WO2005073386A1 - 遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するための組成物および方法 - Google Patents

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Masato Miyake
Tomohiro Yoshikawa
Eiichiro Uchimura
Jun Miyake
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    • B01J2219/00722—Nucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a technique for fixing genetic material. More specifically, the present invention relates to a method for immobilizing a substance such as a biomolecule on a solid support, and a kit, a composition, and the like related thereto.
  • Conventional methods for immobilizing biomolecules on a support include, for example, a method via a covalent bond, a hydrophobic interaction, adsorption, and a solid phase surface treatment such as silanization.
  • Nikiforov et al. Disclosed a method utilizing the binding of an oligomer to a polystyrene gel using a cationic surfactant as a medium (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 A technology for binding to an microtiter well was disclosed (Non-Patent Document 2). Dahlen, P. et al., Describe that cloning capture DNA is adsorbed to a well in a sandwich hybridization in a microtiter well (Non-Patent Document 3). Nikiforov Nikiforov et al. (Non-Patent Document 4) has studied the binding of oligomers to polystyrene beads using NaCl as a medium.
  • the present inventors have found a method of interposing a salt in order to immobilize a biological substance on a support. There is a need to fix the cells to the cells so that they can be introduced into cells. In particular, if arrays of various patterns can be created by arbitrarily mixing a plurality of genetic substances on a support (for example, an array), the development speed of cells is expected to increase significantly. Therefore, the emergence of such technology has been awaited.
  • Non-patent literature l Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22: 4167-4175, 1994
  • Non-patent document 2 Nagata et al., FEBS Letters 183: 379-382 (1985)
  • Non-patent document 3 Dahlen et al., Mol. Cell. Probes 1: 159-168 (1987)
  • Non-patent document 4 PCR Methods Applic. 3: 285—291, 1994
  • an object of the present invention was to develop a method of immobilizing genetic material on a support and introducing it into cells.
  • the present invention also provides a method for releasing a substance such as a biomolecule immobilized upon dissolution in a specific solution after immobilization on a support, or substantially maintaining or improving affinity for a living body such as a cell.
  • One of the issues was to develop a fixing method that would achieve the desired effect.
  • the aim was to develop a technique that allows multiple genetic materials to be arranged on a support in an arbitrary pattern and then introduced into cells.
  • the problem described above is to combine a genetic material such as DNA, RNA, or polypeptide with a substance having an opposite charge, and a salt (organic salt, inorganic salt (for example, inorganic salt such as calcium phosphate contained in a medium)).
  • a salt organic salt, inorganic salt (for example, inorganic salt such as calcium phosphate contained in a medium)
  • the present inventors have also proposed a fixed genetic It was unexpectedly found that the substance, once immobilized, was released slowly when the support (eg, plate) was immersed in a solution such as Atsey's solution.
  • the present inventors have also found that the use of the above-described configuration maintains or improves the affinity for living organisms (eg, tissues, cells).
  • the present invention provides the following.
  • a kit comprising: instructions for mixing the genetic material, the charged material, and a salt on a solid support.
  • kit according to item 1 wherein at least two substances selected from the group consisting of the genetic material, the charged substance, and the salt are provided as a mixture.
  • kits according to item 1 wherein the genetic material is selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA and a combination thereof.
  • biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, lipid, sugar, small organic molecule, and a complex thereof.
  • the charged substance is selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a cationic polyamino acid, and a complex thereof.
  • the charged substance is selected from the group consisting of a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, a ribosome-based reagent, and a charged colloid.
  • kit according to item 1 wherein the salt is obtained by substituting hydrogen of an organic or inorganic acid with a metal or by substituting a hydroxyl group of a base with an organic or inorganic acid group.
  • the above salts are selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins.
  • kit according to item 1 wherein the salt is provided in the form of a buffer, a culture solution and serum.
  • biomolecule is selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, lipid, sugar, small organic molecule, and a complex thereof.
  • the charged substance is a cationic polymer, a cationic lipid, a cationic polyamide.
  • Item 17 The method according to Item 16, wherein the method is selected from the group consisting of:
  • the charged substance is selected from the group consisting of a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, a ribosome-based reagent, and a charged colloid.
  • the salt is selected from the group consisting of calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins. The method described in item 16.
  • the support comprises a material selected from the group consisting of glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer and synthetic polymer.
  • the support is a chip, and the complex is arranged in an array on the chip.
  • a support having genetic material, a charged material having a charge opposite to that of the genetic material, and a salt fixed to the surface.
  • the above salts include calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide.
  • the support according to item 41 which is selected from the group consisting of gum, iron nitrate, amino acids and vitamins.
  • FIG. 1 is a typical result example of Example 4.
  • Figure 1 shows the results of comparing uncomplexed DNA (top) with positively charged material and complexed DNA (bottom, treated with NP10). The state of transfection immediately after the addition of the complex to the solid phase (0 min) and after 1 min, 5 min and 10 min after the addition of the cell-containing solution
  • FIG. 2 shows an example of the result of printing (overlapping) with human mesenchymal stem cells of Example 4.
  • LipofectAMINE2000 was printed at the same coordinates and dried.
  • the fibronectin solution was printed at the same coordinates and dried.
  • mesenchymal stem cells were seeded and cultured for 2 days, and then an image was obtained with a fluorescent image scanner.
  • FIG. 3 shows the state of gene expression on day 3 after transfection into HeLa-K cells in Example 5.
  • PEGFP-Nl and pDsRed2-l, pEGFP-Nl and pPUR6iGFP272 vector were printed on a solid-phase substrate, respectively, dried, and then LipofectAMINE2000 was printed at the same coordinates and dried. Thereafter, the fibronectin solution was printed on the same coordinates and dried.
  • HeLa_K cells were seeded on this, cultured for 3 days, and then an image was obtained with a fluorescent image scanner.
  • FIG. 4 shows the state of gene expression on day 6 after transfection into HeLa-K cells in Example 5.
  • PEGFP-Nl and pDsRed2-l, pEGFP-Nl and pPUR6iGFP272 vector were printed on a solid-phase substrate, respectively, dried, and then LipofectAMINE2000 was printed at the same coordinates and dried. Thereafter, the fibronectin solution was printed on the same coordinates and dried.
  • HeLa-K cells were inoculated on this, cultured for 6 days, and then an image was obtained with a fluorescence image scanner.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing a method for producing a solid-phase transfer excision array (SPTA). This figure illustrates the methodology of solid phase transfer.
  • FIG. 6 shows the results of solid-phase transfer extrusion. The result of producing SPTA using the HEK293 cell line is shown. The part fluorescing green indicates transfected adherent cells. The bar is 3mm.
  • FIG. 7A and FIG. 7B are results showing a comparison between a liquid phase transfusion and SPTA.
  • FIG. 7A shows the results of measuring the GFP intensity / mm 2 for the five cell lines used in the experiment.
  • FIG. 7A shows a method of determining the transfection efficiency as the total fluorescence intensity per unit area.
  • FIG. 7A and FIG. 7B are results showing a comparison between a liquid phase transfusion and SPTA.
  • FIG. 7B is a fluorescent image of EGFP-expressing cells corresponding to the data shown in FIG. 7A.
  • a region indicated by a white circle indicates a region where the plasmid DNA is immobilized.
  • EGFP-expressing cells were not observed even though the cells were immobilized on the solid phase.
  • the white bar indicates 500 xm.
  • a comparison between a conventional liquid phase transfer and SPTA is shown. The upper liquid phase transfer and the lower phase transfer (bottom) correspond to Fig.
  • FIGS. 7C and 7D show an example of a typical protocol of the solid-phase transfection method.
  • FIGS. 7C and D show a typical protocol example of the solid phase transfer method.
  • FIG. 8 shows the result of reducing mutual contamination by coating of the chip.
  • FIG. 8 shows the results of the liquid phase transfection method and SPTA performed using HEK293 cells, HeLa cells, NIT3T3 cells (shown as “3T3”), HepG2 cells, and hMSC. The transfusion efficiency is indicated by GFP intensity. Research results on mutual contamination.
  • pEGFP-NM1 and pDsRed2_N1 are printed in a pine pattern and cultured for hMSC (panelette A) and HEK293 (panel B).
  • FIG. 9 is a graph showing the transcription of the RNAi transcription array in Example 7. The results are shown. Each reporter gene shown in Table 3 was printed on a solid substrate at 4 spots per gene. After drying, the reporter genes corresponding to the siRNAs (28 types) for each transcription factor were printed. It was printed on the coordinates where it was and dried. As a control, siRNA for EGFP was used, and as a negative control,
  • LipofectAMINE2000 was printed on each gene print at the same position and dried. Then, the fibronectin solution was printed on the same coordinates and dried. HeLa_K cells were seeded on this, cultured for 2 days, and then an image was obtained with a fluorescence image scanner.
  • FIG. 10 shows the results of the transfection of the RNAi transfection array in Example 7 for each cell. After the fluorescence brightness of each reporter was quantified by image analysis, the ratio of the brightness of each reporter on which a scrambled RNA as a negative control was printed was calculated. This shows the results of performing this for all reporters and cells.
  • FIG. 11 shows the results of transfection of the RNAi transfection array in Example 8.
  • Each reporter gene expression unit PCR fragment shown in Table 3 is printed on a solid-phase substrate at 4 spots per gene, and after drying, reporter genes corresponding to siRNA (28 types) for each transcription factor are printed. Printed on the coordinates indicated and dried.
  • siRNA for EGFP was used as a control, and scrambled RNA was used as a negative control.
  • LipofectAMINE2000 was printed at the same coordinates of each gene print and dried.
  • the fibronectin solution was printed on the same coordinates and dried. After inoculating each cell with this and culturing for 2 days, an image was obtained with a fluorescence image scanner.
  • FIG. 12 shows the results of the transfection of the RNAi transfection array in Example 8 for each cell. After the fluorescence brightness of each reporter was quantified by image analysis, the ratio of the brightness of each reporter on which a scrambled RNA as a negative control was printed was calculated. This shows the results of performing this for all reporters and cells.
  • FIG. 13 shows the structure of the PCR fragment obtained in Example 8.
  • FIG. 14 shows the structure of pEGFP_Nl.
  • FIG. 15 shows a comparison of transfection efficiency of a transfection microarray using a circular DNA (three on the left, pEGFP_Nl) and a PCR fragment (three on the right, EGFP expression unit).
  • SEQ ID NO: 1 Sequence of pUR6iGFP272 insert
  • SEQ ID NO: 4 PCR fragment from PCR reaction of Example 8.
  • genetic material refers to any material that carries genetic information. Such substances include, but are not limited to, for example, DNA, RNA, PNA, proteins, and the like.
  • the DNA can be in any form, such as cDNA, genomic DNA, artificial DNA, RNAi.
  • RNA may be mRNA, tRNA, rRNA, RNAi, and the like.
  • chargeable substance refers to a substance that may or may have a charge.
  • Such materials include, but are not limited to, positively charged materials and negatively charged materials.
  • the term "positively charged substance” includes all substances having a positive charge. Such substances include, but are not limited to, cationic substances such as cationic polymers, cationic lipids, and the like. Preferably, just such a load
  • the charged substance is a substance capable of forming a complex.
  • Positively charged substances capable of forming such a complex include, for example, substances having a certain molecular weight, such as cationic polymers, or specific solvents, such as cationic lipids (for example, (Water, aqueous solution, etc.) and the like that can remain without being dissolved to some extent, but are not limited thereto.
  • Such preferred positively charged substances include, but are not limited to, for example, polyethyleneimine, poly-L-lysine, synthetic polypeptides or derivatives thereof, and the like.
  • positively charged substances include, but are not limited to, biomolecules such as histones, synthetic polypeptides, and the like.
  • the type of such preferred positively charged substance will vary depending on the type of negatively charged substance that is the partner that forms the complex. Selecting a preferred complexing partner is straightforward to one of skill in the art, and such selection can be made using techniques well known in the art.
  • Various parameters can be considered in selecting such a preferred complexing partner. Such parameters include, for example, various physical and chemical parameters such as charge, molecular weight, hydrophobicity, hydrophilicity, nature of the substituents, pH, temperature, salt concentration, and pressure. Not limited to them.
  • cationic polymer refers to a polymer having a cationic functional group, and includes, for example, polyethyleneimine, poly L-lysine, a synthetic polypeptide or a derivative thereof. Not limited to them.
  • cationic lipid refers to a lipid having a cationic functional group, and includes, but is not limited to, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, and derivatives thereof. Les ,.
  • examples of the cationic functional group include, but are not limited to, primary amine, secondary amine, and tertiary amine.
  • the term "negatively charged substance” includes all substances having a negative charge.
  • examples of such substances include, but are not limited to, biomolecular polymers such as DNA, and anionic substances such as anionic lipids.
  • a negatively charged substance is advantageously a substance capable of forming a complex .
  • Negatively charged substances capable of forming such a complex include, for example, substances having a certain molecular weight such as anionic polymers such as DNA, or specific substances such as anionic lipids. Substances that can remain in the solvent (eg, water, aqueous solution, etc.) without being dissolved to some extent, but are not limited thereto.
  • Such preferred negatively charged substances include, but are not limited to, for example, DNA, RNA, PNA, polypeptides, chemical compounds, and complexes thereof.
  • negatively charged substances include, but are not limited to, biomolecules such as DNA, RNA, PNA, polypeptides, chemical compounds, and complexes thereof, and the like.
  • the type of such preferred negatively charged substances will vary depending on the type of positively charged substance that is the partner that forms the complex.
  • the choice of a complex-forming partner is straightforward for a person skilled in the art, and such a selection can be made using techniques well known in the art.
  • Various parameters can be considered in selecting such a preferred complexing partner. Such parameters also include various ones as well as the parameters to be considered in the above positively charged materials.
  • anionic polymer refers to a polymer having an anionic functional group, and examples thereof include DNA, RNA, PNA, polypeptide, chemical compounds, and complexes thereof. But not limited to them.
  • anionic lipid refers to a lipid having an anionic functional group, and examples thereof include, but are not limited to, phosphatidic acid and phosphatidylserine.
  • examples of the anionic functional group include, but are not limited to, a carboxyl group and a phosphate group.
  • the genetic material of the present invention refers to a "charged substance having an opposite charge" when the genetic substance is a positively charged substance as described above, and refers to a negatively charged substance. If the genetic material is a negatively charged material as described above, a positively charged material should be used.
  • the charge of the target substance can be converted. If the preferred complex partner has the same charge as the substance intended for fixation, either It is possible to promote complex formation by converting the electric charge of the complex.
  • interaction refers to two objects exerting a force on each other when referring to two objects.
  • interactions include, but are not limited to, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, etc. Not done.
  • the interaction is a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, or the like.
  • shared bond is used in a general sense in the art, and refers to a chemical bond formed by sharing an electron pair with two atoms.
  • hydrogen bond is used in the ordinary sense in the art, and has a high electronegativity, only one atom, and the atomic nucleus of a hydrogen atom attracted by extranuclear electrons of the hydrogen atom. Is exposed, which refers to the bond created by attracting another electronegative atom, for example, between a hydrogen atom and an electronegative (fluorine, oxygen, nitrogen, etc.) atom.
  • Biomolecules include, but are not limited to, molecules extracted from living organisms. Any molecule that can affect living organisms is included in the definition of biomolecules. Therefore, molecules synthesized in combinatorial chemistry are included in the definition of biological material as long as they are intended to have an effect on living organisms.
  • Bio substances include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, including DNA such as cDNA and genomic DNA, and RNA such as mRNA), polysaccharides, oligosaccharides. Examples include, but are not limited to, saccharides, lipids, small molecules (eg, small organic molecules), composite molecules thereof, and the like. Thus, biological materials can include cells themselves, parts of tissues, and other materials, as long as they can form a complex with the polymer molecule.
  • polymer molecule refers to a high molecular weight substance formed by polymerization of a monomer, and generally has a molecular weight of about 5,000 or more.
  • protein As used herein, the terms "protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to an amino acid of any length or a modification thereof.
  • the body polymer This polymer may be linear or branched It may be annular.
  • the amino acids may be natural or unnatural and may be modified amino acids.
  • the term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (eg, including unnatural amino acids and the like), peptidomimetic compounds (eg, peptoids) and those known in the art. Other modifications are included.
  • polypeptides containing one or more analogs of an amino acid eg, including unnatural amino acids and the like
  • peptidomimetic compounds eg, peptoids
  • polynucleotide As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide”, “nucleic acid” and “nucleic acid molecule” are used interchangeably herein and refer to a nucleotide of any length or a variant thereof. Refers to a polymer. The term also includes “derivative oligonucleotides” or “derivative polynucleotides.” As used herein, the term “gene” may be used interchangeably with “polynucleotide”, “oligonucleotide”, “nucleic acid” and “nucleic acid molecule”.
  • oligonucleotide or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide having an unusual force or a bond between nucleotides containing nucleotide derivatives, and is used interchangeably.
  • Specific examples of such oligonucleotides include 2,1-methyl-ribonucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and an oligonucleotide.
  • nucleic acid sequence also includes conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and complementary sequences thereof, as well as explicitly stated sequences. Is contemplated. Specifically, degenerate codon substitutions are made by creating a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons has been replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); ⁇ htsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (11985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91. —98 (1994)).
  • degenerate codon substitutions are made by creating a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons has been replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue.
  • RNAi is an abbreviation for RNA interference, and a homologous mRNA is specifically expressed by introducing a factor that causes RNAi such as double-stranded RNA (also referred to as dsRNA) into cells.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RNAi may also be used synonymously with factors that cause RNAi in some cases.
  • factor causing RNAi refers to any factor capable of causing RNAi.
  • a factor that causes RNAi to bow with respect to a “gene” refers to a factor that induces RNAi related to the gene and achieves the effect of RNAi (for example, suppression of expression of the gene).
  • Means Factors that cause such RNAi include, for example, at least a sequence that has at least about 70% homology to a portion of the nucleic acid sequence of the target gene or a sequence that hybridizes under stringent conditions. Examples include, but are not limited to, RNA containing a double-stranded portion having a length of 10 nucleotides or a variant thereof.
  • the factor preferably includes a 3′-protruding end, and more preferably, the 3′-protruding end may be a DNA having a length of 2 nucleotides or more (eg, a DNA having a length of 24 nucleotides).
  • RNAi when a molecule that causes RNAi, such as dsRNA, is introduced into a cell, it is relatively long (eg, 40 base pairs or more).
  • dsRNA an R Naselll-like nuclease called Dicer with a helicase domain is used to cleave the molecule in the presence of ATP with a 3 'terminal force of about 20 base pairs. Cut out to produce short dsRNA (also called siRNA).
  • ⁇ siRN A '' is an abbreviation for short interfering RNA, which is artificially synthesized or biochemically synthesized, or synthesized in an organism, or Short-chain double-stranded RNA of 10 base pairs or more, which is formed by degrading double-stranded RNA of about 40 bases or more in the body, usually has the structure of 5'-phosphate and 3'-OH And the 3 'end protrudes about 2 bases.
  • a specific protein binds to the siRNA to form RISC (RNA-induced d-silencing-complex).
  • This complex recognizes and binds mRNA having the same sequence as the siRNA, and cleaves the mRNA at the center of the siRNA by RNaselll-like enzyme activity.
  • 100% is preferable. Mutation of the base at a position outside the central force of the siRNA leaves partial activity that does not completely eliminate the RNAi cleavage activity. On the other hand, mutation of the base in the center of the siRNA has a large effect, and the mRNA cleavage activity by RNAi is extremely reduced.
  • siRNA itself can be used as a factor that causes RNAi, and a factor that generates siRNA (for example, dsRNA typically having about 40 bases or more) can be used as such a factor. Can be.
  • siRNA acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) by binding the antisense strand of siRNA to mRNA. It is also contemplated that dsRNA is synthesized, and this dsRNA again becomes a substrate for Dicer, generating new siRNA and amplifying the action.
  • RdRP RNA-dependent RNA polymerase
  • the siRNA itself and the factor by which the siRNA occurs are also useful. In fact, in insects and the like, for example, 35 dsRNA molecules almost completely degrade mRNA in a cell having more than 1,000 copies, so it is reasonable to think that siRNA itself and factors that generate siRNA are useful. It is cornered.
  • RNA having a length of about 20 bases (for example, typically about 2123 bases in length) or less which is called siRNA
  • siR NA suppresses gene expression by expressing it in cells and suppresses expression of pathogenic genes targeted by the siRNA, and thus can be used for treatment, prevention, prognosis, and the like of diseases.
  • siRNA used in the present invention may take any form as long as RNAi can be caused.
  • the factor that causes RNAi of the present invention may be a short hairpin structure (shRNA; short hairpin RNA) having an overhang at the 3 ′ end.
  • shRNA refers to a single-stranded RNA containing a partially palindromic base sequence, thereby taking on a double-stranded structure in the molecule to form a hairpin-like structure. For molecules with more than base pairs.
  • shRNAs are artificially chemically synthesized. According to one study, such shRNAs are capable of producing hairpin-structured DNA in which sense and antisense strand DNA sequences are ligated in reverse by synthesizing RNA in vitro with T7 RNA polymerase. .
  • shRNAs can be introduced into cells and then transfected into cells with about 20 bases (typically, for example, 21 bases, 22 bases, 23 bases). It is to be understood that they are degraded to length and cause RNAi like siRNA, and have the therapeutic effect of the present invention. It is to be understood that such effects are exerted on a wide variety of organisms, such as insects, plants, animals (including mammals). As described above, shRNA causes RNAi similarly to siRNA, and thus can be used as an active ingredient of the present invention. The shRNA may also preferably have a 3 'overhang.
  • the length of the double-stranded portion is not particularly limited, but may be preferably about 10 nucleotides or more, more preferably about 20 nucleotides or more.
  • the 3 'protruding end may be preferably DNA, more preferably DNA of at least 2 nucleotides in length, and further preferably DNA of 2 to 4 nucleotides in length.
  • the factor that causes RNAi used in the present invention may be artificially synthesized (for example, chemically or biochemically) or a naturally occurring factor. There is no essential difference in the effect of. For those chemically synthesized, it is preferable to purify them by liquid chromatography or the like.
  • the factor that causes RNAi used in the present invention may be synthesized in vitro. it can.
  • antisense and sense RNAs are synthesized from type I DNA using T7 RNA polymerase and # 7 promoter. When these are annealed in vitro and then introduced into cells, RNAi is induced through the above-described mechanism, and the effects of the present invention are achieved.
  • such RNA can be introduced into cells by the calcium phosphate method.
  • Factors that cause RNAi of the present invention also include factors such as single strands that can hybridize with mRNA, or all similar nucleic acid analogs thereof. Such factors are also useful in the treatment methods and compositions of the present invention.
  • salt is used in the same meaning as commonly used in the art, and includes both inorganic salts and organic salts.
  • a salt is usually formed by a neutralization reaction between an acid and a base. Therefore, the salt may be one in which hydrogen of an organic acid or inorganic acid is substituted with a metal, or one in which a hydroxyl group of a base is substituted with an organic acid group or an inorganic acid group. Salts such as NaCl and KSO generated by the neutralization
  • Salts include regular salts (H does not contain acid H or base OH, such as NaC1, NH Cl, CH C ⁇ ONa, Na CO), and acid salts (H of the acid is a salt). What's left, like
  • Preferred salts include those constituting the medium (e.g., calcium salt, sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, Preferred are amino acids, vitamins, and salts that constitute a buffer solution (eg, Shii-dani calcium, Shii-dani magnesium, sodium hydrogen phosphate, sodium chloride), etc. The effect of maintaining or improving affinity for cells is higher.
  • salts may be used alone or in combination of two or more, and it is preferable to use a plurality of them because the affinity for cells tends to be high.
  • the salt contained in the medium e.g., calcium chloride, magnesium chloride, sodium hydrogen phosphate, Dani natori It is more preferable to use a plurality of salts, and it may be advantageous to use all the salts contained in the medium as they are.
  • glucose may be added.
  • support is used in the same meaning as "substrate,” and refers to a material to which a substance such as a biological molecule can be immobilized.
  • the support material may be a covalent bond or a non-covalent bond, a force having a property of binding to a substance such as a biomolecule used in the present invention, or a derivative having such a property. Any solid material that can be converted is included.
  • any material capable of forming a solid surface can be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (including alloy). And natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon), and the like.
  • the support may be formed from multiple layers of different materials. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide, and silicon nitride can be used.
  • Polyethylene ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorinated resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, poly Acrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenolic resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene 'acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone, etc.
  • Organic materials can be used.
  • a membrane used for blotting such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane
  • a membrane used for blotting such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane
  • the material constituting the support is a solid phase, it is particularly referred to herein as "solid support".
  • solid support it may take the form of a plate, a microwell plate, a chip, a slide glass, a finolem, a bead, a metal (surface), or the like.
  • an electrode material may be used to form a substrate electrode that serves both as a substrate and an electrode.
  • the surface of the substrate electrode is covered with an insulating layer. It is preferable that the biomolecules are separated in each region, and different biomolecules are fixed to each of the separated electrode regions.
  • the electrode material is not particularly limited. Examples of such an electrode material include simple metals such as gold, gold alloys, silver, platinum, mercury, nickel, palladium, silicon, germanium, gallium, and tungsten and alloys thereof, or graphite, glass, and the like. Carbon such as carbon, or an oxide or compound thereof can be used.
  • the electrode film can be formed by plating, printing, sputtering, vapor deposition, or the like.
  • vapor deposition an electrode film can be formed by a resistance heating method, a high-frequency heating method, or an electron beam heating method.
  • sputtering an electrode film can be formed by direct current bipolar sputtering, bias sputtering, asymmetric alternating current sputtering, getter sputtering, high frequency sputtering, or the like.
  • the insulating material used for separating the electrode surface is not particularly limited, but is preferably a photopolymer or a photoresist material.
  • a photoresist for light exposure a photoresist for far ultraviolet, a photoresist for X-ray, and a photoresist for electron beam are used.
  • the photoresist for light exposure include those whose main raw materials are cyclized rubber, polycinnamic acid, and novolak resin.
  • Cyclic rubber, phenolic resin, polymethylisopropenyl ketone (PMIPK), polymethyl methacrylate (PMMA), and the like are used for the deep ultraviolet photoresist.
  • C ⁇ P, metal acrylate, etc. can be used for the X-ray register.
  • a known substance such as PMMA can be used for the electron beam resist.
  • a "chip” refers to a microminiature integrated circuit that has various functions and becomes a part of a system.
  • the “biomolecule chip” includes a substrate and a biomolecule, and the substrate has at least one biomolecule defined in the present specification disposed thereon. If the biomolecule is a cell, the chip is called a cell chip or cell array.
  • the term "coating" when used for a solid support Forming a film of the substance on the surface of the solid support and forming such a film. Coating is performed for various purposes, for example, to improve the quality of the solid support (for example, to improve the service life, to improve environmental resistance such as acid resistance), to improve the affinity of the substance to be bound to the solid support. In many cases, the purpose is to improve the properties.
  • various substances can be used as the substance for such coating.
  • biological substances such as DNA, RNA, protein, and lipid, and polymers (for example, Poly-L-lysine, APS (eg, diaminopropyl silane), MAS, hydrophobic fluoroplastics), silanes, metals (eg, gold, etc.) can be used, but are not limited thereto.
  • polymers for example, Poly-L-lysine, APS (eg, diaminopropyl silane), MAS, hydrophobic fluoroplastics), silanes, metals (eg, gold, etc.
  • silanes eg, gold, etc.
  • metals eg, gold, etc.
  • such a coating advantageously employs a metal such as poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluoropolymer, silane such as epoxysilane or mercaptosilane, gold.
  • a metal such as poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluoropolymer, silane such as epoxysilane or mercaptosilane, gold.
  • a substance it may be preferable to use a substance that is compatible with cells or an object containing cells (eg, a living body, an organ, or the like).
  • immobilization when used for a solid support, retains a target substance (for example, a biomolecule) on the support for at least a certain period of time. State or to bring it into such a state. Therefore, after the substance is fixed on the solid support, if the conditions change (for example, immersion in another solvent), the fixed state may be released.
  • a target substance for example, a biomolecule
  • cell affinity means that a substance is a cell (eg, a bacterial cell, an animal cell, a yeast, a plant cell, etc.) or an object containing a cell (eg, a tissue, an organ, a living body, etc.). ) Is a property that does not have a harmful effect on the cell or the object containing the cell when placed in a state where it can interact with the cell.
  • the substance having cell affinity may be, but is not limited to, a substance with which cells interact preferentially.
  • the substance to be immobilized eg, a positively charged substance and a Z or negatively charged substance
  • the substance to be immobilized preferably has, but is not limited to, cell affinity.
  • the substance to be immobilized has cell affinity
  • the cell affinity was retained or improved.
  • the effect of the present invention is immeasurable in view of the fact that when a substance having a property is immobilized on a solid support, cell affinity is not always maintained.
  • the term "cell” is defined in the same broadest sense as used in the art, and is a constituent unit of a tissue of a multicellular organism, wrapped in a membrane structure that isolates the outside world. Rarely, it refers to an organism that has a self-renewal ability inside and has genetic information and its expression mechanism.
  • the cell used in the present specification may be a naturally occurring cell or an artificially modified cell (for example, a fusion cell, a genetically modified cell).
  • the source of cells can be, for example, a single cell culture, or cells from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or a normally grown cell line. Cell mixtures such as, but not limited to.
  • tissue refers to a cell population having substantially the same function and / or morphology in a multicellular organism.
  • a “tissue” can be referred to as a tissue, even if it is a population of cells having the same origin and different origins, as long as they have the same function and / or morphology.
  • organ or "organ” is used interchangeably, and a certain function of a living individual is localized and operated in a specific part in the individual, and the part is morphologically defined. Is a structure that has independence. Generally, in multicellular organisms (eg, animals and plants), an organ is composed of several tissues having a specific spatial arrangement, and a tissue is composed of many cells. Such organs or organs include those associated with the vasculature. In one embodiment, the organs targeted by the present invention include skin, blood vessels, cornea, kidney, heart, liver, umbilical cord, intestine, nerve, lung, placenta, knee, brain, peripheral extremities, retina and the like. But not limited to them.
  • isolated refers to a substance that naturally accompanies at least a reduced amount in a normal environment, and preferably contains substantially no substance.
  • an isolated cell refers to a cell that is substantially free from other attendant materials (eg, other cells, proteins, nucleic acids, etc.) in its natural environment.
  • isolated for nucleic acids or polypeptides, “isolated”, for example, means that it is substantially free of cellular material or culture medium when made by recombinant DNA technology and is chemically synthesized. Is precursor chemistry Refers to nucleic acids or polypeptides that are substantially free of substances or other chemicals
  • the cells or objects containing cells (eg, organs, tissues, etc.) used in the present invention include cells derived from any organism (eg, prokaryotes (eg, Escherichia coli), eukaryotic unicellular organisms (yeast, etc.). ), Any type of multicellular organism (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), plants (eg, monocotyledons, dicotyledons, etc.)).
  • prokaryotes eg, Escherichia coli
  • yeast eukaryotic unicellular organisms
  • Any type of multicellular organism eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), plants (eg, monocotyledons, dicotyledons, etc.)).
  • cells derived from vertebrates are used, and more preferably, mammals (eg, monopores) , Marsupials, oligodonts, skin wings, winged fins, carnivores, insectivores, longnoses, ungulates, artiodactyls, tubulars, squamata, sponges, whales, primates , Rodents, etc.). More preferably, cells derived from a primate (for example, Rubi quisar, chimpanzee, diploid monkey, human) are used. Human-derived cells may be used.
  • a primate for example, Rubi quisar, chimpanzee, diploid monkey, human
  • sustained release means that when a substance is immersed in a solvent that dissolves the substance, it gradually dissolves while maintaining a solid phase for a certain period of time. .
  • a substance has a sustained release, it will typically remain immobilized for about 5 minutes after immersion in the solvent, preferably for at least about 10 minutes, more preferably for at least about 15 minutes. And, more preferably, remain fixed for at least about 30 minutes.
  • sustained release is maintained for at least about 30 minutes, preferably for at least about 1 hour, more preferably for at least about 3 hours, and even more preferably for at least about 6-12 hours. This is advantageous.
  • the fixed state is usually maintained for at least about 15 minutes.
  • biological activity refers to an activity that a certain factor (eg, a polypeptide or a protein) may have in a living body, and exerts various functions. Activity is included. For example, if a factor is an enzyme, its biological activity includes the enzymatic activity. In another example, where an agent is a ligand, the ligand involves binding to a corresponding receptor. Such biological activity is measured Depending on the activity, it can be measured by a technique well known in the art.
  • condition that do not destroy biomolecules refer to conditions under which at least one biological activity (eg, gene expression activity, enzyme activity, etc.) exerted by biomolecules is not impaired. .
  • Those skilled in the art can appropriately set such conditions by considering various considerations (eg, temperature, pH, pressure, chemical conditions, and the like) according to the biomolecule.
  • the conditions that do not destroy the biomolecule are unknown, the biomaterial is exposed to the conditions to be tested, and then determined by determining whether the target biological activity is retained. be able to. Therefore, it will be understood by those skilled in the art that such conditions may be any conditions when practicing the present invention, as long as the desired biological activity is maintained.
  • reaction or “removal” of a solvent (eg, water, an organic solvent (eg, hexane, etc.) refers to the case where a mixture or a composition containing the solvent is subjected to certain conditions. This is achieved by reducing or eliminating the proportion of solvent in the mixture or composition.
  • a solvent eg, water, an organic solvent (eg, hexane, etc.)
  • pharmaceutically acceptable when referring to a substance, refers to the property that the substance can be administered as a medicament.
  • “Pharmaceutically acceptable substances” that can be used herein include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, Includes but is not limited to bulking agents, buffers, delivery vehicles, diluents, excipients and / or pharmaceutical adjuvants.
  • the compound of interest a compound having biological activity or activity as an active ingredient of a pharmaceutical product
  • a variant or derivative thereof contains one or more physiologically acceptable carriers, It is provided in the form of a composition to be included with a form or diluent.
  • the pharmaceutically acceptable substances used herein are non-toxic to recipients, and preferably are inert at the dosages and concentrations employed, for example, acids. Salts, citrates, or other organic acids; ascorbic acid, human tocopherol; low molecular weight polypeptides; proteins (eg, serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymers (eg, polyvinylinopyrrolidone) ); Amino acids (eg, glycine, gnore) Monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose or dextrin); chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol); (Eg, sodium); and Z or a non-ionic surface activator (eg, Tween, pluronic or polyethylene glycol (PEG)) and the like.
  • acids salts, citrates, or other organic acids
  • ascorbic acid human tocopherol
  • chip refers to a micro integrated circuit having various functions and being a part of a system.
  • DNA chip protein chip
  • cell chip may be used depending on the substance to be loaded.
  • array refers to a fixed pattern of fixed objects on a substrate or film, or the patterned substrate itself. Arrays that are patterned on a small substrate (eg, 10 ⁇ 10 mm) are referred to as microarrays, but microarrays and arrays are used interchangeably herein. Therefore, a micropattern that is patterned to be larger than the above-mentioned substrate may be called a microarray. For example, an array consists of a set of desired polynucleotides that are themselves immobilized on a solid surface or membrane.
  • Array preferably at least 10 two different polynucleotides, more preferably at least 10 3, and further preferably at least 10 4, Ri by more preferably at least 10 5 a. These polynucleotides are arranged in a standardized format, for example, 125 ⁇ 80 mm, 10 ⁇ 10 mm.
  • the term "address” refers to a unique location on a substrate, which may be distinguishable from other unique locations.
  • the address takes any shape suitable for association with the particle associated with that address, and the entity at every each address can be distinguished from the entity at the other address (eg, optically). obtain.
  • the shape of the address can be, for example, circular, elliptical, square, rectangular, or irregular.
  • the size of each address is determined by, among other things, the size of the substrate, the number of addresses on a particular substrate, the amount of analyte and / or available reagents, the size of the microparticles and the size of the array. Depends on the degree of resolution required for any method used.
  • the size can be, for example, in the range of 1-2 nm to a few cm. Any size is possible, consistent with the application of the array.
  • the spatial arrangement and shape of the addresses are designed to suit the particular application for which the microarray is used.
  • the addresses can be tightly packed, widely dispersed, or sub-grouped into a desired pattern appropriate for a particular type of analyte.
  • Microarrays also referred to as DNA microarrays when DNAs are arranged
  • DNA microarrays are widely reviewed in Cell Engineering Separate Volume "DNA Microarrays and the Latest PCR Method", edited by Shujunsha.
  • a labeling method for the synthetic DNA microarray for example, a bifluorescent labeling method can be mentioned.
  • two different mRNA samples are each labeled with different fluorescence, competitive hybridization is performed on the same microarray, both fluorescence is measured, and the difference is compared to determine the difference in gene expression.
  • fluorescent dyes for example, Cy5 and Cy3 are the most widely used powers. The advantage of Cy3 and Cy5 is that there is little overlap in fluorescence wavelengths.
  • the bifluorescent labeling method can be used to detect mutations or polymorphisms as well as differences in gene expression.
  • a fluorescent signal hybridized on the DNA microarray is detected by a fluorescence detector or the like.
  • a fluorescence detector or the like.
  • a variety of such detectors are available to date. For example, a group at Stanford University has developed an original scanner, which combines a fluorescence microscope and a working stage (see http: ZZcmgm. Stanford, edu / pbrown). If the spots are not so dense, DNA microarrays can be read using conventional gel fluorescence image analyzers such as FMBIO (Hitachi Software Engineering) and Storm (Molecular Dynamics).
  • ScanArray 4000 5000 (General Scanning; Scan type (confocal type)), GMS418 Array Scanner (Takara Shuzo; Scan type (confocal type)), Gene Tip Scanner (Japan Laser electron; scanning type (non-confocal type)), Gene Tac 2000 (Genomic Solutions; CCD camera type))).
  • a biomolecule eg, DNA, RNA, polypeptide, etc.
  • a biological substance eg, mRNA
  • they can be chemically synthesized by methods known to those skilled in the art. For example, a synthesis method using an automated solid phase peptide synthesizer is described by: Stewart, J. ⁇ ⁇ et al. (1984). Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co .; Grant, GA (1992). Synthetic Peptides: A User's Guide, WHFreeman; Bodanszky, M. (1993).
  • the present invention can also be used for the detection of a gene amplified by PCR, SDA, NASBA, or the like, in addition to a sample directly collected from a living body.
  • the target gene may be a previously electrochemically active substance, a fluorescent substance such as FITC, rhodamine, atarizine, Texas Red, fluorescein, alkaline phosphatase, peroxidase. , Haptens, luminescent substances, antibodies, antigens, colloidal particles such as colloidal gold, metals, metal ions, and metal chelates with trisbipyridine, trisphenanthone phosphorus, hexamine, etc. Labeling is also possible.
  • microcapsules refer to minute particles or a container-like substance obtained by enclosing a substance with a thin film of molecules or the like. It is usually spherical, with a size of a few zm and a few hundred ⁇ . Generally, a water-in-oil emulsion is formed, and a polymer thin film is formed by interfacial polycondensation at the interface between the fine emulsion particles and the medium liquid to cover the particles. The capsules can then be produced by separating the capsules from the oil by centrifugation and purifying by dialysis.
  • the desired biomolecules can be dissolved and dispersed in the aqueous phase and wrapped in a forceps.
  • the thickness of the film is 10-20 zm and can be semipermeable or have a surface charge.
  • the microcapsules can protect and sequester inclusions such as biological molecules, and can be eluted, mixed or reacted as required.
  • the microcapsules are sprayed onto the substrate by a spraying step such as an ink jet method (such as a bubble jet (registered trademark) method) or a PIN method.
  • Microcapsules can fix contents such as biomolecules to a substrate by raising the temperature above the melting point of the shell.
  • the substrate is preferably coated with a substance having an affinity for the biomolecule.
  • Microlithography can be referred to, and the relevant portions are incorporated herein by reference.
  • the ink jet system (technology) is a technology for ejecting a very small droplet to a predetermined position on a two-dimensional plane using thermal and piezoelectric effects, and is widely used mainly in a printer device.
  • a structure combining a piezoelectric element with a glass capillary Is used.
  • a change in the volume of the piezoelectric element causes a droplet to be ejected from the capillary connected to the liquid force chamber 1 inside the chamber.
  • the size of the ejected droplet is determined by the diameter of the capillary, the volume change of the piezoelectric element, and the physical properties of the liquid.
  • the diameter is about 30 ⁇ .
  • An ink jet device using a piezoelectric element can eject such droplets at a period of about ⁇ .
  • a DNA array manufacturing apparatus using such an ink jet device can drop a desired droplet on a desired spot on a DNA array by relatively moving the ink jet device and the DNA array substrate.
  • the DNA array manufacturing system uses only one inkjet device and is configured to drop a reagent for removing the protecting group at the terminal of the oligomer onto a desired spot.
  • the protecting group of the spot is removed by using this ink jet device to make it active, and then the binding reaction operation of the desired base is performed on the entire DNA array.
  • the desired base is bound only to the spot having the oligomer whose terminal is activated by dropping the reagent from the ink jet device.
  • an operation of protecting the terminal of the newly added base is performed.
  • this operation is repeated until the desired nucleotide sequence is obtained, while changing the spot where the protecting group is removed.
  • a DNA array manufacturing device using a multi-head inkjet device has a configuration in which a desired base can be directly bonded to each spot by preparing an inkjet device for each reagent containing each base.
  • the mechanical microspotting technology is a technology in which a liquid containing an oligonucleotide attached to the tip of a stainless steel pin is mechanically pressed onto the substrate to immobilize it. .
  • the spot obtained by this method is about 50 300 ⁇ m. After microspotting, post-processing such as immobilization with UV light is performed.
  • the spraying step used in the method of the present invention includes an ink jet method (bubble jet). Etch (registered trademark) method), PIN method, and the like.
  • bubble jet ink jet method
  • Etch registered trademark
  • PIN PIN method
  • bubble jet bubble jet
  • the labeling molecule includes a fluorescent molecule, a phosphorescent molecule, a chemiluminescent molecule, or a radioisotope. in this case
  • a detection means depending on the type of the labeled molecule may be used.
  • the present invention provides a kit for fixing genetic material to a support and introducing the material into cells.
  • the kit comprises: a) genetic material, b) a charged material having an opposite charge to the genetic material, and c) a salt, wherein the kit comprises the genetic material and the charged material. And instructions for mixing the salt and the salt on a solid support.
  • This technique is unexpectedly immobilized by mixing genetic material, a material with the opposite charge, and a salt (eg, salts contained in a culture medium) on a support, and then fixing it. This was achieved by unexpectedly finding that the introduction into cells was performed smoothly.
  • the effects of such immobilization include the fact that the diffusion of the substance after immobilization is sustained release, and that the immobilized substance maintains or improves cell affinity.
  • any genetic material can be easily fixed in a mixed form on a support in an arbitrary mixing pattern, it is very useful in array preparation and the like that requires such a technique. is there.
  • kits of the present invention at least two substances selected from the group consisting of a genetic substance, a charged substance, and a salt contained in the kit of the present invention are provided as a mixture. This is because the number of compartments in the kit can be reduced. When considering the mixing of two or more genetic materials on a support, these three materials can all be provided in mixed form.
  • At least two types of genetic material are included in the present invention. And more preferably three or more, and in another preferred embodiment, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more, nine or more, ten or more, twenty or more possible. Alternatively, tens of thousands of genetic materials such as a genome set may be included in the kit of the present invention.
  • the genetic material included in the kit of the present invention can be selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, and a combination thereof.
  • the substance to be included in the present invention has cell affinity.
  • the cell affinity of a substance is determined by assessing the ability of the substance to maintain its viability when the cell is mixed with the cell, compared to when the substance is absent. can do. Such maintenance of cell survival can be specifically determined by measuring various parameters of the cell.
  • a substance with cell tropism may advantageously improve the survival of the cell.
  • the substance (for example, a charged substance) to be included in the present invention may be a biomolecule.
  • this biomolecule may or may not be the target for immobilization.
  • the biomolecule to be immobilized in the present invention may be a gene encoding molecule such as DNA.
  • the fixation method achieved in the present invention when the DNA is treated for gene transfer such as transfatate, the time required to complete the treatment (eg, about 15 min. ), The sustained release was continued, and the effect of efficiently introducing such molecules was achieved.
  • Such a sustained release effect is a force, an irritation force, and an insufficient force that can be achieved by the conventional fixing method.
  • Such effects can be mentioned as notable effects of the present invention.
  • the composition of the present invention retains or improves the affinity for cells after being immobilized, and is particularly suitable for the conventional immobilization method for gene transfer such as transfection. It has been found that such transfer is performed more efficiently and without damage to the cells.
  • the charged substance to be immobilized may be a biomolecule or a non-biomolecule, for example, a synthetic polymer such as a cationic polymer and a cationic lipid poly-L-lysine. It may be a peptide or a derivative thereof.
  • the charged substance includes, for example, a polyamine-based reagent (SuperFect, PolyFect), a polyimine-based reagent (JetPEI, PEI, Fugene6), a ribosome-based reagent (
  • LipofectAMINE LipofectAMINE, LipofectAMINE2000, OligofectAMINE, Effecten
  • charged colloid (gold colloid) polyimine polymer polyL lysine
  • transfection reagents such as synthetic polypeptides or derivatives thereof, and the like, but are not limited thereto.
  • the charged substance used in the present invention is a polyamine-based reagent (SuperFect, PolyFect), a polyimine-based reagent (JetPEI, PEI, Fugene6), a ribosome-based reagent (LipofectAMINE, LipofectAMINE2000, OligofectAMINE). , Effecten), charged colloid (gold colloid) and the like are preferably used. This is because it has a favorable shape, strength, and ease of handling for printing.
  • SuperFect, PolyFect, etc. are exemplified.
  • polyimine-based reagent refers to a reagent having a polyimine in its structure, for example, JetPEI, PEI, Fugene6 and the like.
  • ribosome-based reagent refers to a gene transfer reagent having a ribosome structure, and examples thereof include LipofectAMINE2000, OligofectAMINE, and Effecten.
  • charged colloid refers to a charged colloid among colloids, and examples thereof include a metal colloid (for example, a gold colloid).
  • the salt used in the present invention is a salt obtained by substituting hydrogen of an organic acid or an inorganic acid with a metal, or a hydroxyl group of a base or an organic acid group or It may be substituted with an inorganic acid group.
  • a salt having an affinity for cells Eg, salts used in a medium, salts used in a buffer, etc.
  • salts contained in such a medium include, for example, calcium salt, calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium pyruvate, HEPES, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium chloride , Sodium chloride, monosodium phosphate, disodium phosphate, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acids and vitamins, but are not limited thereto.
  • concentration of such salts can be suitably selected and adjusted by those skilled in the art, and can be advantageously equal to the osmotic pressure of the cells.
  • the salts used in the present invention include buffers, culture solutions, and serum.
  • the biomolecule to be immobilized is advantageously introduced into a cell and exerts a biological activity (eg, a drug effect, an enzyme, signal transduction, gene expression, etc.) within the cell. possible.
  • a biological activity eg, a drug effect, an enzyme, signal transduction, gene expression, etc.
  • the biomolecule can be DNA containing a sequence encoding the gene.
  • signaling the biomolecule can be a signaling stimulator (eg, cytokin, specific ligand, etc.).
  • the biomolecule may be a chemical having a medicinal effect.
  • Chemicals having such medicinal effects include, for example, drugs for central nervous system; drugs for peripheral nerves; drugs for sensory organs; drugs for circulatory organs; drugs for respiratory organs; drugs for digestive organs; hormones; And anal drugs; dermatological drugs; dental oral drugs; other individual organ system drugs; vitamins; nourishing tonics; blood and body fluid drugs; artificial dialysis drugs; other metabolic drugs (e.g., Agents for organ diseases, antidote, addictive addiction, gout remedies, enzyme preparations, antidiabetic agents, metabolic drugs not classified elsewhere); cell stimulants; tumor drugs; radiopharmaceuticals; Drugs; antibiotics; chemotherapeutics; biologicals; preparations; diagnostics; in-vitro diagnostics; unclassified non-therapeutic agents; But not limited to them.
  • drugs for central nervous system drugs for peripheral nerves; drugs for sensory organs; drugs for circulatory organs; drugs for respiratory organs; drugs for digestive organs; hormones; And anal drugs; dermatological drugs; dental oral drugs; other individual organ system drugs;
  • the substances (genes, charged substances, etc.) and salts contained in the composition of the present invention are preferably pharmaceutically acceptable.
  • the genetic material used in the present invention encodes a substance having a biological activity after being introduced into a cell.
  • the genetic material, the charged substance, and the salt to be included in the present invention can be included in a microcapsule.
  • a microcapsule By being contained in the microcapsule, it is convenient to carry, easy to handle, and capable of reducing contamination by other substances.
  • the present invention provides a method for immobilizing genetic material on a support and introducing it into cells.
  • the method comprises: I) providing a support; II) providing the support with: a) a genetic material; b) a charged material having a charge opposite to the genetic material; c) a salt; And III) mixing the genetic material, the charged material and the salt on a solid support.
  • the genetic material, charged substance, and salt to be used in the method of the present invention take any form described in a kit for immobilizing the genetic material on a support and introducing it into cells. be able to.
  • the support used in the present invention is a solid support.
  • the material of the support include, but are not limited to, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymers and synthetic polymers.
  • the support used in the present invention is preferably coated.
  • the support to be used may be coated, or may include a step of coating the support when performing the method.
  • Materials used for such coatings include, but are not limited to, poly-L-lysine, silane, APS, RAS, hydrophobic fluororesins, metals, and mixtures thereof. Utilize materials intended for use in the support Can be done.
  • the support can be prepared fresh or recycled in the method of the present invention. Preferably, it may be advantageous to coat. Coating may be particularly advantageous for recycling purposes.
  • the support may be a chip.
  • the method of the present invention is also applicable in the manufacture of small and integrated devices such as chips, and its usefulness extends over a wide range.
  • the substances immobilized on the chip are preferably arranged in an array.
  • the device is also called an array. Therefore, the method of the present invention can be applied to the production of a biomolecule array or a biomolecule chip. Chips or arrays produced by such methods are particularly useful when used in chip or array applications where sustained release and / or cell affinity is required.
  • the method of the present invention is also particularly useful when an array requiring a high degree of integration is required for simple fixation and thus simple and fine and spotting is required, and particularly useful.
  • the genetic material may be desirable for the genetic material to have biological activity after being introduced into a cell.
  • biological activity include, but are not limited to, drug efficacy, gene expression, enzyme activity, and signal transduction activity.
  • the biomolecule can be DNA containing a sequence encoding that gene.
  • the genetic material can be a signaling stimulator (eg, cytoforce, specific ligand, etc.).
  • the biomolecule may be a chemical having a medicinal effect.
  • a compound having a medicinal effect can be selected from among a variety of compounds as described elsewhere herein.
  • the fixing step may be performed manually (eg, pipetting) using any process or automatically (eg, printer technology such as an ink jet printer).
  • printer technology such as an ink jet printer
  • it can be attached using a print pin of an ink jet printer.
  • the above-described steps for example, a gene such as transfection
  • the above-described steps may be performed, or the above-described steps may be performed after being fixed and stored for a certain period of time.
  • it is necessary to take measures to prevent the sustained release from starting such as immersion in a storage solvent different from the solvent used for sustained release or drying). preferable.
  • DNA is selected as the genetic material, and a polyimine polymer is used as the charged material having a charge opposite to that of the genetic material.
  • a polyimine polymer is used as the charged material having a charge opposite to that of the genetic material.
  • a positively charged substance is selected.
  • the salt include, but are not limited to, salts having an affinity for cells (eg, salts used in a medium, salts used in a buffer, and the like).
  • the material of the support used in the preferred embodiment include slide glass (preferably coated with poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, etc.), polystyrene resin, and the like. But not limited to them.
  • a solid support coated with poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, or the like is preferable. This is because it is known to have favorable effects on the affinity with cells and the efficiency of transfusion.
  • the method of the present invention may preferably include a coating step.
  • the step of providing the substance provided on the support of the present invention is performed under conditions that do not destroy biomolecules.
  • Conditions that do not disrupt such biomolecules can be determined by one of ordinary skill in the art by considering the type of complex partner provided and other conditions for complex formation (eg, pH, temperature, etc.). It can be easily selected by testing appropriate conditions in advance. The selection or testing of such appropriate conditions is within the skill of the ordinary artisan and can be determined by the skilled artisan without undue experimentation.
  • the present invention shows that the objectives (eg, fixation, intracellular transfer, gene expression, etc.) of the present invention are achieved by the above-mentioned manual operation (eg, pipetting) or automatically (eg, printer technology such as an inkjet printer). It turned out for the first time.
  • the present invention it is possible to easily immobilize genetic material on a support using a print pin of an ink jet printer and then introduce the gene material into a cell, and to perform expression analysis of the genetic material in a cell. Now you can.
  • the provision of the mixture of the salt, the genetic material, and the charged material can be performed under conditions that do not destroy the biomolecule.
  • Conditions that do not destroy such biomolecules can be appropriately determined by those skilled in the art by considering the types of complexes and salts provided and other conditions for complex formation (eg, pH, temperature, etc.). Some can be selected and can be easily selected by preliminary testing of appropriate conditions. The selection or testing of such appropriate conditions is within the skill of the ordinary artisan and can be determined by the skilled artisan without undue experimentation.
  • solvent reduction or removal includes, but is not limited to, natural drying, freeze-drying, impression using a desiccant, and the like.
  • the present invention provides a support on which a genetic material, a charged material having a charge opposite to the genetic material, and a salt are immobilized on a surface.
  • the genetic material, charged substance, salt, and support may take any form described in the section of the kit or method for immobilizing the genetic material on the support and introducing it into cells.
  • Power S can.
  • the genetic material eg, DNA, RNA, PNA, and combinations thereof, which preferably encodes a substance that has biological activity after being introduced into a cell
  • the genetic material can be any form that can be introduced into a cell. It is good to be provided in such a form.
  • Such forms include, but are not limited to, for example, the state of naked DNA, the use of plasmids, and viral vectors.
  • two or more kinds or three or more kinds of genetic materials may be contained. Such multiple types may include DNA encoding the gene and RNAi for it.
  • Examples of the chargeable substance include reagents known as gene transfer reagents that are preferably biocompatible.
  • Examples of the salt include, for example, calcium chloride and hydrogen phosphate.
  • Sodium, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, HEPES, salt Since it may be a mixture of calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acid, vitamin, and the like, it may be a medium component.
  • the support of the present invention and the substance immobilized thereon are preferably pharmaceutically acceptable.
  • the substance to be immobilized on the support may be contained in a microcapsule.
  • the support of the present invention is preferably a solid support.
  • examples of the material of the support of the present invention include, but are not limited to, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal, natural polymer, synthetic polymer, and mixtures thereof. Absent.
  • the support may be coated. Coating can be carried out using materials normally contemplated for use on solid supports, such as poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesins, metals, and the like.
  • a coating agent used in cell culture eg, poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, metal, etc. can be used.
  • the solid support may be a chip.
  • the support of the present invention is a chip, preferably, a mixture containing a genetic material, a charged substance and a salt is arranged in an array on the chip.
  • the support of the present invention may be referred to as an array.
  • the genetic material has biological activity after being introduced into a cell.
  • biological activity include, but are not limited to, drug efficacy, gene expression, enzyme activity, and signal transduction activity.
  • the biomolecule can be DNA containing a sequence encoding the gene.
  • signaling the biomolecule can be a signaling stimulator (eg, cytokin, specific ligand, etc.).
  • the biomolecule may be a chemical having a medicinal effect. Compounds with medicinal properties are identified as species, as described elsewhere herein. It can be selected from various compounds.
  • DNA is selected as the genetic material to be immobilized and the opposite of the genetic material. It is preferable that a positively charged substance such as a polyimine polymer is selected as the charged substance having a charge. This is because DNA is generally negatively charged.
  • a positively charged substance such as a polyimine polymer is selected as the charged substance having a charge. This is because DNA is generally negatively charged.
  • the salt include, but are not limited to, salts having an affinity for cells (eg, salts used in a medium, salts used in a buffer, and the like).
  • Examples of the material of the solid support used in the preferred embodiment include, for example, a glass slide (poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin, preferably poly-L-lysine, etc.). , And polystyrene resin, but are not limited thereto.
  • a solid support coated with poly-L-lysine, silane, APS, MAS, hydrophobic fluororesin or the like is preferred. This is because it is known to have a favorable effect on the affinity with cells and the efficiency of transfection.
  • the present invention provides a composition for immobilizing genetic material on a support and introducing the material into cells.
  • the composition of the present invention comprises: a) genetic material, b) a charged material having a charge opposite to the genetic material, and c) a salt.
  • the composition may contain the individual components in admixture or separately.
  • the components of the composition of the present invention have cell tropism.
  • the cell affinity of a substance can be determined by assessing whether or not the viability of the cell is maintained when the substance and the cell are mixed, compared to when the substance is absent. S can.
  • the maintenance of such cell survival can be specifically determined by measuring various parameters of the cell.
  • a substance with cell affinity may advantageously improve the survival of the cell.
  • the components of the composition of the present invention may be biomolecules.
  • this biomolecule may or may not be the target for immobilization purposes.
  • a component of the composition of the present invention may be a gene coding molecule, such as DNA.
  • a treatment for gene transfer such as DNA force S transfat
  • the time required to complete the treatment eg, about 15 min.
  • the degree of effect was achieved if the introduction of such molecules was performed efficiently by continuous sustained release.
  • Such an effect of sustained release was not sufficient, which was not achieved by the conventional fixing method, and such an effect can be mentioned as a remarkable effect of the present invention. It should be noted that these effects were retained even when mixed directly on the support.
  • the composition of the present invention retains or improves the affinity for cells after immobilization, and is particularly efficient and more efficient than conventional immobilization methods in introducing genes such as transfection. It was found that such an introduction could take place without any damage to.
  • the components of the composition of the present invention include anionic polymers such as DNA, RNA, PNA, polypeptides and complexes thereof, such as anionic polymers and anionic lipids. It need not be a biomolecule.
  • the components of the composition of the present invention may be biomolecules or non-biomolecules, for example, synthetic polypeptides such as cationic polymers and cationic lipid poly-L-lysine. Or a derivative thereof and the like.
  • positively charged substances include, but are not limited to, transfusion reagents such as, for example, polyimine polymers, poly L-lysine, synthetic polypeptides or their derivatives.
  • compositions of the present invention may include positively charged materials such as DNA and polyimine polymers.
  • the components of the composition of the present invention are introduced into a cell and exert a biological activity (eg, a drug effect, an enzyme, signal transduction, gene expression, etc.) in the cell.
  • a biological activity eg, a drug effect, an enzyme, signal transduction, gene expression, etc.
  • the genetic material included in the present invention can be DNA containing a sequence encoding the gene.
  • the genetic material may be one that encodes a signaling stimulator (eg, cytoin, a particular ligand, etc.).
  • a medicinal effect is intended, the genetic material may encode a protein having a medicinal effect.
  • Substances having such a medicinal effect include, for example, drugs for the central nervous system; drugs for peripheral nerves; drugs for sensory organs; drugs for circulatory organs; drugs for respiratory organs; drugs for digestive organs; hormones; And topical medicines; dermatologicals; dental and oral medicines; other individual organ system medicines; vitamins; nourishing tonics; blood and body fluids; dialysis drugs; Drugs for organ diseases, antidote, addictive drugs, gout remedies, enzyme preparations, drugs for diabetes, metabolic drugs not classified elsewhere); cell stimulants; tumor drugs; radiopharmaceuticals; ; Antibiotics; chemotherapeutics; biologicals; preparations; diagnostics; in vitro diagnostics; non-classified non-primary therapeutics; and narcotics, including but not limited to Absent.
  • the components of the composition of the present invention are preferably pharmaceutically acceptable.
  • the present invention also provides a device having the genetic material of interest immobilized thereon.
  • the genetic material of interest for example, DNA
  • a substance with the opposite charge for example, DNA
  • a salt for example, salts contained in the culture medium
  • these mixing are performed on a support.
  • non-mixing means that the genetic material has good stability, that multiple genetic materials can be easily mixed, that the concentration ratio of the genetic material can be easily created, and that the genetic material is arrayed.
  • the device of the present invention Due to the effect of such fixation, the device of the present invention has a sustained release of the substance immobilized on the solid support, and / or the immobilized substance retains or improves cell affinity. Is achieved. Therefore, the device of the present invention can be used as a micro-type used in an organism using a living body such as a cell or a part thereof. Provided in the form of target plates, arrays (chips), wells, etc., the substances to be immobilized (active ingredients, DNA encoding expressed genes, etc.) are released slowly and / or cell affinity is maintained This is useful in such situations where it is desired that Certain compounds can be used as pharmaceutical delivery vehicles in cases where it is desirable for a sustained release of an active ingredient.
  • the device of the present invention comprises: a) genetic material, b) a charged material having an opposite charge to the genetic material; c) a salt; and d) the complex and the salt are mixed on a support.
  • a support Includes an immobilized solid support.
  • the support, genetic substance, charged substance, salt, and the like used individually can take any of the forms described in the section (Support for Genetic Material).
  • Such devices may be, for example, commercially available (eg, glass slides, microtiter plates, etc.) or may be self-made.
  • the present invention can be used in making devices or drug delivery devices for Assay, and its utility extends over a wide range.
  • the device of the present invention is also called an array. Therefore, the method of the present invention can be applied to manufacture a biomolecule array or a biomolecule chip. Chips or arrays produced by such methods are particularly useful when used in chip or array applications where sustained release and / or cell affinity is required. The method of the present invention is also particularly useful in arrays where a high degree of integration is required, where simple fixation and thus simple and delicate spotting are required.
  • the present invention when used in connection with an organism, it may be used for human use, but may be used for other hosts (eg, mammals). Therefore, the present invention may be used as a pesticide.
  • DNA was selected as genetic material, and a composition for immobilizing DNA on a solid support was prepared.
  • a plasmid for transfection was prepared as DNA.
  • plasmids pEGFP-N1 and pDsRed2_N1 (both from BD Biosciences, Clontech, CA, USA) were used. In these plasmids, gene expression is under the control of cytomegalovirus (CMV).
  • CMV cytomegalovirus
  • Plasmid DNA was amplified and amplified in E. coli (XLl blue, Stratgene, TX, USA) and used as one of the complex partners. DNA was dissolved in distilled water containing neither DNase nor RNase.
  • a transfection reagent was used as a charged substance having a charge opposite to that of the genetic material.
  • the transfection reagents used are as follows: Effectene Transfection Reagent, cat. No. 301425, Qiagen, CA), TransFastTM Transfection Reagent (E2431, Promega, WI), TfxTM-20 Reagent (E2391, Promega, WI). ), SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA), PolyFect
  • Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA), LipofectAMINE 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen corporation, CA), JetPEI (X4) cone. (1 01-30, Polyplus-transfection, France) and ExGen 500 (R0511, Ferme) ntas Inc., MD).
  • DNA plasmids and the transfection reagent were separately or together combined with distilled water containing neither DNase nor RNase (control), NaCl solution (0.9%) as a salt, and PBS buffer (Sigma).
  • Dulbecco's MEM medium glucose (4.5 g / L), L-glutamine and sodium pyruvate (Nacalai Tester, Kyoto, Japan)), 10% lactose serum albumin (Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan) Was supplemented) and dissolved in this medium.
  • a slide glass, a slide glass coated with poly-L-lysine, silane, APS, PLL or MAS, and a microtiter plate made of polystyrene were used in the present invention.
  • a solution of the dissolved DNA, charged substance and salt or a mixed solution thereof was spotted on each support, and the target genetic material was fixed by allowing the spot to dry naturally.
  • the DNA solution (salt solution or distilled aqueous solution), the transfection reagent solution (salt solution or distilled aqueous solution), and the salt solution, if necessary, used in Example 1, were printed using a printing technique. It was fixed on the support used in Example 1. The procedure is shown below. You.
  • DNA plasmid solution was printed on a support.
  • the DNA plasmid solution was used at a concentration of 10-3000 ⁇ g / ml, and the print was performed using Cartesian Technologies MicroSys 4000 (Genomic Solution), using the same equipment at room temperature (25 ° C) and 65% humidity. went.
  • Example 3 When the DNA plasmid solution and the transfusion reagent solution did not contain a salt, the salt solution shown in Example 1 was printed thereafter. The print was made using Cartesian Technologies MicroSys 4000 (Genomic Solution). The test was performed at room temperature (25 ° C) and humidity of 65%.
  • a fibronectin solution (0.5-5 mg / ml) was printed as needed. Printing was performed using an instrument called Cartesian Technologies MicroSys 4000 (GenomicSolution) under the conditions of room temperature (25 ° C) and 65% humidity.
  • Example 1 After these printings, as in Example 1, it was verified whether fixing was performed. As in Example 1, when a salt solution other than distilled water was used, and when a posterior salt solution was printed, the same fixing effect as in Example 1 was confirmed. In addition, even when the order of 1) and 4) was exchanged, the same fixed effect was observed. Therefore, it became clear that the order of the overstrike had no effect on the fixed effect.
  • CartesianTechnologies MicroSys 4000 (Genomic Solution) was used under the conditions of room temperature (25 ° C) and humidity of 65%.
  • this shRNA was printed between 1) and 2) in Example 3.
  • the support on which the DNA was immobilized was placed in a dish, and the medium containing the above cells was dropped thereon.
  • the dish containing the plate is then transferred to an incubator and the plate is incubated at 37 ° C in a 5% CO atmosphere for 2 or 3 days.
  • FIG. 1-2 shows a part of the results of the transfection.
  • Figure 1 shows the case of mixing from the beginning (control above, mixture below). The elution state of the complex is shown immediately after the addition of the complex to the solid phase (0 min), and after 1 min, 5 min and 10 min after the addition of the cell-containing solution.
  • FIG. 2 shows the transfusion effect on human mesenchymal stem cells in a support printed according to the procedure of Example 2. As shown, even when printing was performed continuously (overstrike), the same cell transfer effect of the genetic material as the mixture was shown.
  • Example 3 when a plurality of genetic materials were repeatedly struck, it was verified whether or not any of the genetic materials was introduced into cells while maintaining the activity. The verification procedure was as described in Example 4.
  • composition ratios as shown in the following table were used.
  • pDNA indicates plasmid DNA.
  • Figure 3 shows the state of gene expression three days after transfection into HeLa-II cells.
  • Figure 4 shows the state of gene expression 6 days after transfection into HeLa-K cells. + shGFP indicates that there is an RNAi molecule, and Pro less indicates that it is not.
  • human mesenchymal stem cells hMSC, PT-2501, Cambrex Bioscience Walkersville, Inc., MD
  • human embryonic kidney cells HEK293 RB1637, RIKEN Cell Bank
  • NIH3T3-3 RB0150, RIKEN Cell Bank, Japan
  • HeLa RB0007, RIKEN Cell Bank, Japan
  • HepG2 RBl648, RIKEN Cell Bank, Japan
  • human MSC cells the cells were maintained in a commercially available human mesenchymal cell basal medium (MSCGM BulletKit PT-3001, Cambrex Bioscience Walkersville, Inc., MD).
  • HEK293 cells In the case of HEK293 cells, NIH 3T3-3 cells, HeLa cells, and HepG2 cells, these cells were used in 10% fetal calf serum (FBS, 29-167-54, Lot No. 2025F, Dainippon Pharmaceutical CO., LTD. Dulbecco's modified Eagle's medium with DMEM, L-glutamine and sodium pyruvate (4.5 g / L); 14246-25, Nakalai Tesque, Japan. All cell lines were controlled at 37 ° C, 5% CO
  • the cells were cultured in an incubator.
  • hMSCs of less than 5 passages to avoid phenotypic changes.
  • the pEGFP_Nl vector and the pDsRed2-Nl vector were used. In both cases, gene expression was under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • the transfected cells continuously expressed EGFP or Ds Red2, respectively.
  • Plasmid DNA was amplified using Escherichia coli, XL1-blue strain (200249, Stratagene, TX) and purified by EndoFree Plasmid Kit (EndoFree Plasmid Maxi Kit 12362, QIAGEN, CA). In all cases, plasmid DNA was dissolved in DNase and RNase-free water.
  • the transfusion reagent was obtained as follows: Effectene Transfection Reagent (power Catalog No. 301425, Qiagen, CA), TransFastTM Transfection Reagent (E2431, Promega, WI), TfxTM-20 Reagent (E2391, Promega, WI), Super Feet Transfection Reagent (30 ⁇ 305, Qiagen, CA), PolyFect Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA), LipofectAMINE 2000 Reagent (11 668-019, Invitrogen corporation, CA), JetPEI (X4) cone. (101-30, Polyplus-transfection, France), and ExGen 500 (R0511, Fermentas Inc., MD).
  • the printing solution contained plasmid DNA and cell adhesion molecules (Plasma fibronectin dissolved in ultrapure water at a concentration of 4 mg ZmL (Catalog No. 16042-41, Nakalai Tesque, Japan)). .
  • the above solution was applied to the surface of the slide using an inkjet printer (synQUAD TM, Cartesian Technologies, Inc., CA) or manually using a 0.5-10 zL tip.
  • the printed slides were dried for 15 minutes at room temperature inside a safety cabinet. Prior to transfection, the total Effectene reagent was gently poured onto DNA-printed glass slides and incubated at room temperature for 15 minutes.
  • Excess Effectene solution was removed from the glass slide using a suction aspirator and dried inside the safety cabinet at room temperature for 15 minutes.
  • the resulting DNA-printed glass slide was placed on the bottom of a 100 mm culture dish, and approximately 25 mL of the cell suspension (2-4 ⁇ 10 4 cells / mL) was gently poured into the dish. The dish is then transferred to a 37 ° C, 5% CO incubator and incubated for 2-3 days.
  • transfection reagents for other transfection reagents (TransFastTM, TfxTM_20, SuperFect, PolyFect, LipofectAMINE 2000, JetPEI (X4) cone. Or ExGen), manufacturers distribute plasmid DNA, fibronectin, and transfection reagents Mix uniformly in a 1.5 mL microtube according to the ratio indicated in the instructions and incubate at room temperature for 15 minutes before printing on the chip. The printing solution was applied onto the surface of the slide glass using an inkjet printer or a 0.5-10 chip. The printed slides were allowed to dry completely for 10 minutes at room temperature inside a safety cabinet.
  • hMSCs human mesenchymal stem cells
  • the solid-phase transfection technology has enabled the technical achievement of a "transfection patch" that can be used for in vivo gene delivery and the solid-phase transfection for high-throughput gene function studies in hMSC. It has been determined that Yong Array (SPTA) will be possible.
  • SPTA Yong Array
  • FIG. Books An example of the results of the above experiment is shown in FIG. Books that use microprinting technology
  • a mixture comprising the selected genetic material, the transfection reagent and appropriate cell adhesion molecules, and salts could be immobilized on a solid support.
  • Cell culture on a support on which the mixture was immobilized allowed the uptake of the genes in the mixture for the cultured cells.
  • the present inventors prepared five different cell lines (HEK293, HeLa, NIH3T3, HepG2, and hMSC). Both the methodology (transfection in solid-phase system) and the conventional liquid-phase system were used and studied under a series of transfusion conditions.
  • RFP red fluorescent protein
  • GFP green fluorescent protein
  • transfection reagents were evaluated: four liquid transfection reagents (Effectene, TransFastTM, TfxTM_20, LopofectAMINE 2000), two polyamines (SuperFect, PolyFect), and two types of polyimine ietPEI ( X 4) and ExGen 500).
  • Transfection efficiency The transfection efficiency was determined as the total fluorescence intensity per unit area ( Figure 7A). Depending on the cell line used, optimal liquid phase results were obtained with different transfusion reagents. These efficient transfection reagents were then used to optimize a solid phase protocol (see FIG. 7CD). Some trends were observed: cell lines that are readily transfatable (e.g., HEK293, HeLa, In the case of NIH3T3), the transfer efficiencies observed with the solid-phase protocol were achieved at essentially similar levels of power, which was slightly better than the standard liquid-phase protocol ( Figure 7B). ).
  • a further cause of cross contamination may be the mobility of transfection cells on a solid support.
  • Arrays were made as described in Example 6. As genetic material, a mixture of plasmid DNA and shRNA was used. The composition is shown in Table 2 below.
  • RNAi microarray using siRNA
  • RNAi transfection microarray was constructed using the same protocol as in Example 6, but using siRNA instead of shRNA.
  • siRNAs were synthesized for each transcription factor using the 18 types of transcription factor reporters and Actin promoter vectors in the following table.
  • siRNA against EGFP was used as a control, and evaluated whether the siRNA knocked down the target transcription factor.
  • scramble RNA was used as a negative control, and the ratio was evaluated by taking these ratios.
  • FIG. 12 summarizes the results for each gene.
  • Nucleic acid fragments as shown in Fig. 13 were obtained by PCR and used as genetic material for the transfection microarray. The procedure is described below.
  • the obtained PCR fragment was subjected to phenol / chloroform extraction and purified by ethanol precipitation.
  • the sequence of the PCR fragment is as follows.
  • FIG. 15 shows the results.
  • Figure 15 compares the circular DNA with the PCR fragment. In both cases, transfection was successfully performed, and it was revealed that transfection was performed similarly to the full-length plasmid even when the PCR fragment was used as genetic material.
  • the present invention provides a method for immobilizing a substance that provides biocompatibility (eg, cell affinity) and / or sustained release onto a solid support, which is unexpectedly simple. By utilizing such effects, various biological phenomena such as gene transfer, signal transduction, and drug efficacy can be exerted using the solid support.
  • biocompatibility eg, cell affinity
  • various biological phenomena such as gene transfer, signal transduction, and drug efficacy can be exerted using the solid support.
  • Cells are an important tool in medical technology, drug development, etc., and their usefulness in the industry should be evaluated because various tools can be developed.

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Abstract

　本発明は、遺伝物質を簡便に支持体に任意のタイミングで任意の組み合わせで固定する方法の開発に有用な技術を提供する。より詳細には、本発明は、遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するためのキットであって、ａ）遺伝物質と、ｂ）該遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電性物質と、ｃ）塩と、を含み、該遺伝物質と該荷電性物質と該塩とを固相支持体上で混合することを指示する指示書を備える、キット、それに使用する組成物、およびそれを利用したシステム、キットに関する。

Description

明 細 書
遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するための組成物および方法 技術分野
[0001] 本発明は、遺伝物質の固定技術に関する。より詳細には、本発明は、固相支持体 に生体分子などの物質を固定するための方法およびそれに関するキット、組成物な どに関する。
背景技術
[0002] マイクロタイタープレートなどの支持体に DNAなどの遺伝物質を固定して種々の分 析を行う試みが広く行われてレ、る。
[0003] 従来支持体に生体分子を固定するやり方としては、例えば、共有結合を介する方 法、疎水性相互作用、吸着、シラン化などの固相の表面処理などの方法がある。
[0004] 例えば、 Nikiforov et al.は、陽イオン性界面活性剤を媒体としたオリゴマーの ポリスチレンゥエルへの結合を利用する方法を開示した (非特許文献 1)。
[0005] Nagata et al.は、未知量のクローニング DNAを 0· 1M MgClの存在下でマ
2
イクロタイターゥエルに結合させる技術を開示した（非特許文献 2)。 Dahlen, P. et al.は、マイクロタイターゥエル中でのサンドイッチハイブリダィゼーシヨンにおいて、 クローニング捕捉 DNAをゥエルに吸着させることを記載してレ、る（非特許文献 3)。 N aClを媒体としたオリゴマーのポリスチレンゥエルへの結合が Nikiforov Nikiforov et al. (非特許文献 4)により検討されている。
[0006] しかし、これらの方法は、固定工程において、一定の工数を必要とするカ 特殊な 処理を必要とすることから、より簡便な生体分子などの物質の固定方法への需要は 大いにある。
[0007] また、固定後に徐放することが望ましい場合も多レ、。そのような場合として、例えば、 マイクロタイタープレートなどのプレート上でいったん生体分子を固定した後、アツセ ィにおいてアツセィ溶液にそのプレートを浸した後にその固定された生体分子が徐 々に放出することが必要な場合などが挙げられる。あるいは、細胞などの生体に対し て固定後に親和性を保持することが求められる場合もあるが、従来の方法では達成 されていないか、あるいは固定後の生体への親和性が大いに低減することが多ぐ満 足な固定方法が開発されていないのが現状である。
[0008] また、本発明者らは、支持体上に生体物質を固定するために、塩を介在させる方法 を見出したが、当該分野においては、支持体の上で簡易、遺伝物質を支持体に固定 し、細胞に導入することを可能にさせるようなことが求められている。特に、複数の遺 伝物質を任意に支持体 (例えば、アレイなど）上で混合することで、種々のパターンの アレイを作成することができれば、細胞に関する開発スピードは格段に上昇すること が期待されることから、そのような技術の登場が待ち望まれてレ、る。
非特許文献 l : Nikiforov et al. 、 Nucleic Acids Res. 22 : 4167— 4175、 19 94
非特許文献 2 : Nagata et al. 、 FEBS Letters 183 : 379— 382 (1985) 非特許文献 3 : Dahlen et al. , Mol. Cell. Probes 1 : 159—168 (1987) 非特許文献 4 : PCR Methods Applic. 3 : 285— 291 , 1994
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 上記現状に鑑み、本発明では、遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入する方法 を開発することを課題の一つとした。本発明はまた、支持体への固定後に、特定の溶 液に溶解したときに固定された生体分子などの物質が徐放され、あるいは細胞など の生体への親和性が実質的に保持または改善されるような効果を達成する固定方 法を開発することも課題の一つとした。特に、複数の遺伝物質を支持体上で任意の パターンで配置し、その後細胞に導入することができるような技術を開発することを目 的とした。
課題を解決するための手段
[0010] 上記課題は、 DNA、 RNA、ポリペプチドなどの遺伝物質を、それとは反対の電荷 を有する物質と、塩 (有機塩、無機塩 (例えば、培地に含まれるリン酸カルシウムなど の無機塩)）とを、支持体上で混合することによって、予想外に、簡便に支持体に固 定され、その後細胞に取り込まれ、細胞において発現することを本発明者らが見いだ したことによって解決された。本発明者らはまた、上記構成によって、固定された遺伝 物質が、固定された後、アツセィ溶液などの溶液に支持体 (例えば、プレート）を浸す と徐放されることを予想外に見いだした。本発明者らはまた、上記構成を用いると、生 体 (例えば、組織、細胞）に対する親和性が保持または改善されることを見いだした。 このように、本発明は、以下を提供する。
1.遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するためのキットであって、
a)遺伝物質と、
b)上記遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電性物質と、
c)塩と、
を含み、
上記遺伝物質と上記荷電性物質と塩とを固相支持体上で混合することを指示する 指示書を備える、キット。
2.上記遺伝物質と、荷電性物質と、塩とからなる群より選択される少なくとも 2つの物 質は、混合されて提供される、項目 1に記載のキット。
3.上記遺伝物質は、少なくとも 2種類存在する、項目 1に記載のキット。
4.上記遺伝子物質は、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合わせからなる群よ り選択される、項目 1に記載のキット。
5.上記荷電性物質は、細胞親和性を有する、項目 1に記載のキット。
6.上記荷電性物質は、生体分子を含む、項目 1に記載のキット。
7.上記生体分子は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこ れらの複合体からなる群より選択される、項目 6に記載のキット。
8.上記荷電性物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ 酸およびその複合体からなる群より選択される、項目 1に記載のキット。
9.上記荷電性物質は、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リボソーム系試薬および 帯電コロイドからなる群より選択される、項目 1に記載のキット。
10.上記塩は、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したものである力 \あるい は塩基の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したものである、項目 1に記載の キット。 11.上記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン 酸ナトリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシ ゥム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、項目 1に記載のキット
12.上記塩は、緩衝液、培養液および血清の形態で提供される、項目 1に記載のキ ッ卜。
13.上記遺伝物質は、細胞に導入された後生物学的活性を有する物質をコードする 、項目 1に記載のキット。
14.上記遺伝物質、上記荷電性物質および上記塩は薬学的に受容可能である、項 目 1に記載のキット。
15.上記遺伝物質、上記荷電性物質および上記塩は、マイクロカプセル中に含まれ る、項目 1に記載のキット。
16.遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するための方法であって、
I)支持体を提供する工程と、
II)上記支持体に、 a)遺伝物質と、 b)上記遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電 性物質と、 c)塩と、を別々のまたは一緒に提供する工程と、
III)上記遺伝物質と上記荷電性物質と塩とを固相支持体上で混合する工程と、 を包含する、方法。
17.上記遺伝物質と、荷電性物質と、塩とからなる群より選択される少なくとも 2つの 物質は、混合されて提供される、項目 16に記載の方法。
18.上記遺伝物質は、少なくとも 2種類存在する、項目 16に記載の方法。
19.上記遺伝子物質は、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合わせからなる群 より選択される、項目 16に記載の方法。
20.上記荷電性物質は、細胞親和性を有する、項目 16に記載の方法。
21.上記荷電性物質は、生体分子を含む、項目 16に記載の方法。
22.上記生体分子は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、および これらの複合体からなる群より選択される、項目 21に記載の方法。
23.上記荷電性物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミ ノ酸およびその複合体からなる群より選択される、項目 16に記載の方法。
24.上記荷電性物質は、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リボソーム系試薬およ び帯電コロイドからなる群より選択される、項目 16に記載の方法。
25.上記塩は、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したものである力 \あるい は塩基の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したものである、項目 16に記載 の方法。
26.上記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン 酸ナトリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシ ゥム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、項目 16に記載の方 法。
27.上記塩は、緩衝液、培養液および血清の形態で提供される、項目 16に記載の 方法。
28.上記遺伝物質は、細胞に導入された後生物学的活性を有する物質をコードする 、項目 16に記載の方法。
29.上記遺伝物質、上記荷電性物質および上記塩は薬学的に受容可能である、項 目 16に記載の方法。
30.上記遺伝物質、上記荷電性物質および上記塩は、マイクロカプセル中に含まれ る、項目 16に記載の方法。
31.上記支持体は、固相支持体である、項目 16に記載の方法。
32.上記支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、 金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、項目 1 6に記載の方法。
33.上記支持体は、コーティングされる、項目 16に記載の方法。
34.上記コーティングは、ポリ— L—リジン、シラン、 APS、 MAS,疎水性フッ素樹脂 および金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、 項目 33に記載の方法。
35.上記支持体はチップである、項目 16に記載の方法。
36.上記支持体はチップであり、上記複合体は上記チップ上にアレイ状に配列され る、項目 16に記載の方法。
37.上記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、項目 16に記載の 方法。
38.上記工程 II)は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、項目 16に記載の方 法。
39.上記工程 III)は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、項目 16に記載の 方法。
40.上記混合物を固相支持体に付着した後、その混合物中の溶媒を低減または除 去する工程をさらに包含する、項目 16に記載の方法。
41.遺伝物質と、上記遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電性物質と、塩とが表面 に固定された、支持体。
42.上記遺伝物質は、細胞に導入され得る、項目 41に記載の支持体。
43.上記遺伝物質は、 2種類以上含まれる、項目 41に記載の支持体。
44.上記遺伝物質は、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合わせからなる群よ り選択される、項目 41に記載の支持体。
45.上記荷電性物質は、細胞親和性を有する、項目 41に記載の支持体。
46.上記荷電性物質は、生体分子を含む、項目 41に記載の支持体。
47.上記生体分子は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、および これらの複合体からなる群より選択される、項目 41に記載の支持体。
48.上記荷電性物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミ ノ酸およびその複合体からなる群より選択される、項目 41に記載の支持体。
49.上記荷電性物質は、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リボソーム系試薬およ び帯電コロイドからなる群より選択される、項目 41に記載の支持体。
50.上記塩は、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したものである力 \あるい は塩基の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したものである、項目 41に記載 の支持体。
51.上記塩は、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン 酸ナトリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシ ゥム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、項目 41に記載の支 持体。
52.上記塩は、緩衝液、培養液および血清の形態で提供される、項目 41に記載の 支持体。
53.上記遺伝物質は、細胞に導入された後生物学的活性を有する物質をコードする 、項目 41に記載の支持体。
54.上記遺伝物質、上記荷電性物質および上記塩は薬学的に受容可能である、項 目 41に記載の支持体。
55.上記遺伝物質、上記荷電性物質および上記塩は、マイクロカプセル中に含まれ る、項目 41に記載の支持体。
56.上記支持体は、固相支持体である、項目 41に記載の支持体。
57.上記支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、 金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、項目 4 1に記載の支持体。
58.上記支持体は、コーティングされる、項目 41に記載の支持体。
59.上記コーティングは、ポリ _L—リジン、シラン、 APS、 MAS,疎水性フッ素樹脂 および金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、 項目 58に記載の支持体。
60.上記支持体はチップである、項目 41に記載の支持体。
61.上記支持体はチップであり、上記複合体は上記チップ上にアレイ状に配列され る、項目 41に記載の支持体。
62.上記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、項目 41に記載の 支持体。
[0013] 本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を 読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。 発明の効果
[0014] 遺伝物質を、支持体 (例えば、アレイ、プレートなど）上で任意のパターンで混合し、 細胞に導入し、遺伝子発現させることが可能となった。従って、複数の遺伝子を同時 に細胞に導入した場合などの細胞における影響を調べることが可能となった。細胞 は、医療技術、医薬開発などにおいて重要なツールであり、そのツールを種々開発 できることから、その産業上における有用性も評価されるべきである。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、実施例 4における代表的な結果例である。図 1は、複合体化していない DNA (上）と、正に荷電した物質と複合体化させた DNA (下、 NP10処理）とを対比 した結果を示す。固相に対して複合体を添加した直後（0分)ならびに、添加の 1分後 、 5分後および 10分後に細胞含有液をカ卩えた後のトランスフエクシヨンの様子を示す
[図 2]図 2は、実施例 4のヒト間葉系幹細胞でのプリント（重ね打ち）の場合の結果例を 示す。固相基板上に pEGFP-Nlベクターをプリントし、乾燥後、 LipofectAMINE2000 を同一座標にプリントし乾燥させた。その後、フイブロネクチン溶液を同一座標に重 ねてプリントし乾燥させた。これに、間葉系幹細胞を播種し、 2日間培養を行った後に 、蛍光イメージスキャナにて画像を取得した。
[図 3]図 3には、実施例 5における HeLa— K細胞にトランスフエタトした後 3日目の遺伝 子発現の様子を示す。固相基板上に pEGFP-Nlと pDsRed2-l， pEGFP-Nlと pPUR6iGFP272ベクターをそれぞれプリントし、乾燥後、 LipofectAMINE2000を同一 座標にプリントし乾燥させた。その後、フイブロネクチン溶液を同一座標に重ねてプリ ントし乾燥させた。これに、 HeLa_K細胞を播種し、 3日間培養を行った後に、蛍光ィメ ージスキャナにて画像を取得した。
[図 4]図 4には、実施例 5における HeLa— K細胞にトランスフエタトした後 6日目の遺伝 子発現の様子を示す。固相基板上に pEGFP-Nlと pDsRed2-l， pEGFP-Nlと pPUR6iGFP272ベクターをそれぞれプリントし、乾燥後、 LipofectAMINE2000を同一 座標にプリントし乾燥させた。その後、フイブロネクチン溶液を同一座標に重ねてプリ ントし乾燥させた。これに、 HeLa-K細胞を播種し、 6日間培養を行った後に、蛍光ィメ ージスキャナにて画像を取得した。
[図 5]図 5は、固相系トランスフエクシヨンアレイ（SPTA)作製方法を模式的に示した 図である。この図は、固相トランスフエクシヨンの方法論を示す。 [図 6]図 6は、固相トランスフエクシヨンの結果を示す。 HEK293細胞株を用いて SPT Aを作製した結果を示す。緑色に蛍光が光っている部分は、トランスフエクシヨンされ た付着細胞を示す。バーは 3mmである。
[図 7A]図 7Aおよび図 7Bは、液相トランスフヱクシヨンと SPTAの比較を示す結果で ある。図 7Aは、実験に用いた 5つの細胞株について、 GFP強度/ mm2を測定した 結果を示す。図 7Aは、トランスフエクシヨン効率を、単位面積あたりの総蛍光強度とし て決定する方法を示す。
[図 7B]図 7Aおよび図 7Bは、液相トランスフヱクシヨンと SPTAの比較を示す結果で ある。図 7Bは、図 7Aの示すデータに対応する、 EGFPを発現する細胞の蛍光画像 である。図 7Bにおいて、白丸で示された領域は、プラスミド DNAを固定化した領域 を示す。プラスミド DNAを固定化した領域以外の領域では、細胞が固相に固定化さ れたにもかかわらず、 EGFPを発現する細胞は観察されなかった。 白棒は、 500 x m を示す。従来の液相トランスフエクシヨンと、 SPTAとの間の比較が示される。上の液 相トランスフエクシヨンと固相トランスフエクシヨン（下）とでは、 Α)測定された蛍光/ m m2の 5種の細胞株について、図 7Aに対応する。 EGFP発現細胞の蛍光写真であり 、白色の円状のものは、プラスミド DNAプリント領域に当たる。この領域の外の領域 の細胞は、 EGFPを発現している力 プリント領域以外の領域にも蛍光を発していな い細胞が付着している。
[図 7C]図 7Cおよび 7Dは、固相トランスフエクシヨン法の代表的プロトコール例を示す
[図 7D]図 7Cおよび Dは、固相トランスフエクシヨン法の代表的プロトコール例を示す。 園 8]図 8は、チップのコーティングによって相互夾雑が低減された結果を示す。 図 8は、 HEK293細胞、 HeLa細胞、 NIT3T3細胞（「3T3」として示す）、 HepG2細胞 、および hMSCを用いて、液相トランスフエクシヨン法および SPTAを行った結果を示 す。トランスフエクシヨン効率を、 GFP強度で示す。相互夾雑についての研究結果。 p EGFP—NM1および pDsRed2_Nlを、巿松模様にプリントし、そして hMSC (パネ ノレ A)および HEK293 (パネル B)を培養したものである。
[図 9]図 9は、実施例 7における RNAiトランスフエクシヨンアレイのトランスフエクシヨン 結果を示す。固相基板上に表 3に示す各レポーター遺伝子を一遺伝子あたり 4スポッ トになるようプリントし、乾燥後、各転写因子に対しての siRNA (28種類）を対応したレ ポーター遺伝子がプリントされている座標上にプリントし、乾燥させた。また、コント口 一ノレとして、 EGFPに対する siRNAを用レ、、ネガティブコントロールとしては、
scrambleRNAをもちいた。その後、、 LipofectAMINE2000を各遺伝子プリント同一座 標にプリントし乾燥させた。その後、フイブロネクチン溶液を同一座標に重ねてプリン トし乾燥させた。これに、 HeLa_K細胞を播種し、 2日間培養を行った後に、蛍光ィメー ジスキャナにて画像を取得した。
[図 10]図 10は、実施例 7における RNAiトランスフエクシヨンアレイのトランスフエクショ ン結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量ィ匕した 後に、ネガティブコントロールであるスクランブル RNAをプリントした各レポーターの輝 度に対する比率を算出した。これを、各レポーター ·各細胞に対してすベて行った結 果を示している。
[図 11]図 11は、実施例 8における RNAiトランスフエクションアレイのトランスフエクショ ン結果を示す。固相基板上に表 3に示す各レポーター遺伝子発現ユニット PCR断片 を一遺伝子あたり 4スポットになるようプリントし、乾燥後、各転写因子に対しての siRNA (28種類）を対応したレポーター遺伝子がプリントされている座標上にプリントし 、乾燥させた。また、コントロールとして、 EGFPに対する siRNAを用レヽ、ネガティブコン トロールとしては、スクランブル RNAをもちいた。その後、、 LipofectAMINE2000を各遺 伝子プリント同一座標にプリントし乾燥させた。その後、フイブロネクチン溶液を同一 座標に重ねてプリントし乾燥させた。これに、各細胞を播種し、 2日間培養を行った後 に、蛍光イメージスキャナにて画像を取得した。
[図 12]図 12は、実施例 8における RNAiトランスフエクシヨンアレイのトランスフエクショ ン結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光輝度を画像解析によって定量ィ匕した 後に、ネガティブコントロールであるスクランブル RNAをプリントした各レポーターの輝 度に対する比率を算出した。これを、各レポーター ·各細胞に対してすベて行った結 果を示している。
園 13]図 13は、実施例 8において得た PCR断片の構造を示す。 [図 14]図 14は、 pEGFP_Nlの構造を示す。
[図 15]図 15は、環状 DNA (左三つ、 pEGFP_Nl)と PCR断片（右三つ、 EGFP発 現単位）とを用いたトランスフエクシヨンマイクロアレイのトランスフエタト効率の比較を 示す。
配列の説明
[0016] 配列番号 1： pUR6iGFP272インサートの配列
配列番号 2：実施例 8で用いたプライマー 1
配列番号 3：実施例 8で用いたプライマー 2
配列番号 4：実施例 8の PCR反応できた PCR断片
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書 において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味 で用いられることが理解されるべきである。
[0018] (用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
[0019] 本明細書において使用される用語「物質」は、当該分野において用いられる最も広 義な意味と同じ意味で含まれ、正または負に荷電することができるものを含む。
[0020] 本明細書において「遺伝物質」とは、遺伝情報を担う任意の物質をいう。そのような 物質としては、例えば、 DNA、 RNA、 PNA、タンパク質などが挙げられるがそれらに 限定されない。 DNAは、 cDNA、ゲノム DNA,人工 DNA、 RNAiなど任意の形態 のものであり得る。 RNAは、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 RNAiなどであってもよい。
[0021] 本明細書にぉレ、て「荷電性物質」とは、電荷を有し得るかまたは有する物質をレ、う。
そのような物質には、正に荷電した物質および負に荷電した物質などが挙げられる がそれらに限定されない。
[0022] 本明細書にぉレ、て「正に荷電した物質」は、正荷電を有するすべての物質を包含 する。そのような物質としては、例えば、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質などの カチオン性物質が含まれるがそれらに限定されなレ、。好ましくは、そのような正に荷 電した物質は、複合体を形成することができる物質であることが有利である。そのよう な複合体を形成することができる正に荷電した物質としては、例えば、カチオン性ポリ マーのようにある程度の分子量を有する物質、あるいは、カチオン性脂質のように特 定の溶媒 (例えば、水、水溶液など）中においてある程度溶解せずに残存することが できる物質などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような好ましい正に荷電 した物質としては、例えば、ポリエチレンィミン、ポリ Lリシン、合成ポリペプチドもしくは それらの誘導体などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。あるいは、正に荷電した 物質としては、ヒストン、合成ポリペプチドなどのような生体分子が挙げられるがそれら に限定されない。そのような好ましい正に荷電した物質の種類は、複合体を形成する パートナーである負に荷電した物質の種類に応じて変動する。好ましい複合体形成 パートナーを選択することは、当業者には容易であり、そのような選択は、当該分野 において周知の技術を用いて行うことができる。そのような好ましい複合体形成パー トナーの選択においては、種々のパラメータを考慮することができる。そのようなパラメ ータとしては、例えば、電荷、分子量、疎水性、親水性、置換基の性質、 pH、温度、 塩濃度、圧力などの種々の物理的パラメータ、化学的パラメータなどが挙げられるが それらに限定されない。
[0023] 本明細書にぉレ、て「カチオン性ポリマー」は、カチオン性の官能基を有するポリマー をいい、例えば、ポリエチレンィミン、ポリ Lリシン、合成ポリペプチドもしくはそれらの 誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。
[0024] 本明細書において「カチオン性脂質」は、カチオン性の官能基を有する脂質をいい 、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルセリ ン、及びその誘導体が挙げられるがそれらに限定されなレ、。
[0025] ここで、カチオン性の官能基としては、例えば、一級ァミン、二級ァミン、三級アミン が挙げられるがそれらに限定されない。
[0026] 本明細書にぉレ、て「負に荷電した物質」は、負荷電を有するすべての物質を包含 する。そのような物質としては、例えば、 DNAなどの生体分子ポリマー、ァニオン性 脂質などのァニオン性物質が含まれるがそれらに限定されなレ、。好ましくは、そのよう な負に荷電した物質は、複合体を形成することができる物質であることが有利である 。そのような複合体を形成することができる負に荷電した物質としては、例えば、 DN Aのようなァニオン性ポリマーのようにある程度の分子量を有する物質、あるいは、ァ 二オン性脂質のように特定の溶媒 (例えば、水、水溶液など）中においてある程度溶 解せずに残存することができる物質などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。その ような好ましい負に荷電した物質としては、例えば、 DNA、 RNA、 PNA、ポリぺプチ ド、化学化合物、及びその複合体などが挙げられるがそれらに限定されない。あるい は、負に荷電した物質としては、 DNA、 RNA、 PNA、ポリペプチド、化学化合物、及 びその複合体などのような生体分子が挙げられるがそれらに限定されない。そのよう な好ましい負に荷電した物質の種類は、複合体を形成するパートナーである正に荷 電した物質の種類に応じて変動する。好ましレ、複合体形成パートナーを選択すること は、当業者には容易であり、そのような選択は、当該分野において周知の技術を用 いて行うことができる。そのような好ましい複合体形成パートナーの選択においては、 種々のパラメータを考慮することができる。そのようなパラメータもまた、上述の正に荷 電した物質において考慮すべきパラメータと同様、種々のものを包含する。
[0027] 本明細書にぉレ、て「ァニオン性ポリマー」は、ァニオン性の官能基を有するポリマー をいい、例えば、 DNA、 RNA、 PNA、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体 が挙げられるがそれらに限定されない。
[0028] 本明細書にぉレ、て「ァニオン性脂質」は、ァニオン性の官能基を有する脂質をレ、レヽ 、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンが挙げられるがそれらに限定され ない。
[0029] ここで、ァニオン性の官能基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基が挙げら れるがそれらに限定されない。
[0030] 従って、本発明の遺伝物質とは、「反対の荷電を有する荷電性物質」とは、遺伝物 質が上述のような正に荷電した物質の場合は、負に荷電した物質をいい、遺伝物質 が上述のような負に荷電した物質の場合は、正に荷電した物質をレ、う。
[0031] また、 目的の物質に対して、正電荷または負電荷を有する置換基などの部分を付 加することによって、その目的の物質の電荷を変換することも可能である。好ましい複 合体パートナーが固定を目的とする物質と同じ電荷を有している場合に、いずれか の電荷を変換することによって複合体形成を促進することが可能である。
[0032] 本明細書において「相互作用」とは、 2つの物体について言及するとき、その 2つの 物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有 結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、 疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ま しくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などである。本明細書において「共 有結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電子対が 2つの原子に共 有されて形成する化学結合をいう。本明細書において「水素結合」とは、当該分野に おける通常の意味で用いられ、電気的陰性度の高レ、原子に一つしかなレ、水素原子 の核外電子が引き寄せられて水素原子核が露出し、これが別の電気的陰性度の高 い原子を引き寄せて生じる結合をいい、例えば、水素原子と電気的陰性度の高い（ フッ素、酸素、窒素などの）原子との間にできる。
[0033] 本明細書において使用される用語「生体物質」または「生体分子」とは、本明細書 において互換可能に用いられ、生体に関連する物質または分子をいう。生体分子は 、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されない。生体に影響を与え 得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで 合成された分子も生体への効果を目的としている限り、生体物質の定義に入る。生 体物質には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのような RNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例え ば、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない 。従って、ポリマー分子と複合体を形成し得る限り、生体物質には、細胞自体、組織 の一部、他の物質も包含され得る。
[0034] 本明細書において「ポリマー分子」とは、モノマーが重合してできる高分子量の物質 をさし、通常、分子量が約 5000以上のものをいう。
[0035] 本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」は、本明細書において互換可能に使用され、任意の長さのァミノ 酸またはその改変体のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していて もよぐ環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであって もよぐ改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の 複合体へとアセンブルされたものも包含し得る。この用語はまた、天然または人工的 に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフ イド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作も しくは改変 (例えば、標識成分との結合体化)。この用語の定義にはまた、例えば、ァ ミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸など を含む）、ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他 の改変が包含される。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸 」および「核酸分子」は、本明細書において互換可能に使用され、任意の長さのヌク レオチドまたはその改変体のポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオ チド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。本明細書では、用語「遺伝子」は、「ポ リヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」と互換可能に使用 され得る。本明細書において用語「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌク レオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含む力、またはヌクレオチド間の結合が通常 とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そ のようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、 2，一〇ーメチルーリボヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換さ れた誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3，一 P5，ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチ ド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体ォ リゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C—5プロピニルゥラシルで置換さ れた誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C—5チアゾールゥ ラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C—5 プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシ トシンがフエノキサジン修飾シトシン（phenoxazine— modified cytosine)で置換さ れた誘導体オリゴヌクレオチド、 DNA中のリボースが 2，_0_プロピルリボースで置換 された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキシ エトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそう ではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様 に、その保存的に改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を 包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1以上の選択された（ または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および/またはデォキシイノシ ン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、 Nucleic A cid Res. 19 : 5081 (1991) ;〇htsukaら、 J. Biol. Chem. 260 : 2605-2608 (19 85)； Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91—98 (1994) )。
[0037] 本明細書において「RNAi」とは、 RNA interferenceの略称で、二本鎖 RNA (ds RNAともいう）のような RNAiを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同な mRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用 レ、られる技術をいう。本明細書において RNAiはまた、場合によっては、 RNAiを引き 起こす因子と同義に用いられ得る。
[0038] 本明細書において「RNAiを引き起こす因子」とは、 RNAiを引き起こすことができる ような任意の因子をレ、う。本明細書にぉレ、て「遺伝子」に対して「RNAiを弓 [き起こす 因子」とは、その遺伝子に関する RNAiを引き起こし、 RNAiがもたらす効果 (例えば 、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのような RNAiを引き起こ す因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約 70% の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を含 む、少なくとも 10ヌクレオチド長の二本鎖部分を含む RNAまたはその改変体が挙げ られるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、 3'突出末端を含み、 より好ましくは、 3'突出末端は、 2ヌクレオチド長以上の DNA (例えば、 2 4ヌクレオ チド長の DNAであり得る。
[0039] 理論に束縛されないが、 RNAiが働く機構として考えられるものの一つとして、 dsR NAのような RNAiを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、 4 0塩基対以上） RNAの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Dicer)と呼ばれる R Naselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、その分子を 3'末端力 約 20塩基対ず つ切り出し、短鎖 dsRNA (siRNAとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「siRN A」とは、 short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまた は生化学的に合成されたもの力、あるいは生物体内で合成されたもの力、あるいは 約 40塩基以上の二本鎖 RNAが体内で分解されてできた 10塩基対以上の短鎖二本 鎖 RNAをレ、い、通常、 5 '—リン酸、 3 '— OHの構造を有しており、 3'末端は約 2塩基 突出している。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、 RISC (RNA— induce d— silencing—complex)が形成される。この複合体は、 siRNAと同じ配列を有する mRNAを認識して結合し、 RNaselll様の酵素活性によって siRNAの中央部で mR NAを切断する。 siRNAの配列と標的として切断する mRNAの配列の関係について は、 100%—致することが好ましレ、。し力、し、 siRNAの中央力 外れた位置について の塩基の変異については、完全に RNAiによる切断活性がなくなるのではなぐ部分 的な活性が残存する。他方、 siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きぐ RNAi による mRNAの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつ mRNAについては、その変異を中央に配した siRNAを合成し、細胞内に導入するこ とで特異的に変異を含む mRNAだけを分解することができる。従って、本発明では、 siRNAそのものを RNAiを引き起こす因子として用いることができるし、 siRNAを生 成するような因子（例えば、代表的に約 40塩基以上の dsRNA)をそのような因子とし て用いることができる。
[0040] また、理論に束縛されることを希望しないが、 siRNAは、上記経路とは別に、 siRN Aのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポリメラーゼ（RdRP)の プライマーとして作用し、 dsRNAが合成され、この dsRNAが再びダイサ一の基質と なり、新たな siRNAを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫など では、例えば 35分子の dsRNA分子が、 1 , 000コピー以上ある細胞内の mRNAを ほぼ完全に分解することから、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子が有用 であることが理角军される。
[0041] 本発明において siRNAと呼ばれる、約 20塩基前後（例えば、代表的には約 21 2 3塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖 RNAを用いることができる。このような siR NAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、その siRNAの標的となる 病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することが できる。
[0042] 本発明において用いられる siRNAは、 RNAiを引き起こすことができる限り、どのよ うな形態を採っていてもよい。
[0043] 別の実施形態において、本発明の RNAiを引き起こす因子は、 3'末端に突出部を 有する短いヘアピン構造（shRNA; short hairpin RNA)であり得る。本明細書に おいて「shRNA」とは、一本鎖 RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより 、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約 20塩基対以上の分子を レ、う。そのような shRNAは、人工的に化学合成される。あるレ、は、そのような shRNA は、センス鎖およびアンチセンス鎖の DNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造の DNAを T7 RNAポリメラーゼによりインビトロで RNAを合成することによって生成す ること力 Sできる。理論に束縛されることは希望しなレ、が、そのような shRNAは、細胞内 に導入された後、細胞内で約 20塩基（代表的には例えば、 21塩基、 22塩基、 23塩 基）の長さに分解され、 siRNAと同様に RNAiを引き起こし、本発明の処置効果があ ることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含 む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、 sh RNAは、 siRNAと同様に RNAiを引き起こすことから、本発明の有効成分として用い ること力 Sできる。 shRNAはまた、好ましくは、 3 '突出末端を有し得る。二本鎖部分の 長さは特に限定されないが、好ましくは約 10ヌクレオチド長以上、より好ましくは約 20 ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、 3'突出末端は、好ましくは DNAであり得、よ り好ましくは少なくとも 2ヌクレオチド長以上の DNAであり得、さらに好ましくは 2— 4ヌ クレオチド長の DNAであり得る。
[0044] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、人工的に合成した (例えば 、化学的または生化学的)ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この 両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、 液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
[0045] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、インビトロで合成することも できる。この合成系において、 T7 RNAポリメラーゼおよび Τ7プロモーターを用いて 、铸型 DNAからアンチセンスおよびセンスの RNAを合成する。これらをインビトロで アニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じて RNAiが引き起こ され、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのよう な RNAを細胞内に導入することができる。
[0046] 本発明の RNAiを引き起こす因子としてはまた、 mRNAとハイブリダィズし得る一本 鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。その ような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
[0047] 本明細書において「塩」は、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味で用 いられ、無機塩および有機塩の両方を含む。塩は、通常、酸と塩基との中和反応に よって生成する。従って、塩は、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したもので あっても、塩基の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したものであってもよい。 塩には中和反応で生成する NaCl、 K SOなどといったもののほ力に、金属と酸との
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反応で生成する PbSO 、 ZnClなど種々の種類があり、これらは、直接中和反応によ
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つて生成したものでなくても、酸と塩基との中和反応から生成したとみなすことができ る。塩としては、正塩（酸の Hや塩基の OHが塩に含まれていなレ、もの、例えば、 NaC 1、 NH Cl、 CH C〇ONa、 Na CO )、酸性塩（酸の Hが塩に残っているもの、例え
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ば、 NaHCO 、 KHSO、 CaHPO )、塩基性塩（塩基の OHが塩の中に残っている
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もの、例えば、 MgCl (OH)、 CuCl (OH) )などに分類することができるがそれらの分 類は、本発明においてはそれほど重要ではなレ、。好ましい塩としては、培地を構成す る塩 (例えば、塩ィ匕カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸 ナトリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシゥ ム、硝酸鉄、アミノ酸、ビタミン、緩衝液を構成する塩 (例えば、塩ィ匕カルゥム、塩ィ匕マ グネシゥム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム）などが好ましい。細胞に対する親 和性を保持または改善する効果がより高いからである。これらの塩は、単独で用いて もよレ、し、複数用いてもよい。複数用いることが好ましい。細胞に対する親和性が高く なる傾向があるからである。従って、 NaClなどを単独で用いるよりも、培地中に含ま れる塩 (例えば、塩化カルゥム、塩化マグネシウム、リン酸水素ナトリウム、塩ィ匕ナトリウ ム）を複数を用いることが好ましぐより好ましくは、培地中に含まれる塩全部をそのま ま使用することが有利であり得る。別の好ましい実施形態では、グルコースを加えても よい。
[0048] 本明細書において使用される「支持体」は、「基板」と同じ意味で使用され、生体分 子のような物質を固定することができる材料 (material)をいう。支持体の材料として は、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体 分子のような物質に結合する特性を有する力、またはそのような特性を有するように誘 導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
[0049] 支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意 の材料が使用され得る力 例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、 プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチ レン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれら に限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例え ば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素 、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポ リプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含 フッ素樹脂、ポリ塩ィ匕ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビエルアルコ ール、ポリビニルァセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ァセタ ール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、 メラミン樹脂、スチレン 'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン 共重合体、シリコーン樹脂、ポリフエ二レンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を 用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、 PVD F膜など、ブロッテイングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材 料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書におい て、プレート、マイクロウヱルプレート、チップ、スライドグラス、フイノレム、ビーズ、金属（ 表面）などの形態をとり得る。
[0050] 1つの実施形態では、本発明では、電極材料を使用して、基板と電極とを兼用した 基板電極とすることもできる。このような基板電極の場合、基板電極の表面を絶縁層 領域で分離し、分離されたそれぞれの電極領域に、それぞれ異なった生体分子を固 定するのが好ましい。電極材料は特に限定されるものではない。そのような電極材料 としては、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン 、ゲルマニウム、ガリウム、タングステンなどの金属単体およびそれらの合金、あるい はグラフアイト、グラシ一カーボンなどの炭素など、またはこれらの酸化物、化合物を 用いることができる。さらに、酸化珪素などの半導体化合物や、 CCD, FET、 CMOS など各種半導体デバイスを用いることも可能である。絶縁基板上に電極膜を形成し、 基板と電極とを一体化した基板電極を用いる場合、この電極膜は、メツキ、印刷、ス パッタ、蒸着などで作製することができる。蒸着を行う場合は、抵抗加熱法、高周波 加熱法、電子ビーム加熱法により電極膜を形成することができる。また、スパッタリン グを行う場合は、直流 2極スパッタリング、バイアススパッタリング、非対称交流スパッ タリング、ゲッタスパッタリング、高周波スパッタリングなどにより電極膜を形成すること が可能である。さらに、ポリピロール、ポリア二リンなどの電解重合膜や導電性高分子 も用いることが可能である。本発明において、電極表面を分離するために用いられる 絶縁材料は特に限定されるものではなレ、が、フォトポリマー、フォトレジスト材料である ことが好ましい。レジスト材料としては、光露光用フォトレジスト、遠紫外用フォトレジス ト、 X線用フォトレジスト、電子線用フォトレジストが用いられる。光露光用フォトレジスト としては、主原料が環化ゴム、ポリ桂皮酸、ノボラック樹脂であるものが挙げられる。遠 紫外用フォトレジストには、環化ゴム、フエノール樹脂、ポリメチルイソプロぺニルケト ン（PMIPK) ,ポリメチルメタタリレート（PMMA)などが用いられる。また、 X線用レジ ストには、 C〇P、メタルアタリレートなどを用いることができる。さらに、電子線用レジス トには、 PMMAなど公知の物質を用いることが可能である。
[0051] 本明細書において「チップ」とは、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型 集積回路をいう。本明細書において、「生体分子チップ」とは、基板と、生体分子とを 含み、その基板には本明細書において定義された生体分子が少なくとも 1つ配置さ れている。生体分子が細胞の場合、そのチップは、細胞チップまたは細胞アレイと呼 は'れる。
[0052] 本明細書において「コーティング」とは、固相支持体について用いられるとき、その 固相支持体の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそのような膜をレ、う。コ 一ティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体の品質向上（例えば、寿命 の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体に結合されるべき物質の親和 性の向上などを目的とすることが多い。そのようなコーティングのための物質としては 、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持体に使用される物質のほか、 DNA、 R NA、タンパク質、脂質などの生体物質、ポリマー（例えば、ポリ- L-リジン、 APS (例 えば、 Ί—ァミノプロビルシラン）、 MAS,疎水性フッ素樹脂）、シラン、金属（例えば、 金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択は当業者の 技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに選択すること ができる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ- L-リジン、 シラン、 APS、 MAS,疎水性フッ素樹脂、エポキシシランまたはメルカプトシランのよ うなシラン、金のような金属を用いることが有利であり得る。このような物質は、細胞ま たは細胞を含む物体 (例えば、生体、臓器など）に適合する物質を用いることが好ま しくあり得る。
[0053] 本明細書において「固定」とは、固相支持体について用いられるとき、その対象とな る物質 (例えば、生体分子）がその支持体において少なくともある一定の時間の間保 持される状態またはそのような状態にさせることをいう。従って、物質が固相支持体上 で固定された後、条件が変化する（例えば、別の溶媒中に浸される）場合は、その固 定状態が解除されてもよい。
[0054] 本明細書において用いられる「細胞親和性」とは、ある物質が細胞（例えば、細菌 細胞、動物細胞、酵母、植物細胞など）または細胞を含む物体 (例えば、組織、臓器 、生体など）と相互作用が可能な状態に置かれたときに、その細胞または細胞を含む 物体に対して有害な影響を与えない性質をいう。好ましくは、細胞親和性を有する物 質は、細胞が優先的に相互作用する物質であり得るがそれに限定されない。本発明 では、固定されるべき物質 (例えば、正に荷電した物質および Zまたは負に荷電した 物質）は、細胞親和性を有することが好ましいがそれに限定されない。固定されるべ き物質が細胞親和性を有する場合、その物質が本発明にしたがって固定されると、 細胞親和性が保持または改善されることが予想外に見いだされた。通常、細胞親和 性を有する物質が固相支持体に固定される場合は、必ずしも細胞親和性が保持され るとは限らなかったことに鑑みると、本発明の効果は計り知れない。
[0055] 本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の 意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜 構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する 生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であって も、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい 。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成 長したトランスジヱニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞 株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
[0056] 本明細書において「組織」（tissue)とは、多細胞生物において、実質的に同一の 機能および/または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有する 力 異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および/または形態を有す るのであれば、組織と呼ばれ得る。
[0057] 本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のあ る機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性 をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特 定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのよ うな臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。 1つ の実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓 、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膝臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに 限定されない。
[0058] 本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が 少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離 された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質 (たとえば、他の細胞、タン パク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについて レ、う場合、「単離された」とは、たとえば、組換え DNA技術により作製された場合には 細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学 物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す
[0059] 本発明で用いられる細胞または細胞を含む物体 (例えば、臓器、組織など）は、ど の生物由来の細胞（たとえば、原核生物（例えば、大腸菌など）、真核生物の単細胞 生物 (酵母など）、任意の種類の多細胞生物 (例えば、動物 (たとえば、脊椎動物、無 脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など)など））でもよい。好ましく は、脊椎動物（たとえば、メタラウナギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生 類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物 (例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇 蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など） 由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、力二クイサル、チンパ ンジ一、二ホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。ヒト由来の細胞が用いられてもよ レ、。
[0060] 本明細書にぉレ、て「徐放」とは、ある物質がその物質を溶解する溶媒に浸される場 合に、一定時間は固相を保ちつつ徐々に溶解することをいう。従って、ある物質が徐 放性を有する場合は、通常、溶媒に浸された後も約 5分間は固定された状態が保た れ、好ましくは少なくとも約 10分間、より好ましくは少なくとも約 15分間は、さらに好ま しくは少なくとも約 30分間固定された状態が保たれる。医薬として用いられる場合は 、徐放性は、少なくとも約 30分間、好ましくは少なくとも約 1時間、より好ましくは少なく とも約 3時間、さらに好ましくは少なくとも約 6— 12時間固定された状態が保たれるこ とが有利である。 DNAのトランスフエクシヨンなど、細胞に直接固定された物質を導 入する目的で使用される場合は、通常、少なくとも約 15分間固定された状態が保た れる。
[0061] 本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタ ンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをレ、い、種々の機能を発揮する活 性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その 酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対 応するレセプタ—への結合を包含する。そのような生物学的活性は、測定対象となる 活性に応じて当該分野において周知の技術によって測定することができる。
[0062] 本明細書において「生体分子を破壊しない条件」とは、生体分子が発揮する少なく とも一つの生物学的活性 (例えば、遺伝子発現活性、酵素活性など）が損なわれな い条件をいう。そのような条件については、当業者はその生体分子に応じ、種々の考 慮事項 (例えば、温度、 pH、圧力、化学的条件など）を考慮することによって、適宜 設定することができる。また、生体分子を破壊しない条件が未知の場合でも、その生 体物質について試験されるべき条件に曝し、その後目的とする生物学的活性が保持 されているかを調べることによってあら力^め決定することができる。従って、本発明を 実施する際には、そのような条件は、 目的とする生物学的活性が保たれている限り、 どのような条件であってもよいことが当業者に理解される。
[0063] 本明細書にぉレ、て溶媒 (例えば、水、有機溶媒 (例えば、へキサンなど） )の「低減」 または「除去」は、その溶媒を含む混合物または組成物を、ある条件に置くことにより 、その混合物または組成物中の溶媒比率が減少またはなくなることによって達成され る。
[0064] 本明細書において「薬学的に受容可能」とは、ある物質について言及するとき、そ の物質が医薬として投与され得る性質をいう。
[0065] 本明細書において使用され得る「薬学的に受容可能な物質」としては、抗酸化剤、 保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量 剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバント挙げ られるがそれらに限定されない。代表的には、 目的とする化合物（生物学的活性また は医薬品の有効成分としての活性を有する化合物）、またはその改変体もしくは誘導 体は、 1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組 成物の形態で提供される。
[0066] 本明細書で使用される薬学的に受容可能な物質は、レシピエントに対して非毒性 であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例え ば、酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、 ひ—トコフヱロール；低分 子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ ン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニノレピロリドン）；アミノ酸 (例えば、グリシン、グノレ タミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他 の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば 、 EDTA)；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対ィォ ン (例えば、ナトリウム）；ならびに Zあるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、 Twe en、プル口ニック（pluronic)またはポリエチレングリコール（PEG) )などが挙げられる 力 Sそれらに限定されない。
[0067] (生体分子チップ ·アレイ）
本明細書において「チップ」とは、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型 集積回路をいう。本明細書では、積載される物質に応じて、「DNAチップ」、「プロテ インチップ」、「細胞チップ」などと称することがある。
[0068] 本明細書において用いられる用語「アレイ」とは、基板または膜上の固定物体の固 定されたパターンまたはパターン化された基板そのものをいう。アレイの中で、小さな 基板（例えば、 10 X 10 mm上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイ というが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、 上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある 。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のポリヌクレオ チドのセットで構成される。アレイは好ましくは異なるポリヌクレオチドを少なくとも 102 個、より好ましくは少なくとも 103個、およびさらに好ましくは少なくとも 104個、さらによ り好ましくは少なくとも 105個を含む。これらのポリヌクレオチドは、例えば、 125 X 80 mm、 10 X 10mmのような規格化されたフォーマット上に配置される。
[0069] 本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい 、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを 伴う微粒子との関連づけに適切であり、そしてすベての各々のアドレスにおける存在 物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状 を採り得る。アドレスの形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、 または不規則な形であり得る。
[0070] 各々のアドレスのサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレス の数、分析物の量および/または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのァレ ィが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例 えば、 1一 2nmから数 cmの範囲であり得る力 そのアレイの適用に一致した任意の 大きさが可能である。
[0071] アドレスの空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に 適合するように設計される。アドレスは、密に充填され得、広汎に分散され得るか、ま たは特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
[0072] マイクロアレイ（DNAが配置されている場合、 DNAマイクロアレイとも呼ばれる）に ついては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概 説されている。
[0073] 合成型 DNAマイクロアレイにおける標識方法としては、例えば、二蛍光標識法が 挙げられる。この方法では、 2つの異なる mRNAサンプルをそれぞれ異なる蛍光で 標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダィゼーシヨンを行って、両方の蛍光 を測定し、それを比較することで遺伝子発現の相違を検出する。蛍光色素としては、 例えば、 Cy5および Cy3などが最も用いられている力 それらに限定されなレ、。 Cy3 および Cy5の利点は、蛍光波長の重なりが殆どないという点である。二蛍光標識法 は、遺伝子発現の相違のみならず、変異または多型性を検出するためにも使用され 得る。
[0074] DNAマイクロアレイを用いたアツセィにおいては、 DNAマイクロアレイ上でハイブリ ダイズした蛍光シグナルを蛍光検出器等で検出する。このような検出器は、現在まで に種々の検出器が利用可能である。例えば、 Stanford Universityのグループは、 オリジナルスキャナを開発しており、このスキャナは、蛍光顕微鏡と稼動ステージとを 組み合わせたものである（http : ZZcmgm. Stanford, edu/pbrownを参照のこと )。従来型のゲル用蛍光イメージアナライザである FMBIO (日立ソフトウェアェンジ二 ァリング）、 Storm (Molecular Dynamics)などでも、スポットがそれほど高密度で なければ、 DNAマイクロアレイの読み取りを行い得る。その他に利用可能な検出器と しては、 ScanArray 4000、同 5000 (GeneralScanning；スキャン型（共焦点型）） 、GMS418 Array Scanner (宝酒造；スキャン型（共焦点型））、 Gene Tip Sea nner (日本レーザ電子；スキャン型（非共焦点型））、 Gene Tac 2000 (Genomic Solutions； CCDカメラ型） )などが挙げられる。
[0075] マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応 の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのよう なソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Er molaeva 〇ら（1998) Nat. Genet. 20 : 19—23)。また、データベースのフォーマ ットとしては、例えば、 Affymetrixが提唱している GATC (genetic analysis tech nology consortium)と呼ばれる开式が挙げられる。
[0076] 本発明において固相支持体に配置される生体分子（例えば、 DNA、 RNA、ポリぺ プチドなど）は、生体由来物質 (例えば、 mRNA)を用いて分子生物学的手法で作製 され得、あるいは、当業者に公知の方法によつ化学的に合成され得る。例えば、 自動 固相ペプチド合成機を用いた合成方法は、以下により記載される： Stewart, J. Μ· et al. (1984). Solid Phase Peptide Synthesis, PierceChemical Co.； Grant, G. A. (1992). Synthetic Peptides: A User' s Guide, W. H.Freeman;Bodanszky, M. (1993).
Principles of Peptide Synthesis , Springer- Verlag; Bodanszky, M. et al. (1994). The Practice of Peptide Synthesis, Springer- Verlag; Fields, G. B. (1997). Phase Peptide Synthesis, AcademicPress;Pennington, M. W. et al. (1994). Peptide Synthesis Protocols, HumanaPress;Fields, G. B. (1997). Solid-Phase Peptide Synthesis, Academic Press0オリゴヌクレオチドは、 Applied Biosystemsなどにより巿販される DNA合成機の何れ力を用いて、自動化学合成により調製され得る。 自動オリゴヌク レオチドの合成のための組成物および方法は、例えば、米国特許第 4, 415, 732号 , Caruthers et al. ( 1983)；米国特許第 4, 500, 707号および Camthers ( 198 5) ;米国特許第 4, 668， 777号， Caruthers et al. ( 1987)に開示されており、当 業者は、これらの方法を利用して、本発明において使用される生体分子を調製する こと力 Sできる。
[0077] 本発明はまた、生体から直接採取したサンプル以外に、 PCR、 SDA、 NASBA法 等で増幅した遺伝子の検出に対しても用いることは可能である。本発明はさらに、標 的遺伝子は予め電気化学的に活性な物質や、 FITC、ローダミン、アタリジン、 Texa s Red,フルォレセインなどの蛍光物質、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ 、グノレコースォキシダーゼなどの酵素、ハプテン、発光物質、抗体、抗原、金コロイド などのコロイド粒子、金属、金属イオン、およびトリスビピリジン、トリスフェナント口リン、 へキサァミンなどとの金属キレートなどで標識しておくことも可能である。
[0078] 本明細書において使用される「マイクロカプセル」とは、分子などの薄膜で物質を包 みこんだ微小な粒子またはその容器状物質をいう。ふつうは球状で，大きさは数 z m 力、ら数百 μ πιである。一般には油中水滴型エマルシヨンをつくり、その微小エマルショ ン粒子と媒質液との界面で界面重縮合によって高分子薄膜をつくり粒子を覆う。つい で遠心分離で油からカプセルを分離し、透析で精製することによって製造することが できる。エマルシヨンをつくるときに水相に目的とする生体分子を溶解分散させて、力 プセル中に包みこむことができる。薄膜の厚さは 10— 20 z mで、半透性を与えたり、 表面電荷をもたせたりすることもできる。本発明においてマイクロカプセルは、生体分 子のような内包物を保護'隔離し、必要に応じて溶出、混合または反応させることがで きる。本発明の生体分子基板を製造する方法では、マイクロカプセルは、インクジエツ ト方式 (バブルジェット（登録商標）方式など）、 PIN方式のような吹きつけ工程によつ て基板に吹き付けられ、吹き付けられたマイクロカプセルは、シェルの融点より温度を 上昇させることによって生体分子のような内容物を基板に固定することができる。この 場合、基板上には、好ましくは、その生体分子と親和性のある物質でコーティングさ れている。
[0079] 微細加工技術については、例えば、 Campbell, S. A. (1996). The Science
andEngmeenng of icroelectronicPaDncation, Oxford University Press; Zaut, P. V. (199b;. MicromicroarrayFaDncation: a Practical Guide to Semiconductor Processing, SemiconductorServices； Madou, M. J. (1997). Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press ;Rai-Choudhury, P. (1997). Handbook of Microlithography,
Micromachining, &Microfabrication: Microlithographyなと 参酌すること力 Sでき、これ らは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
[0080] インクジェット方式 (技術）は、熱、圧電効果を利用し非常に小さい液滴を 2次元平 面の所定の位置に射出する技術であり、主にプリンター装置において広く用いられ ている。 DNAアレイの製造には、圧電素子をガラスキヤピラリーと組み合わせた構造 のインクジェット装置が使用される。液体チャンバ一に接続された圧電素子に電圧を 加えることにより、圧電素子の体積の変化によってチャンバ一内の液体力 チャンバ 一に接続された、キヤビラリ一から液滴となって射出される。射出される液滴の大きさ は、キヤピラリーの径、圧電素子の体積変化量、液体の物理的性質によって決定され るが、一般には、直径が 30 μ πι程度である。圧電素子を用いたインクジェット装置は、 このような液滴を ΙΟΚΗζ程度の周期で射出することができる。このようなインクジェット 装置を使った DNAアレイ製造装置は、インクジェット装置と DNAアレイ基板とを相対運 動させることにより、 DNAアレイ上の所望のスポットに所望の液滴を滴下することがで きる。インクジェット装置を使った DNAアレイ製造装置には、大きくわけて 2種類ある。 1 つはただ 1台のインクジェット装置を用いた DNAアレイ製造装置であり、もう 1つはマル チヘッドのインクジェット装置を用いた装置である。ただ 1台のインクジェット装置を用 レ、た DNAアレイ製造装置は、オリゴマー末端の保護基を除去する試薬を所望のスポ ットに滴下する構成になっている。所望の塩基を導入したレ、スポットの保護基を、この インクジェット装置を用いて除去して活性な状態にした後、 DNAアレイ全体に所望の 塩基の結合反応操作を実施する。この際、インクジェット装置からの試薬の滴下によ つて、末端が活性化したオリゴマーを持つスポットのみに所望の塩基が結合する。こ の後、新たに付加した塩基の末端を保護する操作を行う。次に、保護基を除去する スポットを変更してこの操作を所望のヌクレオチド配列が得られるまで繰返す。一方、 マルチヘッドのインクジェット装置を用いた DNAアレイ製造装置は、各塩基を含む試 薬毎にインクジェット装置を用意することによって、各スポット毎に所望の塩基を直接 結合させることができる構成になっており、前述した 1台のインクジェット装置を用いた DNAアレイ製造装置よりも高レ、スループットが得られる。あらかじめ合成したオリゴヌク レオチドを基板に固定化させる方法のうち、メカニカルマイクロスポッティング技術は、 ステンレス製のピンの先端についたオリゴヌクレオチドを含む液体を機械的に基板上 に押し付けて固定化していく技術である。この方法で得られるスポットは、 50 300 μ m程度になる。マイクロスポッティング後には、 UV光による固定化等の後処理が行わ れる。
本発明の方法に使用される吹き付ける工程としては、インクジェット方式 (バブルジ エツト（登録商標）方式を含む）、 PIN法などが挙げられる。好ましくは、バブルジェット
(登録商標）方式であり得る。マイクロカプセルが効率よく固定化され得るからである。
[0082] 本発明の生体の情報を検査する方法の好ましい実施形態において、上記標識分 子は、蛍光分子、リン光分子、化学発光分子または放射性同位体を含む。この場合
、標識分子の種類に応じた検出手段が使用され得る。
[0083] (本発明の好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明するが、これらの好ましい実施形態の説 明は、例示のために提供され、本発明の範囲を限定すべきでないことが理解される べきである。
[0084] (遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するためのキット）
1つの局面において、本発明は、遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するた めのキットを提供する。このキットは、 a)遺伝物質と、 b)該遺伝物質とは反対の荷電 を有する荷電性物質と、 c)塩とを含み、ここで、このキットは、この遺伝物質とこの荷 電性物質とこの塩とを固相支持体上で混合することを指示する指示書を備える。この 技術は、遺伝物質と、その物質とは反対の電荷を有する物質と、塩 (例えば、培地中 に含まれる塩類）とを支持体上で混合することによって、予想外に固定され、その後 の細胞内への導入がスムーズに行われることが予想外に見出されたことによって達 成された。このような固定による効果は、固定後の物質の拡散が徐放であること、およ び固定後の物質が細胞親和性を保つか改善されていることなどが挙げられる。さらに 、任意の遺伝物質を、支持体上で任意の混合パターンで混ぜた形で簡便に固定す ることが可能となったことから、そのような技術を必要とするアレイ作製などにおいて 大いに有用である。
[0085] 好ましい実施形態では、本発明のキット中に含まれる遺伝物質と、荷電性物質と、 塩とからなる群より選択される少なくとも 2つの物質は、混合されて提供される。キット におけるコンパートメントを削減することができるからである。 2つ以上の遺伝物質の 支持体上での混合を考える場合、これら 3つの物質は、すべて混合された形で提供 され得る。
[0086] 好ましい実施形態では、本発明において含まれる遺伝物質は、少なくとも 2種類存 在し、より好ましくは 3つ以上存在し、別の好ましい実施形態では、 4つ以上、 5っ以 上、 6つ以上、 7つ以上、 8つ以上、 9つ以上、 10以上、 20以上であり得る。あるいは 、ゲノムセットなど、数千一数万の遺伝物質が本発明のキットに含まれていても良い。
[0087] 本発明のキットに含まれる遺伝物質は、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合 わせからなる群より選択され得る。
[0088] 1つの好ましい実施形態において、本発明に含まれるべき物質は、細胞親和性を 有する。ある物質の細胞親和性は、その物質と細胞とを混合したときに、その物質が 存在しないときに比べて、その細胞の生存が維持されるか否力、を評価することによつ て判断することができる。そのような細胞の生存の維持は、細胞の種々のパラメータを 測定することによって具体的に判断することができる。好ましくは、細胞親和性を有す る物質は、その細胞の生存を改善することが有利であり得る。
[0089] 好ましい実施形態において、本発明に含まれるべき物質 (例えば、荷電性物質）は 、生体分子であり得る。ここで、この生体分子が固定の目的の対象であってもよいし、 そうでなくてもよい。
[0090] 本発明の好ましい実施形態において使用され得るそのような生体分子としては、 D NA (例えば、ゲノム DNA、 cDNAなど）、 RNA (例えば、 mRNAなど）、ポリペプチド 、脂質、糖、有機低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリのライブラリーメンバー）、 およびこれらの複合体 (例えば、糖タンパク質、糖脂質、核酸ペプチド、リポタンパク 質などが含まれるがそれらに限定されない）が挙げられるがそれらに限定されない。
[0091] 1つの特定の実施形態では、本発明において固定されるべき生体分子は、 DNAの ような遺伝子コード分子であり得る。本発明において達成された固定方法を用いるこ とによって、 DNAがトランスフエタトのような遺伝子導入のための処置がされるときに、 処置の完了に必要な時間（例えば、約 15分力も約 30分程度）、継続して徐放が起こ ることによって、そのような分子の導入が効率よく行われるという効果が達成された。こ のような徐放効果は、従来の固定方法では達成されな力、つた力、、十分ではなかった こと力 、このような効果は、本発明の特筆すべき効果として挙げることができる。また 、本発明の組成物は、固定された後に、細胞に対する親和性が保持されるかあるい は改善され、特に、トランスフエクシヨンのような遺伝子の導入において従来の固定方 法よりも効率よくかつ細胞に対するダメージなしにそのような導入が行われることが見 いだされた。
[0092] 本発明の好ましい実施形態において、固定されるべき荷電性物質は、生体分子で もよぐ生体分子でなくてもよぐ例えば、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質ポリ Lリ シンなど合成ポリペプチドもしくはそれらの誘導体などであり得る。好ましい実施形態 において、荷電性物質としては、例えば、ポリアミン系試薬（SuperFect, PolyFect)、 ポリイミン系試薬（JetPEI, PEI, Fugene6)、リボソーム系試薬（
LipofectAMINE,LipofectAMINE2000, OligofectAMINE, Effecten)、帯電コロイド（金コ ロイド）ポリイミンポリマー、ポリ Lリシン、合成ポリペプチドもしくはそれらの誘導体など のトランスフエクシヨン試薬などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0093] 別の好ましい実施形態では、本発明において使用される荷電性物質は、ポリアミン 系試薬（SuperFect, PolyFect)、ポリイミン系試薬（JetPEI, PEI, Fugene6)、リボソーム 系試薬（LipofectAMINE，LipofectAMINE2000， OligofectAMINE, Effecten)、帯電コロ イド (金コロイド）などを用いることが好ましい。プリンティングに好ましい形状、強度、 ハンドリングの容易さを有してレ、るからである。
[0094] 本明細書において「ポリアミン系試薬」とは、その構造中にポリアミン（ァミノ基- NH_ またはイミノ基 =NHを 2つ以上もつ脂肪族化合物の総称）を有する試薬をいい、例え ば、 SuperFect, PolyFectなどが例示される。
[0095] 本明細書において「ポリイミン系試薬」とは、その構造中にポリイミンを有する試薬を レ、い、例えば、 JetPEI, PEI, Fugene6などが例示される。
[0096] 本明細書において、「リボソーム系試薬」とは、リボソーム構造をとる遺伝子導入試 薬をいい、例えば、 LipofectAMINE2000, OligofectAMINE, Effectenなどが例示される
[0097] 本明細書において、「帯電コロイド」とは、コロイドのうち、帯電しているものをいい、 例えば、金属コロイド (例えば、金コロイド）が例示される。
[0098] 1つの実施形態において、本発明において使用される塩としては、塩は、有機酸ま たは無機酸の水素を金属に置換したものである力 \あるいは塩基の水酸基を有機酸 基または無機酸基で置換したものであり得る。より好ましくは、細胞に親和性のある塩 (例えば、培地に用いられる塩類、緩衝液中で用いられる塩類など）が挙げられるが それらに限定されなレ、。好ましくは、トランスフエクシヨンを目的とする場合は、培地ま たは緩衝液中に含まれる塩類すベての組み合わせを用いることが有利であり得る。こ のような塩類の組み合わせは、通常細胞にとって好ましい組み合わせであるからであ る。そのような培地の例示としては、例えば、ダルベッコ MEM、 HAM12培地、 ひ M EM培地、 RPM1640 (例えば、ニチレイから巿販）が挙げられるがそれらに限定され なレ、。そのような培地に含まれる塩類としては、例えば、塩ィ匕カルシウム、塩化力リウ ム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、 HEPES、リン酸 一カリウム、リン酸二カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム、 リン酸ニナトリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンなどが挙げら れるがそれらに限定されない。そのような塩の濃度は、当業者が適宜選択して調整 すること力 Sできる力 好ましくは、細胞の浸透圧とほぼ等しいことが有利であり得る。
[0099] 好ましい実施形態において、本発明において使用される塩は、緩衝液、培養液、 血清などをあげることができる。
[0100] 好ましい実施形態では、固定される生体分子は、細胞に導入され、その細胞内で 生物学的活性 (例えば、薬効、酵素、シグナル伝達、遺伝子発現など）を発揮するこ とが有利であり得る。遺伝子発現が目的とされる場合には、生体分子はその遺伝子 をコードする配列を含む DNAであり得る。シグナル伝達が目的とされる場合には、生 体分子はシグナル伝達刺激因子 (例えば、サイト力イン、特定のリガンドなど）などで あり得る。薬効が目的とされる場合は、生体分子は薬効を有する化学物質であり得る 。そのような薬効を有する化学物質としては、例えば、中枢神経系用薬；末梢神経用 剤；感覚器官用薬;循環器官用薬;呼吸器官用薬;消化器官用薬;ホルモン剤；泌尿 生殖器官および肛門用薬;外皮用薬;歯科口腔用剤;その他の個々の器官系用薬； ビタミン剤；滋養強壮薬；血液および体液用薬;人工透析用薬;その他の代謝性医薬 品 (例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿 病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；細胞賦活用剤;腫瘍用薬;放射性医薬品 ；アレルギー用薬;抗生物質製剤；化学療法剤；生物学的製剤；調剤用薬;診断用薬 ；体外診断用医薬品；分類されない治療を主目的としない薬剤;ならびに麻薬などが 挙げられるがそれらに限定されない。
[0101] 医薬としての使用を目的とする場合は、本発明の組成物において含まれる物質 (遺 伝物質、荷電性物質など）および塩は、薬学的に受容可能であることが好ましい。
[0102] 好ましい実施形態において、本発明において使用される遺伝物質は、細胞に導入 された後生物学的活性を有する物質をコードする。
[0103] 別の実施形態において、本発明において含まれるべき遺伝物質、荷電性物質およ び塩は、マイクロカプセル中に含まれ得る。マイクロカプセル中に含まれることによつ て、携帯に便利であり、取り扱レ、も簡便となり、しかも、他の物質による汚染を低減さ せること力 Sできる。
[0104] (遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するための方法）
別の局面において、本発明は、遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するため の方法を提供する。この方法は、 I)支持体を提供する工程と、 II)該支持体に、 a)遺 伝物質と、 b)該遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電性物質と、 c)塩と、を別々の または一緒に提供する工程と、 III)該遺伝物質と該荷電性物質と塩とを固相支持体 上で混合する工程と、を包含する。
[0105] ここで、本発明の方法において用いられるべき遺伝物質、荷電性物質、塩は、遺伝 物質を支持体に固定し、細胞に導入するためのキットにおいて説明される任意の形 態をとることができる。
[0106] 好ましい実施形態において、本発明において使用される支持体は、固相支持体で ある。支持体の材料としては、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪 素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーなどが挙げられるがそれら に限定されない。
[0107] 別の実施形態において、本発明において使用される支持体は、コーティングされて レ、ることが好ましい。本発明の方法では、使用される支持体がコーティングされたもの でもよいし、方法の実施の際に支持体をコーティングする工程を包含していてもょレヽ 。このようなコーティングに使用される物質としては、ポリ—L—リジン、シラン、 APS、 M AS、疎水性フッ素樹脂、金属などあるいはそれらの混合物を用いることができるが、 それらに限定されず、通常支持体において使用することが企図される物質を利用し て行うことができる。支持体は、本発明の方法において、新たに調製することもできる し、リサイクルすることもできる。好ましくは、コーティングすることが有利であり得る。コ 一ティングは特に、リサイクリングを目的とする場合には有利であり得る。
[0108] 本発明の方法の好ましい実施形態では、支持体はチップであり得る。本発明の方 法は、チップのような小型および集積されたデバイスのようなものを製造する際にも適 用可能であり、その有用性は広範な範囲に及ぶ。この場合、チップ上に固定される 物質は、アレイ状に配置されることが好ましい。このようにアレイ状に配置される場合、 そのデバイスはアレイとも呼ばれる。従って、本発明の方法は、生体分子アレイまた は生体分子チップを製造する際に応用することができる。そのような方法によって製 造されたチップまたはアレイは、徐放および/または細胞親和性が要求されるチップ またはアレイの用途において使用される場合に特に有用である。本発明の方法はま た、高い集積度が必要とされるアレイにおいて、簡便な固定従って簡便にかつ細か レ、スポッティングが必要とされる場合にぉレ、て特に有用性が高レ、。
[0109] 本発明の方法の好ましい実施形態では、遺伝物質は、細胞に導入された後、生物 学的活性を有するものであることが所望され得る。このような場合、生物学的活性とし ては、例えば、薬効、遺伝子発現、酵素活性、シグナル伝達活性などが挙げられる がそれらに限定されない。遺伝子発現が目的とされる場合には、生体分子はその遺 伝子をコードする配列を含む DNAであり得る。シグナル伝達が目的とされる場合に は、遺伝物質はシグナル伝達刺激因子（例えば、サイト力イン、特定のリガンドなど） などであり得る。薬効が目的とされる場合は、生体分子は薬効を有する化学物質であ り得る。薬効を有する化合物は、本明細書において別の場所において記載されるよう に種々の化合物の中から選択することができる。
[0110] 本発明の方法において、固定する工程は、どのような工程を用いてもよぐ手動（ピ ペッティングなど）でも、 自動（例えば、インクジェットプリンターなどのプリンター技術） でもよレ、。好ましくは、インクジェットプリンターのプリントピンを用いて付着させることが できる。
[0111] このような種々の目的において本発明の方法が使用される場合は、本発明の固定 が達成された後に引き続いて上述の工程 (例えば、トランスフエクシヨンなどの遺伝子 導入、シグナル伝達測定、薬剤送達など）が行われてもよぐあるいは、固定した後一 定期間保存された後に上述の工程が行われてもよい。保存される場合は、本発明の 方法によって固定された後に、徐放が開始しないような処置 (徐放に使用される溶媒 とは異なる保存溶媒に浸す力 あるいは、乾燥させるなど）を行うことが好ましい。
[0112] 支持体上のトランスフエクシヨンを目的とした特定の実施形態において、遺伝物質と しては、 DNAが選択され、その遺伝物質と反対の電荷を有する荷電性物質としては ポリイミンポリマーのような正に荷電した物質が選択されることが好ましい。 DNAは負 に荷電しているからである。この場合、塩としては、細胞に親和性のある塩 (例えば、 培地に用レ、られる塩類、緩衝液中で用いられる塩類など）が挙げられるがそれらに限 定されない。好ましい実施形態において使用される支持体の材料としては、例えば、 スライドガラス (好ましくはポリ- L-リジン、シラン、 APS、 MAS,疎水性フッ素樹脂な どによってコーティングされる）、ポリスチレン樹脂などが挙げられるがそれらに限定さ れない。ポリ _L—リジン、シラン、 APS、 MAS,疎水性フッ素樹脂などでコーティング された固相支持体が好ましい。細胞との親和性、トランスフエクシヨンの効率に好まし い効果を有することが知られているからである。このような場合、本発明の方法は、好 ましくは、コーティング工程を包含し得る。
[0113] 本発明の方法の好ましい実施形態では、本発明の支持体に提供される物質を提 供する工程は、生体分子を破壊しない条件下で行われる。このような生体分子を破 壊しない条件は、当業者であれば、提供されるおのおのの複合体パートナーの種類 、複合体形成の他の条件 (例えば、 pH、温度など）を考慮することによって適切に選 択することができ、あるいは、予備的に適切な条件を試験することによって容易に選 択すること力 Sできる。そのような適切な条件の選択または試験は、当業者の技術常識 の範囲内であり、当業者は過度な実験をすることなく決定することができる。上述の手 動（ピペッティングなど）でも、 自動（例えば、インクジェットプリンターなどのプリンター 技術)でも、本発明の目的（例えば、固定、細胞内移入、遺伝子発現など）が達成さ れることが本発明によって初めて判明した。本発明では、インクジェットプリンターのプ リントピンを用いて遺伝物質を簡便に支持体上に固定させ、その後細胞内に導入す ること力 Sでき、細胞内での遺伝物質の発現解析などを行うことができるようになった。 [0114] 本発明の好ましい実施形態において、塩と遺伝物質と荷電性物質との混合物の提 供は、生体分子を破壊しない条件下で行われ得る。このような生体分子を破壊しない 条件は、当業者であれば、提供される複合体および塩の種類、複合体形成の他の条 件 (例えば、 pH、温度など）を考慮することによって適切に選択することができ、ある レ、は、予備的に適切な条件を試験することによって容易に選択することができる。そ のような適切な条件の選択または試験は、当業者の技術常識の範囲内であり、当業 者は過度な実験をすることなく決定することができる。
[0115] 本発明の好ましい実施形態において、混合物を固相支持体に付着した後、その混 合物中の溶媒を低減または除去する工程をさらに包含することが有利であり得る。そ のような溶媒低減または除去は、自然乾燥、凍結乾燥、乾燥剤を用いた感想などが 挙げられるがそれらに限定されない。
[0116] (遺伝物質担持支持体）
別の局面において、本発明は、遺伝物質と、該遺伝物質とは反対の荷電を有する 荷電性物質と、塩とが表面に固定された、支持体を提供する。
[0117] ここで、遺伝物質、荷電性物質、塩、支持体は、上記遺伝物質を支持体に固定し、 細胞に導入するためのキットまたは方法のセクションに記載される任意の形態をとる こと力 Sできる。遺伝物質（例えば、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合わせで あって、好ましくは細胞に導入された後生物学的活性を有する物質をコードする）は 、細胞に導入され得る形態であれば、どのような形態で提供されても良レ、。そのような 形態としては、例えば、 Naked DNAの状態、プラスミド、ウィルスベクターの利用な どが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の支持体上には、遺伝物質は、 2種 類以上、または 3種類以上、含まれ得る。そのような複数種類としては、遺伝子をコー ドする DNAとそれに対する RNAiが含まれ得る。荷電性物質 (例えば、カチオン性ポ リマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸またはその複合体など）は、生体適 合性であることが好ましぐ遺伝子導入試薬として知られる試薬が例示され得る。塩（ 例えば、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したものである力 あるいは塩基 の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したもの）としては、例えば、塩化カルシ ゥム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、 HEPES、塩 化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸、ビ タミンそれらの混合物であり得ることから、培地成分であってもよい。 1つの実施形態 では、本発明の支持体およびその上に固定される物質は、薬学的に受容可能である ことが好ましい。あるいは、支持体上に固定されるべき物質は、マイクロカプセル中に 含まれていても良い。
[0118] 1つの実施形態において、本発明の支持体は、固相支持体であることが好ましい。
固相であれば、取り扱いが容易であるからである。従って、本発明の支持体の材料と しては、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属 、天然ポリマー、合成ポリマー、それらの混合物などが挙げられるがそれらに限定さ れない。
[0119] 本発明のデバイスの 1つの好ましい実施形態において、支持体は、コーティングさ れていてもよレ、。コーティングは、ポリ—L—リジン、シラン、 APS、 MAS、疎水性フッ 素樹脂、金属など、通常固相支持体において使用することが企図される物質を利用 して行うことができる。好ましい実施形態では、細胞培養において利用されるコーティ ング剤（例えば、ポリ- L-リジン、シラン、 APS、 MAS,疎水性フッ素樹脂、金属）な どを使用することができる。
[0120] 本発明のデバイスの好ましい実施形態では、固相支持体はチップであってもよい。
本発明の支持体がチップである場合、好ましくは、遺伝物質、荷電性物質および塩 を含む混合物は、チップ上にアレイ状に配列される。このような場合、本発明の支持 体は、アレイとも称され得る。
[0121] 本発明の好ましい実施形態では、遺伝物質は、細胞に導入された後、生物学的活 性を有するものであることが所望され得る。このような場合、生物学的活性としては、 例えば、薬効、遺伝子発現、酵素活性、シグナル伝達活性などが挙げられるがそれ らに限定されない。遺伝子発現が目的とされる場合には、生体分子はその遺伝子を コードする配列を含む DNAであり得る。シグナル伝達が目的とされる場合には、生 体分子はシグナル伝達刺激因子 (例えば、サイト力イン、特定のリガンドなど）などで あり得る。薬効が目的とされる場合は、生体分子は薬効を有する化学物質であり得る 。薬効を有する化合物は、本明細書において別の場所において記載されるように種 々の化合物の中から選択することができる。
[0122] 支持体 (例えば、固相支持体）上のトランスフエクシヨンを目的とした特定の実施形 態において、固定されるべき遺伝物質としては、 DNAが選択され、その遺伝物質と は反対の荷電を有する荷電性物質としてはポリイミンポリマーのような正に荷電した 物質が選択されることが好ましい。 DNAは一般に負に荷電しているからである。この 場合、塩としては、細胞に親和性のある塩 (例えば、培地に用いられる塩類、緩衝液 中で用レ、られる塩類など）が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい実施形態 において使用される固相支持体の材料としては、例えば、スライドガラス（ポリ— L—リ ジン、シラン、 APS、 MAS、疎水性フッ素樹脂、好ましくはポリ—L—リジンなどによつ てコーティングされる）、ポリスチレン樹脂などが挙げられるがそれらに限定されない。 ポリ- L—リジン、シラン、 APS、 MAS、疎水性フッ素樹脂などでコーティングされた固 相支持体が好ましい。細胞との親和性、トランスフエクシヨンの効率に好ましい効果を 有することが知られてレ、るからである。
[0123] (組成物）
1つの局面において、本発明は、遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するた めの組成物を提供する。本発明の組成物は、 a)遺伝物質と、 b)該遺伝物質とは反対 の荷電を有する荷電性物質と、 c)塩と、を含む。この組成物は、個々の成分を混合し て含んでいても良ぐ別個に含んでいても良い。
[0124] 1つの好ましい実施形態において、本発明の組成物の成分は、細胞親和性を有す る。ある物質の細胞親和性は、その物質と細胞とを混合したときに、その物質が存在 しないときに比べて、その細胞の生存が維持されるか否かを評価することによって判 断すること力 Sできる。そのような細胞の生存の維持は、細胞の種々のパラメータを測 定することによって具体的に判断することができる。好ましくは、細胞親和性を有する 物質は、その細胞の生存を改善することが有利であり得る。
[0125] 好ましい実施形態において、本発明の組成物の成分は、生体分子であり得る。ここ で、この生体分子は、固定の目的の対象であってもよいし、そうでなくてもよい。
[0126] 本発明の好ましい実施形態において使用され得るそのような生体分子としては、 D NA (例えば、ゲノム DNA、 cDNAなど）、 RNA (例えば、 mRNAなど）、ポリペプチド 、脂質、糖、有機低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリのライブラリーメンバー）、 およびこれらの複合体 (例えば、糖タンパク質、糖脂質、核酸ペプチド、リポタンパク 質などが含まれるがそれらに限定されない）が挙げられるがそれらに限定されない。
[0127] 1つの特定の実施形態では、本発明の組成物の成分は、 DNAのような遺伝子コー ド分子であり得る。本発明において達成された固定方法を用いることによって、 DNA 力 Sトランスフヱタトのような遺伝子導入のための処置がされるときに、処置の完了に必 要な時間（例えば、約 15分力も約 30分程度）、継続して徐放が起こることによって、 そのような分子の導入が効率よく行われるとレ、う効果が達成された。このような徐放効 果は、従来の固定方法では達成されなかったカ 十分ではなかったことから、このよう な効果は、本発明の特筆すべき効果として挙げることができる。このような効果が、支 持体上で直接混合する場合でも保持されたことは、注目すべきである。また、本発明 の組成物は、固定された後に、細胞に対する親和性が保持されるかあるいは改善さ れ、特に、トランスフエクシヨンのような遺伝子の導入において従来の固定方法よりも 効率よくかつ細胞に対するダメージなしにそのような導入が行われることが見いださ れた。
[0128] 本発明の好ましい実施形態において、本発明の組成物の成分は、 DNA、 RNA、 PNA、ポリペプチド及びその複合体のような生体分子でもよぐァニオン性ポリマー、 ァニオン性脂質のように生体分子でなくてもよい。
[0129] 本発明の好ましい実施形態において、本発明の組成物の成分は、生体分子でもよ ぐ生体分子でなくてもよぐ例えば、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質ポリ Lリシ ンなど合成ポリペプチドもしくはそれらの誘導体などであり得る。好ましい実施形態に おいて、正に荷電した物質としては、例えば、ポリイミンポリマー、ポリ Lリシン、合成ポ リペプチドもしくはそれらの誘導体などのトランスフエクシヨン試薬などが挙げられるが それらに限定されない。
[0130] 支持体上のトランスフエクシヨンを目的とした特定の実施形態において、本発明の 組成物は、 DNAおよびポリイミンポリマーのような正に荷電した物質を含み得る。
[0131] 好ましい実施形態では、本発明の組成物の成分は、細胞に導入され、その細胞内 で生物学的活性 (例えば、薬効、酵素、シグナル伝達、遺伝子発現など）を発揮する ことが有利であり得る。遺伝子発現が目的とされる場合には、本発明に含まれる遺伝 物質は、その遺伝子をコードする配列を含む DNAであり得る。シグナル伝達が目的 とされる場合には、遺伝物質はシグナル伝達刺激因子（例えば、サイト力イン、特定 のリガンドなど）をコードするものなどであり得る。薬効が目的とされる場合は、遺伝物 質は薬効を有するタンパク質をコードするものであり得る。そのような薬効を有する物 質としては、例えば、中枢神経系用薬;末梢神経用剤;感覚器官用薬;循環器官用 薬；呼吸器官用薬;消化器官用薬;ホルモン剤；泌尿生殖器官および肛門用薬;外皮 用薬;歯科口腔用剤；その他の個々の器官系用薬;ビタミン剤；滋養強壮薬；血液お よび体液用薬;人工透析用薬;その他の代謝性医薬品 (例えば、臓疾患用剤、解毒 剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝 性薬など）；細胞賦活用剤；腫瘍用薬;放射性医薬品；アレルギー用薬;抗生物質製 剤；化学療法剤；生物学的製剤；調剤用薬;診断用薬;体外診断用医薬品；分類され ない治療を主目的としない薬剤；ならびに麻薬などが挙げられるがそれらに限定され ない。
[0132] 医薬としての使用を目的とする場合は、本発明の組成物の成分は、薬学的に受容 可能であることが好ましい。
[0133] (デバイス）
別の局面において、本発明はまた、 目的の遺伝物質が固定されたデバイスを提供 する。このデバイスでは、 目的の遺伝物質 (例えば、 DNA)と、その物質とは反対の 電荷を有する物質と、塩 (例えば、培地中に含まれる塩類）とが混合されその支持体 に固定されている。これらの混合は、支持体上で行われる。支持体上で混合すること によって、混合しない場合とは、遺伝物質の安定性がよい、複数の遺伝物質を容易 に混合できる、遺伝子物質の濃度比を容易に作成可能、アレイ化する遺伝物質の調 整が容易、チップ生産性の向上 という点で相違点があり、これのような効果は、予 想外であるといえる。このような固定による効果により、本発明のデバイスは、固体支 持体上に固定された物質の徐放性を有し、および/または固定された物質が細胞親 和性を保つかまたは改善されていることなどが達成される。従って、本発明のデバイ スは、細胞などの生体またはその一部を用いたアツセィなどに用いられるマイクロタイ タープレート、アレイ（チップ）、ゥエルなどの形態として提供され、固定されるべき物 質 (活性成分、発現遺伝子をコードする DNAなど）が徐放されることおよび/または 細胞親和性が保持されることが所望されるアツセィなどにおいて有用である。あるレ、 は、ある有効成分が徐放されることが好ましい場合において、医薬送達媒体として使 用され得る。そのような場合は、遺伝物質、その遺伝物質とは反対の荷電を有する荷 電性物質、塩および支持体は、生体適合性であり、好ましくは薬学的に受容可能で あることが所望される。従って、本発明のデバイスは、 a)遺伝物質、 b)その遺伝物質 とは反対の荷電を有する荷電性物質； c)塩;および d)その複合体とその塩とが支持 体上で混合され固定された固相支持体を含む。個々で使用される、支持体、遺伝物 質、荷電性物質、塩などは、（遺伝物質担持支持体)のセクションにおいて記載され る任意の形態を採ることができる。そのようなデバイスは、例えば、市販のものをカロェ してもよいし (例えば、スライドガラス、マイクロタイタープレートなど）、 自作であっても 良い。本発明は、アツセィ用のデバイスまたは医薬送達デバイスを作製する際に使 用することができ、その有用性は広い範囲に及ぶ。
[0134] チップ上に固定される物質がアレイ状に配置される場合は、本発明のデバイスは、 アレイとも呼ばれる。従って、本発明の方法は、生体分子アレイまたは生体分子チッ プを製造する際に応用することができる。そのような方法によって製造されたチップま たはアレイは、徐放および/または細胞親和性が要求されるチップまたはアレイの用 途において使用される場合に特に有用である。本発明の方法はまた、高い集積度が 必要とされるアレイにおいて、簡便な固定従って簡便にかつ細力いスポッティングが 必要とされる場合において特に有用性が高い。
[0135] 本発明は、生物体に関連して使用する場合、ヒト用途でも使用され得るが、その他 の宿主 (例えば、哺乳動物など）を対象として使用されてもよい。従って、本発明は、 農薬として使用されてもよい。
[0136] 本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、 Ausubel F.A.ら 編 (1988)、 Current Protocols m Molecular Biology ^ Wiley ^ NewYork；、 NY;Samorook J ら（1987)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.およびその 3rdEdition(2001),Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別 冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、 当業者は適宜そのような周知文献を当たることにより本発明を実施することができる。
[0137] 以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的の みに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例 にも限定されるものではなぐ特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0138] 以下に本発明の例示を具体的な実施例を提示して示す。以下の実施例において 用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、 Sigma,和光純薬などから市販される ものを用いた。
[0139] (実施例 1 :固定組成物の作製）
本実施例では、遺伝物質として DNAを選択し、 DNAを固相支持体に固定するた めの組成物を調製した。
[0140] DNAとしてトランスフエクシヨンのためのプラスミドを調製した。プラスミドとして、 pE GFP—N1および pDsRed2_Nl (ともに BD Biosciences, Clontech, CA、 USA) を用いた。これらのプラスミドでは、遺伝子発現はサイトメガロウィルス（CMV)の制御 下にある。プラスミド DNAを、 E. coli (XLl blue, Stratgene, TX, USA)中で増 幅し増幅したプラスミド DNAを複合体パートナーの一方として用いた。 DNAは、 DN aseも RNaseも含まなレ、蒸留水中に溶解した。
[0141] 遺伝物質と反対の電荷を有する荷電性物質として、トランスフエクシヨン試薬を用い た。使用したトランスフエクシヨン試薬は以下の通りである： Effectene Transfectio n Reagent、cat. no. 301425, Qiagen, CA) , TransFastTM Transfection Reagent (E2431 , Promega, WI)， TfxTM- 20 Reagent (E2391 , Promega, WI) , SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA) , PolyFect
Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA) , LipofectAMINE 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen corporation, CA) , JetPEI ( X 4) cone. (1 01-30, Polyplus-transfection, France)および ExGen 500 (R0511 , Ferme ntas Inc. , MD)。 [0142] これらの DNAプラスミドとトランスフエクシヨン試薬とを、別々にまたは一緒に、 DNa seも RNaseも含まない蒸留水（コントロール）、塩として NaCl溶液（0. 9%)、 PBS緩 衝液（Sigma)、およびダルベッコ MEM培地（グルコース（4· 5g/L)、 L一グルタミン およびピルビン酸ナトリウム（ナカライテスタ、京都、 日本）添加、 10%仔ゥシ血清アル ブミン (大日本製薬、大阪、 日本)を補充）を選択し、この培地中に溶解した。
[0143] 支持体としては、本発明では、スライドガラス、ならびにポリ— L—リジン、シラン、 AP S、 PLLまたは MASでコーティングされたスライドガラス、およびポリスチレン製のマイ クロタイタープレートを用いた。
[0144] 溶解された DNA、荷電性物質および塩の溶液またはそれらの混合溶液を、おのお のの支持体上にスポッティングし、スポットを自然乾燥させることによって目的の遺伝 物質を固定した。
[0145] 次に、固定された遺伝物質を PBSに浸すことによって、固定の状況を確認した。確 認は、 PBSへの浸潤直後（0分）、 5分後、 10分後、 15分後、 20分後、 25分後、 30 分後、 40分後、 50分後、 60分後に目視することおよび DNA定量によって行った。
[0146] (結果）
本発明の混合物を使用した例（NaCl溶液、 PBS緩衝液、ダルベッコ培地）では、 1 5分後でも固定が破壊されていないことが確認されたのに対して、蒸留水で調製した 例では、 PBSの浸した直後に固定が破壊され、 DNAが流出していたことが明らかに なった。従って、本発明の方法の物質固定効果は、顕著であることが明らかになった 。塩を使用した例のうち、単塩 (NaCl)では、固定が破壊される時間が比較的早かつ た力 複合塩を使用した例（PBSおよびダルベッコ MEM培地）では、単塩よりも効果 が持続した。特にダルベッコ MEMを使用した例では、その効果は顕著であり、 30分 後でも固定の効果が持続した。この効果は、別々に用いた場合でも一緒に混合した 場合でもほとんど変わらなかった。
[0147] (実施例 2 :プリント技術を用いた、固定の検証一「重ね打ち」）
実施例 1におレ、て用いた DNA溶液 (塩溶液または蒸留水溶液）、トランスフエクショ ン試薬溶液 (塩溶液または蒸留水溶液）、および必要に応じて塩溶液を、プリント技 術を用いて、実施例 1において使用した支持体上に固定した。以下にその手順を示 す。
[0148] 1)まず、 DNAプラスミド溶液を支持体上にプリントした。 DNAプラスミド溶液は、 10 一 3000 μ g/mlという濃度を採用し、プリントは、 Cartesian Technologies MicroSys 4000 (Genomic Solution)とレ、う器機を室温（25°C)、湿度 65%という条件を用いて 行った。
[0149] 2)次に、トランスフエクシヨン試薬溶液を、 0. 5 μ ΐ/ μ 1-3. Ο μ ΐΖ μ Ιという濃度で 用いて、 Cartesian Technologies MicroSys 4000 (Genomic Solution)とレ、う器機を室 温 (25°C)、湿度 65%という条件を用いて上記支持体にプリントした。プリントは、上記 DNAプラスミド溶液がプリントされた箇所に重ね打ちするように行った。
[0150] 3) DNAプラスミド溶液、トランスフヱクシヨン試薬溶液が塩を含まない場合は、この 後、実施例 1に示される塩溶液をプリントした、プリントは、 Cartesian Technologies MicroSys 4000 (Genomic Solution)とレ、う器機を室温（25°C)、湿度 65%という条件を 用いて行った。
[0151] 4)必要に応じて、フイブロネクチン溶液（0. 5— 5mg/ml)を、プリントした。プリントは 、 Cartesian Technologies MicroSys 4000 (GenomicSolution)という器機を室温（25 °C)、湿度 65%という条件を用いて行った。
すべての工程において、各溶液が乾燥した後に次の試薬の重ね打ちを行った。
[0152] (結果）
これらのプリント後、実施例 1と同様に、固定がされたかどうかを検証した。実施例 1 と同様に、蒸留水以外の塩溶液が用いられた場合、および後力 塩溶液をプリントし た場合は、実施例 1と同様固定効果が確認された。なお、 1)一 4)の順序を交換した 場合でも、同様の固定効果が見られたことから、特に、重ね打ちの順序は固定効果 に影響がないことが明らかになった。
[0153] (実施例 3 :複数の遺伝物質を用いた場合の、固定の検証）
次に、複数の遺伝物質を用いた場合にも、同様のプリントが可能かどうかを検証し た。
[0154] 実施例 2の手順に従い、ただし、 1)の遺伝物質溶液のプリントにおいて、プラスミド DNA溶液のプリントに加え、 shRNA (pUR6iGFP272 (インサートの配列は GFP272 caccGGCTAtGTCtAGGAGtGtACC 番号 1) )または pDsRed2_l (BD Biosciences Clontech, CA PT3602- 5)、 B D Biosciences Clontech, CA)溶液をプリントした。プリントは、
CartesianTechnologies MicroSys 4000 (Genomic Solution)とレ、う器機を室温（25°C )、湿度 65%という条件を用いて行った。
[0155] 1つの例として、この shRNAは、実施例 3の 1)と 2)との間にプリントした。
[0156] (結果）
これらのプリント後、実施例 1および 2と同様に、固定がされたかどうかを検証した。 実施例 1および 2と同様に、蒸留水以外の塩溶液が用いられた場合、および後から 塩溶液をプリントした場合は、実施例 1と同様固定効果が確認された。なお、 1ト 4) および shRNA溶液プリントの順序を交換した場合でも、同様の固定効果が見られた ことから、特に、重ね打ちの順序は固定効果に影響がないことが明らかになった。
[0157] (実施例 4 :細胞親和性の確認）
次に、本発明の細胞親和性および遺伝物質の細胞導入の効果を確認するために 、上記実施例 1および 2において調製した DNA固定固相支持体を用いて、細胞のト ランスフエクシヨン実験を行った。
[0158] 本実施例では、以下の 5種類の細胞を利用して、効果を確認した：ヒト間葉系幹細 胞（hMSCs、 PT_2501、 Cambrex Bioscience Walkersville, Inc. , MD)、ヒ ト胚性腎細胞 （HEK293、 RCB1637、 RIKEN Cell Bank, 日本）、 NIH3T3- 3細胞 (RCB0150, RIKEN Cell Bank, 日本）、 HeLa細胞（RCB0007、 RIK EN Cell Bank, 日本）および HepG2 (RCB1648、 RIKEN Cell Bank, 日本）
[0159] 実施例 1一 3において DNAが固定された支持体をディッシュに入れ、その上に、上 記細胞を含む培地を各々滴下した。その後、プレートを含むディッシュをインキュべ ータに移し、 37°Cで、 5% COの雰囲気下で 2日または 3日間そのプレートをインキュ
2
ペートしてトランスフエタトさせた。
[0160] (遺伝子発現の観察） 遺伝子発現の観察は、各々の遺伝子発現の発現産物（EFP、 EGFPおよび DsRe d2)が発する蛍光を観察することによって行った。蛍光の観察には、蛍光顕微鏡 (IX -71, Olympus PROMARKETING Inc. , 日本）を用いた。細胞は、反応後に パラホルムアルデヒド（PFA)固定を行うこと（4% PFA、室温で 10分間処理）により 、観察した。
[0161] (結果）
図 1一 2にトランスフエクシヨンの結果の一部を示す。図 1は、最初から混合した場合 (上にコントロール、下に混合物）を示す。固相に対して複合体を添加した直後（0分） ならびに、添加の 1分後、 5分後および 10分後に細胞含有液をカ卩えた後の複合体の 溶出の様子を示す。図 2は、実施例 2の手順に従ってプリントした支持体における、ヒ ト間葉系幹細胞におけるトランスフエクシヨン効果を示す。示されるように、プリントを連 続的に行った (重ね打ち）の場合でも、混合物と同様の遺伝物質の細胞導入効果が 示された。
[0162] この結果から明らかなように、混合して塩をカ卩えてから支持体に固定された系に加 えて、別個にプリントした場合でも、固定がなされ、 DNAが徐放されることも明らかに なった。このような効果は、従来の技術では明らかでなかったことであり、これにより、 プレート、チップなどで任意の遺伝子を任意の組み合わせで細胞内に導入して観察 することができるという技術が初めて確立されたことになる。また、細胞導入の効果に ついても、重ね打ちの順序に関係ないことが明らかになった。
[0163] また、このほかの本発明の塩を固定に使用した場合でも、トランスフエクシヨンが起こ つていたことが判明した。これは、トランスフエクシヨンが起こるために必要な DNAの 細胞への移入が、いずれの例でも起こっていたことを示す。従って、本発明の支持体 は、細胞親和性および細胞導入効果を維持または改善していたことになる。また、実 施例 1一 2における放出のデータに加え、トランスフエクシヨンが起こっていたことは固 定された遺伝物質が活性を保持していたことを示すことになる。
[0164] このような効果は、塩を用いない溶液では、観察されなかった。また、塩を用いた場 合、プリント (重ね打ち）を行っても効果が保持されていた。従って、この結果は、本発 明は、種々の形態で実施可能であることを示す。特に、固定の際に塩として培地を利 用した系では、単塩を用いた系よりもトランスフエクシヨン効率が高力 たことから、固 定の際に細胞に適合する塩類の組み合わせを用いることが、細胞親和性および遺 伝物質の細胞導入効果の維持または改善にも適切であることがわかる。
[0165] (実施例 5 :複数遺伝物質を用いた重ね打ちの効果）
実施例 3において複数の遺伝物質を重ね打ちした場合に、いずれの遺伝物質の活 性も保持されたまま細胞に導入されるかどうかを検証した。検証手順は、実施例 4に 記載のとおりであった。
[0166] 複数の遺伝物質の組み合わせとして、以下の表に記載のような組成比の組み合わ せを使用した。なお、 pDNAはプラスミド DNAを示す。
[0167] [表 1]
Figure imgf000050_0001
結果を図 3および図 4に示す。
[0168] 図 3には、 HeLa— Κ細胞にトランスフエタトした後 3日目の遺伝子発現の様子を示 す。図 4には、 HeLa-K細胞にトランスフエタトした後 6日目の遺伝子発現の様子を 示す。 +shGFPは、 RNAi分子があるものを示し、 Pro lessは、ないものを示す。
Pro lessは pDsRed2_lとレ、うベクターが CMVプロモータを有しておらず、遺伝子発現 を行わないので、これをネガティブコントロールとして、 shGFPの代わりに使用した場 合の結果である。
[0169] 結果から明ら力、なように、プラスミド DNAに含まれる GFPの蛍光が確認され、それ に対する RNAi分子を重ね打ちした場合に、その RNAi効果が確認され、蛍光が消 長した。従って、遺伝物質が複数ある場合にも、本発明の細胞導入効果が示された ことになる。
[0170] (実施例 6 :アレイを用いた場合） 次に、上述の効果がアレイを用いた場合でも実証されるかどうかを確認するために 規模拡大して実験を行った。
[0171] (実験プロトコル）
(細胞供給源、培養培地、および培養条件）
この実施例では、 5種類の異なる細胞株を使用した：ヒト間葉系幹細胞 (hMSC、 P T— 2501、 Cambrex Bioscience Walkersville, Inc.， MD)、ヒト胚性腎細胞 H EK293 (RCB1637、 RIKEN Cell Bank, 日本）、 NIH3T3— 3 (RCB0150、 RI KEN Cell Bank, 日本）、 HeLa (RCB0007、 RIKEN Cell Bank, 日本）、お よび HepG2 (RCBl 648、 RIKEN Cell Bank, 日本）。ヒト MSC細胞の場合、この 細胞を、市販のヒト間葉細胞基底培地（MSCGM BulletKit PT—3001 , Cambr ex Bioscience Walkersville, Inc. , MD)中で維持した。 HEK293細胞、 NIH 3T3—3細胞、 HeLa細胞および HepG2細胞の場合、これらの細胞を、 10% ゥシ胎 仔血清（FBS、 29— 167— 54、 Lot No. 2025F、 Dainippon Pharmaceutical CO. , LTD. , 日本）を有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、 L一グルタミン およびピルビン酸ナトリウムを有する高グルコース（4· 5g/L) ; 14246— 25、 Nakala i Tesque, 日本）中で維持した。全ての細胞株を、 37°C、 5% COに制御されたィ
2
ンキュベータ一中で培養した。 hMSCを含む実験において、本発明者らは、表現型 の変化を回避するために、 5継代未満の hMSCを使用した。
[0172] (プラスミドおよびトランスフエクシヨン試薬）
トランスフエクシヨンの効率を評価するために、 pEGFP_Nlベクターおよび pDsRe d2—Nlベクター（カタログ番号 6085— 1、 6973— 1、 BD Biosciences Clontech , CA)を使用した。共に遺伝子発現は、サイトメガロウィルス（CMV)プロモーターの 制御下であった。トランスフエタトされた細胞は、それぞれ、連続的に EGFPまたは Ds Red2を発現した。プラスミド DNAを、 Escherichia coli、 XL1— blue株（200249, Stratagene, TX)を使用して増幅し、そして EndoFree Plasmid Kit (EndoFree Plasmid Maxi Kit 12362、 QIAGEN、 CA)によって精製した。全ての場合に おいて、プラスミド DNAを、 DNaseおよび RNaseを含まない水に溶解した。トランス フエクシヨン試薬は以下のようにして得た： Effectene Transfection Reagent (力 タログ番号 301425、 Qiagen、 CA)、 TransFastTM Transfection Reagent (E 2431、 Promega、 WI)、 TfxTM— 20 Reagent (E2391、 Promega、 WI)、 Super Feet Transfection Reagent (30丄 305、 Qiagen、 CA)、 PolyFect Transfect ion Reagent (301105, Qiagen, CA) , LipofectAMINE 2000 Reagent (11 668-019, Invitrogen corporation, CA) , JetPEI ( X 4) cone. (101— 30、 Pol yplus—transfection、 France)、および ExGen 500 (R0511、 Fermentas Inc . , MD)。
[0173] (固相系トランスフエクシヨンアレイ（SPTA)生成）
「リバーストランスフエクシヨン」にってのプロトコルの詳細は、ウェブサイト http : / Z staff a. wi. mit. edu/ sabatmi― public/ reverse― transiection. htm の「 Reverse Transfection Homepage」に記載されていた。本発明者らの固相系トラ ンスフヱクシヨン（SPTA方法）において、疎水性フッ素樹脂コーティングによって分 離した 48平方パターン（3mm X 3mm)を有する 3つの型のスライドガラス（シラン処 理したスライドガラス; APSスライド、およびポリ _L_リジンでコーティングしたスライド ガラス； PLLスライド、および MASでコーティングしたスライド； Matsunami Glass I nd. , LTD. , 日本）を研究した。
[0174] (プラスミド DNAプリンティング溶:液の調製）
SPTAを生成するための 2つの異なる方法を開発した。その主な違いは、プラスミド DNAプリンティング溶液の調製にある。
[0175] (方法 Α)
Effectene Transfection Reagentを使用する場合、プリンティング溶液は、プ ラスミド DNAおよび細胞接着分子 (4mgZmLの濃度で超純水に溶解したゥシ血漿 フイブロネクチン（カタログ番号 16042—41、 Nakalai Tesque、 日本））を含んだ。 上記の溶液を、インクジェットプリンタ（synQUADTM、 Cartesian Technologies , Inc.， CA)を用いてか、または手動で 0. 5— 10 z Lチップを用いて、スライドの表 面に適用した。このプリントしたスライドガラスを安全キャビネットの内側で室温にて 15 分間かけて乾燥させた。トランスフエクシヨンの前に、総 Effectene試薬を、 DNAプリ ントしたスライドガラス上に静かに注ぎ、そして室温にて 15分間インキュベートした。 過剰の Effectene溶液を、吸引ァスピレーターを用いてスライドガラスから除去し、そ して安全キャビネットの内側で室温にて 15分間かけて乾燥させた。得られた DNAプ リントしたスライドガラスを、 100mm培養ディッシュの底に置き、そして約 25mLの細 胞懸濁液（2— 4 X 104細胞/ mL)を、このディッシュに静かに注いだ。次いで、この ディッシュを 37°C、 5% COのインキュベーターに移し、 2— 3日間インキュベートし
2
た。
[0176] (方法
他のトランスフエクシヨン試薬（TransFastTM、 TfxTM_20、 SuperFect, PolyF ect、 LipofectAMINE 2000、 JetPEI ( X 4) cone.または ExGen)の場合、プラス ミド DNA、フイブロネクチン、およびトランスフエクシヨン試薬を、製造業業者が配布す る指示書に示される比率に従って 1. 5mLのマイクロチューブ中で均一に混合し、そ してチップ上にプリンティングする前に室温にて 15分間インキュベートした。プリンテ イング溶液を、インクジェットプリンターまたは 0· 5— 10 チップを用いてスライドガ ラスの表面上に適用した。このプリントしたスライドガラスを、安全キャビネットの内側 で室温にて 10分間かけて完全に乾燥させた。プリントしたスライドガラスを 100mm培 養ディッシュの底に置き、そして約 3mLの細胞懸濁液（2— 4 X 104細胞/ mL)を添 加し、安全キャビネットの内側で室温にて 15分間にわたってインキュベートした。イン キュベーシヨン後、新鮮な培地をこのディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッ シュを 37°C、 5% COのインキュベーターに移し、 2— 3日間インキュベートした。ィ
2
ンキュベーシヨン後、本発明者らは、蛍光顕微鏡（IX— 71、 Olympus PROMARK ETING, INC. , 日本）を用いて、増強された蛍光タンパク質（EFP、 EGFP、および DsRed2)の発現に基づいてトランスフエタト体を観察した。位相差画像を同じ顕微鏡 を用いて撮った。両プロトコルにおいて、細胞をパラホルムアルデヒド（PFA)固定方 法（PBS中の 4% PFA、処理時間は、室温にて 10分間）を用いることによって固定 した。
[0177] (レーザー走查および蛍光強度定量）
トランスフエクシヨン効率を定量するために、本発明者らは、 DNAマイクロアレイスキ ャナ（GeneTAC UC4 X 4、 Genomic Solutions Inc. , MI)を使用した。総蛍 光強度 (任意の単位)を測定した後、表面積あたりの蛍光強度を計算した。
[0178] (結果）
(ヒト間葉系幹細胞の固相系トランスフエクシヨンアレイ）
多様な種類の細胞に分化するヒト間葉系幹細胞 (hMSC)の能力は、組織再生およ び組織復活を標的化する研究にとって特に興味深レ、ものになっている。特に、これら の細胞の形質転換体についての解析は、 hMSCの多能性を制御する因子を解明す る上で、関心が高まっている。 hMSCの研究における重大な障害は、所望の遺伝物 質を用いたトランスフエクシヨンが不可能 (または、非常に困難)な点にある。
[0179] これを達成するための従来の方法は、ウィルスベクターまたはエレクト口ポレーショ ンのいずれかの技術を含む。本発明者らが開発した複合体一塩という系を用いること により、種々の細胞株（hMSCを含む）に対して高レ、トランスフエクシヨン効率ならびに 密集したアレイ中での空間的な局在の獲得を可能にする固相系トランスフエクシヨン が達成された。固相系トランスフエクシヨンの概略を、図 5に示す。
[0180] 固相系トランスフエクシヨンにより、インビボ遺伝子送達のために使用され得る「トラン スフエクシヨンパッチ」の技術的な達成ならびに hMSCにおける高スループットの遺伝 子機能研究のための固相系トランスフエクシヨンアレイ（SPTA)が可能になることが判 明した。
[0181] 哺乳動物細胞をトランスフエタトするための多数の標準的な方法が存在するが、遺 伝物質の hMSCへの導入については、 HEK293、 HeLaなどの細胞株と比較して 不便かつ非常に困難であることが知られている。従来使用されるウィルスベクター送 達またはエレクト口ポレーシヨンのレ、ずれも重要である力 潜在的な毒性（ウィルス方 法）、ゲノムスケールでの高スループット分析を受けにくいこと、およびインビボ研究に 対して制限された適用性 (エレクト口ポレーシヨンに関して）のような不便さが存在する
[0182] 固相支持体に簡便に固定することができ、かつ徐放性および細胞親和性を保持し た固相支持体固定系が開発されたことにより、これらの欠点のほとんど克服すること ができた。
[0183] 上述の実験の結果の一例を、図 6に示す。マイクロプリンティング技術を使用する本 発明者らの技術を用いて、選択された遺伝物質、トランスフエクシヨン試薬および適 切な細胞接着分子、ならびに塩を含む混合物を、固体支持体上に固定化し得た。混 合物を固定化した支持体の上での細胞培養は、その培養細胞に対する、混合物中 の遺伝子の取り込みを可能にした。その結果、支持体-接着細胞における、空間的 に分離した DNAの取り込みを可能にした（図 6)。
[0184] 本実施例の結果、レ、くつかの重要な効果が達成された：高レ、トランスフエクシヨン効 率 (その結果、統計学的に有意な細胞集団が研究され得る）、異なる DNA分子を支 持する領域間の低い相互夾雑 (その結果、個々の遺伝子の効果が、別々に研究され 得る）、トランスフエタト細胞の長期生存、高スループットの互換性のある形式および 簡便な検出方法。これらの基準を全て満たす SPTAの開発は、さらなる研究のため の適切な基盤となる。
[0185] これらの目的の達成を明確に確立するために、上述のように本発明者らは、 5種類 の異なる細胞株（HEK293、 HeLa、 NIH3T3、 HepG2および hMSC)を、本発明 者らの方法論（固相系でのトランスフエクシヨン)および従来の液相系トランスフエクシ ヨンの両方を用いて一連のトランスフエクシヨン条件下で研究した。 SPTAの場合、相 互夾雑を評価するために、本発明者らは、チェック模様のパターンでガラス支持体上 にプリントした赤色蛍光タンパク質 (RFP)および緑色蛍光タンパク質 (GFP)を使用 し、一方、従来の液相系トランスフエクシヨンを含む実験の場合 (ここで、本来、トラン スフェクト細胞の自発的な空間的分離は達成され得ない）、本発明者らは、 GFPを使 用した。レ、くつかのトランスフエクシヨン試薬を評価した： 4つの液体トランスフエクショ ン試薬（Eff ectene、 TransFastTM, TfxTM_20、 LopofectAMINE 2000)、 2 つのポリアミン（SuperFect、 PolyFect)、ならびに 2つの型のポリイミン ietPEI ( X 4)および ExGen 500)。
[0186] トランスフエクシヨン効率：トランスフエクシヨン効率を、単位面積あたりの総蛍光強度 として決定した（図 7A)。使用した細胞株に従って、最適な液相の結果を、異なるトラ ンスフヱクシヨン試薬を用いて得た。次いで、これらの効率的なトランスフエクシヨン試 薬を、固相系プロトコル（図 7C Dを参照のこと）の最適化に使用した。レ、くつかの傾 向が観察された:容易にトランスフエタト可能な細胞株 (例えば、 HEK293、 HeLa、 NIH3T3)の場合、固相系プロトコルで観察されたトランスフエクシヨン効率は、標準 的な液相系プロトコルと比較してわずかに優れていた力 本質的に類似したレベル で達成されている（図 7B)。
[0187] し力、し、細胞をトランスフエタトするのが困難な場合（例えば、 hMSCおよび HepG2 )において SPTA方法論に最適化した条件を用いることによって、本発明者らは、細 胞の特徴を維持しながら、トランスフヱクシヨン効率が 40倍まで増加したことを観察し た（上述のプロトコルおよび図 4C一 Dを参照のこと）。結果を、図 7Bに示す。
[0188] hMSCの特定の場合（図 8)、最良条件は、ポリエチレンィミン（PEI)トランスフヱク シヨン試薬の使用を含んだ。予想したように、高レ、トランスフヱクシヨン効率を実現する ための重要な因子は、ポリマー内の窒素原子（N)の数とプラスミド DNA内のリン酸残 基（P)の数との間の電荷バランス（NZP比率）、ならびに DNA濃度である。一般的 に、 NZP比率および濃度における増大は、トランスフエクシヨン効率の増大を生じる 。並行して、本発明者らは、 hMSCの溶液トランスフエクシヨン実験における高い DN Aおよび高い N/P比率の場合に、細胞生存率の有意な低下を観察した。これら 2つ の拮抗因子に起因して、 hMSCの液相系トランスフエクシヨンの効率は、かなり悪い 非常に低い細胞生存率 (N/P比率 > 10で観察された）であった。しかし、 SPTAプ 口トコノレは、細胞生存率にも細胞形態にも有意に影響を与えることなぐ非常に高い（ 固体支持体に固定された) N/P比率および DNA濃度を許容し (おそらぐ細胞膜に 対する固体支持体の安定化効果に起因する）、従って、このことがおそらぐトランス フエクシヨン効率の劇的な改善の原因となっている。 SPTAの場合、 10の N/P比率 が最適であることが見出され、細胞毒性を最小化しながら十分なトランスフエクシヨン レベルを提供する。 SPTAプロトコルにおいて観察されたトランスフエクシヨン効率の 増大に関するさらなる理由は、高い局所的な DNA濃度 Zトランスフヱクシヨン試薬濃 度（これは、液相系トランスフヱクシヨン実験において使用される場合は細胞死を生成 する）の達成である。
[0189] チップ上での高レ、トランスフエクシヨン効率の達成のための重要な点は、使用される コーティングに使用する物質の種類である。ガラスチップを使用した際のコーティング 剤として、 PLLがトランスフエクシヨン効率および相互夾雑の両方に関して、最良の結 果を提供することを発見した。フイブロネクチンコーティングしない場合、少数のトラン スフェクト体を観察した (他のすべての実験条件は一定に保った)。完全に確立した わけではないが、フイブロネクチンの役割はおそらぐ細胞接着プロセスを加速し (デ ータは示していない）、ゆえに、表面を離れた DNA拡散が可能になる時間を制限す るということである。
[0190] 低い相互夾雑： SPTAプロトコルで観察されたより高レ、トランスフエクシヨン効率は別 として、本技術の重要な利点は、別個に分離された細胞アレイの実現であり、その各 位置では、選択した遺伝子が発現する。本発明者らは、フイブロネクチンでコーティン グしたガラス表面上に、 JetPEI (「実験プロトコル」を参照のこと）およびフイブロネクチ ンと混合した 2つの異なるレポーター遺伝子（RFPおよび GFP)をプリントした。得ら れたトランスフエクシヨンチップを適切な細胞培養に提供した。最良であると見出され た実験条件下において、発現された GFPおよび RFPは、それぞれの cDNAがスポッ トされた領域に局在した。相互夾雑はほとんど観察されなかった（図 6)。しかし、フィ ブロネクチンまたは PLLの非存在下において、相互夾雑は重大な障害であり、そし てトランスフエクシヨン効率は、有意に低かった（図 7)。このことは、細胞接着および支 持体表面から離れて拡散するプラスミド DNAの相対的な割合が、高いトランスフヱク シヨン効率および高い相互夾雑の両方に対して重要な因子であるという仮説を立証 する。
[0191] 相互夾雑のさらなる原因は、固体支持体上のトランスフエクシヨン細胞の移動性で あり得る。本発明者らは、数個の支持体上での細胞接着速度（図 6C)およびプラスミ ド DNAの拡散速度の両方を測定した。その結果は、最適条件下において DNA拡 散はほとんど生じなかった。しかし、高い相互夾雑条件下では、細胞接着が完了する までの時間に、相当の量のプラスミド DNAが固相表面から拡散して枯渴した。
[0192] この確立された技術は、経済的な高スループットの遺伝子機能スクリーニングの状 況において特に重要である。実際に、必要とされる少量のトランスフエクシヨン試薬お よび DNA、ならびに全プロセス（プラスミドの単離から検出まで）を自動化する可能性 は、上記の方法の有用性を増大する。
[0193] 結論として、本発明者らは、複合体一塩を用いた系で、 hMSCトランスフヱクシヨンァ レイを好首尾に実現した。このことは、多能性幹細胞の分化を制御する遺伝子機構 の解明など、固相系トランスフエクシヨンを利用した種々の研究における高スループッ ト研究を可能にすることになる。固相系トランスフエクシヨンの詳細な機構ならびに高 スループットのリアルタイム遺伝子発現モニタリングに対するこの技術の使用に関す る方法論は種々の目的に応用可能であることが明らかになった。
[0194] (実施例 7 : RNAiトランスフエクシヨンマイクロアレイ）
実施例 6に記載のようにアレイを作製した。遺伝物質として、プラスミド DNAと shRN Aとを混合して使用した。その組成を以下の表 2に示す。
[0195] [表 2]
Figure imgf000058_0001
結果を図 9に示す。この図の結果を数値化したデータを、 5種類の細胞について、 図 10にまとめた。
[0196] このように、どのような細胞を用いたとしても、本発明の技術が適用可能であることが 判明した。
[0197] (実施例 7 : RNAiマイクロアレイ = siRNAを用いた場合）
実施例 6と同様のプロトコ一ルを用いて、今度は shRNAの代わりに siRNAを用レヽ て、 RNAiトランスフエクシヨンマイクロアレイを構築した。
[0198] 以下の表の 18種類の転写因子レポーターおよび Actinプロモータベクターを用いて 、各転写因子に対しての siRNAを合成した 28種類。また、コントローノレとして、 EGFPに 対する siRNAを用いて、 siRNAが標的転写因子をノックダウンするか評価した。また、 ネガティブコントロールとしては、 scrambleRNAを用いて、これらの比を取って評価し た。
[0199] [表 3] Mercuryシグ、ナ レ伝達
鍾
pAP1 (PMA)-EGFP
pAPI -EGFP
pCRE-EGFP
pERE-EGFP
pE2F - EGFP
pGAS-EGFP
pGRE-EGFP
pHSE-EGFP
pISRE-EGFP
pMyc-EGFP
pNFAT-EGFP
pNFkB-EGFP
p53 - EGFP
pRARE-EGFP
pRb-EGFP
pSRE-EGFP
pSTAT3-EGFP
pTRE-EGFP 各細胞への固相系トランスフヱクシヨン後、 2日間培養し、蛍光イメージスキャナーに て画像取得後、蛍光量を定量化した。 [0200] (結果）
結果を図 11に示す。この結果を各遺伝子ごとにまとめたものを図 12に示す。
[0201] 図 11一 12から明らかなように、 RNAiを用いた場合、各遺伝子が特異的に発現が 抑制されていることが示された。 RNAiを用いた複数の遺伝物質のアレイを実現する ことができた。
[0202] (実施例 8： PCR断片を用いたトランスフヱクシヨンアレイ）
次に、 PCR断片を遺伝物質として用いた場合でも、本発明が実現可能であることを 実証した。以下にその手順を示す。
[0203] PCRにより、図 13に記載のような核酸断片を取得し、トランスフヱクシヨンマイクロア レイに用いる遺伝物質とした。その手順を以下に示す。
[0204] PCRプライマーとしては、
GG ATAACCGTATTACCGCCATG CAT (酉己歹番号 2)と
ccctatctcggtctattcttttg C AAAAGAATAGAC C GAGATA GGG
(配列番号 3)とを使用して、テンプレートとして、 pEGFP— N1を用いた（図 14を参 照）。 PCRの条件は、以下のとおりである。
[0205] [表 4] 蒸留水 μ L l〇xK〇D— Plus— 緩衝 ί夜 5 μ L
2mM dNT Ps 5 μ L
25mM MgS〇4 2 β L プライマー（各 10 μ Μ) 1 . 5 μ L テンプレート DNA 2 μ L ( lng )
K〇D - Plus - 1 μ L ( lunit /uL π PT 50 μ L サイクル条件： 94°C2min→(94°C15sec→60°C30sec→68°C 3min)→ 4°C (括弧内を 30サイクル）
得られた PCRフラグメントは、フエノール/クロロフオルム抽出を行レ、、エタノール沈殿 法にて精製した。その PCR断片の配列は、以下の通りである。
GGATAACCGT ATTACCGCCA TGCATTAGTT ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG TTCATAGCCC ATATATGGAG TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCT GACCGCCCAA CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC ATCAATGGGC GTGGATAGCG GTTTGACTCA CGGGGATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC GTCAATGGGA GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG TCGTAACAAC TCCGCCCCAT TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA TATAAGCAGA GCTGGTTTAG TGAACCGTCA GATCCGCTAG CGCTACCGGA CTCAGATCTC GAGCTCAAGC TTCGAATTCT GCAGTCGACG GTACCGCGGG CCCGGGATCC ACCGGTCGCC ACCATGGTGA GCAAGGGCGA GGAGCTGTTC ACCGGGGTGG TGCCCATCCT GGTCGAGCTG GACG6CGACG TAAACGGCCA CAAGTTCAGC GTGTCCGGCG AGGGCGAGGG CGATGCCACC TACGGCAAGC TGACCCTGAA GTTCATCTGC ACCACCGGCA AGCTGCCCGT GCCCTGGCCC ACCCTCGTGA CCACCCTGAC CTACGGCGTG CAGTGCTTCA GCCGCTACCC CGACCACATG AAGCAGCACG ACTTCTTCAA GTCCGCCATG CCCGAAGGCT ACGTCCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGG ACGACGGCAA CTACAAGACC CGCGCCGAGG TGAAGTTCGA GGGCGACACC CTGGTGAACC GCATCGAGCT GAAGGGCATC GACTTCAAGG AGGACGGCAA CATCCTGGGG CACAAGCTGG AGTACAACTA CAACAGCCAC AACGTCTATA TCATGGCCGA CAAGCAGAAG AACGGCATCA AGGTGAACTT CAAGATCCGC CACAACATCG AGGACGGCAG CGTGCAGCTC GCCGACCACT ACCAGCAGAA CACCCCCATC GGCGACGGCC CCGTGCTGCT GCCCGACAAC CACTACCTGA GCACCCAGTC CGCCCTGAGC AAAGACCCCA ACGAGAAGCG CGATCACATG GTCCTGCTGG AGTTCGTGAC CGCCGCCGGG ATCACTCTCG GCATGGACGA GCTGTACAAG TAAAGCGGCC GCGACTCTAG ATCATAATCA GCCATACCAC ATTTGTAGAG GTTTTACTTG CTTTAAAAAA CCTCCCACAC CTCCCCCTGA ACCTGAAACA TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT GTTTATTGCA GCTTATAATG GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAATT TCACAAATAA AGCATTTTTT TCACTGCATT CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG TATCTTAAGG CGTAAATTGT AAGCGTTAAT ATTTTGTTAA AATTCGCGTT AAATTTTTGT TAAATCAGCT CATTTTTTAA CCAATAGGCC GAAATCGGCA AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGG6
(配列番号 4)。
[0206] これを用いて作製したチップに、 MCF7を播種し、 2日後に蛍光イメージスキャナー にて画像を取得した。その結果を図 15に示す。図 15では、環状 DNAと PCRフラグメ ントとの比較を行っている。どちらの場合も、トランスフエクシヨンがうまく行われており 、 PCR断片を遺伝物質として使用した場合でも、全長プラスミドと同様にトランスフエ クシヨンされることが明らかになった。
[0207] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発 明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解され る。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体 的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として 援用されるべきであることが理角军される。
産業上の利用可能性
本発明により、予想外に簡便で、生体適合性 (例えば、細胞親和性）および/また は徐放性を提供する物質の固相支持体への固定方法が提供された。このような効果 を利用することにより、種々の生体現象、例えば、遺伝子導入、シグナル伝達、薬効 などを固相支持体を用いて発揮させることができる。細胞は、医療技術、医薬開発な どにおいて重要なツールであり、そのツールを種々開発できることから、その産業上 における有用性も評価されるべきである。

Claims

請求の範囲
[I] 遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するためのキットであって、
a)遺伝物質と、
b)該遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電性物質と、
c)塩と、
を含み、
該遺伝物質と該荷電性物質と該塩とを固相支持体上で混合することを指示する指 示書を備える、キット。
[2] 前記遺伝物質と、前記荷電性物質と、前記塩とからなる群より選択される少なくとも 2 つの物質は、混合されて提供される、請求項 1に記載のキット。
[3] 前記遺伝物質は、少なくとも 2種類存在する、請求項 1に記載のキット。
[4] 前記遺伝物質は、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合わせからなる群より選 択される、請求項 1に記載のキット。
[5] 前記荷電性物質は、細胞親和性を有する、請求項 1に記載のキット。
[6] 前記荷電性物質は、生体分子を含む、請求項 1に記載のキット。
[7] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれら の複合体からなる群より選択される、請求項 6に記載のキット。
[8] 前記荷電性物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸 およびその複合体からなる群より選択される、請求項 1に記載のキット。
[9] 前記荷電性物質は、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リボソーム系試薬および帯 電コロイドからなる群より選択される、請求項 1に記載のキット。
[10] 前記塩は、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したものである力、、あるいは塩 基の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したものである、請求項 1に記載のキ ッ卜。
[II] 前記塩は、塩ィ匕カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナ トリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム 、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、請求項 1に記載のキット。
[12] 前記塩は、緩衝液、培養液および血清の形態で提供される、請求項 1に記載のキット
[13] 前記遺伝物質は、細胞に導入された後生物学的活性を有する物質をコードする、請 求項 1に記載のキット。
[14] 前記遺伝物質、前記荷電性物質および前記塩は薬学的に受容可能である、請求項
1に記載のキット。
[15] 前記遺伝物質、前記荷電性物質および前記塩は、マイクロカプセル中に含まれる、 請求項 1に記載のキット。
[16] 遺伝物質を支持体に固定し、細胞に導入するための方法であって、
I)支持体を提供する工程と、
II)該支持体に、 a)遺伝物質と、 b)該遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電性物 質と、 c)塩と、を別々のまたは一緒に提供する工程と、
III)該遺伝物質と該荷電性物質と塩とを固相支持体上で混合する工程と、 を包含する、方法。
[17] 前記遺伝物質と、荷電性物質と、塩とからなる群より選択される少なくとも 2つの物質 は、混合されて提供される、請求項 16に記載の方法。
[18] 前記遺伝物質は、少なくとも 2種類存在する、請求項 16に記載の方法。
[19] 前記遺伝子物質は、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合わせからなる群より 選択される、請求項 16に記載の方法。
[20] 前記荷電性物質は、細胞親和性を有する、請求項 16に記載の方法。
[21] 前記荷電性物質は、生体分子を含む、請求項 16に記載の方法。
[22] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれら の複合体からなる群より選択される、請求項 21に記載の方法。
[23] 前記荷電性物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸 およびその複合体からなる群より選択される、請求項 16に記載の方法。
[24] 前記荷電性物質は、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リボソーム系試薬および帯 電コロイドからなる群より選択される、請求項 16に記載の方法。
[25] 前記塩は、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したものである力、、あるいは塩 基の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したものである、請求項 16に記載の 方法。
[26] 前記塩は、塩ィ匕カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナ トリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム 、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、請求項 16に記載の方法
[27] 前記塩は、緩衝液、培養液および血清の形態で提供される、請求項 16に記載の方 法。
[28] 前記遺伝物質は、細胞に導入された後生物学的活性を有する物質をコードする、請 求項 16に記載の方法。
[29] 前記遺伝物質、前記荷電性物質および前記塩は薬学的に受容可能である、請求項
16に記載の方法。
[30] 前記遺伝物質、前記荷電性物質および前記塩は、マイクロカプセル中に含まれる、 請求項 16に記載の方法。
[31] 前記支持体は、固相支持体である、請求項 16に記載の方法。
[32] 前記支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属
、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、請求項 16 に記載の方法。
[33] 前記支持体は、コーティングされる、請求項 16に記載の方法。
[34] 前記コーティングは、ポリ一 L—リジン、シラン、 APS、 MAS,疎水性フッ素樹脂および 金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、請求項 3 3に記載の方法。
[35] 前記支持体はチップである、請求項 16に記載の方法。
[36] 前記支持体はチップであり、前記複合体は該チップ上にアレイ状に配列される、請求 項 16に記載の方法。
[37] 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、請求項 16に記載の方 法。
[38] 前記工程 II)は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、請求項 16に記載の方法
[39] 前記工程 III)は、生体分子を破壊しない条件下で行われる、請求項 16に記載の方 法。
[40] 前記混合物を固相支持体に付着した後、その混合物中の溶媒を低減または除去す る工程をさらに包含する、請求項 16に記載の方法。
[41] 遺伝物質と、該遺伝物質とは反対の荷電を有する荷電性物質と、塩とが表面に固定 された、支持体。
[42] 前記遺伝物質は、細胞に導入され得る、請求項 41に記載の支持体。
[43] 前記遺伝物質は、 2種類以上含まれる、請求項 41に記載の支持体。
[44] 前記遺伝物質は、 DNA、 RNA、 PNAおよびそれらの組み合わせからなる群より選 択される、請求項 41に記載の支持体。
[45] 前記荷電性物質は、細胞親和性を有する、請求項 41に記載の支持体。
[46] 前記荷電性物質は、生体分子を含む、請求項 41に記載の支持体。
[47] 前記生体分子は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、脂質、糖、有機低分子、およびこれら の複合体力もなる群より選択される、請求項 41に記載の支持体。
[48] 前記荷電性物質は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸 およびその複合体からなる群より選択される、請求項 41に記載の支持体。
[49] 前記荷電性物質は、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リボソーム系試薬および帯 電コロイドからなる群より選択される、請求項 41に記載の支持体。
[50] 前記塩は、有機酸または無機酸の水素を金属に置換したものであるカ あるいは塩 基の水酸基を有機酸基または無機酸基で置換したものである、請求項 41に記載の 支持体。
[51] 前記塩は、塩ィ匕カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナ トリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム 、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンからなる群より選択される、請求項 41に記載の支持 体。
[52] 前記塩は、緩衝液、培養液および血清の形態で提供される、請求項 41に記載の支 持体。
[53] 前記遺伝物質は、細胞に導入された後生物学的活性を有する物質をコードする、請 求項 41に記載の支持体。
[54] 前記支持体、前記遺伝物質、前記荷電性物質および前記塩は薬学的に受容可能 である、請求項 41に記載の支持体。
[55] 前記遺伝物質、前記荷電性物質および前記塩は、マイクロカプセル中に含まれる、 請求項 41に記載の支持体。
[56] 前記支持体は、固相支持体である、請求項 41に記載の支持体。
[57] 前記支持体は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属
、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、請求項 41 に記載の支持体。
[58] 前記支持体は、コーティングされる、請求項 41に記載の支持体。
[59] 前記コーティングは、ポリ- L—リジン、シラン、 APS、 MAS、疎水性フッ素樹脂および 金属からなる群より選択される物質を含むコーティング剤によって行われる、請求項 5
8に記載の支持体。
[60] 前記支持体はチップである、請求項 41に記載の支持体。
[61] 前記支持体はチップであり、前記遺伝物質、前記荷電性物質および前記塩を含む 混合物は該チップ上にアレイ状に配列される、請求項 41に記載の支持体。
[62] 前記生体分子は、細胞に導入されて生物学的活性を有する、請求項 41に記載の支 持体。
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