FI115462B - Menetelmä immunoglobuliinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

115462

MENETELMÄ IMMUNOGLOBULIININ VALMISTAMISEKSI

Keksintö koskee patenttivaatimuksissa määriteltyä menetelmää immunoglobuliinin tai sen fragmentin valmistamiseksi, menetelmää immunoglobuliinin fragment-5 tikirjaston valmistamiseksi, menetelmää 4-ketjuisen immunoglobuliinin tai sen fragmentin modifioimiseksi, nukleotidisekvenssiä, yhdistelmävektoria, yhdistelmö-äsolua tai organismia ja cDNA-kirjastoa. Immunoglobu-liineista puuttuvat kevyet polypeptidiketjut. Nämä 10 immunoglobuliinit eivät ole sellaisten immunoglobulii-nien hajoamistuotteita, jotka ovat muodostuneet sekä raskaista- että kevyistä polypeptidiketjuista, vaan sitä vastoin määritellään uusi immunoglobuliinien perheen jäsen, erityisesti uusi molekyylityyppi, joka voi 15 olla mukana immunotunnistuksessa. Tällaisia immuno- globuliineja voidaan käyttää useisiin tarkoituksiin, erityisesti diagnostisiin tai terapeuttisin tarkoituksiin, mukaan lukien suojaamisen patologisia tekijöitä vastaan tai proteiinien ekspression tai aktiivisuuden 20 säätelyn.

Tähän saakka immunoglobuliineille on esitetty > rakenne, joka on neljä-ketju malli, joka johtuu kahden identtisen kevyen polypeptidiketjun (kevyet ketjut) ja kahden identtisen raskaan polypeptidiketjun (raskaat

* I

25 ketjut) mukanaolosta, jotka ketjut on yhdistetty disul- fidisidoksin y:n tai T:n muotoisten makromolekyylien · muodostamiseksi. Nämä ketjut ovat muodostuneet muuttu-• · ·’ · mattomasta alueesta ja vaihtelevasta alueesta, muuttu mattoman alueen jakautuessa useampaan domeeniin. Disul-'j1 30 fidisidokset yhdistävät tavallisesti kahta raskasta polypeptidiketjua niinsanotulla "sarana-alueella", joka ’ . sijaitsee muuttumattoman alueen ensimmäisen ja toisen t · domeenin välissä.

t * Niiden proteiinien joukosta, jotka muodostavat ·,. 3 5 immunoglobuliinien luokan, ovat useimmat vasta-aineita ja sen mukaisesti niissä on antigeenin sitomiskohta tai 115462 2 useampia antigeenin sitomiskohtia.

Neljä-ketju mallin mukaan vasta-aineen antigeeniä sitova kohta sijaitsee kunkin raskaan ja kevyen ketjun vaihtelevassa domeenissa ja vaatii raskaan ja 5 kevyen ketjun vaihtelevien domeenien yhdistymistä.

Näiden neljä-ketju mallin immunoglobuliinien määrittelyn suhteen viitataan Roitt. I et ai'iin (Immunology- second-Edition Gower Medical Publishing USA, 1989) . Erityisesti viitataan osaan, joka koskee neljä-10 ketjuisten immunoglobuliinien määrittelyä, niiden poly-peptidi- ja geeneettisiä rakenteita, niiden vaihtelevien ja muuttumattomien alueiden määrittelyä ja sellaisten fragmenttien saamista, jotka on valmistettu entsy-maattisella pilkkomisella hyvin tunnettujen menettely-15 tapojen mukaan.

Keksijät ovat osoittaneet yllättävästi, että erilaisia molekyylejä voidaan eristää eläimistä, jotka tuottavat niitä luonnollisesti, joilla molekyyleillä on immunoglobuliinien funktionaalisia ominaisuuksia, jol-20 loin nämä funktiot ovat joissakin tapauksissa rakenteellisiin elementteihin liittyviä, jotka elementit : eroavat niistä elementeistä, jotka sisältyvät neljä- ketjuisten immunoglobuliinien toimintaan, johtuen esimerkiksi kevyiden ketjujen puuttumisesta.

25 Tuodaan esiin kaksi-ketju mallin immunoglobu- liineja, jotka eivät vastaa niitä fragmentteja, joita · on saatu esimerkiksi luonnollisen neljä-ketju mallin ί immunoglobuliinin pilkkomisella, erityisesti entsymaat- tisella pilkkomisella, eivätkä vastaa sellaisen DNA:n ··· 30 ilmentymistä isäntäsoluissa, joka koodaa luonnollisen .··. neljä-ketju mallin immunoglobuliinin muuttumatonta tai * * > / t vaihtelevaa aluetta tai näiden alueiden osaa, eikä * · '· "· vastaa vasta-aineita, joita on tuotettu lymfopatioiden » *' · yhteydessä esimerkiksi hiirissä, rotissa tai ihmises- 35 sä.

. E. S. Ward et ai. (1) ovat kuvanneet joitakin 115462 3 kokeita, joita on tehty raskaiden polypeptidiketjujen vaihteleville domeeneille (VH) tai/ja kevyiden polypeptidiket juj en vaihteleville domeeneille (VK/Fv) näiden vaihtelevien domeenien spesifisten antigeenien sitomis-5 kyvyn testaamiseksi. Tätä tarkoitusta varten valmistettiin Vh geenien kirjasto näillä spesifisillä antigeeneillä aikaisemmin immunisoitujen hiirten pernan genomi DNA:sta.

Ward et ai ovat kuvanneet julkaisussaan, että 10 Vh -domeenit ovat suhteellisen tahmeita, johtuen luultavasti esillä olevasta hydrofobisesta pinnasta, jonka Vk tai V\ domeenit normaalisti peittävät. He tarkastelevat siis, että pitäisi olla mahdollista suunnitella sellaisia VH -domeeneja, joilla on parannetut ominai-15 suudet ja edelleen, että sellaiset Vh -domeenit, joilla on sitoutumisaktiivisuutta voisivat toimia rakenneosina valmistettaessa vaihtelevia fragmentteja (Fv -fragmentit) tai täydellisiä vasta-aineita.

Keksintö ei lähde liikkeelle siitä ajatukses-20 ta, että neljä-ketju mallin immunoglobuliinin eri fragmentteja (kevyet ja raskaat ketjut) ja näiden fragment-; tien eri domeeneita voidaan modifioida uusien tai pa- t · rannettujen antigeenin sitomiskohtien tai neljä-ketju 1 ’ mallin immunoglobuliinin määrittelemiseksi.

• ]’ 25 Keksijät ovat määrittäneet, että immunoglobu- * · '··.* liineilla voi olla erilainen rakenne kuin tunnettu · neljä-ketju malli ja että tällaiset erilaiset immuno- ·/- · globuliinit tarjoavat uuden keinon diagnostisten rea- genssien, terapeuttisten aineiden tai jonkun muun tut-·*· 30 kimus- tai teollisuustarkoituksiin käytettävän reagens- • · s * sin valmistamiseksi.

* t / < Täten tuodaan esiin uudet immunoglobuliinit, *· ’·* jotka voivat osoittaa neljä-ketju mallin im- ’ · munoglobuliinien funktionaalisia ominaisuuksia, vaikka ’.j# 35 niiden rakenne näyttää monessa tapauksessa olevan sopi vampi niiden käytölle, niiden valmistamiselle ja jois- * 115462 4 sakin tapauksissa niiden modifikaatiolle. Lisäksi näitä molekyylejä voidaan pitää johtorakenteina muiden immunoglobuliinien modifikaatiolle. Näiden immunoglobu-liinien tarjoamat edut käsittävät mahdollisuuden niiden 5 valmistamiseen helpommin.

Tuodaan esiin immunoglobuliineja, joille on tunnusomaista se, että ne sisältävät kaksi raskasta polypeptidiketjua, jotka ovat riittäviä täydellisen antigeenin sitomiskohdan tai useampien antigeenin sito-10 miskohtien muodostamiseksi, jolloin näiltä immunoglo-buliineilta lisäksi puuttuu kevyet polypeptidiketjut. Näille immunoglobuliineille voi edelleen olla tunnusmerkillistä se seikka, että ne ovat sellaisen DNA:n tai cDNA:n ilmentymisen tuote prokaryootti- tai eukaryoot-15 ti-isäntäsolussa, jolla on kamelieläinten lymfosyyteistä tai muista soluista saatavissa olevan kevytketjuv-ajaan immunoglobuliinin sekvenssi.

Mainittuja immunoglobuliineja voidaan saada esimerkiksi sekvensseistä, joita on kuvattu kuvassa 7.

20 Mainitut immunoglobuliinit, joista puuttuvat kevyet ketjut, ovat sellaisia, että niiden raskaiden ; ketjujen vaihtelevilla domeeneilla on neljä-ketjuisen ► I * '· immunoglobuliinin VH:sta eroavat ominaisuudet. Mainitun ' raskasketju immunoglobuliinin vaihtelevassa domeenissa 25 ei ole normaaleja vuorovaikutuskohtia VL:n kanssa tai • ♦ CHl-domeenien kanssa, joita ei esiinny raskasketju-: immunoglobuliineissa. Siten se on monilta ominaisuuk- · siltaan uusi fragmentti, kuten liukoisuudeltaan ja sitomiskohdan sijainniltaan. Tässä tekstissä kutsumme ··· 30 sitä selvyyden vuoksi Vmr.ksi sen erottamiseksi neljä- ketju immunoglobuliinien klassisesta VH:sta.

,· t "Täydellisellä antigeenin sitomiskohdalla" * I » ’· tarkoitetaan keksinnön mukaan kohtaa, joka yksinään * * sallii tunnistuksen ja antigeenin täydellisen sitomi- ’· 35 sen. Tämä voidaan varmistaa millä tahansa menetelmällä, » · · joka koskee sitomisaffiniteetin testausta.

115462 5 Näitä immunoglobuliineja, joita voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai eristää eläimistä, tullaan kutsumaan seuraavilla sivuilla joskus "ras-kasketju- immunoglobuliineiksi". Nämä immunoglobuliinit 5 voivat olla puhtaassa muodossa.

Immunoglobuliineja voidaan saada prokaryoot-tisoluista, erityisesti E.coli-soluista menetelmällä, joka käsittää vaiheet: a) kloonaamalla kevytketjuttoman immunoglobuliinin Vhh 10 domeenia koodaava DNA- tai cDNA-sekvenssi Bluecript vektorissa, joka immunoglobuliini voidaan saada esimerkiksi kamelieläinten lymfosyyteistä, b) ottamalla talteen kloonatut fragmentit sen jälkeen kun ne on monistettu käyttäen Xho-kohdan sisältävää 5'- 15 primeeriä ja Spe-kohdan sisältävää 3'- primeeriä, jolla on seuraava sekvenssi TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG, c) kloonaamalla saatu fragmentti vaiheistuksessa immuno PBS vektorissa sen jälkeen kun vektori on pil- 20 kottu Xho ja Spe restriktioentsyymeillä, d) transformoimalla isäntäsolut, erityisesti E.coli . transfektiolla vaiheen c) yhdistelmä-immuno PBS vekto rilla, (i'*’ e) ottamalla talteen Vhh:ta koodaavan sekvenssin il- • " 25 mentymistuote esimerkiksi käyttämällä dromedaarin Vhh - *...· domeenia vastaan muodostuneita vasta-aineita.

·.· j Immunoglobuliinit voivat olla hetero- spesifisiä immunoglobuliineja, joita voidaan saada menetelmällä, joka käsittää vaiheet: 30 - hankkimalla ensimmäinen DNA- tai cDNA-sekvenssi, * » « · ,···. joka koodaa sellaista Vhh domeenia tai sen osaa, jolla ’·* on määrätty, tietyn antigeenin vastainen spesifisyys ja • · ·. ’i joka käsittää Xho :n ja Spe:n väliset alueet, - hankkimalla toinen DNA- tai cDNA-sekvenssi, joka :·, 35 koodaa VHh -domeenia tai sen osaa, ja jolla on määrät-

* · I

ty, ensimmäisen DNA- tai cDNA-sekvenssin spesifisyydes- 6 11 S462 tä eroava spesifisyys ja joka käsittää Spe :n ja Eco :n väliset alueet, pilkkomalla immuno PBS vektori EcoRl ja Xhol restriktioentsyymeillä, 5 - yhdistämällä saadut VHh- domeeneja koodaavat DNA- tai cDNA-sekvenssit siten, että DNA- tai cDNA-sekvens-sit kloonataan vektorissa sarjassa, transformoimalla isäntäsolu, erityisesti E.coli solu transfektiolla ja ottamalla talteen saadut im-10 munoglobuliinit.

Immunoglobuliineja voidaan saada menetelmällä, joka käsittää vaiheet: hankkimalla DNA- tai cDNA-sekvenssi, joka koodaa sellaista VHH-domeenia tai sen osaa, jolla on määrätty 15 spesifinen antigeenin sitomiskohta, monistamalla hankittu DNA tai cDNA käyttäen 5' -primeeriä, joka sisältää aloituskodonin ja HindiII kohdan ja 3' primeeriä, joka sisältää lopetuskodonin ja Xhol kohdan, 20 - yhdistämällä monistettu DNA tai cDNA plasmidin pMM984 HindiII (asema 2650) ja Xhol (asema 4067) koh- • tiin, transfektoimalla valinnanvaraiset solut, erityi-, * sesti NB-E solut, yhdistelmäplasmidilla, 25 - ottamalla talteen saadut tuotteet.

* i * · * Onnistunut ilmentyminen voidaan varmistaa * * » V ·* vasta-aineilla, jotka on kohdistettu VHH-domeenin alu etta vastaan, erityisesti ELISA analyysillä.

·;· 3 0 Immunoglobuliinit voidaan kloonataan parvovi- » * * * ruksessa.

• · .· , Toisena esimerkkinä näitä immunoglobuliineja * * * ** voidaan saada menetelmällä, joka käsittää toisen DNA:n ’ * tai cDNA:n, jolla on toinen, määrätty antigeenin sito- 35 miskohta, edelleen kloonaamisen plasmidissa pMM984.

Sellaista immunoglobuliinia voidaan edelleen 7 T15462 karakterisoida siten, että sitä voidaan saada menetelmällä, jossa vektori on Yep 52 ja transformoitu yhdis-telmäsolu on hiiva, erityisesti S.cerevisiae.

Erityiselle immunoglobuliinille on tun-5 nusomaista se, että sillä on katalyyttistä aktiivisuutta, erityisesti se, että se on suunnattu sellaista antigeeniä vastaan, joka jäljittelee tietyn substraatin aktivoitua tilaa. Näitä katalyyttisiä vasta-aineita voidaan modifioida niiden sitomiskohdan tasolla, sattu-10 manvaraisella tai suunnatulla mutageneesillä niiden katalyyttisen toiminnan lisäämiseksi tai modifioimisek-si. Tällaisten katalyyttisten vasta-aineiden valmistuksen yleistekniikan osalta voitaneen viitata Lerner et ai'in julkaisuuun (TIBS November 1987. 427-430).

15 Immunoglobuliineille voi olla tunnusomaista se, että niiden vaihtelevat alueet sisältävät asemassa 45 aminohapon, joka ei ole leusiini-, proliini- tai glutamiinijäännös.

Lisäksi raskasketjuimmunoglobuliinit eivät ole 20 sellaisia tuotteita, jotka ovat tunnusomaisia eläinten lymfosyyteille, eivätkä sellaisia, jotka ovat tun- ·,; nusomaisia lymfopatioista kärsivien ihmispotilaiden » » * lymfosyyteille. Immunoglobuliinit, joita tuotetaan » v · ** lymfopatioissa, ovat alkuperältään monoklonaalisia ja • k • 25 johtuvat patogeeenisistä mutaatioista genomitasolla.

» ·

Niillä ei ole ilmeisesti antigeenin sitomiskohtaa.

: Sarana-alue voi yhdistää näiden immunoglobu- liinien kaksi raskasta polypeptidiket jua Roitt et ai' in määritelmän mukaan.

··· 30 Immunoglobuliinit, jotka vastaavat edellä i » · a ’··. määriteltyjä molekyylejä, kykenevät toimimaan vasta- / < aineina.

• · • ’· Mainittujen immunoglobuliinien antigeeniä ’ * sitova kohta (kohdat) sijaitsee (sijaitsevat) raskaan 35 ketjun vaihtelevalla alueella.

Erityisessä näiden immunoglobuliinien ryhmäs- -· » * 115462 8 sä kukin raskas polypeptidiketju sisältää yhden antigeeniä sitovan kohdan sen vaihtelevalla alueella ja nämä kohdat vastaavat samaa aminohapposekvenssiä.

Immunoglobuliineille voi olla tunnusomaista 5 se, että niiden raskaat polypeptidiketjut sisältävät vaihtelevan alueen (Vhh) ja muuttumattoman alueen (Ch) Roitt et ai'in määritelmän mukaisesti, mutta niistä puuttuu muuttumattoman alueen ensimmäinen domeeni. Tätä muuttumattoman alueen ensimmäistä domeenia kutsutaan 10 CH1: ksi .

Nämä immunoglobullinit, joissa ei ole ChI -domeenia, ovat sellaisia, että niiden ketjujen vaihte-leva alue on yhdistetty suoraan sarana-alueeseen vaihtelevan alueen C-terminaalisesta osasta.

15 Edellä kuvatun tyyppiset immunoglobullinit voivat käsittää G-tyypin immunoglobuliineja ja erityisesti immunoglobuliineja, jotka määritellään luokan 2 immunoglobuliineiksi (IgG2) tai luokan 3 immunoglobu-liineiksi (IgG3).

20 Kevyen ketjun ja ensimmäisen muuttumattoman domeenin poissaolo johtaa entsymaattisella pilkkomisel-; la saatujen immunoglobuliinifragmenttien kohdalla ter minologian muunnokseen Roitt et ai'in mukaisessa ter-' minologiassa.

• " 25 Toisaalta termit Fc ja pFc, toisaalta Fc1 ja *··* pFc, ' jotka vastaavat vastaavasti papaiinin ja pepsii- * nin pilkkomisfragmentteja, säilytetään.

V : Termit Fab F(ab)2 F(ab')2 Fabc, Fd ja Fv eivät ole enää sopivia alkuperäisessä merkityksessään, koska ··· 30 näissä fragmenteissa on joko kevyt ketju, kevyen ketjun

Htl vaihteleva alue tai ChI -domeeni.

1 « * ,· > Fragmentteja, jotka on saatu pilkkomalla papa- '* ’· iinilla ja jotka koostuvat VHh -domeenista ja sarana- ‘ * alueesta, tullaan kutsumaan FVHHh:ksi tai F(VHHh)2:ksi 35 siitä riippuen, ovatko ne jääneet disulf idisidosten yhdistämiksi vai eivät.

115462 9

Immunoglobuliinit, jotka vastaavat edellä esitettyjä määritelmiä, voivat olla peräsin eläimistä, erityisesti kamelieläinten heimosta. Keksijät ovat saaneet selville, että raskasketju-immunoglobuliinit, 5 joita on kamelieläimissä, eivät liity patologiseen tilanteeseen, joka indusoisi poikkeavien vasta-aineiden tuotantoa, kuten neljäketjuisten immunoglobuliinien kohdalla. Vanhan maailman kamelieläimiin (Camelus bact-rianus ja Camelus dromaderius) ja uuden maailman kame-10 lieläimiin (esimerkiksi Lama Paccos, Lama Glama ja Lama Vicugna) kohdistuneen vertailevan tutkimuksen perusteella keksijät ovat osoittaneet, että mainittuja immu-noglobuliineja, joista puuttuvat kevyet polypeptidi-ketjut, tavataan kaikista lajeista. Silti erot voivat 15 olla selviä näiden immunoglobuliinien molekyylipa-inoissa eläimistä riippuen. Erityisesti näissä immuno-globuliineissa olevan raskaan ketjun molekyylipaino voi olla noin 43 kd:stä noin 47 kd:iin, erityisesti 45 kd.

Raskasketju immunoglobuliineja voidaan erittää 20 kamelieläinten vereen.

Immunoglobuliineja voidaan saada kamelieläin- ; ten seerumista puhdistamalla ja puhdistusmenetelmä » · kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkeissä. Siinä tapa-,, ‘ uksessa että immunoglobuliinit saadaan kamelieläimistä, * ’’ 25 tuodaan esiin immunoglobuliineja, jotka eivät ole nii- • « *· ·’ den luonnollisessa biologisessa ympäristössä.

; i Immunoglobuliinia IgG2, jota on saatavissa \ ·* kamelieläinten seerumista puhdistamalla, voidaan kuvata seuraavasti: 30 - kromatografiässä Proteiini G Sepharose-pylväs ei

1 I

adsorboi sitä, kromatografiässä Proteiini A Sepharose-pylväs i · adsorboi sitä,

* - sen molekyylipaino on noin 100 kd puskurilla pH

35 4.5 eluoinnin jälkeen (0.15 M NaCl, 0.58% etikkahappo, säädetty pH 4.5:een NaOH:lla) , 115462 10 se koostuu raskaista γ2 polypeptidiketjuista, joiden molekyylipaino on noin 46 kd, mieluummin 45 pelkistyksen jälkeen.

Toiselle immunoglobuliinien ryhmälle, joka 5 vastaa IgG3:a ja jota voidaan saada kamelieläinten seerumista puhdistamalla, voi olla tunnusomaista, että immunogloguliini: adsorboituu kromatografiässä Proteiini A Sepharo-se-pylvääseen,

10 - omaa molekyylipainon noin 100 kd puskurilla pH

3.5 eluoinnin jälkeen (0.15 M NaCl, 0.58% etikkahappo), adsorboituu kromatografiässä Proteiini G Sepharo-se-pylvääseen ja eluoituu puskurilla pH 3.5 (0.15 M

NaCl, 0.58% etikkahappo).

15 - koostuu raskaista γ3 polypeptidiketjuista, jol loin molekyylipaino on noin 45 Kd, erityisesti välillä 43-47 kd pelkistyksen jälkeen.

Mainitut immunoglobuliinit, joista puuttuvat kevyet ketjut, sisältävät kuitenkin raskaissa ketjuis-20 saan muuttumattoman alueen ja vaihtelevan alueen. Muuttumaton alue sisältää eri domeeneja.

. Mainittujen immunoglobuliinien vaihteleva alue ,* sisältää rungot (FW) ja komplementaarisuutta määritte levät alueet (Complementatity determining regions, 25 CDR), erityisesti 4 runkoa ja 3 komplementaarisuusalu-,· että. Se erotetaan neljäketjuisista immunoglobuliineis- ; · ta erityisesti siitä, että tämä vaihteleva alue voi .itsessään sisältää yhden tai useamman antigeenin sito-miskohdan, ilman kevyen ketjun vaihtelevan alueen, 30 joka puuttuu, myötävaikutusta.

Runkojen 1 ja 4 aminohapposekvenssit sisältä-vät tässä järjestyksessä muiden muassa aminohapposek- » ,venssit, jotka voidaan valita seuraavista: tl» > * I t » · 1 1 5462 11 rungon 1 domeenille

GGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS 5 GGSEQGGGSLRLSCAISGYTYG

ggsvqpggsltlsctvsgatys ggsvqaggslrlsctgsgfpys ggsvqaggslrlscvagfgts ggsvqaggslrlscvsfspss 10 rungon 4 domeenille

WGQGTQVTVSS WGQGTLVTVSS 15 WGQGAQVTVSS WGQGTQVTASS RGQGTQVTVSL

CDR3-domeenille 20

ALQPGGYCGYGX----------CL

VSLMDRISQH------------G C

VPAHLGPGAILDLKKY------KY

FCYSTAGDGGSGE---------MY

· *· 25 ELSGGSCELPLLF---------DY

DWKYWTCGAQTGGYF-------GQ

! : RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY

:* *: QKKDRTRWAEPREW---- NN

GSRFSSPVGSTSRLES-SDY--NY

30 ADPSIYYSILXIEY--------KY

DSPCYMPTMPAPPIRDSFGW--DD

TSSFYWYCTTAPY---------NV

i TEIEWYGCNLRTTF--------TR

NQLAGGWYLDPNYWLSVGAY--AI

35 RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY

*. DGWTRKEGGIGLPWSVQCEDGYNY

DSYPCHLL--------------DV

YEYPIADKCS------------RY

115462 12

Kuten edellä on ilmaistu, mainituilta immuno-globuliineilta puuttuu mieluummin täydellisesti CH1 -domeeni.

Tällaiset immunoglobuliinit sisältävät CH2- ja 5 Ch3- domeenit C-terminaalisella alueella sarana-alueeseen nähden.

Immunoglobuliinien muuttumaton alue voi sisältää Ch2- ja Ch3 -domeenit, jotka sisältävät aminohapposekvenssit, jotka on valittu seuraavista: 10 Ch2 -domeenille:

APELLGGPTVFIFPPKPKDVLSITLTP APELPGGPSVFVFPTKPKDVLSISGRP APELPGGPSVFVFPPKPKDVLSISGRP 15 APELLGGPSVFIFPPKPKDVLSISGRP

Ch3 - domeeni lie: 20

GQTREPQVYTLA

GQTREPQVYTLAPXRLEL

• GQPREPQVYTLPPSRDEL

: : G Q PRE PQVYTLPPS REEM

: * 25 GQPREPQVYTLPPSQEEM

* * I * : Keksijät ovat kiinnostavasti osoittaneet, että mainittujen immunoglobuliinien sarana-alue voi esiintyä 3 0 vaihtelevan pituisena. Kun nämä immunoglobuliinit toi- ,*··, mivat vasta-aineina, sarana-alueen pituus ottaa osaa * * '·’ sen etäisyyden määräämiseen, joka erottaa antigeenin 'Λ: sitomiskohdat.

Immunoglobuliinien sarana-alueen sekvenssit 35 voivat olla seuraavat: 115462 13

GTNEVCKCPKCP

tai

^ EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP

Lyhyt sarana-alue vastaa IgG3 molekyyliä ja 10 pitkä sarana-alue vastaa IgG2 molekyyliä.

Eristetty Vhh, joka on johdettu raskasketju immunoglobuliineista tai raskasketju immunoglobuliineja vastaavista Vhh -kirjastoista, voidaan erottaa neljä-ketju mallin immunoglobuliinien Vhh- kloonauksesta nii-15 den sekvenssipiirteiden perusteella, jotka karakterisoivat raskasketj u-immunoglobuli ineja.

Kamelin raskasketju-immunoglobuliinin Vhh alueessa näyttää olevan joukko eroja niihin VnH-aluei-siin nähden, jotka ovat peräisin kaikkien tutkittujen 20 lajien 4-ketjuisista immunoglobuliineista. Vhh/Vl vuorovaikutuksessa mukana olevien jäännösten tasolla huoma-. taan tärkeä ero aseman 45 (FW) tasolla, mikä on 4-ket- I · juisissa immunoglobuliineissa käytännöllisesti katsoen 1 » · aina leusiini (98%) , muiden tässä asemassa olevien • “ 25 aminohappojen ollessa proliini (1%) tai glutamiini O (1%) .

·,· \ Kamelin raskasketju immunoglobuliinissa, sek- ; : : vensseissä, joita on nyt tutkittu, esiintyy leusiini asemassa 45 vain kerran. Se voi olla peräisin neljäket-30 juisesta immunoglobul iini s ta. Muissa tapauksissa on « · * · .···. sen tilalla arginiini- kysteiini- tai glutamiinihappo-

• I

’·’ jäännös. Varattujen aminohappojen läsnäolon tässä ase- massa pitäisi edistää Vhh n tekemistä liukoisemmaksi .

4-ketju immunoglobuliinien VHh kirjosta joh-:·. 3 5 dettujen, muokattujen Vm-alueiden konstruoinnissa vai- ,···, kuttaa kiinnostavalta aminohappojen korvaaminen käyttä- • · • · » 115462 14 en kamelieläimille spesifisiä jäännöksiä, kuten asemassa 45 olevaa.

Toinen kamelieläinten Vhh -domeenin spesifinen piirre on kysteiinin tiheä esiintyminen CDR3 -alueella, 5 joka on yhteydessä kysteiiniin, joka on CDRi:n asemassa 31 tai 33 tai FW2-alueen asemassa 45. Mahdollisuus disulfidisidoksen luomiseen CDR3 -alueen ja lopun vaih-televan domeenin välillä myötävaikuttaisi sitomiskohdan asemaan ja stabiilisuuteen.

10 Lukuunottamatta yhtä patogeenistä myeloomapro- teiinia (DAW) ei tällaisia disulfidisiltoja ole koskaan tavattu 4-ketjuisista immunoglobuliineista peräisin olevien immunoglobuliinien V-alueilla.

Mainituilla raskasketju-immunoglobuliineilla 15 on edelleen erityisenä etuna se, että ne eivät ole tahmean tarttuvia. Niinpä nämä immunoglobuliinit, seerumissa läsnäollessaan, aggregoituvat paljon vähemmän kuin neljäketjuisten immunoglobuliinien eristetyt raskaat ketjut. Mainitut immunoglobuliinit ovat liukoisia 20 konsentraatiossa yli 0.5 mg/ml, mieluummin yli 1 mg/ml ja edullisimmin yli 2 mg/ml.

; Edelleen näillä immunoglobuliineilla on laaja- * 1 · .1 peräinen antigeenin sitomiskirjo ja ne käyvät läpi * » * affiniteetti- ja spesifisyyskypsymisen in vivo. Niinpä “ 25 ne sallivat sellaisten vasta-aineiden eristämisen ja * 1 * · valmistamisen, joilla on tarkoin määrätty spesifisyys · määrättyjen antigeenien suhteen.

!f·’ Mainittujen immunoglobuliinien toinen mielen kiintoinen ominaisuus on, että niitä voidaan modifioida ·1. 30 ja erityisesti humanisoida (muokata osittain ihmispe- .··. räistä muistuttaviksi) . Erityisesti on mahdollista * · > _· ^ korvata näiden immunoglobuliinien koko muuttumaton alue » 1 · ’ ” tai osa siitä ihmisvasta-aineen koko muuttumattomalla alueella tai sen osalla. Esimerkiksi immunoglobuliinin /. 35 Ch2- ja/tai CH3-domeenit voidaan korvata ihmisimmuno- globuliini IgG γ3:η CH2- ja/tai CH3-domeeneilla.

* · • » 1 115462 15

Sellaisissa ihmisperäisiä vasta-aineita osittain muistuttavissa vasta-aineissa on myös mahdollista korvata osa vaihtelevasta sekvenssistä, nimittäin yksi tai useampi niistä rungon jäännöksistä, jotka eivät 5 vaikuta sitovassa kohdassa, ihmisen runkojäännöksillä tai osalla ihmisen vasta-ainetta.

Käänteisesti voitaisiin raskasketju immunoglo-buliinin VHh -alueiden piirteitä (erityisesti peptidi-fragmentteja) tuoda niille Vh- tai VL-alueille, jotka 10 ovat peräisin neljäketjuisista immunoglobuliineista, esimerkiksi pyrittäessä saamaan aikaan immunoglobulii-neille parempi liukoisuus.

Edelleen tuodaan esiin immunoglobuliinifragmentti, joka on kuvattu edellä ja erityisesti frag-15 mentti, joka on valittu seuraavasta joukosta: fragmentti, joka vastaa yhtä raskasta polypepti-diketjua sellaisesta immunoglobuliinista, josta puuttuvat kevyet ketjut, fragmentit, jotka on saatu mainituista immuno-20 globuliineista entsymaattisella pilkkomisella, erityisesti ne, jotka on saatu osittaisella pilkkomisella : käyttäen papaiinia, johtaen Fc-fragmentin muodostumi- • · seen (vakiofragmentti) ja johtaen FVimh-fragmentin (si- ,, ’ sältää raskaiden ketjujen antigeenin sitomiskohdat) tai I* 25 sen dimeerin F(VHHh)2 muodostumiseen tai fragmentti, ’ ·* joka on saatu hajottamalla Fc-fragmentti edelleen papa- : iinilla, mikä johtaa pFc-fragment in muodostumiseen, V : joka vastaa Fc-fragmentin C-terminaalista osaa, homologiset fragmentit, jotka on saatu muilla ··· 30 proteolyyttisillä entsyymeillä, » ♦ * “·. - immunoglobuliinin vaihtelevan alueen fragmentti, / # jossa on ainakin 10, mieluummin 20 aminohappoa tai koko * · > *· vaihteleva alue, erityisesti fragmentti, joka vastaa ’ · eristettyjä VHH-domeeneja tai VHH-dimeerejä, jotka ovat 35 liittyneet saranadisulfidiin, , ··. - fragmentti, joka vastaa immunoglobuliinin sarana- • * » 16 115462 aluetta, tai ainakin kuutta aminohappoa tästä sarana-alueesta, sarana-alueen fragmentti, joka käsittää Pro-X:n toistosekvenssin, 5 - fragmentti, joka vastaa ainakin kymmentä, mie luummin 20:tä aminohappoa muuttumattomalta alueelta tai immunoglobuliinin koko muuttumatonta aluetta.

Fragmentti voi muodostua toistosekvenssistä Pro-X, joka toistosekvenssi sisältää ainakin 3 Pro-X 10 toistoa, X:n ollessa mikä tahansa aminohappo ja edullisesti Gin (glutamiini) , Lys (lysiini) tai Glu (gluta-miinihappo); erityinen toistofragmentti koostuu sekvenssin Pro-X 12-kertaisesta toistosta.

Sellaista fragmenttia voidaan edullisesti 15 käyttää yhdyssiteenä eri tyyppisten molekyylien välillä .

Pro-X-sekvenssin aminohapot valitaan minkä tahansa luonnollisen tai ei-luonnollisen aminohapon joukosta.

20 Fragmentit voidaan saada immunoglobuliinien entsymaattisella pilkkomisella. Niitä voidaan saada . myös ilmentämällä immunoglobuliineja koodaavia nukle- otidisekvenssejä soluissa tai organismeissa tai niitä ’’ voidaan syntetisoida kemiallisesti.

• 25 Tuodaan myös esiin anti-idiotyyppivasta- V.· aineita, jotka kuuluvat raskasketju-immunoglobu- ·,: | liini luokki in. Tällaisia anti-idiotyyppejä voidaan : : : valmistaa ihmis- tai eläin-idiotyyppejä vastaan. Eräs näiden anti-idiotyyppien ominaisuus on, että niitä •h 30 voidaan käyttää idiotyyppi rokotteina, erityisesti .·*·. rokottamiseen glykolipidejä tai glykoproteiineja vas- * · • > taan ja siellä missä hiilihydraatti määrää ratkaisevas- * » · '· ’· ti epitooppia.

Anti-idiotyypit voivat kyetä tunnistamaan _ 35 raskasketju-immunoglobuliinien idiotyypit.

Tällaiset anti-idiotyyppivast a-aineet voivat ' 1 % 115462 17 olla joko syngeenisiä vasta-aineita tai allogeenisiä tai ksenogeenisiä vasta-aineita.

Keksintö koskee myös nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat koko proteiinia tai sen osaa, joka 5 aminohapposekvenssi käsittää peptidisekvenssin, joka on valittu seuraavista:

GGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD

GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS

10 GGSEQGGGSLRLSCAISGYTYG GGSVQPGGSLTLSCTVSGATYS GGSVQAGGSLRLSCTGSGFPYS GGSVQAGGSLRLSCVAGFGTS

GGSVQAGGSLRLSCVSFSPSS

15

WGQGTQVTVSS WGQGTLVTVSS WGQGAQVTVSS WGQGTQVTASS 20 RGQGTQVTVSL

ALQPGGYCGYGX----------CL

’i VSLMDRISQH------------GC

VPAHLGPGAILDLKKY------KY

·'· 25 FCY STAGDGGSGE---- MY

ELS GGSCELPLLF---------DY

: DWKYWTCGAQTGGYF-------GQ

RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY

QKKDRTRWAEPREW------ NN

30 GSRFSSPVGSTSRLES-SDY--NY

'·. ADPSIYYSILXIEY--------KY

DSPCYMPTMPAPPIRDSFGW--DD

·’·: TSS FYWYCTTAPY---------NV

T E I EWYGCNLRTTF--------TR

35 NQLAGGWYLDPNYWLSVGAY--AI

RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY DGWTRKEGGIGLPWSVQCEDGYNY

DSYPCHLL------- DV

VEYPIADMCS------------RY

115462 18

GQPREPQVYTLPPSQEEM

VTVSSGTNEVCKCPKCPAPELPGGPSVFVFP

tai

VTVSSEPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCPAPELLGGPSVFIFP

GTNEVCKCPKCP

APELPGGPSVFVFP

EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP

APELLGGPSVFIFP

» i · * · t » 1 · · 115462 19

Sellaiset nukleotidisekvenssit voidaan johtaa aminohapposekvensseistä ottaen huomioon geneettisen koodin degeneraatio. Niitä voidaan syntetisoida tai eristää soluista, jotka tuottavat mainittuja immunoglo-5 buliineja.

Menettelytapa sellaisten DNA-sekvenssien saamiseksi on kuvattu esimerkeissä.

Lisäksi tarkastellaan myös RNA-.ta, erityisesti mRNA-sekvenssejä, jotka vastaavat näitä DNA-sekvenssejä 10 ja myös vastaavia cDNA-sekvenssejä.

Mainittuja nukleotidisekvenssejä voidaan edelleen käyttää sellaisten alukkeiden valmistamiseen, jotka ovat sopivia soluissa tapahtuvaan osoittamiseen tai DNA- tai cDNA-kirjastojen seulontaan mainittuja 15 immunoglobuliineja koodaavien nukleotidisekvenssien eristämiseksi.

Sellaisia nukleotidisekvenssejä voidaan käyttää yhdistelmävektoreiden valmistamiseen ja näiden vektoreiden sisältämien sekvenssien ekspressointiin 20 isäntäsoluissa, erityisesti prokaryoottisoluissa, kuten bakteereissa tai myös eukaryoottisoluissa ja esimerkik-. si CHO-soluissa, hyönteissoluissa, apinan soluissa, * t # kuten Vero-soluissa tai minkä tahansa muun imettäväisen ‘‘ soluissa. Erityisesti se seikka, että mainituilta im- • i ' ’* 25 munoglobuliineilta puuttuvat kevyet ketjut, sallii V,* niiden erittämiseen eukaryoottisoluissa, koska ei ole ·,; * tarvetta turvautua vaiheeseen, joka käsittää BIP-prote- : : iinin muodostuksen, mikä vaaditaan neljäketjuisille immunoglobuliineille.

•h 30 Monoklonaalisten vasta-aineiden tai immunoglo- .·*·. buliinien tunnettujen yhdistelmä-DNA-teknisten valmis- • tusmenetelmien puuttellisuudet johtuvat siitä, että * * * V useimmissa tapauksissa on pakko kloonata yhtäaikaa VH - » ’*’*· ja VL -domeenit, jotka vastaavat 4-ketjuisten immunoglo- 35 buliinien spesifisiä sitomiskohtia. Eläimet ja erityi- ···, sesti kamelieläimet, jotka tuottavat mainittuja ras- i * » 115462 20 kasketju immunoglobuliineja ja mahdollisesti muut sel-kärankaislajit, kykenevät tuottamaan raskasketju immunoglobuliineja, joissa sitomiskohta sijaitsee yksinomaan VHH-domeenissa. Toisin kuin ne harvat raskasketju immu-5 noglobuliinit, jotka on valmistettu muissa lajeissa erottamalla ketjut tai suoralla kloonauksella, ovat ka-melieläinten raskasketju-immunoglobuliinit käyneet läpi laajakantoisen kypsymisen in vivo. Lisäksi niiden V-alue on luonnollisesti kehittynyt toimiakseen VL:n poissaol-10 lessa. Siitä syystä ne ovat ihanteellisia monoklonaali-sten vasta-aineiden tuottamiseen yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Kun spesifisten antigeeniä sitovien kloonien saaminen ei riipu stokastisesta prosessista, joka edellyttää hyvin suurta yhdistelmäsolujen määrää, sallii 15 tämä myös paljon laajakantoisemman kirjon tutkimiseen.

Tämä voidaan tehdä ei-uudellenjärjestellyn Vhh -kirjon tasolla käyttäen DNA:ta, joka on peräisin mielivaltaisesti valitusta kudoksesta tai solutyypistä tai uudelleenjärjestellyn Vhh -kirjon tasolla, käyttäen 20 DNA:ta, joka on saatu B-lymfosyyteistä. On kuitenkin kiinnostavampaa transkriptoida mRNA vasta-ainetta tuot- , : tavasta solusta ja kloonata cDNA sopivaan vektoriin, mo- • > * nistamalla se edeltä käsin tai ilman edeltävää monis- 1 · * · ' tamista. Tämä johtaa sellaisten vasta-aineiden saarni- » » · , 25 seen, jotka ovat jo käyneet läpi affiniteettikypsymisen.

* * ‘· ' Suuren kirjon tutkimisen pitäisi osoittautua • t h. : erityisen hyödylliseksi etsittäessä vasta-aineita, V ·’ joilla on katalyytistä aktiivisuutta.

Täten saadaan käyttöön kirjastoja, jotka voi-·;· 30 daan kehittää sillä tavalla, että ne sisältävät osan sarana-alueesta, jolloin identifiointi on helppoa, kun • * » y _ sarana kiinnitetään suoraan VHH-domeeniin.

• · · ’· '· Näitä kirjastoja voidaan saada kloonaamalla

’·"· imukudossoluista saatua cDNA:ta, käyttäen edeltävää PCR

35 monistusta tai ilman sitä. PCR primeerien sijainti on ,···, 5'- primeerillä Vhh n promoottori-, leader- tai runko- t a 21 115462 sekvensseissä ja 3'-primeerillä sarana-, CH2-, CH3-, 3'-koodaamattomalla alueella tai polyA-hännässä. Monistetun materiaalin valikointi koon perusteella sallii raskasketju-immunoglobuliineihin rajoittuneen kirjaston 5 konstruoinnin.

Erityisessä esimerkissä käytetään seuraavaa 3'-primeeriä, johon on konstruoitu Kpnl kohta ja joka vastaa aminohappoja 313:sta 319:ään (CGC CAT CAA GGT AAC AGT TGA) yhdessä sellaisten hiiren Vhh -primeerien 10 kanssa, joita Sestry et ai ovat kuvanneet ja jotka sisältävät Xho kohdan

AG GTC CAG CTG CTC GAG TCT GG

15 AG CTC CAG CTG CTC GAG TCT GG

AG GTC CAG CTT CTC GAG TCT GG

XhoI kohta 20 • · ; · Nämä primeerit tuottavat kirjaston kame- i · ’ ·* lieläinten raskasket ju-immunoglobuliineista, jotka : *· 25 käsittävät VnH-alueen (sukua hiiren tai ihmisen alaryh- ,'· mälle III), saranan ja lohkon CH2:sta.

; : Toisessa esimerkissä cDNA on polyadenyloitu 5'-päästään ja hiiri-spesifiset VaH-primeerit on korvattu poly T primeereillä, joissa on sisäänrakennettu 30 Xhol-kohta, nukleotidin 12 tasolla.

i * · ♦ · CTCGAGT12.

• · * ' · > I I * · Käytetään samaa 3'-primeeriä, jossa onKpnl-kohta.

35 Tämä menetelmä kehittää kirjaston, joka sisäl- tää kaikki immunoglobuliinien alaryhmät.

I · 1 > 115462 22

Kloonattaessa alue, joka sisältää sarana-CH2 kohdan, on osa kiinnostuksen kohteesta siinä, että sekä Y2:ssa että Y3:ssa on Sac kohta välittömästi saranan jälkeen. Tämä kohta sallii VHH:ta koodaavan sekvenssin 5 ja saranan liittämisen muiden immunoglobuliinien Fc-alueelle, erityisesti ihmisen IgGireen ja IgG3:een, joilla on sama aminohapposekvenssi tässä kohdassa (Glu- 246 LeU247) - Tässä tarkastellaan esimerkiksi cDNA kirjas-10 toa, joka koostuu raskasketju immunoglobuliinia koodaa-vista nukleotidisekvensseistä, kuten sellaisista, jotka on saatu suorittamalla seuraavat vaiheet: a) käsittelemällä näytettä, joka sisältää imuku-dossoluja, erityisesti perifeerisiä, lymfosyyttejä, 15 pernasoluja, imusolmukkeita tai muuta terveen eläimen imukudosta, erityisesti valittuna kamelieläimistä, tarkoituksena erottaa imukudossolut, b) erottamalla polyadenyloitu RNA solujen muista nukleiinihapoista ja komponenteista, 20 c) antamalla saadun RNA:n reagoida käänteistran- skriptaasin kanssa vastaavan cDNA:n saamiseksi, , ; d) saattamalla vaiheen c) cDNA kontaktiin sellais- t 1 * ten 5'-primeerien kanssa, jotka vastaavat hiiren neljä- ‘ ketjuisten immunoglobuliinien VH-domeenia, jotka aluk- : 25 keet sisältävät määrätyn restriktiokohdan, esimerkiksi * · * ·* XhoI kohdan ja sellaisten 3'-alukkeiden kanssa, jotka *, : vastaavat N-terminaalista osaa CH2-domeenista ja jotka v · sisältävät Kpnl kohdan, e) monistamalla DNA, ·· 30 f) kloonamalla monistettu sekvenssi vektorissa, • » » » erityisesti bluescript-vektorissa, / ^ g) ottamalla talteen ne kloonit, jotka hybridisoi- ’ '· tuvat sellaisen koettimen kanssa, joka vastaa eristetyn * * raskasketju-immunoglobuliinin vakiodomeenia koodaavaa 35 sekvenssiä.

* · Tämä kloonaus synnyttää klooneja, jotka sisäl- 115462 23 tavat DNA-sekvenssejä, lukien mukaan saranaa koodaavan sekvenssin. Se sallii täten immunoglobuliinin alaluokan karakterisoinnin ja FVHHh:n Fc-alueelle liittämisessä hyödyllisen Sacl-kohdan karakterisoinnin.

5 Raskasketju immunoglobuliineja koodaavat sek venssit voidaan myös ottaa talteen sellaisten kloonien valikoinnilla, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, joiden koko on sopusoinnussa CHl-domeenin puuttumisen kanssa.

Lisäksi voi olla mahdollista lisätä seuraavat 10 vaiheet edellä mainitun prosessin vaiheiden c) ja d) väliin: saattamalla mainittu cDNA kontaktiin degeneroituneiden oligonukleotidi-primeerien kanssa DNA-polymeraa-sin ja deoksiribonukleotiditrifosfaattien läsnäollessa, 15 jotka sekvenssit voivat koodata immunoglobuliinin sarana-aluetta ja N-terminaalista VHH-domeenia, jolloin primeerit kykenevät hybridisoitumaan cDNA:n kanssa ja kykenevät aloittamaan sen DNA-sekvenssin lisäämisen, joka on komplementaarinen templaattina käytetylle cDNA-20 : lie, ottamalla talteen monistettu DNA.

: Kloonit voidaan ekspressoida useamman tyyppi sissä ekspressiovektoreissa. Esimerkiksi käyttämällä , ' kaupallisesti saatavaa Immuno PBS-vektoria (Huse et ai: I* 25 Science (1989) 246, 1275) kloonit, jotka on tuotettu * »

Bluescript :ssa edellä kuvatun menetelmän mukaisesti, * » : saadaan talteen PCR:llä, käyttäen samaa Xho:n sisältä- * » V ’ mää 51-primeeriä ja uutta 31-primeeriä, joka vastaa

immunoglobuliinien rungon jäännöksiä 113-103, jossa ·· 30 Spe-kohta on rakennettu: TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG

ACC TG. Tämä menetelmä sallii Vhh·n kloonaamisen Immuno ! : » PBS-vektorin Xho/Spe kohdassa. Geenin 31-pää ei ole kuitenkaan vaiheistuksessa identifiointi "tag": in ja :'· vektorin lopetuskodonin kanssa. Tämän tavoitteen saa- 35 vuttamiseksi rakenne katkaistaan Spe:llä ja 4 emäksen ulkonemat täytetään käyttäen Klenow-fragmenttia, minkä 115462 24 jälkeen vektori yhdistetään uudelleen. Jatkokehitys käsittää tunnistimen ("tag") korvaamisen polyhisti-diinillä siten, että kloonatun VHH:n metallipuhdistus voidaan suorittaa. Tämän saavuttamiseksi rakennetaan 5 ensin Spe/EcoRI kaksisäikeinen oligonukleotidi, joka koodaa 6 histidiiniä ja lopetuskodonia, syntetisoimalla molemmat säikeet ja sen jälkeen kuumentamalla ja liittämällä .

CTA GTG CAC CAC CAT CAC CAT CAC TAA* TAG*

10 AC GTG GTG GTA GTG GTA GTG ATT ATC TTA A

Sitten vektori, joka sisältää insertin, pilkotaan Spe:llä ja EcoRI:11a olemassaolevan "tag"-sekvenssin poistamiseksi, mikä sekvenssi voidaan korvata poly-15 His/lopetus sekvenssillä. Valmistettu Vhh voidaan sa moin osoittaa käyttäen vasta-aineita, jotka on muodostettu dromedaari-VHH-alueita vastaan. Laboratorio-olosuhteissa VnH-alueita valmistetaan Immuno PBS-vektorissa mg-määrinä litraa kohti.

20 Lisäksi tuodaan esiin DNA-kirjasto, joka koos tuu nukleotidisekvensseistä, jotka koodaavat raskasket- , j ju-immunoglobuliinia, jollaista on saatu soluista, » * · _ joissa on uudelleenjärjestyneet immunoglobuliinigeenit.

» · ' Kirjasto voidaan valmistaa soluista, jotka : 25 ovat peräisin eläimestä, joka on immunisoitu määrättyä antigeeniä vastaan aikaisemmin. Tämä sallii sellaisten : vasta-aineiden valikoinnin, joilla on ennalta valittu V ·' spesifisyys sille antigeenille, jota on käytetty im munisointiin.

h 30 Vaihtoehtoisesti cDNA:n monistusta ei tehdä .ennen cDNA:n kloonaamista.

_ Chaperon-proteiini (BIP) pitää solussa eris- "· tettynä neljäketjuisten immunoglobuliinien raskaan ' * ketjun, kunnes se on yhdistynyt kevyen ketjun kanssa.

35 Chaperon-proteiinin sitomiskohta on CHl-domeeni. Koska tämä domeeni puuttuu raskasketju-immunoglobuliineista, 1 15462 25 on raskasketju-immunoglobuliinien eritys riippumaton BIP-proteiinin tai kevyen ketjun läsnäolosta. Lisäksi keksijät ovat osoittaneet, että saadut immunoglobu-liinit eivät ole tahmeita ja sen mukaisesti eivät ag-5 gregoidu epänormaalisti.

Lisäksi voidaan käyttää menetelmää sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka on suunnattu määrättyä antigeeniä vastaan, jolloin vasta-aineen antigeeniä sitova kohta sisältää raskaat poly-10 peptidiketjut ja josta vasta-aineesta edelleen puuttuvat kevyet polypeptidiketjut, jolloin menetelmä käsittää : lymfosyyttien tekemisen jatkuvasti kasvaviksi (immortaaleiksi) jatkuvasti kasvavan solun ja edullise-15 sti myeloomasolujen kanssa hybridooman muodostamiseksi, jolloin lymfosyytit on saatu esimerkiksi kamelieläinten perifeerisestä verestä, muodostuneiden jatkuvasti kasvavien solujen (hyb-ridooma) viljelemisen ja niiden solujen talteenotta-20 misen, jotka tuottavat vasta-aineita, joilla on haluttu spesifisyys.

• Vasta-aineiden valmistaminen voidaan suorittaa t * · myös ilman edeltävää kamelieläinten immunisointia.

, ' Toisen vasta-aineiden valmistusmenetelmän • 25 mukaan ei tarvitse turvautua hybridoomasolutekniikkaan.

' .· Sellaisen menetelmän mukaan vasta-aineet vai- * t · mistetaan in vitro ja niitä voidaan saada menetelmällä, ! joka käsittää vaiheet: kloonaamalla vektoreihin, erityisesti faageihin ja ··· 30 erityisemmin filamenttibakteriofaageihin sellaiset DNA- tai cDNA-sekvenssit, jotka on saatu kamelieläinten lym- y fosyyteistä, erityisesti PBLs:stä, jotka kamelieläimet ' '· on aikaisemmin immunisoitu määrätyillä antigeeneillä, - transformoimalla prokaryoottisolut edellä maini- 35 tuilla vektoreilla sellaisissa olosuhteissa, jotka .·*, sallivat vasta-aineiden tuotannon, > · 115462 26 valikoimalla vasta-aineet niiden raskaan ketjun rakenteen perusteella ja saattamalla ne edelleen antigeeni-affiniteetti selektioon, ottamalla talteen ne vasta-aineet, joilla on 5 haluttu spesifisyys.

Kloonaus voidaan suorittaa vektoreissa, erityisesti plasmideissa, jotka koodaavat bakteeri-membraaniproteiineja. Sitten prokaryoottisolut transformoidaan edellä mainituilla vektoreilla sellaisissa 10 olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aineiden ilmentymisen niiden membraaneissa.

Positiiviset solut valitaan edelleen anti-geeniaffiniteettivalinnalla.

Raskasketjuvasta-aineet, joissa ei ole CH1-15 domeenia, tarjoavat tässä suhteessa selvän edun. CH1-domeeni sitoutuu todellakin BIP-tyypin chaperoni-proteiineihin, joita on läsnä eukaryoottivektoreissa, eikä raskaita ketjuja kuljeteta ulos endosytoplasmisesta retikulumista ellei kevyitä ketjuja ole läsnä. Tämä 20 merkitsee sitä, että eukaryoottisoluissa, ei-nisäkässo-luissa, kuten hiivasoluissa 4-ketjuisten immunoglobu- . liinien tehokas kloonaaminen voi riippua olemassaolevan ’ · *· BIP-tyypin chaperonin ominaisuuksista ja kloonaaminen voi siten olla hyvin vaikea suorittaa. Tässä suhteessa : *· 25 mainitut raskasketjuvasta-aineet, joista CHl-domeeni \ puuttuu, tarjoavat selvän edun.

: Kloonaus voidaan tehdä hiivassa joko vasta- aineiden tuottamiseksi tai hiivan metabolian modifioimi- seksi. Esimerkiksi Yep 52 vektoria voidaan käyttää. Täs- 30 sä vektorissa on hiivan replikaation aloituskohta (ORI) ,· *# 2μ yhdessä selektiomarkkeri Leu 2:n kanssa. Kloonattu * · \’’ geeni on gall-promoottorin kontrollin alaisena ja siis ’. ·· indusoitavissa galaktoosilla. Lisäksi glukoosilla voi- daan repressoida ilmentymistä, mikä sallii hyvin suuren ; 35 solukonsentraation aikaansaamisen ennen induktiota.

.·. Kloonaaminen kohtien BamHI ja Sali välillä * * 115462 27 käyttäen samaa menettelytapaa geenien valmistamiseksi PCR:llä kuin edellä on esitetty, sallii kamelieläinten immunoglobuliinigeenien kloonauksen E.coli1ssa. Esimerkkinä sellaisesta metabolisesta modulaatiosta, joka 5 voidaan saada vasta-aineilla ja jota on ehdotettu hiivalle, voidaan esittää vasta-aineiden kloonaaminen sykliinejä vastaan, toisin sanoen niitä proteiineja vastaan, jotka ovat mukana hiivan sellulaarisen syklin säätelyssä (TIBS 16 430 J.D. Mc Kinney, N, Heintz 10 1991). Toinen esimerkki on CD28:n vastaisen vasta- aineen saattaminen geeniteknisesti hiivan genomiin, joka vasta-aine olisi indusoitava (esimerkiksi gall:llä). CD28 on mukana solunjakautumisen aloituksessa ja siksi tätä molekyyliä vastaan suunnattujen vas-15 ta-aineiden ilmentyminen sallisi tehokkaan solujen monistumisen kontrolloinnin sekä menetelmien optimoinnin bioreaktoreissa tapahtuvassa tuotannossa tai käytettäessä tuotannossa immobilisoituja soluja.

Kloonausvektori voi olla plasmidi tai euka-20 ryootti-virusvektori ja transformoitavat solut voivat olla eukaryoottisoluja, erityisesti hiivasoluja, nisä-; kässoluja, esimerkiksi CHO-soluja tai apinan soluja , kuten Vero-soluja, hyönteissoluja, kasvisoluja tai » * ’ alkueläinsoluja.

• '* 25 Lisää yksityiskohtia, jotka koskevat tällai- *· ‘ sessa tapauksessa sovellettavia menettelytapoja on » t i, : julkaisussa Marks et ai, J. Mol. Biol. 1991, 222:581- ·* 597, johon viitataan.

Edelleen, uusia immunoglobuliineja tai niiden ·. 30 johdannaisia voidaan valmistaa lähtemällä liikkeelle . ·. mainituista immunoglobuliineista tai niiden fragmen teista.

Niinpä edellä mainittuja määritelmiä vastaavia s • immunoglobuliineja voidaan valmistaa määrättyjä anti- 35 geenejä vastaan. Voidaan ottaa käyttöön monoklonaaliset tai polyklonaaliset vasta-aineet, joista puuttuvat 115462 28 kevyet polypeptidiketjut tai antiseerumin, joka sisältää tällaisia vasta-aineita ja jotka on suunnattu määrättyjä antigeenejä vastaan ja esimerkiksi patologisten aineiden, kuten bakteerien, virusten tai parasiittien 5 antigeenejä vastaan.

glykoproteiinit tai peptidit, kuten HIV-viruksen ulkokuoren glykoproteiini, hepatiitti B-viruksen pinta-antigeeni .

Mainitut immunoglobuliinit voidaan kohdistaa 10 myös proteiinia, kapteenia, hiilihydraattia tai nukleiinihappoa vastaan.

Erityiset mainitut vasta-aineet on kohdistettu galaktosyla-l-3-galaktoosi -epitooppia vastaan.

Mainitut immunoglobuliinit sallivat edelleen 15 yhdistelmätuotteiden, kuten raskasketju-immunoglobulii-nin tai sen fragmentin ja toksiinin, entsyymin, lääkkeen, hormonin yhdistelmien valmistuksen.

Esimerkiksi voidaan valmistaa yhdistelmä ras-kasketju immunoglobuliinista, jossa on myeloomaimmunog-20 lobuliinin epitoopin tunnistava antigeenin sitomiskohta ja abrin- tai mistelilektiinitoksiinista. Tällaisella : konstruktiolla olisi käyttöä potilasspesifisessä terä- » * · t.* piassa. Toinen edullinen yhdistelmä on sellainen, joka * voidaan valmistaa yhdistämällä hyönteis-sisälmysanti- * " 25 geeniä tunnistavia raskasketju-immunoglobuliineja ja ·' hyönteisille spesifistä toksiinia, kuten Bacillus thu- : ringiensis1 in tai Bacillus sphaericus'in eri serotyyp- v ‘ pien toksiineja. Tällaista rakennetta voidaan käyttää kasveihin kloonattuna lisäämään olemassa olevien bak- ·· 30 teeritoksiinien spesifisyyttä tai isäntäpiiriä.

Tuodaan esiin myös vasta-aineet, joilla on / § erilainen spesifisyys kussakin raskaassa polypeptidi- • * '· '· ketjussa. Näitä multifunktionaalisia, erityisesti bi- • * funktionaalisia vasta-aineita voitaisiin valmistaa 35 yhdistämällä kaksi mainittujen immunoglobuliinien ras- "·. kasta ketjua tai yksi mainitun immunoglobuliinin ras- 115462 29 kasketju ja neljäketjuisen malli-immunoglobuliinin fragmentti.

Voidaan myös tuoda käyttöön hetero-spesifisiä vasta-aineita, joita voidaan käyttää lääkkeiden tai 5 minkä tahansa biologisen aineen, kuten hormoonien kohdistamiseen. Erityisesti niitä voidaan käyttää hormonien tai sytokiinien selektiiviseen kohdistamiseen rajoitettuun solujen kategoriaan. Esimerkkinä inter-leukiini 2:a (IL2) vastaan muodostuneiden hiiri- tai 10 ihmisvasta-aineiden ja CD4-soluja vastaan valmistettujen raskasketjuvasta-aineiden yhdistelmä. Tätä voitaisiin käyttää aktivoimaan uudelleen CD4-solut, jotka ovat menettäneet IL2-reseptorinsa.

Mainittuja raskasketju immunoglobuliineja voi-15 daan myös käyttää heterospesifisten vasta-aineiden valmistukseen. Niitä voidaan saada aikaan joko edellä kuvatun menetelmän mukaan kahdesta eri spesifisyyden omaavasta vasta-aineesta pelkistämällä eri ketjujen väliset sillat ja hapettamalla uudelleen tavanomaisen 20 menettelytavan mukaisesti tai myös kahden vasta-aineen sarjakloonauksella esimerkiksi Immuno-pBS-vektorissa.

, : Tällaisessa tapauksessa ensimmäinen geeni, joka vastaa VHH-domeenia käsittäen Xho:n ja Spe:n väli- ’ sen alueen, valmistetaan kuten edellä on kuvattu. Toi- * * * . 25 nen geeni valmistetaan sitten analogisella tavalla * ’* käyttäen 5 '-pään primeerinä Spe-kohdan sisältävää pri- : .* meeriä ja 3 1-pään primeerinä lopetuskodonin ja EcoRI- *. · kohdan sisältävää primeeriä. Sitten vektori katkaistaan

EcoRI:11a ja XhoI:11a ja lisäksi molemmat Vm-geenit ·;· 30 katkaistaan vastaavasti Xho/Spe : llä ja Spe/EcoRI: llä .

Ligaation jälkeen molemmat immunoglobu-liinigeenit kloonataan sarjassa. Molempien geenien > * · ’· j välistä tilaa voidaan lisätä viemällä lisäyskodoneita 5'- Spel-primeeriin.

35 Mainittujen IgG2-immunoglobuliinien sarana- ‘ alue voi olla puolijäykkä ja täten sopiva proteiinien 115462 30 kytkemiseen. Tällaisessa sovellutuksessa proteiinit tai peptidit voidaan liittää erilaisiin aineisiin, erityisesti ligandeihin, välikkeenä käytettävän sarana-alueen välityksellä. Fragmentti sisältää edullisesti ainakin 6 5 aminohappoa.

On kiintoisaa käyttää proteiinien kytkemiseen ligandiin tai eri proteiinidomeenien kokoamiseen tois-tosekvenssin Pro-X sisältävää sekvenssiä, jolloin X on mikä tahansa aminohappo ja edullisesti Gin, Lys tai 10 Glu, erityisesti fragmenttia, joka koostuu ainakin 3-kertaisesta toistosta ja mieluummin 12-kertaisesta toistosta.

Sarana-aluetta tai sen fragmenttia voidaan myös käyttää proteiinien kytkemiseen ligandeihin tai 15 eri proteiinidomeenien kokoamiseen.

Tavanomaiset menettelytavat ovat sopivia kytkemiseen ja erityisesti viitattakoon proteiinin muokkaustekniikkaan kokoamalla kloonattuja sekvenssejä.

Mainittuja vasta-aineita voidaan käyttää rea-20 gensseina in_vitro-diagnostiikassa tai kuvantamistek-niikassa. Mainittuja immunoglobuliineja voitaisiin leimata radio-isotoopeilla, kemiallisilla tai entsy- • · * maattisilla leimoilla tai kemiluminesenssileimoilla.

• - · .! * Esimerkiksi ja erityisesti käytettäessä im- :tt” 25 munoglobuliineja kuvantamistekniikassa, osoittamiseen • · *···’ tai havainnointiin, on teknetiumin kaltainen leima,

• I

: erityisesti teknetium 99, edullinen. Tätä leimaa voi- V · daan käyttää suoraan leimaukseen kytkemällä immunoglo- buliineihin tai niiden fragmentteihin tai epäsuoraan ··· 30 leimaukseen teknetiumin kanssa tehtävän kompleksin * · i * .*·*. valmistamisvaiheen jälkeen.

/ t Muita kiinnostavia radioaktiivisia leimoja * · · ’· '· ovat esimerkiksi indium ja erityisesti indium 111, tai • · jodi, erityisesti I131, I125 ja I123.

35 Näiden menettelytapojen kuvaamiseksi viitataan ,···, FR-patenttihakemukseen, joka on julkaistu numerolla 31 115462 2649488.

Näissä sovellutuksissa Vhh~fragmentin pieni koko on ratkaiseva etu kudoksiin tunkeutumisessa.

Tuodaan myös esiin sellaisia monoklonaalisia 5 vasta-aineita, jotka reagoivat edellä kuvattujen vasta-aineiden anti-idiotyyppien kanssa.

Keksintö koskee myös soluja tai organismeja lukuun ottamatta ihmistä, joissa raskasketju-immuno-globuliineja on kloonattu. Tällaisia soluja tai organis-10 meja voidaan käyttää halutun, edeltä valitun spe sifisyyden omaavien raskasketju-immunoglobuliinien tai erityistä kirjoa vastaavien raskasketju-immunoglobuliinien valmistustarkoituksiin. Niitä voidaan myös valmistaa sellaisten solujen metabolismin modifiointi-15 tarkoituksiin, jotka ekspressoivat niitä. Solujen meta bolismin modifiointitapauksessa, kun solut on transformoitu raskasketju-immunoglobuliineja koodaavilla sekvensseillä, käytetään näitä tuotettuja raskasketju-immunoglobul iine j a kuten antisense-DNA:ta. Antisense-DNA 20 aiheuttaa tavallisesti tiettyjen geenien, kuten esimerk iksi trypanosoomien variaabelin pinta-antigeenin tai , , ; muiden patogeenien ekspression estämisen. Myös tiettyjen * · · i .* proteiinien tai entsyymien tuotantoa tai aktiivisuutta

► 1 I

* voidaan inhiboida ekspressoimalla samassa solussa vasta- • ’’ 25 aineita näitä proteiineja tai entsyymejä vastaan.

* ·’ Keksintö koskee myös menetelmää modifioitujen 4-ketjuisten immunoglobuliinien tai niiden fragmenttien V · valmistamiseksi, joiden immunoglobuliinien tai niiden fragmenttien VH-alueet on korvattu raskasketju-··· 30 immunoglobuliinien spesifisillä sekvensseillä tai ami-

Ml» nohapoilla, erityisesti Vim-domeenin sekvensseillä.

,· . Erityiselle modifioidulle neljäketjuisen immunoglobu- •’· liinin VH-domeenille voi olla tunnusomaista se, että * · leusiini, proliini tai glutamiini VH-alueiden asemassa 35 45 on korvattu muilla aminohapoilla ja erityisesti arginiinilla, glutamiinihapolla tai kysteiinillä.

» 115462 32

Edelleen modifioidulle neljäketjuisen immunog-lobuliinin VH- tai VL-domeenille on tunnusomaista CDR-silmukoiden liittäminen yhteen tai FW-alueisiin tuomalla parillisia kysteiinejä, jolloin CDR-alue on valittu 5 joukosta CDRi ja CDR3, FW-alue on FW2-alue ja erityisesti jossa tuoduista kysteiineistä yksi on FR2:n asemassa 31, 33 tai CDR2:n asemassa 45 ja toinen CDR3:ssa.

Erityisesti parillisten kysteiinien tuominen tapahtuu siten, että CDR3 silmukka yhdistetään FW2:een 10 tai CDRl-domeeniin ja erityisemmin, että VH:n CDR3:n kysteiini yhdistetään FW2:n asemassa 31 tai 33 olevaan kysteiiniin tai CDR2:n asemassa 45 olevaan kysteiiniin.

Mainituilla raskasketju-immunoglobuliineilla voidaan modifioida kasvisoluja, siinä tarkoituksessa, 15 että ne saavat uusia ominaisuuksia tai parantuneita ominaisuuksia.

Mainittuja immunoglobuliineja voidaan käyttää syövän geeniterapiaan, esimerkiksi käyttämällä vasta-aineita, jotka on kohdistettu tuumorisoluissa olevia 20 proteiineja vastaan.

Sellaisessa tapauksessa yhden tai kahden Vhh- , , : geenin ilmentyminen voidaan saada aikaan käyttämällä • · parvo- tai adenoviruksista johdettuja vektoreita. Par- * · „ ‘ voviruksille tunnusomainen seikka on se, että ne eivät \ _ 25 ole patogeenisiä tai ovat lähes ei-patogeenisiä normaa- • t * ' leille ihmissoluille ja se seikka, että ne kykenevät : monistumaan helposti syöpäsoluissa (Russel S.J. 1990,

i I

\ 1 Immunol. Today II. 196-200).

Raskasketju-immunoglobuliinit kloonataan esi- ··· 3 0 merkiksi muriini MVM viruksen infektoivan plasmidin * * « > (pMM984) kohdissa Hindi II/XbaI (Merchlinsky et ai, .·*, 1983, J. Virol. 47, 227-232) ja asetetaan sitten MVM38 » * » ’· promoottorin kontrollin alaisuuteen.

‘ * » » · ' * Vim-domeenin geeni monistetaan PCR:lla käyttä- 35 en 51-primeeriä, joka sisältää aloituskodonin ja Hin-dlll kohdan ja 31-primeeriä, joka sisältää lopetuskodo- ! 33 115462 nin ja Xbal-kohdan.

Tämä konstruktio insertoidaan sitten plasmidin kohtien 2650 (Hindlll) ja 4067 (Xbal) väliin.

Kloonauksen tehokkuus voidaan tarkastaa trans-5 fektiolla. Vektori, joka sisältää vasta-aineen, tuodaan silloin sopiviin soluihin (NB-E) transfektiolla.

Solut otetaan talteen kahden päivän jälkeen ja VHH-alueiden läsnäolo määritetään ELISA-analyysillä käyttäen kanin antiseerumia, joka reagoi Vm-osan kansio sa.

Edelleen sallitaan katalyyttisten vasta-aineiden valmistaminen eri teitä. Sellaisten vasta-aineiden tuottaminen, jotka on kohdistettu substraattien aktiivisia tiloja jäljitteleviä komponentteja vastaan, 15 suo sellaisten vasta-aineiden aikaansaamisen, joilla on katalyyttinen funktio (esimerkiksi vanadaatti fosfaatin aktivoitua tilaa jäljittelevänä komponenttina tuottaakseen niiden fosfoesteraasiaktiivisuuksia, fosfonaatti aineena, joka jäljittelee peptidisitoutumista tuottaaks-20 een proteaaseja). Toinen tapa tällaisten vasta-aineiden saamiseksi käsittää satunnaismutageneesin suorittamisen ; vasta-aineklooneissa, esimerkiksi käyttäen PCR:ää, tuo- ! ! · / maila epänormaaleja emäksiä kloonien monistamisen aika- * » * na. Nämä PCR:llä saadut monistetut fragmentit tuodaan t * *i(i 2 5 sitten sopivaan vektoriin kloonaamista varten. Niiden * * ilmentyminen bakteerien pinnalla antaa mahdollisuuden • t : entsymaattista aktiivisuutta omaavien kloonien toteami- V ·' seen substraatin avulla. Nämä kaksi lähestymistapaa voidaan tietysti yhdistää. Lopuksi, modifikaatiot voi-3 0 daan kohdistaa niiden tietojen perusteella, mitä raken-teestä on käytettävissä, esimerkiksi röntgenkrista- / t llografiällä tai NMR:llä saatujen tietojen perusteella.

'» h Nämä modifikaatiot voidaan suorittaa tavanomaisilla geeniteknisillä menettelytavoilla tai täysin synteettis- * 7. 35 esti. Eräs raskasket ju-immunoglobuliinien Vhh · n etu on ..··, se seikka, että ne ovat riittävän liukoisia.

<' · 115462 34

Mainittuja raskasketju-immunoglobuliineja voidaan edelleen valmistaa kasvisoluissa, erityisesti siirtogeenisissä kasveissa. Raskasketju-immunoglobuliineja voidaan esimerkiksi valmistaa kasveissa käyttä-5 en plasmidi pMon530 (Roger et ai. Meth Enzym 153 1566 1987) konstitutiivista kasvi-ekspressiovektoria, kuten on kuvattu klassisille neljäketju-immunoglobuliineille (Hiat et ai. Nature 342 76-78, 1989) käyttäen taas sopivia PCR-primeereitä, kuten edellä on kuvattu, DNA-10 fragmentin tuottamiseen oikeassa vaiheistuksessa.

Muut keksinnön edut ja piirteet tulevat ilmi seuraavista esimerkeistä ja kuvista.

KUVAT

15 1 Kuva 1 : Kameli- IgG:n karakterisointi ja puhdistus af finiteettikromatografiällä Proteiini A- ja Proteiini G-sepharose'11a (Pharmacia) 20 (A) osoittaa, pelkistämisen jälkeen, Camelus dromedar- ius seerumin adsorboitujen ja ei-adsorboitujen frakti- : oiden SDS-PAGE proteiiniprofiilin. Fraktio, joka on * ·

adsorboitu Proteiini A:lie ja eluoitu NaClrlla 0.15 M » · J

. * etikkahapolla 0.58%, osoittaa pelkistettäessä (kaista * ” 25 c) kolme raskasket ju-komponenttia, 50, 46 ja 43 Kd • » *· * vastaavasti, ja kevyen ketjun (kanin IgG kaistalla a) . 1 · Proteiini A Sepharose (Pharmasia) johdannaiselle, jota » » > on muokattu poistamaan albumiinin sitomisalue (kaista e) adsorboiduista ja 0.1 M gly HC1 :11a pH 2.7 eluoi- · 30 duista fraktioista puuttuu 46 Kd:n raskas ketju, joka ·, saadaan ei-adsorboidussa fraktiossa (kaista f) . Mikään < näistä komponenteista ei ole läsnä fraktiossa, joka ei » · ole adsorboitunut proteiini A:lie (kaista D) , kaista b sisältää molekyylipainomarkkerit.

35 » »· » ,··. (B) ja (C) Immunoglobuliinifraktiot, jotka sisältävät > · » t * 115462 35 i t 50 ja 43 Kdm raskaat ketjut voidaan erottaa differen-tiaalieluutiolla. 5 ml C. dromadarius seerumia adsor boidaan 5ml-.n Proteiini G sepharose-kolonniin ja kolonnia huuhdellaan runsaasti 20mM fosfaattipuskurilla, pH 5 7.0. Eluoitaessa puskurilla pH 3.5 (0.15 NaCl, 0.58% etikkahappo) eluoituu 100 Kd:n komponentti, joka pelkistettäessä tuottaa 43 Kd:n raskaan ketjun (kaista 1). Sen jälkeen kun eluantin absorbanssi on laskenut taustan tasolle, voidaan eluoida toinen, 170 Kd.-n immunog- 10 lobuliinikomponentti puskurilla pH 2.7 (0.1 M glysiini HC) . Tämä fraktio tuottaa pelkistyksen jälkeen 50 Kd:n raskaan ketjun ja laajan kevytketjunauhan (kaista 2). Fraktio, joka ei ole adsorboitunut Proteiini G: lie viedään sitten 5 ml:n Proteiini A Sepharose- kolonniin.

15 Huuhtomisen ja puskurilla pH 3.5 (0.15 M NaCl, 0.58% etikkahappo) eluoinnin jälkeen saadaan kolmas, 100 Kd:n immunoglobuliini, joka sisältää pelkästään 46 Kd:n raskaat ketjut (kaista 3).

20 Kuva 2 : Camelus bactrianus'in, Lama vicugna'n, Lama glama'n ja Lama pacos1 in immunoglobuliinit Proteiini ; A:11a (A-kaistat) ja Proteiini G:llä (G-kaistat) ana lysoituna SDS-PAGE:lla ennen pelkistystä (A) ja pelkis- ,, ' tyksen jälkeen (B) : 25 • * * .* 10 μΐ eri lajeista saatua seerumia lisättiin Eppendorf : R - putkiin, jotka sisältävät 10 mg proteiini A- tai I Proteiini G-sepharose1 a, joka on suspendoitu 400μ1:33η immunosaostuspuskuria pH 8.3 (NaCl 0.2. M, Tris 0.01 M; 30 EDTA 0.01 M, Triton X100 1%, ovalbumiini 0.1%) . Putkia ·, pyöritettiin hitaasti 2 tunnin ajan 4°C:ssa. Sentrif- ugoinnin jälkeen pelletit pestiin 3 kertaa puskurissa < · 'i ja kerran puskurissa, josta Triton ja ovalbumiini oli '"· jätetty pois. Sitten pelletit suspendoitiin uudelleen , 35 SDS-PAGE näyteliuokseen, 70ul pellettiä kohti, dithiot- i · reitolin ollessa pelkistimenä tai ilman sitä. Putket 115462 36 sentrifugoitiin sen jälkeen kun niitä oli keitetty kolme minuuttia 100 °C:ssa ja supernatantit analysoitiin.

Kaikilla tutkituilla lajeilla pelkistämättömät fraktiot 5 (A) sisälsivät suunnilleen 170 Kd:n molekyylien lisäksi myös pienempiä, suunnilleen 100 Kd:n pääkomponentteja. Pelkistetystä näytteestä (B) osoitetaan raskas- ja kevytketjuaineosat. Kaikilla lajeilla raskasketjukompo-nentti (merkitty asteriskilla*) on läsnä siinä materi-10 aalissa, joka on eluoitu Proteiini A:lta, mutta puuttuu siitä materiaalista, joka on eluoitu Proteiini G:Itä.

Kuva 3 : IgGi, IgG2 ja IgG3 valmistettiin seerumis ta, joka oli saatu terveistä tai Trypanosama evansi111a 15 infektoidusta Camelus dromedarius1ista (CATT tiitteri 1/160 (3) ja antitrypanosooma-aktiivisuus analysoitiin radioimmunosaostuksella tai Western Blotting-analyysil-lä 20 (A) 35S- metioniinilla leimattu Trypanosome evansi- antigeenilysaatti (500.000 yksikköä) lisättiin Eppen-.· dorf putkiin, jotka sisältävät 10μ1 seerumia tai 20μ1 _ IgGi:tä, IgG2:ta tai IgG3:a 200μ1:β8Ά immunosaostusp- ,, ’ uskuria pH 8.3, joka puskuri sisältää 0.1 M TLCK:ta ' _ 25 proteinaasi-inhibiittorina ja putkia pyöritettiin hi- ’ taasti 4°C:ssa yhden tunnin ajan. Sitten putkiin lisät- ; : tiin 10 mg Proteiini A Sepharose'a, joka on suspendoitu ·’, ' 200μ1:3ηη samaa pH 8.3 puskuria ja inkuboitiin vielä tunti 4°C:ssa.

*· 3 0 Pesun ja sentrifugoinnin, 1500 rpm 12 s, jälkeen kukin pelletti suspendoitiin uudelleen 75 μΐ-.aan SDS-PAGE näyteliuosta, joka sisältää DTT:tä ja kuumennettiin 3 * j minuuttia 100°C:ssa. Eppendorf minifuugissa suoritetun sentrifugoinnin 15000 rpm 30 s, jälkeen supernatantista 35 5μ1 säästettiin radioaktiivisuusmääritystä varten ja loppu analysoitiin SDS-PAGE:11a ja fluorografiällä.

37 115462

Lukemat/5μ1 näytettä on merkitty kutakin kaistaa varten.

(B) 2 0 μg IgGntä, IgG2:ta ja IgG3:a, terveistä ja trypanosoomalla infektoiduista eläimistä erotettiin 5 SDS-PAGE:lla ilman edeltävää pelkistystä tai kuumennusta. Erotetut näytteet siirrettiin sitten sähköisesti nitroselluloosamembraanille, yksi osa membraanista värjättiin Ponceau Redillä proteiinimateriaalin paikantamiseksi ja jäännöstä inkuboitiin 1% ovalbumiinin TST-10 puskurissa kanssa (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 0.05%) proteiinin sitomiskohtien sulkemiseksi. Membraania pestiin sitomiskohtien sulkemisen jälkeen runsaasti TST-puskurilla ja inkuboitiin 2 tunnin ajan | 35S:lla leimatun trypanosooma-antigeenin kanssa. Run- 15 saan pesun jälkeen membraani kuivattiin ja analysoitiin autoradiografiällä. Taustan ja epäspesifisen sitoutumisen välttämiseksi leimattu trypanosoomalysaatti suodatettiin 45 μ:η millipore-filtterin läpi ja inkuboitiin nitroselluloosamembraanille adsorboidun, terveen kame-20 Iin immunoglobuliinin ja ovalbumiinin kanssa.

, Kuva 4 : Affiniteettikromatografiällä Proteiini A

* · ; Sepharose1lla puhdistettu kamelin IgG3 hajotetaan osit- tain papaiinilla ja erotetaan Proteiini A Sepharose- : ’·* 25 'lla.

* # j : : 14 mg puhdistettua IgG3:a liuotettiin 0. IM fosfaatti- • puskuriin pH 7.0, joka sisältää 2 mM EDTAra. Pilkkomi nen suoritettiin inkuboimalla 1 tunti 37°C:ssa eloho-30 peapapaiinin kanssa (1% entsyymiä proteiinimäärästä), 5.104 M aktivoituna kysteiinillä. Pilkkominen estettiin lisäämällä ylimäärä jodiasetamidia (4.102M) (13) . Sen “I jälkeen kun pilkottua tuotetta oli sentrifugoitu eppen- "· dorf-sentrifuugissa 5 min 15000 rpm, erotettiin papa- 35 iinifragmentit proteiini A Sepharose-kolonnissa sito- vaksi (B) ja ei-sitovaksi (NB) fraktioksi. Sitova frak- * 115462 38 tio eluoitiin kolonnista 0. IM glysiini HC1- puskurilla pH 1.7.

Kuva 5 : Kaavamainen esitys IgG3-molekyylien mal- 5 lista, josta kevyet ketjut puuttuvat.

Kuva 6 : Kaavamainen esitys immunoglobuliineista, joissa on raskaat polypeptidiketjut ja joista kevyet ketjut puuttuvat, tarkastellen konventionaalisiin neliö jäketjuisiin immunoglobuliineihin nähden.

Sarana-alueen esittäminen.

Kuva 7 : Kamelin raskasketju-immunoglobuliinien 17

Vhh DNA sekvenssijärjestykset 15

Kuva 8 : Kamelin Vhh21 proteiinin ekspressio ja puhdistus E.coli1sta RASKASKET JUVASTA-AINEET KAMELI ELÄIMISSÄ 20

Kun Camelus dromedarius seerumia adsorboidaan Proteiini G sepharose1 lie, jää liuokseen tuntuva määrä (25-35%) immunoglobuliineja (Ig), jotka voidaan saada ‘ *' sitten talteen affiniteettikromatografiällä Proteiini A

: ’* 25 sepharose'11a (kuva IA). Proteiini G:lle adsorboitunut ,· fraktio voidaan eluoida erottavasti tiukasti sitou- I tuneeksi fraktioksi (25%), joka käsittää molekyylejä, joiden näennäinen molekyylipaino (MW) pelkistymättömänä on 170Kd (kuva IB) ja heikommin sitoutuneeksi fraktiok-!, 30 si (30-45%), jonka näennäinen molekyylipaino on lOOKd (kuva IB). 170Kd:n komponentti tuottaa pelkistämisen jälkeen 50 Kd:n raskaat ketjut ja runsaasti 30 Kd:n ·. ’ kevyitä ketjuja. 100 Kd:n fraktiosta puuttuvat kevyet "· ketjut täysin ja se näyttää koostuvan pelkästään ras- 35 kaista ketjuista, joiden näennäinen MW on pelkistyksen 1 » » jälkeen 43 Kd (Kuva 1C) . Se fraktio, joka ei sitoudu * · * * » 115462 39

Proteiini G:hen voidaan affiniteettipuhdistaa ja eluoi-da Proteiini A-kolonnista toisena 100Kd:n komponenttina, joka pelkistyksen jälkeen näyttää koostuvan pelkästään 46 Kd:n raskaista ketjuista.

5 Niiden raskasketju-immnoglobuliinien määrä, joista kevyet ketjut puuttuvat, nousee 75%:iin Proteiini A:hän sitoutuvista molekyyleistä.

Kun kaikki kolme immunoglobuliinia sitoutuvat Proteiini A:hän, viittaamme niihin IgG:nä : nimittäin 10 IgGi (kevyt ketju ja raskas ketju yl (50Kd) sitoutuu Proteiini G:hen, IgG2 (raskas ketju γ2 (46 Kd) ei si- j j toudu proteiini G:hen ja IgG3 (raskas ketju γ3 (43 Kd) sitoutuu Proteiini G:hen. On mahdollista, että näitä kolmea ala(luokkaa) voidaan edelleen alajaotella.

15 Vanhan maailman kamelieläinten (Camelus bact- rianus ja Camelus dromedarius) ja uuden maailman kamelieläinten (lama pacos, lama glama, lama vicugna) vertaileva tutkimus osoitti, että raskasketju-immunoglo-buliineja tavataan kaikissa tutkituissa lajeissa, vaik-20 ka niillä on pieniä eroja näennäisessä molekyylipainos-sa ja osuudessa. Uuden maailman kamelieläimet eroavat ; vanhan maailman kamelieläimistä siinä, että niillä on suurempi IgG3-molekyyli (raskasketju-immunoglobuliini, ‘ joka sitoutuu Proteiini G:lle), jossa ainesosana olevi- * ’ 25 en raskaiden ketjujen näennäinen molekyylipaino on 47 '' Kd (kuva 2) .

; * Raskasketju-immunoglobuliinien runsaudesta *, ί kamelieläinten seerumissa herää kysymys, mikä on niiden rooli immunovasteessa ja erityisesti, onko niissä anti-·· 30 geeniä sitovaa spesifisyyttä ja jos on, miten laaja välikoimajoukko on. Tähän kysymykseen voitaisiin vastata tutkimalla Trypanosoma evansi'lla infektoituja kame-leita (Camelus dromedarius).

· 35 Tätä tarkoitusta varten valmistettiin vastaa vat IgGi-, IgG2- ja IgG3-fraktiot terveen kamelin seeru- ! 115462 40 mistä ja sellaisesta kamelien seerumista, jossa on korkea anti-trypanosooma tiitteri, joka on mitattu Card I Agglutination Test'illa (3). Radio-immunosaostuksessa

IgGi:n, IgG2:n ja IgG3:n, jotka on johdettu infektoidu!- i j 5 sta kameleista ja jotka osoittavat laaja-alaista hete- j rogeenisyyttä ja kompleksisuutta (kuva 3A), osoitettiin sitovan suuren määrään antigeenejä, jotka ovat läsnä 35S metioniinilla leimatussa trypanosooma-lysaatissa.

Blottauskokeissa 35S metioniinilla leimattu 10 trypanosoomalysaatti sitoutuu IgGireen, IgG2:een ja IgG3:een, jotka on erotettu SDS PAGE:11a ja jotka on saatu infektoiduista eläimistä (Kuva 3B).

Tämä johtaa meidät tekemään sen johtopäätöksen, että kamelieläinten raskasketju IgG2 ja IgG3 ovat 15 oikeita antigeeniä sitovia vasta-aineita.

Immunologinen paradigma lausuu, että laaja vasta-aine-valikoima muodostuu yhdistämällä kevyiden ja raskaiden ketjujen vaihtelevan V alueen valikoimia (6). Kamelin raskasketju-immunoglobuliinit näyttävät olevan 20 ristiriidassa tämän paradigman kanssa.

Immunoglobuliineille on tunnusomaista se, että • niillä on monimutkainen I.E.F. (isoelectric focussing) I · kuva, joka kuvastaa niiden erittäin suurta heterogeeni- t · syyttä. Sen määrittämiseksi, ovatko kaksi raskasta ·* ’* 25 ketjua, jotka muodostavat IgG2:n ja IgG3:n, identtisiä vai eivät, tutkittiin isoelektrisen fokusoinnin

• I

I (I.E.F.) kuvia ennen ketjujen erottamista ja sen jäi- * · » ί : : keen kun ketjut oli erotettu, pelkistämällä ja alkyloi- malla käyttäen jodiasetamidia alkyloivana aineena.

3 0 Koska tämä alkyloiva aine ei vie molekyyliin M|| lisävarauksia, on monomeereillä, jotka saadaan pelkis- i · ·' tämällä ja alkyloimalla raskasketju-homodimeerejä, » * · ‘ί käytännöllisesti katsoen sama isoelektrinen piste kuin dimeerillä, kun taas, jos ne johdetaan raskasketju-35 heterodimeeristä, tulevat monomeerit eroamaan useimmi- » t s ,··*, ssa tapauksissa kylliksi isoelektrisen pisteen osalta, i » i 1 115462 41 jotta erilaiset I.E.F. kuvat muodostuvat.

Camelus dromedarius IgG2:lle ja IgG3:lle havaittu kuva ei muutu pelkistettäessä ja alkyloitaessa jodiasetamidilla, mikä osoittaa, että kumpikin näistä 5 molekyyleistä koostuu kahdesta identtisestä raskaasta ketjusta, jotka liikkuvat samaan kohtaan kuin ne pel-kistämättömat molekyylit, joista ne ovat peräisin.

IgGi:n I.E.F.- kuva muuttuu sitävastoin täysin pelkistyksen jälkeen, koska kunkin molekyylin isoelekt-10 rinen piste määritetään kevyiden ja raskaiden ketjujen isoelektristen pisteiden yhdistelmänä, jotka ketjut tulevat erottamisen jälkeen kukin liikkumaan eri asemiin.

Nämä havainnot osoittavat, että raskaat ketjut 15 voivat yksinään tuottaa laajan vasta-ainevalikoiman ja asettavat kyseenalaiseksi kevyen ketjun myötävaikutuksen käyttökelpoiselle vasta-ainevalikoimalle. Jos tämä välttämättömyys kumottaisiin, mikä muu rooli kevyillä ketjuilla on.

20 Tavallisesti nisäkäs-immunoglobuliineista eristetyt raskaat ketjut pyrkivät aggregoitumaan huo-; mättävästä, mutta liukenevat vain kevyiden ketjujen toimesta (8,9), jotka kevyet ketjut sitoutuvat raskaan > ketjun CHi-domeeniin.

: 25 Muutamat spontaanit tai indusoidut myeloomat * tuottavat ihmisissä ja hiirissä patologista immunoglo- ; ' * buliinia, joka koostuu pelkästään raskaista ketjuista ’ .* (raskasketju-sairaus) . Näissä myeloomaproteiinien ras kaissa ketjuissa on deleetioita CH1- ja VHH-domeeneissa 30 (10). Syy, miksi täyspitkät raskaat ketjut eivät muo dosta eritettyä raskasta ketjua tällaisissa patologi- _ sissa immunoglobuliineissa näyttää juontavan juurensa ' siitä tosiasiasta, että Ig:n synteesi sisältää chape- * ron-proteiinin, immunoglobuliinin raskaan ketjun sito- 35 van proteiinin tai BIP:n (11), jonka kevyt ketju nor-.·*. maalisti korvaa. On mahdollista, että kevyen ketjun 115462 42 alkuperäinen- rooli neljäketju-mallin immunoglobulii-neissa on ollut sitoutuneen raskasketju-chaperonin rooli ja että kevytketjuvalikoimien ilmaantuminen on ollut vain evolutionaarista bonusta.

5 Kamelieläinten γ2 ja γ3 ketjut ovat huomatta vasti lyhyempiä kuin normaali imettäväisen γ-ketju. Tämä viittaisi siihen, että deleetiot ovat tapahtuneet CHi-domeenissa. Erot vanhan ja uuden maailman kame-lieläinten γ2 ja Y3-immunoglobuliinien koossa viitta-10 avat siihen, että deleetiot ovat tapahtuneet useassa evolutionaarisessa vaiheessa erityisesti CHi-domeenissa.

KAMELIELÄINTEN RASKASKETJU-IMMUNOGLOBULIINEISTA 15 PUUTTUU CHi- DOMEENI.

Menettelytapa, jota on seurattu tutkittaessa raskasketju-immunoglobuliinien primäärirakennetta, on yhdistelmä proteiini- ja cDNA-sekvensoinnista; proteii-20 nin sekvensointi on välttämätöntä kullekin immunoglob-uliinille tunnusomaisen sekvenssialueen identifioimi-. seksi. Sellaisen immunoglobuliinin N-terminaali, joka

• I I

on johdettu raskaiden ketjujen vaihtelevan alueen kir- * josta, antaa tietoa vain VHH-alaryhmistä (raskaan ket- • " 25 jun vaihteleva alue) eikä sitä voida käyttää luokan tai ’ .* alaluokan identifiointiin. Tämä merkitsee sitä, että * sekvenssitiedot täytyy saada sisäisistä entsymaatisista : tai kemiallisista pilkkomiskohdista.

Papaiinilla pilkkomisen ja Proteiini A af-t 30 finiteettikromatografiän yhdistelmä salli eri fragment- tien erottamisen antaen tietoa IgG3:n yleisrakenteesta.

- > Kamelin (Camelus dromedarius) IgG3 , joka on

'1 puhdistettu affiniteettikromatografiällä Proteiini A

* Sepharose'lla, pilkottiin osittain papaiinilla ja pil-35 kottu tuote erotettiin Proteiini A Sepharose'lla sito- vaksi ja ei-sitovaksi fraktioksi. Nämä fraktiot ana- • » 115462 43 lysoitiin SDS PAGE :11a pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa (kuva 4).

Sitoutunut fraktio sisälsi pilkkoutumattoman tai osittain pilkkoutuneen materiaalin lisäksi kaksi 5 komponenttia, 28 Kd:n ja 14.4 Kd:n komponentit. Ne erotettiin hyvin geelielektroforeesilla (preparatiivi-sista 19% SDS-PAGE geeleistä) ei-pelkistävissä olosuhteissa ja puhdistettiin edelleen elektroeluutiolla (50nM ammoniumbikarbonaatissa 0.1% (w/v) SDS käyttäen 10 BioRad elektro-eluutteria). Näiden elektroeluoitujen fraktioiden lyofilisoinnin jälkeen jäännös SDS eliminoitiin saostamalla proteiini lisäämällä 90% etanolia, sekoittamalla ja inkuboimalla seosta yön yli -20°C-:ssa (14). Saostunut proteiini koottiin pellettinä 15 sentrifugoimalla (15000 rpm, 5 min.) ja käytettiin proteiinin sekvensointiin. N-terminaalinen sekvensointi suoritettiin käyttäen automaattista Applied Biosystem 477A Edman chemistry - pulssi neste proteiinisekvenaat-toria. Aminohapot identifioitiin niiden fenyylitiohy-20 dantoiini (PTH) -johdannaisina käyttäen Applied Biosystem 120 PTH analysaattoria. Kaikki kemikaalit ja rea-. genssit hankittiin Applied Biosystemsiltä. Kromatogra- ,* fisten tulosten analysointi suoritettiin käyttäen Ap- ! » ' plied Biosystems ' in software versiota 1.61.

: ** 25 Tietokoneavusteinen sekvenssianalyysi varmistettiin *, .· jokaisessa tapauksessa suoralla PTH-analysaattorin '· > kromatogrammien tarkastelulla. Proteiinisekvensointia i ’: varten näytteet liuotettiin joko 50% (v/v) trif- luoroetikkahappoon (TFA) (28 Kd:n fragmentti) tai 100% 30 TFA:han (14 Kd:n fragmentti) . Liuotettujen proteiinien ,··, näytteet, jotka vastasivat 2000 pmol:a (28 KD:n frag- mentti) tai 500 pmol:a (14 Kd:n fragmentti), asetettiin *. u TFA-käsitellyille lasikuitukiekoille. Lasikuitukiekot päällystettiin BioBrene'llä (3mg) ja esikierrätettiin ;·, 3 5 kerran ennen käyttöä.

• i · 28 Kd:n fragmentin N-terminaalinen sekvensoin- » · i t » 115462 44 ti antaa sekvenssin, joka on homologinen γ CH2-domeenin N-terminaalisen osan kanssa ja täten homologinen Fc-fragmentin N-terminaalisen pään kanssa. 14.4 Kd:n fragmentin N-terminaalinen sekvenssi vastaa γ CH2:n vii-5 meistä lysiiniä ja γ CH3-domeenin N-terminaalista päätä (Taulukko 1) . Papaiinifragmenttien molekyylipaino (MW) ja niiden N-terminaalisten sekvenssien identifiointi johti meidät tekemään sen johtopäätöksen, että γ3 raskaiden ketjujen Ch2- ja CH3-domeenit ovat normaaliko-10 koisia ja että deleetion täytyy ilmetä joko CH1- tai VnH'domeenissa, jotta lyhennetty γ3- ketju syntyy. Ne fraktiot, jotka eivät sitoudu Proteiini A Sepharose1 en, sisältävät kaksi nauhaa, 34 ja 17 Kd, jotka ovat enemmän diffuuseja SDS PAGE:ssa, osoittaen, että ne ovat 15 peräisin molekyylin vaihtelevasta N-terminaalisesta osasta (kuva 4).

Pelkistettäessä havaitaan yksi diffuusi 17 Kd:n nauha, joka osoittaa, että 34 Kd:n komponentti on disulfidisidoksinen dimeeri 17 Kd:n komponentista. 34 20 Kd:n fragmentti sisältää ilmeisesti sarana-alueen ja N-terminaalisen domeenin Vhh· . Proteiinisekvenssitietoja voidaan käyttää ! ’ konstruoitaessa degeneroituneita oligonukleotidiprimee- t » ' rejä, jotka sallivat cDNArn tai genomi-DNA.-n PCR-monis- ·' ” 25 tuksen.

On osoitettu, että solut, jotka ovat kamelin ·,: · pernan leimattuja soluja, reagoivat kanin ja anti-kame- : Γ: li-immunoglobuliiniseerumin kanssa ja että perna oli täten ainakin yhden immunoglobuliiniluokan syn-3 0 teesipaikka. Sen vuoksi syntetisoitiin cDNA kamelin pernan mRNA:sta. Olosuhteet RNA:n eristämiseksi olivat '·’ seuraavat: kokonais-RNA eristettiin dromedaaripernasta guanidiini-isotiosyanaattimenetelmällä (15) . mRNA puh-distettiin oligo T-paramagneettisilla helmillä.

:*. 35 cDNA synteesi aikaansaatiin käyttäen 1μς$ mRNA

I I I

.··», templaattia, oligodT primeeriä ja käänteistranskriptaa-

» · t I I

115462 45 siä (BOEHRINGER MAN). Toinen cDNA säie saadaan käyttäen RNAasi H:ta ja E coli DNA- polymeraasi I:tä toimittajan antamien olosuhteiden mukaisesti.

Relevantit sekvenssit monistettiin PCR:lla: 5ng cDNA:ta 5 monistettiin PCRrlla ΙΟΟμΙ reaktioseoksessa (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50mM KC1, 15mM MgCl2, 0.01% (w/v) gelatiinia, 200μΜ kutakin dNTP:a ja 25 pmoolia kutakin primeeriä), joka oli peitetty mineraaliöljyllä (Sigma).

Degeneroituneet primeerit, jotka sisältävät 10 EcoRI ja Kpnl kohdat kloonattiin edelleen pUC 18:aan. Denaturointi- ja liittämiskierroksen jälkeen (94 °C 5 min ajan ja 54 °C 5 min ajan) reaktioseokseen lisättiin 2 yksikköä Tag DNA-polymeraasia ennen kuin siihen kohdistettiin 35 moni s tus syki iä: 1 min 94 °C:ssa (denatu- 15 rointi) 1 min 54 °C-.ssa (liittäminen) , 2 min 72 °C:ssa (pidennys). Vhh- ja CH2 -domeenien välisten sekvenssien monistamiseksi (# 72 kloonia), PCR suoritettiin samoissa olosuhteissa sillä poikkeuksella, että liittämisläm-pötila nostettiin 60 °C:een.

| 20 Yhdellä tutkituista klooneista (#56/36) oli sekvenssi, joka vastaa CH2-domeenin N-terminaalista >v . osaa, joka on identtinen 28 Kd:n fragmentin sekvenssin • · ; ' kanssa. Tämän sekvenssitiedon tarjollaolo salli eksak- tin 3 1-primeerin konstruoinnin ja V^n N-terminaalisen ·’ ” 25 pään ja CH2-domeenin välisen alueen kloonaamisen.

51-primeereitä, jotka vastaavat hiiren VHH:ta * * (16) ja sisältävät XhoI restriktiokohdan, käytettiin : : yhdessä 3 1 -primeerin kanssa, johon oli insertoitu Kpnl- kohta ja monistetut sekvenssit kloonattiin pBluescriptR ,j. 30 :iin. Klooni #56/36, joka osoitti kahta sisäistä Haelll .**. -kohtaa, pilkottiin tällä entsyymillä koettimen valmis-

* I

·’ tamiseksi PCR positiivisten kloonien identifioimiseksi.

*: Monistamisen jälkeen PCR tuotteet tarkastet- tiin 1.2% (w/v) agaroosigeelillä. PCR tuotteiden puh- 35 distaminen käsitti fenoli-kloroformi-uuton ja sitä » i >

,···, seuraavan puhdistuksen edelleen HPLC:llä (GEN-PAC FAX

115462 46 kolonni, Waters) ja lopuksi käyttäen MERMAID tai GENE-CLEAN II kittiä, BIO 101, Inc) tarkoituksenmukaisesti. Näiden puhdistusvaiheiden jälkeen monistettu cDNA pilkottiin sitten EcoRI:llä ja Kpnl:llä sarjaksi #56 kloo-5 neja ja XhoI:llä ja Kpnlrllä sarjan #72 klooneiksi. Loppu-uutto fenoli-kloroformilla edelsi ligaatiota pUC18:aan (sarjan #56 kloonit) tai pBluescriptR :ään (sarjan #72 kloonit).

Kaikki saadut kloonit olivat pienempiä kuin 10 otaksutut 860 emäsparia, jos ne omasivat täydellisen Vhh- ja Ctil-alueen. VnH-alueen N-terminaalia vastaavan osasekvenssin tiedot osoittavat, että 20 kloonista 3 on indenttisiä ja mahdollisesti ei-riippumattomia. Saadut sekvenssit muistuttivat ihmisen alaryhmä III :a 15 ja hiiren alaryhmiä lila ja IIIb (Taulukko 2).

Saatiin klooneja, jotka vastaavat kahta eri CH2-proteiinisekvenssien sarjaa. Ensimmäisellä sekvenssien (#72/41) sarjalla oli N-terminaalinen CH2-alue, joka on identtinen sen alueen kanssa, joka saatiin 20 proteiinisekvensoinnissa 28 Kd:n papaiinifragmenteista, jotka ovat peräisin y3 raskaasta ketjusta, lyhyt sara-: na-alue, joka sisältää 3 kysteiiniä ja vaihteleva alue, joka liittyy sarana-alueeseen, joka vastaa runko (FR4) ' jäännöksiä, joita J minigeenit koodaavat. CHl-domeeni : “ 25 puuttuu täysin. Tämä cDNA vastaa γ3 ketjua (Taulukko V;: 4).

; Yhdessä läheisesti liittyvässä sekvenssissä · (#72/1) on asemassa 259 proliini korvattu treoniinil-lä.

·>· 30 Sekvenssi, joka vastaa CH3:a ja jäljelle jää vää osaa CH2:sta, saatiin PCRrlla cDNA:sta käyttäen .· ( Kpnl primeerinä poly T:tä, johon oli insertoitu Kpnl- • ’·* restriktiokohta 5'-päähän. y3-ketjun kokonaissekvenssi * * vastaa sellaista molekyylipainoa (MW), joka sopii hyvin # 35 yhteen SDS PAGE elektroforeesista saatujen tietojen ,**·, kanssa.

115462 47 Tällä Y3-ketjun sekvenssillä on samankaltaisuutta muiden γ-ketjujen kanssa, paitsi että siitä puuttuu CHl-domeeni, VnH-domeenin ollessa saranan vieressä .

5 Yksi tai kaikki kolme kysteiiniä voisivat todennäköisesti olla vastuussa kahden Y3-ketjun pitämi-! sestä yhdessä.

Nämä tulokset ovat antaneet meille tilaisuuden määrittää IgG3-molekyylille malli, joka perustuu sek-10 venssiin ja papaiini-pilkkomiseen (kuva 5).

Papaiini voi pilkkoa molekyylin sarana-disul-fidien kummaltakin puolelta ja myös CH2:n ja CH3:n välistä. Ei-pelkistävisssä olosuhteissa IgG3:n VHH-do-meenit voidaan eristää disulfidien yhdistäminä dimee-15 reinä tai monomeereinä, riippuen papaiinin pilkkomis-kohdasta.

Toisella kloonien sarjalla #72/29 oli hieman erilainen CH2:n sekvenssi ja sille oli tunnusomaista hyvin pitkä sarana, jota välittömästi edeltää vaihtele-20 va domeeni. Tällä sarana-alueella on 3 kysteiiniä sen C-terminaalisessa päässä, sekvenssissä, joka on homolo-. ginen y3-saranan kanssa. Tämä toinen kloonien sarja voisi edustaa IgG2 alaluokkaa. γ3:η muuttumattomassa osassa ja myös oletetussa y2:ssa ovat useimmat kloonit : 25 identtisiä, osoittaen y2:lle tai y3:lle spesifisiä ‘ .* sekvenssejä. Kuitenkin muutamissa klooneissa, kuten : * #72/1:ssä, on pieniä eroja. Esimerkiksi kloonin #72/1 : tapauksessa havaitaan kaksi nukleotidieroa.

Nyt on sekvensoitu kokonaan tai osittain usei-h 30 ta VHH-alueen cDNA'ita, poikkeuksena N-terminaalisen pään lyhyt alue, joka on johdettu primeeristä.

Translaatiossa enemmistö osoittaa karakteris- » *! tisia raskaan ketjun Ser2i Cys22 ja Tyr90 Tyr9i Cys92 sek- * '”· venssejä, VnH-alueen sisäisen disulf idisillan yhdis- 35 täessä jäännöksiä 22 ja 92. Näillä kaikilla klooneilla on sellainen sekvenssi, joka vastaa vaihtelevan alueen 115462 48 rungon 4 (FR4) jäännöksiä ja joka edeltää välittömästi oletettua saranasekvenssiä (Taulukko 3) . J minigeenit synnyttävät tämän sekvenssin ja se on useimmissa tapauksissa samanlainen kuin ihmis- ja muriini- J mini-5 geenejä koodaava sekvenssi. Sekvenssin pituus alueen Cys92 ja VHH-alueiden C-terminaalisen pään välillä vaih-telee ja määritellyssä sekvenssissä se on 25:stä 37:ään aminohappoa, kuten voidaan otaksua vaihtelevan pituisten J ja D minigeenien uudelleenjärjestymisistä.

10 seita tärkeitä kysymyksiä herää näiden raskasketju-Useita immunoglobuliinien pelkästä läsnäolosta ei-patologisessa tilanteessa. Kaikkein ensimmäiseksi, ovatko | ne oikeita (bona fide) vasta-aineita? Raskasketju-im- j munoglobuliinit, jotka on saatu trypanosoomalla infek- j 15 toiduista kameleista, reagoivat suuren parasiitti-anti- I geenien määrän kanssa, kuten on osoitettu näiden esi merkkien osassa I. Tämä merkitsee sitä, että kamelie-läinten immunosysteemi synnyttää laajan joukon sitomis-kohtia, jotka koostuvat yksittäisistä Vim-domeeneista. 20 Tämän varmentaa PCR:lla saatu raskasketju-immunoglobuliinien VHH-alueiden monimuotoisuus.

Toinen kysymys on "miten niitä eritetään?".

‘ _* Normaaleissa olosuhteissa ei esiinny sellaisten im- ' munoglobuliinien raskaiden ketjujen erittymistä, jotka : *· 25 muodostavat neljäketjuiset malli-immunoglobuliinit.

> 1 ♦

Chaperon-proteiini, raskasketjujen sitova proteiini tai i » l ' j BIP-proteiini estää raskaiden ketjujen erittymisen.

Erittymistä voi tapahtua vain silloin kun kevyt ketju syrjäyttää BIP-proteiinin endoplasmisessa retikulumissa 30 (13) .

,···. Raskasketju-dimeeristä, joka havaitaan ihmisen V tai hiiren seerumissa ns. "raskasketjusairauden" yh- » · teydessä, puuttuvat CHl-domeenit, joiden ajatuksena on antaa suoja BIP-kohdalle (14) . Tämän domeenin puuttues-:*! 35 sa BIP-proteiini ei voi enää sitoa ja estää raskaiden ... ketjujen siirtämistä.

t I t 115462 49

IgGl-luokan, joka koostuu raskaista ja kevyistä ketjuista, läsnäolo kameleissa niin, että ne muodostavat 25%-50% kokonais IgG-molekyylien määrästä herättää myös kysymyksen, miten kypsyminen ja luokan valinta 5 tapahtuu ja mikä rooli kevyellä ketjulla on. Kame-lieläinten kevyt ketju vaikuttaa epätavallisen suurelta ja heterogeeniseltä SDS PAGE:11a tutkittaessa.

Eristetyn domeenin suurin dimensio on 40 Ä ja konventionaalisessa IgGrssä, jossa on CH1 ja Vhh/ 10 (2Vhh+2Ch1) , tulee saavutettavissa oleva väli sitomisko- htien välillä olemaan maksimissaan luokkaa 160 Ä (19). Cul-domeenin deleetiosta niissä kahdentyyppisissä vasta-aineissa, joista puuttuvat kevyet ketjut ja joita on jo sekvensoitu, on tuloksena tämän maksimivälin muuttu-15 minen (kuva 6). IgG3:ssa tulee äärietäisyys Vhh- alueiden äärimmäisten kohtien välillä olemaan luokkaa 80 Ä (2Vhh) . Tämä voisi olla vakava rajoitus agglutinaatiol- le ja ristiinsitomiselle. IgG2:ssa tätä kompensoi ää- 20 rimmäisen pitkä saranajakso, joka koostuu 12- kertaisesta sekvenssin Pro-X (missä X on Gin, Lys tai . Glu) toistosta ja joka sijaitsee N-terminaaliin päin • · · saranan disulfidisilloista. Sitä vastoin ihmisen • ·

IgG3:ssa erittäin pitkä sarana, joka myös ilmeisesti : " 25 syntyy sekvenssiduplikaation tuloksena, ei myötävaikuta ‘ .* kahden sitomiskohdan välimatkan kasvuun, koska tässä * · saranassa on disulfidisiltojen myötä vaihtelua.

.* Yksittäinen VHH-domeeni voisi myös luultavasti sallia sitomiskohdan merkittävän kiertovapauden Fc-j. 3 0 domeenia vastaan.

.Toisin kuin myelooman raskaat ketjut, jotka *’ ovat luultavasti tulosta ChI deleetiosta yhdessä vasta- * * i « ainetta tuottavassa solussa tai raskasketju-vasta-ai-"·”· neet, jotka on tuotettu ekspressiokloonauksella (15) ; 35 kamelieläinten raskasketju-vasta-aineet (kevyet ketjut puuttuvat) ovat syntyneet normaalissa immunologisessa 115462 50 ympäristössä ja otaksutaan, että ne ovat käyneet läpi selektiivisen spesifisyys- ja affiniteettijalostuksen, joka liittyy B-solujen kypsymiseen.

5 Kamelin Vhh21 -proteiinin (kuvassa 7 DR21) ekspressio ja puhdistaminen E.coli'sta

Kloonit voidaan ekspressoida useamman tyyppisissä ekspressiovektoreissa. Esimerkiksi käyttäen kau-10 pallisesti saatavaa vektoria Immuno PBS (Huse et ai: Science (1989) 246, 1275) kloonit, jotka on tuotettu

Bluescript® :ssä edellä kuvatun menettelytavan mukaisesti, on saatu PCR:llä käyttäen samaa XhoI:n sisältä-| vää 5'-primeeriä ja uutta 3'-primeeriä, joka vastaa

15 jäännöksiä 113-103 immunoglobuliinien rungossa ja jossa Spe-kohta on konstruoitu: TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG

GTG ACC TG. Tämä menettelytapa salli VroT-n kloonauksen Immuno PBS-vektorin Xho/Spe-kohdassa. Geenin 3'-pää ei kuitenkaan ollut vaiheistuksessa identifiointi-"tag":in 20 ja vektorin lopetuskodonin kanssa. Tämän aikaansaamiseksi rakenne leikattiin Spe:llä ja 4:n emäksen ul-; konemat täytettiin käyttäen K1enow-fragmenttia, minkä jälkeen vektori yhdistettiin uudelleen.

« ·

Ekspressiovektori plasmidi ipBS (immunopBS) (Strata- • ’ 25 cyte) sisältää pel B leader-sekvenssin, jota käytetään • i ' immunoglobuliiniketjun ekspressioon E.coli1ssa promoot- : tori pLAC:n kontrollin alaisuudessa, ribosomin sitomis- : kohdan ja lopetuskodonit. Lisäksi se sisältää sekvens sin c-terminaaliselle dekapeptidi tag'lie. k 30 - E.coli JM101:ä, jossa ipBS-VHH21-plasmidi on, kasva tettiin 1 l:ssa TB-elatusainetta, jossa on 100 pg/ml ampisilliiniä ja 0.1 % glukoosia 32°C:ssa. Ekspressio '> indusoitiin lisäämällä ImM IPTG (loppupitoisuus) • OD550:n ollessa 1.0. 28°C:ssa tapahtuneen yön yli kes- 35 täneen induktion jälkeen solut otettiin talteen sentri-fugoinnilla 4.000 g 10 min ajan (4°C) ja suspendoitiin 51 115462 uudelleen 10 ml:aan TES-puskuria (0.2 M Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M sakkaroosi). Suspensiota pidettiin jäissä 2 tunnin ajan. Periplasmiset proteiinit poistettiin osmoottista sokkia käyttäen lisäämällä 20 5 ml TES-puskuria laimennettuna 1:4 v/v vedellä, pidettiin jäissä yhden tunnin ajan ja sentrifugoitiin seu-raavaksi 12.000 g 30 min ajan 4°C:ssa. Supernatantin periplasminen fraktio dialysoitiin Tris-HCl:a vastaan, pH 8.8, NaCl 50mM, asetettiin nopeaan Q Sepharose vir-10 tauskolonniin (Pharmacia), pestiin edellä mainitulla puskurilla ensin ja eluoitiin NaCl:11a puskurissa lineaarisella gradientilla 50mM:sta 1 M:een .

Fraktiot, jotka sisälsivät VHH-proteiinin, puhdistettiin edelleen Superdex 75 kolonnissa (Pharma-15 cia) tasapainoitettuna PBS-puskurilla (0.01 M fosfaatti pH 7.2, 0.15 M NaCl). Puhdistetun VHH-proteiinin saan to vaihtelee 2:sta 5 mg/l:aan soluviljelmää.

Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla (I). Positiivinen identifiointi kamelin Vhh vasta-ainefragmentista 20 tehtiin Wester Blot -analyysillä käyttäen vasta-ainetta, joka on muodostettu kaneissa puhdistettua kamelin IgGH3:a vastaan ja anti-kani IgG-alkaalinen fosfataasi · kojugaattia. (II).

i# Proteiinistandardeina käytettiin (Pharmacia) 25 periplasmisia proteiineja, jotka on valmistettu * 1 ml:sta IPTG-indusoitua JM10l/ipBS VHH21:a. Kuvassa 8 • esitetään: C,D: fraktiot nopeasta S Sepharose-kolonni ; kromatografiästä (C:Eluoitu 650mM NaCl:11a D:Eluoitu 700mM NaCl:11a) E,F: fraktiot Superdex 75 kolonni kro-3 0 matograf iästä.

Kuten voidaan nähdä, suurimmat epäpuhtaudet eliminoidaan ioninvaihtokromatografiällä ja jäännösepä-: puhtauksista pääosa eliminoidaan geelisuodatuksella.

i • » 115462 52 •Ή

4J

I I I I I I I

0 I I I I I I I u Λ 0) ο e r~ftftftftftftft 3 «"* g.

X ft 05 E E H ~ c .

0 o u o tt o5 e; 5<tj X W CO CO W W W llil -S“ H m HHHHWHH III* ^ -Q c ta n oi tn s S S J S S o a) p J P P p J P w w w w g1" c β P> > > > E-< E E» JQHW g ® qqqqqqp ai a: a 1¾ *5 « * « « « XWCOCQ .S' e η

vDbbOiOiQjfii&i ft ft ft ft | C

cn ε <d *5 X X * X *5 * l< ft ft ft JS -3 6

Di Oi Di h Ρι ft J J J P

Pi Pi Pi Qi Pi Pi Pi Ε-» E-· E-· E-· rt e o £ ® j EbbCuhftibb ^ ^ ajs

I *^ . > «J

>>>HPJP >>>> Π3

R +J

pi Pi h Pi h h ft Ο Ο Ο Ο ·η ί§ >>>>>>> ft ft ft ft Crt ,: co co w w w w m w w w w a. Oi Oi cp ft ft ft 05 ai « ai $ ” ' o I £ SOOOOOCDO ^ ft ft ft ” kj * 00000*0 co a a a a . c X -ί,®

ft ft ft P P < ,J Ο Ό Ό Ό O -J

j j p J P > ft "TTS χ χ x x NJ§ ί 'Jhn u PJ ns 1 I I . I I I o 1 1 ' ' Ή 0) 6

, iH W

.. 0) I — : e c r- *Q «Ζ- : -3 Ä 3 * ^Z σ\ ·* υ r" -*- — tj-cn "T cn c oo : oo — )>- o)ccn . ___ r— t— i -I , Γ2 w -n^ ?- *: *T 4fc ^5r)

» I—I lB *H fB

, - (Ö O

c -hS^ o c -p -p .Η -Η -Η ·Η 01 Ί Ϊ = * H (0 Φ

HdCCC ^ .5 CJ * 6 H

ΦΟΟΟ-Η 5 e \ 3 m M4J

öOOOEcm 5 2 γμ r-id)CaJ

§ ,S r4 ^ Λ = 5 5,? 3-P0JX1 «hu m I vi m * E-* 2 -P « 53 1 1 5462 fd •n

yj G

w M -h

Γ] M C

E M_ -H

> >= >1

I I <11 -P

in •ff -P

r- sc i-t .H p .h -r — — rN ·^ g r5r5r5r5r5r5®£ m r-· Γ" r" r- r- r- c g ^ * g £ 0

^QCOOCQCQWCQCQ U+J

' <β q) ^CO&H^CU «£<£< £ | I 1-1 uoououoo w+j cococococowcora J§ a Η>Η>Ό<&< 3-h w HC<HEh&h<< -h® <0 uuuuouuu ti m ® jj COCOCOCQCQCOCQW >^t c :®

ij lJ ij Φ J

£ PS g Eh PS PC Pi Λ φ §*

3 H

CO CO CO CO CO CO CO CO h® u o o o o e» o o £Ä ; .: O O ϋ O CD O e? O § xj Εη&ηΟΛ*! <CUÖ< w® * » *H ^ σσσσσυασ ** !··. >>H>>>>> cc CO CO CO CO CO CO ,J «-3 M· J ’ * Φ w *;:, Ξϋϋουσϋοϋ y 3 '.’ * 2 Jj; oouoouaa O ϋ O *s g ... w ·> «tf ;:: w co co *1 : : 2 >1 *: < h j φ ä , ·, ; J§ Ή *. : > > J 5 * J j σ ”5 .

:·. O « > 0M=* • “ -¾ > r-t

... > H M · «J

—--^ ^ w 3 -H rd

• * i—I M S

___Q H 3 h i-i nq.q.apqoC eq.sx jesiutJd <d -h nj PÄÄ 54 1 1 5462

Runko 4 J geenit

Ihminen W G Q G T L V Τ V S S Jl, J4, J5 WGRGTLVTVSS J2 WGQGTTVTVSS J6 WGQGTMVTVSS J3

Hiiri WGQGTTLTVSS Jl WGQGTLVTVSS J2 WGQGTSVTVSA J3 WGAGTTVTVSS J4 cDNA-kloonit

Kameli WGQGTQVTVS S Kloonit WGQGTQVTVSS #72/19 = #72/3 WGQGTLVTVSS 1 K1ooni W G R G T Q V Τ V S S #72/24 WGQGTHVTVSS #72/21 WGQGI QVTASS #72/16

I I

! Taulukko 3: Eräiden rungon 4 jäännösten, joita esiintyy * kameli-VHH-alueella vertailu sellaisten rungon 4 jäännö-·· sten kanssa, jotka vastaavat ihmisen ja hiiren J mini-: geenien konsensusaluetta.

5 55 11546 2 -u α> 3 r—ί ro Ή φ 1 ΙΛ 4-1 *- W X i c : ta 5 (1) c ι 5 - ^ % S 1 I C 5 m 3 * X -U Λ > <0 -Η ' ^ Μ •Η φ '-Η ®

S

tn tnJwwwwwtntntntnMwmwntntn M tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn > >>>>>>><<>>>>>>>>> i >>>>>>>>>>>>>>>>>> j3 $

η σσσσσσσασσσοσισασσ -¾ +J

Ο ΟΟΰυΟϋΟϋΰΰΰΰΰΰΟΟΟΟ jj; jjj < m σσασσσσσσαααοιακαοΐΡι ^ 0 ° 0013000000000000000 § ^ ^ ο ή uoxsauzzzxQzh^zzQs: >» 3 0 1-1 1 H IIIIIIXIIIIIIIXXII 3 II IIIIII<IIIIIII<<OII £4 11 iiiiii(KixiaEii>4fa.aii 11 iiiiiiHiaioii<e4U<i <- • ΐ iti : il 1 ι 1 ι ι ι κ ι tn ι b· 1 ι 0 os u ι ι u <0 6,a: iiiiiiHiiitnii>&40ii ^ ** i-r^iixiit<ttnioiitn<>i« 1 t 0 00 1 -h iixiifa-JiwioiiiJiJtnii

<U

X£ I I Z I I XH2<3XH I lbS(4S I I 3 s * Ή I O' I I »SUb<U<Ufi:HOiX(4X<Pi I I <0 i«m xiauJosatnMao-E-izaJii o > n χ : ιοί (j ι Jw>JhKahx<£czaKt3 ι i cc o o I Ό xXM0e.O<Utn<30ii-iiJQ<Hltn o I O t3a<OtJ<Q<CDH3:E42JQO I u

,!; IJZ UtOUQUUUZ3tflHUUXUU<S£ I

in xMa,ouu<e:cuxQ.xo2<UiJo H

; tno tja!u<whUHwx£Zxoi3ZZ< -h

> · Ο -H

WH (JDJHJSZKWHxxjuzzuh o o<rscnoxwQb.(nuti.uj<wHfl<Q< > ou<xnZHZZB.a.o)Hjh2>x 1-1 >i jMauJ2JznQM«waJuww c

·· 3 -H

a m < > > u. u a a a o < a h h z a a a > c r-i ; σι —1 ’ί <u • · Eg r^nvjop'eooxOrHTrtnr'O' X nj

r-<r4«-t<SnWCar*tMl>l (-4 X

56 1 1 5462 pj g* : • Ώ Si * to w w > h : « £ g· I/JWW fu

Guu· £ w : 10<JW ^ £ fc> > *L ~ I S £ "s H S d“ s 8 :

Isa ||s § g: S S g g g E § : ggg ...____ 3 2; _* e * :3 2 a; "'s'Si'Sl 8 : ?||g :88 8; g g\ Q\ E : - ill W'h B a\a\B ': - ··«--- ^: § % S § B· S'S\g : ^ : g S a. s Ö S S I a 8 : 1 :.ϋ...υ..υ.'· 8g £ S “Sft \B : | U U ra s g a CU g 2S5 gsS m : * S S u s ft ft J...L.........

* w OT 3 S S ww S3 3 3 lii f > > 3 w ίο Sao ^ h g .8 1 i sg a g lii

III s s e "SS

m m « g s i ss • * o r*j rn tu tO H Ή

"§ S 8 g S S

3 2 o o

5 o to to to H

S E- H H I

!r k« tn Im § g IS rt 2 « 'ill· 115462 57 i \ \ sags 2 2 2 2 J" 8 8 i 8

I I I I

.....δΓδΓδ δ δ δ ass a s s . B 8 8 ί a κ i eg I s p § s

<e Q 1 Q I Q Q fid K

! «> 8 \ Si \ ö ϋ 2 w o a 8 g g " " i

I U " 8 I

.....;..........i-vw . s ||| 0] ’ ^ Ή ε

-S

,-h cn -ψ : gj ^ § 1 S iö <0 Λ tj, σ' θ' σ' lii w tn tn αι * -h h ·η ε ε ε ε χ: £ δ δ • M -rj -r-t ·Η 58 115462

VIITTEET

1. Ward, E.S., Gussow, D., Griffits, A.D., Jones, P.T. and Winter G. Nature 341, 544-546 (1989).

2. Ungar-Waron H., Eliase E., Gluckman A. and Trainin Z. Isr. J. Vet. Med., £3, 198-203 (1987).

3. Bajyana Songa E. and Hamers R., Ann. Soc. Beige Med. trop., 68, 233-240 (1988).

4. Edelman G.M., Olins D.E., Gaily J.A. and Zinder N.D., Proc. Nat. Acad. Se., 50, 753 (1963).

5. Franek F. and Nezlin R.S., Biokhimiya, 28, 193 (1963) .

6. Roitt I.M., Brostof J. and Male D.K., Immunology, Gower Med. Pub. London. New-York, p.9.2. (1985).

7. Schiffer M., Girling R.L., Ely K.R. and Edmundson B., Biochemistry, 12, 4620-4631 (1973).

8. Fleischman J.B., Pain R.H. and Porter R.R., Arch.

: ·| Biochem. Biophys, Suppl. 1, 174 (1962).

• 9. Roholt O., Onoue K. and Pressman D. , PNAS 51, 1 7 173-178 (1964).

: j 10· Seligmann M., Mihaesco E., Preud'homme J.L. ,

Danon F. and Brouet J.C., Immunological Rev., 48, 145-167 (1979).

; 11· Henderschot L. , Bole D. , Köhler G. and Kearney J.F., The Journal of Cell Biology, 104, 761-767 .: (1987) .

> » · 12. Henderschot L.M., The Journal of Cell Biology, 111, 829-837 (1990) .

t 115462 59 13. Hamers-Casterman, C., E. Wittouck, W. Van der Loo and R. Hamers, Journal of Immunogenetics, 6, 373-381 (1979).

14. Applied Biosystems - Ethanol Precipitation of Electro Eluted Electrodialysed Sample. Issue n1 27.

15. Maniatis, T. E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1988).

16. Sastry et ai., PNAS, 86, 5728, (1989).

17. Sanger, F. , S. Nicklen and A.R. Coulson, Proc.

Natl. Acad. Sei., U.S.A., 74, 5463-5467 (1977).

18. Kabat E.A., Tai Te Wu, M. Reid-Miller, H.M. Perry and K.S. Gottesman, U.S. Dpt of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987).

19. Valentine, R.c. and N.M. Geen, J.M.B., 22, ( . 615-617 (1967).

» a • a i 1 t 1 I · I · · » 1 a • a a a » · > 1 » a

Claims (33)

115462 60

1. Menetelmä immunoglobuliinin tai sen fragmentin valmistamiseksi, joka on suunnattu määrättyä antigeeniä vastaan, tunnettu siitä, että immunoglobu-5 liini omaa kaksi raskasta polypeptidiketjua, jotka kummatkin polypeptidiketjut omaavat vaihtelevan (VHH)alueen tunnistamaan ja sitomaan yhtä antigeeniä, ja muuttumattoman alueen ja tältä immunoglobuliinilta puuttuessa kaikki normaalit vuorovaikutuskohdat kelo vyille ketjuille, ja jossa prosessiin kuuluu seuraavat vaiheet: - kloonaamalla DNA- tai cDNA-sekvenssit vek-toreihin, jotka koodaavat raskaita polypeptidiketjuja sanotuissa immunoglobuliineissa ja ovat kykenevät 15 tunnistamaan ja sitomaan yhtä tai useampaa antigeeniä, - transformoimalla solut vektoreilla, saatu olosuhteissa jotka mahdollistavat sanottujen raskaiden polypeptidiketjujen ilmenemisen, valitsemalla sopivat immunoglobuliinit 20 viemällä transformoidut solut antigeeni- affiniteettiselektioon, ; ..· - ottamalla talteen vasta-aineet, joilla on haluttu spesifisyys

;' 2. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - • s · , - 25 n e t t u siitä, että immunoglobuliinilta puuttuvat * · « kevyet ketjut. i

,* 3. Vaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, ' tunnettu siitä, että immunoglobuliinilla on muuttumaton alue, josta puuttuu ensimmäinen muuttuma- : 3 0 ton domeeni (ChD .

.,· 4. Jonkin aiemman patenttivaatimuksen mukai- ' : nen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoglobu- t · liinia koodaava DNA tai cDNA -sekvenssi saadaan kame-lieläimeltä. ** 35 5. Jonkin aiemman patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että ensin proka- 115462 61 ryootti- tai eukaryoottisolussa ilmennytetään DNA tai cDNA-sekvenssi, joka koodaa fragmenttia, joka koostuu ainakin kymmenestä aminohappotähteestä vaihtelevilla alueilla raskasta polypeptidiketjua immunoglobuliinis-5 sa, joka omaa kaksi raskasta polypeptidiketjua, jotka kummatkin raskaat ketjut omaavat antigeenille spesifisen sitorniskohdan, sanotun immunoglobuliinin omatessa muuttumattoman alueen, ja tältä immunoglobuliinilta puuttuessa normaalit vuorovaikutuskohdat kevyiden 10 ketjujen kanssa.

5 EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP APELLGGPSVFIFP APELLGGPTVFIFPPKPKDVLSITLTP APELPGGPSVFVFPTKPKDVLSISGRP APELFGGPSVFVFPPKPKDVLSISGRP 10 APELLGGPSVFIFPPKPKDVLSISGRP GQTREPQVYTLA GQTREPQVYTLAPXRLEL GQPREPQVYTLPPSRDEL GQPREPQVYTLPPSREEM 15 GQPREPQVYTLPPSQEEM GGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS 20 GGSEQGGG5LRLSCAISGYTYG GGSVQPGGSLTLSCTVSGATYS GGSVQAGGSLRLSCTGSGFPYS : ·· GGSVQAGGSLRLSCVAGFGTS : GGSVQAGGSLR'LSCVSFSPSS i .. WGQGTQVTVSS ‘ 2 5 WGQGTLVTVSS WGQGAQVTVSS a / WGQGTQVTASS RGQGTQVTVS L · 3 0 a t a 35 115462 66 ja/tai ALQPGGYCGYGX----------CL VSLMDRISQH------------G C VPAHLGPGAI LDLKKY------KY 5 FCYSTAGDGGSGE---------MY ELSGGSCELPLLF---------DY DWKYWTCGAQTGGYF-------GQ RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY QKKDRTRWAEPREW--------NN

6. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottu fragmentti omaa ainakin kymmenen aminohappotähdettä immunoglobuliinin vaihtelevilla alueilla, sanotun fragmentin 15 omatessa aminohappotähteen kohdassa 45 sanottua raskasta ketjua, joka tähde on varattu aminohappo tai kysteiinitähde.

7. Vaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottu fragmentti vastaa 20 immunoglobuliinin polypeptidiä joka muodostaa määrätyn antigeenin sitomiskohdan.

» . : 8. Vaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu fragmentti on : ’ raskaan polypeptidiketjun vaihteleva fragmentti (Vhh) ·

9. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - n e t t u siitä, että DNA- tai cDNA-sekvenssit saadaan : ! eläimiltä, jotka on aiemmin immunisoitu määrätyillä * antigeeneillä.

10 GSRFSSPVGSTSRLES-SDY NY ADPSIYYSILXIEY--------KY DSPCYMPTMPAPPIRDSFGW--DD TSSFYWYCTTAPY---- NV TEIEWYGCNLRTTF--------TR

10. Vaatimuksen 1 tai 9 mukainen menetelmä, ;· 30 tunnettu siitä, että DNA- tai cDNA-sekvenssit saadaan kamelieläimiltä, jotka on aiemmin immunisoitu » määrätyillä antigeeneillä.

"· 11. Vaatimuksen 1, 9 tai 10 mukainen menetel- i - I · * mä, tunnettu siitä, että sanotun raskaan poly- 35 peptidiketjun vaihtelevan alueen aminohapposekvenssi * 115462 62 omaa kohdassa 45 aminohappotähteen, joka on valittu varatuista aminohapoista tai on kysteiinitähde.

12. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaikki tai osa immu- 5 noglobuliinin muuttumattomasta sekvenssistä korvataan kokonaan tai osittain ihmisen vasta-aineen muuttumattomalla sekvenssillä.

13. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat nisäkkään 10 soluja, hyönteisen soluja, ihmisapinasoluja tai kas-visoluj a.

14. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini on heterospesifinen.

15 NQLAGGWYLDPNYWLSVGAY A I RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY DGWTRKEGGIGLPWSVQCEDGYNY DSYPCHLL--------------DV VEYPIADMCS------------RY 20 ja/tai sekvenssi, joka on valittu kuvassa . seitsemän esitetyistä. 1 : *

15. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliinilla tai sen fragmentilla on katalyyttista aktiivisuutta.

16. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini tai 20 sen fragmentti konjugoidaan toksiinin kanssa.

17. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen mene- . : telmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini tai * ♦ sen fragmentti yhdistetään entsyymiin.

18. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen mene- • · , 25 telmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini tai sen fragmentti yhdistetään lääkkeeseen, ί

19. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen mene- • telmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini tai sen fragmentti yhdistetään hormoniin. ;· 30

20. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini tai . sen fragmentti suunnataan biologista molekyyliä vas- t : taan.

> · ‘ 21. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen mene- 35 telmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini tai sen fragmentti suunnataan hapteenia, hiilihydraattia, 115462 63 nukleiinihappoa, solureseptoria tai membraaniproteii-nia vastaan.

22. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoglobuliini tai 5 sen fragmentti suunnataan bakteeria, virusta tai parasiittiä tai niiden antigeeniä vastaan.

23. Menetelmä immunoglobuliinin fragmentti-kirjaston valmistamiseksi, tunnettu siitä, että immunoglobuliini omaa kaksi raskasta polypeptidiket- 10 jua, jotka kummatkin polypeptidiketjut omaavat muuttuvan alueen (VHh) tunnistamaan ja sitomaan antigeeniä, sanotulta immunoglobuliinilta puuttuessa normaalit vuorovaikutusalueet kevyiden ketjujen kanssa, johon menetelmään kuuluu: 15. monistamalla PCR:llä cDNA lymfosyyt- tisoluista, käyttäen immunoglobuliinin raskaan ketjun promoottorissa, johdos- tai kehyssekvenssissä olevaa 5' primeeriä, ja sarana-, Ch2, Ch3 tai 3'-kääntämättömässä kohdassa sanottua Vhh*. ta olevaa 20 3'primeeriä, -kloonaamalla monistettu cDNA vektorissa, : - ottamalla talteen kloonit. I ·

24. Menetelmä 4-ketjuisen immunoglobuliinin tai sen fragmentin modifioimiseksi, joka immunoglobu- i · 25 liini tai sen fragmentti omaa VH-alueen, tunnet-t u siitä että 4-ketjuisen immunoglobuliinin tai sen • fragmentin vaihtelevat alueet osittain korvataan spe- * sifisellä sekvenssillä tai aminohappotähteellä sellaisesta immunoglobuliinista, joka omaa kaksi raskasta ;· 30 polypeptidiketjua, joissa kummassakin polypeptidiket- jussa on vaihteleva alue (VHh) tunnistamaan ja sito- . maan antigeeniä, ja jolla ei ole normaaleja vuorovai- • kutusalueita kevyiden ketjujen kanssa.

* 25. Vaatimuksen 24 mukainen menetelmä, ,, 35 tunnettu siitä että aminohappotähde kohdassa 45 vaihtelevaa aluetta 4-ketjuisessa immunoglobuliinissa 115462 64 korvataan vastaavalla tähteellä immunoglobuliinia, joka omaa kaksi raskasta polypeptidiketjua, jotka kummatkin polypeptidiketjut omaavat vaihtelevan (Vhh) alueen tunnistamaan ja sitomaan antigeeniä, ja jolla 5 ei ole normaalia vuorovaikutusaluetta kevyiden ketjujen kanssa.

26. Vaatimuksen 24 tai 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että tähde kohdassa 45 vaihtele-vaa aluetta 4-ketjuisessa immunoglobuliinissa on valo rattu-aminohappotähde tai kysteiinitähde.

27. Jonkin vaatimuksesta 24-26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että modifioitu fragmentti omaa VH-alueen ja on liukoisempi kuin vastaava ei-modifioitu fragmentti.

28. Jonkin vaatimuksista 24-26 mukainen mene telmä, tunnettu siitä että modifioitu fragmentti omaa VH-alueen ja ei omaa normaaleja kevyen ketjun vuorovaikutuskohtia.

29. Jonkin vaatimuksista 24-28 mukainen mene- 20 telmä, tunnettu siitä että 4-ketjuisen immuno- globuliinin fragmentti valitaan joukosta: Fab, F(ab)2, : F (ab')2, Fabc, Fd, Fv, muuttuvat fragmentit, erityi- » a sesti VH-fragmentit.

30. Nukleotidisekvenssi tunnettu siitä, 25 että se koodaa immunoglobuliiniä, joka käsittää kaksi raskasta polypeptidiketjua, jotka riittävät täydelli-i seen antigeeniä sitovan kohdan tai useampien anti- : geenejä sitovien kohtien muodostamiseen, tämän immuno- globuliinin ollessa edelleen vailla kevyitä polypepti--· 30 diketjuja, jotka immunoglobuliinit käsittävät pepti- disekvenssin, joka on valittu seuraavista: t f I % • a « · ’ · 65 115462 VTVSSGTNEVCKCPKCPAPELPGGPSWFWFP, VTVSSEPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCPAPELLGGPSVFIFP GTNEVCKCPKCP APELPGGPSVFVFP

31. Yhdistelmävektori tunnettu siitä, ’ että se käsittää vaatimuksen 30 mukaisen nukleotidise- '* ’’ 25 kvenssin ja että se on plasmidi, faagi, erityisesti bakteriofaagi, virus, YAC, kosmidi.

· 32. Yhdistelmäsolu tai organismi lukuun otta- : ; : matta ihmistä tunnettu siitä, että se modifioi daan vaatimuksen 31 mukaisella vektorilla.

33. cDNA-kirjasto, joka käsittää nukleoti- disekvenssit, jotka koodaavat raskasketjuimmunoglobu- i liinia tunnettu siitä, että kirjasto on saatu » suorittamalla seuraavat vaiheet: ,* - monistamalla PCR:llä cDNA lymfosyyt- 35 tisoluista, käyttäen immunoglobuliinin raskaan ketjun ·, promoottorissa, johdos- tai kehyssekvenssissä olevaa 115462 67 5' primeeriä, ja sarana-, CH2, Ch3 tai 3'-kääntämättömässä kohdassa sanottua VHh ta olevaa 3"primeeriä, -kloonaamalla monistettu cDNA vektorissa, 5 -ottamalla talteen klooni. » * » 115462 68