DD249712B1

DD249712B1 - Verfahren zur herstellung von lipase

Info

Publication number: DD249712B1
Application number: DD29106886A
Authority: DD
Inventors: Bernhard Fischer; Hans-Peter Kleber
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1986-06-06
Filing date: 1986-06-06
Publication date: 1988-12-14
Also published as: DD249712A1

Abstract

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, das ein Enzym hoher spezifischer Aktivität und Anreicherung liefert. Die Aufgabe wird darin gesehen, durch Züchtung eines Bakterienstammes auf einem bisher nicht verwendeten Kultursubstrat das gewünschte Enzym herzustellen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, den Stamm Acinetobacter calcoaceticus auf wasseriöslichen Fettsäureestern als einziger C-Queile zu züchten, bei deren Abbau Fettsäuren entstehen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lipase, die in der Praxis zur Hydrolyse von Fettsäureestern verwendet werden kann.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, Lipase herzustellen. Zu diesem Zweck werden verschiedene Bakterien- und Hefestämme bzw. Pilze auf komplexen Medien (u.a. Bouillon, Molke, Maisquellwasser) kultiviert, die Bakterien durch Zentrifugation separiert und die Kulturüberstände zur Lipasegewinnung aufbereitet (Literatur z, B. Lipases, ed. B. Borgström und H. Brockmann, Elsevier, Amsterdam, 1984; 0.Haferburg, H.P.Kleber, Acta Blotechnol. 2,1982,4, S.337-342; dies., a.a.O.,3,1983,2, S. 185-186). Zur Lipasegewinnung eingesetzte Stämme sind z. B. solche der Gattung Rhizopus (Rh. spec.), Candida (C. cylindrical, Pseudomonas, Mucor, Aspergillus, Acinetobacter u. a. Die dargestellten Verfahren haben den Nachteil, daß durch Züchtung auf komplexen Medien die Lipase stark verunreinigt ist und zu ihrer Isolierung mehrere aufwendige Reinigungsstufen notwendig sind.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Enzymproduktion anzugeben, das es gestattet, ein Enzym mit wesentlich höherer Reinheit und spezifischer Aktivität zu gewinnen und so die Isolierung aus dem Kulturüberstand zu vereinfachen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, wesentliche bekannte Merkmale der bisherigen Verfahrensweise zu verändern und durch den Einsatz eines bisher kommerziell nicht verwendeten Stammes sowie spezieller Kultivierungssubstrate das gewünschte Enzym mit hoher spezifischer Aktivität zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß das Enzym Lipase aus dem Stamm Acinetobacter calcoaceticus hergestellt wird. Die Stammhaltung geschieht bevorzugt auf 3%igem Bouillon-Agar bei 4°C im Dunklen.

Die Kultivierung von Acinetobacter calcoaceticus erfolgt nach Beimpfen bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C, vorzugsweise bei 3O⁰C, in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium. Die Züchtung wird erfindungsgemäß auf wasserlöslichen Fettsäureestern als einziger C-Quelle durchgeführt, bei deren Abbau Fettsäuren gebildet werden. Solche C-Quellen sind z. B. Polyoxyethylen-sorbitan-laurat, -plamitat oder -oleat u.a. Als N-Quelle wird NH₄CI, (NH₄I₂ SO₄ o.dgl. verwendet. Nach einer Wachstumszeit von 5 bis 40 Stunden —je nach physiologischem Zustand und Menge des Impfmaterials—werden die Bakterien z.B. durch Zentrifugation separiert und der zellfreie Kulturüberstand gewonnen. Das im zellfreien Kulturüberstand bei erfindungsgemäßer Züchtung erhaltene Enzym ist im Gegensatz zu Kultivierungen auf komplexen Medien nur gering mit Fremdstoffen verunreinigt und besitzt eine hohe spezifische Aktivität (Tabelle 1).

Die Isolierung des Enzyms aus dem Kulturüberstand erfolgt an einem hydrophoben Trägermaterial, wie z.B. Octyl-Sepharose, wie folgt: Der gewonnene zellfreie Kutturüberstand wird bei 4°C mit kristallinem NaCI zu einer Konzentration von 1 mmol/l versetzt. Die Lösung wird auf eine mit Octyl-Sepharose gefüllte Glassäule gegeben. Die Lipase adsorbiert dabei an dem hydrophoben Träger. Fremdproteine werden nur gering gebunden. Nacheinander wird die Säule mit 1 mol/l NaCI in Phosphatpuffer (50mmol/l, pH7,5) und 50mmol/l Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Die Lipase wird durch eine 0,5%ige Lösung von Triton X-100 in 50 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,5, von der Octyl-Sepharose abgelöst 60% der ursprünglichen Lipase werden dabei 1Ofach angereichert gefunden. Das so erhaltene Lipasepräparat ist diskelektrophoretisch rein. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

Acinetobacter calcoaceticus (69 V) wird bei 30⁰C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium gezüchtet. Das Medium enthält pro Liter: 6,97K₂HPO₄,1,5g NaH₂PO₄,0,2g MgSO₄ · 7H₂0,7,5mg FeSO₄ 7H₂0,0,75mg MnSO₄ · 4H₂0,0,75mg ZnSO₄ · 7H₂0,0,15mg CuSO₄ · 5H₂0,0,15mg CoCI₂ · 6H₂O und 0,15mg Borsäure.

Ats Impfsuspension dient eine Abschwemmung von Bouillon-Agar. Als C-Quelle wird Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat in einer Konzentration von ЮтІ/І als einziger Kohlenstoffquelle und NH₄CI (3g/l) als N-Ouelle verwendet. Nach einer Wachstumszeit von 12h werden die Bakterien durch Zentrifugation (2000 χ g, 20 min) separiert und der zellfreie Kulturüberstand gewonnen. Zu diesem Kulturüberstand wird NaCI zu einer Konzentration von 1 mol/l zugegeben und die Lösung bei 4 "C auf eine Octyl-Sepharose-Säule aufgetragen. Die Lipaseaktivität verbleibt am Trägermaterial. Nacheinander wird der Träger mit 1 mol/l Natriumchloridlösung (in 50mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,5) und Phosphatpuffer, pH 7,5 gewaschen, bis kein Protein im Eluat nachweisbar ist. Das Enzym wird anschließend mit Triton X-100 (5g/l in 50mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,5) vom Träger gelöst. Das gewonnene Enzym ist diskelektrophoretisch rein. Die Isolierung der Lipase ist in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 1

Volumenaktivität, Proteinkonzentration und spezifische Aktivität der Lipase im Kulturüberstand von Acinetobacter calcoaceticus nach Wachstum auf verschiedenen Kultursubstraten

spezifische Aktivität

(цтоі/тіп/тд Protein) _

26 24 78

Kultursubstrat	Volumenaktivität	Protein
	(pmol/min/ml)	(mg/ml)
Bouillon	0,3	9,5
Polyoxy ethylen-sorbitan-
monolaurat	6,5	0,25
Polyoxyethylen-sorbitan-
monopalmitat	β,ο	0,25
Polyoxyethylen-sorbitan-
monooleat	26,6	0,34

Tabelle 2

Reinigung der Lipase (Kultursubstrat: Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat) von Acinetobacter calcoaceticus

Reinig.-stufe	Volumen (ml)	Protein (mg/ml)	Gesamtakt, (цтоі/тіп)	spez. Aktivität (цтоі/тіп/тд Protein)	Reinig, (-fach)	Ausbeute (%)
Kulturüberstand Triton X-100 Fraktion	190 30	0,34 0,13	5054 3040	78,2 779,2	9,96	60

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten des Stammes Acinetobacter calcoaceticus, dadurch gekennzeichnet, daß als einzige C-Quelle wasserlösliche Fettsäureester eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium kultiviert wird, nach einer Wachstumszeit von 5 bis 40 Stunden die Bakterien separiert werden und das Enzym aus dem Kulturüberstand abetrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliche Fettsäureester Polyqxyethylensorbitanmonooleat, -laurat -pal mi at, -öleat od. dgl. verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem zellfreien Kulturüberstand durch Chromatographie an einem hydrophoben Träger wie z. B. Octylsepharose eine Isolierung des Enzyms bis zur diskelektrophoretischen Reinheit erfolgt.