CN118265792A - 基因修饰多能干细胞、来自其的免疫活性细胞、它们的制造方法和它们的用途 - Google Patents

基因修饰多能干细胞、来自其的免疫活性细胞、它们的制造方法和它们的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供多能干细胞、或者来自该多能干细胞的NK细胞或其前体细胞，所述多能干细胞表达以下的(a)和(b)：(a)编码CC趋化因子受体2型B(CCR2B)的外源基因；(b)编码CC趋化因子配体19(CCL19)的外源基因。

Description

基因修饰多能干细胞、来自其的免疫活性细胞、它们的制造方 法和它们的用途
技术领域
本发明涉及经基因修饰的多能干细胞、来自该多能干细胞的免疫活性细胞、它们的制造方法和它们的用途等。更详细而言，本发明涉及为了细胞免疫疗法而强化了功能的基因修饰多能干细胞、来自该多能干细胞的自然杀伤(NK)细胞或其前体细胞、包括向多能干细胞导入用于功能强化的外源基因的它们的制造方法、以及它们作为细胞药物的用途等。
背景技术
作为参与癌免疫的细胞，可举出T细胞等淋巴细胞、NK细胞、自然杀伤T(NKT)细胞等，使用这些免疫细胞的细胞疗法的研究开发具有半世纪以上的历史。近年来，通过iPS细胞和分化诱导法的开发、iPS细胞的基因修饰法等的技术发展，对iPS细胞进行基因修饰，分化诱导为目标免疫细胞，由此可以制造赋予了高功能的免疫细胞。籍此，可以构建使用免疫细胞的各种治疗策略。
作为与这种基因修饰免疫细胞相关的细胞药品，目前批准有以CD19为靶标的基于CAR-T细胞的药品(Kymriah和Yescarta)。另一方面，NK细胞对癌细胞无需预致敏，且能够不受抗原识别约束地应答。NK细胞在直接识别并杀伤靶细胞的同时，通过产生各种细胞因子使T细胞、巨噬细胞等活化，具有提高免疫功能的作用。另外，NK细胞与T细胞不同，即使使用HLA类型不完全匹配的供体细胞也不易产生GvHD等的问题，进而还难以引起作为T细胞所致副作用的细胞因子释放综合征(CRS)。因此，从最近的T细胞疗法的临床良好结果来看，对于使用同样是抗肿瘤效应细胞的NK细胞的免疫细胞疗法的期待也在提高。
实际上，存在以使用修饰NK细胞的细胞药品为对象的各种临床试验(非专利文献1)。例如Fate Therapeutics公司以实体癌为对象开发了敲除(KO)CD38且表达IL-15·IL-15受体融合蛋白和CD16的来自iPS细胞的修饰NK细胞(例如，专利文献1)。武田药品工业株式会社与德克萨斯大学MD安德森癌症中心共同开发了表达IL-15的CD19-CARNK细胞(例如，非专利文献2)。但是，被当局批准的药品尚不存在。
作为NK细胞中使用的功能强化因子，已知有在上述Fate Therapeutics公司、武田药品工业株式会社的开发品中导入的IL-15、CD16等。已知IL-15在使NK细胞自身增殖·活化的同时，还具有使周围的T细胞活化的功能(非专利文献3－5)。另外，已知CD16通过在NK细胞表面表达而有助于NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)作用(非专利文献6)。因此，使在NK细胞中的功能已广为人知的这些因子在NK细胞中表达并进一步强化其功能的尝试已经在以上述Fate Therapeutics公司、武田药品工业株式会社的开发品为代表的各种修饰NK细胞中被采用。
另一方面，也尝试了通过使各种趋化因子·趋化因子受体在免疫细胞中表达来提高其迁移能力，从而提高对癌细胞的攻击能力。例如专利文献2中公开了使用了表达CCR2等各种趋化因子·趋化因子受体的T细胞的癌症免疫疗法。另外，专利文献3中公开了通过使CCL19与各种白介素一起表达，从而使T细胞的抗肿瘤活性得到增强，增殖性提高。进一步，专利文献4中公开了表达免疫活性因子的CAR免疫细胞，作为CAR免疫细胞还记载了NK细胞也成为对象。另外，作为免疫活性因子，还列举了IL-15和CCR2B。
但是，这些公开至多涉及在T细胞等免疫细胞中表达该因子而强化它们的功能的方法，并不是利用基因修饰iPS细胞的方法。另外，任一文献中均未暗示或记载将CCR2B和CCL19组合并导入NK细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2019/126748
专利文献2：WO 2018/152572
专利文献3：WO 2020/045610
专利文献4：WO 2017/133633
非专利文献
非专利文献1：Nat Rev Drug Discov.2020Mar；19(3):200-218
非专利文献2：N Engl J Med.2020Feb 6；382(6):545-553
非专利文献3：J Exp Med.1994Oct 1；180(4):1395-1403
非专利文献4：Cancer Immunnol Immunother.2012Sep；61(9):1451-1461
非专利文献5：Nat Rev Immunnol.2003Apr；3(4):269-279
非专利文献6：Front Immunnol.2015Jul 27；6:368
发明内容
发明要解决的课题
需要作为进一步的治疗上的选项的基因修饰免疫细胞。因此，本发明的目的在于提供具有高功能的基因修饰免疫活性细胞、特别是来自iPS细胞等多能干细胞的基因修饰NK细胞。
用于解决课题的手段
本发明人等为了达成上述目的而想到使趋化因子·趋化因子受体在NK细胞中高表达。因此，在数目众多的趋化因子·趋化因子受体之中，分别选择CCR2B作为趋化因子受体、CCL19作为趋化因子，通过基因修饰将它们外源性地导入iPS细胞。将该iPS细胞分化诱导为NK细胞并对其功能进行验证时，发现该修饰NK细胞发挥设想以上的高功能。已知在免疫细胞中，包含趋化因子的细胞因子对于癌免疫有时具有两面性，例如，CCL2可以促进免疫抑制细胞的动员，抑制T细胞的功能(例如，CancerLett2007 Jul 8；252(1):86-92.)。即，即使组合多种趋化因子·趋化因子受体，是否能够得到所期待的奖励效果也是完全的未知数，本发明等所发现的该见解是出人意料的。
本发明人等基于该见解进一步反复研究，结果完成了本发明。
即，本发明如下所述。
项目[1]
多能干细胞、或者来自该多能干细胞的NK细胞或其前体细胞，所述多能干细胞表达以下的(a)和(b)：
(a)编码CC趋化因子受体2型B(CCR2B)的外源基因；
(b)编码CC趋化因子配体19(CCL19)的外源基因。
项目[2]
根据项目[1]所述的细胞，其进一步表达以下的(c)和/或(d)：
(c)编码白介素15(IL-15)的外源基因；
(d)编码CD16的外源基因。
项目[3]
根据项目[1]或[2]所述的细胞，其进一步表达以下的(e)：
(e)编码NKG2D或NKG2D-CAR的外源基因。
项目[4]
根据项目[3]所述的细胞，其中，(e)为编码NKG2D-CAR的外源基因。
项目[5]
根据项目[3]所述的细胞，其中，(e)为编码NKG2D的外源基因，且其进一步共表达(f)编码DAP10的外源基因。
项目[6]
根据项目[2]～[5]中任一项所述的细胞，其表达编码IL-15的外源基因，该IL-15为分泌型IL-15。
项目[7]
根据项目[2]～[5]中任一项所述的细胞，其表达编码IL-15的外源基因，且共表达编码IL-15受体α(IL-15Rα)的外源基因。
项目[8]
根据项目[2]～[7]中任一项所述的细胞，其表达编码CD16的外源基因，该CD16为具有高亲和性突变或非截断突变的CD16。
项目[9]
根据项目[8]所述的细胞，其中，CD16具有选自F176V(F158V)和S197P的突变。
项目[10]
药物，其包含项目[1]～[9]中任一项所述的细胞。
项目[11]
根据项目[10]所述的药物，其为癌症的治疗药。
项目[12]
制造癌组织归巢功能和免疫活性细胞动员功能被强化的基因修饰细胞的方法，其包括向多能干细胞导入以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
项目[13]
根据项目[12]所述的方法，其进一步包括将导入有所述外源基因的多能干细胞分化诱导为NK细胞或其前体细胞。
项目[14]
用于制造基因修饰细胞的构建体，其包含以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
项目[15]
根据项目[14]所述的构建体，其中，外源基因包含于单独的构建体中。
项目[16]
表达盒，其包含基因表达控制区域和在该控制区域的控制下的项目[14]或[15]所述的构建体。
项目[17]
载体，其包含项目[16]所述的表达盒。
项目[18]
根据项目[17]所述的载体，其具备表达盒被夹在一对转座子反向重复序列之间的结构。
项目[19]
基因修饰细胞的制作试剂盒，其包含项目[18]所述的载体和转座酶表达载体，且表达以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
项目[20]
根据项目[19]所述的试剂盒，其中，转座酶为PiggyBac转座酶。
项目[21]
癌症的治疗方法，其包括向癌症患者给药项目[1]～[9]中任一项所述的细胞。
项目[22]
项目[1]～[9]中任一项所述的细胞在用于治疗癌症的方法中的用途。
项目[23]
项目[1]～[9]中任一项所述的细胞在制造用于癌症治疗的药物中的用途。
发明效果
本发明的修饰NK细胞或其前体细胞来自导入了用于强化特别是以癌免疫为目的的功能的基因的多能干细胞，通过表达CCR2B和CCL19而具有比以往的细胞更优异的癌组织归巢功能、动员T细胞等免疫活性细胞的功能，具有高抗肿瘤活性。另外，通过使CD16高表达，抗体依赖性细胞毒活性增强、或者通过表达IL-15、进而表达IL-15受体α，持续性、增殖性等也提高。另外，通过使NKG2D(-CAR)和DAP10高表达，带来NKG2D配体刺激的活化信号的增强。
所以，通过使用本发明的修饰NK细胞或其前体细胞，可以提高免疫疗法的治疗效果。进一步，本发明的修饰NK细胞或其前体细胞不仅可能参与NK细胞其自身的活化，而且还可能参与周围的T细胞等免疫细胞的活化，因此可能对现存治疗法中效果有限的疾病的治疗有用。
另外，本发明的修饰NK细胞或其前体细胞通过分化诱导基因修饰多能干细胞而得到，因此与对NK细胞进行基因修饰而得的细胞相比，可以更容易地制造大量的修饰NK细胞或其前体细胞。
根据本发明的规定的因子的组合，对于全部免疫细胞，不仅是如上所述的NK细胞，而且在T细胞、单核细胞/巨噬细胞、树状细胞等中导入基因并表达的情况下，也可以得到抗肿瘤活性高的各种修饰免疫细胞。
附图说明
图1：是示出CCR2B表达iNK细胞具有相对于CCL2的高迁移活性的图。
图2：是示出CCL19表达iNK细胞相对于PBMC具有迁移活性的亢进能力的图。
图3：是示出CD16表达iNK细胞在抗EGFR抗体(Cetuximab)存在下具有增强的细胞毒活性的图。
图4：是示出IL-15表达iNK细胞即使在IL-15非存在下培养，细胞数也不会减少的图。
图5：是示出NKG2D表达iNK细胞通过与A549细胞的共培养刺激而增强IFN-γ分泌活性的图。
图6：是示出CCR2B/CCL19共表达iNK细胞相对于CCL2具有高迁移能力的图。
图7：是示出CCR2B/CCL19共表达iNK细胞对于DC具有高诱引活性的图。
图8：是示出IL2sp/IL-15表达通过提高iNK细胞的增殖·生存、以及共表达全长或者可溶性IL-15Rα来进一步增强其效果的图。
具体实施方式
(I)本发明的基因修饰多能干细胞
本发明提供适于分化诱导为强化了作为免疫活性细胞的功能的基因修饰NK细胞或其前体细胞的基因修饰多能干细胞(以下，也称为“本发明的修饰多能干细胞”)。该多能干细胞是表达以下的(a)和(b)的多能干细胞：
(a)编码CC趋化因子受体2型B(CCR2B)的外源基因；
(b)编码CC趋化因子配体19(CCL19)的外源基因。
癌细胞等靶细胞表达CC趋化因子配体2(CCL2)，因此通过将作为其受体的CCR2B导入多能干细胞并使之表达，可以使由该多能干细胞分化诱导的NK细胞归巢于癌组织等靶标组织。
另一方面，CCL19是CC趋化因子受体7(CCR7)的配体，CCR7在T细胞、树状细胞中表达，因此通过将CCL19导入多能干细胞并使之表达，由该多能干细胞分化诱导的NK细胞可以刺激该细胞周围的T细胞、树状细胞等免疫活性细胞的迁移，提高NK细胞的效果。
本说明书中使用的“多能干细胞”是指具有分化多能性(pluripotency)的细胞，例示有ES细胞、iPS细胞等，优选为iPS细胞。需要说明的是，本说明书中将由iPS细胞分化诱导的NK细胞称为“iNK细胞”。
ES细胞可以通过自身公知的方法制作。作为ES细胞的制作方法，可举出例如：对人胚泡阶段的内部细胞块进行培养的方法(参照例如，Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994))、对通过体细胞核移植而制作的早期胚胎进行培养的方法(Wilmut等，Nature,385,810(1997)；Cibelli et al.,Science,280,1256(1998)；入谷明等,蛋白核酸酶,44,892(1999)；Baguisi等，Nature Biotechnology,17,456(1999)；Wakayama等，Nature,394,369(1998)；Wakayama等，Nature Genetics,22,127(1999)；Wakayama等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999)；RideoutIII等，Nature Genetics,24,109(2000))等，但并不限定于此。另外，ES细胞可以由规定的机构获得，进而还可以购入市售品。例如，人ES细胞株分别可以从美国的WiCell Research Institute获得H1、H7、H9、H13和H14，从澳大利亚的ES Cell International获得HES1～6，从瑞典的Cellartis AB获得SA002、SA181和SA611，从美国的HUES CellFacility获得HUES1～17，从京都大学再生医学研究所获得KhES-1～KhES-5，从国立成育医疗研究中心获得SEES1～SEES7。通过体细胞核移植制作ES细胞时，体细胞的种类、采集体细胞的来源以下述iPS细胞制作的情况为基准。
iPS细胞是可以通过将特定的初始化因子以核酸(DNA或RNA)或蛋白的形态导入体细胞而制造的、具有与ES细胞大致相同的特性例如分化多能性和基于自我复制的增殖能力的体细胞来源的人工干细胞(Takahashi,K.和S.Yamanaka(2006)Cell,126:663-676；Takahashi,K.等，(2007)Cell,131:861-872；Yu,J.等，(2007)Science,318:1917-1920；Nakagawa,M.等，(2008)Nat.Biotechnol.26:101-106；WO2007/069666)。
本说明书中使用的作为“体细胞”的术语是指除了卵子、卵母细胞、ES细胞等生殖系列细胞和分化全能性细胞之外的任何人细胞。体细胞非限定性地包含胎儿体细胞、新生儿体细胞和成熟健康或疾病性体细胞中的任一者，另外还包含初代培养细胞、传代细胞和成株细胞的任一者。具体地，体细胞可例示例如：(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体干细胞)、(2)组织前体细胞、(3)淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞等分化的细胞等。
初始化因子可以由ES细胞中特异性表达的基因、其基因产物或无编码(non-coding)RNA、或对维持ES细胞的未分化起重要作用的基因、其基因产物或无编码RNA、或者低分子化合物构成。作为初始化因子所包含的基因，例示有例如：Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等。这些初始化因子可以单独使用，也可以组合使用。作为初始化因子的组合，例示有：WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu,D.等，(2008)Nat.Biotechnol.,26:795-797、Shi,Y.等，(2008)Cell Stem cell,2:525-528、Eminli,S.等，(2008)Stem Cells,26:2467-2474、Huangfu,D.等，(2008)Nat.Biotechnol.,26:1269-1275、Shi,Y.等，(2008)Cell Stem Cell,3:568-574、Zhao,Y.等，(2008)Cell Stem Cell,3:475-479、Marson,A.(2008)Cell Stem Cell,3:132-135、Feng,B.等，(2009)Nat.CellBiol.,11:197-203、Judson,R.L.等，(2009)Nat.Biotechnol.,27:459-461、Lyssiotis,C.A.等，(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,106:8912-8917、Kim,J.B.等，(2009)Nature,461:649-643、Ichida,J.K.等，(2009)Cell Stem Cell,5:491-503、Heng,J.C.等，(2010)Cell Stem Cell,6:167-74、Han,J.等，(2010)Nature,463:1096-100、Mali,P.等，(2010)Stem Cells,28:713-720和Maekawa,M.等，(2011)Nature,474:225-9中记载的组合。
iPS细胞克隆的选择可以通过以耐药性和报告活性为指标的方法(Cell,126,663-676(2006)、Nature,448,313-317(2007))、利用基于目视的形态观察的方法(Cell,131,861-872(2007))来进行。iPS细胞的确认可以以各种ES细胞特异性基因的表达、瘤形成为指标来进行。
另外，作为iPS细胞，规定的机构例如美国国立卫生研究所(NIH)、理化学研究所(理研)、京都大学等建立的各种人iPS细胞株的任一者均可利用。可举出例如，理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学的253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A31株、FfI-01s04株等。
本说明书中，导入外源基因意指通过将外源基因导入基因组的靶标位点而使外源基因在对象细胞中成为可表达的状态。作为导入外源基因的具体手段，可优选使用通过同源重组将具有以下述方式构建的DNA序列的DNA链(以下，简称为基因导入用靶向载体)整合至对象细胞的靶标位点的方法等，所述DNA序列是将外源基因的DNA按照常法分离，并通过例如将外源基因的DNA片段插入对象细胞的靶标位点而使得结果是外源基因在对象细胞内表达的方式构建的。基因插入位置是通过同源重组方法固定的，因此预期在没有随机整合的情况下，克隆间的表达量的差异以及对其他基因的影响是小的。
该同源重组细胞例如可以通过将上述靶向载体导入至对象细胞来获得。
例如，当基因导入用靶向载体是通过将外源基因的DNA片段(可以基于人CCR2B基因的cDNA(参照例如，Refseq NM_001123396)和人CCL19基因的cDNA(参照例如，Refseq NM_006274)的序列信息，通过常法克隆)插入靶标位点而设计为使该外源基因在对象细胞内表达的情形中，该载体可以采取例如如下所述的构成。
首先，为了通过同源重组将外源基因的DNA片段插入靶标位点，基因导入用靶向载体需要在该外源基因的DNA片段的5’上游和3’下游分别包含与靶标位点同源的序列(5’臂和3’臂)。
为了选择基因导入用靶向载体整合至染色体上的对象细胞，除了插入的外源基因之外，优选在基因导入用靶向载体中包含耐药性基因、报告基因。这里，作为耐药性基因，可举出例如新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因、潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因等；作为报告基因，可举出例如β－半乳糖苷酶(lacZ)基因、氯霉素乙酰转移酶(cat)基因等，但并不限定于此。
耐药性或报告基因优选在能够于对象细胞内发挥功能的任意基因表达控制区域的控制下。这里，作为基因表达控制区域，可举出例如，SV40来源的初始启动子、巨细胞病毒(CMV)长末端重复序列(LTR)、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、鼠白血病病毒(MoMuLV)LTR、腺病毒(AdV)来源的初始启动子等病毒启动子、以及β-肌动蛋白基因启动子、PGK基因启动子、转铁蛋白基因启动子等，但并不限定于此。
另外，基因导入用靶向载体优选在耐药性或报告基因的下游具有polyA信号，例如，可以使用来自病毒基因、或者来自各种哺乳动物或鸟类的基因的终止子序列。优选可使用SV40来源的终止子序列等。
通常，细胞中的基因重组大部分是非同源的，导入的DNA随机地插入染色体的任意位置。所以，通过检测耐药性、报告基因的表达等的选择(阳性选择)，无法有效地仅选择在靶标位点产生同源重组的克隆，对于所选择的所有克隆，需要通过Southern杂交法或PCR法确认重组部位。因此，如果在与基因缺失用靶向载体的靶标位点同源的序列的外侧预先连接例如赋予更昔洛韦敏感性的来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-tk)基因，则该载体随机插入的细胞具有HSV-tk基因，因此无法在含有更昔洛韦的培养基中生长，但通过同源重组靶向至内源性基因座的细胞由于不具有HSV-tk基因而成为更昔洛韦抗性，从而被选择(阴性选择)。或者，若代替HSV-tk基因而连接例如白喉毒素基因，则由于该载体随机插入的细胞被自身产生的该毒素所杀死(阳性选择)，也可以在药剂非存在下选择同源重组体。
向对象细胞导入基因缺失用靶向载体时，可以使用磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Electroporation)法、脂转染法、逆转录病毒感染法、凝集法、显微注射(Microinjection)法、基因枪(粒子枪)法、DEAE-葡聚糖法等中的任一者，如上所述，细胞中的基因重组大部分是非同源的，得到同源重组体的频率低，因此从能够简便地处理大量细胞等的观点出发，通常选择电穿孔法。电穿孔可以直接使用通常向动物细胞导入基因时使用的条件，例如可以通过将处于对数增殖期的对象细胞用胰蛋白酶处理使其分散为单一细胞后，以成为106～108细胞/ml的方式悬浮于培养基，转移至比色杯中，添加基因缺失用靶向载体10～100μg，施加200～600V/cm的电脉冲来进行。
对于整合有基因缺失用靶向载体的对象细胞，也可以通过Southern杂交或PCR法筛选从培养单一细胞而得的克隆分离提取的染色体DNA来鉴定，在使用耐药性基因、报告基因作为其它DNA片段时，可以以它们的表达为指标在细胞阶段选择转化体。例如，在使用包含nptII基因作为阳性选择用标记基因的载体的情况中，将基因导入处理后的对象细胞在含有G418等新霉素系抗生素的培养基中培养，选择出现的抗性克隆作为转化体的候选。另外，在使用包含HSV-tk基因作为阴性选择用标记基因的载体的情况中，在含有更昔洛韦的培养基中培养，选择出现的抗性克隆作为同源重组细胞的后补。将所得克隆分别转移至培养板上，重复进行胰蛋白酶处理、培养基更换后，将一部分作为培养用而保留，将剩余的进行PCR或Southern杂交，确认导入DNA的存在。
另外，在使用病毒作为基因导入用靶向载体的情况中，可举出用包含下述DNA的病毒感染对象细胞的方法，所述DNA包含外源基因和阳性选择用标记基因插入5’和3’臂之间，且在该臂的外侧包含阴性选择用标记基因。病毒、细胞的感染方法、整合有载体的细胞的选择方法等可以与基因缺失用靶向载体中使用的病毒、方法相同。
基因导入用靶向载体的靶标位点只要能够使外源基因在对象细胞成为可表达的状态则没有特别限制，作为这样的位点，可举出基因组内的安全区。这里，安全区是指即使整合了外源基因也不发生表型变化的部位，并且是在大量分化细胞中其基因座打开、导入因子的表达比较稳定、被选作用于在作为药品使用的细胞中整合外源基因的靶标位点的那些。作为这样的安全区，可举出AAVS1(腺相关病毒整合位点1)区域、CCR5(C-C趋化因子受体5)区域、ROSA26区域等。在安全区以外的位点导入了外源基因时，则由于导入的位点的基因被破坏，从而存在导出不期望的表型，或者导入的外源基因的表达被抑制这样的情况，从而需要根据将该细胞分化为何种细胞而用作药品来慎重选择该区域。在安全区导入了外源基因时，由于外源基因的整合位置固定，因此期待所获得的同源重组体间的外源基因的表达量的差异和对其它基因的影响小。
作为用于导入外源基因的另外的一个实施方式，可举出PiggyBac法。在PiggyBac法中，使用整合有包含外源基因的DNA片段的转座子载体和表达转座酶的转座酶表达载体。转座子载体和转座酶表达载体中所含的基因等可以分别存在于上述不同的载体中，也可以包含在单一的载体中。转座子载体和转座酶表达载体例如可以采用如下的构成。
为了通过转座酶将包含外源基因的DNA片段从转座子载体中切出，转座子载体在包含该外源基因的DNA片段的5’上游和3’下游包含反向末端重复序列(Inverted TerminalRepeat)。转座酶识别包含于转座子载体中的末端反向重复序列，将包含夹在末端反向重复序列之间的外源基因的DNA片段从转座子载体中切出。
为了选择外源基因整合至靶标位点的对象细胞，优选在包含外源基因的DNA片段中，在转座子载体中包含耐药性基因、报告基因。这里，作为耐药性基因和报告基因，可以与基因导入用靶向载体中使用的相同。
耐药性和报告基因优选在能够于对象细胞内发挥功能的任意的因表达控制区域的控制下。这里，作为基因表达控制区域，可以与基因导入用靶向载体中使用的相同。
另外，转座子载体优选在耐药性或报告基因的下游具有polyA信号，可以与基因导入用靶向载体中使用的相同。
另外，除了编码转座酶的基因之外，转座酶表达载体还可以包含耐药性基因、报告基因、基因表达控制区域、polyA信号等。耐药性基因、报告基因、基因表达控制区域、polyA信号可以与转座子载体中所含的相同。
为了将转座子载体和转座酶表达载体导入对象细胞，可以使用与基因导入用靶向载体中使用的方法相同的方法。
外源基因整合至靶标位点的细胞，可以通过与筛选整合有基因导入用靶向载体的同源重组细胞的方法相同的方法来筛选。
通过整合了如上所述导入的外源基因的DNA片段的转座子载体和转座酶表达载体，可以将该外源基因的DNA片段整合至对象细胞的基因组的转座酶靶标序列TTAA上。在该方法中，与上述使用基因导入用靶向载体的同源重组法不同，由于靶标序列为TTAA，因此无法限定整合外源基因的位点，但也可以通过在事后使转座酶表达，从而在不留痕迹的情形下除去整合到基因组中的外源基因。
本发明的修饰多能干细胞还可以进一步表达以下的(c)和/或(d)：
(c)编码白介素15(IL-15)的外源基因；
(d)编码CD16的外源基因。
IL-15由单核细胞、巨噬细胞、树状细胞等产生，引起CTL、NK细胞等显示杀肿瘤作用的细胞的增殖·活化。所以，通过将IL-15基因导入多能干细胞并使之表达，由该多能干细胞分化诱导的NK细胞自身被活性化，同时周围的T细胞也可以被活化，可以进一步增强NK细胞的免疫功能。
作为导入的外源性IL-15基因，并无特别限制，可举出例如WO2020/045610中记载的各种形态的外源性IL-15基因，优选编码分泌型的IL-15的那些。作为分泌型的IL-15，可以是含有天然信号肽的天然分泌型IL-15，也可以优选使用例如被IL-2信号肽等异源信号肽替代的修饰IL-15。
本发明的修饰多能干细胞的另外优选的一个实施方式中，编码IL-15基因以及IL-15受体α(以下，有时记为“IL-15Rα”)的外源基因被导入并共表达。该基因可以编码全长(膜结合型)IL-15Rα，也可以编码可溶性(分泌型)IL-15Rα。这里，IL-15Rα基因可以作为与IL-15基因分开的表达构建体而被导入多能干细胞中，也可以作为被构建为与IL-15的融合蛋白而表达的表达构建体被导入。作为这样的IL-15的实例，可以参照例如WO2020/045610的记载。
CD16是对凝集的IgG的Fc部分的亲和性低的受体，可以与靶细胞特异性抗体的Fc部分结合，诱导抗体依赖性细胞毒活性。所以，通过将CD16基因导入多能干细胞并使之表达，由该多能干细胞分化诱导的NK细胞的抗体依赖性细胞毒活性增强，可以发挥更强效的杀肿瘤活性。
CD16中存在NK细胞的大部分、单核细胞的一部分等中表达的跨膜型的CD16a与嗜中性粒细胞中表达的GPI锚型的CD16b的2种同工型。本发明中可用作外源基因的CD16只要能够诱导抗体依赖性毒活性则可以是编码任何同工型的那些，优选为CD16a。另外，CD16基因可以是野生型基因，在优选的一个实施方式中，可以是对IgG的Fc部分的亲和性提高的高亲和性突变体，或者也可以是对ADAM17分解具有抗性的非截断突变体。例如，作为高亲和性突变体，可举出第176位的苯丙氨酸被缬氨酸替换的F176V(成熟型的第158位的苯丙氨酸被缬氨酸替换的F158V)等，作为非截断突变体，可举出第197位的丝氨酸被脯氨酸替换的S197P等。
本发明的修饰多能干细胞还可以进一步表达以下的(e)：
(e)编码NKG2D或NKG2D-CAR的外源基因。
NKG2D是NK细胞中表达的活化受体，通过靶细胞的NKG2D配体的刺激传递活化信号，增强NK细胞的细胞毒活性，另外还增强NK细胞中的IFN-γ、TNFα等细胞因子产生。所以，通过将NKG2D基因导入多能干细胞并使之表达，可以进一步增强由该多能干细胞分化诱导的NK细胞作为免疫活性细胞的功能。
作为导入的NKG2D基因，可以使用NK细胞内源性的NKG2D基因、功能被强化的修饰型基因。通过除了NKG2D基因之外，还共表达编码共轭因子DAP10的外源基因，可以进一步增大NKG2D的效果。或者，也可以作为编码在NKG2D的细胞内结构域连接了DAP10的融合蛋白的基因而导入。
或者，另外还可以导入编码NKG2D-CAR的基因，所述NKG2D-CAR融合有NKG2D的细胞外结构域以及嵌合抗原受体(CAR)的跨膜结构域、共刺激结构域、信号传导结构域。作为这里使用的CAR，可以同样地使用以往的CAR-T细胞中使用的跨膜结构域、共刺激结构域、信号传导结构域的组合，优选跨膜结构域为CD8a、共刺激结构域为2B4、信号传导结构域为CD3z。
上述编码IL-15(和IL-15Rα)、CD16、NKG2D的外源基因可以与编码CCR2B、CCL19的外源基因同样地构建表达构建体，使用相同的方法导入多能干细胞中。
(II)本发明的修饰NK细胞
如此得到的修饰多能干细胞可以通过自身公知的方法，例如，Matsubara等，Biochem Biophys Res Commun.2019Jul 12；515(1):1-8.中记载的方法等分化诱导为NK细胞。所以，本发明还提供由本发明的修饰多能干细胞分化诱导的NK细胞或其前体细胞(以下，前体细胞也统称为“本发明的修饰NK细胞”)。
本发明的修饰NK细胞至少高表达外源性的CCR2B和CCL19，因此能够高效地归巢至表达CCL2的靶标组织(例如癌组织)，并杀伤该靶细胞，另外，能够使周围表达CCR7的T细胞、树状细胞迁移，从而发挥协同抗肿瘤活性。另外，在一个实施方式中，由于进一步表达选自IL-15(和IL-15Rα)、CD16、NKG2D(包含NKG2D/DAP10复合体、NKG2D-CAR)的1种以上的外源基因，因此可以实现由这些功能增强因子带来的进一步的功能强化。所以，本发明的修饰NK细胞可以用作例如通过杀伤表达CCL2的细胞而能够实现治疗效果的任意疾病的药物。
以本发明的修饰NK细胞为活性成分的药物可以在将该NK细胞向对象给药前使用适当的培养基进行培养。另外，还可以在培养基中添加刺激分子而将NK细胞的活化和/或增殖维持增幅。进一步，还可以在培养基中添加血清、血浆。它们在培养基中的添加量没有特别限定，可例示0体积％～20体积％，另外还可以对应于培养阶段而改变使用的血清、血浆的量。例如，可以阶段性地减少血清或血浆浓度来使用。作为血清或血浆的来源，可以是自身或非自身中的任一者，从安全性的观点出发，优选自身来源。
以本发明的修饰NK细胞为活性成分的药物优选非口服地向对象给药使用。作为非口服的给药方法，可举出静脈内、动脉内、肌肉内、腹腔内和皮下给药等方法。给药量根据对象的状态、体重、年龄等而适宜选择，通常以细胞数计，相对于体重60kg的对象，每1次以达到1×106～1×1010个的方式，优选以达到1×107～1×109个的方式，更优选以达到5×107～5×108个方式进行给药。另外，可以1次给药，也可以分数次给药。该药物可以制为适于非口服给药的公知的形态，例如注射或注入剂。该药物可以适宜包含药理学上可接受的赋形剂。该药物为了稳定维持细胞而可以包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为培养基，可举出RPMI、AIM-V、X-VIVO10等培养基，但并不限定于此。另外，该药物中为了稳定化也可以添加医药上可接受的载体(例如人血清白蛋白)、保存剂等。
以本发明的修饰NK细胞为活性成分的药物可以是癌症的治疗药。作为该药物的适用对象的癌症没有特别限制，可举出例如，急性淋巴细胞癌；胞巢横纹肌肉瘤；膀胱癌；骨癌；脑癌(例如，髓母细胞瘤)；乳腺癌；肛门、肛管或肛门直肠的癌；眼癌；肝内胆管癌；关节癌；颈部、胆囊或胸膜的癌；鼻、鼻腔或中耳的癌；口腔癌；外阴癌；慢性骨髓癌；结肠癌；食道癌；子宫颈癌；纤维肉瘤；胃肠道类癌；头颈癌(例如，头颈部扁平上皮癌)；下咽癌；肾癌；喉癌；白血病(例如，急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病)；液体肿瘤；肝癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌)；淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)；恶性间皮瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；多发性骨髓瘤；上咽癌；卵巢癌；胰腺癌；腹膜、网膜和肠系膜的癌；咽癌；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；小肠癌；软组织癌；实体肿瘤；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；尿道癌等，但并不限定于此。
(III)CAR-NK细胞
另外，通过向本发明的修饰NK细胞中导入抗原特异性的CAR(CAR-NK细胞)，可以制为对表达该抗原的细胞特异性的细胞免疫疗法剂。
由本发明的修饰NK细胞制作CAR-NK细胞时，可以适宜选择使用自身公知的方法。
CAR是包含于T细胞信号传导结构域连接的抗体的抗原结合结构域(例如，scFv)的人工构建的杂合蛋白。CAR的特征可举出利用单克隆抗体的抗原结合特性而以非MHC限制性方式将T细胞的特异性和反应性相对于所选靶标进行转换的能力。非MHC限制性抗原识别向表达CAR的NK细胞赋予与抗原加工无关地识别抗原的能力，籍此绕过肿瘤逃逸的主要机制。
本发明的修饰NK细胞中导入的CAR包含能够特异性地识别修饰NK细胞应识别的表面抗原(例如，癌抗原肽、癌细胞中表达亢进的表面受体等)的抗体的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。
作为抗原结合结构域特异性地识别的表面抗原，可举出例如，各种癌(例如，急性淋巴细胞癌；胞巢横纹肌肉瘤；膀胱癌；骨癌；脑癌(例如，髓母细胞瘤)；乳腺癌；肛门、肛管或肛门直肠的癌；眼癌；肝内胆管癌；关节癌；颈部、胆囊或胸膜的癌；鼻、鼻腔或中耳的癌；口腔癌；外阴癌；慢性骨髓癌；结肠癌；食道癌；子宫颈癌；纤维肉瘤；胃肠道类癌；头颈癌(例如，头颈部扁平上皮癌)；下咽癌；肾癌；喉癌；白血病(例如，急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨骨髓性白血病)；液体肿瘤；肝癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌)；淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)；恶性间皮瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；多发性骨髓瘤；上咽癌；卵巢癌；胰腺癌；腹膜、网膜和肠系膜的癌；咽癌；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；小肠癌；软组织癌；实体肿瘤；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；尿道癌等)中表达亢进的表面受体，例如，CD19、EGF受体、BCMA、CD30、Her2、ROR1、MUC16、CD20、间皮素、B细胞突变抗原、CD123、CD3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD33、MUC-1、CD138、CD22、GD2、PD-L1、CEA、硫酸软骨素蛋白多糖-4、IL-13受体α链、IgGκ轻链等、癌抗原肽(例如，来自WT1、GPC3、MART-1、gp100、NY-ESO-1、MAGE-A4等的肽)等，但并不限定于此。
作为本发明中使用的抗原结合结构域，只要是能够特异性识别靶标抗原的抗体片段就没有特别限制，但若考虑CAR制作的容易性，优选通过接头肽连接轻链可变区和重链可变区而成的单链抗体(scFv)。单链抗体中的轻链可变区和重链可变区的配置只要两者能够重构功能性抗原结合结构域则没有特别限定，通常从N末端侧起可以按照轻链可变区－接头肽－重链可变区的顺序设计。作为接头肽，可以使用单链抗体的制作中通常使用的自身公知的接头肽。编码轻链可变区的DNA、编码重链可变区的DNA例如可以分别从抗体产生细胞克隆轻链基因、重链基因，以它们为模板进行PCR等来制备，或者由现有抗体的序列信息化学合成。通过将所得的各DNA片段与编码接头肽的DNA用适当方法连接，可以获得编码单链抗体的DNA。为了使CAR呈递至修饰NK细胞的细胞表面，优选在抗原结合结构域的N末端侧进一步添加前导序列。
作为细胞外铰链结构域和跨膜结构域，可以适宜使用该技术领域通常使用的来自T细胞表面分子的结构域，可举出例如，来自CD8α、CD28的各结构域，但并不限定于此。
作为细胞内信号传导结构域，可举出例如：具有CD3ζ链的那些；在跨膜结构域和CD3ζ链之间进一步具有CD28、CD134、CD137、LCK、DAP10、ICOS、4-1BB等共刺激传导基序的那些；具有2种以上的共刺激传导基序的那些等，但并不限定于此，可以组合使用该技术领域通常使用的任意结构域。
编码细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的核酸序列信息是该技术领域公知的，只要是本领域技术人员就可以基于这些信息从T细胞容易地获得编码各结构域的DNA片段。
通过将分别编码如此得到的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的DNA片段用常法连接，可以获得编码CAR的DNA。
所得编码CAR的DNA，可以直接或者在添加适当的接头和/或核转位信号等后，插入含有在NK细胞内有功能的基因表达控制区域的表达载体中，优选插入质粒载体中。作为在NK细胞内有功能的基因表达控制区域，可以使用哺乳动物细胞中的构成性的SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等，但并不限定于此。另外，还可以使用NK细胞特异性表达的CD16、CD56、NKG2D等基因启动子。
(IV)修饰多能干细胞和修饰NK细胞的制造方法和用于其的试剂·试剂盒
另外，本发明还提供制造癌组织归巢功能和免疫活性细胞动员功能被强化的基因修饰细胞的方法，其包括向多能干细胞导入以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
上述制造方法中，外源基因的制备、基因导入、基因修饰多能干细胞的选择等可以与上述相同地进行。另外，可以进一步导入选自IL-15(和IL-15Rα)、CD16、NKG2D(包含NKG2D/DAP10复合体、NKG2D-CAR)中的1种以上的外源基因。
所得修饰多能干细胞可以通过自身公知的方法分化诱导为NK细胞或其前体细胞。
另外，本发明还提供基因修饰细胞制造用构建体，其包含以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
这里，2种外源基因可以构建为允许通过2A肽、IRES进行多顺反子表达，优选设计为包含在单独的构建体中。
这些构建体在功能性基因表达控制区域(例如，启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号等)的控制下形成表达盒。2种外源基因包含在单独的构建体中的情况，包含这些构建体的表达盒可以担载于单一的载体上，也可以担载于单独的载体上。
在优选的一个实施方式中，表达盒担载于载体上，该载体具备表达盒夹在一对转座子反向重复序列之间的结构。该转座子载体可通过与转座酶表达载体、优选PiggyBac转座酶(PBase)表达载体组合，将目标外源基因整合至细胞的染色体上。所以，本发明另外还提供基因修饰细胞的制作试剂盒，其包含含有上述表达盒的转座子载体和转座酶表达载体，且表达以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
以下举出实施例进一步具体说明本发明，但它们仅为例示，并不对本发明进行任何限定。
实施例
制造例1：基因修饰iPS细胞的制造
作为iPS细胞的亲本株，使用了iPS细胞克隆06E(TC-1133HKK_06E_MCB)。以下将该亲本株设为“未编辑iPS细胞”。在该未编辑iPS细胞中强制表达下述目标基因。作为基因导入法，使用PiggyBac法。另外，各因子的cDNA强制表达中使用持续活性型的EF1alpha(EF1A)启动子区域。
作为表达各目标基因的质粒DNA，准备下述质粒DNA。
#CCR2B表达PiggyBac质粒
#CCL19表达PiggyBac质粒
#IL-15表达PiggyBac质粒
#IL-15受体α表达PiggyBac质粒
#分泌型IL-15受体α表达PiggyBac质粒
#信号肽修饰IL-15表达PiggyBac质粒
#CD16a表达PiggyBac质粒
#NKG2D表达PiggyBac质粒
#NKG2D-CAR表达PiggyBac质粒
#DAP10表达PiggyBac质粒
另外，作为表达PiggyBac转移酶的质粒DNA，制备下述质粒DNA。
#hPBase表达质粒
利用PiggyBac法的基因导入中使用的各质粒DNA通过以下方法构建。人工合成由PiggyBac的3’ITR序列(SEQ ID NO:1)-限制内切酶的多克隆位点(MCS)-PiggyBac的5’ITR序列(SEQ ID NO:2)组成的构建体，将其插入pHSG298质粒(Takara Bio公司)的限制内切酶位点。在制作的PiggyBac ITR质粒的MCS中插入EF1A启动子(PCR扩增)、各目标基因(序列后述)、IRES(人工合成：SEQ ID NO:3)、耐药性基因(序列后述)、和人生长激素poly A(人工合成：SEQ ID NO:4)，由此构建表达各目标基因的质粒DNA。需要说明的是，作为EF1A启动子PCR扩增的PCR模板，使用pBApo-EF1a Pur DNA质粒(Takara Bio公司)。
作为各目标基因(人工合成)，使用CCR2B(人工合成：SEQ ID NO:5)、CCL19(人工合成：SEQ ID NO:6)、IL-15(人工合成：SEQ ID NO:7)、全长IL-15受体α(IL-15Rα)(人工合成：SEQ ID NO:8)、可溶性IL-15受体α(以下，有时记为“sIL-15Rα”)(人工合成：SEQ ID NO:9)、信号肽修饰IL-15(以下，有时记为“IL-2sp/IL-15”)(人工合成：SEQ ID NO:10)、CD16a(人工合成：SEQ ID NO:11)、NKG2D(人工合成：SEQ ID NO:12)、NKG2D-CAR(人工合成：SEQ IDNO:13)和DAP10(人工合成：SEQ ID NO:14)的任一者、或者它们的组合。
作为耐药性基因，使用嘌呤霉素(Puromycin)(人工合成：SEQ ID NO:15)、潮霉素(Hygromycin)(人工合成：SEQ ID NO:16)、博来霉素(Zeocin)(人工合成：SEQ ID NO:17)、新霉素(Neomycin)(人工合成：SEQ ID NO:18)的任一者。
另外，hPBase表达质粒DNA通过以下方法构建。在pHSG298质粒(TakaraBio公司)MCS内的限制酶切位点插入EF1A启动子(通过PCR扩增)、人密码子优化的PBase(人工合成、SEQ ID NO:19)、和人生长激素poly A(人工合成：SEQ ID NO:4)而构建。
使用电穿孔法(Neon Transfection System、Thermo FisherScientific)，将上述导入因子表达质粒DNA(根据目标细胞，1个或多个)和hPBase表达质粒DNA导入未编辑iPS细胞06E中。在质粒DNA导入第二天以后，在加入嘌呤霉素·潮霉素·博来霉素·新霉素药剂1种至4种的液体培养基中培养3天至7天，实施耐药性细胞的筛选。如此制作导入因子表达iPS细胞文库(表1)。
[表1]
根据需要由上述iPS细胞文库实施单细胞克隆，分离导入因子表达iPS细胞克隆。
制造例2：分化诱导为NK细胞
将表达制造例1中制作的目标基因的iPS细胞文库或其克隆放大培养后，分别分化诱导为NK细胞。由iPS细胞分化诱导为NK细胞依照文献(Matsubara等，Biochem BiophysRes Commun.2019Jul12；515(1):1-8.)进行。作为NK细胞分化能力评价之一，通过流式细胞术方法测定NK细胞特异性蛋白的细胞表面表达。作为NK细胞的标志物，使用抗CD56抗体(克隆B159、BD Biosciences、Catalogue No.555518)、抗CD16抗体(克隆3G8、BD Biosciences、Catalogue No.555407)。
结果，任一目标基因表达iPS细胞均可以分化为NK细胞。
试验例1：CCR2B表达iNK细胞的细胞迁移活性
由制造例2中得到的CCR2B表达iPS细胞分化诱导得到的iNK细胞(实施例4)中，使用博伊登室(Boyden chamber)调查相对于含CCL2重组蛋白的培养基的细胞迁移活性。
将各iNK细胞用CFSE(5-或6-(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)荧光素3',6'-二乙酸酯)标记后，以5×105细胞接种于上腔室，将上腔室浸渍于加入有含100ng/mL重组CCL2的培养基的下腔室中，在37℃、5％CO2下进行4小时细胞培养。然后，以CFSE荧光为指标使用流式细胞仪测量从上腔室迁移至下腔室的各iNK细胞的数目。其结果示于图1。
与由导入了空载体的iPSC分化诱导的对照iNK细胞相比，CCR2B表达iNK细胞中迁移至下腔室的细胞数显著更多。由此可知，CCR2B表达iNK细胞具有相对于CCL2的高迁移活性。
试验例2：CCL19表达细胞的细胞迁移活性
使用博伊登室调查相对于制造例2中由CCL19表达iPS细胞分化诱导的iNK细胞(实施例5)的培养上清的末梢血单核细胞(PBMC)的细胞迁移活性。
将解冻·恢复培养的PBMC用CFSE标记后，以4×105细胞/500μL/孔接种于上腔室。将其浸渍于加入有CCL19表达iNK细胞的培养上清、或者由导入空载体的iPSC分化诱导的对照iNK细胞的培养上清的下腔室中，在37℃、5％CO2下进行1.5小时培养。然后，以CFSE荧光为指标，用荧光显微镜拍摄迁移至下腔室的PBMC，同时使用流式细胞仪进行细胞数测量。其结果示于图2。
对于在CCL19表达iNK细胞的培养上清来说，与由导入空载体的iPS细胞分化诱导的对照iNK细胞的培养上清相比，观察到对PBMC的高迁移活性。由以上结果可知，CCL19表达iNK细胞对PBMC具有迁移活性的亢进能力。
试验例3：CD16表达iNK细胞的细胞毒活性
通过流式细胞术确认，在由制造例2中得到的CD16表达iPS细胞分化诱导的iNK细胞(实施例6)中，在细胞表面正确表达CD16(图3左)。
接着，对于该CD16表达iNK细胞，在抗EGFR抗体(Cetuximab)的存在下，使用LDH测定(TakaraBio LDH Cytotoxicity DetectionKit)调查以表达EGFR的A549为靶细胞的细胞毒活性。具体地，将粘附的A549细胞在抗EGFR抗体(Cetuximab)存在下，与iNK细胞共培养4小时，以其酶活性为指标测定由于iNK细胞的细胞毒而由A549细胞释放的LDH量。结果示于图3右。与由空载体导入iPS细胞分化诱导的对照iNK细胞相比，在CD16表达iNK细胞中确认到2倍程度高的细胞毒活性(ADCC活性)。
试验例4：IL-15表达iNK细胞的细胞因子分泌活性
将由制造例2中得到的IL-15表达iPS细胞分化诱导的iNK细胞(实施例7)以2×106细胞/mL接种，在IL-15的非存在下进行4天培养后，使用细胞计数装置NucleoCounterNC-200测量所得的活细胞数。作为阴性对照，使用由导入空载体的iPS细胞分化诱导的iNK细胞。结果示于图4。
与对照iNK细胞相比，在IL-15表达iNK细胞中观察到2倍以上的数量的细胞。因此可知，通过表达IL-15，iNK细胞的增殖·存活提高。
试验例5：NKG2D表达iNK细胞的IFNγ分泌活性
调查了制造例2中得到的各种方式的NKG2D表达iNK细胞中的IFNγ产生。将各NKG2D-iNK细胞(NKG2D-CAR iNK细胞(实施例8)、NKG2D/DAP10共表达iNK细胞(实施例9))与表达ULBP2等NKG2D配体的A549细胞共培养24小时后，回收培养上清，通过ELISA确认IFNγ的表达量。
与A549细胞共培养的结果，确认到在任一NKG2D-iNK细胞中，与由导入空载体的iPS细胞分化诱导的对照iNK细胞相比，IFNγ的产生量显著增加(图5)。由以上结果可知，在任一NKG2D表达iNK细胞中，均观察到NKG2D特异性的IFNγ产生的亢进。
试验例6：CCR2B/CCL19共表达iNK细胞的细胞迁移活性
在由制造例2中得到的CCR2B/CCL19共表达iPS细胞分化诱导的iNK细胞(实施例12)中，使用趋化用Incucyte Clearview 96孔板(Sartorius)调查相对于含CCL2重组蛋白的培养基的细胞迁移活性。该板也分为上腔室和下腔室，可以通过与博伊登室时相同的原理评价细胞迁移。
将各iNK细胞用DiO(3,3’-双十八烷基氧代羰花青高氯酸盐)标记后，在上腔室中接种1×104个细胞，浸渍于加入有1μg/mL的重组CCL2添加或无添加培养基的下腔室中。然后，在37℃、5％CO2下培养，以DiO的荧光为指标，每2小时定量残留于上腔室的细胞30小时。其结果示于图6。
在CCR2B/CCL19共表达iNK细胞中，与CCL2非添加时相比，显著观察到由于下腔室中的CCL2添加，上腔室内的荧光减少。该结果表明，CCR2B/CCL19共表达iNK细胞CCL2依赖性地由上腔室迁移至下腔室。另一方面，由导入空载体的iPSC分化诱导的对照iNK细胞中，没有观察到CCL2依赖性的上腔室中的荧光减少。由此可知CCR2B/CCL19共表达iNK细胞对CCL2显示出高迁移能力。
试验例7：CCR2B/CCL19共表达细胞的细胞迁移活性
使用趋化用Incucyte Clearview 96孔板(Sartorius)，调查相对于由制造例2中得到的CCR2B/CCL19共表达iPS细胞分化诱导的iNK细胞(实施例12)的培养上清的树状细胞(DC)的细胞迁移活性。
将由分离自末梢血单核细胞的CD14阳性细胞(单核细胞)分化诱导的DC用DiO标记后，将8.4×103个细胞接种于上腔室中。将其在10μg/mL的抗CCL19抗体(克隆A15093C、BioLegend、CatalogueNo.612803)存在下或者非存在下浸渍于加入有CCR2B/CCL19共表达iNK细胞的培养上清、或者由导入空载体的iPSC分化诱导的对照iNK细胞的培养上清的下腔室中。然后，在37℃、5％CO2下培养，以2小时间隔，以DiO的荧光为指标定量残留于上腔室中的DC 72小时。其结果示于图7。
将CCR2B/CCL19共表达iNK细胞的培养上清加入下腔室的情况，与加入对照iNK细胞的培养上清时相比，明显观察到上腔室内的荧光的减少。另外，该荧光的减少被抗CCL19抗体的添加所抑制。这表明，相对于CCR2B/CCL19共表达iNK细胞的培养上清，DC以CCL19依赖性的方式发生迁移。由以上结果可知，CCR2B/CCL19共表达iNK细胞对DC具有高诱引活性。
试验例8：IL2sp/IL-15、全长IL-15Rα和可溶性IL-15Rα表达的效果
将由制造例2中得到的IL2sp/IL-15表达iPS细胞分化诱导的iNK细胞(实施例13)、IL2sp/IL-15·全长IL-15Rα共表达iNK细胞(实施例10)、IL2sp/IL-15·可溶性IL-15Rα共表达iNK细胞(实施例11)和由导入空载体作为对照的iPSC分化诱导的iNK细胞在IL-15非存在下进行7天培养。在培养第4天和第7天，使用细胞计数装置NucleoCounterNC-200测量活细胞数。其结果示于图8。测定值以相对于接种时的细胞数的％显示。
与对照iNK细胞相比，IL2sp/IL-15表达iNK细胞、IL2sp/IL-15·全长IL-15Rα共表达iNK细胞、IL2sp/IL-15·可溶性IL-15Rα共表达iNK细胞中观察到非常多数目的活细胞。另外，与IL2sp/IL15单独表达iNK相比，全长IL-15Rα和可溶性IL-15Rα共表达iNK细胞中测量到更多的活细胞。由以上结果可知，IL2sp/IL-15表达通过提高iNK细胞的增殖·存活，以及共表达全长或者可溶性IL-15Rα，其效果进一步亢进。
产业实用性
本发明的修饰多能干细胞和修饰NK细胞可以用作用于细胞免疫疗法、特别是癌免疫疗法的活性成分及其供给原料。
本申请基于在日本提出申请的日本特愿2021-184197(申请日：2021年11月11日)，其内容全部包括在本说明书中。

Claims (20)

1.多能干细胞、或者来自该多能干细胞的NK细胞或其前体细胞，所述多能干细胞表达以下的(a)和(b)：
(a)编码CC趋化因子受体2型B(CCR2B)的外源基因；
(b)编码CC趋化因子配体19(CCL19)的外源基因。
2.根据权利要求1所述的细胞，其进一步表达以下的(c)和/或(d)：
(c)编码白介素15(IL-15)的外源基因；
(d)编码CD16的外源基因。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其进一步表达以下的(e)：
(e)编码NKG2D或NKG2D-CAR的外源基因。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中，(e)为NKG2D-CAR。
5.根据权利要求3所述的细胞，其中，(e)为NKG2D，且其进一步共表达(f)编码DAP10的外源基因。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的细胞，其表达编码IL-15的外源基因，该IL-15为分泌型IL-15。
7.根据权利要求2～5中任一项所述的细胞，其表达编码IL-15的外源基因，且共表达编码IL-15受体α(IL-15Rα)的外源基因。
8.根据权利要求2～7中任一项所述的细胞，其表达编码CD16的外源基因，该CD16为具有高亲和性突变或非截断突变的CD16。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中，CD16具有选自F176V(F158V)和S197P的突变。
10.药物，其包含权利要求1～9中任一项所述的细胞。
11.根据权利要求10所述的药物，其为癌症的治疗药。
12.制造癌组织归巢功能和免疫活性细胞动员功能被强化的基因修饰细胞的方法，其包括向多能干细胞导入以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括将导入有所述外源基因的多能干细胞分化诱导为NK细胞或其前体细胞。
14.用于制造基因修饰细胞的构建体，其包含以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
15.根据权利要求14所述的构建体，其中，外源基因包含于单独的构建体中。
16.表达盒，其包含基因表达控制区域和在该控制区域的控制下的权利要求14或15所述的构建体。
17.载体，其包含权利要求16所述的表达盒。
18.根据权利要求17所述的载体，其具备表达盒被夹在一对转座子反向重复序列之间的结构。
19.基因修饰细胞的制作试剂盒，其包含权利要求18所述的载体和转座酶表达载体，且表达以下的(a)和(b)：
(a)编码CCR2B的外源基因；
(b)编码CCL19的外源基因。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中，转座酶为PiggyBac转座酶。
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