JPWO2014057997A1

JPWO2014057997A1 - 初期化ペプチド及びその用途

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Publication number: JPWO2014057997A1
Application number: JP2014540878A
Authority: JP
Inventors: 仲信林; 和茂洲鎌; 克▲庸▼ 王
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2013-10-09
Publication date: 2016-09-05
Also published as: US20150267174A1; EP2907870A4; EP2907870A1; WO2014057997A1

Abstract

本発明は、分化細胞に、核移行シグナルを含む初期化ペプチドを導入することを含む、多能性スフェロイド細胞の製造方法；該初期化ペプチドを含んでなる、分化細胞からの多能性スフェロイド細胞誘導製剤などを提供する。本発明によれば、Oct3/4やSox2等の転写因子を含む初期化因子、HDAC阻害剤等の初期化を促進する低分子化合物を使用せずに、体細胞の初期化が可能となり、体細胞から人工多能性幹細胞様細胞やリプログラミングした細胞または分化転換した細胞を得ることができる。

Description

本発明は、多能性スフェロイド細胞に関する。具体的には、本発明は、分化細胞に核移行シグナルを有するペプチド、すなわち初期化ペプチドを導入することにより、多能性スフェロイド細胞を製造する方法に関する。また、本発明は、多能性スフェロイド細胞から分化した分化細胞及びその製造方法に関する。さらに、本発明は、初期化ペプチドを含む、組織の損傷を伴う疾患の治療剤に関する。

近年、マウス及びヒトの分化細胞を初期化してiPS細胞が相次いで樹立された。Takahashi及びYamanaka（非特許文献1）は、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を樹立した。Okitaら（非特許文献2）は、Fbx15よりも多能性細胞に発現が限局しているNanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾が胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog iPS細胞）を樹立することに成功した。同様の結果が他のグループによっても再現された（非特許文献3、非特許文献4）。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることが明らかとなった（非特許文献5）。

さらに、Takahashiら（非特許文献6）は、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した。一方、Yuら（非特許文献7）は、Oct3/4, Sox2, Nanog及びLin28遺伝子を使用してヒトiPS細胞を作製した。このように、体細胞に特定の因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。

前述のYuら（非特許文献7）においては、4種の遺伝子のうちNanogまたはLin28遺伝子を除いた3種の遺伝子導入によってiPS細胞コロニーが得られたが、Oct3/4またはSox2遺伝子を除いた3種の遺伝子導入ではiPS細胞コロニーは得られなかったことから、iPS細胞樹立におけるOct3/4及びSox2遺伝子の重要性が示されている（特許文献1も参照）。またParkら（非特許文献8）においても、iPS細胞の樹立にはOct3/4とSox2が必須であると述べられている。

さらにまた、特許文献2においては、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの各遺伝子を導入し、マウスiPS細胞を作製しているが、その際にDox-inducible systemでiPS細胞を誘導するという手法を開示している。また体細胞として成熟B細胞を用いてiPS細胞をうまく誘導できたことが記載されている。

また、体細胞からiPS細胞を誘導することに関する特許文献として、Yamanaka（特許文献3）及びThomsonら（特許文献1）が公開されている。

WO2008/118820 WO2008/124133 WO2007/069666

Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006) Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007) Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007) Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007) Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007) Park I.H et al., Nature, 451: 141-146 (2008)

上記のように、Yamanakaらの発見（Takahashi, K. and Yamanaka, S. Cell, 126: 663-676 (2006)）がブレークスルーとなって、体細胞から人工多能性幹細胞を誘導することを可能にする初期化因子として、いくつかの組み合わせが提案されており、そのいずれも体細胞から人工多能性幹細胞を誘導する。提案された初期化因子の組み合わせの中で共通する因子は、Oct3/4のみである。最近、Oct3/4だけで初期化が起こるとする報告がなされたが（Kim, J.B. et al., Cell, 136: 411-419 (2009)）、これによると、使用された体細胞はSox2遺伝子が内因的に発現されている神経幹細胞であるので、特殊な例であるといえる。また、Oct3/4と他の初期化因子との組み合わせのなかで、Oct3/4とSox2（WO2008/118820）、Oct3/4とKlf4（Kim, J.B. et al., Nature, 454: 646-650 (2008)、Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)）、またはOct3/4とc-Myc（Kim, J.B. et al., Nature, 454: 646-650 (2008)）からなる2因子の組み合わせが報告されている。
しかしながら、報告された初期化因子の組み合わせがなぜ体細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを可能にするのか明らかでないし、その作用機序についても明らかにされていない。

このような情況下において、本発明の目的は、これまでに報告されていない、体細胞の初期化を可能にする新規な方法を見出し、本方法を用いて、体細胞から人工多能性幹細胞様細胞やリプログラミングした細胞または分化転換した細胞を提供することである。

本発明者らは、今回、意外にも、Oct3/4やSox2等を含む山中4因子やその他の初期化因子、HDAC阻害剤等の初期化を促進する低分子化合物を使用せずに、核移行シグナルを有するペプチドを細胞内に導入することにより、体細胞等の分化細胞から多能性スフェロイド細胞を製造することが可能であることを見出した。
ここで「多能性スフェロイド細胞」とは、初期化ペプチドを分化細胞内に導入することによって得られる、多能性幹細胞としての性質をもつスフェロイド形成能のある細胞をいう。核移行シグナルを導入する分化細胞により、その性質は異なるが、形成されたスフェロイドは、多能性幹細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ、抗SSEA-3抗体、抗Tra-1-81抗体、抗Oct3/4抗体、抗Sox2抗体、抗Nanog抗体の陽性像を示し、初期化された多能性状態を呈する。

すなわち、本発明は、以下の発明などを提供するものである。
[１] 分化細胞に初期化ペプチドを導入することを含む、多能性スフェロイド細胞を製造する方法。
[２] 初期化ペプチドが核移行シグナルを有するペプチドである[１]記載の方法。
[３] 初期化ペプチドが核移行シグナルおよび細胞膜透過機能を持つペプチドである[１]に記載の方法。
[４] 初期化ペプチドを含んでなる培地中で分化細胞を培養することにより、分化細胞に初期化ペプチドを導入する、[１]に記載の方法。
[５] リバーストランスフェクション法を用いて分化細胞に初期化ペプチドを導入する、[１]に記載の方法。
[６] 多能性スフェロイドがペリサイトマーカー陽性である細胞である、［１］〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７] [１]〜[６]のいずれかに記載の方法で得られる多能性スフェロイド細胞。
[８] 初期化ペプチドを含んでなる、分化細胞からの多能性スフェロイド細胞誘導製剤。
[９] 初期化ペプチドが核移行シグナルを有するペプチドである[８]に記載の製剤。
[１０] [７]に記載の多能性スフェロイド細胞を含む医薬組成物。
[１１] 初期化ペプチドを含む、組織の損傷に伴う疾患の治療剤。
[１２] 組織の損傷に伴う疾患において、初期化ペプチドを、組織の損傷部位に投与することを含む、当該疾患の治療方法。
[１３] 組織の損傷に伴う疾患の治療に使用するための、初期化ペプチド。
[１４] [７]記載の多能性スフェロイド細胞を分化培地で培養することを含む、分化細胞の製造方法。
[１５] [１４]記載の方法により得られる分化細胞。

本発明により得られた多能性スフェロイド細胞を培養することにより、種々の細胞に分化させることができる。例えば、通常の接着性の培養器で培養を続けることにより、または、レチノイン酸やB-27サプリメント、bFGF、NGF等の分化誘導因子の存在下で培養することにより、神経系の細胞に分化させることができ、例えば、神経幹細胞マーカーである抗Nestin抗体陽性細胞や神経細胞マーカーである抗ニューロフィラメント(NF160)抗体、抗MAP2抗体、抗βTublin III抗体陽性細胞、グリア細胞マーカーである抗GFAP抗体陽性細胞が得られる。

このようにして得られた細胞は、神経疾患（脳卒中、神経変性疾患、パーキンソン病、脊髄損傷による神経脱落）等の疾患治療に用いることができる。
また、例えば、単純組成のサイトカイン添加低血清培地で培養を続けると約2週間で、抗プロインスリン抗体、抗c-peptide抗体での陽性細胞が得られる。通常、インスリン産生β細胞作製には、ES細胞やiPS細胞から胚様体（EB）を作製した後、各種濃度のブドウ糖、複数のサイトカイン、薬剤を加えた数種類の培地で、数ステップ、１〜２ヶ月の経過で分化誘導する方法が取られているが、今回発明した方法によれば、１〜２週間という短期間で高率に、多能性スフェロイドからインスリン産生β細胞の作製が可能となる。
このようにして得られた細胞は、糖尿病治療用の自家または他家のインスリンを分泌するβ細胞や糖尿病治療薬のスクリーニング用に用いることができる。

多能性スフェロイド細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、MUSE細胞と同様に多能性を示し、これらの多能性細胞と同様の分化培養条件で培養することにより多種の体性幹細胞や前駆細胞、分化細胞に分化させることが可能である。多能性スフェロイド細胞は、遺伝子を導入したり、高分子量の生理活性蛋白質を導入したりするのではなく、初期化ペプチドを分化細胞に導入するため、その導入量等の導入条件を容易に調節でき、分化細胞の初期化の程度を容易に調整することができる。

本発明をさらに詳細に説明する。
1. 定義
本明細書中で使用される用語は、以下の意味を包含する。その他の用語は、当業界で一般的に使用される意味を含むことが意図されている。
本発明の多能性スフェロイド細胞は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持つ細胞であり、以下の特性を有する。
（１）Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ-３、Ｔｒａ−１−８１及びＳｏｘ２等の多能性マーカー（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｍａｒｋｅｒ）を発現する。
（２）１細胞から増殖し、自己のクローンを作り続けるクローナリティー（Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を有する。
（３）自己複製（セルフリニューアル）能を有する。
（４）３胚葉系（内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系）へｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで分化し得る。
（５）マウスの精巣や皮下に移植した場合、腫瘍を形成しない。
（６）アルカリフォスファターゼ染色で陽性となる。
（７）細胞が多数凝集して３次元状態になったものであり、接着細胞が初期化ペプチドを導入することによりスフェロイド状に変化し、多分化能を有する細胞となる。

本発明の多能性スフェロイド細胞は、分化細胞である体細胞に初期化ペプチドを導入することにより得られる多能性細胞であるという点で一致するが、初期化された細胞である多能性スフェロイド細胞は非常に短時間で樹立することができる点、腫瘍を形成しない点で、人工多能性幹細胞等の他の多能性幹細胞と大きく異なる。ここで分化細胞である体細胞とは、生殖系列細胞（卵子、卵母細胞、胚性幹(ES)細胞など）を除く、哺乳動物由来のすべての細胞である。
また、本発明の多能性スフェロイド細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞等、神経幹細胞の一般的な体性幹細胞とは異なるが、ＭＵＳＥ細胞と類似の性質を有する。

さらに、本発明の多能性スフェロイド細胞は、以下の特性を有する。
（８）増殖速度が比較的緩やかで、分裂周期が１日以上、例えば１．２〜１．５日である。ただし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が示すような無限増殖は示さない。
（９）増殖の際に非対称分裂を伴う。
（10）核型は正常である。

さらに、本発明の多能性スフェロイド細胞はその初期化の程度に応じて、その性質は異なり、例えば本実施例で得られた多能性スフェロイド細胞は、分化多能性を有しており、間葉系幹細胞のマーカーCD105及び,周皮細胞PericytesのマーカーであるCD146がともに陽性である。
成体組織幹細胞とされる各組織に分散する多能性幹細胞には、代表的なものとして、間葉系幹細胞MSCや脂肪組織由来幹細胞があげられるが、その他にSKPs(skin-derived precursor cells; 皮膚由来前駆細胞）、毛包幹細胞(HFSC; Hair follicle stem cell)も存在する。
最近では、全身各組織に入り込む大小の血管の周囲に存在する周皮細胞（ペリサイト(Pericytes)）が、間葉系幹細胞や脂肪由来幹細胞等の多能性幹細胞のソースであり、全身各組織の再生・修復に深く関与しているのではないかと考えられている。
ここで、本発明の多能性スフェロイド細胞が、CD105およびCD146の両マーカーがダブル陽性であると言うことは、初期化ペプチドによって作成された多能性スフェロイドおよび細胞は、すでに各種臨床試験の段階に入っている間葉系幹細胞の臨床応用のように各種組織における再生・修復の細胞ソースとして活用でき、その間葉系幹細胞のオリジンと考えられる周皮細胞の性格も有するとなれば、さらに生理的な組織再生に応用できる。

本明細書で使用する「初期化」という用語は、「核初期化(nuclear reprogramming)」とも称され、分化した細胞が、未分化細胞、特に分化多能性細胞に誘導、変換される過程又は手段を指す。初期化という現象はもともと、脱核した未受精卵に体細胞の核を注入する、ES細胞を体細胞と融合させる、ES細胞抽出液を体細胞中に浸透化させる、などの方法によって観察されてきた。さらに、Oct3/4、Sox2、Klf4、Nanog、c-Myc、Lin28等の初期化遺伝子や蛋白質を体細胞に導入することにより初期化することが知られていた。本発明における初期化では、このような複雑な操作は必要なく、初期化ペプチド（リプロチン）を細胞に導入することにより、体細胞から多能性スフェロイド細胞へと初期化することができる。

「初期化ペプチド」とは、このような初期化を可能にするペプチドである。本明細書で使用される初期化ペプチドは、核移行シグナルを含むペプチドであって、核内で生理活性を示す転写調節因子等のタンパク質の本来の機能を有さないペプチドである。好ましくは、これらの核移行シグナルを含むペプチドであって、さらに細胞膜貫通機能を持つペプチドである。初期化ペプチドの好適な例としては、核移行シグナルとしては、SV40のラージT抗原の核移行シグナル、ヒストン2Bの核移行シグナル、FGF-2の核小体移行シグナル等が挙げられる。細胞膜貫通機能を有するペプチドとしては、例えばHIVのgp41の細胞膜貫通領域等が挙げられる。また、細胞膜貫通機能と核移行シグナルとしての機能とを併せ持つペネトラチン等の初期化ペプチドを使用することもできる。

初期化ペプチドを、分化細胞を培養する培地に加えることにより導入することができる。初期化ペプチドを培地に加える方法は、単純に培地に溶解する方法であってもよく、リバーストランスフェクション法を用いることもできる。リバーストランスフェクション法とは、具体的には、培養皿等の細胞を培養する固相表面に初期化ペプチドを塗布し風乾した後、又は風乾せずに、その上面から細胞を播種することにより行う。こうすることで、初期化ペプチドを分化細胞に効率よく導入することができる。リバーストランスフェクション法を用いることにより、高効率で・低毒性で細胞に初期化ペプチドを導入することができるため、初期化ペプチドの導入量のコントロールも容易である。

初期化ペプチドを培地に加える場合、その濃度は初期化ペプチドの種類、分化細胞の種類、培地の組成等の培養条件により異なるが、概ね10〜200 μg/mlの濃度で加える。好ましくは20〜80 μg/mlである。
リバーストランスフェクション法を用いるときは、その量は初期化ペプチドの種類、分化細胞の種類、培地の組成等の培養条件により異なるが、固相表面面積あたり概ね1 μg/cm²〜50 μg/cm²の濃度で加える。好ましくは2.5 μg/cm²〜10 μg/cm²である。

初期化ペプチドを分化細胞に導入して多能性スフェロイド細胞を製造するときに用いる培地は、一般的に分化細胞を培養するのに適した培地であればどのような培地でもよい。
体細胞の培養は、例えばDMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)、MEM (minimum essential medium)、α-MEM(minimum essential medium alpha modification)、Ham’s F12、RPMI1640、それらの混合培地などの基本培地に、血清(10% FBS等)、抗生物質（penicillin、streptomycin等）、ピルビン酸Na、グルタミン、非必須アミノ酸、L-デキストロースなどの物質を適宜選択して含有させた培地上で約37℃の温度、5% CO₂存在下にて行うことができる。

例えば、このようにしてリバーストランスフェクション法で初期化ペプチドを線維芽細胞に導入する場合、多能性スフェロイド形成は非常に迅速に起こり、細胞播種後数時間後から起こり、間葉上皮転換様の形態変化を経て、最終的には多能性スフェロイド形成、細胞増殖により多能性スフェロイドの増大経過をたどる。多能性スフェロイドは、直径100〜200 μmまで増大し、多能性スフェロイド形成は、２〜５日以内に完了する。また、これらの多能性スフェロイドには、少なくとも30〜50%以上の細胞が参加するようである。

多能性スフェロイドは、トリプシン等のプロテアーゼとコラゲナーゼ等で処理することによりシングルセルに解離することができる。具体的には、例えばＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液（ＣＴＫ溶液：リプロセル社製）およびＴｒｙｐＬＥ（ライフテクノロジー社製）を用いることができる。得られた細胞を再度培地で培養することにより継代が可能で、多能性スフェロイド細胞を増殖させることができる。

さらに、体細胞の初期化段階で、低酸素条件下で細胞を培養することによって多能性スフェロイド細胞の樹立効率を向上させることができる (Yoshida, Y. et al., Cell Stem Cell 5:237-241 (2009))。本明細書で使用する「低酸素条件」という用語は、細胞培養の際の酸素濃度が空気中の酸素濃度と比べてかなり低いことを意味している。具体的には、このような条件として、5〜10% CO₂ / 95〜90%空気の雰囲気中の酸素濃度より低い酸素濃度、例えば18％以下の酸素濃度からなる条件が挙げられる。前記雰囲気中の酸素濃度の好ましい例は、15％以下（例えば14％以下、13％以下、12％以下又は11％以下）、10％以下（例えば、9％以下、8％以下、7％以下又は6％以下）、或いは5％以下（例えば、4％以下、3％以下又は2％以下）である。或いは、前記雰囲気中の好ましい酸素濃度は、0.1％以上(例えば、0.2％以上、0.3％以上又は0.4％以上)、0.5％以上 (例えば、0.6％以上、0.7％以上、0.8％以上又は0.95％以上)、或いは1％以上 (例えば、1.1％以上、1.2％以上、1.3％以上又は1.4％以上)である。

細胞環境において前記低酸素状態を作るための手法としては、以下のものに限定されないが、酸素濃度を調節することが可能なCO₂インキュベーター中で細胞を培養するという最も簡単な方法でありかつ好ましい例としてのこの方法を挙げることができる。このようなインキュベーターは種々の装置メーカー（例えば、Thermo Scientific, 池本理化工業(Ikemoto Scientific Technology), 十慈フィールド(Juji Field), 和研薬(Wakenyaku)など)から市販されており、上記の目的で使用しうる。

本発明で使用可能な分化細胞は、上記定義のとおり、生殖系列細胞（卵子、卵母細胞、胚性幹(ES)細胞など）又は分化全能性細胞を除く、哺乳動物由来のすべての細胞である。
体細胞が由来する哺乳動物は、特に制限されずいかなる種類の動物も包含する。好ましい哺乳動物は、霊長類（例えばヒト、サル、チンパンジー等）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、及び有蹄類（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ等）、ペット動物(イヌ、ネコ等)から選択され、さらに好ましい哺乳動物はヒト及びマウスである。
体細胞には、非限定的に、胎児(仔)期の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含されるし、さらにまた、組織幹細胞や組織前駆細胞も包含される。
具体的には、体細胞は、非限定的に、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞などを包含する。

体細胞を得るための起源として適する哺乳動物個体は、非限定的に、好ましくは患者自身、或いは、得られた多能性スフェロイド細胞が再生医療のために使用されたときに拒絶反応が生じないという観点から、同一の又は実質的に同一のHLA型をもつ他人である。本明細書で使用するHLA型に関連した「実質的に同一」という用語は、多能性スフェロイド細胞の分化を誘導することによって作製された細胞が患者に移植されるときに、HLA型が、ドナーとレシピエントとの間で、主要HLA類(例えば、HLA-A, HLA-B及びHLA-DRの3つの遺伝子の遺伝子座)が同じである場合のように、移植された細胞が生存可能である程度に一致することを意味する。この定義は以下においても同様に使用される。多能性スフェロイド細胞が投与されないか又は移植されないとき、すなわち例えば、多能性スフェロイド細胞を、患者での薬剤の感受性や副作用の有無を評価するスクリーニング用の細胞供給源として使用する場合、体細胞を、患者自身から、或いは薬剤の感受性や副作用と相関する同一の遺伝子多型を有する他人から、得ることが望ましい。

多能性スフェロイド細胞の作製に先立ち、ヒトを含む哺乳動物から体細胞を取得し、これを動物細胞培養用培地にて培養し、必要であれば継代培養に付し、これにより初代培養細胞又は継代培養細胞を得る。このようにして得られた培養細胞を、多能性スフェロイド細胞の作製のために使用する。

多能性スフェロイド細胞の樹立効率を改善する物質を、培地に添加することによって、多能性スフェロイド細胞の樹立を促進することが可能である。このような物質には、例えば塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、幹細胞因子(SCF)などのサイトカインが含まれる。
また、例えばヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤、例えばバルプロ酸(VPA)(Huangfu, D.ら,Nat. Biotechnol., 26(7):795-797 (2008))、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(G9a)阻害剤、例えばBIX-01294 (BIX) (Shi, Y.ら,Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008);Kubicek, S.ら,Mol. Cell 25:473-481 (2007)；Shi, Y.ら, Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、DNAメチル化酵素(Dnmt)阻害剤、例えば5’-アザシチジン(Huangfu, D.ら,上記)などの低分子化合物が含まれる。またp53に対するshRNAやsiRNAなどのp53阻害剤や、UTF1を細胞内に導入してもよい（Yang Zhaoら, Cell Stem Cell, 3, pp475-479, 2008)。他にもシグナル伝達に関して、Wntシグナルの活性化（Marson A.ら, Cell Stem Cell, 3, pp132-135, 2008）や、マイトジェン活性化プロテインキナーゼおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ-3シグナル伝達の阻害（Silva J.ら, PloS Biology, 6, pp2237-2247 2008）など、さらにはES細胞特異的miRNA (例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell Biol. Doi:10. 1128/MCB. 00398-08), miR-302 (RNA 14:1-10 (2008)), miR-291-3p, Mir-294及びmiR-295 (Nat. Biotechnol. 27:459-461 (2009))の導入などによっても、多能性スフェロイド細胞の樹立効率を改善することができる。

上記のような樹立効率改善物質は、分化多能性に関わる遺伝子の活性化及び分化細胞で特異的に発現される遺伝子の不活性化の両方に何らかの作用をすることが、推定されている(Huangfu, D.ら,上記)。本発明の方法においても、樹立効率改善物質を使用することによって、体細胞から多能性スフェロイド細胞細胞への初期化（すなわち、再プログラム化）を促進することが可能である。

本発明の多能性スフェロイド細胞は、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙを有しており、あらゆる組織へと分化し得る。該多能性スフェロイド細胞は、再生医療等に用いることができる。例えば、各種組織、各種器官等の再生に用いることができる。具体的には神経、脳脊髄、肝臓、筋肉、膵島等が挙げられる。本発明の多能性スフェロイド細胞を、損傷あるいは障害を受けた組織、器官等に直接あるいは近傍に投与することにより、該多能性幹細胞はその組織、器官内に侵入し、その組織特有の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。また、静脈投与等により全身投与してもよい。この場合、該多能性スフェロイド細胞は、例えば、損傷を受けた組織や器官をホーミング等により指向し、そこに到達・侵入した上で、その組織や器官の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。

投与は、例えば皮下注、静注、筋注、腹腔内注等の非経口投与や経口投与、あるいは胚への子宮内注射等により行うことができる。また、局所投与でも全身投与でもよい。局所投与は例えばカテーテルを利用して行うことができる。投与量は、再生しようとする器官、組織の種類や、サイズにより適宜決定することができる。

再生しようとする器官は限定されず、骨髄、脊髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房-乳腺、脂肪組織、角膜、および口、食道、膣、肛門を含む粘膜等を含む。また、治療対象となる疾患として、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、血液系疾患、脊髄損傷等の変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症、移植拒絶、虚血、炎症、皮膚や筋肉の損傷等が挙げられる。

細胞は医薬として許容される基材と共に投与してもよい。該基材は例えばコラーゲン等でできた生体親和性が高い物質や、生分解性の物質でできており、粒子状、板状、筒状、容器状等の形状とすればよく、細胞を該基材に結合させあるいは該基材中に収容して投与すればよい。

また、本発明の多能性スフェロイド細胞をｉｎｖｉｔｒｏで分化誘導し、さらに分化した細胞を用いて組織を構築させ、該分化した細胞又は該組織を移植してもよい。本発明の多能性スフェロイド細胞は、腫瘍化しないので、移植した前記分化した細胞又は該組織に本発明の多能性スフェロイド細胞が未分化のまま含まれていても、癌化の可能性が低く安全である。これらの再生医療において、移植した細胞又は組織のレシピエントによる拒絶を避けるためには、再生医療を受けようとする患者から中胚葉系組織又は間葉系組織等の分化細胞を採取し、該組織から本発明の多能性スフェロイド細胞を製造し、利用することが望ましい。さらに、本発明の多能性スフェロイド細胞を組織の変性や機能不全を原因とする疾患の治療に用いることができる。この場合、例えば、本発明の多能性スフェロイド細胞をｅｘｖｉｖｏで濃縮し、増殖させ、あるいは分化させて体内に戻せばよく、例えば、多能性スフェロイド細胞を特定の組織の細胞に分化させ、該細胞を治療しようとする組織に移植すればよい。また、細胞の移植により、ｉｎｓｉｔｕ細胞治療を行うこともできる。この場合、対象細胞の例として、肝臓細胞、神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞、皮膚細胞、骨格筋細胞などの筋肉細胞が挙げられ、本発明の多能性スフェロイド細胞をこれらの細胞に分化させ、移植し、ｉｎｓｉｔｕで治療を行うことができる。該治療により、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷、筋変性疾患などを治療することができる。本発明の多能性スフェロイド細胞は、腫瘍化しないので、このような治療に用いても癌化の可能性が低く安全である。

また、本発明の多能性スフェロイド細胞を分化させて、血液や血液成分を形成させることにより、血液や血液成分をｅｘｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏで形成させることができる。血液成分として、赤血球、白血球、血小板等が挙げられる。このようにして形成させた血液や血液成分を、自家輸血や他家輸血に用いることができる。

上記のように、本発明の多能性スフェロイド細胞を治療に用いる場合、ｅｘｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏのいずれで分化させてもよい。本発明の多能性スフェロイド細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞、稀突起膠細胞等に分化する。本発明の多能性スフェロイド細胞の分化は、分化因子の存在下で、培養することにより達成することができる。分化因子としては、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびイソプロテレノール；あるいは繊維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。本発明は、本発明の多能性スフェロイド細胞から分化した細胞も包含する。

本発明の多能性スフェロイド細胞を治療に用いる場合、タンパク質性の抗癌物質や生理活性物質等をコードする遺伝子を導入してもよい。これにより、本発明の多能性スフェロイド細胞は、治療薬のデリバリー機能も有することになる。このような物質として例えば、抗血管新生薬が挙げられる。

本発明の初期化ペプチドを含む、組織の損傷に伴う疾患の治療剤は、各種組織に投与することで、組織の細胞の一部が多能性スフェロイド細胞に変化し、各組織で必要な細胞に分化することにより、組織を再生することができる。例えば、各種組織、各種器官等の再生に用いることができる。具体的には神経、脳脊髄、肝臓、筋肉、膵島等が挙げられる。本発明の多能性スフェロイド細胞を損傷あるいは障害を受けた組織、器官等に直接あるいは近傍に投与することにより、該多能性幹細胞はその組織、器官内に侵入し、その組織特有の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。

投与は、再生しようとする組織、器官に直接投与することにより行うことができる。投与量は、再生しようとする器官、組織の種類や、サイズにより適宜決定することができる。

以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、その実施例によって制限されないものとする。

実施例１初期化ペプチドを用いた多能性スフェロイド細胞の作製
ヒト成人線維芽細胞株ＴＩＧ１１３を、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭを主体とした培地中、３７℃、５％ＣＯ_２、加湿条件下において１ｘ１０^７細胞数に到達するまで培養した。リバーストランスフェクション用のプレートは、表１に示された各ペプチドを１２ウェルプレートのそれぞれのウェルに３０μｇ／ウェルの濃度でコーティングした後、風乾によって固相化することで準備した。増殖したＴＩＧ１１３をＣＭＦ−ＰＢＳで洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液で３７℃、１０−１５分インキュベートすることで細胞を解離し、遠心とＰＢＳによる洗浄を２回繰り返した後ｉＰＳ培地（リプロセル社製）に懸濁した。その細胞懸濁液を用いて２ｘ１０^４細胞数のヒト線維芽細胞を、リバーストランスフェクション用のプレートに播種した。リバーストランスフェクション培地として、１０％ウシ胎児血清を含みｂＦＧＦを含まないｉＰＳ培地を用いた。形成されたＥＳコロニー様スフェロイド数を７−１０日後に計測しスフェロイド形成度を判定した（表１）。Ｈ１１，Ｈ１６，Ｈ２９のペプチドを用いた実験ではスフェロイドを形成する細胞の割合を計測した。

上記の各種ペプチドを用いた実験の結果、以下の知見が得られた。
１）ｇｐ４１のアミノ酸；ＨＩＶｇｐ４１＝ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡ（配列番号２１）が変異するとスフェロイド形成能が無くなることがＨ１−Ｈ４の実験結果から分かった。よってＨＩＶｇｐ４１の細胞膜透過機能はスフェロイド形成に重要である。
２）Ｈ１３にスフェロイド形成能がない。よってＨＩＶｇｐ４１の細胞膜透過機能だけではスフェロイド形成はしない。
３）Ｈ１８（ＳＶ４０ＬａｒｇｅＴａｎｔｉｇｅｎＮＬＳ）のみではスフェロイド形成しない。よって核膜貫通機能だけではスフェロイド形成はしない。
４）Ｈ１３とＨ１８を単純に一緒に固相化した場合スフェロイド形成される。よってＨＩＶｇｐ４１ペプチドとＳＶ４０ＬａｒｇｅＴａｎｔｉｇｅｎＮＬＳペプチドが同時に作動することがスフェロイド形成に重要である。
５）細胞膜貫通機能および核膜貫通機能があるＨ１６（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）は、単独でスフェロイド形成が認められた。
６）Ｈ２９にスフェロイド形成能がある。よってＨ２ＢＮＬＳにもスフェロイド形成能がある。
７）スフェロイド形成に参加する細胞数はＨ１１，Ｈ１６，Ｈ２９では８０−９０％以上である。
結論
細胞膜透過機能と核膜貫通機能があるペプチドやペプチドの組み合わせにスフェロイド形成活性がある。

実施例２多能性スフェロイド細胞のキャラクタリゼーション
実施例１において、初期化ペプチドを分化細胞に導入することにより得られた多能性スフェロイド細胞についての未分化、神経マーカー等の発現を調べた。
表１で示したＨ１１ペプチドを用い、実施例１で示した方法により細胞をスフェロイド形成させ、１％Ｈ_２Ｏ_２を含むメタノールを用い室温で５分間でインキュベートして細胞を固定した。その細胞をＰＢＳで５回洗浄後、５％ＦＢＳ／０．０５％ゼラチン／３％スキムミルク／１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下ブロックエース）で室温中１〜２時間ブロッキングした。さらにその細胞をブロックエースに適宜希釈された表２に示される１次抗体と室温２時間反応させた。そしてその細胞をＰＢＳで５回洗浄した後、ＨＰＲ標識された二次抗体をブロックエースに適宜希釈し室温１時間反応させた。最後にその細胞をＰＢＳで５回洗浄した後、ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｔａｉｎＤＡＢＫｉｔ＆エンハンサー（ナカライテスク）のプロトコールに従って抗原を可視化した。
アルカリフォスファターゼ染色のため、前記方法で固定した細胞をＢＣＩＰ／ＮＢＴＣｏｌｏｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて室温で３０分インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄することで反応を停止させた。

結果
その結果、該細胞は、多能性マーカーであるアルカリフォスファターゼ，Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，ＳＳＥＡ−３，Ｔｒａ−１−８１を発現していることを確認した。培養期間が長くなると、神経幹細胞マーカーのマーカーであるネスチン、神経マーカーであるニューロフィラメント１６０，ベータＩＩＩチューブリン，ＭＡＰ２，ＧＦＡＰが発現していることを確認した。さらに、インスリン産生細胞マーカーであるプロインシュリン，Ｃ−ペプチドも発現していることを確認した。
結論
当該スフェロイド形成細胞は、各種マーカー発現において対応する公知細胞は存在せず、新規細胞である。

実施例３ヒト成人線維芽細胞を用いた多能性スフェロイド細胞の調製
実施例１と同様の方法を用いて、ヒト線維芽細胞（倉敷紡績社製）にＨ１１のペプチドを導入した。細胞は、上皮-間葉細胞分化転換様の変化を示し、最終的にはスフェロイドを形成した。
調製したスフェロイドについて、実施例２の方法で多能性マーカー及び分化マーカーの発現解析を行った。その結果、アルカリフォスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇの多能性マーカーは陽性であった。さらに、培養を続けることにより神経幹細胞マーカーであるネスチン、神経マーカーであるニューロフィラメント１６０，ベータＩＩＩチューブリン，ＭＡＰ２，ＧＦＡＰが発現していることを確認した。さらに、インスリン産生細胞マーカーであるプロインシュリン，Ｃ−ペプチドも発現していることを確認した。
また、アルファフェトプロテインおよびアルブミンの発現も確認した。さらにオイルレッドO染色法でも染まり、脂肪組織にも分化していることが分かった。

実施例４種々の細胞を用いた多能性スフェロイド細胞の調製
実施例１と同様の方法で、BHK21、A549、H293細胞、マウスフィーダー細胞（コスモバイオ社：RCHEFC003）、ウシ血管内皮細胞（東洋紡社：CAB300K05）、ブタ血管内皮細胞（東洋紡社：CAP300K05）にＨ１１のペプチドを導入した。いずれの細胞もスフェロイドを形成し、アルカリフォスファターゼ、SSEA-3陽性の細胞を得られた。

実施例５多能性スフェロイド細胞のキャラクタリゼーション
実施例１において、初期化ペプチドを分化細胞に導入することにより得られた多能性スフェロイド細胞についての未分化、神経マーカー等の発現を調べた。
表１で示したＨ１１ペプチドを用い、実施例１で示した方法により細胞をスフェロイド形成させ、１％Ｈ_２Ｏ_２を含むメタノールを用い、室温で５分間インキュベートして細胞を固定した。
表３記載の抗体を用いて、添付文書に従い染色した。2次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体（Promega製Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate）を用いた。
その結果、間葉系幹細胞のマーカーCD105及び,周皮細胞PericytesのマーカーであるCD146がともに陽性であった。血管内皮細胞マーカーであるCD31に関しては陰性であった。

本発明の多能性スフェロイド細胞は、人工多能性幹細胞と同様に任意の分化細胞から作製することができ、しかも人工多能性幹細胞等の他の多能性幹細胞よりも短期間で、簡便な方法により得ることができる。また、他の多能性幹細胞に比べて短期間で種々の体細胞・組織に分化させることができ、かつ腫瘍形成が起こらないので、再生医療や創薬の分野で極めて有用な細胞ソースとなり得る。

本出願は、2012年10月9日付で日本国に出願された特願2012-224618を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。

Claims

分化細胞に初期化ペプチドを導入することを含む、多能性スフェロイド細胞を製造する方法。
初期化ペプチドが核移行シグナルを有するペプチドである、請求項１に記載の方法。
初期化ペプチドが核移行シグナルおよび細胞膜透過機能を持つペプチドである、請求項１に記載の方法。
初期化ペプチドを含んでなる培地中で分化細胞を培養することにより、分化細胞に初期化ペプチドを導入する、請求項１に記載の方法。
リバーストランスフェクション法を用いて分化細胞に初期化ペプチドを導入する、請求項１に記載の方法。
多能性スフェロイドがペリサイトマーカー陽性である細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られる多能性スフェロイド細胞。
初期化ペプチドを含んでなる、分化細胞からの多能性スフェロイド細胞誘導製剤。
初期化ペプチドが核移行シグナルを有するペプチドである、請求項８に記載の製剤。
請求項７に記載の多能性スフェロイド細胞を含む医薬組成物。
初期化ペプチドを含む、組織の損傷に伴う疾患の治療剤。
組織の損傷に伴う疾患において、初期化ペプチドを、組織の損傷部位に投与することを含む、当該疾患の治療方法。
組織の損傷に伴う疾患の治療に使用するための、初期化ペプチド。
請求項７に記載の多能性スフェロイド細胞を分化培地で培養することを含む、分化細胞の製造方法。
請求項１４に記載の方法により得られる分化細胞。