FR3105260A1 - Modèle organoïde cardiaque vascularisé apres incorporation de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines - Google Patents

Modèle organoïde cardiaque vascularisé apres incorporation de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines Download PDF

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Philippe Nirde
Sylvain Richard
Adrien Moreau
Philippe Chevalier
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Diagncell
Diag'ncell
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Universite de Montpellier I
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Association Francaise Contre les Myopathies
Hospices Civils de Lyon HCL
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
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Abstract

La présente invention a pour objet un modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) greffés sur une membrane chorio-allantoïde d’œuf fécondé. La présente invention a également pour objet un procédé d’obtention dudit modèle organoïde cardiaque vascularisé. La présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation de l’activité d’un composé vis-à-vis du modèle organoïde cardiaque vascularisé. La présente invention a également pour objet un kit comprenant ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé.

Description

MODÈLE ORGANOÏDE CARDIAQUE VASCULARISÉ APRES INCORPORATION DE CARDIOMYOCYTES DÉRIVÉS DE CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES INDUITES HUMAINES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se situe dans le domaine médical, et plus particulièrement dans le domaine de la cardiologie.
La présente invention a en effet pour objet un modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) ainsi que son utilisation pour caractériser la toxicité cardiaque d’un composé ou l’activité d’un composé vis-à-vis des cardiomyocytes. La présente invention a également pour objet un procédé d’obtention dudit modèle organoïde cardiaque vascularisé. La présente invention a également pour objet un kit comprenant le modèle organoïde cardiaque vascularisé.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La greffe de cellules sur des membranes chorio-allantoïdes (MCA) d'œufs fertilisés, en conditions in-ovo (dans la coquille), date de 1912 (Murphy et Rous, 1912). Ce n'est que plus récemment que la culture hors de l'œuf (ex-ovo) a été utilisée (Dunn et Boone, 1976) et que certaines cellules tumorales ont été greffées in-ovo (Deryugina et Quigley, 2008). Plus récemment, les inventeurs ont mis au point un procédé de greffe d’au moins une cellule cardiaque ou au moins une cellule capable de se différencier en une cellule cardiaque, ou un fragment de tissu cardiaque sur la MCA d’un œuf fécondé sur la membrane chorio-allantoïde d’un œuf fécondé (WO 2016/198699). Le procédé de greffe sur la MCA à partir des cellules cardiaques nécessite toutefois des interventions chirurgicales afin d’obtenir ces cellules; l’obtention de cellules cardiaques humaines n’est pas toujours facile. Plus récemment encore, un procédé de greffe sur MCA avec des organoïdes cardiaques non vascularisés a été proposé. Ces organoïdes ont été obtenus à partir de cellules cardiaques progénitrices issues de cellules souches embryonnaires humaines (hESC-CPC) après 3 jours de culture in-vitro, puis implantées sur une MCA âgée de 7 jours et demi (Varzideh et al. 2019). Ce procédé de greffe sur la MCA est relativement complexe, car nécessitant la préformation d’un organoïde à partir des cellules hESC-CPC avant d’être xénogreffé sur la MCA, ce qui augmente la difficulté technique mais aussi le temps nécessaire pour pourvoir réaliser la greffe.
Malgré les procédés cités ci-dessus, la cardiologie à ce jour reste démunie de modèles éthiques expérimentaux intermédiaires entre l'expérimentation in-vitro (cellules isolées, culture de cardiomyocytes, greffe organotypique) et l'expérimentation in-vivo (greffe de cœur sur mammifères, y compris l'homme). Il existe donc un besoin réel de disposer de nouveaux modèles d’expérimentationin - vivo. Il existe notamment un besoin de disposer de nouveaux modèles plus simples à obtenir, moins coûteux, et/ou plus flexibles. En particulier, il existe un besoin de nouveaux modèles appropriés à une utilisation dans la médecine personnalisée. Enfin, il existe un besoin de nouveaux modèles permettant notamment d’analyser les effets toxiques et/ou thérapeutiques de composés pharmaceutiques.
De façon avantageuse, les inventeurs ont mis au point ici un nouveau modèle organoïde cardiaque vascularisé, ledit modèle comprenant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) greffés sur une membrane chorio-allantoïde MCA d’œuf fécondé. Avantageusement, après avoir été déposées sur la MCA de l’œuf fécondé, les cellules hiPSC-CM s’auto-organisent de façon spontanée afin de former le modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention.
De façon avantageuse, les hiPSC-CM peuvent être obtenus à partir des cellules somatiques reprogrammées issues de n’importe quel sujet humain, ledit sujet pouvant être, par exemple, atteint d’une pathologie telle qu’une pathologie cardiaque. En outre, ce modèle peut avantageusement être utilisé à des fins de médecine personnalisée, lorsque les cellules proviennent d’un sujet particulier atteint d’une pathologie, par exemple afin d’étudier les mécanismes pathologiques, d’identifier un traitement adapté ou d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé vis-à-vis des cellules hiPSC-CM. Ainsi, ledit modèle donne une plus grande flexibilité dans le choix du modèle, pouvant comprendre une variété de caractéristiques, en fonction des hiPSC-CM choisis.
Les inventeurs ont également découvert de façon surprenante que les cellules hiPSC-CM congelées après leur obtention et directement appliquées après décongélation sur la MCA peuvent générer ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé, sans traitement préalable. Ceci permet de façon avantageuse de pouvoir générer ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention à tout moment, sans avoir besoin de coordonner les processus d’obtention des cellules hiPSC-CM et de préparation des œufs fécondés. Les inventeurs ont donc également développé un procédé d’obtention dudit modèle organoïde cardiaque vascularisé optimisé. Par ailleurs, une banque de cellules hiPSC-CM de différentes origines et/ou ayant différentes caractéristiques (par exemple issues de sujets atteints de différentes pathologies) peut être préparée et stockée de façon stable à long terme jusqu’à ce qu’il soit désiré d’établir un modèle organoïde cardiaque vascularisé sur la base d’une de ces banques de cellules hiPSC-CM.
L’invention sera maintenant décrite de manière détaillée à l’aide d’exemples destinés à l’illustrer sans la limiter, diverses modifications pouvant y être apportées sans sortir du cadre général de l’invention.
La présente invention a pour objet un modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) greffés sur une MCA d’œuf fécondé.
Par «modèle organoïde cardiaque vascularisé », on entend un modèle multicellulaire formant une structure en trois dimensions (3D) occupée par un réseau vasculaire qui irrigue la structure et comprenant des cellules de type cardiomyocytes dérivés/différentiés de cellules souches pluripotentes induites. Le modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend donc des caractéristiques structurelles du cœur et avantageusement reproduit certaines de ses fonctions. À titre d’exemple, le présent modèle peut notamment et de façon autonome se vasculariser et acquérir une fonction contractile synchrone. On parlera indifféremment selon l’invention de «modèle organoïde cardiaque vascularisé » ou de «modèle organoïde cardiaque néo-vascularisé ».
Par «hiPSC-CM», on entend des cellules de type cardiomyocyte (autrement appelé des cellules «cardiomyocyte-like») dérivés/différentiés à partir de cellules souches pluripotentes induites («Human Induced Pluripotent Stem Cells», hiPSCs). Des hiPSCs peuvent notamment être obtenues selon un procédé décrit dans EP 1970446. Des hiPSC-CM peuvent ensuite être obtenus, par exemple par le procédé décrit dans Moreau et al. 2017, Lian et al. 2012).
Par une cellule « cardiomyocyte-like» on entend une cellule qui partage des caractéristiques avec des cardiomyocytes mais qui est d’origine différente (ex: dérivée des hiPSCs comme décrit ci-dessus). Des cellules «cardiomyocyte-like» peuvent notamment être définies par leurs caractéristiques morphologiques et fonctionnelles (ex: contractiles) ainsi que par la présence de biomarqueurs spécifiques (ex: expression de la troponine T cardiaque).
Le terme «vascularisé» désigne une vascularisation du modèle organoïde cardiaque capable de supporter une alimentation en sang des hiPSC-CM formant l’organoïde et dont le système vasculaire provient du système circulatoire vasculaire de l’œuf fécondé (c-à-d. la MCA, elle-même richement vascularisé). Par «vascularisation» on entend le processus physique de formation des vaisseaux sanguins, c'est-à-dire la génération de nouveaux vaisseaux sanguins (néo-vascularisation) au sein du modèle organoïde cardiaque. La vascularisation peut notamment comprendre la productionde - novode cellules endothéliales de la MCA (vasculogenèse) au sein des hiPSC-CM qui s’auto-organisent de façon spontanée afin de former le modèle organoïde cardiaque et la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants dans la MCA de l’œuf fécondé (angiogenèse). En particulier, la vasculogenèse comprend la néovascularisation.
L’expression «œuf fécondé» désigne un œuf fertilisé. De préférence, ledit œuf fécondé est un œuf d’oiseau, de préférence choisi parmi: un œuf de poule et un œuf d’autruche.
L’expression «membrane chorio-allantoïde» ou «MCA» est un terme anatomique qui désigne la membrane extra-embryonnaire qui résulte de la fusion de la membrane de la vésicule allantoïde et de la membrane séreuse de Von Baer (chorion). La membrane chorio-allantoïdecomprend trois couches, ou feuillets: l’ectoderme, attaché à la membrane de la coquille, le mésoderme, enrichi en vaisseaux sanguins et l’endoderme, en contact avec la cavité allantoïde.
Le modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention peut notamment comprendre différents sous-types de hiPSC-CM, par exemple des cellules atriale-like, des cellules ventriculaire-like, et/ou des cellules nodale-like. Par cellule «atrial-like», «ventricular-like» ou «nodal-like» on entend une cellule qui partage des caractéristiques avec une cellule atriale, une cellule ventriculaire, ou une cellule nodale (par ex. une cellule du nœud sino-auriculaire) mais qui est d’origine différente (par ex. dérivée des hiPSCs). Le modèle organoïde cardiaque vascularisé peut également comprendre d’autres types de cellules. À titre d’exemple, le modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend en outre des fibroblastes. Des cellules de type vasculaires et/ou cellules régulatrices de type neuronales peuvent également être ajoutées.
De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend en outre au moins une cellule atriale-like. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend en outre au moins une cellule ventriculaire-like. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend en outre au moins une cellule nodale-like. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend en outre au moins un fibroblaste. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend au moins une cellule atriale-like, au moins une cellule ventriculaire-like, au moins une cellule nodale-like et au moins un fibroblaste.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend au moins une cellule positive à la troponine-T cardiaque, de préférence une majorité de cellules positives à la troponine-T cardiaque. En effet, la troponine-T cardiaque peut être utilisée en tant que marqueur afin d’identifier des cellules «cardiomyocyte-like». À titre d’exemple non-limitatif, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend au moins 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou au moins 95% de cellules positives à la troponine-T cardiaque. À titre d’exemple non-limitatif, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend entre 60 et 95% de de cellules positives à la troponine-T cardiaque, entre 70 et 95%, entre 80 et 90%, entre 90 et 95% de cellules positives à la troponine-T cardiaque. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% de cellules positives à la troponine-T cardiaque. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend entre 60 et 95% de cellules positives à la troponine-T cardiaque, entre 70 et 95%, entre 80 et 90%, ou entre 90 et 95% de cellules positives à la troponine-T cardiaque. Les cellules positives à la troponine-T cardiaque peuvent notamment comprendre des cellules de type atrial («atriale-like», de type ventriculaire («ventriculaire-like»), ou de type nodale («nodale-like»).
Ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé peut également comprendre des cellules négatives à la troponine-T cardiaque. À titre d’exemple non-limitatif, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend au moins 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de cellules négatives à la troponine-T cardiaque. À titre d’exemple non-limitatif, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend entre 5 et 40% de cellules négatives à la troponine-T cardiaque, entre 10 et 40%, entre 20 et 40%, entre 30 et 40%, entre 5 et 10%, entre 5 et 20%, entre 5 et 30%, entre 10 et 20%, entre 10 et 30%, entre 10 et 40%, entre 20 et 30%, entre 20 et 40%, ou entre 30 et 40% des cellules négatives à la troponine-T cardiaque. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend au moins 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de cellules négatives à la troponine-T cardiaque. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend entre 5 et 40% de cellules négatives à la troponine-T cardiaque, entre 10 et 40%, entre 20 et 40%, entre 30 et 40%, entre 5 et 10%, entre 5 et 20%, entre 5 et 30%, entre 10 et 20%, entre 10 et 30%, entre 10 et 40%, entre 20 et 30%, entre 20 et 40%, ou entre 30 et 40% des cellules négatives à la troponine-T cardiaque. Les cellules négatives à la troponine-T cardiaque peuvent notamment comprendre des cellules de type fibroblaste. Dans tous les cas, la quantité de cellules positives à la troponine-T cardiaque est supérieur à la quantité de cellules négatives à la troponine-T cardiaque. À titre d’exemple, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend entre 60% et 95% de cellules positives à la troponine-T cardiaque et entre 5 et 40% de cellules négatives à la troponine-T cardiaque.
De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend au moins 60 % de cellules positives à la troponine-T cardiaque et au moins 5 % de cellules négatives à la troponine-T cardiaque. De préférence, ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé comprend entre 60% et 95% de cellules positives à la troponine-T cardiaque et entre 5 et 40% de cellules négatives à la troponine-T cardiaque.
La présence ou absence de troponine-T cardiaque peut notamment être déterminée par la méthode telle que décrit dans Lian et al 2012.
Les hiPSC-CM utilisés peuvent être dérivés des hiPSCs d’un ou de plusieurs sujets. Par «sujet» on entend un individu humain, quel que soit son âge, son sexe et son origine génétique. L'individu humain peut notamment être un adulte ou un enfant. Le terme «adulte» désigne ici une personne âgée d'au moins 16 ans. Le terme «enfant» comprend les nourrissons de 0 à 1 an et les enfants de 1 à 8 ans, de 8 à 12 ans et de 12 à 16 ans. Bien entendu, même si le modèle décrit ici comprend des hiPSC-CM, il peut également être envisagé d’obtenir des iPSC-CM à partir des iPSC d’un autre animal vertébré, tel que les oiseaux (ex: les poules) ou les mammifères (ex: les singes, les porcs, les souris, les rats, etc.).
Selon un mode de réalisation préférentiel, les hiPSC-CM sont dérivées d’un seul sujet. Selon un mode de réalisation alternatif, les hiPSC-CM sont dérivées de plusieurs sujets et regroupées.
Les hiPSC-CM peuvent être «sains», c’est-à-dire issus d’un sujet exempt de pathologie connue ou «pathologiques», c’est-à-dire issus d’un sujet atteint d’une pathologie. Ledit sujet peut être atteint d’une pathologie cardiaque ou de toute autre pathologie. Ledit sujet peut notamment être atteint d’une pathologie génétique, qu’elle soit une pathologie cardiaque ou non.
Par «pathologie génétique» on entend ici une maladie, partiellement ou complètement, directement ou indirectement, causée par une ou plusieurs anomalies du génome. Ladite pathologie génétique peut notamment être une pathologie non-héréditaire ou héréditaire. Par «pathologie génétique héréditaire» ou «pathologie héréditaire» on entend des pathologies résultant d’une ou plusieurs anomalies du génome héritée(s) d’au moins un parent. De préférence, ladite pathologie génétique est une pathologie génétique héréditaire.
À titre d’exemple non-limitatif, ledit sujet peut être atteint d’une pathologie telle qu’une pathologie cardiaque, un trouble du tissu conjonctif pouvant affaiblir les parois des vaisseaux (par ex. une sclérodermie, un syndrome Ehlers-Danlos, une ostéogenèse imparfaite, une achondroplasie, une maladie polykystique des reins), un trouble musculo-squelettique (par ex. une arthrite, ostéogenèse imparfaite), un diabète, une maladie glomérulaire, une dystrophie musculaire de Duchenne et autres troubles neuromusculaires, un Alzheimer, une maladie d’Huntington et autres pathologies neuronales, une mucoviscidose, une drépanocytose, une maladie de Crohn et autres pathologies digestives, un rétinoblastome, une maladie mitochondriale, etc. Plus globalement, le sujet peut être atteint de n’importe quelle maladie notamment à composante génétique.
De préférence, ledit sujet est atteint d’une pathologie génétique, notamment choisie parmi celles listées ici.
À titre d’exemple non-limitatif, ledit sujet peut être atteint d’une pathologie cardiaque telle qu’une amylose cardiaque, une arythmie cardiaque (par ex. une fibrillation auriculaire, un syndrome de Brugada, unetachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, un syndrome du QT long, unsyndrome du QT court), une cardiopathie congénitale non cyanogène (conduisant par ex. à des anomalies de communication entre les compartiments cardiaques, un canal artériel persistant, des rétrécissements, ou « sténoses »), une cardiopathie congénitale cyanogène (conduisant par ex. à une tétralogie de Fallot ou une transposition des gros vaisseaux), une cardiomyopathie (par ex. unecardiomyopathie dilatée, une cardiomyopathie hypertrophique, une cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène, une cardiomyopathie restrictive), une hypercholestérolémie, une athérosclérose (par ex. une athérosclérose coronarienne), une angine de poitrine, une malformation cardiaque, une cardiopathieischémique chronique, etc.
Le sujet est préférentiellement atteint d’une pathologie cardiaque, plus préférentiellement atteint d’une pathologie cardiaque génétique.
De préférence, la pathologie cardiaque est choisie parmi amylose cardiaque, une arythmie cardiaque (par ex. une fibrillation auriculaire, un syndrome de Brugada, unetachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, un syndrome du QT long, unsyndrome du QT court), une cardiopathie congénitale non cyanogène (conduisant par ex. à des anomalies de communication entre les compartiments cardiaques, un canal artériel persistant, des rétrécissements, ou « sténoses »), une cardiopathie congénitale cyanogène (conduisant par ex. à une tétralogie de Fallot ou une transposition des gros vaisseaux), une cardiomyopathie (par ex. unecardiomyopathie dilatée, une cardiomyopathie hypertrophique, une cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène, une cardiomyopathie restrictive).
Plus préférentiellement, la pathologie cardiaque est une arythmie cardiaque.
L’invention a pour autre aspect un procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé décrit ici, ledit procédé comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes:
- la culture en conditionsex - ovod’un œuf fécondé jusqu’à un stade de développement de l’œuf d’au moins 6 jours,
- la réalisation d’une microlésion en surface de la MCA de l’œuf fécondé,
- la mise en contact des hiPSC-CM, et de ladite MCA, au niveau de ladite microlésion, et
- l’incubation de l’œuf fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, à une température comprise entre 36°C et 39°C et un degré d’hygrométrie compris entre 60% et 90%, préférentiellement entre 60% et 90%, plus préférentiellement de 84%.
Par «conditionsex - ovo», on entend un œuf fécondé, cultivé complétement hors de sa coquille après transfert de l’œuf 48h après le début de l’incubation dans un récipient concave, de préférence des coupelles de pesées en polystyrène. Selon un mode de réalisation particulier, ledit récipient concave est couvert, de préférence dont le couvercle est fabriqué en mettant face à face 2 coupelles reliées par du ruban adhésif, un peu comme une moule. À titre d’exemple alternatif, ledit couvercle peut être un fond d’une boite de pétri ou tout autre couvercle amovible adaptée.
L’expression «un stade de développement de l’œuf d’au moins 6 jours» désigne un œuf ayant été cultivé pendant au moins six jours après la mise en couveuse d’un œuf fécondé. Cette expression inclut un œuf ayant atteint un stade de développement de six jours (J6), sept jours (J7), huit jours (J8), neuf jours (J9), dix jours (J10), onze jours (J11), douze jours (J12), treize jours (J13), quatorze jours (J14), quinze jours (J15), seize jours (J16), dix-sept jours (J17), dix-huit jours (J18), dix-neuf jours (J19), vingt jours (J20), ou vingt-et-un jours (J21).
Selon un aspect particulier du procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention, l’œuf fécondé est cultivé en conditionsex - ovod’un stade de développement d’au moins 6 jours jusqu’à 21 jours au plus, plus préférentiellement de 7 jours et d’au plus 15 jours (soit J7, J8, J9, J10, J11, J12, J13, J14 ou J15), plus préférentiellement de 7 jours et d’au plus 14 jours (soit J7, J8, J9, J10, J11, J12, J13, ou J14), encore plus préférentiellement de 8 jours et d’au plus 10 jours (soit J7, J8, J9, J10). La densité des vaisseaux et la pression vasculaire aux stades J8 à J12 est notamment favorable à la revascularisation du greffon. La MCA est également suffisamment large pour accueillir la greffe. De préférence, l’œuf fécondé est cultivé en conditionsex - ovojusqu’à un stade de développement d’au moins 7 jours et d’au plus 15 jours, soit J7, J8, J9, J10, J11, J12, J13, J14 ou J15, plus préférentiellement d’au moins 7 jours et d’au plus 14 jours (soit J7, J8, J9, J10, J11, J12, J13, ou J14), plus préférentiellement d’au moins 8 jours et d’au plus 10 jours (soit J7, J8, J9, J10).
L’étape de culture, en conditionsex - ovo, de l’œuf fécondé peut être réalisée dans des conditions standard, à savoir:
la température est de préférence comprise entre 36°C et 39°C, de préférence entre 36,5°C et 38,5°C, de préférence entre 37°C et 38°C et plus préférentiellement à 37,8°C, et
le degré d’hygrométrie est de préférence compris entre 30% et 90%, plus préférentiellement entre 60% et 90%, encore plus préférentiellement de 84%.
Selon un aspect particulier du procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention, l’incubation de l’œuf, après réalisation de la microlésion dans une enceinte thermostatée et dans des conditions adaptées, permet la greffe desdits hiPSC-CM sur la MCA. Les hiPSC-CM s’auto-organisent ensuite de façon spontanée afin de former le modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention.
Le procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention comprend l’application d’une microlésion dans la zone d’implantation choisie, ladite microlésion correspondant à une lésion superficielle capable d’entraîner une micro-hémorragie et/ou à une lésion peu étendue. La taille de la microlésion est choisie de telle sorte que la microlésion ne provoque pas de mort par hémorragie de l’œuf embryonné, et dépend de l’œuf et de la densité de vascularisation de la MCA. La surface de la microlésion appliquée est comprise entre 3 mm2et 2000 mm2, de préférence compris entre 20 et 80 mm2. De préférence, l’application est suivie et/ou est concomitante de l’absorption du sang qui s’écoule du fait de la lésion des micro-capillaires.
De préférence, ladite microlésion est réalisée par le retrait du feuillet ectodermique de l’œuf fécondé dans la zone d’implantation choisie.
De préférence, la microlésion est réalisée par le retrait du feuillet ectodermique de l’œuf fécondé, selon l’une des méthodes suivantes:
- le feuillet ectodermique est retiré en utilisant un papier souple: ledit papier souple est capable d’épouser les irrégularités de la surface de la MCA. Selon un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, le feuillet ectodermique est retiré en appliquant sur la MCA un papier absorbant de type «papier buvard», l’application de papier souple présente l’avantage d’absorber le sang qui s’écoule lors de la micro-hémorragie créée,
- le feuillet ectodermique est retiré en utilisant un objet abrasif: ledit objet abrasif est capable de créer l’abrasion du feuillet ectodermique par grattage. Selon un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, le feuillet ectodermique est retiré en mettant en contact la MCA avec un objet abrasif, et en grattant, ledit objet abrasif est choisi de préférence parmi: une pointe d’aiguille métallique pour seringue, une tige de verre et une pointe de cône pour pipette,
- le feuillet ectodermique est retiré en utilisant une substance absorbante, capable de coller à la surface de la MCA, le feuillet ectodermique est ensuite retiré par retrait de la surface absorbante. Selon un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, le feuillet ectodermique est retiré avec une substance absorbante, et de préférence une pointe de coton tige.
Selon un aspect particulier du procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention, ladite microlésion est réalisée par le retrait du feuillet ectodermique de l’œuf fécondé, dans la zone d’implantation choisie, concomitante ou immédiatement suivie d’une étape permettant l’absorption du sang écoulé qui résulte de la microhémorragie induite par le retrait du feuillet ectodermique. De préférence, l’absorption du sang est réalisée par l’application d’une substance absorbante, de préférence en utilisant du papier buvard, ou en utilisant une pointe de pipette monocanale, sans toucher à la MCA.
De préférence, l’œuf est maintenu à une température constante grâce à une incubation dans une enceinte thermostatée, dans laquelle la température intérieure est comprise de préférence entre 36°C et 39°C, de préférence entre 36,5°C et 38,5°C, de préférence entre 37°C et 38°C, plus préférentiellement de 37,7°C ou 37,8°C.
De préférence, l’œuf est incubé dans une enceinte thermostatée, dans laquelle le degré d’hygrométrie est compris de préférence entre 30% et 90%, plus préférentiellement entre 60% et 90%, encore plus préférentiellement de 84%.
De préférence, lors de toutes les manipulations réalisées hors de l’enceinte thermostatée, l’œuf est posé sur un support chauffant, ledit support étant chauffé à une température comprise entre 36°C à 39°C, de préférence comprise entre 36,5°C à 38,5°C, de préférence comprise entre 37°C et 38°C, de préférence chauffé à 38°C. La personne du métier souhaitant maintenir constante la température de l’œuf lors des manipulations pourra choisir un support chauffant permettant de maintenir la température de l’œuf à une valeur optimale. Selon un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, lors des manipulations l’œuf est posé sur une couverture chauffante.
Dans un procédé selon l’invention, la greffe d’au moins un hiPSC-CM désigne l’implantation dudit cardiomyocyte sur la MCA vascularisée d’un œuf fécondé.
Selon un aspect particulier du procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention, lesdits hiPSC-CM sont congelés suite à leur préparation puis décongelés avant l’étape de mise en contact. En effet, les cellules hiPSC-CM peuvent être congelées après leur obtention. De façon surprenant, les inventeurs ont découvert que les cellules hiPSC-CM peuvent être congelées après leur obtention et directement appliquées sur la MCA après décongélation afin de générer ledit modèle organoïde cardiaque vascularisé. Aussi, selon le procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé, les hiPSC-CM mis en contact avec la MCA au niveau de ladite microlésion peuvent être soit des cellules hiPSC-CM «fraîches» (c.-à-d. n’ayant jamais subis une étape de congélation suivi par une étape de décongélation depuis le processus de différenciation en hiPSC-CM), soit des cellules décongelées (ayant donc subit une étape de congélation suivi par une étape de décongélation).
La personne du métier souhaitant congeler et puis décongeler des hiPSC-CM pourra le faire au vu de ses connaissances générales dans le domaine. À titre d’exemple, les cellules sont mises en suspension dans un milieu de congélation comprenant 50% de milieu de culture (par ex. du RPMI 1640 comprenant un supplément de B27 1X), 40% de sérum bovin fœtal et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Les cellules peuvent ensuite être congelées à -80°C pendant au moins 24h avant d’être placées dans l’azote liquide. La décongélation des cellules peut être réalisée selon les méthodes connus de l’homme du métier. À titre d’exemple non limitatif, l’étape de décongélation peut comprendre la dilution des cellules dans du milieu de culture tel que décrit ci-dessus (e.g.4 volumes de milieu de culture pour 1 volume de suspension cellulaire décongelée). Le contenant comprenant la suspension cellulaire peut également être rincé afin de récupérer l’ensemble de la suspension cellulaire, par exemple avec 4 volumes de milieu de culture supplémentaire. Avant d’être placés sur la MCA, les hiPSC-CM décongelés peuvent notamment subir une étape de centrifugation et resuspension dans un milieu supplémenté, par exemple comprenant l’inhibiteur Y-27632. De préférence, un volume de suspension cellulaire inférieur à 50 µL, de préférence compris entre 30 et 40 µL est déposée sur la MCA, de préférence à l’intérieur d’un anneau, ledit anneau étant de préférence un anneau en silicone.
Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet un procédéin - vitrode caractérisation de l’activité d’un composé vis-à-vis du modèle organoïde cardiaque vascularisé, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:
a) l’obtention d’un modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des hiPSC-CM, obtenu notamment par le procédé décrit ici,
b) l’injection du composé dans ledit œuf fécondé greffé, de préférence par une injection intraveineuse,
c) l’observation des hiPSC-CM,
d) la comparaison des résultats de l’observation de l’étape c) avec les résultats de l’observation des hiPSC-CM d’un modèle organoïde cardiaque vascularisé et n’ayant pas reçu ledit composé, et
e) la caractérisation de l’activité dudit composé.
En effet, la comparaison de l’activité des hiPSC-CM ayant été greffés sur un œuf auquel le composé a été administré avec l’activité des hiPSC-CM ayant été greffés sur un œuf n’ayant pas reçu le composé, ou hiPSC-CM de référence, permet de caractériser les propriétés dudit composé.
Selon un aspect préférentiel, les hiPSC-CM utilisés pour générer le modèle organoïde cardiaque vascularisé sont issus d’au moins un sujet sain. Ceci permet notamment d’évaluer la toxicité d’un composé. À titre alternatif, les hiPSC-CM utilisés pour générer le modèle organoïde cardiaque vascularisé sont issus de sujets atteint d’une pathologie, telle que décrite ici. Ceci permet notamment d’évaluer l’effet thérapeutique d’un composé dans un modèle «pathologique».
Selon un aspect plus particulier, la présente invention a pour objet un procédé de caractérisation de l’activité d’un composé vis-à-vis des hiPSC-CM, dans lequel les hiPSC-CM sont observés par une méthode intra-vitale, choisie de préférence parmi: une échographie Doppler et/ou une observation microscopique, des méthodes d'imagerie avec utilisation de sondes fluorescentes ou autre procédé permettant de mesurer la contraction et le rythme, l’activité métabolique, électrique et calcique. Dans un procédé selon l’invention, l’échographie Doppler est réalisée de préférence avec une sonde haute fréquence, de préférence à 30 à 50 MHz. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, l’observation microscopique est réalisée de préférence au moyen d’un microscope optique à fluorescence. L’homme du métier comprendra aisément l’intérêt de l’utilisation d’une méthode intra-vitale et choisira parmi les méthodes existantes celle qui lui paraîtra la plus appropriée selon la nature de la caractérisation souhaitée.
Selon un autre aspect plus particulier, la présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation de l’activité d’un composé vis-à-vis les hiPSC-CM, dans lequel les hiPSC-CM sont observés par une méthode analytique invasive, de préférence choisie parmi une analyse histologique et/ou une analyse biochimique et/ou de biologie moléculaire. Dans ce cas, l’homme du métier choisira parmi les méthodes existantes celle qui lui paraîtra la plus appropriée selon la nature de la caractérisation souhaitée. À titre d’exemple non-limitatif, le niveau d’apoptose ou de nécrose des hiPSC-CM peut être évalué, ou l’observation de l’organoïde cardiaque vascularisé par une méthode histologique, ou encore la mesure de l’expression génique.
Les hiPSC-CM répondent à des stimuli cardiotoniques, telles que des injections intravasculaires (ou des applications locales) de composés tels que l’épinéphrine. Cela démontre que le modèle expérimental obtenu selon les procédés de l’invention représente un reflet fidèle du comportement d’un tissus cardiaquein - vivo. On peut ainsi moduler la physiologie du modèle organoïde cardiaque vascularisé par un agent extérieur ce qui démontre que le modèle organoïde cardiaque vascularisé ainsi obtenu constitue un modèle fidèle d’un système cardiaque intégré et permettent l’étude de divers composés, comme par exemple l’effet de molécules douées d’activité anti-cancéreuse sur le tissu cardiaque.
Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet la caractérisation d’une situation pathologique dans le modèle organoïde cardiaque vascularisé, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:
a) l’obtention d’un premier modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des hiPSC-CM issus d’au moins un sujet atteint d’une pathologie telle que décrit ici, obtenu notamment par le procédé décrit ici (autrement appelé le «organoïde cardiaque vascularisépathologique»),
b) l’observation des hiPSC-CM,
c) la comparaison des résultats de l’observation de l’étape b) avec les résultats de l’observation des hiPSC-CM d’un œuf fécondé greffé selon un deuxième modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des hiPSC-CM issus d’au moins un sujet sain, obtenu notamment par le procédé décrit ici (autrement appelé le «organoïde cardiaque vascularisésain»), et
d) la caractérisation de ladite situation pathologique.
En effet, la comparaison des propriétés structurelles et/ou fonctionnelles des hiPSC-CM d’un modèle organoïde cardiaque vascularisé «pathologique» avec celles des hiPSC-CM d’un modèle organoïde cardiaque vascularisé «sain», ou hiPSC-CM de référence, permet de caractériser ladite pathologie. À titre d’exemple non-limitatif, lesdites propriétés structurelles et/ou fonctionnelles pouvant être évaluées comprennent: l’auto-organisation des hiPSC-CM (e.g. en forme de sphéroïde), le niveau de vascularisation, les interactions entre les hiPSC-CM et leur environnement, le développement d’une activité contractile, électrique, calcique, métabolique, le profil biochimique et biologique moléculaire, le mort cellulaire, la fréquence des battements de l’organoïde, etc. La caractérisation de ladite situation pathologique peut être notamment réalisée selon l’une des méthodes décrites ici.
De préférence, la méthode d’observation desdits hiPSC-CM du modèle organoïde cardiaque vascularisé est choisie dans le groupe constitué par: une méthode intra-vitale, de préférence écho Doppler et/ou microscopie, des méthodes d'imagerie avec utilisation de sondes fluorescentes ou autre procédé permettant de mesurer la contraction et le rythme cardiaque, et une méthode analytique invasive, de préférence une analyse histologique et/ou une analyse biochimique.
L’invention a donc également pour objet l’utilisation du modèle organoïde cardiaque vascularisé décrit ici, obtenu par un procédé décrit ici, pour caractériser la toxicité cardiaque d’un composé. L’invention a également pour objet l’utilisation du modèle organoïde cardiaque vascularisé décrit ici, obtenu par un procédé décrit ici, pour caractériser l’activité un composé vis-à-vis du tissu cardiaque. Aussi, selon un aspect plus particulier, la présente invention a également pour objet l’utilisation du modèle organoïde cardiaque vascularisé, susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention, pour caractériser la toxicité cardiaque d’un composé ou pour caractériser l’activité un composé vis-à-vis des hiPSC-CM, ledit composé étant de préférence un promédicament (prodrogue) ou un médicament. L’invention a également pour objet l’utilisation du modèle organoïde cardiaque vascularisé décrit ici, obtenu par un procédé décrit ici, pour caractériser une situation pathologique des hiPSC-CM.
L‘invention a également pour objet un kit comprenant le modèle organoïde cardiaque vascularisé obtenu, ou susceptible d’être obtenu, par le procédé d’obtention dudit modèle décrit ici. Aussi, l‘invention a également pour objet un kit comprenant le modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’invention.
D’autres caractéristiques et avantages de l’invention apparaissent dans les exemples et figures suivants.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Xénogreffe de hiPSC-CM sur MCA d’œuf fécondé. (A, B) Implantation sur MCA d’une suspension cellulaire de hiPSC-CM dissociés n’ayant jamais subi une étape de congélation suivi par une étape de décongélation qui peut former un sphéroïde homogène vascularisé dès 24h post implantation dans un anneau de silicone. (C) Implantation sur MCA d’une suspension cellulaire de hiPSC-CM ayant subi une étape de congélation suivi par une étape de décongélation qui peut former un sphéroïde homogène vascularisé (illustré par la présence de plexus sanguins) dès 48h post implantation dans un anneau de silicone. Formation d’une néo-vascularisation au sein du sphéroïde, (D) objectivée par la méthode échographique mettant en évidence la fonctionnalité micro-vasculaire par la mise en évidence des flux sanguins. (E) Contraction synchrone des cellules formant le sphéroïde, et (F) contrôle échographique correspondant. (G) La période permettant d’obtenir des formes sphéroïdes vascularisées est de 6 à 14 jours, avec une préférence pour la période 7-10 jours. [Sphé: formation en sphéroïde, Vasc: vascularisation du sphéroïde, Beat: sphéroïde vascularisé contractile, *sphéroïde] De façon générale, 31% des hiPSC-CM greffés ont formés des sphéroïdes, dont 77% sont des sphéroïdes vascularisés et environ 10% ont une activité contractile synchrone spontanée.
EXEMPLES
L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Ces enseignements comprennent des alternatives, des modifications et des équivalents, qui pourront être appréciés par une personne du métier.
Exemple 1: Cellules hiPSC-CM
Les hiPSC-CM sont cultivées en milieu RPMI 1640 + B27 1x dans les conditions suivantes: 37°C, 5% CO2, air saturé en humidité. Les cellules sont cultivées en routine et sont repiquées régulièrement selon les méthodes connues de l’homme du métier avec un renouvellement du milieu trois fois par semaine.
Lorsque des hiPSC-CM fraîchement différenciés sont à greffer sur la MCA, le milieu est enlevé et les cellules sont rincées avec du PBS avant d’être incubées avec du TrypLETMExpress (ThermoFisher Scientific) pendant 10 minutes. En fin de digestion, la TrypLETMExpress est diluée avec du milieu et les cellules sont dissociées par action mécanique (e.g. avec une pipette comprenant une pointe de diamètre approprié). Les cellules sont rincées, soumises à une étape de centrifugation pendant 5 minutes à 200 g à température ambiante afin de les culotter puis re-suspendues et individualisées dans du milieu de culture contenant 10µM de Y-27632.
Lorsque les hiPSC-CM sont stockés avant utilisation, ils sont congelés dans de l’azote liquide dans un milieu de congélation comprenant 50% de RPMI 1640 avec supplément B27 1X, 40% de sérum bovin fœtal et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). D’abord, les cellules sont dissociées et centrifugées comme décrit ci-dessus puis re-suspendues dans du milieu de congélation pré-refroidi. Les cellules sont conservées dans le milieu de congélation; elles sont congelées à -80°C pendant 24h et ensuite placées dans l’azote liquide.
Pour la remise en suspension des hiPSC-CM congelés, la suspension cellulaire congelée est décongelée à la main jusqu’à la présence d’un dernier glaçon. 4ml de RPMI-B27 1X (500 ml de RPMI 1640 + 10 ml de supplément B27 50X) est aspiré avec une pipette, puis avec la même pipette chargée, la suspension cellulaire décongelée est aspirée. La totalité du volume est transféré dans un tube à centrifuger de 15 ml (ou les 5 ml de suspension cellulaire sont transférés dans un tube à centrifuger de 15ml préalablement chargé avec 5 ml de RPMI-B27 1X). De préférence, le cryotube est rincé avec du RPMI-B27 et le milieu de rinçage ajouté au volume précédent. Le volume est mélangé par retournement du tube, puis centrifugé à 200 g pendant 5 min. Le surnageant est retiré avant de rajouter le volume de milieu de culture supplémenté en 10µM de Y-27632 nécessaire aux implants (à 1 ml de RPMI-B27 sont rajouté 1 µl de Y-27632. Un volume de suspension cellulaire de 30 à 40 µl est déposée à l’intérieur de l’anneau.
La composition des cellules greffées peut être déterminée sur un échantillon par méthode de cytométrie telle que décrite dans: Lian et al 2012. Les hiPSC-CM sont décongelés à la main, et les cellules remise en suspension dans le milieu B27-Y27632. 30 à 40 µl d’hiPSC-CM sont déposés sur la MCA microlésée, à l’intérieur d’un anneau de 5mm de diamètre et l’œuf replacé à l’incubateur.
Exemple 2: Conservation des œufs fécondés avant greffe
Les œufs fécondés, de préférence de race White Leghorn poulet ont été reçus de Haas écloserie (Produits avicoles Hass, 67240 Kaltenhouse – France, ou Couvoir Morizeau, 28190 Dangers, France). De façon optionnelle, les œufs ont été nettoyés avec de l'eau froide distillée, imbibée sur une feuille de sopalin pliée en 4 (1 face par œuf nettoyé) puis désinfectés avec une solution de chlorhexidine aqueuse à 0,2 % (Gilbert, France) imbibées sur une feuille de sopalin pliée en 4. Les œufs ont été stockés à 12-13 ° C jusqu'à utilisation, dans un réfrigérateur ventilé dont le flux d'air n’arrive pas directement sur les œufs stockés.
L'incubation commence quand les œufs ont été placés dans une couveuse d'œufs (Fiem MG140 -200, Guanzate - Italie) à 37,5 ° C et 60% d’humidité, équipée avec des portoirs basculants automatiques et un humidificateur froid à ultrasons automatique (Necchi N7600, Bremed - Italie, ou équivalent compatible avec l'automatisme de la couveuse).
Après au moins 42 heures d'incubation (Hamburger - stade Hamilton 11) les œufs ont été transférés dans des coupelles de pesées (89 x 89 x 25) mm stérilisées à l'alcool (Dominique Dutcher SAS, Brumath - France) dont le couvercle a été fait avec une coupelle inversée, maintenue avec un ruban adhésif transparent sur un bord, et placée dans un incubateur à 37,8°C et 84% d'humidité, sans circulation d'air mécanique. L’humidité est assurée par la présence sur le plancher chauffant de l'incubateur d'un récipient (170 x 260 x 25) mm rempli d'eau. De préférence, les œufs fraîchement ouverts ne sont pas du tout manipulés pendant 48h, dès leur mise en incubation dans l'incubateur.
Exemple 3: Obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé
Matériels et Methods
hiPSC-CM utilisés
Les hiPSC-CM utilisés ont été obtenus de deux sujets sains différents et d’un sujet malade souffrant de cardiomyopathie arythmogène. Chez le sujet atteint de cardiomyopathie arythmogène, une variation génétique sur le gène DSC2 a été identifiée.
Les cellules hiPSC-CM n’ayant pas subi une étape de congélation/décongélation (i.e. «fraîches») ont été soit appliquées directement sur la MCA soit congelées puis décongelées avant application sur la MCA, comme décrit ci-dessus.
Mise en culture de l’œuf fécondé sans coquille
Les œufs fécondés sont incubés dans des conditions standard de température (37,8°C) et d'humidité (65%) pendant 96 heures au maximum puis transférés hors de leur coquille dans des coupelles de pesée stériles en polystyrène (cultureex-ovo). Après 6 à 14 jours de développement, de préférence des œufs âgés de 8 à 10 jours d’incubation, à 37,8°C et 84% d'humidité, les greffes peuvent être réalisées. En effet, les œufs fécondés âgés d’au moins 6 jours développent une surface de MCA suffisamment grande pour accueillir une greffe des hiPSC-CM. Le dépôt de l’anneau de silicone peut être réalisé avant la microlésion de la MCA si la MCA est recouverte par un fluide plasmatique qui gêne l’adhésion de l’anneau à la MCA.
Implantation sur la MCA
Les œufs fécondés sont maintenus à l'extérieur de l'incubateur à température constante de 38°C grâce à des plaques chauffantes, ceci afin d'éviter la mort de l'embryon par hypothermie.
Si la MCA est recouverte par un fluide plasmatique qui gêne l’adhésion de l’anneau à la MCA le placement de l’anneau de silicone peut être réalisé avant la microlésion de la MCA.
Le feuillet ectodermique est retiré à l'aide d'un papier « buvard », assez souple pour épouser les irrégularités de la surface de la MCA, et suffisamment épais pour pouvoir absorber la micro-hémorragie qui va résulter du retrait du feuillet ectodermique (ou tout autre objet rigide de faible taille). Si l’anneau n’est pas déjà déposé, un anneau en silicone, de préférence ayant un diamètre interne de 5mm est posé sur la MCA.
Dans le cas présent 40 µl de suspension contenant 500 000 hiPSC-CM est posé sur la MCA à l’intérieur de l’anneau.
Une fois implanté, l'œuf est remis dans l'incubateur et l'œuf laissé sans être déplacé, ni même ouvert pendant 48h suivantes.
Après la greffe, l'œuf est replacé en incubation pendant 48 heures, sans manipulation, afin de favoriser la néo-vascularisation du greffon.
Les œufs de poule greffés avec des hiPSC-CM sur la MCA ont été maintenus en culture jusqu’au stade de développement J18 ou J19.
Observation du greffon obtenu
Dès 48h post greffe, les œufs sont observés tous les jours à la loupe binoculaire et/ou le modèle organoïde cardiaque vascularisé analysé par échographie, en maintenant l’œuf dans un environnement voisin de 37°C: support chauffant pour chauffer les coupelles et lampe Infra-Rouge pour chauffer l’air local ambiant. Le battement du modèle organoïde cardiaque vascularisé est notamment sensible à la température ambiante, y compris l’air. Il est également possible de faire des enregistrements vidéo ou des photos.
Échographie à ultrasons
Un appareil d’échographie à ultrasons (type compact touch UBM, Quentel medical, Cournon d’Auvergne, France) a également été utilisé. Il a été équipé d'un transducteur linéaire à ultrasons de 50 MHz et l'accessoire ClearScan a été rempli d'eau, permettant des interactions parfaites avec les greffons. Le dispositif d'écho-Doppler (Fujifilm Visualsonics, vevo 2100, Amsterdam, Pays-Bas) a été équipé d'un transducteur de 30 MHz ou de 42 MHz, et a été utilisé pour analyser le flux sanguin dans les vaisseaux des greffons.
Résultats
Des analyses par échographie Doppler ont montré une vascularisation fonctionnelle dans les modèles organoïdes cardiaques vascularisé obtenus ici, même non contractiles, qui présentait des vaisseaux intra-tissulaires. Lorsque le modèle organoïde cardiaque est contractile, la fréquence de contraction des hiPSC-CM du modèle est indépendante de la fréquence de pulsation du flux sanguin, contrairement à ce qui a été observé auparavant dans le cadre de la xénogreffe de cardiomyocytes. Cette fréquence indépendante démontre que le modèle créé dispose et exprime des caractéristiques fonctionnelles qui lui sont propres et spécifiques. Ainsi, cela démontre la pertinence du modèle créé dans l’évaluation de situations pathologiques, de l’efficacité et/ou toxicité de composés.
Les arythmies cardiaques observées dans le modèle organoïde cardiaque vascularisé obtenu à partir de hiPSC-CM de sujet atteint de cardiomyopathie arythmogène se caractérisent notamment par l’observation de temps de latence plus lent entre 2 contractions au milieu de contractions régulières et l’observation d’intensité de contraction plus forte que lors de contractions régulières (enregistrement vidéo), par rapport aux modèles organoïdes cardiaques vascularisés obtenus à partir de hiPSC-CM de sujet sain.
Exemple 4: Évaluation de la toxicité cardiaque ou de l’effet thérapeutique d’un promédicament (prodrogue)
Des injections intraveineuses des composés d’intérêt peuvent être réalisées par voie systémique dans l’œuf, à l’aide d’aiguille obtenue à partir de microcapillaires (Drumond microcaps, 1,2mm diamètre) en verre dont la pointe étirée (vertical micropipette puller, Sutter P-30) a été biseautée avec un affûteur d’aiguille en verre (Sutter, Beveler BV10). Les volumes injectés avec ces micropipettes sont de 30 µl. Selon la nécessité du protocole expérimental, des injections peuvent être réalisées tous les jours. Il est également possible, d’utiliser la voie topique, en déposant directement sur l’organoïde vascularisé, la (pro)drogue à tester.
Pour s’assurer que le modèle organoïde cardiaque vascularisé répondait bien à une stimulation adrénergique, une injection de 30 µl d’une solution d’épinéphrine à 100 µM dans du sérum physiologique a été réalisée. L’augmentation du rythme cardiaque a été mesurée à partir des vidéos d’enregistrement réalisées pendant l’expérience.
Conclusion
Le modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des hiPSC-CM greffés sur une MCA d’œuf fécondé selon la présente invention est un modèle hautement avantageux, d’une part au vu de l’aisance relative pour l’obtenir et d’autre part au vu de sa grande flexibilité, qui fait qu’il peut être utilisé dans un grand nombre d’applications.
Son aisance d’obtention est notamment dû au fait qu’il comprend des cellules d’origine humaine non embryonnaire sans toutefois recourir au prélèvement de tissu cardiaque humain en tant que tel. De façon avantageuse, les cellules hiPSC-CM s’auto-organisent spontanément en sphéroïde vascularisé capable de fonctionner en véritable syncytium et de développer des contractions autonomes à rythme constant de manière organisée reflétant une activité synchrone; le modèle se rapproche donc au cœur physiologique (voir aussi la Fig. 1). Par ailleurs, le fait que les cellules hiPSC-CM puissent être stockées puis directement appliquées sur la MCA après décongélation facilite également la mise en place du modèle sur demande.
La flexibilité du modèle est obtenue grâce au fait que les hiPSC-CM utilisées peuvent être sélectionnées selon les besoins (e.g. les cellules peuvent être obtenues à partir d’un sujet sain, un sujet atteint d’une pathologie cardiaque, un sujet atteint d’une pathologie génétique non-cardiaque, etc.), par exemple pour évaluer l'effet des différents composés, dont leur toxicité, sur des greffons correspondants. Cette flexibilité permet même d’intégrer ce modèle dans une approche de médecine personnalisée, les hiPSC-CM pouvant être générées à partir des cellules d’un individu, par exemple afin d’essayer d’anticiper sa réaction à un traitement donné ou de comprendre les mécanismes qui ont causé le développement de la pathologie. Enfin, le modèle organoïde cardiaque selon l’invention peut aussi être utilisé dans diverses autres applications, par exemple en tant que modèle d'ischémie-reperfusion et de revascularisation, de réparation ou de régénération du tissu cardiaque, voir pour la mise au point d'unpacemakerbiologique.
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Claims (11)

  1. Modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) greffés sur une membrane chorio-allantoïde (MCA) d’œuf d’oiseau fécondé.
  2. Modèle selon la revendication 1 dans lequel 60 % à 95 % de cellules sont positives à la troponine-T cardiaque et 5 % à 40 % de cellules sont négatives à la troponine-T cardiaque, comprenant de préférence au moins une cellule atriale-like, au moins une cellule ventriculaire-like, au moins une cellule nodale-like et au moins une cellule de type fibroblaste.
  3. Modèle selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel les hiPSC-CM sont dérivées des iPSCs d’un seul sujet.
  4. Modèle selon la revendication 3, dans lequel les hiPSC-CM sont dérivées des iPSCs d’un sujet atteint d’une pathologie cardiaque génétique, plus préférentiellement une pathologie cardiaque héréditaire, encore plus préférentiellement une arythmie cardiaque.
  5. Procédé d’obtention du modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes:
    - la culture en conditionsex - ovod’un œuf d’oiseau fécondé jusqu’à un stade de développement de l’œuf d’au moins 6 jours,
    - la réalisation d’une microlésion en surface de la membrane chorio-allantoïde (MCA) de l’œuf d’oiseau fécondé,
    - la mise en contact des hiPSC-CM, et de ladite MCA, au niveau de ladite microlésion, et
    - l’incubation de l’œuf d’oiseau fécondé ainsi traité pendant au moins 48h dans une enceinte thermostatée, à une température comprise entre 36°C et 39°C et un degré d’hygrométrie compris entre 80% et 90%.
  6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits hiPSC-CM sont congelés suite à leur préparation puis décongelés avant l’étape de mise en contact.
  7. Utilisation du modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, susceptible d’être obtenu par le procédé selon la revendication 5 ou 6, pour caractériser la toxicité cardiaque d’un composé ou pour caractériser l’activité un composé vis-à-vis des hiPSC-CM, ledit composé étant de préférence un promédicament (prodrogue) ou un médicament.
  8. Procédéin vitrode caractérisation de l’activité d’un composé vis-à-vis d’un modèle organoïde cardiaque vascularisé, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:
    a) l’obtention d’un modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des hiPSC-CM selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, obtenu notamment par le procédé selon la revendication 5 ou 6,
    b) l’injection du composé dans ledit œuf d’oiseau fécondé greffé, de préférence par une injection intraveineuse,
    c) l’observation des hiPSC-CM,
    d) la comparaison des résultats de l’observation de l’étape c) avec les résultats de l’observation des hiPSC-CM d’un modèle organoïde cardiaque vascularisé et n’ayant pas reçu ledit composé, et
    e) la caractérisation de l’activité dudit composé.
  9. Procédéin vitrode caractérisation d’une situation pathologique dans un modèle organoïde cardiaque vascularisé, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:
    a) l’obtention d’un premier modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des hiPSC-CM issus d’au moins un sujet atteint d’une pathologie selon la revendication 4, obtenu notamment par le procédé selon la revendication 5 ou 6,
    b) l’observation des hiPSC-CM,
    c) la comparaison des résultats de l’observation de l’étape b) avec les résultats de l’observation des hiPSC-CM d’un œuf d’oiseau fécondé greffé selon un deuxième modèle organoïde cardiaque vascularisé comprenant des hiPSC-CM issus d’au moins un sujet sain selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, obtenu notamment par le procédé selon la revendication 5 ou 6, et
    d) la caractérisation de ladite situation pathologique.
  10. Procédéin - vitroselon la revendication 8 ou 9, dans lequel la méthode d’observation desdits hiPSC-CM du modèle organoïde cardiaque vascularisé est choisie dans le groupe constitué par: une méthode intra-vitale, de préférence écho Doppler et/ou microscopie, des méthodes d'imagerie avec utilisation de sondes fluorescentes ou autre procédé permettant de mesurer la contraction et le rythme cardiaque, et une méthode analytique invasive, de préférence une analyse histologique et/ou une analyse biochimique.
  11. Kit comprenant le modèle organoïde cardiaque vascularisé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4.
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