KR101481165B1 - 인간 체세포 유래 다능성 줄기세포의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 준비된 Oct4 유전자, Sox2 유전자, Nanog 유전자 및 제4 유전자가 도입된 각각의 바이러스를 생산하는 단계, 상기 각각의 바이러스들을 농축 및 혼합하여 바이러스 농축 혼합액을 준비하고 상기 바이러스 농축 혼합액을 제1 배양액과 혼합하여 바이러스 용액을 준비하는 단계, 제1 배양 용기에서 미리 배양된 인간 체세포들을 부유시킨 후, 상기 부유된 체세포들과 상기 바이러스 용액을 혼합 및 반응시켜 체세포-바이러스 혼합액을 준비하는 단계, 상기 체세포-바이러스 혼합액을 제2 배양액을 포함하는 제2 배양용기에 첨가 및 방치하여 상기 유전자들을 상기 체세포에 도입하는 단계, 및 상기 유전자들이 도입된 체세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

Description

인간 체세포 유래 다능성 줄기세포의 제조 방법 {Method of manufacturing induced pluripotent stem cell originated from human somatic cell}

본 발명은 줄기세포의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 체세포 유래의 다능성 줄기세포를 획기적인 효율로 제조할 수 있는 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

배아줄기(ES)세포는 포유류 포배기 배아(blastocyst)의 내부 세포덩어리(inner cell mass)에서 유래하는 것으로, 인간의 210여 가지 장기로 분화할 수 있는 다능성 (pluripotency)을 유지하면서 무한히 증식하는 특성을 지니고 있다.

따라서 인간 배아줄기세포는 질병연구, 약물의 효능/안전성 검사, 질병의 치료(소아당뇨, 척수손상)에 이용할 수 있으리라 기대되고 있다.

그러나 배아줄기세포를 만들기 위한 인간의 배아 사용은 계속적으로 윤리적 논쟁의 쟁점이 되고 있으며 환자 특이적 또는 질병 특이적 줄기세포를 만들 확률이 매우 낮기 때문에 실용성이 제한되어 있어서 문제가 되고 있다.

본 발명의 목적은 획기적인 효율로 인간 체세포 유래의 다능성 줄기세포를 제조할 수 있는 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 측면에 따른 배아줄기 세포의 제조방법은 인간 배아줄기세포로부터 Oct4 유전자, Sox2 유전자, Nanog 유전자 및 제4 유전자 준비하고 상기 각각의 유전자들을 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector system) 시스템을 이용하여 숙주세포에 감염시켜 각각의 유전자들이 도입된 바이러스들을 생산하는 단계, 상기 각각의 바이러스들을 농축 및 혼합하여 바이러스 농축 혼합액을 준비하고 상기 바이러스 농축 혼합액을 제1 배양액과 혼합하여 바이러스 용액을 준비하는 단계, 제1 배양 용기에서 미리 배양된 인간 체세포들을 부유시킨 후, 상기 부유된 체세포들과 상기 바이러스 용액을 혼합 및 반응시켜 체세포-바이러스 혼합액을 준비하는 단계, 상기 체세포-바이러스 혼합액을 제2 배양액을 포함하는 제2 배양용기에 첨가 및 방치하여 상기 유전자들을 상기 체세포에 도입하는 단계, 및 상기 유전자들이 도입된 체세포를 제3 배양액을 포함하는 제3 배양용기 내에서 배양시키는 단계를 포함한다.

상기 제4 유전자는 Lin28 유전자 및 XIAP(항사멸 유전자) 중 적어도 어느 하나일 수 있다.

상기 감염 단계는 구체적으로 상기 인간 배아줄기세포로부터 상기 Oct4 유전자, Sox2 유전자, Nanog 유전자 및 제4 유전자를 각각 준비하여 상기 유전자들을 각각 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector)에 클로닝하는 단계, 및 클로닝된 렌티 바이러스 벡터들을 상기 숙주세포에 감염시켜 상기 클로닝된 바이러스 벡터들에 의하여 상기 유전자들이 도입된 각각의 바이러스들을 생산하는 단계를 포함한다.

상기 바이러스의 농축은 원심분리에 의하여 이루어질 수 있으며, 상기 바이러스의 혼합은 각각의 바이러스의 양이 동일하도록 이루어지는 것이 바람직하다.

상기 바이러스 농축 혼합액 및 제1 배양액은 1: 1 ~ 5의 비율로 혼합되는 것이 바람직하다.

상기 인간 체세포들의 부유는, 상기 제1 배양용기로부터 세포 분리용액을 이용하여 체세포들을 분리하는 단계, 및 상기 분리된 체세포들을 원심 분리하는 단계에 의하여 이루어질 수 있다.

상기 체세포-바이러스 혼합액 및 제2 배양액의 부피 비율은 1: 10 ~ 20인 것이 바람직하다.

상기 제1 배양액과 제2 배양액의 조성은 동일하게 유지하는 것이 바람직하다.

상기 부유된 체세포들과 상기 바이러스 용액의 반응은 5 내지 15분간 이루어진다.

본 발명에 따른 줄기세포의 제조방법에 따르면, 배아를 사용하지 않고 인간 의 체세포만으로 줄기세포의 확립이 가능할 뿐만 아니라 제조 효율이 매우 우수할 뿐만 아니라 확립된 줄기 세포의 분화 성능이 매우 안정적으로 발현될 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명은 인간의 체세포와 달리 줄기세포에서 특이적으로 과 발현하는 유전인자를 체세포에 도입하여 체세포의 역분화 현상을 유발시킴으로써 인간 체세포 유래 다능성 줄기세포를 확립하는 방법이다.

즉, 본 발명은 이미 분화된 체세포에 직접 재프로그래밍 (reprogramming) 과정을 유도하여 다능성을 가진 줄기세포를 성공적으로 제조할 수 있게 한다.

이와 관계되는 유전인자는 4가지 전사인자 (Oct3/4, Sox2, Nanog, 제4 유전인자)로 Oct3/4와 Sox2는 다능성을 결정하는 핵심적 전사인자로 줄기성 (stemness)과 관련된 유전자를 상향조절하고 분화와 관련된 유전자를 억제하는 역할을 한다. 또한, Nanog 유전자는 인간 배아줄기세포의 클로닝 효율을 높여 초기 역분화된 세포의 생존율을 증진시키는 역할을 한다. 상기 제4 유전인자로는 Lin28 유전자 또는 XIAP 유전자가 사용될 수 있으며, 이들은 동시에 사용될 수도 있다. Lin28 은 클로닝 효과를 지속시키는 유전자로 알려져 있다. 상기 XIAP는 세포의 생존율 저하를 방지하는 항사멸 유전자로 알려져 있다.

본 발명에서는 특히, 상기 유전자들을 효율적으로 체세포에 도입하는 방법을 적정화하기 위해 렌티 바이러스 벡터 (lentiviral vector)를 이용하고 유전자 도입 시 세포의 부착성 여부를 조절함으로써 줄기세포의 제조 효율을 극대화 한다.

이하에서는, 상기 제4 유전자로서 Lin28 유전자를 사용하는 예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하도록 한다.

본 발명의 방법에 따라 줄기세포를 제조하기 위해서는 우선 인간 배아줄기세포로부터 상기 네 가지 전사인자인 Oct4 유전자, Sox2 유전자, Nanog 유전자 및 Lin28 유전자를 생성하여야 한다.

이를 위하여, 인간 배아줄기세포로부터 토탈 RNA (Total RNA)를 추출하고, 이로부터 cDNA를 합성한다. 상기 합성된 cDNA는 소정의 프라이머들에 의하여 클로닝되고 RT-PCR에 의하여 증폭된다.

준비된 상기 전사인자들은 T-벡터에 클로닝되고, 상기 T-벡터에 클로닝된 상기 전사인자들은 다시 렌티 바이러스 벡터 (lentiviral vector)와 상동 재조합 (homologus recombination) 되기 위하여 pENTR4 벡터(Invitrogen사 제조) 등의 엔트리(entry) 클로닝 벡터에 서브 클로닝(sub cloning) 된다.

상기 T-벡터에 클로닝 되어 있는 전사인자들은 각각 상기 엔트리 클로닝 벡터와 리게이션(ligation) 됨으로써 각각 엔트리 클로닝 벡터 벡터에 서브 클로닝 된다.

상기 전사인자들이 서브 클로닝된 엔트리 클로닝 벡터는 렌티 바이러스 벡터와의 상동 재조합을 통하여 렌티 바이러스 벡터에 도입될 수 있다.

상기 각각의 전사인자들을 포함하는 네 종류의 렌티 바이러스 벡터들은 각각의 바이러스에 감염됨으로써 각각의 유전자가 도입된 유전자 도입 바이러스를 생성하게 된다.

상기와 같이 본 발명의 바이러스는 렌티 바이러스 벡터 시스템에 의하여 생성될 수 있다.

상기 네 종류의 유전자들이 효율적으로 도입된 네 종류의 바이러스들은 각각 농축된 후 혼합됨으로써 바이러스 농축 혼합액이 준비될 수 있다. 상기 농축 과정은 각각의 바이러스들을 원심 분리함으로써 이루어질 수 있다. 상기 농축을 통하여 후술할 인간 체세포로의 유전자 도입 효율을 현저히 향상시킬 수 있다.

상기 바이러스 농축 혼합액을 준비하기 위한 각 바이러스들의 함량은 서로 동일하게 유지하는 것이 바람직하다. 이는 네 가지 유전자가 효율적으로 발현되도록 하기 위해서이다.

상기 준비된 바이러스 농축 혼합액은 제1 배양액과 혼합됨으로써 바이러스 용액이 준비될 수 있다. 상기 바이러스 농축 혼합액과 상기 제1 배양액은 혼합 비율은 1: 1 ~ 5이다.

상기 바이러스 농축 혼합액에 대한 상기 제1 배양액의 비율이 5를 초과하면 유전자 도입 효율이 현저히 저하될 수 있는 문제가 있고, 반면에 1 미만이면 유전자 도입의 대상인 체세포의 안정성에 문제가 발생될 수 있다.

상기 바이러스 농축 혼합액과 상기 제1 배양액의 혼합 비율은 바람직하게는 1:1 이다.

상기 네 종류의 유전자 조합이 도입될 인간의 체세포는 유전자 도입이 이루어지기 전에 미리 제1 배양 용기에 배양되어 있고 상기 제1 배양 용기에 부착되어 있다.

유전자 도입을 위해서는 우선, 상기 인간의 체세포가 배양되어 있는 제1 배양 용기에 트리플(triple) 용액 등의 세포 분리 용액을 사용하여 상기 체세포를 상기 제1 배양 용기로부터 분리하여 부유 시켜야 한다. 부유된 체세포들은 원심분리를 통하여 체세포 고형분만으로 분리되어 준비된다.

부유시켜 처리하는 목적은 바이러스 농축액과 세포간의 반응 표면적을 늘리기 위함이다. 부유시킨 세포가 배양용기에 완전히 부착되는 시간은 대략 2시간에서 3시간 정도 소요된다. 본 발명에 따르면 구형세포에 입체적으로 바이러스가 침투할 수 있는 기회가 높아짐으로써 부착체세포 유전자 도입방법과 비교하여 우수한 효율을 가질 수 있다.

상기와 같은 방법으로 부유된 체세포 및 상기 바이러스 용액은 코니컬 튜브(conical tube) 등의 반응 용기에 첨가 및 혼합된 후 5 내지 15분간 반응이 이루어진다.

상기 반응을 통하여 체세포-바이러스 혼합액이 준비될 수 있다.

상기 체세포-바이러스 혼합액은 다시 제2 배양액이 포함된 제2 배양 용기로 옮겨진 후 약 24시간 동안 방치됨으로써 상기 체세포의 감염이 이루어질 수 있다. 즉, 상기 바이러스에 포함된 유전인자들이 상기 체세포로 도입될 수 있다.

상기 체세포-바이러스 혼합액에 대한 제2 배양액의 비율은 10 ~ 20:1로 설계되는 것이 바람직하다. 상기 체세포-바이러스 혼합액에 대한 제2 배양액의 비율이 20을 초과하면 체세포의 유전자 도입 효율이 저하될 수 있다.

또한, 상기 제1 배양액과 제2 배양액의 조성은 동일한 것이 바람직하다. 이 는 상기 체세포의 대사 및 기능을 동일하게 유지함으로써 유전자 발현이 용이하게 하기 위해서이다.

약 24시간 후에 유전자 도입이 이루어진 체세포는 세포 분리 용액을 사용하여 제2 배양 용기로부터 분리되어 다시 제3 배양액을 포함하는 제3 배양용기에 옮겨져 수일 동안 배양됨으로써 줄기세포로 확립될 수 있다.

상기 제3 배양액의 기본 조성은 제2 배양액과 인간 배아줄기세포 배양액을 1;1 로 혼합하고 미분화 유도 인자 등을 추가로 포함한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하도록 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 예시적인 것으로서, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

1. Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28 유전자가 도입된 T-벡터의 준비

(1) 인간 배아줄기세포로부터 토탈 RNA의 추출

회수된 배아줄기세포에 트리졸 시약(Trizol reagent, Sigma사 제조) 1ml을 넣고 5분간 상온에서 방치하여 세포를 파괴시켜 세포내용물을 용출시켰다. 200ul의 클로로포름(chloroform)을 넣고 인버트(invert) 상태로 섞어준 다음 상온에서 15분간 방치하고 1300rpm, 15분, 4℃의 조건 하에서 원심 분리하여 DNA와 단백질의 고형체인 침전부위를 제외한 상층액만을 회수하였다. 그 후 500ul의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 상온에서 10분간 방치하고 1300rpm, 10min, 4℃의 조건 하 에서 원심 분리하여 남아있는 클로로포름 성분을 제거하였다. 그리고 75% EtOH 1ml로 세척(washing)하고 8000rpm, 5min, 4℃의 조건 하에서 원심 분리한 다음 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 건조 시켰다. 그 후 RNA 저해용액(DEPC water) 20ul에 펠렛(pellet)을 녹여 토탈 RNA를 준비하였다.

(2) cDNA 합성

cDNA를 합성하기 위하여 토탈 RNA 3㎕(1㎍/㎕)와 올리고 dT(oligo dT) 2㎕(10pmols/㎕)를 혼합하여 70℃에서 5분간 반응시킨 후 4℃에서 5분간 방치하였다. 리버스 전사 믹스쳐(reverse transcription mixture)(water 5.6ul, ImProm-II 5X buffer 4ul, 25mM MgCl₂ 2.4ul, 10mM dNTP 1ul, RNase inhibitor 1ul(40unit), Improm-II reverse transcriptase 1ul, Promega사 제조)를 15ul 넣고 25℃에서 5분간 어닐링(annealing), 37℃에서 60분 동안 신장(extending), 70℃에서 15분간 Improm-II 리버스 트랜스크립타제(reverse transcriptase)를 불활성화(inactivation) 한다.

(3) RT-PCR

합성된 cDNA는 폴리머라제(제품명: AccuPrime DNA Taq polymerase, Invitrogen사 제조)를 이용하여 95℃ 15분, 95℃ 1분, 51~53℃ 1분, 72℃ 1분간　30 사이클, 72℃ 5분 동안 익스텐션(extension)하였다. 유전자 복제에 사용된 프라이 머는 hOct4(정방향 프라이머: 5'-GAATTC-CCATGGCGGGACACCT-3' (22mer), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-AGTTTGAATGCATGGGAG-3'　　(26mer)), hSox2(정방향 프라이머: 5'-GAATTC-GCATGTACAACATGATGG-3' (24mer)), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-TCACATGTGTGAGAGG-3' (24mer), hNanog(정방향 프라이머: 5'-GAATTC-ACATGAGTGTGGATCCAGCT-3' (26mer), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-TCACACGTCTTCAGGTTG-3' (26mer)), hLin28(정방향 프라이머: 5'-GAATTC-CCATGGGCTCCGTGT-3' (21mer), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-GCTCAATTCTGTGCCTCC-3' (26mer))이다. PCR후 DNA 밴드는 전기 영동하여 에디티움 브로마이드(ethidum bromide) 염색후 UV하에서 관찰하였다. 관찰된 결과는 도 1에서 확인할 수 있다.

도 1은 PCR 후 전기영동에 의하여 검출된 DNA 밴드를 보여주는 사진이다. 도 1을 참조하면, 네 종류의 유전자가 밴드가 정확하게 검출된 것을 확인할 수 있다.

(4) T-벡터 클로닝

T-벡터에 클로닝 하기 위하여 겔 추출 킷(제품명: QIAquick gel extraction kit, Qiagen사 제조)를 이용하여 PCR 밴드만 용리(elution) 하여 pGEM-T 이지 벡터(easy vector) 1ul, 타겟(target) DNA 3ul, 리가제 버퍼(ligase buffer) 1ul, 물 4ul, 리가아제(ligase, Promega사 제조) 1ul를 혼합하여 16℃에서 하루 동안 반응 (overnight reaction) 시켰다. DNA 시퀀싱 장치(sequencing, Applied biosystems company's 3730XL Capillary DNA sequencer machine)을 통하여 4개의 각각의 유전자들이 복제 되었음을 확인하였다. 도 2는 pGEM-T 이지 벡터의 기작을 보여주는 개 념도이다.

2. pENTR4 벡터로 서브 클로닝

T-벡터에 클로닝 된 hOct4, hSox2, hNanog 및 hLin28을 EcoRI 효소를 이용하여 절단(cutting) (도 3)하여 pENTR4 벡터 (도 4)와 리게이션(ligation)을 실시하였다. 도 3은 T-벡터에 클로닝된 유전자들의 전기영동 사진이다.

도 4는 pENTR4 벡터의 기작을 보여주는 개념도이다.

3. 렌티 바이러스 벡터와의 상동 제조합(homologus recombination)

pENTR4/hOct4, hSox2, hNanog 및 hLin28 벡터와 렌티바이러스 벡터와의 재조합 하기 위하여(도 5) 각각의 pENTR4/hOct4, hSox2, hNanog, hLin28 DNA 4ul, 렌티바이러스 벡터 2ul, 물 2ul, LR 클로나제 (LR clonase, Invitrogen사 제조) 효소 2ul을 혼합 하여 20℃에서 오버나잇 반응(overnight reaction)을 실시하였다. 그 후 프로테나제(Proteinase K) 용액 1ul를 넣고 37℃에서 10분간 반응시키고 혼합물을 컴피턴트 셀(competent cell)에 유전자 주입한 후 LB/Apm 아가 플레이트(agar plate)에 도말하여 37℃에서 하룻동안 배양(overnight culture)하였다. 배양 후 DNA 샘플 추출하고 DNA 시퀀싱 장치(sequencing, Applied biosystems company's 3730XL Capillary DNA sequencer machine)를 통하여 상동 재조합이 이루어졌음을 확인하였다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 상동 재조합의 모습을 보여주는 개념도이다. 도 5를 참조하면, 엔트리 클로닝 벡터의 유전자 부위와 렌티 바이러스 벡터의 ccdB 부위가 상호 치환됨으로써 상동 재조합이 이루어지게 된다.

4. 바이러스 생산

바이러스는 293T 세포에 일시 감염(transient transfection)을 실시하여 생산하였고, 칼슘 포스페이트 감염(calcium phosphate transfection)을 이용하였다. 감염 (transfection) 12~16시간 후에 10% FBS가 보충된 배양액(medium) (DMEM; Sigma사 제조)으로 교체하고 약 48시간 동안 바이러스 입자를 생산하였다(도 7). 이 후, 50,000g, 4℃, 4시간 원심 분리하여 바이러스를 농축하였다.　 도 6은 바이러스 생산을 위한 인벨럽(envelope) 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 타겟 벡터의 모식도이다. 도 7은 239T 세포에 렌티바이러스 벡터가 감염된 모습을 보여주는 현미경 사진이다.

5. 인간 체세포에 렌티바이러스 감염을 이용한 유전자 주입

전날 100mm 배양 용기에 준비해 놓은 0.5 x 10⁶개의 인간 체세포를 인위적으로 배양용기로부터 떼어내어 부유시켰다. 상기 부유는 상기 트리플(triple) 용액을 이용하여 체세포를 때어낸 다음 원심분리를 이용하여 체세포 고형분을 분리해냄으로써 이루어졌다. 각각의 유전자에 대응한 각각의 바이러스 농축액 50 ul를 제1 배양액과 1:1 비율로 섞어 (바이러스 혼합액 200ul; 배양액 200ul) 부유된 체세포와 5~10분간 15ml 코니컬 튜브(conical tube)에서 반응시킨 후 제2 배양액 5600ul가 들어있는 100mm 배양 용기에 넣어 주었다. 유전자도입은 24 시간 동안 배양하여 실시하였다. 유전자 주입시의 배양액은 총 6ml을 사용하였고 0.6 ug/ml 폴리브렌(제품명:polybrene, Sigma사 제조)을 처리하였다. 체세포 배양액(제1 배양액) 및 유전자 주입 시 사용한 배양액(제2 배양액)은 하이-글루코스(high-glucose) (4.5g/L), Na-파이루베이트(pyruvate) (0.11g/L) 및 2mM L-글루타민(glutamine)이 들어있는 DMEM 배양액 (No. 11995, Invitrogen사 제조)에 0.1 mM β-머캅토에탄올(mercaptoethanol) (Sigma사 제조), 1% 비필수 아미노산(non-essential amino acid), 50U/ml 페니실린(penicillin), 50ug/ml 스트렙토마이신(streptomycin)과 10% 소혈청 (fetal bovine serum, FBS, Hyclone사 제조)을 첨가하여 사용하였다.

유전자 도입을 실시한 배양 방법 각각의 세포는 배양용기로부터 트리플 용액을 이용하여 떼어낸 뒤 전날 준비된 MEF (Mouse embryonic fibroblast) 지지세포가 들어있는 60mm 배양용기 5개에 나누어 올려　배양하였다. 이때 사용한 배양액은 글루코스(D-glucose) (3.15g/L), Na-파이루베이트(pyruvate) (0.11g/L) 및 2mM L-글루타민(glutamine)이 들어있는 DMEM/F12 배양액 (No. 11320, Invitrogen사 제조)에 0.1 mM β-머캅토에탄올(mercaptoethanol) (Sigma사 제조), 1% 비필수 아미노산(non-essential amino acid), 50U/ml 페니실린(penicillin), 50ug/ml 스트렙토마이신(streptomycin)과 20% 혈청대체제 (serum replacement, SR, Gibco사 제조)를 첨가한 기본배양액에 줄기세포 유지에 필요한 미분화 유도인자인 4ng/ml의 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic Fibroblast Growth Factor)를 넣은 줄기세포 배양액을 이용하였다. 바이러스 감염은 배양 24-48시간 후 형광을 통하여 확인하였다.

[비교예]

본 비교예는 전술한 실시예와 비교하여 유전자 도입 과정을 제외한 나머지 방법은 상시 실시예와 동일한 방법으로 실시되었다.

본 비교예에서는 배양용기에 부착된 체세포에 유전자 도입을 행하였다. 전날 100mm 배양 용기에 준비해 놓은 0.5 x 10⁶개의 인간 체세포에 4개의 전사인자 (Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28) 가 들어있는 바이러스 농축액 50ul 각각을(총 200ul) 5800ul의 배양액 위에 바로 뿌려주었다.

줄기세포의 특성분석

1. 알카리 포스파타제(alkaline phosphatase, AP)활성도 측정

형태적으로 모양을 갖춘 줄기세포 콜로니의 미분화 특성을 규명하기 위하여 미분화 세포의 표식인자로 많이 사용되는 AP의 활성도를 조사하였다. 콜로니를 4% 포름알데하이드(formaldehyde)(Sigma사 제조) 에서 1분 동안 고정한 후 Tris-HCl을 이용하여 세척하고 염색키트(상품명:Fast Red Violet/Naphthol AS-BI, Chemicon사 제조)로 15분 동안 반응시켜 세척한 후 그 반응 정도를 현미경하에서 확인하였다.　

2. 유전자 발현 유무 확인

(1) SSEA-3, 4, TRA-1-60와 TRA-1-81 발현유무 확인

미분화 특성의 인간 배아줄기세포를 인지하는 표지 항원 SSEA (stage- specific embryonic antigen, Santacruz사 제조) 3, 4와 TRA (tumorigenic antigen, Santacruz사 제조) 1-60 와 1-81을 이용하여 조사하였다. 배아줄기세포로 추정되는 콜로니를 4% 파라폼-알데하이드(paraform-aldehyde)(PFA, Sigma사 제조)로 20분간 고정한 후 PBS를 이용하여 3회 세척하고 10% 염소 혈청(normal goat serum)을 이용하여 비특이적 반응 억제(non-specific blocking)를 1시간 실시하였으며, 일차 항체를 1:20의 농도로 4℃에서 오버나잇 (overnight) 반응시켰다. 그 다음 PBS를 이용하여 3회 세척하고 반응 정도를 조사하기 위해 TRITC가 부착된2차 항체(제품명:rhodamine (TRITC)-conjugated goat anti-mouse IgM, 1:200, Jackson Lab)를 처리하고 핵염색을 위해 4‘-6-디아미디노-2-페닐린돌(4‘-6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI, 1:1,000, Sigma사 제조)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 PBS로 충분히 세척하여 형광현미경 하에서 관찰하였다.

(2) 체세포 유래 줄기세포(iPS)로부터 도입된 4가지 유전자의 발현확인

유전자 도입으로 생성된 체세포 유래 줄기세포로부터 외부에서 도입시킨 (외인성, exogenous) 4가지의 유전자와 자체적으로 발현되는 (내인성, endogenous) 4가지 유전자의 발현을 확인하였다. 두 종류의 체세포 유래 줄기세포 주로부터 합성된 cDNA는 폴리머라제(제품명: AccuPrime DNA Taq polymerase, Invitrogen사 제조)를 이용하여 94℃ 3분, 94℃ 30초, 51~53℃ 30초, 72℃ 1분간　30 사이클, 72℃ 5분 동안 익스텐션(extension)하였다. 내인성 유전자발현 확인에 사용된 프라이머는 유전자 복제 시 사용되었던 상기의 내용과 동일하며 외인성 유전자발현 확인에 사용 된 프라이머는 상기의 정방향 프라이머와 유전자 운반체 유래 역방향 프라이머 (5'-ATGCTCGTCAAGAAGACAGG-3)를 이용하였다. PCR후 DNA 밴드는 전기 영동하여 에디티움 브로마이드(ethidum bromide) 염색후 UV하에서 관찰하였다. 관찰된 결과는 도 11에서 확인할 수 있다.

3. 줄기세포의 체외분화검토

배아줄기세포의 체외 분화능을 조사하기 위하여 다수의 콜로니를 3배엽성의 특성을 갖는 배상체(embryoid body, EB) 로 4일 동안 만든 다음 젤라틴(gelatin)이 코팅된 배양용기에 부착시킨 후 혈청이 들어있는 배양액 내에서 2주일간 자발적인 분화를 유도시켜 염색을 실시하였다. 분화된 세포는 4% PFA로 15분 동안 고정하고 PBS로 세척하고 0.2% 트리톤 X-100용액으로 10분 동안 침투시킨 후, 10% 염소 혈청으로 1시간 블로킹 하였다. 외배엽 특성을 조사하기 위해 신경세포 인자인 anti-네스틴 폴리클로날(nestin polyclonlal) 항체(nestin, 1:500, Chemicon), 중배엽 특성을 조사하기 위해 근육세포 항체(anti-α-smooth muscle actin monoclonal 항체 (SMA, 1;25, Santacruz사 제조)), 내배엽 특성을 조사하기 위해 간세포 항체(anti-α-fetoprotein polyclonal 항체 (AFP, 1;200, Sigma사 제조))를 각각 사용하였으며 4℃에서 오버나잇 반응하였다. 각각의 일차 항체에 대한 반응 정도는 TRITC가 부착된 2차 항체(TRITC conjugated goat anti-rabbit IgG, 1:200, Jackson Lab 제조)를 처리하고 DAPI(1:1000)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 PBS로 충분히 세척하여 형광현미경 하에서 그 결과를 관찰하였다.

결과분석

1. 인간 체세포에 유전자 도입여부 검토

도 8은 유전자 도입 후 24시간 후의 체세포의 현미경 사진(A) 및 형광 현미경 사진(B)이다. 도 8을 참조하면, 비너스(Venus) 표지 유전자가 발현된 것을 알 수 있었다.

도 9는 비교예(A) 및 실시예(B)의 방법에 의하여 유전자가 도입된 체세포의 48시간 후 모습을 보여주는 형광 현미경 사진이다. 도 9를 참조하면 비교예의 방법에 의하여 유전자 도입이 이루어진 체세포의 경우보다 실시예의 방법에 의하여 유전자 도입이 이루어진 체세포의 경우가 유전자 도입 효율 이 우수한 것을 알 수 있다.

2. 체세포 유래 줄기세포(iPS)의 생산

도 10은 유전자 도입 후 20~25일 경과 후에 확인된 두 종류의 체세포 유래 줄기세포 (hips 1-1과 hips 1-2)의 현미경 사진(A 와 C) 및 형광 현미경 사진(B와 D)이다. 도 10을 참조하면, 콜로니 형태의 줄기세포가 수립되었음을 확인할 수 있다. 비교예 및 실시예의 방법에 의하여 유전자가 도입되어 형성된 콜로니 수를 비교하면 실시예의 방법에 의하여 형성된 콜로니의 수가 5.1배 많은 것을 확인할 수 있었다.

3. 체세포 유래 줄기세포(iPS)로부터 4가지 유전자의 발현확인

도 11은 체세포 유래 줄기세포 내의 유전자 발현을 보여주는 전기영동 사진이다. 도 11을 참조하면, 두 종류의 인간 체세포유래 줄기세포 (hips 1-1과 hips 1-2) 모두 각각 도입한 전사인자인 네 종류의 내인성(endogenous) 및 외인성 (exogenous) 유전자가 발현되어 있음을 확인할 수 있다.

4. 체세포유래 줄기세포의 특성 검토

(1) 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase, AP) 활성도 조사

도 12는 AP 가 활성화된 체세포 유래 줄기세포의 현미경 사진이다 (실체현미경-Fast Red Violet/Naphthol AS-BI 염색확인).

(2) SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60와 TRA-1-81 발현

도 13은 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60와 TRA-1-81 발현을 확인할 수 있는 현미경 사진들이다. A, B, C 와 D 는 SSEA-3 발현을 조사한 사진, E, F, G 와 H 는 SSEA-4 발현을 조사한 사진, I, J, K 와 L 는 TRA-1-60 발현을 조사한 사진 그리고 M, N, O 와 P는 TRA-1-81 발현을 조사한 사진이다. 도 13을 참조하면 A, E, I와 M 사진은 비너스 표지유전자가 발현됨을 확인할 수 있는 형광 현미경 사진이다. 또한 B, F, J와 N 사진은 DAPI 염색을 통한 형광 현미경 사진이고, C, G, K 와 O 사진은 TRITC 염색을 통하여 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60와 TRA-1-81 의 발현을 확인할 수 있는 사진이다. D, H, L과 P는 DAPI와 TRITC 결과를 합성한 사진이다. 도 13을 참 조하면 인간체세포유래 줄기세포의 표면인자가 공히 제대로 발현되었음을 확인할 수 있다.

(3) 체세포유래 줄기세포(iPS) 의 삼배엽성 분화특성 확인

- 배상체 (embryoid body) 형성 유도

도 14는 분화 유도 4일째의 줄기세포의 분화를 보여주는 현미경 사진(A) 및 형광 현미경 사진이다. 도 14를 참조하면, 배상체가 형성되고 비너스 표지 유전자가 발현되어 있음을 확인할 수 있다.

- 삼배엽성 분화유도

도 15는 분화 유도 14일째의 체세포유래 줄기세포의 분화를 보여주는 형광 현미경 사진들이다. 각 사진들에서 빨간색 부위는 TRITC 염색된 부위이고 파란색 부위는 DAPI 염색된 부위이다.

도 15을 참조하면, 외배엽 (신경세포, A), 중배엽 (근육세포, B) 및 내배엽 (간세포, C)의 분화가 일어났음을 확인할 수 있다.

이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

본 발명에 의하면, 난자를 사용하지 않는 인간 체세포 유래의 줄기세포를 획 기적인 효율로 제조할 수 있어 향후 대량 생산 공정이 가시화될 경우 공정 효율을 극대화하는데 획기적인 기여를 할 것으로 기대하고 있다.

도 1은 PCR 후 전기영동에 의하여 검출된 DNA 밴드를 보여주는 사진이다.

도 2는 pGEM-T 이지 벡터의 기작을 보여주는 개념도이다.

도 3은 T-벡터에 클로닝된 유전자들의 전기영동 사진이다.

도 4는 pENTR4 벡터의 기작을 보여주는 개념도이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 상동 재조합의 모습을 보여주는 개념도이다.

도 6은 바이러스 생산을 위한 인벨럽(envelope) 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 타겟 벡터의 모식도이다.

도 7은 239T 세포에 렌티바이러스 벡터가 감염된 모습을 보여주는 현미경 사진이다.

도 8은 유전자 도입 후 24시간 후의 체세포의 현미경 사진(A) 및 형광 현미경 사진(B)이다.

도 9는 비교예(A) 및 실시예(B)의 방법에 의하여 유전자가 도입된 체세포의 48시간 후 모습을 보여주는 형광 현미경 사진이다.

도 10은 유전자 도입 후 20~25일 경과 후에 확인된 두 종류 체세포 유래 줄기세포 주의 현미경 사진(A 와 C) 및 형광 현미경 사진(B와 D)이다.도 11은 두 종류 체세포 유래 줄기세포 주 내의 내인성 및 외인성 유전자 발현을 보여주는 전기영동사진이다.

도 12는 AP 가 활성화된 줄기세포의 현미경 사진이다.

도 13은 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 와 TRA-1-81 발현을 확인할 수 있는 현미경 사진들이다.

도 14는 분화 유도 4일째의 줄기세포의 분화를 보여주는 현미경 사진(A) 및 형광 현미경 사진 (B)이다.

도 15는 분화 유도 14일째의 줄기세포의 분화를 보여주는 형광 현미경

사진들이다.

Claims (11)

1. 인간 배아줄기세포로부터 Oct4 유전자, Sox2 유전자, Nanog 유전자 및 제4유전자를 준비하고 상기 각각의 유전자들을 렌티 바이러스 벡터 시스템 (lentiviral vector system)을 이용하여 숙주세포에 감염시켜 각각의 유전자들이 도입된 바이러스들을 생산하는 단계;

   상기 각각의 바이러스들을 농축 및 혼합하여 바이러스 농축 혼합액을 준비하고 상기 바이러스 농축 혼합액을 제1 배양액과 혼합하여 바이러스 용액을 준비하는 단계;

   미리 인간 체세포를 제1 배양용기에서 배양하는 단계;

   상기 제1 배양용기로부터 세포 분리용액을 이용하여 상기 배양된 인간 체세포를 분리하고 원심 분리하여 상기 인간 체세포를 부유시키는 단계;

   상기 부유된 인간 체세포를 상기 바이러스 용액과 혼합하여 체세포-바이러스 혼합액을 준비하는 단계;

   상기 체세포-바이러스 혼합액을 제2 배양액을 포함하는 제2 배양용기에 첨가 및 방치하여 상기 유전자들을 상기 체세포에 도입하는 단계; 및

   상기 유전자들이 도입된 체세포를 제3 배양액을 포함하는 제3 배양용기 내에서 배양시키는 단계를 포함하고,

   상기 부유된 인간 체세포의 적어도 일부는 2 내지 3 시간 동안 부유상태를 유지하는 것인, 줄기세포의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 제4 유전자는 Lin28인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,

   상기 감염 단계는,

   상기 인간 배아줄기세포로부터 상기 Oct4 유전자, Sox2 유전자, Nanog 유전자 및 제4 유전자를 각각 준비하여 상기 유전자들을 각각 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector)에 클로닝하는 단계; 및

   클로닝된 렌티 바이러스 벡터들을 상기 숙주세포에 감염시켜 상기 클로닝된 바이러스 벡터들에 의하여 상기 유전자들이 도입된 각각의 바이러스들을 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
5. 제1항에 있어서,

   상기 바이러스 농축은 원심분리에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
6. 제1항에 있어서,

   상기 바이러스의 혼합은 각각의 바이러스의 양이 동일하도록 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
7. 제1항에 있어서,

   상기 바이러스 농축 혼합액 및 제1 배양액은 1: 1 ~ 5의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,

   상기 체세포-바이러스 혼합액 및 제2 배양액의 부피 비율은 1: 10 ~ 20인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
10. 제1항에 있어서,

    상기 제1 배양액과 제2 배양액의 조성은 동일한 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
11. 삭제

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