変異体は2H7.v16バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v6.8キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインにおけるフレームワーク置換はKabatの番号付けに従った2H7.v16に対するものであり、Fc変異(*)はEU番号付けによって示される(上掲のKabat等)。(**)標準コンパレーターとして2H7.v16で測定された変異体;相対値はキメラの値に対して正規化してある。
更なるFc変異が過去に報告された変異(Idusogie等 (2000); Idusogie等 (2001); Shields等 (2001))に基づいてエフェクター機能を改変又は亢進するために安定性又は親和性亢進変異と組み合わせた。これらの変化には実施例5に記載したS298、E333A、K334ACDC活性の低減に対するK322A;ADCC活性を減少させるD265A;CDC活性を亢進するK326A又はK326W;及びFc領域にアロタイプ変化の効果を試験するE356D/M358Lが含まれる。これらの変異の何れもCD20結合親和性に有意な差異を生じなかった。
Figure 2012044997
(**)標準コンパレーターとして2H7.v16で測定された変異体;
相対結合値はキメラの値に対して正規化してある。
タンパク質の分解速度に対する安定性変異の効果を試験するために、2H7.v16と2H7.v73を10mMのヒスチジン、6%のスクロース、0.02%のポリソルベート20、pH5.8中12−14mg/mLで処方し、40℃で16日間インキュベートした。ついで、インキュベートした試料につき、イオン交換クロマトグラフィーによって荷電変異体における変化を、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集と断片化を、細胞ベース(WIL2-S)アッセイでの試験によって相対結合性をアッセイした。
結果(図9)は、加速された安定性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによる主ピークのフラクションの喪失について、2H7.v73が2H7.v16と比較して大なる安定性を有していることを示している。凝集、断片化又は結合親和性については有意差は見られなかった。
実施例7
WIL2-S細胞上のCD20への抗体結合のスキャッチャード分析
平衡解離定数(K)を、放射標識2H7IgGを使用してWIL2-S細胞へ結合している2H7IgG変異体について定量した。IgG変異体はCHO細胞中で産生させた。リツキサン(登録商標)(全実験での入手源はジェネンテック、S. San Francisco, CA)とマウス2H7(BD PharMingen, San Diego, CA)をヒト化変異体との比較に使用した。マウス2H7抗体はまた例えばeBioscience及びCalbiochem(共にSan Diego, CA)、Accurate Chemical & Scientific Corp.(Westbury, NY)、Ancell (Bayport, MN)、及びVinci-Biochem (Vinci, Italy)から入手可能である。希釈は全て結合アッセイバッファー(1%ウシ血清アルブミン、25mMのHEPES、pH7.2、及び0.01%のアジ化ナトリウムを含むDMEM培地)で実施した。0.8nMの濃度の125I-2H7.v16(ラクトペルオキシダーゼでヨウ素化)のアリコート(0.025mL)をV底の96ウェルマイクロアッセイプレートのウェル中に分配し、非放射性抗体の連続希釈物(0.05mL)を加えて混合した。ついで、WIL2-S細胞(0.025mL中60000細胞)を加えた。プレートをシールし、室温で24時間インキュベートした後、3500RPMで15分間遠心分離した。ついで、上清を吸引し、細胞ペレットを洗浄し遠心分離した。上清を再び吸引し、ペレットを1NのNaOHに溶解し、ガンマ計数のためチューブに移した。データを、プログラムLigand (McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983))を使用するスキャッチャード分析 (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980)) に使用した。表9に示す結果は、ヒト化2H7変異体がマウス2H7と比較して類似のCD20結合親和性を、リツキサン(登録商標)と類似の結合親和性を有していたことを示している。2H7.v31は上の表7に示した結合性に基づくとv.16に非常に類似したKを有していると予想される。
表9.スキャッチャード分析による2H7変異体の均衡結合親和性
Figure 2012044997
実施例8
補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイ
2H7IgG変異体について、本質的に開示されている(Idusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001))CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2-S細胞の補体依存性溶解を媒介するその能力をアッセイした。抗体を0.1mg/mL原液から1:3で連続希釈した。各希釈物の0.05mLのアリコートを、0.05mLの正常なヒト補体溶液(Quidel, San Diego, CA)を含んだ96ウェル組織培養プレートに加えた。この混合物に、0.05mL容積で50000WIL2-S細胞を加えた。37℃で2時間のインキュベーション後、0.05mLのアラマーブルー溶液(Accumed International, Westlake, OH)を加え、37℃で更に18時間、インキュベーションを継続した。ついで、カバーをプレートから除去し、それを軌道振盪器で室温にて15分振盪した。相対蛍光単位(RFU)を530nm励起フィルター及び590nm発光フィルターを使用して読み取った。KaleidaGraphソフトウェアを使用して各抗体に対して濃度の関数としてRFUをフィッティングさせることによってEC50を計算した。
結果(表10)は、ヒト化2H7抗体によるCDCの驚くべき改善を示しており、v.73に対してはリツキサン(登録商標)と同様の相対作用強度で、v.75に対してはリツキサン(登録商標)より3倍強く、v.16に対してはリツキサン(登録商標)より3倍弱い。
表10.リツキサンと比較した2H7抗体のCDC活性。>1の数はリツキサン(登録商標)より弱いCDC活性を示しており、<1の数はリツキサン(登録商標)より強い活性を示している。抗体は、(*)によって示したものが一過性に産生された以外は、安定なCHO株から産生された。
Figure 2012044997
実施例9
抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)アッセイ
2H7IgG変異体について、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)読み取りを使用して、本質的に開示されている(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2-S細胞のナチュラルキラー細胞(NK細胞)溶解を媒介するその能力をアッセイした。NK細胞を、CD16としても知られている(Koene等, Blood 90:1109-1114 (1997))FcγRIIIに対してアイソタイプであった正常なヒトドナーから得られた100mLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で希釈した100mLのヘパリン処理血液から調製した。この実験では、NK細胞はCD16(F158/V158)に対してヘテロ接合性のヒトドナーからのものであった。希釈した血液を15mLのリンパ球分離培地(ICN Biochemical, Aurora, Ohio)上に層状にし2000RPMで20分間、遠心分離した。層間界面の白血球を4本の清浄な50mLチューブに分配し、それに15%の仔ウシ血清を含むRPMI培地を満たした。チューブを1400RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをMACSバッファー(0.5%BSA、2mM EDTA)中に再懸濁させ、ビーズ(NK細胞単離キット,130-046-502)を製造者のプロトコール(Miltenyi Biotech)に従って使用してNK細胞を精製した。NK細胞をMACSバッファーで2x10細胞/mLまで希釈した。
アッセイ培地(グリシンなしのF12/DMEM50:50、1mMのHEPESバッファー、pH7.2、ペニシリン/ストレプトマイシン(100単位/mL;Gibco)、グルタミン、及び1%熱不活化仔ウシ血清)中の抗体の連続希釈物(0.05mL)を、96ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。WIL2-S細胞をアッセイバッファーで4x10/mLの濃度まで希釈した。WIL2-S細胞(ウェル当たり0.05mL)を96ウェルプレート中で希釈抗体と混合し、室温で30分間、インキュベートしてCD20への抗体の結合を可能にした(オプソニン作用)。
各ウェルに0.1mLのNK細胞を添加してADCC反応を開始させた。コントロールウェルでは、2%のトリトンX-100を添加した。ついで、プレートを37℃で4時間インキュベートした。放出されたLDHのレベルを、細胞傷害性(LDH)検出キット(キット番号1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana)を製造者のプロトコールに従って使用して測定した。0.1mLのLDH展開液を各ウェルに加えた後、10秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で15分暗室でインキュベートした。ついで、490nmでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全LDHで割ることによって溶解%を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、4変数曲線フィッティング(KaleidaGraph)を用いてEC50濃度を決定した。
結果は、ヒト化2H7抗体がADCCに活性があり、v.31に対してはリツキサン(登録商標)の20倍強い相対作用強度で、v.16に対してはリツキサン(登録商標)より5倍強く、v.73に対してはリツキサン(登録商標)よりほぼ4倍強い。
表11.n回の実験に基づいて2H7.v16と比較したWIL2-S細胞に対する2H7抗体のADCC活性。(>1の値は2H7.v16より低い作用強度を示し、<1の値はより大なる強度を示す。)
Figure 2012044997
更なるADCCアッセイを実施してリツキサン(登録商標)と2H7の組み合わせ変異体を比較した。これらのアッセイの結果は、2H7.v114及び2H7.v115がリツキサン(登録商標)と比較して>10倍の改善されたADCC作用強度を有することを示している(表12)。
表12.n回の実験に基づいてリツキサン(登録商標)と比較したWIL2-S細胞に対する2H7抗体のADCC活性(>1の値はリツキサン(登録商標)より低い作用強度を示し、<1の値はより大なる強度を示す)。
Figure 2012044997
実施例10
カニクイザルにおけるパイロット試験での2H7変異体のインビボ効果
CHO細胞の一過性トランスフェクションによって産生下2H7変異体を、そのインビボ活性を評価するために正常な雄カニクイ(Macaca fascicularis)ザルにおいて試験した。C2B8(リツキサン(登録商標))のような他の抗CD20抗体は、正常な霊長類においてB細胞を枯渇させる能力が証明されている(Reff等, Blood 83: 435-445 (1994))。
一試験では、ヒト化2H7変異体を比較した。平行した試験では、リツキサン(登録商標)もまたカニクイザルにおいて試験された。4匹のサルを5つの用量群のそれぞれに使用した:(1)ビヒクル、(2)0.05mg/kgのhu2H7.v16、(3)10mg/kgのhu2H7.v16、(4)0.05mg/kgのhu2H7.v31、及び(5)10mg/kgのhu2H7.v31。抗体は、試験の1日目に一用量と8日目にもう一用量の全二用量に対して、0、0.2、又は20mg/mLの濃度で静脈内投与した。投薬の最初の日を1日目とし、その前の日を−1日と標記する;回復の最初の日(各群2匹の動物に対して)は11日と標記する。血液試料を−19、−12、1(投薬前)日、及び最初の投薬後6時間、24時間、及び72時間で収集した。更なる試料を8日目(投薬前)、10日目(2動物/群の屠殺前)、及び36日及び67日目(回復動物に対して)に採取した。
末梢B細胞濃度を、CD3−/CD40+細胞を計数するFACS法によって定量した。サル試料中における全リンパ球のCD3−CD40+細胞の割合(パーセント)を次のゲーティング方法によって得た。前方散乱/側方散乱散乱図上にリンパ球集団をマークして領域1(R1)を決めた。R1での事象を使用して、CD40及びCD3マーカーに対して蛍光強度ドットプロットを表示した。蛍光的に標識した同位元素コントロールを用いて、CD40及びCD3陽性の各カットオフ点を決定した。
結果は、2H7.v16と2H7.v31の双方が10mg/kg用量で完全な末梢B細胞枯渇を、また0.05mg/kg用量で部分的な末梢B細胞枯渇を生じさせることができたことを示している(図11)。投薬の最初の72時間の間に測定されたB細胞枯渇の時間経過と程度は二つの抗体に対して同様であった。回復動物の続く分析は、2H7.v31で処置した動物が2H7.v16を投薬したものと比較してB細胞の長い枯渇を示したことを示している。特に、10mg/kgの2H7.v16で処置した回復動物は10日目と36日目の間のある時に実質的なB細胞回復を示した。しかしながら、10mg/kgの2H7.v31で処置した回復動物では、36日目と67日目の間のある時にならないとB細胞は回復を示さなかった(図11)。これは、2H7.v16と比較して2h7.V31の場合に約一ヶ月完全な枯渇の期間が長くなることを示唆している。
低又は高用量でサルの試験では毒性は観察されず、全体的な症状は正常であった。他の試験では、v16はこれらのサルで2週間あけて2用量を静脈内投与した後(100mg/kgx2=1200mg/mx2)の最も高い用量まで耐容性が良好であった。
2H7.v16対リツキサン(登録商標)のカニクイザルにおけるデータは、CDC活性の5倍の減少が作用強度には悪影響を及ぼさないことを示唆している。強力なADCC活性を持つが減少したCDC活性の抗体は、大なるCDC活性を持つものよりも最初の注入反応に対して好ましい安全性状を有しうる。
実施例11
亢進したエフェクター機能を持つフコース欠損2H7変異体抗体
正常なCHO及びHEK293細胞はIgGオリゴ糖に高度に(97−98%)フコースを添加する。血清からのIgGがまた高度にフコシル化される。
フコシル化適格性であるジヒドロ葉酸レダクターゼマイナス(DHFR−)CHO細胞株のDP12と、タンパク質フコシル化に欠損がある細胞株のLec13を用いてこの試験の抗体を産生した。CHO細胞株Pro-Lec13.6a(Lec13)を、イェシーバ大学のアルバートアインシュタイン医科カレッジのパメラ・スタンレー教授から取得した。親株はPro−(プロリン栄養要求株)及びGat−(グリシン、アデノシン、チミジン栄養要求株)である。CHO-DP12細胞株はCHO-K1細胞株(ATCC番号CCL-61)の誘導体であり、これはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損であり、インスリンに対する要求は低い。細胞株は、Superfect法(Qiagen, Valencia, CA)を使用してcDNAを形質移入した。形質移入した抗体を発現するLec13細胞の選択は、10%の不活化FBS(GIBCO)、10mMのHEPES、及び1Xのペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO)を補填したL-グルタミン、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)を含むMEMアルファ培地を含む成長培地中10μg/mlで、ピューロマイシン二塩酸塩(Calbiochem, San Diego, CA) を使用して実施した。CHO細胞を同様に、5%のFBS(GIBCO)、10mMのHEPES、2mMのL-グルタミン、1XのGHT(グリシン、ヒポキサンチン、チミジン)、及び1Xのペニシリン/ストレプトマイシンを補填したNaHCO3を伴いグリシンを伴わない低グルコースDMEMを含むGHTなしのハムF12を含む成長培地で選択された。
コロニーは2ないし3週間以内に形成され、増殖とタンパク質発現のためにプールした。細胞プールを、小バッチタンパク質発現のために3x10細胞/10cmプレートで最初に播種した。細胞は、それらが90−95%の集密度まで成長したところで無血清培地に転換し、3−5日後に細胞の上清を収集し、FcIgG-及び無傷IgG-ELISAで試験してタンパク質の発現レベルを推定した。10mg/Lの組換えヒトインスリン及び1mg/Lの微量元素を補填したPS24生産培地への転換の一日前に約8x10細胞/15cmプレートでLec13及びCHO細胞を播種した。
Lec細胞及びDP12細胞は3−5日間、無血清生産培地に残したままとした。上清を収集し、150mlのコニカルチューブで遠心分離によって透明にし、細胞及び細胞片を除去した。プロテアーゼ阻害剤のPMSFとアプロチニン(Sigma, St. Louis, MO)を添加し、上清を、プロテインGクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を使用する即座の精製の前にMWCO30フィルター(Amicon, Beverly, MA)を用いて撹拌細胞で5倍に濃縮した。全てのタンパク質を、Centripriep-30濃縮器(Amicon)を使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にバッファー交換し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。タンパク質濃度はA280を使用して定量し、アミノ酸組成分析を使用して証明した。
CHO細胞を、ヒト化2H7v16,2H7v.31を発現するベクターでトランスフェクトし、記載されたようにして選択した。2H7v.16抗体は野生型Fc領域を保持する一方、v.31(実施例5、上の表7を参照)は、3のアミノ酸変化がなされた(S298A、E333A、K334A)Fc領域を有しており、FcγRIIIaレセプターに対して高い親和性を生じる(Shields等 J.Biol.Chem.276(9):6591−6604(2001))。トランスフェクションと選択に続いて、個々の細胞コロニーを単離し、タンパク質の発現レベルの評価をし、最も高い発現体をネトトレキセートでの選択にかけて、プラスミドコピー数を増大させ、高レベルの抗体を産生した細胞を選択した。細胞を成長させ、7日の期間、無血清培地に移した後、培地を収集し、プロテインAカラムに充填し、標準的な方法を使用して抗体を溶出させた。抗体の最終濃度を、無傷の抗体を測定するElisaを使用して定量した。全てのタンパク質を、Centripriep-30濃縮器(Amicon)を用いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にバッファー交換し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。
アスパラギン結合オリゴ糖のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法: N結合オリゴ糖は、Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)の方法を使用して組換え糖タンパク質から放出された。簡単に説明すると、96ウェルPVDF-裏打ちマイクロタイタープレート(Millipore, Bedford, MA)を、ミリポア・マルチスクリーン真空マニフォールドに真空を適用することによってPDVF膜を通して吸引した100μlメタノールで条件化した。条件化PVDF膜を3X250μl水で洗浄した。全ての洗浄工程間に、ウェルを、マニフォールドに穏やかな真空をかけることによって完全に液抜きした。膜を、6M塩酸グアニジン、360mMのトリス、2mMのEDTA、pH8.6からなる還元及びカルボキシメチル化バッファー(RCM)で洗浄した。糖タンパク質試料(50μg)を個々のウェルに適用し、穏やかな真空をかけてPVDF膜を通して再び吸引し、ウェルを2X50μlのRCMバッファーで洗浄した。固定化した試料を、各ウェルに50μlの0.1Mジチオスレイトール(DTT)溶液に添加し、37℃で1時間マイクロタイタープレートをインキュベートすることにより還元した。DTTを真空で除去し、ウェルを4x250μl水で洗浄した。システイン残基を、1MのNaOHで新しく調製しRCMバッファーで0.1Mまで希釈した50μlの0.1Mのヨード酢酸(IAA)を添加してカルボキシメチル化した。カルボキシメチル化は雰囲気温度で暗室にて30分間インキュベーションを行うことによって達成した。真空をプレートにかけてIAA溶液を除去し、ウェルを4x250μlの純水で洗浄した。PVDF膜を、100μlの1%PVP360(ポリビニルピロリドン、分子量360000)(Sigma)溶液を添加し、雰囲気温度で1時間インキュベーションすることによりブロックした。PVP-360溶液を穏やかな真空で除去し、ウェルを4x250μlの水で洗浄した。10mMトリスアセテート、pH8.4中25μlの25単位/ml溶液のPNGaseF(New England Biolabs, Beverly, MA)消化液を各ウェルに加え、37℃で3時間、消化を進めた。消化後、試料を500μlのエッペンドルフチューブに移し、各試料に2.5μlLの1.5M酢酸溶液を加えた。酸性化試料を雰囲気温度で3時間インキュベートし、オリゴ糖をグリコシルアミンからヒドロキシル形態に転換した。MALDI-TOF質量スペクトル分析の前に、放出されたオリゴ糖を、コンパクトな反応チューブ(US Biochemical, Cleveland, OH)中に充填したスラリー化された陽イオン交換樹脂(水素形態のAG50W-X8樹脂)(Bio-Rad, Hercules, CA)の0.7ml床を使用して脱塩した。
ポジティブモードでの試料のMALDI-TOF質量スペクトル分析では、脱塩オリゴ糖(0.5μlアリコート)を、1mlのエタノール/10mM塩化ナトリウム1:1(v/v)中で2mgの2,5ジヒドロキシ安息香酸を0.1mgの5-メトキシスリサイリック(methoxyslicyic)酸で溶解することによって調製した0.5μlの2,5ジヒドロキシ安息香酸マトリックス(sDHB)と共に染色なしの標的に適用した。試料/マトリックス混合物を真空乾燥した。ネガティブモードでの分析のために、脱塩N結合オリゴ糖(0.5μlアリコート)を、1:3(v/v)アセトニトリル/13.3mMクエン酸アンモニウムバッファー中で調製した0.5μlの2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンマトリックス(THAP)と共に染色なしの標的に適用した。試料/マトリックス混合物を真空乾燥した後、分析前に大気水分を吸収させた。放出されたオリゴ糖をPerSeptive BioSystems Voyager-DE質量分析計でのMALDI-TOFによって分析した。質量分析計を線形構成のポジティブ又はネガティブモードの何れかで遅延型抽出を使用して20kVで操作した。データは、信号雑音比を改善するためにデータ加算モード(240スキャン)で1300のレーザー出力を用いて獲得した。機器を標準オリゴ糖の混合物を用いて較正し、質量をあてがう前に19点のSavitsky-Golayアルゴリズムを使用して平滑化した。質量スペクトルデータの積分をCaesar7.0データ解析ソフトパッケージ(SciBridge Software)を使用して達成した。
ナチュラルキラー(NK)細胞抗体依存性細胞傷害アッセイ。
ADCCアッセイは実施例9に記載されたようにして実施した。標識細胞(WIL2-S)に対するNK比は1対4であり、アッセイを4時間実施し、毒性をラクトースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して前のようにして測定した。標的細胞を、NK細胞の添加の前に30分間、示した抗体濃度でオプソニン化した。使用したリツキサン(登録商標)抗体はジェネンテック(S. San Francisco, CA)からのものであった。図12は代表的なADCCアッセイの結果を示す。
結果は、低フコシル化抗体が、フコースの完全な補体を持つ抗体よりもより効果的にNK細胞標的細胞死滅を媒介することを示している。低フコシル化抗体2H7v.31が標的細胞死滅の媒介に最も効果的である。この抗体は低濃度で効果的であり、他の抗体より高い濃度で、より大なる割合の標的細胞の死滅を媒介することができる。抗体の活性は次の通りである:Lec13誘導2H7v31>Lec13誘導2H7v16>Dp12誘導2H7v31>Dp12誘導2H7v16>又は=リツキサン。タンパク質及び糖鎖改変が相加的である。Lec13産生及びCHO産生IgGから天然IgGに見出された糖鎖の比較では、ガラクトシル化の度合いに有意な差異を示しておらず、よってこの結果はフコースの存在/不存在のみに帰する可能性がある。
実施例12
インビボでの亢進したADCCを示すフコース欠損2H7変異体抗体
この実施例は、ヒトCD[FcRγIII]とヒトCD20を発現するマウスにおける、DP12中で産生された正常なフコシル化対応物と比較した場合のLec13中で産生されたv.16及びv.31を含むフコース欠損ヒト化2H7変異体のインビボでのADCC活性を記載する。
huCD20TghuCD16TgmCD16−/−マウスの産生
ヒトCD20トランスジェニックマウスをヒトCD20BAC DNA(Invitrogen, Carlsbad, CA)から産生した。ヒトCD20の発現のFACS分析に基づいてマウスをスクリーニングした。ついで、HuCD20TgマウスをhuCD16TgmCD16−/−マウスと交雑させて、huCD20TghuCD16TgmCD16−/−マウスを産生した。
インビトロ処置
2H7変異体又はリツキサン(登録商標)のそれぞれを10から100mg、腹腔内注射によって、huCD20TghuCD16TgmCD16−/−マウスに投与する。等量のアイソタイプの一致した抗体を動物のネガティブコントロール群に同様に適用する。
マウスリンパ球の調製
全血、脾臓、リンパ節及び骨髄からのマウスリンパ球を、“Current Protocols in Immunology, edited by John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach and Warren Strober, 1994”に記載された標準的なプロトコールに従って調製する。
FACS分析
50万の細胞を洗浄し、5μlの染色又はコントロール抗体を含む1%BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水であるFACSバッファー100μlに再懸濁させる。アイソタイプコントロールを含む全ての染色抗体は、PharMingen, San Diego, CAから取得する。ヒトCD20の発現を、FITC結合抗ヒトIgG1二次抗体と共にリツキサン(登録商標)で染色することによって評価する。FACS分析を、FACScan及びCell Quest(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)を使用して実施する。全てのリンパ球は前方及び側方光散乱で定義される一方、全てのBリンパ球は細胞表面上のB220の発現で定義される。
B細胞枯渇及び回復は、注入後の最初の週について毎日の基準でとその後の毎週基準で脾臓、リンパ節及び骨髄において末梢B細胞カウントを分析しhCD20+B細胞をFACSによって分析することによって評価する。注入された2H7変異体抗体の血清レベルをモニターする。
インビボアッセイでのこの結果は、野生型(フコシル化に関して)グリコシル化対応物に対するフコース欠損2H7変異体の増加したADCC活性及びB細胞枯渇に対するインビトロでの知見を確認する。
実施例13
アポトーシス活性
リツキサン(登録商標)を含む抗CD20抗体は二次抗体又は化学的手段によって架橋されると、インビトロでアポトーシスを誘導することが示されている(Shan等, Blood 9:1644-1652 (1998); Byrd等, Blood 99:1038-43 (2002); Pederson等, Blood 99:1314-19 (2002))。化学的に架橋すると、マウス2H7二量体はDaudi細胞のアポトーシスを誘導した(Ghetie等, Proc Natl Acad Sci USA 94:7509-14 (1997))。二次抗体での架橋はマウス2H7抗体でのアポトーシスを誘導した(Shan等, 1998)。これらの活性は、様々な作用機序がインビボでの細胞表面CD20に結合した抗CD20抗体の架橋を生じうるので、生理学的に関連していると考えられる。
RhuMAb2H7.v16[ヒト化2H7v16;RhuMAbは組換えヒトモノクローナル抗体の略である]及びリツキサン(登録商標)を、二次架橋抗体を用いてインビトロでのアポトーシスアッセイで比較した。CD20を発現するヒトBリンパ球細胞株であるRamos細胞(CRL-1596,ATCC,Manassas,VA)を用いて、アネキシンV染色とプロピジウムヨウ素色素排除(Vybrant(登録商標)アポトーシスアッセイキット, Molecular Probes, Seattle, WA)によって測定したアポトーシスを誘導する、抗CD20モノクローナル抗体rhuMAb2H7.v16及びリツキシマブ対ネガティブコントロール抗体のトラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標)、ジェネンテック, South San Francisco, CA)の能力を測定した。Ramos細胞を、10%仔ウシ血清(Biosource International, Camarillo, CA)及び2mMのL-グルタミン(Gibco)を含むRPMI-1640培地(Gibco, Rockville, MD)で培養した。アッセイの前に、細胞を新鮮培地で2回洗浄した後、mL当たり2X10の細胞濃度に調節した。細胞(150mL)を、150mLの予め定まった量のコントロールIgG1、rhuMAb2H7.v16、又はリツキシマブを、F(ab)'2ヤギ抗ヒトFc(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)と共に含む96ウェルアッセイプレート(Becton Dickinson, Palo Alto, CA)に加えた。最終IgG濃度は100、10、1.0、0.1、0.01及び0.001nMであり、F(ab)'2ヤギ抗ヒトFc抗体濃度は各試料抗体濃度の2倍に設定した。各希釈物は3組用意した。37℃で24時間インキュベーションした後、細胞をPBSで2回洗浄した後、アネキシンV及びプロピジウムヨウ素で製造者の推奨に従って染色した。Ramos細胞の染色パターンをFACscanフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用してフローサイトメトリーによって分析し、データを10秒間収集した。データをCellquest Proソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して減らした。(1)アネキシンV染色、(2)アネキシンV及びプロピジウムヨウ素二重染色に対して陽性であったRamos細胞と、(3)未染色生存細胞の数をカウントし、KaleidaGraphソフトウェア(Synergy Software, Reading, PA)を使用してプロットした。
rhuMAb2H7.v16及びリツキシマブは、無関係なIgG1コントロール抗体と比較して、抗ヒトFcで架橋された場合に、Ramos細胞のアポトーシスを誘導した(図13−15)。(rhuMAb2H7)のアポトーシス活性はリツキシマブのものより僅かに低かった。10nM濃度の架橋rhuMAb2H7、リツキシマブ、及びコントロールIgG1抗体の場合に、アネキシンV染色細胞の画分はそれぞれ18.5、16.5、2.5%であり、二重に標識された細胞の画分は29、38、及び16%であり、10秒当たりに計数した生存細胞数は5200、3100、及び8600であった。
これらのインビトロのデータは、アポトーシスがインビボでのB細胞枯渇の一つの潜在的な機構であることを裏付けている。細胞表面CD20に結合したrhuMAb2H7又はリツキシマブのインビボでの架橋は免疫エフェクター細胞の表面上のFcγRを通して生じうる。
実施例14
腫瘍成長のインビボでの抑制
RajiヒトB細胞のリンパ腫細胞株(ATCC CCL86)の成長を阻害するrhuMAb2H7.v16の能力をBalb/cヌード(胸腺欠損)マウスで評価した。Raji細胞はCD20を発現し、ヌードマウスに成長し、転移性疾患を生じると報告されている;腫瘍成長はリツキサン(登録商標)によって阻害される(Clynes等, Nature Medicine 6, 443−446 (2000))。56匹の8−10週齢のBalb/cヌードマウスを、各群が8匹のマウスからなる7群(A−G)に分けた。0日目に、各マウスは側部に5x10のRajiBリンパ腫細胞の皮下注射を受けた。0日目に始まって、各マウスは100uLのネガティブコントロール液(PBS;リン酸緩衝生理食塩水)、リツキサン(登録商標)又は2H7.v16の何れかを受けた。投薬量は体重に依存し、薬剤送達は尾静脈を経る静脈内であった。A群のマウスはPBSを受けた。B−D群はリツキサン(登録商標)を、それぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kgで受けた。E−G群のマウスは2H7v.16をそれぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kgで受けた。注射は6週間の間、毎週繰り返した。処置の間、毎週の間隔で、各マウスにつき、注射部位での明白な腫瘍の存在を検査し、存在した場合には腫瘍体積を測定し記録した。最終検査は8週目に行った(処置なしの2週の間隔後)。
この試験の結果は、rhuMAb2H7.v16とリツキサン(登録商標)の両方がヌードマウスにおいて皮下Raji-細胞腫瘍成長の阻害に効果的であったことを示している(図16−18)。腫瘍成長は4週目に始まりPBSコントロール群で観察された。しかしながら、8週の試験の間、5mg/kg又は0.5mg/kgのリツキサン(登録商標)又は2H7.v16で処置した群には腫瘍は観察されなかった。0.05mg/kgの低用量処置群では、2H7群の一匹の動物に、リツキサン(登録商標)群の一匹の動物に腫瘍が観察された(図18)。
実施例15
カニクイザルCD20のクローニングと抗体結合
カニクイザル(Macaca fascicularis)のCD20DNA配列を、カニクイザル脾臓cDNAライブラリーからCD20をコードするcDNAの単離の際に決定した。cDNA合成及びプラスミドクローニングのSUPERSCRIPTMプラスミド系(カタログ番号18248-013,Invitrogen, Carlsbad, CA)を僅かに変更して用いてライブラリーを構築した。cDNAライブラリーを制限部位XhoI−及びNotIを使用してpRK5Eベクター中にライゲーションさせた。mRNAは脾臓組織(California Regional Research Primate Center, Davis, CA)から単離された。CD20をコードするcDNAを増幅するプライマーはヒトCD20の非コード化配列に基づいて設計した。N末端領域プライマー5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3'及びC末端領域プライマー5'-AAGCTATGAACACTAATG-3'を用い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってカニクイザルCD20をコードするcDNAをクローニングした。PCR反応はPlatinum・Taq・DNAポリメラーゼ・高フィデリティを使用して製造者の推奨に従って(Gibco, Rockville, MD)実施した。PCR産物をpCR(登録商標)2.1-TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)にサブクローニングし、XL-1ブルー大腸菌(Stratagene. La Jolla, CA)中に形質転換した。結合したPCR産物を含むプラスミドDNAを個々のクローンから単離し、配列決定した。
カニクイザルCD20のアミノ酸配列は図19に示す。図20はカニクイザル及びヒトCD20の比較を示す。カニクイザルCD20はヒトCD20と97.3%類似で、8の差がある。細胞外ドメインはV157Aに一つの変化を含む一方、残りの7残基は細胞質又は膜貫通領域に見出すことができる。
ヒトCD20に対する抗体について、CD20を発現するカニクイザル細胞に結合しFITC結合マウス2H7の結合を置換する能力をアッセイした。20ミリリットルの血液を2匹のカニクイザル(California Regional Research Primate Center, Davis, CA)から抜き取ってヘパリンナトリウム中に入れジェネンテック・インクに直接送った。同じ日に、血液試料をプールし、40mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて1:1で希釈した。20mlの希釈した血液を50mlのコニカルチューブ (カタログ番号352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ)中で4x20mlのFicoll-PaqueTMPlus(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)上に層状に加え、Sorval7遠心分離器(Dupont, Newtown, CT)で30分間室温にて1300rpmで遠心分離した。PBMC層を単離し、PBSで洗浄した。赤血球を0.2%NaCl溶液に溶解させ、等価容積の1.6%のNaCl溶液で等張に回復させ、1000RPMで10分間、遠心分離した。PBMCペレットを、5%仔ウシ血清(FBS)を含むRPMI1640(Gibco, Rockville, MD)に再懸濁させ、37℃で1時間、10cmの組織培養皿に分配した。非付着性B及びT細胞集団を吸引により取り除き、遠心分離し、計数した。全体で2.4x10細胞が回収された。再懸濁させたPBMCを20の12x75mm培養チューブ(カタログ番号352053, Falcon)中に分配した。各チューブは0.25mlの容積中に1x10細胞を含む。チューブを4組の5本のチューブに分けた。各組に、培地(RPMI1640、5%FBS)、滴定量のコントロールヒトIgG抗体、リツキサン(登録商標)、2H7.v16、又は2H7.v31の何れかを加えた。各抗体の最終濃度は30、10、3.3及び1.1nMであった。また、各チューブには20ulのフルオレッセインイソチオシアネート(FITC)結合抗ヒトCD20(カタログ番号555622, BD Biosciences, San Diego, CA)を入れた。細胞を穏やかに混合し、氷上で1時間インキュベートした後、非標識PBSで2回洗浄した。細胞表面染色をEpic XL-MCL (Coulter, Miami, FL)で分析し、得られた幾何学的平均値を、抗体濃度に対してプロットした(KaleidaGraphTM, Synergy Software, Reading, PA)。
図21のデータは、2H7v.16と2H7v.31がカニクイザル細胞へのFITC-マウス2H7の結合を競合的に排除したことを示している。更に、リツキサン(登録商標)もまたFITC-マウス2H7の結合を排除し、よって、2H7とリツキサン(登録商標)の双方がCD20上の重複するエピトープに結合することを裏付けている。また、データは、2H7v.16、2H7v.31及びリツキサンに対するIC50値が同様で、4−6nMの範囲に入ることを示している。
実施例16
中程度から重症の関節リウマチにおけるrhuMAb2H7(2H7.v16)のI/II相治験
プロトコール概要
安定した用量の併用メトトレキセートを受ける中程度ないし重症の関節リウマチの患者におけるPRO70769(rhuMAb2H7)の増大用量の安全性に関する無作為プラシーボ対照、多施設、盲式I/II相治験。
目的
この試験の主要な目的は中程度ないし重症の関節リウマチの患者におけるPRO70769(rhuMAb2H7)の増大静脈内(IV)用量の安全性と耐容性を評価することにある。
研究計画
これは、中程度ないし重症のRAの患者におけるMTXと組み合わせてのPRO70769の増大用量の安全性に関する無作為プラシーボ対照、多施設、盲式I/II期の研究者及び患者盲式治験である。治験は、用量増大相と多数の患者の登録を伴う第二相からなる。スポンサーは治療の指定には加わらなかった。
現在はMTXでの治療には満足できない臨床応答を示す生物又は1ないし5の疾患改変抗リウマチ剤に失敗した中程度から重症のRAの患者が登録される。
患者は試験への参加の前に少なくとも12週の間、毎週10−25mgの範囲でMTXを受け、試験薬(PRO70769又はプラシーボ)の最初の用量を受ける前に少なくとも4週の間、安定した投薬を受けていることが必要である。患者はまた安定用量の経口コルチコステロイド(毎日10mgまで又はプレドニゾン等価物)と安定用量の非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を受ける。患者は次の用量増大計画に従って(図22を参照)1日目と15日目に示された用量でPRO70769又はプラシーボ等価物の2回の静脈内注入を受ける。
用量増大は、特定の基準に従って(用量増大規則を参照)、かつ内部の安全性データ審査委員会による安全性データの審査と各コホートで治療された最後の患者への第二の注入の72時間後の急性毒性の評価の後になされる。用量レベルが用量増大相の間、耐容性があると証明された場合には、用量増大相後に、40名の更なる患者(32名は活性及び8名はプラシーボ)を、次の用量レベル:2x50mg、2x200mg、2x500mg、及び2x1000mgのそれぞれに無作為化する。およそ205名の患者を試験に登録する。
B細胞のカウント数を得て、記録する(試験評価のため、セクション4.5及びアペンディックスA-1を参照)。6ヶ月の効果評価を越えて48週の追跡試験期間にフローサイトメトリーを使用して、細胞カウント数を評価する。B細胞枯渇は用量制限毒性(DLC)とは考えられず、むしろPRO70769処置の期待される薬物動態学的結果である。
任意のサブ試験において、血清及びRNA分析のための血液並びに尿試料を様々な時点で患者から得た(セクション3.3.3を参照)。これらの試料を用いて、中程度から重症のRAの患者におけるPRO70769治療への応答の予測となりうる生物マーカーを同定することができる。
結果判定
この研究の主要な結果判定法は中程度から重症のRAの患者におけるPRO70769の安全性と耐容性である。
研究治療
患者のコホートは次の増大計画に従って1日目と15日目に示した用量でPRO70769又はプラシーボの2回の静脈点滴を受ける。
− 10mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:4患者活性薬、1コントロール
− 50mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール
− 200mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール
− 500mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール
− 1000mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール
効果
PRO70769の効果をACR応答によって測定する。ACR20、ACR50及びACR70の応答を達成する患者の割合は治療群によって総括され、95%の信頼区間が各群に対して生じる。これらの応答の成分とベースラインからのその変化は治療と往診によって総括される。
結論
上のデータは、その生物学的性質を維持し、亢進さえするヒト化CD20結合抗体、特にヒト化2H7抗体変異体を産生することに成功したことを証明している。本発明のヒト化2H7抗体はマウスドナー及びキメラ2H7抗体と同様の親和性でCD20に結合し、霊長類におけるB細胞死滅に効果的であり、B細胞枯渇を生じる。ある種の変異体は、NHLを治療するために現在使用されているキメラ抗CD20抗体よりも亢進されたADCCを示し、患者におけるより低用量の治療抗体の使用を支持する。また、マウスFR残基を持つキメラ抗体はそれに対する抗体応答を取り除くには完全なB細胞枯渇を達成するのに効果的な用量で投与されることが必要である場合があるところ、本ヒト化抗体は、特定の疾患及び患者に望ましいように、部分的な又は完全なB細胞枯渇を達成する用量で、異なった時間の間、投与することができる。また、これらの抗体は溶液中で安定性を示した。ヒト化2H7抗体のこれらの性質は、CD20陽性癌及び自己免疫疾患の治療における免疫療法剤としての使用にそれを理想的なものにする;これらの抗体は免疫原性であるとは予想されないし又はヒト患者において完全なマウス又はキメラ抗CD20抗体よりも免疫原性が少なくとも少ないであろう。
文献
特許、公開出願及び他の刊行物を含む本願において引用した文献は出典明示によりここに取り込む。
本発明の実施には、特に示さない限り、当業者の技量内にある分子生物学の一般的技法等を用いる。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel等編, 1987更新); Essential Molecular Biology (T. Brown編, IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel編, Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell等編, Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu等編, Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams等, Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller及びM. Calos編, 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler編, 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard等編, Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2版 (R. Freshney等編, Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed等編, Wiley-Liss 1990); シリーズMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M.及びHauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock及びP. Petrusz編, Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir及びC. Blackwell編); Current Protocols in Immunology (J. Coligan等編 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis及びT.K. Christopoulos編, Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2版) Academic Press, New York; Ed Harlow及びDavid Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2版(C. Borrebaeck編, Oxford University Press, 1995);及びシリーズAnnual Review of Immunology; シリーズAdvances in Immunologyを参照のこと。
図1Aはマウス2H7(配列番号1)、ヒト化2H7.v16変異型(配列番号2)、およびヒトκ軽鎖サブグループI(配列番号3)それぞれの軽鎖可変領域(V)のアミノ酸配列を比較した配列。2H7およびhu2H7.v16のVのCDRは以下の通りである:CDR1(配列番号4)、CDR2(配列番号5)、およびCDR3(配列番号6)。CDR2、CDR3は示すように大括弧で囲っており、フレームワーク領域に隣接している。図1Bはマウス2H7のV配列(配列番号7)、ヒト化2H7.v16変異型(配列番号8)、および重鎖サブグループIIIのヒトコンセンサス配列(配列番号9)を比較した配列。2H7のVおよびhu2H7.v16のCDRは以下の通りである。CDR1(配列番号10)、CDR2(配列番号11)、およびCDR3(配列番号12)。それぞれの鎖のCDR1、CDR2、CDR3は示すように大括弧で囲っており、フレームワーク領域に隣接している。2H7はマウス2H7抗体を示す。2配列間にあるアステリスクは2配列間で異なる箇所を示す。 Kabat ら, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従って残基番号を示し、a、b、c、d、およびeで挿入を示す。 2H7Fabプラスミド(実施例1参照)構築に用いたファージミドpVX4(配列番号13)の配列、およびCDR移植抗IFNαヒト化抗体のL鎖(配列番号14)およびH鎖(配列番号15)のアミノ酸配列を示す。 2H7Fabプラスミド(実施例1参照)構築に用いたファージミドpVX4(配列番号13)の配列、およびCDR移植抗IFNαヒト化抗体のL鎖(配列番号14)およびH鎖(配列番号15)のアミノ酸配列を示す。 2H7Fabプラスミド(実施例1参照)構築に用いたファージミドpVX4(配列番号13)の配列、およびCDR移植抗IFNαヒト化抗体のL鎖(配列番号14)およびH鎖(配列番号15)のアミノ酸配列を示す。 2H7Fabプラスミド(実施例1参照)構築に用いたファージミドpVX4(配列番号13)の配列、およびCDR移植抗IFNαヒト化抗体のL鎖(配列番号14)およびH鎖(配列番号15)のアミノ酸配列を示す。 2H7Fabプラスミド(実施例1参照)構築に用いたファージミドpVX4(配列番号13)の配列、およびCDR移植抗IFNαヒト化抗体のL鎖(配列番号14)およびH鎖(配列番号15)のアミノ酸配列を示す。 キメラ2H7.v6.8Fabをコードする発現プラスミドの配列(配列番号16)を示す。L鎖(配列番号17)およびH鎖(配列番号18)のアミノ酸配列を示す。 キメラ2H7.v6.8Fabをコードする発現プラスミドの配列(配列番号16)を示す。L鎖(配列番号17)およびH鎖(配列番号18)のアミノ酸配列を示す。 キメラ2H7.v6.8Fabをコードする発現プラスミドの配列(配列番号16)を示す。L鎖(配列番号17)およびH鎖(配列番号18)のアミノ酸配列を示す。 キメラ2H7.v6.8Fabをコードする発現プラスミドの配列(配列番号16)を示す。L鎖(配列番号17)およびH鎖(配列番号18)のアミノ酸配列を示す。 キメラ2H7.v6.8Fabをコードする発現プラスミドの配列(配列番号16)を示す。L鎖(配列番号17)およびH鎖(配列番号18)のアミノ酸配列を示す。 実施例1に示すように免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドpDR1(配列番号19;5391bp)の配列を示す。pDR1は無関係な抗体をコードする配列、ヒト化抗CD3抗体の軽鎖(Shalabyら, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992))、太字および下線で開始コドンと終止コドンを示す。 実施例1に示すように免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドpDR1(配列番号19;5391bp)の配列を示す。pDR1は無関係な抗体をコードする配列、ヒト化抗CD3抗体の軽鎖(Shalabyら, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992))、太字および下線で開始コドンと終止コドンを示す。 実施例1に記載した免疫グロブリン重鎖を発現するためのプラスミドpDR2(配列番号20、6135bp)の配列を示す。pDR2は無関係な抗体、ヒト化抗CD3抗体の重鎖(Shalabyら、上述)をコードする配列を含み、開始コドンおよび終止コドンを太字および下線で示す。 実施例1に記載した免疫グロブリン重鎖を発現するためのプラスミドpDR2(配列番号20、6135bp)の配列を示す。pDR2は無関係な抗体、ヒト化抗CD3抗体の重鎖(Shalabyら、上述)をコードする配列を含み、開始コドンおよび終止コドンを太字および下線で示す。 2H7.v16完全L鎖(配列番号21)のアミノ酸配列を示す。DIQ前の初めの19アミノ酸は成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列である。 2H7.v16完全H鎖(配列番号22)のアミノ酸配列を示す。EVQ前の初めの19アミノ酸は成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列である。完全H鎖配列と図1B(配列番号8)のV配列比較であり、ヒトγ1定常領域は配列番号22のアミノ酸114−471由来である。 2H7.v31完全H鎖(配列番号23)のアミノ酸配列を示す。EVQ前の初めの19アミノ酸は成熟ポリペプチド鎖に存在しない分泌シグナル配列である。L鎖は2H7.v16と同じである(図6参照)。 実施例6に示すように2H7.v16および2H7.v73IgG変異体の相対的安定性を示す。アッセイにより、培養前の値に正常化し、培養後維持されることがわかった。 マウス2H7からv75までのヒト化型サブセットへのアミノ酸変異の概略のフローチャートである。 実施例10に示すように、全ての群における絶対的B細胞の平均値を表に表す[CD3-/CD40+]。(2H7研究およびリツキサン研究の組合せ) 実施例11に示すように、フコース欠損2H7変異体の代表的ADCCアッセイの結果を示す。 酵素濃度の機能をアネキシンV染色プロットで表した結果を示す。ラモス細胞を交差結合第二抗体存在下で無関係なIgG1対照抗体(ハーセプチン(登録商標);円形)、リツキシマブ(四角)、またはrhuMAb2H7.v16(三角)処理して、FACSにより分析した。図13−15は実施例13に示す。 アネキシンVおよびプロピジウムヨウ素化物二重染色の結果をプロットして酵素濃度の機能として表した。ラモス細胞を交差結合第二抗体存在下で無関係なIgG1対照抗体(ハーセプチン(登録商標);円形)、リツキシマブ(四角)、またはrhuMAb2H7.v16(三角)処理して、FACSにより分析した。 生細胞数(10秒当たり)を示し、抗体濃度の機能を非染色細胞をプロットした。ラモス細胞を交差結合第二抗体存在下で無関係なIgG1対照抗体(ハーセプチン(登録商標);円形)、リツキシマブ(四角)、またはrhuMAb2H7.v16(三角)処理して、FACSにより分析した。 実施例14に示すように、ヌードマウスにおけるラジ細胞腫瘍成長の抑制を表す。動物に週毎に6週間(縦の矢印で表す;各群n=8マウス)、PBS(対照)またはリツキサン(登録商標)または5mg/kgのrhuMAb2H7.v16で処置を施した。 実施例14に示すように、ヌードマウスにおけるラジ細胞腫瘍成長の抑制を表す。動物に週毎に6週間(縦の矢印で表す;各群n=8マウス)、PBS(対照)またはリツキサン(登録商標)または0.5mg/kgのrhuMAb2H7.v16で処置を施した。 実施例14に示すように、ヌードマウスにおけるラジ細胞腫瘍成長の抑制を表す。動物に週毎に6週間(縦の矢印で表す;各群n=8マウス)、PBS(対照)またはリツキサン(登録商標)または0.05mg/kgのrhuMAb2H7.v16で処置を施した。 実施例15に示すように、カニクイザルのCD20のヌクレオチド配列(配列番号_)およびアミノ酸配列(配列番号_)を示す。 カニクイザルのCD20のアミノ酸配列を示す。ヒトCD20と異なる残基に下線をし、ヒト残基をサル残基の下に直接示した。サルCD20の推定上の細胞外ドメインを太字で示す。 実施例15に示すように、hu2H7.v16、v31、およびリツキサンに結合するCD20を発現するカニクイザル細胞の結果を示す。抗体が持つカニクイザルCD20に結合するFITCコンジュゲートマウス2H7に対する結合および置換能力を分析した。 関節リウマチ第I/II臨床試験の用量段階を図解する。 CHO細胞の2H7.v16の発現ベクターを示す。

Claims (55)

  1. ヒトCD20に結合するヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、インビボで霊長類のB細胞を枯渇するのに有効な抗体であり、H鎖の可変領域(V)に少なくとも一つの抗ヒトCD20抗体の配列番号12のCDR3配列および実質的なヒト重鎖サブグループIII(VIII)のヒトコンセンサスフレームワーク(FR)残基を含んでなる抗体。
  2. さらに配列番号10のH鎖CDR1配列および配列番号11のCDR2配列を含む、請求項1に記載の抗体。
  3. さらに配列番号4のL鎖CDR1配列、配列番号5のCDR2配列、配列番号6のCDR3配列、および実質的にヒトコンセンサスフレームワーク(FR)残基であるヒト軽鎖κサブグループI(VκI)を含む、請求項2に記載の抗体。
  4. 配列番号8のV配列(v16、図1Bに示す)を含む、前記請求項に記載の抗体。
  5. 配列番号2のV配列(v16、図1Aに示す)を含む、請求項4に記載の抗体。
  6. 領域がヒトIgG鎖定常領域に結合している、請求項3に記載の抗体。
  7. ヒトIgGがIgG1またはIgG3である、請求項6に記載の抗体。
  8. 抗体が、それぞれ配列番号21および22の軽鎖および重鎖アミノ酸配列[図6および図7に示す]を有する2H7.v16である、請求項1に記載の抗体。
  9. 抗体が、それぞれ配列番号2および23の軽鎖および重鎖アミノ酸配列[図6および図8に示す]を有する2H7.v31である、請求項1に記載の抗体。
  10. H鎖にD56AとN100AおよびL鎖にS92Aのアミノ酸置換基を持つ[v.96]、請求項5に記載の抗体。
  11. さらにADCCおよび/またはCDC活性を向上するFc領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
  12. アミノ酸置換基が、S298A/E333A/K334Aである、請求項11に記載の抗体。
  13. 抗体が配列番号23[図8に示す]の重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v31である、請求項12に記載の抗体。
  14. さらにCDC活性を減弱するFc領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む、請求項1ないし10のいずれかに記載の抗体。
  15. 少なくとも置換基K322Aを含む、請求項14に記載の抗体。
  16. 抗体が、リツキサンと比較して少なくとも10倍のADCC活性向上を有する2H7.v114または2H7.v115である、請求項1ないし10に記載の抗体。
  17. 霊長類のB細胞がヒトおよびカニクイザルのものである、請求項1に記載の抗体。
  18. 細胞障害性剤に結合している、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
  19. 細胞障害性剤が放射性同位体または毒素である、請求項18に記載の抗体。
  20. 抗体がCHO細胞で生成される、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
  21. 前記請求項のいずれか一に記載の抗体をコードする単離した核酸。
  22. 前記請求項のいずれかに記載の抗体をコードする発現ベクター。
  23. 請求項21に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
  24. 前記請求項のいずれか一に記載の抗体を生成する、請求項23に記載の宿主細胞。
  25. CHO細胞である、請求項24に記載の宿主細胞。
  26. 前記請求項のいずれか一に記載の抗体の生成方法であって、請求項24に記載の抗体を生成する細胞を培養し、細胞培地から抗体を回収することを含む方法。
  27. 請求項1に記載の抗体および担体を含んでなる組成物。
  28. 抗体が2H7.v16であり、担体が薬剤的許容性のある担体である、請求項27に記載の組成物。
  29. 容器およびそれに内包される前記請求項のいずれかに記載の抗体を含む組成物を含んでなる製造品。
  30. さらに、組成物が非ホジキンリンパ腫の治療に用いることが可能であることを示す梱包挿入物を含んでなる、請求項29に記載の製造品。
  31. インビボでB細胞にアポトーシスを引き起こす方法において、前記請求項のいずれかに記載の抗体をB細胞に作用させ、それによってB細胞を殺すことを含む方法。
  32. CD20陽性癌の治療方法において、前記請求項いずれかに記載のヒト化CD20結合抗体の治療的有効量を癌患者に投与することを含む方法。
  33. CD20陽性癌がB細胞リンパ腫または白血病である、請求項32に記載の方法。
  34. CD20陽性癌が非ホジキンリンパ腫(NHL)または白血球優性ホジキン病(LPHD)である、請求項33に記載の方法。
  35. 癌が慢性白血球性白血病またはSLLである、請求項32に記載の方法。
  36. 抗体が、図および表に示すようなアミノ酸配列をそれぞれ持つ2H7.v16、v31、v96、v114、v115よりなる群から選択したものである、請求項34または35に記載の方法。
  37. 抗体が、図6および図7にそれぞれ示す配列番号21および22の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v16である、請求項34または35に記載の方法。
  38. 抗体を275−375mg/mの用量範囲で投与する、請求項33に記載の方法。
  39. さらに、少なくとも一つの化学療法剤を患者に投与することを含む、請求項32に記載の方法。
  40. 癌が非ホジキンリンパ腫(NHL)であり、化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンよりなる群から選択したものである、請求項39に記載の方法。
  41. 自己免疫性疾患の治療方法において、前記請求項のいずれか一つのヒト化CD20結合抗体の治療的有効量を自己免疫性疾患患者に投与することを含む方法。
  42. 自己免疫性疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、ウェゲナー肉芽種症、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発神経障害、筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎よりなる群から選択したものである、請求項41に記載の方法。
  43. 自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項42に記載の方法。
  44. さらに、患者に第二治療薬を投与することを含む、請求項43に記載の方法。
  45. 第二治療薬が免疫抑制剤である、請求項44に記載の方法。
  46. 免疫抑制剤がメトトレキセートである、請求項45に記載の方法。
  47. 皮膚筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、ANCA(血管炎下を含む)再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)、第VIII因子欠損症、血友病A、自己免疫性好中球減少症、カストルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病(GVHD)、IgM媒介、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎(HIV)、閉塞性細気管支炎(非移植性)対NSIP、ギラン-バレー症候群、大血管血管炎、巨細胞(高安)動脈炎、中血管血管炎、川崎病、および結節性多発性動脈炎よりなる群から選択した自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療的有効量のCD20結合抗体またはその機能的フラグメントを罹患患者に投与することを含んでなる方法。
  48. CD20結合抗体がリツキサン(登録商標)である、請求項47に記載の方法。
  49. カニクイザルのCD20の配列番号: のヌクレオチド配列(図19に示す)またはこの配列の変性変異型を含んでなる単離した核酸。
  50. 保存的なアミノ酸置換基を有する配列番号: (図20に示す)または配列番号: (図20)のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離した核酸。
  51. 請求項50に記載の核酸を含んでなるベクター。
  52. 発現コントロール配列に作用可能に結合している請求項49に記載の核酸を含む発現ベクターである、請求項51に記載のベクター。
  53. 請求項50に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
  54. カニクイザルのCD20のアミノ酸配列[配列番号 、図20]を含む単離したポリペプチド。
  55. 20mg/mLのヒト化2H7抗体、pH5.8の10mMヒスチジン硫酸塩、60mg/mlのショ糖、0.2mg/mlのポリソルベート20を含んでなる液状物。
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