CN112639111B - 使用阳离子性脂质的转染心肌细胞的方法 - Google Patents

使用阳离子性脂质的转染心肌细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供向心肌细胞导入核酸的效率优良的手段、特别是转染方法。本发明的向心肌细胞转染核酸的方法包括使含有式(I)所示的化合物或其盐、结构脂质和核酸的组合物与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤。n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，L表示‑C(O)O‑或‑NHC(O)O‑，Ra表示直链状C5‑13烷基、直链状C13‑17烯基或直链状C17链二烯基，Rb表示直链状C2‑9烷基，Rc表示氢原子或直链状C2‑9烷基，Rd表示氢原子或直链状C2‑9烷基，Re表示直链状C2‑9烷基，Rf表示直链状C2‑9烷基。

Description

使用阳离子性脂质的转染心肌细胞的方法
技术领域
本发明涉及能够将核酸导入心肌细胞的组合物。进一步地，本发明涉及使用这样的组合物的向心肌细胞转染核酸的方法、以及心肌细胞的纯化方法和制造方法。
背景技术
心肌细胞在出生的同时丧失其分裂能力，难以再生。因此，近年来，对起因于心肌梗死、心肌炎或衰老等的受损心脏组织移植对胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)等具有多能性的细胞进行分化诱导而得到的心肌细胞的替代疗法受到关注。已经报道了很多由这些多能干细胞向心肌细胞分化诱导的方法(专利文献1、专利文献2、专利文献3和非专利文献1)。但是，为了作为移植用细胞使用，需要通过分选等提高心肌细胞的纯度。
以往，作为筛选心肌细胞的方法，大多采用使用针对心肌细胞或心肌祖细胞的表面标志物筛选心肌细胞的方法，例如，专利文献4中记载了：使用与在心肌细胞中特异性表达的miRNA对应的“miRNA-responsive off-switch mRNA(miRNA应答性关闭开关mRNA)”，能够纯化由多能干细胞等分化诱导得到的细胞群中所含的心肌细胞。
另一方面，关于向心肌细胞导入(转染)期望物质的技术，例如，非专利文献2中记载了：通过将在由L-α-磷脂酰胆碱(PC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DPPE)和胆固醇(CHOL)形成的脂质纳米粒子(LNP)中包封FITC-Dextran(FITC标记葡聚糖)而成的物质转染到培养心肌细胞中，在心肌细胞中观察到了荧光。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2007/002136号
专利文献2：国际公开第2009/118928号
专利文献3：日本特开2010-158206号公报
专利文献4：国际公开第2015/141827号
非专利文献
非专利文献1：Yan P,et al,Biochem Biophys Res Commun.379：115-20(2009)
非专利文献2：Stephen L.Hayward[Univ.Nebraska-Lincoln](Digital Commons@University of Nebraska-Lincoln,2015)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供例如能够用于实施前述专利文献4中记载的方法的、向心肌细胞导入核酸的效率优良的手段、特别是转染方法。另外，在另一观点中，本发明的目的在于，提供利用了这样的手段的心肌细胞的纯化方法和制造方法。
用于解决问题的方法
本发明的发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过使用由下式所示的化合物(一种阳离子性脂质)或其盐与另外的结构脂质形成的脂质粒子，能够高效地将核酸导入心肌细胞，能够解决上述问题，从而完成了本发明。
即，本发明至少涉及以下的发明。
[1]
一种向心肌细胞转染核酸的方法，其包括使组合物与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤，所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)核酸，
[式中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基]。
[2]
根据项1所述的方法，其中，上述核酸为mRNA。
[3]
根据项2所述的方法，其中，上述mRNA包含：
(i)包含被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA。
[4]
根据项2所述的方法，其中，上述mRNA包含：
(i)包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA。
[5]
根据项3或4所述的方法，其中，上述(i)和(ii)的功能性基因各自独立地为选自由抗药性基因、编码荧光蛋白的基因、凋亡诱导基因和自杀基因组成的组中的1种或1种以上的基因。
[6]
根据项1所述的方法，其中，包含心肌细胞的细胞群为包含由诱导多能干细胞、胚胎干细胞或其他干细胞分化诱导得到的心肌细胞的细胞群。
[7]
一种心肌细胞的纯化方法，其包括使组合物与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤，所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
[式中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基]。
[8]
一种心室肌细胞的纯化方法，其包括使组合物与包含心室肌细胞的细胞群接触的步骤，所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
[式中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基]。
[9]
一种心肌细胞的制造方法，其包括使组合物与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤，所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
[式中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基]。
[10]
一种心室肌细胞的制造方法，其包括使组合物与包含心室肌细胞的细胞群接触的步骤，所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
[式中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基]。
[11]
一种用于向心肌细胞转染核酸的组合物，其含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)核酸，
[式中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基]。
[12]
一种用于向心肌细胞转染核酸的试剂盒，其含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)核酸，
[式中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基]。
需要说明的是，本说明书中，有时将“式(I)所示的化合物”记作“化合物(I)”。有时将“式(I)所示的化合物或其盐”称为“本发明的化合物”。有时将“含有式(I)所示的化合物或其盐(本发明的化合物)的脂质粒子”称为“本发明的脂质粒子”。有时将含有本发明的化合物、结构脂质和核酸的用于向心肌细胞转染核酸的组合物称为“本发明的组合物”。有时将含有本发明的化合物、结构脂质和核酸的用于向心肌细胞转染核酸的试剂盒称为“本发明的试剂盒”。
发明效果
根据本发明的转染方法，能够对心肌细胞以优良的转染效率导入各种核酸。另外，通过在这样的转染方法中利用心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA作为核酸，能够高效地纯化细胞群中的心肌细胞，换言之，能够高效地制造包含心肌细胞的细胞群的纯化物。
而且，通过在本发明的转染方法中利用特定的心肌细胞亚型(例如心室肌细胞)特异性的miRNA应答性mRNA作为核酸，能够高效地仅纯化细胞群中的特定的心肌细胞亚型。
附图说明
图1是在实施例中将使用“信使MAX(Messenger MAX)”制备的含有绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的脂质纳米粒子(LNP)和使用本发明的化合物制备的含有GFP mRNA的LNP(制备例8、10、11)向iPSC来源的包含心肌细胞的细胞群转染的次日的相位差显微镜照片和荧光显微镜照片。
图2示出在实施例中将使用“信使MAX”制备的含有GFP mRNA的LNP和使用本发明的化合物制备的含有GFP mRNA的LNP(制备例8、10、11)向iPSC来源的包含心肌细胞的细胞群转染的次日的流式细胞术分析的结果。
具体实施方式
本说明书中，“转染”表示将任意的物质导入细胞的内部。细胞的内部至少包含细胞质内和核内。
本说明书中，将“核酸”(例如“mRNA”)通过转染而导入到细胞内部。核酸的使用量可根据转染的条件、目的等而变更，例如，相对于1×106个细胞，mRNA的使用量为1ng～100μg、优选为100ng～5000ng。
“培养(Culture)”或“进行培养”表示：在组织外或体外、例如在培养皿、培养盘、烧瓶或培养槽(罐)中维持细胞，使其增殖和/或使其分化。
“多能性(pluripotency)”表示：能够分化成各种具有不同的形态、功能的组织、细胞，并且也能够分化成三胚层中任一系统的细胞的能力。“多能性(pluripotency)”不能分化为胚盘，因此不具有形成个体的能力，从这一点来说，与能够分化成包括胚盘在内的生物体的全部组织的“全能性(totipotency)”不同。
“多能性(multipotency)”表示：能够分化为有限数量的多种系统的细胞的能力。例如间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞为multipotent，不为pluripotent。
作为“干细胞(stem cell)”，可列举例如多能干细胞(pluripotent stem cell)。
本发明中能够使用的“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指：具有能够分化成生物体的各种具有不同形态、功能的组织、细胞、并且也能够分化成三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)中任一系统的细胞的能力的干细胞。其没有特别限定，可列举例如胚胎干细胞(ESC)、通过核移植而得到的克隆胚来源的胚胎干细胞、精子干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞(本说明书中有时也称为“iPSC”)等。
另外，本发明中能够使用的“多能干细胞(multipotent stem cell)”是指：具有能够分化为有限数量的多个系统的细胞的能力的干细胞。作为本发明中能够使用的“多能干细胞(multipotent stem cell)”，可列举例如：牙髓干细胞、口腔粘膜来源的干细胞、毛囊干细胞、培养成纤维细胞、骨髓干细胞来源的体干细胞等。优选的多能干细胞(pluripotentstem cell)为ESC和iPSC。
“诱导多能干细胞(iPSC)”是指：向哺乳动物体细胞或未分化干细胞导入特定的因子(核重编程因子)进行重编程而得到的细胞。目前，“诱导多能干细胞”包括各种类型，除了山中等向小鼠成纤维细胞导入Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc这4个因子而建立的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)以外，还可以使用将相同的4个因子导入人成纤维细胞而建立的人细胞来源的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,etal.Cell,(2007)131:861-872.)、在导入上述4个因子后以表达Nanog为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、通过不含c-Myc的方法而制作的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.NatureBiotechnology,(2008)26,101-106)、通过无病毒法导入6个因子而建立的iPS细胞(OkitaK et al.Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,Okita K et al.Stem Cells.31(3):458-66.)。另外，还可以使用Thomson等制作的导入了OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28这4个因子而建立的诱导多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.)、Daley等制作的诱导多能干细胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451:141-146)、樱田等制作的诱导多能干细胞(日本特开2008-307007号)等。此外，还可以使用已公开的所有论文(例如Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,etal.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)或专利(例如日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中记载的该领域中公知的诱导多能干细胞中的任一种。
作为“诱导多能干细胞”，可以利用NIH、理研(理化学研究所)、京都大学等建立的各种iPSC细胞株。例如，在人iPSC株的情况下，可列举理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。或者，可以使用京都大学、Cellular DynamicsInternational等提供的临床级别的细胞株、以及使用这些细胞株制作的研究用和临床用的细胞株等。
作为“胚胎干细胞(ESC)”，在小鼠ESC的情况下，可以利用inGenious targetinglaboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ESC株；在人ESC的情况下，可以利用NIH、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ESC株。例如，作为人ESC细胞株，可利用NIH的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell Research的H1株、H9株、理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。或者，可以使用临床级别的细胞株以及使用这些细胞株制作的研究用和临床用的细胞株等。
本说明书中，只要没有特别说明则“心肌细胞”包含心室肌细胞、心房肌细胞、起搏细胞等亚型中的1种以上。
本说明书中，“包含心肌细胞的细胞群”表示：包含1种以上的心肌细胞和心肌细胞以外的细胞的细胞群，体内(in vivo)的细胞群、离体(ex vivo)的细胞群均可，也可以为培养的细胞群(体外(in vitro))。包含心肌细胞的细胞群例如可以为处于体内的、或用任意方法收集的处于离体的、外周血、心脏、骨髓组织、脂肪组织、骨骼肌组织、羊膜组织、胎盘组织、脐带血等中所含的细胞群，可以为在适合分化诱导为心肌细胞的条件下对能够分化诱导为心肌细胞的细胞(例如干细胞、多能干细胞、ESC、iPSC)进行培养而得到的细胞群(包括胚状体)。
本说明书中，“心肌细胞以外的细胞”没有特别限定，可列举例如源自“包含心肌细胞的细胞群”的生物体组织、培养物中所含的心肌细胞以外的细胞。
一个实施方式中，“包含心肌细胞的细胞群”为包含由iPSC分化诱导而得到的心肌细胞(包含1种以上亚型)和未分化的iPSC等心肌细胞以外的细胞的细胞群。
本说明书中，“包含心室肌细胞的细胞群”为包含1种以上的心室肌细胞和心室肌细胞以外的细胞的细胞群。
本说明书中，“心室肌细胞以外的细胞”没有特别限定，可列举例如心室肌细胞以外的心肌细胞的亚型(例如心房肌细胞、起搏细胞)、心肌细胞以外的细胞。
本发明中的“心肌细胞”、“心室肌细胞”、“心肌细胞以外的细胞”和“心室肌细胞以外的细胞”可以为人源细胞，也可以为源自人以外的哺乳类(非人哺乳动物)的细胞。作为非人哺乳动物，可列举例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、绵羊、猴。
本说明书中，“对象细胞”表示：成为本发明的转染对象的心肌细胞或其的特定亚型(例如心室肌细胞、心房肌细胞、起搏细胞等)。
本说明书中，“miRNA”为通过抑制由mRNA翻译为蛋白质、分解mRNA来参与基因的表达调控的、存在于细胞内的短链(通常为20～25个碱基)的非编码RNA。就该miRNA而言，以能够获得包含miRNA及其互补链的发夹环结构的单链pri-miRNA形式从DNA中转录出来，被位于核内的称为Drosha的酶局部切断而形成pre-miRNA，并被输送到核外，之后再被Dicer切断而具有功能。
“包含(comprise(s)或comprising)～”是指：虽然表示包括了连接在该短语之后的要素、但不限于此。因此表示包括连接在短语之后的要素、但不表示排除其他的任意要素。
“由～构成(consist(s)of或consisting of)”是指：表示包括了连接在该短语之后的全部要素、并且仅限于这些。因此，“由～构成”这一短语表示：所列举的要素为需要的或必须的，其他要素实质上不存在。“基本由～构成”表示：包含连接在该短语之后的任意要素、并且对该要素限定了不影响本发明中规定的活性或作用的其他要素。因此，“基本由～构成”这一短语表示：所列举的要素为需要的或必须的，其他要素为任选的，根据对所列举的要素的活性或作用是否有影响而有时使它们存在、有时使它们不存在。
以下，对本说明书中使用的各取代基的定义进行详细说明。只要没有特别说明，则各取代基具有以下的定义。
本说明书中，作为“直链状C5-13烷基”，可列举例如戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基。
本说明书中，作为“直链状C13-17烯基”，可列举例如：1-十三碳烯基、2-十三碳烯基、3-十三碳烯基、4-十三碳烯基、5-十三碳烯基、6-十三碳烯基、7-十三碳烯基、8-十三碳烯基、9-十三碳烯基、10-十三碳烯基、11-十三碳烯基、12-十三碳烯基；1-十四碳烯基、2-十四碳烯基、3-十四碳烯基、4-十四碳烯基、5-十四碳烯基、6-十四碳烯基、7-十四碳烯基、8-十四碳烯基、9-十四碳烯基、10-十四碳烯基、11-十四碳烯基、12-十四碳烯基、13-十四碳烯基；1-十五碳烯基、2-十五碳烯基、3-十五碳烯基、4-十五碳烯基、5-十五碳烯基、6-十五碳烯基、7-十五碳烯基、8-十五碳烯基、9-十五碳烯基、10-十五碳烯基、11-十五碳烯基、12-十五碳烯基、13-十五碳烯基、14-十五碳烯基；1-十六碳烯基、2-十六碳烯基、3-十六碳烯基、4-十六碳烯基、5-十六碳烯基、6-十六碳烯基、7-十六碳烯基、8-十六碳烯基、9-十六碳烯基、10-十六碳烯基、11-十六碳烯基、12-十六碳烯基、13-十六碳烯基、14-十六碳烯基、15-十六碳烯基；1-十七碳烯基、2-十七碳烯基、3-十七碳烯基、4-十七碳烯基、5-十七碳烯基、6-十七碳烯基、7-十七碳烯基、8-十七碳烯基、9-十七碳烯基、10-十七碳烯基、11-十七碳烯基、12-十七碳烯基、13-十七碳烯基、14-十七碳烯基、15-十七碳烯基、16-十七碳烯基。这些直链状C13-17烯基包含1个碳-碳双键，因此能够形成顺式型和反式型的结构，可以为任一结构。
本说明书中，作为“直链状C17链二烯基”，可列举例如：1,3-十七碳二烯基、1,4-十七碳二烯基、1,5-十七碳二烯基、1,6-十七碳二烯基、1,7-十七碳二烯基、1,8-十七碳二烯基、1,9-十七碳二烯基、1,10-十七碳二烯基、1,11-十七碳二烯基、1,12-十七碳二烯基、1,13-十七碳二烯基、1,14-十七碳二烯基、1,15-十七碳二烯基、1,16-十七碳二烯基、2,4-十七碳二烯基、2,5-十七碳二烯基、2,6-十七碳二烯基、2,7-十七碳二烯基、2,8-十七碳二烯基、2,9-十七碳二烯基、2,10-十七碳二烯基、2,11-十七碳二烯基、2,12-十七碳二烯基、2,13-十七碳二烯基、2,14-十七碳二烯基、2,15-十七碳二烯基、2,16-十七碳二烯基、3,5-十七碳二烯基、3,6-十七碳二烯基、3,7-十七碳二烯基、3,8-十七碳二烯基、3,9-十七碳二烯基、3,10-十七碳二烯基、3,11-十七碳二烯基、3,12-十七碳二烯基、3,13-十七碳二烯基、3,14-十七碳二烯基、3,15-十七碳二烯基、3,16-十七碳二烯基、4,6-十七碳二烯基、4,7-十七碳二烯基、4,8-十七碳二烯基、4,9-十七碳二烯基、4,10-十七碳二烯基、4,11-十七碳二烯基、4,12-十七碳二烯基、4,13-十七碳二烯基、4,14-十七碳二烯基、4,15-十七碳二烯基、4,16-十七碳二烯基、5,7-十七碳二烯基、5,8-十七碳二烯基、5,9-十七碳二烯基、5,10-十七碳二烯基、5,11-十七碳二烯基、5,12-十七碳二烯基、5,13-十七碳二烯基、5,14-十七碳二烯基、5,15-十七碳二烯基、5,16-十七碳二烯基、6,8-十七碳二烯基、6,9-十七碳二烯基、6,10-十七碳二烯基、6,11-十七碳二烯基、6,12-十七碳二烯基、6,13-十七碳二烯基、6,14-十七碳二烯基、6,15-十七碳二烯基、6,16-十七碳二烯基、7,9-十七碳二烯基、7,10-十七碳二烯基、7,11-十七碳二烯基、7,12-十七碳二烯基、7,13-十七碳二烯基、7,14-十七碳二烯基、7,15-十七碳二烯基、7,16-十七碳二烯基、8,10-十七碳二烯基、8,11-十七碳二烯基、8,12-十七碳二烯基、8,13-十七碳二烯基、8,14-十七碳二烯基、8,15-十七碳二烯基、8,16-十七碳二烯基、9,11-十七碳二烯基、9,12-十七碳二烯基、9,13-十七碳二烯基、9,14-十七碳二烯基、9,15-十七碳二烯基、9,16-十七碳二烯基、10,12-十七碳二烯基、10,13-十七碳二烯基、10,14-十七碳二烯基、10,15-十七碳二烯基、10,16-十七碳二烯基、11,13-十七碳二烯基、11,14-十七碳二烯基、11,15-十七碳二烯基、11,16-十七碳二烯基、12,14-十七碳二烯基、12,15-十七碳二烯基、12,16-十七碳二烯基、13,15-十七碳二烯基、13,16-十七碳二烯基、14,16-十七碳二烯基。这些直链状C17链二烯基包含2个碳-碳双键，因此各自能够相互独立地形成顺式型和反式型的结构，各自可以为任一结构。
本说明书中，作为“直链状C2-9烷基”，可列举例如乙基、丁基、丙基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基。
式(I)中的n1、n2、n3、L、Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自的优选例如下所述。
n1优选为3～5的整数。
n2优选为0～2的整数。
n3优选为0～2的整数。
L优选为-C(O)O-。
Ra优选为直链状C5-9烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基。
Rb优选为直链状C4-8烷基。
Rc优选为氢原子或直链状C4-7烷基。
Rd优选为氢原子或直链状C3-6烷基。
Re优选为直链状C3-6烷基。
Rf优选为直链状C3-7烷基。
化合物(I)的优选的具体例如下所述。
化合物(I-A)：n1为3～5的整数、n2为0、n3为0～2的整数、L为-C(O)O-、Ra为直链状C5-9烷基、Rb为直链状C4-8烷基、Rc为氢原子、Rd为氢原子、Re为直链状C3-6烷基、Rf为直链状C3-7烷基的化合物。
化合物(I-B)：n1为3～5的整数、n2为0或1、n3为0或1、L为-C(O)O-、Ra为直链状C5-9烷基、Rb为直链状C4-8烷基、Rc为直链状C5-7烷基、Rd为氢原子、Re为直链状C3-6烷基、Rf为直链状C3-7烷基的化合物。
化合物(I-C)：n1为3～5的整数、n2为0或1、n3为0～2的整数、L为-C(O)O-、Ra为直链状C5-9烷基、Rb为直链状C4-8烷基、Rc为氢原子、Rd为直链状C3-6烷基、Re为直链状C3-6烷基、Rf为直链状C3-7烷基的化合物。
化合物(I-D)：n1为3～5的整数、n2为0或1、n3为0～2的整数、L为-C(O)O-、Ra为直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基、Rb为直链状C3-6烷基、Rc为直链状C3-6烷基、Rd为氢原子、Re为直链状C2-6烷基、Rf为直链状C2-7烷基的化合物。
化合物(I)的更优选的具体例如下所述。
化合物(a)：n1为3或4、n2为0、n3为0或2、L为-C(O)O-、Ra为直链状C7烷基、Rb为直链状C6烷基、Rc为氢原子、Rd为氢原子、Re为直链状C5-6烷基、Rf为直链状C6-7烷基的化合物。
化合物(b)：n1为3～5的整数、n2为0或1、n3为0或1、L为-C(O)O-、Ra为直链状C6-7烷基、Rb为直链状C5-6烷基、Rc为直链状C5-6烷基、Rd为氢原子、Re为直链状C4-5烷基、Rf为直链状C5-6烷基的化合物。
化合物(c)：n1为3～5的整数、n2为0、n3为2、L为-C(O)O-、Ra为直链状C5-9烷基、Rb为直链状C4-8烷基、Rc为氢原子、Rd为直链状C3-5烷基、Re为直链状C3-5烷基、Rf为直链状C3-5烷基的化合物。
化合物(d)：n1为3～5的整数、n2为0或1、n3为0～2的整数、L为-C(O)O-、Ra为直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基、Rb为直链状C3-5烷基、Rc为直链状C3-5烷基、Rd为氢原子、Re为直链状C3-6烷基、Rf为直链状C3-7烷基的化合物。
作为化合物(I)的盐，优选药理学上可接受的盐，可列举例如与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐。
作为与无机碱的盐的优选例，可列举：钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铝盐、铵盐。优选钠盐、钾盐、钙盐、镁盐，更优选钠盐、钾盐。
作为与有机碱的盐的优选例，可列举与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇[三(羟甲基)甲胺]、叔丁胺、环己胺、苄胺、二环己胺、N,N-二苄基乙二胺的盐。
作为与无机酸的盐的优选例，可列举与氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸的盐。优选为与盐酸的盐、与磷酸的盐。
作为与有机酸的盐的优选例，可列举与甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的盐。
作为与碱性氨基酸的盐的优选例，可列举与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸的盐。
作为与酸性氨基酸的盐的优选例，可列举与天冬氨酸、谷氨酸的盐。
以下对本发明的组合物进行说明。
本发明的转染方法、纯化方法和制造方法中，使用含有1)式(I)所示的化合物或其盐(本发明的化合物)、2)结构脂质和3)核酸的用于向心肌细胞转染核酸的组合物、即本发明的组合物将规定的核酸导入到心肌细胞中。
在本发明的典型的实施方式中，本发明的组合物中所含的本发明的化合物和结构脂质形成脂质粒子，核酸被包封在该脂质粒子中。
“结构脂质”只要在与本发明的化合物混合而制备混合脂质成分后能够形成脂质粒子，就没有特别的限定。作为这样的结构脂质，例如可以使用选自由下述物质组成的组中的至少1种：固醇类(例如胆固醇、胆固醇酯、胆固醇半琥珀酸酯等)；磷脂(例如磷脂酰胆碱(例如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、MC-1010(NOF公司)、MC-2020(NOF公司)、MC-4040(NOF公司)、MC-6060(NOF公司)、MC-8080(NOF公司)等)、磷脂酰丝氨酸(例如二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酰油酰磷脂酰丝氨酸等)、磷脂酰乙醇胺(例如二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰肌醇、磷脂酸等)；以及聚乙二醇脂质(PEG脂质)(例如PEG-DAA、PEG-DAG、PEG-磷脂缀合物(phospholipid conjugate)、PEG-Cer、PEG-胆固醇、PEG-C-DOMG、2KPEG-CMG、GM-020(NOF公司)、GS-020(NOF公司)、GS-050(NOF公司)等)。本发明中，作为结构脂质，优选使用固醇类(特别是胆固醇)、磷脂(特别是磷脂酰胆碱)和聚乙二醇脂质这3种全部。
本发明的组合物中的本发明的化合物与结构脂质的比例可根据目的而适当调节。例如，在本发明的组合物中通过含有本发明的化合物和结构脂质的混合脂质成分来形成脂质粒子的情况下，相对于本发明的化合物1摩尔，结构脂质通常为0.008～4摩尔的比例，优选为0.4～1.5摩尔的比例。另外，若采用其他规定的方法，则在混合脂质成分中本发明的化合物通常为1～4摩尔、固醇类通常为0～3摩尔、磷脂通常为0～2摩尔、聚乙二醇脂质通常为0～1摩尔的比率。将本发明的化合物与其他脂质成分混合使用时的更优选方式为本发明的化合物1～1.5摩尔、固醇类0～1.25摩尔、磷脂0～0.5摩尔和聚乙二醇脂质0～0.125摩尔的比率。
“核酸”只要为核苷酸和具有与该核苷酸同等的功能的分子聚合而得到的分子，则为任何分子均可，可列举例如：作为核糖核苷酸的聚合物的RNA、作为脱氧核糖核苷酸的聚合物的DNA、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸混合而成的聚合物、和包含核苷酸类似物的核苷酸聚合物，此外，还可以包含核酸衍生物的核苷酸聚合物。另外，核酸可以为单链核酸或双链核酸。另外，双链核酸还包括将一条链与另一条链在严格条件下杂交的双链核酸。
作为核苷酸类似物，只要是为了与RNA或DNA相比使核酸酶耐性提高或稳定化、为了提高与互补链核酸的亲和性、或者为了提高细胞穿透性、或者为了使其可见化而对核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、RNA或DNA加以修饰而成的分子，则为任何分子均可。作为核苷酸类似物，可以为天然存在的分子或非天然的分子，可列举例如糖部修饰核苷酸类似物、磷酸二酯键修饰核苷酸类似物等。
作为糖部修饰核苷酸类似物，只要是对核苷酸的糖的化学结构的一部分或全部附加或取代任意的化学结构物质而成的物质，则为任何物质均可，作为其具体例，可列举被2’-O-甲基核糖取代的核苷酸类似物、被2’-O-丙基核糖取代的核苷酸类似物、被2’-甲氧基乙氧基核糖取代的核苷酸类似物、被2’-O-甲氧基乙基核糖取代的核苷酸类似物、被2’-O-[2-(胍)乙基]核糖取代的核苷酸类似物、被2’-氟核糖取代的核苷酸类似物、将糖部取代为吗啉代环的核酸类缘体(吗啉代核酸)、通过向糖部导入桥接结构而具有2个环状结构的桥接结构型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、更具体地为2’位的氧原子与4’位的碳原子介由亚甲基桥接而成的锁式人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)以及亚乙基桥接结构型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research,32,e175(2004)]、2’位的碳原子与4’位的碳原子介由酰胺键桥接而成的酰胺桥接结构型人工核酸(Amide-Bridged Nucleic Acids)(AmNA)，还可列举肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.,32,624(1999)]、氧肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.,123，4653(2001)]、和肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.,122,6900(2000)]等。
作为磷酸二酯键修饰核苷酸类似物，只要是对核苷酸的磷酸二酯键的化学结构的一部分或全部附加或取代任意的化学物质而成的物质，则为任何物质均可，作为其具体例，可列举被取代为硫代磷酸酯键的核苷酸类似物、被取代为N3’-P5’磷酰胺(phosphoramidate)键的核苷酸类似物等[细胞工程学，16,1463-1473(1997)][RNAi法和反义法、讲谈社(2005)]。
作为核酸衍生物，只要是为了与核酸相比使核酸酶耐性提高、为了使其稳定化、为了提高与互补链核酸的亲和性、为了提高细胞穿透性、或者为了使其可见化而对该核酸附加其他化学物质而成的分子，则为任何分子均可，作为其具体例，可列举5’-多胺附加衍生物、胆固醇附加衍生物、类固醇附加衍生物、胆汁酸附加衍生物、维生素附加衍生物、Cy5附加衍生物、Cy3附加衍生物、6-FAM附加衍生物、和生物素附加衍生物等。
作为本发明中的核酸，只要是能够通过与包含对象细胞的细胞群接触而向对象细胞转染、从而实现对象细胞的纯化或制造、或者其他所期望的目的的核酸就没有特别限定。
本发明的优选的一个实施方式中，核酸为mRNA。“mRNA”是指：包含能够翻译成蛋白质的碱基序列的RNA。作为本发明中的mRNA，只要是能够在细胞内表达期望的蛋白质的mRNA就没有特别限定。本发明的一个实施方式中，mRNA为可进一步结合有被在对象细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列、包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA。
本发明的优选的一个实施方式中，mRNA包含下述(i)和/或(ii)：
(i)包含被在心肌细胞(或心肌细胞亚型)中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞(或心肌细胞亚型)特异性的miRNA应答性mRNA；
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA。
(i)的实施方式中的“心肌细胞(或心肌细胞亚型)特异性的miRNA应答性mRNA”为“被在心肌细胞(或心肌细胞亚型)中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”与“功能性基因”以“可控制的方式连接”而成的核酸。即，“功能性基因”的表达受到“被在心肌细胞(或心肌细胞亚型)中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”的控制，当存在“在心肌细胞(或心肌细胞亚型)中特异性表达的miRNA”时，根据其存在量来调控“功能性基因”向蛋白质的翻译。典型情况下，在存在“在心肌细胞(或心肌细胞亚型)中特异性表达的miRNA”的心肌细胞(或心肌细胞亚型)中，根据其存在量而抑制“功能性基因”向蛋白质的翻译，该蛋白质在心肌细胞(或心肌细胞亚型)中的表达量(存在量)减少。通过这样的机制，存在“在心肌细胞(或心肌细胞亚型)中特异性表达的miRNA”的心肌细胞(或心肌细胞亚型)与不存在这样的miRNA的心肌细胞(或心肌细胞亚型)以外的细胞之间，“功能性基因”的表达量不同，从而能够将心肌细胞(或心肌细胞亚型)与其他细胞区别开。
“在心肌细胞中特异性表达的miRNA”(以下称为“心肌细胞特异性miRNA”)只要为下述miRNA就没有特别限定，所述miRNA为与心肌细胞以外的细胞、更具体而言与包含心肌细胞的细胞群中的心肌细胞以外的细胞相比、在心肌细胞中更高地表达的miRNA。例如，心肌细胞特异性miRNA可以为：在心肌细胞中的表达量与在心肌细胞以外的细胞中的表达量相比高10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上的miRNA。这样的miRNA可以从数据库的信息(例如http://www.mirbase.org/或http://www.microrna.org/)中所登录的miRNA、和/或记载于该数据库的文献信息中所记载的miRNA中适当地选择。作为在心肌细胞中特异性表达的miRNA，可列举例如hsa-miR-1、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-208a-3p、hsa-miR-208b-3p、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-490-5p、hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-3907、hsa-miR-4324、hsa-let-7e-5p。其中，作为心肌细胞特异性miRNA的优选的具体例，可列举hsa-miR-1、hsa-miR-208a-3p、hsa-miR-208b-3p和hsa-miR-499a-5p。
作为上述(i)中的、包含被在心肌细胞亚型中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞亚型特异性的miRNA应答性mRNA的特定实施方式，可以使用包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA。“心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA”为“被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”和“功能性基因”以“可控制的方式连接”而成的核酸。即，“功能性基因”的表达受到“被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”的控制，存在“在心室肌细胞中特异性表达的miRNA”的情况下，根据其存在量来调控“功能性基因”向蛋白质的翻译。典型情况下，在存在“在心室肌细胞中特异性表达的miRNA”的心室肌细胞中，根据其存在量抑制“功能性基因”向蛋白质的翻译，该蛋白质在心室肌细胞中的表达量(存在量)减少。通过这样的机制，存在“在心室肌细胞中特异性表达的miRNA”的心室肌细胞与不存在这样的miRNA的心室肌细胞以外的细胞之间，“功能性基因”的表达量不同，从而能够将心室肌细胞与其他细胞区別开。
“在心室肌细胞中特异性表达的miRNA”(以下称为“心室肌细胞特异性miRNA”)只要为下述miRNA就没有特别限定，所述miRNA为与心室肌细胞以外的细胞、更具体而言为包含心室肌细胞的细胞群中的心室肌细胞以外的细胞相比在心室肌细胞中更高地表达的miRNA。例如，心室肌细胞特异性miRNA可以为在心室肌细胞中的表达量与在心室肌细胞以外的细胞中的表达量相比高10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上的miRNA。这样的miRNA可以从数据库的信息(例如http://www.mirbase.org/或http://www.microrna.org/)中登录的miRNA、和/或记载于该数据库的文献信息中所记载的miRNA中适当地选择。心肌细胞特异性miRNA中，作为心室肌细胞特异性miRNA的优选的具体例，也可列举hsa-miR-208b-3p。
将以上例示的心肌细胞特异性miRNA的碱基序列示于下述表1。
表1
心肌细胞特异性miRNA miRNA的碱基序列(5’→3’) 序列号
has-miR-1 uggaauguaaagaaguauguau 1
has-miR-22-5p aguucuucaguggcaagcuuua 2
has-miR-133a uuugguccccuucaaccagcug 3
has-miR-133b uuugguccccuucaaccagcua 4
has-miR-143-3p ugagaugaagcacuguagcuc 5
has-miR-145-3p ggauuccuggaaauacuguicu 6
has-miR-208a-3p auaagacgagcaaaaagcuugu 7
has-miR-208b-3p auaagacgaacaaaagguuugu 8
has-miR-490-3p caaccuggaggacuccaugcug 9
has-miR-490-5p ccauggaucuccaggugggu 10
has-miR-499a-5p uuaagacuugcagugauguuu 11
has-miR-1271-5p cuuggcaccuagcaagcacuca 12
has-miR-3907 aggugcuccaggcuggcucaca 13
has-miR-4324 cccugagacccuaaccuuaa 14
has-let-7e-5p ugagguaggagguuguauaguu 15
“被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”(以下称为“心肌细胞特异性miRNA识别序列”)为：被处于与规定的多种蛋白质发生相互作用而形成了RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合物)的状态的心肌细胞特异性miRNA特异性识别的碱基序列。心肌细胞特异性miRNA识别序列只要能够被心肌细胞特异性miRNA识别并杂交形成RISC即可，可以为完全互补的序列，也可以为具有不匹配(错配)的序列。例如，以与心肌细胞特异性miRNA完全互补的序列为基准，心肌细胞特异性miRNA识别序列可以具有1％以下、5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下或50％以下的错配，或者心肌细胞特异性miRNA识别序列可以具有1个碱基、2个碱基、3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基、7个碱基、8个碱基、9个碱基或10个碱基的错配。心肌细胞特异性miRNA识别序列的碱基长度没有特别限定，只要设为与心肌细胞特异性miRNA(包含其的RISC)对应的合适的碱基长度即可，例如，优选为18个碱基以上且23个碱基以下，更优选为20个碱基或21个碱基。
心肌细胞特异性miRNA识别序列中，“被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”(以下称为“心室肌细胞特异性miRNA识别序列”)为：被处于与规定的多种蛋白质发生相互作用而形成了RISC(RNA-induced silencing complex)的状态的心室肌细胞特异性miRNA特异性识别的碱基序列。心室肌细胞特异性miRNA识别序列只要能够被心室肌细胞特异性miRNA识别并杂交形成RISC即可，可以为完全互补的序列，也可以为具有不匹配(错配)的序列。例如，以与心室肌细胞特异性miRNA完全互补的序列为基准，心室肌细胞特异性miRNA识别序列可以具有1％以下、5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下或50％以下的错配，或者心室肌细胞特异性miRNA识别序列可以具有1个碱基、2个碱基、3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基、7个碱基、8个碱基、9个碱基或10个碱基的错配。心室肌细胞特异性miRNA识别序列的碱基长度没有特别限定，只要设为与心室肌细胞特异性miRNA(包含其的RISC)对应的合适的碱基长度即可，例如，优选为18个碱基以上且23个碱基以下，更优选为20个碱基或21个碱基。
将分别对应于以上例示的心肌细胞特异性miRNA的碱基序列的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列(完全互补的碱基序列)示于下述表2。
表2
心肌细胞特异性miRNA 标准的识别序列(5’→3’) 序列号
has-miR-1 auacauacuucuuuacauucca 16
has-miR-22-5p uaaagcuugccacugaagaacu 17
has-miR-133a cagcugguugaaggggaccaaa 18
has-miR-133b uagcugguugaaggggaccaaa 19
has-miR-143-3p gagcuacagugcuucaucuca 20
has-miR-145-3p agaacaguauuuccaggaaucc 21
has-miR-208a-3p acaagcuuuuugcucgicuuau 22
has-miR-208b-3p acaaaccuuuuguucgucuuau 23
has-miR-490-3p cagcauggaguccuccagguug 24
has-miR-490-5p acccaccuggagauccaugg 25
has-miR-499a-5p aaacaucacugcaagucuuaa 26
has-miR-1271-5p ugagugcuugcuaggugccaag 27
has-miR-3907 ugugagccagccuggagcaccu 28
has-miR-4324 uuaagguuagggucucaggg 29
has-let-7e-5p aacuauacaaccuccuaccuca 30
(i)的实施方式中的“功能性基因”只要为可以用于包含心肌细胞的细胞群中的心肌细胞的纯化或包含心室肌细胞的细胞群中的心室肌细胞的纯化的公知的基因、更一般而言可以用于从细胞群中筛选特定细胞的各种基因就没有特别限定。作为这样的“功能性基因”，可列举例如抗药性基因、编码荧光蛋白的基因、凋亡诱导基因、和自杀基因。在使用多种“功能性基因”的情况下，例如后述实施方式中组合使用包含“功能性基因”的(i)的心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA或心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA、和包含“功能性基因”的(ii)的mRNA的情况下，各“功能性基因”可以相互独立地从抗药性基因、编码荧光蛋白的基因、凋亡诱导基因、和自杀基因中选择，彼此可以相同也可以不同。
作为“抗药性基因”，可列举例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因。可以使用这些基因中的任意一种，也可以使用两种以上。
作为“编码荧光蛋白的基因”，可列举例如：Sirius、BFP、EBFP等蓝色荧光蛋白；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP等蓝色荧光蛋白；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green(例如hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer等绿色荧光蛋白；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana等黄色荧光蛋白；KusabiraOrange(例如hmKO2)、mOrange等橙色荧光蛋白；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry等红色荧光蛋白；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed(例如hdKeimaRed)、mRasberry、mPlum等近红外荧光蛋白。可以使用这些基因中的任意一种，也可以使用两种以上。在使用两种以上编码荧光蛋白的基因时，使该荧光蛋白的发光波长不同就不会妨碍彼此的辨识性，因此是优选的。
作为“凋亡诱导基因”，可列举例如IκB、Smac/DIABLO、ICE、HtrA2/OMI、AIF、核酸内切酶G、Bax、Bak、Noxa、Hrk(harakiri)、Mtd、Bim、Bad、Bid、PUMA、活化的胱天蛋白酶-3、Fas、Tk。可以使用这些基因中的任意一种，也可以使用两种以上。
作为“自杀基因”，可列举例如编码白喉A毒素、单纯疱疹胸苷激酶基因(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)的基因。可以使用这些基因中的任意一种，也可以使用两种以上。
本领域技术人员可以设计和制作出合适的、包含对象细胞特异性miRNA识别序列和编码功能性基因的碱基序列的、可用于本发明中的“心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA”和“心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA”(对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA)。必要时，这些对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA的全长的碱基序列的具体例例如可参照前述专利文献4。
根据需要，对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA中也可以包含除了被在对象细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列(对象细胞特异性miRNA识别序列)和“功能性基因”以外的碱基序列。例如，对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA可以包含编码局部定位信号的基因。作为一例，在选择“编码荧光蛋白的基因”作为“功能性基因”的实施方式中，可以在该基因上连接编码局部定位信号的基因。这样的实施方式特别有利于使用成像细胞仪等在图像上进行后述的对象细胞的纯化方法和制造方法中的筛选步骤。
在对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA中，对象细胞特异性miRNA识别序列和“功能性基因”以“可控制的方式连接”是指：在“功能性基因”的开放阅读框(ORF)(其中包含起始密码子)的5’非翻译区域(UTR)内、3’UTR内、或该ORF内(起始密码子的3’侧)中的至少1处包含至少1个对象细胞特异性miRNA识别序列。对象细胞特异性miRNA识别序列的数量可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或8个以上，可以在5’UTR、3’UTR或ORF中的1处以上包含这些识别序列。
本发明的一个实施方式中，对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA中从5’末端向3’末端具备Cap结构(7-甲基鸟苷-5’-磷酸)、编码“功能性基因”的ORF和聚腺苷尾部，在5’UTR内、3’UTR内、和/或ORF内具备至少1个对象细胞特异性miRNA识别序列。为了实现高效的翻译控制(抑制)，优选沿着5’末端向3’末端的方向依次配置对象细胞特异性miRNA识别序列和“功能性基因”，因此优选在5’UTR内包含至少1个对象细胞特异性miRNA识别序列。
关于cap结构与对象细胞特异性miRNA识别序列之间的碱基数和碱基的种类，只要不形成茎结构、立体结构则可以是任意的。例如，cap结构与对象细胞特异性miRNA识别序列之间的碱基数可以设为0～50个碱基、优选10～30个碱基。
关于对象细胞特异性miRNA识别序列与功能性基因的起始密码子(真核生物中通常为AUG)之间的碱基数和碱基的种类，只要不形成茎结构、立体结构则可以是任意的。例如，对象细胞特异性miRNA识别序列与功能性基因的起始密码子之间的碱基数可以设为0～50个碱基、优选10～30个碱基。
优选对象细胞特异性miRNA识别序列中不存在成为起始密码子的碱基序列。例如，当对象细胞特异性miRNA识别序列存在于5’UTR且该识别序列包含作为起始密码子的AUG的情况下，优选按照在与连接于3'侧的功能性基因的关系中位于同一读码框的方式来设计。另外，在对象细胞特异性miRNA识别序列包含作为起始密码子的AUG时，还可将该AUG转换为不为起始密码子的GUG并使用。另一方面，为了使对象细胞特异性miRNA识别序列内的起始密码子的影响降到最低，可以适当地调整该识别序列在5’UTR中的配置位置。例如，cap结构与对象细胞特异性miRNA识别序列内的起始密码子(AUG)之间的碱基数可以设计为0～60个碱基、例如0～15个碱基、10～20个碱基、20～30个碱基、30～40个碱基、40～50个碱基、50～60个碱基。
对于对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA而言，只要如上述那样确定了其中包含的要素(序列)，则本领域技术人员可以通过已知的基因工程学方法、通常通过使用包含启动子序列的模板DNA作为模板的体外合成法来合成。
对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA可以为已验证了在筛选细胞群中的对象细胞中的有效性的mRNA。即，本发明的转染方法、纯化方法和制造方法中，在实施各方法之前，可以根据需要预先进行使用对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA验证在筛选细胞群中的对象细胞中的有效性的步骤(和基于该步骤的结果选择对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA的步骤)。具体而言，可以制作具有上述所例示的5’UTR的、成为候选的多种对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA，分别转染到包含纯度已知的对象细胞的细胞群中，确定在对象细胞的筛选中有效性高者。
对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA可以仅使用一种，也可以使用两种以上。在使用两种以上的对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA时，这些miRNA应答性mRNA中所含的对象细胞特异性miRNA识别序列和功能性基因优选miRNA应答性mRNA彼此之间相互不同。另外，在使用两种以上的对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA时，这些miRNA应答性mRNA中所含的对象细胞特异性miRNA识别序列的数两和与5’末端的距离、以及其他结构特征在各miRNA应答性mRNA中可以相同也可以不同。或者，也可以使用对象细胞特异性miRNA识别序列相同、但功能性基因不同的两种以上的对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA。例如，可使用将Fas和Bim之类的通过不同途径进行信号转导的凋亡诱导基因的组合与相同的对象细胞特异性miRNA识别序列组合而成的、两种对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA，这种情况下，可以期待并非目标的细胞(对象细胞以外的细胞)的高效除去。
作为(ii)的实施方式的mRNA中所含的“功能性基因”，可列举与(i)的实施方式的mRNA中所含的“功能性基因”相同的功能性基因、例如抗药性基因和编码荧光蛋白的基因。
或者，(ii)的实施方式的mRNA中所含的“功能性基因”可以为除了抗药性基因和编码荧光蛋白的基因以外的、显示核酸已被导入细胞的基因即所谓的报告基因。作为这样的报告基因，可列举例如除了荧光蛋白以外的辅助进行发光或显色的蛋白质的基因、在细胞膜上定位和表达且能够与以其为抗原的抗体结合的膜定位蛋白的基因。
本发明的一个实施方式中，可以将(i)的对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA和(ii)的mRNA组合使用。即，可以使(i)的miRNA应答性mRNA和(ii)的mRNA这两者一起接触包含对象细胞的细胞群、并且使之导入到细胞(特别是心肌细胞)中。这样的实施方式中，(ii)的mRNA可称为“对照mRNA”。
通过组合使用对照mRNA，能够使对象细胞的筛选更加高效。例如，在使用抗药性基因作为“对照mRNA”、使用凋亡诱导基因或自杀基因作为“功能性基因”的情况下，通过选择有药剂耐性且未诱导细胞死亡的细胞群，能够提高对象细胞的筛选精度。更具体而言，可以基于显示药剂抗性来识别通过转染而导入的核酸的导入效率差的细胞、即对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA的导入效率差的对象细胞和此外的细胞，在除去这样的细胞的基础上，通过对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA所包含的“功能性基因”是否表达来更高效地筛选对象细胞。这是基于，对于对象细胞而言，其细胞内存在的“心肌细胞特异性miRNA”或“心室肌细胞特异性miRNA”与miRNA应答性mRNA的规定的碱基序列进行杂交而抑制了“功能性基因”的表达，另一方面，对于对象细胞以外的细胞而言，细胞内不存在“心肌细胞特异性miRNA”或“心室肌细胞特异性miRNA”，因此“功能性基因”的表达未被抑制。需要说明的是，可以通过公知的方法来进行显示药剂耐性的细胞群的选择。
另外，在具有编码荧光蛋白的基因作为“对照mRNA”和“功能性基因”时，可以通过选择荧光强度相对低的细胞群来提高对象细胞的筛选精度。更具体而言，基于发出荧光这一点来识别通过转染而导入核酸的导入效率好的细胞，在其细胞群中选择荧光强度相对低的细胞群，从而能够使对象细胞的筛选更加高效。这是由于，对照mRNA中所含的荧光蛋白向对象细胞和其他细胞的导入量和与其同时进行转染的对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA向对象细胞和其他细胞的导入量成比例。基于荧光强度的细胞选择例如可如下进行：使用细胞分选仪(例如BEXON DIKINSON公司的“FACS”)，选择性地分离发出一定基准以上的荧光的细胞。
以下对本发明的转染方法的步骤进行说明。
本发明的转染方法至少包括使本发明的组合物与包含对象细胞的细胞群接触的步骤(本说明书中称为“组合物接触步骤”)，根据需要可以还包括与向心肌细胞导入核酸(转染)相关的其他步骤。另外，本发明的转染方法使用本发明的组合物作为试剂，此外的技术事项可基本上沿用一般的转染方法、例如使用脂质纳米粒子(LNP)或脂质体的转染(脂质体转染)方法。例如，本发明的转染方法可以在能够向包含对象细胞的细胞群转染含有核酸的LNP的条件(能够诱发转染的条件)下进行。
在使本发明的组合物与处于体内的包含对象细胞的细胞群接触时，对给予对象(例如人或非人哺乳动物，优选人)给予该组合物，使得有效量的核酸被送达作为靶标的对象细胞即可。在这样的实施方式中，本发明的组合物稳定且毒性低，可以安全地使用。
以体内方式使用本发明的组合物时，例如优选制成静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、腹腔内注射等注射剂，如果利用其他途径也能够将有效量的核酸送达目标细胞，则也可制成与其相应的剂型。
本发明的优选的一个实施方式中，包含对象细胞的细胞群为通过在适合于分化诱导为对象细胞的条件下培养诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)或其他干细胞、祖细胞等能够分化诱导为对象细胞的细胞而制作的、上述干细胞等与对象细胞混合存在的体外的细胞群。
关于使由iPS细胞或其他多能干细胞经由分化诱导步骤而制备的细胞群(也可以为胚状体)与包含对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA的组合物接触的时期，只要是一定程度的细胞分化为对象细胞后就没有特别限定，根据目的，为适合于向对象细胞转染核酸的时期、例如作为目标的对象细胞的纯度已达到且适合于进行对象细胞的筛选的时期。例如，可以在由iPS细胞形成包含对象细胞的胚状体之日起第10～40天、优选第14～20天或其前后使本发明的组合物与该胚状体接触。
本发明的转染方法中，在组合物接触步骤的前后，可以进行其他步骤、特别是进行包含与要导入细胞的“核酸”对应的处理的步骤。
例如，本发明中可以使用“包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA”作为“核酸”，但是，为了进行导入了该核酸的细胞的浓缩、分离或检测，也可以使用作为“功能性基因”的“抗药性基因”、“编码荧光蛋白的基因”、以及阳性选择标记基因或阴性选择标记基因。在使用“抗药性基因”的实施方式中，例如，在组合物接触步骤之后可以进行以适当的浓度向培养基中添加与抗药性基因(例如嘌呤霉素抗性基因)对应的药剂(例如嘌呤霉素)的步骤、和在该培养基中培养细胞的步骤、通过该培养来选择导入了抗药性基因的细胞的步骤等。在使用“编码荧光蛋白的基因”的实施方式中，例如，在组合物接触步骤之后可以进行照射与该荧光蛋白对应的激发波长的光的步骤、用荧光显微镜或细胞分选仪等检测通过该照射而发出的荧光的步骤、通过该检测来选择荧光蛋白的荧光发光具有规定特征的细胞的步骤等。
本发明中，作为“核酸”，也可以使用“包含被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA”或“包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA”。在该实施方式中，对于对象细胞而言，其细胞内存在的在对象细胞中特异性表达的miRNA与miRNA应答性mRNA的规定的碱基序列进行杂交而抑制了“功能性基因”的表达，另一方面，对于对象细胞以外的细胞而言，细胞内不存在在对象细胞中特异性表达的miRNA，因此“功能性基因”的表达未被抑制。因此，例如使用包含表达该基因则细胞死亡的“凋亡诱导基因”或“自杀基因”作为“功能性基因”的miRNA应答性mRNA时，在组合物接触步骤之后，可以进行根据这些基因是否表达、从而进行混有对象细胞以外的细胞的细胞群内的对象细胞的浓缩、分离或检测的步骤。需要说明的是，这样的实施方式的本发明的“转染方法”与后述的本发明的“心肌细胞的纯化方法”、“心肌细胞的制造方法”、“心室肌细胞的纯化方法”和“心室肌细胞的制造方法”对应，可将关于“转染方法”的技术事项的记载适当地应用于“心肌细胞的纯化方法”、“心肌细胞的制造方法”、“心室肌细胞的纯化方法”和“心室肌细胞的制造方法”。
本发明的优选的一个实施方式中，本发明的转染方法可作为包含下述步骤1、根据需要还包含下述步骤2的方法来实施：
步骤1：在细胞非粘附性容器中，在能够向包含对象细胞的细胞群转染本发明的组合物的条件下，形成包含对象细胞的细胞群的聚集体的步骤(以下有时也称为“聚集体形成步骤”)；
步骤2：从转染了上述组合物后的细胞群中，基于上述组合物所含的核酸在细胞内的功能而筛选对象细胞的步骤(以下有时也称为“筛选步骤”)。
步骤1(聚集体形成步骤)更具体而言可以包含下述步骤1-1或1-2中的任一步骤：
步骤1-1：在细胞非粘附性容器中，在本发明的组合物和微型载体的存在下培养包含对象细胞的细胞群，形成由导入了本发明的组合物中所含的核酸的细胞和上述微型载体构成的聚集体的步骤(以下有时也称为“聚集体形成步骤第1实施方式”)；
步骤1-2：在细胞非粘附性容器中，在本发明的组合物存在下培养包含对象细胞的细胞群，形成由导入了本发明的组合物中所含的核酸的细胞构成的聚集体的步骤(以下有时也称为“聚集体形成步骤第2实施方式”)。
另外，在步骤1(聚集体形成步骤)之前，可以根据需要包含下述步骤A和B：
步骤A：诱导多能干细胞(团)向对象细胞分化的步骤；
步骤B：使步骤A得到的分化诱导后的细胞(集团)分散的步骤。
聚集体形成步骤中的包含对象细胞的细胞群优选为粘附性细胞群。在此，“粘附性细胞(团)”是指：在粘附于成为支架的固相表面的状态下能够最适宜地维持或增殖的细胞(团)。特别地，步骤1-2中的“包含对象细胞的细胞群”为包含具有聚集能力、在于细胞非粘附性容器中培养时能够形成聚集体的细胞的细胞群。另外，步骤1-1中的“包含对象细胞的细胞群”为包含具有与微型载体粘附的能力、在于细胞非粘附性容器中与微型载体一起培养时能够粘附于微型载体的细胞的细胞群。
“包含对象细胞的细胞群”可以为通过任何方式制备的细胞群。例如，在本发明的转染方法中，可以根据需要(作为在步骤1之前进行的上述步骤A)进行用于使多能干细胞分化诱导为对象细胞的步骤。使上述那样的各种多能干细胞分化诱导为对象细胞的方法没有特别限定，可以使用公知的各种方法。作为使多能干细胞分化诱导为对象细胞的方法，可列举例如Laflamme MA等报道的方法(Laflamme MA&Murry CE,Nature 2011,Review)。另外，还可例示通过悬浮培养而使诱导多能干细胞(iPS细胞)形成细胞块(胚状体)而制造心肌细胞的方法、在抑制BMP信号转导的物质的存在下制造心肌细胞的方法(WO2005/033298)、依次添加激活蛋白A和BMP而制造心肌细胞的方法(WO2007/002136)、在促进经典Wnt信号途径的活化的物质的存在下制造心肌细胞的方法(WO2007/126077)、从诱导多能干细胞中分离Flk/KDR阳性细胞并在环孢菌素A的存在下制造心肌细胞的方法(WO2009/118928)等。
经分化诱导的对象细胞是指：至少表达心肌肌钙蛋白(cTnT)或αMHC的细胞。人cTnT例示于NCBI的登记号NM_000364，小鼠的cTnT例示于NM_001130174。人αMHC例示于NCBI的登记号NM_002471，小鼠的αMHC例示于NM_001164171。
聚集体形成步骤中，优选将分散状态的细胞群供于培养。即，本发明的转染方法中，根据需要，可以在聚集体形成步骤的前段步骤中，预先进行用于包含对象细胞的细胞群、优选(作为在步骤1之前进行的上述步骤B)从多能干细胞分化诱导为对象细胞后的细胞群的分散处理的步骤。分散处理可以通过公知的方法来进行，可以采用利用酶等的化学处理、利用移液等的物理处理、和这些的组合。化学处理中，可以使用市售的试剂(例如Liberase TM Research Grade、Roche公司；StemPro Accutase Cell DissociationReagent、Gibco公司；TrypLE Select CTS、Gibco公司等)。
作为聚集体形成步骤中的细胞群的培养中使用的“细胞非粘附性容器”，可以使用(a)容器的表面未经过目的在于提高与细胞的粘附性的人工处理(例如利用胞外基质等的包被处理)的容器、或(b)容器的表面经过了目的在于降低与细胞的粘附性的人工处理(例如利用疏水性分子的包被处理)的容器。“细胞非粘附性”是指：粘附性细胞不发生粘附或难以发生粘附，例如相对于播种到容器中的细胞的总数有小于20％、优选小于10％、进一步优选小于1％的细胞粘附于容器。
作为细胞非粘附性容器的材料，可列举例如聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、特氟龙(注册商标)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙6,6、聚乙烯醇、纤维素、硅、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、和不锈钢。
作为细胞非粘附性容器的形态，可列举例如微孔板、培养盘(培养皿)、细胞培养烧瓶(转瓶、摇瓶等)、细胞培养袋、滚动瓶、生物反应器和培养槽(罐)。细胞非粘附性容器的尺寸也可以根据制造規模来适当(例如1mL～2000L范围内)选择，本发明中，特别优选大容量(例如100mL～2000L)的细胞非粘附性容器。
聚集体形成步骤第1实施方式(步骤1-1)例如如下进行：在细胞非粘附性容器中，对作为粘附性细胞群的包含对象细胞的细胞群添加本发明的组合物和微型载体，在它们的存在下静置培养上述细胞群，由此来进行。这样的步骤中，包含对象细胞的细胞群粘附于微型载体而形成聚集体，在该过程中，本发明的组合物中所含的核酸被导入到构成上述细胞群的细胞中。
因此，聚集体形成步骤第1实施方式中的“聚集体”是指：至少包含1个细胞和1个微型载体的集合体。该聚集体的尺寸依赖于所使用的微型载体的大小，没有特别限定。粘附于1个微型载体的细胞数没有特别限定，例如为2～500个、优选为50～300个。在聚集体形成步骤第1实施方式中培养的细胞群中，包含形成聚集体的细胞(聚集体形成细胞)和不形成聚集体的细胞(非聚集体形成细胞)。聚集体形成细胞相对于它们的总数的比例没有特别限定，例如为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。
聚集体形成步骤第1实施方式中使用的“微型载体”是指：能够在表面粘附包含对象细胞的细胞群的载体。微型载体只要能够在粘附有包含对象细胞的细胞群的状态下悬浮于液体培养基中、能够由此而发挥培养所粘附的细胞群的作用即可，其材质、形状、大小等没有特别限制。
作为微型载体的材质，可列举例如葡聚糖、明胶、胶原蛋白、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、纤维素。
作为微型载体的形状，可列举例如球状(珠)、圆盘状等。
关于球状的微型载体的大小，例如直径为2～1000μm、优选为100～300μm。
微型载体可以为多孔性。
细胞的培养中使用的微型载体的数量没有特别限定，例如每10个细胞为1个微型载体。细胞的培养中使用的微型载体的量没有特别限定，例如相对于1×106个～5×107个细胞为0.1g微型载体、优选相对于2×107个～3×107个细胞为0.1g微型载体。
微型载体可以为市售品，例如可以使用高浓度Synthemax II微型载体(康宁公司)。
聚集体形成步骤第2实施方式(步骤1-2)例如如下进行：在细胞非粘附性容器内，对作为粘附性细胞群的包含对象细胞的细胞群添加本发明的组合物，在其存在下静置培养上述细胞群，由此而进行。这样的步骤中，即使不存在微型载体，包含对象细胞的细胞群也通过细胞彼此而形成聚集体，在该过程中，本发明的组合物中所含的核酸被导入到构成上述细胞群的细胞中。
因此，聚集体形成步骤第2实施方式中的“聚集体”是指：包含至少2个细胞的集合体。多个细胞粘附而成的团块占聚集体的大部分。形成1个聚集体的细胞数没有特别限定，例如为2～500个、优选为50～300个。聚集体形成步骤第2实施方式中培养的细胞群中包含形成聚集体的细胞(聚集体形成细胞)和不形成聚集体的细胞(非聚集体形成细胞)。聚集体形成细胞相对于它们的总数的比例没有特别限定，例如为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。
关于聚集体形成步骤(第1实施方式和第2实施方式)中的静置培养，只要进行足以完成聚集体的形成和转染的时间即可。静置培养时间没有特别限定，例如为2～10小时左右、优选为3～6小时左右、更优选为4～5小时。静置培养的条件也没有特别限定，例如可以设为约37℃、5％CO2存在下。
静置培养后，为了维持所形成的聚集体，可以进行搅拌培养。搅拌培养的时间没有特别限定，例如为12～48小时左右、优选为24小时左右。搅拌培养的条件也没有特别限定，例如可以设为约37℃、5％CO2存在下。
搅拌速度和时间可根据细胞密度和培养容器的大小适当设定，代表性地为静置4～6小时后以25rpm搅拌12小时以上。过度的搅拌或振荡会对细胞施加物理性压力，另外有抑制聚集体的维持之虞。因此，期望按照能使培养基成分和培养基内氧浓度均匀化、且不抑制聚集体的维持的方式来控制搅拌速度。
作为培养基，可以使用适合于包含对象细胞的细胞群的培养的、现有公知的培养基。可使用例如BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、格拉斯哥MEM培养基、改良的MEM(IMEM)培养基、改良的MDM(IMDM)培养基、Medium 199培养基、伊戈尔MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基(高葡萄糖、低葡萄糖)、DMEM/F12培养基、HMA培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、和这些的混合培养基等。培养基的种类和使用量可以由本领域技术人员根据细胞、培养条件适当地设定。
培养基中，可以根据需要添加氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(制品名)、非必需氨基酸、维生素、抗生素(例如青霉素、链霉素、或这些的混合物)、抗菌剂(例如两性霉素B)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等添加物。添加物的种类和使用量可以由本领域技术人员根据细胞、培养条件适当地设定。
根据包含上述那样的聚集体形成步骤的转染方法，不会像使细胞粘附于容器(培养盘、培养皿等)的表面来培养的以往方法那样受到容器表面的面积的制约，能够以商业水平大量地得到导入了期望的核酸的心肌细胞(包含其的细胞群)。
以下，对本发明的对象细胞的纯化方法的步骤进行说明。
本发明的对象细胞的纯化方法至少包括使本发明的组合物与包含对象细胞的细胞群接触的步骤(组合物接触步骤)，根据需要可以还包括与纯化对象细胞有关的其他步骤。另外，本发明的对象细胞的纯化方法中，为了纯化细胞群中的对象细胞、换言之为了提高细胞群中的对象细胞的比率(富集对象细胞)而使用包含特定的核酸的本发明的组合物，此外的技术事项基本上可沿用公知的心肌细胞的纯化方法。
本发明的对象细胞的制造方法中，作为“核酸”，使用上述(i)的对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA、和/或上述(ii)的mRNA。若使这样的包含特定的核酸的本发明的组合物与包含对象细胞的细胞群接触、向对象细胞和其以外的细胞内导入上述规定的核酸，则通过上述那样的机制，在对象细胞内，对象细胞特异性的miRNA应答性mRNA所含的“被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”(心肌细胞特异性miRNA识别序列)或“被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列”(心室肌细胞特异性miRNA识别序列)抑制“功能性基因”的表达量，与此相对地，在对象细胞以外的细胞内，“功能性基因”的表达量不受抑制而成为相对高的表达量。通过利用这样的差异，可以排除细胞群中的对象细胞以外的细胞、提高对象细胞的纯度。
为了以如上所述的方式纯化对象细胞，具体而言，需要在组合物接触步骤之后进行包含与“功能性基因”对应的处理的、用于筛选对象细胞的步骤(本说明书中称为“对象细胞筛选步骤”)。
例如，在使用“编码荧光蛋白的基因”作为“功能性基因”的情况下，适当的是使对象细胞筛选步骤包含下述处理：使用规定的检测装置来检测由该荧光蛋白发出的信号(荧光发光)的处理。作为用于该处理的检测装置，可列举例如流式细胞仪、成像细胞仪、荧光显微镜、发光显微镜、CCD相机。这样的检测装置可以调整为适合于荧光蛋白的吸收波长和发光波长的实施方式(装置的构成、测定条件等)。另外，通过使用荧光显微镜、或使用包被有光应答性细胞培养器材的培养皿(能够使未照射到光的细胞从培养皿剥离)，还能够选择并除去荧光蛋白的表达量高(荧光强度高)的对象细胞以外的细胞。
通过本发明的对象细胞的纯化方法而得到的细胞群可以使对象细胞的纯度提高到一定水平。这样的细胞群中的对象细胞的纯度只要高于未应用本发明的对象细胞的纯化方法而得到的细胞群中的对象细胞的纯度即可，其程度没有特别限定。作为一个指标，通过本发明的对象细胞的纯化方法得到的细胞群中的对象细胞的纯度可以为60％以上、70％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、和100％(实质上检测不到对象细胞以外的细胞)。
关于本发明的对象细胞的纯化方法的、上述说明和此外的本说明书的说明中，“纯化方法”可以适当地替换为“制造方法”。即，关于本发明的“心肌细胞的纯化方法”(提高细胞群中的心肌细胞的纯度或比率的方法)和“心室肌细胞的纯化方法”(提高细胞群中的心室肌细胞的纯度或比率的方法)的相关发明的记载可以分别替换为关于“心肌细胞的制造方法”(提高了心肌细胞的纯度或比率的细胞群的制造方法、或包含在这样的细胞群中的心肌细胞的制造方法)和“心室肌细胞的制造方法”(提高了心室肌细胞的纯度或比率的细胞群的制造方法、或包含在这样的细胞群中的心室肌细胞的制造方法)的记载。另外，可以说本发明的对象细胞的纯化方法和制造方法分别对应于上述本发明的转染方法中的、以对象细胞的纯化和制造为目标的实施方式，关于技术事项的记载也可以适当地相互适用。
以下对本发明的化合物的制造方法进行说明。
以下的制造方法中的各步骤中使用的原料、试剂、以及得到的化合物可以分别形成盐。作为这样的盐，可列举例如与上述本发明的化合物的盐相同的盐。
在各步骤中得到的化合物为游离化合物的情况下，可以通过公知的方法转换为目标盐。反之，在各步骤中得到的化合物为盐的情况下，可以通过公知的方法转换为游离体或作为目标的其他种类的盐。
各步骤中得到的化合物也可以以反应液形态用于之后的反应或者得到粗产物后用于之后的反应，或者可以将各步骤中得到的化合物按照常规方法通过浓缩、晶析、重结晶、蒸馏、溶剂萃取、分馏、层析等分离手段从反应混合物中分离和/或纯化。
各步骤的原料化合物、试剂化合物为市售品时，可以直接使用市售品。
各步骤的反应中，反应时间可以根据所使用的试剂、溶剂而不同，在没有特别记载的情况下，通常为1分钟～48小时、优选为10分钟～8小时。
各步骤的反应中，反应温度可以根据所使用的试剂、溶剂而不同，在没有特别记载的情况下，通常为-78℃～300℃、优选为-78℃～150℃。
各步骤的反应中，压力可以根据所使用的试剂、溶剂而不同，在没有特别记载的情况下，通常为1个大气压～20个大气压、优选为1个大气压～3个大气压。
各步骤的反应中，有时使用例如Biotage公司制Initiator等微波合成装置。反应温度可以根据所使用的试剂、溶剂而不同，在没有特别记载的情况下，通常为室温～300℃、优选为室温～250℃、更优选为50℃～250℃。反应时间可以根据所使用的试剂、溶剂而不同，在没有特别记载的情况下，通常为1分钟～48小时、优选为1分钟～8小时。
各步骤的反应中，在没有特别记载的情况下，使用相对于基质为0.5当量～20当量、优选0.8当量～5当量的试剂。在将试剂作为催化剂使用时，使用相对于基质为0.001当量～1当量、优选0.01当量～0.2当量的试剂。在试剂兼作反应溶剂的情况下，使用溶剂量的试剂。
各步骤的反应中，在没有特别记载的情况下，这些反应在无溶剂下进行、或者在溶解或悬浮于适当的溶剂中后进行。作为溶剂的具体例，可列举实施例中记载的溶剂或以下溶剂。
醇类：甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、2-甲氧基乙醇等；
醚类：乙醚、二异丙基醚、二苯醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、环戊基甲基醚等；
芳香族烃类：氯苯、甲苯、二甲苯等；
饱和烃类：环己烷、己烷、庚烷等；
酰胺类：N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；
卤代烃类：二氯甲烷、四氯化碳等；
腈类：乙腈等；
亚砜类：二甲基亚砜等；
芳香族有机碱类：吡啶等；
酸酐类：乙酸酐等；
有机酸类：甲酸、乙酸、三氟乙酸等；
无机酸类：盐酸、硫酸等；
酯类：乙酸乙酯、乙酸异丙酯等；
酮类：丙酮、甲乙酮等；
水。
关于上述溶剂，可以将两种以上以适当的比例混合而使用。
在各步骤的反应中使用碱的情况下，可以使用例如以下所示的碱或实施例中记载的碱。
无机碱类：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁等；
碱性盐类：碳酸钠、碳酸钙、碳酸氢钠等；
有机碱类：三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、N,N-二甲基苯胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯、咪唑、哌啶等；
金属醇盐类：乙醇钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠等；
碱金属氢化物类：氢化钠等；
金属酰胺类：酰胺钠、二异丙基氨基锂、六甲基二硅基氨基锂等；
有机锂类：正丁基锂、仲丁基锂等。
在各步骤的反应中使用酸或酸性催化剂的情况下，可以使用例如以下所示的酸、酸性催化剂或实施例中记载的酸、酸性催化剂。
无机酸类：盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸等；
有机酸类：乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、10-樟脑磺酸等；
路易斯酸：三氟化硼乙醚络合物、碘化锌、无水氯化铝、无水氯化锌、无水氯化铁等。
关于各步骤的反应，只要没有特别记载，则依据公知的方法、例如第5版实验化学讲座、13卷～19卷(日本化学会编)；新实验化学讲座、14卷～15卷(日本化学会编)；精密有机化学修订第2版(L.F.Tietze，Th.Eicher、南江堂)；修订有机人名反应其结构和要点(东乡秀雄著、讲谈社)；有机合成汇编(ORGANIC SYNTHESES Collective)I～VII卷(JohnWiley&SonsInc)；实验室现代有机合成标准实验步骤汇编(Modern Organic Synthesis inthe Laboratory A Collection of Standard Experimental Procedures)(Jie Jack Li著、牛津大学出版)；综合杂环化学(Comprehensive Heterocyclic Chemistry)III、Vol.1～Vol.14(爱思唯尔日本株式会社)；从人名反应学到的有机合成策略(人名反応に学ぶ有機合成戦略)(富冈清监译、化学同人发行)；综合有机转化(comperhensive OrganicTransformations)(VCH出版社)1989年刊等中记载的方法或实施例中记载的方法来进行。
各步骤中，官能团的保护或脱保护反应依据公知的方法、例如Wiley-Interscience公司2007年刊“有机合成中的保护基(Protective Groups in OrganicSynthesis)，第四版”(Theodora W.Greene，Peter G.M.Wuts著)；Thieme公司2004年刊“保护基(Protecting Groups)第三版”(P.J.Kocienski著)等中记载的方法或实施例中记载的方法来进行。
作为醇等的羟基、酚式羟基的保护基，可列举例如：甲氧基甲基醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚、四氢吡喃基醚等醚型保护基；乙酸酯等羧酸酯型保护基；甲磺酸酯等磺酸酯型保护基；碳酸叔丁酯等碳酸酯型保护基等。
作为醛的羰基的保护基，可列举例如：二甲基缩醛等缩醛型保护基；环状1,3-二烷等环状缩醛型保护基等。
作为酮的羰基的保护基，可列举例如：二甲基缩酮等缩酮型保护基；环状1,3-二烷等环状缩酮型保护基；O-甲基肟等肟型保护基；N,N-二甲基腙等腙型保护基等。
作为羧基的保护基，可列举例如：甲酯等酯型保护基；N,N-二甲基酰胺等酰胺型保护基等。
作为巯基的保护基，可列举例如：苄基硫醚等醚型保护基；硫代乙酸酯、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯等酯型保护基等。
作为氨基和咪唑、吡咯、吲哚等芳香族杂环的保护基，可列举例如：氨基甲酸苄酯等氨基甲酸酯型保护基；乙酰胺等酰胺型保护基；N-三苯基甲基胺等烷基胺型保护基、甲磺酰胺等磺酰胺型保护基等。
保护基的除去可以使用公知的方法、例如使用酸、碱、紫外线、肼、苯肼、N-甲基二硫代氨基甲酸钠、四丁基氟化铵、乙酸钯、三烷基卤硅烷(例如三甲基碘硅烷、三甲基溴硅烷)的方法、还原法等来进行。
各步骤中，在进行还原反应的情况下，作为使用的还原剂，可列举：氢化铝锂、三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝(DIBAL-H)、硼氢化钠、四甲基三乙酰氧基硼氢化铵等金属氢化物类；硼烷四氢呋喃络合物等硼烷类；雷尼镍；雷尼钴；氢气；甲酸等。例如，可以在氢气或甲酸存在下使用雷尼镍或雷尼钴。在对碳-碳双键或三键进行还原的情况下，有使用钯-碳、林德拉(Lindlar)催化剂等催化剂的方法。
各步骤中，在进行氧化反应的情况下，作为使用的氧化剂，可列举：间氯过氧苯甲酸(MCPBA)、过氧化氢、叔丁基过氧化氢等过酸类；高氯酸四丁基铵等高氯酸盐类；氯酸钠等氯酸盐类；亚氯酸钠等亚氯酸盐类；高碘酸钠等高碘酸类；亚碘酰苯等高价碘试剂；二氧化锰、高锰酸钾等具有锰的试剂；四乙酸铅等铅类；氯铬酸吡啶盐(PCC)、二铬酸吡啶盐(PDC)、琼斯试剂等具有铬的试剂；N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)等卤素化合物类；氧气；臭氧；三氧化硫-吡啶络合物；四氧化锇；二氧化硒；2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)等。
各步骤中，在进行自由基环化反应的情况下，作为使用的自由基引发剂，可列举：偶氮双异丁腈(AIBN)等偶氮化合物；4-4’-偶氮双-4-氰基戊酸(ACPA)等水溶性自由基引发剂；空气或氧气存在下的三乙基硼；过氧化苯甲酰等。另外，作为使用的自由基反应试剂，可列举三丁基锡烷、三(三甲基甲硅烷基)硅烷、1,1,2,2-四苯基二硅烷、二苯基硅烷、碘化钐等。
各步骤中，在进行维蒂希(Wittig)反应的情况下，作为使用的维蒂希试剂，可列举亚烷基正膦类等。亚烷基正膦类可以通过公知的方法、例如使盐与强碱反应来制备。
各步骤中，在进行霍纳尔-埃蒙斯(Horner-Emmons)反应的情况下，作为使用的试剂，可列举二甲基膦酰基乙酸甲酯、二乙基膦酰基乙酸乙酯等膦酰基乙酸酯类；碱金属氢化物类、有机锂类等碱。
各步骤中，在进行傅列德尔-克拉夫茨(Friedel-Crafts)反应的情况下，作为使用的试剂，可列举路易斯酸、以及酰氯或烷基化剂(例如卤代烷类、醇、烯烃类等)。或者，也可以使用有机酸、无机酸代替路易斯酸，也可以使用乙酸酐等酸酐代替酰氯。
各步骤中，在进行芳香族亲核取代反应的情况下，作为试剂，使用亲核试剂(例如胺类、咪唑等)和碱(例如碱性盐类、有机碱类等)。
各步骤中，在进行利用碳负离子的亲核加成反应、利用碳负离子的亲核1,4-加成反应(迈克尔加成反应)、或利用碳负离子的亲核取代反应的情况下，作为用于产生碳负离子的碱，可列举有机锂类、金属醇盐类、无机碱类、有机碱类等。
各步骤中，在进行格氏(Grignard)反应的情况下，作为格氏试剂，可列举苯基溴化镁等芳基卤化镁类；甲基溴化镁、异丙基溴化镁等烷基卤化镁类。格氏试剂可以通过公知的方法、例如使用醚或四氢呋喃作为溶剂且使卤代烷或芳基卤与金属镁进行反应来制备。
各步骤中，在进行Knoevenagel缩合反应的情况下，作为试剂，使用被两个吸电子基夹着的活性亚甲基化合物(例如丙二酸、丙二酸二乙酯、丙二腈等)和碱(例如有机碱类、金属醇盐类、无机碱类)。
各步骤中，在进行Vilsmeier-Haack反应的情况下，作为试剂，使用磷酰氯和酰胺衍生物(例如N,N-二甲基甲酰胺等)。
各步骤中，在进行醇类、卤代烷类、磺酸酯类的叠氮化反应的情况下，作为使用的叠氮化剂，可列举叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、三甲基甲硅烷基叠氮、叠氮化钠等。例如，在对醇类进行叠氮化的情况下，有使用叠氮磷酸二苯酯和1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)的方法、使用三甲基甲硅烷基叠氮和路易斯酸的方法等。
各步骤中，在进行还原性氨基化反应的情况下，作为使用的还原剂，可列举三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢气、甲酸等。在基质为胺化合物的情况下，作为使用的羰基化合物，除了可列举多聚甲醛以外，还可列举乙醛等醛类、环己酮等酮类。在基质为羰基化合物的情况下，作为使用的胺类，可列举氨、甲胺等伯胺；二甲胺等仲胺等。
各步骤中，在进行光延反应的情况下，作为试剂，使用偶氮二羧酸酯类(例如偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)、偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD)等)和三苯基膦。
各步骤中，在进行酯化反应、酰胺化反应、或脲化反应的情况下，作为使用的试剂，可列举酰氯、酰溴等酰卤体；酸酐、活性酯体、硫酸酯体等被活化的羧酸类。作为羧酸的活化剂，可列举：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSCD)等碳二亚胺系缩合剂；4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐-n-水合物(DMT-MM)等三嗪系缩合剂；1,1-羰基二咪唑(CDI)等碳酸酯系缩合剂；叠氮磷酸二苯酯(DPPA)；苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)盐(BOP试剂)；碘化2-氯-1-甲基-吡啶盐(向山试剂)；亚硫酰氯；氯代甲酸乙酯等卤代甲酸低级烷基酯；O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)；硫酸；或这些的组合等。在使用碳二亚胺系缩合剂的情况下，可以进一步向反应中加入1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)等添加剂。
各步骤中，在进行偶联反应的情况下，作为使用的金属催化剂，可列举：乙酸钯(II)、四(三苯基膦)钯(0)、二氯双(三苯基膦)钯(II)、二氯双(三乙基膦)钯(II)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁氯化钯(II)、乙酸钯(II)等钯化合物；四(三苯基膦)镍(0)等镍化合物；三(三苯基膦)氯化铑(III)等铑化合物；钴化合物；氧化铜、碘化铜(I)等铜化合物；铂化合物等。可以进一步向反应中加入碱，作为这样的碱，可列举无机碱类、碱性盐类等。
各步骤中，在进行硫羰基化反应的情况下，作为硫羰基化剂，代表性地使用五硫化二磷，但除了五硫化二磷以外还可以使用2,4-双(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷-2,4-二硫化物(Lowesson试剂)等具有1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷-2,4-二硫化物结构的试剂。
各步骤中，在进行Wohl-Ziegler反应的情况下，作为使用的卤化剂，可列举N-碘代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)、溴、磺酰氯等。而且，通过对反应施加热、光、过氧化苯甲酰、偶氮双异丁腈等自由基引发剂，可以使反应加快。
各步骤中，在进行羟基的卤化反应的情况下，作为使用的卤化剂，可列举氢卤酸与无机酸的酰卤，具体而言，在氯化时可列举盐酸、亚硫酰氯、氧氯化磷等，在溴化的情况下可列举48％氢溴酸等。另外，也可以使用通过三苯基膦与四氯化碳或四溴化碳等的作用而由醇得到卤代烷体的方法。或者，还可以使用经过将醇转换为磺酸酯后与溴化锂、氯化锂或碘化钠反应这样的两阶段反应来合成卤代烷体的方法。
各步骤中，在进行Arbuzov反应的情况下，作为使用的试剂，可列举：溴代乙酸乙酯等卤代烷类；亚磷酸三乙酯、亚磷酸三异丙酯等亚磷酸酯类。
各步骤中，在进行砜酯化反应的情况下，作为使用的砜化剂，可列举甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯、甲磺酸酐、对甲苯磺酸酐、三氟甲磺酸酐等。
各步骤中，在进行水解反应的情况下，作为试剂，使用酸或碱。另外，在进行叔丁酯的酸水解反应的情况下，有时为了将副生成的叔丁基阳离子还原地捕获而加入甲酸、三乙基硅烷等。
各步骤中，在进行脱水反应的情况下，作为使用的脱水剂，可列举硫酸、五氧化二磷、氧氯化磷、N,N’-二环己基碳二亚胺、氧化铝、聚磷酸等。
化合物(I)例如可以通过以下的制造方法来制造。本发明中，尤其是在酯化时，通过使用与目标化合物(I)的结构相应的合适原料，能够合成期望结构的化合物(I)。另外，化合物(I)的盐可以通过与无机碱、有机碱、有机酸、碱性或酸性氨基酸的适当混合而得到。
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上述式中，P1、P2、P3、P4、P5和P6各自独立地表示保护基，
化合物(A)表示式：
化合物(B)表示式：R1表示/>
化合物(C)表示式：R2表示/>
以下对含有本发明的化合物的脂质粒子、以及含有该脂质粒子和核酸的用于向心肌细胞转染核酸的组合物(本发明的组合物)的制造方法进行说明。
本发明的脂质粒子可以如下制造：将作为阳离子性脂质的本发明的化合物与其他脂质成分(例如结构脂质)混合后，通过用于由脂质成分制备脂质粒子的公知方法来进行制造。例如，将上述的混合脂质成分溶解于有机溶剂，将得到的有机溶剂溶液与水或缓冲液混合(例如乳化法)，由此可以制造脂质粒子分散液。上述混合可以使用微流体混合系统(例如NanoAssemblr装置(Precision NanoSystems公司))来进行。得到的脂质粒子可供于脱盐或透析以及灭菌过滤。另外，可以根据需要进行pH调节、渗透压调节。
化合物(I)可通过式(I)的n1、n2、n3、L、Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的定义的组合而得到多种结构。在脂质粒子的制造中，作为化合物(I)，可以单独使用具有特定结构的1种化合物，也可以使用结构不同的多种化合物的混合物。
作为“结构脂质”，可列举上述那样的脂质、例如固醇类、磷脂、聚乙二醇脂质。例如，可以使用相对于本发明的化合物1摩尔为0.008～4摩尔的“结构脂质”。本发明的化合物特别优选与作为固醇类的胆固醇、作为磷脂的磷脂酰胆碱、和聚乙二醇脂质混合使用。使用上述成分作为结构脂质时的优选的混合比率为本发明的化合物1～4摩尔、固醇类0～3摩尔、磷脂0～2摩尔和聚乙二醇脂质0～1摩尔。使用上述成分作为结构脂质时的更优选的混合比率为本发明的化合物1～1.5摩尔、固醇类0～1.25摩尔、磷脂0～0.5摩尔和聚乙二醇脂质0～0.125摩尔。
上述有机溶剂溶液中的本发明的化合物、或本发明的化合物与其他脂质成分的混合物的浓度优选为0.5～100mg/mL。
作为有机溶剂，可列举例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或这些的混合物。有机溶剂可以含有0～20％的水或缓冲液。
作为缓冲液，可列举酸性缓冲液(例如乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-吗啉代乙烷磺酸(MES)缓冲液、磷酸缓冲液)、中性缓冲液(例如4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS))。
在使用微流体混合系统进行混合时，优选相对于有机溶剂溶液1体积份混合水或缓冲液1～5体积份。另外，该系统中，混合液(有机溶剂溶液与水或缓冲液的混合液)流速例如为0.01～20mL/分钟、优选为0.1～10mL/分钟，温度例如为5～60℃、优选为15～45℃。
本发明的组合物可以通过在制造脂质粒子或脂质粒子分散液时预先向水或缓冲液中添加核酸而制造成含有核酸的脂质粒子分散液形式。核酸优选以使水或缓冲液中的核酸浓度达到例如0.01～20mg/mL、优选为0.05～2.0mg/mL的方式进行添加。
另外，本发明的组合物也可以通过将脂质粒子或脂质粒子分散液与核酸或其水溶液用公知的方法混和而制造成含有核酸的脂质粒子分散液形式。脂质粒子分散液可以通过使脂质粒子分散于适当的分散介质中来制备。另外，核酸的水溶液可以通过使核酸溶解于适当的溶剂中来制备。
除分散介质和溶剂外的本发明的组合物中的本发明的化合物的含量通常为10～70重量％、优选为40～70重量％。
除分散介质和溶剂外的本发明的组合物中的核酸的含量通常为0.1～25重量％、优选为1～20重量％。
脂质粒子分散液或含有组合物的分散液的分散介质可通过进行透析而置换为水或缓冲液。透析使用截留分子量为10～20K的超滤膜在4℃～室温下实施。也可以反复进行透析。分散介质的置换可以使用切向流过滤(TFF)。另外，在置换分散介质之后，可以根据需要进行pH调节、渗透压调节。作为pH调节剂，可列举例如氢氧化钠、柠檬酸、乙酸、三乙醇胺、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等。另外，作为渗透压调节剂，可列举例如：氯化钠、氯化钾、磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等无机盐类；甘油、甘露醇、山梨醇等多元醇类；葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖等糖类。pH通常调节为6.5～8.0、优选7.0～7.8。渗透压优选调节为250～350Osm/kg。
本发明的组合物中，可以根据需要含有脂质粒子和核酸以外的成分。作为这样的成分，可列举例如适量的稳定剂和抗氧化剂。
作为稳定剂，没有特别限定，可列举例如甘油、甘露醇、山梨醇、乳糖或蔗糖之类的糖类。
作为抗氧化剂，可列举例如抗坏血酸、尿酸、半胱氨酸、生育酚同系物(维生素E，生育酚α、β、γ、δ这4个异构体等)、EDTA、半胱氨酸等。
以下对含有本发明的化合物的脂质粒子、以及含有该脂质粒子和核酸的组合物的分析方法进行说明。
(组合物中的)脂质粒子的粒径可以通过公知的手段来进行测定。例如，可以使用基于动态光散射测定技术的粒径测定装置、Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，通过自相关函数的累积量分析而以Z平均粒径来计算。(组合物中的)脂质粒子的粒径(平均粒径)例如为10～200nm、优选为60～150nm。
本发明的组合物中的核酸(例如siRNA、mRNA)的浓度和包封率可以通过公知的手段进行测定。例如，可以使用Quant-iTTM RiboGreen(注册商标)(Invitrogen)对核酸进行荧光标记，通过测定其荧光强度来求出浓度和包封率。组合物中的核酸的浓度可以使用由浓度已知的核酸水溶液制作的标准曲线来计算，包封率可以基于有无添加Triton-X100(用于使脂质粒子崩解的表面活性剂)所带来的荧光强度差异来计算。需要说明的是，组合物中的核酸的浓度是指被脂质粒子包封的核酸和未被包封的核酸的合计浓度，包封率是指组合物中的全部核酸中被脂质粒子包封的核酸的比例。
以下对本发明的试剂盒进行说明。
本发明的试剂盒含有1)式(I)所示的化合物或其盐(本发明的化合物)、2)结构脂质和3)核酸。本发明的试剂盒中的本发明的化合物、结构脂质和核酸与本发明的组合物中所含的本发明的化合物、结构脂质和核酸相同。
实施例
进一步通过以下的合成例、制备例和实施例来详细地说明本发明，但本发明并不受这些限定，并且可以在不脱离本发明范围的范围内加以改变。
以下实施例中的“室温”通常表示约10℃至约35℃。只要没有特别说明，则混合溶剂中示出的比表示体积比。只要没有特别说明，则％表示重量％。
只要没有特别提及，则实施例的柱色谱中的洗脱在基于TLC(Thin LayerChromatography，薄层色谱法)的观察下进行。TLC观察中，作为TLC板，使用默克(Merck)公司制的60F254，作为展开溶剂，使用在柱色谱中作为洗脱溶剂使用的溶剂。另外，检测使用UV检测器，根据需要使用TLC显色试剂进行观察。在硅胶柱色谱中，记载为NH时使用氨基丙基硅烷键合硅胶，记载为Diol时使用3-(2,3-二羟基丙氧基)丙基硅烷键合硅胶。在制备HPLC(高效液相色谱法)中，记载为C18时使用十八烷基键合硅胶。只要没有特别说明，则洗脱溶剂中所示的比表示体积比。
1H NMR通过傅立叶变换型NMR进行测定。1H NMR的分析使用ACD/SpecManager(商品名)软件等。关于羟基、氨基等的质子峰非常平缓的峰，有时没有进行记载。
MS通过LC/MS和MALDI/TOFMS进行测定。作为电离方法，使用ESI法、APCI法或MALDI法。作为基质，使用CHCA。数据记载了实测值(found)。通常观测到分子离子峰，但有时以碎片离子的形式被观测到。在盐的情况下，通常观测到游离体的分子离子峰、阳离子种、阴离子种或碎片离子峰。
以下的实施例中使用了下述缩写。
MS：质谱
M：摩尔浓度
N：当量浓度
CDCl3：氘代氯仿
DMSO-d6：氘代二甲基亚砜
1H NMR：质子核磁共振
LC/MS：液相色谱质谱分析仪
ESI：electrospray ionization、电喷雾电离
APCI：atmospheric pressure chemical ionization、大气压化学电离
MALDI：Matrix-assisted laser desorption/ionization、基质辅助激光解吸电离
TOFMS：Time-of-flight mass spectrometry、飞行时间型质谱分析
CHCA：α-氰基-4-羟基肉桂酸
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
THF：四氢呋喃
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
TBAF：四丁基氟化铵
DIBAL-H：二异丁基氢化铝
DBU：1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯
[合成例1]4-庚基十一酸3-((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)-2,2-双((辛酰氧基)甲基)丙酯
A)2-庚基壬酸甲酯
在氮气气流且冰冷却下将60％氢化钠(含有矿物油)(3.78g)的脱水DMF(100mL)悬浮液搅拌10分钟。之后在10℃以下滴加丙二酸二甲酯(5.0g)。在该温度下搅拌10分钟后，滴加1-碘庚烷(18.3mL)，升温至室温。4小时后，向反应混合物中加入6N盐酸而进行中和后，用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗涤2次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣溶解于DMSO(75mL)，添加水(0.68mL)、氯化锂(3.21g)，升温到165℃。在该温度下搅拌16小时后加入水，用乙酸乙酯稀释。用饱和食盐水洗涤2次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(8.14g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.90(6H,m),1.20-1.32(20H,m),1.36-1.47(2H,m),1.54-1.62(2H,m),2.33(1H,tt,J＝9.0,5.4Hz),3.67(3H,s)
B)2-庚基壬烷-1-醇
在氮气气流且冰冷却下，向氢化铝锂(2.15g)的脱水THF(92mL)悬浮液中滴加2-庚基壬酸甲酯(7.67g)的脱水THF(50mL)溶液，在10℃以下搅拌1小时。之后升温到室温，搅拌3小时。再次冷却到10℃以下后，一点一点地添加硫酸钠十水合物。用乙酸乙酯稀释后，用硅藻土过滤不溶物，减压馏去溶剂，得到标题化合物(6.91g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.86-0.91(6H,m),1.16-1.34(25H,m),1.41-1.49(1H,m),3.54(2H,t,J＝5.2Hz)
C)2-庚基壬醛
在氮气气流下，将草酰氯(4.9mL)的二氯甲烷(30mL)溶液冷却到-70℃，一边保持在-60℃以下一边滴加二甲基亚砜(6.1mL)的二氯甲烷(30mL)溶液。在-70℃下搅拌15分钟后，一边保持在-60℃以下一边滴加2-庚基壬烷-1-醇(6.9g)的二氯甲烷(25mL)溶液。在-70℃下搅拌2小时后加入三乙胺(23.8mL)，升温至室温。加入饱和氯化铵水溶液，进行分液操作后，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(6.06g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.85-0.92(6H,m),1.19-1.33(20H,m),1.37-1.47(2H,m),1.56-1.65(2H,m),2.18-2.25(1H,m),9.55(1H,d,J＝3.2Hz)
D)4-庚基十一碳-2-烯酸乙酯
在氮气气流且冰冷却下，将60％氢化钠(含有矿物油)(1.4g)的脱水THF(70mL)悬浮液搅拌10分钟。之后在10℃以下滴加(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(16.8g)。在该温度下搅拌10分钟后，滴加2-庚基壬醛(6.0g)的脱水THF(60mL)溶液，升温至室温。短暂搅拌后，升温到50℃。搅拌6小时后，使反应混合物达到5℃以下，添加水后，用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗涤2次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(5.4g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.87(6H,t,J＝6.0Hz),1.16-1.34(25H,m),1.37-1.45(2H,m)2.07-2.15(1H,m),4.19(2H,q,J＝7.5Hz),5.75(1H,d,J＝16.0Hz),6.75(1H,dd,J＝16.0,10.0Hz)
E)4-庚基十一碳酸
在室温下向4-庚基十一碳-2-烯酸乙酯(5.40g)的乙醇(100mL)溶液中加入10％钯碳(1.08g)，在氢气气氛下搅拌20小时。反应后过滤除去钯碳，然后在减压下馏去溶剂。向得到的残渣中加入8N氢氧化钠水溶液(6.38mL)的乙醇(20mL)溶液，在60℃下搅拌5小时。在减压下馏去溶剂后，用6N盐酸使其呈酸性。将残渣用己烷稀释，用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥。在减压下馏去溶剂，得到标题化合物(4.73g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.88(6H,t,J＝7.5Hz),1.17-1.41(25H,m),1.16-1.34(2H,m),2.22-2.34(2H,m)
F)2-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇
在室温下向2,2-双(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(5.0g)、1H-咪唑(2.5g)和DMF(200mL)的混合物中加入叔丁基氯二苯基硅烷(5.1g)的DMF(10mL)溶液。搅拌18小时后，将反应混合物在减压下浓缩。将残渣用乙酸乙酯稀释，用水洗涤3次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(6.4g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 1.07(9H,s),2.34(3H,t,J＝5.5Hz),3.67(2H,s),3.74(6H,d,J＝5.7Hz),7.39-7.48(6H,m),7.63-7.67(4H,m)
G)(5-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲醇
在室温下向2-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(3.5g)、2,2-二甲氧基丙烷(1.5g)的丙酮(35mL)溶液中加入对甲苯磺酸一水合物(89mg)。搅拌2小时后，向反应混合物中加入稀氨水而进行中和后，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(2.7g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 1.07(9H,s),1.27(3H,s),1.41(3H,s),2.12-2.18(1H,m),3.69-3.78(8H,m),7.38-7.47(6H,m),7.65-7.69(4H,m)
H)4-庚基十一酸(5-(羟甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯
在50℃下向(5-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲醇(3.56g)、DMAP(1.37g)和4-庚基十一碳酸(3.18g)的DMF(30mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.47g)。搅拌6小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，，用水洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。在室温下向得到的残渣(6.15g)的THF(20mL)溶液中加入TBAF的THF溶液(1M,10.3mL)。搅拌4小时后，将反应混合物在减压下浓缩。将残渣用乙酸乙酯稀释，用水洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(2.34g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.88(6H,t,J＝6.9Hz),1.22-1.32(25H,m),1.42(6H,s),1.57-1.62(2H,m),2.30-2.35(2H,m),3.48(2H,d,J＝6.6Hz),3.71-3.73(4H,m),4.25(2H,s)
I)4-庚基十一酸(5-(((5-二甲基氨基)戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯
在40℃下向4-庚基十一酸(5-(羟甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯(1.2g)、DMAP(0.94g)和5-(二甲基氨基)戊酸盐酸盐(0.74g)的DMF(30mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.94g)。搅拌4小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(NH、乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(1.37g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.88(6H,t,J＝6.9Hz),1.20-1.32(25H,m),1.42(6H,s),1.45-1.52(2H,m),1.54-1.67(4H,m),2.21(6H,s),2.23-2.31(4H,m),2.35(2H,t,J＝7.5Hz),3.75(4H,s),4.11(2H,s),4.12(2H,s)
J)4-庚基十一酸3-((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)-2,2-双((辛酰氧基)甲基)丙酯
向4-庚基十一酸(5-(((5-二甲基氨基)戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯(1.37g)中加入乙酸(6.85mL)、水(3.43mL)，在70℃下搅拌2小时后，在减压下馏去溶剂。向残渣中加入乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌2小时。用水洗涤2次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。向得到的残渣(400mg)中加入DMAP(478mg)和辛酸(327mg)的DMF(4mL)溶液后，在50℃下加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(478mg)。搅拌4小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用饱和碳酸钠水溶液洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(NH、乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(300mg)。/>
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.86-0.91(12H,m),1.15-1.34(45H,m),1.45-1.52(2H,m),1.53-1.66(4H,m),2.20(6H,s),2.23-2.36(10H,m),4.11(8H,s)
[合成例8]双(2-己基辛酸)2-(((6-(二甲基氨基)己酰基)氧基)甲基-2-((辛酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯
A)2-己基辛酸
在氮气气流且冰冷却下，将60％氢化钠(含有矿物油)(3.78g)的脱水DMF(90mL)悬浮液搅拌10分钟。之后在10℃以下滴加丙二酸二甲酯(5.0g)。在该温度下搅拌10分钟后，滴加1-碘己烷(16.8mL)，升温至室温。8小时后向反应混合物中添加乙酸(1mL)后，用乙酸乙酯稀释，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣溶解于乙醇(EtOH，80mL)，加入8N氢氧化钠水溶液(25mL)，在60℃下搅拌6小时。用6N盐酸中和后，用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣在160℃下加热1.5小时，冷却到室温，然后用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(7.45g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.83-0.92(6H,m),1.22-1.35(16H,m),1.38-1.52(2H,m),1.56-1.67(2H,m),2.34(1H,ddd,J＝8.7,5.4,3.3Hz)
B)(2-(4-甲氧基苯基)-1,3-二烷-5,5-二基)二甲醇
在50℃下搅拌2,2-双(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(506g)的水(2.0L)溶液。加入浓盐酸(18mL)，在30℃附近用3小时滴加对甲氧基苯甲醛(474mL)。之后使反应液为25℃，搅拌5小时。加入2N氢氧化钠水溶液(120mL)，搅拌1小时。滤出晶体，用水洗涤后，用乙酸乙酯/己烷重结晶，得到标题化合物(769g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 3.24(2H,d,J＝5.0Hz),3.67(2H,d,J＝5.4Hz),3.74(3H,s),3.77(2H,d,J＝11.3Hz),3.88(2H,t,J＝11.3Hz),4.53(1H,t,J＝5.4Hz),4.62(1H,t,J＝5.0Hz),5.34(1H,s),6.90(2H,d,J＝8.9Hz),7.33(2H,d,J＝8.9Hz)
C)9-(4-甲氧基苯基)-3,3-二甲基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷
在室温下向(2-(4-甲氧基苯基)-1,3-二烷-5,5-二基)二甲醇(2.00g)、2,2-二甲氧基丙烷(2.46g)的DMF(8mL)溶液中加入吡啶鎓对甲苯磺酸盐(20mg)。搅拌4小时后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次、用饱和食盐水洗涤2次后，用无水硫酸镁干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用乙酸乙酯/己烷重结晶，得到标题化合物(1.62g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.34(6H,s),3.33(2H,s),3.63(2H,d,J＝11.7Hz),3.74(3H,s),3.99(2H,s),4.12(2H,d,J＝11.7Hz),5.37(1H,s),6.90(2H,d,J＝8.8Hz),7.34(2H,d,J＝8.8Hz)
D)(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲醇
在5～20℃下向9-(4-甲氧基苯基)-3,3-二甲基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷(22.0g)的甲苯(200mL)悬浊溶液中滴加1.5M DIBAL-H溶液(60mL)，在15℃下搅拌3小时。添加甲醇(22mL)后，依次滴加2N氢氧化钠水溶液(100mL)、4N氢氧化钠水溶液(200mL)。搅拌1.5小时后，分取甲苯层，用5％食盐水洗涤。在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(14.7g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1.29(3H,s),1.29(3H,s),3.35(2H,s),3.39(2H,d,J＝5.1Hz),3.61(4H,s),3.74(3H,s),4.38(2H,s),4.59(1H,t,J＝5.1Hz),6.90(2H,dlike,J＝7.5Hz),7.24(2H,d like,J＝7.5Hz)
E)辛酸(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯
在50℃下向(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲醇(2.00g)、DMAP(412mg)和辛酸(1.27g)的DMF(20mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.94g)。搅拌4小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(2.78g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.91(3H,m),1.22-1.33(8H,m),1.40(6H,s),1.53-1.61(2H,m),2.26(2H,t,J＝7.6Hz),3.39(2H,s),3.68-3.74(2H,m),3.76-3.80(2H,m),3.80(3H,s),4.15(2H,s),4.42(2H,s),6.87(2H,d,J＝7.8Hz),7.20-7.24(2H,m)
F)辛酸3-羟基-2-(羟甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯
向辛酸(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯(754mg)的THF(6mL)溶液中加入1N盐酸(6mL)，在室温下搅拌6小时。加入饱和碳酸氢钠水溶液或2N氢氧化钠水溶液(4mL)后，用乙酸乙酯萃取，用水和饱和食盐水洗涤。将该一系列操作重复4次，直至完成脱保护。反应结束后，在减压下馏去溶剂，得到标题化合物(608mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 0.85(3H,t,J＝7.3Hz),1.15-1.30(9H,m),1.40-1.50(2H,m),2.22(2H,t,J＝7.5Hz),3.31(2H,s),3.39(4H,d,J＝5.4Hz),3.76(3H,s),3.95(2H,s),4.35(2H,s),4.43(2H,t,J＝5.4Hz),6.89(2H,d,J＝6.6Hz),7.21(2H,d,J＝6.6Hz)
G)双(2-己基辛酸)2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2-((辛酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯
在室温下向辛酸3-羟基-2-(羟甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯(2.0g)、DMAP(0.64g)和2-己基辛酸(2.63g)的DMF(20mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.41g)。在室温下搅拌15小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(3.48g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.83-0.91(15H,m),1.19-1.33(42H,m),1.37-1.47(4H,m),1.51-1.61(4H,m),2.24(2H,t,J＝7.6Hz),2.32(2H,br t,J＝5.4Hz),3.41(2H,s),3.80(3H,s),4.08-4.16(6H,m),4.39(2H,s),6.86(2H,d,J＝7.6Hz),7.19(2H,d,J＝8.8Hz)
H)双(2-己基辛酸)2-(羟甲基)-2-((辛酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯
在室温下向双(2-己基辛酸)2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2-((辛酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯(3.48g)的乙醇(30mL)溶液中加入10％钯碳(280mg)，在氢气气氛下搅拌7小时。反应后过滤除去钯碳，然后在减压下馏去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(1.68g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.91(15H,m),1.19-1.33(42H,m),1.41-1.51(4H,m),1.54-1.63(4H,m),2.30-2.38(4H,m),2.61-2.64(1H,m),3.48(2H,d,J＝7.3Hz),4.08-4.14(6H,m)
I)双(2-己基辛酸)2-(((6-(二甲基氨基)己酰基)氧基)甲基-2-((辛酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯
在室温下向双(2-己基辛酸)2-(羟甲基)-2-((辛酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯(600mg)、DMAP(54mg)和6-(二甲基氨基)己酸(280mg)的DMF(6mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(303mg)。在40℃下搅拌15小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。用硅胶柱色谱(NH,乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(513mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.83-0.92(15H,m),1.19-1.34(42H,m),1.39-1.50(6H,m),1.52-1.73(8H,m),2.21(6H,s),2.21-2.35(8H,m),4.10(8H,s)
[合成例10]4,5-二丁基壬酸3-((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)-2,2-双((辛酰氧基)甲基)丙酯
A)3-丁基庚-2-烯酸乙酯
在氮气气流且冰冷却下，将60％氢化钠(含有矿物油)(3.94g)的脱水THF(100mL)悬浮液搅拌10分钟。之后在10℃以下滴加(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(23.7g)。在该温度下搅拌10分钟后，添加壬-5-酮(10.0g)，升温至室温。短暂搅拌后，升温到50℃。搅拌10小时后，使反应混合物为5℃以下，添加水后用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗涤2次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(4.47g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.92(6H,td,J＝7.3,3.2Hz),1.25-1.47(11H,m),2.14(2H,td,J＝7.6,1.1Hz),2.57-2.62(2H,m),4.14(2H,q,J＝7.1Hz),5.62(1H,s)
B)3-丁基庚酸乙酯
在室温下向3-丁基庚-2-烯酸乙酯(5.80g)的乙醇(25mL)溶液中加入10％钯碳(1.50g)，在氢气气氛下搅拌5小时。反应后过滤除去钯碳后，在减压下馏去溶剂，得到标题化合物(5.49g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.93(6H,m),1.21-1.33(15H,m),1.80-1.88(1H,m),2.22(2H,d,J＝6.9Hz),4.12(2H,q,J＝7.1Hz)
C)2,3-二丁基庚酸乙酯
在氮气气流下将二异丙基胺(11.8mL)的脱水THF(59mL)溶液冷却到-10℃，缓慢地滴加1.6M正丁基锂(n-BuLi)己烷溶液(35.2mL)。滴加结束后，使反应液为0℃，搅拌10分钟。再次冷却到-10℃，滴加3-丁基庚酸乙酯(5.49g)的脱水THF(16mL)溶液，在-5℃附近搅拌30分钟。之后滴加1-碘丁烷(9.43g)，短暂搅拌后使其为室温。搅拌3小时后用6N盐酸中和，然后用乙酸乙酯稀释，用10％硫代硫酸钠水溶液洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(5.57g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.93(9H,m),1.17-1.41(20H,m),1.51-1.65(2H,m),2.34(1H,ddd,J＝10.6,6.5,3.8Hz),4.07-4.19(2H,m)
D)2,3-二丁基庚烷-1-醇
在氮气气流且冰冷却下，向氢化锂铝(1.54g)的脱水THF(66mL)悬浮液中滴加2,3-二丁基庚酸乙酯(5.50g)的脱水THF(10mL)溶液。滴加结束后搅拌10分钟，恢复至室温。搅拌2小时后冷却到5℃以下，每次少量地添加硫酸钠十水合物。在观察不到发泡后，用乙酸乙酯稀释，用硅藻土过滤不溶物。在减压下馏去溶剂，得到标题化合物(4.67g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.86-0.93(9H,m),1.12-1.34(19H,m),1.37-1.46(1H,m),1.47-1.61(1H,m),3.49-3.62(2H,m)
E)2,3-二丁基庚醛
在氮气气流下将2,3-二丁基庚烷-1-醇(4.60g)和DBU(6.02mL)的二氯甲烷(46mL)溶液冷却到-10℃，一边保持-5℃以下一边滴加N-叔丁基苯硫腈氯化物(6.52g)的二氯甲烷(20mL)溶液。在-10℃下搅拌3小时后，用1N盐酸使其呈酸性。进行分液操作后，在减压下馏去溶剂。将残渣用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(4.11g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.83-0.96(9H,m),1.15-1.39(16H,m),1.52-1.60(1H,m),1.62-1.74(2H,m),2.22-2.27(1H,m),9.64(1H,d,J＝2.8Hz)
F)4,5-二丁基壬-2-烯酸乙酯
在氮气气流且冰冷却下，将60％氢化钠(含有矿物油)(1.0g)的脱水THF(41mL)悬浮液搅拌10分钟。之后在10℃以下滴加(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(6.10g)。在该温度下搅拌10分钟后，滴加2,3-二丁基庚醛(4.10g)的脱水THF(8mL)溶液，升温至室温。短暂搅拌后，升温至50℃。搅拌5小时后，使反应混合物为5℃以下，添加水，然后用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗涤2次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(4.14g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.83-0.97(9H,m),1.14-1.38(22H,m),2.16-2.30(1H,m),4.10-4.22(2H,m),5.72-5.78(1H,m),6.80(1H,dd,J＝15.6,9.6Hz)
G)4,5-二丁基壬-2-烯酮酸
将4,5-二丁基壬-2-烯酸乙酯(4.10g)和8N氢氧化钠水溶液(6.1mL)的乙醇(30mL)溶液在60℃下搅拌2小时。在减压下馏去溶剂，用1N盐酸使其呈酸性。将残渣用乙酸乙酯稀释，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(2.80g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.81-0.93(9H,m),1.06-1.47(19H,m),2.16-2.33(1H,m),5.75-5.80(1H,m),6.92(1H,dd,J＝15.8,9.8Hz)
H)4,5-二丁基壬-2-烯酸3-羟基-2-(羟甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯
在室温下向(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲醇(600mg)、DMAP(240mg)和4,5-二丁基壬-2-烯酮酸(706mg)的DMF(4mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(582mg)。搅拌一晩后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将得到的残渣溶解于THF(12mL)后，加入1N盐酸(6mL)，搅拌3天。向反应混合物中加入乙酸乙酯，用5％碳酸氢钠水溶液洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(870mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.93(9H,m),1.13-1.36(18H,m),1.40-1.47(1H,m),2.21(1H,dt,J＝9.3,4.8Hz),2.69(2H,td,J＝6.6,2.5Hz),3.48(2H,s),3.55-3.67(4H,m),3.80-3.82(3H,m),4.23-4.32(2H,m),4.45(2H,s),5.74-5.79(1H,m),6.82-6.91(3H,m),7.21-7.25(2H,m)
I)4,5-二丁基壬-2-烯酸3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-双((辛酰氧基)甲基)丙酯
在室温下向4,5-二丁基壬-2-烯酸3-羟基-2-(羟甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯(870mg)、DMAP(210mg)和辛酸(545mg)的DMF(6mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(757mg)。在60℃下搅拌4小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(1.26g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.83-0.93(15H,m),1.13-1.45(35H,m),1.52-1.61(4H,m),2.17-2.31(5H,m),3.43(2H,s),3.80(3H,s),4.10-4.22(6H,m),4.40(2H,s),5.73(1H,d,J＝15.4Hz),6.78-6.90(3H,m),7.19(2H,d,J＝7.9Hz)
J)4,5-二丁基壬酸3-((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)-2,2-双((辛酰氧基)甲基)丙酯
在室温下向4,5-二丁基壬-2-烯酸3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-双((辛酰氧基)甲基)丙酯(1.26g)的乙醇(10mL)和乙酸乙酯(10mL)的混合溶液中加入10％钯碳(110mg)，在氢气气氛下搅拌一晩。反应后过滤除去钯碳，然后在减压下馏去溶剂。在室温下向残渣(500mg)、DMAP(95mg)和5-(二甲基氨基)戊酸盐酸盐(170mg)的DMF(4mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(194mg)。在50℃下搅拌7小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(NH、乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(250mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.91(15H,m),1.09-1.31(37H,m),1.42-1.52(2H,m),1.54-1.66(6H,m),1.76-1.97(1H,m),2.21(6H,s),2.24-2.35(10H,m),4.07-4.13(8H,m)
[合成例14]二癸酸2-(((4,5-二丁基壬酰基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯
A)4,5-二丁基壬酸乙酯
在室温下向4,5-二丁基壬-2-烯酸乙酯(2,50g)的乙醇(20mL)溶液中加入10％钯碳(0.54g)，在氢气气氛下搅拌5小时。反应后过滤除去钯碳，然后在减压下馏去溶剂，得到标题化合物(2.49g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.82-1.00(9H,m),1.10-1.33(23H,m),1.46-1.63(2H,m),2.19-2.36(2H,m),4.06-4.19(2H,m)
B)4,5-二丁基壬酸
在60℃下将4,5-二丁基壬酸乙酯(2.49g)和8N氢氧化钠水溶液(3.55mL)的乙醇(12.5mL)溶液搅拌7小时。在减压下馏去溶剂，用1N盐酸使其呈酸性。将残渣用乙酸乙酯稀释，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥。在减压下馏去溶剂，得到标题化合物(2.36g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.83-0.94(9H,m),0.95-1.33(20H,m),1.49(1H,ddt,J＝13.7,9.3,6.8,6.8Hz),1.56-1.74(1H,m),2.26-2.42(2H,m)
C)4,5-二丁基壬酸(5-(羟甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯
在室温下向(5-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲醇(800mg)、DMAP(306mg)和4,5-二丁基壬酸(678mg)的DMF(8mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(555mg)。在50℃下搅拌8小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化。在室温下向该化合物的THF(4mL)溶液中加入TBAF的THF溶液(1M,2.32mL)。在室温下搅拌一晩后，将反应混合物在减压下浓缩。将残渣用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(680mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.89(9H,t,J＝6.8Hz),1.09-1.31(20H,m),1.42(6H,s),1.45-1.54(1H,m),1.57-1.62(1H,m),2.29-2.37(3H,m),3.48(2H,d,J＝6.6Hz),3.70-3.75(4H,m),4.25(2H,d,J＝1.9Hz)
D)4,5-二丁基壬酸(5-(((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯
在室温下向4,5-二丁基壬酸(5-(羟甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯(680mg)、DMAP(388mg)和5-(二甲基氨基)戊酸盐酸盐(576mg)的DMF(7mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(669mg)。在50℃下搅拌7小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(740mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.89(9H,t,J＝6.9Hz),1.09-1.31(21H,m),1.42(6H,s),1.48(3H,dt,J＝15.1,7.6Hz),1.60-1.66(2H,m),2.21(6H,s),2.22-2.32(4H,m),2.35(2H,t,J＝7.6Hz),3.75(4H,s),4.09-4.13(4H,m)
E)二癸酸2-(((4,5-二丁基壬酰基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯
向4,5-二丁基壬酸(5-(((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯(1.68g)向加入乙酸(8.4mL)和水(4.2mL)，在75℃下搅拌2小时。减压馏去溶剂，加入乙酸乙酯和饱和氢氧化钠水溶液，搅拌2小时。将有机层用饱和氢氧化钠水溶液、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。在室温下向残渣(700mg)、DMAP(497mg)和癸酸(701mg)的DMF(7mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(859mg)。在50℃下搅拌7小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤2次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷、乙酸乙酯/甲醇和NH,乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(405mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.93(15H,m),1.10-1.32(44H,m),1.40-1.54(3H,m),1.54-1.66(7H,m),2.21(6H,s),2.23-2.35(10H,m),4.11(8H,s)
[合成例18]4,5-二丁基壬酸3-(((4-(二甲基氨基)丁基)氨甲酰基)氧基)-2,2-双((辛酰氧基)甲基)丙酯
在室温下向4,5-二丁基壬酸(5-(羟甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯(0.50g)的四氢呋喃溶液(7.5mL)中加入1,1-羰基二咪唑(0.28g)。搅拌1小时后，将反应混合物在减压下浓缩。将残渣用己烷稀释，除去不溶物，然后将滤液在减压下浓缩。在室温下向残渣中加入四氢呋喃(10mL)、(4-氨基丁基)二甲胺(0.20g)、三乙胺(0.24mL)。搅拌20小时后，用乙酸乙酯稀释，依次用水、氯化铵水溶液、碳酸氢钠水溶液洗涤，在减压下馏去溶剂。向残渣中加入乙酸(3.3mL)、水(1.7mL)，在65℃下搅拌5小时。冷却到室温，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用乙酸乙酯稀释，依次用碳酸氢钠水溶液、水洗涤，在减压下馏去溶剂。向残渣中加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)、DMAP(61mg)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(288mg)、辛酸(0.19mL)。在60℃下搅拌3小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，依次用水、食盐水洗涤后，在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(NH、乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(215mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 0.88(15H,t,J＝7.09Hz)1.10-1.33(32H,m)1.40-1.62(14H,m)2.21(6H,s)2.25-2.32(8H,m)3.16(2H,m)4.10(8H,s)5.84(1H,m)
[合成例20](9Z)-十六碳-9-烯酸3-((3-丁基庚酰基)氧基)-2-(((3-丁基庚酰基)氧基)甲基)-2-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)丙酯
A)(9Z)-十六碳-9-烯酸(5-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯
在氮气气氛、50℃下向(5-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲醇(1.50g)、DMAP(0.49g)和棕榈油酸(1.01g)的DMF(15mL)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.83g)。搅拌21小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(2.11g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δppm 0.85-0.94(3H,m),1.01-1.10(9H,m),1.24-1.35(16H,m),1.40(6H,d,J＝10.3Hz),1.52-1.61(2H,m),1.97-2.07(4H,m),2.25(2H,t,J＝7.6Hz),3.66(2H,s),3.77(4H,q,J＝11.8Hz),4.18(2H,s),5.35(2H,ddd,J＝5.8,3.4,2.7Hz),7.36-7.47(6H,m),7.65-7.69(4H,m)
B)(9Z)-十六碳-9-烯酸3-((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)-2,2-双(((3-丁基庚酰基)氧基)甲基)丙酯
在氮气气氛下向(9Z)-十六碳-9-烯酸(5-(((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二烷-5-基)甲酯(2.11g)中加入乙酸(10.6mL)、水(5.3mL)，在75℃下搅拌8小时。冷却到室温，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用乙酸乙酯稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂，得到残渣(1.95g)。在氮气气氛下称量残渣(0.95g)，溶解于DMF(9.5mL)溶液，然后添加DMAP(0.42g)和3-丁基庚酸(0.64g)，短暂搅拌。之后在50℃下加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.69g)。搅拌6小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(0.71g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δppm 0.84-0.93(15H,m),1.05(9H,s),1.18-1.37(40H,m),1.51-1.60(2H,m),1.78(2H,br d,J＝5.2Hz),1.97-2.07(4H,m),2.17-2.26(6H,m),3.63(2H,s),4.10-4.17(6H,m),5.35(2H,ddd,J＝5.6,3.5,2.2Hz),7.35-7.48(6H,m),7.60-7.65(4H,m)
C)(9Z)-十六碳-9-烯酸3-((3-丁基庚酰基)氧基)-2-(((3-丁基庚酰基)氧基)甲基)-2-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)丙酯
在室温下向(9Z)-十六碳-9-烯酸3-((叔丁基(二苯基)甲硅烷基)氧基)-2,2-双(((3-丁基庚酰基)氧基)甲基)丙酯(0.71g)的THF(2.1mL)溶液中加入TBAF的THF溶液(1M,0.9mL)。在室温下搅拌一晩后，将反应混合物在减压下浓缩。将残渣用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残渣溶解于DMF(5.3mL)溶液，然后添加DMAP(0.14g)和4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.19g)，短暂搅拌。之后在50℃下加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.24g)。搅拌8小时后，向反应混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤1次、用饱和食盐水洗涤1次后，用无水硫酸钠干燥，然后在减压下馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(NH,乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(0.31g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)d ppm 0.85-0.94(15H,m),1.20-1.37(40H,m),1.55-1.66(2H,m),1.66-1.86(4H,m),1.97-2.08(4H,m),2.21(6H,s),2.22-2.39(10H,m),4.08-4.17(8H,m),5.35(2H,ddd,J＝5.6,3.5,2.1Hz)
按照上述各合成例所示的方法或基于这些的方法中的任一方法制造下表中的合成例2～7、9、11～13、15～17、19和21。对于这些合成例，将化合物的名称、结构式、1H NMR化学位移和制造时实施的质量数(表中用MS表示)与合成例1、8、10、14、18和20一起示于表3。
表3-1
表3-2
表3-3
[制备例8]使用合成例8的化合物制备含有GFP mRNA的LNP
将脂质混合物(各阳离子性脂质∶DPPC∶胆固醇∶GM-020＝60∶10.6∶28∶1.4，摩尔比)溶解于90％EtOH、10％水，得到8.5mg/ml的脂质溶液。将GFP mRNA(TriLink)溶解于10mM2-吗啉代乙烷磺酸(MES)缓冲液pH4.0，得到0.22mg/ml的核酸溶液。将得到的脂质溶液和核酸溶液在室温下利用Nanoassemblr装置(Precision Nanosystems)以流速比3ml/分钟：6ml/分钟混合，得到含有组合物的分散液。将得到的分散液用Slyde-A-Lyzer(20k的截留分子量、Thermo scientific)在室温下在水中透析1小时、在4℃下在PBS中透析48小时。接着，用0.2μm的注射器式过滤器(Iwaki)进行过滤，在4℃下保存。将得到的含有GFP mRNA的LNP的分析结果示于下表。以下，使用基于动态光散射测定技术的粒径测定装置ZetasizerNano ZS(Malvern Instruments)，通过自相关函数的累积量分析，以Z平均粒径计算组合物中的脂质粒子的粒径。
表4
平均粒径 多分散度 mRNA浓度 包封率
制备例8 95nm 0.054 158μg/ml 91％
[制备例10]使用合成例10的化合物制备含有GFP mRNA的LNP
使用合成例10的化合物来代替使用合成例8的化合物，除此以外与制备例8同样地制备LNP。将得到的含有GFP mRNA的LNP的分析结果示于下表。
表5
平均粒径 多分散度 mRNA浓度 包封率
制备例10 121nm 0.059 157μg/ml 98％
[制备例11]使用合成例11的化合物制备含有GFP mRNA的LNP
使用合成例11的化合物代替使用合成例8的化合物，除此以外，与制备例8同样地制备LNP。将得到的含有GFP mRNA的LNP的分析结果示于下表。
表6
平均粒径 多分散度 mRNA浓度 包封率
制备例11 126nm 0.098 163μg/ml 97％
[实施例1]LNP向iPSC来源的分化细胞(含有心肌细胞)中的转染
本实施例中，向由iPSC分化诱导而得到的细胞中添加含有EGFP mRNA的LNP，确认其导入效率。
(1)向心肌细胞谱系的诱导
使用由iMatrix-511(Nippi)包被的10cm培养皿，将用StemFit AK03N(AJINOMOTO)进行维持培养的iPSC(Ff-I14s04、由京都大学iPS细胞研究所获得)用Stempro Accutase(Thermo Fisher Scientific)处理5分钟左右，之后通过移液而分离为单个细胞。通过离心分离(1000rpm，5分钟)除去培养基，将得到的细胞在每个30mL生物反应器(ABLE)中播种1×107个细胞，向从StemFit AK03N中除去C液而得到的培养基(AJINOMOTO AK03N的A液400mL和B液100mL，共计500mL)中添加1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μM Rock抑制剂(Y-27632)、2ng/mL BMP4(R&D)和0.5％Matrigel(Growth Factor Reduced，低生长因子)，在37℃、5％氧气条件下培养(55rpm、悬浮搅拌培养法)，形成胚状体(第0天)。次日(第1天)向生物反应器中添加10μg/mL的激活蛋白A 45μL(最终浓度15ng/mL)、10μg/mL的bFGF 15μL(最终浓度5ng/mL)和10μg/mL的BMP454μL(最终浓度20ng/mL)，在37℃、5％氧气条件进一步培养2天。接着(第3天)将得到的胚状体回收至50mL离心管，供于离心分离(200g、1分钟)后，除去培养基，向从StemFit AK03N中除去C液而得到的培养基(AJINOMOTO AK03N的A液400mL和B液100mL，共计500mL)中加入1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10ng/mLVEGF、1μM IWP-3、0.6μM Dorsomorphin和5.4μM SB431542，向所得到的培养基中在37℃、5％氧气条件下(55rpm、悬浮搅拌培养法)下培养3天。
接着(第6天)将生物反应器静置而使胚状体沉降，除去培养基的80～90％后，按照达到总计30mL的量添加添加有1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF的从StemFit AK03N除去C液而得到的培养基(AJINOMOTO AK03N的A液400mL和B液100mL，共计500mL)，在37℃、5％氧气条件下培养(55rpm)到第10天，之后转移到Ultra Low Attachment 10cm dish(超低附着力10cm培养皿，康宁公司)，在37℃、正常氧气条件下进行培养。第6天后，2～3天进行一次相同条件的培养基交换。
(2)RNA转染
将从分化诱导开始起第15天的胚状体用100μg/ml释放酶(ROCHE)处理1小时，用D-PBS(-)溶液(Wako公司)清洗后、用TrypLE select(Thermo Fisher Scientific)处理10分钟。之后加入等量的添加有1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF的从StemFit AK03N中除去C液而得到的培养基(AJINOMOTO AK03N的A液400mL和B液100mL，共计500mL)，通过移液而分离成单个细胞。通过离心分离(1000rpm,5分钟)除去培养基，将得到的细胞悬浮于添加有1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF的从StemFitAK03N中除去C液而成的培养基(AJINOMOTO AK03N的A液400mL和B液100mL，共计500mL)且调整成1x106个细胞/ml。将细胞悬浮液以1ml/孔播种在包被有纤连蛋白(Sigma)的12孔板中。
按照Lipofectamine(注册商标)信使MAX(Thermo Fisher Scientific)所附带的规程，向Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中混合Lipofectamine信使MAX试剂、GFP mRNA(TriLink)，添加到上述12孔板的细胞悬浮液中并混合，在培养箱中在37℃、正常氧气条件下培养1天。
如上述操作那样，对于在制备例8、制备例10和制备例11中分别使用合成例8、合成例10、或合成例11的化合物(阳离子性脂质)制备的含有mRNA(TriLink)的LNP，也同样地添加到上述12孔板的细胞悬浮液中并混合，在培养箱中在37℃、正常氧气条件下培养1天。
(3)mRNA导入细胞的分析
转染次日，用显微镜(Keyence,BZ-X710)进行GFP表达的观察(图1)。接着，为了分析导入效率，将细胞用胰蛋白酶/EDTA(Thermo Fisher Scientific)处理3～4分钟，加入等量的添加有50％ FBS(Thermo Fisher Scientific)的IMDM(Thermo Fisher Scientific)溶液，轻轻地移液，之后回收到15mL离心管中进行离心分离(1000rpm,5分钟)。除去上清后，悬浮于添加有2％ FBS(Thermo Fisher Scientific)的D-PBS(-)溶液(Wako公司)中，用流式细胞术(BD,FACS Aria Fusion)确认GFP阳性细胞的比例(图2)。
产业上的可利用性
通过基于本发明的使用含有特定的化合物(本发明的化合物)、结构脂质和核酸的组合物的转染方法，能够对心肌细胞高效地导入核酸。这样的本发明的转染方法例如可以应用于纯化包含心肌细胞的细胞群中的心肌细胞的方法，换言之，可以应用于制造心肌细胞的纯度高的细胞群的方法。通过这些方法得到的心肌细胞的纯度高的细胞群例如能够用于心衰、缺血性心脏病、心肌梗死、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病、扩张型心肌病等心脏病的治疗。
序列表自由文本
序列号16：对应于序列号1所示的has-miR-1的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号17：对应于序列号2所示的has-miR-22-5p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号18：对应于序列号3所示的has-miR-133a的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号19：对应于序列号4所示的has-miR-133b的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号20：对应于序列号5所示的has-miR-143-3p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号21：对应于序列号6所示的has-miR-145-3p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号22：对应于序列号7所示的has-miR-208a-3p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号23：对应于序列号8所示的has-miR-208b-3p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号24：对应于序列号9所示的has-miR-490-3p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号25：对应于序列号10所示的has-miR-490-5p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号26：对应于序列号11所示的has-miR-499a-5p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号27：对应于序列号12所示的has-miR-1271-5p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号28：对应于序列号13所示的has-miR-3907的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号29：对应于序列号14所示的has-miR-4324的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列号30：对应于序列号15所示的has-let-7e-5p的、标准的心肌细胞特异性miRNA识别序列。
序列表
<110> 国立大学法人京都大学
武田药品工业株式会社
<120> 使用阳离子性脂质的转染心肌细胞的方法
<130> PT38-9036WO
<140> JP2018-151637
<141> 2018-08-10
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
uggaauguaa agaaguaugu au 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
aguucuucag uggcaagcuu ua 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
uuuggucccc uucaaccagc ug 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
uuuggucccc uucaaccagc ua 22
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
ugagaugaag cacuguagcu c 21
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
ggauuccugg aaauacuguu cu 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
auaagacgag caaaaagcuu gu 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
auaagacgaa caaaagguuu gu 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
caaccuggag gacuccaugc ug 22
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
ccauggaucu ccaggugggu 20
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
uuaagacuug cagugauguu u 21
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
cuuggcaccu agcaagcacu ca 22
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
aggugcucca ggcuggcuca ca 22
<210> 14
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
cccugagacc cuaaccuuaa 20
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号1所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-1识别的标准序列
<400> 16
auacauacuu cuuuacauuc ca 22
<210> 17
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号2所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-22-5p识别的标准序列
<400> 17
uaaagcuugc cacugaagaa cu 22
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号3所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-133a识别的标准序列
<400> 18
cagcugguug aaggggacca aa 22
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号4所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-133b识别的标准序列
<400> 19
uagcugguug aaggggacca aa 22
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号5所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-143-3p识别的标准序列
<400> 20
gagcuacagu gcuucaucuc a 21
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号6所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-145-3p识别的标准序列
<400> 21
agaacaguau uuccaggaau cc 22
<210> 22
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号7所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-208a-3p识别的标准序列
<400> 22
acaagcuuuu ugcucgucuu au 22
<210> 23
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号8所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-208b识别的标准序列
<400> 23
acaaaccuuu uguucgucuu au 22
<210> 24
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号9所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-490-3p识别的标准序列
<400> 24
cagcauggag uccuccaggu ug 22
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号10所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-490-5p识别的标准序列
<400> 25
acccaccugg agauccaugg 20
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号11所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-499a-5p识别的标准序列
<400> 26
aaacaucacu gcaagucuua a 21
<210> 27
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号12所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-1271-5p识别的标准序列
<400> 27
ugagugcuug cuaggugcca ag 22
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号13所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-3907识别的标准序列
<400> 28
ugugagccag ccuggagcac cu 22
<210> 29
<211> 20
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号14所示的心肌细胞特异性miRNA has-miR-4324识别的标准序列
<400> 29
uuaagguuag ggucucaggg 20
<210> 30
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 序列号15所示的心肌细胞特异性miRNA has-let-7e-5p识别的标准序列
<400> 30
aacuauacaa ccuccuaccu ca 22

Claims (14)

1.组合物在制备用于治疗心脏病的药物中的应用，其中，包括使组合物与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤，
所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)核酸，
式(I)中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述核酸为mRNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述mRNA包含：
(i)包含被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA。
4.根据权利要求2所述的应用，其中，所述mRNA包含：
(i)包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述(i)和(ii)的功能性基因各自独立地为选自由抗药性基因、编码荧光蛋白的基因、凋亡诱导基因和自杀基因组成的组中的1种或1种以上的基因。
6.根据权利要求1所述的应用，其中，包含心肌细胞的细胞群为包含由诱导多能干细胞、胚胎干细胞或其他干细胞分化诱导得到的心肌细胞的细胞群。
7.一种心肌细胞的纯化方法，其包括使组合物与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤，
所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
式(I)中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基。
8.一种心室肌细胞的纯化方法，其包括使组合物与包含心室肌细胞的细胞群接触的步骤，
所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
式(I)中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基。
9.一种心肌细胞的制造方法，其包括使组合物与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤，
所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
式(I)中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基。
10.一种心室肌细胞的制造方法，其包括使组合物与包含心室肌细胞的细胞群接触的步骤，
所述组合物含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)mRNA，
在此，该mRNA包含：
(i)包含被在心室肌细胞中特异性表达的miRNA特异性识别的碱基序列和编码功能性基因的碱基序列的、心室肌细胞特异性的miRNA应答性mRNA；和/或
(ii)包含编码功能性基因的碱基序列的mRNA，
式(I)中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基。
11.一种用于向心肌细胞转染核酸的组合物，其含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)核酸，
式(I)中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基。
12.一种用于向心肌细胞转染核酸的试剂盒，其含有：1)式(I)所示的化合物或其盐；2)结构脂质；和3)核酸，
式(I)中，n1表示2～6的整数，n2表示0～2的整数，n3表示0～2的整数，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直链状C5-13烷基、直链状C13-17烯基或直链状C17链二烯基，
Rb表示直链状C2-9烷基，
Rc表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Rd表示氢原子或直链状C2-9烷基，
Re表示直链状C2-9烷基，
Rf表示直链状C2-9烷基。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其用于治疗心脏病，使所述试剂盒与包含心肌细胞的细胞群接触。
14.一种体外或离体向心肌细胞转染核酸的方法，其中，包括使权利要求11所述的组合物或权利要求12所述的试剂盒与包含心肌细胞的细胞群接触的步骤。
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