JP5770783B2 - 抗体組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、種々の疾患に有用な抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合タンパク質などの抗体分子の製造に用いる細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、該抗体組成物、およびその用途に関する。
抗体は、高い結合活性、結合特異性及び血中での高い安定性を有することから、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療への応用が試みられてきた（非特許文献１）。
また、遺伝子組換え技術を利用して、ヒト以外の動物の抗体からヒト型キメラ抗体或いはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体の様なヒト化抗体を作製することが試みられている。
ヒト型キメラ抗体とは、抗体可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体である。ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト抗体のＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＣＤＲと置換した抗体である。
哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている（非特許文献１）。
ヒトＩｇＧクラスの抗体は、更にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類のサブクラスに分類されている。ＩｇＧクラスの抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）については、これまでに多数の研究が行われ、ヒトＩｇＧクラスでは、ＩｇＧ１サブクラスの抗体が最も高いＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有していることが報告されている（非特許文献２）。
以上の観点から、市販のリツキサン、ハーセプチンを始めとして、その効果発現に高いエフェクター機能を必要とする抗腫瘍ヒト化抗体の殆どはヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。
ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の発現には、抗体Ｆｃ領域と、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在する抗体レセプター（以下、ＦｃγＲと表記する）及び各種補体成分との結合が必要であり、その結合については、抗体のヒンジ領域及びＣ領域の第２番目のドメイン（以下、Ｃγ２ドメインと表記する）内のいくつかのアミノ酸残基の重要性（非特許文献２および３）の他、Ｃγ２ドメインに結合している糖鎖の重要性（非特許文献２）が示唆されている。
糖鎖に関しては、ボイド（Ｂｏｙｄ）らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）或いはマウスミエローマＮＳ０細胞（ＮＳ０細胞）で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）を各種糖分解酵素で処理し、糖鎖のＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性に対する影響を検討した結果、非還元末端のシアル酸の除去は、両活性に影響を与えないが、更にガラクトース残基を除去することでＣＤＣ活性のみが影響を受け、約５０％程度活性が低下すること、糖鎖の完全な除去は、両活性を消失させることを報告した（非特許文献４）。また、ライフリー（Ｌｉｆｅｌｙ）らは、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞或いはラットミエローマＹ０細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）の糖鎖の分析及びＡＤＣＣ活性を測定した結果、Ｙ０細胞由来のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈが最も高いＡＤＣＣ活性を示し、その活性にはバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃとも表記する）が重要であることを示唆した（非特許文献５、特許文献１）。
これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしており、糖鎖の構造を変えることでより高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能であることを示している。しかし、実際には糖鎖の構造は多様かつ複雑であり、エフェクター機能に真に重要な構造を特定できたとは言い難い。
糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］、いずれの場合も以下の構造式（Ｉ）に示す基本となる共通のコア構造を有することが知られている。
Figure 0005770783
アスパラギンと結合する糖鎖の末端が還元末端、反対側が非還元末端と呼ばれている。Ｎ−グリコシド結合糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあることが知られている。
抗体ＩｇＧ分子のＦｃ領域には、２個所のＮ−グリコシド型の糖鎖結合部位が存在しており、血清中のＩｇＧでは、通常、この部位に、シアル酸やバイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンの付加の程度が少ない複数本の枝を持つコンプレックス型糖鎖が結合している。このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクトースの付加および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性があることが知られている（非特許文献６）。
このような糖鎖の構造は、糖鎖遺伝子、すなわち、糖鎖を合成する糖転移酵素と糖鎖を分解する糖分解酵素の遺伝子によって規定されていると考えられている。
以下に、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成に関して述べる。
糖タンパク質は、小胞体（以下、ＥＲと表記する）内腔で糖鎖の修飾を受ける。Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成過程では、比較的大きな糖鎖が、ＥＲ内腔で伸長しつつあるポリペプチド鎖に転移される。
この際、糖鎖はまず、ドリコールリン酸（以下、Ｐ−Ｄｏｌとも表記する）と呼ばれるα−イソプレン単位を２０個程度含む長鎖の脂質担体のリン酸基に順次付加される。すなわち、ドリコールリン酸にＮ−アセチル−グルコサミンが転移されＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなり、続いてもう１個ＧｌｃＮＡｃが転移されＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなる。
次いで、マンノース（以下、Ｍａｎとも表記する）が５個転移され（Ｍａｎ）５−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌに、さらに、Ｍａｎが４個、グルコース（以下、Ｇｌｃとも表記する）が３個転移される。このようにして、コアオリゴ糖と呼ばれる糖鎖の前駆体（Ｇｌｃ）３−（Ｍａｎ）９−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌができる。
この１４個の糖からなる糖鎖の前駆体はアスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン配列を持ったポリペプチドへＥＲ内腔でひとかたまりのまま転移される。この際、コアオリゴ糖に結合していたドリコールピロリン酸（Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌ）は遊離するが、ピロホスファターゼの分解を受けて再びドリコールリン酸となり再利用される。
糖鎖のトリミングは、糖鎖がポリペプチドに結合すると直ちに開始される。
すなわち、３個のＧｌｃと１ないし２個のＭａｎがＥＲ上で除去され、この除去にはα−１，２−グルコシダーゼＩ、α−１，３−グルコシダーゼＩＩおよびα−１，２−マンノシダーゼが関与することが知られている。
ＥＲ上でトリミングを受けた糖タンパク質はゴルジ体へ輸送され様々な修飾を受ける。
ゴルジ体シス部には、マンノースリン酸を付加するＮ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン１−ホスホジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびα−マンノシダーゼＩが存在し、Ｍａｎ残基を５個にまで減少させる。ゴルジ体メディア部には、コンプレックス型のＮ−グリコシド結合糖鎖の最初の外側のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）、２個のＭａｎを除去するα−マンノシダーゼＩＩ、外側から２個目のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するα−１，６−フコシルトランスフェラーゼが存在する。ゴルジ体トランス部にはガラクトースを付加するガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルノイラミン酸などのシアル酸を付加するシアル酸転移酵素が存在する。このような各種酵素の作用を受けてＮ−グリコシド結合糖鎖が作られることが知られている。
一般的に、医薬への応用が考えられているヒト化抗体の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞を宿主細胞として用い製造されているが、上述したように、抗体のエフェクター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、宿主細胞によって発現された糖タンパク質の糖鎖構造に違いが観察されることから、より高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望まれている。
生産される糖タンパク質の糖鎖構造を改変するために、１）糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤の応用、２）突然変異体の選択、３）糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の導入などの方法が試みられている。
以下に、それら具体的例を述べる。
糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の前駆体であるコアオリゴ糖形成の最初のステップであるＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌの形成を選択的に阻害するツニカマイシン、グリコシダーゼＩの阻害剤であるカスタノスペルミンやＮ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、グルコシダーゼＩＩの阻害剤であるブロモコンヅリトール、マンノシダーゼＩの阻害剤である１−デオキシノジリマイシンや１，４−ジオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール、マンノシダーゼＩＩの阻害剤であるスワンソニンなどが知られている。
糖転移酵素の特異的な阻害剤としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）などに対する基質のデオキシ誘導体が知られている［グライコバイオロジーシリーズ２―糖鎖の細胞における運命（講談社サンエンティフィック）永井克孝・箱守仙一朗・木幡陽編（１９９３）］。
また、１−デオキシノジリマイシンはコンプレックス型糖鎖の合成を抑え、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖の割合を増加させることが知られている。実際に、これら阻害剤を培地に添加することでＩｇＧの糖鎖構造が変化し、抗原結合性などが変化することが報告されている（非特許文献７）。
糖鎖の修飾に係わる酵素の活性に関する突然変異体は、主に、レクチン耐性株として選択され取得されている。例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ ｌｅｃｔｉｎ）などのレクチンを用い、様々な糖鎖構造を有するＣＨＯ細胞変異株がレクチン耐性株として取得されている（非特許文献８）。
糖鎖の修飾に係わる酵素の遺伝子を宿主細胞に導入して生産物の糖鎖構造を改変した例としては、ラットのβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加されたタンパク質の製造が可能であることが報告されている（非特許文献９）。
また、ヒトのβ−ガラクトシド−２−α−フコシルトランスフェラーゼをマウスＬ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−）の発現が確認されている（非特許文献１０）。
さらに、ユマナ（Ｕｍａｎａ）らは、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加が抗体のＡＤＣＣ活性に重要であるとの知見に基づき、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を発現させたＣＨＯ細胞を作製し親株との比較を行っている。
親株のＣＨＯ細胞ではＧｎＴＩＩＩの発現が観察されておらず（非特許文献１１）、作製したＧｎＴＩＩＩ発現ＣＨＯ細胞を用いて発現させた抗体は親株で発現させた抗体と比べ１６倍高いＡＤＣＣ活性を有していることを確認している（非特許文献５、特許文献１）。
またこの際、ユマナ（Ｕｍａｎａ）らは、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の遺伝子を導入したＣＨＯ細胞も作製しており、ＧｎＴＩＩＩまたはＧｎＴＶの過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すことを報告している。
国際公開第９９／５４３４２号
モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２．１（１９９５） ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７） ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），２３，１０９８（１９９３）、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），８６，３１９（１９９５） モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３２，１３１１（１９９５） グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５） バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６，１３０，１９９７ モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），２６，１１１３（１９８９） ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６） ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８，１９８９ サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８，１９９１ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３３７０，１９８４
このように、生産される糖タンパク質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、実際には糖鎖の構造は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。
特に、抗体のエフェクター機能は糖鎖構造により大きな影響を受ける事が明らかになりつつあるが、真に重要な糖鎖構造の特定には至っていない。従って、抗体のエフェクター機能に影響を及ぼす糖鎖構造の同定と、そのような糖鎖構造の付加が可能な宿主細胞の開発が医薬開発の上で求められている。
本発明は、抗体分子の糖鎖構造を制御することが可能な、抗体組成物を生産する宿主細胞、ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物を生産することが可能な細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、該製造方法で製造された抗体組成物を提供することを目的とする。
本発明の要旨は、以下に関する。
１．Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖が結合し、且つヒトインターロイキン５レセプターα鎖を認識する抗体を含有する抗体組成物であって、全ての該抗体が還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖を有する抗体である抗体組成物。
２．糖鎖が、
Figure 0005770783
 を含む糖鎖を含有する前項１に記載の抗体組成物。
３．糖鎖が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した細胞が合成する糖鎖を含有する前項１または２に記載の抗体組成物。
４．α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した細胞を用いることを特徴とする前項１または２に記載の抗体組成物の製造方法。
５．前項１〜３のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患の診断薬。
６．前項１〜３のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患の治療薬。
７．前項１〜３のいずれか１項に記載の抗体組成物を有効成分として含有する、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患の予防薬。
本発明によれば、抗体組成物を生産することが可能な細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、抗体組成物、ならびにその用途を提供することができる。
第１図は、精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。１Ａ図が非還元条件、１Ｂ図が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーン１が高分子量マーカー、２がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、３がＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体、４がＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、５がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）、６がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）、７が低分子量マーカーの泳動パターンをそれぞれ示す。 第２図は、精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、●がＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体、□がＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、■がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）、△がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）の活性をそれぞれ示す。 第３図は、精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、●がＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体、□がＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、■がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）、△がＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）の活性をそれぞれ示す。 第４図は、精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。４Ａ図が非還元条件、４Ｂ図が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーン１が高分子量マーカー、２がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、３がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、４がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、５が低分子量マーカーの泳動パターンをそれぞれ示す。 第５図は、精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定した結果を示した図である。縦軸はｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、●がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、□がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の活性をそれぞれ示す。 第６図は、精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒ発現マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、●がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、□がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の活性をそれぞれ示す。 第７図は、精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のカニクイザルのｈＩＬ−５誘発好酸球増加モデルに対する抑制作用を示した図である。縦軸に末梢血中好酸球数、横軸に日数（抗体及びｈＩＬ−５の投与開始日を０日とした）をそれぞれ示す。１０１、１０２が抗体非投与群、３０１、３０２、３０３がＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体投与群、４０１、４０２、４０３がＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体投与群、５０１、５０２、５０３がＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体投与群の結果をそれぞれ示す。 第８図は、ＹＢ２／０が生産した精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体（８Ａ図）およびＮＳ０が生産した精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体（８Ｂ図）のＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣ溶離の溶離図（左図）とそのＰＡ化糖鎖をα−Ｌ−フコシダーゼ処理した後に逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図（右図）を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第９図は、ＣＨＯ／ｄ細胞が生産した精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体からＰＡ化糖鎖を調製し、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第１０図で、１０Ａ図は、非吸着画分、吸着画分の一部のＧＤ３との結合活性を、抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●が非吸着画分、○が吸着画分の一部をそれぞれ示す。１０Ｂ図は非吸着画分、吸着画分の一部のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。●が非吸着画分、○が吸着画分の一部をそれぞれ示す。 第１１図は、非吸着画分、吸着画分の一部から調製したＰＡ化糖鎖を逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示した図である。１１Ａ図に非吸着画分の溶離図、１１Ｂ図に吸着画分の一部の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第１２図は、６種類の抗ＧＤ３キメラ抗体（１２Ａ図〜１２Ｆ図）から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第１３図は、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が異なる６種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３に対する結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●が抗ＧＤ３キメラ抗体（５０％）、□が抗ＧＤ３キメラ抗体（４５％）、■が抗ＧＤ３キメラ抗体（２９％）、△が抗ＧＤ３キメラ抗体（２４％）、▲が抗ＧＤ３キメラ抗体（１３％）、×が抗ＧＤ３キメラ抗体（７％）の活性をそれぞれ示す。 第１４図は、ドナーＡのエフェクター細胞を用いた、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が異なる６種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。●が抗ＧＤ３キメラ抗体（５０％）、□が抗ＧＤ３キメラ抗体（４５％）、■が抗ＧＤ３キメラ抗体（２９％）、△が抗ＧＤ３キメラ抗体（２４％）、▲が抗ＧＤ３キメラ抗体（１３％）、×が抗ＧＤ３キメラ抗体（７％）の活性をそれぞれ示す。 第１５図は、ドナーＢのエフェクター細胞を用いた、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が異なる６種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。●が抗ＧＤ３キメラ抗体（５０％）、□が抗ＧＤ３キメラ抗体（４５％）、■が抗ＧＤ３キメラ抗体（２９％）、△が抗ＧＤ３キメラ抗体（２４％）、▲が抗ＧＤ３キメラ抗体（１３％）、×が抗ＧＤ３キメラ抗体（７％）の活性をそれぞれ示す。 第１６図は、６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第１７図は、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が異なる６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４に対する結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＣＣＲ４との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）、□が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、▲が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、△が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、●が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、○が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）の活性をそれぞれ示す。 第１８図は、ドナーＡのエフェクター細胞を用いた、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）、□が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、▲が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、△が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、●が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、○が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）の活性をそれぞれ示す。 第１９図は、ドナーＢのエフェクター細胞を用いた、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）、□が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、▲が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、△が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、●が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、○が抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）の活性をそれぞれ示す。 第２０図は、プラスミドＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１の構築を示した図である。 第２１図は、プラスミドＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳの構築を示した図である。 第２２図は、プラスミドＣＨＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１の構築を示した図である。 第２３図は、プラスミドＣＨＡｃｄ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃｄ−ｐＢＳの構築を示した図である。 第２４図は、競合的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた各宿主細胞株におけるＦＵＴ８転写産物量の定量結果を示した図である。ラットＦＵＴ８配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合の各宿主細胞株におけるＦＵＴ８転写産物の量を示す。■がＣＨＯ細胞株、□がＹＢ２／０細胞株を宿主細胞として用いた結果をそれぞれ示す。 第２５図は、プラスミドｍｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１の構築を示した図である。 第２６図は、プラスミドｐＢＳｍｆＦＵＴ８の構築を示した図である。 第２７図は、プラスミドｐＡＧＥｍｆＦＵＴ８の構築を示した図である。 第２８図は、競合的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＦＵＴ８遺伝子過剰発現株の該遺伝子発現量解析結果を示した図である。縦軸にβ−アクチン転写量に対するＦＵＴ８転写量の相対値を示す。 第２９図は、ＦＵＴ８遺伝子過剰発現株より精製した抗ＧＤ３キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。 第３０図は、ｍｆＦＵＴ８−６、ｐＡＧＥ２４９導入株によって産生した抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。３０Ａ図にｍｆＦＵＴ８−６株によって産生した抗体から調製したＰＡ化糖鎖、３０Ｂ図にｐＡＧＥ２４９導入株によって産生した抗体から調製したＰＡ化糖鎖の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第３１図は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎから調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。 第３２図は、プラスミドＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１の構築を示した図である。 第３３図は、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏの構築を示した図である。 第３４図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１の構築を示した図である。 第３５図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２の構築を示した図である。 第３６図は、プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築を示した図である。 第３７図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築を示した図である。 第３８図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４の構築を示した図である。 第３９図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５の構築を示した図である。 第４０図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築を示した図である。 第４１図は、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ 遺伝子破壊ＣＨＯ細胞株である１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６−１株及び１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６株のゲノムサザン解析結果を示した図である。 第４２図は、ＦＵＴ８対立遺伝子破壊株より精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。▲、■はそれぞれ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体産生ＣＨＯ細胞５−０３株由来の精製抗体および１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６−１株由来の精製抗体の活性をそれぞれ示す。 第４３図は、レクチン耐性株が生産した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を示した図である。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□は５−０３株、■はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株、◆はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株、▲はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。 第４４図は、レクチン耐性株が生産した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を示したものである。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□はＹＢ２／０株（ＫＭ２７６０＃５８−３５−１６）、△は５−０３株、●はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。 第４５図は、精製した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。４５Ａ図は５−０３株が生産する抗体、４５Ｂ図はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産する抗体、４５Ｃ図はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産する抗体、および４５Ｄ図はＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体の分析結果を示す。 第４６図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第１の工程を示した図である。 第４７図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第２の工程を示した図である。 第４８図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第３の工程を示した図である。 第４９図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第４の工程を示した図である。 第５０図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第５の工程を示した図である。 第５１図は、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの発現ベクター構築（全６工程）の第６の工程を示した図である。 第５２図は、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＬＣＡレクチンに対する耐性度を示した図である。ＬＣＡレクチンを添加せずに培養した細胞群の生存率を１００％とし、２回測定を行った図である。図中２４９は、発現ベクターｐＡＧＥ２４９を導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＬＣＡレクチンに対する生存率を示す。ＧＭＤはＧＭＤ発現ベクターｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＬＣＡレクチンに対する耐性度を示す。 第５３図は、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株の細胞群が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。 第５４図は、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ ｃＤＮＡクローン２２−８の５’末端にクローン３４−２の５’末端を導入したプラスミドＣＨＯ−ＧＭＤの作製工程を示した図である。 第５５図は、ＧＭＤ遺伝子を発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
発明の実施の形態
本発明の抗体分子をコードする遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する、抗体分子をコードする遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞であればいかなるＣＨＯ細胞も包含される。
本発明において、抗体分子とは、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質などをあげることができる。
抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいう。抗体としては動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることによってヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することもできる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル又はウサギ等があげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスがＩｇＧのヒト抗体が好ましい。
抗体の断片とは、上記抗体のＦｃ領域を含んだ断片を意味する。抗体の断片としては、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域を含む融合タンパク質とは、抗体のＦｃ領域を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどのタンパク質とを融合させた物質を意味する。
本発明において、抗体分子のＦｃ領域に結合する糖鎖としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が挙げられ、そのＮ−グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端側にガラクトースーＮ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）をあげることができる。
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖がそれぞれ１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を有するいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。したがって、Ｆｃ領域に結合した糖鎖構造の観点から物質の同一性を判断することができる。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物（以下、本発明の抗体組成物と称する）とは、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する糖鎖から構成されていてもよい。
本発明において、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、該フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖を意味する。具体的には、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
本発明の抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、好ましくは２０％以上、より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３０％以上、特に好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上である抗体組成物は、高いＡＤＣＣ活性を有する。抗体濃度が低下すれば、それに伴ってＡＤＣＣ活性が低下するが、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上の場合、抗体濃度が低くても高いＡＤＣＣ活性を獲得することができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３―糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することによっても決定することができる。
本発明において、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞とは、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ；Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の卵巣組織から樹立された株化細胞であればいかなる細胞も包含される。その具体的な例としては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞をあげることができる。また、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社 Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を様々な培地に馴化させた亜株なども具体的な例としてあげることができる。
本発明において、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素とは、細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に係わる酵素とは、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素のことを意味する。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースは、ｄｅ ｎｏｖｏの合成経路あるいはＳａｌｖａｇｅ合成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素はすべて細胞内ＧＤＰ−フコースの合成に係わる酵素に包含される。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのｄｅ ｎｏｖｏの合成経路に関与する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ；以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＤＰ−ケト−デオキシマンノース ３，５−エピメラーゼ，４−リダクターゼ；以下、Ｆｘと表記する）などがあげられる。
細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのＳａｌｖａｇｅ合成経路に関与する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ；以下、ＧＦＰＰと表記する）、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅ（フコキナーゼ）などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明において、ＧＭＤとしては、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、（ａ）配列番号６５で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号６５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡまたは、（ｃ）配列番号７１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質（ｄ）配列番号７１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質（ｅ）配列番号７１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＭＤ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、ＧＭＤのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号６５で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６５で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＭＤ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、Ｆｘとしては、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、（ａ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡまたは、（ｃ）配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質（ｄ）配列番号７２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質（ｅ）配列番号７２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦｘ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、Ｆｘのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号４８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４８で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＦｘ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ＧＦＰＰとしては、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡがコードする蛋白質、（ａ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡまたは、（ｃ）配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質（ｄ）配列番号７３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質（ｅ）配列番号７３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＦＰＰ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、ＧＦＰＰのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号５１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号５１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＦＰＰ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素を意味する。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼやα−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
また、上述のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明において、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡがコードする蛋白質、（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡまたは、（ｅ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質（ｆ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質（ｇ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質（ｈ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質（ｉ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質（ｊ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質等があげられる。
また、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１または２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１または２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１、２、４８、５１または６５で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、２、４８、５１または６５で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号２３、２４、７１、７２または７３で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性、ＧＭＤ活性、Ｆｘ活性またはＧＦＰＰ活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号１、２、６５、４８または５１で表されるＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性、ＧＭＤ活性、Ｆｘ活性またはＧＦＰＰ活性を有するためには、それぞれ配列番号２３、２４、７１、７２または７３で表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する。
本発明のＣＨＯ細胞としては、上述の酵素活性が低下または欠失した細胞があげられる。
上述の酵素活性が低下または欠失した細胞としては、すなわち、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株より低下または欠失した細胞を包含する。このような細胞を取得する方法としては、目的とする酵素活性を低下または欠失させることができる手法であれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素活性を低下または欠失させる手法としては、（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあげられる。
ここで、レクチンに耐性である株は、ある一定濃度のレクチンを含む培地中で培養した場合に、親株に比べて統計的な有意差を伴って少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは５倍以上生存率に差が生じる性質を獲得する株を選択することで取得することができる。また、レクチンを含む培地中で培養した場合に、ある一定の生存率、例えば８０％の生存率、で培養可能なレクチンの濃度が、親株に比べ少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０倍以上の濃度となる株を選択することでも取得することができる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等をあげることができる。
本発明のＣＨＯ細胞は、上記の目的とする酵素活性を低下または欠失させる手法を施す前の親株であるＣＨＯ細胞が生産する抗体組成物より、ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物を生産することができる。
また、本発明のＣＨＯ細胞は、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％未満である抗体組成物よりもＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物を生産することができる。
本発明において親株としては、例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下していない細胞があげられる。具体的には、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を低下または欠失させるような処理を施していない細胞が用いられる。
本発明において、ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性を意味する［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
本発明は、また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合糖鎖修飾に関与する酵素の活性が、遺伝子工学的な手法により低下した細胞（以下、本発明の宿主細胞と略記する）に関する。本発明の宿主細胞は、ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物を生産するための宿主細胞として有用である。
本発明の宿主細胞としては、抗体分子を発現できる宿主細胞であればいかなる細胞も包含する。その例として、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられる。これらの細胞の具体的な例としては、後述の３．に記載のものがあげられる。特に、動物細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などが好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＤＯ法、ＲＮＡｉ法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９，（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７，（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３，（１９９５）、細胞工学，１３，２５５，（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法又はリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
本発明の宿主細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３―糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。
生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ＤＮＡの調製方法
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞、各種宿主細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて 細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のごとくヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２ ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社 ）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片ＤＮＡをプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することもできる。
取得した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４， ５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号４８、５１または６５に記載の塩基配列があげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１または２に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号６７または７０に記載の塩基配列があげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号３に記載の塩基配列があげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（ｂ）相同組換え法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する。
ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号６７または７０に記載の塩基配列があげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号３に記載の塩基配列があげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
（ｃ）ＲＤＯ方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ（ＲＮＡ−ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、導入した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述の１の（５）に記載の細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述の５または後述の６に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６，（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５，（１９９８）；へパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２，（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９，（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８，（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３，（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｄ）ＲＮＡｉ方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、 ＲＮＡｉ（ＲＮＡ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載されたＤＮＡの調製方法などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２，（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９，（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７，（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９，（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，７０，（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
これらの酵素は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、ＧＭＤを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
大腸菌由来のＧＭＤの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（１３３番目のトレオニン、１３５番目のグルタミン酸、１５７番目のチロシン、１６１番目のリシン）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，２， ２０００）。
すなわち、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。
一方、ＧＭＤの補酵素ＮＡＤＰや基質であるＧＤＰ−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、ＧＭＤの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。
大腸菌由来のＧＭＤの結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ（配列番号６５）では、１５５番目のトレオニン、１５７番目のグルタミン酸、１７９番目のチロシン、１８３番目のリシンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。
このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
本発明の宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。
（３）酵素についての突然変異を導入する手法
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
方法としては、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法をあげることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体をあげることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述の５または後述の６に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述の１の（５）に記載の方法があげられる。
（４）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明の宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘ、ＧＦＰＰ、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
（５）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
本発明の宿主細胞は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等をあげることができる。
具体的には、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地で１日〜２週間、好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによってことで、本発明のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
上記方法で得られる株としては、例えば、後述の実施例１４（２）で取得したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株Ｎｅｇａ−１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７５６）があげられる。
２．本発明の、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明の、抗体分子の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が制御されるようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に係る酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの１位にフコースの６位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的として、１．に記載の手法を用いて作製した本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、植物カルス細胞より、例えば以下のように作製することができる。
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
具体的には、染色体上の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作製する。
作製した該変異クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した本発明の受精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルス又は細胞に、１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位あるいは３位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した本発明のカルスを作製することができる。
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシン及びサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位あるいは３位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下したトランスジェニック植物を作製することができる。
３．抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子の全長ｃＤＮＡを調製し、該抗体分子をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を、遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、上記１の（１）の（ａ）に記載のＤＮＡの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマー等を用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１ プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９号公報；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５号公報］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９号公報）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５号公報］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４―遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、国際公開９４／００９７７号］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６号、日本特許第２５１７８１３号］等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３号公報、特開平０６−８２３０２１号公報等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２号公報）、卵等をあげることができる。
この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合タンパク質などをあげることができる。
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物の製造方法について記すが、他の抗体組成物を当該方法と同様にして取得することもできる。
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４， １７３（１９９０）］等があげられる。
動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。
合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］によりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。
設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（７）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）及び（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１号公報；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３ ，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、１．に記載本発明の宿主細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１号公報に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１号公報に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。
精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体組成物を製造することができる。
すでに宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、前記１．に記載した方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、本発明の抗体組成物を製造することができる。
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合活性あるいはエフェクター機能はを測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
５．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖タンパク質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
６．抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
抗体組成物は、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。本発明の抗体組成物は、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上であり、高いＡＤＣＣ活性を示す特徴を有している。このような抗体組成物は、上記５．に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ Ｂａｌｋ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ Ｈｙｂｒｉｄ Ｌｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）があげられる。
Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）をあげることができる。
７．本発明の抗体分子の利用
本発明の抗体組成物は高い抗体依存性細胞障害活性を有する。高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍は癌細胞が増殖する。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分であり、化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、本発明の抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもなる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それらの疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体を用いてウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３，３３１−３３６，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ３６，２６０−２６６，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４，１５１１−１５１６，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３−４９７，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７−３９５，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｏｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９−２９１１，２０００）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８抗体（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１−９９１５，１９８９）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３，１９９０）、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗ＰＳＭＡ抗体（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６−２４０１，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９，１９９７）、抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８−２１４６，２０００）などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ａｂｒａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１−３８１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ａｂｒａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２−５６７，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１−５０，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３−１９０，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ａｍｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７−２４５，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｐｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３−１３８１，１９９７）などがあげられる。循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｆｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｓｈｕｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００−１７４０４，１９９７）、抗血液凝固因子抗体（Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８−１１６４，２０００）などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｔｕｇａｒｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５−３９５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｋｏｏｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５−２０７６，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベロ毒素抗体（Ｋａｒｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６−３９９，１９９９）などがあげられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所（現：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社からも入手することができる。
本発明の抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１．抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体の作製
１．抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉＬＨＧＭ４の構築
抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＧＤ３キメラ抗体と表記する）のＬ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｗ Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約４．０３ｋｂの断片と動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＧ４１８耐性遺伝子及びスプライシングシグナルを含む約３．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換してプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を構築した。
次に、上記で構築したプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、更にＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約５．６８ｋｂの断片と抗ＧＤ３キメラ抗体のＨ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＧＭ４［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、更にＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＨ鎖ｃＤＮＡを含む約８．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換して抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を構築した。
２．抗ＧＤ３キメラ抗体の安定生産細胞の作製
上記実施例１の１項で構築した抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を各種細胞株に導入し、優良株を選択することで抗ＧＤ３キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の５μｇを４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２、Ｊ．Ｖ．Ｋｉｌｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３，５７６−５８２（１９８２）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。
５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＤＨＦＲの阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。
形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。尚、実施例９に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し用いた。
このようにして得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１は平成１１年４月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）（現・独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６））にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１として寄託されている。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）］へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳを１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを１０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地［透析牛胎児血清（以下、ｄＦＢＳと表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１０％含むＩＭＤＭ培地］に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、１０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。
増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭに上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを１００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。尚、実施例９に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し用いた。
（３）マウスミエローマＮＳ０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の５μｇを４×１０６細胞のマウスミエローマＮＳ０細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，１９９０］により導入後、４０ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３０２−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳを１０％、Ｌ−グルタミン（以下、Ｌ−Ｇｌｎと表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を２ｍＭ含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２−ｄＦＢＳ（１０）培地（ｄＦＢＳを１０％、Ｌ−Ｇｌｎを２ｍＭ含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地）に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。尚、実施例９に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し用いた。
３．抗体のＧＤ３に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体のＧＤ３に対する結合活性は以下のようにして測定した。
４ｎｍｏｌのＧＤ３を１０μｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ社製）と５μｇのコレステロール（ＳＩＧＭＡ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。該溶液の２０μｌ（４０ｐｍｏｌ／ウェルとなる）を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。
反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液（以下、同様）］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
４．抗ＧＤ３キメラ抗体の精製（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例１の２項（１）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをＢＳＡを０．２％、ＭＴＸを２００ｎＭ、トリヨードチロニン（以下、Ｔ３と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に３×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、２．０Ｌスピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて５０ｒｐｍの速度で攪拌培養した。３７℃の恒温室内で１０日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例１の２項（２）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをＬ−Ｇｌｎを３ｍＭ、脂肪酸濃縮液（以下、ＣＤＬＣと表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を０．５％、プルロニックＦ６８（以下、ＰＦ６８と表記する；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を０．３％の濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に１×１０６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＣＨＯ／ＤＧ４４−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。
（３）ＮＳ０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例１の２項（３）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをＬ−Ｇｌｎを２ｍＭ、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭ、ＦＢＳを１％の濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に１×１０６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）と名付けた。
また、該形質転換細胞クローンをＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＧＩＴ培地に３×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１０日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）と名付けた。
（４）ＳＰ２／０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
特開平５−３０４９８９号公報（ＥＰ５３３１９９）に記載の抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン（ＫＭ−８７１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５１２））をＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＧＩＴ培地に３×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で８日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＧＤ３キメラ抗体を精製した。精製した抗ＧＤ３キメラ抗体は、ＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体と名付けた。
５．精製した抗ＧＤ３キメラ抗体の解析
上記実施例１の４項で得られた各種動物細胞で生産、精製した５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０，１９７０］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量及び精製度を解析した。その結果を第１図に示した。第１図に示したように、精製した各抗ＧＤ３キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、各抗ＧＤ３キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
実施例２．抗ＧＤ３キメラ抗体の活性評価
１．抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
上記実施例１の４項で得られた５種類の精製抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３（雪印乳業社製）に対する結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。第２図は、添加する抗ＧＤ３キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第２図に示したように、５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体は、ほぼ同等のＧＤ３に対する結合活性を示した。この結果は抗体の抗原結合活性は、抗体を生産する動物細胞やその培養方法に関わらず、一定であることを示している。また、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）とＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）の比較から抗原結合活性は、培養に用いる培地にも依らず、一定であることが示唆された。
２．抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例１の４項で得られた５種類の精製抗ＧＤ３キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養したヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４２４）の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＧＤ３キメラ抗体を各最終濃度０．００２５〜２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式（ＩＩ）により求めた。
Figure 0005770783
その結果を第３図に示した。第３図に示したように、５種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のうち、ＹＢ２／０−ＧＤ３キメラ抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示し、次いでＳＰ２／０−ＧＤ３キメラ抗体、ＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体、ＣＨＯ−ＧＤ３キメラ抗体の順に高いＡＤＣＣ活性を示した。培養に用いた培地の異なるＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（３０２）とＮＳ０−ＧＤ３キメラ抗体（ＧＩＴ）では、それらのＡＤＣＣ活性に差は認められなかった。以上の結果は、抗体のＡＤＣＣ活性は、生産に用いる動物細胞によって大きく異なることを示している。その機構としては、抗原結合活性が同等であったことから、抗体のＦｃ領域の構造の差に起因していることが推定された。
実施例３．抗ヒトインターロイキン５レセプターα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製
１．抗ヒトインターロイキン５レセプターα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体の安定生産細胞の作製（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
国際公開９７／１０３５４号に記載の抗ヒトインターロイキン５レセプターα鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と表記する）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０を各種細胞株に導入し、優良株を選択することで抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０の５μｇを４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，１９９０］により導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。尚、実施例９に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し用いた。このようにして得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンＮｏ．３は平成１１年４月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）（現・独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６））にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９０として寄託されている。
（２）ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を用いた生産細胞の作製
国際公開９７／１０３５４号に記載の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを１０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、１０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、５００ｎＭに上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。尚、実施例９に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し用いた。
（３）マウスミエローマＮＳ０細胞を用いた生産細胞の作製
ヤラントン（Ｙａｒｒａｎｔｏｎ）らの方法［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）］に従い、国際公開９７／１０３５４号に記載の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０上の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターを作製し、ＮＳ０細胞を形質転換し、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。尚、実施例９に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として用いた。
２．抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性は以下のようにして測定した。国際公開９７／１０３５４号に記載の抗ｈＩＬ−５Ｒαマウス抗体ＫＭ１２５７をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した溶液の５０μｌを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、４℃で２０時間反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、国際公開９７／１０３５４号に記載の可溶性ｈＩＬ−５Ｒαを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した溶液を５０μｌ／ウェルで加え、４℃で２０時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型ＣＤＲ移植抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
３．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の精製
（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例３の１項（１）で得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンをＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＧＩＴ培地に３×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、１７５ｍｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で８日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過法を用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体と名付けた。
（２）ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例３の１項（２）で得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンをＬ−Ｇｌｎを３ｍＭ、ＣＤＬＣを０．５％、ＰＦ６８を０．３％の濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地に３×１０５細胞／ｍｌとなるように懸濁し、４．０Ｌスピナーボトル（岩城硝子社製）
を用いて１００ｒｐｍの速度で攪拌培養した。３７℃の恒温室内で１０日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過法を用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体と名付けた。
（３）ＮＳ０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
上記実施例３の１項（３）で得られた抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞クローンをヤラントン（Ｙａｒｒａｎｔｏｎ）らの方法［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）］に従い、培養後、培養上清を回収した。培養上清よりイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過法を用いて抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体と名付けた。
４．精製した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の解析
上記実施例３の３項で得られた各種動物細胞で生産、精製した３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量及び精製度を解析した。その結果を第４図に示した。第４図に示したように、精製した各抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、各抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ、精製されたことが確認された。
実施例４．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の活性評価
１．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
上記実施例３の３項で得られた３種類の精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を実施例３の２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。第５図は、添加する抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第５図に示したように、３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、ほぼ同等のｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を示した。この結果は実施例２の１項の結果と同様に、抗体の抗原結合活性は、抗体を生産する動物細胞やその培養方法に関わらず、一定であることを示している。
２．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例３の３項で得られた３種類の精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
国際公開９７／１０３５４号に記載のｈＩＬ−５Ｒα鎖及びβ鎖を発現しているマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養し、１×１０６細胞／０．５ｍｌとなるように調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１．５時間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ
ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて９×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（９×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は９０：１となる）添加した。更に、各種抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を各最終濃度０．００１〜０．１μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は前記式（ＩＩ）により求めた。
その結果を第６図に示した。第６図に示したように、３種類の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のうち、ＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示し、次いでＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体、ＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の順に高いＡＤＣＣ活性を示した。以上の結果は実施例２の２項の結果と同様に、抗体のＡＤＣＣ活性は、生産に用いる動物細胞によって大きく異なることを示している。更に、２種類のヒト化抗体のいずれの場合もＹＢ２／０細胞で生産した抗体が最も高いＡＤＣＣ活性を示したことから、ＹＢ２／０細胞を用いることにより、ＡＤＣＣ活性の高い抗体を製造できることが明らかとなった。
３．抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性評価
上記実施例３の３項で得られた３種類の精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性を評価するため、以下に示す方法に従い、カニクイザルのｈＩＬ−５誘発好酸球増加モデルに対する抑制作用を検討した。カニクイザルに初日よりｈＩＬ−５（調製方法は国際公開９７／１０３５４号に記載）を１μｇ／ｋｇで１日１回、計１４回背部皮下より投与した。各種抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を０日のｈＩＬ−５の投与１時間前に０．３ｍｇ／ｋｇで静脈内に単回投与した。抗体非投与群をコントロールとして用いた。抗体投与群は各群３頭（Ｎｏ．３０１、Ｎｏ．３０２、Ｎｏ．３０３、Ｎｏ．４０１、Ｎｏ．４０２、Ｎｏ．４０３、Ｎｏ．５０１、Ｎｏ．５０２、Ｎｏ．５０３）、抗体非投与群は２頭（Ｎｏ．１０１、Ｎｏ．１０２）のカニクイザルを用いた。投与開始の７日前より投与後４２日目まで経時的に約１ｍｌの血液を伏在静脈または大腿静脈より採取し、１μｌの末梢血中の好酸球数を測定した。
その結果を第７図に示した。第７図に示したように、ＹＢ２／０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体を投与した群では、血中好酸球の増加が完全に抑制された。一方、ＣＨＯ／ｄ−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の投与群では、１頭で完全な抑制作用が認められたものの、２頭ではその抑制作用は不充分であった。ＮＳ０−ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体の投与群では、完全な抑制作用は認められず、その効果は不充分であった。
以上の結果は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、生産に用いる動物細胞によって大きく異なることを示している。更に、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体ではそのｉｎ ｖｉｖｏ活性の高さは、実施例４の２項で述べたＡＤＣＣ活性の高さと正の相関が認められたことから、その活性発現には、ＡＤＣＣ活性の高さが極めて重要であることが示唆された。
以上の結果から、ＡＤＣＣ活性の高い抗体は、ヒトの各種疾患の臨床においても有用であることが期待される。
実施例５．ＡＤＣＣ活性を高める糖鎖の解析
１．２−アミノピリジン標識糖鎖（ＰＡ化糖鎖）の調製
本発明のヒト化抗体を塩酸による酸加水分解にてシアル酸を除去した。塩酸を完全に除去した後、ヒドラジン分解により糖鎖をタンパク質から切断した［メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３，１９８２］。ヒドラジンを除去した後、酢酸アンモニウム水溶液と無水酢酸加えてＮ−アセチル化を行った。凍結乾燥後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］。蛍光標識した糖鎖（ＰＡ化糖鎖）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて不純物と分離した。糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖とした。
２．精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣ分析
上記実施例５の１項の方法で実施例３で作製された各種抗ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ抗体についてＰＡ化糖鎖を行った後、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）による逆相ＨＰＬＣ分析を行った。過剰量のα−Ｌ−フコシダーゼ（ウシ腎由来、ＳＩＧＭＡ社製）をＰＡ化糖鎖に添加して消化を行い（３７℃、１５時間）、逆相ＨＰＬＣで分析した（第８図）。アスパラギン結合糖鎖は３０分間から８０分間の範囲に溶出することをＴａＫａＲａ社製ＰＡ化糖鎖スタンダードを用いて確認した。α−Ｌ−フコシダーゼ消化によって、逆相ＨＰＬＣの溶出位置が移動する糖鎖（４８分間から７８分間に溶出される糖鎖）の全体に占める割合を計算した。結果を第１表に示す。
Figure 0005770783
ＹＢ２／０細胞で生産させた抗ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ移植抗体は約４７％、ＮＳ０細胞で生産させた抗ｈＩＬ−５ＲＣＤＲ移植抗体は約７３％がＮグリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合した糖鎖（以下、「α−１，６−フコースを持つ糖鎖」とも表記する）であった。よって、ＹＢ２／０細胞で生産した抗体は、ＮＳ０細胞で生産した抗体と比較してＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースが結合していない糖鎖（以下、単に、「α−１，６−フコースを持たない糖鎖」と表記する）の割合がα−１，６−フコースを持たない糖鎖が多かった。
３．精製抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の単糖組成分析
トリフルオロ酢酸による酸加水分解により、ＹＢ２／０細胞、ＮＳ０細胞およびＣＨＯ／ｄ細胞で生産した抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の糖鎖を単糖に分解し、ＢｉｏＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて単糖組成分析を行った。Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、コンプレックス型では、１本の糖鎖におけるマンノース数は３であるため、マンノースを３として計算した場合の各単糖の相対比を第２表に示す。
Figure 0005770783
フコースの相対比は、ＹＢ２／０＜ＣＨＯ／ｄ＜ＮＳ０であり、本結果でもＹＢ２／０細胞で生産した抗体の糖鎖はフコース含量が最も低かった。
４．ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞生産抗体の糖鎖解析
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞で生産した精製抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体からＰＡ化糖鎖を調製し、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（島津社製）を用いて逆相ＨＰＬＣ分析を行った（第９図）。第９図において、溶出時間３５〜４５分間がフコースを持たない糖鎖、４５〜６０分間がフコースを持つ糖鎖であった。ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞で生産した抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、マウスミエローマＮＳ０細胞で生産させた抗体と同様に、ラットミエローマＹＢ２／０細胞で生産させた抗体よりもフコースを持たない糖鎖の含量が少なかった。
実施例６．高ＡＤＣＣ活性抗体の分離
フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンカラムを用いて、ラットミエローマＹＢ２／０細胞で生産させた抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の分離を行った。ＨＰＬＣは島津社製ＬＣ−６Ａを用い、流速は１ｍｌ／分、カラム温度は室温で行った。５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を注入後、０．２Ｍα−メチルマンノシド（ナカライテスク社製）の直線濃度勾配（６０分間）にて溶出した。抗ｈＩｌ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を非吸着画分と吸着画分とに分離した。非吸着画分、吸着画分の一部をとり、ｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を測定すると、同様の結合活性を示した（１０Ａ図）。ＡＤＣＣ活性を測定すると、非吸着画分の方が吸着画分の一部よりも高い（１００〜１０００倍）ＡＤＣＣ活性を示した（１０Ｂ図）。さらに、非吸着画分、吸着画分の一部からＰＡ化糖鎖を調製し、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（島津社製）を用いて逆相ＨＰＬＣ分析を行った（第１１図）。非吸着画分は主としてフコースのない糖鎖をもつ抗体であり、吸着画分の一部は主としてフコースがある糖鎖もつ抗体であった。
実施例７．α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＧＤ３キメラ抗体の活性評価
１．α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＧＤ３キメラ抗体の調製
実施例１の２項（１）に記載した方法に従って、抗ＧＤ３キメラ抗体を生産するＹＢ２／０細胞由来の形質転換クローンを得た。それぞれのＹＢ２／０細胞由来の形質転換クローンより抗体を調製し、それぞれをロット１、ロット２、ロット３とした。抗ＧＤ３キメラ抗体ロット１、ロット２、ロット３の糖鎖分析を、実施例１１の（６）の方法に従って行った結果、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、それぞれ５０％、４５％、２９％であった。以下、これらの試料を、抗ＧＤ３キメラ抗体（５０％）、抗ＧＤ３キメラ抗体（４５％）、抗ＧＤ３キメラ抗体（２９％）と表記する。
また、実施例１の２項（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＧＤ３キメラ抗体の糖鎖分析を実施例１１の（６）の方法に従って行った結果、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、７％であった。以下、本試料を抗ＧＤ３キメラ抗体（７％）と表記する。
さらに、抗ＧＤ３キメラ抗体（４５％）と抗ＧＤ３キメラ抗体（７％）を用い、抗ＧＤ３キメラ抗体（４５％）：抗ＧＤ３キメラ抗体（７％）＝５：３および１：７の割合で混合した。これらの試料を、実施例１１の（６）の方法に従って糖鎖分析を行った結果、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が２４％および１３％（分析値）であった。これらを以下、抗ＧＤ３キメラ抗体（２４％）、抗ＧＤ３キメラ抗体（１３％）と表記する。
第１２図には、各試料の糖鎖分析の結果を示した。α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、２回の糖鎖分析の結果を平均した値を用いた。
２．ＧＤ３に対する結合活性の評価（ＥＬＩＳＡ法）
実施例７の１項で調製したα−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる６種類の抗ＧＤ３キメラ抗体のＧＤ３（雪印乳業社製）に対する結合活性は、実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、第１３図に示したように、６種類の抗ＧＤ３キメラ抗体は、いずれも同等のＧＤ３に対する結合活性を示し、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、抗体の抗原結合活性に影響を与えないことが明らかとなった。
３．ヒトメラノーマ細胞株に対するＡＤＣＣ活性の評価
抗ＧＤ３キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４２４）に対するＡＤＣＣ活性は、以下のようにして測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、培地を用いた懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。培地で３回遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ヒトエフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（２×１０５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。さらに、抗ＧＤ３キメラ抗体を各最終濃度０．０００５〜５μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、ヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。細胞障害活性（％）は前記式（ＩＩ）により求めた。
第１４図および第１５図には、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる６種類の抗ＧＤ３キメラ抗体の各種濃度（０．０００５〜５μｇ／ｍＬ）におけるＡＤＣＣ活性を２名の健常人ドナー（Ａ、Ｂ）のエフェクター細胞を用いて測定した結果をそれぞれ示した。第１４図および第１５図に示したように、抗ＧＤ３キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、いずれの抗体濃度においてもα−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合に比例して上昇する傾向を示した。抗体濃度が低ければ、ＡＤＣＣ活性は低下する。抗体濃度が０．０５μｇ／ｍｌでは、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が２４％、２９％、４５％および５０％のＡＤＣＣ活性はほぼ同様の高い活性を示したが、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が２０％未満の抗体である、１３％および７％では、ＡＤＣＣ活性は低かった。本結果は、エフェクター細胞のドナーが異なっても同様であった。
実施例８．α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の活性評価
１．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞の作製
国際公開０１／６４７５４号記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
（１）ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
１０μｇの抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）［ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社製）を５％含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を実施例８の２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を実施例８の２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、得られたクローン化株をＫＭ２７６０＃５８−３５−１６と名付けた。尚、実施例９に示すα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、該転写物の量が比較的低い株を優良株として選択し用いた。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量を実施例８の２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株は５−０３株と名付けた。
２．抗体ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号２５）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ ｍＬに、１００ｍｌの２５ｍｇ／ｍＬ ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液をｖｏｒｔｅｘしながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ ｍＬ ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬ ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）をｖｏｒｔｅｘ下で添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、２０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後ＯＤ４１５を測定した。実施例８の１項で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、ＣＣＲ４に対する結合活性を示した。
３．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製
（１）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
実施例８の１項（１）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ２７６０＃５８−３５−１６を２００ｎＭ ＭＴＸ、Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬製）を５％の濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（インビトロジェン社製）培地に２×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、スピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて３７℃の恒温室内でＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ攪拌培養した。８−１０日間培養して回収した培養上清より、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラム及びゲルろ過法を用いて、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体をＫＭ２７６０−１と名づけた。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養及び抗体の精製
実施例８の１項（２）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞株５−０３株をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地中で、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍｌのＰＢＳバッファーにて細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を３５ｍｌ注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体はＫＭ３０６０と名付けた。
ＫＭ２７６０−１およびＫＭ３０６０のＣＣＲ４に対する結合活性を実施例８の２項記載のＥＬＩＳＡにより測定した結果、同等の結合活性を示した。
４．精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体の解析
本実施例１項で得られた各種動物細胞で生産、精製した２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０，１９７０］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量及び製精度を解析した。精製した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］と一致し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
５．α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の調製
実施例８の３項（１）で調製した、ＹＢ２／０細胞由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０−１と、実施例８の３項（２）で調製した、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ３０６０の糖鎖分析を、実施例１１の（６）の方法に従って行った。α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、ＫＭ２７６０−１は８７％、ＫＭ３０６０は８％であった。以下、これらの試料を、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８７％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）と表記する。
さらに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８７％）と抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）を用い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８７％）：抗ＣＣＲ４キメラ抗体（８％）＝１：３９、１６：６７、２２：５７、３２：４７、４２：３７の割合で混合した。これらの試料を実施例１１の（６）の方法にしたがって糖鎖分析を行なった。α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、それぞれ９％、１８％、２７％、３９％、４６％であった。以下、これらの試料を抗ＣＣＲ４キメラ抗体（９％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（１８％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（２７％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（３９％）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体（４６％）と表記する。
第１６図には、各試料の糖鎖分析の結果を示した。α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、２回の結果を平均した値を用いた。
６．ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の評価（ＥＬＩＳＡ法）
実施例８の５項で調製したα−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性は実施例８の２に記載の方法に従って測定した。
その結果、第１７図に示したように、６種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、いずれも同等のＣＣＲ４に対する結合活性を示し、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合は、抗体の抗原結合活性に影響を与えないことが明らかとなった。
７．ヒトＣＣＲ４高発現細胞株に対するＡＤＣＣ活性の評価
抗ＣＣＲ４キメラ抗体のヒトＣＣＲ４高発現細胞であるＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞（国際公開０１／６４７５４号）に対するＡＤＣＣ活性は、以下のようにして測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
国際公開０１／６４７５４号に記載のヒトＣＣＲ４を発現しているＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞の１．５×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を５．５５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間３０分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、培地を用いた懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を７．５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血６０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．６ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。培地で３回遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ヒトエフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。さらに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度０．０００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性（％）は前記式（ＩＩ）により求めた。
第１８図および第１９図には、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の各種濃度（０．００１〜１０μｇ／ｍＬ）におけるＡＤＣＣ活性を２名の健常人ドナー（Ａ，Ｂ）のエフェクター細胞を用いて測定した結果をそれぞれ示した。第１８図および第１９図に示したように、抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性はいずれの抗体濃度においてもα−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合に比例して上昇する傾向を示した。抗体濃度が低ければ、ＡＤＣＣ活性は低下する。抗体濃度が０．０１μｇ／ｍｌでは、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が２７％、３９％および４６％のＡＤＣＣ活性はほぼ同様の高い活性を示したが、α−１，６−フコースを持たない糖鎖が２０％未満の抗体では、ＡＤＣＣ活性は低かった。本結果は、エフェクター細胞のドナーが異なっても同様であった。
実施例９．宿主細胞株におけるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写物の定量
（１）各種細胞株由来一本鎖ｃＤＮＡの調製
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびラットミエローマＹＢ２／０細胞より、以下の手順で一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を１０％ ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。また、ＹＢ２／０細胞を１０％ ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、４ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−ＧＬＮ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で浮遊細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。これらを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、培養１日目、２日目、３日目、４日目および５日目に各宿主細胞１×１０７個を回収後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により添付の説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた各々の全ＲＮＡ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。各宿主細胞由来α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８ともいう）、β−アクチンのクローニングには該反応液の１倍濃度液を、競合的ＰＣＲによる各遺伝子転写量の定量には該反応液の５０倍希釈水溶液を用い、各々使用するまで−８０℃で保管した。
（２）チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の各ｃＤＮＡ部分断片の取得
チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の各ｃＤＮＡ部分断片の取得は、以下の手順で行った（第２０図）。まず、ヒトＦＵＴ８のｃＤＮＡ［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１２１，６２６，（１９９７）］およびブタＦＵＴ８のｃＤＮＡ［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７１，２７８１０，（１９９６）］に共通の塩基配列に対して特異的なプライマー（配列番号４および配列番号５に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（１）で調製した培養２日目のＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡおよびＹＢ２／０細胞由来ｃＤＮＡを各々１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ 上記遺伝子特異的プライマー（配列番号４および配列番号５）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片９７９ｂｐをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１社製）を用いて精製し、滅菌水１０μｌで溶出した（以下、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いた）。上記増幅断片 ４μｌを、ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株をコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）により形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちｃＤＮＡが組み込まれた６クローンから、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），７，１５１３（１９７９）］（以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いる）に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８（配列番号６および７に示す）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）部分配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、各プラスミドをＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１と称す。
（３）チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンｃＤＮＡの取得
チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの取得は、以下の手順で行った（第２１図）。
まず、チャイニーズハムスターβ−アクチンゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ，Ｕ２０１１４）およびラットβ−アクチンゲノム配列［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１１，１７５９（１９８３）］より、翻訳開始コドンを含む共通配列に特異的なフォワードプライマー（配列番号８に示す）および翻訳終止コドンを含む各配列特異的なリバースプライマー（配列番号９および配列番号１０に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ（東洋紡績社製）を用いて、本項（１）で調製した培養２日目のＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡおよびＹＢ２／０細胞由来ｃＤＮＡ １μｌを含む２５μｌの反応液［ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号８および９、または配列番号８および１０）、５％ ＤＭＳＯ］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で４分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、６５℃で２秒間、７４℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片１１２８ｂｐを精製した。このＤＮＡ断片に対し、ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒造社製）を用いて、添付の説明書に従いＤＮＡ５’末端のリン酸化を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収し、滅菌水１０μｌに溶解した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）３μｇ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）をＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、１６単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。該反応液にｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ３５μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．５μｌを添加して６５℃で３０分間反応させることにより、ＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。この反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理の後エタノール沈殿法を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水 １００μｌに溶解した。
上記で得たチャイニーズハムスターｃＤＮＡ由来増幅断片およびラットｃＤＮＡ由来増幅断片（１１９２ｂｐ）４μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）由来のＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片（約３．０Ｋｂ）１μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）５μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各ｃＤＮＡのＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、各プラスミドをＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳと称す。
（４）ＦＵＴ８スタンダードおよび内部コントロールの調製
各細胞内のＦＵＴ８遺伝子由来ｍＲＮＡ転写量を測定するために、検量線に用いるスタンダードとして、本項（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の各ｃＤＮＡ部分断片をｐＣＲ２．１に組み込んだプラスミドであるＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。ＦＵＴ８定量の内部コントロールとしては、ＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１のうち、チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の内部塩基配列のＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間２０３ｂｐを欠失させることにより得られたＣＨＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。以下にその詳細を説明する。
チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８のスタンダードの調製は次の手順で行った。プラスミドＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μｌに溶解し、２４単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。一方、プラスミドＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μｌに溶解し、２４単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。該反応液の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８ 各ｃＤＮＡ部分断片を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１Ｋｂ）がプラスミドＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１より分離されたことを確認した。各反応液より、１μｇ／ｍｌ パン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて０．０２ｆｇ／μｌ、０．２ｆｇ／μｌ、１ｆｇ／μｌ、２ｆｇ／μｌ、１０ｆｇ／μｌ、２０ｆｇ／μｌ、１００ｆｇ／μｌの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８のスタンダードとした。
チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の内部コントロールの調製は次のように行った（第２２図）。ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ（東洋紡績社製）を用いて、ＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１ ５ｎｇを含む２５μｌの反応液［ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／ｌ 遺伝子特異的プライマー（配列番号１１および１２）、５％ ＤＭＳＯ］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で４分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、６５℃で２秒間、７４℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行った。ＰＣＲ後、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約４．７Ｋｂを精製した。該ＤＮＡ断片に対し、ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒造社製）を用いて、添付の説明書に従いＤＮＡ５’末端のリン酸化を行った後、反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収し、滅菌水５０μｌに溶解した。上記で得たＤＮＡ断片（約４．７Ｋｂ）５μｌおよびＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）５μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより自己環状化反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドＤＮＡに対しＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて配列決定を行い、同プラスミドに挿入されたチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の内部塩基配列ＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間２０３ｂｐが欠失したことを確認した。得られた各プラスミドをＣＨＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１と称す。
次にプラスミドＣＨＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製） ４０μｌに溶解し、２４単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。一方、プラスミドＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μｌに溶解し、２４単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。該反応液の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８部分断片の内部塩基配列２０３ｂｐが欠失した断片を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約８００ｂｐ）がプラスミドＣＨＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１より分離されたことを確認した。各反応液より、１μｇ／ｍｌ パン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて２ｆｇ／μｌの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の内部コントロールとした。
（５）β−アクチンスタンダードおよび内部コントロールの調製
各宿主細胞内のβ−アクチン遺伝子由来ｍＲＮＡ転写量を測定するために、検量線に用いるスタンダードとして、本項（３）で得たチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各ｃＤＮＡのＯＲＦ全長をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）に組み込んだプラスミドであるＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳを、前者は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで、後者は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで、各々切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。β−アクチン定量の内部コントロールとしては、ＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳのうち、チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部塩基配列のＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ間１８０ｂｐを欠失させることにより得られたＣＨＡｃｄ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃｄ−ｐＢＳを、前者は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで、後者は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで、切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。以下にその詳細を説明する。
チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンのスタンダードの調製は次の手順で行った。プラスミドＣＨＡｃ−ｐＢＳ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μｌに溶解し、２５単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）および２０単位のＰｓｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。一方、プラスミドＹＢＡｃ−ｐＢＳ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μｌに溶解し、２５単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）および２４単位のＫｐｎＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。該反応液の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各ｃＤＮＡ ＯＲＦ全長を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片およびＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片（約１．２Ｋｂ）がプラスミドＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳより分離されたことを確認した。各反応液より、１μｇ／ｍｌ パン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて２ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌ、２００ｆｇ／μｌ、１００ｆｇ／μｌ、２０ｆｇ／μｌの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンのスタンダードとした。
チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部コントロールの調製は次の手順で行った（第２３図）。ＣＨＡｃ−ｐＢＳ ２μｇを１００ｎｇ／μｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００μｌに溶解し、１０単位の制限酵素ＤｒａＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、添付の説明書に従ってＤＮＡ末端の平滑化を行った後、反応液を２等分した。
まず一方の反応液には、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ３５μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．５μｌを添加し、６５℃で３０分間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿法を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。残る他方の反応液は０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、チャイニーズハムスターβ−アクチンＯＲＦ部分断片を含む約１．１ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得た脱リン酸化ＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ断片 ０．５μｌ、約１．１ＫｂのＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ断片 ４．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）５μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドＤＮＡに対しＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて配列決定を行い、同プラスミドに挿入されたチャイニーズハムスターβ−アクチンＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ間１８０ｂｐが欠失したことを確認した。本プラスミドをＣＨＡｃｄ−ｐＢＳと称す。
また、ラットβ−アクチンＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ間１８０ｂｐが欠失したプラスミドをＣＨＡｃｄ−ｐＢＳと同様の工程を経て作製した。本プラスミドをＹＢＡｃｄ−ｐＢＳと称す。次にプラスミドＣＨＡｃｄ−ｐＢＳ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μｌに溶解し、２５単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）および２０単位のＰｓｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。一方、プラスミドＹＢＡｃｄ−ｐＢＳ ２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）４０μｌに溶解し、２５単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）および２４単位のＫｐｎＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行った。該反応液の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各ｃＤＮＡ ＯＲＦ全長の内部塩基配列１８０ｂｐが欠失した断片を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片およびＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片（約１．０Ｋｂ）がプラスミドＣＨＡｃｄ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃｄ−ｐＢＳより分離されたことを確認した。各反応液より、１μｇ／ｍｌパン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて２００ｆｇ／μｌの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部コントロールとした。
（６）競合的ＰＣＲによる転写量の定量
本項（４）で作製したＦＵＴ８内部コントロールＤＮＡおよび本項（１）で得た宿主細胞株由来ｃＤＮＡを鋳型として競合的ＰＣＲを行い、各鋳型に由来する増幅産物量の相対値より、宿主細胞株内のＦＵＴ８の転写産物の定量値を算出した。一方、β−アクチン遺伝子は各細胞において恒常的に転写されており、その転写量は細胞間で同程度と考えられているため、各宿主細胞株由来ｃＤＮＡ合成反応の効率の目安として、β−アクチン遺伝子の転写量を定量した。すなわち、本項（５）で作製したβ−アクチン内部コントロールＤＮＡおよび本項（１）で得た宿主細胞株由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各鋳型に由来する増幅産物量の相対値より、宿主細胞株内のβ−アクチンの転写産物の定量値を算出した。以下にその詳細を説明する。
ＦＵＴ８の転写産物の定量は次の手順で行った。まず、本項（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８ ＯＲＦ部分配列の内部配列に対し、共通配列特異的なプライマーセット（配列番号１３および１４に示す）を設計した。
次に、本項（１）で得た各宿主細胞株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１０ｆｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１３および１４）、５％ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして３２サイクル行った。
また、各宿主細胞株由来ｃＤＮＡに代えて、本項（４）で得たＦＵＴ８スタンダードプラスミド５μｌ（０．１ｆｇ、１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、５００ｆｇ、１ｐｇ）を添加した系でＰＣＲを行い、ＦＵＴ８転写量の検量線作製に用いた。
β−アクチンの転写産物の定量は次の手順で行った。まず、本項（３）で得たチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンＯＲＦ全長の内部配列に対し、各遺伝子特異的なプライマーセット（前者を配列番号１５および配列番号１６に、後者を配列番号１７および配列番号１８に示す）をそれぞれ設計した。
次に、本項（１）で得られた各宿主細胞株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１ｐｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１５および配列番号１６、または配列番号１７および配列番号１８）、５％ ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間から成る反応を１サイクルとした１７サイクルの条件で行った。
また、各宿主細胞株由来ｃＤＮＡに代えて、本項（５）で得たβ−アクチンスタンダードプラスミド ５μｌ（１０ｐｇ、５ｐｇ、１ｐｇ、５００ｆｇ、１００ｆｇ）を添加した系でＰＣＲをそれぞれ行い、β−アクチン転写量の検量線作製に用いた。
Figure 0005770783
第３表に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、各遺伝子転写産物および各スタンダードから第３表のターゲット欄に示したサイズのＤＮＡ断片を、各内部コントロールから第３表のコンペティター欄に示したサイズのＤＮＡ断片を増幅させることができる。
ＰＣＲ後の溶液のうち、７μｌを１．７５％アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを１倍濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）に３０分間浸漬し染色した。増幅された各ＤＮＡ断片の発光強度をフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ＳＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）で算出することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。
上記の方法により、スタンダードプラスミドを鋳型としたＰＣＲによって生じた増幅産物量を測定し、その測定値とスタンダードプラスミド量をプロットして検量線を作成した。この検量線を用いて、各発現株由来全ｃＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の量より各株中の目的遺伝子ｃＤＮＡ量を算出し、これを各株におけるｍＲＮＡ転写量とした。
ラットＦＵＴ８配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合の各宿主細胞株におけるＦＵＴ８転写産物の量を第２４図に示した。培養期間を通じてＣＨＯ細胞株はＹＢ２／０細胞株の１０倍以上の転写量を示した。この傾向は、チャイニーズハムスターＦＵＴ８配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合にも認められた。
また、第４表にβ−アクチン転写産物の量との相対値としてＦＵＴ８転写量を示した。培養期間を通じてＹＢ２／０細胞株のＦＵＴ８転写量がβ−アクチンの０．１％前後であるのに対し、ＣＨＯ細胞株は０．５％〜２％であった。以上の結果より、ＹＢ２／０細胞株のＦＵＴ８転写産物量はＣＨＯ細胞株のそれよりも有意に少ないことが示された。
Figure 0005770783
実施例１０．抗ガングリオシドＧＤ３キメラ抗体生産細胞株におけるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子の転写物の定量
（１）各種生産細胞株由来一本鎖ｃＤＮＡの調製
抗ガングリオシドＧＤ３キメラ抗体生産細胞ＤＣＨＩ０１−２０株および６１−３３株より、以下の手順で一本鎖ｃＤＮＡを調製した。ＤＣＨＩ０１−２０株は、実施例１第２項（２）記載のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換クローンである。また６１−３３株は、ＹＢ２／０由来の形質転換細胞７−９−５１株（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）に対し無血清馴化を行った後、２回の限界希釈法による単一細胞化を行って得たクローンである。
ＤＣＨＩ０１−２０株を３ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−ＧＬＮ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．３％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および０．５％脂肪酸濃縮液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＥＸＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で浮遊細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。また、６１−３３株を０．２％ ウシ血清アルブミンフラクションＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）（以下、ＢＳＡと略記する）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で浮遊細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。これらを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、培養１日目、２日目、３日目、４日目および５日目に各宿主細胞１×１０７個を回収し、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により添付の説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた全ＲＮＡ ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
該反応液を水で５０倍希釈し、使用するまで−８０℃で保管した。
（２）競合的ＰＣＲによる各遺伝子転写量の定量
本項（１）で得た抗体生産細胞株由来ｃＤＮＡに対し、実施例９（６）に準じて競合的ＰＣＲによる各遺伝子転写量の定量を行った。
各生産細胞株内のＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、以下の手順で行った。
ＦＵＴ８転写量の定量の際に検量線に用いるスタンダードとして、実施例９（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８のｃＤＮＡ部分断片をｐＣＲ２．１に組み込んだプラスミドであるＣＨＦＴ８−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。
ＦＵＴ８定量の内部コントロールとしては、チャイニーズハムスターＦＵＴ８およびラットＦＵＴ８の内部塩基配列のＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間２０３ｂｐを欠失させることにより得られた実施例９（４）で調製したＣＨＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１およびＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。
本項（１）で得た各生産細胞株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液 ５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１０ｆｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ ＦＵＴ８遺伝子特異的プライマー（配列番号１３および１４）、５％ ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして３２サイクル行った。
また、各生産細胞株由来ｃＤＮＡに代えて、ＦＵＴ８スタンダードプラスミド５μｌ（０．１ｆｇ、１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、５００ｆｇ、１ｐｇ）を添加した系でＰＣＲを行い、ＦＵＴ８転写量の検量線作製に用いた。尚、スタンダードプラスミドの希釈には１μｇ／ｍｌパン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
一方、β−アクチン遺伝子は各細胞において恒常的に転写されており、その転写量は細胞間で同程度と考えられているため、各生産細胞株由来ｃＤＮＡ合成反応の効率の目安として、β−アクチン遺伝子の転写量を以下の手順で定量した。
β−アクチン遺伝子転写量の定量の際に検量線に用いるスタンダードとして、実施例９（３）で調製したチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンのｃＤＮＡのＯＲＦ全長をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）に組み込んだプラスミドであるＣＨＡｃ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃ−ｐＢＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。
β−アクチン定量の内部コントロールとしては、チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部塩基配列のＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ間１８０ｂｐを欠失させることにより得られた実施例９（５）で調製したＣＨＡｃｄ−ｐＢＳおよびＹＢＡｃｄ−ｐＢＳを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。
上記で得た各生産細胞株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液 ５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１ｐｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌβ−アクチン特異的プライマー（配列番号１７および１８）、５％ ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間から成る反応を１サイクルとした１７サイクルの条件で行った。また、各生産細胞株由来ｃＤＮＡに代えて、β−アクチンスタンダードプラスミド１０ｐｇ、５ｐｇ、１ｐｇ、５００ｆｇ、１００ｆｇを添加した系でＰＣＲをそれぞれ行い、β−アクチン転写量の検量線作製に用いた。尚、スタンダードプラスミドの希釈には１μｇ／ｍｌパン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
第３表に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、各遺伝子転写産物および各スタンダードから第３表のターゲット欄に示したサイズのＤＮＡ断片を、各内部コントロールから第３表のコンペティター欄に示したサイズのＤＮＡ断片を増幅させることができる。
ＰＣＲ後の溶液のうち、７μｌを１．７５％アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを１倍濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）に３０分間浸漬し染色した。増幅された各ＤＮＡ断片の発光強度をフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ＳＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）で算出することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。
上記の方法により、スタンダードプラスミドを鋳型としたＰＣＲによって生じた増幅産物量を測定し、その測定値とスタンダードプラスミド量をプロットして検量線を作成した。この検量線を用いて、各生産細胞株由来全ｃＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の量より各株中の目的遺伝子ｃＤＮＡ量を算出し、これを各株におけるｍＲＮＡ転写量とした。
第５表にβ−アクチン転写産物の量との相対値としてＦＵＴ８転写量を示した。培養期間を通じて、ＹＢ２／０細胞由来抗体生産株６１−３３のＦＵＴ８転写量がβ−アクチンの０．３％以下であるのに対し、ＣＨＯ細胞由来抗体生産株ＤＣＨＩ０１−２０は０．７〜１．５％であった。この結果より、ＹＢ２／０細胞由来抗体生産株のＦＵＴ８転写産物量はＣＨＯ細胞由来抗体生産株のそれよりも有意に少ないことが示された。
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実施例１１．マウスα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子過剰発現株の作製
（１）マウスα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）発現プラスミドの構築
１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）で継代培養したマウスミエローマＮＳ０細胞（理化学研究所セルバンク，ＲＣＢ０２１３）１×１０７個に対し、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌを添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。
反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。得られた全ＲＮＡのうち３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
マウスＦＵＴ８ ｃＤＮＡの取得は以下の手順で行った（第２５図）。
まず、マウスＦＵＴ８のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ，ＡＢ０２５１９８）より、翻訳開始コドンを含む配列に特異的なフォワードプライマー（配列番号１９に示す）および翻訳終止コドンを含む配列特異的なリバースプライマー（配列番号２０に示す）を設計した。次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、前述のＮＳ０細胞由来ｃＤＮＡ １μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、４％ＤＭＳＯ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記特異的プライマー（配列番号１９および配列番号２０）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片１７２８ｂｐを精製した。このＤＮＡ断片４μｌを、ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちｃＤＮＡが組み込まれた６クローンから、公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、マウスＦＵＴ８のＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した（そのＤＮＡ配列を配列番号２に示す。また、そのアミノ酸配列を配列番号２４に示す）。尚、本配列には、前述のＧｅｎＢａｎｋ上に登録されたマウスＦＵＴ８配列とはアミノ酸置換を伴う３塩基の不一致があった。以下、本プラスミドをｍｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１と称す。
続いて、マウスＦＵＴ８ ＯＲＦ全長配列を含むプラスミドｐＢＳｍｆＦＵＴ８の構築を以下のように行った（第２６図）。まず、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）１μｇを（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）をＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液にｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ３５μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．５μｌを添加して６５℃で３０分間反応させることにより、ＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。この反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理の後エタノール沈殿法を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
一方、プラスミドｍｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１ １μｇを（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）をＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、マウスＦＵＴ８ ｃＤＮＡ ＯＲＦ全長を含む約１．７ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２．９Ｋｂ）１μｌ、プラスミドｍｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１．７Ｋｂ）４μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）５μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＢＳｍｆＦＵＴ８と称す。
上記ｐＢＳｍｆＦＵＴ８およびｐＡＧＥ２４９を用いて、マウスＦＵＴ８発現ベクターｐＡＧＥｍｆＦＵＴ８の構築を以下の手順で行った（第２７図）。ｐＡＧＥ２４９は、ｐＡＧＥ２４８［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６９，１４７３０（１９９４）］の誘導体であり、ｐＡＧＥ２４８よりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）発現ユニットを含むＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ断片（２．７Ｋｂ）を除去したベクターである。
ｐＡＧＥ２４９ １μｇをＵｎｉｖｅｒｓｅｌ ＢｕｆｆｅｒＨ（宝酒造社製）５０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液にｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ３５μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．５μｌを添加して６５℃で３０分間反応させることにより、ＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。この反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理の後エタノール沈殿法を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水 １０μｌに溶解した。
一方、ｐＢＳｍｆＦＵＴ８ １μｇをＵｎｉｖｅｒｓｅｌ Ｂｕｆｆｅｒ Ｈ（宝酒造社製）５０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、マウスＦＵＴ８ ｃＤＮＡ ＯＲＦ全長を含む約１．７ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＡＧＥ２４９由来のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（６．５Ｋｂ）１μｌ、プラスミドｐＢＳｍｆＦＵＴ８由来のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（１．７Ｋｂ）４μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）５μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＡＧＥｍｆＦＵＴ８と称す。
（２）マウスα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子過剰発現株の作製
本項（１）で構築したマウスＦＵＴ８発現ベクターｐＡＧＥｍｆＦＵＴ８を６１−３３株へ導入し、ＦＵＴ８遺伝子の安定的発現株を取得した。上記６１−３３株は、抗ガングリオシドＧＤ３キメラ抗体を高生産するＹＢ２／０細胞由来の形質転換細胞７−９−５１株（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター，ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）に対し無血清馴化を行った後、２回の限界希釈法による単一細胞化を行って得たクローンである。
プラスミドｐＡＧＥｍｆＦＵＴ８の６１−３３株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＡＧＥｍｆＦＵＴ８ ３０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）６００μｌに溶解し、１００単位の制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しエタノール沈殿法を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。
次に、６１−３３株をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２）に懸濁して２×１０７個／ｍｌとし、細胞懸濁液２００μｌ（４×１０６個）を上記線状化プラスミド １０μｌ（１０μｇ）と混和した。細胞−ＤＮＡ混和液をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移した後、細胞融合装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧０．２ＫＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。この細胞懸濁液を５％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）および０．２％ ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）１０ｍｌに混和し、浮遊細胞用９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１００μｌずつ分注した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清５０μｌを除去し、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（和光純薬工業社製）、５％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）および０．２％ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を１００μｌずつ分注した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら３週間の培養を行い、ハイグロマイシン耐性を示す１４株を取得した。
一方、ｐＡＧＥｍｆＦＵＴ８の母骨格ベクターであるプラスミドｐＡＧＥ２４９を６１−３３株へ導入することにより、ネガティブコントロール株を作製した。上述の手順で、制限酵素ＦｓｐＩにより線状化したプラスミドｐＡＧＥ２４９ １０μｇをエレクトロポレーション法を用いて６１−３３株 ４×１０６ｃｅｌｌｓへ遺伝子導入した。該細胞を５％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）および０．２％ ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）１５ｍｌに混和した後、浮遊細胞用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に移し入れ、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。培養後、８００ｒｐｍで４分間の遠心分離を行い、上清の半量（７．５ｍｌ）を除去した後、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（和光純薬工業社製）、５％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）および０．２％ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）７．５ｍｌを添加して懸濁し、浮遊細胞用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に移し入れた。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら３週間の培養を行い、ハイグロマイシン耐性株を取得した。
（３）マウスα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子過剰発現株における該遺伝子発現量の解析
本項（２）で作製した６１−３３株由来マウスＦＵＴ８過剰発現株１４株より任意に選択した６株およびネガティブコントロール株に対し、競合的ＲＴ−ＰＣＲを用いてＦＵＴ８発現量の比較を行った。
上記過剰発現株を０．５ｍｇ／ｍｌ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（和光純薬工業社製）、５％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）および０．２％ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）に懸濁し、３×１０５個／ｍｌの密度で浮遊細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した後、生細胞１×１０７個を回収し、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ Ｒｎａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５Ｕ／μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌを添加して３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた全ＲＮＡ２．５μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。該反応液を水で５０倍希釈し、実施例９（６）に準じて競合的ＰＣＲによる各遺伝子転写量の定量に供した。
各発現株内のＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、以下の手順で行った。
ＦＵＴ８転写量の定量の際に検量線に用いるスタンダードとして、実施例９（２）で調製したラットＦＵＴ８のｃＤＮＡ部分断片をｐＣＲ２．１に組み込んだプラスミドであるＹＢＦＴ８−ｐＣＲ２．１を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。ＦＵＴ８定量の内部コントロールとしては、実施例９（４）で調製した、ラットＦＵＴ８の内部塩基配列のＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間２０３ｂｐを欠失させることにより得られたＹＢＦＴ８ｄ−ｐＣＲ２．１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。
上記で得た各発現株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１０ｆｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌラットＦＵＴ８遺伝子特異的プライマー（配列番号１３および１４）、５％ ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして３２サイクル行った。
また、各発現株由来ｃＤＮＡに代えて、ＦＵＴ８スタンダードプラスミド ５μｌ（０．１ｆｇ、１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、５００ｆｇ、１ｐｇ）を添加した系でＰＣＲを行い、ＦＵＴ８転写量の検量線作製に用いた。尚、スタンダードプラスミドの希釈には１μｇ／ｍｌ パン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
一方、β−アクチン遺伝子は各細胞において恒常的に転写されており、その転写量は細胞間で同程度と考えられているため、各発現株由来ｃＤＮＡ合成反応の効率の目安として、β−アクチン遺伝子の転写量を以下の手順で定量した。
β−アクチン遺伝子転写量の定量の際に検量線に用いるスタンダードとして、実施例９（３）で調製したラットβ−アクチンのｃＤＮＡのＯＲＦ全長をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）に組み込んだプラスミドであるＹＢＡｃ−ｐＢＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。
β−アクチン定量の内部コントロールとしては、実施例９（５）で調製したラットβ−アクチンの内部塩基配列のＤｒａＩＩＩ−ＤｒａＩＩＩ間１８０ｂｐを欠失させることにより得られたＹＢＡｃｄ−ｐＢＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断し直鎖化したＤＮＡを用いた。
上記で得た各発現株由来のｃＤＮＡ溶液の５０倍希釈液 ５μｌおよび内部コントロール用プラスミド５μｌ（１ｐｇ）を含む総体積２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ ラットβ−アクチン特異的プライマー（配列番号１７および１８）、５％ ＤＭＳＯ］で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間から成る反応を１サイクルとした１７サイクルの条件で行った。
また、各発現株由来ｃＤＮＡに代えて、β−アクチンスタンダードプラスミド１０ｐｇ、５ｐｇ、１ｐｇ、５００ｆｇ、１００ｆｇを添加した系でＰＣＲをそれぞれ行い、β−アクチン転写量の検量線作製に用いた。尚、スタンダードプラスミドの希釈には１μｇ／ｍｌパン酵母由来ｔ−ＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
第３表に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、各遺伝子転写産物および各スタンダードから第３表のターゲット欄に示したサイズのＤＮＡ断片を、各内部コントロールから第３表のコンペティター欄に示したサイズのＤＮＡ断片を増幅させることができる。
ＰＣＲ後の溶液のうち、７μｌを１．７５％アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを１倍濃度のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ社製）に３０分間浸漬し染色した。増幅された各ＤＮＡ断片の発光強度をフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ＳＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）で算出することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。
上記の方法により、スタンダードプラスミドを鋳型としたＰＣＲによって生じた増幅産物量を測定し、その測定値とスタンダードプラスミド量をプロットして検量線を作成した。この検量線を用いて、各発現株由来全ｃＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の量より各株中の目的遺伝子ｃＤＮＡ量を算出し、これを各株におけるｍＲＮＡ転写量とした。
第２８図にβ−アクチン転写産物の量との相対値としてＦＵＴ８転写量を示した。ｍｆＦＵＴ８−１、ｍｆＦＵＴ８−２、ｍｆＦＵＴ８−４の３株およびｐＡＧＥ２４９導入株は、ＦＵＴ８転写量がβ−アクチン転写量の０．３〜１０％であり、ＦＵＴ８転写量が比較的低い株であった。一方、ｍｆＦＵＴ８−３、ｍｆＦＵＴ８−６、ｍｆＦＵＴ８−７の３株は、ＦＵＴ８転写量がβ−アクチン転写量の２０〜４０％であり、ＦＵＴ８発現量が比較的高い株であった。
（４）マウスα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子過剰発現株が産生する抗体の精製
本項（２）で得たＦＵＴ８遺伝子過剰発現株６株およびネガティブコントロール株１株を、２００ｎｍｏｌ／ｌ ＭＴＸ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（和光純薬工業社製）、および０．２％ ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で浮遊細胞培養用Ｔ２２５フラスコ（ＩＷＡＫＩ社製）３本に計１００ｍｌ各々播種した。これらを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で７〜９日間培養後、生細胞数をカウントしてバイアビリティーが同程度（各々３０％以下）であることを確認した後、各細胞懸濁液を回収した。該細胞懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収し、１００００ｒｐｍ、４℃の条件で１時間の遠心分離を行った後、０．２２μｍ孔径１５０ｍｌ容ＰＥＳ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ＮＡＬＧＥＮＥ社製）を用いて濾過した。
０．８ｃｍ径のカラムにＰｒｏｓｅｐ−Ａ ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ（ｂｉｏＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ社製）を厚さ２ｃｍで充填し、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１０ｍｌおよび１ｍｏｌ／ｌグリシン／ＮａＯＨ−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１０ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清 各１００ｍｌをカラムに通筒し、１ｍｏｌ／ｌ グリシン／ＮａＯＨ−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）５０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）２．５ｍｌを用いてＰｒｏｓｅｐ−Ａに吸着した抗体の溶出を行い、溶出液を５００μｌずつ分画すると共に、各画分をそれぞれ２ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌと混合して中和した。ＢＣＡ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１５０，７６（１９８５）］を用いて抗体を高濃度で含む２画分（計１．２ｍｌ）を選択して合一し、１０ｍｏｌ／ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。
（５）マウスα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子過剰発現株が産生する抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
本項（４）で精製した抗ＧＤ３抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、ＧＤ３陽性細胞であるヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１［理化学研究所セルバンク，ＲＣＢ０９９１］を用いてＡＤＣＣ活性を測定した。
１０％ ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）（以下、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）と略記する）で継代培養したＧ−３６１細胞１×１０６個をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５００μｌに懸濁し、Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４ ３．７ＭＢｑを添加して３７℃で３０分間培養することにより、細胞の放射線標識を行った。１２００ｒｐｍで５分の遠心分離を行った後、上清を除去し、標識細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５ｍｌに懸濁した。この洗浄操作を３回繰り返した後、細胞懸濁液を氷上で３０分間静置して放射性物質を自然解離させた。再び上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５ｍｌに懸濁することにより、２×１０５個／ｍｌの標的細胞懸濁液を調製した。
一方、健常人の静脈血 ３０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍｌを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水（大塚製薬社製）３０ｍｌと混合した。混合後、各１０ｍｌをそれぞれＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ ＰＨＡＲＭＡ
ＡＳ社製）４ｍｌ上に穏やかに重層し、室温下２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。分離された単核球画分を各遠心管より集めて合一し、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）３０ｍｌに懸濁した。室温下１２００ｒｐｍで１５分の遠心分離を行った後、上清を除去し、該細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）２０ｍｌに懸濁した。この洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）を用いて２×１０６個／ｍｌのエフェクター細胞懸濁液を調製した。
９６穴Ｕ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各穴に標的細胞懸濁液を５０μｌずつ（１×１０４個／穴）分注した。続いて各穴にエフェクター細胞懸濁液を１００μｌずつ（２×１０５個／穴）分注することにより、エフェクター細胞と標的細胞の比を２０：１とした。次に１０Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、本項（４）で得た各種抗ＧＤ３抗体より０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの希釈系列を調製し、該希釈溶液を各ウェルに５０μｌ添加することにより、終濃度０．００２５μｇ／ｍｌ、０．０２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌとした。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４時間反応させた後、プレートに対し１２００ｒｐｍで５分の遠心分離を行った。各穴の上清５０μｌを１２ｍｍ径ＲＩＡチューブ（ＩＷＡＫＩ社製）に分取し、ＭＩＮＡＸ−γオートガンマーカウンター５５５０（ＰＡＣＫＲＤ社製）を用いて解離５１Ｃｒ量の測定を行った。
また、エフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えてＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）１５０μｌを添加した系で上記の反応を行うことにより、自然解離５１Ｃｒ量の値を求めた。さらにエフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えて１規定 塩酸 １００μｌおよびＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５０μｌを添加した系で上記の反応を行うことにより、全解離５１Ｃｒ量の値を求めた。これらの値を用いて実施例２の２項（３）記載の式（ＩＩ）により、ＡＤＣＣ活性を求めた。
第２９図に各種抗ＧＤ３抗体のＧ−３６１細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した。第２８図においてＦＵＴ８発現量が低かったｍｆＦＵＴ８−１、ｍｆＦＵＴ８−２、ｍｆＦＵＴ８−４の３株は、ネガティブコントロールであるｐＡＧＥ２４９株導入株と同等の高いＡＤＣＣ活性を示した。一方、第２８図においてＦＵＴ８発現量が高かったｍｆＦＵＴ８−３、ｍｆＦＵＴ８−６、ｍｆＦＵＴ８−７の３株は、ＣＨＯ細胞より取得した抗ＧＤ３抗体と同等の低いＡＤＣＣ活性を示した。以上の結果より、宿主細胞のＦＵＴ８発現量を調節することにより、産生抗体のＡＤＣＣ活性を調節し得ることが示された。
（６）マウスα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子過剰発現株が産生する抗体の糖鎖解析
本項（４）で精製した抗ＧＤ３抗体の糖鎖解析を行った。ｍｆＦＵＴ８−６、ｐＡＧＥ２４９株導入株が産生する抗体のヒドラジン分解を行い、糖鎖をタンパク質から切断した［メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３，１９８２］。減圧留去することによってヒドラジンを除去した後、酢酸アンモニウム水溶液と無水酢酸加えてＮ−アセチル化を行った。凍結乾燥後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７，１９８４］。蛍光標識した糖鎖群（ＰＡ化糖鎖群）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った（第３０図）。ピーク面積から計算すると、ｍｆＦＵＴ８−６のα−１，６−フコースのない糖鎖含量は１０％、α−１，６−フコース結合糖鎖含量は９０％であった。ｐＡＧＥ２４９のα−１，６−フコースのない糖鎖含量は２０％、α−１，６−フコース結合糖鎖含量は８０％であった。以上の結果から、ＦＵＴ８遺伝子を過剰発現させることにより、産生抗体のα−１，６−フコース結合糖鎖含量が増加することがわかった。
第３０図は、ｍｆＦＵＴ８−６、ｐＡＧＥ２４９導入株によって産生した抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。第３０Ａ図にｍｆＦＵＴ８−６、第３０Ｂ図にｐＡＧＥ２４９の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。緩衝液Ａとしてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、緩衝液Ｂとしてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）＋ ０．５％１−ブタノールを用い、以下のグラジエントで分析した。
Figure 0005770783
第３０図と第３１図で示した（ｉ）〜（ｉｘ）のピークは、以下の構造を示す。
Figure 0005770783
Figure 0005770783
ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。第３０図と第３１図において、α−１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は、（ｉ）〜（ｉｘ）のうち（ｉ）〜（ｉｖ）のピークが占める面積、α−１，６−フコースが結合した糖鎖群の割合は、（ｉ）〜（ｉｘ）のうち（ｖ）〜（ｉｘ）のピークが占める面積から算出した。
実施例１２．ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子の取得
（１）ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）ｃＤＮＡ配列の取得
実施例９（１）において培養２日目のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より調製した一本鎖ｃＤＮＡより、以下の手順でチャイニーズハムスターＦＵＴ８ ｃＤＮＡを取得した（第３２図）。まず、マウスＦＵＴ８のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ，ＡＢ０２５１９８）より、５’側非翻訳領域に特異的なフォワードプライマー（配列番号２１に示す）および３’側非翻訳領域に特異的なリバースプライマー（配列番号２２に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、前述のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ｃＤＮＡ １μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、４％ＤＭＳＯ、０．５μｍｏｌ／ｌ 上記特異的プライマー（配列番号２１および配列番号２２）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約２Ｋｂを精製した。このＤＮＡ断片４μｌを、ＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従ってプラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちｃＤＮＡが組み込まれた８クローンから、公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。
各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、全ての挿入ｃＤＮＡが、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のＯＲＦ全長を含む配列をコードすることを確認した。このうちＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、本プラスミドをＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１と称す。決定したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示した。また、そのアミノ酸配列を配列番号２３に示した。
（２）ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）ゲノム配列の取得
本項（１）で取得したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ ＯＲＦ全長ｃＤＮＡ断片をプローブとして用い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来λ−ファージゲノムライブラリー（ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ社製）よりモレキュラー・クローニング第２版、 カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）等に記載の公知のゲノムスクリーニングの方法に従いＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ゲノムクローンを取得した。次に、取得したゲノムクローンを各種制限酵素を用いて消化後、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８ ｃＤＮＡの開始コドンを含むＡｆａＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片（約２８０ｂｐ）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、陽性を示した制限酵素断片のうちＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片（約２．５Ｋｂ）およびＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片（約６．５Ｋｂ）を選択してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）へ各々挿入した。
取得した各ゲノム断片の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片はＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含む上流イントロン約２．５Ｋｂの配列を、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片はＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含む下流イントロン約６．５Ｋｂの配列を各々コードすることを確認した。以下、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を含むプラスミドをｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２、ＳａｃＩ−ＳａｃＩ断片を含むプラスミドをｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４と称す。決定したＣＨＯ細胞ＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域の塩基配列（約９．０Ｋｂ）を配列番号３に示した。
実施例１３．α−１，６−フコース転移酵素遺伝子を破壊したＣＨＯ細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
ＣＨＯ細胞α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子エクソン２を含むゲノム領域を欠失したＣＨＯ細胞を作製し、該細胞が生産する抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
１．チャイニーズハムスターα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築
（１）プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏの構築
以下の手順でプラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏを構築した（第３３図）。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、特開平１１−３１４５１２号公報に記載のプラスミドｐｌｏｘＰ １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．０ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＰｕｒｏ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．５μｌ、プラスミドｐｌｏｘＰ由来のＡｓｃＩ−ＡｓｃＩ断片（約２．０Ｋｂ）０．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐｌｏｘＰＰｕｒｏと称す。
（２）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１の構築
実施例１２（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１を構築した（第３４図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２ ２．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ １（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ １（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２由来のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．５μｌ、プラスミドＬＩＴＭＵＳ２８由来のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（約２．８Ｋｂ）０．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１と称す。
（３）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２の構築
本項（２）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２を構築した（第３５図）。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１ ２．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ １（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏ １．０μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＨｐａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ １（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−１由来のＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ断片（約１．５Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐｌｏｘＰＰｕｒｏ由来のＨｐａＩ−ＫｐｎＩ断片（約３．５Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２と称す。
（４）プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築
実施例１２（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３を構築した（第３６図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４ ２．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ １（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｐａＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用い、添付の説明書に従ってＤＮＡ末端の平滑化を行った。フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行ってＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４由来のＨｐａＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．５Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３９由来のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約２．８Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３と称す。
（５）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３の構築
実施例１２（２）で得たチャイニーズハムスターＦＵＴ８のエクソン２を含むゲノム領域を有するプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３を構築した（第３７図）。
プラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４ ２．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１．８ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．０ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−４由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約１．８Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約３．０Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３と称す。
（６）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４の構築
本項（４）および（５）で得たプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３およびｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４を構築した（第３８図）。
プラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３ １．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約３．６ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３ １．０μｇを、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３５μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ３５μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．５μｌを添加し、６５℃で３０分間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水１０μｌに溶解した。
上記で得たプラスミドｐｓｃＦＵＴ８ｇＥ２−３由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．１Ｋｂ）４．０μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−３由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約４．８Ｋｂ）１．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４と称す。
（７）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５の構築
本項（３）および（６）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２およびｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５を構築した（第３９図）。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２ １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて２５℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３０μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．０μｌを添加し、６５℃で１時間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水 １０μｌに溶解した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４ １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位を加えて２５℃で２時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）３０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約５．２ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−２由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．０Ｋｂ）０．５μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−４由来のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片（約５．４２ Ｋｂ）４．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で１５時間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５と称す。
（８）プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの構築
本項（７）で得たプラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５を用いて、以下の手順でプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを構築した（第４０図）。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ジフテリアトキシン発現ユニットを含む約１．２ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５ １．０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）５０μｌに溶解し、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１６単位を加えて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、ｐＨ８．０の１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ３０μｌおよび大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）３．０μｌを添加し、６５℃で１時間反応させることによりＤＮＡ末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したＤＮＡ断片を滅菌水 １０μｌに溶解した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ由来のＲｓｒＩＩ−ＲｓｒＩＩ断片（約１．２Ｋｂ）１．０μｌ、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８ｇＥ２−５由来のＲｓｒＩＩ−ＲｓｒＩＩ断片（約１０．４Ｋｂ）１．０μｌ、滅菌水３．０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５．０μｌを混合し、１６℃で３０分間反応させることにより結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドＤＮＡを単離した。本プラスミドを以下、ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏと称す。
２．α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子エクソン２を含むゲノム領域を１コピー破壊したＣＨＯ細胞の作製
（１）ターゲティングベクターの導入
本実施例第１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを実施例８の１（２）で作製した５−０３株へ導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏの５−０３株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ １５０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１．８ｍｌに溶解し、６００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、５−０３株をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２）に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。同様にしてキュベット３０本分に対し遺伝子導入した後、細胞懸濁液を１０％ ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）３０枚へ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１５μｇ／ｍｌＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１０ｍｌずつ分注した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１０日間の培養を行い、ピューロマイシン耐性株を取得した。
（２）ターゲティングベクター導入株の取得
本項（１）で得たピューロマイシン耐性株より任意の９００個のコロニーを以下の手順で採取した。まず、ピューロマイシン耐性株が出現した１０ｃｍ ディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液 ７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、１５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地（２０％ ＤＭＳＯ、４０％ ウシ胎児血清、４０％ ＩＭＤＭ）と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。レプリカプレートは、１５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した。
（３）ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断
本項（２）で得た９００クローンに対し、以下の手順でゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断を行った。まず、本項（２）で作製したレプリカプレートより公知の方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ）３０μｌに一晩溶解した。また、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号２６に示す）およびベクター内のｌｏｘＰ配列に結合するプライマー（配列番号２７に示す）を設計した。
ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液を各々１０μｌ含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ 上記遺伝子特異的プライマー（配列番号２６および配列番号２７）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとした３８サイクルの条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＣＨＯ細胞ゲノム領域とターゲティングベクター相同領域との境界部を含む約１．７Ｋｂの特異的増幅が認められるものを陽性クローンとした。本法により陽性を示す１クローンを見出した。
（４）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（３）で陽性が確認された１クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、本項（３）で見出された陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、陽性クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ）１５０μｌに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ １２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに溶解し、２５単位の制限酵素ＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）２０μｌに溶解し、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号２８および配列番号２９）を設計した。次に、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、実施例１２（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２ ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ 上記遺伝子特異的プライマー（配列番号２８および配列番号２９）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液 ５μｌに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５ラＳＳＰＥ、５０ラＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ］１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で二晩暴露し現像した。
前述の制限酵素ＰｓｔＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約４．４ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約６．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。
本法により、本項（３）における陽性クローンのゲノムＤＮＡより上記約４．４Ｋｂおよび約６．０Ｋｂの特異的断片が見出された。両断片の量比が１：１であったことから、本クローンは、ＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊したクローンであることが確認された。本クローンを以下、１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６株と称す。
３．α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子を１コピー破壊したＣＨＯ細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例第２項で作製した１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６株へ、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を導入した。
プラスミドｐＢＳ１８５の１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。
まず、１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６株をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）をプラスミドｐＢＳ１８５ ４μｇと混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。
導入後、細胞懸濁液を１０％ ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０ｍｌに懸濁し、さらに同培地を用いて２万倍希釈した。接着細胞培養用１０ｃｍ ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）７枚へ播種後、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。培養後、上清を除去し、１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１０ｍｌずつ分注した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１０日間の培養を行った。
（２）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
本項（１）で得た株より任意の４００個のコロニーを以下の手順で採取した。
まず、１０ｃｍ ディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍｌを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地（２０％ＤＭＳＯ、４０％ ウシ胎児血清、４０％ ＩＭＤＭ）と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレプリカプレートを作製する一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
次に、レプリカプレートを１５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて６日間培養した。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によりｌｏｘＰ配列に挟まれたピューロマイシン耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、ピューロマイシン存在下で死滅する。 本選択法により９１個の陽性クローンを見出した。
（３）ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項（２）で見出された陽性クローンのうち任意の６クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、上記６クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、上記クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ）１５０μｌに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ １２μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１２０μｌに溶解し、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）２０μｌに溶解し、０．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号３０および配列番号３１）を設計した。次に、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、実施例１２（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２ ４．０ｎｇを含む２０μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号３０および配列番号３１）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μｌに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ １．７５ＭＢｑおよび Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液（５ラＳＳＰＥ、５０ラＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ）１５ｍｌを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ５０ｍｌに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で二晩暴露し現像した。
前述の制限酵素ＢａｍＨＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約１９．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。また、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約１２．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。さらに、相同組換えが起こった対立遺伝子からピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去された場合には、同処理により約１１．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。
本法により、上記６クローンのうち５クローンのゲノムＤＮＡより上記約１９．０Ｋｂおよび約１１．０Ｋｂの特異的断片が見出された。両断片の量比が１：１であったことから、ＦＵＴ８ゲノム領域を１コピー破壊した株よりピューロマイシン耐性遺伝子が除去されたことが示された。本クローンを以下、１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６−１株と称す。尚、上述の１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６−１株、１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６株、及び、５−０３株のゲノムサザンの結果を第４１図に示した。なお１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６−１株は２−４６−１の株名で、平成１３年９月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７７５５として寄託されている。
４．α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子破壊株が産生する抗体の精製
本実施例第３項で得たＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊した株１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６−１株を、３×１０５個／ｍｌの密度で１５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）および１０％ ウシ胎児透析血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）へ懸濁後、接着細胞培養用Ｔ１８２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）２本に計６０ｍｌ各々播種した。３日間の培養後、上清を除去し、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）計６０ｍｌへ交換した。
これを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養後、細胞懸濁液を回収した。該細胞懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収し、１００００ｒｐｍ、４℃の条件で１時間の遠心分離を行った後、０．２２μｍ孔径１５０ｍｌ容ＰＥＳ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ＮＡＬＧＥＮＥ社製）を用いて濾過した。
０．８ｃｍ径のカラムにＰｒｏｓｅｐ−Ａ ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ（ｂｉｏＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ社製）を厚さ２ｃｍで充填し、０．１ｍｏｌ／ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１０ｍｌおよび１ｍｏｌ／ｌ グリシン／ＮａＯＨ−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１０ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清１００ｍｌをカラムに通塔し、１ｍｏｌ／ｌ グリシン／ＮａＯＨ−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）５０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．１ｍｏｌ／ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）２．５ｍｌを用いてＰｒｏｓｅｐ−Ａに吸着した抗体の溶出を行い、溶出液を５００μｌずつ分画すると共に、各画分をそれぞれ２ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌと混合して中和した。ＢＣＡ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１５０，７６（１９８５）］を用いて抗体を高濃度で含む２画分（計１．２ｍｌ）を選択して合一し、１０ｍｏｌ／ｌ クエン酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。
５．α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子破壊株が産生する抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
本実施例第４項で精製した抗ＣＣＲ４抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、実施例８に記載のＣＣＲ４陽性細胞株ＣＣＲ４／ＥＬ−４を用いたＡＤＣＣ活性を行った。
１０％ ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）（以下、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）と略記する）で継代培養したＣＣＲ４／ＥＬ−４株１×１０６個をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５００μｌに懸濁し、Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４ ３．７ＭＢｑを添加して３７℃で９０分間培養することにより、細胞の放射線標識を行った。１２００ｒｐｍで５分の遠心分離を行った後、上清を除去し、標識細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５ｍｌに懸濁した。この洗浄操作を３回繰り返した後、細胞懸濁液を氷上で３０分間静置して放射性物質を自然解離させた。再び上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５ｍｌに懸濁することにより、２．０×１０５個／ｍｌの標的細胞懸濁液を調製した。
一方、健常人の静脈血 ３０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍｌを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水（大塚製薬社製）３０ｍｌと混合した。混合後、各１０ｍｌをそれぞれＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ ＰＨＡＲＭＡ
ＡＳ社製）４ｍｌ上に穏やかに重層し、室温下２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。分離された単核球画分を各遠心管より集めて合一し、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）３０ｍｌに懸濁した。室温下１２００ｒｐｍで１５分の遠心分離を行った後、上清を除去し、該細胞をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）２０ｍｌに懸濁した。この洗浄操作を２回繰り返した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）を用いて２．５×１０６個／ｍｌのエフェクター細胞懸濁液を調製した。
９６穴Ｕ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各穴に標的細胞懸濁液を５０μｌずつ（１×１０４個／穴）分注した。続いて各穴にエフェクター細胞懸濁液を１００μｌずつ（２．５×１０５個／穴）分注することにより、エフェクター細胞と標的細胞の比を２５：１とした。次にＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）を用いて、本実施例第４項で得た各抗ＣＣＲ４抗体より０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの希釈系列を調製し、該希釈溶液を各ウェルに５０μｌ添加することにより、終濃度０．００２５μｇ／ｍｌ、０．０２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌとした。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４時間反応させた後、プレートに対し１２００ｒｐｍで５分の遠心分離を行った。各穴の上清７５μｌを１２ｍｍ径ＲＩＡチューブ（ＩＷＡＫＩ社製）に分取し、ＭＩＮＡＸ−αオートガンマーカウンター５５５０（ＰＡＣＫＲＤ社製）を用いて解離５１Ｃｒ量の測定を行った。
また、エフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えてＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）１５０μｌを添加した系で上記の反応を行うことにより、自然解離５１Ｃｒ量の値を求めた。さらにエフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えて１規定 塩酸 １００μｌおよびＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）５０μｌを添加した系で上記の反応を行うことにより、全解離５１Ｃｒ量の値を求めた。
これらの値を用いて前記式（ＩＩ）により、ＡＤＣＣ活性を求めた。
第４２図に各種抗ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性を示した。ＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊した１ｓｔ．△ＦＵＴ８ ２−４６−１株より得た抗体は、該遺伝子破壊前のＣＨＯ細胞５−０３株が産生する抗体に比べ有意に高いＡＤＣＣ活性を示した。また、これら抗体での抗原結合活性には変化は観察されなかった。以上の結果より、宿主細胞のＦＵＴ８対立遺伝子を破壊することにより、産生抗体のＡＤＣＣ活性を向上し得ることが確認された。
実施例１４．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
（１）レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株の取得
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地［ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１倍濃度含むＩＭＤＭ培地］にて接着培養用フラスコ７５ｃｍ２（グライナー社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。５ｍｌのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、ダルベッコＰＢＳで希釈した０．０５％トリプシン（インビトロジェン社製）を１．５ｍｌ添加して３７℃にて５分間放置し、細胞を培養器底面から剥離させた。
剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心操作により回収し、１エ１０５細胞／ｍｌの密度になるようにＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地を添加して懸濁後、未添加又は０．１μｇ／ｍｌのアルキル化剤であるＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎ（以下、ＭＮＮＧと表記、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、培養上清を除き、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）培地に懸濁後、接着培養用９６穴プレート（岩城硝子社製）に１０００細胞／ウエルの密度で播種した。
各ウエルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍｌのレンズマメ凝集素（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのヒイロチャワンタケ凝集素（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ；以下、ＡＡＬと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）、あるいは１ｍｇ／ｍｌのインゲンマメ凝集素（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、Ｌ−ＰＨＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。
ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したコロニーをレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株として取得した。取得したそれぞれのレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株については、ＬＣＡ耐性株をＣＨＯ−ＬＣＡ株、ＡＡＬ耐性株をＣＨＯ−ＡＡＬ株、Ｌ−ＰＨＡ耐性株をＣＨＯ−ＰＨＡ株と名付けた。取得したこれら株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、ＣＨＯ−ＬＣＡ株はＡＡＬに対しても耐性であり、ＣＨＯ−ＡＡＬ株はＬＣＡに対しても耐性であることが分かった。
さらに、ＣＨＯ−ＬＣＡ株及びＣＨＯ−ＡＡＬ株は、ＬＣＡやＡＡＬが認識する糖鎖構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位とフコースの１位がα結合で付加された糖鎖構造を認識するレクチンに対しても耐性を示した。
具体的には、終濃度１ｍｇ／ｍｌのエンドウマメ凝集素（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ
Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＰＳＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地でもＣＨＯ−ＬＣＡ株及びＣＨＯ−ＡＡＬ株は耐性を示し生存することが分かった。また、アルキル化剤ＭＮＮＧ無添加の場合でも、上述の処理を施す細胞数を増やすことでレクチン耐性株を取得することが可能であった。以後、それら株を解析に用いた。
（２）抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞の作製
上記（１）で得られた３種類のレクチン耐性株に、実施例８に記載した方法で、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を導入し、薬剤ＭＴＸによる遺伝子増幅を行い、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産株を作製した。抗体発現量の測定は実施例８の２に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて行い、ＣＨＯ−ＬＣＡ株、ＣＨＯ−ＡＡＬ株、ＣＨＯ−ＰＨＡ株、それぞれから抗体を発現した形質転換株を取得した。
取得したそれぞれの形質転換株については、ＣＨＯ−ＬＣＡ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株、ＣＨＯ−ＡＡＬ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株、ＣＨＯ−ＰＨＡ株由来の形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株と名付けた。なおＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株はＮｅｇａ−１３の株名で、平成１３年９月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７７５６として寄託されている。
（３）レクチン耐性ＣＨＯ細胞による高ＡＤＣＣ活性抗体の生産
上記（２）で得られた３種類の形質転換株を用い、実施例８の３に記載した方法で精製抗体を取得した。各抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品の抗原結合活性は実施例８の２に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。いずれの形質転換株が生産する抗体も、実施例８で作製した通常のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主とした組換え細胞株（５−０３株）が生産する抗体と同等の抗原結合活性を示した。
それら精製抗体を用い、実施例８の７に記載した方法にしたがって各抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品のＡＤＣＣ活性を評価した。その結果を図４３に示した。５−０３株が生産した抗体と比較して、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株及びＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産した抗体では、約１００倍程度のＡＤＣＣ活性の上昇が観察された。一方、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＰＨＡ株が生産した抗体では有意なＡＤＣＣ活性の上昇は観察されなかった。
また、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株とＹＢ２／０株が生産した抗体のＡＤＣＣ活性を実施例８の７に記載した方法にしたがって比較したところ、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体は実施例８の１で作製したＹＢ２／０細胞株が生産した抗体ＫＭ２７６０−１と同様に、５−０３株が生産した抗体に比べ高いＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった（第４４図）。
（４）レクチン耐性ＣＨＯ細胞が生産する抗体の糖鎖解析
上記（３）で精製した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の糖鎖解析を行った。精製したそれぞれの抗体を、ウルトラフリー０．５−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４に溶液を置換した。置換倍率は８０倍以上になるように行なった。抗体は、ＵＶ−１６００（島津社製）を用いて濃度を測定した。抗体のアミノ酸配列から式（ＩＩＩ）［アドバンスズ・イン・プロテインケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１２，３０３，１９６２］を用いてモル吸光定数を算出し、２８０ｎｍの吸光度１．０を１．３８ｍｇ／ｍｌとして濃度を決定した。
Figure 0005770783
Ｅ１ｍｏｌ／ｍｌ ＝ Ｅ１ｍｏｌ／ｌ ／ＭＷ
Ｅ１ｍｏｌ／ｌ： ２８０ｎｍでの吸光係数（ｍｇ−１ ｍｌ ｃｍ−１）
Ｅ１ｍｏｌ／ｍｌ： ２８０ｎｍでのモル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）
Ａ： トリプトファンの２８０ｎｍでのモル吸光係数＝５５５０（Ｍ−１ｃｍ−１）
Ｂ： チロシンの２８０ｎｍでのモル吸光係数＝１３４０（Ｍ−１ｃｍ−１）
Ｃ： シスチンの２８０ｎｍでのモル吸光係数＝２００（Ｍ−１ｃｍ−１）
ｎ１： 抗体１分子あたりのトリプトファンの数
ｎ２： 抗体１分子あたりのチロシンの数
ｎ３： 抗体１分子あたりのシスチンの数
ＭＷ： 抗体の分子量（ｇ／ｍｏｌ）
１００μｇの抗体をヒドラクラブＳ−２０４用Ｔｅｓｔ ｔｕｂｅに入れ、遠心濃縮機にて乾固した。サンプルを乾固させたＴｅｓｔ ｔｕｂｅをホーネン社製ヒドラクラブにてヒドラジン分解を行なった。ヒドラジンはホーネン社製ヒドラジン分解試薬を用い、１１０℃、１時間反応させた［メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３，１９８２］。反応後ヒドラジンを減圧留去させて、反応容器を３０分間放置して室温に戻した。
Ｔｅｓｔ ｔｕｂｅにホーネン社製アセチル化試薬のａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ入れてよく攪拌させ、室温で３０分間反応させた。さらにａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ加えてよく攪拌させ、室温で１時間反応させた。試料を−８０℃のフリーザーで凍結させ、約１７時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料から、ＴａＫａＲａ社製セルロースカートリッジ グリカンプレパレーションキットを用いて糖鎖を回収した。
試料糖鎖溶液を遠心濃縮機にて乾固後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７，１９８４］。２−アミノピリジン溶液は２−アミノピリジン１ｇに対しＨＣｌ７６０μｌを加え（１×ＰＡ溶液）、その溶液を逆浸透精製水で１０倍に希釈したものを用いた（１０倍希釈ＰＡ溶液）。シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇに対し１×ＰＡ溶液２０μｌ、逆浸透精製水４３０μｌを加えて調製した。
試料に１０倍希釈ＰＡ溶液を６７μｌ入れて１００℃、１５分反応させ、放冷後にシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を２μｌ入れて９０℃、１２時間反応させて試料糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識した糖鎖群（ＰＡ化糖鎖群）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。溶離液は１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム、流速は０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行なった。
試料添加後２０分から３０分の溶出液を回収し、遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製、φ６．０ｎｍ×１５０ｎｍ）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った。カラム温度は５５℃、流速は１ｍｌ／ｍｌ、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行なった。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）でカラムを平衡化し、０．５％１−ブタノールの直線濃度勾配にて８０分間溶出した。
各ＰＡ化糖鎖の同定は、分取した各ＰＡ化糖鎖のピークのマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）におけるポストソース分解（Ｐｏｓｔ Ｓｏｕｒｃｅ Ｄｅｃａｙ）分析、ＴａＫａＲａ社製ＰＡ化糖鎖スタンダードとの溶出位置の比較、並びに各種酵素を用いて各ＰＡ化糖鎖を消化後、逆相ＨＰＬＣ分析により行なった（第４５図）。
糖鎖含量は、逆相ＨＰＬＣ分析における各ＰＡ化糖鎖のピーク面積より算出した。還元末端がＮ−アセチルグルコサミンでないＰＡ化糖鎖は、不純物由来であるか、ＰＡ化糖鎖調製中の副反応物であるため、ピーク面積の算出から除外した。
緩衝液Ａとしてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、緩衝液Ｂとしてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）＋ ０．５％ １−ブタノールを用い、実施例１１の（６）と同様に分析した。
第４５図において、α−１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のうち（ｉ
）〜（ｉｖ）のピークが占める面積、α−１，６−フコースが結合した糖鎖群の割合は、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のうち（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）のピークが占める面積から算出した。
レクチン耐性株が生産する抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品の糖鎖構造を分析した結果を第６表に示した。ここで、レクチン耐性株が生産した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の糖鎖を分析した結果を示したものである。実施例１１の（６）に記載した方法で分析しピークの面積から計算した、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合（％）を表に示す。
Figure 0005770783
５−０３株が生産した抗体と比較して、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株が生産した抗体では、分析ピークの面積から計算すると、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が、９％から４８％まで上昇していた。ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＡＬ株が生産した抗体では、α−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が、９％から２７％まで上昇していた。一方、ＰＨＡ耐性株では５−０３株と比較して、糖鎖パターン及びα−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合に殆ど変化は認められなかった。
実施例１５．レクチン耐性ＣＨＯ細胞株の解析
１．抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡにおけるＧＭＤ酵素の発現量解析
実施例１４で取得した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡにおける、フコース生合成酵素として知られるＧＭＤ（ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、ＧＦＰＰ（ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、Ｆｘ（ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、及びフコース転移酵素であるＦＵＴ８（α−１，６−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の各遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
（１）各種細胞株からのＲＮＡ調製
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、実施例８の１（２）で取得した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株５−０３、実施例１４（２）で取得した抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡをそれぞれ３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内にて継代後４日間培養した。培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、各１×１０７細胞より添付の使用説明書に従ってＲＮＡを調製した。続いて、ＳＵＰＥＲ ＳＣＲＩＰＴ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用い、添付の使用説明書に従って各ＲＮＡ５μｇより２０μｌの反応液中にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＧＭＤ遺伝子の発現量解析
ＧＭＤ ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、実施例１７の１で示すＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ
ｃＤＮＡ配列より、配列番号３２で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーと配列番号３３で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーを作製した。
続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３２と３３の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約３５０ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＧＦＰＰ遺伝子の発現量解析
ＧＦＰＰ ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、実施例１６の２で取得したＣＨＯ細胞由来ＧＦＰＰのｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号３４で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーと配列番号３５で示される塩基配列を有する２３ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーを作製した。
続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３４と３５の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２４サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約６００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＦｘ遺伝子の発現量解析
Ｆｘ ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、実施例１６の１で取得したＣＨＯ細胞由来ＦＸの ｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号３６で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーと配列番号３７で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーを作製した。
続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３６と３７の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２２サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約３００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（５）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＦＵＴ８遺伝子の発現量解析
ＦＵＴ８ ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号１３ と１４ の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２０サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約６００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（６）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたβ−アクチン遺伝子の発現量解析
β−アクチンｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号１５と１６の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを１４サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約８００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。
（７）各細胞株におけるＧＭＤ、ＧＦＰＰ、Ｆｘ、ＦＵＴ８遺伝子の発現量
本項（２）から（６）で測定した各細胞株におけるＧＭＤ、ＧＦＰＰ、Ｆｘ、ＦＵＴ ｃＤＮＡ由来ＰＣＲ増幅断片量の値を、各細胞株におけるβ−アクチンのｃＤＮＡ由来ＰＣＲ増幅断片量の値で割り、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＰＣＲ増幅断片量を１とした場合の５−０３株及びＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株における各遺伝子のＰＣＲ増幅断片量を求めた。結果を第７表に示す。
Figure 0005770783
第７表で示したようにＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株のＧＭＤ遺伝子の発現量が他の細胞株と比べ１／１０程度に低下していた。なお、本実験は独立して２回行い、その平均値を使用した。
２．ＧＭＤ遺伝子を強制発現させた抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞株ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡを用いた解析
（１）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ２４９ＧＭＤの構築
実施例１７の１で取得したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ のｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号３８で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマー、及び配列番号３９で示される塩基配列を有する２９ｍｅｒのプライマーを作製した。
続いて、本実施例１項（１）で作製したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号３８と３９の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、５８℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２２サイクル反復した。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約６００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｍｔ−Ｃを得た（第４６図参照）。
次に、実施例１７の１で取得したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤのｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号４０で示される塩基配列を有する４５ｍｅｒのプライマー、及び配列番号４１で示される塩基配列を有する３１ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、本実施例１項（１）で作製したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号４０と４１の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、５７℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを８サイクル反復した後、さらに９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを２２サイクル反復した。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約１５０ｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドＡＴＧを得た（第４７図参照）。
次に、実施例１７の１で作製した３μｇのプラスミドＣＨＯ−ＧＭＤを制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画後、約９００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
１．４μｇのプラスミドｍｔ−Ｃを制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約３．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＷＴ−Ｎ（−）を得た（第４８図参照）。
次に、２μｇのプラスミドＷＴ−Ｎ（−）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
３μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＷＴ−Ｎ（−）ｉｎ ｐＢＳを得た（第４９図参照）。
次に、２μｇのプラスミドＷＴ−Ｎ（−）ｉｎ ｐＢＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
２μｇのプラスミドＡＴＧを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行なってＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＷＴ ｉｎ ｐＢＳを得た（第５０図参照）。
次に、２μｇのプラスミドｐＡＧＥ２４９を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（共に宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約６．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。２μｇのプラスミドＷＴ ｉｎ ｐＢＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ（共に宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを得た（第５１図参照）。
（２）ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡにおけるＧＭＤ遺伝子の安定発現
制限酵素ＦｓｐＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で切断することにより直鎖状としたＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを５μｇ、１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭの濃度で含む３０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地を１０％含むＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）］に懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。培養後、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に培地交換してさらに１９日間培養し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株のコロニー群を取得した。
また同様に、ｐＡＧＥ２４９ベクターを上記と同じ方法でＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株へ導入し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株のコロニー群を取得した。
（３）ＧＭＤ遺伝子を発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株の培養及び抗体の精製
本項（２）で取得したＧＭＤを発現している形質転換細胞群をＭＴＸ（ＳＵＧＭＡ社製）を２００ｎＭ、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地を用いて、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍｌのＰＢＳバッファー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にて細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を３５ｍｌ注入した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。
また同様に、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入した形質転換細胞群を上記と同じ方法で培養後、培養上清より抗ＣＣＲ４キメラ抗体を回収、精製した。
（４）形質転換細胞群におけるレクチン耐性度の測定
本項（２）で取得したＧＭＤ遺伝子を発現している形質転換細胞群を、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭ、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に６×１０４細胞／ｍｌになるように懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に５０μｌ／ウェルずつ分注した。
続いて、このウェルにＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を２００ｎＭ、ハイグロマイシンを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に０ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌの濃度でＬＣＡ（ＬＥＮＳ ＣＵＬＩＮＡＲＩＳ ＡＧＧＬＵＴＩＮＩＮ：Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を懸濁した培地を５０μｌずつ加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で９６時間培養した。
培養後、ＷＳＴ−Ｉ（ベーリンガー社製）を１０μｌ／ウェルになるよう加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間放置して発色させたのち、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度（以下ＯＤ４５０、ＯＤ５９５と表記する）を測定した。また同様に、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入した形質転換細胞群も上記と同じ方法で測定した。以上の実験は独立して２回行なった。
上記で測定したＯＤ４５０からＯＤ５９５を引いた値を各細胞群の生存数とし、ＬＣＡを加えていないウェルの細胞生存数を１００％とした場合の各ウェルの細胞生存数を％で表記し第５２図に示した。
第５２図に示したように、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株ではＬＣＡ耐性度の低下が観察され、０．２ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下での細胞生存率は４０％程度、０．８ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下での細胞生存率は２０％程度であった。
一方、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株では、０．２ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下での細胞生存率は１００％、０．８ｍｇ／ｍｌのＬＣＡ存在下においても細胞生存率は８０％程度であった。以上の結果より、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株はＧＭＤ遺伝子の発現量が低下しており、その結果ＬＣＡに対する耐性を獲得していることが示唆された。
（５）ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
本項（３）で得られた精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
ｉ）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に５００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８硫酸塩（ナカライテスク製）を添加した培地で培養したＣＣＲ４−ＥＬ４株（実施例８の７参照）の１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で９０分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２．５×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
ｉｉ）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
ｉｉｉ）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記ｉ）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いでｉｉ）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２５：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＣＲ４キメラ抗体（本項（３）で精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体、及びＫＭ２７６０−１、ＫＭ３０６０）を最終濃度０．００２５〜２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。
反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は前記式（ＩＩ）により求めた。
ＡＤＣＣ活性測定の結果を第５３図に示した。第５３図に示したように、ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、実施例８で取得したＫＭ３０６０と同程度にまで低下していた。一方、ｐＡＧＥ２４９ベクターを導入したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性は、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体と同程度のＡＤＣＣ活性を有していた。以上の結果より、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株はＧＭＤ遺伝子の発現量が低下しており、その結果ＡＤＣＣ活性の高い抗体を生産出来ることが示唆された。
（６）ＧＭＤを発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖解析
本項（３）で得られた精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖解析を実施例１４（４）に示す方法に従って行ない、その解析結果を第５５図に示した。実施例１４で作製したＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡより取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体と比較して、ＧＭＤ遺伝子を発現させたＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株より取得した精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体では、分析ピークの面積から計算するとα−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が９％に低下していた。以上より、ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＬＣＡ株にＧＭＤ遺伝子を発現させることによって、該細胞の生産する抗体のα−１，６−フコースを持たない糖鎖の割合が５−０３株の生産する抗体と同程度まで低下することが示された。
実施例１６．ＣＨＯ細胞由来の糖鎖合成に係わる各種酵素遺伝子の取得
１．ＣＨＯ細胞のＦｘ ｃＤＮＡ配列の決定（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全ＲＮＡの抽出
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、培養２日目に１×１０７個を回収後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により添付の説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全一本鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製した全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた全ＲＮＡ３μｌに対しＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ
Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＧＦＰＰおよびＦｘのクローニングには該反応液の５０倍希釈水溶液を使用した。使用するまで−８０℃で保管した。
（３）チャイニーズハムスターＦｘのｃＤＮＡ部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターＦｘのｃＤＮＡ部分断片を取得した。
まず公的データーベースに登録されているヒトＦｘのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登録番号Ｕ５８７６６）およびマウスのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登録番号Ｍ３０１２７）に共通の塩基配列に対して特異的なプライマー（配列番号４２および配列番号４３に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号４２および配列番号４３）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片３０１ｂｐをＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した（以下、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いた）。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αをコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）、６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）により形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），７，１５１３（１９７９）］（以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いる）に従って、プラスミドＤＮＡを単離し、Ｆｘ ｃＤＮＡ部分断片が組み込まれた２クローンを得た。各々ｐＣＲＦｘクローン８、ｐＣＲＦｘクローン１２と称す。
Ｆｘクローン８、Ｆｘクローン１２に挿入されたｃＤＮＡの塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒａｅｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入ｃＤＮＡがチャイニーズハムスターのＦｘのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）部分配列をコードすることを確認した。
（４）ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの合成
本項（１）で抽出したＣＨＯ／ＤＧ４４ 全ＲＮＡからの５’および３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製を、ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて行った。方法は添付の説明書に従った。ただしＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を逆転写酵素として用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは各々、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ で１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。
（５）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＦｘ全長ｃＤＮＡの決定
上記（３）項で決定したチャイニーズハムスターＦｘの部分配列をもとにチャイニーズハムスターＦｘ に特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＦｘ ＧＳＰ１−１（配列番号４４）およびＦｘ ＧＳＰ１−２（配列番号４５）、チャイニーズハムスターＦｘ 特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＦｘ ＧＳＰ２−１（配列番号４６）およびＦｘ ＧＳＰ２−２（配列番号４７）を設計した。
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本項（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌ チャイニーズハムスターＦｘ特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲは９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より１μｌをとりＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒで５０倍に希釈した水溶液１μｌをテンプレートとして使用し、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。一回目および二回目のＰＣＲで用いた、プライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長を第８表に示した。
Figure 0005770783
ＰＣＲ後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片をＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、チャイニーズハムスターＦｘの５’領域を含むｃＤＮＡ５クローンを得た。各々をＦｘ５’クローン２５、Ｆｘ５’クローン２６、Ｆｘ５’クローン２８、Ｆｘ５’クローン３１、Ｆｘ５’クローン３２と称す。
同様にチャイニーズハムスターＦｘの３’領域を含むｃＤＮＡ５クローンを得た。各々Ｆｘ３’をＦｘ３’クローン１、Ｆｘ３’クローン３、Ｆｘ３’クローン６、Ｆｘ３’クローン８、Ｆｘ３’クローン９と称す。
上記、５’および３’ＲＡＣＥにより取得した各クローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。
方法は添付のマニュアルに従った。本法より決定した各ｃＤＮＡの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターＦｘｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。決定した配列（配列番号４８）に示す。
２．ＣＨＯ細胞のＧＦＰＰ ｃＤＮＡ配列の決定
（１）チャイニーズハムスターＧＦＰＰのｃＤＮＡ部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターＧＦＰＰのｃＤＮＡ部分断片を取得した。
まず公的データーベースに登録されているヒトＧＦＰＰのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登録番号ＡＦ０１７４４５）、該配列と相同性の高いマウスＥＳＴ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登録番号ＡＩ４６７１９５、ＡＡ４２２６５８、ＢＥ３０４３２５、ＡＩ４６６４７４）、およびＲａｔ ＥＳＴ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登録番号ＢＦ５４６３７２、ＡＩ０５８４００、ＡＷ１４４７８３）の塩基配列を比較し、３種間で保存性の高い領域にラットＧＦＰＰに特異的なプライマーＧＦＰＰ ＦＷ９およびＧＦＰＰ ＲＶ９（配列番号４９および配列番号５０）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項１（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記ＧＦＰＰ特異的プライマーＧＦＰＰ ＦＷ９およびＧＦＰＰ ＲＶ９（配列番号４９および配列番号５０）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で１０分間加熱する条件で行った。
ＰＣＲ後、反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片１．４ＫｂｐをＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、ＧＦＰＰ
ｃＤＮＡ部分断片が組み込まれた３クローンを得た。各々ＧＦＰＰクローン８、ＧＦＰＰクローン１１、ＧＦＰＰクローン１２と称す。
ＧＦＰＰクローン８、ＧＦＰＰクローン１１、ＧＦＰＰクローン１２に挿入されたｃＤＮＡの塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒａｅｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入ｃＤＮＡがチャイニーズハムスターのＧＦＰＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の部分配列をコードすることを確認した。
（２）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＧＦＰＰ全長ｃＤＮＡの決定
本項２（１）で決定したチャイニーズハムスターＦｘの部分配列をもとにチャイニーズハムスターＦｘに特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＧＦＰＰ ＧＳＰ１−１（配列番号５２）およびＧＦＰＰ ＧＳＰ１−２（配列番号５３）、チャイニーズハムスターＧＦＰＰ 特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＧＦＰＰ ＧＳＰ２−１（配列番号５４）およびＧＦＰＰ ＧＳＰ２−２（配列番号５５）を設計した。
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本項（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡ１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌ チャイニーズハムスターＧＦＰＰ特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲは９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より１μｌをとりＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒで５０倍に希釈した水溶液１μｌをテンプレートとして、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。一回目および二回目のＰＣＲで用いた、プライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長を第９表に示した。
Figure 0005770783
ＰＣＲ後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片をＱｉａｅｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に従って、プラスミドｐＣＲ２．１へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
得られた複数のカナマイシン耐性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、チャイニーズハムスターＧＦＰＰの５’領域を含むｃＤＮＡ４クローンを得た。各々をＧＦＰＰ５’クローン１、ＧＦＰＰ５’クローン２、ＧＦＰＰ５’クローン３、ＧＦＰＰ５’クローン４と称す。
同様にチャイニーズハムスターＧＦＰＰの３’領域を含むｃＤＮＡ３クローンを得た。
各々をＧＦＰＰ３’クローン１０、ＧＦＰＰ３’クローン１６、ＧＦＰＰ３’クローン２０と称す。
上記、５’および３’ＲＡＣＥにより取得した各クローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。塩基配列決定後、各ｃＤＮＡの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターＧＦＰＰ ｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定した。決定した配列（配列番号５１）
に示す。
実施例１７．ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子の取得
１．ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡ配列の決定
（１）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ遺伝子のｃＤＮＡ取得（５’及び３’末端配列を除く部分ｃＤＮＡの取得）
ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＧＭＤ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０４２３７７）をクエリーとして、げっ歯類由来ＧＭＤ ｃＤＮＡを公的データベース（ＢＬＡＳＴ）を用いて検索した結果、３種類のマウスＥＳＴ配列が得られた（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＥ９８６８５６、ＢＦ１５８９８８、ＢＥ２８４７８５）。これらＥＳＴ配列を連結させることにより、推定されるマウスＧＭＤ ｃＤＮＡ配列を決定した。
このマウスＧＭＤ ｃＤＮＡ配列より、配列番号５６で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒのプライマー、配列番号５７で示される塩基配列を有する２７ｍｅｒのプライマー、配列番号５８で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマー、配列番号５９で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、配列番号６０で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。
続いて、ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡを増幅するために以下の方法でＰＣＲを行なった。実施例１５の１項（１）で作製したＣＨＯ細胞由来一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの合成ＤＮＡプライマー２種類］を調製した。なお、合成ＤＮＡプライマーには配列番号５６と配列番号５７、配列番号５８と配列番号５７、配列番号５６と配列番号５９、配列番号５６と配列番号６０の組み合わせを用いた。該反応液をＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
このＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画した結果、配列番号５６と配列番号５７の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１．２ｋｂｐ、配列番号５８と配列番号５７の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１．１ｋｂｐ、配列番号５６と配列番号５９の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約３５０ｂｐ、配列番号５６と配列番号６０の合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ産物では約１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。これらＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド２２−８（配列番号５６と配列番号５７の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）、２３−３（配列番号５８と配列番号５７の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）、３１−５（配列番号５６と配列番号５９の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を有する）、３４−２（配列番号５６と配列番号６０の合成ＤＮＡプライマーから増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を有する）を得た。
これらプラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した（５’末端側の開始メチオニンより下流２８塩基の配列、及び３’末端側の終了コドンより上流２７塩基の配列は合成オリゴＤＮＡ配列由来のため、マウスＧＭＤ ｃＤＮＡ配列である）。
さらに、プラスミド２２−８と３４−２に含まれるＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡを組み合わせたプラスミドを作製するため、以下の工程を行った。１μｇのプラスミド２２−８を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約４ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。
２μｇのプラスミド３４−２を制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃にて１６時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片を、Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で末端を脱リン酸化した後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドＣＨＯ−ＧＭＤを得た（第５４図参照）。
（２）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡの５’末端配列の決定
ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡの５’末端側非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）領域の塩基配列より配列番号６１で示される塩基配列を有する２４ｍｅｒのプライマー、及びＣＨＯ由来ＧＭＤ ｃＤＮＡ配列より配列番号６２で示される塩基配列を有する３２ｍｅｒのプライマーを作製し、ｃＤＮＡを増幅するために以下の方法でＰＣＲを行なった。
実施例１５の１項（１）で得られたＣＨＯ細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡ ０．５μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号６１と配列番号６２の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間のサイクルを２０サイクル行なった後、さらに９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを１８サイクル行なった。
該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付の説明書に従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド５’ＧＭＤを得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用い、該プラスミドに含まれるＣＨＯ由来ＧＭＤ ｃＤＮＡの開始メチオニンより下流２８塩基の配列を決定した。
（３）ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡの３’末端配列の決定
ＣＨＯ細胞由来ＧＭＤの３’末端ｃＤＮＡ配列を得るため、以下の方法でＲＡＣＥ法を行なった。実施例１５の１項（１）で取得したＣＨＯ細胞由来ＲＮＡより、３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製をＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、添付の説明書に従って行なった。ただし、逆転写酵素にはＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。
続いて、上記３’ ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡ １μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号６３で示す２４ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマー［本項（１）で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡ配列より作製］、１倍濃度のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ に付属；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液より１μｌを取り、Ｔｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）で２０倍希釈した水溶液１μｌを鋳型として含む２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号６４で示す２５ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマー［本項（１）で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡ配列より作製］、０．５μＭのＮｅｓｔｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ（ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ に付属；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約７００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡはＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド３’ＧＭＤを得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用い、該プラスミドに含まれるＣＨＯ由来ＧＭＤ ｃＤＮＡの終止コドンより上流２７塩基の配列、及び３’側のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ領域４１５ｂｐの塩基配列を決定した。
以上、本項（１）、（２）、（３）より決定したＣＨＯ由来ＧＭＤ遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号６５、それに対応するアミノ酸配列を配列番号７１に示す。
２．ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＧＭＤ遺伝子を含むゲノム配列の決定
実施例１７の１項で決定したマウスＧＭＤ ｃＤＮＡ配列より、配列番号６６で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、以下の方法でＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡを取得した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地［ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地］に３×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌ／ウェルずつ分注した。
３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内でコンフルエントになるまで培養したのち、該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３（１９７６）］に従ってゲノムＤＮＡを調製し、ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ）１５０μｌに一晩溶解した。
上記で取得したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号５９と配列番号６６の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約１００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｅｘ３を得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用いて該プラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号６７に示した。
次に、実施例１７の１項で決定したＣＨＯ細胞由来ＧＭＤ ｃＤＮＡ配列より、配列番号６８で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマー、及び配列番号６９で示される塩基配列を有する２５ｍｅｒのプライマーを作製した。続いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４由来ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、２０μｌの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号６８と配列番号６９の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約２００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用い、添付マニュアルに従って回収した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミドｅｘ４を得た。ＤＮＡシークエンサー３７７（パーキンエルマー社製）を用いて該プラスミドに含まれるＣＨＯ細胞由来ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号７０に示した。
実施例１８．市販抗体の糖鎖解析
ＣＨＯ細胞を宿主細胞にして産生させた市販抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ社、Ｒｏｃｈｅ社製）の糖鎖解析を、実施例１１の（６）の方法にしたがって行った（第３１図）。ピーク面積から計算すると、 Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのα−１，６−フコースのない糖鎖含量は１６％、α−１，６−フコース結合糖鎖含量は８４％であった。 他の市販抗体に関しても同様の分析を行った結果、Ｒｉｔｕｘａｎ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ社、Ｒｏｃｈｅ社、ＩＤＥＣ社製）、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｒｏｃｈｅ社、ＰＤＬ社製）ではＨｅｒｃｅｐｔｉｎよりもα−１，６−フコースのない糖鎖含量が少なかった。
第３１図は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎから調製したＰＡ化糖鎖を、逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
逆相ＨＰＬＣの分析条件、糖鎖構造、α−１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合の算出は実施例１１の（６）と同じ方法で行った。
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (12)

  1. α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した細胞を用いることを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖が結合し、且つヒトインターロイキン５レセプターα鎖を認識する抗体を含有する抗体組成物であって、全ての該抗体が還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖を有する抗体である抗体組成物の製造方法。
  2. α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した細胞を用いることを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖が結合し、且つヒトインターロイキン５レセプターα鎖を認識する抗体を含有する抗体組成物であって、全ての該抗体が還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖を有する抗体である抗体組成物を有効成分として含有する、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患の診断薬の製造方法。
  3. α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した細胞を用いることを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖が結合し、且つヒトインターロイキン５レセプターα鎖を認識する抗体を含有する抗体組成物であって、全ての該抗体が還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖を有する抗体である抗体組成物を有効成分として含有する、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患の治療薬の製造方法。
  4. α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した細胞を用いることを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖が結合し、且つヒトインターロイキン５レセプターα鎖を認識する抗体を含有する抗体組成物であって、全ての該抗体が還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ−グリコシド結合コンプレックス型糖鎖を有する抗体である抗体組成物を有効成分として含有する、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患の予防薬の製造方法。
  5. 糖鎖が、
    Figure 0005770783
    を含む糖鎖を含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 糖鎖が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した細胞が合成する糖鎖を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 抗体が、ｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０ベクターによってコードされる抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 抗体が、ｐＫＡＮＴＥＸ１２５９ＨＶ３ＬＶ０ベクターによってコードされる抗体の可変領域を含む抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 抗体が、ヒト抗体由来定常領域を含む抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 抗体が、ＩｇＧサブクラスの抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 抗体が、ＩｇＧ１サブクラスの抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
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