BR112019017583A2

BR112019017583A2 - ensaio para detecção de câncer pancreático em estágio inicial

Info

Publication number: BR112019017583A2
Application number: BR112019017583A
Authority: BR
Inventors: Mcneill Killary Ann; Chen Nanyue; Balasenthil Seetharaman; T Lott Steven
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2018-02-23
Publication date: 2020-04-07
Also published as: CA3054571A1; CN110612447A; US20190376976A1; EP3586136A4; EP3586136B1; US11693007B2; JP7162398B2; JP2020509374A; EP3586136A1; WO2018156973A1; CN110612447B

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos de detecção de câncer pancreático, particularmente câncer pancreático em estágio inicial, que compreendem medir a expressão do painel de biomarcadores tnc-fn iii-c, tfpi e ca19-9. a expressão pode ser determinada por meio de um elisa, tal como um elisa multiplex. além disso, são fornecidos aqui métodos de tratamento indivíduos identificados como tendo câncer pancreático.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ENSAIO PARA DETECÇÃO DE CÂNCER PANCREÁTICO EM ESTÁGIO INICIAL.

[001] O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos N° 62/463.348, depositado em 24 de fevereiro de 2017, cuja totalidade é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES [002] A presente invenção foi feita com o apoio do governo sob o número de concessão CA111302 concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

1. Campo da Invenção [003] A presente invenção refere-se, de modo geral, aos campos de biologia molecular e medicina. Mais particularmente, ela se refere a biomarcadores para a detecção precoce de câncer pancreático.

2. Descrição da Técnica Relacionada [004] O adenocarcinoma dutal pancreático (Pancreatic Ductal AdenoCarcinoma - PDAC) é a quarta causa principal de mortes por câncer nos Estados Unidos, com a maioria dos pacientes apresentando doença local mente avançada (~ 30 %) ou metástase distante (~ 50 %) quando a ressecção cirúrgica não é mais uma opção curativa (Conlon etal., 1996; Rahibe/a/., 2014). Estima-se que o impacto do diagnóstico de PDAC em estágios iniciais e passível de ressecção melhore a sobrevida em 5 anos para 30 % ou mais, sugerindo que as taxas de mortalidade para pacientes com PDAC seriam substancialmente reduzidas se a doença pudesse ser diagnosticada precocemente (Chu et al., 2010).

[005] Infelizmente, não há biomarcadores que detectem o PDAC em estágio inicial. O biomarcador atual com base no sangue padrão de excelência CA 19-9 não possui a especificidade necessária para

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2/81 detecção precoce da doença (Chu et al., 2010). As tentativas de identificar biomarcadores de PDAC não produziram um único marcador ou combinação de marcadores que resista a várias validações às cegas e melhorem o CA19-9. Assim, há uma necessidade não satisfeita de um novo painel de biomarcadores para melhorar o biomarcador padrão de excelente atual para a detecção precoce de PDAC.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Determinadas modalidades da presente invenção se referem a um painel de biomarcadores para a detecção de câncer, particularmente a detecção precoce de câncer pancreático. Em uma primeira modalidade, é fornecido um ensaio para medir a expressão dos antígenos TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9 que compreende contatar uma pluralidade de antígenos com um anticorpo anti-TNC-FN lll-C, um anticorpo anti-TFPI e um anticorpo anti-CA19-9 para formar complexos de antígeno-anticorpo; e detectar os complexos de antígeno-anticorpo usando porções detectáveis que se ligam distintamente a cada um dos anticorpos, deste modo, medindo a expressão dos antígenos TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9. Em alguns aspectos, o ensaio é um ensaio in vitro ou in vivo.

[007] Em alguns aspectos, a pluralidade de antígenos é obtida a partir de uma amostra biológica. Em determinados aspectos, a amostra biológica é uma amostra de tecido, cirúrgica ou biópsia, um tecido embebido em parafina, uma impressão de tecido congelado, sangue periférico, urina ou um aspirado de agulha fina. Em aspectos particulares, a amostra é uma amostra de sangue, tal como uma amostra de plasma. Em alguns aspectos, a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo em risco de câncer, tal como um indivíduo que tem histórico familiar de câncer hereditário. Em aspectos particulares, a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo com idade acima de 50 anos, tal como 60, 65, 70, 75 ou mais. Em alguns aspectos, o

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3/81 indivíduo não foi previamente diagnosticado com câncer. Em determinados aspectos, o indivíduo não foi testado para diabetes e/ou pancreatite crônica. Em outros aspectos, o indivíduo foi testado e foi determinado que não tem diabetes e/ou pancreatite crônica.

[008] Em determinados aspectos, a detecção é ainda definida como a realização de um ensaio imunoenzimático (ELISA), Western blot ou imuno-histoquímica. Em alguns aspectos, um, dois ou três ELISAs são realizados. Em aspectos particulares, o ELISA é um ELISA em sanduíche. Em aspectos específicos, o ELISA em sanduíche é um ELISA multiplexado, em que dois ou três antígenos são detectados simultaneamente. Em alguns aspectos, os anticorpos são conjugados a uma superfície. Em determinados aspectos, o método compreende ainda lavagem após a formação dos complexos de antígeno-anticorpo para remover antígenos que não estão em um complexo de antígenoanticorpo. Em alguns aspectos, o método compreende ainda adicionar anticorpos de detecção específicos para cada um dos três antígenos após a etapa de lavagem. Em aspectos particulares, os anticorpos de detecção são biotinilados. Consequentemente, em alguns aspectos, a detecção compreende adicionar fluoroforos conjugados com estreptavidina e medir os fluoroforos.

[009] Em alguns aspectos, a amostra não é diluída. Em outros aspectos, a amostra é diluída pelo menos 50 vezes, tal como pelo menos 75 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes ou mais.

[0010] Em alguns aspectos, as porções detectáveis são ligadas aos anticorpos antes de contatar os anticorpos com a pluralidade de antígenos. Em alguns aspectos, as porções detectáveis compreendem sondas fluorescentes, sondas radioativas ou fotossensibilizantes. Em aspectos particulares, as sondas fluorescentes compreendem indocianina verde (ICG), isotiocianato de fluoresceína (FITC) e/ou IRDye800. Em alguns aspectos, as porções detectáveis ligadas aos

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4/81 anticorpos são detectadas por meio de imagiologia óptica, ultrassom, ressonância magnética (MRI), tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computadorizada de emissão de um único fóton (SPECT) ou fototerapia. Em alguns aspectos, a pluralidade de antígenos está compreendida em um tecido. Em determinados aspectos, o tecido é um tumor. Em aspectos particulares, o tecido é tecido humano.

[0011] Em determinados aspectos, a medição compreende comparar a expressão de cada um dos três antígenos com a expressão em uma amostra de controle. Em alguns aspectos, a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo saudável. Em outros aspectos, a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo que tem uma doença benigna. Em determinados aspectos, uma expressão aumentada dos três antígenos comparado com uma amostra de controle indica a presença de câncer ou uma lesão precursora.

[0012] Em alguns aspectos, o método compreende ainda realizar ensaios diagnósticos adicionais, tais como estudos de imagiologia, para o câncer pancreático. Em alguns aspectos, o câncer é câncer pancreático, tal como câncer pancreático em estágio inicial. Em aspectos particulares, o câncer pancreático em estágio inicial é câncer pancreático em Estágio I (por exemplo, Estágio IA ou Estágio IB) ou Estágio II (por exemplo, Estágio HA ou Estágio IIB). Em alguns aspectos, a lesão precursora é uma lesão precursora de câncer pancreático (PanIN).

[0013] Em alguns aspectos, a especificidade do ensaio é de pelo menos 0,8, tal como 0,81,0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87, 0,88, 0,89, 0,90 ou maior. Em determinados aspectos, a precisão do ensaio é de pelo menos 0,7, tal como 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80 ou maior. Em aspectos particulares, a AUG do ensaio é de pelo menos 0,90, tal como 0,91,0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98,

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0,99 ou maior.

[0014] Em alguns aspectos, o método compreende ainda analisar covariáveis do indivíduo em combinação com a presença dos três antígenos. Em determinados aspectos, as covariáveis compreendem idade, sexo, centro, tabagismo e/ou consumo de álcool. Em alguns aspectos, modelos de regressão logística podem ser usados para desenvolver combinações do painel de biomarcadores mais a idade, sexo, centro, tabagismo e consumo de álcool para separar o caso do paciente e doença saudável ou benigna.

[0015] Em outra modalidade, a presente invenção fornece ainda um método de tratamento de câncer pancreático em um indivíduo que compreende administrar uma ou mais terapias antineoplásicas ao indivíduo, em que o indivíduo é identificado como tendo um aumento da expressão dos antígenos TNC-FN III -C, TFPI e CA19-9 comparado com a expressão dos antígenos em um controle. Em alguns aspectos, o controle é um indivíduo saudável.

[0016] Em determinados aspectos, a expressão aumentada dos antígenos é determinada ao realizar um ELISA em uma amostra obtida a partir do indivíduo. Em aspectos particulares, a expressão aumentada dos antígenos é determinada de acordo com os métodos das modalidades (por exemplo, contato de uma pluralidade de antígenos com um anticorpo anti-TNC-FN lll-C, um anticorpo anti-TFPI, um anticorpo anti-TFPI e o anticorpo anti-CA19-9 formar complexos de antígeno-anticorpo e detectar os complexos de antígeno-anticorpo usando porções detectáveis que se ligam distintamente a cada um dos anticorpos, deste modo, medindo a expressão dos antígenos TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9). Em alguns aspectos, a amostra é uma amostra de plasma. Em aspectos particulares, o câncer pancreático é câncer pancreático em estágio inicial.

[0017] Em alguns aspectos, a uma ou mais terapias antineoplásicas

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6/81 são quimioterapia, radioterapia, terapia genética, cirurgia, terapia hormonal, terapia antiangiogênica e/ou imunoterapia.

[0018] Em ainda outra modalidade, é fornecido um kit para detecção de câncer pancreático que compreende um conjunto de anticorpos específicos para os antígenos TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9. O kit pode compreender ainda reagentes, tais como placas ou matrizes, soluções de lavagem e reagentes de detecção, para realizar um ELISA ou outro ensaio de detecção de anticorpos.

[0019] Uma outra modalidade fornece um método para a detecção de uma célula cancerosa que compreende obter uma amostra biológica; contatar a amostra biológica com um anticorpo anti-TNC-FN lll-C, um anticorpo anti-TFPI e um anticorpo anti-CA19-9; e detectar a ligação do anticorpo anti-TNC-FN lll-C, anticorpo anti-TFPI e anticorpo anti-CA199 à amostra, em que a expressão aumentada dos três antígenos comparado com um controle indica a presença de uma célula cancerosa. Em alguns aspectos, o método é in vitro ou in vivo.

[0020] Em determinados aspectos, na amostra biológica é um espécime cirúrgico ou biópsia, um tecido, um tecido embebido em parafina, uma impressão de tecido congelado, sangue periférico, urina ou um aspirado de agulha fina. Em aspectos particulares, a amostra é uma amostra de sangue, tal como uma amostra de plasma. Em alguns aspectos, a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo em risco de câncer, tal como um indivíduo com histórico familiar de câncer hereditário. Em aspectos particulares, a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo com idade acima de 50 anos. Em alguns aspectos, o indivíduo não foi previamente diagnosticado com câncer. Em determinados aspectos, o indivíduo não foi testado para diabetes e/ou pancreatite crônica. Em outros aspectos, o indivíduo foi testado e foi determinado que não tem diabetes e/ou pancreatite crônica.

[0021] Em determinados aspectos, a detecção é ainda definida

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7/81 como a realização de um ELISA. Em alguns aspectos, um, dois ou três ELISAs são realizados. Em aspectos particulares, o ELISA é um ELISA em sanduíche. Em aspectos específicos, o ELISA em sanduíche é um ELISA multiplexado, em que dois ou três antígenos são detectados simultaneamente. Em alguns aspectos, os anticorpos são conjugados a uma superfície. Em determinados aspectos, o método compreende ainda lavagem após a formação dos complexos de antígeno-anticorpo para remover antígenos que não estão em um complexo de antígenoanticorpo. Em alguns aspectos, o método compreende ainda adicionar anticorpos de detecção específicos para cada um dos três antígenos após a etapa de lavagem. Em aspectos particulares, os anticorpos de detecção são biotinilados. Consequentemente, em alguns aspectos, a detecção compreende adicionar fluoroforos conjugados com estreptavidina e medir os fluoroforos.

[0022] Em alguns aspectos, a amostra não é diluída. Em outros aspectos, a amostra é diluída pelo menos 50 vezes, tal como pelo menos 75 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes ou mais.

[0023] Em determinados aspectos, a medição compreende comparar a expressão de cada um dos três antígenos com a expressão em uma amostra de controle. Em alguns aspectos, a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo saudável. Em outros aspectos, a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo que tem uma doença benigna. Em alguns aspectos, o câncer é câncer pancreático, tal como câncer pancreático em estágio inicial. Em aspectos particulares, o câncer pancreático em estágio inicial é câncer pancreático em Estágio I (por exemplo, Estágio IA ou Estágio IB) ou Estágio II (por exemplo, Estágio HA ou Estágio 11B). Em alguns aspectos, a lesão precursora é uma lesão PanIN.

[0024] Em alguns aspectos, a especificidade do ensaio é de pelo menos 0,8, tal como 0,81,0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87, 0,88, 0,89,

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0,90 ou maior. Em determinados aspectos, a precisão do ensaio é de pelo menos 0,7, tal como 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80 ou maior. Em aspectos particulares, a AUC do ensaio é de pelo menos 0,90, tal como 0,91,0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99 ou maior.

[0025] Em outra modalidade, é fornecido um método para medir a expressão de antígeno TFPI que compreende contatar uma pluralidade de antígenos com um anticorpo anti-TFPI para formar complexos de antígeno-anticorpo; e detectar os complexos de antígeno-anticorpo usando porções detectáveis que se ligam distintamente ao anticorpo anti-TFPI, deste modo, medindo a expressão do antígeno TFPI, em que um aumento da expressão de TFPI comparado com um controle indica a presença de uma lesão pré-cancerosa. Em alguns aspectos, a lesão pré-cancerosa é uma lesão PanIN. Em determinados aspectos, a detecção é definida como a realização de um ELISA. Em determinados aspectos, a detecção é ainda definida como a realização de imunohistoquímica ou Western blot ou qualquer método conhecido na técnica para a detecção de complexos de antígeno-anticorpo.

[0026] Em determinados aspectos, a pluralidade de antígenos é obtida a partir de uma amostra biológica. Em alguns aspectos, a amostra biológica é um espécime cirúrgico ou biópsia, tecido, tecido embebido em parafina, impressão de tecido congelado, sangue periférico, urina ou aspirado de agulha fina. Em alguns aspectos, a amostra de sangue é uma amostra de plasma. Em determinados aspectos, a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo em risco de câncer ou que tenha histórico familiar de câncer hereditário.

[0027] Em determinados aspectos, as porções detectáveis são conjugadas aos anticorpos antes de contato dos anticorpos com a pluralidade de antígenos. Em alguns aspectos, as porções detectáveis compreendem sondas fluorescentes, sondas radioativas ou

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9/81 fotossensibilizantes. Em determinados aspectos, as porções detectáveis conjugadas aos anticorpos são detectadas por meio de imagiologia óptica, ultrassom, imagiologia por ressonância magnética (MRI), tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computorizada por emissão de um único fóton (SPECT) ou fototerapia. [0028] Em alguns aspectos, o método compreende ainda analisar covariáveis do indivíduo em combinação com a presença dos três antígenos. Em determinados aspectos, as covariáveis compreendem idade, sexo, centro, tabagismo e/ou consumo de álcool.

[0029] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da invenção, são fornecidos apenas a título de ilustração, uma vez que diversas alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da presente descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0030] Os desenhos a seguir formam parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais determinados aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por meio de referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas aqui.

[0031] Figuras 1A-1D: Desempenho do painel de biomarcadores na coorte TexGen 1. Curvas de características de operação de receptor (ROC) do painel de biomarcadores na diferenciação dos Estágios l/IIA [IA], Estágio IIB [1B], todos os cânceres no Estágio II [1C] e todos os cânceres no estágio inicial [1D] de controles saudáveis na coorte TexGen. As AUCs foram calculadas e seu intervalo de confiança de

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95% (IC) foi estimado usando o método de reamostragem (bootstrapping). Os P valores eram bilaterais e são com base em reamostragem (bootstrapping).

[0032] Figuras 2A-2D: Desempenho do painel de biomarcadores na coorte de conjuntos de referência EDRN 3. [2A] Curvas ROC do painel de biomarcadores na diferenciação dos Estágios IA/IB/IIA de controles saudáveis. [2B] ROC curvas do painel de biomarcadores na diferenciação dos Estágios la/IB/IIA de controles saudáveis na coorte sem histórico de diabetes e pancreatite. [2C] Curvas ROC do painel de biomarcadores na diferenciação do Estágio I IB de controles saudáveis. [2D] Curvas ROC do painel de biomarcadores na diferenciação do Estágio IIB de controles saudáveis em amostras sem histórico de diabetes e pancreatite crônica. As AUCs foram calculadas e seu IC de 95 % foi estimado usando o método de reamostragem (bootstrapping). Os P valores são bilaterais e com base no teste Z usando estimativa de erro padrão de bootstrap. Abreviaturas: AUC, área sob a curva.

[0033] Figuras 3A-3B: Desempenho do painel de biomarcadores na coorte de conjuntos de referência EDRN 3. [3A] Curvas ROC do modelo de painel de biomarcadores para diferenciar todos os cânceres em estágio inicial dos controles saudáveis no conjunto de referência EDRN. [3B] Curvas ROC do painel de biomarcadores na diferenciação de todos os cânceres de controles saudáveis em amostras sem histórico de diabetes e pancreatite crônica. A AUC foi calculada e seu IC de 95% foi estimado por meio do método de reamostragem (bootstrapping). Os P valores são bilaterais e com base no teste Z usando a estimativa de erro padrão de bootstrap.

[0034] Figura 4: Análise ELISA de TFPI em soro de camundongos de controle e camundongos KC que representam PanINs.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS [0035] Mais de 90% dos pacientes com adenocarcinoma

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11/81 pancreático (PDAC) morrem em virtude de sua doença, tornando a detecção da doença em estágio inicial criticamente importante. Detectada em um estágio ressecável, estima-se que a sobrevida de 5 anos do PDAC seja de 30% nos centros maiores, 30-60% nos tumores negativos < 2 cm e 60% nos tumores extremamente pequenos com aproximadamente < 10 mm (Ryan et al., 2014; Mayo et al., 2012; Ishikawa etal., 1999; Tsuchiyya etal., 1986). O biomarcador atual com base no sangue padrão de excelência CA19-9 não possui o valor preditivo necessário para detecção precoce. Embora alguns estudos tenham identificado marcadores que podem melhorar o desempenho do CA19-9, estes estudos estão limitados ao câncer pancreático em estágio avançado ou os biomarcadores não foram testados usando múltiplos estudos de validação às cegas no câncer pancreático em estágio inicial. Além disso, foi mostrado que os biomarcadores atuais não têm sensibilidade e especificidade suficientemente elevadas para rastreamento da população em geral. Em geral, os testes usam abordagens proteômicas de DNA, microRNA ou multiplex com um grande número de marcadores que são difíceis, demorados e caros de traduzir para a clínica.

[0036] Determinadas modalidades da presente invenção fornecem um painel de biomarcadores para a detecção de câncer pancreático, particularmente câncer pancreático em estágio inicial, bem como lesões pré-cancerosas, tais como lesões PanIN. O painel de biomarcadores fornecido foi testado em múltiplas validações às cegas e melhorou significativamente o desempenho e a precisão do CA19-9, especialmente na grande e bem documentada coorte de amostras de estágio inicial usada nos estudos atuais. Além disso, o painel de biomarcadores da presente invenção pode ser usado na clínica, tal como em um ou mais ensaios ELISA em sanduíche (por exemplo, um ELISA multiplex para rastreio de todos os três biomarcadores) que são

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12/81 fáceis de usar, fornecem resultados rápidos e requerem uma única amostra de sangue. Curiosamente, o presente painel de biomarcadores pode ser usado para o rastreio da população em geral, uma vez que foi mostrado ser independente do estado de diabetes e pancreatite crônica. [0037] Especificamente, os presentes estudos identificaram a isoforma otimizada TNC-FN lll-C como um novo biomarcador para o câncer pancreático. Descobriu-se que o TNC-FN lll-C e o TFPI melhoram o desempenho do CA19-9. O painel dos três biomarcadores foi validado em duas validações às cegas usando coortes de amostra grandes de câncer pancreático em estágio inicial e foi mostrado que aumenta consistentemente o desempenho do CA19-9. Assim, o painel adiciona significância estatística ao poder preditivo do CA19-9 para detectar PDAC em estágio inicial e, portanto, tem utilidade clínica como um ensaio para detecção precoce de PDAC ressecável cirurgicamente. [0038] Consequentemente, um método fornecido aqui compreende determinar a presença de câncer pancreático, incluindo câncer pancreático em estágio inicial, através da detecção de níveis alterados do painel de biomarcadores TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9 quando comparado com controles com doença benigna ou saudáveis. Os biomarcadores podem ser medidos por ELISA, western blot, imunohistoquímica ou outros métodos de detecção com base em anticorpos. O método pode compreender anticorpos ligados a agentes de imagiologia, tais como fluoroforos ou radioisótopos, os quais podem ser detectados por meio de imagiologia óptica ou ultrassom. Os indivíduos identificados como tendo níveis alterados de expressão do painel de biomarcadores podem ser tratados para câncer pancreático ou podem ser encaminhados para estudos de imagiologia e outros testes clínicos para detecção precoce de câncer pancreático.

[0039] Além disso, os presentes estudos descobriram que o TFPI pode ser usado como um biomarcador de lesões pré-cancerosas, tais

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13/81 como lesões pancreáticas intraepiteliais. Consequentemente, outras modalidades fornecem métodos de medição de TFPI em uma amostra ou tecido, tal como para detecção de lesões pancreáticas intraepiteliais.

I. Definições [0040] Conforme usado aqui, essencialmente livre, em termos de um componente especificado, é usado aqui para significar que nenhum dos componentes especificados foi propositadamente formulado em uma composição e/ou está presente apenas como um contaminante ou em quantidades vestigiais. A quantidade total do componente especificado resultante de qualquer contaminação não intencional de uma composição está, portanto, bem abaixo de 0,05%, de preferência abaixo de 0,01%. Mais preferida é uma composição na qual nenhuma quantidade do componente especificado possa ser detectada com métodos analíticos padrão.

[0041] Conforme usado aqui no relatório descritivo, um ou uma pode significar um(a) ou mais. Conforme usado aqui na(s) reivindicação(ões), quando usado em conjunto com a palavra que compreende(m), as palavras um ou uma podem significar um(a) ou mais de um(a).

[0042] O uso do termo ou nas reivindicações é usado para significar e/ou, a menos que explicitamente indicado como se referindo apenas a alternativas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, ainda que a invenção sustente uma definição que se refere às alternativas individuais e e/ou. Conforme usado aqui, outro pode significar pelo menos um segundo ou mais.

[0043] Ao longo do presente pedido, o termo cerca de é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método a ser empregado para determinar o valor ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo.

[0044] Conforme usado aqui, o termo indivíduo se refere a um

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14/81 mamífero ou animal humano ou não humano. Mamíferos não humanos incluem animais de criação, animais de companhia, animais de laboratório e primatas não humanos. Indivíduos não humanos incluem especificamente, sem limitação, galinhas, cavalos, vacas, porcos, cabras, cães, gatos, cobaias, hâmsters, martas e coelhos. Em algumas modalidades, um indivíduo é um paciente. Conforme usado aqui, um paciente se refere a um indivíduo que está sob os cuidados de um médico ou outro profissional de saúde, incluindo alguém que tenha consultado, recebido aconselhamento ou recebido uma receita ou outra recomendação de um médico ou outro profissional de saúde.

[0045] O termo tratamento ou tratar se destina a incluir profilaxia, melhora, prevenção ou cura de uma patologia (por exemplo, câncer pancreático). O tratamento após uma condição (por exemplo, câncer pancreático) que tenha começado tem como objetivo reduzir, melhorar ou eliminar completamente a condição e/ou seus sintomas associados ou impedir que ela se agrave. O tratamento de indivíduos antes do início de uma condição tem como objetivo reduzir o risco de desenvolver a condição e/ou diminuir sua gravidade se a condição se desenvolver. Conforme usado aqui, o termo prevenir se refere ao tratamento profilático de um indivíduo que está em risco de desenvolver uma condição, resultando em uma diminuição na probabilidade de que o indivíduo desenvolva o transtorno e na inibição de desenvolvimento adicional de um transtorno já estabelecido.

[0046] Um agente antineoplásico é capaz de afetar negativamente uma célula cancerosa/tumor em um indivíduo, por exemplo, ao promover a morte de células cancerosas, induzir à apoptose em células cancerosas, reduzir a taxa de crescimento de células cancerosas, reduzir a incidência ou número de metástases, reduzir o tamanho do tumor, inibir o crescimento do tumor, reduzir o suprimento sanguíneo para um tumor ou células cancerosas, promover uma resposta imune

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15/81 contra células cancerosas ou um tumor, prevenir ou inibir a progressão do câncer ou aumentar a expectativa de vida de um indivíduo com câncer.

[0047] O termo benefício terapêutico ou terapeuticamente eficaz, conforme usado ao longo do presente pedido, se refere a qualquer coisa que promova ou intensifique o bem-estar do indivíduo em relação ao tratamento médico desta condição. Isto inclui, porém sem limitações, uma redução na frequência ou gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença. Por exemplo, o tratamento de câncer pode envolver, por exemplo, uma redução no tamanho de um tumor, uma redução na capacidade de invasão de um tumor, uma redução na taxa de crescimento do câncer ou prevenção de metástases. O tratamento de câncer também pode se referir ao prolongamento da sobrevida de um indivíduo com câncer.

[0048] O termo anticorpo é usado aqui no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo, contanto que estes exibam a atividade biológica desejada.

[0049] O termo determinar um nível de expressão, conforme usado aqui, significa a aplicação de um reagente específico ao gene, tal como uma sonda, iniciador ou anticorpo, e/ou um método a uma amostra, por exemplo, uma amostra do indivíduo e/ou uma amostra de controle, para averiguar ou medir quantitativa, semiquantitativa ou qualitativamente a quantidade de um gene ou genes, por exemplo, a quantidade de mRNA. Por exemplo, o nível de um gene pode ser determinado através de vários métodos incluindo, por exemplo, imunoensaios incluindo, por exemplo, imuno-histoquímica, ELISA, Western blot, imunoprecipitação e assim por diante, em que um agente

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16/81 de detecção de biomarcadores, tal como um anticorpo, por exemplo, um anticorpo marcado, se liga especificamente ao biomarcador e permite, por exemplo, a determinação relativa ou absoluta da quantidade de biomarcador polipeptídico, hibridização e protocolos de PCR, onde uma sonda ou iniciador ou conjunto de iniciadores é usado para determinar a quantidade de biomarcador de ácido nucleico incluindo, por exemplo, métodos com base em sonda e amplificação incluindo, por exemplo, análise de microarranjo, RT-PCR, tal como RT-PCR quantitativa, análise serial de expressão gênica (SAGE), Northern Blot, tecnologia de codificação de código de barras molecular digital, por exemplo, ensaios de PCR quantitativa NanostringmCounter™ Analysis e TaqMan. Outros métodos de detecção e quantificação de mRNA podem ser aplicados, tal como hibridização in situ de mRNA em células ou amostras de tecido fixadas com formalina e incrustadas em parafina (FFPE). Esta tecnologia é oferecida atualmente pela QuantiGene®ViewRNA (Affymetrix), a qual usa conjuntos de sondas para cada mRNA que se liga especificamente a um sistema de amplificação para amplificar os sinais de hibridização; estes sinais amplificados podem ser visualizados usando um microscópio de fluorescência ou sistema de imagiologia padrão. Este sistema, por exemplo, pode detectar e medir os níveis de transcritos em amostras heterogêneas; por exemplo, se uma amostra tem células normais e tumorais presentes na mesma seção tecidual. Conforme mencionado, análise de expressão gênica com base na sonda TaqMan (com base em PCR) também pode ser usada para medir os níveis de expressão gênica em amostras teciduais e, por exemplo, medir os níveis de mRNA em amostras de FFPE. Em resumo, os ensaios com base na sonda TaqMan usam uma sonda que hibridiza especificamente com o mRNA alvo. Esta sonda contém um corante supressor e um corante repórter (molécula fluorescente) ligados a cada extremidade e a fluorescência é emitida apenas quando ocorre

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17/81 hibridização específica para o mRNA alvo. Durante a etapa de amplificação, a atividade de exonuclease da enzima polimerase faz com que o inibidor e os corantes repórter sejam removidos da sonda e pode ocorrer emissão de fluorescência. Esta emissão de fluorescência é registrada e os sinais são medidos por um sistema de detecção; estas intensidades de sinal são usadas para calcular a abundância de um determinado transcrito (expressão gênica) em uma amostra.

[0050] O termo amostra, conforme usado aqui, inclui qualquer amostra biológica obtida a partir de um paciente. As amostras incluem, sem limitação, sangue total, plasma, soro, glóbulos vermelhos, glóbulos brancos (por exemplo, células mononucleares de sangue periférico), fluido de lavagem dutal, aspirado de mamilo, linfa (por exemplo, células tumorais disseminadas do gânglio linfático), aspirado de medula óssea, saliva, urina, evacuações (isto é, fezes), escarro, fluido de lavagem brônquica, lágrimas, aspirado de agulha fina (por exemplo, coletado por meio de aspiração com uma agulha fina direcionada para um alvo, tal como um tumor, ou é amostragem aleatória de células normais, tal como periareolar), qualquer outro fluido corporal, um tecido (por exemplo, tecido tumoral), tal como uma biópsia de um tumor (por exemplo, biópsia por agulha) ou um linfonodo (por exemplo, biópsia de linfonodo sentinela) e seus extratos celulares. Em algumas modalidades, a amostra é sangue total ou um componente fracionário do mesmo, tal como plasma, soro ou um pélete celular.

[0051] Os termos aumentado, elevado, superexpressa, superexpressão, superexpresso, regular positivamente ou positivamente regulado se referem, indistintamente, a um biomarcador que está presente em um nível detectavelmente maior em uma amostra biológica, por exemplo, plasma, de um paciente com câncer comparado com uma amostra biológica de um paciente sem câncer. O termo inclui superexpressão em uma amostra de um paciente com câncer em

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18/81 virtude de transcrição, processamento pós-transcricional, tradução, processamento pós-traducional, localização celular (por exemplo, organela, citoplasma, núcleo, superfície celular) e estabilidade de RNA e proteína comparado com uma amostra de um paciente sem câncer. A superexpressão pode ser detectada usando técnicas convencionais para a detecção de mRNA (isto é, RT-PCR, PCR, hibridização) ou proteínas (isto é, ELISA, técnicas imuno-histoquímicas, espectroscopia de massa, tecnologia Luminex® xMAP). A superexpressão pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais comparado com uma amostra de um paciente sem câncer. Em determinados casos, a superexpressão é em níveis 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15 vezes ou mais de transcrição ou tradução comparado com uma amostra de um paciente sem câncer.

[0052] Uma etiqueta, agente de imagiologia ou uma porção detectável é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos ou outros meios físicos. Por exemplo, etiquetas úteis incluem ³²P, corantes fluorescentes, reagentes densos em elétrons, enzimas (por exemplo, conforme comumente usado em um ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos e proteínas que podem ser tornados detectáveis, por exemplo, através da incorporação de um radiomarcador no peptídeo, ou usados para detectar anticorpos especificamente reativos ao peptídeo.

[0053] Conforme usado aqui, o termo biomarcador se refere a qualquer característica biológica a partir de amostra de tecido ou uma célula a ser identificada ou quantificada. Um biomarcador pode ser útil ou potencialmente útil para medir o início, progressão, gravidade, patologia, agressividade, grau, atividade, incapacidade, mortalidade, morbidade, subclassificação da doença ou outra característica subjacente de um ou mais processos biológicos, processos patogênicos, doenças ou respostas a uma intervenção terapêutica. Um

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19/81 biomarcador é virtualmente qualquer composto biológico, tal como uma proteína e um fragmento da mesma, um peptídeo, um polipeptídeo, uma proteoglicana, uma glicoproteína, uma lipoproteína, um carboidrato, um lipídio, um ácido nucleico, uma substância química orgânica ou inorgânica, um polímero e uma pequena molécula, o qual está presente na amostra a ser analisada e que pode ser isolado ou medido na amostra.

[0054] Conforme usado aqui, o termo detecção se refere a observar um sinal proveniente de uma porção de etiqueta para indicar a presença de um biomarcador na amostra. Qualquer método conhecido na técnica para detectar uma porção detectável particular pode ser usado para detecção. Métodos de detecção exemplificativos incluem, porém sem limitações, métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos.

II. Detecção de Câncer Pancreático

A. Amostra Biológica [0055] Determinadas modalidades da presente invenção se referem à detecção e quantificação da expressão de determinados antígenos ou biomarcadores (por exemplo, TNG- FN IIIC, TFPI e/ou CA19-9) em uma amostra. Conforme usado aqui, o termo amostra biológica pode se referir a um organismo inteiro ou a um subconjunto de tecidos, células ou partes componentes do mesmo. Uma amostra biológica também pode se referir a um homogeneizado, lisato ou extrato preparado a partir de um organismo inteiro ou um subconjunto de tecidos, células ou partes componentes do mesmo ou uma fração ou porção do mesmo. Tipicamente, a amostra biológica é diluída antes de realização de um ensaio. Exemplos não limitativos de amostras biológicas incluem urina, sangue, líquido cefalorraquidiano (CSF), líquido pleural, expectoração e fluido peritoneal, lavagens da bexiga, secreções, lavagens orais, amostras de tecido, preparações de toque (touch preps) ou aspirados

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20/81 de agulha fina. A amostra pode compreender fluidos corporais e amostras de tecido as quais incluem, porém sem limitações, sangue, biópsias teciduais, fluido espinal, fluido meníngeo, urina, fluido alveolar. Em algumas modalidades, uma amostra biológica pode ser uma linhagem de células, cultura de células ou suspensão de células. De preferência, uma amostra biológica corresponde à quantidade e tipo de DNA e/ou produtos de expressão presentes em uma célula parental a partir da qual a amostra foi derivada. Uma amostra biológica pode ser de um indivíduo humano ou não humano. Em modalidades particulares, a amostra é uma amostra de plasma. O ensaio também pode ser aplicado a um tecido in vivo, tal como durante uma cirurgia.

B. Biomarcadores [0056] A presente invenção fornece um painel de biomarcadores para detecção de câncer pancreático. O painel inclui os biomarcadores TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9. TNC-FN lll-C e TFPI aumentam o desempenho de CA19-9 na detecção de câncer pancreático como um painel de dois marcadores (por exemplo, TNC-FN III-C/CA19-9 ou TFPI/CA19-9) e como um painel de três marcadores (por exemplo, TNCFN III-C/TFPI/CA19-9). O presente painel de biomarcadores melhora a AUC, a especificidade, a sensibilidade e a precisão do ensaio padrão de excelência CA19-9 para detectar o câncer pancreático. Ao aumentar a especificidade do ensaio pela adição de TNC-FN lll-C, o painel corta o número de casos de falsos positivos para um grau tal que os pacientes poderíam ser enviados para novos exames de imagiologia, tais como tomografia computadorizada, ressonância magnética ou ultrassom.

1. CA19-9 [0057] O CA19-9 é um antígeno da glicoproteína mucina associada a tumor que está relacionado à proteína do grupo sanguíneo de Lewis. Embora um elevado nível de CA19-9 seja mais comumente associado ao câncer pancreático, outros tipos de câncer, tais como câncer

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21/81 colorretal, de pulmão e vesícula biliar, também podem ter níveis elevados. Altos níveis de CA19-9 também podem ser causados por condições não cancerígenas, tais como cálculos biliares, bloqueio do duto biliar (icterícia), pancreatite, fibrose cística e doença hepática.

[0058] Um marcador tumoral ideal deve ser específico para um dado tipo de tumor e altamente sensível de modo a se abster de um diagnóstico falso positivo. No entanto, o CA19-9 parece não se enquadrar nestes critérios em virtude de sua sensibilidade inadequada, resultados falsos negativos na população de Lewis negativa (Lea-b-) e muitos resultados falso positivos induzidos por icterícia obstrutiva (1060%) (Wu etal., 2013).

2. TNC-FN lll-C [0059] A tenascina-C é uma glicoproteína da matriz extracelular que é composta por quatro domínios. Uma subunidade tem um domínio TA na extremidade N-terminal, depois um domínio de sequência similar ao fator de crescimento epidérmico (domínio similar a EGF), um domínio de repetição de fibronectina de tipo III (FN III) e um domínio similar a fibrinogênio na extremidade C-terminal. Há um domínio com união (splicing) alternativo no domínio FN III e ele gera alguns tipos de variantes de tenascina-C. As subunidades formam um trímero ao torcer o domínio enrolado N-terminal e formam um hexâmero através de uma ligação de dissulfureto no tecido. Embora variantes de baixo peso molecular de tenascina-C estejam presentes no tecido normal, a presente invenção identificou uma variante de elevado peso molecular de tenascina-C, TNC-FN lll-C, expressa em câncer pancreático. Assim, os presentes estudos são os primeiros a identificar esta isoforma como um biomarcador para o câncer pancreático.

3. TFPI [0060] O inibidor da via do fator tecidual (TFPI) é uma proteína anticoagulante que atua como um inibidor de serina-protease de tipo

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Kunitz. O TFPI é um polipeptídeo com uma única cadeia que pode inibir reversível mente o Fator Xa. Enquanto o Xa é inibido, o complexo XaTFPI também pode, subsequentemente, inibir o complexo do fator tecidual FVIIa. Acredita-se que o FPI seja importante na modulação da trombogênese induzida por TF, uma vez que a formação inadequada de trombos nos vasos sanguíneos pode causar doenças cardiovasculares, tais como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e embolia pulmonar, dentre outras. O TFPI pode ser usado como um biomarcador, individualmente ou em combinação, para a detecção de lesões précancerosas, tais como PanINs.

C. Métodos de Detecção [0061] O nível de expressão do painel de biomarcadores pode ser medido por ELISA, Western blot, espectrometria de massa, um método de detecção imune capilar, focagem isoelétrica, um método de precipitação imune ou imuno-histoquímica. Outros métodos incluem a detecção de imagens ópticas com base em anticorpos, ultrassonografia, ressonância magnética, PET e fototerapia. Em modalidades particulares, os presentes modos se referem a realizar um ou mais ensaios ELISA para detectar a expressão de um ou mais biomarcadores, tais como TNC-FN IIIC, TFPI e CA19-9.

[0062] Um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, ou ELISA, pode ser usado para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Há muitas variações de um ensaio ELISA. Os ensaios ELISA podem ser formatados para detecção direta, indireta, competitiva ou em sanduíche do analito. Todos são com base na imobilização de um antígeno ou anticorpo sobre uma superfície sólida, geralmente uma placa de microtitulação. O método ELISA original compreende a preparação de uma amostra que contém as proteínas biomarcadoras de interesse, revestir as cavidades de uma placa de microtitulação com a amostra, incubar cada cavidade com um anticorpo

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23/81 primário que reconheça um antígeno específico, remover o anticorpo não ligado e detectar os complexos de anticorpo-antígeno. Os complexos de anticorpo-anticorpo podem ser detectados diretamente. Os anticorpos primários são conjugados a um sistema de detecção, tal como uma enzima que produz um produto detectável. Os complexos de anticorpo-anticorpo podem ser detectados indiretamente. Por exemplo, o anticorpo primário é detectado por um anticorpo secundário que é conjugado a um sistema de detecção, conforme descrito acima. A placa de microtitulação é, então, digitalizada e os dados de intensidade bruta podem ser convertidos em valores de expressão usando meios conhecidos na técnica. Kits com uma única e múltiplas sondas estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais, por exemplo, Meso Scale Discovery (MSD).

[0063] Em um método ELISA, um primeiro agente de ligação, ou de captura, tal como um anticorpo que se liga especificamente ao biomarcador de interesse, é imobilizado sobre um substrato ou veículo de fase sólida adequado. A amostra biológica de teste é, então, contatada com o anticorpo de captura e incubada durante um período de tempo desejado. Após lavagem para remover o material não ligado, um segundo anticorpo de detecção, o qual se liga a um epítopo diferente, não sobreposto, sobre o biomarcador é, então, usado para detectar a ligação do biomarcador polipeptídico ao anticorpo de captura. O anticorpo de detecção é, de preferência, conjugado, direta ou indiretamente, a uma porção detectável. Exemplos de porções detectáveis que podem ser empregadas em tais métodos incluem, porém sem limitações, agentes quimioluminescentes e luminescentes; fluoroforos, tais como fluoresceína, rodamina e eosina; radioisótopos; agentes colorimétricos; e marcadores enzimáticos de substrato, tal como biotina.

[0064] Em outra modalidade, o ELISA é um ensaio de ligação

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24/81 competitiva, em que o biomarcador marcado é usado, em vez do anticorpo de detecção marcado, e o biomarcador marcado e qualquer biomarcador não marcado presentes na amostra de teste competem pela ligação ao anticorpo de captura. A quantidade de biomarcador ligado ao anticorpo de captura pode ser determinada com base na proporção de biomarcador marcado detectado.

[0065] Em determinadas modalidades, o biomarcador ou anticorpo ligado ao biomarcador é direta ou indiretamente marcado com uma porção detectável. O papel de um agente detectável é facilitar a etapa de detecção do método diagnóstico, permitindo a visualização do complexo formado pela ligação do agente de ligação ao marcador de proteína (ou fragmento do mesmo). O agente detectável pode ser selecionado de modo a gerar um sinal que pode ser medido e cuja intensidade está relacionada (de preferência proporcional) à quantidade de marcador de proteína presente na amostra que está sendo analisada. Métodos para marcar moléculas biológicas, tais como polipeptídeos e anticorpos, são bem conhecidos na técnica. Qualquer um de uma grande variedade de agentes detectáveis pode ser usado na prática da presente invenção. Agentes detecteis adequados incluem, porém sem limitações: vários ligantes, radionuclídeos, corantes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, micropartículas (tais como, por exemplo, pontos quânticos, nanocristais, fósforo e assim por diante), fotossensibilizantes, enzimas (tais como aquelas usadas em um ELISA, isto é, peroxidase de rábano, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores colorimétricos, marcadores magnéticos e biotina, digoxigenina ou outros haptenos e proteínas para os quais estão disponíveis antissoros ou anticorpos monoclonais.

[0066] Os anticorpos podem ser ligados a agentes de imagiologia de uso para imagiologia e diagnóstico de vários órgãos, tecidos ou tipos de células com patologias. O anticorpo pode ser marcado ou conjugado

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25/81 a um fluoroforo ou radiofármaco para uso como agente de imagiologia. Muitos agentes de imagiologia apropriados são conhecidos na técnica, assim como métodos para sua ligação a proteínas ou peptídeos usando complexos de quelato metálico, radioisótopos, marcadores fluorescentes ou enzimas cuja presença pode ser detectada usando marcadores colorimétricos (tais como, porém, sem limitações, urease, fosfatase alcalina, peroxidase de hidrogênio (rábano silvestre) e glicose oxidase). Em algumas modalidades, o conjugado de imagiologia também será marcado duplamente com um isótopo radioativo de modo a combinar a imagiologia através de abordagens nucleares e ser transformado em uma estrutura cíclica única e otimizada para afinidade de ligação e farmacocinética. Tais agentes podem ser administrados através de qualquer número de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, porém sem limitações, administração oral, inalação, injeção subcutânea (sub-q), intravenosa (I.V.), intraperitoneal (I.P.), intramuscular (I.M.) ou intratecal ou conforme descrito em mais detalhes abaixo.

[0067] Em alguns aspectos, o agente de imagiologia é um cromóforo, tal como um fluoroforo. Fluoroforos exemplificativos adequados para uso com a presente invenção incluem rodamina, rodol, fluoresceína, tiofluoresceína, aminofluoresceína, carboxifluoresceína, clorofluoresceína, metilfluoresceína, sulfofluoresceína, aminorrodol, carboxirrodol, clororrodol, metilrrodol, sulforrodol; aminorrodamina, carboxirrodamina, clororrodamina, metil-rodamina, sulforrodamina e tiorrodamina; cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina, merocianina, cianina 2, cianina 3, cianina 3,5, cianina 5, cianina 5,5, cianina 7, derivados de oxadiazol, piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol, benzoxadiazol, derivados de pireno, azul cascata, derivados de oxazina, vermelho do Nilo, azul do Nilo, violeta de cresila, oxazina 170, derivados de acridina, proflavina, laranja de acridina,

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26/81 amarelo de acridina, derivados de arilmetina, auramina, violeta cristal, verde de malaquita, derivados de tetrapirrol, porfina, ftalocianina e bilirrubina; 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8naftalenossulfonato, 2-p-touidinil-6-naftalenossulfonato, 3-fenil-7isocianatocumarina, N- (p-(2-benzoxazolil)fenil)maleimida, estilbenos, pirenos, 6-FAM (Fluoresceína), 6-FAM (NHS Éster), Fluoresceína dT, HEX, JOE (NHS Éster), MAX, TET, ROX, TAMRA, TARMA™ (NHS Éster), TEX 615, ATTO™ 488, ATTO™ 532, ATTO™ 550, ATTO™ 565, ATTO™ Rho101, ATTO™ 590, ATTO™ 633, ATTO™ 647N, TYE™ 563, TYE™ 665 e TYE™ 705. Em aspectos particulares, o cromóforo é TAMRA.

[0068] A porção detectável pode incluir, porém sem limitações, fluorodeoxiglicose (FDG); 2'-fluoro-2'deoxi-1 beta-D-arabionofuranosil5-etil-uracila (FEAU); 5-[¹²³l]- 2'-fluoro-5-iodo-1p-D-arabinofuranosiluracila; 5-[¹²⁴l]- 2'-fluoro-5-iodo-1 β-D-arabinofuranosil-uracila; 5-[¹³¹l]-2'fluoro-5-iodo-1 β-D-arabinofuranosil-uracila, 5-[¹⁸F]-2'-fluoro-5-fluoro-1 β-D-arabinofuranosil-uracila; 2-[¹¹l]- e 5-([¹¹C]-metil)-2'-fluoro-5-metil-1β-D-arabinofuranosil-uracila; 2-[¹¹C]- 2'-fluoro-5-etil-1-β-Darabinofuranosil-uracila; 5-([¹¹C]-etil)-2'-fluoro-5-etil-1-β-Darabinofuranosil-uracila; 5-(2-[¹⁸F]-etil)-2'-fluoro-5-(2-fluoro-etil)-1^-Darabinofuranosil-uracil, 5-[¹²³l]-2'-f I uoro-5-iodovi ni I-1 -β-Darabinofuranosil-uracila; 5-[¹²⁴l]-2'-fl uoro-5-iodovinil-1 -β-Darabinofuranosil-uracila; 5-[¹³¹ l]-2'-fl uoro-5-iodovinil-1 -β-Darabinofuranosil-uracila; 5-[¹²³l]-2'-fluoro-5-iodo-1^-D-ribofuranosiluracila; 5-[¹²⁴l]-2'-fluoro-5-iodo-1-β-D-ribofuranosil-uracila; 5-[¹³¹l]-2'fluoro-5-iodo-1 -β-D-ribofuranosil-uracila; 5-[¹²³l]-2'-f I uoro-5-iodovi ni I-1 β-D-ribofuranosil-uracila; 5-[¹²⁴l]-2'-fl uoro-5-iodovinil-1 -β-Dribofuranosil-uracila; 5-[¹³¹ l]-2'-f I uoro-5-iodovi ni I -1 -β-D-ribofuranosiluracila; ou 9-4-[¹⁸F]fluoro-3-(hidroximetil)butil]guanina.

[0069] Em alguns aspectos, o agente de imagiologia é um

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27/81 radionuclídeo. Marcadores de radionuclídeo adequados são Tc, In, Ga, Cu, F, Lu, Y, Bi, Ac e outros isótopos de radionuclídeos. Particularmente, o radionuclídeo é selecionado a partir do grupo que compreende ¹¹¹1n, ^99mTc, ^94mTc, ⁶⁷Ga, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁵²Fe, ⁶⁹Er, ⁷²As, ⁹⁷Ru, ²⁰³Pb, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁵¹Cr, ^52mMn, ¹⁵⁷Gd, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁰⁵Rh, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵¹Pm, ¹⁷²Tm, ¹²¹Sn, ^177mSn, ²¹³Bi, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁸F, ¹²³l, ¹²⁴l, ¹³¹l, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br e ⁸²Br, dentre outros. Estes radionuclídeos são catiônicos e podem formar complexos com o quelante através do grupo quelante do conjugado para formar composições marcadas.

[0070] Métodos de detecção e/ou quantificação de um marcador detectável ou material gerador de sinal dependem da natureza do marcador. Os produtos de reações catalisadas por enzimas apropriadas podem ser, sem limitação, fluorescentes, luminescentes ou radioativos ou podem absorver luz visível ou ultravioleta. Exemplos de detectores adequados para detectar tais marcadores detectáveis incluem, sem limitação, filme de raios X, contadores de radioatividade, contadores de cintilação, espectrofotômetros, colorímetros, fluorômetros, luminômetros e densitômetros. Qualquer um dos métodos para detecção pode ser realizado em qualquer formato que permita qualquer preparação, processamento e análise adequados das reações. Este pode ser, por exemplo, em placas de ensaio com múltiplos cavidades (por exemplo, 96 cavidades ou 386 cavidades) ou usando qualquer matriz ou microarranjo adequado. As soluções mãe para vários agentes podem ser feitas manual ou roboticamente e todas as pipetagens, diluições, misturas, distribuições, lavagens, incubações, leituras de amostras, coleta de dados e análises podem ser feitas roboticamente usando um software de análise comercialmente disponível, robótica e instrumentação de detecção para detectar um marcador detectável. A imagiologia pode ser por meio de imagiologia óptica, ultrassom, PET,

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SPECT, MRI ou fototerapia.

[0071] Em alguns aspectos, o um ou mais ensaios podem ser ensaios ELISA em sanduíche. Os três biomarcadores podem ser detectados por três ensaios ELISA separados, como em três placas ou lâminas separadas para cada biomarcador ou uma placa ou lâmina com cavidades separadas para cada biomarcador.

[0072] Em determinadas modalidades, os anticorpos específicos para o antígeno podem ser imobilizados sobre um suporte ou veículo (por exemplo, uma esfera, uma partícula magnética, uma partícula de látex, uma placa de microtitulação, uma cubeta ou outro vaso de reação). Exemplos de materiais carreadores ou de suporte adequados incluem agarose, celulose, nitrocelulose, dextrana, Sephadex, Sepharose, lipossomas, carboximetilcelulose, poliacrilamidas, poliestireno, gabros, papel filtro, magnetita, resina de troca iônica, filme plástico, tubo plástico, vidro de copolímero de poliamina-metil vinil-éterácido maleico, copolímero de aminoácido, copolímero de etileno-ácido maleico, náilon, seda e assim por diante. Os agentes de ligação podem ser imobilizados indiretamente usando agentes de ligação secundários específicos para os primeiros agentes de ligação (por exemplo, anticorpos de camundongo específicos para os marcadores de proteína podem ser imobilizados usando um anticorpo de ovelha específico para o fragmento Fc de IgG anti-camundongo revestido sobre o veículo ou suporte).

[0073] Em outros aspectos, os três biomarcadores podem ser detectados por um ELISA multiplexado para detectar dois ou três dos biomarcadores simultaneamente. Por exemplo, o ELISA multiplexado pode compreender um arranjo de anticorpos com anticorpos de captura colocados em subarranjos nos quais a amostra é incubada, proteínas não específicas são lavadas e o arranjo é incubado com um coquetel de anticorpos de detecção biotinilados, seguido por um conjugado de

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29/81 estreptavidina e fluoroforo que é visualizado por um scanner a laser de fluorescência (por exemplo, Quantibody Multiplex ELISA Array, RayBiotech).

[0074] A presença de vários biomarcadores diferentes em uma amostra de teste pode ser detectada simultaneamente usando um ensaio multiplex, tal como um ELISA multiplex. Os ensaios multiplex oferecem as vantagens de alto rendimento, um pequeno volume de amostra sendo necessário e a capacidade de detectar diferentes proteínas em uma faixa dinâmica de concentrações na placa. Em determinadas modalidades, tais métodos empregam uma matriz, em que múltiplos agentes de ligação (por exemplo, anticorpos de captura) específicos para múltiplos biomarcadores são imobilizados sobre um substrato, tal como uma membrana, cada anticorpo de captura sendo posicionado em uma localização sobre o substrato. Métodos para realização de ensaios que empregam tais arranjos incluem aqueles descritos, por exemplo, nas Publicações de Patentes dos Estados Unidos N^os US2010/0093557A1 e US2010/0190656A1, as descrições das quais são aqui incorporadas especificamente por referência.

[0075] Matrizes Multiplex em vários formatos diferentes com base no uso, por exemplo, na tecnologia de citometria de fluxo, quimioluminescência ou quimioluminescência-elétrons, são bem conhecidas na técnica. As matrizes multiplex de citometria de fluxo, também conhecidas como matrizes multiplex com base em esferas, incluem o sistema Cytometric Bead Array (CBA) da BD Biosciences (Bedford, Mass.) e a tecnologia de análise de perfis de múltiplos analitos (xMAP®) da Luminex Corp.), ambos empregando conjuntos de esferas que são distinguíveis por meio de citometria de fluxo. Cada conjunto de esferas é revestido com um anticorpo de captura específico. Anticorpos de detecção marcados com fluorescência ou estreptavidina se ligam a complexos específicos de biomarcadores de anticorpos formados no

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30/81 conjunto de esferas. Múltiplos biomarcadores podem ser reconhecidos e medidos por diferenças nos conjuntos de esferas, com emissões cromogênicas ou fluorogênicas sendo detectadas usando análise citométrica de fluxo.

[0076] Em um formato alternativo, um ELISA multiplex da Quansys Biosciences (Logan, UT) reveste múltiplos anticorpos de captura específicos em múltiplos pontos (um anticorpo em um ponto) na mesma cavidade em uma placa de microtitulação com 96 cavidades. A tecnologia de quimioluminescência é, então, usada para detectar vários biomarcadores nos pontos correspondentes sobre a placa.

[0077] Um microarranjo de anticorpos também pode ser usado para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Para isto, uma pluralidade de anticorpos é posicionada e covalentemente ligada à superfície do microarranjo ou biochip. Um extrato de proteína que contém as proteínas biomarcadoras de interesse é, em geral, marcado com um corante fluorescente ou biotina. As proteínas biomarcadoras marcadas são incubadas com o microarranjo de anticorpos. Após lavagens para remover as proteínas não ligadas, o microarranjo é digitalizado. Os dados de intensidade de fluorescência bruta podem ser convertidos em valores de expressão usando meios conhecidos na técnica.

D. Imagiologia [0078] Em determinadas modalidades, a presente invenção considera métodos de imagiologia de antígenos alvo usando anticorpos com unidades detectáveis. O anticorpo pode ser marcado com fluorescência e/ou radioatividade que pode ser detectada através de vários métodos conhecidos na técnica.

[0079] Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Imagiologia por Ressonância Magnética nuclear (MRI) são técnicas para a identificação de isótopos em uma amostra (área) ao submeter a amostra a campos

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31/81 magnéticos externos e detectar as frequências de ressonância dos núcleos. Um scanner de ressonância magnética geralmente consiste em um ímã com uma intensidade Tesla de 1,5 a 7 ou mais. Um campo magnético e ondas de rádio são usados para excitar prótons no corpo. Estes prótons relaxam após a excitação e um programa de computador traduz estes dados em imagens de um tecido humano. Em determinadas modalidades, a presente invenção considera que é tirada uma imagem de pré-contraste. Uma vez que a composição é injetada, uma imagem pós-contraste é obtida.

[0080] A RMN envolve, tipicamente, as etapas de alinhamento (polarização) dos spins nucleares magnéticos em um campo magnético constante aplicado e a perturbação deste alinhamento dos spins nucleares empregando uma radiação eletromagnética, geralmente pulso de radiofrequência (RF). Um pulso de uma determinada frequência da portadora contém uma faixa de frequências centradas em torno da frequência da portadora. A transformada de Fourier de uma onda aproximadamente quadrada contém contribuições das frequências na proximidade da frequência principal. O intervalo das frequências de RMN permite usar pulsos de frequência de rádio de milissegundos a microssegundos.

[0081] A tomografia computadorizada por emissão de um único fóton (SPECT) é uma técnica de imagiologia que usa raios gama. Usando uma câmera gama, a informação de detecção é, tipicamente, apresentada como cortes transversais e pode ser reformatada ou manipulada conforme necessário. É injetado um radioisótopo emissor de radiação gama (radionuclídeo) em um indivíduo. O radioisótopo contém ou é conjugado a uma molécula que possui propriedades desejáveis, por exemplo, um radioisótopo marcador foi ligado a um ligante, folato. Isto permite que a combinação de ligante, por exemplo, folato e radioisótopo (o radiofármaco) seja transportada e ligada a um

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32/81 local de interesse no corpo o que, então, (em virtude da emissão gama do isótopo) permite que a concentração de ligante seja observada por uma câmera gama.

[0082] A tomografia por emissão de positrões (PET) é uma técnica de imagiologia que produz uma imagem tridimensional. O sistema detecta pares de raios gama emitidos indiretamente por um radionuclídeo emissor de positrons (rastreador). Imagens tridimensionais da concentração do rastreador dentro da área são, então, construídas por meio de análise computacional. Um isótopo rastreador radioativo é injetado no indivíduo, por exemplo, na circulação sanguínea. Normalmente, há um período de espera enquanto o rastreador se concentra nos tecidos de interesse; então, o indivíduo é colocado no scanner de imagiologia. À medida que o radioisótopo sofre decaimento da emissão de positrons, ele emite um positron, uma antipartícula de elétron com carga oposta, até que desacelera até um ponto onde possa interagir com um elétron, produzindo um par de fótons (gama) que se move em direções aproximadamente opostas. Estes são detectados no dispositivo de digitalização. A técnica depende da detecção simultânea ou coincidente do par de fótons que se move em direção aproximadamente oposta (o scanner possui uma leve tolerância de direção-erro). Fótons que não chegam em pares (isto é, dentro de uma janela de tempo) são ignorados. A fonte dos fótons é localizada ao longo de uma linha reta de coincidência (também denominada de linha de resposta ou LOR). Estes dados são usados para gerar uma imagem. [0083] A luz que tem uma faixa de comprimento de onda de 600 nm e 850 nm está dentro da faixa do espectro próximo do infravermelho, em contraste com a luz visível, que se encontra na faixa de cerca de 400 nm a cerca de 500 nm. Consequentemente, a luz de excitação usada na prática dos métodos diagnósticos da invenção conterá pelo menos um comprimento de onda de luz para iluminar o tecido no

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33/81 comprimento de onda do infravermelho para excitar os compostos, de modo que a fluorescência obtida da área que tem absorção dos compostos da presente invenção seja claramente visível e distinta da autofluorescência do tecido circundante. A luz de excitação pode ser monocromática ou policromática. Deste modo, os compostos da presente invenção são vantajosos, pois eliminam a necessidade de uso de mecanismos de filtragem que seriam usados para obter uma imagem diagnostica desejada se a sonda fluorescente for uma que fluoresce em comprimentos de onda abaixo de cerca de 600 nm. Deste modo, os compostos da presente invenção evitam imagens diagnosticas obscurecidas que são produzidas como um resultado da luz de excitação de comprimentos de onda que seriam refletidos a partir do tecido saudável e causam perda de resolução da imagem fluorescente. [0084] Laboratórios de diagnóstico, consultórios médicos e salas de operação para procedimentos cirúrgicos podem ser equipados com uma sobrecarga de luz que produz comprimentos de onda de luz no espectro emissor óptico útil na prática de métodos diagnósticos da invenção, tais como lâmpadas que produzem luz no comprimento de onda adequado. Tal luz pode ser usada na prática dos métodos diagnósticos da invenção simplesmente ao apagar as outras luzes na sala de cirurgia (para eliminar a luz externa que seria visivelmente refletida a partir do tecido na parte do corpo sob investigação) e acender a luz de excitação da sala de cirurgia de um comprimento de onda próximo do infravermelho na cavidade do corpo ou abertura criada cirurgicamente, de modo que a imagem fluorescente recebida diretamente pelo olho do observador (por exemplo, o cirurgião) seja predominantemente a imagem fluorescente que emana do(s) fluoroforo(s) no campo de visão.

[0085] Dentro de qualquer uma das modalidades de imagiologia, os métodos descritos aqui podem compreender ainda as etapas de gravação das imagens de uma área do indivíduo em um computador ou

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34/81 meio legível em computador. Em determinadas modalidades, os métodos podem compreender ainda transferência das imagens gravadas para um profissional médico que representa o indivíduo sob avaliação.

[0086] Em alguns aspectos, os compostos da presente invenção são usados para identificar um tumor através da administração de tais compostos durante um tempo e sob condições que permitam a ligação do composto a pelo menos uma célula do tipo de célula alvo (por exemplo, recentemente macrófagos recrutados e diferenciados). O composto ligado é, então, detectado opticamente, de modo que a presença de fluorescência do comprimento de onda próximo do infravermelho que emana do composto alvo ligado da presente invenção indica que o tipo de célula alvo que está presente na amostra biológica. [0087] A quantidade do composto conjugado eficaz para uso de acordo com o método da invenção depende de muitos parâmetros, incluindo o peso molecular do conjugado, sua via de administração e sua distribuição tecidual. Anticorpos específicos para antígeno podem ser administrados em uma ou mais doses (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 3 doses) antes de cateterização ou um procedimento de imagiologia externa. O número de doses depende do peso molecular do composto, sua via de administração e sua distribuição tecidual, dentre outros fatores.

[0088] Os anticorpos podem ser administrados por via parentérica ao paciente a ser avaliado quanto a um tumor, por exemplo, por via intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Meios adequados para administração parentérica incluem injetores de agulha (incluindo microagulhas), injetores sem agulha e técnicas de infusão.

E. Métodos de Uso [0089] Os aspectos da presente invenção incluem métodos para

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35/81 diagnosticar ou monitorar o início, progressão ou regressão de câncer em um indivíduo, por exemplo, ao obter amostras de células ou tecidos de um indivíduo e testar tais amostras quanto à presença de expressão alterada dos três biomarcadores TNF-FN lll-C, TFPI e CA19-9. Conforme usado aqui, o termo câncer se refere a um crescimento descontrolado de células que pode interferir com o funcionamento normal dos órgãos e sistemas corporais e inclui tumores primários e metastáticos. Tumores primários ou cânceres que migram de sua localização original e para os órgãos vitais e podem levar à morte do indivíduo através de deterioração funcional dos órgãos afetados. Uma metástase é uma célula cancerosa ou grupo de células cancerosas, distinto da localização primária do tumor, resultante da disseminação de células cancerosas do tumor primário para outras partes do corpo. Metástases podem eventualmente resultar em morte de um indivíduo.

[0090] Os cânceres incluem, porém sem limitações, carcinoma de células basais, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer ósseo; câncer cerebral e do SNC; câncer de mama; câncer de colo do útero; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto ; câncer de tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer endometrial; câncer de esôfago; câncer de olho; câncer da cabeça e pescoço; câncer gástrico; neoplasia intra-epitelial; câncer renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; câncer de pulmão (por exemplo, células pequenas e células não pequenas); linfoma, incluindo linfoma de Hodgkin e não Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer de cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe); câncer de ovário; câncer pancreático; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer renal; câncer do sistema respiratório; sarcoma; câncer de pele; câncer de estômago; câncer testicular; câncer de tiroide; câncer uterino; câncer do sistema urinário, bem como outros carcinomas e sarcomas. Em modalidades particulares, um indivíduo

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36/81 que é diagnosticado ou tratado pelos presentes métodos é um indivíduo que tem câncer pancreático, tal como câncer pancreático em estágio inicial.

[0091] Os métodos descritos aqui podem ser usados para rastrear pacientes com câncer ou podem ser usados para monitorar pacientes diagnosticados com câncer. Por exemplo, em um modo de rastreio, os pacientes com risco de câncer pancreático são examinados com o objetivo de detectar precocemente o câncer de bexiga. Os métodos descritos aqui podem ser usados individualmente ou em conjunto com outros testes. Em geral, o ELISA é realizado em uma amostra de plasma e a expressão alterada do painel de biomarcadores é determinada. Pacientes com expressão alterada dos três biomarcadores são examinados e podem receber tratamento apropriado, se necessário. Após o tratamento, os pacientes são monitorados quanto à recorrência do câncer usando os métodos descritos aqui.

[0092] Em algumas modalidades, uma amostra de teste pode ser uma amostra de um indivíduo que tem câncer pancreático ou uma condição pré-cancerosa, enquanto que uma amostra de controle pode ser uma amostra de um indivíduo que não tem câncer e/ou uma condição pré-cancerosa.

F. Agentes Antineoplásicos [0093] Em algumas modalidades, os presentes métodos identificam um indivíduo que tem um câncer, tal como câncer pancreático, ao detectar a expressão alterada dos três biomarcadores TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9. Em outras modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um indivíduo identificado como tendo um câncer por meio de administração de uma ou mais terapias antineoplásicas.

[0094] A uma ou mais terapias antineoplásicas podem ser uma radioterapia, cirurgia (por exemplo, tumorectomia e uma mastectomia),

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37/81 quimioterapia, terapia genética, terapia com DNA, terapia viral, terapia com RNA, imunoterapia, transplante de medula óssea, nanoterapia, terapia com anticorpo monoclonal ou uma combinação dos precedentes. A terapia antineoplásica pode estar na forma de terapia adjuvante ou neoadjuvante.

[0095] Em algumas modalidades, a terapia antineoplásica é a administração de um inibidor enzimático de pequena molécula ou agente antimetastático. Em algumas modalidades, a terapia antineoplásica é a administração de agentes limitantes de efeitos colaterais (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou gravidade dos efeitos colaterais do tratamento, tais como agentes antieméticos, etc.). Em algumas modalidades, a terapia antineoplásica é radioterapia. Em algumas modalidades, a terapia antineoplásica é a cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia antineoplásica é uma combinação de radioterapia e cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia antineoplásica é irradiação gama. Em algumas modalidades, a terapia antineoplásica é a terapia que tem como alvo a via de PBK/AKT/mTOR, o inibidor de HSP90, o inibidor de tubulina, o inibidor de apoptose e/ou o agente quimiopreventivo. A terapia antineoplásica pode ser um ou mais dos agentes quimioterapêuticos conhecidos na técnica.

[0096] Um primeiro agente antineoplásico pode ser administrado antes, durante, depois ou em várias combinações em relação a uma terapia antineoplásica adicional, tal como terapia de ponto de verificação imune. As administrações podem ser em intervalos que variam de concorrentemente a minutos, de dias a semanas. Em modalidades onde a primeira terapia antineoplásica é fornecida a um paciente separadamente de um agente terapêutico adicional, em geral, é assegurado que um período de tempo significativo não expire entre o tempo de cada administração, de modo que os dois compostos ainda

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38/81 possam exercer um efeito vantajosamente combinado sobre o paciente. Em tais casos, considera que se pode fornecer a um paciente a primeira terapia antineoplásica e a segunda terapia antineoplásica dentro de cerca de 12 a 24 ou 72 h uma da outra e, mais particularmente, dentro de cerca de 6-12 horas uma da outra. Em algumas situações, pode ser desejável prolongar significativamente o período de tempo para o tratamento, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) se passam entre as respectivas administrações.

1. Quimioterapia [0097] Uma ampla variedade de agentes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as presentes modalidades. O termo quimioterapia se refere ao uso de fármacos para tratar o câncer. Um agente quimioterapêutico é usado para indicar um composto ou composição que é administrada no tratamento de câncer. Estes agentes ou fármacos são categorizados por seu modo de atividade dentro de uma célula, por exemplo, se e em que estágio afetam o ciclo celular. Alternativamente, um agente pode ser caracterizado com base em sua capacidade de ligação cruzada diretamente com o DNA, se intercalar no DNA ou induzir a aberrações cromossômicas e mitóticas, afetando a síntese do ácido nucleico.

[0098] Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida; alquilsulfonatos, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); bristostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e

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39/81 criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictyina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida e mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enodiína (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II e caliqueamicina ômega II); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bem como cromoforo neocarzinostatina e cromoforos antibióticos cromoproteicos de enodiína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofênico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zorrubicina; anti-metabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, pteropterina e trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona; antiadrenais, tais como mitotano e

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40/81 trilostano; repositor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamete; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofílico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo polissacarídico PSK; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuázico; triaziquona; 2,2',2-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomona; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (Araθ'); ciclofosfamida; taxoides, por exemplo, paclitaxel e docetaxel gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (por exemplo, CPT-11); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometil-ilornitina (DMFO); retinoides, tal como ácido retinoico; capecitabina; carboplatina, procarbazina, plicomicina, gencitabina, navelbina, inibidores de proteína farnesil transferase, transplatina e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.

2. Radioterapia [0099] Outros fatores que causam danos ao DNA e têm sido usados extensivamente incluem aquilo que é comumente conhecido como raios-γ, raios-X e/ou a distribuição dirigida de radioisótopos a células tumorais. Outras formas de fatores que causam danos ao DNA também são consideradas, tais como micro-ondas, irradiação de feixe de prótons

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41/81 (Patentes dos Estados Unidos N^os 5.760.395 e 4.870.287) e irradiação UV. É mais provável que todos estes fatores causem uma ampla variedade de danos ao DNA, aos precursores de DNA, na replicação e reparo de DNA e montagem e manutenção dos cromossomos. As faixas de dosagem para raios-X variam a partir de doses diárias de 50 a 200 Roentgen por períodos prolongados de tempo (3 a 4 semanas) a doses únicas de 2000 a 6000 Roentgen. As faixas de dosagem para os radioisótopos variam amplamente e dependem da meia-vida do isótopo, intensidade e tipo de radiação emitida e captação pelas células neoplásicas.

3. Imunoterapia [00100] No contexto do tratamento de câncer, produtos imunoterapêuticos, em geral, se baseiam no uso de células efetoras imunes e moléculas que têm como alvo e destroem células cancerosas. O rituximabe (RITUXAN®) é um destes exemplos. O efetor imune pode ser, por exemplo, um anticorpo específico para algum marcador na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo individualmente pode servir como um efetor para terapia ou pode recrutar outras células para realmente afetar a morte celular. O anticorpo também pode ser conjugado a um fármaco ou toxina (quimioterapêutico, radionuclídeo, cadeia A de ricina, toxina do cólera, toxina da tosse convulsa, etc.) e serve como um agente de direcionamento. Alternativamente, o efetor pode ser um linfócito portador de uma molécula na superfície que interage, direta ou indiretamente, com um alvo de célula tumoral. Várias células efetoras incluem células T citotóxicas e células NK.

[00101] Os conjugados de anticorpo-fármaco surgiram como uma abordagem inovadora para o desenvolvimento de produtos terapêuticos para o câncer. O câncer é uma das principais causas de mortes no mundo. Conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) compreendem anticorpos monoclonais (MAbs) que são covalentemente ligados a

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42/81 fármacos que matam células. Esta abordagem combina a alta especificidade dos MAbs contra seus alvos antigênicos com fármacos citotóxicos altamente potentes, resultando em MAbs armados que distribuem a carga (fármaco) às células tumorais com níveis enriquecidos do antígeno. A distribuição dirigida do fármaco também minimiza sua exposição em tecidos normais, resultando em menor toxicidade e melhor índice terapêutico. A aprovação de dois fármacos de ADC, ADCETRIS® (brentuximabe vedotina) em 2011 e KADCYLA® (trastuzumabe entansina ou T-DM1) em 2013 pela FDA validou a abordagem. Atualmente, há mais de 30 candidatos a medicamentos ADC em vários estágios de ensaios clínicos para o tratamento de câncer (Leal et al., 2014). À medida que a engenharia de anticorpos e a otimização da carga útil do ligante estão se tornando cada vez mais maduras, a descoberta e o desenvolvimento de novos ADCs dependem cada vez mais da identificação e validação de novos alvos adequados para esta abordagem e à geração de MAbs de direcionamento. Dois critérios para os alvos de ADC são os níveis de expressão elevados/positivos nas células tumorais e a internaiização robusta.

[00102] Em um aspecto da imunoterapia, a célula tumoral deve ter algum marcador que é passível de direcionamento, isto é, não está presente na maioria das outras células. Há muitos marcadores tumorais e qualquer um destes pode ser adequado para direcionamento no contexto das presentes modalidades. Marcadores tumorais comuns incluem CD20, antígeno carcinoembrionário, tirosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno Sialila de Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erbB e p155. Um aspecto alternativo da imunoterapia é combinar efeitos antineoplásicos com efeitos imunoestimulantes. Moléculas imunoestimulantes também existem, incluindo: citocinas, tais como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gama-IFN, quimiocinas, tais como MIP1, MCP-1, IL-8 e fatores de crescimento, tal como o ligante FLT3.

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43/81 [00103] Exemplos de imunoterapias atualmente sob investigação ou em uso são adjuvantes imunes, por exemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenzeno e compostos aromáticos (Patentes dos Estados Unidos N^os 5.801.005 e 5.739.169; Hui e Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); terapia com citocinas, por exemplo, interferons β e γ, IL-1, GM-CSF e TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); terapia gênica, por exemplo, TNF, IL-1, IL-2 e p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward e Villaseca, 1998; Patentes dos Estados Unidos N^os 5.830.880 e 5.846.945); e anticorpos monoclonais, por exemplo, anti-CD20, antigangliosídeo GM2 e anti-p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; Patente dos Estados Unidos N° 5.824.311). Considera-se que podem ser empregadas uma ou mais terapias antineoplásicas com as terapias de anticorpo descritas aqui.

[00104] Em algumas modalidades, a imunoterapia pode ser um inibidor do ponto de verificação imune. Os pontos de verificação imune podem transformar um sinal (por exemplo, moléculas coestimulatórias) ou desativar um sinal. Os pontos de verificação imunes inibidores que podem ser alvo de bloqueio do ponto de verificação imune incluem o receptor A2A de adenosina (A2AR), B7-H3 (também conhecido como CD276), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), proteína 4 citotóxica associada a linfócitos T (CTLA-4, também conhecida como CD152), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), imunoglobulina de células assassinas (KIR), gene de ativação de linfócitos-3 (LAG3), morte programada 1 (PD-1), domínio de imunoglobulinas de células T e domínio 3 de mucina (TIM-3) e supressor de Ig do domínio V de ativação de células T (VISTA). Em particular, os inibidores do ponto de verificação imune têm como alvo o eixo PD-1 e/ou CTLA-4.

[00105] Os inibidores do ponto de verificação imune podem ser fármacos, tais como pequenas moléculas, formas recombinantes de

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44/81 ligantes ou receptores ou, em particular, são anticorpos, tais como anticorpos humanos (por exemplo, Publicação Internacional de Patente W02015016718; Pardoll, Nat Cancer Rev., 12 (4): 252-64, 2012, ambos aqui incorporados por referência). Podem ser usados inibidores conhecidos de proteínas do ponto de verificação imune ou seus análogos, em particular podem ser usadas formas de anticorpos quimerizadas, humanizadas ou humanas. Conforme aqueles versados na técnica saberão, nomes alternativos e/ou equivalentes podem estar em uso para determinados anticorpos mencionados na presente invenção. Tais nomes alternativos e/ou equivalentes são indistinguíveis no contexto da presente invenção. Por exemplo, sabe-se que o lambrolizumabe também é conhecido sob os nomes alternativos e equivalentes MK-3475 e pembrolizumabe.

[00106] Em algumas modalidades, o antagonista da ligação de PD-1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-1 aos seus parceiros de ligação de ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação de ligante de PD-1 são PDL1 e/ou PDL2. Em outra modalidade, um antagonista de ligação de PDL1 é uma molécula que inibe a ligação de PDL1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação de PDL1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra modalidade, o antagonista da ligação de PDL2 é uma molécula que inibe a ligação de PDL2 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, um parceiro de ligação de PDL2 é PD-1. O antagonista pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo. Anticorpos exemplificativos são descritos nas Patentes dos Estados Unidos N^os8.735.553, 8.354.509 e 8.008.449, todas aqui incorporadas por referência. Outros antagonistas do eixo PD-1 para uso nos métodos fornecidos aqui são conhecidos na técnica, conforme descrito nas Publicações de Patentes dos Estados Unidos N^os 20140294898,

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US2014022021 e US20110008369, todas aqui incorporadas como referência.

[00107] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em nivolumabe, pembrolizumabe e CT-011. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina que compreende uma porção de ligação de PD-1 extracelular PDL1 ou PDL2 ou fundida a uma região constante (por exemplo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulina). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é AMP-224. O nivolumabe, também conhecido como MDX-110604, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 e OPDIVO®, é um anticorpo anti-PD-1 descrito no documento W02006/121168. O pembrolizumabe, também conhecido como MK-3475, Merck 3475, lambrolizumabe, KEYTRUDA® e SCH-900475, é um anticorpo anti-PD-1 descrito no documento W02009/114335. O CT-011, também conhecido como hBAT ou hBAT -1, é um anticorpo anti-PD-1 descrito no documento W02009/101611. O AMP-224, também conhecido como B7-DCIg, é um receptor solúvel de fusão de PDL2-Fc descrito nos documentos WO2010/027827 e WO2011/066342.

[00108] Um outro ponto de verificação imune que pode ser alvo nos métodos fornecidos aqui é a proteína 4 associada a linfócitos T citotóxica (CTLA-4), também conhecida como CD152. A sequência completa de cDNA de CTLA-4 humana tem o número de acesso Genbank L15006. A CTLA-4 é encontrada na superfície das células T e atua como um interruptor desativado quando ligado à CD80 ou CD86 na superfície das células apresentadoras de antígenos. A CTLA4 é um membro da superfamília das imunoglobulinas que é expresso na

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46/81 superfície das células T auxiliares e transmite um sinal inibidor para as células T. A CTLA4 é similar à proteína coestimuladora de células T, CD28 e ambas as moléculas se ligam à CD80 e CD86, também denominadas B7-1 e B7-2, respectivamente, em células apresentadoras de antígeno. A CTLA4 transmite um sinal inibidor para as células T, enquanto que a CD28 transmite um sinal estimulador. A CTLA4 intracelular também é encontrada em células T reguladoras e pode ser importante para sua função. A ativação de células T através do receptor de células T e CD28 leva ao aumento da expressão de CTLA-4, um receptor inibidor para moléculas B7.

[00109] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é um anticorpo anti-CTLA-4 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico), um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.

[00110] Anticorpos anti-CTLA-4 humana (ou domínios VH e/ou VL derivados dos mesmos) adequados para uso nos presentes métodos podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, podem ser usados anticorpos anti-CTLA-4 reconhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos anti-CTLA-4 descritos na Patente dos Estados Unidos N° 8.119.129; Publicações de Patente Internacional N^os WO 01/14424, WO 98/42752 e WO 00/37504 (CP675206, também conhecido como tremelimumabe; antigamente ticilimumabe); Patente dos Estados Unidos N° 6.207.156; Hurwitz et al. 1998; Camacho etal., 2004; e Mokyr etal., 1998 podem ser usados nos métodos descritos aqui. Os ensinamentos de cada uma das publicações supracitados são aqui incorporados por referência. Anticorpos que competem com qualquer um destes anticorpos reconhecidos na técnica pela ligação à CTLA-4 também podem ser usados. Por exemplo, um anticorpo CTLA-4 humanizado é descrito nos Pedidos de Patente

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Internacional N^os W02001014424 e W02000037504 e Patente dos Estados Unidos N° 8.017.114; todos aqui incorporados por referência. [00111] Um anticorpo exemplificativo anti-CTLA-4 é ipilimumabe (também conhecido como 10D1, MDX- 010, MDX- 101 e Yervoy®) ou fragmentos de ligação a antígeno e variantes do mesmo (veja, por exemplo, documento WO 01/14424). Em outras modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e leve ou VRs do ipilimumabe. Consequentemente, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH do ipilimumabe e os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL do ipilimumabe. Em outra modalidade, o anticorpo compete pela ligação com e/ou se liga ao mesmo epítopo na CTLA-4 que os anticorpos supracitados. Em outra modalidade, o anticorpo tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos da região variável com os anticorpos supracitados (por exemplo, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de região variável com o ipilimumabe). [00112] Outras moléculas para modular a CTLA-4 incluem ligantes e receptores de CTLA-4, tais como aqueles descritos nas Patentes dos Estados Unidos N^os 5.844.905, 5.885.796 e Pedidos de Patente Internacionais N^os WO1995001994 e WO1998042752; todos aqui incorporados por referência, e imunoadesinas, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N° 8.329.867, aqui incorporada por referência.

4. Cirurgia [00113] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer sofrerão cirurgia de algum tipo, incluindo cirurgia preventiva, diagnostica ou para classificação de estágio, curativa e paliativa. A cirurgia curativa inclui ressecção, na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisicamente removido, extirpado e/ou destruído, e pode ser usada em conjunto com outras terapias, tal como o tratamento das presentes modalidades,

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48/81 quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia gênica, imunoterapia e/ou terapias alternativas. Ressecção do tumor se refere à remoção física de pelo menos parte de um tumor. Além de ressecção do tumor, o tratamento cirúrgico inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletrocirurgia e cirurgia microscopicamente controlada (cirurgia de Mohs).

[00114] Quando de excisão de parte ou todas as células cancerosas, tecido ou tumor, uma cavidade pode ser formada no corpo. O tratamento pode ser realizado por meio de perfusão, injeção direta ou aplicação local na área de uma terapia adicional contra o câncer. Este tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou a cada 1,2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11 ou 12 meses. Estes tratamentos podem ser de doses variadas também.

5. Outros Agentes [00115] Considera-se que outros agentes podem ser usados isoladamente ou em combinação com outras terapias antineoplásicas para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Estes agentes adicionais incluem agentes que afetam a regulação positiva de receptores na superfície celular e junções de GAP, agentes citostáticos e de diferenciação, inibidores de adesão celular, agentes que aumentam a sensibilidade de células hiperproliferativas a indutores apoptóticos ou outros agentes biológicos. O aumento da sinalização intercelular que eleva o número de junções GAP aumentaria os efeitos antihiperproliferativos sobre a população de células hiperproliferativas vizinhas. Em outras modalidades, agentes citostáticos ou de diferenciação podem ser usados em combinação com determinados aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia antihiperproliferativa dos tratamentos. Considera-se que inibidores de adesão celular melhorem a eficácia das presentes modalidades. Exemplos de inibidores de adesão celular são inibidores de quinase de

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49/81 adesão focal (FAKs) e Lovastatina. Considera-se ainda que outros agentes que aumentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativa à apoptose, tal como o anticorpo c225, podem ser usados em combinação com determinados aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia do tratamento.

III. Kit [00116] Também no âmbito da invenção estão kits para realização de ensaios de ELISA em amostras de plasma para detectar um câncer, tal como câncer pancreático. Um exemplo de tal kit pode incluir um conjunto de anticorpos específicos para os três biomarcadores. O kit pode compreender ainda instruções para uso dos anticorpos para realizar um ensaio ELISA para identificar a expressão alterada dos biomarcadores nas amostras de plasma. O kit pode compreender ainda instruções para fins diagnósticos que indicam que a expressão elevada do painel de biomarcadores de um paciente com câncer indica um risco aumentado de câncer pancreático. O kit pode compreender ainda instruções que indicam que a expressão alterada do painel de biomarcadores em um plasma indica que um paciente deve ser enviado para mais testes diagnósticos e/ou tratado com agentes antineoplásicos para câncer pancreático.

[00117] Em algumas modalidades, um kit pode compreender ainda reagentes de detecção, tais como anticorpos conjugados à estreptavidina. Em algumas modalidades, um kit pode compreender ainda reagentes e tampões incluindo, porém sem limitações, tampões de lavagem. Em algumas modalidades, um kit pode compreender ainda meios de montagem e/ou uma ou mais placas de ELISA de controle.

IV. Exemplos [00118] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Será apreciado por aqueles versados na técnica que os métodos descritos nos exemplos a seguir

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50/81 representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como métodos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles versados na técnica, à luz da presente descrição, apreciarão que podem ser feitas muitas alterações nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e âmbito da invenção.

Exemplo 1 - Análise e Validação da Assinatura de Migração para Câncer pancreático [00119] Painel de Validação de Assinatura de Migração em um Estudo de Laboratório Clínico às Cegas Certificado Pelo CLIA·. A reprodutibilidade em laboratório clínico da assinatura de migração foi testada usando um ELISA em sanduíche para TFPI (Balasenthil et al., 2011) e um ELISA em sanduíche otimizado para TNG usando uma forma com união de TNG, TNC-FN lll-C que os estudos atuais identificaram como um novo biomarcador de câncer pancreático. Os ensaios de assinatura de migração previamente realizados foram repetidos com amostras idênticas em um laboratório CLIA às cegas. Vinte amostras de plasma de PDAC no estágio IV e 20 controles saudáveis foram rastreadas quanto ao CA19-9, TNC-FN lll-C e TFPI. As características dos pacientes são apresentadas na Tabela 5. Os resultados dos ensaios indicaram que os marcadores eram robustos e reprodutíveis no laboratório CLIA, alcançando AUCs para o painel combinado de TFPI, TNC-FN lll-C e CA19-9 de 0,92 (IC de 95 % = 0,82 a 1,00) em ambos os laboratórios versus um desempenho inferior apenas em CA19-9 (AUG 0,71, IC de 95% = 0,52 a 0,90 MDACC) e AUC-0,72 (IC de 95 % = 0,54 a 0,90 no laboratório CLIA). Os valores de AUG e sensibilidade/especificidade nos pontos de corte ideais são apresentados na Tabela 6. Estes ensaios de CA19-9 também foram previamente comparados com kits aprovados pela FDA e encontraram

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51/81 resultados virtualmente idênticos (Haab et al., 2015).

[00120] Estudos de Validação em PDAC em Estágio Inicial·. Os ensaios ELISA foram realizados a seguir usando uma coorte 1 de plasma em estágio inicial (Tabela 1). Na coorte de PDAC em Estágio l/IIA (n = 30) versus controles saudáveis (n = 30), os marcadores de assinatura de migração melhoraram o desempenho de CA19-9 de uma AUC de 0,72 para 0,84 (Figura 1A e Tabela 2). No entanto, no Estágio IIB (n = 22), comparado com controles saudáveis, a combinação de TFPI e TNC-FN lll-C com o padrão de excelência resultou em um valor de AUC muito alto de 0,98 (IC de 95% = 0,95 a 1,00), o qual é significativamente melhor estatisticamente do que aquele com base apenas no CA19-9 (Figura 1B e Tabela 2). No agrupamento de todos os cânceres em estágio II juntos (Estágios IIA/IIB) (n = 57), a adição de TNC-FN lll-C e TFPI melhorou individualmente o desempenho de CA199, com AUCs de 0,92 (IC de 95% = 0,86 a 0,97) e 0,97 (IC de 95% = 0,94 a 0,99), respectivamente, para TNC-FN lll-C + CA19-9 e TFPI + CA19-9, com uma AUC global de 0,97 (IC de 95% = 0,93 a 0,99) para o painel combinado, melhorando significativamente o CA19-9 estatisticamente (P = 0,03) (Figura 1C e Tabela 2). Em uma análise final, o painel combinado de três biomarcadores foi examinado. Os resultados foram estatisticamente significativos para todos os cânceres em estágio inicial (Estágios I e II) (n = 85) versus controles saudáveis (n = 30) pelo fato de que o painel de assinatura de migração melhorou o desempenho de CA19-9 de uma AUC de 0,83 para 0,92 (P = 0,04) (Figura 1D e Tabela 2).

[00121] De forma a definir pontos de corte ideais para estudos de validação e para o refino adicional de um painel de marcadores diagnósticos para a detecção precoce de PDAC, a coorte 1 foi usada como coorte de treinamento para construir um modelo de risco e pontuação estatística. Usando a seleção dianteira na comparação entre

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52/81 todos os cânceres e controles, o painel combinado de biomarcadores com CA19-9, TFPI e TNC-FN lll-C foi selecionado. Com base no modelo de regressão logística, uma pontuação de risco (RS) foi determinada usando RS = 0,0816 * CA19-9 + 0,0783 * TFPI + 0,0229 * TNC-FN III-

C. Um ponto de corte ideal foi decidido em 5,79. Para o painel apenas com CA19-9, RS = 0,0855 * CA19-9 e o ponto de corte ideal foi 1,12. O desempenho do painel de biomarcadores e seu ponto de corte ideal foram testados em duas coortes de validação independentes às cegas. Tabela 1. Características dos indivíduos de estudo na coorte TexGen em estágio inicial e coorte em estágio inicial na Universidade de

Pittsburgh às cegas*.

Característica	Conjunto de Treinamento TEXGEN	Conjunto de validação 1 Coorte da Universidade de Pittsburgh
PDAC (n = 85)	Controles saudáveis (n = 30)	PDAC (n = 23)	Controles saudáveis (n=17)	Pancreatite crônica (n = 24)
Sexo
Masculino	46	19	14	6	13
Feminino	39	11	9	11	11
Idade, anos
<50	4	5	3	3	14
50-60	25	12	6	2	3
61-70	28	10	10	6	6
71-80	22	3	2	2	1
>80	6	-	2	4	-
Histologia
Adenocarcinoma	60	-	15	-	-
Carcinoma dutal infiltrante	24	-	8	-	-
adenocarcinoma de células fusiformes	1	-	0	-	-
Estágio
I	25	-		-	-
IA	1	-		-	-
IB	2	-		-	-
II	33	-		-	-
HA	2	-		-	-
IIB	22	-	23	-	-

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Histórico de consumo de álcool
Atual	28	13	9	4	8
Antigo	18	4	7	5	12
Nunca	39	13	6	7	4
Desconhecido	-	-	1	1	0
Histórico de tabagismo
Atual	7	0	8	4	12
Antigo	44	11	10	6	6
Nunca	34	19	5	7	6
Histórico de diabetes
sim	21	5	5	4	6
Não	64	25	18	13	18
Local
Corpo	6	-	0	-	-
Cabeça	68	-	19	-	-
Lesão sobreposta ao pâncreas	6	-	3	-	-
Cauda	2	-	0	-	-
Outras partes especificadas	3	-	1	-	-
Estágio
Extensão direta	32	-	-	-	-
Extensão direta + linfonodo	16	-	-	-	-
Distante	3	-	-	-	-
Localizado	25	-	-	-	-
Envolvimento linfonodal regional	3	-	-	-	-
Sem Estágio	6	-	-	-	-
Estágio TNM
T1N1Mx	-	-	2	-	-
T2N1Mx	-	-	1	-	-
T3N0Mx	-	-	1	-	-
T3N1Mx	-	-	14	-	-
Τ3Ν1ΒΜΧ	-	-	5	-	-

*PDAC - adenocarcinoma dutal pancreático, traço = não aplicável.

[00122] Validação às Cegas da Coorte 2 de Estágio Inicial Usando a

Pontuação de Risco e Ponto de Corte: O desempenho de painel de assinaturas de migração e de corte correspondente desenvolvido a

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54/81 partir da coorte 1 foi validado em PDAC estágio inicial versus casos com pancreatite crônica ou controles saudáveis na coorte 2 (Tabela 1). Para a análise de validação às cegas, na comparação do estágio I IB (n = 23) versus pancreatite crônica (n = 24), o painel de CA19-9 resultou em uma AUC de 0,84 (IC de 95% = 0,72 a 0,96), enquanto que o painel com os três marcadores forneceu uma AUC ligeiramente maior, tal como 0,86 (IC de 95% = 0,74 a 0,96). O resumo detalhado dos resultados da validação é fornecido na Tabela 7.

[00123] Validação às Cegas do Conjunto de Referência EDRN: O desempenho dos marcadores de assinatura de migração foi, então, analisado no conjunto de referência de 252 amostras EDRN estabelecido pelo NCI proveniente de múltiplas instituições usando SOPs similares. Para casos discriminatórios dos estágios IA/IB/IIA (n = 55) de controles saudáveis (n = 61), comparado ao CA19-9 apenas (AUC de 0,74 (IC de 95% = 0,64 a 0,84), o painel de biomarcadores combinados melhorou a AUC para 0,79 (IC de 95% = 0,70 a 0,87) usando a pontuação de risco e ponto de corte determinados (Figura 2A e Tabela 3). A significância média e especificidade (precisão) correspondentes com base no ponto de corte melhoraram de forma estatisticamente significativa para CA19-9 de 0,66 para 0,77 para o painel de biomarcadores combinados (P < 0,001). Além disso, o painel de biomarcadores combinados melhorou estatisticamente o desempenho do CA19-9 nos casos do Estágio IA/IB/IIA (n = 55) versus pancreatite crônica (n = 62), com uma AUC de 0,69 (IC de 95 % = 0,58 a 0,79) para 0,75 (IC de 95% = 0,65 a 0,84) (P = 0,045), a precisão correspondente melhorou de 0,57 para 0,72 (P < 0,001). Além disso, ao estratificar a coorte para incluir apenas a subpopulação sem histórico de diabetes e pancreatite, foi observada uma melhora apreciável em relação ao desempenho do CA19-9. Dentre os casos no estágio IA/IB/IIA (n = 30) versus controles saudáveis (n = 50), o modelo

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55/81 combinado melhorou a AUG do CA19-9 de 0,78 (IC de 95% = 0,66 a 0,89) para 0,87 (IC de 95% = 0,77 a 0,95) (Figura 2B e Tabela 3). A exatidão correspondente com base no ponto de corte determinado a partir da coorte 1 melhorou estatisticamente para CA19-9 de 0,65 para 0,82 para o painel de biomarcadores combinados (P < 0,001).

[00124] Os resultados da validação de PDAC em estágio 11B (n = 42) versus controles saudáveis (n = 61) indicaram que o painel de biomarcadores combinados tinha uma AUC de 0,87 (IC de 95 % = 0,80 a 0,94) comparado com uma AUC de 0,83 (IC de 95 % = 0,74 a 0,91) para o CA19-9 apenas (Figura 2C e Tabela 3), com uma precisão de melhora estatisticamente significativa de 0,71 para 0,79 (P = 0,03). Para os casos do estágio IIB (n = 42) versus pancreatite crônica (n = 62), o modelo de biomarcador combinado melhorou a AUC do CA19-9 de 0,77 (IC de 95 % = 0,67 a 0,86) para 0,83 (IC de 95 % = 0,74 0,91) (P = 0,05), com a precisão correspondente melhorando estatisticamente de 0,62 para 0,74 (P = 0,009). Dentre as coortes secundárias sem histórico de diabetes e pancreatite, com base em 22 casos de estágio IIB e 50 controles saudáveis, a AUC do painel modelo combinado foi de 0,93 (IC de 95% = 0,87 a 0,98) comparado com uma AUC de 0,88 (IC de 95 % = 0,77 a 0,96) para CA19-9 (Figura 2D e Tabela 3); a precisão correspondente melhorou de 0,76 para 0,83. Assim, o modelo de biomarcadores combinados melhorou o desempenho do padrão de excelência, especialmente para os casos sem diabetes ou pancreatite, sugerindo que a estratificação das coortes pode identificar indivíduos para os quais os valores da AUC podem se aproximar da utilidade clínica.

[00125] O desempenho do painel de biomarcadores foi, em seguida, validado com base na análise combinada de todos os cânceres em estágio inicial (n = 98) versus todos os controles saudáveis (n = 61). Os resultados indicaram uma melhora estatisticamente significativa na

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56/81 classificação de desempenho do painel de biomarcadores em relação ao CA19-9. Em particular, a AUC para CA19-9 foi de 0,78 (IC de 95 % = 0,71 a 0,85), a qual foi significativamente melhorada estatisticamente para 0,83 (IC de 95% = 0,76 a 0,89) com o painel de biomarcadores (Figura 3A e Tabela 3, P = 0,045); a precisão correspondente também foi altamente melhorada estatisticamente de 0,68 para 0,78 (P = 0,001). A validação de todos os cânceres em estágio inicial (n = 98) versus pancreatite crônica (n = 62) também indicou uma melhora estatisticamente significativa de CA19-9 (P = 0,01 para valores de AUC e P < 0,001 para precisão) (Tabela 3). A análise da coorte com obstrução biliar benigna aguda versus PDAC em estágio inicial também mostrou uma melhora no desempenho do modelo combinado em relação ao CA19-9 para todos os cânceres em estágio inicial versus plasma de doença benigna, embora sem significância estatística (Tabela 8). Além disso, entre a subpopulação sem histórico de diabetes e pancreatite (n = 52 casos de PDAC no estágio inicial e n = 50 controles saudáveis), comparado com a AUC para CA19-9 individualmente de 0,82 (IC de 95% = 0,73 a 0,90), o modelo de assinaturas de migração combinado resultou em uma AUC significativamente aumentada estatisticamente de 0,89 (IC de 95 % = 0,82 para 0,95) (P = 0,03) (Figura 3B e Tabela 3); a precisão correspondente melhorou estatisticamente de 0,69 para 0,82 (P < 0,001).

[00126] Os resultados de validação no conjunto de referência EDRN demonstram claramente o valor da adição da assinatura de migração para CA19-9 para detecção precoce de PDAC, bem como a melhora no desempenho do painel global observada pela estratificação da coorte para uma coorte secundária sem diabetes e pancreatite crônica.

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Tabela 2. Desempenho do painel de biomarcadores na coorte TexGen.

Ensaio	Estágio l/IIA (n = 30) vs. Controles (n = 30)	Estágio IIB (n = 22) vs. Controles (n = 30)	Estágio II (n = 57) vs. Controles (n = 30)	Todos em estágio inicial (n = 85) vs. controles (n = 30)
AUC (IC de 95 %)	Valor P *	AUC (IC de 95%)	Valor P*	AUC (IC de 95 %)	Valor P *	AUC (IC de 95 %)	Valor P *
CA19-9	0,72 (0,57, 0,86)	1,00	0,87 (0,76, 0,96)	1,00	0,90 (0,82, 0,95)	1,00	0,83 (0,75, 0,90)	1,00
TFPI	0,71 (0,57, 0,84)	0,91	0,91 (0,81,0,98)	0,58	0,86 (0,77, 0,93)	0,57	0,80 (0,71,0,88)	0,64
TNC-FNIII-C	0,54 (0,39, 0,69)	0,08	0,87 (0,77, 0,95)	0,97	0,75 (0,63, 0,85)	0,04	0,68 (0,57, 0,79)	0,03
TNC-FNIII-C, CA19-9	0,82 (0,71,0,92)	0,27	0,95 (0,89, 0,99)	0,14	0,92 (0,86, 0,97)	0,43	0,89 (0,83, 0,94)	0,22
TFPI, CA19-9	0,82 (0,70, 0,91)	0,29	0,98 (0,93, 1,00)	0,06	0,97 (0,94, 0,99)	0,04	0,91 (0,86, 0,96)	0,06
TNC FNIII-C, TFPI, CA19-9	0,84 (0,74, 0,93)	0,17	0,98 (0,95, 1,00)	0,04	0,97 (0,93, 0,99)	0,03	0,92 (0,86, 0,96)	0,04

Os P valores eram bilaterais e foram calculados com base em reamostragem (bootstrapping). AUC = área sob a curva; IC = intervalo de confiança.

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Tabela 3. Desempenho do painel de biomarcadores no conjunto de referência EDRN.

Ensaio	CA19-9	Assinatura de Migração + CA19-9	Precisão P valor*	AUC P valort
AUC (IC de 95 %)	Sensibilidade (ICde 95%)	Especificidade (IC de 95%)	Precisão (ICde 95%)	AUC (IC de 95 %)	Sensibilidade (IC de 95 %)	Especificidade (IC de 95%)	Precisão (ICde 95%)
Estágio IA/IB/IIA (n = 55) vs. Saudável (n = 61)	0,74 (0,64, 0,84)	0,71 (0,58,0,82)	0,61 (0,48,0,74)	0,66 (0,57,0,74)	0,79 (0,70, 0,87)	0,73 (0,60,84)	0,82 (0,72, 0,90)	0,77 (0,70,0,85)	<0,001	0,095
Estágio IA/IB/IIA (n = 55) vs. CP (n = 62)	0,69 (0,58,0,79)	0,71 (0,58,0,82)	0,44 (0,31,0,57)	0,57 (0,48,0,66)	0,75 (0,65,0,84)	0,73 (0,62,0,84)	0,71 (0,60,0,81)	0,72 (0,64, 0,80)	<0,001	0,045
Sem histórico de diabetes e pancreatite
Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Saudável (n = 50)	0,78 (0,66,0,89)	0,7 (0,53,0,87)	0,6 (0,46,0,72)	0,65 (0,55,0,75)	0,87 (0,77,0,95)	0,8 (0,63,0,93)	0,84 (0,74, 0,94)	0,82 (0,73, 0,91)	<0,001	0,07
Estágio IIB (n = 42) vs. Saudável (n = 61)	0,83 (0,74, 0,91)	0,81 (0,69,0,93)	0,61 (0,48,0,72)	0,71 (0,62,0,79)	0,87 (0,80, 0,94)	0,76 (0,64,0,88)	0,82 (0,72, 0,90)	0,79 (0,71, 0,87)	0,03	0,18
Estágio IIB (n = 42) vs. CP (n = 62)	0,77 (0,67,0,86)	0,81 (0,69,0,93)	0,44 (0,32,057)	0,62 (0,54,0,71)	0,83 (0,74, 0,91)	0,76 (0,62,0,88)	0,71 (0,60,0,82)	0,74 (0,65,0,82)	0,009	0,05

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Sem histórico de diabetes e pancreatite
Estágio IIB (n = 22) vs. Saudável (n = 50)	0,88 (0,77, 0,96)	0,91 (0,77,1)	0,6 (0,46,0,74)	0,76 (0,66,0,83)	0,93 (0,87,0,98)	0,82 (0,64, 0,96)	0,84 (0,74, 0,94)	0,83 (0,73,0,92)	0,08	0,22
Todos os Câncer (n = 98) vs. Saudável (n = 61)	0,78 (0,71,0,85)	0,76 (0,66,0,84)	0,61 (0,48,0,72)	0,68 (0,60,0,75)	0,83 (0,76,0,89)	0,75 (0,65,0,83)	0,82 (0,71, 0,90)	0,78 (0,72,0,84)	0,001	0,045
Todos os Câncer (n = 98) vs. CP (n = 62)	0,73 (0,64, 0,80)	0,76 (0,66,0,84)	0,44 (0,32,0,55)	0,60 (0,52,0,67)	0,78 (0,71,0,85)	0,75 (0,65,0,83)	0,71 (0,60,0,82)	0,73 (0,65, 0,79)	<0,001	0,01
Sem histórico de diabetes e pancreatite
Todos Câncer (n = 52) vs. Saudável (n = 50)	0,82 (0,73, 0,90)	0,79 (0,67,0,89)	0,6 (0,46,0,74)	0,69 (0,61,0,77)	0,89 (0,82,0,95)	0,81 (0,69,0,90)	0,84 (0,72, 0,94)	0,82 (0,75,0,89)	<0,001	0,03

*P valores bilaterais com base no teste Z para equivalência na precisão entre CA19-9 e assinatura de migração + CA19-9, usando estimativa de erro padrão bootstrap. AUC = área sob a curva; CP = pancreatite crônica; IC = intervalo de confiança.

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Tabela 4. Desempenho do painel de biomarcadores na referência EDRN ajustado após a adição de idade e condição do diabetes (não incluída a coorte secundária sem diabetes e pancreatite crônica) para o modelo de risco, com base em modelo desenvolvido usando amostras de referência EDRN definido*.

Ensaio	CA-19-9	Assinatura de migração + CA19-9
AUC (IC de 95%)	Sensibilidade ideal	Especificidade ideal	AUC (IC de 95%)	Sensibilidade ideal	Especificidade ideal
Coorte completa após ajuste para idade e diabetes
Estágio IA/IB/IIA (n = 54) vs. Saudável (n = 56)	0,85 (0,77-0,92)	0,82	0,79	0,86 (0,79-0,93)	0,76	0,84
Estágio IA/IB/IIA (n = 54) vs. Benigno (n = 31)	0,69 (0,60-0,82)	0,39	0,90	0,71 (0,64-0,84)	0,48	0,87
Coorte secundária sem histórico de diabetes e pancreatite após ajuste para idade
Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Saudável (n = 50)	0,89 (0,81-0,96)	0,80	0,90	0,90 (0,83-0,98)	0,80	0,94
Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Benigno (n = 21)	0,65 (0,53-0,82)	0,77	0,52	0,71 (0,60-0,88)	0,93	0,43
Coorte completa após ajuste para idade e diabetes
Estágio IIB (n = 38) vs. Saudável (n = 56)	0,86 (0,75-0,95)	0,71	0,91	0,88 (0,81-0,97)	0,84	0,79
Estágio IIB (n = 38) vs. Benigno (n = 31)	0,64 (0,54-0,79)	0,32	0,97	0,74 (0,67-0,87)	0,82	0,55

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Sub coorte sem histórico de diabetes e pancreatite após ajuste para idade
Estágio IIB (n = 22) vs. Saudável (n = 50)	0,89 (0,79-0,97)	0,86	0,80	0,93 (0,87-1,00)	0,91	0,86
Estágio IIB (n = 22) vs. Benigno (n = 21)	0,59 (0,49-0,81)	0,82	0,48	0,80 (0,67-0,94)	0,77	0,71
Coorte completa após ajuste para idade e diabetes
Todos os Câncer (n = 93) vs. Saudável (n = 56)	0,85 (0,78-0,91)	0,73	0,88	0,86 (0,79-0,93)	0,81	0,8
Todos os Câncer (n = 93) vs. Benignos (n = 31)	0,66 (0,58-0,77)	0,58	0,68	0,71 (0,61-0,82)	0,59	0,74
Sub coorte sem histórico de diabetes e pancreatite após ajuste para idade
Todos Câncer (n = 52) vs. Saudável (n = 50)	0,88 (0,80-0,93)	0,69	0,98	0,90 (0,85-0,97)	0,75	0,96
Todos os Câncer (n = 52) vs. Benignos (n = 21)	0,62 (0,53-0,80)	0,79	0,52	0,74 (0,64-0,87)	0,73	0,67

*Benigno se refere à obstrução biliar benigna aguda. AUC = área sob a curva; IC = intervalo de confiança.

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Tabela 5. Características da população do estudo usada para validação do CLIA.

Característica	No. de casos de PDAC (n = 20)	No. de controles saudáveis (n = 20)
Sexo
Masculino	12	10
Feminino	8	10
Idade, anos*
<50	5	9
50-60	7	5
61-70	6	4
71-80	2	1
Histologia
Adenocarcinoma Estágio IV	20	N/D
His	tórico de consumo de álcool
Atual	9	n/D
Antigo	3	n/D
Nunca	8	N/D
Histórico de tabagismo
Atual	2	N/D
Antigo	8	N/D
Nunca	10	N/D
Histórico de diabetes
sim	5	N/D
Não	15	N/D
Local
Corpo	4	N/D
Cabeça	11	N/D
Lesão sobreposta ao pâncreas	1	N/D
Cauda	3	N/D
Outras partes especificadas	1	N/D
Estágio
Extensão direta	2	N/D
Distante	18	N/D

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Tabela 6. Desempenho de biomarcador do marcador conforme analisado em ambos os laboratórios de pesquisa de biomarcadores, bem como no laboratório CLIA*.

	Resultados do MDACC	Resultados do CLIA
Marcador	AUC (IC de 95%)	Sensibilidade ideal	Especificidade ideal	AUC (IC de 95%)	Sensibilidade ideal	Especificidade ideal
TFPI	0,80 (0,650,94)	0,70	0,80	0,78 (0,640,93)	0,75	0,75
CA19-9	0,71 (0,520,90)	0,65	1,00	0,72 (0,540,90)	0,65	1,00
TNC-FN lll-C	0,59 (0,400,78)	0,60	0,70	0,68 (0,510,85)	0,55	0,80
TNC-FN lll-C + TFPI	0,80 (0,660,94)	0,70	0,85	0,83 (0,690,97)	0,85	0,80
TNC-FN lll-C + CA19-9	0,74 (0,560,92)	0,65	1,00	0,82 (0,650,98)	0,80	0,90
TFPI + CA19-9	0,92 (0,821,00)	0,85	0,85	0,92 (0,821,00)	0,85	0,85
TNC-FN lll-C + TFPI + CA19-9	0,92 (0,821,00)	0,85	0,85	0,92 (0,821,00)	0,95	0,85

Petição 870190082263, de 23/08/2019, pág. 75/111

Tabela 7. Validação do modelo de biomarcador na coorte da Universidade de Pittsburgh.

	CA-19-9	Assinatura de Migração + CA-19-9
Ensaio	AUC (IC de 95 %)	Sensibilida de (IC de 95 %)	Especificid ade (IC de 95 %)	Precisão (IC de 95 %)	AUC (IC de 95%)	Sensibilida de (IC de 95 %)	Especificida de (IC de 95 %)	Precisão (ICde 95%)	Precisão P valor*	AUC P valort
Estágio IIB (n = 23) vs. Controles (n = 17)	0,86 (0,72-0,96)	0,83 (0,65-0,96)	0,76 (0,53-0,94)	0,80 (0,68-0,90)	0,85 (0,73-0,96)	0,83 (0,70-0,96)	0,76 (0,59-0,94)	0,80 (0,70-0,90)	1,00	0,95
Estágio IIB (n = 23) vs. CP (n = 24)	0,84 (0,72-0,96)	0,83 (0,65-0,96)	0,75 (0,560,88)	0,79 (0,66-0,89)	0,86 (0,74-0,96)	0,83 (0,67-0,96)	0,88 (0,73-1,00)	0,85 (0,74-0,94)	0,23	0,87
Estágio IIB (n = 23) vs. controles + CP (n = 41)	0,85 (0,72-0,96)	0,83 (0,65-0,96)	0,74 (0,61-0,86)	0,77 (0,67-0,86)	0,86 (0,75-0,95)	0,83 (0,65-0,96)	0,82 (0,72-0,92)	0,82 (0,73-0,90)	0,31	0,93

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Petição 870190082263, de 23/08/2019, pág. 76/111

Tabela 8. Desempenho do modelo de painel de biomarcadores da coorte de referência EDRN definida na diferenciação dos estágios IA/IB/1 IA, I IB e todas as amostras de câncer a partir de amostras de obstrução biliar benigna aguda.

	CA19-9	Assinatura de Migração + CA19-9
Ensaio	AUC (IC de 95 %)	Sensibilida de (IC de 95 %)	Especificida de (IC de 95 %)	Precisão (IC de 95 %)	AUC (IC de 95 %)	Sensibilida de (IC de 95 %)	Especificidade (IC de 95 %)	Precisão (IC de 95 %)	Precisão P valor*	AUC P valort
Estágio IA/IB/IIA (n = 55) vs. Benigno (n = 31)	0,54 (0,41-0,66)	0,71 (0,58-0,84)	0,26 (0,13-0,42)	0,48 (0,38-0,59)	0,57 (0,45-0,69)	0,73 (0,62-0,84)	0,36 (0,19-0,55)	0,54 (0,45-0,65)	0,27	0,32
Estágio IIB (n = 42) vs. Benigno (n = 31)	0,58 (0,44-0,70)	0,81 (0,69-0,93)	0,26 (0,12-0,42)	0,53 (0,44-0,63)	0,61 (0,48-0,74)	0,76 (0,64-0,88)	0,36 (0,19-0,52)	0,56 (0,45-0,67)	0,65	0,25
Todos os Câncer (n = 98) vs. Benignos (n = 31)	0,56 (0,44-0,67)	0,76 (0,66-0,84)	0,26 (0,13-0,42)	0,51 (0,42-0,60)	0,58 (0,47-0,69)	0,75 (0,65-0,83)	0,36 (0,19-0,52)	0,55 (0,46-0,64)	0,38	0,22
Sem histórico de dia	betes e pancreatite
Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Benigno (n = 21)	0,61 (0,45-0,75)	0,7 (0,54-0,87)	0,33 (0,14-0,53)	0,52 (0,38-0,64)	0,62 (0,46-0,77)	0,8 (0,63-0,93)	0,38 (0,19-0,62)	0,59 (0,46-0,72)	0,28	0,75

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Petição 870190082263, de 23/08/2019, pág. 77/111

Estágio IIB (n = 22) vs. Benigno (n = 21)	0,65 (0,47-0,81)	0,91 (0,77-1,00)	0,33 (0,14-0,53)	0,62 (0,50-0,74)	0,65 (0,49-0,81)	0,82 (0,64-0,96)	0,38 (0,19-0,57)	0,6 (0,48-0,72)	0,75	0,96
Todos os Câncer (n = 52) vs. Benignos (n = 21)	0,62 (0,49-0,76)	0,79 (0,67-0,89)	0,33 (0,14-0,52)	0,56 (0,45-0,67)	0,63 (0,49-0,78)	0,81 (0,69-0,90)	0,38 (0,19-0,62)	0,59 (0,48-0,72)	0,62	0,79

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Tabela 9. Análise de regressão logística na coorte completa da referência EDRN definida e na coorte secundária sem histórico de diabetes e pancreatite.

Amostra e Coeficiente	Coorte Completa	Sem histórico de diabetes e pancreatite
	Estimativa	IC de 95 %	P valor*	Estimativa	IC de 95 %	P valor*
Todos Câncer vs. Saudável
Intercepção	-4,889	(-8,026, -1,751)	0,002	-9,278	(-14,175, -4,381)	<0,001
CA19-9	0,022	(0,005, 0,039)	0,01	0,065	(0,025, 0,105)	0,001
TFPI	0,050	(0,009, 0,091)	0,02	0,079	(0,016, 0,142)	0,01
TNC-FNIII-C	0,007	(-0,004, 0,018)	0,22	0,006	(-0,006, 0,019)	0,33
IDADE	0,034	(-0,008, 0,075)	0,11	0,068	(0,008, 0,128)	0,03
Diabetes	1,165	(0,084, 2,247)	0,03	-	-	-
Estágio IA/IB/IIA vs. Saudável
Intercepção	-5,784	(-9,537, -2,031)	0,003	-10,972	(-17,100, -4,844)	<0,001
CA19-9	0,015	(0,002, 0,029)	0,02	0,067	(0,021,0,114)	0,004
TFPI	0,039	(-0,012, 0,090)	0,14	0,051	(-0,034, 0,136)	0,24
TNC-FNIII-C	0,008	(-0,004, 0,019)	0,20	0,007	(-0,006, 0,020)	0,29
IDADE	0,046	(-0,002, 0,094)	0,06	0,097	(0,023, 0,171)	0,01
Diabetes	1,299	(0,144, 2,454)	0,03	-	-	-
Estágio IIB vs. Saudável
Intercepção	-6,603	(-11,092, -2,113)	0,004	-9,533	(-17,170, -1,895)	0,01

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Tabela 10. Desempenho do biomarcador individual sob diferentes combinações no conjunto de referência EDRN na diferenciação de todas as amostras de câncer, estágio IA/IB/IIA e estágio I IB de controles saudáveis, pancreatite crônica e amostras de obstrução biliar benigna aguda.

Ensaio	AUC (IC de 95 %)
CA19-9	TFPI	TNC-C	CA19-9 + TFPI	CA19-9 + TNC	Todos
Todos os Cânceres (n = 98) vs. Saudável (n = 61)	0,78 (0,71-0,85)	0,66 (0,57-0,74)	0,62 (0,47-0,71)	0,81 (0,74-0,88)	0,81 (0,74-0,87)	0,82 (0,75-0,89)
Todos os Cânceres (n = 98) vs. CP (n = 62)	0,73 (0,65-0,80)	0,65 (0,56-0,74)	0,60 (0,50-0,68)	0,77 (0,69-0,85)	0,77 (0,69-0,83)	0,79 (0,72-0,86)
Todos os Cânceres (n = 98) vs. Benigna (n = 31)	0,56 (0,45-0,67)	0,54 (0,45-0,64)	0,49 (0,40-0,64)	0,55 (0,48-0,68)	0,57 (0,49-0,71)	0,61 (0,53-0,73)
Estágio IA/IB/IIA (n = 55) vs. Saudável (n = 61)	0,74 (0,63-0,84)	0,62 (0,52-0,71)	0,63 (0,48-0,74)	0,77 (0,67-0,85)	0,80 (0,69-0,88)	0,79 (0,70-0,88)
Estágio IA/IB/IIA (n = 55) vs. CP (n = 62)	0,69 (0,58,0,79)	0,61 (0,52-0,71)	0,60 (0,51-0,70)	0,72 (0,63-0,82)	0,75 (0,66-0,84)	0,75 (0,68-0,85)
Estágio IA/IB/IIA (n = 55) vs. Benigna (n = 31)	0,54 (0,43-0,65)	0,49 (0,43-0,64)	0,48 (0,39-0,66)	0,54 (0,46-0,69)	0,57 (0,46-0,73)	0,58 (0,50-0,74)
Estágio IIB (n = 42) vs. Saudável (n = 61)	0,83 (0,74-0,91)	0,72 (0,62-0,83)	0,61 (0,46-0,72)	0,85 (0,75-0,94)	0,84 (0,75-0,92)	0,85 (0,75-0,94)
Estágio IIB (n = 42) vs. CP (n = 62)	0,77 (0,67-0,85)	0,71 (0,61-0,80)	0,59 (0,49-0,70)	0,82 (0,73-0,91)	0,79 (0,69-0,88)	0,83 (0,75-0,91)
Estágio IIB (n = 42) vs. Benigna (n = 31)	0,58 (0,38-0,70)	0,61 (0,49-0,73)	0,50 (0,39-0,66)	0,62 (0,49-0,75)	0,57 (0,46-0,74)	0,64 (0,54-0,78)

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Após o ajuste para idade e condição do diabetes
Todos os Cânceres (n = 93) vs. Saudável (n = 56)	0,85 (0,78-0,91)	0,77 (0,7-0,85)	0,70 (0,63-0,8)	0,87 (0,79-0,93)	0,86 (0,78-0,92)	0,86 (0,79-0,93)
Todos os Cânceres (n = 93) vs. CP (n = 60)	0,86 (0,80-0,92)	0,77 (0,71-0,86)	0,76 (0,69-0,85)	0,86 (0,8-0,92)	0,85 (0,81-0,92)	0,86 (0,81-0,93)
Todos os Cânceres (n = 93) vs. Benigna (n = 31)	0,66 (0,58-0,77)	0,66 (0,58,0,77)	0,65 (0,55-0,76)	0,67 (0,59-0,79)	0,7 (0,59-0,80)	0,71 (0,61-0,82)
Estágio IA/IB/IIA (n = 54) vs. Saudável (n = 56)	0,85 (0,77-0,92)	0,75 (0,65-0,84)	0,72 (0,64-0,82)	0,85 (0,78-0,93)	0,85 (0,79-0,93)	0,86 (0,79-0,93)
Estágio IA/IB/IIA (n = 54) vs. CP (n = 60)	0,86 (0,79-0,93)	0,76 (0,68-0,86)	0,76 (0,69-0,86)	0,85 (0,79-0,93)	0,86 (0,79-0,93)	0,86 (0,79-0,94)
Estágio IA/IB/IIA (n = 54) vs. Benigna (n = 31)	0,69 (0,60-0,82)	0,66 (0,57-0,78)	0,66 (0,57-0,79)	0,69 (0,61-0,82)	0,72 (0,62-0,83)	0,71 (0,64-0,84)
Estágio IIB (n = 38) vs. Saudável (n = 56)	0,86 (0,75-0,95)	0,83 (0,75-0,92)	0,7 (0,60-0,81)	0,88 (0,8-0,97)	0,86 (0,76-0,95)	0,88 (0,81-0,97)
Estágio IIB (n = 38) vs. CP (n = 60)	0,88 (0,82-0,94)	0,82 (0,75-0,91)	0,78 (0,69-0,87)	0,88 (0,82-0,96)	0,88 (0,82-0,94)	0,88 (0,83-0,96)
Estágio IIB (n = 38) vs. Benigna (n = 31)	0,64 (0,54-0,79)	0,71 (0,62-0,83)	0,67 (0,56-0,8)	0,72 (0,62-0,84)	0,70 (0,60-0,83)	0,74 (0,67-0,87)

AUC, área sob a curva. CP, pancreatite crônica. Benigna - Obstrução biliar benigna aguda. Assinatura de migração se refere à combinação tanto de TFPI como TNC-FNIIIC. Os modelos foram desenvolvidos com ou sem adição de idade e condição do diabetes como preditores.

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Tabela 11. Desempenho do biomarcador individual sob diferentes combinações no conjunto de referência EDRN na diferenciação de amostras do estágio IA/IB/IIA e estágio IIB de controles saudáveis, pancreatite crônica e amostras de obstrução biliar aguda benigna sem histórico de diabetes ou pancreatite crônica.

Ensaio	AUC (IC de 95 %)
CA19-9	TFPI	TNC-C	CA19-9 + TFPI	CA19-9 + TNC	Todos
Todos os Cânceres (n = 52) vs. Saudável (n = 50)	0,82 (0,73-0,91)	0,77 (0,68-0,85)	0,65 (0,40-0,76)	0,89 (0,82-0,95)	0,85 (0,78-0,93)	0,89 (0,83-0,96)
Todos os Cânceres (n = 52) vs. Benigna (n = 21)	0,62 (0,40-0,76)	0,58 (0,46-0,72)	0,57 (0,44-0,72)	0,58 (0,49-0,78)	0,68 (0,55-0,81)	0,70 (0,58-0,84)
Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Saudável (n = 50)	0,78 (0,63-0,90)	0,71 (0,58-0,83)	0,67 (0,46-0,798)	0,86 (0,74-0,94)	0,82 (0,71-0,94)	0,86 (0,77-0,95)
Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Benigna (n = 21)	0,61 (0,45-0,75)	0,52 (0,42-0,69)	0,54 (0,41,0,70)	0,58 (0,47-0,78)	0,66 (0,53-0,81)	0,66 (0,57-0,82)
Estágio IIB (n = 22) vs. Saudável (n = 50)	0,88 (0,76-0,97)	0,85 (0,71-0,94)	0,62 (0,37-0,76)	0,93 (0,85-1,0)	0,88 (0,78-0,97)	0,93 (0,86-1,0)
Estágio IIB (n = 22) vs. Benigna (n = 21)	0,65 (0,28-0,81)	0,65 (0,49-0,81)	0,62 (0,49-0,79)	0,66 (0,52-0,83)	0,71 (0,57-0,86)	0,76 (0,64-0,92)
	Após ajustar	para a idade
Todos os Cânceres (n = 52) vs. Saudável (n = 50)	0,88 (0,80-0,93)	0,79 (0,71-0,88)	0,73 (0,64-0,83)	0,90 (0,84-0,96)	0,88 (0,82-0,94)	0,90 (0,85-0,97)
Todos os Cânceres (n = 52) vs. Benigna (n = 21)	0,62 (0,53-0,80)	0,63 (0,52-0,77)	0,65 (0,53-0,79)	0,63 (0,55-0,82)	0,72 (0,62-0,86)	0,74 (0,64-0,87)

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Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Saudável (n = 50)	0,89 (0,81-0,96)	0,74 (0,64-0,86)	0,74 (0,63-0,85)	0,90 (0,81-0,97)	0,89 (0,82-0,97)	0,90 (0,83-0,98)
Estágio IA/IB/IIA (n = 30) vs. Benigna (n = 21)	0,65 (0,53-0,82)	0,61 (0,49-0,78)	0,64 (0,51-0,82)	0,64 (0,54-0,84)	0,71 (0,59-0,87)	0,71 (0,60-0,88)
Estágio IIB (n = 22) vs. Saudável (n = 50)	0,89 (0,79-0,97)	0,87 (0,77-0,96)	0,72 (0,50-0,84)	0,93 (0,85-1,0)	0,88 (0,79-0,97)	0,93 (0,87-1,0)
Estágio IIB (n = 22) vs. Benigna (n = 21)	0,59 (0,49-0,81)	0,70 (0,56-0,85)	0,67 (0,54-0,84)	0,71 (0,57-0,87)	0,75 (0,61-0,9)	0,80 (0,67-0,94)

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72/81 [00127] Avaliação de Fatores de Risco Adicionais, Incluindo Idade e Condição do Diabetes: Com base nos dados do conjunto de referência EDRN, o desempenho dos três marcadores combinado com a idade e condição do diabetes foi explorado com base nos resultados do conjunto de referência EDRN. Para esta análise, um modelo de regressão logística foi readaptado para cada caso/grupo de controle, incluindo todos os três marcadores, mais idade e condição do diabetes entre a coorte completa ou idade apenas entre a coorte secundaria sem diabetes e pancreatite crônica. Os resultados para o desempenho do modelo são apresentados na Tabela 4. Em particular, entre a coorte secundária sem diabetes e pancreatite crônica, a pontuação de risco desenvolvida alcançou uma AUC de 0,90, 0,93 e 0,90, respectivamente, para discriminação dos estágios IA/IB/IIA, estágio IIB ou todos os cânceres em estágio inicial de controles saudáveis. Os resultados para o modelo de regressão logística para câncer em estágio inicial e controles saudáveis são apresentados na Tabela 3.

[00128] Em conclusão, os presentes estudos documentam o papel de TFPI e TNC-FN lll-C ao discriminar casos de PDAC no estágio inicial de controles saudáveis, bem como seu potencial como biomarcador para melhorar o desempenho de CA19-9 para detecção precoce de PDAC. Usando a assinatura de migração e o painel de marcadores e CA19-9 desenvolvido na coorte 3 a qual representa o conjunto de referência EDRN, foi observada uma melhora estatisticamente significativa na AUC que distinguia todos os cânceres em estágio inicial dos controles saudáveis e da pancreatite crônica. Além disso, com base nos pontos de corte ideais desenvolvidos na coorte 1, foram observadas melhoras dramáticas na precisão sobre CA19-9 na coorte 3 para distinguir todos os cânceres em estágio inicial de controles saudáveis e pancreatite crônica. Os resultados indicam que o modelo combinado de painéis de marcadores podería fornecer um teste mais preciso, com

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73/81 elevadas sensibilidades e especificidades para a detecção precoce de PDAC quando usado em combinação com CA19-9 e que o painel é independente do risco de diabetes e pancreatite crônica. Além disso, quando todos os casos de PDAC em estágio inicial foram combinados na coorte EDRN, os resultados foram reforçados, demonstrando significância estatística para múltiplas combinações de casos e controles.

Exemplo 2 - Materiais e Métodos [00129] Coortes Clínicas: Uma coorte de plasma de 20 amostras de PDAC em estágio final IV e 20 controles normais foi usada para estudos de validação no laboratório CLIA. A pré-validação da primeira coorte 1 continha 115 amostras, incluindo 85 casos de PDAC em estágio inicial, estágio I (n = 28), estágio II (n = 57) e 30 controles de rastreio Gl obtidos do repositório TexGen, um consórcio do Texas Medical Center. A Coorte de Validação às Cegas do Estágio Inicial 2 da Universidade de Pittsburgh incluía 64 amostras: Estágio I IB (n = 23), pancreatite crônica (n = 24) e controles Gl (n = 17). A Coorte de Validação às Cegas do Estágio Inicial 3 é o conjunto de referência de 252 amostras de plasma de câncer pancreático da NCI Early Detection Research Network (EDRN), incluindo 98 casos de PDAC em estágio inicial: Estágio IA (n = 7), IB (n = 8), II (n = 1), HA (n = 40), IIB (n = 42), 62 controles de pancreatite crônica, 31 controles de obstrução biliar aguda e 61 controles saudáveis (Haab etal., 2015). Os protocolos de estudo foram aprovados pelo comitê de revisão institucional e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento por escrito.

[00130] Ensaios ELISA·. Os ensaios ELISA para o TFPI foram realizados conforme anteriormente descrito (Balasenthil. Et ai, 2011). Os níveis plasmáticos de Tenascina C [FN lll-C] foram determinados usando um kit Human Tenascin-C (FN lll-C) (IBL-America, Minneapolis, MN), que detecta o domínio FN lll-C por meio de um ELISA em

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74/81 sanduíche. As amostras foram diluídas 50 vezes e, em seguida, incubadas em placas para ELISA pré-revestidas com Mab de IgG antitenascina-C humana (19C4MS) de camundongo específico para o domínio de FN lll-C a 37°C durante 60 minutos. Resumidamente, após lavagem das cavidades 7 vezes com tampão de lavagem, um Ab antiternascina C humana conjugado com peroxidase de rábano foi adicionado e incubado a 4°C (4F10TT) durante 30 minutos. As cavidades foram lavadas com tampão (9 vezes), a solução de cromogênio foi adicionada e incubada durante 30 minutos no escuro em temperatura ambiente. A reação foi interrompida e lida no espaço de 30 minutos usando um leitor de placas ELISA (Spectramax Plus384, Spectramax Plus190, Molecular Devices e leitores de microplacas iMark, BioRad). Os resultados são a absorção média de cavidades em duplicata. ELISAs de CA19-9 foram realizados conforme anteriormente descrito e relatados, em que este ensaio ELISA de CA19-9, com dois outros ensaios de CA19-9, mostraram um desempenho similar ((Balasenthil etal., 2011; Haab. etal., 2015).

[00131] Métodos Estatísticos·. Todos os testes estatísticos foram bilaterais e um P valor abaixo de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

[00132] Análise CLIA-. Um modelo de regressão logística foi usado para distinguir o PDAC de controles saudáveis. Para determinar o limiar da pontuação de risco para sensibilidade e especificidade ideais, o ponto com menor valor de distância forma o ponto (0,1) [(1 sensibilidade)² + (1 - especificidade)²] foi calculado (DeLong etal, 1998). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software Stata 13.1 (Stata Corporation).

[00133] Análise da Coorte 1 de Estágio Precoce (Coorte TexGen): Um modelo de regressão logística foi usado para analisar o desempenho dos marcadores e identificar o desempenho coletivo do

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75/81 painel em relação ao CA19-9. Curvas ROC e AUCs foram calculadas e seu intervalo de confiança de reamostragem (IC de 95 %) foi estimado com base em 500 amostras de reamostragem. A Coorte 1 foi usada como o conjunto de treinamento para avaliar o desempenho aprimorado da adição de TFPI e TNC-FNIII-C comparado com o uso de CA19-9 apenas. Um painel ideal de combinação de marcadores foi desenvolvido usando o método de seleção direta e levando em consideração o valor da AUC. O ponto de corte ideal para a pontuação de risco correspondente foi determinado usando a mesma abordagem da análise CLIA.

[00134] Validação às Cegas de Coortes de Estágio Precoce 2 (Coorte da Universidade de Pittsburgh) e 3 (Conjunto de Referência EDRN)·. O painel final selecionado e seu ponto de corte ideal desenvolvido a partir da coorte 1 foram validados em duas coortes de pacientes independentes (coortes 2 e 3). Uma vez que uma grande proporção de casos de referência na coorte 3 não tinha histórico de diabetes e pancreatite, a validação também foi realizada neste coorte secundária. Curvas ROC empíricas foram construídas com base no painel desenvolvido a partir da coorte 1, com as AUC correspondentes calculadas. Também são computadas a sensibilidade, especificidade e sensibilidade e especificidade médias (denominadas precisão daqui em diante) com base no ponto de corte desenvolvido a partir da coorte

1. Para estimativas de AUC, sensibilidade, especificidade e precisão, intervalo de confiança de 95% de reamostragem foram obtidos com base em 500 amostras de reamostragem. Os P valores para a diferença no desempenho entre o painel de biomarcadores e o painel com CA199 apenas foram calculados com base em um teste Z usando estimativa de erro padrão de reamostragem. Todas as análises foram realizadas usando o software estatístico R (cran.r-project).

[00135] Análise exploratória adicional na coorte 3 que incorpora

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76/81 fatores de risco clínicos: Após validação do painel de biomarcadores (desenvolvido na coorte 1) na coorte 3, a incorporação de fatores de risco clínicos medidos foi adicionalmente explorada na coorte 3, incluindo a idade e condição do diabetes. Modelos de regressão logística foram usados para desenvolver combinações de marcadores candidatos (TFPI e/ou TNC-FN lll-C) com CA19-9, mais idade e condição do diabetes (não incluído entre as coortes secundarias sem diabetes e pancreatite crônica) para separar cada caso e grupo de controle. Curvas ROC empíricas foram construídas com base nas pontuações de risco previstas, com as AUC correspondentes calculadas. Para estimativas de AUC, sensibilidade e especificidade, o intervalo de confiança de 95 % para reamostragem foi obtido com base em 500 amostras de reamostragem, onde o modelo de regressão logística é atualizado para cada amostra de reamostragem.

Exemplo 3 - Validação Adicional do Painel de Biomarcadores de Assinatura de Migração [00136] Como validação adicional do painel de biomarcadores de assinatura a migração, ensaios ELISA foram conduzidos usando o presente painel de biomarcadores de assinatura de migração e seu desempenho foi analisado com base em uma amostra de plasma às cegas independente definida proveniente do The International Agency for Research (IARC) que consistia em 39 amostras de PDAC em estágio inicial e 89 controles saudáveis. Análise estatística foi realizada nos ensaios. Para todas as amostras de PDAC em estágio inicial versus todas as coortes saudáveis usando o conjunto IARC (Tabela 12), a combinação de ambos os biomarcadores com CA19-9 melhorou significativamente o CA19-9 de uma AUC de 0,81 (IC de 95% = 0,72 a 0,90) para uma AUC de 0,86 (IC de 95% = 0,78 a 0,93). Quando covariáveis adicionais (*ldade + Sexo + Centro + Tabagismo + Consumo de álcool) foram incluídas na análise, o painel combinado melhorou

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77/81 ainda mais a AUC para 0,90 (IC de 95% = 0,84 a 0,96). Os resultados foram significativos, uma vez que o algoritmo usado era distinto daquele estabelecido no Exemplo 1, e mais uma vez mostraram que o presente painel de biomarcadores melhorou o desempenho de CA19-9 em múltiplos conjuntos de amostras às cegas e destaca o valor clínico do painel de biomarcadores.

Tabela 12: Desempenho do biomarcador de assinatura de migração na coorte IARC.

Modelo	CUA	P valor
CA19-9	0,81 (0,72-0,90)	<0,0001
TFPI	0,57 (0,45-0,70)	0,2468
TNC-FNIII-C	0,71 (0,62-0,81)	<0,0001
CA19-9 + TFPI	0,81 (0,72-0,90)	<0,0001
CA19-9 + TNC	0,86 (0,78-0,93)	<0,0001
CA19-9 +TNG + TFPI	0,86 (0,78-0,93)	<0,0001
Covariáveis* + CA19-9 + TFPI + TNC	0,90 (0,84-0,96)	<0,0001
*ldade + Sexo + Centro + Ί	fabagismo + Consumo de álcool

[00137] Níveis de TFPI são elevados no modelo de plasma de camundongo geneticamente modificado KC com lesão pancreática (GEMM) que tem lesões precursoras (PanINs) de câncer pancreático comparado com controles de tipo selvagem·. Um dos marcadores de assinatura de migração, TFPI, foi rastreado no soro a partir do modelo KC GEMM. Este modelo GEMM reproduz fielmente o desenvolvimento de câncer pancreático no qual lesões precursoras, denominadas PanINs, estão presentes e podem ser examinadas em momentos definidos antes do desenvolvimento de PDAC. A abordagem GEMM se baseia na hipótese de que: a) modelos de camundongo geneticamente

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78/81 modificados (GEMM) de adenocarcinoma dutal pancreático humano (PDAC) recapitulam fielmente as características clínicas e moleculares da doença humana e b) caracterização de perfil serial de amostras de sangue em GEMM adequado oferecem a oportunidade única de desenvolver painéis de biomarcadores integrados sensíveis e específicos para a detecção de lesões precursoras de câncer pancreático, PanINs. Isto não é possível com amostras humanas uma vez que, em pacientes humanos, a PanIN é detectada predominantemente em sincronia com o adenocarcinoma. Também deve ser enfatizado que os modelos GEMM, além de recapitular fielmente as lesões histológicas que caracterizam os tumores pancreáticos humanos, também apresentam estroma desmoplásico e respostas inflamatórias que se assemelham muito àquelas observadas em pacientes humanos. Assim, o objetivo é identificar o estágio inicial no qual o presente painel de biomarcadores pode detectar o câncer pancreático ou lesões precursoras destinadas a se tornar câncer pancreático quando ressecção da lesão seria considerada curativa.

[00138] Os níveis de TFPI foram examinados por um ensaio ELISA comercial em plasma reunido isolado de camundongos que têm lesões PanIN classificadas (Estágio 1-3) versus camundongos de tipo selvagem de controle. Uma diferença significativa nos níveis de TFPI foi observada no plasma de 8 camundongos KC que têm lesões PanIN versus 3 controles de tipo selvagem (Figura). Os resultados indicaram que TFPI pode ser usada para a detecção precoce de lesões precursoras antes do desenvolvimento de câncer pancreático.

ir ir ir [00139] Todos os métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente invenção. Embora as composições e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será

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79/81 evidente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos métodos e etapas ou sequência de etapas do método descrito aqui sem sair do conceito, espírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, será evidente que determinados agentes que são química e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, enquanto os mesmos ou resultados similares são alcançados. Todos estes substitutos e modificações similares, evidentes para aqueles versados na técnica, são considerados como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

REFERÊNCIAS [00140] As referências a seguir, na medida em que fornecem procedimentos exemplificativos ou outros detalhes suplementares àqueles apresentados aqui, são especificamente incorporadas aqui por referência.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Ensaio para medir a expressão dos antígenos TNC-FN IIIC, TFPI e CA19-9, caracterizado por compreender:

(a) contatar uma pluralidade de antígenos com um anticorpo anti-TNC-FN lll-C, um anticorpo anti-TFPI e um anticorpo anti-CA19-9 para formar complexos de antígeno-anticorpo; e (b) detectar os complexos de antígeno-anticorpo usando porções detectáveis que se ligam distintamente a cada um dos anticorpos, deste modo, medindo a expressão dos antígenos TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9.
2. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio in vitro.
3. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio in vivo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de antígenos é obtida a partir de uma amostra biológica.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra cirúrgica ou biópsia, um tecido embebido em parafina, uma impressão tecidual congelada, sangue periférico, urina ou um aspirado de agulha fina.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é uma amostra de plasma.
8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo em risco de câncer ou que tem uma histórico familiar de câncer hereditário.
9. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado

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2/10 pelo fato de que a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo com idade acima de 50 anos.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não foi previamente diagnosticado com câncer.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não foi testado para diabetes e/ou pancreatite crônica.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que foi determinado que o indivíduo não tem diabetes e/ou pancreatite crônica.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção é ainda definida como realização de um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que um, dois ou três ELISAs são realizados.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ELISA é um ELISA em sanduíche.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ELISA em sanduíche é um ELISA multiplex, em que dois ou três antígenos são detectados simultaneamente.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os anticorpos da etapa (a) são conjugados a uma superfície.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por compreender ainda lavagem após a etapa (a) para remover os antígenos que não estão em um complexo de antígeno-anticorpo.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender ainda adicionar anticorpos de detecção específicos para cada um dos três antígenos após a etapa de lavagem.

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20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os anticorpos de detecção são biotinilados.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende adicionar fluoroforos conjugados com estreptavidina e medir os fluoroforos.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a amostra não é diluída.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a amostra é diluída pelo menos 50 vezes.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as porções detectáveis são ligadas aos anticorpos antes da etapa (a).
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as porções detectáveis compreendem sondas fluorescentes, sondas radioativas ou fotossensibilizantes.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as sondas fluorescentes compreendem verde de indocianina (ICG), isotiocianato de fluoresceína (FITC) e/ou IRDye800.
27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as porções detectáveis ligadas aos anticorpos são detectadas por meio de imagiologia óptica, ultrassom, ressonância magnética (MRI), tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de um único fóton (SPECT) ou fototerapia.
28. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de antígenos está compreendida em um tecido.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o tecido é um tumor.

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30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o tecido é tecido humano.
31. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a medição compreende comparar a expressão de cada um dos três antígenos com a expressão em uma amostra de controle.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo saudável.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo que tem uma doença benigna.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que uma expressão aumentada dos três antígenos comparado com uma amostra de controle indica a presença de câncer ou uma lesão precursora.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer pancreático.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o câncer pancreático é câncer pancreático em estágio inicial.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o câncer pancreático em estágio inicial é câncer pancreático em Estágio I ou Estágio II.
38. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a lesão precursora é uma lesão precursora de câncer pancreático (PanIN).
39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o câncer pancreático em Estágio II é câncer pancreático em Estágio HA ou Estágio IIB.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

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34 a 39, caracterizado pelo fato de que a especificidade do ensaio é de pelo menos 0,8.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 39, caracterizado pelo fato de que a precisão do ensaio é de pelo menos 0,7.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 39, caracterizado por compreender ainda realizar estudos de imagiologia para câncer pancreático.
43. Método de tratamento de câncer pancreático em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma ou mais terapias antineoplásicas ao indivíduo, em que o indivíduo é identificado por ter uma expressão aumentada dos antígenos TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9 quando comparado com a expressão dos antígenos em um controle.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o controle é um indivíduo saudável.
45. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada dos antígenos é determinada ao realizar um ELISA em uma amostra obtida a partir do indivíduo.
46. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada dos antígenos é determinada conforme o método de acordo coma reivindicação 1.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de plasma.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizado pelo fato de que o câncer pancreático é câncer pancreático em estágio inicial.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais terapias antineoplásicas são quimioterapia, radioterapia, terapia gênica, cirurgia,

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6/10 terapia hormonal, terapia antiangiogênica e/ou imunoterapia.
50. Kit para detectar câncer pancreático, caracterizado por compreender um conjunto de anticorpos específicos para os antígenos TNC-FN lll-C, TFPI e CA19-9.
51. Método in vitro para detectar uma célula cancerosa, caracterizado por compreender:

(a) obter uma amostra biológica;

(b) contatar a amostra biológica com um anticorpo anti-TNCFN lll-C, um anticorpo anti-TFPI e um anticorpo anti-CA19-9; e (c) detectar a ligação do anticorpo anti-TNC-FN lll-C, anticorpo anti-TFPI e anticorpo anti-CA19-9 à amostra, em que a expressão aumentada dos três antígenos comparado com um controle indica a presença de uma célula cancerosa.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra cirúrgica ou biópsia, um tecido embebido em parafina, uma impressão tecidual congelada, sangue periférico, urina ou um aspirado de agulha fina.
53. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é uma amostra de plasma.
55. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo em risco de câncer ou que tem um histórico familiar de câncer hereditário.
56. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo com idade acima de 50 anos.
57. Método, de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não foi previamente

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7/10 diagnosticado com câncer.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não foi testado para diabetes e/ou pancreatite crônica.
59. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi determinado como não tendo diabetes e/ou pancreatite crônica.
60. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção é ainda definida como a realização de um ELISA.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que um, dois ou três ELISAs são realizados.
62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o ELISA é um ELISA em sanduíche.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ELISA em sanduíche é um ELISA multiplex, em que dois ou três antígenos são detectados simultaneamente.
64. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os anticorpos da etapa (a) são conjugados a uma superfície.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por compreender ainda lavagem após a etapa (a) para remover os antígenos que não estão em um complexo de antígeno-anticorpo.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado por compreender ainda adicionar anticorpos de detecção específicos para cada um dos três antígenos após a etapa de lavagem.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que os anticorpos de detecção são biotinilados.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende adicionar fluoroforos

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8/10 conjugados com estreptavidina e medir os fluoroforos.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que a amostra não é diluída.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que a amostra é diluída pelo menos 50 vezes.
71. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a medição compreende comparar a expressão de cada um dos três antígenos com a expressão em uma amostra de controle.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo saudável.
73. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a amostra de controle é isolada a partir de um indivíduo que tem uma doença benigna.
74. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer pancreático.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o câncer pancreático é câncer pancreático em estágio inicial.
76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o câncer pancreático em estágio inicial é câncer pancreático em Estágio I ou Estágio II.
77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o câncer pancreático em Estágio II é câncer pancreático em Estágio HA ou Estágio I IB.
78. Método para medir a expressão do antígeno TFPI, caracterizado por compreender:

(a) contatar uma pluralidade de antígenos com um anticorpo anti-TFPI para formar complexos de antígeno-anticorpo; e

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9/10 (b) detectar os complexos de antígeno-anticorpo usando porções detectáveis que se ligam distintamente ao anticorpo anti-TFPI, deste modo, medindo a expressão do antígeno TFPI, em que uma expressão aumentada de TFPI comparado com um controle indicou a presença de uma lesão pré-cancerosa.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a lesão pré-cancerosa é uma lesão PanIN.
80. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a detecção é ainda definida como a realização de um ELISA.
81. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de antígenos é obtida a partir de uma amostra biológica.
82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra cirúrgica ou biópsia, tecido, um tecido embebido em parafina, uma impressão tecidual congelada, sangue periférico, urina ou um aspirado de agulha fina.
83. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é uma amostra de plasma.
84. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é obtida a partir de um indivíduo em risco de câncer ou que tem um histórico familiar de câncer hereditário.
85. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que as porções detectáveis são conjugadas aos anticorpos antes da etapa (a).
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que as porções detectáveis compreendem sondas fluorescentes, sondas radioativas ou fotossensibilizantes.
87. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado

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10/10 pelo fato de que as porções detectáveis ligadas aos anticorpos são detectadas por meio de imagiologia óptica, ultrassom, ressonância magnética (MRI), tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de um único fóton (SPECT) ou fototerapia.