FI89722C - Enzymatisk detergenttilsats och detergentkomposition - Google Patents

Description

89722.

Entsymaattinen pesuaineen lisäaine ja pesuainekoostumus Tämä keksintö koskee rasvamaisten aineiden entsymaattiseksi hajottamiseksi käyttökelpoisia entsyymejä. Keksintö koskee erityisesti uusia lipolyyttisiä entsyymejä, joilla on parannettu lipolyyttinen aktiviteetti pesuolosuhteissa, mikä tekee ne erityisen sopiviksi käytettäviksi pesuaineiden lisäaineina. Keksintö koskee myös menetelmää uusien lipolyyttisten entsyymien tuottamiseksi, niiden käyttöä lisäaineina pesuainekoostumuksissa ja pesumenetelmää, jossa käytetään näitä pesukoostumuksia. Keksintö koskee myös uusia lipolyyttisiä entsyymejä sisältäviä pesukoostumuksia.

Tämän keksinnön mukainen entsymaattinen pesuaineen lisäaine sisältää aktiivisena komponenttina ainakin yhden niistä lukuisista lipolyyttisistä entsyymeistä, joita tuottavat tietyt mikro-organismit ja erityisesti tietyt bakteerit, joiden on todettu eroavan toisistaan fysikokemiallisilta ja entsymaattisilta ominaisuuksiltaan.

2 89722

Vaikkakin lipolyyttisten entsyymien käyttö pesuainekoostu-muksissa on ollut tunnettu useita vuosia (vrt. esim. GB-patenttijulkaisun 1,442,418 sivulla 1, riveillä 36-38 mainitut viitteet) ne vaikuttavat sangen epätyydyttäviltä käytännössä sillä niillä on vain erittäin pieni puhdistus-teho pesuolosuhteissa eivätkä ne täytä nykyisiä stabili-teettivaatimuksia. Laajana kokooma-artikkelina viitataan julkaisuun H. Andree et ai., J. Appi. Biochem., 2 (1980) 218-219, "Lipases as Detergent Components".

Lipolyyttisiä pesuaineen lisäaineita tunnetaan myös esim. GB-patenttijulkaisusta no 1,293,613 ja CA-patentista no. 835,343.

US-patentissa 3,950,277 ja GB-patenttijulkaisussa 1,442,418 kuvataan lipaasientsyymejä, jotka on yhdistetty aktivaattoriin ja vastaavasti kalsium- ja/tai magnesiumio-neihin, joita käytetään tahraantuneiden vaatteiden ja kankaiden esiliottamiseksi ja triglyseriditahrojen ja -lian poistamiseksi polyesteri- tai vastaavasti polyesteri/puu-villakangas-sekoitteista. Sopivia tässä käytettäviä mikro-biperäisiä lipaaseja (eläin- ja kasviperäisten lipaasien ohella) ovat ne jotka saadaan seuraavista: Pseudomonas. Aspergillus. Pneumococcus. Staphylococcus. ja Staphylococcus toxins. Mycobacterium tuberculosis. Mvcotorula lipolvtica ja Sclerotinia.

GB-patenttijulkaisussa 1,372,034 on kuvattu pesuainekoos-tumus, joka sisältää bakteeriperäistä lipaasia kannasta Pseudomonas stutzeri ATCC 19154. Lisäksi on suositeltu että edullisilla lipolyyttisillä entsyymeillä on pH-optimi välillä 6-10, ja niiden tulisi olla aktiivisia mainitulla välillä, erityisesti välillä 7-9. Vuoden 1970 tienoilla tämä oletettu Psedomonas stutzeri-kanta luokiteltiin uudestaan Pseudomonas aeruginosa'ksi. mikä ilmenee esimerkiksi ATCC-luetteloista.

89722 3 EP-patenttihakemuksessa EP-A-0130064 on kuvattu entsymaat-tinen pesuainekoostumus, joka sisältää Fusarium oxy-soorum' ista eristettyä lipaasia, jolla on väitetty suurempi lipolyyttinen pesuteho kuin tavallisilla lipaaseilla.

Laajan tutkimuksen ja kokeilun tuloksena on yllättävästi todettu että lipaasivalmisteita voidaan saada viljelemällä sopivasti valittuja mikro-organismeja, joilla lipaaseilla on lipaasiaktiviteetti moderneissa pesuolosuhteissa, t.s. ne ovat pysyviä ja tehokkaita suurissa pesuainekonsentraa-tioissa, korkeassa pHrssa ja alhaisissa pesulämpötiloissa.

Niinpä keksinnön kohteena on entsymaattinen pesuaineen lisäaine, jonka sisältämät lipolyyttiset entsyymit ovat valmistettavissa viljelemällä tiettyjä kantoja, jotka kuuluvat lajeihin Pseudomonas pseudoalcaliaenes ja Pseudomonas stutzeri. Mainituilla lipaaseilla on pH-optimi välillä noin 8 ja 10,5, niillä on tehokas lipaasiaktiviteetti aina noin 10 g/1 konsentraatioihin asti 60 °C;n ja aihaiseitanan lämpötilan pesuolosuhteissa, edullisesti 30-40 °c:ssa, ja • pH-arvossa noin 7-11, ja mieluimmin välillä noin 9-10,5. pH-optimi määritetään pH-mittarilla TLU-määrityksen olosuhteissa, joka selitetään jäljempänä sivulla 18.

Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan lipolyyttiset \ . entsyymit voidaan valmistaa viljelemällä tavallisissa vil- • jelyolosuhteissa Ps. pseudoalcaliaenes/in uutta eristettyä kantaa, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat kan- : nat, joilla on sisäiset numerot Sp 9, IN II-5, Gr VI-15 ja M-l, jotka tallennettiin elokuun 8 pnä 1985 laitokseen Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Hol-'··. lanti, numeroilla CBS 467.85 (7181), CBS 468.85 (7182), CBS 471.85 (7185) ja CBS 473.85 (7187). Nämä eristetyt kannat on identifioitu taulukossa 1 luetelluilla fenotyyp-: '·; pisillä tunnusmerkeillä.

4 89722

Keksinnön erään toisen edullisen suoritusmuodon mukaan voidaan valmistaa lipolyyttinen entsyymi viljelemällä, tavanomaisissa viljelyolosuhteissa, Ps. pseudoalcaliaenes'in alalaji citrulli tyyppikantaa, joka on tallennettu laitokseen American Type Culture Collection noilla ATCC 29625.

Alan ammattimiehille on tunnettua että Pseudomonas pseudoalealiaenes-laiit. joista esimerkkinä kannat DSM 50188 (sama kuin ATCC 17440, tyyppikanta) ja DSM 50189, eivät muodosta lipaaseja. Kuitenkin on myös tunnettua että mainittu laji on verraten heterogeeninen. Tätä varmentaa uusien kasvipatogeenisten bakteereiden tunnistaminen, jotka löysivät N. W. Schaad et ai., Int. J. Syst. Microbiol., 28 (1978) 117-125, jotka nimitettiin Pseudomonas pseudoalcaliaenes alalaji citrulli. ja vastaavasti M. Goto, Int. J. Syst. Microbiol., 23. (1983) 539-545, nimitetty Pseudomonas pseudoalcaliaenes alalaji koniaci.

Vaikkakin molempien alalajien citrulli ja koniaci feno-tyyppiset tunnusmerkit eroavat hieman toisistaan ja edellä mainittujen lajien tyyppikannoista, alan ammattimiehet katsovat että nämä alalajit kuuluvat lajiin Ps. pseudoalcaliaenes (vrt. esim. N.J. Palleroni, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, voi. 1 ed. N.R. Krieg, Williams and Wilkins, Baltimore/London 1984 s. 173-174). Niiden olemassaolo on osoitus Ps. pseudoalcalioenes-laiin feno-tyyppisissä tunnusmerkeissä esiintyvästä luonnollisesta vaihtelusta. Fenotyyppisten tunnusmerkkien vaihtelut ilmenevät, muiden ohella, Ps. pseudoalcaliaenes-laiin uusien alalajien citrulli ja koniaci lipaasin tuotossa.

Alan ammattimiehelle on myös selvää että uudet eristetyt kannat eroavat jonkin verran Pseudomonas pseudoalcaliaenes' in tähän mennessä havaittujen alalajien kuvatuista tunnusmerkeistä, mutta että ne siitä huolimatta kuuluvat tähän lajiin.

5 39722

Pseudomonas pseudoalcalictenes'in neljän valitun kannan, jotka on määritelty edellä, tuottamalla lipaasilla on hämmästyttävän hyvä stabiliteetti ja teho pesuolosuhteissa.

Sama pätee edellä mainitun Pseudomonas pseudoalcaliaenes alalaji citrulli/n tuottamalle lipaasille, jonka käyttökelpoiset ominaisuudet eivät mitenkään ole johdettavissa Schaad et ai.'in viitteestä.

Keksinnön vielä erään edullisen suoritusmuodon mukaan li-polyyttinen entsyymi voidaan valmistaa viljelemällä tavanomaisissa viljelyolosuhteissa uutta Pseudomonas stutzeri-kantaa, jolla on sisäinen nro Thai IV 17-1 ja joka on tallennettu CBS:ään elokuun 8 pnä, 1985 nro:11a CBS 461.85 (7175). Kannalle on tunnusomaista taulukossa 2 mainitut fenotyyppiset tunnusmerkit. Tämä Pseudomonas stutzeri-kanta pystyy tuottamaan lipaasia, joka on pysyvää pesu-liuoksissa, jotka sisältävät enintään 10 g pesuainetta /1 35 °C:ssa pH-arvossa 9,0.

Kuten edellä mainittiin, oli jo aikaisemmin tunnettua että Pseudomonas stutzeri-kanta ATCC 19154 pystyi tuottamaan stabiilia lipaasia, jota voidaan käyttää pesuaineissa : (vrt. myös US-patenttia 3,511,753). Tämä tallennettu kanta on kuitenkin luokiteltu uudestaan Pseudomonas aeroainosa'na. ·;·: vrt esim. ATCC Catalogue of Bacteria, Phages and rDNA Vec- j\. tors, 16th ed., 1985, s. 134 no 19154. Alan ammattimies ei varmastikaan voinut ennustaa tai odottaa että autenttiset Pseudomonas stutzeri-kannat voisivat tuottaa stabiileja ... lipaaseja, kuten on määritelty tässä keksinnössä. Pseudo- monas stutzeri'ä on kauan pidetty melko heterogeenisenä lajina, johon kuuluu useita bakteerikantoja, joiden ent-syymejä tuottava potentiaali on hyvin erilainen. Mitään viittausta ei myöskään ole annettu mahdollisuudesta käyttää tällaisia lipaaseja moderneissa pesukoostumuksissa ja . . aivan erityisesti että niiden stabiliteetti mainituissa *- pesuolosuhteissa olisi niin hyvä.

6 89722 Tämän keksinnön mukaiset edullisimmat lipaasivalmisteet ovat ne jotka voivat hydrolysoida ainakin noin 10 % ja mieluummin ainakin noin 20 % talteenotetuista rasvoista esimerkissä 9 selitetyissä olosuhteissa jauhemaiselle pesuaineelle pesuainekonsentraation minimimäärän ollessa 2 g/1.

7 89722

Taulukko 1. Pseudomonas pseudoalealigenes-kantojen tunnusmerkit

Sp 9, IN II-5, Gr VI-15 ja M-l ^^^^Kanta Sp 9 IN II-5 Gr VI-15 M-l

Tunnusmerkki _____

Solujen muoto ja koko sauva sauva sauva sauva

Polymorfismi puuttuu puuttuu puuttuu puuttuu

Motiliteetti liikkuva liikkuva liikkuva liikkuva

Itiömuodostus e^- e;*- e*· e·*-

Gram - värjäys

Oksidaasi-reaktio + + + +

Anaerobinen dekstroosi

Aerobinen: dekstroosi ~ ! maltoosi ' . sakkaroosi D-ksy loosi ” - + . Arginiini-dihydrolaasi + + +

Lysiini- dekarboksylaasi ~ • - Omitiini- dekarboksy- _ _ laasi______

Ureaasi “ - -·· Gelatiini-hydrolyysi ~ “

Katalaasi + + + +

Beta-galaktos idaas i _ _ (ONPG-meneteImä) 8 β 9 722

Taulukko 1 (jatko) -^^Kanta Sp 9 IN 11—5 Gr VI—13 M-l

Tunnusmerkki ____

Indolimuodostus “

Nitraatin pelkistys + + + +

Nitraatti pelkistetty ' nitraatin ohi (N^-kaasun muodostus) Tärkkelyshydrolyys i “

Fenyylialaniinideaminointi “ ” “ (+)

Sitraattihyödyntäminen + + + +

Kasvu: 1% setrimidillä + “ n.t. n.t.

6,5% NaCl:llä - n.t. n.t. n.t.

McConkiey'lla + + + +

Kasvu: 4°C:ssa - 42°C:ssa + . + + +

Rikkivedyn muodostus ” “ n,t· n.t.

‘ Käyttäytyminen hapen suhteet aerobinen aerobinen aerobiner aerobinen

Ravinnevaatimukset ei ei ei ei

Pigmentinmuodostus:

King-A-kasvualustaila ~ - King-B-kasvualustalla ” _ . ^ , Maaperä Maaperä Maaperä Maaperä

Eristeen lähde (Espanja) (Intia) (Kreikka) (Malesia) n.t. (not tested) = ei testattu ( + ) heikko tai viivästynyt_ 89722 9

Taulukko 2. Pseudomonas stutzeri-kannan Thai IV 17-1 tunnusmerkit ^--^^Kanta Thai IV 17-1 Tunnusmerkki ______

Solujen muoto ja koko sauva Polymorfismi Puuttuu

Motiliteetti_ liikkuva

Itiömuodostus ei

Gram - värjäys

Oksidaasi-reaktio +

Anaerobinen dekstroosi Aerobinen: dekstroosi (+) maltoosi ·.: : sakkaroosi D-ksyloosi n,t*

Arginiini* dihydrolciasi

Lysiini* dekarboksylaasi Omitiini* dekarboksy- • laasi__ • ’· Ureaasi

Gelatiini-hydrolyysi +

Katalaasi

Beta-galaktosidaasi (ONPG-menete lmä) 10 -9722

Taulukko 2 (jatko) ^~-^^Kanta Thal iv 17-1

Tunnusmerkki Indolimuodostus

Nitraatin pelkistys +

Nitraatti pelkistetty + nitraatin ohi (^-kaasun muodostus) Tärkkelyshydrolyysi +

Fenyylialaniinideaminointi

Sitraattihyödyntäminen +

Kasvu: 1% setrimidillä + 6,5% NaCl:llä (+)

McConkey'lla +

Kasvu: 4°C:ssa 42°C:ssa +

Rikkivedyn muodostus Käyttäytyminen hapen suhteen aerobinen Ravinnevaatimukset ei

Pigmentinmuodostus:

King-A-kasvualustalla King-B-kasvualustaila

Maaperä

Eristeen lähde (Taimaa) n.t. (not tested) = ei testattu ( + ) heikko tai viivästynyt 11 89722

Keksintö koskee myös pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät keksinnön mukaista entsymaattista pesuaineen lisäainetta yhdessä pinta-aktiivisen aineen ja mahdollisesti muiden pesukoostumuksissa tavallisesti käytettyjen aineosien kanssa. Keksinnön mukaisten pesuainekoostumusten aineosat voivat käsittää, oleellisen lisäaineen ohella, yhden tai useamman seuraavista: 1. Entsymaattisissa pesuainekoostumuksissa yleisesti käytettyjä pinta-aktiivisia aineita. Yleisesti voidaan käyttää luonnollisia tai synteettisiä pinta-aktiivisia aineita, esim. vesiliukoisia saippuoita, kationisia, anionisia, ei-ionisia, amfolyyttisiä tai kahtaisionisia pinta-aktiivisia aineita. Esimerkki eräästä paljon käytetystä tämän tyyppisestä pinta-aktiivisesta aineesta on dodekyyli-bentseenisulfonaatti. Pinta-aktiivisia aineita, joita voidaan käyttää sellaisenaan tai seoksena, on läsnä noin 4 -50 % (p/p) määrinä pesuainekoostumuksesta laskettuna.

2. Veden pehmennysaineita, kuten kompleksisia fosfaatteja, esimerkiksi alkalimetallitripolyfosfaattia tai alkalime-tallipyrofosfaattia tai tseoliittejä, mieluummin enintään 40 paino-% pesuainekoostumuksesta. Lisäksi tai vaihtoehtoisesti voidaan käyttää yhdisteitä, kuten alkalimetalli-syano-triasetaattia tai alkalimetalli-sitraattia, joilla on kompleksinen pesuvaikutus pesuainekoostumuksissa.

3. Alkalimetallisilikaatteja tai heikosti aikalisiä yhdisteitä, kuten alkalimetallibikarbonaattia, yleensä enintään 20 paino-%.

4. Täyteaineita, kuten alkalimetallisulfaattia.

5. Yhdisteitä, kuten karboksimetyyliselluloosaa, hajusteita, optisia kirkasteita, puskuriyhdisteitä, polyalky-leeniglykoleja tai etanolia.

12 h 9 7 2 2 6- Muuntyyppisiä entsyymejä, kuten proteaaseja ja amylaa-seja.

Keksinnön mukaisissa entsymaattisissa pesuainekoostumuk-sissa lipaasiaktiviteetti on mieluummin alueella 1-20000 TLU/g koostumusta, kun taas proteolyyttisten entsyymien aktiviteetti on edullisesti alueella 50-10000 Delft-yksik-köä/g (DU/g) pesukoostumusta. Yksi TLU (True Lipase Unit) määritetään titrattavan rasvahapon määränä, joka on ekvivalentti 1 μΐηοοίχη kanssa NaOH:ta per minuutti (vrt. myös jäljempänä selityksen sivua 18). Delft-yksiköt on määritelty julkaisussa J. Amer. Oil Chem. Soc. 60 (1983), 1672.

Toinen ryhmä yhdisteitä, joita voidaan lisätä keksinnön mukaisiin pesuainekoostumuksiin, ovat valkaisuaineet, kuten alkalimetalliperboraatit, erityisesti natriumperbo-raatti, alkalimetalliperkarbonaatti, kuten natriumperkar-bonaatti, perhapot ja niiden suolat, ja näiden valkaisuaineiden aktivaattorit, kuten TAED. Kun pesukoostumus sisältää toisaalta perboraatteja, perkarbonaatteja, aktivaatto-reita ja optisia kirkasteita ja toisaalta proteaaseja, on erittäin yllättävää että keksinnön mukaiset entsymaattiset pesuaineen lisäaineet säilyttävät korkean stabiliteettinsa näiden aineosien läsnäollessa.

Keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla, esimerkiksi sekoittamalla keskenään komponentit tai valmistamalla ensin esiseos, josta myöhemmin valmistetaan lopullinen tuote sekoittamalla se muiden aineosien kanssa. Erään mahdollisen valmistustavan mukaisesti sekoitetaan yksi tai useampi lipolyyttinen entsyymi yhden tai useamman muun yhdisteen kanssa ennaltamää-rätyn entsymaattisen aktiviteetin omaavan konsentraation valmistamiseksi, joka konsentraatti sen jälkeen voidaan sekoittaa muiden haluttujen komponenttien kanssa.

13 89722

Keksinnön mukaiset entsymaattiset pesuaineen lisäaineet voivat myös sisältää yhden tai useampia muita entsyymejä, esimerkiksi proteaasia ja/tai amylaasia, jota voidaan käyttää moderneissa pesuainekoostumuksissa, ja yhden tai useampia muita komponentteja, joita yleisesti käytetään tällä alalla, esimerkiksi ei-ionista suolaa, stabilointiainetta ja/tai päällystysainetta. Entsymaattinen pesuaineen lisäaine sisältää edullisesti lipaasin ohella prote-aasin ja mahdollisesti alfa-amylaasin. On todettu etteivät proteolyyttiset entsyymit hajota keksinnön mukaisia lipo-lyyttisiä entsyymejä. Keksinnön mukaiset entsymaattiset pesuaineen lisäaineet sekoitetaan yleensä yhden tai useamman muun pesuaineen ja muiden sellaisten komponenttien kanssa, joiden tiedetään muodostavan pesukoostumuksia.

Keksinnön erään erityisen suoritusmuodon mukaan käytetään entsymaattista pesuaineen lisäainetta, jossa lipaasiakti-viteetti on alueella 102 - 106 TLU/g lisäainetta, kun taas mahdollisesti läsnäoleva proteolyyttinen aktiviteetti on alueella 5 x 104 - 106 Delft-yksikköä/g.

Keksinnön mukaiset entsymaattiset pesuaineen lisäaineet voivat olla esimerkiksi granulaatin tai rakeiden muodossa, jotka on valmistettu tässä yhteydessä yleisesti tunnettujen menetelmien mukaisesti. Vrt. esim. GB-patentit 1,324,116 ja 1,362,365 ja US-patentit 3,519,570, 4,106,991 ja 4,242,219.

.. . Keksinnön erään erityisen suoritusmuodon mukaan entsymaattinen pesuaineen lisäaine on liuoksen muodossa, jossa on entsyymistabilisaattoria. Tämä stabilisaattori on esimerkiksi propyleeniglykoli. Tällaisia nestemäisiä lisäaineita käytetään edullisesti nestemäisissä pesuainekoostumuksis-sa.

Keksinnön mukaiset pysyvät ja tehokkaat lipolyyttiset entsyymit voidaan sopivasti valmistaa viljelemällä edellä ,, 8S722 14 mainittuja mikro-organismeja sopivissa olosuhteissa. Korkean entsyymisaannon varmistamiseksi on välttämätöntä käyttää helposti assimiloituvia hiili- ja energialähteitä, jollainen on orgaanista alkuperää oleva typpilähde, kuten kaseiini. Viljelyalustaan lisätään edullisesti rasvaa tai öljyä samoinkuin kalsium- tai magnesiumsuoloja ja hivenaineita.

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan viljely-prosessi suoritetaan kuoritussa maidossa, joka edullisesti on laimennettu vedellä suhteessa 1:1 - 1:25 p./til. Hyvä ilmastus on tarpeen käymisen aikana. Alustan pH pidetään sopivasti arvossa 6-10 ja edullisesti välillä 6,5-9.

Keksintö koskee myös pesumenetelmää, jossa käytetään keksinnön mukaista pesuainekoostumusta. Tällainen menetelmä voidaan tyydyttävästi suorittaa noin 60 °C:n tai alhaisemmassa lämpötilassa ja edullisesti 30-40 °C:ssa, yleensä pH-arvossa 7-11. Pesuaika on yleensä 10 - 60 minuuttia. Pesumenetelmässä käytetään edullisesti pesuliuosta, joka sisältää tämän keksinnön mukaista pesukoostumusta määränä, joka on 0,5 - 15 g/litra pesuliuosta, mieluimmin 1-10 g/1.

Lioaasien teko pesumenetelmässä

Modernit pesuaineet sisältävät aineosia, jotka on valittu optimaalisen tehon saavuttamiseksi pesuprosessissa. On itsestään selvää että mikäli lipaasia on tarkoitus käyttää modernissa pesumenetelmässä, sen tulisi olla yhteensopiva sellaisten tavanomaisten aktiivisten ja tehokkaiden aineosien kanssa, joita käytetään moderneissa pesukoostumuk-sissa. Tätä tarkoitusta varten on valittu joukko testi-kriteereitä, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisten li-paasien aktiviteetin ja tehokkuuden osoittamiseksi pesu-olosuhteissa. Nämä kriteerit ovat: is 89722 1. Lipaasien aktiviteetti yleisesti käytetyn pesuaineen runkoaineen, kuten natrium-tripolyfosfaatin (TPP) kanssa. Tämä kriteeri on tärkeä, sillä uskotaan yleisesti että li-paasit ovat aktiviteettinsa ja stabiliteettinsa suhteen riippuvaisia alkalimetalli-ioneista, kuten kalsiumioneis-ta. Tällaiset kalsiumista riippuvaiset lipaasit eivät siten olisi sopivia käyttöä varten moderneissa pesumenetelmissä.

2. Lipaasien aktiviteetti moderneissa pesuaineliuoksissa.

On olemassa lukuisia moderneja pesuainekoostumuksia, joita voidaan käyttää alkalisten lipaasien aktiviteetin ja tehokkuuden testaamiseksi. Olemme valinneet mm pesujauhekoostu-muksen ja pesunestekoostumuksen tyypillisinä esimerkkeinä laajalti käytetyistä moderneista pesuainekoostumuksista. Nämä tyypilliset modernit pesuainekoostumukset ovat: - ALL* (jauhe), Unileverin tuote, Hollanti. Testeissämme käytimme ALL-base-tuotetta (jonka toimitti Unilever Research, Vlaardingen, Hollanti) joka koostumukseltaan vastaa ALL'ia ilman perboraattia, valkaisuaineen aktivaattoria (TAED) ja entsyymejä. ALL on rekisteröity tavaramerkki.

- TIDE* (neste), Procter & Gamble'n tuote ja kaupallisesti saatavissa USA:ssa. Testejämme varten tässä koostumuksessa läsnäolevat entsyymit inaktivoitiin lämpökäsittelyllä.

TIDE on rekisteröity tavaramerkki.

3. Lipaasien aktiviteetti proteaaseja sisältävässä ALL'is- · sa. Koska proteaasit muodostavat tärkeän aineosan moder neissa pesukoostumuksissa lipaasien aktiviteetti ja tehokkuus tulisi ilmetä tämän pesuainekomponentin läsnäollessa (yhdessä pinta-aktiivisen matriisin kanssa).

4. Lipaasien aktiviteetti tyypillisen valkaisuaineen (kuten perboraatin) ja valkaisuaktivaattorin (kuten TAED) ie 85722 läsnäollessa. Valkaisuaineet (ja niiden aktivaattorit alhaisemmissa pesulämpötiloissa) ovat tärkeitä aineosia joissakin moderneissa pesuainekoostumuksissa. Lipaasien aktiviteettia ja tehokkuutta näiden läsnäollessa pidetään tärkeänä kriteerinä.

Lipolyyttisten entsyymien osuus öljyjen ja rasvojen poistossa tekstiileistä määritetään sopivalla testisysteemillä joka sallii keksinnön mukaisten lipaasien aktiviteetin kiistattoman määrittämisen pesuliuoksissa.

Tavallisesti käytetyillä testikankailla, kuten EMPA 101:llä ja EMPA 102:11a (kaupallisesti saatavissa Eid-genössische Materialprttfungs- und Versuchsantalt' ilta, St. Gallen, Sveitsi) on se epäkohta että pesukyky mitataan pigmentin poistona. Kysymys, voidaanko pigmentin poistoa EMPA 10l:stä tai EMPA 102:sta suoraan korreloida rasvojen tai rasvahappojen poistoon, on vaikea ja jo tästä syystä näitä kankaita ei pidetä relevantteina lipaasin tehokkuutta arvioitaessa.

Muut testisysteemit, kuten on selitetty esimerkiksi EP-julkaisussa A-0130064, perustuvat myös väriaineen poistamiseen keinotekoisesti liatusta kankaasta. Samat huomautukset jotka esitettiin EMPA 101:n ja EMPA 102:n käytön yhteydessä pätevät myös tässä. Edellä mainitun patenttihakemuksen testisysteemissä käytetään lisäksi emulgoitua rasvaa substraattina aikalisille lipaaseille. Tämäntyyppinen rasva ei yleensä vastaa niitä rasvatahroja, jotka modernin pesuliuoksen on poistettava, koska tällaiset tahrat eivät ole emulgoidussa muodossa ja emulgoimaton rasva sellaisenaan on kosketuksessa kankaan kanssa.

Andree et ai.,'in julkaisussa J. Appi. Biochem., 2 (1980) 218-229 kuvaamassa testisysteemissä käytetään kankaaseen levitettyä radioaktiivisesti merkittyä rasvaa. Pesuproses- 89722 17 sin jälkeen mitataan kangaskappaleessa oleva radioaktiivisuus ja suhteutetaan se lipolyyttiseen aktiviteettiin. Tässä systeemissä ei kuitenkaan ole mahdollista tehdä eroa rasvasta peräisin olevan radioaktiviteetin ja rasvahapoista peräisin olevan radioaktiviteetin välillä ja siksi tämä testisysteemi ei ole luotettava mitta alkalisten lipaasien toimivuudesta pesuprosessissa.

Keksinnön tarkoituksia varten on kehitetty uusi testi, jota seuraavassa kutsutaan SLM-testiksi, ja jota käytetään alkalisten lipaasien ja niiden aktiviteetin ja tehokkuuden arvioimiseksi pesumenetelmässä. SLM-testissä käytetään samoja periaatteita kuin T. Hashimoto et ai.'in kehittämässä menetelmässä, Yukagaku 34. (1985), 606-612, mutta analyysiä varten tarvittava aika on huomattavasti vähennetty. Menetelmässä käytetään immobilisoitua, ei-emulgoitua rasvaa tai öljyä kankaan päällä testitahrana, pesun jälkeen kangaskappale uutetaan ja analysoidaan uutteet rasvojen ja rasvahappojen suhteen. Riippuen käytetyistä olosuhteista kankaaseen voi pesuprosessin aikana jäädä lipaasiaktivi-teetin tuloksena muodostuneita rasvahappoja, yhdessä tri-glyseridijäännösten kanssa. Niinpä kangaskappaleeseen jääneiden tuotteiden määrät näyttävät muodostavan hyvän mitan lipaasien tehosta pesun aikana. SLM-testi selitetään yksityiskohtaisemmin jäljempänä, yleisten analyysimentelmien yhteydessä.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä.

.. . Esimerkeissä suoritettiin yleiset analyysimenetelmät seu-raavalla tavalla.

fj r> n o r\ 18 3 'J / Z i.

Menetelmä lipaasiaktiviteetin määrittämiseksi A. Oliiviöljyn hvdrolvvsi (TLU-menetelmä)

Keksinnön mukaisten lipaasivalmisteiden aktiviteetit määritettiin joko oliiviöljyn tai p-nitrofenyyli-lauraatin hydrolyysin perusteella. Edellinen menetelmä vastaa pääasiassa Näher'in (G. Näher (1974) "Methods of Enzymatic Analysis", Voi. II, s. 815-818, H.U. Bergmeyer, toim., Academic Press, N.Y., Lontoo) paitsi että vapautettu rasvahappo mitattiin pH-arvossa 8,0 ja 25 °C:ssa pH-mittaril-la. Yksi TLU-yksikkö (True Lipase Unit) määritetään tit-rattavina rasvahappohappoina jotka ovat ekvivalentteja 1 ^moolin kanssa NaOH:ta minuutissa.

B. p-Nitrofenvvli-lauraatin hvdrolvvsi (NPL-menetelmä)

Menetelmä, joka perustuu p-nitro-fenyylHauraatin hydrolyy-siin p-nitrofenoliksi ja lauriinihapoksi on oleellisesti seuraavanlainen: sopiva määrä lipaasia laimennetaan 0,05 M MOPS:iin (3-N-morfoliini-propaani-sulfonihappo)-NaOH, pH

8,0 noin 0,003-0,008 yksikköön NPL/ml. Yksi NPL-yksikkö määritetään sinä lipaasimääränä, joka tarvitaan yhden μΐηοοίίη p-nitrofenolia vapauttamiseksi. 4 ml lipaasiliuos-ta sekoitetaan 1 ml:n kanssa p-nitro-fenyylilauraatti-liuosta (25 mg p-nitro-fenyylilauraattia 25 ml:ssa etanolia ja kaksi tippaa 1 N HC1) ja inkuboidaan 10 minuuttia 30 °C:ssa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 5 ml alkoholista Tris-liuosta (2,5 g tris-(hydroksiroetyyli-amino-metaania) 1 l:ssa etanolia) ja jäähdytetään huoneen lämpötilaan. Ab-sorbanssi mitataan kohdassa 400 nm ja korjataan ilman lipaasia tapahtuvan absorbanssin suhteen. Vapautuneen p-nitrofenolin μmoolimäärät lasketaan kalibrointikäyrästä, joka on muodostettu käyttämällä absorbanssiarvot 400 nmtssa ja sopivia p-nitrofenolin etanoliliuoksia, jota lisätään 1 ml 4 ml:aan 0,05 M MOPS-NaOH-puskuria, pH 8,0 ja 5 ml:aan alkoholista Tris-liuosta.

19 39722

Lipaasien stabiliteetti seurattiin ajallisesti mittaamalla aktiviteetit O, 15 ja 30 minuutin (joskus jopa 90 minuutin) aikana yhdellä näistä menetelmistä.

Menetelmä lipaasistabiliteetin määrittämiseksi pesuliuok-sissa

Joidenkin keksinnön mukaisten lipaasien stabiliteetin määrittämiseksi pesuliuoksissa suoritettiin seuraavat kokeet.

Sopiva määrä esimerkin 1 mukaisesti valmistettua lipaasi-valmistetta lisättiin liuokseen, jossa oli: a) synteettistä hanavettä (Synthetic Tap Water, STW), joka sisälsi 0,433 g CaCl2*6aq, 0,140 g MgCl2*6aq ja 0,210 g NaHC03 litraa kohti tislattua vettä, b) pesuaine valittuna ryhmästä: - ALL-base (=ALL ilman perboraattia, TAED ja entsyymejä) - TIDE plus (= TIDE joka sisältää natrium-tripolyfosfaattia) - TIDE minus (=fosfaattivapaa, sisältää muita runkoaineita).

All-base'n toimitti Unilever Research, Hollanti. TIDE plus ja TIDE minus ovat kaupallisia tuotteita, valmistaja Procter and Gamble, USA. ALL ja TIDE ovat rekisteröityjä tavaramerkkejä.

Kokeet suoritettiin pH-arvossa 9,0 tai 10,3 35, 40 tai 50 °C:ssa. Näytteitä otettiin seoksista 0, 15 ja 30 minuutin (joskus 90 minuutin) jälkeen ja jäännöslipaasiaktivi-teetti määritettiin jommallakummalla kuvatuista menetelmistä. Käytetyt lipaasit olivat Pseudomonas pseudoalcali-aenes. kannat Sp 9 (CBS 467.85), IN II-5 (CBS 468.85),

Gr VI-15 (CBS 471.85) ja M-l (CBS 473.85) ja Pseudomonas stutzeri-kanta Thai IV 17-1 (CBS 461.85).

20 89722

Tulokset on esitetty esimerkeissä 4-7.

Menetelmä lipaasin tehon määrittämiseksi pesuolosuhteissa fSLM-koel

Seuraava on tyypillinen esimerkki siitä, miten SLM-koe edullisesti suoritetaan.

Kankaana käytetään EMPA 211 puuvillalappuja ja trioleiinia tai puhdistettua oliiviöljyä (molempia toimittaa Sigma (USA)) substraatteina. Trioleiinin hydrolyysiä voidaan seurata kromatograafisin menetelmin tekstiilin uuttamisen jälkeen.

SLM-testissä edullisesti käytetty pesumenetelmä on seuraava:

Tilavuudeltaan 20 μ1:η määrästä, jossa on 5 mg oliiviöljyä liuotettuna asetoniin (25%) muodostetaan tahra puuvillaiseen koelappuun (3x3 cm). Lappu ilmakuivataan huoneen lämpötilassa. Pesuliuos, joka sisältää 10 ml STW:tä (standardihanavettä: 0,433 g CaCl2, 0,140 g MgCl2*6 aq. ja 0,210 g NaHC03 litraa kohti tislattua vettä) tai STW:een liuotettua pesuainetta sijoitetaan Erlenmeyer-pulloon (25 ml) jossa on hiottu tulppa ja pidetään ravistinvesihau-teessa 40 °C:ssa. Pesuprosessi aloitetaan lisäämällä lipaa-sia (20 TLU, vrt. jäljempänä) ja välittömästi sen jälkeen likaantunut koelappu Erlenmeyer-pulloon ja ravistetaan 40 minuuttia 40 °C:ssa. Sokkotestissä ei käytetä lainkaan li-paasia.

Pesun jälkeen lappu huuhdotaan STW:llä ja kuivataan sen jälkeen huoneen lämpötilassa. Kuivatut laput pyöröuutetaan lasiputkessa, jossa on 5 ml liuotinta, jolla on sama koostumus kuin substraatin ja tuotteiden kromatograafiseen erottamiseen käytetyllä eluentilla.

89722 21

Uuteliuoksessa jäännöstriglyseridi ja muodostonut vapaa rasvahappo määritetään HPLC:llä.

Laitteisto ja olosuhteet:

Pumppu: Malli 2150 (LKB)

Detektio: Taitekerroinmonitori (Jobin Jvon)

Injektiosysteemi: Wisp (Millipore): 10 μΐ

Integraattori: SP 4270 (Spectra Physics)

Kolonni: CP Microspher-Si (CHROMPACK), 100x4,6 mm

Eluentti: n-heksaani/isopropyylialkoholi/ muurahaishappo: 975:25:2,5 (til./til.) 1 ml/min.

Lämpötila: Ympäristön Näissä olosuhteissa trioleiinin ja oleiinihapon retentio-ajat ovat 1,2, vastaavasti 1,6 minuuttia. Mitataan piikin ala tai sen korkeus. Nämä ovat mittana lapun uuttamisen jälkeen saadusta triglyseridin ja rasvahapon määrästä. Pesemättömästä lapusta talteenotetun triglyseridin määrälle annetaan luku 100 %.

Edellä selitetyissä olosuhteissa oliiviöljyn ja oleiinihapon taitekertoimien väliseksi suhteeksi saatiin 0,85 laskettuna piikin pinta-alasta ja 1,1 laskettuna piikkien korkeudesta.

Esimerkki 1

Kannan Sp 9 lipaasikävmisestä saadun iäädvtvskuivatun supernatantin valmistus

Pseudomonas pseudoalcaliaenes kantaa Sp 9 (CBS 467.85) ympättiin 30 ml:aan steriiliä brain-heart-infuusio-väliai-netta (BHI; Difco) 100 ml:n Erlenmeyer-pullossa. Viljelmää ravisteltiin 16 tuntia 30 °C:ssa orbitaalisekoittimessa no- 22 8 9 722 peudella 300 rpm. BHI:lla kasvatetut solut ympättiin 2 l:n Erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi 500 ml steriiliä kuorittu maito-kasvualustaa. Kuorittu maito-kasvualusta valmistettiin seuraavalla tavalla: - 100 g kuorittua maitoa (Difco) - deionisoitua vettä lisätty 1 litraan; - pH säädetään arvoon 7,0 ennen sterilointia; - sterilointiolosuhteet: 110 °C 30 minuuttia.

Ympättyä, kuorittuun maitoon perustuvaa kasvualustaa sisältävää ravistuspulloa ravisteltiin 48 tuntia orbitaalise-koittimessa nopeudella 250-300 rpm. Lipaasimuodostuksen kasvulämpötila oli 20 °C. Liemi sentrifugoitiin Sorvali R GSA-roottorilla 10000 g:ssa 8-10 °C:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen saatu supernatantti jäädytyskuivattiin sitten li-paasivalmisteeksi.

Muita lipaasituottavien kantojen, esimerkiksi kantojen CBS nro:t 461.85, 468.85, 471.85 ja 473.85, ATCC no 29625 ja DSM 2672 (EP—A—130064) käyminen suoritettiin samalla tavalla paitsi että kannalle CBS 468.85 kasvulämpötila oli 30 °C.

Tämän esimerkin mukaisesti valmistettuja lipaasivalmisteita käytettiin esimerkeissä 4-7 kuvatuissa pysyvyyskokeissa.

Esimerkki 2

Thai IV 17-1 kannan lipaasikävmisestä saadun iäädytyskui-vatun supernatantin valmistus

Pseudomonas stutzeri-kantaa Thai IV 17-1 (CBS 461.85) ympättiin 30 ml:aan steriiliä BHI-väliainetta 100 ml:n Er-lenmeyer-pullossa. Viljelmää ravistettiin 16 tuntia 30 °C:ssa orbitaalisekoittimessa nopeudessa 300 rpm. BHI- 23 89722 kasvatetut solut ympättiin 2 l:n Erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi 500 ml steriiliä GSM-väliainetta. GSM-väliaine valmistettiin seuraavalla tavalla: - 100 g kuorittua maitoa (Difco tai Oxoid); - deionisoitua vettä lisättiin 1 litraan; - pH säädettiin arvoon 7,8 lisäämällä 4 N NaOH:ta;

• * . O

- lämpötila nostettiin 40 C:seen samalla hämmentäen; - lisättiin MAXATASER-liuosta (Gist-brocades); - lämpötila ja pH kontrolloitiin tunnin ajan. Sen jälkeen pH säädettiin arvoon 7. Sterilointi suoritettiin 110 °C:ssa 30 minuutin ajan.

MAXATASE-liuos valmistettiin seuraavalla tavalla: 1 g:aan MAXATASE-jauhetta (2,372xl06 Delft-yksikköä/g) lisättiin deionisoitua vettä 25 ml:aan. Se ravisteltiin huolellisesti 5-10 minuuttia. Liukenemattomat ainekset poistettiin linkoamalla nopeudella 10000 rpm Sorvall-lingon SS34 roottorissa. Supernatantti suodatettiin 0,22 μ MILLI-PORE* suodattimen läpi. Suodos lisättiin sitten litraan 10%:ista kuorittua maitoa. Ympätty kuorittu maito ravistettiin ravistuspulloissa 48 tuntia 20 °C:ssa orbitaalisekoit-timessa nopeudella 150-300 rpm. Sen jälkeen liemi lingot-tiin Sorvali GSA-roottorissa nopeudella 10000 g 8-10 °C:ssa. Saatu supernatantti dialysoitiin EDTA-käsitellyssä dialyysiletkussa 50 tilavuutta vastaan lOmM Tris-HCl-pus-kuria, pH 8, 4 °C:ssa, vaihtamalla puskuri kahdesti, 24 tunnin kuluessa. Dialyysin jälkeen dialyysipussien sisältö yhdistettiin ja jäädytyskuivattiin.

Samalla tavalla suoritettiin käymiset kaikilla muilla esimerkissä 1 mainituilla kannoilla, paitsi kannalla CBS

473.85. Tämän esimerkin mukaisesti saadut lipaasipitoiset supernatantit (paitsi kannasta M-l saatua lipaasia) käytettiin esimerkeissä 8 ja 9 kuvatuissa kokeissa.

24 8 9 722

Esimerkki 3

Kannan M-l lipaasikävmisestä saadun iäädvtvskuivatun supernatantin valmistus

Pseudomonas pseudoalcaliaenes kanta M-l (CBS 473.85) ympättiin 500 ml:aan steriiliä brain-heart-infuusioväliainetta (BHI) (Difco) 500 ml:n Erlenmeyer-pullossa. Viljelmää ravisteltiin 18 tuntia 30 °C:ssa orbitaalisekoittimessa nopeudella 280 rpm. BHl:ssä kasvatetut solut ympättiin 20 l:n fermenttoriin, joka sisälsi 10 1 steriiliä kasvualustaa 1 tai kasvualustaa 2.

- Kasvualusta 1 valmistettiin seuraavalla tavalla: 1000 g kuorittua maitoa suspendoidaan demineralisoituun veteen 9,5 l:aan; lämpötila nostetaan 30 °C:seen ja pH arvoon 7,8 natriumhydroksidiliuoksella; lisää 33xl06 ADU (=26x10** DU) MAXACAL* (Gist-brocades) proteaasi-käsittelyä varten (30 °C ja pH 7,0-7,8) tunnin aikana. Lisätään 0,5-10 ml vaahdonestoainetta (SAG 471 tai Pluronic L-81) ja autoklavoidaan 30 minuuttia 110 °C:ssa.

- Kasvualusta 2 valmistettiin seuraavalla tavalla: 400 g kaseiinia suspendoidaan 5 l:aan demineralisoitua vettä; pH nostetaan arvoon 9,0 (natriumhydroksidin liuoksella) ja lämpötila 50 °C:seen; lisätään 5xl07 ADU:ta (=4xl07 DU) Maxacal* proteaasikäsittelyä varten; inkuboin-ti (90 minuuttia 50 °C:ssa ja pH=9,0) pysäytetään kuumentamalla nopeasti (inkubointi 5 minuuttia 90 °C:ssa). Jäähdyttämisen jälkeen 25 °C:seen pH säädetään arvoon 7,0 lisäämällä rikkihappoa.

Muut komponentit (voi 50 g; MgS04*7aq 5 g; MnS04*4aq 0,1 g ja vaahdonestoainetta SAG 471 0,5-10 ml) lisättiin ja vä- 25 8 9 7 2 2 liaine täydennettiin 10 l:aan demineralisoidulla vedellä ja autoklavoitiin 65 minuuttia 120 °C:ssa.

Kasvualusta jäähdytettiin käymislämpötilaan (30 °C). Käymisolosuhteet: ilmavirta : 0,167 vvm sekoitus: 1000 rpm pH: 6,5 - 10,0 (miel. 6,8-8,0) Käymistä jatkettiin 35-72 tuntia.

Liemi lingottiin käymisen jälkeen Hettich-lingossa (4000 g, 8-10 °C) 30 minuuttia. Supernatantti jäähdytettiin 0 °C:seen ja kiinteätä (NH4)2S04 lisättiin konsentraatioon 70% (p/p) samalla sekoittaen. Muodostunut sakka erotettiin superna-tantista linkoamalla Sorvall-lingossa (10000 g, 4-5 °C)

20-25 min. Sakka lisättiin 10 mM:aan Tris-HCl-puskuria (pH

8) jonka lämpötila oli 0 °C ja kylmää asetonia (< -7 °C) lisättiin 20 minuutin kuluessa konsentraatioon 65% (p/p)-Linkoamisen jälkeen sakka lisättiin 10 mM:aan Tris HCl-puskuria ph 8 ja dialysoitiin 50 tilavuutta vastaan samaa puskuria 4 °C:ssa vaihtamalla puskuri kahdesti 24 tunnin aikana. Dialyysin jälkeen materiaali lyofilisoitiin ja saatu aktiviteetti oli 6000 TLU/g.

Samalla tavalla voidaan käyttää kaikkia muita kantoja jotka on mainittu esimerkissä 1, kuitenkin seuraavilla pienillä modifikaatioilla: kantaa Sp 9 varten voidaan käyttää vain kasvualustaa 1; käymislämpötila on 20 °C kaikille muille kannoille, paitsi kannalle IN II-5, jolle se on 20 tai 30 °C.

Esimerkki 4 26 8 9722

Stabiliteettikokeet käyttäen Pseudomonas pseudoalcaliqenes-lipaaseia ia 8 a ALL-base/1 35. 40 ia 50 °C;ssa Lähde: Jäädytyskuivattu supernatantti

Pesuaineliuos: ALL-base 8 g/1 pH: kuten ilmoitettu

a. Lämpötila: 35 °C

Lipaasikanta pH NPL/1 aika jäännös- xlO-3 (min) aktiviteetti (%) ° iöö

Sp 9 9 19 15 104 30 106 0 100

Sp 9 10,3 19 15 88 30 81 0 100 IN II-5 9 11 15 107 30 102 0 100 IN II-5 10,3 11 15 87 __I I 30 I 77_ 27 S9722

b. Lämpötila: 40 °C

Lipaasikanta pH TLU/1 tai NPL/1 aika jäännös- xl° 3 (min) aktiv. (%) o 100

Sp 9 9,0 14 15 102 30 99 0 100

Sp 9 10,3 14 15 93 30 83 0 100 IN I1-5 9,0 22 15 89 30 79 0 100 IN I1-5 10,3 22 15 76 30 57 0 100

Gr VI-15 10,3 5 15 74 30 61 0 100 M 1 10,3 2,8 15 63 30 68

c. Lämpötila: 50 °C

28 89722

Lipaasikanta pH NPL/1 aika jäännös- xlO-3 (min) aktiv. (%) 0 100

Sp 9 9,0 14 15 95 30 80 0 100

Sp 9 10,3 14 15 56 30 32 0 100 IN II-5 9,0 22 15 60 30 49 0 100 IN II-5 10,3 22 15 27 30 12 0 100

Gr VI-15 10,3 20,9 15 43 30 12 0 100 M 1 I 10,3 I 25 I 15 I 62 _I I_I 30 1 54

Esimerkki 5

Stabiliteettikokeet tiettyjen Pseudomonas_ pseudoalcaliaenes-lipaasien kanssa 4 a:11a ALL-base/1 40 ~ia 50 °C:ssa.

a. Lähde: jäädytyskuivattu supernatantti

Pesuaineliuos: ALL-base, 4 g/1 pH: kuten mainittu

Lämpötila: 40 °C

89722 29

Lipaasikanta pH NPL/1 aika jäännös- xlO-3 (min) aktiviteetti (%) -1---- 0 100

Sp 9 9,0 IA 15 102 30 102 .0 100

Sp 9 10,3 IA 15 109 30 98 O 100 IN II-5 9,0 22 15 100 30 99 O 100 IN II-5 10,3 22 15 96 30 82 b. Lähde: jäädytyskuivattu supernatantti

Pesuaineliuos: ALL-base 4 g/1 pH: kuten mainittu

Lämpötila: 50 °C

Lipaasikanta pH NPL/1 aika jäännös- xlO-3 (min) aktiviteetti (%) -,---- 0 100

Sp 9 9,0 IA 15 97 30 92 O 100

Sp 9 10,3 IA 15 77 30 62 O 100 IN II-5 9,0 22 15 100 30 88 O 100 IN II-5 10,3 22 15 60 ___30_A7_

Esimerkki 6 30 8 9 7 2 2

Stabiliteettikokeet Pseudomonas pseudoalcaligenes-kannan Sp 9 kanssa 6 a:11a TIDE/1 40 ia 50 °C:ssa Lähde: jäädytyskuivattu supernatantti Sp 9: stä

Pesuaineliuos: kuten mainittu, 6 g/1 pH: kuten mainittu

a. Lämpötila 40 °C

Pesuaine pH NPL/1 aika jäännös- xlO-3 (min) aktiviteetti (%) 0 100 TIDE minus 9,0 IA 15 118 30 115 0 100 TIDE minus 10,3 IA 15 106 30 107 0 100 TIDE plus 9,0 IA 15 129 30 127 0 100 TIDE plus 10,3 1A 15 118 30 105 3i 89722

b. Lämpötila: 50 °C

Pesuaine pH NPL/1 aika jäännös- xl0~3 (min) aktiviteetti (%) ---1-,-;--- 0 100 TIDE minus 9,0 14 15 107 30 107 0 100 TIDE minus 10,3 14 15 79 30 67 0 100 TIDE plus 9,0 14 15 120 30 127 0 100 TIDE plus 10,3 14 15 81 30 54

Esimerkki 7

Stabiliteettikokeet Pseudomonas stutzeri-lipaasin Thai iv 17-1 kanssa 5 q:lla ALL-base/1 40 °C:ssa Lähde: Thai IV 17-1 jäädytyskuivattu supernatantti

Pesuaineliuos: ALL-base, 5 g/1 pH: 9,0

Lämpötila: 40 °C

Aika(min) Jäänn, akt. (%) 0 100 25 109 32 89722

Esimerkki 8 Tämä esimerkki havainnollistaa lipaasikantojen Ps. pseudo-alcaliaenes Sp 9, IN II-5, Gr VI-15, M-l, ATCC 29625 ja Ps stutzeri Thai II-5 toimivuutta SLM-testin mukaisessa pesu-menetelmässä, jossa tarkistettiin näiden entsyymien yhteensopivuus moderneissa pesukoostumuksissa (TPP), pesu-jauhekoostumuksessa (ALLbase) ja nestemäisessä koostumuksessa (TIDE neste) läsnäolevan runkoainekomponentin kanssa .

SLM-testi suoritettiin kuten tämän selityksen sivuilla 20-21 on selitetty. Alustavat kokeet osoittivat, että käytetyissä olosuhteissa huomattava määrä lipaasien vaikutuksesta muodostuneita rasvahappoja yhdessä triglyseridijäännösten kanssa jäi tekstiiliin pesun aikana.

Edellä mainittujen lipaasien ja sokkokokeen käyttökelpoisuus testattiin SLM-menetelmällä seuraavissa olosuhteissa: - standardi hanavettä (STW) säädetty pH-arvoon 9,1 alkalilla.

- natriumtripolyfosfaattia (TPP): 2 ja 10 g/1 (pH 9,1) - nestemäinen TIDE: 2 ja 4 g/1 (pH 7,5)

- ALL-base: 2, 4 ja 8 g/1 (pH

9,2-9,6)

Lisätyt lipaasiaktiviteettiyksiköt (20 TLU) saatiin esimerkin 2 mukaisesti valmistetuista jäädytyskuivatuista näytteistä ja kannan M-l tapauksessa esimerkin 3 mukaisesti. Nämä olivat seuraavat: 89722 33

Kanta Sp 9 IN II-5 Gr VI-15 M-l ATCC 29625

Akt. 70 130 50 6000 35 (TLU/cr)_

Kanta Thai IV 17-1

Akt. 165 (TLU/q)_

Tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa.

A. Alkalinen Iinaasi: ei lainkaan (sokko)

Olosuhteet (g/1) Talteenotto (%) _Trialvseridit_ STW - 92,7 TPP 2 80,6 TPP 10 85,0

Neste-TIDE 2 63,5

Neste-TIDE 4 63,9 ALL-base 2 65,3 ALL-base 4 65,8 ALL-base_8_63.4_ 34 ^ 9 722 Β· Alkalilipaasit kannasta Sp 9

Olosuhteet (g/1) Talteenotto (%) _ Triglyseridit Vapaat rasvahapot Yht.

STW - 9,4 91,0 100,4 TPP 2 32,3 45,4 77,7 TPP 10 34,4 19,3 53,7

Neste-TlDE 2 23,1 25,3 48,4'

Neste-TIDE 4 29,4 20,2 49,6 ALL base 2 24,1 30,4 54,5 ALL base 4 34,6 21,3 55,9 c· AlKalilipaaslt kannasta IN II-5

Olosuhteet (g/1) _Talteenotto (%)__ _____Triglyseridit Vapaat rasvahapot Yht.

STW Ve« 3 88,6 TPP 2 11,6 61,0 72,6 TPP 10 39,3 6,3 45,6

Neste-TIDE 2 35 6 16,0 51,6

Neste-TIDE 4 37*8 13,3 51,1 ALL base 2 6,1 66,4 72,6 ALL base 4 20,6 30,6 51,2 -ALL base 8 44,1 11,0 55,2 o n 799

3 5 j J t L C

D. Alkalilipaasit kannasta M-l

Olosuhteet (g/1) _Talteenotto (%)_

Triglyseridit Vapaat rasvahapot Yht.

STW - 9,3 75,9 85,2 TPP 2 24,7 38,8 63,5 TPP 10 32,8 9,9 42,7

Neste-TIDE 2 33,3 12,0 45,3

Neste-TIDE 4 37,5 16,4 53,9 ALL-base 2 12,6 37,3 49,9 ALL-base 4 29,1 15,7 44,8 E. Alkalilipaasit kannasta Gr VI-15

Olosuhteet (g/1) _Talteenotto (%)_

Triglyseridit Vapaat rasvahapot Yht.

STW - 22,0 59,3 81,3 TPP 2 24,1 48,5 72,6 TPP 10 31,5 28,1 59,6

Neste-TIDE 2 49,3 9,5 58,8

Neste-TIDE 4 54,4 0,0 54,4 ALL-base 2 32,0 23,0 55,0 ALL-base 4 37,3 15,6 52,9 ,· > /·’ Γ-* Γ~. .**

36 " :·/ III

F. Alkalilioaasit kannasta ATCC 29625 (Citrullil

Olosuhteet (g/1) _Talteenotto (%)__

Triglyseridit Vapaat rasvahapot Yht.

STW - 2,8 102,5 105,3 TPP 2 3,8 89,0 92,9 TPP 10 42,9 13,0 55,9

Neste-TIDE 2 10,9 54,9 65,8

Neste-TIDE 4 19,2 27,2 46,4 ALL-base 2 24,7 40,5 65,2 'ALL-base 4 36,2 20,0 56,2 G. Alkalilipaasit kannasta Thai IV-17-1

Olosuhteet (g/1) _Talteenotto (%)___

Triglyseridit Vapaat rasvahapot Yht.

---—--- STW - 4,3 75,3 79,6 TPP 2 24,7 29,9 54,7 TPP 10 44,6 10,1 54,8

Neste-TIDE 2 21,2 29,3 50,5

Neste-TIDE 4 24,6 17,9 42,6 ALL-base 2 23,9 27,2 51,2 ALL-base 4 47,0 10,0 57,0 Näistä taulukoista käy selvästi ilmi että keksinnön mukaisilla lipaaseilla on lipolyyttisiä ominaisuuksia tekstiileissä ja erityisesti niistä käy selville niiden erinomainen käyttökelpoisuus nestemäisissä ja jauhemaisissa pesu-koostumuksissa pesuolosuhteissa.

Esimerkki 9 Tämä esimerkki osoittaa tiettyjen keksinnön mukaisten li-paasien ja valkaisuaineen tai proteiinia lohkaisevan entsyymin yhteensopivuuden pesuolosuhteissa. Lipaasien käyttökelpoisuutta testattiin SLM-menetelmällä, kuten on seli- 37 P97?2 tetty tämän selityksen sivulla 20 seuraavissa olosuhteissa: - ALL-base + valkaisuaktivaattori (TAED 3 %): 4 g/1 (pH 9,1) - ALL-base + TAED + valkaisuaine (NaB03.4aq, 13%): 4 g/1 (PH 9,1) - ALL-base + TAED + proteaasi (2000 DU/g pesuainetta): 4 g/1 (pH 9,1)

Lisätyt lipaasiaktiviteettiyksiköt (20 TLU) saatiin esimerkin 2 mukaisesti valmistetuista jäädytyskuivatuista näytteistä ja Ml-kannan tapauksessa esimerkin 3 mukaisesti (katso esimerkki 8).

Lipaasikannat: IN II-5, Ml. Gr VI-15 ja ATCC 29625

Proteaasi: MAXATASE. MAXATASE'n proteolyyttinen aktiviteetti (DU/1) määritettiin Delft-menetelmän mukaisesti, kuvattu julkaisussa J. Amer. Oil Chem. Soc. 60 (1983), 1672.

Tulokset, jotka ilmoitetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 8, esitetään seuraavissa taulukoissa: A. Alkalinen lipaasi kannasta IN II-5

Olosuhteet Talteenotto (%) _Triqlvseridit Vapaat rasvahapot Yhteensä ALL-base + TAED 4,4 62,4 66,8

ALL-base + TAED

+ valkaisuaine 5,7 64,5 70,2

ALL-base + TAED

+ MAXATASE_2j_2_61.1_63.3 8 9 72 2 38 B. Alkalinen lipaasi kannasta M-l

Olosuhteet Talteenotto (%) _Triqlvseridit Vapaat rasvahapot Yhteensä ALL-base + TAED 35,1 16,1 51,2

ALL-base + TAED

+ valkaisuaine 38,1 14,9 53,0

ALL-base + TAED

+ MAXATASE_41.5_10.0_51.6 C. Alkalinen lipaasi kannasta GrVI-15

Olosuhteet Talteenotto (%) _Triqlvseridit Vapaat rasvahapot Yhteensä ALL-base + TAED 42,0 7,4 49,4

ALL-base + TAED

+ valkaisuaine 43,2 7,5 50,7

ALL-base + TAED

+ MAXATASE_42.3_4_J>_46.9 D. Alkalinen lipaasi kannasta ATCC 29625

Olosuhteet Talteenotto (%) _Triqlvseridit Vapaat rasvahapot Yhteensä ALL-base + TAED 34,7 19,8 54,5

ALL-base + TAED

+ valkaisuaine 32,6 27,5 60,1

ALL-base + TAED

4- MAXATASE_36.4_22.4_58.8 39 g 9 7 9 ;· / t- c.

E. Alkalinen lipaasi kannasta Thai IV 17-1

Olosuhteet Talteenotto (%) _Trialvseridit Vapaat rasvahapot Yhteensä ALL-base + TAED 31,0 17,2 48,2

ALL-base + TAED

+ valkaisuaine 32,9 13,8 46,7

ALL-base + TAED

+ MAXATASE_32.5_16.1_48.6

Myös näistä taulukoista käy selvästi ilmi että keksinnön mukaisten lisäaineiden sisältämillä lipolyyttisillä entsyymeillä on lipolyyttinen aktiviteetti tekstiileissä ja erityisesti, että ne käyttäytyvät erinomaisesti nestemäisissä ja jauhemaisissa pesuaineissa pesuolosuhteissa.

Claims (16)

1. Entsymaattinen pesuaineen lisäaine, jonka aktiivinen komponentti on lipolyyttinen entsyymi, tunnettu siitä, että lipolyyttinen entsyymi on entsyymi, joka saadaan lipaasia tuottavasta kannasta, joka on Pseudomonas pseudoalcalicrenes CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85, CBS 473.85 tai ATCC 29625, tai Pseudomonas stutzeri CBS 461.85, tai niiden samanlaiset ominaisuudet omaavaa lipaasia tuottava mutantti tai variantti, jolle entsyymille on lisäksi tunnusomaista: a) pH-optimi välillä 8 - 10,5, mitattuna pH-mittarilla TLU-määrityksen olosuhteissa, b) sillä on tehokas lipolyyttinen aktiviteetti vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää pesuainetta aina noin 10 g/1 konsentraatioihin asti 60 °C:n tai alhaisemman lämpötilan pesuolosuhteissa, ja pH-arvossa 7-11.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsymaattinen pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää proteolyyttistä entsyymiä ja mahdollisesti amy-lolyyttistä entsyymiä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen entsymaattinen pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että lipaa-sin lipolyyttinen aktiivisuus on välillä 102 - 101 2 TLU/g lisäainetta.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen entsymaattinen pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että prote-aasin proteolyyttinen aktiivisuus on välillä 5 x 104 - 102 DU/g lisäainetta. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen entsymaatti 2 nen pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että se on granulaatin tai rakeiden muodossa. 41 39722

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen entsymaatti-nen pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että se on entsyymistabilisaattoria sisältävän nesteen muodossa.

7. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaista entsymaattista pesuaineen lisäainetta yhdessä pinta-aktiivisen aineen ja mahdollisesti muiden tällaisissa koostumuksissa yleisesti käytettyjen aineiden kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että sen lipolyyttinen aktiviteetti on alueella 1 - 20000 TLU/g koostumusta.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se lipolyyttisen entsyymin ohella sisältää proteolyyttisen entsyymin, jonka proteolyyttinen aktiviteetti edullisesti on alueella 50 -10000 Delft-yksikköä (DU)/g koostumusta.

10. Pesumenetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukaista pesuainekoostumusta, jolloin pesun aikana pH on alueella 7-11 ja lämpötila on 60 °C tai alhaisempi.

11. Menetelmä lipolyyttisen entsyymin tuottamiseksi, joka soveltuu käytettäväksi pesuaineissa, ja jolle entsyymille on lisäksi tunnusomaista: a) pH-optimi välillä 8 - 10,5, mitattuna pH-mittarilla TLU-määrityksen olosuhteissa, b) sillä on tehokas lipolyyttinen aktiviteetti vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää pesuainetta aina noin 10 g/1 konsentraatioihin asti 60 °C:n tai alhaisemman lämpötilan pesuolosuhteissa, ja pH-arvossa 7-11, tunnettu siitä, että viljellään lipaasia tuottavaa Pseudomonas pseudoalcaliqenes -kantaa CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85 tai CBS 473.85 tai Pseudomonas stutze- 42 p,9 722 ri -kantaa CBS 461.85 tai niiden samanlaiset ominaisuudet omaavaa lipaasia tuottavaa mutanttia tai varianttia niiden ravintoalustassa lipaasirikkaan liemen valmistamiseksi, minkä jälkeen eristetään lipaasi liemestä.

12. Pseudomonas pseudoalcaliaenes Sp 9, jonka talletusnu-mero on CBS 467.85.

13. Pseudomonas pseudoalcaliaenes IN II-5, jonka talle-tusnumero on CBS 468.85.

14. Pseudomonas pseudoalcaliaenes Gr VI-15, jonka talle-tusnumero on CBS 471.85.

15. Pseudomonas pseudoalcaliaenes M-l, jonka talletusnu-mero on CBS 473.85.

16. Pseudomonas stutzeri Thai IV 17-1, jonka talletusnu-mero on CBS 461.85.

17. Lipaasia tuottavasta Pseudomonas pseudoalcaliaenes -kannasta CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85 tai CBS 473.85 tai Pseudomonas stutzeri -kannasta CBS 461.85 tai niiden samanlaiset ominaisuudet omaavaa lipaasia tuottavasta mutantista tai variantista saadun lipolyyttisen entsyymin käyttö aktiivisena komponenttina pesuainekoos-tumuksissa tai entsymaattisena pesuaineen lisäaineena, jolle entsyymille on lisäksi tunnusomaista: a) pH-optimi välillä 8 - 10,5, mitattuna pH-mittarilla TLU-määrityksen olosuhteissa, b) sillä on tehokas lipolyyttinen aktiviteetti vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää pesuainetta aina noin 10 g/1 konsentraatioihin asti 60 °C:n tai alhaisemman lämpötilan pesuolosuhteissa, ja pH-arvossa 7-11. 43 8 9 72 2