TWI825057B - 標的基因改變用組成物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種傳遞手段，該傳遞手段係用以送達可實現在細胞中高的基因改變效率之基因改變工具。本發明之組成物係一種用以誘導細胞中的標的基因座中之基因改變的組成物，該組成物含有1)式(I)所示之化合物或其鹽，2)結構脂質，以及3)嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸。式(I)中，n表示2至5的整數，R表示直鏈狀C_1-5烷基、直鏈狀C_7-11烯基或直鏈狀C₁₁二烯基，波線各自獨立地表示順型或反型之鍵結。

Description

標的基因改變用組成物

本發明係關於一種可將作為活性成分之CRISPR系統所使用之物質導入至細胞內的組成物。再者，本發明係關於一種使用該組成物誘導細胞中之標的基因座中的基因改變之方法，例如，藉由改變肌肉之肌肉萎縮蛋白基因而預防或治療肌肉萎縮症之方法。

近年，利用基因體編集方法，例如CRISPR(Clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)系統，正進展著用以在各種細胞中進行基因改變之研究開發。然而，藉由利用注射等對生體的投予，在作為目的之細胞中，將CRISPR系統中所必須之編碼gRNA(嚮導RNA，guide RNA)或RNA誘導型核酸酶(Cas9等)之基因等基因改變工具送達，而進行基因改變之相關報告較少，因而期望開發出例如用以將可實現在肌肉中的高基因改變效率之基因改變工具送達之傳遞手段。就CRISPR系統而言，已知有第1類(class 1)及第2類，第1類之中已知有第I型、第III型、第IV型，第2類之中已知有第II型、第V型、及第VI型。為了進行基因改變，與DNA結合並切斷之第2類第II型的Cas9被廣泛地使用，惟也利用同樣地與DNA結合、切斷之第2類第V型的Cpf1(Cas12a)、C2c1(Cas12b)等。再者，與RNA結合並切斷之第2類第VI型的Cas13a(C2c2)、Cas13b等亦被報告。

就對細胞的傳遞手段之一而言，已知有可將gRNA、mRNA等核苷酸內封之脂質奈米粒子(LNP：lipid nanoparticle)。例如已記載針對肝細胞，藉由LNP將CRISPR/Cas9系統之基因改變工具送達之先前技術文獻可列舉下述者。

在非專利文獻1中，記載著藉由使用C12-200(類脂質分子)、膽固醇、C14PEG2000(聚乙二醇脂質)、DOPE(1,2-二油基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)及花生四烯酸所製作之LNP，將SpCas9(源自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)之Cas 9)的mRNA、及利用AAV載體之gRNA及同源重組修復(HDR：Homology-directed repair)模板，分別對Fah^mut/mut小鼠進行靜脈注射，藉此而增加肝臟中之Fah+細胞的比率。

在專利文獻1中，記載著包含gRNA、陽離子性脂質及非陽離子性脂質之脂質粒子。就陽離子性脂質而言，可例示1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)等。在實施例中，記載著藉由將包含Cas9之mRNA及gRNA的LNP對小鼠進行靜脈注射，可在肝細胞之Pcsk9基因及HBV RT基因中辨認到變異(indel，插入或缺失)。

在非專利文獻2中，記載著利用以使用cKK-E12(屬於源自離胺酸系之雙肽之衍生物的類脂質分子)、膽固醇、C14PEG2000及DOPE所製作的LNP，藉由將SpCas9之mRNA及修飾sgRNA靜脈注射至小鼠，可在肝細胞之Pcsk9基因、Fah基因及Rosa26基因辨認到變異(indel)。

另一方面，記載著藉由LNP以外的手段，針對肌肉等將CRISPR/Cas9系統之基因改變工具送達之先前技術文獻可列舉下述者。

在專利文獻2中，記載著為了治療裘馨氏(Duchenne)型肌肉萎縮症以修正小鼠肌肉萎縮蛋白基因(Dmd)之缺損為目的，利用編碼gRNA及Cas9之基因的病毒載體(例如腺相關病毒(AAV))送達至肌肉細胞等。在實施例中，記載著針對在Dmd之外顯子23產生無意義變異(終止密碼子)之mdx小鼠，將跳讀該外顯子用之包含搭載有sgRNA及spCas9基因之載體的重組AAV藉由注射投予，在肌肉纖維及心肌細胞的一部分變成肌肉萎縮蛋白陽性。

在專利文獻3中，亦記載著藉由將編碼gRNA及Cas9之基因等送達至肌肉細胞等，而可修正Dmd等基因。在實施例(實施例9、11等)中，記載著針對從患者採取到的肌肉先驅細胞集團(生體外)，將跳讀Dmd之外顯子51用的搭載有sgRNA及SpCas9基因之表現質體藉由電穿孔法導入後，將該細胞集團移植至免疫不全小鼠，可在該小鼠的體內表現肌肉萎縮蛋白質。

在非專利文獻3中，記載著將gRNA及SaCas9之mRNA或者是SpCas9之mRNA藉由AAV而對mdx小鼠(肌肉萎縮症模式)進行靜脈注射或肌肉內投予，可在心肌及骨骼肌中辨認到外顯子23的缺失(deletion)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2016/197133號手冊

[專利文獻2]WO2016/025469號手冊

[專利文獻3]WO2014/197748號手冊

[非專利文獻1]Yin et al., Nat. Biotech., 34 (2016) p329-333

[非專利文獻2]Yin et al., Nat. Biotech., 35 (2017) p1179-1187

[非專利文獻3]Tabebordbar et al., Science, 351 (2016) p407-411

本發明之目的係提供一種用以將可實現在各種細胞中高的基因改變效率的基因改變工具送達之傳遞手段。

本發明者為了解決上述課題進行精心檢討的結果，發現藉由使用由下述式所示之化合物(一種陽離子性脂質)或其鹽與其他結構脂質所形成之脂質粒子，可將嚮導RNA(gRNA)、以Cas9為代表之RNA誘導型核酸酶蛋白質或包含編碼該RNA誘導型核酸酶之核酸等，有效率地送達至各種細胞中，而可解決上述課題，進而完成本發明。

亦即，本發明係至少關於下述發明。

[1]一種用以誘導細胞中的標的基因座之基因改變的組成物，其係包含：1)式(I)所示之化合物或其鹽，2)結構脂質，以及3)嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA，及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之核酸，

式(I)中，n表示2至5的整數，R表示直鏈狀C_1-5烷基、直鏈狀C_7-11烯基或直鏈狀C₁₁二烯基(alkadienyl group)，波線各自獨立地表示順型或反型之鍵結。

[2]如項1所述之組成物，其中，RNA誘導型核酸酶係Cas9；嚮導RNA係(a)嵌合RNA，或(b)包含2種以上crRNA及tracrRNA之RNA。

[2a]如項1所述之組成物，其中，RNA誘導型核酸酶係Cpf1。

[3]如項1或項2所述之組成物，其中，Cas9係源自化膿性鏈球菌之Cas9。

[4]如項1至項3中任一項所述之組成物，其中，前述嚮導RNA係2種以上的嚮導RNA。

[5]如項1至項4中任一項所述之組成物，其中，細胞係肌肉細胞。

[6]如項1至項5中任一項所述之組成物，其中，標的基因座包含肌肉萎縮蛋白(dystrophin)基因之核苷酸序列。

[7]如項1至項6中任一項所述之組成物，其中，嚮導RNA係(1)包含序列編號1或者是序列編號2所示之核酸序列之嵌合RNA，或(2)(i)包含序列編號3或者是序列編號4所示之核酸序列之crRNA、及 (ii)包含序列編號7或者是序列編號8所示之核酸序列之tracrRNA。

[8]一種改變細胞中之標的基因座之方法，其係包含使項1所述之組成物與細胞接觸之步驟。

[9]如項8所述之方法，其中，RNA誘導型核酸酶係Cas9；嚮導RNA係(a)嵌合RNA，或(b)包含2種以上crRNA及tracrRNA之RNA。

[9a]如項8所述之方法，其中，RNA誘導型核酸酶係Cpf1。

[10]如項8或項9所述之方法，其中，Cas9係源自化膿性鏈球菌之Cas9。

[11]如項8至項10中任一項所述之方法，其中，細胞係肌肉細胞。

[12]如項8至項11中任一項所述之方法，其中，標的基因座包含肌肉萎縮蛋白基因之核苷酸序列。

[13]如項8至項12中任一項所述之方法，其中，嚮導RNA係(1)包含序列編號1或者是序列編號2所示之核酸序列之嵌合RNA，或(2)(i)包含序列編號3或者是序列編號4所示之核酸序列之crRNA，及(ii)包含序列編號7或者是序列編號8所示之核酸序列之tracrRNA。

[14]一種細胞，其係藉由項8至項13中任一項所述之方法所得之標的基因座經改變的細胞。

[15]一種醫藥，其係包含項6所述之組成物。

[16]如項15所述之醫藥，其中，RNA誘導型核酸酶係Cas9；嚮導RNA係(a)嵌合RNA，或(b)包含2種以上crRNA及tracrRNA之RNA。

[16a]如項15所述之醫藥，其中，RNA誘導型核酸酶係Cpf1。

[17]如項15或項16所述之醫藥，其中，Cas9係源自化膿性鏈球菌之Cas9。

[18]如項15至項17中任一項所述之醫藥，其中，嚮導RNA係(1)包含序列編號1或者是序列編號2所示之核酸序列之嵌合RNA，或(2)(i)包含序列編號3或者是序列編號4所示之核酸序列之crRNA、及(ii)包含序列編號7或者是序列編號8所示之核酸序列之tracrRNA。

[19]如項15至項18中任一項所述之醫藥，其係肌肉萎縮症的預防/治療藥。

[20]如項15至項19中任一項所述之醫藥，其係修復型肌肉萎縮蛋白質產生藥。

[21]一種哺乳動物之肌肉萎縮症的預防/治療方法，其係對該哺乳動物投予有效量的項6或項7所述之組成物。

[21a]如項21所述之預防/治療方法，其中，前述投予係靜脈內投予。

[21b]如項21所述之預防/治療方法，其中，前述投予係肌肉內投予。

[22]一種哺乳動物之修復型肌肉萎縮蛋白質產生方法，其係對該哺乳動物投予有效量的項6或項7所述之組成物。

[23]一種項6或項7所述之組成物的用途，其係用以製造肌肉萎縮症的預防/治療劑

[24]一種項6或項7所述之組成物的用途，其係用以使用於肌肉萎縮症的預防/治療。

[25]一種標的基因座經改變之細胞的製造方法，其係包含使項1至項7中任一項所述之組成物與細胞接觸之步驟。

[26]一種標的基因座經改變之非人類哺乳動物之製作方法，其係包含：(1)使項1至項7中任一項所述之組成物與非人類哺乳動物的受精卵、胚胎幹細胞或者是卵母細胞接觸之步驟，(2)選擇標的基因座經改變之前述受精卵、胚胎幹細胞或者是卵母細胞之步驟，及(3)將前述選擇的受精卵、胚胎幹細胞或者是卵母細胞移植至非人類哺乳動物的雌性動物之步驟。

[27]一種用以誘導細胞中之標的基因座的基因改變之組成物的製造方法，其係包含：使包含1)式(I)所示之化合物或其鹽，及2)結構脂質的脂質粒子分散液，及包含3)嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸之水溶液混合的步驟，

式(I)中，n表示2至5的整數，R表示直鏈狀C_1-5烷基、直鏈狀C_7-11烯基或直鏈狀C₁₁二烯基(alkadienyl group)，波線各自獨立地表示順型或反型之鍵結。

[28]如項27所述之製造方法，其中，前述嚮導RNA係2種以上的嚮導RNA。

此外，在本說明書中，有將「式(I)所示之化合物」記載為「化合物(I)」之情形。有將「式(I)所示之化合物或其鹽」稱為「本發明之化合物」之情形。有將「含有式(I)所示之化合物或其鹽(本發明之化合物)的脂質粒子」稱為「本發明之脂質粒子」之情形。再者，有將「嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之核酸」稱為「本發明之活性成分」之情形。有將「嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA」稱為「gRNA等」之情形，有將「RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸」稱為「RNA誘導型核酸酶等」之情形。有將含有本發明之化合物、結構脂質、gRNA等及RNA誘導型核酸酶等之組成物稱為「本發明之組成物」之情形。

本發明之脂質粒子的形狀沒有特別的限定，例如，包含以使本發明之化合物等構成為球形之方式集合而成的複合體、不構成特定之形狀而集合成的複合體、溶解於溶劑中的複合體、均勻或者是不均勻地分散在分散媒介中的複合體等。

藉由本發明，變成可將作為活性成分之CRISPR系統所使用之gRNA等、RNA誘導型核酸酶等，導入至各種細胞、組織或臟器。

第1圖係顯示實施例1之[1-3]「C57BL/6J小鼠中之使用有MmRosa26 sgRNA的DNA變異導入效率評估」之結果。[A]係sgRNA及Cas9 mRNA之各個濃度的從電泳圖及其濃度所算出的變異(indel)導入效率。[B]係顯示sgRNA及Cas9 mRNA之濃度與變異導入效率之關係圖。縱軸表示變異(indel)導入效率(%)，橫軸表示sgRNA及Cas9 mRNA之濃度。

第2圖係顯示關於實施例2之[2-4]「骨骼肌中的DNA變異導入效率評估」之從電泳圖及其濃度所算出的變異(indel)導入效率之結果。

第3圖係顯示關於實施例2之[2-5]「骨骼肌中的外顯子跳讀效率評估」之從電泳圖及其濃度所算出的外顯子跳讀效率之結果。

第4圖係顯示關於實施例2之[2-6]「骨骼肌中的肌肉萎縮蛋白質回復之評估」之從西方墨漬法及其濃度所算出的肌肉萎縮蛋白質之表現量(肌肉萎縮蛋白/Gapdh之相對值)之結果。

第5圖係顯示關於實施例3之[3-4]「源自人類iPS細胞之肌原細胞中DNA變異導入效率評估」之從電泳圖及其濃度所算出的變異(indel)導入效率之結果。

第6圖係顯示關於實施例3之[3-5]「源自人類iPS細胞之肌原細胞中外顯子跳讀效率評估」之從電泳圖及其濃度所算出的外顯子跳讀效率之結果。

第7圖係顯示關於實施例4之[4-5]「源自人類iPS細胞之肌原細胞中之外顯子跳讀效率評估」之從電泳圖及其濃度所算出的外顯子跳讀效率之結果。

第8圖係顯示關於實施例4之[4-6]「源自人類iPS細胞之肌原細胞中之肌肉萎縮蛋白質回復的評估」之從西方墨漬法及其濃度所算出的肌肉萎縮蛋白質的表現量(肌肉萎縮蛋白/GAPDH之相對值)之結果。

第9圖係顯示實施例5「LNP靜脈內投予時的各種組織中之DNA裂解活性(cleavage activity)評估」中變異導入效率的結果。

第10圖係顯示實施例6「使用Dual sgRNAs之骨骼肌中的外顯子跳讀效率(exon skipping efficiency)評估」中外顯子跳讀效率的結果。

此外，第4及8圖以外所示之肌肉萎縮蛋白質，任一者皆表示修復型肌肉萎縮蛋白質(從外顯子43與外顯子46連結而成mRNA轉譯出的人類肌肉萎縮蛋白質)。

(發明之詳細說明)

以下，針對本說明書中所使用之各取代基之定義進行詳述。沒有特別標記限制的各取代基具有下述定義。

本說明書中，就「直鏈狀C_1-5烷基」而言，例如，可列舉甲基、乙基、丙基、丁基、戊基。

本說明書中，就「直鏈狀C_7-11烯基」而言，例如，可列舉1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基，4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一碳烯基、2-十一碳烯基、3-十一碳烯基、4-十一碳烯基、5-十一碳烯基、6-十一碳烯基、7-十一碳烯基、8-十一碳烯基、9-十一碳烯基、10-十一碳烯基。此等直鏈狀C_7-11烯基包含1個碳-碳雙鍵可取得順型及反型的結構，亦可為任意的結構。

本說明書中，就「直鏈狀C₁₁二烯基」而言，例如，可列舉1,3-十一碳二烯基、1,4-十一碳二烯基、1,5-十一碳二烯基、1,6-十一碳二烯基、1,7-十一碳二烯基、1,8-十一碳二烯基、1,9-十一碳二烯基、1,10-十一碳二烯基、2,4-十一碳二烯基、2,5-十一碳二烯基、2,6-十一碳二烯基、2,7-十一碳二烯基、2,8-十一碳二烯基、2,9-十一碳二烯基、2,10-十一碳二 烯基、3,5-十一碳二烯基、3,6-十一碳二烯基、3,7-十一碳二烯基、3,8-十一碳二烯基、3,9-十一碳二烯基、3,10-十一碳二烯基、4,6-十一碳二烯基、4,7-十一碳二烯基、4,8-十一碳二烯基、4,9-十一碳二烯基、4,10-十一碳二烯基、5,7-十一碳二烯基、5,8-十一碳二烯基、5,9-十一碳二烯基、5,10-十一碳二烯基、6,8-十一碳二烯基、6,9-十一碳二烯基、6,10-十一碳二烯基、7,9-十一碳二烯基、7,10-十一碳二烯基、8,10-十一碳二烯基。此等直鏈狀C₁₁鏈二烯基包含2個碳-碳雙鍵，各個可互相獨立地取得順型及反型的結構，各自亦可為任意的結構。

式(I)中之n及波線的較佳例係如下所述。

n較佳為3至5的整數，更佳為3。

波線較佳為兩者皆為順型之鍵結。

化合物(I)之較佳的具體例係如下所述。

化合物(A)：n為3至5的整數，R為順型的直鏈狀C_7-11烯基，波線兩者皆成為順型鍵結的化合物。

化合物(B)：n為4，R為2個碳-碳雙鍵之兩者皆為順型之直鏈狀C₁₁二烯基，波線亦兩者皆為順型鍵結的化合物。

化合物(C)：n為2或3，R為直鏈狀C_1-5烷基，波線兩者皆為順型鍵結的化合物。

化合物(I)之更佳的具體例係如下所述。

化合物(A1)：n為3至5的整數，R為順型的5-庚烯基、7-壬烯基或9-十一碳烯基，波線兩者皆成為順型鍵結的化合物。

化合物(B1)：n為4，R為2個碳-碳雙鍵之兩者皆為順型之2,5-十一碳二烯基，波線亦兩者皆為順型之鍵結的化合物。

化合物(C1)：n為2或3，R為甲基、丙基、或戊基，波線亦兩者皆為順型鍵結的化合物。

化合物(I)之又更佳具體例係(9Z)-十四碳-9-烯酸3-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)-2,2-雙(((9Z,9’Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙酯。

就化合物(I)之鹽而言，較佳為藥理學上容許之鹽，例如，可列舉與無機鹼之鹽、與有機鹼之鹽、與無機酸之鹽、與有機酸之鹽、與鹼性或酸性胺基酸之鹽。

就與無機鹼之鹽的較佳例而言，可列舉鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；鋁鹽、銨鹽。較佳為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽，更佳為鈉鹽、鉀鹽。

就與有機鹼之鹽的較佳例而言，可列舉與三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺丁三醇[參(羥基甲基)甲基胺]、第三丁基胺、環己基胺、苄基胺、二環己基胺、N,N-二苄基乙二胺之鹽。

就與無機酸之鹽的較佳例而言，可列舉與氫氟酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸之鹽。較佳為與鹽酸之鹽、與磷酸之鹽。

就與有機酸之鹽的較佳例而言，可列舉與甲酸、乙酸、三氟乙酸、鄰苯二甲酸、反丁烯二酸、草酸、酒石酸、順丁烯二酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸之鹽。

就與鹼性胺基酸之鹽的較佳例而言，可列舉與精胺酸、離胺酸、鳥胺酸之鹽。

就與酸性胺基酸之鹽的較佳例而言，可列舉與天門冬胺酸、麩胺酸之鹽。

本發明之典型的實施形態中，本發明之化合物係與結構脂質一起形成脂質粒子。此脂質粒子，係在本發明之組成物中，將嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列核酸內封。

結構脂質只要是可與本發明之化合物混合而調製出混合脂質成分後，形成脂質粒子者則為沒有特別的限定者。就如此之結構脂質而言，可使用例如選自：固醇類(例如，膽固醇、膽固醇酯、膽固醇半琥珀酸等)；磷脂質(例如，磷脂醯膽鹼(例如，二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼、二亞麻油醯基磷脂醯膽鹼、MC-1010(NOF CORPORATION)、MC-2020(NOF CORPORATION)、MC-4040(NOF CORPORATION)等)、磷脂醯絲胺酸(例如，二棕櫚醯基磷脂醯絲胺酸、二硬脂醯基磷脂醯絲胺酸、二油醯基磷脂醯絲胺酸、棕櫚醯基油醯基磷脂醯絲胺酸等)、磷脂醯基乙醇胺(例如，二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇胺、二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺、二油醯基磷脂醯基乙醇胺、棕櫚醯基油醯基磷脂醯基乙醇胺、溶血磷脂醯基乙醇胺等)、磷脂醯基肌醇、磷脂酸等)；及聚乙二醇脂質(PEG脂質)(例如，PEG-DAA、PEG-DAG、PEG-磷脂接合物(phospholipid cunjugate)、PEG-Cer、PEG-膽固醇(cholesterol)、PEG-C-DOMG、2KPEG-CMG、GM-020(NOF CORPORATION)、GS-020(NOF CORPORATION)、GS-050(NOF CORPORATION)等)

所成群組中之至少一種。本發明中，就結構脂質而言，較佳為固醇類(特別是，膽固醇)、磷脂質(特別是，磷脂醯膽鹼)及聚乙二醇脂質的3種全部皆使用。

本發明之組成物中之本發明之化合物與結構脂質的比率，係可因應目的而適當地調節。例如，本發明之組成物中，藉由含有本發明之化合物及結構脂質之混合脂質成分而形成脂質粒子時，相對於本發明之化合物1莫耳，結構脂質通常為0.008至4莫耳之比率，較佳為0.4至1.5莫耳之比率。再者，若為其他規定的方式，混合脂質成分中，本發明之化合物通常為1至4莫耳，固醇類通常為0至3莫耳，磷脂質通常為0至2莫耳，聚乙二醇脂質通常為0至1莫耳之比率。本發明之化合物與其他脂質成分混合使用時的更佳態樣，係本發明之化合物為1至1.5莫耳，固醇類為0至1.25莫耳，磷脂質為0至0.5莫耳及聚乙二醇脂質為0至0.125莫耳之比率。

以下，針對本發明之活性成分進行說明。

就本發明中之活性成分而言，用於誘導細胞中之標的基因座中的基因改變的物質，具體而言，使用對應CRISPR系統之嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸。再者，關於用於基因改變的對應CRISPR系統之物質的基本事項係周知，各式各樣的應用事項亦為公知，對於本發明而言亦可適用該等周知或公知的事項(例如，參照前述的先前技術文獻)。若為所屬技術區域具有通常知識者，可因應目的，針對標的基因座或CRISPR系統的各要素，可設計、選擇、製造適當者。

細胞及標的基因座，係可因應基因改變的目的而適當地選擇，沒有特別的限定者，典型而言，係與基因疾病相關，可成為基因治療之對象的細胞及基因座。

本發明之組成物，係可使用用於將活性成分導入多數種的細胞、組織或臟器。就可適用本發明之細胞而言，例如，可列舉間葉系幹細胞、神經幹細胞、皮膚幹細胞、牌細胞、神經細胞、神經膠細胞、胰臟B細 胞、骨髓細胞、系膜細胞、朗格漢斯細胞、表皮細胞、上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、纖維細胞、肌肉(例如，骨骼肌肉、心肌細胞、肌肉母細胞、肌肉衛星細胞、平滑肌細胞)、脂肪細胞、血球細胞(例如，巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺手細胞、肥胖細胞、白血球、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、單核球、巨核球、造血幹細胞)、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨母細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或者是間質細胞、卵細胞、精細胞、或可分化衍生為此等細胞之前驅細胞、幹細胞(例如，包含誘導性多潛能幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞))、原始生殖細胞、卵母細胞、受精卵。再者，就可適用本發明之組織或臟器而言，係上述細胞所存在之任何組織或者是臟器，例如，可列舉腦、腦之各部位(例如，嗅球、扁頭核、大腦基底球、海馬迴、視丘、視丘下部、視丘下核、大腦皮質、延髓、小腦、枕葉、額葉、顳葉、殼核、尾狀核、腦染、黑質)、脊髓、腦下垂體、胃、胰臟、腎臟、肝臟、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、副腎、皮膚、肺、消化管(例如，大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾臟、顎下腺、末梢血、末梢血球、前列腺、胎盤、子宮、骨、關節及肌肉等。此等細胞、組織或臟器亦可為癌化之癌細胞或癌組織等。

在本發明之一較佳實施形態中，細胞較佳為肌肉細胞(例如，心肌細胞、骨骼細胞、肌肉衛星細胞)、纖維母細胞、間葉系幹細胞、血球細胞或iPS細胞，更佳為肌肉細胞(特別是，骨骼肌細胞或肌肉衛星細胞)。就肌肉細胞而言，例如，可列舉從人類(患者或者是健康者)或其他哺乳動物(例如，非人類靈長類(食蟹猴、恆河猴、黑猩猩等)、牛、豬、小鼠、大鼠等疾病模式動物)採取到的肌肉細胞、從生體(例，人類生體內)的肌肉細胞、肌肉細胞株、及幹細胞(例如，iPS細胞、ES細胞)分化衍生出的肌肉細胞。

在本發明之一較佳實施形態中，標的基因座係包含肌肉萎縮蛋白基因的核苷酸序列者。

肌肉萎縮蛋白基因係存在於X染色體上之超過220萬鹼基的巨大基因。藉由轉錄起始點的不同，存在著各式各樣的同功型(isoform)，已知有在全身表現之Dp71、在末端神經細胞表現之Dp116、在腦及腎臟表現之Dp140、在視網膜表現之Dp260、在普爾欽(Purkinje)神經細胞表現之Dp417p、在腦表現之Dp427b、以及在骨骼肌表現之Dp427m等。其中，從Dp427m同功型產生之肌肉萎縮蛋白質，係主要在肌肉細胞內表現之蛋白質，在存在於N末端側之肌動蛋白結合域與細胞骨骼肌動蛋白結合，亦藉由存在於C末端側之高半胱胺酸結構域與肌營養不良蛋白(dystroglycan)複合體結合，與肌動蛋白一起構成細胞骨骼。Dp427m同功型之肌肉萎縮蛋白基因係藉由79個外顯子而構成。

裘馨氏型肌肉萎縮症患者的情況，藉由具有肌肉萎縮蛋白基因的任一個外顯子的缺損或重複變異，或者是藉由外顯子中之鹼基的點變異(無意義變異)或插入缺損變異(框移變異)，使功能性之肌肉萎縮蛋白質幾乎不表現(利用西方墨漬法檢測出為健康人的3%以下的蛋白質量)。另一方面，比較裘馨氏型肌肉萎縮症為更輕微症狀的貝克氏(Becker)型肌肉萎縮症的患者的情況，即使外顯子的缺失或鹼基的點變異存在也不會在中途產生終止密碼子的情形中，表現較正常的肌肉萎縮蛋白質為短的胺基酸序列，或一部份的胺基酸經取代的肌肉萎縮蛋白質。

就肌肉萎縮蛋白基因的變異而言，在裘馨氏型肌肉萎縮症及貝克氏型肌肉萎縮症中，單一或複數個外顯子的缺失佔據一半以上。特別是，就缺失可觀察的多數部位而言，已知有外顯子44與外顯子55之間。對應肌肉萎縮蛋白基因之缺損外顯子的部位，藉由參照例如已發表的論文等 (例如，van Deutekom JC，van Ommen GJ.，Nat Rev Genet.2003)，可確認以哪個外顯子作為對象進行外顯子跳讀可使適當的修復型肌肉萎縮蛋白表現。再者，就使用基因體編集的修復型肌肉萎縮蛋白之表現方法而言，除了外顯子跳讀以外，也可藉由在肌肉萎縮蛋白基因中導入微小缺損或插入而調節讀框的方法，或藉由將缺損的外顯子利用相同重組等進行插入而可能實施。

如上述之在肌肉萎縮蛋白基因產生異常之情形，可藉由(i)將1個或2個以上的外顯子不組入(跳讀)mRNA，以不會產生框移之方式使其前後的外顯子彼此連結，(ii)藉由使1個或2個以上的鹼基插入或缺失而修正框移，(iii)將缺損的外顯子敲入(Knock in)等任一種操作而修正其異常。為上述(i)或(ii)之情形時，產生較正常的肌肉萎縮蛋白質為短或者是長的胺基酸序列，或一部份的胺基酸經取代之肌肉萎縮蛋白質。再者，藉由上述(ii)或(iii)，可產生正常的肌肉萎縮蛋白質。藉由如此之肌肉萎縮蛋白基因的修正，變成可預防或治療肌肉萎縮症等疾病。

人類之肌肉萎縮蛋白基因的核苷酸序列，係可從例如美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)取得(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1756)。

嚮導RNA可為經連結crRNA及tracrRNA之1股RNA之形態，亦即，嵌合RNA(亦有被稱為單一的嚮導RNA，sgRNA等之情形)，也可為不連結而分別各自為1股的RNA(2股RNA的組合，或其以上股數之RNA的組合)的形態。本發明之組成物，可將如此之嚮導RNA，直接以其RNA之形態含有，亦可以含有編碼嚮導RNA之序列的DNA(表現質體等)之形態含有。

嚮導RNA可為以1個鹼基序列作為標的之形態(1股sgRNA，或1組crRNA及tracrRNA)，亦可為以2個以上鹼基序列作為標的之形態(2股以上的sgRNA，或2組以上的crRNA及tracrRNA)。在本說明書中，在各個作為標的之鹼基序列中，有記載為嚮導RNA的「種類」之情形。因此，在本說明書中，有將以2個以上的鹼基序列作為標的之形態中的嚮導RNA記載為「2種以上的嚮導RNA」之情形。嚮導RNA較佳為2種或2種以上。

使用2種以上的嚮導RNA的情形，此等嚮導RNA作為標的之鹼基序列之間的距離沒有特別的限定，較佳為2個嚮導RNA的標的序列沒有重疊之情形。再者，2個嚮導RNA的標的序列較佳為相離1鹼基以上。

使用2種的嚮導RNA的情形，藉由使用此等2種的嚮導RNA之CRISPR系統所產生的DNA切斷處，較佳為包含誘導基因改變之細胞中的標的基因座或標的基因座上之特定的鹼基序列。此時，所謂包含鹼基序列，係指在該鹼基序列的上流與下流有DNA切斷處存在。

使用2種的嚮導RNA的情形，作為2種的嚮導RNA之標的序列沒有特別的限定，例如，可為序列編號3及序列編號4的標的辨識序列雜交的鹼基序列。

本發明之crRNA，係包含與細胞中之標的基因座中的特定鹼基序列(本說明書中，有稱為「標的序列」之情形)雜交之18至20個鹼基左右的核酸序列(本說明書中，有稱為「標的辨識序列」之情形)。就標的辨識序列而言，較佳為序列編號3或序列編號4所示之核酸序列。在本發明之一較佳實施形態中，crRNA包含序列編號3或序列編號4所示之核酸序列。再者，在本發明之一較佳實施形態中，crRNA包含序列編號5或序列編號6所示之核酸序列。標的序列，係藉由CRISPR系統與辨識之較短序列(PAM(前間隔 序列鄰接基序))鄰接。PAM之序列及長度的條件，係因應所使用之核酸酶的種類而不同，PAM典型而言，係與標的序列鄰接之2至5鹼基對序列。

在本發明之一較佳實施形態中，嚮導RNA，係包含序列編號1或序列編號2所示之核酸序列的嵌合RNA(sgRNA)。

在本發明之一較佳實施形態中，嚮導RNA，係(i)包含序列編號3或者是序列編號4所示之核酸序列之crRNA、及(ii)包含序列編號7或者是序列編號8所示之核酸序列之tracrRNA的組合。

序列編號1：對應實施例「HsDMDEx45 # 1」之sgRNA全序列5'-

序列編號2：對應實施例「HsDMDEx45 # 23」之sgRNA全序列5'-

序列編號3：序列編號1之標的辨識序列5'-U(M)^G(M)^G(M)^UAUCUUACAGGAACUCC-3'

序列編號4：序列編號2之標的辨識序列5'-A(M)^G(M)^C(M)^UGUCAGACAGAAAAAAG-3'

序列編號5：序列編號1之crRNA序列 5'-U(M)^G(M)^G(M)^UAUCUUACAGGAACUCCGUUUUAGAGCUA-3'

序列編號6：序列編號2之crRNA序列5'-A(M)^G(M)^C(M)^UGUCAGACAGAAAAAAGGUUUUAGAGCUA-3'

序列編號7：序列編號1之tracrRNA序列5'-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG(M)^U(M)^G(M)^C-3'

序列編號8：序列編號2之tracrRNA序列5'-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG(M)^U(M)^G(M)^C-3'

在序列編號1至8中，顯示鄰接在「(M)」右側之核糖，可為天然(未經修飾)的核糖，亦可為2’-O-甲基核糖或其他修飾核糖，較佳為2’-O-甲基核糖。

再者，在序列編號1至8中「^」所示之2’-O-甲基核糖彼此之鍵結或2’-O-甲基核糖與核糖之鍵結，可為磷酸二酯鍵結，亦可為硫代磷酸酯鍵結，較佳為硫代磷酸酯鍵結。

本發明之標的辨識序列，具有與上述序列編號3及4之任一者所示之核酸序列實質上相同的序列。再者，本發明之crRNA及嵌合RNA(sgRNA)，係在標的辨識序列以外的序列中，具有與上述序列編號1、2、5及6之任一者所示之核酸序列實質上相同的序列。再者，本發明之tracrRNA，具有與上述序列編號7及8之任一者所示之核苷酸序列實質上相 同的序列。在此，「實質上相同的序列」，係指具有至少約75%的序列相同性之序列。因此，本發明之標的辨識序列，crRNA、tracrRNA、嵌合RNA(sgRNA)，係如上述可與各個對應之序列編號所示之序列，具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。序列相同性較佳為至少85%或90%，更佳為至少95%或97%，特佳為至少99%。

所謂「序列相同性」之用語，係指將2個基因序列以使該鹼基對相同成為最大之方式整列時，在2個序列間相同之鹼基對的比率(%)。

序列相同性可以所屬技術領域中具有通常知識者所公知的任意方法來決定。例如，可藉由Higgins等人的多重整列程式之Clustal(Gene 73，1，237-244，1988)來決定。Clustal程式可在例如歐洲生物資訊學研究所(European Bioinformatics Institute(EBI))的網際網路上之網站中利用。

就本發明所使用之RNA誘導型核酸酶而言，例如可舉出RNA誘導型內核酸酶。

RNA誘導型內核酸酶，包含至少1個核酸酶域及與gRNA相互作用之至少1個域。RNA誘導型內核酸酶，係藉由gRNA對基因體的標的部位進行誘導。

RNA誘導型內核酸酶可源自叢集化調節性散在型短回文重複序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeats：CRISPR)/CRISPR-關連(Cas)系統。CRISPR/Cas系統係可為第1類中之第I型、第III型、第IV型，或者是第2類中之第II型、第V型、及第VI型系統。在適當的CRISPR/Cas蛋白質之非限定的例中，包含Cas3、Cas4、Cas5、 Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、Cas12a(或Cpf1)、Cas12b(或C2c1)、Cas12c、Cas13a1(或C2c2)、Cas13a2、Cas13b、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及Cu1966。

在一態樣中，RNA誘導型內核酸酶係源自第2類第II型之CRISPR/Cas系統。在特定的態樣中，RNA誘導型內核酸酶係源自Cas9蛋白質。Cas9蛋白質可源自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophiles)、鏈球菌屬、黃色葡萄球菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、達松維爾類諾卡菌(Nocardiopsis Dassonville)、始旋鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiralis)、綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)、粉紅鏈孢子囊菌(Streptosporangium roseum)、高溫嗜酸菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)、還原硒酸鹽芽孢桿菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum)、新凶手法朗西斯菌(Francisella novicida)、戴白氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、海洋微顫藍細菌(Microscilla marina)、伯克氏細菌(Burkholderia bacteria)、萘降極地單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、極地單胞菌種、瓦氏鍔球藻(Crocosphaera watsonii)、藍桿藻屬(Cyanothece)、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬(Synechococcus)、阿拉伯糖醋鹽桿菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏 製氨菌(Ammonifex degensii)、極端嗜熱纖維素降解厭氧菌(Caldicellulosiruptor becscii)、曲狀桿菌(Campylobacter jejuni)、空腸曲桿菌(Campylobacter coli)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)、金礦菌(Candidatus desulforudis)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)、大芬戈爾德氏菌(Finegoldea magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilusm)、熱丙酸鹽暗色厭氧香腸狀菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜溫嗜酸硫桿狀菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化鐵桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色閃桿菌(Allochromatium vinosum)、海桿菌屬(Marinobacter)、嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亞硝化球菌(Nitrosococccus watsoni)、河魨毒素假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、成簇細枝菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷鹽菌(Methanohalbium evestigatum)、多變魚腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫結球藻(Nodularia spumigena)、念球菌屬(Leuconostoc)、極大節螺藻(Arthrospira maxima)、鈍頂節螺藻(Arthrospira platensis)、節螺藻屬(Arthrospira)、鞘絲藻(Lyngbya)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、顫藻屬(Oscillatoria)、嗜熱菌(Petrotoga mobilis)、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)、或海濱藍藻菌(Acaryochloris marina)。

在一態樣中，RNA誘導型內核酸酶係源自第2類第V型的CRISPR-Cas12a/Cpf1系統。在特定的態樣中，RNA誘導型內核酸酶係源自Cpf1蛋白質。Cpf1蛋白質係可源自胺基酸球菌屬(Acidaminococcus)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、新凶手法朗西斯菌(Francisella novicida)。

CRISPR/Cas蛋白質可為野生型CRISPR/Cas蛋白質、修飾型CRISPR/Cas蛋白質、或野生型或者是修飾型CRISPR/Cas蛋白質的片段。CRISPR/Cas蛋白質，係可為了增大核酸結合親和性及/或特異性，變更酵素活性，或者是變更蛋白質的其他特性而被修飾。

RNA誘導型核酸酶可為Cas核酸酶或Cas切口酵素(nickase)。在此，所謂Cas核酸酶或Cas切口酵素，係指在CRISPR/Cas系統中必須的蛋白質成分，在與被稱戈癬CRISPR RNA(crRNA)及反活性化crRNA(tracrRNA)的2個RNA形成複合體的情形，意指具有活性之內核酸酶或切口酵素。切口酵素係指僅在一者的DNA股置入切口(nick)的DNA切斷酵素。一般而言，Cas9蛋白質包含至少2個核酸酶(亦即，DNase)域。例如，Cas9蛋白質可包含類RuvC核酸酶域及類HNH核酸酶域。RuvC及HNH域係為了在DNA中進行雙股的切斷，而合作切斷一股(Jinek et al.,Science,337：816-821)。在某一態樣中，源自Cas9之蛋白質，係可以僅含有1種功能性核酸酶域(類RuvC或類HNH核酸酶域之任一者)之方式而被修飾。例如，源自Cas9之蛋白質，係可使核酸酶域之一者，以使其不再有功能(亦即，不存在核酸酶活性)之方式以缺失或變異之方式進行修飾。在1個核酸酶域之一者為不活性的態樣中，源自Cas9之蛋白質，係可在雙股核酸中導入切口，惟不會切斷雙股DNA。例如，在類RuvC域中從天門冬胺酸至丙胺酸的變換(D10A)，係將源自Cas9之蛋白質以切口酵素進行變換。同樣地，在HNH域中之從組胺酸至丙胺酸的變換(H840A或H839A)，係將源自Cas9之蛋白質以切口酵素進行變換。各核酸酶域，係可使用如部位特異性突然變異誘發法、PCR仲介性突然變異誘發法、全基因合成、以及所屬技術領域中公知的其他方法之周知的方法進行修飾。

在RNA誘導型核酸酶中，特別是可使用源自鏈球菌屬菌(Streptococcus sp.)或葡萄球菌屬菌(Staphylococcus sp.)、新凶手法朗西斯菌(Francisella novicida)、曲狀桿菌(Campylobacter jejuni)之Cas核酸酶或Cas切口酵素。其中，就來源而言，在鏈球菌屬菌中，較佳為化膿性鏈球菌(S.pyogenes)，在葡萄球菌屬菌中，較佳為黃色葡萄球菌(S.aureus)。源自化膿性鏈球菌之Cas9核酸酶或Cas9切口酵素，係辨識作為PAM序列之NGG或NAG三核苷酸。

本發明之組成物，係可將如此之RNA誘導型核酸酶以蛋白質的形態含有，亦可以含有編碼該蛋白質之胺基酸序列的鹼基序列之核酸(mRNA，或如表現質體之DNA等)的形態含有。

就RNA誘導型核酸酶而言，較佳為Cas9。在本發明之一較佳實施形態中，Cas9係源自化膿性鏈球菌(化膿性鏈球菌)(S.pyogenes)的Cas9(SpCas9)。就Cas9而言，已知為源自各式各樣的細菌或古細菌者，在本發明中除了SpCas9以外，亦可使用例如源自黃色葡萄球菌(S.aureus)之Cas9(SaCas9)等、具有期望的核酸酶活性之Cas9。

在本發明之組成物中，相對於本發明之化合物及結構脂質(或藉由該等所形成之脂質粒子)之本發明之活性成分的比率，係可因應目的及活性成分的種類而適當地調節。例如，在本發明之組成物中，藉由含有本發明之化合物及結構脂質之混合脂質成分而脂質粒子被形成，作為本發明之活性成分之RNA被內封在該脂質粒子時，相對於脂質粒子的質量(亦即，本發明之化合物及結構脂質的合計質量)，本發明之活性成分通常為1至20質量%，較佳為2至10質量%的比率。

「RNA」(核糖核苷酸)，「DNA」(去氧核糖核苷酸)及「核酸」，可為僅含有天然的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸者，亦可因應所需 除了該等以外，為了核酸酶耐性的提升、穩定化、與互補性核酸的親和性提升、細胞穿透性的提升等，而為含有此等的分子結構之一部份經修飾後之核苷酸類似物者。就核苷酸類似物而言，例如，可列舉糖部修飾核苷酸(2’-O-甲基核糖、2’-O-丙基核糖、2’-O-甲氧基乙氧基核糖、2’-O-甲氧基乙基核糖、2’-O-[2-(胍)乙基)核糖、2’-O-氟核糖等)；交聯結構型人工核苷酸(BNA)(鎖人工核苷酸(LNA)、乙烯交聯結構型人工核苷酸(ENA)等)；磷酸二酯鍵修飾核苷酸(磷酸二酯鍵成為硫代磷酸酯鍵的置換物、N3’-P5’磷醯胺酯(Phosphoamidate)鍵的置換物等)。再者，核酸可為5’-多胺加成衍生物、膽固醇加成衍生物、類固醇加成衍生物、膽汁酸加成衍生物、維生素加成衍生物、螢光色素加成衍生物、生物素加成衍生物等。「RNA」、「DNA」及「核酸」可為單股，亦可為雙股。

在本發明之一實施形態中，嚮導RNA的至少一部份，較佳為作為前述核苷酸類似物。就核苷酸類似物而言，較佳為糖部修飾核苷酸及磷酸二酯鍵修飾核苷酸，更具體而言，較佳為2’-O-甲基核糖及磷酸二酯鍵成為硫代磷酸酯鍵的置換物。在嚮導RNA中，較佳為至少序列的3’及5’兩末端之各一鹼基為核苷酸類似物，更佳為至少序列的3’及5’兩末端之各二鹼基或三鹼基為核苷酸類似物。

在嚮導RNA為嵌合RNA之情形中，較佳為至少其序列的3’及5’兩末端各一鹼基為核苷酸類似物，在沒有連結之分別為各1股的RNA(2股RNA之組合)或其以上之股數的RNA形態之情形中，較佳為至少各個RNA序列之3’及5’兩末端各一鹼基為核苷酸類似物(例如，較佳為crRNA之3’及5’的兩末端、及tracrRNA之3’及5’的兩末端為核苷酸類似物)。

將嚮導RNA等及RNA誘導型核酸酶等皆為表現質體等基因構築物的形態時，可為編碼嚮導RNA之序列及編碼RNA誘導型核酸酶蛋白 質之序列的兩者包含在一個基因構築物，亦可為此等序列包含在各別的基因構築物。再者，基因構築物係因應所需，亦可包含啟動子、增強子、起始密碼子、終止密碼子、多腺核苷酸化訊號、細胞核定位訊號(NLS)、藥劑選擇基因、報導子基因等序列。

本發明之組成物可為下述任一種實施型態：(i)僅含有嚮導RNA等(嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA)，不含有RNA誘導型核酸酶等(RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之核酸)之實施形態、(ii)不含有嚮導RNA等，僅含有RNA誘導型核酸酶等之實施形態、或(iii)含有嚮導RNA等及RNA誘導型核酸酶等兩者之實施形態。含有嚮導RNA等時，該嚮導RNA可為1種，亦可為2種或2種以上。在本發明之組成物之一態樣中，較佳為2種或2種以上的嚮導RNA。

在本發明中，組成物中之脂質粒子，係可僅內封CRISPR系統所必須的複數種要素中之1種，亦可內封複數種(例如，gRNA與Cas9之mRNA)。脂質粒子內封複數種要素時，例如，在其製造時中可使用將各要素以合適的濃度(比率)含有之水溶液。

本發明之組成物亦可含有複數種的內封1種要素之脂質粒子。例如，亦可為將僅內封gRNA之脂質粒子、與內封Cas9之mRNA的脂質粒子，混合在組成物中。混合複數種內封1種要素之脂質粒子時，可以一邊考慮基因的改變效率等，一邊使各要素成為合適的濃度(比率)之方式進行。

在本發明之一實施形態中，內封gRNA等之脂質粒子、與內封RNA誘導型核酸酶等之脂質粒子，係藉由於同一組成物(混合溶液)、或藉由於各別的組成物添加至細胞。

在本發明之一實施形態中，包含內封gRNA等與RNA誘導型核酸酶等兩者之脂質粒子的本發明之組成物，係被添加至細胞。

本發明之化合物、脂質粒子及組成物，係可以穩定且低毒性之方式安全地使用。將本發明之組成物使用在生體內時，或作為醫藥使用時，針對投予對象(人類或非人類哺乳動物，較佳為人類)，以將本發明之組成物中之活性成分的有效量送達至作為標的之細胞之方式，投予該組成物即可。

將本發明之組成物使用在生體外時，或作為試藥使用時，藉由添加至培養基等，以使培養中的細胞與本發明之組成物(特別是包含在組成物中之內封活性成分的脂質粒子)接觸，而使活性成分的有效量移行至細胞內之方式進行即可。

本發明之組成物中之活性成分(嚮導RNA等及RNA誘導型核酸酶等)之濃度，係可因應組成物的用途而適當地調節，不是受到特別的限定者。例如，將本發明之組成物使用在生體外時，以高濃度保管含有活性成分之組成物，可以成為合適濃度之方式利用合適的溶劑調製經稀釋的組成物，或添加至培養基等之方式使用即可。例如，添加有本發明之內封有活性成分之脂質粒子的培養基(培養液)，在本發明之組成物一實施形態中，亦可適當地調節該培養基中之內封在脂質粒子之活性成分的濃度。

以下，針對本發明之化合物之製造方法進行說明。

在下述製造方法中之各步驟所用使用的原料或試藥、以及所得之化合物，亦可分別形成鹽。就如此之鹽而言，可列舉例如，與前述本發明之化合物中之鹽相同者。

在各步驟所得之化合物為遊離化合物之情形中，可藉由公知的方法，變換成作為目的之鹽。相反地，在各步驟所得之化合物為鹽之情形中，可藉由公知的方法，變換成遊離體或作為目的之其他種類的鹽。

在各步驟所得之化合物可直接以反應液，或作成粗生成物得到後，使用在接續的反應中，或者是，可將各步驟所得之化合物依據常法，從反應混合物藉由濃縮、結晶析出、再結晶、蒸餾、溶劑萃取、分餾、色層分析法等分離方法進行單離及/或精製。

各步驟之原料或試藥之化合物有市販的情況時，可直接使用市販品。

在各步驟之反應中，反應時間係可根據使用的試藥或溶劑不同，惟，在沒有特別記載時，通常為1分鐘至48小時，較佳為10分鐘至8小時。

在各步驟之反應中，反應溫度係可根據使用的試藥或溶劑不同，惟，在沒有特別記載時，通常為-78℃至300℃，較佳為-78℃至150℃。

在各步驟之反應中，壓力係可根據使用的試藥或溶劑不同，惟，在沒有特別記載時，通常為1大氣壓至20大氣壓，較佳為1大氣壓至3大氣壓。

在各步驟之反應中，例如，有使用Biotage公司製之Initiator等微波(Microwave)合成裝置之情形。反應溫度係可根據使用的試藥或溶劑不同，惟，在沒有特別記載時，通常為室溫至300℃，較佳為室溫至250℃，更佳為50℃至250℃。反應時間係可根據使用的試藥或溶劑不同，惟，在沒有特別記載時，通常為1分鐘至48小時，較佳為1分鐘至8小時。

在各步驟之反應中，試藥在沒有特別記載時，相對於基質，使用0.5當量至20當量，較佳為0.8當量至5當量。將試藥作為觸媒使用時，相對於基質，試藥係使用0.001當量至1當量，較佳為0.01當量至0.2當量。試藥兼作反應溶劑時，試藥係使用溶劑量。

在各步驟之反應中，在沒有特別記載時，此等反應係在無溶劑中進行，或者是溶解或懸濁在適當的溶劑中進行。就溶劑之具體例而言，可列舉實施例所記載之溶劑，或者是下述者。

醇類：甲醇、乙醇、異丙醇、異丁醇、第三丁醇、2-甲氧基乙醇等；醚類：二乙基醚、二異丙基醚、二苯基醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷等；芳香族烴類：氯苯、甲苯、二甲苯等；飽和烴類：環己烷、己烷、庚烷等；醯胺類：N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮等；鹵化烴類：二氯甲烷、四氯化碳等；腈類：乙腈等；亞碸類：二甲亞碸等；芳香族有機鹼類：吡啶等；酸酐類：乙酸酐等；有機酸類：甲酸、乙酸、三氟乙酸等；無機酸類：鹽酸、硫酸等；酯類：乙酸乙酯、乙酸異丙酯等；酮類：丙酮、甲基乙基酮等；水。

上述溶劑可將二種以上以適當的比率混合使用。

在各步驟之反應中使用鹼時，可使用例如以下所示之鹼、或者是實施例所記載之鹼。

無機鹼類：氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂等； 鹼性鹽類：碳酸鈉、碳酸鈣、碳酸氫鈉等；有機鹼類：三乙基胺、二乙基胺、吡啶、4-二甲基胺基吡啶、N,N-二甲基苯胺、1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯、咪唑、哌啶等；金屬烷氧化物類：乙氧基鈉、第三丁氧基鉀、第三丁氧基鈉等；鹼金屬氫化物類：氫化鈉等；金屬胺類：胺化鈉、二異丙基胺化鋰、六甲基二矽胺化鋰等；有機鋰類：正丁基鋰、第二丁基鋰等。

在各步驟之反應中使用酸或酸性觸媒時，可使用例如以下所示之酸或酸性觸媒、或者是實施例所記載之酸或酸性觸媒。

無機酸類：鹽酸、硫酸、硝酸、氫溴酸、磷酸等；有機酸類：乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、對甲苯磺酸、10-樟腦磺酸等；路易士酸(Lewis acid)：三氟化硼二乙基醚錯合物、碘化鋅、無水氯化鋁、無水氯化鋅、無水氯化鐵等。

各步驟之反應在沒有特別記載的限制下，可以根據公知的方法進行，例如，第5版實驗化學講座，13卷至19卷(日本化學會編)；新實驗化學講座，14卷至15卷(日本化學會編)；精密有機化學改訂第2版(L.F.Tietze，Th.Eicher，南江堂)；改訂有機人名反應其工作原理要點(東鄉秀雄著，講談社)；ORGANIC SYNTHESES Collective Volume I至VII(John Wiley & SonsInc)；Modern Organic Synthesis in the Laboratory A Collection of Standard Experimental Procedures(Jie Jack Li著，OXFORD UNIVERSITY出版)；Comprehensive Heterocyclic Chemistry III,Vol.1至Vol.14(ELSEVIER JAPAN股份有限公司)；從人名反應中學習有機合成策略(富岡清監譯，化學同人發行)；Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc.)1989年刊等所記載之方法，或者是實施例所記載之方法。

在各步驟中，官能基的保護或去保護反應，係可以根據公知的方法進行，例如，Wiley-Interscience社2007年刊「Protective Groups in Organic Synthesis，4thEd.」(Theodora W.Greene，Peter G.M.Wuts著)；Thieme社2004年刊「Protecting Groups 3rdEd.」(P.J.Kocienski著)等所記載之方法，或者是實施例所記載之方法。

就醇等羥基或酚性羥基之保護基而言，例如，可列舉甲氧基甲基醚、苄基醚、p-甲氧基苄基醚、第三丁基二甲基矽基醚、第三丁基二苯基矽基醚、四氫吡喃基醚等醚型保護基；乙酸酯等羧酸酯型保護基；甲磺酸酯等磺酸酯型保護基；第三丁基碳酸酯等碳酸酯型保護基等。

就醛之羰基保護基而言，例如，可列舉二甲基縮醛等縮醛型保護基；環狀1,3-二

烷等環狀縮醛型保護基等。

就酮之羰基保護基而言，例如，可列舉二甲基縮酮等縮酮型保護基；環狀1,3-二

烷等環狀縮酮型保護基；O-甲基肟等肟型保護基；N,N-二甲基腙等腙型保護基等。

就羧基之保護基而言，例如，可列舉甲基酯等酯型保護基；N,N-二甲基醯胺等醯胺型保護基等。

就硫醇基之保護基而言，例如，可列舉苄基硫醚等醚型保護基；硫代乙酸酯、硫代碳酸酯、硫胺甲酸酯等酯型保護基等。

就胺基、咪唑、吡咯、吲哚等芳香族雜環之保護基而言，例如，可列舉苄基胺甲酸酯等胺甲酸酯型保護基；乙醯胺等醯胺型保護基；N-三苯基甲基胺等烷基胺型保護基、甲烷磺醯胺等磺醯胺型保護基等。

保護基之去除係可使用公知的方法進行，例如使用酸、鹼、紫外線、聯胺、苯基聯胺、N-甲基二硫代胺基甲酸鈉、四丁基銨氟化物、乙酸鈀、三烷基矽基鹵化物(例如，三甲基矽基碘化物、三甲基矽基溴化物)之方法或還原法等。

在各步驟中，進行還原反應時，就被使用之還原劑而言，可列舉氫化鋁鋰、三乙醯氧基硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二異丁基氫化鋁(DIBAL-H)、硼氫化鈉、四甲基三乙醯氧基硼氫化銨等金屬氫化物類；硼烷四氫呋喃錯合物等硼烷類；雷氏鎳(Raney nickel)；雷氏鈷(Raney cobalt)；氫；甲酸等。例如，在氫或甲酸存在下，可使用雷氏鎳或雷氏鈷。在還原碳-碳雙鍵或參鍵時，有使用鈀-碳或林德拉(Lindlar)觸媒等觸媒之方法。

在各步驟中，進行氧化反應時，就被使用之氧化劑而言，可列舉間氯過苯甲酸(MCPBA)、過氧化氫、第三丁基過氧化氫等過氧類；過氯酸四丁基銨等過氯酸鹽類；氯酸鈉等氯酸鹽類；亞氯酸鈉等亞氯酸鹽類；過碘酸鈉等過碘酸類；氧碘苯等高原子價碘試藥；二氧化錳、過錳酸鉀等具有錳之試藥；四乙酸鉛等鉛類；氯鉻酸吡啶鹽(PCC,Pyridinium chlorochromate)、重鉻酸吡啶鹽(PDC,Pyridinium dichromate)、瓊斯(Jones)試藥等具有鉻之試藥；N-溴代丁二醯亞胺(NBS,N-Bromosuccinimide)等鹵化合物類；氧；臭氧；三氧化硫黃‧吡啶錯合物；四氧化鋨；二氧化硒；2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)等。

在各步驟中，進行自由基環化反應時，就被使用之自由基起始劑而言，可列舉偶氮二異丁腈(AIBN)等偶氮化合物；4-4’-偶氮雙-4-氰基戊酸(ACPA)等水溶性自由基起始劑；在空氣或者是氧存在下之三乙基硼；過氧化苯甲醯等。再者，就被使用之自由基反應試劑而言，可列舉三丁基 錫烷、參(三甲基矽基矽烷)、1,1,2,2-四苯基二矽烷、二苯基矽烷、碘化釤等。

在各步驟中，進行威悌(Wittig)反應時，就被使用之威悌試藥而言，可舉出亞烷基正膦(Alkylidene phosphorane)類等。亞烷基正膦類係可藉由公知的方法，例如，使鏻鹽與強鹼反應而進行調製。

在各步驟中，進行霍納爾-埃蒙斯(Horner-Emmons)反應時，就被使用之試藥而言，可列舉二甲基膦醯基乙酸甲酯、二乙基膦醯基乙酸乙酯等膦醯基乙酸酯類；鹼金屬氫化物類、有機鋰類等鹼。

在各步驟中，進行傅-克(Friedel-Crafts)反應時，就被使用之試藥而言，可列舉路易士酸、醯氯或者是烷基化劑(例如，鹵化烷基類、醇、烯烴類等)。或者是，替代路易士酸，亦可使用有機酸或無機酸，替代醯氯，亦可使用乙酸酐等酸酐。

在各步驟中，進行芳香族親核取代反應時，就試藥而言，可使用親核劑(例如，胺類、咪唑等)及鹼(例如，鹼性鹽類、有機鹼類等)。

在各步驟中，進行由碳陰離子引起的親核加成反應、由碳陰離子引起的親核1,4-加成反應(邁克爾(Michael)加成反應)、或者是由碳陰離子引起之親核取代反應時，就為了產生碳陰離子所使用之鹼而言，可列舉有機鋰類、金屬烷氧化物類、無機鹼類、有機鹼類等。

在各步驟中，進行格利雅(Grignard)反應時，就格利雅試藥而言，可列舉苯基鎂溴化物等芳香基鎂鹵化物類；甲基鎂溴化物、異丙基鎂溴化物等烷基鎂鹵化物類。格利雅試藥係可藉由公知的方法，例如以醚或者是四氫呋喃作為溶劑，使鹵化烷基或鹵化芳香基、與金屬鎂反應而進行調製。

在各步驟中，進行克腦文蓋爾(Knoevenagel)縮合反應時，就試藥而言，可使用夾在兩個拉電子基團之活性亞甲基化合物(例如，丙二酸、丙二酸二乙酯、丙二腈等)及鹼(例如，有機鹼類、金屬烷氧化物類、無機鹼類)。

在各步驟中，進行維爾斯邁爾-哈克(Vilsmeier-Haack)反應時，就試藥而言，可使用氯化磷醯與醯胺衍生物(例如，N,N-二甲基甲醯胺等)。

在各步驟中，進行醇類、烷基鹵化物類、磺酸酯類的疊氮化反應時，就被使用之疊氮化劑而言，可列舉二苯基磷醯基疊氮化物(DPPA)、三甲基矽基疊氮化物、疊氮化鈉等。例如，醇類疊氮化時，有使用二苯基磷醯基疊氮化物與1,8-二氮雜雙環[5,4,0]十一-7-烯(DBU)之方法、使用三甲基矽基疊氮化物與路易士酸之方法等。

在各步驟中，進行還原性胺基化反應時，就被使用之還原劑而言，可列舉三乙醯氧基硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、氫、甲酸等。基質為胺化合物時，就被使用之羰基化合物而言，三聚甲醛以外，可列舉乙醛等醛類、環己酮等酮類。基質為羰基化合物時，就被使用之胺類而言，可列舉氨、甲基胺等1級胺；二甲基胺等2級胺等。

在各步驟中，進行光延反應時，就試藥而言，可使用偶氮二羧酸酯類(例如，偶氮二羧酸二乙基酯(DEAD)、偶氮二羧酸二異丙基酯(DIAD)等)及三苯基膦。

在各步驟中，進行酯化反應、醯胺化反應、或者是脲化反應時，就被使用之試藥而言，可列舉醯氯、醯溴等鹵化醯基物；酸酐、活性酯體、硫酸酯體等經活性化之羧酸類。就羧酸之活性化劑而言，可列舉：1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSCD)等碳二亞胺系縮合 劑；4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三

-2-基)-4-甲基嗎啉氯化物-n-水合物(DMT-MM)等三

系縮合劑；1,1-羰基二咪唑(CDI)等碳酸酯系縮合劑；二苯基磷酸疊氮化物(DPPA)；苯并三唑-1-基氧基-參二甲基胺基鏻鹽(BOP試藥)；碘化2-氯-1-甲基-吡啶(向山試藥)；亞硫醯氯；氯甲酸乙酯等氯甲酸低級烷基；O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)；硫酸；或者是該等的組合等。使用碳二亞胺系縮合劑時，亦可進一步在反應中添加1-羥基苯并三唑(HOBt)、N-羥基琥珀酸醯亞胺(HOSu)、二甲基胺基吡啶(DMAP)等添加劑。

在各步驟中，進行偶合反應時，就被使用之金屬觸媒而言，可列舉乙酸鈀(II)、四(三苯基膦)鈀(0)、二氯雙(三苯基膦)鈀(II)、二氯雙(三乙基膦)鈀(II)、參(二苯亞基丙酮)二鈀(0)、1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵氯化鈀(II)、乙酸鈀(II)等鈀化合物；四(三苯基膦)鎳(0)等鎳化合物；氯化參(三苯基膦)銠(III)等銠化合物；鈷化合物；氧化銅、碘化銅(I)等銅化合物；鉑化合物等。亦可進一步在反應中添加鹼，就如此之鹼而言，可列舉無機鹼類、鹼性鹽類等。

在各步驟中，進行硫羰基化反應時，就硫羰基化劑而言，代表性被使用的是五硫化二磷，除了五硫化二磷以外，亦可使用2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫雜二磷雜丁環-2,4-二硫醚(勞森(Lowesson)試藥)等具有1,3,2,4-二硫雜二磷雜丁環-2,4-二硫醚結構之試藥。

在各步驟中，進行沃爾-齊格勒(Wohl-Ziegler)反應時，就被使用之鹵化劑而言，可列舉N-碘琥珀酸醯亞胺、N-溴琥珀酸醯亞胺(NBS)、N-氯琥珀酸醯亞胺(NCS)、溴、磺醯氯等。進一步，藉由在反應中施加熱、光、過氧化苯甲醯、偶氮二異丁腈等自由基起始劑，可加速反應進行。

在各步驟中，進行羥基的鹵化反應時，就被使用之鹵化劑而言，可列舉鹵化氫酸與無機酸之酸鹵化物，具體而言，在氯化中，可列舉鹽酸、亞硫醯氯、氧氯化磷等，在溴化中，可列舉48%氫溴酸等。再者，亦可使用藉由三苯基膦與四氯化碳或四溴化碳等之作用，從醇獲得鹵化烷基物之方法。或者是，也可使用經過從醇變換成磺酸酯後，與溴化鋰、氯化鋰或碘化鈉反應如此之2階段的反應，而合成鹵化烷基物之方法。

在各步驟中，進行阿爾布佐夫(Arbuzov)反應時，就被使用之試藥而言，可列舉溴乙酸乙酯等鹵化烷基類；三乙基亞磷酸鹽或三(異丙基)亞磷酸鹽等亞磷酸鹽類。

在各步驟中，進行磺基酯化反應時，就被使用之磺化劑而言，可列舉甲磺醯氯、p-甲苯磺醯氯、甲磺酸酐、對甲苯磺酸酐、三氟甲磺酸酐等。

在各步驟中，進行水解時，就試藥而言，可使用酸或鹼。再者，進行第三丁基酯之酸水解反應時，為了還原性地捕捉副生成之第三丁基陽離子，可添加甲酸或三乙基矽烷等。

在各步驟中，進行脫水反應時，就被使用之脫水劑而言，可列舉硫酸、五氧化二磷、氧氯化磷、N,N’-二環己基碳二亞胺、氧化鋁、多磷酸等。

化合物(I)係可藉由例如下述的製法進行製造。化合物(I)之中，屬於波線的兩者皆成為順型鍵之化合物、及屬於波線的一者或兩者成為反型鍵之化合物皆可藉由與下述所示之製法同樣的製法進行製造。在本發明中，特別是在酯化之際，藉由使用對應作為目的之化合物(I)的結構之合適的原料，可合成具有期望結構之化合物(I)。再者，化合物(I)之鹽，係可藉由與無機鹼、有機鹼、有機酸、鹼性或酸性胺基酸合適地混合而獲得。

以下，記載關於含有本發明之化合物之脂質粒子、及含有該脂質粒子與嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或 RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸之組成物的製造方法。

本發明之脂質粒子，係可將本發明之化合物(陽離子性脂質)、與其他脂質成分混合後，藉由用以將脂質成分調製成脂質粒子之公知的方法進行製造。例如，可將上述(混合)脂質成分溶解於有機溶劑中，藉由將所得之有機溶劑溶液與水或者是緩衝液混合(例如，乳化法)，而製造成脂質粒子分散液。上述混合，係可使用微小流體混合系統(例如，NanoAssemblr裝置(Precision NanoSystems公司))進行。所得之脂質粒子，亦可施加脫鹽或者是透析及滅菌過濾。再者，因應所需亦可進行pH調整、滲透壓調整。

化合物(I)，係藉由式(I)之n、R及波線的定義組合，而可取得複數種結構。在脂質粒子的製造中，就化合物(I)而言，可單獨地使用具有特定結構之1種化合物，亦可使用具有不同結構之複數種化合物的混合物。

就「其他脂質成分」而言，可舉出如前述之結構脂質，例如，固醇類、磷脂質、聚乙二醇脂質。「其他脂質成分」，例如，相對於本發明之化合物1莫耳，使用0.008至4莫耳。本發明之化合物，較佳為與其他脂質成分(特別是，膽固醇、磷脂醯膽鹼及聚乙二醇脂質)混合使用。將本發明之化合物與其他脂質成分混合使用時的較佳態樣，係本發明之化合物1至4莫耳，固醇類0至3莫耳，磷脂質0至2莫耳及聚乙二醇脂質0至1莫耳的混合物。本發明之化合物與其他脂質成分混合使用時的更佳態樣，係本發明之化合物1至1.5莫耳，固醇類0至1.25莫耳，磷脂質0至0.5莫耳及聚乙二醇脂質0至0.125莫耳的混合物。

前述之有機溶劑溶液中的本發明之化合物，或者是本發明之化合物與其他脂質成分之混合物的濃度，較佳為0.5至100mg/mL。

就有機溶劑而言，例如，可列舉甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、第三丁醇、丙酮、乙腈、N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、或此等的混合物。有機溶劑亦可含有0至20%之水或者是緩衝液。

就緩衝液而言，可列舉：酸性緩衝液(例如，乙酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、2-N-嗎啉基乙烷磺酸(MES)緩衝液、磷酸緩衝液)、中性緩衝液(例如，4-(2-羥基乙基)-1-哌

乙烷磺酸(HEPES)緩衝液、參(羥基甲基)胺基甲烷(Tris)緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS))。

使用微小流體混合系統進行混合時，較佳為相對於有機溶劑溶液1容積份，混合水或者是緩衝液1至5容積份。再者，在該系統中，混合液(有機溶劑溶液與水或者是緩衝液之混合液)流速，較佳為0.1至10mL/min，溫度較佳為15至45℃。

本發明之組成物，係在製造脂質粒子或脂質粒子分散液之際，在水或者是緩衝液中添加作為活性成分之核苷酸(例如，嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸)並使其含有，藉此，可製造成含有活性成分之脂質粒子分散液。活性成分，較佳為以使水或者是緩衝液中之活性成分的濃度成為0.05至2.0mg/mL之方式進行添加。在本說明書中，有將含有活性成分之水或者是緩衝液，記載為「含有活性成分(嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸)之水溶液」之情形。

製造含有作為活性成分之2種或2種以上嚮導RNA的本發明之組成物時，在該組成物之製造中，較佳為使用含有2種或2種以上嚮導RNA之水溶液。

再者，本發明之組成物，亦可藉由將脂質粒子或脂質粒子分散液、與活性成分或其水溶液，利用公知的方法進行混合，而製造成含有活性成分之脂質粒子分散液。脂質粒子分散液，係可藉由使脂質粒子分散在適當的分散媒介中而進行調製。再者，活性成分的水溶液，係可藉由將活性成分溶解在適當的溶劑中而進行調製。

分散媒介及溶劑除外之本發明之組成物中的本發明之化合物的含量，較佳為40至70重量%。

分散媒介及溶劑除外之本發明之組成物中的活性成分的含量，較佳為1至20重量%。

脂質粒子分散液或含有組成物之分散液的分散媒介，係可藉由進行透析而置換成水或緩衝液。在透析中，使用分劃分子量10至20K之超濾膜，在4℃至室溫實施。亦可重複地進行透析。在分散媒介的置換中，亦可使用切向流過濾(TFF,Tangential Flow Filtration)。再者，分散媒介的置換後，亦可因應所需進行pH調整、滲透壓調整。

以下，記載關於含有本發明之化合物之脂質粒子、及含有該脂質粒子與嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸之組成物的分析方法。

(組成物中之)脂質粒子的粒徑，係可藉由公知的方法進行測定。例如，可使用基於NIBS(非侵入性後方散射)技術之粒徑測定裝置，Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，藉由自相關函數之累積量解析 作為Z平均粒徑而計算出。(組成物中之)脂質粒子的粒徑(平均粒徑)較佳為10至200nm。

本發明之組成物中之作為活性成分的核酸(具體而言，嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸)之濃度及內封率，係可藉由公知的方法進行測定。例如，使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Invitrogen)進行核酸螢光標識，藉由測定其螢光強度而可求取濃度及內封率。組成物中之核酸之濃度，係可利用從已知濃度的核酸水溶液所作成之標準曲線而計算出，內封率，係可以藉由有無添加Triton-X100(用以使脂質粒子崩壞之界面活性劑)所致之螢光強度的不同為基準而計算出。此外，組成物中之濃度，係指被內封於脂質粒子中的核酸及未被內封之核酸的合計濃度，內封率係指組成物中，在核酸全體之中內封有脂質粒子者的比率。

以下，針對本發明之組成物之用途進行說明。

本發明之組成物係可使用在改變細胞中之標的基因座的方法，該方法包含使本發明之組成物與細胞接觸之步驟。藉由如此之方法，可獲得標的基因座經改變之細胞。

在一實施形態中，本發明之組成物係可為了製造包含本發明之組成物之醫藥而使用。換言之，本發明之組成物係可作為醫藥進行調製或製劑化。

在本發明之一較佳實施形態中，醫藥係肌肉萎縮蛋白異常症(例如，肌肉萎縮症(裘馨(Duchenne)型肌肉萎縮症)、肌肉萎縮蛋白基因關連擴張型心肌症)之預防/治療藥、或修復型肌肉萎縮蛋白產生藥。換言之，在本發明之一較佳實施形態中，本發明之組成物，係藉由投予其有效量， 而使用在用以預防/治療哺乳動物中之肌肉萎縮蛋白異常症(例如，肌肉萎縮症(例如，裘馨型肌肉萎縮症，貝克(Becker)型肌肉萎縮症)、肌肉萎縮蛋白基因關連擴張型心肌症)的方法(特別是，用以預防/治療裘馨型肌肉萎縮症的方法)中、或產生修復型肌肉萎縮蛋白之方法中。

所謂肌肉萎縮症，係定義為「以骨骼肌之變性、壞死為主要病變，在臨床上觀察到進行性肌肉能力降低下之遺傳性疾病」。在肌肉萎縮症之中，已知有裘馨型肌肉萎縮症、貝克(Becker)型肌肉萎縮症、艾梅氏型肌肉萎縮症、肢帶型肌肉萎縮症、先天性肌肉萎縮症、三好型肌肉萎縮症、遠端型肌肉萎縮症、顏面肩胛肱骨型肌肉萎縮症、以及肌強直性肌肉萎縮症等。

所謂肌肉萎縮蛋白異常症，係指以肌肉萎縮蛋白基因變異為原因，而由功能缺損型或功能異常型肌肉萎縮蛋白質所引起之各種疾病。包含裘馨型肌肉萎縮症、貝克型肌肉萎縮症、及肌肉萎縮蛋白基因關連擴張型心肌症等。以骨骼肌障礙為主要症狀的情形較多場合，惟，亦存在沒有見到骨骼肌症狀之案例。亦有伴隨著高CK血症、肌球蛋白尿症、擴張型心肌症、認知功能障礙等之情形。

裘馨型肌肉萎縮症係小兒的肌肉萎縮症之中最多患者數著疾病，疾病盛行率係每10萬人口中有4至5名。以進行性的肌肉萎縮為主要症狀，原因係X染色體上之肌肉萎縮蛋白基因由於變異而成為功能不全。在裘馨型肌肉萎縮症中，一半以上的患者具有單一、或複數個外顯子的缺損。由於肌肉萎縮蛋白基因變異導致蛋白質產生讀框偏移，而在途中出現終止密碼子，致使肌肉萎縮蛋白質無法合成而導致引起一連串的症狀。

在本說明書中，所謂修復型肌肉萎縮蛋白，係指基因體編集的結果，表現經回復的肌肉萎縮蛋白。特別是指針對具有框移變異或無意 義變異之肌肉萎縮蛋白基因，藉由使用基因體編集而使表現回復之保持有N末端之肌動蛋白結合域、及C末端之高半胱胺酸結構域的肌肉萎縮蛋白質。由於外顯子的重複而產生框移變異之情形，藉由基因體編集而跳讀該重複外顯子之一者時，亦可有使與正常型具有100%相同性之修復型肌肉萎縮蛋白的表現回復之情形。就修復型肌肉萎縮蛋白而言，特別是指，在缺失外顯子44之人類肌肉萎縮蛋白基因中，從外顯子45被跳讀，而外顯子43與外顯子46連結成的mRNA轉譯出之人類肌肉萎縮蛋白。在其他之中，例如，在缺失外顯子12-44、18-44、46-47、46-48、46-49、46-51、46-53、或46-55之人類肌肉萎縮蛋白基因中，藉由分別跳讀預定的外顯子而被產生之人類肌肉萎縮蛋白亦被包含在修復型肌肉萎縮蛋白中，惟，修復型肌肉萎縮蛋白不是限定為該等者。藉由使用本發明之組成物是否可產生修復型肌肉萎縮蛋白，係例如將細胞內之編碼修復型肌肉萎縮蛋白的mRNA利用PCR而檢測出，藉此而可進行確認。或者是，亦可使用辨識肌肉萎縮蛋白質之抗體並進行西方墨漬法，而從肌肉萎縮蛋白質之分子量進行確認。

在一實施形態中，本發明之組成物，係可使用在標的基因座經改變之細胞的製造方法，該製造方法包含使本發明之組成物與細胞接觸之步驟。

在一實施形態中，本發明之組成物，係可使用在標的基因座經改變之非人類哺乳動物的製作方法，該製造方法包含：(1)使本發明之組成物與非人類哺乳動物之受精卵、胚胎幹細胞或者是卵母細胞接觸之步驟、(2)選擇標的基因座經改變之前述受精卵、胚胎幹細胞或者是卵母細胞之步驟、及(3)將前述被選擇之受精卵、胚胎幹細胞或者是卵母細胞移植至非人類哺乳動物的雌性動物之步驟。

在步驟(1)中，與本發明之組成物接觸之細胞，係除了上述細胞以外，亦可設為例如，iPS細胞等多能性幹細胞、精子幹細胞及原胚生殖細胞等生殖細胞。

步驟(2)中之選擇，係可藉由利用藥劑耐性基因之CRISPR系統中之一般性篩選方法進行，亦可藉由PCR及定序確認而進行。例如，使敲入用或剔除用之載體中含有藥劑耐性基因表現單元，在藉由CRISPR系統針對標的基因座而產生敲入或剔除之受精卵等中，使藥劑耐性基因表現後，將細胞集團藉由藥劑處理，而可選擇標的基因座經改變之受精卵等。

在如上述之本發明的各種方法、醫藥、用途所述之實施形態中，被使用之「組成物」的詳細內容係如前述，例如，組成物所含有之嚮導RNA等、RNA誘導型核酸酶等，細胞、標的基因座的詳細內容及較佳實施形態，亦與使用該組成物之方法、醫藥、用途等所述之發明相同。

本發明之醫藥，係較佳可作成靜脈內注射、動脈內注射、肌肉內注射、皮下注射、腹腔內注射等注射劑，惟，若為即使藉由其他路徑亦可將有效量的活性成分送達至目標細胞，則亦可將該醫藥作成適應之劑型。就注射劑

而言，較佳為靜脈內注射或肌肉內注射。

本發明之醫藥，除了本發明之組成物以外，亦可因應所需而含有製藥學上可容許之物質，例如，作為注射劑進行調製時，可含有注射用水、溶劑、添加劑等。本發明之醫藥中的活性成分之量或濃度，係以獲得期望的預防或治療效果而以可將有效量之活性成分送達至作為目的之細胞之方式，可一邊考量劑型、投予路徑、每1次的投予量、一定期間中之投予次數等，一邊進行適當的調整。就投予路徑而言，較佳為靜脈內(全身)投予或肌肉內投予。

本發明中所謂進行「治療」，係指改變疾病已經發作之對象的生體內(組織中或臟器中)之一定比率的細胞中之標的基因座中的基因，將成為疾病原因之基因的鹼基序列之異常進行修復。再者，所謂進行「預防」，係指改變疾病或症狀尚未發作之對象的生體內(組織中或臟器中)之一定比率的細胞中之標的基因座中的基因，將可成為疾病原因之基因的鹼基序列進行修復。

就成為上述疾病原因之基因的鹼基序列之異常而言，可舉出例如，如與疾病相關連之基因變異(例如，在裘馨型肌肉萎縮症的一部份患者中可觀察到的外顯子44之缺損)。針對沒有進行肌肉萎縮蛋白的產生之外顯子44缺損型裘馨型肌肉萎縮症患者，藉由投予本發明之組成物，而誘導修復型肌肉萎縮蛋白的產生(有被稱為肌肉萎縮蛋白的回復之情形)，其結果，可治療/預防該疾病。

組織中或臟器中之基因被改變之細胞的比率(基因之改變效率)、疾病症狀的回復、緩和、發生的延遲或防止、進行的抑制等的程度，並不是被一律規定者。

就肌肉萎縮症之症狀而言，不是被限定者，可包含肌力低下、肌肉萎縮、運動能力降低、步行障礙、心肌疾病等。肌肉萎縮症之治療包含此等症狀的改善、發作或者是進行的延遲等。

藉由判定是否對肌肉萎縮症之發作、進行或症狀造成影響，而可評估肌肉萎縮症的治療效果。更具體而言，例如，藉由測定對象的肌肉重量、肌肉剖面積、單離骨骼肌的張力、肌力(例如握力)、運動能力(例如，履帶運動能力)等，而可確認肌肉萎縮症的治療效果。

[實施例]

本發明係進一步藉由下述實施例、試驗例及製劑例而更詳細地說明，惟，該等不是限定本發明者，再者，在不脫離本發明之範圍內亦可進行變化。

在下述實施例中之「室溫」通常係指約10℃至約35℃。在混合溶劑中所示之比，在沒有特別說明的限制下，表示容量比。%在沒有特別說明的限制下，表示重量%。

實施例之管柱色層分析法中之溶出，在沒有特別提及之限制下，係在利用TLC(Thin Layer Chromatography，薄層色層分析法)之觀察下進行。在TLC觀察中，使用默克(Merck)公司製之60 F254作為TLC片，使用在管柱色層分析法中作為溶出溶劑所使用之溶劑作為展開溶劑。再者，在檢測中採用UV檢測器，並且因應所需使用TLC發色試藥進行觀察。在矽膠管柱色層分析法中，記載為NH時使用胺基丙基矽烷結合矽膠，記載為Diol時使用3-(2,3-二羥基丙氧基)丙基矽烷結合矽膠。在分取HPLC(高速液體色層分析法)中，記載為C18時使用十八烷基結合矽膠。溶出溶劑中所示之比，在沒有特別說明的限制下，表示容量比。

¹H NMR係利用傅立葉(Fourier)變換型NMR進行測定。在¹H NMR的解析中，使用ACD/SpecManager(商品名)軟體等。針對羥基或胺基等質子峰為非常平緩的峰，係有沒有記載之情形。

MS係藉由LC/MS及MALDI/TOFMS進行測定。就離子化法而言，採用ESI法、APCI法、或MALDI法。使用CHCA作為基質。數據係記載實測值(found)。通常，被觀測之分子離子峰有作為片段離子被觀測到之情形。鹽之情形，通常係以自由體的分子離子峰、陽離子種、陰離子種或者是片段離子峰被觀測到。

在下述實施例中使用下述的簡稱。

MS：質譜

M：莫耳濃度

N：當量濃度(normality)

CDCl₃：氘代氯仿

DMSO-d₆：氘代二甲基亞碸

¹H NMR：質子核磁共振

LC/MS：液體層析質量分析計

ESI：electrospray ionization，電噴灑離子化

APCI：atmospheric pressure chemical ionization，大氣壓化學離子化

MALDI：Matrix-assisted laser desorption/ionization，基質輔助雷射脫除/離子化

TOFMS：Time-of-flight mass spectrometry，飛行時間型質量分析

CHCA：α-氰基-4-羥基桂皮酸

DMF：N,N-二甲基甲醯胺

THF：四氫呋喃

DMAP：4-二甲基胺基吡啶

TBAF：四丁基銨氟化物

[合成例1](9Z)-十四碳-9-烯酸3-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)-2,2-雙(((9Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙基酯

A)2-(((第三丁基二甲基矽基)氧基)甲基)-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇

在2,2-雙(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇(5.45g)、1H-咪唑(2.72g)及DMF(190mL)之混合物中，將第三丁基氯二甲基矽烷(3.01g)之DMF(10mL)溶液在室溫添加。攪拌24小時後，將反應混合物在減壓下濃縮。將殘渣利用乙酸乙酯稀釋，以水3次、飽和食鹽水1次進行洗淨後，利用無水硫酸 鈉乾燥，將溶劑在減壓下餾除。將殘渣利用矽膠管柱色層分析法(乙酸乙酯/己烷)精製而獲得標題化合物(2.25g)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 0.08(6H,s),0.90(9H,s),2.53(3H,t,J=5.5Hz),3.66(2H,s),3.73(6H,d,J=5.5Hz)

B)(9Z)-十四碳-9-烯酸3-((第三丁基(二甲基)矽基)氧基)-2,2-雙(((9Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙基酯

在2-(((第三丁基二甲基矽基)氧基)甲基)-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇(258mg)、(9Z)-十四碳-9-烯酸(769mg)及DMAP(126mg)之DMF(3mL)溶液中，將1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(790mg)在室溫添加。攪拌18小時後，將反應混合物利用乙酸乙酯稀釋，以水2次、飽和食鹽水1次洗淨後，利用無水硫酸鈉乾燥，將溶劑在減壓下餾除。將殘渣利用矽膠管柱色層分析法(NH，乙酸乙酯/己烷)精製而獲得標題化合物(860mg)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 0.03(6H,s),0.81-0.96(18H,m),1.18-1.41(36H,m),1.53-1.67(6H,m),1.91-2.10(12H,m),2.29(6H,t,J=7.6Hz),3.58(2H,s),4.08(6H,s),5.27-5.43(6H,m)

C)(9Z)-十四碳-9-烯酸3-羥基-2,2-雙(((9Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙基酯

在(9Z)-十四碳-9-烯酸3-((第三丁基(二甲基)矽基)氧基)-2,2-雙(((9Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙基酯(5.91g)之THF(120mL)溶液中，將TBAF之THF溶液(1M,14.85mL)與乙酸(4.91mL)的混合物在室溫添加。攪拌3日後，將反應混合物在減壓下濃縮。將殘渣利用乙酸乙酯稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液1次，飽和食鹽水1次洗淨後，利用無水硫酸鈉乾燥， 將溶劑在減壓下進行餾除。將殘渣利用矽膠管柱色層分析法(乙酸乙酯/己烷)精製而獲得標題化合物(4.96g)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 0.82-0.97(9H,m),1.16-1.42(36H,m),1.52-1.68(6H,m),1.90-2.12(12H,m),2.32(6H,t,J=7.6Hz),2.52(1H,t,J=7.0Hz),3.49(2H,d,J=7.0Hz),4.11(6H,s),5.26-5.42(6H,m)

D)(9Z)-十四碳-9-烯酸3-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)-2,2-雙(((9Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙基酯

在(9Z)-十四碳-9-烯酸3-羥基-2,2-雙(((9Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙基酯(4.96g)、DMAP(796mg)及4-(二甲基胺基)丁酸鹽酸鹽(2.19g)之DMF(20mL)溶液中，將1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(2.50g)在室溫添加。攪拌18小時後，將反應混合物利用乙酸乙酯稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液1次、飽和食鹽水1次洗淨後，利用無水硫酸鈉乾燥，將溶劑在減壓下餾除。將殘渣利用矽膠管柱色層分析法(NH，乙酸乙酯/己烷)精製而獲得標題化合物(5.31g)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 0.82-0.94(9H,m),1.20-1.42(36H,m),1.50-1.66(6H,m),1.69-1.83(2H,m),1.90-2.10(12H,m),2.20(6H,s),2.23-2.41(10H,m),4.11(8H,s),5.23-5.44(6H,m)

在下述實施例所用之MmRosa26 sgRNA(序列編號9)及2種HsDMDEx45 sgRNA(HsDMDEx45 # 1 sgRNA及HsDMDEx45 # 23 sgRNA，分別對應前述序列編號1及2)的鹼基序列係如下述。

[實施例1]C57BL/6J小鼠中之使用MmRosa26 sgRNA的DNA變異導入效率評估

[1-1]Cas9 mRNA-LNP之調製

將脂質混合物(合成例1所得之陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28.7：0.7，莫耳比)溶解在90% EtOH、10%無RNase水中，而獲得6.9mg/mL之脂質溶。將Cas9 mRNA(TriLink Bio Technologies)溶解在pH5.5之10mM 2-MES溶液中，而獲得0.15mg/mL之核酸溶液。將所得之脂質溶液及核酸溶液，在室溫，藉由NanoAssemblr(Precision NanoSystems)，以流速比2.7mL/min：5.3mL/min進行混合，而獲得含有將核酸內封之脂質粒子的分散液。所得之分散液係使用Slyde-A-Lyzer(20k的分劃分子量，Thermo scientific)，針對水以4℃、1小時，針對PBS以4℃、18小時進行透析。進一步，使用Amicon(30k的分劃分子量)離心(3,000×g，4℃，至沉積成一定體積為止進行複數次20分鐘離心)，進行利用超過濾之濃縮。接著，使用0.2μm之注射器過濾器(syringe filter)(Iwaki)進行過濾 器過濾，並保存在4℃。將進行如此施作而調製成的分散液作為「Cas9 mRNA-LNP」，並在後述試驗中使用。脂質粒子之粒徑及多分散指數(PDI)係藉由Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)進行測定。再者，脂質粒子中之核酸的濃度及內封率係使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Thermo scientific)進行測定。測定結果示於表2。

[1-2]MmRosa26 sgRNA-LNP之調製

將脂質混合物(在合成例1所得之陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28.7：0.7，莫耳比)溶解在90% EtOH、10%無RNase水中，而獲得6.9mg/mL之脂質溶液。將MmRosa26 sgRNA(GeneDesign，參照前述表1)溶解在pH5.5之10mM 2-MES溶液中，而獲得0.15mg/mL之核酸溶液。將所得之脂質溶液及核酸溶液，在室溫，藉由NanoAssemblr(Precision NanoSystems)，以流速比2.7mL/min：5.3mL/min進行混合，而獲得將核酸內封之脂質粒子的分散液。所得之分散液，係使用Slyde-A-Lyzer(20k之分劃分子量，Thermo scientific)，針對水以4℃、1小時，針對PBS以4℃、18小時進行透析。進一步，使用Amicon(30k之分劃分子量)離心(3,000×g，4℃，至沉積成一定體積為止進行複數次20分鐘離心)，進行利用超過濾之濃縮。接著，使用0.2μm之注射器過濾器(syringe filter)(Iwaki)進行過濾器過濾，並保存在4℃。將進行如此施作而調製成的分散液作為「MmRosa26 sgRNA-LNP」，並在後述試驗中使用。脂質粒子之粒徑及多分散指數(PDI)係藉由Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)進行測定。再者，脂質粒子中之核酸的濃度及內封率係使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Thermo scientific)進行測定。測定結果示於表2。

[1-3]C57BL/6J小鼠中之使用MmRosa26 sgRNA之DNA變異導入效率評估

在9週齡之雄性C57BL/6J小鼠(日本CLEA)之右下肢腓腸肌中，投予MmRosa26 sgRNA-LNP及Cas9 mRNA-LNP之混合溶液(以使以sgRNA及mRNA計之投予量一起成為0.01、0.03、0.1、0.3或1μg/小鼠之方式，將各別的LNP分散液進行混合而調製成者)、或PBS。投予4日後，在3.5%異氟醚麻醉下利用斷頭放血使其安樂死後，取出骨骼肌並且利用液態氮使該骨骼肌迅速地凍結。使用QIAamp快速DNA組織套組(Fast DNA Tissue Kit)(Qiagen)從凍結肌肉組織進行基因體DNA的萃取精製，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(DNA polymerase)(TAKARA)，進行PCR(前置引子(Forward primer)：序列編號10，反置引子(Reverse primer)：序列編號11)。將PCR產物利用QIAquick PCR純化套組(purification kit)(QIAGEN)精製，利用T7內核酸酶(Endonuclease)I(NEB)進行處理後，使用Agilent 4200 TapeStation(Agilent)進行解析。結果示於第1圖。

序列編號10 5'-CTCCGAGGCGGATCACAAGCAATAATAACCTGTAG-3'

序列編號11 5'-TGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAG-3'

[實施例2]人類DMD外顯子45敲入-小鼠Dmd外顯子44剔除小鼠中之使用HsDMDEx45 # 1 sgRNA的DNA變異導入活性、外顯子跳讀效果及修復型肌肉萎縮蛋白表現效果

[2-1]Cas9 mRNA-LNP之調製

藉由實施例1之[1-1]所記載之步驟再度調製Cas9 mRNA-LNP，測定核酸濃度、內封率、粒徑及PDI。測定結果示於表3。

[2-2]HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP之調製

將脂質混合物(在合成例1所製造之陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28.7：0.7，莫耳比)溶解在90% EtOH、10%無RNase水中，而獲得6.9mg/mL之脂質溶液。將HsDMDEx45 # 1 sgRNA(GeneDesign，參照前述表1)溶解在10mM 2-N-嗎啉基乙烷磺酸(MES)溶液pH5.5中，而獲得0.15mg/mL之核酸溶液。將所得之脂質溶液及核苷酸溶液，在室溫，藉由NanoAssemblr(Precision NanoSystems)，以流速比2.7mL/min：5.3mL/min進行混合，而獲得將核酸內封之脂質粒子的分散液。所得之分散液，係使用Slyde-A-Lyzer(20k之分劃分子量，Thermo scientific)，針對水以4℃、1小時，針對PBS以4℃、18小時進行透析。進一步，使用Amicon(30k之分劃分子量)離心(3,000×g，4℃，至沉積成一定體積為止進行複數次20分鐘離心)，進行利用超過濾之濃縮。接著，使用0.2μm之注射器過濾器(syringe filter)(Iwaki)進行過濾器過濾，並保存在4℃。將進行如此施作而調製成的分散液作為「HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP」，並在後述試驗中使用。脂質粒子之粒徑及多分散指數(PDI)係藉由Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)進行測定。再者，脂質粒子中之核酸的濃度 及內封率係使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Thermo scientific)進行測定。測定結果示於表3。

[2-3]人類DMD外顯子45敲入-小鼠Dmd外顯子44剔除小鼠之製作方法

將由10μg之含有人類DMD外顯子45及該外顯子45之5’側0.7kb、3’側0.6kb之序列1.5kb、以FRT序列夾住之新黴素(Neomycin)耐性基因表現單元及源自小鼠Dmd內含子44及內含子45之序列各1.5kb所構成的敲入載體、與2.5μg之pCAG-Cas9表現載體及2種之2.5μg之pU6-sgRNA表現載體(標的序列；序列編號12及序列編號13)一起，對5×10⁵個之源自C57BL/6J小鼠之ES細胞進行電穿孔，藉由PCR及定序確認選拔出經重組的細胞株。藉由Flpe(內翻轉酶)處理去除新黴素耐性單元後，將該ES細胞株顯微注入至ICR小鼠之4倍體胚盤胞，取得嵌合小鼠。藉由嵌合小鼠與雌性C57BL/6J小鼠之體外受精，取得雌性人類DMD外顯子45異合子(hetero)敲入小鼠。接著，對雄性C57BL/6J小鼠與雌性人類DMD外顯子45異合子敲入小鼠之受精卵，顯微注入100ng/μL之Cas9 mRNA(TriLink BioTechnologies)、2種之小鼠Dmd外顯子44剔除用sgRNA(標的序列；序列編號14及序列編號15，FASMAC股份有限公司)及ssODN 50ng/μL(序列編號16，Eurofins Genomics股份有限公司)，針對所得之雄性子代，進行利用PCR及定序確認之基因判定，而選拔出人類DMD外顯子45敲入-小鼠Dmd外顯子44剔除小鼠。

序列編號12 5’-atgaatgtgcctacatatgg-3’

序列編號13 5’-catagcatgcatttggcttc-3’

序列編號14 5’-gaatgaggtagtgttgtagg-3’

序列編號15 5’-gcaggaaatcatcttatagc-3’

序列編號16 5’-gagcaagctgggttagaacaaaggtctgtcagagtcagcatgggaatgaggtagtgttgtagcaggaaatagtgtggtttaggtctctccccgccctctgtgtatgtgtgtgtgtgtgtt-3’

[2-4]骨骼肌中之DNA變異導入效率評估

對12週齡之雄性人類DMD外顯子45敲入-小鼠Dmd外顯子44剔除小鼠之右下肢腓腸肌，將3μg之內封有HsDMD Ex45 # 1 sgRNA之LNP及3μg之內封有SpCas9 mRNA之LNP([2-1]之Cas9 mRNA-LNP與[2-2]之HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP之混合溶液)，對左下肢腓腸肌將PBS，分別進行6次/2週之投予。從初次投予開始至56日後，在3.5%異氟醚麻醉下使小鼠安樂死後，取出骨骼肌並且利用液態氮使該骨骼肌迅速地凍結。將凍結肌肉組織利用含有3%蛋白酶抑制劑雞尾酒(protenase inhibitor cocktail)(Sgima)與5mM EDTA(WAKO)之RIPA緩衝液(buffer)(WAKO)進行均質 化後，使用QIAamp快速DNA組織套組(Fast DNA Tissue Kit)(Qiagen)抽取精製基因體DNA，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(DNA polymerase)(TAKARA)與序列編號17(前置引子)及序列編號18(反置引子)之引子對(primer set)擴增。PCR產物利用QIAquick PCR純化套組(purification kit)(QIAGEN)精製，在再度降溫黏合(annealing)後利用T7內核酸酶I(NEB)處理，使用Agilent 4200 TapeStation(Agilent)電泳，利用附屬之軟體解析。使用所得之數值，利用下述之計算式(數式1)求出變異導入效率。

序列編號17 5’-CAAGTTTAAAATAGCAGAAAACCACTAACTAGCCA-3’

序列編號18 5’-CTGACACATAAAAGGTGTCTTTCTGTCTTGTATCC-3’

其結果，如第2圖所示，相對於PBS投予，在經投予LNP之骨骼肌檢測出特定的DNA之切斷，變異導入效率係5.84±2.15%(Mean±SD)。

[2-5]骨骼肌中之外顯子跳讀效率評估

均質物(Homogenate)之一部份中添加QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN)及氯仿(WAKO)，在混合、離心後，將含有RNA之水槽分離回收，使用RNeasy迷你套組(RNeasy Mini Kit)(QIAGEN)，抽取精製總RNA(Total RNA)。總RNA使用高容量RNA至DNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA kit)(Thermo)逆轉錄，接著，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(DNA polymerase)(TAKARA)與序列編號19(前置引子)及序列編號20(反置引子)之引子對(primer set)擴增。PCR產物利用QIAquick PCR純化套組(purification kit)(QIAGEN)精製後，使用Agilent 4200 TapeStation(Agilent)電泳，利用附屬之軟體進行解析。使用所得之數值，利用下述之計算式(數式2)求出外顯子跳讀效率(exon skipping efficiency)。

序列編號19 5’-GGTGAAAGTACAGGAAGCCGT-3’

序列編號20 5’-TTAGCTGCTGCTCATCTCCAA-3’

[數式2]外顯子跳讀效率(exon skipping efficiency)=100 x b/(a+b)a：未跳讀之產物條帶的峰面積b：已跳讀之產物條帶的峰面積

其結果，如第3圖所示，相對於PBS投予，在經投予LNP之骨骼肌中，檢測出人類外顯子45(human Exon 45)經跳讀(skip)後之較短的PCR產物，其效率係5.07±2.59%(Mean±SD)。

[2-6]骨骼肌中之肌肉萎縮蛋白回復之評估

將均質物之一部份離心，回收上清液。上清中之總蛋白質量利用蛋白質分析套組(Protein assay kit)(Thermo)測定，並調整為0.02μg/uL及3μg/uL。

Gapdh檢測出：在調整成0.02μg/μL之上清液中添加含有還原劑(Thermo)之試樣緩衝液(Sample buffer)(Bio-Rad)，在98℃進行10分鐘處理。將0.2μg/10μL之經還原、熱處理之樣品液添加至TGX ANY KD凝 膠(Bio-Rad)，以200V電泳30分鐘。電泳結束後，使用Trasblot渦輪系統(Trasblot turbo system)(Bio-Rad)轉印至PVDF膜。轉印後之PVDF膜利用iBind溶液(iBind Solution)(Thermo)封阻5分鐘，繼續使用iBind系統(iBind system)(Themo)，藉由利用稀釋液(TOYOBO)稀釋後之抗GAPDH抗體(1：2000，Cell Signaling)及經HRP標識之抗兔子IgG抗體(1：5000，GE)進行印漬(blotting)。印漬結束後之PVDF膜利用蒸餾水洗淨，在ECL Prime西方墨漬檢測試劑(Western Blotting Detection Reagen)(GE)中浸約5分鐘，利用ChemiDoc(Bio-Rad)進行檢測。

肌肉萎縮蛋白檢測：在調整成3μg/μL之上清液中添加含有還原劑(Thermo)之試樣緩衝液(Sample buffer)(Thermo)，在70℃進行10分鐘處理。將30μg/10μL的經還原、熱處理之樣品液添加至3-8%的三羥甲基胺基甲烷乙酸酯(Tris-Acetate)凝膠(Thermo)，以150V電泳約90分鐘。電泳結束後，使用Trasblot渦輪系統(Bio-Rad)轉印至PVDF膜。經轉印之PVDF膜利用iBind溶液(Thermo)封阻5分鐘，繼續使用iBind系統(Thermo)，藉由利用稀釋液(TOYOBO)稀釋後之抗肌肉萎縮蛋白抗體(1：2000，abcam)與經HRP標識之抗兔子IgG抗體(1：5000，GE)進行印漬。印漬結束後之PVDF膜利用蒸餾水洗淨，在ECL Select西方墨漬檢測試劑(Western Blotting Detection Reagen)(GE)浸約5分鐘，利用Imager(Bio-Rad)進行檢測。

將在ChemiDoc檢測出之Gapdh及肌肉萎縮蛋白利用Image Lab軟體(Bio-Rad)解析，計算出作為修復型肌肉萎縮蛋白/Gapdh之相對表現量。以上之結果示於第4圖。相對於PBS投予群，在LNP投予群中確認到顯著的肌肉萎縮蛋白之表現。

[實施例3]使用源自人類iPS細胞之肌原細胞中之HsDMDEx45 sgRNA的DNA變異導入效率及外顯子跳讀效率(其之1)

[3-1]Cas9 mRNA-LNP之調製

利用實施例1之[1-1]所記載之步驟再度調製Cas9 mRNA-LNP，測定核酸濃度、內封率、粒徑及PDI。將測定結果示於表4。

[3-2]HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP之調製

再度使用實施例2之[2-2]中所製作之HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP。將實施例2時之測定結果再度記載於表4。

[3-3]人類iPS細胞之肌肉分化與LNP之導入

將含有去氧羥四環素(Doxycycline)誘導型MyoD表現卡匣之源自肌肉萎縮蛋白Ex 45缺損DMD患者之人類iPS細胞，懸濁於含有10μM Y-27632之AK02N培養基(Ajinomoto)中，在塗佈有基底膠(Matrigel)之6孔盤(6 well plat)中以3×10⁵cells/well之密度播種。翌日，將培養基交換成Primate ES細胞培養基(Cell Medium)(Reprocell)，進一步，在其翌日，藉由交換成含有1μg/mL去氧羥四環素之Primate ES細胞培養基，而開始MyoD基因表現誘導。從添加去氧羥四環素24小時後，交換成含有5% KSR及1μg/mL去氧羥四環素之α基本成分培養基(alpha Minimal Essential Medium)(SIGMA)培養基，培養3日。將培養基減少至700μL，添加Cas9 mRNA-LNP(以mRNA計，1、3或10μg/well)及HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP(以sgRNA計，1、3、 10μg/well)之混合物。在添加6小時後，添加1.3mL之培養基(α基本成分培養基(alpha Minimal Essential Medium)、5% KSR，1μg/mL去氧羥四環素)。

[3-4]源自人類iPS細胞之肌原細胞中的DNA變異導入效率評估

從添加LNP72小時後，將細胞回收，使用QIAamp DNA迷你套組(mini kit)(Qiagen)抽取精製DNA。藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(DNA polymerase)(TAKARA)之PCR(前置引子：前述序列編號17，反置引子：前述序列編號18)擴增含有標的序列之基因體區域，所得之PCR產物藉由QIAquick PCR純化套組(purification kit)(Qiagen)精製。精製後之DNA片段再度低溫黏合後，利用T7內核酸酶I(NEB)處理，使用Agilent 4200 TapeStation(Agilent)電泳，利用附屬之軟體解析。變異導入效率之計算式係與[2-4]相同(參照前述數1)。結果示於第5圖。

[3-5]源自人類iPS細胞之肌原細胞中的外顯子跳讀效率評估

從回收的細胞，使用RNA簡單迷你套組(easy mini kit)(Qiagen)抽取精製總RNA。總RNA使用高容量RNA至DNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA kit)(Thermo)逆轉錄，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(DNA polymerase)(TAKARA)進行PCR(前置引子：序列編號21，反置引子：序列編號22)。所得之PCR產物藉由QIAquick PCR純化套組(purification kit)(Qiagen)精製，使用Agilent 4200 TapeStation電泳，利用附屬之軟體解析。外顯子跳讀效率(exon skipping efficiency)之計算式係與[2-5]相同(參照前述數2)。將結果示於第6圖。

序列編號21 5’-CTACAGGAAGCTCTCTCCCA-3’

序列編號22 5’-TGCTTCCTCCAACCATAAAACA-3’

[實施例4]使用源自人類iPS細胞之肌原細胞中的HsDMDEx45 sgRNA之基因體編集效果及外顯子跳讀效率評估(其之2)

[4-1]Cas9 mRNA-LNP之調製

藉由實施例1之[1-1]所記載之步驟再度調製Cas9 mRNA-LNP，測定核苷酸濃度、內封率、粒徑及PDI。將測定結果示於表5。

[4-2]HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP之調製

再度使用在實施例2之[2-2]所製作之HsDMDEx45 # 1 sgRNA-LNP。將實施例2時之測定結果再度記載於表5。

[4-3]HsDMDEx45 # 23 sgRNA-LNP之調製

在實施例2之[2-2]所記載之步驟中，除了使用「HsDmdEx45 # 23 sgRNA」(參照前述表1之「HsDMDEx45 # 23 sgRNA」)替代「HsDMDEx45 # 1 sgRNA」(實施例4中之HsDMDEx45 # 1 sgRNA，參照前述表1)以外，其餘同樣地施作，而調製HsDMDEx45 # 23 sgRNA-LNP，測定核酸濃度、內封率、粒徑及PDI。將測定結果示於表5。

[4-4]人類iPS細胞之肌肉分化及LNP之導入

將含有去氧羥四環素(Doxycycline)誘導型MyoD表現卡匣(cassette)之源自肌肉萎縮蛋白Ex 45缺損DMD患者之人類iPS細胞及源自正常人之人類iPS細胞，懸濁於含有10μM Y-27632之AK02N培養基(Ajinomoto)，在塗佈有基底膠之6孔盤中以1×10⁵cells/well之密度播種。翌日，將培養基交換成Primate ES細胞培養基(Cell Medium)(Reprocell)，進一步，在其翌日，藉由交換成含有1μg/mL去氧羥四環素之培養基(Primate ES Cell Medium)，開始MyoD基因表現誘導。從添加去氧羥四環素4小時後，交換成含有5% KSR及1μg/mL去氧羥四環素之α基本成分培養基(alpha Minimal Essential Medium)(SIGMA)，培養3日。將源自患者之人類iPS細胞之培養基減少至700μL，添加LNP之混合物(參照下述表6)。在添加6小時後，添加1.3mL之培養基(α基本成分培養基(alpha Minimal Essential Medium)，5% KSR，1μg/mL去氧羥四環素)。

[4-5]源自人類iPS細胞之肌原細胞中的外顯子跳讀效率評估

從LNP添加72小時後，利用經冷卻之PBS將各孔2次洗淨後，利用細胞刮刀(Cell scraper)回收細胞，在4℃以15,000rpm離心分離5分鐘。之後，去除上清液，利用RIPA緩衝液溶解細胞。從一部分細胞溶解液，使用RNA簡單迷你套組(easy mini kit)(Qiagen)抽取精製總RNA。總RNA使用高容量RNA至DNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA kit)(Thermo)逆轉錄，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(DNA polymerase)(TAKARA)進行PCR(前置引子：前述序列編號21，反置引子：前述序列編號22)。所得之PCR產物藉由QIAquick PCR純化套組(purification kit)(Qiagen)精製，使用Agilent 4200 TapeStation電泳，利用附屬之軟體解析。外顯子跳讀效率(exon skipping efficiency)之計算式係與[2-5]相同(參照前述數2)。將結果示於第7圖。

[4-6]源自人類iPS細胞之肌原細胞中的肌肉萎縮蛋白之回復評估

將一部分細胞溶解液之總蛋白質量利用蛋白質分析套組(Protein assay kit)(Thermo)測定，調製成0.083μg/μL及0.58μg/μL。

Gapdh檢測：在調製成0.083μg/μL之細胞溶解液中添加含有還原劑(Thermo)之試樣緩衝液(Sample buffer)(Bio-Rad)，在98℃進行10分鐘處理。將1μg/12μL之經還原、熱處理之樣品液添加至10% Mini-PROTEANTGX預鑄凝膠(Precast gel)(Bio-Rad)，以150V電泳40分鐘。電泳結束後，使用Trasblot渦輪系統(Bio-Rad)轉印至PVDF膜。轉印後之PVDF膜利用iBind溶液(Thermo)封阻5分鐘，接續使用iBind系統(Themo)，藉由利用稀釋液(TOYOBO)稀釋後之抗GAPDH抗體(1：1000，Cell Signaling)與經HRP標識之抗兔子IgG抗體(1：1000，GE)進行印漬。印漬結束後之PVDF膜利用蒸餾水洗淨，在ECL Prime西方墨漬檢測試劑 (Western Blotting Detection Reagen)(GE)中浸約5分鐘，利用ChemiDoc(Bio-Rad)檢測。

肌肉萎縮蛋白檢測：在調製成0.58μg/μL之上清液中添加含有還原劑(Thermo)之試樣緩衝液(Sample buffer)(Thermo)，在70℃進行10分鐘處理。將7μg/12μL之經還原、熱處理之樣品液添加至3-8%三羥甲基胺基甲烷乙酸酯(Tris-Acetate)凝膠(Thermo)，以150V電泳約90分鐘。電泳結束後，使用Trasblot渦輪系統(Bio-Rad)轉印至PVDF膜。轉印後之PVDF膜利用iBind溶液(Thermo)封阻5分鐘，接續使用iBind系統(Thermo)，藉由利用稀釋液(TOYOBO)稀釋後之抗肌肉萎縮蛋白抗體(1：1000，abcam)及經HRP標識之抗兔子IgG抗體(1：1000，GE)進行印漬。印漬結束後之PVDF膜利用蒸餾水洗淨，在ECL Select西方墨漬檢測試劑(Western Blotting Detection Reagen)(GE)中浸約5分鐘，利用ChemiDoc(Bio-Rad)檢測。

利用ChemiDoc檢測出之GAPDH及肌肉萎縮蛋白藉由Image Lab(Bio-Rad)解析，並將修復型肌肉萎縮蛋白之表現量利用GAPDH補正，將源自正常人之人類iPS細胞中的肌肉萎縮蛋白表現量設為100%，計算出相對的表現量。將上述結果示於第8圖。

[實施例5]LNP靜脈內投予時之各種組織中的DNA變異導入效率評估

[5-1]Cas9 mRNA-LNP之調製

將脂質混合物(在合成例1所得之陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28.7：0.7，莫耳比)溶解在90% EtOH、10%無RNase水中，而獲得6.9mg/mL之脂質溶液。將Cas9 mRNA(TriLink BioTechnologies)溶解在pH5.5之10mM 2-MES溶液中，獲得0.15mg/mL之核酸溶液。將所得之脂質溶液及核酸溶液，在室溫，藉由NanoAssemblr(Precision NanoSystems)，以流速比2.7mL/min：5.3mL/min進行混合，而獲得將核酸內封之脂質粒子的分散液。所得之分散液，係使用Slyde-A-Lyzer(20k之分劃分子量，Thermo scientific)，針對水以4℃、1小時，針對PBS以4℃、18小時進行透析。進一步，使用Amicon(30k之分劃分子量)進行離心(3,000×g，4℃，至沉積成一定體積為止進行複數次20分鐘離心)，進行利用超過濾之濃縮。接著，使用0.2μm之注射器過濾器(syringe filter)(Iwaki)進行過濾器過濾，並保存在4℃。將進行如此施作而調製成的分散液作為「Cas9 mRNA-LNP」，並在後述試驗中使用。脂質粒子之粒徑及多分散指數(PDI)係藉由Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)進行測定。再者，脂質粒子中之核酸的濃度及內封率係使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Thermo scientific)測定。將結果示於表7。

[5-2]MmRosa26 sgRNA-LNP之調製

將脂質混合物(在合成例1所得之陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28.7：0.7，莫耳比)溶解在90% EtOH、10%無RNase水中，而獲得6.9mg/mL之脂質溶液。將MmRosa26 sgRNA(GeneDesign，參照前述表1)溶解在pH5.5之10mM 2-MES溶液中，而獲得0.15mg/mL之核酸溶液。將所得之脂質溶液及核酸溶液，在室溫，藉由NanoAssemblr(Precision NanoSystems)，以流速比2.7mL/min：5.3mL/min進行混合，而獲得將核酸內封之脂質粒子的分散液。所得之分散液，係使用Slyde-A-Lyzer(20k之分劃分子量，Thermo scientific)，針對水以4℃、1小時，針對PBS以4℃、18小時進行透析。進一步，使用Amicon(30k之分劃分子量)進行離心(3,000×g，4℃，至沉積成一定體積為止進行複數次20分鐘離心)，進行利用超過濾之濃縮。接著，使用0.2μm之注射器過濾器(syringe filter)(Iwaki)進行過濾器過濾，並保存在4℃。將進行如此施作而調製成的分散液 作為「MmRosa26 sgRNA-LNP」，並在後述試驗中使用。脂質粒子之粒徑及多分散指數(PDI)係藉由Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)進行測定。再者，脂質粒子中之核酸的濃度及內封率係使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Thermo scientific)進行測定。將結果示於表7。

從5週齡之雄性C57BL/6J小鼠之尾靜脈投予50μg之mRosa26 sgRNA及50μg之內封有SpCas9 mRNA之LNP。7日後，在3.5%異氟醚麻醉下進行斷頭放血使小鼠安樂死後，取得腓腸肌、脛骨前肌、大腿四頭肌、橫隔膜、心臟並且利用液態氮迅速地凍結。將凍結組織之基因體DNA使用QIAamp快速DNA組織套組(Fast DNA Tissue Kit)(Qiagen)抽取精製，使用Q5高保真度DNA聚合酶(Q5 High-Fidelity DNA Polymerase)(New England Biolabs Japan)及下述所示之引子對(primer set)(前置引子：前述序列編號17，反置引子：前述序列編號18)擴增。PCR產物利用QIAquick 96 PCR BioRobot kit(QIAGEN)精製，利用T7內核酸酶I(NEB)處理後，使用Agilent 4200 TapeStation(Agilent)電泳，利用附屬之軟體解析。使用所得之數值，利用前述計算式(數1参照)求出變異導入效率。

其結果，如第9圖所示，相對於PBS投予，在經LNP投予之骨骼肌中檢測出對特定的標的DNA之變異導入，變位導入效率在腓腸肌係2.50%，前脛骨筋係1.32%，大腿四頭筋係2.27%，橫隔膜係1.54%，心臟係0.22%，肝臟係1.83。在其他採取之組織中沒有觀察到變異導入。

[實施例6]使用Dual sgRNAs之骨骼肌中的外顯子跳讀效率評估

[6-1]Cas9 mRNA-LNP之調製

脂質混合物(在合成例1所得之陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28.7：0.7，莫耳比)溶解在90% EtOH、10%無RNase水中，獲得6.9mg/mL之脂質溶液。Cas9 mRNA(TriLink BioTechnologies)溶解在pH5.5之10mM 2-MES溶液中，獲得0.15mg/mL之核苷酸溶液。所得之脂質溶液及核酸溶液，在室溫，藉由NanoAssemblr(Precision NanoSystems)，以流速比2.7mL/min：5.3mL/min進行混合，而獲得將核酸內封之脂質粒子的分散液。所得之分散液，係使用Slyde-A-Lyzer(20k之分劃分子量，Thermo scientific)，針對水以4℃、1小時，針對PBS以4℃、18小時進行透析。進一步，使用Amicon(30k之分劃分子量)進行離心(3,000×g，4℃，至沉積成一定體積為止進行複數次20分鐘離心)，進行利用超過濾之濃縮。接著，使用0.2μm之注射器過濾器(syringe filter)(Iwaki)進行過濾器過濾，並保存在4℃。將進行如此施作而調製成的分散液作為「Cas9 mRNA-LNP」，並在後述試驗中使用。脂質粒子之粒徑及多分散指數(PDI)係藉由Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)進行測定。再者，脂質粒子中之核酸的濃度及內封率係使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Thermo scientific)測定。將結果示於表8。

[6-2]HsDMDEx45 # 1+# 23 sgRNA-LNP之調製

脂質混合物(在合成例1製造之陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28.7：0.7，莫耳比)溶解在90% EtOH、10%RNase游離水中，獲得6.9mg/mL之脂質溶液。HsDMDEx45 # 1 sgRNA及HsDMDEx45 # 23 sgRNA在pH5.5之10mM 2-N-嗎啉基乙烷磺酸(MES)溶液每次等量地溶解，獲得0.15mg/mL之核苷酸溶液。所得之脂質溶液及核酸溶液，在室溫，藉由NanoAssemblr(Precision NanoSystems)，以流速比2.7mL/min：5.3mL/min進行混合，而獲得將核酸內封之脂質粒子的分散液。所得之分散液，係使用Slyde-A-Lyzer(20k之分劃分子量，Thermo scientific)，針對水以4℃、1小時，針對PBS以4℃、18小時進行透析。進一步，使用Amicon(30k之分劃分子量)進行離心(3,000×g，4℃，至沉積成一定體積為止進行複數次20分鐘離心)，進行利用超過濾之濃縮。接著，使用0.2μm之注射器過濾器(syringe filter)(Iwaki)進行過濾器過濾，並保存在4℃。將進行如此施作而調製成的分散液作為「HsDMDEx45 # 1+# 23 sgRNA-LNP」，並在後述試驗中使用。脂質粒子之粒徑及多分散指數(PDI)係藉由Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)進行測定。再者，脂質粒子中之核酸的濃度及內封率係使用Quant-iT^TM RiboGreen(註冊商標)(Thermo scientific)測定。將結果示於表8。

在6週齡之雄性人類DMD exon 45敲入-小鼠Dmd exon 44剔除小鼠之右下肢腓腸肌中，將3μg之HsDMDEx45 # 1+# 23及3μg之內封有Cas9 mRNA的LNP以1日4次之方式進行投予。從初次投予開始14日後，在3.5%異氟醚麻醉下進行斷頭放血使小鼠安樂死後，取出骨骼肌並且利用液態氮使該骨骼肌迅速地凍結。在經凍結之骨骼肌中添加Qiazol(QIAGEN)並進行均質化。添加氯仿(WAKO)，在混合、離心後將含有RNA之水槽進行分離回收，使用RNeasy迷你套組(RNeasy Mini Kit)(QIAGEN)，抽取精製總RNA進行。總RNA利用高容量RNA至DNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA kit)(Thermo)逆轉錄，接著，使用Q5高保真度DNA聚合酶(Q5 High-Fidelity DNA Polymerase)(New England Biolabs Japan)及下述所示之引子對(primer set)(前置引子：前述序列編號19，反置引子：前述序列編號20)擴增。RT-PCR產物利用QIAquick PCR純化套組(purification kit)(QIAGEN)精製後，使用Agilent 4200 TapeStation(Agilent)電泳，利用附屬之軟體進行解析。使用所得之數值，利用前述計算式(參照數2)求出外顯子跳讀效率(exon skipping efficiency)。

其結果，如第10圖所示，相對於PBS投予，藉由RT-PCT在經投予LNP之骨骼肌中，檢測出人類外顯子45(human Exon 45)經跳讀(skip)後之較短的PCR產物，其外顯子跳讀效率係47.91±9.32%(Mean±SD)(PBS對象：2.63±0.62%)。

[產業上之可利用性]

本發明之化合物、脂質粒子及組成物，係可對各種細胞、組織及臟器，有效率地將CRISPR系統所使用之gRNA等及RNA誘導型核酸酶等進行導入。因此，本發明之化合物、脂質粒子及組成物，係可作為CRISPR 系統中之DDS技術利用。再者，本發明之化合物、脂質粒子及組成物，係可作為各種疾病，例如肌肉萎縮症之預防/治療藥，或者是作為研究用試藥利用。

<110> 國立大學法人京都大學(KYOTO UNIVERSITY) 日商武田藥品工業股份有限公司(TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED)

<120> 標的基因改變用組成物

<130> PT38-9026WO

<140> TW 107147444

<141> 2018-12-27

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEx45#1 sgRNA

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)..(1)

<223> n代表可以被修飾的尿嘧啶(u)，例如，2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n是a,c,g,oru

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (2)..(2)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (3)..(3)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (93)..(93)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(95)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (94)..(94)

<223> n代表可以被修飾的尿嘧啶(u)，例如，2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (95)..(95)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<400> 1

<210> 2

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEx45#23 sgRNA

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)..(1)

<223> n代表可以被修飾的腺嘌呤(a)，例如，2'-O-甲基腺苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (2)..(2)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (3)..(3)

<223> n代表可以被修飾的胞嘧啶(c)，例如，2'-O-甲基胞苷(cm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (93)..(93)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(95)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (94)..(94)

<223> n代表可以被修飾的尿嘧啶(u)，例如，2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (95)..(95)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEX#1 sgRNA之標的辨識序列

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)..(1)

<223> n代表可以被修飾的尿嘧啶(u)，例如，2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (2)..(2)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (3)..(3)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEX#23 sgRNA之標的辨識序列

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)..(1)

<223> n代表可以被修飾的腺嘌呤(a)，例如，2'-O-甲基腺苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (2)..(2)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (3)..(3)

<223> n代表可以被修飾的胞嘧啶(c)，例如，2'-O-甲基胞苷(cm)

<400> 4

<210> 5

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEX#1 sgRNA之crRNA序列

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)..(1)

<223> n代表可以被修飾的尿嘧啶(u)，例如，2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (2)..(2)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (3)..(3)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<400> 5

<210> 6

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEX#23 sgRNA之crRNA序列

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)..(1)

<223> n代表可以被修飾的腺嘌呤(a)，例如，2'-O-甲基腺苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (2)..(2)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (3)..(3)

<223> n代表可以被修飾的胞嘧啶(c)，例如，2'-O-甲基胞苷(cm)

<400> 6

<210> 7

<211> 60

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEX#1 sgRNA之tracrRNA序列

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (57)..(57)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(59)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (58)..(58)

<223> n代表可以被修飾的尿嘧啶(u)，例如，2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (59)..(59)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<400> 7

<210> 8

<211> 60

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HsDMDEX#23 sgRNA之tracrRNA序列

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (57)..(57)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(59)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (58)..(58)

<223> n代表可以被修飾的尿嘧啶(u)，例如，2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (59)..(59)

<223> n代表可以被修飾的鳥嘌呤(g)，例如，2'-O-甲基鳥苷(gm)

<400> 8

<210> 9

<211> 98

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MmRosa26 sgRNA

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (1)..(1)

<223> 2'-O-甲基鳥苷(gm)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (2)..(2)

<223> 2'-O-甲基腺苷

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (3)..(3)

<223> 2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (95)..(95)

<223> 2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(97)

<223> n是a,c,g,or u

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (96)..(96)

<223> 2'-O-甲基尿苷(um)

<220>

<221> 經修飾鹼基

<222> (97)..(97)

<223> 2'-O-甲基尿苷(um)

<400> 9

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例1[1-3]之前置引子

<400> 10

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例1[1-3]之反置引子

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 15

<210> 16

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例2[2-3]之ssODN

<400> 16

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例2[2-4]、[2-5]及實施例5之前置引子

<400> 17

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例2[2-4]、[2-5]及實施例5之反置引子

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例2[2-5]及實施例6之前置引子

<400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例2[2-5]及實施例6之反置引子

<400> 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例3[3-5]及實施例4[4-5]之前置引子

<400> 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用於實施例3[3-5]及實施例4[4-5]之反置引子

<400> 22

Claims (27)

1. 一種用以誘導細胞中的標的基因座中之基因改變的組成物，其係包含：1)式(I)所示之化合物或其鹽，2)結構脂質，以及3)嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA，及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸，

   

   式(I)中，n表示2至5的整數，R表示直鏈狀C_1-5烷基、直鏈狀C_7-11烯基或直鏈狀C₁₁二烯基，波線各自獨立地表示順型或反型之鍵結。
2. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，RNA誘導型核酸酶係Cas9；嚮導RNA係(a)嵌合RNA，或(b)包含crRNA及tracrRNA之2種以上的RNA。
3. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中，Cas9係源自化膿性鏈球菌之Cas9。
4. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，前述嚮導RNA係2種以上的嚮導RNA。
5. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，細胞係肌肉細胞。
6. 如申請專利範圍第5項所述之組成物，其中，標的基因座包含肌肉萎縮蛋白基因之核苷酸序列。
7. 如申請專利範圍第5項所述之組成物，其中，嚮導RNA係(1)包含序列編號1或者是序列編號2所示之核酸序列之嵌合RNA，或(2)(i)包含序列編號3或者是序列編號4所示之核酸序列之crRNA，及(ii)包含序列編號7或者是序列編號8所示之核酸序列之tracrRNA。
8. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，前述化合物係(9Z)-十四碳-9-烯酸3-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)-2,2-雙(((9Z,9’Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙酯。
9. 一種改變細胞中的標的基因座之方法，其係包含使申請專利範圍第1項所述之組成物與細胞接觸之步驟。
10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，RNA誘導型核酸酶係Cas9；嚮導RNA係(a)嵌合RNA，或(b)包含crRNA及tracrRNA之2種以上的RNA。
11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，Cas9係源自化膿性鏈球菌之Cas9。
12. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，細胞係肌肉細胞。
13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，標的基因座包含肌肉萎縮蛋白基因之核苷酸序列。
14. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，嚮導RNA係(1)包含序列編號1或者是序列編號2所示之核酸序列之嵌合RNA，或(2)(i)包含序列編號3或者是序列編號4所示之核酸序列之crRNA，及(ii)包含序列編號7或者是序列編號8所示之核酸序列之tracrRNA。
15. 一種細胞，其係藉由申請專利範圍第9項所述之方法所得並且包含式(I)所示之化合物或其鹽之標的基因座經改變者，

    

    式(I)中，n表示2至5的整數，R表示直鏈狀C_1-5烷基、直鏈狀C_7-11烯基或直鏈狀C₁₁二烯基，波線各自獨立地表示順型或反型之鍵結。
16. 如申請專利範圍第15項所述之細胞，其中，前述化合物係(9Z)-十四碳-9-烯酸3-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)-2,2-雙(((9Z,9’Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙酯。
17. 一種基因治療用之醫藥製劑，其係包含申請專利範圍第6項所述之組成物。
18. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥製劑，其中，RNA誘導型核酸酶係Cas9； 嚮導RNA係(a)嵌合RNA，或(b)包含crRNA及tracrRNA之2種以上的RNA。
19. 如申請專利範圍第18項所述之醫藥製劑，其中，Cas9係源自化膿性鏈球菌之Cas9。
20. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥製劑，其中，嚮導RNA係(1)包含序列編號1或者是序列編號2所示之核酸序列之嵌合RNA，或(2)(i)包含序列編號3或者是序列編號4所示之核酸序列之crRNA，及(ii)包含序列編號7或者是序列編號8所示之核酸序列之tracrRNA。
21. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥製劑，其係肌肉萎縮症之預防/治療藥。
22. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥製劑，其係修復型肌肉萎縮蛋白產生藥。
23. 一種申請專利範圍第6項所述之組成物的用途，其係用以製造肌肉萎縮症的預防/治療劑。
24. 一種標的基因座經改變的細胞之製造方法，其係包含於生體外使申請專利範圍第1項所述之組成物與細胞接觸之步驟。
25. 一種用以誘導細胞中之標的基因座的基因改變之組成物的製造方法，其係包含：使包含1)式(I)所示之化合物或其鹽，及2)結構脂質的脂質粒子分散液，及包含3)嚮導RNA或者是包含編碼該嚮導RNA之序列的DNA、及/或RNA誘導型核酸酶或者是包含編碼該RNA誘導型核酸酶之序列之核酸之水溶液混合的步驟，

    

    式(I)中，n表示2至5的整數，R表示直鏈狀C_1-5烷基、直鏈狀C_7-11烯基或直鏈狀C₁₁二烯基，波線各自獨立地表示順型或反型之鍵結。
26. 如申請專利範圍第25項所述之製造方法，其中，前述嚮導RNA係2種以上的嚮導RNA。
27. 如申請專利範圍第25項所述之製造方法，其中，前述化合物係(9Z)-十四碳-9-烯酸3-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)-2,2-雙(((9Z,9’Z)-十四碳-9-烯醯基氧基)甲基)丙酯。