ES2719728T3 - Polipéptidos y polinucleótidos, y usos de los mismos como una diana farmacológica para producir fármacos y agentes biológicos - Google Patents

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Merav Beiman
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Dalit Milo
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al ectodominio de C1ORF32 o porciones o variantes del mismo y bloquea la interacción de C1 ORF32 con su contra-receptor, en el que el ectodominio se selecciona de los polipéptidos de SEQ ID NO 147, 148 y 299 y la variante del mismo posee al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma para su uso en terapia.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos y polinucleótidos, y usos de los mismos como una diana farmacológica para producir fármacos y agentes biológicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere al descubrimiento de ciertas proteínas que se expresan de forma diferencial en tejidos específicos y a su uso como dianas terapéuticas y de diagnóstico. De forma más específica, la invención se refiere a una proteína C1ORF32 y sus variantes, que son expresadas de forma diferencial por algunos cánceres, y por lo tanto son dianas adecuadas para inmunoterapia, terapia para el cáncer, y desarrollo de fármacos. La presente invención también se refiere al descubrimiento de dominios extracelulares de C1ORF32 y sus variantes que son dianas adecuadas para inmunoterapia, terapia para el cáncer, y desarrollo de fármacos.
Además, dado que se cree que algunas de las proteínas de la presente divulgación, en base a su estructura de tipo B7, desempeñan un papel en la coestimulación inmune, la divulgación también se refiere al uso de estas proteínas, o a fármacos que modulan estas proteínas (agonistas y antagonistas), como moduladores inmunes y para inmunoterapia, especialmente para el tratamiento de cáncer y trastornos relacionados con el sistema inmune tales como cánceres y trastornos autoinmunes. Además, la invención se refiere de forma más específica a anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico y a terapias y procedimientos de diagnóstico que usan los mismos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen de forma específica a las proteínas de la divulgación o a una porción soluble o secretada de las mismas, especialmente al ectodominio.
Antecedentes de la invención
Los antígenos tumorales se posicionan idealmente como biomarcadores y dianas de fármacos, y desempeñan un papel crítico en el desarrollo de nuevas estrategias para agentes de inmunoterapia activa y pasiva, que se usan como terapias independientes o junto con terapias convencionales para el cáncer. Los antígenos tumorales se pueden clasificar como antígenos específicos de tumores (TSA) donde los antígenos se expresan únicamente en las células tumorales y no en los tejidos normales, o antígenos asociados a tumores (TAA) donde los antígenos se sobreexpresan en células tumorales pero sin embargo también están presentes a bajos niveles en los tejidos normales.
Los TAA y los TSA se validan como dianas para terapia pasiva (anticuerpos) así como para inmunoterapia activa usando estrategias para vencer la tolerancia inmune y estimular el sistema inmune. Los epítopos antigénicos que son las dianas de estos enfoques terapéuticos están presentes en la superficie celular, sobreexpresados en células tumorales en comparación con las células no tumorales, y son dianas de anticuerpos que bloquean la actividad funcional, inhiben la proliferación celular, o inducen la muerte celular.
Existe un número creciente de antígenos asociados a tumores frente a los que se han sometido a ensayo anticuerpos monoclonales o están en uso como tratamiento para el cáncer. La identificación y caracterización molecular de nuevos antígenos tumorales expresados por tumores malignos humanos es un campo activo en la inmunología tumoral. Se han usado varios enfoques para identificar antígenos asociados a tumores como candidatos a diana para inmunoterapia, incluyendo enfoques bioinformáticos de alto rendimiento, basados en genómica y proteómica. La identificación de nuevos TAA o TSA expande el espectro de dianas de antígenos tumorales disponible para el reconocimiento inmune y proporciona nuevas moléculas diana para el desarrollo de agentes terapéuticos para inmunoterapia pasiva, incluyendo anticuerpos monoclonales, tanto sin modificar como armados. Tales nuevos antígenos también pueden indicar el camino de vacunas terapéuticas más eficaces para inmunoterapia activa o adoptiva.
La vacunación para el cáncer implica la administración de antígenos tumorales y se usa para vencer la tolerancia inmune e inducir la respuesta activa de linfocitos T frente al tumor. La terapia de vacunación incluye el uso de ADN desnudo, péptidos, proteínas recombinantes, y terapia celular completa, donde se usan las propias células tumorales del paciente como la fuente de la vacuna. Con la identificación de antígenos tumorales específicos, las vacunaciones se realizan más a menudo mediante terapia celular dendrítica, en la que las células dendríticas se cargan con la proteína o péptido pertinente, o se transfectan con ADN o ARN vectorial.
Las principales aplicaciones de los anticuerpos anti-TAA para el tratamiento del cáncer son terapias con anticuerpos desnudos, terapias con anticuerpos conjugados con fármacos, y terapias de fusión con inmunidad celular. Desde su descubrimiento, los anticuerpos se conciben como "fórmulas mágicas" que podrían suministrar agentes tóxicos, tales como fármacos, toxinas, enzimas y radioisótopos, de forma específica al sitio afectado y dejando sin afectar los tejidos normales no diana. De hecho, los anticuerpos, y en particular los fragmentos de anticuerpo, pueden funcionar como vehículos de sustancias citotóxicas tales como radioisótopos, fármacos y toxinas. La inmunoterapia con tales inmunoconjugados es más eficaz que con los anticuerpos desnudos.
A diferencia del éxito abrumador de los anticuerpos desnudos (tales como Rituxan y Campath) y conjugados (tales como Bexxar y Zevalin) en el tratamiento de tumores malignos hematológicos, solo se han conseguido éxitos modestos en la inmunoterapia de tumores sólidos. Una de las limitaciones principales en la aplicación satisfactoria de la inmunoterapia a tumores sólidos es el gran tamaño molecular de la inmunoglobulina intacta que da como resultado una semivida en suero prolongada pero una mala penetración y captación tumoral. De hecho, solo una muy pequeña cantidad del anticuerpo administrado (tan baja como un 0,01 %) alcanza el tumor. Además de su tamaño, los anticuerpos encuentran otros impedimentos antes de alcanzar sus antígenos diana expresados sobre la superficie celular de los tumores sólidos. Algunas de las barreras incluyen un bajo flujo sanguíneo en los tumores grandes, permeabilidad del endotelio vascular, elevada presión del fluido intersticial del estroma tumoral, y expresión antigénica heterogénea.
Con el advenimiento de la ingeniería de anticuerpos, se han generado fragmentos de anticuerpo de bajo peso molecular que exhiben una penetración tumoral mejorada. Tales fragmentos de anticuerpo se conjugan a menudo con moléculas citotóxicas específicas y se diseñan para suministrarlas selectivamente a las células cancerígenas. Aún así, los tumores sólidos continúan siendo un desafío formidable para terapia, incluso con fragmentos de anticuerpo inmunoconjugados.
La nueva ola de estrategias de optimización implica el uso de modificadores biológicos para modular los impedimentos planteados por los tumores sólidos. Por lo tanto, en combinación con los anticuerpos o sus fragmentos de anticuerpo conjugados, se están usando diversos agentes para mejorar el flujo sanguíneo tumoral, aumentar la permeabilidad vascular, disminuir la presión del fluido intersticial tumoral mediante la modulación de las células de estroma y los componentes de la matriz extracelular, regular positivamente la expresión de los antígenos diana y mejorar la penetración y retención del agente terapéutico.
La inmunoterapia con anticuerpos representa una oportunidad fascinante para combinar con las modalidades convencionales, tales como quimioterapia, así como las combinaciones con diversos agentes biológicos para obtener una actividad sinérgica. De hecho, los mAb sin conjugar son más eficaces cuando se usan en combinación con otros agentes terapéuticos, incluyendo otros anticuerpos.
Otro componente de la respuesta del sistema inmune a la inmunoterapia es la respuesta celular, específicamente la respuesta de linfocitos T y activación de linfocitos T citotóxicos (CTL). La eficacia del sistema inmune en la mediación de la regresión tumoral depende de la inducción de las respuestas de los linfocitos T específicas a antígeno a través de la vigilancia inmune fisiológica, precedida de vacunación, o seguida de transferencia adoptiva de linfocitos T. Aunque se ha identificado una diversidad de antígenos asociados a tumores y se han sometido a ensayo numerosas estrategias inmunoterapéuticas, son poco frecuentes las respuestas clínicas objetivas. Las razones de esto incluyen la incapacidad de los enfoques de inmunoterapia actuales para generar respuestas eficaces de linfocitos T, la presencia de células reguladoras que inhiben la respuesta de los linfocitos T, y otros mecanismos de escape que desarrollan los tumores, tales como la inactivación de los linfocitos T citolíticos a través de la expresión de moléculas coestimuladoras negativas. La inmunoterapia eficaz para el cáncer requerirá el uso de antígenos específicos de tumores apropiados; la optimización de la interacción entre el péptido antigénico, el APC y el linfocito T; y el bloqueo simultáneo de los mecanismos de regulación negativa que impiden los efectos inmunoterapéuticos.
La activación de los linfocitos T desempeña un papel principal en la consecución de respuestas inmunes tanto protectoras como patogénicas, y requiere la realización de una serie de etapas específicas cuidadosamente orquestadas que se pueden anticipar o interrumpir mediante cualquiera de numerosos sucesos críticos. Los linfocitos T primitivos deben recibir dos señales independientes de las células presentadoras de antígeno (APC) con el fin de activarse productivamente. La primera, la Señal 1, es específica de antígeno y se produce cuando los receptores antigénicos de los linfocitos T encuentran el complejo antígeno-MHC apropiado en el APC. Una segunda señal independiente de antígeno (Señal 2) se suministra a través de una molécula coestimuladora de linfocitos T que emplea su ligando expresado en APC. En ausencia de una señal coestimuladora, la activación de los linfocitos T queda mermada o abortada, lo que puede conducir a un estado sin capacidad de respuesta específica de antígeno (conocido como anergia de linfocitos T), o puede dar como resultado la muerte apoptótica de linfocitos T.
Las señales coestimuladoras pueden ser estimuladoras (coestimulación positiva) o inhibidoras (coestimulación negativa o coinhibición). La coestimulación positiva se requiere para la activación óptima de los linfocitos T primitivos, mientras que la coestimulación negativa se requiere para la adquisición de tolerancia inmunológica a lo propio, así como para la finalización de las funciones efectoras de los linfocitos T. Las señales coestimuladoras, particularmente las señales coestimuladoras positivas, también desempeñan un papel en la modulación de la actividad de los linfocitos B. Por ejemplo, la activación de linfocitos B y la supervivencia de los linfocitos B de centros germinales requieren señales derivadas de linfocitos T además de la estimulación mediante antígeno.
Las señales coestimuladoras tanto positivas como negativas desempeñan papeles críticos en la regulación de las respuestas inmunes mediadas por células, y las moléculas que median estas señales han probado ser dianas eficaces para inmunomodulación. En base a este conocimiento, se han desarrollado varios enfoques terapéuticos que implican fijar como diana las moléculas coestimuladoras, y que han demostrado ser útiles para la prevención y el tratamiento de cáncer y enfermedades autoinmunes, así como rechace de trasplante alogénico, cada uno mediante la activación, o la prevención de la inactivación, de las respuestas inmunes en los sujetos con estas patologías. Las parejas de moléculas coestimuladoras consisten habitualmente en ligandos expresados en los APC y sus receptores emparentados expresados en los linfocitos T. Las bien caracterizadas moléculas coestimuladoras B7/CD28 y CD40/CD40L son críticas en la activación primaria de linfocitos T. En los últimos años, se han identificado varias moléculas coestimuladoras adicionales, que pertenecen a la familia de genes B7/CD28 o TNF/TNF-R. Los efectos de los miembros de la familia coestimuladora de TNFR a menudo se pueden segregar funcional, temporal o espacialmente de los de los miembros de la familia CD28 y entre sí. La regulación secuencial y transitoria de las señales de activación/supervivencia de linfocitos T mediante diferentes coestimuladores puede funcionar para permitir la longevidad de la respuesta mientras se mantiene un control estricto de la supervivencia de los linfocitos T.
La familia B7 consiste en ligandos proteicos de superficie celular relacionados estructuralmente que se unen a receptores en los linfocitos regulan las respuestas inmunes. La interacción de los miembros de la familia B7 con su respectivo receptor coestimulador, habitualmente un miembro de la familia relacionada con CD28, aumenta las respuestas inmunes, mientras que la interacción con receptores coinhibidores, tales como CTLA4, atenúa las respuestas inmunes. Los miembros de la familia B7 comparten un 20-40 % de identidad de aminoácidos y están relacionados estructuralmente con los dominios extracelulares que contienen dominios tándem relacionados con los dominios variables y constantes de inmunoglobulinas.
Existen en la actualidad siete miembros conocidos de la familia: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), B7-H1 (PD-L1), B7-H2 (ICOS-L), B7-DC (PD-L2), B7-H3, y B7-H4, cada uno con funciones únicas y a menudo superpuestas. Claramente, cada molécula B7 ha desarrollado su propio nicho indispensable en el sistema inmune. A medida que se continúan diseccionando los nichos de los miembros de la familia B7, su potencial diagnóstico y terapéutico se hace cada vez más evidente. Numerosos miembros de la superfamilia B7 se caracterizaron inicialmente como moléculas coestimuladoras de linfocitos T. Sin embargo, más recientemente se ha hecho evidente que también pueden coinhibir las respuestas de los linfocitos T. Por lo tanto, los miembros de la familia B7 pueden tener efectos opuestos en una respuesta inmune.
Fundamental para la función normal del sistema inmune es su capacidad para distinguir entre propio y no propio, dado que un fallo en la misma podría provocar la aparición de una enfermedad autoinmune. Se conoce que la mayoría de los trastornos autoinmunes implican linfocitos T autorreactivos y/o autoanticuerpos. Por lo tanto, los agentes que son capaces de inhibir o eliminar los linfocitos autorreactivos tienen un potencial terapéutico prometedor. Además, el uso de agentes que exhiben tal actividad inmunosupresora también sería beneficioso para inhibir las respuestas inmunes normales a aloantígenos en pacientes que reciben trasplantes. Por lo tanto, los nuevos agentes que sean capaces de modular señales coestimuladoras, sin comprometer la capacidad del sistema inmune para defenderse contra patógenos, son enormemente ventajosos para el tratamiento y la prevención de tales patologías.
La importancia de los miembros de la familia B7 en la regulación de las respuestas inmunes a antígenos propios y aloantígenos se ha demostrado mediante el desarrollo de inmunodeficiencia y enfermedades autoinmunes en ratones con mutaciones en los genes de la familia B7. Por lo tanto, la manipulación de las señales enviadas por los ligandos B7 ha mostrado potencial en el tratamiento de autoinmunidad, enfermedades inflamatorias, y rechazo a trasplante. Este enfoque descansa, al menos parcialmente, en la supresión final de linfocitos T auto o alorreactivos, presumiblemente debido a que en ausencia de coestimulación (que induce genes de supervivencia celular) los linfocitos T se vuelven altamente susceptibles a la inducción de la apoptosis.
El aprovechamiento del sistema inmune para tratar enfermedades crónicas es el objetivo principal de la inmunoterapia. Las inmunoterapias activa y pasiva se han mostrado como estrategias terapéuticas eficaces. La inmunoterapia pasiva, que usa anticuerpos monoclonales o proteínas de fusión a receptor de Fc, ha alcanzado su madurez y ha mostrado un gran éxito clínico. Se ha aprobado un número creciente de tales agentes terapéuticos, o están en ensayos clínicos, para evitar el rechazo a aloinjerto o para tratar enfermedades autoinmunes y cáncer. La inmunoterapia activa (es decir, las vacunas) ha sido eficaz frente a agentes que normalmente causan enfermedades infecciosas autolimitantes agudas seguidas de inmunidad y han estado a la vanguardia de los esfuerzos para evitar que las enfermedades infecciosas atormenten a la humanidad. Sin embargo, la inmunoterapia activa ha sido mucho menos eficaz frente al cáncer o las enfermedades infecciosas crónicas debido principalmente a que estas han desarrollado estrategias para escapar a las respuestas inmunes normales. Entre estas están los coestimuladores negativos de la familia B7, tales como B7-H1 y B7-H4, que se expresan de forma elevada en ciertos tumores, y permiten la protección local frente al ataque mediado por células inmunes.
La eficacia del sistema inmune en la mediación de la regresión tumoral depende de la inducción de las respuestas de los linfocitos T específicas de antígeno a través de la vigilancia inmune fisiológica, precedida de vacunación, o seguido de transferencia adoptiva de linfocitos T. Aunque se ha identificado una diversidad de antígenos asociados a tumores y se han sometido ensayó numerosas estrategias inmunoterapéuticas, son poco frecuentes las respuestas clínicas objetivas. Las razones de esto incluyen la incapacidad de los enfoques de inmunoterapia actuales para generar respuestas de linfocitos T eficaces, la presencia de células reguladoras que inhiben la respuesta de los linfocitos T, y otros mecanismos de escape que desarrollan los tumores, tales como la inactivación de los linfocitos T citolíticos a través de la expresión de moléculas coestimuladoras negativas. La inmunoterapia eficaz para el cáncer requerirá el uso de antígenos específicos de tumores apropiados; la optimización de la interacción entre el péptido antigénico, el APC y el linfocito T; y el bloqueo simultáneo de los mecanismos de regulación negativa que impiden los efectos inmunoterapéuticos.
Los coestimuladores de la familia B7 desempeñan un papel crítico en la activación y la inhibición de respuestas inmunes antitumorales. Los nuevos agentes que fijan como diana estas moléculas podrían encontrar un uso significativo en la modulación de las respuestas inmunes y el desarrollo de inmunoterapia para el cáncer. Tales agentes se podrían administrar junto con antígenos específicos de tumores, como adyuvantes que sirven para aumentar la respuesta inmune al antígeno en el paciente. Además, tales agentes podían encontrar uso en otros tipos de inmunoterapia para el cáncer, tales como inmunoterapia adoptiva, en la que se amplían las poblaciones de linfocitos T específicos de tumores y se controlan para atacar y eliminar las células tumorales. Los agentes capaces de aumentar tal respuesta antitumoral tienen un gran potencial terapéutico y pueden ser valiosos en el intento de superar los obstáculos de la inmunoterapia tumoral.
La inmunoterapia tumoral pasiva usa la exquisita especificidad y la capacidad lítica del sistema inmune para fijar como diana antígenos específicos de tumores y tratar enfermedades malignas con un mínimo de daño para los tejidos normales. Se han usado varios enfoques para identificar los antígenos asociados a tumores como dianas candidatas para la inmunoterapia. La identificación de nuevos antígenos específicos de tumores amplía el espectro de dianas de antígeno tumoral disponibles para el reconocimiento inmune y proporciona nuevas moléculas diana para el desarrollo de agentes terapéuticos para inmunoterapia pasiva, incluyendo anticuerpos monoclonales, tanto sin modificar como armados. Tales nuevos antígenos también pueden indicar el camino de vacunas terapéuticas más eficaces para inmunoterapia activa o adoptiva.
El desarrollo clínico del bloqueo de la coestimulación se ha logrado con la aprobación de CTLA4Ig (abatacept) para la artritis reumatoide. Esta proteína de fusión soluble, que actúa como inhibidor competitivo de la ruta coestimuladora de B7/CD28, está también en ensayos clínicos para otras enfermedades inmunes tales como psoriasis y esclerosis múltiple, y para rechazo a trasplante. También se han obtenido resultados prometedores en un ensayo clínico en fase II en trasplante de riñón con belatacept, un CTLA4Ig resometido a ingeniería para aumentar la capacidad de unión a sus ligandos, B7.1 y B7.2 (CD80 y CD86, respectivamente). Dos anticuerpos monoclonales anti-CTLA4 completamente humanos, Ipilimumab y tremelimumab, anulan la interacción inhibitoria de CTLA4/B7, y están en fase clínica III para melanoma metastásico y otros cánceres, así como para infección por VIH. Galiximab es un anticuerpo monoclonal primatizado que fija como diana CD80, en fase II para artritis reumatoide, psoriasis y linfoma no Hodgkin. Es importante indicar que las estrategias que usan agentes individuales para bloquear la coestimulación a menudo han probado ser insuficientes. Dada la diversidad de moléculas de coestimulación diferentes, las estrategias futuras pueden implicar el bloqueo simultáneo de varias rutas seleccionadas o la terapia de combinación con fármacos convencionales, tales como inmunosupresores para trastornos relacionados con la inmunidad o fármacos citotóxicos para el cáncer.
A pesar del reciente progreso en el entendimiento de la biología del cáncer y del tratamiento del cáncer, así como en el mejor entendimiento de las moléculas implicadas en las respuestas inmunes, la tasa de éxito para la terapia de cáncer y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes aún es bajo. Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha de nuevas terapias que puedan tratar satisfactoriamente tanto el cáncer como los trastornos autoinmunes.
Breve sumario de la invención
La divulgación se refiere a nuevas composiciones terapéuticas y diagnósticas que contienen al menos una de las proteínas C1ORF32 o una de las nuevas variantes de corte y empalme que se desvelan en el presente documento así como a proporcionar estas nuevas variantes de corte y empalme de C1ORF32, y secuencias de ácidos nucleicos que codifican las mismas o fragmentos de las mismas especialmente el ectodominio o formas secretadas de las proteínas y/o las variables de corte y empalme de C1ORF32.
La divulgación también se refiere a usar dichas proteínas, variantes de corte y empalme y secuencias de ácidos nucleicos como nuevas dianas para el desarrollo de fármacos que se unen específicamente a las proteínas y/o las variables de corte y empalme de C1ORF32, y/o fármacos que agonizan o antagonizan la unión de otros restos a las proteínas y/o las variables de corte y empalme de C1ORF32.
La divulgación también se refiere a fármacos que modulan (agonizan o antagonizan) al menos una actividad biológica relacionada con C1ORF32. Tales fármacos incluyen a modo de ejemplo anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos, ribozimas, moléculas antisentido, ARNip y similares. Estas moléculas se pueden unir directamente o modular una actividad provocada por las proteínas C1ORF32 o el ADN de C1ORF32 o porciones o variantes de las mismas o pueden modular indirectamente una actividad asociada con C1ORF32 o la unión de moléculas a C1ORF32 y porciones y variantes de las mismas tal como mediante la modulación de la unión de C1ORF32 a su contrarreceptor o ligando endógeno.
De acuerdo con la presente divulgación existen porciones discretas de las proteínas C1ORF32 que incluyen diferentes porciones del dominio extracelular que corresponden a los restos 21-186 de la secuencia h 19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147, o los restos 21-169 de la secuencia H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148, o los restos 1-184 de la secuencia H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 299 o variantes de las mismas que poseen al menos un 80 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con las mismas e incluso más preferentemente al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con las mismas.
La presente divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas o diagnósticas que contienen cualquiera de los anteriores.
La presente divulgación también se refiere a compuestos que son adecuados para el tratamiento o la prevención de cáncer, y/o para bloquear o estimular la coestimulación inmune mediada por el polipéptido C1ORF32.
Un objeto específico de la invención es desarrollar nuevos anticuerpos monoclonales o policlonales y fragmentos de anticuerpo y conjugados que los contienen que se unen específicamente al ECD del antígeno C1ORF32 o conjugados o fragmentos del mismo. Estos anticuerpos son potencialmente útiles como agentes terapéuticos y/o agentes de diagnóstico (procedimientos de diagnóstico tanto in vitro como in vivo). En particular, se incluyen anticuerpos y fragmentos que son activantes inmunes o supresores inmunes tales como anticuerpos o fragmentos que fijan como diana células a través de las actividades ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) o CDC (citotoxicidad dependiente de complemento).
Otro objeto de la invención es proporcionar procedimientos diagnósticos que incluyen el uso de cualquiera de los anteriores incluyendo, a modo de ejemplo, ensayos inmunohistoquímicos, ensayos de radioformación de imágenes, formación de imágenes in vivo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia por ranuras, ensayos de unión competitiva, ensayos de formación de imágenes fluorométricos, transferencia de Western, FACS, y similares. En particular, esto incluye ensayos que usan anticuerpos quiméricos o no humanos o fragmentos que se unen específicamente al eCd de la proteína C1ORF32, y/o conjugados, fragmentos o variantes del mismo.
La divulgación también se refiere al uso de nuevos anticuerpos policlonales o monoclonales terapéuticamente eficaces frente a uno cualquiera del del antígeno C1ORF32, seleccionado del grupo que consiste en H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) y fragmentos, conjugados y variantes de los mismos para tratar afecciones en las que el antígeno C1ORF32 o su forma secretada o soluble o el ECD y/o porciones o variantes del mismo se expresan diferencialmente incluyendo diversos cánceres y tumores malignos incluyendo tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, tumores malignos hematológicos que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer es no metastásico, invasivo o metastásico.
La divulgación también se refiere al uso de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo frente al C1ORF32 y/o variantes, conjugados, o fragmentos del mismo y fragmentos y variantes del mismo para el tratamiento y el diagnóstico de cáncer de pulmón, particularmente carcinoma de pulmón microcítico, en el que este antígeno se expresa diferencialmente.
Otro objeto de la invención es usar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, y conjugados que los contienen, frente al C1ORF32 H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) en la modulación (potenciación o inhibición) de la inmunidad incluyendo anticuerpos que activan o suprimen la coestimulación inmune, en particular la coestimulación inmune relacionada con B7 y son capaces de tratar las aplicaciones terapéuticas relacionadas, a través de la estimulación positiva de la actividad de los linfocitos T frente a las células cancerígenas.
Otro objeto específico de la invención es producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpo frente a porciones discretas de las proteínas C1ORF32 incluyendo diferentes porciones del dominio extracelular que corresponden a los restos 21-186 de la secuencia de la proteína C1ORF32 contenidos en la secuencia de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147, o los restos 21-169 de la secuencia de la proteína C1ORF32 contenidos en la secuencia de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148, o los restos 1-184 de la secuencia H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 299.
Un objeto específico de la invención es proporcionar anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de los mismos o un fragmento de unión a antígeno de los mismos que comprenden un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al ECD de las proteínas C1ORF32 y/o variantes y fragmentos del mismo.
La divulgación también se refiere al uso de tales anticuerpos o fragmentos de los mismos para el tratamiento o la prevención de cáncer y/o para la modulación (activación o bloqueo) de la actividad de la diana en el sistema coestimulador inmune.
La divulgación también se refiere a seleccionar anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de los mismos frente a C1ORF32 que son adecuados para el bloqueo o la potenciación de la coestimulación inmune mediada por el polipéptido C1ORF32.
Un objeto específico de la invención es usar anticuerpos frente uno cualquiera del ECD de C1ORF32 o un fragmento o variante del mismo para el tratamiento y el diagnóstico de cánceres que incluyen a modo de ejemplo cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, así como otros tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, tumores malignos hematológicos que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer es no metastásico, invasivo o metastásico.
Con respecto al cáncer de pulmón, la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoide, cáncer de pulmón microcítico o cáncer de pulmón no microcítico.
La divulgación también se refiere al uso de compuestos incluyendo fármacos tales como anticuerpos y fragmentos que se unen a uno cualquiera del antígeno C1ORF32, que son útiles para el tratamiento o la prevención de cáncer y/o para el bloqueo o la potenciación de la coestimulación inmune mediada por el polipéptido C1ORF32.
Un objeto preferente es proporcionar anticuerpos terapéuticos y diagnósticos y fragmentos y conjugados que los contienen útiles en el tratamiento o el diagnóstico de cualquiera de los anteriores que se unen específicamente a los restos de aminoácidos 21-186 de la secuencia de la proteína C1ORF32 contenidos en la secuencia de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147, o los restos 21-169 de la secuencia de la secuencia de la proteína C1ORF32 contenidos en la secuencia de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148, o los restos 1-184 de la secuencia H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 299.
Un objeto preferente también es proporcionar anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a C1ORF32 y los restos específicos identificados anteriormente y fragmentos de la misma, en los que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado, completamente humano y/o es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene actividad de CDC o ADCC en las células diana.
Un objeto preferente también es proporcionar anticuerpos quiméricos y humanos y fragmentos de los mismos y conjugados que los contienen se unen a C1ORF32 y los restos específicos identificados anteriormente y fragmentos de la misma.
Otro objeto específico de la invención es proporcionar fragmentos de anticuerpo y conjugados que los contienen útiles en las terapias anteriores y procedimientos diagnósticos relacionados que incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, F(ab')2, Fv o scFv.
Un objeto de la invención también es unir directa o indirectamente los anticuerpos objeto y sus fragmentos a marcadores u otros restos efectores tales como un marcador detectable, o a un resto efector tal como una enzima, una toxina, un agente terapéutico, o un agente quimioterapéutico.
En una realización preferente, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos se pueden unir directa o indirectamente a un radioisótopo, un quelante metálico, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
Un objeto de la invención también es proporcionar composiciones farmacéuticas y diagnósticas que comprenden una forma terapéutica o diagnósticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención.
La divulgación también se refiere a inhibir el crecimiento de las células que expresan C1ORF32 en un sujeto, comprendiendo: administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une específicamente al antígeno denominado en el presente documento H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) o C1ORF32.
La divulgación también se refiere a proporcionar procedimientos para el tratamiento o la prevención de cáncer, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal se une específicamente a H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) o C1ORF32.
Un objeto más preferente de la invención es usar estos anticuerpos para el tratamiento de cánceres seleccionados entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón, particularmente carcinoma microcítico de pulmón, y en el que el cáncer de pulmón es no metastásico, invasivo o metastásico, en el que preferentemente el anticuerpo tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50).
En otra realización de la invención el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en tumores no sólidos y sólidos, sarcoma, tumores malignos hematológicos que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón, ovario, mama, próstata, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico.
De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos y fragmentos que se unen al antígeno C1ORF32 que son útiles para el tratamiento o la prevención de cáncer, y/o para el bloqueo o la potenciación de la coestimulación inmune mediada por el polipéptido C1ORF32, se puede usar con el bloqueo simultáneo de varias rutas coestimuladoras o en terapia de combinación con fármacos convencionales, tales como inmunosupresores o fármacos citotóxicos para cáncer.
La divulgación también se refiere a ensayos para detectar la presencia de la proteína H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) in vitro o in vivo en una muestra biológica o individual que comprenden poner en contacto la muestra con un anticuerpo que tiene especificidad por los polipéptidos H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o una combinación de los mismos, y detectar la unión de la proteína H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) en la muestra.
Otro objeto de la invención es proporcionar procedimientos para detectar una enfermedad, diagnosticar una enfermedad, monitorizar el desarrollo de una enfermedad o la eficacia de un tratamiento o la recaída de una enfermedad, o seleccionar una terapia para una enfermedad, que comprenden detectar la expresión de un H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50).
En un objeto relacionado, las enfermedades detectadas incluirán cánceres tales como cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, así como otros tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, tumores malignos hematológicos que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer es no metastásico, invasivo o metastásico.
Con respecto al cáncer de pulmón, la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón no metastásico, invasivo o metastásico; carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoide, cáncer de pulmón microcítico o cáncer de pulmón no microcítico; detección de sobreexpresión en metástasis de pulmón (frente al tumor primario); detección de sobreexpresión en cáncer de pulmón, por ejemplo cáncer de pulmón no microcítico, por ejemplo adenocarcinoma, cáncer de células escamosas o carcinoide, o carcinoma macrocítico; identificación de una metástasis de origen desconocido que se originó a partir de un cáncer de pulmón primario; evaluación de un tejido maligno que reside en el pulmón que es de origen no pulmonar, que incluye, pero no se limita a: sarcomas osteogénicos y de tejido blando; tumores colorrectales, uterinos, de cuello y cuerpo uterino; cánceres de cabeza y cuello, mama, testículos y glándulas salivales; melanoma; y tumores de vejiga y riñón; distinción entre diferentes tipos de cáncer de pulmón, que por lo tanto afecta potencialmente a la selección del tratamiento (por ejemplo, tumores microcíticos frente a no microcíticos); análisis de disnea y/o tos crónica y/o hemoptisis sin explicar; diagnóstico diferencial del origen de una efusión pleural; diagnóstico de afecciones que tienen síntomas, signos y complicaciones similares al cáncer de pulmón y donde el diagnóstico diferencial entre estas y el cáncer de pulmón es de importancia clínica que incluyen, pero no se limitan a: causas no malignas de síntomas y signos de pulmón, que incluyen, pero no se limitan a: lesiones e infiltrados pulmonares, sibilancias, estridor, obstrucción traqueal, compresión esofágica, disfagia, parálisis del nervio laríngeo recurrente, ronquera, parálisis del nervio frénico con elevación del hemidiafragma y síndrome de Horner; o detección de una causa de cualquier afección sugestiva de un tumor maligno que incluye, pero no se limita a, anorexia, caquexia, pérdida de peso, fiebre, hipercalcemia, hipofosfatemia, hiponatremia, síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética, ANP elevado, ACTH elevada, hipopotasemia, acropaquia, síndromes neurológicos-miopáticos y tromboflebitis.
Con respecto al cáncer de ovario, los compuestos de la presente invención se puede usar en el diagnóstico, tratamiento o evaluación del pronóstico de cáncer de ovario no metastásico, invasivo o metastásico; estadio correspondiente y potencial maligno; identificación de una metástasis de origen desconocido que se originó a partir de un cáncer de ovario primario; diagnóstico diferencial entre quistes de ovario benignos y malignos; diagnóstico de una causa de infertilidad, por ejemplo diagnóstico diferencial de diversas causas de la misma; detección de una o más afecciones distintas al cáncer de ovario que pueden elevar los niveles en suero de los marcadores relacionados con el ovario, que incluyen, pero no se limitan a: cánceres de endometrio, cuello uterino, tubos de Falopio, páncreas, mama, pulmón y colon; afecciones no malignas tales como embarazo, endometriosis, enfermedad inflamatoria pélvica y miomas; diagnóstico de afecciones que tienen síntomas, signos y complicaciones similares al cáncer de ovario y donde el diagnóstico diferencial entre estas y el cáncer de ovario es de importancia clínica que incluyen, pero no se limitan a: causas no malignas de masas pélvicas, que incluyen, pero no se limitan a: quistes de ovario benignos (funcionales), miomas, endometriosis, neoplasias de ovario benignas y lesiones inflamatorias del intestino; determinación de una causa de cualquier afección sugestiva de un tumor maligno que incluye, pero no se limita a, anorexia, caquexia, pérdida de peso, fiebre, hipercalcemia, dolor esquelético o abdominal, síndrome paraneoplásico, o ascitis.
En un aspecto relacionado, los ensayos anteriores detectarán las células afectadas por la enfermedad usando el anticuerpo que se une específicamente a la proteína H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) o H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), en el que los ensayos se pueden efectuar in vitro o in vivo, e incluyen RIA, ELISA, ensayos fluorométricos, FACS, transferencia por ranuras, transferencia de Western, ensayos inmunohistoquímicos, ensayos de radioformación de imágenes y similares. La divulgación también se refiere a un procedimiento para diagnosticar una enfermedad en un sujeto, que comprende detectar en el sujeto o en una muestra obtenida a partir de dicho sujeto al menos un polipéptido o polinucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO: 48-50147-148, 298-302;
un polipéptido que comprende un puente, una porción de borde, una porción de cola o cabeza, de una cualquiera de SEQ ID NO: 293, o un homólogo o un fragmento de los mismos;
un polinucleótido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 45-46;
un polinucleótido que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido que comprende un puente, una porción de borde, una porción de cola o cabeza, de una cualquiera de SEQ ID NO: 293;
un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico como se expone en las SEQ ID NO: 235, 238, 241, 244.
De acuerdo con una realización adicional, la detección de un polipéptido de la divulgación comprende emplear un anticuerpo capaz de unirse específicamente a al menos un epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende un puente, una porción de borde, una cola o una porción de cabeza de una cualquiera de SEQ ID NO: 293. De acuerdo con una realización, la detección de la presencia del polipéptido o polinucleótido es indicativa de la presencia de la enfermedad y/o su gravedad y/o su desarrollo. De acuerdo con otra realización, un cambio en la expresión y/o el nivel del polinucleótido o polipéptido en comparación con su expresión y/o nivel en un sujeto sano o una muestra obtenida a partir del mismo es indicativo de la presencia de la enfermedad y/o su gravedad y/o su desarrollo. De acuerdo con una realización adicional, un cambio en la expresión y/o el nivel del polinucleótido o polipéptido en comparación con su nivel y/o expresión en dicho sujeto o en una muestra obtenida a partir del mismo en un estadio anterior es indicativo del desarrollo de la enfermedad. De acuerdo con otra realización adicional, la detección de la presencia y/o el cambio relativo en la expresión y/o el nivel del polinucleótido o polipéptido es útil para seleccionar un tratamiento y/o monitorizar un tratamiento de la enfermedad.
La invención también incluye las siguientes realizaciones específicas.
En una realización la invención incluye un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente y/o modula una actividad provocada por uno cualquiera de los polipéptidos C1ORF32, seleccionado entre H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o una variante del mismo y los conjugados que lo contienen.
En otra realización la invención incluye un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a uno cualquiera de los polipéptidos C1ORF32 comprendidos en H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o una variante del mismo que es al menos un 80 % idéntico al mismo.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos anteriores o los fragmentos de los mismos, en los que dicho anticuerpo bloquea o inhibe la interacción de uno de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante del mismo con una actividad o función de homólogo.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores en los que dicho anticuerpo reemplaza o aumenta la interacción de H19011_1_P8 (s Eq ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante del mismo con una función o actividad de homólogo.
En otra realización la invención incluye un procedimiento para modular la actividad de linfocitos, que comprende poner en contacto un linfocito positivo H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID No : 50) con un agente bioactivo capaz de modular la señalización mediada por C1ORF32 en una cantidad eficaz para modular al menos una actividad de linfocitos.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que dicho agente comprende un antagonista de la señalización mediada por C1ORF32 y en el que dicho contacto inhibe la atenuación de la actividad de linfocitos mediada por tal señalización.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que dicho contacto aumenta la actividad de linfocitos.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior en el que dicho antagonista comprende un agente bloqueante capaz de interferir con la interacción funcional del antígeno C1ORF32 y su homólogo.
En otra realización la invención incluye el anticuerpo o fragmento anterior que es adecuado para el tratamiento o la prevención de cáncer mediante la modulación de la actividad de una cualquiera de las proteínas C1ORF32 en un sistema coestimulador de tipo B7.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior en el que el anticuerpo o fragmento administrado inhibe la estimulación negativa de la actividad de linfocitos T frente a las células cancerígenas.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en la que el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en tumores malignos hematológicos tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, y tumores de tejido blando o sólidos tales como cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en la que el cáncer es no metastásico, invasivo o metastásico.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, que se une específicamente a aminoácidos: los restos 21-186 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147, o los restos 21-169 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148, o los restos 1-184 de la secuencia H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que corresponden a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 299, o una variante o fragmento o un epítopo de los mismos.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que el sitio de unión a antígeno contiene de aproximadamente 3-7 aminoácidos contiguos o no contiguos, más habitualmente al menos 5 aminoácidos contiguos o no contiguos. Estos sitios de unión incluyen epítopos conformacionales y no conformacionales.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
En otra realización la invención incluye los anticuerpos o fragmentos anteriores en los que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o primatizado.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que el fragmento se selecciona entre el grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, F(ab'), F(ab), Fv o scFv y unidad de reconocimiento mínima.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que el anticuerpo o fragmento está acoplado a un marcador detectable, o a un resto efector.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que el resto efector es una enzima, una toxina, un agente terapéutico, o un agente quimioterapéutico.
En otra realización la invención incluye cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que el marcador detectable es un radioisótopo, un quelante metálico, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
En otra realización la invención incluye una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos anteriores o un fragmento de los mismos.
En otra realización la invención incluye una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos anteriores o un fragmento de los mismos.
En otra realización la invención incluye un procedimiento de inducción o potenciación de la respuesta inmune, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores y detectar la inducción o potenciación de dicha respuesta inmune
En otra realización la invención incluye un procedimiento para potenciar la respuesta inmune secundaria frente a un antígeno en un paciente, comprendiendo el procedimiento administrar cantidades eficaces de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que el antígeno es un antígeno cancerígeno, y el paciente ha recibido preferentemente un tratamiento con una vacuna anticancerígena.
En otra realización la invención incluye un procedimiento de tratamiento de un paciente con un tumor maligno positivo a C1CRF32, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior que comprende además administrar conjuntamente un agente quimioterapéutico.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que dicho tumor maligno se selecciona entre un grupo que consiste en tumores malignos hematológicos tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, y tumores blandos o sólidos tales como cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer es no metastásico, invasivo o metastásico.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que dicho tumor maligno se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, y en el que el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario o el cáncer de colon es no metastásico, invasivo o metastásico.
La divulgación también se refiere a un ensayo para detectar la presencia de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante de los mismos en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo de uno cualquiera de los anteriores, y detectar la unión de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante de los mismos en la muestra.
En otra realización la invención incluye un procedimiento para detectar una enfermedad, diagnosticar una enfermedad, monitorizar el desarrollo de una enfermedad o la eficacia del tratamiento o la recaída de una enfermedad, o seleccionar una terapia para una enfermedad, que comprende detectar la expresión de un H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o una variante de los mismos. En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior en el que la detección de la expresión de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante de los mismos se realiza in vivo o in vitro.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que la enfermedad se selecciona entre cáncer de pulmón, cáncer de ovario, o cáncer de colon, y en el que el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario o el cáncer de colon es no metastásico, invasivo o metastásico.
La divulgación también se refiere a un procedimiento de inhibición del crecimiento de células que expresan un polipéptido seleccionado entre H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante de los mismos en un sujeto, que comprende: administrar a dicho sujeto cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores.
La divulgación también se refiere a un procedimiento de tratamiento o prevención de cáncer que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión que se une específicamente a H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ iD NO: 50), o un fragmento o variante de los mismos que posee al menos un 80 % de identidad de secuencia con los mismos.
La divulgación también se refiere al procedimiento anterior, en el que el cáncer se selecciona entre un grupo que consiste en tumores malignos hematológicos tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, y tumores blandos o sólidos tales como cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer es no metastásico, invasivo o metastásico.
La divulgación también se refiere al procedimiento anterior, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de ovario, o cáncer de colon, y en el que el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario o el cáncer de colon es no metastásico, invasivo o metastásico.
La divulgación también se refiere al procedimiento anterior en el que el anticuerpo es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno humano, humanizado o quimérico.
La divulgación también se refiere al procedimiento anterior en el que el anticuerpo o fragmento está unido directa o indirectamente a un resto efector.
La divulgación también se refiere al procedimiento anterior, en el que el efector se selecciona entre un fármaco, toxina, radionúclido, fluoróforo y una enzima.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que el anticuerpo tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de uno cualquiera de dichos polipéptidos CTORF32.
La divulgación también se refiere a un procedimiento de uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante de los mismos para la formación de imágenes in vivo de tumores o sitios inflamatorios caracterizado por la expresión diferencial de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante de los mismos.
La divulgación también se refiere al procedimiento anterior que se usa en la evaluación de prognosis de cáncer o de un protocolo de tratamiento.
En otra realización la invención incluye un procedimiento para la identificación sistemática de una enfermedad del sujeto, que comprende detectar en el sujeto o en una muestra obtenida a partir de dicho sujeto un polipéptido que tiene una secuencia al menos un 85 % homologa a un polipéptido que tiene una secuencia que comprende el dominio extracelular de una cualquiera de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50).
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior en el que la identificación sistemática para una enfermedad comprende detectar la presencia o la gravedad de la enfermedad, trastorno o afección, o la prognosis del sujeto, o la selección de tratamiento para dicho sujeto, o la monitorización de tratamiento de dicho sujeto.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que la enfermedad es un cáncer, seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, y en el que el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario y el cáncer de colon es no metastásico, invasivo o metastásico.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que la detección se realiza mediante inmunoensayo.
En otra realización la invención incluye el procedimiento anterior, en el que el inmunoensayo utiliza un anticuerpo que interactúa específicamente con un polipéptido que tiene una secuencia que comprende el dominio extracelular de una cualquiera de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50),
La divulgación también se refiere a un anticuerpo específico frente a H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), o un fragmento o variante de las mismas que provoca la apoptosis o la lisis de las células cancerígenas que expresan dicha proteína.
La divulgación también se refiere a cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que dicha actividad de apoptosis o lisis implica una actividad CDC o ADCC del anticuerpo.
La divulgación también se refiere a cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que las células cancerígenas se seleccionan entre un grupo que consiste en tumores malignos hematológicos tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, y tumores blandos o sólidos tales como cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, y cerebro.
La divulgación también se refiere a cualquiera de los anticuerpos o fragmentos anteriores, en los que las células cancerígenas son células de cáncer de pulmón, ovario o colon.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un resumen esquemático de un análisis de PCR cuantitativo en tiempo real.
Las Figuras 2A-2B muestran la comparación de alineación de las proteínas H19011_1_P8 (Figura 2A) y H19011_1_P9 (Figura 2B) con las proteínas C1ORF32 conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47).
La Figura 3 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_seg13F2R2 (SeQ ID NO: 235) en tejidos de colon normales y cancerígenos.
La Figura 4 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_seg13F2R2 (SEQ ID NO: 235) en tejidos de pulmón normales y cancerígenos.
Las Figuras 5A-5B presentan un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_seg13F2R2 (SEQ ID NO: 235) en diversos tejidos normales. La Figura 5A muestra la expresión de cada muestra con respecto a la mediana de las muestras de colon; la Figura 5B muestra la expresión de cada muestra con respecto a la mediana de las muestras de pulmón.
La Figura 6 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_seg8-13F1R1 (s Eq ID NO: 238) en tejidos de pulmón normales y cancerígenos.
La Figura 7 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011-junc8-10seg13 (SEQ ID NO: 241) en tejidos de pulmón normales y cancerígenos.
La Figura 8 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1OR2F32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_junc8-10seg13 (SEQ ID NO: 241) en tejidos de colon normales y cancerígenos.
Las Figuras 9A-9B presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_junc8-10seg13 (SEQ ID NO: 241) en diversos tejidos normales. La Figura 9A muestra la expresión de cada muestra con respecto a la mediana de las muestras de colon; la Figura 9B muestra la expresión de cada muestra con respecto a la mediana de las muestras de pulmón.
La Figura 10 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_junc8-10seg13 (SEQ ID NO: 241) en un panel específico de sangre.
La Figura 11 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_junc6-10F1R1 (SEQ ID NO: 244) en tejidos de pulmón normales y cancerígenos.
La Figura 12 presenta un histograma que muestra la expresión de transcritos de H19011 de C1ORF32, marco de lectura abierto 32 del cromosoma 1, que son detectables mediante amplicón como se representa en la secuencia de nombre H19011_junc6-10F1R1 (SEQ ID NO: 244) en tejidos de colon normales y cancerígenos.
La Figura 13 presenta las secuencias de nucleótidos de los ORF de longitud completa_EGFP recombinantes: la secuencia específica del gen correspondiente a la secuencia de longitud completa del candidato está marcada en negrita, la secuencia de EGFP está en cursiva no negrita y las SNP conocidos/mutaciones silentes están subrayadas. La Figura 13 presenta la secuencia de ácido nucleico de ORF de longitud completa_EGFP del ADN de C1ORF32_T8_P8_EGFP (1533 bp) (SEQ ID NO: 81).
La Figura 14 presenta las secuencias de las proteínas de fusión de longitud completa_EGFP. La secuencia específica del candidato que corresponde a la secuencia de longitud completa de la proteína está marcada en negrita, la secuencia de EGFP está en cursiva no negrita y los aminoácidos modificados debido a SNP conocidos están subrayados. La Figura 14 presenta la secuencia de aminoácidos de ORF de longitud completa_EGFP de la proteína C1ORF32_P8_EGFP (510 aa) (SEQ ID NO: 91).
Las Figuras 15 demuestran la localización de las proteínas de la membrana celular: la Figura 15 muestra la localización celular de la proteína C1ORF32-EGFP_T8_P8. Todas las imágenes se obtuvieron usando el objetivo 40x del microscopio confocal.
Las Figuras 16 presentan las secuencias de nucleótidos de los dominios extracelulares de las proteínas candidatas, fusionadas la Fc de ratón: ORF de ECD_mFc. La secuencia específica de la proteína candidata que corresponde a la secuencia de ECD está marcada en negrita, la secuencia del sitio de escisión de TEV está subrayada, la secuencia de mFc está en cursiva no negrita y la secuencia de IL6sp está en cursiva negrita. La Figura 16 muestra la secuencia de ADN de C10RF32_T8_P8_ECD_mFc (1287 bp) (SEQ ID NO: 99).
Las Figuras 17 presentan la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión ECD_mFc. La secuencia específica de la proteína candidata que corresponde a la secuencia de ECD está marcada en negrita, la secuencia del sitio de escisión de TEV está subrayada, la secuencia de mFc está en cursiva no negrita y la secuencia de IL6sp está en cursiva negrita. La Figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos de C1ORF32_T8_P8_ECD_mFc (428 aa) (SEQ ID NO: 105).
La Figura 18 muestra los resultados de un análisis de transferencia de Western de las FXYD3_ECD_mFc (SEQ ID NO: 103), AI216611 ECD_mFc (SEQ ID NO: 104), C1ORF32_ECD_mFc (SEQ ID NO: 105), LOC253012_ECD_mFc (SEQ ID NO: 106), ILDR1_ECD_mFc (SEQ ID NO: 107), VSIG1_ECD_mFc (SEQ ID NO: 108) expresadas. Los carriles son como sigue a continuación: carril 1 marcadores de peso molecular (Amersham, arcoíris de amplio espectro, número de catálogo RPN800); carril 2-LOC253012_ECD_mFc; carril 3-FXYD3_ECD_mFc; carril 4 -AI216611 ECD_mFc; carril 5- C1ORF32_ECD_mFc; carril 6-ILDR1_ECD_mFc; carril 7- VSIG1_ECD_mFc.
Las Figuras 19 presentan la unión de los ECD de las proteínas de tipo B7 fusionadas a Fc a los linfocitos T en reposo o los linfocitos T activados con Con A para diferentes períodos de tiempo. La Figura 19 muestra los resultados de unión para el ECD de C1ORF32 fusionada a Fc.
La Figura 20 presenta la respuesta a dosis de la unión de las proteínas de tipo B7 fusionadas a Fc a los linfocitos T activados. Los linfocitos T purificados se cultivaron durante 48 horas. Se añadió Con A durante las últimas 24 horas. A continuación las células se recogieron y se tiñeron con concentraciones crecientes (3, 6, 12, 25 y 50 |jg/ ml) de los ECD de VSIG1, LOC253012, C1ORF32, AI216611, ILDR1 o FXYD3 fusionadas a Fc. Como controles negativos, se usó IgG2a de ratón en las mismas concentraciones.
Las Figuras 21A-21B presentan el efecto de las proteínas fusionadas ECD-Fc en la proliferación de linfocitos T por la secreción de IL-2, tras la activación con Ab anti-CD3. La Figura 21A muestra los niveles de incorporación de BrdU. La Figura 21B muestra los niveles de secreción de IL-2.
La Figura 22 ilustra la unión de los ECD fusionados a Fc de las VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, FXYD3 o C1ORF32 a linfocitos.
La Figura 23 ilustra la unión de los ECD fusionados a Fc de las ILDR1, C1ORF32 y AI216611 a linfocitos T CD4+.
La Figura 24 muestra el efecto de las proteínas de tipo B7 en la activación de linfocitos T. "CD3" significa CD3 solos sin la presencia de una molécula coestimuladora; "CD3 B7.2" significa CD3 un control coestimulador B7 conocido, B7.2; "CD3 B7H4" significa CD3 y B7H4, un control inhibidor B7 conocido; "CD3 B7H3" significa CD3 y B7H3, una proteína estimuladora B7 conocida; "CD3 702" significa CD3 LOC253012-ECD-fusionado a Fc (SEQ ID NO: 106); "CD3 721" significa CD3 AI216611-ECD-fusionado a Fc (SEQ ID NO: 104); "CD3 754" significa CD3 C1ORF32-ECD-fusionado a F (SEQ ID NO: 105); "CD3 768" significa CD3 VSIG1-ECD-fusionado a Fc (SEQ ID NO: 108) "CD3 770" significa CD3 ILDR1-ECD-fusionado a Fc (SEQ ID NO: 107); "CD3 789" significa CD3 FXYD3-ECD-fusionado a Fc (SEQ ID NO: 103). Las Figuras 24A, B y C presentan 3 experimentos diferentes de 3 donantes diferentes.
La Figura 25A-E presenta los resultados de FACS de la unión de ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-Fc (SEQ ID NO: 105), AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104), LOC253012-ECD-Fc (SEQ ID NO: 106), FXYD3-ECD-Fc (SEQ ID NO: 103), y VSIG1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 108) a linfocitos B en reposo.
La Figura 26A-C presenta los resultados de FACS de la unión de ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-F (SEQ ID NO: 105), AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104), LOC253012-ECD-Fc (SEQ ID NO: 106), FXYD3-ECD-Fc (SEQ ID NO: 103), y VSIG1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 108) a linfocitos B activados.
La Figura 27A-B presenta los resultados de FACS de la unión de IL d R1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-Fc (SEQ ID NO: 105), AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104), LOC253012-ECD-Fc (SEQ ID NO: 106), FXYD3-ECD-Fc (SEQ ID NO: 103), y VSIG1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 108) y líneas celulares de linfoma B.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se refiere a uno cualquiera de los antígenos denominados C1ORF32, y su correspondiente secuencia de ácido nucleico, y porciones y variantes del mismo y conjugados que lo contienen y el uso del mismo como una diana terapéutica o de diagnóstico. En particular la invención usa este antígeno y porciones discretas del mismo como una diana de fármaco para anticuerpos terapéuticos. Más particularmente la invención se refiere a la anticuerpos policlonales y monoclonales diagnósticos y terapéuticos y fragmentos de los mismos que se unen al ectodominio de C1ORF32 y porciones y variantes del mismo, especialmente los que fijan como diana el ectodominio o porciones o variantes del mismo particularmente anticuerpos monoclonales humanos o quiméricos, que se unen específicamente al antígeno H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), y variantes del mismo incluyendo los que estimulan o inhiben actividades provocadas por C1ORF32, incluyendo las relacionadas con la modulación de la coestimulación inmune, por ejemplo la coestimulación relacionada con B7.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención derivan de secuencias de línea germinal de cadena pesada y ligera particulares y/o comprenden características estructurales particulares tales como regiones c Dr que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. La invención proporciona anticuerpos aislados, procedimientos de fabricación de tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas diespecíficas que comprenden tales anticuerpos y composiciones farmacéuticas y diagnósticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moléculas diespecíficas de la invención.
La invención también se refiere a procedimientos in vitro e in vivo de uso de los anticuerpos y fragmentos, para detectar C1ORF32, así como para tratar enfermedades asociadas con la expresión de C1ORF32, tales como tumores malignos que expresan diferencialmente C1ORF32. La invención también se refiere a procedimientos de uso de los anticuerpos y fragmentos, específicos para C1ORF32 para tratar trastornos autoinmunes y de trasplante y enfermedad de injerto frente al anfitrión. Por lo tanto, la invención también proporciona procedimientos de uso de los anticuerpos anti-C1ORF32 de la invención y otros fármacos que modulan C1ORF32 para tratar tumores malignos por ejemplo, en el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, tumores malignos hematológicos que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas, cerebro y en los que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico. Preferentemente estos anticuerpos poseerán actividad de ADCC o CDC frente a las células diana tales como células cancerígenas.
Con el fin de que la presente invención se entienda con mayor facilidad, se definen en primer lugar ciertos términos. Se exponen definiciones adicionales en la descripción detallada.
El término C1ORF32 se refiere a la proteína codificada por uno cualquiera de los transcritos de H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45), H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46) que se presentan en el presente documento, particularmente a proteínas como se exponen en una cualquiera de H19011_1_P8 (SEQ ID No : 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), y variantes de las mismas que se expresan diferencialmente, por ejemplo, en cánceres tales como cáncer de pulmón, particularmente carcinoma de pulmón microcítico, en el que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico.
Preferentemente, tales variantes de C1ORF32 poseerán al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con la misma e incluso más preferentemente al menos un 95 % de identidad de secuencia con la misma.
Se prevé que una cualquiera de las proteínas C1ORF32 basadas en esta estructura de dominio es una proteína coestimuladora inmune, por ejemplo, un miembro de la familia de proteínas B7 que está implicado en la coestimulación inmune mediante B7 que incluye, por ejemplo, respuestas de linfocitos T provocadas frente a células cancerígenas y que provoca efectos en la inmunidad tales como desencadenar los efectos autoinmunes.
La expresión "ectodominio (ECD) soluble" o "ectodominios" de C1ORF32 se refiere a las siguientes secuencias de polipéptidos y las correspondientes secuencias de ácido nucleico (que no comprenden el péptido de señal y la TM de la proteína C1ORF32):
>H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) restos 21 a 186 (SEQ ID NO: 147)
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGE SLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREI TIVHDADEQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLEVLGRTGLLADL LPSFAVEIMPE
>H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) restos 21 a 169 (SEQ ID NO: 148)
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGE SLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREI
TIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLLVLEWV,
>H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) restos 1 a 184 (SEQ ID NO: 299)
MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSS
HQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRT
VRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDL EGKNEDSVELLVLGRTGLLADLLPSFAVEIM,
y variantes de las mismas que poseen al menos un 80 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con las mismas e incluso más preferentemente al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con las mismas.
La expresión "respuesta inmune" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulocitos, y las macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o las células producidas por el hígado o el bazo (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complemento) que dan como resultado un daño selectivo a, la destrucción de, o la eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerígenas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
Una "ruta de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señal que desempeña un papel en la transmisión de una señal desde una porción de una célula a otra porción de una célula.
Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana plasmática de una célula.
El término "anticuerpo", como se hace referencia el presente documento, incluye anticuerpos policlonales y monoclonales completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas individuales de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden estar subdivididas además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que se conservan más, denominadas regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del anfitrión, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, proteínas C1ORF32 o C1ORF32). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Algunos ejemplos de fragmentos de unión incluidos en el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V ligero, V pesado, constante ligero (CL) y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando procedimientos recombinantes, mediante un conector sintético que les permite prepararse como una cadena de proteína individual en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena individual estén incluidos en el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se identifican sistemáticamente para su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Un "anticuerpo aislado", como se usa el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está básicamente exento de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a proteínas C1ORF32 o C1ORF32 está básicamente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de proteínas C1ORF32 o C1ORF32, respectivamente). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a proteínas o C1ORF32 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como proteínas C1ORF32 o moléculas C1ORF32 de otras especies, respectivamente. Además, un anticuerpo aislado puede estar básicamente libre de otros materiales celulares y/o productos químicos.
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular individual. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de unión y una afinidad individuales por un epítopo particular.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto la región de marco como la región CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatorias o de sitio específico in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir los anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tales como ratones, han sido injertadas en las secuencias de marco humanas.
La expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una especificidad de unión individual que tienen regiones variables en las que tanto la región de marco como la región CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera humanos fusionados a una célula inmortalizada.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo (que se describe adicionalmente posteriormente), (b) anticuerpos aislados a partir de una célula anfitriona transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una librería combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones de marco y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somáticas in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo.
Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de cadena pesada.
Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan de forma intercambiable en el presente documento con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".
Como se usa el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a proteínas C1ORF32 o C1ORF32 se pretende referir a un anticuerpo que se une a proteínas C1ORF32 o C1ORF32, preferentemente con una KD de 5 x 10-8 M o inferior, más preferentemente 3 x 10-8 M o inferior, y incluso más preferentemente 1 x 10-9 M o inferior. El término "Kasoc" o "Ka", como se usa en el presente documento, se pretende referir a la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kdis" o "Kd", como se usa en el presente documento, se pretende referir a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "KD", como se usa en el presente documento, se pretende referir a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la proporción entre Kd y Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como concentración molar (M). Los valores de KD para los anticuerpos se pueden terminar usando procedimientos bien establecidos en la técnica. Un procedimiento preferente para determinar la KD de un anticuerpo es mediante el uso de resonancia de plasmones superficiales, preferentemente usando un sistema biosensor tal como un sistema BiacoreRTM
Como se usa en el presente documento, la expresión "alta afinidad" por un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-8 o inferior, más preferentemente 10-9 M o inferior e incluso más preferentemente 10-10 M o inferior para un antígeno diana. Sin embargo, la "alta afinidad" de unión puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, "alta afinidad" de unión para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-7 M o inferior, más preferentemente 10-8 M o inferior.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "cola" se refiere a una secuencia peptídica al final de una secuencia de aminoácidos que es única para una variante de corte y empalme. Por lo tanto, una variante de corte y empalme que tiene tal cola se puede considerar opcionalmente como una quimera, en la que al menos una primera porción de la variante de corte y empalme es por lo general altamente homologa (a menudo un 100 % idéntica) a la porción de la correspondiente proteína conocida, mientras que al menos una segunda porción de la variante comprende la cola.
Como se usa en el presente documento, el término "cabeza" se refiere a una secuencia peptídica al comienzo de una secuencia de aminoácidos que es única para una variante de corte y empalme de. Por lo tanto, una variante de corte y empalme que tiene la cabeza se puede considerar opcionalmente como una quimera, en la que al menos una primera porción de la variante de corte y empalme comprende la cabeza, mientras que al menos una segunda porción es por lo general altamente homologa (a menudo un 100 % idéntica) a una porción de la correspondiente proteína conocida.
Como se usa en el presente documento, la expresión "una porción de borde" se refiere a una conexión entre dos porciones de una variante de corte y empalme que no están unidas en la proteína natural o conocida. Un borde puede surgir opcionalmente debido a una unión entre la porción de "proteína conocida" anterior de una variante y la cola, por ejemplo, y/o se puede producir si una porción interna de la secuencia natural ya no está presente, de modo que dos porciones de la secuencia, que no eran contiguas en la proteína conocida, son ahora contiguas en la variante de corte y empalme. Un "puente" puede ser opcionalmente una porción de borde de una variante, o una unión entre una cola y una porción de "proteína conocida" de una variante, o una unión entre una inserción y una porción de "proteína conocida" de una variante.
En algunas realizaciones, un puente entre una cola o una cabeza o una inserción única, y una porción de "proteína conocida" de una variante, comprende al menos aproximadamente 10 aminoácidos, o en algunas realizaciones al menos aproximadamente 20 aminoácidos, o en algunas realizaciones al menos aproximadamente 30 aminoácidos, o en algunas realizaciones al menos aproximadamente 40 aminoácidos, en el que al menos un aminoácido proviene de la cola/cabeza/inserción y al menos un aminoácido proviene de la porción de "proteína conocida" de una variante. En algunas realizaciones, el puente puede comprender cualquier número de aminoácidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 aminoácidos (por ejemplo, 10, 11, 12, 13... 37, 38, 39, 40 aminoácidos de longitud, o cualquier número entre los mismos).
Se debe observar que un puente no se prolonga más allá de la longitud de la secuencia en cualquier dirección, y se debe suponer que cualquier descripción del puente se va a leer de manera tal que la longitud del puente no se prolonga más allá de la propia secuencia.
Además, los puentes se describen con respecto a una ventana deslizante en ciertos contextos posteriormente. Por ejemplo, ciertas descripciones de los puentes presentan el siguiente formato: un puente entre dos bordes (en el que una parte de la proteína conocida no está presente en la variante) se puede describir opcionalmente como sigue a continuación: una porción del puente de CONTIG-NOMBRE_P1 (representando el nombre de la proteína), que comprende un polipéptido que tiene una longitud "n", en el que n es al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, opcionalmente al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud y lo más preferentemente al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, en el que al menos dos aminoácidos comprenden XX (2 aminoácidos en el centro del puente, uno de cada extremo del borde), que tiene una estructura como sigue a continuación (numeración de acuerdo con la secuencia de CONTIG-NOMBRE_P1): una secuencia que parte de cualquier número de aminoácidos de 49 - x a 49 (por ejemplo); y que termina en cualquier número de aminoácidos 50 ((n - 2) - x) (por ejemplo), en el que x varía de 0 a n - 2. En este ejemplo, también se deben leer como incluidos los puentes en los que n es cualquier número de aminoácidos entre 10-50 aminoácidos de longitud. Además, el polipéptido puente no se prolonga más allá de la secuencia, de modo que se debe leer tal que 49 - x (por ejemplo) no sea menor que 1, ni 50 ((n - 2) - x) (por ejemplo) mayor que la longitud total de la secuencia.
En las siguientes subsecciones se describen con mayor detalle diversos aspectos de invención.
ÁCIDOS NUCLEICOS
Un "fragmento de ácido nucleico" o un "oligonucleótido" o un "polinucleótido" se usan en el presente documento de forma intercambiable para referirse a un polímero de restos de ácido nucleico. Una secuencia de polinucleótido se refiere a una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla o doble que se aísla y proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótido complementario (ADNc), una secuencia de polinucleótido genómica y/o secuencias de polinucleótido compuestas (por ejemplo, una combinación de las anteriores).
Por lo tanto, la presente divulgación incluye las secuencias de ácido nucleico que se han descrito anteriormente en el presente documento; fragmentos de las mismas, secuencias hibridables con las mismas, secuencias homólogas a las mismas [por ejemplo, al menos un 90 %, al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % o más idénticas a las secuencias de ácido nucleico que se exponen en el presente documento], secuencias que codifican polipéptidos similares con diferentes usos de condón, secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, tales como supresión, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, de origen natural o inducidas por el hombre, de forma aleatoria o dirigida. La presente divulgación también incluye secuencias de ácido nucleico homólogas (es decir, que forman parte de una secuencia de polinucleótido de la presente divulgación), que incluyen regiones de secuencias únicas a los polinucleótidos de la presente divulgación.
En los casos en los que las secuencias de polinucleótido codifiquen polipéptidos sin identificar previamente, la presente divulgación también incluye nuevos polipéptidos o porciones de los mismos, que están codificados por el polinucleótido aislado y los respectivos fragmentos de ácido nucleico de los mismos descritos anteriormente en el presente documento.
Por lo tanto, la presente divulgación también incluye polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótido de la presente divulgación. La presente divulgación también incluye homólogos de estos péptidos, tales como homólogos que pueden ser al menos un 90 %, al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % o más homólogos con las secuencias de aminoácidos que se exponen posteriormente, según se puede determinar usando el software BlastP del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) usando los parámetros por defecto. Finalmente, la presente divulgación también incluye fragmentos de los polipéptidos descritos anteriormente y polipéptidos que tienen mutaciones, tales como supresiones, inserciones o sustituciones de uno o más aminoácidos, de origen natural o inducidas por el hombre, de forma aleatoria o dirigida.
Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, las secuencias biomoleculares de la presente divulgación se pueden utilizar eficazmente como marcadores patológicos o de tejidos y como fármacos putativos o dianas de fármaco para tratar o prevenir una enfermedad.
PÉPTIDOS
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un análogo o mimético de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los polipéptidos se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de restos de hidrato de carbono para formar glicoproteínas. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" incluyen glicoproteínas, así como no glicoproteínas.
Los productos de polipéptido se pueden sintetizar bioquímicamente tal como empleando técnicas convencionales en fase sólida. Tales procedimientos incluyen síntesis en fase sólida exclusiva, procedimientos de síntesis en fase sólida parcial, condensación de fragmentos, síntesis clásica en solución. Estos procedimientos se usan preferentemente cuando el péptido es relativamente corto (es decir, 10 kDa) y/o cuando no se puede producir mediante técnicas recombinantes (es decir, no se codifica por una secuencia de ácido nucleico) y por lo tanto implica una química diferente.
Los procedimientos de síntesis de polipéptidos en fase sólida se conocen bien en la técnica y se describen además en John Morrow Stewart y Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses (2a Ed., Pierce Chemical Company, 1984).
Los polipéptidos sintéticos se pueden purificar mediante cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman y Co. N.Y.] y la composición de los mismos se puede confirmar a través de secuenciación de aminoácidos.
En los casos en que se desean grandes cantidades de un polipéptido, se pueden generar usando técnicas recombinantes tales como las descritas por Bitter y col., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier y col. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson y col. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu y col. (1987) EMBO J.
6:307-311, Coruzzi y col. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli y col., (1984) Science 224:838-843, Gurley y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, sección VIII, pp 421-463.
Se entenderá que los péptidos identificados de acuerdo con las enseñanzas de la presente divulgación pueden ser productos de degradación, péptidos sintéticos o péptidos recombinantes así como peptidomiméticos, por lo general péptidos sintéticos y peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que hacen a los péptidos más estables mientras están en el cuerpo o más capaces de penetrar en las células. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificación en N-terminal, modificación en C-terminal, modificación del enlace peptídico, que incluye, pero no se limita a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=Ch o CF=CH, modificaciones de la cadena principal, y modificación de restos. Los procedimientos para preparar compuestos peptidomiméticos se conocen bien en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). Se proporcionan detalles adicionales a este respecto posteriormente el presente documento.
Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) del péptido pueden estar sustituidos, por ejemplo, mediante enlaces N-metilados (-N(CHa)-CO-), enlaces éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en los que R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-), enlaces retro amida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en los que R es la cadena lateral "normal", presentada naturalmente en el átomo de carbono.
Estas modificaciones se pueden producir en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varias (2-3) al mismo tiempo.
Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, se pueden sustituir por aminoácidos sintéticos no naturales tales como Fenilglicina, TIC, naftilelartina (Nol), derivados metilados en el anillo de Phe, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr.
Además de lo expuesto anteriormente, los péptidos de la presente divulgación también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros no aminoácido (por ejemplo, ácidos grasos, hidratos de carbono complejos, etc.).
Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la posterior sección de reivindicaciones, el término "aminoácido" o "aminoácidos" se entiende que incluye los 20 aminoácidos de origen natural; los aminoácidos modificados in vivo de forma posterior a la traducción, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos no habituales que incluyen, pero no se limitan a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" incluye tanto D- como L-aminoácidos.
PROTEÍNAS DE FUSIÓN
Una proteína de fusión se puede preparar a partir de una proteína mediante fusión con una porción de una inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina. Más preferentemente, la porción de la inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada que es opcionalmente y más preferentemente una región constante de cadena pesada humana. La región constante de cadena pesada es lo más preferentemente una región constante de cadena pesada de IgG, y opcionalmente y lo más preferentemente es una cadena Fc, lo más preferentemente un fragmento Fc de IgG que comprende los dominios CH2 y CH3. Aunque se puede usar opcionalmente cualquier subtipo de IgG, es preferente el subtipo IgG1. La cadena de Fc puede ser opcionalmente una cadena de Fc conocida o "natural", o alternativamente puede estar mutada. Se describen algunos tipos de mutaciones ilustrativos no limitantes ejemplares en el documento de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 20060034852, publicado el 16 de febrero de 2006. La expresión "cadena de Fc" también comprende opcionalmente cualquier tipo de fragmento Fc.
Se han identificado varios restos de aminoácido específicos que son importantes para la actividad mediada por la región constante del anticuerpo en la subclase IgG. La inclusión, sustitución o exclusión de estos aminoácidos específicos permite por lo tanto la inclusión o exclusión de la actividad específica mediada por la región constante de la inmunoglobulina. Además, los cambios específicos pueden dar como resultado, por ejemplo, aglicosilación y/o otros cambios deseados en la cadena de Fc. Se pueden realizar opcionalmente al menos algunos cambios para bloquear una función de Fc que se considere indeseable, tal como un efecto del sistema inmune indeseable, como se describe con mayor detalle posteriormente.
Algunos ejemplos ilustrativos no limitantes de mutaciones que se pueden realizar en Fc para modular la actividad de la proteína de fusión incluyen los siguientes cambios (dados con respecto a la nomenclatura de secuencia de Fc que da Kabat, en Kabat EA y col.: Sequences of Proteins of Immunological Interest. US Department of Health and Human Services, NIH, 1991): 220C - > S; 233-238 ELLGGP - > EAEGAP; 265D - > A, preferentemente junto con 434N -> A; 297N - > A (por ejemplo para bloquear la N-glicosilación); 318-322 EYKCK - > AYACA; 330-331AP - > SS; o una combinación de los mismos (véase, por ejemplo M. Clark, "Chemical Immunol and Antibody Engineering", pp 1-31 para una descripción de estas mutaciones y sus efectos). El constructo para la cadena de Fc que caracteriza los cambios anteriores comprende opcional y preferentemente una combinación de la región bisagra con los dominios CH2 y CH3.
Las mutaciones anteriores se pueden poner en práctica opcionalmente para potenciar las propiedades deseadas o alternativamente para bloquear propiedades no deseadas. Por ejemplo, se mostró que la aglicosilación de anticuerpos mantenía la funcionalidad de unión deseada mientras que bloqueaba la depleción de linfocitos T o el disparo de la liberación de citoquinas, que pueden ser opcionalmente funciones no deseadas (véase M. Clark, "Chemical Immunol and Antibody Engineering", pp 1-31). La sustitución de la prolina 331 por serina puede bloquear la capacidad de activar el complemento, que se puede considerar opcionalmente una función no deseaba (véase M. Clark, "Chemical Immunol and Antibody Engineering", pp 1-31). El cambio de la alanina 330 por serina junto con este cambio también puede potenciar el efecto deseado de bloqueo de la capacidad de activar el complemento.
Se ha mostrado que los restos 235 y 237 están implicados en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), de modo que cambiar el bloqueo de restos de 233-238 como se describe también puede bloquear la actividad si la ADCC se considera que es una función no deseada.
El resto 220 es normalmente una cisteína para Fc de IgG1, que es el sitio en el que la cadena pesada forma una unión covalente con la cadena ligera. Opcionalmente, este resto se puede cambiar por una serina, para evitar cualquier tipo de unión covalente (véase M. Clark, "Chemical Immunol and Antibody Engineering", pp 1-31).
Los cambios anteriores en los restos 265 y 434 se pueden poner en práctica opcionalmente para reducir o bloquear la unión al receptor de Fc, que puede bloquear opcionalmente la funcionalidad no deseada de Fc relacionada con sus funciones en el sistema inmune (véase "Binding site on Human IgG1 for Fc Receptors", Shields y col., Vol 276, pp 6591-6604, 2001).
Se pretende que los cambios anteriores sean ilustraciones únicamente de cambios opcionales y no se pretende que sean limitantes de ninguna manera. Además, la explicación anterior se proporciona únicamente con fines descriptivos, sin el deseo de quedar unidos a ninguna hipótesis individual.
ADICIÓN DE GRUPOS
Si una proteína es una molécula lineal, es posible colocar diversos grupos funcionales en diversos puntos en la molécula lineal que son susceptibles para o adecuados para modificación química. Se pueden añadir grupos funcionales en los extremos de las formas lineales de la proteína. En algunas realizaciones, los grupos funcionales aumentan la actividad de la proteína con respecto a una o más características, que incluyen, pero no se limitan a, aumento de estabilidad, penetración (a través de membranas celulares y/o barreras tisulares), localización del tejido, eficacia, disminución de la eliminación, disminución de la toxicidad, aumento de la selectividad, aumento de la resistencia a la expulsión mediante bombas celulares, y similares. Por razones de conveniencia y sin desear ser limitante, el extremo N libre de una de las secuencias contenidas en las composiciones de la invención se denominará extremo N de la composición, y el C terminal libre de la secuencia se considerará el extremo C de la composición. Cualquiera del extremo C poder extremo N de las secuencias, o ambos, se pueden unir a un grupo funcional de ácido carboxílico o un grupo funcional de amina, respectivamente.
Los ejemplos no limitantes de grupos funcionales adecuados se describen en Green y Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Capítulos 5 y 7, 1991. Los grupos protectores preferentes son los que facilitan al transporte del principio activo unido los mismos en una célula, por ejemplo, por reducción de la hidrofilia y aumentando la lipofilia del principio activo, siendo éstos un ejemplo para "un resto para transporte a través de membranas celulares".
Estos restos se pueden escindir opcional y preferentemente in vivo, por hidrólisis o de forma enzimática, dentro de la célula. (Ditter y col., J. Pharm. Sci. 57: 783 (1968); Ditter y col., J. Pharm. Sci. 57: 828 (1968); Ditter y col., J. Pharm. Sci. 58: 557 (1969); King y col., Biochemistry 26: 2294 (1987); Lindberg y col., Drug Metabolism and Disposition 17: 311 (1989); y Tunek y col., Biochem. Pharm. 37: 3867 (1988), Anderson y col., Arch. Biochem. Biophys. 239: 538 (1985) y Singhal y col., FASEB J. 1: 220 (1987)). Los grupos protectores de hidroxilo incluyen grupos protectores de ésteres, carbonatos y carbamato. Los grupos protectores de amina incluyen grupos alcoxi y ariloxi carbonilo, como se ha descrito anteriormente parados grupos protectores N-terminales. Los grupos protectores de ácido carboxílico incluyen ésteres alifáticos, bencílicos y arilo, como se ha descrito anteriormente para grupos protectores C-terminales. En una realización, el grupo ácido carboxílico en la cadena lateral de uno o más restos de ácido glutámico o ácido aspártico en una composición de la presente invención se protege, preferentemente con un éster de metilo, etilo, bencilo o bencilo sustituido, más preferentemente como un éster de bencilo.
Los ejemplos ilustrativos no limitantes de grupos protectores N-terminales incluyen grupos acilo (-CO-R1) y grupos alcoxi carbonilo o ariloxi carbonilo (-CO-O-R1), en los que R1 es un grupo alifático, alifático sustituido, bencilo, bencilo sustituido, aromático o un aromático sustituido. Los ejemplos específicos de grupos acilo incluyen, pero no se limitan a, acetilo, (etil)-CO-, n-propil-CO-, iso-propil-CO-, n-butil-CO-, sec-butil-CO-, t-butil-CO-, hexilo, lauroílo, palmitoílo, miristoílo, estearilo, oleoíl fenil-CO-, fenilo sustituido-CO-, bencil-CO- y (bencilo sustituido)-CO-. Los ejemplos de grupos alcoxi carbonilo y ariloxi carbonilo incluyen CH3-O-CO-, (etil)-O-CO-, n-propil-O-CO-, iso-propil-O-cO-, n-butil-O-CO-, sec-butil-O-CO-, t-butil-O-CO-, fenil-O- CO-, fenilo sustituido-O-CO- y bencil-O-CO-, (bencilo sustituido)-O-CO-, Adamantano, naftaleno, miristoleílo, tolueno, bifenilo, cinamoílo, nitrobenzoílo, toluoílo, furoílo, benzoílo, ciclohexano, norbornano, o Z-caproico. Con el fin de facilitar la N-acilación, de uno a cuatro restos de glicina pueden estar presentes en el extremo N de la molécula.
El grupo carboxilo en el extremo C del compuesto se puede proteger, por ejemplo, mediante un grupo que incluye, pero no se limita a, una amida (es decir, el grupo hidroxilo en el extremo C se reemplaza con -NH2, -NHR2 y -NR2R3) o éster (es decir, el grupo hidroxilo en el extremo C se reemplaza con -OR2). R2 y R3 son opcionalmente de forma independiente un grupo alifático, alifático sustituido, bencilo, bencilo sustituido, arilo o un arilo sustituido. Además, tomados junto con el átomo de nitrógeno, R2 y R3 pueden formar opcionalmente un anillo heterocíclico C4 a Ce con aproximadamente 0-2 heteroátomos adicionales tales como nitrógeno, oxígeno o azufre. Los ejemplos adecuados no limitantes de anillos heterocíclicos incluyen piperidinilo, pirrolidinilo, morfolino, tiomorfolino o piperazinilo. Los ejemplos de grupos protectores C-terminales incluyen, pero no se limitan a, -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2, -NH(etilo), -N(etil)2, -N(metil) (etilo), -NH(bencilo), -N(alquil Ci -C4)(bencilo), -NH(fenilo), -N(alquil C1-C4) (fenilo), -OCH3, -O-(etilo), -O-(n-propilo), -O-(n-butilo), -O-(iso-propilo), -O-(sec-butilo), -O-(t-butilo), -O-bencilo y -O-fenilo.
MODIFICACIONES QUÍMICAS
En la presente invención, cualquier parte de una proteína de la invención se puede modificar químicamente de forma opcional, es decir cambiar mediante la adición de grupos funcionales. Por ejemplo, los restos de aminoácido lateral que aparecen en la secuencia nativa se pueden modificar opcionalmente, aunque, tal como se describe a continuación y, como alternativa, otras partes de la proteína se pueden modificar opcionalmente, además de o en lugar de los restos de aminoácido lateral. La modificación se puede realizar opcionalmente durante la síntesis de la molécula si a continuación sigue un procedimiento de síntesis química, por ejemplo mediante la adición de un aminoácido modificado químicamente. Sin embargo, también es posible la modificación química de un aminoácido cuando ya está presente en la molécula (modificación "in situ").
El aminoácido de cualquiera de las regiones de la secuencia de la molécula se puede modificar opcionalmente de acuerdo con uno cualquiera de los siguientes tipos de modificación ejemplares (en el péptido visualizado de forma conceptual como "modificado químicamente"). Los tipos de modificación ejemplares no limitantes incluyen carboximetilación, acilación, fosforilación, glicosilación o acilación grasa. Opcionalmente se pueden usar enlaces de éter para unir el hidroxilo de la serina o treonina al hidroxilo de un azúcar. Opcionalmente se pueden usar enlaces de amida para unir los grupos carboxilo de glutamato o aspartato a un grupo amino en un azúcar (Garg y Jeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press (1985); Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26: 294-308 (1987)). Opcionalmente, también se pueden formar enlaces de acetal y cetal entre aminoácidos e hidratos de carbono. Opcionalmente se pueden preparar derivados de acilo de ácido graso, por ejemplo, por acilación de un grupo amino libre (por ejemplo, lisina) (Toth y col., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier y Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, 1078-1079 (1990)).
Como se usa en el presente documento, la expresión "modificación química", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una proteína o péptido en los que al menos uno de sus restos de aminoácidos se modifica mediante procedimientos naturales, tales como procesamiento u otras modificaciones posteriores a la traducción, o mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Los ejemplos de las numerosas modificaciones conocidas incluyen por lo general, pero no se limitan a: acetilación, acilación, amidación, ADP-ribosilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, metilación, miristilación, pegilación, prenilación, fosforilación, ubiquitinación, o cualquier procedimiento similar.
Otros tipos de modificaciones incluyen opcionalmente la adición de un resto de cicloalcano a una molécula biológica, tal como una proteína, como se describe en la Solicitud de PCT N° WO 2006/050262. Estos restos se diseñan para uso con biomoléculas y se pueden usar opcionalmente para impartir diversas propiedades a las proteínas.
Además, opcionalmente se puede modificar cualquier punto en una proteína. Por ejemplo, opcionalmente se puede realizar la pegilación de un resto de glicosilación en una proteína, tal como se describe en la Solicitud de PCT N° WO 2006/050247. Opcionalmente se puede añadir uno o más grupos de polietilenglicol (PEG) a la glicosilación unida a O y/o unida a N. El grupo PEG puede ser opcionalmente ramificado o lineal. Opcionalmente, cualquier tipo de polímero soluble en agua se puede unir a un sitio de glicosilación en una proteína a través de un engarce de glicosilo.
GLICOSILACIÓN ALTERADA
Las proteínas de la invención se pueden modificar para que tengan un patrón de glicosilación alterado (es decir, alterado a partir del patrón de glicosilación original o nativo). Como se usa en el presente documento, "alterado" se refiera que tiene uno o más restos de hidrato de carbono suprimidos, y/o tiene al menos un sitio de glicosilación añadido a la proteína original.
La glicosilación de proteínas por lo general está unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las especies de reconocimiento para unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más habitualmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación a proteínas de la invención se consigue de forma conveniente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de la proteína de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas que se han descrito anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución con, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia de la proteína original (para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos de la proteína también se puede alterar mediante la introducción de cambios al nivel del ADN.
Otros medios para aumentar el número de restos de hidrato de carbono en las proteínas es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a los restos de aminoácido de la proteína. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, los azúcares se pueden unir a (a) arginina y histidina, (b) grupos carboxilo libre, (c) grupos sulfhidrilo libre tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libre tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento de patente WO 87/05330, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306 (1981).
La retirada de cualquier resto de hidrato de carbono presente en las proteínas de la invención se puede conseguir por vía química o por vía enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína a ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento va como resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando la secuencia de aminoácidos intacta.
La desglicosilación química se describe en Hakimuddin y col., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987); y en Edge y col., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de restos de hidrato de carbono en las proteínas se puede conseguir mediante el uso de una diversidad de endo- y exo-glicosidasas tal como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO
Tal como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, las proteínas de C1ORF32 o proteínas y polipéptidos de C1ORF32 de la presente divulgación o secuencia de ácidos nucleicos o fragmentos de los mismos, especialmente el ectodominio o formas secretadas de proteínas de C1ORF32, así como fármacos que se unen específicamente a las proteínas de C1ORF32 y/o variantes de corte y empalme, y/o fármacos que agonizan o antagonizan la unión de otros restos a las proteínas de C1ORF32 y/o variantes de corte y empalme, y/o fármacos que modulan (agonizan o antagonizan) al menos una actividad biológica relacionada con C1ORF2 (tales fármacos incluyen a modo de ejemplo anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos, ribozimas, moléculas antisentido, ARNip y similares), se pueden usar para tratar cáncer, que incluye pero no se limita a tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro y en las que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, que incluye pero no se limita a tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma No Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico, y/o para bloquear o estimular la coestimulación inmune mediada por el polipéptido de C1ORF32 en un sujeto.
El sujeto de acuerdo con la presente invención es un mamífero, preferentemente un ser humano que se diagnostica con uno de la enfermedad, trastornó o afecciones que se han descrito anteriormente en el presente documento, o como alternativa está predispuesto al menos un tipo de cáncer, que incluye pero no se limita a tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" se refiere a prevenir, curar, invertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener los efectos perjudiciales de las enfermedades, trastornos afecciones que se han descrito anteriormente.
Se observará que el tratamiento de las enfermedades que se han descrito anteriormente de acuerdo con la presente invención se puede combinar con otros procedimientos de tratamiento conocidos en la técnica (es decir, terapia de combinación). Por lo tanto, el tratamiento de neoplasias usando los agentes de la presente invención se puede combinar, por ejemplo, con terapia de radiación, terapia de anticuerpos y/o quimioterapia.
Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento y en la sección de Ejemplos que sigue a continuación, las secuencias biomoleculares de este aspecto de la presente invención se pueden usar como cerámicas terapéuticas valiosas en el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones en los que se sabe que la actividad alterada o la expresión del producto genético de tipo silvestre (proteína conocida) contribuye al inicio o progresión de la enfermedad, trastorno o afección. Por ejemplo, en el caso de que una enfermedad esté causada por la sobreexpresión de un receptor unido a la membrana, se puede usar una variante soluble del mismo como un antagonista que compite con el receptor para la unión del ligando, para terminar de este modo con la señalización del receptor.
Anticuerpos anti-C1ORF32
Los anticuerpos de la invención incluyendo en particular los que tienen las secuencias de la línea germinal, anticuerpos homólogos, anticuerpos con modificaciones con su relativas, anticuerpos sometidos a ingeniería y modificados se caracterizan por características o propiedades funcionales en particular de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen de forma específica a C1ORF32 humano. Preferentemente, un anticuerpo de la invención se une al C1ORF32 correspondiente con alta afinidad, por ejemplo con una KD de 10"8 M o inferior o 10"9 M o inferior o incluso 10"10 M o inferior. Los anticuerpos anti-C1ORF32 de la invención presentan preferentemente una o más de las siguientes características:
(i) se une al C1ORF32 humano correspondiente con una KD de 5. X 10"8 M o inferior;
(ii) modula (aumenta o inhibe) la coestimulación inmune de B7 y actividades y funcionar relacionadas tales como respuesta de linfocitos T implicados en inmunidad y autoinmunidad en antitumoral, y / o
(iii) se une al antígeno de C1ORF32 expresado mediante células cancerígenas que incluyen, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, pero básicamente no se une a células normales. Además, estos anticuerpos y conjugados de los mismos serán eficaces preferentemente para provocar la eliminación selectiva de tales células cancerígenas y para modular respuestas inmunes implicadas en autoinmunidad y cáncer.
Más preferentemente, el anticuerpo se une al antígeno de C1ORF32 humano correspondiente con una KD de 3 X 10"8 M o inferior, o con una KD de 1 X 10"9 M o inferior, o con una KD de 0,1. X 10"9 M o inferior, o con una KD de 0,05. X 10"9 M o inferior o con una KD entre 1 X 10-9 y 1 X 10 -11 M.
En la técnica se conocen ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia C1ORF32, incluyendo por ejemplo, ELISA, transferencias de Western y RIA. En los Ejemplos se describen con detalle ensayos adecuados. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tal como el análisis de Biacore.
Después de la producción de anticuerpo anti-C1ORF32, las secuencias de anticuerpos se pueden unir a C1ORF32 y las secuencias de VH y VL "se pueden mezclar y emparejar" para crear otras moléculas de unión a anti-C1ORF32 de la invención. La unión a C1ORF32 de tales anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede someter a ensayo usando los ensayos de unión que se han descrito anteriormente (por ejemplo, ELISA). Preferentemente, cuando se mezclan y emparejan cadenas de VH y VL, una secuencia de VH a partir de un emparejamiento de VH/VL en particular se sustituye con una secuencia de VH estructuralmente similar. De forma análoga, preferentemente una secuencia de VL de un emparejamiento de VH/VL en particular se sustituye con una secuencia de VL estructuralmente similar. Por ejemplo, las secuencias de VH y VL de anticuerpos homólogos son particularmente susceptibles de mezcla y emparejamiento.
ANTICUERPOS QUE TIENEN SECUENCIAS DE LA LÍNEA GERMINAL EN PARTICULAR
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de la línea germinal en particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de la línea germinal en particular.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de la línea germinal en particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que usa genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Tales sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que portan genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o la identificación sistemática de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana presentada en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana se puede identificar como tal por comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano a las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que tiene la secuencia más próxima (es decir, el % de identidad más elevado) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana en particular puede contener diferentes aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas de origen natural o introducción intencionada de mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado por lo general puede tener una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90 % a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene restos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como que es humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal amino de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede tener una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 95, un 96, un 97, un 98 o un 99 %, o incluso puede tener una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 96 %, un 97 %, un 98 %, o un 99 % a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Por lo general, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de la línea germinal humana en particular presentara no más de 10 aminoácidos diferentes de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede presentar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 aminoácidos diferentes de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.
ANTICUERPOS HOMÓLOGOS
En otra realización más, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de antiC1ORF32 aislado de anticuerpos anti-C1ORF32 preferentes, en las que los anticuerpos mantienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-C1ORF32 precursores.
Como se usa en el presente documento, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = N° de posiciones idénticas/ N° de posiciones totales X 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y del tamaño de cada hueco, que es necesario introducir a la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre secuencias se pueden realizar usando un algoritmo matemático, tal como se describe en los ejemplos más limitantes que siguen a continuación.
El porcentaje identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que usar una tabla de resto de peso de PAM120, una penalización del tamaño del hueco de 12 y una penalización del hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP y en el paquete de software de GCG (disponible en el mercado), usando cualquiera de una matriz Blossum 62 o una matriz pAm250, y un peso de hueco de 16,14. 12.10, 8, 6, o 4 y un peso del tamaño 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Además o como alternativa, las secuencias de proteínas de la presente invención se pueden usar adicionalmente como una "secuencia de búsqueda" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden realizar usando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y col. (1990) J Mol. Biol. 215: 403-10. Se pueden realizar búsquedas de proteínas con b La ST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de la palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologadas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede usar BLAST con Huecos tal como se describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res.
25(17): 3389-3402. Cuando se usan los programas BLAST y BLAST con Huecos, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
Anticuerpos con modificaciones conservativas
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en las que una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos especificadas en base a anticuerpos anti-C1ORF32 deferentes aislados y producidos usando procedimientos en el presente documento, o modificaciones conservativas de las mismas, y en las que los anticuerpos mantienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos antiC1ORF32 de la invención. En diversas realizaciones, los anticuerpos anti-C1ORF32 pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "modificaciones conservativas de secuencia " pretende hacer referencia a modificaciones en aminoácidos que no afectan de forma significativa ni alteran las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son aquéllas en las que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones de CDR de un anticuerpo de la invención se pueden reemplazar con otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado se puede someter a ensayo para la función retenida (es decir, las funciones que se establecen en (c) a (j) mencionados anteriormente) usando los ensayos funcionales que se describen en el presente documento.
Anticuerpos que se unen al mismo epítopo como anticuerpos anti-C1ORF32 de la invención
En otra realización, la invención proporciona anticuerpos que se unen a epítopo preferentes en C1ORF32 humano que poseen propiedades funcionales deseadas tales como modulación de la coestimulación de B7 y funciones relacionadas. Se pueden seleccionar otros anticuerpos con especificidad deseada para el epítopo y tendrán la capacidad de competir de forma cruzada para la unión al antígeno de C1ORF32 con los anticuerpos deseados. ANTICUERPOS MANIPULADOS POR INGENIERÍA Y MODIFICADOS
Un anticuerpo de la invención se puede preparar adicionalmente usando una o más de las secuencias de VH y/o VL derivadas de un material de partida de anticuerpo anti-C1ORF32 para modificar por ingeniería un anticuerpo modificado, anticuerpo modificado que puede tener propiedades alteradas con respecto al anticuerpo de partida. Un anticuerpo se pone modificar por ingeniería modificando uno o más restos dentro de de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo dentro de una o más regiones de CDR y/o dentro de una o más regiones del marco conservado. Además o como alternativa, un anticuerpo se puede modificar por ingeniería modificando restos dentro de las regiones constantes, por ejemplo para alterar las funciones efectuadas del anticuerpo.
Un tipo de modificación por ingeniería de región variable que se puede realizar es injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente a través de restos de aminoácidos que se encuentran en las seis regiones que determinan la complementariedad de cadena pesada y ligera (CDR). Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos de origen natural específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR a partir del anticuerpo de origen natural específico injertado en secuencias de marco conservado a partir de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. y col. (1998) Nature 332: 323­ 327; Jones, P. y col. (1986) Nature 321: 522-525; Queen, C. y col. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029­ 10033; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.225.539 de Winter, y los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen y col.)
Se pueden obtener secuencias de marco conservado adecuadas a partir de darte las bases de datos públicas de ADN o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet), así como en Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación de NIH N° 91-3242; Tomlinson, I. M., y col. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798; y Cox, J. P. L. y col. (1994) "A Directory of Human Germ­ line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J Immunol. 24: 827-836.
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR 1, CDR2 y/o c DR3 de VH y/o VL para mejorar de ese modo las propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Se puede realizar mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir las mutaciones y el efecto en la unión al anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, se puede evaluar en ensayos apropiados in vitro o in vivo. Se introducen modificaciones preferentemente conservativas (tal como se ha discutido anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, pero son preferentemente sustituciones. Además, por lo general se altera no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos dentro de una región de CDR.
Los anticuerpos modificados por ingeniería de la invención incluyen aquéllos en los que se han realizado modificaciones a restos de marco conservado dentro de VH y/o VL, por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Por lo general, tales modificaciones de marco conservado se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es “retromutar" uno, son estos de marco conservado a la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que ha experimentado mutación somática puede contener restos de marco conservado que difieren de la secuencia de línea germinal a partir de la que se deriva el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar por comparación de las secuencias de marco conservador del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de las que se deriva el anticuerpo.
Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro de las regiones de marco conservado o de CDR, los anticuerpos de la invención se pueden modificar por ingeniería para que incluyan modificaciones dentro de la región de Fc, por lo general para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media en suero, fijación de complementos, unión del receptor de Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, uno o más restos químicos se pueden unir al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Tales realizaciones se describen adicionalmente a continuación. La numeración de los restos en la región de Fc es la del índice EU de Kabat.
En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de modo que se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.677.425 de Bodmer y col. el número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo está mutada para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introduce una o más mutaciones de aminoácidos en la región de superficie de contacto del dominio CH2-CH3 del fragmento de Fc-bisagra de modo que el anticuerpo tiene unión a proteína A de Staphylococcyl (SpA) alterada con respecto a la unión de SpA del dominio de Fc-bisagra nativo. Este enfoque se describe con detalles adicionales en el documento de Patente de Estados Unidos N° 6.165.745 de Ward y col. En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, se puede introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, tal como se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N° 6.277.375 de Ward. Como alternativa, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL un epítopo de unión al receptor de recuperación tomado a partir de dos lazos de un dominio de CH2 de una región de Fc de una IgG, tal como se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.869.046 y 6.121.022 de Presta y col. Además en otras realizaciones, la región de Fc se altera por sustitución de al menos un resto de aminoácido con un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados entre los restos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 32o y 322 se pueden reemplazar con un resto de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tiene una afinidad alterada para un ligando efector pero mantiene la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo precursor. El ligando con respecto al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con detalles adicionales en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.624.821 y 5.648.260, ambos de Winter y col.
En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados entre los restos de aminoácidos 329, 331 y 322 se pueden reemplazar con un resto de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tiene la unión a C1q alterada y/o reducida o cito toxicidad dependiente del complemento suprimida (CDC). Este enfoque se describe con detalles adicionales en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 6.194.551 de Idusogie y col.
En otro ejemplo, uno o más restos de aminoácidos dentro de las posiciones de los aminoácidos 231 y 239 se alteran para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la Publicación PCT del documento de patente WO 94/29351 de Bodmer y col.
Además, en otro ejemplo, la región de Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo para un receptor de Fcy por modificación de uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este enfoque se describe adicionalmente en la Publicación PCT del documento de patente WO 00/42072 de Presta. Además, se han realizado mapas de los sitios de unión en la IgG1 humana para Fc gamma, Fc gamma RII, Fc gamma RIII y FcRn y se han descrito variantes con aumento de la unión (véase Shields, R. L. y col. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). Se muestran mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 para aumentar la unión para FcyRIII. Además, se muestran los siguientes mutantes de coordinación para mejorar la unión a Fc gamma. RIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.
Además, en otra realización, se modifica la glicosilación del anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicoslado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo hacia el antígeno. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden realizar, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se puede realizar una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del marco conservado de la región variable para eliminar de este modo la glicosilación en ese sitio. Tal glicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo hacia el antígeno. Tal enfoque se describe con detalles adicionales en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.714.350 y 6.350.861 de Co y col.
Además o como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tiene algún tipo de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tiene aumento de estructuras de GlcNac de bisección. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden realizar, por ejemplo, mediante la expresión del anticuerpo en una célula anfitriona con maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con maquinaria de glicosilación alterada y se pueden usar como células anfitrionas en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de ese modo un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen del gen de la fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares de Ms704, Ms705, y Ms709 carecen de fucosa en sus hidratos de carbono. Las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 FUT8.-/- se crean mediante alteración fijada como diana del gen FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de sustitución (véase la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20040110704 de Yamane y col. e Yamane-Ohnuki y col. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). Como otro ejemplo, el documento de patente EP 1.176.195 de Hanai y col. describe una línea celular con un gen de FUT8 alterado funcionalmente, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en tal línea celular presentan hipofucosilación mediante reducción o eliminación de la enzima relacionada con el enlace alfa 1,6. Hanai y col. también describen líneas celulares que tienen una actividad enzimática baja para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo o no tiene actividad enzimática, por ejemplo la línea celular YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). La Publicación PCT del documento de patente WO 03/035835 de Presta describe una línea celular de CHO variable, células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a hidratos de carbono unidos a Asn (297), dando tan y como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula anfitriona (véase también Shields, R. L. y col. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La Publicación PCT del documento de patente WO 99/54342 de Umana y col. describe líneas celulares modificadas por ingeniería para expresar glicosil transferasas que modifican glicoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas por ingeniería presentan aumento de estructuras de GlcNac de bisección que dan como resultado un aumento de la actividad de ADCC de los anticuerpos (véase también Umana y col. (1999) Nat. Biotech. 17: 176­ 180). Como alternativa, los restos de fucosa del anticuerpo se pueden retirar por escisión usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa retirar restos de fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, A. L. y col. (1975) Biochem. 14: 5516-23).
Otra modificación de los anticuerpos en el presente documento que se contempla en la invención es la pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la vida media biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, por lo general se hace reaccionar con polietilenglicol (p Eg ), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos de PEG se llegan a unir al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se realiza a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende incluir cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tal como mono alcoxi (C1-C10)- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. En la técnica se conocen procedimientos para pegilar proteínas y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, el documento de patente EP 0154316 de Nishimura y col. y el documento de patente EP 0401 384 de Ishikawa y col.
PROCEDIMIENTOS DE MODIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR INGENIERÍA
Como se ha discutido anteriormente, los anticuerpos anti-C1ORF32 que tienen secuencias de VH y VK que se desvelan en el presente documento se pueden usar para crear nuevos anticuerpos anti-C1ORF32, respectivamente, por modificación de las secuencias de VH y/o VL, o las regiones constantes unidas a los mismos. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-C1ORF32, de la invención, se usan para crear anti-C10RF32 relacionados de forma estructural; los anticuerpos que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal comunión a C1ORF32 humano. Por ejemplo, una o más regiones de CDR de un anticuerpo C1ORF32 o mutaciones del mismo, se pueden combinar de forma recombinante con regiones demarco conservado conocidas y/o otras CDR para crear anticuerpos anti-C1ORF32 adicionales, modificados por ingeniería de forma recombinante de la invención, tal como se ha discutido anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las que se describen en la sección anterior. El material de partida para el procedimiento de modificación por ingeniería es una o más de las secuencias de VH y/o VK proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones de CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo modificado por ingeniería, realmente no es necesario preparar (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tienen una o más de las secuencias de VH y/o VK proporcionadas en el presente documento, o una o más las regiones de del mismo. En su lugar, la información contenida en las secuencias se usa como el material de partida para crear una secuencia de "segunda generación" derivada de las secuencias originales y a continuación la secuencia de "segunda generación" se prepara y se expresa como una proteína.
Se pueden usar técnicas convencionales de biología molecular para preparar expresar secuencia de anticuerpo alterado.
Preferentemente, el anticuerpo codificado por las secuencias de anticuerpo alterado es uno que mantiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-C1OF32, respectivamente, producido con procedimientos y con secuencias proporcionadas en el presente documento, cuyas propiedades funcionales incluyen unión al antígeno de C1ORF32 con un nivel de KD específico o inferior y/o la modulación de la coestimulación de B7 y/o unión de forma selectiva a células diana deseadas tal como cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, que expresan el antígeno de C1ORF32.
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar usando ensayos convencionales disponibles en la técnica y/o que se describen en el presente documento.
En ciertas realizaciones de los procedimientos de modificación por ingeniería de los anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria o de forma selectiva a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de anticuerpo anti-C1ORF32 y los anticuerpos anti-C1ORF32 modificados resultantes se pueden identificar sistemáticamente para actividad de unión y/o otras propiedades funcionales deseadas.
Se han descrito en la técnica procedimientos de mutación. Por ejemplo, la Publicación PCT del documento de patente WO 02/092780 de Short describe procedimientos para crear e identifica sistemáticamente mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, ensamblaje de ligación sintética, o una combinación de los mismos. Como alternativa, la Publicación PCT del documento de patente WO 03/074679 de Lazar y col. describe procedimientos para usar procedimientos de identificación sistemática computacional para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.
MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN ANTICUERPOS DE LA INVENCIÓN
Otro aspecto de la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o básicamente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se hace básicamente puro" cuando se purifica más allá de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, y col., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la divulgación puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intrónicas. En una realización preferente, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.
Los ácidos nucleicos de la divulgación se pueden obtener usando técnicas convencionales de biología molecular. Para anticuerpos expresados mediante hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina humana tal como se describe adicionalmente a continuación), se pueden obtener ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo preparado mediante el hibridoma mediante amplificación convencional de PCR o técnicas de clonación de ADNc. Para anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, usando técnicas de presentación de fagos), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede recuperar a partir de la biblioteca.
Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican segmentos de VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas convencionales de ADN recombinante, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmento de Fab o para un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une de forma operativa a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un engarce flexible.
La expresión "unido de forma operativa", tal como se usa en este contexto, pretende indicar que los dos fragmentos de a Dn se unen de modo que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanece en marco.
El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo de forma operativa el ADN que codifican la VH con otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación de NIH N° 91-3242) y fragmentos de ADN que incluyen estas regiones se pueden obtener mediante amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo más preferentemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento de Fab, el ADN que codifica la VH se puede unir de forma operativa a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante CH1 de cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de cadena ligera de cadena completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) uniendo de forma operativa el ADN que codifica la VL en otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación de NIH N° 91-3242) y fragmentos de ADN que incluyen estas regiones se pueden obtener mediante amplificación de PCR convencional. La región constante y cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero lo más preferentemente es una región constante kappa.
Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen de forma operativa a otro fragmento que codifica un engarce flexible, por ejemplo, que codifican la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias de VH y VL se pueden expresar como una proteína contigua de una sola cadena, con las regiones VL y VH unidas por el engarce flexible (véase por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242: 423-426; Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty y col., (1990) Nature 348: 552-554).
Producción de Anticuerpos Monoclonales Anti-C1ORF32 de la Invención
Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente invención se pueden producir mediante una diversidad de técnicas, que incluyen metodología convencional de anticuerpo monoclonal por ejemplo, la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque en principio son precedentes los procedimientos de hibridación de células somáticas, se pueden usar otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B.
Un sistema animal preferente para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. En la técnica se conocen protocolos y técnicas de inmunización para aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión. También se conocen asociados de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.
Se pueden preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención en base a la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparada tal como se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma murino de interés y modifica por ingeniería para contenga secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana) usando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden unir a regiones constantes humanas usando procedimientos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos N° 4.816.567 de Cabilly y col.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones de CDR murino se pueden insertar en un armazón humano usando procedimientos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.225.539 de Winter, y los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen y col.).
En una realización preferente, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos frente a VSIG1 se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones denominados en el presente documento RTM de Ratón HuMAb y RTM de Ratón KM. respectivamente, y en el presente documento se denominan de forma colectiva "ratones Ig humanos". El TM. de Ratón HuMAb (Medarex. Inc.) contiene minisitios de gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina sin reorganizar de cadena pesada (mu y gamma) y ligera kappa humanas, junto con mutaciones fijadas como diana que inactivan los sitios endógenos de cadena mu y kappa (véase por ejemplo, Lonberg, y col. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan expresión reducida de IgM o kappa de ratón, y como respuesta la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera introducidos experimentan intercambio de clases y mutación somática para generar IgG kappa monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. y col. (1994), mencionado anteriormente; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación y uso del TM. de Ratón HuMAb., y las modificaciones genómicas que portan tales ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. y col. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. y col. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724; Choi y col. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. y col. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon y col. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. y col. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse adicionalmente, los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todos de Lonberg y Kay; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.545.807 de Surani y col.; Publicaciones PCT de los documentos de patente con números WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y Publicación PCT del documento de patente N° WO 01/14424 de Korman y col.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se pueden aumentar usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Tales ratones, denominados en el presente documento "TM. de ratones KM", se describen con detalle en la Publicación PCT del documento de patente WO 02/43478 de Ishida y col.
Además adicionalmente, en la técnica están disponibles sistemas alternativos de animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana y se pueden usar para aumentar los anticuerpos anti-VSIG1. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo denominado Xenoratón (Abgenix, Inc.); tales ratones se describen, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati y col.
Además, en la técnica están disponibles sistemas alternativos de animales transcromosómicos que expresan genes de inmunoglobulina humana y se pueden usar para aumentar los anticuerpos anti-C1ORF32 de la invención. Por ejemplo, se pueden usar ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl. Acad Sci. USA 97: 722-727. Además, en la técnica se han descrito vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligera (Kuroiwa y col. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894) y se pueden usar para aumentar los anticuerpos anti-VSIG1.
También se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos de la invención usando procedimientos de presentación de fagos para bibliotecas de identificación sistemática de genes de inmunoglobulina humana. En la técnica se establecen tales procedimientos de presentación de fagos para aislar anticuerpos humanos. Véanse por ejemplo: documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner y col.; documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.427.908 y 5.580.717 de Dower y col.; documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty y col.; y documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths y col.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se deben preparar usando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunes humanas de modo que se cree generar una respuesta al anticuerpo humano después de la inmunización. Tales ratones se describen, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson y col.
INMUNIZACIÓN DE RATONES IG HUMANOS
Cuando se usan ratones Ig humanos para aumentar los anticuerpos humanos de la invención, tales ratones se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida de antígeno de C1ORF32 y/o C1ORF32 recombinante, o proteína de fusión de C1ORF32, tal como se describe en Lonberg, N. y col. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y en la Publicación PCT del documento de patente WO 98/24884 y en el documento de patente WO 01/14424. Preferentemente, los ratones tendrán 6-16 semanas de edad después de la primera infusión. Por ejemplo, se puede usar una preparación purificada o recombinante (5-50 |jg) de antígeno C1ORF32 para inmunizar a los ratones Ig humanos por vía intraperitoneal.
La experiencia anterior con diversos antígenos por otros ha mostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal (IP) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones IP cada dos semanas (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, también se encuentra otros adyuvantes que no son el adyuvante de Freund son eficaces. Además, se encuentra que las células completas en ausencia de adyuvantes son altamente inmunogénicas. La respuesta inmune se puede controlar durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma que se obtienen mediante sangrados retroorbitales. El plasma se puede identificar sistemáticamente mediante ELISA (como se describe a continuación), y para las fusiones se pueden usar ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-C1ORF32. Los ratones pueden estimular por vía intravenosa con antígeno 3 días antes de sacrificarlos y extraer el bazo. Se espera que pueda ser necesario realizar 2-3 fusiones para cada inmunización. Por lo general se inmunizan entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Normalmente se usaron cepas tanto de HCo7 como de HCo12. Además, se pueden cruzar transgén tanto de HCo7 como de HCo12 en conjunto en un solo ratón que tiene dos transgenes de cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12). Como alternativa o adicionalmente, se puede usar la cepa de Ratón KM RTM.
GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS QUE PRODUCEN ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS DE LA INTERVENCIÓN
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención, se pueden aislar esplenocitos y/o células de los nódulos linfáticos a partir de ratones inmunizados y se pueden fusionar con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden identificar sistemáticamente para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, se pueden fusionar suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados con una sexta parte del número de células P3X63-Ag8.653 de mieloma de ratón de no secreción (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50 %. Las células se siembran a aproximadamente 2 X 10"5 en placa de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en un medio selectivo que contiene Suero de Clon fetal al 20 %, medios acondicionados "653" al 18%, origen al 5% (IGEN), L-glutamina4 mM, piruvato sódico 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; el HAT se añade 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar el medio en el HAT se reemplaza con hT. A continuación, los pocillos individuales se pueden identificar sistemáticamente mediante ELISA para anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG. Una vez que se produce crecimiento extenso de hibridoma, el medio se puede observar normalmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos se pueden volver a sembrar, se pueden identificar sistemáticamente de nuevo, y si aún son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al menos dos veces mediante dilución limitante. A continuación, los subclones estables se pueden cultivar in vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo tisular para caracterización.
Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, se pueden cultivar hibridomas seleccionados en matraz es con agitación de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobres garantes se pueden filtrar y concentrar antes de cromatografía por afinidad con proteína A-Sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para asegurar la pureza. La solución tampón se puede intercambiar en PBS, y la concentración se puede determinar mediante DO 280 usando el coeficiente de extinción 1,43. Se pueden tomar alícuotas de los anticuerpos monoclonales y almacenar a -80 grados C.
GENERACIÓN DE TRANSFECTOMAS QUE PRODUCEN ANTICUERPOS MONOCLONALES DE LA INVENCIÓN
También se pueden producir anticuerpos de la invención en un transfectoma de célula anfitriona usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y procedimientos de transfección genética tal como se conoce bien en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, se pueden obtener ADN que codifican cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, mediante técnicas convencionales de biología molecular (por ejemplo, amplificación de PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresión de modo que los genes se unen de forma operativa a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, la expresión "unido de forma operativa" pretende indicar que un gen del anticuerpo se une en un vector de modo que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula anfitriona de expresión usaba. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en un vector separado o, más habitualmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o ligamiento de extremo romo si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos que se describen en el presente documento se pueden usar para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado de modo que el segmento de VH se une de forma operativa a los segmentos de CH dentro del vector y el segmento de VK se une de forma operativa al segmento de CL dentro del vector. Además o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo desde una célula anfitriona. El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de modo que el péptido de señal se une en marco con el extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína que no es inmunoglobulina).
Además de los genes de cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias reguladores que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula anfitriona. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promoteres, potenciador es y otros elementos para el control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción a la traducción de los genes de la cadena del anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Los expertos en la materia observarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferentes para expresión de célula anfitriona de mamífero incluyen elementos virales que dirigen niveles elevados de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promoteres y/o potenciales derivados de citomegalovirus (CMV), Virus 40 de Simio (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Como alternativa, se pueden usar secuencias o reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de beta-globina. Además adicionalmente, los elementos reguladores formados por secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema de promotor SR alfa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del tipo o 1 del virus de leucemia de linfocitos T humanos (Takebe, Y. y col. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).
Además de los genes de cadena del anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células anfitrionas (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores que se pueden seleccionar. El gen marcador que se puede seleccionar facilita la selección de células anfitrionas en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, documentos de Patente de Estados Unidos con números 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todos de Axel y col.). Por ejemplo, por lo general, el gen marcador que se puede seleccionar confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula anfitriona en la que se ha introducido vector. Los genes marcadores que se pueden seleccionar preferentes incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células anfitrionas de dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).
Para expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se transfecta en una célula anfitriona mediante técnicas convencionales. Las diversas formas del término "transfección" pretenden incluir una gran diversidad de técnicas usadas normalmente para la introducción de ADN exógeno en una célula anfitriona procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención en cualquier célula anfitriona procariota eucariota, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y lo más preferentemente en unas anfitrionas de mamífero, es lo más preferente porque en tales células eucariotas, y en particular células de mamífero, es más probable que las células procariota se ensamblen y se pretende un anticuerpo plegado adecuadamente e inmunológicamente activo. Se ha informado que la expresión procariota de genes de anticuerpo es ineficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).
Las células anfitrionas de mamíferos preferentes para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo cédulas de CHO de dhfr, que se describen en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, tal como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma de NSO, células COS y células SP2. En particular, para uso con células de mieloma de NSO, otro sistema de expresión preferente es el sistema de expresión genética GS que se desvela en el documento de patente WO 87/04462, el documento de patente WO 89/01036 y el documento de patente EP 338.841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células anfitrionas de mamífero, los anticuerpos se producen por cultivo de las células anfitrionas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o, más preferentemente, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que están creciendo las células anfitrionas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos convencionales de purificación de proteínas.
CARACTERIZACIÓN DE UNIÓN DE ANTICUERPO A ANTÍGENO
Los anticuerpos de la invención se pueden someter a ensayo para unión a C1ORF32, por ejemplo, mediante ELISA convencional. En resumen, las placas de microtitulación se revisten con C1ORF32 purificado a 0,25 |jg/ ml en PBS, y a continuación se bloquean con albúmina de suero bovino al 5 % en PBS. Se añaden diluciones de anticuerpo (por ejemplo, dilaciones de plasma de ratones inmunizados con C1ORF32) a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37 grados C. Las placas se lavan con PBS/Tween y a continuación se incuban con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específico para Fc de IgG anti-humano de cabra) conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37 grados C. Después del lavado, las placas se desarrollan con sustrato de pNPP (1 mg/ml), y se analizan a DO de 405-650. Preferentemente, los ratones que desarrollan los títulos más elevados se usarán para fusiones.
También se puede usar un ensayo de ELISA tal como se ha descrito anteriormente para identificar sistemáticamente hibridomas que muestran reactividad positiva con el inmunógeno de C1ORF32. Los hibridomas que se unen con alta avidez a C1ORF32 se subclonan y se caracterizan adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células precursoras (mediante ELISA), se puede elegir para fabricar un banco 5-10 viales de células almacenadas a -140 grados C., y para purificación de anticuerpos.
Para purificar anticuerpos antiC1ORF32, los hibridomas seleccionado se puede cultivar en matraces de agitación de 2 litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrendantes se pueden filtrar y concentrar antes de cromatografía por afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía liquida de alto rendimiento para asegurar la pureza. La solución de tampón se puede intercambiar en PBS, y la concentración se puede determinar mediante DO 280 usando un coeficiente de extinción de 1,43. Se pueden tomar alícuotas de los anticuerpos monoclonales y almacenar a -80 grados C.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-C1ORF32 seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar usando reactivos disponibles en el mercado (Pierce, Rockford, III.). Se pueden realizar estudios de competición que usan anticuerpos monoclonales sin marcar y anticuerpos monoclonales biotinilados usando placas para ELISA revestidas con C1ORF32 tal como se ha descrito anteriormente. La unión de mAb biotinilado se puede detectar con una sonda de estreptavidina y fosfatasa alcalina.
Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, se pueden realizar ELISA de isotipo usando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo en particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, se pueden revestir pocillos de placas de microtitulación con 1 pg/ml de inmunoglobulina anti­ humana durante una noche a 4 grados C. Después de bloquear con BSA al 1 %, las placas se hacen reaccionar con 1 mug/ml o menos de anticuerpos monoclonales de ensayo o controles de isotipo purificado, a temperatura ambiente durante una a dos horas. A continuación, los pocillos se pueden hacer reaccionar con cualquiera de IgG1 humana o sondas conjugadas a fosfatasa alcalina específica para IgM humana. Las placas se desarrollan y se analizan tal como se ha descrito anteriormente.
Las IgG humanas anti-C1ORF32 se pueden someter al ensayo adicionalmente para reactividad con antígeno de C1ORF32, respectivamente, mediante transferencia de Western. En resumen, se puede preparar antígeno de C1ORF32 y someter a electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero bovino fetal al 10 %, y se sondan con los anticuerpos monoclonales a someter a ensayo. La unión de la IgG humana se puede detectar usando fosfatasa alcalina de IgG anti-humana y desarrollar con comprimidos de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
CONJUGADOS O INMUNOCONJUGADOS
En otro aspecto, la presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo antiC1ORF32, o un fragmento del mismo, conjugado a un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. En el presente documento, tales conjugados se denominan "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial (por ejemplo, elimina) para las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferentes de citotoxinas terapéuticas que se puede conjugar a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. En el mercado (Mylotarg.TM.; Wyeth) está disponible un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de caliqueamicina.
Las citotoxinas se pueden conjugar a anticuerpos de la invención usando tecnología de conectores disponible en la técnica. Los ejemplos de tipos de conectores que se han usado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y conectores que contienen péptidos. Se puede elegir un conector, es decir, por ejemplo, susceptible a escisión a pH bajo dentro del compartimento lisosomal o susceptible la escisión con proteasas, tal como proteasas que se expresan preferentemente en tejido tumoral tales como catepsinas (por ejemplo, las catepsinas B, C, D).
Para análisis adicional de tipos de citotoxinas, conectores y procedimientos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, véase también Saito, G. y col. (2003) Adv. Drug Deliv. Inv. 55: 199-215; Trail, P. A. y col. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T. M. (2002) Nat. Inv. Cancer 2: 750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P. D. y Springer, C. J.
(2001) Adv. Drug Deliv. Inv. 53: 247-264.
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar a un isótopo radiactivo para generar agentes radiofarmacéuticos citotóxicos, también denominados radioinmunoconjugados. Los ejemplos de isótopos radiactivos que se pueden conjugar a anticuerpos o para uso de forma diagnóstica o terapéutica incluyen, pero no se limitan a, yodo 131, indio 111, itrio 90 y lutecio 177. En la clínica se establecen procedimientos para preparar radioinmunoconjugados. En el mercado están disponibles ejemplos de radioinmunoconjugados, que incluyen Zevalin.TM. (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar.TM. (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden usar procedimientos similares para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invención.
Los conjugados de anticuerpo de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, y el resto de fármaco no se va a interpretar como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-gamma; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfomaquinas, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor de estimulación de colonias de macrófagos y granulocitos ("GM-CSF"), factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.
Las técnicas para conjugar tal resto terapéutico a anticuerpos se conocen bien, véanse, por ejemplo, Arnon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson y col. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Inv., 62: 119-58 (1982).
MOLÉCULAS DIESPECÍFICAS
En otro aspecto, la presente invención se refiere a moléculas diespecíficas que comprenden un anticuerpo antiC1ORF32, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antígenos del mismo, se puede derivatizar o unir a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula diespecífica que se une a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. De hecho, el anticuerpo de la invención se puede derivatizar anticuerpo o unir a más de una molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; también se pretende que tales moléculas multiespecíficas queden incluidas en la expresión "molécula diespecífica" tal como se usa en el presente documento. Para crear una molécula diespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención se puede unir funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una u otras moléculas de unión más, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que se obtiene una molécula diespecífica.
Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas diespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para C1ORF32 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. En una realización de la invención en particular, el segundo epítopo diana es un receptor de Fc, por ejemplo, RI Fc gamma humano (CD64) o un receptor Fc alfa humano (CD89). Por lo tanto, la invención incluye moléculas diespecíficas capaces de unirse tanto a R Fc gamma, R Fc alfa o R Fc épsilon que expresan células efectoras (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)), y las células diana que expresan C1ORF32. Estas moléculas diespecíficas dirigen células que expresan C1ORF32 a células efectoras y desencadenan actividades de células receptoras mediadas por el receptor Fc, tales como fagocitosis de una célula que expresa C1ORF32, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), liberación de citoquinas, o generación de anión superóxido.
En una realización de la invención en la que la molécula diespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir adicionalmente una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-6f. En una realización, la tercera especificidad de unión es una porción del factor anti-potenciación (EF), por ejemplo, una molécula que se une a una proteína de superficie implicada en actividad citotóxica y de ese modo aumenta la respuesta inmune frente a la célula diana.
La "porción del factor anti-potenciación" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y de ese modo da como resultado un aumento del efecto de los determinantes de unión para el receptor Fc o antígeno de célula diana. La "porción del factor anti-potenciación" se puede unir a un receptor Fc o a un antígeno de célula diana. Como alternativa, la porción de factor anti-potenciación se puede unir a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen la primera y segunda especificidades de unión. Por ejemplo, la porción del factor anti-potenciación se puede unir a un linfocito T citotóxico (por ejemplo, a través de CD2, c D3, Cd 8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que da como resultado un aumento de la respuesta inmune frente a la célula diana).
En una realización, las moléculas diespecíficas de la invención comprenden, como una especificidad de unión, al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2. Fv. o una sola cadena de Fv. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o un constructo de una sola cadena tal como se describe en Ladner y col. documento de Patente de Estados Unidos N° 4.946.778.
En una realización, la especificidad de unión para un receptor Fcy se proporciona mediante un anticuerpo monoclonal, cuya unión no está bloqueada por una inmunoglobulina G humana (IgG). Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena gamma localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor transmembrana o soluble que se agrupan en tres clases de receptores Fc gamma: R1 de Fc gamma (CD64), RII de Fc gamma (CD32), y RIII de Fc gamma (CD 16). En una realización preferente, el receptor Fc gamma es un RI Fc gamma humano de alta afinidad. El humano RI Fc gamma es una molécula de 72 kDa, que muestra alta afinidad para la IgG monomérica (10"8-10"9 M" 1).
La producción y caracterización de determinados anticuerpos monoclonales gamma anti-Fc preferentes se describen en Fanger y col. en la Publicación PCT del documento de patente WO 88/00052 y en el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.954.617. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de R1 Fc gamma, RII Fcy o RIII Fcy en un sitio que es distinto del sitio de unión de Fc gamma del receptor y, de este modo, su unión no se bloquea básicamente mediante niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos RI anti-Fc gamma específicos útiles en la presente invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo, N° de Referencia de ATCC HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo del receptor anti-Fcy es una forma humanizada del anticuerpo 22 monoclonal (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. y col. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 y en la Publicación PCT del documento de patente WO 94/10332. La línea celular que produce el anticuerpo H22 está depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con la denominación HAO22CLI y tiene el número de acceso CRL 11177.
Además, en otras realizaciones preferentes, la especificidad de unión para un receptor Fc se proporciona mediante un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humana, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (RI de Fc alfa (CD89)), cuya unión no se bloquea preferentemente con una inmunoglobulina A humana (IgA). La expresión "receptor de IgA" pretende incluir el producto genético de un gen alfa (RI de Fc alfa) ubicado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas de transmembrana alternativamente cortadas y empalmadas de 55 a 10 kDa.
RI de Fc alfa (CD89) se expresa de forma constitutiva en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinófilos y neutrófilos, pero no en poblaciones de células no efectoras. El RI de Fc alfa tiene afinidad media (aproximadamente 5 X 10-7 M-1) tanto para IgA1 como para IgA2, que aumenta después de la exposición a citoquinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H. C. y col. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos para FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que unen Fc.alfa.RI fuera del dominio de unión a ligandos de IgA (Monteiro, R. C. y col. (1992) J. Immunol. 148: 1764).
RI de Fc alfa y RI de Fc gamma son receptores desencadenantes preferentes para uso en las moléculas diespecíficas de la invención porque (1) se expresan principalmente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) se expresan a niveles elevados (por ejemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) son mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); (4) median el aumento de la presentación antigénica de antígenos, incluyendo autoantígenos, dirigidos a los mismos.
Aunque son preferentes los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden usar en las moléculas diespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales de murino, quiméricos y humanizados.
Las moléculas diespecíficas de la presente invención se pueden preparar mediante conjugación de las especificidades de unión constitutivas, por ejemplo, las especificidades de unión de anti-FcR y anti-C1ORF32, usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula diespecífica se puede generar por separado y a continuación conjugar entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una diversidad de agentes de acoplamiento o de reticulación para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véanse por ejemplo, Karpovsky y col. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Otros procedimientos incluyen los que se describen en Paulus (1985) Bering Ins. Mitt. N° 78, 118­ 132; Brennan y col. (1985) Science 229: 81-83), y Glennie y col. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferentes son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, III.).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar a través de enlace de sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferente, la región bisagra se modifica para qué contenga un número impar de restos de sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugación.
Como alternativa, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y expresar y ensamblar en la misma célula anfitriona. Este procedimiento es particularmente útil cuando la molécula diespecífica es una proteína de fusión mAbXmAb, mAbXFab, FabXF(ab')2 o ligandoXFab. Una molécula diespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprende un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de unión, o una molécula diespecífica de una sola cadena que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas diespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de una sola cadena. Los procedimientos para preparar moléculas diespecíficas se describen por ejemplo en el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.260.203; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.455.030; documento de Patente de Estados Unidos N° 4.881.175; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.132.405; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.091.513; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.476.786; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.013.653; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.258.498; y documento de Patente de Estados Unidos N° 5.482.858. La unión de las moléculas diespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar, por ejemplo, mediante ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis de FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o ensayo de Transferencia de Western. Por lo general, cada uno de estos ensayos detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés en particular mediante el uso de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo se pueden detectar usando por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a enzimas que reconoce y se vulnere forma específica a los complejos de anticuerpo y FcR. Como alternativa, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar de forma radiactiva y se puede usar en un radioinmunoensayo (RlA) (véase, por ejemplo, Weintraub. B. Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986). El isótopo radiactivo se puede detectar mediante un medio tal como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porciones de unión al antígeno de los mismos, de la presente invención, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moléculas diespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o diespecíficos) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias.
Por lo tanto, la presente invención presenta una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de acuerdo con la presente invención.
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se usa preferentemente para el tratamiento de cánceres que incluyen, a modo de ejemplo, tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro y en el que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico.
"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que se encuentran con necesidad de tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como aquéllos en los que se va a evitar el trastorno. Por lo tanto, se puede haber diagnosticado que el mamífero a tratar en el presente documento padece el trastorno o puede estar predispuesto o ser susceptible al trastorno. "Mamífero", con fines de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, deportes, o mascota, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de agente de acuerdo con la presente invención que es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero.
Los agentes terapéuticos de la presente invención se pueden proporcionar al sujeto solos, o como parte de una composición farmacéutica en la que se mezclan con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo antiC1ORF32 o a gente de modulación de C1ORF32 de acuerdo con la presente invención tal como un conjugado de péptido soluble que contiene el ectodominio del antígeno CLORF32 o una molécula pequeña tal como un péptido, ribozima, ARNip, otro fármaco que se une a C1ORF32 combinado con al menos otro agente modulador terapéutico o inmune. Ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en terapia de combinación se describen con más detalle a continuación en la sección de usos de los anticuerpos de la invención.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retraso de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado, o molécula diespecífica, se puede revestir en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar al compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que mantiene la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no transmite ningún efecto toxicológico no deseado (véase por ejemplo, Berge, S. M., y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición ácida y sales de adición básica. Las sales de adición acide incluyen las obtenidas a partir de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como a partir de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos a linfáticos mono- y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición básica incluyen las obtenidas a partir de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como a partir de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.
Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesaria en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulgentes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto con procedimientos de esterilización, mencionados anteriormente, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede provocar mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos complementarios.
Las composiciones terapéuticas por lo general deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para concentración elevada del fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferente incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes que se han enumerado anteriormente, si fuera necesario, seguido de microfiltración con esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios a partir de los que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que proporcionan un polvo del principio activo además de cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente de forma estéril del mismo.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, si fuera necesario, seguido de microfiltración con esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios a partir de los que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que proporcionan un polvo del principio activo además de cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente de forma estéril del mismo.
La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se está tratando, y el modo de administración en particular. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación será generalmente la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. Generalmente, de cada cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente un 0,01 por ciento a aproximadamente un noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente de aproximadamente un 0,1 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, lo más preferentemente de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar de forma proporcional tal como lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas para dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico deseado. La memoria descriptiva para las formas unitarias de dosificación de la invención se dictan por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico en particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Para la administración del anticuerpo, los intervalos de dosificación varían de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más normalmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del anfitrión. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o estarán dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administración una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses y una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferentes para un anticuerpo anti-VSIG1 incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal a través de administración intravenosa, con el anticuerpo siendo proporcionado usando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosificaciones, a continuación cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.
En algunos procedimientos, se administran de forma simultánea dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado entra dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo se administra normalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares según se indique midiendo los niveles de sangre de anticuerpo al antígeno diana en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 mug/ml y en algunos procedimientos de aproximadamente 25-300 mug/ml.
Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se necesita una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia variarán dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos presentan una vida media más larga, seguido de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones es necesaria una dosificación relativamente alta en intervalos de tiempo relativamente cortos hasta que se reduce o termina la evolución de la enfermedad, y preferentemente hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de ese momento, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.
Los niveles reales de dosificación de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar con el fin de obtener una cantidad del principio activo que es eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración en particular, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones en particular de la presente invención usadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción o del compuesto que se está usando en particular, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones usadas en particular, la edad, sexo, peso, afección, salud general e historia médica anterior del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-C1ORF32 de la invención da como resultado preferentemente una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de periodos libres de síntomas de la enfermedad, un aumento de la esperanza de vida, remisión de la enfermedad, o una prevención de la alteración o la discapacidad debidas al sufrimiento por la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores positivos para C1ORF32, por ejemplo, tumores de pulmón, tumores de ovarios, y tumores de colon, una "dosificación terapéuticamente eficaz" inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente un 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente un 60 %, y todavía más preferentemente en al menos aproximadamente un 80 % con respecto a los sujetos sin tratar. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia de tumores humanos. Como alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar mediante el examen de la capacidad del compuesto para inhibir tal inhibición in vitro mediante ensayos conocidos por el experto en la materia. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de otro modo mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto habitual en la materia sería capaz de determinar tales cantidades en base a factores tales como la talla del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición o vía de administración seleccionadas en particular.
Una composición de la presente invención se puede administrar a través de una o más vías de administración usando uno o más de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Tal como observará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración preferentes para anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" tal como se usa en el presente documento se refiere a modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Como alternativa, un anticuerpo u otro fármaco o molécula de C1ORF32 y sus conjugados y combinaciones de los mismos que modula una actividad de antígeno C1ORF32 se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, por vía intranasal, por vía oral, por vía vaginal, por vía rectal, por vía sublingual o por vía tópica.
Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto frente a una liberación rápida, tal como formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones se patentan o por lo general son conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferente, una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección con agujas hipodérmicas, tal como los dispositivos que se desvelan en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: documento de Patente de Estados Unidos N° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusión implantable para administrar medicación a una tasa controlada; documento de Patente de Estados Unidos N° 4.486.194. que desvela un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; documento de Patente de Estados Unidos N° 4.447.233, que desvela una bomba de infusión de medicación para administrar medicación a una tasa de infusión precisa; documento de Patente de Estados Unidos N° 4.447.224, que desvela un aparato de infusión implantable de flujo variable para administración continua del fármaco; documento de Patente de Estados Unidos N° 4.439.196, que desvela un sistema de administración osmótica del fármaco que tiene compartimentos con múltiples cámaras; y documento de Patente de Estados Unidos N° 4.475.196, que desvela un sistema de administración osmótica del fármaco. Estas patentes se incorporan en el presente documento por referencia. Los expertos en la materia conocen otros muchos de tales implantes, sistemas de administración, y módulos.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención se pueden formular para asegurar la distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los contextos terapéuticos de la invención cruzan la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para procedimientos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos con números 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan de forma selectiva en células u órganos específicos, aumentando de este modo la administración dirigida del fármaco (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Los restos de fijación como diana ejemplares incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.416.016 de Low y col.); manósidos (Umezawa y col., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman y col. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais y col. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor tensioactivo de la proteína A (Briscoe y col. (1995) Am. J Physiol. 1233: 134); p 120 (Schreier y col. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) Fe Bs Lett.
346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.
USOS PARA DIAGNÓSTICO DEL ANTÍGENO C1ORF32 Y POLINUCLEÓTIDOS CORRESPONDIENTES
De acuerdo con algunas realizaciones, la muestra tomada de un sujeto (paciente) para realizar ensayos de diagnóstico de acuerdo con la presente invención se selecciona entre el grupo que consiste en un fluido o secreción corporal que incluye, pero no se limita a, sangre, suero, orina, plasma, fluido prostático, fluido seminal, semen, las secreciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, fluido cerebroespinal, esputo, saliva, leche, fluido peritoneal, fluido pleural, fluido de quiste, secreciones de sistema ductal de la mama (y/o lavado de los mismos), lavado bronco alveolar, lavado del sistema reproductor y lavado de cualquier otra parte del organismo o sistema en el organismo; muestras de cualquier otro órgano que incluyen células o tejidos aislados, en las que la célula o tejido se puede obtener de un órgano seleccionado entre, pero no limitado a, tejido de pulmón, colon, ovario y/o mama; heces o una muestra de tejido, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el término incluye muestras de componentes de cultivo celular in vivo. Antes de someterla al ensayo de diagnóstico, la muestra se puede diluir opcionalmente con un eluyente adecuado.
En algunas realizaciones, el término "marcador" en el contexto de la presente divulgación se refiere a un fragmento de ácido nucleico, un péptido, o un polipéptido, que está presente de forma diferencial en una muestra tomada de pacientes (sujetos) que tienen una de las enfermedades afecciones que se describen en el presente documento, en comparación con una muestra comparable tomará de sujetos que no tienen una de las enfermedades o afecciones descritas anteriormente.
En algunas realizaciones, se da a entender que el término "polipéptido" se refiere a una molécula que comprende al menos de 2 a varios miles o más aminoácidos. Se va a entender que el término "polipéptido" incluye, entre otros, péptidos nativos (productos de degradación, péptidos sintetizados de forma sintética o péptidos recombinantes), peptidomiméticos, tales como peptoides y semipeptoides o análogos de péptido, que pueden comprender, por ejemplo, cualquier modificación deseable, que incluye, entre otras, modificaciones que hacen que los péptidos sean más estables cuando están en un organismo o sean más capaces de penetrar en las células, u otras tal como observará un experto en la materia. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificación del extremo N, modificación del extremo C, modificación de enlace peptídico, modificaciones en la estructura principal, modificación de restos, u otras. La inclusión de tales péptidos dentro de los polipéptidos puede producir un polipéptido que comparte su identidad con los polipéptidos que se describen en el presente documento, por ejemplo, los que se proporcionan en el listado de secuencias.
En algunas realizaciones, la expresión "presente de forma diferencial" se refiere a diferencias en la cantidad o calidad de un marcador presente en una muestra tomada de pacientes que tienen una de las enfermedades o afecciones que se describen en el presente documento en comparación con una muestra comparable tomada de pacientes que no tienen una de las enfermedades o afecciones que se describen en el presente documento. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico puede estar presente opcionalmente de forma diferencial entre las dos muestra si la cantidad del fragmento de ácido núcleo en una muestra es significativamente diferente de la cantidad del fragmento de ácido nucleico en la otra muestra, por ejemplo tal como se mide mediante hibridación y/o ensayos basados en NAT. Un polipéptido está presente de forma diferencial entre las dos muestras si la cantidad del polipéptido en una muestra es significativamente diferente de la cantidad de polipéptido en la otra. Se debe indicar que si el marcador es detectable en una muestra y no es detectable en la otra, entonces se puede considerar que tal marcador está presente de forma diferencial. Opcionalmente, una cantidad relativamente baja de regulación positiva puede servir como el marcador, tal como se describe en el presente documento. Un experto habitual en la materia podría determinar fácilmente tales niveles relativos de los marcadores; a continuación se proporciona una guía adicional en la descripción de cada marcador individual.
En algunas realizaciones, el término "diagnóstico" se refiere a la identificación de la presencia o naturaleza de una afección patológica. Los procedimientos de diagnóstico se diferencian en su sensibilidad y especificidad. La "sensibilidad" de un ensayo de diagnóstico es el porcentaje de individuos enfermos que dan positivo en el ensayo (porcentaje de "positivos reales"). Los individuos enfermos no detectados por el ensayo son "falsos negativos". Los sujetos que no están enfermos y que dieron negativo en el ensayo se denominan "negativos reales". La "especificidad" de un ensayo de diagnóstico es 1 menos la tasa de falsos positivos, en la que la tasa de "falso positivo" se define como la proporción de los que no tienen la enfermedad que dieron positivo en el ensayo. Aunque un procedimiento de diagnóstico en particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una afección, es suficiente si el procedimiento proporciona una indicación positiva que ayuda en el diagnóstico.
En algunas realizaciones, el término "cualitativo" cuando hace referencia a diferencias en los niveles de expresión de un polinucleótido o polipéptido tal como se describe en el presente documento, se refiere a la presencia frente a la ausencia de expresión, o en algunas realizaciones, la regulación temporal de la expresión, o en algunas realizaciones, el momento de la expresión, o en algunas realizaciones, cualquier modificación después de la traducción a la molécula expresada, y otros, tal como observará un experto en la materia. En algunas realizaciones, el término "cuantitativo" cuando hace referencia a diferencias en los niveles de expresión de un polinucleótido o polipéptido tal como se describe en el presente documento, se refiere a diferencias absolutas en la cantidad de expresión, tal como se determina mediante cualquier medio, conocido en la técnica, o en otras realizaciones, diferencias relativas, que pueden ser estadísticamente significativas, o en algunas realizaciones, cuando se visualiza como un todo o durante un periodo de tiempo prolongado, etc., indican una tendencia en términos de diferencias en la expresión.
En algunas realizaciones, el término "diagnóstico" se refiere a la clasificación de una enfermedad o un síntoma, que determina una gravedad de la enfermedad, control de la evolución de la enfermedad, previsión de un resultado de una enfermedad y/o perspectivas de recuperación. El término "detectar" también puede incluir opcionalmente cualquiera de los anteriores.
El diagnóstico de una enfermedad de acuerdo con la presente invención, en algunas realizaciones, se puede ver influido mediante la determinación de un nivel de un polipéptido de la presente invención en una muestra biológica obtenida del sujeto, en el que el nivel determinado se puede correlacionar con la predisposición a, o la presencia o la ausencia de la enfermedad. Se debe indicar que una "muestra biológica obtenida del sujeto" también puede comprender opcionalmente una muestra que no se ha retirado físicamente del sujeto, tal como se describe con más detalle a continuación.
En algunas realizaciones, el término "nivel" se refiere a niveles de expresión de ARN y/o proteína o al número de copias de ADN de un marcador.
Por lo general, el nivel del marcador en una muestra biológica obtenida del sujeto es diferente (es decir, aumenta o disminuye) del nivel del mismo marcador en una muestra similar obtenida a partir de un individuo sano (en el presente documento se describen ejemplos de muestras biológicas).
Se pueden usar numerosos procedimientos para toma de tejido o fluido bien conocidos para tomar la muestra biológica del sujeto con el fin de determinar el nivel de ADN, ARN y/o polipéptido del marcador de interés en el sujeto.
Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, biopsia con aguja fina, biopsia con aguja, biopsia con aguja núcleo y biopsia quirúrgica (por ejemplo, biopsia cerebral), y lavado. Independientemente del procedimiento usado, una vez que se obtiene una biopsia/muestra, se puede determinar el nivel del marcador y por lo tanto se puede hacer un diagnóstico.
La determinación del nivel del mismo marcador en tejidos normales del mismo origen se realiza preferentemente en el mismo momento para detectar un aumento de la expresión y/o amplificación y/o una disminución de la expresión, del marcador en oposición a los tejidos normales.
En algunas realizaciones, la expresión "cantidad de ensayo" de un marcador se refiere a una cantidad de un marcador en una muestra del sujeto que es coherente con un diagnóstico de una enfermedad o afección en particular. Una cantidad de ensayo se puede presentar en una cantidad absoluta (por ejemplo, microgramo/ml) o una cantidad relativa (por ejemplo, intensidad relativa de señales).
En algunas realizaciones, la expresión "cantidad de control" de un marcador puede ser cualquier cantidad o un intervalo de cantidades a comparar frente a una cantidad de ensayo de un marcador. Por ejemplo, una cantidad de control de un marcador puede ser la cantidad de un marcador en un paciente con una enfermedad o afección en particular o una persona sin tal enfermedad o afección. Una cantidad de control se puede presentar en una cantidad absoluta (por ejemplo, microgramo/ml) o una cantidad relativa (por ejemplo, intensidad relativa de señales).
En algunas realizaciones, el término "detectar" se refiere a la identificación de la presencia, ausencia o cantidad del objeto a detectar.
En algunas realizaciones, el término "marca" incluye cualquier resto o artículo detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, las marcas útiles incluyen 32P, 35S, colorantes fluorescentes, reactivos con densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, tal como se usa normalmente en un ELISA), biotina-estreptavadina, dioxigenina, haptenos y proteínas para las que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales, o moléculas de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a una diana. La marca a menudo genera una señal que se puede medir, tal como una señal radiactiva, cromogénica, o fluorescente, que se puede usar para cuantificar la cantidad de marca unida en una muestra. La marca se puede incorporar o unir a un cebador o sonda covalentemente, o a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, incorporación de nucleótidos radiactivos, o nucleótidos biotinilados que se reconocen con estreptavadina. La marca se puede detectar directa o indirectamente. La detección indirecta puede implicar la unión de una segunda marca a la primera marca, directa o indirectamente. Por ejemplo, la marca puede ser el ligando de un asociado de unión, tal como biotina, que es un asociado de unión para la estreptavadina, o una secuencia de nucleótidos, que es el asociado de unión para una secuencia complementaria, a la que se puede hibridar de forma específica. El asociado de unión se puede detectar directamente en sí mismo, por ejemplo, un anticuerpo en sí mismo se puede marcar con una molécula fluorescente. El asociado de unión también se puede detectar indirectamente, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria puede ser una parte de una molécula de ADN ramificado que a su vez se puede detectar a través de hibridación con otras moléculas de ácidos nucleicos marcadas (véase, por ejemplo, P. D. Fahrlander y A. Klausner, Bio/Technology 6: 1165 (1988)). La cuantificación de la señal se consigue, por ejemplo, mediante recuento de centelleo, densitometría, o citometría de flujo.
Las marcas detectables ejemplares, opcional y preferentemente para uso con inmunoensayos, incluyen, pero no se limitan a, perlas magnéticas, colorantes fluorescentes, radiomarcas, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras usadas normalmente en un ELISA), y marcas calorimétricas tales como oro coloidal o vidrio coloreado o perlas de plástico. Como alternativa, el marcador en la muestra se puede detectar usando un ensayo indirecto, en el que, por ejemplo, un segundo anticuerpo marcado se usa para detectar anticuerpo específico del marcador unido, y/o en un ensayo de competición o inhibición en el que, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo distinto del marcador se incuba simultáneamente con la mezcla.
El "inmunoensayo" es un ensayo que usa un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo en particular para aislar, fijar como diana, y/o cuantificar el antígeno.
La expresión "se une de forma específica (o de forma selectiva)" a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con" o "interactúa o se une de forma específica" cuando hace referencia a una proteína o péptido (hubo otro epítopo), en algunas realizaciones se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros agentes biológicos. Por lo tanto, en las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína en particular al menos dos veces más que el fondo (señal no especifica) y no se unen básicamente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en tales condiciones puede necesitar un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína en particular. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales aumentados hasta proteína básica seminal de especies específicas tales como rata, ratón, o ser humano se pueden seleccionar para obtener solamente los anticuerpos policlonales que son específicamente inmuorreactivos con proteína básica seminal y no con otras proteínas, excepto para variantes polimórficas y alelos de proteína básica seminal. Esta selección se puede conseguir restando anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con moléculas de proteína básica seminal de otras especies. Se puede usar una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, se usan de forma rutinaria inmunoensayos de ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que se pueden usar para determinar inmunorreactividad específica). Por lo general, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal de fondo o ruido y más generalmente más de 10 a 100 veces el fondo.
En otra realización, la presente divulgación proporciona un procedimiento para detectar los polipéptidos de la presente invención en una muestra biológica, que comprende: poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que reconoce de forma específica un polipéptido y detectar dicha interacción; en el que la presencia de una interacción se correlaciona con la presencia de un polipéptido en la muestra biológica.
En algunas realizaciones de la presente invención, los polipéptidos que se describen en el presente documento son ejemplos no limitantes de marcadores para diagnóstico de una enfermedad y/o una afección indicativa. Cada marcador se puede usar solo o en combinación, para diversos usos, que incluyen, pero no se limitan a, pronóstico, predicción, identificación sistemática, diagnóstico temprano, determinación de la evolución, selección de terapia y control del tratamiento de una enfermedad y/o una afección indicativa.
En un objeto relacionado, las enfermedades detectadas incluirán cánceres tales como tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linterna no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro y en las que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico.
Cada polipéptido/polinucleótido se puede usar solo o en combinación, para diversos usos, que incluyen, pero no se limitan a, pronóstico, predicción, identificación sistemática, diagnóstico temprano, determinación de la evolución, selección de terapia y control del tratamiento de la enfermedad y/o una afección indicativa, tal como se ha detallado anteriormente.
Tal combinación puede comprender opcionalmente cualquier subcombinación de marcadores, y/o una combinación que caracteriza al menos otro marcador, por ejemplo un marcado conocido. Además, tal combinación se puede usar opcional y preferentemente tal como se ha descrito anteriormente con respecto a la determinación de una relación entre una medida cuantitativa o semicuantitativa de cualquier otro marcador que se describe en el presente documento con respecto a cualquier otro marcador que se describen el presente documento, y/o cualquier otro marcador conocido, y/o cualquier otro marcador.
De acuerdo con realizaciones adicionales de la presente invención, los marcadores se podrían usar opcionalmente solos o en combinación con marcadores conocidos para cáncer de pulmón, que incluyen pero no se limitan a CEA, CA15-3, Beta-2-microglobulina, CA19-9, TPA, y/o en combinación con las proteínas conocidas para el marcador variable tal como se describe en el presente documento.
De acuerdo con realizaciones adicionales de la presente invención, los marcadores se podrían usar opcionalmente solos o en combinación con marcadores conocidos para cáncer de ovario, que incluyen pero no se limitan a CEA, CA125 (Mucina 16), CA72-4TAG, CA-50, CA 54-61, CA-195 y CA 19-9 en combinación con CA-125, y/o en combinación con las proteínas conocidas para el marcador variable tal como se describe en el presente documento. De acuerdo con realizaciones adicionales de la presente invención, los marcadores se podrían usar opcionalmente solos o en combinación con marcadores conocidos para cáncer de colon, que incluyen pero no se limitan a CEA, CA19-9, CA50, y/o en combinación con las proteínas conocidas para el marcador variable tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporcionan procedimientos, usos, dispositivos y ensayos para el diagnóstico de una enfermedad o afección. Opcionalmente, se puede usar una pluralidad de marcadores. La pluralidad de marcadores puede incluir opcionalmente marcadores que se describen en el presente documento, y/o uno o más marcadores conocidos. La pluralidad de marcadores se correlaciona preferentemente a continuación con la enfermedad o afección. Por ejemplo, tal correlación puede comprender opcionalmente la determinación de la concentración de cada una de la pluralidad de marcadores, y comparar individualmente cada concentración de marcador con un nivel de umbral. Opcionalmente, si la concentración del marcador es superior o inferior al nivel de umbral (dependiendo del marcador y/o el ensayo de diagnóstico que se está realizando), la concentración del marcador se correlaciona con la enfermedad o afección. Opcional y preferentemente, una pluralidad de concentraciones de marcador se correlaciona con la enfermedad o afección.
Como alternativa, tal correlación puede comprender opcionalmente determinar la concentración de cada una de la pluralidad de marcadores, calcular un solo valor índice en base a la concentración de cada una de la pluralidad de marcadores, y comparar el valor índice con un nivel de umbral.
Además, como alternativa, tal correlación puede comprender opcionalmente determinar un cambio temporal en al menos uno de los marcadores, y en la que el cambio temporal se usa en la etapa de correlación.
Además, como alternativa, tal correlación puede comprender opcionalmente determinar si al menos un número "X" de la pluralidad de marcadores tiene una concentración fuera del intervalo predeterminado y/o por encima o por debajo de un umbral (como se ha descrito anteriormente). El valor de "X" puede ser opcionalmente un marcador, una pluralidad de marcadores o todos los marcadores; como alternativa o adicionalmente, en lugar de incluir cualquier marcador en el recuento de "X", puede ser necesario opcionalmente uno o más marcadores específicos de la pluralidad de marcadores para que se correlacione con la enfermedad o afección (de acuerdo con un intervalo y/o umbral).
Además, como alternativa, tal correlación puede comprender opcionalmente determinar si una relación de concentraciones de marcador para dos marcadores está fuera de un intervalo y/o por encima o por debajo de un umbral. Opcionalmente, si la relación está por encima o por debajo del nivel de umbral y/o fuera del intervalo, la relación se correlaciona con la enfermedad o afección.
Opcionalmente, se puede usar una combinación de dos o más de estas correlaciones con un panel individual y/o para su correlación entre una pluralidad de paneles.
Opcionalmente, el procedimiento distingue una enfermedad o afección con una sensibilidad de al menos un 70 % a una especificidad de al menos un 85 % cuando se compara con sujetos normales. Tal como se usa en el presente documento, sensibilidad se refiere al número de muestras positivas (enfermas) detectada con respecto al número total de muestras positivas presentes; especificidad se refiere al número de muestras negativas reales (no enfermas) detectadas sobre el número total de muestras negativas presentes. Preferentemente con el procedimiento distingue una enfermedad o afección con una sensibilidad de al menos un 80 % a una especificidad de al menos un 90 % cuando se compara con sujetos normales. Más preferentemente, el procedimiento distingue una enfermedad o afección con una sensibilidad de al menos un 90 % a una especificidad de al menos un 90 % cuando se compara con sujetos normales. También, más preferentemente, el procedimiento distingue una enfermedad o afección con una sensibilidad de al menos un 70 % a una especificidad de al menos un 85 % cuando se compara con sujetos que presentan síntomas que imitan síntomas de la enfermedad o afección.
Un panel de marcador se puede analizar en un número de formasen conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, cada miembro de un panel se puede comparar con un valor "normal", o un valor que indica un resultado en particular. Un diagnóstico/pronóstico en particular puede depender de la comparación de cada marcador con este valor; como alternativa, si solamente un subconjunto de marcadores está fuera de un intervalo normal, este subconjunto puede ser indicativo de un diagnóstico/pronóstico en particular. El experto en la materia también comprenderá que los marcadores de diagnóstico, marcadores de diagnóstico diferencial, marcadores de pronóstico, marcadores de momento del inicio, marcadores de diferenciación de enfermedad o afección, etc., se pueden combinar en un solo ensayo o dispositivo. Los marcadores también se pueden usar normalmente con múltiples fines, por ejemplo, mediante la aplicación de un umbral diferente o un factor de peso diferente al marcador para los diferentes fines.
En una realización, los paneles comprenden marca topes para los siguientes fines: diagnóstico de una enfermedad; diagnóstico de enfermedad e indicación de si la enfermedad está en una fase aguda y/o si se ha producido un ataque agudo de la enfermedad; diagnóstico de enfermedad e indicación de si la enfermedad está en una fase no aguda y/o si se ha producido un ataque no agudo de la enfermedad; indicación de si se ha producido una combinación de fases o ataques agudos y no agudos; diagnóstico de una enfermedad y pronóstico de un resultado posterior adverso; diagnóstico de una enfermedad y pronóstico de una fase o ataque agudos o no agudos posteriores; evolución de la enfermedad (por ejemplo para cáncer, tal evolución puede incluir, por ejemplo, aparición o reaparición de la metástasis).
Los diagnósticos anteriores también pueden incluir opcionalmente diagnóstico diferencial de la enfermedad para distinguirla de otras enfermedades, incluyendo las enfermedades que pueden presentar uno o más síntomas similares o idénticos.
En ciertas realizaciones, uno o más indicadores de diagnóstico o pronóstico se correlacionan con una afección o enfermedad simplemente por la presencia o ausencia de los indicadores. En otras realizaciones, se pueden establecer los niveles de umbral de un indicador de diagnóstico o pronóstico, y el nivel de los indicadores en una muestra del paciente se puede comparar simplemente con los niveles de umbral. La sensibilidad y la especificidad de un ensayo de diagnóstico y/o pronóstico dependen de más que solamente la "calidad" analítica del ensayo, también dependen de la definición de lo que constituye un resultado anómalo. En la práctica, las curvas de Característica Operativa del Receptor, o curvas "ROC", por lo general se calculan mediante representación del valor de una variable frente a su frecuencia relativa en poblaciones "normales" y de "enfermedad", y/o por comparación de resultados a partir de un sujeto, antes, durante y/o después del tratamiento.
De acuerdo con realizaciones de la presente divulgación, la proteína C1ORF32, polinucleótido o un fragmento del mismo, se pueden representar como un biomarcador para detectar enfermedad y/o una afección indicativa, tal como se ha detallado anteriormente.
De acuerdo con otras realizaciones más, la presente divulgación incluye opcional y preferentemente cualquier secuencia de aminoácido o fragmentos del mismo codificados por una secuencia de ácidos nucleicos que corresponde a C1ORF32, tal como se describe en el presente documento. Cualquier oligopéptido o péptido que se relaciona con tal secuencia de aminoácidos o fragmento de la misma también se puede usar opcionalmente (adicionalmente o como alternativa) como un biomarcador.
INMUNOENSAYOS
Un inmunoensayo se puede usar para detectar y analizar cualitativa o cuantitativamente marcadores en una muestra. Este procedimiento comprende: proporcionar un anticuerpo que se une de forma específica a un marcador; poner en contacto una muestra con el anticuerpo; y detectar la presencia de un complejo del anticuerpo unido al marcador en la muestra.
Para preparar un anticuerpo que se une de forma específica a un marcador, se pueden usar marcadores de proteína purificada. Se pueden preparar anticuerpos que se unen de forma específica a un marcador de proteína usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica.
Después de proporcionar el anticuerpo, un marcador se puede detectar y/o cuantificar usando cualquiera de un número de ensayos de unión inmunológica bien reconocidos. Los ensayos útiles incluyen, por ejemplo, un ensayo inmuno enzimático (EIA) tal como ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA), un ensayo radioinmune (RIA), un ensayo de transferencia de Western, o un ensayo de transferencia por ranuras. Véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos con números 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Generalmente, una muestra obtenida de un sujeto se puede poner en contacto con el anticuerpo que se une de forma específica al marcador.
Opcionalmente, el anticuerpo se puede fijar a un soporte sólido para facilitar el lavado y posterior aislamiento del complejo, antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio o plástico en forma de, por ejemplo, una placa de microtitulación, una varilla, una perla, o una microperla. Los anticuerpos también se pueden unir a un soporte sólido.
Después de incubar la muestra con anticuerpos, la mezcla se lava y se puede detectar el complejo de anticuerpomarcador formado. Esto se puede realizar mediante la incubación de la mezcla lavada con un reactivo de detección. Como alternativa, el marcador en la muestra se puede detectar usando un ensayo indirecto, en el que, por ejemplo, se usa un segundo anticuerpo marcado para detectar anticuerpo específico demarcador unido, y/o en un ensayo de competición o inhibición en el que, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo distinto del marcador se incuba simultáneamente con la mezcla.
Durante todos los ensayos, pueden ser necesarias etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferentemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá el formato de ensayo, marcador, volumen de solución, concentraciones y similares. Normalmente, los ensayos se realizarán a temperatura ambiente, aunque se pueden realizar en un intervalo de temperaturas, tal como de 10 °C a 40 °C.
El inmunoensayo se puede usar para determinar la cantidad de ensayo de un marcador en una muestra de un sujeto. En primer lugar, una cantidad de ensayo de un marcador en una muestra se puede detectar usando los procedimientos de inmunoensayo que se han descrito anteriormente. Si un marcador está presente en la muestra, éste formará un complejo de anticuerpo-marcador con un anticuerpo que se une de forma específica al marcador en las condiciones de incubación adecuadas descritas anteriormente. La cantidad de un complejo de anticuerpomarcador se puede determinar opcionalmente por comparación con un patrón. Tal como se ha indicado anteriormente, no es necesario medir la cantidad de ensayo de marcador en unidades absolutas, siempre y cuando la unidad de medida se pueda comparar con una cantidad y/o señal de control.
Radioinmunoensayo (RIA): En una versión, este procedimiento implica la precipitación del sustrato deseado y en los procedimientos que se detallan a continuación en el presente documento, con un anticuerpo específico y proteína de unión anticuerpo radiomarcada (por ejemplo, proteína A marcada con I125) inmovilizado en un vehículo precipitable tal como perlas de agarosa. El número de recuentos en el sedimento precipitado es proporcional a la cantidad de sustrato.
En una versión alternativa del RIA, se usan un sustrato marcado y una proteína de unión a anticuerpo sin marcar. Una muestra que contiene una cantidad desconocida de sustrato se añade en cantidades variables. La disminución en los cuentos precipitados a partir del sustrato marcado es proporcional a la cantidad de sustrato en la muestra añadida.
Ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA): Este procedimiento implica la fijación de una muestra (por ejemplo, células fijas o una solución de proteínas) que contiene un sustrato de proteína a una superficie tal como una placa de microtitulación. Se aplica un anticuerpo específico para sustrato acoplado a una enzima y se permite que se una al sustrato. A continuación, se detecta la presencia del anticuerpo y se cuantifica mediante una reacción colorimétrica usando la enzima acoplada al anticuerpo. Las enzimas usadas normalmente en este procedimiento incluyen peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Si se calibra bien y queda dentro del intervalo de respuesta, la cantidad de sustrato presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Por lo general se usa un patrón de sustrato para mejorar la precisión cuantitativa.
Transferencia de Western: Este procedimiento implica la separación de un sustrato de otra proteína por medio de un gel de acrilamida seguido de transferencia del sustrato a una membrana (por ejemplo, nailon o PVDF). La presencia del sustrato se detecta a continuación mediante anticuerpos específicos para el sustrato, que a su vez se detectan mediante reactivos de unión al anticuerpo. Los reactivos de unión al anticuerpo pueden ser, por ejemplo, proteína A, u otros anticuerpos. Los reactivos de unión al anticuerpo se pueden radiomarcar o unir con enzimas tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. La detección puede ser mediante autorradiografía, reacción colorimétrica o quimioluminiscencia. Este procedimiento permite tanto la cuantificación de una cantidad de sustrato como la determinación de su identidad mediante una posición relativa en la membrana que es indicativa de una distancia de migración en el gel de acrilamida durante la electroforesis.
Análisis inmunohistoquímico: Este procedimiento implica la detección de un sustrato in situ en células fijas mediante anticuerpos específicos para el sustrato. Los anticuerpos específicos para el sustrato se pueden unir con enzimas o se pueden unir a fluoróforos. La detección y la evaluación subjetiva se realizan con microscopio. Si se usan anticuerpos unidos a enzimas, puede ser necesaria una reacción colorimétrica.
Clasificación celular activada con fluorescencia (FACS): Este procedimiento implica la detección de un sustrato in situ en células mediante anticuerpos específicos para el sustrato. Los anticuerpos específicos para el sustrato se unen a fluoróforos. La detección se realiza por medio de una máquina de clasificación celular que lee la longitud de onda de la luz emitida desde cada célula a medida que pasa a través de un rayo de luz. Este procedimiento puede usar dos o más anticuerpos simultáneamente.
PROCEDIMIENTOS DE RADIOFORMACIÓN DE IMÁGENES
Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, tomografía de emisión de positrones (PET) tomografía computerizada de emisión monofotónica (SPECT). Estas dos técnicas son no invasivas, y se pueden usar para detectar y/o medir una gran diversidad de sucesos y/o funciones tisulares, tales como detección de células cancerígenas por ejemplo. A diferencia de PET, SPECT se puede usar opcionalmente con dos marcas simultáneamente. SPECT tiene algunas otras ventajas así como, por ejemplo con respecto al coste y los tipos de marcas que se pueden usar. Por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N° 6.696.686 describe el uso de SPECT para detección de cáncer de mama.
TERANÓSTICA:
El término teranóstica describe el uso de ensayo diagnóstico para diagnosticar la enfermedad, elección del régimen de tratamiento correcto de acuerdo con los resultados del ensayo de diagnóstico y/o control de la respuesta del paciente a la terapia de acuerdo con los resultados del ensayo de diagnóstico. Los ensayos teranósticos se pueden usar para seleccionar pacientes para tratamientos que es probable que les beneficien en particular y que de forma poco probable produzcan efectos secundarios. También pueden proporcionar una indicación temprana y objetiva de la eficacia del tratamiento en pacientes individuales, de modo que (si fuera necesario) el tratamiento se puede alterar con un mínimo de retraso. Por ejemplo: DAKO y Genentech en conjunto crearon HercepTest y Herceptin (trastuzumab) para el tratamiento del cáncer de mama, el primer ensayo teranóstico aprobado simultáneamente con un nuevo fármaco terapéutico. Además de HercepTest (que es un ensayo inmunohistoquímico), están en desarrollo otros ensayos teranósticos que usan química clínica tradicional, inmunoensayo, tecnologías basadas en células y ensayos de ácidos nucleicos. El ensayo de TPMT (tiopurina S-metil-transferasa) de PPGx lanzado recientemente, que está permitiendo que los doctores identifiquen pacientes con riesgo de reacción es adversas potencialmente mortales a la 6-mercaptopurina, un agente usado en el tratamiento de la leucemia. Además, Nova Molecular fueron los primeros en la realización de genotipos de SNP del gen de la apoliproteína E para predecir respuestas de los pacientes con enfermedad de Alzheimer a terapias colinomiméticas y en la actualidad se usa ampliamente en ensayos clínicos de nuevos fármacos para esta indicación. Por lo tanto, el campo de la teranóstica representa la intersección de la información del ensayo de diagnóstico que predice la respuesta de un paciente a un tratamiento con la selección del tratamiento apropiado para ese paciente en particular.
MARCADORES SUSTITUTOS:
Un marcador sustituto su marcador, que se puede detectar en un laboratorio y/o de acuerdo con un signo o síntoma físico en el paciente, y que se usa en ensayos terapéuticos como un sustituto para un punto final clínicamente significativo. El marcador sustituto es una medida directa de cómo se siente, funciona, o sobrevive un paciente que se espera que prediga el efecto de la terapia. La necesidad de marcadores sustitutos aparece principalmente cuando tales se pueden dividir de forma más temprana, de forma más conveniente, o de forma más frecuente que los puntos finales de interés en términos del efecto del tratamiento en un paciente, que se denominan puntos finales clínicos. De forma ideal, un marcador sustituto debe ser biológicamente plausible, predictivo de la evolución de la enfermedad y se debe poder medir con ensayos estandarizados (que incluyen, pero no se limitan a, modalidades de química clínica tradicional, inmunoensayo, tecnologías basadas en células, ensayos de ácidos nucleicos y formación de imágenes).
Los puntos finales sustitutos se usaron primero principalmente en el área cardiovascular. Por ejemplo, se han aprobado fármacos antihipertensivos en base a su eficacia para reducir la presión sanguínea. De forma análoga, en el pasado, se han aprobado agentes que reducen el colesterol en base a su capacidad para disminuir el colesterol en suero, no en la evidencia directa de que disminuyen la mortalidad por enfermedad cardiaca ateroesclerótica. En la actualidad, la medida de los niveles de colesterol es un marcador sustituto aceptado de ateroesclerosis. Además, los dos marcadores sustitutos usados más habitualmente en la actualidad en estudios de VIH son recuentos de linfocitos T de CD4+ y ARN de VIH en plasma cuantitativo (carga viral). En algunas realizaciones de la presente divulgación, el patrón de expresión de polipéptido/polinucleótido puede servir como un marcador sustituto para una enfermedad en particular, tal como lo observará un experto en la materia.
USOS Y PROCEDIMIENTOS DE LA INVENCIÓN
Los fármacos de C1ORF32 de acuerdo con la invención, especialmente anticuerpos, en particular los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpos, y procedimientos de la presente invención tienen numerosas utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo que implican el diagnóstico y se desea terapéuticamente el tratamiento de trastornos relacionados con el antígeno C1ORF32 y/o trastornos en los que la modulación de la coestimulación inmune, por ejemplo, que implica coestimulación inmune relacionada con B7 que implica al antígeno C1ORF32. Tal como se ha indicado, estas afecciones incluyen en particular cánceres que expresan de forma diferencial el antígeno C1ORF32, tales como cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, incluyendo formas invasivas y metastásicas de los mismos, en las que se desea terapéuticamente la modulación de la coestimulación tal como la implicación de B7. Los anticuerpos anti-C1ORF32 objeto pueden prevenir la estimulación negativa mediada por B7 de la actividad de los linfocitos T frente a células cancerígenas y/o prevenir la estimulación positiva de la actividad de los linfocitos T. Tales anticuerpos se pueden usar en el tratamiento de afecciones que incluyen cánceres tales como tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro y en las que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico.
Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y para diagnosticar una diversidad de trastornos. Los sujetos preferentes incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por células que expresan el antígeno C1ORF32 y células que poseen actividad de C1ORF32. los procedimientos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con expresión anómala del antígeno C1ORF32 usando anticuerpos que se unen de forma específica a H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) Los fármacos de C1ORF32 de acuerdo con la invención se administran junto con otro agente, y los dos se pueden administrar en cualquier orden o de forma simultánea.
Dada la unión específica de los anticuerpos de la invención para C1ORF32, los anticuerpos de la invención se pueden usar para detectar de forma específica la expresión de C1ORF32 en la superficie de las células y, además, se pueden usar para purificar el antígeno C1ORF32 a través de purificación por inmunoafinidad.
Además, dada la expresión de C1ORF32 en diversas células tumorales, los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpo y procedimientos de la presente invención se pueden usar para tratar un sujeto con un trastorno tumorigénico, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan el antígeno C1ORF32 tal como cáncer de pulmón y cáncer de ovario, tal como se ha mencionado.
En una realización, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas y composiciones multiespecíficas y diespecíficas) de la invención se pueden usar para detectar niveles de C1ORF32 o niveles de células que contienen C1ORP32 en su superficie de la membrana, cuyos niveles se pueden unir a continuación a determinados síntomas de enfermedad. Como alternativa, los anticuerpos se pueden usar para inhibir o bloquear función de C1ORF32 que, a su vez, se puede unir a la prevención o mejora de determinados síntomas de enfermedad, lo que implica de este modo a C1ORF32 como un mediador de la enfermedad. Esto se puede conseguir poniendo en contacto una muestra y una muestra de control con el anticuerpo anti-C1ORF32 en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo correspondiente y C1ORF32. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y C1ORF32 se detecta y se compara en la muestra y en el control.
En otra realización, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas y composiciones multiespecíficas y diespecíficas) de la invención inicialmente se pueden someter a ensayo para actividad de unión asociada con uso terapéutico o de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden someter al ensayo usando ensayos de citometría de flujo.
Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas, inmunoconjugados y composiciones) de la invención tienen utilidad tradicional en terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con C1ORF32. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas multiespecíficas o diespecíficas y los inmunoconjugados se pueden usar para provocar una o más de las siguientes actividades biológicas in vivo o in vitro: para inhibir el crecimiento de y/o eliminar una célula que expresa C1ORF32; para mediar fagocitosis o ADCC de una célula que expresa C1ORF32 en presencia de células efectuarás humanas, o para bloquear la unión del ligando C1ORF32 a C1ORF32.
En una realización en particular, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas y composiciones multiespecíficas y diespecíficas) se usan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una diversidad de enfermedades relacionadas. Los ejemplos de enfermedades relacionadas con C1ORF32 incluyen, entre otras, cáncer, tal como cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, otros tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro y en las que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico.
Las vías adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas e inmunoconjugados) de la invención in vivo e in vitro se conocen bien en la técnica y las pueden seleccionar los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos se pueden administrar mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo.
Como se describió anteriormente, los anticuerpos anti-C1ORF32 humanos de la invención se pueden coadministrar con uno u otros agentes terapéuticos más, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico y un agente inmunosupresor. El anticuerpo se puede unir al agente (como un inmunocomplejo) o se puede administrar de forma separada del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después o de forma simultánea con el agente o se puede coadministrar con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticáncer, por ejemplo, radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), sulfato de cisplatino y bleomicina, carmustina, clorambucilo, y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí mismos, solamente son eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de los anticuerpos anti-C1ORF32 humanos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticáncer que funcionan a través de diferentes mecanismos que proporcionan un efecto citotóxico a las células tumorales humanas. Tal coadministración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que los convertiría en no reactivos con el anticuerpo.
Las células efectoras específicas de diana, por ejemplo, células efectoras unidas a composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas) de la invención también se pueden usar como agentes terapéuticos. Las células efectoras para fijar como diana pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, linfocitos citolíticos naturales y otras células que portan receptores de IgG o IgA. Si se desea, las células efectoras se pueden obtener del sujeto a tratar. Las células efectoras específicas de diana se pueden administrar como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas debe ser del orden de 10"8 a 10"9 pero variará dependiendo del fin farmacéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener localización en la célula diana, por ejemplo, una célula tumoral que expresa C1ORF32 y para efectuarla muerte celular, por ejemplo, mediante fagocitosis. Las vías de administración también pueden variar.
La terapia con células efectoras específicas de diana se puede realizar en conjunto con otras técnicas para eliminar células fijadas como diana. Por ejemplo, la terapia antitumoral usando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas) de la invención y/o células efectoras armadas con estas composiciones se puede usar en conjunto con quimioterapia. Además, la inmunoterapia de combinación se puede usar para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de la célula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos anti-C1ORF32 unidos a RI anti-Fc-gamma o anti-CD3 se pueden usar en conjunto con agentes de unión específicos de receptores de IgG o IgA.
Las moléculas diespecíficas y multiespecíficas de la invención también se pueden usar para modular R de Fc gamma o los niveles de R de Fc gamma en células efectoras, tal como mediante protección y eliminación de receptores en la superficie celular. También se pueden usar mezclas de receptores de anti-Fc para este fin.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas e inmunoconjugados) de la invención que tienen sitios de unión al complemento, tales como porciones de IgG1 -2 o -3 o IgM que se unen a complemento, también se pueden usar en presencia de complementos. En una realización, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprende células diana con un agente de unión de la invención y células efectoras apropiadas se puede suplementar mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de células diana revestidas con un agente de unión de la invención se puede mejorar mediante la unión de proteínas de complemento. En otra realización, las células diana revestidas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas) de la invención también se pueden lisar mediante complemento. En otra realización más, las composiciones de la invención no activan el complemento.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas e inmunoconjugados) de la invención también se pueden administrar junto con complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de la invención se encuentran composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o diespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas porque el complemento se localiza en proximidad a los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o diespecíficas. Como alternativa, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o diespecíficas de la invención y el complemento o suero se pueden administrar por separado.
Por consiguiente, a los pacientes tratados con composiciones de anticuerpo de la invención se les puede administrar adicionalmente (antes de, simultáneamente con, o después de la administración de un anticuerpo humano de la invención) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que potencia o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos.
En otras realizaciones, el sujeto se puede tratar adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, aumenta o inhibe, la expresión o actividad de receptores de Fcy o Fcy, por ejemplo, por tratamiento del sujeto con una citoquina. Las citoquinas preferentes para administración durante el tratamiento con la molécula multiespecíficas incluyen factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interferón gamma (IFN-gamma), y factor de necrosis tumoral (TNF).
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y diespecíficas) de la invención también se pueden usar para fijar conmovían a células que expresan R de Fc gamma o C1ORF32, por ejemplo, para marcar tales células. Para tal uso, el agente de unión se puede unir a una molécula que se puede detectar. Por lo tanto, la invención proporciona procedimientos para localizar células ex vivo o in vitro que expresan receptores de Fc, tales como R de Fc gamma, o antígeno C1ORF32. La marca detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático.
En una realización en particular, la invención proporciona procedimientos para detectar la presencia de antígeno C1ORF32 en una muestra, o medir la cantidad de antígeno C1ORF32, respectivamente, que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une de forma específica para C1ORF32 en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y C1ORF32. A continuación, se detecta la formación de un complejo, en la que una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativo de la presencia de antígeno C1ORF32 en la muestra. Tal como se indica, la invención en particular incluye ensayos para detectar el antígeno C1ORF32 in vitro e in vivo tales como inmunoensayos, radioinmunoensayos, radioensayos, ensayos de radioformación de imágenes, ELISA, transferencia de Western, FACS, transferencia por ranuras, ensayos inmunohistoquímicos, y otros ensayos bien conocidos por los expertos en la materia.
En otras realizaciones, la invención proporciona procedimientos para tratar un trastorno mediado por C1ORF32 en un sujeto, por ejemplo, cáncer, tales como tumores no sólidos y sólidos, sarcomas, neoplasias hematológicas que incluyen, pero no se limitan a leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, próstata, pulmón, ovario, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, huesos, piel, páncreas, cerebro y en los que el cáncer puede ser no metastásico, invasivo o metastásico y procedimientos para tratar cualquier afección en la que la modulación de la coestimulación inmune que implica a C1ORF32 se desea terapéuticamente usando anticuerpos anti-C1ORF32 o conjugados solubles de antígeno C1ORF32 u otros fármacos que fijan como diana y modulan (estimulan o inhiben) una o más actividades biológicas de C1ORF32.
Mediante la administración del anticuerpo anti-C1ORF2, conjugado de antígeno soluble de C1ORF32 otro fármaco que fija como diana del antígeno C1ORF32 o una porción del mismo a un sujeto, la capacidad del antígeno C1ORF32 para inducir tales actividades se inhibe o se estimula y, de este modo, se trata del trastorno asociado. El antígeno C1ORF32 soluble o conjugado de antígeno o anticuerpo anti-C1ORF32 o fragmento que contiene composición u otro fármaco que fija como diana y modula C1ORF32 se puede administrar solo o junto con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o un agente radiotóxico que actúa en conjunto con o de formas y enérgica con la composición de anticuerpo para tratar de prevenir la enfermedad mediada por el antígeno C1ORF32. En otra realización más, los inmunoconjugados de la invención se pueden usar para fijar compuestos como diana (por ejemplo, agentes terapéuticos, marcas, citotoxinas, inmunosupresores de radiotoxinas, etc.) a células que tienen receptores de la superficie celular de C1ORF32 mediante la unión de tales compuestos al anticuerpo. Por lo tanto, la invención también proporciona procedimientos para localizar células ex vivo o in vivo que expresan C1ORF32 (por ejemplo, con una marca detectable, tal como un radio isótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o cofactor enzimático). Como alternativa, los inmunoconjugados se pueden usar para eliminar células que tienen receptores de la superficie celular de C1ORF32 fijando citotoxinas o radiotoxinas como diana para el antígeno C1ORF32.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante la siguiente caracterización de secuencias de un transcrito de ADN que codifica el antígeno C1ORF32, sus dominios y datos de expresión en tejidos normales y cancerígenos así como ejemplos vaticinadores que describen la fabricación de anticuerpos totalmente humanos para los mismos. Esta información y los ejemplos son ilustrativos y no se deben interpretar como limitantes adicionalmente.
Ejemplos
Ejemplo 1:
PROCEDIMIENTOS USADOS PARA ANALIZAR LA EXPRESIÓN DEL ARN QUE CODIFICA LAS PROTEÍNAS DE LA DIVULGACIÓN
Las dianas de la presente invención se sometieron a ensayo con respecto a su expresión en diversas muestras de tejido cancerígeno y no cancerígeno y/o con respecto a su expresión en un amplio panel de muestras humanas que contienen diversos tipos de células inmunes, y muestras de neoplasias hematológicas y líneas celulares, así como varias muestras de tejidos normales. La lista de las muestras de ARN específico de sangre usadas para el análisis de qRT-PCR se proporciona en la Tabla 1 que sigue a continuación. Una descripción de las muestras usadas en el panel de tejido normal se proporciona en la Tabla 2. Una descripción de las muestras usadas en el panel de ensayo de cáncer de pulmón se proporciona en la Tabla 3 que sigue a continuación. Una descripción de las muestras usadas en el panel de ensayo de cáncer de ovario se proporciona en la Tabla 4 que sigue a continuación. Una descripción de las muestras usadas en el panel de ensayo de cáncer de colon se proporciona en la Tabla 5 que sigue a continuación. Las claves para la tabla 3, 4 y 5 se proporcionan en las tablas 3_1, 4_1, y 5_1, respectivamente. A continuación se realizaron ensayos tal como se describen la sección "Materiales y Procedimientos Experimentales" que sigue a continuación.
T l 1 M r n n l ífi n r
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 2:
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continuación
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Tabla 3 1
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(continuación)
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Tabla 5 1
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continuación
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Materiales y Procedimientos Experimentales Usados para Obtener Datos de Expresión
Preparación de ARN -El ARN se obtuvo en ABS (Wilmington, DE 19801, USA, http://www.absbioreagents.com), BioChain Inst. Inc. (Hayward, CA 94545 USA www.biochain.com), GOG para muestras de ovario- Pediatic Cooperative Human Tissue Network, Banco de Tejidos del Grupo de Oncología Ginecológica, Children Hospital of Columbus (Columbus OH 43205 USA), Clontech (Franklin Lakes, NJ USA 07417, www.clontech.com), Ambion (Austin, TX 78744 USA, http://www.ambion.com), Asternad (Detroit, MI 48202-3420, USA, www.asterand.com), y en Genomics Collaborative Inc., una División de Seracare (Cambridge, MA 02139, USA, www.genomicsinc.com). Como alternativa, se generó ARN a partir de células de sangre, líneas celulares o muestras de tejido usando el Reactivo TRI (Molecular Research Center), de acuerdo con las instrucciones del Fabricante. Las muestras de tejido y ARN se obtuvieron de pacientes o de postmortem. La mayoría de las muestras de ARN total se trataron con DNasa (Ambion).
RT PCR - Se mezcló ARN purificado (2-10 |jg) con 300-1500 ng de cebadores de Hexámeros Aleatorios (Invitrogen) y dNTP 500 jM en un volumen total de 31,2 a 156 jl. La mezcla se incubó durante 5 min a 65 °C y a continuación se enfrió rápidamente en hielo. A partir de ese momento, se añadieron 10-50 j l de 5X de tampón de primera hebra de SuperscriptII (Invitrogen), de 4,8 a 24 j l de DTT 0,1 M y 80-400 unidades de RNasina (Promega), y la mezcla se incubó durante 10 min a 25 °C, seguido de incubación adicional a 42 °C durante 2 min. A continuación, se añadieron 2-10 j l (400-2000 unidades) de SuperscriptII (Invitrogen) y la reacción (volumen final de 50-250 jl) se incubó durante 50 min a 42 °C y la continuación se inactivó a 70 °C durante 15 min. El ADNc resultante se diluyó a 1:20 en tampón TE (Tris 10 mM y pH = 8, 1 mM EDTA pH = 8).
Se realiza análisis de RT-PCR en Tiempo Real tal como se describe a continuación - Se usó ADNc (5 jl), preparado tal como se ha descrito anteriormente, como un molde en reacciones de PCR en Tiempo Real (volumen final de 20 jl) usando el ensayo de SYBR Green I (PE Applied Biosystem) con cebadores específicos y Enzima UNG (Eurogentech o ABI o Roche). La amplificación se realizó tal como sigue a continuación: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, y a continuación 40 ciclos de 95 °C durante 15 seg, seguido de 60 °C durante 1 min, seguido por etapa de disociación. La detección se realizó usando el SDS 7000 de PE Applied Biosystem. El ciclo en el que las reacciones consiguieron un nivel umbral de fluorescencia (Ct = Ciclo de Umbral, que se describe con detalle a continuación) se registró y se usó para calcular la cantidad relativa de transcrito en las reacciones de RT. La cantidad relativa se calculó usando la ecuación Q = eficaciaA-Ct. La eficacia de la reacción de PCR se calculó a partir de una curva estándar, creada mediante el uso de diferentes disoluciones de varias reacciones de transcripción inversa (RT). Para minimizar las diferencias inherentes en la reacción de RT, las cantidades relativas resultantes se normalizaron usando un factor de normalización calculado de la siguiente manera:
La expresión de varios genes constitutivos (HSKP) se comprobó en cada panel. La cantidad relativa (Q) de cada gen constitutivo en cada muestra, calculado tal como se ha descrito anteriormente, se dividió entre la cantidad media de este gen en todas las muestras de panel para obtener la "Q rel relativa a MED". A continuación, para cada muestra, se calculó la media de la "Q rel relativa a MED" de los genes constitutivos seleccionados y sirvió como factor de normalización de esta muestra para cálculos adicionales. El resumen esquemático del análisis de PCR cuantitativa en tiempo real se presenta en la Figura 1. Tal como se muestra, el eje x muestra el número de ciclos. El punto de CT = Ciclo Umbral, que es el ciclo en el que la curva de amplificación cruza el umbral de fluorescencia que se estableció en el experimento. Este punto es un número de ciclos calculados en el que la señal que los productos de PCR está por encima del nivel de fondo (colorante ROX pasivo) y aún en la fase Geométrica/Exponencial (tal como se muestra, una vez que el nivel de presencia cruza el umbral de medida, presenta una fase de aumento geométrico, durante la que las medidas son las más precisas, seguido de una fase lineal y una fase de meseta; para medidas cuantitativas, las últimas dos fases no proporcionan medidas precisas). El eje y muestra la fluorescencia normalizada del indicador. Se debe indicar que este tipo de análisis proporciona cuantificación relativa.
Para cada muestra de RT, la expresión del amplicón específico se normalizó al factor de normalización calculado a partir de la expresión de diferentes genes constitutivos tal como se ha descrito en la sección anterior.
Estos genes constitutivos son diferentes para cada panel. Para panel de colon - HPRT1 (N° de Referencia en GenBank. NM_000194 (SEQ ID NO: 118); amplicón - HPRTI-amplicón (SEQ ID NO: 181)), PBGD (N° de Referencia en GenBank. BC019323 (SEQ ID NO: 117); amplicón - PBGD-amplicón (SEQ ID NO: 178)), y G6PD (N° de Referencia en GenBank. NM_000402 (SEQ iD NO: 119); amplicón G6pD (SEQ ID NO: 184)). Para panel de pulmón - HPRT1 (N° de Referencia en GenBank. NM_000194 (SEQ ID NO: 118); amplicón - HPRT1-amplicón (SEQ ID NO: 181)), PBGD (N° de Referencia en GenBank. BC019323 (SEQ ID NO: 117); amplicón - PBGD-amplicón (SEQ ID NO: 178)), SDHA (N° de Referencia en GenBank. NM_004168 (SEQ ID NO: 116); amplicón - SDHA-amplicón (SEQ ID n O: 175)) y Ubiquitina (N° de Referencia en GenBank. BC000449 (SEQ ID nO: 115); amplicón - Ubiquitinaamplicón (SEQ iD No : 172)). Para panel de ovario - SDHA (N° de Referencia en GenBank. NM_004168 (SEQ ID NO: 116); amplicón - SDHA-amplicón (SEQ ID NO: 175)), HPRT1 (N° de Referencia en GenBank. NM_000194 (SEQ ID NO: 118); amplicón - HPRT1-amplicón (SEQ ID NO: 181)) y G6PD (N° de Referencia en GenBank. NM_000402 (SEQ ID nO: 119); G6PD amplicón (SEQ ID NO: 184)). Para panel normal - SDHA (N° de Referencia en GenBank. NM_004168 (SEQ ID NO: 116); amplicón - SDHA-amplicón (SEQ ID NO: 175)), Ubiquitina (N° de Referencia en GenBank. BC000449 (SEQ ID NO: 115); amplicón - Ubiquitina-amplicón (SEQ ID NO: 172)), y caja TATA (N° de Referencia en GenBank. NM_003194 (SEQ ID NO: 114); amplicón TATA (SEQ ID NO: 169)). Para panel de sangre -HSB1 l_HUMANA (N° de Referencia. Q9Y450) (SEQ ID NO: 109), DHSA_HUMANA (SEQ ID NO: 110) (N° de Referencia P31040), SFRS4_HUMANA (SEQ ID NO: 111) (N° de Referencia Q08170) y SLC25A3 (N° de Referencia Q7Z7N7) (SEQ ID NO: 112).
Las secuencias de los genes constitutivos medidas en todos los ejemplos de panel de sangre fueron como sigue a continuación:
HSB1 l_HUMANA (SEQ ID NO: 109) (N° de Referencia. Q9Y450).
T05337_seg30-34F1-Cebador directo (SEQ ID NO: 152): GCTCCAGGCCATAAGGACTTC.
T05337_seg30-34R1 (SEQ ID NO: 153)-Cebador inverso: CAGCTTCAAACTCTCCCCTGC.
Amplicón (SEQ ID NO: 154):
G C T C C A G G C C A T A A G G A C T T C A T T C C A A A T A T G A T T A C A G G A G C A G C C C A G G C G G A T G T A G C T G T T T T A G T T G T A G A T G C C A G C A G G G G A G A G T T T G A A G C T
G DHSA_HUMANA (SEQ ID NO: 110) (N° de Referencia P31040)
M78124_seg45-48F1 (SEQ ID NO: 155)-Cebador directo: TTCCTTGCCAGGACCTAGAG
M78124-seg45-48R1-Cebador inverso (SEQ ID NO: 156): CATAAACCTTTCGCCTTGAC
Amplicón (SEQ ID NO: 157):
T T C C T T G C C A G G A C C T A G A G T T T G T T C A G T T C C A C C C C A C A G G C A T A T A T G G T G C T G G T T G T C T C A T T A C G G A A G G A T G T C G T G G A G A G G G A G G C A T T C T C A T T
A A C A G T C A A G G C G A A A G G T T T A T G
SFRS4_HUMANA (SEQ ID NO: 111) (N° de Referencia Q08170)
HUMSRP75Aseg30-33F1 (SEQ ID NO: 158)- Cebador directo: AATTTGTCAAGTCGGTGCAGC HUMSRP75Aseg30-33R1 (SEQ ID NO: 159)- Cebador inverso: TCACCCCTTCATTTTTGCGT
Amplicón (SEQ ID NO: 160):
A ATTT GT C A AGT CGGTGC AGCT GGC A AG ACCT A A AGG ATT AT AT GCGT C AG GCAGGAGAAGTGACTTATGCAGATGCTCACAAGGGACGCAAAAATGAAGG GGTGA SLC25A3 (N° de Referencia Q7Z7N7) (SEQ ID NO: 112)
SSMPCPseg24-25-29F1- Cebador directo (SEQ ID NO: 161): CCCAAAATGTATAAGGAAGAAGGC SSMPCPseg24-25-29R1- Cebador inverso (SEQ ID NO: 162): TTCAAAGCAGGCGAACTTCA
Amplicón (SEQ ID NO: 163):
CAGCCAGGTTATGCCAACACTTTGAGGGATGCAGCTCCCAAAATGTATAAG GAAGAAGGCCTAAAAGCATTCTACAAGGGGGTTGCTCCTCTCTGGATGAGA CAGATACCATACACCATGATGAAGTTCGCCTGCTTTGA
Las secuencias de los genes constitutivos medidas en todos los ejemplos en panel de muestras de tejido normal fueron como sigue a continuación:
Caja TATA (N° de Referencia en GenBank. NM_003194 (SEQ ID NO: 114)).
Cebador directo de caja TATA (SEQ ID NO: 167): CGGTTTGCTGCGGTAATCAT
Cebador inverso de caja TATA (SEQ ID NO: 168): TTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC
Caja TATA -amplicón (SEQ ID No : 169):
CGGTTTGCTGCGGTAATCATGAGGATAAGAGAGCCACGAACCACGGCACT GATTTTCAGTTCTGGGAAAATGGTGTGCACAGGAGCCAAGAGTGAAGAAC AGT CC AGACTGGCAGC AAGA AA
Ubiquitina (N° de Referencia en GenBank. BC000449 (SEQ ID NO: 115))
Cebador directo de Ubiquitina (SEQ ID NO: 170): ATTTGGGTCGCGGTTCTTG
Cebador inverso de Ubiquitina (SEQ ID NO: 171): TGCCTTGACATTCTCGATGGT
Ubiquitina-amplicón (SEQ ID NO: 172)
ATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGACA AT GC AG AT CTT CGT G A AG ACT CT G ACT GGT A AG ACC AT C ACCCT CG AGG TTGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTCAAGGCA SDHA (N° de Referencia en GenBank. NM_004168 (SEQ ID NO: 116))
Cebador directo de SDHA (SEQ ID NO: 173): TGGGAACAAGAGGGCATCTG
Cebador inverso de SDHA (SEQ ID NO: 174): CCACCACTGCATCAAATTCATG
SDHA-amplicón (SEQ ID NO: 175):
TGGGAACAAGAGGGCATCTGCTAAAGTTTCAGATTCCATTTCTGCTCAGTAT CCAGTAGTGGATCATGAATTTGATGCAGTGGTGG
Las secuencias para cebadores y amplicones de los genes constitutivos medidas en todos los ejemplos de cáncer se indican a continuación. Para panel de colon - se usaron HPRT1, PBGD y G6PD. Para panel de pulmón - se usaron PBGD, HPRT1, Ubiquitina y Sd HA. Para panel de ovario - se usaron HPRT1, SDHA y G6PD.
SDHA (N° de Referencia en GenBank. NM_004168 (SEQ ID NO: 116):
Cebador directo de SDHA (SEQ ID NO: 173): TGGGAACAAGAGGGCATCTG
Cebador inverso de SDHA (SEQ ID NO: 174): CCACCACTGCATCAAATTCATG
SDHA-amplicón (SEQ ID NO: 175):
TGGGAACAAGAGGGCATCTGCTAAAGTTTCAGATTCCATTTCTGCTCAGTAT CCAGTAGTGGATCATGAATTTGATGCAGTGGTGG PBGD (N° de Referencia en GenBank. BC019323 (SEQ ID NO: 117)),
Cebador directo de PBGD (SEQ ID NO: 176): TGAGAGTGATTCGCGTGGG
Cebador inverso de PBGD (SEQ ID NO: 177): CCAGGGTACGAGGCTTTCAAT
PBGD-amplicón (SEQ ID NO: 178):
TGAGAGTGATTCGCGTGGGTACCCGCAAGAGCCAGCTTGCTCGCATACAGA CGGACAGTGTGGTGGCAACATTGAAAGCCTCGTACCCTGG HPRT1 (N° de Referencia en GenBank. NM_000194 (SEQ ID NO: 118)),
Cebador directo de HPRT1 (SEQ ID NO: 179): TGACACTGGCAAAACAATGCA
Cebador inverso de HPRT1 (SEQ ID NO: 180): GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT
HPRT1-amplicón (SEQ ID NO: 181):
TGACACTGGCAAAACAATGCAGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGGCAGTATAA T CC A AAG ATGGT C A AGGT CGC A AGCTTGCT GGTG AA A AGG ACC
G6PD (N° de Referencia en GenBank. NM_000402 (SEQ ID NO: 119))
Cebador directo de G6PD (SEQ ID NO: 182): gaggccgtcaccaagaacat
Cebador inverso de G6PD (SEQ ID NO: 183): ggacagccggtcagagctc
G6PD-amplicón (SEQ ID NO: 184):
gaggccgtcaccaagaacattcacgagtcctgcatgagccagataggctggaaccgcatcatcgtggagaagcccttc 888a888acct8ca8a8ctct8acc88ct8tcc
Ubiquitina (N° de Referencia en GenBank. BC000449 (SEQ ID NO: 115))
Cebador directo de Ubiquitina (SEQ ID NO: 170): ATTTGGGTCGCGGTTCTTG
Cebador inverso de Ubiquitina (SEQ ID NO: 171): TGCCTTGACATTCTCGATGGT
Amplicón de Ubiquitina (SEQ iD NO: 172):
ATTTGGGT CGCGGTT CTTGTTT GT GG AT CGCTGTG AT CGT C ACTTG AC A AT GC AG AT CTT CGTG A AG ACT CTG ACTGGT A AG ACC ATC ACCCT CG AGG TTGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTCAAGGCA
Otra metodología usada para predecir el patrón de expresión de las proteínas de la divulgación fue la herramienta de descubrimiento de MED:
MED es una plataforma para recogida de datos públicos de expresión genética, normalización, anotación y rendimiento de diversas consultas. Los datos de expresión a partir de las micromatrices de Affymetrix más ampliamente usadas se descarga del Omnibus de Expresión Genética (GEO - www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO). Los datos se normalizan de forma multiplicativa ajustando el percentil 95 a un valor constante (expresión normalizada = 1200), y el ruido se filtra ajustando el 30 % inferior a 0. Los experimentos se anotan, primero de forma automática, y luego manualmente, para identificar tejido y afección, y los chips se agrupan de acuerdo con esta anotación, y se hace verificación cruzada de este grupo comparando el patrón general de expresión de los genes de cada chip para el patrón de expresión promedio general de los genes en este grupo. Se asigna un valor de expresión a cada conjunto de sonda en cada grupo que es la mediana de las expresiones de ese conjunto de sonda en todos los chips incluidos en el grupo. El vector de expresión de todos los conjuntos de sonda dentro de un cierto grupo es el chip virtual de ese grupo, y la colección de todos esos chips virtuales es un panel virtual. El panel (o subpaneles) se pueden consultar para identificar conjuntos de sondas con un comportamiento requerido (por ejemplo, la expresión específica en un subconjunto de tejidos, o expresión diferencial entre enfermedad y tejidos sanos). Estos conjuntos de sonda están unidos a los a los contigs de LEADS y a RefSeqs (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) mediante formación de mapas a nivel de la sonda, para su análisis adicional.
Las plataformas Affymetrix que se descargan son HG-U95A y la familia HG-U133 (A, B, A2.0 y PLUS 2.0). A continuación se crearon tres paneles virtuales: U95 y U133 Plus 2.0, en base a las plataformas correspondientes, y U133 que usa el conjunto de conjuntos de sonda para HG-U133A, HG-U133 A2.0 y HG-U133 PLUS 2.0+.
Los resultados de la herramienta de descubrimiento MED se presentan en representaciones de dispersión. La representación de dispersión es una representación compacta de un panel dado (colección de grupos). El eje y es la expresión (normalizada) y el eje x describe los grupos en el panel. Para cada grupo, la expresión media se representa con un marcador sólido, y los valores de expresión de los diferentes chips en el grupo se representan con guiones pequeños ("-"). Los grupos se ordenan y se marcan como sigue a continuación - "Otros" grupos (por ejemplo, enfermedades no cancerígenas, benignas, etc.) con un triángulo, Células tratadas con un cuadrado, Normales con un círculo, Emparejados con una cruz, y Cáncer con un diamante. El número de chips en cada grupo también se escribe adyacente a su nombre.
Ejemplo 6
DESCRIPCIÓN PARA EL GRUPO H19011_1
La presente divulgación se refiere a polipéptidos C1ORF32, nuevas variantes de corte y empalme y agentes de diagnóstico y terapéuticos basados en los mismos.
El grupo H19011_1 (ID interna 76432827) representa 2 transcritos y 5 segmentos de interés, cuyos nombres se proporcionan en las Tablas 91 y 92, respectivamente. Las variantes de proteínas seleccionadas se proporcionan en la tabla 93.
Tabla 91 - Transcritos de interés
Nombre del Transcrito
H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45)
H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46)
Tabla 92 - Segmentos de interés
Nombre del Segmento
H19011_1_N13 (SEQ ID NO: 129)
H19011_1_N8 (SEQ ID NO: 130)
H19011_1_N10 (SEQ ID NO: 131)
H19011_1_N11 (SEQ ID NO: 132)
H19011_1_N12 (SEQ ID NO: 133)
Tabla 93 - Proteínas de interés
Nombre de la Proteína Transcritos Correspondientes
H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45)
H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46)
Estas secuencias son variantes de la proteína hipotética conocida de la proteína LOC387597 (identificador de referencia de RefSeq NP_955383 (SEQ ID NO: 47), sinónimos: C1ORF32, NP_955383; tipo LISCH; RP4-782G3.2; dJ782G3.1), denominada en el presente documento como la proteína conocida anteriormente.
C1ORF32 es una proteína hipotética que se descubrió por ordenador durante la anotación del cromosoma 1 (Gregory SG y col. 2006, Nature 441 (7091) 315-321). Su homólogo anotado más cercano pertenece a la familia LISCH7, una subfamilia de la superfamilia de inmunoglobulina. Uno de los miembros anotados de esta familia es el receptor de lipoproteína estimulada por lipólisis que tiene un papel probable en la eliminación de lipoproteína rica en triglicéridos de la sangre (anotación de referencia de Swissprot Q86X29). Heidi Schulz (“Towards a comprehensive description of the human retinal transcriptome: identification and characterization of differentially expressed genes", PhD thesis, University of Würzburg, 2003) desvela varios genes y proteínas C1ORF, entre los que también está C1ORF32. C1ORF32 se describe como una proteína de membrana que tiene un dominio interno, transmembrana y externo. No se desvela actividad biológica del gen/proteína. El documento muestra que C1ORF32 se expresa altamente en la retina. Basándose en una alineación de secuencia, Schulz sugiere que C1ORF32 es un miembro potencial de la familia de proteínas LISCH7 que juega un papel en la homeostasis lipídica.
De acuerdo con la presente divulgación, se predijo que C1ORF32 era un nuevo miembro de B7/CD28 en base a la presencia de un dominio de IgV, además de ser una proteína de membrana de tipo I, al igual que otros miembros conocidos de B7. Además, dos variantes cortadas y empalmadas alternativamente (H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) y H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50)), que comparten solamente los primeros 5 exones con el C1ORF32 de tipo silvestre, son similares a los miembros conocidos de la familia B7 en sus tamaños de exones y la posición de IgV y dominios transmembrana dentro de estos exones. Además, en la presente divulgación se mostró que C1ORF32 estaba sobreexpresado en cáncer microcítico de pulmón.
Como se ha indicado anteriormente, el grupo H19011 representa 2 transcritos, que se indicaron en la Tabla 91 mencionada anteriormente. Estos transcritos codifican proteínas que son variantes de proteína hipotética de la proteína LOC387597 (SEQ ID NO: 47). A continuación se proporciona una descripción de cada proteína variante. Proteína variante H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) tiene una secuencia de aminoácidos tal como se codifica con el transcrito H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45). Las alineaciones a una o más secuencias de proteínas publicadas anteriormente se muestran en la Figura 2A. Una breve descripción de la relación de la proteína variante para cada tal proteína alineada es como sigue a continuación:
Informe de comparación entre H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) y proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47) (Figura 2A):
A. Un polipéptido quimérico aislado que codifica H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que comprende una primera secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAV VQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASK QGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNE que corresponde a los aminoácidos 1 -158 de las proteínas conocidas Q71H61-HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 1 - 158 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), un aminoácido G de unión por puente que corresponde al aminoácido 159 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), una segunda secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a S que corresponde a los aminoácidos 160 - 160 de las proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 160 - 160 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), aminoácidos de unión por puente LG que corresponde al aminoácido 161 -162 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), una tercera secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a LLVLGRTGLLADLLPSFAVEIMPEWVFVGLVLLGVFLFFVLVGICWCQCCPHSCC CYVRCPCCPDSC que corresponde a los aminoácidos 163 - 229 de las proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 163 - 229 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), un aminoácido W de unión por puente que corresponde al aminoácido 230 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), una cuarta secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a CPQA que corresponde a los aminoácidos 231 - 234 de las proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID No : 47), que también corresponde a los aminoácidos 231 - 234 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), y una quinta secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 70 %, opcionalmente al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y lo más preferentemente al menos un 95, un 96, un 97, un 98 o un 99 % a un polipéptido que tiene la secuencia CEYSDRWGDRAIERNVYLST (SEQ ID NO: 293) que corresponde a los aminoácidos 235 - 254 de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), en el que dicha primera secuencia de aminoácidos, aminoácido de unión por puente, segunda secuencia de aminoácidos, aminoácido de unión por puente, tercera secuencia de aminoácidos, aminoácido de unión por puente, cuarta secuencia de aminoácidos y quinta secuencia de aminoácidos son contiguas y se presentan en un orden secuencial.
B. Un polipéptido aislado que codifica una porción del borde de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48), que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 70 %, opcionalmente al menos aproximadamente un 80 %, preferentemente al menos aproximadamente un 85 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95, un 96, un 97, un 98 o un 99% a la secuencia CEYSDRWGDRAIERNVYLST (SEQ ID NO: 293) de H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48).
La localización de la proteína variante se determinó de acuerdo con los resultados de un número de diferentes programas de software y análisis, que incluyen análisis de SignalP y otros programas especializados. Se cree que la proteína variante se localiza como sigue a continuación con respecto a la membrana celular.
La proteína variante H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) también presenta los siguientes SNP no silenciosos (Polimorfismos de un Solo Nucleótido) tal como se enumera en la Tabla 94, (proporcionada de acuerdo con sus posiciones en la secuencia de aminoácidos, con los aminoácidos alternativos enumerados (SEQ ID NO: 48)). Un ejemplo de tal secuencia deducida, con aminoácidos alternativos, que se produjo (usando parte de los SNP que siguen a continuación), se proporciona con el nombre H19011_1_P8_V1 (SEQ ID NO: 49).
Tabla 94 - Mutaciones de aminoácidos
Posiciones de SNP en la secuencia de aminoácidos Aminoácidos alternativos 159 G -> D
161 L -> V
162 G -> E
202 V -> D
202 V -> G
230 W -> C
La proteína variante tiene los siguientes dominios, tal como se determina usando InterPro. Los dominios se describen en la Tabla 95:
Tabla 95 - Dominios de InterPro
Figure imgf000109_0001
La proteína variante H19Q11_1_P8 (SEQ ID NO: 48) se codifica con el transcrito H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45), para el que la porción de codificación comienza en la posición 181 y termina en la posición 942. El transcrito también tiene los siguientes SNP tal como se enumera en la Tabla 96 (proporcionada de acuerdo con su posición en la secuencia de nucleótidos, con el aminoácido alternativo enumerado).
Tabla 96 - SNP del ácido nucleico
Figure imgf000109_0002
La estructura genómica de la proteína H19011_1_P8 (SEQ ID NO: 48) (número de exones relevantes para la región extracelular de la proteína, la longitud de estos exones, el marco del codón en el que se insertan los intrones hita ubicación de las características y dominios de la proteína en la estructura genética) es característica para los tiran dos de la familia de proteína B7 /coestimuladora, tal como se proporciona en la tabla 97.
Tabla 97 - estructura genómica y características de la proteína
Figure imgf000109_0003
La proteína variante H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) tiene una secuencia de aminoácidos tal como se codifica con el transcrito H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46). Las alineaciones para una o más secuencias de proteínas publicadas anteriormente se muestran en la Figura 2B. Una breve descripción de la relación de la proteína variante de acuerdo con la presente invención para cada una de tales proteínas alineadas es como sigue a continuación:
Informe de comparación entre H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) y proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47) (Figura 2B):
A. Un polipéptido quimérico aislado que codifica H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), que comprende una primera secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAV VQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASK QGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNE que corresponde a los aminoácidos 1 -158 de las proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 1 - 158 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), un aminoácido G de unión por puente que corresponde al aminoácido 159 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), una segunda secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a S que corresponde a los aminoácidos 160 - 160 de las proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SEQ ID NO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 160 - 160 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), aminoácidos de unión por puente LG que corresponde al aminoácido 161 -162 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), una tercera secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90% a LLVL que corresponde a los aminoácidos 163 - 166 de las proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (s Eq ID NO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 163 - 166 de H19011_1_P9 (SEQ iD NO: 50), una cuarta secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a EWVFVGLVLLGVFLFFVLVGICWCQCCPHSCCCYVRCPCCPDSC que corresponde a los aminoácidos 186 -229 de las proteínas conocidas Q71H61HUMANA y NP_955383 (s Eq ID NO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 167 - 210 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), un aminoácido W de unión por puente que corresponde al aminoácido 211 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), una quinta secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 90 % a CPQA que corresponde a los aminoácidos 231 - 234 de las proteínas conocidas Q71H61_HUMANA y NP_955383 (SeQ ID nO: 47), que también corresponde a los aminoácidos 212 -215 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), y una sexta secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 70 %, opcionalmente al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y lo más preferentemente al menos un 95, un 96, un 97, un 98 o un 99 % a un polipéptido que tiene la secuencia CEYSDRWGDRAIERNVYLST (SEQ ID NO: 293) que corresponde a los aminoácidos 216 - 235 de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), en el que dicha primera secuencia de aminoácidos, aminoácido de unión por puente, segunda secuencia de aminoácidos, aminoácido de unión por puente, tercera secuencia de aminoácidos, cuarta secuencia de aminoácidos, aminoácido de unión por puente, quinta secuencia de aminoácidos y sexta secuencia de aminoácidos son contiguas y se presentan en un orden secuencial.
B. Un polipéptido quimérico aislado que codifica una porción de borde de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), que comprende un polipéptido que tiene una longitud "n", en el que n tiene una longitud de al menos aproximadamente 10 aminoácidos, opcionalmente una longitud de al menos aproximadamente 20 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos, más preferentemente una longitud de al menos aproximadamente 40 aminoácidos y lo más preferentemente una longitud de al menos aproximadamente 50 aminoácidos, en el que al menos dos aminoácidos comprenden LE, que tiene una estructura tal como sigue a continuación: una secuencia que comienza a partir de cualquiera de los aminoácidos con números 166-x a 166; y que termina en cualquiera de los aminoácidos con números 167 ((n-2) - x), en la que x varía de 0 a n-2.
C. Un polipéptido aislado que codifica una porción de borde de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50), que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 70 %, opcionalmente al menos aproximadamente un 80 %, preferentemente al menos aproximadamente un 85 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95, un 96, un 97, un 98 o un 99% a la secuencia CEYSDRWGDRAIERNVYLST (SEQ ID NO: 293) de H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50).
La localización de la proteína variante se determinó de acuerdo con los resultados de un número de diferentes programas de software y análisis, que incluyen análisis de SignalP y otros programas especializados. Se cree que la proteína variante se localiza como sigue a continuación con respecto a la membrana celular.
La proteína variante H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) también presenta los siguientes SNP no silenciosos (Polimorfismos de un Solo Nucleótido) tal como se enumera en la Tabla 98, (proporcionada de acuerdo con sus posiciones en la secuencia de aminoácidos, con los aminoácidos alternativos enumerados (SEQ ID NO: 50)).
Tabla 98 - Mutaciones de aminoácidos
Posiciones de SNP en la secuencia de aminoácidos Aminoácidos alternativos
159 G -> D
161 L -> V
162 G -> E
183 V -> D
183 V -> G
211 W -> C
La proteína variante H19011_1_P9 (SEQ ID NO: 50) se codifica con el transcrito H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46), para el que la porción de codificación comienza en la posición 181 y termina en la posición 885. El transcrito también presenta los siguientes SNP tal como se enumera en la Tabla 99 (proporcionada de acuerdo con su posición en la secuencia de nucleótidos, con el aminoácido alternativo enumerado).
Tabla 99 - SNP de ácido nucleico
Polimorfismo Posiciones de SNP en secuencia de nucleótidos
G->A 656
C->G 661
G->A 665
T -> A 728
T -> G 728
G -> C 813
Como se ha indicado anteriormente, el grupo H19011 presenta 5 segmentos, que se enumeraron en la Tabla 92 mencionada anteriormente. Estos segmentos son porciones de secuencias de ácidos nucleicos que se describen en el presente documento por separado porque tienen un interés en particular. A continuación se proporciona una descripción de cada segmento.
El grupo del segmento H19011_1_N13 (SEQ ID NO: 129) está apoyado por 3 bibliotecas. El número de bibliotecas se determinó tal como se ha descrito anteriormente. Este segmento se puede encontrar en los siguientes transcritos: H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) y H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46). La Tabla 100 que sigue a continuación describe la posición de inicio y fin de este segmento en cada transcrito.
Tabla 100 - Localización del segmento en los transcritos
Nombre del transcrito Posición de inicio del segmento Posición de fin del segmento H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) 884 1407
H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46) 827 1350
También se proporcionan segmentos cortos relacionados con el grupo mencionada anteriormente. Estos segmentos tienen una longitud de hasta aproximadamente 120 bp, y como tal se incluyen en una descripción separada.
El grupo del segmento H19011_1_N8 (SEQ ID NO: 130) está apoyado por 4 bibliotecas. El número de bibliotecas se determinó tal como se ha descrito anteriormente. Este segmento se puede encontrar en los siguientes transcritos: H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45). La Tabla 101 que sigue a continuación describe la posición de inicio y fin de este segmento en cada transcrito.
Tabla 101 - Localización del segmento en los transcritos
Nombre del transcrito Posición de inicio del segmento Posición de fin del segmento H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) 680 736
El grupo del segmento H19011_1_N10 (SEQ ID NO: 131) está apoyado por 5 bibliotecas. El número de bibliotecas se determinó tal como se ha descrito anteriormente. Este segmento se puede encontrar en los siguientes transcritos: H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) y H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46). La Tabla 102 que sigue a continuación describe la posición de inicio y fin de este segmento en cada transcrito.
Tabla 102 - Localización del segmento en los transcritos
Nombre del transcrito Posición de inicio del segmento Posición de fin del segmento H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) 737 797
H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46) 680 740
El grupo del segmento H19011_1_N11 (SEQ ID NO: 132) está apoyado por 3 bibliotecas. El número de bibliotecas se determinó tal como se ha descrito anteriormente. Este segmento se puede encontrar en los siguientes transcritos: H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) y H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46). La Tabla 103 que sigue a continuación describe la posición de inicio y fin de este segmento en cada transcrito.
Tabla 103 - Localización del segmento en los transcritos
Nombre del transcrito Posición de inicio del segmento Posición de fin del segmento H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) 798 863
H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46) 741 806
El grupo del segmento H19011_1_N12 (SEQ ID NO: 133) está apoyado por 5 bibliotecas. El número de bibliotecas se determinó tal como se ha descrito anteriormente. Este segmento se puede encontrar en los siguientes transcritos: H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) y H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46). La Tabla 104 que sigue a continuación describe la posición de inicio y fin de este segmento en cada transcrito.
Tabla 104 - Localización del segmento en los transcritos
Nombre del transcrito Posición de inicio del segmento Posición de fin del segmento H19011_1_T8 (SEQ ID NO: 45) 864 883
H19011_1_T9 (SEQ ID NO: 46) 807 826
La expresión de C1ORF32, marco de lectura abierta 32 del cromosoma 1, transcritos de H19011 que se pueden detectar con amplicón tal como se representa con la secuencia de nombre H19011_seg13F2R2 (SEQ ID NO: 235) en tejidos de Colon normales y cancerígenos, en tejidos de Pulmón normales y cancerígenos y en diferentes tejidos normales.
La expresión de C1ORF32, marco de lectura abierta 32 del cromosoma 1, transcritos que se pueden detectar con o de acuerdo con el amplicón seg13 - H19011_seg13F2R2 (SEQ ID NO: 235) y los cebadores H19011_seg13F2 (SEQ ID NO: 233) y H19011_seg13R2 (SEQ ID NO: 234) se midió con PCR en tiempo real en panel de colon, panel de pulmón y panel normal. Las muestras usadas se detallan en la Tabla 5, Tabla 3 y Tabla 2 mencionadas anteriormente, respectivamente. Para cada muestra de RT, la expresión del amplicón mencionado anteriormente se normalizó con el factor de normalización calculado a partir de la expresión de varios genes constitutivos tal como se describe en el Ejemplo 1.
Panel de colon - La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras normales (números de muestra 42-70, Tabla 5 mencionada anteriormente). A continuación, se calculó lo recíproco para esta relación, para obtener un valor del número de veces de regulación negativa para cada muestra con respecto a la media de las muestras normales.
La Figura 3 es un histograma que muestra la regulación negativa de los transcritos de C1ORF32 indicados anteriormente en muestras cancerígenas de Colon con respecto a las muestras normales.
Tal como es evidente a partir de la Figura 3, la expresión de transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón anterior en muestras de cáncer era significativamente menor que en las muestras no cancerígenas (números de muestra 42-70, Tabla 5 mencionada anteriormente). De forma notable, se encontró una regulación negativa de al menos 6 veces en 17 de cada 55 muestras de adenocarcinoma.
Se aplicó análisis estadístico para verificar la significancia de estos resultados, como se describe a continuación. El valor de P para la diferencia en los niveles de expresión de transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón anteriores muestras de cáncer de Colon frente a las muestras de tejido normal se determinó con el ensayo de T como 9,36e-004.
Se encontró un umbral de regulación negativa de 6 veces para diferenciar entre muestras de cáncer y normales con un valor de P de 2,67e-004 tal como se comprueba con el ensayo de Fisher exacto.
Los valores mencionados anteriormente demuestran la significancia estadística de los resultados.
Panel de pulmón - La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras normales (números de muestra 51-64 y 69-70, Tabla 3 mencionada anteriormente), para obtener un valor del número de veces de regulación positiva para cada muestra con respecto a la media de las muestras normales.
La Figura 4 es un histograma que muestra la sobreexpresión de los transcritos de C1ORF32 que se han indicado anteriormente en muestras de Pulmón cancerígenas con respecto a las muestras normales.
Tal como es evidente a partir de la Figura 4, la expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma microcítico era significativamente más elevada que en las muestras no cancerígenas (números de muestra 51-64 y 69-70, Tabla 3 mencionada anteriormente). De forma notable, se encontró una sobreexpresión de al menos 6 veces en 9 de cada 9 muestras de carcinoma microcítico.
Se aplicó análisis estadístico para verificar la significancia de estos resultados, como se describe a continuación. El valor de P para la diferencia en los niveles de expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma microcítico de Pulmón frente a las muestras de tejido normal se determinó con el ensayo de T como 3,43e-003.
Se encontró un umbral de sobreexpresión de 6 veces para diferenciar entre muestras de carcinoma microcítico y normales con un valor de P de 4,89e-007 tal como se comprueba con el ensayo de Fisher exacto.
Los valores mencionados anteriormente demuestran la significancia estadística de los resultados.
Panel normal -La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras de colon (números de muestra 3, 4 y 5,
Tabla 2 mencionada anteriormente), para obtener un valor de la expresión relativa de cada muestra con respecto a la media de las muestras de colon, tal como se muestra en la Figura 5A. La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras de pulmón (números de muestra 26, 28, 29 y 30, Tabla 2 mencionada anteriormente), para obtener un valor de la expresión relativa de cada muestra con respecto a la media de las muestras de pulmón, tal como se muestra en la figura 5B.
Los pares de cebadores también están abarcados opcional y preferentemente dentro de la presente divulgación; por ejemplo, para el experimento anterior, se usó el siguiente par de cebador como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un par de cebador adecuado: cebador directo de H19011_seg13F2 (SEQ ID NO: 233); y cebador inverso de H19011_seg13R2 (SEQ ID NO: 234).
La presente divulgación también abarca preferentemente cualquier amplicón obtenido a través del uso de cualquier par de cebadores adecuado, por ejemplo, para el experimento anterior, se obtuvo el siguiente amplicón como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un amplicón adecuado: H19011_seg13F2R2 (SEQ ID NO: 235).
Cebador Directo >H19011_seg13F2 (SEQ ID NO: 233): GTGAGTACAGTGACCGCTGGG
Cebador Inverso >H19011_seg13R2 (SEQ ID NO: 234): GGAGAAGAGTCTGGAATGACCAA
Amplicón >H19011_seg13F2R2 (SEQ ID NO: 235)
GTGAGTACAGTGACCGCTGGGGAGACAGAGCGATCGAGAGAAATGTC TACCTCTCTACCTGACAGCTGTGTGCGCTGGGTTCCTCCTCCACCTCCTGTCC TGCC ACCCCCAAGATTGGT CATTCCAGACTCTT CT CC
La expresión de C1ORF32, marco de lectura abierta 32 del cromosoma 1, transcritos de H19011 que se pueden detectar con amplicón tal como se representa en el nombre de la secuencia H19011_seg8-13F1R1 (SEQ ID NO: 238) en tejidos de Pulmón normales y cancerígenos.
La expresión de C1ORF32, marco de lectura abierta 32 del cromosoma 1, transcritos detectable con o de acuerdo con el amplicón seg8-13F1R1 - H19011_seg8-13F1R1 (SEQ ID NO: 238) y los cebadores H19011_seg8-13F1 (SEQ ID NO: 236) y H19011_seg8-13R1 (SEQ ID NO: 237) se midió con PCR en tiempo real en panel de pulmón. Las muestras usadas se detallan en la Tabla 3 mencionada anteriormente. A las muestras que no presentan detección del amplicón (muestras n° 1, 2, 4-10, 12-27, 29-35, 37-41, 51-64 y 69-70, Tabla 3) se les asignó un valor de Ct de 41 y se calcularon en consecuencia. Estas muestras presentaban un producto de cebador-dímero con una curva de disociación característica y un TM significativamente menor (este producto falso en sentido de artefacto se identificó por su aspecto en el control negativo sin muestra de RT). Para cada muestra de RT, la expresión del amplicón mencionado anteriormente se normalizó con el factor de normalización calculado a partir de la expresión de varios genes constitutivos tal como se describe en el Ejemplo 1. La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras normales (números de muestra 51-64 y 69-70, Tabla 3 mencionada anteriormente), para obtener un valor del número de veces de regulación positiva para cada muestra con respecto a la media de las muestras normales.
La Figura 6 es un histograma que muestra la sobreexpresión de los transcritos de C1ORF32 que se han indicado anteriormente en muestras de Pulmón cancerígenas con respecto a las muestras normales.
Tal como es evidente a partir de la Figura 6, la expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma microcítico era significativamente más elevada que en las muestras no cancerígenas (números de muestra 51-64 y 69-70, Tabla 3 mencionada anteriormente). De forma notable, se encontró una sobreexpresión de al menos 500 veces en 9 de cada 9 muestras de carcinoma microcítico.
Se aplicó análisis estadístico para verificar la significancia de estos resultados, como se describe a continuación. El valor de P para la diferencia en los niveles de expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma microcítico de Pulmón frente a las muestras de tejido normal se determinó con el ensayo de T como 6,70e-003.
Se encontró un umbral de sobreexpresión de 500 veces para diferenciar entre muestras de carcinoma microcítico y normales con un valor de P de 4,89e-007 tal como se comprueba con el ensayo de Fisher exacto.
Los valores mencionados anteriormente demuestran la significancia estadística de los resultados.
Los pares de cebadores también están abarcados opcional y preferentemente dentro de la presente divulgación; por ejemplo, para el experimento anterior, se usó el siguiente par de cebador como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un par de cebador adecuado: cebador directo de H19011_seg8-13F1 (SEQ ID NO: 236); y cebador inverso de H19011_seg8-13R1 (SEQ ID NO: 237).
La presente divulgación también abarca preferentemente cualquier amplicón obtenido a través del uso de cualquier par de cebadores adecuado, por ejemplo, para el experimento anterior, se obtuvo el siguiente amplicón como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un amplicón adecuado: H19011_seg8-13F1R1 (SEQ ID NO: 238). Cebador Directo >H19011_seg8-13F1 (SEQ ID NO: 236): GCCCAGTTTTGCTGTGGAGA
Cebador Inverso >H19011_seg8-13R1 (SEQ ID NO: 237): GGTAGACATTTCTCTCGATCGCTC
Amplicón >H19011_seg8-13F1R1 (SEQ ID NO: 238)
GCCCAGTTTTGCTGTGGAGATTATGCCAGAGTGGGTGTTTGTTGGCCTG GTGCTCCTGGGCGTCTTCCTCTTCTTCGTCCTGGTGGGGATCTGCTGGTGCCA GTGCTGCCCTCACAGCTGCTGCTGCTATGTCCGCTGCCCATGCTGCCCAGAT TCCTGCTGGTGCCCTCAAGCCTGTGAGTACAGTGACCGCTGGGGAGACAGA GCGATCGAGAGAAATGTCTACC
La expresión de C1ORF32, marco de lectura abierta 32 del cromosoma 1, transcritos de H19011 que se pueden detectar con amplicón tal como se representa en el nombre de la secuencia H19011-junc8-10seg13 (SEQ ID NO: 241) en tejidos de pulmón normales y cancerígenos, en tejidos de colon normales y cancerígenos, en diferentes tejidos normales y en el panel específico para sangre.
La expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con o de acuerdo con el amplicón junc8-10seg13 - H19011_junc8-10seg13 (SEQ ID NO: 241) y los cebadores H19011_junc8-10seg13F1 (SEQ ID NO: 239) y H19011_junc8-10seg13R1 (SEQ ID NO: 240) se midió con PCR en tiempo real para panel de pulmón, panel de colon, panel normal panel de sangre. Las muestras usadas se detallan en la Tabla 3, Tabla 5, Tabla 2 y Tabla 1 mencionadas anteriormente, respectivamente. Para cada muestra de RT, la expresión del amplicón mencionado anteriormente se normalizó con el factor de normalización calculado a partir de la expresión de varios genes constitutivos tal como se describe en el Ejemplo 1.
Para panel de pulmón - A la muestra no detectada de (muestra n° 69, Tabla 3) se le asignó un valor de Ct de 41 y se calculó en consecuencia. La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras normales (números de muestra 51, 53, 54, 56, 57, 59, 61, 62, 64 y 70, Tabla 3 mencionada anteriormente), para obtener un valor del número de veces de regulación positiva para cada muestra con respecto a la media de las muestras normales.
La Figura 43 es un histograma que muestra la sobreexpresión de los transcritos de C1ORF3 mencionados anteriormente en muestras de Pulmón cancerígenas con respecto a las muestras normales.
Tal como es evidente a partir de la Figura 7, la expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma microcítico era significativamente más elevada que en las muestras no cancerígenas (números de muestra 51, 53, 54, 56, 57, 59, 61, 62, 64 y 70, Tabla 3 mencionada anteriormente). De forma notable, se encontró una sobreexpresión de al menos 7 veces en 9 de cada 9 muestras de carcinoma microcítico.
Se aplicó análisis estadístico para verificar la significancia de estos resultados, como se describe a continuación. El valor de P para la diferencia en los niveles de expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma microcítico de Pulmón frente a las muestras de tejido normal se determinó con el ensayo de T como 2,34e-003.
Se encontró un umbral de sobreexpresión de 7 veces para diferenciar entre muestras de carcinoma microcítico y normales con un valor de P de 1,08e-005 tal como se comprueba con el ensayo de Fisher exacto.
Los valores mencionados anteriormente demuestran la significancia estadística de los resultados.
Para panel de colon - A la muestra no detectada de (muestra n° 79, Tabla 5) se le asignó un valor de Ct de 41 y se calculó en consecuencia. La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras normales (números de muestra 42-62 y 65-70, Tabla 5 mencionada anteriormente). A continuación, se calculó lo recíproco para esta relación, para obtener un valor del número de veces de regulación negativa para cada muestra con respecto a la media de las muestras normales.
La Figura 8 es un histograma que muestra la regulación negativa de los transcritos de C1ORF32 indicados anteriormente en muestras de colon cancerígenas con respecto a las muestras normales.
Tal como es evidente a partir de la Figura 8, la expresión de transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón anterior en muestras de cáncer era significativamente menor que en las muestras no cancerígenas (números de muestra 42-62 y 65-70, Tabla 5 mencionada anteriormente). De forma notable, se encontró una regulación negativa de al menos 5 veces en 15 de cada 36 muestras de adenocarcinoma.
Se aplicó análisis estadístico para verificar la significancia de estos resultados, como se describe a continuación. Se encontró un umbral de regulación negativa de 5 veces para diferenciar entre muestras de cáncer y normales con un valor de P de 4,29e-004 tal como se comprueba con el ensayo de Fisher exacto.
Los valores mencionados anteriormente demuestran la significancia estadística de los resultados.
Para panel normal - A las muestras no detectadas de (muestras n° 42 y 49, Tabla 2) se les asignó un valor de Ct de 41 y se calculó en consecuencia. La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras de colon (números de muestra 4 y 5, Tabla 2 mencionada anteriormente), para obtener un valor de la expresión relativa de cada muestra con respecto a la media de las muestras de colon, tal como se muestra en la Figura 9A. La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras de pulmón (números de muestra 26, 29 y 30, Tabla 2 mencionada anteriormente), para obtener un valor de la expresión relativa de cada muestra con respecto a la media de las muestras de pulmón, tal como se muestra en la Figura 9B.
Para panel de sangre - La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de muestras normales de riñón (números de muestra 65-67, Tabla 1 mencionada anteriormente), para obtener un valor de la expresión relativa de cada muestra con respecto a la media de las muestras normales de riñón.
Los resultados de este análisis se representan en el histograma de la Figura 10. La expresión del transcrito de C1ORF32 indicado anteriormente es elevada en una muestra de linfoma (muestra n° 33, Tabla 1) pero también en muestra de cerebro normal.
Los pares de cebadores también están abarcados opcional y preferentemente dentro de la presente divulgación; por ejemplo, para el experimento anterior, se usó el siguiente par de cebador como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un par de cebador adecuado: cebador directo de H19011_junc8-10seg13F1 (SEQ ID NO: 239); y cebador inverso de H19011_junc8-10seg13R1 (SEQ ID NO: 240).
La presente divulgación también abarca preferentemente cualquier amplicón obtenido a través del uso de cualquier par de cebadores adecuado, por ejemplo, para el experimento anterior, se obtuvo el siguiente amplicón como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un amplicón adecuado: H19011_junc8-10seg13F1R1 (SEQ ID NO: 241).
Cebador Directo >H19011_junc8-10seg13F1 (SEQ ID NO: 239)
TGTGGAGATTATGCCAGAGTGG
Cebador Inverso >H19011_junc8-10seg13R1 (SEQ ID NO: 240)
GACATTTCTCTCGATCGCTCTGT
Amplicón >H19011_junc8-10seg13F1R1 (SEQ ID NO: 241)
T GT GG AG ATT AT GCC AG AGT GGGT GTTT GTT GGCCT GGT GCTCCT GGGC GT CTT CCTCTT CTT CGTCCTGGTGGGG AT CT GCT GGT GCC AGT GCTGCCCT C A CAGCTGCTGCTGCTATGTCCGCTGCCCATGCTGCCCAGATTCCTGCTGGTGC CCTCAAGCCTGTGAGTACAGTGACCGCTGGGGAGACAGAGCGATCGAGAG AAATGTC
La expresión de C1ORF32, marco de lectura abierta 32 del cromosoma 1, transcritos de H19011 que se pueden detectar con amplicón tal como se representa en el nombre de la secuencia H19011_junc6-10 (SEQ ID NO: 244) en tejidos de pulmón normales y cancerígenos y en tejidos de Colon normales y cancerígenos.
La expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con o de acuerdo con el amplicón junc6-10 -H19011_junc6-10F1R1 (SEQ ID NO: 244) y los cebadores H19011_junc6-10F1 (SEQ ID NO: 242) y H19011_junc6-10R1 (SEQ ID NO: 243) se midió con PCR en tiempo real en panel de pulmón y en panel de colon. Las muestras usadas se detallan en la Tabla 3 y en la Tabla 5 mencionadas anteriormente, respectivamente. Para cada muestra de RT, la expresión del amplicón anterior se normalizó con el factor de normalización calculado a partir de la expresión de varios genes constitutivos tal como se describe en el Ejemplo 1.
Panel de pulmón - La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras normales (números de muestra 51-64, 69 y 70, Tabla 3 mencionada anteriormente). A continuación, se calculó lo recíproco para esta relación, para obtener un valor del número de veces de regulación negativa para cada muestra con respecto a la media de las muestras normales.
La Figura 11 es un histograma que muestra la regulación negativa de los transcritos de C1ORF32 indicados anteriormente en muestras de Pulmón cancerígenas con respecto a las muestras normales.
Tal como es evidente a partir de la Figura 11, la expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma no microcítico, adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas era significativamente menor que en las muestras no cancerígenas (números de muestra 51­ 64, 69 y 70, Tabla 3 mencionada anteriormente). De forma notable, se encontró una regulación negativa de al menos 5 veces en 23 de cada 39 muestras de carcinoma no microcítico especialmente en 8 de cada 17 muestras de adenocarcinoma y en 12 de cada 16 muestras de carcinoma de células escamosas.
Se aplicó análisis estadístico para verificar la significancia de estos resultados, como se describe a continuación. El valor de P para la diferencia en los niveles de expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de carcinoma no microcítico de pulmón, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas de pulmón, frente a las muestras de tejido normal se determinó con el ensayo de T como 1,18e-003, 2,87e-002 y 3,55e-004, respectivamente.
Se encontró un umbral de regulación negativa de 5 veces para diferenciar entre muestras de carcinoma no microcítico de pulmón, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas de pulmón y muestras normales con valor de P de 1,59e-003, 3,54e-002 y 4,78e-004, respectivamente, tal como se comprueba con el ensayo de Fisher exacto.
Los valores mencionados anteriormente demuestran la significancia estadística de los resultados.
Panel de colon - La cantidad normalizada de cada muestra de RT se dividió a continuación entre la media de las cantidades de las muestras normales (números de muestra 42-70, Tabla 5 mencionada anteriormente). A continuación, se calculó lo recíproco para esta relación, para obtener un valor del número de veces de regulación negativa para cada muestra con respecto a la media de las muestras normales.
La Figura 12 es un histograma que muestra la regulación negativa de los transcritos de C1ORF32 indicados anteriormente en muestras cancerígenas de Colon con respecto a las muestras normales.
Tal como es evidente a partir de la Figura 48, la expresión de los transcritos de C1ORF32 que se pueden detectar con el amplicón mencionado anteriormente en muestras de cáncer era significativamente menor que en las muestras no cancerígenas (números de muestra 42-70, Tabla 5 mencionada anteriormente). De forma notable, se encontró una regulación negativa de al menos 9 veces en 23 de cada 55 muestras de adenocarcinoma.
Se aplicó análisis estadístico para verificar la significancia de estos resultados, como se describe a continuación. Se encontró un umbral de regulación negativa de 9 veces para diferenciar entre muestras de cáncer y normales con un valor de P de 7,39e-006 tal como se comprueba con el ensayo de Fisher exacto.
Los valores mencionados anteriormente demuestran la significancia estadística de los resultados.
Los pares de cebadores también están abarcados opcional y preferentemente dentro de la presente divulgación; por ejemplo, para el experimento anterior, se usó el siguiente par de cebador como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un par de cebador adecuado: cebador directo de H19011_junc6-10F1 (SEQ ID NO: 242); y cebador inverso de H19011_junc6-10R1 (SEQ ID NO: 243).
La presente divulgación también abarca preferentemente cualquier amplicón obtenido a través del uso de cualquier par de cebadores adecuado, por ejemplo, para el experimento anterior, se obtuvo el siguiente amplicón como un ejemplo ilustrativo no limitante solamente de un amplicón adecuado: H19011_junc6-10F1R1 (SEQ ID NO: 244). Cebador Directo >H19011_junc6-10F1 (SEQ ID NO: 242).
ACTCTATTACTGTATTATCACCACCCCAG
Cebador Inverso >H19011_junc6-10R1 (SEQ ID NO: 243)
CCCAACAAACACCCACTCCAAC
Amplicón >H19011_junc6-10F1R1 (SEQ ID NO: 244)
ACTCTATTACTGTATTATCACCACCCCAGATGACCTGGAGGGGAAAAA TGAGGGCTCACTGGGACTGCTGGTGTTGGAGTGGGTGTTTGTTGG
Ejemplo 8
CLONACIÓN DE TRANSCRITOS DE LONGITUD COMPLETA QUE CODIFICAN C1ORF32 FUSIONADOS CON EGFP
La clonación de transcritos de Longitud Completa que codifican C1ORF32 fusionados con EGFP se realizó como se describe a continuación.
En primer lugar, se construyó el vector de expresión de EGFP y a continuación se exploraron los marcos de lectura abierta de C1ORF32 (ORF). EGFP se subclonó en pIRESpuro3 (número de catálogo de Clontech: 631619) como sigue a continuación: el vector EGFP-N1 (número de catálogo de Clontech: 6085-1) se digirió con NheI y NotI para extinguir el gen de EGFP. El inserto de EGFP se ligó a continuación en pIRESpuro3 (número de catálogo de Clontech: 631619), que previamente se había digerido con las mismas enzimas, obtener el vector EGFP-pIRESpuro3.
La clonación de los marcos de lectura abierta de C1ORF32 (ORF) se realizó usando las siguientes etapas:
1. Se realizó una reacción de transcripción inversa como sigue a continuación: se mezclaron 10 |jg de ARN purificado con 150 ng de cebadores de Hexámero Aleatorio (Invitrogen, Carlsbad. CA. USA, número de catálogo: 48190-011) y dNTP 500 jM en un volumen total de 156 jl. La mezcla se incubó durante 5 min a 65 °C y a continuación se enfrió rápidamente en hielo. A partir de ese momento, se añadieron 50 □l de tampón de primera hebra de SuperscriptII 5X (Invitrogen, número de catálogo: 18064-014, número de pieza: Y00146), 24 j l de 0,1 M DTT y 400 unidades de RNasina (Promega, Milwaukee. WS. U.S.A., número de catálogo: N2511), y la mezcla se incubó durante 10 min a 25 °C, seguido de incubación adicional a 42 °C durante 2 min. A continuación, se añadieron 10 j l (2000 unidades) de SuperscriptII (Invitrogen, número de catálogo: 18064-014) y la reacción (volumen final de 250 jl) se incubó durante 50 min a 42 °C la continuación se inactivó a 70 jC durante 15 min. El Ad Nc resultante se diluyó a 1:20 en tampón de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8).
2. Se realizó PCR usando Platinum PfX™ (Invitrogen., Carlsbad. CA. USA, número de catálogo: 1178-021) en las siguientes condiciones: 5 j l de tampón Platinum PFX 10x; 5 j l - ADNc a partir de lo anterior; 2 j l - dNTP 10 mM (2,5 mM de cada nucleótido); 0,5 j l - enzima de Platinum PFX; 37 j l - H2O; y 1,5 j l - de cada cebador (15 jM ) en un volumen total de reacción de 50 jl; con un programa de reacción de 5 minutos en 95 °C; 35 ciclos de: 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, 50 segundos a 68 °C; a continuación 10 minutos a 68 °C. Los cebadores que se usaron incluyen secuencias específicas del gen es que corresponden a las coordenadas deseadas de la proteína y sitios enzimáticos de restricción y secuencia de Kozak, tal como se enumera en tabla 136, a continuación. Las letras en negrita en la Tabla 136 representan la secuencia genética específica mientras que las extensiones del sitio de restricción usadas con fines de clonación se presentan en cursiva y las secuencias de Kozak están subrayadas.
La Tabla 136 demuestra las etapas de clonación de dianas de ORF. Por ejemplo, se clonaron FXYD3_T25_P14 y VSIG1_T6_P5 mediante amplificación con PCR de los dos fragmentos de solapamiento de la longitud completa en la etapa 1, seguido de PCR adicional en la etapa 2 usando ambos fragmentos de PCR de la etapa 1 como un molde para generar la longitud completa. VSIG1_T5_P4 Se clonó usando ambos fragmentos de PCR generados en la etapa 1 para digestión y ligación directa, AI216611_T1_P1 se clonó realizando PCR anidada en el producto de PCR generado a partir de la etapa 1. Se cargaron 5 j l de los productos con números 1, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16 y 17 (Tabla 136), en un gel de agarosa al 1 % tenido con bromuro de etidio, sometido a electroforesis en solución de 1xTBE a 100 V, y se visualizo con luz UV. Después de la verificación de la banda del tamaño esperado, el producto restante de PCR se procesó para purificación de ADN usando el kit de purificación de PCR de Qiaquick (Qiagen™, Valencia. CA. U.S.A., número de catálogo 28106). Los productos de PCR extraídos se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas (New England Biolabs, Beverly. MA. U.S.A.), tal como se enumera en la tabla 136. Después de la digestión, los ADN se cargaron en un gel de agarosa al 1 % tal como se ha descrito anteriormente. El tamaño de la banda esperado se escindió y se extrajo a partir del gel usando el kit de Extracción de Gel de QiaQuick™ (Qiagen, número de catálogo: 28707).
Los ADN de los ORF de las dianas digeridas se ligaron al vector EGFP_pIRESpuro3 usando el Sistema de Ligamiento Rápido de ADN LigaFastTM (Promega, número de catálogo: M8221.). Los ADN resultantes se transformaron en DH5a de bacterias E. Coli competentes (RBC Bioscience, Taipei, Taiwán, número de catálogo: RH816) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a continuación se sembraron en placas de agar con LB-ampicilina para selección de plásmidos recombinantes, y se incubó durante una noche a 37 °C.
Al día siguiente, se tomó una serie de colonias de cada transformación que creció en las placas selectivas para análisis adicional mediante formación de placas sembradas en estrías en otra placa selectiva y mediante PCR usando GoTaq ReadyMix (Promega, número de catálogo: M7122.). La identificación sistemática de los clones positivos se realizó mediante PCR usando cebador específico del vector pIRESpuro3 y cebador específico de gen (no se muestran los datos). Después de la finalización de todos los ciclos de PCR, la mitad de la reacción se analizó usando gel de agarosa al 1 % tal como se ha descrito anteriormente. Después de la verificación del tamaño de banda esperado, se cultivaron 2 colonias positivas para cada reacción de ligamiento en 5 ml de Caldo de cultivo Terrific complementado con 100 jg/ml de ampicilina, con agitación durante una noche a 37 °C. El ADN plásmido se aisló de cultivos bacterianos usando el Kit de Miniprep en Centrífuga de Qiaprep™ (Qiagen, número de catálogo: 27106). La clonación precisa se verificó mediante secuenciación de los insertos (Weizmann Institute, Rehovot, Israel). Después de la verificación de una colonia libre de error (es decir, sin mutaciones dentro del ORF), los plásmidos recombinantes se procesaron para análisis adicionales.
Las secuencias de ADN de los C1ORF32 de longitud completa fusionados con EGFP resultantes se muestran en la Figura 13. En en la Figura 13, la secuencia específica del gen que corresponde a la secuencia de longitud completa de la diana se marca con letras en negrita, la secuencia de EGFP se presenta en letra cursiva sin negrita y las mutaciones conocidas de SNP/silenciosa se presentan subrayadas. La Figura 13 presenta la secuencia de ADN de C1ORF32_T8_P8_FGFP (1533 bp) (SEQ ID NO: 81).
Las secuencias de aminoácidos de los C1ORF32 de longitud completa fusionados con EGFP resultantes se muestran en la Figura 14; la secuencia específica del gen que corresponde a la secuencia de longitud completa de la proteína se marca en letras en negrita, la secuencia de EGFP se presenta en letra cursiva sin negrita y los aminoácidos modificados debido a los SNP conocidos se presentan subrayados. La Figura 14 presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína C1ORF32_P8_EGFP (510 aa) (SEQ ID NO: 91).
Tabla 136: detalles de clonación de longitud completa
Figure imgf000118_0001
Ejemplo 9
DETERMINACIÓN DE LA LOCALIZACIÓN CELULAR DE C1ORF32
Con el fin de determinar la localización celular de las dianas de proteína, éstas se clonaron como proteínas de fusión de EGFP (Proteína Fluorescente Verde Potenciada). La localización de las proteínas se observó después de transfección transitoria (Chen y col., Molecular vision 2002; 8; 372-388) usando el microscopio confocal. Las células observaron para la presencia de productos fluorescentes 48 horas después de la transfección.
La determinación de la localización celular de C1ORF32 se realizó mediante transfección transitoria de los constructos recombinantes de ORF-EGFP que se han descrito anteriormente.
Los constructos de C1ORF32 pIRESpuro3 se transfectar de forma transitoria posteriormente en linfocitos T de células HEK-293 como sigue a continuación:
Las células HEK-293T (ATCC, CRL-11268) se sembraron en cubreobjetos de vidrio estériles, 13 mm de diámetro (Marienfeld, número de catálogo: 01 11530), que se colocaron en una placa de 6 pocillos, usando 2 ml de DMEM calentado previamente [Medios de Eagle modificados con Dulbecco, Biological Industries (Beit Ha'Emek, Israel), número de catálogo: 01-055-1A] FBS al 10% (Suero Bovino Fetal) 4 mM de L-Glutamina. Más isquémica se transfectaron 500.000 células por pocillo con 2 |jg del constructo de ADN usando 6 j l de reactivo FuGENE 6 (Roche, número de catálogo: 11-814-443-001) diluido en 94 ul de DMEM. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de complejo se añadió gota a gota a las células y se sometió a agitación vorticial. Las células se colocaron en una incubadora mantenida a 37 °C con contenido de CO2 al 5 %.
48 horas después de la transfección transitoria, las células se procesaron adicionalmente para análisis en microscopio confocal. Los cubreobjetos se lavaron 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron durante 15 minutos con paraformaldehído al 3,7% o al 1 % (PFA) (Sigma, número de catálogo: P-6148). Después de 2 lavados en PBS, los cubreobjetos fijados se pegaron a un portaobjetos usando solución de montaje (Sigma, número de catálogo: G0918) y las células se observaron para la presencia de producto fluorescente usando microscopio confocal. Los resultados se presentan en la Figura 15.
La Figura 15 demuestra que la proteína fusionada con C1ORF32_P8_FGFP (SEQ ID NO: 91) se localiza en la membrana celular; la membrana del retículo endoplasmático (ER) y en las uniones celulares después de la expresión en linfocitos T de células HEK 293. La imagen se obtuvo usando el objetivo de 40x del microscopio confocal.
Ejemplo 10
CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE DOMINIO EXTRACELULAR (ECD) DE C1ORF32 FUSIONADOS CON FC DE RATÓN
La finalidad de este análisis era clonar los ECD de C1ORF32 fusionados a través de su extremo C correspondiente a Fc de ratón (mFc), y expresar los ECD fusionados en linfocitos T de células HEK 293 (ATCC- CRL-11268), con el fin de que fueran usados adicionalmente para producción de anticuerpos así como para evaluación funcional de los ECD de C1ORF32.
Las coordenadas del ECD clonado se describen en la tabla 137:
Tabla 137:
Figure imgf000119_0002
La clonación de las proteínas de fusión (ECD_mFc) se realizó en dos etapas:
1. Clonación de ECD a pIRESpuro3.
2. Subclonación de la IgG2a de Fc de ratón el marco con el extremo C del ECD clonado previamente en pIRESpuro3, a partir de la etapa 1.
La clonación de ECD a pIRESpuro3 se realizó como sigue a continuación:
La clonación del ECD para cada uno de los C1ORF32 se realizó delimitando por PCR la secuencia parcial de aminoácidos de su ECD tal como se describen en la tabla 137, usando su secuencia de longitud total como un molde, y cebadores tal como se enumera en la tabla 138.
Tabla 138: detalles de clonación de ECD
Figure imgf000119_0001
En la Tabla 138, mencionada anteriormente, las letras en negrita representan la secuencia específica del gen mientras que las extensiones del sitio de restricción usadas con fines de clonación se presentan en letra cursiva y la secuencia de Kozak está subrayada.
Los productos de PCR se purificaron y se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas tal como se describe en la tabla 138. Los productos de pCr para C1ORF32 se ligaron en pIRESpuro3, mientras que los productos de PCR VSIG1 e ILDR1 se ligaron en IL6sp_pIRESpuro3 con el fin de aumentar su secreción. La mezcla de ligamiento se transformó en células competentes para DH5a. Los transformantes positivos se identificaron sistemáticamente y se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Clonación de ECD-mFc pIRESpuro3
Se optimizó el codón de la secuencia de proteínas de Fc de ratón (IgG2a) (Referencia - CAA49868 aa 237-469) seguido de secuencia del sitio de escisión de TEV optimizado para estimular la expresión de proteínas en sistema de mamífero. La secuencia optimista se sintetizó mediante GeneArt (Alemania) con sitio de restricción de BamHI de flanqueo en el extremo N y sitio de restricción de NotI en el extremo C. El fragmento de ADN se digirió con BamHI/NotI y se ligó en marco en constructos de ECD_pIRESpuro3 digeridos previamente con las mismas enzimas para dar ECD_mFc_pIRESpuro3. La mezcla de ligamiento se transformó en células competentes para DH5a. Los transformantes positivos se identificaron sistemáticamente y se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Las secuencias de nucleótidos de los ORF de ECD_mFc se muestran en la Figura 16: la secuencia específica del gen que corresponde a la secuencia de ECD está marcada con letra en negrita, la secuencia del sitio de escisión de TEV está subrayada, la secuencia de mFc está en letra cursiva sin negrita y la secuencia de IL6sp está en letra cursiva en negrita. La Figura 16 muestra la secuencia de ADN de C1ORF32_T8_P8_ECD_mFc (1287 bp) (SEQ ID NO: 99).
La secuencia de las proteínas de fusión de ECD_mFc resultantes se muestra en la Figura 17; la secuencia específica del gen que corresponde a la secuencia de ECD está marcada con letra en negrita, la secuencia de sitio de escisión TEV está subrayada, la secuencia de mFc está en letra cursiva sin negrita y la secuencia de IL6sp está en letra cursiva en negrita. La Figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos de C1ORF32_T8_P8_ECD_mFc (428 aa) (SEQ ID NO: 105).
Para generar células que expresan ECD-mFc, se transfectaron linfocitos T de células HEK-293 con los constructos que se han descrito anteriormente que corresponden al dominio extracelular de C1ORF32 fusionado con Fc de ratón. Se generaron grupos estables como sigue a continuación seguido de 48 horas de post transfección, las células se tripsinaron y se transfirieron a un matraz T75 que contiene medio de selección (DMEM FCS al 10 % y 5 |jg/ml de puromicina) para obtener grupos estables. Los medios se cambiaron cada 3 a 4 días hasta la formación de colonias.
Para verificar la identidad de las células, se realizó PCR genómica, que indica las secuencias correctas integradas en el genoma celular (no se muestran los datos).
Se recogió medio privado de células y se purificó mediante perlas de Proteína A-Sefarosa (Amersham número de catálogo 17-5280-04) como sigue a continuación: 1 ml de medio privado de células se incubó con 50 j l de perlas de Proteína A sefarosa durante 45 minutos a temperatura ambiente. Al final del periodo de incubación, las proteínas se eluyeron de los gránulos de perlas con 50 j l de tampón de muestra que contiene Citrato Fosfato 100 mM pH 3,5 y DTT 10 mM. Las muestras se hirvieron durante 3 minutos y se cargaron 25 j l en gel de NuPAGE Bis Tris al 12 % (Invitrogen, número de catálogo NPO342). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon con leche baja en grasa al 10% en PBST (PBS complementado con tween-20 al 0,05%). A continuación, la membrana se transfirió durante 1 hora con fragmento de HRP de Fc de IgG anti ratón de Cabra (Jackson, número de catálogo 115-035-206.) (1:40.000 en solución de bloqueo) a temperatura ambiente. Después de la incubación con solución de ECL (Amersham Biosciences, N° de Catálogo RPN2209), la membrana se expuso a la película.
La Figura 61 muestra los resultados de una transferencia de western en FXYD3_ECD_mFc expresado (SEQ ID NO: 103), AI216611 ECD_mFc (SEQ ID NO: 104), C1ORF32_ECD_mFc (SEQ ID NO: 105), LOC253012_ECD_mFc (SEQ ID NO: 106), ILDR1_ECD_mFc (SEQ ID NO: 107), VSIG1_ECD_mFc (SEQ ID NO: 108).
Las calles son como sigue a continuación: calle 1 Marcadores de peso molecular (Amersham, arcoíris de intervalo completo, número de catálogo RPN800); calle 2- LOC253012_ECD_mFc (SEQ ID NO: 106); calle 3 -FXYD3_ECD_mFc (SEQ ID NO: 103); calle 4 - AI216611 ECD_mFc(SEQ ID NO: 104); calle 5 -C1ORF32_ECD_mFc (SEQ ID NO: 105); calle 6 - ILDR1_ECD_mFc (SEQ ID NO: 107); calle 7 - VSIG1_ECD_mFc (SEQ ID NO: 108).
Ejemplo 11
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA DEL DOMINIO EXTRACELULAR (ECD) DE C1ORF32 FUSIONADOS CON DE FC RATÓN
Para producir C1ORF32 ECD fusionados con Fc de ratón, se usaron grupos de linfocitos T de células HEK 293 transfectados de forma estable con los constructos correspondientes que se han descrito anteriormente en el presente documento. Las células transfectadas, mantenidas normalmente en medio complementado con suero al 10%, se transfirieron en medio libre de suero (EX-CELL293, SAFC) complementado con glutamina 4 mM y antibióticos de selección (5 ug/ml de puromicina), y se cultivaron en suspensión el matraz es de agitación a 37 °C, con agitación. El volumen del cultivo se elevó mediante ilusiones secuenciales hasta una fase de producción de 3-4 días realizada en matraces de agitación de 2 l. el medio de los agitadores se cosechó, se eliminó de las células por centrifugación, se filtró a través de un filtro de 0,22 jm y se mantuvo a -20 °C.
Los ECD de C1ORF32 fusionados con Fc de ratón se purificaron usando cromatografía por afinidad de nProteína A como se describe a continuación.
Las cosechas se concentraron aproximadamente 10 veces usando sistema de ultrafiltración PALL en dos casetes de 10 kDa. El concentrado se ajustó a continuación a pH 7,5, mediante la adición de NaOH 5 M y se filtró a través de un filtro Stericup de 0,2 jm.
El procedimiento de purificación se realizó usando AKTA Explorer (GE Healthcare). Se lavaron 2 ml de nProteína A Sefarosa TM, resina de Flujo Rápido (N° de cat 17-5280-02) en una columna de cromatografía Poli-prep al vacío con 10 volúmenes de columna (CV) de etanol al 70 %, 10 CV de WFI (Agua Estéril para Irrigación (TEVA)) seguido de 10 CV de tampón A. Se transfirieron 2 ml de resina en dos tubos de 500 ml (1 ml cada uno) y se añadió la cosecha concentrada. El tubo se incubó durante una noche a 4 °C en un rodillo para permitir la unión de la proteína. La resina única se transfirió a continuación y se empaquetó el flujo constante en una columna XK16 (GE Healthcare, N° de cat 18-8773-01). La columna se lavó con 20 CV de tampón A (Tris 100 Mm a pH 7,4) y se realizó reducción en una etapa usando el tampón B al 100 % (Citrato/Fosfato a pH 3,0). Las fracciones se valoraron con tampón C al 12,5 % (v/v) (Tris 2 M a pH 8,5) para ajustar el pH a ~7,5 y se combinaron.
El tampón final se intercambió por DPBS (solución salina taponada con Fosfato modificada con Dulbecco a pH 7,4, /o Ca, c/o Mg) pH 7,4 c/o Ca, c/o Mg usando una columna de desalación HiPrep TM (GE Healthcare, N° de cat 17­ 5087-01) de 53 ml. La proteína se filtró a través de un filtro de 0,22 pm, se tomaron alícuotas en condiciones estériles, y se almacenó a -800 °C.
La concentración final de la proteína se determinó mediante ensayo de proteína total de BCA y la proteína se analizó mediante SDS/PAGE de reducción teñida con Coomassie (no se muestran los datos). El nivel de endotoxina se determinó mediante ensayo de LAL colorimétrico (Lisado de Amebocitos de Limulus, QCL-1000, Cambrex). Las identidades de las proteínas específicas se verificaron mediante MS (en el Smoler Proteomics Center, Technion, Haifa, no se muestran los datos).
Los análisis de la proteína resultantes se resumen en la tabla 139.
Tabla 139
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Ejemplo 12
UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS FUSIONADAS CON FC DE LOS ECD A LINFOCITOS T ACTIVADOS
Con el fin de examinar la capacidad de los ECD de C1ORF32 fusionados con Fc que se han descrito anteriormente para unirse a un supuesto contrarreceptor en linfocitos T, estos ECD fusionados con Fc se sometieron a ensayo en linfocitos T en reposo o activados. Los linfocitos T purificados se activaron con ConA (Sigma Aldrich, N° de Cat C5275), seguido de incubación con los ECD de C1ORF32 fusionados con Fc y se analizaron mediante citometría de flujo.
Los linfocitos T se purificaron a partir de sangre completa mediante selección negativa usando Cóctel de Enriquecimiento de Linfocitos T Humanos RosetteSep™ (StemCell Technologies, N° de CAT 15061). Esto dio como resultado una población de linfocitos T (CD3+) con una pureza de un -90 %. Los linfocitos T purificados (1X 105) se cultivaron durante 48 horas en 100 ul de medio RPMI 1640 completo que contenía FBS al 10%, sin ninguna activación o activado con ConA (Concovalina A, 10 ug/ml, Sigma Aldrich, N° de Cat C5275). Los cultivos se cosecharon y se tiñeron con las proteínas fusionadas con Fc de los ECD durante 1 hora a 4 °C (ECD de C1ORF32 fusionados con Fc de IgG2 de ratón). Las proteínas unidas se detectaron con Fc anti-ratón de cabra de F(ab)2 conjugado con FITC durante media hora a 4 °C (Jackson ImmunoResearch Laboratories. N° de CAT 115-096-071). Las muestras se analizaron usando un FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems) y software CellQuest.
La Figura 19 presentan la unión de las proteínas fusionadas con Fc de los ECD C1ORF32 (SEQ ID NO: 105) para linfocitos T en reposo o linfocitos T activados con Con A para diferentes periodos de tiempo. Los linfocitos T humanos primarios de tres donantes diferentes se cultivaron durante un periodo total de 48 horas en ausencia de estímulo (0 horas) o en presencia de Con A, que se añadió a una concentración final de 10 pg/ml para las últimas 6, 18, 24 o 48 horas de cultivo (linfocitos T del donante 5 se cultivaron con Con A durante 0, 6, 18 y 24 horas mientras que los donantes 6 y 7 se cultivaron durante 0, 6, 24 y 48 horas). A continuación, las células se cosecharon y se incubaron con 10 pg/ml de las proteínas fusionadas con Fc de los ECD indicadas. La Figura 19 muestra los resultados de unión para el ECD de C1ORF32 fusionado con Fc. El porcentaje de células positivas se determinó como la diferencia entre las células positivas con la proteína indicada y las células positivas obtenidas con Fc de anti-ratón de cabra de F(ab)2 conjugado con FITC. La Figura 20 presenta la respuesta a la dosis de la unión de proteínas similares a B7 para linfocitos T activados. Los linfocitos T purificados se cultivaron durante 48 horas. Se añadió Con A para las últimas 24 horas. A continuación, las células se cosecharon y se tiñeron con concentraciones crecientes (3, 6. 12, 25 y 50 pg/ml) de los ECD de C1ORF32 fusionados con Fc. Como control negativo, se usó IgG2a de ratón a las mismas concentraciones.
Los resultados presentados en las Figuras 19 y 20 demuestran la unión de todas las proteínas fusionadas con Fc de los ECD sometidas a ensayo (ECD de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611 o c 1o RF32 fusionados con Fc de IgG2 de ratón, SEQ ID NO: 108, 107, 106, 104, o 105, respectivamente), a niveles de unión por encima de los de los controles negativos: IgG2a de ratón (R&D Systems, N° de CAT MAB003) como control de isotipo. Se detectó una unión básica para el ECD de VSIG1 fusionado con Fc y para ECD-Fc de LOC253012 para linfocitos T estimulados con ConA. Los ECD fusionados con Fc de C1ORF32 y AI216611 presentaban una unión más débil para estas células, tal como se puede observar a partir de las Figuras 19 y 20. Se encontró que cada proteína se unía un cierto porcentaje de linfocitos T activados. La clasificación de los niveles de unión fue como sigue a continuación VSIG1 > LOC253012 > ILDR1 = AI216611 > C1ORF32. Ninguna de las proteínas se unía a linfocitos T en reposo (es decir, 0 horas de ConA en la Figura 19).
Efecto de las proteínas fusionadas con Fc de los ECD en la activación de linfocitos T.
Con el fin de someter a ensayo la actividad potencial coestimuladora o/y coinhibidora de las proteínas solubles, los ECD de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, FXYD3 o C1ORF32 fusionados con Fc de IgG2 de ratón, SEQ ID NO: 108, 107, 106, 104, o 105, respectivamente, en la proliferación de linfocitos T y secreción de IL-2, se cultivaron linfocitos T humanos en presencia de anti-CD3 ((clone OKT3, eBioscience, N° de CAT 16-0037-85) y las proteínas de tipo B7, que se han descrito anteriormente. La proteína B7-1 humana recombinante (R&D Systems, N° de CAT 140-B1) se usó como un control positivo para la actividad coestimuladora. La proteína B7-H4 de ratón recombinante (R&D Systems, N° de CAT 4206-B7) se usó como control positivo para la actividad coinhibidora.
En primer lugar, se revistieron placas de 96 pocillos de fondo plano a 4 °C durante una noche con 3 pg/ml de mAb anti-CD3 (clon OKT3) y posteriormente se revistieron con las concentraciones indicadas de B7-1 humano (R&D, 3 pg/ml), B7-H4 de ratón (R&D, 10 pg/ml) o las proteínas fusionadas con Fc de los ECD de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, fXy D3 o C1ORF32 fusionados con Fc de IgG2 de ratón, durante 4 h a 37 °C. Los linfocitos T humanos se purificaron a partir de sangre completa como se ha descrito anteriormente, y se cultivaron en las placas de 96 pocillos revestidas previamente (1 x 105 células/pocillo) en 250 pl de medio RPMi 1640 completo que contenía FBS al 10% durante 48 h. Las placas revestidas se lavaron con PBS tres veces antes de sembrar las células. La proliferación de los linfocitos T se determinó mediante la incorporación de BrdU mediante ELISA de proliferación celular, BrdU (colorimétrico) (Roche). Las células se marcaron con reactivo de marcado de BrdU a una concentración final de 100 pM durante las últimas 18 horas. A continuación las placas centrifugaron (a 300 g, durante 10 min,), y los sobrendantes se aspiraron y se almacenaron a -20 °C para la determinación posterior de IL-2 usando un ELlSA de IL-2 Humano (Diaclone, N° de CAT 850,010 096). La incorporación de BrdU se midió de acuerdo con las instrucciones del fabricante del ELlSA de proliferación celular, BrdU (colorimétrico) (Roche, N° de CAT 11-647-229).
Las Figuras 21A-B presentan el efecto de las proteínas fusionadas con Fc de los ECD en la proliferación de linfocitos T o la secreción de IL-2, después de la activación con Ab anti-CD3. La Figura 21A muestra los niveles de incorporación de BrdU. La Figura 21B muestra los niveles de secreción de IL-2.
Los resultados, presentados en la Figura 21A-B, indican que ninguna de las proteínas fusionadas con ECD-Fc de los ECD de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, FXYD3 o C1ORF32 fusionados con Fc de IgG2 de ratón, presentaba actividad coestimuladora. El control positivo, B7-1, presentaba una fuerte actividad coestimuladora, tal como se esperaba. Parecía que el ECD de ILDR1 fusionado con Fc y el ECD de AI216611 fusionado con Fc tenían actividad coinhibidora, dado que inhibían la proliferación celular del mismo modo que B7-H4, en comparación con la obtenida en presencia del control negativo: IgG2a de ratón (Figura 21A). Sin embargo, no se observó ningún efecto significativo en la secreción de IL-2 de cualquiera de las proteínas fusionadas con ECD-Fc, de los ECD de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, FXYD3 o C1ORF32 fusionados con Fc (Figura 21B).
Ejemplo 13
UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS FUSIONADAS CON FC DE LOS ECD A LINFOCITOS Y A CÉLULAS POSITIVAS PARA CD4
Con el fin de examinar adicionalmente la capacidad de los ECD de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, FXYD3 y C1ORF32 fusionados con Fc para unirse de un supuesto contrarreceptor en linfocitos T, estos ECD fusionados con Fc se sometieron ensayo primero en linfocitos. Se prepararon PBMc a partir de sangre periférica humana, en tampón FACS a 1 x 10e7/ml. Se añadió bloqueador de Fc (hIgG (16D10), N° de lote 080706, 1,3 mg/ml) a 30 ug/ml y las células se incubaron con el bloqueador en hielo durante 30 min. Se añadieron proteínas de fusión a 1 ug/10e6 por tinción en hielo durante 30 min. El 2° Ab se añadió a 1 ug/100 ul/tinción durante 25-30 min (G@mIgG-Fc-FITC: Jackson Immunol Lab, 1 mg/ml, N° de código 115-096-071, N° de lote 71453, 1,0 mg/ml, usado a 1 ug/tinción). Las células se lavaron con el tampón en cada etapa que se ha resumido anteriormente. La unión se analizó por citometría de flujo.
La Figura 22A-B ilustra la unión de los ECD fusionados con Fc de los VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, FXYD3 o C1ORF32 a linfocitos. Tal como se puede observar a partir de la Figura 22A-B, C1ORF32, AI216611 e ILDR1 se unen a un homólogo expresado en linfocitos.
A continuación, se realizó la unión de los ECD fusionados con Fc de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611, FXYD3 y C1ORF32 a células CD4+. Se añadió bloqueador de Fc (hIgG (16D10), N° de lote 080706, 1,3 mg/ml) a 30 ug/ml y las células se incubaron con el bloqueador en hielo durante 30 min. Se añadieron proteínas de fusión a 1 ug/10e6 por tinción en I. durante 30 min. Añadir el 2° Ab a 1 ug/100 ul/tinción durante 25-30 min (G@mIgG-Fc-FITC: Jackson Immunol Lab, 1 mg/ml, N° de código 115-096-071, N° de lote 71453, 1,0 mg/ml, usado a 1 ug/tinción). @CD4 (m@hCD4-APC: BD, N° de cat 3555349, N° de lote 44331). Se añadieron 20 ul de cada uno por tinción, en hielo durante 30 min.
Las células se lavaron con el tampón en cada etapa que se ha resumido anteriormente. La unión se analizó por citometría de flujo.
La Figura 23A-B ilustra la unión de los ECD fusionados con Fc de ILDR1, C1ORF32 y AI216611 a células CD4+. Ejemplo 14
EFECTO DE LAS PROTEÍNAS FUSIONADAS CON FC DE LOS ECD EN LA ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T. Con el fin de someter a ensayo la actividad coestimuladora o/y coinhibidora de las proteínas de tipo B7, se sometió a ensayo el efecto de los ECD de VSIG1, ILDR1, LOC253012, AI216611 o C1ORF32 fusionados con Fc de IgG2 de ratón en proliferación de linfocitos T. Los linfocitos T se purificaron a partir de sangre completa mediante selección positiva usando microperlas de CD3 (microperlas conjugadas con anticuerpos monoclonales CD3 anti-humanos (isotipo: IgG2a de ratón) (Microperlas de CD3 de Sangre Completa de MACS N° 130-090-874). Las Dinaperlas se revisten con CD3 /- B7 con Dinaperlas de Epoxi M-450 (Invitrogen N° de cat 140,11). Para la activación de los linfocitos T de CD3, los linfocitos T de CD3 purificados se estimula con las perlas revestidas con CD3 CD28 a una relación de 1:1 o 1:05 para diversos puntos temporales si fuera necesario. Las células se sembraron a 2 x 10e5 por Portillo en presencia o ausencia de perlas revestidas con CD3 CD28 (2 ug/ml cada una) y la proliferación celular se midió después de 72 horas mediante incorporación de tritio-timidina. Los resultados se muestran en la Figura 24. "CD3" en la Figura 24 se refiere a CD3 solamente sin la presencia de una molécula coestimuladora o coinhibidora; "CD3 B7.2" se refiere a CD3 un control de estimulador de B7 conocido, B7.2; "CD3 B7H4" se refiere a CD3 y B7H4 un control inhibidor de B7 conocido; "CD3 B7H3" se refiere a CD3 y B7H3 una proteína simuladora de b 7 conocida; "CD3 702" se refiere a CD3 LOC253012-ECD-fusionado con Fc (SEQ ID NO: 106); "CD3 721" se refiere a CD3 AI216611- ECD-fusionado con Fc (SEQ ID NO: 104); "CD3 754" se refiere a CD3 C1ORF32-ECD-fusionado con Fc (SEQ ID NO: 105); "CD3 768" se refiere a Cd3 VSIG1-ECD-fusionado con Fc (SEQ ID NO: 108) "CD3 770" se refiere a CD3 ILDR1-ECD-fusionado con Fc (SEQ ID NO: 107); "CD3 789" se refiere a CD3 FXYD3-ECD-fusionado con Fc (SEQ ID NO: 103).
Como puede verse en la Figura 24, LOC253012-ECD-Fc, AI216611- ECD-Fc, VSIG1-ECD-Fc y FXYD3-ECD-Fc tuvieron un efecto inhibitorio en las células T en comparación con CD3 solo en 3 experimentos diferentes (Figuras 24A, B y C).
Ejemplo 15
INTERACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS FUSIONADAS CON ECD-FC CON LÍNEAS CELULARES DE LINFOMA DERIVADAS DE LINFOCITOS B EN REPOSO, LINFOCITOS B ACTIVADOS, Y LINFOCITOS B
Después de la demostración de la unión de las proteínas a linfocitos (Ejemplo 12 y 13, en el presente documento), se examinó la capacidad de las proteínas solubles para unirse a linfocitos B.
Se prepararon PBMC a partir de sangre periférica humana, en tampón FACS a 1 x 10e7/ ml. Se añadió bloqueador de Fc (hIgG (16D10), N° de lote 080706, 1,3 mg/ml) a 30 pg/ml y las células se incubaron con el bloqueador en hielo durante 30 min. Se añadieron proteínas de fusión ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-Fc (SEQ ID NO: 105), AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104), LOC253012-ECD-Fc (SEQ ID NO: 106), FXYD3-ECD-Fc (SEQ ID NO: 103), y VSIG1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 108) a 1 pg/10e6 por tinción en hielo durante 30 minutos. El 2° Ab se añadió a 1 pg/100 pl/tinción durante 25-30 min (G@mIgG-Fc-FITC: Jackson Immunol Lab, 1 mg/ml, N° de código 115-096-071, N° de lote 71453, 1,0 mg/ml, usado a 1 ug/tinción). Las células se lavaron con el tampón en cada etapa como se ha resumido anteriormente. La unión se analizó por citometría de flujo. Después de esto las células se tiñeron con IgM-PE @humano de ratón (BD Bioscience. cA. USA, N° de cat 555783) que es específico para linfocitos B. Las células teñidas se analizaron mediante citometría de flujo. Las células positivas para IgM @humana se seleccionaron para analizar la unión de las proteínas de fusión de la invención a los linfocitos B.
Tal como se muestra en la Figura 25A-E, ILDR1-ECD-Fc y C1ORF32-ECD-Fc se unen a linfocitos B de los 3 donantes sometidos a ensayo. AI216611-ECD-Fc presentaba unión a linfocitos B solamente en 1 donante.
Con el fin de determinar la existencia del homólogo en linfocitos B activados, los PBMC se activaron con LPS durante 72 horas con LPS. A partir de ese momento, la unión con las proteínas fusionadas con Fc de los ECD ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-Fc (SEQ ID NO: 105), AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104), LOC253012-ECD-Fc (SEQ ID NO: 106), FXYD3-ECD-Fc (SEQ ID NO: 103), y VSIG1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 108) se realizó tal como se ha descrito anteriormente, y las células se tiñeron con anticuerpos CD86-Cy5PE @humano de ratón (BD Bioscience. CA. USA, S, N° de cat 555659) y @ CD19-PE humano de ratón (BD Bioscience. CA. USA). Los linfocitos B activados se definieron como población de células de CD19+/CD86+ doble positiva.
Tal como se demuestra en la Figura 26A-C, ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-Fc (SEQ ID NO: 105) y AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104) presentaban unión linfocitos B a activados.
Con el fin de determinar la existencia del homólogo en neoplasias de linfocitos B, la unión de las proteínas fusionadas con Fc de los ECD ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-Fc (SEQ ID NO: 105), AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104), LOC253012-ECD-Fc (SEQ ID NO: 106), FXYD3-ECD-Fc (SEQ ID NO: 103), y VSIG1ECD-Fc (SEQ ID NO: 108) se analizó en líneas celulares de linfoma de linfocitos B. Se adquirieron células Raji (N° de la At Cc CCL-86) y Daudi (N° de la ATCC CCL-213) en la ATCC y se mantuvieron en RPMI FBS al 10 %. Las células se tiñeron con proteína B7s o controles a 10 pg/ml y a partir de ese momento con Fc de IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC (Jackson Immunol Lab. NJ. USA, N° de cat 115-096-071, N° de lote 71453).
La Figura 27A-B ilustra la unión de los ECD fusionados con Fc de las proteínas de tipo B7 (ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107), C1ORF32-ECD-Fc (SEQ ID NO: 105), AI216611-ECD-Fc (SEQ ID NO: 104), LOC253012-ECD-Fc (SEQ ID NO: 106), FXYD3-ECD-Fc (SEQ ID NO: 103), y VSIG1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 108)) a las líneas celulares de linfoma de linfocitos B. ILDR1-ECD-Fc (SEQ ID NO: 107) presentaba una unión clara a ambas líneas celulares de linfoma de linfocitos B.
Ejemplo 17
DESARROLLO DE ANTICUERPOS ANTI-C1ORF32 MONOCLONALES DE RATÓN
Con el fin de someter a ensayo la expresión de proteínas de tipo B7 en diferentes tejidos cancerígenos mediante inmunohistoquímica, se desarrollaron anticuerpos monoclonales de ratón específicos para los ECD fusionados con Fc de las proteínas.
Desarrollo de anticuerpos monoclonales de ratón:
Se inmunizaron cuatro grupos de los ratones Balb/c (3 ratones por grupo) con 4 proteínas de los ECD fusionados con Fc: C1ORF32 (SEQ ID NO: 105). Las inmunizaciones se realizaron 8 veces a intervalos de una semana en múltiples sitios, subcutáneos e intraperitoneales. Se extrajo sangre a los ratones diez días después de la 4a y la 8a inmunizaciones. El suero se identificó sistemáticamente para título de anticuerpos usando un protocolo de ELISA Directo que se describe a continuación.
Las placas para ELISA se revistieron con 50 pl/pocillo de 2,5 pg/ml de proteínas fusionadas con Fc (C1ORF32 fusionados con Fc de IgG2 de ratón, SEQ ID NO: 105,) diluidos en DPBS durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). La IgG humana fusionada con la región Fc de ratón se usó como un control negativo. Después de esto, las placas se bloquearon con 300 pl/pocillo de BSA/DPBS al 1 % durante 15 min a TA. Después de la etapa de bloqueo, los sueros diluidos en serie de ratones inmunizados y la IgG de ratón irrelevante se transfirieron a las placas para ELISA bloqueadas y se incubaron durante 1 hora a TA. A continuación, las placas se lavaron 3 veces con 300 pl/pocillo de tampón de lavado (DPBS con Tween 20 al 0,05 %, pH 7,2 - 7,4). Para la detección, las placas se incubaron durante 1 hora a TA con 50 pl/pocillo de Anticuerpo de Cadena Ligera Kappa de anti-Ratón Cabra con dilución a 1:1000 seguido de un lavado extenso (6 veces con 300 pl/pocillo de tampón de lavado) e incubación con el sustrato. El sustrato, ácido 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS), a 100 pl/pocillo se añadió y se incubó durante aproximadamente 5 min a TA antes de la lectura de las placas a 414 nm usando un lector de placas SPECTRAmax 340 PC de Molecular Devices y el software SOFTmax p Ro .
El título de anticuerpo en suero se definió como la dilución del suero que produce una señal que era dos veces la del fondo.
Los resultados del ensayo de ELISA de los sueros inmunizados después de 4 inmunizaciones se resumen en la Tabla 140.
Los ratones que presentaban los títulos de suero de anticuerpo más elevados, se seleccionaron para producción de hibridoma. Los esplenocitos se fusionaron con la línea celular Ag8.653 de mieloma de ratón. El sobrenadante de los clones de hibridoma se sometió a ensayo mediante ELISA directo (como se ha descrito anteriormente) usando placas revestidas con revestimientos relevantes e irrelevantes. Los resultados en resumen en la Tabla 141A y Tabla 141B.
Para el resto de las proteínas, se realizaron cuatro inmunizaciones adicionales con el fin de facilitar el desarrollo de los títulos de anticuerpo en suero para el resto de las proteínas. Los títulos en sueros después de la 8a inmunización se sometieron a ensayo mediante ELISA directo. Los resultados se resumen en la Tabla 142. Los resultados demuestran que después de la 8 inmunizaciones, los ratones inmunizados con ECD de C1ORF32 fusionado con Fc (SEQ ID NO: 103) desarrollaron suficientes títulos de anticuerpos para producción de hibridoma. En la siguiente etapa, los mejores respondedores se seleccionarán para producción de hibridoma y fabricación de anticuerpo monoclonal.
Los Anticuerpos Monoclonales para cada uno de los antígenos (VSIG1, LOC253012, C1ORF32, FXYD3, AI216611 y ILDR1, SEQ ID NO: 108, 106, 105, 103, 104 y 107, respectivamente) se usan para análisis de Inmunohistoquímica para verificar el perfil de expresión de estas proteínas supuestas en cáncer tejidos sanos.
Tabla 140. Títulos de anticuer o en suero de los ratones inmunizados des ués de 4 inmunizaciones
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
T l 141A. l n f i nl r vinn l r n N° 1722 inmniz n L 2 12
Figure imgf000125_0002
T l 141B. l n f i n l r vinn l r n N° 1722 inmniz n V I 1
Figure imgf000125_0003
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continuación
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Tabla 142 Títulos de anticuer o en suero de los ratones inmunizados des ués de 8 inmunizaciones.
Figure imgf000127_0001
Análisis inmunohistoquímico
La inmunohistoquímica permite la visualización (usando microscopio de luz o confocal) de la distribución del tejido de antígenos específicos (o epítopos). El procedimiento localiza dianas de proteínas de interés mediante la aplicación de anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para superficies de tejido en un procedimiento denominado incubación de anticuerpo.
Este procedimiento implica la detección de un sustrato in situ en células fijas mediante anticuerpos específicos para el sustrato. Los anticuerpos específicos para el sustrato se pueden unir con enzimas o se pueden unir a fluoróforos. La detección se realiza con microscopio y evaluación subjetiva. Si se usan anticuerpos unidos a enzimas, puede ser necesaria una reacción colorimétrica.
El análisis inmunohistoquímico realizado para los antígenos (C1ORF32, SEQ ID NO: 105) consiste en dos fases: Fase I: Calibración del anticuerpo: Se realiza una serie de diluciones de cada uno de los anticuerpos desarrollados frente a los antígenos específicos de proteína usando tejidos de control seleccionados embebidos en parafina y fijados con formalina (FFPE) y líneas celulares. El mejor rendimiento del anticuerpo se selecciona para la Fase II.
Fase II: Distribución de proteína y análisis de localización: Usando la concentración óptima de anticuerpo seleccionada en la Fase I, la distribución y la localización de las proteínas C1ORF32 se analiza en Matrices de Tejido que consisten en tejidos de cáncer y tejidos sanos, buscando la expresión diferencial en algunas de las muestras de cáncer, en comparación con las muestras sanas.
Ejemplo 17
DESARROLLO DE ANTICUERPOS ANTI-C1ORF32 TOTALMENTE HUMANOS
Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos Frente a Antígeno de C1ORF32
Se generan proteínas de fusión compuestas por el dominio extracelular de los C1ORF32 unidos a un polipéptido de Fc de IgG2 de ratón mediante procedimientos recombinantes convencionales y se usan como antígenos para inmunización.
Ratón HuMab Transgénico.
Los anticuerpos monoclonales totalmente humanos para C1ORF32 se preparan usando ratones a partir de la cepa HCo7 del Ratón HuMab transgénico. RTM., que expresa genes de anticuerpo humano. En esta cepa de ratón, el gen endógeno de la cadena ligera kappa de ratón se ha alterado de forma homocigota tal como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12: 811-820 y el gen endógeno de la cadena pesada de ratón se ha alterado de forma homocigota tal como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT del documento de patente WO 01/09187. Además, esta cepa de ratón porta un transgén humanos de cadena ligera kappa, KCo5, tal como se describe en Fishwild y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, y un transgén humano de cadena pesada, HCo7, tal como se describe en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 5.545.806; 5.625.825; y 5.545.807. Inmunizaciones HuMab:
Para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos para C1ORF32, se toman ratones del ratón HuMab de HCo7. RTM. (la cepa se puede inmunizar con proteína de fusión de VSIG1 recombinante purificada derivada de células de mamífero que se transfectar con un vector de expresión que contiene el gen que codifica la proteína de fusión. Los esquemas generales de inmunización para el ratón HuMab. RTM. se describen en Lonberg, N. y col (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y Publicación PCT del documento de patente WO 98/24884. Los ratones tienen 6-16 semanas de edad después de la primera infusión de antígeno. Se usa una preparación de antígeno VSIG1 recombinante purificado (5-50 |jg, purificado a partir de células de mamífero transfectadas que expresan proteína de fusión de VSIG1) para inmunizar los ratones HuMab por vía intraperitoneal.
Los ratones transgénicos se inmunizan dos veces con antígeno en adyuvante completo de Freund o adyuvante IP de Ribi, seguido de 3-21 días de IP (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund o Ribi. La respuesta inmune se controla mediante sangrados retroorbitales. El plasma se identifica sistemáticamente por ELISA (como se describe a continuación), y los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti- VSIG1 se usan para fusiones. Los ratones se estimulan por vía intravenosa con antígeno 3 días antes de sacrificarlos y extraer el bazo.
Selección de ratones HuMab.TM. que producen anticuerpos Anti- C1ORF32:
Para seleccionar ratones HuMab.TM. que producen anticuerpos que se unen a C1ORF32, los sueros de ratones inmunizados se someten a ensayo mediante un ELISA modificado tal como se describe originalmente en Fishwild, D. y col. (1996). En resumen, las placas de microtitulación se revisten con proteína de fusión VSIG1 recombinante purificada a 1-2. jg/ml en PBS, 50 jl/pocillos incubados a 4 grados C. durante una noche y a continuación se bloquean con 200 jl/pocillo de BSA al 5 % en PBS. Las diluciones de plasma de ratones inmunizados con C1ORF32 se añaden a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan con PBS/Tween y a continuación se incuban con un anticuerpo policlonal de cadena ligera kappa de cabra anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollan con sustrato pNPP y se analizan mediante espectrofotómetro a DO 415-650. Los ratones que desarrollaron los títulos más elevados de anticuerpos anti- C1ORF32 se usan para fusiones. Las fusiones se realizan como se describe a continuación y los sobrenadantes de hibridoma se someten a ensayo para actividad de anti-C1ORF32 mediante ELISA.
Generación de Hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para C1ORF32
Los esplenocitos de ratón, aislados de los ratones HuMab, se fusionan con PEG a una línea celular de mieloma de ratón en base a protocolos convencionales. A continuación, los hibridomas resultantes se identifican sistemáticamente para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Las suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionan hasta un cuarto del número de células de mieloma de ratón de no secreción P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580) con PEG al 50 % (Sigma). Las células se siembran aproximadamente 1 X 10-5 /pocillo en la académica titulación de fondo plano, seguido de aproximadamente dos semanas de incubación en medio selectivo que contiene suero bovino fetal al 10%, complementado con origen (IGEN) en RPMI, L-glutamina, piruvato sódico, HEPES, penicilina, estreptomicina, gentamicina, 1x HAT, y beta-mercaptoetanol. Después de 1-2 semanas, las células se cultivan en medio en el que el HAT se sustituye con HT. A continuación, los pocillos individuales se identifica sistemáticamente mediante ELISA (descrito anteriormente) para anticuerpos IgG monoclonales C1ORF32 humanos. Una vez que se produce el crecimiento del hibridoma extensivo, el medio se controla normalmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpo se vuelven a sembrar, se identifica sistemáticamente de nuevo y, si aún es positivo para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti- C1ORF32 se subclonan al menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables se cultivan a continuación in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo tisular para caracterización adicional.
Se seleccionan clones de hibridoma para análisis adicional.
Caracterización estructural de anticuerpos monoclonales humanos anti- C1ORF32 deseados
Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales anti-C1ORF32 obtenidos se obtienen a partir de los hibridomas resultantes, respectivamente, usando técnicas convencionales de PCR y se secuencian usando técnicas convencionales de secuenciación de ADN.
Se identifican las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y de la región variable de cadena ligera. Estas secuencias se pueden comparar con secuencias conocidas de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana y se identifican las CDR de cada cadena pesada y ligera de las secuencias obtenidas anti- C1ORF32.
Caracterización de especificidad de unión y cinética de unión de anticuerpos monoclonales humanos anti-C1ORF32 La afinidad de unión, cinética de unión, especificidad de unión, y competición cruzada de anticuerpos anti- C1ORF32 se examinan mediante análisis de Biacore. Además, la especificidad de unión se examina mediante citometría de flujo.
Afinidad y cinética de unión
Se caracterizan anticuerpos anti-C1ORF32 producidos de acuerdo con la invención para afinidades y cinéticas de unión mediante análisis de Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suecia). La proteína de fusión C1ORF32 humana recombinante purificada según eco valientemente a un chip de CM5 (chip revestido con carboxi metil dextrano) a través de aminas primarias, usando química convencional de acoplamiento de amina y kit proporcionado por Biacore. La unión se mide mediante flujo de los anticuerpos en tampón HBS EP buffer (proporcionado por BIAcore AB) a una concentración de 267 nM a un caudal de 50 pl/min. La cinética de asociación de anticuerpos de asociación a antígeno se sigue durante 3 minutos y la cinética de disociación se sigue durante 7 minutos. Las curvas de asociación y disociación se ajustan a un modelo de unión de Langmuir a 1:1 usando software BlAevaluation (Biacore AB). Para minimizar los efectos de avidez en la estimulación de las constantes de unión, para el ajuste solamente se usa el segmento inicial de datos que corresponden a fases de asociación y disociación.
Formación de mapas de epítopos de anticuerpos anti-C1ORF32 obtenidos
Se usa Biacore para determinar el agrupamiento de epítopos de HuMAb anti-C1ORF32. Los anticuerpos anti-C1ORF32 obtenidos se usan para formar mapas de sus epítopo os en los anticuerpos del antígeno C1ORF32, respectivamente. Estos anticuerpos diferentes se revisten en tres superficies diferentes del mismo chip a 8000 RUs cada uno. Se hacen diluciones de cada uno de los mAb, comenzando a 10 pg/ml y se incuban con C1ORF32 fusionado con Fc (50 nM) durante una hora. El complejo incubado se inyecta en las tres superficies (y una superficie de blanco) al mismo tiempo durante 1,5 minutos a un caudal de 20 pl/min. La señal de cada superficie al final de los 1,5 minutos, después de la resta de los blancos apropiados, se ha representado frente a la concentración de mAb en el complejo. Después del análisis de los datos, los anticuerpos anti-C1ORF32 se clasifican en diferentes grupos de epítopos dependiendo de los resultados de la formación de mapas de epítopos. También se comparan las propiedades funcionales de los mismos.
Se desarrollan líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) que expresan proteína C1ORF32 en la superficie celular y se usan para determinar la especificidad de los HuMAb de C1ORF32 mediante citometría de flujo. Se transfectan células CHO con plásmidos de expresión que contienen ADNc de longitud completa que codifica una forma de transmembrana de antígeno C1ORF32 o una variante del mismo. Las proteínas transfectadas que contienen una marca de epítopo en el extremo N se usan para detección mediante un anticuerpo específico para el epítopo. La unión de un MAb anti-C1ORF32 se evalúa por incubación de las células aceptadas con cada uno de los Ab de C1ORF32 a una concentración de 10 pg/ml. Las células se lavan y se detecta la unión con un Ab de IgG anti­ humano marcado con FITC. Un Ab murino de marca anti-epítopo, seguido de IgG anti-murina marcada, se usa como el control positivo. Se usan Ab no específicos humanos y murinos como controles negativos. Los datos obtenidos se usan para evaluar la especificidad de los HuMAb para la diana del antígeno C1ORF32.
Estos anticuerpos y otros anticuerpos específicos para C1ORF32 se pueden usar en las terapias relacionadas con anti-C1ORF32 que se han descrito anteriormente tales como tratamiento de cánceres en el que el antígeno C1ORF32 se expresa de forma diferencial tal como cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de ovarios y/o para modulación (potenciación e inhibición) de la coestimulación inmune de B7 que implica al antígeno C1ORF32 tal como en el tratamiento de cánceres en el que tales anticuerpos por ejemplo, evitarán la estimulación negativa de la actividad de los linfocitos T frente a células cancerígenas diana deseadas.
Se ha descrito la invención y se proporcionan realizaciones proféticas que se relacionan con la fabricación y selección de anticuerpos anti- C1ORF32 deseados para uso como procedimientos terapéuticos y de diagnóstico en los que la enfermedad o afección está asociada con el antígeno C1ORF32.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al ectodominio de C1ORF32 o porciones o variantes del mismo y bloquea la interacción de C1 ORF32 con su contra-receptor, en el que el ectodominio se selecciona de los polipéptidos de SEQ ID NO 147, 148 y 299 y la variante del mismo posee al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma para su uso en terapia.
2. Un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al ectodominio de C1ORF32 o porciones o variantes del mismo y bloquea la interacción de C1ORF32 con su contra-receptor, en el que el ectodominio se selecciona de los polipéptidos de SEQ ID NO 147, 148 y 299 y la variante del mismo posee al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma para su uso en el tratamiento de cáncer.
3. El anticuerpo o fragmento de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer, en el que el cáncer se selecciona de cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, tumores malignos hematológicos y cáncer de mama, próstata, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas o cerebro.
4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en terapia o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer, comprendido en una composición farmacéutica.
5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en terapia o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se fija a una enzima, una toxina, un agente terapéutico o un agente quimioterapéutico.
6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en terapia o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está fijado a un radioisótopo, un quelante de metales, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en terapia o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-C10ORF32 y en el que dicho anticuerpo se administra con al menos un agente terapéutico seleccionado de un grupo que consiste en un agente citotóxico, un agente radiotóxico y un agente inmunosupresor.
8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en terapia o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está conjugado a un resto terapéutico seleccionado de una citotoxina, un fármaco o una radiotoxina, en el que la citotoxina se selecciona del grupo que consiste en taxol, citocalasina B, gramicina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos, antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos, agentes antimitóticos, duocarmicinas, calicheamicinas, maitansinas y auristatinas.
9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 8 para su uso en terapia o para su uso en el tratamiento de cáncer, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se conjuga a una citotoxina seleccionada del grupo que consiste en metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), daunorrubicina, doxorrubicina, dactinomicina, bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), vincristina y vinblastina.
10. Uso de un anticuerpo policlonal o monoclonal o fragmento del mismo que se une al ectodominio de C1ORF32 o porciones o variantes del mismo, en el que el ectodominio se selecciona de los polipéptidos de SEQ ID NO 147, 148 y 299 y las variantes del mismo que poseen al menos un 80 % de identidad de secuencia con la misma, en el que la modulación de la coestimulación inmune relacionada con B7 que implica el antígeno C1ORF32 es terapéuticamente deseable.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los cánceres se seleccionan de cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, tumores malignos hematológicos y cáncer de mama, próstata, bazo, riñón, vejiga, cabeza y cuello, útero, testículos, estómago, cuello uterino, hígado, hueso, piel, páncreas o cerebro.
12. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento de cáncer o el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dichos tumores malignos hematológicos se seleccionan del grupo que consiste en leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin.
13. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento de cáncer o el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el cáncer de pulmón se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoide, cáncer de pulmón microcítico o cáncer de pulmón no microcítico.
14. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer o el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el cáncer es no metastásico, invasivo o metastásico.
15. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en terapia, o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de cáncer, o el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que las variantes del ectodominio poseen al menos un 90 %, al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO 147, 148 y 299.
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