KR101420740B1 - 핵초기화 인자 - Google Patents

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Abstract

배아 또는 ES세포를 이용하지 않고 분화된 세포의 초기화를 유도하여, ES세포와 유사한 다능성 또는 증식능을 가지는 유도다능성 줄기세포를 간편하고도 재현성이 좋게 수립하기 위한 수단으로서, 하기 3종의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Myc 패밀리 유전자의 각 유전자 산물을 포함하는 체세포의 핵초기화 인자가 제공된다.
배아, ES세포, 세포의 초기화 유도, 유도다능성 줄기세포, Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, 체세포의 핵초기화 인자

Description

핵초기화 인자{Nuclear Reprogramming Factor}
본 발명은 분화된 체세포(somatic cell)를 초기화하여 유도다능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 유도하는 작용을 가지는 핵초기화 인자(nuclear reprogramming factor)에 관한 것이다.
배아성 줄기세포(embryonic stem cell, ES세포)는 사람이나 마우스의 초기 배아로부터 수립(樹立)된 줄기세포로, 생체에 존재하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다능성을 유지한 채 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 이러한 성질을 이용하여, 사람 ES세포는 파킨슨병, 소아 당뇨병, 백혈병 등 많은 질환에 대한 세포이식요법(cell transplantation therapy)의 자원으로서 기대되고 있다. 그러나, ES세포의 이식은 장기이식과 마찬가지로, 거절반응을 야기시킨다는 문제가 있다. 또한, 사람배아를 파괴하여 수립되는 ES세포의 이용에 대해서는, 윤리적 견지에서 반대 의견도 많다. 환자 자신의 분화된 체세포를 이용하여 탈분화(dedifferentiation)를 유도하여, ES세포에 가까운 다능성(pluripotency)이나 증식능(growth ability)을 가지는 세포(본 명세서에서는, 이 세포를 "유도다능성 줄 기세포"(iPS세포)라 하였으나, "배아성 줄기세포양 세포(embryonic stem cell-like cell)" 또는 "ES양 세포(ES-like cell)"라고 불리기도 한다)를 수립할 수 있다면, 거절반응이나 윤리적 문제가 없는 이상적인 다능성 세포로서 이용할 수 있는 것으로 기대된다.
체세포핵을 초기화하는 방법으로서, 예를 들어, 체세포의 핵을 난자에 이식하여 작제한 클론배아로부터 ES세포를 수립하는 기술이 보고되어 있다(W.S. Hwang et al., Science, 303, pp. 1669~74, 2004: W.S. Hwang et al., Science, 308, pp.1777-83, 2005: 이들 논문은 둘 다 날조된 것임이 판명되어, 훗날 취하되었다). 그러나, 이러한 기술은 ES세포를 수립할 목적만으로 클론배아(cloned embryo)를 작제하므로, 불임치료에서 생기는 잉여배아(surplus embryo)를 이용하는 통상의 ES세포에 비해 윤리적 문제가 오히려 크다. 또한, 체세포와 ES세포를 융합시킴으로써, 체세포핵을 초기화하는 기술이 보고되어 있다(M. Tada et al., Curr. Biol., 11, pp.1553-1558, 2001; C.A. Cowan et al., Science, 309, pp. 1369-73, 2005). 그러나, 이러한 방법에 있어서도 결국 사람 ES세포를 이용하게 되어, 윤리적 문제가 해결되지 않는다는 문제가 있다. 그리고, 사람에게 발생한 생식세포종양 유래 세포주의 추출액과 분화된 세포를 반응시킴으로써, 세포핵을 초기화하는 기술이 보고되어 있다(C.K. Taranger et al., Mol. Biol. Cell, 16, pp.5719-35, 2005). 이러한 방법은 추출액 중의 어느 성분이 초기화를 유도하고 있는지 전혀 불명료하여, 기술의 확실성이나 안전성에 문제가 있다.
한편, 분화된 체세포를 초기화하여 유도다능성 줄기세포를 유도하는 작용을 가지는 핵초기화 인자를 스크리닝하는 방법이 제안되어 있다(국제공개 WO2005/80598). 이 방법은 ECAT 유전자(ES세포에서 특이적으로 발현되는 유전자군: ES cell associated transcript)의 발현조절영역에 의해 발현조절을 받는 위치에 마커 유전자가 존재하는 유전자를 함유하는 체세포와 피검물질을 접촉시키고, 마커 유전자 발현세포의 출현 유무를 조사하여, 이 세포를 출현시킨 피검물질을 체세포의 핵초기화 인자의 후보로서 선택하는 공정을 포함하고 있다. 또한, 이 간행물의 실시예 6 등에는 체세포를 초기화하는 방법이 제시되어 있다. 그러나, 상기 간행물에는 핵초기화 인자를 실제로 동정했다는 보고는 없다.
특허간행물 1 국제공개 WO 2005/80598
도 1은 Fbx15유전자에 β geo를 넉인(knockin)한 마우스의 태아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 이용한 초기화인자의 스크리닝방법을 나타낸 그림이다.
도 2는 표 4에 나타낸 24개의 유전자의 도입에 의해 얻어지는 iPS세포의 형태를 나타낸 사진이다. 대조로서 분화된 세포(MEF) 및 정상의 배아성 줄기세포(ES)의 형태도 나타내었다.
도 3은 iPS세포에 있어서의 마커 유전자의 발현을 나타낸 그림이다. iPS세포, ES세포, 및 MEF세포로부터 추출한 총세포 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 행한 결과를 나타내었다.
도 4는 iPS세포에 있어서의 DNA 메틸화상태를 나타낸 그림이다. iPS세포, ES세포 및 MEF세포로부터 추출한 지놈 DNA를 바이설파이트처리하여, 목적 DNA를 PCR증폭 후 플라스미드에 삽입하였다. 각 유전자마다 10클론의 플라스미드를 단리하여 서열을 결정하였다. 메틸화 CpG는 검은 원으로, 비메틸화 CpG는 하얀 원으로 나타내었다.
도 5는 24개의 유전자군, 및 24개의 유전자군으로부터 1유전자씩 제외한 23개 유전자군의 도입에 의해 얻어진 G418세포의 콜로니수를 나타낸 그림이다. 그래프 하측은 G418 선택후 1주간에 얻어진 콜로니수를 나타내며, 그래프 상측은 3주간에 얻어진 클론수를 나타낸다. 4각으로 에워싼 유전자(유전자의 번호는 표 1에 나타낸 것과 동일하다)를 제외한 경우, 콜로니는 전혀 얻어지지 않거나 3주간 후에 소수만 관찰되었다.
도 6은 10개의 유전자군 및 10개의 유전자군으로부터 1유전자씩 제외한 9개의 유전자군의 도입에 의해 수득한 G418세포의 콜로니수를 나타낸 그림이다. #14, #15, 또는 #20의 각 유전자를 제외한 경우에는, 콜로니는 하나도 얻어지지 않았다. #22의 유전자를 제외한 경우에는, 소수의 G418 내성 콜로니가 얻어졌으나, 세포는 분화된 형태를 나타내고 있어, 명백하게 iPS세포와는 달라 있었다.
도 7은 10개의 유전자군, 4개의 유전자군, 3개의 유전자군 또는 2개의 유전자군에 의한 G418 내성 콜로니(초기화콜로니)의 출현수를 나타낸 그림이다. 각 콜로니의 대표적인 형태 및 크기를 나타낸다.
도 8은 MEF유래의 iPS세포를 누드마우스의 피하로 이식하여 형성된 종양을 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, H&E) 염색한 결과를 나타낸 사진이다. 삼배엽계(triploblastic system)의 각종 조직으로의 분화가 관찰되었다.
도 9는 성체피부 섬유아세포로부터 유래하는 iPS세포를 마우스 배반포(blastocyst)에 이식하고, 가상임신 마우스(pseudopregnant mouse)의 자궁에 이식함으로써 작제한 태아를 나타낸 사진이다. 위 그림 좌측의 태아에 있어서, iPS세포로부터 유래된 세포(녹색형광을 발한다)가 전신에 분포되어 있음을 알 수 있다. 아래 그림에서는, 상기 태아의 심장, 간장, 척수의 거의 대부분의 세포가 GFP양성이며, iPS세포로부터 유래함을 알 수 있다.
도 10은 ES세포 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 그림 중 Sox2 minus는 MEF에 3개의 유전자를 도입하여 수립된 iPS세포를, 4ECAT는 MEF에 4개의 유전자를 도입하여 수립한 iPS세포를, 10ECAT는 MEF에 10개의 유전자를 도입하여 수립한 iPS세포를, 10ECAT Skin fibroblast는 피부 섬유아세포에 10개의 유전자를 도입하여 수립한 iPS세포를, ES세포는 마우스 ES세포를, 그리고 MEF는 유전자가 도입되지 않은 MEF세포를 나타낸다. 그 아래 번호는 클론번호를 나타낸다.
도 11은 MEF로부터의 iPS세포수립에 있어서의 bFGF의 효과를 나타낸 그림이다. 통상의 피더세포(feeder cell, STO세포)(좌) 및 bFGF 발현벡터를 도입한 STO세포(우) 상에서 배양한 Fbx15β geo/β geo 마우스유래의 MEF에, 4개의 인자(상단) 또는 c-Myc 이외의 3개의 인자(하단)를 레트로바이러스로 도입하였다. 2주간 G418에 의 한 선택을 행하고 크리스탈블루(crystal blue)로 염색 후, 사진 촬영하였다. 숫자는 콜로니수를 나타낸다.
도 12는 Nanog-EGFP-IRES-Puro 마우스를 이용한 실험에 대해 설명한 그림이다. A. 마우스 Nanog 유전자를 중앙에 포함하는 대장균 인공염색체(BAC)를 단리하고, Nanog의 암호화영역의 상류에 EGFP-IRES-Puro 카세트를 유전자재조합기술(recombineering)에 의해 삽입하였다. B. 개변 BAC로부터 유전자전이 마우스를 작제하였다. GFP의 발현은 배반포의 내부세포 덩어리(inner cell mass)나 생식선(gonad)에 국한하여 관찰되었다.
도 13은 Nanog-EGFP-IRES-Puro 마우스를 이용한 실험에 대해서 설명한 그림이다. Nanog-EGFP-IRES-Puro 마우스를 태아(수정후 13.5일)로부터 두부, 내장 및 생식선을 제거하여 MEF를 수립하였다. 세포분류기(cell sorter)에 의한 해석결과, Nanog-EGFP-IRES-Puro 마우스 유래의 MEF(Nanog)에 있어서도 Fbx15β geo/β geo 마우스 유래의 MEF(Fbx15)나 야생형 마우스 유래의 MEF(Wild)와 마찬가지로 GFP 양성세포는 거의 존재하지 않았다.
도 14는 Nanog-EGFP-IRES-Puro 마우스 MEF(좌) 및 Fbx15β geo/β geo 마우스 MEF(우)로부터 수립한 iPS세포의 사진이다. 각각 퓨로마이신 및 G418로 선별하였다.
도 15는 iPS세포의 증식 결과를 나타낸 그림이다. ES세포, Nanog-EGFP-IRES-Puro 마우스 MEF(좌) 유래의 iPS 세포(Nanog iPS) 및 Fbx15β geo/β geo 마우스 MEF 유래의 iPS세포(Fbx iPS)를 각각 10만개씩 24웰 플레이트에 접종하고, 3일마다 계대하여 세포수를 측정한 결과를 나타내었다. 숫자는 배가시간(doubling time)의 평균을 나타낸다.
도 16은 iPS세포의 유전자발현을 나타낸 그림이다. MEF, ES세포, Nanog-EGFP-IRES-Puro 마우스 MEF(좌) 유래의 iPS 세포(Nanog iPS) 및 Fbx15β geo/β geo 마우스 MEF 유래의 iPS세포(Fbx iPS)에 있어서의 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 해석하였다. 아래 숫자는 계대수(number of passage)를 나타낸다.
도 17은 Nanog iPS세포로부터의 기형종 형성(teratoma formation)을 나타낸 그림이다. 100만개의 ES세포 또는 Nanog iPS세포를 누드마우스의 등부분에 피하 주사하여, 3주간 후에 생긴 종양의 외관(좌) 및 조직상(우, H&E염색)을 나타낸다.
도 18은 Nanog iPS세포로부터의 키메라 마우스의 작제를 나타낸 그림이다. Nanog iPS세포(클론 NPMF4EK-24, 계대수 6)를 배반포에 이식하여 탄생한 키메라 마우스. 90개의 이식배아(transplanted embryo)로부터 4마리의 키메라 마우스가 탄생하였다.
도 19는 Nanog iPS세포로부터의 생식선 전이(germline transmission)를 나타낸 그림이다. 도 18에 나타낸 키메라 마우스와 C57BL/6마우스의 교배에 의해 탄생한 마우스를 지놈 DNA를 PCR로 해석한 바, 모든 마우스에 있어서 Oct3/4와 Klf4의 전이유전자(transgene)가 존재하였므로, 생식선 전이가 확인되었다.
도 20은 iPS세포로부터의 신경세포 분화유도를 나타낸 그림이다. 피부섬유 아세포유래의 iPS세포로부터 실험실 조건(in vitro)에서 분화시킨 신경세포(상, βIII 튜블린 양성), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte, 좌, 04양성), 아스트로사이트(astrocyte, 우, GFAP양성)를 나타낸다.
도 21은 약제에 의한 선별을 이용하지 않는 iPS세포의 수립에 대해 설명한 그림이다. MEF를 10cm 디쉬당 1만 내지 10만개를 도말하여, 4개의 인자를 레트로바이러스로 도입하였다. 대조군(Mock)에서는 콜로니는 생기지 않았으나(좌), 4개의 인자를 도입한 디쉬에서는 편평한(flat) 형질전환 콜로니뿐만 아니라, 팽윤된(swelling) iPS세포와 유사한 콜로니가 얻어졌다(중앙). 이들을 계대배양하면, iPS세포와 유사한 세포가 얻어졌다(우).
도 22는 약제에 의한 선별없이 수립한 세포의 유전자발현을 나타낸 그림이다. 도 21에 도시한 수립된 세포로부터 RNA를 추출하여, ES세포 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 해석하였다.
도 23은 사람 섬유아세포 유래의 iPS세포양 세포를 나타낸 그림이다. 사람태아유래 섬유아세포에 4개의 인자의 사람 상동유전자(homologous gene)를 레트로바이러스로 도입하여 얻어진 콜로니(좌), 및 2회 계대 후의 세포(우)를 나타낸다.
도 24는 사람성체피부(human adult dermal) 섬유아세포로부터의 iPS세포 수립을 나타낸 그림이다. 마우스 레트로바이러스 수용체를 렌티바이러스로 감염시킨 사람성체피부 섬유아세포에, 좌단에 나타낸 인자를 레트로바이러스로 도입하였다. 사진은 바이러스 감염 후 8일째의 위상차상(phase contrast image, 대물x10)을 나타낸다.
발명의 개시
본 발명의 과제는 핵초기화 인자를 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 과제는 난자, 배아나 ES세포를 이용하지 않고 분화된 세포의 초기화를 유도하여, ES세포와 유사한 다능성이나 증식능을 가지는 유도다능성 줄기세포를 간편하면서도 재현성 좋게 수립하기 위한 수단을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하여, 국제공개 WO 2005/80598에 기재된 핵초기화 인자의 스크리닝방법을 이용하여 핵초기화 인자의 동정을 시도하였다. 그 결과, 핵초기화에 관련하는 유전자로서 24개의 후보유전자를 찾아내어, 그들 중 3개의 유전자가 핵초기화에 필수적인 유전자임을 확인하였다. 본 발명은 상기 지견을 바탕으로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의해 체세포의 핵초기화 인자로서, 하기 3종의 유전자: Oct패밀리 유전자, Klf패밀리 유전자, 및 Myc패밀리 유전자의 각 유전자 산물을 포함하는 인자가 제공된다. 본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 하기 3종의 유전자 Oct3/4, Klf4, 및 c-Myc의 각 유전자 산물을 포함하는 상기 인자가 제공된다.
또한, 다른 바람직한 태양에 의하면, 하기 유전자: Sox패밀리 유전자의 유전자 산물을 추가로 포함하는 상기 인자도 제공되며, 보다 바람직한 태양으로서 Sox2의 유전자 산물을 포함하는 상기 인자가 제공된다.
또 다른 바람직한 태양에 따르면, Myc패밀리 유전자의 유전자 산물과 함께, 또는 Myc패밀리 유전자의 유전자 산물 대신에, 사이토카인을 포함하는 상기 인자가 제공되며, 보다 바람직한 태양으로서 사이토카인이 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 및/또는 줄기세포인자(stem cell factor, SCF)인 상기 인자가 제공된다.
특히 바람직한 태양에 따르면, Oct패밀리 유전자, Klf패밀리 유전자, Myc패밀리 유전자, 및 Sox패밀리 유전자의 각 유전자 산물에 더하여, TERT 유전자의 유전자 산물을 포함하는 체세포의 핵초기화 인자, 및 Oct패밀리 유전자, Klf패밀리 유전자, Myc패밀리 유전자, Sox패밀리 유전자, 및 TERT 유전자의 각 유전자 산물에 더하여, 하기 유전자: SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7 및 Bmil로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 유전자 산물을 포함하는 인자가 제공된다.
이들 인자에 더하여, 하기 군: Fbx15, Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 β-catenin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 유전자 산물을 추가로 포함하는 상기 인자가 제공된다.
또한, 상기 발명의 다른 바람직한 태양에 따르면, 하기의 군: ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17. Sall4, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 유전자 산물을 추가로 포함하는 상기 인자도 제공된다.
다른 관점에서는, 본 발명에 의해 체세포의 핵초기화에 의해 유도다능성 줄기세포를 제조하는 방법으로서, 체세포에 상기 핵초기화 인자를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 체세포의 배양물 중에 상기 핵초기화 인자를 첨가하는 공정을 포함하는 상기 방법; 체세포에 상기 핵초기화 인자를 암호화하는 유전자를 도입하는 공정을 포함하는 상기 방법; 상기 핵초기화 인자를 암호화하는 유전자를 적어도 1종 이상 포함하는 재조합벡터를 이용하여 체세포에 이 유전자를 도입하는 공정을 포함하는 상기 방법; 및, 체세포로서 환자로부터 채취한 체세포를 이용하는 상기 방법이 제공된다.
또 다른 관점으로부터는, 본 발명에 의해 상기 방법에 의해 얻어진 유도다능성 줄기세포가 제공된다. 또한, 상기 유도다능성 줄기세포로부터 분화 유도된 체세포도 본 발명에 의해 제공된다.
그리고, 본 발명에 따라, 줄기세포요법으로서, 환자로부터 분리 채취한 체세포를 이용하여 상기 방법에 의해 얻어진 유도다능성 줄기세포를 분화 유도하여 얻어지는 체세포를 이 환자에게 이식하는 공정을 포함하는 요법이 제공된다.
아울러, 본 발명에 따라, 상기 방법에 의해 얻어진 유도다능성 줄기세포를 분화 유도하여 얻어진 각종 세포를 이용하여, 화합물(compound), 약제(medicament), 독물(poison) 등의 생리작용이나 독성을 평가하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 따라, 세포의 분화능 및/또는 증식능을 개선하는 방법으로서, 세포에 대해서 상기 핵초기화 인자를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법, 및 상기 방법에 의해 얻어지는 세포 및 상기 방법에 의해 얻어지는 세포로부터 분화 유도된 체세포가 제공된다.
본 발명에 의해 제공되는 핵초기화 인자를 이용함으로써, 배아나 ES세포를 이용하지 않고 간편하면서도 재현성 좋게 분화된 세포핵의 초기화를 유도할 수 있으며, ES세포와 유사한 분화 및 다능성이나 증식능을 가지는 미분화된 세포인 유도다능성 줄기세포를 수립할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵초기화 인자를 이용하여 환자 자신의 체세포로부터 높은 증식능 및 분화다능성을 가지는 유도다능성 줄기세포를 작제할 수 있으며, 이 세포를 분화시킴으로써 얻어지는 세포(예를 들어, 심근세포, 인슐린 생산세포, 또는 신경세포 등)는 심부전, 인슐린의존성 당뇨병, 파킨슨병이나 척수손상 등 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 이용할 수 있으며, 사람배아를 이용하는 윤리적 문제나 이식 후의 거절반응을 회피할 수 있으므로 극히 유용하다. 또한, 유도다능성 줄기세포를 분화시켜서 생기는 각종 세포(예를 들어, 심근세포, 간세포 등)는 화합물, 약제, 독물 등의 약효나 독성을 평가하기 위한 시스템으로서 극히 유용하다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
본 발명의 핵초기화 인자는 하기 3종의 유전자: Oct패밀리 유전자, Klf패밀리 유전자, 및 Myc패밀리 유전자의 각 유전자 산물을 포함하는 것을 특징으로 하고, 바람직한 태양에서는 상기 3종의 유전자에 더하여 Sox패밀리 유전자의 유전자 산물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 핵초기화 인자를 확인하는 수단으로서는. 예를 들어, 국제공개 WO2005/80598에 기재된 핵초기화 인자의 스크리닝방법을 이용할 수 있다. 상기 간행물의 모든 개시를 참조로서 본 명세서의 개시에 포함시켰다. 당업자는 상기 간행물을 참조함으로써, 핵초기화 인자를 스크리닝하여 본 발명의 초기화인자의 존재 및 작용을 확인할 수 있다.
예를 들어, 초기화 현상을 용이하게 관찰하는 실험계(experimental system)로서 Fbx15 유전자좌에 βgeo(베타갈락토시다제와 네오마이신 내성유전자의 융합유전자)를 넉인(knockin)한 마우스를 이용할 수 있다. 그 상세한 설명을 본 명세서의 실시예에 나타내었다. 마우스 Fbx15 유전자는 ES세포나 초기배아(early embryo) 등의 분화다능성 세포(differentiation pluripotent cell)에 있어서 특이적으로 발현하는 유전자이다. 마우스 Fbx15유전자에 βgeo를 넉인하여 Fbx15의 기능을 결실(缺失)한 호모변이 마우스(homomutant mouse)에서는, 통상 분화다능성이나 발생을 포함하는 비정상적인 표현형은 관찰되지 않는다. 이 마우스에 있어서는 βgeo가 Fbx15유전자의 인핸서나 프로모터에 의해 발현 제어되며, 분화된 체세포에서는 βgeo는 발현되지 않고 G418에 감수성을 나타내었다. 한편, βgeo를 넉인한 호모변이 ES세포는 극히 고농도(12mg/ml 또는 그 이상)의 G418에 내성을 나타낸다. 이 현상을 이용하여 체세포의 초기화를 가시화하는 실험계를 구축할 수 있다.
상기 실험계를 이용하여, 우선 βgeo를 넉인한 호모변이 마우스의 태아(수정후 13.5일)로부터 섬유아세포(Fbx15β geo/β geo의 MEF)를 단리할 수 있다. MEF는 Fbx15 유전자를 발현하지 않으므로 βgeo도 발현되지 않고, G418에 감수성을 나타낸다. 그러나, 이 MEF와 유전자조작을 하지 않은 ES세포(역시 G418에 감수성을 나타낸다)를 융합시키면, MEF의 핵이 초기화되는 결과 βgeo가 발현하여 G418 내성이 된다. 따라서, 이 실험계를 이용함으로써 초기화 현상을 G418 내성으로 가시화할 수 있다.
상기 실험계를 이용하여 핵초기화 인자를 선별할 수 있다. 핵초기화 인자에 관련된 유전자의 후보로서, ES세포에서 특이적인 발현을 나타내는 유전자 및 ES세포의 분화유도다능성(differentiation pluripotency) 유지에 있어서의 중요한 역할이 시사되는 유전자를 복수 선택하고, 이들 후보유전자가 단독으로, 혹은 적절히 조합함으로써 핵초기를 야기시키는지 여부를 확인할 수 있다. 예를 들어, 선별된 1차 후보유전자를 모두 조합함으로써 분화된 세포를 ES세포에 가까운 상태로 초기화 유도할 수 있음을 확인한 후, 그 조합 중에서 1개씩의 유전자를 제외한 조합을 만들어 동일한 작용을 확인하여, 그 유전자가 존재하지 않을 경우에 초기화 유도능이 약해지고, 혹은 초기화 유도능이 상실되는 2차 후보유전자를 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선별된 2차 후보유전자에 대해서 마찬가지 단계를 반복함으로써, 필수의 핵초기화 유전자의 조합을 선택할 수 있고, Oct패밀리 유전자, Klf패밀리 유전자, 및 Myc패밀리 유전자의 3개의 유전자의 유전자 산물의 조합이 핵초기화 인자로서 작용하는 것을 확인할 수 있으며, 또한, 이들 3개의 유전자의 유전자 산물에 더하여 Sox패밀리 유전자의 유전자 산물을 조합이 핵초기화 인자로서 극히 우수한 성질을 가짐을 확인할 수 있다. 핵초기화 인자의 선별방법의 구체적인 예는 본 명세서의 실시예에 구체적으로 개시되어 있으며, 당업자는 상기 일반적 설명 및 실시예의 구체적 설명을 참조함으로써 이들 3종의 유전자의 조합이 체세포의 초기화를 유도하는 것, 및 이들 3종의 유전자 산물의 조합이 핵초기화에 필수임을 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 핵초기화 인자는 적어도 Oct패밀리 유전자, Klf패밀리 유전자, 및 Myc패밀리 유전자의 유전자 산물의 조합을 포함하며, 예를 들어, Oct3/4, Klf4, 및 c-Myc의 3종의 유전자의 유전자 산물의 조합을 포함한다. Oct패밀리 유전자로서는, 예를 들어, Oct3/4, Oct1A, 및 Oct6 등을 들 수 있다. Oct 3/4는 POU패밀리에 속하는 전사인자이며, 미분화 마커로서 보고되어 있다(K. Okamoto et al., Cell, 60, pp461-72, 1990). 또한, Oct 3/4는 다능성 유지에 관여하고 있다는 보고도 있다(J. Nichols et al., Cell, 95, pp379-91, 1998). Klf패밀리 유전자로서는 Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5 등을 들 수 있다. Klf4(Kruppel like factor-4)는 종양억제인자로서 보고되어 있다(A.M. Ghaleb et al., Cell Res., 15, pp92-6, 2005). Myc패밀리 유전자로서는 c-Myc, N-Myc, 및 L-Myc 등을 들 수 있다. C-Myc는 세포의 분화 및 증식에 관여하는 전사제어인자이며(S. Adhikary, M. Eilers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, pp635-45, 2005), 다능성 유지에 관여하고 있다는 보고가 있다(P. Cartwright et al., Development, 132, pp885-96, 2005). Oct 3/4, Klf4, 및 c-Myc 이외의 각 패밀리 유전자의 NCBI 등록번호는 아래와 같다.
마우스 사 람
Klf1 Kruppel-like factor 1 (erythroid) NM_010635 NM_006563
Klf2 Kruppel-like factor 2 (lung) NM_008452 NM_016270
Klf5 Kruppel-like factor 5 NM_009769 NM_001730
c-Myc myelocytomatosis oncogene NM_010849 NM_002467
N-Myc v-Myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian) NM_008709 NM_005378
L-Myc v-Myc myelocytomatosis viral oncogene homolog 1, lung carcinoma derived (avian) NM_008506 NM_005376
Oct1A POU domain, class 2, transcription factor 1 NM_198934 NM_002697
Oct6 POU domain, class 3, transcription factor 1 NM_011141 NM_002699
이들 유전자는 어느 것이나 사람을 포함하는 포유류 동물에 있어서 공통적으로 존재하는 유전자이며, 본 발명에 있어서 상기 유전자 산물을 이용하기 위해서는 임의의 포유류 동물유래(예를 들어, 마우스, 랫트, 소, 양, 말, 원숭이 및 이와 유사한 동물 등의 포유류 동물유래)의 유전자를 이용하는 것이 가능하다. 또한, 야생형의 유전자 산물 이외에 수개(예를 들어, 1-10개, 바람직하기로는 1-6개, 보다 바람직하기로는 1-4개, 보다 더 바람직하기로는 1-3개, 특히 바람직하기로는 1 또는 2개)의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된 변이유전자 산물로서, 야생형의 유전자 산물과 유사한 기능을 가지는 유전자 산물도 이용가능하다. 예를 들어, c-Myc의 유전자 산물로서는 야생형 이외에 안정형(T58A) 등을 이용해도 좋다. 다른 유전자 산물에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명의 핵초기화 인자는 상기 3종의 유전자 산물 이외에 다른 유전자 산물을 포함할 수 있다. 이러한 유전자 산물로서는, Sox패밀리 유전자의 유전자 산물을 들 수 있다. Sox패밀리 유전자로서는 예를 들어, Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17 및 Sox18, 바람직하기로는 Sox2를 들 수 있다. 적어도 Oct패밀리 유전자(예를 들어, Oct3/4), Klf패밀리 유전자(예를 들어, Klf4), Myc패밀리 유전자(예들 들어, c-Myc), 및 Sox패밀리 유전자(예를 들어, Sox2)의 4개의 유전자의 유전자 산물의 조합을 포함하는 핵초기화 인자는 초기화의 효율의 관점에서 본 발명의 바람직한 태양이며, 특히 만능성(pluripotency)의 획득을 위해 Sox패밀리 유전자의 유전자 산물을 조합하는 것이 바람직한 경우가 있다. Sox2는 초기발생 과정에서 발현되며, 전사인자를 암호화하는 유전자이다(A.A. Avilion et al., Genes Dev., 17, pp126-40, 2003). Sox2이외의 Sox패밀리 유전자의 NCBI 등록번호는 이하와 같다.
마우스 사 람
Sox1 SRY-box containing gene 1 NM_009233 NM_005986
Sox3 SRY-box containing gene 3 NM_009237 NM_005634
Sox7 SRY-box containing gene 7 NM_011446 NM_031439
Sox15 SRY-box containing gene 15 NM_009235 NM_006942
Sox17 SRY-box containing gene 17 NM_011441 NM_022454
Sox18 SRY-box containing gene 18 NM_009236 NM_018419
또한, Myc패밀리 유전자의 유전자 산물은 사이토카인(cytokine)으로 치환할 수 있다. 사이토카인으로는 예를 들어, SCF 또는 bFGF 등이 바람직하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직한 태양으로서, 상기 3개의 유전자 산물, 바람직하기로는 상기 4개의 유전자 산물이외에도, 세포의 불사화(不死化, immortalization)를 유도하는 인자를 포함한다. 예를 들어, TERT 유전자의 유전자 산물을 포함하는 인자와, 하기의 유전자: SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, 및 Bmil로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 유전자 산물을 포함하는 인자를 조합하는 것을 들 수 있다. TERT는 DNA 복제시에 있어서의 염색체 말단 텔로미어(telomere) 구조 유지를 위해 필수적이며, 사람에서는 줄기세포나 종양 세포에서는 발현되지만, 많은 체세포에 있어서는 발현되지 않는다(I. Horikawa, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102, pp18437-442, 2005). SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, 또는 Bmil은 Large T antigen과 조합함으로써, 사람 체세포의 불사화를 유도함이 보고되어 있다(S. Akimov et al., Stem Cells, 23, pp1423-1433, 2005; P. Salmon et al., Mol. Ther., 2, pp404-414, 2000). 이들 인자는 특히 사람의 세포로부터 iPS세포를 유도하는 경우에 있어서 극히 유용하다. TERT 및 Bmil 유전자의 NCBI 등록번호는 아래와 같다.
마우스 사 람
TERT telomerase reverse transcriptase NM_009354 NM_198253
Bmil B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 NM_007552 NM_ 005180
그리고, 하기의 군: Fbx15, Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 β-catenin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 중 1종 또는 2종 이상을 유전자 산물을 조합해도 좋다. 초기화의 효율 관점에서 특히 바람직한 태양으로서는, Fbx15, Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 β-catenin의 유전자 산물을 상기 4개의 유전자 산물과 조합한 합계 10개의 유전자 산물을 포함하는 핵초기화 인자를 들 수 있다. Fbx15(Y. Tokuzawa et al., Mol Cell Biol., 23, pp2699-708, 2003), Nanog(K. Mitsui et al., Cell, 113, pp631-42, 2003), ERas(K. Takahashi, K. Mitsui, S. Yamanaka, Nature, 423, pp541-5, 2003), 및 ECAT15-2(A. Bortvin et al., Development, 130, pp1673-80, 2003)은 ES세포 특이적 발현 유전자이고, Tcl1은 Akt의 활성화에 관여하고 있으며(A. Bortvin et al., Development, 130, pp1673-80, 2003), β-catenin은 Wnt신호 전달경로의 중요한 구성인자이며, 다능성 유지에 관여하고 있다는 보고도 있다(N. Sato et al, Nat. Med., 10, pp55-63, 2004).
또한, 본 발명의 핵초기화 인자는, 예를 들어, 하기의 군: ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sall4, Rex1, UTF1, Stella, Stat 3, 및 Grb2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 유전자 산물을 포함하여도 좋다. ECAT1, Esg1, ECAT8, Gdf3, 및 ECAT15-1은 ES세포 특이적 발현유전자이고(K. Mitsui et al., Cell, 113, pp631-42, 2003), Dnmt3L은 DNA 메틸화효소관련인자이며, Sox15는 초기발생과정에서 발현하여 전사인자를 암호화하는 1군의 유전자이다(M. Maruyama et al., J Biol Chem. 280, pp24371-9, 2005). Fthl17은 Ferritin heavy polypeptide-like 17을 암호화하고(A. colLoriot, T. Boon, C. De Smet, Int J Cancer, 105, pp371-6, 2003), Sall4는 배아성 줄기세포에서 고발현하는 Zn 핑거단백질을 암호화하며(J. Kohlhase et al., Cytogenet Genome Res., 98, pp274-7, 2002), Rex1은 Oct3/4의 하류에 있는 전사인자를 암호화하고(E.Ben-Shushan, J.R. Thompson, L.J. Gudas, Y. Bergman, Mol Cell Biol., 18, pp1866-78, 1998). UTF1은 Oct3/4의 하류에 위치하는 전사보조인자이며, 이를 억제하면 ES세포의 증식을 억제한다는 보고가 있다(A. Okuda et al., EMBO J., 17, pp2019-32, 1998). Stat3은 세포증식·분화의 신호인자이며, Stat3의 활성화에 의해 LIF가 작용하며, 다능성 유지에 중요한 역할을 하고 있다(H. Niwa, T, Burdon, I. Chambers, A. Smith, Genes Dev., 12, pp2048-60, 1998). Grb2는 세포막에 존재하는 각종 성장인자 수용체와 Ras/MAPK 캐스케이드 사이를 중개하는 단백질을 암호화하고 있다(A.M. Cheng et al., Cell, 95, pp793-803, 1998).
그러나, 본 발명의 핵초기화 인자에 포함할 수 있는 유전자 산물은 위에서 구체적으로 설명한 유전자의 유전자 산물에 한정되지 않는다. 본 발명의 핵초기화 인자에는 핵초기화 인자로서 기능할 수 있는 다른 유전자 산물이외에 분화, 발생, 또는 증식 등에 관계하는 인자 혹은 기타 생리활성을 가지는 인자를 1 또는 2이상 포함할 수 있으며, 이러한 태양도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 말할 필요도 없다. 핵초기화 인자로서 기능할 수 있는 다른 유전자 산물은 예를 들어, Oct3/4, Klf4, 및 c-Myc의 3종의 유전자 중 1종 또는 2종 만을 발현시킨 체세포를 이용하여, 이 세포에 대해서 핵초기화를 유도할 수 있는 유전자 산물을 스크리닝함으로써 특정할 수 있다. 본 발명에 의해 새로운 핵초기화 인자의 스크리닝방법으로서 상기 스크리닝방법도 제공된다.
또한, 본 발명의 핵초기화 인자에 포함되는 유전자 산물은 예를 들어, 상기 유전자로부터 생산되는 단백질 자체 이외에, 이 단백질과 기타 단백질 또는 펩티드 등과의 융합유전자 산물의 형태라도 무방하다. 예를 들어, 녹색형광단백질(GFP)과의 융합단백질이나 히스티딘 태그 등의 펩티드와의 융합유전자 산물을 이용할 수도 있다. 또한, HIV바이러스로부터 유래하는 TAT 펩티드와의 융합단백질을 제조하여 이용함으로써, 세포막으로부터의 핵초기화 인자의 세포내 도입(intracellular uptake)을 촉진시킬 수 있으며, 유전자도입(gene transduction) 등의 복잡한 조작을 회피하여 융합단백질을 배지에 첨가하는 것만으로 초기화를 유도하는 것이 가능해진다. 이러한 융합유전자 산물의 제조방법은 당업자에게 잘 알려져 있으므로, 당업자는 목적하는 바에 따라 적절한 융합유전자 산물을 용이하게 설계하여 제조하는 것이 가능하다.
본 발명의 핵초기화 인자를 이용하여 체세포의 핵을 초기화하여 유도다능성 줄기세포를 얻을 수 있다. 본 명세서에 있어서 "유도다능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell)"란 ES세포에 가까운 성질을 가지는 세포로서, 보다 구체적으로는 미분화된 세포로서 다능성 및 증식능을 가지는 세포를 포함하는데, 이 용어는 어떤 의미로도 한정적으로 해석해서는 안되며, 가장 넓은 의미로 해석하여야 한다. 핵초기화 인자를 이용하여 유도다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 대해서는, 국제공개 WO2005/80598에 기술되어 있으며(상기 공보에 있어서는, ES양 세포(ES cell-like cell)라는 용어가 이용되고 있다). 유도다능성 줄기세포의 분리수단에 대해서도 구체적으로 설명되어 있다. 따라서, 당업자는 상기 간행물을 참조함으로써, 본 발명의 핵초기화 인자를 이용하여 유도다능성 줄기세포를 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 핵초기화 인자를 이용하여 체세포로부터 유도다능성 세포를 제조하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 체세포 및 유도다능성 줄기세포가 증식가능한 환경에서 핵초기화 인자가 체세포와 접촉가능하다면, 어떤 방법을 채용해도 좋다. 예를 들어, 본 발명의 핵초기화 인자에 포함하는 유전자 산물을 배지 중에 첨가해도 좋으며, 혹은 본 발명의 핵초기화 인자를 발현 가능한 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 이 유전자를 체세포에 도입하는 등의 수단을 채용해도 좋다. 이러한 벡터를 이용하는 경우에는, 벡터에 2종류 이상의 유전자를 집어넣어 각각의 유전자 산물을 체세포에서 동시에 발현시켜도 좋다. 초기화될 체세포에 있어서, 본 발명의 핵초기화 인자에 포함되는 유전자 산물의 1종 또는 2종 이상이 이미 발현되어 있을 경우에는, 본 발명의 핵초기화 인자로부터 이 유전자 산물을 제외하는 것도 가능하며, 이러한 태양도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명의 핵초기화 인자를 이용하여 유도다능성 줄기세포를 제조함에 있어서, 초기화될 체세포의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도다능성 줄기세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 배지 중에 출현한 유도다능성 줄기세포를 선택하는 방법도 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 마커 유전자로서 약제내성 유전자 등을 이용하여 약제내성을 지표로 하여 유도다능성 줄기세포를 분리하는 등의 주지의 수단을 적절히 채용할 수 있다. ES세포의 미분화성 및 다능성을 유지할 수 있는 배지 또는 그 성질을 유지할 수 없는 배지는 당업계에 각종이 알려져 있으며, 적절한 배지를 조합하여 이용함으로써 유도다능성 줄기세포를 효율적으로 분리할 수 있다. 분리된 유도다능성 줄기세포의 분화능 및 증식능은 ES세포에 대해서 범용되어 있는 확인수단을 이용함으로써, 당업자가 용이하게 확인가능하다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 유도다능성 줄기세포의 용도는 특별히 한정되지 않으며, ES세포를 이용하여 행해지고 있는 각종 시험·연구나 ES세포를 이용한 질병의 치료 등에 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 유도다능성 줄기세포를 레티노인산(retinoic acid), EGF 등의 증식인자, 또는 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 등으로 처리함으로써 원하는 분화된 세포(예를 들어, 신경세포, 심근세포, 혈구세포 등)를 유도할 수 있으며, 그와 같이 하여 얻어진 분화된 세포를 환자에게 되돌림으로써 자가세포이식(cellular auto-transplantation)에 의한 줄기세포 요법을 달성할 수 있다. 그러나, 본 발명의 유도다능성 줄기세포의 용도는 상기 특정 태양에 한정되는 것은 아니다.
이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하겠으나, 본 발명의 범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 초기화인자의 선별
초기화인자를 동정하기 위해서는, 초기화현상을 용이하게 관찰하기 위한 실험계가 필요하다. 실험계로서 Fbx15 유전자좌에 βgeo(베타갈락토시다제와 네오마이신 내성 유전자의 융합유전자)를 넉인(knockin)한 마우스를 이용하였다. 마우스 Fbx15 유전자는 ES세포나 초기배아 등의 분화다능성 세포에서 특이적으로 발현하는 유전자이다. 그러나, 마우스 Fbx15 유전자에 βgeo를 넉인하고 Fbx15의 기능을 결실한 호모변이 마우스에 있어서는, 분화다능성이나 발생을 포함하는 비정상적인 표현형은 관찰되지 않았다. 이 마우스에서는 βgeo가 Fbx15 유전자의 인핸서나 프로모터에 의해 발현 제어된다. 즉, 분화된 체세포에서는 βgeo는 발현되지 않고, G418에 감수성을 나타낸다. 한편, βgeo를 넉인한 호모변이 ES세포는 극히 고농도(12mg/ml 또는 그 이상)의 G418에 내성을 나타낸다. 이 현상을 이용하여 체세포의 초기화를 가시화하는 실험계를 구축하였다.
상기 실험계에서, βgeo를 넉인한 호모변이 마우스(homomutant mouse)의 태아(embryo)(수정후 13.5일)로부터 우선 섬유아세포(Fbx15β geo/β geo의 MEF)를 단리하였다. MEF는 Fbx15 유전자를 발현하지 않으므로, βgeo도 발현하지 않고 G418에 감수성을 나타낸다. 한편, 이 MEF와 유전자조작을 가하지 않은 ES세포(역시 G418에 감수성을 나타낸다)를 융합시키면, MEF의 핵이 초기화되는 결과, βgeo가 발현하여 G418 내성이 된다. 즉, 이 실험계에 의해 초기화현상을 G418 내성으로 가시화할 수 있다(국제공개 WO2005/80598). 상기 실험계를 이용하여 초기화인자의 탐색을 행하여(도 1), 초기화인자의 후보로서 ES세포에서 특이적인 발현을 나타내는 유전자, 및 ES세포의 분화다능성 유지에 있어서의 중요한 역할이 시사되는 합계 24개의 유전자를 선별하였다. 이들 유전자를 하기 표 4 및 표 5에 나타낸다. 그리고, #21의 β-catenin 및 #22의 c-Myc에 관해서는 활성형의 변이체(catenin: S33Y, c-Myc:T58A)를 이용하였다.
번호 유전자명 유전자의 설명
1 ECAT1 ES cell associated trasnsript 1 (ECAT1)
2 ECAT2 developmental pluripotency associated 5 (DPPA5), ES cell specific gene 1 (ESG1)
3 ECAT3 F-box protein 15 (Fbx15),
4 ECAT4 homeobox transcription factor Nanog
5 ECAT5 ES cell expressed Ras (ERas),
6 ECAT7 DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like (Dnmt3l), valiant 1
7 ECAT8 ES cell associated transcript 8 (ECAT8)
8 ECAT9 growth differentiation factor 3 (Gdf3),
9 ECAT10 SRY-box containing gene 15 (Sox15),
10 ECAT15-1 developmental pluripotency associated 4 (Dppa4), variant 1
11 ECAT15-2 developmental pluripotency associated 2 (Dppa2),
12 Fthl17 ferritin, heavy polypeptide-like 17 (Fthl17),
13 Sall4 sal-like 4 (Drosophila) (Sall4), transcript variant a
14 Oct3/4 POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1),
15 Sox2 SRY-box containing gene 2 (Sox2),
16 Rex1 zinc finger protein 42 (Zfp42),
17 Utf1 undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 (Utf1)
18 Tcl1 T-cell lymphoma breakpoint 1 (Tcl1),
19 Stella developmental pluripotency-associated 3 (Dppa3),
20 Klf4 Kruppel-like factor 4 (gut) (Klf4),
21 β-catenin catenin (cadherin associated protein), beta 1, 88kDa (Ctnnb1)
22 c-Myc myelocytomatosis oncogene (Myc),
23 Stat3 signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3), transcript variant 1
24 Grb2 growth factor receptor bound protein 2 (Grb2),
NCBI 등록번호
번호 유전자명 특 징 마우스 사 람
1 ECAT1 ES세포 특이적 발현 유전자 AB211060 AB211062
2 ECAT2 ES세포 특이적 발현 유전자 NM_025274 NM_001025290
3 ECAT3 ES세포 특이적 발현 유전자 NM_015798 NM_152676
4 ECAT4 호메오도메인(homeodomain)을 가지는
전사인자, 분화다능성 유지 필수인자		 AB093574 NM_024865
5 ECAT5 Ras패밀리 단백질, ES세포의 증식촉진인자 NM_181548 NM_181532
6 ECAT7 DNA메틸화효소 관련인자, 각인에 필수 NM_019448 NM_013369
7 ECAT8 ES세포 특이적 발현 유전자,
Tudor도메인을 가진다		 AB211061 AB211063
8 ECAT9 ES세포 특이적 발현 유전자,
TGF β패밀리에 속한다		 NM_008108 NM_020634
9 ECAT10 ES세포 특이적 발현 유전자,
SRY패밀리 전사인자		 NM_009235 NM_006942
10 ECAT15-1 ES세포 특이적 발현 유전자 NM_028610 NM_018189
11 ECAT15-2 ES세포 특이적 발현 유전자 NM_028615 NM_138815
12 Fthl17 ES세포 특이적 발현 유전자,
페리틴 중쇄와 유사하다		 NM_031261 NM_031894
13 Sall4 ES세포 특이적 발현 유전자,
Zn핑거단백질		 NM_175303 NM_020436
14 Oct3/4 POU패밀리 전사인자, 다능성 유지에 필수 NM_013633 NM_002701
15 Sox2 SRY패밀리 전사인자, 다능성 유지에 필수 NM_011443 NM_003106
16 Rex1 ES세포 특이적 발현 유전자,
Zn핑거단백질		 NM_009556 NM_174900
17 Utf1 ES세포에서 고발현하는 전사조절인자,
ES세포의 증식을 촉진한다.		 NM_009482 NM_003577
18 Tcl1 AKT를 활성화하는 암유전자.
ES세포에서 고발현된다.		 NM_009337 NM_021966
19 Stella ES세포 특이적 발현 유전자 NM_139218 NM_199286
20 Klf4 ES세포에서 고발현된다. 암억제유전자 및 암유전자의 양쪽 작용이 보고되어 있다 NM_010637 NM_004235
21 β-catenin Wnt신호로 활성화되는 전사인자
다능성 유지에의 관여가 보고되어 있다		 NM_007614 NM_001904
22 c-Myc 세포의 증식, 분화에 관여하는 전사제어
인자 및 암유전자
다능성 유지에 관여함이 보고되어 있다		 NM_010849 NM_002467
23 Stat3 LIF신호로 활성화되는 전사인자
마우스 ES세포의 다능성 유지에 필수		 NM_213659 NM_139276
24 Grb2 성장인자 수용체와 Ras/MAPK 캐스케이드
를 중개하는 어댑터단백질		 NM_008163 NM_002086
이들 유전자의 cDNA를 레트로바이러스 벡터 pMX-gw에 Gateway 기법에 의해 삽입하였다. 우선, 24개의 유전자를 하나씩 Fbx15β geo/β geo의 MEF에 감염시키고, 그 후 ES세포 배양조건에서 G418선별을 행하였다. 그러나, G418 내성 콜로니(G418-resistant colony)는 하나도 얻어지지 않았다. 다음에 총 24개의 유전자의 레트로바이러스를 동시에 Fbx15β geo/β geo의 MEF에 감염시켰다. ES세포 배양조건에서 G418선별을 행하였는 바, 복수의 약제내성 콜로니가 얻어졌다. 이들 콜로니를 단리하여 배양을 계속하였다. 이들 세포는 장기간에 걸쳐 배양이 가능하며, 또한, ES세포와 유사한 형태를 나타냄을 알 수 있었다(도 2). 도 2에서, iPS세포는 유도다능성 줄기세포(ES양 세포, ES-like세포, ESL세포라고도 한다), ES는 배아성 줄기세포를 나타내며, MEF는 분화된 세포(태아섬유아세포)를 나타낸다.
마커 유전자의 발현을 RT-PCR에 의해 검토하였으나, Nanog, Oct3/4 등의 미분화 마커가 발현되었다(도 3). Nanog의 발현은 ES세포와 유사하였으나, Oct3/4의 발현은 ES세포보다 낮음을 알 수 있었다. 또한, DNA 메틸화상태를 바이설파이트시퀀스법(bisulfite sequencing method)으로 확인한 결과, Nanog유전자나 Fbx15유전자는 MEF에 있어서 고메틸화되었으나(highly methylated), iPS세포에 있어서는 탈메틸화되었음(demethylated)을 알 수 있었다(도 4). 각인 유전자(imprinting gene)인 IGF2유전자는 MEF와 iPS세포의 양자에서 약 50%가 메틸화되어 있었다. Fbx15β geo/β geo의 MEF를 채취한 수정 후 13.5일째의 원시생식세포(primordial germ cell)에서는 각인 기억(imprinting memory)이 소거되어 IGF2유전자가 거의 완전히 탈메틸화되는 것이 알려져 있으므로, iPS세포가 Fbx15β geo/β geo의 MEF에 혼입되어 있는 원시생식세포로부터 유래하는 것은 아니라고 결론지었다. 이상의 결과로부터, 24개의 인자의 조합에 의해, 분화된 세포(MEF)를 ES세포에 가까운 상태로 초기화 유도할 수 있음이 나타났다.
다음으로, 24개의 유전자의 전부가 초기화를 위해 필요한지 여부를 검토하였다. 1개의 유전자씩을 제외한 23개의 유전자를 Fbx15β geo/β geo의 MEF에 감염시켰다. 그 결과, 10개의 유전자에 대해서는, 그것을 제외하였을 때, 콜로니의 형성이 저해됨을 알 수 있었다(도 5: 유전자의 번호는 표 4에 나타낸 유전자의 번호에 대응되며, #3, #4, #5, #11, #14, #15, #18, #20, #21 및 #22의 10개의 유전자이다). 이들 10개의 유전자를 동시에 Fbx15β geo/β geo의 MEF에 감염시켰는 바, 24개의 유전자를 동시에 감염시킨 경우에 비하여 의미있고 효율적으로 G418 내성 콜로니가 얻어졌다.
그리고, 이 10개의 유전자로부터 1유전자씩을 제외한 9개의 유전자를 Fbx15βgeo/β geo의 MEF에 감염시켰다. 그 결과, 4개의 유전자(#14, #15, #20 및 #22)를 각각 제외한 경우에는, G418 내성의 iPS세포 콜로니가 형성되지 않음을 알 수 있었다(도 6). 따라서, 10개의 유전자 중 이들 4종의 유전자가 초기화 유도에 있어 특히 중요한 역할을 하는 것이 시사되었다.
실시예 2: 4개의 유전자군의 조합에 의한 초기화유도
10개의 유전자군 중에서 특히 중요성이 시사된 4개의 유전자에 의해 체세포의 초기화의 유도가 가능한지 여부를 검토하였다. Fbx15유전자에 βgeo를 넉인한 MEF세포에 상기 10개의 유전자의 조합, 상기 4개의 유전자의 조합, 상기 4개 중 3개만의 유전자의 조합, 및 상기 4개 중 2개만의 유전자의 조합을 이용하여, 이들 유전자군을 레트로바이러스에 의해 체세포로 도입하였다. 그 결과, 4개의 유전자를 도입한 경우에는, 160개의 G418 내성 콜로니가 얻어졌다. 이 결과는 10개의 유전자를 도입한 경우의 결과(179콜로니)와 거의 동일 수였으나, 4개의 유전자도입의 경우에는 10개의 유전자도입의 경우에 비해 콜로니가 작았다. 또한, 이들 콜로니를 계대배양한 경우, iPS세포의 형태를 나타낸 콜로니는 10개의 유전자도입의 경우에 12클론 중 9클론이었음에 반하여, 4개의 유전자도입의 경우에는 12클론 중 7클론으로 약간 적은 경향이 있었다. 4개의 유전자로서는 마우스 유래의 것, 사람 유래의 것, 어느 쪽이나 거의 동일 수의 iPS세포가 얻어졌다.
상기 4개의 유전자 중에서 선택된 3개의 유전자를 도입한 경우, 어느 조합(#14, #15 및 #20)에서는 36개의 편평한 콜로니(flat colony)가 얻어졌으나, 계대배양하더라도 iPS세포는 관찰되지 않았다. 다른 조합(#14, #20 및 #22)에서는 54개의 작은 콜로니가 얻어졌다. 이들 중 비교적 큰 6개의 콜로니를 계대배양하였는 바, 6클론의 모두에서 ES세포와 유사한 세포가 얻어졌다. 그러나, ES세포에 비하면, 이들 세포끼리나 배양접시로의 접착(adhesion)이 약하다고 여겨졌다. 또한, 세포 증식의 속도도 4개의 유전자를 도입한 경우에 비해 늦었다. 또한, 4개의 유전자 중 3개의 유전자의 다른 2가지 조합의 각각에서는 1개씩 콜로니가 형성되었으나, 계대배양하더라도 세포의 증식은 관찰되지 않았다. 4개의 유전자 중에서 선별된 2개의 유전자의 조합(6가지)에서는, 어느 경우에도 G418 내성 콜로니가 하나도 형성되지 않았다. 이상의 결과를 도 7에 나타내었다.
또한, 도 10에는 ES세포 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내었다. 방법의 상세는 이하와 같다. Fbx15β geo/β geo의 MEF에 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4 및 c-Myc, Sox2 minus라고 표기), 4개의 유전자(3개의 유전자에 Sox2를 부가한 것, 4ECAT라고 표기), 10개의 유전자(4개의 유전자에 표 1의 #3, #4, #5, #11, #18, #21를 부가한 것, 10ECAT라 표기)를 도입하여 수립한 iPS세포, Fbx15 유전자에 βgeo를 넉인한 성체마우스의 꼬리부분 피부로부터 수립한 섬유아세포에 10개의 유전자를 도입하여 수립한 iPS세포(10ECAT Skin fibroblast라고 표기), 마우스 ES세포 및 유전자 도입하지 않은 MEF세포로부터 총세포 RNA를 정제하고, DNaseI 을 처리하여 지놈 DNA의 혼입을 막았다. 역전사반응에 의해 1차 가닥(first strand) cDNA를 작제하고, PCR에 의해 ES세포 마커 유전자의 발현을 관찰하였다. 그리고, Oct3/4, Nanog, ERas의 경우에는, 도입된 레트로바이러스(transduced retrovirus)로부터가 아닌, 내재성 유전자(endogenous gene)로부터의 전사산물만을 증폭하는 프라이머를 이용하여, PCR을 행하였다. 프라이머 서열을 표 6에 나타낸다.
ECAT1 ECAT1-RT-S TGT GGG GCC CTG AAA GGC GAG CTG AGA T
　 ECAT1-RT-AS ATG GGC CGC CAT ACG ACG ACG CTC AAC T
Esg1 pH34-U38 GAA GTC TGG TTC CTT GGC AGG ATG
　 pH34-L394 ACT CGA TAC ACT GGC CTA GC
Nanog 6047-S1 CAG GTG TTT GAG GGT AGC TC
　 6047-AS1 CGG TTC ATC ATG GTA CAG TC
ERas 45328-S118 ACT GCC CCT CAT CAG ACT GCT ACT
　 ERas-AS304 CAC TGC CTT GTA CTC GGG TAG CTG
Gdf3 Gdf3-U253 GTT CCA ACC TGT GCC TCG CGT CTT
　 GDF3 L16914 AGC GAG GCA TGG AGA GAG CGG AGC AG
Fgf4 Fgf4-RT-S CGT GGT GAG CAT CTT CGG AGT GG
　 Fgf4-RT-AS CCT TCT TGG TCC GCC CGT TCT TA
Cripto Cripto-S ATG GAC GCA ACT GTG AAC ATG ATG TTC GCA
　 Cripto-AS CTT TGA GGT CCT GGT CCA TCA CGT GAC CAT
Zfp296 Zfp296-S67 CCA TTA GGG GCC ATC ATC GCT TTC
　 Zfp296-AS350 CAC TGC TCA CTG GAG GGG GCT TGC
Dax1 Dax1-S1096 TGC TGC GGT CCA GGC CAT CAA GAG
　 Dax1-AS1305 GGG CAC TGT TCA GTT CAG CGG ATC
Oct3/4 Oct3/4-S9 TCT　TTC　CAC　CAG　GCC　CCC　GGC　TC
　 Oct3/4-AS210 TGC　GGG　CGG　ACA　TGG　GGA　GAT　CC
NAT1 NAT1 U283 ATT CTT CGT TGT CAA GCC GCC AAA GTG GAG
　 NAT1 L476 AGT TGT TTG CTG CGG AGT TGT CAT CTC GTC
상기 도면에 나타낸 결과로부터, 3개의 유전자를 도입한 경우, ERas나 Fgf4는 효율적으로 발현 유도되는데, 다능성 유지에 필수인자인 Oct3/4와 Nanog의 유도는 일어나지 않거나, 일어나더라도 대단히 약함을 알 수 있었다. 한편, 4개의 유전자를 도입한 경우, Oct3/4와 Nanog가 비교적 강하게 유도된 클론이 조사한 4클론 중에서 1클론(#7)이 존재하였다. 그리고, 10개의 유전자를 도입한 경우에는, 조사한 5클론 중 3클론에 있어서 Oct3/4와 Nanog의 강한 유도가 관찰되었다.
이들 결과로부터, 초기화를 위해서는 적어도 3개의 유전자 조합(#14, #20, 및 #22)이 필수적이며, 그들 3종의 유전자를 포함하는 4유전자군(4-gene group) 및 10유전자군(10-gene group)에서는, 유전자의 수를 증가시킴에 따라 초기화 효율이 상승되는 것이 밝혀졌다.
실시예 3: 초기화된 세포의 다분화능의 해석
수립한 iPS세포의 분화다능성을 평가하기 위하여, 24개의 인자, 10개의 인자, 및 4개의 인자로 수립된 iPS세포를 누드마우스의 피하에 이식하였다. 그 결과, ES세포와 유사한 크기의 종양이 모든 예에서 형성되었다. 조직학적으로 보면, 종양은 여러 종류의 세포로 구성되어 있으며, 연골(cartilage) 조직, 신경(nerve) 조직, 근육(muscle) 조직, 지방(fat) 조직 및 장관양(intestinal tract-like) 조직(도 8)이 관찰되어, iPS세포의 다능성이 증명되었다. 한편, 3개의 인자로 수립한 세포를 누드마우스에 이식하면 종양은 형성되었으나, 조직학적으로는 미분화된 세포로만 형성되어 있었다. 따라서, 분화다능성의 유도를 위해서는 Sox패밀리가 필수임을 알 수 있었다.
실시예 4: 성체마우스의 꼬리로부터 유래하는 섬유아세포의 초기화
마우스 태아 섬유아세포(MEF)로 동정된 4개의 인자를 Fbx15유전자에 βgeo를 넉인하고, 전신에서 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 성체마우스의 꼬리로부터 유래한 섬유아세포로 도입하였다. 그 후, 피더세포(feeder cell) 상에서 ES세포 배양조건과 동일한 조건으로 배양하여, G418에 의한 선별을 행하였다. 약제선택 개시 후 약 2주간에 복수의 iPS세포 콜로니가 얻어졌다. 이들 세포를 누드마우스의 피하로 이식하면, 삼배엽계의 각종 조직으로 이루어진 기형종을 형성하였다. 또한, 성체피부 섬유아세포로부터 유래하는 iPS세포를 배반포에 이식하여 가상임신마우스의 자궁에 이식하였는 바, 수정 후 13.5일째의 배아에 있어서 전신에서 GFP양성 세포가 분포되어 있는 것이 관찰되었다(도 9). 이는, iPS세포가 다능성을 가지고 있으며, 마우스 배아 발생에 기여할 수 있음을 나타내고 있다. 이 결과는 동정한 인자의 군이 태아기의 체세포만이 아니라, 성숙된 마우스의 체세포에 대해서도 초기화를 유도하는 능력이 있음을 나타내고 있다. 성체피부 유래의 세포에서 초기화를 유도할 수 있다는 것은 실용상 극히 중요하다.
실시예 5
iPS세포 수립에 있어서의 사이토카인의 영향을 검토하였다. 피더세포(STO세포)에 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF) 또는 줄기세포인자(SCF)의 발현벡터(pMX 레트로바이러스 벡터)를 도입하고, 이들 사이토카인을 항시적으로(permanently) 발현하는 세포를 수립하였다. Fbx15β geo /β geo 마우스 유래 MEF(50만개/100mm 디쉬)를 이들 STO세포 상에서 배양하고, 4개의 인자를 도입한 후 G418에 의해 선별하였는 바, 통상의 STO세포 상에서 배양하였을 경우와 비교하여 콜로니 형성수가 bFGF(도 11), SCF(데이타 미도시)를 생산하는 STO세포 상에서는 20배 이상 상승하였다. 또한, c-Myc이외의 3개의 인자를 도입하더라도 통상적인 STO세포 상에서는 iPS세포 콜로니는 형성되지 않았으나, bFGF(도 11), SCF(데이타 미도시)를 생산하는 STO세포 상에서는 콜로니의 형성이 관찰되었다. 이들 결과로부터, 사이토카인의 자극에 의해 MEF로부터의 iPS세포의 수립효율이 상승되는 것, 및 c-Myc 대신에 사이토카인을 이용함으로써 핵초기화가 가능해지는 것이 밝혀졌다.
실시예 6
Oct3/4, Klf4, c-Myc 및 Sox2유전자에는 모두 패밀리 유전자(표 1 및 2)가 존재한다. 따라서, 4개의 유전자 대신에 패밀리 유전자에 의해서도 iPS세포가 수립가능한지를 검토하였다. 표 7에 2회의 실험 결과를 합한 것을 나타낸다. Sox패밀리의 경우에는, Sox1은 G418 내성 콜로니수 및 iPS세포의 수립효율 모두 Sox2와 동일한 수준이었다. Sox3은 G418 내성 콜로니수는 Sox2의 10분의 1정도였으나. 선택된 콜로니로부터의 iPS세포 수립효율은 Sox2보다 오히려 높았다. Sox15는 G418 내성 콜로니수 및 iPS세포의 수립효율 모두 Sox2보다 낮았다. Sox17은 G418 내성 콜로니는 Sox2와 동일 정도였으나, iPS세포 수립효율은 낮았다. Klf패밀리에 대해서는, Klf2는 Klf4보다 적은 G418 내성 콜로니가 생겼으나, iPS세포의 수립효율은 동일한 수준이었다. Myc패밀리에 대해서는, 우선 야생형의 c-Myc가 T58A 변이체와 G418 내성 콜로니수, iPS세포 수립효율의 양자에 있어서 동일한 수준임을 확인하였다. 또한, N-Myc 및 L-Myc(모두 야생형)은 모두 c-Myc와 G418 내성 콜로니수, iPS세포 수립효율의 양자에 있어서 동일한 수준이었다.
도입된 유전자 형성된
콜로니수		 선택된
콜로니수		 수립된
iPS세포주수		 iPS세포
수립효율(%)
4개의 인자（cMycT58A) 85 12 5 42
Sox1 84 12 7 58
Sox3 8 8 7 92
Sox15 11 11 1 8
Sox17 78 12 2 17
Klf2 11 10 5 50
c-MycWT 53 11 8 72
N-MycWT 40 12 7 58
L-MycWT 50 12 11 92
3개의 인자（-Sox2） 6 6 2 17
실시예 7
Fbx15-βgeo이외의 리포터로 iPS세포가 수립가능한지를 검토하였다. 우선, Nanog 유전자를 중앙부에 포함하는 대장균 인공염색체(E. coli artificial chromosome, BAC)를 단리하고, 대장균 내의 재조합에 의해 GFP유전자 및 퓨로마이신 내성유전자를 넉인하였다(도 12A). 이어서, 상기 개변 BAC(modified BAC)를 ES세포로 도입하고, 미분화상태 특이적(undifferentiated state specific)으로 GFP양성이 되는 것을 확인하였다(데이타 미도시). 이어서, 상기 ES세포의 마우스 배반포에 이식함으로써, 키메라 마우스를 거쳐 유전자전이 마우스를 작제하였다. 이 마우스에서, GFP양성 세포는 배반포의 내부 세포덩어리나 수정 후 13.5일째 배아의 생식선에서 특이적으로 관찰되었다(도 12B). 수정후 13.5일째의 배아(DBA, 129 및 7BL/6마우스의 잡종)로부터 생식선을 제거하고 MEF를 단리하였다. 흐름세포측정(flow cytometry)에 의해 단리된 MEF는 GFP음성임을 확인하였다(도 13). 이 MEF에 4개의 인자를 레트로바이러스로 도입하고 퓨로마이신에 의하여 선택하였는 바, 복수의 내성 콜로니가 얻어졌다. 그 중의 약 10-20%만이 GFP양성이었다. GFP양성 콜로니를 계대배양하면, ES세포와 유사한 형태(도 14)나 증식(도 15)을 나타내었다. 또한, 유전자발현을 보면, Fbx15β geo/β geo의 MEF로부터 G418선별에 의해 단리된 iPS세포보다 ES세포에 더 유사한 패턴임을 알 수 있었다(도 16). 이 세포를 누드마우스에 이식하면, 기형종이 형성된 것으로부터 iPS세포인 것이 확인되었다(도 17). 그리고, Nanog-GFP선택에 의한 iPS세포를 C57BL/6마우스의 배반포에 이식함으로써, 키메라 마우스가 탄생하였다(도 18). 그리고, 이 키메라 마우스끼리 교배시킴으로써 생식선전이가 확인되었다(도 19). 이 Nanog-GFP선별에 의해 수립되어 보다 ES세포에 가까운 iPS세포에서는, 레트로바이러스로부터의 4개의 인자는 거의 완전히 발현되지 않으며(almost completely silenced), 내재성의 Oct3/4나 Sox2에 의해 자기복제(self-replication)가 유지되고 있음이 시사되었다.
실시예 8
10cm 융합성(confluent) iPS세포를 트립신 처리하여, ES세포용 배지에 현탁하였다(STO세포는 현탁후 10~20분 젤라틴 코팅한 디쉬에 접착시킴으로써 제거하였다). 2×106의 세포를 HEMA(2-hydroxyethyl methacrylate)로 코팅한 대장균 배양용 디쉬에서 4일간 부유배양하여, 배아유사체(embryoid body, EB)를 형성시켰다(day 1-4). EB형성 4일째(day 4)에 EB를 전량 10cm 조직배양용 디쉬로 옮겨 ES세포용 배지에 24시간 배양하여 접착시켰다. 24시간 후(day 5)에 ITS/피브로넥틴 함유 배지로 교환하였다. 7일간 배양하여(2일마다 배지교환을 행한다). 네스틴(nestin) 양성 세포를 선별하였다(무혈청하에서 배양하면, 다른 계보(pedigree)의 세포가 어느 정도 죽어간다)(day 5-12). 다음으로, A2B5양성 세포의 유도를 행하였다. 7일후(day 12), 트립신 처리하여 세포를 흩트려서(separated), 잔존하는 EB를 제거하였다. 1×105개의 세포를 폴리-L-오르니틴/피브로넥틴이 코팅된 24웰 플레이트에 접종하고, N2/bFGF함유 배지로 4일간 배양하였다(2일마다 배지교환(day 12-16). 4일후(day 16)에 N2/bFGF/EGF함유 배지로 교환하여, 4일간 배양하였다(2일마다 배지교환)(day 16-20). 4일후(day 20)에 N2/bFGF/PDGF함유 배지로 교환하여, 4일간 배양하였다(2일마다 배지교환)(day 20-24). 이 기간(day 12-24)에 세포가 과도하게 증식되어 융합상태(confluent)가 된 경우에는, 수시 계대하여 1~2×105개의 세포를 접종하였다(계대시기에 따라 수는 변경된다). 4일후(day 24)에 N2/T3배지로 교환하여 7일간 배양하고(day 24-31), 2일마다 배지교환을 행하였다. Day 31째에 고정하고, 면역염색하였다. 그 결과, iPS세포로부터 ΒIII 튜블린 양성의 신경세포, 04양성의 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte), GFAP양성의 아스트로사이트 (astrocyte)로의 분화가 확인되었다(도 20).
실시예 9
Fbx15-βgeo 넉인 마우스 이외의 임의의 마우스 체세포로부터 iPS세포를 수립하기 위하여, 약제에 의한 선별을 이용하지 않는 수립방법을 개발하였다. 10cm 디쉬(STO 피더세포상)에 마우스 태아 섬유아세포(MEF)를 지금까지보다 소수(1만, 5만 또는 10만개) 배양하고, 레트로바이러스에 의해 대조군 DNA 또는 4개의 인자를 도입하였다. ES세포배지에 2주간 배양(G418 선별없이)을 행한 바, 대조군 DNA를 도입한 디쉬에서는 콜로니 형성이 관찰되지 않았으나, 4개의 인자를 도입한 디쉬에 서는 형질전환되었을 것으로 여겨지는 편평한 콜로니뿐만 아니라, 복수의 컴팩트한 콜로니가 형성되었다(도 21). 이들로부터 24개의 콜로니를 선택하여 배양을 계속하였는 바, ES세포와 유사한 형태가 관찰되었다. 이 유전자발현을 RT-PCR로 검토하였는 바, 7개의 클론에서 ES세포 마커인 Esg1의 발현이 관찰되었다. 또한, 클론 4에서는 Nanog, ERas, GDF3, Oct3/4, Sox2 등의 많은 ES세포 마커의 유도가 관찰되어, 이로부터 iPS세포라고 생각되었다(도 22). 이상의 결과로부터, iPS세포 수립에는 Fbx15-βgeo넉인 등을 이용한 약제선별(drug selection)은 필수가 아니며, 임의의 마우스유래 체세포로부터 iPS세포를 수립할 수 있음이 입증되었다. 본 기술에 의해 질환모델 마우스의 체세포로부터도 iPS세포가 수립할 수 있는 가능성이 제시되었다.
실시예 10
iPS세포를 유도하는 세포로서 섬유아세포 이외의 세포인 간세포(hepatocyte) 및 위점막세포(gastric mucous cell)를 검토하였다. Fbx15β geo/β geo 마우스의 간으로부터 간세포를 환류(perfusion)에 의해 단리하였다. 이 간세포에 4개의 인자를 레트로바이러스로 투여하여 G418에 의해 선별하였는 바, 복수의 iPS세포 콜로니가 얻어졌다. DNA 마이크로어레이에 의한 유전자발현 패턴 해석의 결과, 간유래의 iPS세포는 피부 섬유아세포나 태아 섬유아세포 유래의 iPS세포보다 ES세포에 더 유사함이 밝혀졌다. 위점막세포로부터도 간세포로부터와 마찬가지로 iPS세포가 얻어졌다.
실시예 11
PD98059는 MAP 키나제의 저해제로서, 많은 분화된 세포에 있어서는 증식을 억제하지만, ES세포에서는 미분화상태의 유지와 증식을 촉진하는 것이 알려져 있다. 따라서, iPS세포 수립에 있어서의 PD98059의 효과를 검토하였다. Nanog-EGFP-IRES-Puro의 선별마커를 가지는 마우스로부터 수립한 MEF에 4개의 인자를 레트로바이러스로 투여하고, 퓨로마이신에 의한 선별을 행하였다. PD98059를 투여하지 않은 경우, 얻어진 iPS세포 콜로니 중에서 GFP양성의 비율은 8%였다. 한편, PD98059(최종농도 25μΜ)를 레트로바이러스 감염의 다음날로부터 지속적으로 투여한 군에서는, 얻어진 콜로니의 45%가 GFP양성이었다. 이는 PD98059가 GFP양성의, 보다 ES세포에 가까운 iPS세포의 증식을 촉진하지만, GFP음성의 iPS세포나 분화된 세포의 증식은 억제하기 때문이라 생각되었다. 이로부터, PD98059는, 보다 ES세포에 가까운 iPS세포의 수립이나 약제선별을 하지 않은 iPS세포의 수립에 이용할 수 있음이 나타났다.
실시예 12
태아유래의(embryonic) 사람피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)에 마우스 이코트로픽 바이러스(ecotropic virus) 수용체인 solute carrier family 7(Slc7a1, NCBI 등록번호 NM_007513)을 렌티바이러스로 발현시킨 세포에, 마우스 Oct3/4유전자 프로모터 하류에 적색형광 단백질 유전자를, PGK프로모터 하류에 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자를 각각 도입한 플라스미드를 핵전이방법(nucleofection)으로 도입하였다. 하이그로마이신에 의한 선별을 행하여, 안정하게 발현하는 세포주를 수립하였다. 800,000개의 세포를 마이토마이신(mitomycin) 처리한 STO세포 위에 접종하고, 다음날 레트로바이러스에 의해 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc(어느 것이나 사람유래)를 도입하였다. 3주간 후에 얻어진 콜로니(도 23의 좌)를 24개 선택하여, STO세포를 접종한 24-웰 플레이트에 옮겨 배양하였다. 2주간 후에 늘어난 1클론을 STO세포를 접종한 6-웰 플레이트에 계대하여 배양한 결과, ES세포와 유사한 형태의 세포가 얻어져(도 23의 우), iPS세포임이 시사되었다. 배지는 언제나 마우스 ES세포용 배지를 이용하였다.
실시예 13
사람성체피부 섬유아세포(adult HDF)에 렌티바이러스로 Slc7a1(마우스 레트로바이러스 수용체)를 도입한 세포를 800,000개의 피더세포(마이토마이신처리 STO세포)상에 접종하고, 이하의 조합으로 레트로바이러스에 의해 유전자를 도입하였다.
1. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, SV40 Large T antigen
2. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, HPV16 E6
3. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, HPV16 E7
4. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
5. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT, Bmil
(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT는 사람유래, Bmil은 마우스유래)
마우스 ES세포의 배양조건하에서 약제선별없이 배양을 계속하였는 바, 상기 1의 조합으로 인자를 도입한 디쉬에서 바이러스감염 8일 후에 iPS세포라고 생각되는 콜로니가 출현하였다(도 24). 다른 조합(2 내지 5)에 있어서도, 1의 조합의 경우만큼은 명료하지 않지만, iPS세포와 같은 콜로니가 출현하였다. 4개의 인자만을 도입해도 전혀 콜로니는 출현하지 않았다.
본 발명에 의해 제공된 핵초기화 인자를 이용함으로써 배아나 ES세포를 이용하지 않고 간편하면서도 재현성 좋게 분화된 세포핵의 초기화를 유도할 수 있으며, ES세포와 동일한 분화 및 다능성이나 증식능을 가지는 미분화된 세포인 유도다능성 줄기세포를 수립할 수 있다.
<110> Kyoto University <120> Nuclear Reprogramming Factor <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 1 tgtggggccc tgaaaggcga gctgagat 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 2 atgggccgcc atacgacgac gctcaact 28 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 3 gaagtctggt tccttggcag gatg 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 4 actcgataca ctggcctagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 5 caggtgtttg agggtagctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 6 cggttcatca tggtacagtc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 7 actgcccctc atcagactgc tact 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 8 cactgccttg tactcgggta gctg 24 <210> 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caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300 gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360 caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420 gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480 atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540 gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600 cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660 ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720 ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 780 gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 840 aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900 atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960 tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020 gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080 ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1140 tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200 atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260 tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1320 gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380 ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1440 gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1500 ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1560 tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1620 tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1680 gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1740 tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800 gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860 atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920 gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980 acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040 catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100 acacctcccc ctgaacctga aacataa 2127 <210> 24 <211> 456 <212> DNA <213> virus HPV16 E6 <400> 24 atgtttcagg acccacagga gcgacccaga aagttaccac agttatgcac agagctgcaa 60 acaactatac atgatataat attagaatgt gtgtactgca agcaacagtt actgcgacgt 120 gaggtatatg actttgcttt tcgggattta tgcatagtat atagagatgg gaatccatat 180 gctgtatgtg ataaatgttt aaagttttat tctaaaatta gtgagtatag acattattgt 240 tatagtttgt atggaacaac attagaacag caatacaaca aaccgttgtg tgatttgtta 300 attaggtgta ttaactgtca aaagccactg tgtcctgaag aaaagcaaag acatctggac 360 aaaaagcaaa gattccataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat gtcttgttgc 420 agatcatcaa gaacacgtag agaaacccag ctgtaa 456 <210> 25 <211> 297 <212> DNA <213> virus HPV16 E7 <400> 25 atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60 gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120 ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180 tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240 gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297

Claims (18)

  1. a) Oct3/4 유전자 또는 그의 유전자 산물;
    b) Klf 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물; 및,
    c) Myc 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물, 또는 Sox 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물, 또는 Myc 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물 및 Sox 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물을 포함하되,
    상기 Klf 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물은 Klf2 및 Klf4로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 유전자 또는 그의 유전자 산물이며,
    상기 Myc 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물은 c-Myc, L-Myc 및 N-Myc로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 유전자 또는 그의 유전자 산물이고,
    상기 Sox 패밀리 유전자 또는 그의 유전자 산물은 Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 및 Sox17로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 유전자 또는 그의 유전자 산물이며,
    초기화되는 체세포가 상기 유전자 산물들 중 하나 또는 그 이상을 발현하고 있는 경우 상기 유전자 또는 그의 유전자 산물이 선택적으로 배제되는 것을 특징으로 하는 체세포의 핵초기화 인자.
  2. 제1항에 있어서,
    사이토카인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    인자.
  3. 제2항에 있어서,
    사이토카인은 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF), 줄기세포인자(SCF), 또는 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF) 및 줄기세포인자(SCF)인 것을 특징으로 하는
    인자.
  4. 제3항에 있어서,
    Oct3/4, Klf4 및 Sox2의 3종류의 유전자 또는 그의 유전자 산물, 및 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF)인 사이토카인 각각을 포함하는 것을 특징으로 하는
    인자.
  5. 제1항에 있어서,
    Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 c-Myc의 4종류의 유전자 또는 그의 유전자 산물 각각을 포함하는 것을 특징으로 하는
    인자.
  6. 제1항에 있어서,
    Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 L-Myc의 4종류의 유전자 또는 그의 유전자 산물 각각을 포함하는 것을 특징으로 하는
    인자.
  7. 제1항에 있어서,
    TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Fbx15, Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sall4, Rex1, UTF1, Stella, Stat3 및 Grb2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 유전자 또는 그의 유전자 산물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    인자.
  8. 체세포와 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 개시된 핵초기화 인자를 접촉시키는 공정을 포함하는 유도다능성 줄기세포를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    체세포는 사람의 체세포인 것을 특징으로 하는
    방법.
  10. 체세포와 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 개시된 핵초기화 인자를 접촉시켜 수득한 유도다능성 줄기세포의 분화를 유도하는 공정을 포함하는, 분화-유도된 체세포의 제조방법.
  11. (1) 체세포와 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 개시된 핵초기화 인자를 접촉시켜 유도다능성 줄기세포를 수득하는 공정; 및,
    (2) 상기 (1) 공정에서 수득한 유도다능성 줄기세포의 분화를 유도하여 분화-유도된 체세포를 수득하는 공정을 포함하는, 분화-유도된 체세포의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    체세포는 사람의 체세포인 것을 특징으로 하는
    방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
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