JPH0829082B2 - 新規リパーゼおよびその製法 - Google Patents
新規リパーゼおよびその製法Info
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- JPH0829082B2 JPH0829082B2 JP63053189A JP5318988A JPH0829082B2 JP H0829082 B2 JPH0829082 B2 JP H0829082B2 JP 63053189 A JP63053189 A JP 63053189A JP 5318988 A JP5318988 A JP 5318988A JP H0829082 B2 JPH0829082 B2 JP H0829082B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipase
- enzyme
- activity
- pseudomonas
- action
- Prior art date
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なリパーゼおよびその製法に関する。
（従来技術） リパーゼはトリグリセリドを基質とし、これを脂肪酸
とグリセリンとに加水分解する酵素である。また、反応
液中の水分含量を減少させると脂肪酸とアルコールより
エステルを合成する作用も知られている。
とグリセリンとに加水分解する酵素である。また、反応
液中の水分含量を減少させると脂肪酸とアルコールより
エステルを合成する作用も知られている。
現在、リパーゼの工業的利用が盛んに試みられており
特に脂肪酸生産プロセスへのリパーゼの導入が期待され
ている。工業的に油脂を分解し、脂肪酸を生産させるプ
ロセスは、現在、高温、高湿下での化学的加水分解法に
よって行われている。しかし、酵素反応を導入する事に
より、常温、常圧下で反応を進ませることができるた
め、エネルギー消費量を減少させることができるばかり
ではなく、化学的加水分解法では分解され易かった不飽
和脂肪酸を分解させることなく得ることもできる。ま
た、酵素の基質特異性に着目し、エステル交換反応を利
用して、安価な油脂を原料とし、付加価値の高い油脂を
生産することも可能である。
特に脂肪酸生産プロセスへのリパーゼの導入が期待され
ている。工業的に油脂を分解し、脂肪酸を生産させるプ
ロセスは、現在、高温、高湿下での化学的加水分解法に
よって行われている。しかし、酵素反応を導入する事に
より、常温、常圧下で反応を進ませることができるた
め、エネルギー消費量を減少させることができるばかり
ではなく、化学的加水分解法では分解され易かった不飽
和脂肪酸を分解させることなく得ることもできる。ま
た、酵素の基質特異性に着目し、エステル交換反応を利
用して、安価な油脂を原料とし、付加価値の高い油脂を
生産することも可能である。
酵素を工業利用しようとする際には、反応速度・雑菌
汚染等の面から温度に対する安定性が要求されることが
多く、リパーゼもまた例外ではない。耐熱性リパーゼと
いう点においては、特にシュードモナス属細菌がこれら
のリパーゼを生産しうることが報告されている。
汚染等の面から温度に対する安定性が要求されることが
多く、リパーゼもまた例外ではない。耐熱性リパーゼと
いう点においては、特にシュードモナス属細菌がこれら
のリパーゼを生産しうることが報告されている。
すなわち、シュードモナス・メフィティカ・バリュタ
ス・リポリティカ（Pseudomonas mephitcavar.lipolyti
ca）が生産する。作用最適温度70℃、60℃、14時間の熱
処理によっても失活しないリパーゼ（特公昭50−2555
3）、シュードモナス・フラジー（Pseudomonas fragi）
が生産する。作用最適温度65〜70℃、pH9、50℃、24時
間の熱処理によっても失活しないリパーゼ（特開昭61−
280274）、シュードモナス・フルオレセンス・バイオタ
イプＩ（Pseudomonas fluorescens）が生産する、作用
最適温度67℃、60℃、20時間の熱処理によっても86.9％
の活性を保持するリパーゼ（特開昭57−58885）などの
報告が知られている。
ス・リポリティカ（Pseudomonas mephitcavar.lipolyti
ca）が生産する。作用最適温度70℃、60℃、14時間の熱
処理によっても失活しないリパーゼ（特公昭50−2555
3）、シュードモナス・フラジー（Pseudomonas fragi）
が生産する。作用最適温度65〜70℃、pH9、50℃、24時
間の熱処理によっても失活しないリパーゼ（特開昭61−
280274）、シュードモナス・フルオレセンス・バイオタ
イプＩ（Pseudomonas fluorescens）が生産する、作用
最適温度67℃、60℃、20時間の熱処理によっても86.9％
の活性を保持するリパーゼ（特開昭57−58885）などの
報告が知られている。
（発明が解決しようとする問題点） 工業的な油脂の加水分解、改質等の油脂原料として
は、牛脂・豚脂・ヤシ油・パーム油等の常温で固体であ
る油脂が用いられる傾向にある。したがって、油脂を融
点以上の温度で反応させるか、有機溶剤の添加により液
状化した後反応させねばならない。このため、工業用リ
パーゼとして、耐熱性を持ち、しかも高温下で最適反応
性を持つものか、または、有機溶剤に対して耐性を持
ち、その存在下で反応を進められるのでなくてはならな
い。更に、脂肪酸生産用リパーゼには、上記固体脂をで
きるだけ短時間に、より高い分解率（90％以上）で分解
する能力が要求され、また金属石けんの生成を避ける点
から、活性発現や活性増大のためにカルシウムの添加を
必要としないものが要求される。このようなリパーゼの
検索は盛んに行われてきたが、工業的レベルでその需要
に応えられる酵素は現在まで得られていない。
は、牛脂・豚脂・ヤシ油・パーム油等の常温で固体であ
る油脂が用いられる傾向にある。したがって、油脂を融
点以上の温度で反応させるか、有機溶剤の添加により液
状化した後反応させねばならない。このため、工業用リ
パーゼとして、耐熱性を持ち、しかも高温下で最適反応
性を持つものか、または、有機溶剤に対して耐性を持
ち、その存在下で反応を進められるのでなくてはならな
い。更に、脂肪酸生産用リパーゼには、上記固体脂をで
きるだけ短時間に、より高い分解率（90％以上）で分解
する能力が要求され、また金属石けんの生成を避ける点
から、活性発現や活性増大のためにカルシウムの添加を
必要としないものが要求される。このようなリパーゼの
検索は盛んに行われてきたが、工業的レベルでその需要
に応えられる酵素は現在まで得られていない。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、耐熱性を持つリパーゼを生産する微生
物を広く自然界より探索した結果、神奈川県厚木市の土
壌より分離したシュードモナス属に属するKWI−６菌株
が、前述の要求をみたすリパーゼを生産することを見出
した。その後、このリパーゼを精製して理化学的性質を
調べたところ、新規リパーゼであることを見出し、本発
明を完成した。
物を広く自然界より探索した結果、神奈川県厚木市の土
壌より分離したシュードモナス属に属するKWI−６菌株
が、前述の要求をみたすリパーゼを生産することを見出
した。その後、このリパーゼを精製して理化学的性質を
調べたところ、新規リパーゼであることを見出し、本発
明を完成した。
本発明のリパーゼの生産に使用する微生物は、シュー
ドモナス属に属し、上記の理化学的性質を有するリパー
ゼの生産能力を有するものであれば、いかなるものでも
よいが、具体的には前記のシュードモナスKWI−56菌株
が挙げられる。
ドモナス属に属し、上記の理化学的性質を有するリパー
ゼの生産能力を有するものであれば、いかなるものでも
よいが、具体的には前記のシュードモナスKWI−56菌株
が挙げられる。
次に、活性測定法および本発明のリパーゼの理化学的
性質について詳細に説明する。
性質について詳細に説明する。
活性測定法（回転撹拌法） a,反応 反応容器に1/20M リン酸緩衝液（pH7.0）5ml、オリ
ーブ油1ml、酵素液を所定量（通常1ml以下）入れ、37
℃、60分、スターラー500rpmで反応を行った後、エタノ
ール20mlを加えて停止させる。
ーブ油1ml、酵素液を所定量（通常1ml以下）入れ、37
℃、60分、スターラー500rpmで反応を行った後、エタノ
ール20mlを加えて停止させる。
b,測定 反応で生成した脂肪酸を1/20NのKOHで滴定する。酵素
活性は、１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離させる
酵素量を１ユニット（IU）とした。
活性は、１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離させる
酵素量を１ユニット（IU）とした。
なお、本酵素の活性測定は、特に記載しないかぎり上
記の条件において行った。
記の条件において行った。
作用 パーム油、オリーブ油、ヤシ油および牛脂に対して、
1000IU/g−oilとなるように酵素を添加し、50℃で20時
間反応させると、95％以上分解する。
1000IU/g−oilとなるように酵素を添加し、50℃で20時
間反応させると、95％以上分解する。
基質特異性 種々に基質に対する分解活性を50℃において測定し、
同条件でのオリーブ油に対する分解活性を100として第
１表に示した。
同条件でのオリーブ油に対する分解活性を100として第
１表に示した。
このリパーゼは、トリミリスチン、トリカプリン、ト
リカプリリンをとくによく分解する。また、鯨ろうは分
解するが、オレイン酸の低級アルコールエステルは、分
解しない。
リカプリリンをとくによく分解する。また、鯨ろうは分
解するが、オレイン酸の低級アルコールエステルは、分
解しない。
作用最適pH及び安定pH範囲 オリーブ油を基質として回転攪拌法にて、本発明のリ
パーゼに対するpHの影響を調べた。結果を第１図に示し
た。第１図は、活性の最大値を100とし、各pHにおける
相対活性を示す。第１図から作用最適pHは5.5〜7.0であ
ることがわかる。
パーゼに対するpHの影響を調べた。結果を第１図に示し
た。第１図は、活性の最大値を100とし、各pHにおける
相対活性を示す。第１図から作用最適pHは5.5〜7.0であ
ることがわかる。
次に、本発明のリパーゼをブリトン−ロビンソン緩衝
液を用い、30℃、24時間各pHに保持したのち、回転攪拌
法にてpHの安定性を調べた。結果を第２図に示した。第
２図も活性の最大値を100とし、各pHにおける相対活性
を示す。第２図から本発明のリパーゼはpH4〜10で安定
である。
液を用い、30℃、24時間各pHに保持したのち、回転攪拌
法にてpHの安定性を調べた。結果を第２図に示した。第
２図も活性の最大値を100とし、各pHにおける相対活性
を示す。第２図から本発明のリパーゼはpH4〜10で安定
である。
作用適温の範囲 オリーブ油を基質とし、各温度で20分間反応を行い、
活性を調べた。結果を第３図に示した。第３図は、活性
の最大値を100とし、各温度における相対活性を表わ
す。第３図から、本酵素の作用最適温度は60〜65℃であ
ることがわかる。
活性を調べた。結果を第３図に示した。第３図は、活性
の最大値を100とし、各温度における相対活性を表わ
す。第３図から、本酵素の作用最適温度は60〜65℃であ
ることがわかる。
熱安定性 1/20Mピペス緩衝液（pH7.0）に酵素を蛋白濃度で0.1
％となるように調製し、37〜75℃に30分〜24時間保持し
たのち、回転攪拌法で残存活性を測定した。結果は、未
処理酵素の活性を100として第４図及び第５図に示し
た。本酵素は、60℃、24時間の加熱処理後も96％の活性
を維持していた。
％となるように調製し、37〜75℃に30分〜24時間保持し
たのち、回転攪拌法で残存活性を測定した。結果は、未
処理酵素の活性を100として第４図及び第５図に示し
た。本酵素は、60℃、24時間の加熱処理後も96％の活性
を維持していた。
pH、温度などによる失活の条件 本発明のリパーゼは、第２図より、pH3以下またはpH1
2以上では、37℃、24時間で失活することがわかる。ま
た、第４図及び第５図よりpH7.0において、70℃では24
時間後に82％失活することがわかる。
2以上では、37℃、24時間で失活することがわかる。ま
た、第４図及び第５図よりpH7.0において、70℃では24
時間後に82％失活することがわかる。
阻害 金属イオンによる活性阻害を調べた。
1/20Mのピペス緩衝液を用い、1mMの下記金属塩存在
下、回転攪拌法で活性を測定し、金属塩無添加の場合の
活性を100として測定結果を第２表に示した。Cu2+、Z
n2+、Hg2+およびSn2+は本酵素を失活させることがわか
る。また、Ca2+の添加が酵素活性に影響を及ぼさないこ
とから、本酵素では活性発現・増大のために反応系へCa
2+を添加する必要はない。
下、回転攪拌法で活性を測定し、金属塩無添加の場合の
活性を100として測定結果を第２表に示した。Cu2+、Z
n2+、Hg2+およびSn2+は本酵素を失活させることがわか
る。また、Ca2+の添加が酵素活性に影響を及ぼさないこ
とから、本酵素では活性発現・増大のために反応系へCa
2+を添加する必要はない。
次に界面活性剤による活性阻害を調べた。各種界面活
性剤を0.5％含む1/20Mリン酸緩衝液（pH7.0）を用い
て、オリーブ油を基質とした回転攪拌法により活性を測
定した。測定結果を、界面活性剤無添加の場合の活性を
100として第３表に示した。
性剤を0.5％含む1/20Mリン酸緩衝液（pH7.0）を用い
て、オリーブ油を基質とした回転攪拌法により活性を測
定した。測定結果を、界面活性剤無添加の場合の活性を
100として第３表に示した。
第３表から反応液中に界面活性剤が0.5％共存する系
ではコール酸ソーダ、デオキシコール酸ソーダ、タウロ
コール酸ソーダ等の胆汁酸塩で50〜80％、その他の界面
活性剤で90％以上の阻害を受けることがわかる。
ではコール酸ソーダ、デオキシコール酸ソーダ、タウロ
コール酸ソーダ等の胆汁酸塩で50〜80％、その他の界面
活性剤で90％以上の阻害を受けることがわかる。
リパーゼの中には、胆汁酸塩の共存によって活性の増
大するものがあるが、本酵素は活性の発現に胆汁酸塩を
必要とせず、むしろその存在により阻害を受けることが
明らかとなった。
大するものがあるが、本酵素は活性の発現に胆汁酸塩を
必要とせず、むしろその存在により阻害を受けることが
明らかとなった。
精製方法 シュードモナスsp.KWI−56をオレイン酸１％、ポリペ
プトン２％、KH2PO40.1％、MgSO4・7H2O 0.05％、酵母
エキス0.1％を含有する培地で培養し、この培養液にア
セトン50％を添加し、遠心分離により菌体を除去した。
次に遠心上澄液を精密過により濃縮し、さらに本酵素
がアセトン処理に耐性を持っていることを利用してアセ
トン沈殿をくり返し、最後にゲル過により、電気泳動
的に単一な本酵素の精製標品を得た。比活性は2550IU/m
g−蛋白であった。
プトン２％、KH2PO40.1％、MgSO4・7H2O 0.05％、酵母
エキス0.1％を含有する培地で培養し、この培養液にア
セトン50％を添加し、遠心分離により菌体を除去した。
次に遠心上澄液を精密過により濃縮し、さらに本酵素
がアセトン処理に耐性を持っていることを利用してアセ
トン沈殿をくり返し、最後にゲル過により、電気泳動
的に単一な本酵素の精製標品を得た。比活性は2550IU/m
g−蛋白であった。
等電点（pI） アンフォラインPAGプレート（LKB社製）を用い、1500
V 1.5時間の等電点電気泳動を行った。標準物質とし
て、チトクロームＣ（pI9.60）、キモトリプシン（pI8.
80）、鯨ミオグロビン（pI8.05）、馬ミオグロビン（pI
7.00）、カルボニックアンヒドラーゼ（pI6.00）、β−
ラクトグロブリンＢ（pI5.10）、フィコシアニン（pI4.
65）を用いた。この等電点電気泳動法による測定結果か
ら、pI＝5.0が得られた。
V 1.5時間の等電点電気泳動を行った。標準物質とし
て、チトクロームＣ（pI9.60）、キモトリプシン（pI8.
80）、鯨ミオグロビン（pI8.05）、馬ミオグロビン（pI
7.00）、カルボニックアンヒドラーゼ（pI6.00）、β−
ラクトグロブリンＢ（pI5.10）、フィコシアニン（pI4.
65）を用いた。この等電点電気泳動法による測定結果か
ら、pI＝5.0が得られた。
分子量 SDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、分子量330
00の値を得た。分子量マーカーとして、フォスフォリラ
ーゼｂ（分子量97400）、牛血清アルブミン（分子量662
00）、オボアルブミン（分子量42699）、カルボニック
アンヒドラーゼ（分子量31000）、トリプシンインヒビ
ター（分子量21500）、リゾチーム（分子量14400）を用
いた。
00の値を得た。分子量マーカーとして、フォスフォリラ
ーゼｂ（分子量97400）、牛血清アルブミン（分子量662
00）、オボアルブミン（分子量42699）、カルボニック
アンヒドラーゼ（分子量31000）、トリプシンインヒビ
ター（分子量21500）、リゾチーム（分子量14400）を用
いた。
糖含有の有無 フェノール硫酸法による発色は認められず、糖は含有
しない。
しない。
元素分析 Ｈ（6.8％）、Ｃ（47.5％）、Ｎ（14.7％） 本発明のリパーゼの酵素を生産するには、シュードモ
ナス属に属する細菌、特にKWI−56菌株を利用するのが
好ましい。
ナス属に属する細菌、特にKWI−56菌株を利用するのが
好ましい。
この菌株の菌学的性質を以下に示す。この菌学的性質
の検討には、「微生物の分類と同定」（長谷川武治著、
学会出版センター）、「医学細菌同定の手びき」（S.T.
Cowan著、坂崎利一訳、近代出版）、「新細菌培地学講
座」（坂崎利一著、近代出版）に記載された方法、培地
組成を用いた。
の検討には、「微生物の分類と同定」（長谷川武治著、
学会出版センター）、「医学細菌同定の手びき」（S.T.
Cowan著、坂崎利一訳、近代出版）、「新細菌培地学講
座」（坂崎利一著、近代出版）に記載された方法、培地
組成を用いた。
ａ）形態 細胞の形及び大きさ：長さ2.2〜3.0ミクロン、幅0.
5〜0.7ミクロンの桿菌 細胞の双形性：単独または短連鎖 連動性：あり、１本の極鞭毛を持つ 胞子：なし グラム染色：陰性 抗酸性：なし ｂ）生育状態 肉汁寒天平板培養：円形、とつ円状、表面は滑らか
で光沢がある。わずかに黄色を帯びた白色。
5〜0.7ミクロンの桿菌 細胞の双形性：単独または短連鎖 連動性：あり、１本の極鞭毛を持つ 胞子：なし グラム染色：陰性 抗酸性：なし ｂ）生育状態 肉汁寒天平板培養：円形、とつ円状、表面は滑らか
で光沢がある。わずかに黄色を帯びた白色。
肉汁寒天斜面培養：糸状、生育は普通、表面は滑ら
かで光沢がある。色素生成せず。わずかに黄色を帯びた
白色。
かで光沢がある。色素生成せず。わずかに黄色を帯びた
白色。
肉汁液体培養：生育は普通、混濁、色素生成せず。
肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通、液化。
リトマスミルク：微アルカリ性、液化。
ｃ）生理学的性質 硝酸塩の還元：陽性。
脱窒反応：陰性。
MRテスト：陰性。
VPテスト：陰性。
インドールの生成：陰性。
硫化水素の生成：わずかに陽性。
デンプンの加水分解：陰性。
クエン酸の利用：ユーサーの培地；陽性。
クリステンセンの培地；陽性。
無機窒素源の利用：硝酸ナトリウムは利用しないが
硫酸アンモニウムは利用する。
硫酸アンモニウムは利用する。
色素の生成：シュードモナスＦアガー、シュードモ
ナスＰアガー（ディフコ社製）、クリグラーの培地（指
示薬は含まず）、TSI寒天培地（指示薬は含まず）にお
いて、色素の生成はみられない。
ナスＰアガー（ディフコ社製）、クリグラーの培地（指
示薬は含まず）、TSI寒天培地（指示薬は含まず）にお
いて、色素の生成はみられない。
ウレアーゼ：陽性。
オキシダーゼ：陽性。
タカラーゼ：陽性。
生育の範囲 pH:4.5〜8.5で生育。5.5〜7.0で最適。
温度:15〜37℃で生育。10℃および40℃で生育はみら
れない。33℃前後が最適。
れない。33℃前後が最適。
酸素に対する態度：好気性 ０−Ｆテスト：好気的に酸を生成。
糖類からの酸およびガスの生成の有無 Hugh−Leifson法による。
Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクト
ース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソル
ビット、Ｄ−マンニット、イノシット、グルセリンから
ガスは発生しないが酸を生成する。デンプンからはガス
も糖も生成しない。
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクト
ース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソル
ビット、Ｄ−マンニット、イノシット、グルセリンから
ガスは発生しないが酸を生成する。デンプンからはガス
も糖も生成しない。
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陽性。
プロトカテキン酸の分解：オルト型。
グルコン酸の酸化：陽性。
アルギニン脱炭酸：陰性。
リジン脱炭酸：陽性。
リパーゼの生産：陽性。
炭素化合物の利用:Stanierらの方法による。
グルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノー
ス、マルトース、ソルビトール、Ｌ−スレオニン、Ｌ−
アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、アセトアミ
ド、DL−β−ヒドロキシ酪酸で生育するが、グリシン、
イスリン、イタコン酸、メタコン酸では生育せず。
ス、マルトース、ソルビトール、Ｌ−スレオニン、Ｌ−
アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、アセトアミ
ド、DL−β−ヒドロキシ酪酸で生育するが、グリシン、
イスリン、イタコン酸、メタコン酸では生育せず。
以上の菌学的性質からバージイのマニュアル・オブ・
デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第８版（Berger
s' Manual of Determinative Bacteriology 8ed）およ
び、バージイのマニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジー（Bergeys'Manual of Systematic Bac
teriology）に基づき検索した結果、シュードモナス・
セパシアにほぼ一致した。しかし、従来のシュードモナ
ス・セパシアは、40℃において生育可能であるが、本菌
株は37℃以上の温度下でなければ生育はできない。ま
た、従来のシュードモナス・セパシアは非蛍光性の色素
を生産するにもかかわらず、本菌株では色素の生産を見
ることはできない。
デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第８版（Berger
s' Manual of Determinative Bacteriology 8ed）およ
び、バージイのマニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジー（Bergeys'Manual of Systematic Bac
teriology）に基づき検索した結果、シュードモナス・
セパシアにほぼ一致した。しかし、従来のシュードモナ
ス・セパシアは、40℃において生育可能であるが、本菌
株は37℃以上の温度下でなければ生育はできない。ま
た、従来のシュードモナス・セパシアは非蛍光性の色素
を生産するにもかかわらず、本菌株では色素の生産を見
ることはできない。
さらに、既知の耐熱性リパーゼを生産するシュードモ
ナス属細菌、すなわち前記のシュードモナス・メフィテ
ィカ・バリエタス・リポリティカ、シュードモナス・フ
ラジー、シュードモナス・フルオレセンス・バイオタイ
プＩと比較しても、少なくとも以下の菌学的性質に関し
て差異がみられる。
ナス属細菌、すなわち前記のシュードモナス・メフィテ
ィカ・バリエタス・リポリティカ、シュードモナス・フ
ラジー、シュードモナス・フルオレセンス・バイオタイ
プＩと比較しても、少なくとも以下の菌学的性質に関し
て差異がみられる。
以上の知見より、本菌株はシュードモナス・セパシア
と極めて近い分類学的関係にありながらも新菌株である
と判断し、シュードモナス・KWI−56株と命名した。本
菌株は昭和62年10月15日に通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した。微生物受託番号は、微工研
条寄第3178号（FERM BP−3178）である。
と極めて近い分類学的関係にありながらも新菌株である
と判断し、シュードモナス・KWI−56株と命名した。本
菌株は昭和62年10月15日に通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した。微生物受託番号は、微工研
条寄第3178号（FERM BP−3178）である。
本菌株を用いて耐熱性リパーゼを生産することができ
る。培養条件は次のとおりである。
る。培養条件は次のとおりである。
まず培地組成であるが、本菌株はオリーブ油等の油脂
またはオレイン酸等の脂肪酸が培地中に存在する時にの
み誘導的にリパーゼを生産する。このため、炭素源とし
ては油脂または脂肪酸を用いるか、もしくはグルセリ
ン、各種糖類などの本菌株が資化しうる物質に、適当な
量の油脂または脂肪酸を添加したものを使用すればよ
い。窒素源には、硫酸アンモニウム、肉エキス、ポリペ
プトン、大豆粉などが利用できる。さらに無機塩とし
て、カリウム、ナトリウム、リン酸、マグネシウム、カ
ルシウムなどの各塩類を添加する必要がある。
またはオレイン酸等の脂肪酸が培地中に存在する時にの
み誘導的にリパーゼを生産する。このため、炭素源とし
ては油脂または脂肪酸を用いるか、もしくはグルセリ
ン、各種糖類などの本菌株が資化しうる物質に、適当な
量の油脂または脂肪酸を添加したものを使用すればよ
い。窒素源には、硫酸アンモニウム、肉エキス、ポリペ
プトン、大豆粉などが利用できる。さらに無機塩とし
て、カリウム、ナトリウム、リン酸、マグネシウム、カ
ルシウムなどの各塩類を添加する必要がある。
以上述べた培地組成でpHを0.7に調整し、27℃におい
て、好気的に培養をおこなえば、培養開始後１日〜２日
間で培地中のリパーゼ生産量は最大となる。得られた培
養液は遠心分離や過によって菌体を除去した後、その
上澄液を酵素液として回収できる。この酵素液から本発
明のリパーゼを精製するには、酵素液を有機溶剤（アセ
トン、エタノール等）による沈殿法、硫安による塩析
法、限外過膜法等の常法により濃縮し、ゲル過、電
気泳動等により、酵素標品を得ることができる。
て、好気的に培養をおこなえば、培養開始後１日〜２日
間で培地中のリパーゼ生産量は最大となる。得られた培
養液は遠心分離や過によって菌体を除去した後、その
上澄液を酵素液として回収できる。この酵素液から本発
明のリパーゼを精製するには、酵素液を有機溶剤（アセ
トン、エタノール等）による沈殿法、硫安による塩析
法、限外過膜法等の常法により濃縮し、ゲル過、電
気泳動等により、酵素標品を得ることができる。
（作用） 本発明の耐熱性リパーゼは、カルシウムの添加なしに
天然油脂、トリグリセリドに対して高い分解能を有し、
とくに固体脂に対してその融点以上の温度で作用しうる
能力を有しているので常温、常圧下で油脂を加水分解し
て脂肪酸を生産したり、エステル交換反応により油脂の
改質を行うことができる。
天然油脂、トリグリセリドに対して高い分解能を有し、
とくに固体脂に対してその融点以上の温度で作用しうる
能力を有しているので常温、常圧下で油脂を加水分解し
て脂肪酸を生産したり、エステル交換反応により油脂の
改質を行うことができる。
次に実施例により本発明を説明する。
実施例１ オレイン酸１％、ポリペプトン２％、KH2PO40.1％、M
gSO4・7H2O0.05％、酵母エキス0.1％よりなる液体培地19
lを30l溶ジャーファーメンターに入れ、加圧蒸気滅菌し
た後、あらかじめ同培地で30℃11時間振とう培養したシ
ュードモナス・sp/KWI−56株の前培養液を接種し、pH
7、27℃、44時間、300rpm、1vvmで通気攪拌培養した。
培養液にアセトンを同量添加した後、遠心分離により菌
体を除去して粗酵素液を得た。
gSO4・7H2O0.05％、酵母エキス0.1％よりなる液体培地19
lを30l溶ジャーファーメンターに入れ、加圧蒸気滅菌し
た後、あらかじめ同培地で30℃11時間振とう培養したシ
ュードモナス・sp/KWI−56株の前培養液を接種し、pH
7、27℃、44時間、300rpm、1vvmで通気攪拌培養した。
培養液にアセトンを同量添加した後、遠心分離により菌
体を除去して粗酵素液を得た。
実施例２ 上記粗酵素液からアセトンを除去した後、中空糸型メ
ンブレンフィルター（孔径0.2μｍ）を用いて濃縮し、
比活性180IU/mg−蛋白の濃縮液3lを得た。この液に冷却
したアセトンを60％となるように添加し、夾雑蛋白を遠
心分離によって除去した。この上澄液（比活性450IU−m
g−蛋白）に更に冷アセトンを90％となるように添加し
て酵素を沈殿として遠心分離によって回収した。
ンブレンフィルター（孔径0.2μｍ）を用いて濃縮し、
比活性180IU/mg−蛋白の濃縮液3lを得た。この液に冷却
したアセトンを60％となるように添加し、夾雑蛋白を遠
心分離によって除去した。この上澄液（比活性450IU−m
g−蛋白）に更に冷アセトンを90％となるように添加し
て酵素を沈殿として遠心分離によって回収した。
沈殿を1/10M硫安を含む1/50Mリン酸緩衝液（pH7.0）
に溶解し、液体クロマトグラフによるゲル過（東ソー
社製TSKgel G3000SW、通液速度20ml/min）を行った。こ
の操作によって得られた酵素液は、SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動において単一バンドを示した。この酵素
液を限外過（アミコン社製ダイヤフロー膜、分画分子
量10000）により脱塩・濃縮した後、凍結乾燥した比活
性2550IU/mg−蛋白の精製酵素標品を得た。
に溶解し、液体クロマトグラフによるゲル過（東ソー
社製TSKgel G3000SW、通液速度20ml/min）を行った。こ
の操作によって得られた酵素液は、SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動において単一バンドを示した。この酵素
液を限外過（アミコン社製ダイヤフロー膜、分画分子
量10000）により脱塩・濃縮した後、凍結乾燥した比活
性2550IU/mg−蛋白の精製酵素標品を得た。
実施例３ 本発明のリパーゼを用い回転攪拌法に準じて、各種油
脂の分解実験を行った。
脂の分解実験を行った。
パーム油・ヤシ油・牛脂等の固体脂およびオリーブ油
を各々100mgとり、これに緩衝液5mlおよび酵素100IUを
添加して、回転攪拌法により50℃、20時間反応させた。
第６図に示したように、いずれの油脂も95％以上分解す
ることができた。
を各々100mgとり、これに緩衝液5mlおよび酵素100IUを
添加して、回転攪拌法により50℃、20時間反応させた。
第６図に示したように、いずれの油脂も95％以上分解す
ることができた。
実施例４ オレイン酸とグリセリンを基質としてエステル合成反
応を行わせ、逆反応活性を測定した。
応を行わせ、逆反応活性を測定した。
グリセリン5ml、オレイン酸0.5mlに酵素液0.5ml（50I
U）を添加し、37℃、500rpm、60分反応させた後、アセ
トンとエタノールの１対１混合液20mlを添加して反応を
停止させた。逆反応活性は残存するオレイン酸を1/10NK
OH（エタノール溶液）にて滴定し１分間に１μmolのオ
レイン酸化を消費する活性を1IUとした。
U）を添加し、37℃、500rpm、60分反応させた後、アセ
トンとエタノールの１対１混合液20mlを添加して反応を
停止させた。逆反応活性は残存するオレイン酸を1/10NK
OH（エタノール溶液）にて滴定し１分間に１μmolのオ
レイン酸化を消費する活性を1IUとした。
本発明の酵素では逆反応活性の分解活性に対する比は
0.032であった。
0.032であった。
実施例５ 大豆油とグリセリンを基質としてエステル交換反応を
行わせた。大豆油20g、グリセリン40gに酵素液1ml（100
00IU）を添加し、30℃、90分間攪拌し反応させた。
行わせた。大豆油20g、グリセリン40gに酵素液1ml（100
00IU）を添加し、30℃、90分間攪拌し反応させた。
反応終了後、反応液をシリカゲル薄層クロマトグラフ
ィーにより分析した結果、モノグリセリドおよびジグリ
セリドが生成していることを確認した。
ィーにより分析した結果、モノグリセリドおよびジグリ
セリドが生成していることを確認した。
（効果） 本発明によれば、シュードモナスsp.KWI−56菌株を培
養し、その培養液から本発明のリパーゼを得ることがで
きる。このリパーゼはカルシウムの添加なしに天然油
脂、トリグリセリンに対して高い分解能を有し、とくに
固体脂に対してその融点以上の温度で作用しうる能力を
有しているので、常温常圧下で油脂を加水分解して脂肪
酸を生産したり、エステル交換反応により油脂の改質を
行うことができる。
養し、その培養液から本発明のリパーゼを得ることがで
きる。このリパーゼはカルシウムの添加なしに天然油
脂、トリグリセリンに対して高い分解能を有し、とくに
固体脂に対してその融点以上の温度で作用しうる能力を
有しているので、常温常圧下で油脂を加水分解して脂肪
酸を生産したり、エステル交換反応により油脂の改質を
行うことができる。
第１図は、本発明の酵素の作用最適pHを表わし、第２図
は本発明の酵素の安定pH範囲を表わす。 第３図は、本発明の酵素の作用適温の範囲を表わし、第
４、５図は、本発明の酵素の熱安定性を表わす。 第６図は、本発明の酵素の油脂分解性を表わす。
は本発明の酵素の安定pH範囲を表わす。 第３図は、本発明の酵素の作用適温の範囲を表わし、第
４、５図は、本発明の酵素の熱安定性を表わす。 第６図は、本発明の酵素の油脂分解性を表わす。
Claims (2)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有する新規リパー
ゼ。 作用 パーム油、オリーブ油、ヤシ油および牛脂を反応温度50
℃、20時間で95％以上分解する。 基質特異性 各種トリグリセリドを分解し、とくにトリミリスチン、
トリカプリン、トリカプリリンをよく分解する。 作用最適pH及び安定pH範囲 オリーブ油を基質とした場合、作用最適pH5.5〜7.0、安
定pH4〜10。 作用適温の範囲 オリーブ油を基質とした場合60〜65℃である。 熱安定性 pH7.0で60℃までは24時間安定である。 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量
は33,000である。 糖含有の有無 フェノール硫酸法による発色は認められず、糖は含有し
ない。 - 【請求項２】シュードモナス属に属するシュードモナス
KWI−56菌株（微工研条寄第3178号）を培養し、該培養
物から請求項（１）記載のリパーゼを採取することを特
徴とするリパーゼの製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63053189A JPH0829082B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 新規リパーゼおよびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63053189A JPH0829082B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 新規リパーゼおよびその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01225481A JPH01225481A (ja) | 1989-09-08 |
| JPH0829082B2 true JPH0829082B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=12935928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63053189A Expired - Lifetime JPH0829082B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 新規リパーゼおよびその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0829082B2 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61280274A (ja) * | 1985-06-05 | 1986-12-10 | Sapporo Breweries Ltd | 新規リパ−ゼ |
| US4933287A (en) * | 1985-08-09 | 1990-06-12 | Gist-Brocades N.V. | Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions |
| JPH0755147B2 (ja) * | 1986-03-12 | 1995-06-14 | 生体機能利用化学品新製造技術研究組合 | 新規リパ−ゼ |
-
1988
- 1988-03-07 JP JP63053189A patent/JPH0829082B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01225481A (ja) | 1989-09-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |