CN108883178B - 含抗体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及稳定的含抗体的溶液制剂，其中抑制了功能性取代FVIII的双特异性抗体的Emicizumab(ACE910)的聚集体形成。具体地，本发明涉及pH 4.5至pH 6.5的上述含抗体溶液制剂，其含有20至180mg/mL的上述双特异性抗体，10mM至40mM的组氨酸‑天冬氨酸盐缓冲液，0.2至1mg/mL的泊洛沙姆188，和100mM至300mM的精氨酸。

Description

含抗体制剂
[技术领域]
本发明涉及包含结合凝血因子IX(FIX)和/或活化的凝血因子IX(FIXa)和结合凝血因子X(FX)的功能性取代凝血因子VIII(FVIII)的双特异性抗体的制剂。
[背景技术]
已发现功能性取代FVIII的双特异性抗体，其结合凝血因子IX(FIX)和/或活化的凝血因子IX(FIXa)和结合凝血因子X(FX)(非专利文献1和2；专利文献1至3)。双特异性抗体Emicizumab(ACE910)通过功能性取代FVIII改善由于FVIII缺乏和功能障碍引起的凝血反应的减少；因此，正在对血友病A患者进行临床试验。
已经开发了许多抗体溶液制剂，迄今为止报道的高浓度抗体的溶液制剂是使用组氨酸和精氨酸的制剂(专利文献4)和使用组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的制剂(专利文献5)。同时，已经报道了使用组氨酸/组氨酸-HCl作为缓冲液的包含淀粉样蛋白(A)的稳定液体药物抗体制剂(专利文献6)。
然而，对于包含上述双特异性抗体的溶液制剂，尚未报道其中聚集体形成和/或具有电荷异质性的组分受到抑制的稳定溶液制剂。
[引用列表]
[专利文献]
[专利文献1]WO2005/035756
[专利文献2]WO2006/109592
[专利文献3]WO2012/067176
[专利文献4]WO2002/030463
[专利文献5]WO2011/090088
[专利文献6]WO2013/131866
[非专利文献]
[非专利文献1]Nat Med.2012；18(10):1570-74
[非专利文献2]PLoS One.2013；8(2):e57479
[发明概述]
[需要解决的问题]
本发明的目的是提供包含Emicizumab(ACE910)的稳定溶液制剂，所述Emicizumab是功能性取代FVIII的结合FIX和/或FIXa和结合FX的双特异性抗体。
[解决问题的手段]
作为实现上述目的的专门研究的结果，发明人发现了pH 4.5至6.5的溶液制剂(其包含20至180mg/mL的上述双特异性抗体，10mM至40mM组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，0.2至1mg/mL的泊洛沙姆188，和100mM至300mM精氨酸)可以是稳定的含抗体的溶液制剂，其中聚集体形成和/或具有电荷异质性的组分被抑制，从而完成了本发明。
具体而言，本发明提供以下：
[1]pH 4.5至6.5的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中第一多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:1，2和3(Q499的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:4，5和6(J327的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；并且第三多肽和第四多肽包含共同L链，其分别包含SEQ ID NO:7，8和9(L404的L链CDR)的L链CDR 1，2和3的氨基酸序列；
10mM至40mM组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.2至1mg/mL泊洛沙姆188；和
100mM至300mM精氨酸。
[2][1]的抗体溶液制剂，其中在双特异性抗体中，第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且第三多肽和第四多肽包含SEQ ID NO:12的共同L链。
[3][1]或[2]的抗体溶液制剂，其中泊洛沙姆188的浓度为0.5mg/mL。
[4][1]-[3]中任一项的抗体溶液制剂，其中所述pH为6.0。
[5][1]-[4]中任一项的抗体溶液制剂，其中组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度为20mM。
[6][1]-[5]中任一项的抗体溶液制剂，其中精氨酸的浓度为150mM。
[7][1]至[6]中任一项的抗体溶液制剂，其基本上不含氯离子或乙酸根离子。
[8]pH 6的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；并且第三多肽和第四多肽包含SEQ ID NO:12的共同L链；
20mM L-组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.5mg/mL泊洛沙姆188；和
150mM L-精氨酸。
[9][1]-[8]中任一项的抗体溶液制剂，其用于皮下施用。
[10][1]-[9]中任一项的抗体溶液制剂，其用于治疗血友病A。
[11]一种稳定含有抗体的溶液制剂中的抗体的方法，其包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸，由此组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度为10mM至40mM，泊洛沙姆188的浓度为0.2至1mg/mL，并且精氨酸的浓度为100mM至300mM。
[12]抑制含抗体的溶液制剂中抗体缔合(聚集体形成)的方法，其包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸，由此组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度为10mM至40mM，泊洛沙姆188的浓度为0.2至1mg/mL，并且精氨酸的浓度为100mM至300mM。
[13]一种抑制含抗体制剂中具有电荷异质性的组分的方法，其包括向溶液中添加组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，其中组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度为10mM至40mM。
[本发明的效果]
本发明提供了显示出优异稳定性的含抗体制剂。此外，本发明还已经提供了含抗体制剂，其中聚集体形成和/或具有电荷异质性的组分在其溶液状态下被抑制。
[附图简要说明]
图1显示了在实施例8的振荡试验后存在的不溶性异物的照片(a：0mg/mL泊洛沙姆188；b：0.5mg/mL泊洛沙姆188)。
图2显示了实施例8的振荡试验和冻融后存在的不溶性微粒(微粒/mL)的数量的图。
[实施本发明的手段]
下面将详细描述本发明。
本发明提供pH 4.5-6.5的溶液制剂，其包含：20-180mg/mL的Emicizumab(ACE910)(其是功能性取代FVIII的结合FIX和/或FIXa和结合FX的双特异性抗体)；10mM至40mM的组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；0.2至1mg/mL的泊洛沙姆188为；和100mM至300mM的精氨酸。
上述双特异性抗体Emicizumab(ACE910)在下文描述。
双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对；其中第一多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:1，2和3(Q499的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其分别包含SEQ IDNO:4，5和6(J327的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；并且第三多肽和第四多肽包含共同L链，其分别包含SEQ ID NO:7，8和9(L404的L链CDR)的L链CDR 1，2和3的氨基酸序列。
更具体地，上述双特异性抗体是以下双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对；其中第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:13的H链可变区的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:14的H链可变区的氨基酸序列；并且第三多肽和第四多肽共同L链，其包含SEQ ID NO:15的L链可变区的氨基酸序列。
更具体地，上述双特异性抗体是以下双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对；其中第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；并且第三多肽和第四多肽包含SEQ ID NO:12的共同L链。此类抗体可通过WO2005/035756，WO2006/109592，WO2012/067176等中描述的方法获得。
本发明的制剂中的抗体浓度没有特别限制，但优选为20mg/mL至180mg/mL。实例包括20mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，120mg/mL，150mg/mL和180mg/mL。本发明制剂的抗体浓度的上限没有特别限制，但通常为250mg/mL。
用于本发明的抗体不受特别限制，只要它们与期望抗原结合即可，并且它们可以是多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体是优选的，因为可以稳定地产生均质抗体。
包含在本发明的氨基酸序列中的氨基酸可以是翻译后修饰的(例如，通过焦谷氨酰化将N端谷氨酰胺修饰成焦谷氨酸是本领域技术人员公知的)。当然，这种翻译后修饰的氨基酸包括在本发明中使用的抗体中。
在本发明中，短语“功能性取代FVIII”意指识别FIX或FIXa和识别FX，并通过FIXa促进FX活化(通过FIXa促进FXa产生)。可以使用例如包含FXIa，FX，合成底物S-2222(FXa的合成底物)和磷脂的测量系统来评估促进FXa产生的活性。这种测量系统显示与血友病A病例的疾病严重程度和临床症状的相关性(Rosen S,Andersson M,Blomba¨ck M等.Clinicalapplications of a chromogenic substrate method for determination of FVIIIactivity.Thromb Haemost 1985；54:811-23)。
在本发明中，术语“共同L链”是指能够与两个或更多个不同H链中的每一个形成配对并且显示对每种抗原的结合能力的L链。本文中，术语“不同H链”优选是指针对不同抗原的抗体的H链，但不限于此；它指的是氨基酸序列彼此不同的H链。例如，可以根据WO 2006/109592中描述的方法获得共同L链。
在本发明中，术语“稳定的含抗体制剂”是指这样的制剂，其中难以产生来自蛋白质例如抗体的聚集体和/或电荷异质性组分，即其中在溶液中难以发生变质反应(包括不溶性聚集体、可溶性聚集体、具有电荷异质性的组分)的制剂。
“具有电荷异质性的组分”是指由于脱酰胺，氧化，水解等而具有与主要组分不同的蛋白质表面电荷的组分。
在本发明中，“多肽”通常是指长度约为10个氨基酸或更长的肽和蛋白质。通常，它们是生物衍生的多肽，但不特别限于此，并且可以是例如包含人工设计的序列的多肽。此外，它们可以是任何天然存在的多肽，合成多肽，重组多肽等。另外，上述多肽的片段也包括在本发明的多肽中。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括单克隆抗体，多克隆抗体，二聚体，多聚体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，抗体衍生物和经修饰的抗体(Miller K等.JImmunol.2003,170(9),4854-61)，只要它们显示出期望的生物活性。抗体可以是小鼠抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，或衍生自其他物种的抗体，或人工合成的抗体。本文公开的抗体可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)，类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。免疫球蛋白可以衍生自任何物种(例如，人，小鼠或兔)。术语“抗体”，“免疫球蛋白(immune globulin)”和“免疫球蛋白(immunoglobulin)”在广义上可互换使用。
“双特异性抗体”是指具有两个可变区的抗体，每个可变区识别不同的表位，其中可变区存在于同一抗体分子中。双特异性抗体可以是识别两种或更多种不同抗原的抗体，或识别同一抗原上的两种或更多种不同表位的抗体。双特异性抗体不仅可以包括完整抗体，还可以包括抗体衍生物。
通过使用基因工程技术产生的重组抗体可用作抗体。重组抗体可以通过以下获得：从杂交瘤或产生抗体的细胞(例如产生抗体的致敏淋巴细胞)中克隆编码抗体的DNA，将其插入载体中；然后将其引入宿主(宿主细胞)以产生抗体。
双特异性抗体不限于IgG型；例如，IgG型双特异性抗体可以从通过将产生IgG抗体的两种类型的杂交瘤融合而产生的杂交瘤(四倍体)分泌(Milstein C.等.,Nature 1983,305:537-540)。它们也可以通过将构成两种目的IgG的L链和H链基因，即总共四种基因导入细胞中共表达基因来分泌。
可以通过本领域技术人员已知的方法生产本发明的抗体。具体地，将编码目标抗体的DNA插入表达载体中。进行表达载体的插入，使得表达将在表达调控区例如增强子和启动子的控制下进行。接下来，使用该表达载体转化宿主细胞以表达抗体。在这种情况下，可以使用宿主和表达载体的适当组合。
由此获得的本发明的抗体可以从宿主细胞内部或细胞外部(培养基等)中分离，并纯化成基本上纯的均质抗体。可以通过通常用于分离和纯化抗体的方法分离和纯化抗体，并且方法不受任何限制。例如，通过适当选择和组合柱色谱，过滤，超滤，盐析，溶剂沉淀，溶剂萃取，蒸馏，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦，透析，重结晶等，可以分离和纯化抗体。
在优选的方面，本发明制剂中的组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液是通过用液体例如含有作为游离氨基酸的天冬氨酸的水溶液滴定溶液例如补充有作为游离氨基酸的组氨酸的水溶液而制备的缓冲液。或者，可以通过以相反顺序添加氨基酸，或通过用粉末直接滴定来制备缓冲液。
本发明人进行了冻融试验，热加速试验，长期储存试验和冷冻储存试验，以评估各种添加剂对含有上述双特异性抗体的样品在储存过程中的稳定性的影响。结果，发明人发现，与磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液相比，通过使用组氨酸缓冲液抑制了聚集体形成和/或具有电荷异质性的组分。
此外，发明人发现，聚集体形成和/或具有电荷异质性的组分通过使用天冬氨酸(其是酸性氨基酸，作为用于缓冲的抗衡离子种类)，即通过使用组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液作为缓冲液而被抑制。
本发明制剂中组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度(量)优选为10至100mM，更优选10至40mM。此外，组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度(量)的实例是10mM，20mM和40mM。
此外，与据报道作为含抗体制剂的稳定剂的氯化钠相比，发现添加精氨酸显示出更高的稳定效果(即，抑制聚集体形成的效果和抑制具有电荷异质性的组分的效果)。
本发明制剂中精氨酸的浓度(量)优选为100mM至300mM。精氨酸浓度(量)的实例包括100mM，150mM，200mM和300mM。
本发明制剂的溶液pH优选为4.5至6.5，更优选为5.5至6.5，甚至更优选为5.5至6。pH的实例包括5.5和6。
包含在本发明制剂中的表面活性剂是例如聚山梨醇酯20(PS20)和普朗尼克F-68(泊洛沙姆188：聚乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)，特别优选泊洛沙姆188。添加到本发明制剂中的泊洛沙姆188(或PX188)的量优选为0.2mg/mL至1mg/mL。添加到制剂中的泊洛沙姆188的量的实例包括0.2mg/mL，0.5mg/mL，0.8mg/mL和1mg/mL。
用于本发明的组氨酸可以是组氨酸本身或其衍生物，L-组氨酸是特别理想的。本发明中使用的精氨酸可以是精氨酸本身，其衍生物或其盐，特别优选L-精氨酸或其盐。优选的精氨酸盐包括天冬氨酸盐和谷氨酸盐。
本发明的制剂还可含有氨基酸。用于本发明的优选氨基酸是天然氨基酸或氨基酸衍生物，特别优选的氨基酸是L-甲硫氨酸和L-脯氨酸。
本发明的制剂可以进一步含有糖。用于本发明的优选糖是蔗糖，海藻糖，葡甲胺和山梨糖醇。
添加到本发明制剂中的氨基酸或糖的量通常为1mM至1000mM，优选5mM至500mM，更优选10mM至300mM。
本发明的制剂还可含有无机盐。用于本发明的优选无机盐是镁盐和钙盐。
此外，优选本发明的制剂不含天冬氨酸以外的阴离子作为缓冲液(缓冲剂)或稳定剂的抗衡离子。在一个方面，此类制剂的实例包括基本上不含氯离子或乙酸根离子的制剂。“基本上不含氯离子或乙酸根离子”是指氯离子和乙酸根离子的浓度为例如5mM或更低，优选2mM或更低，更优选1mM或更低。通过使用具有大的稳定作用的天冬氨酸作为抗衡离子并且基本上不包含具有小的稳定作用的氯离子或乙酸根离子，可以在不增加渗透压的情况下产生高度稳定的含抗体制剂。
如果需要，本发明的制剂可另外含有适当的冷冻保护剂，悬浮剂，增溶剂，等渗剂，防腐剂，吸附抑制剂，稀释剂，赋形剂，pH调节剂，镇痛剂，含硫还原剂，抗氧化剂等。
冷冻保护剂包括例如糖，例如海藻糖，蔗糖和山梨糖醇。
增溶剂包括，例如，聚氧乙烯硬化蓖麻油，聚山梨醇酯80，烟酰胺，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，聚乙二醇和蓖麻油脂肪酸乙酯。
等渗剂包括例如氯化钠，氯化钾和氯化钙。
防腐剂包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，山梨酸，苯酚，甲酚和氯甲酚。
吸附抑制剂包括，例如，人血清白蛋白，卵磷脂，葡聚糖，环氧乙烷/环氧丙烷共聚物，羟丙基纤维素，甲基纤维素，聚氧乙烯硬化蓖麻油和聚乙二醇。
含硫还原剂包括，例如，含有巯基的那些，例如N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰高半胱氨酸，硫辛酸，硫代二甘醇，硫代乙醇胺，硫代甘油，硫代山梨糖，硫代乙醇酸及其盐，硫代硫酸钠，谷胱甘肽和具有一至七个碳原子的硫代链烷酸。
抗氧化剂包括，例如，异抗坏血酸，二丁基羟基甲苯，丁基羟基苯甲醚，α-生育酚，生育酚乙酸酯，L-抗坏血酸及其盐，L-抗坏血酸棕榈酸酯，L-抗坏血酸硬脂酸酯，亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，没食子酸三甲酯，没食子酸丙酯和螯合剂例如乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，焦磷酸钠和偏磷酸钠。
在实施方案中，本发明的制剂如下：
pH 6的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；并且第三多肽和第四多肽包含SEQ ID NO:12的共同L链；
20mM L-组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.5mg/mL泊洛沙姆188；和
150mM L-精氨酸；
或
pH 6的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体Emicizumab(ACE910)
20mM L-组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.5mg/mL泊洛沙姆188；和
150mM L-精氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的制剂如下：
pH 6的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；并且第三多肽和第四多肽包含SEQ ID NO:12的共同L链；
20mM L-组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.05mg/mL PS20；和
150mM L-精氨酸；
或
pH 6的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体Emicizumab(ACE910)
20mM L-组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.05mg/mL PS20；和
150mM L-精氨酸。
本发明的含抗体制剂可以通过任何适当的途径施用于患者，例如，通过推注或连续输注一段时间，静脉内，肌内或皮下。静脉内施用或皮下施用是优选的。
Emicizumab(ACE910)的剂量为例如0.001至1000mg/kg，施用间隔至少一天或更长。
更具体地，例如，在以1mg/kg的初始剂量施用Emicizumab(ACE910)后，Emicizumab(ACE910)可以每周一次以0.3mg/kg的连续剂量施用。或者，例如，在以3mg/kg的初始剂量施用Emicizumab(ACE910)后，Emicizumab(ACE910)可以每周一次以1mg/kg的连续剂量施用。在另一个实例中，在以3mg/kg的初始剂量施用Emicizumab(ACE910)后，Emicizumab(ACE910)可以每周一次以3mg/kg的连续剂量施用。
本发明的含抗体制剂可用于由于FVIII活性和/或活化的凝血因子VIII(FVIIIa)降低或缺乏而发生和/或进展的疾病。例如，它们可用于血友病A，其中已出现针对FVIII/FVIIIa的抑制剂的血友病A，获得性血友病A，维勒布兰德病(von Willebrand’s disease)，但不特别限于此。
本发明的另一个实施方案是用于稳定含抗体溶液制剂中的抗体的方法。优选地，用于稳定含抗体溶液制剂中的抗体的方法包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸。
本发明的另一个实施方案是用于减少含抗体溶液制剂中抗体的缔合(聚集体形成)的方法。优选地，用于减少含抗体溶液制剂中抗体的缔合(聚集体形成)的方法包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸。
此外，上述稳定抗体的方法和减少抗体缔合(聚集体形成)的方法包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸，优选抗体浓度为20-180mg/mL，组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液浓度为10mM至40mM，泊洛沙姆188浓度为0.2至1mg/mL，精氨酸浓度为100mM至300mM，pH为4.5至6.5；或更优选地，抗体浓度为20至180mg/mL，组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液浓度为20mM，泊洛沙姆188浓度为0.5mg/mL，精氨酸浓度为150mM，pH为6。
本发明的另一个实施方案是在含抗体制剂中减少具有电荷异质性的组分的方法。优选地，在含抗体制剂中减少具有电荷异质性的组分的方法包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液。更优选地，在含抗体制剂中减少具有电荷异质性的组分的方法包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，其中组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液浓度为10mM-40mM，或20mM。
在本发明的另一个实施方案中，在含抗体制剂中减少具有电荷异质性的组分的方法包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸。更优选地，在含抗体制剂中减少具有电荷异质性的组分的方法包括向溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸，优选抗体浓度为20-180mg/mL，组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液浓度为10mM至40mM，泊洛沙姆188浓度为0.2至1mg/mL，精氨酸浓度为100mM至300mM，pH为4.5至6.5；或更优选地，抗体浓度为20至180mg/mL，组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液浓度为20mM，泊洛沙姆188浓度为0.5mg/mL，精氨酸浓度为150mM，pH为6。
在上述用于稳定抗体的方法、用于减少抗体的缔合(聚集体形成)的方法和用于减少具有电荷异质性的组分的方法中，所述抗体优选为双特异性抗体，更优选为Emicizumab(ACE910)。
如本文所用，由表述“包含”提及的方面包括由表述“基本上由...组成”引用的那些，以及由表述“由...组成”引用的那些。
本文所述的数值可在一定范围内变化，例如，取决于仪器或设备，测量条件和本领域技术人员使用的程序，并且只要它们在允许实现本发明目的的范围内，例如，它们可以包含大约10％的偏差。
本文明确引用的所有专利和参考文献通过引用整体并入本说明书中。
通过以下实施例进一步说明本发明，但不应解释为限于此。
[实施例]
[实施例1]
组氨酸在人源化IgG4抗体ACE910的热加速储存过程中的聚集体抑制效果
(1)材料
ACE910是一种双特异性人源化IgG4抗体，可识别血液凝固因子IX和血液凝固因子X，预计可通过功能性替代活化的凝血因子VIII来预防血友病A的出血。
(2)测试样品
制备pH 6.0的液体组合物，其含有100mg/mL的ACE910,150mmol/L的NaCl和以下缓冲液中的任何一种：20mmol/L的磷酸盐缓冲液；20mmol/L的柠檬酸盐缓冲液；20mmol/L的乙酸盐缓冲液；20mmol/L的组氨酸缓冲液。将5至15μL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂在25℃的热调节浴中静置8周，然后用作测试样品。
(3)测量和计算ACE910聚集体量的方法
样品中聚集体的量通过尺寸排阻色谱法(SEC)使用G3000SWXL(Tosoh)柱测量，其中磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)含有300mmol/L的氯化钠，用于流动相，流速为0.5mL/min。
在检测到的峰中，具有最大面积和高度的峰被确定为单体，并且比单体更早检测到的峰统称为聚集体峰(高分子量物质，HMWS)。
计算所有峰的峰面积，并使用以下等式计算目标峰的峰面积比：
目标峰的峰面积比(％)＝100×(目标峰的峰面积)/(目标峰的峰面积+其他峰的总峰面积)
(4)结果
获得的结果如表1所示。
[表1]
在25℃储存后的聚集体增加(％)
Figure BDA0001812026810000131
从表1中可以清楚地看出，当补充20mmol/L的组氨酸时，样品在25℃下热加速8周后显示出高的聚集体抑制效果。
[实施例2]
盐浓度和精氨酸在人源化IgG4抗体ACE910的热加速储存和冻融过程中的聚集体抑制效果
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备pH 6.0的液体组合物，其含有100mg/mL的ACE910，20mmol/L的组氨酸，以及下列添加剂中的任何一种：50mmol/L的NaCl；75mmol/L的NaCl；150mmol/L的NaCl；和150mmol/L的精氨酸。将5至15μL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂在25℃的热调节浴中静置8周，或者进行10个循环的冻融(F/T)(5℃/-20℃)，然后用作测试样品。
(3)测量和计算ACE910聚集体量的方法
如实施例1中所述进行该方法。
(4)结果
获得的结果如表2所示。
[表2]
在25℃储存后和冻融后的聚集体增加(％)
Figure BDA0001812026810000141
从表2中可以清楚地看出，当补充150mmol/L的精氨酸时，样品在25℃下进行8周的热加速试验和冻融后显示出高的聚集体抑制效果。
[实施例3]
天冬氨酸在人源化IgG4抗体ACE910的冻融过程中的聚集体抑制效果
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备pH 6.0的液体组合物，其含有100mg/mL的ACE910，20mmol/L的组氨酸，150mmol/L的NaCl或150mmol/L的L-天冬氨酸钠作为抗衡离子。将5至15μL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂进行10个循环的冻融(5℃/-20℃)，然后用作测试样品。
(3)测量和计算ACE910聚集体量的方法
如实施例1中所述进行该方法。
(4)结果
获得的结果如表3所示。
[表3]
冻融后的聚集体增加(％)
Figure BDA0001812026810000151
从表3可以清楚地看出，当补充天冬氨酸时，样品在冻融后显示出高的聚集体抑制效果。
[实施例4]
在人源化IgG4抗体ACE910的热加速储存过程中通过pH抑制聚集体和具有电荷异质性的组分的效果
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备液体组合物，其含有100mg/mL的ACE910，20mmol/L的组氨酸-天冬氨酸和150mmol/L的精氨酸-天冬氨酸，并且pH为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0或7.5。将5至15μL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂在25℃的热调节浴中静置8周，然后用作测试样品。
(3)测量和计算ACE910聚集体量的方法
如实施例1中所述进行该方法。
(4)测量和计算具有电荷异质性的ACE910组分的方法
通过离子交换色谱法(IEC)通过BioPro QA-F柱(YMC)测量样品中具有电荷异质性的组分的量，其中使用Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH 7.8)作为流动相A和含有氯化钠(500mmol/L)的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH 7.8)作为流动相B，流动速率为0.5mL/min。
在检测到的峰中，具有最大面积和高度的峰被确定为主峰，并且在主峰之后检测到的峰统称为酸性峰。
计算所有峰的峰面积，并使用以下等式计算目标峰的峰面积比：
目标峰的峰面积比(％)＝100×(目标峰的峰面积)/(目标峰的峰面积+其他峰的总峰面积)
(5)结果
获得的结果如表4所示。
[表4]
在25℃储存后的聚集体增加(％)和酸性峰-1增加(％)
Figure BDA0001812026810000161
从表4可以清楚地看出，在pH 4.5至6.5，特别是在pH 5.5和pH 6.0下的样品显示出在25℃下储存后抑制聚集体和具有电荷异质性的组分的高效果。
[实施例5]
在人源化IgG4抗体ACE910的热加速储存过程中通过组氨酸浓度抑制聚集物和具有电荷异质性的组分的效果
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备pH 6.0的液体组合物，其含有100mg/mL的ACE910，150mmol/L的精氨酸和5mmol/L，10mmol/L，20mmol/L或40mmol/L的组氨酸-天冬氨酸。将5至15μL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂在25℃的热调节浴中静置8周，然后用作测试样品。
(3)确定和计算ACE910聚集体量的方法
如实施例1中所述进行该方法。
(4)测量和计算具有电荷异质性的ACE910组分的方法
如实施例4中所述进行该方法。
(5)结果
获得的结果如表5所示。
[表5]
在25℃储存后的聚集体增加(％)和酸性峰-1增加(％)
Figure BDA0001812026810000171
从表5可以清楚地看出，含有10mmol/L或更多的组氨酸-天冬氨酸的样品在25℃下储存后显示出抑制聚集体和具有电荷异质性的组分的高效果。
[实施例6]
冻融，热加速储存和冷冻储存人源化IgG4抗体ACE910过程中精氨酸浓度的聚集体抑制效果
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备pH 6.0的液体组合物，其含有100mg/mL的ACE910，20mmol/L的组氨酸-天冬氨酸和75mmol/L，100mmol/L，150mmol/L，200mmol/L，或300mmol/L的精氨酸。将5至15μL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂进行10次冻融循环(5℃/-20℃)，或者在25℃的热调节浴中静置8周或在-20℃六个月，然后用作测试样品。
(3)测量和计算ACE910聚集体量的方法
如实施例1中所述进行该方法。
(4)结果
获得的结果如表6所示。
[表6]
在冻融后，在25℃储存后和在20℃储存后的聚集体增加(％)
Figure BDA0001812026810000181
由表6可知，含有100mmol/L或100mmol/L以上精氨酸的样品在冻融后，在25℃储存后，以及在-20℃储存后显示出高的聚集体抑制效果。
[实施例7]
泊洛沙姆188在人源化IgG4抗体ACE9105℃储存过程中抑制不溶性异物和不溶性微粒的效果
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备pH 6.0的液体组合物，其含有80mg/mL的ACE910，20mmol/L的组氨酸-天冬氨酸，150mmol/L的精氨酸，以及下列添加剂中的任何一种：0mg/mL的泊洛沙姆188；0.2mg/mL的泊洛沙姆188；0.5mg/mL的泊洛沙姆188；1.0mg/mL的泊洛沙姆188；0.05mg/mL的聚山梨醇酯20；以及1.0mg/mL的聚山梨醇酯20。将1.0mL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂在5℃的冰箱中放置5个月，然后用作测试样品。
(3)观察不溶性异物的方法
通过将样品置于用于小瓶的视觉检查台的样品平台上，旋转样品平台并观察小瓶来评估不溶性异物的存在。
(4)测量不溶性微粒的方法
使用液体微粒计数器(Hach Ultra Analytics，Model 9703)测定溶液中不溶性微粒的数量。
(5)结果
获得的结果如表7所示。
[表7]
Figure BDA0001812026810000191
从表7可以清楚地看出，含有0.05mg/mL的PS20的样品和含有0.2mg/mL或更高的泊洛沙姆188的样品在5℃下储存后显示出抑制不溶性微粒和不溶性异物形成的高效果。
[实施例8]
泊洛沙姆188在人源化IgG4抗体ACE910的振荡应力和冻融储存过程中抑制不溶性异物和不溶性微粒的效果
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备pH6.0的液体组合物，其含有150mg/mL的ACE910，20mmol/L的组氨酸-天冬氨酸，150mmol/L的精氨酸-天冬氨酸，以及下列添加剂中的任何一种：0mg/mL的泊洛沙姆188；0.2mg/mL的泊洛沙姆188；0.5mg/mL的泊洛沙姆188；以及0.8mg/mL的泊洛沙姆188。将0.9mL组合物分别装入玻璃小瓶。
将如此制备的含人源化抗体的溶液制剂在室温下使用振荡器以200次/分钟的速度振荡24小时，或10次冻融循环(5℃/-20℃)，然后用作测试样品。
(3)观察不溶物的方法
如实施例7中所述进行该方法。
(4)测量不溶性微粒的方法
如实施例7中所述进行该方法。
(5)结果
获得的结果显示在表8和图1和2中。
[表8]
在振荡和冻融储存后不溶性异物的检测率(％)
Figure BDA0001812026810000201
从表8和图1和2中可以清楚地看出，含有0.2mg/mL或更高的泊洛沙姆188的样品显示出在经受振荡应力和冻融储存后抑制不溶性微粒和不溶性异物形成的高效果。
[实施例9]
人源化IgG4抗体ACE910浓度对热加速储存和冻融储存过程中稳定性的影响
(1)材料
使用实施例1中描述的抗体。
(2)测试样品
制备pH 6.0的液体组合物，其含有20mmol/L的组氨酸-天冬氨酸，150mmol/L的精氨酸-天冬氨酸，0.5mg/mL的泊洛沙姆188和20mg/mL,30mg/mL，40mg/mL，120mg/mL，150mg/mL或180mg/mL的ACE910。将0.65mL组合物分别装入玻璃小瓶。
将由此制备的含人源化抗体的溶液制剂在40℃的热调节浴中静置8周，或进行5或10个冻融循环(25℃/-20℃)，然后用作测试样品。
(3)测量和计算ACE910聚集体量的方法
如实施例1中所述进行该方法。
(4)测量和计算具有电荷异质性的ACE910组分的方法
通过阴离子交换色谱法(AIEC)通过TSKgel Q-STAT柱(Waters)测量样品中具有电荷异质性的组分的量，其中使用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 8.0)作为流动相A和含有氯化钠(200mmol/L)的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 8.0)作为流动相B，流动速率为0.5mL/min。
在检测到的峰中，具有最大面积和高度的峰被确定为主峰，并且在主峰之前检测到的峰统称为基峰，并且在主峰之后检测到的峰统称为酸性峰。
此外，利用阳离子交换色谱(CIEC)通过ProPac WCX-10G柱(Thermo Scientific)测量具有电荷异质性的组分的量，其中使用含有9.6mmol/L的Tris，6.0mmol/L的哌嗪和11.0mmol/L的咪唑的缓冲液(pH 6.0)作为流动相A，含有9.6mmol/L的Tris，6.0mmol/L的哌嗪，11.0mmol/L的咪唑，100mmol/L的NaCl作为流动相B(pH 10.1)，流速为0.5mL/min。
在检测到的峰中，具有最大面积和高度的峰被确定为BiAb峰，并且在BiAb峰之前检测到的峰统称为前峰，并且在BiAb峰之后检测到的峰统称为后峰。
计算所有峰的峰面积，并使用以下等式计算目标峰的峰面积比：
目标峰的峰面积比(％)＝100×(目标峰的峰面积)/(目标峰的峰面积+其他峰的总峰面积)
(5)结果
获得的结果如表9所示。“SE”，“AE”和“CE”分别表示尺寸排阻色谱，阴离子交换色谱和阳离子交换色谱的结果。
[表9]
在40℃储存后和在冻融后聚集体的量(％)和具有电荷异质性的组分的量(％)
Figure BDA0001812026810000231
从表9可以清楚地看出，比较含有20mg/mL-180mg/mL的ACE910的样品，结果表明，样品在40℃储存后和冻融后具有相当的，足够的稳定性。
[工业适用性]
与常规制剂相比，本发明的抗体溶液制剂在溶液状态下具有优异的稳定性，并且在低温，环境温度和高温下储存后以及在冻融后显示抑制蛋白质例如抗体分子的聚集体形成。其中难以发生变质反应的本发明的抗体溶液制剂可用于例如通过皮下施用治疗血友病A。
Figure IDA0001812026870000011
Figure IDA0001812026870000021
Figure IDA0001812026870000031
Figure IDA0001812026870000041
Figure IDA0001812026870000051
Figure IDA0001812026870000061
Figure IDA0001812026870000071
Figure IDA0001812026870000081

Claims (12)

1.pH 4.5至6.5的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中所述第一多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:1，2和3(Q499的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；所述第二多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:4，5和6(J327的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；并且所述第三多肽和所述第四多肽包含共同L链，其分别包含SEQ ID NO:7，8和9(L404的L链CDR)的L链CDR 1，2和3的氨基酸序列；
20mM组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.5至1mg/mL泊洛沙姆188；和
100mM至300mM精氨酸。
2.权利要求1的抗体溶液制剂，其中在所述双特异性抗体中，所述第一多肽和所述第三多肽形成一对，所述第二多肽和所述第四多肽形成一对；其中所述第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述第三多肽和所述第四多肽包含SEQ ID NO:12的共同L链。
3.权利要求1或2的抗体溶液制剂，其中泊洛沙姆188的浓度为0.5mg/mL。
4.权利要求1至3中任一项的抗体溶液制剂，其中所述pH为6。
5.权利要求1至4中任一项的抗体溶液制剂，其中精氨酸的浓度为150mM。
6.权利要求1至5中任一项的抗体溶液制剂，其基本上不含氯离子或乙酸根离子。
7.pH 6的抗体溶液制剂，其包含：
20至180mg/mL的双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中所述第一多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述第二多肽包含H链，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；并且所述第三多肽和所述第四多肽包含SEQ ID NO:12的共同L链；
20mM L-组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液；
0.5mg/mL泊洛沙姆188；和
150mM L-精氨酸。
8.权利要求1至7中任一项的抗体溶液制剂，其用于皮下施用。
9.权利要求1至8中任一项的抗体溶液制剂，其用于治疗血友病A。
10.稳定含有抗体的溶液制剂中的抗体的方法，其包括向所述溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸，由此组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度为20mM，泊洛沙姆188的浓度为0.5至1mg/mL，并且精氨酸的浓度为100mM至300mM，
其中所述抗体是双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中所述第一多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:1，2和3(Q499的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；所述第二多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:4，5和6(J327的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；并且所述第三多肽和所述第四多肽包含共同L链，其分别包含SEQ ID NO:7，8和9(L404的L链CDR)的L链CDR 1，2和3的氨基酸序列。
11.抑制含抗体的溶液制剂中抗体缔合(聚集体形成)的方法，其包括向所述溶液中加入组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，泊洛沙姆188和精氨酸，由此组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度为20mM，泊洛沙姆188的浓度为0.5至1mg/mL，并且精氨酸的浓度为100mM至300mM，
其中所述抗体是双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中所述第一多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:1，2和3(Q499的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；所述第二多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:4，5和6(J327的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；并且所述第三多肽和所述第四多肽包含共同L链，其分别包含SEQ ID NO:7，8和9(L404的L链CDR)的L链CDR 1，2和3的氨基酸序列。
12.抑制含抗体制剂中具有电荷异质性的组分的方法，其包括向所述溶液中添加组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液，其中组氨酸/天冬氨酸盐缓冲液的浓度为20mM，并且其中所述抗体是双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成一对，第二多肽和第四多肽形成一对，其中所述第一多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:1，2和3(Q499的H链CDR)的H链CDR1，2和3的氨基酸序列；所述第二多肽包含H链，其分别包含SEQ ID NO:4，5和6(J327的H链CDR)的H链CDR 1，2和3的氨基酸序列；并且所述第三多肽和所述第四多肽包含共同L链，其分别包含SEQ ID NO:7，8和9(L404的L链CDR)的L链CDR 1，2和3的氨基酸序列。
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