FI119882B - Gram-negatiivisten alkalofiilisten mikro-organismien käyttö alkalikestoisten entsyymien tuotossa - Google Patents

Description

Gram-negatiivisten alkalofiilisten mikro-organismien käyttö alkalikestoisten entsyymien tuotossa Tämä keksintö koskee mikrobiologian aluetta ja erityisemmin 5 alkalofiilisiä mikro-organismeja ja niiden käyttöä alkalikestoisten entsyymien tuotannossa.

Alkalofiilit määritellään organismeiksi, jotka kasvavat optimaalisesti alkalisessa pH-ympäristössä, erityisesti pH:n 10 ollessa yli 8, ja yleensä pH-alueella 9-10. Alkalofiilien voidaan havaita elävän myös ympäristöissä, joiden pH on niinkin korkea kuin 12. Ehdottomat alkalofiilit eivät kykene kasvamaan neutraalissa pH:ssa.

15 Alkalofiilejä voidaan havaita sellaisissa jokapäiväisissä ympäristöissä kuten puutarhamaassa, johtuen luultavasti lyhytaikaisista aikalisistä olosuhteista, jotka aiheutuvat biologisesta aktiivisuudesta, kuten ammonifikaatiosta, sulfaatin pelkistämisestä tai fotosynteesistä. Paljon runsaam-20 pi, monipuolisempi alkalofiilisten organismien lähde voidaan havaita luonnollisina esiintyvissä, pysyvästi aikalisissä ympäristöissä kuten soodajärvissä.

Yksityiskohtaisempi tutkimus soodajärvistä ja alkalofiili-25 sistä organismeista yleisesti esitetään julkaisussa Grant, W.D., Mwatha, W.E. ja Jones, B.E. (1990) FEMS Microbiology Reviews, 75./- 255-270), joka teksti on tässä yhteydessä sisällytetty viitteenä. Luetteloita aikalisistä soodajärvistä voi löytää julkaisuista Grant, W.D. ja Tindall, B.J., Mic-30 robes in Extreme Environments, (edit. R.A. Herbert ja G.A. Codd); Academic Press, London, (1986), ss. 22-54; ja Tindall, B.J., Halophilic Bacteria, volyymi 1 (edit. F. Rodri-guez-Valera); CRC Press Inc., Boca Raton, FL, (1988), ss. 31-70, molemmat tekstit myös tässä sisällytettynä viit-35 teenä.

Alkalofiilejä, joista suurin osa on Bacillus-lajeja, on eristetty suolattomista ympäristöistä, ja niitä käsittele- 2 vät Horikoshi, K. ja Akiba, T. julkaisussa Alkalophilic Microorganisms (Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N.Y., (1982)). Siinä ei kuitenkaan käsitellä alkalofiilisiä organismeja suolaisista ja aikalisistä ympäristöistä kuten 5 järvistä. Ehdottoman anaerobisia bakteereja aikalisistä, ylisuolaisista ympäristöistä ovat äskettäin kuvailleet Shi-ba, H. julkaisussa Superbugs (edit. K. Horikoshi ja W.D. Grant); Japan Scientific Societies Press, Tokyo ja Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N.Y., (1991), ss. 191-211; 10 ja Nakatsugawa, N., samassa julkaisussa, ss. 212-220.

Soodajärvet, joita voidaan tavata erilaisista paikoista ympäri maailmaa, saavat alkunsa geologisten, maantieteellisten ja ilmastollisten olosuhteiden yhdistelmästä. Niille on 15 tunnusomaista suurten natriumkarbonaattimäärien (tai niiden kompleksien) läsnäolo, jotka ovat muodostuneet haihtumis-väkevöitymisen johdosta, sekä Ca2+:n ja Mg2+:n puuttuminen vastaavasti, jotka poistaisivat karbonaatti-ioneja liukenemattomina suoloina. Muut suolat, kuten NaCl, voivat myös 20 väkevöityä, josta on seurauksena ympäristöjä, jotka ovat sekä aikalisiä että suolaisia.

Tästä ilmeisen kovasta ympäristöstä huolimatta, soodajärvet toimivat kuitenkin asuinpaikkana suurelle prokaryoottipopu-25 laatiolle, joista muutamat tyypit voivat olla vallitsevia pysyvinä tai kausiluonteisina kukintoina. Organismeja esiintyy alkalofiilisistä syanobakteereista haloalkalofii-lisiin arkeobakteereihin. Ei sitäpaitsi ole epätavallista löytää tavallisia alkalofiilisiä organismeja elämässä soo-30 dajärvissä erilaisilla, laajalti kautta koko maailman levittäytyneillä alueilla, kuten esimerkiksi Itä-Afrikan Rift Valley'ssa, USA:n länsiosissa, Tiibetissä, Kiinassa ja Unkarissa. Natronobakteereja esimerkiksi on eristetty ja identifioitu soodajärvistä, jotka sijaitsevat Kiinassa 35 (Wang, D. ja Tang, Q., "Natronobacterium from Soda Lakes of China", Recent Advances in Microbial Ecology (Proceedings of the 5th International Symposium on Microbial Ecology, edit. T. Hattori et ad.); Japan Scientific Societies Press, 3

Tokyo, (1989), ss. 68-72), ja läntisessä USA:ssa (Morth, S. ja Tindall, B.J. (1985) System. Appi. Microbiol., 6_, 247-250). Natronobakteereja on tavattu myös soodajärvistä, jotka sijaitsevat Tiibetissä (W.D. Grant, julkaisemattomia ha-5 vaintoja) ja Intiassa (Upasani, V. ja Desai, S. (1990)

Arch. Microbiol., 154, ss. 589-593).

Alkalofiilit ovat jo saaneet aikaan vaikutuksen koskien biotekniikan soveltamista kulutustavaroiden valmistukseen. 10 Alkalofiilisten mikro-organismien tuottamille alkalinkestä-ville entsyymeille on jo löydetty käyttöä teollisissa prosesseissa ja niillä on huomattava taloudellinen potentiaa li. Näitä entsyymejä käytetään esimerkiksi tällä hetkellä pesuainekoostumuksissa ja nahan parkitsemisessa, ja niille 15 ennustetaan löytyvän käyttösovellutuksia elintarvike-, jät-teidenkäsittely- ja tekstiiliteollisuudessa. Alkalofiilit ja niiden entsyymit ovat lisäksi mahdollisesti käyttökelpoisia biomuunnoksiin, erityisesti puhtaiden enantiomeerien synteesissä.

20 Tämä keksintö koskee menetelmää uusien aerobisten, gram-negatiivisten alkalofiilisten bakteerien puhdasviljelmien valmistamiseksi. Näitä bakteereja on eristetty näytteistä, jotka käsittävät maaperän, veden, sedimentin ja muutaman 25 muun lähteen, joista kaikki saatiin aikalisistä soodajär- vistä ja niiden ympäriltä. Näitä alkalofiilejä on analysoitu numeerisen taksonomian toimintaperiaatteiden mukaisesti suhteessa toinen toisiinsa ja myös useaan eri tunnettuun bakteeriin nähden, niiden uutuuden varmistamiseksi. Sen li-30 säksi näitä bakteerisia taksoneita rajataan vielä analysoimalla erilaisia kemotaksonomisia ominaisuuksia.

Tässä selityksessä esitetään tutkimustietoja, jotka koskevat niiden ympäristöjen koostumusta, joista mikro-organis-35 meja sisältävät näytteet saatiin, sekä kuvataan alustoja, joita tarvitaan niiden tehokasta eristämistä ja viljelyä varten niin, että alaa tavallisesti tunteva henkilö voi helposti paikantaa sellaisen ympäristön ja kyetä eristämään 4 tämän keksinnön mukaisesti saatavat organismit noudattamalla tässä kuvailtavia menettelytapoja.

Tässä esitetään mikro-organismeja, jotka tuottavat käyttö-5 kelpoisia alkalinkestäviä entsyymejä, ja keksintö koskee erityisesti menetelmää näiden entsyymien olennaisesti puhtaiden valmisteiden saamiseksi. Nämä entsyymit kykenevät toimimaan korkeassa pH:ssa, mikä tekee niistä ainutlaatuisen sopivia käyttösovellutuksiin, joissa tarvitaan sellai-10 siä ääriolosuhteita. Alkalinkestäviä entsyymejä voidaan esimerkiksi käyttää pesuainekoostumuksissa, nahan parkitsemisessa ja elintarvike-, jätteidenkäsittely- ja tekstiiliteollisuudessa sekä biologisissa muunnoksissa, kuten puhtaiden enantiomeerien valmistuksessa.

15 Näitä alkalinkestäviä entsyymejä koodittavat geenit voidaan eristää, kloonata ja ilmentää yhteensopivissa ekspressio-isännissä, jotta entsyymituotteita saadaan aikaan suuria tilavuusmääriä, jotka voidaan haluttaessa helpommin puhdis-20 taa ja käyttää erilaisissa teollisissa sovellutuksissa, jos villityypin kannalla ei onnistuttaisi tuottamaan riittäviä määriä haluttua entsyymiä, tai sen fermentointi ei ole kelvollista.

25 Kuvio 1. Pelkistetty dendrogrammi, joka esittää ryhmiä (fe-noneja), jotka on saatu SG-kertoimen ja painottamattomia keskiarvoja käyttävän kytkentämenetelmän avulla.

Kuvio 2. Pelkistetty dendrogrammi, joka esittää ryhmiä (fe-30 noneja), jotka on saatu Sj-kertoimen ja painottamattomia keskiarvoja käyttävän kytkentämenetelmän avulla.

Kuvio 3. Pelkistetty dendrogrammi, joka on saatu SG-kertoi-men ja painottamattomia keskiarvoja käyttävän kytkentäme-35 netelmän avulla, käyttäen johdettuja, minimimäärään perustuvia erottelutestejä.

5 Näytteenotto

Useita satoja bakteerikantoja on eristetty maaperä-, vesi-ja sedimenttinäytteistä ja muutamista muista lähteistä al-5 kalisista järvistä ja niiden ympäriltä. Nämä näytteet saatiin osana tutkimusta kolmen vuoden ajanjakson kuluessa. Eristetyt bakteerit ovat ei-fototrofisiä eubakteereja. Tähän mennessä sellaisia bakteereja ei ole karakterisoitu.

10 Näytteet kerättiin steriileihin muovipusseihin. Näytteenotto suoritettiin Elmenteita-, Nakuru-, Bogoria-, Crater (So-nachi)-, Little Naivasha (Oloidien)-, Magadi- ja Little Ma-gadi (Nasikie Engida)-järviltä, joista kaikki sijaitsevat Keniassa, Itä-Afrikassa. Ympäristöltään samankaltaisia al-15 kalisia soodajärviä voi löytää myös Tiibetistä, Kiinasta, Unkarista ja läntisestä USA:sta. Kussakin näytteenottopai-kassa määritettiin fysikaaliset parametrit, kuten pH, johtokyky ja lämpötila, sekä paikan ja näytteen fysikaalinen ulkonäkö. Jotkut näytteistä käsiteltiin paikan päällä 36 20 tunnin sisällä näytteen keräämisestä, mutta valtaosa tutkittiin muualla useita viikkoja näytteiden keräämisen jälkeen .

Taulukossa 1 luetellaan erilaisia kantoja, jotka on eris-25 tetty. Kannat luetellaan sen paikan mukaisesti, mistä näyte on otettu, itse näytteen fysikaalisen ulkonäön mukaan ja viitaten taulukkoon 2, jossa esitetään järvivesinäytteiden kemiallinen analyysi.

30 Taulukossa 3 esitetään luettelo eristetyistä kannoista, järjestettynä numeerisen taksonomia-analyysin tulosten mukaisesti. Taulukossa 3 esitetään sen lisäksi näytteen fysikaalisia ominaisuuksia, erityisesti lämpötila, johtokyky ja alkalinen pH sekä lukuisia eristysalustoja, joita tarvitaan 35 uusien bakteerien puhdasviljelmien saamiseksi. Nämä alustat on kirjainkooditettu viittaamalla liite A:han.

β

Taulukoissa 1, 2 ja 3 esitetään tuloksia, joiden avulla näytteenottopaikkojen ympäristö voidaan karakterisoida. Näytteiden kemiallinen ja fysikaalinen analysointi varmistaa alkalisen pH:n läsnäolon sekä epätavallisen korkeat 5 Na2CC>3-tasot, joihin kytkeytyvät matalat Ca2+- ja Mg2+-tasot.

Mutanäytteistä ei ole saatavissa kemiallista analyysiä. Sen lisäksi muutamista näytteistä ei ole saatavissa kemiallista analyysiä (lähemmin taulukko 1). Samasta paikasta otettuja 10 muita näytteitä on kuitenkin analysoitu ja kuvailtu taulukoissa 1-3. On tunnettua, että soodajärvien tyypilliset pe-rusympäristöt ovat pysyviä pH:n ja ionikoostumuksen suhteen. Näistä paikoista löydetyt mikrobipopulaatiot pysyvät sen lisäksi suureksi osaksi pysyvinä. Siten on odotetta-15 vissa, että tiettyjen näytteiden kemiallisen analysoinnin puuttumisesta huolimatta, ympäristö, josta bakteerit saatiin, voidaan kuitenkin määrittää taulukoissa 1-3 esitetyistä tuloksista.

20 Tuoreet soodajärven vesinäytteet viljeltiin alkaliselle ravintoalustalle (Alusta A) pian keräämisen jälkeen. Mikroskooppinen tarkastelu osoitti bakteerityyppien odottamattoman suuren moninaisuuden. Ottaen huomioon ympäristön erittäin alkalinen luonne, elävien bakteerien lukumäärissä 25 esiintyi odottamattoman runsaasti organotrofisiä bakteereja, määrien vaihdellessa 105 - 106 pesäkkeen muodostavaa yksikköä ml:ssa. Näytteet varastoitiin joko jäähdytetyissä tai ympäristön lämpötiloissa. Muutaman viikon säilytyksen jälkeen näytteen sisältämien bakteerien kokonaislukumäärät 30 kohosivat, kun taas tyyppien moninaisuus pieneni.

Taulukko 1 7

AlkalofUliset kannat järjestettynä niiden alkuperäpaikan mukaisesti 5 Näytteen Näytteen Analyysi

Kannat _sijainti _ulkonäkö__(Taul. 2) 1E.1, 2E.1, Elmenteita-järvi Muta kuivuneesta E.M.

4E.1, 5E.1, (itäinen lahti) järvikerrostumasta 35E.2, 36E.2, 10 37E.2, 38E.2 wE.5, wEll, Elmenteita-järvi Sedimentti ja vesi, E.T.

wE12 (itäinen lahti) rantavyöhyke.

15 39E.3, 40E.3, Elmenteita-järvi Muta ja vesi 1 41E.3, 42E.3, (itäinen lahti) rantavyöhyke.

44E.3, 53E.4, Spirulina-vaahto.

56E. 4 20 45E.3, 47E.3, Elmenteita-järvi Ruskea vesi 2 57E.4 suo, kaakkois- ja sedimentti poukama 48E.3, 58E.4 " Harmaa muta 2 25 59E.4 Elmenteita-järvi Vesi ja hiekka- 3 (luoteislahti) sedimentti, ranta vyöhyke 16N.1, 17N.1 Nakuru-järvi, Muta ja vesi, E.T.

30 18N.1, 19N.1, pohjoisranta rantavyöhyke 20N.1, 26.1, Hippo-niemen ja 28N.1, wNl, Njoro-niemen wNk2. välissä.

49N.3, 50N.3 " Vesipatsas, ranta- 4 35 61N.4 vyöhyke.

51N.3, 52N.3 " Järvisedimentti, 4 rantavyöhyke.

5

Taulukko 1 (jatkoa) 8 Näytteen Näytteen Analyysi

Kannat_sijainti_ulkonäkö (Taul. 2) 63N.4 Nakuru-järvi; Muta ja vesi E.T.

vesilammikko, luoteissuolarannat.

10 6B.1, 7B.1, Bogoria-järvi, Muta ja vesi, E.T.

8B.1, 9B.1, pohjoismuta- rantavyöhyke.

10B.1, 24B.1, rannat.

25B.1, wBl, wB2, wB4, wB5 15 wBn4 64B.4 " Soodamudan kuiva E.M.

kuori.

65B.4 " Muta vesirajassa 5 20 wBs4 Bogoria-järvi, Muta ja vesi, E.T.

lounaisranta. rantavyöhyke.

11C.1, 12C.1, Crater-järvi, Muta ja vesi, E.T.

29C.1, pohjoisniemi rantavyöhyke.

25 73aC.4, 73bC4, " " 6 7 4C. 4 75C.4 " Soodamuta, ranta- E.M.

viiva.

30 77LN.4, 78LN.4 Little Naivasha- Vesipatsas ja 7 järvi, sedimentti eteläranta.

21M.1, 22M.1, Magadi-järvi, Muta ja vesi E.T.

35 27M.1 ylemmän läntisen poukaman penger.

92LM.4, 94LM.4 Little Magadi- Lähdevesi ja 8 järvi, luoteiset sedimentti 40 lähteet.

Taulukossa 1 E.T. = Ei testattu E.M. = Ei merkitystä 9

Taulukko 2

Kenian soodajärvivesien kemiallinen analyysi 5 Analyysi Na+ K+ Ca2+ Mg2~ Si02 P045- Cl“ S042~ C032~ OKT* KA§ (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) 1 196 3,58 0,07 a.i.r. 2,91 0,03 65,1 2,0 68,0 0,8 119 2 140 3,32 0,48 0,13 1,85 0,02 46,8 1,7 32,0 1,2 86 3 167 3,32 0,06 a.i.r. 3,10 0,03 51,8 1,7 64,0 2,2 103 10 4 326 5,63 0,15 a.i.r. 3,25 0,15 57,5 0,5 198,3 1,9 259 5 735 5,50 0,21 0,01 2,23 0,09 100,9 1,0 476,7 0,9 612 6 140 8,95 0,06 0,01 2,13 0,04 12,4 0,8 90,0 1,1 133 7 8,7 1,79 0,28 0,65 1,02 0,003 4,8 0,5 <10,0 <0,07 18 8 483 4,35 0,03 0,03 0,64 0,08 157,8 1,7 166,0 1,2 105 15 a.i.r. = alle ilmaisurajojen *0KT = orgaaninen kokonaistyppi §KA = kokonaisalkalisuus milliekvivalenttia/litra 10

Taulukko 3

Ryhmiksi* järjestettyjen kantojen alkuperä Näyte 5 Lämpöt. Johtokyky Erist.

Ryhmä Kanta Sijainti pH °C mS/cm alusta

1 1E.1CT Elmenteita 9,5 35 e.t. A

1 2E.1 Elmenteita 9,5 35 e.t. A

1 wB2 Bogoria e.t. e.t. e.t. A

10 1 wB5 Bogoria e.t. e.t. e.t. A

1 wBs4 Bogoria 10,5 e.t. 19 A

1 10B.1 Bogoria 10,5 36 45 A

1 20N.1 Nakuru 10,5 36 30-40 A

1 27M.1 Magadi 11,0 36 100 A

15 1 Comamonas terrigenaT (NCIMB 8193)

1 wNk2 Nakuru 10,5 e.t. 19 A

1 Pseudomonas putidaT (NCIMB 9494)

2 39E.3 Elmenteita 10-10,5 23 13,9 M

2 4IE.3 Elmenteita 10-10,5 23 11,3 N

20 2 45E. 3CT Elmenteita 10 27 11,3 P

2 47E.3 Elmenteita 10 27 11,3 O

2 51N.3 Nakuru 10-10,5 29 40,1 P

2 52N.3 Nakuru 10-10,5 29 40,1 P

2 42E.3 Elmenteita 10-10,5 23 13,9 N

25 2 50N.3 Nakuru 10-10,5 29 40,1 N

2 Pseudomonas stutzeriT (NCIMB 11358)

wN2 Nakuru e.t. e.t. e.t. A

Pseudomonas beijerinckii1 (NCIMB9041)

4E.1 Elmenteita 9,5 35 e.t. A

30 - 5E.1 Elmenteita 9,5 35 e.t. A

3 6B.1 Bogoria 10,5 36 45 A

3 7B.1 Bogoria 10,5 36 45 A

3 8B.1 Bogoria 10,5 36 45 A

3 38E.2 Elmenteita e.t. e.t. e.t. B

35 3 56E.4 Elmenteita 10-10,5 23 13,9 C

3 25B.1 Bogoria 10,5 36 45 A

3 26N.1 Nakuru 10,5 36 30-45 A

3 11C.1 Crater 9,0 30 10 A

Taulukko 3 (jatkoa) 11 Näyte Lämpöt. Johtokyky Erist. 5 Ryhmä Kanta Sijainti pH °C mS/cm alusta

3 wBl Bogoria e.t. e.t. e.t. A

3 12C.1 Crater 9,0 30 10 A

3 28N.1CT Nakuru 10,5 36 30-40 A

3 6 IN.4 Nakuru 10-10,5 29 40, 1 E

10 3 36E.3 Elmenteita e.t. e.t. e.t. K

3 40E.3 Elmenteita 10-10,5 23 13,9 M

3 65B.4 Bogoria e.t. e.t. 41,9 C

3 94LM.4 Little Magadi 9-9,5 81 35,0 L

3 19N.1 Nakuru 10,5 36 30-40 A

15 3 24B.1 Bogoria 10,5 36 45 A

3 21M.1 Magadi 11,0 36 100 A

3 29C.1 Crater 9,0 30 10 A

3 35E.2 Elmenteita e.t. e.t. e.t. I

3 37E.2 Elmenteita e.t. e.t. e.t. J

20 3 48E.3 Elmenteita 10,0 27 11,3 P

3 78LN.4 Little

Naivasha 8,5-9 30 1,2 G

3 73aC.4 Crater e.t. e.t. 10,2 D

3 75C.4 Crater e.t. e.t. e.t. H

25 3 73bC.4 Crater e.t. e.t. 10,2 D

3 74C.4 Crater e.t. e.t. 10,2 H

3 77LN.4 Little

Naivasha 8,5-9 30 1,2 F

3 wNl Nakuru e.t. e.t. e.t. A

30 3 49N.3 Nakuru 10-10,5 29 40,1 Q

3 44E.3 Elmenteita 10,0 27 13,9 O

3 58E.4 Elmenteita 10,0 27 11,3 G

3 57E.4 Elmenteita 10,0 27 11,3 C

4 wE5 Elmenteita e.t. e.t. e.t. A

35 4 wB4CT Bogoria e.t. e.t. e.t. A

4 wNkl Nakuru 10,5 e.t. 19 A

4 wEll Elmenteita 10,4 e.t. 13 A

4 wE12 Elmenteita 10,4 e.t. 13 A

Taulukko 3 (jatkoa) 12 Näyte Lämpöt. Johtokyky Erist. Ryhmä Kanta Sijainti pH °C mS/cm alusta

5 5 9B.1 Bogoria 10,5 36 45 A

5 16N.1 Nakuru 10,5 36 30-40 A

5 17N. 1CT Nakuru 10,5 36 30-40 A

5 22M.1 Magadi 11,0 36 100 A

6 18N.1 Nakuru 10,5 36 30-40 A

10 6 59E.4 Elmenteita 10,0 31-33 12,7 G

6 6 4B. 4CT Bogoria e.t. e.t. e.t. E

6 63N.4 Nakuru 9,0 e.t. e.t. C

6 53E.4 Elmenteita 10-10,5 23 13,9 G

92LM.4 Little Magadi 9-9,5 81 35,0 L

15 - wBn5 Bogoria 10,5 e.t. 19 A

Mikro-organismiryhmät saadaan analyysin avulla, joka on numeerisen taksonomian toimintaperiaatteiden mukainen, käyttäen SG/UPGMA-menetelmää (selvitys jäljempänä ja kuvio 20 1) .

e.t. = ei testattu

Eristysalustoille annetut kirjainkoodit viittaavat Liite 25 A:han.

Näytteiden käsittely: Alkalofiilisten bakteerien rikastaminen ja eristäminen 30 Hyvin monenlaisia rikastus- ja eristämismenetelmiä käytettiin. Jotkut menetelmistä oli suunniteltu spesifisesti alkalof iilisten bakteerien rikastamiseen ja eristämiseen, joilla esiintyy tunnusomaisia entsyymiaktiivisuustyyppejä alkalisessa pH:ssa. Muita yleisluonteisempia menetelmiä 35 käytettiin monen erityyppisen alkalofiilisen bakteerisen eristämiseksi. Joissakin tapauksissa otettiin huomioon järvissä vallitsevat erityisolosuhteet (Taulukko 2), kun kokeita suoritettiin bakteerien eristämiseksi.

13

Eri ravintoalustoja, joita käytettiin uusien alkalofUlisten bakteerien eristämiseen, merkitään tunnuksilla Alusta A - Alusta Q. Käytettyjen erityyppisten alustojen koostu-5 mukset esitetään Liite A:ssa.

Epäspesifisten alkaloflitisten organotrofisten bakteerien eristämiseksi soodajärvivesinäytteet tai niiden laimennukset levitettiin alkalisen ravintoagarin pinnalle, pH 10 -10 pH 10,5 (Alusta A). Konsistenssiltaan kiinteämmät näytteet, muta, sedimentti jne. suspendoitiin ensin alkaliseen ravin-toliemeen (Alusta A) ennen pintalevitystä alkaliselle ra-vintoagarille (Alusta A). Bakteereja viljeltiin lämpökaa-pissa, edullisesti 37°C:ssa. Joissakin tapauksissa näytteet 15 suspendoitiin alkaliseen ravintoliemeen (Alusta A), ja bakteereja viljeltiin ravistuksessa, edullisesti 37°C:ssa 2-3 päivän ajan ennen liemen pintalevitystä alkaliselle ravin-toagarille (Alusta A) bakteeripesäkkeiden eristämiseksi.

20 Tietyntyyppistä entsyymiaktiivisuutta ilmentävien alkalo- fiilisten bakteerien eristämiseksi näytteet levitettiin alkalisen ravintoagarin pinnalle, joka sisälsi spesifisiä substraatteja, kuten maitoalbumiinia tai kaseiinia tai oliiviöljyä. Joissakin tapauksissa näytteen sisältämiä bak-25 teereja voidaan rikastaa yhden päivän ajan tai useita viikkoja epäspesifisessä alkalisessa ravintoliemessä, kuten Alusta A:ssa, ennen liemen levittämistä alkaliselle ravin-toagarille bakteerien osoittamista varten, jotka ilmentävät entsyymiaktiivisuutta, kuten lipolyyttistä tai proteolyyt-30 tistä aktiivisuutta.

Taksonominen analyysi

Seitsemänkymmentä bakterikantaa, jotka oli eristetty alka-35 lisistä järvistä ja niiden ympäriltä, sijoitettiin gram-negatiivisina bakteereina tunnettuun bakteeriryhmään, perustuen (1) Dussault'in muunnokseen Gram'in värjäysreak-tiosta (Dussault, H.P., (1955), J. Bacteriol., 1Q_, 484- 14 485); (2) KOH-herkkyyskokeeseen (Gregersen, T., (1978),

Eur. J. Appi. Microbiol, and Biotech. _5, 123-127; Halebian, S. et. ad., (1981), J. Clin. Microbiol., 13_, 444-448); (3) aminopeptidaasireaktioon (Cerny, G., (1976), Eur. J. Appi.

5 Microbiol., 3_, 223-225; samassa julkaisussa, (1978), _5, 113-122); ja monissa tapauksissa varmistuksen perustuessa myös (4) kinonianalyysiin (Collins, M.D. & Jones, D., (1981), Microbiol. Rev., _45_, 316-354), käyttäen menetelmää, jota Collins, M.D. on kuvaillut julkaisussa Chemical Met-10 hods in Bacterial Systematics (edit. M. Goodfellow & D. Minnikin) ss. 267-288, Academic Press, Lontoo, 1985.

Seitsemästäkymmenestä kannasta testattiin 104 ominaisuutta. Tulokset analysoitiin käyttäen numeerisen taksonomian toi-15 mintaperiaatteita (Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., julkaisussa Numerical Taxonomy, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1973). Testatut ominaisuudet ja niiden testaustavat on koottu Liite B:hen. Liite C:ssä ilmoitetaan lisäksi, kuinka kukin ominaisuus kooditettiin taksonomista analyysiä var-20 ten.

Koska keksijöiden tiedossa ei ole yhtään hyvin dokumentoitua, täysin tai ehdottoman ei-fototrofista, alkalofiilistä gram-negatiivista eubakteeria, samaan analyysiin otettiin 25 kontrolleiksi 20 tunnettua gram-negatiivista bakteeria käsittävä vaihteleva joukko, käyttäen muunneltuja pH-olo-suhteita. Nämä 20 tunnettua vertailubakteeria esitetään taulukossa 4, josta on nähtävissä, että useimmissa tapauksissa on käytetty tunnetun lajin tyypillistä "mallikantaa". 30

Taulukko 4

Gram-negatiiviset ei-alkalofiiliset vertailukannat * 35 (C.t.) Comamonas terrigena1 NCIMB 8193 (P.p.) Pseudomonas putidaT NCIMB 9494 (P.s.) Pseudomonas stutzeri1 NCIMB 11358 (A.t.) "Alcaligenes tolerans" Leicesterin yliopiston kanta 15 (V.c.) Vibrio costicola1 NCIMB 701 (P.a.) Providencia alcalifaciens1 NCTC 10286 (P.v.) Proteus vulgaris1” ATCC 13315 (M.v.) Moellerella wisconsensis1 NCTC 12132 5 (E.t.) Edwardsiella tardaT NCTC 10396 (A.h.) Aeromonas hydrophila1 NCTC 8049 (A.s.) Aeromonas sp. S5 Leicesterin yliopiston kanta (F.a.) Flavobacterium aquatile1 NCIMB 8694 (E.c.) Escherichia coliT NCTC 9001 10 (E.a.) Enterobacter aerogenes1 NCTC 10006 (K.a.) Klebsiella pneumonia ATCC 15380 ("K. aerogenes") (H.a.) Hafnia alvei1 ATCC 13337 (C.f.) Citrobacter freundii1 NCTC 9750 (S.m.) Serratia marcescens1 NCTC 10211 15 (P.b.) Pseudomonas beijerinckii1 NCIMB 9041 (H.e.) Halomonas elongata1 ATCC 33173 * kuvioissa 1 ja 2 käytetty lyhenne T tarkoittaa "tyyppikantaa" 20 NT tarkoittaa "neotyyppikantaa"

Testitulosten analysointi

Taksonomisen samankaltaisuuden estimointi 25 Feneettiset tulokset, jotka käsittivät 104 yksikköominai-suutta, pisteytettiin kuten Liite C:ssä on esitetty, ja esitetään "n x t"-matriisimuodossa, jonka t-sarakkeet tarkoittavat t bakteerikantoja, ryhmitettäväksi samankaltaisuuksien perusteella, ja jonka n-rivit ovat yksikköominai-30 suuksia. Bakteerikantojen taksonominen samankaltaisuus arvioitiin yhtäläisyyskertoimen avulla (Sneath, P.H.A. ja So-kal, R.R., Numerical Taxonomy, edellä, ss. 114-187) . Vaikka monia erilaisia kertoimia on käytetty biologisessa luokittelussa, vain muutamalle kertoimelle on löytynyt käyttöä 35 bakteriologiassa. Keksinnön mukaisesti on valittu kahden assosiaatiokertoimen käyttäminen (Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., samassa julkaisussa, s. 129 ja seuraavat sivut), nimittäin, Gower'in ja Jaccard'in kertoimet. Näitä on usein 16 käytetty bakteriologisten tulosten analysointiin, ja niillä on laaja hyväksyntä alaa tuntevien keskuudessa, koska niiden on osoitettu johtavan vakaisiin luokitteluihin.

5 Kooditetut tulokset analysoitiin käyttäen TAXPAK-ohjelma-pakkausta (Sackin, M.J., "Programmes for classification and identification". Methods in Microbiology, volyymi 1_9 (edit. R.R. Colwell ja R. Grigorova), ss. 459-494, Academic Press, Lontoo, (1987)), ajon tapahtuessa DEC VAX -tietokoneella 10 Leicester'in yliopistossa, Iso-Britanniassa.

Yhtäläisyysmatriisi konstruoitiin kaikille kantapareille, käyttäen Gower'in kerrointa (SG), sallien mahdollisuus negatiivisiin yhteensopivuuksiin (Sneath, P.H.A. ja Sokal, 15 R.R., edellä, ss. 135-136), käyttämällä RTBNSIM-ohjelmaa TAXPAK:issa. Ensisijaiseksi analyysivälineeksi, ja sellaiseksi, johon useimmat tässä esitetyt argumentit perustuvat, valittiin Gower'in kerroin muiden kertoimien edelle, yhtä-läisyysmatriisien muodostamiseksi, koska se on käyttökel-20 poinen kaikentyyppisiin ominaisuuksiin tai tuloksiin, nimittäin, kaksitilaisiin, monitilaisiin (järjestettyihin ja kvalitatiivisiin) ja kvantitatiivisiin.

Yhtäläisyysmatriisin ryhmäanalyysi toteutettiin käyttämällä 25 aritmeettisiin keskiarvoihin perustuvaa, painottamatonta pariryhmämenetelmä (UPGMA) -algoritmiä, joka tunnetaan myös nimellä painottamaton keskiarvokytkentämenetelmä, ajamalla SMATCLST-aliohjelmaa TAXPAKrissa.

30 Ryhmäanalyysin tuloksena on dendrogrammi, jonka pelkistetty versio esitetään kuviossa 1. Dendrogrammi kuvaa yhtäläi-syystasoja bakteerikantojen välillä. Dendrogrammi saadaan käyttäen DENDGR-ohjelmaa TAXPAK:ssa.

35 Feneettiset tulokset, joissa jätetään pois monitilaiset ominaisuudet (ominaisuudet 1-5, 11 ja 12; Liite C) , ja jotka siten sisältävät 193 yksikköomionaisuutta ja pisteytetään binäärijärjestelmänä (positiivinen = 1, negatiivinen = 17 0), analysoitiin uudelleen käyttäen Jaccard'in kerrointa (Sj) (Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., edellä, s. 131), ajamalla RTBNSIM-ohjelmaa TAXPAKrissa. Lisädendrogrammi saatiin käyttämällä SMATCLST:tä UPGMA-optiolla ja DENDGR-ali-5 ohjelmia TAXPAKrissa. Pelkistetty versio tästä dendrogram-mista kuvataan kuviossa 2. Liite E:ssä esitetään ominaisuuksien positiivisten tilojen prosenttiosuus kussakin ryhmässä .

10 Ryhmäanalyysin tulokset SG/UPGMA-menetelmä

Kuvio 1 esittää ryhmäanalyysin tuloksia, jotka perustuvat Gower'in kertoimeen ja UPGMA-menetelmään, koskien 70:tä 15 uutta gram-negatiivista alkalofiilistä bakteeria, jotka on eristetty aikalisistä järvistä ja niiden ympäriltä, yhdessä 20:n tunnetun gram-negatiivisen bakteerin kanssa.

Kuusi luonnollista ryhmää eli fenonia muodostetaan alkalo-20 fiilisistä bakteereista, jotka sisältävät 65 kantaa 70:stä alkalofiilisestä kannasta, 73 %:n yhtäläisyystasolla. Vaikka 73 %:n valinta Iinjaustasoksi voi vaikuttaa keinotekoiselta, se pysyy numeerisessa taksonomiassa käytössä olevan käytännön rajoissa (Austin, B. ja Priest, F., Modern Bacte-25 rial Taxonomy, s. 37; Van Nostrand Reinhold; Wokingham, U.K., (1986)). Linjausprosenttitason asettaminen alemmaksi yhdistäisi toisiinsa selvästi yhteydessä olevien organismien ryhmiä, kun taas korkeampi prosenttisuus saisi aikaan koko joukon vähemmän tarkkarajaisia ryhmiä. Tason ollessa 30 73 %, yksittäiset ryhmät voivat edustaa erillisiä baktee- risukuja. Ryhmittelyn merkitsevyyttä tällä tasolla tukevat sen lisäksi kemotaksonomiset tutkimustulokset (jäljempänä), ja ryhmäkuvio, joka saadaan käyttämällä Jaccard'in kerrointa (kuvio 2).

Ryhmityksen merkitsevyyttä 73 %:n tasolla tukevat TESTDEN-ohjelmalla saadut tulokset. Tämä ohjelma testaa kaikkien dikotomisten ryhmäparien tai niiden komplementin merkitse- 35 18 vyyttä (käsittäen 4 tai useampia kantoja) UPGMA:11a muodostetussa dendrogrammissa, jossa erilaisuusmittana on euklidisten etäisyyksien neliöt. Ohjelmassa oletetaan, että ryhmät ovat ylipallomaisia. Kriittiseksi peittotasoksi asetet-5 tiin 0,25 %. Kuten taulukosta 5 voidaan havaita, ryhmien erottuminen on erittäin merkitsevä.

Taulukko 5 SG/UPGMA-menetelmällä muodostettujen ryhmien merkitsevyys, 10 aikaansaatuna TESTDEN-ohjelmalla

Ryhmä eroaa Ryhmästä Merkitsevyystasolla 1 2 p = 0,99 15 1+2 3+4 p = 0,99 1+2+3+4 5+6 p < 0,90 1+2+3+4+5+6 kontrollit p = 0,99 5 6 p = 0,99 20

Ryhmien erottamisen mitta voidaan lisäksi estimoida ryhmien peittävyyden todennäköisyydestä. Tämä saatiin aikaan käyttäen OVERMAT-ohjelmaa TAXPAK:issa kriittisen peittoasetuk-sen ollessa 2,5 %. Kuten taulukosta 6 voidaan nähdä, ryhmi-25 en välillä on suurempi kuin 95 %:n todennäköisyys alle 2,5 %:n peitolle. Monen ryhmäyhdistelmän kohdalla peitto on tosiasiassa 0. Vain ryhmien 3 ja 4 todennäköisyys on alempi koskien < 2,5 %:n peittoa, mutta nämä ryhmät voidaan selvästi erottaa toisistaan kemotaksonomisten tulosten perus-30 teella (jäljempänä).

19

Taulukko 6

Todennäköisyysprosentti sille, että ryhmäpeittävyys on < 2,5 %

Ryhmä 1 2 3 4 5 6 5 1 2 95 3 99 95 4 95 95 90 5 99 >99 >99 >99 10 6 >99 >99 99 >99 >99

Kontrollit osoittavat odotusten mukaisesti, että ryhmäana-lyysi ryhmittää Enterobacteriaceae-heimon erilleen. Aero-monas- ja Pseudomonas-lajit, jotka ovat mukana kontrollei-15 na, ryhmittyvät lisäksi erillisesti. Tämä on täysin yhdenmukainen näiden organismien tämän hetkisen taksonomian kanssa (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, volyymi 1, Williams ja Wilkins, Baltimore/Lontoo, 1984).

20 Alkalofiilisistä kannoista viisi asettuu pääryhmien ulkopuolelle. Kaksi kantaa, 4E.1 ja 5E.1, muodostavat erillisen mutta läheisesti yhteen kuuluvan parin, ja liittyvät ilmeisesti yhteen alkalofiilisten bakteerien pääryhmien kanssa. Kanta wN2 on myös ryhmittämätön, mutta se liittyy ilmeises-25 ti läheisesti johonkin Pseudomonas-lajiin ja alkalofiilisten bakteerien pääfenoneihin. Kannat 92LM.4 ja wBn5 eivät liity alkalofiilisiin pääfenoneihin ja edustavat luultavasti erillisiä ryhmiä uusissa alkalofiilisissä bakteereissa.

30 Ryhmät 1 ja 2 ovat ainoat fenonit, jotka liittyvät läheisesti tunnettuihin organismeihin, so. Pseudomonas- ja Coma-monas-lajeihin. Pseudomonas putidan ja Pseudomonas stutze-rin erottaminen erillisiksi taksoneiksi pysyy täysin näiden organismien tämänhetkisen taksonomisen aseman puitteissa 35 (Palleroni, N.J. et ai., (1973), Int. J. Systematic Bacte-riol., 23, 333-339; Gavini, F. et ai., (1989), samassa julkaisussa, 3_9, 135-144; Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, edellä).

20

Alkuperäisen dendrogrammin perusteella oli selvää, että Pseudomonas stutzeri jää ryhmän 2 ulkopuolelle eikä ole läheisessä suhteessa ryhmän muihin jäseniin. Tämä todetaan, 5 kun kantojen euklidiset etäisyydet ryhmän sentroidista lasketaan ja niitä käytetään ryhmän säteen laskemiseksi (Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., edellä, ss. 194 ja seuraa-vat sivut). Ryhmän säde on 3,91 (99 %:n luotettavuustasol-la), ja kantojen keskimääräinen etäisyys sentroidista on 10 2,84 (keskihajonta 0,46). Pseudomonas stutzeri, etäisyy dellä 3,91 sentroidista, on selvästi juuri feneettisen yli-avaruuden rajalla, joka määrää ryhmä 2:n.

Selvä erottaminen ryhmien 1 ja 2 välillä on mahdollista 15 käyttäen minimimääräisten erottelutestien periaatetta (jäljempänä) .

Jokainen ryhmä 2:n alkalofiilisistä kannoista on tutkittu kahden riippumattoman laboratorion toimesta, jotka ovat 20 asiantuntijoita bakteerien identifioinnissa, nimittäin the German Culture Collection (DSM, Braunschweig, Saksa) ja the Laboratory for Microbiology, Delftin Teknillisessä Korkeakoulussa Hollannissa. Kumpikaan näistä laboratorioista ei kyennyt suorittamaan kantojen positiivista identifioin-25 tia, vaikka kumpikin oli samaa mieltä siitä, että Pseudo-monaksen kanssa oli samankaltaisuutta, sijoittaen ne joko RNA-homologia ryhmään I (Palleroni, N.J. et ad., edellä) tai erityisemmin Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcali-genes tai Pseudomonas pseudoalcaligenes-ryhmiin (Gavini, F. 30 et ad., edellä) . Yhtään Pseudomonas-lajia ei kuitenkaan tunneta, jotka kykenevät kasvamaan samoissa voimakkaasti aikalisissä olosuhteissa (pH 10) kuin tässä kuvaillut uudet kannat. Pseudomonas pseudoalcaligenesT:tä DSM 50188 ja Pseudomonas alcaligenes1:tä DSM 50342 yritettiin viljellä 35 alkalisessa liemialustassa (Alusta A, Liite A) mutta onnistumatta .

21 Näiltä asiantuntijoilta saadut tulokset, yhdessä tässä kuvailtujen löydösten kanssa, osoittavat selvästi, että nämä alkalofiiliset kannat ryhmissä 1 ja 2 edustavat uusia bak-teerilajeja.

5

Ryhmät 3, 4, 5 ja 6 ovat epäjatkuvia fenoneja, jotka erotetaan toisistaan minimimääräisten erottelutestien (jäljempänä) ja kemotaksonomisten markkereiden (jäljempänä) perusteella. Näillä fenoneilla ei esiinny merkitsevää yhtäläi-10 syyttä tunnettujen bakteeriryhmien suhteen, ja ne edustavat siten uusia sukuja tai lajeja.

PAGE-elektroforeesin avulla saadut kokosoluproteiinikuviot osoittavat, että muutamat kannat ovat todennäköisesti 15 identtisiä. Esimerkkejä ovat: 1E.1CT ja 2E.1; 6B.1, 7B.1 ja 8B.1; 45E.3CT ja 47E.3. Dendrogrammi osoittaa, että näillä kannoilla on yhteisenä keskimääräinen SG-arvo 92,3 %, mikä antaa todennäköiseksi koevirheeksi 3,8 % (Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., edellä). Kannoilla 73bC.4 ja 74C.4, jotka 20 näyttävät kuuluvan läheisesti yhteen (90 % SG) , on samankaltaiset mutta ei identtiset geelikuviot.

Sj/UPGMA-menetelmä 25 Jaccard'in kerroin on käyttökelpoinen lisäväline Gower'in kertoimelle, koska sitä voidaan käyttää fenonien ilmaisemiseksi jälkimmäisessä, jotka on muodostettu negatiivisten yhteensopivuuksien ja vääristymien avulla, johtuen tarpeettomasta painotuksesta, joka on asetettu potentiaalisesti 30 subjektiivisiin kvalitatiivisiin tuloksiin. Jaccard'in kerroin on siis käyttökelpoinen alunperin Gower'in kerrointa käyttäen määriteltyjen ryhmien oikeellisuuden varmistamiseksi. Jaccard'in kerroin on erityisen käyttökelpoinen vertailtaessa biokemiallisesti reaktiokyvyttömiä organisme-35 ja (Austin, B. ja Priest, F.G., edellä, s. 37).

Pääasiassa kaikki So/UPONlA-menetelmällä muodostetut ryhmät löydetään Sj/UPGMA-menetelmän avulla muodostetusta dendro- 22 grammista (kuvio 2). Vaikka ryhmien kokoonpano on käytännöllisesti katsoen identtinen kummassakin dendrogrammissa, jotkut kannat ovat vaihtaneet paikkaa. Ryhmittämättömät kannat 4E.1 ja 5E.1 siirtyvät ryhmään 1/5, kannat 42E.3 ja 5 50N.3 siirtyvät ryhmästä 2 ryhmään 3/4. Kannoista wNk2,

Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, wE5 tulee ryhmit-tämättömiä.

Odotusten mukaisesti Sj-transformaatio (-muuunnos) yhdistää 10 (SG) ryhmät 1 ja 5. Kummallekin näistä ryhmistä on tunnusomaista se, että ne käsittävät biokemiallisesti melko reak-tiokyvyttömiä kantoja. Ryhmät 1 ja 5 ovat kuitenkin selvästi erottuvat. Ryhmään 1 kuuluu kantoja, jotka muodostavat kermaisia/beigevärisiä, pyöreitä pesäkkeitä, kun taas ryh-15 mään 5 kuuluvat kannat muodostavat yksinomaan kirkkaan keltaisia, epäsäännöllisiä pesäkkeitä.

Sj-transformaatio ryhmittää sen lisäksi useimmat ryhmä 4:n kannat yhteen ryhmä 3:n kantojen kanssa. Kemotaksonomisten 20 tulosten pohjalta (jäljempänä), jotka osoittavat, että ryhmä 4:n kannat sisältävät Q9:n ja ryhmä 3:n kannat sisältävät pääasiassa Q6:n, on kuitenkin ilmeistä, että näitä ryhmiä ei tulisi yhdistää, koska ne sisältävät selvästi erilaisia kantoja. Näistä syistä johtuen ollaan sitä miel-25 tä, että SG/UPGMA-menetelmän avulla muodostettu ryhmittely on parempi esitys näiden kantojen todellisesta taksonomisesta asemasta. Sj/UPGMA-menetelmä toimii kuitenkin painottamalla sitä, että yksikään tunnetuista kannoista, ei edes Pseudomonas-kontroilikannat, ei ole merkitsevästi samankal-30 täinen uusien alkalofiilisten bakteeriryhmien kanssa, yhtä Comamonas-lajipoikkeusta lukuun ottamatta.

Ryhmien kemotaksonominen määrittely 35 Kemotaksonomia on organismien kemiallisten koostumusten tutkimista liittyen niiden systematiikkaan. Esimerkiksi kromosomaalisen DNA:n, ribosomaalisen RNA:n, proteiinien, soluseinien ja -membraanien analysointi voi antaa arvok- 23 kaita käsityksiä taksonomisista sukulaisuussuhteista, ja sitä voidaan käyttää lisävälineenä mikro-organismien taksonomioiden konstruoimiseksi tai varmistamiseksi (Goodfellow, M. ja Minnikin, D.E., Chemical Methods in Bacterial Syste-5 matics, (edit. Goodfellow, M. ja Minnikin, D.E.), Academic Press, Lontoo ja Orlando, FL, (1985), ss. 1-15). Ei kuitenkaan aina ole mahdollista valita ennalta, minkä tyyppinen kemiallinen informaatio on eniten diagnosoiva tietyn luokittelun kannalta. Amfipaattisilla polaarisilla lipideillä, 10 tärkeimmillä hengityskinoneilla, bakteerimembraaneissa sijaitsevilla rasvahapoilla ja kromosomaalisen DNA:n analysoinnilla on kaikilla taksonomista merkitsevyyttä eri bakteerien luokittelussa (Lechevalier, H. ja Lechevalier, M.P., Microbial Lipids, volyymi 1 (edit. Ratledge, C. ja 15 Wilkinson, S.G.), Academic Press, Lontoo ja San Diego, CA, (1988), ss. 869-902).

Polaariset lipidit 20 Polaaristen lipidien uuttaminen bakteereista ja niiden analysoiminen kaksiulotteisen ohutlevykromatografiän avulla (2D-TLC) voi tuottaa diagnostisesti arvokkaita kuvioita. Stationäärisen vaiheen soluja uutettiin 1:1 (tilavuus/tila-vuus) CHCI3:CH3OH: 11a ja tutkittiin 2D-TLC:n avulla kuten 25 Ross, H.N.H., Grant, W.D. ja Harris, J.E. ovat kuvailleet, Chemical Methods in Bacterial Systematics, (edit. Goodfellow, M. ja Minnikin, D.E.), Academic Press, Lontoo ja Orlando, FL (1985), ss. 289-300. Lipidityypit kromatogram-meissa tehtiin näkyviksi käyttäen useita erilaisia vali-30 koivia värejä (Ross, H.N.M., el: a_L., edellä, s. 291; ja

Trincone, A., et. ad., J. Gen. Microbiol., (1990), 136, ss. 2327-2331). Komponenttien aitous varmistettiin kromatogra-foimalla rinnakkain tunnettujen lipidien kanssa.

35 Tämän analysoinnin tulokset gram-negatiivisia alkalofiilejä edustavilla kannoilla esitetään taulukossa 7. Näissä ei esiinny selvää polaaristen lipidien kuviota, joka olisi selvästi erottuva jollekin ryhmistä. Kaikki kannat sisältä- 24 vät fosfatidyyliglyserolia, difosfatidyyliglyserolia, fos-fatidyyliglyserolifosfaattia ja fosfatidyylietanoliamiinia. Tietyt kannat, erityisesti ryhmässä 3, sisältävät lisäksi fosfatidyyliglyserolisulfaattia (PGS). PGS:n jakaantuminen 5 ryhmän 3 sisällä sopii suurin piirtein yhteen ryhmän arvellun alarakenteen kanssa, joka käy selvästi ilmi feneetti-sistä ja muista kemotaksonomisista tuloksista. PGS ei ole sen vuoksi valikoiva ryhmä 3:n osalta.

10 Odottamatta tehtiin havainto, että suurin osa bakteereista sisälsi glykolipidin, joka lukuisten rinnakkain suoritettujen kromatografisten analyysien perusteella näytti yhteiseltä tämän keksinnön mukaisten gram-negatiivisten bakteerien glykolipidin kanssa. Alkalofiilisissä bakteereissa ei 15 aikaisemmin ole osoitettu olevan läsnä glykolipidejä (Krul-wich, T.A. et a.L., CRC Critical Reviews in Microbiology, (1988), 1_6, 15-36). Sitä paitsi, useasta kannasta saatujen lipidien rinnakkaiskromatografoinnista päätellen, glykoli-pidi tavataan myös gram-positiivisista, soodajärvistä eris-20 tetyistä alkalofiileistä. Sen vuoksi on mahdollista, että glykolipidin kemiallinen rakenne voi olla kemotaksonominen markkeri obligaateille alkalofiileille.

Taulukko 7 25 Gram-negatiivisten alkalofiilisten bakteerien polaariset lipi-dikomponentit

Ryhmä Kanta_PG PPG PGP PE PGS GL AL UPL

IE. 1CT + + + + 30 2E. 1 + + + + + 1 1 OB. 1 + + + + 3 + 20N.1 + + + + + 27M.1 + + + + wNk .2 + + + + + 35 _ _ _ ____ ' : + + + + + 4 IE. 3 + + + + + 45E. 3CT + + + + + 25 2 5 IN.3 + + + + + 52N.3 + + + + + 42E.3 + + + + + 5 ON.3 ++ + + + 5 P. s. ++ + -5E.1 ++ + ++ + + 6B.1 ++++ + 10 7B.1 ++ + + + 8B.1 ++++ + 25B.1 + + + + + 26B.1 ++++ + 12C.1 + + + + + + 15 3 28N.1CT ++ + + + 36E.2 + + + + + + 40E.3 ++ + ++ + 94LM.4 ++ + ++ + 19N.1 ++++ + 20 24B.1 ++ + + + 21M.1 ++++ + 29C.1 +++++ 35E.2 + + + + + 3 7E .2 + + + + + + 25 48E.3 + + + + + + 73aC. 4 + + + + + + 74C.4 ++ + ++ + 49E.3 ++ + ++ + 44E.3 ++ + ++ + 30 58E.4 ++ + + + wE5 + + + + + wB4CT ++ + + 4 wNkl ++ + + + + 35 wEl1 ++++ ++ wE12 ++++ + 9B.1 ++ + + 26 5 16N.1 + + + + 17N. 1CT ++ + + + 22M.1 ++ + + 5 18N.1 ++++ + 59E.4 ++ + + 6 6 4B. 4CT ++ + + 63N.4 ++++ + 53E.4 ++++ + 10______ _ _ _ _ (PG) fosfatidyyliglyseroli; (DPG) difosfatidyyliglyseroli; (PGP) fosfatidyyliglyserolifosfaatti; (PE) fosfatidyylietanoliamiini; 15 (PGS) fosfatidyyliglyserolisulfaatti; (GL) tunnistamaton glykolipidi (glykolipidejä), α-naftolipositiivinen (sarakkeessa oleva numero ilmaisee positiivisten täplien määrän TLC-levyssä); (AL) tunnistamaton aminolipidi (ninhydriinipositiivinen); 20 (UPL) tunnistamaton fosfolipidi (fosfolipidejä).

Isoprenoidikinonit

Isoprenoidikinonit eli hengityskinonit ovat aerobisten bak-25 teerien plasmamembraanin tunnusomaisia komponentteja. Tyyppejä on kahdenlaisia; menakinonit ja ubikinonit. Isoprenoidikinonien merkitys taksonomisina tunnusmerkkeinä perustuu polyprenyyli-sivuketjun pituuden ja tyydyttyneisyysasteeseen vaihteluun (Collins, M.D. ja Jones, D. (1981), edellä).

30

Pakastekuivattuja stationäärivaiheen bakteerisoluja uutettiin, käyttäen Collins, M.D.'n modifioimaa menetelmää, Chemical Methods in Bacterial Systematics, edellä, ss. 267-284, 1:1 (tila- vuus/tilavuus) CHCI3 :CH30H:ssa 50°C:ssa 16 tunnin ajan. Kinoneja 35 tutkittiin käänteisfaasiohutlevykromatografiän avulla, jota Collins, M.D. on kuvaillut (edellä).

27

Kinonianalyysien tulokset miltei kaikista gram-negatiivisista alkalofiilikannoista esitetään taulukossa 8. Kaikki testatut kannat sisälsivät yksinomaan ubikinoneja, mikä vahvistaa niiden asemaa gram-negatiivisina bakteereina (Collins, M.D. ja Jones, 5 D., edellä). Taulukossa 8 esitetään täysin selvästi, että pää asialliset ubikinonit ovat Q6 ja Q9. On myös selvää, että Q6:n sisältävät kannat kuuluvat yksinomaan ryhmä 3:een, ja että tämä erottaa ryhmä 3:n kaikista muista ryhmistä, koska ne sisältävät kantoja, joissa Q9 on pääasiallinen ubikinoni.

10 28

Taulukko 8

Kantojen tärkeimmät hengityskinonit järjestettyinä ryhmittäin 5 Ryhmä 1 Ryhmä 2 Ryhmä 3

Kanta 0 Kanta 0 Kanta 0 IE. 1CT Q9 39E.3 Q9 6B.1 Q6 2E.1 Q9 4IE.3 Q9 7B.1 Q6, Q9 wE>2 Q9 45E. 3CT Q9 8B.1 Q6, Q9 10 wB5 Q9 47E.3 Q9, Q10 38E.2 Q6 wBs 4 Q9 52N.3 Q9 56E.4 Q6 10B.1 Q9 42E.4 Q9 25B.1 Q6, Q9 20N.1 Q9 50N.3 Q9 26N.1 Q6 27M.1 Q9 12C.1 Q6 15 C.T.* [Q8+Q9 (t) ] 28N.1CT Q6 wNk2 Q9 6 IN.4 Q6 P.p.* [Q9] 36E.2 Q6 40E.3 Q6, Q9 65B.4 Q6 20 94LM.4 Q6, Q9 19N.1 Q6, Q9 24B.1 Q6, Q9 21M.1 Q6 29C.1 Q6 2 5 3 5E.2 Q6 37E.2 Q6 48E.3 Q6 78LN.4 Q6 73aC.4 Q6 30 75C.4 Q6 73bC.4 Q6 74C.4 Q6, Q9 77LN.4 Q6 49E.3 Q6 35 58E.4 Q6 57E.4 Q6 29

Taulukko 8 (jatkoa)

Ryhmä 4 Ryhmä 5 Ryhmä 6 Ryhmätön

Kanta 0 _Kanta 0 _Kanta 0 Kanta 0 5 wE5 Q9 9B.1 Q9 18N.1 Q9 wN.2 Q9 wB4CT Q9 16N.1 Q9 59E.4 Q9 5E.1 Q8 wNkl Q9 17N. 1CT Q9,Q10 64B.4CT Q9 92LM.4 Q9 wEl1 Q9,Q10(t) 22M.1 Q9 63N.4 Q9 wBn5 Q8,Q9(t) wW12 Q9 22M.1 Q9 53N.4 Q9 10 _ _ _ _ _ _ Q = Ubikinoni, numero osoittaa sivuketjun isopreeniyksik-köjen lukumäärän.

15 (t) = jälkiä *C.t. = Comamonas terrigenaT NCIMB 8193, kinonitulos saadaan julkaisusta J. Tamaoka et ai., International Journal of Systematic Bacteriology, 3_7, 52-59, (1987).

20 P.p. = Pseudomonas putidaT NCIMB 9494, kinonitulos saadaan julkaisusta M.D. Collins ja D. Jones, Microbiological Reviews, 45, 316-354, (1981) .

25 Rasvahapot

Rasvahappoprofiilien analysoinnilla on ollut merkittävä vaikutus bakteerien luokitteluun, erityisesti rajoittuen sukuihin ja lajeihin gram-positiivisilla bakteereilla ja 30 sädesienillä (Kroppenstedt, R.M., Chemical Methods in Bacterial Systematics (edit. M. Goodfellow ja D.E. Minnikin), Academic Press; Lontoo ja Orlando, FL, (1985), ss. 173-199); Lechevalier, H. ja Lechevalier, M.P., edellä.

35 Pakastekuivattuja stationäärivaiheen soluja (200-300 mg) uutettiin 16 tunnin ajan 75°C:ssa tolueeni:metanoli:väk. rikkihapossa (2,5 ml:2,5 ml:0,2 ml), ja jäähdytyksen jälkeen lipidit erotettiin heksaaniin (kahdesti 1 ml). Jään- 30 nöshappo poistettiin käyttäen NH4HCC>3:a. Lipidiuutteet vä-kevöitiin 02-vapaassa N2-atmosfäärissä, liuotettiin 300 pl:aan heksaania ja sijoitettiin preparatiivisille piihap-pogeelilevyille (Merck F254, tyyppi T). Levyt kehitettiin 5 heksaani:dietyylieetterissä 85:15 (tilavuus/tilavuus), ja rasvahapon metyyliesterit kaavittiin pois, uutettiin hek-saanin kanssa ja väkevöitiin 02-vapaassa N2-virrassa.

Rasvahapon metyyliesterit liuotettiin heptaaniin ja analy-10 soitiin kaasukromatografoimalla käyttäen Packard'in malli 439 -kromatografia, joka oli varustettu liekki-ioni saatio-detektoreilla. Näytteet jaettiin näytejakajan avulla ja analysoitiin samanaikaisesti kahdella kolonnilla, so., CP-SIL-88 (Chrompack) (pituus 50 metriä, sisähalkaisija 0,22 15 mm) ja Ultra-2 (Hewlett/Packard) (pituus 50 metriä, sisähalkaisi ja 0,20 mm). Kantajakaasuna oli typpi; injektioläm-pötila 120°C; lämpötilagradientti 2,5°C/minuutti 240°C:seen, ja isotermisesti 240°C:ssa 30 minuutin ajan. Rasvahappome-tyyliesterit osoitettiin vertaamalla tunnettuihin standar-20 diseoksiin. Joidenkin piikkien identtisyys varmistettiin kaasukromatografia-massaspektrometrian avulla käyttäen Carlo Erba HRGC 5160 Mega-sarjan kaasukromatografia, joka oli varustettu CP-SIL-88-kolonnilla (pituus 50 metriä, sisähalkaisi ja 0,22 mm) heliumin toimiessa kantajakaasuna, ja suo-25 ralla injektiolla AMD 403 -massaspektrometrin lähteeseen.

Rasvahappokoostumukset gram-negatiivisia bakteereja edustavilla yksittäisillä bakteereilla esitetään taulukossa 9. Taulukossa 10 esitetään kullekin ryhmälle tunnusomaiset 30 rasvahappoprofiilit. Ryhmät 1, 2, 3 ja 4 ovat melko tyypil listä gram-negatiivisten bakteerien enemmistöä, joissa pääasiallinen tyydyttynyt rasvahappo on C16:0, käsittäen vähemmän C14:0- ja C18:0-muotoja. Tärkeimmät tyydyttymättömät rasvahapot näissä alkalofiilisissä bakteereissa ovat C16:0-35 ja C18:l (11-cis)-muotoja, mikä myös on tyypillistä, samoin kuin parittomien rasvahappojen puuttuminen (Wilkinson, S.

G., julkaisussa Microbial Lipids, volyymi 1 (edit. Rat-ledge, C. ja Wilkinson, S. G.), Academic Press, Lontoo ja 31

San Diego, CA, (1988), ss. 299-488). Vähäisiä määriä C17:0-ja Cl9:O-syklopropaanihappoja tavataan gram-negatiivisten bakteerien joissakin kannoissa. Ryhmä 3:n kannoilla on melko yksinkertaiset rasvahappoprofiilit, C16:0- ja C18:0-5 muotojen vastatessa 67-88 % kaikista hapoista, ja C16:0 sekä C18:0-muotojen 20 %:tiin saakka lopuista hapoista. Siinäkin tapauksessa rasvahappokuviot tukevat käsitystä, että ryhmä 3 sisältää useita alaryhmiä, päätelmä, joka on myös johdettavissa feneettisistä (numeerinen taksonomia) ja po-10 laaristen lipidien analyyseistä (taulukko 7).

Ryhmään 1 kuuluvat kannat voidaan erottaa ryhmään 2 kuuluvista kannoista suoraketjuisten tyydyttyneiden ja tyydytty-mättömien rasvahappojen keskinäisen runsauden perusteella, 15 samoin kuin C18:l (11-cis)-prosenttimäärien perusteella. Ryhmä l:n ja 2:n sisältämien alkalofiilisten bakteerien rasvahappoprofiilit ovat monimutkaisemmat kuin ryhmä 3:n vastaavilla bakteereilla, käsittäen paljon enemmän pieni-määräisiä komponentteja. Numeerisen taksonomian aineiston 20 pohjalta, ryhmä l:n ja 2:n alkalofiiliset kannat ovat jonkin verran samankaltaisia kuin Pseudomonas-lajit. Kuitenkin se, että useimmille Pseudomonas-lajeilie ominaiset hydrok-sirasvahapot puuttuvat kokonaan, osoittaa edelleen, että läheinen sukulaisuussuhde on kyseenalainen.

25

Ryhmiin 5 ja 6 kuuluvat kannat ovat harvinaisia paitsi siksi, että ne sisältävät huomattavan määrän C16:0-muotoa, muut merkittävät rasvahapot ovat parittomia haaraketjuisia happoja (40-85 %). Näistä kannoista puuttuvat myös merkit-30 tävät määrät C18:0-muotoa tai muita tyydyttymättömiä happoja, joita on läsnä tuntuvia määriä ryhmiin 1, 2, 3 ja 4 kuuluvissa alkalofiilisissä kannoissa. C15:0 ja C17:0 isoja anteisohappojen läsnäolo suurina määrinä on tunnusomaista vain hyvin harvalle gram-negatiivibakteeriryhmälle, 35 varsinkin lajeille, jotka ovat eksoottisista ympäristöistä, kuten Thermus, tai heikosti kehittyneille taksoneille, kuten Flavobacterium (Wilkinson, S.G., edellä). Tämä tulos tähdentää edelleen tämän keksinnön mukaisten alkalofiilis- 32 ten kantojen uutuutta. Ryhmiin 5 ja 6 kuuluvat kannat voidaan erottaa toisistaan niiden sisältämien haaraketjuisten rasvahappojen suhteellisten osuuksien avulla, ja erityisemmin parillisten tai parittomien rasvahappojen suhteellisten 5 osuuksien avulla.

Taulukko 9

Gram-negatiivisten alkalofiilien rasvahappokoostumus+

Ryhmä —> 1 2 10 _ _ _ _ _ _ _ : .-'vim : 1E.1CT 2E. 1 45E.3CT 50E.3 10:1 12:0 t t 3,6 4,7 15 12:1 0,2 0,3 13:0 <0,1 14:0 0,7 0,7 3,8 3,9 14:0 iso 14:1 2,6 0,9 20 15:0 0,3 0,6 0,9 15:0 iso 0,1 0,2 15:0 anteiso < 0,1 0,3 15:0 syklo 16:0 29,0 32,0 28,5 34,4 25 16:0 iso 0,3 0,2 16:1 7, 4 9,6 4, 1 4,3 17:0 0,5 2,3 0, 9 1,1 17:0 iso 0,2 0,6 17:0 anteiso 30 17:0 syklo 0,4a 1,8 17:1 0,3 1,6 17 :1 br 1,7 18:0 12,0 4,7 17,9 10,8 18:0 tuntematon 0,2 0,4 35 18:1 9-cis 0,2 t 0,5 0,3 18:1 9-trans 0,5 0,6 5,9 2,9 18:1 11-cis 42,0 44,0 23,9 24,1 18:1 tuntematon 0,2 0,3 33 18:2 0,5 1,9 19:0 0,1 19:0 syklo 1,3 19:1 br 5 20:0 0, 4 5,3 2,7 20:1 3,6 1,2 22:0 3,3 1,5 24:0 0,2 10 + = % kokonaisrasvahappoja t = jälkiä br = haarautunut a = C17:0 syklo tai C18:0 tuntematon 15

Taulukko 9 (jatkoa)

Ryhmä --> 3

Rasvahappo 25B.1 28N.1CT 36E.2 24B.1 37E.2 48E.3 20 10:1 0,4 12:0 0,5 0,5 0,3 t 12 :1 13 : 0 25 14:0 4,5 4, 4 3,4 2,6 2, 9 2,6 14:0 iso 14:1 0,1 15:0 0,70,6 0,9 0,3 15:0 iso 30 15:0 anteiso 15:0 syklo 16:0 37,3 24,1 42,0 36,7 33,3 26,0 16:0 iso 16:1 11,6 15,0 10,0 5,8 3,4 8,0 35 17:0 0,2 1,2 0,3 17:0 iso 17:0 anteiso 17:0 syklo 1,8 0,3 34 17:1 0,6 17:1 br 18:0 8,9 0,2 0,9 2,0 0,6 1,1 18:0 tuntematon 5 18:1 9-cis t t t 0,6 t 18:1 9-trans 2,4 0,2 t 1,0 0,6 0,6 18:1 11-cis 27,5 54,2 43,0 50,6 41,6 57,7 18:1 tuntematon 18:2 2,7 0,5 t t 10 19:0 19:0 syklo 0,4 12,9 2,0 19:1 br 20:0 2,4 20 :1 15 22:0 1,4 24:0 + = % kokonaisrasvahappoja 20 t = jälkiä br = haarautunut a = C17:0 syklo tai C18:0 tuntematon 35

Taulukko 9 (jatkoa)

Ryhmä --> 4 5

Rasvahappo WB4CT WE11 9B.1 16N.1 17N.1CT

5 10:0 0,5 12:0 0,9 0,2 12:1 0,8 13 : 0 14:0 3,8 1,3 3,2 1,9 1,2 10 14:0 iso 0,7 t t 14:1 0,1 15:0 0, 7 0,2 15:0 iso 8,7 9,3 8,2 15:0 anteiso 32,3 27,1 35,3 15 15:0 syklo < 0,1 16:0 26,8 26,9 22,5 17,4 12,5 16:0 iso 4, 7 5, 8 6,7 16:1 7,9 2,4 17:0 0,4 0,3 20 17:0 iso 0,3 3,2 6,0 5,1 17:0 anteiso 21,9 24,4 29,8 17:0 syklo 0,2 17:1 <0,1 17:1 br 25 18:0 5,2 3,5 2,3 5,3 1,2 18:0 tuntematon 18:1 9-cis t 2,5 18:1 9-trans 1,7 0,9 *0,5 *1,6 *1,0 18:1 11-cis 47,4 48,1 30 18:1 tuntematon 18:2 1,0 0,3 19:0 19:0 syklo 1,0 19:1 br 11,2 35 20:0 1,3 0,4 20:1 0,3 22:0 0,8 0,2 24:0 40 4 = sisältää kaikki Cl8:1-isomeerit + = % kokonaisrasvahappoja t = jälkiä br = haarautunut 45 a = C17:0 syklo tai C18:0 tuntematon 36

Taulukko 9 (jatkoa)

Ryhmä --> 6 ryhmittämätön

Rasvahappo 59E.4 64B.4CT 5E.1 92LM.4 5 10:1 12 : 0 12 :1 13 : 0 14:0 3,9 6,4 3,8 1,5 10 14:0 iso 0,7 2,0 14 :1 15:0 t 3,8 t 15:0 iso 3,9 12,6 44,0 15:0 anteiso 24,8 18,1 9,9 15 15:0 syklo 16:0 26,3 40,5 74,7 18,7 16:0 iso 2, 4 3, 7 2,1 16:1 2,9 17:0 t 2,4 20 17:0 iso 0,6 1,7 15,7 17:0 anteiso 6,1 3,7 6,8 17:0 syklo 17 :1 17:1 br 25 18:0 16,2 4,8 2,6 1,5 18:0 tuntematon 5,9 18:1 9-cis 18:1 9-trans *5,7 *0,5 *10,0 18:1 11-cis 30 18:1 tuntematon 18:2 2,7 19:0 19:0 syklo 19:1 br 35 20:0 4,6 20:1 22:0 2,6 24:0 40 4 = sisältää kaikki Cl8:1-isomeerit + = % kokonaisrasvahappoja t = jälkiä br = haarautunut 45 a = C17:0 syklo tai C18:0 tuntematon 37

Taulukko 10

Gram-negatiivisten alkalofiiliryhmien rasvahappoprofiilit

Ryhmä

5 12 3A/B 3C

Vallitsevat rasva- C16:0 C16:0 C16:0 C16:0 hapot (> 10 %) C18:l 11-cis C18:0 C16:l C18:l 11-cis C18 :1 11-cis C18:l 11-cis 10 n-tyydyttynyt ~ 40 % 60-65 % 30-55 % ~ 40 % n-tyydyttymätön ~ 60 % = 33 % 45-70 % ~ 60 % iso < 1 % < 1 % 0% 0% anteiso 0% <1% 0% 0% 15 kaikkiaan haaraisia <1% <3% 0% 0% syklo 0 % < 5 % 0 % hiilimäärä parillinen > 95 % > 90 % > 99 % > 99 % hiilimäärä pariton <5% <10% <1% <1% 20 lisämarkkerit C17:0 syklo

Cl9:0 syklo Cl 7:1 br 25 br = haaroittunut 38

Taulukko 10 (jatkoa)

Ryhmä 5 3D 4 5 6

Vallitsevat rasva- C16:0 C16:0 C15:0 anteiso C15:0 br hapot (> 10 %) C18:l 11-cis C18:l 11-cis C16:0 C16:0

Cl 7 : 0 anteiso 10 n-tyydyttynyt 30-40 % 30-40 % 15-30 % 55-60 % n-tyydyttymätön 50-65 % 50-60 % < 2 % < 10 % iso 0% <1% -20% 10-20 % anteiso 0 % 0 % 50-65 % 20-30 % kaikkiaan haarainen 0 % 1-12 % > 70 % - 40 % 15 syklo 2-15 % <2% 0% 0% hiilimäärä parillinen > 80 % > 85 % 20-35 % 55-65 % hiilimäärä pariton < 20 % < 15 % 65-80 % 35-45 % 20 lisämarkkerit C17:0 syklo C19:0 syklo br = haaroittunut 39

Nukleiinihapot

Olennainen osa kaikessa taksonomisessa tutkimuksessa on geneettisen aineen, nukleiinihappojen, analysointi. Kromo-5 somaalisen DNA:n koostumukseen eivät vaikuta kasvuolo-suhteet, ja oikea analysointi voi kumota organismin taksonomisen aseman. Kromosomaalinen DNA voidaan analysoida määrittämällä yksittäisten kantojen emäskoostumus (G+C mooli-%) ja emässekvenssihomologia-asteet kantaparien välillä 10 DNA-DNA-reassosiaation (hybridisaation) avulla (Owen, R.J. ja Pitcher, D., Chemical Methods in Bacterial Systematics (edit. M. Goodfellow ja D.E. Minnikin), Academic Press, Lontoo ja Orlando, FL (1985), ss. 67-93).

15 DNA:n emäskoostumus

Guaniini + sytosiini-koostumus (G+C mooli-%) on vakio jonkin tietyn organismin kromosomaalisessa DNA:ssa. Läheisesti toisiinsa liittyvillä organismeilla on samankaltaiset 20 G+C-koostumukset. G+C-tuloksia on kuitenkin tulkittava riippumattomien taksonomisten tulosten yhteydessä, koska DNA-näytteiden samankaltainen G+C-mooliprosentti ei itsessään merkitse biologista sukulaisuutta.

25 DNA uutettiin eksponentiaaliseen vaiheeseen kasvatetuista soluista kloroformi:fenoli-menetelmällä ja saostettiin etanolilla. Emäskoostumus määritettiin lämpödenaturaatio-menetelmän avulla (Marmur, J. ja Doty, P. (1962), J. Mol. Biol., 3_, 585-594) Phillips'in malli PV8764 spektrofoto-30 metrillä lämpötilaohjelmoinnin kanssa. Toinen menetelmä käsitti HPLC-analyysin Beckman'in kultasysteemillä, käyttäen Beckman'in ultrapallomaista täytettä sisältävää ODS-kolonnia, ja 0,04 M kaliumdivetyfosfaattia + asetonitrii-liä (9 + 1, tilavuus/tilavuus) eluenttina, virtausnopeu-35 della 1,5 ml/min., sen jälkeen kun DNA on käsitelty nukle-aasi Pl:n ja alkalisen fosfataasin kanssa.

40 Näiden analyysien tulokset esitetään taulukossa 11. Alka-lofiilisten bakteerien G+C-mooliprosenttiarvot kattavat 30 mooliprosentin alueen (37,6 - 67,1 mooli-%). Ryhmien sisällä vaihtelu on kuitenkin vain 3-7 mooli-%, mikä edel-5 leen varmistaa sen, että ryhmän sisällä olevat kannat ovat läheisesti toisiinsa liittyviä.

Taulukko 11

Gram-negatiivisten alkalofiilisten bakteerien DNA:n emäs-10 koostumus G+C-mooli-%

Ryhmä Kanta HPLC TM

15 2E.1 55.2 1 wBs 4 51,2 20N.1 51,1 wNk2 53,0 20 2 42E.2 62,7 wBl 63,0 3 2 8N. 1CT 64,1 37E.2 67,1 2 5 wNl 6 4,8 wE5 58,5 wB4CT 65,3 4 wNk1 61,0 30 wEll 59,7 wE12 58,1 = 5 17N. I""1 50,0 22M.1 43,8 35 6 64B. 41"1 4TTÖ 53E.4 37,6 ei wN2 64,1 40 wBn5 54,6 DNA-DNA-hybridisaatio 45 Käytetty menetelmä oli pääpiirteittäin Crosa, J.H. et ad.'in käyttämä menetelmä (Int. J. Systematic Bacteriol., 29, 328-332, 1979). Tritiumilla leimattua DNA:ta valmistettiin käyttäen katkoluentapakkausta (Amersham, N5000) 50 valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pariuttamisseoksia inku- 41 boitiin 65°C:ssa 16 tunnin ajan. Tulokset esitetään taulukossa 12, josta voidaan nähdä, että DNA-sekvenssihomolo-gian aste on korkeampi ryhmien sisällä kuin ryhmien välillä.

5

Taulukko 12

Ryhmien sisäiset ja ryhmien väliset DNA-DNA-homologia-arvot gram-negatiivisille alkalofiilisille bakteereille 10 Ryhmä 1 2 3 4 5 6

Kanta 2E.1 45E.3CT 28N.1CT wE12 17N.1CT 64B.4CT

1 2E.1 100 33 35 25 25 15 20N.1 56 2 45E. 3CT 100 25 42E.3 76 30 20 28N.1CT 20 34 100 26 30 30 56E.4 51 3 21M.1 53 37E.2 37 44E.3 55 2 5 wE12 100 wBeCT 41 43 5 17N.1CT 45 44 36 24 100 44 30 22M.1 65 6 64B. 4CT 21 31 35 25 34 100 53E.4 60 35 SS 17 20 20 42

Arvot antavat hybridisaatioprosentin kantojen (rivit) ja H3-leimattujen kantojen välillä (sarakkeet).

SS = lohen sperman DNA.

5

Edustavien lajien määrittäminen

Jokaisen SG/UPGMA-menetelmällä muodostetun yksittäisen ryhmän 10 sentroidi (painopiste) laskettiin käyttäen RGROUPS-ohjelmaa TAXPAK:issa. Pisteryhmän sentroidi, joka edustaa todellista organismia projisoituna yliavaruuteen, edustaa hypoteettista keskiarvo-organismia. Sentroidi edustaa harvoin jos koskaan todellista organismia. Sen vuoksi laskettiin ryhmän jokaisen 15 jäsenen euklidiset etäisyydet ryhmän sentroidista, sen osoittamiseksi, mikä kanta oli lähimpänä hypoteettista keskiarvo-organismia. Lähinnä sentroidia olevaa kantaa nimitettiin "keskiverto"-organismiksi (osoitettu yläindeksillä "CT") .

20

Keskiverto-organismina voidaan ajatella "tyyppikantaa", joka edustaa läheisimmin jokaisen tietyn ryhmän olennaisia ja erottavia tunnusmerkillisiä ominaisuuksia. Keskivertokannat esitetään taulukossa 13.

25

Taulukko 13 Keskivertokannat

Ryhmän Kantojen Kantojen keskim. Sentrotyyppi 30 numero määrä euklidinen etäisyys Euklidinen ryhmässä sentroidista Keskihaj. etäisyys

Kanta sentroidista 1 2 3 4 5 6 11 3,67 0,30 1E.1 2,88 2 35 2 9 3,20 0,52 45E.3 2,30 3 34 3,52 0,32 28N.1 2,90 4 5 3,97 0,29 wB4 2,87 5 4 3,25 0,29 17N.1 2,13 6 5 3,11 0,41 64B.4 1,93 40 _ _ _ ___ _ _ 43

Kutakin keskiverto-organismia on kuvattu, jotta kyettäisiin erottamaan nämä organismit kaikista muista aikaisemmin tunnetuista ja kuvatuista bakteereista. Jokaisen ryhmän määrit-5 telyä varten on lisäksi laskettu minimimäärä erottelutestejä niin, että voidaan selvästi havaita, että näitä uusia bakteereja sisältävät ryhmät voidaan helposti erottaa toisistaan ja kaikista muista tunnetuista bakteereista.

10 Keskivertokantojen kuvailu

Kanta 1E.1CT (Ryhmä 1)

Aerobinen, liikkuva, gram-negatiivinen sauvanmuotoinen bakteeri, 1,7-3,3 pm x 0,5-0,7 pm.

15

Ehdoton alkalofiili, kasvaa parhaiten pH-välillä 9-10.

Muodostaa alkaliagarilla (Alusta A) sileitä, kermanvärisiä pesäkkeitä, alussa läpikuultavia mutta muuttuen sameiksi 20 muutaman päivän kuluttua. Pesäkkeet ovat pyöreitä, ehyt-reunaisia ja kuperia, halkaisijaltaan 2-3 mm.

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on höytyinen, johon liittyy pohjasakan ja pintakelmun muodostumista.

25

Kasvaa hyvin lämpötilavälillä 20 °C - 40 °C. Kasvaa hitaasti 10° - 15 °C:ssa. Ei kasvua 8 °C:ssa eikä 45 °C:ssa.

KOH-testi: positiivinen 30 Aminopeptidaasi: heikosti positiivinen

Oksidaasi: negatiivinen

Katalaasi: positiivinen

NaCl:n sietokyky: 0 % - < 8 %. Ei kasvua 8 %:ssa

Gelatiinin hydrolyysi: positiivinen 35 Tärkkelyksen hydrolyysi: positiivinen Tärkeimmät polaariset lipidikomponentit: fosfatidyyliglyseroli difosfatidyyliglyseroli 44 fosfatidyyliglyserolifosfaatti fosfatidyylietanoliamiini Tärkein ubikinoni: Q9 Tärkeimmät rasvahapot: C16:0, C18:0, 11-cis C18:0 5

Kemo-organotrofi. Kasvaa kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteella ja peptoneilla. Kasvu yksinkertaisilla sokereilla ja orgaanisilla hapoilla hyvin rajoitettua (esim., kasvua havaitaan vain riboosilla, sakkaroosilla ja pyruvaa-10 tiliä).

Kanta 45E.3CT (Ryhmä 2)

Aerobinen, gram-negatiivinen, sauvanmuotoinen bakteeri, 3-15 4,5 pm x 0,6 pm. Liikkuva yhden polaarisen flagellan avulla.

Ehdoton alkalofiili, joka kasvaa pH-välillä 7,8-11,2. Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, sameita, kermanvärisiä pesäkkeitä, 1-2 mm halkaisijaltaan. Pesäkkeet 20 ovat pyöreitä, kuperia ja ehytlaitaisia.

Kasvu on alkalisessa liemessä (Alusta A) hidasta (37°C), vähäistä, tasaisesti sameaa, muodostaen pintakelmun, ei pohjasakkaa .

25

Kasvaa hyvin lämpötilavälillä 20°C-40°C. Kasvaa hitaasti 10°C:ssa. Ei kasvua 8°C:ssa eikä 45°C:ssa.

KOH-testi: positiivinen 30 Aminopeptidaasi: positiivinen

Oksidaasi: positiivinen

Katalaasi: positiivinen

NaCl:n sietokyky: 0 % - 12 %. Kasvu 12 %:ssa on hidasta

Ei kasvua 15 %:ssa 35 Gelatiinin hydrolyysi: positiivinen Tärkkelyksen hydrolyysi: positiivinen (heikko) Tärkeimmät polaariset lipidikomponentit: fosfatidyyliglyseroli 45 difosfatidyyliglyseroli fosfatidyyliglyserolifosfaatti fosfatidyylietanoliamiini glykolipidi (α-naftoli-positiivinen) 5 Tärkein ubikinoni: Q9 Tärkeimmät rasvahapot: C16:0, C18:0, 11-cis C18:l

Kemo-organotrofi. Kasvaa kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteella ja peptoneilla. Ei kasvua yksinkertaisilla 10 sokereilla. Kasvaa orgaanisilla hapoilla (esim., fumaraatti, sukkinaatti, pyruvaatti, asetaatti, laktaatti) ja joillakin rasvahapoilla (esim., propionaatti, valeraatti) ja aminohapoilla (esim., proliini, alaniini, fenyylialaniini).

15 Kanta 28N.1CT (Ryhmä 3)

Aerobinen, liikkuva, gram-negatiivinen sauvanmuotoinen bakteeri, 4,8-5,5 pm x 0,6-0,8 pm. Ehdoton alkalofiili, joka kasvaa pH-välillä 8,5-10,7.

20

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, pyöreitä, sameita pesäkkeitä, joiden rakenne on sitkoinen. Pesäkkeissä on kupera kohouma ja ehyt reuna. Pesäkkeen väri on alussa kerma/beige, muuttuen muutaman päivän kuluttua vaa-25 leanpunaiseksi.

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on voimakasta, höytyistä, johon liittyy pintakelmu ja pohjasakka.

30 Kasvaa hyvin lämpötilavälillä 20°C-45°C. Kasvaa hitaasti 10°C:ssa ja 15°C:ssa. Ei kasvua 50°C:ssa.

KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: positiivinen 35 Oksidaasi: positiivinen

Katalaasi: positiivinen

NaCl:n sietokyky: 0 % - 12 %. Ei kasvua 15 %:ssa

Gelatiinin hydrolyysi: negatiivinen 46 Tärkkelyksen hydrolyysi: positiivinen Tärkeimmät polaariset lipidikomponentit: fosfatidyyliglyseroli difostatidyyliglyseroli 5 fosfatidyyliglyserolifosfaatti fosfatidyyliglyserolisulfaatti fosfatidyylietanoliamiini Tärkein ubikinoni: Q6 Tärkeimmät rasvahapot: C16:0, C16:l, 11-cis C18:l 10 G+C: 64,1 mooli-% (HPLC)

Kemo-organotrofi. Kasvaa hyvin kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteella ja peptoneilla. Kasvaa yksinkertaisilla sokereilla, rasvahapoilla ja aminohapoilla.

15

Kanta wB4CT (Ryhmä 4)

Aerobinen, gram-negatiivinen, sauvanmuotoinen bakteeri, 3-4 pm x 0,6-0,8 pm, esiintyy usein solupareina.

20

Alkalofiili, kasvaa hyvin pH-välillä 7,5-10,9.

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, beigen-värisestä ruskeanvärisiin pesäkkeitä. Pesäkkeet ovat jonkin 25 verran vaihtelevia: 1- > 5 mm kooltaan, muodon vaihdellessa pyöreästä säännöttömään, matalan kuperia tai pystysuunnassa kohonneita, reunojen ollessa aaltolaitaisia tai ehytlaitaisia.

30 Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on höytyistä, pohjasakan muodostavaa ja pintakelmuista.

Kasvaa parhaiten lämpötilavälillä 15°C-45°C, ei kasvua 50°C:ssa.

KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: positiivinen 35 47

Oksidaasi: hyvin heikosti positiivinen, voidaan nähdä negatiivisena

Katalaasi: positiivinen

NaCl:n sietokyky: 0 % > 12 %, ei kasvua 15 %:ssa 5 Gelatiinin hydrolyysi: negatiivinen Tärkkelyksen hydrolyysi: negatiivinen Tärkeimmät polaariset lipidikomponentit: fosfatidyyliglyseroli difosfatidyyliglyseroli 10 fosfatidyyliglyserolifosfaatti fosfatidyylietanoliamiini Tärkein ubikinoni: Q9 Tärkeimmät rasvahapot: C16:0, 11-cis C18:l G+C: 65,3 mooli-% (TM) 15

Kemo-organotrofi. Kasvaa hyvin kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteella. Kasvu yksinkertaisilla sokerilla on rajoitettua. Kasvaa orgaanisilla hapoilla (esim., laktaatti, asetaatti, fumaraatti), rasvahapoilla (esim., propionaatti, 20 valeraatti, kapraatti) ja aminohapoilla (esim., proliini, seriini, lysiini).

Kanta 17N.1CT (Ryhmä 5) 25 Aerobinen, gram-negatiivinen, pitkä ohut, sauvanmuotoinen bakteeri, 5,5-10,5 pm x 0,6 pm, muodostaen joskus lyhyitä soluketjuja. Iän mukana pleomorfisiä, oudosti turvonneet muodot vallitsevat.

30 Ehdoton alkalofiili, kasvaa parhaiten pH-välillä 8-10,5.

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, sameita, keltaisia pesäkkeitä, 2-3 mm halkaisijaltaan. Pesäkkeiden muoto vaihtelee pyöreästä epäsäännölliseen, käsittäen kupe-35 rasta nuppimaiseen kohouman, ja ehytlaitaisen, aaltolaitai-sen tai liuskaisen reunan iästä riippuen.

48

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on tasaista ja pohjasakkaa muodostavaa ilman pintakelmua.

Kasvaa hyvin lämpötilavälillä 15°C - 37°C. Kasvaa hitaasti 5 10°C:ssa eikä lainkaan 8°C:ssa. Ei kasvua 40°C:ssa tai sen yläpuolella.

KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: heikosti positiivinen 10 Oksidaasi: negatiivinen

Katalaasi: positiivinen

NaCl:n sietokyky: 0 % - < 12 %, kasvaa parhaiten 0 %:isessa NaCl:ssa

Gelatiinin hydrolyysi: positiivinen 15 Tärkkelyksen hydrolyysi: heikosti positiivinen Tärkeimmät polaariset lipidikomponentit: fosfatidyyliglyseroli difosfatidyyliglyseroli fosfatidyyliglyserolifosfaatti 20 fosfatidyylietanoliamiini glykolipidi (α-naftoli-positiivinen) Tärkein ubikinoni: Q9, Q10 Tärkeimmät rasvahapot: C15:;0 anteiso, C16:0, C17:0 anteiso G+C: 50 mooli-% (HPLC) 25

Kemo-organotrofi. Kasvaa hyvin kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteella. Kasvu yksinkertaisilla sokereilla on rajoitettua (esim., kasvua havaittu vain fruktoosilla; kasvua ei ole havaittu glukoosilla, riboosilla, laktoosilla).

30 Kasvaa orgaanisilla hapoilla (esim., fumaraatti, suk- kinaatti, pyruvaatti, 2-ketoglukonaatti) ja aminohapoilla.

Kanta 6 4B.4CT (Ryhmä 6) 35 Aerobinen, gram-negatiivinen, sauvanmuotoinen bakteeri, 2,0-3, 5 pm x 0,8-1,0 pm.

Ehdoton alkalofiili, kasvaa parhaiten pH-välillä 8,2 - 10,9.

49

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, sameita pesäkkeitä, aluksi kermamaisen keltaisia väriltään, iän myötä muuttuvat beigenvärisiksi. Pesäkkeiden halkaisija on noin 5 4 mm, muoto aluksi pyöreä, sitten säännötön; pystysuunnassa litteä tai loivan kupera, myöhemmin kupera; ehytlaitaisen reunan muuttuessa aaltolaitaiseksi.

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on tasaista, 10 pohjasakkaa muodostavaa, ilman pintakelmua.

Kasvaa hyvin 15°C:ssa - 45°C:ssa, ei kasvua 10°C:ssa eikä 50°C:ssa.

15 KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: negatiivinen

Oksidaasi: positiivinen

Katalaasi: positiivinen

NaCl:n sietokyky: 0 % < 12 %, ei kasvua 15 %:ssa 20 Gelatiinin hydrolyysi: positiivinen Tärkkelyksen hydrolyysi: heikosti positiivinen Tärkeimmät polaariset lipidikomponentit: fosfatidyyliglyseroli difostatidyyliglyseroli 25 fosfatidyyliglyserolifosfaatti fosfatidyylietanoliamiini glykolipidi (α-naftoli-positiivinen) Tärkein ubikinoni: Q9 Tärkeimmät rasvahapot: C15:0 iso, C15:0 anteiso, C16:0 30 G+C: 41,0 ±0,9 mooli-% (HPLC)

Kemo-organotrofi. Kasvaa hyvin kompleksisilla aineilla kuten hiivauutteella. Kasvaa joillakin yksinkertaisilla sokereilla (esim., glukoosi, riboosi, maltoosi ja fruktoosi), orgaani-35 silla hapoilla (esim., asetaatti, laktaatti, sitraatti ja fumaraatti), joillakin rasvahapoilla (esim., propionaatti ja kapraatti) ja aminohapoilla (esim., proliini, histidiini ja alaniini).

50

Ei-ryhmittyvät kannat

Kannat, jotka eivät joudu tässä määriteltyihin ryhmiin, ovat 5 myös uusia bakteereja, joita ei aikaisemmin ole tunnettu eikä kuvailtu. Nämä kannat, kooditettuina wN2, 4E.1, 5E.1, 92LM.4 ja wBn5, voivat edustaa alkalofiilisten bakteerien harvinaisempia muunnoksia ja ovat luultavasti sellaisten bakteeriryhmien jäseniä, jotka edustavat uusia sukuja ja la-10 jeja, joita ei tällä hetkellä ole kuvailtu. Kuvaus näistä "ei-ryhmittyvistä" kannoista on tehty, jotta kyettäisiin erottamaan nämä organismit kaikista muista aikaisemmin tunnetuista ja kuvailluista bakteereista.

15 Kanta wN2

Aerobinen, gram-negatiivinen, liikkuva, sauvanmuotoinen bakteeri, usein pareina esiintyvä.

20 Ehdoton alkalofiili, kasvaa parhaiten pH-välillä 9-10.

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, läpikuultavia, beigenvärisiä pesäkkeitä, 1-2 mm halkaisijaltaan. Pesäkkeet ovat pyöreitä, kuperia, reunan ollessa ehytlaitai-25 nen.

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on höytyistä, johon liittyy rengas tai pintakelmu ja pohjasakan muodostuminen .

30

Kasvaa hyvin 20°C:ssa-30°C: ssa. Ei kasvua 15°C:ssa eikä 40°C:ssa.

KOH-testi: positiivinen 35 Aminopeptidaasi: heikosti positiivinen

Oksidaasi: heikosti positiivinen

Katalaasi: positiivinen 51

NaCl-sietokyky: ehdoton halofiili, kasvua 4 %:isessa

NaClrssa, ei kasvua 0 %:isessa tai 8 %:isessa NaClrssa Gelatiinin hydrolyysi: hitaasti positiivinen Tärkkelyksen hydrolyysi: positiivinen 5 Tärkein ubikinoni: Q9 G+C: 64,1 (TM)

Kemo-organotrofi. Metabolisesti reagoimaton. Ei kasvua yksinkertaisilla sokereilla eikä orgaanisilla hapoilla. Kasvaa 10 kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteella ja pepto-neilla ja joillakin aminohapoilla.

Kanta 4E.1 15 Aerobinen, gram-negatiivinen, liikkuva, sauvanmuotoinen bakteeri, 1,7-5,2 pm x 0,75 pm.

Ehdoton alkalofiili, kasvaa parhaiten pH-välillä 8,2-10,9.

20 Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, sameita, beigenvärisiä tai ruskeanvärisiä pesäkkeitä, 2-4 mm halkaisijaltaan. Pesäkkeet ovat pyöreitä muodoltaan, kuperia pystysuunnassa, ehytlaitaisia.

25 Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on voimakasta ja höytyistä, johon liittyy pohjasakka ja pintakelmu.

Kasvaa hyvin lämpötilavälillä 20°C-37°C. Kasvaa hyvin hitaasti 10°C:ssa eikä lainkaan 8°C:ssa. Ei kasvua 40°C:ssa tai 30 sen yläpuolella.

KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: positiivinen

Oksidaasi: hyvin heikosti positiivinen, voi näyttää nega- 35 tiiviselta

Katalaasi: positiivinen

NaCl-sietokyky: 0 % - 12 %, voi kasvaa heikosti 15 %:ssa

Gelatiinin hydrolyysi: negatiivinen 52 Tärkkelyksen hydrolyysi: negatiivinen

Kemo-organotrofi. Ei kasva yksinkertaisilla sokereilla, paitsi riboosilla. Kasvaa hyvin kompleksisilla substraa-5 teillä kuten hiivauutteella, ja orgaanisilla hapoilla (esim., sukkinaatti, pyruvaatti, sitraatti, malonaatti, ase-taatti ja laktaatti), rasvahapoilla (esim., propionaatti, valeraatti ja suberaatti), ja aminohapoilla (esim., prolii-ni, seriini, histidiini ja lysiini).

10

Kanta 5E.1

Aerobinen, gram-negatiivinen, sauvanmuotoinen bakteeri, 3,0-5, 3 pm x 1,3 pm.

15

Ehdoton alkalofiili, kasvaa parhaiten pH-välillä 9-10,5.

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, sameita, ruskeanvärisiä pesäkkeitä, 3-4 mm halkaisijaltaan. Pesäkkeet 20 ovat muodoltaan melko epäsäännöllisiä, yleensä litteästä nuppimaiseen pystysuunnassa, reunan ollessa liuskainen.

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) vaihtelee kohtalaisesta runsaaseen, tullen höytyiseksi, johon liittyy poh-25 jasakka ja pintakelmu.

Kasvaa parhaiten lämpötilavälillä 20°C-40°C. Kasvaa hitaasti 10°C:ssa. Ei kasvua 45°C:ssa.

30 KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: positiivinen

Oksidaasi: negatiivinen

Katalaasi: positiivinen

NaCl:n sietokyky: 0 % - 12 %, voi kasvaa heikosti 15 %:ssa 35 ei kasvua 20 %:isessa NaCl:ssa

Gelatiinin hydrolyysi: positiivinen Tärkkelyksen hydrolyysi: heikosti positiivinen Tärkeimmät polaariset lipidikomponentit: 53 fosfatidyyliglyseroli difosfatidyyliglyseroli fosfatidyyliglyserolifosfaatti fosfatidyyliglyserolisulfaatti 5 fosfatidyylietanoliamiini glykolipidi (α-naftoli-positiivinen) Tärkein ubikinoni: Q8 Tärkeimmät rasvahapot: C16:0, C18:l 10 Kemo-organotrofi. Ei kasva yksinkertaisilla sokereilla. Kas vaa hyvin kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteel-la, orgaanisilla hapoilla (esim., pyruvaatti, sitraatti, asetaatti ja laktaatti), rasvahapoilla (esim., propionaatti, kapraatti ja valeraatti) ja aminohapoilla (esim., proliini, 15 alaniini ja lysiini).

Kanta 92LM.4

Aerobinen, gram-negatiivinen, sauvanmuotoinen bakteeri, 2,0-20 3,5 pm x 0,5-1,0 pm.

Ehdoton alkalofiili, ei kasvua alle pH 7,5:n.

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, kerman- 25 värisiä pesäkkeitä, alussa läpinäkyviä mutta myöhemmin sa meita. Pesäkkeet kehittyvät pyöreistä ehytlaitaisista säännöttömiksi liuskaisiksi, pystysuunnassa kuperiksi.

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on hidasta, 30 heikkoa, höytyistä, johon liittyy pohjasakka mutta ei pin- takelmua.

Kasvaa parhaiten lämpötilavälillä 10°C-40°C, ei kasvua 8°C:ssa eikä 45°C:ssa.

KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: negatiivinen

Oksidaasi: positiivinen 35 54

Katalaasi: positiivinen

NaCl-sietokyky: 0 % - 15 %, kasvu 15 %:ssa on hidasta ei kasvua 20 %:ssa

Gelatiinin hydrolyysi: positiivinen 5 Tärkkelyksen hydrolyysi: heikosti positiivinen Tärkein ubikinoni: Q9 Tärkeimmät rasvahapot: C15:0 iso, C15:0 anteiso C16 : 0, Cl 7:0 iso 10 Kemo-organotrofi. Kasvaa kompleksisilla substraateilla kuten hiivauutteella ja peptoneilla, ja useilla eri sokereilla, orgaanisilla hapoilla ja aminohapoilla.

Kanta wBn5 15

Aerobinen, gram-negatiivinen, pieni sauvanmuotoinen bakteeri, muodostaen usein lyhyitä soluketjuja.

Ehdoton alkalofiili, ei kasvua alle pH 8:n.

20

Muodostaa alkalisella agarilla (Alusta A) sileitä, pyöreitä, kuperia pesäkkeitä, joiden reuna on ehytlaitainen, noin 1 mm läpimittaisia. Pesäkkeet ovat alussa kerman/beigenvärisiä, läpinäkyviä, muuttuen sameiksi, ruskeiksi.

25

Alkalisessa liemessä (Alusta A) kasvu (37°C) on alussa tasaisen sameaa, pöhjasakkaista ilman pintakelmua, muuttuen 4 päivän kuluttua höytyiseksi, johon liittyy pintakelmun muodostuminen .

30

Kasvaa 30°C:ssa ja 37°C:ssa. Ei kasvua 40°C:ssa.

KOH-testi: positiivinen

Aminopeptidaasi: positiivinen 35 Oksidaasi: positiivinen

Katalaasi: positiivinen

NaCl-sietokyky: ehdoton halofiili; kasvaa 4 %:isessa NaCl:-ssa, ei kasvua 0 %:ssa eikä 8 %:ssa 55

Gelatiinin hydrolyysi: hitaasti positiivinen Tärkkelyksen hydrolyysi: negatiivinen Tärkein ubikinoni: Q8, Q9 G+C: 54,6 mooli-% (TM) 5

Kemo-organotrofi. Kasvaa usealla kompleksisella substraatilla kuten hiivauutteella ja peptoneilla, samoin kuin sokereilla, orgaanisilla hapoilla, rasvahapoilla ja aminohapoilla .

10

Ryhmän määrittely laskemalla minimimääräisten erottelutes-tien avulla, ja todennäköisyysmatriisin konstruointi gram-negatiivisten alkalofiilien identifioimiseksi 15 Yksi numeerisen luokittelututkimuksen tarkoituksista on fe-neettisten tulosten käyttäminen, joka määrittelee ryhmät valitulla yhtäläisyystasolla, tuntemattomien kantojen jakamiseksi tai identifioimiseksi. Luokitttelutestituloksia voidaan käyttää vähimmäistestijoukon määrittämiseksi, jotka 20 tarvitaan ryhmien määrittelemiseksi 73 %:n (SG) yhtäläisyys-tasolla, ja niiden ominaisuuksien identifioimiseksi, jotka ovat eniten diagnosoivia (ennustavia) yksittäisen ryhmän osalta. Toisin sanoen, vähimmäistestimäärän määrittelemiseksi, jotka tarvitaan määräämään tuntematon organismi ennalta 25 määrättyyn ryhmään korkealla ennustettavuusasteella.

Minimimääräisistä erottelutesteistä voidaan konstruoida to-dennäköisyysmatriisi tuntemattomien kantojen identifioimiseksi. Analyysi saadaan suoritetuksi käyttämällä ohjelma-30 yhdistelmää, joka sisältää CHARSEP:in ja DIACHAR:in (TAX- PAK), ja MCHOICE:n (ei TAXPAK:in yhteydessä, mutta saatavissa Data-Mail'in avulla Leicesterin yliopistosta, Iso-Britan-niasta). Identifiointimatriisin arvostelu saadaan aikaan käyttäen MOSTTYP- ja OVERMAT-ohjelmia. Käytännön esimerkkejä 35 näiden ohjelmien käyttämisestä bakteerien identifiointiin todennäköisyyden mukaan ovat julkaisseet Williams, S.T., et_ ai., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, ss. 1815-1830; ja

Priest, F.G. ja Alexander, B., (1988), J. Gen. Microbiol., 56 134, ss. 3011-3018; samassa julkaisussa, (1990), 136, ss. 367-376.

"n x t"-taulukko konstruoitiin testituloksista käyttäen 5 ominaisuuksia 6-10 ja 13-104 (Liite C) arvosteltuna kaksi-järjestelmänä (positiivinen = 1, negatiivinen = 0). Tätä tu-losmatriisia täydennettiin seuraavien neljän ylimääräisen ominaisuustilan avulla: 10 [105] Kirkkaan keltaiset pesäkkeet (ominaisuusnumero 1, Lii te C) [106] Läpinäkyvät pesäkkeet (kasvatettu Alusta A:11a, Liite A) [107] Lipaasi (lipolyyttinen aktiivisuus oliiviöljyllä 15 (Alusta M)) [108] Oksidaasipositiivinen 10 sekunnin sisällä (koe 9, Liite B)

Tulosmatriisia tarkastellaan ensin käyttäen CHARSEP-ohjel-20 maa, jolla lasketaan erotusindeksit ja siten yksittäisten ominaisuuksien diagnostinen arvo, eron tekemiseksi ryhmien välillä. Testit, joiden VSP-indeksi on > 25 % (Sneath, P.H.A., (1979), Computers and Geosciences, _5, 349-357) hy väksytään, ominaisuudet, joiden diagnostinen arvo on alhai-25 nen (VSP < 25 %), hylättiin. Etusija annetaan ominaisuuksille, joilla on korkeimmat VSP-indeksit edellyttäen, että arvosteluperusteet DIACHAR- ja MCHOlCE-ohjelmissa täytetään myös. Tässä esimerkissä 38:11a testillä on VSP-indeksi > 25 %, ja 9:llä, 24:stä lopullisesti valituista ominaisuuksista, 30 VSP-indeksi on > 50 % (taulukko 11).

Tulosmatriisia tarkastellaan seuraavaksi DIACHAR-ohjelman avulla, jolla määritetään kunkin ryhmän eniten diagnosoivat ominaisuustilat. Ominaisuustilojen määräksi asetettiin 10.

35 Tämä tulos mahdollistaa toisensa mahdottomaksi tekevien omi-naisuustilojen valinnan ryhmien välillä. Näistä testeistä niin monta kuin mahdollista säilytetään minimimääräisten erottelutestien lopullisessa identifiointimatriisissa; tässä 57 esimerkissä 6-9 diagnostista ominaisuutta ryhmää kohti. Loput, käyttämättömät testit pannaan myös muistiin ja niitä voidaan käyttää lisätesteinä identifioinnin varmistamiseksi (taulukko 12).

5 MCHOICE-ohjelma järjestää testit ryhmiin, jotka voidaan esittää dendrogrammimuodossa käyttämällä MDEND-aliohjelmaa. Ryhmät identifioivat testit, joilla on samankaltainen erot-teluarvo, mikä siten mahdollistaa testien hylkäämisen, joil-10 la ei onnistuta tekemään merkitsevää erottelua, samoin kuin mahdollistaa valintojen tekemisen testien välillä, joiden diagnostinen arvo on sama tai hyvin samankaltainen.

Taulukossa 13 esitetään 24 testiä käsittävä sarja, joka on 15 minimimäärä, joka tarvitaan ryhmien määrittelemiseksi, ja joita voidaan käyttää tuntemattomien kantojen määrittelemiseksi. Taulukossa 13 esitetään lisäksi identifiointimatrii-si, joka sisältää positiivisten ominaisuuksien prosenttiosuudet, jotka määrittelevät ryhmät 24:n minimimääräisen 20 erottelukokeen perusteella. Tämä lasketaan IDMAT-ohjelmalla.

58

Taulukko 14

Minimimääräisiin erottelukokeisiin käytettyjen ominaisuuksien erotusarvot 5

Ominaisuus VSP-indeksi [23] N-asetyyliglukosamiini 35,4 [26] Sakkaroosi 44,8 [27] Maltoosi 41,4 10 [32] Laktaatti 51,6 [41] Propionaatti 60,9 [43] Valeraatti 63,4 [44] Sitraatti 45,1 [45] Histidiini 38,0 15 [47] Glykogeeni 31,7 [51] 3-hydroksibutyraatti 66,1 [52] 4-hydroksibentsoaatti 38,0 [58] Leusiiniaryyliamidaasi 36,6 [59] Valiiniaryyliamidaasi 50,5 20 [64] Fosfohydrolaasi 52,8 [65] a-galaktosidaasi 33,9 [85] Amp isilliini 36,8 [92] Fusidiinihappo 68,7 [93] Metisilliini 58,3 25 [99] Polymyksiini 62,8 [102] Vankomysiini 48,3 59

Taulukko 15

Erottelutestit kullekin kuudelle ryhmälle (SG) 5 Ryhmä 1: kermaisia, pyöreitä, sameita, limaisia pesäkkeitä. Positiivinen Negatiivinen [58] Leusiiniaryyliamidaasi [23] N-asetyyliglukosamiini 10 (91 %) (9 %) [59] Valiiniaryyliamidaasi [27] Maltoosi (9 %) (91 %) [64] Fosfohydrolaasi (91 %) [41] Propionaatti (9 %) [99] Polymyksiini (89 %) [42] Kapraatti 15 [43] Valeraatti (9 %) [44] Sitraatti (9 %) [45] Histidiini [47] Glykogeeni (9 %) [52] 4-hydroksibentsoaatti 20 [65] a-galaktosidaasi

Ryhmä 2: pieniä, kermaisia, läpikuultavia pesäkkeitä.

Positiivinen Negatiivinen 25 [21] Tärkkelys [23] N-asetyyliglukosamiini [31] Asetaatti [26] Sakkaroosi [41] Propionaatti [45] Histidiini [43] Valeraatti [50] 2-ketoglukonaatti [53] Proliini [52] 4-hydroksibentsoaatti 30 [107] Lipaasi [68] a-glukosidaasi [108] Oksidaasi (10 sek. sis.) [69] β-gluksidaasi [92] Fusidiinihappo

Ryhmä 3: kermaisia, sameita pesäkkeitä.

35

Positiivinen Negatiivinen [31] Asetaatti [64] Fosfohydrolaasi (3 %) 60 [32] Laktaatti [65] α-galaktosidaasi (3 %) [41] Propionaatti (94 %) [92] Fusidiinihappo (3 %) [43] Valeraatti (97 %) [96] Tetrasykliini (3 %) [44] Sitraatti (94 %) [102] Vankomysiini 5 [51] 3-hydroksibutyraatti(94 %)[104] Basitrasiini [53] Proliini [58] Leusiiniaryyliamidaasi (94 %)

Ryhmä 4: beigenvärisistä ruskeisiin, sameita pesäkkeitä.

10

Positiivinen Negatiivinen [32] Laktaatti [45] Histidiini [33] AIaniini [85] Ampisilliini 15 [48] 3-hydroksibutyraatti [86] Nalidiksiinihappo [59] Valiiniaryyliamidaasi [88] Trimetopriimi

[99] Polymyksiini [89] Penisilliini G

[93] Metisilliini 20 Ryhmä 5: kirkkaan keltaisia [105], sameita pesäkkeitä.

Positiivinen Negatiivinen [64] Fosfohydrolaasi [23] N-asetyyliglukosamiini 25 [65] a-galaktosidaasi [32] Laktaatti [66] β-galaktosidaasi [33] L-alaniini [85] Ampisilliini [34] Mannitoli [92] Fusidiinihappo [41] Propionaatti [93] Metisilliini [42] Kapraatti 30 [96] Tetrasykliini [43] Valeraatti [102] Vankomysiini [45] Histidiini [104] Basitrasiini [48] 3-hydroksibentsoaatti [51] 3-hydroksibutyraatti [52] 4-hydroksibentsoaatti 35 [99] Polymyksiini 61

Ryhmä 6; kermaisia, säännöttömiä, litteitä pesäkkeitä.

Positiivinen Negatiivinen 5 [21] Tärkkelys [17] Pyruvaatti [23] N-asetyyliglukosamiini [52] 4-hydroksibentsoaatti [26] Sakkaroosi [58] Leusiiniaryyliamidaasi [27] Maltoosi [59] Valiiniaryyliamidaasi 10 [31] Asetaatti [65] a-galaktosidaasi [33] Alaniini [99] Polymyksiini [44] Sitraatti [47] Glykogeeni [51] 3-hydroksibutyraatti

15 [89] Penisilliini G

[92] Fusidiinihappo [93] Metisilliini [96] Tetrasykliini [104] Basitrasiini 20

Selitys: Hakasuluissa olevat numerot ennen ominaisuustilaa, viittaavat ominaisuustiloihin ja yksikkötesteihin Liitteissä B ja C. Prosenttisuudet suluissa viittaavat positiivisiin ominaisuustiloihin.

Taulukko 16 62

Todennäköisyysmatriisi alkalofiilien identifiointia varten: 5 Positiivisten erotteluominaisuuksien prosenttijakauma, joka määrää gram-negatiivisten alkalofiilisten bakteerien ryhmät 73 %:n tasolla (SG)

Ryhmä 10 _ _____ _ : 1 2 3 4 5 6 [23] N-asetyyliglukosamiini 13 0 26 20 0 100 [26] Sakkaroosi 25 0 74 20 25 100 [27] Maltoosi 25 0 68 60 50 100 15 [32] Laktaatti 38 50 100 100 0 40 [41] Propionaatti 0 100 91 60 0 80 [43] Valeraatti 13 100 97 80 0 40 [44] Sitraatti 13 50 94 20 50 100 [45] Histidiini 0 0 71 0 0 80 20 [47] Glykogeeni 0 13 26 20 25 100 [51] 3-hydroksibutyraatti 13 25 94 100 0 100 [52] 4-hydroksibentsoaatti 0 0 71 80 0 0 [58] Leusiiniaryyliamidaasi 88 63 94 60 50 0 [59] Valiiniaryyliamidaasi 88 25 65 100 25 0 25 [64] Fosfohydrolaasi 88 13 3 20 75 40 [65] a-galaktosidaasi 0 0 3 20 75 0 [85] Amp isilliini 50 63 56 0 100 80 [92] Fusidiinihappo 25 0 3 20 100 100 [93] Metisilliini 50 13 50 0 100 100 30 [99] Polymyksiini 88 50 81 100 0 0 [102] Vankomysiini 13 13 3 20 100 75 [105] Keltainen pesäke 0 0 0 0 100 0 [106] Läpikuultava pesäke 0 100 3 0 0 0 [107] Lipaasi 0 100 21 0 0 0 35 [108] Oksidaasi (10 sek.) 25 88 6 0 0 0 63

Erottelutestien arvostelu ja identifioinnin luotettavuuden arviointi 5 Erottelutestien arvosteluun liittyy kaksi näkökohtaa. Ensiksi, testien oikeellisuus voidaan analysoida käyttäen käytännön esimerkkejä, jotka voidaan edelleen arvostella käyttäen tilastollista teoriaa, tai testit voidaan arvioida suoraan käyttäen tilastollisisa menetelmiä.

10

Kuvaus 1

Erottelutestien käytännöllinen arvostelu 15 Monet tutkijat arvioivat erottelutestien tarkkuuden vain määrittämällä uudelleen valikoitujen, ryhmää edustavien jäsenten ominaisuustilat. Tätä lähestymistapaa on käytetty tässä keskivertokantojen kohdalla (jäljempänä). Paljon täsmällisempi lähestymistapa, jota harvoin käytetään, on kaik-20 kien kantojen tutkiminen, joita käytettiin alkuperäisessä numeerisessa taksonomia-analyysissä. Sovellettaessa ryhmä-analyysiä, käyttäen vain tuloksia, jotka oli saatu minimi-määräisistä erottelutesteistä johdetusta sarjasta, rekonstruoitua dendrogrammia voidaan verrata alkuperäiseen. Käyttä-25 mällä ainoastaan 24:ää aikaisemmin kuvailtua (taulukko 16) erottelutestiä, kaikkia 70:tä uutta gram-negatiivista alka-lofiilistä bakteeria koskevat tulokset (kaksitilaiset, binaarimuodossa) analysoitiin ryhmäanalyysissä SG/UPGMA-mene-telmän avulla. Rekonstruoitu dendrogrammi esitetään uudel-30 leen kuviossa 3. Tämä rekonstruoitu dendrogrammi vastaa hyvin edullisesti alkuperäistä dendrogrammia (kuvio 1).

Vaikka ryhmien asemassa on esiintynyt jonkin verran uudelleenjärjestelyä, niiden koostumus on suureksi osaksi muut-35 tumaton, ja ne määritellään suunnilleen samalla yhtäläisyys-tasolla kuin alkuperäiset ryhmät. Ryhmä 4 on kuitenkin yhdistynyt ryhmä 3:n kanssa, yhden ainoan kannan siirtyessä ryhmä l:een. Tämä tähdentää edelleen vaikeutta, joka liittyy 64 ryhmä 4:n määrittelyyn pelkästään feneettisten tulosten perusteella. Useita kertoja on tähdennetty, että kemotaksono-misia lisätuloksia tarvitaan, asianmukaisen eron tekemiseksi ryhmä 3:n ja ryhmä 4:n välillä.

5

Sekä alkuperäisessä dendrogrammissa että rekonstruoinnissa (kuvio 3), ryhmä 3 näyttää sisältävän useita alaryhmiä yli 73 %:n yhtäläisyystasolla. Ryhmä 3:n hienorakennetta tukevat myös kemotaksonomiset tutkimustulokset (edellä).

10

Kuvaus 2

Erottelutestien teoreettinen arvostelu 15 Ryhmien peittävyyden arviointi toteutetaan käyttäen OVERMAT-ohjelmaa. Tällä ohjelmalla tutkitaan matriisia, joka on konstruoitu positiivisten arvojen prosenttisosuudesta koskien valikoituja ominaisuustiloja, vaikeasti erotettavaa peit-toarvoa vastaan, ottaen huomioon sentroidikoordinaattien ja 20 ryhmäsäteen määrittelemät ryhmät (kaksi kertaa neliöllinen keskiarvo kantojen etäisyyksistä sentroidista). Jos ryhmien välillä on merkitsevää päällekkäisyyttä, tuntemattomat kannat eivät ehkä liity mihinkään niistä riittävällä luotettavuudella (Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., edellä, s. 394-25 400). Valitulla 2,5 %:n kriittisellä peittoarvolla (joka on sitovampi tila kuin useimpien tutkijoiden käyttämä: esim. Priest, F.G. ja Alexander, B., (1988), edellä; ja Williams, S.T. et_ ad., (1983), edellä), ryhmien välillä ei esiintynyt merkitsevää päällekkäisyyttä (95 %:n luotettavuustaso) pait-30 si ryhmä 3:n ja ryhmä 4:n välillä, joissa todelliseksi peitoksi laskettiin 4 %. Kemotaksonomisia tuloksia ei kuitenkaan otettu lukuun konstruoitaessa identifiointimatriisia. Kinonianalyysien perusteella ryhmä 3:n kannat voidaan erottaa ryhmä 4:n kannoista.

Kuvaus 3 65

Identifioinnin luotettavuuden teoreettinen arviointi 5

Hypoteettinen mediaaniorganismi (HMO) on toinen määritelmä "keskitason" organismista ryhmän sisällä (Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., edellä, ss. 194 ja sen jälkeen). HMO ei ole oikea organismi vaan kuviteltu organismi, jossa kullakin omi-10 naisuudella ilmenee yleisin tila. MOSTTYP-ohjelma laskee HMO:t kullekin ryhmälle identifiointimatriisissa ja yrittää sen jälkeen identifioida ne. Toisin sanoen, MOSTTYP on ohjelma identifiointimatriisin arvioimiseksi laskemalla kaikkein tyypillisimpien kantojen identifiointipistearvot ryhmi-15 en suhteen. Hyvällä identifiointimatriisilla tulisi saada suuri todennäköisyys HMO:n määräämiseksi uudelleen omaan ryhmäänsä. Tämän analyysin tulokset olivat hyvin tyydyttäviä (taulukko 17), erityisesti siksi, että MOSTTYP oli ohjelmoitu käsittämään vain 20 ensimmäistä identifiointimatriisin 20 diagnostista testiä (taulukko 16), so., poislukien testit 105-108. Kukin HMO määrättiin uudelleen alkuperäiseen ryhmäänsä Willcox'in todennäköisyysarvoilla 0,998-1,000 (Will-cox, W.R. eli ad., (1973) J. Gen. Microbiol., 7_7, 317-330) . Kaikki taksonomiset etäisyydet olivat lyhyitä, ja taksonomi-25 sen etäisyyden keskivirheet olivat kaikki negatiivisia, mikä osoitti, että kaikki HMO:t olivat lähempänä ryhmän sentroi-dia kuin ryhmän keskitasoa (taulukko 17).

Taulukko 17 66

Identifiointipistearvot kunkin ryhmän hypoteettiselle medi-5 aaniorganismille MOSTTYP-ohjelmalla aikaansaatuina

Identifiointipistearvot

Willcox'in Taksonominen Taksonomisen etäisyy- 10 Ryhmä todennäköisyys etäisyys den keskivirhe 1 0,999 0,194 -2,742 2 0,999 0,236 -2,214 3 1,000 0,231 -2,115 15 4 0,998 0,195 -2,998 5 1,000 0,217 -1,839 6 1,000 0,182 -2,502 1 0 Kuvaus 3

Identifiointipistemäärän käytännöllinen arviointi

Kantojen identifiointi, käyttäen minimimääräistä erottelu-25 testisarjaa, saadaan aikaan käyttäen MATIDEN-ohjelmaa TAX-PAK:issa. Ohjelma vertailee läsnäolo-poissaolo-tietoja tuntemattoman kannan osalta jokaisen ryhmän suhteen vuorollaan, positiivisten ominaisuuksien prosenttisuuksia sisältävässä identifiointimatriisissa. Identifiointikertoimet lasketaan, 30 nimittäin Willcox'in todennäköisyys, taksonominen etäisyys ja taksonomisen etäisyyden keskivirhe. Tulokset ilmaistaan esittämällä identifiointipistearvot parhaalle ryhmälle ja toiseksi parhaille vaihtoehtoryhmille. Lisäksi tallennetaan ei-tyypilliset tulokset ("ominaisuudet vastaan"). Analyysis-35 sä, jossa käytettiin oikeiden kantojen tuloksia, keskiverto-tyypit määriteltiin uudelleen alkuperäisiin ryhmiinsä Willcox'in todennäköisyysarvoilla 0,9996-1,000 (taulukko 18). Taksonomiset etäisyydet olivat pienet. Taksonomisen etäisyy- den keskivirheet olivat kaikki negatiivisia, mikä osoitti, että keksivertotyypit olivat lähempänä ryhmän sentroidia kuin ryhmän keskitasoa.

67 5 Taulukko 18

Identifjointipistearvot kunkin ryhmän keskiverto-organismille aikaansaatuina MATIDEN-ohjelman avulla 10 Identifiointipistearvo Määrätty Willcox'in Taksonominen D:n keski-Ryhmä Kanta ryhmään todennäköis. etäisyys (D) virhe 1 2E.1 1 1,000 0,309 -0,283 15 2 45E. 3CT 2 1, 000 0,226 -1, 749 3 28N.1CT 3 1, 000 0,305 -0,622 4 wB4CT 4 0, 9996 0,265 -1,092 5 17N. 1CT 5 0, 9999 0,255 -0,478 6 64N. 4CT 6 1, 000 0,211 -1, 126 20

Kuvaus 5

Tuntemattomien näyteisolaattien identifiointi 25

Identifiointimatriisista arvioitiin sen kyky määrätä tuntemattomia alkalofiilejä tässä rajattuihin ryhmiin. Arvosteluperusteina onnistuneelle identifioinnille olivat: (a) bakteerit oli eristetty samankaltaisesta elinpaikasta, 30 mutta maantieteellisesti muualta, kuin Itä-Afrikan sooda- j ärvet; (b) Willcox'in todennäköisyys on suurempi kuin 0,95 ja pienet arvot taksonomiselle etäisyydelle ja sen keskivirheelle (< 3) ; 35 (c) identifiointipistearvo parhaalle ryhmälle on merkitse västi parempi kuin pistearvot kahden seuraavaksi parhaan vaihtoehdon osalta; 68 (d) "ominaisuuksia vastaan", parhaan ryhmän osalta tulisi olla nolla tai vähässä määrin.

Tuntemattomia mikro-organismeja voidaan tutkia käyttäen tau-5 lukossa 16 lueteltuja vähimmäistestejä. Ominaisuustilat määritetään ja identifiointipistearvot saadaan käyttäen MATI-DEN-ohjelmaa. Tämä ohjelma vertailee tuntemattoman ominai-suustiloja identifiointimatriisiin, joka on määritetty kaikille ennalta määritetyille ryhmille, laskee parhaan yhteen-10 sopivuuden ja määrää tuntemattoman sopivimpaan ryhmään.

Willcox'in todennäköisyys lasketaan identifioinnin hyväksyttävyyden määrittämiseksi. Willcox'in todennäköisyydet 0,85 ja 0,95 on hyväksytty arvosteluperusteiksi onnistu-15 neelle identifioinnille (Williams, S.T., et ad. (1983), edellä; Priest, F.G. ja Alexander, B., (1988), edellä). Tun temattoman taksonominen etäisyys ryhmäsentroidista lasketaan, ja sitä voidaan verrata ryhmän säteeseen. Taksonomisen etäisyyden keskivirheen tulisi olla pienempi kuin 20 ylempi arvo +3,0, jota Sneath, P.H.A. on esittänyt ((1979), ss. 195-213). Tietyssä ryhmässä läsnä olevan tuntemattoman identtisyyden lisävarmistamiseksi voidaan sen lisäksi käyttää fysikaalisia tunnusmerkkejä, biokemiallisia lisätuloksia ja kemotaksonomisia markkereita.

25 Näiden viiden kuvauksen avulla saadut tulokset, yhdessä numeerisesta taksonomia-analyysistä ja kemotaksonomisista tuloksista saatujen tilastollisten tulostietojen kanssa, ovat osoituksena vakaasta luokittelusta, joka identifioi 6 pää-30 ryhmää uusia gram-negatiivisia alkalofiilisiä bakteereja.

Alkalikestoisten entsyymien tuottaminen ja käyttö Tämän keksinnön mukaisesti tuotettavat alkalofiiliset mikro-35 organismit tuottavat useita erilaisia alkalia sietäviä entsyymejä. Esimerkkejä entsyymiaktiivisuuksista, joita on läsnä tämän keksinnön mukaisesti tuotettavia gram-negatiivisia bakteereja edustavissa kannoissa, voidaan löytää Liitteistä 69 D ja E. Nämä entsyymit kykenevät suorittamaan tehtävänsä äärimmäisen korkeassa pH:ssa, mikä tekee niistä ainutlaatuisen sopivia niiden käyttämiseksi monissa erilaisissa prosesseissa, joissa tarvitaan sellaista entsyymiaktiivisuutta ympä-5 ristöissä tai reaktio-olosuhteissa, joiden pH on korkea.

Esimerkit erilaisista käyttösovellutuksista, koskien alkali-kestoisia entsyymejä, ovat pesuainekoostumuksissa, nahan parkitsemisessa, elintarvikkeiden käsittelyssä, jätteiden 10 käsittelyssä ja tekstiiliteollisuudessa. Näitä entsyymejä voidaan käyttää myös biologisissa muunnoksissa (biotrans-formaatioissa), erityisesti puhtaiden enantiomeerien valmistuksessa .

15 Tämän keksinnön mukaisia alkalofiilisiä bakteereja voidaan helposti seuloa alkalikestoisten lipaasien, proteaasien ja tärkkelystä hajottavien entsyymien tuotantoa varten, mm., käyttäen tässä kuvailtavia menetelmiä.

20 Liemi, jossa alkalofiilisiä bakteereja viljellään, sisältää tyypillisesti yhtä tai useampaa entsyymiaktiivisuustyyppiä. Entsyymin tai entsyymejä sisältävää lientä voidaan käyttää suoraan haluttuun prosessiin sen jälkeen, kun bakteerit on poistettu siitä esimerkiksi sentrifugoimalla tai suodatta-25 maila.

Viljelmän suodos voidaan haluttaessa väkevöidä pakastekui-vaamalla, ennen tai jälkeen dialysoinnin, tai ultrasuoda-tuksen avulla. Entsyymit voidaan myös ottaa talteen saosta-30 maila ja suodattamalla. Liemen sisältämä entsyymi tai entsyymit voidaan vaihtoehtoisesti eristää ja puhdistaa esimerkiksi kromatografisilla menetelmillä tai geelielektrofo-reesin avulla, ennen käyttämistä haluttuun prosessiin. Tarkat menetelmät, joita käytetään viljelmän suodoksen käsitte-35 lemiseen ja/tai alkalikestoisten entsyymien uuttamiseen ja/tai puhdistamiseen, eivät ole tämän keksinnön kannalta ratkaisevia, ja voidaan määrittää alaa tuntevan henkilön toimesta.

70

Kiinnostuksen kohteena olevia alkalikestoisia entsyymejä koodittavat geenit voidaan kloonata ja ilmentää organismeissa, jotka kykenevät ilmentämään haluttua entsyymiä puh-5 taassa muodossa tai helposti talteen otettavassa muodossa.

Seuraavat esimerkit esitetään menetelmien kuvaamiseksi tämän keksinnön mukaisten gram-negatiivisten alkalofiilisten bakteerien identifiointia varten, samoin kuin näiden alkalofii-10 listen bakteerien seulontamenetelmien kuvaamiseksi, koskien erilaisten alkalikestoisten entsyymien läsnäoloa, ja menetelmien kuvaamiseksi näiden entsyymien myöhempää tuotantoa ja käyttöä varten teollisissa prosesseissa. Näitä esimerkkejä ei tule tulkita tämän keksinnön piiriä rajoittavaksi.

15

Esimerkki 1

Tuntemattomien isolaattien identifiointi 20 Kuusi gram-negatiivista, alkalofiilistä bakteerikantaa eristettiin Mono Lake'sta, ylisuolaisesta alkalisesta järvestä, joka sijaitsee Kaliforniassa, USA:ssa (Javor, B., julkaisussa Hypersaline Environments, Springer Verlag, Berliini ja Heidelberg (1988), ss. 303-305). Kannat eristettiin näyt-25 teistä, jotka käsittivät osittain pinnanalaista, soodapääl-lysteistä puuta, sintteriä ja soodamaata, kerättyinä Mono Lake'n piiristä (Kalifornia, USA) toukokuussa 1990, rikas-tusviljelyn avulla 37°C:ssa Alusta A:ssa (Liite A). Kuutta kantaa kuvaillaan taulukossa 19. Kantoja tutkittiin käyttäen 30 21:tä testiä 24:stä vähimmäistestistä, jotka on lueteltu taulukossa 16. Ominaisuustilat määritettiin ja identifioin-tipistearvot saatiin käyttäen MATIDEN-ohjelmaa. Tulokset esitetään taulukossa 20.

Taulukko 19 71

AlkalofUliset kannat Mono Lake'lta 5 Pesäkkeen ^ _ _ _ _ _ _ _ Solun

Kanta Näyte Väri_Muoto Pystykuva Reuna muoto ML005 sintteri beige pyöreä kupera ehyt sauva ML104 puuaine punerva/ pyöreä kupera ehyt sauva 10 beige ML201 puuaine keltainen pyöreä kupera ehyt sauva ML203 puuaine punerva/ pyöreä kupera ehyt sauva beige ML206 puuaine keltainen pyöreä kupera ehyt lyhyt 15 sauva ML301 maa beige pyöreä kupera ehyt sauva 20 Taulukko 20

Esimerkki MATIDEN-ohjelman tulosteesta kuuden tuntemattoman kannan identifioimiseksi identifiointimatriisia vastaan 25 A. Tuntemattoman viitenumero on ML005

Arvo Prosenttia: tunte- Paras Seur. paras

Ominaisuus mattomassa taksoni taksoni 30 [23] N-asetyyliglukosamiini + 26 20 [26] Sakkaroosi + 74 20 [27] Maltoosi + 68 60 [32] Laktaatti + 99 99 [41] Propionaatti + 91 60 35 [43] Valeraatti + 97 80 [44] Sitraatti + 94 20 [45] Histidiini + 71 1 [47] Glykogeeni + 26 20 72 [51] 3-hydroksibutyraatti + 94 99 [52] 4-hydroksibentsoaatti - 71 80 [58] Leusiiniaryyliamidaasi + 94 60 [59] Valiiniaryyliamidaasi + 65 99 5 [64] Fosfohydrolaasi - 3 20 [65] α-galaktosidaasi e.t. 3 20 [85] Amp isilliini - 56 1 [92] Fusidiinihappo - 3 20 [93] Metisilliini - 50 1 10 [99] Polymyksiini + 81 99 [102] Vankomysiini - 3 20 [105] Kelt, pesäke - 11 [106] Läpinäk. pesäke e.t. 3 1 [107] Lipaasi e.t. 21 1 15 [108] Oksidaasi (10 sek.) + 61 e.t. = ei testattu

Isolaatin ML005 paras tunniste on ryhmä 3. Pistearvot ker-20 toimille: 1 (Willcox'in todennäköisyys), 2 (Taksonominen etäisyys), 3 (Taksonomisen etäisyyden keskivirhe).

12 3

Ryhmä 3 0,9999 0,407 1,475 25 Ryhmä 4 0,8266 x 10~4 0,526 4, 590

Ryhmä 2 0,4086 x 10~7 0,584 6,296

Ominaisuudet vastaan Ryhmä 3 % Taksonissa Arvo tuntemat-30 tomassa [108] Oksidaasi (10 sek.) 6 + 73

Lisäominaisuudet, jotka auttavat erottamaan

Ryhmä 3:n Ryhmä 4:stä o o, o o 5 [106] Läpinäkyvä pesäke 3 99 [107] Lipaasi 21 99 B. Tuntemattoman viitenumero on ML104 10

Arvo Prosenttia: tunte- Paras Seur. paras

Ominaisuus mattomassa taksoni taksoni [23] N-asetyyliglukosamiini - 13 1 [26] Sakkaroosi - 25 1 [27] Maltoosi - 25 1 [32] Laktaatti - 38 50 20 [41] Propionaatti - 1 99 [43] Valeraatti - 13 99 [44] Sitraatti - 13 50 [45] Histidiini - 1 1 [47] Glykogeeni - 1 13 25 [51] 3-hydroksibutyraatti - 13 25 [52] 4-hydroksibentsoaatti - 1 1 [58] Leusiiniaryyliamidaasi + 88 63 [59] Valiiniaryyliamidaasi + 88 25 [64] Fosfohydrolaasi + 88 13 30 [65] α-galaktosidaasi e.t. 1 1 [85] Amp isilliini - 50 63 [92] Fusidiinihappo - 25 1 [93] Metisilliini - 50 13 [99] Polymyksiini + 88 50 35 [102] Vankomysiini - 13 13 [105] Kelt, pesäke - 1 1 [106] Läpinäk. pesäke e.t. 1 99 [107] Lipaasi e.t. 1 99 74 [108] Oksidaasi (10 sek.) + 25 88 e.t. = ei testattu 5 Isolaatin ML104 paras tunniste on ryhmä 1. Pistearvot ker-toimille: 1 (Willcox'in todennäköisyys), 2 (Taksonominen etäisyys), 3 (Taksonomisen etäisyyden keskivirhe).

12 3 10 Ryhmä 1 0,9999 0,271 -1,108

Ryhmä 2 0,825 x 10~5 0,473 3, 797

Ryhmä 4 0,407 x 10~7 0,534 4, 767

Ominaisuuksia vastaan Ryhmä 1 15 % Taksonissa Arvo tuntemat- (ei yhtään) tomassa

Lisäominaisuuksia, jotka auttavat erottamaan

Ryhmä 1:n Ryhmä 2:sta 20 % % [106] Läpinäkyvä pesäke 1 99 [107] Lipaasi 1 99

Ryhmä 1:n Ryhmä 4:stä 25 % % (ei yhtään) C. Tuntemattoman viitenumero on ML201 30 Arvo Prosenttia: tunte- Paras Seur. paras

Ominaisuus mattomassa taksoni taksoni [23] N-asetyyliglukosamiini - 1 13 35 [26] Sakkaroosi - 25 25 [27] Maltoosi - 50 25 [32] Laktaatti - 1 38 [41] Propionaatti - 1 1 75 [43] Valeraatti - 1 13 [44] Sitraatti - 50 13 [45] Histidiini - 1 1 [47] Glykogeeni - 25 1 5 [51] 3-hydroksibutyraatti - 1 13 [52] 4-hydroksibentsoaatti - 1 1 [58] Leusiiniaryyliamidaasi + 50 88 [59] Valiiniaryyliamidaasi + 25 88 [64] Fosfohydrolaasi + 75 88 10 [65] α-galaktosidaasi e.t. 75 1 [85] Amp isilliini + 99 50 [92] Fusidiinihappo + 99 25 [93] Metisilliini + 99 50 [99] Polymyksiini - 1 88 15 [102] Vankomysiini + 99 13 [105] Kelt, pesäke + 99 1 [106] Läpinäk. pesäke e.t. 1 1 [107] Lipaasi e.t. 1 1 [108] Oksidaasi (10 sek.) - 1 25 20 e.t. = ei testattu

Isolaatin ML201 paras tunniste on ryhmä 5. Pistearvot ker-toimille: 1 (Willcox'in todennäköisyys), 2 (Taksonominen 25 etäisyys), 3 (Taksonomisen etäisyyden keskivirhe).

12 3

Ryhmä 5 0,9999 0,267 -0,176

Ryhmä 1 0,835 x 10~4 0,437 2,435 30 Ryhmä 2 0, 177 x 10-11 0,641 7,593

Ominaisuuksia vastaan Ryhmä 5 % Taksonissa Arvo tuntemattomassa 35 (ei yhtään) 76

Lisäominaisuuksia, jotka auttavat erottamaan

Ryhmä 5;n Ryhmä l;stä o o

O O

[65] a-galaktosidaasi 75 1 5 Ryhmä 5:n Ryhmä 2:sta o o

O O

[65] a-galaktosidaasi 75 1 [106] Läpinäkyvä pesäke 1 99 [107] Lipaasi 1 99 10 D. Tuntemattoman viitenumero on ML203

Arvo Prosenttia: tunte- Paras Seur. paras 15 Ominaisuus mattomassa taksoni taksoni [23] N-asetyyliglukosamiini + 26 20 [26] Sakkaroosi + 74 20 [27] Maltoosi + 68 60 20 [32] Laktaatti + 99 99 [41] Propionaatti + 91 60 [43] Valeraatti + 97 80 [44] Sitraatti + 94 20 [45] Histidiini +71 1 25 [47] Glykogeeni + 26 20 [51] 3-hydroksibutyraatti + 94 99 [52] 4-hydroksibentsoaatti + 71 80 [58] Leusiiniaryyliamidaasi + 94 60 [59] Valiiniaryyliamidaasi + 65 99 30 [64] Fosfohydrolaasi - 3 20 [65] α-galaktosidaasi e.t. 3 20 [85] Ampisilliini - 56 1 [92] Fusidiinihappo - 3 20 [93] Metisilliini - 50 1 35 [99] Polymyksiini + 81 99 [102] Vankomysiini + 3 20 [105] Kelt, pesäke - 1 1 [106] Läpinäk. pesäke e.t. 3 1 77 [107] Lipaasi e.t. 21 1 [108] Oksidaasi (10 sek.) + 6 1 e.t. = ei testattu 5

Isolaatin ML203 paras tunniste on ryhmä 3. Pistearvot ker-toimille: 1 (Willcox'in todennäköisyys), 2 (Taksonominen etäisyys), 3 (Taksonomisen etäisyyden keskivirhe).

10 12 3

Ryhmä 3 0,9989 0,437 2,076

Ryhmä 4 0,1090 x 10-2 0,526 4,590

Ryhmä 2 0,8137 x 10~9 0,650 7, 793 15 Ominaisuuksia vastaan Ryhmä 3 % Taksonissa Arvo tuntemattomassa [102] Vankomysiini 3 + [108] Oksidaasi (10 sek.) 6 + 20

Lisäominaisuuksia, jotka auttavat erottamaan

Ryhmä 3:n Ryhmä 4:sta o. o, "o o (ei yhtään) 25 E. Tuntemattoman viitenumero on ML206

Arvo Prosenttia: tunte- Paras Seur. paras 30 Ominaisuus mattomassa taksoni taksoni [23] N-asetyyliglukosamiini - 1 13 [26] Sakkaroosi + 25 25 [27] Maltoosi - 50 25 35 [32] Laktaatti - 1 38 [41] Propionaatti - 1 1 [43] Valeraatti - 1 13 [44] Sitraatti - 50 13 78 [45] Histidiini - 1 1 [47] Glykogeeni + 25 1 [51] 3-hydroksibutyraatti - 1 13 [52] 4-hydroksibentsoaatti _ 1 1 5 [58] Leusiiniaryyliamidaasi + 50 88 [59] Valiiniaryyliamidaasi + 25 88 [64] Fosfohydrolaasi + 75 88 [65] α-galaktosidaasi e.t. 75 1 [85] Ampisilliini + 99 50 10 [92] Fusidiinihappo + 99 25 [93] Metisilliini + 99 50 [99] Polymyksiini - 1 88 [102] Vankomysiini + 99 13 [105] Kelt, pesäke + 99 1 15 [106] Läpinäk. pesäke e.t. 1 1 [107] Lipaasi e.t. 1 1 [108] Oksidaasi (10 sek.) - 1 25 e.t. = ei testattu 20

Isolaatin ML206 paras tunniste on ryhmä 5. Pistearvot ker-toimille: 1 (Willcox'in todennäköisyys), 2 (Taksonominen etäisyys), 3 (Taksonomisen etäisyyden keskivirhe).

25 12 3

Ryhmä 5 0,9999 0,345 1,766

Ryhmä 1 0,2530 x 10~5 0,512 4, 013

Ryhmä 6 0,2531 x 10~13 0,652 10,883 30 Ominaisuuksia vastaan Ryhmä 5 % Taksonissa Arvo tuntemattomassa (ei yhtään) 79

Lisäominaisuuksia, jotka auttavat erottamaan

Ryhmä 5:n Ryhmä 1:stä o o, o o 5 [65] a-galaktosidaasi 75 1 F. Tuntemattoman viitenumero on ML301

Arvo Prosenttia: 10 tunte- Paras Seur. paras

Ominaisuus mattomassa taksoni taksoni [23] N-asetyyliglukosamiini - 26 1 [26] Sakkaroosi + 74 1 15 [27] Maltoosi + 68 1 [32] Laktaatti + 99 50 [41] Propionaatti + 91 99 [43] Valeraatti + 97 99 [44] Sitraatti + 94 50 20 [45] Histidiini + 71 1 [47] Glykogeeni + 26 13 [51] 3-hydroksibutyraatti + 94 25 [52] 4-hydroksibentsoaatti - 71 1 [58] Leusiiniaryyliamidaasi + 94 63 25 [59] Valiiniaryyliamidaasi + 65 25 [64] Fosfohydrolaasi - 3 13 [65] α-galaktosidaasi e.t. 3 1 [85] Amp isilliini + 56 63 [92] Fusidiinihappo - 31 30 [93] Metisilliini + 50 13 [99] Polymyksiini + 81 50 [102] Vankomysiini - 3 13 [105] Kelt, pesäke - 11 [106] Läpinäk. pesäke e.t. 3 99 35 [107] Lipaasi e.t. 21 99 [108] Oksidaasi (10 sek.) + 6 88 e.t. = ei testattu 80

Isolaatin ML301 paras tunniste on ryhmä 3. Pistearvot ker-toimille: 1 (Willcox'in todennäköisyys), 2 (Taksonominen etäisyys), 3 (Taksonomisen etäisyyden keskivirhe).

5 12 3

Ryhmä 3 1,000 0,429 1,918

Ryhmä 2 0,2841 x 10~6 0,603 6, 731

Ryhmä 4 0,9313 x 10~8 0,623 6, 704 10

Ominaisuuksia vastaan Ryhmä 1 % Taksonissa Arvo tuntemattomassa [108] Oksidaasi (10 sek.) 6 + 15

Lisäominaisuuksia, jotka auttavat erottamaan

Ryhmä 3:n Ryhmä 2:sta o. o, "o "o [106] Läpinäkyvä pesäke 3 99 20 [107] Lipaasi 21 99

Esimerkki 2 25 Proteolyyttisien entsyymien tuottaminen

Kahden alkalofiilisen kannan (1E.1 ja 9B.1) proteolyyttisen entsyymin (entsyymien) tuotanto testattiin 7:ssä erilaisessa alustassa, jotka oli tasapainotettu alkalisessa pH:ssa. Ko-30 keet suoritettiin 2 litran ravistelupulloissa, joissa oli haitat, jokaisen pullon sisältäessä 400 ml ravintoalustaa R-X (Liite A). Pullot sijoitettiin orbitaali-inkubaattoriin, joka pyöri 280 kierrosta minuutissa vakiolämpötilassa 37°C:ssa. Viljelyalustanäytteitä poistettiin pulloista 1, 2, 35 3, 4, 5, 6 ja 8 päivän välein entsyymipitoisuuden määrittä mistä varten, joka ilmaistaan Alkaline Delft Units-yksik-köinä (ADU - jota kuvaillaan GB-patenttijulkaisussa 1 353 317) .

81

Taulukossa 21 esitetään maksimaaliset entsyymisaannot ja viljelyalustan pH sillä hetkellä, jolloin entsyymitaso määritettiin .

5

Taulukko 21

Proteolyyttisten entsyymien tuotanto Kanta 1E.1CT Kanta 9B.1

10 Alusta ADU/ml Alustan pH ADU/ml Alustan pH

R 100 8,2 14 9,7 S 140 8,5 49 9,1 T 111 8, 7 6 9,1 15 U 6 9,7 4 9,7 V 51 9,5 7 9,6 W 94 9,2 7 9,3 X 100 9,6 28 9,6 20

Testitulokset osoittavat selvästi proteolyyttisten entsyymien läsnäolon, joita tämän keksinnön mukaiset alkalofiili-set bakteerit ovat tuottaneet kasvuliemessä.

25 Esimerkki 3

Pesusuorituskykytesti käyttäen proteolyyttisiä entsyymejä

Alkalofiilisten bakteerien entsyymivalmisteita testattiin 30 erityisesti kehitetyssä minipesukokeessa käyttäen puuvilla-tilkkuja (2,5 x 2,5 cm), jotka oli tahrattu maidolla, verellä ja musteella (saatu EMPA'lta, St. Gallen, Sveitsi, ja merkinnällä EMPA 116). Ennen pesukoetta tilkkuja esikäsitel-tiin liuoksella, joka sisälsi anionista pinta-aktiivista pe-35 suainetta, natriumperboraattia ja valkaisuaktivaattoria (TAED) ympäröivässä lämpötilassa 15 minuutin ajan. Tämän käsittelyn jälkeen testiliuskat huuhdeltiin juoksevassa vedessä, josta oli poistettu suola, 10 minuutin ajan ja ilmakui- 82 vattiin. Tästä käsittelystä on tuloksena lian kiinnittyminen, mikä tekee sen poistamisesta vaikeamman.

Pesukokeet suoritettiin 100 ml:n erlenmeyerpulloissa, jotka 5 oli varustettu haitalla, ja jotka sisälsivät 30 ml määrättyä pesuainekoostumusta sekä 300 ADU:a testattavaa proteaasia. Kuhunkin pulloon sijoitettiin kaksi esikäsiteltyä EMPA 116 -testitilkkua. Pullot asetettiin edestakaisin ravistelevaan vesihauteeseen (2 cm:n liikepituus) ja ravisteltiin 320 lii-10 kettä minuutissa. Kokeet suoritettiin 40°C:ssa 30 minuutin aikana. Pesun jälkeen tilkkuja huuhdeltiin juoksevassa vedessä, josta suola oli poistettu, 10 minuuutin ajan ja ilma-kuivattiin. Testitilkkujen reflektanssi mitattiin 680 nm:ssä Photovolt-fotometrin avulla (Malli 577), joka oli varustettu 15 vihreäsuotimellä.

Usean erilaisen alkalofiilisen bakteeriviljelmän superna-tanttifraktion pesuteho eurooppalaisissa pesuainejauheissa määritettiin edellä määritellyn menetelmän mukaisesti. Su-20 pernatanttifraktioita käsiteltiin eri tavoin entsyymiä sisältävien valmisteiden valmistamiseksi.

100 ml:n erlenmeyerpulloihin panostettiin pesuainejauhetta IEC, liuotettuna normin mukaiseen johtoveteen, jonka saksa-25 lainen kovuus oli 15°, jotta saatiin loppupitoisuudeksi 4 g litraa kohti.

Pesuainejauhe IEC:n koostumus oli seuraava: 30 Komponentti p-%

Lineaarinen natriumalkyylibentseenisulfonaatti 6,4 (alkaaniketjun keskiketjunpituus (Cll,5))

Etoksyloitu talialkoholi (14EO) 2,3

Natriumsaippua 2,8 35 Natriumtripolyfosfaatti (STPP) 35,0

Natriumsilikaatti 6,0

Magnesiumsilikaatti 1,5

Karboksimetyyliselluloosa 1,0 83

Natriumsulfaatti 16,8

Natriumperboraattitetrahydraatti 18,5 TAED 1,5

Sekalaista + vesi 100:ksi 5

Normaali vesijohtovesi sisältää CaCl2x2H20:ta, 0,291 g/1; MgCl2x6H20:ta, 0,140 g/1 ja NaHCCbia, 0,210 g/1 liuotettuna suolavapaaseen veteen.

10 Kuhunkin pulloon lisättiin kaksi EMPA 116 -tilkkua ja riittävästi entsyymiä sisältäviä valmisteita, jotta loppuaktii-visuudeksi saatiin 300 ADU:a. Saippuaveden lopputilavuus oli 30 ml. Vertailun vuoksi yksi pullo ei sisältänyt lainkaan entsyymivalmistetta, joka oli korvattu vedellä. Koe toistet-15 tiin joko kaksi tai kolme kertaa. Tulokset esitetään taulukossa 22 .

Taulukko 22 Käyttöpesukokeet 20 proteolyyttistä entsyymiä sisältävien valmisteiden suorituskyky pesutormulaatiossa Käsittelemätön viljelmän supernatantti 25 Valmiste Keskimäärin liuennut EMPA 116 -testitilkuista

Kannasta_Koe 1_Koe 2_Koe 3

Ei yhtään (kontrolli) 11,4 11,8 13,0 IE. 1CT 29,2 22,2 24,7 30 9B.1 23,7 23,9 24,2 17N. 1CT 11,8 18,4 24B. 1CT 17,3 16,3 84

Pakastekuivattu supernatanttifraktio

Valmiste Keskimäärin liuennut EMPA 116 -testitilkuista 5 Kannasta_Koe 1_Koe 2_Koe 3

Ei yhtään (kontrolli) 10,4 11,8 13,0 IE. 1CT 15, 1 28, 9 30,0 9B.1 21,7 14,9 17,4 10 17N. 1CT 13,7 17,9 24B.1 17,8 17,3

Dialysoitu supernatanttifraktio 15 Valmiste Keskimäärin liuennut EMPA 116 -testitilkuista

Kannasta_Koe 1_Koe 2_Koe 3

Ei yhtään (kontrolli) 11,4 11,8 13,0 IE. 1CT 26, 4 22, 7 26,3 20 9B.1 18,7 16,7 17,0 17N. 1CT 12,0 12,6 24B.1 12,6 12,4

Supernatanttifraktjoiden ultrasuodatuskonsentraatti 25

Valmiste Keskimäärin liuennut EMPA 116 -testitilkuista

Kannasta Koe 1 Koe 2

Ei yhtään (kontrolli 10,4 11,4 30 IE. 1CT 14,6 26,0 9B.1 15,5 16,1 85

Supernatanttifraktioiden asetönisaostumat

Valmiste Keskimäärin liuennut EMPA 116 -testitilkuista 5 Kannasta Koe 1 Koe 2

Ei yhtään (kontrolli) 10,4 11,4 IE. 1CT 13,4 23,4 9B.1 12,6 14,7 10

Koetulokset osoittavat tämän keksinnön mukaisten kantojen tuottamien proteolyyttisten entsyymien tehokkuuden pesu-aineformulaatioissa, toimitettuna eri muodoissa, ja saadun parannetun pesutehon.

15

Esimerkki 4 Tärkkelystä pilkkovien entsyymien tuottaminen 20 Kannasta 1E.1CT testattiin tärkkelystä pilkkovien entsyymien tuotanto tärkkelystä sisältävällä alustalla, joka oli tasapainotettu alkalisessa pH:ssa.

500 ml:n erlenmeyerpulloihin panostettiin 100 ml alkalista 25 alustaa (Alusta Y, Liite A) , joka sisälsi 2 % liukoista tärkkelystä. Pulloihin siirrostettiin (5 %) kannan 1E.1CT-soluja, joita oli kasvatettu 24 tunnin ajan Alusta A:11a (37°C). Kontrolleiksi siirrostettiin myös samanlaiset, alkalista alustaa sisältävät pullot, jotka eivät sisältäneet 30 tärkkelystä.

Pullot asetettiin orbitaaliravisteluinkubaattoriin, joka pyöri 280 kierrosta minuutissa, vakiolämpötilassa 37°C 24 tunnin ajan. Entsyymiaktiivisuuden sisältävä neste erotet-35 tiin soluista 10 minuutin kuluessa nopeudessa 4000 rpm.

Supernatantin entsyymiaktiivisuus määritettiin käyttäen Nelson' in ja Somogyi'n pelkistävien sokerien määritystä (Met 86 hods in Microbiology, volyymi 5B, ss. 300-301; (edit. J.R. Norris ja D.W. Ribbons), Academic Press, Lontoo, 1971).

Tärkkelystä pilkkovan entsyymin aktiivisuuden määrittäminen 5 pelkistävien sokerien määrityksen avulla Liuokset

Reagenssi 1 10 144 g Na2SC>4:ää liuotetaan lievästi lämmittäen 500 mitään suolavapaata vettä. Liuoksiin lisätään 12 g kaliumnatrium-tartraattitetrahydraattia, 24 g Na2C03ta ja 16 g NaHCChta. Liuoksen kokonaistilavuus säädetään 800 mltksi lisäämällä suolavapaata vettä.

15

Reagenssi 2 36 g Na2S04tää liuotetaan lievästi lämmittäen 100 mitään suolavapaata vettä ja lämmitettyyn liuokseen lisätään 4 g Cu-20 SChxätbOtta. Liuoksen kokonaistilavuus säädetään 200 mltksi lisäämällä suolavapaata vettä.

Välittömästi ennen käyttöä, reagenssit 1 ja 2 sekoitetaan suhteessa 4:1 (reagenssi 1 : reagenssi 2).

25

Reagenssi 3 25 g ammoniummolybdaattitetrahydraattia liuotetaan 450 mitään suolavapaata vettä, ja 21 ml väkevöityä rikkihappoa 30 lisätään kunnollisessa sekoituksessa. 3 g Na2HAsC>4x7H201 ta liuotetaan 25 mitään suolavapaata vettä, ja tämä liuos lisätään molybdaattiliuokseen. Yhdistettyä liuosta lämmitetään 48 tunnin ajan 37°Ctssa ja kaikki saostuma suodatetaan pois.

100 mg glukoosia liuotetaan suolavapaaseen veteen ja koko- 5 naistilavuus säädetään 100 ml:ksi. Ennen käyttöä liuos lai mennetaan 10-kertaisesti suolavapaalla vedellä.

87

Standardi

Substraatti 10 0,25 % liukoista tärkkelystä (Merck, tuotenumero 1257) liuo tettuna 0,1 M Na2CC>3-NaHCC)3-puskuriin, pH 10,1.

Määritys 15 0,9 ml tärkkelyssubstraattiliuosta, pH 10,1 lisätään koeput keen. Koeputki asetetaan vesihauteeseen 25°C:seen ja annetaan tasapainottua. Entsyymireaktio aloitetaan lisäämällä 0,1 ml entsyymiä sisältävää viljelmän supernatanttia. Reaktion annetaan jatkua 30 minuutin ajan. Reaktio pysäytetään lisää-20 mällä 1 ml Reagenssi 1/2:ta ja kuumentamalla 10 minuutin ajan 100°C:ssa. Seos jäähdytetään jäiden päällä 5 minuutin aikana, ja sen jälkeen lisätään 0,5 ml reagenssi 3:a, ja sinisen värin annetaan kehittyä 30 minuutin aikana huoneen lämpötilassa. Seos laimennetaan lisäämällä 1,0 ml suolava-25 paata vettä, ja ekstinktio mitataan 500 nm:ssä spektrofoto-metrissä. Pelkistävät sokerit määritetään glukoosiekviva-lentteina standardikuvaajalta.

Yhdeksi tärkkelystä pilkkovaksi entsyymiäköiivisuusyksiköksi 30 määritellään 1 pg vapautuneita pelkistäviä sokereita mitattuna glukoosina, millilitraa kohti minuutissa pH 10,l:ssä ja 25°C:ssa.

Taulukossa 23 esitetään muodostuneiden tärkkelystä pilkko-35 vien entsyymiyksikköjen määrä.

88

Taulukko 23 Tärkkelystä pilkkovien entsyymien tuotanto kannalla IE.1

Optinen 5 Alusta tiheys Loppu-pH Entsyymiyksikköjä/1 5 5 0 nm + tärkkelys 2,25 9,4 1150 ei tärkkelystä 0,75 10,3 660 10

Kokeen tulokset osoittavat selvästi tämän keksinnön mukaisen bakteerikannan tuottamien tärkkelystä pilkkovien entsyymien läsnäolon kasvuliemessä.

15 Esimerkki 5 Tärkkelystä pilkkovien entsyymien pysyvyys pesuaineessa

Kannan 1E.1 tärkkelystä pilkkovien entsyymien kyky kestää 20 pesuaineita, mikä on olennaista niiden käytön kannalta suur-pesuaineissa tai tekstiilien liisterinpoistossa, osoitetaan.

100 ml:n erlenmeyerpulloihin, jotka oli varustettu haitoilla, panostettiin kuhunkin 30 ml 0,1 M Na2C03/NaHCC>3-puskuria, 25 pH 10,1, joka sisälsi 0,12 g natriumdodekyylisulfaattia (vastaa 4 g litrassa). Puoleen pulloista lisättiin 0,3 g perunatärkkelystä (vastaa 1 %:ia).

Kuhunkin pulloon annosteltiin entsyymiä sisältävää superna-30 tanttia kannasta 1E.1CT, lisäämällä 0,5, 1,0 tai 2,0 ml (taulukko 23). Supernatanttineste korvattiin 1,0 ml :11a vettä kontrolliksi. Välittömästi entsyymin lisäämisen jälkeen poistettiin 0,1 ml:n näyte (aika=nolla tuntia) entsyymi-aktiivisuuden mittaamista varten.

Pulloja inkuboitiin ravistellen 25°C:ssa 2,5 tunnin ajan, jona ajanhetkenä toinen 0,1 ml:n näyte poistettiin entsyymi-aktiivisuuden mittaamista varten.

35 89

Koe toistettiin vertailun vuoksi käyttäen Bacillus subti- liksesta saatua tavanomaista a-amylaasia.

5 Entsyymiaktiivisuus määritettiin käyttäen edellä kuvailtua pelkistävien sokereiden menetelmää.

Tulokset on esitettynä taulukossa 24.

10 Taulukko 24

Kannan 1E.1CT tärkkelystä pilkkovien entsyymien pysyvyys pesuaineissa

Entsyymiä sisältävää Entsyymi- 15 supernatanttia yksikköjä elpynyt lisätty (ml) Olosuhteet pH Oh. 2,5 h 0 * 10,4 0 0 0,5 SDS 10,3 26 20 20 1,0 10,3 44 48 2.0 10,3 109 113 0 * 10,3 0 0 0,5 SDS + 10,2 12 17 25 1,0 Tärkkelys 10,1 36 48 2.0 10,2 79 120

Standardi § SDS 10,4 0 0

Standardi § SDS + Tärkkelys 10,2 0 0 30 * korvattu 1 ml :11a vettä § 2,8 RAU-yksikköä Bacillus subtiliksen α-amylaasia - Yksi RAU (Reference Amylase Unit) määritellään entsyymimääräksi, 35 joka muuntaa 1 mg:n tärkkelystä minuutissa pH 6,6:ssa ja 30°C:ssa tuotteeksi, jolla tuotteella, reaktiossa jodin kanssa, on vastaavan suuruinen absorbanssi 620 nm:ssä kuin liu 90 oksella, joka sisältää 25 g CoCl2x6H20:ta, 3,84 g K2Cr207:ää ja 1 ml 1 M HCl:ää 100 ml:ssa tislattua vettä.

Tämän testin tulokset osoittavat selvästi tärkkelystä pilk-5 kovien entsyymien pysyvyyden pesuaineen läsnä ollessa, joita entsyymejä tämän keksinnön mukainen alkalofiilinen bakteerikanta tuottaa.

Esimerkki 6 10

Lipolyyttisten entsyymien tuottaminen

Yhdestätoista uudesta kannasta, jotka selvästi ilmensivät lipaasiaktiivisuutta (Liite D), testattiin edelleen lipo-15 lyyttisten entsyymien tuotanto. Nuo yksitoista kantaa ovat esimerkkejä ryhmä 2:sta ja ryhmä 3:sta (kuvio 1).

Kokeet suoritettiin 100 ml:n erlenmeyerpulloissa, jotka sisälsivät 30 ml steriiliä alkalista ravintoalustaa, pH 9,6, 20 siirrostettuina sopivalla bakteerikannalla. Kolmea erilaista alustaa käytettiin, merkittynä Z - BB (Liite A). Pullot asetettiin ravistelevaan orbitaali-inkubaattoriin (300 rpm) 30°C:ssa 48 tunnin ajaksi.

25 Solut erotettiin kasvuliemestä sentrifugoimalla ja superna-tantti dialysoitiin 50 tilavuutta vastaan 0,1 M Tris-HCl-puskuria pH 9, vaihtaen puskuri kolmesti24 tunnin kuluessa.

Dialysaatti pakastekuivattiin, jolloin saatiin lipaasival-miste (taulukko 25) .

30 Tämän esimerkin mukaisesti saatuja lipaasivalmisteita käytettiin esimerkissä 7 jäljempänä kuvailtavaan pesukokeeseen.

91

Taulukko 25 Lipaasituotanto

Tuotanto- Lipaasia Lipaasia 5 Kanta alusta TLU/ml* TLU/g 39E.3 BB 1,3 134 40E.3 Z 1,2 118 4IE.3 Z 1,1 82 10 42E.3 Z 1,2 76 44E.3 Z 1,2 99 45E. 3CT AA 1,4 98 48E.3 BB 2,0 152 49N.3 BB 1,5 123 15 50N.3 BB 2,0 100 51N.3 BB 1,0 98 52N.3 BB 1,2 128 * TLU = True Lipase Unit -yksikkö, joka määritellään US- 20 patentissa 4,933,287.

Tämän testin tulokset osoittavat selvästi lipolyyttisten entsyymien läsnäolon, joita tämän keksinnön mukaiset alka-lofiiliset bakteerit ovat tuottaneet, kasvuliemessä ja dia-25 lysoidun kasvuliemen pakastekuivatussa valmisteessa.

Esimerkki 7

Lipaasipesukoe 30

Esimerkin 6 lipaasivalmisteista testattiin suorituskyky pe-suolosuhteissa TIDER-jauheessa (1,5 g/1), joka on Procter & Gamble'n pesuainetuote.

35 Pesukoe (SLM-testi) suoritettiin kuten US-patentissa 4 933 287 on kuvailtu, joka on tässä sisällytetty viitteenä. Kontrollina käytettiin lipaasia, joka oli saatu Pseudomonas ai- 92 caligenes -kannasta Ml (CB3 473.85), kuten US-patentissa 4,933,287 on kuvailtu. Tulokset esitetään taulukossa 26.

Taulukko 26 5 Lipaasipesukoe

Pesuaine: TIDER (jauhe), 1,5 g/1 Lipaasi: 2 TLU/ml

Ca2+: 1CT5 M (natriumtripolyfosfaatti lisättynä) 10 pH: 9,5

Takaisin saanti (%)

Kanta Triglyseridit Kokonaislipidi 15 39E.3 55,3 73,4 40E.3 82,0 89,9 41E.3 44, 7 78,7 42E.3 55,5 74,8 44E.3 6,6 76,9 20 45E. 3CT 81,6 92,9 48E.3 76,5 82,9 49N.3 72,4 82,0 50N.3 50,5 76,6 51N.3 80,4 87,6 25 52N.2 77, 0 84,7

Ml 88,5 91,5 kontrolli* 98,7 98,7 * Normin mukainen vesijohtovesi, joka määritellään US-pa-30 tentissä 4,933,287

Triglyseridien ja kokonaislipidien elpymisprosentin aleneminen, verrattuna kontrolliin, osoittaa selvästi tämän keksinnön mukaisten alkalofiilisten bakteerien tuottamien lipo-35 lyyttisten entsyymien kyvyn hajottaa ja poistaa triglyseri-dejä ja niiden hajotustuotteita, jotka on kiinnitettynä kan-gasnäytteessä, samoin kuin niiden parantuneen tehon verrattuna tunnettuun lipaasiin.

93

Liite A

Tässä keksinnössä käytetyt alustat 5 Alusta A

Glukoosi 10,0 gl-1

Peptoni (Difco: Detroit, MI, USA) 5,0 gl-1

Hiivauute (Difco) 5,0 gl_1 K2HP04 1,0 gl_1 10 MgS04x7H20 0,2 gl_1

NaCl 40,0 gl_1

Na2C03 10,0 gl_1 *Agar 2 0,0 gl-1 15 * (kun tarvitaan kiinteään alustaan)

Alusta B

Glukoosi 10,0 gl-1

Peptoni (Difco) 5,0 gl-1 20 Hiivauute (Difco) 5,0 gl-1 K2HP04 1,0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

NaCl 40,0 gl_1

Na2C03 10,0 gl_1 25 Novobiosiini 50,0 gl-1

Agar 2 0,0 gl-1

Alusta C

94

Glukoosi 10,0 gl-1 5 Peptoni (Difco) 5,0 gl_1

Hiivauute (Difco) 5,0 gl_1 K2HP04 1,0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

NaCl 40,0 gl_1 10 Na2C03 10,0 gl_1

Maidon albumiini 10,0 gl-1

Agar 20,0 gl-1

Alusta D 15

Glukoosi 10,0 gl-1

Peptoni (Difco) 5,0 gl-1

Hiivauute (Difco) 5,0 gl-1 K2HP04 1,0 gl-1 20 MgS04x7H20 0,2 gl-1

NaCl 40,0 gl-1

Na2C03 10,0 gl-1

Kaseiini 20,0 gl-1

Agar 2 0,0 gl-1 25

Alusta E

Liukoinen tärkkelys 10,0 gl-1

Peptoni (Difco) 5,0 gl-1 30 Hiivauute (Difco) 5,0 gl-1 K2HP04 1,0 gl-1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

NaCl 40,0 gl-1

Na2C03 10,0 gl-1 35 Maidon albumiini 10,0 gl-1

Agar 2 0,0 gl-1

Alusta F

95

Liukoinen tärkkelys 10,0 gl-1 5 Peptoni (Difco) 5,0 gl_1

Hiivauute (Difco) 5,0 gl_1 K2HP04 1,0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

NaCl 40,0 gl_1 10 Na2C03 10,0 gl_1

Kaseiini 20,0 gl-1

Agar 2 0,0 gl-1

Alusta G 15 Härän sappi (Oxoid: Basingstoke, UK) 10,0 gl-1 (NH4)2S04 5, 0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

Hiivauute (Difco) 0,5 gl_1 20 Maidon albumiini 10,0 gl-1

Agar 2 0,0 gl-1 Säädetty pH-arvoon 8,5 50 % risen Na2CC>3-liuoksen avulla

Alusta H 25 Härän sappi (Oxoid) 10,0 gl-1 (NH4)2S04 5, 0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

Hiivauute (Difco) 0,5 gl_1 30 Kaseiini 20,0 gl-1

Agar 2 0,0 gl-1 Säädetty pH-arvoon 8,5 50 % risen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta I

96

Sabouraud Dekstroosiagar (Oxoid) 65,0 gl-1 5 NaCl 40,0 gl_1

Na2C03 20, 0 gl_1

Sykloheksimidi 50,0 mgl-1

Penisilliini G 25000 IU1-1

Streptomysiini 25 mgl-1 10

Alusta J

Bacto Perunadekstroosiagar (Difco) 39,0 gl-1

NaCl 40,0 gl_1 15 Na2C03 20, 0 gl_1

Novobiosiini 50,0 mgl-1

Alusta K

20 Bacto Perunadekstroosiagar (Difco) 39,0 gl-1

NaCl 40,0 gl_1

Na2C03 20, 0 gl_1

Sykloheksimidi 50,0 mgl-1

Penisilliini G 25000 IU1-1 25 Streptomysiini 25,0 mgl-1

Alusta L

Glukoosi 0,2 gl_1 30 Peptoni (Difco) 0,1 gl_1

Hiivauute (Difco) 0,1 gl_1 K2HP04 1,0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

NaCl 40,0 gl_1 35 Na2C03 10,0 gl_1

Kaseiini 20,0 gl-1

Agar 2 0,0 gl-1

Alusta M (pH 9,6) 97 Härän sappi (Oxoid) 2,0 gl-1 (NH4)2S04 1,0 gl_1 5 MgS04x7H20 0, 04 gl_1

Hiivauute (Difco) 0,1 gl-1

Oliiviöljy 10,0 ml 1__

Na2C03 6, 1 gl_1

Agar 2 0,0 gl-1 10

Alusta N (pH 9,6) Härän sappi (Oxoid) 2,0 gl-1 (NH4)2S04 1,0 gl_1 15 MgS04x7H20 0, 04 gl_1

Hiivauute (Difco) 0,1 gl_1

Oliiviöljy 10,0 ml 1_1

Na2C03 6, 1 gl_1

Tergitoli 7 /Fluka: Buchs, CH)500 ppm 2 0 Agar 2 0,0 gl-1

Alusta O (pH 9,6) Härän sappi (Oxoid) 2,0 gl-1 25 (NH4)2S04 1,0 gl_1

MgS04x7H20 0, 04 gl-1

Hiivauute (Difco) 0,1 gl-1

Oliiviöljy 10,0 ml 1__

Na2C03 6, 1 gl_1 30 NaCl 40,0 gl_1

Agar 2 0,0 gl-1

Alusta P (pH 9,6) 98 Härän sappi (Oxoid) 10,0 gl-1 5 (NH4)2S04 5, 0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

Hiivauute (Difco) 0,5 gl-1

Oliiviöljy 10,0 ml 1__

NaCl 40,0 gl_1 10 Agar 2 0,0 gl-1 Säädetty pH-arvoon 9,6 50 % risen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta Q (pH 9,6) 15 Härän sappi (Oxoid) 10,0 gl-1 (NH4)2S04 5, 0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

Hiivauute (Difco) 0,5 gl_1

Oliiviöljy 10,0 ml 1__ 2 0 Agar 2 0,0 gl-1 Säädetty pH-arvoon 9,6 50 % risen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta R (pH 9,5) 25 Tuorehiiva 82,5 gl-1

Glukoosi 3,3 gl-1 K2HP04 1,6 gl_1 K2C03 0,6 gl_1 KHCO3 1,76 gl_1 30 CaCl2 0, 05 gl-1

MgS04x7H20 0,05 gl-1

FeS04 0,005 gl~:

MnS04 0, 0066 gl_1

Alusta S

99

Tuorehiiva 8,25 gl-1 5 Glukoosi 1,32 gl_1 K2HP04 1,6 gl_1

CaCl2 0,05 gl_1

MgS04x7H20 0,05 gl-1

FeS04 0,005 gl~: 10 MnS04 0, 0066 gl_1

NaCl 40,0 gl_1 Säädetty pH-arvoon 10,5 40 %:isen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta T (pH 10,1) 15

Glukoosi 10,0 gl-1

Peptoni (Difco) 5,0 gl-1

Hiivauute (Difco) 5,0 gl_1 K2HPO4 1,0 gl_1 20 MgS04x7H20 0,2 gl_1

NaCl 40,0 gl_1

Na2C03 10,0 gl_1

Alusta U 25 Härän sappi (Oxoid) 10,0 gl-1 (NH4)2S04 5, 0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

Hiivauute (Difco) 0,5 gl_1 30 Kaseiini 10,0 gl-1 Säädetty pH-arvoon 9, 8 40 % risen Na2CC>3-liuoksen avulla

Alusta V

35 Tryptonisoijaliemi (Oxoid) 30,0 gl-1 Säädetty pH-arvoon 9, 9 40 % risen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta W (pH 10,1) 100

Liukoinen tärkkelys 10,0 gl-1 5 Peptoni (Difco) 5,0 gl_1

Hiivauute (Difco) 5,0 gl_1 K2HP04 1,0 gl_1

MgS04x7H20 0,2 gl-1

NaCl 40,0 gl_1 10 Na2C03 10,0 gl_1

Alusta X

Kuorittu maito (Difco) 100,0 gl-1 15 Säädetty pH-arvoon 10,8 25 %:isen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta Y

Hiivauute (Difco) 1,0 g 20 KNO3 10,0 g KH2P04 1,0 g

MgS04x7H20 0,2 g

Na2C03 10,0 g

NaCl 40,0 g 25 Liukoinen tärkkelys (Merck) 20,0 g

Suolavapaa vesi 1 litra

Alusta Z

30 Aivo-sydäninfuusio (Difco) 20,0 g

Na2EDTA (Komplexion III,

Siegfried AG, Sveitsi) 1,0 g

FeS04x7H20 0,006 g

MnS04xH20 0,003 g 35 CaCl2x2H20 1,0 g

MgS04x7H20 0,25 g

Tween 80 5,0 g

Soijaöljy 5,0 g 101

Tislatulla vedellä 1 litraksi, alustan pH säädetty pH-arvoon 9,6 25 % risen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta AA 5

Hiivauute (Difco) 20,0 g KH2PO4 5,0 g

FeS04x7H20 0,006 g

MnS04xH20 0,003 g 10 CaCl2x2H20 1,0 g

MgS04x7H20 0,25 g

Tween 80 5,0 g

Soijaöljy 5,0 g

Tislatulla vedellä 1 litraksi, alustan pH säädetty pH-arvoon 15 9, 6 25 % risen Na2C03-liuoksen avulla 50 % risen Na2C03-liuoksen avulla

Alusta BB

20 Aivosydäninfuusio (Difco) 20,0 g

FeS04x7H20 0,006 g

MnS04xH20 0,003 g

CaCl2x2H20 1,0 g

MgS04x7H20 0,25 g 25 Tween 80 5,0 g

Soijaöljy 5,0 g

Tislatulla vedellä 1 litraksi, alustan pH säädetty pH-arvoon 9, 6 25 % r isen Na2C03-liuoksen avulla 50 %risen Na2C03-liuoksen avulla.

102

Liite B

Menetelmät yksikkökokeille 5 1. Ominaisuusnumerot 1-5

Pesäkkeen väri, muoto, pystykuva, reuna, koko Bakteerisuspensio levitettiin alkalisen ravintoagarin (Alusta A) pinnalle ja viljeltiin 37°C:ssa. Pesäkkeitä tarkasteltiin 48 tunnin kuluttua.

10 2. Ominaisuusnumero 6 ja 7

Solun morfologia, gram-värjäysreaktio

Bakteerisolut, joita oli kasvatettu alkalisessa ravinto-liemessä (Alusta A, ilman agaria) 24 tunnin ajan, sentrifu-15 goitiin ja resuspendoitiin pieneen määrään alkalista ravin-tolientä ja annettiin ilmakuivua mikroskoopin objektilasil-la. Tai, bakteereja viljeltiin 24-48 tunnin ajan alkalisella ravintoagarilla (Alusta A), jotta muodostuu pesäkkeitä. Bak-teeripesäkkeet suspendoitiin fysiologiseen saliiniin, ja 20 muutaman pisaran annettiin ilmakuivua mikroskoopin objekti-lasilla. Gram'in värjäystesti suoritettiin käyttäen Dus-sault'in modifikaatiota (Journal of Bacteriology, 7_0, 484-485, 1955) safraniini vastavärinä.

25 3. Ominaisuusnumero 8

Oksidaasireaktio

Suodinpaperille, joka oli kostutettu N,N,N',N'-tetrametyyli-p-fenyleenidiamiinin 1 %:isella vesiliuoksella, tai oksidaa-sin identifiointikiekoille (bioMerieux: Charbonieres-les-30 Bains, Ranska) pyyhkäistiin nuori bakteeriviljelmä alkali- seita ravintoagarilta. Purppuranpunainen väri 1 minuutin sisällä rekisteröitiin positiiviseksi reaktioksi. Kontrollina käytetyllä E. colilla ei saatu positiivista reaktiota yhden minuutin sisällä.

103 4. Ominaisuusnumero 9 Testi kuoritulla maidolla

Minimaalialusta, joka sisälsi (g/1 tislattua vettä) hiivauu-5 tetta, 1,0; KN03:a, 10,0; K2HP04:ää, 1,0; MgS04x7H20:ta, 0,2; NaCl:a, 40,0; Na2C03:a, 10,0; agaria, 20,0, täydennettiin kuoritun maidon jauheella, 5,0 g/1, steriloitiin autoklavoi-malla ja valettiin petrimaljoille. Bakteerit siirrostettiin ja inkuboitiin 37°C:ssa. Kirkastuneet alueet bakteeripesäk-10 keiden ympärillä muutoin sameassa alustassa rekisteröitiin positiivisena reaktiona. Ei-alkalofiiliset vertailukannat testattiin identtisellä tavalla käyttäen alustoja, joiden koostumus oli sama mutta ilman Na2C03:a niin, että saatiin pH:ksi 6,8-7,0.

15 5. Ominaisuusnumero 10 Gelatiinin hydrolyysi

Hiili-gelatiinilevyjä (bioMerieux) tai "chargels"-levyjä (Oxoid) inkuboitiin 37°C:ssa alkalisessa ravintoliemessä 20 (Alusta A) yhdessä bakteerien kanssa. Musta sedimentti osoitti positiivisen reaktion.

6. Ominaisuusnumero 11 NaCl-sietokyky 25 Kahta menetelmää käytettiin.

(a) Bakteerikantoja viljeltiin 37°C:ssa alkalisella ravinto-agarilla (Alusta A), joka sisälsi 0 %, 4 %, 8 %, 12 % tai 15 % (paino/tilavuus) NaCl:a. Agarmaljat tutkittiin bakteerien kasvun osalta 48 tunnin kuluttua.

30 (b) Bakteerikantoja viljeltiin 37°C:ssa alkalisessa ravinto-liemessä (Alusta A), joka sisälsi 0 %, 4 %, 8 %, 12 %, 15 % tai 25 % NaCl:a. Bakteerien kasvua seurattiin mittaamalla optista tiheyttä käyttäen Klett-mittaria (vihreäsuodin) 0, 35 12, 24, 48, 72 ja 114 tunnin kohdalla.

104

7. Ominaisuusnumero 12 Kasvun minimi-pH

Ravintoagaria, pH 6,8-7,0 (Alusta A ilman natriumkarbonaat-5 tia) valettiin ruudutetuille petrimaljoille. Kaistale jähmettynyttä agaria poistettiin toisesta päästä ja korvattiin sulatetulla 4 %:isella (paino/tilavuus) agarilla, joka sisälsi 3,6 % (paino/tilavuus) Na2CC>3:a ja 0,8 % (paino/tila-vuus) NaOH:a. Maljan yli annettiin kehittyä yön aikana pH-10 gradientti 10,5 - 7. Bakteerit siirrostettiin pintalevityk-sen avulla pH-gradienttia pitkin ja viljeltiin 37cC:ssa 48 tunnin ajan. Sen kohdan pH, jossa bakteerikasvu lakkasi, mitattiin laakakantaisen elektrodin avulla ja "Alkalite" pH-liuskoilla (Merck: Darmstadt, Saksa).

15 8. Ominaisuusnumerot 13-21 Hiilihydraattien käyttö

Minimaalialusta, joka sisälsi (g/1 tislattua vettä) hiivauu-tetta, 1,0; KN03:a, 10,0; K2HP04:ää, 1,0; MgS04x7H20:ta, 0,2; 20 NaCl:a, 40,0; Na2C03:a, 10,0; agaria, 20,0, täydennettiin tutkittavalla hiilihydraatilla, 2,0 g/1, ja valettiin ruudutetuille petrimaljoille. Bakteerit siirrostettiin käyttäen 25-kärkistä monipistesiirrostajaa 1,0 ml:sta bakteerisuspen-siota, jota oli kasvatettu 48 tunnin ajan alkalisessa ravin-25 toliemessä (Alusta A). Agarmaljoja inkuboitiin 37cC:ssa 48 tunnin ajan. Tulokset taltioitiin vertaamalla bakteerikasvua minimaaliravintoalustalla, joka sisälsi hiilihydraattitäy-dennyksen, kasvuun minimaalialustalla ilman testattavaa hiilihydraattia. Ei-alkalofiiliset vertailukannat testattiin 30 identtisellä tavalla käyttäen alustoja, joiden koostumus oli sama mutta ilman Na2C03:a, jotta pH:ksi saatiin 6,8-7,0.

9. Ominaisuusnumerot 22-53 Kasvu hiilisubstraateilla 35 Kaupallisesti saatavaa testiliuskaa ATB 32 GN käytettiin hyväksi (API-bioMerieux: La Balme les Grottes, Ranska). Liuskoja käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti mutta lisäämällä 1,0 ml liuosta, joka sisälsi 4 % NaCl:a ja 1 % Na2C03:a 105 perusalustaa sisältäviin ampulleihin. Liuskoja inkuboitiin 37°C:ssa 48 tunnin ajan. Ei-alkalofiilisiä vertailukantoja inkuboitiin normaalissa perusalustassa.

5 10. Ominaisuusnumerot 54-72

Entsyymiaktiivisuudet

Kaupallisesti saatavaa koeliuskaa APIZYM käytettiin hyväksi (API-bioMerieux), jota käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti, paitsi että alkalofiiliset bakteerisolut suspen-10 doitiin alkaliseen ravintoliemeen (Alusta A). Liuskoja inkuboitiin 37°C:ssa 4 tunnin ajan.

11. Ominaisuusnumerot 73-82 Aminohapot hiilen- ja typenlähteinä 15 Samaa tekniikkaa käytettiin kuin testeissä 14-21, paitsi että KNO3 jätettiin pois minimaaliravintoalustalta.

12. Ominaisuusnumerot 83-104 Herkkyys antibiooteille 20 Laiha bakteerisuspensio alkalisessa ravintoliemessä levitettiin alkalisen ravintoagarin pinnalle (Alusta A) ja annettiin kuivua. Kaupallisesti saatavia antibioottiherkkyys-testikiekkoja (Oxoid tai Mast Laboratories: Merseyside, UK) sijoitettiin agarin pinnalle. Bakteereja viljeltiin 37°C:ssa 25 48 tunnin ajan. Kirkkaat vyöhykkeet antibioottikiekkojen ym pärillä osoittivat herkkyyden.

Liite C

Yksikkötestit analyysiin numeerisen taksonomian avulla 30

Ominaisuus- Testin numero kuvaus Tietokonekoodi 1

Pesäkeväri valkoinen = 1 35 kermanvärinen = 2 beige = 3 keltainen = 4 oranssi = 5 106 vaal.punainen = 6 ruskea = 7 punainen = 8 5 2 Pesäkemuoto pyöreä = 1 säännötön = 2 pistemäinen = 3 rihmainen = 4 10 3 Pesäkkeen pystykuva kupera = 1 kohonnut = 2 nuppimainen = 3 litteä = 4 15 4 Pesäkkeen reuna ehyt = 1 aaltoileva = 2 liuskainen = 3 hapsumainen = 4 20 5 Pesäkekoko halkaisija mm:ssä 6 Solumorfologia sauva = 1 kokki = 2 25 7 Gram-värjäys negatiivinen = 1 positiivinen = 2 8 Oksidaasitesti negatiivinen = 1 30 positiivinen = 2 9 Koe kuoritulla maidolla negatiivinen = 1 positiivinen = 2 35 10 Gelatiinin hydrolyysi negatiivinen = 1 positiivinen = 2 107 11 NaCl-sietokyky kasvua pitoisuudessa 0 % - 4 % = 1 0 % - 8 % = 2 5 0 % - 12 % = 3 0 % - 15 % = 4 kasvua vain pitoisuudessa 0 % =5 0 % - 15 % = 6 10 12 Minimi-pH kasvulle ravintoagarilla pH 7,5 =7,5 pH 8,0 =8,0 pH 8,5 =8,5 15 pH 9,0=9,0 pH 9,5 =9,5 pH 10 =10,0 pH 10,5 = 10,5 20 13-21 Hiilihydraatin käyttö 13 Formiaatti 14 Fumaraatti 15 Sukkinaatti 16 Galaktoosi lisääntynyt kasvu = 2 25 17 Pyruvaatti yhtä hyvä kasvu = 1 18 Fruktoosi kasvu inhiboitunut= 0 19 Laktoosi 20 Ksyloosi 21 Tärkkelys 30 22-53 Kasvu hiilisubstraateilla 22 Ramnoosi 23 N-asetyyliglukosamiini 24 D-riboosi 35 25 Inositoli 26 D-sakkaroosi 27 Maltoosi 28 Itakonaatti 108 29 Suberaatti 30 Malonaatti 31 Asetaatti 32 DL-laktaatti positiivinen = 2 5 33 L-alaniini negatiivinen = 1 34 Mannitoli 35 D-glukoosi 36 Salisiini 37 D-melibioosi 10 38 L-fukoosi 39 D-sorbitoli 40 L-arabinoosi 41 Propionaatti 42 Kapraatti 15 43 Valeraatti 44 Sitraatti 45 Histidiini 46 5-ketoglukonaatti 47 Glykogeeni 20 48 L-seriini 50 2-ketoglukonaatti 51 3-hydroksibutyraatti 52 4-hydroksibentsoaatti 53 L-proliini 25 54-72 Entsyymiaktiivisuudet 54 Alkalinen fosfataasi 55 Esteraasi (C4) 56 Esteraasilipaasi (C8) 57 Lipaasi (C14) 30 58 Leusiiniaryyliamidaasi 59 Valiiniaryyliamidaasi 60 Kystiiniaryyliamidaasi positiivinen = 2 61 Trypsiini negatiivinen = 1 62 Kymotrypsiini 35 63 Hapan fosfataasi 64 Naftoli-AS-BI-fosfohydrolaasi 65 a-galaktosidaasi 66 β-galaktosidaasi 109 67 β-glukuronidaasi 68 α-glukosidaasi 69 β-glukosidaasi 70 N-asetyyli-β-glukosaminidaasi 5 71 α-mannosidaasi 72 α-fukosidaasi 73-82 Aminohapot hiilen- ja typenlähteinä 73 Seriini 10 74 Proliini 75 Asparagiini 76 Arginiini lisääntynyt kasvu = 2 77 Alaniini yhtä hyvä kasvu = 1 78 Lysiini ei kasvua = 0 15 79 Metioniini 80 Fenyylialaniini 81 Glysiini 82 Väliini 20 83-104 Antibioottiherkkyys 83 Gentamysiini 10 pg 84 Nitroturantoiini 50 pg 85 Ampisilliini 25 pg 86 Nalidiksiinihappo 30 pg 25 87 Suitametoksatsoli 50 pg 88 Trimetopriimi 2,5 pg 89 Penisilliini G 1 IU antibioottiherkkä 90 Kloramfenikoli 25 pg kasvun inhibitio = 2 91 Erytromysiini 5 pg 30 92 Fusidiinihappo 10 pg antibioottiresis- 93 Metisilliini 10 pg tentti, ei kasvun 94 Novobiosiini 5 pg inhibitiota = 1 95 Streptomysiini 10 pg 96 Tetrasykliini 25 pg 35 97 Suitafuratsoli 100 pg 98 Oleandomysiini 5 pg

99 Polymyksiini 300 IU

100 Rifampisiini 2 pg 110 101 Neomysiini 30 μg 102 Vankomysiini 30 gg 103 Kanamysiini 30 gg

104 Basitrasiini 10 IU

5

Liite D

Proteolyyttisen, amylolyyttisen ja lipolyyttisen aktiivisuuden seulonta 10

Proteolyyttinen aktiivisuus

Ryhmä 1 15 Kanta Maidon albumiini Kaseiini Veri Gelatiini IE. 1CT + + + + 2E.1 - - - - wB2 - - wB5 - - - - 20 wBs 4 — + + + 10B.1 + + + + 20N.1 + + - + 27M.1 - + - - wNk2 - + — + 25

Ryhmä 2

Maidon albumiini Kaseiini Veri Gelatiini

Kanta 39E.3 e.t. e.t. e.t. + 30 41E.3 e.t. e.t. e.t. + 45E.3CT e.t. e.t. e.t. + 47E.3 e.t. e.t. e.t. + 51N.3 e.t. e.t. e.t. + 52N.3 e.t. e.t. e.t. + 35 42N.3 e.t. e.t. e.t. + 50N.3 e.t. e.t. e.t. +

Ill

Ryhmä 3

Kanta Maidon albumiini Kaseiini Veri Gelatiini 6B.1 + + - + 5 7B.1 + + - - 8B.1 - + - + 38E.2 e.t. e.t. e.t.

56E.4 + e.t. e.t.- 25B.1 e.t. + e.t. + 10 26N.1 - + - + 11C.1 + + - + wBl - - - + 12C.1 - + - - 28N.1CT - - 15 61N.4 + e.t. e.t.

36E.2 e.t. e.t. e.t.

40E.3 e.t. e.t. e.t. + 65B.4 + e.t. e.t.- 94LM.4 e.t. e.t. e.t. + 20 19N.1 - + - + 24B.1 + + - + 21M.1 + + + + 29C.1 - - 35E.2 e.t. e.t. e.t.

25 37E.2 e.t. e.t. e.t.

48E.3 e.t. e.t. e.t. + 78LN.4 e.t. + e.t. + 73aC.4 e.t. + e.t. + 75C.4 e.t. + e. t. + 30 73bC.4 e.t. + e.t. + 74C.4 e.t. + e.t.- 77LN.4 e.t. + e.t.- wNl - - 49N.3 e.t. e.t. e.t. + 35 44E.3 e.t. e.t. e.t. + 58E.4 e.t. e.t. e.t.

57E.4 + e.t. e.t. + 112

Ryhmä 4

Maidon albumiini Kaseiini Veri Gelatiini

Kanta wE5 - - - + 5 wB4CT - - wNkl - - - + wEl1 - - wE 12 - - - + 10 Ryhmä 5

Maidon albumiini Kaseiini Veri Gelatiini

Kanta 9B.1 - + - + 16N.1 + e.t. e.t. + 15 17N. 1CT + + - + 22M.1 + + - +

Ryhmä 6

Maidon albumiini Kaseiini Veri Gelatiini 2 0 Kanta 18N.1 + + - + 59E.4 + e.t. e.t. + 6 4B. 4CT + e.t. e.t. + 63N.4 + e.t. e.t. + 25 53E.4 + e.t. e.t. +

Ryhmittämättömät kannat Maidon albumiini Kaseiini Veri Gelatiini 3 0 Kanta wN2 - - - + 4E.1 - - - - 5E.1 - - - + 92LM.4 e.t. e.t. e.t. + 35 wBn5 - - - + e.t. = ei testattu 113

Amylolyyttinen ja lipolyyttinen aktiivisuus

Ryhmä 1 Tärkin Lipaasiakt. Esteraasilipaasi- Lipaa- 5 Kanta hydrolyysi oliiviöljyllä aktiivisuus_siakt.

IE. 1CT + - + + 2E.1 + - + wB2 - - + wB5 - - + - 10 wBs4 - - + - 10B.1 + - + - 20N.1 - - + - 27M.1 - - + - wNk2 + - + - 15

Ryhmä 2 Tärkin Lipaasiakt. Esteraasilipaasi- Lipaa-

Kanta hydrolyysi_oliiviöljyllä_aktiivisuus siakt.

39E.3 + + + — 20 41E.3 + + + - 45E. 3CT + + + + 47E.3 + + - - 51N.3 + + + + 52N.3 + + + + 25 42N.3 + + + + 50N.3 + + + +

Ryhmä 3 Tärkin Lipaasiakt. Esteraasilipaasi- Lipaa- 3 0 Kanta hydrolyysi_oliiviöljyllä_aktiivisuus siakt.

6B.1 - - + 7B.1 + - + + 8B.1 + + + + 38E.2 -- + - 3556E.4 - + + + 25B.1 — — + + 26N.1 - - + - 11C.1 - - + - 114 wBl -- + - 12C.1 + --- 28N.1CT + - + - 6 IN . 4 +--- 5 36E.2 - 40E.3 + + + + 65B. 4 + - + - 94LM.4 +-+- 19N.1 +- + + 10 24B.1 -- + - 21M.1 +--- 29C.1 +- + + 35E.2 -- + - 37E.2 -- + - 15 48E.3 - + + - 78LN.4 --+- 73aC.4 — — + — 75C.4 +--- 73bC.4 + — + — 20 74C.4 +- + - 77LN.4 --++ wNl + — + — 49N.3 + + + - 44E.3 + + + + 25 58E.4 + + + - 57E. 4 + - +

Ryhmä 4 Tärkin Lipaasiakt. Esteraasilipaasi- Lipaa- 3 0 Kanta hydrolyysi_oliiviöljyllä_aktiivisuus siakt.

wE5 + — + — wB4CT -- + - wNkl + — + — wEl1 --+- 35 wE12 - - + 115

Ryhmä 5 Tärkin Lipaasiakt. Esteraasilipaasi- Lipaa-

Kanta hydrolyysi_oliiviöljyllä_aktiivisuus siakt.

9B.1 + - + 5 16N.1 + - + - 17N. 1CT + - + 22M.1 + - +

Ryhmä 6 10 Tärkin Lipaasiakt. Esteraasilipaasi- Lipaa-

Kanta hydrolyysi_oliiviöljyllä_aktiivisuus siakt.

18N.1 + - + - 59E.4 + - + 64B. 4CT + - + 15 63N.4 + 53E. 4 + — + —

Ryhmittämättömät kannat 20 Tärkin Lipaasiakt. Esteraasilipaasi- Lipaa-

Kanta hydrolyysi_oliiviöljyllä_aktiivisuus siakt.

wN2 + — + + 4E.1 - - + 5E.1 + - + 25 92LM.4 + + + wBn5 - - + Tärkin (=tärkkelyksen) hydrolyysi määritetty ominaisuus 21:n mukaisesti (Liite B) 30 Lipaasiaktiivisuus (oliiviöljy) määritetty alustoilla M-P (Liite A)

Esteraasilipaasiaktiivisuus määritetty ominaisuus 56:n mukaisesti (Liite B)

Lipaasiaktiivisuus määritetty ominaisuus 57:n mukaisesti 35 (Liite B) 5 116

Liite E

Positiivisten tilojen prosenttimäärä ryhmien ominaisuuksille

Ryhmä

Ominaisuus 123456 [6] Solumorfologia 9 0 12 0 0 0 [7] Gram-värjäys 000000 10 [8] Oksidaasitesti 55 100 35 80 0 20 [9] Koe kuoritulla maidolla 36 11 6 20 0 20 [10] Gelatiini 67 100 56 60 100 100 [13] Formaatti 0 0 15 40 0 0 15 [14] Fumaraatti 45 78 74 80 75 60 [15] Sukkinaatti 45 89 85 40 67 50 [16] Galaktoosi 45 11 12 40 25 0 [17] Pyruvaatti 64 89 88 40 75 0 [18] Fruktoosi 45 11 68 60 50 100 20 [19] Laktoosi 900000 [20] Ksyloosi 18 11 15 20 0 0 [21] Tärkkelys 73 100 91 20 100 100 [22] Ramnoosi 9 0 15 20 0 0 [23] N-asetyyli- 25 glukosamiini 9 0 26 20 0 100 [24] D-riboosi 27 0 50 0 0 20 [25] Inositoli 9 0 9 0 50 0 [26] D-sakkaroosi 27 0 74 20 25 100 [27] Maltoosi 9 11 74 40 50 100 30 [28] Itakonaatti 0 11 6 0 0 0 [29] Suberaatti 9 67 53 40 0 0 [30] Malonaatti 0 11 65 0 25 40 [31] Asetaatti 18 100 100 80 25 100 [32] DL-laktaatti 27 56 100 100 0 40 35 [33] L-alaniini 18 89 82 100 0 100 [34] Mannitoli 0 0 41 20 0 80 [35] D-glukoosi 9 11 71 60 0 60 [36] Salisiini 0 0 3 20 0 60 117 [37] D-melibioosi 003000 [38] L-fukoosi 0 0 0 20 0 20 [39] D-sorbitoli 18 0 41 0 0 40 [40] L-arabinoosi 9 0 3 40 0 0 5 [41] Propionaatti 9 100 94 80 0 80 [42] Kapraatti 0 78 32 40 0 80 [43] Valeraatti 9 100 97 80 0 40 [44] Sitraatti 9 56 94 20 50 100 [45] Histidiini 0 0 71 0 0 80 10 [46] 5-ketoglukonaatti 0 0 21 0 0 0 [47] Glykogeeni 9 22 26 20 25 100 [48] 3-hydroksibemntsoaatti 9 0 38 0 0 0 15 [49] L-seriini 0 0 68 60 0 0 [50] 2-ketoglukonaatti 0 0 56 80 25 20 [51] 3-hydroksibutyraatti 18 33 94 100 0 100 20 [52] 4-hydroksibentsoaatti 0 0 71 80 0 0 [53] L-proliini 45 100 100 80 25 80 [54] Alkalinen fosfataasi 100 44 94 40 100 60 25 [55] Esteraasi (C4) 100 100 100 100 100 100 [56] Esteraasilipaasi (C 8) 100 89 85 100 100 100 [57] Lipaasi (C14) 9 67 26 0 0 0 [58] Leusiiniaryyliamidaasi 30 91 67 94 60 50 0 [59] Valiiniaryyliamidaasi 91 33 65 100 25 0 [60] Kystiiniaryyliamidaasi 73 0 15 0 0 0 35 [61] Trypsiini 64 11 9 60 0 0 [62] Kymotrypsiini 73 0 3 20 75 0 [63] Hapan fosfataasi 91 11 94 100 100 60 118 [64] Naftolifosfohydrolaasi 91 22 3 20 100 40 [65] α-galaktosidaasi 0 11 3 20 100 0 [66] β-galaktosidaasi 9 0 0 20 100 0 5 [67] β-glukuronidaasi 9 0 3 20 25 0 [68] a-glukosidaasi 27 0 79 60 100 40 [69] β-glukosidaasi 9 0 9 80 75 0 [ 70 ] N-asetyyli^-glukosaminidaasi 27 0 0 0 0 0 10 [71] α-mannosidaasi 000000 [72] cx-f ukosidaasi 9 0 0 20 0 0 [73] Seriini 22 13 29 60 100 50 [74] Proliini 56 63 65 80 100 100 [75] Asparagiini 67 38 61 60 75 100 15 [76] Arginiini 56 25 53 80 50 50 [77] Alaniini 67 100 62 40 100 50 [78] Lysiini 44 75 71 80 75 100 [79] Metioniini 60 50 53 nc 50 50 [80] Fenyylialaniini 89 100 76 100 100 100 20 [81] Glysiini 44 13 29 80 50 50 [82] Väliini 44 50 41 0 50 25 [83] Gentamysiini 36 67 3 20 0 0 [84] Nitrofurantoiini 18 33 21 0 0 0 2 5 [85] Amp isilliini 45 67 56 0 100 80 [86] Nalidiksiinihappo 36 78 76 0 0 20 [87] Sulfametoksatsoli 30 18 33 38 0 0 0 [88] Trimetopriimi 45 22 35 0 75 60 [89] Pensilliini G 27 11 29 0 75 100 [90] Kloramfenikoli 100 100 100 100 100 100 [91] Erytromysiini 91 100 100 100 100 100 35 [92] Fusidiinihappo 18 0 3 20 100 100 [93] Metisilliini 45 11 50 0 100 100 [94] Novobiosiini 18 0 3 0 25 0 [95] Streptomysiini 100 78 97 100 75 100 119 [96] Tetrasykliini 45 22 3 20 100 100 [97] Sulfafuratsoli 40 13 20 ne 0 0 [98] Oleandomysiini 100 38 94 100 100 100 [99] Polymyksiini 89 63 78 100 0 0 5 [100] Rifampisiini 100 38 78 100 100 100 [101] Neomysiini 0 13 0 0 0 0 [102] Vankomysiini 22 13 0 20 100 75 [103] Kanamysiini 11 13 0 0 0 0 [104] Basitrasiini 33 13 0 20 100 100

Claims (3)

1. Menetelmä alkalikestoisten entsyymien tuottamista varten käyttökelpoisen puhtaan bakteeriviljelmän valmistami- 5 seksi, tunnettu siitä, että alkalisesta ympäristöstä saaduista näytteistä eristetään aerobisia, gram-negatiivisia, sauvanmuotoisia, ehdottoman alkalofiilejä bakteereja, jotka kuuluvat johonkin kuudesta ryhmästä, joiden keskiverto-kannoilla on ainakin seuraavat ominaisuudet 10 - kanta antaa positiivisen reaktion KOH-testissä, kanta antaa positiivisen reaktion katalaasites-tissä, kannan NaCl-sietokyky on 0 % - <8 %, kannan tärkeimmät polaariset lipidikomponentit 15 ovat fosfatidyyliglyseroli, difosfatidyyliglyse- roli, fosfatidyyliglyserolifosfaatti ja fosfati-dyy1ietanoliamiini, kannan tärkein ubikinoni on Q9 tai Q6 ja kannan tärkein rasvahappo on C16:0. 20

2. Menetelmä alkalikestoisten entsyymien tuottamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä saatavissa olevia bakteereita viljellään sopivassa kasvualustassa, erotetaan bakteerit kasvualustasta 25 ja otetaan entsyymiaktiivisuus talteen kasvualustasta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisesti saatavissa olevan puhtaan bakteeriviljelmän käyttö alkalikestoisten entsyymien tuottamiseksi. 30