DE3688334T3

DE3688334T3 - Modifizierung von Pflanzen mittels gentechnologischer Verfahren, um Insekten zu bekämpfen oder zu kontrollieren.

Info

Publication number: DE3688334T3
Application number: DE3688334T
Authority: DE
Inventors: Henri Marcel Jozef De Greve; Maria Benita Leonor Iguala Fernandez Salgado; Marc Charles Ernest Van Montagu; Mark Albert Vaeck; Marcus Florent Oscar Zabeau; Jan Jozef August Leemans; Hermanus Fransiscus Paulus Hofte
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1985-01-18
Filing date: 1986-01-17
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2006-01-18
Also published as: EP0451878B1; EP0193259B1; AU5245886A; DE3682789D1; HK1004757A1; BR8600161A; AU594036B2; ATE70307T1; EP0451878A1; JP3033959B2; AU623996B2; EP0193259A1; ATE88503T1; IL77641A; BR1100252A; JPH08252092A; EP0451878B2; CA1341630C; DE3688334T2; JPS62111689A

Description

Die Erfindung stellt chimäre Gene, die aus der Anwendung von Arbeitsweisen der Gentechnik entstehen, bereit.
Die Erfindung betrifft insbesondere das Einführen und Integrieren eines chimären Gens, das für ein von Bacillus thuringiensis produziertes Polypeptidtoxin codiert, in Pflanzenzellen und den Erhalt einer Insekten-kontrollierenden oder bekämpfenden Expressionsstärke des genannten Polypeptidtoxins intrazellulär durch transformierte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen.
DNA-Rekombinationstechnik wird laufend angewandt, um bestimmte Mikroorganismen wie Bakterien und Hefe gentechnisch zu verändern, um spezifische Proteine zu synthetisieren. Die gentechnische Veränderung bzw. Manipulation von höheren Organismen im gegenwärtigen Stadium der Technik erfordert, daß eine oder wenige Zellen genetisch verändert werden, aus denen sich der gesamte Organismus entwickeln kann. Unter höheren Organismen zeigen die Zellen von bestimmten Pflanzen ausgezeichnete Regenerationsfähigkeit und werden deshalb als potentiell gutes Material für die gentechnische Veränderung derartiger Pflanzen angesehen. Außerdem ist bei höheren Pflanzen ein bekanntes System verfügbar, um fremde DNA in das Genom der Pflanze einzuführen. Dieses System wird von dem tumorinduzierenden Plasmid aus dem gramnegativen Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens geliefert. Agrobacterium kann ge netisch Pflanzenzellen transformieren durch stabiles Intergrieren von T-DNA, einen gut definierten Fragment des Ti-Plasmids in das Genom der Pflanzenzelle. In jüngerer Zeit wurden wichtige Fortschritte gemacht um die Verwendung des Ti-Plasmids als ein Vektor für Pflanzen-Gentechnologie zu erleichtern. Es wurde gefunden, daß kleine, direkt wiederholte Sequenzen, die die T-DNA flankieren (Grenzsequzenzen), eine Schlüsselrolle bei der T-DNA-Integration spielen. Nicht-onkogene Ti-Plasmid-Vektoren sind konstruiert worden, aus denen onkogene Tumorgene mit Hilfe einer internen Deletion in der T-DNA entfernt worden sind. Diese Ti-Plasmide enthalten noch die Grenzsequenzen und übertragen infolgedessen T-DNA ohne Tumorinduktion. Ein Beispiel für einen solchen Ti-Plasmid-abgeleiteten Vektor aus genterhnischer Veränderung von Pflanzen ist pGV3850, der eine Substitution des internen T-DNA-Gens durch das üblicherweise verwendete Klonierungsvehikel pBR322 enthält. Verschiedene Verfahren sind entwickelt worden um infizierte Pflanzen, die das pGV3850 enthalten, zu regenerieren. pGV3850 mit den pBR322 Sequenzen vorhanden in seiner T-DNA ist ein wirksames Akzeptorplasmid für Gentransfer-Versuche in Pflanzenzellen. Tatsächlich werden in pBR322-artigen Plasmiden geklonte Gene in einem einzigen experimentellen Schritt zu Agrobacterium transferiert und via homologer Rekombination in die pGV3850 T-DNA eingebaut.
Ein anderer großer Vorteil in der Entwicklung von Pflanzen-Gentechnologie ist die Anwendung von Pflanzen-Regulationssequenzen um chimäre Gene in Pflanzen zu exprimieren. Allgemein enthalten diese chimären Gene eine Promotorregion, abgeleitet von einen Gen, das auf natürliche Weise in Pflanzenzellen exprimiert ist, die Sequenz, die exprimiert werden soll, und vorzugsweise eine 3'nicht-translatierte Region, die eine Polyadenylierungsstelle eines Gens enthält, das in Pflanzenzellen natürlich exprimiert ist. Beispielsweise wurden durch Anwendung des Nopalin-Synthase-Promotors und von bakteriellen Genen für antibiotische Resistenz, dominant selektierbare Marker für Pflanzenzellen konstruiert.
Obwohl bestimmte chimäre Gene jetzt erfolgreich in transformierten Pflanzenzellen exprimiert worden sind, ist eine solche Espression keineswegs einfach. Verschiedene Beweislinien zeigen an, daß die Expressionstärke der fremden Gene nichtpflanzlicher Herkunft nicht nur in verschiedenen transformierten Geweben stark schwankt, sondern allgemein sehr gering ist. Sol che geringen Stärken der Genexpression können verschiedene Gründe haben. Zunächst unvollständige Transcription des Gens aufgrund von unbeabsichtigten Transcription-Terminationssignalen; zweitens ineffizientes Reifen (processing) der Boten-RNA; drittens fehlerhafter Transport der Boten-RNA vom Kern zum Zytoplasma; viertens Instabilität der Zytoplasma-Boten-RNA; fünftens ineffiziente Translation der Zytoplasma-Boten-RNA; sechstens Instabilität des Proteins aufgrund seine Empfindlichkeit gegenüber pflanzenspezifischen Proteinen. Infolgedessen läßt sich die erfolgreiche Transformation von Pflanzenzellen unter Verwendung von Vektoren, wie die oben beschriebenen, nicht notwendigerweise voraussagen, bevor eine gewünschte Transformation unternommen wird.
Die Veränderung von differenzierten Pflanzenzellen und ihren Nachkommen, um das Bt2-Polypeptid und/oder eine ausgelesene Version davon und/oder ein Polypeptid mit substantieller Sequenzhomologie dazu zu exprimieren, ist sehr viel schwieriger als die Veränderung von anderen Genen, wie antibiotische Resistenz-Gene oder andere Pflanzengene wie Thaumatin, aus einem oder mehreren der folgenden Gründe: (1) der große Umfang des Bt2-Toxins, selbst in seiner ausgelesenen Form; (2) die besonderen Eigenschaften des Bt2-Polypeptids (wie – aber nicht beschränkt auf – Löslichkeit des Polypeptids); (3) die potentielle Toxizität des Bt2-Polypeptids gegenüber den Pflanzenzellen oder (4) das in Pflanzenzellen und ihren Nachkommen synthetisierte Bt2-Polypeptid muß im wesentlichen die gleichen Eigenschaften beibehalten, wie das in Bakterien synthetisierte Kristallprotein.
Bacillus thuringiensis (nachfolgend mit B.t, (oder Bt) bezeichnet) Bakterien schließen etwa 19 bekannte Varietäten ein, die Polypeptidtoxine produzieren, die während der Sporenbildung parasporale Kristalle bilden, Das von B.t. erzeugte Protein ist toxisch für die Larven bestimmter Insekten, Die von einer bestimmten Varietät produzierten Toxine zeigen starke insektizide Aktivität gegen bestimmte Lepidoptera- und/oder Coleoptera- und/oder Diptera-Larven. Siehe z.B., Tyrell D. J. et al., J. Bacteriology, (81) 145 (Nr. 2): S. 1052–1062, Wenn von Insektenlarven verdaut, werden die Kristalle löslich gemacht und im Mitteldarm des Insektes aufgeschlossen und ergeben mindestens ein aktiven Polypeptidoxin von dem man anninmt, daß es auf die Zellmembran des Mitteldarms wirkt. Untersuchungen haben ergeben, daß einzelne Kristallpolypeptide insektizide Aktivität entfalten. Yamamoto, T. et al., Current Microbiology, (83) 9: S. 279–284; Yamamoto, T. et al., Arch. Biochem. Biophysics, (83) 227: (Nr. 1): S. 233–241; Lilley, M, et al., J. Gen. Microbiol., (80) 118: S. 1–11; Bulla, L.A. et al., J. Biol. Chem., (81) 256 (Nr. 6): S. 3000–3004.
Die toxische Aktivität des Kristallpolypeptids, das von Bacillus thuringiensis Varietäten produziert wird, ist gegenüber einzelnen Insektenarten hochspezifisch und dieses erweist sich als sicher bzw. ungefährlich für höhere Säugetiere.
Präparate, die die Kristalle enthalten, werden kommerziell als biologisches Insektizid verwendet. Beispielsweise: Bactospeine, von Biochem Products Ltd., Dipel Abbott Laboratories; und Thuricide, Sandoz AG. Die Wirksamkeit von Präparaten, die von bakteriellen Wirten erhalten werden, ist jedoch begrenzt, da angemessene Schädlingsbekämpfung wiederholte und zeitlich genau festgelegte Anwendungen erfordert. Zusätzlich erschweren die Kosten für die Produktion derartiger Präparate den wirksamen Wettbewerb mit anderen handelsüblich verfügbaren Produkten, wie pyrethroiden Derivaten.
Molekulargenetische Untersuchungen haben erwiesen, daß zumindest einige Polypeptidtoxine, die von Bacillus thuringiensis produziert werden, von Plasmiden codiert werden. Stahly, D. P. et al., (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 84, S. 581–588; Debaboc, V. G. et al., (1977), Genetika, 13, S. 496–501. Gene die toxische Kristallpeptide aus verschiedenen B.t. Stämmen codieren, wurden geklont und in anderen Bakterienwirten exprimiert. (Schnepf & Whiteley, PNAS (81) 78: 2993–2897. Klier, A. et al., EMBO J. (82) 1 (Nr. 7), S. 791–799; Adang et al., Gene, (36) S. 289, 1985; Schnepf et al., J. Biol. Chem., (20) S. 6264, 1985; Shibano et al., Gene, (34), 1985.
In Anbetracht der großen Bedeutung von Pflanzen sowohl für den Verbrauch als auch für die Erzeugung von wertvollen Produkten ist es in hohem Maße wünschenswert, Pflanzen genetisch in der Weise zu verändern, daß Pflanzenzellen Polypeptidtoxine erzeugen können, die im wesentlichen gleich sind den Toxinen die von Bacillus thuringiensis produziert werden, ohne nachteilige Auswirkungen auf die Pflanzen. Durch stabile Integrierung von exogenen DNA-Fragmenten, die für Polypeptidtoxine produziert vom Bacillus thuringiensis codieren, in das Genom der Pflanzenzelle und Erzielung einer insektenbekämpfenden Expressionsstärke der genannten exogenen DNA-Fragmente in Pflanzen, würden so transformierte Pflanzen und ihre Nachkommen resistent gegenüber bestimmten Schadinsekten werden. Auf diese Weise genetisch veränderte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen könnten einen wirtschaftlich vorteilhaften Ersatz für vorhandene handelsübliche Varietäten bieten, indem im wesentlichen die Notwendigkeit, bestimmte chemische oder biologische Insektizide anzuwenden vermieden und ein zuverlässigeres Mittel zur Bekämpfung bestimmter Schadinsekten bereitgestellt wird, unter Beibehaltung der normalen morphologischen Eigenschaften.
Es ist ein Ziel der Erfindung neue chimäre Gene bereitzustellen, die für das von Bacillus thuringiensis produzierte Polypeptidtoxin codieren. Die Pflanzen-Regulationssequenzen der chimären Gene dirigieren die Expression in transformierten Pflanzenzellen.
Hybrid-Plasmid-Vektoren, die die chimären Gene enthalten, ermöglichen das Einführen und Integrieren und die Expression der chimären Gene in einem Pflanzenzellengenom.
Genetisch veränderte Pflanzenzellen werden durch Transformation von Pflanzenzellen mit den Hybrid-Plasmid-Vektoren, welche die chimären Gene enthalten, hergestellt.
Erfindungsgemäß werden bereitgestellt: ein chimäres Gen, das eine Promotorregion, abgeleitet von einem Gen, das auf natürlicher Weise in einer Pflanzenzelle exprimiert ist wie z. B. Pnos, PTR2, Pssu pea, Pssu 301, oder P35; und eine 3' nicht-translatierte Region, einschließlich einer Polyadenylierungsstelle, eines Gens, das auf natürlicher Weise in einer Pflanzenzelle exprimiert ist wie z. B. 3'ocs, 3't7, 3'nos oder 3'SSu301, und eine Kodierungssequenz, die nur einen Teil des Bt2-Proteins von 13 kodiert, wobei der Proteinteil sich von der Nukleotidposition 141 bis zu einer Nukleotidposition zwischen den Nukleotidpositionen 1961 und 2314 in 13 erstreckt, umfasst.
Transformierte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen exprimieren ein wie vorstehend beschriebenes chimäres Gen und sind für bestimmte Insekten im Wesentlichen toxisch. Transformierte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen können bei der Insektenbekämpfung verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
1 ist eine Aufnahme, die eine 7,5% SDS PAGE, gefärbt mit Coomassie Blau zeigt.
Bahn 1: B.t. Kurstaki Kristallproteinpräparat;
Bahn 2: B.t. Berliner Kristallproteinpräparat;
Bahn 3: Molekulargewichtsmarker

a) Phosphorylase B (92 500 Dalton);
b) Rinderserumalbumin (66 200 Dalton)
c) Ovalbumin (45 000 Dalton); und
d) Kohlensäureanhydrase (31 000 Dalton).

2 ist ein schematisches Diagramm von Plasmid pEcoR251. Das EcoRI Endonuclease-Gen (EndRI) ist mit dem P_R Promotor (P_R) fusioniert und enthält eine nur einmal vorhandene BglII Klonierungsstelle. Amp: B-Lactamase-Gen.
3 zeigt Restriktionsenzymkarten der Inserts in 4 immunopositiven partialen Sau3A Abbau-Klonen von B.t. Berliner 1715 Plasmid DNA, geklont in pEcoR251.
4 ist eine Aufnahme, die eine 7,5% SDS PAGE, gefärbt mit Coomassie Blau zeigt.
Bahn 1: B.t. Kurstaki Kristallproteinpräparat
(identisch mit 1, Bahn 1);
Bahn 2: B.t. Berliner Kristallproteinpräparat
(identisch mit 1, Bahn 2);
Bahn 3: Gesamtlysat von E. coli K514, das das Bt200 Plasmid enthält; und
Bahn 4: Kontrolle (Gesamtlysat von E. coli K514 ohne Bt200 Plasmid).
5 ist eine Aufnahme, die die Ergebnisse von Immunoblotting-Experimenten unter Verwendung eines Kaninchen-anti-B.t.-Kurstaki Kristallserums zeigt.
Bahn 1: B.t. Berliner Kristallproteinpräparat;
Bahn 2: B.t. Kurstaki Kristallproteinpräparat;
Bahn 3: Gesamtlysat von E. coli K514, das das PBt200 Plasmid beherbergt;
Bahn 4: Kontrolle (Gesamtlysat von E. coli K514 ohne pBt 200).
6 ist eine Aufnahme, die die Ergebnisse eines Immunoblotting-Experiments unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Kurstaki Kristallserums (A) und eines Karinchen-anti-Berliner Kristallserums (B) zeigt. Teil C zeigt eine Coomassie-Färbung der 7,5% SDS PAGE nach dem Blottingverfahren (das gleiche Gel wie für das in Teil A gezeigte Blotting verwendet).
Bahn 1: Bt2-Protein (gereinigt wie im Abschnitt 5.1 beschrieben);
Bahn 2: B.t. Berliner Kristallproteine; und
Bahn 3: B.t. Kurstaki Kristallproteine.
7 ist eine Aufnahme, die eine Coomassie-Färbung einer SDS PAGE zeigt.
Bahn 1: Gesamtlysat von E. Coli K514, das pBt200 beherbergt;
Bahn 2: Gereinigtes Bt2-Protein, hergestellt aus dem E. coli K514, das PBt200 beherbergt;
8 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse eines ELISA-Versuches zeigt. Bindungskurven von Bt2-Protein und löslich gemachten B.t. Kristallproteinen unter Verwendung eines Ziegen-anti-B.t. Kristallserums als Ziegen-Antikörper und eines Mäuse-anti-Bt2 Serums als erstem Antikörper.
9 ist ein Diagramm das die Ergebnisse eines ELISA-Versuchs wiedergibt, der die Reaktionsfähigkeit der verschiedenen anti-Berliner-kristallmonoklonalen Antikörper mit:

(A) Gesamt-Berliner Kristallproteinen; und
(B) gereinigtem Bt2-Protein zeigt.

10 zeigt einen Vergleich von N-terminalen Aminosäuresequenzen der 130 Kd Kristallproteine:

1) abgeleitet von der DNA-Sequenz, publiziert von Wong et al., J. Biol. Chem. 258, S. 1960–1967 (1983) (bezeichnet B.t. W);
2) bestimmt für das Bt2-Protein.

11 faßt den immunologischen Nachweis von Polypeptiden unter Anwendung von Western-Blotting mit einem Kaninchen-anti-B.t.-Berliner Kristallserum zusammen. Polypeptide werden von pBt200 Derivaten codiert, die verschiedene Deletionen enthalten, die durch Restriktionsenzymspaltung, wie in der Figur angegeben, erzeugt wurden.
12: A zeigt die Restriktionskarte des HpaI-NdeI-Fragmentes, das das gesamte Bt2-Gen enthält, angegeben als ein Kasten bzw. als eine Box. B zeigt die aufeinanderfolgenden Regionen des Bt2-Gens. Die Boxen zeigen die Abschnitte, die von jedem Strang sequenziert worden sind. C zeigt die Sequenzierungsstrategie. Restriktionsfragmente wurden am Ende mit Polynukleotidkinase, strangisoliert und unter Anwendung der Maxam und Gilbert Methode sequenziert, markiert. Die Pfeile zeigen die Länge der in jedem Versuch sequenzierten Region an.
13 zeigt die DNA-Sequenz des vollständigen Bt2-Gens, die das offene Leseraster (Positionen 21 bis 3605) und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz (1155 Aminosäuren) angibt. Die experimentell bestimmte Aminosäuresequenz des Bt2-Proteins ist durch einen Strich über den entsprechenden Aminosäuren angegeben.
14 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Bt2-Gens (Berliner) mit den abgeleiteten Sequenzen von drei anderen B.t. Kristallprotein-Genen, geklont von anderen B.t. Stämmen.
B.t. Kurstaki HD73 (Adang et al, Gene 36, S. 289, 1985)
B.t. Kurstaki HD1 (Schnepf et al, J.B.C. 20, S. 6264, 1985)
B.t. Sotto (Shibano et al, Gene 34, S. 243, 1985).
In den letzteren drei Sequenzen sind nur diejenigen Aminosäuren angegeben, die sich von denjenigen unterscheiden, die in der Bt2-Sequenz an der homologen Stelle vorhanden sind. Gegebenenfalls wurden Lücken bzw. Fehlstellen eingeführt (angegeben durch "–"), um die Sequenzen gleichzurichten.
15 ist eine schematische Skizze des Aufbaus der Bt2-Genkassette pHD160.
16 ist eine schematische Darstellung der verschiedenen Bt2-Genkassetten.
17 zeigt die experimentelle Vorgehensweise, die zum Aufbau des Plasmids pLB10 angewandt wurde. Ebenfalls gezeigt wird die Struktur der Plasmide pLK54 und PlK57, beschrieben in J. Botterman et al (in Vorbereitung).
18 zeigt den Aufbau und die Struktur von pLBKm25.
19 zeigt die Vorgehensweise, die angewandt wurde, um Bt:NPTII Fusionen und Bt2 Deletionen zu konstruieren.
20 ist eine schematische Wiedergabe der verschiedenen Bt2 3'-End-Deletions-Mutanten, verwendet zur Kartierung des 3'-Endes des Minimaltoxin codierenden Fragmentes. Pfeile geben die Positionen der 3'-Enden an.
21 ist eine Aufnahme, die die Ergebnisse eines Immunoblotting-Versuches unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Berliner Kristallserums zeigt. Die analysierten Proben waren Gesamtextrakte von Bt2-Deletionsklonen, angegeben in 20 und in Abschnitt 7.
22 zeigt die 3'-Endpunkte von Deletionsklonen pLB834 und pLB879 auf der Bt2-Sequenz, verwendet, um das minimale Genfragment, das ein aktives Toxin codiert, zu skizzieren. Ebenfalls gezeigt sind die abgeleitete Aminosäuresequenz und die Position einer mutmaßlichen Trypsinspaltungsstelle.
23 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus der Bt2:NPTII Fusions-Genkassetten pLBKm23, pLBKm33 und pLBKm14. Ebenfalls gezeigt sind die 5'-stromaufwärts-Sequenzen der Bt2:NPTII Fusionen in den verschiedenen Konstrukten (Sequenzen, die einer BamHI-Stelle entsprechen, sind unterstrichen).
24 ist eine schematische Wiedergabe der verschiedenen Bt:NPTII Fusions-Genkassetten.
25 ist eine Aufnahme, die die Ergebnisse eines NPTII-Assays, wie von Reiss et al (Gene, 30, 5.217, 1984) beschrieben, zeigt. Die analysierten Proben waren die Überstände von Zellextrakten von bakteriellen Klonen, die NPTII oder verschiedene Bt2-NPTII Fusionsproteine produzierten.
23 bedeutet K514 (lambda) (pLBKm23)
860 bedeutet K514 (lambda) (pLBKm860)
865 bedeutet K514 (lambda) (pLBKm865)
NPT bedeutet HB101 (lambda dv) (ein Geschenk von Julian Davis, ehemals von Biogen).
26 zeigt die ungefähren Positionen der 3'-Enden der Bt-Sequenzen in verschiedenen Deletionen und Bt:NPTII Fusionen (angegeben durch Pfeile) an.
27 zeigt die Vorgehensweise, die zur Adaption der Bt2 und der Bt2:NPTII Kassetten für Expression in Pflanzenzellen angewandt wurde.
28 zeigt die DNA-Sequenzen an der Verbindung zwischen den Promotorregionen und der codierenden Sequenz der Bt-Genkassetten, wie sie in den verschiedenen veränderten Ti-Plasmiden vorhanden sind. Sequenzen, die von den ursprünglichen Promotorregionen und von der codierenden Sequenz des Bt2-Gens abgeleitet sind, sind unterstrichen. Einige relevante Restriktionsenzymstellen, die am Aufbau der chimären Gene teilgenommen haben, sind angegeben. Das ATG-Startcodon ist eingerahmt.
29 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus, wie im Abschnitt 8 des Beispiels 2 beschrieben.
B: BamHI, Hp: HpaI, H: HindIII, E: EcoRI, Bg: BglII.
30 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus von pGV831: pGV831 wurde von R. Deblaere, Lab. für Genetische Virologie, Freie Universität Brüssel, Belgien konstruiert. Es ist ein Derivat von pGV700, wie in der EP-A-83112985.3 beschrieben. Die angewandten DNA-Rekombinationstechniken folgten Maniatis et al, Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Laboratory.
Das HindIII-Fragment, das in pGV700 vorhanden war, wurde in pGV600 (Leemans et al, J. Mol. Appl. Genet., 1, 149–164, 1981) subkloniert. Rekombinantes Plasmid pGV742 wurde als Cb^R Cm^s Tc^S-Rekombinante isoliert. Eine interne Deletion wurde in pGV742 durch Abbau mit BamHI und erneutem Ringschluß erzeugt. Dies produzierte pGV744. Eine interne Deletion wurde in pGV744 durch Abbau mit EcoRI und erneutem Ringschluß erzeugt und ergab pGV149. Das HindIII-NruI-Fragment aus pGV749 wurde in pGV110 geklont, pGV710 war mit EcoRI abgebaut worden, das vorstehende 5'-Ende unter Verwendung von DNA-Polymerase aufgefüllt und wurde anschließend mit HindIII abgebaut. Das entstandene Plasmid pGV815 wurde als eine Sm^R, Cb^R-Rekombinante isoliert. Sowohl die EcoRI-Stelle als auch die HindIII-Stelle von pGV815 wurden durch Abbau mit diesen Enzymen und durch Auffüllen der vorstehenden Enden mit DNA-Polymerase und anschließenden erneuten Ringschluß entfernt. Schließlich wurde ein chimäres Gen, das den Nopalinsynthase-Promotor und das Neomycin-Phosfotransferase-Gen von Tn5 enthielt, als BcV-BamHI-Fragment aus pKC7/:nos isoliert und in der BglII-Stelle von pGV825 geklont. Es wurde das Sp^R, Km^R-rekombinante Plasmid pGV831 erhalten.
31 ist eine schematische Darstellung der T-Region des Ti-Plasmids pGV3850 und des Zwischenvektors pHD205. Die schraffierten Bereiche (crossed lines) geben die Bereiche an, die an der Cointegration von pGV3850 mit pHD205, um pHD1050 zu produzieren, beteiligt waren. Die T-Region von Hybrid-Ti-Plasmid pHD1050 ist dargestellt.
H: HindIII
Bt: chimäres Bt2-Gen unter Kontrolle des Nopalinsynthase-Promotors
nos: Nopalinsynthase-Gen
Ap, Km: Gene, die Ampicillin- und Kanamycin-Resistenz codieren.
32 ist eine schematische Darstellung der T-Region von Ti-Plasmid pGV2260 und des Zwischenvektors pHD208. Die markierten Bereiche (crossed lines) geben die Bereiche an, die an der Cointegration von pGV2260 mit pHD208, um pHD1076 zu produzieren, beteiligt waren. Die T-Region von Hybrid-Ti-Plasmid pHD1076 ist angegeben.

1: Vektorfragment
2: T-DNA-Grenzregion
3: Bt2 Genkassette
4: Pssu Promotorfragment
5: Pnos Promotorfragment
6: Neomycin-Phosfotransferase Genkassette
7: T-DNA Grenzregion
8: Vektorfragment

Schwarze Dreiecke geben die T-DNA Grenzregionen Ap, Sp, Km an: Gene, die jeweils Ampicillin-, Spectinomycin- und Kanamycin-Resistenz codieren; Pnos: Nopalinsynthase-Promotor Pssu: Kleine Untereinheit von Ribulose-Biphosphat-Carboxylase-Promotor B.t.: Bt2 Gen-Kassette.

33 zeigt schematische Wiedergaben der verschiedenen Zwischen-Expressionsvektoren.
34 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse eines ELISA-Versuches mit Tabak-Kallusgewebe, transformiert mit C58Cl Rif^® pHD1076, wie in Abschnitt 11, Beispiel 1 beschrieben, gezeigt. Der Hüll-Antikörper ist Ziegen-anti- B.t.-Kristallserum. Kaninchen-anti-Bt2 wurde als erster Antikörper verwendet.
Die Zahlen 1 bis 14 sind transformierte Kalli.
Die optische Dichte (O.D.) entsprechend einem Gehalt von 4 ng Bt2 Protein je Gramm Gewebe, bestimmt in einem Rekonstruktionsexperiment, ist in der Figur angegeben.
35 ist eine Diagramm, das die Ergebnisse eines ELISA-Versuches mit Tabak-Kallusgewebe, transformiert mit C58Cl Rif^® pHD1076, wie beschrieben in Abschnitt 11, Beispiel 1, zeigt. Der Hüll-Antikörper ist Ziegen-anti-B.t. Kristallserum. Kaninchen-anti-Bt2-Serum wurde als erster Antikörper verwendet.
Die Zahlen 1 bis 21 sind transformierte Kalli. Der O.D.-Wert entsprechend einem Gehalt/Level von 4 ng Bt2-Protein je Gramm Gewebe, bestimmt in einem Rekonstruktionsexperiment, ist in der Figur angegeben.
36 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse eines ELISA-Versuches mit Tabak-Kallus-Gewebe, transformiert mit C58Cl Rif^® pHD1076 wie beschrieben in Abschnitt 11.2, Beispiel 1, zeigt. Der Hüll-Antikörper ist Ziegen-anti-B.t. Kristallserum. Verschiedene monoklonale Antikörper wurden als erste Antikörper verwendet. Die Reaktivität mit nichttransformierten SR1-Kallusgewebe (verwendet als negative Kontrolle) ist ebenfalls gezeigt.
37 ist eine Beschreibung des Versuchsprotokolls, das zur Herstellung von Kallusgewebeextrakten, die zum immunologischen Nachweis von in diesem Kallus exprimierten Bt2 verwendet wurden, angewandt wurde.
38 ist ein Diagramm, das die Wachstumsrate von M. sexta Larven der ersten Entwicklungsstufe auf Blättern von transformierten Tabakpflanzen als Futter, wie in Abschnitt 10, Beispiel 5 beschrieben, erhalten worden waren. Die nichtschraffierten Flächen geben die Anzahl Larven (von insgesamt 20 getesteten Larven) an, die nach dreitägiger Fütterung in das L2-Stadium gingen.
39 ist ein Diagramm, das Kurven für die vollständige Wachstumsrate in einem 4 Tage-Zeitraum für M, sexta Larven auf Blättern von transformier tem Tabak als Futter angibt (die Angaben stammen aus den gleichen Versuchen wie die in 38 gezeigten). Die angegebenen Zahlen sind die Anzahl Larven, die sich zu einem bestimmten Zeitpunkt im L2-Stadium befanden (je Pflanze wurden 20 Larven getestet). C₁–C₄ sind Kontrollpflanzen (lediglich mit dem Pnos-NPTII-Gen transformiert). Die anderen Zahlen (N20-1, N20-46) beziehen sich auf einzelne Pflanzen, mutmaßlich transformiert mit PGS1110.
40 zeigt die DNA-Sequenzen der P35S-1 und P35-2 Promotorfragmente aus Blumenkohl-Mosaikvirus Cm4-184 (Gardner et al., 1981, Nucl. Acid Res., 9, 2781–2888).
41 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus von pGSH50.
42 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus von pGV1500.
43 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus von pGSH150 und pGHS151.
44 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus von pAGS007 aus Pssu301 Wildtyp-Gen.
Im Sinne der Beschreibung ist/sind unter dem Begriff "Polypeptid" ein intaktes Protein oder Fragment(e) davon zu verstehen.
Unter "Pflanze" ist ein vielzelliger differenzierter Organismus zu verstehen, der zur Photosynthese fähig ist, einschließlich Angiospermen (monocotyle und dicotyle) und Gymnospermen. "Pflanzenzellen" beziehen sich auf eine oder mehrere von einer Pflanze abgeleitete Zellen. Unter "Pflanzenzellen Nachkommen" ist jede Zelle oder jedes Gewebe zu verstehen, das von Pflanzenzellen stammt, einschließlich Kallus; Pflanzenteile, wie Stiele, Wurzeln, Früchte, Blätter oder Blüten; Pflanzen; Pflanzensamen; Pollen und Pflanzenembryos. Unter "chimäres Gen" ist ein hybrides DNA-Segment zu verstehen, das ein für Transkription wesentliches Regulatorsignal enthält, bezeichnet als Promotor, verschmolzen mit mindestens einer Strukturgensequenz, die für ein spezifisches Polypeptid codiert.
Unter "Identifizierung" ist die Selektion oder das Durchmustern von Zellen, die das gewünschte Gen beherbergen und exprimieren, zu verstehen. Selektierbare Marker ermöglichen das Wachstum (Selektion) unter sonst lethalen Bedingungen wie Kanamycin-Resistenz (Km^R). Durchmusterbare Marker fügen eins identifizierbare Eigenschaft hinzu (Durchmustern), die nicht-transformierten Zellen fremd ist. Unter "natürlich exprimiertem Gen" ist ein DNA-Fragment zu verstehen, das entweder ursprünglich Teil eines Pflanzengenoms ist oder durch Agentien wie Bakterien oder Viren, die RNA, Protein oder beide ohne menschlichen Eingriff eingeführt worden ist.
Ein chimäres Gen kann auch ein nicht-translatiertes DNA-Fragment einschließen, das sich auf der 3'-Seite (stromabwärts) der Strukturgensequenz befindet, die ihrerseits ein Regulatorsignal einschließen kann, das als Polyadenylierungssignal bezeichnet wird und vorzugsweise von einem in Pflanzen natürlich exprimierten Gen abgeleitet ist.
Ein natürlich exprimiertes Gen schließt eine 3'-nicht-translatierte Region ein, die ihrerseits ein Polyadenylierungssignal einschließt, wobei beide sich auf der 3'-Seite eines Stoppcodons in einer monocistronen mRNA befinden. Man nimmt an, daß die 3'-nicht-translatierte Region von mRNA an der Weiterverarbeitung (processing) der Stabilität und/oder dem Transport der mRNA beteiligt ist. Man nimmt ebenfalls an, daß diese 3'-nicht-translatierte Region von mRNA eine Basensequenz enthält, Polyadenylierungssignal, das von einem Enzym in der Zelle erkannt wird. Dieses Enzym fügt zu dem mRNA-Molekül eine wesentliche Anzahl von Adenosinresten hinzu, um einen Poly-A-"Schwanz" auf der mRNA zu bilden.
Das Verfahren, das allgemein in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 116 718 mit dem Titel "Process for the Introduction of Expressible Genes into Plant Cell Genomes and Agrobacterium Strains Carrying Hybrid T Plasmid Vektors Useful for this Process" beschrieben ist, kann für das Einführen und die Integration von einem oder mehreren chimären Genen gemäß der Erfindung in ein Pflanzenzellengenom verwendet werden. Dies wird erreicht durch:
(1) Isolierung mindestens eines DNA-Fragmentes aus Bacillus thuringiensis, das für ein Polypeptidtoxin codiert, durch Abbau von bakterieller DNA, und Insertieren des erhaltenen Gemisches von DNA-Fragmenten in ein Klonierungsvehikel, das von einem bakteriellen Wirt beherbergt wird; und
(2) Identifizierung von Bakterienklonen, die DNA-Fragmente beherbergen, die für das genannte Polypeptidtoxin codieren; und
(3) Charakterisierung der Struktur des DNA-Fragmentes, das für das genannte Polypeptidtoxin codiert; und
(4) Entfernung der nicht gewünschten DNA-Sequenzen, die das gewünschte DNA-Fragment flankieren; oder
(5) Synthese eines DNA-Fragmentes das für Bt2 codiert; oder
(6) Konstruktion eines DNA-Fragmentes, das das DNA-Fragment aus (4), verschmolzen mit einem DNA-Fragment, enthält, das für ein Identitizierungspolypeptid codiert, um ein Fusionspolypeptid zu produzieren; und
(7) Insertion des genannten DNA-Fragmentes aus (4) oder (5) oder (6) in Plasmidvektoren unter der Kontrolle von Pflanzenregulatorsquenzen, bewirtet von/in einem bakteriellen Wirt; und
(8) Einführen von Plasmiden aus (7) durch Konjugation (oder Mobilisierung) in einen Bakterienwirt, der geeignete Helferplasmide beherbergt; und
(9) Konjugation von Bakterienklonen aus (8) zu Agrobacterium tumefaciens, das einen Akzeptor Ti-Plasmidvektor beherbergt; und
(10) Identifizierung von Agrobacterium tumefaciens, das das gewünschte chimäre Gen enthält; und
(11) Inberührungbringen von Pflanzenzellen mit Agrobacterium tumefaciens aus (10); und
(12) Identifizierung von transformierten Pflanzenzellen aus den entsprechenden/geeigneten Kulturmedien; und
(13) immumologischer Nachweis von Bt2-Antigenen, die in Extrakten von transformierten Pflanzenzellen vorhanden sind; und
(14) Verfahren von transformierten Pflanzenzellen, um eine differenzierte Pflanze zu regenerieren.
Es wird in Betracht gezogen, daß andere Klonierungsvektoren und Bakterienwirtstämme, als in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, verwendet werden können. Vektoren auf Ti-Basis, wie pGV3850, in die Rekombinationsplasmide vor dem Transfer zu Pflanzenzellen integrieren, sind als cis-Typ-Vektoren bekannt. Es gibt auch Vektorsystem auf Ti-Basis, in die die Rekombinationsplasmide nicht in das vorhandene Ti-Plasmid integrieren, oder in denen große Bereiche des natürlich vorkommenden Ti-Plasmids fehlen. Diese Systeme vom binären Typ, Hoekema et al, Nature, Bd. 303, 179 (1983), oder Mini-Ti-Plasmide, Framond et al, Biotechnology, Bd. 1, 262 (1983) führen auch, wie gezeigt wurde, DNA in Pflanzenzellen ein. Diese Plasmide enthalten eine Grenzsequenz (zumindest eine, vorzugsweise zwei), die das Gen, das in Pflanzen eingeführt werden soll, flankieren. Ein Marker, der in Pflanzenzellen selektierbar oder durchmusterbar ist, ist zweckmäßig, aber nicht wesentlich. Solche Plasmide sind zur autonomen Replikation in A. tumefaciens befähigt und brauchen nicht in ein vorhandenes Ti-Plasmid zu integrieren. Virulenzfunktionen, benötigt, um den Transfer zu DNA auszuführen, wie die chimären Gene der vorliegenden Erfindung, zu Pflanzenzellen, können in trans bereitgestellt werden. Hoekema et al, Nature, Bd. 303, 179 (1983), s. auch Fraley, R.T. et al, Biotechnology, Bd. 3, 629 (1985) und Klee et al, Biotechnology, Bd. 3 637 (1985).
A. tumefaciens ist nicht das einzige Mittel zum Einführen von Genen in Pflanzen. DNA kann mit physikalischen Mitteln wie Elektroporation oder mit chemischen Mitteln wie Polyethylenglykol(PEG)-Verschmelzung (Fusion) eingeführt werden. Es wird angenommen, daß jede andere Arbeitsweise, die DNA, wie die chimären Gene nach der Erfindung, einführt, angewandt werden kann. Es können auch RNA virale Vektoren, die eine RNA-Kopie eines insektiziden chimären Gens einführen, Verwendung finden.
Weiterhin können Plasmidvektoren, die andere Regulatorsequenzen, als in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, enthalten, Verwendung finden. Beispielsweise können Enhancer eingeschlossen werden, vor oder nach oder in solcher Nähe zu dem chimären Gen, daß sie ihre Funktion ausüben.
Pflanzenzellen, transformiert mit Plasmidvektoren enthaltend das chimäre Gen nach der Erfindung, können dann auf geeignetem Medium, vorzugsweise Selektions-Wachstumsmedium, kultiviert werden, und Pflanzen, die das Polypeptidtoxin exprimieren, können aus dem erhaltenen Kallus regeneriert werden. Anschließende Generationen von Pflanzenzellen sollten auch Expression des Polypeptidtoxins zeigen.
Die Erfindung zieht in Betracht, daß die Hybridplasmid-Transformationsvektoren verwerden können, um Pflanzenzellen und deren Nachkommen zu entwickeln, die Insektenresistenz-Eigenschaften besitzen. Es wird in Betracht gezogen, daß Pflanzen, vor allen dicotyle Pflanzen, andere als weiter unten in den Beispielen beschrieben, transformiert werden können, wie Baumwolle, Zuckerrüben, Sojabohne, Raps und Gemüse, wie Kohl, Blattsalat und Bohnen. Transformierte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen sind gegen bestimmte Schadinsekten geschützt, indem sie eine insektenbekämpfende Menge an Polypeptidtoxin exprimieren. Unter bekämpfender Menge wird eine toxische (lethale) oder bekämpfende (sublethale) Menge an Polypeptidtoxin verstanden. Allgemein werden in dieser Beschreibung die Begriffe Kontrollieren/Regeln und Bekämpfen austauschbar verwendet, und es ist kein Unterschied beabsichtigt, ausgenommen dort, wo es sich aus dem Kontext klar ergibt, daß eine Differenzierung zwischen einer lethalen und nicht lethalen Dosis beabsichtigt ist. Die transformierten Pflanzen sollten morphologisch normal sein und auf die für sie gebräuchliche Weise für Verbrauch und/oder Produktion von Produkten kultiviert werden. Weiterhin sollten transformierte Pflanzen im wesentlichen den Bedarf an chemischen oder biologischen Insektiziden für die Bekämpfung von Lepidoptera- -Larven erheblich verringern. Da die Gene, die für das Polypeptidtoxin codieren, stabil im Genom der Pflanzenzelle integriert und daher vererbbar sind, sollten die aus solchen transformierten Pflanzen erhaltenen Samen ebenfalls Pflanzen produzieren, die das Polypeptidtoxin, auf im wesentlichen gleichen Niveau exprimieren und dadurch ebenfalls gegen bestimmte Schadinsekten geschützt sind.
Zusätzlich wird in Betracht gezogen, daß transformierte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen zur Bekämpfung von bestimmten Schadinsekten verwendet werden können, indem auf die Schädlinge und/oder das Biotop dieser Schädlinge (d.h. der Ort, der geschützt werden soll, z.B. wachsende Nutzpflanzen, oder ein Bereich, auf dem Nutzpflanzen wachsen sollen) eine wirksame (bekämpfende) Menge von transformiertem Pflanzenmaterial alleine oder zusammen mit anderen Komponenten aufgebracht wird.
Als Beispiel, aber nicht einschränkend, angegeben, können transformierte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen allein oder als eine Komponente in einer Formulierung oder einem Mittel verwendet werden. Für praktische Anwendungen können Pflanzenzellen und ihre Nachkommen als das aktive Material oder als ein fester Träger in gebräuchlichen Schädlingsbekämpfungsmitteln und Formulierungen verwendet werden. Solche Mittel und Formulierungen können auch Zusätze, wie grenzflächenaktive Mittel und Stabilisatoren, enthalten. Beispiele für solche Mittel und Formulierungen schließen Pasten, Stäubemittel, netzbare Pulver, Granulate, Köder und Aerosol-Mittel ein.
Die Mittel und Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt. Die Menge an transformiertem Pflanzenmaterial, die verwendet werden soll, hängt von mehreren Faktoren ab, beispielsweise von der Art der Schädlinge, der angewandten Formulierung oder des angewandten Mittels, dem Zustand der von Schädlingen befallenen Nutzpflanze und den vorherrschenden Wetterbedingungen. Allgmein können transformierte Pflanzenzellen und ihre Nachkommen etwa 0,1 bis etwa 100 Gew.-% des Mittels oder der Formulierung ausmachen, vorzugsweise etwa 1,0 bis etwa 99 Gew.-%.
Bekannte insektizide, fungizide, biozide, herbizide und Düngemittel Verbindungen und Mittel, die mit den Polypeptidtoxinen verträglich sind, können als Komponenten in die oben beschriebenen Mittel und Formulierungen eingeschlossen werden, um zusätzliche günstige Wirkungen und Vorteile zu erhalten.
In der Praxis versuchen bestimmte Lepidoptera-Larven sich auf/von transformierten Pflanzen zu ernähren. Eine geringe Menge an transformiertem Pflanzenmaterial wird aufgenommen und verdaut. Das aufgenommene Material wird im Mitteldarm des Insektes aufgeschlossen und setzt das aktive Polypeptidtoxin frei, das auf die Zellmembran des Mitteldarms einwirkt und den Schädling tötet oder sein Wachstum verhindert.
Ebenfalls in der Praxis, wenn alleine oder als eine Komponente in einer Formulierung oder einem Mittel eingesetzt, versuchen bestimmte Lepidoptera- und/oder Coleoptera-Larven sich von Pflanzen zu ernähren, die mit diesen Formulierungen oder Mitteln behandelt worden sind. Eine kleine Menge des behandelten Pflanzenmaterials wird aufgenommen. Das aufgenommene Material, das die Formulierung oder das Mittel enthält, wird im Mitteldarm des Insektes aufgeschlossen und setzt das Polypeptidtoxin frei, das auf die Zellmembran des Mitteldarms einwirkt, um den Schädling zu töten oder sein Wachstum zu verhindern.
Die gentechnische Manipulation nach der Erfindung wird allgemein wie folgt ausgeführt:

1. Isolierung und Präparierung von Antikörpern, die für B.t. Kristallpolypeptide spezifisch sind. A. Isolierung von Bacillus thuringiensis (B.t.) Kristallpolypeptiden. B. Präparierung/Herstellung von Antikörpern (polyklonal und monoklonal) gegen B.t. Kristallpolypeptide.
2. B.t. Genbank-Präparate. A. Präparierung von Gesamt-DNA oder Plasmid-DNA aus/von B.t., vorzugsweise Plasmid-DNA. B. Partieller Abbau der gereinigten DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym. C. Klonieren von DNA-Fragmenten in/zu einem geeigneten E. coli Plasmidexpressionsvektor.
3. Isolierung von Rekombinationsplasmiden, die B.t.-Polypeptidgene enthalten. A. Aussieben/Aussuchen (screening) der transformierten E. coli Zellen mit Anti-B.t.-Kristallproteinserum. B. Identifizierung und Isolierung von Bakterienklonen, die das Polypeptid exprimieren.
4. Charakterisierung von Bt2-Protein. A. Reinigung des Polypeptids, das von kloniertem B.t.-Gen codiert wird. B. Prüfung/Analyse zur Bestätigung, daß das von Klonen exprimierte Polypeptid immunologisch das gleiche ist wie B.t.-Kristallpolypeptid. C. Prüfung/Analyse, um zu bestätigen, daß das von Klonen exprimierte Polypeptid insektizid wirkt.
5. Kartieren und Subklonieren von Bt2 einschließlich Restriktionsenzymanalyse, Subklonieren und DNA-Sequenz-Bestimmung.
6. Konstruktion der Toxin-Genkassette einschließlich Entfernung von unerwünschten flankierenden ATG-Triplets, die dem Initiator ATG vorangehen, und Zusatz von geeigneten Restriktionsenzym-Spaltungsstellen unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotid-Linkern.
7. Konstruktion von Zwischenvektoren.
8. Konstruktion von Hybrid-Ti-Plasmiden.
9. Manipulation von Pflanzen. A. Identifizierung von transformierten Pflanzengeweben, die das Toxin produzieren unter Anwendung von Immunoassays und Quantifizierung der erzeugten Toxinspiegel. B. Regenerierung von Pflanzen aus Geweben.
10. Nachweis von Bt2-Toxin in manipulierten Pflanzen.
11. Bestimmung der Toxizität von manipulierten Pflanzen gegenüber Insekten.

Verschiedene Arten von chimären Genen (Promotor-Genfusionen) wurden angewandt, um Pflanzenzellen genetisch zu transformieren, und es können grundsätzlich drei verschiedene Arten von pflanzenspezifischen Promotoren unterschieden werden: Promotoren:

1. Ti-Plasmid-abgeleitete Promotoren (Pnos, PTR, gelegentlich hier als PTR2 bezeichnet).
2. Pflanzenpromotoren (Pssu Erbse, Pssu301).
3. Pflanzenviruspromotoren (P35S aus/von Blumenkohl-Mosaikvixus).

Typen von chimären Genen:
1. Typ I:
Direkte Promotor-Genfusionen, bei denen die gesamte Bt2-codierende Sequenz hinter das Promotorfragment insertiert wird. Beispiele sind: Pnos-Bt2 (pHD1050, pHD1060) , Erbse-Bt2 (pHD1076) , PTR2-Bt2 (pGS1161) , Pssu301-Bt2 (pGS1181), P35S-1-Bt2 (pGS1261), P35S-2-Bt2 (pGS1271). Einige der Konstrukte enthalten nicht die intakte 5'-nicht-translatierte Region des ursprünglichen Transkriptes (Pnos, Pssu Erbse), aber andere tun dies (PTR, Pssu301). Diese Gene sind nicht Teil der beanspruchten Erfindung.
2. Typ II:
Chimäre Pssu-Tp-Bt2-Genfusion, bei der das Bt2-Gen mit der Transitpeptid (Tp)-Sequenz der kleinen Untereinheit von RuBisco fusioniert und unter Kontrolle des Pssu-Promotors exprimiert wird. In diesem Falle wird ein Fusionsprotein vorzugsweise hergestellt aus den natürlichen Translations-Initiationssignal des ssu-Gens. Van Den Broeck et al (1985) zeigten den Transport des Bakterien-NPTII-Proteins in Pflanzenchloroplasten unter Anwendung einer Fusion zwischen dem Transitpeptid des ssu von RuBisco und den NPTII-codierenden Bereich. In Anbetracht dieser Ergebnisse konstruierten wir das chimäre Gen Pssu-Tp:Bt2. Sowohl der Pssu-Promotor als auch das Transitpeptid (Tp)-Fragment wurden von dem von Van Den Broeck et al (1985) benutzten Erbsen-Gen. abgeleitet. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle ist in 28 gezeigt. Man sollte erwähnen, daß die ursprüngliche 5'-nicht-translatierte Region der Erbsen-m-RNA in Pssu-Tp:Bt2 erhalten bleibt, so daß das chimäre Gen von/aus der ursprünglichen ssu-Translations-Initiationsstelle (pHD1080) translatiert wird. Dieses Gen ist nicht Teil der beanspruchten Erfindung.
3. Typ III:
Direkte Promotor-Genfusionen, bei denen nur ein Teil der Bt2-codierenden Sequenz verwendet wird ("ausgelesenes Bt2"). Fragmente der Bt2-Sequenz, die noch ein aktives Toxin codieren, werden hinter den pflanzenspezifischen Promotoren insertiert. Die in den Pflanzenzellen unter Verwendung dieser Konstrukte produzierten toxischen Polypeptide sollten biologische und biophysikalische Eigenschaften aufweisen, die sich von denen des intakten Bt2-Proteins unterscheiden, wie spezifische, toxische Aktivität oder Löslichkeit.
Beispiele: pGS1162, pGS1163, pGS1262.
4. Typ IV:
Direkte Promotor-Genfusionen, bei denen ein Bt:NPTII-Fusionsgen (manchmal auch als Bt2:NPTII bezeichnet) hinter den Promotor insertiert werden. Fusionsgene wurden konstruiert/aufgebaut, die aus einem Fragment der Bt2-codierenden Sequenz (die noch ein aktives Toxin codiert), verschmolzen mit der codierenden Sequenz des NPTII-Enzyms, bestehen. Die hier verwendeten Bt:NPTII-Fusionsgene legen Fusionsproteine fast, die aminoterminale Teile des Bt2-Proteins, verschmolzen mit einem intakten Neomycin-Phosphotransferase (NTPII)-Enzym, enthalten. Diese Fusionsproteine besitzen eine spezifische Toxizität, vergleichbar mit derjenigen des intakten Bt2-Proteins, und halten Neomycin-Phosphotransferase-Enzymaktivität bei. Auf diese Weise ermöglicht die Expression der Bt:NPTII-Fusionsproteine in Pflanzenzellen die direkte Selektion bezüglich der Produktion dieses Proteins durch Isolieren von Kanamycin-resistenten (Km^R)-transformierten Zellen. Außerdem sollte das Niveau des Km^R direkt mit der Menge an synthetisiertem Protein in Beziehung gesetzt sein. Auf diese Weise sollte Selektion von Pflanzen, die gegenüber einem hohen Niveau an Kanamycin resistent sind, unter allen möglichen Transformationen diejenigen identifizieren, die hohe Niveaus/Anteile/Mengen des toxischen Fusionsproteins produzieren. Außerdem könnte die Expression des Fusionsproteins durch ein Bt:NPTII-Fusionsgen andere wünschenswerte Eigenschaften haben, wie Stabilität in Pflanzenzellen. Beispielsweise kann mRNA stabiler sein/werden. Unterschiede an den mit diesen Fusionsgenen von Typ N erhaltenen Eigenschaften können auf innere Unterschiede in den Eigenschaften des exprimierten Fusionsproteins im Vergleich mit dem intakten Bt2-Protein zurückzuführen sein.
Beispiele: pGS1110, pGS1151, pGS1152, pGS1171, pGS1251, pGS1253, pGS1281.
Auch alternative Konstruktionen der erwünschten, hier beschriebenen Transformationsvektoren werden in Betracht gezogen. Beispielsweise können andere pflanzenspezifische exogene Promotoren verwendet werden als hier beschrieben. Die Verwendung/der Einsatz einer verschiedenen exogenen Promotorsequenz kann nützlich sein, um die Expression der insertierten exogenen DNA in einer regulierten Weise auszurichten. Beispiele für andere Typen oder Arten der Regulation, von denen Gebrauch gemacht werden kann, schließen gewebsspezifische Expression (Blätter, Wurzeln, Blütenstiele) ein, sowie induzierbare Expression (Temperatur, Licht oder chemische Faktoren). Zusätzlich könnte, wenn die Daten für die DNA-Sequenz, die für die von Bacillus thuringiensis produzierten Endotoxine codiert, gegeben sind, ein Transformationsvektor kontruiert werden, der ein künstlich erzeugtes DNA-Fragment enthält, das im wesenlichen ähnlich/gleich ist dem hier beschriebenen Bt2-DNA-Fragment. Dieses künstlich erzeugte DNA-Fragment könnte dann verwendet werden, um Pflanzen in im wesentlichen der gleichen Weise, wie hier beschrieben, zu transformieren.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung und stellen keinerlei Einschränkung des Rahmens der Erfindung dar. Einige Beispiele erfüllen einen Vergleichszweck und sind nicht Teil der beanspruchten Erfindung. Diese Beispiele werden durch das Wort "Vergleich" in Klammern gekennzeichnet.
Experimentell
1. Isolierung von Bacillus thuringiensis (B.t.) Kristallproteinen
Kristalle wurden aus Sporenpräparaten von Stämmen B.t. Berliner 1715 (erhalten von Dr.A.Klier, EMBO J. 1, Nr. 7, S. 791–799, 1982) und B.t. var. Kurstaki, (J. Bacteriol. 145, Nr. 2, S. 1052, 1981, wie von Mahillon und Delcour (J. Microbiol. Meth., Bd. 3, Nr. 2, S. 69–76, 1984 beschrieben) isoliert und gereinigt. Die Kristallproteine wurden durch Inkubieren der gereinigten Kristalle bei 37°C während 2 h in 0,2 M Thioglykolat und 0,1 M NaHCO₃, pH 9,5 in Lösung gebracht und anschließend das unlösliche Material durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit entfernt. Mit diesem Verfahren werden mehr als 80% der in den Kristallen vorhandenen Proteine in Lösung gebracht. Die gelösten Kristallproteine wurden auf 7,5% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS PAGE) analysiert. Das aus Bt Berliner erhaltene Kristallprotein enthielt mindestens zwei Haupt-Proteinarten im Bereich des hohen Molekulargewichtes (scheinbares Molekulargewicht von 140 und 130 Kd) und weniger Protein von etwa 120 Kd, wie durch Anfärben der Gele mit Coomassie-Brilliantblau gezeigt (1). Die in Lösung gebrachten Kristallproteine des Stammes Kurstaki zeigten eine Hauptbande für 130 Kd Protein und eine schwächere Bande für 60 Kd (l).
Diese in Lösung gebrachten Kristallproteine zeigten eine starke toxische Aktivität gegenüber Larven in der dritten Entwicklungsstufe des Kohlweißlings Pieris brassicae (LD₅₀ Werte: 0,5 ng/Larve für Kurstaki und 0,65 ng/ Larve für Berliner), wenn der im folgenden Abschnitt 5,2 beschriebene Toxizitätstest durchgeführt wurde.
2. Herstellung von Antikörpern, die für B.t. Kristallproteine spezifisch sind.
2.1 Polyklonale Antisera
Antisera gegen B.t. Kristallproteine (Berliner 1715 und Kurstaki) wurden getrennt in Kaninchen und Mäusen erzeugt. Antiserum gegen B.t. Kristallproteine (Kurstaki), erzeugt in Ziegen, wurde durch Entgegenkommen von Dr. L. Bulla, Universität von Idaho, erhalten. Nach bestem Wissen und Gewissen der Anmelderin wurde das Antiserum durch bekannte Verfahren hergestellt, die im wesentlichen ähnlich/gleich sind den für Kaninchen und Maus beschriebenen Verfahren.
Kaninchen erhielten subkutan 0,5 mg eines Präparats mit in Lösung gebrachtem Kristallprotein (0,25 ml, dialysiert gegen PBS pH 7,4), vermischt mit einem gleichen Volumen vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA). Nach drei Monaten erhielten die Kaninchen eine weitere Injektion von Präparat des gleichen Typs, und drei Wochen später wurden Blutproben entnommen. BALBc-Mäuse erhielten intraperitoneal injiziert 100 μg Kristallproteinlösung, vermischt mit CFA (1:1 Vol.). Vier bis sechs Wochen später erhielten sie eine Booster-Injektion von 50 μg Kristallprotein PBS, und vier Tage später wurden Blutproben entnommen. Die Antigenreaktivität der Seren wurde durch Immunodiffusionstests (Ouchterlony assay) bestätigt. Es wurde eine starke Kreuzreaktion zwischen Berliner 1715 und Kurstaki Kristallproteinpräparaten beobachtet, die anzeigte, daß sie antigenisch verwandte Komponenten enthielten.
Einige Mäuse wurden getötet und ihre Milz aseptisch entnommen für Zellfusionsexperimente (s. 2.2).
2.2 Monoklonale Antikörper
Obwohl nicht wesentlich für die hier beschriebenen Toxin-exprimierenden Klone wurden Hybridona-produzierende monoklonale Antikörper gegen B.t. Kristallproteine entsprechend dem folgenden Verfahren, ursprünglich beschrieben von Koehler and Milstein (Nature 256: 495–497, 1975) erzeugt. Monoklonale Antikörper wurden als ein zusätzliches und mehr spefizisches Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit von Toxin in Bakterienklonen und Pflanzenzellen verwendet.
Milzzellen von immunisierten BALBc Mäusen (s. 2.1) wurden mit der SP2/0 Myelomazell-Linie (Shulman, M. et al., Nature 276, S. 269, 1978) fusioniert. Die Zellen wurden zu 3.10⁵ je Vertiefung in Mikrotiterplatten plattiert und 10–14 Tage später wurden die Überstände hinsichtlich der Anwesenheit von Anti-Kristallproteinantikörpern getestet und unter Anwendung eines Enzymimmunoassays (Engvall und Pesce, Scand. J. Immunol., suppl. 7, 1978) mit mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziegen-anti-Mausimmunoglobulin als zweitem Antikörper (Sigma, A-5153). Etwa 4% der Vertiefungen waren positiv für das Antigen (Kristallprotein). Positive Klone wurden zweimal mittels Grenzverdünnung subkloniert. Positive Subklone wurden selektiert, aufgezogen und ihre Kultur-Überstände, die die monoklonalen Antikörper enthielten, wurden gesammelt. Es wurde eine Gesamtzahl von 17 Hybdridoma-Zell-Linien, die monoklonale Antikörper produzieren, die mit B.t.-Berliner Kristallproteinen reagieren, erzeugt.
3. Konstruktion einer Genbank aus Plasmid DNA von B.t. Stamm Berliner 1715.
Konstad et al., J. Bacteriol., 54, S. 419–428 (1983) haben berichtet, daß B.t. Berliner 1715 zwei verwandte Toxingene enthält, die beide auf Plasmiden lokalisiert sind. Intakte Endotoxingene wurden aus einer Genbank von Gesamt B.t. Berliner 1715 Plasmid DNA isoliert unter Verwendung von partiellen Sau3A Ektrakten von Plasmid DNA. B.t. Berliner 1715 Zellen wurden in LB-Medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics, (1972) , Cold Spring Harbor Laboratory, New York) über Nacht bei 37°C gezüchtet. Plasmid DNA wurde von B.t. Berliner 1715 isoliert unter Anwendung der Denaturierung-Renaturierungsmethode, beschrieben von Kronstadt et al., J. Bacteriol., 54, S. 419–428 (1983). Analyse der Plasmid-DNA auf 0,5% Agarosegelen zeigte, daß dieses Plasmid-DNA-Präparat mehrere und unterschiedliche Plasmidarten in unterschiedlichen molaren Konzentrationen enthielt. Um die Genbank zu konstruieren, wurden 30 μg Plasmid-DNA partiell mit Sau3A bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 500 μl abgebaut. 100 μl Proben wurden nach jeweils 10, 20, 30, 45 und 60 min. Inkubation entnommen und mit Phenol-Chloroform extrahiert. Das Sau3A abgebaute DNA wurde Korn(größen)-fraktioniert auf einem 10 bis 40% Saccharosegradienten und die Größe der DNA-Fragmente in den verschiedenen Fraktionen wurde auf einem 0,8% Agarosegel bewertet. Die Fraktionen, die DNA im 6 bis 10 Kb Größenbereich enthielten, wurden zusammengegeben und mit BglII-digeriertem pEcoR251-Vektor-DNA li gasiert. Das pEcoR251-Plasmid ist ein Derivat von Plasmid pBR322, bei dem das EcoRI-PuvII-Fragment ersetzt worden ist durch ein chimäres EcoRI-Endonukleasegen, das mit einem PR Promotor-Fragment abgeleitet von Plasmid pLK5 (Zabeau und Stanley, EMBO Journal, 1217–1224 (1982) verschmolzen ist, wie in 2 gezeigt. Das pEcoR251 enthält eine einmalige BglII-Stelle im EcoRI-Endonukleasegel, wo Insertion das Gel inaktiviert. Der pEcoR251-Vektor ist ein Suizidvektor ähnlich dem Positive-Selektions-Klonierungsvehikel pSCC31 beschrieben von Cheng und Modrich (J. Bacteriol. 154, 1005–1008, 1983). Sau3A DNA-Fragmente wurden in mit BglII-abgebautem pEcoR251 ligasiert. Rekombinierte Plasmide wurden selektiert durch Transformieren des Ligationsgemisches zu kompetenten E. coli K514-Zellen (Colson et al., Genetics 52, S. 1043–1050, 1965), wie von Dagert und Ehrlich, Gene 6 (1980), 23–28 beschrieben. Die Zellen wurden auf LB-Medium (Miller, l.c.supplementiert mit Ampicillin (100 μg/ml) plattiert, Es wurden verschiedene Genbänke konstruiert, die jeweils zwischen 600 und 1500 rekombinante Klone enthielten. Die Analyse der in zwölf willkürlich ausgewählten Klonen vorhandenen rekombinierten Plasmide bestätigte, daß in jeder Genbank mindestens 10 von 12 Klonen insertierte Fragmente mit Abmessungen/Größen von 5 bis 15 Kb enthielten.
4. Isolierung von rekombinierten Plasmiden, die B.t.-Kristallproteingene enthalten
Die Kolonien der Genbank wurden bezüglich Kristallproteine produzierenden Bakterien getestet unter Verwendung eines Kaninchenserums, das gegen gereinigte B.t.-Berliner Kristallproteine (s. 2.1 oben) entwickelt worden war. Die angewandten Verfahren sind leicht verändert gegenüber Helfman et al., (PNAS 80: 31–35, 1983). Bakterienkolonien, gezüchtet auf 150 mm viereckigen Petrischalen, wurden auf Nitrocelluloseblättern (Schleicher & Schuell, 0,45 μm, 401196) replika-plattiert. Die Blätter wurden in 0,1 M NaOH eingetaucht, bis sich die Kolonien auflösten. Die Blätter wurden dann an der Luft getrocknet, in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 während 30 min. gewaschen und über Nacht bei 4°C während 2 h bei Raumtemputur unter leichter Bewegung in PBS enthaltend 1% rohes Ovalbumin (Sigma, A-5253) inkubiert. Die Nitrocelluloseblätter wurden in PBS gespült und 2 h in Kaninchen-anti Kristallserum, verdünnt in PBS, 1% Ovalbumin, 2% Triton X-100 bei Raumternperatur unter leichtem Rühren/Bewegen inkubiert. Nach zusätzlichem Waschen wurden die Blätter mit mit Peroxidase markierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (Sigma, A-6154) inkubiert (2 h bei Raumtemperatur). Nach gründlichem Waschen mit PBS/0,2% Triton wurden die Blätter mit Substratlösung (das Substrat war 4-Chlor-1-naphtol, Sigma, C-8890) zur Reaktion gebracht. Positive Kolonien entwickelten sich als dunkelblaue Flecken. Unter Anwendung von Reinverdünnungen von gereinigter Kristallproteinlösung wurde die Nachweisgrenze dieses Tests mit 1 bis 10 ng Protein/ml bewertet. Insgesamt wurden vier verschiedenen immunopositive Klone aus einer Genbank von 1250 Klonen isoliert. Aus jedem Klon wurde Plasmid-DNA entsprechend dem Verfahren von Zabeau und Stanley, EMBO J., 1, 1217–1224, 1982 hergestellt. Primäre Restriktionskarten wurden konstruiert/aufgestellt durch Ausführen von Einzel-Restriktionsenzym-Abbau und gleichzeitigem Restriktionsenzym-Abbau. Vergleich der Restriktionskarten für die Enzyme EcoRI, EcoRV, BamHI, SacI, MluI und Pstl (s. 3) zeigten, daß alle vier Plasmide DNA-Fragmente unterschiedlicher Größen trugen, die eine klare Überlappungsregion zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Bt2-Gene durch eine 4,2 Kb Region, die den vier verschiedenen rekombinierten Plasmiden gemeinsam ist, kodiert werden muß. Für weitere Untersuchungen subklonierten wir ein 7,5 Kb BamHI-PstI-Fragment aus Klon B12 (s. 3) in das Plasmid PUC8 (J. Viera und J. Messing, Gene, 19, p. 259–268, 1982) und dieses rekombinierte Plasmid wurde als pBt200 bezeichnet.
5. Charakterisierung des Bt2-Proteins
5.1. Identifizierung eines 130 Kd Kristallproteins kodiert von pBt200
Der E. coli Stamm K514, der das pBt200-Plasmid (siehe Abschnitt 4) enthält, zeigte eine starke positive Reaktion beim Kolonietest. Dies wurde weiter bestätigt unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunosorbensassays (ELISA) (Engvall/Pesce, 1978, Scand. J. Immunol., Suppl. 7). Für den ELISA-Test wurde das folgende Verfahren angewandt: biegsame Polyvinyl-Mikrotiterplatten, beschichtet mit Ziegen-anti-Bt-Kristallprotein-Antikörper wurden mit (einen) Lysat von Bakterienkolonien inkubiert (Lysate wurden durch Ausfrieren von pelletisierten Zellen, anschließendes Inkubieren in 0,1 M NaOH während 15 min und anschließender Neutralisation mit 0,1 M HCl erhalten). Nach dem Waschen wurde ein verdünntes Kaninchen- oder Mäuse-an ti-B.t. Kristallproteinserum zugesetzt. Nach 1- bis 2-stündiger Inkubation wurden die Platten gewaschen und mit Kaninchen- oder Mäuse-anti-Bt Kristallserum (entsprechend verdünnt) inkubiert. Nach 1- bis 2-stündiger Inkubation wurden die Platten gewaschen und mit Ziegen-anti-Kaninchen- oder anti-MäuseIgG-Antikörper, mit alkalischer Phosphatase markiert (Sigma A-8025, A-5153), inkubiert. Nach dem Inkubieren und Waschen wurde das Substrat (p-Nitrophenylphosphat, Sigma, 104–105) zugesetzt und die Reaktion durch Messen der optischen Dichte (O.D.) bei 405 nm überwacht. Die Nachweisgrenze des Tests für gereinigtes, in Lösung gebrachtes Kristallprotein lag, wie bewertet, im Bereich von 0,1–1 ng/ml.
Die Gesamt-Zell-Proteinextrakte von E. coli Stämmen, die pBt200 beherbergen, wurden auf SDS PAGE analysiert. Ein starkes, neues Proteinband war im hohem Molekulargewichtsbereich sichtbar, entsprechend einen Molekulargewicht von etwa 130 Kd. Dieses Band war in K514 Zellen, die das pUC8-Vektorplasmid ohne Insert enthielten, nicht vorhanden. Dieses neue Protein wanderte auf SDS PAGE auch gemeinsam mit einem der Haupt-Kristallproteine von B.t Berliner und mit den Haupt-Kristallprotein von B.t. Kurstaki (s. 4).
Die Beziehung/Verwandtschaft dieses Proteins, das Bt2 genannt, wurde mit B.t. Kristallproteinen wurde durch Immunoblotting bestätigt. Western-Blotting-Versuche wurden ausgeführt unter Verwendung von sowohl Kaninchen-anti-B.t, Kurstaki-Kristallserum und Kaninchen-anti-B.t. Berliner-Kristallserum. Es wurde eine starke Reaktion des Bt2-Proteins mit beiden Antisera beobachtet (s. 5 und 6).
Diese Ergebnisse zeigen, daß das klonierte Bt2-Gen für eines der Kristallproteine von B.t. Berliner, das immunologisch mit dem 130 Kd Kristallprotein von B.t. Kurstaki verwandt ist, codiert.
Die Menge an positiv reagierendem Material in Bakterienextrakten wurde unter Anwendung eines ELISA-Assays quantifiziert. Unter Verwendung von gereinigtem Kristallprotein als einen Standard wurde bewertet, daß die Menge an Kristallprotein produziert von E. coli, das pBt200 beherbergt, im Bereich von 5 bis 10% des gesamten Zellproteingehaltes liegt. Diese Bewertung/Schätzung stimmt gut überein mit der beobachteten Insentität der Bande der Bt2-Proteinbande auf SDS PAGE nach Einfärben mit Coomassie-Blau. Um weiter hin das 130 Kd Protein, codiert von dem pBt200-Plasmid (genannt Bt2-Protein) zu charakterisieren, haben wir ein Schnellreinigungsverfahren entwickelt, das Vorteil zieht aus der relativen Unlöslichkeit des Proteins. 5 g Zellen erhalten aus einer 2 1 über-Nacht-Kultur von K514 (pBt200) wurden erneut in 50 ml 50 mM TRIS pH 7,9, 50 mM EDTA, 15% Saccharose suspendiert, mit Lysozym (100 μg/ml) behandelt, beschallt (30 min bei 400 W in einem Labsonic 1515), vermischt mit 200 ml PBS, pH 7, enthaltend 2% Triton X100 und während 30 min auf Eis inkubiert. Das Lysat wurde bei 15 000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet, das Bt2-Protein enthielt, wurde erneut im gleichen Puffer suspendiert und das Verfahren wurde wiederholt. Darauf wurde das Pellet zweimal mit 200 ml PBS gewaschen. Um das Bt2-Protein in Lösung zu bringen, wurde das Pellet erneut in 50 ml Extraktionspuffer 0,2 n Thioglycolat und 0,1 M NaHCO₃, pH 9,5 während 2 h bei 37°C suspendiert. Ein wirksames (> 90%) und selektives In-Lösung-Gehen von Bt2-Protein wurde auf diese Weise erzielt.
Diese halbgereinigten Proteinpräparate wurden für weitere Untersuchungen eingesetzt. Antisera wurden gegen Bt2-Protein in Kanichen in Mäusen erzeugt unter Anwendung eines gleichen/ähnlichen Immunisierungsprotokolls wie in Abschn. 2.1 beschrieben. Diese Antisera reagierten gleich gut mit in Lösung gebrachten Kristallproteinen aus B.t. Berliner und Kurstaki, wie mit Bt2 selbst, in dem oben beschriebenen ELISA-Test (8 zeigt Ergebnisse mit dem Mäuseserum).
Eine gleichartige positive Reaktion wurde beobachtet unter Verwendung von gereinigten Antikörpern, aus anti-Bt-Kristallserum, mittels Affinitätschromatographie auf einem Immunoabsorbens von Bt2 (Bt2-Protein gekuppelt auf mit CNBr-aktivierter Sepharose 4B, Pharmacia). Diese Antikörper reagierten auch beim Western-Blotting mit einem 130 Kd Protein, das sowohl in B.t. Berliner- als auch Kurstaki Kristallen vorhanden war.
Schließlich erwiesen sich in dem ELISA-Test 9 der 17 monoklonalen Antikörper, die gegen Gesamt-B.t. Berliner-Kristallproteine erzeugt worden waren, auch als reaktionsfähig mit dem Bt2-Protein (Code-Nummern: 1F6, 167, 4D6, 4F3, 8G10, 10E3, 1,7, 4.8, C73) (9). Die gleichen 9 Antikörper waren auch mit B.t. Kurstaki Kristallproteinen reaktionsfähig.
Allgemein benötigen sowohl das Bt2-Protein als auch die Haupt-130 Kd-Kristallproteine aus B.t. alkalischen pH-Wert und die Anwesenheit von reduzierenden Reagentien, um vollständig in Lösung zu gehen. Außerdem fallen sie beide bei pH 4 bis 5 aus.
So zeigt das geklonte Genprodukt Bt2 biochemische Eigenschaften, die ähnlich/gleich sind denjenigen des Haupt-130 Kd-Kristallproteins aus B.t. Berliner und B.t. Kurstaki und ist immunologisch mit diesen Kristallproteinen verwandt.
Das Bt2-Protein wurde weiter mittels DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie und mittels Sephacryl-Gelfiltration gereinigt. Die amino-terminale Sequenz dieses gereinigten Proteins wurde unter Verwendung eines Gasphasen-Sequenzers (Applied Biosystem) betrieben entsprechend Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, 7990–7997, 1981), bestimmt.
Die Sequenz der ersten 20 N-terminalen Aminosäuren erwies sich als im wesentlichen identisch mit der N-terminalen Sequenz, abgeleitet von der DNA-Sequenz eines geklonten B.t. Kurstaki Gens (Wong et al., J. Biol. Chem., 258 (3), 1960–1967 (1983), 10).
5.2 Insektentoxizität des Bt2-Proteins
Kristalle von B.t. sind dafür bekannt, daß sie besonders toxisch gegenüber Larven von bestimmten Lepidoptera-Arten sind. Um zu prüfen, ob Bt2-Protein eine gleichartige toxische Aktivität entfaltet, wurden Toxizitätstests mit Larven des Kohlweißlings Pieris brassicae durchgeführt. Proteinlösungen bekannter Konzentration ausgedrückt als ppm (1 ppm = 1 μg/ml), wurden in Wasser reihenverdünnt. Kleine Scheiben (0,25 cm²) wurden aus frischen Kohlblättern ausgeschnitten und auf jede Scheibe wurden 5 μl einer Testlösung gebracht. Die Scheiben wurden luftgetrocknet und jede Scheibe wurde in ein Glasfläschchen gegeben, das eine Larve enthielt. Larven der dritten Entwicklungsstufe wurden aus einer synchronisierten Kultur von P. brassicae erhalten. Während einer 10 h Zeitspanne vor der Häutung wurden diese Larven in getrennten Glasfläschchen in Anwesenheit von Futter inkubiert. Unmittelbar nach dem Häuten erhielten sie eine Blattscheibe. Wenn die erste Scheibe verbraucht war, wurde der Larve eine frische Scheibe ohne Probe angeboten.
Für jede Probenverdünnung wurden 50 Larven getestet. Die Fütterung und die Lebensfähigkeit wurden alle 24 h bis zu 120 h aufgezeichnet. Wie aus Tabelle 1 zu sehen, zeigten Bt2-Probenpräparate gleiche/ähnliche Toxizitätsgrade für P. brassicae-Larven, wie löslich gemachte Kristalle von B.t. Berliner 1715.
Um die Wirkung von sublethalen Dosen von Bt2-Toxin auf das Wachstum von P. brassicae-Larven zu testen, wurde das folgende Versuchsmuster angewandt: Kohlblätter wurden in eine Lösung, die eine bekannte Konzentration von Bt2-Protein (0,01 bis 1 ppm) enthielt, eingetaucht und getrocknet. Gruppen von 100 Larven der dritten Entwicklungsstufe (aus synchronisierten Kulturen) wurden auf mit Bt2-beschichteten Blättern gefüttert. Die Blätter wurden regelmäßig durch neue, in der gleichen Weise behandelte Blätter ersetzt. Das Wachstum der Larven wurde während einer Zeitspanne von 7 Tagen verfolgt, die der Zeitspanne entspricht, die für die Entwicklung von der dritten zur fünften Entwicklungsstufe notwendig ist. Wie aus den in Tabelle 2 zusammengestellten Ergebnissen zu sehen, induziert das Bt2-Protein eine signifikante Wachstumshemmung in P. brassicae-Larven bei sublethalen Dosen. Die Wachstumshemmung war bei einer Konzentration von 0,01 ppm, die 2,67 ng Protein/g Blatt, entspricht, evident. Während der ersten 48 h fraßen die Larven auch 3,6 cm² (83 mg) Blätter, die mit 0,01 ppm beschichtet waren, und nahmen infolgedessen etwa 0,22 ng Bt2-Protein auf. Zu diesen Zeitpunkt befanden sich 93% der Larven noch in dem L3-Stadium, während sich nur 33% der Kontroll-Larven in diesem Stadium befanden. So konnte eine Hemmwirkung auf das Wachstum mit Termindosen beobachtet werden, die deutlich unter den LD₅₀-Werte (1,65 ng/Larve, s. Tab.1) lagen.
Diese Ergebnisse zeigen an, welcher Grad an Bt2-Proteinsynthese in transformierten Pflanzenzellen erreicht werden muß, damit Insektenresistenz gegenüber P. brassicae exprimiert wird. Eine Grad/Stufe von 2,7 ng Bt2-Protein/g Gewebe reicht aus, um das Wachstum der Larven zu verzögern. Dies kann bereits als solches adäquat sein, um eine verheerende Ausbreitung der Larven im Feld aufzuhalten. Toxizitätsversuche mit Bt2-Protein wurden auch an Larven des Tabak-Hornwuchs (Manduca sexta) durchgeführt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, ist Bt2-Protein geringfügig stärker toxisch als Gesamt-Berliner Kristallproteine (100% Mortalität bei 12,5 ng/cm²). Zusätzlich wird deutliche Wuchshemmung bei sublethalen Dosen (2,5 ng je cm²) beobachtet: 4,4 mg Körpergewicht nach 7 Tagen verglichen mit 30,5 mg für Kontroll-Larven. Aufgrund der Tatsache, daß Manduca mit künstlicher Nahrung gefüttert wird (s. Bell, R.A. & Joachim, F.G. (1976) Ann. Entomol. Soc. Am., 69: 365–373), werden die Ergebnisse etwas anders ausgedrückt, nämlich als ng Toxin aufgebracht je cm² Agarmedium.
6. Charakterisierung des Bt2-Gens
Um das Bt2-Toxin-Gen auf dem 7,2 Kb BamHI-PstI-Fragment des pBt200-Plasmids zu lokalisieren wurde eine Reihe von Deletionen in dem 7.2 Kb DNA-Fragment vorgenommen mit HpaI bzw. KpnI und IbaI. Die von diesen Deletionsplasmiden kodierten Plasmide wurden immunologisch analysiert unter Anwendung der ELISA-Technik und des Western-Blottings (hier auch als Immuno-Blotting bezeichnet) (Towbin et al., PNAS, USA 76: 4350–4354, 1979 und Burnette, W.N. An. Biochemistry, 112, S. 195–203, 1981).
Die Ergebnisse (als Diagramm in 11 angegeben) können wie folgt zusammengefaßt werden: (1) Deletion des HpaI Fragmentes führt zu Synthese eines intakten Bt2-Proteins auf einer niedrigeren Stufe. Diese Feststellung zeigt an, daß die Deletion nur die Regulatorregion, nicht aber den strukturellen Teil des Gens beeinflußt. (2) Deletion des Kpn Fragmentes führt zu einem etwa 70 Kd-Proteinfragment, das noch durch Immuno-Blotting nachgewiesen werden kann. (3) Die Xba-Deletionen näher am 5' Ende veranlassen keine Proteinfragmente, die durch das Western-Blotting-Verfahren nachweisbar sind. Diese Ergebnisse zeigen, daß das intakte Gen, welches das 130 Kd-Protein codiert, auf einem 4.3 Kd HpaI-PstI-Fragment lokalisiert ist (s. 11). Um die genaue Struktur des Bt2-Gens zu bestimmen, wurde die vollständige Nukleotid-Sequenz des 4.060 Basen-Paare (Bp) HpaI-NdeI Fragmentes nach der Maxam und Gilbert-Sequenzierungsmethode bestimmt. Die angewandte Sequenzierungsstrategie ist in 12 als Diagramm dargestellt.
Die vorgeschlagene Nukleotid-Sequenz wurde hauptsächlich durch Sequenzieren des Komplementärstranges bestätigt. Die Untersuchung der Sequenz zeigte das Vorhandensein eines einzigen großen offenen Leserasters an, das bei Position 141 begann und bei Position 3605 endete und das ein Protein aus 1 155 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 127 Kd kodierten konnte. Dies stimmt überein mit dem Molekulargewicht von 130 Kd des Bt2-Proteins, wie durch SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Außerdem stimmte die aus den Nukleotid-Sequenzen vorhergesagte aminoterminale Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz überein, die an gereinigtem Bt2-Protein bestimmt wurde (s. 10 und 13).
Die vollständige Aminosäuresequenz des Bt2-Toxins zeigt extensive Homologie mit den abgeleiteten Aminosäuresequenzen von drei anderen Bt-Kristallproteinen von/aus denen die Gene geklont und sequenziert worden waren: B.t. Kurstaki Hdl (Dipel), (Schnepf et al., J. Biol. Chem., 20, S. 6264, 1985), B.t. Kurstaki HD73 (Adang et al., Gene, 36, S. 289, 1985) und B.t. Sotto (Shibano et al., Gene, 34, S. 243, 1985).
Der Vergleich dieser anderen Bt-Sequenzen mit unseren Bt2 auf dem Aminosäureniveau (14) zeigte auch, daß sie ähnliche, aber deutlich getrennte Proteine kodieren, die Regionen auffallender Homologie zeigen, aber auch Bereiche, die sich merklich unterscheiden.
7. Konstruktion der "Toxin-Gen"-Kassetten
7.1 Konstruktion einer Kassette, die das intakte Bt2-Gen trägt
Inspektion der DNA-Sequenz des Bt2-Gens zeigte, daß die 160 Bp-Region unmittelbar stromaufwärts des ATG-Translations-Startcodons 5 ATG Triplets enthält. Die Translation von eukaryontischen Genom startet üblicherweise beim ersten AUG in der Information für das Protein (in RNA wird T durch U ersetzt). Diese AUG-Triplets können als Initiator/Start AUG's wirken und vorzugsweise über das genuine Bt2-Startcodon erkannt werden und so das Ausmaß der Expression in transformierten Pflanzenzellen reduzieren. Außerdem befinden sich diese AUGs in anderen Leserastern und könnten Nicht-Sinn Polypeptide verursachen. Um den Start der Translation bei diesen AUG-Triplets zu verhindern, wurden die Sequenzen stromaufwärts des Bt2-Gens durch exonucleolytische Behandlung entfernt, vor der Insertion des Bt2-Gens in die Ti-Expressionsvektoren. Zu diesem Zwecke wurden Deletionsderivate des pBt2-Plasmids konstruiert, in denen stromaufwärts Sequenzen bis zu dem Start ATG deletiert waren. 35 μg pBt200 DNA wurden mit HpaI abgebaut und mit 6 Einheiten Ba131 Exonuclease (Biolabs, New England) während 1, 1,30, 2, 2,30 und 3 min in 300 μl 12 mM MgCl₂, 12 mM CaCl₂. 0,6 M NaCl, 1 mM EDTA und 20 mM tris-HCl – pH 8,0, bei 30°C behandelt. 1 μg mit Ba131-behandelte Moleküle von jeder Reaktion wurden bei 4°C an 0,13 μg phosphorylierte BamHI Linker (Biolabs, New England) mit 2 Einheiten T4 DNA-Ligase in einen Gesamtvolumen von 20 μl ligasiert.
Nachdem die T4-Ligase bei 68°C während 10 min inaktiviert worden war, wurde jedes Ligationsgemisch mit 20 Einheiten BamHI während 1 h bei 37°C abgebaut. Anschließend wurden 50 ng DNA mit 0,1 Einheit T4 DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 100 μl während 20 h bei 4°C rezirkularisiert.
Ein Fünftel dieses Ligationsgemisches wurde in/zu kompetente E. coli K514-Zellen transformiert (Colson et al., Genetics 52 (1965), 1043–1050) wie von Dagert und Ehrlich, Gene 6 (1980), 23–28 beschrieben. Zellen wurden auf LB-Medium plattiert (l.c.), angereichert mit Carbinicillin (100 μg/ml).
Die Deletions-Endpunkte in den Plasmiden wurden zunächst analysiert durch Messen der Größe der neu erzeugten EcoRI-Fragmente, der rekombinierten Plasmide auf einem 2% Agarosegel. Die Nucleotid-Sequenzen der genauen Deletions-Endpunkte in Plasmiden, bei denen Deletionen unmittelbar vor dem Start des Bt2-Gens endeten, wurden bestimmt. Klon pHD100 hatte eine Deletion, die 8 Bp vor dem Initiator/Start ATG endete und entfernte alle stranaufwärts gelegenen Nicht-Initiator-ATGs. Klon pBa3,3 enthält den BamHI-Linker verschmolzen mit dem vierten Bp der Cvdierungssequenz und Klon pBa23-3 enthält den Bam-Linker verschmolzen mit Bp –33.
In einer zweiten Manipulationsstufe wurden die nicht kodierenden Sequenzen am 3'-Ende des Toxin-Gens deletiert unter Verwendung von Ba131 Exonuclease (Biolabs, New England). 30 μg pHD100 Plasmid-DNA wurden mit NdeI abgebaut und mit Ba131 Exonuclease während 3, 4, 5, 6 und 8 min bei 30°C in Puffer behandelt. Bei jedem Zeitintervall wurden 60 μl Aliquots (jeder enthielt 6 μg mit BA131-behandelte DNA-Moleküle) entfernt. Nach Zugabe von phosphorylierten BglII-Linkern (Biolaps, New England) zu den mit Ba131-behandelten DNA-Molekülen wurden die DNA-Moleküle mit 0,1 U T4-Ligase über Nacht bei 4°C rezirkularisiert. Das Ligationsgemisch wurde in/zu kompentene E. coli K514-Zellen (Colson et al., l.c.) umgewandelt, wie von Dagert und Ehrlich, (l.c.) beschrieben. Die Zellen wurden auf LB-Medium (l.c.) angereichert mit Carbinicillin (100 μg/ml) plattiert. Nach Bestimmung der Größe/des Umfangs der Deletion in verschiedenen Plasmiden unter Anwendung von Restriktionsenzym-Abbau und Agarose-Gelelektrophorese wurden pHD160, pHD162 und pHD163 für weitere Experimente zurückgehalten. In pHD160 befindet sich die BglII-Stelle bei etwa 30 Bp hinter dem TAA-Stopcodon des Bt2-Gens; in pHD162 liegt BglII bei etwa 250 Bp hinter TAA und in pHD163 befindet sich BglII in Position 3342 (Bp) in der Bt2-Kodierungssequenz. Die Konstruktion/der Aufbau von pHD160 ist schematisch als Diagramm in 15 angegeben. Auf diese Weise konstruierten wir Toxin-Genkassetten, die das Bt2-Gen auf einem BamHI-BglII-Fragment tragen, das ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle der TI-Expressionsvektoren insertiert werden wird. Um pHD164 zu konstruieren, wurde das BamHI-Sacl-Fragment von pHD160, das das 5'-Ende der Codierungssequenz enthielt, durch das entsprechende BamHI-Sacl-Fragment von pBa3.3 ersetzt. Um pHD159 zu konstruieren, wurde das BamHI-SacI-Fragment von pHD163 durch das BamHI-SacI-Fragment von pBa3.3 ersetzt (16).
Um Plasmid pDC3 (16) zu erzeugen, wurde Plasmid pHD164 mit DraI abgebaut, an BglII-Linker ligasiert und das Fragment, das das Bt2-Gen enthielt, wurde in die BglII-Stelle von pLK57 geklont (17). Auf diese Weise wurde die BglII-Stelle der BamHI-BglII-Kassette in große Nähe zum TAA-Stopcodon von Bt2 gebracht.
7.2. Konstruktion von Kassetten, die veränderte Bt2-Gene enthalten
7.2.1 Ausgelesene Bt2-Gene
7.2.1.1. Rational
Ergebnisse der grundlegenden Forschung über die funktionellen Eigenschaften von B.t.-Kristallproteinen zeigen an, daß die qroßen, etwa 130 Kd Kristallproteine relativ unlöslich sind und zusätzlich Protoxine sind, die im Mitteldarm des Insektes zu aktiven Toxinen von geringerem Molekulargewicht, die ihre toxischen Effekte auf die Insekten ausüben können, abgebaut werden müssen (Bulla, L.A., Jr., D.B. Bechtel, K.J. Kramer, Y.I. Shetna, A.I. Aronson und P.C. Fitz-James, 1980, Rev. Microbiol., B. 147–203; Bulla, L.A., Jr., K.J. Kramer, D.J. Cox, B.L. Jones, L.I. Davidson und G.L. Lookhart, 1981, Biol. Chem., 256: 3000–3004; T.A. Angus, Can. J. Microbiol., 2: 416 (1956); M.M. Lecadet, "Microbial Toxins", Bd. II, herausgegeben von T.C. Montie und S. Kadis, Acadenic Press, Inc., New York und London, 1970, S. 437–471). Die spezifische Aktivität des Bt Toxins, wenn von den Insekten als Teil einer Zusammensetzung von gentechnisch veränderten Pflanzenmaterial aufgenommen, wird nicht nur durch die Gesamtmenge von vorhandenen Toxin, sondern auch durch den Grad der Zugänglichkeit von aktiven Toxin, freigesetzt im Mitteldarm, bestimmt werden. Es wurde gezeigt, daß einige Insektenarten wirksamer als andere sind beim In-Lösung-Bringen und/oder "Verarbeiten" (enzymatischer Abbau) von B.t.-Protoxinen (Vortrag von Dr. P. Luthy in "Second Workshop Bacterial Protein Toxins", Wepion, Belgien, 30. Juni – 4. Juli 1985; wird in den Kongreßberichten veröffentlicht). Es kann daher bei der Entwicklung von insektenresistenten Pflanzen von Vorteil sein, ausgelesene Toxine abgeleitet von Bt2 zu konstruieren, die die Eigenschaften haben, daß sie sind: 1) bereits weiterverarbeitetes oder partiell weiterverarbeitetes Toxin, das volle toxische Aktivität entfaltet und 2) löslicher ist als das ursprüngliche Bt2-Protein. Pflanzen, die solche ausgelesenen Polypeptide exprimieren, können eine höhere spezifische Toxizität gegenüber Insekten entfalten als Pflanzen, die intaktes Bt2 im gleichen Grad (in gleicher Menge) exprimieren.
7.2.1.2 Konstruktion der Deletionsmutanten
1. Positionierung des Toxin-Gens hinter den P_L-Promotor
Ein Gen, das für ein 130 Kd Kristallproteintoxin von B.t. Berliner 1715 codiert, wurde in/zu pUC8 (Viera und Messing, Gene 1, 259–268, 1982) geklont und verursachte pBt200. Charakteristika dieses Genes, genannt Bt2, und des resultierenden Toxins (Bt2-Protein) wurden in den Abschnitten 5 und 6 beschrieben.
Um eine regulationsfähige hochgradige Expression in E. coli sicherzustellen, wurde das Bt2-Gen hinter dem P_L-Promotor angeordnet (17). Hierzu wurde das Plasmid pBt200, das das Bt2-Gen auf einen 7,7 Kb BamHI-Fragment trug, mit Hpal geschnitten, mit Ba131 behandelt, an BamHI-Linker ligasiert, mit BamHI geschnitten und selbst-ligasiert (wie in Abschnitt 7.1 beschrie ben). Aus den sich ergebenden Klonen wurden Deletionsderivate mit unterschiedlichen Längen der stromaufwärts gelegenen Sequenzen selektioniert und hinter den P_L-Promotor des Expressionsplasmids pLK54 insertiert (s. 17 und Botterman et al., in press, Gene 1986) unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und Pstl.
Die entstehenden Plasmide wurden bezüglich der Produktion von Bt2-Protein getestet und eines von denen, die die höchste Konzentrationen an Bt2 produzierten, bezeichnet pLB10, wurde für weitere Experimente selektioniert. Plasmid pLB10 stammte von pBa23-3 (17, Abschnitt 7.1).
2. Konstruktion von Deletionen
Von den zuvor in pBt200 mit XbaI und KpnI hergestellten internen/inneren Deletionen veranlaßte nur die KpnI-Deletion die Entstehung von immunologisch nachweisbaren Bt2-abgeleitetem Protein (s. Abschnitt 6). Deletionen wurden in pLB10 gemacht unter Verwendung der Restriktionsenzyme KpnI und HindIII. Western-Blotting-Analyse und ELISA zeigten, daß nur die KpnI-Deletionsmutante, die das größte Fragment enthielt, das sich vom Start bis zur Position 2167 des Bt2-Gens erstreckte, ein stabiles, etwa 80 Kd Polypeptid produzierte. Das von dem HindIII-Deletionsderivat codierte Polypeptid ist wahrscheinlich hochempfindlich gegenüber E. coli Proteasen.
Interessanterweise entfaltete das von der KpnI-Deletionsmutante codierte Polypeptid eine insektizide Aktivität, die derjenigen des intakten Bt2-Proteins äquivalent war: In einem Experiment wurde der LD₅₀-Wert auf P. brassicae-Larven der dritten Entwicklungsstufe zu 2,5 ng je Larve für die Kpn Deletionsmutante bestimmt, verglichen mit 2 ng je Larve für das intakte Bt2. Dieses Ergebnis zeigt an, daß das ausgelesene Bt2-Genprodukt aus der KpnI-Deletion die gesamte aktive toxische Einheit umfaßt/enthält.
Die vorangehenden Daten legen nahe, daß das kleinste Genfragment von Bt2, das ein aktives Toxin codiert, innerhalb des KpnI-Deletionsfragmentes enthalten ist, sich aber über die HindIII-Stelle hinauserstreckt. Um den genauen Endpunkt des Minimalfragmentes, das das aktive Toxin codiert, zu kartieren, wurden Deletionsmutanten konstruiert, die N-terminale Fragmente abnehmender Größe enthielten. Hierzu wandten wir eine Strategie an, die uns erlaubte, gleichzeitig Deletionsmutanten und Translational-Fusionen zum NPTII-Gen (siehe Abschnitt 7.2.2) zu konstruieren. Die Konstruktion des Zwischenplasmids pLBKm25 ist in 18 dargestellt. Wie in 18 gezeigt, ist pLBKm25 von pLB10 abgeleitet (siehe vorhergehenden Abschnitt) und von pLKCm91, das in Abschnitt 7.2.2.2 beschrieben werden wird.
Wie gezeigt, ist dieses Plasmid mit einer DNA-Sequenz mit Stopcodons in den drei Leserastern hinter einer einzigen SalI-Stelle ausgestattet. Dieses Konstrukt wurde mit KpnI geschnitten mit Ba131 abgebaut, mit SalI geschnitten, mit Klenow-Polymerase behandelt und religasiert (19). Auf diese Weise wurde der deletierte codierende Bereich mit einem Stopcodon verschmolzen, mit einem Minimum an Nicht-Sinn codierender Sequenz. Ein Überblick über die Deletionsklone ist in 20 gegeben. Gesamt-Zellextrakte wurden von den Klonen (nach Induktion) hergestellt und im Western-Blotting und ELISA analysiert, um quantitativ Bt2-artige Polypeptide nachzuweisen, sowie in einem Insektentoxizitätsassay um aktives Toxin festzustellen. Die Ergebnisse sind in 21 dargestellt und zeigen, daß der Nachweis eines stablien Polypeptids allmählich abnimmt, wenn der Endpunkt des codierenden Bereiches näher zur HindIII-Stelle rückt.
Von einer bestimmten Position an (noch stromabwärts von HindIII gelegen) war fast kein Bt2-artiges Protein mehr nachweisbar. Außerdem fiel die Toxizität des extrahierten Materials aus diesen Klonen abrupt ab, wenn der 3'-Endpunkt eine besondere Position zwischen HindIII und KpnI durchlief. Die beiden Klone, die das kleinste toxische (pLB879) und das größte nichttoxische (pLB834) Polypeptid charakterisieren, wurden mittels DNA-Sequenzanalyse verifiziert. Diese Analyse zeigte, daß der kritische Endpunkt für ein stabiles aktives Toxin bei der Kartierung zwischen den Positionen 1797 und 1820 auf dem Bt2-Gen liegt (22). Deshalb umfassen alle N-terminalen Genfragmente von Bt2, die stromabwärts von Position 1820 (Bp) enden, ein Genfragment, das ein aktives Toxin codiert. Interessanterweise zeigte der Gesamt-Zellextrakt eines Klones (pLB820) eine sehr viel stärkere Reaktion mit einem polyklonalen Antiserum und einem monoklonalen Antikörper beim Western-Blotting. Außerdem war das von diesem Klon produzierte Protein in E. coli stärker löslich als das KpnI-Deletionsgenprodukt und zeigte dennoch volle toxische Aktivität.
7.2.2. Fusionsgene zu NPTII
7.2.2.1 Rationale
Es ist bekannt, daß amino-terminale Fusionen am NPTII-Gen Fusionsproteine erzeugen können, die noch Kanamycinresistenz in Bakterien verleihen (Reiss et al., EMBO J. 3, S. 3317, 1984).
Da NPTII ein höchst geeigneter Selektionsmarker bei der gentechnischen Veränderung von Pflanzen ist, könnten solche Genfusionen sehr erfolgversprechende Anwendungen finden. Wenn nämlich solche NPTII-Fusionsproteine eingesetzt werden, um Pflanzen zu transformieren, würde eine Selektion für/bezüglich hohe Kanamycinresistenz direkte Selektion für eine hohe/starke Expression des Fusionsproduktes erlauben. Daher könnten Toxin-Gen-Fusionen mit NPTII verwendet werden, um Pflanzen zu transformieren und bezüglich transformierter Pflanzen zu selektionieren, die hohe Gehalte an Toxin exprimieren, mittels Selektion für Kanamycinresistenz.
7.2.2.2 Konstruktion der Fusions-Genkassetten
Verschiedene Fragmente des Bt2-Gens wurden mit den N-Terminus von NPTII fusioniert.
Eines der Fusionsproteine, bezeichnet Bt:NPT2, wird nachstehend genauer beschrieben.
1. Konstruktion des Bt:NPT2-Fusionsgens
Die Konstruktion des Bt:NPT2-Gens wird in 23 gezeigt. pLK54 ist ein pBR322-Derivat, das den P_L-Promotor und 2 Phagen fd Transkriptions-Terminatoren in Tandemanordnung enthält (Abschnitt 7.2.1.2). pKM109/90 enthält das NPTII-Gen von Tn5 auf pBR322 (Reiss et al., EMBO J., 1984) (24).
Ein 1141 Bp-Genfragment von pKm109/90, das das NPTII-Gen enthält, wurde in pLK54 geklont und veranlaßte die Entstehung von pLKm90. Um eine BglII-Stelle hinter dem NPTII-Gen zu erzeugen, wurden nach Klenow-Polymerasebehandlung BglII-Linker an der XbalII-Stelle und an der SalI-Stelle ligasiert. Dies ergab pLKM91.
pHD159 ist ein Derivat von pBT200 (Abschnitt 7.1), wodurch ein BamHI-Linker mit dem vierten Bp und ein BglII-Linker mit Bp 3342 (nach Ba131-Behand1ung) fusioniert worden ist. Das BamHI BglII-Fragment dieses Plasmids, das das deletierte Bt2-Gen enthielt, wurde in die BamHI-Stelle von pLKm91 insertiert, in einer Orientierung, und veranlaßte die Entstehung eines Bt2:NPTII-Fusionsgens auf pLBKm10.
Um pLBKm13 zu konstruieren, wurde ein Asp 728, Klenow-behandeltes BglII-Fragment zwischen der BamHI-Stelle (nach Einfüllen) und der BglII-Stelle von pLKm91 insertiert.
Um die Bt:NPTII-Fusionsproteine in E. coli zu produzieren, wurden analoge Konstrukte zu pLBKm10 und 13 hergestellt, die 5'-Leitsequenzen des Bt2-Gens mit einer Ribosom-Bindungsstelle enthielten. Dafür tauschten wir bei einem anderen Ba131-Deletionsderivat von pBt200, pBa23-3 (Abschnitt 7.1) mit dem BamHI-Linker in Position –33 das BamHI-SacI-Fragment gegen pLBKm10 aus, wodurch pLBKm23 entstand.
Für die Expression des Fusionsproteins Bt:NPT2 hinter dem Pnos-Promotor und dem 35S-Promotor wurde das BamHI-SacI-Fragment von pHD160 (beschrieben in Abschnitt 7.1) zwischen den gleichen Stellen in pLBKm13 geklont und ergab pLBKm33.
Schließlich verwendeten wir für die Konstruktion mit dem Petunia ssu-Promotor (siehe Abschnitt 8) eine modifizierte Bt:NPTII-Kassette, worin der 3'-nicht-codierende Bereich bis zum Stopcodon von NPTII entfernt worden war. Um dies zu erreichen, wurde das NCol-BglII-Fragment von pLBKm13, das das 3'-Ende des NPTII-Gens enthielt, durch ein NCol Bg1II-Fragment erzeugt von/aus pLKm91 (23) ersetzt. Dieses Plasmid wurde mit Ddel geschnitten, mit Klenow-Polymerase behandelt und an einen BglII-Linker ligasiert, worauf die entstehende DNA durch NCol und BglII geschnitten wurde. 23 zeigt auch die 5' Bt2-Sequenzen in den verschiedenen Konstrukten.
Zusammenfassend enthält das Bt:NPTII-Gen (24):

1) Das 5'-Ende des Bt2-Gens, das 8 Bp stromaufwärts von dem Start ATG-Codon oder bei Position +4 oder bei Position –33 beginnt und sich zur Nucleotid-Position 2173 hin erstreckt.
2) ein 16 Bp Linkerfragment
3) den NPTII-codierenden Bereich der bei Nulceotidposition 13 beginnt.

2. Eigenschaften des in E. coli exprimierten Fusionsproteins
Das Fusionsgen Bt:NPT2, hinter dem P_L-Promotor in der Plasmidkonstruktion pLBKm23 angeordnet (23) wurde in E. coli exprimiert, um die Eigenschaften des Fusionsproteins zu untersuchen.
2.1 Identifizierung des Fusionsproteins in E. coli
Ein E. coli-Klon transformiert mit pLBKm23, wurde in SDS-PAGE und in Western-Blotting analysiert. Coomassie-Einfärbung des voilständigen Bakterienextraktes in SDS-PAGE zeigte die Anwesenheit einer neuen Proteinbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht, das der erwarteten Größe des Fusionsproteins (etwa 110 Kd) entsprach.
Das Protein konnte auch in Wester-Blotting sichtbar gemacht werden unter Verwendung von entweder anti-Bt2-Serum oder anti-NPTIII-Serum. Wiederum zeigte die positiv reagierende Bande die erwartete Größe des Fusionsproteins. Das Protein ist ziemlich stabil in E. coli, da nur begrenzte Mengen an Abbauprodukten nachgewiesen wurden (Banden von niedrigerem Molekulargewicht).
2.2 Kanamvcin-Resistenz des veränderten E. coli-Klons und NPTII-Aktivität des Bt:NPT2-Proteins
Das E, coli-Klon, das das pLBKm23-Gen enthielt, war in der Tat resistent gegenüber Kanamycin. Bakterien konnten auf 100 μg/ml Km wachsen (zum Vergleich: das Wildtyp-NPTII-Gen verleiht Resistenz gegenüber mehr als 1000 μg/ml).
NPTII-Aktivität des Bt-NPT2-Fusionsproteins wurde bewertet unter Anwendung eines NPTII-Assays, woanders beschrieben (Reiss et al., Gene 30, S. 217, 1984). Ein Zellextrakt des E. coli-Klons, das das Bt:NPT2-Protein exprimiert, wurde auf Gel unter nicht-denaturierenden Bedingungen laufen gelas sen parallel mit einem Extrakt aus einem E. coli-Klon, das das Wildtyp-NPTII produziert. Die Zellextrakte wurden wie folgt hergestellt: die E. coli-Klone wurden während etwa 4 h bei 28°C in 20 ml Kulturen (enthaltend LB-Medium) wachsen gelassen, zentrifugiert und erneut in 1 ml TES-Puffer suspendiert, zweimal 2 min bei 50 Watt in Labsonic 1515 beschallt und 30 min bei 15 000 UpM zentrifugiert; der Überstand wurde in unserem Experiment verwendet. Die Position und NPTII-spezifische Aktivität der Proteine wurde durch in sito Phospholylierung von Kanamycin unter Verwendung von ³²P-ATP (Reiss et al., 1984, Gene, 30, 217–223) bestimmt. Ein Gel, das die gleichen Proben enthielt, wurde parallel geführt und in einem Western-Blotting-Verfahren (mit Anti-Bt2 und Anti-NPTII-Antikörpern) verwendet. Durch Vergleich mit Reihenverdünnungen von gereinigtem Bt2 und gereinigten NPTII-Proteinproben, die auf diesem Gel eingeschlossen waren, konnte die in den für Aktivitätsmessung verwendeten Proben enthaltene Menge Protein bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen an, daß die Aktivität des Bt:NPTII-Proteins grob die gleiche war wie die von NPTII (25).
2.3 Verhalten des Bt:NPT2 Fusionsproteins in E. coli
Die Ergebnisse in dem vorangegangenen Abschnitt zeigen, daß die spezifischen NPTII Enzymaktivitäten vom intakten NPTII Enzym und des Fusionsproteins im wesentlichen äquivalent waren. Dies scheint in gewisser Weise inkompatibel mit dem "in vivo" Verhalten des Proteins zu sein. Während ein E. coli, das Wildtyp NPTII produziert, gegenüber mehr als 1000 μg/ml Km resistent ist, zeigen veränderte E. coli, die in vergleichbarem Maße Protein exprimieren, nur eine Resistenz gegenüber 100 μg/ml.
Es ist jedoch bekannt, daß in E. coli stark exprimierte Proteine (wie es hier der Fall ist unter Verwendung des starken P_L-Promotors) dazu neigen, innerhalb der Zelle auszufallen. Man könnte erwarten, daß, wenn eine wesentliche Fraktion des Bt:NPT2-Proteins in einer ausgefällten Form in E. coli vorhanden (und der Hauptteil des Proteins enzymatisch inaktiv ist) das Ergebnis ein wenig resistenter Phänotyp ist.
Die Analyse eines Bakterienextraktes des Bt:NPT2-Klons unter Anwendung eines Western Blottings zeigt an, daß in der Tat fast alles Protein in einer unlöslichen Form vorhanden war. Nach Lyse der Zellen und Zentrifugieren wurde der Hauptteil an nachweisbarem Bt:NPT2 im Pellet gefunden (im Gegensatz zu dem NOPII Wildtyp-Protein, das überwiegend in der Überstandsfraktion vorhanden ist. Um das in der Pelletfraktion vorhandene Protein in Lösung zu bringen, wurden 8 M Harnstoff + 2% ME (Mercaptoethanol) benötigt. Nach Dialyse, um das in Lösung gebrachte Protein zu renaturieren, wurde ein angereichertes Bt:NPT2-Proteinpräparat erhalten, das in Insektentoxizitätstests geprüft werden konnte (sh. 2.4).
2.4 Toxizität des Bt:NPT2-Proteins
Vorangegangene Toxizitätstests haben gezeigt, daß das Polypeptid, das von Gen KpnI-Deletionsfragment von Bt2 codiert wird, noch 100% der toxischen Aktivität des intakten Bt2-Proteins aufweist (Abschnitt 7.2.1.2). Zusätzlich haben unsere Untersuchungen bezüglich der Identifizierung von minimal aktiven toxischen Fragmenten gezeigt, daß dieses Kpn-Fragment ein (etwa 60 Kd) aktives Toxin umfaßt, das die gesamte toxische Aktivität des Bt2 Moleküls aufweist, Im folgenden wollten wir bestimmen, ob das Bt:NPTII-Fusionsprotein noch den gleichen Grad an Toxizität besitzt.
Hierzu wurden Toxizitätsgehalte von angereicherten Bt:NPT2 und gereinigtem Bt2-Protein gegenüber Insektenlarven verglichen. Die exakte Menge von Fusionsproteinen in Proben wurde unter Anwendung von ELISA (mit einem monoklonalen Antikörper spezifisch für den N-terminalen Bereich von Bt2:4D6) und von Western Blotting (Vergleich der Bandenintensität von Verdünnungen des Fusionsproteins und von gereinigten Bt2) bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß spezifische toxische Aktivität gegenüber Larven von M. sexta und P. brassicae im wesentlichen die gleiche war für Bt:NPT2-Fusionsprotein wie für intaktes Bt 2 (Tabellen 4 und 5).
Zusammengenommen zeigen die obigen Daten daß das Bt:NPT2-Protein NPTII Aktivität sowohl "in vivo" als auch "in vitro" besitzt und zusätzlich, daß es eine gleich starke insektizide Aktivität aufweist wie das Bt2-Toxin. Daher zeigt dieses ausgelesene Toxin klar eine wertvolle Alternative bei der gentechnischen Manipulation von Pflanzen, die einen hohen Grad an Insektentoxizität exprimieren.
2.5 Selektion von zusätzlichen Bt2:NPTII-Fusionen die einen Phänotyp mit höherer Kanamycinresistenz exprimieren.
Die mit dem zuvor konstruierten Bt:NPTII-Gen erhaltenen Ergebnisse waren vielversprechend, da dieses Fusionsprotein Kanamycinresistenz verlieh, normale Grade von Toxizität zeigte und relativ stabil war. Jedoch war die von der Bt:NPT2-Fusion verliehene Kanamycinresistenz relativ gering im Vergleich mit den Wildtypzellen. Da das isolierte gereinigte Pnos-Bt:NPT2-Protein eine spezifische NPTII-Aktivität besitzt, die derjenigen des Wildtyp-NPTII-Proteins vergleichbar ist, schlossen wir daraus, daß die geringe Kanamycinresistenz der geringen Löslichkeit des Fusionsproteins in E. coli zuzuschreiben war. Ein Phänotyp mit relativ geringer Resistenz kann in eim effizientes Selektionssystem in Pflanzen eingreifen. Daher zogen wir die Möglichkeit in Betracht, daß andere Bt-NPTII-Fusionen unterschiedliche/andere physikochenische Eigenschaften haben könnten, die zu einen Phänotyp mit einer höheren Km-Resistenz "in vivo" führen würden. Wir entwarfen einen Versuch, um das NPTII-Gen willkürlich mit der Bt2-Sequenz in dem Bereich zwischen der KpnI-Stelle und der Processing-Stelle zu fusionieren. Das Experiment wurde wie folgt durchgeführt:
Wir verwendeten Plasmid pLBKm25 (18), das folgende Elemente von Interesse enthielt: einen P_L-Promotor und das Bt2-Gen, fusioniert bei 1100 Bp stets der Kpn2-Stelle mit dem NPTII-Gen (sh. 19). Eine einzige XhoI-Stelle trennt das Bt von dem NPTII-Gen. Dieses Plasmid wurde durch KpnI Abbau linearisiert und mit Ba131 Exonuclease behandelt. Die Ba131-Reaktion wurde titriert, so daß die Deletionen nicht weit hinter die HindIII-Stelle fortschritten, die stromaufwärts von der C-terminalen Processing-Stelle lokalisiert wurde. Das mit Ba131 behandelte Plasmid wurde an XhoI-Linker ligasiert, mit XhoI abgebaut und selbst-ligasiert. Als Ergebnis wurde das NPTII mit Fragmenten des Bt2-Gens unterschiedlicher Größe fusioniert. Diese Plasmide, transformiert in E. coli, verliehen Kanamycinresistenz unter der Bedingung, daß das NPTII2-Gen mit dem Bt2-Gen rasterfusioniert wurde. Transformanten wurden auf Platten, die niedrige Konzentrationen an Kanamycin (20 μg/ml) enthielten, selektioniert und bezüglich der Fähigkeit ausgesucht, auf höheren Kanamycin-Konzentrationen wachsen zu können.
145 kanamycinresistente Transformanten wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, auf höheren Kanamycinkonzentrationen zu wachsen, untersucht. 8 Transformanten erwiesen sich als mehr resistent und konnten auf Konzentrationen höher als 200 μg/ml Kanamycin wachsen. Der Fusionspunkt in allen 8 Klonen wurde durch Restriktionsenzym-Kartierung mit einer Genauigkeit von 20 Bp bestimmt. Überraschenderweise hatten 7 von 8 Klonen ihren Fusionspunkt im Umkreis der HindIII-Stelle in Position 1680 des Bt-Gens. Ein Klon (pLBKm860) befand sich (mapped) bei Position etwa 2050. Obwohl der Hauptteil der Deletionen um Position 1800 fusioniert war, bewirkte keine von diesen einen Phänotyp mit höherer Kanamycinresistenz. Die 7 Klone, deren Fusionspunkt um die HindIII-Stelle fusioniert waren, sind zu kurz um ein aktives Toxin zu codieren. Jedoch war einer der Klone (pLBKm860):
Stabiler, da mehr Protein je Menge Gesamtzellextrakt bei der Western blot Analyse nachgewiesen wurde; und
Löslicher, da mehr ausgelesenes Bt-Protein im Überstand nachgewiesen wurde.
Die Positionen der 3' Endpunkte in den Bt2 codierenden Sequenzen in den Klonen 860 und 865 sind in 26 wiedergegeben. Die Toxizität der Fusionsprotein und der ausgelesenen Bt2-Genprodukte ist in Tabelle 6 erläutert.
7.3 Adaption von Kassetten, die ausgelesene Bt2-Gene oder Bt-Genfusionen enthalten für Expression in Pflanzenteilen.
Plasmide pLBKm860 und 865 wurden wie in 27 beschrieben modifiziert, um Plasmide plBKm1860 und pLBKm1865 zu erzeugen, pLBKm2860 war von (27) pLBKm860 abgeleitet. Indem das BamHI-SacI-Fragment von pLBKm14 durch das BamHI-SacI-Fragment von pLB820 und 884 ersetzt wurde, wurden die neuen Plasmide, pLB1820 bzw. 1884 bezeichnet, erzeugt. pLB2820 war von pLB1820 abgeleitet. Als Beispiel werden die Endkonstrukte pLBKm1860, pLBKm1865 und pLBKm2860 in 24 gezeigt.
8. Konstruktionen von Zwischen-Expressionsvektoren, die das Toxin-Gen enthalten.
8.1 Überblick
Tabelle 7 gibt einen Überblick über die veränderten Plasmide, die konstruiert und in Pflanzentransformations-Experimenten verwendet worden waren. Jedes veränderte Ti-Plasmid ist das Ergebnis einer Kointegration eines Rezeptor-Ti-Plasmids mit einem Zwischen-Vektor. Jeder Zwischenvektor enthält ein chimäres Toxin-Gen, das eine Pflanzenpromotorsequenz, abgeleitet von dem angegebenen Expressionsvektor und eine Bt-Genkassette umfaßt.
Zusammenbau von chimären Genen
Tabelle 7 gibt die Plasmide an, aus denen die Bt-Genkassetten isoliert wurden. Die Konstruktion dieser Plasmide wurde in den vorangegangenen Teilen (Abschnitten) beschrieben. Die detaillierten Karten der in Tabelle 7 erwähnten Expressionsvektoren sind in 33 angegeben (A–J).
Die detaillierte Konstruktion der beiden chimären Gene, die in pHD205 und pHD208 vorhanden sind, wird beispielhaft beschrieben. Beim experimentellen Verfahren wurden Standard DNA-Rekombinationstechniken angewandt und es wurde entsprechend Versuchsprotokollen von Maniatis (Cold Spring Harbor, 1982) verfahren.
Die verschiedenen Pflanzenpromotoren die verwendet wurden, sind (Tabelle 7):
Pnos: Ein konstitutiver und relativ schwacher Promotor, abgeleitet von dem T-DNA-codierten Nopalin-Synthase-Gen.
Pssu-Erbse: Abgeleitet von einen schwach exprimierten Glied der Familie der kleinen Untereinheit von Ribulose-Biphosphat-Carbaxylase-Genen von Erbse. Die Expression läßt sich in grüne Geweben leicht induzieren.
PTR2: Ein konstitutiver Promotor abgeleitet von der T_R-DNA des Octopin-Ti- Plasmids (Velten et al., 1984, EmBO J., 3, 2723). In den Expressionsvektoren pGSH150 und pGSH160 ist das duale Promotorfragment von pop443 (Velten et al., l.c.) abgeleitet. Der 5' nichttranslatierte Bereich des 2'-Promotors wurde vervollständigt durch Zusatz eines BamHI-Linkers, um die Sequenz
zu produzieren.
Das Klonieren in die/zu der BamHI-Stelle läßt so den 5'-nichttranslatierten Bereich des 2'-Gens intakt und fusioniert die Bt-Gen-Kassette mit dem Start ATG des 2'-Gens.
Die Bedeutung einer intakten 5'-nichttranslatierten Region, um hohe Expressionsstärken von chimären Genen zu erzielen, wurde gezeigt (Jones et al., EMBO J., 4, 2411, 1985).
Pssu301: ist der Promotor eines rbs (Ribulose-Biphosphat-Carboxalyse kleine Untereinheit) Gens von Petunia, wovon etwa 50% der Petunia rbs mRNA transcribiert wird (Dean et al., EMBO J, 1984, Nr. 12). Durch ortsspezifische Mutagenese war die Sequenz um das Startcodon (TAACTATGGCTT) zu TAACCATGGCTT verändert worden unter Erzeugung einer NCoI-Stelle auf dem Startcodon. In gleicher Weise erzeugte Modifikation um das TAA-Stopcodon von zu
eine BglII-Stelle.
Als Ergebnis konnte der codierende Bereich des ssu-310-Gens durch NcoI-Bgl-II-Abbau genau entfernt und durch die unter 7.2 beschriebene Bt-Genkassetten ersetzt werden.
Isolieren und Charakterisieren des Promotorfragmentes (Pssu PET) und des 3'-Endes (ssu-PET) wird von Dean et al. in PNAS, Usa, Bd. 82, 4964 (1985) beschrieben. Die Konstruktion von pAGS007 (33H) wird in 44 beschrieben.
P35S: ist ein starker konstitutiver Promotorer, abgeleitet von Blumenkohl- Mosaik-Virus (CAMV). Das P35S-1 Promotor Fragment ist von CAMV Isolat Cm4-184 abgeleitet. Es enthält ein Fragment (nt6492–7454) des CAMV Genoms (Gardner et al., 1981, Nucl. Acid Ries., 9, 2871–2888) und eine stromabwärts gelegene BamHI-Stelle für Klonierung (40).
P35S-2 enthält CAMV Sequenzen von 6492 bis 7466 gefolgt von einer ClaI-Stelle.
P35S-1 und P35S-2 unterscheiden sich somit lediglich in der Länge der 5'-nichttranslatierten Sequenzen des 35S CAMV Transcriptes.
Promotor-Bt-Gen-Verbindungen
28 zeigt die DNA-Sequenzen an der Verbindung zwischen den Promotorregionen und der codierenden Sequenz der Bt-Genkassetten wie sie in den verschiedenen veränderten Ti-Plasmiden vorhanden sind. Sequenzen, die von den ursprünglichen Promotorregionen und von der codierenden Sequenz des Bt2-Gens abgeleitet sind, sind unterstrichen. Einige relevante Restriktionsexzymstellen, die beim Zusammenbau der chimären Gene beteiligt waren, sind angegeben. Das ATG-Startcodon ist eingerahmt.
Verbindungen zwischen Bt-Genkassetten und den 3'-Enden
Alle chimären Gene sind am 2'-Ende bereitgestellt mit einer Sequenz, die die 3'-nichttranslatierte Region einschließlich der Polyadenylierungsstelle enthält, eines Gens, das in Pflanzenzellen natürlich exprimiert wird. Die folgenden Sequenzen wurden verwendet:
3'ocs (in pHD1060, pHD1076, pHD1080).
Ein 706 Bp PvuII-Fragment, das den 3'-nichttranslatierten Bereich des Octopin-Synthase-Gens (Pos. 11939–11233 nach Gielen et al, EMBO 4, S. 835, 1984) enthält.
Ein 212 Bp EcoRV-ClaI-Fragment, das den 3'-nichttranslatierten Bereich von T-DNA-Gen 7 enthält, geklont in/zu der SmaI-Stelle von pUC8 und erneut isoliert als ein EcoRI-SalI-Fragment (Pos 2317–2105 nach Gielen et al, l.c.)
3'nos (in pGS1110)
Ein 182 Bp Ta9I-ClaI-Fragment, das den 3'-nichttranslatierten Bereich des Nopalinsynthase-Gens (Pos 1290–1472 nach Depicker et al., J.M.A.G. 1, S. 561, 1982) enthält.
3'SSu301 (in pGS1171, PGS1181)
Ein etwa 1, 2 Kb BglII-BamHI-Fragment, abgeleitet von dem 3'-Ende des ssu301-Gens wurde durch ortsspezifische Mutagenese wie folgt konstruiert:
Stopcodierender Bereich (der TAA ist)
Beispiel 8.1 (Vergleich)
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von pHG205, ein Zwischenvektor, der ein chimäres Bt2 Toxin-Gen enthält, welches umfaßt: den Nopalinsynthase-Promotor, die Bt2 Toxin-Genkassette von pHD 160 und ein DNA-Fragment, das den 3'-nichttranslatierten Bereich des Nopalinsynthase-Gens einschließlich der Polyadenylierungsstelle enthält. Im chimären Gen ist die Bt2-Genkassette so orientiert, daß die Expression des Bt2-Proteins von dem Nopalinsynthase-Promotor erhalten werden kann. Die Bt2-Genkassette wurde aus pHD160 mit BamHI und BglII ausgeschnitten und in die BamHi-Stelle von pLGV2382 insertiert (Herrera-Estrella et al., EMBO J., 2, 987–995, 1983). 2 μg von pHD160 DNA wurden vollständig mit jeweils 2 Einheiten BglII und BamHI (Boehringer Mannheim) während 1 h bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl abgebaut unter Verwendung des von Marniatis et al, (Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Laboratory 133–134) beschriebenen Inkubationspuffers. Fünf μg pLGV2382 DNA wurden mit BamHI unter den gleichen Berüngungen vollständig abgebaut. Anschließend wurden die terminalen 5'-Phosphate aus der DNA entfernt durch Behandlung mit Kälberdarm-alkalischer Phosphatase (CIP) (Boehringer Mannheim) unter Anwendung der von Maniatis et al., l.c. beschriebenen Bedingungen. Ein Fünftel der BamHI abgebauten und mit CIP behandelten pLGC2382 DNA wurde an 0,1 μg mit BamHI-BglII abgebauter pHD160 DNA ligasiert, mit 0,01 Einheiten T4 DNA Ligase (Boehringer Mannheim) in einem Endvolumen von 20 μl. Ligationspuffer und Inkubation wie von Boehrinqer Mannheim empfohlen (Broschüre "T4 Ligase" , Boehringer Mannheim August 1980, 10.M.880.486) . Das Ligationsgemisch wurde in/zu kompetenten E. coli K514-Zellen (Colson et al., Genetics 52 (1965), 1043–1050) transformiert entsprechend Dagert und Ehrlich, l.c. Die Zellen wurden auf LB-Medium plattiert (Miller, l.c.) angereichert mit Carbenicillin (100 μm/ml). Die Transformanten wurden bezüglich der Anwesenheit von rekombinierten Plasmiden ausgesucht mit Hilfe von Mikroskala DNA-Präparaten, ausgeführt entsprechend Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979), 1513–1523. Die Orientierung des BamHI-BglII-Fragmentes in der BamHI-Stelle von pLGV2382 wurde mittels BamHI PstI Doppelabbau bestimmt. Das Doppelabbaumuster von rekombinierten Plasmiden zeigt 4 Fragmente nach Agarose Gel-Elektrophorese. In der alpha-Orientierung sind Fragmente von etwa 5700 Bp, 3000 Bp, 2300 Bp und 920 Bp vorhanden, während in der beta-Orientierung Fragmente von etwa 6200 Bp, 3000 Bp, 1800 Bp und 920 Bp vorhanden sind. Ein rekombiniertes Plasmid mit der alpha-Orientierung (das Toxin-Gen unter Kontrolle des Nopalinsynthase-Promotors) wird in den folgenden Experimenten eingesetzt und mit pHD205 bezeichnet.
Beispiel 8.2 (Vergleich)
In diesem Beispiel wird die Konstruktion von pHD208 beschrieben. Der Zwischenvektor pHD208 enthält ein chimäres Bt2 Toxin-Gen, welches umfaßt: Den Promotor von einem Erbsen-Gen, das eine kleine Untereinheit von Ribulose-Biphosphat-Carboxylase (Pssu) codiert, die Bt2 Toxin-Genkassette von pHD160 und den 2'-nichttranslatierten Bereich des Octopinsynthase-Gens einschließlich der Polyadenylierungsstelle. Die Fragmente des chimären Gens wurden im Klonierungsvektor pGV831 zusammengestellt, wie in diesem Beispiel beschrieben und in 29 als Diagrammen angegeben. Die Konstruktion von pGV831 ist in 30 zusammengefaßt.
Stufe 1:
Insertion eines 706 Bp PvuII-Fragmentes, das die 3'-nichttranslatierte Region des Octopinsynthase-Gens enthält, in pGV831, um pGV858 zu erhalten.
Fünf μg pGV831 DNA wurden vollständig mit 5u (μg) HpaI bei 37°C während 1 h abgebaut unter Verwendung des Inkubationspuffers beschrieben von Maniatis et al., l.c. Anschließend wurden die terminalen 5'-Phosphate aus der DNA entfernt durch eine Behandlung mit CIP unter Anwendung der Bedingungen, wie von Maniatis et al., l.c., beschrieben. Zwanzig μg pGV99 DNA (De Greve et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 499–512, 1982) wurden mit 20 Einheiten PvuII während 1 h bei 37°C abgebaut.
Die entstandenen DNA-Fragmente wurden mittels Elektrophorese auf einem horizontalen Agarosegel (0,8% Agarose in TBE-Puffer) getrennt. Das Agaroseband, das das 706 Bp PvuII-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA mittels Elektroelution wiedergewonnen. Nach Phenolisierung und Etherextraction wurde DNA mit Ethanol durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge während 10 min ausgefällt, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und erneut in 20 μl H₂O suspendiert.
0,03 μg mit HpaI abgebautes und mit CIP behandeltes pGV831 wurde an 0,1 μg des gereinigten 706 Bp-Fragmentes ligasiert mit 1U T4-Ligase in einem Endvolumen von 10 μl. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli K514 Zellen transformiert (Colson et al., l.c.), wie von Dagert und Ehrlich, l.c., beschrieben. Zellen wurden auf LB-Medium (Miller, l.c.) angereichert mit Carbenicillin (100 μg/ml) plattiert. Die entstandenen rekombinierten Plasmide wurden durch Doppelabbau mit PstI und ApaI-Digestion charakterisiert. Eines der erhaltenen Plasmide, pGV858, lieferte die gewünschten Abbau-Fragmente von etwa 5300, 1700, 1500 und 900 Bp und wurde weiter verwendet.
Stufe 2:
Konstruktion eines modifizierten Pssu-Fragmentes und Insertion dieses Fragmentes in pGV858, um pHD503 zu erhalten.
Eine BamHI-Stelle wurde unmittelbar stromabwärts von dem Pssu-Promotor positioniert durch Insertieren des HindIII-BamHI Polylinkers von pUC8 (Vierra and Messing, Gene 19, S. 259–266, 1982) in pKC7::Pssu. pKC7::Pssu wurde von Lab. of Getietics, State University, Gent, Belgien bereitgestellt. Es enthielt das EcoRI-HindIII Fragment, das den Promotor für eines der Erbsengene einschließt, welches die kleine Untereinheit (ssu) von Ribulose-Biphospnatcarboxylasse codiert (RUDP-case) (Herrera-Estrella, Nature 3:10; 115–120, 1984), geklont in Vektor pKC7 (Rao und Rogers, Gene 7, 1979). 1 μg pKC7::Pssu wurde mit 1 U HindIII und 1 U BamHI abgebaut. 1 μg pUC8 DNA wurde mit 1 U HindII und 1 U BamHI bei 37°C während 1 h abgebaut. 0,1 μg jeder abgebauten DNA wurden vermischt und ligasiert mit 0,01 Einheiten T4 DNA Ligase in einem Endvolumen von 20 μl. Das Ligationsgemisch wurde in/zu kompetenten E. coli K514 Zellen transformiert (Dagert und Ehrlich, l.c.). Zellen wurden auf LB Medium (Miller, l.c.) angereichert mit 100 μg/ml Carbenicillin plattiert. In einem der erhaltenen rekombinierten Plasmide, pGV861, wurde das HindIII BamHI Fragment, das das Km^R-Gen vom pKC7 enthielt, durch den 20 Bp HindIII-GamHI Polylinker von pUC8 ersetzt.
5 μm pGV858 wurden mit 5 Einheiten BamHI während 1 h bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl abgebaut unter Verwendung des Inkubationspuffers, beschrieben von Maniatis et al., l.c. Anschließend wurden die terminalen 5'-Phosphate aus der DNA entfernt durch Behandlung mit CIP unter Anwendung der von Maniatis et al., l.c. beschriebenen Bedingungen. 2 μg pGV861 wurden mit 2 Einheiten BglII, BamHI und PvuI während 1 h bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl abgebaut unter Verwendung des von Maniatis et. al., l.c., beschriebenen Inkubationspuffers.
0,2 μg mit BamHI abgebautes und mit CIP behandeltes pGV858 wurde an 0,05 μg mit BamHI-BglII PvuI abgebautes pGV861 ligasiert mit 0,01 Einheiten T4 DNA Ligase (Boehringer Mannheim) in einem Endvolumen von 20 μl. Das Ligationsgemisch wurde in/zu kompetente E. coli K514 Zellen (Colson et al., l.c.) transformiert entsprechend Dagert und Ehrlich, l.c. Zellen wurden auf LB-Medium (Miller, l.c.) angereichert mit Carbenicillin (100 μq/ml) plattiert. Carbenicillin-resistente Klone wurden bezüglich der Anwesenheit von rekombinierten Plasmiden ausgesucht mittels Restriktionsenzym-Abbau von DNA, hergestellt durch die Mikroskala-Technik, beschrieben von Birnboim und Doly, l.c.
In einem der rekombinierten Plasmide, pHD503, wurde das BBglII-BamHI Fragment, das den Erbsen-ssu-Promotor einschließt, in die korrekte Orientierung gegenüber des 3'-Endes des Octopinsynthasegens insertiert. pHD503 enthält eine einzige BamHI-Stelle, lokalisiert zwischen dem Pssu-Promotor und dem 3'-Ende des Octopinsynthase-Gens.
Stufe 3:
Insertion der BamHI-BglII Bt2 Gen-Kassette in die BamHI-Stelle von pHD503, um den Zwischenexpressionsvektor pHD208 zu erhalten. 2 μg pHD160 DNA wurden vollständig mit 2 Einheiten BglII und Einheiten BamHI während 1 h bei 37°C in einem Endvolumen von 20 μl abgebaut. 5 μg pHD503 DNA wurden mit 5 Einheiten BamHI unter den gleichen Bedingungen bis zur Vollständigkeit abgebaut, mit CIP behandelt unter Anwendung der von Maniatis et al., l.c. beschriebenen Bedingungen, um die terminalen 5'-Phosphate aus der DNA zu entfernen. 0,1 μg mit BamHI-BglII abgebauter pHD160 DNA wurde an 0, 2 μg mit BamHI abgebauter und CIP behandelter pHD503 DNA ligasiert mit 0,01 U T4 DNA Ligase in einem Endvolumen von 20 μl.
Das Ligationsgemisch wurde in/zu kompetenten E. coli K514 Zellen (Dagert und Ehrlich, l.c.) transformiert. Die Zellen wurden auf LB-Medium (Miller, l.c.) angereichert mit Streptomycin (20 μg/ml) und mit Spectinomycin (50 mg/ml) plattiert. Streptomycin/Spetinamycin-resistente Klone wurden bezüglich der Anwesenheit von rekombinierten Plasmiden ausgesucht mittels Restriktionsenzym-Abbau von DNA, hergestellt aus diesen Klonen mit Hilfe der Mikroskala-Technik, beschrieben von Birnboim und Doly, l.c., pHD208, ein rekombiniertes Plasmid, das die Bt2 Gen-Kassette in der korrekten Orientierung mit Bezug auf den Pssu-Promotor enthielt, wurde isoliert und in weiteren Experimenten verwendet.
Beispiel 8.3
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von pGSH151. Der Zwischenvektor pGSH151 enthält ein chimäres Bt:NPTII Fusions-Gen, welches umfaßt: den Pro motor von Transkript 2 der TR-DNA des Octopin Ti-Plasmids (PTR2) (Velten et al., l.c.), die Bt:NPTII Fusions-Genkassette von pLBKm13 und den 3' nichttranslatierten Bereich des Gens 7 der T-DNA des Octopin Ti-Plasmids.
Die Fragmente des chimären Gens wurden, wie in diesem Beispiel beschrieben, zusammengebaut bzw. zusammengestellt. Alle Arbeitsweisen wurden, wie von Maniatis et al. in Molecular Cloning (1982) beschrieben, ausgeführt.
Stufe 1: Konstruktion von pGSH50 (41)
Dieses Plasmid enthält den TR-Promotor PTR2 mit einem vollständig intakten 5' nicht-translatierten Bereich, gefolgt von einem ATG-Startoodon, gefolgt von einer einzigen BamHI-Stelle, und das 3'-nicht-translatierte Ende des Transkript 7 Gens.
pOP443 (Velten et al., 1984) enthält ein ClaI-HdIII Fragment, welches das PTR2 und das PTR1 des Octopin Ti-Plasmids umfaßt. Um die BamHI-Stelle zu entfernen, wurde pOP443 vollständig mit BamHI und SalI abgebaut, die klebrigen Enden mit dem Klenow-Fragment von E. coli Polymerase I behandelt und mit T4-Ligase selbst-ligasiert.
Nach der Transformation wurden Ampicillin-resistente Kolonien selektioniert und ihre Plasmide bezüglich der Abwesenheit von BamHI und SalI-Stellen ausgesucht, wodurch man pOP4433SF erhielt.
Um eine ClaI-Stelle gegenüber dem 3' nicht-translatierten Ende von Transcript 7 in pAP2034 (Velten et al., 1984) zu erhalten, wurde pAP2034 vollständig mit BamHI abgebaut, mit dem Klenow-Fragment von E. coli Polymerase I behandelt und an mit Kinase behandelte (kinated) ClaI-Linker ligasiert. Die DNA wurde anschließend vollständig mit ClaI abgebaut und mit T4-Ligase selbst ligasiert; unter den Amp^R Transformanten wurde pAP2043C selektioniert.
Von pOP443BSF wurde das ClaI-HindIII Fragment, das die TR-Promotoren enthielt, zwischen die entsprechenden Stellen von pAP2034 geklont, wodurch pGSH50 entstand.
Stufe 2: Konstruktion von pGV1500 (42)
pGV825 wird von Deblaere et al. in NAR, 13, 4777 (1985) beschrieben. Um seine Größe/seinen Umfang zu verringern, wurde pGV825 mit PvuII abgebaut und selbst-ligasiert. Das entstandene Plasmid pGV956 enthält eine einzige BamHI- und einzige BglII-Stelle innerhalb der T-DNA, pJB63 wird von Botterman et al. (in press, Gene, (1986)) beschrieben. Das BamHI-BglII Fragment, das mehrere nur einmal vorhandene Restriktionssteilen enthielt, wurde zwischen die entsprechenden Stellen in pGV956 geklont, wodurch pGV1500 entstand.
Stufe 3: Konstruktion von pGSN150 (43)
pGSH50 wurde mit EcoRI abgebaut, mit dem Klenow-Fragment von E. coli Polymerase I behandelt und mit HindIII abgebaut. Das erhaltene Fragment, das die TR-Promotoren enthielt, wurde zwischen die HpaI- und die HindIII-Stelle des Plasmids pGV1500 geklont.
Stufe 4: Konstruktion von pGSH151 (3)
Das BamHI-BglII Fragment von pLBKm13, das das Bt2-Gen enthielt, wurde in die BamHI-Stelle von pGSH150 geklont, wodurch eine in-Raster-Fusion des Bt2-Gens, beginnend am 2. Codon (bis) zu einem ATG-Startcodon hinter dem PTR2 erzeugt wurde.
9. Einführen der Zwischen-Expressionsvektoren, die das Toxin-Gen enthalten, in Agrobacterium
Das Einführen/Einbringen von Zwischen-Expressionsvektoren in Akzeptor Ti-Plasmide von Agrobacterium erfolgte in zwei Stufen: zuerst wird der Zwischen-Expressionsvektor in/zu E. coli Stamm GJ23 transformiert, der zwei Helferplasmide trägt: R64 drd 11, das tra-Funktionen enthält und p GJ28, das die mob-Funktionen enthält (Finnegan et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982), 344–351). Sodann wird der E. coli Stamm, der alle drei Plasmide trägt, mit einem Agrobacterium-Stamm, der ein Akzeptor Ti-Plasmid enthält, welches einen mit den Zwischen-Expressionsvektor homologen Bereich trägt, konjugiert, im wesentlichen wie von Van Haute et al., (EMBO J. 2 411–418, 1983) beschrieben. Das rekombinierte Ti-Plasmid, das bei einem einzelnen Crossover-Vorgang entsteht, wird durch Selektionieren bezüglich des antibiotischen Resistenzmarkers, getragen von von Zwischen-Expressionsvektor, isoliert.
Als Beispiel wird Cointegration von pGV205 mit pGV3850 und von pHD208 mit pGV2260 beschrieben. Die verwendeten Zwischenvektoren und Rezeptor Ti-Plasmide sind in Tabelle 7 aufgelistet und in den 31-33 dargestellt.
Beispiel 9.1: (Vergleich)
Der Zwischen-Expressionsvektor pHD205 wurde in das Akzeptor Ti-Plasmid pGV3850 insertiert, um das Hybrid-Ti-Plasmid pHD1050 zu ergeben. Wie im Diagramm der 31 angegeben, enthält pHD1050 das chimäre Bt2-Gen unter Kontrolle des Pnos-Promotors sowie das Nopalinsynthase-Gen positioniert zwischen T-DNA Grenzfragmenten.
Das Plasmid pHD205 wurde in kompetente E. coli GJ23 Zellen eingeführt mittels Transformation entsprechend Dagert und Ehrlich, l.c. Um E. coli GJ23 Zellen, transformiert mit pHD205, zu selektionieren, wurden die Zellen auf LB-Medium (Miller, l.c.) angereichert mit Carbenicillin (100 μg/ml) plattiert.
Das flüssige LB-Medium wurde mit einer der pHD205 transformierten E. coli GJ23 Kolonien inokuliert und über-Nacht (etwa 18 h) kultiviert. 0,1 ml dieser Kultur wurde mit 0,1 ml einer über-Nacht Kultur des C58Cl Rif^® (auch GV3101 bezeichnet, Van Larebeke et al., Nature 252, 169–170, 1974), enthaltend (pGV3850) Zambryski et al (EMBO J. 2, 2143–2156, 1983) konjugiert und über Nacht bei 28°C auf festem LB-Medium (Miller, l.c.) kultiviert.
Agrobacterium-Stämme, die hybride Ti-Plasmide enthielten, entstanden aus einem einzelnen Crossover-Vorgang, wurden isoliert durch Selektionierung bezüglich des Kanamycin-Neomycin-Markers, der von dem pHD205-Plasmid getragen wird, auf Minimal-A-Medium (Miller, l.c.) angereichert mit Neomycin (400 μg/ml). Nach Reinigung der Transkonjuganten auf LB-Medium (Miller, l.c.) angereichert mit Rifampicin (100 μg/ml) und mit Kanamycin (25 μg/ml). Die physikalische Struktur des T-Bereiches eines der Transkonjuganten, pHD1050, wurde bestimmt entsprechend der Methode, beschrieben von Dhaese et al., (Nucl. Acids Res. 7 (1979), 1837–1849), durch Hybridisierung von mit P³² markierten pHD205 gegen HindIII, abgebaut zu Gesamt-DNA von C58Cl Rif^® pHD1050. Die Struktur der T-Region von pHD1050 ist im Diagramm der 31 dargestellt.
Beispiel 9.2 (Vergleich)
Der Zwischen-Expressionsvektor pHG208 wurde in das Akzeptor Ti-Plasmid pGV2260 insertiert, um das hybride Ti-Plasmid pHD1076 zu erhalten. Wie im Diagramm der 32 angegeben, enthält pHD1076 das chimäre Bt2-Gen unter der Kontrolle des Pssu-Promotors sowie je ein chimäres Gen, das das Neomycin-Phsphotransferase-Gen unter der Kontrolle des Pnos-Promotors enthält, angeordnet zwischen T-DNA Grenzfragmenten. Das Ti-Plasmid pGV2260 wird in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 83112985 (Veröffentlichungs-Nr. 0116718) beschrieben. Das Plasmid pHD208 wurde in kompetente E. coli GH23-Zellen eingeführt mittels Transformation entsprechend Dagert und Ehrlich, l.c. Um bezüglich E. coli GT23-Zellen, transformiert mit pHD208, zu selektionieren, wurde das Transformationsgemisch auf LB-Medium (Miller, l.c.), angereichert mit Carbenicillin (100 μg/ml), plattiert.
Flüssiges LB-Medium wurde mit einer der transformierten E. coli Kolonien inokuliert und über Nacht kultiviert. 0,1 ml der über-Nacht-Kultur des E. coli Stamms der alle 3 Plasmide trug, wurde über Nacht mit einer Über-Nacht-Kultur des C58Cl Rif^® bei 28°C auf LB-Medium (Miller, l.c.) konjugiert. Agrobacterium-Stämme, die Hybrid-Ti-Plasmid, entstanden aus einem einzigen Crossover-Vorgang zwischen pGV2260 und pHD208, enthielten, wurden isoliert durch Selektionierung bezüglich des Streptomycin-Spectinomycin-Markers, der von dem pHD208-Plasmid getragen wird, auf Minimal-A-Medium (Miller, l.c.), angereichert mit Spectinomycin (300 μg/ml) und Streptomycin (300 μg/ml).
Transkonjuganten wurden auf LB-Medium (Miller, L.c.) angereichert mit Rifampicin (100 μg/ml), Spectinomycin (100 μg/ml) und Streptomycin (300 μg/ml) gereinigt. Die physikalische Struktur eines der Transkonjuganten, pHD1076, wurde mittels Hybridisierung von mit P³² markiertem pHD208 gegen mit PstI abgebauter Gesamt-DNA von C58Cl Rif^® pHD1076 entsprechend der von Dhaese et al. (l.c.) beschriebenen Methode bestimmt. Die physikalisehe Struktur von pHD1076 ist in 32 gezeigt.
Beispiel 9.3
Der Zwischen-Expressionsvektor pGSH151 wurde in das Akzeptor-Ti-Plasmid pGV2260 insertiert, um das Hybrid-Ti-Plasmid pGS1151 zu erhalten.
Die angewandte Methode was eine Drei-Eltern-Kreuzung entsprechend Dittag et al. (1980), PNAS, 77, 7347–7351.
Flüssiges LB-Medium wurde mit einer der pGSH151 transformierten E. coli K514 Kolonien inokuliert und über Nacht bei 37°C kultiviert. 0,1 ml dieser Kultur wurden zusammen mit 0,1 ml von über-Nacht-Kulturen von HB101 (pRK2013) Figurski & Helinski (1979), PNAS, 76, 1648–1652 und mit 0,1 ml C58Cl Rif^® (Van Larebeke et al., Nature, 252, 169–170) auf LB-Platten plattiert und über-Nacht bei 28°C kultiviert.
Die Zellen wurden von den LB-Platten gesammelt und Verdünnungen wurden auf Minimal-A-Medium (Miller, l.c.) angereichert mit Spectinomycin (300 μg/ml) und mit Streptomycin (1 μg/ml) plattiert. Transkonjuganten wurden auf LB-Medium gereinigt, das Rifampicin (100 μg/ml), Spectinomycin (100 μg/ml) und Streptomycin (300 μg/ml) enthielt. Die physikalische Struktur eines der Transkonjuganten, pGS1151, wurde durch Hybridisieren von mit P³² markierten pGSH151 gegen mit PstI-BamHI abgebauter Gesamt-DNA von C58Cl Rif^® (pGS1151) entsprechend Dhaese et al., l.c. bestimmt.
10. Isolierung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die das chimäre Toxingen, insertiert in ihr Genom, enthalten
Verfahren:
Es werden hier zwei verschiedene Vorgehensweisen für die Transformation von Tabakpflanzenzellen mit Transformationsvektoren, wie den in Abschnitt 9 beschriebenen, und für die Erzeugung von Kallusgewebe und/oder differenzierten Pflanzen aus diesen transformierten Zellen beschrieben.
Verfahren 1: Cokultivierung von Protoplasten
Dieses Verfahren beschreibt die Cokultivierung von Tabakprotoplasten mit Agrobacterium C58Cl Rif^® und die Isolierung von transformierten Tabakzelllinien mittels Klassieren bezüglich der Anwesenheit eines durchmusterbaren Markers, wie Nopalin, oder bezüglich der Expression eines selektierbaren Markers, wie Kanamycinresistenz, und der Regenerierung von Gesamtpflanzen aus transformierten Kalluslinien.
Stufe 1: Herstellung von Protoplasten

a) Züchte 10–12 cm hohe Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR-1 aseptische Pflanzen während 4 Wochen in vitro in einem Medium, das die halbe Stärke der mineralischen Komponenten sowie die halbe Stärke der Vitamine und der Saccharose des Murashige und Skoog-Mediums (Murashige und Skoog, Physiol. Plant, 15, 473–479, (1962)) enthält.
b) Inkubiere Blattsegmente von drei gut entwickelten jungen Blättern mit 20 ml 1,4%iger Cellulase Onozuka R-10 und mit 0,4% Macerozym Onozuka (beide von Yakult Pharmaceutical Industry, Co., Ltd., Japan) in der folgenden Lösung: KCl 2,5 g/l MgSO₄·7H₂O 1 g/l KH₂PO₄ 0,136 g/l Sorbit 73 g/l Polyvinylpyrrolidon – 10 0,3 g/l
c) Inkubiere über Nacht bei 24°C im dunkeln.
d) Filtriere durch ein Nylon-Filter mit einer Maschenweite von 50 μm.
e) Zentrifugiere in 15 ml Röhrchen bei 80 g während 10 min, entferne den Überstand und suspendiere das Pellet erneut in 20 ml der gleichen Lösung, aber ohne Enzyme.
f) Zentrifugiere während 10 min bei 80 g, um überschüssige Enzyme zu entfernen und entferne den Überstand.
g) Suspendiere das Pellet erneut in 20 ml des 1/2 starken Murashige und Skoog-Mediums, angereichert mit 0,22% CaCl₂·2H₂O und 0,4 M Mannit pH 5, 6.
h) Zentrifugiere während 10 min bei 80 g, entferne den Überstand.
i) Suspendiere die Pellets erneut in 20 ml Medium 55 (s. weiter unten).
j) Zähle die Protoplasten und verdünne auf eine Dichte von 10⁵ pp/ml. Inkubiere in 5 an Petri-Schalen (2,5 ml je Petri-Schale) im dunkeln während etwa 4 Tagen.

Stufe 2: Cokultivierungen mit Agrobacterium Stamm C58Cl Rif^®, der das Hybrid-Ti-Plasmid enthält (Abschnitt 9).

a) Eine KuLtur von Agrobacterium C58CL Rif^® wurde bis zur Sättigung in LB-Medium gezüchtet, 1 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden erneut in einem gleichen Volumen von 0,01 M MgCl₂ suspendiert. Nachdem etwa 30% der Protoplasten ihre erstem Zellteilung begonnen hatten, wurden 50 μl der Bakteriensuspension zu 2,5 ml der Protoplastensuspension zugegeben (dies bedeutet etwa 100–500 Bakterien je Protoplast).
b) Inkubiere 48 h im dunkeln.
c) Überführe die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen, wasche die Petri-Schale mit dem gleichen Volumen Medium 55, angereichert mit Claforan 500 mg/l, und gebe dies zu dem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugiere während 10 min bei 80 g, entferne den Überstand und suspendiere das Pellet erneut im gleichen Volumen Medium 55, angereichert mit Claforan 500 mg/l.
d) Überführe in 5 cm Petri-Schalen (2,5 ml/Schale), zu diesem Zeitpunkt beträgt die Zelldichte etwa 10⁴ Zellen/ml. Inkubiere unter 400 Lux 16 h pro Tag bei 23°C während 1–2 Wochen, bis kleine Aggregate von 4–8 Zellen sich gebildet haben.
e) Setze ein gleiches Volumen Medium 56 (s. unten) zu.
f) Nach 3–4 Wochen werden Kolonien auf Medium 56, verfestigt mit 0,7% Agarose, mit verringerter Mannitkonzentration (0,2 M anstelle von 0,44 M) und angereichert mit Claforan 250 mg/l, plattiert. In diesem Stadium müssen die Kolonien mehr als 50 Zellen/Kolonie enthalten. Wenn Km^R als selektierbarer Marker verwendet wird, werden 50 μg/ml Km als Selektionsmittel zu dem Medium gegeben.
g) Inkubiere 2–3 Wochen bei 800 Lux 16 h pro Tag, 23°C.
h) Transferiere isolierte Kalli in das gleiche Medium. Sproßinduktion setzt ein. In diesem Stadium wird Kallusgewebe entnommen, um bezüglich der Anwesenheit von Nopalin unter Anwendung des Verfahrens, wie von Aerts et al., Plant Sci. Lett. 17, 43–50 (1979) beschrieben, zu klassieren, wenn Nopalin als durchmusterbarer Marker verwendet worden ist.

Stufe 3: Regenerierung von transformierten Tabakpflanzen

a) Züchte Nopalin-positive oder Kanamycin-resistente Kalli während 4 Wochen.
b) Übertrage die (sich) differenzierenden Kalli auf hormonfreies. Murashige und Skoog (Medium).
c) Züchte während 3 Wochen.
d) Trenne Sprossen und übertrage auf das gleiche Medium, züchte während 2–3 Wochen, bis die Pflanzen Wurzeln bilden.
e) In diesem Stadium werden kleine Pflanzen zur Züchtung in 250 ml Behälter überführt, die 50 ml hormonfreies Murashige und Skoog-Medium halber Stärke enthalten.
f) Züchte während 2–3 Wochen. Entferne ein unteres Blatt zum Nachweis von Nopalin oder Untersuchung bezüglich Kanamycinresistenz-Aktivität und für immunologischen Nachweis des Toxins.

Der Blattscheiben- (hier manchmal auch als Blattsegmente bezeichnet) Test zum Testen der Km-Resistenz einer Pflanze wird wie folgt ausgeführt. Schmale Scheiben werden aus in vitro gezüchteten Pflanzen ausgeschnitten und in Petri-Schalen überführt, die Kallus-induzierendes Medium (M&S Makro- und Mikronährstoffe und Vitamine, 3% Saccharose, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l NAA und 0,1 mg/l BAP) mit unterschiedlichen Kanamycinsulfat-Konzentrationen (50–500 mg/l) enthalten.
Nach dreiwöchiger Inkubation in einem Pflanzengewebe-Kulturraum wird das Kalluswachstum auf den Blattscheiben überwacht. Der Km-Resistenzgrad der Pflanze wird als die höchste Konzentration an Km, bei der die Blattscheibe noch Kallusgewebe wachsen läßt, bestimmt.
Die Untersuchung bezüglich der Anwesenheit von Nopalin (Nopalintest) wird entsprechend den von Aerts M., Jacobs M., Hernalsteens J-P., Van Montagu M. und Schell J. in (1979) Plant Sci. Letters 17, 43–50) beschriebenen Verfahren ausgeführt.
Zusammensetzung von Medium 55:

– Halbe Stärke der Makronährstoffe der Murashige und Skoog-Salze
– 1 ml/l von 1000 × Mikronährstoffe Heller modifiziert
– 1 ml/1 von 1000 × Vitaminen Morel & Wetmore
– 100 ml/l Inosit
– 10 ml/l einer Vorratslösung, enthaltend FeSO₄ 5,57 g/l und Na₂EDTA 7,45 g/l
– Benzylaminopurin 1 ml/l Naphthalinessigsäure 3 mg/l
– Mannit 80 g/l (0,44 M)

Saccharose 20 g/l
1000 × Vitamine Morel	Mikronährstoffe Heller
und Wetmore für 100 ml	modifiziert (500 ml)
Ca-pantothenat 100 mg	500 mg ZnSO₄·7H₂O
Biotin 1 mg	50 mg H₃BO₃
Niacin 100 mg	50 mg MnSO₄·4H₂O
Pyridoxin 100 mg	50 mg CuSO₄·5H₂O
Thiamin 100 mg	15 mg AlCl₃
	15 mg NiCl₂

Zusammensetzung von Medium 45:
Medium 56 ist das gleiche wie Medium 55, mit der Abwandlung, daß 0,2 mg/l Naphthalinessigsäure und 1 mM Glutamin zugesetzt sind.
Verfahren 2: Infektion von Blattsegmenten mit Agrobacterium Stamm C581 Rif^®, der ein Hybrid-Ti-Plasmid enthält
Dieses Verfahren beschreibt die Infektion von Blattsegmenten mit C58Cl Rif^® und die Isolierung von transformierten Zellinien mittels Selektion auf Ranamycin-haltigem Medium.
Sterile Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SR-1 Pflanzen wurden in vitro in Pflanzennährstoffagar gezüchtet, der die halbe Stärke des vollständigen Murashige & Skoog (M&S) Salzgemisches, ergänzt mit der halben Stärke der organischen Nährstoffe und der Saccharose des vollständigen M&S-Mediums, enthielt. 20 SR-1 Blattsegmente von etwa 1 cm² wurden auf 5 ml flüssigem M&S-Medium (ohne Hormone) in einer 9 cm Petri-Schale, enthaltend 0,1 ml einer gewaschenen Bakteriensuspension von C58Cl Rif^® schwimmen gelassen.
Die Inkubation erfolgte auf einer Schüttelmaschine bei 60 UpM im dunkeln während 48 h bei 25°C. Anschließend wurden die Blattsegmente zweimal mit M&S-Medium (ohne Hormone), das 500 mg/l Claforan enthielt, gespült und dann auf ein Medium gegeben, das sowohl die Kallus- als auch Sproßbildung ermöglicht. Dieses Medium enthält M&S-Makro- und Mikronährstoffe und Vitamine, 3% Saccharose, 500 mq/l Claforan, 500 mg/l Kanamycinsulfat, 0,1 mg/l NAA und 1,0 mg/l BAP. Der End-pH-Wert des Mediums betrug 5,8. Sechs Blattscheiben wurden je 9 cm Petri-Schale angeordnet, die etwa 30 ml Medium enthielt und während 3 Wochen bei 23°C (etwa 1°C) unter einem 16 h 2000 Lux/Tag Be lichtungszyklus inkubiert. Nach 3 Wochen wurden die Scheiben, die Kallus und kleine Sprossen trugen, in das gleiche Medium für weitere 3 Wochen überführt. Zu der Zeit wurden Sprossen über 1 cm Länge in M&S Medium ohne Hormone und ohne Km, enthaltend 500 mg/l Claforan, überführt. Danach wurden Sprossen etwa alle 3 Wochen auf halbstarkes M&S ohne Hormone überführt und die Claforan-Konzentration allmählich verringert (1. Transfer: 250 μg/ml, 2. Transfer: 125 μg/ml, 3. Transfer: 0 μg/ml Claforan). Während des ersten Transfers auf 1/2 starkes M&S wurde Blattmaterial entfernt, um auf Kanamycin-Resistenz zu testen. Blattscheiben wurden in Petri-Schalen überführt, die Kallus-induzierendes Medium enthielten (M&S Makro- und Mikronährstoffe und Vitamine, 3% Saccharose, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l NAA und 0,1 mg/l BAP), das unterschiedliche Kanamycinsulfat-Konzentrationen (50–500 mg/l) enthielt. Die Pflanzen wurden bezüglich Km-Resistenz auf einem Medium ohne Claforan getestet, wenn sich das Material als frei von Agrobakterien erwiesen hatte.
Beispiel 10.1: Kallus und Pflanzen, transformiert mit pHD1050. (Vergleich)

T-DNA: Pnos-Bt2 (Bt2-Gen, fusioniert mit Pnos).
Marker: Nopalinsynthase als Markergen mit zusätzlicher Grenzsequenz zwischen dem Bt-Gen und dem nos-Gen.
Transformationsmethode: Protoplast-Infektion

Etwa 250 Kalli wurden bezüglich Nopalin gescrennt und 19% waren Nos⁺, dies bedeutet eine hohe Transformationseffizienz.
Insgesamt wurden 180 unterschiedliche Kalluslinien, sowohl nos⁺ als auch nos^–, die aus diesen Transformationsexperimenten erzeugt worden waren, hinsichtlich der Anwesenheit von Bt2 untersucht unter Anwendung des empfindlichen, oben (Abschnitt 5.1) beschriebenen ELISA-Testes. Die meisten Klone wurden bald nach der Transformation während der Initialphase der Vermehrung (Durchmesser nur 5 mm) getestet und einige wurden erneut nach einer Periode der Subkultur (3 Monate später) getestet. Auf der Basis der Immunoassay-Ergebnisse wurde eine Anzahl (25) von Kalluslinien für Pflanzenregeneration ausgewählt. Aus jedem Kallus wurden Pflanzen regeneriert, und jede von ihnen erhielt eine bestimmte Zahl bzw. Nummer (insgesamt 149 Pflanzen).
Die 149 Pflanzen wurden in vitro et und anschließend wurden 138 in die Gewächshäuser überführt. Alle diese Pflanzen erschienen vollständig normal, bluten und setzten Samen an. Einige Pflanzen wurden hinsichtlich Insektentoxizitäts-Assays getestet. Von den Kalluslinien 161, 165 und 206 wurde die Gesamt-DNA präpariert und die Integration des Bt2-Gens in Southern Blotting analysiert. Integration von mindestens einer Kopie des Bt2-Gens/Genoms wurde nachgewiesen.
Beispiel 10.2: Kallus und Pflanzen, transformiert mit pHD1060 (Vergleich)

T-DNA: Pnos-Bt2
Selektierbarer Marker: Kanamycin-Resistenz (Km)
Transformationsmethode: Protoplastinfektion (Verfahren 1) und Blattscheibeninfektion (Verfahren 2).

Gemäß Verfahren 1 wurden Kanamycin-resistente Protoplastklone erhalten und als Kalli gezüchtet. Kalli wurden willkürlich selektiert und zur Sproßbildung in Generationsmedium gegeben. Von diesen Kanamycin-resistenten Klonen entwickelte und isolierte Sprosse wurden als Pflanzen in vitro fortgepflanzt/vervielfältigt. Darauf wurden einige dieser Pflanzen in das Gewächshaus überführt.
Entsprechend Verfahren 2 wurden Kanamycin-resistentes Kallusgewebe und Sprossen induziert. Nicht-geklontes Kallusgewebe wurde in kontinuierlicher Kultur in vitro gehalten. Kanamycin-resistente Sprossen wurden isoliert und in vitro als kleine Pflanzen (2–5 cm) fortgepflanzt. Diese kleinen Pflanzen wurden erneut auf Kanamycin-Resistenz getestet unter Anwendung des Blattscheibenassays (50 μg/ml Km). Die Sprossen, die bei dieser Kanamycin-Konzentration deutlich resistent waren, wurden für weitere in vitro-Fortpflanzung selektiert. Pflanzen wurden gegebenenfalls in das Gewächshaus überführt. Mit Hilfe der Southern Blotting-Analyse wurde die Anwesenheit von sowohl dem NPTII-Gen als auch des Bt2-Gens im Blattgewebe bestätigt.
Beispiel 10.3: Kalli und Pflanzen transformiert mit pDH1076 (Vergleich)

T-DNA: Pssu-Bt2 (Bt2-Gen fusioniert mit Pssu)
Selektierbarer Marker: Kanamycin-Resistenz
Transformationsmethode: Blattscheibeninfektion.

Unter Anwendung der im Verfahren 2 beschriebenen Bedingungen wurden beide Kallus-Transformationen der Sproßinduktion auf den infizierten Blattscheiben ausgeführt. Unter Anwendung der Kallus-Induktionsverfahrensweise wurden eine Anzahl Kalli durch teilweise Reinigung erhalten und als getrennte Semiklone gehalten. Auf der Basis von positivem Immunoassay-Ergebnissen wurden 5 dieser Linien für weitere Weg ausgewählt (1076-4, 10, 11, 12, 13). Entsprechend der Sproßinduktionsverfahrensweise, angewandt im ursprünglichen Stadium von Blattscheibeninfektion, wurde eine Anzahl (72) kanamycinresistenter Pflanzen regeneriert (Selelction auf 50 μg/ml Km).
Nach erneutem Test im Blattscheibentest erwiesen sich 65% dieser (Pflanzen) als echt resistent gegenüber 50 μg/ml Km. Aus den Blättern von einigen "in vitro" vermehrten Pflanzen wurde Kallusgewebe generiert und "in vitro" für weitere Versuche vermehrt.
Beispiel 10.4: Kalli und Pflanzen transformiert mit pHD1080 (Vergleich)

T-DNA: Pssu-Transitpeptid (Tp) Bt2
Selektierbarer Marker: Kanamycinresistenz/(Nos)
Transformationsmethode: Blattscheibeninfektion.

Kanamycinresistente Kalli und Sprosse wurden gemäß Verfahren 2 induziert. Etwa 20 kanamycinresistente Kalluslinien wurden bezüglich Nopalinexpression analysiert und alle erwiesen sich als positiv. 86 kanamycinresistente Sprosse wurden selektiert, "in vitro" vermehrt und erneut bezüglich Kanamycinresistenz (unter Anwendung des Blattscheibentestes) bezüglich Nopalinexpression getestet.
52 Pflanzen (60%) waren sowohl kanamycinresistent als auch nopalinpositiv und diese wurden weiter "in vitro" vermehrt: Etwa 10% der Pflanzen exprimierten nur einen der beiden Marker.
Beispiel 10.5 Pflanzen transformiert mit pGS1110

T-DNA: Pnos-Bt:NPTII (Fusion)
Selektierbarer Marker: Kanamycinresistenz/Nos
Transformationsmethode: Blattscheibeninfektion

Blattscheiben von "in vitro" gehaltenen SR-1-Pflanzen wurden während 48 h mit einer Suspension von Agrobacterium tumefacien C58Cl Rif^® pGS1110 inkubiert (Verfahren 2). Gleiche Verdünnungen von verschiedenen Kontrollstämmen, die chimäre Gene enthalten, welche intaktes NPTII codieren, wurden dazugenommen. Nach zwei Wochen wurde aktive Sproßbildung auf M&S-Medium, enthaltend 50 mg/l Kanamycin, beobachtet sowohl bei den Kontrollen als auch bei pGS1110. Jedoch trat nach Übertragung auf frisches selektiertes M&S-Medium ein Unterschied zwischen den Kontrollen und pGS1110 auf. Einige Sprosse auf Scheiben, die mit dem letzteren Stamm inokuliert waren, wurden gelb und wuchsen langsam. Die am besten wachsenden und grünen Sprosse wurden auf Medium ohne Kanamycin übertragen. Ein Teil von ihnen konnte auf diese Weise gerettet werden und begann nach der zweiten Übertragung auf kanamycinfreies Medium normal zu wachsen.
Etwa 70 Sprosse wurden aus dem pGS1110 Übertragungs-(Transformations-)-experiment gerettet. Eine Vorauswahl (screening) unter 35 dieser Sprosse zeigte, daß 28 davon (85%) reale Transformanten waren, da sie Nopalin produzierten. Diese wichtige Beobachtung legt nahe, daß, obwohl die Sprosse nicht lange auf Km enthaltendem Medium gehalten worden waren, eine phänotypische Selektion für die Expression des Fusionsproteins stattgefunden hatte.
Die erhaltenen Sprossen wurden "in vitro" als kleine Pflanzen auf nichtselektivem Medium vermehrt. Eine Anzahl dieser Pflanzen wurde bezüglich Km^R-Resistenz unter Anwendung des Blattscheibenassays getestet. Die meisten von ihnen exprimierten einen bestimmten Grad von Km^R, da sie Kallus auf Km enthaltendem Medium bildeten. Unterschiedliche Resistenzgrade bzw. -konzentrationen wurden im Bereich von 50–500 mg Km/Liter registriert. Jedoch waren die meisten Pflanzen nur gegenüber niedrigen Km-Graden/-konzentrationen resistent. Zwei von insgesamt 61 Pflanzen zeigten Resistenz gegenüber 200 μg/ml Km und partielle Resistenz gegenüber 5.00 μg/ml Km (sehr schwaches Kalluswachstum).
Für eine Anzahl Pflanzen wurden Kopien in Vermikulittöpfe überführt. Nachdem sie eine Höhe von 10–15 an erreicht hatten, wurde ein erster Insektentixozitätstest auf Blättern dieser Pflanzen ausgeführt (sh. Abschnitt 13).
Beispiel 10.6: Pflanzen transformiert mit pGS1161 (Vergleich)

T-DNA: PTR2-Bt2
Selektierbarer Marker: Kanamycinresistenz
Transformationsmethode: Blattscheibeninfektion.

Blattscheiben von "in vitro" gehaltenen SR-1-Pflanzen wurden während 48 h mit einer Suspension von Agrobacterium tumefaciens C58Cl Rif^® pGS1161 inkubiert. Als Kontrolle wurde ein A. tumefaciens C58Cl Rif^® pGS1110 enthaltend NPTII unter Kontrolle von pTR eingeschlossen/dazugenommen. Nach zwei Wochen wurde Sproßbildung auf einem Medium, das 50 mg/l Kanamycinsulfat enthielt, beobachtet. Nach drei Wochen wurden Scheiben auf frisches Selektionsmedium überführt und nach weiteren drei Wochen wurden die am besten wachsenden Sprosse auf kanamycinfreies Medium überführt. Der Grad an Km^R wurde systematisch unter Anwendung des Blattscheibentestes bestimmt. Die meisten Pflanzen zeigten einen hohen Grad an Resistenz (Kallusbildung auf 500 μg/ml Km).
Beispiel 10.7 Pflanzen transformiert mit pGS1151

T-DNA: PTR2-Bt:NPT2 (Fusion)
Selektierbarer Marker: Kanamyeinresistenz
Transformationsniethode: Blattscheibeninfektion

Blattscheiben von "in vitro" kultivierten SR-1-Pflanzen wurden während 48 h mit einer Suspension von Agrobacterium tumefaciens C58Cl Rif^® inkubiert. Als Kontrolle wurde A. tumefaciens C58Cl Rif^® pGS1160 enthaltend NPTII unter Kontrolle von pTR (in den Tests) eingeschlossen.
Sproßbildung und Entwicklung der Sprosse auf Medium, das 50 mg/l Kanamycinsulfat enthielt, war etwas geringer auf Scheiben, die mit pGS1151 behandelt worden waren, als bei den Kontrollscheiben (pGS1160). Nach drei Wochen wurden Scheiben auf frisches Selektionsmedium übertragen und nach weiteren vier Wochen wurden die am besten wachsenden Sprosse auf kanamycinfreies Medium übertragen. Die Sprosse wurden "in vitro" als Pflanzen vermehrt und der Grad an Km^R dieser Pflanzen wurde systematisch unter Anwendung des Blattscheibentests bestimmt. Eine Anzahl Pflanzen war vollständig resistent gegenüber 500 μg/ml Km (normales Kalluswachstums). Diese Daten zeigen, daß der PTR-Promotor höhere Grade an Fusionsproteinexpression in Tabakblättern dirigiert als der Pnos-Promotor (pGS1110, Beispiel 5 in diesem Abschnitt).
Kopien der Pflanzen wurden auf Töpfe übertragen und im Gewächshaus gezüchtet/weiterwachsengelassen. Mit einer Auswahl von Pflanzen, denjenigen, die hohe Km-Resistenz aufwiesen, wurden detaillierte Insektentoxizitätstests durchgeführt (sh. Abschnitt 13). Der Grad von Km wurde systematisch unter Anwedung des Blattscheibentests bestimmt.
Beispiel 10.8 Pflanzen transformiert mit pGS1162 oder pGS1163

T-DNA: PTR2-Bt/820 – PTR2-Bt2/884
Selektierbarer Marker: Kanamycinresistenz
Transformationsmethode: Blattscheibeninfektion.

Blattscheiben, erhalten von "in vitro" gezüchteten SR-1-Pflanzen, wurden mit Agrobacterium tumefaciens C58Cl Rif^® pGS1162, pGS1163 oder pGS1160 (als Kontrolle) infiziert. Die Scheiben wurden in Medium überführt, die verschiedene Km-Konzentrationen (50-100-200 mg/l) enthielten. Sprosse erhalten auf allen drei Konzentrationen wurden auf Km-freies Medium überführt. Km-Resistenz wurde mit Hilfe des Blattscheibentests auf Kallus induzierendem Medium, das 50–500 μg/ml Km enthielt, geprüft.
Beispiel 10.9: Pflanzen transformiert mit pGS1152

T-DNA: pTR2-Bt:NPT860 Selektrierbarer Marker: Kanamycinresistenz Transformationsmethode: Blattscheibeninfektion

Blattscheiben erhalten von "in vitro" gezüchteten SR-1-Pflanzen wurden mit Agrobacterium tumefaciens C58Cl Rif^® pGS1152 infiziert. Als Kontrolle wurden Scheiben, infiziert mit Agrobacterium tumefaciens C58Cl Rif^® pGS46D, verwendet. Die Scheiben wurden auf Medien überführt, die unterschiedliche Km-Konzentrationen (50-100-200 ml/l) enthielten. Sprosse wurden auf allen drei Konzentrationen erhalten, obwohl weniger reichlich als bei Kontrollscheiben infiziert mit C58Cl Rif^® GS1160.
11. Immunologischer Nachweis von Bt2-Protein in manipulierten Pflanzengeweben (Vergleich)
Die Expression von Bt2 in manipulierten Pflanzen (entweder Kallusgewebe oder differenzierte Pflanzen) wurde unter Anwendung des im Abschnitt 5 beschriebenen und für das Testen von Pflanzenextrakten angepaßten ELISA-Test überwacht.
Bedingungen für die Herstellung und das Testen von Pflanzenextrakten wurden in Rekonstruktionsexperimenten ermittelt, bei denen gereinigtes Bt2-Protein mit Pflanzenextrakten gemischt wurde.
In Rekonstruktionsexperimenten beobachteten wir keinen signifikanten Verlust an Antigen-Aktivität von Bt2-Protein (weniger als 20%) aufgrund der Anwesenheiten von Pflanzenextrakten. Im ELISA-Test waren noch 0,1 mg/ml gereinigtes Bt2-Protein nachweisbar. Jedoch trat bei Rekonstruktionsexperimenten eine gewisse Variabilität im Hintergrund auf, wahrscheinlich verursacht von in den Extrakten vorhandenen Pflanzenproteinen. Infolgedessen lag die zuverlässige Nachweisgrenze unter diesen Bedingungen in der Größenordnung von 1 ng/g Gewebe, was einer Menge/Konzentration von 2 ng Bt2 Protein je Gramm Pflanzengewebe entspricht.
11.1 Screening von individuellen Kalli
Für die immunologische Screering von individuellen Kalli wurde das folgende Versuchsverfahren entwickelt:
Zweihundert mg Kallusgewebe wurden mit 150–200 μl Extraktionspuffer gemischt. Der Extraktionspuffer hatte folgende Zusammensetzung: 50% einer Lösung von N₂CO₃ 500 mM und DIT 100 mM und 50% fetales Kälberserum. Das Gewebe wurde homogenisiert durch Zerdrücken mit einen Spachtel, worauf die Zelltrümmer abzentrifugiert wurden. 50 μl Überstände wurden zu 50 μl PBS pH 7,4 + 10% fetales Kälbexserum in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, beschichtet mit Ziegenantikörpern gegen B.t. Kristallprotein, wie beschrieben, zugegeben. Während des gesamten Verfahrens wurden die Proben in Eis gehalten/gepackt und die Mikrotiterplatten bei 4°C während 1,5–2 h inkubiert. Darauf wurde das ELISA-Verfahren wie in 5.1 beschrieben fortgesetzt, um Bt2-Protein mit entwender Kaninchen-anti-B2-Serum oder mit einem Gemisch aus Monoklonalen anti-Bt2-Antikörper 4D6, 10E3, 1.7, und 4.8 (in der Form von Kulturüberständen) nachzuweisen.
Beispiel 11.1:
Analyse von Kalli transformiert mit C58Cl Rif^® pHD1050.
Transformierte Kallusklone wurden mit Hilfe der Protoplast-Cokultivierungsmethode wie in Abschnitt 10, Beispiel 10.1 beschrieben erhalten. Da festgestellt wurde, daß 19% der Klone Nopalin exprimierten (Nos⁺), wurden mindestens 19% von ihnen transformiert. Jedoch können aufgrund einer zusätzlichen Grenzfrequenz im Zwischenexpressionsvektor (pLGV2382) das Nos-Gen und das Bt2-Gen unabhängig voneinander sowie als Tandem insertiert werden und infolgedessen wurden sowohl Nos⁺ als auch Nos^–-Klone im ELISA-Test gescreent.
Insgesamt wurden 180 Kallusklone (130 Nos^–, 50 Nos⁺) getestet. Einige dieser Klone wurden erneut ein- oder zweimal zu unterschiedlichen Zeitintervallen nach der ersten Vermehrung aus Protoplastkultur getestet. In keinem dieser Fälle konnte ein klares positives Signal registriert werden. Wenn die Substrat-Reaktionszeiten des Versuchs verlängert wurden (Über-Nacht-Inkubation bei 4°C), produzierten einige Klone (sowohl Nos⁺ als auch Nos^–) ein sehr schwaches Signal über dem Hintergrund (der Hintergrund war Kontrollkallus ohne Bt2-Gen). Da jedoch die erhaltenen Werte deutlich unterhalb der zuverlässigen Nachweisgrenze des Testsystems lagen, konnten keine festen Schlußfolgerungen bezüglich der Expression von Bt2-Protein in diesen Kalli gezogen werden.
Beispiel 11.2
Nachweis von Bt2-Protein in Tabakkallusgewebe, transformiert mit C58Cl Rif^® phd1076.
Transformiertes Kallusgewebe, erhalten von Blattsegmentinfektionen unter Verwendung vom Agrobacterium Stamm C58Cl Rif^® (pHD1076) (sh. Abschnitt 10, Beispiel 10.3), wurden immunologisch hinsichtlich der Anwesenheit von Bt2-Protein gesreent.
Nach ursprünglicher Vermehrung wurden Kalli ein zweites Mal nach 20 Tagen übertragen. Wenn sie optimales Wachstum erreicht hatten, wurden 200 mg von jeder Kalluslinie für immunologisches Screening im ELISA-Test verwendet. In einem ersten Versuch zeigten 9 von 14 transformierten Kalli ein positives Signal deutlich über den Hintergrund, der mit den 4 Kontrollkalli (nichttransformierter SR-1-Kallus) erhalten worden war, wenn sie mit einem spezifischen Kaninchen-anti-Bt2-Serum zur Reaktion gebracht wurden (sh. 34). Drei transformierte Kalli erzeugten ein Signal, das etwa 5 ng Bt2-Protein je Gramm Gewebe, wie durch Vergleich mit einer positiven Kontrolle (Kontrolle SR-1 vermischt mit einer bekannten Menge an Bt2-Protein) bestimmt. Alle Proben gaben Signale, die den Hintergrundniveausignalen (erhalten mit SR-1 Kontrollkallus) gleich waren, wenn sie mit normalem Kaninchenserum aus einer negativen Kontrolle zur Reaktion gebracht wurden. In einem zweiten Versuch lieferten 13 von 21 transformierten Kalli ein Signal das deutlich über dem Hintergrund lag (35). Einer der Kalli erzeugte ein Signal, das 4 ng Bt2 je Gramm Gewebe entsprach. Diese Ergebnisse zeigen an, da Bt2-Protein in einem nachweisbaren Ausmaß in einer Fraktion/einen Teil der Kalli, transformiert mit pHD1076, produziert wird.
Etwa 5 Wochen nach den ersten ELISA-Testen wurden 4 ausgewählte Linien (1076-10, 11, 12 und 13), die beim ursprünglichen Screening hohe positive Werte ergeben hatten, erneut in ELISA getestet. Von jeder Linie wurden verschiedene "Subklone" getestet (der ursprüngliche Kallus war in Stücke geteilt worden, die unabhängig voneinander im nächsten Wachstumszyklus vermehrt wurden; jedes neue Stück wird hier als Subklon bezeichnet). Von 1076-10 war ein Subklon positiv, einer negativ; von 1076-12 waren 2 Sub klone positiv; von 1076-13 waren 3 Subklone positiv und 2 waren negativ. Diese Ergebnisse zeigen an, daß Kallusgewebe ursprünglich als B.t.-positiv ermittelt, bei weiterer Vermehrung B.t. negativen Kallus ergeben/entwickeln kann.
11.2 Nachweis von Bt2 in gepoolten Kallusextrakten
Um detaillierte Immunoassay-Untersucnungen mit erhöhter Nachweisempfindlichkeit auszuführen, wurden konzentrierte Extrakte von größeren Mengen tranformierter Kallusgewebe hergestellt. Das hier entwickelte Verfahren, um einen Extrakt, angereichert an Bt2-Protein zu erhalten, basiert auf der Eigenschaft von Bt2, bei pH 4–5 auszufallen.
Beispiel 11.2.1: Kalli transformiert mit pHD1076
Mit pHD1076 transformierte Kalli wurden auf Medium enthaltend 0,05 mg/ml Kanamycinsulfat gezüchtet und 140 g nicht geklonte transformierte Kalli wurden gesammelt (ein Pool von Kalluslinien 1076-4, 10, 11, 12, 13 und eine Anzahl nicht gesreenter Linien). Ein Extrakt wurde hergestellt durch Homogenisieren der Kalli in Gegenwart von 70 ml Extraktionspuffer (Na₂CO₃ 500 mM, pH 10, DIT 5 mM, PMFS 170 μg/ml).
Der Überstand erhalten nach Zentrifugieren bei 15.000 UpM wurde durch Zugabe von 50 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung pH 7,5 verdünnt. Anschließend wurde der pH-Wert des verdünnten Extraktes mit 1 M HCl auf pH 6 gebracht und der Extrakt während 20 min bei 0°C inkubiert; der Überstand wurde durch Zentrifugieren isoliert und bei 0°C aufgehoben (Fraktion pH 6). Wenn der pH-Wert auf 4,5 gesenkt wurde, wurde in gleicher Weise ein neuer Niederschlag isoliert (Fraktion pH 4,5). Die Pellets wurden einmal mit H₂O gewaschen und anschließend während 20 min bei Raumtemperatur im folgenden Puffer inkubiert: Na₂CO₃ 500 mM pH 10, DTT 50 mM, PMSF 170 μg/ml (Pellet pH 6 in 1,5 ml und Pellet pH 4,5 in 2 ml).
Das unter diesen Bedingungen in Lösung gehende Material wurde nach dem Zentrifugieren bei 15.000 UpM isoliert und diese Proben wurden als 1076 pH 6 bzw. 1076 pH 4,5 bezeichnet.
Ein vollständig identisches Verfahren wurde angewandt um Extrakte aus normalem SR-1 Kallusmaterial (hier als negative Kontrolle verwendet) herzustellen und man erhielt zwei Präparate bezeichnet SR-1 pH 4,5. Der Gesamtproteingehalt in diesen Proben betrug:

1076 pH 6 600 μg/ml

1076 pH 4,5 6560 μg/ml

SR-1 pH 6 380 μg/ml

SR-1 pH 4,5 3840 μg/ml
Um die Effizienz des Verfahrens zu bewerten, wurde ein Rekonstruktionsexperiment durchgeführt, bei dem 1 μg gereinigtes Bt2 zu 20 g Sr-1 Kontrollkallusgewebe beim Start der Probenhomgenisierung gegeben wurde. Die Anwesenheit von Bt2-Protein in diesen Extrakten wurde mittels ELISA (mit Ziegen-anti-Bt-Kristallserum und Kaninchen-anti-Bt2, 6002) bestimmt. Eine starke Reaktion wurde in der Fraktion 1076 pH 4,5 im Vergleich mit der negativen Kontrolle (SR-1) registriert. Fraktion 1076 pH 6 ergab ein Signal, das nur geringfügig höher lag als SR-1 pH 6, was anzeigt, daß diese Fraktion nur einen kleinen Teil des Bt2-Proteingehaltes enthält.
Im ELISA-Test ergab Fraktion 1076 pH 4,5 auch eine signifikante Reaktion mit fünf verschiedenen monoklonalen Antikörpern, spezifisch für Bt2-Protein, nämlich 1,7, 4D6, 4,8, 10E3 und 1F6 (sh. 36). Dies zeigt stark an, daß Fraktion 1076 pH 4,5 Bt2-Protein enthält, das in der gleichen Konfiguration vorliegt wie das bakterielle Bt2.
Im folgenden versuchten wir Bt2-Protein aus dem Extrakt zu entfernen unter Anwendung eines Verfahrens der Immunopräzipitation. Ein 5% Volumen von Kaninchen-anti-Bt2-Serum wurde zu dem Extrakt gegeben, der bei 4°C während 1 h inkubiert wurde. Anschließend wurde ein 5% Volumen von Ziegen-anti-Kaninchen-Ig-Serum zugesetzt und anschließend bei 5,4 h inkubiert. Das Präzipitat wurde abzentrifugiert und der Überstand einem ELISA-Test unterworfen. Dieser Überstand enthielt mindestens 10 mal weniger Bt2-Aktivität als die ursprüngliche 1976 pH 4,5 Fraktion, was anzeigt, daß das Material, das die positiven Signale in ELISA erzeugt, spezifisch durch Anti-Bet2-Antikör per entfernt worden sein könnte, was wiederum die Bt2 Natur der im ELISA-Test positiv reagierenden Substanz bestätigt.
In einen nächsten Versuch wurden die obigen Proben gegen Carbonatpuffer pH 10 dialysiert. Eine quantitative Bestimmung des Bt2-Gehaltes vom Extrakt 1076 pH 4,5 wurde ausgeführt, finden Verdünnungen des Extraktes und eine Lösung von gereinigtem Bt2-Protein als Standard im ELISA getestet wurden. Der bestimmte/ermittelte Wert war 122 ng Bt2/ml Extrakt (Gesamtvolumen 2 ml). Rekonstruktionsexperimente (Bt2 zugegeben zu SR-1 Kontrollkallus bei Beginn der Extraktion) zeigten an, daß nur 20% Bt2-Protein während des Extraktionsverfahrens verlorengeht, und daß 80% in der pH 4,5 Fraktion enthalten sind. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse konnte man berechnen, daß die Gesamtmenge an Bt2-Protein, die ursprünglich in 140 g Kallus vorhanden war, 305 ng betrug, d.h. 2,2 ng/g, ein Ergebnis, das gut mit den ursprünglichen Schätzungen übereinstimmt, die für das Screening von individuellen Kalli gemacht worden sind (sh. 34 und 35). Diese Daten zeigen, daß Bt2-Protein, das in Extrakten von transformierten Kalli enthalten ist, mit Hilfe eines Präzipitationsverfahrens bei pH 4,5 wie oben beschrieben, spezifisch konzentriert werden kann, was uns ermöglichte, die Menge an Bt2-Protein, die in diesen Pflanzengeweben produziert wurde, genauer zu quantifizieren.
Beispiel 11.2.2: Kalli transformiert mit pHD1050.
Ein 500 g Pool von selektionierten Kallusklonen (auf der Basis von vorangegangenen ELISA-Tests auf individuelle Kalli, etwa 25 Kalluslinien, die Werte über den Hintergrund ergaben, wurden selektiert) und homogenisiert in Anwesenheit von 1000 ml Extraktionspuffer unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben. Material, das bei pH 6 löslich blieb, aber bei pH 4,5 ausfiel, wurde durch Zentrifugieren isoliert und anschließend in einem kleinen Volumen Carbonatpuffer pH 10 wieder aufgelöst (sh. Beispiel 11.2.1). ELISA-Analyse des Materials zeigte positive Signale, die 60 ng/ml Bt2 oder 1,2 ng/g Kallusgewebe entsprechen (Tabelle 8).
Beispiel 11.2.3: Kalli transformiert mit pHD1060 und HD 1080
In diesem Beispiel wurde ein leicht abgeändertes und extensiveres Extraktionsvorgehen angewandt, um Bt2-Protein aus den manipulierten Pflanzenmaterial zu isolieren. Ein Vorgehen wurde entwickelt um eventuelles restliches Bt2-Protein, das nicht in einer einzelnen Extraktionsstufe, wie in den Verfahren der Beispiele 11.2.1 und 11.2.2 angewandt, in Lösung gehen würde, zurückzugewinnen. Dies könnte der Fall sein, da Bt2-Protein einige hoch/stark hydrophoben Bereiche enthält, die möglicherweise mit Pflanzenzellenmembranstrukturen in Wechselwirkung treten und daher schwierig in Abwesenheit von Detergentien in Lösung gebracht werden könnten. Dieses hier angewandte stufenweise Verfahren würde die Rückgewinnung von zusätzlichen Proteinen ermöglichen, die mit unlöslicher Pflanzenzellstruktur assoziiert sind. Eine schematische Darstellung der Vorgehensweise ist in der 37 gegeben.
Eine erste Proteinfraktion wurde mittels Extraktion in Carbonatpuffer pH 10 + DTT erhalten und mittels Säurefällung (pH 4,5) konzentriert (Fraktion I). Diese Fraktion entspricht dem pH 4,5 Extrakt, der unter Anwendung des Verfahrens in den Beispielen 11.2.1 und 11.2.2 erhalten worden war.
Das in dieser ersten Extraktionsstufe nicht in Lösung gegangene und im Pellet verbliebene Material wurde dann mit dem gleichen Extraktionspuffer behandelt, der 1% Triton-X-100 enthielt. Proteine, die unter diesen Bedingungen in Lösung gingen und bei pH 4,5 ausfielen, sind in Fraktion II enthalten. Die letzte Stufe schließt in-Lösung-bringen in 2% SDS und anschließende Acetonfällung ein, wodurch Fraktion III erhalten wurde. Die Fraktionen I und II wurden mittels ELISA und Western-Blotting analysiert; Fraktion III, die SDS enthielt, wurde nur mittels Western-Blotting analysiert.
ELISA-Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben: Positive Signale wurden in Fraktion I und II von beiden Konstruktionen 1060 und 1080 nachgewiesen, entsprechend Bt2-Gehalten/Konzentrationen von 1,9 bzw. 1,4 ng/g ursprüngliches Gewebe (Fraktion 2) und 0,27 bzw. 0,29 ng/g (Fr. II). Western-Blotting des mit SDS in Lösung gebrachten Materials (Fraktion III) zeigte die Anwesenheit einer schwachen, etwa 130 Kd Bande für sowohl 1060 als auch 1080-Kallusmaterial an (unter Verwendung von Kaninchen-anti-Bt2-Serum). Die Nachweisgrenze des Western-Blotting betrug 10 ng/Bahn, daher enthielten diese Fraktionen mindestens 0,39 ng/g für 1060 und 0,6 ng/g für 1080.
Western-Blotting der Fraktionen I von 1050, 1060 und 1080 zeigte keine Anwesenheit einer 130 Kd Bande, wahrscheinlich weil die Konzentration von Bt2-Protein in diesen Fraktionen zu gering ist.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen an, daß geringe Gehalte/Konzentrationen an Bt2-Protein in der Tat in mit pHD1060 und pHD1080 transformierten Kalli exprimiert werden. Obwohl eine Analyse in kleinem Maßstab von einzelnen/individuellen Kalli nicht den Nachweis von immunopositiven Klonen in diesen Konstruktionen erlauben mag, führt ein rigoroseres Extraktions- und Konzentrationsverfahren mit einem Pool von selektionierten Kalli deutlich zu zuverlässigem und quantitativen Nachweis von Bt2-Protein. Eine wesentliche Fraktion des Bt2 war stark an unlösliches Pflanzenmaterial gebunden und konnte nur unter Verwendung von Detergentien wie Triton und SDS freigesetzt werden.
11.3 Nachweis von Bt2-Protein in Blättern von regenerierten transformierten Pflanzen
Für die Routineuntersuchung von Blattproben wurde das folgende Verfahren festgelegt:
Grünes Blattgewebe (200–400 mg) wurde von "in vitro" gezüchteten Pflanzen (5–10 an hoch wie in Abschnitt 10, Beispiel 1 beschrieben) entnommen und in Anwesenheit von Extraktionspuffer (200 μl) der 50% von Na₂CO₃ 500 mM, 100 mM DTT, 480 μg/ml Leupeptin (Sigma, L-2884), 2 mM PMSF, 2 mg/ml Ascorbinsäure (Sigma, A-7631), 2 mM EDTA und 50% FCS enthielt, homogenisiert. Das Gewebe wurde homogenisiert durch Zerdrücken mit einen Spachtel, worauf die Zelltrümmer zentrifugiert wurden. Darauf wurde das gleiche ELISA-Verfahren wie für das screening von Kallusgewebe (sh. Abschnitt 11.1) angewandt.
Beispiel 11.3.1: Nachweis von Bt2-Protein in Tabakpflanzen transformiert mit C58Cl Rif^® pHD1050
Blätter von den "in vitro" vermehrten Pflanzen (70 individuelle Pflanzen regeneriert aus 25 selektierten Kallusklonen) wurden hinsichtlich Bt2-Expression dem ELISA-Test unterworfen, unter den oben beschriebenen Bedingungen:
Von 70 getesteten Pflanzen ergaben 5 eine deutliche positive Reaktion über dem Hintergrund, der mit Blättern von nichttransformiertem SR-1 entsprechend Bt2 Gehalten im Bereich von 6 bis 25 ng je Gramm feuchtes Gewebe erhalten worden war (sh. Tabelle 9).
Eine dieser Pflanzen mit dem höchsten Wert (Pflanze Nr. 161-9: 25 ng) wurde genauer untersucht. Der Blattextrakt reagierte positiv mit einem Kaninchen-anti-Bt2-Serum und mit einem Gemisch von monoklonalen, für das Bt2-Molekül spezifischen Antikörpern (unverdünnte Kulturüberstände von den Klonen 1.7, 4.8, 4D6, 10E3). Außerden reagierte der Extrakt nicht mit einem Pool von Monoklonalen, die eine irrelevante Spezifität entfalteten. Der Pflanzenextrakt wurde mindestens zweimal erneut getestet nach Einfrieren bei –20°C und Auftauen unter Verwendung der gleichen Reagentien. Identische Ergebnisse wurden jedesmal erzielt, jedoch nahm der Gehalt an Bt2 allmählich mit jedem Einfrier/Auftauzyklus ab, wahrscheinlich als Ergebnis von Bt2-Protein-Abbau.
Pflanze 161-9 wurde nach Vermehrung unter Gewächshausberüngungen in einen Stadium, wo sie etwa zu Blühen begann, erneut getestet. Wieder wurde ein deutliches positives Signal erhalten, das dieses Mal einen Gehalt von etwa 5 ng Bt2/Gramm Gewebe entsprach.
Dieses Ergebnis zeigt an, daß die in veränderten Pflanzenblättern nachgewiesenen Gehalte/Konzentrationen an Bt2-Protein beträchtlich schwanken können, je nach dem Alter, den Wachstumsbedingungen der Pflanze usw.
Beispiel 11.3.2 Screening von Tabakpflanzen transformiert mit C58Cl Rif^® pHD1060
Screening von 76 "in vitro" vermehrten kanamycinresistenten Pflanzen ergab keine deutlich Bt2-positiven Pflanzen unter Anwendung der im Beispiel 11.3.1 beschriebenen ELISA-Methode.
Beispiel 11.3.3: Screening von Tabakpflanzen transformiert mit C58Cl Rif^® pHD1076
Blattextrakte von "in vitro" vermehrten Pflanzen, die durch das Sproßinduktionsverfahren erhalten worden waren, wurden im ELISA-Test gescreent (Methode wie in Beispiel 11.3.1). Siebzehn Pflanzen wurden getestet und keine von ihnen ergab ein positives Signal. Anschließend wurde eine weitere Anzahl (21) Pflanzen gescreent und in Töpfen 15–20 cm hoch gezogen. Erneut wurde im ELISA-Test kein positives Signal über dem Hintergrund beim Screening dieser Pflanzen erhalten.
Beispiel 11.4: Screening von Tabakpflanzen transformiert mit pHD1080
Etwa 30 "in vitro" vermehrte Pflanzen wurden in ELISA-Tests qescreent. Eine Pflanze (Pflanze Nr. 174) gab ein positives Signal entsprechend 20 ng/g Bt2 sowohl mit Kaninchen-anti-Bt2-Serum als auch mit einem Pool von monoklonalen Antikörpern. Der Extrakt dieser Pflanze war durchweg positiv beim erneuten Testen in anschließenden Versuchen.
11.4 Nachweis von Bt2-Protein in Kallusgewebe leitet von Blättern von transformierten Pflanzen.
Die im Abschnitt 11.4, Beispiele 11.1.2, 11.3, Beispiel 11.3.3 dargelegten Daten legen nahe, daß die hier verwendeten Pssu-Promotorkonstruktionen (pHD1076) in differenzierten Pflanzenblättern weniger als aktiv sind als in Kallus.
Um dies weiter zu untersuchen, wurde neues Kallusgewebe auf Blättern der gleichen Pflanzen erzeugt, die in den vorangegangenen Versuchen verwendet worden waren, Blattscheiben wurden auf Kallus induzierendem Medium gezüchtet und einige Wochen später wurde das Kallusmaterial gesammelt und in einem gleichen/ähnlichen Verfahren (mit dem einzigen Unterschied, daß in der Stufe I Extraktion ein Tris pH 7,5-Puffer verwendet wurde anstelle eines Na₂CO₃ pH 10/DTT-Puffers) analysiert.
Kallus, der gleichzeitig aus nichttransformierten SR-1-Blättern induziert worden war, wurde als negative Kontrolle eingesetzt.
ELISA-Analyse der pHD1076-transformierten Kalli ergab nachweisbare Mengen an Bt2-Protein (Tabelle 10).
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein chimäres Gen mit dem Pssu-Promotor der Erbse in der hier verwendeten Konstruktion funktional ist und Expression von Bt2-Protein im Tabakkallusgewebe induziert, das abgeleitet ist von Blättern, die keine nachweisbaren Mengen des gleichen Proteins exprimierten. Daher muß ein chimäres Gen, das Expression in nichtdifferenziertem Kallusgewebe dirigiert, nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß, wenn überhaupt, in differenzierten Pflanzenblättern aktiv sein.
12. Insektizide Aktivität des in veränderten Kalli produzierten Bt2-Proteins
Verfahren:
Toxizitätstests wurden mit Larven der ersten Entwicklungsstufe von Manduca sexta ausgeführt, die mit Kunstnahrung gefüttert wurden, Drei bis vier ml flüssige Kunstnahrung (Bell, R.A. & Joachim, F.G. (1976) Ann. Entomol. Soc. Ann. 69: 365–373) wurden in jedes Abteil (4 cm²) von viereckigen Petrischalen gegeben. Formaldehyd wurde aus der Nahrung weggelassen. Nachdem die Nahrung fest geworden war, wurden 200 μl einer bekannten Probenverdünnung auf die Oberfläche der Nahrung aufgebracht und in einem kühlen Luftstrom getrocknet. Vier neu geschlüpfte Larven wurden in jedes Abteil gegeben und Wachstum und Mortalität wurden während einer Zeitspanne von 3–5 Tagen verfolgt.
Beispiel 12.1: Kallusextrakt aus Kalli, transformiert mit pHD1076 (Vergleich)
Ein konzentrierter Extrakt eines Pools von Kalli, transformiert mit pHD1076 wurde wie im Abschnitt 11.2, Beispiel 11.2.1 beschrieben, hergestellt. Extraktverdünnungen wurden auf die Oberfläche der Nahrung aufgebracht und ihre Toxizität bewertet. Das extrahierte Material 1976 pH 4,5 hatte deutlich eine toxische Wirkung auf die Manduca sexta Larven: bei 12,5 μl/cm² zeigten alle Larven Wuchshemmung und bei 50 μl/cm² starben 100 (Tabelle 11). Toxische Aktivität dieses Materials wurde nach Immunopräzipitation deutlich verringert (100% normales Wachstum bei 12,5 und 25 μl/cm² und lediglich 37% tot bei 50 μl/cm²), was anzeigt, daß die toxische Aktivität durch anti-Bt2-Antikörper eliminiert werden kann. Extrakt von nichttransformierten SR-1-Kallusgewe-be, die negative Kontrolle, war vollständig nicht-toxisch. Da die Anwesenheit von Bt2-Protein in den Extrakten immunologisch quantifiziert wurde, konnten wir die beobachtete Toxizität mit der bestimmten Bt2-Konzentration korrelieren. Die Immuniassaywerte zeigten an, daß 1076 pH 4 122 ng/ml Bt2 enthielt. Daher entsprachen 50 ml Extrakt pro cm² 6,1 ng Bt2-Protein/cm². Frühere Toxizitätstests mit Bt2 auf Manduca (Abschnitt 5.2, Tabelle 3) zeigten an, daß Bt2 bei 12 ng/cm² zu 100 lethal ist, während 2,5 ng/cm² Wuchshemmung indizieren.
Zusammen zeigen diese Ergebnisse an, daß das im manipulierten Kallusgewebe exprimierte Bt2 ein funktionelles Toxin ist und Toxizität entfaltet, die im gleichen Stärke-/Potenzbereich liegt, wie das bakterielle Bt2-Genprodukt.
13. Insektizide Aktivität, entfaltet von Blättern von transformierten Tabakpflanzen
Verfahren
Um die insektizide Aktivität exprimiert in Blättern von transformierten Tabakpflanzen zu bewerten, wurden die Wachstumsrate und die Mortalität von Manduca sexta Larven, die mit diesen Blättern gefüttert wurden, aufgezeichnet und mit der Wachstumsrate von Larven verglichen, die mit nichttransformierten SR-1 gefüttert wurden. Das folgende Verfahren wurde angewandt:
Verfahren I:
Die nachfolgenden Versuchen wurden mit Blattscheiben angeordneten Petrischalen durchgeführt. Vier Blattscheiben vom Durchmesser 4 cm wurden ausgestanzt, auf feuchtes Filterpapier in eine Petrischale gegeben zusammen mit 4 × 10 Larven der ersten Entwicklungsstufe von M. sexta. Vorzugsweise wurden junge Blätter vom oberen Teil der Pflanze verwendet. Vierundzwanzig Stunden später wurde eine zweite Scheibe zugegeben. Zwischen 48 h und 100 h nach Versuchsbeginn wurde die Anzahl der schlüpfenden Insekten in regelmäßigen Zeitintervallen gezählt. Hieraus konnten wir die MT₅₀-Zeit berechnen, zu der 50% der Larven sich gehäutet hatten. Das ganze Experiment wurde in einer Wachstumskammer bei 26°C und 90% relativer Feuchtigkeit unter einer Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit durchgeführt.
Um in diesem Versuch die Konzentrationen abzuschätzen die benötigt werden, tun eine spürbare Wirkung auf Wachstumsrate und Lebensfähigkeit von Manduca sexta-Larven zu haben, mußte eine Reihe von Rekonstruktionsexperimenten eingeschlossen werden. Hierzu wurde gereinigtes, in Lösung gebrachtes Bt2-Protein (Abschnitt 5.1) reihenverdünnt in PBS, das 0,5% Triton X-100 enthielt. Standardvolumina von Bt2-Lösung wurden mechanisch (um einen sehr homogenen Überzug zu erzielen) auf Tabakblattscheiben versprüht. Zehn L1 (erste Entwicklungsstufe) Larven wurden auf jede Blattscheibe gesetzt und 3 Scheiben wurden je Bt2-Konzentration verwendet. Wachstumsrate und Mortalität der Larven wurden über eine 100 h Zeitspanne verfolgt.
Verfahren 2
Ein im wesentlichen gleiches Verfahren wie oben wurde angewandt. Diese experimentelle Vorgehensweise war jedoch etwas ausführlicher, um wirksamer zu sein beim zuverlässigen Nachweis sehr geringer Effekte auf die Wachstumsrate der Larven. Das Verfahrensschema unterschied sich von dem Vorangegangenen in folgenden Punkten:

– es wurde dafür gesorgt, daß alle Pflanzen sich genau in dem gleichen Stadium und dem gleichen Zustand befanden, so daß die Wirkungen auf Larvenwachstum, verursacht durch Unterschiede im Zustand des Blattgewebes, minimal sein würden.
– Larvenwachstum wurde bis zum L₃-Stadium verfolgt (anders als in den vorangegangenen Versuchen, wo das Wachstum nur bis zu L₂ überwacht worden war).
– Es wurde nicht nur die Häufungszeit der Larven aufgezeichnet, sondern auch das Larvengewicht im Endstadium gemessen.

Die in diesem Schema verwendeten Pflanzen wurden im Gewächshaus gezogen, bis sie eine Höhe von 60–80 an erreichten, aber noch nicht blühten. Blattscheiben wurden ausgeschnitten, auf feuchtes Filterpapier in Petrischalen gegeben, und jede Scheibe wurde mit 10 Larven der ersten Entwicklungsstufe besetzt. Je Pflanze wurden fünf Gruppen von 10 Larven verwendet (5 Blattscheiben).
Wachstumsrate und Mortalität wurden über eine Zeitspanne von 7 Tagen verfolgt (zu dieser Zeit waren fast 100% der Kontrollen im L₃-Stadium).
Beispiel 13.1 (Vergleich)
Pflanzen transformiert mit pDH1050, 1060, 1076 und 1080 wurden im Insektentest entsprechend Verfahren 1 gescreent. Es konnte keine signifikante Wirkung auf Wachstumsrate und Lebensfähigkeit der Larven unter Anwendung dieses Verfahrens aufgezeichnet werden. Die Ergebnisse eines Rekonstruktionsexperimentes mit gereinigten bakteriellen Bt2-Protein lauteten wie folgt:
Wuchshemmung, aber keine Mortalität, wurde bei 25 ng/g und etwa 50% Mortalität wurde bei 50 ng/g beobachtet.
Beispiel 13.2 (Vergleich)
Ein extensiver Toxizitätstest unter Anwendung des Verfahrens 2 wurde mit einer Anzahl transformierter Pflanzen durchgeführt, die zuvor als Bt+ in Immunoassays durchgemustert worden waren. Diese Pflanzen waren
161-9 (Pnos-Ht2, nos+) (pHD1050 Beispiel 1 Abschnitt 10)
147 (Pnos-Ht2, nos+) (pHD1050 Beispiel 1 Abschnitt 10)
174 (Pssu-Tp-Bt2, Km+, nos+) pHD1080 Beispiel 4 Abschnitt 10)
Als Kontrollen wurde eine Bt^–-Pflanze (161-6) und eine nicht transformierte SR-1 verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefaßt.

A) Die Anzahl Larven, die sich noch im L₂-Stadium befanden oder bereits in das L₃-Stadium übergegangen oder gestorben waren, 150 Stunden nach Versuchsbeginn. Der L₂–L₃-Übergang ist deutlich etwas früher bei den Larvengruppen, die mit SR-1 und 161-6 gefüttert wurden als bei den Larven, die mit den Bt⁺-Pflanzen 161-9, 147 und 174 gefüttert wurden. In keiner dieser Gruppen wurde eine signifikante Mortalität notiert (10% oder weniger wird als Hintergrund angesehen).
B) Das mittlere Larvengewicht am Ende des Versuchs wird in der oberen Zeile angegeben (Larven in 5er Gruppen von 10, Abweichung berechnet ausgehend von den Mittelwerten dieser Gruppen).

Unten sind die Gewichtswerte angegeben, die für die 5 größten Larven aus jeder Gruppe à 10 berechnet wurden. Diese Ergebnisse sind kompatibel mit der Kinetik des L3–L4-Übergangss Die Kontroll-Larven sind etwas größer/dicker als Larven, die auf Bt⁺-Pflanzen fraßen.
Beispiel 13.3
Insektentoxizitätsversuche wurden mit Blättern von Pflanzen durchgeführt, die aus den Transformationsverfahren mit pGS1110 (Abschnitt 10, Beispiel 10.5) erhalten worden waren. Die Pflanzen waren 10–20 an (hoch) und die Versuche wurden entsprechend Verfahren 1 durchgeführt. Der L1–L2-Übergang wurde überwacht und 2 Gruppen à 10 Larven wurden je Pflanze eingesetzt. Es wurde ein signifikanter Wuchshmmung-Effekt beobachtet, den einige der Pflanzen gegenüber M. sexta Larven entfalteten. Die Daten bezüglich des L1–L2 Verhältnisses nach etwa dreitägiger Fütterung sind in Tabelle 13 zusammengefaßt. Die in diesen Versuchen verwendeten Kontrollpflanzen waren mit Vektoren, die nur Pnos-NPTII enthielten, transformiert worden. In Versuch 1 produzierten 3 Pflanzen von 8 Pflanzen, die vermeintlich (putatively) mit pGS1110 transformiert worden waren, Wuchshemmung (N20-38, N20-22, N20-18), verglichen mit den 3 Kontrollpflanzen (C1, C2, C3). In Versuch 2 produzierte eine Pflanze (N20-37) von 6 Pflanzen Wuchshemmung im Vergleich mit den 4 Kontrollpflanzen (C4, C5, C6, C7). Die Unterschiede in der Wachs tumsrate sind ersichtlich, wenn die vollständigen Wachstumsrate-Kurven verglichen werden (siehe 38 und 39).
Die gleichen Pflanzen wurden auch bezüglich der Anwesenheit von Nopalin und der Resistenz gegen Kanamycin gescreent, um zu bestimmen, ob sie echte Transformanten waren. Das Ergebnis der Screeningdaten für diese Pflanzen, die in den vorliegenden Insektenversuchen verwendet wurden, sind in Tabelle 14 zusammengefaßt. Alle vier Pflanzen, die eine Wirkung auf das Larvenwachstum zeigten, befinden sich unter den positiven Transformanten, da sie Kanamycin-resistent (Km^R) und Nopalin-positiv (nos+) sind.
Beispiel 13.4
Insektentoxizitätsversuche wurden mit Blättern von Pflanzen ausgeführt, die durch Transformation mit pGS1151 erzeugt worden waren (Abschnitt 10, Beispiel 10.7). Die Pflanzen waren 15–30 an hoch zum Zeitpunkt des Versuchsbeginnes und waren unter Gewächshausbedingungen gezüchtet worden.
Zwei unabhängige Versuche werden nachstehend beschrieben: Einige der im ersten Versuch getesteten Pflanzen wurden im Versuch II erneut getestet, um die beobachteten Toxizitätswirkungen zu bestätigen.
Versuch I:
Der Versuch wurde wie in Verfahren 2 (dieser Abschnitt) beschrieben ausgeführt mit der Abwandlung, daß nur zwei Gruppen à 10 Larven je Pflanze verwendet wurden (frisch geschlüpfte Manduca sexta Larven).
Wachstumsrate und Mortalität der Larven wurden über einen Zeitraum von 7 Tagen verfolgt und am Ende dieser Zeitspanne wurde das Larvengewicht bestimmt. Detaillierte Ergebnisse aus Versuch I sind in Tabelle 15 wiedergegeben und zeigen an, daß Larven transformiert mit pGS1151 Phasen signifikante Wuchshemmung im Anfangsstadium des Versuches zeigten, verglichen mit Larven, die auf einer Kontrollpflanze fraßen. Beispielsweise waren nach 71 Stunden 60% der Larven, die auf Kontrollpflanze N21-107 fraßen, in das L2-Stadium übergegangen, während die Anzahl an L2-Larven auf den Pflanzen N21-18, 43, 53, 50 und 11 nur 15% oder weniger beträgt. Wenn über eine längere Zeitspanne verfolgt, wurde signifikante Mortalität bei den Larven aufgezeichnet, die auf pGS1151 transformierten Pflanzen fraßen. Auf einer dieser Pflanzen (N21-11) erreichte die Mortalität nach weniger als 7 Tagen 100%. Die Mortalität auf der Kontrollpflanze erreichte nur 15% am Tag 7 und 45% der Larven hatten bereits das L3-Stadium erreicht (dies im Gegensatz zu anderen Pflanzen, die im wesentlichen keine L3-Larven am Tag 7 hatten).
Versuch II
Ergebnisse eines zweiten Insektentests (II) mit neu geschlüpften M. sexta Larven wurde mit einigen der Pflanzen, die auch in Versuch I verwendet worden waren, entsprechend Verfahren 1 erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 wiedergegeben. Eins hohe Mortalitätsrate wurde bei den Pflanzen notiert, die mit pGS1151 transformiert worden waren (75–100% tot), während fast alle Larven, die auf den Kontrollpflanzen N21-102, 104 und 107 fraßen, noch nach 4 Tagen lebensfähig waren. Eine vollständige Liste aller Pflanzen, die für die Insektentests I und II verwendet wurden, ist in Tabelle 17 gegeben. Ebenfalls angegeben sind die Km-Resistenzgrade, die für die mit pGS1151 transformierten Pflanzen bestimmt worden waren; die prozentuale Mortalität der auf/mit diesen Pflanzen gefütterten Larven nach mehreren Tagen; und das durchschnittlictie Gewicht der Larven, die nach 7 Tagen in Versuch I überlebten.
Zusammenfassung:
Tabakpflanzen, transformiert mit pGS1151 und selektiert bezüglicher hoher Km-Resistenz, bewirken deutlich schwere toxische Effekte gegenüber Larven, die sich von diesen Pflanzen ernähren. Die hier beobachteten Effekte bei Insektenlarven sind die gleichen, wie die vom B.t.-Toxin bakteriellen Ursprungs hervorgerufenen (siehe Abschnitt 5.2, Tabellen 2 und 3); d.h. Wuchshemmung im Anfangsstadium (Verzögerung des Übergangs von einer Entwicklungsstufe zur nächsten) gefolgt vom Tod.
Aus Tabelle 17 ist ersichtlich, daß die Pflanzen, die die höchsten Km-Resistenzgrade entfalten (500 μg/ml Km) auch die höchsten Mortalitätsraten bewirken. Auf diese Weise waren wir unter Verwendung der Fusionproteinkon struktion in der Lage, bezüglich effizienter Expression von Toxizität zu Selektieren durch Selektion bezüglich Km-Resistenz.
Es sei darauf hingewiesen, daß die Verwendung eines Fusionsproteins, wie hier beschrieben, einen besonderen Vorteil darstellen kann, nicht nur weil direkte Selektion für Transformanten von Interesse durchgeführt werden kann, sondern auch weil das Fusionsprotein selbst einige ihm innewohnenden brauchbaren Eigenschaften besitzen kann. Beispielsweise können Bt2:NPTII Fusionsproteine in Pflanzenzellen stabiler sein als intaktes Bt2-Protein und/oder die von den Fusionsgenen abgeleitete Boten-RNA kann stabiler sein als RNA von intaktem Bt2.
14. Stabile Vererbung von neuem Phänotyp, erworben durch Transformation (Vergleich)
Eine wesentliche Fraktion der Pflanzen, transformiert mit den hier beschriebenen Transformationsvektoren, wird, stabil in ihr Genom insertiert, ein Fragment von neu erworbener DNA enthalten, das/die sowohl ein chimäres Bt-Toxin-Gen als auch ein Marker-Gen (nos, NPTII) enthält. Dies wurde durch die Ergebnisse von Southern Blotting-Experimenten bestätigt. Die neuen phänotypischen Eigenschaften, die durch diese Transformationsmethode erworben wurden (Expression von Bt-Toxin, antibiotische Resistenz, Nopalinproduktion) wurden entsprechend der klassischen Mendel-Genetik vererbt werden. Um die stabile/beständige Vererbung der neuen Eigenschaften zu verifizieren, wurden F₁-Abkömmlinge von transformierten Pflanzen bezüglich der Expression von Bt-Toxin und der Synthese von Nopalin analysiert.
Man ließ transformierte Tabakpflanzen blühen und Samen entwickeln. Es wurde dafür gesorgt, daß keine Kreuzbestäubung stattfand. Aus 4 Pflanzen, die zuvor als Bt⁺ (161-9, 10^–1, 147^–8, 174) identifiziert worden waren, ließ man Samen in Agarmedium keimen und F₁-Pflanzen wurden bezüglich der Anwesenheit von Nopalin (Nopalinsynthase ist als Marker-Gen in den Elternpflanzen vorhanden) analysiert. Die Pflanzen wurden 3 Wochen nach Keimen (etwa 1 cm hoch) oder später nach 6 bis 7 Wochen (2–4 cm) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 wiedergegeben.
Von den Pflanzen 10-1 und 147-8 waren etwa 3/4 der F₁ (Pflanzen) nos⁺ wie aus der Mendelschen Vererbung eines einzelnen Locus zu erwarten (1:2:1) war.
Für F₁-Pflanzen von 161-9 war das Nopalinsignal sehr schwach, wenn die Pflänzchen etwa 3 Wochen nach dem Keimen getestet wurden. Wegen dieser schwachen Expression waren die Nopalinsignale nicht deutlich sichtbar und daher wurde die Anzahl von Positiven in diesem Stadium möglicherweise unterschätzt. Jedoch wurde in der 7. Woche ein deutlich positives Signal bei 3/4 der Pflanzen nachgewiesen. Der Grund für die niedrige/geringe Expression im frühen Stadium/Alter dieser Pflanzen ist nicht bekannt.
In der F₁-Generation von Pflanze 174 erwiesen sich von 45 analysierten Pflanzen 43 als nos⁺. Dieser hohe Prozentsatz (95%) von nos⁺ zeigt an, daß das nos⁺ Gen in das Genom an mehr als einem unabhängigen Lotus insertiert ist. F₁-Pflanzen wurden auch bezüglich der Expression von Bt2-Toxin unter Anwendung von ELISA analysiert. Die Daten der ELISA-Teste mit Blattgewebe zeigten an, daß Bt2⁺ Phänotyp mit nos⁺ korreliert war. Daher wird die Bt2⁺-Eigenschaft stabil/dauerhaft vererbt.
Mikroorganismus-Hinterlegung: Kulturen von Zellen, die Zwischen-Klonierungsvektoren und Hybridplasmid-Vektoren enthalten, wurden am 10. Dezember 1984 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Grisbachstrasse 8, D-3400 Göttingen, BRD, hinterlegt (abgesandt dorthin am 5. Dezember 1984) und erhielten die folgenden Hinterlegungsnummern:
Kulturen von B.t.-Berliner 1715 wurden bei der gleichen Stelle hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer DSM 3131. Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR-1 wurde bei Agriculture, National Seed Storage Laboratory, Colorado State University, Ft. Collins, Colorado 80523 hinterlegt und erhielt die Serien-/Hinterlegungsnummer 191197 und ist auf Anforderung frei erhältlich.
Kulturen von Zellen, die Zwischen-Klonierungsvektoren und Hybridplasmid Vektoren enthalten, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 24. Dezember 1985 hinterlegt und erhielten folgende Hinterlegungsnummern:
Ihre Lebensfähigkeit wurde geprüft und am 27. Dezember 1985 bestätigt. Kulturen von E. coli K514 sind im Handel erhältlich. Tabelle 1 Toxizität (gegenüber P. brassicae Larven) von Bt2 und B.t. Kristallproteinen

TABELLE 4 Toxizität von Bt:NPT2 Fusionsprotein bei P. brassicae der 3. Entwicklungsstufe ( Mortalität nach 4 Tagen)
TABELLE 5 Toxizität von intaktem Bt2 Protein, 60 Kd "Processed" Bt2 Protein (mit Trypsin abgebaut) und Bt:NPT2 Fusionsprotein bei Larven von Manduca sexta % Mortalität nach 4 Tagen
Larvengewicht nach 4 Tagen (mg/Larve)
Toxinverdünnungen wurden auf Kunstnahrung, wie in Abschnitt 12 beschrieben, aufgebracht. 30 Larven der ersten Entwicklungsstufe wurden je Verdünnung verwendet. TABELLE 6 Toxizität von Bt:NPTII Fusionsproteinen oder Bt2 Deletionen bei P, brassicae Larven der 3. Entwicklungsstufe (% Mortalität nach 4 Tagen)
TABELLE 7 Zusammenfassung von manipulierten Ti Plasmiden und ihren Zwischen-Vektoren
TABELLE 8 Ergebnisse der Immunoassays mit gesammelten Kallus-Extrakten
TABELLE 9 Konzentrationen an Bt2 Protein nachgewiesen in Blättern von 5 immunopositiven Pflanzen, transformiert mit pHD1050
TABELLE 10 Immunoassays mit Extrakten von Kalli abgeleitet von Blättern von transformiertem Tabak
TABELLE 11 Toxizität von Kallusextrakt für Manduca sexta Larven
TABELLE 12 Wachstumsrate und Mortalität von Manduca sexta Larven auf transformierten Tabakblättern

TABELLE 14 Charakteristika von Pflanzen aus Versuch Nr. 20
TABELLE 15
Wachstumsrate und Mortalität von Manduca sexta Larven auf Tabakblättern transformiert mit pGS1151 (Versuch I)
Dargestellt sind:
Die Zahl der Larven in einem bestimmten Stadium (L1, L2 oder L3) oder tot (D) von Gruppen zu 20 Larven nach einer Zeitspanne Füttern auf/mit den Tabakblättern.
TABELLE 15 (Fortsetzung)
TABELLE 17
Prozentuale Mortalität und mittleres Gewicht von Manduca sexta Larven nach einer bestimmten Zeitspanne Füttern auf/mit Tabakblättern von Pflanzen transformiert mit pGS1151. Es sind die vollständigen Ergebnisse der beiden unabhängigen Versuche I und II (Tabellen 15 und 16) zusammengestellt. Kanamycinresistenzgrade der Pflanzen, die das Bt:NPT2 Fusionsprotein exprimieren, sind auch angegeben (μg/ml Km bei dem noch Kalluswachstum stattfindet).
TABELLE 17 (Fortsetzung)
TABELLE 18 Häufigkeit von Nopalin-positiven Pflanzen in der F Generation abgeleitet von transformierten Tabakpflanzen

Claims

Ein chimäres Gen, das eine Promotorregion, abgeleitet von einem Gen, das auf natürlicher Weise in einer Pflanzenzelle exprimiert ist wie z. B. Pnos, PTR2, Pssu pea, Pssu 301, oder P35; und eine 3' nicht-translatierte Region, einschließlich einer Polyadenylierungsstelle, eines Gens, das auf natürlicher Weise in einer Pflanzenzelle exprimiert ist wie z. B. 3'ocs, 3't7, 3'nos oder 3'SSu301, und eine Kodierungssequenz, die nur einen Teil des Bt2-Proteins von 13 kodiert, wobei der Proteinteil sich von der Nukleotidposition 141 bis zu einer Nukleotidposition zwischen den Nukleotidpositionen 1961 und 2314 in 13 erstreckt, umfasst.