JPH01225481A - 新規リパーゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なリパーゼおよびその製法に関する。

（従来技術） リパーゼはトリグリセリドを基質とし、これを脂肪酸と
グリセリンとに加水分解する酵素である。また、反応液
中の水分含量を減少させると脂肪酸とアルコールよりエ
ステルを合成する作用も知られている。

現在、リパーゼの工業的利用が盛んに試みられておシ特
に脂肪酸生産プロセスへのリパーゼの導入が期待されて
いる。工業的に油脂を分解し、脂肪酸を生産させるプロ
セスは、現在、高温、高湿下での化学的加水分解法によ
って行われている。しかし、酵素反応を導入する事によ
り、常温、常圧下で反応を進ませろことができるため、
エネルギー消費量を減少させることができるばかシでは
なく、化学的加水分解法では分解され易かった不飽和脂
肪酸を分解させることなく得ることもできる。また、酵
素の基質特異性に着目し、エステル交換反応を利用して
、安価な油脂を原料とし、付加価値の高い油脂を生産す
ることも可能である。

酵素を工業利用しようとする際には、反応速度・雑菌汚
染等の面から温度に対する安定性が要求されることが多
く、リパーゼもまた例外ではない。耐熱性リパーゼとい
う点においては、％忙シェードモナス属細菌がこれらの
リパーゼを生産しうろことが報告されている。

すなわち、シェードモナス働メフィディカ・バリュタ、
Ｘｌｌリボリティ力（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｐ
ｈｉ　ｔｃａｖａｒ、　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が生産
する、作用ｉ適１ｉ７０Ｃ，６０Ｃ，１４時間の熱処理
によっても失活しないリパーゼ（特公昭５０−２５５５
３　）、シ−−モナス◆フラジ−（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｆｒａｇｉ　）　　が生産する、作用最適温度６
５〜７０Ｃ，ｐＨ９，５０ｒ、２４時間の熱処理によっ
ても失活しないリパーゼ（特開昭６ｌ−２８０２７４）
、シェードモナス・フルオレセンス・バイオタイプＩ（
ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　
）が生産する、作用最適温度６７Ｃ，６０Ｃ，２０時間
の熱処理によっても８６．９チの活性を保持するリパー
ゼ（特開昭５７−５８８８５）などの報告が知られてい
る。

（発明が解決しようとする問題点） 工業的な油脂の加水分解、改質等の油脂原料としては、
牛脂・豚脂・ヤシ油・パーム油等の常温で固体である油
脂が用いられる傾向にある。

したがって、油脂を融点以上の温度で反応させるか、有
機溶剤の添加によジ液状化した後反応させねばならない
。このため、工業用リパーゼとして、耐熱性を持ち、し
かも高温下で最適反応性を持つものか、または、有機溶
剤に対して耐性を持ち、その存在下で反応を進められる
ものでなくてはならない。更に、脂肪酸生産用リパーゼ
には、上記固体脂をできるだけ短時間に、よシ高い分解
率（９０俤以上）で分解する能力が要求され、また金属
石けんの生成を避ける点から、活性発現や活性増大のた
めにカルシウムの添加を必要としないものが要求される
。このようなリパーゼの検索は盛んに行われてきたが、
工業的レベルでその需要に応えられる酵素は現在まで得
られていない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、耐熱性を持つリパーゼを生産する微生物
を広く自然界よル探索した結果、神奈川県厚木市の土壌
よ夕分離したシ−−モナス属に属するＫＷＩ−５６菌株
が、前述の要求をみたすリパーゼを生産することを見出
した。その後、このリパーゼを精製して理化学的性質を
調べたところ、新規リパーゼであることを見い出し、本
発明を完成した。

本発明のリパーゼの生産に使用する微生物は、シー−ト
モナス属に属し、上記の理化学的性質を有するリパーゼ
の生産能力を有するものであれば、いかなるものでもよ
いが、具体的には前記のシー−トモナスＫＷＩ　−５６
菌株が挙げられる。

次に、活性測定法および本発明のリパーゼの理化学的性
質について詳細に説明する。

■　活性測定法（回転攪拌法） ８１反　　応 反応容器に１／２０Ｍ　９ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）５
ｍ、オリーブ油ｘａｌ、酵素液を所定量（通常１ゴ以下
）入れ、３７Ｃ，６０分、スターシー５ｏｏｒｐａで反
応を行った後、エタノール２０ｍを加えて停止させる。

ｂ、　　測　　　　　定 反応で生成した脂肪酸を１／２０　ＮのＫＯＨで滴定す
る。酵素活性は、１分間にｌマイクロモルの脂肪酸を遊
離させる酵素量を１ユニツト（ＩＵ）とした。

なお、本酵素の活性測定は、特に記載しないかぎシ上記
の条件において行った。

■作　用 パーム油、オリーブ油、ヤシ油および牛脂に対して、１
０００　ＩＵ／Ｐ−ｏｉｌとなるように酵素を添加し、
５０Ｃで２０時間反応させると、９５俤以上分解する。

■　基質特異性 種々の基質に対する分解活性を５０Ｃにおいて測定し、
同条件でのオリーブ油に対する分解活性を１００として
第１表に示した。

このリパーゼは、トリミリスチン、トリカプリン、トリ
カブリリンをとくによく分解する。また、鯨ろうは分解
するが、オレイン酸の低級アルコールエステルは、分解
しない。

第１表 注）６５℃、２０分叉応で測定 ■　作用最適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 オリーブ油を基質として回転攪拌法にて、　　（本発明
のリパーゼに対するｐＨの影響を調べたう結果を第１図
に示した。第１図は、活性の最大値をＺｏｏとし、各ｐ
Ｈにおける相対活性を示す。第１図から作用最適ｐＨは
５．５〜７．０であることがわかる。

次に、本発明のリパーゼをプリトン−ａビンノン緩衝液
を用い、３０Ｃ，２４時間各ｐＨに保持したのち、回転
攪拌法にてｐＨの安定　　１性を調べた。結果を第２図
に示した。第２図も活性の最大値を１００とし、各ｐＨ
における相対活性を示す。第２図から本発明のリパーゼ
はｐＨ４〜１０で安定である。

■　作用適温の範囲 オリーブ油を基質とし、各温度で２０分間反応を行い、
活性を調べた。結果を第３図に示した。第３図は、活性
の最大値を１００とし、各温度における相対活性を表わ
す。第３図から、本酵素の作用最適温度は６０〜６５Ｃ
であることがわかる。

■熱安定性 １／２０Ｍピペス緩衝液（ｐＨ７，０）に酵素を蛋白濃
度で０．１％となるように調製し、３７〜７５Ｃに３０
分〜２４時間保持したのち、回転攪拌法で残存活性を測
定した。結果は、未処理酵素の活性をＺｏｏとして第４
図及び第５図に示した。本酵素は、６００．２４時間の
加熱処理後も９６俤の活性を維持していた。

■　ｐＨ１温度などによる失活の条件 本発明のリパーゼは、第２図より、ｐＨ３以下またはｐ
Ｈ１２以上では、３７Ｃ，２４時間で失活することがわ
かる。また、第４図及び第５図よりｐＨ７，０において
、７ＣＩ’では２４時間後に８２％失活することがわか
る。

■阻　害 金属イオンによる活性阻害を調べた。

１／２０Ｍのピペス緩衝液を用い、ｌｒＩＬＭの下記金
属塩存在下、回転攪拌法で活性を測定し、金属塩無添加
の場合の活性を１００として測定結果を第２表に示した
。Ｃｕｒ″、Ｚｎ”、　Ｈｇ”＋およびＳｎ２＋は本酵
素を失活させることがわかる。

また、Ｃａ！＋の添加が酵素活性に影響を及ぼさないこ
とから、本酵素では活性発現φ増大のために反応系へＣ
ａ２４ｐを添加する必要はない。

第　　２　　表 次に界面活性剤による活性阻害を調べた。

各種界面活性剤を０．５１含む１／２０Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）を用いて、オリーブ油を基質とした回転
攪拌法によシ活性を測定した。

測定結果を、界面活性剤無添加の場合の活性をＺｏｏと
して第３表（示した。

第　　３　　表 第３表から反ろ液中に界面活性剤が０．５％共存する系
ではコール酸ソーダ、デオキシコール酸ソーダ、タウロ
コール酸ソーダ等の胆汁酸塩で５０〜８０チ、その他の
界面活性剤で９０％以上の阻害を受けることがわかる。

リパーゼの中には、胆汁酸塩の共存によって活性の増大
するものがあるが、本酵素は活性の発現に胆汁酸塩を必
要とせず、むしろその存在によシ阻害を受けることが明
らかとなった。

■精製方法 シェードモナスＳｐ、ＫＷＩ−５６ヲオレイン酸１％、
ポリペプトン２チ、ＫＨ＊ＰＯ４ｏ、　１％、ＭｇＳＯ
４・７ＨｚＯｏ、　０５　％、酵母ｘ＊ｘ　ｏ、　Ｉ　
Ｔｏｔ含有する培地で培養し、この培養液にアセトン５
０％を添加し、遠心分離により菌体を除去した。次に遠
心上澄液を精密濾過によシ濃縮し、さらに本酵素がアセ
トン沈殿に耐性を持っていることを利用してアセトン沈
殿をくり返し、最後にゲル濾過によ）、電気泳動的に単
一な本酵素の精製標品を得た。比活性は２５５０ＩＵ／
Ｊ−蛋白でありり。

［相］等電点（ｐＩ） アンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）を用い、
１５００Ｖ　１５時間の等電点電気泳動を行った。標準
物質として、チトクロームＣ（１）Ｉ９．６０）、キモ
トリプシン（ｐＩ　＆８０　）、諒ミオグロビン（１）
Ｉ＆０５）、馬ミオグロビン（ｐＩ７．ＯＯ）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（ｐＩ　６．００　）、β−ラク
トグロブリンＢ　（１）Ｉ　５．１０　）、フィコシア
ニン（ｐＩ　４６５　）を用いた。この等電点電気泳動
法による測定結果から、ｐＩ＝５．０が得られた。

■分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により、分子量３
３０００の値を得た。分子量マーカーとして、フォスフ
ォリラーゼｂ（分子量９７４００）、牛血清アルブミン
（分子量６６２００）、オボアルプミン（分子量４２６
９９）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量３１００
０）、トリプシンインヒビター（分子量２１５００）、
リゾチーム（分子量１４４００）を用いた。

＠　糖含有の有無 フェノール硫酸法による発色は認められず、糖は含有し
ない。

［相］元素分析 Ｈ（ａ、８％）、Ｃ（４７，５％）、Ｎ（１４，７％）
本発明のリパーゼの酵素を生産するには、シュードモナ
ス属に属する細菌、特にＫＷＩ−５６菌株を利用するの
が好ましい。

この菌株の菌学的性質を以下に示す。この菌学的性質の
検討には、「微生物の分類と同定」（長谷用武治著、学
会出版センター）、［医学細菌同定の手びきＪ　（Ｓ、
Ｔ、Ｃｏｖａｎ著、坂崎利−訳、近代出版）、「新細菌
培地学講座」（坂崎利−著、近代出版）に記載された方
法、培地組成を用いた。

ａ）形　　態 ■細胞の形及び大きさ：長さ２２〜３．０ミクロン、幅
０．５〜０．７ミクロンの桿菌 ■細胞の双形性：単独または短連鎖 ■運動性：あシ、１本の極鞭毛を持つ ■胞子：なし ■ダラム染色：陰性 ■抗酸性：なし ｂ）生育状態 ■肉汁寒天平板培養二円形、とつ円状、表面は滑らかで
光沢がある。わずかに黄色を帯びた白色。

■肉汁寒天斜面培養：糸状、生育は普通、表面は滑らか
で光沢がある。色素生成せず。

わずかに黄色を帯びた白色。

■肉汁液体培養：生育は普通、混濁、色素生成せず。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通、液化。

■リドマスミルク：微アルカリ性、液化。

Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陽性。

■脱窒反応：陰性。

■ＭＲテスト：陰性。

■ｖｐテスト：陰性。

■インドールの生成：陰性。

■硫化水素の生成：わずかに陽性。

■デンプンの加水分解：陰性。

■クエ？酸の利用：ユーザーの培地；陽性。

クリステンセンの培地；陽性。

■無機窒素源の利用：硝酸ナトリウムは利用しないが硫
酸アンモニウムは利用する。

［相］色素の生成ニジエートモナスＦアガー、シュード
モナスＰアガー（デイフコ社製）、クリグラ−の培地（
指示薬は含まず）、ＴＳＩ寒天培地（指示薬は含まず）
において、色素の生成はみられない。

■ウレアーゼ：陽性。

＠オキシダーゼ：陽性。

０タカラーゼ：陽性。

■生育の範囲 ｐＨ：ｔｓ〜８．５で生育。５．５〜７．０で最適。

温度：１５〜３７Ｃで生育。１０Ｃおよび・４０Ｃで生
育はみられない。３３Ｃ 前後が最適。

■酸素に対する態度：好気性 ＠　Ｏ−Ｆテスト：好気的に酸を生成。

■糖類からの酸およびガスの生成の有無Ｈｕｇｈ−Ｌｅ
　ｉ　ｆＳｏｎ法による。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、 Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ −７ラクトース、Ｄ−ガラクトース、 麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−／ルビット
、Ｄ−マンニット、イ ノジット、グリセリンからガスは発生 しないが酸を生成する。デンプンから はガスも糖も生成しない。

＠ポリーβ−ヒトａΦシ酪酸の蓄積：陽性。

［相］グロトカテキン酸の分解：オルト型。

［相］グルコン酸の酸化：陽性。

■アルギニン脱炭酸：陰性。

Ｏリジン脱炭酸：陽性。

［相］リパーゼの生産：陽性。

［相］炭素化合物の利用：　５ｔａｎｉｅｒらの方法に
よ、る。

グルコース、ガラクトース、ラクトース、アラとノース
、マルトース、ンルビトール、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ア
ルギニン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、アセトアミド
、ＤＬ−β−ヒドロキシ酪酸で生育するが、グリシン、
イスリン、イタコン酸、メタコン酸では生育せず。

以上の菌学的性質からバーシイのマニュアルΦオプ・デ
イタミネイティブ会バクテリオロジー第８版（Ｂｅｒｇ
ｅｙｓ’Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｌ）ｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　８ｅｄ）および、バ
ーシイのマニュアル・オプ・システマティックーバクテ
リオロジー（Ｂｅｒｇｅｙｓ’Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ）に
基づき検索した結果、シー−トモナス・セパシアにほぼ
一致した。しかし、従来のシェードモナス・セパシアは
、４０Ｃにおいて生育可能であるが、本菌株は３７Ｃ以
下の温度下でなければ生育はできない。また、従来のシ
ュードモナス・セパシアは非螢光性の色素を生産するに
もかかわらず、本菌株では色素の生産を見ることはでき
ない。

さらに、既知の耐熱性リパーゼを生産するシュードモナ
ス属細菌、すなわち前記のシュードモナス・メフィテイ
カ・バリエタス・リポリティカ、シェードモナス・フラ
ジ−、シュードモナス・フルオレセンス・バイオタイグ
エと比較しても、少なくとも以下の菌学的性質に関して
差異がみられる。

以上の知見よシ、本菌株はシェードモナス・セパシアと
極めて近い分類学的関係にありながらも新菌株であると
判断し、シェードモナス・ＫＷＩ−５６株と命名した。

本菌株は昭和６２年ｌθ月１５日に通商産業省工業技術
院微垂物工業技術研究所に寄託した。微生物受託番号は
、微工研菌寄第９６５９号（ＦＥＢＭ　Ｐ−９６５９）
である。

本菌株を用いて耐熱性リパーゼを生産することができる
。培養条件は次のとおシである。

まず培地組成であるが、本菌株はオリーブ油等の油脂ま
たはオレイン酸等の脂肪酸が培地中に存在する時にのみ
誘導的にリパーゼを生産する。このため、炭素源として
は油脂または脂肪酸を用いるか、もしくはグリセリン、
各種糖類などの本菌株が資化しうる物質に、適当な量の
油脂または脂肪酸を添加したものを使用すればよい。窒
素源には、硫酸アンモニウム、肉エキス、ポリペプトン
、大豆粉などが利用できる。

さらに無機塩として、カリウム、ナトリウム、リン酸、
マグネシウム、カルシウムなどの各塩類を添加する必要
がある。

以上述べた培地組成でｐＨｔ−０，７に調整し、２７Ｃ
において、好気的に培養をおこなえば、培養開始後１日
〜２日間で培地中のリパーゼ生産量は最大となる。得ら
れた培養液は遠心分離や濾過によって菌体を除去した後
、その上澄液を酵素液として回収できる。この酵素液か
ら本発明のリパーゼを精製するには、酵素液を有機溶剤
（アセトン、エタノール等）による沈殿法、硫安による
塩析法、限外濾過膜法等の常法により濃縮し、ゲル濾過
、電気泳動等により、酵素標品を得ることができる。

（作　　用） 本発明の耐熱性リパーゼは、カルシウムの添加なしに天
然油脂、トリグリセリドに対して高い分解能を有し、と
くに固体脂に対してその融点以上の温度で作用しうる能
力を有しているので常温、常圧下で油脂を加水分解して
脂肪酸を生産したシ、エステル交換反応により油脂の改
質を行うことができる。

次に実施例によシ本発明を説明する。

〔実施例〕

実施例１ オレイン酸１俤、ポリペプトン２％、Ｋ）４Ｐ０゜０．
１幅、Ｍｇ　ＳＯ４・７　Ｈｚｏ　０．０５％、酵母エ
キス０．１％よりなる液体培地１９Ｊを３０ノ容ジャー
ファーメンタ−に入れ、加圧蒸気滅菌した後、あらかじ
め同培地で３０Ｃ１１時間振とり培養したシェードモナ
スＳｐ、ＫＷＩ−５６株の前培養液を接種し、ｐＨ７，
２７Ｃ，４４時間、３００ｒｐｌＳＩＶＶＴｎで通気攪
拌培養した。培養液にアセトンを同量添加した後、遠心
分離により菌体を除去して粗酵素液を得た。

実施例２ 上記粗酵素液からアセトンを除去した後、中空糸型メン
ブレンフィルター（孔径０．２μｎ）を用いて濃縮し、
比活性１８０　ＩＵ／ｌＲ９−蛋白の濃縮液３Ｂを得た
。この液に冷却したアセトンを６０係となるように添加
し、夾雑蛋白を遠心分離によって除去した。この上澄液
（比活性４５０ＩＵ／＋１９−蛋白）に更に冷アセトン
を９０％となるように添加して酵素を沈殿として遠心分
離によって回収した。

沈殿を１／ＩＯＭ硫安を含む１１５０ＭＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ７，ｏ）に溶解し、液体クロマトグラフによるゲ
ル濾過（東ソー社製ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００　ＳＷ
。

通液速度２０ｍ／ｍ）を行った。この操作によって得ら
れた酵素液は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に
おいて単一バンドを示した。この酵素液を限外濾過（ア
ミコン社製ダイヤ７０−膜、分画分子量１００００）に
よシ脱塩・濃縮した後、凍結乾燥し【比活性２５５０Ｉ
Ｕ／ｒｎ９−蛋白の精製酵素標品を得た。

実施例３ 本発明のリパーゼを用い回転攪拌法に準じて、各種油脂
の分解実験を行った。

パーム油・ヤシ油・牛脂等の固体脂およびオリーブ油を
各々１００ｍ９とり、これに緩衝液５ゴおよび酵素１０
０　ＩＵを添加、して、回転攪拌法により５ｏＣ１２０
時間反応させた。第６図に示したように、いずれの油脂
も９５チ以上分解することができた。

実施例４ オレイン酸とグリセリンを基質としてエステル合成反応
を行わせ、逆反応活性を測定した。

グリセリン５ゴ、オレイン酸０．５　ｍＡ’に酵素液ｏ
、５ｍ１（ｓｏＩＵ）を添加し、３７Ｃ，５００ｒｐｌ
、　６０分反応させた後、アセトンとエタノールのｌ対
ｌ混合液ｚｏｍｌを添加して反応を停止させた。

逆反応活性は残存するオレイン酸を１／ｌ０ＮＫＯＨ（
エタノール溶液）にて滴定し１分間に１μｍｏｌのオレ
イン酸を消費する活性をＩ　ＩＵとした。

本発明の酵素では逆反応活性の分解活性に対する比は０
．０３２であった。

実施例５ 大豆油とグリセリンを基質としてエステル交換反応を行
わせた。大豆油２０１、グリセリン４０りに酵素液１Ｍ
（ｌｏ　ｏ　ｏ　ｏ　ＩＵ）を添加し、３０Ｃ，９０分
間役押し反応させた。

反応終了後、反応液をシリカゲル薄層りａマドグラフィ
ーにより分析した結果、モノグリセリドおよびジグリセ
リドが生成していることを確認した。

（効　　果） 本発明によれば、シェードモナスＳｐ、ＫＷＩ−５６菌
株を培養し、その培養液から本発明のリパーゼを得るこ
とができる。このリパーゼはカルシウムの添加なしに天
然油脂、トリグリセリドに対して高い分解能を有し、と
くに固体脂に対してその融点以上の温度で作用しうる能
力を有しているので、常温常圧下で油脂を加水分解して
脂肪駿を生産したり、エステル交換反応によシ油脂の改
質を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の酵素の作用最適ｐＨを表わし、第２
図は本発明の酵素の安定ｐＨ範囲を表わす。 第３図は、本発明の酵素の作用適温の範囲を表わし、第
４．５図は、本発明の酵素の熱安定性を表わす。 第６図は、本発明の酵素の油脂分解性を表わす。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する新規リパーゼ。 ［１］作用 パーム油、オリーブ油、ヤシ油および牛脂を反応温度５
   ０℃、２０時間で９５％以上分解する。 ［２］基質特異性 各種トリグリセリドを分解し、とくにトリミリスチン、
   トリカブリン、トリカブリリンをよく分解する。 ［３］作用最適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 オリーブ油を基質とした場合、作用最適ｐＨ５．５〜７
   ．０、安定ｐＨ４〜１０。 ［４］作用適温の範囲 オリーブ油を基質とした場合６０〜６５℃である。 ［５］熱安定性 ｐＨ７．０で６０℃までは２４時間安定である。 ［６］分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子
   量は３３，０００である。
2. （２）シュードモナス属に属するシュードモナスＫＷＩ
   −５６菌株（微工研菌寄第９６５９号）を培養し、該培
   養物から請求項（１）記載のリパーゼを採取することを
   特徴とするリパーゼの製法。