WO2020158636A1 - 核酸等を細胞内へ導入する方法 - Google Patents

核酸等を細胞内へ導入する方法 Download PDF

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nucleic acid
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complex
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Inventor
岡本　晃充
ウィランパット カルンソムワン
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国立大学法人東京大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a nucleic acid and a nucleic acid analog into cells and a reagent for carrying out the method.
  • Nucleic acid is one of the biological substances that play important roles in life such as preservation of genetic information and protein synthesis.
  • therapeutic agents that utilize the function of nucleic acids in the living body, such as oligonucleotide therapeutic agents (antisense nucleic acid, siRNA, etc.), have received attention in the field of clinical medicine.
  • Oligonucleotide therapeutic agents are expected as a breakthrough in the treatment of diseases that are difficult to treat with conventional small molecule drugs.
  • the nucleic acid molecule since the nucleic acid molecule has many negative charges, it has a low affinity for the hydrophobic cell membrane, and as a result, the efficiency of introduction into cells is poor. This low efficiency of introduction into cells has become a serious problem in oligonucleotide therapeutic agents.
  • Non-Patent Document 1 use of a neutral lipid-oligonucleotide complex has been reported as a method for safely introducing a nucleic acid into cells. It has been reported so far that tumor growth was suppressed by introducing an siRNA complex targeting cholesterol and an oncogene into a mouse model (Non-Patent Document 2). However, intravascular administration of cholesterol has problems associated with cardiovascular events, and the use of cholesterol remains uncertain in terms of safety to the living body. On the other hand, it has been reported that a complex of a naturally-occurring polyunsaturated fatty acid, which is expected to be safe to the living body, and an anticancer agent is effective in terms of pharmacokinetics and efficacy (Non-patent document) 3-5).
  • introduction of a nucleic acid into a cell using a polyunsaturated fatty acid is considered to be pharmacokinetically advantageous, but the introduction efficiency into the cell, the effect of the nucleic acid complex on the cell, etc. are unknown. There are many points.
  • Raouane et al. Bioconjugate Cahemistry, 2012, 23:1091-1104. Raouane et al., Journal of of Medimidinal Chemistry, 2011, 54:4067-4076. Bradley et al., Clinical Cancer Research, 2001, 7: 3229-3238. Kuznetsova and Chen, Bioorganic Medicinal Chemistry Letter, 2006, 16: 974-977. Wang and Jiang, Bioorganic Medicinal Chemistry Letter, 2006, 16, 2974-2977.
  • the present invention provides a method for simply and efficiently introducing a nucleic acid or a nucleic acid analog into a cell, which is capable of avoiding adverse effects on the cell, and a carrier-nucleic acid complex etc. used in the method.
  • the purpose is to provide the body.
  • Another object of the present invention is to provide a reagent for introducing nucleic acid or the like into cells.
  • the present inventors found that the polyunsaturated fatty acid-DNA complex was micellar. It was found that aggregates were formed and efficiently taken up by cells. Furthermore, the inventors have found that after the polyunsaturated fatty acid-DNA complex enters the cell, the ester bond in the cell cleaves the ester bond to separate the polyunsaturated fatty acid and the DNA, and the DNA is transferred to the nucleus. Confirmed that it will be migrated.
  • the ester bond in the cell cleaves the ester bond to separate the polyunsaturated fatty acid and the DNA
  • the polyunsaturated fatty acid used by the present inventors as a carrier molecule (carrier) for introducing a nucleic acid into cells is a biological substance originally present in cells, almost no adverse effect on cells occurs. It seems that you will not get it.
  • the present inventors have also found that a polyunsaturated fatty acid-DNA complex can be simply and efficiently prepared simply by mixing a methyl iodide ester of polyunsaturated fatty acid and a nucleic acid.
  • the present invention is the following (1) to (9).
  • a carrier-nucleic acid or the like complex for introducing a nucleic acid or the like into a cell which is characterized in that it is an ester of a polyunsaturated fatty acid and a nucleic acid or the like.
  • the polyunsaturated fatty acid is ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, pinolenic acid, ⁇ -eleostearic acid, ⁇ -eleostearic acid, mead acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, eicosatri Characterized by selecting from the group consisting of enoic acid, stearidonic acid, arachidonic acid, eicosatetraenoic acid, adrenic acid, boseopentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, ozbondic acid, docosapentaenoic acid, tetracosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid
  • a method for introducing a nucleic acid or the like into a cell which comprises a step of bringing the carrier-nucleic acid, etc. complex according to any one of (1) to (3) above into contact with the cell.
  • a reagent for introducing into a cell such as a nucleic acid, which contains a halogenated alkyl ester of a polyunsaturated fatty acid.
  • the reagent according to (5) or (6) above, wherein the polyunsaturated fatty acid has 18 or more and 25 or less carbon atoms and has 2 or more double bonds.
  • the polyunsaturated fatty acid is ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, pinolenic acid, ⁇ -eleostearic acid, ⁇ -eleostearic acid, mead acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, eicosatri To be selected from the group consisting of enoic acid, stearidonic acid, arachidonic acid, eicosatetraenoic acid, adrenic acid, boseopentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, ozbondic acid, docosapentaenoic acid, tetracosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid.
  • a method for producing the complex according to any one of (1) to (3) above which comprises a step of mixing the reagent according to any one of (5) to (8) above and a polyunsaturated fatty acid.
  • a nucleic acid or a nucleic acid analog can be efficiently introduced into cells.
  • the fatty acid and the nucleic acid etc. are bound by an ester bond, the fatty acid and the nucleic acid etc. are easily separated by the intracellular enzyme (esterase). .. Therefore, it is possible to introduce the nucleic acid itself, which is a functional molecule, into the cell.
  • the intracellular transfection reagent (halogenated alkyl ester of polyunsaturated fatty acid) according to the present invention can easily produce a polyunsaturated fatty acid-nucleic acid complex by simply mixing with the nucleic acid or the like. It is possible.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of an oligonucleotide (prooligonucleotide) to which a carrier (polyunsaturated fatty acid) that can be decomposed by an enzyme is bound.
  • the nucleic acid and the unsaturated fatty acid are linked via a linker containing an ester bond.
  • Unsaturated fatty acids and nucleic acids can be bound by post-synthesis modifications and cleaved by esterases.
  • the result of having observed the incorporation of the pro-oligonucleotide into HeLa cells is shown.
  • (A) to (d) are the results of observing the fluorescence derived from cells after adding the pro-oligonucleotide to the culture solution.
  • the bar is 50 ⁇ m.
  • (E) is the result of measuring the uptake rate of prooligonucleotide into cells. The ratio of the number of fluorescent cells to the total number of cells was calculated. Values are shown as the mean% in each sample and error bars indicate standard error.
  • (F) and (g) show a fluorescence photograph (f) of a cell incorporating linolenate-T 10 FT 10 and a distribution (g) of fluorescence in the cell. The bar is 10 ⁇ m.
  • FIG. 2 shows a conceptual diagram of a pathway in which linolenate-T 20 is transported from the outside of the cell to the nucleus.
  • Linolenate-T 20 added to cells forms microparticles of 110-130 nm (1).
  • the clathrin mechanism allows microparticles to be taken up into cells (2).
  • microparticles are destabilized and linolenate-T 20 molecules are released (3).
  • Linolenate-T 20 is cleaved by esterase in endosomes to separate nucleic acids (4). Nucleic acid released from endosomes is rapidly transported into the nucleus (5).
  • the first embodiment of the present invention is a carrier-nucleic acid etc. complex for introducing a nucleic acid etc. into a cell, which is characterized in that it is an ester of polyunsaturated fatty acid and nucleic acid etc. is there.
  • the carrier is a carrier molecule for introducing a nucleic acid or the like into cells, and corresponds to a polyunsaturated fatty acid in the first embodiment. That is, in the first embodiment, the carrier-nucleic acid etc. complex is a polyunsaturated fatty acid-nucleic acid etc. complex (hereinafter also referred to as “nucleic acid etc. complex of the present invention”).
  • nucleic acid and the like includes nucleic acids such as DNA and RNA, as well as nucleic acid analogs obtained by subjecting nucleic acids to various chemical modifications.
  • the sugar contained in the nucleic acid or the like may be ribose, deoxyribose, or those chemically modified.
  • the base may be adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil as well as inosine, and further chemically modified such as 7-deazaadenine, 7-deazaguanine and hypoxanthine. May be.
  • the nucleic acid analog may be any one that is well known in the art and can be selected by those skilled in the art.
  • a phosphorothioate in which one oxygen atom of the phosphodiester bond portion of a nucleic acid is replaced with sulfur Phosphorothioate
  • LNA Locked nucleic acid
  • the oxygen atom at the 2′-position and the carbon atom at the 4′-position of RNA are bridged with methylene, monoholino nucleic acid analog and the like.
  • the length of the nucleic acid or the like can be appropriately selected according to the purpose, and when it is used for introducing a nucleic acid drug or the like into cells, for example, it is about 3 to 50 bases, about 10 to 30 bases. May be
  • the polyunsaturated fatty acid used in the present embodiment is not particularly limited, but has, for example, 17 to 30 carbon atoms, preferably 18 to 25 carbon atoms, and has 2 or more double bonds (divalent or higher).
  • a fatty acid having three or more double bonds (trivalent or more) is desirable.
  • Preferred polyunsaturated fatty acids are not particularly limited, but include, for example, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, pinolenic acid, ⁇ -eleostearic acid, ⁇ -eleostearic acid, mead acid, dihomo- ⁇ - Linolenic acid, eicosatrienoic acid, stearidonic acid, arachidonic acid, eicosatetraenoic acid, adrenic acid, boseopentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, ozbondic acid, docosapentaenoic acid, tetracosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid You can
  • the nucleic acid and the like and the polyunsaturated fatty acid are bound by an ester bond.
  • the complex easily enters the cell, and then the ester bond existing in the cell cleaves the ester bond, so that only the nucleic acid and the like are introduced into the cell. ..
  • Nucleic acid and the like introduced into cells in this way can be rapidly transferred to the nucleus (see Examples).
  • any method known to those skilled in the art may be used for the esterification reaction of the nucleic acid or the like with the polyunsaturated fatty acid.
  • the nucleic acid and the like of the present invention are synthesized by mixing the nucleic acid and the like and incubating the mixture for several hours. can do.
  • the nucleic acid complex of the present invention when the nucleic acid or the like has a function such as antisense oligonucleotide, RNAi, nucleic acid aptamer or nucleic acid decoy, the nucleic acid complex of the present invention is a so-called nucleic acid drug ( It can be used as a prodrug of a nucleic acid drug.
  • the second embodiment is a method of introducing a nucleic acid or the like into a cell, which is a method of introducing a nucleic acid or the like into a cell, which comprises a step of bringing the nucleic acid-like complex of the present invention into contact with the cell.
  • the step of bringing the nucleic acid complex of the present invention into contact with cells can be performed by a method well known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid complex of the present invention may be simply added to a cell culture system.
  • the nucleic acid or the like of the present invention is transformed into a target cell or organ. It can be delivered and contacted.
  • a plurality of the nucleic acid and the like of the present invention are aggregated to form a micelle-like aggregate, and when contacted with a cell (cell membrane), they are rapidly taken up into the cell by endocytosis and the like.
  • the fatty acid and the nucleic acid and the like are separated by the endogenous esterase, and the nucleic acid and the like are considered to exert a desired function in the cell.
  • the third embodiment is a reagent for introducing into cells such as nucleic acid, which contains a halogenated alkyl ester of polyunsaturated fatty acid.
  • a halogenated alkyl ester of a polyunsaturated fatty acid for example, an iodide alkyl ester of a polyunsaturated fatty acid is mixed with a desired nucleic acid or the like, and the mixture is incubated under appropriate conditions, whereby the nucleic acid or the like of the present invention can be easily prepared. Complexes can be prepared.
  • the reagent according to the third embodiment it is possible to bind a nucleic acid and a polyunsaturated fatty acid by post-synthesis modification.
  • the halogenated alkyl ester of polyvalent saturated fatty acid has a function and use as a reagent for introducing nucleic acid into cells.
  • the halogen is preferably iodine
  • the alkyl is preferably lower alkyl (having about 1 to 6 carbon atoms), for example, methyl, ethyl, propyl and the like.
  • the fourth embodiment of the present invention includes a step of mixing a halogenated alkyl ester of a polyunsaturated fatty acid (a reagent for intracellular introduction of a nucleic acid or the like according to the third embodiment) with a nucleic acid and incubating the mixture.
  • a halogenated alkyl ester of a polyunsaturated fatty acid a reagent for intracellular introduction of a nucleic acid or the like according to the third embodiment
  • the conditions for incubating after mixing the halogenated alkyl ester of polyunsaturated fatty acid with the nucleic acid or the like differ depending on the type of the nucleic acid or the like, but can be selected by a person skilled in the art through preliminary experiments.
  • the nucleic acid is DNA, it may be incubated at, for example, about 20° C. to 70° C. for about 1 to 10 hours.
  • the polyunsaturated fatty acid, the nucleic acid and the like in the third embodiment refer
  • oligonucleotide binding To a mixture of 100 ⁇ l oligonucleotide (poly dT 20 ) in water (30 nmol) and 600 ⁇ l acetonitrile was added methyl iodide alkyl ester of unsaturated fatty acid (3a, 3b, 3c) (500 equivalents) and DIEA (N,N-dimethylformamide) (500 eq) was added. The reaction mixture was heated at 60° C. for 6 hours and then cooled to room temperature. The crude reaction was purified by reverse phase HPLC.
  • oleate-T 20 the complexes of oleic acid, linoleic acid, and linolenic acid with poly dT 20 are referred to as oleate-T 20 , linoleate-T 20, and linolenate-T 20 , respectively.
  • the resulting mixture was heated at 65°C for 15 minutes and then slowly cooled to room temperature.
  • the obtained sample was centrifuged with a filter tube having a pore size of 0.45 ⁇ m to remove aggregates.
  • Samples were added to 96-well plates supplemented with 90% FBS (in PBS) for determination of micelle stability.
  • the sample was excited at 450 nm using a multi-well Cytation 5 plate reader (BioTek Instruments, JPN), and the fluorescence intensity was measured over time in the wavelength range of 475 nm to 650 nm for 24 hours.
  • the FRET measurement was performed by keeping the sample at 37°C.
  • Result 2-1 Synthesis of pro-oligonucleotide
  • the added lipid molecule substantially constitutes a lipid layer coating DNA or RNA and passes through a cell membrane.
  • polyunsaturated fatty acids disrupt the structure and fluidity of cell membranes due to their lipophilicity, and promote uptake of biomolecules by cells.
  • paclitaxel conjugated with polyunsaturated fatty acids has been reported to improve the treatment efficiency of chemotherapy. Therefore, the inventors decided to bind an ester of polyunsaturated fatty acid to a nucleic acid by post-synthesis modification.
  • This polyunsaturated fatty acid ester is decomposed by esterases existing inside cells (Fig. 1). Oligonucleotides (pro-oligonucleotides) bound to a carrier that can be decomposed by an enzyme are considered to return to the original nucleic acid after being efficiently transported to cells.
  • Chloride was quantitatively converted to iodide (3a-c) with sodium iodide.
  • Iodide (3a-c) was mixed with DNA and reacted at 60° C. for 6 hours in the presence of diisopropylethylamine to obtain a pro-oligonucleotide in which 1 equivalent of fatty acid methyl ester and DNA were bound.
  • prooligonucleotides oleate-T 20 , linoleate-T 20 , linolenate-T 20 ) to which 1 equivalent of fatty acid methyl ester was bound were synthesized.
  • a pro-oligonucleotide (oleate-T 10 FT 10 , linoleate-T) in which 1 equivalent of unsaturated fatty acid iodide was bound to T 10 FT 10 in which dT labeled with fluoroscein was inserted at the center of the poly dT sequence was used.
  • 10 FT 10 and linolenate-T 10 FT 10 were synthesized.
  • fatty acid methyl ester could not be added to the poly dT sequence in which the hydroxy group at the 5'end was modified with fluorescein.
  • the efficiency of introduction of fatty acid methyl ester due to post-synthesis modification was low. This point can be improved by using, for example, a nucleic acid containing 7-deazaguanine, 7-deazaadenine, inosine or the like instead of a purine base such as G or A.
  • linoleate-T 10 FT 10 was taken up by 30 to 40% of cells (FIGS. 2c and e). Then, the cell-derived fluorescence intensity increases as the number of double bonds of the polyunsaturated fatty acid increases, and linolenate-T 10 FT 10 shows that the cell-derived fluorescence intensity is within 2 hours after addition to the cells. It became very strong (uptake into cells: 94%) (Fig. 2d and e). The fluorescence distribution in the fluorescence image showed that most of linolenate-T 10 FT 10 translocated to the nucleus (FIGS. 2f and g). Fluorescence was also observed from the cytoplasmic region of the cells, but was much weaker than the fluorescence from the nucleus, no granular fluorescent spots were observed, and no fluorescence from the cell membrane was also confirmed.
  • Aggregates of pro-oligonucleotides are thought to be micelle-like vesicles formed by self-assembly. It is known that the endocytic pathway depends on the size of the vesicle. Endocytosis of vesicles less than 200 nm in diameter proceeds by a clathrin-mediated mechanism. On the other hand, an energy-dependent process is required for the uptake of larger vesicles into cells (Biochem. J., 2004, 377, 159-169). Aggregates composed of Linolenate-T 20 were vesicles less than 200 nm in diameter whose structure was maintained in 90% FBS for several hours (Fig. 3c).
  • the aggregates derived from Linoleate-T 20 had a diameter of less than 200 nm, but the existence time in 90% FBS was short, and oleate-T 20 had a size of greater than 200 nm and 90% FBS. The existence time in the inside was even shorter.
  • the size of aggregates derived from Linolenate-T 20 is in the range of vesicle sizes that undergo clathrin-mediated endocytosis. Thus, vesicles composed of Linolenate-T 20 are speculated to be taken up intracellularly by a route similar to the average 200 nm lipoplex, as previously reported.
  • nucleic acid-transporting nucleic acid complexes larger than the size of the nuclear pore limit the transport of nucleic acids to the nucleus. Therefore, in order for the nucleic acid to be transported into the nucleus, the nucleic acid needs to be separated from the complex so as to have the size of the original nucleic acid that can pass through the nuclear pore. Aggregates of pro-oligonucleotides are taken into cells via endosomes, but inside endosomes are in a weakly acidic environment due to the action of a proton pump.
  • the present inventors performed FRET analysis in order to investigate the stability of linolenate-T 20 aggregates under weakly acidic conditions (pH 5.2), which are comparable to those in endosomes. as a result.
  • Aggregates of Iinolenate-T 20 is in an environment of weak acid (pH 5.2), similar to the aggregates from oleate-T 20 and linoleate-T 2 0, fluorescence from DiO was rapidly increased within 1 hour (Fig. 3d). That is, it is considered that the aggregate of linolenate-T 20 is easily destabilized in an acidic environment.
  • Fig. 5 the pathway from the addition of pro-oligonucleotide to cells to the transport of nucleic acids to the nucleus is summarized in Fig. 5 as a conceptual diagram.
  • the reaction of the pro-oligonucleotide at each step and its transport are considered to proceed very rapidly.
  • the carrier-nucleic acid complex (ester of polyvalent fatty acid and nucleic acid) according to the present invention is easily introduced into cells and functions as the original nucleic acid without leaving an inappropriate residue in the cells. Can be demonstrated. Therefore, the present invention is expected to be used in the field of drug discovery such as nucleic acid drugs.

Abstract

本発明は、核酸または核酸誘導体を簡便かつ効率的に細胞内へ導入する方法であって、細胞への悪影響を回避し得る方法、および当該方法で使用される担体－核酸等複合体の提供を目的とする。また、本発明は、核酸等を細胞内へ導入するための試薬の提供を目的とする。より具体的には、本発明は、核酸等を細胞内へ導入するための担体－核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする複合体を提供する。さらに、発明は、当該複合体を細胞に接触させことを含む、当該核酸等を細胞内へ導入する方法を提供する。さらに、本発明は、当該複合体を簡便に調製する試薬として、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬を提供する。

Description

核酸等を細胞内へ導入する方法
　本発明は、核酸および核酸アナログを細胞内へ導入する方法および当該方法の実施のための試薬に関する。
　核酸（DNA/RNA）は、遺伝情報の保存およびタンパク質の合成など、生命にとって重要な役割を担う生体物質の１つである。近年では、生体における核酸の機能を利用した治療薬、例えば、オリゴヌクレオチド治療薬（アンチセンス核酸やsiRNAなど）などが臨床医学分野において注目されている。オリゴヌクレオチド治療薬は、従来の小分子薬での治療が難しい疾患治療のブレークスルーとして期待されている。オリゴヌクレオチド治療薬の薬効を最大限発揮させるためには、核酸分子を細胞中に効率的に導入する必要がある。しかしながら、核酸分子は多くの負電荷を有しているため、疎水性の細胞膜との親和性が低く、その結果、細胞への導入効率が悪い。この細胞への導入効率の低さが、オリゴヌクレオチド治療薬における深刻な問題となっている。
　これまでに、標的細胞に核酸を導入するための様々な方法が提唱されてきた。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、ハイドロダイナミック法、ウイルスベクター法、遺伝子銃（パーティクルガン法）および核酸と抗体またはペプチド担体との複合体を使用する方法などが報告されている。しかしながら、これらの方法によると、細胞へ与えるダメージが大きい、担体からの核酸の漏出が生じる、担体が細胞に大量に残存してしまう、ウイルスベクターによる癌遺伝子の組み換えなどの懸念が残るなど、多くの問題を抱えている。
　そこで、細胞内へ核酸を安全に導入する方法として、中性脂質－オリゴヌクレオチド複合体の利用が報告されている（非特許文献１）。これまでに、例えば、コレステロールと癌遺伝子を標的とするsiRNA複合体をマウスモデルに導入することで、腫瘍の増殖を抑制したことが報告されている（非特許文献２）。しかし、コレステロールの血管内投与は、心血管イベントとの関連性の問題が存在しており、コレステロールの使用は生体への安全性の点で不安が残る。他方、生体への安全性が見込まれる天然由来の多価不飽和脂肪酸と、抗がん剤との複合体について、薬物動態および薬効の点で有効であることが報告されている（非特許文献３～５）。従って、多価不飽和脂肪酸を用いて核酸を細胞に導入することは、薬物動態学的には有利であると考えられるが、細胞への導入効率、核酸複合体の細胞への影響など、不明な点が多い。
Raouaneら, Bioconjugate Cahemistry, 2012, 23:1091-1104. Raouaneら, Jornal of Medidinal Chemistry, 2011, 54:4067-4076. Bradleyら, Clinical Cancer Research, 2001, 7: 3229-3238. KuznetsovaおよびChen, Bioorganic Medicinal Chemistry Letter, 2006, 16: 974-977. WangおよびJiang, Bioorganic Medicinal Chemistry Letter, 2006, 16, 2974-2977.
　上記事情に鑑み、本発明は、核酸または核酸アナログを簡便かつ効率的に細胞内へ導入する方法であって、細胞への悪影響を回避し得る方法、当該方法で使用される担体－核酸等複合体の提供を目的とする。
　また、本発明は、核酸等を細胞内へ導入するための試薬の提供を目的とする。
　本発明者らは、多価不飽和脂肪酸（例えば、リノレン酸）とDNAを、エステル結合を介して結合させ、細胞に添加したところ、多価不飽和脂肪酸－DNAの複合体が、ミセル様凝集体を形成して、効率よく細胞に取り込まれることを見出した。さらに、発明者らは、多価不飽和脂肪酸－DNA複合体が細胞内に入った後、細胞内のエステラーゼによってエステル結合が切断され、多価不飽和脂肪酸とDNAが分離され、DNAが核へ移行することを確認した。本発明者らが、核酸を細胞内へ導入するためのキャリア分子（担体）として使用した多価不飽和脂肪酸は、元々細胞内に存在する生体物質であることから、細胞への悪影響はほとんど生じ得ないと考えられる。
　また、本発明者らは、多価不飽和脂肪酸のヨウ化メチルエステルと核酸とを混合するだけで、多価不飽和脂肪酸－DNA複合体を簡便かつ効率的に調製できることも見出した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（９）である。
（１）核酸等を細胞内へ導入するための担体－核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする、前記複合体。
（２）前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする上記（１）に記載の複合体。
（３）前記多価不飽和脂肪酸が、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、ピノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ－γ－リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択させることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の複合体。
（４）核酸等を細胞へ導入する方法であって、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の担体－核酸等複合体を細胞に接触させる工程を含む、前記方法。
（５）多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬。
（６）前記ハロゲン化アルキルエステルが、ヨウ化アルキルエステルであることを特徴とする、上記（５）に記載の試薬。
（７）前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする上記（５）または（６）に記載の試薬。
（８）前記多価不飽和脂肪酸が、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、ピノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ－γ－リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択されることを特徴とする上記（７）に記載の試薬。
（９）上記（５）ないし（８）のいずれかに記載の試薬と多価不飽和脂肪酸を混合する工程を含む、上記（１）ないし（３）いずれかの複合体を製造する方法。
　本発明にかかる方法によれば、核酸または核酸アナログを細胞へ効率良く導入することが可能である。
　さらに、本発明にかかる多価不飽和脂肪酸－核酸等複合体は、エステル結合によって脂肪酸と核酸等が結合されているため、細胞内の酵素（エステラーゼ）によって容易に脂肪酸と核酸等に分離される。従って、機能分子である核酸等そのものを細胞内へ導入することが可能である。
　本発明にかかる核酸等の細胞内導入試薬（多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステル）は、核酸等と混合するだけで、多価不飽和脂肪酸－核酸等複合体を容易に製造することが可能である。
酵素によって分解可能な担体（多価不飽和脂肪酸）が結合したオリゴヌクレオチド（プロオリゴヌクレオチド）の模式図である。核酸と不飽和脂肪酸はエステル結合を含むリンカーを介して結合している。不飽和脂肪酸と核酸は、合成後修飾により結合可能で、エステラーゼによって切断される。 HeLa細胞へのプロオリゴヌクレオチドの取り込みを観察した結果を示す。（ａ）～（ｄ）は、プロオリゴヌクレオチドを培養液に添加した後の細胞由来の蛍光を観察した結果である。バーは50μm。（ａ）脂肪酸で修飾していないT10FT10；（ｂ）oleate-T10FT10；（ｃ）linoleate-T10FT10；（ｄ）linolenate-T10FT10。（ｅ）は、プロオリゴヌクレオチドの細胞への取り込み率を測定した結果である。全細胞数に対する蛍光を発する細胞数の比率を算定した。値は各サンプルにおける平均%で示し、エラーバーは、標準誤差を示す。（ｆ）および（ｇ）は、linolenate-T10FT10を取り込んだ細胞の蛍光写真（ｆ）と細胞内における蛍光の分布を（ｇ）を示す。バーは10μm。 プロオリゴヌクレオチド凝集体に含まれるFRET色素の放出を解析した結果を示す。FRET色素のDiOおよびDilと、プロオリゴヌクレオチド凝集体の混合物に、90% FBSを加えた後、蛍光スペクトルを測定した（λexc = 450 nm）。（ａ）oleate-T20、pH7.0；（ｂ）linoleate-T20、pH7.0；（ｃ）linolenatee-T20、pH7.0；（ｄ）linolenate-T20、pH5.2。 プロオリゴヌクレオチドをエステラーゼで処理し、反応産物を経時的に検出した結果を示す。Ａはプロオリゴヌクレオチド（linolenate-T20）の存在率の経時変化を示し、Ｂは各時点（0、2、4、6および8時間後）における反応物を逆相HPLCで分析した結果を示す。 linolenate-T20が細胞外から核へ輸送される経路の概念図を示す。細胞に添加されたlinolenate-T20は、110-130 nmの微粒子を形成する（1）。クラスリン機構により、微粒子が細胞の中に取り込まれる（2）。エンドソーム内の酸性条件において、微粒子が不安定化し、linolenate-T20分子が放出される（3）。linolenate-T20はエンドソーム内のエステラーゼで切断されて、核酸が分離する（4）。エンドソームから放出された核酸は速やかに核内へ輸送される（5）。
　本発明の第１の実施形態は、核酸等を細胞内へ導入するための担体－核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする複合体である。
　ここで担体とは、核酸等を細胞内へ導入するためのキャリア分子のことで、第１の実施形態においては、多価不飽和脂肪酸に相当する。すなわち、第１の実施形態において、担体－核酸等複合体とは、多価不飽和脂肪酸－核酸等複合体（以下「本発明の核酸等複合体」とも記載する）のことである。
　本明細書において核酸等とは、DNAおよびRNAなどの核酸の他、核酸に種々の化学修飾を施した核酸アナログを含む。核酸等に含まれる糖はリボース、デオキシリボースおよびこれらに化学修飾が施されてものであってもよい。また、塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルの他、イノシンであってもよく、さらに、これらに化学修飾が施された、例えば、7-デアザアデニン、7-デアザグアニンおよびヒポキサンチンなどであってもよい。さらに、核酸アナログは、当該技術分野において周知であって、当業者によって選択可能なものであればよく、例えば、核酸のリン酸ジエステル結合部分の酸素原子を１つ硫黄に置換したホスホロチオエート（Phosphorothioate）、RNAの2’位の酸素原子と4’位の炭素原子をメチレンで架橋したLNA（Locked nucleic Acid）、モノホリノ核酸アナログなどを挙げることができる。
　また、核酸等の長さは、目的に応じて適宜選択することが可能であり、核酸医薬等の細胞内への導入に使用する場合などは、例えば、3～50塩基、10～30塩基程度であってもよい。
　本実施形態で使用される多価不飽和脂肪酸は、特に限定はしないが、例えば、炭素数17～30、好ましくは、炭素数18～25で、2個以上の二重結合（二価以上）、好ましくは3個以上の二重結合（三価以上）を有する脂肪酸が望ましい。好ましい多価不飽和脂肪酸として、特に限定はしないが、例えば、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、ピノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ－γ－リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸などを挙げることができる。
　本発明の核酸等複合体は、核酸等と多価不飽和脂肪酸がエステル結合によって結合させている。このような形体をとることで、当該複合体は容易に細胞内へ入り、その後、細胞に内在するエステラーゼによってエステル結合が切断され、その結果、核酸等のみが細胞内へ導入されることになる。このようにして細胞内へ導入された核酸等は速やかに核へ移行することが可能である（実施例を参照のこと）。
　核酸等と多価不飽和脂肪酸とのエステル化反応は、当業者において周知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化メチルエステル（特に、ヨウ化メチルエステルが好ましい）を用いると、これと核酸等を混合し、数時間インキュベートするだけで、本発明の核酸等複合体を合成することができる。
　また、本発明の核酸等複合体において、核酸等が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi、核酸アプタマーまたは核酸デコイなどの機能を有する場合には、本発明の核酸等複合体は、いわゆる、核酸医薬（核酸医薬のプロドラッグ）として使用することが可能である。
　第２の実施形態は、核酸等を細胞へ導入する方法であって、本発明の核酸等複合体を細胞に接触させる工程を含む、核酸等の細胞への導入方法である。
　本発明の核酸等複合体を細胞に接触させる工程は、当業者において周知の方法により実施可能である。例えば、インビトロにおいては、細胞の培養系に本発明の核酸等複合体を添加するだけでもよい。また、インビボにおいては、例えば、静脈内注射等による投与（例えば、非特許文献２などを参照のこと）、または、標的化DDSなどの利用により、本発明の核酸等を目的の細胞または臓器に送達し、接触させることができる。
　本発明の核酸等は複数が集まってミセル様凝集体を形成し、細胞（細胞膜）と接触するとエンドサイトーシス等によって、速やかに細胞内へ取り込まれる。細胞内では、上述のとおり、内在性のエステラーゼによって、脂肪酸と核酸等が分離され、核酸等は細胞内において所望の機能を発揮すると考えられる。
　第３の実施形態は、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬である。
　多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステル、例えば、多価不飽和脂肪酸のヨウ化アルキルエステルを、所望の核酸等と混合し、適当な条件下でインキュベートするだけで、容易に本発明の核酸等複合体を調製することができる。第３の実施形態にかかる試薬を用いることで、合成後修飾により、核酸と多価不飽和脂肪酸を結合させることが可能であるため、天然の核酸に多価不飽和脂肪酸を結合させることも、可能である。多価飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルは、核酸等の細胞内導入用試薬としての機能および用途を有する。ここで、ハロゲンとしては、ヨウ素が好ましく、アルキルとしては、低級アルキル（炭素数１～６程度）、例えば、メチル、エチル、プロピルなどが好ましい。
　第４の実施形態は、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステル（第３の実施形態にかかる核酸等の細胞内導入用試薬）と、核酸等を混合し、インキュベートする工程を含む、本発明の核酸等複合体を製造する方法である。
　ここで、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルと核酸等を混合した後、インキュベートする条件は、核酸等の種類によって異なるが、当業者であれば予備的な実験により選択することができる。核酸がDNAの場合、例えば、20℃～70℃程度で、1～10時間程度インキュベートしてもよい。第３の実施形態における多価不飽和脂肪酸および核酸等については、第１の実施形態における説明を参照のこと。
　本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．材料および実験方法
１－１．材料等
　すべての試薬は、Sigma-Aldrich, Wako Chemicals, and Tokyo Chemical Industryから購入した。1H and 13C NMRスペクトルはBruker Avance 600 (600 MHz)で測定した。エレクトロスプレーイオン化マススペクトル（Electrospray ionization mass spectra：ESI-MS）は、Bruker microTOF II-NACで記録した。MALDI-TOFマススペクトルは、Bruker microflex-NACで記録した。DNAは、NTS H-8 DNA/RNA synthesizer（Nihon Techno Service）で合成した。合成したオリゴヌクレオチドは、GILSON Inc.と JASCO Inc.のモジュールで構成されたHPLCシステムで精製した。吸収スペクトルはShimadzu UV-2550分光光度計およびRF-5300PC分光光度計で測定した。
１－２．プロオリゴヌクレオチド（不飽和脂肪酸－DNA複合体）の合成
　各プロオリゴヌクレオチドは、スキーム１に示す経路で合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
１－２－１．化合物2a
　40 mlのリノレン酸（1a）（4.02 mL, 13 mmol）水溶液に、Na2CO3（5.51 g、52 mmol）を添加した。20分後、反応液を0℃に冷却し、nBu4NHSO4（3.02 mL、2.6 mmol）、ジクロロメタン（80 mL）およびクロロ硫酸クロロメチル（1.71 mL, 16.9 mmol）を添加した。反応液を25℃で、一晩撹拌した。その後、水（50 mL）とクロロメタン（50 mL）を添加して、反応を停止した。水層をジクロロメタンで抽出した（100 mL×2）。有機層をMg2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。合成産物は、カラムクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン－ヘキサン（1:9, v/v）で溶出して精製し、油性無色のリノレン酸のクロロメチルアルキルエステル（2a）を得た（収率60%、2.14 g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
１－２－２．化合物3a
　化合物2aのアセトニトリル溶液（1 g、2.87 mmol）にヨウ化ナトリウム（1.3 g、8.61 mmol）を添加した。フラスコをアルミホイルで遮光し、反応液を25℃で一晩撹拌した。その後、水（50 mL）とクロロメタン（50 mL）を添加して、反応を停止させ、水層をジクロロメタン（100 mL×2）で抽出した。有機層を飽和NaHCO3水溶液（50 ml）、5 %亜硫酸ナトリウム水溶液（50 mL）および塩水（25 ml×2）で洗浄後、濃縮し、油性黄色のリノレン酸のヨウ化メチルアルキルエステル（3a）を得た（収率100%、1.82 g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
１－２－３．化合物2b
　１－２－１．と同様にして、リノール酸（1b）からリノール酸のクロロメチルアルキルエステル（2b）を合成した。油性無色の物質として化合物2bを得た（収率79%、2.47 g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
１－２－４．化合物3b
　１－２－２．と同様にして、リノール酸のクロロメチルアルキルエステル（2b）からリノール酸のヨウ化メチルエステル（3b）を合成した。油性黄色の物質として化合物3bを得た（収率100%、1.19 g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
１－２－５．化合物2c
　１－２－１．と同様にして、オレイン酸（1c）からオレイン酸のクロロメチルアルキルエステル（2c）を合成した。油性無色の物質として化合物2cを得た（収率82%、2.31 g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
１－２－６．化合物3c
　１－２－２．と同様にして、オレイン酸のクロロメチルアルキルエステル（3b）からオレイン酸のヨウ化メチルエステル（3c）を合成した。油性黄色の物質として化合物3cを得た（収率100%、1.14 g）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
１－２－７．オリゴヌクレオチドの結合
　100 μlのオリゴヌクレオチド（ポリdT20）水溶液（30 nmol）および600 μlのアセトニトリルの混合液に、不飽和脂肪酸のヨウ化メチルアルキルエステル（3a、3b、3c）（500当量）およびDIEA（N,N-ジメチルホルムアミド）（500当量）を添加した。反応混合物を60℃で6時間加熱した後、室温まで冷却した。粗反応物を、逆相HPLCで精製した。以下、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸とポリdT20との複合体を、各々、oleate-T20、linoleate-T20およびlinolenate-T20とする。
１－３．脂肪酸を結合した蛍光標識プロオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込み
　不飽和脂肪酸を結合した蛍光標識プロオリゴヌクレオチド（2 μM、1.0 μL）をOPTI-MEM（9.0 μL）と混合した。3.5 cmのグラスボトムディッシュで培養した細胞（1×105細胞）を1 mlの1×PBS(-)で1回洗浄した後、各サンプル（各蛍光標識プロオリゴヌクレオチド）溶液をグラスディッシュの中央に添加し、細胞と接触させた。その後、細胞は37℃で2時間培養した。次いで、サンプル溶液を除去し、各ディッシュを1×PBS(-)とOPTI-MEMで洗浄した。蛍光イメージは、共焦点レーザー走査顕微鏡下で記録した（Ex：488 nm, 505 nmより大きな波長を検出した）。
１－４．動的光散乱法（Dynamic Light Scattering）
　プロオリゴヌクレオチドで形成される粒子（ミセル）のサイズをMalvern Zetasizer Nano-ZS90（Malvern Instruments）で測定し、Zetasizer software（Malvern Instruments）で解析した。各サンプルを調製した後、核酸フリーの水で希釈した。全ての測定は、25℃で実施し、各サンプルについて、少なくとも10回のsub-runを伴う3回の測定を実施した。
１－５．フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）によるミセルの安定性の測定
　3,3’-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate (DiO) および1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate (Dil)を、2 mg/mlとなるようにエタノールに溶解した。また、不飽和脂肪酸－DNA複合体をエタノールに溶解したサンプル溶液に、5 wt%となるように各色素を添加した。エタノールを減圧濃縮装置で蒸発させ、脂質の薄いフィルムを得た。得られたフィルムは、最終濃度1 mg/mlとなるように、25 mM NaHPO4、50 mM KCl、pH = 7.2で再水和させた。得られた混合物を65℃で15分間加熱後、ゆっくりと室温まで冷却した。得られたサンプルをポアサイズ0.45μmのフィルターチューブで遠心し、凝集物を除去した。ミセルの安定性の測定のために、90 % FBS（PBS中）を添加した96-ウェルプレートにサンプル加えた。multi-well Cytation 5 plate reader（BioTek Instruments、JPN）を用い、サンプルを450 nmで励起し、475 nm～650 nmの波長範囲で、24時間、経時的に蛍光強度を測定した。FRETの測定は、サンプルを37℃に保温して行った。
１－６．エステラーゼによるリノレン酸の除去
　ブタの肝臓エステラーゼ（0.3 mg/ml）を含むPBS（10×）180 μlを、10 μmolのlinolenate-T20を（リノレン酸を結合したポリdT）含むチューブに添加した。混合物を37℃のインキュベーター中で震盪した。サンプル溶液の一部を以下の条件にて、逆相HPLCで分析した。
HPLC条件：
Aバッファー（0.1 M TEAA バッファー）
Bバッファー（CH3CN）
グラジエント；（B）5%→100%（30分間）
１－７．インビトロにおけるCell Viability Prestoblue（登録商標）アッセイ
　HeLa細胞は、10 %(v/v)胎児ウシ血清（FBS）および1 %(v/v) antibiotic-antimycotic solutionを含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium：DMEM）で、37℃、5 % CO2の条件で培養した。細胞が80 %コンフルエントとなった時点で、継代した。細胞は細胞濃度を5,000細胞/ウェルにて、96-ウェルプレートに播種し、一晩培養し、接着させた。72時間後、細胞を、種々の濃度（6.25、12.5、25、50および100 nM）のlinolenate-T20で処理した。細胞のみをポジティブコントロールとし、DMEMのみをネガティブコントロールとした。細胞の生存率は、Prestoblueアッセイで測定した。Prestoblue溶液を各ウェルに添加し、37℃、5% CO2の条件で1時間培養した。multi-well Cytation 5 plate reader（BioTek Instruments, JPN）を使用して、560 nmで励起し、590 nmの吸光度を測定した。
２．結果
２－１．プロオリゴヌクレオチドの合成
　リポソーム法を含む核酸送達システムにおいて、添加した脂質分子は、実質的には、DNAまたはRNAをコートする脂質層を構成し、細胞膜を通過することが知られている。特に、多価不飽和脂肪酸は、その脂溶性により細胞膜の構造と流動性を破壊し、細胞による生体分子の取り込みを促進する。例えば、多価不飽和脂肪酸を結合させたパクリタキセルは、化学療法の治療効率を向上させることが報告されている。そこで、発明者らは、多価不飽和脂肪酸のエステルを合成後修飾により、核酸に結合させることにした。この多価不飽和脂肪酸エステルは細胞内に内在するエステラーゼによって分解される（図１）。酵素によって分解可能な担体と結合したオリゴヌクレオチド（プロオリゴヌクレオチド：pro-oligonucleotides）は、細胞へ効率的に輸送されたのち、本来の核酸に戻ると考えられる。
　18個の炭素原子を有し、不飽和結合の数が異なる（1～3）長鎖脂肪酸（1a-c）は（18炭素鎖の不飽和脂肪酸；オレイン酸、cis-Δ9-オクタデカン酸(1a)；リノール酸、cis,cis-Δ9,Δ12-オクタデカジエン酸(1b)；リノレン酸、cis,cis,cis-Δ9,Δ12,Δ15-オクタデカトリエン酸(1c)）を、クロロ硫酸クロロメチルと反応させ、脂肪酸のクロロメチルエステル（2a-c）を合成した。塩化物を、ヨウ化ナトリウムで、定量的にヨウ化物（3a-c）に変換した。ヨウ化物（3a-c）をDNAと混合し、ジイソプロピルエチルアミン存在下、60℃で6時間反応させ、1当量の脂肪酸メチルエステルとDNAが結合したプロオリゴヌクレオチドを得た。DNAとしてポリdT配列を用いて反応を行ったところ、1当量の脂肪酸メチルエステルが結合したプロオリゴヌクレオチド（oleate-T20、linoleate-T20、linolenate-T20）が合成された。また、フルオロセインで標識したdTをポリdT配列の中央に挿入したT10FT10に、1当量の不飽和脂肪酸ヨウ化エステルを結合させたプロオリゴヌクレオチド（oleate-T10FT10、linoleate-T10FT10、linolenate-T10FT10）を合成した。
　なお、5’端のヒドロキシ基がフルオロセインで修飾されたポリdT配列に対して脂肪酸メチルエステルを付加させることはできなかった。また、プリンを含む配列の場合、合成後修飾による、脂肪酸メチルエステルの導入効率は低かった。この点については、例えば、G、Aなどのプリン塩基の代わりに、7-デアザグアニン、7-デアザアデニンまたはイノシンなどを含む核酸を用いることで改善できると考えられる。
２－２．プロオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込み
　2 μMのプロオリゴヌクレオチド溶液をHeLa細胞に添加し、2時間培養した後、細胞由来の蛍光を観察した。不飽和脂肪酸を結合していないT10FT10を添加した場合には、細胞から蛍光は検出されなかった（図２ａおよびｅ）。この結果から、不飽和脂肪酸を結合していない核酸は、細胞に取り込まれないことが確認された。
　oleate-T10FT10由来の蛍光は、不飽和脂肪酸を結合していないT10FT10と同様に、細胞から検出されなかった（図２ｂおよびｅ）。これに対し、linoleate-T10FT10は、30～40%の細胞によって取り込まれることが確認された（図２ｃおよびｅ）。そして、細胞由来の蛍光強度は、多価不飽和脂肪酸の二重結合の数が増えるに従って増大し、linolenate-T10FT10は、細胞への添加後2時間以内に、細胞由来の蛍光強度が非常に強くなった（細胞への取込率：94%）（図２ｄおよびｅ）。蛍光イメージにおける蛍光の分布から、linolenate-T10FT10は、その大部分が核へ移行することが示された（図２ｆおよびｇ）。蛍光は細胞の細胞質領域からも観察されたが、核からの蛍光よりもかなり弱く、粒状の蛍光スポットは確認されなかった、また、細胞膜からの蛍光も確認されなかった。
２－３．細胞内におけるプロオリゴヌクレオチドの安定性
　脂肪酸メチルエステルとDNAが結合したプロオリゴヌクレオチドは、水中でミセル様凝集体を形成すると考えられる。そこで、水中での凝集体のサイズ（流体力学的径）を、Zetasizerで測定した。その結果、凝集体サイズは不飽和脂肪酸の不飽和度が増加するにつれて減少した（oleate-T20, 368; linoleate-T20, 150; linolenate-T20, 112 nm）。オリゴヌクレオチドへ蛍光色素を導入すると凝集体のサイズが12-23%増大した（oleate-T10FT10, 412; linoleate-T10FT10, 184; linolenate-T10FT10, 132 nm）。
　次に、プロオリゴヌクレオチド凝集体の安定性を凝集体コア部由来の疎水性プローブの放出を追跡することで評価した。疎水性プローブとして、Forster resonance energy transfer（FRET）ペアとして機能する3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate（DiO、ドナー、λem 505 nm）および1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（DiI、アクセプター、λem 575 nm）を凝集体内部に封入した。凝集体コア中では、DiI/DiO同士が接触するため、FRETが生じるが、凝集体の崩壊またはDilとDiOの放出により、FRETが減少する。測定開始時（90% FBS添加時）、全てのプロオリゴヌクレオチドは、FRETにより生じる、Dil由来の575 nmの蛍光を示し、DiO由来の505 nmの蛍光は検出されなかった（図３ａ、ｂおよびｃ）。しかし、oleate-T20またはlinoleate-T20由来の凝集体では、測定開始後1時間以内でDiO由来の蛍光が急速に増大し、その後蛍光の増大は少なかった（図ａおよびｂ）。この結果から、oleate-T20およびlinoleate-T20からなる凝集体では、90% FBSの存在下において、分子が頻繁に出入りするのに十分な大きさの、緩い凝集体を形成することが示唆された。これに対し、linolenate-T20で構成される凝集体においては、oleate-T20およびlinoleate-T20とは異なり、DiO由来の蛍光は9時間程度かけて緩やかに増大した（図３ｃ）。この結果から、linolenate-T20によって形成され凝集体は、他の２つの凝集体よりも安定した形体を維持していることが示唆された。
　プロオリゴヌクレオチドの凝集体は、自己集合によって形成されるミセル様の小胞と考えられる。エンドサイトーシスの経路は小胞のサイズによって異なることが知られている。直径200 nm以下の小胞のエンドサイトーシスは、クラスリンを介したメカニズムによって進行する。他方、これより大きな小胞が細胞内へ取り込まれるためには、エネルギーに依存した工程が必要である（Biochem. J., 2004, 377, 159-169）。 Linolenate-T20で構成される凝集体は、直径200 nm未満の小胞で、その構造は、90 % FBS中で数時間維持された（図３ｃ）。他方、Linoleate-T20に由来する凝集体は、直径200 nm未満のサイズであったが、90% FBS中における存在時間は短く、oleate-T20は直径200 nm より大きなサイズで、90% FBS中における存在時間はさらに短かった。
　Linolenate-T20に由来の凝集体のサイズは、クラスリンを介したエンドサイトーシスが行われる小胞サイズの範囲である。従って、Linolenate-T20で構成される小胞は、以前報告されたように、平均200 nmのリポプレックス（lipoplex）と同様の経路で細胞内に取り込まれると推測される。
２－４．プロオリゴヌクレオチドの核移行
　linolenate-T10FT10を取り込んだ細胞の核内からは、強い蛍光が検出された（図２ｆおよびｇ）。このことは、リノレン酸が結合したオリゴヌクレオチドの細胞内輸送が、マイクロインジェクションで核領域に注入されると速やかに核内へ移行する短鎖DNAの場合と同様であることを示している。しかしながら、プロオリゴヌクレオチド凝集体のサイズは核膜孔のサイズ（8 nm）より大きい。核膜孔は、核膜に存在する輸送チャネルで、核と細胞質間の両方向性の物質交換を媒介する唯一の出入り口である。核膜孔のサイズよりも大きな核酸輸送核酸複合体は、核酸の核への輸送が制限されるとの報告がある。従って、核酸が核内へ輸送されるためには、核膜孔を通過し得る本来の核酸のサイズとなるように、核酸が複合体から分離される必要がある。
　プロオリゴヌクレオチドの凝集体は、エンドソームを介して細胞内へ取り込まれるが、エンドソーム内は、プロトンポンプの作用により弱酸性の環境にある。そこで、発明者らは、エンドソーム内におけると同程度の弱酸性条件（pH 5.2）でlinolenate-T20凝集体の安定性を調べるために、FRET解析を行った。その結果。Iinolenate-T20の凝集体は弱酸性（pH5.2）の環境では、oleate-T20およびlinoleate-T20由来の凝集体と同様に、DiO由来の蛍光が1時間以内に速やかに増大した（図３ｄ）。すなわち、linolenate-T20の凝集体は、酸性の環境下において容易に不安定化すると考えられる。
　エンドソームのような酸性環境下において、linolenate-T20の凝集体は不安定化し、エンドソームから放出され、その後、linolenate-T20のエステル結合は、細胞に内在するエステラーゼによって切断され、脂肪酸と核酸が分離されことが予想される。そこで、エステラーゼ処理後のlinolenate-T20の変化をモニターした。
　linolenate-T20をブタ肝臓由来のエステラーゼで処理した後、処理産物を逆相HPLCで分析した。エステラーゼ処理後、0、2、4、6および8時間後に反応物を逆相HPLCで分離したところ、linolenate-T20のピーク（プロオリゴ）は経時的に減少し（図４ＡおよびＢ）、代わって、ポリdTのピーク（オリゴ）が増大し、8時間後にはほぼ全てのlinolenate-T20が核酸（ポリdT）に変換されたことが確認された（図４Ｂ）。
　以上の結果を踏まえて、プロオリゴヌクレオチドを細胞へ添加してから、核酸が核へ輸送されるまでの経路について、図５に概念図としてまとめた。プロオリゴヌクレオチドの各ステップにおける反応およびその輸送は非常に速やかに進行すると考えられる。
　本発明にかかる担体－核酸等複合体（多価脂肪酸と核酸とのエステル）は、細胞内に容易に導入され、細胞内に不適切な残留物を残すことなく、本来の核酸としての機能を発揮し得る。従って、本発明は、核酸医薬などの創薬分野等においての利用が期待される。

Claims (9)

  1. 　核酸等を細胞内へ導入するための担体－核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする、前記複合体。
  2. 　前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする請求項１に記載の複合体。
  3. 　前記多価不飽和脂肪酸が、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、ピノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ－γ－リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択させることを特徴とする請求項１または２に記載の複合体。
  4. 　核酸等を細胞へ導入する方法であって、請求項１ないし３に記載の担体－核酸等複合体を細胞に接触させる工程を含む、前記方法。
  5. 　多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬。
  6. 　前記ハロゲン化アルキルエステルが、ヨウ化アルキルエステルであることを特徴とする、請求項５に記載の試薬。
  7. 　前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする請求項６に記載の試薬。
  8. 　前記多価不飽和脂肪酸が、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、ピノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ－γ－リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択されることを特徴とする請求項７に記載の試薬。
  9. 　請求項５ないし８のいずれかに記載の試薬と多価不飽和脂肪酸を混合する工程を含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の複合体を製造する方法。
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