NO313617B1

NO313617B1 - Cytotoksisk medikament, konjugater av metyltritisantitumor- midler, mellomprodukter og anvendelse derav samt fremgangsmåte forfremstilling, farmasöytisk preparat og frysetörket farmasöytiskpreparat

Info

Publication number: NO313617B1
Application number: NO19952206A
Authority: NO
Inventors: Philip Ross Hamann; Lois Hinman; Irwin Hollander; Ryan Holcomb; William Hallett; Hwei-Ru Tsou; Martin J Weiss
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 2002-11-04
Also published as: US5739116A; JP3650165B2; NZ536440A; JP2005139200A; NZ328762A; NZ272274A; ATE223234T1; EP0689845A2; DK0689845T3; KR100408376B1; JPH0848637A; PT689845E; US5767285A; DE69528016T2; AU697280B2; EP0689845B1; ES2181752T3; BR1101078A; BR1100990A; CA2150785A1

Description

Denne oppfinnelse vedrører cytotoksisk medikament, konjugater av metyl-tritisantitumor-midler, mellomprodukter og anvendelse derav samt fremgangsmåte for fremstilling , farmasøytisk preparat og frysetørket farmasøytisk preparat. Det beskrives følgelig bærer-medikament-konjugater som er fremstilt av disulfid-analoger av calicheamicin-familien av sterke antitumor-antibiotika og deres derivater, såvel som lignende analoger av beslektede antitumor-antibiotika, så som esperamiciner. Bæreren kan være et antistoff, en vekstfaktor eller et steroid som målsøker en uønsket samling av celler, så som dem i en tumor. Hele proteinbærere såvel som deres antigen-gjenkjennende fragmenter og deres kjemisk eller genetisk manipulerte fragmenter er nyttige for den målsøkende delen av konjugatene.

Mer spesielt innbefatter ett aspekt av oppfinnelsen et cytotoksisk medikament-konjugat med formel:

hvor

Z er et protein valgt fra mono- og polyklonale antistoffer, deres antigengjen-kjennende fragmenter og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker og vekstfaktorer og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker, hvor en kovalent binding til proteinet er et amid dannet fra omsetning med "m" lysin sidekjeder eller et steroid, hvor den kovalente binding til steroidet er et amid eller en ester;

Alk 1 og Alk 2 er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylen kjede;

Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, så må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR<*>, S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR\ med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en binding;

n er et helt tall fra 0 til 5;

R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -0H, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium -A" hvor A" er et

farmasøytisk akseptabelt anion som gir et salt;

Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden eller

hver naftyliden eller fenotiazin er eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR<*>, S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)„CONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor, med det forbehold at når Ar er naftyliden, er Z<1> ikke hydrogen og med det forbehold at når Ar er fenotiazin, er Sp<1> en binding bare forbundet

med nitrogen og Alk<1> er ikke en binding;

Sp er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk er en binding, er

Sp en binding;

Z<1> er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR*, 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR\ 0(CH2)nCONHR' eller

S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor;

Z<2> er Q-Sp-S-S-W, hvor W er

R5 er -CH3, -C2H5 eller -CH(CH3)2;

X<1> er et j od eller bromatom;

R5' er et hydrogen eller gruppen RCO, hvor R er hydrogen, forgrenet eller uforgrenet (Ci - Cio) alkyl eller (Ci - Cio) alkylengruppe, en (C6-Cn) arylgruppe, en (C6-C11) aryl-alkyl (Ci - C5) gruppe eller en heteroaryl eller hetero-arylalkyl (Ci - C5) gruppe hvor heteroaryl er 2- eller 3-furyl, 2- eller 3-tienyl, 2- eller 3-(N-metylpyrrolyl), 2-, 3- eller 4-pyridyl, 2-, 4- eller

-(N-metyl-imidazolyl), 2-, 4- eller 5-oksazolyl, 2-, 3-, 5- eller 6-pyrimidinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-kinolyl eller 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-isokinolyl, alle aryl og heteroaryl eventuelt substituert med én eller flere hydroksy, amino, karboksy, halogen, nitro, lavere (Ci - C3) alkoksy eller lavere (Ci -

C5) tioalkoksygrupper;

Sp er en lineær eller forgrenet divalent eller trivalent (Ci - Ci s) rest, di valent eller trivalent aryl eller heteroarylrest, divalent eller trivalent (C3 - Cis) cykloalkyl eller heterocykloalkylrest, divalent eller trivalent aryl- eller heteroarylalkyl (Ci - Cig) rest, divalent eller trivalent cykloalkyl- eller heterocykloalkylalkyl (Ci - ds) rest eller divalent eller trivalent (C2 - C\ s) umettet alkylrest, hvor heteroaryl er furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminokumarinyl eller fenazinyl og hvor når Sp er en trivalent rest, kan Sp i tillegg være substituert med lavere (Ci - C5) dialkylamino, lavere (Ci - C5) alkoksy, hydroksy eller lavere (Ci - C5) alkyltiogrupper; og

Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- eller =NHO-m er fra 0,1 til 15.

Et annet aspekt ved denne oppfinnelse innebærer forbindelse Forbindelse med formelen

hvor

Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3,

Alk 1 og Alk 2er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede; Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR<*>, CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR', med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en

binding;

n er et helt tall fra 0 til 5;

R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -0H, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium-A" hvor A" er et

farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt;

Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR<*>, CONHR', 0(CH2)„COOR<*>, S(CH2)nCOOR<*>, 0(CH2)nCONHR* eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden eller

hver naftyliden eller fenotiazin er eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor, med det forbehold at når Ar er naftyliden, er Z1 ikke hydrogen og med det forbehold

at når Ar er fenotiazin, er Sp1 en binding bare forbundet med nitrogen; Sp 2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk 2 er en binding, er

Sp en binding;

Z1 er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller

S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor;

Z<2> er Q-Sp-S-S-W, hvor W er

R5 er -CH3, -C2H5 eller -CH(CH3)2;

X<1> er et j od eller bromatom;

R5<1> er en hydrogen eller gruppen RCO, hvor R er hydrogen, forgrenet eller uforgrenet (Ci - Cio) alkyl eller (Ci - Cio) alkylengruppe, en (C6-C11) arylgruppe, en (C6-C11) aryl-alkyl (Ci - C5) gruppe eller en heteroaryl eller heteroaryl-alkyl (Ci - C5) gruppe hvor heteroaryl er 2- eller 3-furyl, 2- eller 3-tienyl, 2- eller 3-(N-metylpyrrolyl), 2-, 3- eller 4-pyridyl, 2-, 4- eller 5-(N-metylimidazolyl), 2-, 4- eller 5-oksazolyl, 2-, 3-, 5- eller 6-pyrimidinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-kinolyl eller 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-isokinolyl, alle aryl og heteroaryl er eventuelt substituert med én eller flere hydroksy, amino, karboksy, halogen, nitro, lavere (Ci - C3) alkoksy eller lavere (Ci -

C5) tioalkoksygrupper;

Sp er en lineær eller forgrenede divalent eller trivalent (Ci - Cis) rest, divalent eller trivalent aryl eller heteroarylrest, divalent eller trivalent (C3 - Cn) cykloalkyl eller heterocykloalkylrest, divalent eller trivalent aryl- eller heteroaryl-alkyl (Ci - Cis) rest, divalent eller trivalent cykloalkyl- eller heterocykloalkyl-alkyl (Ci - Cis) rest eller divalent eller trivalent (C2 - Cn) umettet alkylrest, hvor heteroaryl er furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminokumarinyl eller fenazinyl og hvor når Sp er en trivalent rest, kan Sp være i tillegg substituert med lavere (Ci - C5) dialkylamino, lavere

(Ci - C5) alkoksy, hydroksy eller lavere (Ci - C5) alkyltiogrupper;

Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- eller =NO-.

Et tredje aspekt ved denne oppfinnelse innebærer forbindelse Forbindelse med formelen:

hvor Ar er en 1,2-, 1,8- eller 2,7-naftyliden eller hver naftyliden eller fenotiazin er eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR", CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n er et helt tall fra 0 til 5 og R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium - A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt, med det forbehold at når Ar er fenotiazin, er Sp<1> en binding bare forbundet med nitrogen; Z<3> er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3,

Alk 1 og Alk 2er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede;

Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert, med det forbehold at

når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en binding;

Sp 2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk 2 er en binding, er

Sp en binding; og

Z<1> er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR* eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert, med det forbehold at når Ar er naftyliden, er Z<1> ikke hydrogen og med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp 2 en binding og Alk 2 er ikke en binding, deretter er Z 1 ikke C, alkyl.

Fig. 1: DNA og aminosyresekvenser for h-P67.6 lett kjede.

Fig. 2: DNA og aminosyresekvenser for h-P67.6 tung kjede.

Fig. 3: Plasmid for h-P67.6 tung kjede-ekspresjon.

Fig. 4: Plasmid for innsetting av h-P67.6 tung kjede.

Fig. 5: Plasmid for h-P67.6 lett kjede-ekspresjon.

Fig. 6: Det protonmagnetiske resonsans-spektrum for 4-formylfenoksyeddik syre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. Fig. 7: Det protonmagnetiske resonans-spektrum for 4-formylbenzosyre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. Fig. 8: Det protonmagentiske resonans-spektrum for 4-formyl-3-metoksyfenoksyeddiksyre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. Fig. 9: Det protonmagnetiske resonans-spektrum for 6-formyl-2-naftosyre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. Fig. 10: Det protonmagnetiske resonans-spektrum for 4-(4-acetylfenoksy)-butansyre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetyl-hydrazid. Fig. 11: Det protonmagnetiske resonans-spektrum for 4-(4-acetylfenoksy)-butansyre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetyl-hydrazid, N-hydroksysuksinimidester. Fig. 12: Det protonmagnetiske resonans-spektrum for 4-(4-formylfenoksy)-butansyre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetyl-hydrazid.

Siden oppdagelsen av metodologi for fremstilling av monoklonale antistoffer ble publisert i 1970-årene (G. Kohler og C. Milstein, "Nature" 256, 495 (1975)), har det blitt gjort tallrike forsøk på å benytte disse proteiner til å gi antitumor-midler evne til selektiv målsøking etter tumorer. (Se f.eks. T. Ghose og A.H. Blair, "CRC Critical Rev. Drug Carrier Systems" 3, 263 (1987), G.A. Koppel, "Bioconjugate Chem." 1,13 (1990), og J. Upeslacis og L. Hinman, "Ann. Rep. Med. Chem." 23, 151 (1988).). Selv om det fortsatt er fremgang på dette området, produserer de fleste klassiske antitumor-midler antistoff-konjugater som er forholdsvis ineffektive av forskjellige årsaker. Blant årsakene til denne ineffektivitet er mangelen på styrke hos det kjemoterapeutiske middel, og dets dårlige utnyttelse på grunn av mangelen på effektiv frigivelse av medikamentet på stedet hvor det skal virke.

Den sterke familien av antibakterielle midler og antitumor-midler, kollektivt kjent som calicheamicinene eller LL-E33288-komplekset, er beskrevet og krevd beskyttelse for i US-patent nr. 4.970.198 (1990). De sterkeste av midlene er betegnet 7^, som her ganske enkelt henvises til som gamma. Dihydroderivatene av disse forbindelsene er beskrevet i US-patent nr. 5.037.651 (1991), og de N-acylerte derivater er beskrevet i US-patent nr. 5.079.233 (1992). Beslektede forbindelser som også er nyttige i denne oppfinnelse innbefatter esperamicinene som er beskrevet og krevd beskyttelse for i US-patent nr. 4.675.187 (1987), 4.539.203, 4.554.162, og europeisk patent nr. 289.030. Alle disse forbindelsene inneholder et metyltrisulfid som kan omsettes med passende tioler for å danne disulfider, og som på samme tid innfører en funksjonell gruppe så som et hydrazid eller et lignende nukleofil. Eksempler på denne omsetning med calicheamicinene er gitt i US-patent nr. 5.053.394, som også beskriver målsøkende former av calicheamicinene. All informasjon i de ovennevnte patent-mothold er herved inntatt som referanse. To forbindelser som er nyttige for syntesen av konjugater med bærermolekyler, som beskrevet og krevd beskyttelse for i US-patent nr. 5.053.394, er vist i tabell 1.

Inkludert som bærermolekyler i US-patent nr. 5.053.394 er steroider, vekstfaktorer, antistoffer, antistoff-fragmenter, og deres genetisk eller enzymatisk konstruerte motstykker, heretter referert til i entall eller som en gruppe som bærer. Bærerens essensielle egenskaper er dens evne til å gjenkjenne et antigen eller en reseptor som er knyttet til en uønsket cellelinje. Eksempler på bærere er gitt i US-patent nr. 5.053.394, og slike bærere er også passende i foreliggende oppfinnelse. Antistoff-bærere kan være fra nesten enhver pattedyrart (f.eks. mus, menneske, hund etc), og kan fremstilles ved flere forskjellige fremgangsmåter (f.eks. antistoffer fra musedyr via hybridomer, menneske-antistoffer via hybridomer fra transgenetiske mus etc).

Spesifikke eksempler på bærere som det er gitt eksempler på her er antistoffene P67.6, A33, CT-M-01 og "anti-Tac"-antistoffet fra Waldman. Disse antistoffene benyttes her i to former: i en form fra musedyr, betegnet med en "m"

(f.eks. m-P67.6), og en genetisk konstruert, humanisert form, betegnet med en "h"

(f.eks. h-P67.6), ettersom det passer. Den grunnleggende teknologi for humanise-ring er beskrevet av Winter i US-patent 5.225.539 (1993), og av Adair i WO 91/09967 (1991). m-P67.6 er beskrevet i LD. Bernstein et al., "J. Clin. Invest." 79, 1153 (1987), og gjenkjenner CD33-antigenet som er fremherskende i visse human-myeloide tumorer, spesielt akutt ikke-lymfocyttisk leukemi (ANLL).

Fig. 1 og Fig. 2 viser DNA-kodingen og forventede aminosyresekvenser for de variable regioner på ett spesielt h-P67.6 som er spesielt egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse. Rammeverket for dette antistoff er EU-rammeverket for human-IgG4 vist i Gottlieb et al., "Biochemistry: 9, 3115 og 3161 (1970). Antistoffet ble fremstilt ved å benytte den generelle strategi beskrevet i WO 91/09967. Under henvisning til skjemaene, er de overlappende oligonukleotider som ble syntetisert (Oligo LI til L8) vist med doble understrekninger, og fremgansmåten for PCR-sammensetning (se WO 92/01059) ble brukt for disse sekvenser. CDR-regionene på proteinet er vist med understrekning med én enkelt linje, og andre

aminosyrer som ble tatt fra musedyr-sekvensene er vist med dobbel understrekning. Restriksjons-setene som ble benyttet til å spleise sekvensene til plasmider er antydet ved begynnelsen av slutten av sekvensene. De variable deler av den tunge kjede ble klonet på plasmid pMRR14 (WO 93/06231) for å gi plasmidet betegnet pAL63

(skjema 3), og den variable del av den lette kjede ble klonet på plasmid pMRR15 (skjema 4) for å gi pAL60 (skjema 5). Plasmidene pMRR14 og pMRR15 inneholdt de konstante regioner av henholdsvis de tunge og de lette kjedene, og derfor inneholdt pAL63 og pAL60 komplette sekvenser for de P67.6-tunge og -lette kjeder. Plasmidene ble ko-transfektert inn i CHO-L761-celler for å frembringe en h-P67.6-produserende linje, fra hvilken h-P67.6 ble renset ved hjelp av standardmetoder. Det resulterende h-P67.6 bandt seg til HL60-celler i konkurranse med musedyr-antistoff med ca. 50% tap av immunoaffinitet. Denne binding ble hemmet ved for-håndsinkubering med løselig CD3 3-antigen.

Antistoffet m-CT-M-01 er beskrevet i Europeisk publikasjon nr. 0208615, og gjenkjenner polyepitelmucin (PEM)-antigenet som er til stede i mange faste tumorer i mennesker, spesielt i bryst, lunger og eggstokker. Den humaniserte versjon av dette antistoff, h-CT-M-01, er beskrevet i PCT publikasjon WO 93/06231 (1993). Antistoffet m-A33 er beskrevet i US-patenter nr. 5.160.723 og 5.431.897, og er et musedyr-antistoff som gjenkjenner et glykoprotein-antigen som er tilstede på tykktarm-kreftceller. Den humaniserte versjon av dette antistoff, h-A33, er beskrevet i UK patent nr. 2.278.357. Anti-Tac er beskrevet i T.A. Waldman et al., "J. Immunol." 126, 1393 (1981), og er et musedyr-antistoff som er reaktivt med IL-2-reseptoroen som finnes på aktiverte og funksjonelt modne T-celler, inklusive abnormalt aktiverte leukemi-celler.

De to grunnleggende typer av konjugater som er beskrevet i US-patent nr. 5.053.394, er slike som er knyttet til lysinrester av antistoffet, og slike som er knyttet til de oksyderte karbohydratrester ved hjelp av fremgangsmåten som læres i US-patent nr. 4.671.958. Lysintilknytning, sik som beskrevet i US-patent nr. 5.053.394, gir konjugater som er stabile overfor hydrolyse under normale fysiologiske betingelser. De karbohydratbaserte konjugater, som innebærer dannelse av et hydrazon fra et hydrazid eller et lignende derivat, er hydrolytisk ustabile under visse betingelser, og det er i mange tilfeller en fordel. Noe ustabilitet er ofte nødvendig for å tillate frigivelse av medikamentet så snart konjugatet er internalisert i målcellen, men en viss grad av stabilitet er viktig for å forhindre for tidlig frigivelse av medikamentet fra antistoffet. Imidlertid lider disse karbohydratbaserte konjugater av forskjellige ulemper. Først er det nødvendig å benytte periodat for å frembringe aldehyder av karbohydratrestene av antistoffet. Antistoffer inneholder cysteiner, cystiner, metioniner, tryptofaner eller tyrosinrester som er nødvendige for at antistoffet skal fungere riktig. Imidlertid kan disse samme aminosyrer være følsomme overfor periodatoksydering, og hvis en slik oksydering finner sted til en aminosyre som enten er del av antigen-bindingssetet på antistoffet, eller en strukturelt viktig region nær antigen-bindingssetet, kan dets immunoaffinitet bli betydelig svekket. En annen ulempe med å benytte karbohydrater ved konjugering, er variabiliteten av hydrazonene og beslektede strukturer som frembringes av de naturlig forekommende sukkertyper og hydrazid-derivatet. Ikke bare er hydrazonene offer for forskjellige grader av hydrolyse på grunn av forskjellene i deres lokale struktur, men andre strukturer, så som hydratiserte arter, piperadiner etc, kan også frembringes. Ethvert konjugat kan inneholde strukturer som enten er for stabile eller for labile for optimal aktivitet.

Begrensede eksempler på hvordan noen av egenskapene til de karbohydratbaserte konjugater og de lysinbaserte konjugater kan kombineres, har blitt oppdaget ved å benytte andre, svakere klasser av antikreft-midler. Cullinan, i US-patent nr. 5.006.652 og 5.094.849, lærer at visse bifunksjonelle forbindelser som inneholder både karboksylsyre og aldehyd- eller keto-funksjonalitet, kan benyttes som spacere mellom lysinene av antistoffene og hydrazid-derivatene av Vinca-alkaloidene, mens Johnson, i US-patent nr. 5.028.697 og 5.144.012, lærer noe lignende for methotrexate-analoger. Sinam et al. beskriver også lignende konstruksjoner i WO patent nr. 90/03401. Det er ikke i noen av disse tilfeller bevist at denne fremgangsmåte er nyttig for fremstilling av konjugater av metyltrisulfid-antitumor-antibiotika, spesielt calicheamicinene eller esperamicinene. De frem-dratte patenter beviser ikke at disse konstruksjoner av enten Vinca-alkaloidene, methotrexate-analogene eller andre midler er overlegne i sin biologiske profil, sammenlignet med konjugatene som er fremstilt ved å benytte lysinbaserte eller karbohydratbaserte konjugater.

Foreliggende oppfinnelse beskriver en serie av konjugater som er fremstilt av de sterke metyltrisulfid-antitumor-antibiotika som er fremstilt med et forbedret linkersystem som gir konjugater som, biologisk sett, i mange tilfeller er høyst overlegne i forhold til konjugatene av de samme medikamenter, som er fremstilt ved hjelp av andre fremgangsmåter.

Konjugatene i henhold til denne oppfinnelse benytter linkere som kan tilsettes til et derivat av et medikament, spesielt hydrazider og beslektede nukleofiler, fremstilt av metyltrisulfidholdige antitumor-antibiotika. Linkeme krever en karbonylgruppe i den ene enden for dannelse av en Schiff s base, spesielt et hydrazon, og en karboksylsyre i den andre enden. Karboksylsyren kan aktiveres og deretter omsettes med lysinene på et antistoff eller andre målsøkende proteiner, eller med et amin, alkohol eller andre passende nukleofiler på andre målsøkende midler som er blitt valgt på grunn av sin evne til å målsøke uønskede celleansamlinger. Disse konstruksjoner, som for antistoffer inneholder elementer av både de lysinbaserte konjugater og de karbohydratbaserte konjugater, overvinner ikke bare ulempen med tidligere beskrevne konstruksjoner, men har den ytterligere fordel at de kan fininnstilles ved å variere strukturen til linkeren, slik at den optimale mengde hydrolytisk stabilitet/ustabilitet kan "skreddersys". Dette kan resultere i maksimal toksisitet overfor målcellene, med minimal toksisitet overfor celler som ikke er målceller. Den optimale hydrazonstabilitet/ustabilitet er ikke nødvendigvis den samme for hver medikament- og målsøkningsmiddel-kombinasjon.

Fremgangsmåten for konstruksjon av konjugatene beskrevet i denne patentsøknad, gir konjugater av metyltrisulfid-antitumor-antibiotika som er uventet stabile i forhold til de karbohydratbaserte konjugater, uten tap av aktivitet. I noen tilfeller er konjugatene 100 ganger sterkere enn de tilsvarende konjugater som fremstilles ved den karbohydratbaserte fremgangsmåte, og viser i tillegg redusert cytotoksisitet overfor cellelinjer som de ikke er målrettet mot. Dette resulterer i konjugater med opptil 10.000 ganger høyere selektivitet mellom cellelinjer de er målrettet og ikke målrettet mot.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig forbindelse med formelen:

hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt er substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR* eller S(CH2)nCONHR' hvor n er et helt tall fra 0 til 5 og R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (Ci-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium - A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt;

Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3,

Alk1 og Alk2 er uavhengig en forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede; Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar<*->Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller

S(CH2)nCONHR', hvor n og R' er som ovenfor definert;

Sp<2> er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at Sp<1> og Sp2 ikke begge er

samtidig en binding; og

Z<1> er fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl,

(C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR<*>, 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert.

Det er videre beskrevet forbindelse med formel:

hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen substituert med COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR* eller S(CH2)nCONHR' og eventuelt substituert med én eller to grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (Ci-C4) tioalkoksy, halogen eller nitro, hvor n er et helt tall fra 0 til 5 og R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium - A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt; Z<3> er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3,

Alk 1 og Alk 2 er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio)

alkyl enkj ede;

Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)„COOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR', med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en binding hvor n og R' er som ovenfor definert i (C), med det forbehold at når Ar er 1,3- eller 1,4- fenylen eventuelt substituert med én gruppe med (C1-C6) alkyl eller (C1-C5) alkoksy og Alk 2 er en binding, er Sp 1 ikke en binding, -O-eller -NHCO-;

Sp 2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk 2er en binding, er

Sp2 en binding; og

Z1 er H eller (C,-C5) alkyl.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre forbindelse med formelen:

hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Q-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen eller nitro; Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3,

Alk<1> er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede;

Alk er en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede;

Sp<1> er -CONH-;

Sp 2 er en binding, -S eller -O-, med det forbehold at når Alk 2 er en binding, er

Sp<2> en binding; og

Z<1> er H eller (C1-C5) alkyl;

med det forbehold at når Alk 1 er C2, er Alk 2 en binding 0gZ 1 er Ci, deretter har Ar

11 2

minst én substituent, med det forbehold at når Alk er C2, Z er H, Alk er en binding 0g Ar er 1,4-fenylen og har Ar minst én substituent og med det forbehold at

11 2

når Alk er C3, Z er Ci, er Alk en binding og Ar er 1,4-fenylen, og Ar har minst én substituent.

Det er videre beskrevet forbindelse med formelen:

hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Q-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen eller nitro; Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er en metall som fullfører et salt, -N3,

Alk<1> er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede;

Alk 2 er en binding eller en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede;

Sp<1> er en -S-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)„-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)„COOR', 0(CH2)„CONHR' eller S(CH2)„CONHR',

hvor n og R' er som ovenfor definert;

Sp en binding; og

Z<1> er H eller (Ci-C5) alkyl.

11? 2

Gruppene Alk , Sp , Alk og Sp i kombinasjon, såvel som gruppen Ar omtalt nedenfor, gir karbonylgruppen avstand fra karboksylsyren. Videre kan Alk<*>

og Sp* innvirke på reaktiviteten av karboksylgruppen både i løpet av og etter at den har blitt aktivert. Når Alk 2 og Sp 2 sammen er en binding, innvirker Sp 1-gruppen også på reaktiviteten til karbonylgruppen på den andre enden av linkeren, og stabiliteten til produktet som dannes av reaksjonene ved dette karbonyl. Gruppen R' kan benyttes til å innvirke på løseligheten og andre fysiokjemiske egenskaper til disse forbindelsene. En foretrukket utførelsesform for Alk<*> er (C2"C5)alkylen, og for Sp <1> et oksygenatom. En foretrukket utførelsesform for gruppene Alk ? og Sp? sammen er en binding.

Som angitt tidligere er stabilitet viktig for å forhindre for tidlig frigivelse av medikamentet fra antistoffet, men noe ustabilitet er nødvendig for å tillate frigivelse av medikamentet så snart konjugatet er blitt internalisert i målcellene.

Valget av Ar har en betydelig innvirkning på stabiliteten til produktene som er utledet av karbonylgruppen når Alk 1 og Sp 7 sammen er en binding. Både den relative posisjon av Sp I og Sp 9 såovel som nærværet av ytterligere substituenter på Ar, kan benyttes til å fininnstille den hydrolytiske oppførsel til produktet som er dannet av karbonylgruppen.

Strukturen til spesifikke eksempler på linkere er som følger:

Kun noen få av de enklere av disse linkerne er kommersielt tilgjengelige, dvs. linkerne 1, 2, 3, 19, 23, 24 og 33. Sammenbindingsstoff 20 er listet opp av Chemical Abstract Services med registreringsnr. 5084-45-7. Mange linkere som inneholder aryletere som en del av sin struktur, så som 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 25, 28, 30 og 31, kan fremstilles ved å alkylere et fenolisk keton med en elektrofil, så som etyl-4-brombutyrat, under anvendelse av en passende base, så som kaliumkarbonat, i et passende løsningsmiddel, så som N,N-dimetylformamid, og deretter omdanne esteren til den karboksylsyre som kreves ved hydrolyse med f.eks. natriumhydroksyd eller kaliumkarbonat i vandig metanol. Denne strategi kan også benyttes med linkere så som 5, 6, 9, 11, 18 eller 27, hvor karbonylgruppen føres gjennom de innledende trinn av fremstillingen i en maskert form, så som et olein eller en alkohol. Karbonylgruppen kan så senere frembringes, som beskrevet i eksemplene, ved oksydering med henholdsvis ozon eller pyridiniumklorkromat. Denne fremgangsmåte er spesielt verdifull når en mer reaktiv karbonyl er til stede i den endelige linker.

Når det er nødvendig kan den nødvendige karboksylsyre innføres i en maskert form som i fremstillingen av linker 26. I dette tilfelle er fenolen alkylert med 5-brom-l-penten, og syren er frigitt fra olefmet ved omsetning med ozon, fulgt av pyridiniumklorkromat-oksydering. Linkere så som 22 eller 32, kan fremstilles ved alkylering av et passende sekundært amin (henholdsvis et piperazin- eller fenotiazinderivat) med en passende elektrofil, og deretter å eksponere den nødven-dige karboksylsyre i et senere trinn, lik de tidligere nevnte strategier. Linker 12 ble fremstilt ved å redusere det tilsvarende cinnamat med hydrogen. Selv om denne omsetning ga et relativt urent produkt, var den rå blanding nyttig for omdannelse til det nødvendige hydrazon, fordi ingen av biproduktene inneholdt aldehydgrupper. Strukturene med mer kompliserte substituenter, så som linkerne 33, 34, 35 eller 36, kan fremstilles av enklere strukturer, ved f.eks. å omsette en ester med en passende nukleofil, eller ved å kvaternisere et amin med en elektrofil, så som metyljodid.

Linkerne definert ovenfor kan benyttes til å danne konjugater som følger:

Under henvisning til skjema 1 ovenfor, er linkeren i struktur A, hvor Z<*>, Alk<*>,

19 9

Sp1, Ar, Sp<z> og Alk<z> er som definert ovenfor, kondensert med en forbindelse med struktur Q-Sp-SS-W, som selv er utledet fra en metyltritio-antitumor-antibiotika, og hvor W er

R^ er -C<H>3, -<C>2H5 eller -Cr^CH^, X er et jodin- eller brominatom, R^' er et hydrogen eller gruppen RCO, hvor R er hydrogen, en forgrenet eller ikke forgrenet (Cj-Cjø)alkyl- eller (Cj-CjQ)alkylengruppe, en (C^-Ci i)arylgruppe, en (Cg-Cj j)arylalkyl(Cj-C5)gruppe, eller en heteroaryl- eller heteroarylalky^Cj-C^)-gruppe hvor heteroaryl er definert som 2- eller 3-furyl, 2- eller 3-tienyl, 2- eller 3-(N-metylpyrrolyl), 2-, 3- eller 4-pyridinyl, 2-, 4- eller 5-(N-metylimidazolyl), 2-, 4-eller 5-oksazolyl, 2-, 3-, 5- eller 6-pyrimidinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-kinolyl, eller 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-isokinolyl, idet alle aryl- og heteroarylgruppene eventuelt er substituert med én eller flere hydroksy-, amino-, karboksy-, halogen-, nitro-, lavere(<C>j-C3)alkoksy- eller lavere(Cj-C5)tioalkoksygrupper, Sp er et rett-kjedet eller forgrenet, toverdig eller treverdig (Cj-Cjg)-radikal, to verdig eller treverdig aryl- eller heteroarylradikal, toverdig eller treverdig {^-CjgXykloalkyl-eller heterocykloalkylradikal, toverdig eller treverdig aryl- eller heteroarylalkyl-(C j-C^g)-radikal, toverdig eller treverdig cykloalkyl- eller heterocykloalkylalkyl-(Cj<-C>jg)-radikal, eller toverdig eller treverdig (C2-<C>]<g>)<->umettet alkylradikal, hvor heteroaryl er furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminokumarinyl eller fenazinyl, og hvor, hvis Sp er et treverdig radikal, det kan være ytterligere substituert med lavere (Cj^^ialkylamino-, lavere (C j-C^alkoksy-, hydroksy- eller lavere (CrC5)alkyltiogrupper, og Q er H2<N>HNCO-, H2NHNCS-, H2NHNCONH-, H2NFINCSNH- eller H^NO-, for å fremstille en forbindelse med struktur B, hvor Z<1>, Alk<1>, Sp<1>, Ar, Sp<2> og Alk<2> er som definert ovenfor, Z<2> er Q-Sp-SS-W, hvor Sp og W er som definert ovenfor, Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-,

=NHNCSNH- eller =NO-, og Z<3> er -OH.

Kondenseringen kan utføres i de fleste forlikelige, organiske løsningsmidler, men er spesielt effektiv i alkoholiske løsningsmidler, så som metanol eller etanol. Denne kondensasjonsreaksjon er syrekatalysert. Karboksylsyren i selve linkerne er i mange tilfeller tilstrekkelig til å katalysere denne omsetningen, men å tilsette en syrekatalysator, så som ca. 5% eddiksyre, hjelper i mange tilfeller til å bedre omset-ningshastigheten. Temperaturen i denne omsetning kan være fra ca. omgivelsestemperatur til tilbakeløpstemperaturen for løsningsmidlet. Produktene isoleres i ren form ved å fjerne de flyktige løsningsmidler og å rense blandingen ved kromatografi på et egnet medium så som BIOSIL A™, en modifisert kiselgel som er tilgjengelig fra Bio-Rad. Det skal forstås at produktene med struktur B, såvel som produktene fra den ytterligere omdanning av disse forbindelser, eksisterer som lett interkonver-bare syn- og anti-isomerer ved området definert som Q, og at disse produkter kan eksistere i forskjellige hydratiserte former, avhengig av de eksakte betingelser i løsningsmidlet og ved hvilken pH-verdi disse forbindelser undersøkes. Slike varierende fysikalske former er også inkludert innenfor rammen av denne patent-søknad.

Karboksylsyren med struktur B (Z 3 = -OH) omdannes deretter til en aktivert ester under forberedelsen for konjugering av disse mellomprodukter med bærermolekyler. Slike overføringer omdanner Z (struktur B) til halogen, -N3,

F.eks. fører omsetning av karboksylformen av struktur B (Z<3> = -OH) med et koblingsmiddel, så som 1,3-dicykloheksylkarbodiimid eller l-(3-dimetylamino-propyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid og N-hydroksysuksinimid eller annen sammenlignbar karboksylaktiverende gruppe i et inert løsningsmiddel, så som N,N-dimetylformamid, tetrahydrofuran eller acetonitril, til dannelsen av en aktivert ester, så som N-hydroksysuksinimidesteren beskrevet her. Disse aktive estere kan isoleres i ren form ved å fjerne de flyktige løsningsmidler og kromatografi på et passende medium, så som BIOSIL A™. Alternativt kan koblingsreaksjonen stoppes med en flerverdig karboksylsyre, filtreres og organiske løsninsmidler destilleres av, og det rå produkt kan benyttes i følgende trinn uten ytterligere rensing. Dette er spesielt nyttig hvis den aktive ester er vanskelig å håndtere, så som når

Det siste trinn i konstruksjonen av konjugatene i henhold til denne patentsøknad innebærer omsetning av en aktivert ester (struktur C) med et målsøkende molekyl, som vist i skjema 1. Dette gir en forbindelse med struktur D,

19 11 9 9

hvor Z1, Z<z>, Alk<1>, Sp<1>, Ar, Sp<z> og Alkz er som definert ovenfor, m er 0,1 til 15, og Z er et protein så som en vekstfaktor eller et mono- eller polyklonalt antistoff,

deres antigen-gj enkj eimende fragmenter, eller deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker eller et steroid, hvor en kovalent binding til et protein er et amid dannet i omsetningen med "m"-lysin-sidekjeder, og den kovalente binding til et steroid er et amid eller en ester.

Denne konjugeringsreaksjon kan utføres i forskjellige passende buffere, så som borat, fosfat eller HEPES, ved lett basisk pH (pH ~ y ^ £)en en(jelige konstruksjon kan deretter renses ved passende metoder, så som gel-eksklusjons-kromatografi, for å fjerne ikke tilknyttet medikament og aggregater for å gi monomere konjugater. Denne sekvens av trinn utgjør fremgangsmåte A, slik som beskrevet mer i detalj i eksempeldelen av denne patentsøknad.

Alternative fremgangsmåter for å danne konjugatene i skjema 1 er også innbefattet, som vist i skjema 2.

F.eks. kan linkeren (struktur A som definert ovenfor) omdannes til en aktiv ester og omsettes med det målsøkende molekyl før omsetningen med medikamentet.

111 9 Slik manipulering omdanner struktur A til struktur E, hvor Z , Alk , Sp , Ar, Sp

9 9 3

og Alk<z> er som definert ovenfor, Z<z> er et oksygenatom, og Z<J> er halogen, -N3,

Den aktiverte ester omsettes så med bæreren for å danne struktur F, hvor Z<*>,

119 9 9

Alk1, Sp<1>, Ar, SpA og Alk^ er som definert ovenfor, Z er et oksygenatom, m er ca. 1 til ca. 20, og Z<3> er et protein valgt blant mono- og polyklonale antistoffer, deres antigen-gjenkjennende fragmenter, og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker og vekstfaktorer og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker, hvor en kovalent binding til proteinet er et amid dannet ved omsetning med "m"-lysin-sidekjeder, eller et steroid, hvor den kovalente binding til steroidet er et amid eller en ester.

Så snart det målsøkende molekyl er blitt modifisert med linkeren, kan det omsettes med en forbindelse med struktur Q-Sp-SS-W, som selv er utledet fra et metyltritio-antitumor-antibiotika, og hvor W og Sp er som definert ovenfor, og Q er H2NHNCO-, H2NHNCS-, H2NHNCONH-, H2NHNCSNH- eller H2NO-, for å

fremstille en forbindelse med struktur D (se ovenfor).

Denne sekvens av trinnene i skjema 2 utgjør fremgangsmåte B i eksempel-seksjonen av denne patentsøknad. Lignende antistoff-karbonylsammensetninger er dekket i US-patent nr. 5.144.012 nevnt ovenfor. De fleste linkerne som er eksem-plifisert her er nye, og har den fordel at et meget bredere utvalg av strukturelle typer og dermed et meget bredere utvalg av stabile typer er påvist. Som et spesifikt eksempel ga acetofenonlinkerne, som er nye i denne patentsøknad, konjugater med bedre hydrolytiske medikament-frigivelsesegenskaper, og som er sterkere når de benyttes sammen med eksemplene på antistoffer som er vist her. Spesielt ga de to konjugatene fremstilt av h-P67.6 under anvendelse av 4-formylbenzenpropansyre eller 4-acetylbenzenbutansyre kondensert med calicheamicin-N-acetylgamma-hydrazid (de to konjugatene er kun forskjellige i det at Z<*> = -H, henholdsvis -CH^, i struktur 3 i figur 1) in vitro IC^-verdier på 1,0 og 0,012 ng/ml, og spesifisitets-indices på henholdsvis 950 og 26.000. Selv om det kan sees at de acetofenonbaserte linkerne er overlegne i dette tilfelle, er det ikke nødvendigvis lett å forutse hvilken linker som er overlegen i enhver målsøknings-middel/medikament-konstruksjon.

Vurdering av de biologiske egenskaper til konjugatene inkluderte å måle deres evne til å gjenkjenne antigenet på målcellelinjer, i forhold til det umodifiserte antistoff, og å bestemme deres selektivitet og cytotoksiske potensialer, ved å benytte følgende fremgangsmåter: Relativ immunoaffinitet til konjugatene bestemmes i en konkurrerende bindingsmåling hvor varierende konsentrasjoner av testkonjugat tillates å

konkurrerere med en fastsatt mengde av det samme antistoff merket med 1ZJI-Bolton Hunter-reagens med hensyn til binding til et fastsatt antall celler. For m-eller h-P67.6 benyttes HEL 92.1.7-menneske-erytroleukemiceller [ATCC (American Type Culture Collection) TIB 180] i en konsentrasjon på 10 n celler/ml, for CT-M-01 benyttes cellelinje A2780DDP (E.M. Newman et al., "Biochem. Pharmacol." 37, 443 (1988)), og form- ellerh-A33 benyttes cellelinje COLO 205 (ATCC CCL 222). Konsentrasjonen av testkonjugat som kreves for å oppnå 50% inhibering av bindin-gen av det merkede antistoff til målceller, sammenlignes med konsentrasjonen av et referansepreparat av naturlig antistoff som kreves for 50% inhibering.

Prøver for måling justeres til ~300 /lg protein/ml i mediet og seks fortløpende fire gangers fortynninger av hver gjøres i stand i mediet (RPMI-1640 inneholdende 5% varme-inaktivert kalvefosterserum), for totalt syv konsentrasjoner av hver prøve. Referanse-antistoffet fortynnes på samme måte. En alikvot på 0,05 ml av hver fortynning overføres til et 12x75 mm plastrør, og 0,05 ml av merket referanse-antistoff tilsettes i en mengde av 4 /Ag/ml. Rørene blandes og avkjøles ved 4 oC. Deretter tilsettes 0,1 ml avkjølt cellesuspensjon til hvert rør. Alle rørene blandes

o

igjen, og inkuberes i 1 time ved 4 C.

Kontroller for å bestemme maksimal binding og ikke-spesifikk binding inngår i hver måling. Maksimal binding bestemmes ved å blande 0,05 ml medium,

0,05 ml I-antistoff og 0,1 ml celler. Ikke-spesifikk binding bestemmes ved å blande 0,05 ml av 500 fi<g>/ ml naturlig antistoff, 0,05 ml jodinert antistoff og 0,1 ml celler.

Ved slutten av inkubasjonen vaskes cellene to ganger, ved sentrifugering og gjenoppslemming, med 3 ml kald PBS hver gang. Cellene resuspenderes i 0,5 ml PBS, overføres til rene rør, og radioaktivitet bestemmes i en gamma-teller.

Prosent inhibering av binding beregnes med følgende ligning:

De prosentvise inhiberingsverdier avsettes for sammenligning med prøve-konsentrasjonene, og av de resulterende kurver interpoleres de prøvekonsentra-sjoner som gir 50% inhibering av binding (IC^q). Den relative immunoaffinitet for hvert testet konjugat bestemmes deretter som følger:

Cytotoksisitet-aktivitet bestemmes ved en in vitro pulsmåling, hvor varierende konsentrasjoner av testkonjugat inkuberes med antigen-positive og antigen-negative celler i 1 time, og deretter kultiveres i 3 dager. Levedyktighet måles ved [ Hjtymidin-innføring i løpet av de siste 24 timene av kultiveringen. Som et mål på styrke bestemmes konsentrasjonen av testkonjugat som kreves for å

inhibere [ H]tymidin-innføring ved 50% (IC^q) ut fra titreringskurven. Spesifisiteten bestemmes ved å sammenligne IC^Q-verdiene for antigen-positive og antigen-negative celler for P67.6, A33 og m-CT-M-01, eller ved å bruke et konjugat av det samme medikament med det ikke-målsøkende antistoff P67.6 for h-CT-M-01-

konjugater eller MOPC-21 for anti-Tac-konjugater. MOPC-21 (F. Melchers, "Biochem. J." 119, 765 (1970)) er et antistoff som ikke gjenkjenner noe normalt forekommende, fysiologisk viktig antigen.

For P67.6 benyttes antigen-positive HL-60-menneskepromyelocytiske leukemiceller (ATCC CCL 240) og antigen-negative Raji-menneske-Burkitt-lymfomaceller (ATCC CCL 86). For A33 benyttes antigen-positive COLO 205-celler og antigen-negative Raji-celler, og for h-CT-M-01 benyttes ZR-75-1-celler (ATCC CRL1500). For m-CT-M-01 benyttes antigen-positive A2780DDP-celler og antigen-negative Raji-celler, og for h-CT-M-01 benyttes ZR-75-1-celler (ATCC CRL1500). Celler oppsamles ved sentrifugering, telles og gjenoppslemmes i friskt medium (RPMI-1640 + 5% varme-inaktivert kalvefosterserum + antibiotika) ved en cellekonsentrasjon på _106/ml.

Prøver for måling rejusteres til ~1 jug/ml medikament-ekvivalenter i mediet, og fem fortløpende ti gangers fortynninger av hver gjøres i stand i mediet, totalt seks konsentrasjoner av hver prøve. I tilegg inkluderes en kontroll av mediet i hvert prøvesett, såvel som calicheamicin-N-acetylgamma- som en medikamentkontroll. En alikvot på 0,1 ml cellesuspensjon helles i 17x100 mm plastrør som inneholder 0,1 ml prøve, og en separat serie av rør gjøres i stand for hver cellelinje. En kapsel settes løst på rørene, og de inkuberes i 1 time ved 37 OC i fuktig atmosfære med 5% CC>2 i luften. Ved slutten av inkuberingen vaskes cellene to ganger ved sentrifugering, og gjenoppslemmes med 8 ml medium hver gang. Cellepellets resuspenderes i 1 ml medium og legges på plate in triplo på mikrotiterplater med 96 brønner, idet hver brønn er på 0,2 ml. Platene inkuberes i 2 dager ved 37 oC som ovenfor. Deretter fjernes 0,1 ml medium fra hver brønn og erstattes med 0,1 ml frisk medium inneholdende 0,1 fiCi [ H]tymidin. Platene returneres til inkubatoren for å stå der én dag til. Platene fryses og tines, og celler høstes på glassfiber-filtermatter.

Mengden av [ FTJtymidin innført bestemmes ved væske-scintillasjonstelling.

Gjennomsnittet av målt cpm i kulturene in triplo av hver prøvefortynning beregnes, og prosent inhibering av [ H]tymidin-innføring beregnes ved hjelp av følgende ligning, hvor verdiene for ingen inhibering og maksimal inhibering kommer fra henholdsvis mediumkontrollene og den høyeste konsentrasjon av calicheamicin-N-acetylgamma:

De prosentvise inhiberingsverdier avsettes for sammenligning med prøve-konsentrasj onene, og av de resulterende kurver interpoleres den prøvekonsentrasjon som gir 50% inhibering av [<J>H]tymidin-innføring (IC^q). For P67.6-, A33- og m-CT-M-01 -konjugatene beregnes spesifisiteten av et spesielt konjugat for antigen-positive celler ved å ta forholdet mellom IC^q mot ikke-målceller og IC^q mot målceller. Det samme forhold beregnes for det frie medikament. Deretter, for å korrigere for innebygde forskjeller i sensitivitet mellom de to cellelinjer og medikamentet, beregnes spesifisitetsindeks for hver prøve som følger:

For konjugater av Anti-Tac eller h-CT-M-01 beregnes spesifisitetsindeksen som forholdet mellom IC^Q-verdiene for det ikke-målsøkende konjugat og det målsøkende konjugat som følger:

IN VIVO ANTI-TUMORANALYSE

Menneske-tumorer (enten ~10 -10 celler eller 5 til 8 fragmenter av faste tumorer med størrelse 2 mm<3>) implanteres subkutant i atymiske mus (nakne mus), og testprøver inokuleres intraperitonealt (ip) ved flere doseringsnivåer i henhold til en q 4 dager x 3 plan, idet det startes 2-3 dager etter tumor-implantering med 5 mus pr. testgruppe, og 10 i saltoppløsnings-kontrollgruppen. Tumor-masse anslås ved å måle tumorlengden og -bredden en gang ukentlig inntil 42 dager etter tumorimplan-tering med en Fowler ultra CAL II elektronisk "caliper" og ved å anvende formelen: mg tumor = {lengde(mm) x bredde(mm)}/2. Tumorvekst-inhibering beregnes som forholdet mellom gjennomsnittlig tumormasse hos behandlede dyr sammenlignet med ubehandlede kontroller, og uttrykkes som "% T/C". (0% T/C betyr ingen påvisbar tumor. Alle kontroUdyr utvikler rutinemessig lett målbar tumor).

For P67.6-konjugater legges menneske-leukemibenmargsceller som er CD-33-positive på plate i nærvær av 2 ng/ml medikament-ekvivalenter. Antall kolonier som dannes telles og rapporteres som prosenten, mot en kontroll som består av et h-CT-M-01 -konjugat som ikke gjenkjenner CD-33-antigenet. Alle de rapporterte data ble fremskaffet med benmarg fra én pasient, hvis leukemiceller hadde god antigen-ekspresjon og god respons overfor denne generelle type behandling.

For anti-Tac ble perifert blod fra CML-pasienter testet. Stamceller for celler av de forskjellige hematopoetiske avstamninger kan oppdages ved å kultivere benmargceller og blodceller på en halvfast matrise så som metylcellulose, og å observere dannelsen av kolonier som inneholder modne, differensierte celler. Det finnes stamceller som formerer seg vegetativt for å danne kolonier av granulocytter eller makrofager, eller begge, kalt kolonidannende enheter for granulocytter/ makrofager (CFU/GM). Noen CFU/GM danner kolonier innen syv dager (D7 CFU/GM), og noen krever fjorten dager for kolonidannelse (Dl4 CFU/GM) [N. Jacobsen, et al., "Blood" 52: 221, (1978), og Ferrero D et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 80: 4114, (1983)]. Inhibering av veksten av D14 CFU/GM på blodceller behandlet med anti-Tac, ble sammenlignet med dem behandlet med ikke-målsøkende MOPC 21-konjugater. Antallet D14 CFU/GM-kolonier avsettes for sammenligning med prøvekonsentrasjoner, og av de resulterende kurver interpoleres prøvekonsentrasjonen som gir 50% inhibering av D14 CFU/GM-kolonivekst. Spesifisitet ble målt ved forholdet mellom IC^q for det ikke-målsøkende konjugat og IC50 for det målsøkende konjugat. Normalt blod produserer ikke CFU/GM-kolonier, og normal benmarg-D14 CFU/GM-kolonier inhiberes ikke av anti-Tac-konjugater.

Oppfinnelsen er ytterligere beskrevet ved hjelp av følgende fremstillinger og eksempler. Fremstillingene beskriver syntese av forbindelser som er nyttige i denne oppfinnelse, men for hvilke det ikke finnes tidligere kjent teknikk. Eksemplene beskriver syntesen av forbindelser som er nyttige og nye i denne oppfinnelse.

SYNTESE AV STRUKTURENE A (Skjema 1 og Skjema 2)

EKSEMPEL 1, FORBINDELSE 5

4-( 2- oksoetoksy) hen7enpropansyrp;

4-hydroksybenzenpropansyre (500 mg, 3,01 mmol) får omsettes med 910 mg (7,52 mmol) allylbromid ved hjelp av den samme fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 2, for å få 610 mg (82%) 2-propenyl-4-(2-propenyloksy)benzenpropan-syreester i form av en f arveløs olje. Produktet benyttes i neste omsetning uten ytterligere rensing. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er overensstemmende med det ønskede produkt: IR (ren) 3450, 1740, 1650, 1610, 1510 cm"<1>, MS (CI low res) m/e 247 (M+H), 229, 215, 187,175. Analyse beregnet for C15<H>1803: C: 73,15, H:

7,37. Funnet: C: 73,09, H: 6,74. 2-propenyl-4-(2-propenyloksy)benzenpropansyreester (271 mg, 1,1 mmol) behandles med 0,14 ml (1,38 mmol) 10M natriumhydroksydløsning i henhold til samme som fremgangsmåte beskrevet i eksempel 2, for å få 196 mg (86%) 4-(2-propenyloksy)benzenpropansyre i form av et hvitt pulver. Produktet benyttes i neste omsetning uten ytterligere rensing: smp. 88-89°. <!>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3200,1720,1700,1610 cm"<1>, MS (CI low res) m/e 207 (M+H), 189, 175, 147. Analyse beregnet for C12<H>14<0>3<: >C: 69,89, H: 6,84. Funnet: C: 69,87, H: 6,68.

4-(2-propenyloksy)benzenpropansyre (120 mg, 0,58 mmol) behandles med ozon ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2, for å få 100 mg (82%) 4-(2-oksoetoksy)benzenpropansyre i form av et hvitt pulver: smp. 95-100°. <*>H NMR er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3400, 1740, 1720, 1610

cm"<1>, MS (CI low res) m/e 207, 191, 179, 165, 149.

EKSEMPEL 2, FORBINDELSE 6

3-( 7.- oksoetoksy) hen7. osyre

En blanding av 1,0 g (7,24 mmol) 3-hydroksybenzosyre, 3,0 g (25,3 mmol) allylbromid og 5 g (36,2 mmol) kaliumkarbonat i 4 ml N,N-dimetylformamid omrøres ved romtemperatur i 12 timer. Blandingen fortynnes med 20 ml eter og vaskes 5 ganger med 20 ml vann. Det organiske sjikt vaskes deretter i rekkefølge med 20 ml mettet natriumbikarbonatløsning og 20 ml mettet natriumkloridløsning. Det organiske sjikt fraskilles og tørkes over magnesiumsulfat. Blandingen filtreres og den organiske løsning konsentreres under våkum for å få 1,4 g (88%) 3-(2-propenyloksy)benzosyre-2-propenylester i form av en klar, farveløs olje. Produktet benyttes i neste omsetning uten ytterligere rensing. H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt: IR (KBr) 1720, 1650, 1600 cm"<1>, MS (CI low res) m/e 219 (M+H), 203, 175, 161. Analyse beregnet for C13H1403: C: 71,54, H: 6,47. Funnet: C: 70,31, H: 5,97.

En løsning av 917 mg (4,2 mmol) 3-(2-propenyloksy)benzosyre-2-propenyl-ester i 9 ml metanol/vann (3:2) ved romtemperatur, behandles med 0,53 ml (5,25 mmol) 10M natriumhydroksydløsning. Løsningen får omrøres i 1 time, og surgjøres deretter med 5 ml 10% natriumbisulfatløsning og ekstraheres med 25 ml etylacetat. Det organiske sjikt vaskes med mettet natriumkloridløsning, tørkes over magnesiumsulfat, og konsentreres under våkum for å få 732 mg (97%) 3-(2-propenyloksy)benzosyre i form av et hvitt pulver. Produktet benyttes i neste omsetning uten ytterligere rensing: smp. 78-79°. <!>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3000,1690,1620,1590 cm"1, MS (CI low res) m/e 179 (M+H), 161, 135. Analyse beregnet for C10<H1>0O3: C: 67,41, H: 5,66. Funnet: C: 67,37, H: 5,59.

En løsning av 300 mg (1,68 mmol) 3-(2-propenyloksy)benzosyre i 5 ml metylenklorid avkjøles til -78 oC. Ozon innføres ved å boble gassen i løsningen gjennom et glassrør inntil en blå farve holder seg. Løsningen spyles deretter med en strøm av argon, og 1 ml metylsulfid tilsettes. Løsningen fortynnes med 20 ml eter og vaskes med vann. Det organiske sjikt fraskilles, og får stå over magnesiumsulfat og deretter konsentreres under våkum for å få 283 mg (93%) 3-(2-oksoetoksy)-benzosyre i form av en farveløs olje. Produktet benyttes i neste omsetning uten ytterligere rensing: smp. 120-130°. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3400, 3000, 1680, 1590 cm"<1>, MS (CI low res) m/e 181 (M+H), 163, 139, 119.

FREMSTILLING 3, FORBINDELSE 7

4-( 4- acety1 fen oksy) hutan syre

En løsning av 0,90 g (6,61 mmol) 4'-hydroksyacetofenon og 1,93 g (9,92 mmol) etyl-4-brombutyrat i 1,80 ml N,N-dimetylformamid omrøres under tørre betingelser i 48 timer med 2,74 g (19,8 mmol) kaliumkarbonat og 0,110 g (0,66 mmol) kaliumjodid. Reaksjonsblandingen inndampes deretter under våkum, og resten deles mellom eter og vann. Den organiske fase fraskilles, vaskes tre ganger med vann, tørkes med magnesiumsulfat, filtreres og inndampes under våkum for å få et brunt faststoff. Dette omkrystalliseres fra en varm eter-heksanblanding. De beige krystallene lufttørkes, og etterlater 0,84 g (51%) 4-(4-acetylfenoksy)butan-syreetylester: smp. 59-61°C. IR (KBr) 1740,1670 cm"<1>, ltt NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt: MS (FAB) m/e 251,1285 A = -0,2

mm/i (M<+> + H). Analyse beregnet for C14<H1>804: C: 67,18, H: 7,25, O: 25,57.

Funnet: C: 67,16, H: 7,16, O: 25,68.

En prøve av 0,25 g (1,00 mmol) 4-(4-acetylfenoksy)butansyre-etylester (eksempel 1) oppløses i 15 ml metanol/vann (3:2) under omrøring. Deretter tilsettes 0,21 g (1,50 mmol) kaliumkarbonat, og omsetningen omrøres i 18 timer i argonatmosfære. Deretter inndampes reaksjonsblandingen under vakuum, og resten oppløses i 20 ml av en 0,1N løsning av natriumhydroksyd. Denne basiske løsning vaskes med eter, den vandige fase surgjøres ved tilsetning av natriumbisulfat, filtreres og inndampes, og den resulterende blanding ekstraheres med etylacetat. Denne løsning tørkes deretter med magnesiumsulfat, filtreres og inndampes, og etterlater et elfenbenshvitt faststoff. Dette krystalliseres fra etylacetat med tilsetning av et likt volum av eter. Dette gir 0,18 g (80%) 4-(4-acetylfenoksy)butansyre i form av lys beige krystaller: smp. 148-50°C, IR (KBr) 1730, 1650 cm"<1>. lB NMR CDC1

3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 223,0974 A = -

0,4 mm/i (M<+> + H). Analyse beregnet for C12<H>14<0>4: C: 64,85, H: 6,35, O: 28,80.

Funnet: C: 64,61, H: 6,36, O: 29,03.

FREMSTILLING 4, FORBINDELSE 8

4-( 3- formy1fenoksy) hi] tansyre

3-hydroksybenzaldehyd (900 mg, 7,37 mmol) behandles med 2,16 g (11,05 mmol) etyl-4-brombutyrat, 3,06 g (22,11 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (110 mg, 0,74 mmol) natriumjodid under de samme betingelser som i fremstilling 3, for å få en gul olje. Rensing ved flash-kromatografi under anvendelse av heksan/etylacetat (10:1) ga 1,6 lg 4-(3-formylfenoksy)butansyreetylester i form av en lys gul olje. % NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 1730, 1700, 1600, 1580 cm"<1>, MS (CI low res) m/e 237 (M+H), 191, 115.

En løsning av 385 mg (1,63 mmol) 4-(3-formylfenoksy)butansyreetylester og 850 mg (6,15 mmol) kaliumkarbonat omrøres i 6 ml metanol/vann (3:2) ved romtemperatur i 8 timer. Løsningen konsentreres deretter under våkum. Resten oppløses i 10 ml 0,IN natriumhydroksydløsning og vaskes med 20 ml eter. Det vandige sjikt fraskilles og surgjøres med natriumbisulfat, og ekstraheres med etylacetat. Det organiske sjikt vaskes med mettet natriumkloridløsning, og tørkes deretter over magnesiumsulfat. Blandingen filtreres deretter, og konsentreres under våkum for å få 315 mg 4-(3-formylfenoksy)butansyre i form av et hvitt faststoff.

Produktet benyttes i neste reaksjon uten ytterligere rensing, smp. 62-63°. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr)

3400, 3000, 1700, 1690, 1590 cm-<1>, MS (CI low res) m/e 209 (M+H), 191, 123.

FREMSTILLING 5, FORBINDELSE 9

4-( 4- formy1fenoksy) hutansyre

4-hydroksybenzylalkohol (1 g, 8,06 mmol) behandles med 1,73 g (8,86 mmol) etyl-4-brombutyrat, 3,34 g (24,2 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (120 mg, 0,81 mmol) natriumjodid under de samme betingelser som beskrevet i fremstilling 3 for å få 1,73 g 4-[4-(hydroksymetyl)fenoksy]butansyre-etylester i form av en lys brun olje (90%). Produktet benyttes i neste omsetning uten ytterligere rensing. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 3400, 1730, 1610, 1580, 1510 cm'1, MS (CI) m/e 238, 221, 115.

En blanding av 230 mg (0,97 mmol) 4-[4-(hydroksymetyl)fenoksy]butansyre-etylester, 624,2 mg (2,9 mmol) pyridiniumklorkromat og en katalytisk mengde av en 4 A molekylsikt omrøres i 2 ml metylenklorid ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen fortynnes med 20 ml eter, filtreres og konsentreres under våkum for å få 175 mg (76%) av en lys gul olje. Oljen (150 mg, 0,63 mmol) oppløses i 2,3 ml metanol/vann (3:2), og behandles med 307 mg (2,22 mmol) kaliumkarbonat i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4, for å få 100 mg (75%) 4-(4-formylfenoksy)butansyre i form av et hvitt pulver. Produktet benyttes uten ytterligere rensing. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3000, 1740, 1660 cm'1, MS (CI (low res)) m/e 209 (M+H), 191, 123.

FREMSTILLING 6, FORBINDELSE 10

4-( 4- a r- Pityl - 7 - m etyl fen oksy) hi i tan syre

Idet fremgangsmåten ifølge fremstilling 3 benyttes, alkyleres 2,00 g (13,32 mmol) 4-hydroksy-3-metylacetofenon med etyl-4-brombutyrat. Dette gir 3,45 g (98%) 4-(4-acetyl-2-metylfenoksy)butansyre-etylester i form av en gylden olje, etter tørking ved 75°C under våkum. IR (ren) 1740, 1675 cm"<1>, <l>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 265 (M<+> + H). Analyse beregnet for C^r^øCV C: 68,16, H: 7,63, O: 24,21. Funnet: C: 67,92, H: 7,44, O: 24,64. Idet fremgangsmåten ifølge fremstilling 3 benyttes, forsåpes 2,50 g (9,46 mmol) 4-(4-acetyl-2-metylfenoksy)butansyre-etylester for å få den ønskede forbindelse i form av et faststoff. Det omkrystalliseres fra etylacetat/eter, og etterlater 1,32 g (59%) 4-(4-acetyl-2-metylfenoksy)butansyre som hvite krystaller, smp. 114-16°C. IR (KBr) 1730, 1650 cm"<1.><*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 237 (M<+> + H). Analyse beregnet for C13H1604: C: 66,08, H: 6,83, O: 27,09. Funnet: C: 65,88, H: 6,92, O: 27,20.

FREMSTILLING 7, FORBINDELSE 11

4-(4-fnrTTiy1-7-rnetoVsyferinVsy)r)iitaTisyrR 4-hydroksy-3-metoksybenzylalkphol (lg, 6,49 mmol) behandles med 1,73 g (7,13 mmol) etyl-4-brombutyrat, 2,69 g (19,46 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (97,22 mg, 0,65 mmol) natriumjodid som beskrevet i fremstilling 3, for å få 821 mg 4-[4-(hydroksymetyl)-2-metoksyfenoksy]butansyre-etylester i form av en lys brun olje (47%). <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 3500, 1730, 1620, 1600 cm"<1>, MS (CI (low res)) m/e 269 (M+H), 251, 223, 195.

4-[4-(hydroksymetyl)-2-metoksyfenoksy]butansyre-etylester (431 mg, 1,61 mmol) behandles med 1,0 g (4,8 mmol) pyridiniumklorkromat ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5, for å få 280 mg (65%) 4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy)butansyre-etylester i form av en farveløs olje. <!>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 1730, 1690,

1600, 1580 cm-<1>.

4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy)butansyre-etylester (240 mg, 0,90 mmol) oppløses i 3 ml metanol/vann (3:2) og behandles med 435 mg (3,15 mmol) kaliumkarbonat i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4 for å få 125 mg (58%) 4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy)butansyre i form av et hvitt pulver, smp. 143-148°. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3575, 3500, 1720, 1700, 1680, 1600, 1585 cm"<1>, MS (CI (low res)) m/e 239 (M+H), 221, 207, 153.

FREMSTILLING 8, FORBINDELSE 12

4- fnrmy1hCTi7im<p>mpansyre

En blanding av 253 mg (1,44 mmol) 4-formylkanelsyre og 32,61 mg platinaoksyd i 10 ml metanol omrøres over natten ved romtemperatur i en atmosfære av hydrogen tilført med en ballong. Blandingen filtreres gjennom celitt og konsentreres under våkum. Resten oppløses i 0,1N natriumhydroksydløsning og vaskes med eter. Det vandige sjikt surgjøres deretter, og produktet ekstraheres med etylacetat. Det organiske sjikt vaskes med mettet natriumkloridløsning og tørkes over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet fjernes under våkum for å gi en ikke skillbar blanding av 4-formylfenylpropansyre og andre reduksjonsprodukter. Blandingen benyttes i neste omsetning uten karakterisering eller ytterligere rensing.

FREMSTILLING 9, FORBINDELSE 13

4-( ?. J3- diTnp. toksy- 5-fnrmy1fp.riok^^

Idet fremgangsmåten ifølge fremstilling 3 benyttes, alkyleres 3,30 g (18,41 mmol) 3,4-dimetoksy-5-hydroksybenzaldehyd med etyl-4-brombutyrat. 4-(2,3-dimetoksy-5-formylfenoksy)butansyre-etylester oppnås i form av en guloransje olje etter tørking under høyt våkum ved 60°C (5,45 g, 100%): IR (ren) 1735, 1690 cm"<1>,

<*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 297 (M<+> + H). Analyse beregnet for <C>15<H>20O6: C: 60,80, H: 6,80, O: 32,40.

Funnet: C: 60,51, H: 6,86, O: 32,63.

Idet fremgangsmåten ifølge fremstilling 3 benyttes, forsåpes en prøve av 4,70 g (15,86 mmol) 4-(2,3-dimetoksy-5-formylfenoksy)butansyre-etylester, hvilket gir den ønskede forbindelse i form av et kremfarvet faststoff. Dette omkrystalliseres fra etylacetat/eter og etterlater 3,65 g (86%) 4-(2,3-dimetoksy-5-formylfenoksy)butansyre som elfenbenshvite krystaller, smp. 90-92°C. IR (KBr) 1710, 1690 cm"<1>, lU NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 269 (M+ + H). Analyse beregnet for C13H1606: C: 58,20, H: 6,01, O: 35,79.

Funnet: C: 58,10, H: 6,09, O: 35,81.

FREMSTILLING 10, FORBINDELSE 14

4-( 4- fir, e, ry1- 236- dimetoksyfenoksy) biitansyre

Idet fremgangsmåten i fremstilling 3 benyttes, behandles 2,61 g (13,32 mmol) 4-acetyl-2,6-dimetoksyfenol med etyl-4-brombutyrat. Dette gir det ønskede produkt etter tørking ved -70 OC, under høyt våkum, i form av en brun olje. Denne kromatograferes på en kolonne av kiselgel, og elueres med en 1:1 blanding av eter/heksan, og etterlater 0,40 g (10%) 4-(4-acetyl-2,6-dimetoksyfenoksy)butansyre-etylester som en farveløs olje. IR (ren) 1735,1675 cm"<1>, % NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 311,1489 A = +0,6 mm/i (M<+> + H). Analyse beregnet for C16H2206: C: 61,92, H: 7,14, 0: 30,94.

Funnet: C: 61,48, H: 7,04, O: 31,48.

Ved å følge fremgangsmåten i fremstilling 3, behandles 0,179 g (0,577 mmol) 4-(4-acetyl-2,6-dimetoksyfenoksy)butansyre-etylester med kaliumkarbonat, som gir et elfenbenshvitt faststoff. Omkrystallisering fra etyleacetat/heksan gir 4-(4-acetyl-2,6-dimetoksyfenoksy)butansyre i form av hvite krystaller (0,14 g, 88%),

smp. 122-24°C. IR (KBr) 1735, 1660 cm"<1>. <l>H NMR (CDC13) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 283 (M<+> + H). Analyse beregnet for C14<H>1806: C: 59,57, H: 6,43, O: 34,01. Funnet: C: 59,34, H: 6,40, O: 34,26.

FREMSTILLING 11, FORBINDELSE 15

4-( 4- acety1- 2- metoksyfenoksy) hutansyre

Idet fremgangsmåten i fremstilling 3 benyttes, alkyleres 2,21 g (13,32 mmol) 4-hydroksy-3-metoksyacetofenon, og gir et faststoff. Dette omkrystalliseres som i fremstilling 3, og etterlater 3,23 g (86%) 4-(4-acetyl-2-metoksyfenoksy)butansyre-etylester som hvite krystaller, smp. 53-55°C. IR (KBr) 1745, 1675 cm"<1>. lU NMR

(CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 281 (M<+>

+ H). Analyse beregnet for C15H20<O>5<:> C: 64,27, H: 7,19, O: 28,54. Funnet: C:

64,26, H: 7,05, O: 28,69. Ved å følge fremgangsmåten i fremstilling 3, forsåpes 2,74 g (9,78 mmol) 4-(4-acetyl-2-metoksyfenoksy)butansyre-etylester. Dette gir 4-(4-acetyl-2-metoksyfenoksy)butansyre som elfenbenshvite krystaller etter omkrystallisering fra etylacetat (1,61 g, 87%), smp. 161-63°C. IR (KBr) 1720, 1670 cm"<1>. <!>H NMR (CDC1 3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 253 (M<+> + H).

Analyse beregnet for C13H1605: C: 61,90, H: 6,39, O: 31,71. Funnet: C: 61,75, H: 6,37,0: 31,88.

FREMSTILLING 12, FORBINDELSE 16

4-[ 4-( 3- nksnhiityl)fp.nnksy]hntansyre

4-hydroksybenzylaceton (2 g, 12,18 mmol) behandles med 2,61 g (13,4 mmol) etyl-4-brombutyrat, 5,05 g (36,5 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (182 mg, 1,22 mmol) natriumjodid i 2 ml N,N-dimetylformamid som beskrevet i fremstilling 3, for å få 2,73 g 4-[4-(3-oksobutyl)fenoksy]butan-etylester i form av en lys brun olje (80%), smp. 32-34°- lU NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 1730, 1720, 1610, 1580, 1510

cm"<1>. MS (CI (low res)) m/e 279 (M + H) 233,221. Analyse beregnet for C16<H>22

04: C: 69,04, H: 7,97. Funnet: C: 68,33, H: 7,68.

4-[4-(3-oksobutyl)fenoksy]butansyre-etylester (716 mg, 2,57 mmol) oppløses i 5 ml metanol/vann (3:2) og behandles med 1,24 g (9,0 mmol) kaliumkarbonat i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4, for å få 385 mg (60%) 4-[4-(3-oksobutyl)fenoksy]butansyre i form av et hvitt pulver, smp. 97-99°. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 1730,

1700, 1620, 1520 cm"<1>. Analyse beregnet for C14H18<0>4<:> C: 67,18, H: 7,25.

Funnet: C: 66,55, H: 7,09.

EKSEMPEL 13, FORBINDELSE 17 4-( 2- acery1- 5- mRtoksyfRnoksy) butansyre

Ved å følge fremgangsmåten i fremstilling 3, alkyleres 2,21 g (13,32 mmol) 2-hydroksy-4-metoksyacetofenon, og opparbeides som før, og etterlater 3,40 g (91%) 4-(2-acetyl-5-metoksyfenoksy)butansyre-etylester som en gul olje. IR (ren)

1740, 1665 cm"<1>. <*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 281 (M<+> + H). Analyse beregnet for C15<H>20<O>5: C: 64,27, H: 7,19, O: 28,54. Funnet: C: 64,06, H: 7,24, O: 28,70.

Idet fremgangsmåten i fremstilling 3 benyttes, behandles 2,50 g (8,92 mmol) 4-(2-acetyl-5-metoksyfenoksy)butansyre-etylester med kaliumkarbonat, hvilket gir et hvitt faststoff. Dette omkrystalliseres fra etylacetat/eter, og etterlater 1,61 g (71%) 4-(2-acetyl-5-metoksyfenoksy)butansyre i form av farveløse krystaller, smp.

127-29°C. IR (KBr) 1720, 1655

cm"<1>. H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS

(FAB) m/e 253 (M<+> + H). Analyse beregnet for C13H1605: C: 61,90, H: 6,39, O: 31,71. Funnet: C: 61,82, H: 6,37, O: 31,81.

FREMSTILLING 14, FORBINDELSE 18

4-[ 4-( 3- oksopropy1) fp, noksy] hi] tansyrfi

Ved å følge fremgangsmåten i fremstilling 3, alkyleres 2,80 g (18,41 mmol)

3-(4-hydroksyfenyl-l-propanol) med etyl-4-brombutyrat. Produktet tørkes ved 70o C, under høyt våkum, og etterlater 4,70 g (96%) 4-[4-(3-hydroksypropyl)fenoksy]-butansyre-etylester som en farveløs olje. IR (ren) 3400 (br.), 1735 cm"<1>. <*>H NMR

(CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (CI) m/e 267 (M<+> +

H). Analyse beregnet for C^F^O^ C: 67,65, H: 8,33, O: 24,03. Funnet: C: 67,40, H: 8,20, O: 24,38.

Ved å benytte fremgangsmåten ifølge fremstilling 3, forsåpes 4,13 g (15,51 mmol) 4-[4-(3-hydroksypropyl)fenoksy]butansyre-etylester med kaliumkarbonat for å få et faststoff. Dette omkrystalliseres fra en etylacetat-heksanblanding, og gir 2,45 ( 66%) 4-[4-(3-hydroksypropyl)fenoksy]butansyre i form av hvite krystaller, smp.

92-94°C. IR (KBr) 3420 (br.), 1710 cm"<1>. <l>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (CI) m/e 239 (M<+> + H). Analyse beregnet for C

13<H>18°4<:> C: 65'53' H: 7'61' 0: 26'86- Funnet: C: 65>75> H: 7>87> 0: 26>38-

En 1,19 g (5,00 mmol) prøve av 4-[4-(3-hydroksypropyl)fenoksy]butansyre oppløses under omrøring i 250 ml metylendiklorid. Deretter tilsettes 3,77 g (17,49 mmol) pyridiniumklorkromat, idet blandingen omrøres i 4 timer, og deretter filtreres den gjennom en celitt-pute. Reaksjonsblandingen fortynnes så med et likt volum av eter, som utfeller salter. Denne blandingen filtreres deretter gjennom en kiselgel-pute, og filtratet inndampes, hvilket gir et brunt faststoff. Faststoffet omkrystalliseres fra en eter-heksanblanding, og gir 0,21 (18%) 4-[4-(3-oksopropyl)fenoksy]-butansyre i form av elfenbenshvite krystaller, smp. 100-03 OC. IR (KBr) 1715 cm-<1>. <*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (CI) m/e 237 (M<+> + H). Analyse beregnet for C13<H>1604: C: 66,09, H: 6,83, O: 27,09.

Funnet: C: 65,91, H: 6,72, O: 27,35.

EKSEMPEL 15, FORBINDELSE 20 4-[( 7- ar. p. ty1- 1- nfifTalRny1)riksy]hiitansyrp;

En 3,42 g (18,37 mmol) prøve av l-hydroksy-2-acetonafton alkyleres som i fremstilling 3, Det rå produkt tørkes under høyt våkum ved 60 OC for å få 5,21 g (94%) 4-[(2-acetyl-l-naftalenyl)oksy]butansyre-etylester i form av en gylden væske.

IR (nren) 1730, 1665 cm"<1>. <!>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 301 (M<+> + H). Analyse beregnet for Cjgl^øO^

C: 71,98, H: 6,71, O: 21,31. Funnet: C: 72,11, H: 6,58, O: 21,31.

Ved å benytte fremgangsmåten i fremstilling 3, forsåpes 2,84 g (9,46 mmol) 4-[(2-acetyl-l-naftalenyl)oksy]butansyre-etylester. Det rå produkt omkrystalliseres fra etylacetat/eter for å få 1,15 g (45%) 4-[(2-acetyl-l-naftalenyl)oksy]butansyre i form av gyldne krystaller, smp. 104-06°C. IR (KBr) 1720, 1640 cm"<1>. <!>H NMR

(CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 273 (M<+>

+ H). Analyse beregnet for C16<H>1604: C: 70,58, H: 5,92, O: 23,50. Funnet: C: 70,40, H: 5,89, 0:23,71.

FREMSTILLING 16, FORBINDELSE 21

4-[ 4-( 4- fhiorhen7. oy1) fenoksy] hutansyre

Ved å følge fremgangsmåten i fremstilling 3, alkyleres 3,98 g (18,41 mmol) 4-fluor-4'-hydroksybenzofenon med etyl-4-brombutyrat. De rå, gule faststoff omkrystalliseres fra eter, og gir 2,97 g (49%) 4-[4-(4-fluorbenzoyl)fenoksy]butansyre-etylester i form av hvite krystaller, smp. 57-59°C. IR (KBr) 1720, 1735, 1645

cm"<1.> H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS

(FAB) m/e 311 (M<+> + H). Analyse beregnet for C19H1904F: C: 69,08, H: 5,80, F:

5,75, O: 19,37. Funnet: C: 69,09, H: 5,62, F: 5,95, O: 19,34. Ved å benytte fremgangsmåten i fremstilling 3, forsåpes 0,48 g (1,45 mmol) 4-[4-fluorbenzoyl)fenoksy]butansyre-etylester. Det rå, hvite faststoffprodukt omkrystalliseres fra en eter-heksanblanding, og etterlater 0,16 (36%) 4-[4-(4-fluor-benzoyl)fenoksy]butansyre som hvite krystallter, smp. 109-111°C. IR (KBr) 1735, 1700, 1640 cm"1. NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 303 (M<+> + H). Analyse beregnet for C17H15<0>4F: C: 67,54, H: 5,00, F: 6,28, O: 21,18. Funnet: C: 67,28, H: 4,89, F: 6,41, O: 21,42.

EKSEMPEL 17, FORBINDELSE 22 4-( 4- flp, ery1fe, ny1)- 1 - piperayinvalfirinsyre 4'-piperazinoacetofenon (102 mg) oppløses i 1 ml N,N-dimetylformamid. Etter tilsetning av metyl-5-bromvalerat (0,077 ml) og kaliumkarbonat (69 mg), omrøres blandingen ved romtemperatur i 65 timer. TLC (10% MeOH/Cr^C^)

skulle vise kun én eneste produktflekk, uten rest av utgangsmateriale. Reak-sjonsløsningen inndampes under våkum. Resten tas opp i metylenklorid, vaskes to ganger med vann og tørkes over natriumsulfat. Inndamping av løsningsmidlet gir 137 mg 4-(4-acetylfenyl)-l-piperazinvalerinsyre-metylester i form av gule krystaller, hvis H NMR (CDCl^-spektrum er i overensstemmelse med den forventede struktur.

4-(4-acetylfenyl)-l-piperazinvalerinsyre-metylester (15,3 mg) oppslemmes i 0,1 ml kaliumhydroksydløsning (33,2 mg/ml). Etter oppvarming ved 100 oC 1150 min. er utgangsmaterialet fullstendig oppløst og fraværende ved TLC (10% MeOH/CH2Cl2). Etter at reaksjonsløsningen er surgjort til pH 4 ved å tilsette 0,2N

HCL, ekstraheres den vandige løsning med metylenklorid. Etter inndamping av det organiske sjikt til tørrhet, oppløses resten i metylenklorid og filtreres. Inndamping av det organiske sjikt gir 7 mg 4-(4-acetylfenyl)-l-piperazinvalerinsyre i form av et hvitt faststoff. *H NMR (CDC^-spektret er i overensstemmelse med den forventede struktur. MS (FAB) m/e 305 (M<+> + H), 327 (M<+> + Na), 348 (M<+>

+ 2Na-H).

FREMSTILLING 18, FORBINDELSE 25

4-( ?- k1r) r- 4- formylfenoksy) r) utansyre

Ved å følge fremgangsmåten i fremstilling 3, alkyleres 2,88 g (18,41 mmol) 3- klor-4-hydroksybenzaldehyd som før. Dette gir 4,65 g (93%) 4-(2-klor-4-formylfenoksy)butansyre-etylester i form av en oransje olje. IR (ren) 1730,1685

cm"<1.><*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (CI)

m/e 271 (M<+> + H). Analyse beregnet for C13H1504C1: C: 57,68, H: 5,58, Cl: 13,10, O: 23,64. Funnet: C: 58,05, H: 5,37, Cl: 12,43, O: 24,15. I henhold til fremgangsmåten i fremstilling 3, forsåpes 3,52 g (13,00 mmol) 4- (2-klor-4-formylfenoksy)butansyre-etylester for å gi et hvitt faststoff. Dette omkrystalliseres fra etylacetat, og resulterer i 1,78 g (56%) 4-(2-klor-4-formylfenoksy)butansyre i form av hvite krystaller, smp. 128-31 OC. IR (KBr) 1730, 1650 cm"<1.><*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (CI) m/e 243 (M<+> + H). Analyse beregnet for Cj jHj jC^Cl: C: 54,45, H: 4,57, Cl: 14,61, O: 26,37. Funnet: C: 54,61, H: 4,70, Cl: 14,25, O: 26,42.

EKSEMPEL 19, FORBINDELSE 26

5- acety1- 2-( 3- karhoksypropoksy) hfinzosyre- me1y1estex

Under tørre betingelser oppløses 3,58 g (18,41 mmol) 5-acetylsalicylsyre-metylester i 25 ml tørt N,N-dimetylformamid. Til denne løsning tilsettes 3,07 g (20,58 mmol) 5-brom-l -penten, 6,83 (20,58 mmol) kaliumkarbonat, og 0,246 g (1,65 mmol) kaliumjodid, og reaksjonsblandingen omrøres i 24 timer ved omgivelsestemperatur. En ytterligere porsjon 5-brompenten tilsettes til omsetningen, fulgt av halve porsjoner av de andre to reagensene ovenfor, og omrøringen fortsetter i 72

timer. Blandingen inndampes deretter under høyt våkum ved 70 oC. Resten fordeles mellom eter/vann, og den organiske fase fraskilles, tørkes med magnesiumsulfat, filtreres og inndampes under våkum for å etterlate 4,60 g (95%) 5-acetyl-2-(4-pentenyloksy)benzosyre-metylester i form 7av en gul væske. IR (ren) 1735, 1710,

1680 cm"<1>. <*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt.

MS (FAB) m/e 263 (M<+> + H). Analyse beregnet for C15<H>l<g>04: C: 68,69, H: 6,92,

O: 24,40. Funnet: C: 68,60, H: 6,92, O: 24,46.

En prøve av 0,203 g (0,775 mmol) 5-acetyl-2-(4-pentenyloksy)benzosyre-metylester oppløses i 5 ml metylendiklorid, i argonatmosfære, og avkjøles til -78 OC i et tørris/aceton-bad, under omrøring. Deretter ledes ozongass inn i denne løsning i 10 min., inntil den får en lyst blåaktig farve. Så tilsettes 0,5 ml dimetylsulfid for å stoppe omsetningen, og den får oppvarmes til romtemperatur i 2 timer. Blandingen inndampes deretter under høyt våkum, og etterlater det rå aldehydprodukt som en olje, som benyttes "som den er" i det andre trinn. Den oppløses i 5 ml'N,N-dimetylformamid, og 1,02 g (2,71 mmol) pyridiniumdikromat tilsettes. Denne reaksjons-blanding forsegles, og får stå i 20 timer. Den helles deretter i 50 ml vann, ekstraheres med eter, og den organiske fase vaskes med vann igjen, tørkes med magnesiumsulfat, filtreres og inndampes, og gir oljeaktive krystaller. Disse omkrystalliseres fra en blanding av etylacetat og heksan, og gir 0,109 g (50%) 5-acetyl-2-(3-karboksypropoksy)benzosyre-metylester i form av hvite krystaller,

smp. 111-113°C. IR (KBr) 1725, 1645 cm"<1.><!>H NMR (CDCI3) er i overens-

stemmelse med det ønskede produkt. MS (FAB) m/e 281 (M<+> + H). Analyse beregnet for C14H1606: C: 60,00, H: 5,75, O: 34,25. Funnet: C: 59,96, H: 5,75, O: 34,27. FREMSTILLING 20, FORBINDELSE 27 4-( 4- fnrmy1- 2- nitrofenoksy)hiitflnsyrR 4-hydroksy-3-nitrobenzyl-alkohol (1 g, 5,91 mmol) behandles med 1,44 g (7,39 mmol) etyl-4-brombutyrat, 2,86 g (20,69 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (88 mg, 0,59 mmol) natriumjodid som beskrevet i fremstilling 3, for å få 1,45 g 4-[4-(hydroksymetyl)-2-nitrfenoksy]butansyre-etylester i form av en lyst gul olje (86%). lU NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 3400, 1730, 1710,1630, 1580 cm'1. MS (CI) m/e 284 (M + H), 238. Analyse beregnet for C13H1706N: C: 55,12, H: 6,05. Funnet: C: 55,36, H: 6,03. 4-[4-(hydroksymetyl)-2-nitrofenoksy]butansyre-etylester (300 mg, 1,06 mmol) behandles med 799 mg (3,71 mmol) pyridiniumklorkromat ved å benytte fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5, for å få 188 mg (63%) 4-(4-formyl-2-nitrofenoksy)butansyre-etylester i form av en farveløs olje. lK NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 1730, 1700, 1610, 1570 cm-1. MS (CI) m/e 282 (M + H). 4-(4-formyl-2-nitrofenoksy)butansyre-etylester (135 mg, 0,48 mmol) opp-løses i 3 ml metanol/vann (3:2) og behandles med 232 mg (1,68 mmol) kaliumkarbonat i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4, for å få 84 mg (69%) 4-(4-formyl-2-nitrofenoksy)butansyre i form av et gult pulver, smp. 136-139°. H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3400, 1730, 1700,1650, 1600, 1570 cm'1. MS (CI) m/e 254, 236, 224, 208, 196, 168. EKSEMPEL 21, FORBINDELSE 28 4- [ ?-[[( 4- flr, p, 1y1fpT) y1) amino] m^ 4'-(2-hydroksy-3-metoksybenzylamino)acetofenon (500 mg, 1,84 mmol) behandles med 629 mg (3,22 mmol) etyl-4-brombutyrat, 764 mg (5,53 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (182 mg, 1,22 mmol) natriumjodid i 2 ml N,N-dimetylformamid som beskrevet i fremstilling 3, for å få 680 mg 4-[2-[[(4-acetylfenyl)amino]metyl]-6-metoksyfenoksy]butansyre-etylester i form av en lyst brun olje (95%). <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 3400, 1730, 1660, 1600 cm-1. MS (CI) m/e 386 (M + H), 115. Analyse beregnet for C22H2705N: C: 68,55, H: 7,06, N: 3,63. Funnet: C: 68,27, H: 6,81, N: 3,54. 4-[2-[[(4-acetylfenyl)amino]metyl]-6-metoksyfenoksy]butansyre-etylester (250 mg, 0,65 mmol) oppløses i 5 ml metanol/vann (3:2) og behandles med 313 mg (2,27 mmol) kaliumkarbonat i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4, for å få 166 mg (71%) 4-[2-[[(4-acetylfenyl)amino]metyl]-6-metoksyfenoksy]-butansyre i form av et rødfarvet faststoff, smp. 85-95°C. <!>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 3400, 1720, 1630, 1580 cm-1. MS (CI) m/e beregnet for C20H23O5Na: 380,1473. Funnet: 380,1482, 358 (M + H), 233, 223, 221, 136.

EKSEMPEL 22, FORBINDELSE 29 5- acRty1- 2-( 3- karhnksypropoksy) hen7osyre 1 -( 3- hrornpmpy1) ester

Til en løsning av 0,744 g (3,00 mmol) 5-acetyl-2-(4-pentenyloksy)benzosyre (eksempel 19) i argonatmosfære, under omrøring, i 36 ml metylendiklorid, tilsettes 1,67 g (12,0 mmol) 3-brompropanol. Dette følges av 0,912 g (9,0 mmol) trietylamin og 1,66 g (3,75 mmol) benzotriazol-l-yloksytris(dimetylamino)fosfoniumheksa-fluor-fosfat, og omsetningen omrøres i 20 timer. Blandingen inndampes deretter under høyt våkum ved 65 C. Resten fordeles mellom eter og vann, eterfasen vaskes to ganger til med vann, tørkes med magnesiumsulfat, filtreres og inndampes, og etterlater en gummi. Denne kromatograferes på en kolonne av kiselgel, og elueres med etylacetat/heksan (1:2) for å fa 0,80 g (72%) 5-acetyl-2-(4-pentenyloksy)-benzosyre-l-(3-brompropylester i form av en farveløs olje. IR (ren) 1730, 1700,

1680 cm"<1.> % NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt.

MS (FAB) m/e 369 (M<+> + H). Analyse beregnet for C17H2104Br: C: 55,30, H: 5,73, O: 17,33, Br: 21,64. Funnet: C: 55,34, H: 5,44, O: 17,34, Br: 21,88. Ved å følge fremgangsmåten i eksempel 19, ozoniseres 0,377 g (1,02 mmol) 5-acetyl-2-(4-pentenyloksy)benzosyre-l-(3-brompropyl)ester, og oksyderes deretter ytterligere med pyridiniumdikromat, og frembringer en farveløs gummi som delvis krystalliserer seg. Denne omkrystalliseres fra en blanding av like deler av etylacetat og heksan, og etterlater 0,277 g (70%) 5-acetyl-2-(3-karboksypropoksy)benzosyre-l-(3-brompropyl)ester som hvite krystaller, smp. 103-05°C. IR (KBr) 1730, 1645 cm"<1>. <*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med tittelproduktet. MS (CI) m/e 389 (M<+> + H). Analyse beregnet for C16H1906Br: C: 49,63, H: 4,95, O: 24,79, Br: 20,63. Funnet: C: 49,90, H: 4,75, O: 24,94, Br: 20,39.

FREMSTILLING 23, FORBINDELSE 30

4-( 4- acety1- 3- flnorfenoksy) butansyre

En løsning av 2-fiuor-4-metoksyacetofenon i 5 ml DMSO omrøres ved 100O C i nærvær av 730 mg (15 mmol) natriumcyanid, for å få et mørkt, viskøst bunnfall. Blandingen får avkjøle, helles deretter i 50 ml isvann, og surgjøres med 6N vandig HC1. Den sure løsning ekstraheres med etylacetat (50 ml x 2), og de organiske sjikt slås sammen og vaskes med vann. Det organiske sjikt ekstraheres deretter to ganger med 1,0N vandig natriumhydroksydløsning. Det basiske sjikt vaskes én gang med eter, surgjøres så med natriumbisulfat i form av et faststoff, og ekstraheres to ganger med etylacetat. Etylacetatsjiktene kombineres, vaskes deretter med 10% natrium-bisulfatløsning, og mettes med natriumkloridløsning. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat og konsentreres under våkum, ved omgivelsestemperatur, for å få 143 mg (31%) av en olje.

Oljen isolert ovenfor oppløses i 1 ml N,N-dimetylformamid, og behandles med 205 mg (1,05 mmol) etyl-4-brombutyrat, 4,07 g (2,95 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (1,26 mg, 0,008 mmol) natriumjodid ifølge fremgangsmåten beskrevet i fremstilling 3, for å få 39 g 4-(4-acetyl-3-fluorfenoksy)butansyre-etylester i form av en lyst brun olje (17%). lU NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. MS (CI (low res)) m/e beregnet for. C j4H

1804F: 269,1189. Funnet: 269,1191.

4-(4-acetyl-3-fluorfenoksy)butansyre-etylester (20 mg, 0,0745 mmol) opp-løses i 1 ml metanol/vann (3:2), og behandles med 30,91 mg (0,22 mmol) kaliumkarbonat ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4, for å få 14 mg (82%) 4-(4-acetyl-3-fluorfenoksy)butansyre i form av et hvitt pulver, smp. 110-111 o C. <1> H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR

(KBr) 1710, 1670, 1610 cm"<1>. MS m/e beregnet for C12<H>13<0>4FNa: 263,0695.

Funnet: 263,0699.

EKSEMPEL 24, FORBINDELSE 31

( ?- ar, ety1fp. noksy) hutansyre

2-acetylfenol (lg, 7,34 mmol) behandles med 1,79 g (9,18 mmol) etyl-4-brombutyrat, 3,55 g (25,71 mmol) kaliumkarbonat og en katalytisk mengde (11 mg, 0,07 mmol) natriumjodid som beskrevet i fremstilling 3, for å få 1,84 g (2-acetyl-fenoksy)smørsyre-etylester i form av en lyst gul olje, som størkner når den får stå,

smp. 43-45 o C. <1>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 1730, 1660, 1600 cm"<1>. MS (CI) m/e 251 (M + H), 232, 205.

(2-acetylfenoksy)butansyre-etylester (500 mg, 2,00 mmol) oppløses i 3 ml metanol/vann (3:2) og behandles med 828 mg (5,99 mmol) kaliumkarbonat ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4, for å få 412 mg (93%) (2-acetylfenoksy)-butansyre i form av et hvitt pulver. % NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (KBr) 1710, 1670, 1590 cm"<1.>

MS m/e- beregnet for C12<H>1504: 223,0970. Funnet: 223,0971.

EKSEMPEL 25, FORBINDELSE 32

2- ar. p. tyl- l OH- fenotiazin- l O- heksansyre

En løsning av 500 mg (2,07 mmol) 2-acetylfenotiazin i 8 ml tetrahydrofuran avkjøles til -78 OC, og 4,14 ml (2,07 mmol) av en 0,5M løsning av kaliumbis(tri-metylsilyl)amid i toluen tilsettes. Etter fem minutter tilsettes en løsning av [(6-bromheksyl)oksy]-(l,l-dimetyletyl)dimetylsilan i 2 ml tetrahydrofuran, og omsetningen får oppvarmes til romtemperatur. Blandingen fortynnes med 25 ml etylacetat, og vaskes med 10% natriumbisulfatløsning og mettet natriumklorid-løsning. Tørkes deretter over magnesiumsulfat og konsentreres under våkum for å få en mørkfarvet rest. Flash-kromatografi (3:1 heksan/etylacetat) gir 318 mg (33%) 1-[ 10-[6-[[(l, 1 -dimetyletyl)dimetylsilyl]oksy]heksyl]-l 0H-fenotiazin-2-yl]etanon i form av en mørkfarvet olje. <*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 1680, 1600, 1560 cm"<1>. MS m/e beregnet for C

26<H>37N02SSi: 455,2314. Funnet: 455,2312.

En løsning av 150 mg (0,33 mmol) l-[10-[6-[[(l,l-dimetyletyl)dimetylsilyl]-oksy]heksyl]-10H-fenotiazin-2-yl]etanon i 0,6 ml tetrahydrofuran behandles med 0,41 ml (0,41 mmol) IM tetrabutylammoniumfluorid i tetrahydrofuran. Omsetningen omrøres i 3 timer ved romtemperatur, og fortynnes deretter med 20 ml etylacetat. Det organiske sjikt vaskes i rekkefølge med 10% natriumbisulfatløsning og mettet natriumkloridløsning. Tørkes deretter over magnesiumsulfat og konsentreres under våkum for å fa 114 mg l-[10-(6-hydroksyheksyl)-10H-fenotiazin-2-yl]etanon i form av en mørk olje. <!>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt. IR (ren) 3400, 1680, 1590 1560 cm"<1>. MS m/e beregnet for C

20H23NO2S: 341,1449. Funnet: 341,1456.

En løsning av 41 mg (0,12 mmol) l-[10-(6-hydroksyheksyl)-10H-fenotiazin-2-yl]etanon i 0,16 ml N,N-dimetylformamid behandles med 158 mg (0,42 mmol) pyridiniumdikromat, og omrøres ved romtemperatur i 12 timer. Blandingen fortynnes med eter, og filtreres gjennom en pute av celitt med hjelp av 100 ml eter. Filtratet vaskes i rekkefølge med 10% natriumbisulfatløsning og mettet natrium-kloridløsning, tørkes deretter over magnesiumsulfat og konsentreres under våkum for å få 10 mg (23%) 2-acetyl-10H-fenotiazin-l O-heksansyre i form av en mørk rest.

<*>H NMR (300 MHz, CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt.

MS (CI) m/e 323 (M<+> + H).

EKSEMPEL 26, FORBINDELSE 34 5- acetyl- 2-( 3- karhoksypropoksy)- N-( 2- dimety1aminoety1) hRn7. amiH

En prøve av 0,140 g (0,50 mmol) 5-acetyl-2-(3-karboksypropoksy)benzosyre-metylester (eksempel 19) oppvarmes over dampbad, under tørre betingelser, med 5,49 ml (50,0 mmol) N,N-dimetyletylendiamin i 5 timer. Blandingen får avkjøles i 20 timer til omgivelsestemperatur, og inndampes under våkum ved 55°C. Den brune gummi som oppnås gnis med eter, og den gjenværende rest tas opp i vann og surgjøres med saltsyre. Dette ekstraheres deretter med etylacetat, og den vandige løsning inndampes under våkum, og etterlater en gummi. Den gnis deretter med varm kloroform, og denne løsning inndampes for å få brunt glass. Dette kromatograferes på en preparativ kiselgelplate, som elueres med en 9/1 blanding av kloroform og metanol. Produktbåndet skjæres ut fra platen, gnis med ovennevnte løsningsmiddelblanding, filtreres og inndampes, og etterlater 0,025 g (15%) 5-acetyl-2-(3-karboksypropoksy)-N-(2-dimetylaminoetyl)benzamid i form av en lyst brun gummi. MS (FAB) m/e 337,1753 _ = + 0,9 varan (M<+> + H), 359 (M<+> + Na).

<*>H NMR (CDCI3) er i overensstemmelse med det ønskede produkt.

EKSEMPEL 27, FORBINDELSE 35

5-acety1-2-(3-karhoksopropoksy)-N-(7-H internt salt

Til 100 mg 5-acetyl-2-(3-karboksypropoksy)-N-(2-dimetylaminoetyl)benz-amid i 2 ml metanol og 8 ml fosfatbuffer med pH 8,6, tilsettes 0,5 ml dimetylsulfat. pH i omsetningen kontrolleres ca. hvert 30. minutter, og 0,1N natriumhydroksyd tilsettes etter behov for å fa pH tilbake til ^5 Ettø. 4 timer Qemes løsningsmidlene under våkum, og produktet renses på BioSil A med en metanol-i-kloroformgradient for å få 5-acetyl-2-(3-karbometoksypropoksy)-N-(2-trimetylaminoetyl)benzamid-klorid, som tas med til neste trinn. <*>H NMR (CDCI3): 8,6 ppm (1H, d), 8,1 ppm

(lH,dd), 7,1 ppm (1H, d), 4,3 ppm (2H, t), 4,0 ppm (2H, br t), 3,9 ppm (2H, br s), 3,7 ppm (3H, s), 3,7 ppm (1H, t), 3,3 ppm (9H, s), 2,1 ppm (3H, s), 2,1 ppm (2H, t), 2,3 ppm (2H, m).

Ovennevnte produkt oppløses i 2 ml tetrahydrofuran og behandles med et overskudd av IN natriumhydroksyd i 16 timer ved omgivelsestemperatur. Det organiske ko-løsningsmiddel fjernes under våkum, og den vandige løsning som gjenstår surgjøres med IN HC1 til en pH-verdi på ca. 5. Løsningen inndampes deretter under våkum for å få glass som krystalliseres ved henstand. Det resulterende 5-acetyl-2-(3-karboksypropoksy)-N-(2-trimetylaminoetyl)benzamid, internt salt, kan benyttes uten ytterligere rensing. MS(FAB)m/e351 (M + H).

EKSEMPEL 28, FORBINDELSE 36

5- acery1- 7,-[ N-( 2- dimety1aminne. ty1)- 3-^ internt salt

Til 1,16 g 5-acetylsalicylsyre-metylester i 10 ml N,N-dimetylformamid tilsettes 1 g kloreddiksyre-metylester og 1,2 g kaliumkarbonat. Etter omrøring av denne blanding ved omgivelsestemperatur i 16 timer filtreres omsetningen, fortynnes med eytlacetat og vaskes én gang med vann og to ganger med saltoppløsning. Etylacetatet tørkes med magnesiumsulfat, filtreres og inndampes for å få 5-acetyl-2-(karboksymetoksy)benzosyre som et rått produkt. Krystallisering fra metanol ved -15°C gir 0,6 g hvite krystaller. <!>H NMR (CDCI3): 8,5 ppm (1H, d), 8,1 ppm (1H, dd),

6,9 ppm (1H, d), 4,8 ppm (2H, s), 4,0 ppm (3H, s), 3,8 ppm (3H, s), 2,6 ppm (3H, s).

450 mg av ovennevnte produkt omrøres i 1 ml N,N-dimetyletylendiamin ved omgivelsestemperatur i 16 timer. Omsetningen fortynnes deretter med etylacetat og vann. Vannsjiktet ekstraheres fem ganger med etylacetat, og etylacetatet fra de forskjellige ekstraksjoner slås sammen, tørkes med magnesiumsulfat, filtreres og inndampes for å få 380 mg 5-acetyl-2-[N-(2-dimetylaminoetyl)-3-karboksamido-propoksy]benzosyre-metylester i form av en gulaktig olje, som er ren nok til videre bruk. <l>H NMR (CDCI3): 8,6 ppm (1H, d), 8,2 ppm (1H, dd), 8,1 ppm (1H, br t),

7,0 ppm (1H, d), 4,7 ppm (2H, s), 4,0 ppm (3H, s), 3,5 ppm (2H, q), 2,7 ppm (3H, s), 2,6 ppm (2H, t), 2,3 ppm (6H, s).

Til 280 mg av ovennevnte forbindelse i 15 ml metanol og 5 ml kloroform tilsettes 1 ml metyljodid. Etter 3 timer ved omgivelsestemperatur fjernes de flyktige bestanddeler. *H NMR indikerer nærvær av det ønskede 5-acetyl-2-[N-(2-trimetyl-aminoetyl)-3-karboksamidopropoksy]benzosyre-metylesterjodid. H NMR (CDCI3

+CD3OD): 8,8 ppm (1H, br t), 8,6 ppm (1H, d), 8,2 ppm (1H, dd), 7,1 ppm (1H, d),

4,7 ppm (2H, s), 4,0 ppm (3H, s), 3,9 ppm (2H, q), 3,8 ppm (2H, t), 3,4 (9H, s), 2,6 ppm (3H, s).

Ovennevnte forbindelse oppløses i -5 ml metanol. Fem ekvivalenter av natriumhydroksyd tilsettes som en 5N løsning i vann. Etter 5 timer ved omgivelsestemperatur justeres pH til -7,5 med fortynnet HC1, og de flyktige bestanddeler fjernes under våkum for å få et rått produkt som inneholder 5-acetyl-2-[N-(2-trimetylaminoetyl)-3-karboksamidopropoksy]benzosyre, internt salt. MS (CI)

m/e 323 (M<+> + H).

SYNTESE AV STRUKTUR B (Skjema 1).

Generell fremgangsmåte

Medikament/hydrazid-derivatet (Q-Sp-SS-W hvor Q er F^NHN-) oppløses i alkohol eller annet forlikelig, organisk løsningsmiddel som inneholder ~3 til 10 ekvivalenter av karbonyllinkeren og -1-10% eddiksyre eller annen passende syrekatalysator. En minimal mengde løsningsmiddel gir en raskere omsetning. Vannfrie betingelser gir de beste resultater, siden kondensasjonen er en likevekts-reaksjon. Omsetningen får fortsette ved en temperatur på -20-60 OC inntil den er fullstendig, ved HPLC, eller alternativt ved TLC. Dette krever fra noen timer til én dag eller mer, avhengig av linkeren og de spesifikke reaksjonsbetingelser. Løsningsmidlene fjernes under våkum, og det rå produkt renses på en passende kiselgel, så som BIOSIL-A™, under anvendelse av et passende løsningsmiddel-ystem, så som en gradient på 0-20% metanol i enten kloroform eller etylacetat. Produktene er tilstrekkelig rene for de påfølgende trinn.

EKSEMPEL 29 4-formylfenoksyeddiksyre (1) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 4,4 min.,

F AB MS: 1641 (M + H),

UV maks. ved 291 og 305 nm (acetat),

<*>HNMR: Se fig. I.

FREMSTILLING 30

4-formylbenzosyre (2) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgammadimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 5,2 min.,

F AB MS: 1611 (M + H),

UV maks. ved 292 og 302 nm (etanol),

<l>H NMR: Se fig. II.

FREMSTILLING 31

4-formyl-3-metoksyfenoksyeddiksyre (3) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 4,7 min.,

F AB MS: 1671 (M + H),

UV maks. ved 282, 291 og 325 nm (etanol),

<*>HNMR: Se fig. III.

FREMSTILLING 32

6-formyl-2-naftosyre (4) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,1 min.,

F AB MS: 1661 (M + H),

UV maks. ved 257, 267, 277, 313 og 321 nm (etanol),

<!>HNMR: Se fig. IV.

FREMSTILLING 33

4-(2-oksoetoksy)benzenpropansyre (5) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid..

HPLC retensjonstid: 6,0 min., F AB MS: 1669 (M + H),

UV - intet maksimum.

FREMSTILLING 34

3- (2-oksoetoksy)benzosyre (6) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 5,5 min., F AB MS: 1641 (M + H),

UV - intet maksimum.

FREMSTILLING 35

4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,4 min., F AB MS: 1683 (M + H),

UV maks. ved 285 nm (etanol),

<l>H NMR: Se fig. V.

FREMSTILLING 36

4- (4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,2 min., UV maks. ved 285 nm (etanol).

FREMSTILLING 37

4-(3-formylfenoksy)butansyre (8) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,3 min.,

F AB MS: 1669 (M + H).

FREMSTILLING 38

4-(4-formylfenoksy)butansyre (9) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,1 min.,

F AB MS: 1669 (M + H),

UV maks. ved 291 nm (etanol),

<*>H NMR: Se fig. VII.

FREMSTILLING 39

4-(4-acetyl-2-metylfenoksy)butansyre (10) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,8 min.,

F AB MS: 1697 (M + H).

EKSEMPEL 40 4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (11) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 5,5 min.,

F AB MS: 1699 (M + H),

UV maks. ved 284, 300 og 316 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 41

4-formylbenzenpropansyre (12) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 5,6 min.,

F AB MS: 1639 (M + H).

EKSEMPEL 42 4-(2,3-dimetoksy-5-formylfenoksy)butansyre (13) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 5,8 min., F AB MS: 1729 (M + H),

UV maks. ved 302 nm (etanol).

EKSEMPEL 43 4-(4-acetyl-2,6-dimetoksyfenoksy)butansyre (14) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 6,0 min., F AB MS: 1743 (M + H),

UV maks. ved 287 nm (etanol).

EKSEMPEL 44 4-(4-acetyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (15) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 6,1 min., FAB MS: 1713 (M + H),

UV maks. ved 284 nm (etanol).

EKSEMPEL 45 4-[4-(3-oksobutyl)fenoksy]butaneddiksyre (16) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 6,6 min., FAB MS: 1611 (M + H),

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 46 4-(2-acetyl-5-metoksyfenoksy)butansyre (17) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 6,5 min., FAB MS: 1713 (M + H), UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 47 4-[4-(3-oksopropyl)fenoksy]butansyre (18) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 9,8 min., FAB MS: 1697 (M + H), UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 48 4-acetylbenzenbutansyre (19) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 6,4 min., FAB MS: 1667 (M + H), UV maks. ved 281 nm (etanol).

EKSEMPEL 49 4-[(2-acetyl-l-naftalenyl)oksy]butansyre (20) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid. HPLC retensjonstid: 7,8 min., FAB MS: 1733 (M + H), UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 50

4-[4-(4-fluorbenzoyl)fenoksy]butansyre (21) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 8,4 min.,

FAB MS: 1763 (M + H),

UV maks. ved 284 nm (etanol).

EKSEMPEL 51

4-(4-acetylfenyl)-l-piperazinpentansyre (22) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 5,0 min.,

FAB MS: 1641 (M + H),

UV maks. ved 322 nm (etanol).

EKSEMPEL 52 ll-(4-acetylfenoksy)undekansyre (23) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 4,8 min. (65% acetonitrilisokratisk), FAB MS: 1781 (M + H),

UV maks. ved 286 nm (etanol).

EKSEMPEL 53

5-[(4-acetylfenyl)amino]-5-oksopentansyre (24) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 5,2 min.,

FAB MS: 1710 (M + H),

UV maks. ved 295 nm (etanol).

EKSEMPEL 54 4- (2-klor-4-formylfenoksy)butansyre (25) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,5 min.,

FAB MS: 1704 (M + H),

UV maks. ved 292 nm (etanol).

EKSEMPEL 55 5- acetyl-2-(3-karboksypropoksy)benzosyre-metylester, (26), kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,1 min.,

FAB MS: 1741 (M + H),

UV maks. ved 285 nm (etanol).

EKSEMPEL 56 4-(4-formyl-2-nitrofenoksy)butansyre (27) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,2 min.,

FAB MS: 1741 (M + H),

UV maks. ved 294 nm (etanol).

EKSEMPEL 57 4-[2-[[(4-acetylfenyl)amino]metyl]-6-metoksyfenoksy]butansyre (28) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 7,7 min.,

FAB MS: 1818 (M + H),

UV maks. ved 232 nm (etanol).

EKSEMPEL 58 4-(4-acetyl-3-flurofenoksy)butansyre (30) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,1 min.,

FAB MS: 1701 (M + H),

UV maks. ved 273 nm (etanol).

EKSEMPEL 59 4-(2-acetylfenoksy)butansyre (31) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,1 min.,

FAB MS: 1683 (M + H),

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 60 2-acetyl-10H-fenotiazin-10-heksansyre (32) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 6,2 min.,

FAB MS: 1833 (M + NH4),

UV maks. ved 281, kraftig skulder ved 356 nm (CH3CN).

EKSEMPEL 61

4-acetylfenyleddiksyre (33) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid.

HPLC retensjonstid: 5,0 min.,

FAB MS: 1639 (M + H),

UV maks. ved 281 nm (acetonitril).

SYNTESE AV STRUKTURENE C (fig. 1)

Generel l fremgangsmåte.

Karboksylsyre-hydrazonene som oppnådd ovenfor omdannes til OSu-estrene (Z -N-suksinimidyloksy) ved å oppløse dem i et passende løsningsmiddel så som acetonitril eller acetonitril inneholdende 10-20% N,N-dimetylformamid eller tetrahydrofuran for bedre solubilisering, og ved å tilsettes _2_5ekvivalenter av N-hydroksysuks<inim>id og ^2.5 ekvivaienter av N-hydroksysuksinimid og ~2_10 ekvivalenter av l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (EDCI) som hydrokloridsalt. Omsetningen får foregå ved omgivelsestemperatur inntil den er fullstendig, målt ved HPLC, eller alternativt ved TLC, som vanligvis er 1-8 timer. Deretter fjernes løsningsmidlene, og det rå produkt renses på en passende kiselgel, så som BIOSIL-A™, under anvendelse av et passende løsningsmiddelsystem, så som en gradient av 0-20% metanol i enten kloroform eller etylacetat. Produktene er deretter tilstrekkelig rene for konjugeringstrinnet.

EKSEMPEL 62

4-formylfenoksyeddiksyre (1) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 6,5 min.

EKSEMPEL 63

4-formylbenzosyre (2) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 6,6 min.,

FAB MS: 1708 (M + H),

UV maks. ved 310 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 64

4-formyl-3-metoksyfenoksyeddiksyre (3) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,0 min.,

FAB MS: 1768 (M + H),

UV maks. ved 279, 288 og 320 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 65

4-formyl-2-naftosyre (4) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,4 min.,

FAB MS: 1758 (M + H),

UV maks. ved 272 og 323 nm (etanol).

EKSEMPEL 66

4-(2-oksoetoksy)benzenpropansyre (5) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgarnma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,1 min.,

FAB MS: 1766 (M + H),

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 67

3-(2-oksoetoksy)benzosyre (6) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,7 min.,

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 68A

4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicm-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,5 min.,

FAB MS: 1780 (M + H),

UV maks. ved 283 nm (acetonitril).

<!>H NMR: Se fig. VI.

EKSEMPEL 68B

4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-(l-hydroksy-2,5-diokso-3-pyrrolidinsulfonsyre-mononatriumsalt)ester (dvs. ester med "sulfonato-N-hydroksysuksimid").

HPLC retensjonstid: 5,2 min.,

UV maks. ved 278 nm (etanol).

EKSEMPEL 69

4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-gamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,6 min.,

UV maks. ved 283 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 70

4-(3-formylfenoksy)butansyre (8) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimideX67er.

HPLC retensjonstid: 7,4 min.,

FAB MS: 1766 (M + H),

UV maks. ved 283 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 71

4-(4-formylfenoksy)butansyre (9) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,0 min.,

FAB MS: 1766 (M + H),

UV maks. ved 289 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 72

4-(4-acetyl-2-metylfenoksy)butansyre (10) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 8,2 min.,

FAB MS: 1794 (M + H).

EKSEMPEL 73

4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (11) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 6,6 min.,

FAB MS: 1796 (M + H).

EKSEMPEL 74

4-formylbenzenpropansyre (12) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 6,7 min.,

FAB MS: 1736 (M + H).

EKSEMPEL 75

4-(2,3-dimetoksy-5-formylfenoksy)butansyre (13) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 6,7 min.,

FAB MS: 1826 (M + H).

UV maks. ved 298 nm (etanol).

EKSEMPEL 76

4-(4-acetyl-2,6-dimetoksyfenoksy)butansyre (14) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,7 min.,

FAB MS: 1840 (M + H).

UV maks. ved 286 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 77

4-(4-acetyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (15) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,2 min.,

FAB MS: 1810 (M + H).

UV maks. ved 284 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 78

4-[4-(3-oksobutyl)fenoksy]butansyre (16) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,9 min.,

FAB MS: 1808 (M + H).

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 79

4-(2-acetyl-5-metoksyfenoksy]butansyre (17) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,4 min.,

FAB MS: 1810 (M + H).

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 80

4-[4-(3-oksopropyl)fenoksy]butansyre (18) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 13,1 min.,

FAB MS: 1794 (M + H).

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 81

4-acetylbenzenbutansyre (195) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,7 min.

EKSEMPEL 82

4-[(2-acetyl-l-naftalenyloksy]butansyre (20) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 9,4 min.,

FAB MS: 1830 (M + H).

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 83

4-[4-(4-fluorbenzoyl)fenoksy)butansyre (21) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 9,3 min.,

FAB MS: 1860 (M + H).

UV maks. ved 284 nm (etanol).

EKSEMPEL 84

4- (4-acetylfenyl)-l-piperazinpentansyre (22) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 6,3 min.,

FAB MS: 1863 (M + H).

UV maks. ved 306 nm (1:1 acetonitril/kloroform).

EKSEMPEL 85 1 l-(4-acetylfenoksy)undekansyre (23) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 15,5 min.,

FAB MS: 1878 (M + H).

UV maks. ved 284 nm (etanol).

EKSEMPEL 86

5- [(4-acetyl)amino]-5-oksopentansyre (24) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 6,2 min.,

FAB MS: 1807 (M + H).

UV maks. ved 292 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 87

4- (2-klor-4-formylfenoksy)butansyre (25) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgarnma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,5 min.,

FAB MS: 1800 (M + H).

UV maks. ved 290 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 88

5- (acetyl-2-(3-karboksypropoksy)benzosyre-metylester, (26), kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,2 min.,

FAB MS: 1838 (M + H).

UV maks. ved 284 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 89

4-(4-formyl-2-nitrofenoksy)butansyre (27) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,1 min.,

FAB MS: 1811 (M + H).

UV maks. ved 293 nm (etanol).

EKSEMPEL 90

4-[2-[[-4-acetylfenyl]amino]metyl]-6-metoksyfenoksy]butansyre (28) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 9,2 min.,

FAB MS: 1916 (M + H).

UV maks. ved 309 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 91

4-(4-acetyl-3-fluorfenoksy)butansyre (30) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgarnma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 8,2 min.,

FAB MS: 1798 (M + H).

UV maks. ved 270 nm (etanol).

EKSEMPEL 92

4-(2-acetylfenoksy)butansyre (31) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 8,1 min.,

FAB MS: 1780 (M + H).

UV - intet maksimum.

EKSEMPEL 93

2-(acetyl-10H-fenotiazin-10-heksansyre (32) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 8,3 min.,

FAB MS: 1930(M + NH4).

UV maks. ved 281 nm (acetonitril).

EKSEMPEL 94

4-acetylfenyleddiksyre (33) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid-N-hydroksysuksimidester.

HPLC retensjonstid: 7,2 min.,

FAB MS: 1736 (M + H).

UV maks. ved 280 nm (acetonitril).

SYNTESE AV STRUKTURENE D (fremgangsmåte A, skjema 1)

Generell prosedyre

Den aktiverte ester ovenfor oppløses i et passende organisk løsningsmiddel, så som dimetylformamid, og tilsettes til en løsning av antistoff i en menge av ~1-15 mg/ml i en passende buffer, så som fosfat med pH 7,4 (50 mM, 100 mM salt), slik at konsentrasjonen av organisk ko-løsningsmiddel er -10-30% og -2-10 ekvivalenter aktiv ester benyttes pr. mol antistoff. Konjugeringsreaksjonen får fortsette ved omgivelsestemperatur i -4-24 timer. Løsningen konsentreres ved bruk av en halvgjennomtrengelig membran, hvis nødvendig, og renses ved standard størrelses-eksklusjonskromatografi, så som med SEPHACRYL™ S-200 gel. Monomer-fraksjonene slås sammen, og lasten av medikament på antistoffet anslås ved hjelp av UV-vis absorbanse ved 280 nm for antistoff og 333 nm eller annen passende bølgelengde for calicheamicin-hydrazonene.

SYNTESE AV STRUKTURENE E (skjema 2)

Generell fremgangsmåte

Karboksylsyrene på spacerne aktiveres som OSu-estrene (Z -N-suksinimidyloksy) ved å oppløse dem i et passende løsningsmiddel, så som tetrahydrofuran inneholdende 10-20% dimetylformamid, og ved å tilsette -2-3 ekvivalenter av N-hydroksysuksinimid og -2-5 ekvivalenter av l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etyl-karbodiimid (EDCI) som hydrokloridsalt. Omsetningen får foregå ved omgivelsestemperatur inntil den er fullstendig, vurdert ved hjelp av TLC, som vanligvis er 1-8 timer. Deretter fjernes løsningsmidlene, og det rå produkt renses på en passende kiselgel, så som Biosil-A, ved å benytte et passende løsningsmiddel-system, så som en gradient av 0-5% metanol i kloroform. Produktene renses generelt ytterligere ved omkrystallisering fra en blanding av etylacetat/heksaner, eller andre passende løsningsmidler.

Følgende produkter ble laget ved hjelp av ovennevnte metode:

(SuOH = N-hydroksysuksinimid)

FREMSTILLING 95

4- formy1ffinoVsyp, Hriiksyrp,- N^ ( 1)

CI MS: 278 (MH<+>), NMR (CDC13+D6DMS0): 9,9 ppm (1H, s, CH=0), 7,9 og 7,1

(2H hver, d, ArH), 5,2 (2H, s, OCH2), 2,9 (4H, s, CH2CH2).

FREMSTILLING 96

4- fnrmy1- 3- metoksyfenoksyeddiksyre-N- hyHroksysiiksinimidester3 ( 3).

CI MS: 308 (MH<+>), NMR (CDC13): 10,3 ppm (1H, s, CH=0), 7,8 (1H, d,

ArH), 6,6 (1H, dt, ArH), 6,55 (1H, d, ArH), 5,1 (2H, s, OCH2), 3,95, (3H, s, OCH3

), 2,9 (4H, s, CH2C<H>2).

FREMSTILLING 97

4-( 4- acefy1fenoksy) hiitarisyrp- N- hydroksysi] ksiriimiHesterJ ( 7).

CI MS: 320 (MH<+>), NMR (CDCI3): 7,9 og 7,0 (2H hver, d, ArH), 4,2 (2H, s,

OCH2), 2,9 (6H, m, CH2CH2 + 0=CCH2), 2,6 (3H, s, OCCH3), 2,3 (2H, m, CH2).

SYNTESE AV STRUKTURENE F (skjema 2)

Generell fremgangsmåte.

Den aktiverte ester ovenfor oppløses i et passende organisk løsningsmiddel, så som N,N-dimetylformamid, og tilsettes til en løsning av antistoff i en mengde av ~1-15 mg/ml i en passende buffer, så som fosfat med pH 7,4 (50 mM, 100 mM salt), slik at konsentrasjonen av organisk ko-løsningsmiddel er -10-25%, og -2-20 ekvivalenter aktiv ester benyttes pr. mol antistoff. Konjugeringsomsetningen får foregå ved omgivelsestemperatur i -4-24 timer. Bufferen byttes, og de organiske ko-løsningsmidler og biprodukter fjernes ved hjelp av en avsaltingskolonne så som en PD-10, under anvendelse av acetatbuffer med pH 5,5 (25 mM acetat, 100 mM NaCl). Løsningen konsentreres ved bruk av en halvgjennomtrengelig membran, om nødvendig, og produktet benyttes uten ytterligere rensing i det følgende trinn. Antall karbonylgrupper innført pr. antistoff er vanligvis ca. halvparten av antall ekvivalenter av OSu-ester som benyttes, og kan ytterligere kvantifiseres under anvendelse av p-nitrofenylhydrazin eller annen sammenlignbar metode, om ønskelig.

SYNTESE AV STRUKTURENE D (fremgangsmåte B, skjema 2) Generell fremgangsmåte

Medikament-hydrazid-derivatet oppløses i et passende organisk løsnings-middel, så som N,N-dimetylformamid, og tilsettes til en løsning av antistoff-linker-konjugat (struktur F) fra foregående trinn i en mengde av -1-15 mg/ml i en passende buffer, så som pH-acetat (25 mM, 100 mM salt), slik at konsentrasjonen av organisk ko-løsningsmiddel er -10-15%, og -2-15 ekvivalenter hydrazid benyttes pr. mol antistoff. Konjugeringsomsetningen får foregå ved omgivelsestemperatur i -4-24 timer. Bufferen byttes, og de organiske ko-løsningsmidler og biprodukter fjernes ved å benytte en avsaltingskolonne så som en PD-10, under anvendelse av en buffer med pH 7,4 (50 mM fosfat, 100 mM NaCl). Løsningen konsentreres ved å benytte en halvgjennomtrengelig membran, om nødvendig, og renses ved standard størrelses-eksklusjonskromatografi, så som med SEPHACRYL™ S-200 gel. Monomer-fraksjonene slås sammen, og lasten av medikament på antistoffet vurderes ved hjelp av UV-synlig absorbans ved 280 nm for antistoff, og 333 nm, eller annen passende bølgelengde, for calicheamicin-hydrazonene.

EKSEMPEL 98 (FREMGANGSMÅTE A OG B)

Konjugat av 4-formylfenoksyeddiksyre (1) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

In vivo: 29% T/C (2 fig x 3 doseringer ~ 5/5 levende -28 d),

Ex vivo: 95% inhibering.

EKSEMPEL 99 (FREMGANGSMÅTE A OG B)

Konjugat av 4-formylfenoksyeddiksyre (1) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

Ex vivo: 90% inhibering.

EKSEMPEL 100 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-formylfenoksyeddiksyre (1) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-CT-M-01.

EKSEMPEL 101 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-formylbenzosyre (1) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

Ex vivo: 63% inhibering.

EKSEMPEL 102 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-formylbenzosyre (2) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 103 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-formylbenzosyre (2) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-CT-M-01.

EKSEMPEL 104 (FREMGANGSMÅTE A OG B)

Konjugat av 4-formyl-3-metoksyfenoksyeddiksyre (3) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 105 (FREMGANGSMÅTE A OG B)

Konjugat av 4-formyl-3-metoksyfenoksysyre (3) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

Ex vivo: 90% inhibering.

EKSEMPEL 106 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-formyl-3-metoksyfenoksyeddiksyre (3) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-CT-M-01.

EKSEMPEL 107 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 6-formyl-2-naftosyre (4) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 108 (FREMGANGSMÅTE A) Konjugat av 4-(2-oksoetoksy)benzenpropansyre (5) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 109 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(2-oksoetoksy)benzenpropansyre (5) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

Ex vivo: 71% inhibering.

EKSEMPEL 110 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 3-(2-oksoetoksy)benzosyre (6) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 111 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 3-(2-oksoetoksy)benzosyre (6) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 112 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

In vivo: 0% T/C (1 /Ltg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

0% T/C (3 ng x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

0% T/C (6 /ig x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d), Ex vivo: 96% inhibering.

EKSEMPEL 113 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-gamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 114 (FREMGANGSMÅTE A ELLER B)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

Iv vivo: 22% T/C (0,5 \ ig x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

0% T/C (1 fig x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d), 1% T/C (3 fig x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

0% T/C (6/ig x 3 doseringer, 2/5 levende - 28 d), Ex vivo: 98% inhibering.

EKSEMPEL 115 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-CT-M-01.

EKSEMPEL 116 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-A33.

In vivo: 4% T/C (3 /zg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

5% T/C (6 fig x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d).

EKSEMPEL 117 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-A33.

EKSEMPEL 118 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-gamma-dimetylhydrazid og h-A33.

EKSEMPEL 119 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenoksy)butansyre (7) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og anti-Tac.

EKSEMPEL 120 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(3-formylfenoksy)butansyre (8) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 121 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-formylfenoksy)butansyre (9) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

In vivo: 12% T/C (1 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

9% T/C (3 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d), 3%o T/C (6 fig x 3 doseringer, 4/5 levende - 28 d), Ex vivo: 98% inhibering.

EKSEMPEL 122 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-formylfenoksy)butansyre (9) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

In vivo: 17% T/C (0,5 ng x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

23% T/C (1 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

9% T/C (3 /xg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

0% T/C (6 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d).

EKSEMPEL 123 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetyl-2-metylfenoksy)butansyre (10) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 124 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetyl-2-metylfenoksy)butansyre (10) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 125 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (11) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 126 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-formyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (11) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 127 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-formylbenzenpropansyre (12) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 128 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-formylbenzenpropansyre (12) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 129 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(23-o'inietoksy-5-formylfenoksy)butansyre (13) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 130 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(2,3-dimetoksy-5-formylfenoksy)butansyre (13) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 131 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetyl-2,6-dimetoksyfenoksy)butansyre (14) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 132 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetyl-2,6-dimetoksyfenoksy)butansyre (14) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 133 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (15) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 134 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetyl-2-metoksyfenoksy)butansyre (15) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 135 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-[4-(3-oksobutyl)fenoksybutansyre (16) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 136 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(2-acetyl-5-metoksyfenoksy]butansyre (17) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 137 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(2-acetyl-5-metoksyfenoksy]butansyre (17) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 138 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-[4-(3-oksopropyl)fenoksy]butansyre (18) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 139 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-[4-(3-oksopropyl)fenoksy]butansyre (18) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

In vivo: 23% T/C (0,5 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

10% T/C (1 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

4%> T/C (3 Mg x 3 doseringer, 4/5 levende - 28 d),

0% T/C (6 Mg x 3 doseringer, 2/5 levende - 28 d),

Ex vivo: 99% inhibering.

EKSEMPEL 141 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-acetylbenzenbutansyre (19) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

In vivo: 21% T/C (0,5 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

25% T/C (1 Mg x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

0% T/C (3 Mg x 3 doseringer, 4/5 levende - 28 d),

0%) T/C (6 Mg x 3 doseringer, 1/5 levende - 28 d), Ex vivo: 99% inhibering.

EKSEMPEL 142 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-[(2-acetyl-l-naftalenyl)oksy]butansyre (20) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

In vivo: 36% T/C (1 fig x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

22% T/C (3 /ig x 3 doseringer, 5/5 levende - 28 d),

11% T/C (6 /xg x 3 doseringer, 4/5 levende - 28 d),

Ex vivo: 76% inhibering.

EKSEMPEL 143 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-[(2-acetyl-l-naftalenyl)oksy]butansyre (20) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 144 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-[4-(4-fluorbenzoyl)fenoksy]butansyre (21) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 145 (FREMGANGSMÅTE A)

EKSEMPEL 146 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetylfenyl)-l-piperazinpentansyre (22) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 147 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 1 l-(4-acetylfenoksy)undekansyre (23) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 148 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 1 l-(4-acetylfenoksy)undekansyre (23) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 149 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 5-[(4-acetylfenyl)amino[-5-oksopentansyre (24) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og m-P67.6.

EKSEMPEL 150 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(2-klor-4-formylfenoksy)butansyre (25) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 151 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 5-acetyl-2-(3-karboksypropoksy)benzosyre (26)-metylester kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 152 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-formyl-2-nitrofenoksy)butansyre (27) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 153 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-[2-[[(4-acetylfenyl)amino]metyl]-6-metoksyfenoksy]butansyre (28) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 154 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(4-acetyl-3-fluorfenoksy)butansyre (30) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 155 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-(2-acetylfenoksy)butansyre (31) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 156 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 2-acetyl-10H-fenotiazin-10-heksansyre (32) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

EKSEMPEL 157 (FREMGANGSMÅTE A)

Konjugat av 4-acetylfenyleddiksyre (33) kondenseres med calicheamicin-N-acetylgamma-dimetylhydrazid og h-P67.6.

De beskrevne konjugater er nyttige for å inhibere veksten av uønskede celler, noe som er en viktig del av oppfinnelsen. Følgelig inkluderer oppfinnelsen også farmasøytiske preparater for å hemme veksten av celler, omfattende en effektiv cellevekst-hemmende mengde av konjugatet ifølge krav 1,15 eller 16 og et parenteralt-administrerbart medium. Slike preparater formuleres ved fremgangsmåter som vanligvis benyttes innen farmasøytisk kjemi. Konjugatene er akseptabelt løselige i fysiologisk akseptable fluider, så som fysiologisk saltvannsoppløsninger og andre vandige løsninger som trygt kan administreres parenteralt.

Det er videre beskrevet frysetørket farmasøytisk preparat for å hemme veksten av celler, omfattende et konjugat ifølge krav 15 eller 16 som blir oppnådd ved frysetørking av en omtrent 1 mg/ml løsning av konjugatet oppløst i ca. 5 mM natriumfosfatbuffer ved en pH på ca. 7,4 inneholdende 100 mM natriumklorid og 100 mM sukrose.

Produkter for parenteral administrering formuleres ofte og distribueres i faststoff-form, fortrinnsvis frysetørket form, for rekonstituering umiddelbart før bruk. Slike formuleringer er nyttige preparater av foreliggende oppfinnelse. Fremstillingen av dem forstås godt av en farmasøytisk kjemiker. Generelt omfatter de blandinger av uorganiske salter, for å gi isotonisitet, og dispergerende midler, så som sukrose, for at det tørkede preparatet skal oppløses raskt ved rekonstituering. Slike formuleringer rekonstitueres med meget godt renset vann eller fysiologisk akseptable buffere til en kjent konsentrasjon, basert på medikamentet.

Et foretrukket frysetørket farmasøytisk preparat for inhibering av veksten av celler blir oppnådd ved frysetrøking av en omtrent 1 mg/ml løsning av konjugatet oppløst i omtrent 5 mM natriumfosfatbuffer ved en pH på omtrent 7,4 inneholdende omtrent 100 mM natriumklorid og omtrent 100 mM sukrose. For konjugatet som har formelen Z^CO-Alk^Sp^Ar-Sp^Alk^CCZ^Z2]^

Z<3> er fortrinnsvis antistoffet h-CT-M-01 eller h-p67.7;

Alk1 er fortrinnsvis C4alkylen; Sp<1> er fortrinnsvis -0-;

Ar er fortrinnsvis 1,4-fenylen; Alk 2 og Sp 2 er fortrinnsvis sammen en binding; Z 1 er fortinnsvis Cialkyl; og Z er fortrinnsvis calicheamicin N-acetyl-gammaTdimetyl-hydrazid.

Den optimale plan for dosering og administrering av konjugatene i henhold til oppfinnelsen må bestemmes av den behandlende lege, i lys av pasientens tilstand.

Det er selvfølgelig vanlig å administrere cytotoksiske medikamenter i form av oppdelte doseringer, med intervaller av dager eller uker mellom hver serie av doseringer. Konjugatene er effektive over et vidt doseringsspekter, og doseringer pr. uke vil vanligvis falle innenfor området fra ca. 1 til ca. 10.000 ug/m medikament, mer fortrukket i området fra ca. 10 til ca. 200 ug/m 2.

Claims

1. Cytotoksisk medikament konjugat med formel: hvor Z er et protein valgt fra mono- og polyklonale antistoffer, deres antigengj en- kj ennende fragmenter og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker og vekstfaktorer og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker, hvor en kovalent binding til proteinet er et amid dannet fra omsetning med "m" lysin sidekjeder eller et steroid, hvor den kovalente binding til steroidet er et amid eller en ester; Alk 1 og Alk 2 er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylen kjede; Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -0-, med det forbehold at når n = 0, så må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR, CONHR', 0(CH2)nCOOR<*>, S(CH2)nCOOR\ 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR', med det forbehold at når Alk1 er en binding, er Sp<1> en binding; n er et helt tall fra 0 til 5; R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium -A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som gir et salt; Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden eller hver naftyliden eller fenotiazin er eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor, med det forbehold at når Ar er naftyliden, er Z1 ikke hydrogen og med det forbehold at når Ar er fenotiazin, er Sp1 en binding bare forbundet med nitrogen og Alk<1> er ikke en binding; Sp 2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk 2er en binding, er Sp2 en binding; Z1 er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor; Z<2> er Q-Sp-S-S-W, hvor W er R5 er -CH3, -C2H5 eller -CH(CH3)2; X<1> er et j od eller bromatom; R5' er et hydrogen eller gruppen RCO, hvor R er hydrogen, forgrenet eller uforgrenet (Ci - Cio) alkyl eller (Ci - Cio) alkylengruppe, en (C6-C11) arylgruppe, en (C6-C11) aryl-alkyl (Ci - C5) gruppe eller en heteroaryl eller hetero-arylalkyl (Ci - C5) gruppe hvor heteroaryl er 2- eller 3-furyl, 2- eller 3-tienyl, 2- eller 3-(N-metylpyrrolyl), 2-, 3- eller 4-pyridyl, 2-, 4- eller -(N-metyl-imidazolyl), 2-, 4- eller 5-oksazolyl, 2-, 3-, 5- eller 6-pyrimidinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-kinolyl eller 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-isokinolyl, alle aryl og heteroaryl eventuelt substituert med én eller flere hydroksy, amino, karboksy, halogen, nitro, lavere (Ci - C3) alkoksy eller lavere (Ci - C5) tioalkoksygrupper; Sp er en lineær eller forgrenet divalent eller trivalent (Ci - C\$) rest, divalent eller trivalent aryl eller heteroarylrest, divalent eller trivalent (C3 -Cis) cykloalkyl eller heterocykloalkylrest, divalent eller trivalent aryl- eller heteroarylalkyl (Ci - Cis) rest, divalent eller trivalent cykloalkyl- eller heterocykloalkylalkyl (Ci - Cis) rest eller divalent eller trivalent (C2 - Cis) umettet alkylrest, hvor heteroaryl er furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminokumarinyl eller fenazinyl og hvor når Sp er en trivalent rest, kan Sp i tillegg være substituert med lavere (Ci - C5) dialkyl amino, lavere (Ci - C5) alkoksy, hydroksy eller lavere (Ci - C5) alkyltiogrupper; og Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- eller =NHO-m er fra 0,1 til 15.

2. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 1, hvor Alk er en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede og Z1 er fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR<*>, 0(CH2)nCONHR eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert i krav 1.

3. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 1, hvor Alk 2 og Sp 2er sammen en binding og Z1 er H eller (C1-C5) alkyl.

4. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 1, hvor Sp1 er en binding, -S-, - O-, -CONH-, -NHCO- eller -NR' hvor R' er definert i krav 1, med det forbehold at når Alk1 er en binding, er Sp<1> en binding.

5. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 4 hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)„COOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert i krav 1 eller Ar er en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden hver eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-Cé) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR* hvor n og R' er som definert i krav 1.

6. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 5 hvor Z er et protein valgt fra mono- og polyklonale antistoffer, deres antigen-gjenkjennende fragmenter og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker og vekstfaktorer og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker, hvor en kovalent binding til proteinet er et amid dannet fra omsetning med "m" lysin sidekjeder.

7. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 6 hvor Z2 er Q-Sp-S-S-W, hvor W er R5, X<1>, R5', R og Sp er som definert i krav 1; og Q er -NHNCO-.

8. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 7 hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR<*>, 0(CH2)nCOOR\ S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert i krav 1, Alk 2 og Sp 2 er sammen en binding og Z 1 er H eller (C1-C5) alkyl.

9. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 8, hvor Sp1 er -O- eller en binding, Alk1 er Ci til C6 alkylen, Ar er 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én eller to grupper av (C1-C3) alkyl, (C1-C3) alkoksy, halogen,_nitro, COOR' eller CONHR' hvor R' er som definert i krav 1 og Z<1> er (Ci-C3) alkyl.

10. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 9, hvor Z er et monoklonalt antistoff som gjenkjenner CD33 antigen og Z er calicheamicin gamma dimetyl-hydrazid eller calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

11. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 9, hvor Z3 er et monoklonalt antistoff som gjenkjenner polyepithelial mucin antigen og Z er calicheamicin gamma dimetylhydrazid eller calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

12. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 9, hvor Z er et monoklonalt antistoff som gjenkjenner et glykoprotein antigen til stede på kolon kreft celler og Z er calicheamicin gamma dimetylhydrazid eller calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

13. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 9, hvor Z3 er et monoklonalt antistoff som gjenkjenner IL2 reseptor tilstede på celler valgt fra gruppen bestående av aktivert og funksjonelt modne T-celler og abnormt aktiverte leukemi celler og Z er calicheamicin gamma dimetylhydrazid eller calicheamicin N-acetyl gamma dimetyl-hydrazid.

14. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 9, hvor Z er antistoff h- eller m-P67,6, h- eller m-CT-M-01, h- eller m-A33 eller anti-Tac og Z er calicheamicin gamma dimetylhydrazid eller calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

15. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 14 hvor Z3 er antistoff h-CT-M-01 og Z er calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

16. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 14 hvor Z er antistoff h-P67,6 og Z 2 er calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

17. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 14, hvor Z<3> er antistoff h- 2 11 P67,6, Z er calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid, Sp er -O-, Alk er C3 alkylen, Ar er 1,4-fenylen og Z<1> er Ci alkyl.

18. Cytotoksisk medikament konjugat ifølge krav 8 hvor Sp<1> er -O- eller en binding, Alk<1> er en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede, med det forbehold at når Alk1 er en binding, er Sp<1> en binding, Z<1> er (C1-C5) alkyl og Z er calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

19. Forbindelse med formelen hvor Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3, Alk 1 og Alk 2 er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede; Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR<*>, 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR', med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en binding; n er et helt tall fra 0 til 5; R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium-A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt; Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR<*>, CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR*, 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden eller hver naftyliden eller fenotiazin er eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR<*>, 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor, med det forbehold at når Ar er naftyliden, er Z<1> ikke hydrogen og med det forbehold at når Ar er fenotiazin, er Sp1 en binding bare forbundet med nitrogen; Sp<2> er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk2 er en binding, er Sp en binding; Z<1> er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR<*>, S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som definert ovenfor; Z<2> er Q-Sp-S-S-W, hvor W er R5 er -CH3, -C2H5 eller -CH(CH3)2; X<1> er et j od eller bromatom; R5' er en hydrogen eller gruppen RCO, hvor R er hydrogen, forgrenet eller uforgrenet (Ci - Cio) alkyl eller (Ci - Cio) alkylengruppe, en (C6-C11) arylgruppe, en (C6-C11) aryl-alkyl (Ci - C5) gruppe eller en heteroaryl eller heteroaryl-alkyl (Ci - C5) gruppe hvor heteroaryl er 2- eller 3-furyl, 2- eller 3-tienyl, 2- eller 3-(N-metylpyrrolyl), 2-, 3- eller 4-pyridyl, 2-, 4- eller 5-(N-metylimidazolyl), 2-, 4- eller 5-oksazolyl, 2-, 3-, 5- eller 6-pyrimidinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-kinolyl eller 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- eller 8-isokinolyl, alle aryl og heteroaryl er eventuelt substituert med én eller flere hydroksy, amino, karboksy, halogen, nitro, lavere (Ci - C3) alkoksy eller lavere (Ci - C5) tioalkoksygrupper; Sp er en lineær eller forgrenede divalent eller trivalent (Ci - Cis) rest, divalent eller trivalent aryl eller heteroarylrest, divalent eller trivalent (C3 - Cis) cykloalkyl eller heterocykloalkylrest, divalent eller trivalent aryl- eller heteroaryl-alkyl (Ci - Cis) rest, divalent eller trivalent cykloalkyl- eller heterocykloalkyl-alkyl (Ci - Cis) rest eller divalent eller trivalent (C2 - Cis) umettet alkylrest, hvor heteroaryl er furyl, tienyl, N-metylpyrrolyl, pyridinyl, N-metylimidazolyl, oksazolyl, pyrimidinyl, kinolyl, isokinolyl, N-metylkarbazoyl, aminokumarinyl eller fenazinyl og hvor når Sp er en trivalent rest, kan Sp være i tillegg substituert med lavere (Ci - C5) dialkylamino, lavere (Ci - C5) alkoksy, hydroksy eller lavere (Ci - C5) alkyltiogrupper; Q er =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH- eller =NO-.

20. Forbindelse ifølge krav 19 hvor Z er hydroksy.

21. Forbindelse ifølge krav 20 hvor Alk 2 er en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede og Z<1> er fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR eller S(CH2)„CONHR'.

22. Forbindelse ifølge krav 20 hvor Alk er en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede og Z<1> er H eller (C1-C5) alkyl.

23. Forbindelse ifølge krav 20 hvor Alk 2 og Sp 2 er sammen en binding og Z 1er H eller (C1-C5) alkyl.

24. Forbindelse ifølge krav 20 hvor Alk 2 og Sp 2 er sammen en binding og Z 1 er fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR'.

25. Forbindelse ifølge krav 20, hvor Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, - NHCO- eller -NR', med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en binding.

26. Forbindelse ifølge krav 25 hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR<*>, S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)„CONHR' eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden hver eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR\ 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)„CONHR<*>.

27. Forbindelse ifølge krav 26 hvor Z<2> er Q-Sp-SS-W, hvor W er R5, X<1>, R5', R og Sp er som definert i krav 19; og Q er =NHNCO-.

28. Forbindelse ifølge krav 27 hvor Alk 2 og Sp 2 er sammen en binding, Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-C6) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' og Z<1> er H eller (Ci-C5) alkyl.

29. Forbindelse ifølge krav 28 hvor Sp1 er -O-, Alk1 er C4 alkyl, Ar er 1,4-fenylen og Z1 er Ci alkyl.

30. Forbindelse ifølge krav 29 hvor Z er calicheamicin gamma dimetylhydrazid eller calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

31. Forbindelse med formelen: hvor Ar er en 1,2-, 1,8- eller 2,7-naftyliden eller hver naftyliden eller fenotiazin er eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR<*>, S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n er et helt tall fra 0 til 5 og R<* >er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium - A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt, med det forbehold at når Ar er fenotiazin, er Sp<1> en binding bare forbundet med nitrogen; Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3, Alk 1 og Alk 2er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede; Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR<1->, -N(CH2CH2)2N- eller -X- Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert, med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en binding; Sp 2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk 2er en binding, er Sp en binding; og Z1 er H, (C1-C5) alkyl eller fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert, med det forbehold at når Ar er naftyliden, er Z<1> ikke hydrogen og med det forbehold at når Alk1 er en binding, er Sp 2 en binding og Alk 2 er ikke en binding, deretter er Z 1 ikke Ci alkyl.

32. Forbindelse ifølge krav 31, hvor Z 1 er H eller (Ci-C5) alkyl og Sp 2 og Alk 2er hver en binding.

33. Forbindelse ifølge krav 32, hvor Sp1 er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'- eller -N(CH2CH2)2N- og Alk<1> er en forgrenet eller uforgrenet (Cj-Cio) alkylenkjede.

34. Forbindelse ifølge krav 33, hvor Ar er en usubstituert 1,2-, 1,8- eller 2,7- naftyliden eller

35. Forbindelse med formelen: hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt er substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)„CONHR' hvor n er et helt tall fra 0 til 5 og R' er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (Ci-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium - A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt; Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3, Alk 1 og Alk 2er uavhengig en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede; Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X- Ar'-Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)„CONHR', hvor n og R' er som ovenfor definert; 2 12 Sp er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at Sp og Sp ikke begge er samtidig en binding; og Z1 er fenyl eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)nCOOR\ 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' hvor n og R' er som ovenfor definert.

36. Forbindelse ifølge krav 35, hvor Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'- eller -N(CH2CH2)2N-.

37. Forbindelse ifølge krav 36, hvor Ar er usubstituert 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen og Z<l> er usubstituert fenyl.

38. Forbindelse med formelen: hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-tenylen substituert med COOR , CONHR', 0(CH2)nCOOR\ S(CH2)„COOR, 0(CH2)„CONHR' eller S(CH2)„CONHR' og eventuelt substituert med én eller to grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (Ci-C4) tioalkoksy, halogen eller nitro, hvor n er et helt tall fra 0 til 5 og R er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C5) kjede eventuelt substituert med én eller to grupper av -OH, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, (C1-C3) dialkylamino eller (C1-C3) trialkylammonium - A" hvor A" er et farmasøytisk akseptabelt anion som fullfører et salt; Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3, Alk og Alk er uavhengig en binding eller forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede; Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- eller -X- Ar<*->Y-(CH2)n-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR', med det forbehold at når Alk<1> er en binding, er Sp<1> en binding hvor n og R' er som ovenfor definert i (C), med det forbehold at når Ar er 1,3- eller 1,4- fenylen eventuelt substituert med én gruppe med (Ci-Ce) alkyl eller (C1-C5) alkoksy og Alk 2 er en binding, er Sp 1 ikke en binding, -O-eller -NHCO-; Sp 2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk 2 er en binding, er Sp2 en binding; og Z1 er H eller (C1-C5) alkyl.

39. Forbindelse ifølge krav 38, hvor Alk1 er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede og Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- og Alk<2> og Sp<2> er hver en binding.

40. Forbindelse ifølge krav 39, hvor Ar er usubstituert 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen og Z<1> er (C1-C5) alkyl.

41. Forbindelse med formelen: > hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen eller nitro; Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er et metall som fullfører et salt, -N3, Alk<1> er en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede; Alk er en binding eller forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede; Sp<1> er -CONH-; Sp 2 er en binding, -S eller -O-, med det forbehold at når Alk 2 er en binding, er Sp en binding; og Z<1> er H eller (C1-C5) alkyl; med det forbehold at når Alk<1> er C2, er Alk<2> en binding 0g Z<1> er Ci, deretter har Ar 11 2 minst én substituent, med det forbehold at når Alk' erC2,Z' erH, Alk er en binding 0g Ar er 1,4-fenylen og har Ar minst én substituent og med det forbehold at når Alk1 er C3, Z1 er Ci, er Alk<2> en binding og Ar er 1,4-fenylen, og Ar har minst én substituent.

42. Forbindelse ifølge krav 41, hvor Alk 2 og Sp 2 er hver en binding, Ar er usubstituert 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen og Z<1> er (C1-C5) alkyl.

43. Forbindelse ifølge krav 41, hvor Ar er usubstituert 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen og Alk 2 og Sp 2 er hver en binding.

44. Forbindelse med formelen: hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen eller nitro; Z er halogen, hydroksy, OM hvor M er en metall som fullfører et salt, -N3, Alk1 er en forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede; Alk er en binding eller en forgrenet eller uforgrenet (Ci-Cio) alkylenkjede; Sp1 er en -S-, -N(CH2CH2)2N- eller -X-Ar'-Y-(CH2)„-Z hvor X, Y og Z er uavhengig en binding, -NR'-, -S- eller -O-, med det forbehold at når n = 0, må minst én av Y og Z være en binding og Ar' er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (C1-C5) alkyl, (C1-C4) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)„CONHR' eller S(CH2)nCONHR', hvor n og R' er som ovenfor definert; Sp 2 er en binding, -S- eller -O-, med det forbehold at når Alk 2 er en binding, er Sp en binding; og Z<1> er H eller (C1-C5) alkyl.

45. Forbindelse ifølge krav 44, hvor Sp1 er en -S- eller -N(CH2CH2)2N- og Alk<2 >og Sp 2er hver en binding.

46. Forbindelse ifølge krav 45, hvor Ar er usubstituert 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen og Z1 er (C1-C5) alkyl.

47. Forbindelse ifølge kravene 38, 41 eller 44 hvor Alk 2 og Sp 2er hver en binding.

48. Forbindelse ifølge kravene 36, 39 eller 45, hvor Ar er usubstituert 1,2-, 1,3-eller 1,4-fenylen.

49. Forbindelse ifølge kravene 38, 42, 43,44 eller 47, hvor Z er hydroksy,

50. Farmasøytisk preparat for å hemme veksten av celler, omfattende en effektiv cellevekst-hemmende mengde av konjugatet ifølge krav 1,15 eller 16 og et parenteralt-administrerbart medium.

51. Frysetørket farmasøytiske preparat for å hemme veksten av celler, omfattende et konjugat ifølge krav 15 eller 16 som blir oppnådd ved frysetørking av en omtrent 1 mg/ml løsning av konjugatet oppløst i ca. 5 mM natriumfosfatbuffer ved en pH på ca. 7,4 inneholdende 100 mM natriumklorid og 100 mM sukrose.

52. Fremgangsmåte for fremstilling av målrettete konjugater som angitt i krav 1 omfattende omsetning av en forbindelse med formelen 112 2 12 3' hvor Alk , Sp , Ar, Sp , Alk , Z og Z er som definert i krav 1; og Z er med en bærer Z 3 , hvor Z 3er et protein valgt fra mono- og polyklonale antistoffer, deres antigen-gjenkjennende fragmenter og deres kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker, i en vandig, bufret løsning ved en pH på mellom 6,5 og 9,0 og en temperatur på 4° til 40°C i 1 til 48 timer for å danne målrettete konjugater som angitt i krav 1.

53. Fremgangsmåte ifølge krav 52 hvor forbindelsen med formel er dannet ved: (a) omsetning av H2Z med en forbindelse med formelen i et alkoholisk løsningsmiddel med et kokepunkt som er mindre enn ca. 100°C i nærvær av 5% eddiksyre eller en karboksylsyre katalysator ved 20° til 70°C i 1 til 24 timer, hvor Alk<1> og Alk2, Sp1, n, R', Sp<2>, Z<1> og Ar er som definert i krav 52, for å produsere et mellomprodukt med formel 11 2 2 1 2 hvor Alk , Sp , Ar, Sp , Alk , Z og Z er som definert i krav 51; (b) isolering av mellomproduktet fra trinn (a); og (c) omsetning av det isolerte mellomprodukt fra trinn (b) med N-hydroksysuccinimid, 2, 3, 5, 6-tetrafluorfenol, pentafluorfenol, 4-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol eller N-hydroksysulfosuccinimid i nærvær av DCC, EDCI eller andre karbodiimid i et inert, organisk løsningsmiddel så som acetonitril eller acetonitril inneholdende 5-50% DMF.

54. Fremgangsmåten ifølge krav 52 eller krav 53 hvor Alk 2 og Sp 2 er sammen en binding og Z<1> er H eller (C1-C5) alkyl.

55. Fremgangsmåten ifølge krav 53 eller krav 54, hvor Sp<1> er en binding, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO- eller -NR', med det forbehold at når Sp<1> er en binding, er Alk<1> en binding.

56. Fremgangsmåten ifølge krav 53 eller krav 54, hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Ce) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)„COOR', S(CH2)nCOOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR' eller en 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- eller 2,7-naftyliden, hver eventuelt substituert med én, to, tre eller fire grupper av (d-Cé) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (d-C4) tioalkoksy, halogen, nitro, COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)„COOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)nCONHR'.

57. Fremgangsmåten ifølge krav 53 eller krav 54, hvor en kovalent binding til Z protein er et amid dannet fra en omsetning med lysin sidekjeder av Z proteinet.

58. Fremgangsmåten ifølge kravene 53 eller 54, hvor Z2 er Q-Sp-S-S-W og W er R5, X<1>, R5', R og Sp er som definert i krav 1 og Q er =NHNCO-.

59. Fremgangsmåten ifølge krav 53, hvor alkoholisk løsningsmiddel i trinn (a) er metanol; karboksylsyrekatalysatoren i trinn (a) er 5% eddiksyre; det isolerte mellomprodukt i trinn (b) blir omsatt i trinn (c) med N-hydroksysuccinimid i nærvær av EDCI i acetonitril; og vandig bufret løsning av trinn (d) er fosfatbuffer som har en pH på 7,4 til 8,0.

60. Fremgangsmåten ifølge krav 59, hvor Z1 er (C1-C5) alkyl.

61. Fremgangsmåten ifølge krav 60, hvor Ar er 1,2-, 1,3- eller 1,4-fenylen eventuelt substituert med én, to eller tre grupper av (Ci-Cé) alkyl, (C1-C5) alkoksy, (C1-C4) tioalkoksy, halogen, nitro eller COOR', CONHR', 0(CH2)nCOOR', S(CH2)„COOR', 0(CH2)nCONHR' eller S(CH2)„CONHR'.

62. Fremgangsmåten ifølge krav 61, hvor Sp1 er -O-, Alk<1> er C4 alkylen, Ar er 1,4-fenylen og Z1 er Ci alkyl.

63. Fremgangsmåten ifølge krav 62, hvor Z er antistoff h-P67,6, h-CT-M-01, m-CT-M-01, h-A33, m-A33 eller anti-Tac.

64. Fremgangsmåten ifølge krav 63, hvor Z er calicheamicin gamma dimetyl-hydrazid eller calicheamicin N-acetyl gammadimetylhydrazid.

65. Fremgangsmåten ifølge krav 64, hvor Z 3 er antistoff h-CT-M-01 og Z 2 er calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

66. Fremgangsmåten ifølge krav 64, hvor Z 3 er antistoff h-P67,6 og Z 2 er calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

67. Fremgangsmåten ifølge krav 56, hvor Sp1 er -O- eller en binding; Alk1 er en binding eller forgrenet eller uforgrenet (C1-C10) alkylenkjede, med det forbehold at når Alk 1 er en binding, er Sp 1 en binding; Z 1 er (C1-C5) alkyl; og Z 2 er calicheamicin N-acetyl gamma dimetylhydrazid.

68. Konjugat som krevd i hvilket som helst av kravene 1 til 18 for anvendelse for å kontrollere veksten av en uønskete celle hos et pattedyr.

69. Forbindelse for anvendelse ifølge krav 68 hvor uønsket celle er en kreftcelle.

70. Forbindelse for anvendelse ifølge krav 69 hvor kreften er bryst, lunge eller eggstokk- kreft eller leukemi.

71. Anvendelse av et konjugat som krevd i hvilket som helst av kravene 1 til 18 ved fremstillingen av et medikament for å kontrollere veksten av en uønskete celle hos et pattedyr.

72. Anvendelse ifølge krav 71 hvor den uønskede celle er en kreftcelle. i

73. Anvendelse ifølge krav 72 hvor kreften er bryst, lunge eller eggstokk-kreft eller leukemi.