JPH10504970A

JPH10504970A - 普遍的またはランダム化免疫グロブリン軽鎖を用いる抗体ライブラリーの製造方法

Info

Publication number: JPH10504970A
Application number: JP8509628A
Authority: JP
Inventors: カーロスエフバーバス; デニスアールバートン; リチャードエイラーナー
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-09-01
Publication date: 1998-05-19
Also published as: CA2198899A1; WO1996007754A1; PT779933E; DE69530305D1; US5667988A; EP0779933A4; AU706343B2; ES2196077T3; ATE236992T1; DE69530305T2; AU3504695A; DK0779933T3; EP0779933B1; CA2198899C; US6096551A; EP0779933A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗体ライブラリーの製造方法、特に当該ライブラリーを含む糸状ファージ粒子の表面に表示させた免疫グロブリン重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域内に変異を誘発することによって抗体ライブラリーの多様性を高める方法を開示する。本発明はまた、該ライブラリーの多様性を高めるために有用なオリゴヌクレオチド、および該ライブラリーの製造方法で有用な普遍的軽鎖を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】普遍的またはランダム化免疫グロブリン軽鎖を用いる抗体ライブラリーの製造方法技術分野本発明は、一般に蛋白生化学および免疫学の分野に関し、具体的には可変重鎖および軽鎖ポリペプチドを含む異種二量体免疫グロブリン分子の調製方法に関する。背景完全もしくは部分的合成抗体の結合部位またはパラトープの大型ライブラリーは、糸状ファージ表示ベクター（ファージミドと称される）を用いて構築され、多様で新規な免疫特異性を有する単クローン性抗体の大型ライブラリーがもたらされてきた。この技術は、糸状ファージ増殖の会合（assembly）期において糸状ファージの外殻（コート）蛋白の膜アンカードメインを遺伝子産物と遺伝子を連結する手段として利用され組合せ式ライブラリー(combinatorial library)からの抗体のクローニングと発現に利用されてきた(Kangら、Proc．Natl．Acad．Sci .，USA，88:4363-4366(1991))。抗体の組合せ式ライブラリーはｃｐＶＩＩＩ膜アンカー（Kangら、上掲書）およびｃｐＩＩＩ膜アンカー(Barbasら、Proc．Nat l．Acad．Sci.，USA，88:7978-7982(1991))の両方を用いて作製された。糸状ファージを基にした組合せ式抗体ライブラリーの多様性は、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を混ぜ合わせることによって(Kangら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA ，88:11120-11123(1991))、該ライブラリーのクローン化重鎖遺伝子の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を変化させることによって(Kangら、Proc．Natl．Acad．S ci.，USA，89:4457-4461(1992))、さらにエラー向性(error-prone)ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりランダム変異を該ライブラリーに導入することによって(Gramら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89:3576-3580(1992))高めることができる。蛋白の変異誘発は該蛋白の機能を変化させるために利用され、幾つかの事例では蛋白の結合特異性を変化させるために実施された。典型的には、この変異誘発は位置特異的であり、したがって当該蛋白において誘発するべき変異の体系的な選択に左右され煩雑である。例えば、ラットトリプシンが位置特異的変異によって修飾されたコーレイらの文献を参照されたい(Coreyら、J．Amer．Chem．Soc., 114:1784-1790(1992))。チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の選択されたコドンの部分的ランダム化を変異誘発手段として用いて種々のＴＫ蛋白が生成された(M unirら、J.Biol.Chem.，267:6584-6589(1992))。有用な結合機能について操作可能な抗体分子（重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリペプチドを含む）のレパートリーを増やすための方法はまだまだ必要とされている。発明の簡単な説明このファージミド表示技術は、免疫グロブリン軽鎖を操作し多様な免疫グロブリン特異性をもつライブラリーを調製することによって改善できることが分かった。特に、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをランダム変異誘発によってのその相補性決定領域（ＣＤＲ）でランダム化して、新規で有用な免疫特異性を引き出せるより大きくより多様な軽鎖ライブラリーを作製できることを示す。したがって一実施形態では、本発明は、重鎖遺伝子と組み合わせて使用する免疫グロブリン軽鎖遺伝子ライブラリーを作製し、さらに多様で新規な免疫特異性をもつ抗体ライブラリーを作製するための遺伝子ライブラリーを作製するために、免疫グロブリン軽鎖遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）に突然変異を誘発する方法を開示する。本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを用いて実施することによって免疫グロブリン軽鎖遺伝子のＣＤＲ部分を増幅させることを含むが、この場合、該オリゴヌクレオチドは３ ’および５’末端を有し、さらに下記を含む：ａ）免疫グロブリン軽鎖遺伝子の第一のフレームワーク領域とハイブリダイズする能力を有するその３’末端に位置するヌクレオチド配列；ｂ）免疫グロブリン軽鎖遺伝子の第二のフレームワーク領域とハイブリダイズする能力を有するその５’末端に位置するヌクレオチド配列；およびｃ）その３’と５’末端の間に位置する下記式のヌクレオチド配列：〔ＮＮＫ〕_n' ここでＮはそれぞれ別個にいずれかのヌクレオチドで、ＫはＧまたはＴで、ｎは３から約２４で、当該３’および５’末端ヌクレオチド配列は長さが約６から５０ヌクレオチドである。さらにまた包含されるものは、それらに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、本発明は、さらに下記工程を含む前記変異誘発方法を包含する：ａ）増幅ＣＤＲを分離し、変異免疫グロブリン軽鎖遺伝子ライブラリーを作製し；ｂ）この分離した変異軽鎖遺伝子ライブラリーを１つまたは２つ以上の重鎖遺伝子と組み合わせて発現させ、発現重鎖および軽鎖遺伝子の組合せ式抗体ライブラリーを作製し；さらにｃ）予め選んだ抗原と結合する能力についてこの組合せ式抗体ライブラリーの種を選別する。一実施形態では、この１つまたは２つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子は、本明細書でさらに述べるように重鎖遺伝子ライブラリーとして提供される。関連する実施形態として、本方法で用いられるオリゴヌクレオチドは３’と５ ’末端の間に下記式のヌクレオチド配列をもつことができる：〔ＭＮＮ〕_n' ここで、Ｎはそれぞれ別個にいずれかのヌクレオチドで、ＭはＡまたはＣで、ｎは３から約２４である。さらに本発明では、特定の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインポリペプチドは、極めて多様な重鎖の軽鎖パートナーとして（すなわちこの軽鎖は異なる重鎖との結合に際して機能的な異種二量体抗体分子を形成する）有用で、本明細書で開示する組合せ式ライブラリーにおいて軽鎖として普遍的に機能する能力を呈することが開示される。したがって、好ましい変異誘発方法では、該免疫グロブリン可変ドメイン軽鎖遺伝子には、配列番号２および６２（本明細書で開示する好ましい普遍的軽鎖ポリペプチドをコードする）で示す軽鎖から成る群から選ばれる配列の特徴をもつ配列が含まれる。関連する実施形態では、本発明は、普遍的軽鎖ポリペプチド遺伝子のＣＤＲドメインの突然変異誘発による多様化を経ないで該ポリペプチド遺伝子を直接使用することを目的とする。特に、本発明は、以下の工程を含む免疫グロブリン可変ドメイン重鎖および軽鎖ポリペプチドを有する異種二量体免疫グロブリン分子を製造する方法を目的とする：ａ）配列番号２および６２に示す軽鎖から成る群から選ばれる軽鎖の配列の特徴をもつ配列を含む免疫グロブリン可変ドメイン軽鎖遺伝子を、１つまたは２つ以上の免疫グロブリン可変ドメイン重鎖遺伝子と組合せて、組合せ式免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子ライブラリーを形成するが、この場合の組合せは、該重鎖および軽鎖遺伝子の同時発現が可能なベクターに該重鎖遺伝子の１つと軽鎖遺伝子とを機能できるように連結することを含み；ｂ）該組合せ式ライブラリーを発現させて発現重鎖および軽鎖ポリペプチドの組合せ式抗体ライブラリーを作製し；さらにｃ）予め選んだ抗原と結合する能力について該組合せ式抗体ライブラリーの種を選別する。さらにまた目的とされるものは、列挙した変異誘発を実施するためにＰＣＲプライマーとして使用するオリゴヌクレオチド組成物である。図面の簡単な説明図１は、本発明の半合成Ｆａｂ異種二量体の選別に使用されるハプテン共役物の構造を示す。共役物１は、実施例５Ｂで詳述するフルオレセイン−ＢＳＡ（Ｆ１−ＢＳＡ）である。共役物２および３はそれぞれＳ−ＢＳＡおよびＣ−ＢＳＡで、これらは実施例５Ｂで説明するように調製された。図２は、ＥＬＩＳＡによって調べた選別Ｆａｂ異種二量体の抗合成ハプテン共役物特異性のグラフである。ＥＬＩＳＡに用いた抗原は左から右の順に、原型ｐＣ３ＡＰ３１３特異的破傷風類毒素（右上がり斜線入り棒線）、Ｆ１−ＢＳＡ共役物（黒棒線）、ＢＳＡ（ジグザグ棒線）、Ｓ−ＢＳＡ(右下がり斜線入り棒線) およびＣ−ＢＳＡ（白棒線）である。標準的なＥＬＩＳＡを実施例６Ａで説明するように実施した。発明の詳細な説明Ａ．定義アミノ酸残基：ポリペプチドのペプチド結合でポリペプチドを化学的に消化（加水分解）して生成されるアミノ酸。本明細書のアミノ酸残基は好ましくは“Ｌ ”型異性体である。しかし“Ｄ”型異性体残基も、該ポリペプチドが所望の機能的特性を保持するかぎり何れのＬ−アミノ酸残基の代用とすることもできる。ＮＨ₂はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標準的なポリペプチド命名法（J．Biol．Chem.，243:3552-59(1969)に記載され、37CFR § 1. 822(b)(2)で採用）に従い、アミノ酸残基の略称は下記の対応表に示す。本明細書に公式で表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への通常の方向で左から右の方向で表される。さらに、“アミノ酸残基 ”という語句は広く規定され、対応表に列挙されたアミノ酸並びに修飾および通常でないアミノ酸（例えば３７ＣＦＲ１．８２２（ｂ）（４）に挙げられ、さらに参照により本明細書に含まれるもの）を含む。さらに、アミノ酸残基配列の開始および末端のダッシュは１つまたは２つ以上のアミノ酸残基をもつまた別の配列とのペプチド結合、またはアミノ末端基（例えばＮＨ₂）もしくはアセチルとの共有結合またはカルボキシ末端基（例えばＣＯＯＨ）との共有結合を示す。組換え体（リコンビナント）ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子：２つのＤＮＡセグメントを機能的に連結することによって生成されるＤＮＡ分子。したがって、リコンビナントＤＮＡ分子は、自然の状態では通常一緒に見出されることのない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物学的起源を持たない（すなわち進化的に異なる）ｒＤＮＡ分子は“異種”であるという。ベクター：細胞内で自律的に増殖でき、さらにそれに対してＤＮＡセグメント（例えば遺伝子またはポリヌクレオチド）が機能的に連結可能でそれによって添付されたセグメントの複製をもたらすｒＤＮＡ分子。１つまたは２つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子発現を誘導することができるベクターは、本明細書で“発現ベクター”と称される。特に重要なベクターは、逆転写酵素を用いて得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）のクローニングを可能にする。レセプター：レセプターは、特異的に（非任意的に）別の分子に結合することができる分子である（例えば蛋白、糖蛋白など）。抗体：抗体という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子）を指すために本明細書では用いられる。代表的な抗体分子は無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の部分であるが、後者は当技術分野ではＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ（ｖ）として知られるものを含む。抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）重鎖並びに軽鎖可変および超可変領域を含む抗体分子の構造部分である。免疫反応するという用語は、抗原決定基含有分子と抗体結合部位を含む分子（例えば完全な抗体分子またはその部分）との間での特異的結合を指す。単クローン性抗体：単クローン性抗体とは、特定のエピトープと免疫反応することができるただ１種の抗体結合部位を含む抗体分子集団をいう。したがって、単クローン性抗体は典型的には、それが免疫反応するいずれのエピトープについてもただ１つの結合親和性を示す。したがって、単クローン性抗体は、各々が異なるエピトープに対して免疫特異的な複数の抗体結合部位を含む可能性がある（例えば二重特異的単クローン性抗体）。歴史的には単クローン性抗体は、クローンとして純粋な免疫グロブリン分泌細胞株の永続化によって生成されたが、単クローンとして純粋な抗体分子集団は本発明の方法によってもまた調製できる。融合ポリペプチド：少なくとも２つのポリペプチドおよび、この２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチドとして機能できるように連結する連結配列を含むポリペプチド。融合ポリペプチドとして連結されたこの２つのポリペプチドは、典型的には２種のそれぞれ別個の起源に由来し、したがって融合ポリペプチドは、自然の状態では通常一緒には見出されない２つの連結ポリペプチドを含む。上流：ＤＮＡの転写方向と反対の方向、したがって非コード鎖では５’から３ ’方向、またｍＲＮＡでは３’から５’の方向。下流：配列の転写または読み出しの向きのＤＮＡ配列の方向で、ＤＮＡの非コード鎖では３’から５’方向、またＲＮＡ転写物では５’から３’方向。シストロン：アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ分子におけるヌクレオチド配列で、上流および下流のＤＮＡ発現制御成分を含む。リーダーポリペプチド：ポリペプチドのアミノ末端に存在する長さの短いアミノ酸配列で、これはポリペプチドを内側膜を通過するように運搬または誘導し、それによってペリプラズム間隙およびおそらくはそれを越えてそれが最終的に分泌されることを担保する。リーダー配列ペプチドは通常はポリペプチドが活性を得る前に除去される。読み枠：翻訳に用いられる連続する３つずつ（トリプレット）のヌクレオチド（コドン）。この読み枠は翻訳開始コドンの存在場所に左右される。Ｂ．抗体分子または抗体分子ライブラリーの作製方法１．一般原理本発明は、単一のベクター系を用いて遺伝子レパートリーから予め選択したリガンド結合特異性について同時にクローニングとスクリーニングを実施する系を利用する。この系はクローニングとスクリーニングの方法論を連動させ、２つの必要条件を含む。第一に、インビトロ発現宿主（例えば大腸菌）における異種二量体レセプターのポリペプチド鎖の発現は、機能的な異種二量体レセプターが会合してリガンドを結合させるレセプターを生成することができるように、この２つのポリペプチド鎖の同時発現を必要とする。第二に、予め選択されたリガンドと結合能に関するライブラリーから分離されたメンバーのスクリーニングは、発現されたレセプター分子の結合能を簡便な手段と相互に関連させ、該メンバーをライブラリーから分離する手段を必要とする。発現とスクリーニングの連動は、機能的なレセプターの会合を可能にするために細菌細胞のペリプラズム間隙への融合蛋白の集中化、および問題のライブラリーメンバーの簡便なスクリーニングを可能にするためにファージの会合中に糸状ファージ粒子のコート上への融合蛋白の集中化を一体化させることによって達成される。ペリプラズム集中化は、本発明の融合蛋白に分泌シグナルドメインを含ませることによって提供される。ファージ粒子への集中化は、本発明の融合蛋白に糸状ファージコート蛋白膜アンカードメインを含ませることによって提供される。本発明は、一実施形態においてＤＮＡ分子ライブラリーの作製方法を開示するが、各ＤＮＡ分子は糸状ファージ粒子の表面で融合蛋白を発現させるためにシストロンを含む。この方法は、（ａ）連結緩衝液中で（ｉ）免疫グロブリン可変鎖ポリペプチドコード遺伝子レパートリーと（ｉｉ）融合蛋白発現シストロンの形成に適した直線状形態にした複数のＤＮＡ発現ベクターとを一緒にして連結混合物を作製し、さらに（ｂ）該遺伝子レパートリーが該複数のベクターと機能的に連結され、ライブラリを形成するために十分な時間該混合物を連結条件に付すという工程を含む。この実施形態では、ポリペプチドコード遺伝子レパートリーは二本鎖ＤＮＡ型で、当該レパートリーの各メンバーは方向性のある連結に適した粘着末端を有する。さらに、大多数のＤＮＡ発現ベクターは、各々、（ａ）共通の読み枠内に該ポリペプチド遺伝子を方向性をもって受け入れられるように適合しており、さらに（ｂ）それぞれ上流および下流の翻訳可能ＤＮＡ配列に機能的に連結される、上流および下流の粘着末端を有する直線状ＤＮＡ分子である。本発明のポリペプチドについて本明細書で開示するように、上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は分泌シグナル（好ましくはｐｅ１Ｂ分泌シグナル）をコードし、下流の翻訳可能ＤＮＡ配列は糸状ファージのコート蛋白膜アンカーをコードする。翻訳可能ＤＮＡ配列はまた、本明細書で開示するＤＮＡ発現ベクターについて規定するように、それぞれの上流および下流のＤＮＡ発現制御配列に機能的に連結される。このように作製したライブラリーは、このライブラリーで表現されるシストロンをもつ生成ライブラリーによってコードされる融合蛋白の発現とスクリーニングのために、本明細書で開示する発現とスクリーニングの方法によって利用できる。２．遺伝子レパートリーの作製遺伝子レパートリーとは異なる遺伝子（好ましくはポリペプチドコード遺伝子（ポリペプチド遺伝子）を収集したものであり、天然の起源から分離可能であるが、また人工的に作出できる。好ましい遺伝子レパートリーは保存遺伝子で構成される。特に好ましい遺伝子レパートリーは、機能的な二量体レセプター分子を形成するために会合できるポリペプチドをコードする一方または両方の遺伝子を含む。本発明を実施するために有用な遺伝子レパートリーは、少なくとも１０³、好ましくは少なくとも１０⁴、より好ましくは少なくとも１０⁵、さらに最も好ましくは少なくとも１０⁷の異なる遺伝子を含む。遺伝子レパートリーの多様性を調べる方法は当業者には周知である。好ましくはこのレセプターは、保存遺伝子（すなわち長さが少なくとも約１０ヌクレオチドの保存ヌクレオチド配列を含む遺伝子）類のメンバーの１つによってコードされたリガンド（例えば抗体分子またはその免疫学的に活性な部分）と結合できる異種二量体ポリペプチドであろう。遺伝子は、いくつかの方法を用いて保存遺伝子レパートリーに属するかについて明らかにできる。例えば、分離遺伝子は、弱厳密条件(low stringency condit ion)下でハイブリダイゼーションプローブとして用い、ゲノムＤＮＡ中に存在する保存遺伝子レパートリーの他のメンバーをサザン(J．Mol．Biol.，98:503(197 5))が記載した方法を用いて検出できる。ハイブリダイゼーションプローブとして用いた遺伝子が、このゲノムの多数の制限エンドヌクレアーゼフラグメントとハイブリダイズする場合、この遺伝子は保存遺伝子レパートリーのメンバーである。一般に本発明は、多様な抗体ライブラリーの調製、それに続く該ライブラリーの所望の結合特性についてのスクリーニングによって新規な抗体分子を製造する方法に関する。この方法は、免疫グロブリン可変重鎖および軽鎖可変領域ドメインのＣＤＲ領域に縮退性を取り込ませるために、縮退オリゴヌクレオチドおよびプライマー伸長反応を用いて異種二量体免疫グロブリン分子ライブラリーをファージミドライブラリー形として調製し、さらに該ファージミドの表面に変異ポリペプチドを出現させることを含む。その後、この出現蛋白を予め選択した抗原との結合能についてスクリーニングする。さらに、重鎖および軽鎖免疫グロブリンコード遺伝子ライブラリーを交雑して、重鎖種および軽鎖種の任意の対形成を行ないより多くの固有異種二量体を得ることができる。そのような交雑は本明細書でさらに詳述するように種々の方法を用いて実施できるが以下の（１）−（５）を含む。（１）ただ１つの重鎖を軽鎖ライブラリーと交雑する；（２）ただ１つの軽鎖を重鎖ライブラリーと交雑する；（３）ランダム化軽鎖または重鎖をただ１つの重鎖または軽鎖に対してそれぞれ交雑する；（４）ランダム化重鎖または軽鎖をただ１つの軽鎖または重鎖に対してそれぞれ交雑する；（５）ランダム化軽鎖または重鎖をランダム化重鎖または軽鎖に対してそれぞれ交雑する。他の並べ替えもまた明白である。ランダム化とは、本明細書でさらに説明するように予め選択した軽鎖または重鎖の可変ドメインにおける１つまたは２つ以上のＣＤＲ領域の変異誘発による軽鎖（または重鎖）遺伝子ライブラリーの調製を含むことを一般に意味する。抗体レパートリーを作製するための上記の方法について特に好ましい入れ替えは、重鎖ライブラリーと交雑した(特にランダム化重鎖ライブラリーと交雑した) ランダム化軽鎖遺伝子の使用による。別の特に好ましい実施形態では、本明細書でさらに説明するように、重鎖ライブラリーと交雑するただ１つの軽鎖として配列番号２および６２に示す軽鎖から成る群から選ばれる“普遍的軽鎖”の使用である。関連する好ましい実施形態では、ランダム化した普遍的軽鎖が重鎖または重鎖ライブラリーに対して使用される。他の好ましい方法もまた本明細書で開示する。３．ファージミド表示蛋白ファージミド上の表示蛋白としての異種二量体免疫グロブリン分子の表示は、糸状ファージ粒子の表面蛋白の何れにおいても達成できるが、特に好ましいものは本明細書で説明するように遺伝子ＩＩＩ蛋白または遺伝子ＶＩＩＩ蛋白を含む表示蛋白である。糸状ファージ上の表示蛋白として遺伝子ＩＩＩ蛋白または遺伝子ＶＩＩＩ蛋白を使用することは本明細書の他の箇所で詳しく説明してきた。特に好ましい表示蛋白は、本明細書で説明するように免疫グロブリン重鎖または軽鎖に融合させた遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩに由来するファージ粒子膜アンカーの使用を含む融合物である。この実施形態では、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の少なくとも１つの可変ドメインＣＤＲを含むポリペプチドが、ファージの遺伝子ＩＩＩ蛋白または遺伝子ＶＩＩＩ蛋白の膜アンカードメインに融合される。好ましくは、全ＣＤＲを含む完全な可変ドメインが融合される。免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変領域を用いる場合は、該融合蛋白は１つまたは２つ以上の相補性決定領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含むことができる。カバット(Kabat)の免疫グロブリンアミノ酸残基配列の位置番号付与システムを用いた場合、軽鎖ＣＤＲについては以下の通りである：ＣＤＲ１（残基２３−３５）、ＣＤＲ２（残基４９−５７）およびＣＤＲ３(残基８８−９８) 。さらに重鎖ＣＤＲについては以下の通りである：ＣＤＲ１（残基３０−３６）、ＣＤＲ２（残基４９−６６）およびＣＤＲ３（残基９４−１０３）。カバットらの文献を参照されたい(Kabatら、「免疫学的意義を有する蛋白の配列」(“Seq uence of Proteins of Immunoligical Interest”)、第5版、NIH(1991))。免疫グロブリン融合表示蛋白のＣＤＲに変異を誘発する場合、このＣＤＲのいくらか、大半または全てが除去され、変異によって導入され新しく取り込ませた配列によって置換することができる。ＣＤＲは種々の大きさの挿入物を当該免疫グロブリンの能力を損なうことなく収容する力が強く、この新規にランダム化され選別されたアミノ酸残基配列を会合させ、表示することができる。ある実施形態では、ファージ表示蛋白は多数の結合部位を含むように操作することが可能である。例えば、典型例として重鎖免疫グロブリンを用いる場合、本発明の方法によってＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称されるＣＤＲの１つまたは２つ以上に別々に結合部位を作出することができる。さらに、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ中、多数の重鎖および軽鎖ＣＤＲ中というような組合せで結合部位を導入することも可能である。別の実施形態では、ファージ表示蛋白は、天然の表示蛋白構造によって提供される安定化に加えて安定化構造を導入することができる。ジスルフィドブリッジが形成できるように、その末端に該ヌクレオチドはシステイン残基をコードすることができる。システイン残基による置換では、約５から２０アミノ酸残基のループ構造が形成されるように変化させることができる。好ましいファージ表示蛋白は免疫グロブリン重鎖可変ドメインポリペプチドに融合させた糸状ファージアンカーを利用し、この軽鎖は、本明細書でさらに開示するように発現中に重鎖と結合（会合）して表示異種二量体レセプターを形成する。４．オリゴヌクレオチド本発明の異種二量体免疫グロブリン分子の調製は、重鎖または軽鎖可変ドメインの予め選択したＣＤＲ領域にランダム変異を誘発するためにデザインされた合成オリゴヌクレオチドの利用を含む。さらに、本明細書で開示するこのオリゴヌクレオチド手法は、縮退オリゴヌクレオチドの使用により種々のランダム化結合部位をもつ極めて大きな集団を単一反応で作出するという特別な利点を有する。この変異誘導オリゴヌクレオチドは免疫グロブリンＣＤＲのアミノ酸残基配列をコードする遺伝子をランダム化し、さらに、その後の発現ファージミド表示蛋白の予め選択した結合能についてのスクリーニングは、これまでに開示しさらに実施例で説明するように実施される。いくつかのオリゴヌクレオチドデザインが、ＣＤＲを含む種々の長さをもつ結合部位を形成するために用いられる。最後に、連続する４、５、６、８、１０または１６アミノ酸残基のシリーズが、縮退オリゴヌクレオチドにより免疫グロブリン可変ドメインのＣＤＲ領域でランダム化される。本方法で使用するオリゴヌクレオチドの一般的構造はＡＮＢの一般式をもち、ここでＡおよびＢは、免疫グロブリンポリペプチド遺伝子の領域（これは変異が導入されるＣＤＲ領域と接する）に対して相同性をもつ領域を規定し、Ｎは縮退性をもつ領域を規定し、この領域内に４種の塩基（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）を用い全ての可能なヌクレオチドトリプレットの組合せを与えることによって可変アミノ酸残基が導入される。各領域（Ａ，ＢたはＮ）のヌクレオチドの数は大きく変動してもよいが、Ｎは該表示蛋白の読み枠を保存するためにトリプレットでなければならない。典型的には、領域ＡおよびＢは、プライマー伸長反応時に鋳型とのハイブリダイゼーション特異性を付与するために十分な長さをもつ。したがって、領域ＡおよびＢは、典型的に各々少なくとも６ヌクレオチドで、好ましくは長さが各々少なくとも９ヌクレオチドであるが、長さが約５０ヌクレオチドまで可能である。Ｎについては、典型的には長さは大きく変動し、典型的には長さは３から２４アミノ酸残基である。表示蛋白が免疫グロブリンである場合は、領域ＡおよびＢの相同性は、該結合部位が挿入されるＣＤＲと接する免疫グロブリン読み枠領域（ＦＲ）に対して誘導される。したがって、ある実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖遺伝子または軽鎖遺伝子のＣＤＲにおいて変異を誘発するプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドを目的とする。このオリゴヌクレオチドは５’および３’末端を有し、さらに下記を含む：ｉ）免疫グロブリン遺伝子の第一の読み枠領域とハイブリダイズすることができる、３’末端に位置する長さが約６から５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列；ｉｉ）免疫グロブリン遺伝子の第二の読み枠領域とハイブリダイズすることができる、５’末端に位置する長さが約６から５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列；ｉｉｉ）当該５’および３’末端の間に位置する下記の式のヌクレオチド配列：〔ＮＮＫ〕_nまたは〔ＭＮＮ〕_n 式中、ｎは３から２４までの全整数で、Ｎはそれぞれ別個にいずれのヌクレオチドでもよく、ＫはＧまたはＴ、ＭはＡまたはＣであり、ここで当該５’および３ ’末端のヌクレオチド配列は、長さが約６から５０ヌクレオチドまたはそれに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをもつ。好ましくは、ｎは４、５、６、８、１０または１６である。読み枠の選択は、結合部位が挿入されるＣＤＲによって左右される。したがって、例えばＣＤＲ３に挿入する場合、該オリゴヌクレオチドの３’および５’領域は、ＣＤＲ３に接するＦＲ４およびＦＲ３を規定するコード鎖に対してそれぞれ相補的なヌクレオチド配列となるように選択される。この場合、該ヌクレオチドは鋳型ＤＮＡの非コード（アンチセンス）鎖と相補的であろう。さらに、該読み枠領域配列は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖ＣＤＲ領域が本方法によって変異が誘発されているか否かによって変化する。結合部位の挿入について代表的で好ましいＣＤＲは免疫グロブリン重鎖または軽鎖のＣＤＲ３である。代表的な免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドは、本明細書で開示するようにファージミドベクターｐＣ３ＡＰ３１３によって発現される。好ましいものはヒト免疫グロブリン異種二量体分子で、したがって好ましい実施形態では、変異誘発される免疫グロブリンおよびそれに対して相補的なオリゴヌクレオチドはヒトに由来する。変異重鎖および軽鎖ＣＤＲを作製するために特に好ましい本方法で使用するオリゴヌクレオチドは実施例で説明する。本明細書で開示するように、ポリメラーゼ連鎖反応による変異誘発方法は極めて様々である。２通りの異なる方法を詳細に述べるが、これらは、縮退ヌクレオチドに導入するオリゴヌクレオチドが異なる。したがって、縮退ＰＣＲプライマーは、それらが上流方向または下流方向のＰＣＲプライマーであるか否かによってコード性または非コード性であるようにデザインされる。プライマーはまた本明細書で開示したものに対して相補的であるように、さらに機能的に同等であるようにデザインできる。同様に、本明細書で開示するオリゴヌクレオチドプライマープールＫＶ６Ｒおよびｋ１０の例で説明するように、読み枠配列は、ＣＤＲに対する変異の程度を維持しつつ長さを変えることができる。したがって、本明細書で開示するようにオリゴヌクレオチドは、種々の５’および３’末端並びに種々の量の縮退トリプレットヌクレオチドを含むことができる。軽鎖を変異させるために好ましいオリゴヌクレオチドは実施例で述べるが、オリゴヌクレオチドプライマープールＫＶ４Ｒ、ｋ８、ＫＶ５６、ｋ９、ＫＶ６Ｒ、ｋ１０、ＫＶ１０Ｒ、ｐ３１３Ｋ３８ＯＶｂ、ｐ３１３Ｋ３１０ＯＶｂおよびｐ３１３Ｋ３１６ＯＶｂを含む。他のオリゴヌクレオチドも当業者の評価にしたがって用いることができる。本発明で使用できるオリゴヌクレオチドは、周知のように種々の化学的方法で合成できる。優れた概説書は「オリゴヌクレオチド合成：実際的手法」（“Olig onucleotide Synthesis: A Practical Approach”，M.J．Gait編、JRL Press，ニューヨーク、NY(1990)）である。適切な合成方法には、例えばホスホトリエステルまたはホスホジエステル法ある（Narangら、Meth．Enzymol.，68:90(1979); 米国特許第４３５６２７０号；および Brownら、Meth．Enzymol.，68:109(1979 )を参照されたい）。プライマー伸長反応およびＰＣＲ反応に使用する合成オリゴヌクレオチドの精製は周知である(Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコル」 (“Current Protocols in Molecular Biology”)，John Wiley & Sons，ニューヨーク(1987)を参照のこと）。本発明で使用するオリゴヌクレオチドはオペロンテクノロジー(Operon Technolkogy，Alameda，カリフォルニア）により商業的に合成されている。５．プライマー伸長反応プライマー、プローブおよびプライマー伸長によって合成される核酸フラグメントまたはセグメントについて本明細書で用いられる“ポリヌクレオチド”および“オリゴヌクレオチド”という用語は、２つまたは３つ以上、好ましくは３つより多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される分子と定義される。その正確な大きさは多くの因子によって左右されるが、傾向としては最終的使用条件に依存する。本明細書で用いられるように“プライマー”という用語は、核酸の制限消化反応から精製されたものであるか、合成によって製造されたものであるかにかかわらず、核酸の鎖に対して相補的なプライマー伸長反応生成物の合成が導入される条件下に（すなわちヌクレオチドと重合反応試薬（例えばＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）の存在下で適切な温度とｐＨの下に）置かれたとき、核酸合成の開始点として作用することができるポリヌクレオチドを指す。好ましくは、最大の効率のためにこのプライマーは一本鎖であるが、選択肢として二本鎖形態であってもよい。二本鎖の場合、伸長反応生成物の調製の前に先ずその相補鎖から分離するようにプライマーは処理される。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合試薬の存在下で伸長生成物の合成を開始するために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは多くの因子（温度およびプライマーの由来を含む）に左右されるであろう。例えば、標的配列のコンプレキシティーによりポリヌクレオチドプライマーは典型的には１５から２５またはそれより多いヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドしか含まない場合も可能である。短いプライマー分子は、一般に、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。本明細書で用いられるプライマーは、合成されまたは増幅される特定の各配列の異なる鎖に対して“実質的に”相補的であるように選択される。このことは、プライマーは、その対応する鋳型の鎖と非任意的にハイブリダイズするために十分相補的でなければならないことを意味する。したがって、このプライマー配列は鋳型の正確な配列に対応する場合もあれば対応しない場合もある。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’末端に付着させ、プライマーの残余配列はこの鎖と実質的に相補的である。そのような非相補的フラグメントは、典型的にはエンドヌクレアーゼ制限部位をコードする。また別に、プライマー配列が合成または増幅される鎖の配列と、それらと非任意的にハイブリダイズできるように十分に相補的であるということを条件に、非相補的塩基またはより長い配列をプライマー内に点在させ、それによってポリヌクレオチド合成条件下で伸長生成物を形成することができる。本発明のプライマーはまた、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはその相補物を含むことができる(Kriegら、Nucl．Acids Res.，12:7057-70 (1984);Studierら、J．Mol．Biol.，189:113-130(1986)；および分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、サンブルック(Sambrook)ら編、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)を例えば参照のこと）。ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーが用いられる場合、このプライマーは増幅されるべきポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズし、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの第二のポリヌクレオチド鎖は、例えば大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Klenow）フラグメントを用いて完結される。出発のポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドの生成とＤＮＡポリヌクレオチドの生成を交互に行なうことによって増幅される。プライマーはまた、鋳型配列またはＲＮＡ向性ＲＮＡポリメラーゼのための複製開始部位を含むことができる。典型的なＲＮＡ向性ＲＮＡポリメラーゼにはリザルディーが記載したＱＢレプリカーゼが含まれる(Lizardiら、Biotechnology, 6:1197-1202(1988))。ＲＮＡ向性ポリメラーゼは、鋳型配列または複製開始部位を含む少量の鋳型ＲＮＡ鎖から大量のＲＮＡ鎖を生成する。クラマーが報告したように(Kramerら、J．Mol．Biol.，89:719-736(1974))、これらのポリメラーゼは典型的には鋳型鎖の１００万倍の増幅をもたらす。プライマーのヌクレオチド配列の選択は、例えば結合部位が導入される表示蛋白遺伝子の領域からの核酸上の距離、使用される第二のプライマーに対する核酸上のそのハイブリダイゼーション部位などの因子によって左右される。ＰＣＲ反応は適切ないずれかの方法によって実施される。一般に、それは緩衝水溶液（すなわちＰＣＲ緩衝液）中で好ましくはｐＨ７−９、最も好ましくは約８で実施される。好ましくは、過剰モルのプライマーが鋳型鎖を含む緩衝液に混合される。プライマー：鋳型が約１０⁴：１の大過剰モルが工程の効率を改善するために好ましい。ＰＣＲ緩衝液はまた、デオキシリボヌクレオチド三燐酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）およびポリメラーゼ（典型的には耐熱性）を、いずれもプライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応に適した量で含む。得られた溶液（ＰＣＲ混合物）は約９０℃−１００℃まで約１から１０分、好ましくは１から４分加熱される。この加熱時間の後、溶液を５４℃に冷却する。この温度はプライマーのハイブリダイゼーションに好ましい。合成反応は室温からポリメラーゼ（誘導薬剤）がもはや効率的に機能しない温度より高い温度までの間で実施される。したがって、例えばＤＮＡが誘導薬剤として用いられる場合、この温度は一般に約４０℃よりも高くない。代表的なＰＣＲ緩衝液は緩衝液１００μｌにつき以下を含む：５０ＭｍＫＣｌ；１０Ｍｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；１．５ＭｍＭｇＣｌ₂；０．００１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチン；２００μＭのＤＡＴＰ；２００μＭのＤＴＴＰ；２００μＭのＤＣＴＰ；２００μＭのＤＧＴＰ；および２．５単位のテルムス・アクアチクス(Thermus aquaticus)のＤＮＡポリメラーゼＩ（米国特許第４８８９８１８号）。代表的なＰＣＲ増幅は実施例で説明する緩衝系を用いて実施される。誘導薬剤は、プライマー伸長生成物の合成を達成するために機能する何れの化合物または系（酵素を含む）でもよい。この目的のために適切な酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および耐熱性酵素を含む他の酵素が含まれるが、これらは、各核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長生成物を形成するために適切な態様のヌクレオチドの組合せを促進するであろう。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始し、合成が終了するまで鋳型鎖にそって５’方向に進行し、種々の長さの分子を生じる。しかしながら、本明細書で開示するものと同じ工程を用いて５’末端で合成を開始させ、上方に進行させる誘導薬剤を用いてもよい。誘導薬剤はまた、ＲＮＡプライマー伸長生成物の合成を達成するために機能する化合物または系（酵素を含む）でもよい。好ましい実施形態では、この誘導薬剤はＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）であってもよい。これらのポリメラーゼは相補的なＲＮＡポリヌクレオチドを生じる。このＲＮＡポリメラーゼの高い代謝回転率によって、シャンバリンらの報告のように出発ポリヌクレオチドは増幅される（Chamberlinら、「酵素」(“The Bnzymes”)P.Boyer編、pp87 -108，アカデミックプレス、ニューヨーク(1982)）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの別の利点は、先にジョイスらが報告したように(Joyceら、Nuc．Acids Res.，17: 711-722(1989))、ｃＤＮＡの一部分が１つまたは２つ以上の変異誘発性オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置き換えられ、部分的に不適合の鋳型を直接転写することによって、変異がポリヌクレオチド合成に導入されるということである。転写を基にする増幅系はギンゲラスらが既に報告した（Gingerasら、「ＰＣＲプロトコル：方法と応用の手引」(“PCR Protocol，A Guide to Methods an d Applications”)，pp245-252,アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア(1990)）。誘導薬剤がＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼであり、したがってリボヌクレオチド三燐酸を取り込む場合、十分量のＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰがプライマー伸長反応混合物に加えられ、得られた溶液は上記のように処理される。新しく合成された鎖とその相補的な核酸鎖は二本鎖分子を形成し、ＰＣＲについて既に知られているようにこれは工程の後続ステップで用いることができる。ＰＣＲは典型的には、サーモサイクリング（すなわち、低い限界が約１０℃から約４０℃で高い限界が約９０℃から約１００℃の温度範囲内にあるＰＣＲ反応混合物の温度の上昇と下降の繰り返し）によって実施される。この上昇と下降は連続的であるが、好ましくは、ポリヌクレオチド合成、変成およびハイブリダイゼーションに適した各温度において相対的安定時間を有する温度相を形成する。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４６８３１９２号、４６８３２０２号、４８００１５９号および４９６５１８８号、並びに少なくともいくつかの成書(「ＰＣＲ技術：原理とＤＮＡ増幅のための応用」(“PCR Technology: Principles and Applications for DNA Arnplification”)，H.Erlch 編、ストックトンプレス、ニューヨーク(1989))；「ＰＣＲプロトコル：方法と応用」(“PCR Protocol，A Guide to Methods and Applications”)，Innisら編、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア(1990)）を含む）に詳細に記載されている（この内容は参照により本明細書に含まれる）。ＰＣＲは、オーバーラッピングＰＣＲまたはクロスオーバーＰＣＲと称される方法によって２つの異なるＰＣＲ生成物をつなぎ合わせるために実施することができる。この方法は重鎖および軽鎖ＰＣＲ反応生成物を連結するために用いられ、本明細書で詳述する。オーバーラッピングＰＣＲ方法では、プライマー対内の縮退オリゴヌクレオチドとして３’プライマーまたは５’プライマーのいずれかをデザインすることによってＣＤＲに変異を簡便に導入することができる。両方の方法が実施例を説明する。本発明のオリゴヌクレオチドと方法を用いるまた別の好ましいＰＣＲ反応は実施例で詳述する。６．ファージ表示ベクター可変（Ｖ）領域内のＣＤＲのランダム変異誘発とスクリーニング方法（例えばバルバスらが報告したようなもの（Barbasら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，8 9:4457-4461(1992)）を用いて、本明細書で開示する改良を有する多様な結合部位特異性を含む抗体ライブラリーを調製する。抗体分子を調製するための本発明の方法は、発現された表示蛋白の極めて大きな集団をスクリーニングし、それによって所望の結合反応性をコードする１つまたは２つ以上の特異的クローンの位置を突き止める手段を提供するそれらの特別な利点のためにファージ表示ベクターを使用することを含む。ファージ表示ベクターの使用は、先に報告されたファージミドをベースにした抗体分子の組合せ式ライブラリーの使用に由来する。この組合せ式ライブラリーの作製と操作方法は文献に詳細に報告されているので、本発明の固有例の作製および使用に必要な特徴を除き本明細書では詳しくは述べない。しかしながら、一般にこの方法は、ライブラリーの抗体種のクローニングと発現のために糸状ファージ（ファージミド）表面発現ベクター系を含む。組合せ式ライブラリーを作製するための種々のファージミドクローニング系は他の研究者らによって記載されている。ファージミドでの組合せ式抗体ライブラリーの調製については、例えば以下を参照されたい：Kangら、Proc．Natl．Acad ．Sci.，USA，88:4363-4366(1991);Barbasら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，8 8:7978-7982(1991); Zebedeeら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89:3175-3179( 1992);Kang ら、Proc．Natl.Acad．Sci.，USA，88:11120-11123(1991);Barbasら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89:4457-4461(1992);およびGramら、Proc．Na tl．Acad．Sci.，USA，89:3576-3580(1992)。これらの文献の開示内容は参照により本明細書に含まれる。ａ．ファージ表示ベクターの構造本発明の好ましいファージミドベクターは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に下記（１）−（３）を含む融合ポリペプチドをコードし、さらに発現することができるヌクレオチド配列を含むリコンビナントＤＮＡ（ＲＤＮＡ）分子である：（１）原核細胞分泌シグナルドメイン、（２）免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変領域を表す異種ポリペプチド、および（３）糸状ファージ膜アンカードメイン。このベクターは、融合ポリペプチドを発現させるためにＤＮＡ発現制御配列、好ましくは原核細胞制御配列を含む。糸状ファージ膜アンカーは、好ましくは糸状ファージ粒子のマトリックスと結合することができ、それによってファージ表面に融合ポリペプチドを取り込ませることができるｃｐｉｉｉまたはｃｐｖｉｉｉコート蛋白である。該ベクターのために好ましい膜アンカーは糸状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄおよび同等な糸状ファージから入手できる。好ましい膜アンカードメインは、遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＶＩＩＩによってコードされるコート蛋白に見出される。糸状ファージコート蛋白の膜アンカードメインはコート蛋白のカルボキシ末端領域の一部分であり、脂質二重層膜を貫通するための疎水性アミノ酸残基領域および、膜の細胞質面で通常見出され、この膜から伸長する荷電をもつアミノ酸残基領域を含む。ファージｆ１では、遺伝子ＶＩＩＩのコート蛋白の膜貫通領域は、Ｔｒｐ−２６からＬｙｓ−４０の残基を含み、細胞質領域はカルボキシ末端の４１から５２の１１残基を含む(Ohkawaら、J．Biol．Chem.，256:9951-9958(1981))。代表的な膜アンカーはｃｐｉｉｉの残基２６から４０を含むであろう。したがって、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列はＭ１３糸状ファージ遺伝子ＶＩＩＩのコート蛋白（ｃｐｖｉｉｉまたはＣＰ８とも称される）に由来する。遺伝子ＶＩＩＩのコート蛋白は、典型的には約２５００から３０００コピーのコート蛋白をもつファージ粒子の大半の全面を覆って成熟糸状ファージに存在する。さらに、別の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３糸状ファージ遺伝子ＩＩＩのコート蛋白（ｃｐｉｉｉとも称される）に由来する。遺伝子ＩＩＩコート蛋白は、典型的には約４から６コピーのコート蛋白をもつファージ粒子の一方の端において成熟糸状ファージに存在する。糸状ファージ粒子の構造、それらのコート蛋白および粒子の会合の詳細な説明については下記の文献を参照されたい：Rachedら、Microbiol．Rev.，50:401-42 7(1986); Modelら、“バクテリオファージ：第２巻”、R．Calendar 編、Plenum Publishing Co.，pp375-456(1988)。分泌シグナルは、グラム陰性細菌のペリプラズム膜に該蛋白を集中させる蛋白のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルはｐｅ１Ｂ分泌シグナルである。エルウィニア・カロトバ（Erwinia carotova）から得られる２つのｐｅ１Ｂ遺伝子産物変形体に由来する分泌シグナルドメインの推定アミノ酸残基配列はリーらが報告している(Leiら、Nature，331:543-546(1988))。ｐｅ１Ｂ蛋白のリーダー配列は融合蛋白のための分泌シグナルとして以前に用いられた(Betterら、Science，240:1041-1043(1988); Sastryら、Proc．Natl．A cad．Sci.，USA，86:5728-5723(1989);およびMmllinaxら、Proc．Natl．Acad．S ci.，USA，87:8095-8099(1990))。本発明で有用な大腸菌由来の他の分泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列はオリバーの論文に記載されている（Oliver、「大腸菌とチフス菌」(“Escherichia coli and Salmonella Typhimu rium”)，F.C．Neidhard編、アメリカ微生物学会、ワシントンD.C.，1:56-69(19 87)）。ＤＮＡ発現制御配列は、構造遺伝子産物の発現のために一組のＤＮＡ発現シグナルを含み、さらに周知のようにシストロンと機能的に連結（該シストロンが構造遺伝子産物を発現できるように）された５’および３’構成成分を含む。５’ 制御配列は、転写を開始させるプロモーターおよび、上流の翻訳可能ＤＮＡ配列の５’末端に機能的に連結されたリボソーム結合部位である。３’制御配列は、異種融合蛋白をもちさらにそれに機能的に連結された少なくとも１つの枠内の終止コドンで示される。好ましい実施形態では、本発明で用いられるベクターは、原核細胞の複製起点またはレプリコン（すなわち形質転換された原核宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）中で染色体から離れてリコンビナントＤＮＡ分子を自律的に複製させ維持させる能力を有するＤＮＡ配列）を含む。そのような複製起点は当技術分野で周知である。好ましい複製起点は宿主細胞において効率的なものである。好ましい宿主細胞は大腸菌である。大腸菌の好ましい株は、アンバー終止コドンがグルタミン（Ｑ）として翻訳されるのでｓｕｐＥである。大腸菌でのベクターの使用について、好ましい複製起点はｐＢＲ３２２および種々の他の一般的なプラスミドで見出されるＣｏｌＥ１である。また好ましいものは、ｐＡＣＹＣおよびその誘導体で見出されるｐ１５Ａ複製起点である。ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは分子生物学では広く用いられてきており、種々のプラスミドについて入手可能で少なくともサンブルックらによって報告されている（分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、サンブルック(Sambrook)ら、コールドスプリングハーバー研究所出版、ニューヨーク(1989)）。ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは、２つの“バイナリー”プラスミドが用いられる場合には本発明の実施形態で使用するために特に好ましい。その理由は、それらは各々大腸菌でプラスミドの複製を誘導する能力を有し、一方、他方のレプリコンは同じ大腸菌細胞内で第二のプラスミド内に存在するからである。換言すれば、ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａは非干渉性レプリコンで、同じ宿主内で２つのプラスミドの維持を可能にする（例えばサンブルックら、上掲書１．３− １．４ページを参照のこと）。この特徴は、バイナリーベクターを用いる場合特に重要である。なぜならば、ファージの複製を許容する単一の宿主細胞は２種の別々のベクターの別個でかつ同時の複製を支援しなければならないからである。例えば、第一のベクターが重鎖ポリペプチドを発現しているとき、さらに第二のベクターは軽鎖ポリペプチドを発現し、さらに重鎖および軽鎖遺伝子ライブラリーの混合物はすべての重鎖および軽鎖の可能な組合せを結合させることが所望されるからである。さらに、原核細胞レプリコンを含むこれらの具体例はまた、その発現によって選択的利点（例えば薬剤耐性）が形質転換細菌宿主に付与される遺伝子を含むことができる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する抵抗性を付与するものである。ベクターは典型的にはまた、翻訳可能なＤＮＡ配列の挿入のために都合のよい制限部位を含む。代表的なベクターは、プラスミドｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ＰＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（BioRad Laboratories(リッチモンド、カリフォルニア)から入手可能）、さらにｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（ファルマシア（ピスカタウェー、ニュージャージー）から入手可能）である。本明細書で用いられるように、“ベクター”という用語は核酸を指すが、この核酸は異なる環境に前者の核酸が機能的に連結されている別の核酸を移転させることができる。好ましいベクターは、自律的な複製と機能的に連結されたＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子産物の発現が可能なものである。したがって、ベクターは好ましくはレプリコンと前記の選別可能なマーカーを含む。ＤＮＡ配列またはセグメントに関して本明細書で用いられるように、“機能的に連結される”という語句は、配列またはセグメントが共有結合によって（好ましくは通常のホスホジエステル結合によって）ＤＮＡの１つの鎖（一本鎖か二本鎖かにかかわらず）に、当該配列がベクター内で機能できるように（すなわち発現できるように）合流させることを意味する。転写ユニットまたは本発明のカセットが機能的に連結されるベクターの選択は、当技術分野でよく知られているように所望される機能特性（例えばベクターの複製および蛋白の発現）および形質転換される宿主細胞に直接左右されるが、これらはリコンビナントＤＮＡ分子の構築分野では固有の制約条件である。好ましい実施形態では、ベクターは、その中に含まれる２つのシストロン（例えば重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子）を同時に発現させることができる。同時発現は種々の系で達成され、したがって、２種の遺伝子産物の十分な相対量が産生され、機能的な異種二量体の会合と発現が可能である限り特定のデザインに限定される必要はない。同時発現が可能な好ましいベクターは本明細書で詳述する。好ましい実施形態では、ＤＮＡ発現ベクターは、本発明の開示にしたがってゲノムを被包化する糸状ファージ粒子形での簡便な操作のためにデザインされる。この実施形態では、ＤＮＡ発現ベクターはさらに糸状ファージの複製起点を明示するヌクレオチド配列を含むが、これは適切な遺伝的補完が存在するとき、該ベクターは一本鎖複製形の糸状ファージとして増殖することができ、さらに糸状ファージ粒子としてパッケージされるものである。この特徴は、後でファージ粒子（さらにその中に含まれるベクター）がファージ粒子集団を含む他の粒子から分離(segregation)されるためにファージ粒子内にパッケージングされる能力を提供する。糸状ファージの複製起点は、周知のように複製の開始、複製の終了および複製によって生じた複製形のパッケージングのための部位を規定するファージゲノムの領域である(Raschedら、Microbiol．Rev.，50:401-427(1986); Horiuchi，J． Mol．Biol.，188:215-223(1986)を例えば参照された）。本発明で使用するに好ましい糸状ファージの複製起点は、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄファージの複製起点である(Shortら、Nucl．AcidsRes.，16:7583-7600(1988)）。本発明のファージミド表示蛋白のクローニング、変異誘発および発現のための好ましいＤＮＡ発現ベクターは、本明細書に開示する二シストロン性ファージミド発現ベクターｐＣ３ＡＰ３１３である。ｐＣ３ＡＰ３１３は、重鎖融合物および軽鎖を含む両方のファージミド表示蛋白を同時に発現させることができる。遺伝暗号とそれに付随する重複性のために、意図される重鎖または軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列をコードする多数のポリペプチド配列をデザインすることができることは理解されよう。したがって、本発明は、遺伝暗号の重複性の特徴を取り込んだそのような様々なポリヌクレオチド配列およびそれに相補的な配列も包含する。本発明のヒト単クローン性抗体を製造する発現ベクターが抗体発現に適合する宿主細胞で実施されるかぎり、本発明は、当該発明のベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。本明細書で述べるように、好ましい宿主細胞は大腸菌である。本発明のファージミド表示蛋白を産生するプラスミド形態の好ましいファージミド発現ベクターは、ブダペスト条約の要請に従い米国菌培養収集所(ＡＴＣＣ) （ロックビル、メリーランド）に寄託された。ファージミド発現ベクターｐＣ３ＡＰ３１３は対応するＡＴＣＣ取得番号７５４０８をもち、好ましい免疫グロブリン軽鎖可変ドメインポリペプチドコード遺伝子を含む。ｂ．抗体ライブラリーの作製のためのファージミド表示ベクターの利用本明細書で使用するファージミドベクターは、抗体由来異種二量体蛋白をコードし、さらに当該蛋白をファージミド表示蛋白の形態で該ファージミドの表面に発現させることができるヌクレオチド配列を含むリコンビナントＤＮＡ（ＲＤＮＡ）である。代表的で好ましいファージミドベクターは実施例で述べるプラスミドｐＣ３ＡＰ３１３である。異種二量体免疫グロブリン分子を製造する方法は一般に以下の工程を含む：（１）問題の重鎖または軽鎖Ｖ領域をコードする遺伝子をファージミド表示ベクターに導入し；（２）抗体Ｖ領域遺伝子のＣＤＲと相同な領域を含み、さらに本明細書で詳述するようにランダム化したコード配列を製造するために縮退性をもつ領域を含むオリゴヌクレオチドを用いたプライマー伸長反応によって該ファージミド表示蛋白ベクターにランダム化結合部位を導入して、各々がファージミド表面表示蛋白上に種々の推定的結合部位を発現することができる表示ベクターの大型集団を形成し；（３）糸状ファージ粒子の表面に該表示蛋白および結合部位を発現させ；さらに（３）アフィニティー技術（例えば予め選択した抗原に対するファージ粒子の選別）を用いて表面発現ファージ粒子を分離(スクリーニング) し、それによって予め選択した抗原と結合する結合部位を含む表示蛋白を含む１つまたは２つ以上のファージミドの種を分離する。産生された抗体結合部位の更なる性状調査として、このランダム化ＣＤＲをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸残基配列を、核酸配列決定（sequencing）によって求めた。アミノ酸残基の一次配列の情報によって、結合部位の反応性に関するきわめて重要な情報が提供される。免疫グロブリン異種二量体の重鎖および軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ３の抗体結合部位の代表的な調製は実施例で述べる。問題の抗体結合部位を発現することができる特定のベクターの分離は、糸状ファージ遺伝子の発現とファージ粒子の会合を許容する宿主細胞への、該ファージミド表示蛋白の発現が可能な二シストロン性発現ベクターの導入を含む。典型的には宿主は大腸菌である。その後、ファージ粒子を会合させるために必要な遺伝的補完を提供するために、ヘルパーファージゲノムが該ファージミド発現ベクターを含む宿主細胞に導入される。得られた宿主細胞を培養して、導入したファージ遺伝子および表示蛋白遺伝子を発現させ、さらにファージ粒子については会合させ宿主細胞から放出させる。続いて放出ファージ粒子を宿主細胞培養液から採集し、所望の抗体結合特性についてスクリーニングする。典型的には、採集粒子は予め選択した抗原との結合について“選別”される。続いて強力に結合する粒子を採集し、個々の粒子種をクローンとして分離し、さらに抗原との結合についてスクリーニングする。所望の抗原結合特異性をもつ結合部位を産生するファージを選別する。本発明を実施するためにファージミド表示ベクターの操作のための多くの異なる並べ替えを本明細書で開示するが、本発明はこれらに限定されない。ある実施形態では、本発明は、異種二量体の重鎖または軽鎖のいずれかのポリペプチド内に抗体結合部位を作製する方法を開示するが、該方法は免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子相補性決定領域内に突然変異を誘発することを含む。さらに、この突然変異誘発は、本発明のＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ部分を増幅させ、ＣＤＲ部分にランダム変異誘発を導入することを含む。７．普遍的軽鎖本発明はまた免疫グロブリン軽鎖の発見を開示するが、当該軽鎖は、種々の重鎖のいずれかと複合体を形成し機能的な異種二量体となる能力を有し、したがって、種々の重鎖とともに用いることができるその能力を暗示させるために普遍的軽鎖と称される。特に有用なことは、普遍的軽鎖を用いて抗体の大レパートリーを作製する場合の容易さと多様性である。ある実施形態では、普遍的軽鎖は重鎖（例えばランダム化重鎖）と交雑される。特定の実施形態では、好ましい特異性をもっ重鎖をＣＤＲ変異誘発によってランダム化し、得られた重鎖ライブラリーを普遍的軽鎖と交雑して抗体レパートリーを作製し、続いてこれを所望の結合親和性についてスクリーニングする。この手法によって改善された結合特異性を得るために既知の重鎖の最適化が提供される。普遍的軽鎖の使用によって、機能的な異種二量体性抗体分子を生じる組合せの数が増加する。別の実施形態では、本発明は、修飾された普遍的軽鎖遺伝子ライブラリーを得るために変異誘発用フレームワークとして普遍的軽鎖を使用することを目的とする。この軽鎖ライブラリーは、本明細書で開示するように既知の重鎖を最適化するために用いることができ、また重鎖ライブラリーと交雑することもできる。普遍的軽鎖は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、さらに重鎖ライブラリーの実質的に種々の重鎖と複合体を形成する能力を有する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドである。“重鎖ライブラリーの実質的に種々の重鎖”という語句は、普遍的軽鎖が重鎖ライブラリーの重鎖種の少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも１％、より好ましくは重鎖ライブラリーの重鎖種の少なくとも１０％と複合体を形成することを意味する。好ましい普遍的軽鎖は、配列番号２に示した軽鎖アミノ酸残基配列、またはＡＴＣＣの取得番号、ＡＴＣＣ７５４０８で寄託されたプラスミドｐＣ３ＡＰ３１３の軽鎖遺伝子によってコードされる配列の配列特徴を有する。好ましい普遍的軽鎖はまた、配列番号６２に示した軽鎖アミノ酸残基配列、または実施例８Ｂ１で記載するプラスミドｐ６Ｆの軽鎖遺伝子によってコードされる配列の配列特徴を有する。配列特徴とは、発現された軽鎖蛋白が配列番号２または６２で示した軽鎖と類似の態様で機能することを意味する。類似性は、この発現される軽鎖遺伝子が当該同じものまたは実質的に同じものに機能的に付随しており、重鎖遺伝子が、配列番号２もしくは６２で示した軽鎖とともに形成された異種二量体と同じ免疫親和性もしくは実質的に同じ免疫親和性で抗原と免疫複合体を形成する異種二量体を生じる場合に示される。好ましくは、普遍的軽鎖には、配列番号２または６２で示したアミノ酸残基配列が含まれる。したがってある実施形態では、本発明は、可変ドメイン重鎖および軽鎖ポリペプチドを有する異種二量体性免疫グロブリン（抗体）分子の調製を目的とするが、この調製は、重鎖遺伝子ライブラリーとの交雑に普遍的軽鎖を用い、続いて本発明の発現およびスクリーニングを実施する。この方法は以下の工程を含む：ａ）配列番号２または６２で示した軽鎖の配列特徴を有する配列を含む免疫グロブリン可変ドメイン軽鎖遺伝子を、１つまたは２つ以上の免疫グロブリン可変ドメイン重鎖遺伝子と組み合わせて組合せ式免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子ライブラリーを作製し、この場合当該組合せは、当該重鎖および軽鎖遺伝子の同時発現が可能なベクター内で当該軽鎖遺伝子と当該重鎖遺伝子の１つとを機能的に連結することを含み；ｂ）該組合せ式遺伝子ライブラリーを発現させて、重鎖および軽鎖の発現されたポリペプチドの組合せ式抗体ライブラリーを形成し；さらに、ｃ）予め選択した抗原と結合する能力について当該組合せ式抗体ライブラリーの種を選別する。好ましい実施形態では、前述の方法で用いられる重鎖ライブラリーは、変異誘発されたＣＤＲドメインをもつランダム化重鎖ライブラリーである。好ましい実施形態では、前述の方法で用いられる免疫グロブリン軽鎖遺伝子は、配列番号２または６２で示す軽鎖遺伝子の配列特徴を有する。また別の実施形態では、本発明は、変異誘発法で普遍的軽鎖を利用して本発明の軽鎖ライブラリーを作製することを目的とする、この態様での軽鎖の変異誘発は、例えば実施例で詳細に説明するように種々の方法で実施できる。実施例本発明に関する以下の実施例は例示であって、したがって本発明を制限するものと解されるべきではない。のみならず、当業者には既に明らかなまたはこの後で明らかとなる本発明の変更も、この後の本発明の請求の範囲内に含まれるであろう。１．合成ハプテン共役物と結合するファージミド表示Ｆａｂ重鎖および軽鎖異種二量体の作製抗ハプテン結合部位を有するＦＡＢ抗体（当該Ｆａｂはファージ表面に発現される）の発現を得るための本発明の実施に際しては、抗体の重鎖（Ｖ_HおよびＣ_H １から成るＦｄ）および軽鎖（カッパ鎖）（Ｖ_L、Ｃ_L）を先ず異種二量体Ｆａｂ分子の会合のために大腸菌のペリプラズムに集中させた。この系では、第一のシストロンは、融合蛋白、Ｆｄ−ｃｐｉｉｉと機能的に連結されたペリプラズム分泌シグナル（ｐｅ１Ｂリーダー）をコードする。第二のシストロンは、カッパ軽鎖に機能的に連結された第二のｐｅ１Ｂリーダーをコードする。ｐｅ１Ｂリーダーの存在によって、半合成と同様に天然の結合部位を含む融合蛋白と軽鎖の両方で細菌細胞質からペリプラズム間隙へ協調的にしかし別々に分泌が促進された。この過程では、各鎖は、その後切断されるｐｅ１Ｂリーダー配列によってペリプラズム間隙に運ばれる。この重鎖はｃｐｉｉｉ膜アンカードメインによって膜に固定され、一方、軽鎖はペリプラズムに分泌された。Ｆａｂ分子は重鎖と可溶性軽鎖との結合によって形成された。さらに、本発明で用いられる発現ベクターは、実施例５Ｃで説明するように可溶性Ｆａｂ異種二量体の産生を可能にする。Ａ．ファージミドＦａｂ表示蛋白を発現できる二シストロン性発現ベクター、ｐＣｏｍｂ３の調製本発明のＰｃｏｍｂ３ファージミド発現ベクターは、抗ハプテン抗体の発現に用いられる。重鎖の可変（Ｖ_H）および定常（Ｃ_H１）ドメインを含む抗体Ｆｄ鎮は、バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ（３）コート蛋白のＣ−末端ドメインと融合させた。糸状ファージの遺伝子ＩＩＩは、４０６残基のマイナーファージコート蛋白、ｃｐｉｉｉ（ｃｐ３）をコードするが、これは、細菌膜上でのファージの会合過程が生じる前に発現され、大腸菌のペリプラズムに面している内側膜上に蓄積される。このファージミドベクター（Ｐｃｏｍｂ３と称する）は、Ｆａｂの表面への出現と可溶形の両方を可能にした。最初該ベクターは、バルバスら（Barbasら、 Methods，A Companion to Methods in Enzymology，2:119-124(1991)、この文献は参照により本明細書に含まれる）が報告したように組合せ式Ｆａｂライブラリーのクローニング用にデザインされた。ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ部位は、完全なＰＣＲ増幅重鎖（Ｆｄ）配列をクローニングするために提供された。ＰＣＲ生成物のＸｈｏＩ／ＡａｔＩＩ消化物の挿入を許容するＡａｔＩＩ制限部位もまた存在する。ＳａｃＩおよびＸｂａＩ部位は、本発明のＰＣＲ増幅抗体軽鎖をクローニングするために提供された。これらのクローニング部位は、先に報告されたマウスとヒトのＰＣＲプライマーと適合した(Huseら、Science，246:1275-1281(1989);Perssonら、Proc．Natl，Acad．S ci.，USA，88:2432-2436(1991))。発現蛋白をペリプラズム間隙に誘導するｐｅ１Ｂリーダー配列のヌクレオチド配列はヒュースら（上掲書）によって報告された。このベクターはまた、シャインら(Shineら、Nature，254:34(1975))が報告したリボソーム結合部位を含んでいた。ファージミドベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（これはＣｏｌＥ１およびＦ１起点並びにβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む）の配列はショートら(Shortら、Nuc．Acids Res.，16:7583-7600(1988))が既に報告し、その完全な配列についてはジェンバンク(GenBank)取得番号５２３３０を有する。さらに別の制限部位、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩ（これらはエンプティーベクターのＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ部位の間に位置する）は、ショートら（上掲書）の記載のようにＰｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔの５１塩基対充填フラグメントに由来した。定まった二次構造を欠く可撓性の５アミノ酸残基のつなぎ紐配列をコードするヌクレオチド配列は、発現される融合蛋白での相互反応を最小にできるようにＦａｂとｃｐ３ヌクレオチドドメインとの間に並置した。したがって、得られた組合せ式ベクターＰｃｏｍｂ３は、１つの融合蛋白を発現させる２つのカセットを有するＤＮＡ分子、Ｆｄ／ｃｐ３および１つの可溶性蛋白、該軽鎖から成る。このベクターはまた、５’から３’の方向で列挙した下記の機能的に連結された構成成分を含んでいた：ＬａｃＺプロモーター／オペレーター配列から成る第一のカセット；ＮｏｔＩ制限酵素；リボソーム結合部位；ｐｅ１Ｂリーダー；スペーサ一領域；５’Ｘｈｏおよび３’ＳｐｅＩ制限部位に囲まれたクローニング領域；つなぎ紐配列；その後に終止コドンが続くバクテリオファージｃｐ３をコードする配列；２つのカセット間に配置されたＮｈｅＩ制限部位；その後に発現制御リボソーム結合部位が続く第二のＬａｃＺプロモーター／オペレーター配列；ｐｅ１Ｂリーダー；スペーサー領域；その後に発現制御終止配列が続く５’ＳａｃＩおよび３’ＸｂａＩ制限部位に囲まれたクローニング領域および第二のＮｏｔＩ制限部位。上記の発現ベクターでは、Ｆｄ／ｃｐ３融合物および軽鎖蛋白は別々のｌａｃプロモーター／オペレーター配列制御下に置かれ、さらに膜上での機能的な会合のためにペリプラズム間隙に誘導された。ベクターにファージＦ１遺伝子間領域を内包させることによって、ヘルパーファージの助けによる一本鎖ファージミドのパッケージングが可能になった。ヘルパーファージの二重感染によってｃｐ３の２つの形態の発現が可能になった。その結果、Ｆｄ／ｃｐ３融合物とヘルパーファージの天然のｃｐ３との間のビリオン内取り込みのための競合によって正常なファージの形態発生が混乱した。得られたパッケージングされたファージミドは天然のｃｐ３（これは感染に必要である）およびコードされたＦａｂ融合蛋白（これは選別のために表示される）を含んでいた。感染性Ｎ−末端ドメインとの融合は宿主細胞を感染に対して抵抗性にする傾向があるので、Ｃ−末端ドメインとの融合はファージの接近のために必要であった。上記に説明したＰｃｏｍｂ３発現ベクターは、ヒト抗ハプテンＦａｂ抗体の作製のために本発明で用いる下記で説明するＦａｂ表示ファージミド発現ベクターの基礎的構築物を形成する。当該表面表示ファージミド発現ベクター、ｐＣ３ＡＰ３１３は、本発明の実施のために１９９３年２月２日にＡＴＣＣに寄託された。該寄託ベクターはＡＴＣＣ取得番号７５４０８を割り当てられた。ｐＣ３ＡＰ３１３発現ベクターは、バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ並びに破傷風類毒素に対するヒトＦａｂ抗体をコードする重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を含んでいた。ｐＣ３ＡＰ３１３中の抗破傷風類毒素重鎖および軽鎖可変ドメインのＤＮＡコード鎖ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１および２の配列表に掲載されている。アミノ酸残基配列への翻訳のための該ヌクレオチドの読み枠は、ｐＣ３ＡＰ３１３の軽鎖および重鎖可変ドメインの両方についてヌクレオチド１位から始まる。破傷風類毒素特異配列は、パーソンら（上掲書、この文献は参照により本明細書に含まれる）が報告したように、破傷風類毒素で免疫した個体の末梢血リンパ球から得た抗体の重鎖および軽鎖のファージラムダベクター組合せ式ライブラリーのスクリーニングから最初入手された。クローン３を該ライブラリーのスクリーニングで選択し、続いて、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩおよびＳａｃＩ／ＸｂａＩで制限消化して、さらに同じように消化したＰｃｏｍｂ３ベクターにつなぐことによって重鎖および軽鎖配列をそれぞれ分離した。発現ベクターライブラリーを作製する連結過程およびそれに続く抗ハプテンＦａｂ抗体の発現は、実施例２で述べるように実施される。２．半合成軽鎖および重鎖ライブラリーからのヒト抗ハプテン抗体の選別Ａ．二シストロン性発現ベクターによって産生されたファージミドＦａｂ表示蛋白の軽鎖ＣＤＲ３内のランダム化部位の調製１）縮退オリゴヌクレオチドコートプライマーによるＰＣＲＣＤＲ３重鎖および軽鎖ドメインの両方がランダム化されている半合成ヒトＦａｂライブラリーを構築して糸状ファージの表面に表示させ、３種のハプテン共役物との結合について選別した。破傷風毒素と免疫反応するヒト抗体をコードする重鎖および軽鎖を含むファージミド発現ベクター、ｐＣ３ＡＰ３１３をＰＣＲ用鋳型として用いた。ここで述べるオーバーラップＰＣＲ増幅プロトコルを用いて、予め決定したアミノ酸残基の位置でＣＤＲ３をランダム化させた軽鎖ライブラリーを調製した。このライブラリーでは、ヒトで天然に生じるループの長さに対応させるために、オリゴヌクレオチドプライマープールは８、９および１０アミノ酸の長さのＣＤＲ３を形成させるようにデザインされた。多様性はカバト(Kabat)９２−９６位に対しては制限された。なぜならばこの残余の４つの位置は自然の状態では高度に保存されているからである。ｐＣ３ＡＰ３１３の読み枠１から読み枠３の終わりまで軽鎖の５’末端を増幅させるために、以下のプライマー対を用いた。５’コード（センス）オリゴヌクレオチドプライマー、ＫＥＦで、これはヌクレオチド配列５’ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＧ３’（配列番号３）をもち、フレームワーク１の５ ’領域に対応する軽鎖の非コード鎖とハイブリダイズし、さらにフレームワーク１の開始部を含む。３’非コード（アンチセンス）オリゴヌクレオチドプライマー、ＫＶ１２Ｂで、これはヌクレオチド配列５’ＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣ３’（配列番号４）をもち、フレームワーク３領域の３’末端に対応する軽鎖のコード鎖とハイブリダイズする。これらオリゴヌクレオチドプライマーはオペロンテクノロジーズ(Operon Technologies、アラメダ、カリフォルニア)によって合成された。オリゴヌクレオチドプライマーに関して用いられるコードまたはセンスという用語は、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ鎖と同じ配列を有し、さらに非コード鎖とハイブリダイズするプライマーを指す。同様に、非コードまたはアンチセンスという用語は、コード鎖と相補的でしたがってそれとハイブリダイズするプライマーを指す。オーバーラップＰＣＲについては、それぞれの一組のＰＣＲ反応は１００マイクロリットル（μｌ）の反応物中で実施し、当該反応物は、特定の組合せにした上記のオリゴヌクレオチドプライマーの各々１マイクログラム（μｇ）、２．５ＭｍのｄＮＴＰ（ＤＡＴＰ、ＤＣＴＰ、ＤＧＴＰ、ＤＴＴＰ）を８μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ１μｌ、１０ｎｇの鋳型ｐＣ３ＡＰ３１３および１０×ＰＣＲ緩衝液(Promega Biotech、マジソン、ウィスコンシン（市販品を購入））１０μｌを含んでいた。パーキンエルマーシータス（Perkin-Elmer Cetus）９６００ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステムサーモサイクラーで３５回のＰＣＲ増幅を続いて実施した。増幅サイクルは、９４℃での変成１分、４７℃でのアニーリング１分、続いて７２℃での伸長２分から成る。十分量の増幅生成物を得るために、同じＰＣＲ反応を１５回実施した。続いて得られたＰＣＲ増幅生成物を標準的な電気溶出技術（分子クローニング：実験室マニュアル、サンブルック(Sambrook)ら編、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)）を用いて１．５％アガロースゲル上でゲル精製した。簡単に記せば、ゲル電気泳動の後、予め決めた大きさのＤＮＡフラグメントを含むゲルの領域を切り出し、透析膜中に電気的に溶出させ、エタノール沈澱を実施し、さらに、１０ミリモル（Ｍｍ）のトリス−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン−塩酸塩）（ｐＨ７．５）および１ＭｍのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む緩衝液に最終濃度５０ｎｇ／ｍｌで再懸濁させた。続いて、この精製した増幅生成物を第二のＰＣＲ反応の生成物とともにオーバーラップ伸長ＰＣＲ反応で使用し（これら両反応については下記で述べる）、変異を誘発した第三の相補性決定領域（ＣＤＲ３）を含む再構築可変ドメイン軽鎖中でこれら２つの生成物を再結合させた。第二のＰＣＲ反応は、フレームワーク領域３の３’末端から軽鎖定常領域の末端で伸長する軽鎖を増幅させた。全長８アミノ酸を有するＣＤＲ３の４ランダムアミノ酸残基配列をコードするこの領域を増幅させるために、以下のプライマー対を用いた。５’コードオリゴヌクレオチドプライマープール（ＫＶ４Ｒと称する）は下記式で表されるヌクレオチド配列を有する；５’ＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ３’（配列番号５）、ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよく、ＫはＧまたはＴのいずれかである。３’非コードプライマー（Ｔ７Ｂ）は、軽鎖定常ドメインの３’末端のコード鎖とハイブリダイズし、５’ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ３’（配列番号６）の配列をもつ。プライマープールの５’末端は、オリゴヌクレオチドプライマーＫＶ１２Ｂの相補的ヌクレオチド配列によって表されるフレームワーク３の３’末端と相補的で、プライマープールの３’末端はフレームワーク４の５’末端と相補的である。プライマープールのこの２つの特定される末端の間の領域は１２量体のＮＮＫ縮退によって表される。この第二のＰＣＲ反応は、オリゴヌクレオチドプライマーの各々を１μｇ含む上記の反応物１００μ ｌ中で実施された。得られたＰＣＲ生成物は、全部で８アミノ酸残基を有する軽鎖ＣＤＲ３の４変異誘発アミノ酸残基の多様な集団をコードした。得られたＣＤＲ３において、この４変異誘発アミノ酸残基の位置は、アミノ末端側で変化せずに残された３つのアミノ酸残基（Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ）によって、さらにカルボキシ末端側で１つのアミノ酸残基（Ｔｈｒ）によって囲まれていた。続いてこの生成物を上記のようにゲル精製した。８アミノ酸残基をもつＣＤＲ３の４ランダム化アミノ酸残基を調製するためのまた別のオリゴヌクレオチドプールはＫ８と呼んだ。これは下記の式をもつ。５’ＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ３’（配列番号７）。Ｋ８プライマーはＫＶ４Ｒの３’末端から９ヌクレオチドを欠いていた。続いて第一および第二のＰＣＲ反応由来のゲル精製物１００ナノグラムとプライマー対としてそれぞれ１μｇのＫＥＦとＴ７Ｂオリゴヌクレオチドプライマーとを最後のＰＣＲ反応で混合し、オーバーラップ伸長によって完全な軽鎖フラグメントを形成した。このＰＣＲ反応混合物はまた、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ１μｌおよび２．５ＭｍのＤＮＴＰ８μｌを上記のように含んでいた。十分量の増幅生成物を得るために、同じオーバーラップＰＣＲ増幅を１５回実施した。フレームワーク１から始まり軽鎖の定常領域の末端まで伸長する生成軽鎖フラグメントは、したがって、４つの新しいアミノ酸残基をコードするランダムに変異したＣＤＲ３領域を含んでいた。実施例４Ａで説明するようにそれらをｐＣ３ＡＰ３１３表面表示ファージミド発現ベクターに取り込ませてライブラリーを形成する前に、１５回の反応から得られた軽鎖フラグメント増幅生成物を先ずプールし、続いて上記のようにゲル精製した。ＫＶ４ＲまたはＫ８のいずれかを用いて増幅させて生じた８アミノ酸のＣＤＲ３をもつ軽鎖ライブラリーをＫ８と称した。全部で９アミノ酸をもつＣＤＲ３をコードするためのランダム化軽鎖（この場合５アミノ酸残基がランダム化されている）を作製するために、ＫＶ５Ｒを前述の３’プライマー、Ｔ７Ｂとともに用いた。このＫＶ５Ｒは記式、５’ＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ３’（配列番号８）をもつが、ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＫはＧまたはＴである。９アミノ酸残基をもつＣＤＲ３の５ランダム化アミノ酸残基を調製するためのまた別のオリゴヌクレオチドプールをＫ９と称したが、５’ＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ３’（配列番号９）なる式を有し、式中ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＫはＧまたはＴである。このＫ９プライマーはＫＶ５Ｒの３’末端から９ヌクレオチドを欠いていた。ＫＶ５ＲまたはＫ９の何れかで増幅させて生じたＰＣＲ生成物は、全部で９アミノ酸残基を有する軽鎖ＣＤＲ３の５変異アミノ酸残基の多様な集団をコードした。得られたＣＤＲ３では、この５つの変異アミノ酸残基の位置は、アミノ末端側では未変化のままで残る３アミノ酸残基（Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ）によって、さらにカルボキシ末端側では１アミノ酸残基（Ｔｈｒ）によって囲まれる。この増幅によって生じた９つのアミノ酸のＣＤＲ３を有する軽鎖ライブラリーをＫ９と称した。全部で１０アミノ酸をもつ（そのうちの６アミノ酸残基がランダム化された）ＣＤＲ３のコード用ランダム化軽鎖ＣＤＲ３を作製するために、先に述べたように３’プライマー、Ｔ７ＢとともにＫＶ６Ｒプライマーを用いた。このＫＶ６Ｒプライマーは、５’ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ３’（配列番号１０）なる式をもつが、式中ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＫはＧまたはＴである。１０アミノ酸残基をもつＣＤＲ３に６つのランダム化アミノ酸残基を調製するためのまた別のオリゴヌクレオチドプールはＫ１０と称し、５’ＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ３’なる式をもつが、ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＫはＧまたはＴである（配列番号１１）。Ｋ１０プライマーは、ＫＶ６Ｒプライマーの５’および３’末端の両方でそれぞれ１２ヌクレオチドおよび９ヌクレオチド短くなった。ＫＶ６ＲまたはＫ１０のいずれかを用いた増幅によって得られたＰＣＲ生成物は、全部で１０アミノ酸残基を有する軽鎖ＣＤＲ３の６変異アミノ酸残基の多様な集団をコードした。この増幅によって生じた１０アミノ酸のＣＤＲ３をもつ軽鎖ライブラリーをＫ１０と称した。得られたＣＤＲ３では、この６つの変異アミノ酸残基の位置は、アミノ末端側では未変化のままで残る３アミノ酸残基（Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ）によって、さらにカルボキシ末端側では１アミノ酸残基（Ｔｈｒ）によって囲まれていた。全部で１０アミノ酸をもつ（そのうちの全ての１０アミノ酸残基がランダム化された）ＣＤＲ３をコードするランダム化軽鎖ＣＤＲ３を作製するために、先に述べた３’プライマー、Ｔ７ＢとともにＫＶ１０Ｒプライマーを用いた。このＫＶ１０Ｒプライマーは、５’ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ３’（配列番号１２）なる式をもつが、式中ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＫはＧまたはＴである。得られたＰＣＲ生成物は、全部で１０アミノ酸残基を有する軽鎖ＣＤＲ３の１０変異アミノ酸残基の多様な集団をコードした。この増幅によって生じた１０アミノ酸のＣＤＲ３をもつ軽鎖ライブラリーをＫ１０’と称した。２）非コード縮退オリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲ重鎖および軽鎖ＣＤＲ３の両方がランダム化されているまた別の半合成ヒトＦａｂライブラリーを構築して糸状ファージの表面に表示させ、３種のハプテン共役物との結合について選別した。アミノ酸残基置換または付加をコードするために鋳型ＤＮＡ配列にランダム化ヌクレオチドを導入するまた別の方法は、上記実施例２Ａ１）で述べたような縮退オリゴヌクレオチドコードプライマーの代わりに非コード縮退プライマーを用いることであった。このコード（センス）縮退物は５’−ＮＮＫ−３’なる式を有するが、ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよく、さらにＫはＧまたはＴであった。本発明で使用するためには、オーバーラップＰＣＲ方法で用いられる非コード（アンチセンス）オリゴヌクレオチドプライマーは、通常の５’から３’方向で表現した場合５’−ＭＮＮ−３’なる縮退式を有するが、ここでＭはＡまたはＣのいずれかと同等である。３’から５’方向に表記すれば、この非コードオリゴヌクレオチドは３’−ＮＮＭ−５’ なる式を有し、これはコード鎖の式５’−ＮＮＫ−３’に対して相補的配列である。したがって、本発明で用いられる非コードオリゴヌクレオチドプライマーは、コードオリゴヌクレオチドプライマーと同じコード配列縮退の取り込みを提供する。言い換えれば、特定のＣＤＲランダム化アレンジメントを有する半合成ライブラリーは、予め定めたコードプライマーまたは非コードプライマーとともにオーバーラップＰＣＲを用いることによって得られる。非コードプライマーの使用はまた、ここで述べるように異なるオーバーラッププライマーの使用を必要とする。このＰＣＲ生成物もまた、破傷風毒素と免疫反応するヒト抗体をコードする重鎖および軽鎖配列を含むファージミド発現ベクター、ｐＣ３ＡＰ３１３から調製された。予め定めたアミノ酸残基部位にランダム化ＣＤＲ３をもつ軽鎖ライブラリーは、ここで述べるオーバーラップＰＣＲ増幅プロトコルを用いて調製した。このライブラリーでは、オリゴヌクレオチドプライマープールは、長さが８、１０および１６アミノ酸のＣＤＲ３を形成するようにデザインされた。３つの全てのライブラリーについて、ＣＤＲ３は、コード性縮退物５’−ＮＮＫ−３’と相補的な非コード性縮退物５’−ＭＮＮ−３’を実施例２Ａ１）で述べたプライマーとして用いたように使用して完全にランダム化された。フレームワーク１からｐＣ３ＡＰ３１３のＣＤＲ３の末端まで軽鎖の５’末端を増幅させ、さらに縮退ヌクレオチド配列をこの増幅ＤＮＡに取り込ませるために以下のプライマー対を用いた。５’コード（センス）オリゴヌクレオチドプライマー、ＫＥＦ、これは５’ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＧ３’ （配列番号３）のヌクレオチド配列を有し、フレームワーク１の５’領域と対応しフレームワーク１の開始部を含む軽鎖の非コード鎖とハイブリダイズした。３つの別々の非コード（アンチセンス）オリゴヌクレオチドプライマープールを、８、１０または１６ランダム化アミノ酸残基をもつ軽鎖ＣＤＲ３ライブラリーを調製するためにデザインした。縮退オリゴヌクレオチドは、フレームワーク領域３の３’末端からＣＤＲ３を通ってフレームワーク領域４の５’末端とオーバーラップした。８ランダム化アミノ酸残基を取り込ませるためのｐ３１３Ｋ３８ＯＶｂと呼ぶプライマープールは、５’から３’方向表記で以下の非コードヌクレオチド配列を有する：５’ＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＣ３’。式中、ＭはＡまたはＣのいずれか、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかである（配列番号１３）。この増幅によて形成された軽鎖ライブラリーはＣＤＲ３ −ＬＣＮＣ８と呼んだ。１０ランダム化アミノ酸残基を取り込ませるためのｐ３１３Ｋ３１０ＯＶｂと称するプライマープールは、５’から３’方向表記で下記の非コードヌクレオチド配列を有していた：５’ＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＣ３’。式中、ＭはＡまたはＣのいずれか、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかである（配列番号１４）。この増幅によて形成された軽鎖ライブラリーはＣＤＲ３−ＬＣＮＣ１０と呼んだ。１６ランダム化アミノ酸残基を取り込ませるためのｐ３１３Ｋ３１６ＯＶｂと称するプライマープールは、５’から３’方向表記で下記の非コードヌクレオチド配列を有していた：５’ＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＣ３’。式中、ＭはＡまたはＣのいずれか、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかである(配列番号１５) 。この増幅によって形成された軽鎖ライブラリーはＣＤＲ３−ＬＣＮＣ１６と呼んだ。続いて、３種の別々の第一のＰＣＲ増幅を、上記に列挙したこの３種の非コード縮退プライマーと対にしてＫＥＦプライマーを用いて実施した。増幅は実施例２Ａ１）で述べたように実施した。第二のＰＣＲ増幅によってフレームワーク領域４から軽鎖定常領域の末端までの軽鎖の増幅がもたらされた。ｐ３１３ＫＦ４０Ｆと呼ぶこの５’コードオリゴヌクレオチドは、５’ＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣ３ ’（配列番号１６）なるヌクレオチド配列を有していた。このプライマーはフレームワーク領域４の５’末端で開始し、オーバーラップ領域に縮退オリゴヌクレオチドプライマー内の対応する領域を提供する。３’非コードプライマー、Ｔ７Ｂは、軽鎖定常ドメインの３’末端でコード鎖とハイブリダイズし、５’ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ３’（配列番号６）なる配列を有していた。オーバーラップＰＣＲのためには、第一と第二の反応から得られた増幅生成物１００ｎｇをプールし、続いて精製してから、上記のようにプライマー対、ＫＥＦおよびＴ７Ｂを用いてＰＣＲの第三ラウンドを実施し、オーバーラップ伸長によって完全な軽鎖フラグメントを形成した。１５の並行した反応から得た軽鎖フラグメントの増幅生成物を先ずプールし、続いて上記のようにゲル精製した。その後、ｐＣ３ＡＰ３１３表面表示ファージミド発現ベクターにそれらを取り込ませ、実施例４Ａで述べるようにライブラリーを形成させた。得られた半合成軽鎖ライブラリーは、８、１０または１６ランダム化アミノ酸をもつＣＤＲ３をコードした。本明細書に開示する個々のオリゴヌクレオチドプライマーを基にした種々の軽鎖オリゴヌクレオチドプライマーの式は請求の範囲に示す。これらは対応する配列番号２６から３１を有する。Ｂ．二シストロン性発現ベクターによって製造されるファージミドＦａｂ表示蛋白の重鎖ＣＤＲ３内のランダム化部位の調製長さが５、１０および１６アミノ酸のランダム化ＣＤＲ３をもつ重鎖ライブラリーをまた、ｐＣ３ＡＰ３１３表面表示発現ベクターをＰＣＲ鋳型として用いて調製した。続いて、下記のよう調製して得られたライブラリーを実施例２Ａ１）で調製したＫ８、Ｋ９およびＫ１０軽鎖ライブラリーと交雑した。１０アミノ酸残基をもつ重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、ヒト抗体で用いられるほぼ平均的な長さである。この領域の遺伝的多様性に関する先の報告に基づき、代表的な短ＣＤＲ３および長ＣＤＲ３として５および１６アミノ酸残基をもつＣＤＲ３を選択した。ＮＮＫまたはＮＮＳ縮退物を用いた完全なランダム化によって５、１０および１６と呼ぶライブラリーが得られた。また別に、ＨＣＤＲ３の後ろから２番目がアスパラギン酸として固定され、Ｇ、ＦおよびＥと呼ぶライブラリー（それぞれ５、１０および１６アミノ酸残基ＣＤＲ３）を得た。ＦおよびＥライブラリーの最初の位置もまた、トリプレットコドンＧＧＴでコードされるグリシン残基として固定した。後ろから２番目のアスパラギン酸（カバットポジション１０１）はカバットらが報告したように（上掲書、この文献は参照により本明細書に含まれる）ヒト抗体の７５％で保存されている。このカバット１０１位は、ショシアら(Chothiaら、J．Mol．Biol.，196:901-917 (1987)、この開示内容は参照により本明細書に含まれる）が報告したように、免疫グロブリンのループ構造の安定化のために構造的に重要であると考えられる。以下の増幅は重鎖Ｇ、ＦおよびＥライブラリーを調製するために実施された。第一のＰＣＲ反応は、フレームワーク領域１から始まりＣＤＲ３に対して５’側に位置するフレームワーク領域３の末端まで伸びる、ｐＣ３ＡＰ３１３ファージミドの重鎖フラグメントの領域の増幅を生じた。ｐＣ３ＡＰ３１３鋳型とともに使用するようにデザインされた縮退プライマープールによって、調製されたＣＤＲ３の３通りの長さの全てについてＣＤＲ３の最後から２つ目の保存アスパラギン酸残基は保持された。この部位におけるアスパラギン酸の保持は、この残基を含む発現蛋白が高い親和結合特性を示すので、本発明で使用するについて好ましい。フレームワーク１からフレームワーク３の末端まで重鎖の５’末端を増幅させるために、以下のプライマー対を用いた。５’ＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ３’（配列番号１７）なる配列をもつ５’コードオリゴヌクレオチドプライマー、ＦＴＸ３は、フレームワーク１の領域５’に対応しさらにその開始部分を含む重鎖の非コード鎖とハイブリダイズした。５’ＴＣＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴ３’（配列番号１８）なる配列をもつ３’非コードオリゴヌクレオチドプライマー、ＢＦＲ３Ｕは、フレームワーク３領域の５’末端に対応する重鎖のコード鎖とハイブリダイズした。このオリゴヌクレオチドプライマーはオペロンテクノロジーズによって合成された。ＰＣＲ反応は実施例２Ａ１）で述べたように実施した。続いて、得られたＰＣＲ増幅生成物を前述のようにゲル精製し、第二のＰＣＲ反応生成物とともにオーバーラップ伸長ＰＣＲ反応で用い（後者の両方とも下記で説明する）、この２つの生成物を再結合させて変異ＣＤＲ３を含む再構築重鎖を得た。第二のＰＣＲ反応は、フレームワーク領域３の３’末端からＣ_H１領域の末端へと続く重鎖の増幅をもたらした。ＣＤＲ３の４番目の位置にアスパラギン酸をもつ５ランダムアミノ酸残基配列をコードするためのこの領域を増幅させるべく、以下のプライマー対を用いた。ＨＣＤＲＤ５と呼ぶ５’コードオリゴヌクレオチドプライマープールは以下の式で表されるヌクレオチド配列を有していた：５’ＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣ３’（配列番号１９）。ここで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかで、ＫはＧまたはＴのいずれかである。プライマープールの５’末端は、オリゴヌクレオチドプライマーＢＦＲ３Ｕの相補的ヌクレオチド配列によって表されるフレームワーク３の３’末端と相補的で、さらにプライマープールの３’末端はフレームワーク４の５’末端と相補的である。プライマープールのこの２つの特定される末端の間の領域は、４つのＮＮＫトリプレットを含む１２量体とＣＤＲ３の末端から次の保存アスパラギン酸残基をコードする配列によって表される。３’非コードオリゴヌクレオチドプライマー、Ｒ３Ｂは、５’ＴＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＧＧ３’（配列番号２０）なる配列をもち、Ｃ_H１の３’末端と対応する重鎖のコード鎖とハイブリダイズした。配列５’−ＮＮＫ−３’は、３’から５’方向に読むときプライマーでは相補的配列３’−ＮＮＭ−５’をもつコード鎖配列を表す。したがって下記に列挙するプライマーでは、非コード鎖配列は５’から３’方向に読むとき５’−ＭＮＮ −３’である。コード鎖トリプレット配列５’−ＮＮＫ−３’は有害な終止コドンの生成を防止するようにデザインされた。ＮＮＫの発現によって生じるであろうただ１つの終止コドンは、ファージミドがアンバー抑圧宿主細胞、好ましくは大腸菌ｓｕｐＥ株で発現されるとき抑圧されるアンバー変異であろう。続いて、第二のＰＣＲ反応は、各々１μｇのオリゴヌクレオチドプライマーＨＣＤＲＤ５およびＲ３Ｂを含む上記で述べた１００μｌの反応物中でｐＣ３ＡＰ３１３により実施した。生じたＰＣＲ生成物は、ＣＤＲ３の４番目のアミノ酸残基の位置に保存アスパラギン酸残基をもつ長さが５アミノ酸残基の変異ＣＤＲ３の多様な集団をコードした。この生成物を続いて上記に述べたようにゲル精製した。続いて、第一と第二のＰＣＲ反応のゲル精製物の１００ナノグラムと、プライマー対としてＦＴＸ３およびＲ３Ｂオリゴヌクレオチドプライマーの各々１μｇとを最後のＰＣＲ反応物中で混合して、オーバーラップ伸長によって完全な重鎖フラグメントを形成した。このＰＣＲ反応混合物はまた、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌのＴａｑポリメラーゼおよび８μｌの２．５ＭｍＤＮＴＰを上記のように含んでいた。ＰＣＲ反応は前述のように実施した。十分量の増幅精製物を得るために、同じＰＣＲ反応を１５回実施した。得られた重鎖フラグメントはフレームワーク１で始まりＣ_H１の末端まで続き、保存アスパラギン酸を含む５アミノ酸残基をコードするためのランダム変異誘発ＣＤＲ３を有していた。１５回の反応から得た重鎖フラグメント増幅生成物を先ずプールし、続いて上記のようにゲル精製し、その後、消化したｐＣ３ＡＰ３１３表面表示ファージミド発現ベクターに取り込ませ、実施例４で述べるようにライブラリーを形成した。得られたＣＤＲ３−ランダム化重鎖ファージミドライブラリーをライブラリーＧと呼んだ。５アミノ酸残基を発現させるためのｐＣ３ＡＰ３１３でのＣＤＲ３のランダム化に加えて、１０アミノ酸残基を含むＣＤＲ３の発現のために増幅を実施した。第二の反応では５’コード縮退プライマー（ＨＣＤＲＤ１０と呼ぶ）を重鎖ＣＤＲ３を含む１０アミノ酸残基をコードさせるために用いたという点を除き、上記のように２つのＰＣＲ増幅を別々に実施した。ここで用いた縮退５’コードプライマーは、ｐＣ３ＡＰ３１３で最初のアミノ酸の場所にグリシン残基を保持し、保存アスパラギン酸を９番目のアミノ酸の場所に取り込ませるようにデザインされた。このＨＣＤＲＤ１０プライマーはの式は、５’ＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣ３’（配列番号２１）で、式中、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＫはＧまたはＴである。ＨＣＤＲＤ１０プライマーを使用することによりコードされるＣＤＲ３を含むアミノ酸配列は、ＣＤＲ３の９番目に保存アスパラギン酸残基を有していた。得られた生成物をプールし、上記のように精製し、その後、消化したｐＣ３ＡＰ３１３表面表示ファージミド発現ベクターに挿入し実施例４Ｂで述べるようにライブラリーを形成した。生じたＣＤＲ３−ランダム化重鎖ファージミドライブラリーはライブラリーＦと呼んだ。鋳型ｐＣ３ＡＰ３１３を用いたＰＣＲ増幅をまた１６アミノ酸残基を含むランダム化ＣＤＲ３を発現させるために実施した。この増幅に用いた縮退５’コードプライマーは、ｐＣ３ＡＰ３１３鋳型の第一のアミノ酸の位置にグリシン残基を保持し、さらに１５番目のアミノ酸の位置に保存アスパラギン酸残基を取り込ませるようにデザインされた。第二の反応では５’コード縮退プライマー（ＨＣＤＲＤ１６と呼ぶ）を１６ランダムアミノ酸残基をコードさせるために用いたという点を除き、上記のように２つのＰＣＲ増幅を５アミノ酸有するＣＤＲ３のために別々に実施した。このＨＣＤＲＤ１６プライマーの式は、５’ＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣ３’（配列番号２２）で、式中、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＫはＧまたはＴである。ＨＣＤＲＤ１６プライマーを使用することによりコードされるＣＤＲ３を含むアミノ酸配列は、１５位に保存アスパラギン酸残基を有していた。得られた生成物をプールし、上記のように精製して、その後、消化したｐＣ３ＡＰ３１３表面表示ファージミド発現ベクターに挿入し実施例４Ｂで述べるようにライブラリーを形成した。生じたファージミドライブラリーをライブラリーＥと呼んだ。上記で述べたように、ｐＣ３ＡＰ３１３から増幅させた後ろから２番目に保存アスパラギン酸をもつこの得られた種々の長さのランダム化重鎖ＣＤＲ３を精製して消化し、別々の発現ライブラリーの調製のために実施例４Ｂで述べるようにｐＣ３ＡＰ３１３につなぎ戻した。同じようなオーバーラップＰＣＲ増幅で、長さが５、１０または１６の完全にランダム化したＣＤＲ３をもつ重鎖ライブラリーを調製した。ＣＤＲ３−ＨＣ５の調製用の縮退オリゴヌクレオチドプールの式は、５’ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ３’で、ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＳはＧまたはＣである（配列番号２３）。得られたライブラリーはＣＤＲ３−ＨＣ５と呼んだ。ＣＤＲ３− ＨＣ１０ライブラリーの調製用の縮退オリゴヌクレオチドプールの式は、５’ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ３’で、ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＳはＧまたはＣである（配列番号２４）。得られたライブラリーはＣＤＲ３−ＨＣ１０と呼んだ。ＣＤＲ３−ＨＣ１６ライブラリーの調製用の縮退オリゴヌクレオチドプール（７ＥＣＤＲ３と呼ぶ）のヌクレオチド式は、５’ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ３’で、ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴで、ＳはＧまたはＣである（配列番号２５）。得られたライブラリーはＣＤＲ３ −ＨＣ１６と呼んだ。上記で述べたように、ｐＣ３ＡＰ３１３から増幅されたこの得られた完全にランダム化した種々の長さの重鎖ＣＤＲ３を続いて精製し消化して、発現ライブラリーの調製のために実施例４Ｂで述べるように消化ｐＣ３ＡＰ３１３発現ベクターにつなぎ戻した。３．普遍的軽鎖をもつ重鎖および軽鎖発現ベクターライブラリーの調製Ａ．普遍的軽鎖による交雑ランダム重鎖ライブラリーランダム重鎖フラグメントとただ１つの普遍的軽鎖の集団を含む発現されたヒトＦａｂ抗体ライブラリーを得るために、交雑ファージミドライブラリーが構築される。このライブラリーは、高い親和性で予め選択されたリガンドと結合するＦａｂ抗体の選別のためにランダム重鎖とただ１つの普遍的軽鎖を含むリコンビナントヒトＦａｂ抗体の発現を提供する。バルバスら(Barbasら、Proc．Natl．A cad．Sci.，USA，88:7978-7982(1991))が報告したように、重鎖がランダムであるライブラリーが調製される。普遍的軽鎖を含むｐＣ３ＡＰ３１３ベクターをＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｐＣ３ＡＰ３１３の天然の重鎖を除去し、ランダム重鎖ライブラリーのＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ消化物と置き換える。また別には、重鎖がランダムであるライブラリーは、実施例８で述べる異なる普遍的軽鎖を含むｐ６ＦベクターをＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｐ６Ｆの天然の重鎖を除去して、さらにランダム重鎖ライブラリーのＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ消化物で置き換えることによって調製される。ランダム重鎖および普遍的軽鎖の存在を証明するために、各交雑ライブラリーから得られた任意選択クローンの配列を決定した。Ｂ．普遍的軽鎖と交雑されたランダム化ＣＤＲ重鎖ライブラリーまた別には、ランダム化ＣＤＲ重鎖フラグメントとただ１つの普遍的軽鎖の集団を含む発現されたヒトＦａｂ抗体ライブラリーは、交雑ファージミドライブラリーの構築によって得ることができる。このライブラリーは、高い親和性で予め選択されたリガンドと結合するＦａｂ抗体の選別のために、ランダム化ＣＤＲ重鎖とただ１つの普遍的軽鎖を含むリコンビナントヒトＦａｂ抗体の発現を提供する。重鎖のＣＤＲ３領域がランダム化されているライブラリーは実施例４Ｂで述べるように調製される。また別には、重鎖のＣＤＲ１またはＣＤＲ２領域は、実施例４Ｂで教示する方法によってランダム化される。さらに、一層大きな多様性をもつ重鎖ＣＤＲ領域を作製するために創出された１つまたは２つ以上のランダム化ＣＤＲ領域を有する重鎖ライブラリーが目的とされる。普遍的軽鎖を含むｐＣ３ＡＰ３１３ベクターをＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化してｐＣ３ＡＰ３１３の天然の重鎖を除去し、さらにランダム化重鎖ライブラリーのＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ消化物をこの消化ｐＣ３ＡＰ３１３ベクターにランダムに結合（交雑）させて、普遍的軽鎖と重鎖ライブラリー由来のランダム化重鎖の１つを含むベクター集団を形成する。交雑ライブラリーはしたがって、普遍的軽鎖とランダム化重鎖ライブラリーとの結合によって調製される。ランダム化重鎖とただ１つの普遍的軽鎖の存在を証明するために、各交雑ライブラリーから任意に選択したクローンの配列を決定する。４．ランダム化ＣＤＲ３をもつ重鎖および軽鎖発現ベクターライブラリーの調製Ａ．軽鎖ライブラリー実施例２Ａで作製したコードおよび非コード縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用いてオーバーラップＰＣＲ増幅から得たランダム化ＣＤＲ３をもつ軽鎖を、実施例１で述べたように調製したｐＣ３ＡＰ３１３ベクターＰｃｏｍｂ３由来一価Ｆａｂファージ表示ベクターに続いて別々に挿入した。実施例２Ａで調製した増幅反応の各々から得たＰＣＲ生成物を別々にファージミド発現ベクターに挿入し、ファージミドライブラリーを調製した。実施例２Ａで調製したゲル精製軽鎖ＰＣＲＣＤＲ３−ランダム化生成物を下記で述べるように制限酵素で消化し、同様に消化したｐＣ３ＡＰ３１３ファージミド発現ベクターに別々につないだ。実施例２Ａで調製した軽鎖ＰＣＲ生成物を発現させるファージミドライブラリーの調製のために、このＰＣＲ生成物を別々にＳａｃＩおよびＡａｔＩＩで消化し、実施例１で述べたように調製したｐＣ３ＡＰ３１３ファージミド発現ベクターを同様に消化したものに別々につないだ。ＳａｃＩおよびＡａｔＩＩによるｐＣ３ＡＰ３１３ベクターの消化によって、天然の軽鎖可変ドメインの５’末端で始まりフレームワーク４の開始部までのヌクレオチド配列領域が除去された。したがって繋ぎ合わせることによって、軽鎖フレームワークからランダム化ＣＤＲ３ＰＣＲ生成物とｐＣ３ＡＰ３１３ベクターに存在する天然のフレームワーク４ドメインとの機能的連結が得られた。得られた軽鎖ライブラリーの発現はＬａｃＺプロモーターおよびｐｅ１Ｂリーダー配列の制御下にあった。本発明のランダム化軽鎖ＣＤＲ３をもつＦａｂの各々を発現させるファージミドライブラリーは以下の手順で調製した。ＰＣＲ生成物挿入物を含む環状化ベクターの形成のために、６４０ｎｇの消化ＰＣＲ生成物を直線化ｐＣ３ＡＰ３１３ファージミドベクター２μｇと混合し、１０単位のＢＲＬリガーゼ（ガイザースバーグ、メリーランド）を用いて１５０μｌの反応容積のＢＲＬリガーゼ緩衝液中で室温で一晩連結を進行させた。別々の連結反応を５回実施してランダム化ＣＤＲ３をもつファージライブラリーの大きさを増加させた。連結反応に続いて、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン２μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１５μ １および３００μｌのエタノールを混合してこの環状化ＤＮＡを−２０℃で２時間沈澱させた。その後ＤＮＡを４℃１５分の微量遠心沈殿によって沈澱させた。このＤＮＡ沈殿物を７０％冷エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。沈殿物を１０μｌの水に再懸濁し、電気穿孔(electroporation)により３００μｌの大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換させてファージライブラリーを作製した。ここで開示したＰＣＲ増幅と形質転換工程から得られた全収量はそれぞれ別個の約１０⁸の形質転換体であった。コード縮退プライマープールを用いて得られたＰＣＲ生成物から生じた、４、５、６および１０アミノ酸残基のランダム化ＣＤＲ３をもつ軽鎖ライブラリー（それぞれ８、９、１０および１０アミノ酸残基のＣＤＲ３において）をそれぞれ別個にＫ８、Ｋ９、Ｋ１０およびＫ１０’と称した。非コード縮退プライマープールを用いて得られたＰＣＲ生成物から生じた、８、１０および１６アミノ酸残基のＣＤＲ３をもつ軽鎖ライブラリーをそれぞれ別個にＣＤＲ３−ＬＣＮ８、ＣＤＲ３−ＬＣＮ１０およびＣＤＲ３−ＬＣＮ１６と称した。Ｂ．重鎖ライブラリーオーバーラップＰＣＲ増幅によって実施例２Ｂで作製したランダム化ＣＤＲ３もつ重鎖を、実施例１で述べたように調製した一価Ｆａｂファージ表示ベクターに続いて別々に挿入した。実施例２Ｂで調製した増幅反応の各々から得たＰＣＲ生成物を別々にファージミド発現ベクターに挿入し、ファージミドライブラリーを調製した。実施例２Ｂで調製したゲル精製軽鎖ＰＣＲフラグメントを下記で述べるように制限酵素で消化し、同様に消化したｐＣ３ＡＰ３１３ファージミド発現ベクターに別々につないだ。実施例２Ｂで調製した重鎖ＰＣＲ生成物を発現させるファージミドライブラリーの調製のために、このＰＣＲ生成物を別々にＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、実施例１で述べたように調製したｐＣ３ＡＰ３１３ファージミド発現ベクターを同様に消化したものに別々につないだ。ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩによるｐＣ３ＡＰ３１３ベクターの消化によって、重鎖可変ドメインの５’末端で始まり重鎖定常ドメインＣ_H１の開始部までの天然のヌクレオチド配列領域が除去された。したがって繋ぎ合わせることによって、フレームワーク１からランダム化ＣＤＲ３ＰＣＲ生成物とｐＣ３ＡＰ３１３ベクターに存在する天然のＣ_H１ドメインとの機能的連結が得られた。得られた重鎖ライブラリーの発現はＬａｃＺプロモーターおよびｐｅ１Ｂリーダー配列の制御下にあった。本発明のランダム化重鎖ＣＤＲ３をもつＦａｂの各々を発現させるファージミドライブラリーを軽鎖について上記で述べたように調製した。ここで開示したＰＣＲ増幅と形質転換工程から得られた全収量はそれぞれ独立した約１０⁸の形質転換体であった。ＰＣＲ生成物から得られた長さが５、１０または１６アミノ酸残基をもち、後ろから２番目にアスパラギン酸を保持しているＣＤＲ３を含む重鎖ライブラリーをそれぞれ別個にＧ、ＦおよびＥと称した。長さが５、１０または１６アミノ酸残基の完全にランダム化されたＣＤＲ３をもつ重鎖ライブラリーをそれぞれ別個にＣＤＲ３−ＨＣ５、ＣＤＲ３−ＨＣＩ０およびＣＤＲ３−ＨＣ１６と称した。Ｃ．交雑された重鎖および軽鎖ライブラリーランダム化重鎖および軽鎖フラグメントの両方をもつ発現ヒトＦａｂ抗体を得るために、交雑ファージミドライブラリーを構築した。このライブラリーはリコンビナントヒトＦａｂ抗体の発現を提供するが、当該抗体は、高い親和性で合成ハプテンと結合する抗体の選別のために、重鎖および軽鎖の両方でそのＣＤＲ３が選択的にランダム化された重鎖および軽鎖を含む。両ＣＤＲ３がランダム化されたライブラリーは、実施例４Ａで調製された軽鎖ライブラリーをＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｐＣ３ＡＰ３１３の天然の重鎖を除去し、実施例４Ｂで調製した合成重鎖ライブラリーのＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ消化物で置き換えて調製された。Ｋ８、Ｋ９およびＫ１０軽鎖ライブラリーとＧ、ＦおよびＥ重鎖ライブラリーとの組合せによって９つの交雑ライブラリーを調製した。さらに、軽鎖ＣＤＲ３の役割を調べるために、フルオレセインと反応するＦａｂ抗体（Ｆ２２と呼ぶ）をコードする先に選別したクローンの重鎖ドメインを、軽鎖Ｋ８、Ｋ９およびＫ１０ライブラリーと交雑した。交雑ライブラリーは、先ず軽鎖ライブラリーを重鎖ライブラリーから斜線によって分けて表記することによって明示される（例えばＫ８／Ｆ）。得られた全ての交雑ライブラリーは、１０⁷の形質転換体を含むＫ９／Ｆ２２およびＫ８／Ｆ２２を除き、少なくとも１０⁸の独立した形質転換体から成っていた。Ｆａｂフラグメントから成るＫ１０／Ｅと呼ぶ交雑ライブラリーは２０箇所がランダム化されていた。交雑ライブラリーを“完全”にするためには（すなわちここでは全てのあり得るメンバー（重鎖および軽鎖ライブラリーメンバーの組合せ）が提示される）、１０³⁰個より多い形質転換体が必要とされるであろう。軽鎖および重鎖ＣＤＲ３の目当ての変異を証明するために、未交雑ライブラリーの各々から任意に選択したクローンを交雑の前に配列決定した。他の軽鎖ライブラリー、Ｋ１０’、ＣＤＲ３−ＬＣＮＣ８、ＣＤＲ３−ＬＣＮＣ１０およびＣＤＲ３−ＬＣＮＤ１６を、実施例４Ｂで調製した重鎖ライブラリーの全てと同様に交雑し、種々のランダム化アミノ酸残基をもつ種々の長さのＣＤＲ３をもつさらに別の交雑ライブラリーを形成する。Ｄ．ＣＤＲ３ランダム化重鎖とただ１つの普遍的軽鎖ライブラリーの交雑ランダム化重鎖および普遍的軽鎖フラグメントをもつ発現ヒトＦａｂ抗体を得るために、交雑ファージミドライブラリーを構築した。このライブラリーによって、予め選択されたリガンドと高い親和性で結合するＦａｂ抗体の選別のためにＣＤＲ３がランダム化されている重鎖をもつリコンビナントヒトＦａｂ抗体の発現が提供される。このライブラリーはまた、予め選択されたリガンドと高い親和性で結合するＦａｂ抗体の選別のためにただ１つの普遍的軽鎖をもつリコンビナントヒトＦａｂ抗体の発現を提供する。普遍的軽鎖をＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｐＣ３ＡＰ３１３の天然の重鎖を除去し、実施例４Ｂで調製される合成重鎖ライブラリーのＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ消化物で置き換えることによって、重鎖のＣＤＲ３がランダム化されているライブラリーを調製する。交雑ライブラリーは、配列番号２に示すようなアミノ酸配列をもつ普遍的軽鎖とＧ、ＦおよびＥライブラリーとの組合せによって調製される。この交雑ライブラリーは、重鎖ＣＤＲ３の５箇所、１０箇所または１６箇所がランダム化されたＦａｂフラグメントとただ１つの普遍的軽鎖から成る。重鎖ＣＤＲ３に目指す変異が生じたことを証明するために、未交雑ライブラリーの各々から任意に選択されたクローンを交雑前に配列決定する。配列番号６２に示すようなヌクレオチド配列をもつまた別の普遍的軽鎖、６Ｆを実施例４Ｂで調製した重鎖ライブラリーの全てと同様に交雑して、種々のランダム化されたアミノ酸残基をもつ種々の長さの重鎖ＣＤＲ３とただ１つの普遍的軽鎖とをもつさらに別の交雑ライブラリーを形成する。５．ファージで発現される抗ハプテンＦａｂ抗体の選別Ａ．ファージ発現半合成Ｆａｂ異種二量体の調製形質転換の後、合成ハプテンと反応するＦａｂを発現するファージを分離するために、標的合成ハプテンでの選別を下記実施例５Ｂに述べるように実施した。合成ハプテンによる選別のために、半合成Ｆａｂ抗体を発現しているファージを先ず調製した。３ｍｌのＳＯＣ培養液を選別したファージライブラリーに混合し、培養を２２０ｒｐｍで１時間３７℃で震盪した。なお、ＳＯＣは２０グラム（ｇ）のバクトートリプトン、５ｇの酵母抽出物および０．５ｇのＮａＣｌを１リットルの水に混合し、ｐＨを７．５に調整することによって作製し、さらに使用直前に２０ｍｌのグルコースを混合して、ファージコート蛋白３（Ｆｄ−ｃｐｉｉｉ）に固定された重鎖ドメインおよび可溶性軽鎖異種二量体の発現を誘発させた。続いて１０ｍｌのＳＢ（２０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む）を混合し、この混合物を３００ｒｐｍでさらにもう１時間震盪した。なお、ＳＢは１リットルにつき３０ｇのトリプトン、２０ｇの酵母抽出物および１０ｇのＭｏｐｓ緩衝液を加え、ｐＨを７に調製して作製した。得られた混合物を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＳＢに混合し、１時間震盪し、その後ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０¹²ｐｆｕ）を混合し、この混合物さらに２時間震盪した。この後、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを混合し、３０℃で一晩維持した。より低い温度によって異種二量体のより良好なファージ表面への取り込みが得られた。上清を遠心（ＪＡ１０ローターで４０００ｒｐｍｌ５分４℃）によって清澄にした。ファージは、４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００および３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌの混合物で沈澱させ、氷上で３０分維持し、その後遠心（ＪＡ１０ローターで９０００ｒｐｍ２０分４℃）した。ファージ沈澱塊を２ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、破片を沈澱させるために微量遠心沈殿を３分実施し、新しい試験管に移して、下記に述べるような以後のスクリーニングのために−２０℃で保存した。コロニー形成単位（ｃｆｕ）の決定のために、ファージ（パッケージされたファージミド）をＳＢで希釈し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＳＢで増殖させた５０μｌの新鮮な（Ａ_OD600＝１）大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にその１μｌを用いて感染させた。ファージと細胞を室温に１５分保持し、続いてＬＢ／カルベニシリンプレートに直接播種した。Ｂ．ファージミド表示半合成Ｆａｂ異種二量体の選別１）ファージミドＦａｂ表示合成結合部位蛋白の多重選別実施例４Ａ、４Ｂおよび４Ｃで作製したファージライブラリーを合成ハプテン共役標的分子で被覆したマイクロタイタープレート上でここで述べるように選別した。ランダム化重鎖もしくは軽鎖ドメインまたはその両方を含む抗体を改善された親和性についてスクリーニングするために３つの合成ハプテンを選択した。図１に示す１、２および３と標識した共役物は、それぞれフルオレセイン−ＢＳＡ（Ｆ１−ＢＳＡ）、Ｓ−ＢＳＡ（脱カルボキシル反応を触媒する触媒性抗体の選別用類似体）およびＣ−ＢＳＡ（他の２つのハプテンと類似するが、単調な（ flat）芳香環系を含み他のハプテンの陰イオン性特性を欠く）であった。共役物１はバルバスらが記載した（Barbasら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA,89:4457- 4461(1992)、この文献は参照により本明細書に含まれる）。共役物２および３はルイスらによって以前に報告された(Lewisら、Reports，1019-1021(1991)、この文献は参照により本明細書に含まれる）。試薬は被覆緩衝液（０．１Ｍ重炭酸塩、ｐＨ８．６）中で４０μｇ／ｍｌの濃度で用いられた。開示する選別方法は、初めにパームリーら(Parmleyら、Gene，73:305-318(198 8))が記載したものの変更であった。この方法（調製の１つを下記に述べる）は、本発明で使用するために調製した全てのライブラリーについてのファージ調製物の各々で実施した。このハプテンはＢＳＡに共役させたので、選択的圧力はハプテン結合性を希求しさらにＢＳＡ結合を排除する選択ために用いられた。これは、選別前に１％ＢＳＡ含有ＴＢＳにファージを再懸濁させ、選別の度に３％ＢＳＡとマイクロタイター皿の２％無脂肪ドライミルクによるブロッキングとを交互に実施することによって達成された。マイクロタイタープレート（Costar3690）の凹み（ウェル）を別々に上記のように調製した精製標的共役物で４℃で一晩被覆した。このウェルを２度水で洗浄し、さらにＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でウェルを完全に満たし、３７℃で１時間プレートを保温することによってこのウェルをブロックした。ブロック用溶液は震盪によって除去し、上記の用に調製したファージライブラリーの各々５０μｌ（典型的には１０¹¹ｃｆｕ）を各ウェルに添加し、さらにプレートを３７℃で２時間保温した。ファージを除去し、プレートを水で１度洗浄した。続いて各ウェルをＴＢＳ／トゥイーン（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％トゥイーン２０）で１０回１時間以上かけて室温で洗浄し、さらにピペットて吸い上げ吹き出してウェルを洗浄し、洗浄と洗浄の間ではＰＢＳ／トゥイーンでウェルを完全に満たした。プレートをもう一度蒸留水で洗浄し、付着ファージを５０μｌの溶出緩衝液（０．１ＭＨＣｌ、固形グリシンでｐＨ２．２に調整、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む）を各ウェルに添加して、室温で１０分保持して溶出させた。この溶出緩衝液をピペットで数回吸い上げ吹き出してしてから除去し、使用した溶出緩衝液５０μｌにつき２Ｍトリス塩基３μｌで中和させた。溶出ファージを用いて新鮮な（ＯＤ₆₀₀＝１）大腸菌ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ細胞２ｍｌを室温で１５分感染させ、その後２０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと１０μ ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＳＢ１０ｍｌを加えた。適量（２０、１０および１／１０μｌ）を播種のために取り出しプレートから溶出したファージ（パッキングされたファージ）の数を求めた。この培養を１時間３７℃で震盪し、その後、これを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＳＢ１００μｌに添加し１時間震盪した。続いてヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０¹²ｐｆｕ）を加え、培養をさらに２時間震盪した。この後、７０ μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、培養を３７℃で一晩保温した。ファージの調製と更なる選別は上記のように繰り返した。最終的なファージ放出率は、２ｍｌの増殖期ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を上記のように感染させ、適量を選択培地に播種することによって決定した。洗浄と選別の第一ラウンドからの酸溶出に続いて、ファージ表示Ｆａｂライブラリーを次の選別ラウンドで組合せて、ライブラリーの収集物から最も高い親和性をもつクローンを競合的結合によって特定した。この選別されたバインダーの配列決定によって、クローンの起源ライブラリーを続いて決定した。この工程によって、それぞれの対応する選択合成標的と結合する能力についてクローンをＦａｂライブラリーの各々から選別した。続いて、実施例５Ｃで述べるように更なる性状決定のために選別ファージ表面ライブラリーを可溶性半合成Ｆａｂ抗体を発現するライブラリーに変換した。Ｃ．可溶性Ｆａｂ表示結合部位蛋白の調製上記に述べたようにファージの表面に発現される半合成Ｆａｂ抗体の特異性をさらに調べるために、可溶性異種二量体を調製し、合成共役標的被覆プレート上でのＥＬＩＳＡアッセーおよび下記のように可溶性競合蛋白の濃度を高めていく競合ＥＬＩＳＡによって分析した。重鎖および軽鎖から成る可溶性Ｆａｂ（すなわち異種二量体）を調製するために、上記実施例５Ｂで選別した陽性クローン由来ファージミドＤＮＡを分離し、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化した。これらの酵素による消化で適合性のある粘着末端が生じた。ｇＩＩＩ部分を欠く４．７ｋｂＤＮＡフラグメントをゲル精製し（０．６％アガロース）、自家結合させた。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの形質転換はｇＩＩＩフラグメントを欠くリコンビナントの分離を可能にした。クローンをＸｈｏＩ／ＸｂａＩ消化（１．６ｋｂフラグメントを生じるはずである）によってｇＩＩＩフラグメントの除去について調べた。クローンを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンと２０ｍＭのＭｇＣｌ₂を含むＳＢ１００ｍｌ中でＯＤ₆₀₀が0.2 となるまで増殖させた。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、培養を一晩３０℃で増殖させた（３７℃での増殖では異種二量体の収量は僅かに減少するだけである）。細胞をＪＡ１０ローターで４０００ｒｐｍ１５分、４℃で遠心して沈澱させた。細胞を３４μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む４ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で超音波（５０％効率で２−４分）によって溶解させた。破片をＪＡ２０ローターで４℃１４０００ｒｐｍ１５分遠心して沈澱させた。上清を直接ＥＬＩＳＡ分析に用い、−２０℃で保存した。大量のクローンを調べるについては、１０ｍｌの培養が分析用に十分量の半合成Ｆａｂ抗体を提供した。この場合、超音波は２ｍｌの緩衝液中で実施された。上記の用に調製した可溶性異種二量体を、実施例６で述べるように用いることができるＥＬＩＳＡで調べた。６．可溶性半合成Ｆａｂ異種二量体の性状決定Ａ．ＥＬＩＳＡ予備的なＥＬＩＳＡアッセーを実施して、上記のように選別したファージ半合成Ｆａｂ抗体の合成ハプテンに対する結合特異性を先ず調べた。ＥＬＩＳＡについては、実施例５Ｂで調製した合成ハプテン１μｇ／ウェルをマイクロタイターの個々のウェルに別々に混合し、４℃で一晩維持しハプテン溶液をウェルの壁に付着させた。この維持時間の後、ウェルを１度ＰＢＳで洗浄し、その後３％ＢＳＡ溶液とともに維持してウェルの非特異的部位をブロックした。このプレートを３７℃で１時間維持し、その後プレートをひっくり返して震盪しＢＳＡ溶液を除去した。続いて、実施例５Ｃで調製した半合成Ｆａｂ異種二量体を発現している可溶性Ｆａｂ異種二量体を別々に各ウェルに混合し、３７℃で１時間維持し、免疫反応生成物を形成させた。この維持時間の後、ウェルを１０回ＰＢＳで洗浄し、未結合可溶性抗体を除去し、続いて１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈したアルカリホスファターゼ共役二次ヤギ抗ヒトＦＡＢとともに維持した。ウェルを３７℃で１時間維持し、その後ウェルを１０回ＰＢＳで洗浄し、続いてｐ−ニトロフェニルホスフェートで反応を進行させた。実施例５Ｂで述べたように５ラウンドの選別および表面表示型から可溶性抗体産生型への変換の後、フルオレセイン共役物（１）との結合について選別された２０クローンのうち２０が、共役物Ｓ−ＢＳＡ（２）との結合について選別された２０のうち１８が、共役物Ｃ−ＢＳＡ（３）との結合について選別された２０のうち１つがＥＬＩＳＡ分析で陽性であった。Ｆ２２由来ライブラリーから得られた全てのクローンもまた、共役物１との結合について選別した後に陽性であった。精製クローンの交差反応性はＥＬＩＳＡによって調べ、図２に示す。図２の左から右に示したＥＬＩＳＡで用いた抗原は、最初のｐＣ３ＡＰ３１３−特異的破傷風類毒素（右上がり斜線入り棒線）Ｆ１−ＢＳＡ共役物（黒色棒線）、ＢＳＡ（ジグザグ斜線入り棒線）、Ｓ−ＢＳＡ共役物（右下がり斜線入り棒線）およびＣ−ＢＳＡ共役物（白色棒線）であるクローンＦ２２、Ｐ２、Ｓ４およびＳ１０は、それらが選別された共役物について特異的であった。クローンＳ４は親抗原の破傷風類毒素に対してある程度の反応性を保持していた。クローンＳ２およびＣ１５は結合についてより無差別的であった。ＢＳＡとの結合に対抗する選別はこの抗原とのＦａｂの限定的反応性によって示されるように効果的であった。Ｂ．親和性特性決定幾つかの精製クローンの親和性は表面プラズモンレゾナンス（plasmon resona nce)によって調べた。ゲル濾過で判定した場合唯一認められる単量体Ｆａｂが、グリフィスら(Griffithsら、EMBO J.，12:725-734(1993))が記載した単鎖抗体二量体化の最近の報告と異なり観察された。選別クローンについての結合および遊離親和性定数(on and off affinity constants)、それぞれＫ_onおよびＫ_offは、ファルマシアバイオセンサー(Pharmacia Biosensor，ピスカタウェー、ニュージャージー）のバイアコア(Biacore)装置を製造元の指示にしたがって使用して決定した。Ｆ１−ＢＳＡ共役物は１０Ｍｍの酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）中で固定し、ＣＭ５バイアコアセンサーチッピ上で６００レゾナンス単位を得た。Ｋ_onおよびＫ_offは、それぞれ５および８μｌ／分の流速でＰＢＳ中で文献（Altschunら、Biochem.，31:6298-6304(1992)）に記載されたように標準的分析によって決定した。動的定数および平衡定数の編集は表Ｉに示す。全てのＫｄ値はナノモル範囲に近かった。Ｆ２２由来ライブラリーから強く選別されたクローンＰ２は親クローンより僅かに低い親和性を有していた。表面プラズモンレゾナンスによるＦ１− ＢＳＡ共役物に対するＦ２２の親和性は、競合分析で求めた親和性と極めて近かった。Ｃ．結合部位蛋白の配列決定核酸配列決定は、上記で性状を調べた本発明の特異的可溶性合成ハプテン結合Ｆａｂ異種二量体をコードする二本鎖ＤＮＡでシークエナーゼ１．０(USB、クリーブランド、オハイオ)を用いて実施した。選択抗体のＣＤＲ３領域の配列は表２および３で示される。両方の表の左側に選択抗体（クローンと称する）と抗ハプテン共役物番号（１、２または３、これを基に抗体はスクリーニングされた）が列記されている。次の欄は左から右に、表示クローン由来の重鎖（表２ではＨＣＤＲ３）および軽鎖ＣＤＲ３（表３ではＬＣＤＲ３）のいずれかのアミノ酸残基配列が示されている。配列番号は、重鎖および軽鎖配列のどちらかの側に記載されている。それぞれの表の最後の欄は、当該クローンが由来し、選別された交雑軽鎖および重鎖ライブラリーの名称を示す。全例において、軽鎖が初めに表記され、重鎖ライブラリーまたはそれが存在しない場合は空白が続く。この選別クローンのアミノ酸残基、それらが由来するライブラリーおよびそれらが選別された合成ハプテンを見れば多くの特色が直ちに明瞭となる。５つの長さのＨＣＤＲ３を含むライブラリーに由来するクローンはいずれもこの競合選別に残らなかった。さらに、軽鎖の変更のみをもつライブラリーに由来するクローンはいずれも選別されなかった。全てのクローンが、最初と後ろから２番目の残基がＧｌｙおよびＡｓｐとしてそれぞれ固定されている重鎖ライブラリーに由来していた。クローンＦＬ１８は第一位にセリンを含み、おそらく合成と会合の人為産物であり、ただ１つの塩基の変化（ＧＧＴからＡＧＴ）の結果である。これは、ライブラリーＥおよびＦの先の調査でも認められた。これらの結果は、半合成Ｆａｂライブラリーの完全性は、それから派生する抗体の品質とは必ずしも相関しないことを示唆している。ライブラリーＫ８、ＣＤＲ３−ＨＣ５およびＧは全て９９％完全性と判定されるために十分なメンバーを含んでいたが、それでもこれらのライブラリーに由来するクローンはいずれも競合的選別に残らなかった。実際、殆どのクローンは、最も不完全なしかしおそらくは極めて構造的に多様な交雑ライブラリーから由来していた。これらの結果は、結合部位の進化は、小さな変異よりも広範囲の変異によって最良の成果が得られる改造下にあるという事実を際立たせる。これは、フーゲンブームら（Hoogenboomら、J．Mol．Biol. ，227:381-388(1992))が先に報告した５残基のランダム化によって分離された親和性の低いクローンの説明となるかもしれない。クローンでのコンセンサス配列の選別についての証拠が存在する。例えば、クローンＳ４、Ｓ１０およびＳ１２のＨＣＤＲ３の第８位には芳香族残基が存在する。それらの対応する軽鎖はそれぞれ塩基性のダブレットＫＫ、ＲＲおよびＫＲを含んでいる。さらにまた、配列類似性は、長さが異なるが極めて類似のカルボキシ末端ＨＣＤＲ３領域を含むクローンＳ４およびＳ２で認められる。７つのクローンの配列決定後、クローンＳ１０およびＳ２は、ヌクレオチドレベルにおいてそれぞれ３倍および２倍同一であることが認められた。先に選別されたクローンＦ２２のＬＣＤＲ３の役割の調査によって、出発クローンと比較してこの領域には非常に異なる配列が許容されるかもしれない。優勢なクローンはＰ２で、配列決定された１０クローンのうちでアミノ酸レベルで５倍の同一性が認められた。このクローンは４つの固有のヌクレオチド配列によってコードされることが分かった。天然に発生するネズミおよびヒトカッパ軽鎖ＣＤＲ３領域は、カバット９５位にＰｒｏの強力な保存性を示す。半合成ライブラリーに由来するクローンのいずれもこの位置にプロリン（Ｐ）を含まない。このことは、プロリンは構造的な理由以外の何かのために保存されているか、またはある程度この配列は編集されることを示唆している。したがって、種々の抗ハプテン半合成Ｆａｂ抗体は、特に重鎖および軽鎖ＣＤＲ３における１つまたは２つのＣＤＲ領域のランダム化に由来する半合成抗体ライブラリーから直接選別することができる。天然に発生する抗体のように、半合成抗体は種々の程度の交差反応性を示す。より大きな構造的多様性をもつライブラリー（より多くの残基がランダム化されているもの）は、完全であるが構造的に限定されたライブラリーよりも機能的に優れていた。しかしながら、アスパラギン酸として固定された後ろから２番目の位置を保持できる程度まで重鎖ＣＤＲ３の多様性を強制することによってライブラリーの品質は改善され、この残基の構造的役割に光が当てられる。そのような現象は未だ重鎖ＣＤＲ３では観察されてはいないが、この領域の４つの位置はこれから調べる必要がある。７．ヒト抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体軽鎖および重鎖ライブラリーに由来するファージミドＦａｂ表示蛋白を発現できる二シストロン性発現ベクターライブラリーの調製Ａ．リンパ球ｍＲＮＡの調製甲状腺組織を抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を含む橋本甲状腺炎の患者から入手し、アサートンら（Athertonら、Immunology，55:271-279(1985)）の記載にしたがって甲状腺リンパ球を甲状腺組織から分離した。続いてＲＮＡを新しく分離した細胞から抽出した（Hexhamら、Autoimmunity，12:135-141(1992); Hexhamら、Autoimmunity，14:169-172(1992)）。手術時の橋本病の患者の血清のＥＬＩＳＡによる分析(Schardtら、J．Immunol．Methods，55:155-168(1982))によって、高レベルの甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）自家抗体（主にＩｇＧ／カッパ型）の存在が示唆された。Ｂ．重鎖および軽鎖甲状腺ペルオキシダーゼ抗体ライブラリーのラムダファージにおける構築重鎖および軽鎖甲状腺ペルオキシダーゼ抗体ライブラリーを、実施例７Ａで分離したリンパ球ｍＲＮＡを用いヘキサムら（Hexhamら、Autoimmunity，12:135-1 41(1992)）の記載にしたがって先ずラムダファージで構築した。干渉耐性Ｍ１３ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Stratagene、ラホイヤ、カリフォルニア）を用いインビボ切り出し工程によって、この重鎖および軽鎖ラムダファージライブラリーをファージミドライブラリーに変換した。軽鎖をコードするラムダファージライブラリーの切り出しに続いて、１１個のクローンを更なる分析のために任意に選択した。ＤＮＡを分離し、シークエナーゼ２．０（米国バイオケム）を用いてジデオキシ鎖終結法(Sangerら、Proc．Nat l．Acad．Sci.，USA，74:5463-5467(1977))によって、ヌクレオチド配列を決定した。Ｃ．重鎖および軽鎖甲状腺ペルオキシダーゼ抗体ライブラリーのＰｃｏｍｂ３における構築実施例７Ｂで特定した配列をコードする重鎖および軽鎖抗体を切り出したファージミドベクターから除去し、一価Ｆａｂファージ表示ベクター、Ｐｃｏｍｂ３に挿入した。重鎖および軽鎖配列をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩおよびＳａｃＩ／ＸｂａＩによる制限消化によってそれぞれ分離し、同様に消化したＰｃｏｍｂ３ベクターにつないだ。発現ベクターライブラリーを作製する連結工程は、実施例２で述べたように実施した。第一次ライブラリーは１０⁵の独立したクローンを含んでいた。１２のクローンを任意に選択し、ＮｏｔＩでＤＮＡを制限消化して分析した。調べたクローンの８３％が、Ｆａｂ含有ベクターと一致する２．５ｋｂの挿入フラグメントを含んでいた。８．ファージで発現した抗甲状腺ペルオキシダーゼＦａｂ抗体の選別Ａ．Ｆａｂ異種二量体を発現するファージの調製甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）と反応するＦａｂを発現するファージを、実施例７Ｃで作製した発現ベクターライブラリーを用いて実施例２で述べたように調製し、Ｆａｂ表示蛋白をもつファージを含むファージライブラリーを作製した。Ｂ．ファージミド表示Ｆａｂ異種二量体の選別１）ファージミドＦａｂ表示結合部位蛋白をもつファージライブラリーの多重選別ＴＰＯ標的分子で被覆したマイクロタイタープレート上で実施例５Ｂ１に述べたように実施例８Ａで調製したファージライブラリーを選別し、抗ＴＰＯＦａｂ異種二量体を表示しているファージミドを分離した。ＴＰＯ被覆ＥＬＩＳＡプレートで選別工程を連続して繰り返し、約１０⁴倍に濃縮させることができた。選別の第一ラウンドでは２×１０³コロニー形成単位（ｃｆｕ）を回収し、第二ラウンドでは３．２×１０³ｃｆｕを回収し、第三ラウンドでは＞１０⁶ｃｆｕを回収し、第四ラウンドでは＞１０⁷ｃｆｕを回収した。続いて、この選抜されたファージ表面発現クローンをさらに性状を調べるために実施例５Ｃで述べたように可溶性Ｆａｂ抗体を発現するクローンに変換した。９．可溶性Ｆａｂ異種二量体の性状決定Ａ．ＥＬＩＳＡＥＬＩＳＡアッセーは、選別した個々のファージＦａｂ抗体のＴＰＯとの結合特異性の特性を調べるために実施された。該標的分子およびＦａｂはアルカリホスファターゼ（シグマ、セントルイス、ミズーリー）に共役させた抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）で検出されたので、ＥＬＩＳＡは合成ハプテンの代わりにＴＰＯを用いて実施例６Ａで述べたように実施した。実施例８Ｂ１で述べた選別を４回り繰り返し、さらに表面表示型から可溶性抗体産生型へとファージミド形態を変換させた後、ＴＰＯとの結合について選別した２４クローンのうち１７クローンはＥＬＩＳＡ分析で陽性であった。精製クローンの無関係の蛋白との交差反応性は実施例６Ａで述べたようにＥＬＩＳＡで調べた。ＥＬＩＳＡで用いた抗原は、一連の濃度のヒトＴＰＯ、ヒトサイログロブリン(RSP Ltd，Cardiff，CF2 7HE)、ヒトミエロペルオキシダーゼ（シグマ、セントルイス、ミズーリ）およびウシラクトペルオキシダーゼ（シグマ、セントルイス、ミズーリ）であった。ＴＰＯ被覆ブレートへのＦａｂの結合はヒトＴＰＯで抑制されたが、ヒトサイログロブリン（１００Ｎｍまで）、ヒトミエロペルオキシダーゼ（２００Ｎｍまで）またはウシラクトペルオキシダーゼ（１０μＭまで）では抑制は認められなかった。Ｂ．親和性特性の決定いくつかの精製クローンの親和性は、競合物質として種々の濃度のＴＰＯを用いて抑制ＥＬＩＳＡで調べた。６Ｆ、７Ｆおよび１０Ｉの親和性定数はそれぞれ８．０×１０⁸、８．０×１０⁸および０．３×１０⁹Ｍ^-1であった。したがって、３つの新規で多様な高親和性（約１０^-9Ｍ^-1）の高ＴＰＯＦａｂ抗体が直接Ｐｃｏｍｂ３ファージ表示組合せ式ライブラリーから選別された。これらのＦａｂ（６Ｆ、７Ｆおよび１０１と呼ぶ）は、ＴＰＯに対して最高の親和性を有するＦａｂ１０Ｉを含む富裕化ファージ集団から１２：４：１の相対頻度で得られた。Ｃ．結合部位蛋白の配列決定本発明の固有の可溶性ＴＰＯ結合Ｆａｂ異種二量体のヌクレオチド配列を決定した。抗ＴＰＯ単クローン性抗体２Ｇ４(Horimotoら、Autoimmunity，14:1-7(19 92)；Hexhamら、Autoimmunity，14:169-172))およびリコンビナント抗ＴＰＯ抗体のＳＰシリーズ(Portolanoら、Biochem．Biophys．Res．Comm.，179:372-377( 1991); Portolanoら、J．Clin．Invest.，90:720-726(1992);Portolanoら、J．I mmunol.，150:880-887(1993))のヌクレオチド配列もまた求めた。核酸配列決定は、シークエナーゼ２．０(USB、クリーブランド、オハイオ)を用いて二本鎖ＤＮＡで実施した。プライマーＳＥＱＧｂ、ＳＥＱＫｂおよびＭ１３逆プライマーをヘキサムら（Hexhamら、Autoimmunity，12:135-141(1992)）が記載したように用いた。配列分析およびデータベース検索は、プログラムのＧＣＧシュート（Devereux ら、Nucl．Acids Res.，12:387-395(1984)）を用いシリコン・グラフィクス・クリムソン（Silicon Graphics Crimson）のSＥＲＣセグネット機関を利用して実施した。可変領域配列を特定し、ジェンバンク(GenBank)およびＥＭＢＬデータベースの検索のためにＦＡＳＴＡプログラムを用いて、さらに既知配列との直接の比較によって分析した(Kabatら、上掲書)。抗ＴＰＯ抗体由来のＣＤＲ領域の配列は表４および５に示す。両方の表で、左側には抗ＴＰＯ抗体（クローンと表記）が挙げられている。左から右に次の欄に示されているものは、表示のクローンの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ、表４）および軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ、表５）のいずれかのアミノ酸残基配列である。配列番号表に挙げた完全なアミノ酸残基配列に対応する配列番号は、表４および５の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列の各々の隣に表示されている。６Ｆ、７Ｆおよび１０ＩのＨＣおよびＬＣ可変領域のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の分析によって、Ｖカッパ、ＶＨ、ＫカッパおよびＤＨ遺伝子の殆どをそれらが由来した生殖細胞系統遺伝子に割りふることができる。これら抗体の驚くべき特徴は、それらのうちの５つ（６Ｆ、１０Ｉおよび表示した３つのＳＰ抗体）は同じｖｋ０２またはｖｋ０１２生殖細胞系統遺伝子によってコードされるＶカッパＩ軽鎖を持つらしいということである(Pargentら、Eur．J．Immuno l.，21:1821-1827(1991))。ｖＫ０２は、ｖｋ０１２のそれとは区別できないコード領域を有し、したがって該抗体軽鎖のいずれかの生殖細胞系統遺伝子への割り振りは同じように妥当である。６Ｆおよび１０Ｉの軽鎖はｖｋ０１／０１２生殖細胞系統遺伝子とそれぞれ９８．９％および９９．６％のヌクレオチド同一性を共有する。他の２つの抗ＴＰＯ抗体（２Ｇ４および７Ｆ）は、ｋｖ３２５生殖細胞系統遺伝子に対してそれぞれ８７％および９７％の大きな相同性を示す軽鎖を使用する(Radouxら、J．Exp．Med.，164:2119-2124(1986))ｋｖ３２５生殖細胞系統遺伝子もまた本発明で普遍的軽鎖として開示され、配列番号２で示される軽鎖配列である。甲状腺ペルオキシダーゼ抗体ライブラリーでの表れ方の偏りに関する問題を強調するために、抗原選別とヌクレオチド配列決定前に該ライブラリーから１１のクローンを任意に選択した。結果は、１１の全ての軽鎖配列は互いに異なり、さらに抗ＴＰＯＦａｂ軽鎖アミノ酸残基配列と異なっている。この１１のクローンは３つの異なるカッパ遺伝子族に由来し、多様なライブラリーを示唆していた。この１１の配列の分析によって、２つ（１％）はｖｋ０２／０１２を利用し４つ（３６％）はｋｖ３２５を利用していたが、これらは、ここでまた開示する抗ｇｐ１２０抗体で得られるものと同じような頻度である。ｖｋ０２／０１２およびｋｖ３２５遺伝子が４５−５０生殖細胞系統のカッパ遺伝子のうち３つのみを構成するとすれば、これらの遺伝子は非選別ライブラリーでの予想頻度よりも高い頻度で存在する。これは、ＰＣＲプライマーのデザインによって導入された偏りに起因するであろうが、このｖｋ０２／０１２生殖細胞系統軽鎖はまた、異なるＰＣＲプライマーを用いた場合に得られた抗ＴＰＯ抗体のＳＰシリーズで強く表れている。さらに、ｖｋ０２／０１２およびｋｖ３２５の軽鎖は、いくつかのヒトハイブリドーマ由来抗非自己抗原抗体でしばしば表れる。このことは、正常および自己免疫細胞の両方で抗体産生細胞におけるｖｋ０２／０１２およびｋｖ３２５軽鎖の過剰表現であると説明できるであろう。２つの抗体、６Ｆおよび１０Ｉの天然の軽鎖は、抗ＴＰＯ自己抗体のＳＰ族を使用するように同じ生殖細胞系統のＶカッパ遺伝子、ｖｋ０２／０１２を使用する。ｖｋ０２／０１２遺伝子はまた、アセチルコリンレセプター自己抗体および類リューマチ因子を含む幾つかの他の自己抗体で発現される。ハイブリドーマに由来する軽鎖および重鎖対はインビボ対形成を表し、一方、本明細書で開示するリコンビナント抗体は、インビボおよびインビトロ対形成の両方を表すであろう。既知軽鎖配列でのｖｋ０１／０１２およびｖｋ３２５軽鎖の発生頻度を決定するために、ｖｋ０２／０１２およびｖｋ３２５の生殖細胞系統可変領域コードセクションを用いてヌクレオチド配列データベースを検索した。ｋｖ０２／０１２軽鎖を含む既知特異性をもつ７つのヒトハイブリドーマ抗体のうち５つは自己抗体であった。認識される既知特異性をもつｋｖ０２／０１２を含む２４抗体のうち１９は自己抗体であった。非自己抗原に対するハイブリドーマ抗体は、ヘモフィルス・インフルエンザーエ（Haemophilus influenzae）（ｋｖ０２／０１２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ｋｖ０２／０１２）、ナイセリア・メニンジチデス（Neisseria meningitides）（ｋｖ３２５）、ヒトサイトメガロウイルス（ｋｖ３２５）およびＨＩＶ（ｋｖ３２５）を含む広範囲の特異性を示した。したがって、ハイブリドーマ抗体で代表されるように、インビボ対形成はまた、高頻度でｋｖ０２／０１２およびｋｖ３２５軽鎖を含む。さらに、ＰＣＲによって抹消リンパ球から増幅された(Marksら、Eur．J．Immunol.，21:985-991(199 1))３４のカッパ軽鎖遺伝子の多様で抗原非選別サンプルでは、ｖｋ０２／０１２は４倍表現されていた。ハプテンＮＰＮに対するネズミの応答およびＨＩＶ− １ｇｐ１２０蛋白に対するヒトの応答に対する以前の実験では、軽鎖と特定の重鎖との対形成で顕著な混乱が観察された。これらを合わせ、さらにデータベースの自己抗体過剰表現化を考えると、これらの結果は、ｋ０２／０１２軽鎖遺伝子の発現は自己免疫だけでなく正常な免疫反応でもまた高い。ｖｋ０２／０１２は、したがって多使用“形成用”軽鎖または“普遍的”軽鎖（これは異なる重鎖と組み合わせることができ、この場合特異性は重鎖によって指令される）であるかもしれない。破傷風類毒素、ｋｖ３２５と結合するｐＣ３ＡＰ３１３ファージミド発現ベクターの天然の軽鎖は、外来抗原（例えばサイトメガロウイルスおよびジゴキシン）に対する抗体で識別された。レパートリークローニングおよび配列決定の方法論を用いて、ｐＣ３ＡＰ３１３は高頻度で観察された。例えば、この軽鎖はＢ型肝炎表面抗原と結合する抗体に非変異遺伝子として見出され、抗サイログロブリン抗体では僅かに変異していた。ＨＩＶ表面糖蛋白ｇｐ１２０と結合する３３の抗体の比較によって、１３を下らない抗体が最も密接な生殖細胞系統遺伝子としてｐＣ３ＡＰ３１３軽鎖を有していることが示された。したがって、天然のｐＣ３ＡＰ３１３軽鎖および天然の６Ｆ軽鎖は、レパートリークローニングによって得られたＦａｂ抗体異種二量体でのそれらの高い表れ方のため普遍的軽鎖を作り出した。ｐＣ３ＡＰ３１３および６Ｆ軽鎖は、それぞれヒト生殖細胞系統遺伝子Ｈｕｍｋｖ３２５およびＨｕｍｋｖ０２／０１２であり、広範囲の異なる重鎖Ｆａｂフラグメントによる対形成に際して種々のＪ領域との組合せで普遍的軽鎖Ｖ領域として機能する。したがって、この軽鎖は、種々の抗原と結合する重鎖との組合せにおいて、当該普遍的軽鎖の存在によってその特異性と親和性が失われない場合には形成性機能を示す。このアミノ酸残基軽鎖配列はこの点について固有であり、したがって、天然および合成起源のリコンビナント抗体ライブラリーの有用性に重要な役割を果たす。この天然のｐＣ３ＡＰ３１３に普遍的軽鎖配列をコードさせるか、または異種二量体の結合特異性と親和性を改善するためにさらにランダム化させるヒト抗ハプテン抗体を製造する能力は、医薬としての触媒性抗体の開発においては重要であろう。のみならず、天然／天然重鎖および軽鎖ＣＤＲドメイン、天然重鎖およびランダム化軽鎖ＣＤＲドメイン、ランダム化重鎖および天然軽鎖ＣＤＲドメイン、さらに最終的にはランダム化重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを有する固有の交雑ライブラリーを作製することができる能力は、ライブラリーから選別されたクローンの発現によって新規なまたは改善された特異性と親和性をもつ新規で改善されたＦａｂ異種二量体を作製するために本発明によって提供される貴重な方法論である。１０．材料の寄託以下のプラスミドは１９９３年２月２日またはそれ以前に米国菌収集所（ＡＴＣＣ）（1301，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA）に寄託された。本寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する条約（ブダペスト条約）の規定にしたがって行なわれた。これによって寄託の日から３０年間活性を有するプラスミド寄託物の維持が保障される。該寄託物は、関連する合衆国特許の発行に際し、または一切の合衆国もしくは外国の特許出願の公衆に対する公開に際し（いずれか早いもの）、活性を有するプラスミドの子孫の永続的および非制限的利用可能性を担保し、さらに３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２およびそれによる合衆国特許および商標委員会の規則（８８６ＯＧ６３８に対する特例とともに３７ＣＦＲ§１．１４を含む）にしたがい該委員会が決定した者に対して該プラスミドの子孫の利用可能性を担保するブダペスト条約の規定にしたがいＡＴＣＣにより入手できる。本出願の譲受け人は、該プラスミド寄託物が適切な条件下で培養されるときは、当該寄託物が死滅しまたは消失しまたは破壊された場合は、通知に従い同じプラスミドの活性を有する標本と直ちに置き換えることに同意する。寄託されたプラスミドの利用可能性を、対応する特許規則にしたがっていずれかの政府の権威の下に付与された権利に違反して本発明を実施する権利と解してはならない。前述の明細書は、当業者が本発明を実施するために十分であると考えられる。本発明は寄託されたプラスミドによって範囲が制限されない。なぜならば、当該寄託された実施形態は本発明の特徴の１つの例示であり、機能的に同等であるいずれのプラスミドも本発明の範囲内に含まれるからである。材料の寄託は、本明細書に含まれる記載が、本発明のいずれかの特徴（その最善の実施形態を含む）の実施について不適切であることを認知しようとするものではなく、また請求の範囲をそれが表している特定の例示に制限しようとするものでもない。実際、本明細書に示したものに加えて、当業者には本発明の種々の変更が前述の記載および添付の請求の範囲から明瞭であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バートンデニスアールアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラジョラビューモントアベニュー 6044 (72)発明者ラーナーリチャードエイアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラジョライーストローズランドドライヴ 7750

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫グロブリン軽鎖遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異を誘発するためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが３’および５’末端を有し、さらに、（ａ）免疫グロブリン遺伝子の第一のフレームワークとハイブリダイズすることができる、当該３’末端に位置するヌクレオチド配列、（ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第二のフレームワーク領域とハイブリダイズすることができる、当該５’末端に位置するヌクレオチド配列、および（ｃ）当該３’および５’末端の間に式、〔ＮＮＫ〕_n'のヌクレオチド配列を含み、式中、Ｎはそれぞれ別個にいずれかのヌクレオチドで、ＫはＧまたはＴで、ｎは３から約２４であり、当該３’および５’末端ヌクレオチド配列は長さが約６から５０ヌクレオチドである、前記プライマーとして有用なオリゴヌクレオチド。２．当該５’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴ−３’（配列番号２６）もしくは５’−ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴ−３’（配列番号２７）を有する、請求の範囲第１項のオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。３．当該３’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２８）もしくは５’−ＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ−３’（配列番号２９）を有する、請求の範囲第１項のオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。４．ｎが４、５、６、１０または１６である請求の範囲第１項のオリゴヌクレオチド。５．当該免疫グロブリンがヒトである請求の範囲第１項のオリゴヌクレオチド。６．当該ＣＤＲがＣＤＲ３である請求の範囲第１項のオリゴヌクレオチド。７．当該式が５’−ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴ〔ＮＮＫ〕₁₀ＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１２）の請求の範囲第１項のオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。８．免疫グロブリン軽鎖遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異を誘発するためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドが３’および５’末端を有し、さらに、（ａ）免疫グロブリン遺伝子の第一のフレームワークとハイブリダイズすることができる、当該３’末端に位置するヌクレオチド配列、（ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第二のフレームワーク領域とハイブリダイズすることができる、当該５’末端に位置するヌクレオチド配列、および（ｃ）当該３’および５’末端の間に式、〔ＭＮＮ）_n'のヌクレオチド配列を含み、式中、Ｎはそれぞれ別個にいずれかのヌクレオチドで、ＭはＡまたはＣで、ｎは３から約２４であり、当該３’および５’末端ヌクレオチド配列は長さが約６から５０ヌクレオチドである、前記プライマーとして有用なオリゴヌクレオチド。９．当該５’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡ−３’（配列番号３０）を有する、請求の範囲第８項のオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。１０．当該３’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号３１）を有する、請求の範囲第１項のオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。１１．ｎが８、１０または１６である請求の範囲第８項のオリゴヌクレオチド。１２．当該免疫グロブリンが、ヒトである請求の範囲第８項のオリゴヌクレオチド。１３．当該ＣＤＲが、ＣＤＲ３である請求の範囲第８項のオリゴヌクレオチド。１４．免疫グロブリン軽鎖遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）に変異を誘発することを含むポリペプチドに抗体結合部位を作製する方法であって、当該方法が、ＰＣＲプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって該免疫グロブリンのＣＤＲ部分を増幅することを含み、ここで当該オリゴヌクレオチドは３’および５’末端を有し下記条件を含むオリゴヌクレオチド、またはそれに対して相補的配列を有するオリゴヌクレオチドであって、当該条件は、（ａ）免疫グロブリン遺伝子の第一のフレームワークとハイブリダイズすることができる、当該３’に位置するヌクレオチド配列、（ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第二のフレームワーク領域とハイブリダイズすることができる、当該５’末端に位置するヌクレオチド配列、および（ｃ）当該３’および５’末端の間に式、〔ＮＮＫ〕_n'のヌクレオチド配列を含み、式中、Ｎはそれぞれ別個にいずれかのヌクレオチドで、ＫはＧまたはＴで、ｎは３から約２４であり、当該３’および５’末端ヌクレオチド配列は長さが約６から５０ヌクレオチドである、前記抗体結合部位を作製する方法。１５．当該５’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴ−３’（配列番号２６）もしくは５’−ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴ−３’（配列番号２７）を有するオリゴヌクレオチド、またはそれに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである請求の範囲第１４項の方法。１６．当該３’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２８）もしくは５’−ＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ−３’（配列番号２９）を有するオリゴヌクレオチド、またはそれに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである請求の範囲第１４項の方法。１７．ｎが４、５、６、１０または１６である請求の範囲第１４項の方法。１８．当該免疫グロブリンがヒトである請求の範囲第１４項の方法。１９．当該ＣＤＲがＣＤＲ３である請求の範囲第１４項の方法。２０．該式が５’−ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴ〔ＮＮＫ〕₁₀ ＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１２）のオリゴヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの請求の範囲第１４項の方法。２１．当該免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、配列番号２または配列番号６２に示す軽鎖の配列特性を有する配列を含む請求の範囲第１４項の方法。２２．当該免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、ＡＴＣＣ取得番号７５４０８の軽鎖遺伝子の配列特性を有する請求の範囲第１４項の方法。２３．以下の工程をさらに含む請求の範囲第１４項の方法：（ａ）増幅ＣＤＲを分離し、変異誘発免疫グロブリン軽鎖遺伝子ライブラリーを形成し、（ｂ）変異誘発軽鎖遺伝子の該分離ライブラリーを１つまたは２つ以上の重鎖遺伝子と組み合わせて発現させ、発現させた重鎖および軽鎖遺伝子の組合せ式抗体ライブラリーを形成し、さらに（ｃ）予め選択した抗原との結合能力について当該組合せ式抗体ライブラリーの種を選別する。２４．当該１つまたは２つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子が重鎖遺伝子ライブラリーである請求の範囲第２３項の方法。２５．免疫グロブリン軽鎖遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）に変異を誘発することを含むポリペプチドに抗体結合部位を作製する方法であって、当該方法が、ＰＣＲプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって該免疫グロブリンのＣＤＲ部分を増幅することを含み、ここで当該オリゴヌクレオチドは３’および５’末端を有し下記条件を含むオリゴヌクレオチド、またはそれに対して相補的配列を有するオリゴヌクレオチドであって、当該条件は、（ａ）免疫グロブリン遺伝子の第一のフレームワークとハイブリダイズすることができる、当該３’に位置するヌクレオチド配列、（ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第二のフレームワーク領域とハイブリダイズすることができる、当該５’末端に位置するヌクレオチド配列、および（ｃ）当該３’および５’末端の間に式、〔ＭＮＮ〕_n'のヌクレオチド配列を含み、式中、Ｎはそれぞれ別個にいずれかのヌクレオチドで、ＭはＡまたはＣで、ｎは３から約２４であり、当該３’および５’末端ヌクレオチド配列は長さが約６から５０ヌクレオチドである、前記抗体結合部位を作製する方法。２６．当該５’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡ−３’（配列番号３０）を有するオリゴヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである請求の範囲第２５項の方法。２７．当該３’末端が、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号３１）を有するオリゴヌクレオチド、またはそれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである請求の範囲第２５項の方法。２８．ｎが８、１０または１６である請求の範囲第２５項の方法。２９．当該免疫グロブリンが、ヒトである請求の範囲第２５項の方法。３０．当該ＣＤＲが、ＣＤＲ３である請求の範囲第２５項の方法。３１．当該免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、配列番号２または配列番号６２に示した軽鎖の配列特性を有する配列を含む請求の範囲第２５項の方法。３２．当該免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、ＡＴＣＣ取得番号７５４０８の軽鎖遺伝子の配列特性を有する請求の範囲第２５項の方法。３３．以下の工程をさらに含む請求の範囲第２５項の方法：（ａ）増幅ＣＤＲを分離し、変異誘発免疫グロブリン軽鎖遺伝子ライブラリーを形成し、（ｂ）変異誘発軽鎖遺伝子の該分離ライブラリーを１つまたは２つ以上の重鎖遺伝子と組み合わせて発現させ、発現させた重鎖および軽鎖遺伝子の組合せ式抗体ライブラリーを形成し、さらに（ｃ）予め選択した抗原との結合能力について当該組合せ式抗体ライブラリーの種を選別する。３４．当該１つまたは２つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子が重鎖遺伝子ライブラリーである請求の範囲第３３項の方法。３５．以下の工程を含む免疫グロブリン可変ドメイン重鎖および軽鎖ポリペプチドを有する異種二量体免疫グロブリン分子を製造する方法：（ａ）配列番号２または６２に示した軽鎖の配列特性を有する配列を含む免疫グロブリン可変ドメイン軽鎖遺伝子を、１つまたは２つ以上の免疫グロブリン可変ドメイン重鎖遺伝子と組み合わせて組合せ式免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子ライブラリーを形成し、当該組合せ工程が、当該重鎖および軽鎖遺伝子の同時発現が可能なベクターに当該軽鎖遺伝子と当該重鎖遺伝子の１つとを機能的に連結することを含み、（ｂ）該組合せ式遺伝子ライブラリーを発現させて、発現させた重鎖および軽鎖ポリペプチドの組合せ式抗体ライブラリーを形成し、さらに（ｃ）予め選択した抗原との結合能力について当該組合せ式抗体ライブラリーの種を選別する。３６．当該免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、ＡＴＣＣ取得番号７５４０８の軽鎖遺伝子の配列特性を有する請求の範囲第３５項の方法。３７．当該１つまたは２つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子が重鎖遺伝子ライブラリーである請求の範囲第３５項の方法。