PT98578B - Processo para a preparacao de enzimas tolerantes a alcalis e de composicoes que os contem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 98 578

REQUERENTE: GIST-BROCADES N.V., holandesa, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Países Baixos

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ENZIMAS TOLERANTES A ÁLCALIS E DE COMPOSIÇÕES QUE OS CONTEM

INVENTORES: Brian Edward Jones, William Duncan Grant e Nadine Claire Collins

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América, 6 de Agosto de 1990, sob o N⁹ 07/562,863.

iNPI MOD. 113 RF 1C732

áescripão roforosite ' patasito da inven a* 3 le GJàl-llOOADld M.Y., iolandes-à, industriai a cossrcial, con sal» un datcrinasewep 1, ?.l. Box 1, 2500 00 Oelffc, Paísea

Oaiuos (inventoras: Brian 2d»ard Jones residente na Holanda a Oiliian Puncan Grant e ladino Olaira Collins, residentes aa Ta^latârra), para ”20002535 3Α5.Δ 1 raOAdâçSO 13 3312ΙΗΔ3 iOLElàlinS λ ALCALIS a 03 COLPOSIÇUSS Q35 03 000223· f presente invenção inscreve-se no o:.··'po da 'icrcbíologia a mais pnrticulnrmonte no ceo'-?o doo '•ícrocrpanisnos alcalifilieos.

ΔΡΪ2ΟΗ>~07.00 OA IlWaÇão

Or alcalifiios são definidos como orpenis.nos que sxibsir ura crescimento óptimo num ambienta de ob llcnlino, particular.oente cot valoras du pl superiores a 3, e '-•aruluante compreendidos ne intervalo entra pU 9 e 10. Os nl a·! ifil os pode· tam.bóv eer encontrados era ambientes que ovibou rn valor de p? irrito alto, fcnl como 12. Os alcnlifilos constrangidos são incapazes de crescer a un ob neutro.

Os elcalifilos pode? ser aecc;tr-.:_;-õos ’a aubiente^ cenrne, t~1 a u n no solo de perdias, \ ravsselsc.nta leeies i ccn~lpÕea alcalinas traaiientes eripiunlas por activilndc riolópica, tal cono fermentação .u-ondacal, redução uo sulfatos ou fotceeíntecs. {La fonte muito

FB ouis ric-a de uma raior variedade da orjnnisaos nlcalifílicos yode ser encontrada cn ambientes aXcalieos estáveis naturais, fecio como lagos de águas carbonatadas.

•bu estudo mais minucioso dos lagos d; águas carbonatadas e doa organismos alcalifíl.icoc na generalidade eueontra-oe em Grant, Avatha, J.E. e Jones, í.d. ((19Í0) FEJS Licrobiology Seviews 75, 255-270), cujo texto é m.ii incorporado para rafar macia. As listas de lagos d:.·, águas carbonatadas alcalinas podem encontrar-se nas putlicagães dc brmnt, d.D. e Tindall, â.J. a.a bicrobeo in Extreme Environmants (c'r. E.A. Herbsrt a S.A. Godd); Academic Press, Loadon, (1925), ρρ. 22-54; a Tindall, 3.J. em daloptiilic Bactéria, Volume 1, (ed, F. fíodrigu^g-Yalara}; CSC Press Inc., Boca .ir.ton, EL (1933), pp. 31-70, sendo também ambos os textos aqui imeerporados para referencia.

d', aicalifilos, a maioria dos çr'ic são espécies Sacillus, foram isolados dc aehiortco rãc t d’.i-:cc a cão trsfcacos or noricccbi, K. e Aâibn, T.

. ddcll jnllle Eie:’o arguais ca (dprigj.cr-Verlag, Berlim,

Lcidelbarp, Nova •claalixílicos de

Eorâ, (ldd’>). nablantce salinos· gndovic, o? e alcalinos, organismos tais coco

c.c, não são a,li trotedsg» do bactérias estrita.iente arcerábi.eas provenientes âe msâdeutea alcalinos hipersslinos, db.ssss descritos recenfceuante por Sâiòa, d. am Suparbugs (eas.

âorikosai e d.ô. Granfc); Jopan è-cientific cocieties Press, dodyo c opringer-Zerlag, x-crli.,, âeiuelbarg, ...ϊ,, (15.-1), p_?<. Is 1-211; e por âakatsugãss. A., ibiâ, gg« 212-220.

Os lagos âa águas earoonutacas, oca sc po^em encontrar -em diversos locais e-, todo o uun.go, são crrgg-con por uma combinação dc condições geológicas, ^co^ráxicas a climáticas. ^ão caracterizados pela presença uc pLiu-iti :U_,r>i> Lc C S OS. O S: _.. S S· (ou. LS SOU'· c^nplcnos) formados por concentração por via evaporativa, bem como pela corresponcante ausência du Ca² *e kg²* que teria-, removido os iões carbonato na forna cs ,;ais insolúveis. Outros sm.im, tais como cloreto fa sodio, poder; também concentrar-sa, resultando em ambientes que são simultaneamente alcalinos e salinos.

Apesar deste ambiente a^arentsmente hostil, os lagos de águas carbonatadas são todavia a residência da una grande população de organismos procariotas, alguns tipos dos quais podam dominar como núcleos p;rmanentes ou sazonais. Os organismos vão desde cinnobactérias alcalifílicas ató arqueobactórias ‘u.ioqanoalcalixXlicaE. ΔΙόη disso aão é invulgar encontraremos. tipos correntes ds organismos alcalifílicos habitando lagoa da ágeom carbonatadas *: várias localizações bastante dispnrsas através do mundo, tais como no East àfrican hift iailey, .ma parte ocidental dos estados Unidos, Tibete, China a ':’ã;rá.a. Per exemplo, forna isoladas e identificadas mstrouohactóriao em lagos dc água.? carbonatadas localizados na mbima (hang, D. e Tang, Q., **hatronognctsrium fro./ lo la Lakes ;d llinn” in Recaat Adviacam ln hicrohiml Eeology (Procomlings t.;s oth Intàrnaticncl £y:.:,s^f;03Z ou dicr-sbial dcology, eds.

2. dateori e.t al. )j Japa.; dcdontlílc Eoci^ties Press, hokyo, (imdp), pág. 61-72) o un rei dental dos dotados bhiidoo •dd-rbh, S. & Tindall. 2.J. (11?;) lp;tv:. Appl. bicroòiol., £ 2;7-251). Também se encontraram natronobactérias em lagos de *_'Λ.Ί3 carbonatadas localizados no Tibete (d. D, Srant, observações não publicada* o Índia (Igusani, V. a Decai, d. (dlhd) drch. Jicrobiol,, .m, pp» 511-555).

Cs alcalifilos já produziram impacto na aplicação da õicteciiologiu para a produção Ja produtos para o consumidor, ds enzimas tolerantes a álcalis pmnduzxdos por microorganismos alcalifílicos já tivera.; aplicação em processos industriais v ta,.; u,„ considerável _,^teucial econóiiiico. for exemplo, estes enzimas são aorreutenante utilizados sm composições detergentes a no curtimoato ae couro, o prevê-se quê vannam a tar aplicação na

imdáiSbrla alimentar, no tratãmentc dc resíduos e em indústrias torneeis. Adicionalmeuts os alcalifilos e os seus enzimas são poteneialnente úteis para biotransformações, especialmate na sínteses da enantiónieros puros.

iidádii ia ipyp.EçKc á presente invenção revela culturas puras da novas zuetérias aerotieas alcalifílicas, Grum-negativas. Estas bactérias foram isoladas de amostras ue fcwlo, água, sedimentos e aa certo número de outras fontes, tenso sido todas obtidas de lagos da águas carbonataras alcalinas, oa dos ses arredores. Estes alcalifilos foram eraliordós de acordo con os princípios da taxonomia numérica r^lutivamente uns aos outros e também en relação a uma grande v..riedade ds bactérias conue ci das a fim de confirmar o s^u carácter novo. Adicionalnente esta alasse taxon&nica fcacteriana é posteriormente circunscrito por una análise de várias cmrusterísticas quiuiotaxonónicas.

L presente invenção també?â revela dm cos da composição dor embiortes a partir dos puais foram cabidas as amostras contende cs míeroorgunismos, ben como cs r..sloz requeridos para o seus i„cim..cmto * cultura eficientes, u ..:o-do que qualquer especialista na técnica possa facilmente localizar ut: tal amãiaate c sapa capaz ds isolar os organismos dm presente invenção seguindo os proceuiuentos descritos na donstitui tamb cáii tLá objectivo da presente invenção revelar nieroorgauisnos ^oe produzem enzimas tolerantes a álcalis úteis, bem como os mstomos para a obtenção dλ composições ssseneiaimsntc puras destes enzimas. Ester euziinun sao capazes ue realizar as suas funções a valores altos t.-_ ;'·) 0 que os corna slngular»uance au-e^anuos para apneaçoes que requeiram estas condições extremas, for exemplo, os enzimas tolerantes a álcalis pouem ser empregues em composições

- 4 ^s:ifc33, ^atares, d:

rscíduos rata.tentos xcn como para biotrãnsfor:.iaç3os, t£ vnnntióneros puros.

> indústrias tsxteis, como a produção da

Oo ^aaas qua codificam estes enzitolcrantes a álcali;

eoauusidos ã expressão sm xespedeireo proporcionando una fonts iaCÍxátiCOS _br anda;

isolados, elonados a expressão compatíveis, e prOixUios

V* ti J .A D» mais xacaxmeut.

qua, se ce;

atifieados e usados &n várias aplicações industriais no caso '? -estripo natural não produzir quantidades suficientes do :usina desejado, ou não £ emente oca.

) ^:,'77^;: -d¹/¹* ^!. T r T ' 3 A‘f*

7-tfúy.*? •^'•íaL·· t> .dX .3? X w.

ddqrrn 1. Dendro^rama simplificado mostrando feixes (fenões) obtidos con o ceei icicnte S^s o processo ue libação por nédia não ponaeraua.

figura 2. Dendrograma simplificado mostrando feixes (fenões) obtidos com o coeficiente S _T e o processo da ligação por -.láliajenão ponderada.

xdjdtt d. Denárograiuâ siiaplixxc-ieo o.otido com o coeficiente áç e o processo de libação por média não ponderada utilizando o teste discriminatório mínimo derivado

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Amostragem

Foram isoladas várias centenas de estirpes de bactérias a partir de amostras do solo, de águas e sedimentos e de uma diversidade de outras fontes nos lagos alcalinos e nos seus arredores. Sstas amostras foram obtidas como parte de uma investigação ao longo de um período de 3

bactérias isolaaas suo ou>occ^riao nao lototroiicus.

Até no presente ear-acfccrizadas.

.»> viU òa ataria nao tinham

SÍu,O j2 1 encontrar-se lagos de A^uno carbonatadas ambientes semelhantes no iibste, China, mungria

As amostras foram recolhidas em sacos ds plástico esterilizados. a 0.,.100 tr U.ÍÍ1 foi realizada aos i^gon nlmentaita, x.aduru, foporia, drater (donachi), Little «uivasha (Oloidien), Aagadi, a Little Aagadi (aasikic fugida), _Haa sa localizam todos no quénia, África Oriental. ?odem também ds estias cozoonatamas alcalinas co>a o na parte ocidental dos fstados unidos. dm cada local de amostragem ./.odiram-sa parâmetros físicos tais como ph, conductividade a tamparatara, bem seno o aspecto físico do locai a da amostra. Aigam.es das amostras foram tratadas decaimento xias primeiras 3 5 moras depois da recolha da amostra, mas a maioria foi examinada lon_&o do local, algumas sacanas depois da recolha.

quadro 1 enumera varino estripes x.srum isolaaas. mo estripes estuo ngrupauas de acorno com o .ísico da própria ... análise

-tOÍ C, uA JL J--„.i. Ll - í

;.G£tx\ *

ealro

- .u„'Liu e o...3 rom -Zs :*t«. uo _tux..xicu nas auostras ua agua u.o lago.

icrní quadre o fornece uma lista das estripas isoladas, dispostas de acordo com os reoultados da wUalioa taxonómica numérica. Adieionuinente o quadro 3 fornece propriedades físicas ua amostra» em particular a temperatura, a c^amactibilidade e o pu alcalino, asm como os numerosos meios ,m. isolamento necessários para se obterem culturas puras ua novn bactéria. Astes meios não letras codificadas com referencia ao apêndice A.

quadros i, z e o xornecem canos o partir uoo quais se pouem caracterizar os ambientes dos locais da amostragem, is análises física e química das amostras confirmam a presença ae pL alcalino, oem como a presença de ó

rívoia in.vulgarpenta altos do do 2¾ > associados a baixos níveis dc Ca²⁺3 .»g^a+.

dão há análises químicas dijoocí/ais para aaostrau Io lo-íc. Glén disco cão há análises ^oíoicco disponíveis cara um oscasuo nú.-cro ue aaostrao (ver ^pmlro 1). Todavia, outros auoutrar tocadas no ucc.c local foram analisado,® e são descritas nos quadros i a 3, baba-se que os ambientas básicos dos lavor dc á_uuru carbonatadas são untáveis relativaaanta ao acu pd 0 oojpou-ição ióuica. nión luro, as populações ricrobianao encontradas nestes locais ;urrareeas auiplauent 3 estivais, Assim ' ds esperar que, apesar ma falta de uma análise química du na certo nwuaro ue amostrar, 0 âmuiemte Ie onde forar ertides ar bactérias poda ao untaaco rrr detrrainado a partir los dados apresentador nos quedros 1 a ê~ ·

ío euoctrao recontes de égca doa Inpoa Ia águas carbonatadas forem deporifadne o,., placar con u.,» '?in nutriente alcalino Casio d) imediatamente depois ns sua recaída. Λ iuspscção microrcé_;;ice mceurum una diversidade rurpreenJentcinsnte alta do tipoo de bactérias, dourileranao a maturrea extreranents alcalina dos ambientes, as contagens apresentaram núneros inesperada a er.tr altor de oactérins orpanotróficas, na para de Id- 1G^ unidades de formação ua colónias por ml. As r^outrau foram conservador quer arrefecidas, quer à temperatura ambiente. Após nua arratsaaqt-â ci_oumar semuas c r.émsro total ue bactérias xia mostra naúontou, enquanto que a diversidade de tipos decresceu.

álcaliiíliças ci;

lo ..ui 0.5.

c::

E;-?í4?		i.;0 3-Í».*. ti 7.-7 iy .^4^*11	Aspecto ca amostra	análise Onadro 2
1.1,	27.1,	Lake 7:l~entcitc	S·?.··;? do leito do	Ϊ.2.
4.1,	>2.1,	(çorti oriental)	1.,,.0
j ~ ·> ., . «- ,	SÓS.2,
Q -? 0	<* .··
«-* £ -...· » -. .í j	%.'· ; · <&
Ví Αίί» j	«Lil,	Lake Elmenteita	Sedimento e água	Ν.Ϊ.
VCÍ2		(parte oriental)	zona litoral
39η.3,	40E.3,	Lake Slmenteite	lama e água,	1
41fi.3,	42E.3,	(parte oriental)	zona litoral
44a.3,	521.4,		Snirulina sctwi.
5ÔÊ.4
452.3,	472.3,	Ififce Eldsntcita	égua onstansa ·.?
577.4		p5nto.no, ‘.Taco 72?	sediasnto
4C7.3,	52C.4	«	lasí; cinzenta	á.
5o^.4		LaKô Elmenteita	água e sedimento	3
		lado NW	arenoso,zona litoral
16κ,1,	17N.1,	Lake Nakuru,	lama e água,	N.T.
1 óii. 1 f	19W.1,	margem norte entre	zona litoral
201«1,	26N.1,	Hippo
2 ôis«1 j	wNl,	Point e Njoro
wE2, wHKl,	Point
WKKz.
49N.3,	50N.3,	II	coluna de água,	ή
610.4			zona litoral
517.3,	»* C, ·>·- r, .· .2, „» » O·	n	seaimeato do lago
			zona litoral
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Γ'ΠΛΒΐζΗ 1

JL - - i,- -4- jL <- é,/.- i.	.oca! co „o. oc orogom	U.-peeto 3c omostrc	-náli<.e iuadro ΐ
· έ4	ajdi.e zHKurujíuro, água,íundo salino a dw	Lama e água	η. 1.
62.1, 7S1, 9B.1, 104.1, 24B.1, 252.1, vBl wB2, vB4, wB5 wBn4	Lake Bogoria, bancos de lana a norte	Lama e água zona litoral	N.T.
V “Μ <· -i·	fl	!'w d. - i· i* Jk 0 s i Ϊ ,10 XO ku.0 •w -Ji X.’ .X Íl L· - Λ V	i» · ->r ·
õoís.4	<1	lama na iinna de água	5
	Lake Bogorio margem 3c	Lodo a água sona litoral	y, rp - i · «
X X -ω» «X $ X M U « X } & ./ ' j · X 9	orater JEíiág, norte	noc o a agua zona litoral	ií « X‘ *
Σόαΰ.Η, 73όΰ»4, 7 ou .4	M	II	ó
75C.4	H	lama carbonatada linha da margem	h.xk.
77LN.4, 78LN.4	Little Lake Naivasha,aargem sul	Coluna de água e sedimento	7
21*1.1, 22M.1, 27M.1	Lake Bsagadi caminho sobre o braço oeste	Lodo e água	N.T.
92LM.4, 94LM.4	Little Lake nascente a	água fresca e sedimento	3

* Κ.ΐ. * não ensaiado • N.R» = não relevante

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Análise quiraica de água dos la^os carbonatados do Quénia

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MEIO DE ISOLA-

QUADRO 3

ORIGEM DAS ESTIRPES DISPOSTAS POR FEIXES »

AMOSTRA

FEIXE ESTIRPE	LOCALIZAÇÃO	pll	TEMP.	CONDUCTIVIDADE
	lE.l01 as.i01			°c	mS/cm
1	Elmenteita	9.5	35	n.t.
1	Elmenteita	9.5	35	n.t.
1	wB2	Bogoria	n.t.	n.t.	n.t.
1	wB5	Bogoria	n.t.	n.t.	n.t.
1	wBs4	Bogoria	10.5.	n.t.	19
1	10B.1	Bogoria	10.5	36	45
1	20N.1	Nakuru	10.5	36	30-40
1	27M.1	Magadi	11.0	36	100
1	Comamonas terrigenaT (ncImB 8193)
1	wNk2	Nakuru	10.5	n.t.	19
1	Pseudomonas putida™ (NCIMB 9494)
2	39E.3	Elmenteita	10-10.5	23	13.9
2	41E.3	Elmenteita	10-10.5	23	11.3
2	45E.3CT	Elmenteita	10	27	11.3
2	47E.3	Elmenteita	10	27	11.3
2	51N.3	Nakuru	10-10.5	29	40.1
2	52N.3	Nakuru	10-10.5	29	40.1
2	42E.3	Elmenteita	10-10.5	23	13.9
2	50N.3	Nakuru _	10-10.5 29	40.1
2	Pseudomonas stutzeri1 (NCIMB 11358)
*	wN2	Nakuru	n.t.	n.t.	n.t.
-	Pseudomonas beijerinckii1	(NCIMB 9041)
-	4E.1	Elmenteita	9.5	35	n.t.
«»	5E.1	Elmenteita	9.5	35	n.t.
3	6B.1	Bogoria	10.5	36	45
A	7B.1	Bogoria	10.5	36	45
3	8B.1	Bogoria	10.5	36	45
3	38E.2	Elmenteita	n.t.	n.t.	n.t.
3	56E.4	Elmenteita	10-10.5	23	13.9
3	25B.1	Bogoria	10.5	36	45
3	26N.1	Nakuru	10.5	36	30-45
3	11C.1	Crater	9.0	30	10
3	wBl	Bogoria	n.t.	n.t.	n.t.
3	12C.1	Crater	9.0	30	10
3	ZÔN.l01’	Nakuru	10.5	36	30-40
3	61N.4	Nakuru	10-10.5	29	40.1
3	36E.3	Elmenteita	n.t.	n.t.	n.t.
3	40E.3	Elmenteita	10-10.5	23	13.9
3	65B.4	Bogoria	n.t.	n.t.	41.9
3	94LM.4	Little Magadi 9-9.5	81	35.0
3	19N.1	Nakuru	10.5	36	30-40
3	24B.1	Bogoria	10.5	36	45
3	21M.1	Magadi	11.0	36	100
3	29C.1	Crater	9.0	30	10
3	35E.2	Elmenteita	n.t.	n.t.	n.t.
3	37E.2	Elmenteita	XI· t·	n.t.	n.t.
3	48E.3	Elmenteita	10.0	27	11.3

h3 C| l-1 > > > > f O a 5*3 P3 > > > > !> > Ω ttf í> ί> i> > ί> I is-lJZiSSiaTIOTJfciCS ι > t í> í> í> > i> > > í>

QUADRO 3 (CONT)

ORIGEM DAS ESTIRPES DISPOSTAS POR FEIXES »

FEIXE	ESTIRPE	LOCALIZAÇÃO	pH	TEKP. COímDUCTIVIDADE	MEIO DE ISOLAMENTO
°c	mS/cm
3	78LN.4	Little Naivasba	8.5-9	30	1.2	G
3	73aC.4	Crater	n.t.	n.t.	10.2	D
3	75C.4	Crater	n.t.	n.t.	n.t.	H
3	73bC.4	Crater	n.t.	n.t.	10.2	D
3	74C.4	Crater	n.t.	n.t.	10.2	H
3	77LN.4	Little Naivasba	8.5-9	30	1.2	F
3	tóííl	Nakuru	n.t.	n.t.	n.t.	A
3	49N.3	Nakuru	10-10.5 29	40.1	Q
3	44E.3	Elmenteita	10.0	27	13.9	0
3	58E.4	Elmenteita	10.0	27	11.3	G
3	57E.4	Elmenteita	10.0	27	11.3	c
4	wE5	Elmenteita	n.t.	n.t.	n.t.	A
4	wB4^	Bogoria	n.t»	n.t.	n.t.	A
4	vNkl	Nakuru	10.5	n.t.	19	A
4	wEll	Elmenteita	10,4	n.t.	13	A
4	wEl2	Elmenteita	10.4	n.t.	13	A
5	9B.1	Bogoria	10.5	36	45	A
5	16N.1	Nakuru	10.5	36	30-40	A
5	17N.1CT	Nakuru	10.5	36	30-40	A
5	22M.1	Magadi	11.0	36	100	A
6	18N.1	Nakuru	10.5	36	30-40	A
6	59E.4	Elmenteita	10.0	31-33	12.7	G
6	64B.4C2	Bogoria	n.t.	n.t.	n.t.	E
6	63N.4	Nakuru	9.0	n.t»	n.t.	C
ó	53E.4	Elmenteita	10-10.5	23	13.9	G
-	92LM.4	Little Magadi 9-9.5	81	35.0	L
-	wBn5	Bogoria	10,5	n.t.	19	A

* Os feixes de niicroorganismos são obtidos por análise de acordo com os princípios da taxonomia numérica, utilizando o método S_G/ UPGMA (ver discussão adiante e fig· 1).

n.t. ³ não testado.

Os códigos de letras indicados para o meio de isolamento referem-se ao Apêndice A.

Aplicou-rm m...,a ampla diverslAnds d-a n-mlom ’s cnriquecimcsto z isolsments. Λ1_οηαε tos métodos xora.i previstos aspecíficamante paru o enriquecimento a isolamento ua (^etari-as alcalifílicas que oxidem tipos específicos da actividade enzimática a um pl alcalino. Outras técnicas ue xxàturesu mais geral foram aplicaras para o isolamento ua Avarsas espécies de lactárias alcnliiílicns. dm alguns casos -z-: condiçoes particulares prevalecentes nos la^os (quadro 2) ..·...-..í..* tor^uns n.i *23.m«.. -^ujúí*w us r~,.u_rr.-.r.... uo nt^criSncias para o isolamento ae 'bactérias.

Gs diferentes .ncios nutrientes vv.royncj pnr3 o isolamento das novas ductérias alcalifílicas r~o srslissoes veio A - meio p. ã composição úos diversos meios nsprspues está indicada no Apêndice A.

Gora o isolamento de bactérias tsqpretróficas slcalidíiiesr .-ão ,.„u^eciiicas as amostras de : · ..·. u.. 1 ·.* ηθ **' ·.*··) a s .. .^ C .1. «> 0 .... v _w...... .,.. .i_fc. □ u.m a a ç o e s , ·-..·;.:... r^licauas scmCC asar nutriente uicalino, pn ld-_vm ld,i v ,dv. i,). As As ss.s.ist*usis mais solida, lodo, ··.s.,isantos, etc, deras ;rim.,irs zczZzz en suspensão na..... caída rtriente alcalina (maio A) antac uo acra... aplicadas sobrte um

.. , , r nutriente alcalino (saio ...)» A., Gnctériac foram cultivadas s’.' . incubador aquecido, da preferência a -A-d» alguns casos amostras fora..» j.pOd--νο.ι.-Κί· «.· 3 numa calda nutriente

,.;.dsalinn (maio A) a as lactérias dom.., cultivadas com agitação, v_ prefer*ucia a 3/-C, dursuitu d a d uias, antes áe se espalmar ·:. malda sofre um agnr nutriente alcalino (meio A) para o d nlamauto ,.e colónias de bactérias»

Iara o isolamento de bueterias ulc-lixílicas enibiudo tipos específicos ua activiaaue ,.·_,.„ . ,1j. âs âaosvrâs a.ora.... '..tispèrsae sosrc o upar nutriente ί.· — wtiX—.ίο co 11.saustmtCs aspGCirxcos, tais como iseteairumine ou caseína ou azeito. Am alguns casos as • bactérias na amostra podem ser enriquecidas por um nia ou

várias semanas numa ca Ida nutrient a alcalina não especifica, tal como o meio A, antes de se dispersar a calda sobre um alcalino especifico para a detecção de exibam actividade enzimática, tal como a par nutriente 'octárias que actividade lipollfcica ou proteolítica.

ANálISE TAXOM&ÍICA estirpes da bactérias isoladas la.eos de águas alcalinos a dos terrenos adjacentes focam atribuidas ao tipo de bactérias conhecido como bactérias Sramnerativas, com base em (1) modificação de Pussault da reacção •na mancha do frui (Bussault, H.P., (1995) J. Bacteriol., 70, 414-425); (?) o teste de sensibilidade ο Κ0.Π (Gregersen, 1., (1975), Sur. J. Appl. Aicrobiol. and Biotech. 2 123-127; ’-alebian, S. et al. (1991), J. Clia. nierohiol., 13, 444-448); (3) a reacção à aninopeptidaso (Csroy, O., (1976) fur. J,

Zçnl. Microbiol., 3, 223-225; ibid (1978) 2« 113-122); e an uitos casos a confirmação também nn boss de (4) ura análise puinonas (Golliuc, Ϊ5.Γ. b Jou.es, D., (1931) Microbiol.

ⁿav., 22» 316-354) utilleaudn o --'todo descrito por Gollins,

d.f. em Cbenical Metbpds in Paetç-íal Bystenatics (eds. M. ?03dfôll0tf & D. Jifíuikin) ; ·« ?f.7-2u^;d, Acaíevic Press, London,

1^25.

d s 70 estirpes foram ensaiadas unto a 104 caracteres. ?s resultados foram nnclisaJos i’tili7.sndo os prircipics la faacntnxs nu.2rica (Sneath, 2.Π.Λ. e Pobnl, P,2., en Ihamerlcol Taxcnpuy, u.b. Prseman S- Co., São 7ra.nci.sco, 1973). Os caracteres ensaiados s o modo como foram ersaiados são apresentado> ro Ap*?dica ?. Adicionalmeata c -pãndicr 7 indica o .íoí.o co '-C cada carácter foi codificada _ara s análise fcsrrnárica.

Co-Ό po inventores não tf conhecimento de eubactárias 7rr~'-rnp;itív3s alauilifílicaa, não fotofráficas, estritas ou corstrnn^ifnn, eouvenioutmente

; '' · ? · ) ( ·.· í i - · ’’ * / < .t.) \ ,· ♦ V ♦ J

V- «L. « z \ X · Z · / k · · v . ) \ ·(»/' k-t . . J dovaxt?^'· dCTdd 'ItA?

.7’3u..’Tí-..'.·?·.'/.:^ .v?tá.da^A dT '< 9Λ.34 •:?5eut*o<'i-nísçí 1135:’ *dcAifs”’? fclar^aa est.ir^a da. dniversióa-i.s Ά

JLi ti X C kÀ ...ítJ. lJ viorxo ecA-ticr-j. ; ' : ^x./ /-i

j. X íj V X — w*lC j.«-í íX X -dt'. X 1. -,ς. A X U- -.1 -;.-I „ ’ ., . *? X >.* X 4Í4' .· 'V £\COttiti3 Vai^jiiju j.i>“ “' ,.. ivu ~ Λ Õ^r\Z- JL d V_- /. X .J. _L, í: .i. ·.· :.,. 5. i jC » £ Λ. d A <4iwâ CJ.-3 XdídX d Ciíi.ta¹ iibxú iv-Oi>.5 xiel. ix*.o .'**'?. v, .. ju «, *, , <f ».'.

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Jd'uêi. v./lv X &» X Zrir JLa Χ» -i %£· -£* â· '1 L·* X V X \Z W *' xxXôb&ÍdÍÍ3 yslaudlOílXU XaXw iJwv-J (, ».·íiéÍ2v-jaíiSX i _xâiniii „ivci ' .t ..·....·,

Citrooscter xrxx..i^xi- ^vxd ;.'/>>

^errátiã íNtreenden^· ^uí. x^ii λ^ι3£ν<ί£Χ·.ίϊ0ϊϊί13 jieXJáriilC .<XX^x siviriJí naioiuonas elonvatã Λϊυν 3^173 *?í:v3 'itiira ití íza-va Ί*. ^v2 ^?:;.d*' <a·· ”·iA'i coala;· o aa a„ évalií»ção da senelhaace taxonó-M-ca

Oç dados fonéticos, consistindo on 104 caracteres unitários, fora«s escalonados como se .indica no àpenõice C e dispostos na fornia ee '.n.a ©atriz n x t, cujas t colunas represente·?· as t estirpes de oactérias a agrupar na “ase de semelhanças, i cujas n linhas '~o os caracteres unitários. A se^el^npa texooáaicu nas estirões hncteriae.is foi e'·1ί .-.eds por meio c.a oa» coeficiente de similaridade (3neata, ?. ^:a 1. e Rokal, ?.« 1., Tão^erícel „axono···/, obra citai?, oáps.

114-1:7). Pnbcre tos!®⁹ sido utilizada© muitos coeficieots1 'if erentes per-j a clas.cific.’·)&·? rioló^ire, .npea.es oa nó nn c-cshso tem utilisί^Λί?ο r-'^vlar en decfccriolo^ie* Escolhemos a •-oliceção de dois coeficientes ds cscocicçio (Sncath, f. a. 1., ¹ ?ο-ηηί, i. 1., onaa cifcoí?., iVè ·? sepuintes) noaen”uarate

o.t coeficientes de foaer c Jaecnri. t;stes te-··¹ sfa trooneatemente eolicodoc à análise -⁴-g dedos bacteriológicos o ic'* uma omnle aceitccsc oni o o esnecâalistes na notório, u.?3. voo .-na vrovatan fornecer c.lcnsificac^co sóldnos.

•?n flos codificados forc -acaliccdon utilizando n ponho**·? ó?. ntobrares TÓXPAX (^r‘echin,

f.d., Procrammss for clersificetion ar·-'· identificatioc”» In fathpdo in Llerobiolo??,, fcl-an 19 (oó.c. h.h. Coiro 11 -? '--ri^orovo), pp, 459-494, Ac^ictic Press, London, ^19^7)) executndos num compnto.dor ?.··? ·.·.'; na driversideds le Lcicoster, foi construi'’a sl-.U-eri^o^e pnre todo? cn lc o.·; ti .>t ► , J. -·? .* ·· . | d Coror (C_;) eco '* a -- Λ ’--··τ- ( η ’-'·. 1· ·

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Ι'Ί-Ιόΐ) ?tilinnn.a o l/atr^acnto 'ri ?'rí;· ' raceis o caiaria lon •rj2 nutri:?. ts er utilizando o àtir ca ’ aunr,;õu i ·, · ·· , ' ' .:

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aa? c .a.il epraarítoac.

cc-3fici2r.te Go?er foi oscol?!*¹? 77· orefsrSncia sohrs oxtros ca toiois a ?: p a? ..atriz?:· .'.

t.dtosv?! 3 tods? 22 tâ. 1.; esr^etod? a 1 .atados, ?ác:LiUsa U-aiT í, .. .. ti-ÚSÍtíiO ,

-1 ?j'lôo ' ' âlsdiaiíto foi ióilíEâà utíliES.ito i ???? ã? soac-srao? co? 0 aljorids; (..1), tosto':? oaaaail? o?.?? 0 jrso-to' astostoa (óOLisaâ daaaas 1 · >..i---- . - . . ..· :...*· X 3- .:........« si-silsrxdad·? porque ' a -1 x... ? 2 , í oj: e ?...'. 2 ? o. t2

2 oualitotxv??) ;

3.

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.totado ia probos d;

à 2-32Í3S arit.· 2 tica.2 .-.a d3 di.t3do .' i. 22-2;) 3.32 30 L 2 OdO 3 3.1d rosuito.a ia análise de feitas ' u. ..-alojarasa, do -usl 33 atatos a vortoa siaplisioto2 ?..if_.i 1 daidrogtaa ..aocra ?a totai?· le ;s si ai?! eato? 3. tatirsas õoaeerisaa'. ... 2.3:1 ir 33332.2 ' o: tido ..toilisaato

[.λ.,..;;.? _:..dd.a!? 2; 1 iid

-1=: tr'..,;.,; .. ....2--1 j„ 00 O , ' .«J: ,O .

C. -. 32.,33.., ...,UÍ tlcsJCuOÚO 02.3 2. 33,2.3-. 3 Í.2 O 1.3 J Sig ΟΠ'ΧΧΟ.; 1) '.

c. ...ir.aaivvj ^aio ,2.2 to.·?- cana a-a-s... ?;...xtc:nc3, 2 cotoliea«.Oõ o. 1. . --3^-.2 .. X<3'.!..CÍa (_fu5iti»v ” 1, 3 Í_oi2 tiV 3 — -·) 2ύΙ*Χ.: £ΐιίυ;ι.ί3ί>Ί..χ· taolioja a 2 eotoitosato: a toccato Cd/a (lautos, í.li.: tosto Γ.,’,, 2.32 eitaa, · pá, 151) aa-aaondo 0 çoo^raa todtoto., a. 11 . toi odtila 3.2 outro jaáaa? otiliraols o tototo... c.2. 3 o.aão JFtolto 2 £ο1·“3όί.ίϋύο da d ld. e.„ 'torto, o. a auã &ó -aliiicr.1-3 dest-o -tonlrodraja está rsuaistito:?,.: ?is fig. 1. ' tototoui . forrse? 2 sertontauas to a-tocos positivos tcs C 3.a£-23-..3 a. C23.» toixx.

Iaialtoto.00 ia análise to íõir??

i.to3-;.3 , /.,1 ... A

V

À fig» 1 aosfcra os resultados aa análise ao feixes, baseada uo coexieieata ue Gower e no &étoào • libwá, ue zd oactérias aicalifílicas novas, Gram-negativas,

do 3 terreno?

iaoladas ds lopoo de á:a.mr sdeclinas í oavolaat · , caja^amta am 23 àrctériam vrrãa-aaaativa 0. 73. 7331..77, hmtdriro oicaliflílicmo, .₂jc almlíixlica’, mo asm/ma ao fciáial.

ma!

:.ss 70 ratírpva aiaílatiâaáa . .: 733* daoir a escolho ao xíval 73;' par- η -’,ίναΐ 3; uolinoo^nC po&.:a :ar arditráriu, ostá e.a aoacurdaaci/ co.a o prática corrente í . íaaamãm:: nmaáriea C„-cctic, 3. :. rricst» f., in ama ,raaa3 deirdolá;

ria

Icxon . Ον. 3., (IS :5)), ria?;rc a aívol i-.feria.· íris, eo;a:i ar ^rap-m x 3;,.;ii,;rrios, expmiía pos .aa v r arltiplicidada 3o faiae..; :

7C.' :a fainas iniivi333i„. ma,;.;

-¹ -. -araaaa,

Cofia?-amo am am-maa

V» 4, '..J mmemmam n.itidsnê;me nm maaim^m, mporior praCaaixi, r 3 -a 3 a fia i 3 os. Ao uí ve1 :.: -mammiaar .macros 'rociariam:

ilea 3i.a'·., a aipaificâaai.:, 3a dmaamãa da diaa aval a pci .. am 3,..3 aaadâmacçãa im ioáaa .-,.- / - m i ,-, .1. · í. j « ai daaaáàm ía ama.....;

aa.. ..

arma o eoaicx m rivel áe 73,. 5 a^aiada fato praraa t,m’m v ai .iaicâucia 3a toraaçmo ^ml-m ra.ailtalos ao pmpu ^ãfim Sacia aa to 3. o a a... mma

ã. amá-.icos 3a mims (camramaaaam A ou mia mtirms) aa í márapram mr??'O por 31m3? cma fiataneim Saaliu3?uju a. ^.-.aaaa, ou os seus cmmlaxantos, roam amida. d propam. a?;.., a., Z i auc aa xáim r-~-j Aimr aarárima. .3 'am foi òatadaiacida aa uivai j2>;.

m.i3 rc p<

a acpar.ipão loa feixes £ altuaente significativa.

mauro

m.^ârleaccie doa feixea ^arrlos pala uétmm m/ppGup faruacido

Feixe separado	de Feixe	ao nível de significância de
1	2	p * 0.99
1+2	3+4	p · 0.99
1+2+3+4	5+6	p < 0.90
1+2+3+4+5+6	controles	p » 0.99
5	6	p « 0.99

Uma medida adicional da separação de feixes pode ser estimada a partir da probabilidade de sobreposição de feixes* Esta foi obtida utilizando o programa OVERMAT em TAXPAK com a sobreposição critica ajustada a 2,5%. Cojao se pode ver do quadro 6 há uma probabilidade superior a 95% de menos do que 2,5% de sobreposição entre os feixes. Para a maioria de combinações de feixes a sobreposição é efectivamente nula. Apenas os feixes 3 e 4 têm uma pequena probabilidade de <2,5% de sobreposição, mas estes feixes podem ser facilmente distinguidos um do outro com base em dados quimiotaxonámicos (ver adiante).

Quadro 6

Percentagem de probabilidade de a sobreposição dos feixes ser <2,5%

Feixe

Os controles mostram, como se esperava, que a análise de feixes agrupa as Enterobacteriaceae

- 19 separadamente. Adicionalmente as espécies Aeromcnas e Pseudomonas, incluidas como controles, também se agrupam separadamente. Isto é perfeitamente consistente com a taxamonia corrente organismos (Bergey* s Manual of Systematic Bacteriology, Volume 1, Williams and Wilkins, BaItimore/London, 1984).

Cinco das estirpes alcalifílicas ficam de fora dos feixes principais. Duas estirpes, 4E.1 e 5E.1, formam um par separado mas relacionado e estão obviamente associadas com os grupos principais de bactérias alcalifílicas. Â estirpe wN2 também não está abrangida por qualquer feixe mas está aparentemente relacionada com uma espécie Pseudomonas e os principais fenSes de bactérias alcalifílicas. As estirpes 92LM.4 e WBn5 não se associam com os principais fenães alcalifílicos e provavelmente representam grupos distintos de novas bactérias alcalifílicas.

Os feixes 1 e 2 são os únicos fenões que mostram uma associação com organismos conhecidos, isto é, as espécies Pseudomonas e Comamonas. A separação de Pseudomonas putida e Pseudomonas stutzeri em grupos taxonámicos diferentes está perfeitamente de acordo com o conhecimento taxonómico corrente destes organismos (Palleroni, N.J. et al, (1973), Int. J. Systematic Bacteriol., 23, 333-339; Gavini, F. et al, (1989), ibid, 39, 135-144; Bergey*s Manual of Systematic Bacteriology, supra).

Torna-se evidente a partir do dendrograma original que Pseudomonas stutzeri é uma espécie marginal* ao feixe 2 e não está intimamente relacionada com os outros membros do feixe. Isto pode ver-se quando as distâncias Euclideanas das estirpes a partir do centroide do feixe são calculadas e usadas para o cálculo do raio do feixe. (Sneath, P.H.A. e Sokal), R.R., obra citada, págs. 194 e seguintes). 0 raio do feixe é 3,91 (nível de confiança 99%) e a distância média das estirpes desde o centroide é de 2,84

(desvio padrão 0,46). Pseudomonas stutzeri a uma distância do centroide de 3,91 está nitidamente nos limites reais do hiperespaço fenético que define o feixe 2.

É possivel uma discriminação nitida entre os feixes 1 e 2 utilizando o conceito do teste discriminatório mínimo (ver adiante),

Cada uma das estirpes alcalifílicas no feixe 2 foi examinada por dois laboratórios independentes especializados na identificação de bactérias, nomeadamente o German Culture Collection (DSM), Braunschweig, Alemanha) e o Laboratório de Microbiologia da Universidade de Tecnologia de Lelft, Holanda. Nenhum destes laboratórios foi capaz de fornecer uma identificação positiva das estirpes, embora ambos concordassem que existia uma semelhança com Pseudomonas, quer colocando-se no grupo de homologia de ARN I (Palleroni, N.J. et al, obra citada) ou mais concretamente nos grupos Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcaligenes ou Pseudomonas psaudoalcaligenes (Gavini, F. et al, supra). Todavia, não se conhece qualquer espécie Pseudomonas que seja capaz de crescer nas mesmas condiçSes altamente alcalinas (pH 10) como as novas estirpes aqui descritas. Foi feita uma tentativa para cultivar Pseudomonas pseudoalcaligenes¹ psm 50188 e Pseudomonas alcaligenes^ dsm 50342 num meio de calda alcalina (meio A, Apêndice A) mas sem qualquer exito.

Os resultados destes especialistas, conjuntamente com as descobertes aqui descritas, indicam claramente que estas estirpes alcalifílicas nos feixes 1 e 2 representam novas espécies de bactérias.

Os faixes 3, 4, 5 e' 6 são fenões discretos que se distinguem uns dos outros com base no teste discriminatório mínimo (ver adiante) e em marcadores qui-niotaxonómicos (ver adiante). Estes fenões não exibem similaridade significativa com grupos conhecidos de bactérias,

UH4MUMUVH

e deste modo representam novos géneros ou espécies*

Âs configurações de proteínas celulares inteiras geradas por electroforese PAGE indicam que um certo número de estirpes provavelmente são idênticas. Os exemplos incluem; IE.1^CT e 2E.lj 6B.1, 7B.1 e 8B.lj 45Ε.3^ΰϊ _e 47E.3. 0 dendrograma revela que estas estirpes estão relacionadas com um valor Sg médio de 92,3%, indicando um erro de teste provável de 3,8% (Sneath, P.H.A* e Sokal, R.R., obra citada). Às estirpes 73bc.4 e 74C.4, que parecem estar intimamente relacionadas (90% Sg têm configurações de gel semelhantes mas não iguais.

Método Sj/UPGMA

O coeficiente de Jaccard é um complemento útil ao coeficiente de Gower, visto que pode ser utilizado para detectar fenões no último gerados por emparelhamentos negativos, ou distorções devidas à atribuição de pesos indevidos a dados qualitativos potencialmente subjectivos. Consequentemente o coeficiente de Jaccard é útil para confirmar a validade de feixes definidos inicialmente pela utilização do coeficiente de Gower. 0 coeficiente de Jaccard é particularmente útil para a comparação de organismos bioquimicamente não reactivos (Austin, B., e Priest, F.G., obra citada, pág. 37.

No essencial todos os feixes gerados pelo método Sg/UPGMÁ sao recuperados no dendrograma produzido pelo método Sj/UPGMA (fig. 2). Embora a composição dos feixes seja virtualmente idêntica em ambos os dendrogramas, um número reduzido de estirpes mudou de posição* As estirpes nao abrangidas por feixes 4E.1 e 5E.1 deslocam-se para o feixe 1/5, as estirpes 42E.3 e 5GN.3 deslocam-se do feixe 2 para o feixe 3/4. As estirpes wNK2, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, wE5 ficam não abrangidas por feixes.

Não surpreendentemente, a transformação Sj combina os feixes (Sq) 1 e 5» Ambos estes feixes são caracterizados como consistindo era estirpes moderadamente não reactivas bioquimicamente. Todavia, os feixes 1 e 5 são nitidamente distintos» 0 feixe 1 consiste em estirpes que produzem colónias circulares de cor creme/beige, enquanto que as estirpes do feixe 5 produzem exclusivamente colónias irregulares de cor amarelo brilhante.

Além disso a transformação Sj agrupa a maioria das estirpes do feixe 4 com as estirpes do feixe

3. Todavia, é evidente a partir dos dados quimiotaxonómicos (ver adiante), que mostram que as estirpes do feixe 4 contêm Q9 e as estirpes do feixe 3 contêm principalmente Q6, que estes feixes não deveriam ser combinados uma vez que contêm estirpes distintamente diferentes» Por estas razões é considerado que a divisão em feixes produzida pelo método Sg/UPGxúÂ é a melhor representação do estado taxonómico real destas estirpes. Contudo, o método Sj/UPGIúA serve para destacar que, com a única excepção de uma espécie Comamonas, nenhuma das espécies conhecidas, nem mesmo as estirpes de controle Pseudomonas, apresentam qualquer semelhança significativa com os feixes das novas bactérias alcalifílicas.

Definição quimiotaxonómica dos feixes

A quimiotaxonomia é o estudo da composição quimica de organismos em relação à sua sistemática. A análise do ADN cromossómico, do A&N ribossómico, de proteínas, paredes celulares e membranas, por exemplo, pode proporcionar perspectivas valiosas das relações taxonómicas a podem ser usadas como ura instrumento adicional para construir ou verificar as taxonomias de rnicroorganisrnos (Goodfellow, K. a Ainnikin, D.E. in Chemical Methods in Bactéria! Systematics, (eds. Goodfellow, M. e Minnikin» D.E.), Academic Press, bondou a Orlando, FL, (1985), pp. 1-15). Todavia, nem sempre é possível decidir à priori qua tipo de informação quimica será

melhor como diagonóstico para uma dada classificação. Os Iipidos polares anfipáticos, as principais quinonas respiratórias, os ácidos gordos localizados nas membranas bacterianas e a análise do ADN cromossámico são factore3 tendo todos eles significãncia taxonómica para a classificação de várias bactérias (Lechevalier, ii. e Lechevalier, &.P., in Nicrobial Lipids, volume 1 (eds. Ratledge, G. e Wilkinson, S.G.) Academic Press, London e San Diego» GA, (1988), pp. 869-902).

Lípidos polares

Á extracção dos lípidos polares a partir de bactérias e a sua análise por cromatografia de camada fina bidimensional (2D-TLC) pode fornecer configurações de valor em diagonóstico. As células de fases estacionárias foram extraídas com CHGlgíCHgOH Ιϊΐ (v/v) e examinadas por 2D-XLC como é descrito por Ross, Grant, λ’.D. e Harris, J.E., in Chemical Methods in Bacterial Systematics, (eds. Goodfellow, 11. e Minnikin, D.E.), Academic Press, London e Orlando, FL. (1985), pp. 289-300. Os tipos de lípidos presentes nos croroatogramas foram visualizados utilizando uma variedade da tintos diferenciais Ross, et al., supra, p, 291; e Tricone, A., et .al., J. Gen. Microbiol., (1990), 136, pp. 2327-2331). A identidade dos componentes foi confirmada por co-cromatografia com lípidos conhecidos.

Os resultados desta análise para estirpes representativas de alcalifilos Gram-negativos são apresentados no quadro 7. Estes nSo mostram qualquer configuração de lípidos polares nítida que seja distinta para qualquer dos feixes. Todas as estirpes contêm fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, fosfato ce fosfatidilglicerol e fosfatidiletanolamina, Adicionalmente algumas estirpes, particularmente no feixe 3, contêm sulfato de fosfatidilglicerol (PGS). A distribuição de PGS no interior do feixe 3 coincide amplamanfce com a estrutura de subgrupos

suspeita do feixe, evidente a partir dos dados fenéticos e outros dados quiraiotaxonómicos. 0 PGS á por conseguinte um marcador não exclusivo para o feixe 3.

Descobrimos, surpreendentemente, que uma maioria das bactérias continha um glicolípido o qual, com base em numerosas análises co-cromatográficas, é aparentemente comum às bactérias Gram-negativas da presente invenção. Anteriormente não tinha sido demonstrado que os glicolípidos estavam presentes em bactérias alcalifílicas (Krulwich, T.Â. et al, CR.C Criticai Reviews in Microbiology, (1988), 16, 15-36). Além disso, como se deduz por co—cromatografia de lípidos obtida a partir de várias estirpes, o glicolípido é também encontrado em alcalifilos Gram-positivos isolados de lagos de águas carbonatadas, ê possivel, por consequência, que á a estrutura quimica do glicolípido possa ser um marcador quimiotaxonõmico para os alcalifilos constrangidos·.

QUADRO 7

COMPONENTES DE LÍPIDOS POLARES DE BACTÉRIAS ALCALIFÍLICAS

GRAM-NEGATIVAS

FEIXE	ESTIRPE	PG	DPG	PGP	PE	PG3	GL	AL	UPL
	IE.1CT	+	+	+	+
	2E.1	4	+	4	+		+
1	1OB.1	+	+	+	+		3+
	20N.1	+	+	+	+		+
	27M.1	+	4		+		+
	wNK.2	+	+	+					+
	39E.3	+	+	+	+		4
	41E.3	+	+	4	+		+
	45E.3CT	+	+	+	+		+
2	51N.3	+	+	+	4		+
	52N.3	+	+	4*	+		+
	42E.3	4	+	+	+		+
	5ON.3	+	+	+	+	4
	P.s.	+	4	+	+
«R*	5E.1	+	+	♦	+	+	+		+
	6B.1	+	+	+	+			+
	7B.1	+	+	+	+		+
	8B.1	+	+	+	+		+
	25B.1	+	+	+	+		+
	26N.1	+	+	+	+		4
	12C.1	+	+	+	+		+	+
3	28N.1CT		+	+	+	+
	36E.2	+	+	+	+	+	+
	4OE.3	4*	+	+	+	4	4
	94LM.4	+	+	4	+	+	4
	19N.1	+	+	+	+		4
	24B.X	+	4	+	+		+
	21M.1	+	+	+	+		+

FEIXE	ESTIRPE	PG	DPG	PGP	PE	PGS	GL	AL	UPL
	29C.1	♦	4	+		*
	35E.2	+			+	4·
	37E.2	+		+	+	4	4
	48E.3	+	+	+	+	4	4·
	73aC«4	+	+	+	+	+	+
	74C.4	4	4	+		+	+
	49E.3	+	4	4	+	4·	+
	44E.3	+	+	+	+	4	+
	58E.4	+	+	+	+		+
	wE5		+	+	+	4-
	wB4CT	+	+	+	+
4	wNkl	+	+	+	4			4·	4
	wEll	+	+	+	+			+	+
	wE12	+	+	+	+				4
	9B.1	4	+	+	+
5	lóN.l	+	4		+
	17N.1CT	+	4	+	+		4
	22M.1	+	+	+	+
	18N.1	+	+	♦	4		+
	59E.4	+	+	+	+
6	64B. 4G^	+	+		4
	63N.4		4	+	4-
	53E.4	4		4	+		4

(PG) fosfatidilglicerol; (DPG) difosfatidilglieerol;

(PG?) Tosfato'de fosfatidilglicerol;

(PE) fosfatidil etanolamina;

(PGS) sulfato de fosfatidilglicerol;

(GL) glicolípido não identificado, a-naftol positivo (o número na coluna indica o número de manchas positivas na placa de TLC);

(AL) asiino-lípido não identificado (ninhidrina i>ositiva);

(uPL) fosfato-lípiuo (s) nao identificado (s);

- 27 — gSS2B33

Quinonas isoprenoides

Aa quinonas isoprenoides ou respiratórias são componentes caracteristicos da membrana plasmática de bactérias aerábicas. Há dois tipos; menaquinonas e ubiquinonas. 0 valor das quinonas isoprenoides como critério taxonémico reside na variação no comprimento das cadeias laterais poliprenílicas e no grau de saturação (Collins, M.D* e Jones, D. (1981) obra citada.

Células bacterianas liofilizadas como fase estacionária foram extraídas, utilizando um processo modificado de Collins, M.D. (em Chemical in Bacterial Systematics, obra citada, págs. 267-284) em CHCl^iCH^OH líl (v/v) a 50^aC durante 16 horas. As quinonas foram examinadas por cromatografia de camada delgada em fase inversa como é descrita por Collins, M.D. (obra citada).

Os resultados das análises das quinonas de quase todas as estirpes de alcalifilos Gram-negativos são representados no quadro 8. Todas as estirpes ensaiadas continham exclusivamente ubiquinonas, o que confirma o seu estado como bactérias Gram-negativas (Collins, M.D. e Jones, D., obra citada). 0 quadro 8 mostra muito nitidamente que a maioria das ubiquinonas são Q6 e Q9. É também evidente que as estirpes que contêm Q6 são exclusivas do feixe 3 e que esta circunstância distingue o feixe 3 de todos os outros feixes, uma vez que contêm estirpes que possuem Q9 como a ubiquinona principal.

- 28 QUADRO 8

PRINCIPAIS QUINQNAS RESPIRATÓRIAS DAS ESTIRPES DISPOSTAS

POR FEIXES

EEIXE,	1	PEIXE	2	FEIXE	3
ESTIRPE	Q	ESTIRPE	Q	ESTIRPE	Q
1E.1CT	Q9	39E.3	Q9	6B.1	Q6
2E.1	Q9	41E.3	Q9	7B.1	Q6.	Q9
wB.2	Q9	45E.3CT	Q9	8B.1	Q6>	Q9
wB5	Q9	47E.3	Q9,	Q1O 38E.2	Q6
wBs4	Q9	52N.3	Q9	56E.4	Q6
1OB.1	Q9	42E.3	Q9	25B.1	Q6,	Q9
20N.1	Q9	5ON.3	Q9	26N.1	Q6
27M.X	Q9			12C.1	Q6
C.t.*	JQ8+Q9(t){			28N.1CT	Q6
wNk2	Q9			61N.4	Q6
P.p.í	|Q9|			36E.2	Q6

4QE.3 Q6, Q9

65B.4 Q6

94LM.4 Q6, Q9

19N.1 Q6, Q9

24B.1 Q6, Q9

21M.1 Q6

29C.1 Q6

35E.2 Q6

37E.2 Q6

48E.3 Q6

78LN.4 Q6

73aG.4 Q6

75C.4 Q6

73bC.4 Q6

74C.4 Q6, Q9

77LN.4 Q6

49E.3 Q6

58E.4 Q6

57E.4 Q6

FEIXE ESTIRPE	4 Q	QUADRO FEIXE ESTIRPE	8 (CONTINUAÇÃO)	6 Q	FEIXE- ESTIRPE	Q
5 Q	FEIXE ESTIRPE
wE5	Q9	9B.1	Q9	18N.1	Q9	wN.2	Q9
wB4CT	Q9	16N.1	Q9	59E.4	Q9	5E.1	Q8
wNKl	Q9	17N.1CT	Q9,Q10	64B.4g^·	Q9	92LM.4	09
wE.ll	Q9,Q10(t)	22M.1	Q9	63N.4	Q9	wBn5	Q8»Q9(t)
wE12	Q9	22M.1	Q9	53E.4	Q9

Q » ubiquinona, o número indica o número de unidades isopreno de cadeia lateral.

(t) vestígios : C.t. “ Comamonas terrigen^· NCIMB 8193, o resultado da quinona é obtido de J. Tamaoka et al, International Journal of Systematic Bacteriology, 37, 52-59, (1987).

P.p. - Pseudomonas putida^T NCIMB 9494, o resultado da quinona é obtido de M.D, Collins e D. Jones, Microbiological Reviews, 45, 316-354, (1981).

Ácidos Gordos

A análise dos perfis de ácidos gordos tem tido um impacto significativo sobre a classificação das bactérias, especialmente na circunscrição de géneros e espécies entre bactérias Gram-positivas e actinomicetos (Kroppenstedt, R.M., in Chemical Methods in Bacterial Systematics (eds. M. Goodfellow e D.E. Minnikin), Academic Press; London e Orlando, FL, (1985), pp. 173-199); Lechevalier, ti. e Lechevalier, M.P., supra.

Células de fase estacionária liofilizadas (200-300 mg) foram extraídas durante 16 horas a 75^SC em toluenoimetanol;ácido sulfúrico concentrado (2,5ml:2,5ml;0,2ml) e depois do arrefecimento os lípidos foram

- 30 diluídos em hexano (2 vezes Iml). 0 ácido residual foi removido utilizando NH4HCO3· Os extractos lipídicos foram concentrados em atmosfera de azoto isenta de oxigénio, foram dissolvidos em 300 ul de hexano e foram aplicados em placas de sílica-gel preparativas (Merck F254, tipo T). Às placas foram desenvolvidas em hexano: éter dietílico 85:15 (v/v) e os ésteres metílicos dos ácidos gordos foram isolados por raspagem da placa, extraídos com hexano e concentrados sob uma corrente de azoto isento de oxigénio»

Os ésteres metílicos dos ácidos gordos foram dissolvidos em heptano ε foram analisados por cromatografia em fase gasosa utilizando um cromatégrafo Packard modelo 439 equipado com detectores de ionização de chama» As amostras foram divididas por um splitter” de amostra e analisadas simultaneamente em duas colunas, designadamente uma coluna CP-SIL-88 (Chrorapack) (comprimento 50 m, diâmetro interno 0,22mm) e Ultra-2 (Hewlett/Packard) (comprimento 50m, diâmetro interno 0,20mm). 0 gás de arrasto era azotoj a temperatura de injecção é 120^aC; gradiente de temperatura: 2,5^aC por minuto até 240^sC e isotérmico a 240^aC durante 30 minutos. Os ésteres metílicos dos ácidos gordos foram comparados com referência a misturas padrão conhecidas. A identidade de alguns picos foi confirmada por meio de cromatografia em fase gasosa-espectrometria de massa utilizando um cromatógrafo de fase gasosa Cario Erba HRGC 5160 série Mega equipado com uma coluna CP-SIL-88 (comprimento 50m, diâmetro interno 0,22mm) utilizando hélio como gás de arrasto e injecção directa na fonte de um espectrómetro de massa AMD 403.

A composição em ácidos gordos de bactérias Gram-negativas individuais representativas são apresentadas no quadro 9« 0 quadro 10 mostra os perfis de ácidos gordos individuais de cada um dos feixes. Os feixes 1,2,3 e 4 são bastante típicos da maioria das bactérias Gram-negativas, sendo o principal ácido gordo saturado C16:0, com quantidades mínimas de C14:0 e C18:0. Os principais ácidos gordos insaturados nestas bactérias alcalifílicas são C16íQ e C18:l (11-eis) o que também é tipieo, bem como a falta de ácidos gordos ímpares (wilfcinson, 3.G. in Microbial Lipids, volume 1 (eds. Ratledge, C, e Wil&inson, S.G.), Academic Press, London e San Diego, CA, (1988) pp. 299-488).

Encontram-se quantidades mínimas de ácidos C17:0 e C19;0 de ciclopropano em algumas estirpes de bactérias Gram-negativas. As estirpes do feixe 3 exibem perfis de ácidos gordos bastante simples, contribuindo Gí6:0 e C18:l com 67 a 88% dos ácidos totais, e perfazendo Clóxi mais C18l0 até 20% do restante. Mesmo assim as configurações de ácidos gordos apoiam a ideia de que o feixe 3 contém vários subgrupos, uma conclusão que também se pode inferir a partir da análise fenética (taxonomia numérica) e da análise de lípidos polares (quadro 7).

As estirpes do feixe 1 podem ser distinguidas das do feixe 2 com base na abundância relativa de ácidos gordos saturados e insaturados de cadeia linear, bem como pela quantidade em percentagem de C18:l (ll-cis). As bactérias alcalifílicas dos feixes 1 e 2 têm perfis de ácidos gordos mais complexos do que as do feixe 3, com muitos mais componentes minoritários. A partir da evidência da taxonomia numérica as estirpes alcalifílicas dos feixes 1 e 2 exibem alguma semelhança com espécies Pseudomonas. Todavia, a ausência total de qualquer ácido gordo hidroxilado, que são típicos da maioria das espécies Pseudomonas, reforça a ideia de que é duvidosa uma relação próxima.

As estirpes dos feixes 5 e 6 são notáveis pelo facto de, além de conterem quantidades abundantes de C16x0, os outros ácidos gordos maioritários serem ácidos gordos de cadeia ramificada de ordem impar (40-85%), Também estas estirpes' apresentam uma falta significativa de quantidades de C18il ou quaisquer outros ácidos insaturados que • estão presentes em quantidade apreciável nas estirpes

- 32 alcalifílicas dos feixes 1,2,3 e 4. A presença de grandes quantidades de ácidos C15;0 e C17:0 iso e anteiso, é característica apenas de um número muito reduzido de classes de bactérias Gram-negativas, nomeadamente espécies oriundas de ambientes exóticos tais como Thermus, ou espécies taxonomicamente mal definidas tais como Flavobacterium (Wilkinson, S.G., obra citada). Este resultado sublinha ainda mais o carcácter novo das estirpes alcalifílicas da presente invenção. As estirpes dos feixes 5 e 6 podem ser distinguidas umas das outras pela proporção de ácidos gordos de cadeia ramificada que contêm e mais especialmente pelas proporções relativas de ácidos gordos de ordem impar e de ordem par.

COMPOSIÇÃO EM ÁCIDOS GORDOS DE ALCALIFILOS

GRAM-NEGAIIVOS

FEIXE
ÁCIDO GORDO	1E.1CT	2E.1	45E.3CT	SOE.3
10.0
12:0	t	t	3.6	4.7
12:1	0.2	0.3
13.0			<0.1
14:0	0.7	0.7	3.8	3.9
14:0 iso
14:1	2.6	0.9
15.0.		0.3	0.6	0.9
15.0 iso			0.1	0.2
15:0 anteiso			<0.1	0.3
15.0 ciclo
16:0	29.0	32.0	28.5	34.4
16:0 iso		0.3		0.2
16:1	7.4	9.6	4,1	4.3
17:0	0,5	2.3	0.9	1.1
17:0 iso			0.2	0.6
17:0 anteiso
17:0 ciclo			0.4a	1.8
17:1	0.3	1.6
17:1 br				1.7
18:0	12.0	4.7	17.9	10.8
18: o desconbecid	o 0.2	0.4
18:1 9-cis	0.2	t	0.5	0.3
18:1 9-trans	0.5	0.6	5.9	2.9
18:1 11-cis	42.0	44.0	23.9	24.1
18:1 desconhecido	0.2	0.3
18:4			0.5	1.9
19:0			o.r
19:0 ciclo			4	1.3
19:1 br
20:0	0.4		5.3	2.7
20:1	3.6	1.2
22:0			3.3	1.5
24:0			0.2,

+ » % ácidos gordos totais t = vestigios br» ramificado a » C17 ciclo ou C18:0 desconhecido

Ç A. . X « / éíja;

FEIXE	3
ÁCIDC	> GORDO	25B.1	28N.1UX	36E.2	248.1	37E.2 i	i 43E.3
10:0			0.4
12:0			0.5	0.5		0.3	t
12:1
13:0
14:0		4.5	4.4	3.4	2.6	2.9	2.6
14:0	iso
14:1			0.1
15:0		0.7	0.6			0.9	0.3
15:0	iso
15:0	anteiso
15:0	ciclo
'16:0		37.3	24.1	42.0	36.7	33.3	26.0
16: o	iso
16:1		11.6	15.0	10.0	5.8	3.4	3.0
17:0			0.2			1.2	0.3
17:0	iso
17:0	anteiso
17:0	ciclo					1.8	0.3
17:1		0.6
17:1	br
1. ‘:		8.9	0.2	0.9	2.0	0.6	1.1
l'.‘:C	..esconhecido
18:1	9-cis		t	t	t	0.6	t
1 c*: 1	9-trans	2.4	0.2	t	1.0	3 ♦ o	0.6
18:1 ll-cis	27.5	54.2	43.0	50,6	41.6	57.7
13:1
18:2 desconhecido ι í .. n	2.7			0,5	t	t
1 ✓ « V 15:0	ciclo		0.4			12.9	2.0
19:1	br
20:0		2.4
xh u · X
22:0		1.4
24:0

+ - % ácidos gordos totais t - vestigios br - ramificado a = €17 ciclo ou C18: o desconhecido

FEIXES	4 5
ACIDO GORDO	WB4CT	WE11	9B.1	16N.1	17N.1CT
10:0	0.5
12:0	0.9	0.2
12:1		0.8
14:0	3.8	1.3	3.2	1.9	1.2
14:0 iso			0.7	t	t
14:1		0.1
15:0	0.7	0.2
15:0 iso			8,7	9.3	8.2
15:0 anteiso			32.3	27.1	35.3
15:0 cicio	< 0.1
16:0	26.8	26.9	22.5	17.4	12,5
16:0 iso			4.7	5.6	6.7
16:1	7.9	2.4
17:0	0.4	0.3
17:0 iso		0.3	3.2	6.0	5.1
17:0 anteiso			21.9	24.4	29.8
17:0 ciclo	0.2
17:1	< 0.1
17:1 br
13:0	5.2	3.5	2.3	5.3	1.2
18:0 desconhecido
13:1 9-cis	t	2.5
18:1 9-trans	1.7	0.9	»0.5	»1.6	»1.0
id:i ll-cie	47.4	48.1
13:1 desconhecido
18:2	1.0	0.3
19:0
19:0 ciclo	1.0
19:1 br		11,2
20:0	1.3	0.4
20:1		0.3
Í2.0	0.3	0.2
24.0

• * inclui todos os isómero» (13:1) t * vestígios br * ramificado a » C17 ciclo ou C18: o desconhecido

FEIXE	6	NAO PERTENCENTES A *ΈΙΧ£§
ACIDO GORDO	59E.4	64B.4CT	5E.1	92LM.4
10:0 12:0 12:1 13:0 14:0	3.9	6.4	3.8	1.5
14:0 iso 14:1 15:0	0.7 t	2.0 3.8	t
15:0 iso	3.9	12.6		44.0
15:0 anteiso	24.8	18.1		9.9
15:0 ciclo 16:0	26.3	40.5	74.7	18.7
16:0 iso	2.4	3.7		2.1
16:1 17:0 17:0 iso	t 0.6	2.4 1.7	2.9	15.7
17:0 anteiso	6.1	3.7		6.8
17:0 ciclo 17:1 17:1 br 18:0	16.2	4.8	2.6	1.5
18:0 desconhecido 18:1 9-cis 18:1 9-trans	* 5.7	*0.5	5.9 *10.0
13:1 11-efs 18:ldesconhecido 13:2 19:0 19:0 ciclo 19:1 br 20.0 20:1 22:0 24:0	2.7 4.6 2.6

* inclui todos os isómeros + %ácidos gordos totais t vestígios br ramificado a C17 ciclo ou C18í o desconhecido

JPE2FIS DE AGIDOS DOS FEIXES DF ALCALIFÍLICOS GRASÍ-NEGAITVOS

II

Λ ramificado

- 38 #

ΙΑ

Η t-» 1- ί ο

ϋ ο

s»„i α

<3 θ' tn

Μ

X H Ε=3 &4

-4^- cn

Μ		*s	*S		i ρ	>«		;,Μ
,η		ο	Ο	Ο	ο		ο	η	ιη
		Ό	r4	CM	CO			\Ο	<ί
ο	ο
··	·»	1	V	1	1	ί		1	1
ΙΛ	Ό
ι—4	ι—1	tn		ο	ο			ιη	tn
ο	C0	tn		1-4	CM			ιη	<*3

Ο	ο
ω		05
Ή		•Η
β)		Ο	> >5 *. >	èM	m?.	fci		s.-o us		SM
44		44	Ο	CM	O	tn	O	o	tn	O
α		β	cn		CM	Ό	r**		cn	O
α	ο	©
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tn	ο	r-
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O	«Ό									Γ-	<35
i—1	i—l	O	o				CM			ρ—1	1-1
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05
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44
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β
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ts						Tf				•pf
O						ίΊΜ 4.U				co
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O						«pf				O
k						4-f			Ϊ4	•pf
Ot						•pf			0	O
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03			0			ci)		0		Tf
O			O			54		Oh	«H	0
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O			$4			44		—	β	©
<2)		0	S			β		0	0	k
		k	44		O	Çl		o	._*s	o
05	u<	β	0		0	g		54	54	Ό
O	o	44	w		•pf	t—f	0	0	0	«
--v’·	-ι	•S	,-l ·. t			V	p4	r)	0	O
•H		0	•pf	o	•M	44	u			k
o	A	t	1	0	β	O	•pf	a	a	0
<5	\z	tí	β	•pf	0	44	O	β	β	S

ramificado

Η

Μ χ>

Ácidos nucleicos

Um componente essencial de qualquer estudo taxonóroico á uma análise do material genético - os ácidos nucleicos. A composição do ADN eromossómieo não & afectada pelas condiçtSa3 de crescimento do organismo e uma análise apropriada pode confirmar ou refutar a posição taxonómica do organismo. 0 ADíT eromossómieo pode ser analisado pela determinação da composição de bases (G + C Xmolar) de estirpes individuais, e as homologias de sequências de bases entra pares de estirpes por reassociação ΑΓΠ-ADN (hibridizaçâo (,73a, S.J. e Pitcher, D., in Chemical nethods in Bactsrial Syategatics (eds. M. Goodfellow s D.2. Minnikin), Acaderaic Press, London e Orlando, FL (1985), pp» 67-93).

Composição de bases de ADÍT

A composição de guanina mais citosina (G+C imolar) é constante para o ADN eromossómieo do qualquer organismo determinado. Os organismos intimamente relacionados têm composições G+C semelhantes. Todavia, os resultados G+C têm que ser interpretados dentro do contexto de dados taxonóinicos independentes, visto que valores G+C imolar semelhantes de amostra de ADN provenientes de organismos diferentes não implicam por si só a sua relação biológica.

ADN foi extraído de células cultivadas na fase de crescimento exponencial em meio A pelo método do clorofórmio: fenol e foi precipitado com etanol. A composição de bases foi determinada pelo método da desnaturação térmica (íiarmur, J. e Doty, P. (1962) J. Mol. Biol., 3_» 585— -594) num espectrofotóraetro Philips modelo PV8764 com programação de temperatura. Um segundo método envolveu a análise HPLC num aparelho Beckman System Gold utilizando uma coluna Beckman Oltrasphare ODS e dihidrogenofosfato de potássio 0,04 M mais acetonitrilo (9+1, v/v) como eluente, com um débito . de 1,5 ml/min, após tratamento do ADN com nuclease PI e

- 40 QUADRO 11

COMPOSIÇÃO DE BASES DE ADN DE BACTÉRIAS ALCALIFILICAS

FEIXE	ESTIRPE	G+C % molar HPLC	1 TM
1 i	2E.1 wBs4 20N.1 WNk2 1	55.2 51.1	51.2 53.0
2	42E.2	62,7
3	wBl rT 28N.lbi 37E.2 wNl	64.1 67.1	63.0 64.8
4	wE5r„ wB4bi wNkl wEll wE12		58.5 65.3 61.0 59.7 58.1
5	17N.1CT 22M.1	50.0 43.8
	64B.4CI 53E.4	41.0 37.6
non	wN2 wBn5		64.1 54.6

Hibridização molecular ADN-ÂDN

O método utilizado foi essencialmente o de Grosa, J.H. et al, (int. J. Systematie Bacteriol», 29» 328-332, 1979). Foi preparado ADN marcado com trício utilizando um conjunto para *nick-translaction* (Amersham, N5000) de acordo com as instruções do fabricante. As misturas de reassociação foram incubadas a 65^SC durante 16 horas, Os resultados são apresentados no quadro 12, a partir do qual se pode ver que a homologia da sequência de ADN é maior no interior dos feixes do que entre os feixes.

QUADRO 12

HOMOLOGIA ADN-ADN INIER-FEIXES E INTRA-FEIXES VALORES PARA

BACTÉRIAS ALCALIFÍLICAS GRAM-NEGATIVAS

FEIXX |		1	2	3	4	5	)é.......1
1	ESTIRPE	2E.1	45E.3CT	28N.1CT	wE12	CT 17N.1	648.4°*
1	2E.1 20N.1	100 56		33	35	25	25
2	45E.3CT 42E.3		100 76		25	30
3	28N.1CT 56E.4 21M.1 37E.2 44E.3	20	34 37	100 51 53 55	26	30	30
4	wEl2 wB4^*			41	100 43	í 1	1
5	17N.1°* 22M.1	45	AA	36	24	100 65	44
6	64B.4CT 53E.4	21	31	35	25	34	100
	SS	17				20	20

Os valores fornecem a hibridização em percentagem entre as estirpes (linhas) e as estirpes marcadas com H³ (colunas).

SS * ADN de esperma de salmão.

- 42 Determinação das estirpes representativas centroide de cada feixe individual gerado pelo método Sç/dPGLA foi analisado era computador utilizando o programa RGROUPS em TAXPAK. 0 centroide de um feixe de pontos representando organismos reais projactado no hiperespaço representa um organismo médio hipotético. 0 centroide raramente representa um organismo real, ou mesmo não o representa. Por conseguinte as distâncias Euclideanas de cada uai dos membros do feixe a partir do centroide do feixe foram calculadas com o fim de estabelecer qual a estirpe mais próxima do organismo médio hipotético. A estirpe mais próxima do centroide foi designada como organismo centrotipo (indicado com o índice superior CT).

organismo centrotipo pode ser considerado como a estirpe tipo” que mais especificamente representa as características essenciais e discriminantes de cada feixe particular. As estirpes centrotipo estão registadas no quadro 13.

QUADRO 13

ESTIRPES CENTROTIPO

FEAXÊ Fs	NS DE ESTIRPES NO FEIXE	DISTANCIA EUCLIDEANA MÉDIA DAS ESTIRPES DESDE	CENTROTIPO J
DISTANCIA EUCLIDEAΝΛ DESDE 0 CENTROI ESTIRPE DE
0 CENTROIDE	DESVIO PADRÃO
1	11	3.67	0.30	1E.1 2.88
2	9	3.20	0.52	45E.3 2.30
3	34	3.52	0.32	28N.1 2.90
4	5	3.97	0.29	wE4 2.87
5	4	3.25	0.29	17N.1 2.13
6	5	3.11	0.41	64B,4 1.93

- 43 Foi feita unia descrição de cada um dos 'organismos centro tipo de modo a poder-se distinguir estes organismos de todas as outras bactérias anteriormente conhecidas e descritas. Adicionalmente foi também avaliado por computador o número mínimo de testes discriminatórios para definir cada feixe, de modo que pode ver-se nitidamente que os feixes que contêm estas novas bactérias podem ser facilmente distinguidos uns dos outros e da todas as outras bactérias conhecidas.

«DESCRIÇÃO DAS ESTIRPES CENTROTIPO

Estirpe 1E,1^CT (feixe 1)

Uma bactéria em forma de haste, Gram-negativa, móvel aeróbica, 1,7-3,3 pm x 0,5-0,7 pm.

Àlcalifilo constrangido, cresce melhor entre plí 9 e pH 10*

Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, de côr creme, inicialmente translúcidas mas que se tornam opacas passados alguns dias. As colónias são circulares, inteiras ε convexas, com 2-3 de diâmetro.

Em calda alcalina (meio A) o crescimento (37²C) é floeulento com a formação de um sedimento e peiicula superficial* ientamente a 10-15^aG

Cresce bem entre 20^aC e 40^sC Não há crescimento a 8^aG ou 45²C.

Cresce

Seste de KOH: aminopeptldase oxidase catalase:

tolerância a NaCl:

uidrólisa de gelatina:

positivo fracamente positivo negativo positivo % a <8%.

Não há crescimento a positivo

- 44 hidrólise de amido: positivo priticipais componentes lipídicos polares: fosfatidilgliceol difosfatidilglicerol fosfato de fosfatidilglicerol fosfatidiletanolamina principal ubiquinona: Q9 principais ácidos gordos: 016:0, 018:0, 11-cis 018:1

Quimioorganotrofo. Cresce em substratos complexos tais como extracto de leveduras e peptonas. Crescimento muito restrito sobre açucaras simples a* ácidos orgânicos (por exemplo, crescimento observado apenas sobre ribose, sacarose e piruvato).

i

Estirpe 45E.3^C-Í· (feixe 2) · ~

Uma bactéria em forma de haste, Gram-negativa, aeróbica, 3-4,5 pm x 0,6 jum. Móvel com um flagelo polar simples.

Alcalifilo constrangido crescendo entre pH 7,8 e pH 11,2. Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias molas, opacas, de cor creme, 1-2 mm de diâmetro. Às colónias são circulares, convexas e inteiras.

Em calda alcalina (meio A) o crescimento (37^aC) é lento, com turvação uniforme, película superficial e sem sedimento.

Cresce lentamente a 10^eC

Cresce bem entre 20® Não há crescimento a 8^SC

C e 40⁹C. ou 45^aC.

teste de KOH: aminopep tidas e: oxidase: catalase:

tolerância a NaCl:

positivo positivo positivo positivo

0% a 12%. 0 crescimento a 12% é lento

Não há crescimento a 15% hidrólise de gelatina: positivo hidrólise de amido: positivo (fraco) principais componentes lipídicos polares: fosfatidilglicerol principal ubiquinona: principais ácidos gordos:

difosfatidilglicarol fosfato de fosfatidilglicerol fosfatidiletanolamina glicolípido (^-naftol positivo) Q9

C16:0, C18:0 11-cis C18:l

Quimioorganotrofo. Cresce sobra babstratos complexos tais como extracto de levedaras z poptonas. Não cresce sobre açucares simples. Cresce sobre ácidos orgânicos (por exemplo), fumaratos, succinatos, piruvatos, acetatos, lactatos) e alguns ácidos gordos (por exemplo, propionatos, valeratos) e aminoácidos (por exemplo, prolina, alanina, fenilalanina).

Estirpe 28N.1^CI (feixe 3)

Uraa bactéria em forma de haste, gram-aegativa, móvel, aeróbica, 4-8-5,5 jum x 0,6-0,8 ^m. Alcalifilo constrangido crescendo entra pH 8,5 e pH 10,7.

Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, circulares, opacas com uma textura filamentosa. As colónias têm uma elevação convexa a uraa margem inteira. A cor da colónia é inicialmente creme/beige, tornando-se rósea após alguns dias,

Sm calda alcalina (meio A) o crescimento (37^SC) á denso, flocolento com uma película superficial e um sedimento.

Cresce bem entre 20^aC e 45 ²C, Cresce lentamente a 1^SG e 15²C. Não há crescimento a 50²C.

Teste de KOH: Positivo Aminopeptidase: positivo

oxidase:

catalase tolerância a NaCl: 01 a 12%. Não hidrólise de gelatina: hidrólise de amido:

principais componentes lipídicos polares:

Principal ubiquinona: principais ácidos gordos: C + C:

positivo positivo há crescimento a 15%.

negativo positivo fosfatidilglicerol difosfatidilglicerol fosfato de fosfatidilglicerol silfato de fosfatidilglicerol fosfatidiletauolamina qô

016:0, 016:1, 11-cis C18:l

64,1% molar (HPLC).

Quimioorganotrofo. Cresce bera sobre substratos complexos, tais como extracto de levedura e peptonas. Cresce sobre açúcares simples, ácidos orgânicos, ácidos gordos e aminoácidos.

f*T

Estirpe wL4 (feixe 4)

Uma bactéria era forraa de haste, gram-negafiva, aeróbica, 3-4 μ® x 0,6-0,8 μπι, ocorrendo frequentemente como pares de células. Alcalifilo, cresce bem entra ph 7,5 e ph 10,9.

Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, de cor beige a castanha. As colónias são um tanto variáveis: 1 a 5 mm de tamanho, circulares a irregulares na forma, levemente convexas ou elevadas em alçado, com uma margem ondulada ou inteira.

Em calda alcalina (meio A) o crescimento (37^aC) é floculento, formação de sedimento com uma película superficial.

melhor crescimento entre 15^aC e 45^aO, não há crescimento a 50^aG.

Teste de KOE: aainopeptidase: oxidase:

catalase:

tolerância a NaCl: hidrólise de gelatina: aidrólise de araido: principais componentes

Positivo positivo muito fracamente positivo, pode considerar-se negativo positivo ® a >12%, não há crescimento a 15%.

negativo negativo lipídicos polares: fosfatidilglicerol difosfatidilglicerol fosfato de fosfatidilglicerol fosfâtidiletanolamina principal ubiquinona: Q9 principais ácidos gordos: €16:0, 11-eis €13:1 € + €: 65,3% molar

Quimioorganotrofo. Cresce bem sobre substratos complexos tais como extracto de levedura. 0 crescimento sobre açúcares simples é restrito: cresce sobre ácidos orgânicos (por exemplo) lactato, acetato, fumarato) ácidos gordos (por exemplo propionato, valerato, caprato) e aminoâcidos (por exemplo prolina, serina, lisina).

Estirpe 17N.l^^T(feixe 5)

Círaa bactéria em forma de haste, aeróbica, gram-negativa, longa, delgada, 5,5-10,5 pia x 0,6 /um, por vezes formando cadeias curtas de células. Com a idade torna-se pleomórfica, predominam formas entumescidas peculiares.

Alcalifilo constrangido, cresce melhor entre pH 8 e plí 10,5.

Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, opacas, amarelas, 2-3 mm de diâmetro. As colónias variam de circulares a irregulares em forma, com um alçado convexo a um bonado, e margem inteira, ondulada ou labada, consoante a idade.

— 43 —

Em calda alcalina (meio A), o crescimento (37^SC) é uniforme e há formação de sedimento sem película superficial.

Cresce bem entre 15^SC e 37^SC. Cresce lentamente a 10^sC e não cresce a 8^aC. Não há crescimento a 40^sC ou acima.

leste de KOH:		positivo
aminopeptidase:	fracamente	positivo
oxidase:		negativo
catalase:		positivo
tolerância a NaCl:	02 a <12%, cresce melhor a	0% de NaCl
hidrólise de gelatina:		positivo
hidrólise de amido:	fracamente	positivo

principais componentes lipídicos polares: fosfatidilglicerol difosfatidilglicerol fosfato de fosfatidilglicerol fosfatidíl-etanolamina glicolípido (^-naftol positivo) principal ubiquinonas Q9, QIC principais ácidos gordos: C15:0 anteiso, C16:G, C17:0 anteiso

G + C: 50,0% molar (HPLC),

Quimoorganotrofo. Cresce bem sobre substratos complexos tais como extracto de leveduras. 0 crescimento sobre açucares simples é restrito (por exemplo, crescimento observado apenas sobre fructose; não se observou crescimento sobre glucose, ribose, lactose). Cresce sobre ácidos orgânicos (por exemplo), fumarato, succinato, piruvato, 2-cetogliuconato) e aminoácidos).

Estirpe 64B.4^C1(Eeixe 6)

Uma bactéria em forma de haste, Gram-negativa, aeróbica, 2,0-3,5 um x 0,8-1,0 um.

Alcalifilo constrangido, cresce melhor entre pH 8,2 e pH 10,9.

- 49 Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, opacas, inicialmanta de cor amarelo crema, tornando-se beige com a idade.

As colónias têm cerca de 4 mm de diâmetro, são circulares tornando-se irregulares; chatas ou fracanente convexas de alçado tornando-se convexas; com margem inteira que se torna ondulada.

Em caláa alcalina (meio A) o crescimento (37^SG) é uniforme, formação de sedimentos sem película superficial.

crescimento a 10^sC ou 50^sC. xesta de nCh: nminopeptidase: oxidase: catalase:

Cresce bem a 15^SC até 45²C, não há positivo negativo positivo positivo tolerância a NaCl: 01 <.12%, não há crescimento a 15% hidrólise ds gelatina: positivo hidrólise de amidos: fracaraente positivo principais componentes lipídicos polares: fosfatidilglicerol difosfatidilglicerol fosfato de fosfatidilglicerol fosfatidiletanolamina glicolípido («É-nattol positivo) principal ubiquinona: Q9 principais ácidos gordos: C15:0 iso, C15:0 anteiso, C16:0 G + C: 41,0 + 0,98 molar (HPLC)

Quimiooraganotrofo. Cresce bera sobre substratos complexos tais como extracto de leveduras, cresce em alguns açucares simples (por exemplo glucose, rioose, íaaltose e fructose) ácidos orgânicos (por exemplo acetato, lactato, citrato e fumarato) alguns ácidos gordos (por exemplo propionato e caprato) e aminoácidos (por exemplo

prolina, histidina e alanina).

Estirpes não pertencentes a faixes

As estirpes que n§o caem nos feixes aqui definidos são taibém bactérias novas, não conhecidas ou descritas anteriormente, Estas estirpes, designadas wN2, 4E.1, 5E.1, 92LM.4 e wBn5, podem representar variedades mais raras de bactérias alcalifilicas e são provavelmente membros de feixes de bactérias representando novos géneros e espécies nãc descritas actualmente. Foi feita uma descrição destas estirpes íern dos feixes** de modo a poder-se distinguir estes organismos de todas as outras bactérias anteriormente conhecidas e descritas.

Estirpe wN2

Uma bactéria em forma de haste, aeróbica, Gram-negativa, móvel, frequentemente em pares.

Alcalifilo constrangido, cresce melhor entre pH 9 a pH 10, bobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, translúcidas, de cor beige, com 1 a 2 mm de diâmetro. As colónias são circulares, convexas com uma margem inteira.

Em calda alcalina (meio A) o crescimento (37^SC) é floculento com um anel ou película superficial e formação de um sedimento.

Cresce bem a 20^sC até 30C. Aão há crescimento a 15²C ou 40^sC.

leste ae KOH: atiinopeptidase : oxiaaseí catalase:

tolerância a NaCl:

PositiAi fracaraante positi\ fracamente positi\ positi\ halofilo constrangido, crescimento 4/. de NaCl

- 51 Hidrólise de gelatina hidrólise principal de amido: ubiquinona

Ião há crescimento a 0% ou 8% de NaCl levemente positivo positivo

Q9

64.1 <T_M ).

Quimioorganotrofo. Metabolicamente não reactivo. Não há crescimento sobre açúcares simples ou ácidos orgânicos. Cresce sobre substratos complexos tais como extracto de levedura e peptonas, e sobre alguns aminoácidos.

Estirpe 4E.1

Uma bactéria em forma de naste, acro bica, gram-negativa, móvel, cor?. 1,7-5,2 pm x 0,75 ym.

Âiealifilo constrangido, cresce melhor entre pH 8,2 e pH 10,9.

Sobre agar alcalino (meio Λ) forna colónias moles, opacas, de cor beige ou castanha, com 2-4mm de diâmetro. As colónias são circulares em forma, convexas em alçado, com uma margem inteira.

Zm calca alcalina (meio A) o crescimento (37²C) é denso a floculento, com um sedimento c película superficial.

Cresce ban entre 20^sC e 37®C. Cresce muito lentamente a 10^sC e não cresce a 3²C. Não há crescimento a 4í)^sC ou superior.

leste de KOfí: positiva aminopeptidase: positivo oxiaase: muito fracamente positivo pode parecer negativo catalase: positivo tolerância 3 NaCl: v a 321, pode crescer fracamente a l?n» Iso há crescimento a 20%

negativo negativo

Quimiaorganotrofo. Não cresce sobre

orgânicos (por exemplo succinato, piruvato, citrato, malonato, acetato e lactato) ácidos gordos (por exemplo pripionato, valerato e suberafco) e aminoácidos (por exemplo prolína, serina, histidina e lisina).

Astirpe 5E.I bua bactéria aeróbica, Gram-negativa, em forma de haste, com 3,0-5,3 pm x 1,3 pm.

Àlcalifilo constrangido, cresce melhor entre ph 9 e ph 10,3.

Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, opacas, de cor castanha, com 3-4 mm de diâmetro. As colónias sâo moderadamente irregulares na forma, geralmente achatadas a levemente umbonadas em alçado com uma margem lobada.

En calda alcalina (meio A) o crescimento (37^SC) é moderado a denso, tornando-se floeulento com um sedimento e película superficial.

Cresce bem entre 20^BG e 40^sC. Cresce lentamente a 10^fiC. NSo cresce a 45-C.

leste de KOH: aminopaptidase: oxidase: catalase: tolerância a NaCl positivo positivo negativo positivo

Oh a 12h, pode crescer fracamente a 15;5. hão ,iá crescimento a 20X.

hidrólise de gelatina: hidrólise de amido;

positivo fracamente positivo principais componentes lipídiccs polares: fosfatidilglicerol difosfatidilglicerol fosfato de fosfatidilglicerol sulfato de fosfatidilglicerol fosfatidiletanolamina glicolípido ( -naftol positivo) principal ubiquinona: principais ácidos gordos;

Q3

Clõ;G, C18;l.

Quimioorganotrofo. Não cresce sobre açucares simples. Cresce bem sobre substratos complexos tais como extracto de levedura, ácidos orgânicos (por exemplo piruvato, citrato, acetato e lactato) ácidos gordos (por exemplo propionato, caprato e vaiarato) a aminoácidos (por exemplo prolxna, alanina e lisina).

Estirpe 92LM.4

Uma bactéria em forma de haste, Gram-negativa, aeróbica, com 2,0-3,5 pm x 0,5-1,0 jum.

Alcalifilo constrangido, sen crescimento abaixo de pH 7,5.

Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, de cor creme, inicialmente translúcidas mas que se tornam opacas. As colónias desenvolvem-se a partir de uma forma circular, passando a irregular, de forma lobada, com uma elevação convexa.

Em calda alcalina (meio A) o crescimento(37^sC) é lento, ligeiro, floculento com um sedimento sem película superficial.

Cresce entre 10⁸C e 40^sC, não cresce a 8^SC ou 45^SC.

Teste de KOH: aminopeptidase: oxidase: catalase:

tolerância a NaCl:

0% a 152, o crescimento a lento. Não há crescimento positivo negativo positivo positivo

15m é hidrólise de gelatina: positivo hidrólise de amido: fracamente positivo principal ubiquinona: Q9 principais ácidos gordos: C15:0 iso, C15:0 anteiso, Gló:O,

C17:0 iso.

, Quimioorganotrofo, Cresce sobre substratos complexos tais como extracto de levedura e peptonas, e sobre uma variedade de açucares, ácidos orgânicos e aminoácidos.

Cstirpe WBn5

Uma bactéria em forma de haste, aeróbica, Gram-negativa, pequena, frequentemente formando curtas cadeias de células.

Alcalifilo constrangido, sem crescimento abaixo de plí 8«

Sobre agar alcalino (meio A) forma colónias moles, circulares, convexas, con uma margem inteira, com cerca de 1 mm de diâmetro. As colónias são inicialmente de cor crame/beige, transparentes tornando-se opacas, a castanhas.

j&n calda alcalina (meio A) o crescimento (37²C) é no inicio uuiformemente turvo com um sedimento mas sem película superficial, tornando-se ao fim de 4 dias floculento com formação de uma película.

Cresce a 3G^SC a 37⁵G. Não cresce a ,h € h· “'· “* w »

- 55 teste de KOH: a;ninopeptidase oxidase:

catalase:

tolerância a NaCl:

hidrólise de gelatina: aidrólise de amido: principal ubiquinona;

G + G

positivo positivo halofilo constrangido. Crescimento a 4% de NaCl. Não há crescimento a 0% ou 8Í.

lentamente positivo negativo

Q8, Q9

54,6 %molar (1\.)

Quimioorganotrofo. Cresce sobre uma série de substratos complexos, tais como extracto de leveduras e peptonas, assim como açúcares, ácidos orgânicos, ácidos gordos e aminoácidos.

Definição de feixes pelo cálculo do número mínimo de testes discriminatórios, e construção de uma matriz de probabilidade para a identificação de alcalifilos Gram-negativos

Uni dos objectivos de um estudo de classificação numérica é o uso de dados fenétiços, que definem os feixes a um nível de similaridade seleccionado, para a atribuição ou identificação de estirpes desconhecidas. Os dados do teste de classificação podem ser usados para determinar o minimo conjunto de testes que são necessários para definir os feixes ao nível de similaridade de 73% (SG) e para identificar os caracteres que são mais aptos para diagnóstico (predictivos) para os feixes individuais. Por outras palavras, o mínimo número de testes requeridos para atribuir um organismo desconhecido a um feixe pré-determinado com um elevador grau de predictauilidade.

A partir dos testes discriminatórios mínimos pode ser construída uma matriz de probabilidade para a

identificação de estirpes desconhecidas. À análise á realizada pela utilização de uma combinação dos programas CHARSEP e DIACHAR (TAXPAK) e MCHOICE (nao existe era TAXPAK mas pode obter-se por Data-Mail da Universidade de Leicester, U.K.). A avaliação da matriz de identificação é proporcionada pela utilização dos programas MOSTTYP e OVERMAT. Podem encontrar-se exemplos práticos do uso destes programas para a identificação probabilística de bactérias publicados por Williams, S.T., et al»» (1983), J. Gen. Microbiol., 129, pp. 1815-1830 e Priest, í’.G. e Alexander, B., (1988), J. Gen. Microbiol., 134, pp, 3011-3018; ibid, (1990), 136, pp. 367-376,

Foi construída uma tabela n x t* a pai*tir dos dados do teste utilizando os números 6 a 10 e 13 ε 104 (Apêndice G) escalonados em notação binária (positivo =1, negativo = 0). Esta matriz de dados foi suplementada com os seguintes 4 estados extra de caracteres:

[105] colónias amarelo brilhantes (carácter η² 1,Apêndice C) [lOoj colónias translúcidas (crescimento em meio A, Apêndice A) [107] lipase (actividade lipolítica em azeita (meio M)) [108] oxidase positivo dentro ds 10 segundos (teste 9,Apândice3j

A matriz de dados é primeiro examinada utilizando um programa CHARSEP que calcula índices de separação e deste modo o valor de diagonóstico dos caracteres individuais para discriminação entre os feixes. Os testes com um índice V3P > 25b (Sneath, P.H.A., (1979)

Oomputers and Geosciences, 5., 349-357) são aceites, os caracteres com um baixo valor de diagonóstico (VSP < 25%) foram rejeitados» É dada preferência para os caracteres com os mais altos índices VSP, com a condição de que sejam também satisfeitos os critérios nos programas DIACHAR e HCHOICE. deste exemplo 38 testes têm ira índice VSP > 25%, e 9 dos 24 caracteres finalmnte escolhidos têm um índice VSP > 501 (quadro 11).

A matriz de dados é a seguir reexa- 57 -

'QZ

U x C Jjí 5Ct32?

meio do programa DIAGHAR, que determina os as mais importantes es. diagnóstico da cada stador tiiU G.Qí* feixes. 0 número de estados ma caracterss foi estabelecido e

10. msta resultado permita a escolha ds estados de caracteres mutuamente exclusivos entre os faixes. 0 máximo possível destas testes aão retidos na matriz de identificação final da testas discriminatórios mínimosj neste exenplo entre 6 e 9 caracteres «le diagnóstico por feixe. Os restantes testas não utilizados são também anotados e podem sar aplicados como testes aJicionois para a confirmação cia identificação (quadro programa bf^:CICf ordena os testo

3? grupos que podem ser colocados na forna de umi dendrogre;:·-; utilimando n suhrotina ADSbf. Os grupos identificam testas com valor discriminatório semelhante, permitindo deste modo a rejeição de testes que não estabelecem, uma discriminação significativa, bem como permite □ escolha entre testes de valor •o diagnóstico igual ou muito senalliants.

quadro 13 nostra o conjunto de 24 testes que s o número minimo requerido para definir os feixes e que podem ser usados para a atribuição de estirpes desconhecidas. Adicionalmente o quadro 13 mostra a matriz de identificação qua consiste na percentagem da caracteres positivos que definem os feixes na base dos 24 testes discriminatórios mínimos. Isto á calculado paio programa IDmAT.

- 5b QJA-ORO 14

VALORES Dfe SEPARAÇÃO DE CARACTERES USADOS PARA OS TESTES liscrihxhatOrios mínimos

; 'Λ 3 · Ui.· --fcXJ.	3TER	.........—------- índice VSP
[23]	A-aceti! glueosasiina	35.4
[Ζύ]	Sacarose	44.8
[27]	ilaltose	41.4
[32]	Lactato	51.6
[41]	Propionato	60.9
[43]	Valerato	63.4
[44 ]	Citrato	45.1
[45]	ííistidina	33.0
L^7]	Glicogénio	31.7
L>i]	3-hidroxibutirato	66.1
[52]	4-hidroxibenzoato	38.0
po]	Leucina arilamidase	36.6
P*I	Valina arilamidase	50.5
[ó4]	Fosfohidrolase	52.8
p5]	-galactosidase	33.9
(35]	Ampicilina	36.8
(52]	Acido fusídico	68.7
	deticilina	58.3
[95]	Polimixina	62.3
[iv2	] Vancomicina	48.3

QU4D20 15

XnSTL DISCRIAINATÚdlO PARA CADA Ora DOS 6 FEIXES (Sç)

PfilXE 1: Colónias mucoides, opacas, circulares, de cor creme.

Positivos Negativos

|S2| |39|	Laucina arilamidase (91%) J Valina arilamidase (91%) |	23 J N-acetilglucosamina 27{ Maltose (9%)
jó4|	Eosfohidrolase (91%) |41|	Propionato (9%)
í>M	Polimixina (89%) J	42 J	Caprato
	1	43|	Valerato (9%)
	|44i	Citrato (9%)
	|45|	Histidina
	I	47]	Glicogénio (9%)
	1	521	4-hidroxibenzoato
	1	65 j	-galactosidase
.. N13	x 2: Translúcidas, pequenas, de cor	crema
	Positivos		Negativos
μΐ{	Amido |	231	N-acetilglueosamina
|31|	Acetato |	26 J	Sacarose
j4ij	Propionato |	45 |	Histidina
|43j	Valerato |50	2-cetogluconato
jSâj	Prolina	52j	4-niaroxibenzoato
i10? í Lipase )	68)	cT__glucosidase
j rui	>j Oxidase (dentro de 10 secs.)	691	8 - glucosidase
	J 92	Ácido fusídico
	íd 3: Colónias opacas, creme
	Positivos		Negativos
|31	Acetato	64	i^osfonidrolase (3%)
|32	Lactato	65	-galactosidase (3%
(41	Propionato (94%)	92	Ácido fusidico (3%)
’ ·?. 0 j	valerato (97%)		Tetraciclina (3%)
> k l··'4	Citrato (94%)	102J Vancomicina
|51j 3-hidroxibutirate (94%)	104| Bacitracina
| 53	Prolina
1 58	Leucina^arilamidase (94%)

BjfiRgawT,

	QUADRO 15 (CONTINUAÇÃO)	6 FAIXAS (Sn)
ϊΈάΐώ DláCAi.lINAT&tIO PA2Á CADA UM	DOS
FEIXE	4: opacas, beije a castanhas Positivos		Lenitivos
|32|	Lactato	|45|	Histidina
|33|	Alanina	|85|	Ampicilina
|4B|	3-hidroxibutirato	|86|	Acido Naladixico
|59|	Valina arilamidase	|88|	Trimetoprima
i 991	Polimixina	|89| |93|	Penicilina G Meticilina
	5: opacas, amarelo brilhantes j105 Positivos	1	Negativos
j 64j	íOsfohidrolase	)23|	N-acetilglucosamina
|65|	-galactosidase	|32|	Lactato
	-galactosidase	|33|	L-alanina
p5j	Aaipicilina	|34|	hannitol
j92j	Acido Pusidico	|41|	Propionato
j93|	Meticilina	|42|	Caprato
i^í	Tetraciclina	|43|	Valerato
j IÚ21	Vancomicina	j451	Histidina
j 104 j	Baeitraciaa	|43| |51| |52| |39|	3-hidroxibenzoato 3- hidroxibutirato 4- hidroxibenzoato Polimixina
PAl/hs	6: achatadas irregulares, de cor creme Positivos	Negativos
jzl j	ϋΡίΧνχΟ	|17|	Piruvato
|23j	N-aeetilglucosamina	|52|	4-hidroxibenzoato
{2oj	Sacarose	|58|	Leucina arilanxàse
j27|	r.altose	|59|	Valina arilamidase
|3i|	Acetato	|65|	-galactosidase

_ Positivos Negativos j 331 Âlaaiiiâ |93j Polinixina í44j Citrato j47j Glicogénio pij 3-ãidroxibutirato j ò9 j Penicilina 5 j92j Acido Fusidico j93j Aeticilina j9õJ Tetraciclinea j iv4j Sacitracina nota: os números entre parêntesis rectos antecedendo o estado do carácter referem-se aos estados de caracteres e testes unitários nos Apêndices B e C. As percentagens nos parêntesis referem-se aos estados de caracteres positivos.

- 62 Vil

QUADRO 16

AEILIDADE RARA A

REIFJCAÇÃC à τ rs >τ T TT » π , xiijkJxmXi,* -Làjvg <

DISTRIBUIÇÃO EM PERCENTAGEM DE CARACTERES DISCRIMINATÓRIOS

POSITIVOS QUE DEFINEN OS FEIXES DE BACTÉRIAS ALCALIFÍLICAS

GRAU-NEGATIVAS AO NÍVEL DE 73% (Sc,)

	FEIXE
1	2		4 5	3
	N-aeetilglueosaíiiina	13	0	26	20	0	100
	Sacarose	.,5	‘0	74	20	25	100
pz'í	^altose	;5	0	63	60	50	10o
pz, j	Lactato	33	50	100	100	0	40
j4I|	Propionato	0	100	91	60	0	30
j43j	Valerato	13	100	97	80	0	40
KM	Citrato	13	50	94	20	50	100
|4ii|	Histidina	0	0	71	0	0	30
j47j	Glicogénio	0	13	26	20	25	10o
|A 1	3-hidroxibutirato	13	25	94	100	0	100
í 52 j	4-hidroxibenzoato	0	0	71	30	0	0
|3d|	Leucina arilamidase	33	63	94	60	50	0
j53|	Valina arilamidase	30	25	b5	10u	25	0
I >.'‘f j	Fosfohidrolase	3b	13	3	20	7 5	40
jo3|	-galactosidase	0	0	3	20	75	ô
1 o5 j	Anpicilina	50	63	56	0	100	80
j92|	Acido Fusidico	25	0	3	20	100	100
j33|	Neticilina	50	13	50	0	100	100
pyf	Polimixina	33	30	31	100	0	0
j102| Vancomicina	13	13	3	20	100	75
1105	j Colónia amarela	0	õ	0	0	100	0
j 106	{ Colónia translúcida	0	100	3	0	0	0
1107	1 Lipase	0	100	21	0	0	0
j 1 Uv	j Gxidase (10 secs)	25		6	0	0	0

17ALIAÇÃ3 DOS TESTES DISCRIhldAlúuijS E ATRIBUIÇÃO DA CONFIANÇA

DE IDENTIFICAÇÃO

A avaliação dos testes discriminatórios tem dois aspectos* Primeiro a validade dos testes pode sar analisada utilizando exemplos práticos, que poden ser posteriormente avaliados utilizando a teoria estatística, ou os testes podem ser submetidos directamente à análise teórica utilizando métodos estatísticos*.

ILUSTRAÇÃO 1

UnA AVALIAÇÃO PRATICA DOS TESTES DISCRIMINATÓRIOS

Huitos cientistas estimam a axactidão dos testes discriminatórios apenas redetermxnando os estados de caracteres de exemplos representativos dos feixes escolhidos. Esta abordagem foi aqui utilizada para as estirpes centrotipo (ver adiante). Uma abordagem muito mais exigente, que raramente é aplicada, é examinar todas as estirpes que foram usadas na análise taxonómica numérica original. Quando submetido à análise de feixes utilizando apenas os danos auquiridos a partir do conjunto derivado de testes discriminatórios minimos, o dendrograma reconstruído pode ser comparado o original. Utilizando apenas os 24 testes discriminatórios descritos previamente (quadro 16) os dados (2 estados, forma binária) para todas as 70 bactérias alcalifxlicas Gram-negativas novas foram submetidos à análise de feixes pelo método Sq/UPGHA. 0 dendrograma reconstruído está reproduzido na fig. 3. Este dendrograma reconstruído assemelha-se muito favoravelmente ao dendrograma originai (fig. 1).

Embora tenha havido algum rearranjo ae posições dos feixes, a sua composição permanece amplamente inalterada e são definidos aproximadamente ao mesmo nível de si· nilaridade que o original. 0 feixe 4, contudo, combinou-se con o faixe 3, dcslocando-sa apenas una única estirpe para o feixe 1. Esta circunstância mais uma vez põe em destaque a dificuldade de se definir o feixe 4 com base aoenas-nos dados

Lsticos. Foi jã sublinhado por diversas vezes que íaccários dados quimiotaxonfeicos suplementares para sao estabelecer a conveniente distinção entra o feixe 3 e o feixe

Fa ambos os dendrogramas originais o na reconstrução (fig. 3) o feixe 3 parece compreender vários, cub-feixes acima do nível de similaridade de 731. A estrutura fina co faixe 3 é também confirmada pelos dados quimiotaxonónieos (ver adiante).

ILUSTRAÇÃO 2 uvA AVALIAÇAO

TEÓEK

Δ OOfc

TxiSTEb DISCxIAIfATÚRIG:

Ê conseguida uua avaliação ue

SO.'C posição de feixes utilizando o programa 0VE2EAT. Este progra.<a examina a matriz construída a partir dos valores positivos ie percentagem para os estados de caracteres seleccionados reintivamante a ue valor de sobreposição critica considerando os deixes definidos pelas coordenadas do centroide e pelo raio uo feixe (dobro da raiz do quadrado médio das distâncias das estirpes desde o centroide). 3a houver sobreposição significativa entra os feixes as estirpes desconhecidas pode..: não ser identificadas com confiança suficiente por qualquer deles (dneath, P.H.A. e Sokal, Α.Π., obra citada, págs 394-40o) dara um valor escolhido de sobreposição critica de 2, oh (que ú

a.,«o condição mais exigente do que é usada pela maioria doa Cientistas: ver rriest, E.G. a Alexandder, B., (133o) obra <..L CuOEi j diliiams, S.T. et al, (12d3) obra citada) não aouvs n sobreposição significativa entre os feixes (nível de confiança 351) excepto entre o faixe 3 a o feixe 4, cn que a ãObrspViòlçctO rhdi £0Í CiãlCUldúU COáuO CCuuú ύϋ ú»· xO^dViU, OS dados quimiotaxonómicos (ver acima) não foram tomados em consinderação quando se construiu a matriz de identificação.

Coo base na analisa da quiaonas, as ostirpos do faixe 3 podam sor distinguidas das estirpes do feixe 4.

ILUSIRAÇAC 3

AVALIAÇa

Xfi

A DA CONFIANÇA BS lONNTIFICAÇÃC ΰ organismo médio Hipotético (líAO) á outro dado estimado do organismo médio num feixe (Sneató,

3.S.A. a Sokal, 2.R., obra citada, págs. 1S4 a seguintes). Ai.i.d iião é uma estirpe real mas sim uu organismo uipotética que ;«i a maioria dos estados comuns para cada carácter.

ro;

uOSxll? calcula oa;

cada faixa na matriz di identificação e tenta em seguida identificá-los. For outra* _zúlavras, ο ΜΟάϊϊϊΡ é um programa para avaliar uma matriz do identificação calculando cotações de identificação das estirpes mais típicas em relação aos feixes, uma boa matriz de identificação deverá dar uma alta probabilidade de que um AAO naja recolocado no seu próprio feixe. Os resultados desta -x.iálise foram muito satisfatórios (quadro 17) espaci-almente -^..n vss que o iàOSTTX? foi programado para considerar apenas oc primeiros 20 testes de diagnóstico da aatriz de identificação (quadro 16), isto é, excluindo os testas 105-108. Cada ANO foi racolocado no seu feixe original com probabilidades de fillcox . , 5 > o—1, UOd (x 1 leox, »»n» êc cl, (1 7o ) J · ci*;« áicrobiol., 77, 317-330). As distâncias taxoaómicas foram todas baixas e os erros padrão da distância taxonómica foram, rodos negativos, indicando que os N3iG’s estavam todos mais próximos do centroide do feixe do qua a média do faixe (quadro

Hwweeinwn

QUADRO 17

COTAÇÕES DA IDENTIFICAÇÃO PARA O ORGANISMO MÉDIO HIPOTÉTICO

DE CADA PEIXE FORNECIDO PELO PROGRAMA AOSTTfP

Cotação de Identificação

Probabilidade fnlhd Willcox

Distância Erro Padrão da DistânTaxonómica cia Taxonómica

1 2	0.999 0.999	0.194 0.236	-2.742 -2.214
*1	1.000	0.231	-2.115
4	0 · 99u	0.195	-2.998
5	1.000	0.217	-1.839
6	1.000	0.182	-2,502

ILiiSTDAÇAO 4 uAA AVALIAÇÃO PRÁTICA DAS COTAÇÕES TL IDENTIFICAÇÃO

A identificação de estirpes utilizando o ainiiao conjunto de testes discriminatórios é realizada utilizando o programa EAIIDEA em TAXJPAK. 0 programa compara a presença-ausência de dados para uma estirpe uesconâeeida relatívamente a cada faixe, por sua vez, numa h-utriz de identificação de caracteres positivos em percentagem, cão calculados coeficientes de identificação, nomeadamente a prooaoilidade de Xillcox, a distância taxonómica e o erro padrão da distância taxonómica. Os resultados são apresentados mostrando as cotações de identificação para o melhor feixe e para os dois feixes de alternativa a seguir ao melhor. Auicionaimente registam-se os resultados atípicos (caracteres contrários). Numa análise utilizando dados de estirpes reais os centrotipos foram reatribuidos aos seus feixes originais com probabilidades de hillcox de 0,3995-1,000 (quadro 13). As urstâncias taxonómicas eram baixas, Os erros panrão das

- ύζ

distâncias taxonómicas foran todos negativos, indicando que os centrotipos estavam mais próximos do cantroide do feixe 3o que a média do feixe»

QUADRO 15

COTAÇÕES de identificação para OS ORGANISMOS centrotipo de

CADA FEIXE FORNECIDOS FSL3 PROGRAMA HAT!SEU

Cotação de Identificação

FEIXE	Estirpe	Atribuida ao reixe	Probabilidade de Uíllcox	Distância Taxanomica (D)	Erro Padrão de D
1	2E.1	1	1.000	0.309	-0.283
	45E.3CT	2	1.000	0.226	-1.749
o	28N.1 1	3	1.000	0.305	-0.622
4	wB4C1	4	0.9996	0.265	—1·092
,5	17u.lC1	5	0.9999	0.255	-0.478
6	64^.4^	6	1.000	0.211	-1.126

ILUSTRAÇÃO 5

IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS DESCONHECIDOS*

A matriz de identificação foi avaliada quanto ã aptidão para atribuir alcalifilos Gran-negativos desconhecidos aos faixes aqui definidos. Os critérios para uma identificação com êxito foram;

(a) bactérias isoladas de um nabitat semelhante ao dos lagos de águas carbonatadas da África Oriental, mas geograficamente separados daqueles;

(b) una probabilidade de Uillcox maior do que 0,95 e baixos valoras pira a distância fixoiónici a o seu erro padrão (<3);

(c) una cotação de identificação para o melaor feixe significavj- vciúituife iitóxiior ao que as oufiuns em r» * 5

nelhores alternativas imediatas;

(d) os caracteres contrários do melhor feixe devem ser nulos ou en número reduzido.

Os microorganismos desconhecidos poden ser examinados utilizando os testes minimos enumerados mo puedro 16. Os estados de caracteres são determinados e as cotações de identificação são obtidas utilizando o programa ^T<ATIPEd. Este programa compara os estados de caracteres da incógnita com a matriz de identificação determinada para todos os feixes pré-determinados, calcula o melhor emparelhamento e atribui a incógnita ao feixe mais apropriado.

É calculada uma probabilidade de billcox para determinar a aceitabilidade da identificação, brooabilidades de sfillcox de 0,35 e 0,95 tSm sido aceites como critério para uma identificação com êxito (Williams, S.T., et al (1933) obra citada; Priest, F.G. e Alexander, D. (1988) obra citada). É calculada a distância taxonómica da incógnita desde o eentroida do feixe e pode depois ser comparada com o raio do feixe. 0 erro padrão da distância taxonómica dever ser menor do que o valor superior de +3,0 sugerido por Sneath, P.n.A. (1979) pags. 195—213). Além disso poderão ser utilizadas caracteristicas fisicas, dados bioquímicos adicionais e marcadores quimiotaxonómicos para confirmar posteriormente a identidade da incógnita num feixe particular.

9s resultados fornecidos por estas cinco ilustraçSes, em combinação com os dados estatísticos fornecidos pela análise taxonómica numérica a os dados quimiotaxonómicos, indicam uma classificação sólida que identifica 6 grupos principais de novas bactérias alcnlifilicas Gram-negativas.

Produção e aplicação de enzimas tolerantes a álcalis

Os microorganismos alcalifilicos ia presente invenção prodaizeu una diversidade da enzimas

- 69 —

UXU.ijplOu <ίΰ ^;iCtÍVXnau23 2UZX âatXCíi.:> prêSCíltcS &J CCtirpSS representativas das oactérias Gran-negativas aa presente invenção. Estes enzimas são capazes d» realizar as suas funções ,· valores de pu extremaaente altos, tornando-os siugularmcnte auequados para a sua aplicação •<ue requeiram esta actividade numa diversidade de processos enzimática em ambientes de ρ;Ί elevado, ou condições da reacção.

Os exemplos das várias aplicações para enzimas tolerantes -a álcalis são em composições detergentes, no curtimento da couro, e>a processamento r.li-usntar, no tratamento de resíduos e na indústria têxtil.

; dotes enzimas também podem ser utilizados para fiotransformações, espaexalaenfca na preparação de enautióaeros • >LI7OS ·

As bactérias alcalifilicas da prasente invenção podem facilmente ssr isoladas para a produção la lipases, proteases e enzimas ce degradação de amidos tolerantes a álcalis, entre outros, utilizando os métodos aqui 'xccritos,

A caída na qual as bactérias alca lifxlicas são cultivadas contém tipicamente um ou sais tipos de setividade enzimática. Δ calda que contém o enzima ou enzimas jocq ser utilizada directamente no processo pretendido, depois da remoção das bactérias da mesma por nexo de centrifugação ou filtração, por cxenplo.

da cultura depois da podem sor iodados por precipitação e filtração. Cono alternativa o enzima ou enzimas contidos na calda podem ser isolados e purificados por meios eromatográficos ou por alectroforece por por exemplo, antes de serem aplicados ao processo poír concentrado

QGsajado o filtrado liofilização, antes ou álisc, ou por ultruxiltracão. Os enzimas também

pretendido. Os métodos euaetos filtrada da cultura, e/ou para raciuas tolerantes a álcalis, : rafara à presente invenção, e utilizados para tratar o extrair e/ou purificar or .ão· são críticos no que se podem ser determinados por quclquer especialista na matéria.

tolerantes if - Σ i j ϊ? ΰ S S O S us £3^33 çu3 codificai aaziaias a álcalis cox interessa podam ser cloaados e em organismos capazes da expressão do enzi...?

pretendido numa forma pura ou facilmente isolável.

>ara ilustrar

Os exemplos rara que se segue aoa identificação u,j rornecidos ,-a etárias alcalifílicas ãrar-napativas da presente invenção, rem como métodos de pesquisa destas bactérias alcalifílicas quanto a presença de várias enzimas tolerantes a álcalis, e. . .'todos para a produção subsequente a aplicação destes enzimas cu processos industriais. Estes exemplos não devam ser tomados como limitativos do âmbito ca presente invenção.

..fxenplo 1 ttificação da isolados desconhecidos

Isolar-,'i-se estirpes de bactérias alcalifílicas tíram-negativas de Nono Lake, um lago alcalino nipersalino situado na Califórnia, USA (Javor, B., em ^ypersaline Bnvironments, Springer verlag, Berlim e Heidelber^ (IpóC) págs. 303-305). As estirpes foram isoladas de amostras ele madeira incrustada com carbonato, parcialmente suomersa, turfa e solo alcalino recolhidos das imediações do Nono Lake (Califórnia, USA) em maio de 1590, por enriquecimento de cultura a 37^SC em meio A (Apêndice A)i As seis estirpes são aescritas no quadro 19. as estirpes foram examinadas utiiizando 21 dos 24 testes mínimos enumerados no quadro lo. us estados de caracteres foram determinados a as cotações de identificação foram obtidas utilizando o progra • 1« jcíÂTImiu* Os resultados estão indicados no quadro 20.

E3nw-g .AbaUFXMCAS DE MOMO LÃKE

Estirpe	Amostra		Colonia			Forma ’ da célula
Cor	forma	Perfil	hacgea
HEGG5	turfa	beije	circular	convexa	inteira	haate
MH04	madeira	boea/beije	circular	convexa	inteira	haate
«UOi	«adaira	amarela	circular	convexa	inteira	haate
HL2G3	madeira	roaa/beije	circular	convexa	inteira	haate
»L2G6	madeira	amarelo	circular	convexa	inteira·	curta haate
HUOl	solo	beija	circular	convexa	inteira	haate

QUADRO 20
EXEMPLOS DOS RESULTADOS FORNECIDOS PELO PROGRAMA	MATIDEN PARA
IDENTIFICAR 6 ESTIRPES DESCONHECIDAS RELATIVAMENTE A MATRIZ	DE
IDENTIFICAÇÃO	•
A. 0 número da referência da incógnita	é ML005
	valor na	Percentagem no:
Carácter	incógnita melhor taxão melhor txxão	Í8g·
|23| N*acetilglucosamina	4*	26	20
|26| Sacarose	+	74	20
|27| Maltose		68	- 60
J32J Lactato	-F	99	99
J.411 Propionato		91	60
{43j Valerato	*	97	80
J44{ Citrato		94	20
J45| Histidina	*	71	1
{47;j Glicogénio	4-	26	20
{51| 3-HÍdroxibutirato	+	94	99
152-1 4-Hidroxibenzoato	+	71	80
{58{ Leucina arilamidase	*	94	60
{59{ Valina arilamidase	+	65	99
|64{ Fosfohidrolade	-	3	20
j 65 { <r-Galactosidase	n.t.	' 3	20
|85j Ampicilina	-	56	1
{92{ Acido Fusidico	-	3	20
{93j Meticilina	-	50	1
{99| Polimixina	+	81	99
{1024’ Vancomicina	-	3	20
{105| Colónia amarela	-	1	1
|106| Colónia translúcida	n.t.	3	1
{107{ Lipase	n * t ♦	21	1
{108{ Oxidase (10 sec.) n.t, = não testado	4	6	1

- 73 Β*

Α melhor identificação de isolado ML005 é o feixe 3» Cotações para as coeficientes: 1 (probabilidade de Willcox), (distância taxonómica).

feixe 3 Feixe 4

Feixe 2 taxonómica), 3

0.9999

0.8266 x 1G~⁴ 0.4086 x 10~⁷

(erro	padrão d
to	3
0.407	1.475
0.526	4.590
0.584	6.296

distância

Caracteres contra i

j108J Oxidase (10 sec.)

Feixe 3 % no taxão Valor na incógnita 6 +

Caracteres adicionais que auxiliam a separação

Feixe 3 do Feixe 4 % %

J106| Colónia translúcida 3 99 j107{ Lipase 21 99

B.

número da referência da incógnita ó ML1Q4

Caracter

Percentagem no:

valor da melhor taxão melhor taxão ime. incógnita diato

1

1 |23| N-acetilglucosamina |26| Sacarose

|27|	Maltose
|32|	Lactato
|41|	Propionato
|43|	Valerato
|44|	Citrato
|45|	Histidina
|47|Glicogónio
j 5113-hidroxibutirato
|52|	4-bidroxibenzoato
|58|	Leucina aeilamidase
|59|	Valina arilamidase
|64|	Posfohídrolase
|65|	<f __Galac tosidade
|85|	Ampicilina
|92|	Ãcido fusidico
|93|	Meticilina
|99|	Polimixina
|1O2| Vancomicina
1105	| Colónia amarela
|106	| Colónia translúcida
|1O7	| Lipase
|108| Oxidase (10 sec.)

-	25	1
-	38 .	50
-	1	99
-	13	99
-	13	50
-	1	1
-	1	13
-	13	25
•i»	1	1
4·	88	63
+	88	25
+	88	13
n.t.	1	1
-	50	63
-	25	1
-	50	13
*·	88	50
	13	13
-	1	1
n.t.	1	99
n»t»	1	99
	25	88

n.t» » não testado

A melhor identificação de isolado ML104 S o feixe 1» CotaçÓes para as coeficientes; 1 (probabilidade de Willcox), 2 (distância taxonómica), 3 (erro padrão de distância taxonómica)·

- 7-5 V

	1	2	3
Feixe 1	0.9999	0,271	-1.108
Feixe 2	0.825 x 1θ“5	0,473	3.797
Feixe 4	0,407 x 1θ“7	0,534	4.767

Caracteres cintra Feixe 1 % no taxlo Valor na incógnita (nenhum)

Caracteres adicionais que auxiliam a separação

Feixe 1 do Feixe 2 % % |106j colónia translúcida 1 99

1107J Lipase 1 99

Feixe 1 do Fexxe 4

.......%..........

(nenhum)

Β· Ο número da referência da incógnita é ML201

Percentagem no:

Caracter	valor na incógnita	melhor taxão melhor tâxão Ime. diato
[23] N-acetilglueosamina		1	13
[26] Sacarose	-	25	25
[27] Maltosa	-	50	25
[32] Lactato		1	38
[41] Propionato	-	1	1
[43] Valerato	-	1	13
[44] Citrato	-	50	13
[45] His tina	-	1	1
[47] Glicogénio		25	1
[51] 3-Hidooxibutir»to	-	1	13
[52] 4-Hidroxibenzoato		1	1
[58] Leucina arilamidase	+	50	88
[59] Valina arilamidase	+	25	88
[64] Fosfohidrolase	+	75	88
[65] ^-Galactosidade	n«t.	75	1
[85] Ampicilina		99	50
[92] Áciso Fusidico	+	99	25
[93] Meticilina	+	99	50
[99] Polimixina	·-	1	88
[102] Vancomicina	+	99	13
[105] Colónia amarela		99	1
[106] Colónia translúcida	n< t ·	1	1
[107] Lipase	% n* L·	1	1
[108] Oxidase (10 sec.)		1	25
n*t.-- não testado A melhor identificação de	isolado	ML201 é o	feixe 5. Cotações

para as coeficientes: 1 (probabilidade de Willcox), 2 (distância taxonómica), 3 (erro padrão de distância taxonómica).

I,

	1	2	3
Feixe 5	0.9999	0.267	-0.176
Feixe 1	0.835 x IO-4	0.437	2.435
	-11
Feixe 2	0.177 x 10	0.641	7.593

> Feixe 5

Caracteres contra %no taxao Valor na incógnita (nenhum)

Caracteres adicionais que auxiliam a separação |65j qf-Galactosídase

165 J ^-Galactosidase |106J Colónia translúcida |107I Lipase

Feixe 5 do Feixe 1 % %

1

Feixe 5 do Feixe 2 % %

1

99

99

D* 0 número da referência da incógnita é ML203

Percentagem no:

Garacter	valor na incógnita	melhor taxão melhor taxão ime. diat
[23] N-acetilglucosamina	+	26	20
[26] Sacarose		74	20
[27] Maltose	+	68	60
[32] Lactato	+	99	99
[4Í],Propionato	+	91	60
[43] Valerato		97	80
[44] Citrato		94	20
[45] Histiidina	+	71	1
[47] Glicogénio		26	20
[5l] 3-Hidroxibutirato		94	99
[52] 4-Hidroxibenzoafco	+	71	80
[58] Leucina arilamidase		94	60
[59] Vallina arilamidase	*	65	99
[64] Fosfohidrolase	-	3	20
[65] <-Galactosidase	n,fc»	3	20
[85] Ampicilina	-	56	1
[92] Acido Fusidico	-	3	20
[93] Meticilina	-	50	1
[99] Polimixina	4*	81	99
[10.2] Vancomicina	4?	3	20
[l05] Colónia amarela	-	1	1
[106] Golónia translúcida	n.t.	3	1
[107] Lipase	n.t.	21	1
[108] Oxidase (10 sec.)	-	6	1

n.t. = não testado

A melhor identificação de isolado ML203 é o feixe 3, Cotações para as coeficientes: 1 (probabilidade de Willcox), 2 (distância taxonÓmica), 3 (erro padrão de distância taxonómica).

Feixe 3 Feixe 4 Feixe 2

0,9989

0,1090 x 10 0.8137 x 10“⁹

0,437

0,526

0,650

2.076

4.590

7.793

Caracteres contra % no taxão

JlO2{ Vancomícina 3 j108f Oxidase (10 sec») 6

Feixe 3 valor^na incógnita

Caract.eres adicionais que auxiliam a separação

Feixe 3 do %

Feixe 4 %

(nenhum)

E. Ο número da referência da incógnita é ML206

Caracter

Percentagem no:

valor na melhor taxão melhor taxao ime. incógnita diato

J 23 J N-acetilglucosamina	-	1	13
126 J Sacarose	*	25	25
|27| Maltose	-	50	25
)32| Lactato	-	1	38
J 41J Propionato	-	1	l
{43j Valerato	-	1	13
[44| Citrato	-	50	13
J45{ Histidina	!	1	1
|47{ Glicogénio	1 ♦	25	1
|51J 3-Hidroxiburirato	-	1	13
J52| 4-Hidroxibenzoato	1	1	1
J58 J Leucina arilamidase	1 *	50	88
{59| Valina arilamidase	{ *	25	88
|64| Fosfohidrolase	♦	75	88
J 65 J ^-Galactosidase	{ n.t.	75	1
{85 J Ampicilina	*	99	50
|92j Acido Fusidico	I *	99	25
|93j Meticilina	i *	99	50
J 991 Polimixina	-	1	88
j102 j Vancomicina	1 *	99	13
{105| Colónia amarela	1 *	99	1
|106j Colónia translúcida	j n.t«	1	1
}107J Lipase	j n.t.	1	1
|108| Oxidase (10 sec.)	1 -	1	25
ft«t« = não testado
à melhor identificação de	isolado ML206 é o feixe 5. CotaçSes
para as coeficientes:	1 (probabilidade de	Willcox), 2
(distância taxonómica),	3 (erro	padrão	de distância

•taxonómica).

- 81 Feixe 5 Feixe 1 Feixe 6

Caracteres contra

ΜΝΜΜΜΜΜΜΜΝΜΜΜΒΜΜΜΜΜΜ············ (nenhum)

1 2	3
0.9999		0.345	1.766
0.2530 x	10 5	0.512	4.013
0.2531 x	-13
10	0.652	10.883

% no taxão

Feixe 5 valor na incógnita

Caracteres adicionais que auxiliam a separação

Feixe 5 do %

J65J^Λ-Galactosidase 75

Feixe 1 %

diato

F* 0 número da referência da incógnita é ML301	Percentagem xão rnelier ta
Caracter	valor na melhor ta incógnita
|23|	W-acetilglucosamina	«	26	1
|26|	Sacarose		74	1
|27|	Maltose	*	68	1
|32|	Lactato		99	50
|41|	Propionato		91	99
l«l	Valerato	•l·	97	99
|44|	Citrato	+	94	50
|45|	Histidina	+	71	1
|47|	Glicogénio	+	26	13
|51|	3-Hidroxibutirato		94	25
|52|	4*hidroxibenzoato	-	71	1
|58|	Leucina arilamidase		94	63
|59|	Valina arilamidase		63	25
|64|	Fosfohidrolase	-	3	13
|65|	«MSalactosidase	n.t.	3	1
|85|	Ampieilina	+	56	63
|92|	Acido Fusidico	-	3	1
|93|	Meticilina		50	13
|99|	Polimixina		81	50
|102| Vancomicina	-	3	13
|105	[ Colónia amarela	-	1	1
1106	[ Colónia translúcida	n»£♦	3	99
1107	| Lipase	n.t.	21	99
j 108	| Oxidase (10 sec»)	+	6	88
n.t.	= não testado

A melhor identificação de isolado ML301L é o feixe 3. Cotações para as coeficientes: 1 (probabilidade de Willcox), 2 (distância taxonómica), 3 (erro padrão de distância taxonómica).

Feixe 3 Feixe 2	1 1.000 0.2041 χ 10*°	2 0,429 0*603	3 1,91S 6,731
Feixe 4	0*9313 x 1Ô*8	0,623	6,704

Cagftfeterea contra % no taxão |108 t oxidas®' (10 aec .) è

Feixe ,3 valer na incógnite *

Cagagtegea _:adigioaaía_; que anxiliaa a sepagagãa

Í106Í colónia translúcida

Feixe 3 do

Feixe 2 %

w 84 *

EXEMPLO 2

Produção de enzinas proteolíticos

Foram ensaiadas duas estirpes alca’ lifílicas (1E.1 e 9B.1) quanto à produção de enzinas proteolíti cos, em 7 meios diferentes ajustados a um pH alcalino. As experiências foram realizadas em balões agitados de 2 litros, com um defleetor, contendo cada um dos balões 400 ml de um meio nutriente R a X (Apêndice A). Os balões foram colocados num incubador orbital que rodava a 280 rotações por minuto ã temperatura constante de 37^SC. Foram retiradas amostras dos meios de cultura dos balões a intervalos de 1,2,3,4,5,6 e 8 dias para a determinação do conteúdo de enzimas que é expresso em unidades Delft alcalinas (ADU - como é descrito na Memória Descritiva da Patente Britânica 1 353 317).

quadro 21 apresenta os rendimentos enzimáticos máximos e os pfl dos meios de cultura no momento em que foram realizadas as medições de níveis de enzimas·

QUADRO 21

PRODUÇÃO DE ENZIMAS PROTEOLÍTICOS

ESTIRPE 1E.1^CT ESTIRPE 9B.1

MEIO	ADU/ml	MEIO DE pH	ADU/ml	, MEIO DE pfl
R	100	8.2	14	9.7
S	140	8.5	49	9.1
T	111	8.7	6	9.1
u	6	9.7	4	9.7
V	51	9.5	7	9.6
w	94	9.2	7	9.3
X	100	9.6	28	9.6
Os resultados do teste indicam cia-

ramente a presença de enzimas proteolíticos, produzidos pelas bactérias alcalifílicas da presente invenção, nas caídas de cultura.

EXEMPLO 3

Teste do comportamento à lavagem utilizando enzimas protsolíticos

Ensaiaram-se composições enzimati’ cas das bactérias alcalifílicas num ensaio de mini-lavagem desenvolvido especialmente, utilizando amostras de tecido de algodão (2,5x2,5cm) manchadas com leite, sangue e tinta (obtidas de EMPA, St. Gallen, Suiça, e designado EMPA 116). Antes do ensaio da lavagem as amostras de tecido foram tratadas previamente com uma solução contendo um agente tensioactivo aniónico, perborato de sódio e um activador de branqueamento (TAED) â temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois deste tratamento as amostras de tecido de ensaio foram enxaguadas em água desmineralizada corrente durante 10 minutos e secas ao ar. Este tratamento origina a fixação da mancha, tornando a sua remoção mais dificil*

Os testes de lavagem foram realizados em balões Erlenmeyer de 100 ml dotados de um deflectgor e contendo 30 ml de uma composição detergente definida mais 300 ADU da protease a ensaiar. Em cada balão foram colocadas duas amostras de tecidos de ensaio EMPA 116 pré-tratadas. Os balões foram colocados num banho-maria com agitação alternativa (movimentos de 2cm) e agitados a 320 rpm. Os ensaios foram realizados a 40^sC durante 30 minutos. Depois da lavagem as amostras de tecido foram passadas por água desmineralizada corrente durante 10 minutos e secas ao ar. A reflectância das amostras de tecido de ensaio foram medidas a 680 nm com um fotómetro Photovolt (modelo 577) equipado com um filtro verde.

Determinou-se o comportamento à lavagem da fracção sobrènadante de culturas de várias bactérias

- 86 aicalifílicas em detergentes em pó europeus de acordo com o método acima descrito* As fracções soforenadantes foram submetidas a vários tratamentos de modo a produzirem composições contendo enzimas*

Carregaram-se balões de Erlenmeyer de 100 ml com detergente em pó IEC dissolvido em água corrente comum de 15® de dureza alemã, de modo a obter-se uma concentração final de 4 g por litro*

A composição do detergente em pó IEC era a seguinte:

componente % p/p alquil-benzeno-sulfonato de sódio de cadeia linear 6,4 (comprimento de cadeia médio da cadeia de alcano (C11.5)) álcool de sebo etoxilado (14 EO) 2,3 sabão de sódio 2,8 tripolifosfato de sódio (STPP) 35,0 silicato de sódio 6,0 silicato de magnésio 1,5 carboxi-metil-celulose 1,0 sulfato de sódio 16,8 perborato de sódio tetrahidrato 18,5

TAED 1,5 diversos ♦ água até 100.

A água corrente padrão é composta por CaCl₂,2H₂0, 0,291 g/1; MgCl*6H₂0, 0,140 g/1 e NaHC03» 0.210 g/1, dissolvidos em água desmineralizada*

Adicionaram-se a cada balão duas amostras de tecido EMPA 116 e composições contendo enzimas suficientes para se obter uma actividade final de 300 ADU. 0 volume final de calda era de 30 ml. Para comparação um dos balões não continha composição enzimática, que foi substituída

por água. A experiência foi repetida duas ou três vezes. Os resultados são indicados no quadro 22.

QUADRO 22

EXPERIÊNCIAS DE APLICAÇÃO DE LAVAGEM

COMPORTAMENTO DE COMPOSIÇÕES CONTENDO ENZIMAS
PROTEOLlTICOS NUMA FORMULAÇÃO DE LAVAGEM
	Sobrenadante da	cultura não tratada
Composição	Remissão média	das amostras de	tecido EMPA 116
obtida da estirpe nenhum	Experiência 1	Experiência 2	Experiência 3
(controle)	11.4	11.8	13.0
1E.1CT	29.2	22.2	24.7
9B.1	23.7	23*9	24.2
17N.1CT		11.8	18.4
24B.1		17.3	16.3
Composição	Fracção sobrenadante liofilizada
obtida da	Remissão média das amostras de	s Tecido EMPA 116
estirpe nenhum	Experiência 1	Experiência 2	Experiência 3
(controle)	10.4	11.8	13.0
1E,1CI	15.1	28.9	30.0
9B.1	21.7	14,9	17.4
17N.1CT		13.7	17.9
24B.1		17,8	17.3
	Fracção de sobrenadante dializadas
Composição	Remissão média	das amostras de	Tecido EMPA 116
obtida da
estirpe	Experiência 1	Experiência 2 Experiência
nenhum
(confio	11.4 26.4	11.8 22,7	13,0 26.3
9b.Iqj	18*7	16*7	17.0
17N.1 x		12.0	12.6
24B.1		12.6	12.4

Concentrado por ultrafiltraçao de fracçoes sobrenadantes

Composição	Remissão média das amostras de tecido EMPA 116
obtida da
estirpe	Experiência 1	Experiência 2
nenhum
(controle)	10,4	11.4
1E.1CT	14.6	26.0
9B.1	15.5	16.1
Precipitados com acetona de fraeções	de sobrenadantes
Composição	Remissão média das amostras de tecido EMPA 116
obtida da
estirpe	Experiência 1	Experiência 2
nenhum
(controle)	10.4	11.4
1E.1CT	13.4	23.4
9B.1	12*6	14,7

Os resultados das experiências demonstram a eficácia dos enzimas proteolíticos produzidos pelas estirpes da presente invenção, presentes em várias formas, em formulações detergentes e o melhor comportamento à lavagem obtido.

EXEMPLO 4

Produção de.....enzimas, gue,ύβ§.^3ο„3ϊηίάθ3

CT

A estirpe 1E*1^V foi ensaiada quanto à produção de enzimas que degradam amidos, num meio contendo amido ajustado a um pH alcalino.

Balães de Erlenmeyer de 500 ml foram carregados com 100 ml de meio alcalino (meio Y, Apêndice A) contendo 2% de amido solúvel. Os balSes foram inoculados (5%) com células da estirpe 1E.1^CT cultivada durante 24 horas

- 89 em meio A (37^aC). Gomo controles inocularam-se também balões semelhantes com meio alcalino não contendo amido.

Os balões foram colocados num incubador com agitação orbital que rodava a 280 rotações por minuto, a uma temperatura constante de 37-C durante 24 horas. 0 fluido que continha a actividade enzimática foi separado das células por centrifugação durante 10 minutos a 4000 rpm*

A actividade enzimática do sobrenadante foi determinada utilizando o ensaio de açúcar redutor de Nelson e Somogyi (Methods in Hicrobiology, volume 5B, pp. 300-301; (eds. J.R. Norris e D.W. Rihbons), Academic Press, London, 1971).

Determinação da actividade enzimática de degradação de amidos pelo ensaio do açúcar redutor

Soluções

Reagente 1

144g de Na2S0^ são dissolvidos por aquecimento suave em 500 ml de água desmineralizada. Adicionam-se 12 g de tartarato de sódio e potássio tetrahidrato, 24 g de Ν82θΟ^ e 16 g de NaHGOg às soluções. O volume total de solução é ajustado a 800 ml pela adição de água desmineralizda.

Reagente 2

Dissolvem-se 36 g de Na£S0^, mediante aquecimento moderado, em 100 ml de água desmineralizada e adicionam-se 4 g de CuSO^.SH^O ã solução tépida* 0 volume total da solução é ajustado a 200 ml pela adição de água desmineralizada.

Imediatamente antes da utilização os reagentes 1 e 2 são misturados na relação de 4:1 (reagente 1: reagente 2).

Reagente 3

Dissolvem-se 25 g de molibdato de amónio tetrahidrato em 450 ml de água desmineralizada e adicionam-se 21 ml de ácido sulfúrico eoncentrado mediante agitação vigorosa. Dissolvem-se 3 g de NagHASO^* 787,^ ^e!B de água desmineralizada e esta solução é adicionada à solução de molibdato. A solução global é aquecida durante 48 horas a 37⁹C e qualquer precipitado é eliminado por filtração.

Padrão

Dissolvem-se 100 mg de glucose em ãgua desmineralizada e o volume total é ajustado a 100 ml. Antes da utilização a solução é diluida 10 vezes com água desmineralizada.

Substrato

0,25% de amido solúvel. (Merck, produto n² 1257) dissolvido em tampão Jte^COq-NaHCQg 0,1 M, pH 10,1.

Ensaio

0,9 ml da solução de substrato de amido, pH 10,1 são colocados num tubo de ensaio. 0 tubo de ensaio e colocado em banho-maria a 25^SC e deixa-se equilibrar a temperatura. A reacção enzimática é iniciada pela adição de 0,1 ml do sobrenadante da cultura contendo o enzima. Deixa-se prosseguir a reacção durante 30 minutos. A reacção ê interrompida pela adição de 1 ml do reagente 1/2 e aquecimento durante 10 minutos a 100^sC. A mistura é arrefecida sobre gelo durante 5 minutos e depois adicionam-se 0,5 ml do reagente 3 e deixa-se desenvolver a cor azul à temperatura ambiente durante 30 mnutos. A mistura é diluida por adição de 1,0 ml de água desmineralizada e mede-se a extinção a 500 nm num espectrofotometro» Os açucares redutores são medidos como equivalentes de glucose a partir de uma curva padrão*

Uma unidade de actividade de enzima de degradação de amido é definida como 1 pg de açucares redutores medidos como glucose, libertado por ml e por minuto a pH 10,1 e a 25²C.

número de unidades de enzima de degradação de amido formadas está indicado no quadro 23*

QUADRO 23

Produção de enzimas de degradação de amido pela estirpe 1E.1

	MEIO	DENSIDADE Óptica a 55Chm	FINAL	ENZIMA UNIDADES POR LITRO
	MAIS AMIDO	2.25	9.4	1150
	SEM AMIDO	0.75	10.3	660

Os resultados do ensaio indicam claramente a presença de enzimas de degradação de amidos, produzidos pela estirpe bacteriana alcalifílicas da presente invenção, na calda de cultura.

EXEMPLO 5

Estabilidade de enzimas que degradam amidos era detergentes

S demonstrada a capacidade dos nm enzimas que degradam amidos, produzidos pela estirpe 1E.1 , para tolerar os detergentes, o que é essencial para a sua aplicação em detergentes de lavandaria ou para desengomar texteis.

Balões de Erlenmeyer de 100 ml dotados de um deflector foram carregados, cada um com 30 ml de

de um tampão de S^^Og/NaHCO^ 0,1 PN 10,1, contendo 0,12 g de dodecil-sulfato de sódio (equivalente a 4 g por litro). Adicionou-se a metade dos balões 0,3 g de amido de batata (equivalente a 1%).

Cada balão foi adicionado de CT sobrenadante contendo o enzima da estirpe 1E.I^a por adição de 0,5, 1,0 ou 2,0 ml (ver quadro 23). Como controle 0 líquido sobrenadante foi substituído por 1,0 ml de água. Imediatamente depois da adição do enzima retirou-se uma amostra de 0,1 ml (tempo = 0 horas) para a medição da actividade enzimática.

Os balões foram incubados com agitação a 25²C durante 2,5 horas, retirando-se após este período de tempo uma segunda amostra de 0,1 ml para medição da actividade enzimática.

A experiência foi repetida para comparação utilizando uma amilase convencional obtida de Bacillus subtilis.

A actividade enzimática foi determinada utilizando método de açucares redutores descritos acima.

Os resultados estão indicados no quadro 24.

QUADRO 24

ESTABILIDADE DE ENZIMAS QUE DEGRADAM AMIDOS DA

ESTIRPE 1E.i££eM DETERGENTES

Setomulapte eoaimatío aaaiaa aáicioaaáo	unidades de eoriasa re* eaperadas 3*5 &·
Caí)	ewxçõss	pS	Ô li*
0 X		10*4	s	0
0*8	SôS	10*3	20	20
1*0		10.3	4<	43
2*0		19,3	109	113
c a		1@*3	O	0
0.5	sss *	10.2	12	11
1*0	ASIÔÔ	1Θ.1	36	40
2*0		10*2	79	120
Mtfo § SOS		Χθ.4	9	Ô
FadrSõ § SOS * amido	10*1	8	3

afe eobstittiiáo por I sai de água § 2,3 8â9 4* Λ·*33ΐ1ββ> 4a Baeillilua aubtília * «m MO <se£$rea®e &9U09 %»ie> í iefíniia saa© a fsaMídade 4o eatías Ψ&& eoaverte i sg & aaido por aíauto a pS 3,3 « a 30#£ aom iMRjfâsie© qaa» apd» a sôaeçSs eoa iodo# fcôa assa absorvfccia g S20 o» igsseX I d© sse sotaçSo cemtesrôs 25 g âe CôSl^»⁶^* & ^áe ^2¾% δ 1 «t á« 801 1 M ea 103 &X de âgaa destilada»

0» raanltaáôs deste teste deaonstra?i: elarawaté a estaMiidasa doa oas&iss <se dogradaa aaiâos, pradazidas pala estirpe baeteriaaa alealifíiica da presente

ÍiwwçSô» aa preaesça de detergente®*

EXEMPLO 6

Produção de enzimas lipoliticos das novas estirpes que exibiram nitidamente actividade de lipase (Apêndice D) foram ensaiadas posteriormente quanto a produção de enzimas lipoliticos. As 11 estirpes são exemplos do feixe 2 e do feixe 3 (fig. 1).

As experiências foram realizadas em balões cónicos de 100 ml contendo 30 ml de meio nutriente alcalino estéril, pH 9,6, inoculado com a estirpe bacteriana apropriada. Utilizaram-se 3 meios diferentes, nomeadamente os meios Z a BB (apêndice A). Os balões foram colocados num incubador com agitação orbital (300 rpm) a 30^sC durante 48 Ii. As células foram separadas da calda de cultura por centrifugação e os sobrenadantes foram dialisados contra 50 volumes de tampão tris-HCl 0,1 mM pH 9, com 3 mudanças de

tampão ao	longo de 24.h	. 0s dialisados	foram liofilizados
obtendo-se	uma composição	de lipase (quadro	25).
	As	composições de	lipase obtidas	de
acordo com	este exemplo	foram utilizadas	para o ensaio	de
lavagera descrito no exemplo 7 adiante.
		QUADRO 25
	PRODUÇÃO DÊ LIPASE
ESTIRPE	MEIO DE	LIPASE	LIPASE
	PRODUÇÃO	TLU/ml	TLU/g
39E.3	BB	1.3	134
40E.3	Z	1.2	118
41E.3	Z	1.1	82
42E.3	Z	1.2	76
44E.3--	Z	1.2	99
45E.3bi	AA	1.4	98
48E.3	BB	2.0	152
49N.3	BB	1.5	123
50M.3	BB	2.0	100
5 IN. 3	BB	1.0	98
52N.3	BB	1.2	128

- 95 * TLU = True Lipase Unifc definida na patente americana 4 933 287

Os resultados deste teste demonstrara nitidamente a presença de enzimas lipiliticos, produzidos pelas bactérias aicalifílicas da presente invenção, na calda de cultura e numa composição liofilizada do dialisado da calda de cultura.

EXEMPLO 7 leste de lavagem com lipase

As composições de lipase do exemplo 6 foram ensaiadas quanto ao seu comportamento em condições de lavagem em pé TIDE& (1,5 g/1) um produto detergente de Procter & Gamble.

teste de lavagem (teste SLM) foi realizado como é descrito na patente americana 4 933 287, que é aqui indicada para referência* Como controle foi utilizda uma lipase obtida de Pseudomonas alcaligenes estirpe Ml (CB3 473*85) descrita na patente americana 4 933 287, Os resultados sao apresentados nço quadro 26.

QUADRO 26

TESTE DE LAVAGEM COM LIPASE

Detergente: TIDE^R (pó), 1,5 g/1

Lipase: 2 TLU/ml

Ca2⁺ « io 5 (tripolifosfato de sódio adicionado) pH : 9,5

ESTIRPE CKGLICERIDOS LIPIDOS TOTAIS

39E.3	55.3	73.4
40E.3	82.0	89.9
41E.3	44.7	78.7
42E.3	55.5	74.8
44E.3	6.6	76.9
45E.3CT	81.6	92.9
48.3	76.5	82.9
49N.3	72.4	82.0
50N.3	50.5	76.6
5ÍNT3	80.4	87.6
52N.2	77.0	84.7
Ml	88.5	91.5
Controle *	98.7	98.7

* Agua corrente padrão definida na patente americana 4 933 287.

A diminuição da percentagem de recuperação de triglicéridos e lípidos totais, em comparação com o controle, indicam nitidamente a capacidade dos enzinas lipolíticos, produzidos pelas bactérias alcalifílicas da presente invenção, para degradar e remover triglicéridos e os seus produtos de degradação impregnados numa amostra de tecido, bem como o seu melhor desempenho em comparação com uma lipase conhecida.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   - ia Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

   - a cultura de uma bactéria a® meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica, alcalifilica permanente, em forma de haste, Gram-negativa, tendo as seguintes características ;

   a) forma colónias circulares de cor creme;

   b) cresce optimamente entre pH 9 e pH 10;

   c) dá uma resposta positiva aos seguintes testes:

   1) Leucina arlamidase
2. 2) Valina arilamidase
3. 3) fosfohidrolase;
4. 4) Polimixina;

   d) dá uma resposta negativa aos seguintes testes:

   1) N-acetilglucosamina

   2) Maltose

   3) Propionato

   4) Gaprato
5. 5) Valerato
6. 6) Citrato
7. 7) Histidina
8. 8) Glicogéneo
9. 9) 4-hidroxibenzoato
10. 10) ^-galactosidase

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    - 29 Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura de bactérias num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria alcalifilica permanente, em forma de haste, Gram-negativa, aeróbica, tendo as seguintes caracteristicas:

    a) forma pequenas colónias de cor creme;

    b) cresce optimamente entre pH 7 e pH 11,2;

    c) dá uma resposta positiva aos seguintes testes;

    1) Amido

    2) Acetato

    3) Propionato

    4) Valerato

    5) Prolina

    6) Lipase

    7) Oxidase (resposta dentro de 10 segundos);

    d) dá uma resposta negativa aos seguintes testes:

    1) N-acetilglucosamina

    2) Sacarose

    3) Histidina

    4) 2-cetoglueonato

    5) 4-hiroxibenzoato

    6) ^-glucosidase

    7) <B-giucosidase

    8) Ácido fusidico.

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    _ 32 _

    Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica alcalifílica permanente, em. forma de haste, Gram-negativa, tendo as seguintes caracteristicas:

    a) forma colónias opacas de cor creme;

    b) cresce opticamente entre pH 8,5 e pH 10,7;

    c) contém ubiquinona 6 como uma quinona respiratória maioritária;

    .d) dá uma resposta positiva aos seguintes testes;

    1) Acetato

    2) Lactato

    - 99 3) Propionato

    4) Valerato

    5) Citrato

    6) 3-hidroxibenzoato

    7) Prolina

    8) Leucina arilamidase;

    e) dá uma resposta negativa aos seguintes testes:

    1) Fosfohidrolase

    2) DÇ-galactosidase

    3) Ácido fusídico

    4) Tetraciclinas

    5) Vancomicina

    6) Bacitracina, separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    —* Z|. Ô *»

    Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica alcalifilica permanente, em forma de haste, Gram-negativas, tendo as seguintes caracteris ticas:

    a) forma colónias opacas de cor amarelada acastanhada;

    b) cresce opticamente entre pH 7,5 e pH 10,9;

    c) contém ubiquinona 9 como quinona respiratória maioritária

    d) dá uma resposta positiva aos seguintes testes:

    1) Lactato

    2) Alanina

    3) 3-hidroxibutirato

    4) Valina arilamidase

    5) Polimixina;

    e) dá uma resposta negativa aos seguintes testes:

    1) Histidina

    2) Ampicilina

    - 100 3) Ácido naladíxico

    4) Trimetoprima

    5) Penicilina G

    6) Meticilina.

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    -53-.

    Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica, alcalifílica permamente, em forma de haste, Gram-negativa, tendo as seguintes caracterís ticas:

    a) forma colónias de cor amarelo vivo;

    b) cresce opticamente entre pS 8 e pH 10,5;

    c) dá uma resposta positiva aos seguintes testes:

    1) Posfohidrolase

    2) (X-galactosidase

    3) ^-galactosidase

    4) Ampicilina

    5) Ácido fusídico

    6) Meticilina

    7) Tretaciclinas

    8) Vaneomieina

    9) Bacitracina;

    d) dá uma resposta negativa aos seguintes testes:

    1) N-acetilglucosamina

    2) Lactato

    3) L-alanina

    4) Manitol

    5) Propionato

    6) Caprato

    7) Valerato

    8) Histidina

    9) 3-hidroxibenzoato

    101 -

    10) 3-hidroxibutirato
11. 11) 4-bidroxibenzoato
12. 12) Polimixina.

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    - 6® Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis caracterizado por compreender;

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica, alcalifxlica permanente, em forma de haste, Gram-negativa, tendo as seguintes caracteris: ticas:

    a) forma colónias achatadas irregulares, de cor creme a beije;

    b) cresce opticamente entre pH 8,2 e pH 10,9;

    c) dá uma resposta positiva aos seguintes testes:

    1) Amido

    2) N-acetilglucosamina

    3) Sacarose

    4) Maltose

    5) Acetato ó) Alanina

    7) Citrato

    8) Glicogéneo

    9) 3-hidroxibutirato

    10) Penicilina G

    11) Acido fusídico

    12) Meticilxna
13. 13) Tetraciclinasine
14. 14) Bacitracina;

    d) dá uma resposta negativa aos seguintes testes;

    1) Piruvato

    2) 4-hidroxibenzoato

    3) Leucina arilaminase

    4) Valina arilamidase

    - 102 5) ty-galactosidase

    6) polimixina.

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    - 7s Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura da bactéria num maio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica, alcalifílica permanente, em forma de haste, móvel, Gram-negativa, tendo as seguintes carae teristicas:

    a) células frequentemente aos pares;

    b) cresce opticamente entre pH 9 e pH 10;

    c) era agar alcalino forma colónias moles, translúcidas, de cor beije, com 1 a 2 mm de diâmetro, que são circulares, convexas, com uma margem inteira;

    d) em calda alcalina o crescimento (37^SC) é floculento cora uma película anelar ou superficial e formação de um sedimento;

    e) cresce opticamente a 20^sC até 30^sC;

    f) nao apresenta crescimento a 15^SC ou a 40^aC;

    g) o teste de KOH é positivo;

    h) o teste de aminopeptidase é fracamente positivo;

    i) o teste de oxidase é fracamente positivo;

    j) o teste da catalase é positivo;

    k) é halófila permanente;

    l) cresce opticamente em NaCl a 4%;

    m) não cresce a 0% de NaCl ou a 8%

    n) a hidrólise do teste de gelatina é lentamente positiva;

    o) a hidrólise de amido ê positiva;

    p) não cresce em açucares simples;

    q) não cresce em ácidos orgânicos;

    r) creme em extracto de levedura e peptonas;

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    103 -

    - 8® Processo para a preparaçao de enzima3 tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aerobica, alcalifílica permanente, era forma de haste, móvel, Gram-negativa, tendo as seguintes carac teristicas:

    a) cresce opticamente entre pH 8,2 e pH 10,9;

    b) em agar alcalino forma colónias moles, opacas, de cor beige ou castanha, com 2 a 4 mm de diâmetro, que são de forma circular, são convexas vistas de lado, com uma margem inteira;

    c) em calda alcalina o crescimento (37^SG) é denso e floculento com um sedimento e película superficial;

    d) cresce optimamente entre 20²C e 37²C;

    e) não cresce a 80^sC ou a 40²C ou a temperaturas superiores;

    f) 0 teste de KOH é positivo;

    g) o teste da aminopeptidase ê positivo;

    h) 0 teste da oxidase é muito fracamente positivo;

    i) 0 teste da catalase é positivo;

    j) cresce a uma concentração de NaCl compreendida entre 0% a 15%;

    k) não cresce a 20% de NaCl;

    l) a hidrólise do teste de gelatina é negativa;

    m) a hidrólise de amido é negativa;

    n) cresce em extracto de levedura;

    o) cresce em ácidos orgânicos escolhidos do grupo que consiste em succionatos, píruvatos, citratos, malonatos, acetatos e lactatos;

    p) cresce em ácidos gordos escolhidos do grupo que consiste em propionatos, valeratos e suberatos;

    q) cresce em aminoácidos escolhidos do grupo que consiste em prolina, serina, histidins e lisana,

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    - 104 - 9? Processo para a preparaçao de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender;

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica alcalifílica permanente, em forma de haste, Gram-negativa, tendo as seguintes caracteristicas:

    a) cresce optimamente entre pH e pH 10,5;

    b) em agar alcalino forma colónias moles, opacas, de cor castanha, com 3 a 4 mm de diâmetro que são de forma moderadamente irregular, geralmente achatadas e levemente salientes, com uma margem lobada;

    c) em calda alcalina o crescimento (37⁹C) é moderado a denso, tornando-se floculento com um sedimento e película superficial;

    d) cresce optimamente entre 20^sC e 40^aC;

    e) não cresce a 45^SC;

    f) o teste da KOH é positivo;

    g) o teste da aminopeptidase é positivo;

    h) o teste da oxidase é negativo;

    i) o teste da catalase é positivo;

    j) cresce a uma concentração de NaCl de 0% a 12%;

    k) não cresce a 20% de NaCl;

    l) o teste da hidrólise de gelatina é positivo;

    m) a hidrólise em amido é fracamente positiva;

    n) não cresce em açucares simples;

    o) cresce em extracto de leveduras;

    p) cresce em ácidos orgânicos escolhidos do grupo que consiste em piruvatos, citratos, acetatos e lactatos;

    q) cresce em ácidos gordos escolhidos do grupo que consiste em propionatos, eapratos e valeratos;

    r) cresce em aminoácidos s escolhidos do grupo que consiste em prolina, alanina e lisina,

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    - 105 Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aerobica, alcalifílica permanente, em forma de haste, Gram-negativa, tendo as seguintes características:

    a) não cresce abaixo de pH 7,5;

    b) em agar alcalino forma colónias moles, de cor creme, inicialmente translúcidas mas que se tornam opacas;

    c) em agar alcalino as colónias desenvolvem-se de circulares e inteiras e tornam-se irregulares, de forma lobada, sendo convexas quando vistas lataralmente;

    d) em calda alcalina o crescimento (37²G) é lento, leve, floculanto com um sedimento mas sem película superficial;

    e) cresce optimamente entre 10-G e 40⁹C;

    f) não cresce a 8²G ou 45^SC;

    g) o teste da KGI-I é positivo;

    h) o teste da aminopeptidase é negativo;

    i) o teste da oxidase é positivo;

    j) o teste da catalase é positivo;

    k) cresce a uma concentração de NaCl compreendida entre 0 e 15%;

    l) não cresce a 20% de NaCl;

    m) a hidrólise do teste de gelatina é positiva;

    n) a hidrólise de amido é fracamente positiva;

    o) cresce em extracto de levedura e peptonas;

    p) cresce em açucares;

    q) cresce em ácidos orgânicos;

    r) cresce em aminoácidos;

    - separação da bactéria do meio de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio de cultura.

    - 11^a Processo para a preparação de enzimas tolerantes a álcalis, caracterizado por compreender:

    - a cultura da bactéria num meio de cultura, consistindo a bactéria numa bactéria aeróbica, alcalifílica permanente, em forma de haste, pequena, Gram-negativa, tendo as seguintes características:

    a) as células formam frequentemente cadeias curtas;

    b) não cresce abaixo de pH 8;

    c) em agar alcalino forma colónias moles, circulares, convexas com uma margem inteira, com cerca de 1 mm de diâmetro que inicialmente são transparentes, de cor creme/beije, tornando-se as colónias opacas e de cor castanha com a idade;

    d) em calda alcalina o crescimento (37^SC) é inicialmente uniformemente turvo com um sedimento mas sem película superficial, tornando-se floculento com a formação de uma película;

    e) cresce optimamente entre 30²G e 37-C;

    f) não cresce a 40^sG;

    g) o teste da KOH é positivo;

    h) o teste da aminopeptidase é positivo;

    i) o teste da oxidase é positivo;

    j) o teste da catalase é positivo;

    k) é halófila permanente;

    l) cresce a uma concentração de 4% de NaCl;

    m) não cresce a 0% de NaCl ou a 852 de NaCl;

    η) o teste da hidrólise de gelatina ê positivo lento;

    o) a hidrólise de amido é negativa;

    p) cresce em extracto de levedura e peptonas;

    q) cresce em açucares;

    r) cresce em ácidos orgânicos;

    s) cresce em ácidos gordos;

    t) cresce em aminoácidos;

    - separação da bactéria de cultura; e

    - isolamento da actividade do enzima do meio da cultura.

    - 107

    - 12^s

    Processo para a preparação de uma coa·* posição essencialmente pura do enzima preparado de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolítica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 13® Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolítica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 14 3 Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolítica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 15^a Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolítica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 16â Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolítica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 108

    17® Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por sa incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividade proteolitica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 18ã Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolitica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 19® Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm actividade lipolítica.

    - 20® Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolitica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 21® Processo para a preparação da uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste

    - 109 em actividades proteolítica, lipolítica e de degradação de amido.

    - 22S Processo para a preparação de uma composição essencialmente pura do enzima preparado de acordo còsa a reivindicação 11, caracterizado por se incorporarem enzimas que têm uma actividade escolhida do grupo que consiste em actividades proteolítica e de degradação de amido.

    A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente norte-americano apresentado em 6 de Agosto de 1990, sob o N⁹ 07/562,863.