WO2007114319A1 - 抗体の血中動態を制御する方法 - Google Patents

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Tomoyuki Igawa
Hiroyuki Tsunoda
Tatsuhiko Tachibana
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody modification method for controlling blood kinetics of an antibody, a pharmaceutical composition containing an antibody with controlled blood kinetics as an active ingredient, a method for producing the same, and the like.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 2
  • ADCC antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC complement-dependent cytotoxic activity
  • the blood half-life By improving the blood half-life, it is possible to expect a reduction in dosage and an extension of the administration interval, and it is possible to provide a low-cost and highly convenient antibody drug. Specifically, it is possible to extend the blood half-life by subjecting the Fc region to amino acid substitution that improves affinity for neonatal Fc receptor, which is known as an IgG salvage receptor. In addition, the half-life in blood can be improved by shuffling the CH1, CH2, and CH3 constant regions (Non-patent Document 6). However, since the amino acid sequence of the constant region of IgG antibody is conserved in humans, from the viewpoint of antigenicity, fewer artificial amino acid substitutions to be introduced into the constant region are better.
  • Non-Patent Document 10 The phase is largely dependent on the binding of IgG to the neonatal Fc receptor, which is a salvage receptor, and antigen-dependent loss (Non-Patent Document 10), and the variable region is thought to have no significant effect on the blood half-life.
  • Non-Patent Document 11 by squeezing IgG It reduces the isoelectric point (pi) of IgG (Non-patent Document 11) or is modified with polyamine to increase the pi of IgG (Non-patent Document 12). In either case, the half-life in blood is not improved, but the half-life is shortened, and the blood half-life can be improved by modifying pi by modification.
  • Non-patent Document 13 shows that by modifying Anti-Tac Fab with an organic acid, pi was reduced and AUC (Area under curve) was improved.
  • Non-Patent Document 15 and Non-Patent Document 16 show that when pi was decreased by modifying Anti-Tac dsFv with an organic acid, AUC decreased.
  • Non-patent document 17 shows that when pi is reduced by altering the variable region of Anti-Tac-scFv toxin by amino acid substitution, the half-life (tl / 2) and AUC are reduced.
  • Non-patent document 18 shows that the force of adding an amino acid that lowers pi to the C-terminal of scFv. In this way, low molecular weight antibodies are not modified! /, Or when pi is reduced by amino acid substitution, AUC may be improved or AUC may be reduced. To do Therefore, the blood half-life cannot always be controlled as intended.
  • Non-Special Terms 1 Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 2005; 23: 1073-1078
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  • Non-Special Terms 11 Yamasaki Y, Sumimoto K, Nishikawa M, Yamashita F, Yamaoka K, Hashida M, Takakura ⁇ , harmacokinetic analysis or in vivo disposition of succinylated proteins targeted to liver nonparenchymal cells via scavenger receptors: importanc e of molecular size and negative charge density for in vivo recognition by receptors.,
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  • Non-Patent Document 13 Yang K, Basu A, Wang M, Chintala R, Hsieh MC, Liu S, Hua J, Zhang ng, Zhou J, Li M, Phyu H, Petti G, Mendez M, Janjua H, Peng P , Longley C, Borowski V, Mehlig M, Filpula D., Tailoring structure-function and pharmacokinetic pro perties of single-chain Fv proteins by site-specific PEGylation., Protein Eng. 2003 Oct; 16 (10): 761-70 .
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  • Non-Patent Document 16 Kim IS, Yoo TM, Kobayashi H, Kim MK, Le N, Wang QC, Pastan I, Carras quillo JA, Paik CH., Chemical modification to reduce renal uptake of disulfide -bonded variable region fragment of anti -i, ac monoclonal antibody labeled with 99m Tc., Bioconjug Chem. 1999 May-Jun; 10 (3): 447-53.
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  • Non-Patent Document 25 Gobburu JV, Tenhoor C, Rogge MC, Frazier DE Jr, Thomas D, Benj amin C, Hess DM, Jusko WJ. Pharmacokinetics / dynamics of 5c8, a monoclonal anti body to CD 154 (CD40 ligand) suppression of an immune response in monkeys. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Aug; 286 (2): 925-30.
  • Non-Patent Document 26 Kashmiri SV, Shu L, Padlan EA, Milenic DE, Schlom J, Hand PH., Generation, characterization, and in vivo studies of humanized anticarcinoma antibody CC49., Hybridoma. 1995 Oct; 14 (5): 461-73.
  • Non-Patent Document 27 Graves SS, Goshorn SC, Stone DM, Axworthy DB, Reno JM, Bottin o B, Searle S, Henry A, Pedersen J, Rees AR, Libby RT., Molecular modeling and prural clinical evaluation of the humanized NR — LU— 13 antibody., Clin Cancer Res. 1999 Apr; 5 (4): 899-908.
  • Non-Patent Document 28 Couto JR, Blank EW, Peterson JA, Ceriani RL., Anti-BA46 monoclonal antibody Mc3: humanization using a novel positional consensus and in vivo and in vitro characterization., Cancer Res. 1995 Apr 15; 55 ( 8): 1717-22.
  • Non-Patent Document 29 Adams CW, Allison DE, Flagella K, Presta L, Clarke J, Dybdal N, McKeever K, Sliwkowski MX.Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab., Cancer Immunol Im munother. 2005 Sep 3 ;: 1-11
  • Non-Patent Document 30 Binz HK, Amstutz P, Pluckthun A., Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains., Nat Biotechnol. 2005 Oct; 23 (10): 1257-68.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the object thereof is by modification by substitution of amino acid residues exposed on the surface of a polypeptide containing an FcRn binding region such as an IgG antibody.
  • the present inventors have conducted intensive research on a method for controlling the blood half-life of a polypeptide containing an FcRn binding region by amino acid substitution. As a result, the present inventors modified the residues exposed on the surface of the variable region residues of IgG antibody, which is a polypeptide containing the FcRn binding region, and controlled the surface charge to control the IgG antibody blood.
  • a method to control the medium half-life has been developed. Specifically, we found a modified region of the variable region that can control the surface charge and control the blood half-life of an IgG antibody without affecting the function 'structure of the antibody. did. Furthermore, according to the present invention, it was confirmed that an antibody with a controlled blood half-life actually retains activity.
  • the method of the present invention is widely used for polypeptides containing FcRn-binding regions that are recycled through the salvage pathway of FcRn, such as IgG, regardless of the type of target antigen, and whose main metabolic pathway is not renal excretion. Applicable.
  • the present invention relates to a method for controlling the blood half-life of a polypeptide containing an FcRn binding region by amino acid substitution, by modifying the amino acid residues exposed on the surface of the polypeptide containing the FcRn binding region. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a polypeptide comprising an FcRn-binding region with a controlled blood half-life, and a method for producing these pharmaceutical compositions.
  • a method for producing a polypeptide comprising an FcRn-binding region with controlled blood kinetics wherein (a) the charge of at least one amino acid residue that can be exposed on the surface of the polypeptide comprising an FcRn-binding region is Altering a nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid residue to alter, (b) culturing the host cell to express the nucleic acid, and (c) including an Fc Rn binding region from the host cell culture. Recovering the polypeptide,
  • a method for controlling blood kinetics of a polypeptide containing an FcRn-binding region comprising: Altering the charge of at least one amino acid residue that can be exposed on the surface of the polypeptide comprising the binding region;
  • a human antibody comprising a complementarity-determining region (CDR) derived from a non-human animal, a framework region (FR) derived from a human and a human constant region, wherein the antibody is added to the surface of the antibody by CDR or FR.
  • At least one amino acid residue that can be exposed is an amino acid residue having a different charge from that of the corresponding position of wild-type CDR or FR, and the variable region is derived from an antibody derived from a non-human animal.
  • the method for producing a humanized antibody according to [17] or [18], comprising the step of culturing the host cell according to [21], the step of recovering the polypeptide from the cell culture, [23]
  • the charge of at least one amino acid residue is selected by the Kabat numbering in the heavy chain variable region, and the amino acid residue powers at positions 10, 12, 23, 39, 43, and 105 are also selected.
  • IgG antibody with controlled blood kinetics compared to before amino acid residue modification [24]
  • the modified amino acid residue is included in the following group (a) or (b) V:
  • composition comprising the IgG antibody according to [23] or [24] and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • FIG. 1 shows the results of evaluation of the coagulation activity of humanized bispecific antibodies (humanized A69 (hA69a) / humanized B26 (hB26-F123e4) / humanized BBA (hAL-F123j4)).
  • FIG. 1 shows the results of evaluation of the coagulation activity of humanized bispecific antibodies (humanized A69 (hA69a) / humanized B26 (hB26-F123e4) / humanized BBA (hAL-F123j4)).
  • FIG. 1 shows the results of evaluation of the coagulation activity of humanized bispecific antibodies (humanized A69 (hA69a) / humanized B26 (hB26-F123e4) / humanized BBA (hAL-F123j4)).
  • FIG. 1 shows the results of evaluation of the coagulation activity of humanized bispecific antibodies (humanized A69 (hA69a) / humanized B26 (hB26-F123e4) / humanized BBA (hAL-F123j4)).
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of antibody modeling. The side chains are highlighted for amino acids that can change the surface charge. For the number, use the sequence number of the Kabat database (Kabat EA et al. 1991. sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH).
  • FIG. 6 is a graph showing the calibration curve of the pi marker in isoelectric focusing for 6-pl5 and the pi of each sample calculated from the calibration curve. Changes in surface charge due to differences in the amino acid sequence of the variable region and changes in pi due to changes in surface charge due to amino acid modification were observed.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analyzing the binding activity to factor X, which is an antigen, using humanized B26 antibodies (hB26-F123e4, hB26-pl5) with unmodified and modified variable regions. As a result of the analysis, it was confirmed that the binding activity of the variants with different isoelectric points was equivalent.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in mouse plasma concentrations of ATF, hA69-PF, BiAb, and hB26-PF.
  • the present invention provides a method for controlling blood kinetics of a polypeptide containing an FcRn binding region.
  • a preferred embodiment of the method of the present invention is a method comprising changing the charge of at least one amino acid residue that can be exposed on the surface of a polypeptide comprising an FcRn binding region. That is, by changing the isoelectric point (pi) of the polypeptide containing the FcRn binding region by changing the charge of the amino acid residue, the blood kinetics of the protein can be controlled.
  • Non-Patent Documents 19 to 22 the efficiency of renal filtration in renal excretion shown in Non-Patent Documents 19 to 22 may be suppressed to the extent that it is negative for protein charge, while protein charge does not affect it.
  • the blood half is reduced by reducing the pi of the low molecular weight antibody.
  • Reabsorption of renal filtered protein into the proximal tubule may be suppressed to the extent that it is negative for the charge of the protein, and pi cannot freely control the blood half-life of low-molecular-weight antibodies. I don't think so.
  • IgG antibodies have a sufficiently high molecular weight, and thus the main metabolic pathway is not renal excretion.
  • IgG antibodies with Fc are known to have a long half-life by being recycled through the salvage pathway of FcRn expressed in endothelial cells such as blood vessels, and IgG is metabolized mainly in endothelial cells.
  • Non-patent Document 23 IgG that is non-specifically taken up by endothelial cells binds to FcRn, so that IgG is recycled and powerful molecules that cannot be bound are metabolized.
  • IgG with reduced binding to FcRn has a short blood half-life, and conversely, it can increase the blood half-life by increasing the binding to FcRn (Non-patent Document 23).
  • the conventional method for controlling blood kinetics of IgG has been performed by changing the binding to FcRn by modifying Fc.
  • the type of target antigen is selected. Regardless, it was shown that the blood half-life of IgG with the same Fc correlated with pi with a high correlation coefficient, and by actually changing the pi of the variable region in two types of antibodies against different antigens, Fc It was shown that it is possible to control the blood half-life without modifying.
  • the method for controlling blood kinetics found in the present invention is that FcRn binding regions in which the main metabolic pathway recycled by the salvage pathway of FcRn is not renal excretion, such as any IgG that does not depend on the type of target antigen Is widely applicable to polypeptides comprising
  • the polypeptide containing the FcRn-binding region in the present invention is not limited to an IgG antibody, but is a protein that can bind to an Fc receptor (FcRn) (has binding activity or affinity). If it is.
  • the polypeptide containing the FcRn-binding region in the present invention is a protein containing the Fc region or Fc-like region of an antibody, although not particularly limited thereto.
  • the polypeptide containing the FcRn binding region in the present invention include IgG antibodies. Further, even if these antibodies (proteins) are modified, any protein capable of binding to FcRn is included in the polypeptide containing the FcRn-binding region of the present invention.
  • the most preferred example of the polypeptide containing the FcRn binding region is an IgG antibody.
  • an IgG antibody when used as the polypeptide containing the FcRn-binding region of the present invention, it may be a bispecific IgG antibody that can be any subtype as long as it is an IgG type antibody molecule.
  • This bispecific antibody is an antibody having specificity for two different epitopes, and includes antibodies that recognize different antigens as well as antibodies that recognize different epitopes on the same antigen. Even in the case of antibody molecules, in the case of low molecular weight antibodies where renal excretion is the main metabolic pathway for scFv and Fab, pi cannot control blood dynamics as described above.
  • the present invention can be applied to any antibody molecular form as long as renal excretion is not the main metabolic pathway, as long as it is an Fc-binding protein.
  • examples thereof include scFv-Fc, dAb-Fc, and Fc-fusion protein. Since renal excretion of these molecules is not a major metabolic pathway, blood kinetics can be controlled by changing pi by the method found in the present invention.
  • the antibody molecule to which the present invention can be applied may be an antibody-like molecule.
  • An antibody-like molecule is a molecule that exhibits a function by binding to a target molecule (Non-patent Document 30), and examples thereof include DARPins, Affibody, and Avimer.
  • blood kinetics are controlled means that the blood kinetics is the target direction by comparing the blood kinetics before and after modification of the polypeptide containing the FcRn binding region. It means that it has changed. That is, when the purpose is to increase the blood half-life, control of blood kinetics means to increase the blood half-life, and when the purpose is to shorten the blood half-life, Moderate control means shortening the blood half-life.
  • control of blood kinetics in the present invention means any parameter such as half-life in blood, average blood residence time, blood clearance, etc. (understanding by pharmacokinetic exercises (Nanyama Do))). For example, it can be evaluated as appropriate by performing non-compartmental analysis according to the attached procedure using the pharmacokinetic analysis software WinNonlin (Pharsight).
  • the "amino acid that can be exposed to the surface” usually refers to an amino acid on the surface of a polypeptide constituting the polypeptide containing the FcRn binding region.
  • An amino acid on the surface of a polypeptide is an amino acid whose side chain can be in contact with a solvent molecule (usually a water molecule), and not necessarily all of the side chains need to be in contact with a solvent molecule.
  • the amino acid is the amino acid on the surface.
  • a person skilled in the art can create a homology model of a polypeptide or antibody by homology modeling using commercially available software, etc., and thereby select an appropriate residue as an amino acid on the surface. it can.
  • the “amino acid that can be exposed on the surface” is not particularly limited, but is preferably outside the FcRn binding region in the polypeptide containing the FcRn binding region! /.
  • the FcRn binding region include an Fc region and an Fc-like region.
  • the amino acid residue whose charge is changed is the amino acid in the heavy chain variable region or the light chain variable region of the IgG antibody. It is preferably a residue.
  • the variable region include a complementarity determining region (CDR) and a framework region (FR).
  • HI, H3, H5 , H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H39, H42, H43, H44, H46, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, ⁇ 85 , ⁇ 86, H105, H108, HI10, HI12 can be exemplified as surface amino acids The present invention is not limited to these.
  • H chain CDR region surface amino acids can be similarly selected using a homology model.
  • H97 is exposed on the surface of almost all antibodies.
  • L In the chain FR region LI, L3, L7, L8, L9, Lll, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L38, then 39, then 41, then 42, then 43, then 45, then 46, 49, then 57, then 60, then 63, then 65, then 66, then 68, then 69, then 70, then 74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, L107 , L108 can be exemplified as the surface amino acid, but the present invention is not limited thereto.
  • surface amino acids can be selected in the same manner using a homology model.
  • Modification of an amino acid residue in the method of the present invention specifically refers to substitution of the original amino acid residue with another amino acid residue, deletion of the original amino acid residue, This refers to adding a new amino acid residue, etc., but preferably refers to substituting the original amino acid residue with another amino acid residue. That is, the “modification of charge of amino acid residue” in the present invention preferably includes amino acid substitution.
  • the polypeptide containing the FcRn binding region is an IgG antibody
  • the amino acid residue charge for example, Kabat in the heavy chain variable region of the IgG antibody.
  • examples include an embodiment in which the charge of at least one amino acid residue selected at the 10th, 12th, 23rd, 39th, 43th, and 105th positions by numbering is changed.
  • amino acid residues shown in the above numbering amino acid residues other than those whose charge has been modified need not be modified as long as the desired blood kinetics can be controlled. As appropriate, it can be modified so that it has the same kind of charge as the modified amino acid residue or no charge.
  • amino acids charged amino acids are known. Generally, lysine), arginine (R), and histidine (H) are known as positively charged amino acids (positively charged amino acids). Aspartic acid (D), glutamic acid (E), and the like are known as negatively charged amino acids (negatively charged amino acids). Other amino acids are known as non-charged amino acids.
  • modified amino acid residue is preferably selected as appropriate from the following (a) or (b) V, an amino acid residue group included in the group of shifters, Not limited.
  • the amino acid residue is preferably modified so that the isoelectric point (pi) of the polypeptide containing the FcRn-binding region is changed.
  • these amino acid residues may contain a small number of non-charged amino acid residues.
  • the number of amino acid residues subjected to modification in the method of the present invention is not particularly limited.
  • the minimum amino acid residues necessary to achieve the desired controlled blood kinetics in order not to reduce the binding activity with the antigen.
  • the modified amino acid sequence is preferably a human sequence in order to not increase the antigenicity, but the present invention is not limited to this.
  • mutations may be introduced at locations other than the alteration introduced so that the isoelectric point is changed so that the modified FR (FR1, FR2, FR3, FR4) becomes a human sequence as each FR.
  • a method for replacing each FR with a human sequence in this way is reported in a non-patent document (Ono K et al., Mol Immunol. 1999 Apr; 36 (6): 387-395.).
  • each FR in order to change the isoelectric point of each FR, it may be changed to another human FR whose isoelectric point changes (for example, FR3 may be replaced with another human FR whose isoelectric point decreases) ).
  • FR3 may be replaced with another human FR whose isoelectric point decreases
  • Such humanization methods are reported in non-patent literature (Dall'Acqua WF., Methods. 2005 May; 36 (l): 43-60.).
  • the target controlled blood kinetics cannot be reached with slight surface charge modification!
  • Non-Patent Document 24 compares the blood kinetics of chimera EP5C7.g4, which is a chimeric antibody (IgG4) of anti-E, P-Selectin antibody, and HuEP5C7.g4, which is a human rabbit antibody (IgG4). It has been shown that the blood kinetics of the individuals are comparable.
  • Non-Patent Document 25 includes anti-CD154. It was shown that the blood kinetics in the force-quizal of ch5d8, which is a chimeric antibody of the antibody, and Hu5c8, which is a human potato antibody, are comparable in both blood kinetics.
  • Non-patent document 26 shows that the blood kinetics of the chimeric antibody cCC49 and the human ivy antibody HuCC49 in mice are equivalent.
  • Non-patent document 27 and non-patent document 28 show that in the evaluation in mice, the distribution of blood kinetics of mouse antibody and humanized antibody is equivalent, and mouse Fc and human Fc are Since both cross the mouse FcRn, the blood kinetics and distribution of the chimeric antibody and the humanized antibody are considered to be equivalent.
  • blood kinetics are comparable between chimeric and humanized antibodies. That is, when humanized by a known method described in Non-Patent Document 7, etc., the blood kinetics are equivalent to those of the chimeric antibody, and humanized antibodies with controlled blood kinetics are produced by known methods. It is not possible.
  • the blood kinetics are controlled as compared with the chimeric antibody by changing the pi of the antibody by modifying the surface amino acid.
  • Humanized antibodies can be made that have been controlled (ie, have increased blood half-life or decreased blood kinetics).
  • the modification of the surface amino acid for controlling blood kinetics may be performed at the same time as the humanization, or may be further modification of the human rabbit antibody.
  • Non-Patent Document 29 blood movements of three humanized antibodies trastuzumab, bevacizumab, and pertuzumab humanized using the same human antibody FR sequence
  • g is almost I have a strong power. That is, when humanization is performed using the same FR sequence, the blood kinetics are almost the same.
  • blood concentration can be controlled for the first time by changing the pi of the antibody by modifying the surface amino acid by the method found in the present invention. Become.
  • human antibody libraries can be compared to the human antibody produced first by changing the pi of the antibody by altering the surface amino acid of the human antibody produced by human antibody-producing mice.
  • human antibodies with controlled blood kinetics ie, increased blood half-life or decreased blood kinetics
  • the amino acid sequence of the antibody in which the charge of the amino acid residue is modified as described above is further changed by amino acid substitution, deletion, addition and Z or insertion. Modified antibodies are included. In addition, for antibodies whose amino acid sequence has been altered by amino acid substitution, deletion, addition and Z or insertion, or chimerization or humanization, antibodies whose amino acid residue charge has been further altered. included.
  • Amino acid substitutions, deletions, additions, and Z or insertions, and alterations in amino acid sequences such as humanization and chimerization can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the variable region and constant region of an antibody used when the antibody of the present invention is produced as a recombinant antibody are also used for amino acid substitution, deletion, addition and Z or insertion, or chimerization or humanization. You can modify the amino acid sequence more.
  • the antibody in the present invention may be an antibody derived from any animal such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, or a camel antibody.
  • a modified antibody in which an amino acid sequence is substituted such as a chimeric antibody, and a humanized antibody may be used. It may also be a modified antibody in which various molecules are bound.
  • Chimeric antibody is an antibody produced by combining sequences derived from different animals. For example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable (V) region and a human antibody heavy chain and light chain constant (C) region can be exemplified. The production of a chimeric antibody is known, for example, by linking a DNA encoding an antibody V region and a DNA encoding a human antibody C region, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it. Antibody can be obtained
  • Humanized antibody refers to a complementarity determining region (CDR) of an antibody derived from a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, also called a reshaped human antibody. Implanted into antibody CDRs. Methods for identifying CDRs are well known and fe (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National
  • amino acid residues in FR that can be modified include those that bind directly to the antigen by non-covalent bonds (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53) and those that affect or act on the CDR structure (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17) and the portion related to the VH-VL interaction (EP239400 patent publication).
  • the C region of these antibodies is preferably derived from a human antibody.
  • C 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3 and C ⁇ 4 can be used for the H chain, and C ⁇ and C ⁇ can be used for the L chain.
  • the human antibody C region may be modified as necessary to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody in the present invention preferably comprises a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a constant region derived from a human antibody.
  • the humanized antibody is preferably composed of CDRs of antibodies derived from mammals other than human and FR and C regions derived from human antibodies.
  • the constant region derived from a human antibody has a unique amino acid sequence for each isotype such as IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the constant region used for the humanized antibody in the present invention may be a constant region of an antibody belonging to any isotype.
  • the HI HgG constant region is used, but is not limited thereto.
  • the FR derived from a human antibody used for a humanized antibody is not particularly limited, and may be an antibody belonging to any isotype.
  • variable region and constant region of the chimeric antibody and humanized antibody in the present invention may be modified by deletion, substitution, insertion and / or addition as long as the binding specificity of the original antibody is exhibited.
  • Chimeric antibodies and humanized antibodies using human-derived sequences are considered useful when administered to humans for therapeutic purposes and the like due to their reduced antigenicity in the human body.
  • the antibody before mutagenesis in the method of the present invention (in the present specification, simply referred to as "the present invention
  • a known sequence can be used for the gene encoding the H chain or L chain of the antibody (which may be referred to as “antibody”), and can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be obtained from an antibody library, or a hybridoma that produces a monoclonal antibody can also be obtained by cloning a gene encoding the antibody.
  • antibody libraries many antibody libraries are already known, and methods for producing antibody libraries are also known, so that those skilled in the art can appropriately obtain antibody libraries. is there.
  • antibody phage libraries Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97, Water houses et al "Nucleic Acids Res 1993, 21: 2265-6, Griffiths et al "EMBO J. 1994, 13: 3245-60, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14, and JP 20-504970 You can refer to the literature.
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of a phage by the phage display method, and a phage that binds to an antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • an appropriate expression vector can be prepared based on the sequence to obtain a human antibody.
  • a method for obtaining a gene encoding an antibody of an hybridoma antibody uses a known technique, using a desired antigen or a cell expressing the desired antigen as a sensitizing antigen.
  • the obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and monoclonal antibody-producing cells (nobridoma) are screened by the usual screening method.
  • monoclonal antibody-producing cells are screened by the usual screening method.
  • the sensitized antigen for obtaining the antibody gene encoding the H chain and L chain is a complete antigen having immunogenicity. And incomplete antigens including haptens that do not exhibit immunogenicity.
  • a full-length protein of the target protein or a partial peptide can be used.
  • substances composed of polysaccharides, nucleic acids, lipids and the like can serve as antigens, and the antigen of the antibody of the present invention is not particularly limited.
  • Antigens can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, according to methods using baculovirus (eg, W098 / 46777).
  • Hypridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al. (G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46).
  • the immunogenicity of the antigen is low, it may be immunized by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a soluble antigen can be obtained by binding an antigen to other molecules as necessary.
  • a transmembrane molecule such as a receptor
  • the extracellular region of the receptor can be used as a fragment, or a cell expressing the transmembrane molecule on the cell surface can be used as an immunogen. .
  • Antibody-producing cells can be obtained by immunizing an animal with the appropriate sensitizing antigen described above. Alternatively, antibody-producing cells can be obtained by immunizing lymphocytes capable of producing antibodies in vitro.
  • lymphocytes capable of producing antibodies in vitro.
  • mammals to be immunized various mammals can be used, but rodents, maggots, and primates are generally used. Examples include primates such as rodents such as mice, rats, mice, and mussters, maggots such as magpies, and monkeys such as cynomolgus monkeys, monkeys, baboons and chimpanzees.
  • transgenic animals having a repertoire of human antibody genes are also known, and human antibodies can be obtained by using such animals (WO96 / 34096; Mendez et al., Nat. Genet 199 7, 15: 146-56).
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are human myeloma cells such as U266. Can be obtained to obtain a desired human antibody having an antigen-binding activity (see Japanese Patent Publication No. 59878).
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (W093 / 12227, WO92 / 03918, W094).
  • a sensitized antigen is appropriately diluted and suspended in Phosphate-Buffered Saline (PBS) or physiological saline, etc., and mixed with an adjuvant as necessary to emulsify the animal. Performed by intraperitoneal or subcutaneous injection. Thereafter, preferably, a sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is administered several times every 4 to 21 days. Confirmation of antibody production can be performed by measuring the desired antibody titer in the serum of animals by a conventional method.
  • Hyperidoma is produced by fusing antibody-producing cells obtained from animals or lymphocytes immunized with a desired antigen with myeloma cells using a conventional fusion agent (eg, polyethylene glycol).
  • a conventional fusion agent eg, polyethylene glycol
  • the hybridoma cells are cultured and proliferated, and the binding specificity of the antibody produced by the hybridoma is determined by a known analysis method such as immunoprecipitation, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), etc. taking measurement.
  • the hybridoma producing the antibody having the target specificity, affinity or activity measured can be subcloned by a technique such as limiting dilution.
  • a probe for example, a sequence encoding an antibody constant region
  • an antibody-producing cell such as sensitized lymphocyte
  • a gene encoding the selected antibody such as sensitized lymphocyte
  • clone from mRNA by RT-PCR.
  • Immunoglobulins fall into five different classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM. In addition, these classes are divided into several subclasses (isotypes) (eg IgG-1, IgG-2, IgG-3, and IgG-4; IgA-1 and IgA-2, etc.).
  • the H chain and L chain used for antibody production in the present invention may be derived from antibodies belonging to any of these classes and subclasses, but are not particularly limited, but IgG is particularly preferred.
  • the genes encoding the H chain and the L chain can be modified by genetic engineering techniques.
  • genetically engineered antibodies that have been artificially modified to reduce xenoantigenicity to humans such as mouse antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, hamster antibodies, Hedge antibodies, camel antibodies, etc.
  • chimeric antibody, humanized antibody, etc. Can be produced as appropriate.
  • a chimeric antibody is an antibody consisting of the variable regions of the non-human mammal, for example, the H chain and L chain of a mouse antibody, and the constant regions of the H chain and L chain of a human antibody, and encodes the variable region of a mouse antibody.
  • the DNA to be obtained can be obtained by ligating the DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • the human rabbit antibody is also called a reshaped human antibody, and has a DNA sequence designed to link the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals such as mouse antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Several oligonucleotides prepared so as to have overlapping parts are synthesized by the PCR method.
  • the obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (see EP239400; WO96 / 02576).
  • the human antibody FR to be ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen-binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms the appropriate antigen-binding site (K. Sato et al, Cancer Res. 1993, 53: 851-856).
  • modifications may be made to improve the biological properties of the antibody, such as binding to the antigen.
  • the modification in the present invention can be carried out by site-specific mutation (see, for example, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), PCR mutation, cassette mutation, and the like.
  • antibody variants with improved biological properties are 70% or more, more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more (e.g., 95% or more, 97%, 98%, 99%, etc.) amino acids It has the amino acid sequence of the variable region of the antibody based on sequence homology and / or similarity.
  • sequence homology and / or similarity is defined as the difference between the original antibody residue after aligning the sequence and introducing a gap as necessary so that the sequence homology takes the maximum value. It is defined as the percentage of amino acid residues that are homologous (same residues) or similar (amino acid residues that fall into the same group based on the characteristics of the side chains of common amino acids).
  • natural amino acid residues are based on the properties of their side chains: (1) hydrophobicity: alanine, isoleucine, parin, methionine and leucine; (2) neutral hydrophilicity: asparagine, glutamine, cysteine, threonine and Serine; (3) acidity: aspartic acid and glutamic acid; (4) basicity: arginine, histidine and lysine; (5) in chain orientation Residues affected: Glycine and proline; and (6) Aromaticity: categorized into tyrosine, tributophane and feruaranine groups.
  • variable regions of the H chain and L chain interact to form the antigen-binding site of the antibody.
  • CDR complementarity determining regions
  • the antibody gene encoding the H chain and L chain of the present invention is not limited as long as the polypeptide encoded by the gene maintains the binding property with the desired antigen. It suffices if the fragment portion containing the antigen binding site is coded.
  • the heavy chain variable region is usually composed of three CDR regions and four FR regions.
  • amino acid residues to be used for “modification” can be appropriately selected from, for example, amino acid residues located in the CDR region or FR region.
  • modification of the amino acid residues in the CDR region may reduce the antigen-binding ability. Therefore, the amino acid residue to be used for “modification” in the present invention is not particularly limited, but is preferably selected from amino acid residues located in the FR region. If it is confirmed that the binding ability of the CDR is not reduced by the modification, it is possible to select the location.
  • sequences that can be used as FRs of antibody variable regions in organisms such as humans and mice can be appropriately obtained by those skilled in the art using public databases and the like.
  • the present invention relates to a polypeptide comprising an FcRn-binding region whose blood kinetics are controlled by the method of the present invention.
  • a human sputum antibody whose blood kinetics are controlled by the method of the present invention.
  • the human antibody is, for example, a humanized antibody comprising a complementarity determining region (CDR) derived from a non-human animal, a framework region (FR) derived from human and a human constant region, and the antibody surface in CDR or FR
  • CDR complementarity determining region
  • FR framework region
  • At least one amino acid residue that can be exposed to is an amino acid residue having a different charge from the amino acid residue at the corresponding position of wild-type CDR or FR
  • the variable region is derived from an antibody derived from the non-human animal And the same stationary It is a humanized antibody with controlled blood kinetics compared to a chimeric antibody having a region.
  • the human constant region preferably refers to a region containing a wild-type human Fc region, but may be a modified Fc! /.
  • the present invention also relates to a method for producing a polypeptide comprising an FcRn binding region with controlled blood kinetics by using the method of the present invention. That is, the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising an FcRn binding region with controlled blood kinetics. Furthermore, polypeptides comprising an FcRn binding region produced by the method of the present invention are also included in the present invention.
  • a preferred embodiment of the production method of the present invention is a method for producing a polypeptide comprising an FcRn-binding region with controlled blood kinetics, wherein (a) the polypeptide is exposed on the surface of the polypeptide containing the FcRn-binding region. Modifying a nucleic acid encoding a polypeptide comprising said amino acid residue such that the charge of at least one amino acid residue is altered, (b) culturing a host cell so that said nucleic acid is expressed, (c) Recovering a polypeptide comprising an FcRn binding region from a host cell culture.
  • modifying a nucleic acid refers to modifying a nucleic acid so as to correspond to the amino acid residue introduced by the “modification” in the present invention. More specifically, it means that a nucleic acid encoding an original (before modification) amino acid residue is modified to a nucleic acid encoding an amino acid residue introduced by the modification. Usually, it means that genetic manipulation or mutation treatment is performed such that at least one base is inserted, deleted or substituted into the original nucleic acid so as to be a codon for coding the target amino acid residue. That is, the codon encoding the original amino acid residue is replaced by the codon encoding the amino acid residue introduced by the modification.
  • Such nucleic acid modification can be appropriately performed by those skilled in the art using known techniques such as site-directed mutagenesis and PCR mutagenesis.
  • the nucleic acid of the present invention is usually carried (inserted) in an appropriate vector and introduced into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it stably holds the inserted nucleic acid.
  • Escherichia coli is used as the host, a pBluescript vector (Stratagene) is preferred as a cloning vector. It is possible to use various commercially available vectors.
  • an expression vector is useful.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
  • a pBEST vector manufactured by Promega
  • pET vector manufactured by Invitrogen
  • pME18S-FL 3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)
  • the DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells may be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing a polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila). S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells can be exemplified.
  • bacterial cells eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus
  • insect cells eg, Drosophila
  • S2, Spodoptera SF9 animal cells
  • animal cells eg CHO, CO
  • Vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipofussion method, microphone It can be carried out by a known method such as a mouth injection method.
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest.
  • These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or they may be heterologous signals.
  • the polypeptide is recovered when the polypeptide of the present invention is extracted in the medium.
  • the polypeptide of the present invention is produced in a cell, the cell is first lysed, and then the polypeptide is recovered.
  • the ability of recombinant cell culture to recover and purify the polypeptides of the present invention also includes ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, ion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobicity.
  • Ammonium sulfate or ethanol precipitation acid extraction, ion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobicity.
  • Interaction chromatography Known methods, including tea chromatography, hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography can be used.
  • the present invention also provides a composition (pharmaceutical) comprising a polypeptide (eg, an IgG antibody) containing an FcRn-binding region whose blood kinetics are controlled by the method of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a composition comprising a polypeptide (eg, an IgG antibody) containing an FcRn-binding region whose blood kinetics are controlled by the method of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition usually refers to a drug for treatment or prevention of a disease, or examination / diagnosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection in the form of a suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterilized water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, antiseptic It may be formulated in combination with drugs, binders, etc., by mixing in unit dosage forms generally required for pharmaceutical practice.
  • the amount of active ingredient in these preparations is set so that an appropriate amount within the specified range can be obtained.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice using a vehicle such as water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (eg D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • a suitable solubilizing agent such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and Z or benzyl alcohol may be used in combination as a solubilizing agent.
  • a buffer for example, phosphate buffer solution and sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, pro-hydrochloric acid hydrochloride
  • a stabilizer for example, benzyl alcohol and phenol
  • an antioxidant also good.
  • the prepared injection is usually filled into a suitable ampoule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
  • parenteral administration for example, injection Type, nasal dosage form, pulmonary dosage form, and transdermal dosage composition.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose of the pharmaceutical thread or the composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be set, for example, in the range of O.OOOlmg to lOOOmg per kg body weight at a time. Or, for example, the power that can be a dose of 0.001 to 100,000 mg per patient.
  • the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but those skilled in the art can set an appropriate administration dose and administration method in consideration of these conditions.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a polypeptide that constitutes a polypeptide (eg, a humanized antibody) containing an FcRn-binding region whose blood dynamics are controlled by the method of the present invention. Furthermore, a vector carrying the nucleic acid is also included in the present invention.
  • the present invention provides a host cell having the nucleic acid.
  • the host cell is not particularly limited, and examples thereof include E. coli and various animal cells.
  • the host cell can be used, for example, as a production system for production and expression of the antibody or polypeptide of the present invention.
  • Production systems for polypeptide production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • Examples of eukaryotic cells that can be used as host cells include animal cells, plant cells, and fungal cells.
  • animal cells include mammalian cells such as CHO (j. Exp. Med. (1995) 108: 945), COS ⁇ HEK293, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa ⁇ Vero, and amphibian cells such as Examples are Xenopus oocytes (Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340), and insect cells such as S19, Sf21, Tn5.
  • CHO-DG44 For the expression of the antibody of the present invention, CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7 cells, HEK293 cells, and BHK cells are preferably used. In animal cells, CHO cells are particularly preferred for the purpose of mass expression.
  • introduction of the vector into the host cell for example, calcium phosphate method, DEAE dextran method, cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim) It can be performed by a method such as the method used, the elect mouth position method, or lipofection.
  • plant cells for example, cells derived from Nicotiana tabacum and Lemna minor are known as protein production systems, and the antibody of the present invention can be obtained by a method of culturing these cells.
  • Fungal cells include fermenters such as cells of the genus Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharom; Saccharomyces pombe etc.), and filamentous fungi such as Aspergillus.
  • Protein expression systems using cells of the genus (such as Aspergillus niger) are known and can be used as the antibody production host of the present invention.
  • prokaryotic cells there is a production system using bacterial cells.
  • a production system using Bacillus subtilis in addition to the above-mentioned E. coli is known and can be used for the production of the antibody of the present invention.
  • a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody of the present invention is cultured to express the polynucleotide.
  • the culture can be performed according to a known method. For example, when animal cells are used as hosts, for example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as a culture solution. At that time, the cells may be cultured by serum-free culture, even in combination with serum supplements such as FBS and fetal calf serum (FCS).
  • the pH during culture is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, with medium exchange, aeration, and agitation as necessary.
  • examples of the system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the target polynucleotide is introduced into these animals or plants, and the polypeptides are produced and collected in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When animals are used, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, pigs, hidges, mice, mice, etc. can be used (Vicki Glaser, SPECTRU M Biotechnology Applications (1993)). In addition, when using mammals, Nick animals can be used.
  • a polynucleotide encoding the antibody of the present invention is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat j8 casein.
  • the polynucleotide fragment containing the fusion gene is then injected into a goat embryo and the embryo is transferred to a female goat.
  • the antibody of interest can be obtained from the milk produced by the transgene goat born from the goat that received the embryo or its progeny. Hormones may be administered to the transgenic sheep as appropriate in order to increase the amount of milk containing antibodies produced by the transgenic dog (Ebert et al., Bio / Technology (1994) 12: 699-702) .
  • a silkworm can be used as an insect that produces the antibody of the present invention.
  • the antibody of interest can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with baculovirus inserted with a polynucleotide encoding the antibody of interest (Susumu et al "Nature (1985) 315 : 592-4).
  • a plant for producing the antibody of the present invention
  • tobacco can be used.
  • a polynucleotide encoding the antibody of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired antibody can be obtained from the leaves of this tobacco (Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131- 8).
  • a desired antibody can be obtained from duckweed cells (Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 200 6 Dec; 24 (12) : 1591-1597) 0
  • the antibody thus obtained can be isolated from the host cell or the outside of the cell (medium, milk, etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. Separation and purification of antibodies are not limited in any way as long as separation and purification methods used in usual polypeptide purification are used. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. In combination, antibodies can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography ⁇ , etc .; ⁇ 2 »Gare (Strategies for Protein Purincation ana Charactenzatio n: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. (199b Cold Spring Harbor Laboratory Press)
  • chromatographies are liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • Columns used for affinity mouthmatography include protein A columns and protein G.
  • columns using protein A include Hyper D, POROS, and Sepharose FF. (Pharmacia) and the like.
  • an appropriate protein-modifying enzyme can be allowed to act before or after purification of the antibody, and the peptide can be partially removed.
  • the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidease, protein kinase, darcosidase and the like.
  • a method for producing a polypeptide comprising the FcRn-binding region of the present invention with controlled blood kinetics comprising the steps of culturing the host cell of the present invention as described above and recovering the cell culture force polypeptide. This is one of the preferred embodiments of the present invention.
  • this is a bispecific antibody consisting of a combination of anti-Factor Xa antibody A69-VH, anti-Factor X antibody B26-VH, and hybrid light chain (BBA), which has the strongest effect on shortening blood clotting time.
  • BBA hybrid light chain
  • A69- heavy chain variable region KABATID- 000064 (Kabat Database)
  • B26- H chain variable region EMBL Accession No. AB063872 (IMGT Database)
  • Humanized antibodies were prepared by grafting the complementary antigen-determining regions (hereinafter referred to as CDRs) of each mouse antibody into the human antibody FRs of (l)-(3).
  • 12 synthetic oligo DNAs of about 50 bases were prepared alternately so that the ends were annealed by about 20 bases.
  • the synthetic oligo DNA was designed to encode a human sequence at the 5 ′ end, a mouse sequence at the 3 ′ end, or all bases to encode a human sequence. Furthermore, it anneals to the 5 'end of the antibody variable region gene, anneals to the primer having the Xhol cleavage sequence and the 3' end of the antibody variable region gene, has the Sfil cleavage sequence, and the 5 'end sequence of the intron sequence.
  • a coding primer was made.
  • Synthetic oligo DNA prepared to 2.5 ⁇ M is mixed at 1 ⁇ L each, and lx TaKaRa Ex Taq Buffer, 0.4 mM dNTPs, 0.5 units TaKaRa Ex Taq (all Takara Shuzo) is prepared, and the reaction solution becomes 48 ⁇ L. It was prepared as follows. After incubating at 94 ° C for 5 minutes, reactions of 94 ° C for 2 minutes, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes were performed for 2 cycles to assemble and extend each synthetic oligo DNA.
  • the fragment was cloned using pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) by the method described in the attached instructions.
  • the base sequence of each DNA fragment is determined using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) with the DNA sequencer ABI PRISM 3730x L DNA Sequencer or ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems) according to the method described in the attached instructions. did.
  • the reaction mixture was digested with 1% agarose gel electrophoresis. It was subjected to electrophoresis.
  • a DNA fragment of the desired size (about 400 bp) was purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) by the method described in the attached instruction, and eluted with sterilized water 301. Thereafter, an expression vector for animal cells was prepared as follows.
  • IgG4 which is a heterogeneous combination of heavy chains
  • IgGl knobs- into-hole technology Merchant AM et al., Nature Biotechnology, 1998, Vol. L6, p.677-681.
  • the amino acid substitution product to the CH3 part of IgG4 was used.
  • amino acid substitution -ppcpScp- ⁇ -ppcpPcp-
  • a chain variable region antibody gene fragment was inserted to prepare a humanized A69 heavy chain expression vector.
  • the humanized B26 heavy chain variable region antibody gene fragment was inserted into an expression vector in which the constant region gene substituted with E356C, T366S, L368A, or Y407V was inserted into pCAGGS.
  • a piece was inserted to prepare a humanized B26 heavy chain expression vector.
  • a plasmid (pCAG-g ⁇ DNA) in which the wild type antibody L chain constant region was inserted into pCAGGS was digested with EcoRI to prepare an expression vector in which the humanized BBA L chain variable region antibody gene fragment was inserted.
  • E. coli DH5 ⁇ strain was transformed using Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics).
  • Humanized bispecific antibodies were expressed using the following method. Human embryonic kidney cancer cell origin ⁇ 293 ⁇ strain (Invitrogen) is suspended in DMEM medium (Invitrogen) containing 10% Fetal Bovine Serum (Invitrogen), and dish for adherent cells at a cell density of 5-6 X 10 5 cells / mL Add 10 mL to each dish (diameter 10 cm, CORNING) CO incubator (37
  • CHO-S-SFM-II (Invitrogen) medium containing m (Invitrogen) was added.
  • 1 Mix the plasmid DNA mixture prepared in 1 (total 13.8 g) with 1 g / mL Polyethylenimine (Polyciences Inc.) 20.7 ⁇ L and CHO-S-SFMII medium 690 ⁇ L and let stand at room temperature for 10 minutes Throw in the cells in each dish and cook for 4-5 hours in a CO incubator (5% CO at 37 ° C)
  • Example 1 To ⁇ Ka ⁇ the 100 rProtein A of ⁇ L Sepharose T M Fast Flow ( Amersham Biosciences) in the culture supernatant obtained by the method described, was mixed by inversion over 4 hours at 4 ° C. Transfer the solution to a 0.22 ⁇ m filter cup Ultrafree (R) -MC ( Millipore), wash 3 times with 500 ⁇ L of TBS containing 0.01% Tween (R) 20, and then add 100 ⁇ l to rProtein A Sepharose TM resin. The suspension was suspended in 50 mM sodium acetate aqueous solution containing 0.01% Tween (R) 20 and pH 3.3 and allowed to stand for 2 minutes, and then the antibody was eluted. Immediately, 6.7 L of 1.5 M Tris-HCl, pH 7.8 was added and neutralized. [0092] 1-5. Concentration quantification of humanized bispecific antibody
  • Goat anti-human Igu (Biosource International) was prepared in a coating buffer of “tl ⁇ g / mL and immobilized on Nunc-Immuno plate (Nunc). After blocking with Diluent buffer (DB), DB As a standard for calculating antibody concentration, HI HgG4 (humanized anti-antigen) was diluted 11 times with DB in a 3-fold series from 2000 ng / mL.
  • TF antibody (see WO 99/51743) was added in the same manner, washed 3 times and then reacted with Goat anti-human IgG, alkaline phosphatase (Biosource International) After washing 5 times, Sigma 104 (R) phosphatase The color was developed using substrate (Sigma—Aldrich) as a substrate, and the absorbance at 405 nm was measured at a reference wavelength of 655 nm from the absorbance reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories) Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories) Using the software, the standard calibration curve force is also measured in the culture supernatant. HgG concentration was calculated.
  • BiacorelOOO or BiacoreQ was used, and quantification was performed using Sen sor Chip CM5 (BIACORE) to which Protein A was immobilized. Specifically, according to the manufacturer's protocol, react protein protein (SIGMA) solution diluted to 10 g / mL with 10 mM sodium acetate aqueous solution (pH 4.0, BIACORE) on activated sensor chip at 5 / z L / min for 30 min. Then, a blocking operation was performed to prepare a ProteinA-immobilized sensor chip. Using this sensor chip, the concentration of the culture supernatant and purified product was measured using Biacore 1000 (BIACORE).
  • SIGMA protein protein
  • HBS-EP Buffer (BIACOR E) was used for sensor chip fixation and concentration measurement.
  • a humanized IgG4 antibody humanized anti-tissue factor antibody, see WO 99/51743
  • HBS-EP Buffer in a 2-fold series from 4000 ng / mL was used as a standard for concentration measurement. .
  • Hemophilia To determine whether bispecific antibodies correct blood clotting ability, we examined the effect of the antibody on active ⁇ partial thromboplastin time (APTT) using Fact or VIII-deficient plasma. . A mixture of 50 ⁇ L of antibody solution of various concentrations 50 ⁇ L Factor VIII deficient plasma (Biomeri eux) and 50 ⁇ L of APTT reagent (Dade Behring) was heated at 37 ° C. for 3 minutes. The coagulation reaction is initiated by adding 50 L of 20 mM CaCl (Dade Behring) to the mixture.
  • APTT active ⁇ partial thromboplastin time
  • the bispecificity is determined from the clotting time when the bispecific antibody is added.
  • Factor VIII-like activity (%) of the antibody was calculated.
  • the FR amino acid of the human antibody was modified with the aim of increasing the activity of the humanized bispecific antibody with reduced blood coagulation ability.
  • mutation was introduced into the variable region of the humanized antibody using the method of Quik and hange 3 ⁇ 4ite-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) and the attached instruction manual 3 ⁇ 4.
  • the reaction solution was digested with 1% agarose gel. The sample was subjected to electrophoresis.
  • a DNA fragment of the desired size (about 400 bp) was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) by the method described in the attached instruction, and eluted with sterilized water 301. Thereafter, an expression plasmid for animal cells was prepared by the method shown in Example 1-2. Humanized bispecific antibodies were prepared by the methods shown in Examples 13, 4, 14 and 15, and the blood clotting activity was evaluated by the method shown in Example 16.
  • a humanized bispecific antibody (humanized A69 (hA6) having activity equivalent to that of the chimeric bispecific antibody (A69 / B26 / BBA) by repeated amino acid modification of the FR sequence and evaluation of blood coagulation ability 9a) / Humanized B26 (hB26-F123e4) / Humanized BBA (hAL-F123j4)) was obtained (FIG. 1).
  • Each antibody variable region sequence is shown in the following SEQ ID NOs.
  • Humanized A69 antibody VH (hA69a) SEQ ID NO: 1 (base sequence), SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence)
  • Humanized A69 antibody H chain variable region (hA69a, nucleotide sequence number: 1) and humanized B26 antibody H chain variable region (hB26) produced by Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) by the method described in the attached instructions -A mutation was introduced into F123e4, nucleotide sequence number: 3).
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • a DNA fragment of the desired size (about 400 bp) was purified by QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction, and eluted with sterilized water 301.
  • QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit
  • a DNA fragment was inserted into an expression plasmid having a wild-type constant region to prepare an H chain expression vector.
  • the modified amino acid residues and SEQ ID NOs of each antibody are shown in Table 1. (HA69-N97R, hA69-pl8), humanized B26 antibody (hB26-F123e4) and its variant (hB26-pl5) were prepared.
  • Humanized A69 antibody (hA69a) and its variants (hA69-N97R, hA69-pl8) are expressed in the H chain expression vector (variable regions are hA69-N97R, hA69-pl8) and L chain expression vectors (variable regions are hAL).
  • the humanized B26 antibody (hB26-F123e4) and its variant (hB26-pl5) are expressed in H chain expression vectors (variable regions are hB26-F 123e4 and hB26-pl5) L chain expression vectors (variable regions are B26-VL
  • the amino acid sequence is WO2005 / 035756 (SEQ ID NO: 18) was combined and expressed according to Example 13 The antibody in the culture supernatant was purified by the method shown in Example 14.
  • an antibody-expressing cell line was established as follows.
  • nucleotide sequence encoding the 2-amino acid (Ala-Ser) on the N-terminal side of the H chain constant region becomes the Nhel recognition sequence (GCTAGC) with the wild type H chain constant region gene of HgG4 PCR amplification of the H chain constant region using primers designed to have a Notl recognition site with the primer at the end of 3, and the primer at the end, and the pBluescriptKS + vector (Toyobo) Nhel, Notl (both PBCH4 (including IgG4 constant region gene) ligated with the vector digested with Takara Shuzo was prepared.
  • terminal nucleotide sequence of the H chain variable region of humanized A69-H chain antibody (hA69-PFL: SEQ ID NO: 11) and humanized B26-H chain antibody (hB26-PF: SEQ ID NO: 12)
  • Primer with a Kozak sequence (CCACC) and EcoRI recognition sequence and a primer with Nhel recognition sequence 3.
  • CCACC Kozak sequence
  • Nhel both Takara Shuzo
  • the variable region and the constant region were ligated by inserting into pBCH4 digested with EcoRI and Nhel.
  • the prepared humanized A69-H chain antibody vector was digested with EcoRI and Notl (both Takara Shuzo), and cloned into PCXND3, an expression vector for animal cells that was also digested with EcoRI and Notl.
  • the flow of construction of this vector pCXND3 is as follows. [0100] DHFR- ⁇ ⁇ -rVH-PM1-f (see W092 / 19759) antibody
  • EcoRI and Smal sites collect only the vector side, then Ec oRI-Notl-BamHI adaptor (Takara Shuzo) was clawed.
  • This vector was named pCHOI.
  • pCXND3 A vector in which the DHFR gene expression site of pCHOI was cloned into the restriction enzyme Hindlll site of pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) was named pCXND3.
  • the produced human B26-H chain antibody vector was digested with EcoRI and Notl (both Takara Shuzo), and cloned into an animal cell expression vector pCXZDl that was also digested with Eco RI and Notl.
  • the pCXZDl vector is an expression vector in which the neomycin resistance gene of the PCXND3 vector is replaced with a zeocin resistance gene.
  • Example 1-2 the L chain variable region of the humanized BBA-L chain antibody (hAL-s8, SEQ ID NO: 8) was cloned into a plasmid (pCAG-g ⁇ DNA) into which the L chain constant region was inserted.
  • a plasmid pCAG-g ⁇ DNA
  • L chain expression vector was prepared.
  • the prepared three expression vectors were linearized with restriction enzymes, and then introduced into CHO-DG44 cells to establish antibody-expressing cell lines.
  • a stable expression cell line was prepared as follows. Genes were introduced by the electopore position method using GenePulserXcell (Bio-Rad). And cooling on ice for 10 minutes a mixture of 0.75mL of CHO cells suspended in the antibody expression vector and PBS (1 X 10 7 cells / mL), 1.5 kV after transfer to a cuvette, 25 mu capacitance of the FD A pulse was given. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the cells treated with the electoporation were suspended in 40 mL of CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing HT supplement (Invitrogen) at a 1-fold concentration.
  • a 10-fold diluted solution was prepared with the same medium and dispensed at 100 L / well onto a 96-well culture plate. After culturing for 24 hours in a CO incubator (5% CO 2), Geneticin (Invitrogen) 0.5 mg / m
  • the bispecific antibody was purified by the following method from the culture supernatant obtained in Example 4.
  • the culture supernatant was equilibrated with equilibration buffer (20 mmol / L Sodium Phosphate buffer, 150 mol / L NaCl, pH 7.0).
  • RProtein A Sepharose Fast Flow7 fume (Amersham Biosciences ⁇ 50 mmI.D.X 9.9 cmH.
  • wash buffer 1 (20 mmol / L Sodium Phosphate buffer, 150 mol / L NaCl, pH 7.0
  • wash buffer 2 After washing with 50 mmol / L sodium acetate buffer (pH 6.0), elution was performed using 50 mmol / L Acetic acid. Immediately after elution, 1.5 mol / L Tris-HCl, pH 7.8 was added to adjust to pH 6.3.
  • Solvent B 20 mmol / L Sodium Acetate buffer, 1 mol / L NaCl, pH6.0
  • the three detected peaks were collected to collect two types of homodimers (hA69-PF, hB26-PF) and one type of heterodimer, the bispecific antibody BiAb.
  • ATF is a human antibody obtained as a monoclonal antibody against human tissue factor and has a constant region of human IgG4. The origin of ATF is described in detail in WO99 / 051743.
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region are shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, respectively.
  • ATF and hA69-PF, BiAb, hB26-PF prepared in Example 5 and hA69-N97R, hA69-pl8, hB26-e, hB26-pl5 prepared in Example 3 depend on the amino acid sequence of the variable region. In order to evaluate the change in surface charge and the change in surface charge due to amino acid modification, analysis by isoelectric focusing was performed.
  • ATF, hA69-PF, BiAb, hB26-PF, and humanized A69 antibody hA69-N97R and its Isoelectric focusing of the modified hA69-pl8 and the humanized B26 antibody hB26-F123e4 and its modified hB26-pl5 was performed as follows. Phast-Gel Dry IEF (AmerchamBioscience) gel was swollen for about 30 min with the following swelling solution using Phastsystem Cassette (AmerchamBioscience).
  • Step 1 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15 ° C 75 Vh
  • Step 2 200 V 2.5 mA 3.5 W 15 ° C 15 Vh
  • Step 3 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15 ° C 410 Vh
  • the gel after electrophoresis was fixed with 20% TCA, and then silver staining was performed using a Silver staining Kit, protein (Amercham Bioscience) according to the protocol attached to the kit. After staining, the known isoelectric point of the pi marker was also calculated.
  • Figure 3 shows the results of isoelectric focusing analysis.
  • Fig. 4 shows the calibration curve of pi and mobility prepared from the pi marker and the isoelectric point calculated from it. Since each sample has an antibody-derived charged heterogeneity, the isoelectric point was calculated based on the mobility of the main band.
  • hB26-PF is about 9.2
  • BiAb is about 8.7
  • hA69-PF is about 8.0
  • ATF is about 7.2
  • hA69-N97R is about 8.9
  • hA69-pl8 is about 8.5
  • hB26-F123e4 is about 8.7
  • hB26-pl5 is about 9.0.
  • hA69-N97R, hA69-pl8, and hA69-PF modify the same humanized antibody variable region, giving hA69-PF a change in pi of about 0.9 compared to hA69-N97R!
  • hB26-pl5 was able to impart a pi change of about 0.3.
  • the isoelectric point changes depending on the amino acid sequence of the variable region, and H10, H12, H23, H39, H43, H97 of the selected variable region. It was shown that the isoelectric point can be changed by modifying the surface amino acids of H105.
  • Humanized A69 antibody (hA69a) and its modified antibody (hA 69-N97R) were evaluated as follows.
  • Factor IXa ⁇ Enzyme Research Laboratories
  • Coating buffer 100 mM sodium bicarbonate, pH 9.6, 0.02% sodium azide
  • Tween (R) 20 After washing 3 times with PBS (-) containing Tween ( R ) 20, diluent buffer (50 mM Tris-HC1, pH 8.1, 1% bovine serum albumin, 1 mM MgCl, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween (R) 20, 0.
  • diluent buffer 50 mM Tris-HC1, pH 8.1, 1% bovine serum albumin, 1 mM MgCl, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween (R) 20, 0.
  • the plate was blocked with 02% sodium azide for 2 hours at room temperature. After removing the buffer, 100 L / well of purified antibody diluted with diluent buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour. After washing P1ate three times, 100 ⁇ L / well of alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG (BIOSOURCE) diluted 1/4000 in diluent buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the plate 5 times, the chromogenic substrate (Sigma) was added at 100 L / well and incubated at room temperature for 30 minutes. Absorbance at 405 nm (control 655 nm) was measured with a Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories).
  • the modified antibodies (hA69-N97R, hA69-pl8, hA69-PF) used in Example 8 were evaluated as follows. Oating buffer (0.05 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9) Factor IXa (Enzyme Research Laboratories) diluted to 1 ⁇ g / mL with Nino- Immuno plate (Nunc-Immuno 96 Micro Well plates MaxiSorp (Nalge Nunc International)) was dispensed at 100 ⁇ L / well, and incubated at 4 ° C for more than ⁇ . After washing 3 times with PBS containing 0.05% Tween (R) 20, diluent buffer (tris buffered saline with tween20 Add pH 8.0 (SIGMA), 1% bovine serum albumin, 0.02% sodium azide) to the plate at 200 ⁇ L / well, block for 2 hours at room temperature, remove the buffer, and then add the purified antibody diluted in diluent buffer.
  • the plate was blocked with M NaCl, 0.05% Tween ( R ) 20, 0.02% sodium azide) at room temperature for 2 hours. After removing the buffer, 100 L / well of purified antibody diluted with diluent buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the plate 3 times, 100 ⁇ L / well of alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG (BIOSOURCE) diluted 1/4000 in diluent buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the plate 5 times, a chromogenic substrate (Sigma) was added at 100 / zL / well and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • BIOSOURCE alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG
  • ATF was acquired as a monoclonal antibody against human tissue factor, and the constant region of human IgG4 It is a human ivy antibody with a region.
  • the origin of ATF is described in detail in WO99 / 051743.
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region are shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, respectively.
  • mice C57BL / 6J, Nippon Charles Co., Ltd.
  • the pharmacokinetics in River 1) were evaluated.
  • ATF, hA69-PF ⁇ BiAb, hB26-PF were administered to mice (C57BL / 6J, Charles River Japan) at 5 mg / kg as a single intravenous dose before and after administration for 15 minutes, 2 hours, 8 hours, 1 Blood was collected every day, 2 days, 4 days, 7 days, 11 days, 14 days, 21 days, and 28 days. The collected blood was immediately centrifuged at 4 ° C and 15,000 rpm for 15 minutes to obtain plasma. The separated plasma was stored in a freezer set to ⁇ 20 ° C. or lower until measurement.
  • mice C57BL / 6J, Charles River Japan
  • hA69-N97R, hA69-pl 8, hB26-F123e4 and hB26-pl5 were administered to mice (C57BL / 6J, Charles River Japan) as a single intravenous dose of 1 mg / kg before and 15 minutes after administration.
  • Blood was collected at 2 hours, 8 hours, 1 day, 2 days, 5 days [3 ⁇ 4, 7 days [3 ⁇ 4, 9 days [3 ⁇ 4, 14 days [3 ⁇ 4, 21 days [3 ⁇ 4, 28 days].
  • the collected blood was immediately centrifuged at 4 ° C and 15,000 rpm for 15 minutes to obtain plasma.
  • the separated plasma was stored in a freezer set at ⁇ 20 ° C. or lower until measurement was performed.
  • Mouse plasma concentration was measured by ELISA. Calibration curve samples with plasma concentrations of 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, and 0.1 ⁇ g / mL were prepared. Imunopre ⁇ to (Nunc-Immunorp, MaxiSorp (Nalge) obtained by immobilizing calibration curve samples and mouse plasma measurement samples with anti-human IgG (y-chain specific) F (ab ') 2 (Sigma) nunc International)) and allowed to stand at room temperature for 1 hour, then Goat Anti-Human IgG-BIOT (Southern Biotechnology Associates) and Streptavi din-alkaline phosphatase conjugate (Roche Diagnostics) On the other hand, a color reaction was performed using BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System (Kirkegaard & Perry Laboratories) as a substrate, and the absorbance at 650 nm was measured with a microplate reader. The mouse plasma concentration was calculated from the absorbance of the calibration curve
  • the blood half-life can be shortened by increasing the pi by modifying the surface amino acids of the variable region of hB26-F123e4 (shown in Table 4).
  • the surface amino acids of the variable region specifically examples: H10, H12, H23, H39, H43, H97, H105
  • Pyr (Q) is an N-terminal glutamine residue that is thought to be pyrodaltamyl, and the N-terminal amino group is protected, so Pyr (Q) and E There is no significant difference in charge.
  • the part where pi changes due to amino acid substitution is indicated by *.
  • T1 / 2 of ATF with the lowest pi is about 2.1 times longer than hA69-N97R, so the surface amino acids present in the variable region of hA69-N97R
  • the blood half-life of hA69-N97R can be further increased. Comparing the antibodies used in this example, the blood half-life of hB26-PF with the highest pi and ATF with the lowest pi is about 2.4 times different, and blood kinetic control by amino acid modification of the variable region is the existing control. Compared to technology High effect can be expected.
  • artificial amino acid substitution to be introduced into the constant region is small, but it is better to control the blood half-life by modifying the surface amino acid of the variable region. It is thought that.
  • the risk of antigenicity is small as compared to the conventional method of altering the constant region because of the fact that amino acid substitution is performed in the variable region.
  • the control for extending the blood half-life it is possible to show a greater effect than the conventional method of modifying the constant region.
  • it is possible to control the blood half-life of a polypeptide containing an FcRn-binding region such as an IgG antibody by controlling the surface charge without changing the structure 'function (activity) in the variable region.

Abstract

　FcRn結合領域を含むポリペプチドであるIgG抗体の可変領域残基のうち、表面に露出している残基を改変し表面電荷をコントロールすることでIgG抗体の血中半減期を制御できることを見出した。本発明の方法によって血中半減期が制御された抗体は、実際に活性を保持していることが確認された。本発明の方法は、標的抗原の種類によらず、IgG抗体等のFcRnのサルベージ経路によりリサイクルされるFcRn結合領域を含むポリペプチドに対して広く適用可能である。

Description

明 細 書
抗体の血中動態を制御する方法
技術分野
[0001] 本発明は、抗体の血中動態を制御するための抗体改変方法、血中動態が制御さ れた抗体を有効成分として含有する医薬組成物、および、その製造法等に関する。 背景技術
[0002] 抗体は血中での安定性が高ぐ副作用も少ないことから医薬品として注目されてい る。中でも IgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発 されている (非特許文献 1、非特許文献 2)。第 2世代の抗体医薬として、エフェクター 機能等を増強させる技術が開発されている。例えば、 IgG抗体の Fc領域のアミノ酸置 換により抗体依存性細胞障害活性 (ADCC)活性や補体依存性細胞障害活性 (CDC) 活性を増強させる技術が知られている（非特許文献 3)。このようなエフェクター機能 を増強させるだけではなぐ抗体の血中半減期を向上させる Fcのアミノ酸置換が報告 されている（非特許文献 4、非特許文献 5)。血中半減期を向上させることによって、 投与量の低減や投与間隔の延長が期待でき、低コスト且つ利便性の高い抗体医薬 を提供することが可能である。具体的には、 IgGのサルベージレセプターとして知られ ている neonatal Fc receptorに対する親和性を向上させるアミノ酸置換を Fc領域に施 すことによって血中半減期を延長することが可能である。また、 CH1、 CH2、 CH3の定 常領域を shufflingすることで血中半減期を向上させることが可能である（非特許文献 6)。し力しながら、 IgG抗体の定常領域のアミノ酸配列はヒトにおいて保存されている ため、抗原性の観点からは、定常領域に導入する人工的なアミノ酸置換は少ない方 がよい。
[0003] IgG抗体の可変領域にアミノ酸置換を施す技術は、ヒト化 (非特許文献 7)をはじめと して、結合活性を増強させるための相補性決定領域 (CDR)のアミノ酸置換による affini ty maturation (非特許文献 8)、フレームワーク (FR)のアミノ酸置換による物理化学的 安定性の向上 (非特許文献 9)が報告されている。よって、定常領域のアミノ酸置換と は異なり、可変領域のアミノ酸置換は抗体の機能の増強や特性の向上のために一般 的に行われる手法である。ヒトイ匕抗体の CDRのアミノ酸配列は、ヒト以外の動物種のァ ミノ酸配列であるために抗原性のリスクは問題視する必要はない。また、 FR配列にお いてち、 Kabat Database (http://ftp.ebi.ac.uk/ pub/ databases/kabat/)および ΙΜ(^ Γ Database (http：〃 imgt.cines.fr/)で公開されているヒト抗体の FR配列と同じであれば 、抗原性のリスクは小さいと考えられる。し力しながら、 IgG抗体の血中半減期を向上 させる方法は、上述した定常領域である Fcのアミノ酸置換によるものだけであり、抗原 性のリスクが小さい可変領域のアミノ酸置換による IgG抗体の血中半減期を向上させ る方法はこれまで報告されていない。この理由としては、 IgGの血中半減期は IgGのサ ルベージレセプターである neonatal Fc receptorへの結合と抗原依存的な消失に大き く依存しており (非特許文献 10)、可変領域は大きく血中半減期に影響しないと考え られてきたことが挙げられる。また、 IgGをスクシンィ匕することによりァ-オンィ匕し IgGの 等電点 (pi)を低下させる（非特許文献 11)、あるいは、ポリアミンにより修飾することで カチオンィ匕し IgGの piを上昇させているが（非特許文献 12)、いずれも血中半減期が 向上することはなぐ逆に半減期は短くなつており、修飾により piを改変することで血 中半減期を向上することはできて 、な 、。
一方、全長抗体である IgGに対して低分子化された低分子化抗体である Fabや scFv は半減期が短いことから、ポリエチレングリコール等の高分子により修飾することで腎 排泄を低減させ血中半減期を向上させることが可能である (非特許文献 13)。高分子 修飾以外では低分子化抗体の等電点 (pi)を改変することで血中動態が変化すること が報告されている。例えば、非特許文献 14には Anti-Tac Fabを有機酸により修飾す ることで piを低下させ AUC(Area under curve)は向上したことを示している。一方、非 特許文献 15および非特許文献 16には Anti-Tac dsFvを有機酸により修飾することで piを低下させたところ AUCは低下したことを示して ヽる。非特許文献 17には Anti-Tac -scFv toxinの可変領域にアミノ酸置換により改変をカ卩えることで piを低下させると半 減期 (tl/2)および AUCが低下することを示している。非特許文献 18には scFvの C末 に piを低下させるアミノ酸を付加した力 AUCはほとんど変化しな力つたことを示して V、る。このように低分子化抗体にお!、ては修飾な!/、しはアミノ酸置換により piを低下さ せた場合、 AUCが向上する場合もあれば AUCが低下する場合もあり、 piを改変するこ とで必ずしも血中半減期を目的どおり制御することはできない。
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発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は IgG抗体等の FcR n結合領域を含むポリペプチドの表面に露出するアミノ酸残基の置換による改変によ り、 FcRn結合領域を含むポリペプチドの血中半減期を制御する方法、アミノ酸置換に より血中半減期が制御された FcRn結合領域を含むポリペプチドからなる医薬組成物 、並びに、それらの医薬組成物の製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、アミノ酸置換により FcRn結合領域を含むポリペプチドの血中半減期 を制御する方法について、鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは FcRn結合領 域を含むポリペプチドである IgG抗体の可変領域残基のうち、表面に露出している残 基を改変し表面電荷をコントロールすることで IgG抗体の血中半減期を制御する方法 を開発した。具体的には抗体の機能'構造に影響を与えること無く表面電荷をコント ロールし IgG抗体の血中半減期を制御することができる可変領域の改変箇所を見出 した。さらに本発明により、血中半減期が制御された抗体が、実際に活性を保持して 、ることを確認した。
[0008] 本発明の方法は、標的抗原の種類によらず、 IgG等の FcRnのサルベージ経路によ りリサイクルされ、主代謝経路が腎排泄ではな ヽ FcRn結合領域を含むポリペプチドに 対して広く適用可能である。
[0009] 本発明は、 FcRn結合領域を含むポリペプチドの表面に露出するアミノ酸残基の置 換による改変により、 FcRn結合領域を含むポリペプチドの血中半減期を制御する方 法、アミノ酸置換により血中半減期が制御された FcRn結合領域を含むポリペプチドか らなる医薬組成物、並びに、それらの医薬組成物の製造方法に関し、より具体的に は、
〔1〕 血中動態が制御された FcRn結合領域を含むポリペプチドの製造方法であって 、 (a) FcRn結合領域を含むポリペプチドの表面に露出し得る少なくとも一つのァミノ 酸残基の電荷が変わるように、該アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする核酸を 改変し、（b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（c)宿主細胞培養物から Fc Rn結合領域を含むポリペプチドを回収することを含む方法、
〔2〕 前記 FcRn結合領域を含むポリペプチドの表面に露出し得るアミノ酸残基力 Fc Rn結合領域を含むポリペプチド中の FcRn結合領域以外の領域にある〔1〕に記載の 方法、
〔3〕 前記 FcRn結合領域が、 Fc領域または Fc様領域力 なる〔2〕に記載の方法、 〔4〕 FcRn結合領域を含むポリペプチドが IgG抗体である〔1〕に記載の方法、 〔5〕 工程 (a)で電荷が変えられるアミノ酸残基が、 IgG抗体の重鎖可変領域または 軽鎖可変領域のアミノ酸残基である〔4〕に記載の方法、
〔6〕 前記血中動態の制御が、血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランスの いずれかのパラメーターの制御である〔1〕に記載の方法、
〔7〕 工程 (a)におけるアミノ酸残基の電荷の改変が、アミノ酸置換による〔1〕に記載 の方法、
〔8〕 〔1〕に記載の方法により製造される FcRn結合領域を含むポリペプチド、
〔9〕 FcRn結合領域を含むポリペプチドの血中動態を制御する方法であって、 FcRn 結合領域を含むポリペプチドの表面に露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電 荷を変えることを含む方法、
〔10〕 前記 FcRn結合領域を含むポリペプチドの表面に露出し得るアミノ酸残基が、 F cRn結合領域を含むポリペプチド中の FcRn結合領域以外の領域にある〔9〕に記載の 方法、
〔11〕 前記 FcRn結合領域が、 Fc領域または Fc様領域力 なる〔10〕に記載の方法、 〔12〕 FcRn結合領域を含むポリペプチドが IgG抗体である〔9〕に記載の方法、 〔13〕 電荷が変えられるアミノ酸残基が、 IgG抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変 領域のアミノ酸残基である〔12〕に記載の方法、
〔14〕 前記血中動態の制御が、血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランス のいずれかのパラメーターの制御である〔9〕に記載の方法、
〔15〕 アミノ酸残基の電荷の改変が、アミノ酸置換による〔9〕に記載の方法、
〔16〕 〔9〕に記載の方法により血中動態が制御された FcRn結合領域を含むポリぺプ チド、
〔 17] ヒト以外の動物由来の相補性決定領域 (CDR)、ヒト由来のフレームワーク領 域 (FR)およびヒト定常領域を含むヒトイ匕抗体であって、 CDRまたは FRにお 、て抗体 表面に露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残基が野生型の CDRまたは FRの対応す る位置のアミノ酸残基とは異なる電荷を有するアミノ酸残基であり、可変領域が該ヒト 以外の動物由来の抗体に由来し且つ同じ定常領域を有するキメラ抗体に比べて血 中動態が制御されたヒト化抗体、
〔18〕 前記ヒト定常領域が野生型のヒト Fc領域を含む〔17〕に記載のヒト化抗体、 〔19〕 〔17〕または〔18〕に記載のヒト化抗体および医薬的に許容される担体を含む 組成物、
〔20〕 〔17〕または〔18〕に記載のヒト化抗体を構成するポリペプチドをコードする核 酸、
〔21〕 〔20〕に記載の核酸を有する宿主細胞、
[22] 〔21〕に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回 収する工程を含む〔 17〕または〔 18〕に記載のヒト化抗体の製造方法、 〔23〕 重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43 位、および 105位のアミノ酸残基力も選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基の電荷が 改変され、当該アミノ酸残基の改変前と比べて血中動態が制御された IgG抗体、 〔24〕 前記改変されたアミノ酸残基が、以下の（a)または (b) V、ずれかの群に含まれ るアミノ酸残基から選択される〔23〕に記載の IgG抗体：
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)、
〔25〕 〔23〕または〔24〕に記載の IgG抗体および医薬的に許容される担体を含む組 成物、
〔26〕 〔23〕または〔24〕に記載の IgG抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸 [27] 〔26〕に記載の核酸を有する宿主細胞、
〔28〕 〔27〕に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回 収する工程を含む〔23〕または〔24〕に記載の抗体の製造方法、
を、提供するものである。
図面の簡単な説明
[図 1]ヒト化二重特異性抗体（ヒト化 A69 (hA69a) /ヒト化 B26 (hB26- F123e4)/ヒト化 BB A (hAL-F123j4) )の凝固活性にっ 、て評価した結果を示す図である。評価の結果、 キメラ二重特異性抗体と同等以上の凝固活性を示した。
[図 2]ヒト化 A69- H鎖可変領域（hA69a)とヒト化 BBA(hAL- F123j4)およびヒト化 hB26- H鎖可変領域（hB26-F123e4)とヒト化 BBA(hAL-F123j4)を使用して抗体モデリング を実施した結果を示す図である。表面電荷を変化させることが可能なアミノ酸につ ヽ て側鎖を強調して示した。番号については、 Kabatデータベースの配列番号（Kabat EA et al. 1991. sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)を 用し 7こ
[図 3]ATFゝ hA69- PFゝ BiAb、 hB26- PF、 hA69- N97R、 hA69- pl8、 hB26- F123e4、 hB2
6-pl5について等電点電気泳動による分析結果を示す写真である。
[図 4]ATFゝ hA69- PFゝ BiAb、 hB26- PF、 hA69- N97R、 hA69- pl8、 hB26- F123e4、 hB2 6-pl5について等電点電気泳動における piマーカーの検量線、および、検量線より 算出された各サンプルの piを示す図である。可変領域のアミノ酸配列の違いによる表 面電荷の変化、および、アミノ酸改変による表面電荷の変化により piの変化が観察さ れた。
[図 5]未改変および可変領域を改変したヒト化 A69抗体（hA69a、 hA69-N97Rおよび h A69- N97R、 hA69- pl8、 hA69- PF)を用いて抗原である Factor IXaへの結合活性を解 祈した結果を示す図である。解析の結果、等電点を変化させた改変体の結合活性は 同等であることが確認された。
[図 6]未改変および可変領域を改変したヒト化 B26抗体（hB26-F123e4、 hB26-pl5)を 用いて抗原である Factor Xへの結合活性を解析した結果を示す図である。解析の結 果、等電点を変化させた改変体の結合活性は同等であることが確認された。
[図 7]ATF、 hA69-PF、 BiAb、 hB26-PFのマウス血漿中濃度推移を示した図である。
[図 8]ATFゝ hA69- PFゝ BiAb、 hB26- PF、 hA69- N97R、 hA69- pl8、 hB26- F123e4、 hB2 6-pl5の薬物動態的パラメーターであるクリアランス (CL)と半減期 (Tl/2)と piの相関を 示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、 FcRn結合領域を含むポリペプチドの血中動態を制御する方法を提供す る。本発明の方法の好ましい態様としては、 FcRn結合領域を含むポリペプチドの表 面に露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷を変えることを含む方法である。 即ち、アミノ酸残基の電荷を変えることによって、 FcRn結合領域を含むポリペプチド の等電点 (pi)を変化させることにより、該タンパク質の血中動態を制御することができ る。
[0012] 上述のように scFvや Fabのような低分子化抗体は、 piの改変によって血中動態を必 ずしも制御することはできな 、。 scFvや Fabのような低分子化抗体の主代謝経路は腎 排泄であることが知られている。し力しながら、非特許文献 19〜22に示されている腎 排泄における腎ろ過の効率はタンパク質の電荷に陰性であるほどに抑制されることも あれば、一方でタンパク質の電荷は影響しないという報告もある。実際、非特許文献 14-18に示されて 、るように、低分子化抗体の piを低下させることによって血中半減 期を長くすることができる報告もあれば、短くすることができる報告もある。腎ろ過され たタンパク質の近位尿細管への再吸収はタンパク質の電荷に陰性であるほどに抑制 されることもあり、 piにより低分子化抗体の血中半減期を自在に制御することはできな いと考えられる。
[0013] 一方、 IgG抗体は分子量が十分大きいため主代謝経路が腎排泄ではない。 Fcを有 する IgG抗体は血管等の内皮細胞で発現している FcRnのサルベージ経路によりリサ イタルされることによって長い半減期を有することが知られており、 IgGは主に内皮細 胞において代謝されていると考えられている（非特許文献 23)。すなわち、内皮細胞 に非特異的に取り込まれた IgGが FcRnに結合することによって IgGはリサイクルされ、 結合できな力つた分子は代謝されると考えられて 、る。 FcRnへの結合性を低下させ た IgGは血中半減期が短くなり、逆に FcRnへの結合性を高めることで血中半減期を 長くすることができる（非特許文献 23)。このように、これまでの IgGの血中動態の制御 方法は Fcを改変することで FcRnへの結合性を変化させることで行われてきた力 本 発明の実施例 8において、標的抗原の種類に関わらず、同一の Fcを有する IgGの血 中半減期が piと高い相関係数で相関することが示され、実際に異なる抗原に対する 2 種類の抗体において可変領域の piを改変することで、 Fcを改変することなく血中半減 期を制御することが可能であることが示された。内皮細胞への非特異的な取り込みの 速度は、負電荷を帯びた細胞表面と IgGの物理ィ匕学的なクーロン相互作用に依存す ると考えられることから、 IgGの piを低下（上昇）させることでクーロン相互作用が低減（ 増大）し、内皮細胞への非特異的な取り込みが減少（増大）し、結果として内皮細胞 における代謝を減少 (増大)させることで血中動態を制御することができたと考えられ る。内皮細胞と細胞表面負電荷とのクーロン相互作用は物理化学的な相互作用であ ることから、この相互作用は標的抗原に依存しないと考えられる。そのため、本発明 で見出された血中動態の制御方法は、標的抗原の種類によらない任意の IgGなど、 F cRnのサルベージ経路によりリサイクルされる主代謝経路が腎排泄ではない FcRn結 合領域を含むポリペプチドに広く適用可能である。
[0014] 従って、本発明における FcRn結合領域を含むポリペプチドは、 IgG抗体に限定され ず、 Fcレセプター (FcRn)と結合し得る（結合活性もしくは親和性を有する）タンパク質 であればよい。好ましくは、本発明における FcRn結合領域を含むポリペプチドは、特 に制限されないが、抗体の Fc領域もしくは Fc様領域を含むタンパク質である。本発明 における FcRn結合領域を含むポリペプチドとしては、例えば、 IgG抗体が挙げられる 。また、これらの抗体 (タンパク質)の改変体であっても、 FcRnと結合し得るタンパク質 であれば、本発明の FcRn結合領域を含むポリペプチドに含まれる。本発明において FcRn結合領域を含むポリペプチドの最も好ま 、例としては、 IgG抗体を挙げることが できる。
[0015] 本発明の FcRn結合領域を含むポリペプチドとして IgG抗体を用いる場合、 IgGタイプ の抗体分子であれば 、かなるサブタイプでもよぐ二重特異性の IgG抗体であっても ょ 、。この二重特異性抗体は 2種類の異なるェピトープに対して特異性を有する抗体 であり、異なる抗原を認識する抗体のほか、同一の抗原上の異なるェピトープを認識 する抗体も含まれる。また、抗体分子であっても、 scFvや Fabにょうに腎排泄が主要な 代謝経路であるような低分子化抗体の場合は前述のように piでは血中動態を制御す ることができな 、が、本発明は腎排泄が主要な代謝経路ではな ヽ Fc結合タンパク質 であればいかなる抗体分子形でも適用可能であり、例えば、 scFv-Fc, dAb-Fc, Fc融 合タンパク質等が挙げられる。これらの分子の腎排泄は主要な代謝経路ではないた め、本発明で見出された方法により piを変化させることで血中動態を制御することが 可能である。本発明が適用できる抗体分子は、抗体様分子であってもよい。抗体様 分子とは、ターゲット分子に結合することで機能を発揮するような分子であり（非特許 文献 30)、例えば、 DARPins、 Affibody、 Avimer等が挙げられる。
[0016] 本発明にお 、て「血中動態が制御された」とは、 FcRn結合領域を含むポリペプチド の改変前と改変後の血中動態を比較して、血中動態が目的の方向に変化しているこ とを意味する。すなわち、血中半減期を長くすることが目的の場合は、血中動態の制 御は血中半減期を長くすることを意味し、血中半減期を短くすることが目的の場合は 、血中動態の制御は血中半減期を短くすることを意味する。
[0017] 本発明において FcRn結合領域を含むポリペプチドの血中動態が目的の方向に変 化している、すなわち血中動態が目的どおり制御できているか否かは、例えば、マウ ス、ラット、ゥサギ、ィヌ、サル等を用いた動態試験を実施することによって適宜評価 することができる。本発明における「血中動態の制御」とは、より具体的には、血中半 減期、平均血中滞留時間、または血中クリアランス等のいずれかのパラメーター（ファ 一マコキネテイクス 演習による理解 （南山堂)）の制御を挙げることができる。例え ば、体内動態解析ソフト WinNonlin (Pharsight)を用いて、付属の手順書に従い Nonco mpartmental解析することによって適宜評価することができる。
[0018] 本発明において「表面に露出し得るアミノ酸」とは、通常、 FcRn結合領域を含むポリ ペプチドを構成するポリペプチドの表面にあるアミノ酸を指す。ポリペプチドの表面に あるアミノ酸は、その側鎖が溶媒分子 (通常は水分子）に接し得るアミノ酸であり、必 ずしも側鎖の全てが溶媒分子に接する必要はなぐ側鎖の一部でも溶媒分子に接す る場合は、そのアミノ酸は表面にあるアミノ酸である。当業者であれば、市販のソフト ウェアを用いたホモロジ一モデリング等により、ポリペプチドや抗体のホモロジーモデ ルを作製することができ、それにより適切な残基を表面にあるアミノ酸として選択する ことができる。
[0019] 本発明において「表面に露出し得るアミノ酸」は、特に制限されないが、 FcRn結合 領域を含むポリペプチド中の FcRn結合領域の外にあることが好まし!/、。この FcRn結 合領域とは、例えば、 Fc領域または Fc様領域を挙げることができる。
[0020] 本発明における FcRn結合領域を含むポリペプチドが IgGである場合には、本発明 にお 、て電荷を変えるアミノ酸残基は、 IgG抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領 域のアミノ酸残基であることが好ましい。該可変領域としては、具体的には、相補性 決定領域 (CDR)、フレームワーク領域 (FR)を挙げることができる。
[0021] 当業者であれば、抗体可変領域における表面アミノ酸はホモロジ一モデリング等に より作製されたホモロジ一モデルにより適宜選択することが可能である力 例えば H 鎖 FR領域においては HI, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H39, H42, H43, H44, H46, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83 , Η85, Η86, H105, H108, HI 10, HI 12が表面アミノ酸として例示することができる力 本発明はこれらに限定されることはない。
[0022] また H鎖 CDR領域に関しては、同様にしてホモロジ一モデルにより表面アミノ酸を 選択することが可能であり、例えば H97はほぼ全ての抗体で表面に露出している。 L 鎖 FR領域においては LI, L3, L7, L8, L9, Lll, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L38, し 39,し 41,し 42,し 43,し 45,し 46,し 49,し 57,し 60,し 63,し 65,し 66,し 68,し 69,し 70,し 74 , L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, L107, L108が表面アミノ 酸として例示することができるが、本発明はこれらに限定されることはない。また L鎖 C DR領域に関しては、同様にしてホモロジ一モデルにより表面アミノ酸を選択すること が可能である。
[0023] 本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」とは、具体的には、元のアミノ酸残基 を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなァミノ 酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基 へ置換することを指す。即ち、本発明における「アミノ酸残基の電荷の改変」とは、好 ましくはアミノ酸置換が挙げられる。
[0024] 本発明において FcRn結合領域を含むポリペプチドが IgG抗体である場合には、上 記「アミノ酸残基の電荷を変える」ために、例えば、該 IgG抗体の重鎖可変領域にお ける Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43位、および 105位のアミノ酸 残基力 選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基の電荷を改変する態様を挙げること ができる。上記のナンバリングで示されたアミノ酸残基のうち、当該電荷が改変された アミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、 目的とする血中動態の制御が得られていれば改 変する必要はないが、適宜、改変されたアミノ酸残基と同種の電荷を有する、または 電荷を有しな 、ように改変することができる。
[0025] アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が知られている。一般的に正の電荷を帯 びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン )、アルギニン (R)、ヒスチジン (H)が知 られている。負の電荷を帯びたアミノ酸 (負電荷アミノ酸）としては、ァスパラギン酸 (D) 、グルタミン酸 (E)等が知られている。これら以外のアミノ酸は電荷を有さないアミノ酸 として知られている。
[0026] 上記「改変されたアミノ酸残基」としては、好ましくは、以下の（a)または (b) V、ずれ カゝの群に含まれるアミノ酸残基カゝら適宜選択されるが、特に制限されない。
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H) [0027] なお、元の（改変前の）アミノ酸残基が既に電荷を有する場合、電荷を有さな ヽアミ ノ酸残基となるように改変することも本発明の好ましい態様の一つである。すなわち、 本発明における改変としては、（1)電荷を有するアミノ酸力 電荷を有さないアミノ酸 への置換、 (2)電荷を有するアミノ酸から元とは反対の電荷を有するアミノ酸への置 換、（3)電荷を有さないアミノ酸から電荷を有するアミノ酸への置換、が挙げられる。
[0028] 本発明の方法においては、 FcRn結合領域を含むポリペプチドの等電点 (pi)が変化 するように、アミノ酸残基が改変されることが好ましい。また、改変によって導入される アミノ酸残基が複数の場合、これらアミノ酸残基の中に電荷を持たな ヽアミノ酸残基 が少数程度含まれて 、てもよ 、。
[0029] 本発明の方法において改変に供されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、 例えば、抗体の可変領域を改変する場合、抗原との結合活性を低下させないために 、また抗原性を上げないために、 目的の制御された血中動態を達成するための必要 最低限のアミノ酸残基を改変することが好まし 、。
[0030] また好ましくは、抗原性を上げな!/、ために、改変後のアミノ酸配列がヒト配列である ことが好ましいが本発明はこれに限定されることはない。さらに、改変後の FR(FR1、 F R2、 FR3、 FR4)が各 FRとしてヒト配列になるように、等電点が変化するように導入した 改変以外の箇所に変異を導入してもよい。このようにして各 FRをヒト配列に置き換え る方法は非特許文献（Ono K et al.， Mol Immunol. 1999 Apr;36(6):387-395.)で報告 されている。また、各 FRの等電点を変化させるために、等電点が変化する他のヒト FR に改変してもよい（例えば FR3を等電点が低下する他のヒト FRと交換してもよい)。この ようなヒト化方法は非特許文献 (Dall'Acqua WF., Methods. 2005 May;36(l):43- 60.) で報告されている。
[0031] また、僅かな表面電荷の改変にぉ 、て目的の制御された血中動態に到達しな！、場 合に、表面電荷の改変と血中動態の評価を繰り返し行うことで、血中動態に制御され た所望の FcRn結合領域を含むポリペプチドを取得することが可能である。
[0032] 非特許文献 24には抗 E, P-Selectin抗体のキメラ抗体 (IgG4)である chimeric EP5C7. g4とヒトイ匕抗体 (IgG4)である HuEP5C7.g4のァカゲサルにおける血中動態を比較し両 者の血中動態は同等であることが示されている。また非特許文献 25には、抗 CD154 抗体のキメラ型抗体である ch5d8とヒトイ匕抗体である Hu5c8の力-クイサルにおける血 中動態を比較し両者の血中動態は同等であることが示されている。非特許文献 26に は、キメラ抗体の cCC49とヒトイ匕抗体の HuCC49のマウスにおける血中動態が同等で あることが示されている。また非特許文献 27、および、非特許文献 28には、マウスに おける評価において、マウス抗体とヒト化抗体の血中動態 '分布が同等であることが 示されており、マウス Fcおよびヒト Fcは共にマウス FcRnに交差することから、同キメラ 抗体と同ヒト化抗体の血中動態 ·分布は同等であると考えられる。これらの例に示され ているように、キメラ抗体とヒト化抗体の間で血中動態は同等である。すなわち、非特 許文献 7等に示される公知の方法によってヒト化した場合、キメラ抗体と比較して血中 動態は同等であり、公知の方法では血中動態が制御されたヒト化抗体を作製すること はできない。
[0033] 本発明で見出された方法により、キメラ抗体をヒト化する際に、表面アミノ酸に改変 を加えることで抗体の piを変化させることにより、キメラ抗体と比較して血中動態が制 御された (すなわち、血中半減期を長くした、あるいは、血中動態を短くした)ヒト化抗 体が作成可能である。血中動態を制御するための表面アミノ酸の改変は、ヒト化と同 時であってもよぐあるいは、ヒトイ匕抗体をさらに改変することであってもよい。
[0034] 非特許文献 29には、同じヒト抗体の FR配列を用いてヒト化を行った 3種類のヒト化抗 体 trastuzumab、 bevacizumab、 pertuzumabの血中動 |gはほぼ、 |Ρ]等でめ こと力 己 れている。すなわち、同じ FR配列を用いてヒト化を行った場合、血中動態はほぼ同等 である。血中濃度を制御するためには、上述のようなヒト化の工程に加えて、本発明 で見出された方法により表面アミノ酸に改変を加えることで抗体の piを変化させること で初めて可能となる。
[0035] またヒト抗体ライブラリーゃヒト抗体産生マウス等力も作製されたヒト抗体の表面アミ ノ酸に改変を加えることで抗体の piを変化させることにより、最初に作製されたヒト抗 体に比べて血中動態が制御された (すなわち、血中半減期を長くした、あるいは、血 中動態を短くした)ヒト抗体が作成可能である。
[0036] 本発明における「抗体」には、上述のようにアミノ酸残基の電荷を改変した抗体に対 して、さらにアミノ酸の置換、欠失、付加及び Z若しくは挿入等により、アミノ酸配列が 改変された抗体が含まれる。また、アミノ酸の置換、欠失、付加及び Z若しくは挿入、 またはキメラ化やヒト化等により、アミノ酸配列が改変された抗体に対して、さらに、ァ ミノ酸残基の電荷が改変された抗体が含まれる。
[0037] アミノ酸の置換、欠失、付加及び Z又は挿入、並びにヒト化、キメラ化などのアミノ酸 配列の改変は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。同様に、本発明に おける抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可変領域及び定常領 域も、アミノ酸の置換、欠失、付加及び Z若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等によ りそのアミノ酸配列を改変してもよ 、。
[0038] 本発明における抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ャギ抗体、ラ クダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中で もヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、各種分子を結合 させた抗体修飾物であってもよ ヽ。
[0039] 「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例 えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変 (V)領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常 (C)領 域力 なる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗 体 V領域をコードする DNAとヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、これを発現べ クタ一に組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる
[0040] 「ヒト化抗体」とは、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由 来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region)をヒト抗体の CDRへ移植したものである。 CDRを同定するための方法は公知 で fe (Kabat et al., sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National
Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)。また、 その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号 EP 125023 号公報、 WO 96/02576号公報参照)。そこで公知の方法により、例えば、マウス抗体 の CDRを決定し、該 CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region ; FR)とが 連結された抗体をコードする DNAを取得し、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用い た系により産生することができる。このような DNAは、 CDR及び FR両方の末端領域に オーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマ 一として用いて PCR法により合成することができる (W098/13388号公報に記載の方 法を参照)。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、 CDRが良好な抗原結合部位を 形成するように選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の CDRが適切な抗原結合部 位を形成するように、抗体の可変領域における FRのアミノ酸を改変してもよい（Sato e t al.， Cancer Res. (1993) 53: 851-6)。改変できる FR中のアミノ酸残基には、抗原に 直接、非共有結合により結合する部分 (Amit et al.， Science (1986) 233: 747- 53)、 C DR構造に影響または作用する部分（Chothia et al.， J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17 )及び VH-VL相互作用に関連する部分 (EP239400号特許公報）が含まれる。
[0041] 本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体 の C領域は，好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。例えば H鎖では、 C y 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C κ、 C λを使用することができる。また、抗体またはそ の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を必要に応じ修飾してもよい。本 発明におけるキメラ抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト 抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物 由来抗体の CDRと、ヒト抗体由来の FRおよび C領域とからなる。ヒト抗体由来の定常 領域は、 IgG (IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgM、 IgA、 IgD及び IgE等のアイソタイプごと に固有のアミノ酸配列を有する。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は 、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒ HgGの定 常領域が用いられるが、これに限定されるものではない。また、ヒト化抗体に利用され るヒト抗体由来の FRも特に限定されず、どのアイソタイプに属する抗体のものであつ てもよい。
[0042] 本発明におけるキメラ抗体及びヒト化抗体の可変領域及び定常領域は、元の抗体 の結合特異性を示す限り、欠失、置換、挿入及び/または付加等により改変されてい てもよい。
[0043] ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が 低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。
[0044] 本発明の方法における変異導入前の抗体 (本明細書においては、単に「本発明の 抗体」と記載する場合あり）の H鎖又は L鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いる ことも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ラ イブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリド 一マ力も抗体をコードする遺伝子をクローユングして取得することも可能である。
[0045] 抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、 抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入 手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、 Clackson et al.， Nature 1991, 352: 624—8、 Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581—97、 Water houses et al" Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6、 Griffiths et al" EMBO J. 1994, 13: 3245-60、 Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14、及び特表平 20— 504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリ 一とする方法 (W095/15393号パンフレット)やリボソーム提示法等の公知の方法を用 いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンユングによりヒト抗 体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファ ージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結 合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。抗原に結 合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを 作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、 WO92/01 047、 WO92/20791, WO93/06213, W093/11236, W093/19172, WO95/01438, W 095/15388を参考にすることができる。
[0046] ノ、イブリドーマ力 抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技 術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用し て、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融 合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナ ルな抗体産生細胞 (ノ、イブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイプリドーマの mR NAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域)の cDNAを合成し、これを所望 の抗体定常領域 (C領域)をコードする DNAと連結することにより得ることができる。 [0047] より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、上記の H鎖及び L鎖 をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、 免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タン ノ ク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖 類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明の 抗体の抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法に より行うことができ、例えば、バキュロウィルスを用いた方法 (例えば、 W098/46777な ど)などに準じて行うことができる。ハイプリドーマの作製は、たとえば、ミルスティンら の方法 (G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3- 46)等に準じて行 うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する 巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合さ せることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原とし て用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞 表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
[0048] 抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得 ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球を in vitroで免疫化して抗体産生 細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲ ッ歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ノ、ムスター 等のゲッ歯目、ゥサギ等のゥサギ目、力-クイザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパン ジ一等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子の レパートリーを有するトランスジヱニック動物も知られており、このような動物を使用す ることによりヒト抗体を得ることもできる (WO96/34096; Mendez et al.， Nat. Genet. 199 7, 15: 146-56参照)。このようなトランスジエニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリ ンパ球を in vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リン パ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266と融合させることにより、抗原への結合活性を 有する所望のヒト抗体を得ることもできる (特公平ト 59878号公報参照)。また、ヒト抗体 遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫す ることで所望のヒト抗体を取得することができる (W093/12227、 WO92/03918、 W094 [0049] 動物の免疫化は、例えば、感作抗原を Phosphate-Buffered Saline(PBS)または生理 食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動 物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント 不完全アジュバントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生 の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することに より行われ得る。
[0050] ハイプリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体 産生細胞を、慣用の融合剤 (例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細 胞と融合して作成することができる (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Pr actice, Academic Press, 1986, 59-103)。必要に応じハイプリドーマ細胞を培養'増殖 し、免疫沈降、放射免疫分析 (RIA)、酵素結合免疫吸着分析 (ELISA)等の公知の分 析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、 必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハ イブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローユングすることもできる。
[0051] 続 、て、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（ 感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブ (例えば、抗体定常領域 をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等)を用いてクロー-ングすることがで きる。また、 mRNAから RT-PCRによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリ ンは、 IgA、 IgD、 IgE、 IgG及び IgMの 5つの異なるクラスに分類される。さらに、これらの クラスは幾つかのサブクラス (アイソタイプ) (例えば、 IgG-l、 IgG-2、 IgG-3、及び IgG-4 ;IgA-l及び IgA-2等)に分けられる。本発明において抗体の製造に使用する H鎖及び L鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属する抗体に由来するものであっても よぐ特に限定されないが、 IgGは特に好ましいものである。
[0052] ここで、 H鎖及び L鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも 可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ハムスター抗体、ヒッジ抗 体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目 的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等 を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗 体の H鎖、 L鎖の可変領域とヒト抗体の H鎖、 L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウ ス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し 、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができ る。ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえ ばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR; complementary determining region)を連結 するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作 製した数個のオリゴヌクレオチドカゝら PCR法により合成する。得られた DNAをヒト抗体 定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主 に導入し産生させることにより得られる (EP239400; WO96/02576参照)。 CDRを介して 連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するもの が選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部 位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ い (K. Sato et al, Cancer Res. 1993, 53: 851-856)。
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善す るために改変を行うことも考えられる。本発明における改変は、部位特異的突然変異 (例えば、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、 PCR変異、カセッ ト変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変 異体は 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 (例えば、 95% 以上、 97%、 98%、 99%等)のアミノ酸配列相同性及び/または類似性を元となった抗 体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及 び/または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化 、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同 (同じ残基)または類似 (一般的 なアミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸 残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づ いて (1)疎水性：ァラニン、イソロイシン、パリン、メチォニン及びロイシン； (2)中性親水 性：ァスパラギン、グルタミン、システィン、スレオニン及びセリン； (3)酸性：ァスパラギ ン酸及びグルタミン酸； (4)塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリジン； (5)鎖の配向に 影響する残基:グリシンおよびプロリン;ならびに (6)芳香族性:チロシン、トリブトファン 及びフエ-ルァラニンのグループに分類される。
[0054] 通常、 H鎖及び L鎖の可変領域中に存在する全部で 6つの相補性決定領域 (超可 変部; CDR)が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち 1つの可変 領域であっても全結合部位を含むものよりは低い親和性となるものの、抗原を認識し 、結合する能力があることが知られている。従って、本発明の H鎖及び L鎖をコードす る抗体遺伝子は、該遺伝子によりコードされるポリペプチドが所望の抗原との結合性 を維持していればよぐ H鎖及び L鎖の各々の抗原結合部位を含む断片部分をコー ドしていればよい。
[0055] 重鎖可変領域は、上述のように、通常 3つの CDR領域と 4つの FR領域によって構成 されている。本発明の好ましい態様において「改変」に供するアミノ酸残基としては、 例えば、 CDR領域あるいは FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択するこ とができる。一般的に CDR領域のアミノ酸残基の改変は、抗原に対する結合能を低 下させる場合がある。従って、本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては 、特に限定されるものではないが、 FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選 択することが好ましい。 CDRであっても改変によって結合能が低下しないことが確認 された場合は、その箇所を選択することが可能である。
[0056] また、ヒトもしくはマウス等の生物において、抗体の可変領域の FRとして利用可能な 配列を、当業者であれば、公共のデータベース等を利用して適宜取得することがで きる。
[0057] さらに本発明は、本発明の方法によって血中動態が制御された FcRn結合領域を含 むポリペプチドに関する。
[0058] 本発明の好ましい態様においては、本発明の方法によって血中動態が制御された ヒトイ匕抗体を提供する。該ヒト抗体は、例えば、ヒト以外の動物由来の相補性決定領 域 (CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域 (FR)およびヒト定常領域を含むヒト化抗体 であって、 CDRまたは FRにおいて抗体表面に露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残 基が野生型の CDRまたは FRの対応する位置のアミノ酸残基とは異なる電荷を有する アミノ酸残基であり、可変領域が該ヒト以外の動物由来の抗体に由来し且つ同じ定常 領域を有するキメラ抗体に比べて血中動態が制御されたヒト化抗体である。
[0059] 上記ヒト定常領域とは、好ましくは、野生型のヒト Fc領域を含む領域を指すが、改変 された Fcであってもよ!/、。
[0060] また本発明は、本発明の方法を利用することによる、血中動態が制御された FcRn 結合領域を含むポリペプチドの製造方法に関する。即ち、本発明は血中動態が制御 された FcRn結合領域を含むポリペプチドの製造方法を提供する。さら〖こ、本発明の 方法によって製造される FcRn結合領域を含むポリペプチドもまた本発明に含まれる。
[0061] 本発明の製造方法の好ましい態様としては、血中動態が制御された FcRn結合領域 を含むポリペプチドの製造方法であって、（a) FcRn結合領域を含むポリペプチドの表 面に露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷が変わるように、該アミノ酸残基 を含むポリペプチドをコードする核酸を改変し、 (b)宿主細胞を該核酸が発現するよ うに培養し、（c)宿主細胞培養物から FcRn結合領域を含むポリペプチドを回収するこ とを含む方法である。
[0062] 本発明の上記方法において「核酸を改変する」とは、本発明における「改変」によつ て導入されるアミノ酸残基に対応するように核酸を改変することを言う。より具体的に は、元（改変前）のアミノ酸残基をコードする核酸について、改変によって導入される アミノ酸残基をコードする核酸へ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコ ードするコドンとなるように、元の核酸に対して、少なくとも 1塩基を挿入、欠失または 置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ 酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドン によって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例え ば、部位特異的変異誘発法、 PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能 である。
[0063] また、本発明における核酸は、通常、適当なベクターへ担持 (挿入)され、宿主細胞 へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特 に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローユング用ベクターと しては pBluescriptベクター (Stratagene社製）などが好まし!/、が、市販の種々のべクタ 一を利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクター を用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管 内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれ ば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社 製）、大腸菌であれば pETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であれば pME18S-FL 3ベクター（GenBank Accession No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベクタ 一（Mol Cell Biol. 8:466- 472(1988))などが好ましい。ベクターへの本発明の DNAの 挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことが でさる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. J ohn Wiley & Sons. Section 11.4-11.11)。
[0064] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞 (例:ストレブトコ ッカス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞 (例:酵母、 ァスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフイラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： C HO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、 Bowesメラノーマ細胞）および植物細 胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム 沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel e t al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、リポフエクシヨン法、マイク 口インジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
[0065] 宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、また は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに 組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ つても、異種シグナルであってもよい。
[0066] 上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分 泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場 合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
[0067] 組換え細胞培養物力も本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ -ゥムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ァ-オンまたはカチオン交換クロマトグラフィ 一、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ- ティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト グラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
[0068] また本発明は、本発明の方法によって血中動態が制御された FcRn結合領域を含 むポリペプチド (例えば IgG抗体）、および医薬的に許容される担体を含む組成物 (薬 剤）に関する。
[0069] 本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査 · 診断のための薬剤を言う。
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例 えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤 の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは 媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、 安定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般 に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化す ることが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容 量が得られるように設定する。
[0070] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実 施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙 げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等）、ポリアルコール（ プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソル ペート 80 (TM)、 HCO- 50等）を併用してもよい。
[0071] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及 び Zまたはべンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩 衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤 (例えば、塩酸プロ力イン)、安定剤 (例え ば、ベンジルアルコール及びフエノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された 注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
[0072] 本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤 型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば 、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に 投与することができる。
[0073] 投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体 をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬糸且成物の投与量は、例えば、一回につ き体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲に設定することが可能である。または、 例えば、患者あたり 0.001〜100000mgの投与量とすることもできる力 本発明はこれら の数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、 年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投 与量及び投与方法を設定することが可能である。
[0074] また本発明は、本発明の方法によって血中動態が制御された FcRn結合領域を含 むポリペプチド (例えば、ヒト化抗体等）を構成するポリペプチドをコードする核酸を提 供する。さらに該核酸を担持するベクターもまた、本発明に含まれる。
[0075] さらに本発明は、上記核酸を有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、特に制 限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを挙げることができる。宿主細胞は 、例えば、本発明の抗体もしくはポリペプチドの製造や発現のための産生系として使 用することができる。ポリペプチド製造のための産生系には、 in vitroおよび in vivoの 産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系及び原核細胞 を使用する産生系が挙げられる。
[0076] 宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細 胞が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CHO (j. Exp. Med. (1995 ) 108: 945)、 COSゝ HEK293、 3T3、ミエローマ、 BHK(baby hamster kidney)、 HeLaゝ Vero等、両生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle et al.， Nature (1981 ) 291: 338-340)、及び昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が例示される。本発明の抗 体の発現においては、 CHO- DG44、 CHO- DX11B、 COS7細胞、 HEK293細胞、 BHK 細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法 、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP(Boehringer Mannheim製）を 用いた方法、エレクト口ポレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能 である。
[0077] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞 およびゥキクサ（Lemna minor)が蛋白質生産系として知られており、この細胞をカル ス培養する方法により本発明の抗体を産生させることができる。真菌細胞としては、酵 母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属の細胞（サッカロミセス'セレピシェ（Sa ccharomyces cerevisiae)、サッカロ；セス-ホンへ (Saccharomyces pombe)等)、及び 糸状菌、例えば、ァスペルギルス (Aspergillus)属の細胞（ァスペルギルス · -ガー（As pergillus niger)等）を用いた蛋白質発現系が公知であり、本発明の抗体産生の宿主 として利用できる。
[0078] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、上 述の大腸菌（E. coli)に加えて、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗 体産生に利用できる。
[0079] 本発明の宿主細胞を用いて抗体を産生する場合、本発明の抗体をコードするポリ ヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養を行 ヽ、ポリ ヌクレオチドを発現させればよい。培養は、公知の方法に従って行うことができる。例 えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640 、 IMDMを使用することができる。その際、 FBS、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を 併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8とする のが好ましい。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培 地の交換、通気、攪拌を加える。
[0080] 一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリ ヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。 本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0081] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRU M Biotechnology Applications (1993))。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェ ニック動物を用いることができる。
[0082] 例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、ャギ j8カゼインのような乳汁 中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製す る。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をャギの胚へ注入し、この胚 を雌のャギへ移植する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はそ の子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジエニックャギ から産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェ ニックャギに投与してもよい（Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702)。
[0083] また、本発明の抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。
カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィ ルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることがで きる（Susumu et al" Nature (1985) 315: 592—4)。
[0084] さらに、植物を本発明の抗体産生に使用する場合、例えばタバコを用いることがで きる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現 用ベクター、例えば pMON 530に挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファ シエンス（Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリア をタバコ、例えば、ニコチアナ'タパカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの 葉より所望の抗体を得ることができる（Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8) 。また、同様のバクテリアをゥキクサ (Lemna minor)に感染させ、クローンィ匕した後にゥ キクサの細胞より所望の抗体を得ることができる（Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 200 6 Dec;24(12):1591-1597) 0
[0085] このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外 (培地、乳汁など)から単 離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は 、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何 ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過 、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳 動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて抗体を分離、精 製することができる。 [0086] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ-ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマ トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロ マトグフフィ ~~等; Ο2» げりれる (Strategies for Protein Purincation ana Charactenzatio n: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(199b Cold Spring Har bor Laboratory Press)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例え ば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ァフィ-テイク 口マトグラフィ一に用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙 げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。
[0087] 必要に応じ、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させる ことにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパ ク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダー ゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
上述のように本発明の宿主細胞を培養し、該細胞培養物力 ポリペプチドを回収す る工程を含む、血中動態が制御された本発明の FcRn結合領域を含むポリペプチド の製造方法もまた、本発明の好ま 、態様の一つである。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0088] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限 されるものではない。
〔実施例 1〕二重特異性抗体のヒトイ匕
特願 2005-112514において血液凝固時間の短縮効果が最も高力つた抗 FactorlXa 抗体 A69-VH、抗 FactorX抗体 B26-VH、ハイブリッド L鎖 (BBA)の組み合わせから成 る二重特異性抗体にっ 、て、以下のようにヒト化を実施した。
1 - 1.ヒト抗体の相同性検索
——般公開されている Kabat Database (ftp://ftp. ebi. ac. uk/ pub/ aatabases/kaoat/) および IMGT Database (http：〃 imgt. cines. fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入 手し、構築したデータベースを用いてマウス A69-H鎖可変領域 (アミノ酸配列：配列 番号： 15)、マウス B26-H鎖可変領域 (アミノ酸配列：配列番号： 16)、マウス BBA-L鎖 可変領域 (アミノ酸配列：配列番号： 17)に分けてホモロジ一検索を行った。その結果 、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことからヒト化抗体の フレームワーク領域 (以下、 FR)に使用することにした。
(1) A69- H鎖可変領域： KABATID- 000064 (Kabat Database)
(Kippsら、 J Clin Invest. 1991 ; 87 : 2087-2096)
(2) B26- H鎖可変領域： EMBL Accession No. AB063872(IMGT Database)
(Unpublished data)
(3) BBA-L鎖可変領域： KABATID- 024300 (Kabat Database)
(Welschofb, J Immunol Method. 1995 ; 179 : 203-214)
(l)-(3)のヒト抗体の FRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域 (以下、 CDR)を移植 したヒト化抗体を作製した。
また、 NCBIより一般公開されている相同性検索 Web site (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)を使用して、（4)- (6)のヒト抗体に相同性の高いヒト抗体の分泌シグ ナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用した
(4) A69- H鎖可変領域： GenBank Accession No. AF062257
(5) B26- H鎖可変領域： GenBank Accession No. AAC 18248
(6) BBA- L鎖可変領域： GenBank Accession No. AAA59100
1 - 2.ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築
分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列 において、 50 base程度の合成オリゴ DNAを 3，末端が約 20 base程度ァニールするよう に交互に 12本作製した。合成オリゴ DNAは 5'末端側にヒト配列、 3'末端側にマウス配 列をコードするか、または全塩基がヒト配列をコードするように設計した。さらに、抗体 可変領域遺伝子の 5'末端にァニールし、 Xhol切断配列を有するプライマーと抗体可 変領域遺伝子の 3'末端にァニールし、 Sfil切断配列を有し且つイントロン配列の 5'末 端配列をコードするプライマーを作製した。 2.5 μ Mに調製した合成オリゴ DNAを各 1 μ Lで混合し、 lx TaKaRa Ex Taq Buffer, 0 .4 mM dNTPs, 0.5 units TaKaRa Ex Taq (全て宝酒造)をカロえ、反応液 48 μ Lになるよ うに調製した。 94°C 5分保温した後に、 94°C 2分、 55°C 2分、 72°C 2分からなる反応 を 2サイクル行い、各合成オリゴ DNAのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次 に、抗体遺伝子の 5，末端および 3，末端にァニールするプライマー (各 10 M)を 1 μ L 添加し、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分力 なる反応を 35サイクル行い、 72°C 5分 反応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。 PCR後、反応液全量を 1 %ァガローズゲ ル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400 bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extracti on Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出し た。該断片を pGEM- T Easy Vector Systems (Promega)を用いて、添付説明書記載の 方法でクローユングを行った。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3730x L DNA Sequencerまたは ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems)にて 、添付説明書記載の方法に従い決定した。
正しいヒトイ匕抗体可変領域遺伝子配列であることが確認された H鎖可変領域断片 挿入プラスミドを Xholおよび Sfilで、 L鎖可変領域断片挿入プラスミドを EcoRIで消化し た後に、反応液を 1 %ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400 bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方 法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。その後、以下のようにして動物細胞用発現べ クタ一を作製した。 H鎖がヘテロな組み合わせである IgG4を優先的に発現させるため に、 IgGlの knobs— into— hole技術 (Merchant AMら、 Nature Biotechnology, 1998年、 V ol. l6、 p.677-681)を参考に IgG4の CH3部分へのアミノ酸置換体を用いた。さらに H鎖 のダイマー形成促進のためにヒンジにもアミノ酸置換 (-ppcpScp-→-ppcpPcp-)を導 入した。 -ヮトリ 13ァクチンプロモーターを有する pCAGGS (Niwaら、 Gene、 1991年、 V ol. 108、 p.193-199)に Y349C、 T366Wに置換した定常領域遺伝子を組み込んだ発 現ベクターにヒト化 A69 H鎖可変領域抗体遺伝子断片を挿入し、ヒト化 A69H鎖発現 ベクターを作製した。また、 pCAGGSに E356C、 T366S、 L368A、 Y407Vに置換した定 常領域遺伝子を組み込んだ発現ベクターにヒト化 B26 H鎖可変領域抗体遺伝子断 片を挿入し、ヒト化 B26H鎖発現ベクターを作製した。また、 pCAGGSに野生型の抗体 L鎖定常領域が挿入されたプラスミド (pCAG-g κ DNA)を EcoRIで消化し、ヒト化 BBA L 鎖可変領域抗体遺伝子断片を挿入した発現ベクターを作製した。連結反応は Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用い、大腸菌 DH5 α株（東洋紡績)を形質転 換した。
[0090] 1 - 3.ヒト化二重特異性抗体の発現
ヒト化二重特異性抗体の発現は、以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由 来 ΗΕΚ293Η株（Invitrogen)を 10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を含む DMEM培 地 (Invitrogen)へ懸濁し、 5〜6 X 105個 /mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（直 径 10 cm, CORNING)の各ディッシュへ 10 mLずつ蒔きこみ COインキュベーター（37
2
°C、 5 % CO )内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、 1 %の Fetal Bovine Seru
2
m(Invitrogen)を含む CHO- S- SFM- II (Invitrogen)培地 6.9 mLを添カ卩した。 1 2で調 製したプラスミド DNA混合液（合計 13.8 g)を 1 g /mL Polyethylenimine (Polyscienc es Inc.) 20.7 μ Lと CHO- S- SFMII培地 690 μ Lと混合して室温 10分間静置したものを 各ディッシュの細胞へ投入し、 4〜5時間、 COインキュベーター（37°Cにて 5 % CO )
2 2 内でインキュベートした。その後、 1 %の Fetal Bovine Serum(Invitrogen)を含む CHO- S -SFM- II (Invitrogen)培地 6.9 mLを添カ卩して、 3日間 COインキュベーター内で培養
2
した。培養上清を回収した後、遠心分離 (約 2000 g、 5分間、室温)して細胞を除去し 、さらに 0.22 /z mフィルター MILLEX(R)-GV (Millipore)を通して滅菌した。該サンプル は使用するまで 4°Cで保存した。
[0091] 1 4.ヒト化二重特異性抗体の精製
実施例 1 2に記載の方法で得られた培養上清に 100 μ Lの rProtein A SepharoseT M Fast Flow (Amersham Biosciences)を添カ卩し、 4°Cで 4時間以上転倒混和した。その 溶液を 0.22 μ mのフィルターカップ Ultrafree(R)- MC (Millipore)に移し、 0.01 % Tween(R) 20を含む TBS 500 μ Lにて 3回洗浄後、 rProtein A Sepharose™榭脂に 100 μしの 0.0 1 % Tween(R) 20を含む 50 mM酢酸ナトリウム水溶液， pH 3.3に懸濁して 2分間静置し たのち、抗体を溶出させた。直ちに、 6.7 Lの 1.5 M Tris-HCl , pH 7.8をカ卩えて中和 した。 [0092] 1 - 5.ヒト化二重特異性抗体の濃度定量
以下に示すとおり、 2種類の方法で測定した。
Goat anti-human Igu (Biosource International)を coating bufferに "t l μ g/mLに 製し、 Nunc- Immuno plate(Nunc)に固相化した。 Diluent buffer (D.B. )にてブロッキン グ処理した後、 D.B.を用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、抗 体濃度算出のためのスタンダードとして、 2000 ng/mLから 3倍系列で D.B.にて 11段階 希釈したヒ HgG4 (ヒト型化抗 TF抗体、 WO 99/51743参照）を同様に添加した。 3回洗 净したのち、 Goat anti-human IgG, alkaline phosphatase (Biosource International) 反応させた。 5回洗浄したのち、 Sigma 104(R) phosphatase substrate (Si gma— Aldrich) を基質として発色させ、吸光度リーダー Model 3550 (Bio-Rad Laboratories)〖こより、参 照波長 655 nmとして 405 nmの吸光度を測定した。 Microplate Manager III (Bio-Rad L aboretories)ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線力も培養上清中のヒ HgG濃 度を算出した。
また、 BiacorelOOOまたは BiacoreQ(BIACORE)を使用し、 ProteinAを固定化した Sen sor Chip CM5(BIACORE)を用いて定量した。具体的にはメーカーのプロトコールに 従い、活性化したセンサーチップに 10 mM酢酸ナトリウム水溶液 (pH 4.0, BIACORE) で g/mLに希釈した ProteinA(SIGMA)溶液を 5 /z L/分で 30分間反応させ、その後 ブロッキング操作を実施して ProteinA固定化センサーチップを作製した。このセンサ 一チップを用いて、 Biacore 1000(BIACORE)を使用して培養上清および精製品の濃 度を測定した。センサーチップの固定および濃度測定には HBS-EP Buffer(BIACOR E)を使用した。また、濃度測定時の標準品として 4000 ng/mLから 2倍系列で HBS-EP Bufferにて 6段階希釈したヒト化 IgG4抗体 (ヒト化抗組織因子抗体、 WO 99/51743参 照)を使用した。
[0093] 1 - 6.ヒト化二重特異性抗体の血液凝固活性評価
血友病 A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、 Fact or VIII欠乏血漿を用いた活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間 (APTT)に対する同抗 体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液 50 μ Factor VIII欠乏血漿 (Biomeri eux) 50 μ L及び APTT試薬（Dade Behring) 50 μ Lの混合液を 37°Cで 3分間加温した。 凝固反応は 20 mMの CaCl (Dade Behring) 50 Lを同混合液に加えることにより開始
2
させた。 CR-A(Amelung)が接続された KClOA(Amelung)により凝固するまでの時間 を測定した。
Factor VIII欠乏血漿の凝固時間を 0%、正常血漿の凝固時間を 100 %としたときに作 製される検量線を用いて、二重特異性抗体を添加した際の凝固時間から二重特異 性抗体の Factor VIII様活性 (%)を算出した。
[0094] 1 - 7.血液凝固活性を保持したヒト化二重特異性抗体の取得
上述した血液凝固活性評価にぉ 、て、血液凝固能が低下したヒト化二重特異性抗 体について、活性上昇を目指してヒト抗体の FRのアミノ酸を改変した。具体的には、 Quikし hange ¾ite— Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用い飞、添付説明書 ¾己 の方法でヒト化抗体可変領域に変異を導入した。 目的のヒト化抗体可変領域遺伝子 配列であることが確認された H鎖可変領域断片挿入プラスミドを Xholおよび Sfilで、 L 鎖可変領域断片挿入プラスミドを EcoRIで消化した後に、反応液を 1 %ァガローズゲ ル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400 bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extracti on Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出し た。その後、実施例 1—2に示す方法で、動物細胞用発現プラスミドを作製した。実施 例 1 3、 1 4、 1 5に示す方法でヒト化二重特異性抗体を調製し、実施例 1 6に 示す方法で血液凝固活性を評価した。
[0095] FR配列のアミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことでキメラ二重特異 性抗体 (A69/B26/BBA)と同等の活性を有するヒト化二重特異性抗体 (ヒト化 A69 (hA6 9a) /ヒト化 B26 (hB26- F123e4)/ヒト化 BBA (hAL- F123j4) )を取得した（図 1)。各抗体 可変領域配列を以下の配列番号に示した。
(1)ヒト化 A69抗体 VH (hA69a) 配列番号： 1 (塩基配列）、配列番号： 2 (アミノ酸配列 )
(2)ヒト化 B26抗体 VH (hB26-F123e4) 配列番号： 3 (塩基配列）、配列番号： 4 (ァミノ 酸配列）
(3)ヒト化 BBA抗体 VL (hAL-F123j4) 配列番号： 5 (塩基配列）、配列番号： 6 (ァミノ 酸配列） [0096] 〔実施例 2〕二重特異性抗体の分離に向けた可変領域のアミノ酸改変箇所の選定 ヒト化 A69抗体およびヒト化 B26抗体の可変領域表面に露出するアミノ酸残基を確 認するために、 MOEソフトウェア（Chemical Computing Group Inc. )を用いて、ホモ口 ジーモデリングによりヒトイ匕 A69抗体およびヒト化 B26抗体の抗体 Fv舅域モデルを作製 した。モデルを図 2に示した。本モデルの詳細な解析により、 CDR以外の FR配列にお いて表面に露出するアミノ酸の中で、 H10、 H12、 H23、 H39、 H43、 H105 (Kabatナン ノ リング、 Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NI H)が、活性を低下させること無ぐ等電点を変化させることができる候補になると考え られた。 CDRにおいては、表面に露出するアミノ酸として H97を選択した。
[0097] 〔実施例 3〕ヒト化 A69抗体とその改変体およびヒト化 B26抗体の可変領域アミノ酸配列 の改変
ヒト化 A69抗体とヒト化 B26抗体の等電点を変化させるために、ヒト化 A69 H鎖可変領 域およびヒト化 B26 H鎖可変領域のアミノ酸改変を行った。具体的には、 QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法で作 製したヒト化 A69抗体 H鎖可変領域 (hA69a、塩基配列番号： 1)およびヒト化 B26抗体 H鎖可変領域 (hB26-F123e4、塩基配列番号 : 3)に変異を導入した。 目的のヒト化抗 体可変領域遺伝子配列であることが確認された H鎖可変領域断片挿入プラスミドを X hoiおよび Sfilで消化した後に、反応液を 1 %ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的 のサイズ（約 400 bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて 添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。実施例 1—2に示す方 法で、野生型定常領域をもつ発現プラスミドに DNA断片を挿入し、 H鎖発現ベクター を作製した。各抗体の改変したアミノ酸残基および配列番号を表 1に示した。 （hA69- N97R、 hA69- pl8)、ヒト化 B26抗体（hB26- F123e4)とその改変体 (hB26- pl5)を調製し た。ヒト化 A69抗体 (hA69a)とその改変体（hA69-N97R、 hA69-pl8)は、 H鎖発現べクタ 一（可変領域は hA69-N97R、 hA69-pl8)と L鎖発現ベクター（可変領域は hAL-F123j 4、配列番号: 6)を組み合わせて、実施例 1—3に従い発現した。また、ヒト化 B26抗体 (hB26-F123e4)とその改変体 (hB26-pl5)は、 H鎖発現ベクター（可変領域は hB26-F 123e4、 hB26-pl5) L鎖発現ベクター（可変領域は B26-VL、アミノ酸配列は WO2005/ 035756 (配列番号： 18)を組み合わせて、実施例 1 3に従い発現した。培養上清中 の抗体を実施例 1 4に示す方法で精製した。
[0098] [表 1]
Figure imgf000038_0001
[0099] 〔実施例 4〕ヒト化 A69抗体およびヒト化 B26抗体からなる二重特異性抗体発現細胞株 の榭立
ヒト化二重特異性抗体を調製するために、以下のようにして抗体発現細胞株を榭立 した。
ヒ HgG4の野生型 H鎖定常領域遺伝子を铸型にして H鎖定常領域の N末端側の 2ァ ミノ酸 (Ala-Ser)をコードする塩基配列が Nhel認識配列 (GCTAGC)になるように設計し た 5，末端側プライマーと 3，末端側にアニーリングし、かつ Notl認識部位を持つように 設計したプライマーを用いて H鎖定常領域を PCR増幅し、 pBluescriptKS+ベクター（ 東洋紡）を Nhel, Notl (ともに宝酒造)で消化したベクターと連結した pBCH4(IgG4定常 領域遺伝子を含む)を作製した。ヒト化 A69-H鎖抗体 (hA69-PFL:配列番号： 11)およ びヒト化 B26-H鎖抗体 (hB26-PF：配列番号： 12)の H鎖可変領域の 5，末端塩基配列 に相補的でコザック配列 (CCACC)および EcoRI認識配列を有するプライマーと Nhel 認識配列を有する 3，末端塩基配列にプライマーを用 1ヽて PCRを行ヽ、得られた PCR 産物を EcoRI, Nhel (ともに宝酒造)で消化、同様に EcoRI, Nhelで消化した pBCH4に 挿入して可変領域と定常領域を連結した。作製したヒト化 A69-H鎖抗体ベクターを Ec oRI, Notl (ともに宝酒造)で消化し、同様に EcoRI, Notlで消化した動物細胞用発現べ クタ一 PCXND3にクローユングした。本ベクター pCXND3の構築の流れについて、以 下に べる。 [0100] DHFR- Δ Ε- rVH- PM1- f(W092/ 19759参照）の抗体 H鎖遺伝子とベクターを分割 するために、制限酵素 EcoRI, Smal部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、 Ec oRI-Notl-BamHI adaptor (宝酒造）をクローユングした。このベクターを pCHOIと命名 した。 pCHOIの DHFR遺伝子発現部位を pCXN (Niwaら、 Gene 1991； 108 : 193- 200) の制限酵素 Hindlll部位にクローユングしたベクターを pCXND3と命名した。また、作 製したヒトイ匕 B26-H鎖抗体ベクターを EcoRI, Notl (ともに宝酒造)で消化し、同様に Eco RI, Notlで消化した動物細胞用発現ベクター pCXZDlにクローニングした。 pCXZDl ベクターは PCXND3ベクターのネオマイシン耐性遺伝子をゼォシン耐性遺伝子に置 き換えた発現ベクターである。また、実施例 1—2に従って、ヒト化 BBA-L鎖抗体 (hAL -s8、配列番号： 8)の L鎖可変領域を L鎖定常領域が挿入されたプラスミド (pCAG-g κ DNA)にクローユングして、 L鎖発現ベクターを作製した。作製した 3種類の発現べ クタ一を制限酵素で直鎖上にしたのちに、 CHO-DG44細胞に遺伝子導入して抗体 発現細胞株を榭立した。
[0101] 安定発現細胞株の作製は次に示すようにして行った。 GenePulserXcell (Bio-Rad) を用いたエレクト口ポレーシヨン法により遺伝子導入した。各抗体発現ベクターと PBS に懸濁した CHO細胞（1 X 107細胞 /mL)の 0.75mLを混合したものを氷上で 10分間冷 却し、キュベットに移した後に 1.5 kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (I nvitrogen)を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen) 40 mLに懸濁した。同様 の培地で 10倍希釈液を作製し、 96ゥエル培養用プレートに 100 L/wellで分注した。 COインキュベーター（5 % CO )で 24時間培養後、 Geneticin (Invitrogen)を 0.5 mg/m
2 2
L、 Zeocin (Invitrogen)を 0.6 mg/mLになるように、添カ卩して 2週間培養した。薬剤耐性 を示す形質転換細胞のコロニーを順次拡大培養し、榭立した高産生細胞株を用い て大量培養を行い、培養上清を得た。
[0102] 〔実施例 5〕ヒト化抗体ホモダイマーとヒト化二重特異性抗体の分離精製
実施例 4で得られた培養上清カゝら以下の方法で二重特異性抗体を精製した。培養 上清を平衡化バッファー（20 mmol/L Sodium Phosphate buffer, 150 mol/L NaCl, pH 7.0)で平衡ィ匕した rProtein A Sepharose Fast Flow7フム (Amersham Biosciences ^ 50 mmI.D. X 9.9 cmH. = 194.3 mL— resin)に添カ卩し、洗浄用バッファー 1 (20 mmol/L Sod ium Phosphate buffer, 150 mol/L NaCl, pH7.0)、洗浄用バッファー 2 (50 mmol/L Sod ium Acetate buffer, pH6.0)で洗浄した後に 50 mmol/L Acetic acidを用いて溶出した 。溶出後に直ちに 1.5 mol/L Tris-HCl, pH 7.8を加えて pH 6.3に調整した。
[0103] 得られた精製溶液を Solvent A (10 mmol/L sodium Phosphate buffer, pH6.3)で平 衡化した SP TOYOPEARL 650Mカラム（東ソ一、 26 mmI.D. X 22.3 cmH. = 118.3 mL -resin)に添カ卩した。以下に示すような溶液および Gradientで抗体の表面電荷の差を 用いた分離を行った。
solvent A ： 20 mmol/L bodium Acetate buffer, pHo.O
Solvent B ： 20 mmol/L Sodium Acetate buffer, 1 mol/L NaCl, pH6.0
Flow rate ： 10 mL/min (113 cm/h)溶出時のみ 5.3 mL/min (60 cm/h)
Gradient ： 0→ 15 % B Step wise 3 Column Volume (CV)通液
15→ 35 % B gradient 6 CV
35→ 50 % B gradient 10 CV
50→100 % B gradient 3 CV
100 % B Step wise 4 CV通液
溶出の結果、検出された 3本のピークを分取することで、 2種類のホモダイマー（hA6 9- PF、 hB26-PF)と 1種類のへテロダイマーである二重特異性抗体 BiAbを回収した。
[0104] 〔実施例 6〕調製抗体の等電点電気泳動による分析
ATFはヒト組織因子に対するモノクローナル抗体として取得され、ヒト IgG4の定常領 域を持つヒトイ匕抗体である。 ATFの由来については WO99/051743に詳細に記載さ れており、 H鎖可変領域と L鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：13、配 列番号： 14に示した。 ATFおよび実施例 5において調製した hA69-PF、 BiAb、 hB26- PF、実施例 3において調製した hA69-N97R、 hA69-pl8、 hB26-e、 hB26-pl5につい て、可変領域のアミノ酸配列の違いによる表面電荷の変化、および、アミノ酸改変に よる表面電荷の変化について評価するために等電点電気泳動による分析を実施し た。
[0105] ATF、 hA69- PF、 BiAb、 hB26- PF、および、ヒト化 A69抗体である hA69- N97Rとその 改変体である hA69-pl8、および、ヒト化 B26抗体である hB26-F123e4とその改変体で ある hB26-pl5の等電点電気泳動は以下のとおり行った。 Phastsystem Cassette (Ame rchamBioscience社製）を用いて以下の膨潤液で 30 minほど Phast- Gel Dry IEF (Ame rchamBioscience社製)ゲルを膨潤させた。
ミリ 1.5mL
Pharmalyte 5-8 for IEF (AmerchamBioscience社 ) 50 μ L
Pharmalyte 8-10.5 for IEF (AmerchamBioscience社製) 50 μ L
膨潤したゲルを用 、て PhastSystem(AmerchamBioscience社製)により以下のプログ ラムで電気泳動を行った。サンプルは Step 2でゲルに添カ卩した。 piマーカーとして、 C alibration Kit for pI(AmerchamBioscience社製) 使用した。
Step 1 : 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 75 Vh
Step 2: 200 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 15 Vh
Step 3: 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 410 Vh
泳動後のゲルは 20 % TCAで固定した後、 Silver staining Kit, protein(AmerchamBi oscience社製)を用い、キットに添付されて 、るプロトコールに従!、銀染色を行った。 染色後、 piマーカーの既知等電点カもサンプルの等電点を算出した。等電点電気泳 動による分析結果を図 3に示した。 piマーカーから作製した piと移動度の検量線およ びそれより算出された等電点を図 4に示した。なお各サンプルは抗体由来の電荷的 ヘテロジェ-ティーが存在するため、メインのバンドの移動度をもとに等電点を算出し た。
これより可変領域のアミノ酸配列の違いによる表面電荷の変化、および、アミノ酸改 変による表面電荷の変化により piの変化が観察された。 hB26-PFが約 9.2、 BiAbが約 8.7、 hA69- PFが約 8.0、 ATFが約 7.2、 hA69- N97Rが約 8.9、 hA69- pl8が約 8.5、 hB26 - F123e4が約 8.7、 hB26- pl5が約 9.0であった。 hA69- N97Rと hA69- pl8、 hA69- PFは 同じヒト化抗体可変領域を改変しており、 hA69-N97Rと比較して hA69-PFにお!/、ては 約 0.9の piの変化を付与することができ、 hB26-F123e4と比較して hB26-pl5は約 0.3の piの変化を付与することができた。本検討において、可変領域のアミノ酸配列の違い により等電点が変化し、さらに選択した可変領域の H10、 H12、 H23、 H39、 H43、 H97 、 H105の表面アミノ酸の電荷的に改変することによって等電点を変化させることが可 能であることが示された。
[0107] 〔実施例 7〕ヒト化 A69抗体とその改変体およびヒト化 B26抗体とその改変体の結合活 性評価
ヒト化 A69抗体とその改変抗体の機能を評価するために、以下の方法で抗原である Factor IXaに対する結合活性を評価した。ヒト化 A69抗体 (hA69a)とその改変抗体 (hA 69- N97R)の評価は以下のように行った。 Coating buffer (100 mM sodium bicarbonate, pH 9.6, 0.02 % sodium azide)で 1 μ g/mLに希釈した Factor IXa β (Enzyme Research Labratories)を、 Nunc- Immuno plate (Nunc- Immuno 96 Micro Well plates MaxiSo rp™(Nalge Nunc International) )に 100 μ L/wellで分注後、 4°Cでー晚インキュベーシ ヨンした。 Tween(R) 20を含む PBS (-)で 3回洗浄後、 diluent buffer (50 mM Tris- HC1, p H 8.1, 1 % bovine serum albumin, 1 mM MgCl , 0.15 M NaCl, 0.05 % Tween(R) 20, 0.
2
02 % sodium azide)で plateを室温で 2時間 blockingした。 Bufferを除去後、 diluent buffe rで希釈した精製抗体を 100 L/well添加し、室温で 1時間インキュベーションした。 P1 ateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1/4000希釈したアルカリホスファターゼ標識ャギ抗 マウス IgG (BIOSOURCE)を 100 μ L/well添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした 。 Plateを 5回洗浄後、発色基質（Sigma)を 100 L/well添カ卩し、室温で 30分インキュべ ーシヨンした。 405 nm (対照 655 nm)における吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories)で測定した。
[0108] 実施例 8に使用した改変抗体 (hA69-N97R, hA69-pl8, hA69-PF)の評価は以下の よつ【こ行った。し oating buffer (0.05 M carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.りノで 1 μ g/ mLに希釈した Factor IXa(Enzyme Research Labratories)を、 Nunc— Immuno plate (Nu nc- Immuno 96 Micro Well plates MaxiSorp (Nalge Nunc International) )に 100 μ L/wellで分注後、 4°Cでー晚以上インキュベーションした。 0.05 % Tween(R) 20を含 む PBSで 3回洗浄後、 diluent buffer (tris buffered saline with tween20 pH 8.0 (SIGMA ), 1 % bovine serum albumin, 0.02 % sodium azide)を plateに 200 μ L/well添カ卩し、室温 で 2時間 blockingした。 Bufferを除去後、 diluent bufferで希釈した精製抗体を 100 L/ well添カ卩し、 4°Cでー晚インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1 /500希釈したアルカリホスファターゼ標識マウス抗ヒト IgG4 (Southern Biotechnology) を 100 L/well添カ卩し、室温で 2時間インキュベーションした。 Plateを 5回洗浄後、 Blue Phos Microwell Phosphatase substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories社 製)を基質として 100 L/well添カ卩し、室温で約 30分インキュベーションした。 650 nm における吸光度を Microplate Reader Vmax (Molecular Devices)で測定した。その結 果、図 5に示すとおり、表面電荷を変化させるために可変領域を改変した抗体は、改 変前の抗体と同等の結合活性を示した。
[0109] また、ヒト化 B26抗体 (hB26-F123e4)とその改変抗体 (hB26-pl5)の機能を評価する ために、以下の方法で抗原である Factor Xに対する結合活性を評価した。 Coating b ulfer (100 mM sodium bicar Donate, pH 9.り, 0.02 % sodium azide)で 1 μ g/mUこ希釈 した Factor X(Enzyme Research Labratories)を、 Nunc— Immuno plate (Nunc— Immuno 96 Micro Well™ plates MaxiSorp (Nalge Nunc International) )に 100 L/wellで分 注後、 4°Cでー晚インキュベーションした。 Tween(R) 20を含む PBS (-)で 3回洗浄後、 dil uent buffer (50 mM Tris— HCl, pH 8.1, 1 % bovine serum albumin, 1 mM MgCl , 0.15
2
M NaCl, 0.05 % Tween(R) 20, 0.02 % sodium azide)で plateを室温で 2時間 blockingし た。 Bufferを除去後、 diluent bufferで希釈した精製抗体を 100 L/well添カ卩し、室温 で 1時間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1/4000希釈した アルカリホスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG (BIOSOURCE)を 100 μ L/well添カロし、 室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 5回洗浄後、発色基質（Sigma)を 100 /z L /well添カ卩し、室温で 30分インキュベーションした。 405 nm (対照 655 nm)における吸光 度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- Rad Laboratories)で測定した。その結果、 図 6に示すとおり、表面電荷を変化させるために可変領域を改変した抗体は改変前 の抗体と同等の結合活性を示した。
以上のことから、本実施例における可変領域の改変は抗体の抗原結合に影響しな いことが示された。
[0110] 〔実施例 8〕調製抗体の体内動態評価
8 - 1.マウスを用いた体内動態試験
ATFはヒト組織因子に対するモノクローナル抗体として取得され、ヒト IgG4の定常領 域を持つヒトイ匕抗体である。 ATFの由来については WO99/051743に詳細に記載さ れており、 H鎖可変領域と L鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：13、配 列番号： 14に示した。 ATFおよび実施例 5において調製した hA69-PF、 BiAb、 hB26- PF、実施例 3において調製した hA69-N97R、 hA69-pl8、 hB26-e、 hB26-pl5につい て、マウス（C57BL/6J、日本チャールズリバ一）における体内動態を評価した。 ATF、 hA69- PFゝ BiAb、 hB26- PFをマウス（C57BL/6J、 日本チャールズリバ一）に 5 mg/kgで 静脈内単回投与し投与前および投与後 15分間、 2時間、 8時間、 1日間、 2日間、 4日 間、 7日間、 11日間、 14日間、 21日間、 28日間で採血を行った。採取した血液は直ち に 4°C、 15,000 rpmで 15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施 するまで- 20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。同様に、 hA69-N97R、 hA69-pl 8、 hB26- F123e4、 hB26- pl5をマウス（C57BL/6J、 日本チャールズリバ一）に 1 mg/kg で静脈内単回投与し投与前および投与後 15分間、 2時間、 8時間、 1日間、 2日間、 5 日 [¾、 7日 [¾、 9日 [¾、 14日 [¾、 21日 [¾、 28日 で採血を行った。採取した血液 ίま直 ちに 4°C、 15,000 rpmで 15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実 施するまで- 20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。
[0111] 8 - 2. ELISA法による血漿中濃度測定
マウス血漿中濃度測定は ELISA法にて測定した。血漿中濃度として 6.4、 3.2、 1.6、 0 .8、 0.4、 0.2、 0.1 μ g/mLの検量線試料を調整した。検量線試料およびマウス血漿測 定試料を Anti- human IgG( y -chain specific) F(ab')2(Sigma社製)で固相化したィムノ プレ ~~ト (Nunc- Immuno Plate, MaxiSorp(Nalge nunc International社製))に分注し、室 温で 1時間静置後、 Goat Anti-Human IgG- BIOT(Southern Biotechnology Associate s社製)および Streptavi din— alkaline phosphatase conjugate (Roche Diagnostics社製) を川頁次反 、 せ、 BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を基質として用い発色反応を行い、マイクロプレートリーダー にて 650 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフ トウエア SOFTmax PRO (Molecular Devices社製）を用いて算出した。 ATFゝ hA69- PF 、 BiAb、 hB26-PFの血漿中濃度推移を図 7に示した。
[0112] 8 - 3.薬物動態データの算出方法 得られた血漿中濃度推移のデータを薬物動態解析ソフト WinNonlin (Pharsight社製 )で非モデル依存的解析を行 ヽ薬物動態学的パラメーター (クリアランス (CL)、半減 期 (T1/2))を算出した。 T1/2は最終の 3点もしくは WinNonlinが自動設定した最終相 の血漿中濃度力も算出した。得られた薬物動態的パラメーターを表 2に示した。
[0113] [表 2] hA69-N97R hA69-p18 hA69-PF ATF
Pi 8.Θ 8.5 8.0 7.2
Cし mL/h/kg 0.412 0.300 0.204 0.136
T1 /2 day 12.6 1 5.0 1 8.7 26.1 hB26-F123e4 hB26-p15 hB26-PF BiAb
Pi 8.7 9.0 9.2 8.7
CL mL/h/kg 0.346 0.450 0.600 0.362
T1 /2 day 13.4 1 1.9 10.8 13.6
[0114] さらに piに対して、各抗体のクリアランス (CL)、半減期 (T1/2)をプロットしたものを図
8に示した。使用した各抗体は同一の定常領域配列を有するにも関わらず、 piとタリ ァランス (CL)および半減期 (T1/2)は高い相関関係を示し、 piが低いほどクリアランス が低下し、長い血中半減期を有することが見出された。このように同一の定常領域配 列であっても pi値によって血中半減期を制御することが可能であり、すなわち、 piを低 下させることによって血中半減期を延長させることが可能であり、 piを上昇させること によって半減期を短くすることが可能であることが示唆された。実際に、本実施例で は hA69-N97Rの可変領域の表面アミノ酸を改変し (改変した箇所を表 3に示した）、 pi を低下させることで血中半減期を長くすることが可能であり、また hB26-F123e4の可 変領域の表面アミノ酸を改変し (改変した箇所を表 4に示した)、 piを上昇させることで 血中半減期を短くすることが可能であることが示された。これらのことから可変領域の 表面アミノ酸（具体例として、 H10、 H12、 H23、 H39、 H43、 H97、 H105)を電荷的に改 変することで、 IgGの血中動態を制御できることが示された。
[0115] [表 3] 名称 H 1 H 12 H23 H27 H43 H97 H 103 し 99 hA69-N97R Pyr(Q) K K G Q R Q G hA69-p18 Pyr(Q) K K G E N E G A69-PF E V T Y E し E Q
* 氺 * * * 表 4] 名称 H1 H9 H10 H28 H37 H39 H43 H 103 L99 hB26-F123e4 Pyr(Q) P D M A Q Q Q G hB26-p15 Pyr(Q) P D M A K K R G hB26-PF E A Q T V Q K R Q
* * * *
上記表 3および表 4中、 Pyr(Q)はピロダルタミルイ匕していると考えられる N末のグルタ ミン残基であり N末のアミノ基が保護されて ヽるため、 Pyr(Q)と Eでは電荷的に大きな 差異はない。また、表 3および表 4中でアミノ酸置換により piが変化する箇所を *で示 した。
本発明により、可変領域の表面アミノ酸を置換し IgGの piを低下させることで IgGの血 中半減期を延長できることが可能であり、また、逆に可変領域の表面アミノ酸を置換 UgGの piを上昇させることで IgGの血中半減期を短くすることが可能であることが見出 された。
マウスを用いた血中動態の検討においては、非特許文献（Nat Biotechnol. 1997 ; 1 5 : 637-640)に定常領域の Fcに存在するアミノ酸を改変し、 FcRnへの親和性を高める ことで血中半減期 (T1/2)を約 1.5倍延長することが可能であることが示されており、本 発明にお 、ても hA69-N97Rと hA69-PFを比較した場合、同一の定常領域配列にお いて可変領域の表面アミノ酸を改変し piを低下させることによって血中半減期 (T1/2) を約 1.5倍延長することができた。さらに hA69- N97Rと hA69-PF、 ATFを比較すると、 pi の最も低い ATFの T1/2は、 hA69- N97Rよりも約 2.1倍も長いことから、 hA69- N97Rの 可変領域に存在する表面アミノ酸をさらに改変し piを低下させることによって、 hA69- N97Rの血中半減期をさらに長くすることが可能である。本実施例に使用した抗体を 比較すると、 piが最も高い hB26-PFと最も低い ATFの血中半減期では約 2.4倍異なつ ており、可変領域のアミノ酸改変による血中動態制御は既存の制御技術と比較して 高い効果が期待できる。また、抗原性の観点からは定常領域に導入する人工的なァ ミノ酸置換は少な 、ほうがよぐ可変領域の表面アミノ酸を改変することで血中半減期 を制御する本発明は医薬品の開発において有用であると考えられる。
産業上の利用可能性
本発明の方法の好ましい態様においては、アミノ酸の置換が可変領域にて行われ ること力ら、定常領域を改変する従来の方法に比べて、抗原性のリスクが小さい。また 、血中半減期を延長させる制御においては、従来法である定常領域を改変する方法 よりも大きな効果を示すことが可能である。また、可変領域において構造'機能 (活性 )を変化させることなぐ表面電荷をコントロールすることで IgG抗体等の FcRn結合領 域を含むポリペプチドの血中半減期を制御することが可能である。本発明の方法を 用いることにより、実際に活性を保持したまま血中半減期が制御された FcRn結合領 域を含むポリペプチドの取得が可能である。

Claims

請求の範囲
[I] 血中動態が制御された FcRn結合領域を含むポリペプチドの製造方法であって、 (a ) FcRn結合領域を含むポリペプチドの表面に露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残 基の電荷が変わるように、該アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする核酸を改変 し、（b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（c)宿主細胞培養物から FcRn結 合領域を含むポリペプチドを回収することを含む方法。
[2] 前記 FcRn結合領域を含むポリペプチドの表面に露出し得るアミノ酸残基力 FcRn 結合領域を含むポリペプチド中の FcRn結合領域以外の領域にある請求項 1に記載 の方法。
[3] 前記 FcRn結合領域が、 Fc領域または Fc様領域力 なる請求項 2に記載の方法。
[4] FcRn結合領域を含むポリペプチドが IgG抗体である請求項 1に記載の方法。
[5] 工程 (a)で電荷が変えられるアミノ酸残基が、 IgG抗体の重鎖可変領域または軽鎖 可変領域のアミノ酸残基である請求項 4に記載の方法。
[6] 前記血中動態の制御が、血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランスのい ずれかのパラメーターの制御である請求項 1に記載の方法。
[7] 工程 (a)におけるアミノ酸残基の電荷の改変が、アミノ酸置換による請求項 1に記載 の方法。
[8] 請求項 1に記載の方法により製造される FcRn結合領域を含むポリペプチド。
[9] FcRn結合領域を含むポリペプチドの血中動態を制御する方法であって、 FcRn結合 領域を含むポリペプチドの表面に露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷を 変えることを含む方法。
[10] 前記 FcRn結合領域を含むポリペプチドの表面に露出し得るアミノ酸残基力 FcRn 結合領域を含むポリペプチド中の FcRn結合領域以外の領域にある請求項 9に記載 の方法。
[II] 前記 FcRn結合領域が、 Fc領域または Fc様領域力 なる請求項 10に記載の方法。
[12] FcRn結合領域を含むポリペプチドが IgG抗体である請求項 9に記載の方法。
[13] 電荷が変えられるアミノ酸残基が、 IgG抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の アミノ酸残基である請求項 12に記載の方法。
[14] 前記血中動態の制御が、血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランスのい ずれかのパラメーターの制御である請求項 9に記載の方法。
[15] アミノ酸残基の電荷の改変が、アミノ酸置換による請求項 9に記載の方法。
[16] 請求項 9に記載の方法により血中動態が制御された FcRn結合領域を含むポリぺプ チド。
[17] ヒト以外の動物由来の相補性決定領域 (CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域 (FR) およびヒト定常領域を含むヒトイ匕抗体であって、 CDRまたは FRにお 、て抗体表面に 露出し得る少なくとも一つのアミノ酸残基が野生型の CDRまたは FRの対応する位置 のアミノ酸残基とは異なる電荷を有するアミノ酸残基であり、可変領域が該ヒト以外の 動物由来の抗体に由来し且つ同じ定常領域を有するキメラ抗体に比べて血中動態 が制御されたヒト化抗体。
[18] 前記ヒト定常領域が野生型のヒト Fc領域を含む請求項 17に記載のヒト化抗体。
[19] 請求項 17または 18に記載のヒト化抗体および医薬的に許容される担体を含む組 成物。
[20] 請求項 17または 18に記載のヒト化抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸。
[21] 請求項 20に記載の核酸を有する宿主細胞。
[22] 請求項 21に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収 する工程を含む請求項 17または 18に記載のヒト化抗体の製造方法。
[23] 重鎖可変領域における Kabatナンバリングによる 10位、 12位、 23位、 39位、 43位、お よび 105位のアミノ酸残基力 選ばれる、少なくとも 1つのアミノ酸残基の電荷が改変 され、当該アミノ酸残基の改変前と比べて血中動態が制御された IgG抗体。
[24] 前記改変されたアミノ酸残基が、以下の（a)または (b) V、ずれかの群に含まれるアミ ノ酸残基から選択される請求項 23に記載の IgG抗体：
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)。
[25] 請求項 23または 24に記載の IgG抗体および医薬的に許容される担体を含む組成 物。
[26] 請求項 23または 24に記載の IgG抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸。 請求項 26に記載の核酸を有する宿主細胞。
請求項 27に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収 する工程を含む請求項 23または 24に記載の抗体の製造方法。
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