CN101084015B - 组氨酸-醋酸盐缓冲液中的抗体制剂 - Google Patents

组氨酸-醋酸盐缓冲液中的抗体制剂 Download PDF

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Abstract

本申请描述了抗体制剂，其包含在组氨酸-醋酸盐缓冲液中配制的单克隆抗体，以及包含结合HER2的结构域II的抗体(例如，Pertuzumab)的制剂，和包含结合DR5的抗体(例如，Apomab)的制剂。

Description

组氨酸-醋酸盐缓冲液中的抗体制剂
这是按照37CFR1.53(b)提交的非临时性申请，要求2004年10月20日提交的临时申请60/620,413的优先权，将其内容并入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及抗体制剂，包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液中配制的单克隆抗体，以及包含结合HER2的结构域II的抗体的制剂(例如，Pertuzumab)，和包含结合DR5的抗体的制剂(例如，Apomab)。
背景技术
在过去十年中，生物技术的进步已经使得有可能利用重组DNA技术生产多种蛋白质进行药物应用。因为蛋白质比传统有机和无机药物更大和更复杂(即除了复杂的三维结构之外还具有多个官能团)，这些蛋白质的制剂形成了特殊的问题。为了使蛋白质保留生物学活性，制剂必须保持蛋白质氨基酸至少核心序列的构象完整性完好无损，同时保护蛋白质的多个官能团不受降解。蛋白质的降解途径可以包括化学不稳定性(即涉及通过键的形成或剪切修饰蛋白质的任何过程，其致成新的化学实体)或物理不稳定性(即蛋白质较高次序结构的改变)。化学不稳定性可以由脱酰胺作用，外消旋作用，水解，氧化作用，β消除或二硫化物交换产生。物理不稳定性可以例如由变性，聚集，沉淀或吸附作用产生。三种最常见的蛋白质降解途径为蛋白质聚集，脱酰胺作用和氧化作用。Cleland等人Critical Reviews in TherapeutcDrug Carrier Systems 10(4)：307-377(1993)。
抗体制剂
用于药物应用的蛋白质包括抗体。可用于治疗的抗体的例子为结合HER2抗原的抗体，如Pertuzumab。
美国专利号6,339,142描述了HER2抗体组合物，包括抗HER2抗体及其一种或多种酸性变体的混合物，其中酸性变体的量少于大约25％。Trastuzumab是例示性的HER2抗体。
美国专利号6,267,958和6,685,940(Andya等人)描述了冻干的抗体制剂，包括HER2和IgE抗体制剂。WO97/04807和US 2004/0197326A1(Fick等人)描述了用IgE抗体治疗过敏性哮喘的方法。WO99/01556(Lowman等人)涉及具有倾于异构化作用的天冬酰胺(aspartyl)残基的IgE抗体，及其改进的变体。US 2002/0045571(Liu等人)提供了粘性降低的浓缩型蛋白质制剂，例示为人源化IgE抗体制剂，rhuMAb E25和E26。WO 02/096457和US2004/0170623(Arvinte等人)描述了包含抗IgE抗体E25的稳定的液体制剂。还参见涉及高浓度抗IgE制剂的US 2004/0197324 A1(Liu和Shire)。
美国专利号6,171,586(Lam等人)描述了稳定的水性抗体制剂。F(ab’)2rhuMAb CD18抗体配制在醋酸钠和组氨酸-HCl缓冲液中。rhuMAb CD18的优选制剂为10mM醋酸钠，8％海藻糖，0.01％TWEEN20TM，pH5.0。于40℃保存一个月的rhuMAb CD20的醋酸盐(pH5.0)制剂比在组氨酸中配制的那些样品(pH5.0或6.0)显示更大的稳定性。
US 2003/0190316(Kakuta等人)涉及配制的抗体hPM-1，其为人源化IL-6受体抗体。单体损失在柠檬酸钠(pH6.7)中最大，接下来为磷酸钠(pH6.8)，Tris-HCl(pH7.2)，组氨酸-HCl(pH7.2)和甘氨酸(pH7.6)，依次递减。评估了磷酸钠(pH6.5)，磷酸盐-His(pH6.0或6.5)，His-HCl(pH6.5)，和磷酸钠(pH6.0)对hPM-1稳定性的影响。
WO2004/071439(Burke等人)指出在natalizumab(抗α4整联蛋白人源化单克隆抗体)制剂中由聚山梨醇酯80的降解导致杂质增多，这显然是通过涉及金属离子和组氨酸的氧化反应造成的。因而，选择磷酸盐缓冲液。
WO2000/066160(英文对应文本EP1174148A1)(Okada等人)涉及在磷酸钠或柠檬酸钠缓冲液中结合人血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa的纤维蛋白原受体的人源化C4G1抗体的制剂。
WO2004/019861(Johnson等人)涉及CDP870，一种聚乙二醇化的抗TNFαFab片段，其在50mM醋酸钠(pH5.5)和125mM氯化钠中以200mg/ml配制。
WO2004/004639(Nesta，P)涉及huC242-DM1一种肿瘤-激活的免疫毒素在50mM琥珀酸缓冲液(pH6.0)和蔗糖(5％w/v)中的制剂。
WO03/039485(Kaisheva等人)发现Daclizumab(人源化IL-2受体抗体)在琥珀酸钠缓冲液pH6.0中具有最高的稳定性，并且在组氨酸中随着缓冲液被氧化而迅速丧失效力。
WO 2004/001007涉及在组氨酸HCl，醋酸钠或柠檬酸钠缓冲液中的CD80单克隆抗体。
美国专利号6,252,055(Relton，J.)涉及在马来酸盐，琥珀酸盐，醋酸钠或磷酸盐缓冲液中配制的抗CD4和抗CD23抗体，而磷酸盐被鉴定为优选的缓冲液。
美国专利号5,608,038(Eibl等人)涉及高度浓缩的多克隆免疫球蛋白制品，其中具有免疫球蛋白，葡萄糖或蔗糖，以及氯化钠。
WO03/015894(Oliver等人)涉及100mg/mL
Figure S05843463520070620D000031
25mM组氨酸-HCl，1.6mM甘氨酸，pH6.0，和冻干的的水性制剂，所述
Figure S05843463520070620D000033
在配制时(冻干之前)包含25mM组氨酸，1.6mM甘氨酸和3％w/v甘露醇pH6.0。
US 2004/0191243A1(Chen等人)报道了一种人IgG2抗体ABX-IL8的制剂。
US 2003/0113316A1(Kaisheva等人)涉及一种冻干的抗IL2受体抗体制剂。
HER2抗体
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长，分化和存活重要的调节剂。该受体家族包括四个不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR，ErbB1，或HER1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因编码的EGFR与人恶性肿瘤的病因有关。具体地，在乳腺、膀胱、肺、头、颈和胃癌以及胶质母细胞瘤中已经观察到EGFR表达的提高。EGFR受体表达提高通常与相同肿瘤细胞产生的EGFR配体，转化生长因子α(TGF-α)，增多相关联，其导致通过自分泌刺激途径激活受体。Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.64：127-154(1994)。在这些恶性肿瘤的治疗中已经将抗EGFR或其配体TGF-α和EGF的单克隆抗体评估为治疗剂。参见，例如，Baselga and Mendelsohn.，同上；Masui等人Cancer Research44：1002-1007(1984)；和Wu等人J.Clin.Invest.95：1897-1905(1995)。
HER家族的第二个成员，p185neu，最初被鉴定为来自化学处理大鼠的神经母细胞瘤的转化型基因的产物。neu原癌基因的激活形式通过所编码蛋白质的跨膜区中的点突变(缬氨酸到谷氨酸)产生。在乳房和卵巢癌中观察到neu人同系物的扩增并且与预后不良相关联(Slamon等人，Science，235：177-182(1987)；Slamon等人，Science，244：707-712(1989)；和美国专利号4,968,603)。到目前为止，对于人肿瘤未曾报道过与Neu原癌基因中的点突变类似的点突变。HER2的过表达(经常但并非一律由于基因扩增)在其它癌中也曾观察到，包括胃，子宫内膜，唾腺，肺，肾，结肠，甲状腺，胰腺和膀胱的癌。参见，King等人，Science，229：974(1985)；Yokota等人，Lancet：1：765-767(1986)；Fukushige等人，Mol Cell Biol.，6：955-958(1986)；Guerin等人，Oncogene Res.，3：21-31(1988)；Cohen等人，Oncogene，4：81-88(1989)；Yonemura等人，Cancer Res.，51：1034(1991)；Borst等人，Gynecol.Oncol.，38：364(1990)；Weiner等人，Cancer Res.，50：421-425(1990)；Kern等人，Cancer Res.，50：5184(1990)；Park等人，Cancer Res.，49：6605(1989)；Zhau等人，Mol.Carcinog.，3：254-257(1990)；Aasland等人Br.J.Cancer57：358-363(1988)；Williams等Pathobiology59：46-52(1991)；和McCann等人，Cancer，65：88-92(1990)。HER2可以在前列腺癌中过表达(Gu等人Cancer Lett.99：185-9(1996)；Ross等人Hum.Pathol.28：827-33(1997)；Ross等人Cancer 79：2162-70(1997)；和Sadasivan等人J.Urol.150：126-31(1993))。
已经描述过抗大鼠p185neu和人HER2蛋白质产物的抗体。Drebin和同事培育出抗大鼠neu基因产物，p185neu的抗体。参见，例如，Drebin等人，细胞41：695-706(1985)；Myers等人，Meth.Enzym.198：277-290(1991)；和WO94/22478。Drebin等人Oncogene2：273-277(1988)报道与p185neu两个不同区域反应的抗体的混合物带来对于移植入裸小鼠中的neu-转化NIH-3T3细胞的协同抗肿瘤效应。还参见1998年10月20日公布的美国专利5,824,311。
Hudziak等人，Mol.Cell.Biol.9(3)：1165-1172(1989)描述了一组HER2抗体的生成，其利用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3表征。在暴露于所述抗体72小时之后通过单层结晶紫染色来测定SK-BR-3细胞的相对细胞增殖。利用这种测定法，用抑制细胞增殖56％的称作4D5的抗体获得最大抑制。该组中的其它抗体在此测定法中减少细胞增殖的程度较小。进一步发现抗体4D5使得过表达HER2的乳腺肿瘤细胞系对于TNF-α的细胞毒性效应变得敏感。还参见1997年10月14日公开的美国专利号5,677,171。在Hudziak等人中讨论的HER2抗体在以下文献中做进一步表征。Fendly等人CancerResearch 50：1550-1558(1990)；Kotts等人体外26(3)：59A(1990)；Sarup等人Growth Regulation 1：72-82(1991)；Shepard等人J.Clin.Immunol.11(3)：117-127(1991)；Kumar等人Mol.Cell.Biol.11(2)：979-986(1991)；Lewis等人Cancer Immunol.Immunother.37：255-263(1993)；Pietras等人Oncogene9：1829-1838(1994)；Vitetta等人Cancer Research 54：5301-5309(1994)；Sliwkowski等人J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)；Scott等人J.Biol.Chem.266：14300-5(1991)；D′souza等人Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202-7206(1994)；Lewis等人Cancer Resecrch 56：1457-1465(1996)；和Schaefer等人Oncogene 15：1385-1394(1997)。
鼠HER2抗体4D5的重组人源化形式(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，Trastuzumab或美国专利号5,821,337)在临床上对于患有过表达HER2的乳癌的患者有效，所述患者先前已经接受过广泛的抗癌治疗(Baselga等人，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。1998年9月25日Trastuzumab收到食品与药物管理局的销售许可，用于治疗其肿瘤过表达HER2蛋白的患有转移性乳癌的患者。
在Tagliabue等人Int.J.Cancer47：933-937(1991)；McKenzie等人Oncogene 4：543-548(1989)；Maier等人Cancer Res.51：5361-5369(1991)；Bacus等人Molecular Carcinogenesis 3：350-362(1990)；Stancovski等人PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等人Cancer Research 52：2580-2589(1992)；Xu等人Int.J.Cancer 53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等人Cancer Research 52：2771-2776(1992)；Hancock等人Cancer Res.51：4575-4580(1991)；Shawver等人Cancer Res.54：1367-1373(1994)；Arteaga等人Cancer Res.54：3758-3765(1994)；Harwerth等人J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美国专利号5,783,186；和Klapper等人Oncogene14：2099-2109(1997)中描述了具有各种特性的其它HER2抗体。
同源性筛选已经鉴定了两种其它HER受体家族成员；HER3(美国专利号5,183,884和5,480,968以及Kraus等人PNAS(USA)86：9193-9197(1989))和HER4(EP Pat Appln No 599，274；Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1746-1750(1993)；和Plowman等人，Nature，366：473-475(1993))。这些受体都对于至少某些乳癌细胞系都呈现增强的表达。
一般在细胞中发现HER受体的各种组合，并且异源二聚体化作用被认为增强对于多种HER配体的细胞反应的多样性(Earp等人Breast CancerResearch and Treatment35：115-132(1995))。EGFR与六种不同的配体结合；表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGF-α)，双调蛋白(amphiregulin)，肝素结合型表皮生长因子(HB-EGF)，beta细胞蛋白(betacellulin)和上皮调节蛋白(epiregulin)(Groenen等人Growth Factors 11：235-257(1994))。缘自单基因选择性剪切的调蛋白蛋白质家族是HER3和HER4的配体。调蛋白家族包括α，β和γ调蛋白(Holmes等人，Science，256：1205-1210(1992)；美国专利号5,641,869；和Schaefer等人Oncogene15：1385-1394(1997))；neu分化因子(NDFs)，神经胶质生长因子(GGFs)；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)；和感觉与运动神经元衍生的因子(SMDF)。综述参见Groenen等人Growth Factors11：235-257(1994)；Lemke，G.Molec.& Cell.Neurosci.7：247-262(1996)和Lee等人Pharm.Rev.47：51-85(1995)。最近鉴定了三种另外的HER配体；据报道结合HER3或HER4的神经调节蛋白-2(NRG-2)(Chang等人Nature 387509-512(1997)；and Carraway等人Nature387：512-516(1997))；结合HER4的神经调节蛋白-3(Zhang等人PNAS(USA)94(18)：9562-7(1997))；和结合HER4的神经调节蛋白-4(Harari等人Oncogene 18：2681-89(1999))。HB-EGF，beta细胞蛋白和上皮调节蛋白也结合HER4。
尽管EGF和TGFα并不结合HER2，EGF刺激EGFR和HER2形成异源二聚体，其激活EGFR并导致HER2在异源二聚体中的转磷酸作用。二聚体化作用和/或转磷酸作用似乎激活HER2酪氨酸激酶。参见Earp等人，同上。同样地，当HER3与HER2共表达时，形成活性信号复合物并且抗HER2抗体能够破坏这种复合物(Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.，269(20)：14661-14665(1994))。此外，当与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG)的亲和性提高到较高的亲和性状态。关于HER2-HER3蛋白复合物还参见，Levi等人，Journal of Neuroscience 15：1329-1340(1995)；Morrissey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1431-1435(1995)；和Lewis等人，CancerRes.，56：1457-1465(1996)。HER4，像HER3一样，与HER2形成活性信号复合物(Carraway和Cantley，Cell78：5-8(1994))。
为了靶向HER信号途径，将rhuMAb2C4(Pertuzumab，OMNITARGTM)开发为人源化抗体，其抑制HER2与其它HER受体的二聚体化作用，由此抑制配体驱动的磷酸化作用和激活作用，以及RAS和AKT途径的下游激活作用。在Pertuzumab作为治疗实体肿瘤的单一药剂的I期试验中，用Pertuzumab治疗三名患有晚期卵巢癌的受试者。一名患者有持续的部分反应，而其它受试者病情稳定持续15周，Agus等人Proc Am Soc Clin Oncol 22：192，Abstract 771(2003)。
DR5抗体
本领域已经鉴定了属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的各种配体和受体。这些配体包括肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)，肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)，淋巴毒素-β(“LT-β”)，CD30配体，CD27配体，CD40配体，OX-40配体，4-1BB配体，LIGHT，Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称作Apo2L或TRAIL)，Apo-3配体(也称作TWEAK)，APRIL，OPG配体(也称作RANK配体，ODF，或TRANCE)，和TALL-1(也称作BlyS，BAFF或THANK)(参见，例如，Ashkenazi，Nature Review，2：420-430(2002)；Ashkenazi and Dixit，Science，281：1305-1308(1998)；Ashkenazi andDixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11：255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7：750-753(1997)Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，pages 377-411；Locksley等人，Cell，104：487-501(2001)；Gruss and Dower，Blood，85：3378-3404(1995)；Schmid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：1881(1986)；Dealtry等人，Eur.J.Immunol.，17：689(1987)；Pitti等人，J.Biol.Chem.，271：12687-12690(1996)；Wiley等人，Immunity，3：673-682(1995)；Browning等人，Cell，72：847-856(1993)；Armitage等人Nature，357：80-82(1992)，1997年1月16日公开的WO 97/01633；1997年7月17日公开的WO 97/25428；Marsters等人，Curr.Biol.，8：525-528(1998)；Chicheportiche等人，Biol.Chem.，272：32401-32410(1997)；Hahne等人，J.Exp.Med.，188：1185-1190(1998)；1998年7月2日公开的WO98/28426；1998年10月22日公开的WO98/46751；1998年5月7日公开的WO/98/18921；Moore等人，Science，285：260-263(1999)；Shu等人，J.Leukocyte Biol.，65：680(1999)；Schneider等人，J.Exp.Med.，189：1747-1756(1999)；Mukhopadhyay等人，J.Biol.Chem.，274：15978-15981(1999))。
由这些TNF家族配体介导的各种细胞反应的诱导一般通过它们结合到特异性细胞受体上而起始。某些，但并非全部TNF家族配体通过细胞表面“死亡受体”结合，并诱导各种生物学活性以激活胱天蛋白酶，或执行细胞死亡或凋亡途径的酶(Salvesen等人，细胞，91：443-446(1997))。到目前为止鉴定的TNF受体超家族的成员包括TNFR1，TNFR2，TACI，GITR，CD27，OX-40，CD30，CD40，HVEM，Fas(也称作Apo-1或CD95)，DR4(也称作TRAIL-R1)，DR5(也称作Apo-2或TRAIL-R2)，DcR1，DcR2，osteoprotegerin(OPG)，RANK和Apo-3(也称作DR3或TRAMP)等。
这些TNF受体家族成员的大多数共有细胞表面受体的典型结构，包括细胞外，跨膜和细胞内区域，而其它成员则被发现天然为缺少跨膜和细胞内结构域的可溶性蛋白质。典型TNFRs的细胞外部分包含起始自NH2端的多重半胱氨酸富集结构域(CRDs)的重复氨基酸序列模式。
几年前称作Apo-2L或TRAIL的配体被鉴定为细胞因子TNF家族的成员(参见，例如，Wiley等人，Immunity，3：673-682(1995)；Pitti等人，J.Biol.Chem.，271：12697-12690(1996)；WO 97/01633；WO 97/25428；公开于1998年6月9日的美国专利5,763,223；公开于2001年9月4日的美国专利6,284,236)。全长天然序列人Apo2L/TRAIL多肽为281个氨基酸长的II型跨膜蛋白质。通过酶学剪切多肽的细胞外区域，一些细胞能够产生天然可溶形式的多肽(Mariani等人，J.Cell.Biol.，137：221-229(1997))。可溶形式的Apo2L/TRAIL结晶研究显示一种类似于TNF和其它相关蛋白质结构的同源三聚体结构(Hymowitz等人，Molec.Cell，4：563-571(1999)；Cha等人，Immunity，11：253-261(1999)；Mongkolsapaya等人，Nature Structural Biology，6：1048(1999)；Hymowitz等人，Biochemistry，39：633-644(2000))。不过，Apo2L/TRAIL，不像其它TNF家族成员，被发现具有独特的结构特征，其中三个半胱氨酸残基(同源三聚体每个亚基的位置230上)一起与锌原子配位，并且锌结合对于三聚体稳定性和生物学活性是重要的(Hymowitz等人，同上；Bodmer等人，J.Biol.Chem.，275：20632-20637(2000))。
在文献中已经报道Apo2L/TRAIL可以在免疫系统调节中发挥作用，包括在自身免疫疾病如风湿性关节炎中(参见，例如，Thomas等人，J.Immunol.，161：2195-2200(1998)；Johnsen等人，细胞因子，11：664-672(1999)；Griffith等人，J.Exp.Med.，189：1343-1353(1999)；Song等人，J.Exp.Med.，191：1095-1103(2000))。
已经报道Apo2L/TRAIL的可溶形式在许多癌细胞中诱导凋亡，包括结肠，肺，乳房，前列腺，膀胱，肾，卵巢和脑的肿瘤，以及黑素瘤，白血病，和多发性骨髓瘤(参见，例如，Wiley等人，同上；Pitti等人，同上；公开于2000年2月29日的美国专利6,030,945；公开于2004年6月8日的美国专利6,746,668；Rieger等人，FEBS Letters，427：124-128(1998)；Ashkenazi等人，J.Clin.Invest.，104：155-162(1999)；Walczak等人，Nature Med.，5：157-163(1999)；Keane等人，Cancer Research，59：734-741(1999)；Mizutani等人，Clin.Cancer Res.，5：2605-2612(1999)；Gazitt，Leukemid，13：1817-1824(1999)；Yu等人，Cancer Res.，60：2384-2389(2000)；Chinnaiyan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，97：1754-1759(2000))。鼠肿瘤模型的体内研究进一步提示Apo2L/TRAIL，单独或结合化疗或放疗，能够发挥基本的抗肿瘤作用(参见，例如，Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上；Gliniak等人，Cancer Res.，59：6153-6158(1999)；Chinnaiyan等人，同上；Roth等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，265：1999(1999)；PCT申请US/00/15512；PCT申请US/01/23691)。与许多类型的癌细胞相反，大多数正常的人细胞类型似乎通过某种重组形式的Apo2L/TRAIL耐受凋亡诱导(Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上)。Jo等人报道多组氨酸标记的可溶形式的Apo2L/TRAIL在诱导正常分离的人肝细胞的体外凋亡，但不能诱导非人肝细胞的凋亡(Jo等人，Nature Med.，6：564-567(2000)；还参见，Nagata，Nature Med.，6：502-503(2000))。据信某些重组Apo2L/TRAIL制品对于患病和正常细胞的生化特性和生物学活性可以有所不同，这取决于，例如，标记分子的存在或缺失，锌含量，和三聚体百分比含量(参见，Lawrence等人，Nature Med.，Letter tothe Editor，7：383-385(2001)；Qin等人，Nature Med.，Letter to the Editor，7：385-386(2001))。
已经发现Apo2L/TRAIL结合至少五种不同的受体。结合Apo2L/TRAIL的受体中至少两种包含功能性细胞质死亡结构域。一种这类受体称作“DR4”(和/或称作TR4或TRAIL-R1)(Pan等人，Science，276：111-113(1997)；还参见公开于1998年7月30日的WO98/32856；公开于1999年7月29日的WO99/37684；公开于2000年12月7日的WO 00/73349；公开于2002年8月13日的US 6,433,147；公开于2002年10月8日的US6,461,823，和公开于2002年1月29日的US 6,342,383)。
Apo2L/TRAIL的另一种这类受体称作DR5(或者它还称作Apo-2；TRAIL-R或TRAIL-R2，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER)(参见，例如，Sheridan等人，Science，277：818-821(1997)，Pan等人，Science，277：815-818(1997)，公开于1998年11月19日的WO98/51793；公开于1998年9月24日的WO98/41629；Screaton等人，Curr.Biol.，7：693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，16：5386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17：141-143(1997)；公开于1998年8月20日的WO98/35986；公开于1998年10月14日的EP870，827；公开于1998年10月22日的WO98/46643；公开于1999年1月21日的WO99/02653；公开于1999年1月25日的WO99/09165；公开于1999年3月11日的WO99/11791；公开于2002年8月13日的US 2002/0072091；公开于2001年12月7日的US 2002/0098550；公开于2001年12月6日的US 6,313,269；公开于2001年8月2日的US2001/0010924；公开于2003年7月3日的US 2003/01255540；公开于2002年10月31日的US 2002/0160446，公开于2002年4月25日的US2002/004878；公开于2002年2月的US 6,342,369；公开于2003年5月27日的US 6,569,642，公开于2000年6月6日的US 6,072,047，公开于2003年11月4日的US 6,642,358；公开于2004年6月1日的IS 6,743,625)。像DR4一样，据报道DR5包含细胞质死亡结构域并且能够在配体结合后发出凋亡信号(或经与分子相结合，所述分子如激动剂抗体，其模仿配体的活性)。在Apo-2L/TRAIL和DR5之间形成的复合物的晶体结构描述于Hymowitz等人，Molecular Cell，4：563-571(1999)中。
在配体结合后，DR4和DR5都能够通过称作FADD/Mort1的包含死亡结构域的接头分子，独立地通过募集和激活凋亡起始因子胱天蛋白酶-8而促进凋亡(Kischkel等人，Immunity，12：611-620(2000)；Sprick等人，Immunity，12：599-609(2000)；Bodmer等人，Nature Cell Biol.，2：241-243(2000))。
据报道Apo2L/TRAIL也结合称作DcR1，DcR2和OPG的那些受体，据信它们充当抑制剂，而非信号传导剂(参见，例如，DcR1(也称作TRID，LIT或TRAIL-R3)(Pan等人，Science，276：111-113(1997)；Sheridan等人，Science，277：818-821(1997)；McFarlane等人，J.Biol.Chem.，272：25417-25420(1997)；Schneider等人，FEBS Letters，416：329-334(1997)；Degli-Esposti等人，J.Exp.Med.，186：1165-1170(1997)；和Mongkolsapaya等人，J.Immunol.，160：3-6(1998))；DcR2(也称作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters等人，Curr.Biol.，7：1003-1006(1997)；Pan等人，FEBS Letters，424：41-45(1998)；Degli-Esposti等人，Immunity，7：813-820(1997))，和OPG。与DR4和DR5相反，DcR1和DcR2受体并不发出凋亡信号。
在文献中已经报道了某些结合DR4和/或DR5受体的抗体。例如，在某些哺乳动物细胞中针对DR4受体并且具有激动性或凋亡性活性的抗DR4抗体在，例如，公开于1999年7月29日的WO 99/37684；公开于2000年7月12日的WO 00/73349；公开于2003年8月14日的WO 03/066661中进行了描述。还参见，例如，Griffith等人，J.Immunol.，162：2597-2605(1999)；Chuntharapai等人，J.Immunol.，166：4891-4898(2001)；公开于2002年12月2日的WO 02/097033；公开于2003年5月22日的WO 03/042367；公开于2003年5月8日的WO 03/038043；公开于2003年5月8日的WO03/037913。同样地描述了某些抗DR5抗体，参见，例如，公开于1998年11月8日的WO 98/51793；Griffith等人，J.Immunol.，162：2597-2605(1999)；Ichikawa等人，Nature Med.，7：954-960(2001)；Hylander等人，“An Antibodyto DR5(TRAIL-receptor 2)Suppresses the Growth of Patient DerivedGastrointestinal Tumors Grown in SCID Mouse”，Abstract，2d InternationalCongress on Monoclonal Antibody in Cancers，Aug.29-Sept.1，2002，Banff，Alberta，Canada；公开于2003年5月8日的WO 03/038043；公开于2003年5月8日的WO 03/037913。此外，已经描述了具有对DR4和DR5受体都有交叉反应性的某些抗体(参见，例如，公开于2001年6月26日的美国专利6,252,050)。
发明概述
本发明这里部分涉及，将组氨酸-醋酸盐(histine-acetate)，pH5.5-6.5，鉴定为特别有用的缓冲液，其用于配制单克隆抗体，特别是易于脱酰胺作用(deamidation)和/或聚集(aggregation)的全长IgG1抗体。该制剂阻止其中抗体产品的降解。
因而，在第一方面，本发明涉及一种稳定的药物制剂，其包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液pH5.5-6.5中的单克隆抗体。所述单克隆抗体优选地结合选自HER2，CD20，DR5，BR3，IgE和VEGF的抗原。
此外，本发明涉及治疗受试者疾病或病症的方法，包括向受试者施用有效量的所述制剂以治疗所述疾病或病症。
在另一方面，本发明涉及一种药物制剂，其包括：(a)易于发生脱酰胺作用或聚集的全长IgG1抗体，其量为从大约10mg/mL到大约250mg/mL；(b)组氨酸-醋酸盐缓冲液(histine-acetate buffer)，pH5.5-6.5；(c)选自海藻糖和蔗糖的糖，其量从大约60mM到大约250mM；和(d)聚山梨醇酯20，其量为从大约0.01％到大约0.1％。
本发明还提供降低治疗性单克隆抗体的脱酰胺作用或聚集作用的方法，包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液，pH5.5-6.5中配制所述抗体。
在又一方面，本发明涉及包含抗体，糖和表面活性剂的药物制剂，所述抗体在pH从大约5.5到大约6.5的组氨酸缓冲液中结合HER2的结构域II。
本发明还涉及一种药物制剂，其包含从大约20mg/mL到大约40mg/mL的量的Pertuzumab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，蔗糖，和聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为大约5.5到大约6.5。
本发明还涉及一种药物制剂，其包含在pH从大约5.5到大约6.5的组氨酸缓冲液中的DR5抗体，糖，和表面活性剂。
在另一方面，本发明涉及一种药物制剂，其包含从大约10mg/mL到大约30mg/mL的量的Apomab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，海藻糖，和聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为大约5.5到大约6.5。
在又一方面，本发明提供一种治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者施用有效量的药物制剂以治疗癌症。
本发明还涉及带有可以通过注射器刺穿的塞子的小瓶或不锈钢罐，所述小瓶或罐中包含可选为冻干形式的所述制剂。
另外，本发明提供制备药物制剂的方法，包括：(a)制备单克隆抗体制剂；和(b)评估制剂中单克隆抗体的物理稳定性，化学稳定性，或生物学活性。
附图简述
图1描绘了HER2的细胞外结构域的结构域I-IV(分别为SEQ IDNos.19-22)。
图2A和2B描绘了以下氨基酸序列的比对：鼠单克隆抗体2C4可变轻(VL)(图2A)和可变重(VH)(图2B)链结构域(分别为SEQ ID Nos.1和2)；人源化2C4版本574的VL和VH结构域(分别为SEQ ID Nos.3和4)，以及人VL和VH共有框架(hum κ1，轻kappa亚基I；humIII，重亚基III)(分别为SEQID Nos.5和6)。星号标识在人源化2C4版本574和鼠单克隆抗体2C4之间或在人源化2C4版本574和人框架之间的区别。互补决定区(CDRs)在括号中。
图3A和3B显示Pertuzumab轻链和重链的氨基酸序列(分别为SEQ IDNos.15和16)。CDR以粗体显示。计算的轻链和重链的分子量为23,526.22Da和49,216.56Da(还原形式的半胱氨酸)。糖部分附着于重链的Asn299上。
图4A和4B显示Pertuzumab轻和重链的氨基酸序列，每个都包括完整的氨基末端信号肽序列(分别为SEQ ID Nos.17和18)。
图5图示了2C4在HER2的异源二聚体结合位点上的结合，由此阻止与活化的EGFR或HER3的异源二聚体化作用。
图6描绘了HER2/HER3与MAPK和Akt途径的偶联。
图7比较了Trastuzumab和Pertuzumab的活性。
图8通过离子交换(IEX)分析显示了Pertuzumab制剂的稳定性。
图9通过大小排阻层析(SEC)分析显示了Pertuzumab制剂的稳定性。
图10反映了Pertuzumab在不同的制剂中的物理稳定性。
图11来自Pertuzumab液体制剂的搅动研究(agitation study)。
图12来自Pertuzumab液体制剂的其它搅动研究。
图13来自Pertuzumab制剂的冻-融研究。
图14A和14B显示Trastuzumab轻链(SEQ ID No.13)和重链(SEQ ID No.14)的氨基酸序列。
图15A和15B描绘了变体Pertuzumab轻链序列(SEQ ID No.23)和变体Pertuzumab重链序列(SEQ ID No.24)。
图16A和16B显示了在IgG抗体中普遍观察到的寡糖结构。
图17A和17B显示了特异性抗IgE抗体E25，E26，HAE1和Hu-901折轻和重链的序列(SEQ ID Nos.37-44)。在图17A中，可变轻链结构域在残基111的残基VEIK结束。在图17B中，可变重链结构域在残基120附近的残基VTVSS结束。
图18A是比较鼠2H7(SEQ ID No.25)，人源化2H7v16变体(SEQ ID No.26)，和人kappa轻链亚基I(SEQ ID No.27)中每一种的可变轻结构域(VL)的氨基酸序列的序列比对。2H7和hu2H7v16的VL的CDR如下：CDR1(SEQID No.57)，CDR2(SEQ ID No.58)，和CDR3(SEQ ID No.59)。
图18B是比较鼠2H7(SEQ ID No.28)，人源化2H7v16变体(SEQ ID No.29)，和重链亚基III的人共同序列(SEQ ID No.30)的可变重结构域(VH)的氨基酸序列的序列比对。2H7和hu2H7v16的VH的CDR如下：CDR1(SEQ IDNo.60)，CDR2(SEQ ID No.61)，和CDR3(SEQ ID No.62)。
在图18A和图18B中，每条链中的CDR1，CDR2和CDR3都包括在括号中，侧翼为框架区，表示为FR1-FR4。2H7指鼠2H7抗体。在序列两行之间的星号表示在两条序列之间不同的位置。残基根据Kabat等人Sequences of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991)编号，插入显示为a，b，c，d，和e。
图19描绘了三种不同的VEGF抗体的可变结构域序列，其分别为SEQID Nos.31-36。
图20显示下列Apomab样品的大小排阻层析(SEC)洗脱曲线：(a)对照和制剂，其在(b)pH4.0，(c)pH5.0，(d)pH6.0和(e)pH7.0的条件制备。在分析前将制备的样品保存于40℃2个月。
图21描绘了保存过程中Apomab抗体单体损失的pH速率曲线。在保存过程中于30℃和40℃监测SEC的单体动力学，并计算一级速率常数。
图22提供Apomab样品的离子交换层析(IEC)洗脱曲线如下：(a)对照和制剂，其在(b)pH4.0，(c)pH5.0，(d)pH6.0和(e)pH7.0的条件制备。在分析之前将配制的样品保存于40℃2个月。
图23显示在保存期间IEC主峰损失的pH速率曲线。在保存过程中于30℃和40℃监测IEC的主峰动力学，并计算一级速率常数。
图24显示人Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.45)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID No.46)。核苷酸位置447上的“N”(在SEQ ID No.45中)用来表示核苷酸碱基可以是“T”或“G”。
图25A和25B显示于1998年11月19日在WO 98/51793中公开的人DR5受体(SEQ ID No.47)的411个氨基酸序列，以及编码核苷酸序列(SEQID No.48)。
图26A和26B显示人DR5受体的440个氨基酸序列以及编码核苷酸序列(SEQ ID No.50)，其也于1998年8月20日在WO98/35986中公开。
图27显示Apomab7.3重链氨基酸序列(SEQ ID No.51)。
图28显示Apomab7.3轻链氨基酸序列(SEQ ID No.52)。
图29显示16E2重链(SEQ ID No.53)和Apomab7.3重链(SEQ ID No.51)氨基酸序列的比对。
图30显示16E2轻链(SEQ ID No.54)和Apomab7.3轻链(SEQ ID No.52)氨基酸序列的比对。
图31A和31B描绘了Apomab7.3的可变重链氨基酸序列(图31A；SEQID No.55)和可变轻链氨基酸序列(图31B；SEQ ID No.56)。CDR残基以粗体标识。
图32显示成熟2H7v16和2H7v511轻链(分别为SEQ ID Nos.63和64)的比对。用Kabat可变结构域残基编号方法和Eu恒定结构域残基编号方法显示序列。
图33显示成熟2H7v16和2H7v511重链(分别为SEQ ID Nos.65和66)的比对。用Kabat可变结构域残基编号方法和Eu恒定结构域残基编号方法显示序列。
优选实施方案详述
I.定义
术语“药物制剂”指一种制备物，其形式允许活性成分的生物学活性有效，并且其不包含其它组分，所述其它组分对于将对其施用该制剂的受试者来说具有不可接受的毒性。这些制剂是无菌的。
“无菌(sterile)”制剂是经灭菌的(asceptic)或不含所有活体微生物及其孢子。
在这里，“冷冻”制剂是在0℃以下温度的制剂。一般来说，冷冻制剂不是冻干的，它在之前或之后也未进行冻干。优选地，冷冻制剂包含进行保存的冷冻药物物质(在不锈钢罐中)或冷冻药物产品(在最终的药瓶配置中)。
“稳定的”制剂是这样的制剂，其中的蛋白质在保存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。优选地，该制剂在保存后基本上保持其物理和化学稳定性，以及其生物学活性。一般基于希望的制剂保质期来选择贮存期。用来测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域已有的并且在例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，New York，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.DrugDelivery Rev.10：29-90(1993)中进行了综述。可以在选定的温度下测量稳定性持续选定的时间。优选地，所述制剂在大约40℃稳定至少大约2-4周，和/或在大约5℃和/或15℃稳定至少3个月，和/或在大约-20℃稳定至少3个月或至少1年。另外，所述制剂优选在制剂的冷冻(至，例如，-70℃)和融解后是稳定的，例如在1，2或3个循环的冻融之后。稳定性能够以许多不同的方式进行定性和/或定量地评估，包括评估聚集物形成(例如利用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过肉眼观察)；通过利用阳离子交换层析或毛细管分区电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较减小的和完整的抗体；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估生物学活性或抗体的抗原结合功能；等等。不稳定性可以包括下列的任一种或多种：聚集，脱酰胺作用(例如Asn脱酰胺作用)，氧化作用(例如Met氧化作用)，异构化作用(例如Asp异构化作用)，剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，未配对的半胱氨酸，N-末端延伸，C-末端加工，糖基化作用差异，等等。
本文的“脱酰胺”单克隆抗体是这样一种抗体，其中它的一个或多个天门冬酰胺残基已经被衍生成，例如，天冬氨酸或异-天冬氨酸。
“易于脱酰胺作用”的抗体是这样一种抗体，其包括一个或多个被发现易于发生脱酰胺基的残基。
“易于聚集”的抗体是这样一种抗体，其已经被发现与其它抗体分子一起聚集，特别是在冷冻和/或搅动之后。
“易于片段化”的抗体是这样一种抗体，其已经被发现剪切成两个或多个片段，例如在其铰链区。
“减弱脱酰胺作用，聚集，或片段化”意欲相对于在不同的pH或在不同的缓冲液中配制的单克隆抗体来防止或减少脱酰胺作用，聚集，或片段化的量。
在这里，单克隆抗体的“生物学活性”指该抗体结合抗原并导致可测量生物学反应的能力，所述生物学反应可以在体外或体内进行测量。这种活性可以是拮抗性的(例如当所述抗体为HER2抗体时)或激动性的(例如当所述抗体结合DR5时)。对于Pertuzumab而言，在一个实施方案中，生物学活性指配制的抗体抑制人乳癌细胞系MDA-MB-175-VII增殖的能力。当所述抗体为Apomab时，生物学活性可以指，例如，配制的抗体杀伤结肠癌，Colo205细胞的能力。
“等渗的”意指目标制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗制剂一般将具有从大约250到350mOsm的渗透压。等渗性可以利用例如蒸气压或冰冻型渗压计进行测量。
如本文所用的，“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液优选具有的pH从大约5.0到大约7.0，优选从大约5.5到大约6.5，例如从大约5.8到大约6.2，最优选具有大约6.0的pH。将控制pH在此范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐，琥珀酸盐，琥珀酸盐，葡萄糖酸盐，组氨酸，柠檬酸盐，甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。本文的优选缓冲液是组氨酸缓冲液。
“组氨酸缓冲液”是包括组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸氯化物，组氨酸醋酸盐，组氨酸磷酸盐，组氨酸硫酸盐。发现在本文实施例中鉴定的优选组氨酸缓冲液是组氨酸醋酸盐。在优选的实施方案中，通过用醋酸(液体)滴定L-组氨酸(游离碱，固体)来制备组氨酸醋酸盐缓冲液。优选地，组氨酸缓冲液或组氨酸-醋酸盐缓冲液为pH5.5-6.5，优选地pH5.8-6.2。
本文的“糖”包含常规组合物(CH2O)n及其衍生物，包括单糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，还原性糖，非还原性糖等等。本文的糖的实例包括葡萄糖，蔗糖，海藻糖(trehalose)，乳糖，果糖，麦芽糖，右旋糖苷，甘油，右旋糖苷，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇，sylitol，山梨糖醇，甘露醇，密里二糖(mellibiose)，松三糖(melezitose)，蜜三糖(raffinose)，甘露三糖(mannotriose)，水苏糖(stachyose)，麦芽糖，乳果糖(lactulose)，麦芽酮糖(maltulose)，山梨醇(glucitol)，麦芽糖醇，乳糖醇，异-麦芽酮糖(maltulose)，等等。本文优选的糖是非还原性二糖，如海藻糖或蔗糖。
在本文中，“表面活性剂”指表面活性制剂，优选非离子性表面活性剂。本文的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20和，聚山梨醇酯80)；聚羟亚烃(poloxamer)(例如聚羟亚烃188)；Triton；十二烷基磺酸钠(SDS)；月桂基磺酸钠；辛基糖甙钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-、或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-、柯卡酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、或异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、或异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺；甲基可可酰基钠或甲基油基牛磺酸钠；以及MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，New Jersey)；聚乙二醇，聚丙二醇，和乙烯与丙烯二醇的共聚物(例如Pluronics，PF68等)；等等。本文优选的表面活性剂是聚山梨醇酯20。
“HER受体”是受体蛋白质酪氨酸激酶，它属于HER受体家族，包括EGFR，HER2，HER3和HER4受体以及将来鉴定的此家族的其它成员。HER受体一般将包含细胞外结构域，它可以结合HER配体；亲脂性跨膜结构域；保守性细胞内酪氨酸激酶结构域；和具有几个酪氨酸残基的羧基末端信号结构域，它可以进行磷酸化。优选地HER受体是天然序列人HER受体。
HER2的细胞外结构域包含四个域，结构域I(氨基酸残基从大约1-195)，结构域II(氨基酸残基从大约196-320)，结构域III(氨基酸残基从大约321-488)，和结构域IV(氨基酸残基从大约489-632)(没有信号肽的残基编号)。参见Garrett等人Mol.Cell..11：495-505(2003)，Cho等人Nature421：756-760(2003)，Franklin等人癌细胞5：317-328(2004)，或Plowman等人Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746-1750(1993)。还参见本文的图1。
术语“ErbB1”，“HER1＂，“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可以相互交换使用，并且如例如在Carpenter等人Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中公开的，称作EGFR，包括其自然发生的突变形式(例如Humphrey等人PNAS(USA)87：4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)。erbB1指编码EGFR蛋白质产物的基因。
表述方式“ErbB2”和“HER2”在本文中可以相互交换使用，并且称作人HER2蛋白质，例如，在Semba等人，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto等人Nature 319：230-234(1986)(Genebank编号X03363)中所述。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因而“neu”指编码大鼠p185neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。
“ErbB3”和“HER3”指例如，在美国专利号5,183,884和5,480,968以及Kraus等人PNAS(USA)86：9193-9197(1989)中所公开的受体多肽。
本文的术语“ErbB4”和“HER4”指例如在欧洲专利申请号599,274；Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1746-1750(1993)；和Plowman等人，Nature，366：473-475(1993)中公开的受体多肽，包括其异构体，例如，在公开于1999-04-22的WO99/19488中所披露的。
“HER配体”意指结合和/或激活HER受体的多肽。本文中具体的目标HER配体是天然序列人HER配体如表皮生长因子(EGF)(Savage等人，J.Biol.Chem.247：7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等人，Science 223：1079-1082(1984))；双调蛋白也称作雪旺细胞瘤(schwanoma)或角化细胞自分泌生长因子(Shoyab等人Science 243：1074-1076(1989)；Kimura等人Nature 348：257-260(1990)；和Cook等人Mol.Cell.Biol.11：2547-2557(1991))；β纤维素(Shing等人，Science259：1604-1607(1993)；和Sasada等人Biochem.Biophys.Res.Commun.190：1173(1993))；肝素结合型表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等人，Science 251：936-939(1991))；上皮调节蛋白(epiregulin)(Toyoda等人，J.Biol.Chem.270：7495-7500(1995)；和Komurasaki等人Oncogene 15：2841-2848(1997))；调蛋白(参见下文)；神经调节蛋白-2(NRG-2)(Carraway等人，Nature 387：512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.94：9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari等人Oncogene 18：2681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan等人J.Biol.Chem.272(6)：3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF，TGF-α，双调蛋白，β纤维素，HB-EGF和上皮调节蛋白。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包括β纤维素，上皮调节蛋白，HB-EGF，NRG-2，NRG-3，NRG-4和调蛋白。
当用在本文中时“调蛋白”(HRG)指由在美国专利号5,641,869或Marchionni等人，Nature，362：312-318(1993)中公开的调蛋白基因产物所编码的多肽。调蛋白的实例包括调蛋白-α，调蛋白-β1，调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等人，Science，256：1205-1210(1992)；和美国专利号5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles等人细胞69：205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等人.Cell 72：801-815(1993))；]神经胶质生长因子(GGFs)(Marchionni等人，Nature，362：312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho等人J.Biol.Chem.270：14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等人Oncogene 15：1385-1394(1997))。该术语包括天然序列HRG多肽的生物学活性片段和/或氨基酸序列变体，如其EGF样结构域片段(例如HRGβ1177-244)。
本文的“HER二聚体”是非共价结合的二聚体，包括至少两种不同的HER受体。当表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可以形成这种复合物，并且可以通过免疫沉淀进行分离并通过SDS-PAGE进行分析，如例如Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.，269(20)：14661-14665(1994)所述。这些HER二聚体的实例包括EGFR-HER2，HER2-HER3和HER3-HER4异二聚体。另外，HER二聚体可以包含两个或多个结合不同HER受体，如HER3，HER4或EGFR的HER2受体。其它蛋白质，如细胞因子受体亚基(例如gp130)可以与二聚体相结合。
HER2上的“异二聚体结合位点”，指HER2的细胞外结构域中的区域，在形成二聚体后，它与EGFR，HER3或HER4细胞外结构域中的区域相接触，或相接触。在HER2的结构域II中发现该区。Franklin等人Cancer Cell5：317-328(2004)。
“HER激活”或“HER2激活”指任何一个或多个HER受体，或HER2受体的激活，或磷酸化作用。一般来说，HER激活导致信号转导(例如由HER受体的细胞内激酶结构域引发的信号转导，所述结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基)。HER激活可以通过HER配体与包括目标HER受体的HER二聚体的结合来介导。HER配体结合HER二聚体可以激活二聚体中一个或多个HER受体的激酶结构域并由此导致一个或多个HER受体中酪氨酸残基的磷酸化作用，和/或其它底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化作用，如Akt或MAPK细胞内激酶。
以最宽泛的意义使用本文的术语“抗体”，具体包括全长单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两个全长抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展示所需的生物学活性。
本文中所用的术语“单克隆抗体”指从实质上均一的抗体群获得的抗体，即包含该群体的单个抗体除了可能在单克隆抗体生产过程中发生的变体以外都相同和/或结合相同的表位，这些变体一般以小量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体都针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，其优势还在于它们未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆的”指抗体获自实质上均一的抗体群的特征，不应理解为限定由任何特定方法产生抗体。例如根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等，自然，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA法(如美国专利4,816,567)来制备。“单克隆抗体”还可以用Clackson等，自然，352：624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志，222：581-597(1991)所述技术从噬菌体抗体库中分离。
本文中单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分等同于或同源于源自特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列，而链的其余部分等同于或同源于来自另一种物种的抗体或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列条件是它们展示所需生物学活性(见美国专利4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报，81：6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括“灵长类化(primatized)”抗体，其包含源于非人灵长类可变结构域抗原结合序列(例如Old World Monkey，猿等)和人恒定区序列。
抗体片段”包括全长抗体的一部分，优选包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；二价抗体；线性化抗体；单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。
“全长抗体”是这样一种抗体，其包含抗原-结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域s，CH1，CH2和CH3。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，全长抗体具有一种或多种效应功能。
本文中术语“主要种类抗体”指组合物中的一种抗体结构，其在该组合物中是在量上占优势的抗体分子。在一个实施方案中，主要种类抗体是HER2抗体，如结合HER2结构域II的抗体，比Trastuzumab更有效抑制HER二聚体化作用的抗体，和/或结合HER2的异二聚体结合位点的抗体。本文的主要组分HER2抗体的优选实施方案是这样一种实施方案，其包括SEQID Nos.3和4中的可变轻和可变重氨基酸序列，最优选包括SEQ ID Nos.15和16中的轻链和重链氨基酸序列(Pertuzumab)。
本文中“氨基酸序列变体”抗体是具有不同于主要种类抗体的氨基酸序列的抗体。一般，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少大约70％同源性，优选地，它们至少将与主要种类抗体具有大约80％，更加优选至少大约90％同源性。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列之内或邻近的某些位置上具有取代，删除，和/或添加。本文的氨基酸序列变体的实例包括酸性变体(例如脱酰胺抗体变体)，碱性变体，在其一个或两个轻链上具有氨基末端引导延伸(例如VHS-)的抗体，在其一个或两个重链上具有C-末端赖氨酸残基的抗体，等等，并且包括重和/或轻链氨基酸序列变异的组合。本文的特定目标抗体变体是在其一个或两个轻链上包含氨基末端引导延伸的抗体，任选地进一步包括相对于主要种类抗体的其它氨基酸序列和/或糖基化作用差异。
“治疗性单克隆抗体”是用于治疗人受试者的抗体。本文公开的治疗性单克隆抗体包括：用于癌症和各种非恶性疾病或病症的HER2抗体；用于治疗B细胞恶性瘤，自身免疫疾病，移植物排斥，或阻抑针对外源抗原的免疫反应的CD20或BR3抗体；用于治疗IgE介导的病症的IgE抗体；用于治疗癌症的DR5或VEGF抗体。
本文的“糖基化作用变体”抗体是具有一个或多个糖部分附于其上的抗体，其不同于附于主要种类抗体上的一个或多个糖部分。本文的糖基化作用变体的实例包括具有G1或G2寡糖结构，而非G0寡糖结构附于其Fc区上的抗体，有一个或两个糖部分附于其一个或两个轻链上的抗体，没有糖附于抗体的一个或两个重链上的抗体，等等，以及糖基化作用变化的组合。
当抗体具有Fc区时，可以将寡糖结构如图16所示的结构附于抗体的一个或两个重链上，例如在残基299上(298，残基的Eu编号)。对于Pertuzumab来说，G0是占优势的寡糖结构，在Pertuzumab组合物中发现有较少量的其它寡糖结构如G0-F，G-1，Man5，Man6，G1-1，G1(1-6)，G1(1-3)和G2。
除非另外指定，本文的“G1寡糖结构”包括G-1，G1-1，G1(1-6)和G1(1-3)结构。
本文中“氨基末端引导延伸(amino-terminal leader extension)”指氨基末端引导序列的一个或多个氨基酸残基，其存在于抗体的任何一个或多个重或轻链的氨基末端。例示性的氨基末端引导延伸包含或由存在于抗体变体一条或两条轻链上的三个氨基酸残基，VHS组成。
“同源性”被定义为在比对序列和引入缺口之后氨基酸序列变体残基相同的百分比，如果有必要的话，去实现最大百分比同源性。进行比对的方法和计算机程序是本领域公知的。一种这类计算机程序为“Align2”，其于1991年12月10日在美国版权局，华盛顿区，DC20559以用户文件存档。
抗体“效应功能”指那些可归结于抗体Fc区的生物学活性(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)。“效应功能”的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将全长抗体指定到不同的“类别”。有五种主要的全长抗体类别：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，其中几种可以进一步分入“亚类”(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。对应于不同类别抗体的链恒定结构域分别叫作α，δ，ε，γ，和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcγR III，而单核细胞表达FcγR I，FcγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫学年鉴9：457-92(1991)，464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，如美国专利5,500,362号或5,821,337号中所述。这类试验中有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。任选地或另外，目的分子的ADCC活性可在体内评估，例如在Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)公开的动物模型中。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应剂功能的白细胞。优选所述细胞至少表达FcγR III并执行ADCC效应剂的功能。例如可介导ADCC的人白细胞包括人外周血单个核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒T细胞和中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可分离自其天然来源，例如如本文所述分离自血液和PBMC。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。而且，优选的FcR是与IgG抗体结合的受体(γ受体)，包括FcγR I，FcγR II和FcγR III亚型，以及这些受体的等位基因变体和可替换的剪接形式。FcγR II受体包括FcγR IIA(“活化型受体”)和FcγR IIB(“抑制型受体”)，二者的氨基酸序列相似，主要区别在其胞浆结构域。活化型受体FcγR IIA在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受体FcγR IIB在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见综述Daeron，免疫学年鉴15：203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫学年鉴9：457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫学方法)4：25-34(1994)；和de Haas等，实验室及临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)126：330-41(1995)中对FcR进行了综述。其它FcR，包括将来被确定的，均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生期的受体，FcRn，其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志24：249(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在时分子裂解标靶的能力。补体活化途径由补体系统第一个成分(C1q)结合至一个与同源抗原形成复合物的分子(如抗体)来启动。为评价补体活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫学方法杂志202：163(1996)所述进行CDC试验。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而免疫球蛋白不同种型的重链中二硫键数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在其一个端有可变结构域(VH)，紧接着多个恒定结构域。每个轻链端有可变结构域(VL)，而另一端有恒定结构域；轻链恒定结构域与重链第一恒定结构域并列，轻链的可变结构域与重链的可变结构域并列。据信在轻链和重链的可变结构域之间特定氨基酸形成一个界面。
术语“可变的”是指不同抗体的可变区某些部分序列差异很大，且这些部分在每种特定抗体与其特定抗原的结合和特异性中有用。然而在抗体整个可变区中可变性的分布并不均等。它集中在轻链和重链可变区的三个被称为高变区的节段中。可变区的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然轻链和重链的可变区分别包含四个FR，它们大多采用β片层构型，通过三个高变区相连，这些高变区与β片层结构形成环状，有时形成部分环状。每条链的高变区通过FR连接至十分接近，并与其他链的高变区共同形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但显示多种效应功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。
当用在本文中时术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常含有来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重链可变区的残基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高变环”的残基(例如轻链可变区的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重链可变区的残基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物学杂志196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残基以外的可变区残基。
抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为“Fab”的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab’)2片段，它有两个抗原结合位点并仍能与抗原交联。
“Fv”是最小抗体片段，包含完整的抗原识别和抗原结合位点。这个区域是由一条重链和一个轻链可变区紧密、非共价结合成的二聚体。在VH-VL二聚体表面，每个可变区的三个高变区在构型上相互作用，从而限定抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特性。但即使单个可变区(或Fv中仅包含三个抗原特异性高变区的那一半)也能识别并结合抗原，只是比完整结合位点的亲和力低。
Fab片段还包含轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’不同于Fab片段之处在于，其重链CH1结构域的羧基端添加了数个残基，其中包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。本文中Fab’-SH指一种Fab’，其中恒定区的半胱氨酸残基有至少一个游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab’片段对且它们之间有铰链区半胱氨酸的形式产生的。抗体片段的其它化学连接也是已知的。
可以将脊椎动物任何物种的抗体的“轻链”指定为两种完全不同的型之一，称作κ和λ，型别区分的依据是其恒定区氨基酸序列。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选地，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段在WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458中进行了描述。
术语“二价抗体(diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，被迫与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP 404，097；WO93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院学报，90：6444-6448(1993)中对二价抗体作更充分地描述。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大多数的部分而言，人源化抗体人免疫球蛋白(受体(recipient)抗体)，其中受体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力(capacity)的非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类(供体(donor)抗体)的高变区的残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。这些修饰旨在进一步细化抗体的功能。一般情况下，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变区的全部，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常为人免疫球蛋白的至少一部分。祥见Jones等，自然321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人源化HER2抗体包括huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或Trastuzumab
Figure S05843463520070620D000261
如美国专利5,821,337的表3中所述，本文特别将其并入作为参考；本文所述的人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4抗体。
对于本文的目的而言，“Trastuzumab，”
Figure S05843463520070620D000271
和“huMAb4D5-8＂分别指包括SEQ ID NOS.13和14中的轻和重链氨基酸序列的抗体。
在这里，“Pertuzumab，”“rhuMAb2C4，”和“OMNITARGTM”分别指包括SEQ ID NOS.3和4中的可变轻和可变重氨基酸序列的抗体。其中Pertuzumab是全长抗体，优选地它分别包含SEQ ID NOS.15和16中的轻链和重链氨基酸序列。
“裸抗”是未偶联到异种分子，如细胞毒性部分或放射性标准上的抗体(如本文所定义的)。
“亲和性-成熟的”抗体是在其一个或多个高变区中具有一或多种变化的抗体，所述变化导致所述抗体与不具有那些变化的亲代抗体相比，前者对于抗原的亲和性提高。优选的亲和性成熟的抗体将具有纳摩尔的或甚至皮摩尔的靶抗原亲和性。通过本技术领域已知的方法产生亲和性-成熟的抗体。Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992)描述了通过VH和VL域重排的亲和性成熟(affinity maturation)。CDR和/或框架残基的随机突变由Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，91：3809-3813(1994)；Schier等，Gene，169：147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.，155：1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.，154(7)：3310-3319(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)描述。
“激动剂抗体”是结合并激活受体的抗体。一般地，激动剂抗体的受体激活能力将至少在定性上与受体的天然激动剂配体相似(并且可以是基本上在定性上相似)。激动剂抗体的实例是结合TNF受体超家族中的受体，如DR5的抗体，并且其诱导表达TNF受体(例如DR5)的细胞的凋亡。确定凋亡诱导的测定法在WO98/51793和WO99/37684中进行了描述，特此将二者并入本文作为参考。
“分离的”抗体是指从其天然环境成份中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成份是会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，且可能包括酶，激素，和其它蛋白型或非蛋白型溶质。在优选的实施方案中，该抗体将纯化成(1)按劳里(Lowry)方法测定的抗体重量百分比超过95％，且最优选重量百分比超过99％，(2)其纯化程度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列，或(3)在还原性或非还原性条件下进行SDS-PAGE并使用考马斯蓝或者，优选银染测定具有同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为该抗体天然环境中的至少一种成份不存在。然而，一般来说，分离的抗体由至少一个纯化步骤制备。
“比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚体化作用”的HER2抗体是比Trastuzumab更有效地(例如至少大约2-倍更加有效地)减弱或消除HER二聚体的抗体。优选地，这种抗体至少大约与鼠单克隆抗体2C4，鼠单克隆抗体2C4的Fab片段，Pertuzumab，和Pertuzumab的Fab片段同样有效地抑制HER2二聚体化作用。可以通过直接研究HER二聚体，或通过评估HER激活，或缘自HER二聚化作用的下游信号，和/或通过评估抗体-HER2结合位点等等来评估HER二聚化作用抑制。筛选具有比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚体化作用的抗体的测定法在Agus等人Cancer Cell 2：127-137(2002)和WO01/00245(Adams等人)中进行了描述。例如，可以通过评估，例如，HER二聚体形成的抑制(参见，例如，Agus等人Cancer Cell 2：127-137(2002)的图1A-B；和WO01/00245)；表达HER二聚体的细胞的HER配体激活的减弱(例如，WO01/00245和Agus等人Cancer Cell 2：127-137(2002)的图2A-B)；HER配体与表达HER二聚体的细胞的结合的阻抑(例如，WO01/00245，和Agus等人Cancer Cell 2：127-137(2002)的图2E)；在HER配体存在(或缺失)时表达HER二聚体的癌细胞(例如MCF7，MDA-MD-134，ZR-75-1，MD-MB-175，T-47D细胞)的细胞生长抑制(例如，WO01/00245和Agus等人Cancer Cell 2：127-137(2002)的图3A-D)；下游信号的抑制(例如，HRG-依赖型AKT磷酸化作用的抑制或HRG-或TGFα-依赖型MAPK磷酸化作用的抑制)(参见，例如，WO01/00245，和Agus等人Cancer Cell 2：127-137(2002)的图2C-D)来测定HER二聚体化作用的抑制。还可以通过研究抗体HER2结合位点，例如，通过评估结合HER2的抗体的结构或模型，如晶体结构，来评估抗体是否抑制HER二聚体化作用(参见，例如，Franklin等人Cancer Cell 5：317-328(2004))。
HER2抗体可以比Trastuzumab更加有效地“抑制HRG-依赖型AKT磷酸化作用”和/或抑制“HRG-或TGFα-依赖型MAPK磷酸化作用”(例如至少2-倍更加有效地)(例如参见Agus等人Cancer Cell 2：127-137(2002)和WO01/00245)。
HER2抗体可以“不抑制HER2外部结构域(ectodomain)切割”(Molina等人Cancer Res.61：4744-4749(2001)。
“结合HER2的异二聚体结合位点”的HER2抗体，结合结构域II中的残基(任选地还结合其它HER2细胞外结构域，如结构域I和III中的残基)，并且至少在某种程度上可以空间阻碍HER2-EGFR，HER2-HER3，或HER2-HER4异二聚体的形成。Franklin等人Cancer Cell 5：317-328(2004)表征了HER2-Pertuzumab晶体结构，保存在RCSB蛋白质数据库(ID CodeIS78)，例证了结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。
“结合HER2的结构域II”的抗体结合结构域II中的残基并且任选地结合HER2其它结构域，如结构域I和III中的残基。优选地结合结构域II的抗体结合到HER2的结构域I，II和III之间的连接上。
当在本文中使用时“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞，特别是表达HER的癌细胞的生长的化合物或组合物。因而，生长抑制剂可以是显著减少处于S期的表达HER的细胞的百分比的抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻抑细胞周期进程(在S期以外处)的试剂，如诱导G1阻滞和M-期阻滞的试剂。典型的M-期阻抑剂包括长春花碱类(vincas)(长春新碱和长春碱)，紫杉烷，和拓扑II抑制剂如阿霉素，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)，和博来霉素。那些阻滞G1的试剂也延伸到S期阻滞，例如，DNA烷化剂如它莫西芬，强的松，达卡巴嗪(dacarbazine)，氮芥(mechlorethamine)，顺铂，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，和阿糖胞苷(ara-C)。其它信息可以见于The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohnand Israel，eds.，Chapter 1，entitled＂Cell cycle regulation，oncogenes，andantineoplastic drugs＂by Murakami等人(WB Saunders：Philadelphia，1995)，特别是第13页。
“生长抑制性”抗体的实例是那些结合HER2和抑制过表达HER2癌细胞的生长的抗体。优选的生长抑制性HER2抗体以大约0.5-30μg/ml的抗体浓度抑制细胞培养物中SK-BR-3乳房肿瘤细胞的生长超过20％，优选超过50％(例如从大约50％到大约100％)，其中所述生长抑制是在SK-BR-3细胞暴露于抗体六天之后(参见发布于1997年10月14日的美国专利号5,677,171)测定的。SK-BR-3细胞生长抑制测定在该专利和下文中作更加详细的描述。优选的生长抑制性抗体是鼠单克隆抗体4D5的人源化变体，例如，Trastuzumab。
“诱导凋亡”的抗体是指诱导程序性细胞死亡的抗体，所述死亡可通过膜联蛋白(annexin)V的结合，DNA片段化，细胞皱缩，内质网膨胀，细胞碎裂，和/或膜泡(称为凋亡小体)形成确定。所述细胞通常是表达该抗体所结合抗原的细胞。优选地所述细胞是肿瘤细胞。例如磷脂酰丝氨酸(PS)转位可以通过膜联蛋白结合测量；DNA片段化可以通过DNA梯度评估；而伴随着DNA片段化的核/染色质浓缩可以通过亚二倍体细胞的任何增长进行评估。优选地，在膜联蛋白结合测定中，诱导凋亡的抗体是导致相对于未处理细胞对膜联蛋白结合的诱导为大约2-50倍，优选地大约5-50倍，最优选大约10-50倍的抗体，所述测定利用表达该抗体所结合抗原的细胞进行。诱导凋亡的抗体的实例为HER2抗体7C2和7F3，和某些DR5抗体。
“表位2C4”是抗体2C4结合的HER2细胞外结构域中的区域。为了筛选结合2C4表位的抗体，可以进行常规交叉阻抑测定，如在Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and DavidLane(1988)中所述的测定。或者，可以进行表位图谱绘制以评估抗体是否结合到HER2的2C4表位上。表位2C4包含来自HER2细胞外结构域中结构域II的残基。2C4和Pertuzumab在结构域I，II和III的连接处结合HER2的细胞外结构域。Franklin等人癌细胞5：317-328(2004)。
“表位4D5”是抗体4D5(ATCC CRL10463)和Trastuzumab进行结合的HER2细胞外结构域中的区域。这一表位靠近HER2的跨膜结构域，并且在HER2的结构域IV内。为了筛选结合4D5表位的抗体，可以进行常规交叉阻抑测定，如在Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所述的测定。或者，可以进行表位图谱绘制以评估抗体是否结合到HER2的4D5表位上(例如从HER2的大约残基529到大约残基625的区域中任何一个或多个残基，包括残基529和残基625)。
“表位7C2/7F3”是7C2和/或7F3抗体(都保存在ATCC，参见下文)结合的HER2细胞外结构域的结构域I之内的，氨基末端上的区域。为了筛选结合7C2/7F3表位的抗体，可以进行常规交叉阻抑测定，如在Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and DavidLane(1988)中所述的测定。或者，可以进行表位图谱绘制以证实抗体是否结合到HER2上的7C2/7F3表位上(例如从HER2的大约残基22到大约残基53的区域中任何一个或多个残基)。
“治疗”指治疗性治疗和预防性措施。需要处理的人包括已经患有疾病的人以及要预防疾病的人。因此，可以将本文待处理的患者诊断为患有疾病或可能倾向或易于患有该疾病。
术语“癌症”和“癌的”指或描述哺乳动物的生理状态，其一般表征为无节制的细胞生长。癌症的实例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚细胞瘤(包括髓母管细胞瘤和视网膜母细胞瘤)，肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑液细胞肉瘤)，神经内分泌肿瘤(包括类癌样肿瘤，促胃泌素瘤，和胰岛细胞癌)，间皮瘤，神经鞘瘤(包括听神经瘤)，脊膜瘤、腺癌、黑素瘤，和白血病或淋巴恶性瘤。这些癌症的更加具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，肠胃癌包括胃肠癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，阴囊癌，食道癌，胆道肿瘤，以及头和颈部的癌。
术语“有效量”指对患者疾病有效的药物量。当所述疾病是癌症时，药物的有效量可以减少癌细胞的数目；减少肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上延缓并且优选终止)癌细胞浸润入外周器官；抑制(即，在某种程度上延缓并且优选终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻一种或多种与癌症相关联的症状。在药物可以阻止癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。所述有效量可以延长进程自由存活，导致产生目标反应(包括部分反应，PR，或完全反应，CR)，提高整体存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状。
“表达HER2的癌症”是包含具有HER2蛋白存在于其细胞表面上的细胞的癌症。
“过表达”HER受体的癌症是这样一种癌症，其与相同组织类型的非癌细胞相比，在其细胞表面具有显著更高水平的HER受体，如HER2。这种过表达可能是由基因扩增或由增强的转录或翻译而引起的。HER受体过表达可以在诊断性或预后性测定中通过评估存在于细胞表面上的HER蛋白质的水平提高而进行测定(例如通过免疫组化测定；IHC)。或者，或此外，可以通过例如荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公开的WO98/45479)，DNA印迹，或聚合酶链式反应(PCR)技术，如定时定量PCR(RT-PCR)测量编码HER的核酸在细胞中的水平。还可以通过测量在生物液如血清中渗出的抗原来研究HER受体过表达(参见，例如，1990-06-12发布的美国专利号4,933,294；1991-04-18公开的WO91/05264；1995-03-28发布的美国专利5,401,638；和Sias等人J.Immunol.Methods132：73-80(1990))。除了以上测定之外，熟练专业人员还可利用各种体内测定法。例如，可以将患者体内的细胞暴露于抗体，所述抗体任选地标记了可检测标记，例如放射性同位素，并且可以通过例如外部扫描放射性或通过分析取自先前暴露于抗体的患者的活检组织来评估抗体与患者体内细胞的结合。
相反，“不过表达HER2受体”的癌症是这样一种癌症，其与相同组织类型的非癌细胞相比，并不会表达高于正常水平的HER2受体。
“过表达”HER配体的癌症是这样一种癌症，其与相同组织类型的非癌细胞相比，产生显著更高水平的该配体。这种过表达可能是由基因扩增或由增强的转录或翻译引起的。可以通过评估患者体内配体(或编码它的核酸)的水平来诊断性确定HER配体的过表达，例如在肿瘤活检组织中或通过各种诊断性测定法如IHC，FISH，DNA印迹，PCR或上述的体内测定法来进行。
本文中所用的术语“细胞毒制剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和镥的放射性同位素)，化疗剂，和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)和环膦酰胺(cyclosphamide)(
Figure S05843463520070620D000321
)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如benaodopa，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙撑亚胺和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenins(特别是bullatacin和bullatacinone)；delta-9-四氢大麻酚(dronabinol，
Figure S05843463520070620D000322
)；beta-拉帕酮；拉帕醇；colchicines；白桦脂酸；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan))；CPT-11(依立替康，
Figure S05843463520070620D000323
)；乙酰基喜树碱，东莨菪甙元，和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼树酸；替尼泊甙；cryptophycins(特别是cryptophycin1和cryptophycin8)；海兔毒素(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如烯二醇抗生素(如加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1和加利车霉素ω1，参见例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicinA；esperamicin；以及新制癌菌素生色团(chromophore)和相关的色蛋白enediyne抗生素生色团)，阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)(包括
Figure S05843463520070620D00033134613QIETU
，吗啉代-阿霉素，氰基吗啉代-阿霉素，2-吡咯啉基-阿霉素，阿霉素HCl脂质体注射液
Figure S05843463520070620D000331
脂质体阿霉素TLC D-99
Figure S05843463520070620D000332
聚乙二醇化的脂质体阿霉素
Figure S05843463520070620D000333
和脱氧阿霉素)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱(maytansinoids)(包括美登素和柄型菌素)米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure S05843463520070620D00034150217QIETU
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；rhizoxin；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素，verracurinA，杆孢菌素A，蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(
Figure S05843463520070620D000341
紫杉醇的白蛋白改造纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)，和紫杉萜
Figure S05843463520070620D000342
chloranbucil；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类药剂如顺铂，奥沙利铂和卡铂；长春花碱，其阻止微管蛋白聚合作用形成微管，包括长春碱()，长春新碱(
Figure S05843463520070620D000344
)，长春地辛(ELDISINE
Figure S05843463520070620D000345
Figure S05843463520070620D00034134950QIETU
)，和长春瑞宾(NAVELBINE
Figure S05843463520070620D000347
)；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；leucovovin；诺安托(novantrone)；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊拜膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS2000，二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄醛如维甲酸，包括bexarotene
Figure S05843463520070620D000348
二膦酸盐如氯甲双磷酸盐(例如，BONEFOS
Figure S05843463520070620D000349
或OSTAC)，依替膦酸钠(DIDROCAL
Figure S05843463520070620D0003411
)，NE-58095，唑来膦酸(zoledronic acid)/zoledronate
Figure S05843463520070620D0003412
阿仑膦酸钠
Figure S05843463520070620D0003413
帕米膦酸钠
Figure S05843463520070620D0003414
替鲁膦酸盐
Figure S05843463520070620D0003415
或利塞膦酸盐
Figure S05843463520070620D0003416
曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊烷核苷胞核嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制在涉及失控细胞增殖的信号途径中的基因表达的反义寡核苷酸，如，例如，PKC-α，Raf，H-Ras，和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗如
Figure S05843463520070620D000351
疫苗和基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN
Figure S05843463520070620D000352
疫苗，LEUVECTIN
Figure S05843463520070620D000353
疫苗，和VAXID疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，LURTOTECAN
Figure S05843463520070620D000355
)；rmRH(例如，ABARELIX
Figure S05843463520070620D000356
)；BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomib
Figure S05843463520070620D000357
CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂如oblimersen sodium()；pixantrone；EGFR抑制剂(参见下面的定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下面的定义)；和可药用的盐，酸或任何上述药剂的衍生物；以及以上药剂中的两种或多种的组合，如CHOP，环磷酰胺，阿霉素，长春新碱和脱氢皮质醇的组合疗法的缩写，以及FOLFOX，用奥沙利铂(ELOXATINTM)结合5-FU和leucovovin的治疗方案的缩写。
这一定义还包括作用来调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如具有混合激动剂/拮抗剂模式的抗雌激素剂，包括，他莫昔芬4-羟基他莫昔芬，托瑞米芬
Figure S05843463520070620D000359
碘昔芬，屈洛昔芬，雷洛昔芬
Figure S05843463520070620D0003510
曲沃昔芬，keoxifene，和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)如SERM3；无激动剂特性的纯抗雌激素剂如fulvestrant
Figure S05843463520070620D0003511
和EM800(这种药剂可以阻抑雌激素受体(ER)二聚作用，抑制DNA结合，增强ER更新，和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾族芳香酶抑抑制剂如福美司坦和依西美坦(exemestane)和非甾族芳香酶抑制剂如阿纳托唑
Figure S05843463520070620D0003513
来曲唑
Figure S05843463520070620D0003514
和氨鲁米特，和其它芳香酶抑制剂包括伏氯唑(vorozole)，甲地孕酮醋酸盐
Figure S05843463520070620D0003516
fadrozole，咪唑；促黄体激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(LUPRON
Figure S05843463520070620D0003517
和ELIGARD
Figure S05843463520070620D0003518
)，戈舍瑞林，布舍瑞林，和tripterelin；性类固醇，包括孕激素如甲地孕酮醋酸盐和甲羟孕酮醋酸盐，雌激素如己烯雌酚和普雷马林(premarin)，和雄性激素/视黄醛如氟甲睾酮，所有的transretionicacid和芬维A胺；奥那司酮(onapristone)；抗黄体酮剂；雌激素受体下调剂(ERDs)；抗雄性激素如氟他胺，尼鲁米特和比卡鲁胺(bicalutamide)；睾丸酮；和可药用的盐，酸或任何上述药剂的衍生物；以及以上药剂中的两种或多种的组合。
如本文所用的，术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并且，任选地，抑制EGFR激活的治疗剂。这种制剂的实例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455(ATCC CRL HB 8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL8509)(参见，美国专利号4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，如嵌合的225(C225或Cetuximab；ERBUTIX)和重构的人225(H225)(参见，WO96/40210，Imclone Systems Inc.)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利号5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利号5,891,996中所述；和结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF(参见WO98/50433，Abgenix)。抗EGFR抗体可以缀合以细胞毒性剂，由此生成免疫缀合物(参见，例如，EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子实例包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，CP-358774或Erlotinib HCL(TARCEVATM；Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU5271；Sugen)。
“酪氨酸激酶抑制剂”是在某种程度上抑制酪氨酸激酶如HER受体的酪氨酸激酶活性的分子。这类抑制剂的实例包括在前段落中提到的EGFR靶向药物以及小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂如可获自Takeda的TAK165，双-HER抑制剂如优选结合EGFR但抑制HER2和EGFR-过表达细胞的EKB-569(可获自Wyeth)，口服HER2GW572016(可获自Glaxo)和EGFR酪氨酸激酶抑制剂，和PKI-166(可获自Novartis)；pan-HER抑制剂如canertinib(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂如可获自ISIS Pharmaceuticals的反义试剂ISIS-5132，其抑制Raf-1信号过程；非-HER靶向TK抑制剂如Imatinib甲磺酸盐(GleevacTM)，可获自Glaxo；MAPK细胞外调节的激酶I抑制剂CI-1040(可获自Pharmacia)；喹唑啉，如PD153035，4-(3-氯苯胺)喹唑啉；pyridopyrimidines；pyrimidopyrimidines；pyrrolopyrimidines，如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706；pyrazolopyrimidines，4-(苯氨基)-7H-吡咯基[2，3-d]嘧啶；姜黄素(diferuloyl甲烷，4，5-二(4-对氟苯胺)邻苯二甲酰亚胺)；包含硝基噻吩部分的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如结合HER-编码核酸的那些)；喹噁啉(美国专利号5,804,396)；tryphostins(美国专利号5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；pan-HER抑制剂如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS3521；Isis/Lilly)；Imatinib甲磺酸(Gleevac；Novartis)；PKI166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或下面任一个专利公开文本中所述的：美国专利号5,804,396；WO99/09016(American Cyanimid)；WO98/43960(American Cyanamid)；WO97/38983(Wamer Lambert)；WO99/06378(Warner Lambert)；WO99/06396(WarnerLambert)；WO96/30347(Pfizer，Inc)；WO96/33978(Zeneca)；WO96/3397(Zeneca)；和WO96/33980(Zeneca)。
“抗血管生成剂”指在某种程度中阻抑或干扰血管形成的化合物。抗血管生成因子可以，例如，是结合参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。本文优选的抗血管生成因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，如Bevacizumab
术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白的总称。这类细胞因子有淋巴因子，单核因子，和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；苗勒管(mullerian)-抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
配制的抗体优选是基本上纯的并且是基本上均一的(即不含污染性蛋白质等)。“基本上纯的”抗体意指基于组合物的总重量，包括至少大约90％重量比的抗体的组合物，优选至少大约95％重量比。“基本上均一的”抗体意指基于组合物的总重量，包括至少大约99％重量比的抗体的组合物。
本文的“B细胞表面标记”或“B细胞表面抗原”是在B细胞表面上表达的抗原，其可以用与其结合的抗体靶向。例示性的B细胞表面标记包括CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD40，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白细胞表面标记(有关描述参见The Leukocyte Antigen Facts Book，2nd Edition.1997，ed.Barclay等人Academic Press，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标记包括RP105，FcRH2，B细胞CR2，CCR6，P2X5，HLA-DOB，CXCR5，FCER2，BR3，Btig，NAG14，SLGC16270，FcRH1，IRTA2，ATWD578，FcRH3，IRTA1，FcRH6，BCMA，和239287。与哺乳动物的其它非B细胞组织相比本文的特定目标B细胞表面标记优选在B细胞上表达，并且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。本文的优选B细胞表面标准是CD20或BR3。
“℃D20”，抗原，或“CD20”是大约35-kDa，非糖基化的磷蛋白，见于来自外周血或淋巴器官的超过90％的B细胞表面。CD20存在于正常的B细胞以及恶变的B细胞，但是并不在干细胞上表达。在文献中CD20的其它名称包括＂B-淋巴细胞限制型抗原＂和″Bp35″。CD20抗原在例如Clark等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：1766(1985)中进行了描述。
仅仅对于本文的目的而言，“人源化2H7”指2H7抗体的人源化变体，所述2H7抗体的CDR序列公开于美国专利号5,500,362(图5和6)中，特此将其并入本文作为参考。本文的人源化2H7抗体的实例包括WO2004/056312中所述的变体，以及其它变体，包括，但不限于：2H7v16，2H7v31，2H7v73，2H7v75，2H7v96，2H7v114，2H7v115，2H7v116，2H7v138，2H7v477，2H7v375，等等，在此将WO2004/056312也并入本文作为参考。
在一个实施方案中，人源化2H7抗体包含下列CDR序列中的一种，两种，三种，四种，五种或六种：
CDR L1序列RASSSVSYXH其中X是M或L(SEQ ID No.67)，例如SEQ ID No.57(图18A)，
SEQ ID No.58的CDR L2序列(图18A)，
CDR L3序列QQWXFNPPT其中X是S或A(SEQ ID No.68)，例如SEQ ID No.59(图18A)，
SEQ ID No.60的CDR H1序列(图18B)，
AIYPGNGXTSYNQKFKG的CDR H2序列，其中X是D或A(SEQ IDNo.69)，例如SEQ ID No.61(图18B)，和
VVYYSXXYWYFDV的CDR H3序列，其中位置6上的X是N，A，Y，W或D，而位置7上的X是S或R(SEQ ID No.70)，例如SEQ ID No.62(图18B)。
上面的CDR序列一般存在于人可变轻和可变重框架序列之内，如基本上人轻链κ亚基I(VL-I)的人共有FR残基，和基本上人重链亚基III(VHIII)的人共有FR残基。还参见WO 2004/056312(Lowman等人)。
可变重区可以连接到人IgG链恒定区上，其中该区可以是，例如，IgG1或IgG3，包括天然序列和变体恒定区。
在优选的实施方案中，这类抗体包含SEQ ID No.29的可变重结构域序列(v16，如图18B中所示)，任选地还包括SEQ ID No.26的可变轻结构域序列(v16，如图18A中所示)，其在位置56,100，和/或100a上任选地包含一个或多个氨基酸取代，例如D56A，N100A或N100Y，和/或可变重结构域中的S100aR，在可变轻结构域位置32和/或92上的一个或多个氨基酸取代，例如M32L和/或S92A。优选地，抗体是完整抗体，包括SEQ ID Nos.63或64的轻链氨基酸序列，和SEQ ID No.65，66，71或72的重链氨基酸序列。
优选的人源化2H7抗体是ocrelizumab(Genentech)。
本文的抗体可以进一步包含Fc区中的提高ADCC活性的至少一个氨基酸取代，如这样一种氨基酸取代，其中氨基酸取代在位置298,333，和334上，优选S298A，E333A，和K334A，其利用重链残基的Eu编号。还参见美国专利号6,737,056B1，Presta。
这些抗体的任一种可以包含Fc区中的至少一个取代，其增强FcRn结合或血清半寿期，例如在重链位置434上的取代，如N434W。还参见美国专利号6,737,056B1，Presta。
这些抗体的任一种可以包含Fc区中的至少一个氨基酸取代，其增强CDC活性，例如，至少包含位置326上的取代，优选K326A或K326W。还参见美国专利号6,528,624B1(Idusogie等人)。
一些优选的人源化2H7变体是那些包括SEQ ID No.26的可变轻结构域和SEQ ID No.29的可变重结构域的变体，包括在Fc区(如果存在的话)中有或无取代的变体，以及那些包括在SEQ ID No.29中具有取代N100A；或D56A和N100A；或D56A，N100Y，和S100aR的可变重结构域以及在SEQ ID No.26中具有取代M32L；或S92A；或M32L和S92A的可变轻结构域的变体。
已经将2H7v16的可变重链中的M34鉴定为抗体稳定性的潜在来源并且是另一种取代的潜在候选物。
在本发明的一些优选实施方案的总结中，基于2H7v16的变体的可变区包含v16的氨基酸序列，但除了在下表中所指出的氨基酸取代位置之外。除非另外指定，2H7变体将与v16具有相同的轻链。
例示性的人源化2H7抗体变体
2H7版本 重链(VH)改变 轻链(VL)改变 Fc改变
16用于参照
31 S298A，E333A，K334A
73 N100A M32L
75 N100A M32L S298A，E333A，K334A
96 D56A，N100A S92A
114 D56A，N100A M32L，S92A S298A，E333A，K334A
15 D56A，N100A M32L，S92A S298A，E333A，K334A，E356D，M358L
16 D56A，N100A M32L，S92A S298A，K334A，K322A
38 D56A，N100A M32L，S92A S298A，E333A，K334A，K326A
477 D56A，N100A M32L，S92A S298A，E333A，K334A，K326A，N434W
375 K334L
588 S298A，E333A，K334A，K326A
511 D56A，N100Y，S100aR M32L，S92A S298A，E333A，K334A，K326A
一种优选的人源化2H7包含2H7v16可变轻结构域序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQG
和2H7v16可变重结构域序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVV
当所述人源化2H7v16抗体是完整抗体时，它可以包含轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQG TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
和SEQ ID No.65的重链氨基酸序列或：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNo.71).
另一种优选的人源化2H7抗体包含2H7v511可变轻结构域序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID No.73)
和2H7v511可变重结构域序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ IDNo.74).
当所述人源化2H7v511抗体是完整抗体时，它可以包含轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID No.64)
和SEQ ID No.66的重链氨基酸序列或：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNo.72)。
本文的“B细胞恶性瘤”包括非何杰金(Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡NHL，小淋巴细胞(SL)NHL，中级/滤泡NHL，中级弥散性NHL，高级免疫母细胞NHL，高级淋巴母细胞NHL，高级小非凹陷性细胞NHL，bulky病NHL，套细胞淋巴瘤，AIDS-相关性淋巴瘤，和Waldenstrom’s巨球蛋白血症；白血病，包括急性淋巴母细胞白血病(ALL)，慢性淋巴母细胞白血病(CLL)，毛细胞白血病和慢性髓母细胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；和其它血液学恶性瘤。这些恶性瘤可以用抗B细胞表面标记，如CD20的抗体进行治疗。
如本文所用的术语“非何杰金氏淋巴瘤”或“NHL”，指除了何杰金氏淋巴瘤之外的淋巴细胞的癌症。一般通过何杰金氏淋巴瘤中存在Reed-Sternberg细胞而非何杰金氏淋巴瘤中缺失所述细胞可以将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。如本文所用的术语所包括的非何杰金氏淋巴瘤的实例包括任何可以由本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学者)按照本领域已知的分类方案来鉴定的疾病，所述分类方案如修订的欧美淋巴瘤(European-American Lymphoma)(REAL)方案，描述于Color Atlas ofClinical Hematology，Third Edition；A.Victor Hoffbrand and John E.Pettit(eds.)(Harcourt Publishers Limited 2000)(具体参见图11.57，11.58和/或11.59)。更具体的实例包括但不限于，复发性或难治性NHL，前线(front line)低级NHL，III/IV期NHL，化疗耐受型NHL，前体B成淋巴细胞白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或前淋巴细胞(prolymhocytic)白血病和/或小淋巴细胞淋巴瘤，B细胞前淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结节外边缘区-MALT淋巴瘤，结节边缘区淋巴瘤，毛状细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡淋巴瘤，中级/滤泡NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡样(follicular))，中级弥散型NHL，弥散型大B细胞淋巴瘤，浸润性NHL(包括浸润性前线NHL和浸润性复发NHL)，自体同源干细胞移植后复发性或难治性NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出淋巴瘤，高级成免疫细胞NHL，高级成淋巴细胞NHL，高级小非凹陷性细胞NHL，bulky病NHL，Burkitt’s淋巴瘤，前体(外源)T细胞淋巴母细胞白血病和/或淋巴瘤，成人T细胞淋巴瘤和/或白血病，T细胞慢性淋巴细胞白血病和/或前淋巴细胞白血病，大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样肉芽肿病和/或Sezary综合征，结节外天然杀伤/T细胞(鼻型)淋巴瘤，肠型T细胞淋巴瘤，肝脾型T细胞淋巴瘤，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤，皮肤淋巴瘤，间变性(anaplastic)大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤，肠T细胞淋巴瘤，外周T细胞(未另外指定)淋巴瘤和血管免疫母细胞型T细胞淋巴瘤。
在本文中“自身免疫疾病”是源自或针对个体自身组织或其共分离物或临床表现，或缘自其病症的疾病或紊乱。自身免疫疾病或紊乱的实例包括，但不限于关节炎(类风湿性关节炎，幼年型类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病关节炎，和关节强硬性脊椎炎)，银屑病，皮炎包括特应性皮炎、慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，毒性表皮坏死溶离，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化症如进行性系统硬化症，炎性肠病(IBD)(例如，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，自身免疫炎性肠病)，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜表层炎)，呼吸窘迫综合征，包括成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，IgE-介导的疾病如过敏性和变应性和特应性鼻炎，脑炎如Rasmussen氏脑炎、葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，大肠炎如显微镜结肠炎和胶原样结肠炎，血管球性肾炎(GN)如膜性GN(膜性肾病)，先天性膜性肾病，膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，和快速进展性GN，过敏疾病，过敏反应，湿疹，哮喘，涉及T细胞和慢性炎性反应的疾病，动脉粥样硬化，自身免疫心肌炎，白血球粘着不足，系统性红斑狼疮(SLE)如皮肤SLE，亚急性皮肤红斑狼疮，狼疮(包括肾炎型、大脑炎型、幼儿型、非肾型、平圆形、脱发型)，幼儿型(I型)糖尿病，包括幼儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，成人糖尿病(II型糖尿病)，多发性硬化症(MS)如脊-眼(spino-optical)MS，由细胞因子和T-淋巴细胞介导的与急性和延迟性过敏症相关联的免疫反应，肺结核，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病，韦格纳肉芽肿病，粒细胞缺乏症，脉管炎(包括大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu’s)脉管炎)，中血管脉管炎(包括川崎病和多发性结节性动脉炎)，CNS脉管炎，全身坏死性脉管炎，和ANCA-相关性脉管炎，如Churg-Strauss脉管炎或综合征(CSS))，颞动脉炎，再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血，纯红细胞发育不全(PRCA)，因子VIII缺乏症，血友病A，自身免疫中性粒细胞减少症，全血细胞减少，白血球减少症，与白细胞渗出有关的疾病，CNS炎性疾病，多器官损伤综合症，抗原抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基膜病，抗磷脂抗体综合症，过敏性神经炎，白塞病，Castleman综合症、Goodpasture综合征、雷诺氏综合症、干燥综合症、渗出性多形性红斑(Steven-Johnson syndrome)、类天疱疮比如大疱性类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮(vulgaris)，落叶型天疱疮(foliaceus)，和天疱疮粘膜类天疱疮(pemphigus mucus-membranepemphigoid))，自身免疫性多性发内分泌病，Reiter′氏病，免疫复合物性肾炎，慢性神经病如IgM多发性神经元炎或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如由心肌梗塞患者发展的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，睾丸或卵巢的自身免疫疾病包括自身免疫睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺机能减退，自身免疫内分泌疾病包括甲状腺炎如自身免疫甲状腺炎，慢性甲状腺炎(Hashimoto’s甲状腺炎)，或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺机能减退，阿狄森氏病，Grave氏病，多腺综合症如自身免疫性多腺综合症(或多腺内分泌综合症)，副肿瘤(paraneoplastic)综合征，包括神经学肿瘤伴随综合征如Lambert-Eaton肌无力综合征或Lambert-Eaton综合征，僵人综合症，脑脊髓炎如变态反应性脑脊髓炎，重症肌无力，小脑变性，边缘系统和/或脑干脑炎，神经性肌强直，斜视眼阵挛或斜视肌阵挛综合症(OMS)，和感觉性神经病，Sheehan综合征，自身免疫肝炎，慢性肝炎，狼疮样肝炎，慢性活动型肝炎或自身免疫性慢性活动型肝炎，淋巴样间质性肺炎(lymphoid interstitialpneumonitis)、闭塞性细支气管炎(非移植物)相对于NSIP，Guillain-Barré综合症，Berger氏病(IgA肾病)，原发性胆汁性肝硬变、口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻、疱疹样皮炎、冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(ALS；Lou Gehrig氏病)，冠状动脉病，自身免疫性内耳疾病(AIED)，或自身免疫性听力损失、眼肌阵挛综合症(opsoclonus myoclonus syndrome)(OMS)，多发性软骨炎如顽固性多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，淀粉样变性，巨细胞性肝炎，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞性淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和意义未确定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，外周神经病，副肿瘤综合征，神经通路疾病(channelopathies)如癫痫症，偏头痛，心律不齐，肌肉紊乱，聋，盲，周期性麻痹，和中枢神经系统神经通路疾病，孤独症，炎性肌病，局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)，自身免疫性肝病，纤维肌痛，多发性内分泌失调，Schmidt氏综合症，肾上腺炎，胃萎缩，老年性痴呆，脱髓鞘病，心肌梗塞后综合征(Dressler’s syndrome)，脱发(alopecia)arcata，CREST综合症(钙质沉着，雷诺现象，食管动力障碍(dysmotility)，指端硬化，和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫性不育，强直性脊柱炎，混合结缔组织病，南美洲锥虫病，风湿热，反复流产，农民肺，多形性红斑，心脏切开后综合征，Cushing综合征，鸟类爱好者(bird-fancier′s)肺，阿尔波特氏综合征、肺泡炎如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，疟疾，利什曼病，kypanosomiasis，血吸虫病，蛔虫病，曲菌病，Sampter氏综合症，Caplan综合征，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，内眼炎，erythema elevatum et diutinum，胎儿成红细胞增多症(erythroblastosis fetalis)，嗜酸性粒细胞筋膜炎(eosinophilicfaciitis)，Shulman综合症，Felty综合征，flariasis，睫状体炎比如慢性睫状体炎，异时性睫状体炎，或Fuch睫状体炎，Henoch-Schonlein紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，埃可病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏病，细小病毒感染，风疹病毒感染，免疫接种后综合症，先天性风疹感染，Epstein-Barr病毒感染，腮腺炎，Evan氏综合症，自身免疫性腺功能不良，Sydenham舞蹈病，链球菌感染后肾炎，闭塞性血栓性脉管炎，甲状腺毒症(thyrotoxicosis)，脊髓痨(tabes dorsalis)，和巨细胞多肌痛。
本文的“肿瘤坏死因子受体超家族”或“TNF受体超家族”指被TNF家族的细胞因子结合的受体多肽。一般，这些受体是在其细胞外结构域中具有一个或多个半胱氨酸富集重复序列的I型跨膜受体。TNF受体超家族可以进一步细分成(1)死亡受体；(2)诱饵(decoy)受体；和(3)缺失死亡结构域的信号受体。“死亡受体”在其细胞质或细胞内区中包含“死亡结构域”，即作用来在细胞中转导能够导致凋亡或某些基因的诱导的信号的区域或序列。“诱饵受体”缺失功能性死亡结构域并且不能转导导致凋亡的信号。TNF基因家族中的细胞因子的实例包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，肿瘤坏死因子-β(TNF-beta或淋巴毒素)，CD30配体，CD27配体，CD40配体，OX-40配体，4-1BB配体，Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称作TRAIL)，Apo-3配体(也称作TWEAK)，护骨蛋白(osteoprotegerin)(OPG)，APRIL，RANK配体(也称作TRANCE)，和TALL-1(也称作BlyS，BAFF或THANK)。TNF受体超家族中的受体的实例包括：1型肿瘤坏死因子受体(TNFR1)，2型肿瘤坏死因子受体(TNFR2)，p75神经生长因子受体(NGFR)，B细胞表面抗原CD40，T细胞抗原OX-40，Apo-1受体(也称作Fas或CD95)，Apo-3受体(也称作DR3，swl-1，TRAMP和LARD)，称作“跨膜激活剂和CAML-互作剂”或“TACI”的受体，BCMA蛋白质，DR4，DR5(或者称作Apo-2；TRAIL-R2，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER)，DR6，DcR1(也称作TRID，LIT或TRAIL-R3)，DcR2(也称作TRAIL-R4或TRUNDD)，OPG，DcR3(也称作TR6或M68)，CAR1，HVEM(也称作ATAR或TR2)，GITR，ZTNFR-5，NTR-1，TNFL1，CD30，淋巴毒素β受体(LTBr)，4-1BB受体和TR9(EP988，371A1)。
术语“Apo-2配体”，“Apo-2L”，“Apo2L”，Apo-2配体/TRAIL”和“TRAIL”在本文中可以互换使用，指包括图24(SEQ ID No.46)中所示氨基酸序列的氨基酸残基114-281的多肽序列，包括95-281，包括残基92-281，包括残基91-281，包括残基41-281，包括残基39-281，包括残基15-281，或包括残基1-281，以及以上序列的生物学活性片段，删除，插入，和/或取代变体。在一个实施方案中，所述多肽序列包含图24(SEQ ID No.46)的残基114-281。任选地，所述多肽序列包含图24(SEQ ID No.46)的残基92-281或残基91-281。Apo-2L多肽可以由图24(SEQ ID No.45)中所示的天然核苷酸序列编码。任选地，编码残基Prol19(图24；SEQ ID No.45)的密码子可以是“CCT”或“CCG”。任选地，所述片段或变体是具有生物学活性的并且具有与任一种以上序列至少大约80％氨基酸序列同一性，或至少大约90％序列同一性，或至少95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性。该定义包括Apo-2配体的取代变体，其中它的天然氨基酸中的至少一个被其它氨基酸如丙氨酸残基所取代。该定义还包括分离自Apo-2配体来源或通过重组和/或合成方法制备的天然序列Apo-2配体。本发明的Apo-2配体包括在1997-01-16公布的WO97/01633，1997-07-17公布的WO97/25428，公布的July 22，1999-07-22公布的WO 99/36535，2001-01-04公布的WO 01/00832，2002-02-07公布的WO 02/09755，2000-12-14公布的WO 00/75191，和2000-02-29发布的美国专利号6,030,945中公开的称作Apo-2配体或TRAIL的多肽。该术语一般用来指包括多肽的单体，二聚体，三聚体，六聚体或高度寡聚体形式。除非另外特别声明，所用提及Apo-2L序列的氨基酸残基的编号都使用根据图24(SEQ ID No.46)的编号。
“Apo-2配体受体”包括本领域称作“DR4”和“DR5”的受体。Pan等人描述了称作＂DR4＂的TNF受体家族成员(Pan等人，Science，276：111-113(1997)；还参见1998-07-30公开的WO98/32856；1999-07-29公开的WO 99/37684；2000-12-07公开的WO 00/73349；2002-08-13发布的US 6,433,147；2002-10-08发布的US 6,461,823，和2002-01-29发布的US 6,342,383)。Sheridan等人，Science，277：818-821(1997)和Pan等人，Science，277：815-818(1997)描述了Apo2L/TRAIL的另一种受体(还参见，1998-11-19公开的WO98/51793；1998-09-24公开的WO98/41629)。这种受体称作DR5(或者该受体还被称作Apo-2；TRAIL-R，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER；Screaton等人，Curr.Biol.，7：693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，16：5386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17：141-143(1997)；1998-08-20公开的WO98/35986；1998-10-14公开的EP870，827；1998-10-22公开的WO98/46643；1999-01-21公开的WO99/02653；1999-02-25公开的WO99/09165；1999-03-11公开的WO99/11791；2002-08-13公开的US2002/0072091；2001-12-07公开的US 2002/0098550；2001-12-06发布的US6,313,269；2001-08-02公开的US 2001/0010924；2003-07-03公开的US2003/01255540；2002-10-31公开的US 2002/0160446，2002-04-25公开的US 2002/0048785；2003-05-27发布的US 6,569,642，2000-06-06发布的US6,072,047，2003-11-04发布的US 6,642,358)。如上所述，Apo-2L的其它受体包括DcR1，DcR2，和OPG。当在本文中使用时术语“Apo-2L受体”包括天然序列受体和受体变体。这些术语包括在许多哺乳动物，包括人中表达的Apo-2L受体。Apo-2L受体可以如在许多人组织种系中天然发生的那样进行内源表达，或者可以通过重组或合成方法进行表达。“天然序列Apo-2L受体”包含具有与衍生自天然的Apo-2L受体相同的氨基酸序列的多肽。因而，天然序列Apo-2L受体可以具有来自任何哺乳动物，包括人的天然发生的Apo-2L受体的氨基酸序列。这种天然序列Apo-2L受体可以分离自天然或者能够通过重组或合成方法产生。术语“天然序列Apo-2L受体”具体包括天然发生的截短或分泌形式的受体(例如，包含，例如，细胞外结构域序列可溶形式)，天然发生的变体形式(例如，其它剪切形式)和天然发生的等位基因变体。受体变体可以包括天然序列Apo-2L受体的片段或删除突变体。图25A-C显示1998-11-19在WO98/51793中公开的人DR5受体的411氨基酸序列，及其核苷酸序列(SEQ ID Nos.47和48)。人DR5受体的转录剪切变体是本领域已知的。这种剪切变体编码图26A-C中所示的人DR5受体的440氨基酸序列，及其核苷酸序列(SEQ ID Nos.49 and 50)，如1998-08-20在WO 98/35986中所公开的。
本文中所用的“死亡受体抗体”一般指针对肿瘤坏死因子受体超家族中的受体，并且包含能够产生凋亡信号的死亡结构域的抗体，这类抗体包括DR5抗体和DR4抗体。
以宽泛的意义使用“DR5受体抗体”，“DR5抗体”，或“抗DR5抗体”来意指结合至少一种形式的DR5受体或其细胞外结构域的抗体。任选地DR5抗体融合或连接到异源序列或分子上。优选地所述异源序列允许或有助于抗体形成较高级或寡聚复合物。任选地，DR5抗体结合DR5受体但不结合或与任何其它Apo-2L受体(例如DR4，DcR1，或DcR2)交叉反应。任选地抗体是DR5信号活性的激动剂。
任选地，如在BIAcore结合测定中所测量的，本发明的DR5抗体在大约0.1nM到大约20mM的浓度范围上结合DR5受体。任选地，如在BIAcore结合测定中所测量的，本发明的DR5抗体显示大约0.6nM到大约18mM的IC50值。
仅仅对于本文的目的而言，术语“Apomab”指结合DR5并且包含SEQ IDNos.55和56的可变重和可变轻氨基酸序列的激动剂抗体。优选地Apomab分别包含SEQ ID Nos.51和52的重和轻链。
II.抗体的生产
可以根据本发明配制的抗体的生产技术如下。
(i)抗原筛选和制备
优选地，抗体结合的抗原是生物学上重要的糖蛋白并且将抗体施用给患疾病或病症的哺乳动物可以带来哺乳动物的治疗益处。不过，也考虑了针对非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原，见美国专利5,091,178)的抗体。
在抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体例如生长因子等。抗原的实例包括如肾素等分子；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素-B链；前胰岛素；卵泡刺激激素；降钙素；黄体激素；胰高血糖素；因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和vonWillebrands因子等凝血因子；蛋白C等抗凝血因子；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(调节对T细胞表达和分泌的正常激活)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；苗勒管(Muellerian)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠绒毛膜促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素(inhibin)；激活素(activin)；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养素-3、-4、-5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，例如NGF-β；血小板衍生的生长因子(PDGF)；纤维母细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化型生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子(osteoinductivefactor)；免疫毒素；骨形态发生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变(decay)加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；粘着素；调节蛋白；整合素，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如HER2、HER3或HER4受体；以及上述任何多肽的片段。
本发明所包含的抗体的例示性分子靶标包括CD蛋白质如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22，CD34和CD40；ErbB受体家族的成员如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；B细胞表面抗原，如CD20或BR3；肿瘤坏死受体超家族的成员，包括DR5；前列腺干细胞抗原(PSCA)；细胞粘附分子如LFA-1，Macl，p150.95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，α4/β7整合素，和αv/β3整合素包括其α或β亚基(例如抗CD11a；抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子如VEGF及其受体；组织因子(TF)；肿瘤坏死因子(TNF)如TNF-α或TNF-β，α干扰素(α-IFN)；白介素，如IL-8；IgE；血液组抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白质C等等。
可以将可溶性抗原或其片段，任选地偶联到其它分子上，用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，如受体，可以将这些的片段(例如受体的细胞外结构域)用作免疫原。或者，可以将表达跨膜分子的细胞用作免疫原。这类细胞可以来自天然来源(例如癌细胞系)或者可以是通过重组技术进行转化来表达跨膜分子的细胞。可以用于制备抗体的其它抗原及其各种形式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
为产生HER2抗体，用于其生产的HER2抗原可以是，例如，HER2或其部分的细胞外结构域的可溶形式，其包含所需的表位。或者，可以使用在其细胞表面表达HER2的细胞(例如过表达HER2的经转化的NIH-3T3细胞；或癌细胞系如SK-BR-3细胞，参见Stancovski等人PNAS(USA)88：8691-8695(1991))来生成抗体。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体获自一群基本上同质的抗体，即，包含该群的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可以在单克隆抗体生产期间生成的可能的变体。因而，修饰语“单克隆”表明抗体并非不同抗体组合物的特性。
例如，可以利用Kohler，自然256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4816567)制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，按上述方法免疫小鼠或其它适当的宿主动物，例如仓鼠，来诱导出产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体可与免疫中应用的蛋白特异性结合。或者，可以将淋巴细胞在体外进行免疫，然后，用聚乙二醇等适当的融合剂将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理与应用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
在适当的培养基中接种并培养如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选包括一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的所述培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质可防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些可有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定产生高水平抗体、并且对HAT等培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(得自Salk Institute Cell Distribution Center，圣迭戈，加利福尼亚，美国)和SP-2或X63-Ag8-653细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，马里兰，美国)。还有报道将人杂交瘤细胞和小鼠-人异质性杂交瘤细胞系用于制备人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体制备技术和应用，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987))。
测定杂交瘤细胞生长培养基中针对所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或体外结合试验，例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)，测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和性可以，例如，通过Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析进行测定。
在产生具有所需的特异性、亲和力和/或活性之抗体的杂交瘤细胞被鉴定之后，可以通过有限稀释方法将所述克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体：原理和应用，pp.59-103，Academic Press，1986))。用于此目的的适当培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物体内生长形成腹水瘤。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中适当分离。
用传统的方法可容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测定其序列(例如，利用能够与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。所述杂交瘤细胞可作为此类DNA的优选来源。所述DNA一经分离，将其连接入表达载体，然后将载体转化入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。有关在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述性论文包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可以从抗体噬菌体文库中分离，所述抗体噬菌体文库用在McCafferty等，自然348：552-554中所述技术制备。Clackson等，自然352：624-628(1991)和Marks等，生物化学杂志222：581-597(1991)分别叙述了利用噬菌体文库对鼠和人的抗体的分离。随后的文献叙述了高亲和力(nM范围)人抗体的产生，其通过链改组(chain shuffling)(Marks等，生物/技术，10：779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为构建很大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，核酸研究，21：2265-2266(1993))。因此，对于单克隆抗体的分离，这些技术是传统的单克隆抗体杂交瘤技术的可替代方法。
也可以对DNA进行修饰，例如，用编码人重链和轻链恒定区的序列取代其鼠同源序列(美国专利号4816567；Morrison等，美国国家科学院院刊81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白的编码序列。
通常这类免疫球蛋白多肽取代抗体恒定区，或取代抗体的一个抗原结合位点的可变区已产生嵌合型二价抗体，其包括一个特异性针对一种抗原的抗原结合位点，和具有针对不同抗原的特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
本领域已经描述了人源化非人抗体的方法。优选地，人源化抗体具有一个或多个被引入的非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常是“引入”的残基，其典型地来源于“引入”可变区。根据Winter和其同事的方法(Jones等，自然，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-327(1988)；Verhoeyen等，科学239：1534-1536(1988))，通过用人抗体的相应序列取代鼠类CDR或CDR序列，可以基本上进行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4816567)，其中基本上少于完整的人可变区的序列被来源于非人类物种的相应序列代替。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被噬齿类抗体中类似位点的残基代替。
在制备人源化抗体中应用的人重链和轻链可变区的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适”方法，可在已知人可变区序列的完整文库中筛选啮齿类抗体的可变区序列。然后，将与啮齿类序列最相近的人的序列作为人源化抗体的框架(FR)(Sims等，免疫学杂志.151：2296(1993)；Chothia等，分子生物学杂志.196：901(1987))。另一种方法应用来源于特定亚组轻链或重链之所有人类抗体共同序列的特定框架。相同的框架可以用于若干不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院院刊89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志.，151：2623(1993))。
更为重要的是抗体被人源化且保留对抗原的高亲和力和其它良好的生物学活性。为了达到此目的，根据优选的方法，利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物，通过此方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型为公众可获得且为本领域技术人员所熟知。已有能说明并显示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。观察这些显示结果可以分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与抗原结合能力的残基。这样，可以从受体筛选FR残基，并将其与重要的序列组合，以得到所需抗体特性，例如对靶抗原的亲和力增强。通常，CDR残基直接并且主要涉及对抗原结合的影响。
WO 01/00245描述了结合HER2并且阻抑HER受体的配体激活的例示性人源化HER2抗体的生产。本文的特定目标人源化抗体基本上与鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)同样有效地阻抑EGF，TGF-α和/或HRG介导的MAPK的激活，和/或与鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)同样有效地结合HER2。本文的人源化抗体可以，例如，包含并入人可变重结构域的非人高度可变区残基，并且可以进一步包含选自69H，71H和73H位置上的框架区(FR)取代，上述操作利用在Kabat等人，Sequence of Protein ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)中给出的可变结构域编号系统。在一个实施方案中，人源化抗体包含在位置69H，71H和73H位置中的两个或全部位置上的FR取代。
本文的例示性的目标人源化抗体包含可变重结构域互补决定残基GFTFTDYTMX，其中X优选为D或S(SEQ ID No.7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID No.8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ ID No.9)，任选地包含那些CDR残基的氨基酸修饰，例如其中所述修饰基本上保留或提高抗体的亲和性。例如，目标抗体变体可以在以上可变重CDR序列中具有从大约一个到大约七个或大约五个氨基酸取代。这类抗体变体可以通过，例如，如下所述的亲和性成熟来制备。最优选的人源化抗体包含SEQID No.4中的可变重结构域氨基酸序列。
除了前段中的那些可变重结构域CDR残基之外，人源化抗体可以包含例如可变轻结构域互补决定残基KASQDVSIGVA(SEQ ID No.10)；SASYXXX，其中位置5上的X优选是R或L，其中位置6上的X优选是Y或E，而位置7上的X优选是T或S(SEQ ID No.11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID No.12)。这类人源化抗体任选地包含以上CDR残基的氨基酸修饰，例如其中所述修饰基本上保持或增强抗体的亲和性。例如，目标抗体变体可以在以上可变轻CDR序列中具有从大约一个到大约七个或大约五个氨基酸取代。这类抗体变体可以通过，例如，如下所述的亲和性成熟来制备。最优选的人源化抗体包含SEQ ID No.3中的可变轻结构域氨基酸序列。
本申请还涉及结合HER2并阻抑HER受体的配体激活的亲和性成熟抗体。亲本抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如，分别包含SEQ ID Nos.3和4的可变轻和/或重序列的抗体(即变体574)。亲和性成熟抗体优选地以优于鼠2C4或变体574(例如从大约两倍或大约四个倍，到大约100倍或大约1000倍增强亲和性，例如，如利用HER2-细胞外结构域(ECD)ELISA所评估的)的亲和性结合HER2受体。例示性的进行取代的可变重CDR残基包括H28，H30，H34，H35，H64，H96，H99，或两个或多个的组合(例如这些残基的两个，三个，四个，五个，六个，或七个)。进行改变的可变轻CDR残基的实例包括L28，L50，L53，L56，L91，L92，L93，L94，L96，L97或两个或多个(例如这些残基的两个，三个，四个，五个，高达大约十个)的组合。
要求保护各种形式的人源化抗体或亲和性成熟抗体。例如，人源化抗体或亲和性成熟抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性剂偶联，以便生成免疫偶联物。或者，人源化抗体或亲和性成熟抗体可以是全长抗体，如全长IgG1抗体。
(iv)人抗体
除了进行人源化以外还可制备人类抗体。例如现在已能产生如下转基因动物(如小鼠)，它们通过免疫能产生人类抗体的所有成分而不产生内源免疫球蛋白。例如，有报道称，嵌合及种系(germ-line)突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体的产生被完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到这类种系突变小鼠中将导致因抗原攻击而产生人类抗体。见，例如，Jakobovits等，美国国家科学院学报，90：2551(1993)；Jakobovits等，自然，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.7：33(1993)；和美国专利号5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348：552-553(1990))从未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区基因的所有组成而体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技术，将抗体V区基因克隆在与丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因相同的框架内，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特点进行的选择也导致对显示这些性质的抗体的编码基因进行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；其综述见，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，结构生物学的最新观点(Current Opinion in Structural Biology)3：564-571(1993)。可使用若干来源的V基因片段进行噬菌体展示。Clackson等，自然，352：624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因的随机组合小文库中分离了抗-恶唑酮抗体的一个多样性阵列。可基本如Marks等，分子生物学杂志222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBOJ.12：725-734(1993)所述构建未经免疫的人类供者V基因的所有组成，并分离针对抗原多样性阵列(包括自身抗原)的抗体。亦参见美国专利号5565332和5573905。
如上所述，人类抗体也可通过体外活化的B细胞而产生(见美国专利5,567,610和5,229,275)。
人类抗HER2抗体在1998年6月30日公布的美国专利5772997和1997年1月3日公开的WO97/00271中叙述。
(v)抗体片段
已开发了生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片段通过对完整抗体的蛋白水解性消化获得(见Morimoto等，生物化学和生物物理学方法杂志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992))和Brennan等，科学，229：81(1985))。但现在可直接通过重组宿主细胞产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并经化学连接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技术10：163-167(1992))。依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab’)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。抗体片段也可以是“线性化抗体”，如美国专利5,641,870所述。这类线性化抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可以与HER2蛋白的两种不同表位结合。其它这种抗体可将HER2结合位点与针对EGFR、HER3和/或HER4的结合位点组合。或者，可将抗HER2臂与结合白细胞上引发分子的臂结合，从而集中针对HER2表达细胞的细胞防御机制，所述引发分子如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG Fc受体(FcγR)如Fcγ RI(CD64)、Fcγ RII(CD32)和FcγRIII(CD16)。双特异性抗体还可用于将细胞毒制剂定位至表达HER2的细胞。这些抗体具有HER2结合臂和结合细胞毒制剂(例如皂草素，抗INF-α，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab’)2双特异性抗体)。
WO 96/16673描述了双特异性HER2/Fc γ RIII抗体，而在美国专利5837234中公开了双特异性ErbB2/Fcγ RI抗体IDM1(Osidem)。双特异性HER2/Fc α抗体见WO98/02463。美国专利5821337中教导了双特异性HER2/CD3抗体。MDX-210是双特异性HER2-FcγRIII Ab。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。完整双特异性抗体的传统制备方法是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，自然，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤(quadroma))可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)。
依据不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的带有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半上存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节，见Suresh等，酶学方法，121：210(1986)。
根据美国专利5,731,168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这使得异二聚体的产量比不想要的终产物如同型二聚体的高。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利号4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，公开于美国专利号4676980中。
从抗体片段制备双特异性抗体的技术也已有文献描述。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab′)2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇，再与等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。
近期的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，实验医学杂志，175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每一Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过度表达HER2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志，148(5)：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，美国国家科学院学报，90：6444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，152：5368(1994)。
考虑二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，147：60(1991)。
(vii)其它氨基酸序列修饰
考虑本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特点。抗体的氨基酸序列变体可通过在抗体核酸中引入适当的核苷酸变化或通过肽合成制备。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所需的特性。所述氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
一种鉴别抗体中处于诱变优选位置的某些残基或区域的有用方法是Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989)所述的“丙氨酸扫描诱变”。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸取代(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过在取代点引入进一步的或其他的变体而改进。因而，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身的性质不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的具有预期活性的抗体变体。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包括100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的该抗体。抗体分子的其它插入变体包括使该抗体的N-或C-末端与能增加该抗体的血清半衰期的酶或多肽融合。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使抗体分子中至少一个氨基酸残基被不同残基取代。最有兴趣进行取代诱变的位点包括高变区，也可以考虑FR的改变。保守取代见表1的“优选取代”栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表1中“取代举例”栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。
表1
起始残基 例示性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
通过选择取代来实现抗体生物学特性的基本修饰，所述取代在其维持(a)取代区多肽骨架结构，例如，如片层或螺旋状构象，(b)在靶位点上分子的电荷或疏水性，或(c)侧链大小的效应上明显不同。氨基酸可根据它们侧链性质的相似性分组(在A.L.Lehninger，in Biochemistry，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975)中)：
(1)非极性：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)
(2)不带电的极性：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)，Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)，Arg(R)，His(H)
或者，天然存在的残基可根据共有的侧链特性分成几组：
(1)疏水型：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水型：cys，ser，thr；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链方向的残基：gly，pro；和
(6)芳香基：trp，tyr，phe。
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。
不参与维持抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基也可被取代，通常被丝氨酸取代，以提高该分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反，可在该抗体中添加半胱氨酸连接以提高其稳定性(特别当该抗体为抗体片段如FV片段时)。
取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体高变区的一或多个残基。通常，所选用于进一步开发的变体相对于其亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法是利用了噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，使高变区的几个位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的高变区修饰位点，可通过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的高变区残基。此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以确定抗原与抗体之间的接触点也较有利。这些接触残基及其邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对它们全部进行筛选，选出在一或多个相关实验中具有优势特性的抗体以便进一步开发。
所述抗体的另一种类型的氨基酸变体改变了该抗体原来的糖基化模式。所谓改变就是去掉该抗体中的一或多个碳水化合物部分，和/或添加一或多个原本不存在于该抗体中的糖基化位点。
抗体的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指将碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促相连的识别序列。因此，多肽中存在上述任一种三肽序列都可产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附着于羟基氨基酸，主要是丝氨酸、苏氨酸，但也可用5-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。
在抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列，使其包含一或多个上述三肽序列而实现(在添加N-连接糖基化位点的情况下)。这种改变也可通过在原始抗体的序列中添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(在添加O-连接的情况下)。
当所述抗体包含Fc区时，可以改变附于其上的糖。例如，具有成熟糖结构的抗体在美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L中进行了描述，所述成熟糖结构缺少海藻糖附于抗体的Fc区上。还参见US2004/0093621A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。在附于抗体Fc区上的糖中具有对分N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体在WO03/011878，Jean-Mairet等人和美国专利号6,602,684，Umana等人中提及。在附于抗体Fc区上的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体在WO97/30087，Patel等人中报道。还参见，WO98/58964(Raju，S.)和WO99/22764(Raju，S.)，其涉及具有变化的糖附于其Fc区上的抗体。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子由本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对抗ErbB2抗体之早期制备的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。
(viii)筛选具有所需特性的抗体
以上已经描述了生成抗体的技术。可以根据需要进一步选择具有某种生物学特性的抗体。
为了鉴定抑制HER受体的配体激活的抗体，可以测定该抗体阻抑HER配体结合表达HER受体的细胞的能力(例如结合另一种HER受体，该受体与目标HER受体一起形成HER异寡聚体)。例如，可以将天然表达，或经转染后表达HER异寡聚体的HER受体的细胞与抗体一起温并且随后暴露于经标记的HER配体。随后可以评估HER2抗体阻抑配体结合HER异寡聚体中的HER受体的能力。
例如，基本上如WO01/00245中所述可以利用24孔板中的冰上单层MCF7培养物进行HER2抗体对HRG结合MCF7乳腺瘤细胞系的抑制。可以将HER2单克隆抗体加到每个孔中并温育30分钟。随后可以添加125I-标记的rHRGβ1177-224(25pm)，可以将温育持续4到16个小时。可以制备剂量反应曲线并对目标抗体计算IC50值。在一个实施方案中，阻抑HER受体的配体激活的抗体在这种测定中将具有大约50nM或更少，更加优选10nM或更少的IC50，以抑制HRG结合MCF7细胞。其中所述抗体是抗体片段如Fab片段，在这种测定中抑制HRG结合MCF7细胞的IC50可以是，例如，大约100nM或更少，更加优选50nM或更少。
或者，或此外，可以评估HER2抗体阻抑存在于HER异寡聚体中的HER受体的HER配体-刺激的酪氨酸磷酸化作用的能力。例如，可以将内源表达HER受体或经转染后表达它们的细胞与抗体一起温育并且随后利用抗磷酪氨酸单克隆(其任选地缀合以可检测的标记)测定HER配体-依赖型酪氨酸磷酸化作用活性。还可利用美国专利号5,766,863中所述的激酶受体激活测定法来确定HER受体激活以及抗体对该活性的阻抑。
在一个实施方案中，可以基本上如WO01/00245中所述来筛选抗体，所述抗体抑制MCF7细胞中的p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激。例如，可以将MCF7细胞接种在24-孔板中并且可以将针对HER2的单克隆抗体添加到每孔中并于室温温育30分钟；随后可以将rHRGβ1177-244加入到每管中至终浓度0.2nM，可以将温育持续8分钟。从每孔中吸出培养基，可以通过添加100μl的SDS样品缓冲液(5％SDS，25mM DTT，和25mM Tris-HCl，pH6.8)来终止反应。可以将每个样品(25μl)在4-12％梯度凝胶(Novex)上进行电泳并且随后电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。可以将抗磷酪氨酸(以1μg/ml)免疫印迹显影，并可以通过反射密度计量来量化Mr～180,000上的优势反应条带的强度。选择的抗体在这种测定中将优选显著抑制p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激至对照的大约0-35％。可以准备通过反射密度计量测定的p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激的抑制剂量反应曲线，并且可以计算目标抗体的IC50。在一个实施方案中，阻抑HER受体的配体激活的抗体将具有大约50nM或更少，更加优选10nM或更少的IC50，以便在这种测定中抑制p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激。当所述抗体是抗体片段如Fab片段时，IC50为大约100nM或更少，更加优选100nM或更少，以便在这种测定中抑制p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激。
还可以评估抗体对MDA-MB-175细胞的生长抑制作用，例如，基本上如Schaefer等人Oncogene 15：1385-1394(1997)中所述的那样。根据这种测定，可以用HER2单克隆抗体(10μg/mL)处理MDA-MB-175细胞4天并且结晶紫染色。与HER2抗体一起温育可以显示对这种细胞系的生长抑制作用，类似于单克隆抗体2C4所展示的那样。在另一个实施方案中，外源性HRG将不会显著逆转这种抑制。优选地，在外源性HRG存在和缺失的情况下，该抗体将能够在比单克隆抗体4D5更大的程度上抑制MDA-MB-175细胞的细胞增殖(任选地，在比单克隆抗体7F3更大的程度上)。
在一个实施方案中，目标HER2抗体可以阻抑MCF7和SK-BR-3细胞中HER2与HER3的调蛋白依赖型关联，如在共免疫沉淀实验中所测定的，所述实验如在WO01/00245中所述，这种阻抑基本上比单克隆抗体4D5更加有效，并且优选基本上比单克隆抗体7F3更加有效。
为了鉴定生长抑制性HER2抗体，可以筛选抑制过表达HER2的癌细胞生长的抗体。在一个实施方案中，选择的生长抑制性抗体能够抑制细胞培养物中的SK-BR-3细胞的生长大约20-100％并且优选大约50-100％，抗体浓度为大约0.5-30μg/ml。为了鉴定这种抗体，可以进行美国专利号5,677,171中所述的SK-BR-3测定。根据这种测定，将SK-BR-3细胞生长在F12和DMEM培养基的1:1混合物中，所述培养基添加了10％胎牛血清，谷氨酸盐和青霉素链霉素。将SK-BR-3细胞以20,000细胞接种在35mm细胞培养皿(2mls/35mm皿)中。每皿添加0.5-30μg/ml的HER2抗体。六天后，利用电子COULTERTM细胞计数仪与细胞数目，与未处理的细胞相比较。可以将抑制SK-BR-3细胞生长大约20-100％或大约50-100％的那些抗体选作生长抑制抗体。筛选生长抑制抗体，如4D5和3E8的测定法参见美国专利号5,677,171。
为了选择诱导凋亡的HER2抗体，可以利用BT474细胞进行膜联蛋白结合测定。如前段所述，培养BT474细胞并接种在培养皿中。随后移除培养基并以单独的新鲜培养基或包含10μg/ml单克隆抗体的培养基替代。三天培育期后，用PBS洗涤单层并通过胰蛋白酶化作用进行分离。随后离心细胞，重悬于Ca2+结合缓冲液中并如上面有关细胞死亡测定所讨论的那样等分到试管中。随后试管接受标记过的膜联蛋白(例如膜联蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。可以利用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson)来分析样品。将那些相对于对照来说诱导了统计学上显著水平的膜联蛋白结合的抗体选作凋亡诱导抗体。除了膜联蛋白结合测定之外，还可以利用使用BT474细胞的DNA染色测定法。为了进行这种测定，把如前两段所述用目标抗体处理过的BT474细胞与9μg/ml HOECHST33342TM一起于37℃温育2hr，随后利用MODFIT LTTM软件(Verity SoftwareHouse)在EPICS ELITETM流式细胞仪(Coulter Corporation)上进行分析。利用这种测定可以将抗体选作促凋亡抗体，所述抗体诱导凋亡细胞百分比的变化比未经处理的细胞的情况(高达100％的凋亡细胞)高2倍或更多(优选3倍或更多)。筛选诱导凋亡的HER2抗体，如7C2和7F3的测定法参见WO98/17797。
为了筛选被目标抗体结合的HER2上的表位的抗体，可以进行常规交叉阻抑测定，如在Antibody，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所述，以便评估抗体是否交叉阻抑抗体，如2C4或Pertuzumab是否结合HER2。或者，或此外，可以通过本领域已知的方法进行表位绘图和/或可以研究抗体-HER2结构(Franklin等人Cancer Cell 5：317-328(2004))，看HER2的何种结构域被抗体所结合。
(ix)免疫偶联物
本发明还涉及免疫偶联物，其含有与细胞毒药物偶联的抗体，所述细胞毒药物如化疗药物、毒素(例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即放射偶联物)。
可有效用于制备这类免疫偶联物的化疗药物如上述。本文还涉及抗体与一或多种小分子毒素，如加利车霉素，美登素(美国专利5,208,020)，单端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶联物。
在本发明的一个优选实施方案中，使抗体与一或多个美登素分子偶联(如每个抗体分子与约1-约10个美登素分子偶联)。美登素可转化成May-SS-Me，然后还原成May-SH3，并与修饰过的抗体反应(Chari等，癌症研究52：127-131(1992))产生美登木素生物碱-抗体偶联物。
另一种目标免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的HER2抗体。加利车霉素家族的抗生素能在亚pM浓度水平产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素结构类似物包括，但不限于γ1 1、α2 1、α3 1、N-乙酰基-γ1 1、PSAG以及θ1 1(Hinmam等，癌症研究53：3336-3342(1993)和Lode等，癌症研究58：2925-2928(1998))。也见美国专利5,714,586；5,712,374；5,264,586和5,773,001，其包含在本文作为参考。
可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(PhytolacaAmericana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。例见1993年10月28日公开的WO93/21232。
本发明还涉及一种免疫偶联物，其在抗体与具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间形成。
多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。
抗体与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科学238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的例示性偶联剂。见WO94/11026。这种接头可能是有利于细胞毒药物在细胞内释放的“可断开的接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等，癌症研究52：127-131(1992))。
在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉抗生物素蛋白)偶联，将该抗体-受体偶联物给予患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。
(x)其它抗体修饰
本文涉及对抗体的其它修饰。例如，可以使抗体与一种非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物交联。还可将抗体包被于通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate)微囊)中，胶体药物传递系统(如脂质体、白蛋白小球体、微乳胶、纳米颗粒和纳米胶囊)或巨乳胶(macroemulsions)中。这些技术公开于Remingtons’s Pharmaceutical Sciences，16版，Oslo，A.，Ed.(1980)。
在效应功能方面可能希望改进本发明的抗体，以增强抗体的抗原依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖型细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。或者或此外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而在该区域中形成链间二硫键。这样制得的同质二聚抗体可能有改进的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤能力和依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。也可如Wolff等Cancer Research53：2560-2565(1993)描述的那样，用异二聚功能性交联剂来制备抗肿瘤活性增强的同质二聚抗体。或者，可将抗体工程改造成具有双Fc区，从而可能增强补体裂解和ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3：219-230(1989)。
WO00/42072(Presta，L)描述了在人效应细胞存在时ADCC功能提高的抗体，其中所述抗体在其Fc区包含氨基酸取代。优选地，ADCC提高的抗体在Fc区的位置298，333，和/或334上包含取代。优选地经改变的Fc区是人IgG1Fc区，其包括这些位置中的一个，两个或三个上的取代或由其组成。
在WO99/51642，美国专利号6,194,551B1，美国专利号6,242,195B1，美国专利号6,528,624B1和美国专利号6,538,124(Idusogie等人)中描述了C1q结合和/或补体依赖型细胞毒性(CDC)改变了的抗体。所述抗体在其Fc区的氨基酸位置270，322，326，327，329，313，333和/或334中的一个或多个位置上包含氨基酸取代。
例如，为了提高抗体的血清半寿期，可以如美国专利5,739,277中所述，将补救受体结合表位并入抗体(特别是抗体片段)中。如本文所用的，术语“补救受体结合表位”指负责提高体内血清半寿期的IgG分子的Fc区的表位(例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)。在其Fc区具有取代并且血清半寿期提高的抗体还在WO00/42072(Presta，L)中进行了描述。
还考虑具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的经改造的抗体(美国申请号US2002/0004587A1，Miller等人)。
还可以将本文公开的HER2抗体配制成免疫脂质体。通过本领域已知的方法，如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和1997-1-23日公开的WO97/38731中所述的方法，来制备包含抗体的脂质体。在美国专利号5,013,556中公开了具有提高的周转时间的脂质体。
可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱，胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生成特别有用的脂质体。将脂质体通过确定孔径大小的滤器压出以产生具有所需直径的脂质体。如在Martin等人J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，可以将本发明的抗体的Fab′片段通过二硫交互反应偶联到脂质体上。任选地将化疗剂包含在所述脂质体中。参见Gabizon等人J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
(ix)例示性抗体
可以根据本发明配制的例示性抗体包括，但不限于下列：
抗ErbB抗体，包括抗HER2抗体，如本文中更加详细描述的那些；
结合B细胞表面标记的抗体，所述B细胞表面标记如CD19，CD20(例如Rituximab和人源化2H7)，CD22，CD40或BR3；
结合IgE的抗体，包括可由Genentech商购的Omalizumab
Figure S05843463520070620D000692
E26(本文的图17A-B)，HAE1(本文的图17A-B)，在其Fc区的位置265上具有氨基酸取代的IgE抗体(US 2004/0191244A1)，Hu-901(图17A-B herein)，WO2004/070011中的IgE抗体，或包含任何这些IgE抗体的可变结构域的抗体(包括抗体片段和全长抗体)。还参见，Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)；国际公开号WO 95/19181；美国专利号5,714,338，发布于1998-02-03；美国专利号5,091,313，发布于1992-02-25；1993-03-04公开的WO 93/04173；1999-01-14公开的WO 99/01556；和美国专利号5,714,338；
结合血管内皮生长因子(VEGF)或其受体的抗体，包括可由Genentech商购的Bevacizumab(AVASTINTM)，和Ranibizumab(LUCENTISTM)；
抗IL-8抗体(St John等人，Chest，103：932(1993)，和国际公开号WO95/23865)；
抗PSCA抗体(WO01/40309)；
抗CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)；
抗CD11a抗体，包括efalizumab(美国专利号5,622,700，WO 98/23761，Steppe等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)，和Hourmant等人，Transplantation 58：377-380(1994))；抗CD18抗体(1997-04-22发布的美国专利号5,622,700，或1997-07-31公开的WO 97/26912)；
抗Apo-2受体抗体(1998-11-19公开的WO 98/51793)；
抗TNF-α抗体包括cA2
Figure S05843463520070620D000694
CDP571和MAK-195(参见，1997-09-30发布的美国专利号5,672,347，Lorenz等人J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)，和Dhamaut等人Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；
抗组织因子(TF)(欧洲专利号0 420 937 B1，1994-11-09授权)；
抗人α4β7整合素(1998-02-19公开的WO 98/06248)；
抗EGFR抗体，包括1996-12-19公开的WO 96/40210中的嵌合的或人源化225抗体；
抗CD3抗体，如OKT3(1985-05-07发布的美国专利号4,515,893)；
抗CD25或抗tac抗体如CHI-621
Figure S05843463520070620D000701
和
Figure S05843463520070620D000702
(参见1997-12-02发布的美国专利号5,693,762)；
抗CD4抗体如cM-7412抗体(Choy等人Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；
抗CD52抗体如CAMPATH-1H(Riechmann等人Nature 332：323-337(1988)；
抗Fc受体抗体如Graziano等人J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的抗FcγRI的M22抗体；
抗癌胚抗原(CEA)抗体如hMN-14(Sharkey等人Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995)；
抗乳腺上皮细胞的抗体包括huBrE-3，hu-Mc 3和CHL 6(Ceriani等人Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；
结合结肠癌细胞的抗体如C242(Litton等人Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；
抗CD38抗体，例如AT13/5(Ellis等人J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；
抗CD33抗体如Hu M195(Jurcic等人Cancer Res 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；
抗CD22抗体如LL2或LymphoCide(Juweid等人Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995)；
抗EpCAM抗体如17-1A
Figure S05843463520070620D000703
抗GpIIb/IIIa抗体如abciximab或c7E3Fab
抗RSV抗体如MEDI-493
Figure S05843463520070620D000705
抗CMV抗体如PROTOVIR
Figure S05843463520070620D000706
抗HIV抗体如PRO542；
抗肝炎抗体如抗Hep B抗体OSTAVIR
Figure S05843463520070620D000707
抗CA125抗体OvaRex；
抗特异型GD3表位抗体BEC2；
抗αvβ3抗体VITAXIN
抗人肾细胞癌抗体如ch-G250；ING-1；
抗人17-1A抗体(3622W94)；
抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；
抗GD3神经节苷脂的抗人黑色素瘤抗体R24；
抗人鳞状细胞癌(SF-25)；和
抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
(xi)抗体变体组合物
在至少一个方面，本发明涉及包括组合物的制剂，所述组合物包含主要种类抗体及其一种或多种变体的混合物。当所述主要种类抗体结合HER2时，优选地HER2抗体(主要组分HER2抗体及其抗体变体的其中之一或二者)是这样一种抗体，其结合HER2的结构域II，比Trastuzumab更加有效地抑制HER二聚体化作用，和/或结合HER2的异二聚体结合位点。在这里主要种类抗体的优选实施方案是这样的抗体，其包括SEQ ID Nos.3和4中的可变轻和可变重氨基酸序列，最优选包括选自SEQ ID No.15和23的轻链氨基酸序列，和选自SEQ ID Nos.16和24的重链氨基酸序列。
在一个实施方案中，配制的HER2抗体组合物包含主要组分HER2抗体与其包含氨基末端引导延伸的氨基酸序列变体的混合物。优选地，氨基末端引导延伸在抗体变体的轻链上(例如在抗体变体的一个或两个轻链上)。主要组分HER2抗体或抗体变体可以是全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2片段的Fab)，但是优选两者都是全长抗体。本文的抗体变体可以在其任何一个或多个重或轻链上包含氨基末端引导延伸。优选地，氨基末端引导延伸在抗体的一个或两个轻链上。氨基末端引导延伸优选包含或由VHS-组成。组合物中氨基末端引导延伸的存在可以通过各种分析技术进行检测，包括，但不限于，N-末端序列分析，电荷异质性测定(例如，阳离子交换层析或毛细管区位电泳)，质谱分析，等等。组合物中抗体变体的量一般从构成任何用于检测变体的测定法(优选N末端序列分析)的检测极限的量到小于主要种类抗体的量。一般组合物中抗体分子的大约20％或更少(例如从大约1％到大约15％，例如从5％到大约15％)包含氨基末端引导延伸。优选利用定量N-末端序列分析或阳离子交换分析(优选地利用高分辨率，弱阳离子交换柱，如PROPAC WCX-10TM阳离子交换柱)来测定这种百分比量。除了氨基末端引导延伸变体之外，还包括其它的主要种类抗体和/或变体的氨基酸序列变化，包括但不限于在其一个或两个重链上包含C-末端赖氨酸残基的抗体，去酰胺化的抗体变体，等等。
另外，主要种类抗体或变体可以进一步包含糖基化作用变异，非限制性的实例包括含有附着在其Fc区上的G1或G2寡糖结构的HER2抗体，含有附着在其轻链上的糖部分的HER2抗体(例如附着到抗体的一个或两个轻链上的一个或两个糖部)，HER2抗体包括非糖基化重链。
III.制剂的制备
在第一方面，本发明提供稳定的药物制剂，其包括单克隆抗体，优选地全长人或人源化IgG1抗体，所述抗体在pH5.5-6.5，优选pH5.8-6.2的组氨酸-醋酸盐缓冲液中。不过，制剂中的抗体可以是包含抗原-结合区的抗体片段，如Fab或F(ab’)2片段。
在另一实施方案中，本发明涉及一种药物制剂，其包含以下成份或基本上由以下成份组成：大约10mg/mL到大约250mg/mL的易于发生脱酰胺或聚集的全长IgG1抗体；组氨酸-醋酸盐缓冲液，pH5.5-6.5；大约60mM到大约250mM的量的选自海藻糖和蔗糖的糖；和大约0.01％到大约0.1％量的聚山梨醇酯20。
在又一个实施方案中，本发明提供一种药物制剂，其包含在pH从大约5.5到大约6.5的组氨酸缓冲液中的结合HER2的结构域II的抗体，糖和表面活性剂。例如，该制剂可以包含从大约20mg/mL到大约40mg/mL的量的Pertuzumab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，蔗糖，和聚山梨醇酯20，其中该制剂的pH为从大约5.5到大约6.5。
在另一方面，本发明提供一种药物制剂，其包含在pH从大约5.5到大约6.5的组氨酸缓冲液中的DR5抗体，糖和表面活性剂。这种制剂可以，例如，包含从大约10mg/mL到大约30mg/mL的量的Apomab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，海藻糖，和聚山梨醇酯20，其中该制剂的pH为从大约5.5到大约6.5。
该制剂尤其对易于发生脱酰胺和/或聚集和/或片段化的抗体有用，因为该缓冲液阻滞其中配制的抗体的脱酰胺和/或聚集和/或片段化。此外，不像其它利用HCl制备的组氨酸缓冲液，组氨酸-醋酸盐缓冲液缺少在本文中发现有益的氯离子，因为当其与糖组合时这种缓冲液与聚山梨醇酯20对抗体具有相同的保护作用，并且是稳定的且可以保存在不锈钢罐中。因而，除了其本身包含易于发生脱酰胺和/或聚集和/或片段化的抗体的制剂以外，本发明还提供减弱治疗性单克隆抗体的脱酰胺，聚集和/或片段化的方法(例如，相对于在不同的pH或在不同的缓冲液中的组合物)，包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液，pH5.5-6.5中配制抗体。在这一实施方案中，可以在配制抗体之前或之后测定或测量脱酰胺，聚集和/或片段化，所述配制的抗体在制剂中及其保存时显示可接受的脱酰胺作用，聚集和/或片段化。
制剂中的抗体可以结合抗原，包括但不限于：HER2，CD20，IgE，DR5，BR3和VEGF。
当所述配制的抗体结合HER2时，它优选结合HER2的结构域II，比Trastuzumab更加有效地抑制HER二聚体化作用，和/或结合HER2的异二聚体结合位点。在本文中HER2抗体的优选实施方案是这样的抗体，其包括SEQ ID Nos.3和4中的可变轻和可变重氨基酸序列，最优选包括SEQ IDNos.15和16中的轻链和重链氨基酸序列(Pertuzumab)。
可以在这里配制的CD20抗体的实例包括：“C2B8”，它现在叫做“Rituximab”
Figure S05843463520070620D000731
可由Genentech商购(还参见美国专利号5,736,137，特此并入本文作为参考)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，命名为“Y2B8＂或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN可由Biogen-Idec商购(还参见美国专利号5,736,137，特此并入本文作为参考)；鼠IgG2a“B1，”也称作“Tositumomab，”任选地标记131I以生成“131I-B1”抗体(碘I131tositumomab，BEXXARTM)(美国专利号5,595,721，特此并入本文作为参考)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press等人血液69(2)：584-591(1987)及其包括“补缀框架(framecworkpatched)”或人源化1F5的变体(WO03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏号HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(Clark等人PNAS82：1766-1770(1985)；美国专利号5,500,362，并入本文作为参考)；人源化2H7；huMax-CD20(WO04/035607，Genmab，Denmark)；AME-133(Applied Molecular Evolution)；A20抗体或其变体如嵌合或人源化A20抗体(分别为cA20，hA20)(US2003/0219433，Immunomedics)；和单克隆抗体L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2，其可获自International Leukocyte Typing Workshop(Valentine等人，In：Leukocyte Typing III(McMichael，Ed.，p.440，Oxford University Press(1987))。
在配制的CD20抗体的优选实施方案中，CD20抗体是人源化2H7抗体。在本文中优选的人源化2H7抗体是2H7v16和2H7v511。人源化2H7v16可以是完整抗体或包含可变轻和可变重序列的抗体片段(SEQ ID Nos.26和29)。当所述人源化2H7v16抗体是全长抗体时，优选地它包含SEQ ID Nos.63和65的轻和重链氨基酸序列。
当所述抗体结合VEGF时，优选地它包含图19中所示的可变结构域序列。最优选的抗VEGF抗体是全长人源化IgG1抗体，Bevacizumab(AVASTINTM)，可由Genentech商购。
当所述配制的抗体结合IgE时，优选地它选自以下抗体组成的组：E25，可由Genentech商购的Omalizumab
Figure S05843463520070620D00074154637QIETU
(还参见图17A-B)，E26(本文的图17A-B)，HAE1(本文的图17A-B)，在其Fc区的位置265上具有氨基酸取代的IgE抗体(US 2004/0191244A1)，Hu-901(本文的图17A-B)，WO2004/070011中的IgE抗体，或包括那些IgE抗体任一种的可变结构域的抗体(包括抗体片段和全长抗体)。
当所述抗体结合肿瘤坏死因子(TNF)超家族中的受体或死亡受体时，优选地它结合DR5，并优选是激动剂抗体。在这一领域中的出版物包括Sheridan等人，Science，277：818-821(1997)，Pan等人，Science，277：815-818(1997)，1998-11-19公开的WO98/51793；1998-09-24公开的WO98/41629；Screaton等人，Curr.Biol.，7：693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，16：5386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17：141-143(1997)；1998-08-20公开的WO98/35986；1998-10-14公开的EP870，827；1998-10-22公开的WO98/46643；1999-01-21公开的WO99/02653；1999-02-25公开的WO99/09165；1998-03-11公开的WO99/11791；2002-08-13公开的US2002/0072091；2001-12-07公开的US 2002/0098550；2001-12-06发布的US6,313,269；2001-08-02公开的US 2001/0010924；2003-07-03公开的US2003/01255540；2002-10-31公开的US 2002/0160446，2002-04-25公开的US 2002/0048785；2002-02发布的US 6,342,369；2003-05-27公开的US6,569,642，2000-06-06发布的US 6,072,047，2003-11-04发布的US 6,642,358；2004-06-01发布的US 6,743,625。最优选的DR5抗体是Apomab。
以上提及的每种制剂都包含缓冲液，优选组氨酸缓冲液，最优选组氨酸-醋酸盐缓冲液pH5.5-6.5，优选地5.8-6.2，例如大约6.0。缓冲液的浓度至少部分根据所需的pH来规定。缓冲液的例示性浓度从大约1mM到大约200mM，优选地从大约10mM到大约40mM，最优选大约20mM。
制剂中的抗体浓度优选为从大约10mg/mL到大约250mg/mL。抗体浓度可以根据所希望的用途和制剂施用模式来确定。例如，当所述制剂用于IV给药(例如HER2抗体)时，制剂中的抗体浓度优选地从大约20mg/mL到大约40mg/mL。在例示性的希望用于静脉内(IV)给药的Pertuzumab制剂中，抗体浓度为从大约20mg/mL到大约40mg/mL，最优选大约30mg/mL。
当所述抗体用于SQ或IM给药(例如对于抗IgE抗体来说)时，可能需要较高浓度的抗体。这种基本上高的抗体浓度可以从大约50mg/mL到大约250mg/mL，或从大约80mg/mL到大约250mg/mL，或从大约100mg/mL到大约200mg/mL。
当所述制剂包含DR5抗体，如Apomab时，例示性的抗体浓度从大约10mg/mL到大约30mg/mL，例如大约20mg/mL DR5抗体；这类制剂可以用于静脉内给药。
用于给药的制剂优选为含水制剂(未冻干的)并且之前亦未进行冻干。尽管所述制剂可以进行冻干，但优选不做冻干处理。不过，没有在冻干过程中同时进行干燥的水性制剂的冷冻是特别要求保护的，这有利于其更长期的保存，例如在不锈钢罐中。
所述制剂优选地进一步包含糖，最优选二糖，如海藻糖或蔗糖。一般包含减少可溶性聚集物形成的量的糖，所述可溶性聚集物如在冻/融之后出现的那些。对于HER2抗体制剂来说，例示性的糖浓度为从大约10mM到大约1M，例如从大约60mM到大约250mM，最优选大约120mM，对于DR5抗体制剂来说为大约240mM。
尽管本文发现包含组氨酸-醋酸盐缓冲液和糖的制剂是稳定的，所述制剂任选地进一步包含表面活性剂，如聚山梨醇酯，最优选聚山梨醇酯20。一般包含减少可溶性聚集物形成(如在摇晃或运输后发生的)的量的表面活性剂。表面活性剂浓度优选地为从大约0.0001％到大约1.0％，最优选从大约0.01％到大约0.1％，例如大约0.02％。
任选地，所述制剂并不包含大量的盐如氯化钠。
制剂一般是无菌的，而这可以根据本领域技术人员已知的用于制成适于向人受试者给药的药物制剂的方法来实现，包括在制备制剂之前或之后通过无菌滤膜滤过。
另外，希望制剂在保存时稳定。熟练技术人员可以采用各种稳定性测定法来确定制剂的稳定性。例如，所述制剂可以是在以下保存条件下稳定的制剂：于大约40℃至少4周；于大约5℃或大约15℃至少3个月或至少1年；和/或大约-20℃至少3个月。稳定性可以在配剂时或在所述温度下保存后，通过评估制剂中抗体的物理稳定性，化学稳定性，和/或生物学活性来进行测试。物理和/或稳定性可以通过多种不同的方式定性和/或定量地评估，包括评估聚集物形成(例如利用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过肉眼观察)；通过利用阳离子交换层析或毛细管区位电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较减小的和完整的抗体；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能；等等。不稳定性可能会导致聚集，脱酰胺作用(例如Asn脱酰胺作用)，氧化作用(例如Met氧化作用)，异构化作用(例如Asp异构化作用)，剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，未配对的半胱氨酸(s)，N-末端延伸，C-末端加工，糖基化作用差异，等等。能够利用熟练技术人员可以获得的各种技术来评估生物学活性或抗原结合功能。
如上所述，特别考虑了制剂的冷冻。因此，可以在冻融后对制剂测试稳定性。
因此，本发明还提供了一种制备药物制剂的方法，包括制备本文所述的制剂，和评估制剂中的单克隆抗体的物理稳定性，化学稳定性，或生物学活性。
在优选的实施方案中，提供在小瓶中的优选水性形式的制剂，所述小瓶具有能够被注射器穿刺的盖子。合意地将小瓶保存于大约2-8℃，直到将它给药于其需要的受试者。小瓶可以是例如20cc的小瓶(例如对于420mg剂量)或50cc小瓶(例如对于1050mg剂量)。对于DR5抗体，如Apomab，可以在5cc玻璃小瓶(例如5.5ml注满)提供该制剂。
在另一实施方案中，在不锈钢罐中提供制剂。在不锈钢罐中的制剂任选地是冷冻的和未冻干的。
可以在制剂中包括一种或多种其它可药用的载体，赋形剂或稳定剂，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中所述的那些，只要它们不会副作用于制剂的所需特性。可接受的载体，赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度上对接受者无毒，包括：其它缓冲液剂；共溶剂；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；可生物降解的聚合物如聚酯；防腐剂；和/或形成盐的补偿离子如钠。
IV.用抗体制剂进行治疗
在一个实施方案中，本发明提供治疗受试者中疾病或病症的方法，包括向受试者施用有效量的本文所述的制剂以治疗疾病或病症。
当制剂中的抗体结合HER2时，优选将它用于治疗癌症。所述癌症一般将包含HER2-表达细胞，从而使得本文的HER2抗体能够结合癌细胞。因而，在此实施方案中本发明涉及在受试者中治疗表达HER2的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的HER2抗体药物制剂以治疗癌症。能够用该组合物进行治疗的各种癌症列在上面定义一节中。
还考虑HER2抗体制剂可以用于治疗和种非恶性疾病或病症，包括自身免疫疾病(例如银屑病)；子宫内膜异位；硬皮病；再狭窄；息肉如结肠息肉，鼻息肉或胃肠息肉；纤维腺瘤；呼吸道疾病(参见上面的定义)；胆囊炎；神经纤维瘤病；多囊肾病；炎性疾病；皮肤病包括银屑病和皮炎；血管病(参见上面的定义)；涉及血管上皮细胞异常增生的病症；胃肠溃疡；Menetrier氏病，分泌性腺瘤或蛋白质流失综合症；肾病；血管生成疾病；眼睛疾病如老年性黄斑变性，眼假组织胞浆菌病综合征(presumed ocular histoplasmosissyndrome)，增生型糖尿病视网膜病变导致的视网膜新血管形成，视网膜血管生成，糖尿病性视网膜病，或老年性黄斑变性；骨相关病理如骨关节炎、软骨病和骨质疏松症；脑局部缺血事件后损伤；纤维变性或水肿(edemia)疾病如肝硬化，肺部纤维化，carcoidosis，throiditis，系统性高粘滞性综合征，Osler Weber-Rendu病，慢性闭塞性肺病，或烧伤、外伤、辐射、中风、缺氧或局部缺血后的水肿；皮肤过敏反应；糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病；Guillain-Barre综合症；移植物抗宿主疾病或移植排斥；Paget氏病；骨或关节炎；光老化(例如由对人皮肤的UV辐射引起的)；良性前列腺肥大；某些微生物感染，所述微生物包括选自腺病毒，汉滩病毒，博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，耶尔森菌属(Yersinia spp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的微生物病原；由血小板聚集引发的血栓；生殖性疾病如子宫内膜异位，卵巢过度刺激综合征，先兆子痫，功能障碍性子宫出血，或月经频多；滑膜炎；动脉粥样瘤(atherorma)；急性和慢性肾病(包括增生性血管球性肾炎和糖尿病诱导的肾病)；湿疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性休克和真菌感染；家族性腺瘤息肉病；神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏病、爱滋病相关的痴呆、震颤性麻痹、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、脊柱肌肉萎缩(spinal muscular atrophy)和小脑变性)；骨髓增生异常综合征；再生障碍性贫血；局部缺血性损伤；肺、肾或肝的纤维化；T细胞介导的过敏疾病；婴儿肥大性幽门狭窄；泌尿障碍综合症；银屑病关节炎；和桥本氏甲状腺炎。本文疗法的优选非恶性指征包括银屑病、子宫内膜异位、硬皮病、血管病(例如再狭窄、动脉粥样硬化、冠状动脉病，或高血压)，结肠息肉，纤维腺瘤或呼吸道疾病(例如哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张或囊性纤维化)。
在制剂中的抗体结合B细胞表面标记如CD20或BR3时，可以将该制剂用于治疗B细胞恶性瘤，如NHL或CLL，自身免疫疾病，移植排斥，或阻抑对外来抗原，如抗体，毒素，基因治疗病毒载体，移植物，感染因子，或同种抗原的免疫反应(参见WO 01/03734，Grillo-Lopez等人)。
当在制剂中的抗体是IgE抗体时，可以将它用于治疗IgE介导的病症(USSN 2004/0197324A1，Liu and Shire)，如过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性(atopic)皮炎，过敏性胃肠病(allergic gastroenteropathy)，过敏，湿疹，风疹，过敏性支气管肺曲菌病(bronchopulmonary aspergillosis)，寄生虫病，高(hyper)-IgE缩合征，共济失调性毛细血管扩张症(ataxia-telangiectasia)，维-奥二氏综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)，胸腺淋巴发育不全(thymicalymphoplasia)，IgE骨髓瘤，和移植物抗宿主的反应。
结合TNF超家族中受体(例如结合DR5)的抗体，或结合VEGF(或其受体)的抗体，可以用来治疗癌症，所述癌症的各种形式在上面的定义一节进行了描述。优选地，DR5抗体制剂治疗的癌症是实体肿瘤或NHL。
当所述适应症是癌症时，可以用抗体制剂与化疗剂的组合来治疗患者。组合给药包括利用分离的制剂或单一药物制剂进行共给药或同时给药，和以任一种顺序连续给药，其中有一个时期两种(或所有)活性药剂同时发挥其生物学活性。因而，化疗剂可以在组合物施用之前或之后施用。在此实施方案中，在化疗剂的至少一次施用和组合物的至少一次施用之间的时间优选为大约1个月或更少，最优选大约2周或更少。或者，将化疗剂和组合物在单一制剂或分离制剂中同时施用给患者。
用所述制剂治疗将带来癌症或疾病的病征或症状的改善。例如，当进行治疗的疾病为癌症时，这种治疗可以带来存活的改善(整体存活和/或无进展存活)和/或可以带来目标临床反应(部分或完全)。另外，用化疗剂和抗体制剂的组合进行治疗可以对患者带来协同性的或大于加成性的治疗益处。
优选地，施用的制剂中的抗体是裸抗体。不过，施用的抗体可以与细胞毒性剂偶联。优选地，其结合的免疫偶联物和/或抗原由细胞内化，导致免疫偶联物杀伤其结合的癌细胞的治疗效力提高。在优选的实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。这些细胞毒性剂的实例包括美登木生物碱(maytansinoids)，刺孢霉素(calicheamicins)，核糖核酸酶和DNA核酸内切酶。
根据已知方法，如静脉内给药，例如，作为丸药，或通过一段时间的持续灌注，通过肌肉内，腹膜内，脑脊髓内(intracerobrospinal)，皮下，关节内，滑液内，鞘内，口服，局部，或吸入途径将所述制剂施用给人患者。优选静脉内，肌肉内或皮下给药抗体组合物，最优选静脉内给药。
对于皮下递送来说，可以通过注射器；注射装置(例如INJECT-EASETM和GENJECTTM装置)；注射笔(如GENPENTM)；无针装置(例如MEDIJECTORTM和BIOJECTORTM)；或皮下贴片递送系统施用所述制剂。
对于疾病的预防和治疗来说，适当剂量的抗体将取决于如上所定义的待治疗的疾病类型，疾病的严重性和进程，给药抗体是为了预防性还是治疗性目的，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。将抗体一次性或经过一系列治疗施用给患者。根据疾病的类型和严重性，大约1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的HER2或DR5抗体是用于施用给患者的起始候选剂量，可以通过一次或多次分离的给药，或通过连续灌注来进行。抗体的剂量一般为从大约0.05mg/kg到大约10mg/kg。如果施用化疗剂，通常以其已知的剂量施用它，或任选地降低用量，因为施用化疗剂会带来药物的组合作用或副作用。这类化疗剂的制备和剂量方案可以根据生产商的说明书或医师经验确定来使用。这类化疗的制备和剂量方案还在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，MD(1992)中进行了描述。
其它治疗性方案可以与抗体组合，包括，但不限于：第二(第三，第四，等等)化疗剂(即不同化疗剂的混合物)；另一种单克隆抗体；生长抑制剂；细胞毒性剂；化疗剂；EGFR-靶向药物；酪氨酸激酶抑制剂；抗血管生成剂；和/或细胞因子；等等。
除了上面的治疗方案之外，患者还可以进行手术去除癌细胞和/或放疗。
V.制造的商品
在本发明的另一实施方案中，提供包含本发明的药物制剂的制造商品，并提供其使用说明书。所述制造商品包括容器。合适的容器包括，例如，瓶子，小瓶(例如双室小瓶)，注射器(如双室注射器)和试管。所述容器要以由许多材料如玻璃或塑料形成。所述容器盛有制剂，而在容器上或与之相关联的标记可以标示用法说明。盛有制剂的容器可以是多用途小瓶，其允许反复施用重构的制剂(例如2-6次施用)。制造商品可以进一步包括从其它商业和用户立场所需要的材料，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤器，针，注射器，以及在前部分所述的使用说明书的包装插入物。
通过参照下列实施例将会更加充分地理解本发明。不过，它们不应被视为限制本发明的范围。将引用的所有文献和专利并入本文作为参考。
实施例
稳定的Pertuzumab液体制剂
这些实施例描述了稳定的液体制剂的研制和稳定性测试，所述液体制剂包含蛋白质浓度为大约10mg/mL-180mg/mL的Pertuzumab。选定的制剂具有低混浊度，并且在物理和化学上是稳定的。从该制剂中去除氯离子以减少溶蚀的危险。该制剂是等渗的，并且适于皮下或肌肉内递送。利用组氨酸-醋酸盐和蔗糖制剂防止振荡(agitation stress)后形成不可溶的聚集物，无需包括聚山梨醇酯20。
分析方法
颜色，外观和澄清度(CAC)
在室温白色荧光下通过相对于白色和黑色背景肉眼观察小瓶来测定样品的颜色，外观和澄清度。
UV浓度测量
首先将液体产品用制剂缓冲液稀释从而使278nm附近的Amax为0.5-1.0吸光度单位。在HP8453分光光度计上在1cm径长的石英杯中测量经稀释样品的UV吸光度。测量278nm和320nm的吸光度。将来自320nm的吸光度用于校正由于较大聚集物、泡沫和颗粒造成的背景光散射。相对于制剂缓冲液将测量调零。利用1.50(mg/mL)-1cm-1的吸收率来测定蛋白质浓度。
pH测量
利用RADIOMETER COPENHAGEN PHM82TM pH计于室温测量pH。所用的探测器是与放射计连接器相组合的玻璃/参照电极(Sigma，Cat#E-5759)。使用pH4.01和pH7.00(EM Science)的标准溶液来校准所述pH计。
离子交换层析(IEX)
采用阳离子交换层析测量电荷变量的改变。这种测定采用在HP1100TMHPLC系统上的DIONEX PROPAC WCX-10TM柱。用包含20mM MES pH6.0的流动相A将样品稀释到1mg/mL。随后将50mL的经稀释样品加载到保持环境温度的柱上。利用包含20mM MES，250mM NaCl，pH6.0的流动相B以浅NaCl梯度洗脱峰。于280nm监测洗脱物。利用HPCHEMSTATIONTM软件(Rev A08.03)分析数据。
毛细管区位电泳(CZE)
通过CZE测定Fab和F(ab’)2片段的纯度。将这一测定在BIORADBIOFOCUSTM3000TM毛细管电泳系统上以BIOCAP XLTM毛细管，50μmI.D.，44.6cm全长，和距离检测仪40cm的条件跑电泳。
大小排阻层析(SEC)
使用大小排阻层析来量化聚集物和片段。这种测定利用TSK G3000SWXLTM，7.8x300mm柱并在HP1100TM HPLC系统上运行。用流动相将样品稀释到10mg/mL并且注射体积为20μL。流动相为pH6.8的100mMK2HPO4并且用等度梯度以0.5mL/min将蛋白质洗脱45分钟。于280nm监测洗脱物的吸光度。利用HP CHEMSTATIONTM软件(Rev A08.03)进行整合。
生物学活性
通过测量其抑制人乳癌细胞系MDA-MB-175-VII的增殖的能力来测定Pertuzumab的生物学活性。
实施例1
在下列缓冲液条件中以1.0mg/mL的蛋白质浓度来配制Pertuzumab Fab和F(ab’)2抗体片段：
10mM柠檬酸盐，140mM NaCl，pH4.0；
10mM琥珀酸盐，140mM NaCl，pH5.0；
10mM琥珀酸盐，140mM NaCl，pH6.0；
10mM组氨酸，140mM NaCl，pH7.0；和
10mM甘氨酰甘氨酸(glycylglycine)，140mM NaCl，pH8.0。
过滤每种制剂并等分到3cc WHEATONTM USP I型玻璃瓶中，所述玻璃瓶用涂布TEFLONTM的灰色丁基合成橡胶塞子封口。将样品保藏于40±2℃。药物产品的稳定性分析显示Fab和F(ab’)2在pH5.0和6.0之间最稳定。
表2.pH对保存于40℃的Fab或F(ab’)2的降解的效应
Figure S05843463520070620D000821
实施例2
用120mM蔗糖和0.02％聚山梨醇酯20将Pertuzumab配制到20mM组氨酸-醋酸盐缓冲液中。用醋酸将制剂的pH调节到5.0和7.0之间的最终pH。蛋白质浓度为30mg/mL。将每种制剂填充入3cc USP I型玻璃瓶中并保存于40℃进行稳定性分析。结果显示Pertuzumab在pH6.0左右最稳定。
表3.pH对保存于40℃的Pertuzumab的降解的影响
制剂pH 温度(℃) 保存时间(wks) SEC％单体 IEX％主峰
5.0 40 2 99.4 57.4
5.5 40 2 99.4 59.2
6.0 40 2 99.4 60.6
6.5 40 2 99.3 60.5
7.0 40 2 99.1 54.0
5.0 40 4 97.3 48.1
5.5 40 4 99.1 50.5
6.0 40 4 99.1 53.3
6.5 40 4 99.0 52.3
7.0 40 4 98.6 42.3
实施例3
在下列赋形剂中制备蛋白质浓度为100mg/mL的Pertuzumab制剂：
(1)10mM组氨酸-HCl，240mM蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0；
(2)10mM组氨酸-醋酸盐(histine-acetate)，240mM蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0；
(3)10mM组氨酸-磷酸盐(histine-phosphate)，240mM蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0；
(4)10mM组氨酸-硫酸盐(histine-sulfate)，240mM蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0.
将每种制剂填充入3cc FORMA VITRUMTM USP I型玻璃瓶，所述玻璃瓶用FLUROTECTM面(faced)的丁基橡皮塞子封口。将样品保存于30℃和40℃并对稳定性评估质量(CAC)和纯度(SEC，IEC)。稳定性结果显示于40℃保存后组氨酸-磷酸盐缓冲液中的Pertuzumab比在其它组氨酸缓冲液中降解得快得多(图8和图9)。
实施例4
在下列缓冲液中通过超滤/渗滤将Pertuzumab浓缩至各种浓度：
(1)20mM组氨酸-醋酸盐，pH6.0；
(2)10mM组氨酸-HClpH6.0，和
(3)10mM组氨酸-硫酸盐，pH6.0。
在过滤前测量每种制剂的浊度。结果，如图10中所示，表明在组氨酸-醋酸盐和组氨酸-HCl中配制的Pertuzumab样品比在组氨酸-硫酸盐缓冲液中的样品具有更少量的不溶性聚集物。
实施例5
Pertuzumab以30mg/mL配制在20mM组氨酸-醋酸盐，120mM蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0中。将Pertuzmab填充在316L和HASTELLOYTM不锈钢微型罐中。将所有样品保存于-20℃和5℃并评估质量(CAC)，纯度(SEC，IEC)和强度(UV-Vis)。稳定性分析显示Pertuzumab在这种制剂中于-20℃和5℃保存至少3个月后是稳定的。无氯化物的制剂与316L和HASTELLOYTM不锈钢罐是相容的。
表4.在不锈钢罐中Pertuzumab的稳定性
Figure S05843463520070620D000841
a.颜色，外观和透明度的通过：澄清到微乳白色，无色到浅黄色溶液。
实施例6
利用切流过滤(TFF)来配制Pertuzumab。最终的制剂包含20mM组氨酸-醋酸盐，120mM蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0，蛋白质浓度为30mg/mL。将样品填充入20M1FORMA VITRUMTM USP I型玻璃瓶，所述玻璃瓶盖用20mm FLUROTECTM面的丁基橡皮塞子加帽，并以铝片盖封口。将所有样品保存于-70℃，5℃，15℃，并通过质量(CAC)，纯度(SEC，IEC)，强度(UV-Vis)，和势能(Bio测定)评估稳定性。结果显示Pertuzumab在这种制剂中于5℃和15℃保存至少3个月后是稳定的。
表5.在玻璃瓶中的Pertuzumab的稳定性
Temp(℃) 时间(月) CAC UV Spec.(mg/mL) SEC(％单体) IEC(％主峰) Bio测定(％比活性)
0 通过 29.2 99.8 64.1 83
-70 1 通过 29.7 99.8 65.2 92
3 通过 30.7 99.8 67.0 93
5 3 通过 30.4 99.7 67.2 90
15 1 通过 29.7 99.7 64.4 78
3 通过 30.4 99.7 65.5 93
实施例7
在下列缓冲液条件中配制100mg/mL的Pertuzumab：
(1)10mM组氨酸-HCl，pH6.0；
(2)10mM组氨酸-HCl，240mM蔗糖，pH6.0；
(3)20mM琥珀酸盐pH6.0；和
(4)20mM琥珀酸盐，240mM蔗糖pH6.0.
将每种制剂添加以不同浓度的聚山梨醇酯20。将所有样品填充入3ccUSP I型玻璃瓶中并于室温以70rpm水平搅动达7天。在第7天时间点上就浊度方面评估每个样品的稳定性。结果表明在最终的制剂中使用聚山梨醇酯20有效防止了不溶性聚集物的形成。参见图11。
实施例8
在下列制剂中制备Pertuzumab：
(1)25mg/mL Pertuzumab，10mM组氨酸-HCl，240mM蔗糖，pH6.0；
(2)50mg/mL Pertuzumab，10mM组氨酸-HCl，240mM蔗糖，pH6.0；
(3)60mg/mL Pertuzumab，20mM组氨酸-醋酸盐，120mM蔗糖，pH6.0.
将各种量的聚山梨醇酯20添加到每种制剂中。将所有样品填充入3ccUSP I型玻璃瓶中，并于室温以70rpm水平搅动达7天。在第7天时间点上就浊度方面评估每个样品的物理稳定性。结果表明使用组氨酸-HCl和蔗糖制剂中的聚山梨醇酯20有效防止了不溶性颗粒的形成。包含组氨酸-醋酸盐和蔗糖的制剂对于蛋白质似乎具有与聚山梨醇酯20相同的保护性作用。参见图12.
实施例9
如下配制Pertuzumab：
(1)100mg/mL蛋白质，10mM组氨酸-HCl，pH6.0；
(2)100mg/mL蛋白质，20mM琥珀酸盐，pH6.0；
(3)60mg/mL蛋白质，20mM组氨酸-醋酸盐，pH6.0。
将每种制剂混合以不同量的蔗糖。将所有样品无菌装入3cc USP I型玻璃瓶中。随后将它们冷冻于-70℃并于5℃融解三次。在三个周期的冻融之后测定每个样品的物理稳定性。结果表明蔗糖防止在冻融过程中形成可溶性聚集物。参见图13。
实施例10
用于治疗性用途的优选的Pertuzumab制剂基本上由20mM组氨酸醋酸盐、120mM蔗糖、0.02％聚山梨醇酯20、pH6.0中的30mg/mL Pertuzumab组成。
化合物 浓度 量/L
Pertuzumab 30mg/mL 30g
L-组氨酸MW＝155.16g/mol 20mM 3.10g
冰醋酸MW＝60.05g/mol密度＝1.05g/cm3 11.6mM 0.66mL
蔗糖MW＝342.3g/mol 120mM 41.1g
聚山梨醇酯20密度＝1.012g/cm3 0.02％(w/v) 0.2mL
MW：分子量
420mg剂量瓶配置：
小瓶：20cc Formal Vitrum Type I glass
塞子：20mm DAIKYO GREYTM，氟-树脂压制
帽：20mm顶部铝片
满装体积：14.50mL
递送物：生理盐水IV袋中的14.0mL Pertuzumab.
1050mg剂量瓶配置：
小瓶：50cc FormalVitrum Type I glass
塞子：20mm DAIKYO GREYTM，氟-树脂压制
帽：20mm顶部铝片
满装体积：36.0mL
递送物：生理盐水IV袋中的35.0mL Pertuzumab.
实施例11
本实施例涉及另一种Pertuzumab制剂，其已经用于I期和II期临床试验。该组合物由25mg/ml Pertuzumab，10mM组氨酸-HCl缓冲液，240mM蔗糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0组成。
成分 浓度
Pertuzumab 25mg/ml
L-His HCI.H2O(MW209.6) 1.12mg/ml(0.0125M)
L-His(MW155.2) 0.72mgml(0.0099M)
蔗糖(MW342.3) 82.15mg/ml(0.240M)
聚山梨醇酯20 0.2mg/ml(0.02％)
实施例12
细胞凋亡由内在和外在途径介导。化疗可以引发细胞损害并且可能通过响应细胞损害的内在途径而促进凋亡。不过，癌细胞经常通过在p53肿瘤抑制剂基因中的突变形成对化疗的抗性(Ashkenazi A.Targeting Death andDecoy Receptors of the Tumour-Necrosis Factor Superfamily.Nature Reviews2：420-430(2002))。位于细胞表面上的死亡受体，如DR4和DR5，通过不包括p53的外在途径促进凋亡。激动性分子，如Apo2L，结合DR4和DR5受体并通过Fas-关联的死亡结构域激活胱天蛋白酶(caspase)8和10。胱天蛋白酶8和10随后激活胱天蛋白酶3，6，和7以诱导凋亡。肿瘤细胞上的死亡受体的分子信号对于消除耐受传统疗法和分子像Apo2L的癌细胞有治疗性效力，目前正对其进行临床评估。
“Apomab”是全长CHO衍生的人源化IgG1，构建有λ轻链。它是针对DR5的激动剂抗体，其已经显示诱导各种癌细胞系的凋亡。利用鼠肿瘤植入模型的临床前研究已经显示Apomab与Apo2L相比具有类似或增强的肿瘤减小作用。正在将Apomab作为抗癌剂进行评估，其用于晚期实体肿瘤和非Hodgkin氏淋巴瘤(NHL)中。用在这些实验中的Apomab的重和轻链氨基酸序列显示在图27和28中。
抗体制剂的制备
重组产生的Apomab具有非常稀的蛋白质浓度和高pH。将所述材料浓缩到大约20mg/mL并利用Millipore Labscale切流过滤(TFF)系统以MILLIPORE PELLICONTM XL，PLCGC10，50cm膜交换入20mM醋酸钠，pH5.0缓冲液中。利用没有海藻糖和TWEEN
Figure S05843463520070620D000891
的醋酸钠，组氨酸醋酸盐，和磷酸钠将Apomab样品配制入各种缓冲液系统中，pH从4.0到7.0，利用10,000Da分子量隔绝膜(Pierce，Inc)进行透析。在最后的透析中添加240mM的海藻糖。透析后，向制剂中加入0.02％TWEEN20TM并用0.22μm滤器(Millipore，Inc.)过滤样品。将0.5mL体积的Apomab装入无菌3cc玻璃瓶(Forma Vitrum，Inc.)中并以13mm塞子(Daikyo，Inc)封闭。在-70℃，5℃，30℃，和40℃保存达3个月来评估蛋白质稳定性。
Apomab制剂的稳定性
对于药物产品稳定性测试，将Apomab配剂品装入5cc FORMA玻璃瓶中。使小瓶装填5.5mL的配制抗体，用20mm
Figure S05843463520070620D000893
塞子封闭，并以头朝上的位置保存于-70℃，5℃，30℃，和40℃。
对于药物物质稳定性测试，将Apomab配剂品通过0.22μm滤器进行无菌过滤并将10mL装入高压蒸汽处理过的20cc316L不锈钢小罐。将小罐头朝上竖直放置于-20℃和5℃。于规定的时间间隔从小罐中无菌移取1mL等份试样以评估蛋白质质量。对照小瓶为保存于-20℃中的3cc玻璃瓶中的1mL等份试样。
颜色，外观和澄清度
在室温白色荧光下利用白色和黑色背景的观察台来肉眼评估样品的澄清度，外观和颜色。为了分析药物物质，将小罐样品转移至3cc玻璃小瓶中进行检查。
pH
以用来测量缓冲液的THERMO ORION SURE-FLOW ROSSTM半微pH电极或用来测量蛋白质pH筛选样品的THERMO ORION GLSTM组合微pH电极，用于毒理学稳定性样品的Beckman微电极在室温测量pH。用pH7和pH4的缓冲液标准(EM Science)每天校准METERLABTM pHM240 pH/离子仪(Radiometer Analytical)。
浓度
利用AGILENT8453TM分光光度计通过紫外线吸收光谱来测定蛋白质浓度。以合适的空白制剂缓冲液来稀释样品以给出从0.5到1.0的吸光度。用稀释溶液将仪器调零并从240到500nm扫描光谱。从279nm纳米处的吸光度减去320nm纳米处的吸光度值以纠正偏移和光散射。通过下列等式来计算蛋白质浓度：
浓度(mg/mL)＝(A279-A320)X稀释因子
吸收率系数cm-1(mg/mL)-1
最初将基于序列的吸收率系数测定为1.32cm-1(mg/mL)-1并将这个值用于pH筛选研究。通过氨基酸分析和蛋白质水解法测定的后来的值为1.7cm-1(mg/mL)-1并且将这个值用于用在毒理学研究中的Apomab的稳定性分析。
离子交换层析
在装备了二极管阵列检测器的1100系列HPLC(Agilent Technologies，Inc.)上进行离子交换层析。在PROPAC WCX-10TM(Dionex)柱(4x250mm)上以0.5mL/min的流速，柱温度40℃进行层析。流动相A为25mM磷酸钠，pH6.5。流动相B为100mM氯化钠，与流动相A在相同的缓冲液中。用100％流动相A平衡柱。对于pH筛选样品将20mg量的Apomab加到柱上并于214nm监测吸光度。以下列梯度将蛋白质从柱上洗脱下来：
时间 (min)   ％A      ％B
0            100      0
50           0        100
51           100      0
70           100      0
对于用在毒理学研究中的物质的稳定性分析，将30mg量的Apomab加到柱上并于280nm监测吸光度。以下列梯度将蛋白质从柱上洗脱下来：
梯度：     时间 (min) ％A      ％B
0         100         0
40.0      40          60
41.0      0           100
45.0      0           100
45.1      100         0
60.0      100         0
大小排阻层析
在装备了二极管阵列检测器的1100系列HPLC(Agilent Technologies，Inc.)上进行大小排阻层析。将50μg量的Apomab加到TSK凝胶3000SWXLTM(7.8x300mm)柱上并对pH筛选样品以0.9mL/min的流速运行20分钟，而对毒理学稳定性样品以0.5mL/min的流速运行30分钟，以0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH6.2作为流动相。于280nm监测吸光度。
效能
效能生物测定的目的是利用ALAMARBLUETM测量Apomab杀伤Colo205细胞的能力。Colo205是一种结肠癌细胞系，它表达DR5和DR4死亡受体。这种测定包括基于代谢活性检测的荧光/比色生长指示剂。ALAMARBLUETM是一种氧化还原染料，它在氧化状态是蓝色和非荧光性的。细胞内代谢还原作用将它转变成红色，这种红色也是荧光性的。颜色和荧光的改变与活体细胞的代谢活性和数目成比例。当细胞死亡时信号降低。用抗Fc将Apomab稀释在培养基中，随后将Colo205细胞加入到Apomab样品中，于37℃温育48小时。最后2-3小时加入ALAMARBLUETM。于530nm激发和590nm发射读取培养板以得到相对荧光单位(RFU)。通过KALEIDAGRAPHTM分析数据。生成杀伤的稀释曲线。
结果
制剂pH筛选研究
利用由未增殖的稳定细胞系产生的Apomab研究pH对抗体稳定性的作用。对于这种分析，将Apomab以20mg/mL抗体配制在20mM醋酸钠缓冲液中，pH4.0，4.5，5.0，5.5；20mM组氨酸醋酸盐缓冲液中，pH6.0和6.5；和20mM磷酸钠缓冲液中，pH7.0。所有制剂都包含240mM海藻糖和0.02％TWEEN将制剂于-70℃，5℃，30℃，和40℃的温度保存达3个月，并通过各种分析测定法，包括CAC，pH，浓度，SEC和IEC来测定蛋白质稳定性。在样品保存过程中没有观察到CAC，pH或蛋白质浓度的显著变化。
通过SEC分析样品显示在5℃和-70℃保存期间没有发生显著的变化。不过，在30℃和40℃保存期间观察到了降解，其表现抗体片段和可溶性的聚集物的形成(图20)。为了比较制剂，监测保存期间抗体单体的动力学并且计算一级速率常数。对于抗体单体损失所获得的pH速率曲线显示在图21中。通过在pH6.0的组氨酸醋酸盐缓冲液中配制而获得了对于抗体单体稳定性的最佳条件。
通过IEC监测Apomab电荷异质性。在5℃和-70℃保存期间没有发生IEC曲线的显著变化。不过，观察到了降解，其表现根据制剂的不同而形成了酸性或碱性的变体(图22)。通常，增强碱性的变体在较低的制剂pH下形成而更酸性的变体在较高的制剂pH下形成。为了比较制剂，在保存期间监测IEC主峰的动力学并计算一级速率常数。对于IEC主峰损失所获得的pH速率曲线显示在图23中。通过IEC观察到的速率常数比由SEC观察到的常数高大约10倍(图21)。所以，IEC主峰的损失是抗体的初步降解，其将最终限制产品的保存期。另外，通过SEC观察到，通过在pH6.0的组氨酸醋酸盐缓冲液中配制而获得了稳定IEC主峰的最佳抗体稳定性。
在上述pH筛选数据的分析之后，选择Apomab制剂，其包含20mM组氨酸醋酸盐，240mM海藻糖，0.02％聚山梨醇酯20，pH6.0中的20mg/mL抗体。对于药物产品，药瓶配置包括装在5cc FORMA VITRUMTM小瓶中的5.5mL，所述小瓶带有20mM DAIKYOTM West塞子。将Apomab保存在不锈钢罐中。
在上述5cc玻璃瓶配置中评估Apomab药物产品的稳定性。将小瓶保存于-70℃(对照)，5℃，30℃，和40℃。于特定的时间间隔抽取样品并通过下列测定进行分析：颜色，外观，澄清度(CAC)，pH，蛋白质浓度，SEC，IEC，和效能。保存于-70℃和5℃的样品的这些测定结果显示在表6中，而保存于30℃和40℃的样品的结果显示在表7中。
表6.保存于-70℃和5℃的Apomab的稳定性数据
IECTemp 浓度 SEC (％主 效能(℃) 时间点 澄清度 颜色 pH (mg/mL) (％单体) 峰) (％比活性)
                                  6.0接受标准：     报告     报告    ±0.3   20±2     >95％   报告    60-140％
NA     T＝0     澄清     无色     5.9     20.2     99.8     63       94-70    1月      澄清     无色     6.0     20.5     99.8     63       86-70    2月      澄清     无色     6.0     20.4     99.7     64       91-70    3月      澄清     无色     6.0     20.5     99.7     63       83-70    6月      澄清     无色     6.0     20.4     99.7     64       85-70    9月      澄清     无色     6.0     20.4     99.8     65       89-70    12月     澄清     无色     6.0     20.8     99.7     63       107
5      1月      澄清     无色     6.0     20.5     99.7     63       895      2月      澄清     无色     6.0     20.4     99.7     64       995      3月      澄清     无色     6.0     20.6     99.7     63       845      6月      澄清     无色     6.0     20.5     99.7     64       935      9月      澄清     无色     6.0     20.6     99.7     64       885      12月     澄清     无色     6.0     20.7     99.6     64       106
表7.保存于30℃和40℃的Apomab的稳定性数据
                                              浓度      SEC       IEC        效能Temp(℃)时间点  澄清度     颜色      pH     (mg/mL)   (％单体)  (％主峰)  (％比活性)
 接受标准：      报告      报告   6.0±0.3   20±2      >95％     报告     60-140％
30      1月      澄清      无色      6.0      20.6      98.2       59        9130      2月      澄清      无色      6.0      20.3      97.4       54        8030      3月      澄清      无色      6.0      20.6      97.2       49        7430      6月      澄清      无色      6.0      20.2      94.1       37        5130      9月      澄清      浅黄      6.0      20.4      93.2       31        5530      12月     澄清      浅黄      6.0      20.6      91.6       25        59
40      1月      澄清      无色      6.0      20.4      96.6       44        7940      2月      澄清      无色      6.0      20.0      93.7       31        6440      3月      澄清      浅黄      5.9      20.3      91.5       22        5340      6月      澄清      浅黄      6.0      20.2      83.9       NT        2640      9月      澄清      黄色      5.9      20.3      78.8       NT        2540      12月     澄清      黄色      5.9      20.5      71.4       NT        31
NT＝未定量
在-70℃和5℃下保存12个月后没有观察到蛋白质质量的变化。例如，pH保持在6.0±0.3，Apomab呈现为澄清和无色液体，蛋白质浓度保持在20.0±2.0mg/mL，并且％单体未改变。另外，％IEC主峰没有显著变化而通过细胞杀伤效能测定确定的％比活性在60％到140％比活性的测定精度内。结果显示保存在5cc玻璃瓶中的Apomab在5℃稳定至少12个月。
表7显示蛋白质质量的改变发生在30℃和40℃。SEC显示％单体降低，伴随着主要为片段的物质的增多。聚集物与更高温度的情况一样增多，但速率低得多。不过，聚集物在40℃、6个月后明显增多。IEC％主峰降低，伴随着酸性变体的相应增多。在40℃、2个月和30℃、9个月后碱性峰稍微降低。在40℃保存六个月后，降低发生到IEC主峰不再能整合的程度。细胞杀伤生物测量显示在较高温度下较长的保存时间导致％比活性的损失。蛋白质浓度和pH未改变。溶液在40℃、3个月和30℃、9个月后变得浅黄并且在40℃、9个月后变成黄色。
药物物质稳定性
药物物质的冻融稳定性数据显示在表8中。
表8.装在小型不锈钢罐中的Apomab的冻融稳定性数据
Temp(℃) 冻融 浓度 SEC(冻/融) 循环数 澄清度 颜色 pH (mg/mL) (％单体)
        接受标准：           报告          报告       6.0±0.3     20.0±2.0        95％
对照(未冷冻)果    0          澄清          无色          6.0          20.9          99.6-20/25            1          澄清          无色          6.0          20.8          99.6-20/25            2          澄清          无色          6.0          20.8          99.6-20/25            3          澄清          无色          6.0          20.9          99.6
表9.装在小型不锈钢罐中的Apomab的稳定性数据
Temp 浓 度 SEC IEC 效能(℃) 时间点 澄清度 颜色 pH (mg/mL) (％单体)(％主峰)(％比活性)
                                  6.0接受标准：      报告     报告     ±0.3   20±2    >95％   报告    60-140％
NA     T＝0     澄清     无色     5.9     20.0     99.7     63     88-20    1月      澄清     无色     6.0     20.6     99.7     63     107-20    3月      澄清     无色     6.0     20.6     99.7     63     82-20    6月      澄清     无色     6.0     20.3     99.7     64     92-20    9月      澄清     无色     6.0     20.6     99.7     64     92-20    12月     澄清     无色     6.0     21.2     99.7     65     94
5      1月      澄清     无色     6.0     20.5     99.7     62     955      3月      澄清     无色     6.0     20.7     99.6     62     715      6月      澄清     无色     6.0     20.4     99.5     62     845      9月      澄清     无色     6.0     20.8     99.4     61     845      12月     澄清     无色     6.0     21.3     99.2     59     82
在-20℃冷冻至少15小时并在环境温度下融解三次之后没有观察到蛋白质的化学特性显著改变。例如，Apomab呈现为澄清和无色液体，pH保持在6.0±0.3，而SEC单体峰百分比未改变。
在-20℃和5℃评估不锈钢容器中的Apomab稳定性(表9)。
于特定的间隔、在无菌条件下从小罐中抽取样品并进行分析。
就pH，CAC，蛋白质浓度和通过IEC获得的％主峰而言，Apomab未显示蛋白质质量的改变，但通过SEC可知每3个月损失0.1％的单体。在5℃保存3个月期间观察到效力降低。不过，样品的效力在6个月和9个月的时间点再次提高。所以，在3个月时间点的效力差异被归结为测定偏差。通过pH，CAC，蛋白质浓度，SEC得到的％单体，IEC得到的％主峰，可见Apomab未显示蛋白质质量的改变，并且效力没有明显改变。稳定性数据显示Apomab在-20℃稳定至少1年而在5℃稳定三个月。
结论
进行制剂筛选研究以选择Apomab制剂。利用醋酸钠，组氨酸醋酸盐，和磷酸钠，与240mM二水海藻糖和0.02％聚山梨醇酯20一起作为缓冲液，pH范围覆盖了4.0到7.0的pH筛选显示，Apomab在pH6.0的溶液中最稳定。所以，开发了由20mM组氨酸醋酸盐，240mM海藻糖，0.02％聚山梨醇酯2，pH6.0组成的制剂，并且通过实验证明是稳定的。利用这种制剂，显示Apomab在5℃稳定至少12个月。另外，当保存在316L不锈钢容器中时，显示Apomab在-20℃稳定至少12个月而在5℃稳定三个月。当进行多达3次冻融循环时还显示Apomab是稳定的。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)
ANDYA，JAMES
GWEE，SHIANG C.
LIU，JUN
SHEN，YE
<120>组氨酸-醋酸盐缓冲液中的抗体制剂
<130>P2104R1 PCT
<140>PCT/US2005/037471
<141>2005-10-19
<150>US 60/620,413
<151>2004-10-20
<160>74
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
                 50                  55                  60
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
  1               5                  10                  15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser
                 65                  70                  75
Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
                 95                 100                 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
                110                 115
<210>3
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>4
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
                 95                 100                 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115
<210>5
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
                 20                  25                  30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>6
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu
                 95                 100                 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的.
<220>
<221>Xaa
<222>10
<223>Xaa优选为D或S
<400>7
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa
                  5                  10
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>8
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
  1               5                  10                  15
Lys Gly
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>9
Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
                  5                  10
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>10
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala
                  5                  10
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的.
<220>
<221>Xaa
<222>5
<223>Xaa优选为R或L
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>Xaa优选为Y或E
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>Xaa优选为T或S
<400>11
Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa
                  5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>12
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr
                  5
<210>13
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ly sAla Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
                110                 115                 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                125                 130                 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
                140                 145                 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
                155                 160                 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
                170                 175                 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
                185                 190                 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
                200                 205                 210
Arg Gly Glu Cys
<210>14
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
                 20                  25                  30
Asp Thr Tyr Ile Hi s Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cy sSer Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr
                 95                 100                 105
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115                 120
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
                125                 130                 135
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
                140                 145                 150
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
                155                 160                 165
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
                170                 175                 180
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
                185                 190                 195
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
                200                 205                 210
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
                215                 220                 225
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
                230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
                275                 280                 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
                290                 295                 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                305                 310                 315
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
                320                 325                 330
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
                335                 340                 345
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
                350                 355                 360
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
                365                 370                 375
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
                380                 385                 390
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                395                 400                 405
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                410                 415                 420
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
                425                 430                 435
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445
<210>15
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
                110                 115                 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                125                 130                 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
                140                 145                 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
                155                 160                 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
                170                 175                 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
                185                 190                 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
                200                 205                 210
Arg Gly Glu Cys
<210>16
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
                 95                 100                 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
                110                 115                 120
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
                125                 130                 135
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
                140                 145                 150
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
                155                 160                 165
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
                170                 175                 180
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
                185                 190                 195
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
                200                 205                 210
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
                215                 220                 225
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
                230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
                260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
                275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
                290                 295                 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                305                 310                 315
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys yal Ser Asn Lys Ala Leu
                320                 325                 330
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
                335                 340                 345
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
                350                 355                 360
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                365                 370                 375
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
                380                 385                 390
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                395                 400                 405
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                410                 415                 420
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
                425                 430                 435
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445
<210>17
<211>233
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>17
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr
  1               5                  10                  15
Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
                 20                  25                  30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
                 35                  40                  45
Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                 50                  55                  60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
                 65                  70                  75
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 80                  85                  90
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
                 95                 100                 105
Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
                110                 115                 120
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala A1a Pro Ser Val Phe
                125                 130                 135
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
                140                 145                 150
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
                155                 160                 165
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser G y Asn Ser Gln Glu
                170                 175                 180
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                185                 190                 195
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
                200                 205                 210
TyrAla Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
                215                 220                 225
Lys Ser Phe Asn Arg Gly G1u Cys
                230
<210>18
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>18
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr
  1               5                  10                  15
Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
                 20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
                 35                  40                  45
Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro
                 50                  55                  60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly
                 65                  70                  75
Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser
                 80                  85                  90
Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
                 95                 100                 105
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu G1y
                110                 115                 120
Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly G1n Gly Thr Leu Val Thr
                125                 130                 135
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
                140                 145                 150
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
                155                 160                 165
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
                170                 175                 180
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Ple Pro Ala Val Leu
                185                 190                 195
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
                200                 205                 210
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
                215                 220                 225
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
                230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
                260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
                275                 280                 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                290                 295                 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                305                 310                 315
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                320                 325                 330
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
                335                 340                 345
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
                350                 355                 360
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
                365                 370                 375
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
                380                 385                 390
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
                395                 400                 405
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
                410                 415                 420
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                425                 430                 435
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
                440                 445                 450
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
                455                 460                 465
Pro Gly
<210>19
<211>195
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala
  1               5                  10                  15
Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly
                 20                  25                  30
Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr
                 35                  40                  45
Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly
                 50                  55                  60
Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln
                 65                  70                  75
Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
                 80                  85                  90
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr
                 95                 100                 105
Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu
                110                 115                 120
Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg
                125                 130                 135
Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile
                140                 145                 150
Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn
                155                 160                 165
Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser
                170                 175                 180
Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg
                185                 190                 195
<210>20
<211>124
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro
  1               5                  10                  15
Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro
                 20                  25                  30
Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
                 35                  40                  45
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp
                 50                  55                  60
Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly
                 65                  70                  75
Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp
                 80                  85                  90
Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val
                 95                 100                 105
Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro
                110                 115                 120
Cys Ala Arg Val
<210>21
<211>169
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val
  1               5                  10                  15
Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe
                 20                  25                  30
Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala
                 35                  40                  45
Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu
                 50                  55                  60
Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
                 65                  70                  75
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile
                 80                  85                  90
Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln
                 95                 100                 105
Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu
                110                 115                 120
Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe
                125                 130                 135
Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln
                140                 145                 150
Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly
                155                 160                 165
Glu Gly Leu Ala
<210>22
<211>142
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro
  1               5                  10                  15
Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys
                 20                  25                  30
Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val
                 35                  40                  45
Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln
                 50                  55                  60
Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val
                 65                  70                  75
Ala CysAla Hi s Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys
                 80                  85                  90
Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys
                 95                 100                 105
Phe Pro Asp Glu Glu GlyAla Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
                110                 115120
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu
                125                 130                 135
Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
                140
<210>23
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>23
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln
                 20                  25                  30
Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
                 35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly
                 50                  55                  60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                 65                  70                  75
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
                 80                  85                  90
Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr
                 95                 100                 105
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
                110                 115                 120
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
                125                 130                 135
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
                140                 145                 150
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
                155                 160                 165
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                170                 175                 180
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
                185                 190                 195
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
                200                 205                 210
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                215
<210>24
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
                 95                 100                 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
                110                 115                 120
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
                125                 130                 135
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
                140                 145                 150
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
                155                 160                 165
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
                170                 175                 180
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
                185                 190                 195
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
                200                 205                 210
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
                215                 220                 225
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
                230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
                260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
                275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
                290                 295                 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                305                 310                 315
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
                320                 325                 330
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
                335                 340                 345
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
                350                 355                 360
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                365                 370                 375
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
                380                 385                 390
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                395                 400                 405
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                410                 415                 420
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
                425                 430                 435
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                440                 445
<210>25
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>25
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
  1               5                  10                  15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>26
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>27
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
                 20                  25                  30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>28
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>28
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
                 80                  85                  90
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser
<210>29
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser
<210>30
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly G v Ser Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
                 65                  70                  75
Ly s Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                   85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu
                 95                 100                 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115
<210>31
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的.
<400>31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser
                 20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
                 35                  40                  45
Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>32
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>32
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser G v Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser
                 65                  70                  75
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Asp Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser
                 95                 100                 105
Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr
                110                 115                 120
Val Ser Ser
<210>33
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser
                 20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro 6lu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>34
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser
                 95                 100                 105
Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
                110                 115                 120
Val Ser Ser
<210>35
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>35
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser
                 20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys
<210>36
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr
                 20                  25                  30
His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr
                 95                 100                 105
Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln G v Thr Leu Val Thr
                110                 115                 120
Val Ser Ser
<210>37
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>37
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
                140                 145                 150
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
                155                 160                 165
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
                170                 175                 180
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
                185                 190                 195
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
                200                 205                 210
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                215
<210>39
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp
                 20                  25                  30
Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                 35                  40                  45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
                 50                  55                  60
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 65                  70                  75
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
                 80                  85                  90
Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
                 95                 100                 105
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
                110                 115                 120
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
                125                 130                 135
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
                140                 145                 150
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
                155                 160                 165
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                170                 175                 180
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
                185                 190                 195
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
                200                 205                 210
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                215
<210>40
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp
                 20                  25                  30
Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                 35                  40                  45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
                 50                  55                  60
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 65                  70                  75
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
                 80                  85                  90
Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
                 95                 100                 105
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
                110                 115                 120
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
                125                 130                 135
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
                140                 145                 150
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
                155                 160                 165
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                170                 175                 180
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
                185                 190                 195
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
                200                 205                 210
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                215
<210>38
<211>218
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>38
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp
                 20                  25                  30
Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                 35                  40                  45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
                 50                  55                  60
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 65                  70                  75
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
                 80                  85                  90
Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
                 95                 100                 105
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
                110                 115                 120
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                125                 130                 135
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
<400>40
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
  1               5                  10                  15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly
                 20                  25                  30
Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
                110                 115                 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                125                 130                 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
                140                 145                 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
                155                 160                 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
                170                 175                 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
                185                 190                 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
                200                 205                 210
Arg Gly Glu Cys
<210>41
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
                 20                  25                  30
Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
                 35                  40                  45
Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr
                 50                  55                  60
Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
                65                  70                   75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His
                 95                 100                 105
Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
                110                 115                 120
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
                125                 130                 135
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cy s Leu Val
                140                 145                  150
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
                155                 160                 165
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                170                 175                 180
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                185                 190                 195
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
                200                 205                 210
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
                215                 220                 225
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
                260                 265                 270
Ser Hi s Glu Asp Pro Glu Val Lys PheAsn Trp Tyr Val Asp Gly
                275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                305                 310                 315
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                320                 325                 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
                335                 340                 345
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
                350                 355                 360
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                365                 370                 375
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp G u Ser Asn Gly Gln
                380                 385                 390
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                395                 400                 405
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                410                 415                 420
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
                425                 430                 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445                 450
Lys
<210>42
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser G y Tyr Ser Ile Thr
                 20                  25                  30
Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
                 35                  40                  45
Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr
                 50                  55                  60
Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His
                 95                 100                 105
Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
                110                 115                 120
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
                125                 130                 135
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
                140                 145                 150
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
                155                 160                 165
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                170                 175                 180
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                185                 190                 195
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
                200                 205                 210
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
                215                 220                 225
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
                260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
                275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Tnr Val Leu His Gln
                305                 310                 315
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                320                 325                 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
                335                 340                 345
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
                350                 355                 360
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                365                 370                 375
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
                380                 385                 390
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                395                 400                 405
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                410                 415                 420
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
                425                 430                 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445                 450
Lys
<210>43
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
                 20                  25                  30
Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
                 35                  40                  45
Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr
                 50                  55                  60
Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His
                 95                 100                 105
Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
                110                 115                 120
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
                125                 130                 135
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
                140                 145                 150
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
                155                 160                 165
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                170                 175                 180
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                185                 190                 195
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
                200                 205                 210
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
                215                 220                 225
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
                260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
                275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                305                 310                 315
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                320                 325                 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
                335                 340                 345
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
                350                 355                 360
Glu Met Thr Lys Asn Gln yal Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                365                 370                 375
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
                380                 385                 390
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                395                 400                 405
GlySer Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Ly s Ser Arg
                410                 415                 420
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
                425                 430                 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445                 450
Lys
<210>44
<211>453
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr
                 50                  55                  60
Asn Glu Lys Phe Lys AlaA rg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser
                 95                 100                 105
Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
                110                 115                 120
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
                125                 130                 135
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
                140                 145                 150
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
                155                 160                 165
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                170                 175                 180
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
                185                 190                 195
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
                200                 205                 210
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
                215                 220                 225
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                230                 235                 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
                245                 250                 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
                260                 265                 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                290                 295                 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                305                 310                 315
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
                320                 325                 330
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
                335                 340                 345
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
                350                 355                 360
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
                365                 370                 375
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
                380                 385                 390
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
                395                 400                 405
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                410                 415                 420
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
                425                 430                 435
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
                440                 445                 450
Pro Gly Lys
<210>45
<211>1042
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>不确定
<222>447
<223>N是T或G
<400>45
tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg  50
ctgcctggct gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga 100
tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 150
atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta 200
ctttaccaac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca 250
ttgcttgttt cttaaaagaa gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa  300
gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc aagtggcaac tccgtcagct  350
cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt tctacagttc  400
aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtccncag  450
agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc  500
ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct  550
gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg  600
aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg ttttactaca tctattccca  650
aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca  700
aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata  750
ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata  800
tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg  850
acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat  900
gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga  950
aaaagcaata acctcaaagt gactattcag ttttcaggat gatacactat 1000
gaagatgttt caaaaaatct gaccaaaaca aacaaacaga  aa        1042
<210>46
<211>281
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>46
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr
  1               5                  10                  15
Cys Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys
                 20                  25                  30
Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met
                 35                  40                  45
Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser
                 65                  70                  75
Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys
                 80                  85                  90
Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu
                 95                 100                 105
Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln
                110                 115                 120
Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr
                125                 130                 135
Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys
                140                 145                 150
Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser
                155                 160                 165
Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly
                170                 175                 180
Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu
                185                 190                 195
Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile
                200                 205                 210
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
                215                 220                 225
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
                230                 235                 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg
                245                 250                 255
Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
                260                 265                 270
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
                275                 280
<210>47
<211>411
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>Xaa
<222>410
<223>Xaa是L或M
<400>47
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg
  1               5                  10                  15
Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro
                 20                  25                  30
Gly Leu Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val
                 35                  40                  45
Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp
                 50                  55                  60
Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser
                 65                  70                  75
Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp
                 80                  85                  90
Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr
                 95                 100                 105
His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp
                110                 115                 120
Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr
                125                 130                 135
Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro
                140                 145                 150
Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val
                155                 160                 165
Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His
                170                 175                 180
Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val
                185                 190                 195
Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys
                200                 205                 210
Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp
                215                 220                 225
Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp
                230                 235                 240
Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val
                245                 250                 255
Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly
                260                 265                 270
Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro
                275                 280                 285
Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala
                290                 295                 300
Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp
                305                 310                 315
Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg
                320                 325                 330
Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu
                335                 340                 345
Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp
                350                 355                 360
Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp
                365                 370                 375
Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Glu
                380                 385                 390
Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn
                395                 400                 405
Ala Asp Ser Ala Xaa Ser
                410
<210>48
<211>1799
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>48
cccacgcgtc cgcataaatc agcacgcggc cggagaaccc cgcaatctct   50
gcgcccacaa aatacaccga cgatgcccga tctactttaa gggctgaaac  100
ccacgggcct gagagactat aagagcgttc cctaccgcca tggaacaacg  150
gggacagaac gccccggccg cttcgggggc ccggaaaagg cacggcccag  200
gacccaggga ggcgcgggga gccaggcctg ggctccgggt ccccaagacc  250
cttgtgctcg ttgtcgccgc ggtcctgctg ttggtctcag ctgagtctgc  300
tctgatcacc caacaagacc tagctcccca gcagagagcg gccccacaac  350
aaaagaggtc cagcccctca gagggattgt gtccacctgg acaccatatc  400
tcagaagacg gtagagattg catctcctgc aaatatggac aggactatag  450
cactcactgg aatgacctcc ttttctgctt gcgctgcacc aggtgtgatt  500
caggtgaagt ggagctaagt ccctgcacca cgaccagaaa cacagtgtgt  550
cagtgcgaag aaggcacctt ccgggaagaa gattctcctg agatgtgccg  600
gaagtgccgc acagggtgtc ccagagggat ggtcaaggtc ggtgattgta  650
caccctggag tgacatcgaa tgtgtccaca aagaatcagg catcatcata  700
ggagtcacag ttgcagccgt agtcttgatt gtggctgtgt ttgtttgcaa  750
gtctttactg tggaagaaag tccttcctta cctgaaaggc atctgctcag  800
gtggtggtgg ggaccctgag cgtgtggaca gaagctcaca acgacctggg  850
gctgaggaca atgtcctcaa tgagatcgtg agtatcttgc agcccaccca  900
ggtccctgag caggaaatgg aagtccagga gccagcagag ccaacaggtg  950
tcaacatgtt gtcccccggg gagtcagagc atctgctgga accggcagaa 1000
gctgaaaggt ctcagaggag gaggctgctg gttccagcaa atgaaggtga  1050
tcccactgag actctgagac agtgcttcga tgactttgca gacttggtgc  1100
cctttgactc ctgggagccg ctcatgagga agttgggcct catggacaat  1150
gagataaagg tggctaaagc tgaggcagcg ggccacaggg acaccttgta  1200
cacgatgctg ataaagtggg tcaacaaaac cgggcgagat gcctctgtcc  1250
acaccctgct ggatgccttg gagacgctgg gagagagact tgccaagcag  1300
aagattgagg accacttgtt gagctctgga aagttcatgt atctagaagg  1350
taatgcagac tctgccwtgt cctaagtgtg attctcttca ggaagtgaga  1400
ccttccctgg tttacctttt ttctggaaaa agcccaactg gactccagtc  1450
agtaggaaag tgccacaatt gtcacatgac cggtactgga agaaactctc  1500
ccatccaaca tcacccagtg gatggaacat cctgtaactt ttcactgcac  1550
ttggcattat ttttataagc tgaatgtgat aataaggaca ctatggaaat  1600
gtctggatca ttccgtttgt gcgtactttg agatttggtt tgggatgtca  1650
ttgttttcac agcacttttt tatcctaatg taaatgcttt atttatttat  1700
ttgggctaca ttgtaagatc catctacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag  1750
ggcggccgcg actctagagt cgacctgcag aagcttggcc  gccatggcc  1799
<210>49
<211>440
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>49
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg
  1               5                  10                  15
Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro
                 20                  25                  30
Gly Pro Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val
                 35                  40                  45
Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp
                 50                  55                  60
Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser
                 65                  70                  75
Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp
                 80                  85                  90
Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr
                 95                 100                 105
His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp
                110                 115                 120
Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr
                125                 130                 135
Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro
                140                 145                 150
Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val
                155                 160                 165
Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His
                170                 175                 180
Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro Ala Val Glu
                185                 190                 195
Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro Cys Ser
                200                 205                 210
Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val Leu
                215                 220                 225
Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
                230                 235                 240
Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro
                245                 250                 255
Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn
                260                 265                 270
Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro
                275                 280                 285
Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val
                290                 295                 300
Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala
                305                 310                 315
Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn
                320                 325                 330
Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe
                335                 340                 345
Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys
                350                 355                 360
Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala
                365                 370                 375
Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val
                380                 385                 390
Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala
                395                 400                 405
Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp
                410                 415                 420
His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn Ala
                425                 430                 435
Asp Ser Ala Met Ser
                440
<210>50
<211>1323
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>50
atggaacaac ggggacagaa cgccccggcc gcttcggggg cccggaaaag   50
gcacggccca ggacccaggg aggcgcgggg agccaggcct gggccccggg  100
tccccaagac ccttgtgctc gttgtcgccg cggtcctgct gttggtctca  150
gctgagtctg ctctgatcac ccaacaagac ctagctcccc agcagagagc  200
ggccccacaa caaaagaggt ccagcccctc agagggattg tgtccacctg  250
gacaccatat ctcagaagac ggtagagatt gcatctcctg caaatatgga  300
caggactata gcactcactg gaatgacctc cttttctgct tgcgctgcac  350
caggtgtgat tcaggtgaag tggagctaag tccgtgcacc acgaccagaa  400
acacagtgtg tcagtgcgaa gaaggcacct tccgggaaga agattctcct  450
gagatgtgcc ggaagtgccg cacagggtgt cccagaggga tggtcaaggt  500
cggtgattgt acaccctgga gtgacatcga atgtgtccac aaagaatcag  550
gtacaaagca cagtggggaa gccccagctg tggaggagac ggtgacctcc  600
agcccaggga ctcctgcctc tccctgttct ctctcaggca tcatcatagg  650
agtcacagtt gcagccgtag tcttgattgt ggctgtgttt gtttgcaagt  700
ctttactgtg gaagaaagtc cttccttacc tgaaaggcat ctgctcaggt  750
ggtggtgggg accctgagcg tgtggacaga agctcacaac gacctggggc  800
tgaggacaat gtcctcaatg agatcgtgag tatcttgcag cccacccagg  850
tccctgagca ggaaatggaa gtccaggagc cagcagagcc aacaggtgtc  900
aacatgttgt cccccgggga gtcagagcat ctgctggaac cggcagaagc  950
tgaaaggtct cagaggagga ggctgctggt tccagcaaat gaaggtgatc 1000
ccactgagac tctgagacag tgcttcgatg actttgcaga cttggtgccc 1050
tttgactcct gggagccgct catgaggaag ttgggcctca tggacaatga 1100
gataaaggtg gctaaagctg aggcagcggg ccacagggac accttgtaca 1150
cgatgctgat aaagtgggtc aacaaaaccg ggcgagatgc ctctgtccac 1200
accctgctgg atgccttgga gacgctggga gagagacttg ccaagcagaa 1250
gattgaggac cacttgttga gctctggaaa gttcatgtat ctagaaggta 1300
atgcagactc tgccatgtcc taa                              1323
<210>51
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Glu Arg Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
                 20                  25                  30
Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Gln Gly Gly Ser Thr Gly Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
                 65                  70                  75
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ile Leu Gly Ala Gly Arg Gly
                 95                 100                 105
Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
                110                 115                 120
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
                125                 130                 135
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
                140                 145                 150
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
                155                 160                 165
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                170                 175                 180
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                185                 190                 195
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
                200                 205                 210
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
                215                 220                 225
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
                260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
                275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                305                 310                 315
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                320                 325                 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
                335                 340                 345
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
                350                 355                 360
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                365                 370                 375
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
                380                 385                 390
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                395                 400                 405
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                410                 415                 420
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
                425                 430                 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445                 450
Lys
<210>52
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>52
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
  1               5                  10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr
                 20                  25                  30
Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
                 35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
                 50                  55                  60
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
                 65                  70                  75
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ala Asp
                 80                  85                  90
Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
                 95                 100                 105
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
                110                 115                 120
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
                125                 130                 135
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys
                140                 145                 150
Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro
                155                 160                 165
Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser
                170                 175                 180
Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln
                185                 190                 195
Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr
                200                 205                 210
Glu Cys Ser
<210>53
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>53
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Glu Arg Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
                 20                  25                  30
Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
                 65                  70                  75
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ile Leu Gly Ala Gly Arg Gly
                 95                 100                 105
Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
                110                 115                 120
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
                125                 130                 135
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
                140                 145                 150
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
                155                 160                 165
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
                170                 175                 180
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
                185                 190                 195
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
                200                 205                 210
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
                215                 220                 225
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
                260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
                275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                305                 310                 315
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                320                 325                 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
                335                 340                 345
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
                350                 355                 360
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                365                 370                 375
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
                380                 385                 390
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                395                 400                 405
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                410                 415                 420
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
                425                 430                 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445                 450
Lys
<210>54
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>54
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
  1               5                  10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr
                 20                  25                  30
Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
                 35                  40                  45
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
                 50                  55                  60
Ser Gly Ser Se rSer Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
                 65                  70                  75
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp
                 80                  85                  90
Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
                 95                 100                 105
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
                110                 115                 120
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
                125                 130                 135
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys
                140                 145                 150
Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro
                155                 160                 165
Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser
                170                 175                 180
Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln
                185                 190                 195
Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr
                200                 205                 210
Glu Cys Ser
<210>55
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Glu Arg Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
                 20                  25                  30
Asp Tyr Ala Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
                 35                  40                  45
Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Gln Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala
                 50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
                 65                  70                  75
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
                 80                  85                  90
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ile Leu Gly Ala Gly Arg Gly Trp
                 95                 100                 105
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
                110                 115                 120
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
                125
<210>56
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>56
Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
  1               5                  10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr
                 20                  25                  30
Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
                 35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
                 50                  55                  60
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
                 65                  70                  75
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ala Asp
                 80                  85                  90
Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
                 95                 100                 105
Val Leu Gly
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>57
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
                 5                   10
<210>58
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的.
<400>58
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser
                  5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>59
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
                  5
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>60
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
                  5                  10
<210>61
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>61
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
  1               5                  10                  15
Lys Gly
<210>62
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>62
Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
                  5                  10
<210>63
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>63
Aso Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
                110                 115                 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
                125                 130                 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                140                 145                 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
                155                 160                 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
                170                 175                 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
                185                 190                 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
                200                 205                 210
Gly Glu Cys
<210>64
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
                110                 115                 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
                125                 130                 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                140                 145                 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
                155                 160                 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
                170                 175                 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
                185                 190                 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
                200                 205                 210
Gly Glu Cys
<210>65
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>66
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys yal Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn yal Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<220>
<221>Xaa
<222>9
<223>Xaa是M或L
<400>67
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His
                  5                  10
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<220>
<221>Xaa
<222>4
<223>Xaa是S或A
<400>68
Gln Gln Trp Xaa Phe Asn Pro Pro Thr
                  5
<210>69
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<220>
<221>Xaa
<222>8
<223>Xaa是D或A
<400>69
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
  1               5                  10                  15
Lys Gly
<210>70
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<220>
<221>Xaa
<222>6
<223>Xaa是N，A，Y，W或D
<220>
<221>Xaa
<222>7
<223>Xaa是S或R
<400>70
Val Val Tyr Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
                  5                  10
<210>71
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly
<210>72
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala A a Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser ASn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly
<210>73
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>74
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser

Claims (46)

1.一种稳定的药物制剂，其包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液、pH 5.5-6.5中的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是全长人源化IgG抗体，且易于发生脱酰胺或聚集，并且所述单克隆抗体结合HER2。
2.权利要求1的制剂，其中所述pH为从5.8到6.2。
3.权利要求1的制剂，其中所述组氨酸-醋酸盐缓冲液浓度为从1mM到200mM。
4.权利要求3的制剂，其中所述组氨酸-醋酸盐缓冲液浓度为从10mM到40mM。
5.权利要求1的制剂，其中所述抗体浓度为从10mg/mL到250mg/mL。
6.权利要求5的制剂，其中所述单克隆抗体浓度为从20mg/mL到40mg/mL。
7.权利要求5的制剂，其中所述单克隆抗体浓度为从80mg/mL到250mg/mL。
8.权利要求1的制剂，其还包括糖，其中所述糖是海藻糖或蔗糖。
9.权利要求8的制剂，其中所述糖浓度是从10mM到1M。
10.权利要求9的制剂，其中所述糖浓度是从60mM到250mM。
11.权利要求1的制剂，其还包括表面活性剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯。
12.权利要求11的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。
13.权利要求11的制剂，其中所述表面活性剂的浓度是从0.0001％到1.0％。
14.权利要求13的制剂，其中所述表面活性剂的浓度是从0.01％到0.1％。
15.权利要求1的制剂，其是无菌的。
16.权利要求1的制剂，其在40℃保存至少4周的情况下是稳定的。
17.权利要求1的制剂，其在于5℃或15℃保存至少3个月的情况下是稳定的。
18.权利要求1的制剂，其在于-20℃保存至少3个月的情况下是稳定的。
19.权利要求1的制剂，其在冻融的情况下是稳定的。
20.权利要求1的制剂，其是水性的。
21.权利要求1的制剂，其是冷冻的。
22.权利要求1的制剂，其不是冻干的并且先前未对其进行过冻干。
23.权利要求22的制剂，其是水性的并可施用于受试者。
24.权利要求23的制剂，其中所述制剂用于经静脉内(IV)，皮下(SQ)或肌肉内(IM)给药。
25.权利要求24的制剂，其用于经IV给药，所述抗体浓度为从20mg/mL到40mg/mL。
26.权利要求24的制剂，其用于SQ给药，所述抗体浓度为从80mg/mL到250mg/mL。
27.一种带可被注射器穿透的塞子的小瓶，该小瓶中包含权利要求1的制剂。
28.权利要求27的小瓶，其保存于2-8℃。
29.权利要求27的小瓶，其是20cc或50cc的小瓶。
30.一种不锈钢罐，在罐中包含权利要求1的制剂。
31.权利要求30的罐，其中的制剂是冷冻的。
32.一种药物制剂，其包括：
(a)易于发生脱酰胺或聚集的全长人源化IgG1抗体，并且该抗体结合HER2，其量为10mg/mL到250mg/mL；
(b)组氨酸-醋酸盐缓冲液，pH 5.5-6.5；
(c)选自海藻糖和蔗糖组成的组的糖，其量为60mM到250mM；和
(d)聚山梨醇酯20，其量为0.01％到0.1％。
33.一种减少治疗性单克隆抗体的脱酰胺或聚集的方法，包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液，pH 5.5-6.5中配制抗体，其中所述抗体结合HER2。
34.权利要求33的方法，包括在抗体的配制之前或之后评估任何抗体脱酰胺或聚集。
35.一种药物制剂，其包含在pH5.5到6.5的组氨酸-醋酸盐缓冲液中的结合HER2的结构域II的抗体，糖和表面活性剂，其中所述糖是海藻糖或蔗糖，所述表面活性剂为聚山梨醇酯。
36.权利要求35的制剂，其中缓冲液是组氨酸-醋酸盐。
37.权利要求35的制剂，其中HER2抗体包含分别在SEQ ID Nos.3和4中的可变轻链氨基酸序列和可变重链氨基酸序列。
38.权利要求37的制剂，其中HER2抗体包含选自SEQ ID No.15和23的轻链氨基酸序列，和选自SEQ ID No.16和24的重链氨基酸序列。
39.权利要求35的制剂，其中制剂的pH为5.8到6.2。
40.权利要求35的制剂，其中抗体是全长抗体。
41.权利要求35的制剂，其中抗体浓度为20mg/mL到40mg/mL。
42.一种药物制剂，其包含20mg/mL到40mg/mL的量的Pertuzumab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，蔗糖和聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH从5.5到6.5。
43.权利要求42的制剂，其包含30mg/mL的Pertuzumab，20mM的组氨酸-醋酸盐，120mM的蔗糖，和0.02％的聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为6.0。
44.一种带可被注射器穿透的塞子的小瓶，其中包含权利要求35的制剂。
45.一种不锈钢罐，在该罐中包含权利要求35的制剂。
46.制备药物制剂的方法，包括：
(a)制备权利要求1的制剂；和
(b)评估该制剂中单克隆抗体的物理稳定性，化学稳定性或生物学活性。
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