JP4093757B2 - ヒトｃｔｌａ−４抗体およびその使用 - Google Patents

ヒトｃｔｌａ−４抗体およびその使用 Download PDF

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Description

【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／１５０，４５２号の利益を主張し、その開示を本明細書中でその全体を参考文献として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、分子免疫学および、ヒト疾患の処置に関する。特に、ヒトＣＴＬＡ−４に対する新規のヒト配列抗体、ならびにこれらの抗体を使用してヒト疾患および感染を処置する方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
脊椎動物の免疫系は、最適な免疫活性化を達成するため多数のシグナルを必要とする；例えば、Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５４：１−１４（１９８９）；Ｐａｕｌ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．，編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版（１９９８）、詳しくは１２章および１３章、４１１〜４７８ページを参照のこと。Ｔリンパ球（Ｔ細胞）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）間の相互作用は、免疫応答に必須である。Ｔ細胞およびＡＰＣ上で見出される多くの付着分子のレベルは、免疫応答の間、増加する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ａ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３−２５２（１９８７）；ＳｈａｗおよびＳｈｉｍｕｚｕ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＫｉｎｄｔおよびＬｏｎｇ編、１：９２−９７（１９８８）；およびＨｅｍｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ９：１０９−１１３（１９８８））。これらの分子のレベルの増加は、なぜ活性化されたＡＰＣが、休止ＡＰＣよりも抗原特異的Ｔ細胞増殖の刺激においてより効果的であるかを説明するのに役立ち得る（Ｋａｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１０９−１１４（１９８３）；Ｋｒｅｉｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２９３７−２９４５（１９８５）；ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２９０７−２９１１（１９８８）；およびＨａｗｒｙｌｏｗｉｃｚおよびＵｎａｎｕｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０８３−４０８８（１９８８））。
【０００４】
Ｔ細胞免疫応答は、細胞−細胞相互作用（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ａ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３−２５２（１９８７））、特にＴ細胞と補助細胞（ＡＰＣなど）間、および可溶性免疫伝達物質（サイトカインまたはリンフォカイン）の産生（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（１９８７）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊｏｕｒ．Ｍｅｄ ３１７：９４０−９４５；Ｓａｌｌｕｓｔｏ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８）を含む複合プロセスである。この応答は、Ｔ細胞レセプター複合体（Ｗｅｉｓｓ（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５９３−６１９）および他の「アクセサリー」表面分子（Ａｌｌｉｓｏｎ（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４１４−４１９；上記Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９８７））を含むいくつかのＴ細胞表面レセプターによって、調節される。これらのアクセサリー分子の多くは、細胞表面上のモノクローナル抗体の反応性によって定義される天然に存在する細胞表面分化（ＣＤ）抗原である（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，編、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．（１９８７））。
【０００５】
初期の研究は、Ｂリンパ球活性化が、２つのシグナルを必要とすることを示唆し（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ（１９７０）Ｓｃｉｅｎｃｅ １６９：１０４２−１０４９）、そして現在は、全てのリンパ球は、その最適な活性化のため２つのシグナル、すなわち、抗原特異的シグナルまたはクローンシグナル、および第２の抗原非特異的シグナルを必要とすると思われている（上記Ｊａｎｅｗａｙ）。Ｆｒｅｅｍａｎ（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４−２７２２は、ＭＡｂ Ｂ７によって認識されるＢ細胞活性化抗原（Ｆｅｅｍａｎ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３２６０）をコードするｃＤＮＡクローンを単離し、そして配列決定した。このｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は、標識されたＭＡｂＢ７およびＭＡｂ ＢＢ−１の両方によって染色することで示された（Ｃｌａｒｋ（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１００−１１３；Ｙｏｋｏｃｈｉ（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：８２３；Ｆｒｅｅｍａｎら、（１９８９）上述；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９８７）、上述）。さらに、この抗原の発現は、単球などの他の直系の細胞において検出された（Ｆｒｅｅｍａら、上述）。
【０００６】
Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）抗原性の応答は、ＡＰＣによって提供されるシグナルを必要とする。第１シグナルは、Ｔ細胞レセプター複合体（Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，８６：１０１５（１９９０））とＡＰＣ上のクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子のからみで示される抗原（Ａｌｌｅｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：２７０（１９８７））との相互作用によって開始される。この抗原特異的シグナルは、全ての応答を起こすのに十分ではなく、そして第２シグナルの非存在下において、実際はクローンの不活化またはアネルギーを導き得る（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１３４９（１９９０））。ＭＨＣによって提供される第２「同時刺激」シグナルの要求は、多くの実験系において示された（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、上述；ＷｅａｖｅｒおよびＵｎａｎｕｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １１：４９（１９９０））。この第２シグナルの分子性質は、完全には理解されていないが、いくつかの場合においてインターロイキン（ＩＬ）−１（ＷｅａｖｅｒおよびＵｎａｎｕｅ、上述）などの可溶性分子および細胞間接着に関与する膜レセプター（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５（１９９０））の両方は、同時刺激シグナルを提供し得ることは、明らかである。
【０００７】
ＣＤ２８抗原（免疫グロブリンのスーパーファミリーのホモダイマー糖タンパク質（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ８４：８５７３−８５７７（１９８７）））は、最も成熟したヒトＴ細胞において見出された（Ｄａｍｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２２９６−２３００（１９８３））アクセサリー分子である。現行の証拠は、この分子が、Ｔ細胞レセプター複合体によって開始されるＴ細胞活性化経路とは異なる代替のＴ細胞活性化経路において機能することを示唆する（Ｊｕｎｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４４７２−４４８１（１９８７））。ＣＤ２８抗原反応性モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、種々のポリクローナル刺激によって開始されるＴ細胞応答を増大させ得る（Ｊｕｎｅら、上述によって概説される）。これらの刺激の効果は、ｍＲＮＡ安定化を増加させる（Ｌｉｎｄｓｔｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３３９−３４３（１９８９））結果、ＭＡｂ誘導サイトカイン産生から生じ得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ８６：１３３３−１３３７（１９８９）；およびＬｉｎｄｓｔｅｎら（１９８９）、上述）。抗ＣＤ２８ ｍＡｂはまた、阻害の影響を有し得る。すなわち、これらは、自己混合リンパ球反応（Ｄａｍｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：５０９６−６００１（１９８１））および抗原特異的Ｔ細胞クローンの活性化（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１２８９−１２９６（１９８６））をブロックし得る。
【０００８】
ＣＤ２８は、Ｂ細胞活性化抗原（Ｂ７／ＢＢ−１）に対するカウンターレセプターであることがいくつかの研究により示された（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：５０３１−５０３５（１９９０））。Ｂ７／ＢＢ−１抗原は、本明細書中以後「Ｂ７抗原」として示される。Ｂ７リガンドはまた、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるが、ＣＤ２８と対照的に、細胞外領域において２つのＩｇドメイン（Ｎ末端可変（Ｖ）様ドメインに次いで定常（Ｃ）様ドメイン）を有する。
【０００９】
Ｔ細胞への非特異的同時刺激シグナルの送達は、ＡＰＣにおいて見出された少なくとも２つの相同性のＢ７ファミリーメンバー（Ｂ７−１（Ｂ７、Ｂ７．１、またはＣＤ８０とも称される））およびＢ７−２（Ｂ７．２またはＣＤ８６とも称される）を必要とする。これらの両方がＣＤ２８を介してＴ細胞へ同時刺激シグナルを送達し得る。ＣＤ２８を介する同時刺激は、Ｔ細胞活性化を促進する。
【００１０】
Ｂ７抗原およびＣＤ２８レセプターの細胞外部分と免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｃ．γ．１（重鎖定常領域）の遺伝的融合を使用することで、ＣＤ２８とＢ７抗原の間の相互作用が、特徴付けられた（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））。固定化されたＢ７Ｉｇ融合タンパク質およびＢ７陽性ＣＨＯ細胞は、Ｔ細胞の増殖を同時刺激することが示された。
【００１１】
Ｂ７陽性ＣＨＯ細胞によるＴ細胞刺激はまた、特異的にＩＬ−２の転写レベルを増加するように刺激する。さらなる研究は、抗ＣＤ２８ＭＡｂが、Ｂ細胞白血病株との細胞性相互作用によって特定のＴ細胞白血病細胞株において誘導されるＩＬ−２産生を阻害することを示した（Ｋｏｈｎｏら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１−１−１０（１９９０）。
【００１２】
ＣＤ２８は、単一の細胞外可変領域（Ｖ）様ドメインを有する（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ、上述）。相同性分子、ＣＴＬＡ−４は、マウス細胞溶解性のＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーの示差的スクリーニングによって同定された（Ｂｒｕｎｅｔ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：２６７−２７０）。
【００１３】
ＣＴＬＡ−４は、マウス細胞溶解性のＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーの示差スクリーニングによって初めに同定された（Ｂｒｕｎｅｔ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：２６７−２７０）Ｔ細胞表面分子である。ＣＴＬＡ−４はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであり；ＣＴＬＡ−４は、単一の細胞外Ｉｇドメインを含む。ＣＴＬＡ−４転写は、細胞溶解性活性を有するＴ細胞集団において見出され、ＣＴＬＡ−４は細胞溶解性応答において機能し得ることが示唆された（Ｂｒｕｎｅｔら、上述；Ｂｒｕｎｅｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１０３−２１−３６（１９８８））。研究者らは、ＣＴＬＡ−４のヒト対応遺伝子のクローニング（Ｄａｒｉａｖａｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１９０１−１９０５（１９８８））およびこの遺伝子のＣＤ２８と同じ染色体領域（２ｑ３３−３４）に対するマッピング（Ｌａｆａｇｅ−Ｐｏｃｈｉｔａｌｏｆｆら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３１：１９８−２０１（１９９０））を報告した。このヒトＣＴＬＡ−４ ＤＮＡとＣＤ２８タンパク質をコードするＤＮＡ間の配列比較は、膜近傍の（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）領域および細胞質の領域において最も高い相同性度で配列の有意な相同性を示す（Ｂｒｕｎｅｔら、１９８８、上記；Ｄａｒｉａｖａｃｈら、１９８８、上記）。
【００１４】
いくつかの研究により、ＣＴＬＡ−４は、第２同時刺激物質として類似の機能を有することが示唆された（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５９５−１６０４（１９９２）；Ｗｕら、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１３２７−１３３５（１９９７）Ｌｉｎｄｓｌｅｙ，Ｐ．ら、米国特許第５，９７７，３１８号；同第５，９６８，５１０号；同第５，８８５，７９６号；および同第５，８８５，５７９号）。しかし、他の研究者らは、ＣＴＬＡ−４が、Ｔ細胞活性化の緩衝物質（ｄａｍｐｅｎｅｒ）として反対の役割を有すると報告した（Ｋｒｕｍｍｅｌ（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：４５９−４６５）；Ｋｒｕｍｍｅｌら、Ｉｎｔ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：５１９−５２３（１９９６）；Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．７：８８５−８９５（１９９７））。ＣＴＬＡ−４欠損マウスは、広範囲に及ぶリンパ球増殖に羅患することが報告された（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、上述）。ＣＴＬＡ−４遮断は、インビトロにおいて（Ｗａｌｕｎａｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１：４０５−４１３（１９９４））およびインビボにおいて（Ｋｅａｒｎｅｙ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１０３２−１０３６）Ｔ細胞応答を増大させ、抗腫瘍免疫を悪化させ（Ｌｅａｃｈ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１７３４−１７３６）、そして誘発された自己免疫疾患を増す（Ｌｕｈｄｅｒ（１９９８）Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：４２７−４３２）ことが報告された。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞免疫応答の初期の特性に対して代替のまたは付加的な影響を有することもまた、報告された（Ｃｈａｍｂｅｒｓ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：３９６−４０４；Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１９８９−１９９３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４４５−４５０）。これは、ＣＴＬＡ−４に対して自己抗体を有する自己免疫患者がいくらかいるという知見と一致する。ＣＴＬＡ−４ブロック抗体は、これらの患者において病原の役割を有することがあり得る（Ｍａｔｓｕｉ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４３２８−４３３５）。
【００１５】
非ヒトＣＴＬＡ−４抗体は、上記で議論した種々の研究において使用された。しかし、ヒトにおいて抗体のインビボでの治療的な用途および診断的な用途の開発に面する主要な障害の１つは、非ヒト免疫グロブリンの内因性の免疫原性である。例えば、免疫応答性ヒト患者は、げっ歯類のモノクローナル抗体の治療的用量を投与される場合、その患者は、げっ歯類の免疫グロブリン配列に対する抗体を産生し；これらのヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、治療的抗体を中和し、そして急性毒性の原因となり得る。先の抗体におけるこれらおよび他の欠損は、本発明によってＣＴＬＡ−４に対するヒト抗体の供給によって克服される。
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体、およびヒトタンパク質に関連する非免疫グロブリンが実質的にないヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体を提供する。
【００１７】
関連する局面において、本発明はまた、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する治療的に有効なヒト配列抗体を提供する。いくつかの実施形態において、治療的に有効なヒト配列抗体は、通常のヒトＴ細胞の細胞表面上のＣＴＬＡ−４に結合する。他の実施形態において、ＣＤ抗原ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５およびＣＤ６９によってマーカーされたＴ細胞サブ集団は、治療的に有効なヒト配列抗体の投与の間およびその後も安定のままである。他の実施形態において、治療的に有効なヒト配列抗体は、通常のヒトＴ細胞の細胞表面上のＣＴＬＡ−４に結合する。他の実施形態において、ヒト配列抗体は、患者において十分寛容される。関連する実施形態において、
提供されるものはまた、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する多数のヒト配列抗体を含むポリクローナル抗体の組成物である。ポリクローナル抗体の組成物は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する少なくとも約２，５，１０，５０，１００，５００または１０００個の異なるヒト配列抗体を含み得る。
【００１８】
本発明はまた、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、そしてヒトＢ７へのヒトＣＴＬＡ−４の結合をブロックする、またはヒトＢ７へのヒトＣＴＬＡ−４の結合をブロックしないヒト配列抗体を提供する。
【００１９】
本発明はまた、少なくとも１０8Ｍ-1の平衡結合定数（Ｋａ）でヒトＣＴＬＡ−４に結合するヒト配列抗体を提供する。提供されるものはまた、少なくとも１０9Ｍ-1の平衡結合定数（Ｋａ）でヒトＣＴＬＡ−４に結合するヒト配列抗体である。
【００２０】
本発明はまた、ヒトＢ７へのヒトＣＴＬＡ−４の結合を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％でブロックするヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体を提供する。
【００２１】
本発明はまた、ＩｇＧまたはＩｇＭのいずれかの抗体重鎖を有する、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体を提供する。ＩｇＧ抗体重鎖は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得る。本発明はまた、抗体軽鎖がκ軽鎖であるヒト配列抗体を提供する。ヒト配列抗体は、それぞれ配列番号２から配列番号２３に示されるような可変領域のヌクレオチド配列を含むヒトＩｇＧ重鎖核酸およびヒトκ軽鎖核酸によってコードされ得る。
【００２２】
本発明はまた、ヒト配列抗体を提供し、ここでこのヒト配列抗体は、それぞれ配列番号１６および配列番号６に示されるような可変領域のヌクレオチド配列を含むヒトＩｇＧ重鎖核酸およびヒトκ軽鎖核酸によってコードされる。
【００２３】
本発明はまた、ヒト配列抗体を提供し、ここでこのヒト配列抗体は、それぞれ配列番号１８および配列番号８に示されるような可変領域のヌクレオチド配列を含むヒトＩｇＧ重鎖核酸およびヒトκ軽鎖核酸によってコードされる。
【００２４】
本発明はまた、ヒト配列抗体を提供し、ここでこのヒト配列抗体は、それぞれ配列番号２２および配列番号１２に示されるような可変領域のヌクレオチド配列を含むヒトＩｇＧ重鎖核酸およびヒトκ軽鎖核酸によってコードされる。
【００２５】
本発明はまた、ヒト配列抗体を提供し、ここでこのヒト配列抗体は、それぞれ配列番号１７および配列番号７に示されるような重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列によってコードされる。
【００２６】
本発明は、ヒト配列抗体を提供し、ここでこのヒト配列抗体は、それぞれ配列番号１９および配列番号９に示されるような重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列によってコードされる。
【００２７】
本発明はまた、ヒト配列抗体を提供し、ここでこのヒト配列抗体は、それぞれ配列番号２３および配列番号１３に示されるような重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列によってコードされる。
【００２８】
本発明は、ヒト配列抗体を提供し、ここで、ヒト配列抗体は、それぞれＶ遺伝子セグメントＶＨ３−３０．０およびＶＫ Ａ−２７由来の可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含むヒトＩｇＧ重鎖核酸およびヒトκ軽鎖核酸によってコードされる。
【００２９】
本発明はまた、ヒト配列抗体を提供し、ここで、ヒト配列抗体は、それぞれＶ遺伝子セグメントＶＨ３−３３およびＶＫ Ｌ−１５由来の可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含むヒトＩｇＧ重鎖核酸およびヒトκ軽鎖核酸によってコードされる。
【００３０】
本発明のいくつかのヒト配列抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＳＹＴＭＨ（配列番号２７）、ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３２）およびＴＧＷＬＧＰＦＤＹ（配列番号３７）、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ（配列番号２４）、ＧＡＦＳＲＡＴ（配列番号２９）およびＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号３５）を含む。
【００３１】
本発明のいくつかのヒト配列抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＳＹＴＭＨ（配列番号２７）、ＦＩＳＹＤＧＳＮＫＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３３）およびＴＧＷＬＧＰＦＤＹ（配列番号３８）、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡ（配列番号２５）、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号３０）およびＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号３５）を含む。
【００３２】
本発明の他のヒト配列抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＳＹＧＭＨ（配列番号２８）、ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３４）およびＡＰＮＹＩＧＡＦＤＶ（配列番号３９）、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡ（配列番号２６）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３１）およびＱＱＹＮＳＹＰＰＴ（配列番号３６）を含む。
【００３３】
本発明はまた、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体を提供し、ここで、このヒト配列抗体は、トランスジェニック非ヒト動物によって産生される。このトランスジェニック非ヒト動物は、マウスであり得る。
【００３４】
本発明はまた、ＦａｂフラグメントであるヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体を提供する。
【００３５】
本発明は、各々がヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する少なくとも２つのヒト配列抗体を含む多価複合体を提供する。この２つの異なる抗体は、互いに共有結合的にまたは非共有結合的に連結され得る。
【００３６】
本発明は、ヒト配列抗体の重鎖をコードする核酸を提供する。その核酸は、配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含み得る。
【００３７】
本発明は、ヒト配列重鎖導入遺伝子およびヒト配列軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を提供し、この動物は、ヒトＣＴＬＡ−４、フラグメントまたはそのアナログで免疫化され、それによって動物は、ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒト配列抗体を発現する。トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニックマウスであり得る。トランスジェニックマウスは、ＨＣｏ７またはＨＣｏ１２を含み得る。
【００３８】
本発明は、ヒト配列重鎖導入遺伝子およびヒト配列軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物由来のＢ細胞を含むハイブリドーマ細胞株を提供し、ここで、このハイブリドーマは、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体を産生する。関連する実施形態において、ハイブリドーマは、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体またはその結合フラグメントを分泌し、ここで、抗体は、以下からなる群から選択される：重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列、それぞれＳＹＴＭＨ（配列番号２７）、ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３２）およびＴＧＷＬＧＰＦＤＹ（配列番号３７）、ならびに軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列、それぞれＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ（配列番号２４）、ＧＡＦＳＲＡＴ（配列番号２９）およびＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号３５）、ならびに配列番号１７および配列番号７にそれぞれ示されるような重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト配列抗体；重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列、それぞれＳＹＴＭＨ（配列番号２７）、ＦＩＳＹＤＧＳＮＫＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３３）およびＴＧＷＬＧＰＦＤＹ（配列番号３８）、ならびに軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列、それぞれＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡ（配列番号２５）、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号３０）およびＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号３５）、ならびに配列番号１９および配列番号９にそれぞれ示されるような重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト配列抗体；または重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＳＹＧＭＨ（配列番号２８）、ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３４）およびＡＰＮＹＩＧＡＦＤＶ（配列番号３９）、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡ（配列番号２６）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３１）およびＱＱＹＮＳＹＰＰＴ（配列番号３６）、ならびに配列番号２３および配列番号１３にそれぞれ示されるような重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む請求項１に記載のヒト配列抗体。
【００３９】
本発明は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物はさらに、標的抗原に対する免疫応答を誘導するために効果的な薬剤を含み得る。提供されるものはまた、化学療法剤である。さらに、免疫抑制性分子に対する抗体もまた、提供される。
【００４０】
本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒト配列抗体（ここで、この抗体は、ヒトＢ７へのヒトＣＴＬＡ−４の結合をブロックする）の有効用量を患者に投与する工程を含む、患者において抗体に対する免疫応答を誘導する、増大させる、または長くする方法を提供する。この抗原は、腫瘍抗原であり得、またはこの抗原は、病原体由来であり得る。この腫瘍抗原はまた、テロメラーゼであり得る。上記病原体は、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であり得る。この病原体はまた、ＨＩＶであり得る。この方法はさらに、抗原、またはフラグメントもしくはそのアナログを患者に投与する工程を含み得、それによってヒト配列抗体と組み合わせた抗原は、免疫応答を導入する、増大させる、または長くする。抗原は、腫瘍抗原またはアルツハイマー病に羅患している患者などの患者におけるアミロイド形成の成分であり得、そして抗原は、ＡＢペプチドであり得る。この方法はさらに、患者にサイトカインを投与する工程を含み得る。
【００４１】
本発明は、互いに連結されるヒトＣＴＬＡ−４に対する少なくとも２つのヒト配列抗体を含む多価調製物の有効用量を患者に投与する工程を含む、患者における免疫応答を抑制する方法を提供する。本発明は、互いに連結されるヒトＣＴＬＡ−４に対する少なくとも２つのヒト配列抗体を含むポリクローナル調製物の有効用量を患者に投与する工程を含む、患者における免疫応答を抑制する方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する単離されたまたは組換えヒト配列抗体およびヒトモノクローナル抗体、ならびにこのような抗体の１つまたは組み合わせを含む組成物を提供する。本発明のヒト配列抗体のいくつかは、高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合すること、および／またはヒトＣＴＬＡ−４とそのリガンド（ヒトＢ７−１分子およびＢ７−２分子）との相互作用をブロックすることで、特徴付けられる。従って、本発明のヒト配列抗体およびヒトモノクローナル抗体は、インビボおよびインビトロにおいて診断的薬剤または治療的薬剤として使用され得る。
【００４３】
本発明のヒト配列抗体は、種々の抗体アイソタイプ、またはその混合物（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなど）を含み得る。代表的に、それらは、ＩｇＧ１（例えば、ＩｇＧ１ｋ）アイソタイプおよびＩｇＭアイソタイプを含む。ヒト配列抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であり得、または抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖフラグメント）のみを含み得る。いくつかのヒト配列抗体は、組換えヒト配列抗体である。いくつかのヒト配列抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）由来のＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。このハイブリドーマは、例えば、Ｂ細胞と不死化細胞とを融合することによって作製され得る。本発明のいくつかのヒト配列抗体は、４Ｃ８、４Ｅ１０、４Ｅ１０．５、５Ａ８、５Ｃ４、５Ｃ４．１．３、５Ｄ７、５Ｄ７．１、５Ｅ１０、５Ｅ１０．１２、５Ｇ１、５Ｇ１．４，６Ａ１０、６Ｃ９、６Ｃ９．６、６Ｄ９、６Ｄ９．７、６Ｇ４、７Ｅ４、７Ｅ４．４、７Ｅ６、７Ｈ８、８Ｅ８、８Ｅ８．４、８Ｆ８、８Ｆ８．１９、８Ｈ１、９８１０、９Ａ１０．１、９Ｂ９、９Ｃ１、９Ｇ５、１０５Ｂ、１０Ｂ５．８、１０Ｂ９、１０Ｂ９．２、１０Ｄ１、１０Ｄ１．３、１０Ｅ１１、１０Ｅ４、１０Ｅ４．５、１１Ｂ４、１１Ｄ１０、１１Ｅ４、１１Ｅ４．１、１１Ｅ８、１１Ｆ１０、１１Ｆ１１、１１Ｆ９、１１Ｇ１、１１Ｇ１．５、１Ｃ７、１Ｈ８．８、２Ａ７、２Ａ７．６、２Ｅ２、２Ｅ２．７、２Ｅ７、２Ｅ７．２、２Ｇ１、２Ｇ１．２、３Ｃ１２、３Ｅ１０、３Ｅ１０．５、３Ｅ６、３Ｅ６．０、３Ｆ１０、４Ａ１、４Ｂ６および４Ｂ６．１２と呼ばれるハイブリドーマによって産生される。小数点後の接尾辞は、同じハイブリドーマ細胞株の異なるクローン単離体を示す。
【００４４】
本発明のヒト配列抗ＣＴＬＡ−４抗体のいくつかは、以下の性質の１つ以上によって特徴付けられ得る：ａ）ヒトＣＴＬＡ−４に対する特異性（ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合）；ｂ）少なくとも約１０7Ｍ-1、または約１０9Ｍ-1、または約１０10Ｍ-1〜１０11Ｍ-1またはそれ以上の平衡結合定数（Ｋａ）でのヒトＣＴＬＡ−４に対する結合親和性；ｃ）少なくとも約１０3、約１０4、または約１０5ｍ-1ｓ-1の動力学的結合定数（ｋａ）；および／または、ｄ）少なくとも約１０3、約１０4、または約１０5ｍ-1ｓ-1の平衡解離定数（ｋｄ）。
【００４５】
別の局面において、本発明は、本発明のヒト配列抗体、または抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。従って、本発明の抗体コード核酸を含む組換え発現ベクター、およびそのようなベクターでトランスフェクトされた宿主細胞はまた、本発明によって含まれる、これらの宿主細胞を培養することで本発明の抗体を作製する方法も同様に本発明によって含まれる。
【００４６】
さらに別の局面において、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から単離されたＢ細胞を提供し、そのＢ細胞は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の種々のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ）を発現し得る。単離されたＢ細胞は、ヒトＣＴＬＡ−４抗原（またはその抗原性フラグメント）および／またはヒトＣＴＬＡ−４発現細胞の精製されたまたは濃縮された調製物で免疫化されたトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）由来であり得る。トランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有し得る。単離されたＢ細胞は、ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒトモノクローナル抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供するため不死化され得る。
【００４７】
従って、本発明はまた、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを提供する。このハイブリドーマは、不死化細胞と融合されたヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）由来のＢ細胞を含み得る。トランスジェニック非ヒト動物は、抗体産生ハイブリドーマを生成するためヒトＣＴＬＡ−４抗原および／またはヒトＣＴＬＡ−４発現細胞の精製されたまたは濃縮された調製物で免疫化され得る。
【００４８】
さらに別の局面では、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）（また、本明細書中で「ＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅTM」といわれる）を提供する。トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスであり得る。このトランスジェニック非ヒト動物は、ＣＴＬＡ−４抗原（またはその抗原フラグメント）の精製されたかまたは濃縮された調製物および／またはヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞で免疫化され得る。このトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプ転換を起こすことによって、ヒトＣＴＬＡ−４（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ）に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプを産生することが可能であり得る。アイソトープ転換は、例えば、古典的なまたは非古典的なアイソタイプ転換によって、発生し得る。
【００４９】
別の局面では、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４と特異的に反応するヒト配列抗体およびヒト配列モノクローナル抗体を産生する方法を提供する。本発明のいくつかの方法は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）を、ヒトＣＴＬＡ−４抗原の精製されたかまたは濃縮された調製物および／またはヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞で、免疫化する工程を包含する。次いで、この動物のＢ細胞（例えば、脾臓Ｂ細胞）が獲得され得、そして、骨髄腫細胞と融合され、ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成し得る。
【００５０】
本発明の抗ヒトＣＴＬＡ−４ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ）は、誘導化され得るかまたは別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、Ｆａｂ’フラグメント））に連結され得る。例えば、本発明の抗体または抗原結合部分は、１つ以上の他の分子実態に機能的に連結され得る（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合またはその他によって）。例えば、ヒト配列抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはその抗原結合フラグメントは、治療学的部分（例えば、細胞障害性薬物、酵素学的活性な毒素、もしくはそのフラグメント）、放射性同位体、または低分子抗癌薬物に結合され得る。本発明の抗体はまた、例えば、細胞毒性因子で放射性標識した（例えば、131Ｉ（例えば、Ｓｈｅｎ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ ８０（１２ Ｓｕｐｐｌ）：２５５３−２５５７）、銅−６７（例えば、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ（１９８８）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２１７−２２５））または、例えば、リボソーム不活化タンパク質ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）（例えば、Ｂｏｙｌｅ（１９９６）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２２１−２３０）を参照のこと）に結合された、細胞障害性医薬品に結合され得る。
【００５１】
別の局面では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアおよび本発明の少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体（ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する）、またはその抗原結合部分組成物、を含む組成物（例えば、薬学的および診断的組成物）を提供する。いくつかの組成物は、ヒト配列抗体またはその抗原結合部分の組み合わせを含み、好ましくは、それらのそれぞれは、別個のエピトープに結合する。本発明の少なくとも１つのヒト配列抗体もしくは少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体組成物またはその抗原結合部分、ならびに、本発明の少なくとも１つの二重特異性もしくは多重特異性分子の組み合わせを含む組成物（例えば、薬学的組成物）はまた、本発明の範囲内である。
【００５２】
インビボ方法については、抗体またはその抗原結合部分（または本発明の二重特異性もしくは多重特異性分子）は、Ｔ細胞関連疾患、つまり免疫応答を増大させるかまたは抑制するかまたは延長することによって回復され得るかまたは予防され得る疾患に罹患するヒト被験体に投与され得る。
【００５３】
本発明のヒト配列モノクローナル抗体およびヒト配列抗体組成物はまた、他の公知の治療法（例えば、抗癌治療）と組み合わせて投与され得る。従って、本発明は、薬学的にキャリアと共に、治療学的な有効量のヒト配列の薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する、被験体における癌を処置するための方法を提供する。いくつかのそのような方法はワクチンを含む。いくつかのそのようなワクチンとしては、腫瘍細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ−改変腫瘍細胞ワクチン、または抗原充填樹状細胞ワクチンが挙げられる。いくつかのそのような方法において、癌は、前立腺癌、黒色腫、または上皮癌である。
【００５４】
ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒト配列抗体は、免疫応答または免疫抑制のどちらかの刺激を必要とする処置の方法において使用され得る。以前の徴候は、ヒトＣＴＬＡ−４がヒトＢ７に結合するのを阻害する抗体を用いて処置される。免疫応答の延長の刺激、増強による処置に対して影響される疾患としては、癌（前立腺、腎臓または結腸の癌を含む）、病原体感染、自己抗原に関連した疾患（例えば、アミロイド形成疾患）（アルツハイマー病を含む）、および炎症性またはアレルギー性成分を有する疾患が挙げられる。免疫抑制は、お互いに連結するヒトＣＴＬＡ−４に対する少なくとも２つの異なった抗体を含む多価調製物を用いて達成される。処置に対して影響される疾患としては、対宿主性移植片病、対移植片性宿主病、自己免疫疾患および炎症などが挙げられる。
【００５５】
さらに別の局面では、本発明は、例えば、ヒトＣＴＬＡ−４関連疾患を診断するためのサンプル中におけるヒトＣＴＬＡ−４抗原の存在をインビトロまたはインビボで検出するための方法を提供する。いくつかの方法において、このことは、抗体とヒトＣＴＬＡ−４との間の複合体の形成を可能にする条件下で、コントロールサンプルと共に、試験されるサンプルを、本発明のヒト配列抗体もしくはヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分（または二重特異性もしくは多重特異性分子）と接触することによって達成される。次いで、複合体形成は、両方のサンプルにおいて検出され（例えば、ＥＬＩＳＡを用いて）、そして、サンプル間の複合体形成における任意の統計学的に有意な差異は、サンプルにおけるヒトＣＴＬＡ−４抗原の存在を示している。
【００５６】
本発明の性質および利点をさらに理解することは、明細書の残りの部分、図面、および請求の範囲を参照することによって、理解され得る。
【００５７】
本明細書中で記載された全ての出版物、図面、ＧｅｎＢａｎｋ登録参照（配列）、ＡＴＣＣ寄託、特許および特許出願は、それぞれが個々に示されるような程度に、全ての目的について、本明細書中に参考として明確に援用される。
【００５８】
（詳細な説明）
本発明は、発現、特に過剰発現、またはヒトＣＴＬＡ−４および／または関連分子の活性化、特に過剰活性化によって特徴付けられる疾患を処置および診断するための新規の抗体ベースの治療を提供する。本発明の治療は、ヒトＣＴＬＡ−４に存在するエピトープに結合する、ヒト配列抗体、ヒト配列モノクローナル抗体、またはその抗原結合部位を使用する。これらのヒト配列抗ＣＴＬＡ−４抗体は、機能的アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ−４のリガンドと結合する能力もしくは細胞を活性化する能力を阻害することによって、例えば、シグナルを細胞に伝達する能力を阻害することによって）またはアゴニスト（例えば、リガンドの効果を刺激するために）として作用し得る。
【００５９】
本発明のヒト配列抗体は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプ転換を起こすことによって、ヒトＣＴＬＡ−４（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＥ）に対するヒト（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル）抗体の多数のアイソタイプを産生可能な非ヒトトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）において産生され得る。従って、本発明の種々の局面は、抗体および抗体フラグメントおよびその薬学的組成物、ならびに非ヒトトランスジェニック動物およびそのようなモノクローナル抗体を作製するためのＢ細胞およびハイブリドーマを含む。本発明の抗体を使用する、ヒトＣＴＬＡ−４もしくは関連した、交差反応性増殖因子レセプターを発現する細胞を検出するためか、または、インビトロかまたはインビボのどちらかにおいてヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞の増殖、分化および／または運動性を阻害するための方法がまた、本発明によって包含される。
【００６０】
記述される場合を除き、用語「患者」または「被験体」は交換可能に使用され、そして、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびに、ウサギ、ラット、およびマウスなどの実験動物、ならびに他の動物をいう。
【００６１】
用語「処置すること」は、症状、合併症、もしくは疾患の生化学的徴候の開始を予防または遅延するための本発明の化合物または薬剤の投与、症状の軽減または疾患、状態、もしくは障害（例えば、自己免疫障害）のさらなる発生の阻止または阻害を含む。処置は、疾患の出現後の徴候の、予防的（疾患の開始を予防もしくは遅延するかまたはその臨床学的もしくは亜臨床的な徴候の出現を予防する）または治療学的抑制あるいは予防的または治療学的軽減であり得る。
【００６２】
一般的に、句「十分に耐性の」は、処置の結果として発生しそして処置決定に影響する健康状態における有害な変化の非存在をいう。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「リンパ球」は、当該分野で通常の意味を有し、そして、血中で見出される単核の非食作用性白血球、リンパ、リンパ系組織（すなわち、ＢおよびＴリンパ球）のいずれかをいう。
【００６４】
句「Ｔリンパ球の亜集団」または「Ｔ細胞サブセット」は、特定の細胞表面マーカーの発現によって特徴付けられるＴリンパ球またはＴ細胞をいう（Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．ら編、１９９７，Ｔｈｅ Ｌｅｕｌｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍを参照のこと）。Ｔ細胞に関する用語「安定な」は、Ｔ細胞サブセットの頻度または割合が、薬剤の投与の経路または期間にわたって変化しないという事実をいう。
【００６５】
用語「細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原−４」「ＣＴＬＡ−４」「ＣＴＬＡ４」、「ＣＴＬＡ−４抗原」および「ＣＤ１５２」（例えば、Ｍｕｒａｔａ（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：４５３−４６０を参照のこと）は、交換可能に使用され、そして、ＣＴＬＡ−４（例えば、Ｂａｌｚａｎｏ（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：２８−３２）と少なくとも１つの共通のエピトープを有する改変体、アイソフォーム、ヒトＣＴＬＡ−４の種相同体、およびアナログを含む。
【００６６】
ヒトＣＴＬＡ−４の全長ｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１５００６を有する。アミノ酸１〜３７の領域は、リーダーペプチドである；３８〜１６１は、細胞外Ｖ様ドメインである；１６２〜１８７は、膜貫通領域である；そして１８８〜２２３は、細胞質ドメインである。ヌクレオチド配列の改変体が報告されており、位置４９でのＧからＡへの転移、位置２７２でのＣからＴへの転移、そして位置４３９でのＡからＧへの転移を含む。マウスＣＴＬＡ−４の全長ＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬ登録番号Ｘ０５７１９（Ｂｒｕｎｅｔら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：２６７−２７０）を有する。アミノ酸１〜３５の領域は、リーダーペプチドである。
【００６７】
ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）の全長ＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６０９５８を有する；マウス配列の登録番号は、Ｘ６０９５８である；ラット配列の登録番号は、Ｕ０５５９３である。ヒトＢ７−２（ＣＤ８６）の全長ｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２５２５９を有する；マウス配列の登録番号は、Ｌ２５６０６である。
【００６８】
ＣＤ２８をコードする遺伝子は、広範囲に特徴付けられている。ニワトリｍＲＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６７９１５である。ラットｍＲＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５５２８８である。ヒトｍＲＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０２９８８である。マウスｍＲＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ３４５３６である。
【００６９】
用語「エピトープ」は、抗体と特異的に結合し得るタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常は、分子（例えば、アミノ酸または糖側鎖）の化学的に活性な表面配置からなり、そして通常は、特異的な３次元の構造的特性、ならびに特異的電荷特性を有する。立体配座のエピトープおよび非立体配座のエピトープは、前者に結合するが後者には結合しないということが変性溶媒の存在下で消失する点で区別される。
【００７０】
インタクトな「抗体」は、ジスフィルド結合によって内部連結された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）からなる。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域からなる。この重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域からなる。この軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域を散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得る。各々のＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番で配置された：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。用語抗体は、ＣＴＬＡ−４に結合する能力を保持するインタクトな抗体の抗原結合部位を含む。結合の例は以下である：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスフィルド橋によって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨが独立した遺伝子によって遺伝暗号を指定されるが、組換え法を使用して、単一のタンパク質鎖として作製し得る合成リンカーによってこれらは連結され得、ここで、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対をなして一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。このような単鎖抗体は、参考文献によって用語「抗体」に含まれる。組換え技術またはインタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、フラグメントを調製し得る。
【００７１】
二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、２つの異なる結合特異性を有する（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同５，８３７，２４３号；Ｚｅｉｌｄｅｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１２４６−１２５２；Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ（１９９９）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ９：４７−５４；Ｋｅｌｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４００８−４０１４を参照のこと）。例えば、本発明は、細胞表面抗原（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に対する１つの結合部位およびエフェクター細胞の表面上のＦｃレセプターに対する第二の結合部位を有する二重特異性抗体を提供する。本発明はまた、少なくとも３つの結合部位を有する多重特異的抗体を提供する。用語「二重特異性抗体」はさらに、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）を含む。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上のこれら２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用して、これによってこのドメインを別の鎖の相補性ドメインと強いて対をなしめ、そして２つの抗原結合部位を作製する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【００７２】
用語「ヒト配列抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発あるいはインビボの体性（ｓｏｍａｔｉｃ）変異誘発によって誘導された変異）。しかし、本明細書中で使用される場合、用語「ヒト配列抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に接がれた抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含むことを意図しない。
【００７３】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する、単一の結合特異性を示す抗体をいう。１つの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化した細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００７４】
用語「ダイクローナル（ｄｉｃｌｏｎａｌ）抗体」は、ヒトＣＴＬＡ−４に対する少なくとも２つの抗体の調製物をいう。代表的には、異なる抗体は、異なるエピトープに結合する。
【００７５】
用語「オリゴクローナル（ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ）抗体」は、ヒトＣＴＬＡ−４に対する３〜１００の異なる抗体の調製物をいう。代表的には、このような調製物における抗体は、範囲の異なるエピトープに結合する。
【００７６】
用語「ポリクローナル抗体」は、ヒトＣＴＬＡ−４に対する１より多い（２以上）の異なる抗体の調製物をいう。このような調製物は、範囲の異なるエピトープに結合する抗体を含む。
【００７７】
本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４レセプターによって形質導入されたシグナルをブロックするかまたはアンタゴナイズするヒトＣＴＬＡ−４に対するヒト配列抗体を提供する。これらの抗体のいくつかは、ヒトＢ７の対応するレセプターにＣＴＬＡ−４が相互作用することを阻害するように、ヒトＣＴＬＡ−４上のエピトープに結合し得る。ヒトＣＴＬＡ−４のヒトＢ７との相互作用は、ヒトＣＴＬＡ−４レセプターを保有するＴ細胞の不活性化を導くシグナルを変換するので、相互作用の拮抗作用は、ヒトＣＴＬＡ−４レセプターを保有するＴ細胞の活性化を効果的に誘導、増大または延長する。これによって、免疫応答を延長するかまたは増大する。「ブロッキング抗体」は、抗体結合部位対ヒトＣＴＬＡ−４リガンド結合部位の比が１：１より大きくそして抗体の濃度が１０-8Ｍより大きいような条件下で、細胞に発現したヒトＢ７リガンドへの可溶性ヒトＣＴＬＡ−４の結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または９９．９％だけ減少する抗体をいう。
【００７８】
時には多価調製物として言及する他の抗体調製物は、同一の細胞上の多様なヒトＣＴＬＡ−４レセプターにクロスリンクするような様式で、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する。レセプターのクロスリンクは、ヒトＣＴＬＡ−４のヒトＢ７への結合に対して同一または同様の効果を有する。従って、レセプターのクロスリンクは、免疫抑制を生じるヒトＣＴＬＡ−４応答を効果的に作動（ａｇｏｎｉｚｅ）する。
【００７９】
クロスリンクはまた、異なるエピトープ特異性を有する、可溶性の二価の抗体を結合することによって達成され得る。これらのポリクローナル抗体調製物は、ヒトＣＴＬＡ−４上の異なるエピトープに結合する、少なくとも２対の重鎖および軽鎖を含む。その結果、免疫抑制シグナルは、ヒトＣＴＬＡ−４クロスリンクの結果として変換され得る。
【００８０】
用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された本発明の全てのヒト配列抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子（以下の項Ｉにさらに記載される）についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体；宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体、または他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む他の任意の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体）を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する。しかし、このような抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対するトランスジェニックな動物が使用される場合は、インビボ体性変異誘発）に供され得、従って、組換え体抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列由来でかつヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列に関する場合、インビボのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在し得ない。
【００８１】
「異種（異種性）抗体」は、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関して規定される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物からならない生物中に見出されるアミノ酸配列または核酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体または核酸配列をコードする抗体をいい、一般にはトランスジェニック非ヒト動物の種以外の種由来である。
【００８２】
「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物組織の軽鎖および重鎖を有する抗体をいう。例えば、マウス軽鎖に関連するヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例は、前述のキメラ抗体およびヒト化抗体を含む。
【００８３】
用語「実質的に純粋な」または「単離された」は、目的種（例えば、本発明の抗体）が同定されかつ目的種が存在する優勢な種（すなわち、モル基準で組成物において他の個々のいずれの種より豊富である）であるようにその天然の環境の成分から分離および／または回復されたことを意味する；「実質的に純粋な」組成物または「単離された」組成物はまた、目的種が存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む場合を意味する。実質的に純粋な組成物または単離された組成物はまた、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０〜９０重量％より多く含み得る。単離された目的種（例えば、本発明の抗体）はまた、実質的に同質（慣習的な検出方法によって、夾雑種は組成物中に検出され得ない）にまで精製され得、ここで、組成物は、実質的に単一の高分子種の誘導体からなる。ヒトＣＬＴＡ−４に対する単離された抗体は、ヒトＣＬＴＡ−４に結合せず異なる抗原に結合する他の抗体を実質的に含み得ない。しかし、ヒトＣＴＬＡ−４のエピトープ、アイソフォームまたは改変体に特異的に結合する単離された抗体は、他の関連抗原（例えば、他の種（例えば、ＣＴＬＡ−４種ホモログ）由来）に対する交差反応性を有する。さらに、本発明の単離された抗体は、他の細胞性物質（例えば、非免疫グロブリン関連タンパク質）および／または化学物質を実質的に含まない。
【００８４】
「特異的結合」は、優勢な抗原に結合する抗体をいう。抗体に「特異的（または選択的）に結合する」という句は、タンパク質および他の生物工学製品の異種性集団におけるタンパク質の存在に決定的な結合反応をいう。代表的には、抗体は、少なくとも約１×１０6Ｍ-1もしくは１０7Ｍ-1、または約１０8Ｍ-1〜１０9Ｍ-1、または約１０10Ｍ-1〜１０11Ｍ-1、またはそれ以上の結合定数（Ｋａ）で結合し、そして優勢な抗原または非常に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性より少なくとも２倍大きい親和性で優勢な抗原に結合する。句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書中では用語「抗原に対して特異的に結合する抗体」と相互交換可能に使用される。
【００８５】
ペプチドに関して言及される場合、句「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、標的分子に対する中間の結合親和性または高い結合親和性を有する、排他的または優勢なペプチド分子をいう。句「特異的に結合する」は、タンパク質および他の生物工学製品の異種性集団の存在における標的タンパク質の存在に決定的な結合反応をいう。従って、指定されたアッセイ条件下で、特定された結合部分は、特定の標的タンパク質に好ましく結合し、そして試験サンプルに存在する他の成分に顕著な量では結合しない。このような条件下で標的タンパク質に対する特異的な結合は、特定の標的抗原に対するその特異性について選択される結合部分を必要とし得る。種々のアッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に反応するリガンドを選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、免疫沈降、Ｂｉａｃｏｒｅおよびウエスタンブロットを使用して、ＣＴＬＡ−４と特異的に反応するペプチドを同定し得る。代表的には、特異的反応または選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナルまたはノイズであり、そしてより代表的には、１０倍のバックグラウンドである。
【００８６】
ＩｇＧ抗体についての用語「高親和性」は、少なくとも約１０7Ｍ-1、少なくとも約１０8Ｍ-1、少なくとも約１０9Ｍ-1、少なくとも約１０10Ｍ-1、少なくとも約１０11Ｍ-1、または少なくとも約１０12Ｍ-1、あるいはそれ以上（たとえば、１０13Ｍ-1、もしくは１０14Ｍ-1、またはそれ以上）の平衡結合定数（Ｋａ）をいう。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体のアイソタイプについて変化し得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「Ｋa」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡結合定数をいうことが意図される。この定数は、１／Ｍの単位を有する。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「Ｋd」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数をいうことが意図される。この定数は、Ｍの単位を有する。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「ｋa」は、特定の抗体−抗原相互作用の動力学結合定数をいうことが意図される。この定数は、１／Ｍｓの単位を有する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「ｋd」は、特定の抗体−抗原相互作用の動力学解離定数をいうことが意図される。この定数は、１／Ｍｓの単位を有する。
【００９１】
「特定の抗体−抗原相互作用」は、平衡定数および動力学定数が測定される元での実験的条件をいう。
【００９２】
「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【００９３】
「アイソタイプ変換（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」は、抗体のクラス、またはアイソタイプが１つのＩｇクラスから他のＩｇクラスの１つへ変化することによる現象をいう。
【００９４】
「非変換（ｎｏｎｓｗｉｔｃｈｅｄ）アイソタイプ」は、アイソタイプ変換が生じない場合に産生される重鎖のアイソタイプクラスをいう；非変換アイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、代表的には、機能的に再構成されたＶＤＪ遺伝子の直下にある第一のＣＨ遺伝子である。アイソタイプ変換は、古典的アイソタイプ変換または非古典的アイソタイプ変換として分類された。古典的アイソタイプ変換は、導入遺伝子内の少なくとも１つの変換配列領域を含む組換え事象によって生じる。非古典的アイソタイプ変換は、例えば、ヒトσμとヒトΣμ（δ関連欠失）との間の相同組換えによって生じ得る。他の中での代替の非古典的変換機構（例えば、相互導入遺伝子および／または相互染色体の組換え）は、アイソタイプ変換を生じかつ実現し得る。
【００９５】
用語「変換（ｓｗｉｔｃｈ）配列」は、変換組換えの原因であるＤＮＡ配列をいう。「変換ドナー」配列、代表的に、μ変換領域は、変換組換えの間に欠失される定常領域の５’（すなわち、上流）である。「変換アクセプター」領域は、欠失される定常領域と置換定常領域（例えば、γ、εなど）との間である。組換えが常に生じる特異的部位が存在しないので、最終の遺伝子配列は、代表的にはこの構築物から予想され得ない。
【００９６】
「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より特異的には、免疫グロブリンタンパク質に共有結合で結合する炭化水素の単位のパターンとして規定される。異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質的に類似であるとして特徴付けられ得る。ここで、当業者は、導入遺伝子のＣＨ遺伝子が由来する種に対してよりも非ヒトトランスジェニック動物の種におけるグリコシル化のパターンにより同種であるような異種抗体のグリコシル化パターンを認識する。
【００９７】
物体に適用される場合、用語「天然に存在する」は、物体が天然に見出され得る事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得そして研究室員によって作為的に改変されなかった生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００９８】
用語「再構成された」は、重鎖または軽鎖免疫グロブリン座（ｌｏｃｕｓ）の構成をいい、ここで、Ｖセグメントは、実質的に完全なＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードする構成における、それぞれＤ−ＪセグメントまたはＪセグメントのすぐ隣に位置される。再構成された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡと比較することによって同定され得る；再構成された座は、少なくとも１つの再結合されたヘプタマー／ノナマー相同性エレメントを有する。
【００９９】
Ｖセグメントに関して、用語「再構成された」または「生殖系構成」は、ＤセグメントまたはＪセグメントのすぐ隣にあるようにＶセグメントが再結合されない構成をいう。
【０１００】
用語「核酸」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸は、一本鎖または二重鎖であり得る。
【０１０１】
ＣＴＬＡ−４に結合する抗体または抗体の部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して、用語「単離された核酸」は、抗体または抗体の部分をコードするヌクレオチド配列が、ＣＴＬＡ−４以外の抗原に結合する抗体または抗体の部分をコードする他のヌクレオチド配列（この他の配列は、ヒトゲノムＤＮＡ中の核酸に天然において隣接し得る）を含まない核酸をいうことが意図される。配列番号４〜２３は、本発明の１０Ｄ１、４Ｂ６、および１Ｅ２ヒト抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域を含む、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
２つの核酸またはポリペプチドの文脈で、用語「実質的に同一」は、以下の配列比較方法および／または視覚的検査を使用して測定されるように、最大一致のために比較および整列された場合に、少なくとも約８０％、約９０％、約９５％以上のヌクレオチド同一性またはアミノ酸残基同一性を有する２以上の配列または部分配列をいう。例えば、本発明は、配列番号１、配列番号２に対して実質的に同一な配列を有する核酸を提供する。このような「実質的に同一」な配列は、代表的に、相同であるとみなされる。「実質的に同一」は、少なくとも約５０残基長である配列領域にわたって、少なくとも約１００残基の領域にわたって、もしくは少なくとも約１５０残基の領域にわたって、または比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。以下に記載されるように、任意の２つの抗体配列は、Ｋａｂａｔにおける番号付けスキームを使用することによって、１つの様式においてのみ整列され得る。従って、抗体について、同一性パーセントは、固有かつ十分に規定された意味を有する。
【０１０３】
免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸を、それぞれＨｘおよびＬｘと称し、ここでｘは、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７および１９９１）のスキームに従ったアミノ酸位置を指定する番号である。Ｋａｂａｔは、各亜群についての抗体の多くのアミノ酸配列を列挙し、そしてコンセンサス配列を生成するために、その亜群における各残基位置について最も一般的に存在するアミノ酸を列挙する。Ｋａｂａｔは、列挙された配列における各アミノ酸に対して残基番号を割り当てる方法を使用し、そして残基番号を割り当てるこの方法は、当該分野で標準的となっている。Ｋａｂａｔのスキームは、保存されたアミノ酸を参照して、Ｋａｂａｔにおけるコンセンサス配列の１つと当該抗体を整列させることによって、Ｋａｂａｔの概論に含まれていなかった他の抗体へと拡張可能である。Ｋａｂａｔの番号付け体系を使用することによって、異なる抗体における等価な位置のアミノ酸が容易に同定される。例えば、ヒト抗体のＬ５０位のアミノ酸は、マウス抗体のアミノ酸Ｌ５０位と等価な位置を占める。同様に、抗体軽鎖をコードする核酸は、個々の核酸によってコードされるアミノ酸配列が、Ｋａｂａｔの番号付け慣例に従って整列される場合に整列される。
【０１０４】
句「〜に対して選択的（または、特異的）にハイブリダイズする」は、配列が複雑な混合物（例えば、総細胞性またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列に分子が結合すること、二重鎖形成すること、またはハイブリダイズすることをいう。ここで、特定のヌクレオチド配列は、バックグラウンドの少なくとも約１０倍で検出される。１つの実施形態では、核酸は、他の方法で本発明の範囲内であると決定された核酸（例えば、本明細書中に記載された例示的な配列）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその能力によって、本発明の範囲内である（すなわち、配列番号１または配列番号２に対して実質的に同一である）と決定され得る。
【０１０５】
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、代表的には複雑な核酸混合物中で、プローブがその標的部分配列に対してハイブリダイズするが、有意な量（ポジティブシグナル（例えば、本発明の核酸の同定）は、バックグラウンドハイブリダイゼーションの約１０倍である）で他の配列には結合しない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、例えば、以下において見出される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＰＲＯＢＥＳ，第Ｉ部、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）。
【０１０６】
一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度ｐＨでの特定の配列に対する熱融点（Ｔm）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔmは、標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（Ｔmで標的配列は過剰に存在し、プローブの５０％が平衡状態で占められるような）温度である（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）。ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、代表的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（以下に引用される）に記載されるような不安定化剤（例えば、ホルムアミド）を添加することにより達成され得る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションについて、ポジティブシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的な高ストリンジェンシーまたは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を包含する：４２℃でインキュベートされる５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、または６５℃でインキュベートされる５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳに、６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴う。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブシグナル（例えば、本発明の核酸の同定）は、バックグラウンドハイブリダイゼーションの約１０倍である。本発明の範囲内にある核酸を同定するために使用されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション、または６５℃での５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション（両方とも、６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄を伴う）が挙げられる。本発明では、本発明の核酸を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを、本明細書中に開示される核酸配列を使用するストリンジェントな条件下での標準的なサザンブロットにおいて同定し得る。このようなハイブリダイゼーション（本発明の範囲内にある核酸を同定するため）についてのさらなるストリンジェント条件は、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーションを含む条件である。
【０１０７】
しかし、ハイブリダイゼーション様式の選択は、決定的ではなく−核酸が本発明の範囲内であるか否かを決定する条件を示すのは、洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明の範囲内にある核酸を同定するために使用される洗浄条件としては、例えば、以下が挙げられる：ｐＨ７で約０．０２モル濃度の塩濃度であり、かつ少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度であるか；または、７２℃で約０．１５Ｍ ＮａＣｌの塩濃度で約１５分間；または、少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度で約０．２×ＳＳＣの塩濃度にて約１５〜約２０分間；または、ハイブリダイゼーション複合体を、０．１％ＳＤＳを含む約２×ＳＳＣの塩濃度を有する溶液を用いて室温にて２回１５分間洗浄し、次いで、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６８℃にて２回１５分間洗浄するか；あるいは、等価な条件。ＳＳＣ緩衝液および等価な条件の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＴｉｊｓｓｅｎおよびＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと。
【０１０８】
本発明の核酸は、全細胞中、細胞溶解産物中、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態において存在し得る。標準的技術（アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該分野において周知の他の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＴｉｊｓｓｅｎおよびＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと））によって、他の細胞成分または他の夾雑物（例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質）から分離されて精製された場合に、核酸は、「単離」されているか、または「実質的に純粋にされている」。本発明の核酸配列および本発明を実施するために使用される他の核酸（ＲＮＡか、ｃＤＮＡか、ゲノムＤＮＡか、またはこれらのハイブリッド）を、種々の供給源から単離し得、遺伝子操作し得、増幅し得、および／または組換え的に発現させ得る。任意の組換え発現系が使用され得、これには細菌（例えば、酵母）に加えて、昆虫、または哺乳動物系が含まれる。あるいは、これらの核酸を、インビトロで化学的に合成し得る。核酸操作のための技術（例えば、発現ベクター中へのサブクローニング、プローブの標識化、配列決定、およびハイブリダイゼーションなど）が、科学技術文書および特許文書に十分に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＴｉｊｓｓｅｎおよびＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと）。核酸は、当業者に周知の多くの任意の一般的手段によって、分析され得、そして定量され得る。これらとしては、例えば、以下が挙げられる：ＮＭＲ、分光測光法、Ｘ線撮影法、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法（例えば、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散法（単一または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ）、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸または標的またはシグナル増幅方法、放射性標識化、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィーのような生化学的分析方法。
【０１０９】
ｃＤＮＡ、ゲノムまたはその混合物のいずれかに由来する本発明の核酸組成物（しばしば、ネイティブな配列にある（改変された制限部位などを除く））は、標準的な技術に従って変異されて、遺伝子配列を提供し得る。コード配列について、これらの変異は、所望されるアミノ酸配列に影響を与え得る。特に、ネイティブなＶ、Ｄ、Ｊ、定常領域、スイッチおよび本明細書中に記載される他のこのような配列に対して実質的に相同であるか、またはそれらから誘導体化されたＤＮＡ配列が意図される（ここで「誘導体化された」とは、配列が、別の配列と同一であるか、または別の配列から改変されていることを示す）。
【０１１０】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置された場合に、「作動可能に連結され」ている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それらが配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列に関して、作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接していること、および、２つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、隣接し、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。スイッチ配列について、作動可能に連結されたとは、配列がスイッチ組換えに影響を及ぼし得ることを示す。
【０１１１】
用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいうことを意図される。ベクターの１つの型が「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターはウイルスベクターであり、ここではさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結し得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中において自律複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中では、「組換え発現ベクター」（または単純に、「発現ベクター」）という。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用性を有する発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用し得る。なぜなら、プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるからである。しかし、本発明は、等価な機能を供するこのような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス））を含むことを意図される。
【０１１２】
用語「組換え宿主細胞」（または単純に、「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞をいう。このような用語は、特定の被験細胞のみならず、このような細胞の子孫をもいうことを意図することが理解されるべきである。特定の改変は、変異または環境のいずれかの影響に起因して、後の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお本明細書中で使用されるような用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１１３】
用語「ミニ遺伝子座導入遺伝子（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、天然に存在する生殖細胞系Ｉｇ遺伝子座と比較した場合に、非必須ＤＮＡ部分（例えば、介在配列；イントロンまたはそれらの部分）の少なくとも１つの内部（すなわち、その部分の末端ではない）欠失を有する、免疫グロブリンのゲノム遺伝子座の部分を含む導入遺伝子をいう。
【０１１４】
「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、以下が挙げられる：32Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、およびタンパク質であって、これらに対する抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質（例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、ペプチドに放射性標識を組み込むことによって検出可能になされ得、そしてこのペプチドと特異的反応性の抗体を検出するために使用され得る）。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、細胞の文脈における用語「選別」とは、例えば、蛍光活性化細胞選別機を用いて成し遂げられ得るような細胞の物理的選別、および細胞表面マーカーの発現に基づく細胞の分析（例えば、選別をしないＦＡＣＳ分析）の両方をいう。
【０１１６】
句「免疫細胞応答」とは、免疫細胞移動、標的細胞の殺傷、貪食作用、抗体産生、および免疫応答の他の可溶性エフェクターなどを生じる、免疫細胞における生化学的変化をもたらす、外部刺激または内部刺激（例えば、抗原、サイトカイン、ケモカイン、および他の細胞）に対する免疫系細胞の応答をいう。
【０１１７】
用語「Ｔリンパ球応答」および「Ｔリンパ球活性」とは、本明細書中で交換可能に使用され、Ｔリンパ球に依存する免疫応答（すなわち、Ｔリンパ球の増殖および／またはＴリンパ球のヘルパー細胞傷害性キラーＴリンパ球、もしくはサプレッサーＴリンパ球への分化、抗体産生を引き起こすかまたは妨げる、Ｂリンパ球へのヘルパーＴリンパ球によるシグナルの供給、細胞傷害性Ｔリンパ球による特定の標的細胞の殺傷、および他の免疫細胞の機能を調節するサイトカインのような溶解性因子の放出）の成分をいう。
【０１１８】
用語「免疫応答」とは、リンパ球、抗原提示細胞、病原体、顆粒球、および上記の細胞または肝臓によって産生された可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の協調作用をいい、それは、侵入する病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性細胞、あるいは、自己免疫または異常炎症の場合は、正常なヒト細胞または組織に対する選択的損傷、そららの破壊、またはそれらの人体から排除を引き起こす。
【０１１９】
免疫応答の成分は、当業者に周知の種々の方法によって、インビトロで検出され得る。例えば、（1）細胞傷害性Ｔリンパ球が、放射性に標識された標的細胞と共にインキュベートされ得、そしてこれらの標的細胞の溶解が、放射能の放出によって検出され得、（２）ヘルパーＴリンパ球が、抗原および抗原提示細胞と共にインキュベートされ、そしてサイトカインの合成および分泌が標準的方法によって測定され得（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎ Ａら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２（４）：３７３−８０）、（３）抗原提示細胞が、タンパク質抗原全体と共にインキュベートされ得、そしてＭＨＣ上のこの抗原の提示がＴリンパ球活性化アッセイか生物物理学的方法のいずれかによって検出され得（Ｈａｒｄｉｎｇら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６、４２３０−４）、（4）肥満細胞がそれらのＦｃ−εレセプターに架橋する試薬と共にインキュベートされ得、そしてヒスタミン放出が酵素免疫アッセイによって測定され得る（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎら、１９８３、ＴＩＰＳ ４：４３２−４３７）。
【０１２０】
同様に、モデル生物（例えば、マウス）またはヒト患者のいずれかにおける免疫応答産物はまた、当業者に周知の種々の方法によって検出され得る。例えば、（1）ワクチン接種に応じた抗体の産生は、臨床実験室で現在使用される標準的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって容易に検出され得る；（２）炎症部位への免疫細胞の移動は、皮膚表面を引っ掻いて、そして無菌容器を配置し、引っ掻き傷の部位にわたって移動する細胞を捕捉することによって検出され得る（Ｐｅｔｅｒｓら、１９８８、Ｂｌｏｏｄ ７２：１３１０−５）；（３）マイトジェンに応じた末梢血液単核細胞の増殖または混合リンパ球反応は、3Ｈ−チミジンを用いて測定され得る；（４）顆粒球、マクロファージ、およびＰＢＭＣにおける他の病原体の食作用能力は、標識された粒子と共にＰＭＢＣをウェルに配置することによって測定され得る（Ｐｅｔｅｒｓら、１９８８）；および（５）免疫系細胞の分化は、ＣＤ４およびＣＤ８のようなＣＤ分子に対する抗体でＰＢＭＣを標識し、そしてこれらのマーカーを発現するＰＢＭＣの画分を測定することによって測定され得る。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、句「シグナル変換経路」または「シグナル変換事象」とは、少なくとも１つの生化学的反応をいうが、より一般的には、刺激性化合物または因子との細胞の相互作用から起こる一連の生化学的反応をいう。従って、細胞との刺激性化合物の相互作用は、シグナル変換経路を介して伝達される「シグナル」を発生させ、最終的には、細胞応答（例えば、上に記載される免疫応答）を引き起こす。
【０１２２】
シグナル変換経路とは、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役目を果たす種々のシグナル変換分子間の生化学的関係をいう。本発明のシグナル変換分子としては、例えば、本発明のＭＡｂ１４７．１が挙げられる。本明細書中で使用される場合、句「細胞表面レセプター」とは、、シグナルを受け取り、そして細胞の形質膜にわたってこのようなシグナルを伝達可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面レセプター」の例は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＣＴＬＡ−４のＢ７リガンドである。
【０１２３】
細胞におけるシグナル変換経路は、細胞の内側または細胞側にある刺激物質との細胞の相互作用によって開始され得る。外部（すなわち、細胞の外側）刺激物質（例えば、抗原提示細胞上のＭＨＣ抗原複合体）が細胞表面レセプター（例えば、Ｔ細胞レセプター）と相互作用すると、シグナル変換経路は、細胞膜を横切って、細胞の原形質を通って、そしていくつかの場合は核内に、シグナルを伝達し得る。内部（すなわち、細胞内部）刺激物質が細胞内シグナル変換分子と相互作用すると、シグナル変換経路は、細胞の原形質を通って、そしていくつかの場合は細胞の核内に、シグナルの伝達を起こし得る。
【０１２４】
シグナル変換は、例えば、分子のリン酸化；非共有結合アロステリック相互作用；分子の複合体化；分子のコンホメーションの変化；カルシウム放出；イノシトールリン酸産生；タンパク質分解性切断；環状ヌクレオチド産生およびジアシルグリセリド産生を通じて起こり得る。代表的には、シグナル変換は、シグナル変換分子をリン酸化することにより起こる。
【０１２５】
用語「非特異的Ｔ細胞活性化」とは、Ｔ細胞の抗原特異性に非依存性のＴ細胞の刺激をいう。
【０１２６】
（ＣＴＬＡ−４に対するヒト抗体の産生）
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびヒトの配列抗体は、従来のモノクローナル抗体方法論（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術）を含む、種々の技術によって産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための任意の技術（例えば、Ｂリンパ球のウイルス性またはオンコジーン性形質転換）が利用され得る。ハイブリドーマを調製するための１つの動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、大変よく確立された手順である。免疫プロトコルおよび融合のために免疫された脾細胞の単離のための技術は、当該業界で公知である。融合パートナー（例えば、マウスミエローマ細胞）および融合手順もまた公知である（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０１２７】
ヒトモノクローナル抗体およびヒトのＣＴＬＡ−４に対して指向されるヒト配列抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系を保有するトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。これらのトランスジェニックマウス（本明細書中で、「ＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅTM」としても言及される）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子小座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を含み、これは、内因性μ鎖座およびκ鎖座を不活性化する標的化された変異と共に、再構成されないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードする（Ｌｏｎｂｅｒｇ．Ｎ．ら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９および米国特許第５，７７０，４２９号）。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの減少した発現を示し、そして免疫に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランスジーンは、クラススイッチ変異および体細胞変異を受け、高アフィニティヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら、（１９９４）、前出；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１に概説される；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３、ならびにＨａｒｄｉｎｇ、Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。トランスジェニックマウスの調製は、以下のＳｅｃｔｉｏｎ ＩＩおよびＴａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｔａｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に詳細に記載される。さらに、米国特許第５，６２５，１２６号および同第５，７７０，４２９号（両方ともＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋａｙ，ａｎｄ ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに属す）；米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉらに属す）；国際出願公開番号ＷＯ ９８／２４８８４（１９９８年６月１１日公開）；ＷＯ９４／２５５８５（１９９４年１１月１０日公開）；ＷＯ９３／１２２７（１９９３年６月２４日公開）；ＷＯ９２／２２６４５（１９９２年１２月２３日公開）；ＷＯ９２／０３９１８（１９９２年３月１９日公開）を参照のこと。あるいは、以下の実施例１および実施例２に記載されるＣＭＤおよびＨＣｏ１２トランスジーンが、ヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体を生成するために使用され得る。
【０１２８】
ＣＴＬＡ−４に対するヒトモノクローナル抗体を完全に生成するための詳細な手順は、以下の実施例に記載される。種々の抗原による度重なる経験は、トランスジェニックマウスが、最初に完全フロイントアジュバント中の抗原で腹腔内（ＩＰ）免疫され、引き続いて、一週間おきに不完全フロイントアジュバント中の抗原でＩＰ免疫する（総計６まで）場合、応答するということが示された。しかし、フロイント以外のアジュバントもまた、効果的であることが見い出されている。さらに、アジュバントの非存在下での全細胞が、高い免疫原性であることがわかっている。免疫応答は、眼窩後方（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）出血によって得られている血漿サンプルを用いる、免疫プロトコルの過程にわたってモニターされ得る。血漿は、（以下に記載されるように）ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ得、そして抗ＣＴＬＡ−４ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスは、融合のために使用され得る。マウスは、屠殺および脾臓の除去の３日前に抗原で静脈内で追加免疫され得る。各免疫化に対する２〜３回の融合が行われる必要があり得ることが予期される。典型的に、６〜２４匹の間のマウスが各抗原に対して免疫される。通常は、ＨＣｏ７株とＨＣｏ１２株の両方が使用される。さらに、ＨＣｏ７とＨＣｏ１２の両方のトランスジーンは、２つの異なるヒト重鎖トランスジーンを有する１匹のマウス内に一緒に導入され得る。
【０１２９】
ヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマが、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ内で増殖される。上清が濾過され得、そしてプロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるアフィニティクロマトフラフィーの前に濃縮され得る。溶出されたＩｇＧは、ゲル電気泳動法および高速液体クロマトグラフィーでチェックされ、精製を確かめられる。緩衝溶液が、ＰＢＳに交換され得、そして濃度が、１．４３の吸光係数を用いるＯＤ２８０によって決定され得る。モノクローナル抗体は、アリコートされ得、そして−８０℃で貯蔵され得る。
【０１３０】
選択されたヒト抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を特定のエピトープに結合するか否かを決定するために、各抗体は、市販の試薬（Ｐｅｉｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してビオチン化され得る。標識されないモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合研究が、上記のようなＣＴＬＡ−４でコートされたＥＬＩＳＡプレートを使用して行われ得る。ビオチン化されたＭＡｂ結合は、ストレップ−アビジン（ｓｔｒｅｐ−ａｖｉｄｉｎ）−アルカリホスファターゼプローブで検出され得る。
【０１３１】
精製された抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡが行われ得る。マイクロタイタープレートのウェルを、１μg／ｍｌの抗ヒトＩｇＧで４℃で一晩コートする。１％のＢＳＡでブロックした後、プレートを、１μg／ｍｌ以下のモノクローナル抗体または精製されたアイソタイプコントロールと、室温で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧＩ特異的アルカリホスファターゼ結合プローブかヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼ結合プローブのいずれかと反応させ得る。プレートを展開し、そして上記のように分析する。
【０１３２】
ＣＴＬＡ−４を発現する生存細胞へのモノクローナル抗体の結合を実証するために、フローサイトメトリーが使用され得る。簡潔に言うと、（標準的な増殖条件下で増殖された）ＣＴＬＡ−４を発現する細胞株を、０．１％のＢＳＡおよび１０％の牛胎仔血清を含むＰＢＳ中で、種々の濃度のモノクローナル抗体と混合し、そして３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、一次抗体染色と同じ条件下で、細胞をフルオレセインで標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルは、単一の細胞に対してゲートする（ｇａｔｅ）光散乱および側方散乱（ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ）の性質を用いるＦＡＣＳｃａｎ装置によって分析され得る。蛍光顕微鏡検査法を用いる代替のアッセイが、（フローサイトメトリーアッセイに加えて、またはその代わりに）使用され得る。細胞は、正確に上に記載されるように染色され得、そして蛍光顕微鏡検査法によって試験され得る。この方法は、個々の細胞の視覚化を可能とするが、抗原の密度に依存して減少した感度を有し得る。
【０１３３】
抗−ＣＴＬＡ−４ヒトＩｇＧを、ウエスタンブロットによってＣＴＬＡ−４抗原との反応性についてさらに試験し得る。簡潔には、ＣＴＬＡ−４を発現する細胞由来の細胞抽出物を、調製し、そしてドデシルスルフェートポリアシルアミドナトリウムゲル電気泳動に供した。電気泳動後に、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％の胎児子ウシ血清で遮断し、そして試験されるべきモノクローナル抗体を用いて精査した。ヒトＩｇＧ結合を、抗ヒトＩｇＧアルカリンホスファターゼを使用して検出し、そしてＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて展開し得る。
【０１３４】
（ヒトモノクローナル抗−ＣＴＬＡ−４抗体を産生するトランスジェニック非ヒト抗体の産生）
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）を提供し、このマウスは、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現し得る。高い親和性のヒト配列抗体がまた、提供される。数匹のトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。数匹のトランスジェニック非ヒト動物を、ＣＴＬＡ−４抗原および／またはＣＴＬＡ−４を発現する細胞の精製または富化された調製物で免疫化する。数匹のトランスジェニック非ヒト動物は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチングを受けることによってＣＴＬＡ−４に対するヒトモノクローナル抗体の複数のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＥ）を産生し得る。アイソタイプスイッチングは、例えば、古典的または非古典的なアイソタイプスイッチングによって起こり得る。
【０１３５】
異種の抗体レパートリーを用いる、外来の抗原刺激に対して応答するトランスジェニック非ヒト動物の設計は、トランスジェニック動物内に含まれる異種の免疫グロブリン導入遺伝子が、Ｂ細胞の展開の経路全体にわたって正確に機能することを必要とする。数匹のマウスにおいて、異種の重鎖導入遺伝子の正確な機能は、アイソタイプスイッチングを含む。従って、本発明の導入遺伝子は、アイソタイプスイッチングおよび以下の１以上を産生するように構築される：（１）高レベルおよび細胞型特異的発現、（２）機能的遺伝子の再配列、（３）対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、（４）十分な主なレパートリーの発現、（５）シグナル導入、（６）体細胞の過剰変異、および（７）免疫応答の間の導入遺伝子抗体遺伝子座の支配。
【０１３６】
前述の判断基準の全てが、満たされる必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に崩壊されるトランスジェニック動物において、導入遺伝子が、対立遺伝子排除を活性化する必要はない。さらに、導入遺伝子が機能的に再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、導入遺伝子動物において、機能的な遺伝子再配列の第２の判断基準は、少なくとも既に再配列されている導入遺伝子について必要ではない。分子免疫学の背景について、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版（１９９８），Ｐａｕｌ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．，編、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【０１３７】
数匹のトランスジェニック非ヒト動物を使用して、トランスジェニック動物の生殖系列において、再配列された異質免疫グロブリン、再配列されていない異質免疫グロブリン、または再配列された異質免疫グロブリンと再配列されていない異質免疫グロブリンとの組み合わせの重鎖および軽鎖導入遺伝子を含む本発明のヒトモノクローナル抗体を産生した。重鎖導入遺伝子の各々は、少なくとも１つのＣＨ遺伝子を含む。さらに、重鎖導入遺伝子は、機能的なアイソタイプスイッチ配列を含み得、これは、トランスジェニック動物のＢ細胞中の複数のＣＨ遺伝子をコードする異質導入遺伝子のアイソタイプスイッチングを支持し得る。このようなスイッチ配列は、導入遺伝子ＣＨ遺伝子の供給源として役割を果たす種由来の生殖系列免疫グロブリン遺伝子座中に天然に存在する配列であり得るか、またはこのようなスイッチ配列は、導入遺伝子構築物を受容する種（トランスジェニック動物）に存在する配列由来であり得る。例えば、トランスジェニックマウスを産生するために使用されるヒト導入遺伝子構築物は、マウス重鎖遺伝子座に天然に存在する配列と同じスイッチ配列を取り込む場合でさえ、より高い頻度でアイソタイプスイッチング事象を産生し得、おそらく、マウスのスイッチ配列は、マウススイッチリコンビナーゼ酵素系で機能するように最適化されるが、ヒトスイッチ配列はそうではない。スイッチ配列は、従来のクローニング方法によって単離およびクローニングされ得るか、免疫グロブリンスイッチ領域配列に関連する、公開された配列情報に基づいて設定された、オーバーラップ合成オリゴヌクレオチドから新たに合成され得る（Ｍｉｌｌｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１５：７３０５−７３１６（１９９１）；Ｓｉｄｅｒａｓら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：６３１−６４２（１９８９））。
【０１３８】
前述のトランスジェニック動物の各々について、機能的に再配列された異質重鎖および軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子は、トランスジェニック動物のＢ細胞の有意なフラクションにおいて見出される（少なくとも１０％）。
【０１３９】
本発明のトランスジェニック動物を産生するために使用される導入遺伝子は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、少なくとも１つの多様性遺伝子セグメント、少なくとも１つの結合している遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含む重鎖導入遺伝子を含む。免疫グロブリンの軽鎖導入遺伝子は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、少なくとも１つの結合している遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含む。この軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、トランスジェニック非ヒト動物と異質であり、このセグメントは、トランスジェニック非ヒト動物を含まない種由来の免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに対応している。本発明の１つの局面において、導入遺伝子は、個々の遺伝子セグメントが再配列されように構築される（すなわち、機能的免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするように再配列されない）。このような再配列されていない導入遺伝子は、Ｖ，Ｄ，およびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的組換え）を支持し、そして、好ましくは、ＣＴＬＡ−４抗原に曝された場合に、トランスジェニック非ヒト動物内で、得られた再配列された免疫グロブリン重鎖中のＤ領域遺伝子セグメントの全てまたは一部の取り込みを支持する。
【０１４０】
このような導入遺伝子は、代表的に、Ｃ、Ｄ、およびＪセグメントの実質的な部分およびＶ遺伝子セグメントのサブセットを含む。このような導入遺伝子構築物中で、種々の調節配列（ＲＮＡ処理のための、例えば、プロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列）、組換えシグナルなどは、異種ＤＮＡ由来の対応する配列を含む。このような調節配列は、本発明において使用される非ヒト動物または非ヒト動物に関連する種から導入遺伝子に取り込まれ得る。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスでの使用のために、げっ歯類の免疫グロブリンエンハンサー配列を用いて導入遺伝子に組み込まれ得る。あるいは、合成的調節配列は、導入遺伝子に取り込まれ得、ここで、このような合成調節配列は、哺乳動物のゲノム中に天然に存在することで公知の機能的ＤＮＡ配列と同質ではない。合成調節配列は、例えば、スプライスアクセプター部位またはプロモーター／エンハンサーモチーフの許容配列を特定するような、コンセンサスルールに従って設計される。この導入遺伝子は、最小の遺伝子座を含み得る。
【０１４１】
ＣＴＬＡ−４に対してヒト抗体を産生するために使用される数匹のトランスジェニック動物は、米国特許第５，７７０，４２９号の実施例３７に記載される少なくとも１、代表的には２〜１０、そして時々２５〜５０以上の導入遺伝子のコピー、または以下の実施例２に記載される導入遺伝子（例えば、ＨＣｏ１２）、米国特許第５，７７０，４２９号の実施例３８に記載される軽鎖導入遺伝子の少なくとも１つのコピー、以下の実施例１に記載されるＣｍｕ欠失の２つのコピー、および米国特許第５，７７０，４２９号の実施例９に記載されるＪｋａｐｐａ欠失の２つのコピーを含む。得られた動物に抗原を注射し、そしてこれらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生のために使用される。
【０１４２】
数匹のトランスジェニック動物は、ネイティブマウスと理想的に実質的に同一である有意なレパートリーを有する、免疫グロブリン産生を示す。従って、例えば、内因性Ｉｇ遺伝子が不活性である動物の全免疫グロブリンレベルは、約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌの血清の範囲である。
【０１４３】
トランスジェニックマウスによって発現される免疫グロブリンは、代表的に、約半分以上の高い抗原タンパク質（例えば、ブドウ球菌タンパク質Ａ）を認識する。代表的に、この免疫グロブリンは、抗原に対して、少なくとも約１０7Ｍ-1、１０8Ｍ-1、１０9Ｍ-1、１０10Ｍ-1、１０11Ｍ-1、１０12Ｍ-1、１０13Ｍ-1以上の予め選択された結合定数を示す。
【０１４４】
本発明のトランスジェニックマウスは、上記のように、ヒトＣＴＬＡ−４抗原の精製または富化調製物（またはその抗原フラグメント）および／またはヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞を用いて免疫化され得る。このマウスは、導入遺伝子内のスイッチ組換え（シス−スイッチング）を介してクラススイッチングを受けるＢ細胞を産生し、そしてＣＴＬＡ−４と反応性である免疫グロブリンを発現する。免疫グロブリンは、ヒト配列抗体であり得、ここで、重鎖および軽鎖ポリペプチドは、ヒト導入遺伝子配列によってコードされ、この配列は、体細胞変異およびＶ領域組換え結合部ならびに生殖系列コード配列によって誘導される配列を含み得；これらのヒト配列免疫グロブリンは、他の生殖系列非配列が、体細胞変異ならびに異なるＶ−ＪおよびＶ−Ｄ−Ｊ組換え結合の結果として存在し得る場合でさえ、ヒトＶＬまたはＶＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬまたはＪＨセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であると言われ得る。このようなヒト配列抗体に関して、ヒト生殖系列Ｖ，Ｊおよび重鎖の場合、Ｄ遺伝子セグメントによってコードされた、各鎖の可変領域は、代表的に少なくとも８０％であり；頻繁に、少なくとも８５％の可変領域は、導入遺伝子上に存在するヒト生殖系列配列によってコードされ；しばしば、９０または９５％以上の可変領域配列が、導入遺伝子上に存在するヒト生殖系列配列によってコードされる。しかし、非生殖系列配列は、体細胞変異ならびにＶＪおよびＶＤＪ結合によって導入されるので、ヒト配列抗体は、頻繁に、数種の可変領域配列（および、頻繁ではないが、定常領域配列）を有し、これは、マウスの生殖系列のヒト導入遺伝子において見出される場合、ヒトＶ，Ｄ，またはＪ遺伝子セグメントによってコードされる。代表的に、このような非生殖系列配列（または個々のヌクレオチド部分）は、ＣＤＲ中にもしくはその近く、または体細胞変異が群がることで公知の領域において群がる。
【０１４５】
所定の抗原と結合するヒト配列抗体は、アイソタイプスイッチングから得られ得、ヒト配列γ鎖（例えば、γ１、γ２、γ３、またはγ４）およびヒト配列軽鎖（例えば、κまたはλ）を含むヒト抗体は、産生される。このようなアイソタイプスイッチされたヒト配列抗体は、特に続く第２（すなわち配列）抗原チャレンジに対する特定の配列に対して、抗原による親和性成熟およびＢ細胞の選択の結果として、しばしば、代表的に可変領域中およびＣＤＲの約１０残基にまたはその残基内に、１以上の体細胞変異を含む。いくつかの高親和性ヒト配列抗体は、少なくとも約１×１０7Ｍ-1、または少なくとも約１×１０8Ｍ-1、または少なくとも約１×１０9Ｍ-1、または約１×１０9Ｍ-1より多く、あるいは５×１０9Ｍ-1から１×１０11Ｍ-1以上の平衡結合定数を有する。
【０１４６】
本発明の別の局面は、高親和性（例えば、１０7Ｍ-1より高い結合定数を有する）でＣＴＬＡ−４に結合するヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを産生するために使用され得るマウス由来のＢ細胞に関連する。これらのハイブリドーマを使用して、ＣＴＬＡ−４との結合に関する少なくとも１０7Ｍ-1の結合定数（Ｋａ）を有する免疫グロブリンを含む組成物を産生するために使用される。このような免疫グロブリンは、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域から構成されるヒト配列軽鎖を含み、この軽鎖可変領域は、ヒトＶｋまたはＶλ遺伝子セグメントおよびＪｋまたはＪλセグメントによってコードされたポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有し、そしてこの軽鎖定常領域は、ヒトＣｋまたはＣλセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する。これはまた、重鎖可変領域および定常領域からなるヒト配列重鎖を含み、この重鎖可変領域は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、必要に応じてＤ領域、およびヒトＪＨセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有し、そしてこの重鎖定常領域は、ヒトＣＨ遺伝子セグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する。
【０１４７】
本発明はまた、別の機能性分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（上記のような例えば、サイトカイン、細胞毒性薬剤、免疫刺激性薬剤もしくは阻害薬剤、Ｆａｂフラグメントなど））に対して誘導体化または連結するヒトＣＴＬＡ−４に対する、ヒトモノクローナル抗体およびヒト配列抗体を提供し、複数の結合部位または標的エピトープに結合する二重特異性または多重特異性分子を産生する。例えば、本発明の抗体または抗原結合部分は、（例えば、化学的結合、遺伝子的融合、非共有結合などによって）１以上の他の結合分子（例えば、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物）に機能的に連結され得る。
【０１４８】
従って、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４に対する第１結合特性および第２標的エピトープに対する第２結合特性を有する少なくとも１つのヒト配列抗体または抗原結合フラグメントを含む、二重特異性または多重特異性組成物を含む。この第２標的エピトープは、Ｆｃレセプター（例えば、ヒトＦｃγＲＩまたはヒトＦｃγレセプター）であり得る。従って、本発明は、エフェクター細胞（例えば、モノサイト、マクロファージまたは多形核細胞（ＰＭＮ））を発現するＦｃγＲ１、ＦｃγＲまたはＦｃεＲと、ヒトＣＴＬＡ−４を発現する標的細胞との両方に結合し得る二重特異性および多重特異性分子を含む。これらの複数の特異的（例えば、二重特異性または多重特異性）分子は、ヒトＣＴＬＡ−４発現細胞をエフェクター細胞に対して標的し、Ｆｃレセプター媒体エフェクター細胞の活性（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４発現細胞の貪食作用、抗体依存性細胞媒体細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカインの放出、またはスーパーオキシドアニオンの産生）を捕捉する。
【０１４９】
本発明の二重特異性分子および多重特異性分子は、少なくとも１つの抗体またはその抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む）への結合特異性を有する。この抗体は、軽鎖または重鎖のダイマー、あるいはそれらの任意の最小のフラグメント（例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるようなＦｖまたは一本鎖構築物）であり得る。本発明の二重特異性分子および多重特異性分子は、ＦｃγＲまたはエフェクター細胞の表面上に存在するＦｃγＲに対する結合特異性、および標的細胞抗原（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）に対する第二の結合特異性を含み得る。
【０１５０】
Ｆｃレセプターに対する結合特異性は、モノクローナル抗体によって提供され、その結合は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によってブロックされない。本明細書中で使用される場合、用語「ＩｇＧレセプター」は、第１染色体上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかをいう。これらの遺伝子は、合計で、１２個の膜貫通または可溶性レセプターアイソフォームをコードし、これらは、３つのＦｃγレセプターのクラスに分類される：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）。例えば、Ｆｃγレセプターは、ヒト高親和性ＦｃγＲＩであり得る。ヒトＦｃγＲＩは、７２ｋＤａの分子であり、これは、モノマーＩｇＧに対する高い親和性（１０8〜１０9Ｍ-1）を示す。
【０１５１】
これらの好ましいモノクローナル抗体の産生および特徴付けは、ＰＣＴ出願公開ＷＯ ８８／０００５２および米国特許第４，９５４，６１７号において、Ｆａｎｇｅｒらによって記述される。これらの抗体は、レセプターのＦｃγ結合部位とは異なる部位において、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合し、従って、それらの結合は、生理学的レベルのＩｇＧによって、実質的にブロックされない。本発明において有用な特定の抗ＦｃγＲＩ抗体は、ＭＡｂ ２２、ＭＡｂ ３２、ＭＡｂ ４４、ＭＡｂ ６２およびＭＡｂ １９７である。ＭＡｂ ３２を産生するハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ９６４９）から入手可能である。抗ＦｃγＲＩ ＭＡｂ ２２、ＭＡｂ ２２のＦ（ａｂ’）フラグメント、は、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ（Ａｎｎａｎｄａｌｅ，Ｎ．Ｊ．）から得られ得る。他の実施形態において、抗Ｆｃγレセプター抗体は、モノクローナル抗体２２（Ｈ２２）のヒト化形態である。Ｈ２２抗体の産生および特徴付けは、Ｇｒａｚｉａｎｏ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：４９９６−５００２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／１０３８４に記載される。細胞株を産生するＨ２２抗体は、表記ＨＡ０２２ＣＬ１でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、１９９２年１１月４日に寄託され、登録番号ＣＲＬ １１１７７を有する。
【０１５２】
Ｆｃレセプターに対する結合特異性はまた、ヒトＩｇＡレセプター（例えば、Ｆｃ−αレセプター（ＦｃαＲ（ＣＤ８９）））に結合する抗体によって提供され得る。好ましくは、この抗体は、内因性ＩｇＡによってブロックされない部位でヒトＩｇＡレセプターに結合する。用語「ＩｇＡレセプター」は、第１９染色体上に配置される１つのα−遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を含むことが意図される。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａのいくつかの代替的にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが示されている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性顆粒球および好中球性顆粒球上で恒常的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上では発現されない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の両方に対して、中程度の親和性（約５×１０7Ｍ- 1）を有し、これは、サイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ）への曝露の際に増加する（Ｍｏｒｔｏｎ（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：４２３−４４０）。４つのＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体（Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定され、これらは、ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側のＦｃαＲＩに結合する）は、Ｍｏｎｔｅｉｒｏ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４によって記載されている。
【０１５３】
本発明の二重特異性分子または多重特異性分子は、さらに、標的細胞抗原（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４）を認識する（例えば、結合する）、結合特性を含み得る。この結合特異性は、本発明のヒト配列抗体またはヒトモノクローナル抗体によって提供される。
【０１５４】
本明細書中で使用されるような「エフェクター細胞特異的抗体」は、エフェクター細胞のＦｃレセプターに結合する抗体または機能的抗体フラグメントをいう。本発明における使用のための好ましい抗体は、内因性免疫グロブリンによって結合されない部位で、エフェクター細胞のＦｃレセプターを結合する。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、用語「エフェクター細胞」は、免疫応答の認識段階および活性化段階とは対照的に、免疫応答のエフェクター段階に関係する免疫細胞をいう。例示的な免疫細胞としては、骨髄起源またはリンパ起源の細胞（例えば、リンパ球（例えば、細胞溶解生Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞およびＴ細胞））、キラー細胞、天然のキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥胖細胞、および好塩基性細胞が挙げられる。エフェクター細胞は、特定のＦｃレセプターを発現し、そして特定の免疫機能を実施する。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る（例えば、ＡＤＣＣを誘導し得る好中球）。例えば、ＦｃαＲを発現する、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびリンパ球は、標的細胞の特異的殺傷および免疫系の他の成分に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関連する。エフェクター細胞はまた、標的抗原、標的細胞、または微生物を貪食し得る。
【０１５６】
エフェクター細胞上での特定のＦｃＲの発現は、サイトカインのような体液性因子によって制御され得る。例えば、ＦｃγＲＩの発現は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）によって上方制御され得る。この増強された発現は、標的細胞に対するＦｃγＲＩ保有細胞によって、細胞傷害生活性（例えば、貪食作用を含む）を増加させる。
【０１５７】
「標的細胞」は、組成物（例えば、本発明のヒト配列抗体またはヒトモノクローナル抗体、本発明の二重特異性または多重特異性分子）によって、標的化され得る、被験体（例えば、ヒトまたは動物）中の任意の所望されない細胞を意味する。標的細胞は、ヒトＣＴＬＡ−４を発現または過剰発現する細胞であり得る。ヒトＣＬＴＡ−４を発現する細胞は、腫瘍細胞（例えば、リンパ腫）を含み得る。
【０１５８】
本発明のヒト配列抗体およびヒトモノクローナル抗体に加えて、他の抗体が、本発明の二重特異性または多重特異性分子において使用され得、例えば、ネズミの、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体を含む。
【０１５９】
キメラマウス−ヒトモノクローナル抗体（すなわち、キメラ抗体）は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、ネズミ（または他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域は、制限酵素を用いて消化されて、ネズミＦｃをコードする領域を除去し、そしてヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の等価な部分が置換される。（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ（１９９８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９を参照のこと）。
【０１６０】
キメラ抗体は、ヒトＦｖ可変領域由来の等価配列と結合する抗原に直接は関連しないＦｖ可変領域の配列を置き換えることによって、さらにヒト化され得る。ヒト化キメラ抗体の一般的な概説は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９９：１２０２−１２０７およびＯｉ（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４によって提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つからの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全てまたは一部をコードする核酸配列を、単離、操作、および発現する工程を包含する。このような核酸の供給源は、当業者に周知であり、そして例えば、７Ｅ３、抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ抗体産生ハイブリドーマから得られる。次いで、キメラ抗体またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡは、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。適切なヒト化抗体は、代替的に、ＣＤＲ置換によって産生され得る。米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０。
【０１６１】
特定のヒト抗体のＣＤＲの全ては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換され得るか、またはＣＤＲのいくつかのみが、非ヒトＣＤＲで置換され得る。Ｆｃレセプターへのヒト化抗体の結合のために必要とされるＣＤＲの数を置き換えることが必要となるのみである。抗体は、任意の方法によってヒト化され、これは、非ヒト抗体由来のＣＤＲを有するヒト抗体のＣＤＲの少なくとも一部分を置換し得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得る方法を記述する。英国特許出願ＧＢ ２１８８６３８Ａ（１９８７年３月２６日出願）を参照のこと。ヒトＣＤＲは、例えば、ＷＯ ９４／１０３３２、表題「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ」に記載される、オリゴヌクレオチド部位指向性変異誘発を使用して非ヒトＣＲで置換され得る。
【０１６２】
特定のアミノ酸が置換、欠失または付加されているキメラ抗体およびヒト化抗体はまた、本発明の範囲内である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、抗原への結合を改善するためにフレームワーク領域内でアミノ酸置換を有し得る。マウスＣＤＲを有するヒト化抗体において、ヒトフレームワーク領域内に配置されたアミノ酸は、マウス抗体の対応する位置に配置されたアミノ酸で置換され得る。このような置換は、公知であり、いくつかの例においてヒト化抗体の抗原への結合を改善する。アミノ酸が付加、欠失または置換された抗体は、本明細書中に改変抗体または変更抗体といわれる。
【０１６３】
本発明の二重特異性分子および多重特異性分子はさらに、抗Ｆｃ結合特異性および抗ヒトＣＴＬＡ−４結合特異性に加えて第３の結合特異性を含み得る。第３の結合特異性は、抗増強因子（ＥＦ）部分（例えば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質へ結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増加する分子）であり得る。「抗増強因子部分」は、抗体、機能抗体フラグメント、または所定の分子（例えば、抗原またはレセプター）へ結合し、それによってＦｃレセプターまたは標的細胞抗原に対する結合決定基の効果の増強を引き起こすリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、Ｆｃレセプターまたは標的細胞抗原に結合し得る。あるいは、抗増強因子部分は、第１および第２の結合特異性が結合する実体とは異なる実体に結合し得る。例えば、抗増強因子部分は、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または標的細胞に対する増加した免疫応答に関与する他の免疫細胞分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞を結合し得る。
【０１６４】
本発明の二重特異性分子および多重特異性分子は、化学技術（例えば、Ｋｒａｎｚ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５８０７を参照のこと）、「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」技術（例えば、米国特許第４，４７４，８９３号を参照のこと）、または組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。本発明の二重特異性分子および多重特異性分子はまた、当該分野で公知の方法および本明細書中に記載されるような方法を用いて、成分結合特異性（例えば、抗ＦｃＲおよび抗ヒトＣＴＬＡ−４結合特異性）を結合することによって調製され得る。例えば、二重特異性分子および多重特異性分子の各結合特異性は、別々に作製され得、次いで、互いに結合され得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々のカップリング剤または架橋剤が、共有結合のために使用され得る。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８を参照のこと）が挙げられる。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．（１９８５）Ｎｏ．７８、１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３）、Ｇｌｅｎｎｉｅ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５）によって記載されるものが挙げられる。他の結合剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、これらの両方は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。
【０１６５】
結合特異性が抗体（例えば、２つのヒト化抗体）である場合、これらは、この２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合され得る。このヒンジ領域は、結合体化の前に、奇数（例えば、１）のスルフヒドリル残基を含むために改変され得る。
【０１６６】
あるいは、両方の結合特異性は、同じベクターでコードされ、そして同じ宿主細胞で発現され、集合され得る。この方法は、二重特異性分子および多重特異性分子がＭＡｂ×ＭＡｂ、ＭＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合、特に有用である。本発明の二重特異性分子および多重特異性分子（例えば、二重特異性分子）は、一本鎖二重特異性抗体のような一本鎖分子、１つの一本鎖抗体および１つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子、または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子および多重特異性分子はまた、一本鎖分子であってもよいし、または少なくとも２つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子および多重特異性分子を調製するための方法は、例えば、以下に記載される：米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および米国特許第５，４８２，８５８号。
【０１６７】
二重特異性分子および多重特異性分子のその特定の標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウエスタンブロットアッセイによって確認され得る。これらのアッセイの各々は、一般的に、特に目的のタンパク質−抗体複合体の存在を、目的の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることによって検出する。例えば、ＦｃＲ抗体複合体は、例えば、酵素結合抗体または抗体−ＦｃＲ複合体を認識して特異的に結合する抗体フラグメントを用いて検出され得る。あるいは、この複合体は、任意の種々の他の免疫アッセイを用いて検出され得る。例えば、抗体は、放射性に標識され得、そしてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に使用され得る（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【０１６８】
改変抗体がまた、本発明に含まれる。用語「改変抗体」としては、例えば、抗体の一部を欠失、付加または置換することによって改変された、モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体のような抗体が挙げられる。例えば、抗体は、定常領域を欠失し、そしてこれを半減期（例えば、血清半減期）、抗体の安定性または親和性を増加する定常領域を用いて置換することによって、改変され得る。
【０１６９】
本発明の抗体結合体を使用して、所定の生物学的応答を改変、または生物学的応答（例えば、エフェクター細胞をリクルートする）を作製し得る。薬物部分は、古典的化学治療剤に限定されるように構築されない。例えば、この薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、以下が挙げられ得る：酵素学的に活性な毒素、またはその活性なフラグメント（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；腫瘍壊死因子またはインターフェロンαのようなタンパク質；あるいは、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の増殖因子のような生物学的応答改変因子。
【０１７０】
このような治療部分を抗体へ結合体化するための技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）４７５−５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０１７１】
（薬学的組成物）
本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと一緒に処方されたヒトモノクローナル抗体および／またはヒト配列抗体（インタクトまたは結合フラグメント）を１つまたはこれらの組み合わせを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの組成物としては、本発明の複数（例えば、２つ以上）の単離されたヒト抗体および／もしくはヒト配列抗体またはこれらの抗原結合部分の組み合わせが挙げられる。いくつかの組成物において、この組成物の各抗体またはその抗原結合部分は、異なる予め選択されたヒトＣＴＬＡ−４のエピトープに結合するモノクローナル抗体またはヒト配列抗体である。
【０１７２】
（Ａ．有効投薬量）
投薬レジメンが調整されて、最適な所望の応答（例えば、治療応答）が提供される。例えば、単一ボーラスが投与され得るか、数回分けられた用量が長い時間で投与され得るか、またはこの用量は、治療状況の緊急性によって示されるように、比例して減少または増加され得る。非経口組成物を投与の容易さのためおよび投薬量の均一性のための投薬量単位で処方することが、特に有利である。本明細書中に使用されるような投薬単位形態は、処置される被験体に対してまとまった投薬量として適した物理的に分離された単位をいい：各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連する所望の治療効果を生成するために計算された予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態に関する詳細は、（ａ）活性な化合物および活性化される特定の治療効果の特有の特徴、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためにこのような活性化合物を調合する際の当該分野において固有の限定によって規定されるかまたはこれらに直接依存する。
【０１７３】
薬学的に受容可能な抗酸化剤の例としては：（１）水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レクチン、プロピル没食子酸塩、α−トコフェノールなど）；ならびに（３）金属キレート剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）が挙げられる。
【０１７４】
選択された投与経路に関わらず、本発明の化合物（これは、適切な水和形態で使用され得る）および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の慣用的な方法によって薬学的に受容可能な投薬形態に処方される。
【０１７５】
本発明の薬学的組成物中の実際の活性成分投薬量レベルは、患者に対して毒性であることなく、活性成分量（これは、特定の患者、組成物および投与形態に対する所望の治療応答を達成するのに有効である）を得るために変更され得る。この選択された投薬量レベルは、種々の薬物動態学的因子に依存し、この薬物動態学的因子としては、以下が挙げられる：使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用された他の薬物、化合物および／もしくは物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および以前の病歴などの因子。
【０１７６】
医師または獣医師は、薬学的組成物中に使用される本発明の化合物の用量を、所望される治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで開始し得、そして徐々に所望の効果が達成されるまでこの投薬量を増化し得る。一般的に、本発明の組成物の適切な日用量は、治療効果を生成するのに効果的な最も低い用量の化合物量である。このような有効用量は、一般的に、上記の因子に依存する。投与が静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、または皮下投与であるか、あるいは標的部位の近位に投与されることが好ましい。所望する場合、治療化合物の有効日用量は、日中を通じて適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６回以上の副用量として、必要に応じて、単位投薬形態で投与され得る。本発明の化合物が単独で投与されることが可能なので、薬学的処方物（組成物）としてこの化合物を投与することが好ましい。
【０１７７】
本明細書中に記載される免疫関連状態および疾患の処置に関する本発明の組成物の有効用量は、多くの異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態；この患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の医薬、ならびに処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む）に依存して変化する。処置投薬量は、安全性および効果を最適化するために滴定されることが必要である。
【０１７８】
抗体の投与について、投与量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより通常には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な処置レジームは、毎２週当たり一回、または１ヶ月に一回または毎３〜６ヶ月に一回の投与を必要とする。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与された各抗体の投与量は、示された範囲内に入る。抗体は、通常、複数時に投与される。単回投与間の間隔は、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔はまた、患者におけるＣＴＬＡ−４に対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように、不規則である。いくつかの方法では、投与量は、１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整され、そしていくつかの方法では、２５〜３００μｇ／ｍｌである。あるいは、抗体は、持続性放出処方物として投与され得る。この場合、わずかな頻度の投与しか必要とされない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体が最長の半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体そして非ヒト化抗体である。投与の投与量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化し得る。予防的適用においては、比較的低い投与量が、長期の時間にわたり比較的頻度の低い間隔で投与される。いくらかの患者は、彼らの余生にわたって処置を受け続ける。治療的適応においては、比較的短い間隔での比較的高い投与量が時折、疾患の進行が減少するかまたは停止するまで、そして好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで必要とされる。その後、患者は、予防的レジームを投与され得る。
【０１７９】
免疫原をコードする核酸の投与量は、患者当たり、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターについての投与量は、１投与あたり１０から１００以上のビリオンに変化する。
【０１８０】
本発明のいくつかのヒト配列抗体およびヒトモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするために処方され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの非常に親水性の化合物を含む。本発明の治療的化合物が（所望の場合に）ＢＢＢを通過することを確実にするために、これらは、例えば、リポソーム中に処方され得る。リポソームを製造するための方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または器官へ選択的に輸送され、従って標的化薬物送達を促進する１以上の部分を含み得る（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照のこと）。例示的な標的化部分としては、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）またはビオチン（例えば、Ｌｏｗへの米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｔｈｅｒ．３９：１８０）；界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）プロテインＡレセプター（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）（これらの異なる種が本発明の処方物、および発明の分子の成分を含み得る）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３をも参照のこと）が挙げられる。いくつかの方法では、本発明の治療的化合物は、リポソーム中に処方され得る；より好ましい実施形態では、リポソームは、標的部分を含む。いくつかの方法では、リポソーム中の治療化合物は、腫瘍または感染に近位の部位にボーラス注入により送達される。組成物は、容易に注射可能に存在する程度に流体であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用に対して保護されるべきである。
【０１８１】
治療的適用について、薬学的組成物は、確立された疾患に罹患している患者にさらなる発症を阻止するかもしくは阻害するか、または疾患、その症状もしくは生物学的マーカーを後退させるかもしくは除去するに十分な量で投与される。予防的な適用について、薬学的組成物は、疾患に対して感受性であるかまたは疾患の危険にある患者に、疾患、その症状または生物学的マーカーの発症を遅延するか、阻害するかまたは予防するに十分な量で投与される。このことを達成するに適切な量は、「薬学的に有効な用量（治療有効量）」または「予防的に有効な用量（予防有効量）」として規定される。投与量は、処置される疾患、被検体のサイズ、被検体の症状の重症度、および選択された投与の具体的な組成物または経路に依存する。具体的には、腫瘍の処置において、「治療的に有効な量」は、未処置被検体と比較して、少なくとも約２０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％、腫瘍増殖を阻害し得る。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における推定の効力を、動物モデル系で評価され得る。あるいは、この組成物の特性は、従来のインビトロでのアッセイにより阻害する化合物の能力を試験することにより評価され得る。治療的に有効な量の治療的化合物は、腫瘍サイズを減少させ得、またはそうでなければ、被検体における症状を寛解する。
【０１８２】
組成物は、この組成物がシリンジにより送達可能である程度に滅菌および流体であるべきである。水に加えて、キャリアは、等張緩衝化生理食塩水溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコールなど）、およびそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、および塩化ナトリウム）を組成物中に含むことは好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含むことにより実行され得る。
【０１８３】
上記のように活性な化合物が安定に保護される場合、その化合物は、例えば、不活性な希釈剤または吸収可能な食用キャリアと共に経口投与され得る。
【０１８４】
（Ｂ．投与の経路）
本発明の薬学的組成物はまた、併用療法において（すなわち、他の薬剤と組み合わせて）、投与され得る。例えば、癌の処置では、併用療法は、少なくとも１つの抗腫瘍剤または他の従来の治療（例えば、放射線治療）と、本発明の組成物を含み得る。
【０１８５】
薬学的に受容可能なキャリアとしては、生体適合性の、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性遅延剤および吸収遅延剤などが挙げられる。キャリアは、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適切であり得る。投与の経路に依存して、活性化合物（すなわち、抗体、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子および多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子）は、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の天然条件から化合物を保護するために材料中にコーティングされ得る。
【０１８６】
「薬学的に受容可能な塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を維持する塩をいい、そしてこれは、任意の所望でない毒物学的効果を与えない（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。このような塩の例としては、酸添加塩および塩基添加塩が挙げられる。酸添加塩としては、非毒性無機酸（例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素、ヨウ化水素、亜リン酸など）から誘導される酸添加塩、ならびに非毒性有機酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸（ａｌｋａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族系酸スルホン酸および芳香族スルホン酸など）から誘導される酸添加塩が挙げられる。塩基添加酸としては、アルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）から誘導される塩基添加酸、ならびに非毒性有機アミン（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど）から誘導される塩基添加酸が挙げられる。
【０１８７】
本発明の組成物は、当該分野で公知の種々の方法により投与され得る。投与の経路および／または様式は、所望の結果に依存して変化する。活性化合物は、迅速な放出（例えば、制御放出処方物（移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムが挙げられる））に対して化合物を保護するキャリアと共に調製され得る。生分解性生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｉｄｒｉｄｅ）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製のための多くの方法は、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８により記載される。薬学的組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０１８８】
投与の特定の経路により本発明の化合物を投与するためには、化合物の不活性化を防止するために、材料でその化合物をコーティングするか、またはその材料と同時投与する必要があり得る。例えば、化合物は、適切なキャリア（例えば、リポソーム）または希釈剤中で被検体に投与され得る。薬学的に受容可能な希釈剤としては、生理食塩水、および水性緩衝溶液が挙げられる。リポソームとしては、水−イン−油−イン−水（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）ＣＧＦエマルジョンならびに従来のリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎら（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０１８９】
薬学的に受容可能なキャリアとしては、滅菌の注射可能な溶液または分散液の即時的な調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌散剤が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体よび薬剤の使用は、当該分野で公知である。活性な化合物と不適合である任意の従来の媒体または薬剤の範囲を除いて、本発明の薬学的化合物におけるそれらの使用は、意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【０１９０】
治療組成物は、典型的には、滅菌、実質的に等張性、そして製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の高薬物濃度に対して安定なあつらえられた構造体として処方され得る。キャリアは、例えば、水、エタノール、ピロール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの安定な混合物を含む溶液または分散媒体であり得る。適切な流動度が、例えば、レクチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウム））を組成物中に含むことは好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチン）を組成物中に含ませることにより行われ得る。
【０１９１】
滅菌注射可能な溶液は、上に列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中で必要とされる量の活性化合物を組み込み、必要に応じて次いで滅菌濾過することにより調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を塩基性分散媒体および上に列挙される成分から必要とされる他の成分を含む、滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射可能な溶液の調製のための滅菌散剤の場合、調製の好ましい方法は、減圧乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））であり、これは、活性成分の散剤および事前に滅菌濾過したそれらの溶液から、任意のさらなる所望の成分を得る。治療組成物はまた、当該分野で公知の医療デバイスで投与され得る。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイス）で投与され得る。本発明において有用な移植片およびモジュールの例としては以下が挙げられる：米国特許第４，４８７，６０３号（これは、制御された速度で医薬品を予製するための移植可能なマイクロインヒュージョン（ｍｉｃｒｏ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ）ポンプを開示する）；米国特許第４，４８６，１９４号（これは、皮膚を介して医薬品を投与するための治療デバイスを開示する）；米国特許第４，４４７，２３３号（これは、正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを開示する）；米国特許第４，４４７，２２４号（これは、持続性薬物送達のための可変フロー移植可能注入装置を開示する）；米国特許第４，４３９，１９６号（これは、マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する）；および米国特許第４，４７５，１９６号（これは、浸透圧薬物送達システムを開示する）。多くの他のこのような移植片、送達システムおよびモジュールが公知である。
【０１９２】
（Ｃ．処方物）
治療用組成物のために、本発明の処方物は、経口投与、経鼻投与、局所投与（頬側投与および舌下投与を含む）、直腸投与、膣投与および／または非経口投与のために適切な処方物を含む。この処方物は、単位投与形態中に都合よく存在し得、そして薬学の当該分野において公知の任意の方法によって調製され得る。キャリア物質と組み合わせられて単回投薬形態を生成し得る活性成分の量は、処置される被検体および投与の特定の形態に応じて変化し得る。キャリア材料と組み合わせられて、単回投薬形態を生成し得る活性成分の量は、一般に、治療的効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％中に、この量は、約０．０１％〜約９９％の活性成分、約０．１％〜約７０％の活性成分、または約１％〜約３０％の活性成分の範囲である。
【０１９３】
膣投与に適切な本発明の処方物としてはまた、適切であることが当該分野において公知のキャリアを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡沫、またはスプレーの処方物が挙げられる。本発明の組成物の局所投与または経皮投与のために投薬形態としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと、ならびに必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または噴霧剤と混合され得る。
【０１９４】
成句「非経口投与」および「非経口的に投与された」とは、経腸的投与および局所的投与以外の、通常、注入による投与の形態を意味し、、そして限定することなく、静脈内の、筋肉内の、動脈内の、鞘内の、包内の、眼窩内の、心臓内の、皮内の、腹腔内の、経気管の（ｔｒａｎｓｔｒａｃｈｅａｌ）、皮下の、表皮下の、関節内の、被膜下の、クモ膜下の、脊椎内の、硬膜外の、および胸骨下の注射および注入が挙げられる。
【０１９５】
本発明の薬学的組成物中に使用され得る適切な水性キャリアおよび非水性キャリアとしては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、ならびに注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合に必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【０１９６】
これらの組成物はまた、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の存在を防止することは、滅菌手順によって（前出）、および種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）を含ませることによって確実となり得る。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を組成物中に含ませることもまた、所望され得る。さらに、注射可能な薬学的形態の長期の吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含ませることによって、もたらされ得る。
【０１９７】
本発明の組成物を、ヒトおよび動物に対して薬剤として投与する場合、その組成物は、単独で、あるいは、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた、例えば０．０１〜９９．５％（または０．１〜９０％）の活性成分を含む薬学的組成物として与えられ得る。
【０１９８】
薬学的組成物は、一般に、滅菌で、実質的に等張で、そして米国の食品医薬品庁の全ての優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）に完全に適合する。
【０１９９】
（本発明の方法および使用）
（Ａ．方法）
本発明の組成物（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒト配列抗体およびヒトモノクローナル抗体ならびにその誘導体／結合体）は、インビトロおよびインビボでの診断および治療における用途を有する。例えば、これらの分子は、例えば、インビトロまたはエキソビボにおいて、培養中の細胞に対して投与され得るか、あるいは、例えば、インビボにおいて被検体に投与され得、種々の障害を処置、予防、または診断し得る。用語「被検体」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物として、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類））が挙げられる。この方法は、Ｔ細胞媒介性応答を増強するか、または減少することによって処置され得る障害を有するヒト患者の処置のために特に適切である。
【０２００】
ＣＴＬＡ−４に対する抗体を、他の薬剤とともに投与する場合、２つの薬剤が、順番に、または同時のいずれかで投与され得る。この方法を使用して、黒色腫、結腸ガン、前立腺ガン、および腎臓ガンを含む任意の種類のガンを処置し得る。
【０２０１】
例えば、（抗体価を増加するために）ＣＴＬＡ−４でコートされたラテックスミクロスフェアが、Ｔ細胞増殖および活性化を阻害し得る。同一の抗体結合部位を有する薬剤は、Ｆａｂとして、または可溶性ＩｇＧとして存在する場合には、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストとして作用し得、そして高度に架橋された場合は、ＣＴＬＡ−４アゴニストとして作用し得る。従って、抗ＣＴＬＡ−４抗体の多価形態は、免疫応答のダウンレギュレーションのための有用な治療剤である。
【０２０２】
ラテックスミクロスフェアまたは他の不溶性粒子に結合することに加えて、抗体を、お互いに架橋し得るか、またはマルチマーを形成するように遺伝子操作し得る。架橋は、直接的な化学結合によるものであっても、例えば、抗体−ビオチン−アビジン複合体のような間接的な結合によるものであってもよい。架橋は、化学的結合基を使用する場合の共有結合であっても、タンパク質間相互作用またはタンパク質−リガンド相互作用を使用する場合の非共有結合であってもよい。結合のための遺伝子操作のアプローチとしては、例えば、高親和性ＩｇＧ抗体の可変領域の、ＩｇＭ発現ベクター中または任意のタンパク質部分（例えば、ポリリジンなど）中での再発現が挙げられる。高親和性ＩｇＧ抗体のＩｇＭ抗体への変換は、非常に高度のアビディティを有する１０価の複合体を生成し得る。ＩｇＡ2発現ベクターを使用してもまた、多価抗体複合体を生成し得る。ＩｇＡ2は、Ｊ鎖および分泌成分とともに、ポリマーを形成し得る。ＩｇＡ2は、好中球、マクロファージ、および単球において発現するＩｇＡレセプターＣＤ８９とさらに架橋され得るというさらなる利点を有し得る。
【０２０３】
作用（ａｇｏｎｉｓｍ）は、少なくとも２つの重複しないＣＴＬＡ−４上のエピトープに対する抗体を含む、ＣＴＬＡ−４に対するポリクローナル抗体のいくつかの調製物を使用してもまた、得られ得る。２つの結合部位を含むそのような調製物中の１つの抗体は、２分子のＣＴＬＡ−４と結合して、小さなクラスターを形成し得る。次に、異なる結合部位を有する第２の抗体を、これらの小さなクラスターと結合（凝集）させて、大きなクラスターを形成し得、それによって、シグナルをＴ細胞に伝達してＣＴＬＡ−４を保有（発現）するＴ細胞の活性化を阻害、減少または防止し得る（細胞表面上の）ＣＴＬＡ−４の複合体を形成し得る。従って、ポリクローナル抗体のいくつかの調製物は、上記の多価調製物と類似の作用を示す。
【０２０４】
従って、抗ＣＴＬＡ−４抗体の多価調製物またはポリクローナル調製物は、ＣＴＬＡ−４レセプターに作用し、それによって、作用しない場合には、ＣＴＬＡ−４レセプターを保有するＴ細胞によって媒介される免疫応答を抑制するために有用である。そのような抗体の多価調製物または抗体のポリクローナル調製物を使用して処置し得る疾患のいくつかの例としては、自己免疫疾患、移植片拒絶、および炎症が挙げられる。
【０２０５】
（Ｂ．使用）
（１．免疫応答の活性化）
（ａ．ガン）
いくつかの治療方法によって、ガン患者は処置される。抗体によるＣＴＬＡ−４の遮断は、患者内のガン細胞に対する免疫応答を増強し得る。必要に応じて、ＣＴＬＡ−４に対する抗体を、免疫原性薬剤（例えば、ガン細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび糖質分子を含む）、細胞、ならびに免疫刺激性のサイトカインおよびＢ７のような細胞表面抗原をコードする遺伝子によってトランスフェクトされた細胞（例えば、Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ａ．ら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５、１００６７〜１００７１を参照のこと））と組合せ得る。。
【０２０６】
マウス実験系において、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与後の、いくらかの腫瘍の移植は、腫瘍の拒絶をもたらし得る。いくつかの場合において、確立された腫瘍の腫瘍拒絶が生じる；他の場合において、腫瘍の増殖が、抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用によって減速する。一般に、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、免疫原性の腫瘍に対して効果的である。操作上は、免疫原性の腫瘍とは、腫瘍のためにその腫瘍自体を使用するワクチン化が、腫瘍チャレンジに対する免疫をもたらし得る腫瘍として定義される。ヒトにおいて、いくつかの腫瘍（例えば、黒色腫）が、免疫原性であることが示されている。ＣＴＬＡ−４遮断薬によるＴ細胞活性化の閾値を上げることによって、本発明者らが宿主において腫瘍応答を活性化することを予測し得ることが、予想される。
【０２０７】
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、ワクチン化プロトコールと組み合わせた場合、最も効果的である。腫瘍に対するワクチン化のための多くの実験上の戦略が、開発されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．、２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：６０−６２；Ｌｏｇｅｔｈｅｔｉｓ、Ｃ．、２０００、ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２；Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８；Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８を参照のこと；Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．およびＳｚｎｏｌ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３−３０４３ ＤｅＶｉｔａ，Ｖら、（編）１９９７，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ中もまた参照のこと）。これらの戦略の１つにおいて、ワクチンが、自己の腫瘍細胞または同種異系の腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入された場合、最も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン化のための抗原呈示の強力な活性化因子であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（８０：３５３９〜４３））。
【０２０８】
ＧＭＣＳＦ改変腫瘍細胞ワクチンの使用とともに用いられる抗ＣＴＬＡ−４遮断薬は、多数の実験的腫瘍モデル（例えば、乳房癌腫）（Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９８）前出）、原発性前立腺ガン（Ｈｕｒｗｉｔｚ Ａ．ら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０（９）：２４４４〜８）および黒色腫（ｖａｎ Ｅｌａｓ，Ａら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：３５５−６６）において有効でることが示されている。これらの例において、非免疫原性腫瘍（例えば、Ｂ１６黒色腫）が、免疫系による破壊に対して感受性となった。腫瘍細胞ワクチンもまた、他の免疫活性化因子（例えば、ＩＬ２）および、とりわけ、同時刺激分子を発現するように改変され得る。
【０２０９】
種々の腫瘍内での遺伝子発現の研究および大規模な遺伝子発現パターンの研究が、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義をもたらした（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１〜７）。多くの場合において、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍内および腫瘍が発生した細胞内において発現する分化抗原である（例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２）。より重要なことに、多くのこれらの抗原は、宿主において見出される腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示され得る。腫瘍において発現するタンパク質および／またはペプチドに対する免疫応答を生じるために、腫瘍において発現する組換えタンパク質および／またはペプチドの集団と、ＣＴＬＡ−４遮断薬とを、組み合わせて使用し得る。これらのタンパク質は、通常、免疫系によって自己抗原として見られ、従って、免疫系に対して耐性である。腫瘍抗原としてはまた、タンパク質テロメラーゼ（染色体のテロメアの合成のために必要であり、そして８５％を越えるヒトのガンにおいて発現し、そして限られた数の体細胞組織においてのみ発現する（Ｋｉｍ，Ｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６、２０１１〜２０１３））が挙げられ得る（これらの体細胞組織は、種々の手段によって、免疫の攻撃から防御され得る）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変化させるか、または２つの関連しない配列間での融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体中のｂｅｒ−ａｂｌ）を生じる体細胞変異のために、ガン細胞において発現する「腫瘍抗原（ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）」であり得るか、またはＢ細胞腫瘍由来のイディオタイプであり得る。他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルスウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）のようなヒトのガンと関連するウイルス由来のタンパク質を含み得る。ＣＴＬＡ−４遮断薬と組み合わせて使用され得る腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織自体から単離された、精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質のフラグメントを含み、そしてこれらＨＳＰは、腫瘍の免疫性を惹起するための抗原呈示細胞への送達において非常に効率的である（Ｓｕｏｔ，ＲおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８；Ｔａｍｕｒａ，Ｙら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７−１２０）。
【０２１０】
樹状細胞（ＤＣ）は、強力な抗原呈示細胞であり、抗原特異的応答をプライムするために使用され得る。ＤＣは、エキソビボにおいて生成され、そして種々のタンパク質、ペプチド抗原および腫瘍細胞抽出物を有し得る（Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：３２８−３３２）。ＤＣはまた、これらの腫瘍抗原を発現する遺伝的手段によっても、形質導入され得る。ＤＣは、免疫の目的ために腫瘍細胞と直接的に融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ，Ａら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３３２−３３６）。ワクチン接種方法として、ＤＣ免疫は、効果的にＣＴＬＡ−４遮断薬と組合せられ、より強力な抗腫瘍応答を、活性化し得る。
【０２１１】
ＣＴＬＡ−４遮断薬はまた、標準的な癌処置と組み合わされ得る。ＣＴＬＡ−４遮断薬は、化学療法レジメンと効率的に組み合わされ得る。これらの場合において、投与される化学療法試薬の用量を減少させることが可能であり得る（Ｍｏｋｙｒ，Ｍ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：５３０１−５３０４）。ＣＴＬＡ−４遮断薬と化学療法との組み合わせ使用の背後にある科学的根拠は、細胞死（これは、ほとんどの化学療法化合物の細胞障害性作用の結果である）が、抗原提示経路における腫瘍抗原の増加したレベルを生じるべきであるということである。細胞死を介してＣＴＬＡ−４遮断薬との相乗作用を生じ得る他の組み合わせ治療は、照射、手術およびホルモン剥奪である（Ｋｗｏｎ，Ｅ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２６）：１５０７４−９）。これらのプロトコルの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。新脈管形成インヒビターはまた、ＣＴＬＡ−４遮断薬と組み合わされ得る。新脈管形成の阻害は、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る腫瘍細胞死を引き起こす。
【０２１２】
ＣＴＬＡ−４遮断抗体はまた、腫瘍細胞に対してＦｃαまたはＦｃγレセプター発現エフェクター細胞を標的とする、二特異的抗体と組み合わせて使用され得る（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同第５，８３７，２４３号を参照のこと）。二特異的抗体は、２つの別々の抗原を標的とするために使用され得る。例えば、抗Ｆｃレセプター／抗腫瘍抗原（すなわち、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二特異的抗体は、腫瘍の部位に対してマクロファージを標的とするために使用されてきた。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効率的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＣＴＬＡ−４遮断薬の使用により増強される。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二特異的抗体の使用によって、直接ＤＣに送達され得る。
【０２１３】
腫瘍は、広範な種々の機構によって宿主免疫監視を回避する。これらの機構の多くは、腫瘍によって発現され、かつ免疫抑制性であるタンパク質の不活化によって克服され得る。これらには、例えば、Ｔｇｆβ（Ｋｅｈｒｌ，Ｊ，ら（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．およびＯ’Ｇａｒｒａ，Ａ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １３：１９８−２００）、およびＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ，Ｍ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１３６３−１３６５）。これらの実体の各々に対する抗体は、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わされて、免疫抑制剤の効果を妨げ、そして宿主による腫瘍免疫応答を支持する。
【０２１４】
宿主免疫応答性を活性化するために使用され得る他の抗体は、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせて使用され得る。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ−４０抗体は、効率的にＴ細胞ヘルパー活性に置き換わり得（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４−４７８）、そしてＣＴＬＡ−４抗体とともに使用され得る（Ｉｔｏ，Ｎ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１（５）５２７−４０）。Ｔ細胞同時刺激分子（例えば、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．ら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６８２−６８５（１９９７）、およびＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６２−２６６））に対する活性化抗体はまた、Ｔ細胞活性化の増加したレベルを提供する。
【０２１５】
骨髄移植は、造血起源の種々の腫瘍を処置するために現在使用されている。対宿主性移植片病は、この処置の結果として起こるが、治療的利益が対腫瘍性移植片応答から得られ得る。ＣＴＬＡ−４遮断薬を使用して、ドナーの移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の効果を増加させ得る（Ｂｌａｚａｒ，Ｂ．ら（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：６３６８−６３７７）。
【０２１６】
抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および増大、ならびに腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のためのこれらの細胞のレシピエントへの養子移入に関与する、いくつかの実験的処置プロトコルもまた存在する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．およびＲｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．（１９９９）２８５：５４６−５１）。これらの方法をまた使用して、病原菌（例えば、ＣＭＶ）に対するＴ細胞応答を活性化し得る（以下を参照のこと）。抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下でのエキソビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を増加させることが予想され得る。
【０２１７】
（ｂ．感染性疾患）
本発明の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝された患者を処置するために使用される。上記で考察された腫瘍に対するその適用と同様に、抗体媒介ＣＴＬＡ−４遮断薬は、単独、またはアジュバントとしてワクチンと組み合わされて使用され、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激し得る。ＣＴＬＡ−４遮断薬は、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＭｃＣｏｙ，Ｋ．ら（１９９７）１８６（２）；１８３−１８７）およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４１５３−４１６０）の感染の急性期において有効であることが示された。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例としては、現在有効なワクチンが存在しない病原体、または従来のワクチンが完全に有効ではない病原体が挙げられる。これらには、ＨＩＶ、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ（Ａ、ＢおよびＣ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｒｐｅｓ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｍａｌａｒｉａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＴＬＡ−４遮断薬は、感染の過程にわたって変化した抗原を提示するＨＩＶのような因子によって確立された感染に対して特に有用である。これらの新規のエピトープは、抗ヒトＣＴＬＡ−４投与の時間において外来性であるとして認識され、従って、ＣＴＬＡ−４を介した陰性のシグナルによって鈍らされない強力なＴ細胞応答を引き起こす。
【０２１８】
本発明の方法によって処置され得る感染を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例としては、以下が挙げられる：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ（Ａ、ＢまたはＣ）、ｈｅｒｐｅｓウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス）、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ｉｎｆｌｕｅｎｚａウイルス、ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ、ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ、ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ、ｃｏｘｓａｃｋｉｅウイルス、ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ、ＲＳウイルス、ｍｕｍｐｓウイルス、ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、ｍｅａｓｌｅｓウイルス、ｒｕｂｅｌｌａウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、ｄｅｎｇｕｅウイルス、ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、ｍｏｌｌｕｓｃｕｍウイルス、ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ、ｒｏｂｉｅｓウイルス、ＪＣウイルスおよびａｒｂｏｖｉｒａｌ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス。
【０２１９】
本発明の方法によって処置され得る感染を引き起こす病原性細菌のいくつかの例としては、以下が挙げられる：ｃｈｌａｍｙｄｉａ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ細菌、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ｐｓｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉおよびｃｏｎｏｃｏｃｃｉ、ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ｐｒｏｔｅｕｓ、ｓｅｒｒａｔｉａ、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ｂａｃｉｌｌｉ、ｃｈｏｌｅｒａ、ｔｅｔａｎｕｓ、ｂｏｔｕｌｉｓｍ、ａｎｔｈｒａｘ、ｐｌａｇｕｅ、ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、ならびにＬｙｍｅｓ病細菌。
【０２２０】
本発明の方法によって処置され得る感染を引き起こす病原性真菌のいくつかの例としては、以下が挙げられる：Ｃａｎｄｉｄａ（ａｌｂｉｃａｎｓ、ｋｒｕｓｅｉ、ｇｌａｂｒａｔａ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなど）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ｎｉｇｅｒなど）、Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ケカビ属、アブシディア属、クモノスカビ属）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ。
【０２２１】
本発明の方法によって処置され得る感染を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例としては、以下が挙げられる：Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉ、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ。
【０２２２】
上記の方法のすべてにおいて、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、他の形態の免疫治療（例えば、サイトカイン処置（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＩＬ−２）、または二特異的抗体治療（これは、腫瘍抗原の増大した提示を提供する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【０２２３】
（ｃ．疾患の処置および治療的処置に対する有益な「自己免疫」反応の促進） 抗ＣＴＬＡ−４抗体が自己免疫応答を引き起こし、増幅させる能力は、多くの実験系（ＥＡＥ−実験的自己免疫脳脊髄炎、ＭＳについてのマウスモデル（Ｐｅｒｒｉｎ、Ｐ．ら（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７（４）：１３３３−１３３６）；糖尿病（Ｌｕｈｄｅｒ，Ｆ．ら（１９９８）前出））において実証されてきた。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを用いる抗腫瘍応答の誘導は、多くの抗腫瘍応答が抗自己反応性に関与することを明らかにする（抗ＣＴＬＡ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ改変Ｂ１６黒色腫において観察される色素脱失（ｖａｎ Ｅｌｓａｓら、前出）；Ｔｒｐ−２ワクチン接種したマウスにおける色素脱失（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，Ｗ．ｒａ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２９８２−２９８７）；ＴＲＡＭＰ腫瘍細胞ワクチンによって引き起こされる自己免疫前立腺炎（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ａ．（２０００）前出）、ヒト臨床試験において観察される黒色腫ペプチド抗原ワクチン接種および白斑（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡおよびＷｈｉｔｅ，ＤＥ（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９（１）：８１−４））。
【０２２４】
従って、疾患の処置のためにこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生じるワクチン接種プロトコルを考案するために、抗ＣＴＬＡ−４遮断薬を種々の自己タンパク質とともに使用することを考慮し得る。例えば、アルツハイマー病は、脳のアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適切な蓄積に関与し；アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着を清澄し得る（Ｓｃｈｅｎｋら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：１７３−１７７）。
【０２２５】
他の自己タンパク質はまた、アレルギーおよび喘息の処置のためのＩｇＥ、ならびに慢性関節リウマチの処置のためのＴＮＦのような標的として使用され得る。最後に、種々のホルモンに対する抗体応答は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用によって誘導され得る。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は、避妊のために使用され得る。特定の腫瘍の増殖に必要なホルモンおよび他の適切な因子に対する中和抗体応答はまた、可能性のあるワクチン接種標的と考えられ得る。
【０２２６】
抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用のための上記と類似の方法は、治療的自己免疫応答の誘導のために使用され、他の自己抗原（例えば、アミロイド沈着（アルツハイマー病におけるＡβを含む）、ＴＮＦαおよびＩｇＥのようなサイトカイン）の不適切な蓄積を有する患者を処置し得る。
【０２２７】
（２．免疫応答の不活化）
免疫応答によって引き起こされる疾患は、過敏性疾患と称される。自己耐性および引き続く自己（ｓｅｌｆ）（または自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ））抗原に対する免疫応答の不全によって引き起こされる疾患は、自己免疫疾患と称される。過敏性疾患はまた、外来抗原（例えば、微生物）に対する制御されてないかまたは過剰な応答により生じ得る。
【０２２８】
ヒトＣＴＬＡ−４に対する可溶性抗体は、Ｔ細胞の増大および活性化を促進し（すなわち、ここでＣＴＬＡ−４機能（例えば、リガンドへの結合）が阻害され；このシナリオにおいて、この抗体はＣＴＬＡ−４機能に対するアンタゴニストである）、反対の効果を生じるこれらの同じ抗体の結合価を増加させる（ここで、対照的に、これらの抗体は免疫応答を抑制するためのＣＴＬＡ−４のアゴニストとして作用している）（例えば、ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ，１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，２５３３−２５４０を参照のこと）。抗原特異的Ｔ細胞応答（例えば、病原性自己反応性Ｔ細胞の標的であるＴ細胞応答）を不活化する目的のために、これらのＴ細胞に特異的な標的抗原（すなわち、抗原および／またはＭＨＣ／抗原複合体）は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の多結合価形態で投与されなければならない。
【０２２９】
（ａ．炎症）
炎症は、流体の蓄積および食作用性白血球（例えば、顆粒球および単球）の移動を伴う毛細管拡張の結果を示す。炎症は、種々の感染に対して宿主を防御する際に重要であるが、炎症性障害における望ましくない結果（例えば、アナフィラキシーショック、関節炎、痛風および虚血再灌流）もまた有し得る。活性化Ｔ細胞は、炎症において重要な調節の役割を有し、インターフェロンγおよびコロニー刺激因子（これは次いで、食作用性白血球を活性化する）を放出する。活性化食作用性白血球は、多くの特定の細胞表面分子（ホーミングレセプターという）を発現するために誘導され、これは食細胞を標的内皮細胞に付着させるために役立つ。炎症性応答は、本発明の治療薬剤を用いる処置によって減少または排除され得る。例えば、ＣＴＬＡ−４に対する抗体の多結合価調製物は、活性化Ｔ細胞の活性化をブロックし、それによってこれらの細胞が、食作用性細胞型の活性化のために必要な分子を放出することを妨げる。
【０２３０】
（ｂ．自己免疫疾患）
免疫抑制が所望されるさらなる状況は、自己免疫疾患（例えば、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、スティッフマン症候群、慢性関節リウマチ、重症筋無力症およびエリテマトーデス）の処置における状況である。これらの疾患においては、身体は、それ自身の抗原のうちの１つに対する細胞免疫応答および／または体液免疫応答を発生し、その抗原の破壊、および強力な不具および／または致命的な結果を導く。活性化Ｔ細胞は、真性糖尿病のような多くの自己免疫疾患において主要な役割を果たすと考えられている。自己免疫疾患は、Ｔ細胞の活性化を阻害する本発明の治療剤のうちの１つを投与することによって処置される。必要に応じて、それに対して自己免疫疾患が標的化される自己抗原またはそのフラグメントは、免疫抑制剤の直前、免疫抑制剤と同時に、または免疫抑制剤の直後に投与され得る。このように、抑制処置に乗じて耐性が自己抗原に導入され得、それによって連続的な免疫抑制の必要性を除去する。例えば、Ｃｏｂｂｏｌｄら、ＷＯ９０／１５１５２（１９９０）を参照のこと。
【０２３１】
（ｃ．対宿主性移植片病）
本発明の治療薬剤についての関連した使用は、「対宿主性移植片」病（ＧＶＨＤ）に関する免疫反応を調節する際におけるものである。ＧＶＨＤは、免疫学的にコンピテントな細胞が同種異系のレシピエントに移される場合生じる潜在的に致死性の疾患である。この状況において、ドナーの免疫コンピテントな細胞は、レシピエントの組織を攻撃し得る。皮膚、腸の上皮および肝臓の組織が頻繁な標的であり、ＧＶＨＤの過程の間に破壊され得る。疾患は、免疫組織が移植される（例えば、骨髄移植）場合、特に重篤な問題を提示するが、あまり重篤でないＧＶＨＤもまた同様に他の場合（心臓移植および肝臓移植を含む）において報告されている。本発明の治療薬剤は、ドナー白血球の活性化を阻害し、それによって宿主において標的細胞を溶解するそれらの能力を阻害する。
【０２３２】
（ｄ．移植拒絶）
最近数年にわたって、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および骨髄のような組織および器官を移植するための外科的技術の効率においてかなりの改善があった。おそらく、主な目立った問題点は、移植された同種移植片または器官に対してレシピエントに免疫寛容性を誘導するための満足のいく薬剤を欠くことである。同種異系細胞または器官が宿主に移植される（すなわちドナーおよびドニーが同じ種由来の異なる個体である）場合、宿主免疫系は、移植された組織の破壊を導く移植における外来抗原に対する免疫応答を開始するようである（対移植片宿主病）。ＣＤ８+細胞、ＣＤ４+細胞および単球はすべて、移植組織の拒絶に含まれる。本発明の治療薬剤は、ドニーにおけるＴ細胞媒介同種抗原誘導免疫応答を阻害するのに有用であり、これによってこのような細胞が移植された組織または器官の破壊に関係することを妨げる。
【０２３３】
（Ｂ．サンプル中のＣＴＬＡ−４の存在を検出／測定するための方法）
本発明は、さらに、サンプル中のヒトＣＴＬＡ−４抗原の存在を検出するための方法、またはヒトＣＴＬＡ−４抗原の量を測定するための方法を提供し、この方法は、サンプルおよびコントロールサンプルを、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（ヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する）と、抗体またはその部分とヒトＣＴＬＡ−４との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触する工程を包含する。次いで、複合体の形成が検出され、ここで、コントロールサンプルと比較したサンプルの複合体形成の差がサンプル中のヒトＣＴＬＡ−４抗原の存在を示す。
【０２３４】
（Ｃ．キット）
本発明の組成物（例えば、ヒト配列抗体、ヒト抗体、複数特異的および二特異的分子）ならびに使用の説明書を含むキットもまた本発明の範囲内である。キットは、さらに、少なくとも一つのさらなる試薬、または本発明の一つ以上のさらなるヒト抗体（例えば、第一のヒト抗体とは異なるＣＴＬＡ−４抗原におけるエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体）を含み得る。キットは、代表的に、キットの内容物の意図された使用を示す標識を含む。用語標識は、キット上に供給されるか、キットともにか、またはそうでなければキットに添えられた任意の書かれたまたは記録された物質を含む。
【０２３５】
（実施例）
（実施例１．Ｃｍｕ標的マウスの作製）
（ＣＭＤ標的化ベクターの構築）
プラスミドｐＩＣＥｍｕは、マウスＩｇ重鎖座のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメント（ｍｕ遺伝子にわたる）を含み、これは、Ｂａｌｂ／Ｃゲノムラムダファージライブラリーから得られた（Ｍａｒｃｕら、Ｃｅｌｌ ２２：１８７，１９８０）。このゲノムフラグメントは、プラスミドｐＩＣＥＭＩ９ＨのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化される（Ｍａｒｓｈら、；Ｇｅｎｅ ３２、４８１−４８５，１９８４）。ｐＩＣＥｍｕに含まれる重鎖配列は、ｍｕイントロンエンハンサーのちょうど３’に位置するＥｃｏＲＩ部位の下流に、ｍｕ遺伝子の最後の膜貫通エキソンの約１ｋｂ下流に位置するＸｈｏＩ部位に伸長するが、多くのｍｕスイッチ反復領域は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける継代によって欠失した。
【０２３６】
標的化ベクターは、以下のように構築された（図１を参照のこと）。１．３ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩフラグメントが、ｐＩＣＥｍｕから切り出され、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にサブクローン化した。このｐＩＣＥｍｕフラグメントが、Ｃｍｕ１の約１ｋｂの５’の位置のＨｉｎｄＩＩＩ部位からＣｍｕ１内に位置するＳｍａＩ部位に伸長する。得られたプラスミドをＳｍａＩ／ＳｐｅＩで消化し、そしてｐＩＣＥｍｕからの約４ｋｂのＳｍａＩ／ＸｂａＩフラグメント（Ｃｍｕ１ ３’のＳｍａＩ部位から最後のＣｍｕエキソンのすぐ下流に位置するＸｂａＩ部位に伸長する）を挿入した。得られたプラスミド（ｐＴＡＲ１）をＳｍａＩ部位で線状にし、そしてｎｅｏ発現カセットを挿入した。このカセットは、ホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）プロモーター（ＸｂａＩ／ＴａｑＩフラグメント；Ａｄｒａら（１９８７）Ｇｅｎｅ６０：６５−７４）の転写制御化にてｎｅｏ遺伝子から構成され、そしてｐｇｋポリアデニル化部位を含む（ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；Ｂｏｅｒら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２９９−３０８）。このカセットは、プラスミドｐＫＪ１（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚら、（１９９１）Ｃｅｌｌ６５：１１５３−１１６３によって記載される）から得られ、ここからｎｅｏカセットがＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切り出され、そしてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）にサブクローン化してｐＧＥＭ−７（ＫＪ１）を作製した。ｎｅｏカセットをＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化によってｐＧＥＭ−７（ＫＪ１）から切り出し、平滑末端化しそしてゲノムＣｍｕ配列の反対方向にプラスミドｐＴＡＲ１のＳｍａＩ部位にサブクローン化した。得られたプラスミドをＮｏｔ Ｉで線状にし、そして単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）カセットを、Ｍａｎｓｏｕｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２に記載されるように、相同組換え体を保有するＥＳクローンの濃縮を可能にするように挿入した。このカセットは、Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５：１１５３−１１６３によって記載されるように、マウスｐｇｋプロモーターおよびポリアデニル化部位によってブラケット化（ｂｒａｃｋｅｔｅｄ）されるｔｋ遺伝子のコード配列からなる。得られたＣＭＤ標的化ベクターは、合計で約５．３ｋｂの重鎖座位に対する相同性を含み、そして消化して変異ｍｕ遺伝子（ここに第１のＣｍｕエキソンの独特のＳｍａＩ部位におけるｎｅｏ発現カセットを挿入した）を作製した。標的化ベクターをＰｖｕＩを用いて線状化し、これは、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションの前にに１５３−１１６３ゅうしたとうををょうくをｓｐがいするｉｌｌｙ，Ｃ．プラスミド配列内で切り出す。
【０２３７】
（標的化ＥＳ細胞の生成および分析）
ＡＢ−１ ＥＳ細胞（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．およびＢｒａｄｌｅｙ、Ａ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：１０７３−１０８５）を有糸分裂的に不活化されたＳＮＬ７６／７細胞フィーダー層で増殖させた（同書）。基本的にＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．（１９８７）ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編）Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ｐ．７１−１１２）に記載される。線状化ＣＭＤ標的化ベクターが、Ｈａｓｔｙら、（Ｈａｓｔｙ，Ｐ．Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５０：２４３−２４６）に記載される方法によってＡＢ−１細胞にエレクトロポレーションされた。エレクトロポレートされた細胞を１〜２×１０6細胞／ディッシュの密度で１００ｍｍのディッシュにプレートした。２４時間後、Ｇ４１８（活性成分の２００マイクログラム／ｍｌ）およびＦＩＡＵ（５×１０−７Ｍ）を培地に加え、そして薬剤耐性クローンを８〜９日にわたって増殖させた。クローンをピックアップし、トリプシン処理し、２つの部分に分け、そしてさらに増殖させた。次いで、それぞれのクローンから誘導される細胞の半分を凍らせ、そして他の半分を、ベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
【０２３８】
ＤＮＡ分析をサザンブロットハイブリダイゼーションによって実行した。ＤＮＡをＬａｉｒｄら（Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．ら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４２９３）に記載されるようにクローンから単離した。単離されたゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、そして９１５ｂｐ ＳａｃＩフラグメント、プローブＡ（図１）を用いてプローブし、これは、ｍｕイントロンエンハンサーとｍｕスイッチ領域との間の配列にハイブリダイズする。プローブＡは、野生型遺伝子座からの９．９ｋｂのＳｐｅＩフラグメント、およびＣＭＤ標的化ベクターと相同的に組換えられたｍｕ座からの診断上の７．６ｋｂのバンドを検出する（ｎｅｏ発現カセットがＳｐｅＩ部位を含む）。サザンブロット分析によってスクリーニングされる１１３２ Ｇ４１８およびＦＩＡＵ耐性クローンのうち、３つがｍｕ座において相同な組換えを示す７．６ｋｂのＳｐｅ Ｉバンドを示した。これらの３つのクローンは、さらに酵素ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、およびＥｃｏＲＩで消化されてベクターがｍｕ遺伝子に相同的に一体化されることを確かにする。プローブＡを用いてハイブリダイズされる場合、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩまたはＥｃｏＲＩを用いて消化される野生型ＤＮＡのサザンブロットは、それぞれ１５．７ｋｂ、７．３ｋｂおよび１２．５ｋｂのフラグメントを生成するが、標的化ｍｕ対立遺伝子の存在が、それぞれ７．７ｋｂ、６．６ｋｂおよび１４．３ｋｂのフラグメントによって示される。ＳｐｅＩ消化によって検出される３つ全ての陽性クローンは、ｎｅｏカセットのＣｍｕ１エキソンへの挿入について診断的な期待されるＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、およびＥｃｏＲＩ制限フラグメントを示した。
【０２３９】
（変異ｍｕ遺伝子を保有するマウスの作製）
３つの標的ＥＳクローン（数２６４、２７２および４０８と指定される）を解かし、Ｂｒａｄｌｅｙ（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ（１９８７）ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編）Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ｐ．１１３−１５１）に記載されるようにＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞に注射した。注射された胚盤胞を偽妊娠の雌の子宮に移してインプットＥＳ細胞および宿主胚盤胞から誘導される細胞の混合物を提示するキメラマウスを作製した。キメラに対するＥＳ細胞寄与の程度は、ブラックＣ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドのＥＳ細胞株から誘導されるアゴーチ（ａｇｏｕｔｉ）コート着色の量によって視覚的に推定され得る。クローン２７２および４０８は、低いパーセンテージのキメラのみ（すなわち、低いパーセンテージのアゴーチ色素沈着）を作り出したが、クローン２６４は、高いパーセンテージの雄性キメラを作り出した。これらのキメラは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌で繁殖され、アゴーチの子孫が作製され、ＥＳ細胞ゲノムの生殖細胞系列を示す。標的化ｍｕ遺伝子についてのスクリーニングは、（ＥＳ細胞ＤＮＡの分析について上記されるように）尾部生検からのＢｇｌＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析によって実行された。およそ５０％のアゴーチ子孫は、１５．７ｋｂの野生型のバンドに加えて７．７ｋｂのハイブリダイズしたＢｇｌＩバンドを示し、これは、標的ｍｕ遺伝子の生殖細胞系列移行を示す。
【０２４０】
（ｍｕ遺伝子の機能的不活化についてのトランスジェニックマウスの分析）
ｎｅｏカセットのＣｍｕ１への挿入がＩｇ重鎖遺伝子を不活化したか否かを決定するために、クローン２６４キメラをＪＨＤ変異についてホモ接合のマウスで繁殖させた。このＪＨＤ変異は、ＪＨ遺伝子セグメントの欠失の結果として重鎖発現を不活化する（Ｃｈｅｎら、（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６４７−６５６）。４つのアゴーチ子孫を作製した。血清をこれらの動物から一か月の年齢で得、そしてマウスＩｇＭの存在についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。４つの子孫のうちの２つは、ＩｇＭを完全に欠く（表１）。ＢｇｌＩ消化およびプローブＡ（図１）を用いるハイブリダイゼーションによる尾部生検からのＤＮＡのサザンブロット分析、ならびにＳｔｕＩ消化および４７５ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩフラグメント（同書）による４つの動物の遺伝子型決定は、血清ＩｇＭを発現しない動物が、重鎖座位の一方の対立遺伝子がＪＨＤ変異を保有する動物であり、他方の対立遺伝子がＣｍｕ１変異を保有することを示した。ＪＨＤ変異に対してヘテロ接合型のマウスは、血清Ｉｇの野生型レベルを示す。これらのデータは、Ｃｍｕ１変異がｍｕ遺伝子の発現を不活化することを示す。
【０２４１】
【表１】
Figure 0004093757
（表１）ＣＭＤとＪＨＤの変異の両方を保有するマウス（ＣＭＤ／ＪＨＤ）について、ＪＨＤ変異についてヘテロ接合性型のマウス（＋／ＪＨＤ）について、野生型（１２９Ｓｖ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｆ１マウス（＋／＋）について、およびＪＨＤ変異についてホモ接合型Ｂ細胞不足マウス（ＪＨＤ／ＪＨＤ）についての血清ＩｇＭのレベル（ＥＬＩＳＡによって検出される）。
【０２４２】
（実施例２．ＨＣｏ１２トランスジェニックマウスの作製）
（ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子）
Ｈｃｏ１２導入遺伝子を、ｐＨＣ２（Ｔａｙｌｏｒら、１９９４、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５７９−５９１）の８０ｋｂ挿入物およびｐＶｘ６の２５ｋｂ挿入物の同時注射によって作製した。プラスミドｐＶｘ６は、以下に記載のように構築された。
【０２４３】
８．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント（約２．５ｋｂの５’隣接ゲノム配列および５ｋｂの３’隣接ゲノム配列とともに生殖細胞系列ヒトＶＨ１−１８（ＤＰ−１４）遺伝子を含む）を、プラスミドベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローン化してプラスミドｐ３４３．７．１６を作製した。７ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメント（約５ｋｂの５’隣接ゲノム配列および１ｋｂの３’隣接ゲノム配列とともに生殖細胞系列ヒトＶＨ５−５１（ＤＰ−７３）遺伝子を含む）を、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミドクローニングベクターｐＧＰ１ｆにクローン化（Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）して、プラスミドｐ２５１ｆを作製した。ｐＧＰ１ｆ、ｐＧＰ１ｋ（配列番号１）から誘導される新規なクローニングベクターを、ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩで消化し、そして１０ｋｂ ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント（これは、約４ｋｂの５’隣接ゲノム配列および５ｋｂの３’隣接ゲノム配列とともに生殖細胞系列ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）遺伝子を含む）にライゲートした。得られたプラスミドｐ１１２．２ＲＲ．７を、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、そしてｐ２５１ｆの７ｋｂ精製ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ挿入物とライゲートした。得られたプラスミドｐＶｘ４を、ＸｈｏＩで消化し、そしてｐ３４３．７．１６の８．５ｋｂ ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入物とライゲートした。クローンをＶＨ１−１８遺伝子ともに、他の２つのＶ遺伝子と同じ方向で得た。次いで、このクローン（ｐＶｘ６と指定される）を、ＮｏｔＩで消化し、そして精製された２６ｋｂ挿入物を、ｐＨＣ２の精製された８０ｋｂ ＮｏｔＩ挿入物を１：１のモル比で一緒に、半日（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊ）Ｆ２胚の前核に、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、１９９４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）によって記載されるように同時注入した。Ｖｘ６とＨＣ２の両方からの配列を含むトランスジェニックマウスの３つの独立した系統を、注入された胚から発生したマウスから確立した。これらの系統は、（ＨＣｏ１２）１４８８１、（ＨＣｏ１２）１５０８３および（ＨＣｏ１２）１５０８７と名付けた。次いで、３つの系統のそれぞれを実施例１に記載されるＣＭＤ変異、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７１導入遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１）を含むマウスで繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖座およびカッパ軽鎖座の破壊についてホモ接合型のバックグラウンドでヒト重鎖およびカッパ軽鎖導入遺伝子を発現する。
【０２４４】
（実施例３．ヒトＩｇＧκ抗ヒトＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の生成）
（細胞ベースの抗原）
ヒトＣＴＬＡ−４およびマウスＣＤ３ζ遺伝子由来の配列を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを、架橋合成オリゴヌクレオチドを共に用いて、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅によって構築した。コードされる融合タンパク質は、以下の配列を含む：ｉ．アミノ酸１〜１９０をコードするヒトＣＴＬＡ−４（シグナルペプチド、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインおよびヒトＣＴＬＡ−４の推定膜貫通配列全体を含む）およびｉｉ．マウスＣＤ３ζアミノ酸５２〜カルボキシル末端（Ｗｅｉｓｓｍａｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１０１８−１０２１）。増幅ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。次いで、クローニングしたインサートを、ベクターｐＢＡＢＥ（これは、ピューロマイシン耐性をコードする遺伝子を含む（Ｍｏｒｇａｎｓｔｅｒｎ，ＪＰおよびＬａｎｄ，Ｈ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５８７−９６（１９９０））にサブクローニングし、ｐＢＡＢＥ−ｈｕＣＴＬＡ−４／ＣＤ３ｚを作製した。ｐＢＡＢＥ−ｈｕＣＴＬＡ−４／ＣＤ３ｚを、レトロウイルスパッケージング株ψ−２にトランスフェクトし、そしてピューロマイシン耐性細胞のプールを選択した。これらの細胞を、マウスＴ細胞ハイブリドーマＢＷ５１４７（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−４７）と共に共培養した。共培養の２日後、非接着性のＢＷ５１４７細胞を、取り出しそしてピューロマイシンに対する耐性について選択した。このピューロマイシン耐性細胞のプールを、段階希釈によってサブクローン化し、そしてＦＡＣＳによってヒトＣＴＬＡ−４の表面発現について試験した。細胞表面で高レベルのヒトＣＴＬＡ−４を発現するクローンを選択した。
【０２４５】
（可溶性抗原）
ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを含む組換えＣＴＬＡ−４融合タンパク質を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（カタログ番号３２５−ＣＴ−２００）。細胞外ＣＴＬＡ−４フラグメントを、このＣＴＬＡ−４細胞外ドメインのＣ末端の後ろに位置する第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位での、このＣＴＬＡ−４融合タンパク質のタンパク質分解性切断によって調製した。融合タンパク質を、５０：１の融合タンパク質：第Ｘａ因子の比で第Ｘａ因子を用いて処理し、ＣＴＬＡ−４フラグメントを、プロテインＧ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＭｏｎｏ Ｑ ＨＰＬＣを通して分離した。フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマウスＢ７分子を発現する細胞（ＬｔｋｍＢ７．１：マウスＢ７．１ ｃＤＮＡクローン発現ベクターでトランスフェクトしたマウスＬｔｋ（−）細胞）に対する結合によって、ヒトＣＴＬＡ−４ダイマーの存在について試験した。陽性のフラクションをプールし、ＰＢＳ緩衝液で透析した。
【０２４６】
（トランスジェニックマウス）
２つの異なるマウス系統を使用して、ＣＴＬＡ−４反応性モノクローナル抗体を生成した。系統（（ＣＭＤ）＋＋；（ＪＫＤ）＋＋；（ＨＣｏ７）１１９５２＋／＋＋；（ＫＣｏ５）９２７２＋／＋＋）および系統（（ＣＭＤ）＋＋；（ＪＫＤ）＋＋；（ＨＣｏ１２）１５０８７＋／＋＋；（ＫＣｏ５）９２７２＋／＋＋）。これらの系統の各々は、内因性重鎖（ＣＭＤ）およびκ軽鎖（ＪＫＤ）の遺伝子座の破壊についてホモ接合性である。両系統はまた、ヒトκ軽鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を含み、個々の動物は、インサート＃１１９５２についてヘミ接合またはホモ接合性のいずれかである。この２つの系統は、使用したヒト重鎖トランスジーンにおいて異なる。マウスは、ＨＣｏ７またはＨＣｏ１２トランスジーンのいずれかについて、ヘミ接合性またはホモ接合性である。ＣＭＤ変異は、実施例１において記載する。（ＨＣｏ１２）１５０８７マウスの作製については、実施例２において記載する。ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１−８２０）ならびに（ＫＣｏ５）９２７２（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１）および（ＨＣｏ７）１１９５２マウスは、米国特許第５，７７０，４２９（ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙ、１９９８年６月２３日）に記載される。
【０２４７】
（免疫）
トランスジェニックマウスを、最初に、ＰＢＳ中の１〜３×１０7細胞またはアジュバント（完全ＦｒｅｕｎｄまたはＲｉｂｉのいずれか）中の１０〜５０μｇの可溶性融合タンパク質で、ｉ．ｐ．（腹腔内）免疫した。その後、免疫したマウスを、ＰＢＳ中の１〜３×１０7細胞で２〜４週毎にｉ．ｐ．でブーストした。動物を、２〜５ヶ月の間、プロトコル上で維持した。融合前に、動物を、約１０6細胞または１０〜２０μｇ可溶性抗原（融合タンパク質または融合タンパク質および細胞外フラグメント）で、−３日目および−２日目にｉ．ｖ．（皮下）でブーストした。いくつかの動物にはまた、−４日目に融合タンパク質をｉ．ｖ．で与えた。ＣＴＬＡ−４反応性ＩｇＧκモノクローナル抗体を生じる首尾よい融合が、種々の異なるプロトコル（細胞のみ、可溶性抗原のみ、ならびに、細胞免疫およびその後の融合前の可溶性抗原のｉ．ｖ．供与を含む）によって免疫したマウスから得られた。
【０２４８】
（融合）
脾臓細胞を、標準的な手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｅｎｎｅｎｔｔら、１９８０、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＯｉおよびＨｅｒｔｚｅｎｂｅｒｇ、１９８０、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、３５７−３７２頁、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｈａｌｋ、１９８４、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ編、７６６−７８０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄ、ＦＬ）によって、マウス黒色腫細胞（系統Ｐ３×６３ Ａｇ８．６．５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０またはＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）に融合させた。細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ、ＯＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ｏ−５００３）、ＢＭＥ（Ｇｉｂｃｏ ２１９８５−０２３）、３％ Ｏｒｉｇｅｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｉｇｅｎ Ｉｇ５０−０６１５）、および５％Ｐ３８８ｄ１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ６３））馴化培地中で培養した。ＨＡＴまたはＨＴ補助剤を、最初の増殖および選択の間で培地に添加した。
【０２４９】
（ハイブリドーマスクリーニング）
ヒトＩｇＧκ抗体を分泌するハイブリドーマを同定するために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）を、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−００６−０９８）で、４℃で一晩コートした。プレートを洗浄し、１％ ＢＳＡを含有する１００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでブロックした。５０μｌの細胞培養上清を添加し、１〜２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ−３８１３または＃Ａ−７１６４）に結合体化したヤギ抗κ軽鎖１００μｌ／ウェルと共に、１時間インキュベートした。プレートを、各工程の間で、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。類似のアッセイを、ヒトＣＴＬＡ−４と反応性のヒト抗体を分泌するハイブリドーマを同定するために使用した。このアッセイは、ＥＬＩＳＡプレートを、ヤギ抗ヒトＦｃγ抗体の代わりに組換えＣＴＬＡ−４融合タンパク質でコートしたことを除いて同じであった。
【０２５０】
（モノクローナル抗体の特徴付け）
ヒトＣＴＬＡ−４に結合するヒトＩｇＧκを分泌することがＥＬＩＳＡによって示された７２個のハイブリドーマを、サブクローン化した。これらのサブクローンのうちの４７個を、その分泌ヒト抗体がＣＴＬＡ−４発現細胞に結合するか否か、およびその抗体がＢ７を発現する細胞への可溶性ＣＴＬＡ−４の結合を阻害するか否かを決定するために試験した。結合を、フローサイトメトリーによって決定した。阻害を測定するために、５０μｌの各上清を、１０5ＬｔｋｍＢ７．１細胞および２５ｎｇの組換えＣＴＬＡ−４融合タンパク質と共にインキュベートした。次いで、平均チャネル蛍光を、フローサイトメトリーによって決定した。図２は、Ｂ７．１を発現する細胞への可溶性ＣＴＬＡ−４の結合の阻害を示す。組換えヒトＣＴＬＡ−４融合タンパク質で染色されたＬｔｋｍＢ７．１細胞の平均チャネル蛍光（ＭＣＦ）を、ハイブリドーマ上清の存在下で決定した。ブロッキング抗体を分泌するハイブリドーマは、低いＭＣＦ値を生じる。ＢＮＩ３．１（Ｃａｔ＃３４５８０Ｄ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７結合をブロックする、ポジティブコントロールマウスモノクローナル抗体として使用した。
【０２５１】
約４０％のハイブリドーマが、Ｂ７リガンドへのＣＴＬＡ−４結合を強力に阻害するようである。
【０２５２】
次いで、クローン１０Ｄ１．３、４Ｂ６．１２および１１Ｅ８由来の抗体を、ＢＩＡコア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によってアッセイし、結合速度論を決定した。精製組換えＣＴＬＡ−４細胞外フラグメントを、ＣＭ５センサーチップ＠１２００ＲＵに結合させた。結合を、０．２５、０．５、１、２．５および５μｇ／ｍｌの濃度で、５μｌ／分の流速で抗体を添加することによって測定した。結合曲線を、ＢＩＡ評価ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに当てはめた。抗体を、プロテイン−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって精製した。決定した結合速度（ｏｎ ｒａｔｅ）および解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）を、表２に示す：
【０２５３】
【表２】
Figure 0004093757
表２．表面上に固定した組換えＣＴＬＡ−４に対するヒトＩｇＧκ抗体の結合速度論。
【０２５４】
１０個の異なるヒトＩｇＧκ抗ヒトＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（３Ａ４、９Ａ５、２Ｅ２、２Ｅ７、４Ｂ６、４Ｅ１０、５Ｃ４、５Ｇ１、１１Ｅ８および１１Ｇ１）の段階希釈を、組換えＣＴＬＡ−４融合タンパク質をコートしたマイクロタイターウェルに添加した。２時間のインキュベーション後、ビオチン化抗体１１Ｅ８を、０．１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに添加した。サンプルを、３０分間インキュベートし、洗浄し、そして結合抗体を、アルカリホスファターゼ／ストレプトアビジン結合体で検出した。力価を表３に示す。抗体１１Ｅ８の結合は、それ自体およびこれらの他のヒト抗体のうちの７個によってブロックされた。しかし、結合は、抗体３Ａ４によっても９Ａ５によってもブロックされなかった。相互結合実験は、１１Ｅ８結合が、ＣＴＬＡ−４への３Ａ４および９Ａ５の結合のいずれの結合もブロックしないことを示した。
【０２５５】
（ＤＮＡ配列）
ＲＮＡを、約２×１０6細胞の各サブクローン化したハイブリドーマ細胞系統から抽出し、そしてＩｎｂｉｔｒｏｇｅｎ製の試薬およびプロトコル（Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋおよびｃＤＮＡ Ｃｙｃｌｅ：Ｃａｔ．＃Ｌ１３１０−０１および＃Ｋ１５２０−０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを合成するために使用した。ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖Ｖ領域のフラグメントを、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、縮重ＦＲ１プライマーおよび固有の定常領域プライマーを使用して増幅した。得られたＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングし、そしてそのインサートの配列を決定した。ハイブリドーマ１０Ｄ１．３の重鎖および軽鎖フラグメントの先行の配列を、図４に示す。ハイブリドーマ１０Ｄ１．３の重鎖および軽鎖フラグメントについて決定した配列を、図５〜図８に示す。
【０２５６】
表３．ＭＡｂ １０Ｄ１、４Ｂ６および１Ｅ２についての軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列
【０２５７】
【表３】
Figure 0004093757
（実施例４．インタクトな抗体を発現するための部分抗体配列の使用）
抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と優先的に相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用を担っているので、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である。これは、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列にグラフティングされた（Ｇｒａｆｔｅｄ）、その特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む、発現ベクターを構築することによる（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１；５２２−５２５）。このようなフレームワーク配列は、生殖系列の抗体遺伝子配列を含む、公のＤＮＡデータベースから得られ得る。これらの生殖系列配列は、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。なぜなら、これらは、完全にアセンブルされた可変遺伝子を含まず、これらの完全にアセンブルされた遺伝子は、Ｂ細胞成熟の間のＶ（Ｄ）Ｊ連結によって形成されるからである。生殖系列遺伝子配列はまた、体細胞性の変異に起因して、高い親和性の二次レパートリー抗体の配列とは、個々のヌクレオチドで異なる。しかし、体細胞性変異は、可変領域にわたって均等に分布されない。例えば、体細胞性変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分においては、比較的低頻度である。さらに、多くの体細胞性変異は、抗体の結合特性を有意に変更しない。この理由から、元々の抗体の結合特性に類似する結合特性を有するインタクトな組換え抗体を再現（ｒｅｃｒｅａｔｅ）するために、特定の抗体の全体のＤＮＡ配列を得ることは必要ではない（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５５３５（１９９９年３月１２日出願）（これは、全ての目的のために本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。代表的には、ＣＤＲ領域にわたる部分的な重鎖および軽鎖配列が、この目的に十分である。この部分配列を使用して、どの生殖系列の可変遺伝子セグメントおよび接合遺伝子セグメントが、組換え抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次いで、生殖系列配列を使用して、可変領域の欠失部分を充填する。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の特性に寄与しない。この理由のため、発現構築物のための対応する生殖系列リーダー配列を使用する必要はない。欠失している配列を加えるために、クローニングしたｃＤＮＡ配列を、連結またはＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドを結合し得る。あるいは、可変領域全体を、短い重複オリゴヌクレオチドのセットとして合成し得、そしてＰＣＲ増幅によって結合し、合成可変領域クローン全体を作製し得る。このプロセスは、特定の制限部位の排除または組み込み、あるいは特定のコドンの最適化のような、特定の利点を有する。
【０２５８】
ハイブリドーマ由来の重鎖転写産物および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列が、天然の配列と同一のアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を作製するために、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを消化するために使用される。合成重鎖配列およびκ軽鎖配列は、３つの様式で、天然の配列とは異なり得：反復されたヌクレオチド塩基のストリングが、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を容易にするために中断され；最適な翻訳開始部位が、コザックの法則に従って取り込まれ（Ｋｏｚａｋ、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、１９８６７−１９８７０）；そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位は、翻訳開始部位の操作された上流である。
【０２５９】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコーディング鎖配列、および対応する非コーディング鎖配列が、３０〜５０個のヌクレオチドセグメントに破壊され、その結果、コーディング鎖配列に関するヌクレオチド間の破壊は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのおよその中心点で生じる。従って、各鎖について、オリゴヌクレオチドは、所望の配列に完全にかかる重複した２本鎖のセットに集められ得る。これらのオリゴヌクレオチドは、１５０〜４００個のヌクレオチドセグメントにおよぶプールに組み合わされる。次いで、このプールは、１５０〜４００個のヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を産生するための鋳型として使用される。代表的に、単一の可変領域オリゴヌクレオチドセットが、２個の重複したＰＣＲ産物を生成するために、別個に増幅される２つのプールに分けられる。次いで、これらの重複産物が、ＰＣＲ増幅により組み合わされ、完全な可変領域を形成する。発現ベクター構築物に容易にクローン化され得るフラグメントを生成するために、ＰＣＲ増幅において、重鎖定常領域または軽鎖定常領域（κ軽鎖のＢｂｓＩ部位、またはγ重鎖の場合、ＡｇｅＩ部位を含む）の重複フラグメントを含むこともまた、所望され得る。
【０２６０】
次いで、再構築された重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、クローン化されたプロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域３’未翻訳配列、ポリアデニル化配列、および転写終結配列と組み合わされ、発現ベクター構築物を形成する。重鎖発現構築物および軽鎖発現構築物が、単一のベクターに組み合わされ得るか、両方の鎖を発現している宿主細胞を形成するために次いで融合される宿主細胞に同時感染され得るか、連続感染され得るか、または別個にトランスフェクトされ得る。
【０２６１】
ヒトＩｇＧｋに関する発現ベクターの構築における使用のためのプラスミドが、以下に記載される。このプラスミドが構築され、その結果、ＰＣＲ増幅されたＶ重鎖ｃＤＮＡ配列およびＶκ軽鎖ｃＤＮＡ配列が、完全な重鎖ミニ遺伝子および軽鎖ミニ遺伝子を再構築するために使用され得る。これらのプラスミドが、完全なヒト、またはキメラの、ＩｇＧ１ｋ抗体またはＩｇＧ４ｋ抗体を発現するために使用され得る。同様のプラスミドが、他の重鎖アイソタイプの発現のため、またはλ軽鎖を含む抗体の発現のために構築され得る。
【０２６２】
κ軽鎖プラスミド、ｐＣＫ７−９６（配列番号４０）が、κ定常領域およびポリアデニル化部位を含み、その結果、開始メチオニンのＨｉｎｄＩＩＩ部位上流を含む５’プライマーを用いて増幅されたκ配列が、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｂｓＩを用いて消化され、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｂｓＩを用いて消化されるｐＣＫ７−９６中にクローン化され、ポリアデニル化部位と共に完全な軽鎖コード配列を再構築し得る。このカセットは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして単離され得、そして細胞へのトランスフェクションの機能的ミニ遺伝子を作製さるために転写プロモーター配列に連結され得る。
【０２６３】
γ１重鎖プラスミド（ｐＣＧ７−９６）（配列番号４１）が、ヒトγ定常領域およびポリアデニル化部位を含み、その結果、開始メチオニンのＨｉｎｄＩＩＩ部位上流を含む５’プライマーを用いて増幅されるγ配列が、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩを用いて消化され、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩを用いて消化されたｐＣＧ７−９６にクローン化され、ポリアデニル化部位と共に、完全なγ１重鎖コード配列を再構築する。このカセットは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離され、そして転写プロモーター配列に連結され、細胞へのトランスフェクションに関する機能的ミニ遺伝子を作製し得る。
【０２６４】
γ４重鎖プラスミド、ｐＧ４ＨＥ（配列番号４２）は、ヒトγ４定常領域およびポリアデニル化部位を含み、その結果、開始メチオニンのＨｉｎｄＩＩＩ部位上流を含む５’プライマーを用いて増幅されるγ配列が、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩを用いて消化され得、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩを用いて消化されたｐＧ４ＨＥにクローン化され、ポリアデニル化部位と共に、完全なγ４重鎖コード配列を再構築し得る。このカセットは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離され、そして転写プロモーター配列に連結され、細胞へのトランスフェクションのために、機能的なミニ遺伝子を作製し得る。
【０２６５】
多数の異なるプロモーター（ＣＭＶ、ユビキチン、ＳＲα、およびβアクチンを含む）が、再構築された重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現するために使用され得る。例えば、ベクターｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）が、上記のκ、γ１、またはγ４カセットのいずれかを用いた連結のために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、またはＥｃｏＲＩのいずれかを用いて切断され、哺乳動物細胞に直接トランスフェクトされ得る発現ベクターを形成し得る。
【０２６６】
（実施例５．ＣＴＬＡ−４への１０Ｄ．１結合）
（Ａ．精製された組み換えヒトＣＴＬＡ−４への結合）
精製された組み換えヒトＣＴＬＡ−４への１０Ｄ１の結合が、標準的な方法および手順を使用してＥＬＩＳＡにより示された（図９および図１０）。精製されたＣＴＬＡ−４でコーティングされたマイクロタイタープレートが、１０Ｄ１の濃度を変化させてインキュベートされ、次いで、アルカリホスファターゼに結合体化されヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2を用いて開発された。このデータは、４−パラメーター曲線に十分に一致する用量依存性結合を示す（相関係数は、−１．０である）。１５ｎｇ／ｍｌでの最大の半分の結合が、ＣＴＬＡ−４への１０Ｄ１の高い結合能力に反映する。結合の飽和が、約０．１μｇ／ｍｌで観察された。
【０２６７】
（Ｂ．Ｔ細胞の血漿膜上で発現されたＣＴＬＡ−４への１０Ｄ．１結合）
Ｔ細胞の血漿膜上で発現されるＣＴＬＡ−４への１０Ｄ１の結合を示すために、フローサイトメトリーアッセイから図１０において結果が示された。フローサイトメトリーアッセイが、抗レベルのヒトＣＴＬＡ−４を発現するためにトランスフェクトされたＴ細胞株を用いて使用された。フルオレセインで標識された１０Ｄ１（１０Ｄ１−ＦＩＴＣ）の濃度の変更が、５８αβＣＴＬＡ−４細胞と共にインキュベートされた。蛍光を結合された細胞が、フローサイトメトリーにより決定された。精製されたＣＴＬＡ４と共に見られるように、１０Ｄ１は、４−パラメーター平衡に十分に一致した用量依存性の様式でＣＴＬＡ４発現細胞に結合した（相関係数は、−９９９である）。最大の半分の結合は、１９０ｎｇ／ｍｌであり、そして飽和は、２μｇ／ｍｌで達成された。１０Ｄ１は、試験された任意のＣＴＬＡ−４陰性細胞株（ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４およびＭＣＦ１０Ａ乳癌上皮腫瘍およびＬ５４０ホジキン腫瘍細胞を含む）に結合しなかったか、またはマウスＣＴＬＡ−４を発現している細胞に結合しなかった。これらのデータは、ヒトＣＴＬＡに対する１０Ｄ１の特異性を示す。しかし、１０Ｄ１は、アカゲザルＣＴＬＡ−４と交差反応することが示された（以下を参照のこと）。
【０２６８】
（Ｃ．正常なヒト組織との１０Ｄ１の交差反応性）
この研究において、試験材料（ａｒｔｉｃｌｅ）（１０Ｄ１−ＦＩＴＣ）のフルオレセイン標識された形態が、結合を評価するために使用された。この研究の目的は、正常なヒト組織の凍結切片（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）を用いて、１０Ｄ１−ＦＩＴＣの潜在的な交差反応性を評価することであった。予期しない交差反応性は、観察されなかった。
【０２６９】
研究が、食品医薬品局優良実験室規範（ＧＬＰ）規則（２１ ＣＦＲパート５８）に従って行われた。ヒト組織パネルが、ＥＣ ＣＰＭＰガイドラインＩＩＩ／５２７１／９４のＡｎｎｅｘ ＩＩ「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」における「交差反応性の免疫組織化学的調査のために使用されるヒト組織の提案されるリスト」上の全ての組織、および１９９７ ＵＳ ＦＤＡ／ＣＢＥＲ「Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ」において推薦される全ての組織を含んだ。
【０２７０】
間接的な免疫ペルオキシダーゼ方法を使用して、１０Ｄ１−ＦＩＴＣは、陽性コントロール、ヒトＣＴＬＡ４発現細胞、５８αβＣＴＬＡ４ＣＤ３ζ細胞ならびにヒト扁桃腺において陽性コントロールリンパ球を特異的に染色した。１０Ｄ１−ＦＩＴＣ反応性が、強度に対して緩和され、そして抗体の２つの濃度が、調べられた（１０μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌ）。陽性コントロール５８αβＣＴＬＡ４ＣＤζおよび陽性コントロールヒト扁桃腺リンパ球の両方において、１０Ｄ１−ＦＩＴＣは、膜および膜の直下の細胞質において別々の丸い顆粒を染色した。反応性は、臨時の小胞リンパ球、小胞内リンパ球、および上皮下のリンパ球を用いて観察された。全ての扁桃腺リンパ球の１〜２％未満が、１０Ｄ１−ＦＩＴＣと反応性であった。
【０２７１】
１０Ｄ１−ＦＩＴＣは、陰性コントロールヒト脳（小脳）と反応しなかった。アイソタイプ一致の陰性コントロール抗体（ＨｕｌｇＧ１−ｋ−ＦＩＴＣ）は、陽性コントロールヒトＣＴＬＡ４−発現５８αβＣＴＬＡ４ＣＤ３ζまたはヒト扁桃性のいずれかに特異的に結合しなかったか；または陰性コントロールヒト脳（小脳）に特異的に結合しなかった。
【０２７２】
交差反応性を決定するために、１０Ｄ１−ＦＩＴＣが、２つの濃度（１０μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌ）で正常なヒト組織のパネルに適用された。特異的な１０Ｄ１−ＦＩＴＣ反応性は、扁桃腺（３／３ドナー）、結腸における粘膜下リンパ節（胃腸管−結腸［３／３ドナー］）、および血液スミア（２／３ドナー）におけるリンパ球について観察された。
【０２７３】
免疫反応性細胞は、代表的な形態学（大核を有する丸い分子細胞：細胞質比および乏しい細胞質、樹状プロセスの欠如、直径が１０〜１５μｍ）および組織内の位置（例えば、リンパ球組織内の代表的な位置）に基づいて、リンパ球として同定された。全ての３人のドナー由来の扁桃腺（試験組織）において、リンパ球、１０Ｄ１−ＦＩＴＣは、膜においておよび膜の直下の細胞質において別々の丸い顆粒を特異的に染色した。反応性は、臨時の小胞リンパ球、小胞内リンパ球、および上皮下のリンパ球を用いて観察される。全ての扁桃腺リンパ球の１〜２％未満が、１０Ｄ１−ＦＩＴＣと反応性であった。
【０２７４】
調べられた１／３のドナーにおいて、１０Ｄ１−ＦＩＴＣもまた、結腸における粘膜下のリンパ節（胃腸管−結腸［大腸］）に位置する臨時の小胞リンパ球および小胞内リンパ球において、別々の顆粒を特異的に染色した。再び、別々の膜顆粒が、染色された。
【０２７５】
調べられた３個体のドナーのうち２個体由来の末梢血スメアにおいて、１０Ｄ１−ＦＩＴＣが、希なリンパ球の膜と結合する直径約１μｍの別々の顆粒を特異的に染色した。この顆粒は、環または曲がったパターンで配置された。全ての末梢血白血球の１〜２％未満が、１０Ｄ１−ＦＩＴＣと反応性であった。
【０２７６】
（表４ 正常ヒト組織とのＭＡｂ １０Ｄ１の交差反応性）
【０２７７】
【表４】
Figure 0004093757
Figure 0004093757
（Ｄ．マカクＣＴＬＡ−４との１０Ｄ．１の特異的反応性）
高レベルでマカクＣＴＬＡ−４を発現するように形質転換したＴ細胞を用いて、マカクＣＴＬＡ−４との特異的反応性を実証した（表５）。これらのデータは、１０Ｄ１についてのＣＴＬＡ−４エピトープが、マカクとヒトとの間で保存されており、従ってマカクは、抗ＣＴＬＡ４ ＨｕＭＡｂ １０Ｄ１のインビボ安全性を評価するのに良好なモデルであることを示唆する。
【０２７８】
【表５】
Figure 0004093757
ＭＡｂ １０ＤＩ（１０μｇ／ｍｌ）を、種々の種由来の組換えＣＴＬＡ−４を発現する細胞株とともにインキュベートし、そしてＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧによって検出した。細胞に関した蛍光をＦＡＣＳｃａｎによって決定し、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した。これらのデータは、ＭＡｂ １０Ｄ１がマカクおよびヒトＣＴＬＡ−４と十分に反応するが、マウスＣＴＬＡ−４とは反応しないことを示す。
【０２７９】
（実施例６．ＣＴＬＡ−４がＢ７リガンドに結合することの１０Ｄ１によるブロック）
ＣＴＬＡ−４に対する１０Ｄ１の結合がＣＴＬＡ−４とＣＴＬＡ−４リガンド（Ｂ７．１およびＢ７．２）の相互作用をブロックすることを示すため、フローサイトメトリーによって競合アッセイを実施した（図１１および図１２）。図１１に示すように、ＦＩＴＣ標識ヒトＢ７．２−Ｉｇ融合タンパク質を５８αβＣＴＬＡ４ Ｔ細胞および種々の濃度の１０Ｄ１ ＭＡｂとともにインキュベートした。図１２において、ＦＩＴＣ標識ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質をマウス Ｂ７．１形質転換細胞および種々の濃度の１０Ｄ１ ＭＡｂとともにインキュベートした。
【０２８０】
この競合アッセイは、１０Ｄ１が、低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＣＴＬＡ４−Ｂ７相互作用を効率的に阻害する能力を実証する。効果的な濃度は、かなり低い濃度のＣＴＬＡ−４およびＢ７分子を有する生理学的な条件下では、生じる可能性がかなり低い。ＥＬＩＳＡアッセイにおいてビオチン化試薬を用いて、同様のデータを得た。
【０２８１】
これらのインビトロ研究によりＭＡｂ １０Ｄ１が高い親和性および特異性でヒトＣＴＬＡ−４に結合すること、ならびに１０Ｄ１の結合が、Ｂ７同時刺激分子とＣＴＬＡ−４との間の相互作用を排除することが実証される。１０Ｄ１についてのこれらのデータは、マウス腫瘍モデルにおいて有効性を示した抗マウスＣＴＬＡ−４抗体についてのインビトロ活性プロフィールと一致する。
【０２８２】
（実施例６．１０Ｄ．１のエピトープマッピング）
ビオチン標識抗体および非標識抗体を用いて競合的ＥＬＩＳＡを実施し、ＣＴＬＡ−４エピトープ特異性を決定した。４つの抗ＣＴＬＡ−４エピトープ結合基をヒト抗体の間で同定し、そして市販のマウスモノクローナル抗体ＢＮ１３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）および８Ｈ５（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐ．Ｂａｙｐｏｒｔ，Ｍｎ）によってさらなる２つのエピトープを規定した。図３および１３Ａ〜１３Ｇは、ＣＴＬＡ−４に対する結合について抗体の間の示差的競合を実証する競合的結合アッセイの結果を示す。これらの結果を表６にまとめる。
【０２８３】
抗ＣＴＬＡ−４エピトープ結合基４ａおよび４ｂにおける抗体は、類似の結合特性を有し、そしてさらに細胞表面で発現されたＢ７．１に対するＣＴＬＡ−４−Ｉｇ結合の強力なブロッカーである（表６）。例えば、図３は、ビオチン標識１１Ｅ８抗体および１０の非標識抗体（３Ａ４、９Ａ５，２Ｅ２，２Ｅ７、４Ｂ６、４Ｅ１０、５Ｃ４、５Ｇ１、１１Ｅ８および１１Ｇ１）での結果を示す。抗体１１Ｅ８結合は、それ自体、ならびにエピトープ基４ａおよび４ｂにおける他のヒト抗体のうち７つでブロックされる。しかし、１１Ｅ８の結合は、抗体３Ａ４または９Ａ５（エピトープ基１および２）によってはブロックされない。相互の結合実験は、１１Ｅ８結合がＣＴＬＡ−４に対する９Ａ５または３Ａ４結合のいずれかをブロックしないことを示した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。エピトープ基４ａ抗体１０Ｄ１およびマウス抗体１４７について同様の結果が示される（図１３Ｄおよび１３Ｆ）。エピトープ基４ｂにおける抗体（図１３Ｅ）は、エピトープ４ｂ抗体が、相互の結合実験においてエピトープ基２抗体と競合する（図１３Ｂ）こと以外は、基４ａ抗体と同様である。エピトープ基３、４ａおよび４ｂに属するヒト抗体は、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７．１結合の効果的なブロッカーである（図３および表６）。
【０２８４】
【表６】
Figure 0004093757
（実施例７．１０Ｄ１は、ヒト活性化Ｔ細胞に結合する）
１０Ｄ１抗体が正常ヒトＴ細胞により発現されるＣＴＬＡ−４に結合する能力を、得られたそして活性化されたＴ細胞のフローサイトメトリー分析により試験した（図１４）。２×１０6／ｍｌの新鮮単離したヒト末梢血単球細胞を、２μｇ／ｍｌのＴ細胞窒素、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）の存在下または非存在下でインキュベートした。４日間のインキュベーション後、細胞を洗浄して、以下の抗体で染色した：１）抗体なし；２）ＨｕＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、ヒトＩｇＧ１および抗ＥＧＦレセプター抗体；３）１０Ｄ１−ＦＩＴＣ、ヒトＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ−４抗体；ならびに４）１４７−ＦＩＴＣ−マウス抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体。１時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、そしてウサギ抗ＦＩＴＣ ＩｇＧ、続いて、ヤギ抗ウサギ−ＰＥを用いて染色した。前方散乱対側方散乱によってゲートしたリンパ球上で分析を実施した。図１４に示されるように、休止しているリンパ球は、１０Ｄ１抗体に結合せず、一方、ＰＨＡ−活性化Ｔ細胞は、細胞表面で低レベルのＣＴＬＡ−４を発現する。
【０２８５】
（実施例８．１０Ｄ１は、活性化Ｔ細胞の補体依存性または抗体依存性の溶解を媒介しない）
ＭＡｂ １０Ｄ１が、ＣＴＬＡ−４発現細胞の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣＣ）または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を検討した。
【０２８６】
ＣＤＣＣ実験のために、補体の供給源としてウサギ血清を用いて、ＣＤＣＣについての至適条件を提供する。ウサギ補体は、ヒト補体よりもヒトＩｇＧ1でのＣＤＣＣ媒介においてより有効であることが示された（Ｊｕｒｉａｎｚ，Ｍａｓｌａｋら、１９９９）。ＰＨＡ刺激Ｔ細胞を、51Ｃｒで標識し、そして補体の供給源として、ウサギ血清とともに、またはウサギ血清なしで、種々の濃度の抗ＣＴＬＡ４ ＭＡｂ １０Ｄ１または抗ＣＤ３ ＭＡｂとともにインキュベートした。１時間のインキュベーション後、死亡する細胞によって放出された51Ｃｒを、γカウンターを用いて決定した。２％ＳＤＳでインキュベートした標的細胞を１００％の溶解コントロールとして使用した。抗ＣＴＬＡ−４ ＭＡｂ １０Ｄ１は、活性化Ｔ細胞のＣＤＣＣを媒介しなかった（図１５）。同じ条件下で、マウスＩｇＧ２、抗ＣＤ３ ＭＡｂは、有意なＣＤＣＣを導いた。マウスＩｇＧ２aおよびヒトＩｇＧ１の両方とも、ウサギ補体を効率的に固定する；従ってこれらの差異は、おそらく、活性化されたＴ細胞上でＣＤ３に比較して大きく低下したＣＴＬＡ−４の発現を反映する。
【０２８７】
同様に、エフェクター細胞として自系の単核細胞を用いて、ＭＡｂ １０Ｄ１についてＡＤＣＣ活性は観察されなかった（図１６）。ＰＨＡ刺激Ｔ細胞を51Ｃｒを用いて標識し、そして種々の濃度の抗ＣＴＬＡ４ ＭＡｂ １０Ｄ１または抗ＣＤ３ ＭＡｂ、および新鮮な自系の単核細胞とともにインキュベートした。エフェクター細胞対標的細胞の比は１００：１であった。４時間のインキュベーション後、死亡する細胞によって放出された51Ｃｒを、γカウンターを用いて決定した。２％ＳＤＳでインキュベートした標的細胞を１００％の溶解コントロールとして使用した。抗ＣＤ３ ＭＡｂはマウスＩｇＧ２a（ヒトエフェクター細胞でＡＤＣＣを効率的に媒介し得る）であるが、低レベルのＡＤＣＣしか観察されなかった。これらのデータは、効率的なＡＤＣＣについて標的細胞の表面上で必要な高レベルの抗原発現と一致する。ＭＡｂ １０Ｄ１は、一般に、ヒトＩｇＧ１であり、アイソタイプは、ＣＤＣＣおよびＡＤＣＣを媒介し得るので、これらの活性化の欠失は、活性化Ｔ細胞上の非常に低レベルのＣＴＬＡ−４発現に起因する可能性が高い。さらに、霊長類での毒性研究において活性化されたＴ細胞の数の増加が観察され（以下参照）、これは、インビボでのＭＡｂ １０Ｄ１による活性化Ｔ細胞のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣＣ活性の欠失と一致する。
【０２８８】
（実施例９．カニクイザルにおける１０Ｄ１の前臨床毒性試験）
１０Ｄ１抗体およびマカクの２つの独立した毒性学的研究を実施した。全８匹のサルを分析した。重大な臨床的、免疫毒性学的、または組織病理学的知見なしに、４匹のサル（雄性２匹および雌性２匹）は、３回ボーラスのｉ．ｖ．用量の３ｍｇ／Ｋｇのヒト抗ＣＴＬＡ４に耐え、そして４匹のサル（雄性２匹および雌性２匹）は、３回ボーラスｉ．ｖ．用量の１０ｍｇ／Ｋｇのヒト抗ＣＴＬＡ４に耐えた。
【０２８９】
（Ａ．１０Ｄ１の霊長類毒性学研究（３．０ｍｇ／Ｋｇ））
インビボで１０Ｄ１の効果を検討するため、霊長類の毒性研究を２匹のマカクを用いて実施した。ＭＡｂ １０Ｄ１の複数用量の毒性研究において、この抗体をマカクの静脈注射によって投与した。この研究の目的は、ある用量を与えた２匹のサルにおけるＭＡｂ １０ＤＩの耐性、およびマウス腫瘍後退モデルにおける有効な処置と適合可能なスケジュール、およびヒト臨床試験における推奨用量を決定することであった。２匹の雌性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｉｌａｒｉｓ）を、１、４および７日目の、３回の静脈ボーラス用量の３．０ｍｇ／Ｋｇ １０Ｄ１で処置して、これらの動物における安全性およびＴ細胞活性化を評価した。初回の用量の投与後、１４日までの有害反応、体重低下／上昇、ならびに疾病率および死亡率のいずれかについて、これらの動物を観察した。最終用量の７日後に、この動物を屠殺して、剖検し、その器官を個々に検討した。血液サンプルを、フローサイトメトリーによるＴ細胞集団および活性マーカーの発現の試験のために、各用量の前および剖検の前に収集した。血漿をまた血液サンプルから収集し、ＥＬＩＳＡによって１０Ｄ１抗体レベルおよび抗１０Ｄ１抗体応答を決定した。
【０２９０】
この動物は、処置経過の間、なんの臨床的症状もなしに抗体１０Ｄ１の３回用量を耐えた。これらの動物の体重は、有意に変化しなかった。いずれの動物での剖検についても試験された４７の器官／組織でひどい知見は証明されなかった。
【０２９１】
組織病理学研究を、Ｒｅｄｆｉｅｌｄ研究所（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ，ＡＲ）で行った。これらの研究の結果は、ＭＡｂ １０Ｄ１の複数の投薬は、試験されたいずれの器官および組織においても、急性毒性を生成しなかったことを示した。
【０２９２】
薬物動態学的分析は、両方のサルの血漿中の有意なレベル（９７．３μｇ／ｍｌまで）の１０Ｄ１ ＭＡｂの存在を示した（表７を参照のこと）。１０Ｄ１の血漿レベルは、フローサイトメトリーおよび５８αβＣＴＬＡ−４ Ｔ細胞を使用して、ＦＩＴＣ−１０Ｄ１との競合アッセイによって決定した。
【０２９３】
【表７】
Figure 0004093757
抗１０Ｄ１抗体応答の評価は、ＥＬＩＳＡによって行った。有意な抗１０Ｄ１応答は、この研究の経過中、いずれの動物においても観察されなかった（図１７）。マイクロタイタープレートを、１０Ｄ１ ＭＡｂ（ＩｇＭアッセイ用）または１０Ｄ１ Ｆ（ａｂ’）2（ＩｇＧアッセイ用）でコーティングした。様々な時点の結晶サンプルの希釈物を、このプレートを用いてインキュベートし、そして抗１０Ｄ１抗体を、抗ＩｇＭまたはＩｇＧ Ｆｃ特異的アルカリ性ホスファターゼ試薬を使用して検出した。ＩｇＭ抗１０Ｄ１抗体は、１４日目までに発生したようであるが、力価は非常に低い。これらのデータは、これらのサルが抗体の３回の投薬の後の抗１０Ｄ１抗体応答を発生しなかったことを示した。
【０２９４】
これらのデータは、これらの動物が、この研究の経過の間、ＭＡｂ １０Ｄ１に対する有意な抗体応答を発生しなかったことを示す。
【０２９５】
免疫毒物学を、この研究の経過の間、リンパ球集団のフローサイトメトリー分析によって研究した。試験されたリンパ球サブセットは、全Ｔ細胞に対するマーカーとしてＣＤ３を含み、全Ｂ細胞に対するマーカーとしてＣＤ２０を含んだ。Ｔ細胞は、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞マーカー）およびＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞マーカー）の発現のため、ならびに活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ６９、およびＨＬＡ−ＤＲのためにさらに細分化された。Ｔ細胞集団または活性化マーカーの発現の著しい変化は見られなかった。その結果を以下の表８にまとめる。
【０２９６】
【表８】
Figure 0004093757
ヘパリン化した血液サンプルを、ＦＩＴＣまたはＰＥ標識した抗リンパ球試薬を使用してフローサイトメトリーによって分析した。％ＣＤ３および％ＣＤ２０は、リンパ球ゲートに基づく。さらなるＴ細胞マーカーおよび活性化マーカーは全てＣＤ３陽性細胞に基づく。これらのデータは、ＭＡｂ １０Ｄ１がＢ細胞およびＴ細胞集団、またはＴ細胞活性化マーカーに対して有意な効果を有さないことを示す。
【０２９７】
（Ｂ．１０Ｄ１ 霊長類毒物学研究（３．０ｍｇ／Ｋｇおよび１０．０ｍｇ／Ｋｇ）
６匹のカニクイザル（４匹の雄および２匹の雌）（実験的に処理され、この研究の開始時の体重は２．４〜３．８ｋｇであった）を、以下の表９に示されるような処置群に割りあてた。
【０２９８】
【表９】
Figure 0004093757
各動物に、１週間の間３日ごとの静脈内注射（すなわち「スロープッシュ」ボーラス注射）によってヒト抗ＣＴＬＡ４（５ｍｇ／ｍｌの濃度）の用量を投与した。詳細な臨床観察は、一日に少なくとも２回行い（「ケージサイド観察」）、そして徹底的な物理試験を、この研究の前および１２日目に各動物に行った。体重を週毎（研究前、７日目および１４日目）に測定し、そして検眼鏡検査試験を、研究前および１２日目に全ての動物について行った。血漿化学、血液学および凝固パラメーターの評価のための血液サンプルを、研究前および１４日目に全ての動物から収集した。選択した血液学的パラメーターのためのさらなるサンプル（全血細胞および白血球分画細胞のみ）を、各投薬日（１、４および７日目）に、投薬する前に収集した。標準尿検査のための尿サンプルを、投薬前および１３日目に、特別に設計されたケージパンからのドレナージによって得た。血液サンプルをまた、各投薬（１、４および７日目）、および終了前（１４日目）に、Ｍｅｄａｒｅｘによって行われる様々な分析のために回収した。これらは、試験物濃度の分析物（薬物動態学）、試験物に対する抗体の存在の決定、およびフローサイトメトリー分析を含んだ。全ての動物を１４日目に安楽死させ、この時点において、完全肉眼的検死を行い、主な器官を計量し、そして組織の標準完全セットを各動物から回収し、そして光顕微鏡によって試験のために処理した。
【０２９９】
３日ごとに、合計３回の用量で３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルのヒト抗ＣＴＬＡ４を静脈内投与することは、カニクイザルによる非常に良好な耐性を示した。ケージサイド観察および物理試験の毒性の臨床的徴候はなく、そして体重、肉眼試験検査、臨床病理学パラメーター、肉眼検死検査、器官重量または組織形態学に対する影響はなかった。
【０３００】
血漿サンプル中の試験物濃度の分析の結果（すなわち、４および７日目の投薬前、ならびに１４日目の検死の前に得たサンプルにおいて測定されたトラフレベル）は、試験物に対する用量依存性暴露を示した。７日目に、投薬前の平均濃度は、３ｍｇ／ｋｇ用量の群、および１０ｍｇ／ｋｇ用量の群についてそれぞれ、約８４μｇ／ｍｌおよび２４０μｇ／ｍｌであった。
【０３０１】
サルにおける３日ごとの投薬スケジュールの血漿中への試験物の蓄積の可能性を、４日目と７日目との間のトラフレベルの差（すなわち、７日目の平均濃度はは、４日目のものの約２倍高かった）、ならびに１４日目（最後の投与の１週間後）の高い残留レベル（これは７日目のトラフレベルと同じであった）から証明した。試験物に対する抗体形成の証拠は、６匹の研究動物のうちの２匹（１群から１匹、他方は２群から）で検出された。前者の場合、抗体応答は、循環からの試験物のクリアランスに影響を与え得るようであった。リンパ球サブセットのフローサイトメトリー分析は、１日目と１４日目との間の全ＣＤ３陽性細胞の適度な増加を示し、これはＣＤ３／ＣＤ４陽性細胞の増加、およびＣＤ３／ＣＤ８陽性細胞（２群のみ）のそれぞれの減少に相関した。ＣＤ２９およびＨＬＡ−ＤＲを中程度に発現するＣＤ３細胞の割合は、この研究の経過中に増加し、このことは、ＣＴＬＡ４抗体が抗原特異性Ｔ細胞を増強し得るという以前の知見と一致した。
【０３０２】
結果として、循環するリンパ球亜集団の小さな変化を除いて、この研究において試験された最も高い用量レベル（すなわち、１０ｍｇ／ｋｇの３回の投薬を３日間隔で与える）は、カニクイザルにおいて全く効果のない用量レベルであった。
【０３０３】
（実施例１０． 前立腺癌（ＭＤＸＣＴＬＡ４−０１）および黒色腫（ＭＤＸＣＴＬＡ４−０２）におけるＭＡｂ １０Ｄ１のＩ期ヒト臨床試験）
ＭＤＸＣＴＬＡ４−０１は、進行性、転移性、ホルモン性の難治性の前立腺癌を有する患者における、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（抗ＣＴＬＡ−４）モノクローナル抗体１０Ｄ１（ＭＡｂ １０Ｄ１）のオープンラベル（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ）研究である。処置は注射液として３．０ｍｇ／Ｋｇの投薬量で静脈内投与される、単回用量のＭＡｂ １０Ｄ１である。
【０３０４】
この試行の目的は、（ｉ）ＭＡｂ １０Ｄ１の投与が非特異性Ｔ細胞活性を生じるか否かを決定すること、（ｉｉ）これらの患者におけるＭＡｂ １０Ｄ１についての安全性／耐性特性を証明すること、および（ｉｉｉ）ＭＡｂ １０Ｄ１の薬力学的特性を決定し、ＭＡｂ １０Ｄ１に対する宿主免疫応答の発生を評価することである。さらに、この研究は、効力の予備的な証拠を同定することを試みる。この研究は、１４人の被験体における単回用量のＭＡｂ １０Ｄ１の多中心性オープンラベル研究である。この研究は、４つの段階からなる：スクリーニング、注入、注入後、および追跡（以下の表１０を参照のこと）。
【０３０５】
【表１０】
Figure 0004093757
前立腺の一次腺癌、およびアンドロゲン欠失後の前立腺の進行性の転移性癌であると組織学的診断された患者、ならびに少なくとも１つの全身性非ホルモン性操作された患者を、この研究における関連についてスクリーニングした。被験体は、進行性の転移性疾患、進行性ＰＳＡ、ＰＳＡ＞５ｎｇ／ｍｌ、テストステロン ＜５０ｎｇ／ｄｌ、一次性腺アンドロゲン抑制、余命 ＞１２週、およびＫａｒｈｏｆｓｋｙ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｔｕｓ ６０％以上を有さなければならない。
【０３０６】
被験体は、血液学的機能診断、生物学的機能診断および免疫機能診断のために、身体検査、ＥＣＧ、胸部放射線学、画像診断、および血液サンプリングを受け、そしてバイタルサインをモニタリングされる。毎月の電話インタビューを使用して、処置後６ヶ月まで、有害事象（疾患の進行後の自己免疫の有害事象を含む）のサブセットに関する情報を収集および記録する。ＰＳＡ（減少、減少の持続時間、進行、進行の時間）、および疾患応答（完全、部分的、安定な進行）をモニタリングする。ＭＡｂ １０Ｄ１の血漿濃度を、注射の直前、注射の間、およびその２ヶ月後までで評価する。
【０３０７】
処置された４人の前立腺癌被験体のデータを表１１に示す。有害事象は記録されなかった。処置された全ての被験体について、ＭＡｂ １０Ｄ１は非常に耐性であるようである。
【０３０８】
この試験における患者の免疫状態をモニタリングする重要性、および抗ＣＴＬＡ−４抗体によるＴ細胞活性化に対する一般化された効果をモニタリングする特定の目的のために、この研究におけるエントリー基準は、それぞれ５００／ｍｌ以上および５００／ｍ以上の最小レベルのＣＤ４細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を含んだ。しかし、この研究における最初の発生の間、前立腺癌患者は、Ｔ細胞数を有意に減少したが、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は明らかに存在することが観察された。多くの患者は、初めに上記のエントリー基準に基づいて拒絶された（表１１を参照のこと）。明らかに減少した観察されたＴ細胞数は、これらの患者における癌ワクチン接種を包含する処置において関連性を有し得る前立腺癌患者において以前に示されていない知見である。これらの観察に続いて、エントリー基準を、それぞれ３００／ｍｍｌ以上および２００／ｍｌ以上のＣＤ４数およびＣＤ８数を有する患者を含むように補正した。
【０３０９】
ＭＡｂ １０Ｄ１の投与が所望しない非特異的Ｔ細胞活性化を引き起こし得るか否かを評価するために、前立腺癌の被験体由来の末梢血リンパ球を、以下のマーカーの各々についてフローサイトメトリーによって分析した：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６９、およびＨＬＡ−ＤＲ。血液サンプルを、表１０に示される時点で採取した。ここまでは、処置された前立腺癌被験体の各々についての処置の経過の間、これらのマーカーのいずれの頻度の有意な変化も観察されなかった。この分析の例を表１２に示す。これは被験体のうち２人におけるＭＡｂ １０Ｄ１投与の前、間および後における、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６９陽性細胞、およびＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９陽性細胞の頻度を示す。これらのデータは、ＭＡｂ １０Ｄ１が非特異的Ｔ細胞活性化を生じないことを示す。
【０３１０】
表１２．３．０ｍｇ／Ｋｇ ＭＡｂ １０Ｄ１で処置された前立腺癌被験体におけるＴ細胞活性化マーカーのフローサイトメトリー分析
【０３１１】
【表１１】
Figure 0004093757
ＩＶ段階悪性黒色腫を有する被験体において、ＭＡｂ １０Ｄ１を使用する第二の臨床試験（ＭＤＸＣＴＬＡ４−０２）もまた、開始されている。ＭＡｂ １０Ｄ１の単一用量が、３．０ｍｇ／Ｋｇの投薬量で、輸液として、静脈内投与される。この研究はまた、上の、表９に記載されるように４つの段階（スクリーニング、注入、注入後および経過観察）からなる。
【０３１２】
この研究の目的は、前立腺癌における上記研究に関するもの、ならびにＩＶ段階悪性黒色腫を有する患者におけるＭＡｂ １０Ｄ１についての安全性／耐容性プロフィールを具体的に確立することである。１人の患者が、この研究において処置されている（表１３を参照のこと）。前立腺癌の研究においてと同様に、ＭＡｂ １０Ｄ１は、十分に許容的であるようである。この被験体におけるＴ細胞活性化マーカーのフローサイトメトリー分析（前立腺腫瘍試験に対して実施された分析に類似する）はまた、非特異的Ｔ細胞活性化の証拠を示さなかった。
【０３１３】
【化１】
Figure 0004093757
Figure 0004093757
Figure 0004093757
Figure 0004093757

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、μ１エクソンのＳｍａＩ部位へのｎｅｏカセットの標的化された挿入を概略的に示す。図１Ａ）μ座のゲノム構造の概略図である。黒塗りボックスは、μエクソンを示す；図１Ｂ）ＣｍＤ標的ベクターの概略図。点線は、構築物に含まれるこれらのゲノムμ配列を示す。プラスミド配列は示されていない；図１Ｃ）ｎｅｏカセットがμ１に挿入された標的化されたμ座の概略図。右下のボックスは、標的構築物とμ座との間の相同組換えのこれらのＲＦＬＰ診断を示す。ＲＦＬＰはプローブＡを用いてサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出し、９１５ｂｐのＳａｃＩフラグメントを図１Ｃに示す。
【図２】 図２は、以下に詳細に記載されるように、ヒトＣＴＬＡ−４に対する可溶性ヒト配列抗体が、マウスＢ７．１を発現する細胞への組換え可溶性ヒトＣＴＬＡ−４の結合を阻害することを実証する実験の結果を示す。
【図３】 図３は、以下に詳細に記載されるように、ヒトＣＴＬＡ−４の非重複エピトープを認識する本発明のヒト配列抗体を同定するための競合結合アッセイの結果を示す。
【図４】 図４は、抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１．３の重鎖および軽鎖フラグメントについての予備的なヌクレオチド配列データを示す。
【図５】 図５は、抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖可変領域（ＶK）のヌクレオチド配列を示す。ＶKＡ−２７生殖系列配列（配列番号４）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１（配列番号６）および４Ｂ６（配列番号８）を図の上部に記載する。ＶKＬ−１５生殖系列配列（配列番号１０）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１Ｅ２（配列番号１２）を図の下部に示す。３つの抗ＣＴＬＡ−４抗体のＶK配列をそれらの生殖系列がコードされたＶK遺伝子配列とアライメントした。相補的な決定残基（ＣＤＲ）を標識した。ダッシュは配列同一性を示す。
【図６】 図６は、抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の重鎖可変領域（ＶH）のヌクレオチド配列を示す。ＶH３−３０．３生殖系列配列（配列番号１４）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１（配列番号１６）および４Ｂ６（配列番号１８）を図の上部に示す。ＶH３−３３生殖系列配列（配列番号２０）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１Ｅ２（配列番号２２）を図の下部に示す。３つの抗ＣＴＬＡ−４抗体のＶH配列をそれらの生殖系列コード配列とアライメントする。相補的な決定残基（ＣＤＲ）を標識する。ダッシュは配列同一性を示す。
【図７】 図７は、抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。図５に記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体の推定アミノ酸ＶK配列を示す。ＶKＡ−２７生殖系列配列（配列番号５）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１（配列番号７）および４Ｂ６（配列番号９）を図の上部に示す。ＶKＬ−１５生殖系列配列（配列番号１１）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１Ｅ２（配列番号１３）を図の下部に示す。
【図８】 図８は、抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の重鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。図６に記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体の推定アミノ酸ＶH配列を示す。ＶH３−３０．３生殖系列配列（配列番号１５）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１（配列番号１７）および４Ｂ６（配列番号１９）を図の上部に示す。ＶH３−３３生殖系列配列（配列番号２１）に由来する抗ＣＴＬＡ−４抗体１Ｅ２（配列番号２３）を図の下部に示す。
【図９】 図９は、ＥＬＩＳＡによるＭＡｂ１０Ｄ１の組換えヒトＣＴＬＡ−４への結合実験の結果を示す。ＭＡｂ１０Ｄ１は、用量依存性および飽和速度で、精製された組換えＣＴＬＡ−４に結合する。
【図１０】 図１０は、１０Ｄ１のＣＴＬＡ−４発現Ｔ細胞株への結合を示す。これらのデータは、ＭＡｂ１０Ｄ１が、用量依存性および飽和速度で、ＣＴＬＡ−４発現細胞に結合することを示す。
【図１１】 図１１は、ヒトＢ７．２ＩｇのＣＴＬＡ４発現Ｔ細胞への結合の阻害を示す。これらのデータは、コントロールヒトＭＡｂと比較して、ＭＡｂ１０Ｄ１は、Ｂ７．２のＣＴＬＡ−４への結合を効率的に阻害し得ることを示す。
【図１２】 図１２は、ＣＴＬＡ−４−ＦＩＴＣがマウスＢ７．１発現細胞に結合するのを阻害する結果を示す。これらのデータは、コントロールヒトＭＡｂと比較して、ＭＡｂ１０Ｄ１は、ＣＴＬＡ−４のＢ７．１への結合を効率的に阻害し得ることを示す。
【図１３】 図１３は、エピトープ群分類を示す抗ＣＴＬＡ−４ヒトＭＡｂの競合ＥＬＩＳＡを示す。
【図１４】 図１４は、ＰＨＡで刺激したＴ細胞におけるＣＴＬＡ−４発現を示す。活性化された、休止していないＴ細胞は、細胞表面で、低いが検出可能であるレベルのＣＴＬＡ−４を発現する。
【図１５】 図１５は、活性化Ｔ細胞の相補体依存性溶解におけるＭＡｂ１０Ｄ１の結果を示す。ＰＨＡで活性化されたＴ細胞の溶解は観察されなかった。
【図１６】 図１６は、活性化Ｔ細胞の抗体依存性溶解におけるＭＡｂ１０Ｄ１の結果を示す。ＰＨＡで活性化されたＴ細胞の溶解は、１０Ｄ１および単核細胞では、観察されなかった。
【図１７】 図１７は、１０Ｄ１抗体で注射されたカニクイザルにおける抗１０Ｄ１ＩｇＭおよびＩｇＧ応答を示す。１０Ｄ１に対する有意な抗体応答は観察されなかった。
【図１８】 図１８は、処置された４人の前立腺癌被験体のデータである表１１を示す。
【図１９】 図１９は、ＩＶ段階悪性黒色腫を有する患者におけるＭＡｂ １０Ｄ１についてのデータである表１３を示す。

Claims (7)

  1. 以下：
    （ａ）配列番号１７に記載のアミノ酸を有する重鎖可変アミノ酸配列；および
    （ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変アミノ酸配列、
    を含むヒトモノクローナル抗体であって、ここで、該抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に結合し得る、ヒトモノクローナル抗体。
  2. 請求項１に記載の抗体をコードする、単離された核酸であって、ここで、該核酸は、配列番号６および１６に記載の核酸配列を含む、核酸。
  3. 請求項２に記載の核酸を含む、ベクター。
  4. 前記ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項３に記載のベクター。
  5. 請求項３または４に記載のベクターによって形質転換された、単離された組換え宿主細胞。
  6. 請求項１に記載の抗体を産生し得るように改変された、単離された細胞または細胞株。
  7. 請求項３または４に記載のベクターによって形質転換された、請求項６に記載の単離された細胞または細胞株。
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