NO309198B1

NO309198B1 - Renkultur av alkalifile bakterier og anvendelse derav for fremstilling av alkali-tolerante enzymer

Info

Publication number: NO309198B1
Application number: NO921324A
Authority: NO
Inventors: Brian Edward Jones; William Duncan Grant; Nadine Claire Collins
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1990-08-06
Filing date: 1992-04-03
Publication date: 2000-12-27
Also published as: KR100215259B1; EP0473217B1; PT98578B; AU640043B2; ATE159285T1; DE69127944D1; FI921489A; DK0473217T3; NO921324L; KR920702408A; FI921489A0; CA2067234C; JPH05501960A; FI119882B; PT98578A; DE69127944T2; WO1992002613A1; IE912786A1; ES2110426T3; GR3025626T3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår feltet mikrobiologi og mer spesielt feltet alkalifile mikroorganismer, samt anvendelse derav for fremstilling av alkali-tolerante enzymer.

Alkalifile organismer er definert som organismer som viser optimal vekst i alkalisk pH-miljø, spesielt ved pH over 8, og vanligvis i området mellom pH 9 og 10. Alkalifile organismer kan også finnes levende i miljøer med en pH så høy som 12. Obligat alkalifile organismer kan ikke vokse ved nøytral pH.

Alkalifile organismer kan finnes i slike vanlige miljøer som hagejord, antagelig på grunn av skiftende alkaliske betingelser forårsaket av biologisk aktivitet såsom ammoni-fisering, sulfatreduksjon eller fotosyntese. En mye rikere kilde til større variasjon av alkalifile organismer kan finnes i naturlig forekommende stabile alkaliske miljøer såsom natronsjøer.

En mer detaljert undersøkelse av natronsjøer og alkalifile organismer generelt er tilveiebragt i W.D. Grant, W.E. Mwatha og B.E. Jones ((1990) FEMS Microbiology Reviews, 75, 255-270), og denne tekst er medtatt i det foreliggende som referanse. Oppregninger av alkaliske natronsjøer kan finnes i publikasjonene av W.D. Grant og B.J. Tindall i Microbes in Extreme Environments, (red. R.A. Herbert og G.A. Codd); Academic Press, London, (1986), s. 22-54; og B.J. Tindall i Halophilic Bacteria, vol. 1, (red. F. Rodriguez-Valera); CRC Press Inc., Boca Raton, FL, (1988), s. 31-79, og begge disse tekster er også medtatt i det foreliggende som referanse.

Alkalifile organismer, hvorav hovedmengden er Bacillus-arter, er blitt isolert fra ikke-saltholdige miljøer og er omtalt av K. Horikoshi og T. Akiba i Alkalophilic Micro-organisms (Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N.Y., (1982)). Alkalifile organismer fra saltholdige og alkaliske miljøer såsom innsjøer er imidlertid ikke omtalt i denne publikasjon. Strengt anaerobe bakterier fra alkaliske, hypersaltholdige miljøer er nylig blitt beskrevet av H. Shiba i Superbugs (red. K. Horikoshi og W.D. Grant.) ; Japan Scientific Societies Press, Tokyo og Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N.Y., (1991), s. 191-211; og av N. Nakatsugawa, samme sted, s. 212-220.

Natronsjøer, som kan finnes på forskjellige steder rundt i verden, er fremkommet ved en kombinasjon av geologiske, geografiske og klimatiske forhold. De er karakterisert ved . tilstedeværelse av store mengder natriumkarbonat (eller komplekser derav) dannet ved fordampningskonsentrasjon, såvel som ved tilsvarende mangel på Ca 2+ og Mg 2 +, som ville fjerne karbonat-ioner som uløselige salter. Andre salter såsom NaCl kan også konsentreres, hvilket resulterer i miljøer som både er alkaliske og saltholdige.

Til tross for dette tilsynelatende barske miljø, er natronsjøer ikke desto mindre oppholdssted for en stor populasjon av prokaryote organismer, hvorav noen få typer kan dominere som permanente eller periodiske oppblomstringer. Organismejie er i området fra alkalifile cyanobakterier til halogenalkalifile arkeobakterier. Videre er det ikke uvanlig å finne felles typer alkalifile organismer som har oppholdssted i natronsjøer på vidt forskjellige steder i hele verden såsom i den øst-afrikanske Rift Valley, i vestlige deler av USA, i Tibet, Kina og Ungarn. F.eks. er natronobakterier blitt isolert og identifisert i natronsjøer i Kina (D. Wang og Q. Tang, "Natronobacterium from Soda Lakes of China" i Recent Advances in Microbial Ecology, (Proceedings of the 5th International Symposium on Microbial Ecology, red. T. Hattori et al.,); Japan Scientific Societies Press, Tokyo, (1989), s. 68-72) og i vestlige deler av USA (S. Morth og B.J. Tindall,

(1985) System. Appl. Microbiol., 6, 247-250). Natronobakterier er også blitt funnet i natronsjøer i Tibet (W.D. Grant upubliserte observasjoner) og i India (V. Upasani og S. Desai,

(1990) Arch. Microbiol., 154, s. 589-593).

Alkalifile organismer har allerede gjort seg gjeldende ved anvendelse i bioteknologi for fremstilling av forbruks-produkter. Alkali-tolerante enzymer dannet av alkalifile mikroorganismer har allerede funnet anvendelse ved industrielle prosesser og har et betydelig økonomisk potensiale. Disse enzymer anvendes f.eks. for tiden i vaskemiddelblandinger og ved garving av lær, og de ventes å finne anvendelse i matvare-, avfallsbehandling- og tekstilindustrien. Dessuten er alkalifile organismer og deres enzymer potensielt egnet for biotransformasjoner, særlig ved syntese av rene enantiomere forbindelser.

Foreliggende oppfinnelse angår ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, kjennetegnet ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper:

a) danner kremfarvede, sirkulære kolonier,

b) vokser optimalt mellom pH 9 og 10,

c) gir positiv respons ved følgende tester:

1) Leucin-arylamidase

2) Valin-arylamidase

3) Fosfatohydrolase

4) Polymixin;

d) gir negativ respons ved følgende tester:

1) N-acetylglukosamin

2) Maltose

3) Propionat

4) Kaprat

5) Valerianat

6) Citrat

7) Histidin

8) Glykogen

9) 4-hydroksybenzoat

10) of-galaktosidase.

Foreliggende oppfinnelse angår også ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, kjennetegnet ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper:

a) danner små, kremfarvede kolonier,

b) vokser optimalt mellom pH 7,8 og 11,2,

c) gir positiv respons ved følgende tester:

1) Stivelse

2) Acetat

3) Propionat

4) Valerianat

5) Prolin

6) Lipase

7) Oksydase (respons innen 10 sek.);

d) gir negativ respons ved følgende tester:

1) N-acetylglukosamin '

2) Sakkarose

3) Histidin

4) 2-ketoglukonat

5) 4-hydroksybenzoat

6) a-glukosidase

7) S-glukosidase

8) Fusidinsyre.

Foreliggende oppfinnelse angår ytterligere ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, kjennetegnet ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper:

a) danner kremfarvede, opake kolonier,

b) vokser optimalt mellom pH 8,5 og 10,7,

c) inneholder ubikinon 6 som et hoved-respirasjons-kinon;

d) gir positiv respons ved følgende tester:

1) Acetat

2) Laktat

3) Propionat

4) Valerianat

5) Citrat

6) 3-hydroksybenzoat

7) Prolin

8) Leucin-arylamidase:

e) gir negativ respons ved følgende tester:

1) Fosfohydrolase

2) at-galaktosidase

3) Fusidinsyre

4) Tetracyklin

5) Vancomycin

6) Bacitracin.

a) danner beige til brunfarvede, opake kolonier,

b) vokser optimalt mellom pH 7,5 og 10,9,

c) _inneholder ubikinon 9 som et hoved-respirasjons-kinon,

d) gir positiv respons ved følgende tester:

1) Laktat

2) Alanin

3) 3 -hydroksybutyrat

4) Valin-arylamidase

5) Polymixin;

e) gir negativ respons ved følgende tester:

1) Histidin

2) Ampicillin

3) Naladixinsyre

4) Trimethoprim

5) Penicillin G

6) Methicillin.

a) danner lysegule kolonier,

b) vokser optimalt mellom 8 og 10,5,

c) gir positiv respons ved følgende tester.

1) Fosfohydrolase

2) a-galaktosidase

3) S-galaktosidase

4) Ampicillin

5) Fusidinsyre

6) Methicillin

7) Tetracyklin

8) Vancomycin

9) Bacitracin

d) gir negativ respons ved følgende tester:

1) N-acetylglukosamin

2) Laktat

3) L-alanin

4) Mannitol

5) Propionat

6) Kaprat

7) Valerianat

8) Histidin

9) 3-hydroksybenzoat

10) 3 -hydroksybutyrat

11) 4-hydroksybenzoat

12) Polymixin.

Foreliggende oppfinnelse angår også ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, kjennetegnet ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) danner kremfarvede til beige-farvede, uregelmessige, flate kolonier,

b) vokser optimalt mellom pH 8,2 og 10,9,

c) gir positiv respons ved følgende tester:

1) Stivelse

2) N-acetylglukosamin

3) Sakkarose

4) Maltose

5) Acetat

6) Alanin

7) Citrat

8) Glykogen

9) 3 -hydroksybutyrat

10) Penicillin G

11) Fusidinsyre

12) Methicillin

13) Tetracyklin

14) Bacitracin;

d) gir negativ respons ved følgende tester:

1) Pyruvat

2) 4-hydroksybenzoat

3) Leucin-arylamidase

4) Valin-arylamidase

5) a-galaktosidase

6) Polymixin.

Foreliggende oppfinnelse angår også ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, kjennetegnet ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, bevegelige, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper:

a) celler ofte i par,

b) vokser optimalt mellom pH 9 og 10,

c) danner på alkalisk agar glatte, gjennomskinnelige, beige-farvede kolonier med diameter 1-2 mm, som er

sirkulære, konvekse med hel kant,

d) i alkalisk buljong er veksten (37°C) fnuggaktig med en ring eller overflatehinne og dannelse av et

bunnfall,

e) vokser optimalt ved 20-30°C,

f) ingen vekst ved 15 eller 40°,

g) KOH-testen er positiv,

h) aminopeptidasetesten er svakt positiv,

i) oksydasetesten er svakt positiv,

j) katalsetesten er positiv,

k) obligat halofil,

1) vokser optimalt med 4% NaCl,

m) ingen vekst med 0 eller 8% NaCl,

n) testen for hydrolyse av gelatin er langsomt positiv, 0) hydrolyse av stivelse er positiv,

p) vokser ikke på enkle sukkerarter,

q) vokser ikke på organiske syrer,

r) vokser på gjærekstrakt og peptoner.

a) vokser optimalt mellom pH 8,2 og 10,9,

b) danner på alkalisk agar glatte, opake, beige eller brunfarvede kolonier med diameter 2-4 mm, som har sirkulær form, konveks profil og med hel kant, c) i alkalisk buljong er veksten (37°C) massiv og fnuggaktig med et bunnfall og overflatehinne,

d) vokser optimalt mellom 20 og 37°C,

e) ingen vekst ved 8 eller 40°C eller over denne temperatur,

f) KOH-testen er positiv,

g) aminopeptidasetesten er positiv,

h) oksydasetesten er meget svakt positivt,

1) katalasetesten er positiv,

j) vokser ved en NaCl-konsentrasjon på mellom 0 og 15%, k) ingen vekst med 20% NaCl,

1) testen for hydrolyse av gelatin er negativ,

m) hydrolyse av stivelse er negativ,

n) vokser på gjærekstrakt,

0) vokser på organiske syrer valgt fra gruppen som består av suksinat, pyruvat, citrat, malonat, acetat og laktat,

p) vokser på fettsyrer valgt fra gruppen som består av

propionat, valerianat og suberat,

q) vokser på aminosyrer valgt fra gruppen som består av

prolin, serin, histidin og lysin.

a) vokser optimalt mellom pH 9 og 10,5,

b) ..danner på alkalisk agar glatte, opake, brunfarvede kolonier med diameter 3-4 mm, som har ganske

uregelmessig form, har generelt flat til lett bølget profil med fliket kant,

c) i alkalisk buljong er veksten (37°) moderat til massiv, og blir fnuggaktig med et bunnfall og

overflatehinne,

d) vokser optimalt mellom 20 og 40°C,

e) ingen vekst ved 45°C,

f) KOH-testen er positiv,

g) aminopeptidasetesten er positiv,

h) oksydasetesten er negativ,

1) katalasetesten er positiv,

j) vokser ved en NaCl-konsentrasjon på 0-12%,

k) ingen vekst ved 20% NaCl.

1) testen for hydrolyse av gelatin er positiv,

m) hydrolyse av stivelse er svakt positiv, n) vokser ikke på enkle sukkerarter,

o) vokser på gjærekstrakt,

p) vokser på organiske syrer valgt fra gruppen som •

består av pyruvat, citrat, acetat og laktat,

q) vokser på fettsyrer valgt fra gruppen som består av

propionat, kaprat og valerianat,

r) vokser på aminosyrer valgt fra gruppen som består av

prolin, alanin og lysin.

a) vokser ikke under pH 7,5,

b) danner på alkalisk agar glatte, kremfarvede kolonier, i begynnelsen gjennomskinnelige, men som

blir opake,

c) på alkalisk agar utvikles koloniene fra sirkulære,

..hele og blir uregelmessige, med fliket form og

konveks profil,

d) i alkalisk buljong er veksten (37°C) langsom, lett, fnuggaktig med bunnfall, men ingen overflatehinne,

e) vokser optimalt mellom 10 og 40°C,

f) ingen vekst ved 8 eller 45°C,

g) KOH-testen er positiv,

h) aminopeptidasetesten er negativ,

i) oksydasetesten er positiv,

j) katalasetesten er positiv,

k) vokser ved en NaCl-konsentrasjon på mellom 0 og 15%, 1) ingen vekst med 20% NaCl,

m) testen for hydrolyse av gelatin er positiv,

n) hydrolyse av stivelse er svakt positiv,

o) vokser på gjærekstrakt og peptoner,

p) vokser på sukkerarter,

q) vokser på organiske syrer,

r) vokser på aminosyrer.

a) cellene danner ofte korte kjeder,

b) vokser ikke ved pH under 8,

c) danner på alkalisk agar glatte, sirkulære, konvekse kolonier med hel kant, med diameter ca. 1 mm og som

i begynnelsen er gjennomskinnelige, med kremfarvet/- beige farve, og koloniene blir opake og får brun

farve med tiden,

d) i alkalisk buljong er veksten (37°C) i begynnelsen jevnt uklar med et bunnfall, men ingen overflatehinne, og blir fnuggaktig med dannelse av en hinne,

e) vokser optimalt mellom 30 og 37°C,

f) ingen vekst ved 40°C,

g) KOH-testen er positiv,

h) _aminopeptidasetesten er positiv,

i) oksydasetesten er positiv,

j) katalasetesten er positiv,

k) obligat halofil,

1) vokser med 4% NaCl,

m) ingen vekst med 0 eller 8% NaCl,

n) testen for hydrolyse av gelatin er langsomt positiv, o) hydrolyse av stivelse er negativ,

p) vokser på gjærekstrakt og peptoner,

q) vokser på sukkerarter,

r) vokser på organiske syrer,

s) vokser på fettsyrer,

t) vokser på aminosyrer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rene kulturer av nye aerobe, gram-negative alkalifile bakterier. Disse bakterier er blitt isolert fra prøver av jord, vann, sediment og en rekke andre kilder, som alle er kommet fra alkaliske natronsjøer og fra områder rundt disse. Disse alkalifile organismer er blitt analysert i henhold til prinsippene ved numerisk klassifikasjon med hensyn til hverandre og også med hensyn til forskjellige kjente bakterier for bekreftelse av nyheten ved dem. Dessuten er disse bakterieklassifikasjoner videre avgrenset ved en analyse av forskjellige kjemotaksonomiske karakteregenskaper.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også data med hensyn til sammensetning av miljøene som prøvene med mikro-organismene ble tatt fra, såvel som de nødvendige medier for effektiv isolering og dyrking av dem, slik at en vanlig fagmann lett kan lokalisere et slikt miljø og være i stand til å isolere organismene ifølge foreliggende oppfinnelse ved å følge de fremgangsmåter som er beskrevet i det foreliggende.

Det er også et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe mikroorganismer som danner egnede alkali-tolerante enzymer, såvel som anvendelse av disse for oppnåelse av hovedsakelig rene preparater av disse enzymer. Disse enzymer kan utføre sine funksjoner ved høy pH, hvilket gjør dem unikt_ egnet for anvendelser som fordrer slike ekstreme betingelser. F.eks. kan alkali-tolerante enzymer anvendes i vaskemiddelblandinger, ved garving av lær og i matvare-, avfalls-behandlings- og tekstilindustrien, såvel som for biotransformasjoner såsom dannelse av rene enantiomere forbindelser.

Genene som koder for disse alkali-tolerante enzymer, kan isoleres, klones og bringes til ekspresjon i forenlige ekspresjonsverter under tilveiebringelse av en kilde til større volum av enzymprodukter som, hvis ønskelig, lettere kan renses og brukes ved forskjellige industrielle anvendelser, dersom villtype-stammen ikke danner tilstrekkelige mengder av det ønskede enzym, eller ikke fermenterer godt.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1. Forenklet dendrogram som viser klynger (fenoner)

oppnådd med SQ-koeffisienten og "Unweighted Average Linkage"-metoden.

Fig. 2. Forenklet dendrogram som viser klynger (fenoner)

oppnådd med Sj-koeffisienten og "Unweighted Average Linkage"-metoden.

Fig. 3. Forenklet dendrogram oppnådd med SQ-koeffisienten og "Unweighted Average Linkage"-metoden under anvendelse av de deriverte minimumsdiskriminatortester.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen Prøvetaking

Flere hundre stammer av bakterier er blitt isolert fra prøver av jord, vann, sediment og en rekke andre kilder i og rundt alkaliske innsjøer. Disse prøver ble oppnådd som en del av en undersøkelse i løpet av et tidsrom på 3 år. De isolerte bakterier er ikke-fototrofe eubakterier. Inntil nå er ikke slike bakterier blitt karakterisert i noen særlig grad.

Prøvene ble oppsamlet i sterile plastposer. Prøve-takingen ble utført ved innsjøene Elmenteita, Nakuru, Bogoria, Crater (Sonachi), Little Naivasha (Oloidien), Magadi og Little Magadi (Nasikie Engida), som alle finnes i Kenya, Øst-Afrika. Alkaliske natronsjøer med lignende miljøer kan også finnes i Tibet, Kina, Ungarn og vestlige deler av USA. På hvert prøvetakingssted ble fysiske parametre såsom pH, ledningsevne og temperatur registrert, såvel som det fysiske utseende av stedet og prøven. Noen av prøvene ble behandlet lokalt innen 36 timer etter oppsamling av prøven, men hovedmengden ble undersøkt et annet sted, flere uker etter oppsamling.

I tabell 1 er det oppregnet forskjellige stammer som er blitt isolert. Stammene er oppregnet i henhold til det sted som prøven ble tatt fra, det fysiske utseende av selve prøven og en henvisning til tabell 2, som viser den kjemiske analyse av prøvene fra innsjøvannet.

Tabell 3 viser en liste av de isolerte stammer anordnet ifølge resultatene av den numeriske klassifiseringsanalyse. Videre viser tabell 3 prøvens fysiske egenskaper, spesielt temperatur, ledningsevne og alkalisk pH, såvel som de tallrike isolasjonsmedier som fordres for oppnåelse av rene kulturer av de nye bakterier. Disse medier er bokstavkodet med henvisning til Vedlegg A.

Tabellene 1, 2 og 3 viser data ved hvilke miljøet på prøvetakingsstedene kan karakteriseres. Den kjemiske og fysiske analyse av prøvene bekrefter tilstedeværelse av alkalisk pH såvel som tilstedeværelse av uvanlig høye nivåer av Na2C03, koblet med lave nivåer av Ca<2+> og Mg<2+>.

Det foreligger ingen kjemisk analyse når det gjelder slamprøver. Videre foreligger det for noen få prøver ingen kjemisk analyse (se tabell 1). Imidlertid er det blitt analysert andre prøver tatt på samme sted, og disse er beskrevet i tabellene 1-3. Det er kjent at de basiske miljøer i natronsjøer er stabile når det gjelder pH og ione-sammensetning. Videre er mikrobepopulasjonene som finnes på disse steder, i stor grad vedvarende stabile. Det må således ventes at til tross for mangel på kjemisk analyse av visse prøver, kan ikke desto mindre miljøet fra hvilket bakteriene ble tatt,-bestemmes ut fra dataene vist i tabeller 1-3.

De friske natronsjø-vannprøver ble utplatet på et alkalisk næringsmedium (Medium A) like etter oppsamling. Mikroskopisk undersøkelse viste en uventet høy mangfoldighet av bakterietyper. Når man tar i betraktning miljøets sterkt alkaliske beskaffenhet, viste gjennomførbare tellinger uventet høye antall organotrope bakterier, i området 10 - IO<6> koloni-dannende enheter pr. ml. Prøvene ble oppbevart enten avkjølt eller ved romtemperatur. Etter noen få ukers lagring, steg det totale antall bakterier i prøven, mens mangfoldigheten av typer minsket.

Bokstavkodene for isolasjonsmediene viser til Vedlegg A.

Behandling av prøvene: Anriking og isolering av alkalifile bakterier

Det ble anvendt mange forskjellige anrikings- og isolasjonsmetoder. Noen av metodene ble spesifikt utformet for anriking og isolering av alkalifile bakterier som viser spesifikke typer enzymaktivitet ved alkalisk pH. Andre teknikker av mer generell beskaffenhet ble anvendt for isolering av forskjellige sorter alkalifile bakterier. I noen tilfeller ble det tatt hensyn til de spesifikke betingelser i innsjøene (Tabell 2) når det ble utført forsøk for isolasjon av bakterier.

De forskjellige næringsmedier som ble anvendt for isolering av de nye alkalifile bakterier, er betegnet Medium A - Medium Q. Sammensetningen av de forskjellige anvendte medier er vist i Vedlegg A.

For isolering av ikke-spesifikke alkalifile organotrofe bakterier, ble natronsjø-vannprøver eller fortynninger av disse utstrøket på alkalisk næringsagar, pH 10 - pH 10,5 (Medium A). Prøver med mer fast konsistens, slam, sediment o.s.v., ble først suspendert i en alkalisk næringsbuljong (Medium A) før utspreding på en alkalisk næringsagar (Medium A). Bakteriene ble dyrket i en oppvarmet inkubator, fortrinnsvis ved 37°C. I noen tilfeller ble prøvene suspendert i en alkalisk næringsbuljong (Medium A) og bakteriene dyrket ved rysting, fortrinnsvis ved 37°C i 2-3 dager før buljongen ble utspredt på en alkalisk næringsagar (Medium A) for isolering av bakteriekolonier.

For isolering av alkalifile bakterier som viste spesifikke enzymaktivitetstyper, ble prøver spredt på alkalisk næringsagar som inneholdt spesifikke substrater såsom laktalbumin eller kasein eller olivenolje. I noen tilfeller kan bakteriene i prøven anrikes i 1 dag eller i flere uker i en ikke-spesifikk alkalisk næringsbuljong såsom Medium A før utspreding av buljongen på en alkalisk næringsagar som er spesifikk for påvisning av bakterier som viser enzymaktivitet såsom lipolytisk eller proteolytisk aktivitet.

Klassifiseringsanalyse

70 stammer av bakterier isolert fra alkaliske innsjøer og rundt disse ble henført til bakterietypen kjent som gram-negative bakterier på basis av (1) Dussault-modifikasjonen ay Grams farvereaksjon (H.P. Dussault (1955), J. Bacteriol., 70, 484-485); (2) KOH-sensitivitetstesten T. Gregersen (1978), Eur. Appl. Microbiol. og Biotech. 5, 123-127; S. Halebian et al., (1981), J. Clin. Microbiol., 13, 444-448); (3) amino-peptidase-reaksjonen G. Cerny (1976), Eur. J. Appl. Microbiol., 3, 223-225; samme sted (1978), 5, 113-122); og i mange tilfeller bekreftelse også på basis av (4) en kinonanalyse (M.D. Collins & D. Jones (1981), Microbiol. Rev., 45, 316-354) under anvendelse av metoden beskrevet av M.D. Collins i Chemical Methods in Bacterial Systematics (red. M. Goodfellow & D. Minnikin) s. 267-288, Academic Press, London, 1985.

De 70 stammer ble undersøkt med hensyn til 104 egenskaper. Resultatene ble analysert ved anvendelse av prinsippene ved numerisk klassifikasjon (P.A.H. Sneath og R.R. Sokal i Numerical Taxonomy, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1973). De undersøkte egenskaper, og hvordan de ble undersøkt, er oppført i Vedlegg B. Dessuten angir Vedlegg C hvordan hver egenskap ble kodet for klassifiseringsanalyse.

Siden oppfinnerne ikke kjenner til noen godt dokumenterte fullstendige eller obligat ikke-fototrofe, alkalifile gram-negative eubakterier, ble en uensartet samling av 20 kjente gram-negative bakterier brukt som kontroller for den samme analyse under anvendelse av modifiserte pH-betingelser. Disse 20 kjente referansebakterier er oppført i tabell 4, fra hvilken det vil kunne sees at det i de fleste tilfeller er blitt anvendt "Stammetypen" av de kjente arter.

Analyse av testdata

Vurdering av klassifiseringslikhet

De fenetiske data, som besto av 104 egenskapsenheter, ble bedømt som angitt i Vedlegg C og oppført i form av en "n x t"-matriks, hvis t-kolonner representerer t-bakteriestammene for gruppering på basis av likhet, og hvis n-rekker er egenskaps-enheten. Klassifiseringslikhet hos bakteriestammene ble vurdert ved hjelp av en likhetskoeffisient (P.H.A. Sneath og R.R. Sokal, Numerical Taxonomy, som ovenfor, s. 114-187). Skjønt det er blitt anvendt mange forskjellige koeffisienter for biologisk klassifisering, har bare noen få funnet regelmessig anvendelse i bakteriologien. Vi har valgt å anvende to assosiasjonskoeffisienter (P.H.A. Sneath og R.R. Sokal, samme sted, s. 129 et seq.), nemlig Gower og Jaccard-koeffisientene. Disse er ofte blitt anvendt ved analyse av bakteriologiske data og er meget godt anerkjent av fagfolk på området, siden de er blitt vist å resultere i robuste klassifiseringer.

De kodede data ble analysert under anvendelse av TAXPAK-programpakken (M.J. Sackin, "Programmes for classification and identification", i Methods in Microbiology, vol. 19 (red. R.R. Colwell og R. Grigorova), s. 459-494, Academic Press, London,

(1987)) kjørt på en DEC VAX-computer ved universitetet i Leicester, U.K.

En likhetsmatriks ble konstruert for alle stammepar under anvendelse av Gower-koeffisienten (SG) med frihet til å velge negative motstykker (P.H.A Sneath og R.R. Sokal som ovenfor, s. 135-136) under anvendelse av RTBNSIM-programmet i TAXPAK. Som hoved-analysemidlet og det som de fleste av argumentene oppført i det foreliggende er basert på, ble Gower-koeffisienten valgt fremfor andre koeffisienter for dannelse av likhetsmatrikser fordi det kan anvendes for alle egenskaps-typer eller datatyper, nemlig to-tilstand, fler-tilstand (ifølge orden og kvalitativt) og kvantitativt.

Klyngeanalyse av likhetsmatriksen ble utført ved anvendelse av "Unweighted Pair Group"-metoden med aritmetisk gjennomsnitts-(UPGMA)-algoritme, også kjent som "Unweighted Average Linkage"-metoden ved kjøring av SMATCLST sub-rutinen i

TAYPAK

Resultatene av klyngeanalysen er et dendrogram, og en forenklet versjon av dette er vist på fig. 1. Dendrogrammet illustrerer likhetsnivåene mellom bakteriestammene. Dendrogrammet er oppnådd ved anvendelse av DENDGR-programmet i

TAXPAK.

De fenetiske data, hvor flertilstands-egenskaper er utelatt (egenskaper 1-5, 11 og 12; Vedlegg C) og som således består av 193 egenskapsenheter, og som er notert i totegns-system (positiv = 1, negativ = 0), ble analysert på nytt under anvendelse av Jaccard-koeffisienten" (Sj) (P.H.A. Sneath og R.R. Sokal, samme sted, s. 131) ved kjøring av RTBNSIM-programmet i TAXPAK. Et ytterligere dendrogram ble oppnådd ved anvendelse av SMATCLST med UPGMA-valg og DENDGR-sub-rutiner i TAXPAK. En forenklet versjon av dette dendrogram er illustrert på fig. 2. Vedlegg E gir de prosentvise positive egenskapstilstander i hver klynge.

Resultater av klynge-analysen

S^/UPGMA-metoden

Fig. 1 viser resultatene av klyngeanalyse, basert på Gower-koeffisienten og UPGMA-metoden, av 70 nye, gram-negative, alkalifile bakterier isolert fra alkaliske innsjøer og rundt disse, sammen med 20 kjente gram-negative bakterier.

Seks naturlige klynger eller fenoner av alkalifile bakterier som innbefatter 65 av de 70 alkalifile stammer, dannes ved 73% likhetsnivået. Skjønt valget av 73% for delineasjonsnivået kan synes vilkårlig, er det i overensstemmelse med gjeldende praksis ved numerisk klassifikasjon (B. Austin og F. Priest i Modem Bacterial Taxonomy, s. 37; Van Nostrand Reinholdt; Wokingham, U.K., (1986)). Plassering av delineasjonen ved lavere prosentandel ville kombinere grupper av klart ubeslektede organismer, mens en høyere prosentandel ville gi en mangfoldighet av mindre veldefinerte klynger, Ved 73%-nivået kan de individuelle klynger representere adskilte bakterieslekter. Videre understøttes signifikansen av klyngedannelse ved dette nivå ved kjemotaksonomiske data (se nedenfor) og det klyngemønster som fås ved anvendelse av Jaccard-koeffisienten (fig. 2).

Signifikansen av klyngedannelsen ved 73%-nivået under-stuttes av resultatene av TESTDEN-programmet. Dette program tester signifikansen av alle dikotome par av klynger (omfat-tende 4 stammer eller flere) i et UPGMA-dannet dendrogram med kvadrerte euklidske distanser), eller deres komplement, som .et mål. Programmet antar at klyngene er hypersfæriske. Den kritiske overlapping ble satt til 0,25%. Som det vil kunne sees av tabell 5, er adskillelsen av klyngene meget signifikant .

Et ytterligere mål på klyngeseparasjon kan vurderes ut fra sannsynligheten for klyngeoverlapping. Dette ble oppnådd ved anvendelse av OVERMÅT-programmet i TAXPAK med den kritiske overlapping anført ved 2,5%. Som det kan sees av tabell 6, er det en sannsynlighet på mer enn 95% for under 2,5% overlapping mellom klyngene. For mange av klyngekombinasjonene er overlappingen i praksis null. Bare klyngene 3 og 4 har mindre sannsynlighet for < 2,5% overlapping, men disse klynger kan klart skilles fra hverandre på basis av kjemotaksonomiske data (se nedenfor).

Kontrollen viser at klyngeanalysen, som ventet, grupperer Enterobacteriaceae separat. Dessuten grupperes også Aeromonas- og Pseudomonas-artene, medtatt som kontroller, også separat. Dette er helt i overensstemmelse med någjeldende klassifisering av disse organismer (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1, Williams og Wilkins, Baltimore/London, 1984).

Fem av de alkalifile stammer er utenfor hovedklyngene.

To stammer, 4E.1 og 5E.1, danner et adskilt, men beslektet par og har tydeligvis forbindelse med hovedgruppene av alkalifile bakterier. Stamme wN2 foreligger heller ikke i klynger, men er tydeligvis beslektet med en Pseudomonas-art og hovedfenon-ene av alkalifile bakterier. Stammene 92LM.4 og wBn5 har ikke forbindelse med de alkalifile hovedfenoner og representerer sannsynligvis adskilte grupper av nye alkalifile bakterier.

Klynger 1 og 2 er de eneste fenoner som viser forbindelse med kjente organismer, d.v.s. Pseudomonas- og Camamonas-artene. Separasjonen av Pseudomonas putida og Pseudomonas stutzeri til separate prøver er helt i overensstemmelse med den nå gjeldende klassifikasjonsstilling for disse organismer (N.J. Palleroni et al., (1973), Int. J. Systematic Bacteriol., 23, 333-339; F. Gavini et al., (1989), samme sted, 39, 135-144; Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, som ovenfor).

Det var klart ut fra det opprinnelige dendrogram at Pseudomonas stutzeri er en "outsider" til klynge 2 og har ikke nær forbindelse med de andre medlemmer av klyngen. Dette kan sees når de euklidske distanser for stammene fra klyngens geometriske tyngdepunkt beregnes og anvendes til beregning av radiusen av klyngen (P.H.A. Sneath og R.R. Sokal som ovenfor, s. 194 et seq). Klyngeradiusen er 3,91 (99% konfidensnivå) og middelavstanden for stammene fra det geometriske tyngdepunkt er 2,84 (standardavvik 0,46). Pseudomonas stutzeri med en avstand fra det geometriske tyngdepunkt på 3,91 er tydelig helt på grensen til fenetisk hyperdistanse som definerer klynge 2.

En klar diskriminering mellom klynge 1 og 2 er mulig ved anvendelse av begrepet minimums-diskrimineringstestene (se nedenfor).

Hver av de alkalifile stammer i klynge 2 er blitt undersøkt av to uavhengige laboratorier som er eksperter på identifisering av bakterier, nemlig Tysk kultursamling (DSM, Braunschweig, FRG) og Laboratory for Microbiology ved Teknologiuniversitetet, Delft, Nederland. Ingen av disse laboratorier var i stand til å gi en positiv identifikasjon av stammene, skjønt begge var enige om at det var en likhet med Pseudomonas, som enten plasserte dem i RNA-homologigruppe I (N.J. Palleroni et al., som ovenfor) eller mer spesifikt i gruppene Comamonas testosteroni/ Pseudomonas alcaligenes eller Pseudomonas pseudoalcaligenes (F. Gavini et al., som ovenfor). Imidlertid er det ikke kjent noen Pseudomonas-arter som kan vokse under de samme sterkt alkaliske betingelser (pH 10) som de nye stammer beskrevet i det foreliggende. Det ble gjort et forsøk på å dyrke Pseudomonas pseudoalcaligenes T DSM 50188 og Pseudomonas alcaligenes T DSM 50342 i et alkalisk buljongmedium (Medium A, Vedlegg A), men uten hell.

Resultatene fra disse eksperter, sammen med de oppdagel-ser som er beskrevet her, viser tydelig at disse alkalifile stammer i klynge 1 og 2 representerer nye bakteriearter.

Klyngene 3, 4, 5 og 6 er adskilte fenoner som skiller seg fra hverandre på basis av minimums-diskrimineringstestene (se nedenfor) og kjemotaksonomiske markører (se nedenfor). Disse fenoner viser ingen betydelig likhet med kjente bakterie-grupper og representerer således nye slekter eller arter.

Helcelle-proteinmønstre frembragt ved PAGE-elektroforese viser at det er sannsynlig at en rekke stammer er identiske.

CT

Eksempler innbefatter: 1E.1 og 2E.1; 6B.1. 7B.1 og 8B.1; 45E.3 CT og 47E.3. Dendrogrammet viser at disse stammer er beslektet ved en gjennomsnittlig SQ-verdi på 92,3%, hvilket . tyder på en sannsynlig testfeil på 3,8% (P.H.A. Sneath og R.R. Sokal, som ovenfor). Stammene 73bC.4 og 74C.4, som ser ut til å være nær beslektet (90% S^), har lignende, men ikke identiske, gelmønstre.

S_/UPGMA-metode

J

Jaccard-koeffisienten er et nyttig supplement til Gower-koef f isienten, siden den kan anvendes til påvisning av fenoner i sistnevnte fremkommet ved negative motstykker eller forvrengninger på grunn av at det ikke legges riktig vekt på potensiell subjektive kvalitative data. Følgelig er Jaccard-koef f isienten egnet til bekreftelse- av gyldigheten av klynger som i begynnelsen er definert ved anvendelse av Gower-koef f isienten. Jaccard-koeffisienten er spesielt egnet ved sammenligning av biokjemisk ikke-reaktive organismer (B. Austin og F.G. Priest, som ovenfor, s. 37).

I hovedsaken fås alle klyngene som er dannet ved SG _,/UPGMA-metoden i dendrogrammet som dannes ved S u-,/UPGMA-metoden (fig. 2). Skjønt sammensetningen av klyngene hovedsakelig er identisk i begge dendrogrammer, har noen få stammer forandret posisjon. Ikke-klyngedannende stammer 4E.1 og 5E.1 går inn i klynge 1/5, stammene 42E.3 og 50N.3 går fra klynge 2 til klynge 3/4. Stammene wNk2, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, wE5 blir ikke-klyngedannende.

Ikke overraskende kombinerer SJ T-transformasjonen (S^G)-klyngene 1 og 5. Begge disse klynger er karakterisert til å bestå av biokjemisk ganske ikke-reaktive stammer. Imidlertid er klyngene 1 og 5 klart forskjellige. Klynge 1 består av stammer som danner kremfarvede/beige sirkulære kolonier, mens stammene i klynge 5 utelukkende danner lysegule, uregelmessige kolonier.

Videre grupperer Sj-transformasjonen mesteparten av stammene i klynge 4 med stammene i klynge 3. Det er imidlertid klart ut fra de kjemotaksonomiske data (se nedenfor), som viser at stammene i klynge 4 inneholder Q9 og stammene i klynge 3 hovedsakelig Q6, at disse klynger ikke bør blandes, siden de inneholder klart forskjellige stammer. Av disse grunner regner man med at klyngedannelsen ved SG/UPGMA-metoden er den bedre representasjon av den virkelige taksonomiske stilling for disse stammer. Imidlertid tjener Sj/UPGMA til ny understreking av at med det enkelte unntak av en Comamonas-art, har ingen av de kjente stammer, ikke engang Pseudomonas-kontroiIstammene, noen betydelig likhet med klyngene av de nye alkalifile bakterier.

Kjemotaksonomisk definisjon av klyngene Kjemotaksonomi er studiet av de kjemiske sammensetninger av organismer i forhold til deres systematikk. Analyse av kromosomal-DNA, ribosomal-RNA, proteiner, cellevegger og membraner kan f.eks. gi verdifullt innblikk i klassifiserings-slektskap og kan anvendes som et ytterligere redskap til konstruksjon eller verifisering av klassifiseringene av mikroorganismer (M. Goodfellow og D.E. Minnikin i Chemical Methods in Bacterial Systematics, (red. M. Goodfellow og D.E. Minnikin, Academic Press, London og Orlando, FL, (1985),

s. 1-15). Det er imidlertid ikke alltid mulig å avgjøre på forhånd hvilken type kjemisk informasjon som vil være mest diagnostisk for en gitt klassifikasjon. De amfipatiske polare lipider, hoved-respirasjonskinonene, fettsyrer som finnes i bakteriemembranene og analyse av kromosomal-DNA har alle taksonomisk signifikans ved klassifikasjon av forskjellige bakterier (H. Lechevalier og M.P. Lechevalier i Microbial Lipids, vol. 1 (red. C. Ratledge og S.G. Wilkinson) Academic Press, London og San Diego, CA, (1988), s. 869-902).

Polare lipider

Ekstraksjon av polare lipider fra bakterier, og analyse av dem ved todimensjonal tynnsjiktkromatografi (2D-TLC) kan gi mønstre av diagnostisk verdi. Stasjonærfase-celler blir ekstrahert i 1:1 (på volumbasis) CHCl3:CH3OH og undersøkt ved 2D-TLC som beskrevet av H.N.H. Rosse, W.D. Grant og J.E. Harris, i Chemical Methods in Bacterial Systematics, (red. M. Goodfellow og D.E. Minnikin), Academic Press, London og Orlando, FL. (1985), s. 289-300. Lipidtypene som fantes på kromatogrammene, ble visualisert ved anvendelse av flere forskjellige farvestoffer (H.N.M. Ross et al., som ovenfor,

s. 291; og A. Trincone et al., J. Gen. Microbiol., (1990), 136, s. 2327-2331). Komponentenes identitet ble bekreftet ved ko-kromatografi med kjente lipider.

Resultatene av denne analyse når det gjelder representative stammer av gram-negative alkalifile bakterier er oppført i tabell 7. Disse viser intet klart mønster av polare lipider som er typisk for noen klynge. Alle stammene inneholder fosfatidyj.glycerol, difosfatidylglycerol, fosfatidylglycerol-fosfat og fosfatidyletanolamin. Dessuten inneholder visse stammer, spesielt i klynge 3, fosfatidylglycerolsulfat (PGS). Fordelingen av PGS i klynge 3 stemmer i stor grad overens med den antatte undergruppestruktur av klyngen som fremgår av de fenetiske og andre kjemotaksonomiske data. PGS er derfor en ikke-eksklusiv markør for klynge 3.

Vi ble overrasket over å finne at hovedmengden av bakteriene inneholdt et glykolipid som på basis av tallrike ko-kromatografiske analyser viste seg å være felles for gram-negative bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse. Glyko-lipider er tidligere ikke blitt vist å være til stede i alkalifile bakterier (T.A. Krulwich et al., CRC Critical Reviews in Microbiology, (1988), 16, 15-36). Ifølge bedømmel-se ved ko-kromatografi av lipider oppnådd fra flere stammer, finnes videre glykolipidet også i gram-positive alkalifile organismer isolert fra natronsjøer. Det er derfor mulig at glykolipidets kjemiske struktur kan være en kjemotaksonomisk markør for obligat-alkalifilene.

Isoprenoid-kinoner

Isoprenoid eller respirasjonskinoner er karakteristiske komponenter i plasmamembranen hos aerobe bakterier. Det er to typer; menakinoner og ubikinoner. Verdier av isoprenoid-kinoner som taksonomiske kriterier ligger i variasjonen i lengden av polyprenylsidekjeden og metningsgraden (M.D. Collins og D. Jones (1981), som ovenfor).

Frysetørkede stasjonærfase-bakterieceller ble ekstrahert under anvendelse av en modifisert fremgangsmåte av M.D. Collins (i Chemical Methods in Bacterial Systematics, som ovenfor, s. 267-284), i 1:1 (på volumbasis) CHC13:CH30H ved 50°C, i 16 timer. Kinonene ble undersøkt ved reversert-fase-tynns j iktskromatograf i som beskrevet av M.D. Collins (som ovenfor).

Resultatene av kinonanalyser av nesten alle stammene av gram-negative alkalifile bakterier er illustrert i tabell 8. Alle de undersøkte stammer inneholdt utelukkende ubikinoner som beskrefter deres stilling som gram-negative bakterier (M.D. Collins og D. Jones, som ovenfor). Tabell 8 viser helt klart at hovedmengden av ubikinonene er Q6 og Q9. Det fremgår også at stammene som inneholder Q6, er spesielle for klynge 3 og at dette skiller klynge 3 fra alle de andre klynger, siden de inneholder stammer som har Q9 som hoved-ubikinon.

Fettsyrer

Analyse av fettsyreprofiler har hatt en betydelig påvirkning på bakterie-klassifikasjon, særlig ved avgrensing av slekter og arter blant gram-positive bakterier og actino-myceter (R.M. Kroppenstedt, i Chemical Methods in Bacterial Systematics (red. M. Goodfellow og D.E. Minnikin), Academic Press; London og Orlando, FL, (1985), s. 173-199);

H. Lechevalier og M.P. Lechevalier, som ovenfor.

Frysetørkede stasjonærfase-celler (200-300 mg) ble ekstrahert i 16 timer ved 75°C i toluen:metanol:kons. svovelsyre (2,5 ml:2,5 ml: 0,2 ml), og etter avkjøling ble lipidene oppdelt i heksan (2 ganger 1 ml). Restsyre ble fjernet ved anvendelse av NH4HC03. Lipidekstraktene ble konsentrert under 02~ fritt N2, oppløst i 3 00 fil heksan og påført på preparative silikagelplater (Merke F254, Type T). Platene ble fremkalt i heksan:dietyleter 85:15 (på volumbasis), og fettsyre-metylesterne avskrapet, ekstrahert med heksan og konsentrert under en strøm av 02~fritt N2.

Fettsyre-metylesterne ble oppløst i heptan og analysert ved gasskromatografi ved anvendelse av en kromatograf av type

Packard modell 43 9 utstyrt med flamme-ioniseringsdetektorer. Prøvene ble delt ved hjelp av en prøvedelingsanordning og analysert samtidig over to kolonner, nemlig CP-SIL-88 (Chrompack) (lengde 50 meter, innvendig diameter 0,22 mm) og (Ultra-2 (Hewlwtt/Packard) (lengde 50 m, innvendig diameter . 0. 20 mm). Bærergassen var nitrogen, injeksjonstemperaturen 120°C, temperaturgradienten 2,5°C/min., til 240°C, og isoterm ved 240°i 30 minutter. Fettsyremetylestere ble utpekt med kjente standardblandinger som referanse. Identiteten av noen topper ble bekreftet ved hjelp av gasskromatografi-masse-spektrometri under anvendelse av en gasskromatograf av typen Carlo Erba HRGC 5160 Mega-serier, utstyrt med en kolonne av typen CP-SIL-88 (lengde 50 m, innvendig diameter 0,22 mm) med helium som bærergass og direkte injeksjon i kilden til et massespektrometer av typen AMD 403.

Fettsyresammensetningene av representative individuelle gram-negative bakterier er oppført i tabell 9. Tabell 10 viser de unike fettsyreprofiler av hver av klyngene. Klynge 1, 2, 3 og 4 er ganske typisk for hovedmengden av gram-negative bakterier hvor den viktigste mettede fettsyre er C16:0 med mindre mengder av C14:0 og C18:0. De viktigste umettede fettsyrer i disse alkalifile bakterier er C16:0 og C18:l (11-cis), som også er typisk, og det er også mangelen på fettsyrer med ulike tall (S.G. Wilkinson i Microbial Lipids, vol. 1 (red. C. Ratledge og S.G. Wilkinson) Academic Press, London og San Diego, Ca, (1988), s. 299-488). Mindre mengder av C17:0- og C19:0-cyklopropansyrer finnes i noen stammer av gram-negative bakterier. Stammene i klynge 3 viser ganske enkle fettsyreprofiler, hvor C16:0 og C18:l bidrar med 67-88% av den totale mengde syrer, og C16:l pluss C18:0 utgjør 20% av resten. Likevel understøtter fettsyremønstrene den oppfatning at klynge 3 inneholder flere undergrupper, en konklusjon som også fremkommer ved fenetiske (numerisk klassifikasjon) og polarlipid-analyser (tabell 7).

Stammene i klynge 1 kan skilles fra stammene i klynge 2 ved den relative rikelighet av rettkjedede mettede og umettede fettsyrer, såvel som de prosentvise mengder av C18:l (11-cis). De alkalifile bakterier i klynge 1 og 2 har mer komplekse fettsyreprofiler enn bakteriene i klynge 3, med mange flere mindre komponenter. Ut fra bekreftelsen ved numerisk klassifikasjon viser de alkalifile stammer i klynge 1 og 2 en viss likhet med Pseu. domonas- a. rter. Imidlertid viser videre den totale mangel på hydroksy-fettesyrer som er typisk for de fleste Pseuodomonas-arter, at et nært slektskap er tvilsomt.

Stammene i klynge 5 og 6 er bemerkelsesverdige på den måte at ved siden av at de inneholder hovedmengder av C16:0, er de andre hoved-fettesyrer forgrenede, uliketall-syrer, (40-85%). Disse stammer mangler også betydelige mengder av C18:l eller andre umettede syrer som finnes i vesentlige mengder i de alkalifile stammer i klynge 1, 2, 3 og 4. Tilstedeværelse av store mengder av C15:0- og C17:0-iso- og antiisosyrer er karakteristisk for bare noen meget få klasser av gram-negative bakterier, spesielt arter fra eksotiske miljøer, såsom • Thermus, eller dårlig definerte typer såsom Flavobacterium (S.G. Wilkinson, som ovenfor). Dette resultat understreker videre nyheten av de alkalifile stammer ifølge foreliggende oppfinnelse. Stammene i klynge 5 og 6 kan skilles fra hverandre ved den andel av forgrenede fettsyrer de inneholder, og mer spesielt ved de relative andeler av like- og ulike tall-fettsyrer.

Nukleinsyrer

En viktig komponent ved alle klassifikasjonsundersøkelser er en analyse av det genetiske materiale - nukleinsyrene. Sammensetningen av kromosomal-DNA er upåvirket av vekstbeting-elsene for organismen, og en hensiktsmessig analyse kan bekrefte eller motbevise organismens taksonomiske posisjon. Kromosomal-DNA kan analyseres ved bestemmelse av basesammensetningen (G+C mol%) for individuelle stammer, og basesekvens-homologiene mellom stammepar ved DNA-DNA-reassosiasjon (hybridisering) (R.J. Owen og D. Pitcher i Chemical Methods i Bacterial Systematics (red. M. Goodfellow og D.E. Minnikin), Academic Press, London og Orlando, FL (1985), s. 67-93).

DNA-basesammenstning

Sammensetningen av guanin pluss cytosin (G+C mol%) er konstant-for kromosomal-DNA for enhver gitt organisme. Nær beslektede organismer har lignende G+C-sammensetninger. Imidlertid må G+C-resultatene tolkes på bakgrunn av uavhengige taksonomiske data, siden lignende G+C mol% av DNA-prøver fra forskjellige organismer ikke i seg selv tyder på biologisk slektskap.

DNA ble ekstrahert fra celler dyrket til eksponensiell fase i medium A ved kloroform:fenol-metoden, og ble utfelt med etanol. Basesammensetningen ble bestemt ved den termiske denatureringsmetode (J. Marmur og P. Doty (1962), J. Mol. Biol., 3, 585-594) på et spektrofotometer av typen Phillips modell PV8764 med temperaturprogrammering. En annen metode innbefattet HPLC-analyse på en Beckman-systemgull under anvendelse av en kolonne av typen Beckman-ultrasfære ODS og 0,04 M kaliumdihydrogenfosfat pluss acetonitril (9 + 1, på volumbasis) som elueringsmiddel med en strømningshastighet på 1,5 ml/min., etter behandling av DNA med nuklease-Pl og alkalisk fosfatase.

Resultatene av disse analyser er oppført i tabell 11. G+C-mol%-verdiene for de alkalifile bakterier dekker et område på 30 mol% (37,6 - 67,1 mol%). Innenfor klyngene er imidlertid variasjonen bare 3-7 mol%, som ytterligere beskrefter at stammene i en klynge er nær beslektet med hverandre.

DNA-DNA-molekylhybridisering

Den anvendte metode var i hovedsaken metoden ifølge

J.H. Crosa et al., (Int. J. Systematic Bacteriol., 29, 328-332, 1979) . Tritium-merket DNA ble tillaget ved anvendelse av et "nick"-translasjonssett (Amersham, N5000) ifølge fabrikan-tens instruksjoner. Gjenforeningsblandingene ble inkubert ved 65°C i 16 timer. Resultatene er oppført i tabell 12, fra hvilken det vil kunne sees at DNA-sekvenshomologien er høyere innenfor klyngene enn mellom klyngene.

Verdiene viser prosentvis hybridisering mellom stammene (rader) og H-merkede stammer (kolonner).

SS = laksespermie-DNA.

Bestemmelse av representative stammer

Det geometriske tyngepunkt i enhver individuell klynge fremkommet ved S_/UPGMA-metoden ble beregnet under anvendelse av RGROUPS-programmet i TAXPAK. Det geometriske tyngepunkt i en klynge av punkter som representerer virkelige organismer projisert i hyper-rom representerer en hypotetisk gjennom-snittsorganisme. Det geometriske tyngdepunkt representerer sjelden, hvis noen gang, en virkelig organisme. Derfor ble de euklidske avstander for hver av medlemmene i klyngen fra klyngens geometriske tyngepunkt beregnet for fastsettelse av hvilken stamme som var nærmest den hypotetiske gjennomsnitts-organisme. Stammen som var nærmest det geometriske tyngdepunkt, ble betegnet "centrotype"-organismen (vist med tilføyelsen "CT" over linjen).

Man kan forestille seg centrotype-organismen som den "stammetype" som er nærmest til å representere de vesentlige og diskriminerende trekk ved hver spesiell klynge. Centro-stammetypene er oppført i tabell 13.

En beskrivelse av hver av centro-organismetypene er blitt gjort for at disse organismer skal kunne skjelnes fra alle andre bakterier som tidligere er kjent og beskrevet. Dessuten er minimumsantallet av diskrimineringstester for definering av hver klynge blitt beregnet slik at det tydelig kan sees at klyngene som inneholder disse nye bakterier, lett kan skjelnes fra hverandre og fra alle andre kjente bakterier.

Beskrivelse av centro-stammetyper

CT

Stamme 1E.1 (klynge 1)

En aerob, bevegelig, gram-negativ stavformet bakterie, 1,7-3,3 ^m x 0,5-0,7 fim.

Obligat alkalifile bakterier, vokser best mellom pH 9 og 10.

På alkalisk agar (medium A) dannes det glatte, kremfarvede kolonier, i begynnelsen gjennomskinnelige, men de blir opake etter noen få dager. Koloniene er sirkulære, hele og konvekse, men diameter 2-3 mm.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) fnuggaktig med dannelse av et bunnfall og overflatehinne.

Vokser godt mellom 20 og 40°C. Vokser langsomt ved 10-15°. Ingen ved 8 eller 45°C.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakt og peptoner. Vokser på enkle sukkerarter og organiske syrer meget begrenset (f.eks. vekst bare observert på ribose, sakkarose og pyruvat).

PT

Stamme 45E. 3 ( klvnae 2)

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie, 3-4,5 fim x 0,6 /im. Bevegelig ved hjelp av en enkelt polar flimmertråd.

Obligat alkalifil bakterie som vokser mellom pH 7,8 og 11,2. På alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, opake, kremfarvede kolonier, med diameter 1-2 mm. Koloniene er sirkulære, konvekse og hele.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) langsom, liten med jevn turbiditet, overflatehinne og intet bunnfall.

Vokser godt mellom 20 og 40°C. Vokser langsomt ved 10°.C. Ingen vekst ved 8 eller 45°C.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakt og peptoner. Ingen vekst på enkle sukkerarter. Vokser på organiske syrer (f.eks. fumarat, suksinat, pyruvat, acetat, laktat) og noen fettsyrer (f.eks. propionat, valerat) og aminosyrer (f.eks. prolin, alanin, fenylalanin).

Stamme 28N. 1U1 ( klynge 3)

En aerob, bevegelig, gram-negativ, stavformet bakterie, 4,8-5,5 nm x 0,6-0,8 [ im. Obligat alkalifil bakterie som vokser mellom pH 8,5 og 10,7.

På alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, sirkulære, opake kolonier med en seig konsistens. Koloniene har konveks profil og hel kant. Kolonifarven er i begynnelsen kremaktig/- beige, men blir lyserød etter noen få dager.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) massiv, fnuggaktig med en overflatehinne og bunnfall.

Vokser godt mellom 20 og 45°C. Vokser langsomt ved 10 og 15°C. Ingen vekst ved 50°C.

Kjemoorganotrof. Vokser godt på komplekse substrater såsom gjærekstrakt og peptoner. Vokser på enkle sukkerarter, organiske syrer, fettsyrer og aminosyrer.

Stamme wB4 CT( klynge 4)

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie, 3-4 /im x 0,6-0,8 /im, forekommer ofte som cellepar.

Alkalifil, vokser godt mellom pH 7,5 og 10,9.

På alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, beige til brune kolonier. Koloniene er noe variable: størrelse: 1 - >5 mm, sirkulær til uregelmessig form, svakt konveks eller oppstående profil med bølgete eller hel kant.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) fnuggaktig, bunnfalls-dannende med en overflatehinne.

Vokser best mellom 15 og 45°C, ingen vekst ved 50°C.

Kjemoorganotrof. Vokser godt på komplekse substrater såsom gjærekstrakt. Veksten er begrenset på enkle sukkerarter. Vokser på organiske syrer (f.eks. laktat, acetat, fumarat), fettsyrer (f.eks. propionat, valerianat, kaprat) og aminosyrer (f.eks. prolin, serin, lysin).

PT

Stamme 17N. 1 ( klvnoe 5)

En aerob, gram-negativ, lang, tynn, stavformet bakterie 5,5 - 10,5 /im x 0,6 /im, som noen ganger danner korte cellekjeder. Med tiden dominerer pleomorfe, egenartede, opp-svulmede former.

Obligat alkalifil bakterie, vokser best mellom pH 8 og 10,5.

På alkalisk agar (Medium A) dannes, glatte, opake, gule kolonier med diameter 2-3 mm. Formen på koloniene varierer fra sirkulær til uregelmessig, med konveks til pukkelformet profil, og hel, bølget eller fliket kant, avhengig av alder.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) jevn og bunnfalls-dannende uten noen overflatehinne.

Vokser godt mellom 15 og 37°C. Vokser langsomt ved 10°C og ikke i det hele tatt ved 8°C. Ingen vekst ved 40°C eller over dette.

Kjemoorganotrof. Vokser godt på komplekse substrater såsom gjærekstrakt. Vekst på enkle sukkerarter er begrenset (f.eks. vekst bare observert på fruktose; ingen vekst observert på glukose, ribose, laktose). Vokser på organiske syrer (f.eks. fumarat, suksinat, pyruvat, 2-ketoglukonat) og aminosyrer.

Stamme 64B. 4CT ( klynge 6)

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie 2,0-3,5 /im x 0,8-1,0 /im.

Obligat alkalifil bakterie, vokser best mellom pH 8,2 og 10, 9.

På alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, opake kolonier, først med kremaktig gul farve, og blir deretter beige med alderen. Koloniene har en diameter på ca. 4 mm, sirkulær som blir uregelmessig; flat eller svakt konveks profil, som blir konveks; med en hel kant som blir bølge-formet .

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) jevn, bunnfallsdannende uten noen overflatehinne.

Vokser godt ved 15-45°C, ingen vekst vekst ved 10 eller 50°C.

Kjemoorganotrof. Vokser godt på komplekse substanser såsom gjærekstrakt. Vokser på noen enkle sukkerarter (f.eks. glukose, ribose, maltose og fruktose), organiske syrer (f.eks. acetat, laktat, eitrat og fumarat), noen fettsyrer (f.eks. propionat og kaprat) og aminosyrer (f.eks. prolin, histidin og alanin).

Ikke-klyngedannende stammer

Stammene som ikke kommer inn under de klynger som er definert i det foreliggende, er også nye bakterier som ikke tidligere er kjent eller beskrevet. Disse stammer, med koder wN2, 4E.1, 5E.1, 92LM.4 og wBn5, kan representere sjeldnere . typer av alkalifile bakterier og er sannsynligvis medlemmer av bakterieklynger som representerer nye slekter og arter som på det nåværende tidspunkt ikke er beskrevet. En beskrivelse av disse "ikke-klyngedannende" stammer er blitt gjort for at man skal kunne skille disse organismer fra alle andre bakterier som tidligere er kjent og beskrevet.

Stamme wN2

En aerob, gram-negativ, bevegelig, stavformet bakterie, ofte i par.

Oblicjat alkalifil bakterie, vokser best mellom pH 9 og 10.

På alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, gjennomskinnelige, beige-farvede kolonier med diameter 1-2 mm. Koloniene er sirkulære, konvekse med hel kant.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) fnuggaktig med en ring eller overflatehinne og dannelse av bunnfall.

Vokser godt ved 20-30°C. Ingen vekst ved 15 eller 4 0°C.

Kjemoorganotrof. Metabolsk ikke-reaktiv. Ingen vekst på enkle sukkerarter eller organiske syrer. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakt og peptoner, og på noen aminosyrer.

Stamme 4E. 1

En aerob, gram-negativ, bevegelig, stavformet bakterie, 1,7-5,2 fim x 0,75 fim.

Obligat alkalifil bakterie, vokser best mellom pH 8,2 og 10, 9.

På alkalisk agar (medium A) dannes glatte, opake, beige eller brunfarvede kolonier med diameter 2-4 mm. Koloniene har sirkulær form, konveks profil, med hel kant.

I alkalisk buljong (medium A) er veksten (37°C) massiv og fnuggaktig med bunnfall og overflatehinne.

Vokser godt mellom 20 og 37°C. Vokser meget langsomt ved 10°C og ikke i det hele tatt ved 8°C. Ingen vekst ved 40°C eller over dette.

Kjemoorganotrop. Vokser ikke på enkle sukkerarter, bortsett fra ribose. Vokser godt på komplekse substrater såsom gjærekstrakt, og på organiske syrer (f.eks. suksinat, pyruvat, citrat, malonat, acetat og laktat), fettsyrer (f.eks. propionat, valerionat og suberat) og aminosyrer (f.eks. prolin, serin, histidin og lysin).

Stamme 5E. 1

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie, 3,0-5,3 fim x 1, 3 fim.

Obligat alkalifil bakterie, vokser best mellom pH 9 og 10,5.

PÅ alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, opake, brunfarvede kolonier med diameter 3-4 mm. Koloniene har en ganske uregelmessig form, generelt flat til lett pukkelformet i profil, med fliket kant.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) moderat til massiv, og blir fnuggaktig med bunnfall og overflatehinne.

Vokser godt mellom 20 og 4 0°C. Vokser langsomt ved 10°C. Ingen vekst ved 45°C.

Kjemoorganotrof. Vokser ikke på enkle sukkerarter. Vokser gdclt på komplekse substrater såsom gjærekstrakt, organiske syrer (f.eks. pyruvat, citrat, acetat og laktat), fettsyrer (f.eks. propionat, kaprat og valerianat) og aminosyrer (f.eks. prolin, alanin og lysin).

Stamme 92LM. 4

En aerob, gram-negativ, stavformet bakterie, 2,0-3,5 /im x 0,5 x 1,0 /im.

Obligat alkalifil bakterie, ingen vekst under pH 7,5.

På alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, kremfarvede kolonier, i begynnelsen gjennomskinnelige, men som blir opake. Koloniene utvikles fra sirkulær, hel, til uregelmessig, fliket form, med konveks profil.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) langsom, svak, fnuggaktig med bunnfall, men ingen overflatehinne.

Vokser mellom 10 og 40°C, ingen vekst ved 8 eller 45°C.

Kjemoorganotrof. Vokser på komplekse substrater såsom gjærekstrakt og peptoner og på forskjellige sukkerarter, organiske syrer og aminosyrer.

Stamme wBn5

En aerob, gram-negativ, liten, stavformet bakterie, som ofte danner korte cellekjeder.

Obligat alkalifil bakterie, ingen vekst under pH 8.

På alkalisk agar (Medium A) dannes glatte, sirkulære, konvekse kolonier med hel kant, med diameter ca. 1 mm. Koloniene er i begynnelsen kremfarvet/beige, gjennomskinnelig, blir opake, brune.

I alkalisk buljong (Medium A) er veksten (37°C) i begynnelsen jevnt uklar med bunnfall, men uten overflatehinne; blir etter 4 dager fnuggaktig med dannelse av en hinne.

Vokser ved 30 og 37°C. Ingen vekst ved ved 40°C.

Kjemoorganotrof. Vokser på en rekke komplekse substrater såsom gjærekstrakt og peptoner, såvel som sukkerarter, organiske syrer, fettsyrer og aminosyrer.

Klyngedefinisjon ved beregning av minimumsantallet for diskriminerende tester, og konstruksjon av en sannsynlighetsmatriks for identifikasjon av gram-negative alkalifile bakterier

Ett av formålene ved en numerisk klassifiserings-undersøkelse er å anvende de fenetiske data, som definerer klyngene ved et utvalgt likhetsnivå, for utpeking eller identifisering av ukjente stammer. Klassifikasjons-testdataene kan anvendes for bestemmelse av det minimums-testsett som

fordres for definering av klyngene ved 73% (S.J-likhet snivået, og for identifisering av de egenskaper som er mest diagnostiske (forutsigbare) for de individuelle klynger. Med andre ord, det minimumsantall tester som fordres for å henføre en ukjent organisme til en forutbestemt klynge med en høy grad av forutsigbarhet.

Ut fra minimums-diskriminatortestene kan det konstrueres en sannsynlighetsmatriks for identifikasjon av ukjente stammer. Analysen oppnås ved anvendelse av en kombinasjon av CHARSEP- og DIACHAR- (TAXPAK)- og MCHOICE- (ikke på TAXPAK men kan fås ved Datapost fra Universitetet i Leicester, U.K.)-programmene. En vurdering av identifikasjonsmatriksen fås ved anvendelse av MOSTTYP- og OVERMÅT-programmene. Praktiske eksempler».på anvendelse av disse programmer for sannsynlig-hetsidentifikasjon av bakterier er blitt publisert av S.T. Williams et al., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, s. 1815-1830; og F.G. Priest og B. Alexander (1988), J. Gen. Microbiol. 134, s. 3011-3018; samme sted, (1990), 136, s. 367-376.

En "n x t"-tabell ble konstruert ut fra testdataene ved anvendelse av egenskapsnummerne 6-10 og 13-104 (Vedlegg C) oppført i totallssystem (positiv = 1, negativ = 0). Denne datamatriks ble supplert med følgende fire ekstra-egenskapstilstander:

[105] Lysegule kolonier (egenskap nr. 1, Vedlegg C)

[106] Gjenomskinnelige kolonier (dyrket på Medium A,

Vedlegg A)

[107] Lipase (lipolytisk aktivitet i olivenolje (Medium M))

[108] Oksydase-positiv innen 10 sek. (test 9, Vedlegg B)

Datamatriksen undersøkes først ved anvendelse av CHARSEP-programmet, som beregner separasjonsindekser og således den diagnostiske verdi av de individuelle egenskaper for skjelning mellom klyngene. Tester med en VSP-indeks > 25% (P.H.A. Sneath (1979), Computers and Geosciences, 5, 349-357) ble godtatt, og egenskaper med lav diagnostisk verdi (VSP < 25%) ble forkastet. Det gis preferanse for egenskaper med de høyeste VSP-indekser, under forutsetning av at kriteriene i DIACHAR- og MCHOICE-programmene også oppfylles. I dette eksempel har 38 tester en VSP-indeks >25%, og 9 av de 24 egenskaper som er valgt til slutt, har en VSP-indeks >50%

(tabell 11).

Datamatriksen undersøkes deretter på nytt ved hjelp av DIACHAR-programmet, som bestemmer de mest diagnostiske egenskapstilstander for hver av klyngene. Antallet egenskaps-tUstander ble satt til 10. Dette resultat gjør mulig valg av egenskapstilstander klyngene seg imellom som gjensidig utelukker hverandre. Så mange som mulig av disse tester beholdes i den endelige identifiseringsmatriks av minimums-diskrimineringstester; i dette eksempel mellom 6 og 9 diagnostiske egenskaper pr. klynge. De gjenværende, ubrukte tester noteres også og kan anvendes som ytterligere tester for bekreftelse av identifikasjon (tabell 12).

MCHOICE-programmet ordner testene i grupper som kan vises frem i form av et dendrogram under anvendelse av MDEND-sub-rutinen. Gruppene identifiserer tester med lignende diskrimi-neringsverdi, og gir således mulighet for forkastelse av tester som ikke gir noen signifikant diskriminering, likesom det blir mulig å velge mellom tester med lik diagnostisk verdi eller med diagnostisk verdi som har stor likhet.

Tabell 13 viser settet med 24 tester som er det minimumsantall som fordres for definering av klyngene, og som kan anvendes for utpeking av ukjente stammer. Dessuten viser tabell 13 identifikasjonsmatriksen som består av prosent-andelen av positive egenskaper som definerer klyngene på basis av de 24 minimums-diskrimineringstester. Dette er beregnet ved IDMAT-programmet.

Vurdering av diskrimineringstestene og av identifiseringens pålitelighet

Vurderingen av diskrimineringstestene har to aspekter. For det første kan testenes gyldighet analyseres ved anvendelse av praktiske eksempler, som kan vurderes videre ved anvendelse av statistisk teori, eller testene kan direkte underkastes teoretisk vurdering ved anvendelse av statistiske metoder.

Illustrasjon 1

En praktisk vurdering av diskrimineringstestene

Mange forskere fastsetter nøyaktigheten av diskrimineringstestene bare ved å bestemme på nytt egenskapstilstandene for utvalgte klyngerepresentanter. Denne fremgangsmåte er blitt anvendt her for centro-stammetypene (se nedenfor). En mye grundigere fremgangsmåte som sjelden anvendes, er å undersøke alle stammene som ble anvendt ved den opprinnelige numeriske taksonomiske analyse. Når det rekonstruerte dendrogram underkastes klynge-analyse hvor det bare anvendes de data som fås ved det avledede sett av minimums-diskrimineringstester, kan det sammenlignes med det opprinnelige. Ved anvendelse av kun de 24 diskrimineringstester som er beskrevet tidligere (tabell 16), ble dataene (to-tilstands-, binær form) for alle de 70 nye gram-negative alkalifile bakterier underkastet klynge-analyse ved SG/UPGMA-metoden. Det rekonstruerte dendrogram er reprodusert på fig. 3. Dette rekonstruerte dendrogram er meget gunstig sammenlignet med det opprinnelige dendrogram (fig. 1).

Skjønt det har vært en viss omordning av klyngenes posisjon, er sammensetningen av dem i stor grad uforandret, og de er definert ved omtrent det samme likhetsnivå som det opprinnelige. Klynge 4 er imidlertid blitt blandet med klynge 3, idet en enkelt stamme er overført til klynge 1. Dette tjener videre til understreking av vanskeligheten med definering av klynge 4 bare ved fenetiske data. Det er flere ganger blitt understreket at supplerende kjemotaksonomiske data fordres for fullgod skjelning mellom klynge 3 og klynge 4.

I både det opprinnelige dendrogram og rekonstruksjonen (fig. 3) viser det seg at klynge 3 omfatter flere underklynger over 73% likhetsnivået. Den fine struktur av klynge 3 understøttes også ved de kjemotaksonomiske data (se ovenfor).

Illustrasjon 2

En teoretisk vurdering av diskrimineringstestene

En vurdering av klyngeoverlapping oppnås ved anvendelse av OVERMAT-programmet. Dette program undersøker matriksen som er konstruert ut fra de prosentvise positive verdier for de utvalgte egenskapstilstander, mot en kritisk overlappingsverdi, ved betraktning av klyngene definert ved koordinatene for centroiden og klyngeradiusen (to ganger rotmiddelkvadrat av avstandene for stammene fra det geometriske tyngdepunkt). Hvis det er en betydelig overlapping mellom klyngene, vil man kanskje ikke kunne identifisere noen ukjente stammer med tilstrekkelig sikkerhet (P.H.A. Sneath og R.R. Sokal, som ovenfor, s. 394-400). Ved en valgt kritisk overlappingsverdi på 2,5% (som er en strengere betingelse enn det som anvendes av de fleste forskere; se F.G. Priest og B. Alexander (1988), som ovenfor; og S.T. Williams et al., (1983), som ovenfor) var det ingen betydelig overlapping mellom klyngene (95% konfidensnivå) bortsett fra mellom klynge 3 og klynge 4, hvor den virkelige overlapping ble beregnet til 4%. Imidlertid ble det ikke tatt hensyn til kjemotaksonomiske data (se ovenfor) ved konstruksjon av identifikasjonsmatriksen. PÅ basis av kinonanalyser kan stammer fra klynge 3 skjelnes fra stammene i klynge 4.

Illustrasjon 3

En teoretisk vurdering av identifikasjonspåliteligheten Den hypotetiske medianorganisme (HMO) er en annen beregning av den "gjennomsnittlige" organisme i en klynge (P.H.A. Sneath og R.R. Sokal, som ovenfor, s. 194 og følgen-de) . En HMO er ikke en virkelig stamme, men en hypotetisk organisme som representerer den mest vanlige tilstand for hver egenskap. MOSTTYP-programmet beregner HMO'er for hver klynge i identifikasjonsmatriksen og forsøker så og identifisere dem. Med andre ord er MOSTTYP et program for vurdering av en identifikasjonsmatriks ved beregning av identifikasjonspoeng for de mest typiske stammer i forhold til klyngene. En god identifikasjonsmatriks bør gi høy sannsynlighet for at en HMO tilbakeføres til sin egen klynge. Resultatene av denne analyse var meget tilfredsstillende (tabell 17), særlig siden MOSTTYP var programmert til bare å ta hensyn til de første 20 diagnostiske tester i identifikasjonsmatriksen (tabell 16), d.v.s. at testene 105-108 ble utelukket. Hver HMO ble tilbakeført til sin opprinnelige klynge med Willcox-sannsynligheter på 0,998-1,000 (W.R. Willcox et al., (1973) J. Gen. Microbiol., 77, 317-330). De taksonomiske avstander var alle lave, og standardfeilene for de taksonomiske avstander var alle negative, hvilket viser at HMO'ene alle var nærmere klyngens geometriske tyngdepunkt enn gjennomsnittet for klyngen (tabell 17).

Illustrasjon 4

En praktisk vurdering av identifikasjonspoeng Identifikasjon av stammer ved anvendelse av minimums-settet av diskrimineringstester oppnås ved anvendelse av MATIDEN-programmet i TAXPAK. Programmet sammenligner tilstedeværelse-fraværs-data for en ukjent stamme i forhold til hver klynge etter tur i en identifikasjonsmatriks med prosentvise positive egenskaper. Identifikasjonskoeffisienter beregnes, nemlig Willcox sannsynlighet, taksonomisk avstand ,og standardfeilen for den taksonomiske avstand. Resultatene fremvises og viser identifikasjonspoengene for den beste klynge og for de to nest beste alternative klynger. Dessuten noteres de atypiske resultater ("egenskaper mot"). Ved en analyse hvor det anvendes data fra virkelige stammer, ble centrotypene tilbakeført til sine opprinnelige klynger med Willcox-sannsynligheter på 0,9996-1,000 (tabell 18). De taksonomiske avstander var lave. Standardfeilene for den taksonomiske avstand var alle negative, hvilket viser at centrotypene var nærmere det geometriske tyngdepunkt for klyngen enn gjennomsnittet for klyngen.

Illustrasjon 5

Identifikasjon av ukjente isolater Identifikasjonsmatriksen ble fastsatt med hensyn til evnen til henføring av ukjente gram-negative alkalifile bakterier til klyngene definert i det foreliggende. Kriteriene for en vellykket identifikasjon var:

(a) bakterier isolert fra et sted som var likt, men geogra-fisk adskilt fra, de øst-afrikanske natronsjøer, (b) en Willcox-sannsynlighet større enn 0,95 og lave verdier

for taksonomisk avstand og dens standardfeil (<3),

(c) et identifikasjonspoeng overfor den beste klynge,

betydelig bedre enn mot de to nest beste alternativer,

(d) "egenskaper mot" den beste klynge bør være null eller noen få i antall.

Ukjente mikroorganismer kan undersøkes ved anvendelse av minimumstestene oppregnet i tabell 16. Egenskapstilstandene bestemmes og identifikasjonspoeng oppnås ved anvendelse av MATIDEN-programmet. Dette program sammenligner egenskapstilstandene for den ukjente prøve med identifikasjonsmatriksen som er bestemt for alle de for-bestemte klynger, beregner det beste motstykke og henfører den ukjente prøve til den mest passende Jclynge.

En Willcox-sannsynlighet beregnes for bestemmelse av identifikasjonens godtagbarhet. Willcox-sannsynligheter på 0,85 og 0,95 er blitt godkjent som kriterier for en vellykket identifikasjon (S.T. Williams et al., (1983), som ovenfor, F.G. Priest og B. Alexander (1988), som ovenfor). Den taksonomiske avstand for den ukjente prøve fra klyngens geometriske tyngdepunkt beregnes og kan sammenlignes med klyngens radius. Standardfeilen for den taksonomiske avstand bør være mindre enn den øvre verdi på +3,0 som er foreslått av P.H.A. Sneath ((1979), s. 195-213). Videre kan fysiske karakteregenskaper, ytterligere biokjemiske data og kjemotaksonomiske markører anvendes for ytterligere bekreftelse av identiteten for den ukjente prøve i en spesiell klynge.

Resultatene som tilveiebringes ved disse fem illustrasjo-ner, sammen med de statistiske data tilveiebragt ved den numeriske taksonomiske analyse og de kjemotaksonomiske data, viser en robust klassifikasjon som identifiserer 6 hovedgrup-per av nye, gram-negative, alkalifile bakterier.

Fremstilling og anvendelse av alkali-tolerante enzymer

De alkalifile mikroorganismer ifølge foreliggende oppfinnelse danner mange forskjellige alkali-tolerante enzymer. Eksempler på enzymaktiviteter som finnes i representative stammer av de gram-negative bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse kan finnes i Vedlegg D og E. Disse enzymer kan utføre sine funksjoner ved meget høy pH, hvilket gjør dem unikt egnet for anvendelse i mange forskjellige prosesser som fordrer slik enzymatisk aktivitet i miljøer eller reaksjons-betingelser med høy pH.

Eksempler på de forskjellige anvendelser for alkali-tolerante enzymer er i vaskemiddelblandinger, lærgarving, matvarebehandling, avfallsbehandling og i tekstilindustrien. Disse enzymer kan også anvendes for biotransformasjoner, særlig ved fremstilling av rene enantiomerer.

De alkalifile bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse kan lett undersøkes med hensyn til dannelse av f.eks. alkali-tolerante lipaser, proteaser og stivelses-nedbrytende enzymer, ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet i det foreliggende .

Buljongen som alkalifile bakterier dyrkes i, inneholder typisk én eller flere typer enzymatisk aktivitet. Buljongen som inneholder enzymet eller enzymene, kan anvendes direkte i den ønskede prosess etter fjerning av bakteriene fra den ved hjelp av f.eks. sentrifugering eller filtrering.

Hvis ønskelig, kan dyrkningsfiltratet konsentreres ved frysetørking før eller etter dialyse, eller ved ultra-filtrering. Enzymene kan også gjenvinnes ved utfelling og

filtrering. Alternativt kan enzymet eller enzymene som finnes i buljongen, isoleres og renses ved f.eks. kromatografi eller gelelektroforese, før anvendelse ved den ønskede prosess. De nøyaktige metoder som anvendes for behandling av dyrkningsfiltratet og/eller for ekstraksjon og/eller rensing av de alkali-tolerante enzymer, er ikke avgjørende for den foreliggende oppfinnelse og kan bestemmes av en fagmann på området.

Genene som koder for aktuelle alkali-tolerante enzymer, kan klones og uttrykkes i organismer som kan uttrykke det ønskede enzym i ren eller lett gjenvinnbar form.

Følgende eksempler er tilveiebragt for illustrering av metoder for identifikasjon av gram-negative alkalifile bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse, såvel som metoder til undersøkelse av disse alkalifile bakterier med hensyn til tilstedeværelse av forskjellige alkali-tolerante enzymer, og metoder for etterfølgende produksjon og anvendelse av disse enzymer i industrielle prosesser. Disse eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Identifikasjon av ukjente isolater

Seks stammer av gram-negative, alkalifile bakterier ble isolert fra Mono Lake, en alkalisk innsjø med høyt saltinnhold som ligger i California, USA. (B. Javor i Hypersaline Environments, Springer Verlag, Berlin og Heidelberg (1988) ,

s. 303-305). Stammene ble isolert fra prøver av delvis neddykket soda-overtrukket tre, tuff og soda-jord oppsamlet fra omgivelsene rundt Mono Lake (California, U.S.A.) i mai 1990 ved anrikingsdyrkning ved 37°C i Medium A (Vedlegg A).

De seks stammer er beskrevet i tabell 19. Stammene ble undersøkt under anvendelse av 21 av de 24 minimumstester oppregnet i tabell 16. EgenskapstiIstandene ble bestemt og identifiseringspoeng oppnådd ved anvendels av MATIDEN-programmet. Resultatene er vist i tabell 20.

Tabell 20

Eksempel på verdier fra MATIDEN- proqrammet for identifisering av seks ukjente stammer mot identifikasjonsmatriksen A. Referansenummer for ukjent prøve er ML005

Beste isolat ML005-identifikasjon er klynge 3. Poeng for koeffisienter: 1 (Willcox-sannsynlighet), 2 (taksonomisk avstand), 3 (standardfeil for taksonomisk avstand).

Ytterli<g>ere egenskaper som hjelper ved adskillelse av: B. Referansenummer for ukjent prøve er ML104

Beste isolat ML104-identifikasjon er klynge 1. Poeng for koeffisienter: 1 (Willcox-sannsynlighet), 2 (taksonomisk avstand), 3 (standardfeil for taksonomisk avstand).

Ytterligere egenskaper som hjelper ved adskillelse av:

C. Referansenummer for ukjent prøve er ML201

Beste isolat ML2 01-identif ikas jon er klynge 5. Poeng f.or koeffisienter: 1 (Willcox-sannsynlighet), 2 (taksonomisk avstand), 3 (standardfeil for taksonomisk avstand).

Ytterligere egenskaper som hjelper ved adskillelse av:

D. Referansenummer for ukjent prøve er ML203

Beste isolat ML203-identifikasjon er klynge 3. Poeng for koeffisienter: 1 (Willcox-sannsynlighet), 2 (taksonomisk avstand), 3 (standardfeil for taksonomisk avstand).

Ytterligere egenskaper som hjelper ved adskillelse av:

E. Referansenummer for ukjent prøve er ML206

Beste isolat ML206-identifikasjon er klynge 5. Poeng for koeffisienter: 1 (Willcox-sannsynlighet), 2 (taksonomisk avstand), 3 (standardfeil for taksonomisk avstand).

Ytterligere egenskaper som hjelper ved adskillelse av:

F. Referansenummer for ukjent prøve er ML301

Beste isolat ML301-identifikasjon er klynge 3. Poeng for koeffisienter: 1 (Willcox-sannsynlighet), 2 (taksonomisk avstand), 3 (standardfeil for taksonomisk avstand).

Ytterligere egenskaper som hjelper ved adskillelse av:

Eksempel 2

Dannelse av proteolvtiske enzymer

To alkalifile stammer (1E.1 og 9B.1) ble undersøkt med hensyn til dannelse av proteolytisk(e) enzym(er) i 7 forskjellige medier balansert ved alkalisk pH. Forsøkene ble utført i 2 liters rystekolber med skvalpeplate, og hver av kolbene inneholdt 400 ml av næringsmediene R-X (Vedlegg A). Kolbene ble anbragt i en inkubator med rotering i krets med 280 opm ved konstant temperatur på 37°C. Prøver av dyrkningsmedier ble fjernet fra kolbene med mellomrom på 1, 2, 3, 4, 5, 6, og 8 dager for bestemmelse av enzyminnholdet, som uttrykkes i alkaliske Delft-enheter (ADU - som beskrevet i britisk patent nr. 1.353.317).

Tabell 21 viser de maksimale enzymutbytter og pH i dyrkningsmediet i det øyeblikk hvor målingen av enzymnivåene ble utført.

Resulatet av prøven viser tydelig tilstedeværelse av proteolytiske enzymer, dannet av de alkalifile bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse, i dyrkningsbuljongen.

Eksempel 3

Vaskeytelsesundersøkelse ved anvendelse av proteol<y>tiske enzymer

Enzympreparater fra de alkalifile bakterier ble undersøkt i en spesielt utviklet mini-vasketest under anvendelse av

tøystykker av bomull (2,5 x 2,5 cm) tilsmusset med melk, blod og blekk (levert fra EMPA, St. Gallen, Sveits, med betegnelse EMPA 116). Før vasketesten ble tøystykkene for-behandlet med en løsning som inneholdt et anionisk overflateaktivt middel,

natriumperborat og en blekemiddelaktivator (TAED) ved romtemperatur i 15 min. Etter denne behandling, ble forsøks-tøystykkene skyllet i rennende avmineralisert vann i 10 min. og lufttørket. Denne behandling resulterer i fiksering av smusset, slik at fjerning av det blir vanskeligere.

Vasketestene ble utført i 100 ml Erlenmeyer-kolber forsynt med en skvalpeplate og som inneholdt 30 ml av en definert vaskemiddelblanding pluss 300 ADU protease for testing. I hver kolbe ble det anbragt to for-behandlede EMPA 116-test-tøystykker. Kolbene ble anbragt i et vannbad med frem- og tilbakerysting (2 cm slaglengde) og agitert med 320 opm. Testene ble utført ved 40°C i 30 min. Etter vasking, ble tøystykkene skyllet i rennende avmineralisert vann i 10 min. og lufttørket. Refleksjonskoeffisienten for forsøks-tøystykkene ble målt ved 680 nm med et Photovolt-fotometer (modell 577) utstyrt med et grønt filter.

Vaskeytelsen hos supernatantfraksjonen av kulturer av forskjellige alkalifile bakterier i europeiske pulver-vaskemidler ble bestemt ifølge fremgangsmåten spesifisert ovenfor. Supernatantfraksjonene ble underkastet forskjellige behandlinger for fremstilling av enzymholdige preparater.

100 ml Erlenmeyer-kolber ble ifylt pulvervaskemiddel IEC oppløst i standard-springvann med tysk hardhet 15° for oppnåelse av en endelig konsentrasjon på 4 g/liter.

Sammensetningen av pulvervaskemidlet IEC var som følger:

Standard-springvann består av CaCl_.2H20, 0,291 g/l; MgCl.6H20, 0,140 g/l og NaHC03, 0,210 g/l oppløst i avmineralisert vann.

Til hver kolbe ble det tilsatt to EMPA 116-tøystykker og tilstrekkelig mengde enzym-holdige preparater til at man fikk en sluttaktivitet på 3 00 ADU. Såpevannets slutt-volum var

3 0 ml. Til sammenligning inneholdt én kolbe intet enzym-preparat, som var erstattet med vann. Prøven ble gjentatt enten to eller tre ganger. Resultatene er vist i- tabell 22.

Frysetørket supernatantfraksion

Fremstilt Giennomsn. bedring av EMPA 116- test- tøvstvkker ut fra

Dialvserte supernatantfraksioner

Fremstilt Giennomsn. bedrin<g> av EMPA 116- test- tøystykker ut fra

Ultrafiltreringskonsentrat av supernatantfraksioner Fremstilt Giennomsn. bedring av EMPA 116- test- tøystykker ut- fya Aceton- utfellinger av supernatantfraksioner Fremstilt Giennomsn. bedrin<g> av EMPA 116- test- tøystykker ut fra

Resultatene av prøvene viser effektiviteten av de proteolytiske enzymer dannet av stammene ifølge foreliggende oppfinnelse, tilveiebragt i forskjellige former, i vaske-middelpreparater, og den oppnådde forbedrede vaskeytelse.

Eksempel 4

Dannelse av stivelses- nedbrytende enz<y>mer

Stamme 1E.1 CT ble undersøkt med hensyn til dannelse av stivelses-nedbrytende enzymer på et stivelses-holdig medium som ble holdt på alkalisk pH.

500 ml Erlenmeyer-kolber ble ifylt 100 ml alkalisk medium (Medium Y, Vedlegg A) som inneholdt 2% løselig stivelse. Kolbene ble inokulert (5%) med celler av stamme 1E.1 CT dyrket i 24 timer på Medium A (37°C). Som kontroller ble lignende kolber med alkalisk medium som ikke inneholdt stivelse, også inokulert.

Kolbene ble anbragt i en rysteinkubator som roterte i krets med 280 opm, ved konstant temperatur på 37°C, i 24 timer. Fluidet som inneholdt enzymaktiviteten, ble skilt fra cellene ved sentrifugering i 10 min. ved 4000 opm.

Supernatantens enzymaktivitet ble bestemt ved anvendelse av analysen med reduserende sukker av Nelson og Somogyi

(Methods in Microbiology, vol. 5B, s. 300-301; (red. J.R. Norris og D.W. Ribbons), Academic Press, London, 1971).

Bestemmelse av stivelses-nedbrytende enzymaktivitet

ved reduserende sukker-analysen

Løsninger

Reagens 1

144 g Na2S04 oppløses ved forsiktig varming i 500 ml avmineralisert vann. 12 g kalium-natriumtartrat-tetrahydrat, 24 g Na2C03 og 16 g NaHC03 settes til løsningene. Løsningens totale volum bringes til 800 ml ved tilsetning av avmineralisert vann.

Reagens 2

36 g Na2S04 oppløses ved forsiktig oppvarming i 100 ml avmineralisert vann, og 4 g CuS04.5H20 settes til den oppvarmede løsning. Løsningens totale volum bringes til 200 ml ved tilsetning av avmineralisert vann.

Like før anvendelse blandes Reagensene 1 og 2 i forholdet 4:1 (Reagens 1 : Reagens 2).

Reagens 3

25 g ammoniummolybdat-tetrahydrat oppløses i 450 ml avmineralisert vann, og 21 ml konsentrert svovelsyre tilsettes med grundig blanding. 3 g Na2HAs04.7H20 oppløses i 25 ml avmineralisert vann, og denne løsning settes til molybdat-løsningen. Den totale løsning oppvarmes i 48 timer ved 37°C, og eventuell utfelling filtreres fra.

Standard

100 mg glukose oppløses i avmineralisert vann, og det totale volum bringes til 100 ml. Før anvendelse fortynnes løsningen 10 ganger med avmineralisert vann.

Substrat

0,25% løselig stivelse (Merck, produkt nr. 1257) oppløst i 0,1 M Na2C03-NaHC03-buffer, pH 10,1.

Analyse

0,9 ml stivelses-substratløsning, pH 10,1, anbringes i et testrør. Testrøret anbringes i et vannbad ved 25°C, og likevekt får innstilles. Enzymreaksjonen startes ved tilsetning av 0,1 ml av den enzymholdige kultursupernatant.. Reaksjonen får gå i 30 min. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 1 ml av reagens 1/2 og oppvarming i 10 min. ved 100°C. Blandingen avkjøles på is i 5 min., og deretter tilsettes

0,5 ml av reagens 3, og den blå farve får utvikles i løpet av 30 min. ved romtemperatur. Blandingen fortynnes ved tilsetning av 1,0 ml avmineralisert vann, og ekstinksjonen måles ved 500 nm i et spektrofotometer. De reduserende sukkerarter måles som glukose-ekvivalenter fra en standardkurve.

Én enhet stivelses-nedbrytende enzymaktivitet er definert som 1 fig^ av reduserende sukkerarter målt som glukose frigjort pr. milliliter pr. minutt ved pH 10,1 og 25°C.

Antallet dannede stivelses-nedbrytende enzymenheter er vist i tabell 23.

Resultatene av testen viser tydelig tilstedeværelse av stivelses-nedbrytende enzymer, dannet av de alkalifile bakteriestammer ifølge foreliggende oppfinnelse, i dyrkningsbuljongen.

Eksempel 5

Stabilitet av stivelses- nedbrytende enzymer i vaskemiddel Evnen hos de stivelses-nedbrytende enzymer fra stamme 1E.1 CT til å motstå vaskemidler, hvilket er av vesentlig betydning for anvendelse av dem i tøyvaskemidler eller ved tekstil-avliming, er vist.

100 ml Erlenmeyer-kolber forsynt med skvalpeplate ble hver ifylt 30 ml 0,1 M Na2C03/NaHC03-buffer, pH 10,1 som inneholdt 0,12 g natriumdodecylsulfat (ekvivalent med 4 g/l). Til halvparten av kolbene ble det tilsatt 0,3 g potetstivelse (ekvivalent med 1%).

I hver kolbe ble det tilsatt enzym-holdig supernatant fra

CT

stamme 1E.1 ved tilsetning av 0,5, 1,0 eller 2,0 ml (se tabell 24). Som kontroll ble supernatantvæsken erstattet med 1,0 ml vann. Like etter tilsetning av enzymet ble en 0,1 ml prøve fjernet (tid = 0 timer) for måling av enzymaktivitet.

Kolbene ble inkubert med rysting ved 25°C i 2,5 timer, etter hvilket tidsrom en andre 0,1 ml prøve ble fjernet for måling av enzymaktivitet.

Som sammenligning ble forsøket gjentatt under anvendelse av en vanlig Qf-amylase fra Bacillus subtilis.

Enzymaktiviteten ble bestemt under anvendelse av metoden med reduserende sukkerarter beskrevet tidligere.

Resultatene er oppført i tabell 24.

§ 2,8 RAU Bacillus subtilis a-amylase - Én RAU (referanse-amylaseenhet) er definert som den mengde enzym som vil omdanne 1 mg stivelse pr. min. ved pH 6,6 og 30°C til et produkt som ved reaksjon med jod har en absorbans ved 620 nm lik absorb-ansen av en løsning som inneholder 25 g CoCl_.6H„0, 3,84 g K2Cr2ON7 og 1 ml 1 M HCl i 100 ml destillert vann.

Resultatene av denne test viser tydelig stabiliteten av de stivelses-nedbrytende enzymer dannet av de alkalifile bakteriestammer ifølge foreliggende oppfinnelse, i nærvær av vaskemiddel.

Eksempel 6

Dannelse av lipolytiske enzymer

11 av de nye stammer som klart viste lipaseaktivitet (Vedlegg D), ble undersøkt ytterligere med hensyn til dannelse av lipolytiske enzymer. De 11 stammer er eksempler fra klynge 2 og klynge 3 (fig. 1).

Forsøkene ble utført i 100 ml koniske kolber som inneholdt 30 ml sterilt alkalisk næringsmedium, pH 9,6, inokulert med den passende bakteriestamme. Tre forskjellige medier ble anvendt, betegnet medium Z - BB (Vedlegg A). Kolbene ble anbragt i en rysteinkubator som roterte i krets (300 opm) ved 30°C i 48 timer.

Cellene ble skilt fra dyrkningsbuljongen ved sentrifugering og supernatanten dialysert mot 50 volumdeler 0,1 mM Tris-HCl-buffer pH 9, med 3 bufferskift i løpet av 24 timer. Dialysatet ble frysetørket, hvorved man fikk et lipasepreparat (tabell 25).

Lipasepreparatene oppnådd ifølge dette eksempel ble anvendt for vasketesten beskrevet i eks. 7 nedenfor.

Resultatene av denne test viser tydelig tilstedeværelse av lipolytiske enzymer, dannet av alkalifile bakterier ifølge den foreliggende oppfinnelse, i dyrkningsbuljongen og i et frysetørket preparat av den dialyserte dyrkningsbuljong.

Eksempel 7

Lipase- vasketest

Lipasepreparatene fra eks. 6 ble undersøkt med hensyn til ytelse under vaskebetingelser i TIDE'-pulver (1,5 g/l), et vaskemiddelprodukt fra Procter & Gamble.

Denne vasketest (SLM-test) ble utført som beskrevet i US-patent 4.933.287, som er medtatt i det foreliggende som referanse. Som kontroll ble anvendt en lipase fra Pseudomonas alcaligenes stamme Ml (CB3 473.85) som beskrevet i US-patent 4.933.287. Resultatene er vist i tabell 26.

Reduksjonen i prosentvis gjenvinning av triglycerider og total mengde lipider, sammenlignet med kontrollen, viser tydelig evnen hos de lipolytiske enzymer dannet av de alkalifile bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse, til nedbryting og fjerning av triglycerider og deres nedbrytnings-produkter som er trengt ned i en tøyprøve, såvel som deres forbedrede yteevne sammenlignet med en kjent lipase.

Vedlegg B

Metoder for enhetstester

1. Egenskaper nr. 1- 5

Kolonifarve. - form, - profil, - kant, - størrelse

En suspensjon av bakterier ble spredt over en alkalisk næringsagar (Medium A) og dyrket ved 37°C. Koloniene ble undersøkt etter 4 8 timer.

2. Egenskaper nr. 6 og 7

Cellemorfologi. Gram' s farvereaksion Bakterieceller dyrket i alkalisk næringsbuljong (Medium A uten agar) i 24 timer, ble spunnet ned i en sentrifuge og suspendert på nytt i en liten mengde alkalisk næringsbuljong, og fikk lufttørke på et obj ekt-glass. Eller, bakterier ble dyrket i 24-48 timer på en alkalisk næringsagar (Medium A) for dannelse av kolonier. Kolonier av bakterier ble suspendert i fysiologisk

saltløsning, og noen få dråper fikk lufttørke på et

objektglass. Gram's farvetest ble utført ved anvendelse av Dussault-modifikasjonen (Journal of Bacteriology, 70, 484-485, 1955) med safranin som kontrafarving.

3. Egenskap nr. 8

Oksydasereaksi on

Filtrerpapir fuktet med en 1% vandig løsning av N,N,N,N'-tetrametyl-p-fenylendiamin eller oksydase-identifikasjonsplater (bioMérieux: Charbonieres-les-Bains, Frankrike) ble påstrøket en ung bakteriekultur fra alkalisk næringsagar. Purpurfarve innen 1 min. ble notert som positiv reaksjon. E. coli, som ble anvendt som kontroll, ga ikke positiv reaksjon innen 1 min.

4. Egenskap nr. 9

Skummetme1k- 1e st

Et minimal-medium som besto av (g/l desillert vann) gjærekstrakt, 1,0; KNO 10,0; K HPO 1,0; MgSO .7H 0 0,2; NaCl 40,0; Na_C03 10,0; agar 20,0 ble supplert med 5,0 g/l pulver av skummet melk, sterilisert ved auto-klavering og hellet i petriskåler. Bakterier ble inokulert og inkubert ved 37°C. Klare områder rundt bakteriekolonier i en ellers opak agar ble notert som positiv reaksjon. Ikke-alkalifile referansestammer ble undersøkt på identisk måte ved anvendelse av medier med samme sammensetning, men uten Na9C0_ for oppnåelse av en pH på 6,8-7,0.

5. Egenskap nr. 10

Gelatinhydrolyse

Trekull-gelatin-plater (bioMérieux eller "chargeler"

(Oxoid) ble inkubert ved 37°C i en alkalisk nærings-bul jong (Medium A) sammen med bakterier. Et svart bunnfall viste positiv reaksjon.

Vedlegg B (forts.)

6. Egenskap nr. 11

NaCl- toleranse

To metoder ble anvendt.

(a) Bakteriestammer ble dyrket ved 37°C på en alkalisk næringsagar (Medium A) som inneholdt 0, 4, 8, 12 . eller 15 vekt/vol% NaCl. Agarplatene ble undersøkt med hensyn til bakterievekst etter 48 timer. (b) Bakteriestammer ble dyrket ved 37°C i en alkalisk næringsbuljong (Medium A) som inneholdt 0, 4, 8, 12, 15 eller 25% NaCl. Bakterieveksten ble kontrollert

ved målinger av optisk densitet under anvendelse av et Klett-meter (grønt filter) etter 0, 12, 24, 48, 72 og 144 timer.

7. Egenskap nr. 12

Minimums- pH for vekst

Næringsagar, pH 6,8-7,0 (Medium A uten natriumkarbonat) ble hellet i kvadratiske petriskåler. En strimmel av størknet agar ble fjernet fra én ende og erstattet med smeltet 4 vekt/vol% agar som inneholdt 3,6 vekt/vol% Na2CO_ og 0,8 vekt/vol% NaOH. En pH-gradient fra pH 10,5 til "pH 7 over platen fikk utvikles over natten. Bakteriene ble inokulert ved påstryking langs pH-gradienten og dyrket ved 37°C i 48 timer. pH-verdien på det punkt hvor bakterieveksten opphørte, ble målt med en elektrode med flat øvre del og med "Alkalite" pH-strimler (Merck:

Darmstadt, Tyskland).

8. Egenskaper nr. 13 - 21

Karbohydrat- utnyttelse

Et minimal-medium som besto av (g/l destillert vann) gjærekstrakt 1,0; KNO 10,0; K HPO 1,0; MgSO . 711,0 0,2; NaCl 40,0; Na^^ 10,0; agar 20,0 ble supplert med 2,0 g/l av karbohydratet som skulle undersøkes, og hellet i kvadratiske petriskåler. Bakteriene ble inokulert under anvendelse av en 25 punkts multi-punkts inokulator, fra 1,0 ml av en bakteriesuspensjon dyrket i 48 timer i en alkalisk næringsbuljong (Medium A). Agarplatene ble inkubert ved 37°C i 48 timer. Resultatene ble notert ved sammenligning av bakterieveksten på minimal-næringsmedium inneholdende et karbohydrat-supplement, med veksten på et minimal-medium uten karbohydratet som skulle undersøkes. Ikke-alkalifile referansestammer ble undersøkt på identisk måte under anvendelse av medier med samme sammensetning, men uten Na„C0-., for oppnåelse av en pH på 6,8 - 7,0.

Vedlegg B (forts.)

9. Egenskaper nr. 22- 53

Vekst på karbonsubstrater

Det ble gjort bruk av den kommersielt tilgjengelige teststrimmel ATB 32 GN (API-bioMérieux: La Balme les Grottes, Frankrike. Strimlene ble anvendt ifølge produsentens instruksjoner, men med tilsetning av 1,0 mm av en løsning som inneholdt 4% NaCl og 1% Na2C03 til de tilveiebragte medisinglass med basalmedium. Strimlene ble inkubert ved 37°C i 48 timer. Ikke-alkalifile

referansestammer ble inkubert i standard-basalmediet.

10. Egenskaper nr. 54- 72

Enzymatiske aktiviteter

Det ble gjort bruk av den kommersielt tilgjengelige teststrimmel APIZYM (API-bioMérieux), som ble anvendt ifølge produsentens instruksjoner, bortsett fra at de alkalifile bakterieceller ble suspendert i alkalisk næringsbuljong (Medium A). Strimlene ble inkubert ved 37°C i 4 timer.

11. Egenskaper nr. 73- 82

Aminosyrer som karbon- og nitrogenkilde

Det ble anvendt samme teknikk som for testene 14-21, bortsett fra at KNO^ ble utelatt fra minimal-nærings-mediet.

12. Egenskaper nr. 83- 104

Antibiotisk følsomhet

En lett suspensjon av bakterier i alkalisk næringsbuljong ble utspredt på overflaten av alkalisk næringsagar (Medium A) og fikk tørke. Kommersielt tilgjengelige testskiver for undersøkelse av følsomhet overfor antibio-tika (Oxoid) eller Mast Laboratories: Merseyside, U.K.) ble påført på agaroverflaten. Bakteriene ble dyrket ved 37°C i 48 timer. Klare soner rundt antibiotikaskivene viste følsomhet.

Vedlegg D

Undersøkelse med hensyn til proteolytisk, amylolytisk og lipolytisk aktivitet

Proteolytisk aktivitet (forts.)

Amylolytisk og lipolytisk aktivitet

Amylolytisk og lipolytisk aktivitet (forts.)

Ikke- klyngedannende stammer

Vedlegg E

Prosentandel positive tilstander for egenskaper i klynger

Prosentandel positive tilstander . for egenskaper i klynger

Claims

1. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) danner kremfarvede, sirkulære kolonier, b) vokser optimalt mellom pH 9 og 10, c) gir positiv respons ved følgende tester: 1) Leucin-arylamidase 2) Valin-arylamidase 3) Fosfatohydrolase 4) Polymixin; d) gir negativ respons ved følgende tester: 1) N-acetylglukosamin 2) Maltose 3) Propionat 4) Kaprat 5) Valerianat 6) Citrat 7) Histidin 8) Glykogen 9) 4-hydroksybenzoat 10) a-galaktosidase.

2. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) danner små, kremfarvede kolonier, b) vokser optimalt mellom pH 7,8 og 11,2, c) gir positiv respons ved følgende tester: 1) Stivelse 2) Acetat 3) Propionat 4) Valerianat 5) Prolin 6) Lipase 7) Oksydase (respons innen 10 sek.); d) gir negativ respons ved følgende tester: 1) N-acetylglukosamin 2) Sakkarose 3) Histidin 4) 2-ketoglukonat 5) 4-hydroksybenzoat 6) a-glukosidase 7) E-glukosidase 8) Fusidinsyre.

3. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) danner kremfarvede, opake kolonier, b) vokser optimalt mellom pH 8,5 og 10,7, c) inneholder ubikinon 6 som et hoved-respirasjons-kinon; d) gir positiv respons ved følgende tester: 1) Acetat 2) Laktat 3) Propionat 4) Valerianat 5) Citrat 6) 3-hydroksybenzoat 7) Prolin 8) Leucin-arylamidase: e) gir negativ respons ved følgende tester: 1) Fosfohydrolase 2) a-galaktosidase 3) Fusidinsyre 4) Tetracyklin 5) Vancomycin 6) Bacitracin.

4. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) danner beige til brunfarvede, opake kolonier, b) vokser optimalt mellom pH 7,5 og 10,9, c) inneholder ubikinon 9 som et hoved-respirasjons-kinon, d) gir positiv respons ved følgende tester: 1) Laktat 2) Alanin 3) 3-hydroksybutyrat 4) Valin-arylamidase 5) Polymixin; e) gir negativ respons ved følgende tester: 1) Histidin 2) Ampicillin 3) Naladixinsyre 4) Trimethoprim 5) Penicillin G 6) Methicillin.

5. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) danner lysegule kolonier, b) vokser optimalt mellom 8 og 10,5, c) gir positiv respons ved følgende tester. 1) Fosfohydrolase 2) a-galaktosidase 3) S-galaktosidase 4) Ampicillin 5) Fusidinsyre 6) Methicillin 7) Tetracyklin 8) Vancomycin 9) Bacitracin d) gir negativ respons ved følgende tester: 1) N-acetylglukosamin 2) Laktat 3) L-alanin 4) Mannitol 5) Propionat 6) Kaprat 7) Valerianat 8) Histidin 9) 3-hydroksybenzoat 10) 3-hydroksybutyrat 11) 4-hydroksybenzoat 12) Polymixin.

6. Ren Jpakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) danner kremfarvede til beige-farvede, uregelmessige, flate kolonier, b) vokser optimalt mellom pH 8,2 og 10,9, c) gir positiv respons ved følgende tester: 1) Stivelse 2) N-acetylglukosamin 3) Sakkarose 4) Maltose 5) Acetat 6) Alanin 7) Citrat 8) Glykogen 9) 3 -hydroksybutyrat 10) Penicillin G 11) Fusidinsyre 12) Methicillin 13) Tetracyklin 14) Bacitracin; d) gir negativ respons ved følgende tester: 1) Pyruvat 2) 4-hydroksybenzoat 3) Leucin-arylamidase 4) Valin-arylamidase 5) a-galaktosidase 6) Polymixin.

7. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, bevegelige, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper : a) celler ofte i par, b) ..vokser optimalt mellom pH 9 og 10, c) danner på alkalisk agar glatte, gjennomskinnelige, beige-farvede kolonier med diameter 1-2 mm, som er sirkulære, konvekse med hel kant, d) i alkalisk buljong er veksten (37°C) fnuggaktig med en ring eller overflatehinne og dannelse av et bunnfall, e) vokser optimalt ved 20-30°C, f) ingen vekst ved 15 eller 40°, g) KOH-testen er positiv, h) aminopeptidasetesten er svakt positiv, i) oksydasetesten er svakt positiv, . j) katalsetesten er positiv, k) obligat halofil, 1) vokser optimalt med 4% NaCl, m) ingen vekst med 0 eller 8% NaCl, n) testen for hydrolyse av gelatin er langsomt positiv, o) hydrolyse av stivelse er positiv, p) vokser ikke på enkle sukkerarter, q) vokser ikke på organiske syrer, r) vokser på gjærekstrakt og peptoner.

8. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, bevegelige, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper : a) vokser optimalt mellom pH 8,2 og 10,9, b) danner på alkalisk agar glatte, opake, beige eller brunfarvede kolonier med diameter 2-4 mm, som har sirkulær form, konveks profil og med hel kant, c) i alkalisk buljong er veksten (37°C) massiv og fnuggaktig med et bunnfall og overflatehinne, d) vokser optimalt mellom 20 og 37°C, e) ingen vekst ved 8 eller 40°C eller over denne temperatur, f) KOH-testen er positiv, g) _ aminopeptidasetesten er positiv, h) oksydasetesten er meget svakt positivt, i) katalasetesten er positiv, j) vokser ved en NaCl-konsentrasjon på mellom 0 og 15%, k) ingen vekst med 20% NaCl, 1) testen for hydrolyse av gelatin er negativ, m) hydrolyse av stivelse er negativ, n) vokser på gjærekstrakt, o) vokser på organiske syrer valgt fra gruppen som består av suksinat, pyruvat, citrat, malonat, acetat og laktat, p) vokser på fettsyrer valgt fra gruppen som består av propionat, valerianat og suberat, q) vokser på aminosyrer valgt fra gruppen som består av prolin, serin, histidin og lysin.

9. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) vokser optimalt mellom pH 9 og 10,5, b) danner på alkalisk agar glatte, opake, brunfarvede kolonier med diameter 3-4 mm, som har ganske uregelmessig form, har generelt flat til lett bølget profil med fliket kant, c) i alkalisk buljong er veksten (37°) moderat til massiv, og blir fnuggaktig med et bunnfall og overflatehinne, d) vokser optimalt mellom 20 og 40°C, e) ingen vekst ved 45°C, f) KOH-testen er positiv, g) aminopeptidasetesten er positiv, h) oksydasetesten er negativ, i) katalasetesten er positiv, j) vokser ved en NaCl-konsentrasjon på 0-12%, k) ingen vekst ved 20% NaCl. 1) -testen for hydrolyse av gelatin er positiv, m) hydrolyse av stivelse er svakt positiv, n) vokser ikke på enkle sukkerarter, o) vokser på gjærekstrakt, p) vokser på organiske syrer valgt fra gruppen som består av pyruvat, citrat, acetat og laktat, q) vokser på fettsyrer valgt fra gruppen som består av propionat, kaprat og valerianat, r) vokser på aminosyrer valgt fra gruppen som består av prolin, alanin og lysin.

10. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) vokser ikke under pH 7,5, b) danner på alkalisk agar glatte, kremfarvede kolonier, i begynnelsen gjennomskinnelige, men som blir opake, c) på alkalisk agar utvikles koloniene fra sirkulære, hele og blir uregelmessige, med fliket form og konveks profil, d) i alkalisk buljong er veksten (37°C) langsom, lett, fnuggaktig med bunnfall, men ingen overflatehinne, e) vokser optimalt mellom 10 og 40°C, f) ingen vekst ved 8 eller 45°C, g) KOH-testen er positiv, h) aminopeptidasetesten er negativ, i) oksydasetesten er positiv, j) katalasetesten er positiv, k) vokser ved en NaCl-konsentrasjon på mellom 0 og 15%, 1) ingen vekst med 20% NaCl, m) testen for hydrolyse av gelatin er positiv, n) hydrolyse av stivelse er svakt positiv,0) vokser på gjærekstrakt og peptoner, p) vokser på sukkerarter, q) vokser på organiske syrer, r) _vokser på aminosyrer.

11. Ren bakteriekultur egnet for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, karakterisert ved at bakteriene består av aerobe, gram-negative, små, stavformede, obligat alkalifile bakterier med følgende karakteregenskaper: a) cellene danner ofte korte kjeder, b) vokser ikke ved pH under 8, c) danner på alkalisk agar glatte, sirkulære, konvekse kolonier med hel kant, med diameter ca. 1 mm og som i begynnelsen er gjennomskinnelige, med kremfarvet/- beige farve, og koloniene blir opake og får brun farve med tiden, d) i alkalisk buljong er veksten (37°C) i begynnelsen jevnt uklar med et bunnfall, men ingen overflatehinne, og blir fnuggaktig med dannelse av en hinne, e) vokser optimalt mellom 30 og 37°C, f) ingen vekst ved 40°C, g) KOH-testen er positiv, h) aminopeptidasetesten er positiv, 1) oksydasetesten er positiv, j) katalasetesten er positiv, k) obligat halofil, 1) vokser med 4% NaCl, m) ingen vekst med 0 eller 8% NaCl, n) testen for hydrolyse av gelatin er langsomt positiv, o) hydrolyse av stivelse er negativ, p) vokser på gjærekstrakt og peptoner, q) vokser på sukkerarter, r) vokser på organiske syrer, s) vokser på fettsyrer, t) vokser på aminosyrer.

12. Anvendelse av bakteriene ifølge et hvilken som helst av ' kravene 1-11 for fremstilling av alkali-tolerante enzymer, som omfatter: at bakteriene ifølge et hvilket som helst kravene 1-11 dyrkes i et dyrkningsmedium; bakteriene skilles fra dyrkningsmediet; og enzymaktiviteten utvinnes fra dyrkningsmediet.