UA121453C2 - Спосіб одержання фармацевтичної композиції, яка містить антитіло - Google Patents

Спосіб одержання фармацевтичної композиції, яка містить антитіло Download PDF

Info

Publication number
UA121453C2
UA121453C2 UAA201411972A UAA201411972A UA121453C2 UA 121453 C2 UA121453 C2 UA 121453C2 UA A201411972 A UAA201411972 A UA A201411972A UA A201411972 A UAA201411972 A UA A201411972A UA 121453 C2 UA121453 C2 UA 121453C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antigen
binding
antibody
binding molecule
antibodies
Prior art date
Application number
UAA201411972A
Other languages
English (en)
Inventor
Томоюкі Іґава
Томоюки ИГАВА
Сініа Ісіі
Ацухіко Маеда
Ацухико МАЕДА
Такасі Накай
Original Assignee
Чугей Сейяку Кабусікі Кайся
Чугей Сейяку Кабусики Кайся
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41161956&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA121453(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Чугей Сейяку Кабусікі Кайся, Чугей Сейяку Кабусики Кайся filed Critical Чугей Сейяку Кабусікі Кайся
Publication of UA121453C2 publication Critical patent/UA121453C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/544—Mucosal route to the airways
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу виготовлення фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, за рахунок виготовлення антитіл класу IgG, які здатні зв'язуватися з характерним антигеном, визначення антигензв'язувальної активності згаданих антитіл при різних значеннях кислотних та нейтральних рН, вибору антитіла, антигензв'язувальна активність якого є рН-залежною, одержання гену, що кодує антитіло, виготовлення антитіла із використанням гена, та змішування виготовленого на етапі антитіла з прийнятним носієм з одержанням фармацевтичної композиції, при цьому вибирають антитіло, антигензв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж його антигензв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується способу виготовлення фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, за рахунок виготовлення антитіл класу дес, які здатні зв'язуватися з характерним антигеном, визначення антигензв'язувальної активності згаданих антитіл при різних значеннях кислотних та нейтральних рН, вибору антитіла, антигензв'язувальна активність якого є рН-залежною, одержання гену, що кодує антитіло, виготовлення антитіла із використанням гена, та змішування виготовленого на етапі антитіла з прийнятним носієм 3 одержанням фармацевтичної композиції, при цьому вибирають антитіло, антигензв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж його антигензв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5.
Галузь техніки
Цей винахід стосується способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, та способів збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул, а також антиген-зв'язувальних молекул, що мають покращену фармакокінетику, антиген-зв'язувальних молекул, що мають збільшену кількість разів зв'язування з антигеном, та способів скринінгу та одержання таких молекул.
Попередній рівень техніки
Антитіла привертають до себе увагу як фармацевтичні препарати, оскільки вони є надзвичайно стійкими у плазмі та мають небагато шкідливих ефектів. На цей час на ринку доступними є ряд фармацевтичних препаратів антитіл типу ІдсС, та набагато більше фармацевтичних препаратів на основі антитіл зараз розробляється (непатентні документи 1 та 2). Крім того, розроблено різні методи, які можна застосовувати до фармацевтичних препаратів другого покоління на основі антитіл, включаючи такі, як методи, що підсилюють ефекторну функцію, антиген-зв'язувальну здатність, фармакокінетику та стійкість, та такі, що знижують ризик імуногенності (непатентний документ 3). Взагалі, необхідна доза фармацевтичного препарату на основі антитіл є дуже високою. Це, у свою чергу, спричиняє проблеми, такі як висока вартість виробництва, а також складність при виробництві фармацевтичних складів для підшкірного введення. Теоретично дозу фармацевтичного препарату на основі антитіл можна знизити шляхом покращення фармакокінетики антитіл або шляхом покращення афінності між антитілами та антигенами.
У літературі повідомляється про способи покращення фармакокінетики антитіл шляхом штучного заміщення амінокислот у константних ділянках (непатентні документи 4 та 5). Подібно до цього, про формування афінності повідомлялося як про спосіб підвищення антиген- зв'язувальної здатності або антиген-нейтралізуючої активності (непатентний документ 6). Цей метод дозволяє підсилити антиген-зв'язувальну активність шляхом введення амінокислотних мутацій у гіперваріабельну ділянку (СОК) варіабельної ділянки або їй подібної. Підсилення антиген-зв'язувальної здатності дозволяє покращити біологічну активність іп мйго або знизити дозу та, крім того, дозволяє покращити ефективність іп мімо (непатентний документ 7).
Антиген-нейтралізуюча здатність єдиної молекули антитіла залежить від її афінності. За
Зо допомогою збільшення афінності антиген можна нейтралізувати меншою кількістю антитіл. Різні способи можна використовувати для підвищення афінності антитіла. Крім того, якщо афінність можна зробити безмежною шляхом ковалентного зв'язування антитіла з антигеном, єдина молекула антитіла може нейтралізувати одну молекулу антигену (двовалентне антитіло може нейтралізувати дві молекули антигену). Проте, стехіометрична нейтралізація одним антитілом одного антигену (одним двовалентним антитілом двох антигенів) є межею попередньо існуючих способів, та, отже, неможливо повністю нейтралізувати антиген меншою кількістю антитіл, ніж кількість антигенів. Інакше кажучи, ефект підвищення афінності має обмеження (непатентний документ 9). Для того, щоб пролонгувати ефект нейтралізації нейтралізуючого антитіла на певний період часу, це антитіло слід вводити у дозі, яка перевищує кількість антигену, що виробляється в організмі під час такого ж самого періоду. При покращенні фармакокінетики антитіла або тільки способу формування афінності, який описано вище, існує, отже, обмеження стосовно зниження необхідної дози антитіла.
Відповідно, для того, щоб підтримувати антиген-нейтралізуючий ефект антитіла протягом наміченого періоду часу за допомогою меншої ніж кількість антигену кількості антитіла, єдине антитіло мусить нейтралізувати численні антигени. Способи нейтралізації численних антигенів єдиним антитілом включають інактивацію антигену із використанням каталітичних антитіл, що є антитілами, яким надана каталітична функція. Коли антиген є білком, його можна інактивувати шляхом гідролізу його пептидних зв'язків. Антитіло може неодноразово нейтралізувати антигени шляхом каталізу такого гідролізу (непатентний документ 8). Існує багато попередніх повідомлень, опублікованих стосовно каталітичних антитіл та способів їх отримання. Проте, нема повідомлень стосовно каталітичних антитіл, які мають достатню каталітичну активність як фармацевтичні агенти. Детальніше, при дослідженні антитіла іп мімо для певного антигену не виявлено жодної публікації стосовно каталітичних антитіл, які можуть виробляти порівняльний або сильніший ефект навіть при низьких дозах або виробляти більш тривалий ефект навіть при такій самій дозі порівняно зі звичайним некаталітичним нейтралізуючим антитілом.
Як сказано вище, не було жодних повідомлень про антитіла, які порівняно зі звичайними нейтралізуючими антитілами можуть виробляти більш суттєвий ефект іп мімо за допомогою єдиного антитіла, що нейтралізує численні антигенні молекули. Отже, з точки зору зменшення дози та подовження тривалості, зараз є потреба у нових способах, які б дозволили отримати нові молекули антитіл, які порівняно зі звичайними нейтралізуючими антитілами мають сильніший ефект іп мімо стосовно індивідуальної нейтралізації численних антигенних молекул.
Документи попереднього рівня техніки, які стосуються цього винаходу, наведено нижче:
Документи попереднього рівня техніки
Непатентні документи
Непатентний документ 1: Мопосіопа! апііроду зиссез5ез іп їпе сіїпіс. дапісе М Евіспені, Сіажк
У Козепзм/еїд, І ашга В Радеп 5 Майшем С Оем/йя, Маїиге Віоїесппоїоду 23, 1073-1078 (2005).
Непатентний документ 2: Раміом АК, ВеїІзеу М. Те (пегарешіс апіїродіез тагкейю 2008. Еиг
У Ріпат Віорпапт. 2005 Арг; 59(3):389-96.
Непатентний документ 3: Кіт 5), Рагк У, Нопо Н.У). Апіїроду епдіпеегіпу Тог те демеІортепі ої
Шегарешійс апіібодіє5. Мої СеїІ5. 2005 А!ца 31; 2001): 17-29. Немієму.
Непатентний документ 4: Ніпіоп РЕ, Хіопд УМ, удо МО, Тапо МТ, Кеїег 5, Тзиги5пйа М. Ап епдіпеетгед питап да апіїроду м/йй Іопдег зегит Ппаїг-Іїе. ) Іттипої. 2006 дап 1; 176(1):346-56.
Непатентний документ 5: СПеїййе М, Рором 5, Вогмак У, Кади С, Маїезої ОЮ, Медезап С, ОбБег
ВУ, Мага Е5. Іпстеазіпа Ше зегит регзібіїепсе ої ап (ДдС;ь йтадтепі Бу гтапдот тиадепезвів.
МаїВіоїесппої. 1997 диї; 15(7):637-40.
Непатентний документ 6: Каїраї А, Веуа М, Набег І, Сарриссіїййї с, Хее Н, Впай КЕ, Такеиспі
Т, Гегтег ВА, Стеа В. А депега! теїйоай ог дгеайну ітргоміпд Ше айіпйу ої апіїбодієв Бу ивіпа сотрбіпайогіаї Іргагієв5. Ргос Маї! Асай 5сі ОБА. 2005 дип 14; 102(24):8466-71. Ериб 2005 дип 6.
Непатентний документ 7: Уми Н, Ріаїт О5, допп5оп 5, Вгежап ХА, УМосаз КМ, Раїе! МК, УУпйе
М, Моипа У, Кіепег РА. Оємеіортенпі ої Моїамігитаб, ап Опга-роїепі Апііроду ог Ше Ргемепіоп ої Кезрігагу Зупсуйаї! Міги5 Іптесіоп іп їе Оррег апа І ожег Кезрігасогу Тгасі. У Мої Віої. 2007, 368, 652-665.
Непатентний документ 8: Напзоп СМ, Мізпіуата М, Раш! 5. Саїамйс апііродіез апа ВПеїг арріїсайноп5. Сит Оріп ВіоїесНпої. 2005 Оес; 16(6):631-6.
Непатентний документ 9: Каїйапазулаті Р, Коаївіай 5, Ко5Коз І, Би ОО, І асКіеє 5, Варсоок .).
ЮОетопвігаїйоп ої ап іп мімо депегаїєд 5!йр-рісотоїаг апйіпйу ту питап топосіопа! апіїбоду іптепецКкіп-8. Віоспет Віорпуз Ве5 Соттип. 2005 бер 9; 334(4):1004-13.
Суть винаходу
Задачі, які розв'язує винахід
Вищевказані обставини зумовили відкриття цього винаходу. Отже, завдання цього винаходу - це розробка способів багаторазового зв'язування антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, з антигенами та способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, а також розробка антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, які є здатними зв'язуватися з антигенами багато разів, антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, які мають покращену фармакокінетику, фармацевтичних композицій, що містять такі антиген-зв'язувальні молекули, переважно антитіла, та розробка способів скринінгу та отримання таких антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, та композицій.
Засоби розв'язання задач
У цьому описі винаходу описані дослідження стосовно способів багаторазового зв'язування поліпептидів, які мають антиген-зв'язувальну здатність, таких як антиген-зв'язувальні молекули, переважно антитіл, з антигенами та способів подовження періоду піврозпаду таких молекул у плазмі (крові) (покращення їх фармакокінетики). Внаслідок вказаного визначили, що коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули, переважно антитіла, при ранньому ендосомному рН є нижчою, ніж її антиген-зв'язувальна активність при рН плазми (крові), то буде можливим зв'язати антигени неодноразово та мати триваліший період піврозпаду у плазмі.
Отже, цей винахід стосується способів багаторазового зв'язування антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, з антигенами, способів покращення фармакокінетики антиген- зв'язувальних молекул, переважно антитіл, та способів скринінгу та отримання антиген- зв'язувальних молекул, переважно антитіл, з покращеною фармакокінетикою; цей винахід також стосується антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, які є здатними неодноразово зв'язувати антигени, та антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл з покращеною фармакокінетикою.
Цим винаходом пропонується спосіб скринінгу антитіла, який включає наступні етапи: (а) визначення антиген-зв'язувальної активності антитіла при рН від 6,7 до 10,0; (р) визначення антиген-зв'язувальної активності антитіла при рН від 4,0 до 6,5 та (с) вибирання антитіла, антиген-зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рн від 4,0 до 6,5, при цьому: бо (1) фармакокінетика антитіла є покращеною,
(2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В одному випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу антитіла, який включає етап вибору антитіла, антиген-зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 удвічі або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5.
В одному варіанті здійснення винаходу пропонується спосіб скринінгу антитіла, який включає наступні етапи: (а) зв'язування антитіла з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (р) поміщення антитіла, яке зв'язалося з антигеном за (а), в умови рН від 4,0 до 6,5 та (с) отримання антитіла, яке відокремилося при умові рН від 4,0 до 6,5, при цьому: (1) фармакокінетика антитіла є покращеною, (2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується спосіб скринінгу антитіла, зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5, який включає наступні етапи: (а) зв'язування антитіла з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (Б) елюювання антитіла, яке зв'язалося з колонкою при рН від 6,7 до 10,0, з колонки при умові рН від 4,0 до 6,5 та (с) збирання елюйованого антитіла, при цьому: (1) фармакокінетика антитіла є покращеною, (2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В іще іншому варіанті здійснення винаходу пропонується спосіб скринінгу антитіла, зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5, який включає наступні етапи: (а) зв'язування бібліотеки антитіл з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (р) елюювання антитіла з колонки при умові рН від 4,0 до 6,5; (с) ампліфікування гена, що кодує елюйоване антитіло; та (4) отримання елюйованого антитіла, при цьому: (1) фармакокінетика антитіла є покращеною, (2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В одному випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу антитіла, де принаймні одна амінокислота гіперваріабельної ділянки (СОК) або амінокислотний залишок 27 у важкому ланцюзі антитіла (за нумерацією за Кабаї) заміщений гістидином або принаймні один гістидин бо вставлений в СОК антитіла.
В іншому випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу для отримання антитіла, яке є найкращим стосовно утримання у плазмі.
В іще іншому випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу для отримання антитіла, яке є здатним зв'язуватися з антигеном два або більше разів.
В іще одному випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу для отримання антитіла, яке є здатним зв'язуватися з більшою кількістю антигенів порівняно з кількістю його антиген-зв'язувальних ділянок.
В іще одному випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу для отримання антитіла, яке усередині клітини відокремлює антиген, з яким воно зв'язалося ззовні клітини.
В іще одному випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу для отримання антитіла, яке зв'язується з антигеном, та інтерналізується у клітину, та виділяється за межі клітини у вільній від антигену формі.
В іще одному випадку виконання винаходу пропонується спосіб скринінгу для отримання антитіла, яке має підвищену здатність елімінувати антиген у плазмі.
Цим винаходом також пропонується спосіб одержання антитіла, який включає наступні етапи: (а) визначення антиген-зв'язувальної активності антитіла при рН від 6,7 до 10,0; (р) визначення антиген-зв'язувальної активності антитіла при рН від 4,0 до 6,5; (с) вибирання антитіла, антиген-зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5; (а) отримання гена, що кодує антитіло, вибране у (с); та (є) одержання антитіла із використанням гена, отриманого у (а), при цьому: (1) фармакокінетика антитіла є покращеною, (2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній
Зо від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В одному варіанті здійснення винаходу пропонується спосіб одержання антитіла, який включає наступні етапи: (а) зв'язування антитіла з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (Б) надання можливості антитілу за (а), зв'язаному з антигеном, витримуватися при умові рН від 4,0 до 6,5; (с) збирання антитіла, яке відокремилося при умові рН від 4,0 до 6,5; (4) отримання гена, що кодує антитіло, отримане у (с); та (є) одержання антитіла із використанням гена, отриманого у (4), при цьому: (1) фармакокінетика антитіла є покращеною, (2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується спосіб одержання антитіла, зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5, який включає наступні етапи: (а) зв'язування антитіла з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (Б) елюювання антитіла, яке зв'язалося з колонкою при рН від 6,7 до 10,0, з колонки при умові рН від 4,0 до 6,5; (с) збирання елюйованого антитіла; (4) отримання гена, що кодує антитіло, отримане у (с); та (є) одержання антитіла із використанням гена, отриманого у (а), при цьому: бо (1) фармакокінетика антитіла є покращеною,
(2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В іще іншому варіанті здійснення винаходу пропонується спосіб одержання антитіла, зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5, який включає наступні етапи: (а) зв'язування бібліотеки антитіл з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (р) елюювання антитіла з колонки при умові рН від 4,0 до 6,5; (с) ампліфікування гена, що кодує елюйоване антитіло; (4) збирання елюйованого антитіла; (є) отримання гена, що кодує антитіло, зібране у (а); та () одержання антитіла із використанням гена, отриманого у (є), при цьому: (1) фармакокінетика антитіла є покращеною, (2) кількість разів зв'язування антитіла з антигеном є збільшеною, (3) кількість антигенів, які можуть зв'язуватися антитілом, є збільшеною, (4) антиген відокремлюється усередині клітини від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини, (5) антитіло, яке зв'язалося з антигеном та інтерналізувалося у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини або (6) здатність антитіла елімінувати антиген у плазмі є підвищеною.
В одному випадку виконання винаходу пропонується спосіб одержання антитіла, який далі включає етап заміщення принаймні однієї амінокислоти гіперваріабельної ділянки (СОК) або амінокислотного залишку 27 у важкому ланцюзі антитіла (за нумерацією за Кара) гістидином або вставляння принаймні одного гістидину в СОЕ. антитіла.
Цим винаходом також пропонується:
ПЇЇ антиген-зв'язувальна молекула, що має значення КО(рно5,вуУКО(рн7, 4), визначене як відношення КО для антигену при рН 5,8 та КО для антигену при рН 7,4, яке становить 2 або більше;
І) антиген-зв'язувальна молекула за |1|, де значення КО(рн5 вуУКО(рнН?7,4) становить 10 або більше;
ІЗЇ антиген-зв'язувальна молекула за (1), де значення КО(рно5,вуУКО(рн?7,4) становить 40 або більше;
ЇЇ антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від (1| до ІЗ), де принаймні одна амінокислота антиген-зв'язувальної молекули заміщена гістидином або принаймні один гістидин вставлений в антиген-зв'язувальну молекулу;
І5Ї антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від |1| до |4|Ї, де антиген-зв'язувальна молекула має антагоністичну активність;
ІБЇ антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від |1| до (5), де антиген-зв'язувальна молекула зв'язується з мембранним антигеном або розчинним антигеном;
Ї/Ї антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від |1| до ІбБ), де антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло;
ІВЇ фармацевтична композиція, яка включає антиген-зв'язувальну молекулу за будь-яким від
ПІ до 71;
ІЗЇ спосіб покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рн 7,4;
МОЇ спосіб збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рн 74;
ПІ спосіб збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4;
121 спосіб відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген- зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рн 7,4;
І1З3| спосіб виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рн 7,4; 141 спосіб підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антиген у плазмі шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рн 7,4; 151 спосіб за будь-яким від (9) до (14)Ї, де значення КО(рн5,вуУКО(рін7, 4), визначене як відношення КО для антигену при рН 5,8 та КО для антигену при рН 7,4, становить 2 або більше;
І16Ї спосіб за будь-яким від (9) до (14), де значення КО(рн5,вуУКО(рн?7,4) становить 10 або більше;
І17| спосіб за будь-яким від (9) до (14), де значення КО(рнН5,вУКО(рн?7 4) становить 40 або більше; 18) спосіб покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу;
М9| спосіб збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу;
І20| спосіб збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу; (211 спосіб відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген- зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген- зв'язувальну молекулу;
Зо (22)| спосіб виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу;
І23| спосіб підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антиген у плазмі шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу;
І(24| спосіб за будь-яким від І18| до (23), де заміщення гістидином або вставка гістидину підвищує значення КО(рно5,вуУкКО(рн7,4), визначеного як відношення антиген-зв'язувальної активності при рН 5,8 та антиген-зв'язувальної активності при рН 7,4, порівняно зі значенням
КОо(рН5,вУКО (рН? 4) до заміщення гістидином або вставки гістидину; (251 спосіб за будь-яким від (|9| до (24), де антиген-зв'язувальна молекула має антагоністичну активність; (26| спосіб за будь-яким від (9) до (25), де антиген-зв'язувальна молекула зв'язується з мембранним антигеном або розчинним антигеном; (27| спосіб за будь-яким від |9І| до (26, де антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло; (281) спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (а) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0; (р) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 та (с) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рн від б,7 до 10,0 є більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5;
І29| спосіб скринінгу за (28)Ї, який включає етап вибору антитіла, антиген-зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 удвічі або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5;
ІЗОЇ спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (а) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (Б) поміщення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном за (а), в умови рН від 4,0 до 6,5 та
(с) отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5;
ЇЗТ|Ї спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є вищою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який включає наступні етапи: (а) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рн; (Б) елюювання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з колонкою при першому значенні рнН, з колонки при умові другого значення рН та (с) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули;
ЇЗ2| спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є більшою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який включає наступні етапи: (а) зв'язування бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рн; (р) елюювання антиген-зв'язувальної молекули з колонки при умові другого значення рн; (с) ампліфікування гена, що кодує елюйовану антиген-зв'язувальну молекулу; та (4) отримання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули;
ІЗ3|Ї спосіб скринінгу за ІЗ11 або ІЗ21, де перше значення рнН становить від 6,7 до 10,0, а друге значення рН становить від 4,0 до 6,5;
ІЗ4| спосіб скринінгу за будь-яким від (281 до ІЗЗІЇ, де принаймні одна або більше амінокислот антиген-зв'язувальної молекули заміщені гістидином або принаймні один гістидин вставлений в антиген-зв'язувальну молекулу;
ЇЗ5| спосіб скринінгу за будь-яким від (28) до ІЗЗ|Ї для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка є найкращою стосовно утримання у плазмі;
ІЗбЇ спосіб скринінгу за будь-яким від (28) до ІЗЗ|Ї для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка є здатною зв'язуватися з антигеном два або більше разів;
ІЇЗ7| спосіб скринінгу за будь-яким від (28) до ІЗЗ|Ї для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка є здатною зв'язуватися з більшою кількістю антигенів порівняно з кількістю її антиген-зв'язувальних ділянок;
ІЗВ| спосіб скринінгу за будь-яким від (28) до ІЗЗ|Ї для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка усередині клітини відокремлює антиген, з яким вона зв'язалася ззовні клітини;
ЇЗ9|Ї спосіб скринінгу за будь-яким від (28) до ІЗЗ|Ї для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язується з антигеном, та інтерналізується у клітину, та виділяється за межі клітини у вільній від антигену формі;
І4ОЇ спосіб скринінгу за будь-яким від (28) до ІЗЗ|Ї для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка має підвищену здатність елімінувати антиген у плазмі;
Ї41| спосіб скринінгу за будь-яким від (28) до |І40)Ї, де антиген-зв'язувальна молекула використовується як фармацевтична композиція;
І421| спосіб скринінгу за будь-яким від (|281| до |41Ї, де антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло;
І43Ї спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (а) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0; (р) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5; (с) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рн від б,7 до 10,0 є більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5; (ад) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, вибрану у (с); та (є) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (4);
І44| спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (а) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (б) надання можливості антиген-зв'язувальній молекулі, зв'язаній з антигеном за (да), витримуватися при умові рН від 4,0 до 6,5; (с) збирання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5; (а) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (с); та (є) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (а);
І45| спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є вищою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який 60 включає наступні етапи:
(а) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рн; (Б) елюювання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з колонкою при першому значенні рн, з колонки при умові другого значення рн; (с) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (4) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, отриману у (с); та (є) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (а);
І46| спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є вищою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який включає наступні етапи: (а) зв'язування бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рн; (р) елюювання антиген-зв'язувальної молекули з колонки при умові другого значення рн; (с) ампліфікування гена, що кодує елюйовану антиген-зв'язувальну молекулу; (4) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (є) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (4); та () одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (е);
І47| спосіб одержання за І|451) або І46Ї, де перше значення рнН становить від 6,7 до 10,0, а друге значення рН становить від 4,0 до 6,5;
І48| спосіб одержання за будь-яким від |43| до |47|, який далі включає етап заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу;
І49| спосіб одержання за будь-яким від (|431| до (|481, де антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло;
І5ОЇ фармацевтична композиція, яка містить антиген-зв'язувальну молекулу, одержану за будь-яким способом одержання від І431| до (491.
Ефекти винаходу
Цим винаходом пропонуються способи одержання єдиних антиген-зв'язувальних молекул, переважно антитіл, які неодноразово зв'язуються з численними антигенними молекулами. Коли
Зо антиген-зв'язувальна молекула, переважно антитіло, зв'язується з численними антигенними молекулами, тоді фармакокінетику антиген-зв'язувальної молекули, переважно антитіла, можна покращити, та така молекула може демонструвати найкращі ефекти іп мімо порівняно з ефектами звичайних антиген-зв'язувальних молекул.
Стислий опис ілюстративного матеріалу
Фіг. 1 - це схема, яка показує шлях антитіл, зв'язаних зі зв'язаним з мембраною антигеном.
Фіг. 2 - це схема, яка показує механізм, за допомогою якого молекули до реутилізуються за допомогою ЕсКп.
Фіг. З - це схема, яка показує повторне зв'язування молекул дос з новим антигеном після відділення від зв'язаного з мембраною антигеном усередині ендосом.
Фіг. 4 - це схема, яка показує повторне зв'язування молекул дО з новим антигеном після відділення від розчинного антигену усередині ендосом.
Фіг. 5 - це схема, яка ілюструє метод пенінгу із використанням колонки з іммобілізованим антигеном.
Фіг. 6 представляє графіки фагового ЕЛАЙЗА (ЕІ І5А) для клонів, набутих внаслідок пенінгу з використанням колонки. Верхній графік показує природний тип (М/Т), а нижній графік показує
СІ 5.
Фіг. 7 - це графік, що показує біологічну нейтралізуючу активність антитіл проти рецептора
ІІ 6, які зв'язуються залежним від рН чином.
Фіг. 8 представляє графіки, які показують результати Віасоге-сенсорграми для зв'язування антитіл проти рецептора І 6, які зв'язуються залежним від рН чином, з розчинним рецептором
ІЇ.6 при рН 7,4. Верхній графік показує УМТ; другий графік зверху показує НЗрі/ 73; третій графік зверху показує НІ170/ 82 та нижній графік показує СІ Н5Л 73.
Фіг. 9 представляє графіки, які показують результати Віасоге-сенсорграми для зв'язування антитіл проти рецептора ІІ 6, які зв'язуються залежним від рН чином, з розчинним рецептором
І.6 при рН 5,8. Верхній графік показує М/Т; другий графік зверху показує НЗрі/ 73; третій графік зверху показує НІ170/ 82 та нижній графік показує СІ Н5Л 73.
Фіг. 10 представляє графіки, які показують результати Віасоге-сенсорграми для асоціації (рн 7,4) з рецептором І/6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора 16, які зв'язуються залежним від рН чином. Верхній графік показує УМ"; другий графік зверху показує НЗрі/І 73; третій графік зверху показує Н170/ 82 та нижній графік показує
СІ Н5Б/ 73.
Фіг. 11 - це Віасоге-сенсорграма, яка вказує на неодноразове зв'язування антитіл проти рецептора ІІ 6, які зв'язуються залежним від рН чином, з 5К344.
Фіг. 12 - це графік, що показує загальну кількість зв'язаного антигену в експерименті багаторазового зв'язування антитіл проти рецептора І/6, що зв'язуються залежним від рн чином, з 5344.
Фіг. 13 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі антитіл проти рецептора І 6, які зв'язуються залежним від рН чином, у трансгенних мишей з рецептором І/І-6 людини.
Фіг. 14 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі антитіл проти рецептора ІІ 6, які зв'язуються залежним від рН чином, у мавп супотоїЇдив.
Фіг. 15 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій С-реактивного білку у плазмі (СЕР) у мавп супотоїЇди5 для антитіл проти рецептора ІІ 6, які зв'язуються залежним від рн чином.
Фіг. 16 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій рецептора ІІ 6 незв'язаного типу мавп супотоїЇди5 у мавп супотоїЇди5 для антитіл проти рецептора І! 6, які зв'язуються залежним від рН чином.
Фіг. 17 представляє графіки, які показують результати Віасоге-сенсорграми для асоціації (рн 7,4) з рецептором І/б6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора ІГ.6, які зв'язуються залежним від рН чином. Рухаючись зверху униз, представлено результати для МТ, НЗрі/ 73-ІДИ, Ем2-ІДдоІ та Ем4-Ідсаі.
Фіг. 18 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі для антитіл проти рецептора 16 (УТ, НЗрі/І 73-ІДИІ, Ем2-ІДдсІ та Ем4-ІдоІі), які зв'язуються залежним від рн чином, у трансгенних мишей з рецептором 1-6 людини.
Фіг. 19 представляє графіки, які показують результати Віасоге-сенсорграми для асоціації (рн 7,4) з рецептором 1-6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора ІГ.6, які зв'язуються залежним від рН чином. Рухаючись зверху униз, представлено результати для М/Т, Ем4-ІДдаї, Ем4-Ідс2 та Ем4-М58.
Зо Фіг. 20 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі для антитіл проти рецептора І 6 (МТ, Ем4-Ідасі, Ем4-Ід52 та Ем4-М58), які зв'язуються залежним від рн чином, у трансгенних мишей з рецептором 1-6 людини.
Фіг. 21 представляє графіки, які показують результати Віасоге-сенсорграми для асоціації (рн 7,4) з рецептором 1-6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора 1.6, які зв'язуються залежним від рН чином. Рухаючись зверху униз, представлено результати для ЕмІ-М71, ЕмІ-М7З, Ем3-М71 та Ем3-М73.
Фіг. 22 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі для антитіл проти рецептора І/6, які зв'язуються залежним від рН чином, у мавп супотоЇди5 під час введення НЗрі/І 73-ІДаІ, Емі-М71, ЕмІі-М7З, Ем2-ІдаІ, Ем3-М7З та Ем4-М73З у дозі 0,5 мг/кг та під час введення високоафінного антитіла (АБ) у дозі 1,0 мг/кг.
Фіг. 23 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій СКР у мавп супотоїЇди5 для антитіл проти рецептора 116, які зв'язуються залежним від рН чином (групи, яким вводилися
Нзріл 73-Іда-, Емі-М71-, ЕмІ-М73-, Ем2-ІдаІ-, Ем3-М73-, Ем4-М73- та високоафінне АБ).
Фіг. 24 - це графік, що показує зміну за часом концентрацій рецептора 1-6 незв'язаного типу мавп супотоЇди5 у мавп супотоїЇдив5 для антитіл проти рецептора ІГ 6, які зв'язуються залежним від рН чином (групи, яким вводилися НЗрі/ 73-ІдаїІ-, ЕміІ-М71-, Емі-М73-, Ем2-Ідаї-, Ем3-М73-, Ема-
М73- та високоафінне АБ).
Фіг. 25 - це схема, яка показує ЕК1, ЕК2, ЕКЗ та ЕК4 разом з СОКІ1, СОК2 та СОКЗ важких ланцюгів (МНІТ, МН2, УНЗ, МН) та легких ланцюгів (МІ 1, МІ/2, МІ-3). Зірочки вказують на місця, де існують амінокислотні мутації у вирівняних послідовностях.
Фіг. 26 представляє Віасоге-сенсорграму, яка показує залежне від рН зв'язування антитіла проти 1-6, клону 2 проти 1-6, з І/-6 при рН 7,4 та рН 5,5. Криві на сенсорграмі при рН 7,4 відповідають 100, 50, 25,12,5 та 6,25 нг/мл 1-6 у напрямку зверху униз.
Фіг. 27 представляє Віасоге-сенсорграми, яка показує залежне від рН зв'язування антитіла проти рецептора 1-31, клону 1 проти ІСЗ1К, з рецептором 1-31 при рН 7,4 та рН 5,5. Криві на сенсорграмі при рН 5,5 відповідають 100, 50,25,12,5 та 6,25 нг/мл рецептора 1-31 у напрямку зверху униз.
Фіг. 28 показує зміну концентрації антитіла у плазмі після внутрівенного введення миші розчину суміші, що містить 5К344 та антитіло проти людського рецептора 1-6.
Фіг. 29 показує зміну концентрації 5К344 у плазмі після внутрівенного введення миші розчину суміші, що містить 5К344 та антитіло проти людського рецептора ІІ -6.
Варіанти здійснення цього винаходу
Цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул. Більш специфічно, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рн порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування 3 антигеном антиген- зв'язувальних молекул шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антиген- зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген- зв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул.
Цим винаходом також пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген- зв'язувальною молекулою, шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул.
Цим винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини. Більш специфічно, цим
Зо винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антиген- зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом зниження антиген- зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген- зв'язувальної молекули.
Цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген- зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальної молекули.
Цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рн порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом бо також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти в антиген- зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген- зв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген- зв'язувальної молекули.
Цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антиген- зв'язувальних молекул. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул (пролонгація утримання у плазмі) шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген- зв'язувальною здатністю при нейтральному рнН. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул.
Далі, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген- зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рн.
Крім того, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген- зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антиген-зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальних молекулах. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул.
Зо У цьому описі винаходу словосполучення "покращення фармакокінетики", "поліпшення фармакокінетики", "найкраща фармакокінетика" взаємозамінюються словосполученнями "покращення утримання у плазмі (крові)", "поліпшення утримання у плазмі (крові)" та "найкраще утримання у плазмі (крові)", відповідно, та ці фрази є синонімічними.
У цьому описі винаходу вираз "зниження антиген-зв'язувальної активності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при нейтральному рН" означає, що антиген- зв'язувальна здатність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 є зниженою порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН від 6,7 до 10,0, переважно, що антиген- зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 5,5 до 6,5 є зниженою порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН від 7,0 до 8,0, та більш переважно, що антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 є зниженою порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рн 7,4. Отже, у цьому винаході кислотний рн зазвичай становить рН від 4,0 до 6,5, переважно рнН від 5,5 до 6,5, та більш переважно рн 5,8.
Альтернативно, у цьому винаході нейтральне рН зазвичай становить рН від 6,7 до 10,0, переважно рН від 7,0 до 8,0, та більш переважно рін7 4.
У цьому описі винаходу фразу "зниження антиген-зв'язувальної здатності антиген- зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН" можна взаємозамінювати фразою "підвищення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при нейтральному рН порівняно 3 антиген- зв'язувальною здатністю при кислотному рН". Інакше кажучи, у цьому винаході різницю в антиген-зв'язувальній здатності антиген-зв'язувальної молекули слід підвищити між значеннями кислотного та нейтрального рН. Наприклад, значення КО(рн5,вуУкКор(рнН?7,4) слід підвищити, як описано нижче. Різницю антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули між значеннями кислотного та нейтрального рН можна підвищити, наприклад, за допомогою одного з наступних способів або їх обох, а саме: за допомогою зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН та підвищення антиген-зв'язувальної здатності при нейтральному рн.
Умови для визначення антиген-зв'язувальної активності, відмінні від рН, можуть бути вибрані відповідним чином фахівцями у цій галузі, та ці умови особливо не обмежуються.
Антиген-зв'язувальну активність можна визначити, наприклад, в умовах буферу МЕ5 та при бо 37 "С, як описано у Прикладах цього опису винаходу. Крім того, антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, використовуючи Віасоге (СЕ Неайпсаге) або йому подібний, як описано у Прикладах цього опису винаходу. Коли антиген - це розчинний антиген, тоді активність зв'язування з розчинним антигеном можна визначити шляхом випорскування антигену, як аналітичного зразка, на чип з іммобілізованою антиген-зв'язувальною молекулою. Альтернативно, коли антиген - це мембранний антиген, тоді активність зв'язування з мембранним антигеном можна визначити шляхом випорскування антиген-зв'язувальної молекули, як аналітичного зразка, на чип з іммобілізованим антигеном.
У цьому винаході різниця значень антиген-зв'язувальної активності при кислотному та нейтральному рН особливо не обмежується, доки антиген-зв'язувальна активність при кислотному рН є нижчою, ніж антиген-зв'язувальна активність при нейтральному рН. Проте, значення КО(рн5,вуУКО(рн?,4), яке є відношенням константи дисоціації (КО) при відокремленні від антигену при рН 5,8 та відношенням константи дисоціації при відокремленні від антигену при рН 7,4, переважно становить 2 або більше, більш переважно 10 або більше, а іще більш переважно 40 або більше. Верхня границя значення КО(рн5,вуУКО(рн7, 4) особливо не обмежується, та може мати будь-яке значення, наприклад, 400,1000 або 10000, доки молекулу можна отримувати за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Коли антиген - це розчинний антиген, тоді антиген-зв'язувальну активність можна представляти у вигляді константи дисоціації (КО). Альтернативно, коли антиген - це мембранний антиген, тоді антиген- зв'язувальну активність можна представляти у вигляді позірної константи дисоціації. Константу дисоціації (КО) та позірну константу дисоціації (позірну КО) можна визначити за способами, відомими фахівцям у галузі, наприклад, використовуючи Віасоге (ЗЕ НеайПсаге), графік
Зсаїснага або ГАС5.
Альтернативно, можна використовувати, наприклад, Ка - константу швидкості дисоціації як індикатор різниці значень антиген-зв'язувальної активності при кислотному та нейтральному рн.
Коли константа швидкості дисоціації (Ка) використовується як індикатор різниці зв'язувальної активності замість константи дисоціації (КО), тоді значення Ка(рно5,вука(рн7,), яке є відношенням константи швидкості дисоціації (Ка) при відокремленні від антигену при рН 5,8 та константи швидкості дисоціації при відокремленні від антигену при рН 7,4, переважно становить
Зо 2 або більше, більш переважно 5 або більше, навіть більш переважно 10 або більше та іще більш переважно 30 або більше. Верхня границя значення Ка(рн5б,вуУка(рні7,4) особливо не обмежується та може мати будь-яке значення, наприклад, 50,100 або 200, доки молекулу можна отримувати за способами, загально відомими фахівцям у цій галузі.
Коли антиген - це розчинний антиген, тоді антиген-зв'язувальну активність можна представляти у вигляді константи швидкості дисоціації (Ка). Альтернативно, коли антиген - це мембранний антиген, тоді антиген-зв'язувальну активність можна представляти у вигляді позірної константи швидкості дисоціації. Константу швидкості дисоціації (Ка) та позірну константу швидкості дисоціації (позірну Ка) можна визначити за способами, відомими фахівцям у галузі, наприклад, використовуючи Віасоге (СЕ пеаййсаге) або ГАС5.
У цьому винаході, коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули визначається при різних значеннях рН, тоді переважно, щоб умови вимірювання, за виключенням рН, були постійними.
Способи зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рн 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 (способи надання здатності зв'язуватися залежним від рН чином) особливо не обмежуються та можуть бути будь-якими способами. Такі способи включають, наприклад, способи зниження антиген-зв'язувальної активності при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 шляхом заміщення гістидином амінокислот в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу. Вже відомо, що антитілу можна надати залежної від рН антиген-зв'язувальної активності шляхом заміщення гістидином амінокислот в антитілі (РЕВЗ І ецег, 309(1), 8588 (1992)). Такі гістидинові сайти мутації (заміщення) або сайти вставки гістидину особливо не обмежуються, та прийнятним є будь-який сайт, доки антиген- зв'язувальна активність при рН 5,8 є нижчою за антиген-зв'язувальну активність при рН 7,4 (значення КО(рнН5,вуУКО(рнН?7 4) стає більшим) порівняно з антиген-зв'язувальною активністю до здійснення мутації або вставки. Коли антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло, тоді такі сайти включають, наприклад, сайти усередині варіабельної ділянки антитіла. Відповідну кількість сайтів гістидинової мутації або сайтів вставки гістидину можуть відповідним чином визначити фахівці у галузі. Гістидином можна заміщувати або гістидин можна вставляти на єдиному сайті або на двох сайтах або більше. Можна також одночасно вводити негістидинову бо мутацію (мутацію амінокислотами, відмінними від гістидину). Крім того, гістидинову мутацію можна вводити одночасно зі вставкою гістидину. Можна заміщувати гістидином або вставляти гістидин наугад, використовуючи спосіб, такий як гістидинове сканування, який використовує гістидин замість аланіну при аланіновому скануванні, який відомий фахівцям у цій галузі.
Альтернативно, антиген-зв'язувальні молекули, значення КО(рн5,вуУКО(рн7, 4) яких підвищується порівняно зі значенням КО(рн5,8УКО(рн7, 4) до мутації, можна вибирати з бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з випадковою гістидиновою мутацією або вставкою гістидину.
Коли гістидин заміщує амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули або вставляється між амінокислотами цієї молекули, тоді переважно, проте необов'язково, щоб антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рнН 7,4 після заміщення гістидином або вставки гістидину була порівняльною з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 перед заміщенням гістидином або вставкою гістидину. Фраза "антиген-зв'язувальна активність антиген- зв'язувальної молекули при рН 7,4 після заміщення гістидином або вставки гістидину є порівняльною з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 перед заміщенням гістидином або вставкою гістидину" означає, що навіть після заміщення гістидином або вставки гістидину антиген-зв'язувальна молекула зберігає 10 95 або більше, переважно 50 95 або більше, більш переважно 80 95 або більше та іще більш переважно 90 95 або більше антиген-зв'язувальної активності перед заміщенням гістидином або вставки гістидину. Коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули ослаблюється внаслідок заміщення гістидином або вставки гістидину, тоді антиген-зв'язувальну активність можна відрегулювати шляхом введення заміщення, делеції, додавання та/або вставки однієї або більше амінокислот в антиген- зв'язувальну молекулу, так щоб антиген-зв'язувальна активність стала порівняльною з антиген- зв'язувальною активністю до заміщення гістидином або вставки гістидину. Цей винахід також включає такі антиген-зв'язувальні молекули, які мають порівняльну зв'язувальну активність, яка є результатом заміщення, делеції, додавання або вставки однієї або більше амінокислот після заміщення гістидином або вставки гістидину.
Альтернативні способи ослаблення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 включають методи заміщення неприродними амінокислотами амінокислот в антиген-зв'язувальній молекулі
Зо або методи вставки неприродних амінокислот в амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули.
Відомо, що рКа можна штучно регулювати, використовуючи неприродні амінокислоти (Апдему.
Спет. Іпі. Ей. 2005, 44, 34; Снет бос ВНеу. 2004 бер 10;33(7):422-30; Атіпо Асідз. 1999;16(3- 4):345-79). Отже, у цьому винаході неприродні амінокислоти можна використовувати замість гістидину, описаного вище. Таке заміщення неприродними амінокислотами та/або вставку неприродних амінокислот можна проводити одночасно із заміщенням гістидином та/або вставкою гістидину, що описано вище. У цьому винаході можна використовувати будь-які неприродні амінокислоти. Можна використовувати неприродні амінокислоти, відомі фахівцям у галузі.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула - це речовина, що має константну ділянку антитіла, тоді альтернативні способи зниження антиген-зв'язувальної активності антиген- зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 включають способи модифікації константної ділянки антитіла, що міститься в антиген- зв'язувальній молекулі. Такі способи модифікації константної ділянки антитіла включають, наприклад, способи заміщення константної ділянки, описані у Прикладах цього опису винаходу.
Альтернативні способи модифікації константної ділянки антитіла включають, наприклад, способи визначення різних ізотипів константної ділянки (ІДС, Ідс2, ІдСЗ та Ідс4) та вибору ізотипу, який знижує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8 (підвищує швидкість дисоціації при рН 5,8). Альтернативно, способи включають способи зниження антиген-зв'язувальної активності при рН 5,8 (підвищення швидкості дисоціації при рН 5,3) шляхом заміщення амінокислот в амінокислотній послідовності ізотипу природного типу (амінокислотній послідовності природного типу ДО, Ідс2, ІдСЗ або Ідс4). Послідовність шарнірної ділянки константної ділянки антитіла є суттєво різною серед ізотипів (ДО, Ідо2, ІдОЗ та Ідся), та ця різниця в амінокислотній послідовності шарнірної ділянки має сильний вплив на антиген- зв'язувальну активність. Отже, можна вибрати відповідний ізотип, щоб знизити антиген- зв'язувальну активність при рН 5,8 (підвищити швидкість дисоціації при рН 5,8), враховуючи тип антигену або епітопу. Крім того, оскільки різниця в амінокислотній послідовності шарнірної ділянки має суттєвий вплив на антиген-зв'язувальну активність, то припускають, що переважні сайти амінокислотних заміщень в амінокислотній послідовності ізотипу природного типу будуть знаходитися усередині шарнірної ділянки.
Коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної речовини при рн |о5,в ослаблюється порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 (коли збільшується значення КО(рн5,8)/КО(рн7, 4) шляхом використання вищеописаних способів та їм подібних, тоді зазвичай переважно, щоб значення КО(рн5,8)кКО(рн7, 4) перебільшувало у 2 рази або більше, більш переважно у 5 разів або більше та навіть більш переважно у десять разів або більше значення для оригінального антитіла, проте винахід особливо не обмежується цим.
У цьому описі винаходу термін "покращення фармакокінетики" означає пролонгацію часу, необхідного для елімінування антиген-зв'язувальної молекули з плазми (наприклад, досягнення стану, коли антиген-зв'язувальна молекула не може повернутися у плазму внаслідок розпаду у клітинах або за іншими причинами) після введення тварині, такій як людина, миша, щур, мавпа, кроль або собака, а також означає пролонгацію часу утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули, яка має форму, здатну зв'язуватися з антигенами (наприклад, має вільну від антигену форму) протягом періоду, доки вона не елімінується з плазми після введення. Навіть якщо антиген-зв'язувальна молекула циркулює у плазмі, вона не може зв'язуватися з антигеном, коли вона вже зв'язалася з іншим антигеном. Отже, період, коли антиген-зв'язувальна молекула може знов зв'язатися з іншим антигеном, подовжується (підвищується ймовірність зв'язатися з іншим антигеном) шляхом пролонгації періоду, коли антиген-зв'язувальна молекула знаходиться у вільній від антигену формі. Це дозволяє скоротити період, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальних молекул іп мімо (інакше кажучи, пролонгувати період, коли антиген зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою). Наприклад, відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів у плазмі в організмі (загальної кількості молекул антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами та вільних від них) взагалі зменшується протягом певного періоду часу після введення антиген-зв'язувальних молекул.
Проте, таке зменшення можна пригальмувати (наприклад, ступінь зменшення можна зробити меншим) шляхом пролонгації часу утримання антиген-зв'язувальних молекул у формі, здатній зв'язуватися з антигенами. Наслідком цього стає підвищення відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів в організмі протягом певного періоду часу після введення антитіла.
Детальніше, у цьому винаході словосполучення "покращення фармакокінетики"
Зо необов'язково означає пролонгацію (подовження) часу, необхідного для елімінування антиген- зв'язувальної молекули після введення. Навіть якщо час, що є необхідним для елімінування антиген-зв'язувальної молекули після введення, залишається незмінним, у цьому винаході фармакокінетику можна вважати "покращеною", якщо: час утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули, що має форму, здатну зв'язуватися з антигеном (наприклад, антиген-зв'язувальна молекула має вільну від антигену форму) є пролонгованим; період, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальної молекули в організмі, є скороченим (інакше кажучи, період, коли антиген-зв'язувальна молекула є зв'язаною з антигеном, є пролонгованим) та відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів в організмі є збільшеним. Отже, у цьому винаході словосполучення "покращення фармакокінетики" охоплює принаймні наступне: (1) пролонгацію часу, необхідного для елімінування антиген-зв'язувальної молекули з плазми після введення антиген-зв'язувальної молекули; (2) пролонгацію часу утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули у формі, здатній зв'язуватися з антигеном після введення антиген-зв'язувальної молекули; (3) скорочення періоду, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальної молекули в організмі після введення антиген-зв'язувальної молекули (пролонгацію періоду, коли антиген- зв'язувальна молекула є зв'язаною з антигеном в організмі); та (4) збільшення відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів в організмі.
Коли антиген - це розчинний антиген, що є присутнім у плазмі, навіть якщо фармакокінетика антиген-зв'язувальної молекули (швидкість елімінування 3 плазми) є еквівалентною, трапляються випадки, коли елімінування антигену, зв'язаного з антиген-зв'язувальною молекулою, прискорюється. Зниження фармакокінетики антигену (прискорення елімінування з плазми) зумовлює відносне покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули та, отже стає причиною пролонгації часу, коли антиген-зв'язувальна молекула є присутньою у плазмі у формі, здатній зв'язуватися з антигенами. Отже, в одному варіанті здійснення словосполучення "покращення фармакокінетики" антиген-зв'язувальних молекул цього бо винаходу включає підвищення швидкості елімінування розчинних антигенів з плазми після введення антиген-зв'язувальних молекул (здатність антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени з плазми).
У цьому винаході, коли антиген - це мембранний антиген, тоді можна визначити за допомогою тесту, чи зв'язується єдина антиген-зв'язувальна молекула з численними антигенами, чи удосконалюється фармакокінетика антиген-зв'язувальної молекули. Визначити, чи "покращилася фармакокінетика" можна наступним способом. Наприклад, визначити, чи подовжився час, необхідний для елімінування антиген-зв'язувальної молекули після введення, можна шляхом визначення будь-якого одного з параметрів для антиген-зв'язувальної молекули, такого як період піврозпаду у плазмі, середній час утримання у плазмі та кліренс у плазмі ("Рпаптасокіпеїїс5: Еп5Ппи-піуот КіКаї (паегеїапаіпуд їгоцди ргасіїсе)" Мап7апао). Наприклад, коли період піврозпаду у плазмі або середній час утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули, яку ввели мишам, щурам, мавпам, кролям, собакам, людям або іншим тваринам, подовжився, тоді фармакокінетику антиген-зв'язувальної молекули вважають покращеною. Ці параметри можна визначити за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, параметри можна належним чином визначити за допомогою некомпартментального аналізу, використовуючи програмне забезпечення для аналізу фармакокінетики М/пМопіїп (Рпагзідно згідно з доданою інструкцією виробника.
Альтернативно, чи подовжився час утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули у формі, здатній зв'язуватися з антигенами після введення антиген-зв'язувальної молекули, можна визначити шляхом вимірювання концентрації у плазмі вільної від антигену антиген- зв'язувальної молекули та шляхом визначення будь-якого одного з параметрів для вільної від антигену антиген-зв'язувальної молекули, таких як період піврозпаду у плазмі, середній час утримання у плазмі та кліренс у плазмі. Концентрацію вільної від антигену антиген-зв'язувальної молекули у плазмі можна визначити за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі.
Наприклад, такі вимірювання описано у Сіїп Рпагтасої. 2008 Арг; 48(4):406-17.
Крім того, чи скоротився період, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальних молекул в організмі після введення антиген-зв'язувальних молекул (чи подовжився період, коли антиген- зв'язувальна молекула є зв'язаною з антигеном в організмі), можна визначити шляхом визначення концентрації у плазмі незв'язаного антигену, що є вільним від антиген-зв'язувальних
Зо молекул, та враховуючи період, коли концентрація вільного антигену у плазмі або відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигенів залишається низькою. Концентрацію у плазмі вільного антигену або відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигену можна визначити за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, такі вимірювання описано у Рпапт Ке5. 2006 дап; 23():95-103. Альтернативно, коли антиген впливає на деяку функцію іп мімо, тоді визначити, чи зв'язався антиген антиген-зв'язувальною молекулою, яка нейтралізує функцію антигену (антагоністичною молекулою), можна шляхом випробовування того, чи нейтралізувалася функція антигену. Чи нейтралізувалася функція антигену, можна визначити, проаналізувавши іп мімо маркер, який відбиває функцію антигену.
Чи зв'язався антиген антиген-зв'язувальною молекулою, яка активує функцію антигену (агоністичною молекулою), можна визначити, проаналізувавши іп мімо маркер, який відбиває функцію антигену.
Нема жодного особливого обмеження стосовно визначення концентрації у плазмі вільного антигену та відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигену та стосовно аналізу маркера іп мімо, проте визначення переважно виконується після певного періоду після введення антиген-зв'язувальної речовини. У цьому винаході такий період після введення антиген-зв'язувальної речовини особливо не обмежується, та належний період можуть визначити фахівці у цій галузі, залежно від властивостей антиген-зв'язувальної речовини, що вводиться, та їм подібного. Приклади періоду є наступними: один день після введення антиген- зв'язувальної речовини; три дні після введення антиген-зв'язувальної речовини; сім днів після введення антиген-зв'язувальної речовини, 14 днів після введення антиген-зв'язувальної речовини та 28 днів після введення антиген-зв'язувальної речовини.
У цьому винаході переважно покращувати фармакокінетику у людини. Навіть коли важко визначити утримання у плазмі у людини, це можна передбачити на підставі утримання у плазмі у мишей (наприклад, звичайних мишей, трансгенних мишей, що експресують антиген людини, та трансгенних мишей, що експресують ЕсКп людини) або у мавп (наприклад, мавп супотоїЇдив).
Способи визначення утримання у плазмі особливо не обмежуються. Визначення можна виконувати, наприклад, згідно зі способами, описаними у Прикладах цього опису винаходу.
Чи є антиген-зв'язувальна молекула здатною зв'язуватися з антигенами багато разів, можна 60 визначити, здійснивши тестування того, чи відокремлюється антиген, зв'язаний з антиген-
зв'язувальною молекулою за такої ж самої нейтральної умови, що і у плазмі, за такої ж самої кислотної умови, що і в ендосомі, та зі скількома антигенами антиген-зв'язувальна молекула може повторно зв'язатися за нейтральної умови. Специфічно, визначення можна виконувати, дозволивши антиген-зв'язувальній молекулі та антигену утворити комплекс за нейтральної умови, піддавши цей комплекс дії кислотної умови протягом заздалегідь визначеного періоду часу, а потім зробити випробовування, чи може антиген-зв'язувальна молекула повторно зв'язуватися з антигеном за нейтральної умови, використовуючи при цьому пристрій для аналізу реакцій між антигеном та антиген-зв'язувальною молекулою, такий як Віасоге. Коли антиген- зв'язувальна здатність антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рн зв'язувальну здатність, зросла удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю антиген- зв'язувальної молекули перед модифікацією, тоді можна вважати, що кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, зросла удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю антиген-зв'язувальної молекули перед модифікацією. Альтернативно, коли антиген - це мембранний антиген, та, отже, антиген- зв'язувальна молекула елімінується з плазми внаслідок опосередкованого антигеном захоплення та руйнування у лізосомі, тоді можна визначити, чи зросла кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, порівняно з кількістю разів зв'язування до модифікації, шляхом порівняння фармакокінетики або тривалості зв'язування антигену між антиген-зв'язувальною молекулою, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, та антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації. Наприклад, коли тривалість зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, подовжується удвічі порівняно 3 антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації, тоді вважають, що кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, збільшується удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації. Альтернативно, коли визначається концентрація у плазмі незв'язаного антигену, що є вільним від антиген-зв'язувальної молекули, та період, коли концентрація у плазмі вільного антигену або відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигену залишається низькою, подовжується удвічі, тоді вважають, що кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з наданою рн-
Зо залежною зв'язувальною здатністю збільшується удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації.
Коли антиген - це розчинний антиген, якщо антиген, зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою за нейтральної умови у плазмі, відокремлюється в ендосомі, а антиген-зв'язувальна молекула повертається до плазми, тоді антиген-зв'язувальна молекула може знов зв'язатися з антигеном за нейтральної умови у плазмі. Отже, антиген-зв'язувальна молекула, що має властивість відокремлюватися від антигену у кислотній умові ендосоми, є здатною зв'язуватися з антигенами багато разів. Порівняно з тим, коли антиген, зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою, не відокремлюється в ендосомі (антиген залишається зв'язаним з антиген- зв'язувальною молекулою, коли повертається до плазми), у випадку, коли антиген, зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою, відокремлюється в ендосомах, антиген доставляється в лізосому, а потім руйнується, та, отже, швидкість елімінування антигену з плазми зростає.
Тобто, використовуючи швидкість елімінування антигену з плазми як показник, також можна визначити, чи є антиген-зв'язувальна молекула здатною зв'язуватися з антигенами багато разів.
Швидкість елімінування антигену з плазми можна визначити, наприклад, шляхом введення антигенів (наприклад, мембранного антигену) та антиген-зв'язувальних молекул іп мімо, а потім шляхом вимірювання концентрації антигенів у плазмі. Коли антиген (наприклад, мембранний антиген) виробляється або виділяється іп омімо, тоді концентрація антигену у плазмі зменшується, якщо швидкість елімінування антигену з плазми зростає. Отже, можна також визначити, чи є антиген-зв'язувальна молекула здатною зв'язуватися з антигенами багато разів, використовуючи при цьому концентрацію антигену у плазмі як показник.
У цьому описі винаходу словосполучення "збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули" означає, що кількість циклів зростає, коли за один цикл враховується процес, де антиген-зв'язувальна молекула, що вводиться людині, миші, мавпі або їм подібним, зв'язується з антигеном та інтерналізується у клітину. Специфічно, у цьому описі винаходу фраза "антиген-зв'язувальна молекула зв'язується двічі з антигеном" означає, що антиген-зв'язувальна молекула, зв'язана з антигеном, інтерналізується у клітину та виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини, та виділена антиген-зв'язувальна молекула знов зв'язується з іншим антигеном та знов інтерналізується у клітину.
Коли антиген-зв'язувальна молекула інтерналізується у клітину, тоді вона може бути у 60 формі, зв'язаній з єдиним антигеном, або двома, або більше антигенами.
У цьому описі винаходу фраза "кількість разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули зростає" необов'язково означає, що кількість разів зв'язування з антигеном зростає у кожної антиген-зв'язувальної молекули. Наприклад, серед антиген-зв'язувальних молекул у сукупності антиген-зв'язувальних молекул може зростати пропорція антиген-зв'язувальних молекул, які зв'язуються з антигенами двічі або більше разів, або може зростати середня кількість зв'язувальних подій антиген-зв'язувальних молекул у сукупності антиген-зв'язувальних молекул.
У цьому винаході переважно, щоб кількість разів зв'язування з антигеном антиген- зв'язувальної молекули зростала, коли молекула вводиться людині. Проте, коли важко визначити кількість разів зв'язування антигену у людини, тоді кількість разів зв'язування у людини можна передбачити на підставі результатів, отриманих внаслідок вимірювання або аналізу іп міо із використанням мишей (наприклад, трансгенних мишей, що експресують антиген, та трансгенних мишей, що експресують ГсКп людини) або мавп (наприклад, мавп супотоїЇдив).
У цьому винаході переважно, щоб антиген-зв'язувальна молекула зв'язувалася з антигенами двічі або більше разів. Наприклад, переважно, щоб антиген-зв'язувальні молекули у сукупності антиген-зв'язувальних молекул принаймні у 10 95 випадків або більше, переважно у
ЗО 95 випадків або більше, більш переважно у 50 95 випадків або більше та іще більш переважно у 80 95 випадків або більше (наприклад, у 90 95 випадків або більше, у 95 95 випадків або більше тощо) зв'язувалися з антигенами двічі або більше разів.
У цьому описі винаходу фраза "збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою" означає збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою протягом періоду, доки антиген-зв'язувальна молекула не зруйнується у лізосомі клітини після введення антиген-зв'язувальної молекули тварині, такій як людина, миша або мавпа.
Взагалі, антитіла, такі як (Дб, мають два зв'язувальні домени, та, отже, єдине антитіло зв'язується максимум з двома антигенами. Антитіло, зв'язане з антигеном (антигенами), інтерналізується у клітину, та антитіло та антиген (антигени) руйнуються у лізосомі. Звичайно, антитіла, такі як їдс, можуть зв'язуватися максимум з двома антигенами. Коли антиген-
Зо зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули, такої як антитіло, при ендосомному рН ослаблюється порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН плазми шляхом використання способів цього винаходу, тоді антиген-зв'язувальна молекула, така як антитіло, інтерналізована у клітину, відокремлюється від антигену, та виділяється за межі клітини, та, отже, може знов зв'язуватися з іншим антигеном. Інакше кажучи, способи цього винаходу дозволяють антиген-зв'язувальній молекулі зв'язуватися з більшою кількістю антигенів, ніж кількість її антиген-зв'язувальних ділянок. Специфічно, внаслідок використання способів цього винаходу, наприклад, Ідс, що має дві антиген-зв'язувальні ділянки, може зв'язуватися з трьома або більше антигенами, переважно чотирма або більше антигенами, протягом періоду, доки антитіло не руйнується після введення. Наприклад, коли антитіло - це нейтралізуюче антитіло, тоді словосполучення "збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген- зв'язувальною молекулою" можна взаємозамінювати словосполученням "збільшення кількості антигенів, які антиген-зв'язувальна молекула може нейтралізувати". Отже, слово "зв'язувати" можна замінити словом "нейтралізувати", коли антитіло - це нейтралізуюче антитіло.
У цьому винаході словосполучення "збільшення кількості антигенів, що можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою" необов'язково означає збільшення кількості антигенів, що можуть зв'язуватися кожною антиген-зв'язувальною молекулою. Наприклад, середня кількість антигенів, що можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою у сукупності антиген- зв'язувальних молекул, може збільшуватися, або може збільшуватися пропорція антиген- зв'язувальних молекул, які можуть зв'язуватися з більшою кількістю антигенів, ніж кількість їхніх антиген-зв'язувальних ділянок.
У цьому винаході переважно, щоб кількість антигенів, що можуть зв'язуватися антиген- зв'язувальною молекулою, збільшувалася, коли молекула вводиться людині. Проте, коли важко визначити таку кількість у людини, тоді кількість у людини можна передбачити на підставі результатів, отриманих внаслідок вимірювання або аналізу іп мйго із використанням мишей (наприклад, трансгенних мишей, що експресують антиген, та трансгенних мишей, що експресують ЕБсКп людини) або мавп (наприклад, мавп супотої!ди5). Коли антитіло - це нейтралізуюче антитіло, тоді зазвичай припускають, що вищеописана кількість разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули корелює з кількістю антигенів, які можуть бути нейтралізовані антиген-зв'язувальною молекулою. Отже, кількість антигенів, які можуть бути бо нейтралізовані антиген-зв'язувальною молекулою, можна визначити за такими ж самими способами, які описано вище для визначення кількості разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули.
Крім того, цим винаходом пропонуються способи зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигенами двічі або більше разів в організмі шляхом введення антиген- зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рн.
Цей винахід також стосується способів нейтралізації антигенів, кількість яких є більшою, ніж кількість антиген-зв'язувальних ділянок антиген-зв'язувальної молекули, яка має нейтралізуючу активність, шляхом введення антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рН. Переважно, цей винахід стосується способів нейтралізації трьох або більше антигенів, переважно чотирьох або більше антигенів шляхом введення |до, антиген-зв'язувальна активність якого при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рн.
Цей винахід також стосується способів відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. У цьому винаході антиген може відокремлюватися від антиген-зв'язувальної молекули будь-де усередині клітини; проте, переважно, щоб антиген відокремлювався усередині ранньої ендосоми. У цьому винаході фраза "антиген відокремлюється усередині клітини від зв'язаної з ним ззовні антиген- зв'язувальної молекули" необов'язково означає, що кожен антиген, інтерналізований у клітину внаслідок зв'язування з антиген-зв'язувальною молекулою, відокремлюється від антиген- зв'язувальної молекули усередині клітини. Можна прийняти, що пропорція антигену, який відокремлюється від антиген-зв'язувальної молекули усередині клітини, збільшується порівняно з пропорцією до ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН.
Крім того, цей винахід стосується способів підсилення внутрішньоклітинного зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, вільної від антигену, з ЕСКп шляхом ослаблення антиген- зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-
Зо зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Звичайно, ЕБоКп зв'язується з антиген- зв'язувальною молекулою усередині ендосоми. Проте, припускається, що антиген-зв'язувальна молекула, зв'язана з мембранним антигеном, не зв'язується з БсКп. Отже, у переважному варіанті здійснення, коли антиген - це зв'язаний з мембраною антиген, тоді цей винахід включає способи підсилення ендосомного відокремлення антигенів від антиген-зв'язувальних молекул та, внаслідок цього, підсилення зв'язування з ЕсКп антиген-зв'язувальних молекул шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при ендосомному рН (кислотному рН) порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН плазми (нейтральному рН). Коли антиген - це розчинний антиген, тоді антиген-зв'язувальна молекула може зв'язуватися з ЕсКп у присутності або відсутності антигену. Якщо відокремлення антигену від антиген-зв'язувальної молекули усередині ендосом можна стимулювати шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при внутрішньоендосомному (кислотному) рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН плазми (нейтральному рН), тоді зв'язування з ЕсКп антиген-зв'язувальної молекули, що є "вільною від антигену", можна підсилити за допомогою способів цього винаходу.
Незалежно від того, чи є антиген розчинним або зв'язаним з мембраною, якщо антиген- зв'язувальна молекула, вільна від антигену, може повертатися до плазми з ЕсКп, то антиген- зв'язувальна молекула може знов зв'язуватися з антигеном. Повторюючи цей процес, антиген- зв'язувальна молекула може зв'язуватися з антигеном багато разів. У цьому винаході словосполучення "підсилення зв'язування з ЕсКп антиген-зв'язувальної молекули усередині клітини" необов'язково означає, що кожна антиген-зв'язувальна молекула зв'язується з ЕсКп.
Можна прийняти, що пропорція антиген-зв'язувальних молекул, вільних від антигену, які зв'язуються з ГоКп усередині клітини, збільшується порівняно з пропорцією до ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при ендосомному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН плазми. Переважні антиген-зв'язувальні молекули у способах цього винаходу підсилення внутрішньоклітинного зв'язування між антиген- зв'язувальною молекулою та ЕсКп включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, які зв'язуються зі зв'язаними з мембраною антигенами (мембранними антигенами), такими як мембранні білки. Інші переважні антиген-зв'язувальні молекули включають антиген-зв'язувальні молекули, які зв'язуються з розчинними антигенами, такими як розчинні білки.
Способи підсилення зв'язування антиген-зв'язувальної молекули та ЕсКп усередині клітини альтернативно називаються способами стимулювання зв'язування з ЕсКп антиген-зв'язувальної молекули усередині клітини, наприклад, усередині ендосом.
Крім того, цей винахід стосується способів виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рн. У цьому винаході вираз "виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини" необов'язково означає, що кожна антиген-зв'язувальна молекула, що зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини. Можна прийняти, що пропорція антиген-зв'язувальних молекул, що виділяються за межі клітини, збільшується порівняно з пропорцією до ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген- зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Переважно, щоб антиген-зв'язувальна молекула, що виділяється за межі клітини, зберігала антиген-зв'язувальну здатність. Крім того, спосіб виділення антиген- зв'язувальної молекули, що зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини можна також назвати способом надання антиген-зв'язувальній молекулі такої властивості, що антиген-зв'язувальна молекула стає такою, яку легше виділити за межі клітини у вільній від антигену формі, коли антиген-зв'язувальна молекула зв'язана з антигеном та інтерналізована у клітину.
Крім того, цей винахід стосується способів підвищення здатності антиген-зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. У цьому винаході термін "здатність елімінувати антигени у плазмі" означає здатність елімінувати з плазми антигени, які є присутніми у плазмі, коли антиген- зв'язувальні молекули вводяться іп мімо або виділяються іп мімо. Отже, у цьому винаході словосполучення "підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антиген у плазмі" означає, що швидкість елімінування антигенів з плазми, коли антиген-зв'язувальні молекули вводяться іп мімо, прискорюється порівняно зі швидкістю до зниження антиген- зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рН порівняно з антиген- зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Чи зростає здатність антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі, можна визначити, наприклад, шляхом введення розчинних антигенів та антиген-зв'язувальних молекул іп мімо, а потім вимірювання концентрації розчинних антигенів у плазмі. Коли концентрація розчинних антигенів у плазмі після введення розчинних антигенів та антиген-зв'язувальних молекул зменшується внаслідок зниження антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН, тоді можна визначити, що здатність антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі підвищилася.
Цей винахід також стосується способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу.
Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу.
Крім того, цей винахід стосується способів збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу.
Цим винаходом також пропонуються способи відокремлення антигену усередині клітини від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген- зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу.
Цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу.
Цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу.
Сайт гістидинової мутації або мутації неприродною амінокислотою (заміщення, вставка тощо) особливо не обмежується. Заміну гістидином або неприродною амінокислотою можна зробити на будь-якому сайті, або гістидин або неприродну амінокислоту можна вставити на будь-якому сайті. Переважні сайти заміщення або вставки гістидину або неприродної амінокислоти включають, наприклад, сайти усередині ділянки, що має вплив на антиген- зв'язувальну здатність антиген-зв'язувальної молекули. Наприклад, коли антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло, тоді такі ділянки включають варіабельну ділянку або гіперваріабельну ділянку (СОК) антитіла. Кількість гістидинових мутацій або мутацій неприродною амінокислотою особливо не обмежується. Гістидином або неприродною амінокислотою можна замістити або їх можна вставити на єдиному сайті або на двох або більше сайтах. Крім того, делецію, додавання, вставку та/або заміщення інших амінокислот можна зробити одночасно із заміщенням або вставкою гістидину або неприродної амінокислоти.
У цьому винаході, коли антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло, тоді можливі сайти заміщення гістидином або неприродною амінокислотою включають, наприклад, сайти у послідовності СОК або послідовності, що є відповідальною за структуру СОК антитіла. Такі сайти включають, наприклад, сайти, перелічені нижче. Амінокислотні позиції пронумеровано на підставі нумерації за Кабаї (Кабраї ЕА єї ап, (1991) бЗедиєпсе5 ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї
Іптегеві, МІН).
Важкий ланцюг: Н27, НЗ1, НЗ2, НЗ3, НЗ5, Н5БО, Н5В8, Н5О, НЄ, Нб2, НбЗ, Нб4, Нб5, НО,
НІТО0Б та НІ102.
Легкий ланцюг 124,127,128,132,153,1 54,1 56, 190, 1 92 та 1 94.
Серед вищевказаних сайтів НЗ2, НОТ, І 53, І 90 та І 94 можуть бути універсальними сайтами модифікації.
Зо Коли антиген - це рецептор 1І/-6 (наприклад, рецептор І/-6 людини), переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними.
Важкий ланцюг: Н27, НЗ1, НЗ2, НЗ5, Н5О, Н58, НЄ, Нбе2, НбЗ, Нб4, Нб5, НІТОбЬ та НІ1О2.
Легкий ланцюг: 124,127,128,132,153, 1 56, 1 90, 1 92 та 1 94.
Коли гістидином або неприродною амінокислотою роблять заміщення на численних сайтах, тоді переважні комбінації сайтів заміщення включають, наприклад, комбінацію Н27, НЗ1 та НЗ5; комбінацію Н27, НЗ1, НЗ2, НЗ5, Н58, Нб2 та Н102; комбінацію І 32 та І 53 та комбінацію І 28, І 32 та 1 53.
Коли антиген - це 1/-6 (наприклад, І/-6 людини), тоді переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними.
Важкий ланцюг: НЗ2, Н5БУ, НЄ! та НО9.
Легкий ланцюг: І 53, І 54, І 90 та І 94.
Коли антиген - це рецептор 1-31 (наприклад, рецептор 1--31 людини), тоді переважні сайти модифікації включають НЗ3З. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ним.
Стосовно вищевказаних сайтів, тільки один сайт може заміщуватися гістидином або неприродною амінокислотою. Альтернативно, численні сайти можуть заміщуватися гістидином або неприродною амінокислотою.
Способи цього винаходу можна використовувати для будь-яких антиген-зв'язувальних молекул, незалежно від типу антигену-мішені.
Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу особливо не обмежуються, доки вони мають специфічну зв'язувальну активність з антигеном, що представляє інтерес. Переважні антиген- зв'язувальні молекули цього винаходу включають, наприклад, речовини, що мають антиген- зв'язувальний домен антитіла. Антиген-зв'язувальний домен антитіла включає, наприклад, СОК та варіабельну ділянку. Коли антиген-зв'язувальний домен антитіла - це СОЕК, тоді антиген- зв'язувальна молекула може включати усі шість СОК цілого антитіла, або одну, або дві, або більше з них. Альтернативно, коли антиген-зв'язувальна молекула включає СОК як зв'язувальний домен антитіла, тоді СОК може включати амінокислотну делецію, заміщення, додавання та/або вставку або може бути частковою СОК.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул шляхом модифікації (наприклад, шляхом амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген- зв'язувальної молекули шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів збільшення кількості антигенів, що можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів відокремлення усередині клітини антигену від антиген- зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів вивільнення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі.
У переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна речовина цього винаходу включає антиген-зв'язувальні речовини, які включають ЕсКп-зв'язувальну ділянку. Після інтерналізації у клітини антиген-зв'язувальні речовини, які включають ЕсКп-зв'язувальну ділянку, можуть
Зо повертатися до плазми РЕсКп-реутилізаційним шляхом. ЕсКп-зв'язувальна ділянка - це переважно домен, який безпосередньо зв'язується з ЕсКп. Переважна ЕсЕп-зв'язувальна ділянка включає, наприклад, ділянки Ес антитіла. Проте, ЕсКп-зв'язувальна ділянка цього винаходу може бути ділянкою, яка може зв'язуватися з поліпептидом, що має здатність зв'язуватися з ГсКп, таким як альбумін або Ідс, оскільки така ділянка, яка може зв'язуватися з поліпептидом, що має ЕсКп-зв'язувальну здатність, може зв'язуватися опосередковано з ЕсКп за допомогою альбуміну, ДО тощо.
Антигени, що розпізнаються антиген-зв'язувальними молекулами, такими як антитіла, що представляють інтерес у способах цього винаходу, особливо не обмежуються. Такі антитіла, що представляють інтерес, можуть розпізнавати будь-який антиген. Антитіла, фармакокінетику яких слід покращити за способами цього винаходу, включають, наприклад, антитіла, які розпізнають мембранні антигени, такі як рецепторні білки (зв'язані з мембраною рецептори та розчинні рецептори), та клітинні поверхневі маркери, та антитіла, які розпізнають розчинні антигени, такі як цитокіни. Переважні приклади мембранних антигенів цього винаходу включають мембранні білки. Приклади розчинних антигенів цього винаходу включають розчинні білки. Антигени, що розпізнаються антитілами, фармакокінетику яких слід покращити способами цього винаходу, включають, наприклад, 1-1, І -2, 1-3, 1-4, 11 -5, 1-6, 1-7, 1-8, 11 -9, 1-10, 1-11, 1-12, 11-15, 11 - 31, 1-23, рецептор 1-2, рецептор ІІ -6, рецептор ОМ, ор130, рецептор ІІ -5, С040, С04, Ра», остеопонтин, СКТН2, С0О26, РОСЕ-О, СО20, моноцитний хемотактичний фактор, СО23, ТМЕ-а,
НМавВ-1, інтегрин а4, ІСАМ-1, ССК2, СО11а, СОЗ3, ІєМу, ВГуз, НГА-ОВ, ТОаБ-В, СО052 та рецептор 1-31. Особливо переважні антигени включають рецептор ІЇ -6.
Крім того, антиген-зв'язувальна молекула, що представляє інтерес у способах цього винаходу, включає антиген-зв'язувальні молекули, які мають антагоністичну активність (антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули) та антиген-зв'язувальні молекули, що мають агоністичну активність (агоністичні антиген-зв'язувальні молекули). У переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула включає антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули, зокрема, антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули, що розпізнають мембранні антигени, такі як рецептори, або розчинні антигени, такі як цитокіни. Наприклад, антагоністична антиген-зв'язувальна молекула, яка розпізнає рецептор, інгібує зв'язування ліганду з рецептором шляхом зв'язування з рецептором та, отже, інгібує передачу сигналу, 60 опосередковану рецептором.
У цьому винаході антиген-зв'язувальна молекула, яка представляє інтерес, особливо не обмежується, та вона може бути будь-якою антиген-зв'язувальною молекулою. Антиген- зв'язувальна молекула цього винаходу переважно має як антиген-зв'язувальну активність (антиген-зв'язувальну ділянку), так і ЕсКп-зв'язувальну ділянку. Зокрема, переважна антиген- зв'язувальна молекула цього винаходу включає ділянку, яка зв'язується з ЕоКп людини.
Антиген-зв'язувальна молекула, яка має як антиген-зв'язувальну активність, так і ЕсКп- зв'язувальну ділянку, включає, наприклад, антитіла. Антитіла, переважні у контексті цього винаходу, включають, наприклад, антитіла дв. Коли антитіло, яке слід використовувати, - це антитіло Ідс, тоді тип (до не обмежується; можна використовувати ідо, що належить до будь- якого ізотипу (підкласу), такий як Ідсі, Ідс2, дез або Ідс4. Крім того, амінокислотні мутації (наприклад, М73) можна вводити у константну ділянку будь-якого з цих ізотипів до.
Амінокислотні мутації, які слід вводити, включають, наприклад, ті мутації, які підсилюють або ослаблюють зв'язування з рецептором Ееу (Ргос Маї! Асай 5сі ОА. 2006 Маг 14; 103(11):4005- 10), або ті, що підсилюють або ослаблюють зв'язування з БсКп () Віо! Спет. 2001 Маг 2:276(9):6591-604), проте вони не обмежуються цими прикладами. Альтернативно, можна змінювати залежне від рН зв'язування шляхом вибирання відповідної константної ділянки, такої як ІдО2.
Коли антиген-зв'язувальна молекула, яка представляє інтерес цього винаходу, - це антитіло, тоді вона може бути антитілом, що походить від будь-якої тварини, таким як мишаче антитіло, антитіло людини, антитіло щура, антитіло кроля, антитіло козла або антитіло верблюда. Крім того, антитіло може бути модифікованим антитілом, наприклад, химерним антитілом, та зокрема, модифікованим антитілом, яке включає амінокислотне заміщення у послідовності гуманізованого антитіла, тощо. Антитіла також включають біспецифічні антитіла, продукти модифікації антитіл, з'єднані з різними молекулами, та поліпептиди, які включають фрагменти антитіл. "Химерні антитіла" - це антитіла, отримані внаслідок комбінації послідовностей, що походять від різних тварин. Специфічно, химерне антитіло включає, наприклад, антитіла, що мають варіабельні (М) ділянки важкого та легкого ланцюгів від мишачого антитіла та константні (С) ділянки важкого та легкого ланцюгів від антитіла людини.
Зо "Гуманізовані антитіла", які також називаються антитілами людини зі зміненою формою, - це антитіла, у яких гіперваріабельні ділянки (СОК) антитіла, що походять від ссавця, що не є людино, наприклад, миші, трансплантуються у СОК антитіла людини. Способи ідентифікації
СОР є відомими (КаБбаї єї ай, бедиепсе ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві (1987), Маїйопаї!
Іпвійше ої Неайй, Веїйезаа, мМа.; Споїнпіа єї ап, Маїшге (1989) 342:877). Загальні способи генетичної рекомбінації, що є придатними для цього, є також відомими (дивись Європейську патентну заявку ЕР 125023 та УМО 96/02576).
Термін "біспецифічне антитіло" означає антитіло, яке має у молекулі одного й того ж самого антитіла варіабельні ділянки, які розпізнають різні епітопи. Біспецифічне антитіло може бути антитілом, яке розпізнає два або більше різних антигенів, або антитілом, яке розпізнає два або більше різних епітопів на одному й тому ж антигені.
Крім того, поліпептиди, що включають фрагменти антитіла, включають, наприклад, фрагменти ЕРар, фрагменти Е(ар)2, 5сЕм (Маї Віотесппої. 2005 Зер;23(9)І 126-36), доменні антитіла (ДАВ) (МУО 2004/058821, УМО 2003/002609), 5сЕм-Ес (МО 2005/037989), аАр-Ес та злиті білки Ес. З них, молекули, що включають домен Ес, мають активність зв'язування з ЕсКп, та внаслідок цього є придатними для використання у способах, розкритих у цьому винаході.
Крім того, антиген-зв'язувальні молекули, які можна використовувати у цьому винаході, можуть бути подібними до антитіла молекулами. Антитіло-подібна молекула - це молекула, яка може демонструвати функції шляхом зв'язування з молекулою-мішенню (Сигтепі Оріпіоп іп
ВіоїесппоЇоду 2006, 17:653-658; Ситепі Оріпіоп іп Віотесппоіоду 2007, 18:1-10; Ситепі Оріпіоп іп зігисіига! Віоіоду 1997, 7:463-469; Ргоївіп бсіепсе 2006, 15:14-27), та включає, наприклад,
САВРіп5 (МО 2002/020565), Айіроду (УМО 1995/001937), Амітег (МО 2004/044011; МО 2005/040229) та Аапесіп (МО 2002/032925). Якщо ці антитіло-подібні молекули можуть зв'язуватися з молекулами-мішенями залежним від рН чином, тоді єдина молекула може зв'язуватися з багатьма молекулами-мішенями.
Крім того, антиген-зв'язувальна молекула може бути рецепторним білком або злитим з рецептором білком Ес, який зв'язується з мішенню, включаючи, наприклад, злитий білок ТМЕК-
Ес, злитий білок П/1Б-Ес, злитий білок МЕСЕК-Ес та злитий білок СТІ А4-Ес (Маї Мей. 2003
Уап;9(1):47-52; Віобгидв. 2006:20(3):151-60). Якщо такі рецепторні білки та злиті з рецептором білки Ес можуть зв'язуватися з молекулами-мішенями залежним від рН чином, тоді єдина 60 молекула може зв'язуватися з багатьма молекулами-мішенями.
Крім того, антиген-зв'язувальна молекула може бути штучним лігандним білком або штучним злитим лігандним білком, який зв'язується з мішенню та має нейтралізуючий ефект, та включає, наприклад, мутантний 1-6 (ЕМВО 4. 1994 Юес 15:13(24):5863-70). Якщо такі штучні лігандні білки або штучні злиті лігандні білюм можуть зв'язуватися з молекулами-мішенями залежним від рН чином, тоді єдина молекула може зв'язуватися з багатьма молекулами- мішенями.
Крім того, антитіла цього винаходу можуть включати модифіковані цукрові ланцюги.
Антитіла з модифікованими цукровими ланцюгами включають, наприклад, антитіла з модифікованою глікозиляцією (М/О 99/54342), антитіла з дефіцитом у фукозі, що додається до цукрового ланцюга (М/О 00/61739; МО 02/31140; УМО 2006/067847; УМО 2006/067913) та антитіла, що мають цукрові ланцюги з бісекторним сісСМАс (М/О 02/79255).
Хоча способи цього винаходу не обмежуються будь-якою специфічною теорією, взаємозв'язок між послабленням антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН, покращення фармакокінетики та багаторазове зв'язування з антигеном можна пояснити, наприклад, наступним чином.
Наприклад, коли антитіло - це антитіло, що зв'язується з мембранним антигеном, тоді антитіло, яке введене в організм, зв'язується 3 антигеном, а потім захоплюється шляхом інтерналізації в ендосоми у клітинах разом з антигеном та при цьому антитіло зберігає зв'язок з антигеном. Потім, антитіло переміщується до лізосом, зберігаючи зв'язок з антигеном, та антитіло руйнується лізосомою разом з антигеном. Опосередковане інтерналізацією елімінування з плазми називається антиген-залежним елімінуванням, та повідомлялося про таке елімінування багатьма молекулами-антитілами (Огид Оізсом Тодау. 2006 дап; 11(1-2):81-8).
Коли єдина молекула антитіла до зв'язується з антигенами двовалентним чином, тоді єдина молекула антитіла інтерналізується, зберігаючи зв'язок з двома молекулами антигену, та руйнується у лізосомі. Отже, у випадку звичайних антитіл одна молекула антитіла (ДО не може зв'язуватися з трьома або більше молекулами антигену. Наприклад, єдина молекула антитіла дб, що має нейтралізуючу активність не може нейтралізувати три або більше молекул антигену.
Відносно подовжене утримання (повільне елімінування) молекул дос у плазмі є наслідком
Зо функції БсКп, що є відомим як рецептор реутилізації молекул дб. Коли молекули до захоплюються в ендосоми внаслідок піноцитозу, тоді вони зв'язуються з ЕсКп, що експресується в ендосомах за кислотних умов, що існують в ендосомах. У той час, коли молекули Ідс, які не зв'язалися з ЕсКп, переносяться до лізосом, де вони руйнуються, молекули
ІЧ, що зв'язалися з ЕсКп, переміщуються до клітинної поверхні та знов повертаються у плазму, при цьому відокремлюючись від ЕРсКп за нейтральних умов у плазмі.
Альтернативно, коли антиген - це антиген, який зв'язується з розчинним антигеном, тоді антитіло, яке введене в організм, зв'язується з антигеном, а потім захоплюється у клітини, при цьому антитіло зберігає зв'язок з антигеном. Багато антитіл, захоплених у клітини, виділяються за межі клітин завдяки ЕсКп. Проте, оскільки антитіла виділяються за межі клітин та при цьому зберігають зв'язок з антигенами, то антитіла не можуть зв'язуватися з антигенами знов. Отже, подібно до антитіл, що зв'язуються з мембранними антигенами, у випадку звичайних антитіл, одна молекула антитіла дос не може зв'язуватися з трьома або більше молекулами антигенів.
Автори цього винаходу зробили висновок, що, коли антитіла, які зв'язуються з антигенами, такими як мембранні антигени, захоплюються в ендосоми шляхом інтерналізації, то антитіла, які зберігають зв'язок з антигенами, переміщуються до лізосом та руйнуються, а антитіла Ідс, від яких антигени відокремлюються в ендосомах, можуть зв'язуватися з ЕсКп, які експресуються в ендосомах. Специфічно, автори цього винаходу визначили, що антитіло, яке сильно зв'язується з антигеном у плазмі, проте слабо зв'язується з антигеном усередині ендосоми, може зв'язуватися з антигеном у плазмі та, продовжуючи утворювати комплекс з антигеном, захоплюватися в ендосоми у клітинах внаслідок інтерналізації; потім відокремлюватися від антигену в ендосомі; потім зв'язуватися з ЕсКп та переміщуватися до клітинної поверхні та повертатися знов у плазму у стані, не зв'язаному з антигенами, внаслідок чого воно нейтралізує численні антигени, зв'язані з мембраною. Крім того, автори цього винаходу визначили, що антитіло, яке має властивість сильно зв'язуватися з антигенами у плазмі, проте слабо зв'язуватися з антигенами в ендосомі, може відокремлюватися від антигенів в ендосомі, навіть коли антитіло зв'язалося з антигенами, такими як розчинні антигени; отже, вони знов виділяються у плазму у незв'язаному з антигенами стані та можуть нейтралізувати численні розчинні антигени.
Зокрема, автори цього винаходу відмітили, що рН у плазмі відрізнялося від рН в ендосомах, 60 та, отже, вони визначили, що антитіла, які сильно зв'язуються з антигенами в умовах рн плазми, проте слабо зв'язуються з антигенами в умовах ендосомного рН, мали перевагу стосовно утримання у плазмі, оскільки одна молекула антитіла могла зв'язуватися з численними антигенами.
Ендосоми, які є мембранними везикулами, утворюють мережі у цитоплазмі еукаріотних клітин, та вони відповідають за метаболізм макромолекул у процесі від клітинної мембрани до лізосом. Повідомлялося, що рН в ендосомах є зазвичай кислотним рн, яке становить від 5,5 до 6,0 (Маї Кем Мої! СеїІ ВіоІ. 2004 Рер; 5(2):121-32). Проте, відомо, що рН у плазмі є майже нейтральним (звичайно 7,4).
Отже, антиген-зв'язувальна молекула, антиген-зв'язувальна активність якої при кислотному рН є більш слабкою порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при нейтральному рн, зв'язується з антигеном у плазмі, яка має нейтральний рН, захоплюється у клітини, а потім відокремлюється від антигену в ендосомах, які мають кислотний рН. Антиген-зв'язувальна молекула, яка відокремилася від антигену, зв'язується з ЕсКп, переміщується до клітинної поверхні та повертається знов у плазму у незв'язаному з антигенами стані. Внаслідок цього антиген-зв'язувальна молекула може зв'язуватися з антигенами багато разів, що зумовлює покращення фармакокінетики.
Речовини антиген-зв'язувальних молекул
Крім того, цим винаходом пропонуються антиген-зв'язувальні молекули, антиген- зв'язувальна активність яких при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0, переважно антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН від 5,0 до 6,0 є нижчою, ніж при рН від 7,0 до 8,0. Специфічно, антиген-зв'язувальні молекули, антиген- зв'язувальна активність яких при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0, включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4. Антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, можуть також визначатися як антиген- зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 є вищою, ніж при рН 5,8.
Що стосується антиген-зв'язувальних молекул цього винаходу, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, доки антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 є нижчою, ніж зв'язування при рн 7,4, то нема обмежень стосовно різниці у зв'язувальній
Зо активності, та антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 мусить тільки бути нижчою, навіть незначно.
Переважний варіант здійснення антиген-зв'язувальної молекули цього винаходу, антиген- зв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, включає антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 удвічі або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8. Більш переважний варіант здійснення антиген- зв'язувальної молекули включає антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 у десять разів або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8. Іще більш переважний варіант здійснення антиген-зв'язувальної молекули включає антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рн 7 А у 40 разів або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8.
Специфічно, у переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула цього винаходу має антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8, яка є нижчою, ніж при рН 7,4, де значення КО(рно5,вуУкКО(рн7,4), яке є відношенням КО для антигену при рН 5,8 та КО для антигену при рН 7,4, переважно становить 2 або більше, більш переважно 10 або більше, та іще більш переважно 40 або більше. Верхня границя значення КО(рнН5,вуУКО(рн7, 4) особливо не обмежується та може мати будь-яке значення, наприклад, 400,1000 або 10000, доки молекулу можна одержувати за способами, звичайними для фахівців у цій галузі.
В іншому переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула цього винаходу, антиген-зв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, має значення
БО Ка(рн5,вуКа(рн? 4), яке є відношенням Ка для антигену при рн 5,8 та Ка для антигену при рН 7,4, яке становить 2 або більше, більш переважно 5 або більше, навіть більш переважно 10 або більше та іще більш переважно 30 або більше. Верхня границя значення Карноь,вука(рнті,а) особливо не обмежується та може мати будь-яке значення, наприклад, 50,100 або 200, доки молекулу можна одержувати за способами, звичайними для фахівців у цій галузі.
Умови, відмінні від рН, при яких вимірюється антиген-зв'язувальна активність, можуть відповідним чином бути вибрані фахівцями у цій галузі, та ці умови особливо не обмежуються; проте, вимірювання можна виконувати, наприклад, в умовах буфера МЕ5З та при 37 "С, як описано у Прикладах. Крім того, антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, бо використовуючи Віасоге Т100 (СЕ Неайсаге) або йому подібний, як описано у Прикладах.
Передбачається, що така антиген-зв'язувальна молекула, яка слабо зв'язується з антигеном при кислотному рН, легко відокремлюється від антигену в ендосомних кислотних умовах, та що після інтерналізації у клітини вона зв'язується з БсКп та легко виділяється за межі клітин.
Антиген-зв'язувальна молекула, що виділяється за межі клітин, не руйнуючись усередині клітин, може знов зв'язуватися з іншими антигенами. Отже, коли антиген-зв'язувальна молекула - це, наприклад, антиген-зв'язувальна нейтралізуюча молекула, при цьому - це антиген-зв'язувальна молекула, що може легко відокремитися від антигену при ендосомних кислотних умовах, тоді вона може зв'язуватися з антигенами багато разів та нейтралізувати їх. Внаслідок цього антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0, є найкращими стосовно утримання у плазмі.
У переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула, антиген-зв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, включає антиген-зв'язувальні молекули, у яких принаймні одна амінокислота в антиген-зв'язувальній молекулі заміщена гістидином або неприродною амінокислотою або у які вставлений принаймні один гістидин або неприродна амінокислота. Ділянка, у яку вводиться мутація гістидином або неприродною амінокислотою, особливо не обмежується, та вона може бути будь-якою ділянкою, доки антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 є слабшою, ніж при рН 7,4 (значення КО(рн5,вУКО(рн?7 4) є більшим або значення Ка(рно5,вуКа(рні,ї) є більшим) порівняно з антиген-зв'язувальною активністю до заміщення. Приклади включають варіабельні ділянки та гіперваріабельні ділянки (СОК) антитіла у випадку, коли антиген-зв'язувальна молекула - це антитіло. Кількість амінокислот, які слід замістити гістидином або неприродною амінокислотою, та кількість амінокислот, які слід вставити, можуть відповідним чином визначити фахівці у цій галузі. Одна амінокислота може заміщуватися гістидином або неприродною амінокислотою, або одну амінокислоту можна вставити, або дві або більше амінокислот можуть заміщуватися гістидином або неприродними амінокислотами, або дві або більше амінокислот можна вставити. Крім того, окрім заміщень гістидином або неприродною амінокислотою або окрім вставки гістидину або неприродної амінокислоти, можна також одночасно здійснювати делецію, додавання, вставку та/або заміщення, та їм подібне, інших амінокислот. Заміщення на гістидин або неприродну амінокислоту або вставку гістидину або неприродної амінокислоти можна виконувати наугад,
Зо використовуючи спосіб, такий як гістидинове сканування, при якому використовується гістидин замість аланіну при аланіновому скануванні, який є добре відомим фахівцям у цій галузі.
Антиген-зв'язувальні молекули, значення КО(рн5,вУКО(рн7,4) або Ка(рно,вука(рні7,4) яких збільшуються порівняно зі значеннями до мутації, можна вибрати з антиген-зв'язувальних молекул, у яких було наугад проведено мутацію гістидином або неприродною амінокислотою.
Переважні антиген-зв'язувальні молекули з мутацією гістидином або неприродною амінокислотою, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рн 7,4, включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 після мутації гістидином або неприродною амінокислотою є еквівалентною антиген- зв'язувальній активності при рН 7,4 до мутації гістидином або неприродною амінокислотою. У цьому винаході фраза "антиген-зв'язувальна молекула після мутації гістидином або неприродною амінокислотою має антиген-зв'язувальну активність, яка є еквівалентною антиген- зв'язувальній активності до мутації гістидином або неприродною амінокислотою" означає, що, коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули до мутації гістидином або неприродною амінокислотою становить 100 95, тоді антиген-зв'язувальна активність антиген- зв'язувальної молекули після мутації гістидином або неприродною амінокислотою становить принаймні 10 95 або більше, переважно 50 95 або більше, більш переважно 80 95 або більше та іще більш переважно 90 95 або більше. Антиген-зв'язувальна активність при рн 7,4 після мутації гістидином або неприродною амінокислотою може бути більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при 7,4 до мутації гістидином або неприродною амінокислотою. Коли антиген- зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули знижується внаслідок заміщення або вставки гістидину або неприродної амінокислоти, тоді антиген-зв'язувальну активність можна відрегулювати шляхом введення заміщення, делеції, додавання та/або вставки, та їм подібного, однієї або більше амінокислот в антиген-зв'язувальну молекулу, так що антиген-зв'язувальна активність стає еквівалентною антиген-зв'язувальній активності до заміщення або вставки гістидину. Цей винахід також включає такі антиген-зв'язувальні молекули, зв'язувальну активність яких зробили еквівалентною за допомогою заміщення, делеції, додавання та/або вставки однієї або більше амінокислот після заміщення або вставки гістидину.
Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула - це речовина, яка включає константну ділянку антитіла, тоді в іншому переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальної бо молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, цей винахід включає способи модифікації константних ділянок антитіл, які містяться в антиген-зв'язувальних молекулах. Специфічні приклади константних ділянок антитіл після модифікації включають константні ділянки, описані у Прикладах.
Коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної речовини при рн |о5,в ослаблюється порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 (коли значення
КО(рн5,вУКО(рн7,4) збільшується) внаслідок вищеописаних способів та їм подібних, тоді звичайно переважно, щоб значення КО(рн5,в)/кКО(рн7,4) перебільшувало у 2 рази або більше, більш переважно у 5 разів або більше та навіть більш переважно у десять разів або більше значення щодо оригінального антитіла, проте, цими значеннями особливо не обмежуються.
Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу можуть, крім того, мати будь-яку іншу властивість, доки їхня антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0. Наприклад, антиген-зв'язувальні молекули можуть бути антагоністичними або агоністичними антиген-зв'язувальними молекулами. Переважні антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу включають, наприклад, антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули.
Зазвичай, антагоністична антиген-зв'язувальна молекула інгібує опосередковану рецептором внутрішньоклітинну передачу сигналу шляхом інгібування зв'язування між лігандом (агоністом) та рецептором.
Крім того, цим винаходом пропонуються антитіла, у яких амінокислота принаймні на одному з сайтів, вказаних нижче, заміщена гістидином або неприродною амінокислотою. Амінокислотні позиції пронумеровано на підставі нумерації за Кабаї (Кабаї ЕА єї аї., (1991) бЗедиепсев ої
Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї! Іптегеві, МІН).
Важкий ланцюг: Н27, НЗ1, НЗ2, НЗ3, НЗ5, Н5БО, Н5В8, Н5О, НЄ, Нб2, НбЗ, Нб4, Нб5, Нео,
НІТО0Б та НІ102.
Легкий ланцюг 124,127,128,132,153,1 54,1 56, 190, 1 92 та 1 94.
Серед вищевказаних сайтів НЗ2, НОТ, І 53, І 90 та І 94 можуть бути універсальними сайтами модифікації.
Коли антиген - це рецептор 1-6 (наприклад, рецептор 1І--6 людини), тоді переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними.
Важкий ланцюг: Н27, НЗ1, НЗ2, НЗ5, Н5О, Н58, НЄ, Нбе2, НбЗ, Нб4, Нб5, НІТОбЬ та НІ1О2.
Зо Легкий ланцюг 124,127,128,132,153, 1 56, 1 90, 1 92 та 1 94.
Коли гістидин або неприродна амінокислота заміщує на численних сайтах, тоді переважні комбінації сайтів заміщення включають, наприклад, комбінацію Н27, НЗ1 та НЗ5; комбінацію
Н27, НЗІ1, НЗ2, НЗ5, Н58, Нба2 та НІ102; комбінацію 132 та І 53 та комбінацію 128, 1 32 та І 53.
Крім того переважні комбінації сайтів заміщення важкого та легкого ланцюгів включають комбінацію Н27, НЗІ, І 32 та І 53.
Коли антиген - це 1/-6 (наприклад, І/-6 людини), тоді переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними.
Важкий ланцюг: НЗ2, НБУ, НЄ! та НО9О.
Легкий ланцюг: І 53, І 54, І 90 та І 94.
Коли антиген - це рецептор 1-31 (наприклад, рецептор І--31 людини), тоді переважні сайти модифікації включають НЗ3З. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ним.
Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу можуть розпізнавати будь-який антиген.
Антигени, що розпізнаються антитілами цього винаходу, специфічно включають вищезгадані рецепторні білки (зв'язані з мембраною рецептори або розчинні рецептори), мембранні антигени, такі як клітинні поверхневі маркери, та розчинні антигени, такі як цитокіни, наприклад,
ІС-1, 1С-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 11-68, 1-9, 1-10, 12-11, 1-12, 11-15, 1-31, 1-23, рецептор 1І--2, рецептор 1/-6, рецептор ОМ, ор130, рецептор І/-5, СО40, 204, Раб, остеопонтин, СЕТН2,
СОр26, РОСЕ-ОЮ, СО20, фактор моноциту хемоатрактанту, СО23, ТМЕ-а, НМОВ-1, інтегрин ай,
ІСАМ-1, ССК2, СО11а, СОЗ, ІЄМУу, ВІ уз, НГА-ОВ, ТаБ-В, СО52 та рецептор 1-31.
Особливо переважні антигени включають рецептор ЇЇ -6.
Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу описані вище.
У переважному варіанті здійснення цього винаходу антиген-зв'язувальні молекули включають антитіла. Антитіла, що мають антиген-зв'язувальну активність та ЕсКп-зв'язувальну ділянку, включають, наприклад, антитіла Ід. Коли антитіло, що використовується, - це антитіло
Ід, тоді нема жодного обмеження стосовно його типу. Можна використовувати ІдДС1, ІдС2,
ІЧО3, Ід2с4 та їм подібне.
Походження антитіла цього винаходу особливо не обмежується, та воно може мати будь- яке походження. Можна використовувати, наприклад, антитіла миші, антитіла людини, антитіла щурів, антитіла кролів, антитіла козлів, антитіла верблюдів та їм подібні. Крім того, антитіла 60 можуть бути, наприклад, вищеописаними химерними антитілами, та, зокрема, модифікованими антитілами із заміщеннями в амінокислотних послідовностях, такими як гуманізовані антитіла.
Антитіла можуть також бути вищеописаними біспецифічними антитілами, продуктами модифікації антитіл, до яких приєднали різні молекули, поліпептидами, що включають фрагменти антитіл, та антитілами з модифікованими цукровими ланцюгами.
Покоління химерних антитіл є відомим. У випадку химерного антитіла людини-миші, наприклад, ДНК, що кодує М-ділянку антитіла, може бути зв'язаною з ДНК, що кодує С-ділянку антитіла людини; це можна вставити у вектор експресії та увести хазяїну для отримання химерного антитіла. "Гуманізовані антитіла", також називаються антитілами людини зі зміненою формою, - це антитіла, у яких гіперваріабельна ділянка (СОК), що походить від ссавця, що не є людиною, наприклад, миші, трансплантуються у СОК антитіла людини. Способи ідентифікації СОК є відомими (КаБбаї єї а), Зедиепсе ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегевзі (1987), Маїйопаї! Іпвійше ої
Неанй, ВеїШйезада, ма.; Споїніа еї а), Маїште (1989) 342:877). Загальні способи генетичної рекомбінації, що є придатними для цього, є також відомими (дивись європейську патентну заявку ЕР 125023 та УМО 96/02576). Гуманізовані антитіла можна отримати за відомими способами, наприклад, можна визначити СОМ мишачого антитіла та отримати ДНК, що кодує антитіло, у якому СОК приєднана до каркасної ділянки (ЕК) антитіла людини. Гуманізовані антитіла можна потім отримувати із використанням системи, яка використовує традиційні вектори експресії. Такі ДНК можна синтезувати шляхом ПЛР, використовуючи як праймери декілька олігонуклеотидів, які вироблено так, щоб вони мали частини, які перекривають кінцеві ділянки як СОК, так і ЕК (дивись спосіб, описаний у М/О 98/13388). Каркасні ділянки антитіла людини, з'єднані за допомогою СОК, вибираються так, що СОК утворюють придатну антиген- зв'язувальну ділянку. Якщо необхідно, амінокислоти у каркасних ділянках варіабельної ділянки антитіла можна заміщувати так, щоб СОК антитіла людини зі зміненою формою могли утворювати придатну антиген-зв'язувальну ділянку (зай, К. єї а)., Сапсег Нев. (1993) 53:10.01- 6). Амінокислотні залишки у каркасних ділянках, які можна модифікувати, включають частини, які безпосередньо зв'язуються з антигеном за допомогою нековалентних зв'язків (Атії еї аї.,
Зсіепсе (1986) 233: 747-53), частини, що впливають або мають вплив на структуру СОК (Споїпіа еї аї., У. Мої. Віої. (1987) 196: 901-17), та частини, що залучаються у взаємодії МН-МІ. (ЕР
Коо) 239400).
Коли антитіла цього винаходу - це химерні антитіла або гуманізовані антитіла, тоді С- ділянки цих антитіл переважно походять від антитіл людини. Наприклад, СУу!1, Су2, СуЗ та Суд можна використовувати для Н-ланцюга, проте Ск та СА можна використовувати для І -ланцюга.
Крім того, якщо необхідно, амінокислотні мутації можна вводити у С-ділянку антитіла людини для підсилення або ослаблення зв'язування з рецептором Есу або РсКп або для покращення стійкості або продуктивності антитіла. Химерне антитіло цього винаходу переважно включає варіабельну ділянку антитіла, що походить від ссавця, який не є людиною, та константну ділянку, що походить від антитіла людини. Проте, гуманізоване антитіло переважно включає гіперваріабельні ділянки (СОК) антитіла, що походить від ссавця, який не є людиною, та каркасні ділянки та С-ділянки, що походять від антитіла людини. Константні ділянки, що походять від антитіл людини, переважно включають ЕсКп-зв'язувальну ділянку. Такі антитіла включають, наприклад, до (дес, Ід52, ІдОЗ та Ідс4). Константні ділянки, що використовуються для гуманізованих антитіл цього винаходу, можуть бути константними ділянками антитіл будь- якого ізотипу. Переважно використовується константна ділянка (ДС людини, проте нею не обмежуються. Каркасні ділянки, які походять від антитіла людини та які використовуються для гуманізованих антитіл, особливо не обмежуються, та вони можуть походити від антитіла будь- якого ізотипу.
Варіабельні та константні ділянки химерних та гуманізованих антитіл цього винаходу можна модифікувати шляхом делеції, заміщення, вставки та/"або додавання та їм подібного, доки демонструється зв'язувальна специфічність оригінальних антитіл.
Оскільки імуногенність в організмі людини знижується, то вважають, що химерні та гуманізовані антитіла, які використовують похідні від людини послідовності, є корисними, коли їх вводять людям для терапевтичних цілей тощо.
Антитіла цього винаходу можна отримати за будь-яким способом. Наприклад, антитіла, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є первинно більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН 7,4, або порівняльною з нею, можна штучно модифікувати шляхом заміщення гістидином, описаним вище, або йому подібним способом, так щоб їх антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 стала нижчою, ніж при рН 7,4. Альтернативно, антитіла, антиген- зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, можна вибрати шляхом 60 скринінгу ряду антитіл, отриманих з бібліотеки антитіл або гібридом, як описано нижче.
Коли гістидин заміщує амінокислоти в антитілі, тоді можна використовувати відомі послідовності для амінокислотної послідовності важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла до введення мутацій гістидином або можна використовувати амінокислотні послідовності антитіл, щойно отриманих за способами, відомими фахівцям в цій галузі. Наприклад, антитіла можна отримати з бібліотеки антитіл, або їх можна отримати шляхом клонування генів, що кодують антитіла, з гібридом, що утворюють моноклональні антитіла.
Що стосується бібліотек антитіл, то вже відомо багато бібліотек антитіл, та способи виробництва бібліотек антитіл є також відомими; отже, фахівці у цій галузі можуть належним способом отримати бібліотеки антитіл. Наприклад, стосовно фагових бібліотек антитіл можна звернутися до такої літератури, як Сіаскхоп еї аїЇ, Машге 1991, 352: 624-868; Маїкз єї ан, 9. Мої.
Віо!. 1991222: 581-97; Магетоизез вї а, Мисівїс Асіаз Вев. 1993, 21: 2265-6; Спінйнь5 єї аї, ЕМВО
У. 1994,13: 324.0-60; Майднап сеї аї, Маїште Віотесппоіоду 1996, 14: 309-14; та дарапезе Раїепі
Копуо Рибіїсайоп Мо. (ЧР-А) Н2г0-504970 (публікація щодо японської національної фази заявки, що не пройшла експертизу, яка відповідає міжнародній публікації, яка не є японською). Крім того, можна використовувати відомі способи, такі як способи, що використовують як бібліотеки еукаріотні клітини (МУМО 95/15393) та способи рибосомного виявлення. Крім того, також відомі способи отримання антитіл людини шляхом пенінгу із використовуванням бібліотек антитіл людини. Наприклад, варіабельні ділянки антитіл людини можна експересувати на поверхні фатів як одноланцюгові антитіла (5сСЕм), використовуючи способи фагового виявлення, та можна вибрати фаги, що зв'язуються з антигенами. Генетичний аналіз вибраних фагів може визначити послідовності ДНК, що кодують варіабельні ділянки антитіл людини, які зв'язуються з антигенами. Якщо послідовності ДНК 5сЕм, які зв'язуються з антигенами, виявлено, можна отримати придатні вектори експресії на основі цих послідовностей, щоб отримати антитіла людини. Ці способи є вже добре відомими, та стосовно них можна звернутися до УМО 92/01047,
МО 92/20791, МО 93/06213, УМО 93/11236, УМО 93/19172, УМО 95/01438 та МО 95/15388.
Що стосується способів отримання генів, які кодують антитіла, з гібридом, взагалі можна використовувати відомі способи, під час яких використовуються бажані антигени або клітини, що експресують бажані антигени, у якості сенсибілізуючих антигенів, використовуючи їх для здійснення імунізації згідно з традиційними способами імунізації, зливаючи отримані імунні клітини з відомими батьківськими клітинами за допомогою традиційних способів злиття клітин, здійснюючи скринінг клітин (гібридом), що виробляють моноклональні антитіла, за допомогою традиційних способів скринінгу, синтезуючи кКДНК варіабельних ділянок (М-ділянок) антитіла з
МРНК отриманих гібридом із використанням ревертази та зшиваючи їх з ДНК, що кодують бажані константні ділянки (С-ділянки) антитіла.
Більш специфічно, сенсибілізуючі антигени для отримання вищеописаних генів антитіл, що кодують Н-ланцюги та І-ланцюги, включають як повні антигени з імуногенністю, так і неповні антигени, які включають гаптени та їм подібне без антигенності; проте, вони не обмежуються цими прикладами. Наприклад, можна використовувати суцільні білки та часткові пептиди білків, що представляють інтерес. Крім того, відомо, що речовини, які включають полісахариди, нуклеїнові кислоти, ліпіди та їм подібне, можуть бути антигенами. Отже, антигени антитіл цього винаходу особливо не обмежуються. Антигени можна приготувати згідно зі способами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, способами на основі бакуловірусу (наприклад, УМО 98/4677 7) та їм подібними. Гібридоми можна отримати, наприклад, за способом Міївєїеїп та інших (а. Копієг апа с. Міївієїп, Меїшйтод» Епгутої. 1981, 73: 3-46) та йому подібним. Коли імуногенність антигену є низькою, тоді імунізацію можна виконувати після з'єднання антигену з макромолекулою, яка має імуногенність, такою як альбумін. Альтернативно, якщо необхідно, то антигени можна перетворювати у розчинні антигени шляхом з'єднання їх з іншими молекулами.
Коли трансмембранні молекули, такі як мембранні антигени (наприклад, рецептори) використовуються як антигени, тоді частини зовнішньоклітинних ділянок мембранних антигенів можна використовувати як фрагмент, або клітини, що експресують трансмембранні молекули на їхній клітинній поверхні, можна використовувати як імуногени.
Клітини, що виробляють антитіла, можна отримати шляхом імунізації тварин, використовуючи при цьому відповідні сенсибілізуючі антигени, як описано вище. Альтернативно, клітини, що виробляють антитіла, можна приготувати шляхом імунізації іп міо лімфоцитів, які можуть виробляти антитіла. Різних ссавців можна використовувати для імунізації; такі тварини, що зазвичай використовуються, включають гризунів, зайцеподібних (Іадотогрпах) та приматів.
Такі тварини включають, наприклад, гризунів, таких як миші, щури та хом'ячки; зайцеподібних (адотогрпав), таких як кролі; та приматів, які включають мавп, таких як мавпи супотоїЇдив, макаки-резус, бабуїни та шимпанзе. Крім того, також відомими є трансгенні тварини, які є бо носіями репертуарів генів антитіл людини, та антитіла людини можна отримати,
використовуючи цих тварин (дивись УМО 96/34096; Мепае? еї аї., Маї. Сепеї. 1997, 15: 146-56).
Замість використання таких трансгенних тварин, наприклад, бажані антитіла людини, що мають зв'язувальну активність проти антигенів, можна отримати шляхом сенсибілізації іп міо лімфоцитів людини бажаними антигенами або клітинами, що експресують бажані антигени, з наступним злиттям сенсибілізованих лімфоцитів з клітинами мієломи людини, такими як 0266 (дивись японську патентну заявку КоКоКи Рибіїсайоп Мо. (УР-В) НО1-59878 (пройшла експертизу, ухвалена японська патентна заявка, яку опубліковано для опонентів)). Крім того, бажані антитіла людини можна отримати шляхом імунізації трансгенних тварин, що є носіями повного репертуару генів антитіла людини, бажаними антигенами (дивись МО 93/12227, УМО 92/03918,
УМО 94/02602, УМО 96/34096 та УМО 96/33735).
Імунізацію тварин можна здійснювати шляхом відповідного розведення та суспендування сенсибілізуючого антигену у сольовому розчині з фосфатним буфером (РВ5), фізіологічному сольовому розчині або їм подібному та шляхом змішування цього з ад'ювантом з метою емульгування, якщо це необхідно. Цю суміш потім вводять тваринам шляхом інтраперитонеальної або підшкірної ін'єкції Потім сенсибілізуючий антиген, змішаний з неповними ад'ювантом Фрейнда, переважно вводиться декілька разів кожні 4-21 день.
Виробництво антитіла можна підтвердити шляхом вимірювання титру антитіла, яке представляє інтерес, у сироватці тварини, використовуючи при цьому традиційні способи.
Клітини, що виробляють антитіла, які отримано з лімфоцитів або тварин, імунізованих бажаним антигеном, можна злити з клітинами мієломи, щоб генерувати гібридоми, використовуючи при цьому традиційні для злиття агенти (наприклад, поліетиленгліколь) (Содіпа, Мопосіопа! Апііродієв: Рііпсіріеє5 апа Ргасіїсе, Асадетіс Ргев5, 1986, 59-103). Коли це необхідно, клітини гібридом можна культивувати та вирощувати, а зв'язувальну специфічність антитіла, виробленого з цих гібридом, можна вимірювати, використовуючи відомі аналітичні способи, такі як імунопреципітація, радіоїмуноаналіз (КІА) та твердофазний імуноферментний аналіз (ЕЛАЙЗА). Після цього гібридоми, що виробляють антитіла, які представляють інтерес, у яких визначили специфічність, афінність або активність, можна субклонувати за способами, такими як обмежувальне розведення.
Після цього, гени, що кодують вибрані антитіла, можна клонувати з гібридом або клітин, що
Зо виробляють антитіла (сенсибілізованих лімфоцитів та їм подібних), використовуючи зонди, які можуть специфічно зв'язуватися з цими антитілами (наприклад, олігонуклеотиди, які є комплементарними до послідовностей, що кодують константні ділянки антитіла). Можна також клонувати гени з МРНК, використовуючи КТ-РСЕК (полімеразно-ланцюгову реакцію зі зворотною транскриптазою). Імуноглобуліни поділяються на п'ять різних класів, ІдА, дО, ЧЕ, Ідс та І9М. Ці класи далі поділяються на декілька підкласів (ізотипів) (наприклад, Ідо-1, Іда-2, ІДИ-3 та Ідо-4;
ІЗА-1 та ІдА-2; та їм подібні). Н-ланцюги та І -ланцюги, що використовуються у цьому винаході для виробництва антитіл, особливо не обмежуються, та вони можуть походити від антитіл, які належать до будь-якого з цих класів або підкласів; проте, особливо переважним є Ід.
У цьому описі винаходу можна модифікувати гени, що кодують Н-ланцюги, та гени, що кодують І-ланцюги, використовуючи при цьому способи генної інженерії. Генетично модифіковані антитіла, такі як химерні антитіла та гуманізовані антитіла, які штучно модифікували з метою зниження гетерологічної імуногенності та їй подібного проти людини, можна відповідним чином виробляти для антитіл, таких як мишачі антитіла, щурячі антитіла, кролячі антитіла, антитіла хом'ячків, антитіла овець та антитіла верблюдів. Химерні антитіла - це антитіла, які включають варіабельні ділянки Н-ланцюга та І -ланцюга антитіла ссавця, який не є людиною, такого як мишаче антитіло, та константні ділянки Н-ланцюга та І-ланцюга антитіла людини. Химерні антитіла можна отримати шляхом зшивання ДНК, що кодує варіабельну ділянку мишачого антитіла, з ДНК, що кодує константну ділянку антитіла людини, шляхом вставки цього у вектор експресії та введення вектора хазяїну для виробництва антитіла. Гуманізоване антитіло, яке також називають антитілом людини зі зміненою формою, можна синтезувати шляхом ПЛР, використовуючи декілька олігонуклеотидів, отриманих так, що вони мають перекриваючі частини на кінцях послідовностей ДНК, побудованих для з'єднання гіперваріабельних ділянок (СОК) антитіла ссавця, що не є людиною, такого як миша. Отриману
ДНК можна зшити з ДНК, що кодує константну ділянку антитіла людини. Зшиту ДНК можна вставити у вектор експресії, а вектор можна увести хазяїну з метою отримання антитіла (дивись
ЕР 239400 та УМО 96/02576). Каркасні ділянки антитіла людини, зшиті за допомогою СОК, вибираються, коли СОК утворює сприятливу антиген-зв'язувальну ділянку. Якщо необхідно, амінокислоти у каркасній ділянці варіабельної ділянки антитіла можна заміщувати так, щоб СОК антитіла людини зі зміненою формою утворювала відповідну антиген-зв'язувальну ділянку (К. 60 За єї аі., Сапсег Нев. 1993, 53: 10.01-10.06).
Окрім описаної вище гуманізації, антитіла можна модифікувати з метою покращення їх біологічних властивостей, наприклад, шляхом зв'язування з антигеном. У цьому винаході таких модифікацій можна досягнути за допомогою способів, таких як сайт-спрямований мутагенез (дивись, наприклад, КипКе! (1910.0) Ргос. Май. Асай. сі. ОСОБА 82: 488), ПЛР-мутагенез та касетний мутагенез. Взагалі, мутантні антитіла, біологічні властивості яких були покращені, демонструють гомологію та/або подібність амінокислотних послідовностей у 70 95 або більше, більш переважно у 80 95 або більше та навіть більш переважно у 90 95 або більше (наприклад, 9595 або більше, 97 95, 9895 або 9995) при порівнянні з амінокислотною послідовністю варіабельної ділянки оригінального антитіла. У цьому описі винаходу гомологія та/або подібність послідовності визначається, як відношення амінокислотних залишків, що є гомологічними (такий самий залишок) або подібними (амінокислотні залишки, які класифікуються до такої ж самої групи на основі загальних властивостей амінокислотних бічних ланцюгів) до залишків оригінального антитіла, після того, як значення гомології послідовності досягло максимального значення внаслідок вирівнювання послідовності та введення проміжків, якщо необхідно. Взагалі, природні амінокислотні залишки поділяються на групи на основі характеристик їхніх бічних ланцюгів, а саме: - гідрофобні: аланін, ізолейцин, валін, метіонін та лейцин; - нейтральні гідрофільні: аспарагін, глютамін, цистеїн, треонін та серин; - кислотні: аспарагінова кислота та глютамінова кислота; - лужні: аргінін, гістидин та лізин; - залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: гліцин та пролін; та - ароматичні: тирозин, триптофан та фенілаланін.
Взагалі, усього шість гіперваріабельних ділянок (СОК), що є присутніми у варіабельних ділянках Н-ланцюга та І -ланцюга, взаємодіють одна з одною, утворюючи антиген-зв'язувальну ділянку антитіла. Також відомо, що сама варіабельна ділянка є здатною розпізнавати та зв'язуватися з антигеном, хоча її афінність є нижчою, ніж афінність усієї зв'язувальної ділянки.
Отже, гени антитіла, що кодують Н-ланцюг або І-ланцюг цього винаходу, можуть кодувати фрагменти, кожен з яких включає антиген-зв'язувальну ділянку Н-ланцюга або І -ланцюга, доки поліпептид, який кодується генами, зберігає активність зв'язування з бажаним антигеном.
Зо Як описано вище, варіабельна ділянка важкого ланцюга взагалі складається з трьох СОК та чотирьох каркасних ділянок. У переважному варіанті здійснення цього винаходу амінокислотні залишки, які слід "модифікувати", можна відповідним чином вибрати з амінокислотних залишків, наприклад, у СОК або у каркасній ділянці. Взагалі, модифікації амінокислотних залишків у СОК можуть знижувати антиген-зв'язувальну здатність. Отже, відповідні амінокислотні залишки, які слід "модифікувати" у цьому винаході, переважно вибираються з амінокислотних залишків у каркасних ділянках, проте не обмежуються ними. Можна вибирати амінокислоти у СОК, доки підтверджується, що модифікація не знижує зв'язувальну здатність. Альтернативно, використовуючи доступні бази даних та їм подібне, фахівці у цій галузі можуть отримати відповідні послідовності, які можна використовувати як каркасну ділянку варіабельної ділянки антитіла організму, такого як людина або миша.
Крім того, цим винаходом пропонуються гени, що кодують антитіла цього винаходу. Гени, що кодують антитіла цього винаходу, можуть бути будь-якими генами, та вони можуть бути ДНК,
РНК, аналогами нуклеїнових кислот та їм подібним.
Крім того, цим винаходом також пропонуються клітини-хазяїни, які є носіями генів, описаних вище. Клітини-хазяїни особливо не обмежуються та включають, наприклад, Е. соїї та різні тваринні клітини. Клітини-хазяїни можна використовувати, наприклад, як системи виробництва для одержання та експресування антитіл цього винаходу. Системи виробництва іп міїго та іп мімо є доступними для систем виробництва поліпептидів. Такі системи виробництва іп мйго включають, наприклад, системи виробництва, що використовують еукаріотні клітини або прокаріотні клітини.
Еукаріотні клітини, які можна використовувати як клітини-хазяїни, включають, наприклад, тваринні клітини, рослинні клітини та клітини грибів. Тваринні клітини включають: клітини ссавців, наприклад, СНО (9. Ехр. Меа. (1995) 108: 94.0), СО5, НЕК293, 313, мієлому, ВНК (нирку дитинча хом'ячка), Не а та Мего; клітини амфібій, такі як овоцити Хепориз Іаємі5 (МаїІе еї аї.,
Маїшге (1981) 291: 338-340); клітини комах, такі як 519, 5121 та Тп5. Клітини СНО-ЮОС44, СНО- рх118, СО57, клітини НЕК293 та клітини ВНК переважно використовуються для експресування антитіл цього винаходу. Серед тваринних клітин клітини СНО є особливо переважними для великомасштабної експресії. Вектори можна вводити у клітини-хазяїни, наприклад, за допомогою способів з використанням фосфату кальцію, способів з використанням ОЕАЕ-
Зо декстрану, способів, що використовують БОТАР катіонних ліпосом (Воепгіпдег-МаппНеїт), способів електропорації та способів ліпофекції.
Стосовно рослинних клітин, наприклад, клітини, що походять від Місойапа їабасит та ряски (Гетпа тіпог), є відомими як система для виробництва білків. Калюси можна культивувати з цих клітин для виробництва антитіл цього винаходу. Стосовно клітин грибів, відомі системи експресії білків - це ті системи, що використовують клітини дріжджів, наприклад, клітини роду зЗасспаготусев (такі як Засспаготусе5 сегемівіаеє та Засспаготусе5 ротре); та клітини ниткоподібних грибів, наприклад, роду Азрегойив (такі як Аврегайшв5 підег), Ці клітини можна використовувати як хазяїв для виробництва антитіл цього винаходу.
Бактеріальні клітини можна використовувати у прокаріотних системах виробництва.
Стосовно бактеріальних клітин, окрім вищеописаних систем виробництва, що використовують
Е. соїї, відомими є системи виробництва, що використовують Васіїйи5 зиБбійй5. Такі системи можна використовувати для виробництва антитіл цього винаходу.
Способи скринінгу
Цим винаходом пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, антиген- зв'язувальна активність яких при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рН. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які можуть окремо зв'язуватися з багатьма антигенами. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які є найкращими стосовно утримання у плазмі. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремлюється усередині клітини від антигену, який був зв'язаний нею ззовні клітини. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину та яка виділяється за межі клітини у вільній від антигену формі. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген- зв'язувальної молекули, яка має підвищену здатність елімінувати антигени у плазмі. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які є особливо корисними, коли їх використовують як фармацевтичні композиції. Специфічно, цим винаходом пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи:
Зо (а) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0; (р) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 та (с) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рн від 6,7 до 10,0 перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рн від 4,0 до 6,5.
У способах скринінгу цього винаходу антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0 особливо не обмежується, доки вона є антиген-зв'язувальною активністю при рН від 6,7 до 10,0. Проте, наприклад, переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рН від 7,0 до 8,0, а більш переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рН 7,4. Далі, антиген- зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 особливо не обмежується, доки вона є антиген-зв'язувальною активністю при рН від 4,0 до 6,5. Проте, наприклад, переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рН від 5,5 до 6,5, а більш переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 або 5,5.
Антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Фахівці у цій галузі можуть відповідним чином визначити умови, відмінні від рН. Антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити як константу дисоціації (КО), позірну константу дисоціації (позірну
КО), константу швидкості дисоціації (Ка) позірну константу швидкості дисоціації (позірна Ка) та їм подібними. Ці константи можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, використовуючи Віасоге (СЕ пеаййсаге), Зсаїснага ріої, або ЕАС5.
У цьому описі винаходу фраза "етап вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген- зв'язувальна активність якої при рН від 6,7 до 10,0 перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5" має таке ж саме значення, що і фраза "етап вибирання антиген- зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН від 6,7 до 10,0".
Різниця між антиген-зв'язувальною активністю при рН від 6,7 до 10,0 та антиген- зв'язувальною активністю при рН від 4,0 до 6,5 особливо не обмежується, доки антиген- бо зв'язувальна активність при рН від 6,7 до 10,0 перебільшує антиген-зв'язувальну активність при від 40 д ,5. те, антиген-зв'язувальна активність при від 'Є,7 д Оп важн
Н 4,0 до 6,5. Проте, а ен-зв'язувальна а с Н 6,7 до 10,0 переважно перебільшує удвічі або більше, більш переважно у 10 разів або більше та іще більш переважно у 40 разів або більше антиген-зв'язувальну активність при рн від 4,0 до 6,5. ім того, цим винаходом також пропонуються сп и скринінгу антиген-зв'язувальних
К ого аходом тако опонуються способи с а ен-зв'язува молекул, які включають наступні етапи: в'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при умові відб,7 д ,0; а) зв'язува а ен-зв'язувальної моле за ено ові рН 6,7 до 10,0 (Б) поміщення антиген-зв'язувальної молекули, що зв'язалася з антигеном за (а), в умови рН від 4,0 до 6,5; та (с) отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5. ім того, цим винаходом також пропонуються сп и скринінгу антиген-зв'язувальних
К ого аходом тако опонуються способи с а ен-зв'язува молекул, які включають наступні етапи: (а) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, що не зв'язується з антигеном при умові рн від 4,0 до 6,5; (5) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, вибраної у (а), з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0 та тримання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном при умові від с) о а а ен-зв'язувальної моле а зв'язаласяза ено ові рН 6,7 до 10,0. ім того, цим винаходом також пропонуються сп и скринінгу антиген-зв'язувальних
К ого аходом тако опонуються способи с а ен-зв'язува молекул, які включають наступні етапи: в'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при умові відб,7 д ,0; а) зв'язува а ен-зв'язувальної моле за ено ові рН 6,7 до 10,0 (Б) поміщення антиген-зв'язувальної молекули, що зв'язалася з антигеном за (а), в умови рН від 4,0 до 6,5; (с) отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5; (4) ампліфікування гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, що відокремилася; та (є) отримання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули.
Етапи від (а) до (4) можна повторювати двічі або більше разів. Отже, цим винаходом пропонуються способи, описані вище, які далі включають етап повторювання етапів від (а) до
Зо (4) двічі або більше разів. Кількість повторів етапів від (а) до (4) особливо не обмежується; проте, ця кількість зазвичай становить десять разів або менше.
Крім того, цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи: (а) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, що не зв'язується з антигеном при умові рн від 4,0 до 6,5; (р) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, вибраної у (а), з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (с) отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (а) ампліфікування гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, що відокремилася; та (є) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули.
Етапи від (а) до (4) можна повторювати двічі або більше разів. Отже, цим винаходом пропонуються способи, описані вище, які далі включають етап повторювання етапів від (а) до (4) двічі або більше разів. Кількість повторів етапів від (а) до (4) особливо не обмежується; проте, ця кількість зазвичай становить десять разів або менше.
Коли бібліотеку фагів або їй подібне використовують у способах скринінгу цього винаходу, тоді етап ампліфікування гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, може також бути етапом ампліфікування фагів.
У способах цього винаходу зв'язування антиген-зв'язувальної молекули та антигену можна здійснювати за умови будь-якого стану без особливого обмеження. Наприклад, зв'язування антиген-зв'язувальної молекули та антигену можна здійснювати шляхом контактування антигену з іммобілізованою антиген-зв'язувальною молекулою або шляхом контактування антиген- зв'язувальної молекули з іммобілізованим антигеном. Альтернативно, зв'язування антиген- зв'язувальної молекули та антигену можна здійснювати шляхом контактування антигену та антиген-зв'язувальної молекули у розчині.
Крім того, цим винаходом пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, зв'язувальна активність яких при першому рН є більшою, ніж при другому рнН, які включають наступні етапи: в'язування антиген-зв'язувальної молекули з колонк іммобілізованим антигеном при а) зв'язува а ен-зв'язувальної моле з колонкою З обілізова а ено бо умові першого рн;
(р) елюювання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з колонкою при першому рн, з колонки при умові другого рН та (с) отримання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули.
Крім того, цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, зв'язувальна активність яких при першому рН є меншою, ніж при другому рн, які включають наступні етапи: (а) пропускання антиген-зв'язувальної молекули крізь колонку з іммобілізованим антигеном при умові першого рн; (Б) збирання антиген-зв'язувальної молекули, яка елюювалася без зв'язування з колонкою на етапі (а); (с) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, зібраної у (Б), з колонкою при умові другого рН та (4) отримання антиген-зв'язувальної молекули, що зв'язалася з колонкою на етапі (с).
Крім того, цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, зв'язувальна активність яких при першому рН є більшою, ніж при другому рН, які включають наступні етапи: (а) зв'язування бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого рн; (р) елюювання антиген-зв'язувальної молекули з колонки при умові другого рн; (с) ампліфікування гена, що кодує елюйовану антиген-зв'язувальну молекулу; та (4) отримання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули.
Етапи від (а) до (с) можна повторювати двічі або більше разів. Отже, цим винаходом пропонуються способи, описані вище, які далі включають етап повторювання етапів від (а) до (с) двічі або більше разів. Кількість повторів етапів від (а) до (с) особливо не обмежується; проте, ця кількість зазвичай становить десять разів або менше.
У цьому винаході перше та друге значення рН може бути будь-яким значенням рнН, доки вони не є ідентичними. У переважній комбінації першого та другого значення рН, наприклад, перше значення рнН становить від 6,7 до 10,0, а друге значення рН становить від 4,0 до 6,5; у більш переважній комбінації перше значення рН становить від 7,0 до 8,0, а друге значення рн становить від 5,5 до 6,6; а у іще більш переважній комбінації перше значення рН становить 7,4, а друге значення рН становить 5,8 або 5,5.
В іншій переважній комбінації першого та другого значення рН, наприклад, перше значення рН становить від 4,0 до 6,5, а друге значення рН становить від 6,7 до 10,0; у більш переважній комбінації перше значення рнН становить від 5,5 до 6,5, а друге значення рН становить від 7,0 до 8,0; а у іще більш переважній комбінації перше значення рН становить 5,8 або 5,5, а друге значення рнН становить 7,4.
Антиген-зв'язувальні молекули, що піддаються скринінгу за способами цього винаходу, можуть бути будь-якими антиген-зв'язувальними молекулами. Наприклад, можна використовувати вищеописані антиген-зв'язувальні молекули при скринінгу за цим винаходом.
Наприклад, можна піддавати скринінгу антиген-зв'язувальні молекули, які включають природні послідовності, або антиген-зв'язувальні молекули, які включають амінокислотні послідовності із заміщеннями. Переважні антиген-зв'язувальні молекули, які піддаються скринінгу у цьому винаході, включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, у яких принаймні одна амінокислота заміщена гістидином або принаймні один гістидин вставлений. Ділянка здійснення заміщення або вставки гістидину особливо не обмежується, та їх можна ввести на будь-якій ділянці. Крім того, заміщення або вставку гістидину можна здійснити на одній ділянці, або його можна здійснити на двох або більше ділянках. Крім того, переважні антиген-зв'язувальні молекули, які піддаються скринінгу у цьому винаході, включають, наприклад, антиген- зв'язувальні молекули, які включають модифіковані константні ділянки антитіла.
Антиген-зв'язувальні молекули, які піддаються скринінгу за способами цього винаходу, можуть являти собою деяку кількість різних антиген-зв'язувальних молекул, яким зробили заміщення або вставки гістидину на різних ділянках, наприклад, шляхом гістидинового сканування.
Отже, способи скринінгу цього винаходу можуть далі включати етап заміщення принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі гістидином або етап вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу.
У способах скринінгу цього винаходу замість гістидину можна використовувати неприродні амінокислоти. Отже, цей винахід можна також розуміти як такий, де замість вищезгаданого гістидину використовуються неприродні амінокислоти.
Крім того, способи скринінгу цього винаходу можуть далі включати етап модифікації амінокислот константних ділянок антитіл.
Антиген-зв'язувальні речовини, які піддаються скринінгу за способами скринінгу цього винаходу, можна одержати за будь-яким способом. Наприклад, можна використовувати вже існуючі антитіла, вже існуючі бібліотеки (бібліотеки фагів та їм подібне), антитіла та бібліотеки, які одержані з гібридом, отриманих шляхом імунізації тварин, або з В-клітин імунізованих тварин, антитіла та бібліотеки (бібліотеки з високим вмістом гістидину або неприродної амінокислоти, бібліотеки, у які ввели гістидин або неприродну амінокислоту на специфічних ділянках тощо), отримані шляхом здійснення мутацій гістидином або мутацій неприродною амінокислотою у вищезгаданих антитілах та бібліотеках, і так далі.
Антиген-зв'язувальні молекули, які зв'язуються з антигеном багато разів, які, внаслідок цього, мають перевагу стосовно утримання у плазмі, можна отримати за способами скринінгу цього винаходу. Отже, способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу для отримання антиген-зв'язувальних молекул, які мають перевагу стосовно утримання у плазмі.
Крім того, антиген-зв'язувальні молекули, що можуть зв'язуватися з антигеном 2 або більше разів, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи, можна отримати за способами скринінгу цього винаходу. Отже, способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, здатних зв'язуватися з антигеном два рази або більше.
Крім того, антиген-зв'язувальні молекули, що є здатними зв'язуватися з більшою кількістю антигенів порівняно з кількістю їхніх антиген-зв'язувальних ділянок, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи, можна отримати за способами скринінгу цього винаходу. Отже, способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу для отримання антиген-зв'язувальних молекул, які є здатними зв'язуватися з більшою кількістю антигенів порівняно з кількістю їхніх антиген-зв'язувальних ділянок. Наприклад, коли антитіло - це нейтралізуюче антитіло, тоді способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу для отримання антиген-зв'язувальних молекул, які можуть нейтралізувати більшу кількість антигенів, ніж кількість антиген-зв'язувальних ділянок антиген-зв'язувальних
Зо молекул.
Крім того, антиген-зв'язувальні молекули, що є здатними відокремлюватися усередині клітини від антигену, що зв'язався з цією молекулою ззовні клітини, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи, можна отримати за способами скринінгу цього винаходу. Отже, способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу для отримання антиген-зв'язувальних молекул, які є здатними відокремлюватися усередині клітини від антигену, що зв'язався з цими молекулами ззовні клітини.
Крім того, антиген-зв'язувальні молекули, які є зв'язаними 3 антигеном та які інтерналізувалися у клітину та виділилися за межі клітини у вільній від антигену формі, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи, можна отримати за способами скринінгу цього винаходу. Отже, способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу для отримання антиген-зв'язувальних молекул, які зв'язалися 3 антигеном, та інтерналізувалися у клітину, та виділилися за межі клітини у вільній від антигену формі.
Крім того, антиген-зв'язувальні молекули, які можуть швидко елімінувати антигени у плазмі, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи, можна отримати за способами скринінгу цього винаходу. Отже, способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу для отримання антиген-зв'язувальних молекул з підвищеною (високою) здатністю елімінувати антигени у плазмі.
Крім того, очікують, що такі антиген-зв'язувальні молекули будуть особливо переважними у якості фармацевтичних препаратів, тому що дозу та частоту введення пацієнтам можна знизити, внаслідок чого зменшується загальна доза. Отже, способи скринінгу цього винаходу можна використовувати як способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул для застосування як фармацевтичних композицій.
Крім того, цим винаходом пропонуються бібліотеки, у яких вміст гістидину збільшений порівняно з оригінальними бібліотеками. Бібліотеки, що містять антиген-зв'язувальні молекули з підвищеним вмістом гістидину, можна використовувати у способах скринінгу, описаних вище, та у способах одержання, описаних далі.
Бібліотеки з підвищеним вмістом гістидину можна отримати за способами, відомими фахівцям у цій галузі Вони включають наступний спосіб. 20 типів кодонів-триплетів (тринуклеотидів), що кодують 20 типів амінокислот, можна увести за рівною частотою, коли бо синтезують нуклеїнові кислоти для отримання бібліотеки за способом тринуклеотидів () Мої
Віої!. 2008 Реб 29; 376(4): 1182-200). Внаслідок цього можна зробити так, щоб позиція, мутована для бібліотеки, містила 20 типів амінокислот з однаковою ймовірністю. Частоту гістидину у позиції, мутованої для бібліотеки, можна підвищити, збільшуючи пропорцію тринуклеотиду, що кодує гістидин, порівняно з рештою амінокислот серед 20 типів під час синтезу.
Способи одержання антиген-зв'язувальних молекул
Цим винаходом пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, антиген- зв'язувальна активність яких при ендосомному рН є нижчою, ніж при рН плазми. Цим винаходом також пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які є найкращими щодо утримання у плазмі. Цим винаходом також пропонуються способи одержання антиген- зв'язувальних молекул, які є особливо корисними, коли їх використовують як фармацевтичні композиції.
Специфічно, цим винаходом пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи: (а) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0; (р) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5; (с) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рн від б,7 до 10,0 є більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5; (4) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, вибрану у (с); та (є) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (а).
Цим винаходом також пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи: (а) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при рН від 6,7 до 10,0; (Б) надання можливості антиген-зв'язувальній молекулі, зв'язаній з антигеном з (а), витримуватися при умові рН від 4,0 до 6,5; (с) збирання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5; (4) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, отриману у (с); та (є) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (а).
Зо Крім того, цим винаходом пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи: (а) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, що не зв'язується з антигеном при умові рн від 4,0 до 6,5; (р) зв'язування антигену при умові рН від 6,7 до 10,0 з антиген-зв'язувальною молекулою, вибраною в (а); (с) збирання антиген-зв'язувальної молекули, що зв'язалася з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (а) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (с); та (є) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (а).
Крім того, цим винаходом пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи: (а) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (б) надання можливості антиген-зв'язувальній молекулі, зв'язаній з антигеном в (да), витримуватися при умові рН від 4,0 до 6,5; (с) збирання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5; (а) ампліфікування гена, що кодує відокремлену антиген-зв'язувальну молекулу; (є) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (Ї) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (є); та (9) одержання антиген-зв'язувальної молекули, використовуючи ген, отриманий у (1).
Етапи від (а) до (4) можна повторювати двічі або більше разів. Отже, цим винаходом пропонуються способи, описані вище, які далі включають етап повторювання етапів від (а) до (4) двічі або більше разів. Кількість повторів етапів від (а) до (4) особливо не обмежується; проте, ця кількість зазвичай становить десять разів або менше.
Крім того, цим винаходом пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи: (а) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, що не зв'язується з антигеном при умові рн від 4,0 до 6,5; (р) зв'язування антигену за умови рН від 6,7 до 10,0 з антиген-зв'язувальною молекулою, вибраною в (а);
(с) збирання антиген-зв'язувальної молекули, що зв'язалася з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (а) ампліфікування гена, що кодує відокремлену антиген-зв'язувальну молекулу; (є) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (9 отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (е); та (9) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (0).
Етапи від (а) до (4) можна повторювати двічі або більше разів. Отже, цим винаходом пропонуються способи, описані вище, які далі включають етап повторювання етапів від (а) до (4) двічі або більше разів. Кількість повторів етапів від (а) до (4) особливо не обмежується; проте, ця кількість зазвичай становить десять разів або менше.
Крім того, цим винаходом пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, зв'язувальна активність яких при першому рН є більшою, ніж при другому рнН, які включають наступні етапи: (а) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого рн; (р) елюювання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з колонкою при першому рн, з колонки при умові другого рн; (с) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (а) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (с); та (є) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (4).
Крім того, цим винаходом пропонуються способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, зв'язувальна активність яких при першому рН є більшою, ніж при другому рнН, які включають наступні етапи: (а) зв'язування бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого рн; (р) елюювання антиген-зв'язувальної молекули з колонки при умові другого рн; (с) ампліфікування гена, що кодує елюйовану антиген-зв'язувальну молекулу; (4) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (є) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (4); та
Зо () одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (є).
Етапи від (а) до (с) можна повторювати двічі або більше разів. Отже, цим винаходом пропонуються способи, описані вище, які далі включають етап повторювання етапів від (а) до (с) двічі або більше разів. Кількість повторів етапів від (а) до (с) особливо не обмежується; проте, ця кількість зазвичай становить десять разів або менше.
Коли бібліотеку фагів або їй подібне використовують у способах одержання цього винаходу, тоді етап ампліфікування гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, може також бути етапом ампліфікування фагів.
Антиген-зв'язувальні речовини, що використовуються у способах одержання цього винаходу, можна отримати за будь-яким способом. Наприклад, можна використовувати вже існуючі антитіла, вже існуючі бібліотеки (бібліотеки фагів та їм подібне), антитіла та бібліотеки, які приготували з гібридом, отриманих внаслідок імунізації тварин, або з В-клітин імунізованих тварин, антитіла та бібліотеки (бібліотеки з високим вмістом гістидину або неприродної амінокислоти, бібліотеки, у які ввели гістидин або неприродну амінокислоту на специфічних ділянках тощо), отримані внаслідок здійснення мутацій гістидином або мутацій неприродною амінокислотою у вищезгаданих антитілах та бібліотеках, і так далі.
У вищеописаних способах одержання цього винаходу антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рнН від 6,7 до 10,0 особливо не обмежується, доки вона є антиген-зв'язувальною активністю при рН від 6,7 до 10,0. Переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рН від 7,0 до 8,0, а більш переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рН.
Альтернативно, антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рн від 4,0 до 6,5 особливо не обмежується, доки вона є антиген-зв'язувальною активністю при рн від 4,0 до 6,5. Переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рн від 5,5 до 6,5, а більш переважна антиген-зв'язувальна активність - це антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 або 5,5.
Антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Фахівці у цій галузі можуть відповідним чином визначити умови, відмінні від рН. "Етап вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при 60 рН від 6,7 до 10,0 перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5", є синонімічним до "етапу вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рн від 6,7 до 10,0".
Різниця між антиген-зв'язувальною активністю при рН від 6,7 до 10,0 та антиген- зв'язувальною активністю при рН від 4,0 до 6,5 особливо не обмежується, доки антиген- зв'язувальна активність при рнН від 6,7 до 10,0 перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5. Антиген-зв'язувальна активність при рН від 6,/ до 10,0 переважно перебільшує удвічі або більше, білош переважно у десять разів або більше, а іще більш переважно у 40 разів або більше антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5.
У способах одержання цього винаходу зв'язування антиген-зв'язувальної молекули та антигену можна здійснювати за будь-якою умовою, та ця умова особливо не обмежується.
Наприклад, зв'язування антиген-зв'язувальної молекули та антигену можна здійснювати шляхом контактування антигену з іммобілізованою антиген-зв'язувальною молекулою або шляхом контактування антиген-зв'язувальної молекули з іммобілізованим антигеном. Альтернативно, зв'язування антиген-зв'язувальної молекули та антигену можна здійснювати шляхом контактування антигену та антиген-зв'язувальної молекули у розчині.
У способах одержання, описаних вище, перше та друге значення рН може бути будь-яким значенням рН, доки вони не є ідентичними. У переважній комбінації першого та другого значення рН, наприклад, перше значення рН становить від 6,7 до 10,0, а друге значення рн становить від 4,0 до 6,5; у більш переважній комбінації перше значення рнН становить від 7,0 до 8,0, а друге значення рН становить від 5,5 до 6,5; а у іще більш переважній комбінації перше значення рН становить 7,4, та друге значення рН становить 5,8 або 5,5.
В іншій переважній комбінації першого та другого значень рН, наприклад, перше значення рН становить від 4,0 до 6,5, а друге значення рН становить від 6,7 до 10,0; у більш переважній комбінації перше значення рнН становить від 5,5 до 6,5, а друге значення рН становить від 7,0 до 8,0; а у іще більш переважній комбінації перше значення рН становить 5,8 або 5,5, а друге значення рнН становить 7,4.
Антиген-зв'язувальні молекули, що одержуються за способами одержання, описаними вище, можуть бути будь-якими антиген-зв'язувальними молекулами. Переважні антиген-зв'язувальні
Зо молекули включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, у яких принаймні одна амінокислота заміщена гістидином або принаймні один гістидин вставлений. Ділянка, де здійснюється така мутація гістидином, особливо не обмежується, та її можна здійснювати на будь-якій ділянці. Крім того, мутацію гістидином можна здійснювати на одній ділянці або її можна здійснювати на двох або більше ділянках.
Отже, способи одержання цього винаходу можуть далі включати етап заміщення принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі гістидином або вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу.
У способах одержання цього винаходу замість гістидину можна використовувати неприродні амінокислоти. Отже, цей винахід можна також розуміти як такий, де замість вищезгаданого гістидину використовуються неприродні амінокислоти.
Крім того, в іншому варіанті здійснення цього винаходу, антиген-зв'язувальні молекули, що одержуються за способами одержання, описаними вище, включають, наприклад, антиген- зв'язувальні молекули, які включають модифіковані константні ділянки антитіл. Отже, способи одержання цього винаходу можуть далі включати етап модифікації амінокислот константних ділянок антитіла.
Антиген-зв'язувальні молекули, які одержуються за способами одержання цього винаходу, мають перевагу стосовно утримання у плазмі. Отже, способи одержання цього винаходу можна використовувати як способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які мають перевагу стосовно утримання у плазмі.
Крім того, очікують, що антиген-зв'язувальні молекули, отримані за цими способами одержання, є здатними зв'язуватися з антигеном два або більше разів, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи. Отже, способи одержання цього винаходу можна використовувати як способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, здатних зв'язуватися з антигеном два рази або більше.
Крім того, очікується, що антиген-зв'язувальні молекули, які отримані за способами одержання цього винаходу, будуть здатними зв'язуватися з більшою кількістю антигенів порівняно з кількістю їхніх антиген-зв'язувальних ділянок, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи. Отже способи одержання цього винаходу можна використовувати як способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які є здатними зв'язуватися з більшою бо кількістю антигенів порівняно з кількістю їхніх антиген-зв'язувальних ділянок.
Крім того, очікується, що антиген-зв'язувальні молекули, отримані за способами одержання цього винаходу, будуть здатними відокремлюватися усередині клітини від антигену, що зв'язався з цими молекулами ззовні клітини, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи. Отже, способи одержання цього винаходу можна використовувати як способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які є здатними відокремлюватися усередині клітини від антигену, що зв'язався з цими молекулами ззовні клітини.
Крім того, очікується, що антиген-зв'язувальні молекули, отримані за способами одержання цього винаходу, будуть здатними зв'язуватися з антигеном, інтерналізуватися у клітину, а також виділятися за межі клітини у вільній від антигену формі, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи. Отже, способи одержання цього винаходу можна використовувати як способи одержання антиген-зв'язувальних молекул, які здатні зв'язуватися з антигеном, та інтерналізуватися у клітину, та виділятися за межі клітини у вільній від антигену формі.
Крім того, очікується, що антиген-зв'язувальні молекули, отримані за способами одержання цього винаходу, будуть здатними швидко елімінувати антигени з плазми, коли їх вводять тваринам, таким як люди, миші або мавпи. Отже, способи одержання цього винаходу можна використовувати як способи одержання антиген-зв'язувальних молекул з підвищеною (високою) здатністю елімінувати антигени у плазмі.
Крім того, такі антиген-зв'язувальні молекули можуть знижувати кількість доз у пацієнтів, та очікують, що вони будуть особливо переважними у якості фармацевтичних препаратів. Отже, способи одержання цього винаходу можна використовувати як способи одержання антиген- зв'язувальних молекул для застосування як фармацевтичних композицій.
Відповідні вектори зазвичай несуть гени (вони вставлені у вектори), отримані за допомогою способів одержання цього винаходу, а потім вони вводяться у клітини-хазяїни. Вектори особливо не обмежуються, доки вони стабільно утримують вставлені нуклеїнові кислоти.
Наприклад, коли у якості хазяїна використовується ЕзсПегіспіа соїї (Е. сої), тоді переважні вектори клонування включають вектор рВінйезсгірі (5ігаї(адепе); проте, можна використовувати різні комерційно доступні вектори. Коли використовуються вектори для одержання антиген- зв'язувальних молекул цього винаходу, тоді вектори експресії є особливо корисними. Вектори експресії особливо не обмежуються, доки ці вектори експресують антиген-зв'язувальні
Зо молекули іп міїго, в Е. соїї, у культуральних клітинах або у організмі. Наприклад, вектор РВЕЗТ (Рготеда) є переважним для експресії іп міїго; вектор рЕТ (Іпмігодеп) є переважним для Е. соїї; вектор РМЕ185-ГІ З (СепВапкК Ассезбзіоп Мо. АВО09864) є переважним для культивованих клітин; а вектор РМЕ185 (Мої Сеї! ВіоІ. 8:466-472 (1988)) є переважним для організмів. ДНК цього винаходу можна вставити у вектори за традиційними способами, наприклад, шляхом зшивання із використанням сайтів рестрикції ферментів (Ситепі ргоїосої!5 іп МоїІесшаг ВіоІоду, едії. Аизибеї еї аї., (1987) РибіїзА. допп УмМієу є Бопв, Зесійоп 11.4-11.11).
Вищевказані клітини-хазяїни особливо не обмежуються, залежно від мети можна використовувати різні клітини-хазяїни. Приклади клітин для експресії антиген-зв'язувальних молекул включають бактеріальні клітини (такі як біїгеріососси5, ейарпуіососси5, БЕ. соїїЇ, зігеріотусев та Васійи5 зибБій5), еукаріотні клітини (такі як дріжджі та АзрегадіПи5), клітини комах (такі як Огозорпіа 52 та бродорієга 5Е9), клітини тварин (такі як СНО, СО5, Неї а, С127, 33,
ВНК, НЕК293 та клітини меланоми Воу/е5) та рослинні клітини. Вектори можна вводити у клітину-хазяїна за відомими способами, наприклад, способами преципітації з фосфатом кальцію, способами електропорації (Сиггепі ргоїосоЇ5 іп МоїІесшаг Віоюду ей. А!йзибеї єї аї. (1987) Рибіїзн. Удойп о МУйеу 4 5Боп5, Зесіоп 9.1-9.93, способами ліпофекції та способами мікроїін'єкцій.
Клітини-хазяїни можна культивувати за відомими способами. Наприклад, коли у якості хазяїна використовуються клітини тварин, тоді у якості культурального середовища можна використовувати ОМЕМ, МЕМ, ВБРМІ 1640 або ІМОМ. їх можна використовувати з сироватковими добавками, такими як фетальна бичача сироватка (ЕВС) або фетальна теляча сироватка (ЕС5). Клітини можна культивувати у культурах без сироватки. Переважне рн становить приблизно 6-8 протягом періоду культивування. Інкубацію здійснюють зазвичай при температурі від 30 С до 40 "С протягом приблизно 15-200 годин. Середовище міняють, піддають аерації або збовтують, якщо необхідно.
Відповідні сигнали секреції можна ввести до поліпептидів, що представляють інтерес, так щоб антиген-зв'язувальні молекули, що експресуються у клітині-хазяїні, виділялися у просвіт ендоплазматичного ретикулуму, у періплазматичний простір або у середовище ззовні клітини.
Ці сигнали можуть бути ендогенними до антиген-зв'язувальних молекул, що представляють інтерес, або можуть бути гетерологічними сигналами.
З іншого боку, наприклад, системи одержання, які використовують тварини або рослини, можна використовувати як системи для одержання поліпептидів іп мімо. Полінуклеотид, що представляє інтерес, вводиться тварині або рослині, та цей поліпептид виробляється у тілі тварини або рослини, а потім збирається. "Хазяїни" цього винаходу включають таких тварин та такі рослини.
Система одержання, що використовує тварин, включає системи одержання, що використовують ссавців або комах. Можна використовувати ссавців, таких як козли, свині, вівці, миші та велика рогата худоба (міскі СІазгег ХРЕСТКШМ ВіогесппоЇоду Арріїсайіоп5 (1993)). Ссавці можуть бути трансгенними тваринами.
Наприклад, полінуклеотид, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу цього винаходу, отримують як ген, злитий з геном, що кодує поліпептид, який специфічно виробляється у молоці, такий як козячий р-казеїн. Після цього у ембріони козла шляхом ін'єкції вводять полінуклеотидні фрагменти, що містять злитий ген, а потім їх трансплантують козам. Бажані антиген-зв'язувальні молекули можна отримати з молока, що виробляється трансгенними козами, народженими від кіз, які отримали ці ембріони, або від їхнього потомства. Гормони можна вводити відповідним чином, щоб збільшити об'єм молока, яке містить антиген- зв'язувальну молекулу, що виробляється трансгенними козами (Ебегі еї аї., Віо/Тесппоіоду (1994) 12: 699-702).
Комах, таких як тутовий шовкопряд, можна використовувати для одержання антиген- зв'язувальних молекул цього винаходу. Коли використовують тутових шовкопрядів, тоді можна використовувати бакуловіруси, які є носіями полінуклеотиду, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, що представляє інтерес, для інфікування тутових шовкопрядів, а антиген- зв'язувальну молекулу, що представляє інтерес, можна отримати з рідин їхніх організмів.
Крім того, коли рослини використовуються для одержання антиген-зв'язувальних молекул цього винаходу, тоді, наприклад, можна використовувати тютюн. Коли використовується тютюн, тоді полінуклеотид, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, що представляє інтерес, вставляється у рослинний вектор експресії, наприклад, РМОМ 530, а потім цей вектор вводять у бактерії, такі як Аагорасієтішт Шштеїасіеп5. Цим бактеріям потім дозволяють інфікувати тютюн, такий як Місоїйапа їіабасит, а бажані антиген-зв'язувальні молекули можна збирати з їхнього
Зо листя (Ма еї аї., Еиг. У. Іттипої. (1994) 24:131-138). Альтернативно, можна інфікувати ряску (Гетпа тіпої) такими ж самими бактеріями. Після клонування бажані антиген-зв'язувальні молекули можна отримати з клітин ряски (Сох КМ 6ї аї., Маї. Віотесппої. 2006 Оес; 24(12):1591- 1597).
Отримані таким чином антиген-зв'язувальні молекули можна виділити зсередини або ззовні (такого як середовище та молоко) клітин-хазяїнів та очистити, щоб отримати по суті чисті та гомогенні антиген-зв'язувальні молекули. Способи виділення та очищення антиген- зв'язувальних молекул особливо не обмежуються, та можна використовувати способи виділення та очищення, які зазвичай використовуються для очищення поліпептидів. Антиген- зв'язувальні молекули можна виділяти та очищувати, відповідним чином вибравши та скомбінувавши, наприклад, хроматографічні колонки, фільтрування, ультрафільтрування, знесолювання, преципітацію з розчинника, екстрагування розчинником, дистиляцію, імунопреципітацію, електрофорез на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505), ізоелектрофокусування, діаліз та рекристалізацію.
Хроматографія включає, наприклад, афінну хроматографію, іонообмінну хроматографію, гідрофобну хроматографію, гель-фільтрацію, хроматографію з оберненою фазою та адсорбційну хроматографію (5ігагедіе5 Тог Ргоївїп Ригійсайоп апа Спагасіегігайоп: А І арогаїогу
Соцйгзе Мапиаї. Ей Оапієї АВ. Маїзнак еї аї!., (1996) Соїй Зргіпд Нагрог І арогаогу Ргез5). Такі способи хроматографії можна здійснювати, використовуючи хроматографію з рідкою фазою, таку як НРІ С (рідинну хроматографію високого розв'язання) та ЕР'С (рідинну хроматографію швидкого розв'язання). Колонки, що використовуються для афінної хроматографії, включають колонки білка А та колонки білка 5. Колонки, що використовують колонки білка А, включають, наприклад, Нурег ОО, РОКОЗ5 та 5Зерпагозе РЕ. Р. (Рпаптасіа).
Якщо необхідно, необов'язково можна модифікувати антиген-зв'язувальну молекулу, та пептиди можна частково стерти, дозволивши відповідному ферменту модифікації білків діяти до або після очищення антиген-зв'язувальної молекули. Такі ферменти модифікації білків включають, наприклад, трипсин, хімотрипсин, лізил ендопептидази, протеїнкінази та глюкозидази.
Антитіла проти рецептора 1-6
Крім того, цим винаходом пропонуються антитіла проти рецептора ІІ -6 згідно з пунктами від бо (а) до (т), переліченими нижче:
(а) антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає амінокислотну послідовність, у якій принаймні один з Туг на позиції 27, Азр на позиції 31, А5р на позиції 32, Тгр на позиції 35, Туг на позиції 51, Азп на позиції 59, 5ег на позиції 63, Меї на позиції 106 та Туг на позиції 108 в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 (варіабельна ділянка Н5З) заміщений
Ні; (Б) антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (НЗрі), яка має амінокислотну послідовність, у якій Туг на позиції 27, А5р на позиції 31 та Тгр на позиції 35 в амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 1 (варіабельна ділянка Н5З) заміщені Нів; (с) антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, у якій Туг на позиції 27, Азр на позиції 31, Авр на позиції 32, Тгр на позиції 35, Азп на позиції 59, Зег на позиції 63 та Туг на позиції 108 в амінокислотній послідовності «ЕО ІЮ МО: 1 (варіабельна ділянка Н5З) заміщені Нів; (4) антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (Н170), яка має амінокислотну послідовність, у якій Туг на позиції 27, А5р на позиції 31, А5р на позиції 32, Тгр на позиції 35, Авп на позиції 59, 5ег на позиції 63 та Туг на позиції 108 заміщені Ні та у якій Зег на позиції 99 заміщений Маї, а ТНг на позиції 103 заміщений Іе в амінокислотній послідовності зЕО
ІО МО: 1 (варіабельна ділянка Н5З); (є) антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, у якій А5р на позиції 31, Туг на позиції 51, 5ег на позиції 63, Меї на позиції 106 та
Туг на позиції 108 в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 (варіабельна ділянка Н5З) заміщені Нів; () антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (СІН5), яка має амінокислотну послідовність, у якій А5р на позиції 31, Туг на позиції 51, 5ег на позиції 63, Меї на позиції 106 та Туг на позиції 108 заміщені Ні та у якій 5ег на позиції 99 заміщений Ре, а Тиг на позиції 103 заміщений Пе в амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮ МО: 1 (варіабельна ділянка
НЗ5З); (4) антитіло, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, у якій принаймні один з Ар на позиції 28, Туг на позиції 32, Сім на позиції 53, 5ег на позиції 56 та Азп на позиції 92 в амінокислотній послідовності зЕО ІО МО: 2 (варіабельна ділянка РЕ) заміщений Ні; (п) антитіло, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (І73), яка має амінокислотну послідовність, у якій Аз5р на позиції 28, Туг на позиції 32 та Сім на позиції 53 в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 (варіабельна ділянка РЕТІ) заміщені Нів; () антитіло, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (І 82), яка має амінокислотну послідовність, у якій Туг на позиції 32 та Сім на позиції 53 в амінокислотній послідовності зЕО ІЮ
МО: 1 (варіабельна ділянка Н5З) заміщені Нів; (Ї) антитіло, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (СІ І 5), яка має амінокислотну послідовність, у якій Туг на позиції 32, Сім на позиції 53, 5ег на позиції 56, та Азп на позиції 92 в амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 2 (варіабельна ділянка РЕТІ) заміщені Нів; (К) антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (Б) та варіабельну ділянку легкого ланцюга (В); () антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (4) та варіабельну ділянку легкого ланцюга (і); (т) антитіло, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (ї) та варіабельну ділянку легкого ланцюга (Пп).
Специфічні приклади варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, у якій принаймні один з Туг на позиції 27, Азр на позиції 31, А5р на позиції 32, Тгр на позиції 35, Туг на позиції 51, Азп на позиції 59, 5ег на позиції 63, Меї на позиції 106 та Туг на позиції 108 в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 (варіабельна ділянка Н5З) заміщений
Ні5, включають, наприклад, наступні варіабельні ділянки важкого ланцюга: варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: З (НЗрі); варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 4 (НІ1790): варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО: 5 (СІ Н5).
Специфічні приклади варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, у якій принаймні один Азр на позиції 28, Туг на позиції 32, Сім на позиції 53, Зег на позиції 56 та Азп на позиції 92 в амінокислотній послідовності зЕО ІО МО: 2 (варіабельна ділянка РЕТ1ІЇ) заміщений Ніх, включають, наприклад, наступні варіабельні ділянки легкого ланцюга: варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6 (І 73); варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7 (І 82); варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8 (СП 5).
Амінокислотні позиції та заміщення у кожному з вищеописаних антитіл НЗрі, НІ1Т70, СІ Н5,
ІЇ73, 182 та СІ! 5 наведено нижче у Таблиці 1. Амінокислотні позиції представлено на основі нумерації за Кабаї.
Таблиця 1
Положення| 27 | 31 | 32 | 33135501 58/61 | 6216364 | 65 | 95 | 99 МоовВ| 102 нрві Інн |(ніні Її 1 її 71 1 1 1 1 11
НІ7о нінІнініІні Ін! Ін! | Ї (У 1ї ні
СіН5 І Ін ні ні! Її ні | її ен "Положення 24 | 27 |28| 321 53 | 55 | 56 | 90 | 92 | 94 753 | Її |нінінІінЇ 1 її 1 ще | Її | |нінІн! її 1 си5 І ЇЇ її ІніІінінІн!І |н/ х У антитіла природного типу (М/7) Н-ланцюг має гістидин на позиції 33, тоді як Ї -ланцюг має гістидин на позиції 55.
Цим винаходом пропонуються антитіла, які включають принаймні будь-яке одне амінокислотне заміщення, описане вище в від (а) до (Її), та способи одержання цих антитіл.
Отже, антитіла цього винаходу також включають антитіла, що включають не лише будь-які амінокислотні заміщення, описані вище у від (а) до ()), але також амінокислотні заміщення, відмінні від тих, які описано вище у від (а) до (|). Амінокислотні заміщення, відмінні від тих, які описано вище у від (а) до (|), включають, наприклад, заміщення, делецію, додавання та/або вставку в амінокислотних послідовностях гіперваріабельних ділянок (СОК) та каркасних ділянок (ЕВ).
Крім того, цим винаходом пропонуються антитіла проти рецептора 1-6 від (1) до (28), які перелічені нижче: (1) антитіло, що має варіабельну ділянку важкого ланцюга (варіабельна ділянка МНІ1-Іда1), яка має амінокислотну послідовність від позиції 1 до 119 в ЗЕО ІЮ МО: 21 (МНІ1-ІДС1); (2) антитіло, що має варіабельну ділянку важкого ланцюга (варіабельна ділянка МН2-Іда1), яка має амінокислотну послідовність від позиції 1 до 119 в ЗЕО ІЮ МО: 22 (МН2-Іда1); (3) антитіло, що має варіабельну ділянку важкого ланцюга (варіабельна ділянка МНЗ-ІдС1), яка має амінокислотну послідовність від позиції 1 до 119 у ЗЕО ІЮ МО: 23 (МНЗ-ІДС1); (4) антитіло, що має варіабельну ділянку важкого ланцюга (варіабельна ділянка МН4-ІдСа1), яка має амінокислотну послідовність від позиції 1 до 119 у ЗЕО ІЮ МО: 24 (МНА-ІДС1); (5) антитіло, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (варіабельна ділянка Мі 1-
СК), яка має амінокислотну послідовність від позиції 1 до 107 у БЕО ІЮО МО: 25 (МІ 1-СК); (6) антитіло, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (варіабельна ділянка Мі 2-
СК), яка має амінокислотну послідовність від позиції 1 до 107 у БЕО ІЮ МО: 26 (МІ 2-СК); (7) антитіло, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга (варіабельна ділянка МІ 3-
СК), яка має амінокислотну послідовність від позиції 1 до 107 у БЕО ІЮ МО: 27 (МІ 3-СК); (8) антитіло (Ем1-ІдО1), яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за (2) та варіабельну ділянку легкого ланцюга за (6); (9) антитіло (Ем2-ІДО1), яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за (1) та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 7 (І 82); (10) антитіло (Рм3-ІДСІ), яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за (4) та варіабельну ділянку легкого ланцюга за (5); (11) антитіло (Ем4-ІдС1), яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за (3) та варіабельну ділянку легкого ланцюга за (7);
(12) антитіло (МНЗ-ІДО2АСК), яке включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 33; (13) антитіло (МНЗ-М58), яке включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО: За; (14) антитіло (МНЗ-М73), яке включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 35; (15) антитіло (Ем4-ІДс2АСК), яке включає важкий ланцюг за (12) та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 27 (МІ 3-СК); (16) антитіло (Ем4-М58), яке включає важкий ланцюг за (13) та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 27 (МІ 3-СК); (17) антитіло (Ем4-М7З3), яке включає важкий ланцюг за (14) та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 27 (МІ 3-СК); (18) антитіло (МН2-М71), яке включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО: 36 (МН2-М71); (19) антитіло (МН2-М73), яке включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО: 37 (МН2-М73); (20) антитіло (МН4-М71), яке включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО: 38 (МНА-М71); (21) антитіло (МН4-М73), яке включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО: 39 (МНА-М73); (22) антитіло (Ем1-М71), яке включає важкий ланцюг за (18) та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 26 (МІ 2-СК); (23) антитіло (Емі-М7З3), яке включає важкий ланцюг за (19) та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 26 (МІ 2-СК); (24) антитіло (Гм3-М71), яке включає важкий ланцюг за (20) та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 25 (МІ 1-СК); (25) антитіло (Ем3-М7З3), яке включає важкий ланцюг за (21) та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 25 (МІ 1-СК); (26) антитіло, яке включає легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 25(МІ1-СК); (27) антитіло, яке включає легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 26 (МІ 2-СК) та (28) антитіло, яке включає легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 27 (МІ 3-СК).
Крім того, цим винаходом пропонуються ЕК (каркасні ділянки) та СОК (гіперваріабельні ділянки) від (а) до (м), які перелічені нижче: (а) СОКІ1 важкого ланцюга 5ЕО 10 МО: 40 (УНІ, 2, 3, 4); (Б) СОК2 важкого ланцюга 5ЕО 10 МО: 41 (УНІ, 2); (с) СОК2 важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 42 (МНЗ); (4) СОК2 важкого ланцюга 5ЕО 1О МО: 43 (МН); (є) СОКЗ важкого ланцюга 5ЕО 10 МО: 44 (УНІ, 2); () СОКЗ важкого ланцюга 5ЕО 10 МО: 45 (МНЗ, 4); (9) РК! важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 46 (УНІ, 2); (п) РКТ важкого ланцюга 5ЕО І МО: 47 (МНЗ, 4); () РК2 важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 48 (МНІ, 2, 3, 4); () ЕКЗ важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 49 (МНІ); (К) РКЗ важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 50 (МН); () РКЗ важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 51 (МНЗ, 4); (т) РК4 важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 52 (УНІ, 2, 3, 4); (п) СОКІ легкого ланцюга 5БЕО ІЮО МО: 53 (МІ1, 2); (о) СОКІ легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 54 (МІ 3); (р) СОК2 легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 55 (МІ1, МІ 3); (4) СОК2 легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 56 (МІ 2); () СОКЗ легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 57 (МІ1, 2, 3); (5) ЕК! легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 58 (МІ1, 2, 3); (9 ЕК2 легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 59 (МІ1, 2, 3); (0) РКЗ легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 60 (МІ1, 2, 3) та (м) ЕК4 легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 61 (МІ1, 2, З).
Відповідні послідовності, які вказано вище від (а) до (м), представлено на Фіг. 25. Крім того, цим винаходом пропонуються поліпептиди, що включають будь-яку одну з перелічених вище від (а) до (м) ЕК та СОК.
Антитіла проти рецептора 1-6 цього винаходу також включають фрагменти та модифіковані продукти антитіл, які включають будь-яке амінокислотне заміщення, описане вище. Такі фрагменти антитіл включають, наприклад, Бар, Е(ав)2, Ем, сигнальний ланцюг Ем (5сЕм), у якому Ем Н- та І -ланцюгів з'єднані разом за допомогою відповідного лінкера, однодоменний Н- ланцюг та однодоменний І -ланцюг (наприклад, Маї. Віотесппої. 2005 Зер; 23(9):1126-36), унітіла (Опіроау) (УМО 2007/059782 АТ) та ЗМІР (МО 2007/014278 Аг). Походження антитіл особливо не обмежується. Антитіла включають антитіла людини, миші, щурів та кролів. Антитіла цього винаходу можуть також бути химерними, гуманізованими, повністю гуманізованими антитілами, та їм подібними.
Специфічно, такі фрагменти антитіл отримують шляхом обробки антитіл ферментами, наприклад, папаїном або пепсином, або шляхом побудови генів, які кодують такі фрагменти антитіл, вставляючи їх у вектори експресії, а потім експресуючи їх у відповідні клітини-хазяїни (дивись, наприклад, Со, М.5. еї аї., у. Іттипої!. (1994) 152, 2968-2976; Вейцетг, М. 4 Ногміїг, А. Н.
Меїтоадвз іп Епгутоїоду (1989) 178, 476-496; Рінескіпип, А. 5 5Кеїта, А. Меїпоавз іп Епгутооду (1989) 178, 497-515; І атоуї, Е., Меїйосз іп Епгуто!оду (1989) 121, 652-663; Ноиззеаих, «. еї аї.,
Меїнод3з іп Епгутоіоаду (1989) 121, 663-666; Віка, В. Е. єї аІ., ТІВТЕСН (1991) 9, 132-137).
Цим винаходом пропонуються способи одержання (ї) поліпептиду цього винаходу або (ії) поліпептиду, кодованого геном, який кодує поліпептид цього винаходу, де ці способи включають етап культивування клітини-хазяїна, яка містить вектор, у який введений полінуклеотид, що кодує поліпептид цього винаходу.
Більш специфічно, цим винаходом пропонуються способи одержання поліпептиду цього винаходу, які включають етапи: (а) культивування клітини-хазяїна, яка містить вектор, у який введений ген, що кодує поліпептид цього винаходу; та (р) отримання поліпептиду, кодованого цим геном. 5сЕм отримують шляхом з'єднання М-ділянок Н- та І-ланцюгів антитіла. У такому 5сЕмМ
Зо варіабельна ділянка важкого ланцюга з'єднана з варіабельною ділянкою легкого ланцюга за допомогою лінкера, переважно пептидного лінкера (Нивіоп, у. 5. єї аїЇ., Ргос. Маї). Асай. 5сі.
И.5.А. (1988) 10.0, 5879-5883). Варіабельні ділянки важкого ланцюга та легкого ланцюга у зсЕм можуть походити від будь-яких антитіл, описаних вище. Пептидний лінкер для з'єднання варіабельних ділянок включає, наприклад, довільні одноланцюгові пептиди від 12 до 19 амінокислотних залишків.
Коли антитіло проти рецептора І/-6 цього винаходу включає константну ділянку, тоді константна ділянка може мати будь-який тип, наприклад, можна використовувати ІдС1, ІдС2 або 1дс4. Константна ділянка - це переважно константна ділянка антитіла людини.
Альтернативно, константна ділянка може мати модифіковану форму, яка включає заміщення, делецію, додавання та/або вставку в амінокислотну послідовність константних ділянок Ідс1 людини, Ідс2 людини або Ідс4 людини.
Переважний рецептор 1//-6, з яким зв'язується антитіло проти рецептора 1-6 цього винаходу, - це рецептор 1-6 людини.
Антитіла проти рецептора 1-6 цього винаходу мають перевагу стосовно утримання у плазмі, та вони існують протягом подовженого періоду у плазмі у формі, здатній зв'язуватися з антигеном, тобто, з розчинними або пов'язаними з мембраною рецепторами 1-6. Отже, антитіла проти рецептора 1-6 зв'язуються іп мімо з розчинними або пов'язаними з мембраною рецепторами 1-6 протягом подовженого періоду. Крім того, антитіла проти рецептора 1-6 є здатними зв'язуватися з рецепторами 1/-б двічі або більше разів, та, внаслідок цього, припускають, що вони є здатними нейтралізувати три або більше рецепторів ІІ -6.
Фармацевтичні композиції
Цей винахід також стосується фармацевтичних композицій, які включають антиген- зв'язувальні молекули цього винаходу, при цьому антиген-зв'язувальні молекули виділені за допомогою способів скринінгу цього винаходу або антиген-зв'язувальні молекули одержані за допомогою способів одержання цього винаходу. Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу та антиген-зв'язувальні молекули, що одержані за допомогою способів одержання цього винаходу мають переваги стосовно утримання у плазмі, та, внаслідок цього, очікують, що вони будуть знижувати частоту введення антиген-зв'язувальних молекул та, як наслідок, будуть корисними як фармацевтичні композиції. Фармацевтична композиція цього винаходу може бо включати фармацевтично прийнятні носії.
У цьому винаході фармацевтичні композиції зазвичай означають агенти для лікування або профілактики або тестування та діагностування хвороб.
Фармацевтичні композиції цього винаходу можна виготовляти за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Наприклад, їх можна використовувати парентерально, у формі ін'єкцій, стерильних розчинів або суспензій, які включають воду або іншу фармацевтично прийнятну рідину. Наприклад, такі композиції можна виготовляти шляхом змішування у стандартній лікарській формі, яка взагалі дозволяється згідно із загально ухваленою практикою виробництва ліків, шляхом відповідного комбінування з фармацевтично прийнятними носіями або середовищами, особливо зі стерильною водою, фізіологічним сольовим розчином, рослинною олією, емульгатором, суспензією, сурфактантом (ПАР), стабілізатором, ароматизатором, екципієнтом, наповнювачем, консервантом, зв'язувальним агентом тощо. У таких складах кількість активного інгредієнта регулюється з метою отримання відповідної кількості у попередньо визначеному діапазоні.
Стерильні композиції для ін'єкції можна виготовити, використовуючи наповнювачі, такі як дистильована вода для ін'єкцій, згідно зі стандартною практикою виготовлення фармацевтичних складів.
Водні розчини для ін'єкції включають, наприклад, фізіологічний сольовий розчин та ізотонічні розчини, що містять декстрозу або інші ад'юванти (наприклад, Ю-сорбіт, О-манозу, Ю-маніт та натрію хлорид). Можна також використовувати у комбінації відповідні солюбілізатори, наприклад, спирти (етанол та їм подібне), поліспирти (пропіленгліколь, поліетиленгліколь та їм подібне), неіонні сурфактанти (полісорбат 80 (ТМ), НСО-50 та їм подібне).
Олії включають кунжутну олію та соєву олію. Бензилбензоат та/або бензиловий спирт можна використовувати у комбінації як солюбілізатори. Можна також комбінувати буфери (наприклад, фосфатний буфер та натрій ацетатний буфер), заспокійливі агенти (наприклад, прокаїну гідрохлорид), стабілізатори (наприклад, бензиловий спирт та фенол) та/або антиоксиданти.
Відповідні ампули наповнюються приготованими препаратами для ін'єкцій.
Фармацевтичні композиції цього винаходу переважно вводяться парентерально. Наприклад, композиції можуть бути у дозованій формі для ін'єкцій, введення крізь ніс, введення крізь легені або введення крізь шкіру. Наприклад, їх можна вводити системно або місцево шляхом
Зо внутрівенної ін'єкції, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрічеревної ін'єкції, підшкірної ін'єкції тощо.
Способи введення можна відповідним чином вибрати з урахуванням віку та симптомів пацієнта. Доза фармацевтичної композиції, що містить антиген-зв'язувальну молекулу, може становити, наприклад, від 0,0001 до 1000 мг/кг для кожного введення. Альтернативно, доза може становити, наприклад, від 0,001 до 100000 мг на пацієнта. Проте, цей винахід не обмежується числовими значеннями, описаними вище. Дози та способи введення різняться залежно від ваги, віку, симптомів пацієнта тощо. Фахівці у цій галузі можуть встановити відповідні дози та способи введення, враховуючи описані вище фактори.
Амінокислоти, що містяться в амінокислотних послідовностях цього винаходу, можна модифікувати після трансляції. Наприклад, фахівцям у цій галузі добре відома модифікація залишку глютаміну (СіІп) на М-закінченні у залишок піроглютамінової кислоти (росіІш) шляхом піроглютамінування. Природно, що такі модифіковані після трансляції амінокислоти включаються в амінокислотні послідовності у цьому винаході.
Усі документи попереднього рівня техніки, які процитовано в цьому описі винаходу, включені до нього шляхом посилання.
Приклади
Далі у цьому описі винаходу цей винахід буде докладно описаний з посиланням на
Приклади, але їх не слід вважати обмежувальними.
Приклад 1. Одержання модифікованого гуманізованого антитіла РМІ1
Одержання рекомбінантного розчинного рецептора 1-6 людини (5К344)
Рекомбінантний ІЇ/-6 рецептор людини рецептора ІЇ-б людини, який служив антигеном, приготували, як описано нижче. Отримали клітинну лінію СНО, яка постійно експресує розчинний рецептор 1-6 людини (далі позначається як 5К344) (Уатазвгакі, еї а!І., Зсіепсе 1988; 241: 825-828 (СепВапк йХ12830)), який складається з амінокислотної послідовності від 1-ї амінокислоти до 344-ї амінокислоти на М-закінченні, як повідомлялося у У. Віоспет., 108, 673- 676 (1990).
ЗК344 очистили від культуральної надосадової рідини, отриманої з клітин СНО, що експресують 5К344, використовуючи три колонкові хроматографії: колонкову хроматографію
ВіІне Зерпагозе 6 ЕЕ, афінну хроматографію, де використовується колонка, у якій антитіло, що є специфічним до 5344, іммобілізоване, та колонкову хроматографію з гель-фільтрацією. бо Фракцію, що елюювалася як головний пік, використовували як кінцевий очищений продукт.
Приготування рекомбінантного розчинного рецептора 1-6 мавп Супотоїдиз (сії -6А)
Праймери оліго-ДНК Кпебкп (5ЕБО ІЮ МО: 16) та КпебКг2 (5ЕО ІЮО МО: 17) отримали на основі загально доступної послідовності гена рецептора І/-6 макаки резус (Вігпеу еї аї.,
Епзетбіє 2006, Мисівїс Асіа5 Нев., 2006, дап. 1; 34 (Оагаразе і55йцеє): 0556-61). Використовуючи
КДНК, отриману з підшлункової залози супотодіи5 як матрицю, фрагмент ДНК, який кодує ген рецептора І/-6 мавп супотоїЇди5 повної довжини, приготували шляхом ПЛР із використанням праймерів КпебкИ та КПпебКг2. Використовуючи отриманий фрагмент ДНК як матрицю, фрагмент ДНК у 1131 пар основ (рр) (ЗЕО ІЮ МО: 20), який кодує білок, у якому бхНі5 додано до
С-закінчення розчинної ділянки (Мей -Рго363), що містить сигнальну ділянку гена рецептора 1-6 мавп супотоїЇди5, ампліфікували шляхом ПЛР, використовуючи праймери оліго-ДНК Супої 6К
М-ЕсоКкІ (ЗЕО ІЮ МО: 18) та Супо!їбК С-Мої-Ніз (5ЕО ІЮ МО: 19). Отриманий фрагмент ДНК перетравлювали ЕсоКіІ та Мої! та вставили у вектор експресії для клітин ссавців, та це потім використовували для виробництва лінії СНО зі стабільною експресією (клітини СНО, що виробляють супо.51І -68).
Культуральне середовище клітин СНО, що виробляють супо.5ІЇ-6К, очистили колонкою
Ніз Ттар (СЕ Неайсаге Віозсіеєпсе5), концентрували, використовуючи Атісоп Ойга-15 ОПгасе!- 1о0к (МіШіроге), а потім очистили гель-фільтраційною колонкою Зирегдех 200 пг 16/60 (СЕ
Неакрсаге Віозсіепсе5), внаслідок чого отримали кінцевий очищений продукт - розчинний рецептор 1-6 мавп супотоїЇдиз (далі у цьому описі винаходу позначається як сі! -6В8).
Приготування рекомбінантного ІІ -6 мавп супотоїЇдив (сі! -6)
І/-б мавп супотоЇдиє приготували наступним способом. Отримали нуклеотидну послідовність, що кодує 212 амінокислот, зареєстрованих під номером доступу ЗУЛЗЗРКОТ Мо.
Р79341, її клонували у вектор експресії для клітин ссавців та ввели у клітини СНО, внаслідок чого отримали клітинну лінію зі стабільною експресією (клітини СНО, що виробляють супо.ІЇ -6).
Культуральне середовище клітин СНО, що виробляють супо.ІЇ-б6, очистили колонкою 5рР- зерпагозе/РЕ (СЕ Неакрсаге Віозсіепсе5), концентрували, використовуючи Атісоп ОкКга-15
ОПгасе!-5Кк (МіШіроге), а потім далі очищували гель-фільтраційною колонкою Зирегаех 75 пг 26/60 (СЕ Неайкйсаге Віозсіепсе5). Це концентрували, використовуючи Атісоп ОПйга-15 ОПпгасе!І-5К (МіШіроге), внаслідок чого отримали кінцевий очищений продукт ІЇ-6 мавп супотоїЇди5 (далі у
Зо цьому описі винаходу позначається сі!--6).
Створення клітинної лінії Вагє3, що експресує др130 людини
Клітинну лінію Ває3, що експресує др130 людини, створили так, як вказано нижче, з метою отримання клітинної лінії, що демонструє ІІ -6б-залежне зростання.
КДНК повної довжини др1і30 людини (НІібі еї аї., Се 1990; 63: 1149-1157 (СепВапк
ЯММ 002184)) ампліфікували шляхом ПЛР та клонували у вектор експресії рСО527е0, який отримали внаслідок видалення ділянки експресії гена ОНЕК з рено (Нігаца, єї аІ., РЕВ5 І ецег 1994; 356: 244-248) та вставки ділянки експресії стійкого до 2еосіп гена, внаслідок чого побудували рСОо522ео/др130. кКДНК повної довжини 1І-6К людини ампліфікували шляхом ПЛР та клонували у рсрОМАЗ.1 (ях) (Іпмігодеп), внаслідок чого побудували ПІЇ-6Е/рсОМАЗ.1(). 10 мкг роеОо527ео/др130 вмішали у клітини Вагз (0,68х107 клітин), суспендовані у сольовому розчині з фосфатним буфером (РВ5), та піддали пульсаційній обробці із використанням Сепе Риїзег (Віо-
Вад) з напругою 0,33 кВ та електричною ємністю 950 мкФ. Клітини Ваг3, що зазнали введення гена внаслідок обробки шляхом електропорації, культивували протягом одного дня та ночі у середовищі КРМІ1640 (Іпмігодеп), що містило 0,2 нг/мл інтерлейкіну-3 миші (Рергоїесії) та 10 95 фетальну бичачу сироватку (далі у цьому описі винаходу позначається як ЕВ5, НусСіопе), а потім піддали скринінгу, додавши середовище КРМІ1640, що містило 100 нг/мл інтерлейкіну-б людини (К.2О Зузіетв), 100 нг/мл розчинного рецептора інтерлейкіну-б людини (КО Зузіетв) та 10 95 ЕВ5, внаслідок чого утворилася клітинна лінія Ваєн3, що експресує др130 людини (далі у цьому описі винаходу позначається як ВагзЗ/др130). Оскільки ця клітинна лінія ВагзЗ/др130 проліферується у присутності інтерлейкіну-б людини (К8О Бувзіет5) та 5К344, її можна використовувати для оцінки активності антитіла проти рецептора ІІ -6 інгібувати зростання (а саме, активності нейтралізувати рецептор ІІ -6).
Виробництво гуманізованого антитіла проти рецептора 1-6 У контексті цього прикладу та будь-де у цьому описі винаходу термін "природний тип" скорочується як М/Т, термін "важкий ланцюг природного типу" скорочується як Н(УМТ) (амінокислотна послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9), та термін "легсий ланцюг природного типу" скорочується як Ц(М/Т) (амінокислотна послідовність
ЗБО ІЮ МО. 10). У цьому контексті, мутації були зроблені у каркасній послідовності та послідовності гіперваріабельної ділянки (СОМ) гуманізованого мишачого антитіла РМ'І, описаного у Сапсег Ке5. 1993, Реб. 15; 53(4): 851-6, внаслідок чого отримали модифіковані Н- 60 ланцюги Н5ЬЗ (амінокислотна послідовністьї ЗЕБО 10 МО: 1) та РЕТН (амінокислотна послідовність: 5ЕО ІЮ МО: 11), та модифіковані І -ланцюги 128 (амінокислотна послідовність:
ЗЕБЕО ІЮ МО: 12) та РЕТЇ. (амінокислотна послідовність: ЗЕО ІЮ МО: 2). Більш специфічно, мутантів отримали, використовуючи набір для сайт-спрямованого мутагенезу ОцікСпапде Зйе- рігесієй Мшиадепебвів Кії (Зігаїадепе) згідно зі способом, описаним в доданих інструкціях, та отримані плазмідні фрагменти вставили у вектор експресії для клітин ссавців, внаслідок чого отримали бажані вектори експресії Н-ланцюгів та вектори експресії І -ланцюгів. Нуклеотидні послідовності отриманих векторів експресії визначили, використовуючи традиційні способи, відомі фахівцям у цій галузі.
Експресія та очищення гуманізованого антитіла проти рецептора ІІ -6 Антитіла експресували за способом, описаним нижче. Клітинну лінію НЕК29ЗН, що походить від раку нирки ембріону людини (Іпмийгодеп), суспендували у ОМЕМ (Іпмийгодеп), доповненому 10 95 ЕВ5 (Іпуйтодеп).
Клітини розташували по 10 мл на чашку у чашках для прилипаючих клітин (10 см в діаметрі;
СОРМІМС) з щільністю клітин від 5 до бх105 клітин/мл та культивували в інкубаторі з СО» (37 "С, 590 СО») протягом одного усього дня та ночі. Потім середовище видалили шляхом відсмоктування та додали 6,9 мл середовища СНО-5-5ЕЕМ-ЇЇ (Іпийгодеп). Отриману плазміду ввели у клітини способом ліпофекції. Отримані культуральні надосадові рідини зібрали, центрифугували (приблизно 2000 49, 5 хвилин, кімнатна температура), щоб видалити клітини, та стерилізували шляхом фільтрування крізь фільтр 0,22:мкм МІС ЕХФ-СМ (МійПроге), внаслідок чого отримали надосадові рідини. Антитіла очистили від отриманих культуральних надосадових рідин за способом, відомим фахівцям у цій галузі, використовуючи гРгоївіп А Зерпагозе мМ Раві
Ріом/ (Атегепат Віозсіепсе5). Щоб визначити концентрацію очищеного антитіла, вимірювали поглинання при 280 нм, використовуючи спектрофотометр. Концентрацію антитіл розрахували з визначених значень, використовуючи коефіцієнт поглинання, визначений за способом РАСЕ (Ргоївіп бсієпсе 1995; 4:2411-2423).
Приклад 2. Виробництво антитіла НЗрі/І 73, що зв'язується залежним від рН чином
Спосіб утворення антитіла, здатного нейтралізувати антиген багато разів
Оскільки молекули Ідс є бівалентними, то єдина молекула ІдС може нейтралізувати до двох молекул антигенів, коли дві ділянки зв'язуються 3з антигенами; проте, вона не може нейтралізувати три або більше молекул антигенів. Отже, для підтримання нейтралізуючого
Зо ефекту нейтралізуючого антитіла протягом певного періоду часу, необхідно вводити таку кількість антитіла, яка є еквівалентною або більшою, ніж кількість антигену, що виробляється протягом цього періоду часу. Отже, є обмеження стосовно ступеню, до якого необхідну дозу антитіла можна знижувати внаслідок покращення фармакокінетики або афінності антитіла.
Отже, якщо можна було б нейтралізувати дві або більше молекули антигенів єдиною молекулою
ІС, то така ж сама доза могла б подовжити тривалість нейтралізуючого ефекту, або, альтернативно, дозу антитіла, що є необхідною для досягнення такої ж самої тривалості, можна було б знизити.
Для нейтралізуючих антитіл існує два типи антигенів-мішеней: антигени розчинного типу, які є присутніми у плазмі, та пов'язані з мембраною антигени, які експресуються на поверхні клітин.
Коли антиген - це пов'язаний з мембраною антиген, тоді введене антитіло зв'язується з мембранним антигеном на клітинній поверхні, та це антитіло потім захоплюється в ендосоми усередині клітини шляхом інтерналізації разом з мембранним антигеном, зв'язаним з антитілом.
Після цього антитіло, що зберігає зв'язок з антигеном, рухається до лізосоми, де воно руйнується лізосомою разом з антигеном. Елімінування антитіла з плазми, опосередковане інтерналізацією мембранним антигеном, називається антиген-залежним елімінуванням, та про нього повідомлялося для багатьох молекул антитіл (Огид біб5сом. Тодау, 2006 дап; 11(1-2): 81-8).
Оскільки єдина молекула антитіла дО зв'язується з двома молекулами антигенів, коли вона бівалентно зв'язується з антигенами, а потім інтерналізується та безпосередньо руйнується лізосомою, то єдине звичайне антитіло |ДС не може нейтралізувати дві або більше молекул антигенів (Фіг. 1).
Причина тривалого утримання (повільного елімінування) молекул дО у плазмі полягає у тому, що діє ЕсКп, відомий як рецептор реутилізації молекули до (Маї. Кем. Іттипої. 2007 Зер; 7(9): 715-25). Молекули Ідс, які захопилися в ендосоми внаслідок піноцитозу, зв'язуються з
ЕсКп, що експресується в ендосомах за внутрішньоендосомними кислотними умовами.
Молекули Ідс, зв'язані з ЕсКп, рухаються до клітинної поверхні, де вони відокремлюються від
ЕсКп у нейтральних умовах у плазмі та повертаються до плазми, тоді як молекули Ідс, нездатні зв'язуватися з ЕсКп, продовжують рухатися до лізосом, де вони руйнуються (Фіг. 2).
Молекули ІдсС, зв'язані з мембранним антигеном, захоплюються у внутрішньоклітинні ендосоми шляхом інтерналізації, рухаються у лізосоми, зберігаючи зв'язок з антигеном, та бо зазнають руйнування. Коли антитіло дО бівалентно зв'язується з антигенами, тоді воно нейтралізує дві молекули антигенів та піддається руйнуванню разом з антигенами. Якщо антитіло дб, коли воно захоплюється у внутрішньоклітинні ендосоми шляхом інтерналізації, може відокремлюватися від антигену при внутрішньоендосомних кислотних умовах, тоді відокремлене антитіло може бути здатним зв'язатися з ЕсКп, що експресується в ендосомах.
Молекула дО, відокремлена від антигену та зв'язана з ЕРсоКп, переноситься до клітинної поверхні, а потім відокремлюється від ЕсКп при нейтральних умовах у плазмі, тим самим повертаючись назад до плазми. Молекула їдсС, що повернулася до плазми, є здатною знов зв'язатися з новим мембранним антигеном. Повторення цього процесу дозволяє єдиній молекулі дО неодноразово зв'язуватися з мембранними антигенами, тим самим сприяючи нейтралізації численних антигенів єдиною молекулою Ідс (Фіг. 3).
У випадку розчинного антигену, введене антитіло зв'язується з антигеном у плазмі та залишається у плазмі у формі комплексу антиген-антитіло. Зазвичай, тоді як утримання антитіла у плазмі триває дуже довго (швидкість елімінування є дуже повільною) внаслідок дії
ЕсКп, як описано вище, утримання антигену у плазмі є коротким (швидкість елімінування є високою). Отже, зв'язані з антитілом антигени демонструють утримання у плазмі, яке є порівняльним з утриманням у плазмі антитіла (швидкість елімінування є дуже повільною).
Антигени виробляються в організмі з постійною швидкістю та при відсутності антитіла є присутніми у плазмі у концентрації, при якій швидкість виробництва антигенів та швидкість елімінування антигенів знаходяться у рівновазі. У присутності антитіла більшість антигенів зв'язуються з антитілами, наслідком чого є дуже повільна швидкість елімінування антигенів.
Отже, концентрація антигенів у плазмі підвищується порівняно з концентрацією при відсутності антитіла (Кідпеу Іпі. 2003, 64, 697-703; У. Майопа! Сапсег Іпвійше 2002, 94(19), 1484-1493; У.
АПегду апа Сіїпіса! Іттипоїоду 1997, 100(1), 110-121; Ек. 9). Іттипої. 1993, 23; 2026-2029).
Навіть якщо афінність антитіла до антигену є безмежною, то концентрація антигенів підвищується, коли антитіло повільно вилучається з плазми, та нейтралізуючий ефект антитіла припиняється після того, як концентрація антитіл буде дорівнювати концентрації антигенів.
Незважаючи на те, що антитіла з більш сильною константою дисоціації (КО) можуть нейтралізувати розчинні антигени при низькій концентрації антитіл, антитіла при концентрації, що становить половину або менше концентрації присутнього антигену, є нездатними
Зо нейтралізувати антигени незалежно від того, наскільки сильною є афінність антитіла (Віоспет.
Віорпуб. Неб5. боттип. 2005 бер 9; 334(4): 1004-13). Як і у випадку з молекулами Ідс, не зв'язаними з антигенами, молекули дос, зв'язані з антигенами у плазмі, також захоплюються в ендосоми внаслідок піноцитозу та зв'язуються з ЕГсКп, що експресується в ендосомах при внутрішньоендосомних кислотних умовах. Молекули Ідс, зв'язані з ЕсКп, рухаються до клітинної поверхні, при цьому антитіло зберігає зв'язок з антигеном, а потім відокремлюється від
ЕсКп за нейтральних умов у плазмі. Оскільки молекули ІдсС повертаються до плазми, зберігаючи зв'язок з антигеном, то вони не можуть зв'язуватися з новими антигенами у плазмі. У випадку, якщо молекули дос можуть відокремлюватися від антигену за внутрішньоендосомних кислотних умов, то відокремлений антиген не буде здатним зв'язатися з ЕсКп та внаслідок цього може руйнуватися лізосомами. З іншого боку, молекули дО можуть повертатися до плазми знов, зв'язуючись при цьому з ЕсКп. Оскільки молекули до, що повернулися до плазми, вже відокремилися від антигену в ендосомах, вони є здатними зв'язуватися знов з новим антигеном у плазмі. Повторення цього процесу дозволяє єдиній молекулі (дО неодноразово зв'язуватися з розчинними антигенами. Це сприяє тому, що єдина молекула до нейтралізує численні антигени (Фіг. 4).
Отже, незважаючи на те, чи є антиген мембранним антигеном або розчинним антигеном, якщо відокремлення антитіла до від антигену є можливим за внутрішньсоендосомних кислотних умов, то єдина молекула Ідс буде здатною багаторазово нейтралізувати антигени. Для того, щоб антитіла дсС відокремлювалися від антигенів за внутрішньоендосомними кислотними умовами, необхідно, щоб зв'язок антиген-антитіло був суттєво слабкішим при кислотних умовах порівняно з нейтральними умовами. Оскільки мембранні антигени на клітинній поверхні слід нейтралізувати, то антитіла мусять сильно зв'язуватися з антигенами при рН біля клітинної поверхні, а саме при рН 7,4. Оскільки повідомлялося, що внутрішньоендосомне рН зазвичай становить від 5,5 до 6,0 (Маї. Кем. Мої. Сей. Віої. 2004 Рер; 5(2): 121-32), то вважають, що антитіло, яке слабко зв'язується з антигеном при рН від 5,5 до 6,0, відокремлюється від антигену за внутрішньоендосомними кислотними умовами. Більш специфічно, єдина молекула
Іо, яка сильно зв'язується з антитілом при рн 7,4 біля клітинної поверхні та слабко зв'язується з антигеном при внутрішньоендосомному рН від 5,5 до 6,0, може бути здатною нейтралізувати численні антигени, а, тим самим, покращити фармакокінетику.
Взагалі, взаємодії білок-білок складаються з гідрофобної взаємодії, електростатичної взаємодії та водневого зв'язку, та міцність зв'язування зазвичай виражається як константа зв'язування (афінність) або позірна константа зв'язування (авідність). Залежне від рн зв'язування, міцність зв'язування якого різниться для нейтральних умов (рН 7,4) та кислотних умов (рН від 5,5 до 6,0), відбувається у природно виникаючих взаємодіях білок-білок.
Наприклад, вищезгадане зв'язування між молекулами ІдсС та ЕсКп, відомого як рецептор реутилізації для молекул дО, є сильним при кислотних умовах (рН від 5, 5 до 6,0), проте є помітно слабким при нейтральних умовах (рН 7,4). Більшість таких взаємодій білок-білок, що змінюються залежно від рнН, пов'язані із залишками гістидину. Оскільки рКа залишку гістидину дорівнює приблизно рН від 6,0 до 6,5, то стан відокремлення протонів залишків гістидину є різним для нейтральних умов (рН 7,4) та кислотних умов (рН від 5,5 до 6,0). Специфічно, залишки гістидину не заряджені та діють як акцептори атому водню при нейтральних умовах (рН 7,4), проте вони стають позитивно зарядженими та діють як донори атому водню при кислотних умовах (рН 5,5-6,0). Повідомлялося, що залежне від рН зв'язування вищеописаної взаємодії ІдДО-РоКп також пов'язується із залишками гістидину, присутніми в Їде (Мої. Сеїї. 2001
Арг; 7(4): 867-77).
Отже, взаємодіям білок-білок можна надати залежності від рН шляхом заміщення амінокислотного залишку, що залучається у взаємодії білок-білок, залишком гістидину або шляхом введення гістидину у ділянку взаємодії. Такі спроби також робилися у взаємодіях білок- білок між антитілами та антигенами, та мутантне антитіло з антиген-зв'язувальною здатністю, зниженою при кислотних умовах, успішно отримали шляхом введення гістидину у послідовність
СОК антитіла проти лізоциму яєчного білку (РЕВЗ І ецег (мої. 309, Мо. 1, 85-88,1992)). Крім того, повідомлялося про антитіло, отримане внаслідок введення гістидину у його послідовність СОК, яке специфічно зв'язується з антигеном при низькому рН ракових клітин, проте слабо зв'язується при нейтральних умовах (ММО 2003-105757).
Хоча повідомлялося про способи надання залежності від рН у реакціях антиген-атитіло, як описано вище, але не повідомлялося про молекулу дос, яка нейтралізує численні антигени внаслідок сильного зв'язування з антигенами при рН 7,4 рідини організму та слабого зв'язування з антигенами при внутрішньоендосомному рН від 5,5 до 6,0. Інакше кажучи, не було
Зо жодних повідомлень стосовно модифікацій, які суттєво ослаблюють зв'язування при кислотних умовах, проте зберігають зв'язування при нейтральних умовах, так що, порівняно з немодифікованим антитілом, модифіковане антитіло зв'язується з антигенами багато разів іп мімо та, внаслідок цього, демонструє покращену фармакокінетику, а також подовжену тривалість нейтралізуючого ефекту при одній і тій же дозі.
Рецептор І/-6 є присутнім в організмі у формі або розчинного рецептора //-6, або мембранного рецептора 1-6 (Маї. Сііп. Ргасі. Впештаїйо!. 2006 Мом; 2(11): 619-26). Антитіла проти рецептора І/-б6 зв'язуються як з розчинним рецептором 1-6, так і з мембранним рецептором 1-6, та нейтралізують їхню біологічну дію. Вважають, що після зв'язування з мембранним рецептором 1І--6 антитіла проти рецептора 1-6 захоплюються у внутрішньоклітинні ендосоми шляхом інтерналізації, зберігаючи при цьому зв'язок з мембранним рецептором І -6, потім рухаються у лізосоми, зберігаючи зв'язок з мембранним рецептором 1-6, та зазнають руйнування лізосомами разом з мембранним рецептором 1-6. Фактично повідомлялося, що гуманізоване антитіло проти рецептора 1І/-6 демонструє нелінійний кліренс, та його антиген- залежне елімінування суттєво впливає на елімінування гуманізованого антитіла проти рецептора 1-6 (Тпе уЧоштаї ої АПештаїйоіоду, 2003, 30; 71426-1435). Отже, одне гуманізоване антитіло проти рецептора 1-6 зв'язується з одним або двома мембранними рецепторами 1-6 (одновалентно або бівалентно), а потім інтерналізується та руйнується у лізосомах. Отже, якщо можна одержати модифіковані антитіла, які б демонстрували суттєво знижену зв'язувальну здатність при кислотних умовах, проте зберігали б таку ж саму зв'язувальну здатність, що і гуманізоване антитіло природного типу проти рецептора 1-6 при нейтральних умовах (залежне від рН зв'язування антитіла проти рецептора ІІ -6), тоді численні рецептори 1-6 можна було б нейтралізувати єдиним гуманізованим антитілом проти рецептора 1І/-6. Отже, на відміну від гуманізованих антитіл природного типу проти рецептора ІІ 6, антитіла проти рецептора 1-6, що зв'язуються залежним від рН чином, можуть подовжити тривалість нейтралізуючого ефекту іп мімо при однаковій дозі.
Виробництво гуманізованого антитіла НЗрі/73 проти рецептора 1І/-6б, що зв'язується залежним від рН чином
Про введення гістидину у СОК повідомлялося як про спосіб надання залежного від рн зв'язування реакції антиген-антитіло (РГЕВЗ І еЦег (мо!. 309, Мо. 1, 85-88, 1992)). Для того, щоб бо знайти амінокислотні залишки на поверхні варіабельної ділянки Н5З/РЕТІ, отриманої у
Прикладі 1, та можливі залишки, що взаємодіють з антигеном, утворили модель ділянки Ем
Н5З/РАТІ. шляхом гомологічного моделювання, використовуючи програмне забезпечення МОЕ (Спетіса! Сотршйпуд Сгоир Іпс.). Тривимірну модель, побудовану на основі інформації про послідовність Н5ЗЗ/РЕТЇ,, використовували для вибору Н27, НЗ1, НЗ5, 1 28, І 32 та І 53 (нумерація за Кабаї, Кабаї, Е.А. еї аї., 1991, Зедиепсез ої Ргоївїіп5 ої Іттипоїодісаї! Іптегеві, МІН) як сайти мутації, які можуть надавати залежне від рН зв'язування з антигеном шляхом введення гістидину. Продукт, у якому залишки на Н2г7, НЗ1І та НЗ5 у Н5З, отриманому у Прикладі 1, замістили гістидинами, позначили як НЗрі (амінокислотна послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3, а продукт, у якому залишки на 128, 132 та 153 у РЕ1Ї, отриманому у Прикладі 1, замістили гістидинами, позначили як І.73 (амінокислотна послідовність: 5ЕО ІЮ МО: 6).
Виробництво, експресія та очищення вектора експресії НЗрі/ 73
Амінокислотну модифікацію здійснювали з метою отримання антитіл, модифікованих на вибраних сайтах. Мутації здійснили в Н5З (нуклеотидна послідовність: ЗЕО ІЮО МО: 13) та РЕТІ. (нуклеотидна послідовність: 5ЕО ІО МО: 14), які отримали у Прикладі 1, внаслідок чого отримали НЗрі (амінокислотна послідовність: 5ЕБЕО ОО МО: 3) та 173 (амінокислотна послідовність: ЗЕО ІЮ МО: 6). Більш специфічно, набір для сайт-спрямованого мутагенезу
ОєгйікСнапде 5пе-Оігесіей Мшадепевзіз КИ (Зігаїадепе) використовували згідно зі способом, описаним в інструкціях, що додаються, та отримані фрагменти плазмід вставили у вектор експресії для клітин ссавців, внаслідок чого отримали бажаний вектор експресії важкого ланцюга та вектор експресії легкого ланцюга. Нуклеотидні послідовності отриманих векторів експресії визначили за способом, відомим фахівцям у цій галузі. НЗріЛ.73, що використовує
НЗрі для важкого ланцюга та І 73 для легкого ланцюга, експресували та очистили за способом, описаним у Прикладі 1.
Приклад 3. Надання залежної від рН антиген-зв'язу вальної здатності шляхом Нів- модифікації СОК, використовуючи спосіб фагового виявлення
Виробництво молекули 5сЕм гуманізованого антитіла РМІ1
Гуманізоване антитіло РМ'І, яке є гуманізованим антитілом проти ІІ -6А (Сапсег Вез. 1993
Реб 15; 53(4): 851-6), перетворили у 5сЕм. Ділянки МН та МІ ампліфікували шляхом ПЛР та отримали гуманізоване РМІ НІ. 5сЕм, що має лінкерну послідовність СООСОО5ООоо5055055
Коо) (ЗЕО ІО МО. 15) між МН та МІ.
Вибір позицій, у які можна вводити гістидин, шляхом гістидинового сканування
ПЛР виконували, використовуючи ДНК гуманізованого РМІ Ні 5сЕм як матрицю для отримання гістидинової бібліотеки, у якій будь-яка одна з амінокислот СОК заміщена гістидином. Частини бібліотеки побудували шляхом ПЛР, використовуючи праймери, у яких кодон амінокислоти, яку бажано мутувати для бібліотеки, замістили САТ, при цьому кодон відповідає гістидину, а інші частини побудували шляхом звичайної ПЛР. Ці частини потім з'єднали шляхом ПЛР-складання. Побудовану бібліотеку перетравлювали 5Ійї, вставили у фагемідний вектор рЕЇ ВО ай, який також перетравили 5ІїЇ а потім використовували для перетворення Хі І-Віне (5ігаїадепе). Отримані колонії використовували для визначення зв'язування з антигеном шляхом фагового ЕЛАЙЗА та аналізу послідовності НІ. зсЕм. Фаговий
ЕЛАЙЗА виконували, використовуючи планшет, покритий 52344 при 1 мкг/мл згідно з У. Мої.
Віої. 1992; 227: 381-388. Клони, які, як визначили, зв'язуються з 5К344, піддали секвенуванню із використанням специфічних праймерів.
Титр фагів визначили шляхом ЕЛАЙЗА з антитілом проти Ехад (СЕ Неайсаге) та антитілом проти МІ З (ЗЕ Неанйсаге). Це значення потім використовували для вибору позицій, де заміщення залишку СОК гістидином суттєво не змінювало зв'язувальну здатність порівняно з гуманізованим РМІ НІ 5сЕм, на основі результатів фагового ЕЛАЙЗА для 582344. Вибрані позиції наведено у Таблиці 2. Нумерація кожного залишку відповідала нумерації за Кабаї (Кабаї, сеї аї., 1991, Зедиепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, МІН).
Таблиця 2. Позиції заміщення гістидином, які суттєво не впливають на зв'язувальну здатність
НЗ1, Н5О, Н54, Н5б, Н5б7, Н5В8, Н59, НбО, НЄ, Нб2, НбЗ, Нб4, Нб5, НіОба, НІООЬ, НІ102 124, 126,127,128,130,131,132,152,153,154,156,190, 192, 193, 1 94.
Побудова модифікованої гістидином бібліотеки СОК
Побудували бібліотеку, у якій амінокислоти залишків СО, які суттєво не змінювали зв'язувальну здатність, коли їх заміщували гістидином, та які наведено у Таблиці 2 (позиції, у які можна вводити гістидин), - це їхня оригінальна послідовність (послідовність природного типу) або гістидин. Бібліотеку побудували на основі послідовностей РЕ1Н важкого ланцюга та РЕ. легкого ланцюга, отриманих у Прикладі 1, так що мутовані позиції для бібліотеки мають 60 оригінальні послідовності або гістидини (або оригінальну послідовність, або гістидини).
Частини бібліотеки побудували шляхом ПЛР, використовуючи праймери, побудовані так, що позиція, яку бажано мутувати для бібліотеки, має оригінальний амінокислотний кодон або кодон гістидину, а інші частини отримали шляхом звичайної
ПЛР або ПЛР із використанням синтетичних праймерів, як у частинах бібліотеки. Ці позиції потім з'єднали за допомогою ПЛР-складання (9. Мої. Віоїі. 1996; 256: 77-88).
Цю бібліотеку використовували для будування бібліотеки рибосомного виявлення згідно з ..
Іттипоіодіса! Меїподз 1999; 231: 119-135. Для того, щоб здійснити трансляцію іп міо без клітин
ЕвсНетіснпіа соїї, послідовність 50А (рибосомна ділянка зв'язування) та промотор Т7 додали до
Б-кінця, а часткову послідовність гену 3, що служить лінксером для рибосомного виявлення, пришили до 3'-кінця, використовуючи 5ІЇЇ.
Отримання залежного від рН зв'язувального 5сЕм з бібліотеки шляхом пенінгу на гранулах
Для того, щоб концентрувати тільки 5сСЕМ, що має здатність зв'язуватися з 52344, двічі здійснювали пенінг за способом рибосомного виявлення згідно з Маїиге Віоїесппоіоду 2000 Оес; 18: 1287-1292. Отриманий 5344 біотинілували, використовуючи МН5-РЕО4-Віоїіп (Ріегсе), внаслідок чого отримали антиген. Пенінг здійснювали, використовуючи 40 нМ біотинілованого антигену.
Використовуючи отриману сукупність ДНК як матрицю, НІ 5сЕм відновили шляхом ПЛР, використовуючи специфічні праймери. Після перетравлювання 51 перетравлений НІ 5сЕм вставили у фагемідний вектор рЕГ! ВО ай, який також перетравили 5ІЇ, а потім використовували для перетворення ХІ І-Віне (5ігагадепе).
Клітини ЕвсНегїіспіа сої, які є носіями бажаної плазміди, вирощували до 0,4-0,6 0.0. (оптична щільність)у/умл у середовищі 2УТ, що містило 100 мкг/мл ампіциліну та 2 96 глюкози. До цього додали фаг-хеллер (М1ІЗ3КО7,4,5 х 107 бляшкоутворюючих одиниць (ріш)), статично культивували протягом 30 хвилин при 37 "С, а потім культивували при збовтуванні протягом 30 хвилин при 37 "С. Культуру перенесли до 50-мл пробірки РаІсоп, центрифугували протягом 10 хвилин при 3000 обертів/хвилину, ресуспендували у середовищі 2УТ, що містило 100 мкг/мл ампіциліну, 25 мкг/мл канаміцину та 0,5 мМ ІРТО, а потім інкубували протягом ночі при 30 "С.
Інкубовану протягом ночі культуру осадили 2,5 М Масі та 10 95 ПЕГ, а потім розвели РВ5, внаслідок чого отримали розчин фагової бібліотеки. 10 95 М-РВЗ (РВ5 містив 10 95 знятого
Зо молока) та 1 М Ттіз-НСІ додавали до розчину фагової бібліотеки, доки не отримали кінцеву концентрацію 2,595 М-РВ5 та рН 7,4. Пенінг здійснювали за способом типового пенінгу, використовуючи антиген, іммобілізований на магнітних гранулах (9. Іттипої. Меїйоаз 2008 Маг 20; 332(1-2): 2-9; У. Іттипої. Мештоаз 2001 дап 1; 247(1-2): 191-203; Віоїтесппої. Ргод. 2002 Маг-
Арг; 18(2): 212-209). Більш специфічно, 40 пмоль міченого біотином 5К344 додали до отриманої фагової бібліотеки та цю бібліотеку піддали контактуванню з антигеном протягом 60 хвилин при 37 "С. Додали покриті стрептавідином гранули (Оупа! М-280), промиті 5 95 М-РВ5 (РВ5, який містить 5 95 знятого молока), та дозволили зв'язуватися протягом 15 хвилин при 37 "С. Гранули промили 5 разів як 0,5 мл РВ5Т (РВ5, який містить 0,1 95 Гееп-20, рН 7,4), так і РВЗ (рН 7.4).
Гранули потім суспендували в 1 мл РВЗ5 (рН 5,5) при 37 "С та негайно відновили фаг.
Відновлений фаговий розчин додали до 10 мл ХГ. І-Віне (20600 0,4-0,5) у фазі логарифмічного зростання та залишили настоюватися протягом 30 хвилин при 37 "С для інфікування. Інфіковані
Е. соїї помістили у планшет 225 мм х 225 мм, що містив 2УТ, 100 мкг/мл ампіциліну та 2 95 глюкози. Ці клітини Е. Соїї використовували, щоб започаткувати додаткову фагову культуру таким самим способом, як описано вище, та повторювали пенінг 8 разів.
Оцінка шляхом фагового ЕЛАЙЗА
Вищевказані єдині колонії інокулювали у 100 мкл 2УТ, 100 мкг/мл ампіциліну, 2 95 глюкози та 12,5 мкг/мл тетрацикліну та культивували протягом ночі при 30 "С. 2 мкл цієї культури інокулювали у 300 мкл 2УТ, 100 мкг/мл ампіциліну та 2 95 глюкози, а потім культивували протягом 4 годин при 37 "С. Фаг-хелпер (МІЗКО?7) додали до культури при 9 х 108 рі, залишили настоюватися протягом 30 хвилин при 37 "С та збовтували протягом 30 хвилин при 37 "С для інфікування. Після цього середовище замінили 300 мкл 2УТ, 100 мкг/мл ампіциліну, 25 мкг/мл канаміцину та 0,5 мМ ІРТО. Після культивування протягом ночі при 30 "С відновили центрифуговану надосадову речовину. 360 мкл 50 мМ РВ5 (рН 7,4) додали до 40 мкл центрифугованої надосадової рідини та піддали ЕЛАЙЗА. На мікротитраційний планшет з 96 комірками 5ігеріаумеї! (Коспе) нанесли покриття на ніч за допомогою 100 мкл РВ5, що містив 62,5 нг/мл міченого біотином 5К344. Після видалення антигену шляхом промивання РВЗТ здійснювали блокування 250 мкл 2 95 ВБА-РВ5 протягом 1 години або більше. Після видалення 2 6 ВБА-РВЗ додали отриману надосадову рідину та дозволили настоюватися протягом 1 години при 37 "С для зв'язування з антитілом. Після промивання додали 50 мМ РВ5 (рН 74) бо або 50 мМ РВ5 (рН 5,5) та інкубували, настоюючи протягом 30 хвилин при 37 "С. Після промивання виконували виявлення за допомогою НЕР-кон'югованого антитіла проти М14 (Атегзпат РІагтасіа Віоїесі), розведеного єдиним розчином 2 95 ВБА-РВ5 та ТМВ (7утеад), потім додали сірчану кислоту, щоб припинити реакцію, та здійснювали вимірювання поглинання при 450 нм.
Проте, за допомогою пенінгу із використанням іммобілізованого на магнітних гранулах антигену не отримали жодного клону, що демонстрував би сильну залежну від рН зв'язувальну здатність. Клони, які, як визначили, демонстрували слабку залежну від рН зв'язувальну здатність, піддали секвенуванню із використанням специфічних праймерів. Позиції у цих клонах, де гістидин був присутнім у великому співвідношенні, наведено у Таблиці 3.
Таблиця 3. Позиції заміщення гістидином, виявленні із використанням фагової бібліотеки (пенінг на магнітних гранулах)
Н5БО, Н58, НЄ, Не2, НеЗ, Нба4, Нб5, НІ102 124,127,128,132,153,156,190, 1 92, 1 94.
Отримання залежного від рН зв'язувального 5сЕм з бібліотеки шляхом пенінгу на колонці
Жодних клонів, що мали сильну залежну від рН зв'язувальну здатність не отримали внаслідок типового пенінгу із використанням іммобілізованого на магнітних гранулах антигену.
Це може бути наслідком наступних причин. У пенінгу із використанням антигену, іммобілізованого на магнітних гранулах або на планшеті, зібрали усі фаги, що відокремилися від магнітних гранул або планшета при кислотних умовах. Отже, фагові клони, які мають слабку залежність від рН та які відновлюються разом, зменшують подібність того, що клони, які мають сильну залежність від рН, включаються у кінцеві концентровані клони.
Отже, пенінг із використанням колонки з іммобілізованим антигеном використовували як більш точний спосіб пенінгу (Фіг. 5). Нема жодних попередніх повідомлень щодо отримання клонів, які мають залежну від рН зв'язувальну здатність шляхом використання пенінгу на колонці з іммобілізованим антигеном. У пенінгу із використанням колонки з іммобілізованим антигеном, коли фаги, які зв'язалися за нейтральними умовами, елюються за кислотними умовами, тоді клони, які мають слабку залежність від рН, знов зв'язуються з антигеном усередині колонки та, внаслідок цього, менше елюються, зумовлюючи вибіркове елюювання з колонки клонів з більш сильною залежністю від рН, які менше зв'язуються усередині колонки.
Зо Крім того, хоча "усі" фаги, що відокремилися за кислотними умовами, відновлюються при пенінгу із використанням антигену, іммобілізованого на магнітних гранулах або планшеті, пенінг із використанням колонки з іммобілізованим антигеном дозволяє вибірково відновлювати фаги, які мають сильну залежну від рН зв'язувальну здатність, дозволяючи кислотному буферу протікати крізь колонку, щоб розпочати елюювання та відновлення тільки "відповідних фракцій".
По-перше, приготували колонку, у якій антиген ЗК344 був іммобілізований. 200 мкл зігеріамідіп Зерпагохе (ЗЕ Неайпсаге) промили 1 мл РВ5, суспендували у 500 мкл РВ5 та дозволили контактувати з 400 пмоль міченого біотином 5К344 протягом 1 години при кімнатній температурі. Після цього порожню колонку (Атег5пат РІпаптасіа Віоїесп) наповнили вищевказаною сефарозою та промили приблизно З мл РВ5. Вищезазначену
РЕС-осаджену бібліотеку фагів розвели до 1/25 із застосуванням 0,5 95 ВБА-РВ5 (рН 7,4), пропустили крізь фільтр 0,45 нм, а потім додали до колонки. Після промивання приблизно 6 мл
РВЗ (рН 7,4), дозволили 50 мМ МЕ5-Масі (рн 5,5) протікати крізь колонку, щоб елюювати антитіла, які відокремилися за низьким рн. Зібрали відповідні елюйовані фракції та відновлений фаговий розчин додали до 10 мл ХІІ-Віне (00600 0,4-0,5) у логарифмічній фазі зростання та дозволили настоюватися протягом 30 хвилин при 37 "С.
Інфіковані Е. соЇїї нанесли на планшет 225 мм х 225 мм, що містив 2УТ, 100 мкг/мл ампіциліну та 2 95 глюкози. Ці Е. соїї використовували для того, щоб започаткувати додаткову фагову культуру за таким самим способом, як описано вище, та пенінг повторювали 6 разів.
Оцінка шляхом фагового ЕЛАЙЗА
Отримані фаги оцінили шляхом фагового ЕЛАЙЗА. Клони, які, як визначили, мали сильну залежність від рН, піддали секвенуванню із використанням специфічних праймерів. Внаслідок цього отримали декілька клонів, що демонстрували сильну залежність зв'язування від рн порівняно з клонами природного типу. Як показано на Фіг. б, визначили, що клон СІ 5 (Н-ланцюг:
СІ Н5, І-ланцюг: СІ І 5) (СІ Н5:амінокислотна послідовність 5ЕО ІЮ МО: 5, СІ | 5:амінокислотна послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8) демонстрував особливо сильне залежне від рН зв'язування порівняно з антитілом природного типу. Тим самим підтвердили, що антитіла, які демонструють сильне залежне від рН зв'язування, які при цьому не можна отримати шляхом типового пенінгу із використанням антигену, іммобілізованого на магнітних гранулах, можна отримати шляхом пенінгу із використанням колонки з іммобілізованим антигеном. Отже, визначили, що пенінг із бо використанням колонки з іммобілізованим антигеном є надзвичайно ефективним способом отримання з бібліотеки антитіл з залежним від рН зв'язуванням. Проаналізували амінокислотні послідовності клонів, що демонструють залежне від рН зв'язування, та позиції, де гістидин був присутнім з високою ймовірністю у концентрованих клонах, наведено у Таблиці 4.
Таблиця 4. Позиції заміщення гістидином, визначені за допомогою фагової бібліотеки (пенінг на колонці)
НЗ1, Н5БО, Н5В8, Не2, НеЗ, Нб5, НІТО0Б, НІ1ТО2 124,127,128,132,153,156,190, 1 92, 194
Приклад 4. Експресія та очищення модифікованого гістидином гуманізованого антитіла проти рецептора 1-6
Одержання, експресія та очищення вектора експресії модифікованого гістидином гуманізованого антитіла проти рецептора 1-6
Для того, щоб перетворити клони, які демонструють сильну залежність від рН у фаговому
ЕЛАЙЗА до ІдС, ампліфікували МН та М, відповідно, шляхом ПЛР, перетравили Хпої/мнпеї! та
ЕсСоОКІІ та вставили у вектор експресії для клітин ссавців. Нуклеотидну послідовність кожного фрагмента ДНК визначили за способом, відомим фахівцям у цій галузі. СІ Н5/ 73, у якому СГ НЬ використовували для важкого ланцюга, а І 73, отриманий у Прикладі 2, використовували для легкого ланцюга, експресували та очистили як ДО. Експресію та очищення здійснювали за способом, описаним у Прикладі 1.
Антитіло, що має навіть більш високу залежність від рН, отримали шляхом комбінування ділянок мутації. На основі позицій, де Ніх5 концентрувався у фаговій бібліотеці, а також на основі інформації про структуру тощо, замістили гістидином НЗ2, Н58, Нб2 та НІ102 у НЗрі, який отримали як важкий ланцюг у Прикладі 2, а НО5 та НО9 далі замістили валіном та ізолейцином, відповідно, внаслідок чого отримали Н170 (ЗЕО ІЮ МО: 4). Цей варіант одержання здійснювали за способом, описаним у Прикладі 1. Крім того, І 82 (5ЕО ІО МО: 7) отримали, замістивши 28-й гістидин 73, який отримали як легкий ланцюг у Прикладі 2, аспарагіновою кислотою. Цей варіант одержання здійснювали за способом, описаним у Прикладі 1. Н170/ 82, у якому Н1Т70 використовували для важкого ланцюга, а 182 використовували для легкого ланцюга, експресували та очищували як до, використовуючи спосіб описаний у Прикладі 1.
Приклад 5. Оцінка І-6А-нейтралізуючої активності залежного від рН зв'язувального антитіла
Зо Оцінка нейтралізуючої активності клонів, перетворених в дес, стосовно рецептора 1-6 людини
Оцінили нейтралізуючу активність стосовно рецептора ІІ -6 чотирьох антитіл: гуманізованого антитіла РМІ1 (природного типу) та НЗрі// 73, СІ Н5/ 73 та Н170/ 82, отриманих у Прикладах 2 та 4.
Більш специфічно, нейтралізуючу активність стосовно рецептора 1//-6б визначили із використанням ВакгзЗ/дріІЗО, що демонструють залежне від рецептора 1Г-6/1/-6 зростання.
Вагз/одріЗО промили тричі середовищем КРМІ1640, що містило 10 95 ЕВ5, потім суспендували при 5 х 107 клітин/мл у середовищі КРМІ1640, що містило 60 нг/мл інтерлейкіну-б6 людини (Тогау), 60 нг/мл рекомбінантного розчинного рецептора 1-6 людини (ЗК344) та 10 55 ЕВ5. 50 мкл суспензії помістили у кожну комірку планшета з 96 комірками (Согпіпд). Після цього очищене антитіло розвели КМРІ1640, що містило 10 95 ЕВ5, та 50 мкл антитіла підмішали до кожної комірки. Після культивування протягом З днів при 37 "С та в умовах 5 95 СО» реагент
Му5Т-8 (Сеї! Соипіїпу Кії-8, Ро|їпао
Ї арогафогіез), розведений удвічі РВ5, додали по 20 мкл/комірку, а потім негайно вимірили поглинання при 450 нм (контрольна довжина хвилі: 620 нм), використовуючи Бипгізе Сіазвіс (Тесап). Після культивування протягом 2 годин знов вимірили поглинання при 450 нм (контрольна довжина хвилі: 620 нм). Нейтралізуючу активність стосовно рецептора 1-6 оцінювали на основі зміни поглинання після 2 годин. Внаслідок цього, як показано на Фіг. 7, було продемонстровано, що НЗрі//73, СІ Н5//73 та Н1І70/182 мали еквівалентну біологічну нейтралізуючу активність порівняно з гуманізованим антитілом РМІ1 (природного типу).
Приклад 6. Аналіз антитіла, що зв'язується залежним від рН чином, з використанням Віасоге
Аналіз зв'язування клонів, що зв'язуються залежним від рН чином, з розчинним рецептором
І/-6
Аналіз кінетики реакцій антиген-антитіло при рН 5,8 та рн 7,4 здійснювали, використовуючи
Віасоге Т100 (СЕ Неаксаге), на чотирьох антитілах: гуманізованому антитілі РМІ1 (природного типу) та НЗріЛ.73, СІ Н5/. 73 та НІ170/ 82, які отримали у Прикладах 2 та 4 (буфер: 10 мМ МЕ5 (рН 7,4 або рн 5,8), 150 мМ Масі та 0,0595 Туеєп 20). Різні антитіла зв'язувалися на сенсорному чипі з іммобілізованим рекомбінантним білком А/5З (Ріегсе) шляхом амінного з'єднання. 5К344, доведений до концентрації від 9,8 до 400 нМ, випорснули на чип, як бо аналітичний зразок. Асоціацію та відокремлення клонів, що зв'язуються залежним від рН чином з 5К344, спостерігали у реальному часі (Фіг. 8 та 9). Усі вимірювання виконували при 37 "с.
Константи швидкості асоціації Ка (1/Мс) та константи швидкості дисоціації Ка (1/с) розраховували, використовуючи програмне забезпечення Віасоге Т100 ЕмаЇІцайоп б5оймаге (СЕ
Неайсаге), а константи дисоціації КО (М) розраховували на основі цих значень (Таблиця 5).
Крім того, відношення афінності при рН 5,8 та рН 7,4 розраховували для кожного клону, внаслідок чого визначили залежне від рН зв'язування. Усі вимірювання виконували при 37 "С.
Внаслідок розрахунку відношення афінності між рН 5,8 та рН 7,4 для кожного клону визначили, що залежне від рН зв'язування (афінність) НЗрі/ 73, НІ170/ 82 та СІ Н5/Л 73 з 5344 перебільшувало у 41 раз, 394 разів та 66 разів, відповідно, порівняно із зв'язуванням антитіла природного типу (МУТ), при цьому кожен демонстрував залежне від рН зв'язування, яке перебільшувало більш ніж у 15 разів зв'язування антитіла природного типу.
Іще не повідомлялося про антитіла проти рецептора І/-б, які б сильно зв'язувалися з антигеном при рН 7, плазми, проте слабко зв'язувалися б з антигеном при внутрішньоендосомному рН від 5,5 до 6,0. У цьому дослідженні отримали антитіла, які зберігають біологічну нейтралізуючу активність, що є еквівалентною активності гуманізованого антитіла природного типу проти рецептора 1-6, та афінність при рН 7,4, проте демонструють афінність при рН 5,8, яка є специфічно зниженою більш ніж у 10 разів.
Таблиця 5
Порівняння зв'язування клонів, що зв'язуються залежним від рН чином, спрямованих проти
ЗК344, з розчинним рецептором 1-6 я ре мон | кою ферлю ат» (ом ГО)
Аналіз зв'язування клонів, що зв'язуються залежним від рН чином, з мембранним рецептором 1-6
Реакції антиген-антитіло з мембранним рецептором 1-6 при рН 5,8 та рН 7,4 спостерігали для вищеотриманих клонів, що зв'язуються залежним від рН чином, використовуючи Віасоге
Т100 (СЕ Неайрсаге). Зв'язування з мембранним рецептором 1-6 оцінювали шляхом визначення зв'язування з рецептором ІІ -6, іммобілізованим на сенсорному чипі. ЗЕ344 піддали біотинілуванню згідно зі способом, відомим фахівцям у цій галузі, та біотинілований 5344 іммобілізували на сенсорному чипі стрептавідином, використовуючи афінність між стрептавідином та біотином. Усі вимірювання здійснювали при 37 "С, та буфер рухомої фази містив 10 мМ МЕЗ (рН 5,8), 150 мМ Масі та 0,05 95 Тмеєп 20. Клони, що зв'язуються залежним
Зо від рН чином, випорснули при умові рН 7,4, та дозволили зв'язатися з 5ЗК344 (буфер для випорскування зразка: 10 мМ МЕЗ (рН 7,4), 150 мм масі, 0,05 95 Тмжееп 20), та спостерігали залежну від рН відокремлення кожного клону при рН 5,8 рухомої фази (Фіг. 10).
Швидкість дисоціації (Ка(1/с)) при рН 5,8 розраховували, використовуючи програмне забезпечення Віасоге Т100 Емаїчайоп Зоймаге (СЕ Неайпсаге), шляхом приведення у відповідність тільки відокремленої фази при рН 5,8, де 0,5 мкг/мл зразка зв'язалися у 10 мМ
МЕЗ (рН 7,4), 150 мМ Масі та 0,05 95 Тмееп 20 та відокремилися у 10 мМ МЕЗ (рН 5,8), 150 мМ
Масі та 0,0595 Тмеєеп 20. Подібно до цього швидкість дисоціації (Ка(1/с)) при рН 7,4 розраховували, використовуючи програмне забезпечення Віасоге ТІОО Емаїчайоп 5оймаге (СЕ
Неайсаге), шляхом приведення у відповідність тільки відокремленої фази при рН 7,4, де 0,5 мкг/мл зразка зв'язалися у 10 мМ МЕЗ (рН 7,4), 150 мМ Масі та 0,05 95 Тмжееп 20 та відокремилися у 10 мМ МЕЗ (рН 7,4), 150 мм масі та 0,05 906 Тмееп 20. Константу залежної від рН швидкості дисоціації для кожного клону наведено у Таблиці 6.
Таблиця 6
Порівняння константи швидкості дисоціації клонів, що зв'язуються залежним від рН чином, спрямованих проти 5К344, що походить від мембранного рецептора ІІ -6 ди дд
Найвищу залежність швидкості дисоціації від рН спостерігали у НЗрі/ 73, потім у СГН5Б/Л 73 та НІ170//82 у порядку зниження, та кожен клон демонстрував більш високе залежне від рн відокремлення від мембранного рецептора ІІ -6 порівняно з антитілом природного типу. Проте, ступінь залежних від рН асоціації/відокремлення різнився між розчинним рецептором 1-6 та мембранним рецептором 1І/-6. Виявили, що НІ170/.82, який демонстрував найвищий ступінь залежного від рН зв'язування в аналізі зв'язування з розчинним рецептором 1-6, демонстрував найнижчий ступінь залежного від рН зв'язування у аналізі зв'язування з мембранним рецептором 1-6. Взагалі, відомо, що коли молекули дО одновалентно зв'язуються з розчинним антигеном (афінність), вони бівалентно зв'язуються з мембранними антигенами (авідність).
Припускають, що ця різниця у режимі зв'язування між розчинними антигенами та мембранними антигенами впливала на залежне від рН зв'язування НІ170/ 82.
Приклад 7. Підтвердження багаторазового зв'язування з антигеном антитіла, що зв'язується залежним від рН чином
Як описано у Прикладі 2, антитіла, що зв'язуються залежним від рН чином, можуть бути здатними зв'язуватися з антигенами багато разів. Специфічно, антитіло, що зв'язується залежним від рН чином, яке зв'язалося з антигеном, неспецифічно захоплюється в ендосоми, проте відокремлюється від розчинного антигену за внутрішньоендосомними кислотними умовами. Антитіло зв'язується з ЕсКп та, тим самим, повертається до плазми. Оскільки антитіло, що повернулося до плазми, не зв'язане з антигеном, то воно здатне зв'язуватися з антигенами багато разів. Повторення цього процесу дозволяє антитілам, що зв'язуються залежним від рН чином, зв'язуватися з антигенами багато разів. Проте, для антитіл дос, які не мають залежної від рН зв'язувальної здатності, не усі антигени відокремлюються від антитіл за внутрішньоендосомними кислотними умовами. Отже, такі антитіла, що повернулися до плазми за допомогою ЕсКп, залишаються зв'язаними з антигеном та, внаслідок цього, не можуть зв'язуватися з новими антигенами. Внаслідок цього, майже в усіх випадках кожна єдина молекула антитіл |до є здатною нейтралізувати тільки два антигени (у випадку бівалентного зв'язування).
Зо Отже, було визначено, чи були здатними три антитіла (НЗрі/ 73, СІ Н5/Л 73 та НІ170/ 82), які зв'язуються залежним від рН чином та які побудовано у Прикладах 2 та 4, зв'язуватися з антигеном 5К344 багато разів порівняно з гуманізованим антитілом РМІ1 (природного типу, УМТ).
Використовували Віасоге (СЕ Неайпсаге) для визначення того, що антитіла, які зв'язуються при рН 7,4 та відокремлюються при рН 5,8, були здатними зв'язуватися з антигеном багато разів. Антитіло, яке слід оцінити, зв'язали з іммобілізованим на сенсорному чипі рекомбінантним білком А/З (Ріегсе) за допомогою способу амінного з'єднання та дозволили рухомій фазі з рн 7,4 текти (етап 1). Розчину 5К344, відрегульованому до рН 7,4, потім дозволили текти як аналітичному зразку, щоб зв'язати 5К344 з антитілом при рн 7,4 (етап 2). Це зв'язування при рн 7,4 моделює зв'язування антигену у плазмі. Після цього буфер, доведений до рН 5,8, самостійно (не містив 5К344) додали як аналітичний зразок, для того щоб піддати зв'язок антигену з антитілом дії кислотних умов (етап 3). Це відокремлення при рН 5,8 моделює стан зв'язування комплексів антиген-антитіло в ендосомах. Після цього етап 2 повторили. Це моделює повторне зв'язування антитіла, яке повернулося до плазми за допомогою ЕсКп, з новим антигеном. Після цього етап 2 повторили, щоб піддати комплекс антиген-антитіло дії кислотних умов. Повторювання "етапу 2 - етапу 3" багато разів при 37 "С, як описано вище, може моделювати стан іп мімо, при якому антитіла багато разів захоплюються з плазми в ендосоми шляхом піноцитозу та повертаються до плазми за допомогою ЕсКп (Маї. Кем.
Іттипої. 2007 Зер; 7(9): 715-25).
Отримані клони, які зв'язуються залежно від рН та які описано вище, проаналізували, використовуючи Віасоге Т100 (СЕ Неайнсаге), стосовно їх здатності зв'язуватися з антигеном 5К344 багато разів при рН 5,8 та рН 7,4. Більш специфічно, аналіз здійснювали наступним способом. Усі вимірювання виконували при 37 "С. По-перше, антитіла-зразки, описані вище, зв'язали на сенсорному чипі з іммобілізованим рекомбінантним білком А/з (Ріегсе) шляхом амінного з'єднання, де буфер рухомої фази був наступним: 10 мМ МЕЗ (рН 5,8), 150 мМ Масі та 0,05 95 Туееп 20 (етап 1). 5К344, доведений до концентрації приблизно 40 нМ, випорскували як аналітичний зразок протягом З хвилин при рН 7,4 та дозволили зв'язуватися (буфер для випорскування 5К344 був наступним: 10 мМ МЕЗ5 (рН 7,4), 150 мМ Масі та 0,05 95 Тмуеєп 20) (етап 2). Після цього випорскування 5К344 припинили та дозволили рухомій фазі з рН 5,8 текти протягом приблизно 70 секунд, щоб піддати комплекс антНТто/5К344 дії кислотних умов (етап 3). Цей процес зв'язування (етап 2)/піддавання дії кислотних умов (етап 3) повторювали десять разів безперервно, внаслідок чого спостерігали сенсор граму у реальному часі, яку зображено на Фіг. 11. Антитіло природного типу демонструвало менший ступінь відокремлення 5КЗ44 під час дії кислотних умов на етапі 3, та, внаслідок цього, пропорція антитіла, здатного зв'язуватися з новими антигенами після етапу 2, була надзвичайно низькою. Навпаки, визначили, що клони, які зв'язуються залежно від рН, особливо НІ170/182 та СІ Н5Б//73, демонстрували настільки сильне відокремлення протягом дії кислотних умов на етапі 3, що більша частина зв'язаного 5К344 відокремилася, та, отже, майже усі антитіла були здатними зв'язуватися з новими антигенами після етапу 2. Під час 10-разового повторення зв'язування (етапу 2) та дії кислотних умов (етапу 3) майже усі антитіла Н170/ 82 та СІ Н5/ 73 були здатними зв'язуватися з новими антигенами у кожному повторі.
Отримані сенсорграми використовували для розрахунку зв'язувальної кількості 5К344 у кожному повторі етапів 2 та З для кожного зразка із використанням програмного забезпечення
Віасоге ТІОО Емаїнайоп 5оймаге (СЕ Неайсаге). Сумарні значення в залежності від часу 10 повторів етапів 2 та З наведено на Фіг. 12. Сумарні значення КИ, отримані на 10-му повторі етапів 2 та З дорівнюють загальній кількості антигенів, що зв'язалися під час 10 циклів. Клони, що зв'язуються залежно від рН, особливо Н170/182 та СІ Н5/ 73, демонстрували найбільшу загальну кількість зв'язаних антигенів порівняно з антитілом природного типу, та було
Зо продемонстровано, що вони здатні неодноразово зв'язуватися з приблизно у 4 рази більшою кількістю антигенів, ніж кількість антигенів, зв'язаних антитілом природного типу. Отже, було виявлено, що, надаючи антитілу природного типу здатності зв'язуватися залежно від рн, такі антитіла можуть неодноразово зв'язуватися з антигенами та, як слідство, нейтралізувати численні антигени.
Приклад 8. Тестування ФК/ФД антитіла, що зв'язується залежно від рн, із використанням трансгенних мишей з рецептором 1-6 людини
Рецептори 1-6 присутні у тілі як у формі розчинного рецептора ІІ -6, так і у формі рецептора
І/-6 мембранного типу (Маї. Сіїп. Ргасі. ЕПешитаїоІ. 2006 Мом; 2(11): 619-26). Антитіла проти рецептора 1-6 зв'язуються з розчинними рецепторами 1-6 та рецепторами 1-6 мембранного типу та нейтралізують їхню біологічну активність. Вважають, що антитіло проти рецептора 1-6 зв'язується з рецептором 1-6 мембранного типу, потім захоплюється в ендосому усередині клітини шляхом інтерналізації, при цьому антитіло зберігає зв'язок з рецептором 1-6 мембранного типу, а потім рухається до лізосоми, продовжуючи зберігати зв'язок з рецептором
І/-6 мембранного типу, де воно руйнується лізосомою разом з рецептором 1-6 мембранного типу. Якщо НЗрі// 73, СІ Н5Б/ 73 та НІ170/ 82 які є проаналізованими у Прикладі 6 антитілами проти рецептора 1-6, що зв'язуються залежно від рН, є здатними повертатися до плазми за допомогою ЕсКп внаслідок відокремлення за кислотними умовами усередині ендосом, то ці антитіла, що повернулися до плазми, можуть знов зв'язуватися з антигенами. Це зумовлює нейтралізацію численних рецепторів І/-6 мембранного типу єдиною молекулою антитіла. Чи є повернення до плазми за допомогою ЕсКп наслідком відокремлення за кислотними умовами усередині ендосом побудованих антитіл проти рецептора ІІ--6, які зв'язуються залежно від рн, чи ні, можна визначити шляхом оцінювання, чи покращилася фармакокінетика цих антитіл порівняно з фармакокінетикою антитіл природного типу.
Отже, фармакокінетику у трансгенних мишей з рецептором І/-6 людини (миші ПІС-6А д,
Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА 1995 Мау 23; 92(11): 4862-6) визначали для чотирьох типів антитіл, а саме: гуманізованого антитіла РМІ1 (антитіла природного типу, МУТ) та Нзрі/ 73, СІ Н5/ 73 та
НІ70/182, побудованих у Прикладах 2 та 4. УМ, Нзріл/ 73, СІН5З//73 або НІ70/82 ввели шляхом внутрішньовенної ін'єкції у вигляді єдиної дози мишам ПІІ -6К 19 у дозі 25 мг/кг, а зразки крові узяли до ведення та після певного періоду часу. Узяту кров негайно центрифугували бо протягом 15 хвилин при 15000 обертів за хвилину при 4 "С, внаслідок чого отримали плазму.
Відокремлену плазму зберігали у морозильнику при температурі -20 "С або нижче, доки не розпочали здійснювати вимірювання.
Вимірювання концентрації у мишачій плазмі здійснювали шляхом ЕЛАЙЗА. Зразки для калібрувальної кривої приготували при наступних значеннях концентрації у плазмі: 6,4, 3,2,1,6, 0,8, 0,4, 0,2 та 0,1 мкг/мл. Зразки для калібрувальної кривої та зразки для вимірювання у мишачій плазмі помістили в імунопланшет (Мипсо-Іттипо Ріаїє, Махібогр (Маїде Мипс
Іп'егпайопаї)) з іммобілізованим Е(ар)2 проти людського дос (специфічний до у-ланцюга) (Зідта) та залишили відстоюватися, не турбуючи його, протягом 1 години при кімнатній температурі. Козлячому анти-людському ІдДС-ВІОТ (бБошційегп Віоїесппоіоду Авзосіа(е5) та кон'югату стрептавідин-лужна фосфатаза (Коспе Оіадповіїс5) дозволили після цього реагувати та здійснювали хромогенну реакцію, використовуючи систему ВісеРпо5 Місгожеї! Рпозрпаїазе
ЗибБ5ігаїєз Зувсіет (КігКедаага 4 Реїту І арогаїогіеб5) як субстрат. Поглинання при 650 нм вимірювали за допомогою апарата для читання мікропланшетів. Концентрації у мишачій плазмі розрахували з поглинання за калібрувальною кривою, використовуючи аналітичне програмне забезпечення ЗОЕТтах РКО (Моїесшіаг Оемісе5). Зміну за частом концентрацій у плазмі для антитіла природного типу (М/Т), а також для НЗрі// 73, СІ Н5/І 73 та НІ170/ 82 наведено на Фіг. 13.
Фармакокінетика покращилася для усіх з НЗрі/ 73, СІН5/Л 73 та НІ170/Л82 порівняно з антитілом природного типу. Зокрема, фармакокінетика НЗрі//73 та СІ Н5Б//73 покращилася суттєво. Антитіло природного типу проти рецептора 1-6, зв'язане з рецептором 1-6 мембранного типу, залучається в ендосому усередині клітини шляхом інтерналізації, рухається до лізосоми, зберігаючи при цьому зв'язок з антигеном, а потім руйнується; отже, воно має короткий період перебування у плазмі. На відміну від цього, оскільки фармакокінетика антитіл проти рецептора 116, які зв'язуються залежно від рН, покращилася суттєво, вважають, що антитіла проти рецептора 1-6, які зв'язуються залежно від рН, повертаються знов до плазми за допомогою ЕсКп внаслідок відокремлення від антигену, рецептора 1-6 мембранного типу, за кислотними умовами усередині ендосом.
Незважаючи на те, що фармакокінетика покращилася для усіх з НЗрі/// 73, СІ Н5/ 73 та
НІТ70/.82 порівняно з антитілом природного типу, ефект пролонгованого періоду присутності у
Зо плазмі Н170/ 82 був слабкішим порівняно з ефектом НЗрі/І 73 та СІ Н5Б/ 73. Оскільки вважають, що молекули ІдС зазвичай зв'язуються бівалентно зі зв'язаним з мембраною антигеном, вважають, що антитіла проти рецептора І/-б6 також зв'язуються бівалентно (авідність) з рецепторами 1-6 мембранного типу, а потім вони інтерналізуються. Як показано у Прикладі 6, аналіз із використанням Віасоге виявив, що Н170/82 швидко відокремлювався від рецептора
І/-6 при рН 5,8 під час зв'язування з розчинним рецептором 1І--6 (Фіг. 9), проте швидкість його відокремлення від рецептора 1-6 при рН 5,8 під час зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу була надзвичайно повільною (Фіг. 10). Виходячи з цього, вважають, що причина слабкого ефекту пролонгації періоду присутності у плазмі НІ1Т70/.82 полягає у тому, що антитіло було нездатним адекватно відокремлюватися усередині ендосом після його інтерналізації, що є наслідком його повільного відокремлення при рН 5,8 під час зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу. А саме, щодо випадку стосовно мембранних антигенів, визначили, що для того, щоб єдина молекула ІдсС нейтралізувала численні мембранні антигени, рН-залежність відокремлення для бівалентного зв'язування (авідність) є більш важливою порівняно з рн- залежністю для одновалентного зв'язування (афінність).
Приклад 9. Тестування ФК/ФД антитіла, що зв'язується залежно від рн, із використанням мавп супотодіи5
Оскільки фармакокінетика антитіл проти рецептора І/6, що зв'язуються залежно від рн, покращилася суттєво у Прикладі 8, то вважали, що антитіла проти рецептора 1-6, які зв'язуються залежно від рН, повертаються до плазми за допомогою ЕсКп внаслідок відокремлення від антигену, рецептора ІІ -6 мембранного типу, при кислотних умовах усередині ендосом. Якщо антитіла, що повернулися до плазми, можуть зв'язуватися знов з рецепторами
І/-6 мембранного типу, то вважають, що нейтралізація антигену, рецептора І--6 мембранного типу, антитілами проти рецептора ІІ -6, які зв'язуються залежно від рН, триває довше для такої ж самої дози порівняно з антитілами природного типу проти рецептора ІІ -6. Крім того, оскільки розчинний рецептор 1І--6 також присутній серед рецепторів 1-6, то вважають, що нейтралізація антигену триває довше для такої ж самої дози також і у відношенні розчинних рецепторів ІІ -6.
Фармакокінетику у мавп супотодіи5 оцінювали для антитіла природного типу та для
НзЗріЛ/73. Антитіло природного типу або НЗірі/73 ввели мавпам супотодіи5 шляхом внутрішньовенної ін'єкції у вигляді єдиної дози Імг/кг, та зразки крові брали до ведення та з бо часом. Узяту кров негайно центрифугували протягом 15 хвилин при 15000 обертів за хвилину при 4 "С, внаслідок чого отримали плазму. Відокремлену плазму зберігали у морозильнику при температурі -20 "С або нижче, доки не розпочали здійснювати вимірювання.
Вимірювання концентрації у плазмі мавп супотодіих здійснювали шляхом ЕЛАЙЗА. По- перше, фрагмент Е(ар)2 антитіла проти людського дО (специфічний до у-ланцюга) (Зідта) помістили у імунопланшет (Мипс-Іттипо Ріаїє, Махізогр (МаїЇде Мипс Іпіегпайіопаї)) та залишили відстоюватися, не турбуючи його, протягом ночі при 4 "С, внаслідок чого отримали планшети з іммобілізацією проти людського дО. Приготували зразки для калібрувальної кривої, що мали наступні значення концентрації у плазмі: 3,2, 1,6, 0,8,0,4, 0,2, 0,1 та 0,05 мкг/мл, та приготували зразки для вимірювання у плазмі мавп супотодієи5, розведені у 100 разів; 200 мкл 20 нг/мл І -68 мавп супотоЇди5 додали до 100 мкл зразків для калібрувальної кривої та зразків для вимірювання у плазмі; а потім їм дозволили відстоюватися, не турбуючи їх, протягом 1 години при кімнатній температурі. Після цього зразки помістили в планшет з іммобілізацією проти людського дО та дозволили відстоюватися, не турбуючи їх, протягом іще 1 години при кімнатній температурі. Біотинілованому антитілу проти І--6К людини (КУ) дозволили вступати в реакцію протягом 1 години при кімнатній температурі, а потім дозволили реагувати протягом 1 години з стрептавідин-РоОТтуНКРВЗО (е(егеозресіїс Оеїесіоп Тесппоодіебє). Хромогенну реакцію здійснювали, використовуючи ТМР Опе Сотропепі НЕР МісгоугеїЇ З!ибрзїгаге (ВіоЕхХ І арогайогіє5) як субстрат, потім реакцію припинили ІМ сірчаною кислотою (Зпожа Спептісаї) та вимірювали поглинання при 450 нм за допомогою апарата для читання мікропланшетів. Концентрації у плазмі мавп супотодіих розрахували з поглинання за калібрувальною кривою із використанням аналітичного програмного забезпечення ЗОЕТтах РКО (МоїІесшаг Оемісе5). Зміну за часом концентрацій у плазмі для антитіла природного типу та для НЗрі/ 73 після внутрішньовенного введення зображено на фіг. 14. Як наслідок, фармакокінетика НЗрІЛЛЗ3 суттєво покращилася порівняно з фармакокінетикою антитіла природного типу у мавп супотодіиб5 у такий самий спосіб, що і у випадку трансгенних мишей з рецептором 1-6 людини. Оскільки фармакокінетика антитіла проти рецептора 1І--6, яке зв'язується залежно від рн, Нзрі/ 73, покращилася суттєво, то вважали, що НЗрі// 73 повертається до плазми за допомогою ЕсКп внаслідок відокремлення від антигену, рецептора ІІ -6 мембранного типу, при кислотних умовах усередині ендосом.
Для того, щоб оцінити ступінь, до якого рецептор І--6 мембранного типу мавп супотодіив
Зо нейтралізується внаслідок внутрішньовенного введення антитіла природного типу та НзЗрі/І 73, досліджували вплив зразків антитіл на С-реактивний білок плазми (СЕР), індукований 1-6 мавп супотодіи5. Оскільки СКР вивільняється, коли ІІ -6 зв'язується з рецепторами 1-6 мембранного типу, то СЕР служить індикатором нейтралізації рецепторів І -6 мембранного типу. ІЇ/-6 мавп супотодіив (супо.І./-6, отриманий у Прикладі 1), що містив 1 95 інактивовану плазму мавп супотодіи5, вводили підшкірно у нижню частину спини тварин щоденно по 5 мкг/кг з третього по десятий день після введення антитіла природного типу або НЗрі// 73. Зразки крові узяли з підшкірної вени мавп супотодіи5 безпосередньо перед початком введення І! -6 (день 3) та після введення з інтервалами у 24 години (з 4-го по 11-й день), а потім відокремили плазму.
Концентрації СРК окремих тварин вимірювали за допомогою Сіає В САР (Капіо Спетісаї), використовуючи автоматичний аналізатор (ТВА-120ЕК, ТозПпіра Меаійіса! Зувзіетв5). Зміна за часом концентрації СЕР після введення 1-6 супотодіи5 стосовно антитіла природного типу та
НЗрі//73 наведена на Фіг. 15. Внаслідок цього тривалість пригнічення СРА була суттєво подовжена НЗрі/І 73 порівняно з антитілом природного типу. На основі цих результатів вважали, що антитіло проти рецептора 1-6, яке зв'язується залежно від рН, НзЗрі/ 73, повертається до плазми за допомогою ЕсКп внаслідок відокремлення його від антигену, рецептора 1-6 мембранного типу, при кислотних умовах усередині ендосом; та воно нейтралізує рецептор 1-6 мембранного типу, знов зв'язуючись з ним; та тим самим пригнічує виробництво СКР протягом більш тривалого періоду часу порівняно з антитілом природного типу. Інакше кажучи, було продемонстровано, що єдина молекула антитіла НЗрі/ 73 здатна зв'язуватися з рецепторами
І/-6 мембранного типу та нейтралізувати їх більш ніж один раз. Оскільки тривалість пригнічення виробництва СКР НЗрі/73 подовжується порівняно з тривалістю пригнічення антитілом природного типу, то було показано, що тривалість часу, коли антиген, рецептор 1-6 мембранного типу, зв'язується антитілами, подовжується для НЗрі/Л/ 73 порівняно з антитілом природного типу.
Для того, щоб оцінити ступінь, до якого розчинний рецептор І/-6 мавп супотодіи5 нейтралізується внаслідок внутрішньовенного введення антитіла природного типу та НЗрі/! 73, вимірили концентрацію незв'язаного розчинного рецептора 1-6 мавп супотодіи5 у плазмі мавп супотодіни5. Усі антитіла типу дО (дО мавп супотої!ди5, антитіло проти людського рецептора
І/-6, та комплекс антитіла проти людського рецептора 1-6 та розчинного рецептора 1-6 мавп бо супотоЇди5), що є присутніми у плазмі, адсорбували на Білок А шляхом додавання 30 мкл плазми мавп супотоїди5 до відповідної кількості полімеру гРгоївіп А Зерпагозе Раві РіІом/ (СЕ
Неаййсаге), висушеного у 0,22 мкм фільтрувальній чашці (Міййроге). Після зупинення високошвидкісної центрифуги відновили розчин, який пройшов наскрізь (далі позначається "розчин, що пройшов"). Оскільки розчин, що пройшов, не містить комплекс антитіла проти рецептора 1-6 людини та розчинного рецептора 1-6 мавп супото!/див5, який зв'язується з білком
А, то концентрацію незв'язаного розчинного рецептора 1-6 можна вимірити шляхом вимірювання концентрації розчинного рецептора 1-6 мавп супотоЇди5 у розчині, що пройшов.
Моноклональне антитіло проти І/-6К людини (КО), мічене рутенієм за допомогою Зиїо-Гад
МН5 Езіег (Мезо 5саїе Оізсомегу), та біотиніловане антитіло проти ІІ-6К людини (КУО) змішали зі зразками для калібрувальної кривої рецептора І/-6 мавп супотоЇди5, концентрацію яких довели до 4000, 2000, 1000, 500, 250,125 та 62,5 пг/мл, та зразки плазми обробили Білком А, як описано вище. Сумішам дозволили реагувати протягом 1 години при кімнатній температурі.
Після цього суміші помістили у планшет з 96 комірками ЗА-Соаїєд 5іапаага МА2400 (Мезо 5саїє різсомегу). Після реакції протягом іще однієї години та промивання, помістили Кеай Вийег Т (Х4) (Мезо 5саїе Оізсомегу). Одразу після цього виконали вимірювання за допомогою з5есіог Ітадег 2400 (Мезо зсаїе Оізсомегу). Концентрації рецептора 1-6 мавп супотоїЇди5 розрахували з даних калібрувальної кривої із використанням аналітичного програмного забезпечення БОЕт тах РКО (МоїІесшаг Оемісе5). Зміна за часом концентрацій незв'язаного розчинного рецептора 1-6 мавп супотоЇди5 для антитіла природного типу та НЗрі/ 73 наведено на Фіг. 16. Внаслідок цього тривалість нейтралізації розчинного рецептора ІЇ-б6 мавп супотоїди5 за допомогою НЗрі/ 73 було суттєво подовжено порівняно з антитілом природного типу. На основі цього результату вважали, що антитіло проти рецептора 1//-б, яке зв'язується залежно від рН, НЗрі/ 73, відокремлюється від антигену, розчинного рецептора 1-6, при кислотних умовах в ендосомах; та воно повертається до плазми за допомогою ЕсКп; та зв'язується з розчинним рецептором І - 6 та знов нейтралізує його.
Оскільки тривалість пригнічення незв'язаного розчинного рецептора 1-6 мавп супотоїдив за допомогою НЗрі/Л/73 подовжується порівняно з пригніченням антитілом природного типу, то було вказано, що тривалість часу, коли антиген, розчинний рецептор 1-6, зв'язується антитілами, подовжується для НЗрі/І 73 порівняно з антитілом природного типу.
Зо Ці результати вказують на те, що час, доки антитіло не зникає з плазми, а також час, коли розчинний та мембранний рецептори 1/-б зв'язуються антитілом в організмі, суттєво подовжився для антитіл проти рецептора 1/6, які зв'язуються залежно від рН, які було розроблено для сильного зв'язування з антигеном при рН 7,4, яке є рН у плазмі, але для слабкого зв'язування з антигеном при рН 5,8, яке є рН усередині ендосом, порівняно з антитілом природного типу проти рецептора ІЇ/-6. Це дозволяє зменшити дозу та частоту введення пацієнтам, та, як слідство, загальну дозу введення. Отже, вважають, що антитіло проти рецептора 1-6, яке зв'язується залежно від рН, є особливо переважним як фармацевтичний препарат для використання як антагоніста 1! -6.
Приклад 10. Покращення залежного від рН зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу шляхом оптимізації варіабельної ділянки.
Оптимізація варіабельних ділянок НЗрі/ 73 та СІ Н5/ 82
У Прикладі 9 було показано, що антитіла, які мають залежну від рН зв'язувальну здатність, демонструють переважні ефекти. Отже, для того, щоб далі покращити залежні від рн зв'язувальні здатності, зробили мутації у послідовності СОМ СІ Н5, отриманого у Прикладі 3, внаслідок чого побудували МНІ-ІДСІ (ЗЕО ІЮ МО: 21) та МН2-І9СІ (ЗЕО ІЮ МО: 22). Крім того, зробили мутації у каркасній послідовності та у послідовності СОК НЗрі, внаслідок чого побудували модифіковані важкі ланцюги МНЗ-ІдСІ (ЗЕО ІЮ МО: 23) та МН4А-ІДдаІ (ЗЕО ІЮ МО: 24).
Зробили мутації у послідовностях СОР. 173 та 182, внаслідок чого побудували модифіковані легкі ланцюги МІ1-СК (5ЕО ІЮ МО: 25), М 2-СК (ЗЕО ІЮ МО: 26) та МІ 3-СК (5ЕО ІО МО: 27).
Більш специфічно, мутантів побудували, використовуючи набір для сайт-спрямованого мутагенезу ОцікСпапде Зйе-Оігесієа Миадепезвів Кії (бігагадепе), згідно зі способом, описаним в доданих інструкціях, та отримані плазмідні фрагменти вставили у вектор експресії для клітин ссавців, внаслідок чого побудували бажані вектори експресії важкого ланцюга та вектори експресії легкого ланцюга. Нуклеотидні послідовності отриманих векторів експресії визначили за способами, відомими звичайним фахівцям у цій галузі.
Антитіло, що має МН2-ІдОІ (ЗЕО ІЮО МО: 22) у якості важкого ланцюга та МІ 2-СК (ЗЕО ІО МО: 26) у якості легкого ланцюга, позначили як Емі-ІдСІ, антитіло, що має МНІ1-ІдаіІ (ЗЕО ІЮ МО: 21) у якості важкого ланцюга та І 82 у якості легкого ланцюга, позначили як Ем2-ІдсІі, антитіло, що має
МНА-ЇО9б1І (5ЕО ІЮ МО: 24) у якості важкого ланцюга та МІ 1-СК (ЗЕО ІЮО МО: 25) у якості легкого 60 ланцюга, позначили як Ем3-Ідсі, та антитіло, що має МНЗ-ІдаІ (5ЕО ІЮ МО: 23) у якості важкого ланцюга та МІ 3-СК (5ЕО ІЮ МО: 27) у якості легкого ланцюга, позначили як Ем4-Ідсі. З них Ема2-
І9СІ та Ем4-ІдеІ експресували та очистили. Експресію та очищення виконували за способом, описаним у Прикладі 1.
Аналіз зв'язування клонів, що зв'язуються залежно від рН, з розчинним рецептором 1-6
Аналіз кінетики реакцій антиген-антитіло при рН 7,4 виконували на чотирьох типах антитіл, а саме: гуманізованому антитілі РМІ1 (природний тип, М/Т), та МТ, НЗрі/ 73-ІДаіІ, Ем2-ІдсІ та Ема4-
Іа, побудованим у Прикладах 2 та 10, використовуючи Віасоге Т100 (СЕ Неайсаге) (буфер:
ММ МЕЗ (рН 7,4), 150 мМ Масі, 0,05 95 Тмеєп 20). Кожне антитіло зв'язали на сенсорному чипі, на якому був іммобілізований К(аб)2 проти до, специфічний до ланцюга у (Ріегсе), шляхом 10 амінного з'єднання, а потім 5К344, доведений до концентрації від 9,8 до 40 нМ, випорснули як аналітичний зразок. Асоціацію з 5К344 та відокремлення від нього спостерігали у реальному часі для клонів, що зв'язуються залежно від рН. Усі вимірювання виконували при 37 "с.
Константи швидкості асоціації ка (1/Мс) та константи швидкості дисоціації Ка (1/с) розрахували, використовуючи програмне забезпечення Віасоге Т100 ЕмаїЇчайоп б5оймжмаге (СЕ Неайпсаге), та константи дисоціації КО (М) розрахували на основі цих значень (
Таблиця 7
Порівняння констант швидкості дисоціації клонів, що зв'язуються залежно від рн, які відокремлюються від розчинного рецептора 1-6, 58344
Внаслідок розрахунку афінності при рН 7,4 для кожного клону визначили, що константи дисоціації (афінність, значення КО) УМТ, НЗрі/Л 73-ІДдСІ, Ем2-ІДСІ та Ем4-ІДСІ щодо 54344 становили, відповідно, 2,7 НМ, 1,4 нМ, 2,0 нМ та 1,4 нМ, та вони були майже еквівалентними.
Продемонстрували, що Ем2-ІДСІ та Ем4-ІДС! мають зв'язувальну здатність з розчинним рецептором І//-6, яка є еквівалентною або більшою порівняно зі зв'язувальною здатністю антитіла природного типу.
Аналіз зв'язування клонів, що зв'язуються залежно від рН, з рецептором 1-6 мембранного типу
Реакції антиген-антитіло щодо рецептора 1-6 мембранного типу спостерігали при рн 5,8 та при рН 7,4 для чотирьох типів побудованих клонів: УТ, НЗрі/ 73-ІдсІ, Ем2-ІДдсіІ та Ема4-Ідсі, використовуючи Віасоге Т100 (СЕ Неайвсаге). Зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу визначили шляхом оцінювання зв'язування з рецептором ІІ--6, іммобілізованим на сенсорному
Зо чипі. зК344 біотинілували згідно зі способом, відомим фахівцям у цій галузі, та біотинілований 5К344 іммобілізували на сенсорному чипі за допомогою стрептавідину, використовуючи афінність між стрептавідином та біотином. Усі вимірювання виконували при 37 "С. Буфер рухомої фази був наступним: 10 мМ МЕ5 (рН 5,8), 150 мм Масі та 0,05 95 Тм'ееп 20. До цього випорснули клони, що зв'язуються залежно від рН, при рН 7,4, дозволивши їм зв'язатися з 5344 (буфер для випорскування зразка: 10 мМ МЕЗ (рН 7,4), 150 мМ Масі, 0,05 95 Тмеєп 20), потім залежне від рН відокремлення кожного клону спостерігали при рН рухомої фази 5,8 (Фіг. 17).
Концентрації зразків довели до 0,25 мкг/мл. Зв'язування здійснювали у 10 мМ МЕЗ (рн 7,4), 150 мМ масі та 0,05 95 Туееп 20. Відокремлення здійснювали у 10 мМ МЕЗзЗ (рН 5,8), 150 мМ
Масі та 0,05 95 Тмееєп 20. Для цього випадку константи швидкості дисоціації (Ка(1/с)) при рН 5,8 розрахували, приводячи у відповідність тільки фазу відокремлення при рН 5,8, використовуючи при цьому програмне забезпечення Віасоге ТІ0О Емаїчайоп Зоймаге (СЕ Неайвсаге). Подібним способом концентрації зразків довели до 0,25 мкг/мл, зв'язування здійснювали у 10 мМ МЕЗ (рн 7,4), 150 мМ Масі та 0,05 95 Тмееп 20, відокремлення виконували у 10 мМ МЕЗ (рН 7,4), 150 мм масі та 0,05 96 Туееп 20, та константи швидкості дисоціації (Ка(Мс)) при рН 7,4 розрахували, приводячи у відповідність тільки фазу відокремлення при рН 7,4, використовуючи при цьому програмне забезпечення Віасоге ТІ00О Емаїчайоп Зоймаге (СЕ НеаїШсаге). Залежні від рн константи швидкості дисоціації для кожного клону наведено у Таблиці 8.
Таблиця 8
Порівняння констант швидкості дисоціації клонів, що зв'язуються залежно від рН, при відокремленні від рецептора 1-6 мембранного типу, 5К344
Ка(1/5) Ка(1/5) ка(рноь.вука(рнт.а)
Внаслідок розрахунку залежності від рН для кожного клону значення залежності від рн зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу чотирьох клонів, УМТ, НЗрі/І 73-ІДИІ, Еме2-ІдосІ та
Ем4-ІДСІ, стосовно 5К344 перебільшували у 1,0 раз, 2,59 рази, 7,18 рази та 5,56 рази, відповідно. Ем2-ЇдДС! та Ем4-ІДс! продемонстрували більш високу залежність від рН при відокремленні від рецептора ІІ -6 мембранного типу порівняно з НЗрІЛЛЗ-Ідаі.
На підставі вищевказаного, було продемонстровано, що Ем2-ЇдсІ та Ем4-ІДОІ демонструють більш сильне залежне від рН зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу, ніж НЗрі// 73-
І9СІ, при цьому підтримуючи афінність щодо розчинного рецептора ІІ -6 таку саму або сильнішу порівняно з афінністю антитіла природного типу.
Приклад 11. Тестування ФК/ФД антитіл, що зв'язуються залежно від рН, з оптимізованими варіабельними ділянками з використанням трансгенних мишей з рецептором 1-6 людини
Фармакокінетику Ем2-ЇДдСІ та Ем4-ІдсіІ, а також антитіла природного типу та НЗрі/ 73-ІдДаІ, отриманого та оціненого у Прикладі 1, оцінювали, використовуючи трансгенних мишей з рецептором ІЇ-6 людини, яких використовували у Прикладі 8. Антитіло природного типу,
НЗрі/ 73-ІДаї, Ем2-ІДдОІ або Ем4-ІдОІ вводили шляхом внутрішньовенної ін'єкції у вигляді єдиної дози мишам ПІ -6К 19 у дозі 25 мг/кг, та концентрацію кожного антитіла у плазмі вимірювали таким самим способом, як і у Прикладі 8. Зміну за часом концентрацій у плазмі антитіла природного типу, НЗрі/ 73-ІДаі, Ем2-ІДдоІ та Ем4-ІДОІ наведено на Фіг. 18.
Фармакокінетика НЗрі/ 73-ІДСІ була покращена порівняно з антитілом природного типу за таким самим способом, що і у Прикладі 8, проте фармакокінетика Ем2-ІДдсіІ та Ем4-Ідсі іще більше покращилася порівняно з НЗрі//73-І9СІ. Вимірювання стосовно концентрацій незв'язаного рецептора 1-6, які вимірювалися у мавп супотоїди5 у Прикладі 9, у цьому тесті здійснювали у мишей ПІ -6К 19, використовуючи такий самий спосіб. Внаслідок цього, подовження тривалості нейтралізації розчинного рецептора І/-6 підтвердили для Ем2-ІдсіІ та
Ем4-ІДСІ порівняно з подовженням тривалості нейтралізації для НЗрі// 73-94! (дані не наведено). Як вказано у Прикладі 10, залежне від рН зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу покращилося для Ем2-Ідсі та Ем4-ІдсІ порівняно з НЗрі/ 73-ІДСІ. Отже, було
Зо вказано, що подальше покращення фармакокінетики та тривалості нейтралізації розчинного рецептора 1-6 порівняно з НЗрі/ 73-ІДОІ є можливим за рахунок покращення залежного від рн зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу.
Приклад 12. Покращення залежного від рН зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу шляхом оптимізації константної ділянки
Оптимізація константної ділянки Ем4-ЇІдсі
Взагалі повідомлялося, що зв'язування з антигенами, пов'язаними з мембраною, різниться залежно від константної ділянки антитіла (У. Іттипої. Меїпод5 1997 дип 23; 205(1): 67-72).
Константні ділянки антитіл, що зв'язуються залежно від рн, які отримали вище, мали тип Ідої.
Отже, виконали дослідження щодо оптимізації константної ділянки з метою покращення залежного від рН зв'язування з рецептором ІЇ-6 мембранного ізотипу. Мутацію зробили у природно виникаючій константній ділянці, а саме, константній ділянці Ідс2 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 28), внаслідок чого побудували константну ділянку І(ІЧ2ДОК (ЗЕО ІЮ МО: 29). Іншу мутацію зробили у константній ділянці І(952ДОК, внаслідок чого побудували константну ділянку М58 (ЗЕО ІЮ МО: 30). Мутації далі зробили у константній ділянці Ідбс2 та М58, внаслідок чого побудували константні ділянки М71 (5ЕО ІЮО МО: 31) та М7З (ЗЕО ІЮ МО: 32).
МНЗ-ІдД2ЛОК (ЗЕО ІЮ МО: 33) побудували шляхом заміщення константної ділянки МНЗ-Їда, отриманої у Прикладі 10, константною ділянкою ІдсС2ДОеК, МНЗ-М58 (5ЕБО ІО МО: 34) побудували шляхом заміщення константної ділянки константною ділянкою М58 та МНЗ-М7З (ЗЕО ІО МО: 35) побудували шляхом заміщення константної ділянки константною ділянкою М73. бо
Більш специфічно, побудували вектори експресії, у яких частину константної ділянки МНЗ, що використовувалася у Прикладі 10, замістили бажаною константною ділянкою шляхом перетравлення МпеййМої! та зшивання. Нуклеотидні послідовності отриманих векторів експресії визначили, використовуючи спосіб, відомий звичайним фахівцям у цій галузі.
Експресію та очищення здійснювали для наступних антитіл: Ем4-І952, використовуючи МНЗ-
ІЯс2лЛОК (ЗЕБО ІО МО: 33) для важкого ланцюга та М 3-СК (5ЕБО ІЮО МО: 27) для легкого ланцюга; Ем4-М58, використовуючи МНЗ-М58 (ЗЕО ІО МО: 34) для важкого ланцюга та МІ 3-СК (ЗЕО ІО МО: 27) для легкого ланцюга; та Ем4-М73, використовуючи МНЗ-М7З (ЗЕО ІО МО: 35) для важкого ланцюга та МІ 3-СК (5ЕО ІЮ МО: 27) для легкого ланцюга. Експресію та очищення здійснювали за способом, описаним у Прикладі 1.
Аналіз зв'язування Ем4, який має оптимізовану константну ділянку, з розчинним рецептором
І/-6
Асоціацію з 5К344 та відокремлення від нього спостерігали у реальному часі, використовуючи такий самий спосіб, що і у Прикладі 10, для отриманих таким способом Ем4-
ІЗ, Ем4-Ідс2, Ем4-М58 та Ем4-М73, а також для антитіла природного типу. Константи швидкості асоціації Ка(1/Мс) та константи швидкості дисоціації Ка(1/с) розрахували після аналізу за таким же способом, а потім константи дисоціації КО (М) розрахували на основі цих значень (Таблиця 9).
Таблиця 9
Порівняння констант швидкості дисоціації клонів, які зв'язуються залежно від рнН та які відокремлюються від розчинного рецептора 1-6, 58344
Внаслідок розрахунку афінності при рН 7,4 для кожного клону встановили, що константи дисоціації (афінність, значення КО) Ем4-Ідс1, Ем4-ІДС2, Ем4-М58 та ЕРм4-М7/З щодо 54344 становили 1,4 нМ, 1,3 нМ, 1,4 нМ та 1,4 нМ, відповідно, та вони є майже еквівалентними. Це вказує на те, що зв'язувальна здатність клонів, що зв'язуються залежно від рН, з розчинним рецептором 1-6, 5К344, не змінюється навіть після модифікування константної ділянки. На основі цього результату вважали, що зв'язувальна здатність з розчинним рецептором 1-6 не змінюється для Ем!, Ем2 та Ем3, навіть якщо константну ділянку модифікують подібним способом.
Аналіз зв'язування Ем4, що має оптимізовану константну ділянку, з рецептором 1-6
Зо мембранного типу
Реакції антиген-антитіло з рецептором І/-6 мембранного типу при рН 5,8 та рН 7,4 спостерігали для отриманих таким способом Ем4-Ідаі, Ем4-ІДС2, Ем4-М58 та Ем4-М73, а також для антитіла природного типу за таким самим способом, як і у Прикладі 10, використовуючи
Віасоге ТІ0О (СЕ Неайпсаге) На Фіг. 19 наведено результати, отримані внаслідок випорскування клонів, що зв'язуються залежно від рН, за умовами рН 7,4, для того, щоб сприяти зв'язуванню з 5К344, та внаслідок спостереження залежного від рН відокремлення кожного клону у рухомій фазі з рН 5,8. Наступні аналізи виконували за таким самим способом, як і у Прикладі 10, та швидкості залежного від рН відокремлення для кожного клону наведено у
Таблиці 10.
Таблиця 10
Порівняння констант швидкості дисоціації клонів, що зв'язуються залежно від рН, при відокремленні від рецептора 1-6 мембранного типу, 5К344
Ка(1/5) Ка(1/5) ка(рноь.вука(рнт.а)
Таблиця 10 (продовження)
Ка(1/5) Ка(1/5) ка(рноь.вука(рнт.а)
Внаслідок розрахунку залежності від рН для кожного клону встановили, що залежність від рН Ем4-Їда1, Ем4-Ідс2, Ем4-М58 та Ем4-М7З щодо 5К344 перебільшувала у 5,6 разів, 17,0 разів, 17,6 разів та 10,1 разів, відповідно; отже, усі з Ем4-ІДс2, Бу4-М58 та Ем4-М7З демонстрували більш високе залежне від рН відокремлення від рецептора 1-6 мембранного типу порівняно з
Ем4-Ідат1.
На підставі результатів аналізу зв'язування з розчинним рецептором 1-6 та зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу із використанням варіабельної ділянки Ем4, визначили, що заміщення константної ділянки від ЇДС1 на Ідс2, М58 або М7З могло б покращити залежне від рН зв'язування з рецептором І/-6 мембранного типу, не спричиняючи змін в афінності з розчинним рецептором 1-6. Вважали, що це є доречним длябБуї, Ем2Тагм3.
Приклад 13. Тестування ФК/ФД антитіл, які зв'язуються залежно від рН та мають оптимізовану константну ділянку, із використанням трансгенних мишей з рецептором 1-6 людини
Фармакокінетику Ем4-Ідс1, Ем4-Ід02 та Ем4-М58, отриманих у Прикладі 12, оцінювали, використовуючи трансгенних мишей з рецептором 1//-6 людини (миші ПІІ -6К 19), яких використовували у Прикладі 8 для дослідження впливу константної ділянки на фармакокінетику.
Антитіло природного типу, Ем4-Ідс1, Ем4-Ідо2 або Рм4-М58 ввели мишам ПІГ-6К 4 шляхом внутрішньовенної ін'єкції єдиною дозою, що становила 25 мг/кг, а потім виконували вимірювання концентрацій у плазмі кожного антитіла за таким самим способом, як і у Прикладі 8. Зміну за часом концентрацій у плазмі для антитіла природного типу, Ем4-ІдСс1, Ем4-Ід62 та Ем4-М58 наведено на Фіг. 20.
Подібно до Прикладу 11, фармакокінетика Ем4-ІДс! покращилася порівняно з антитілом природного типу, а фармакокінетика Ем4-Ід2 та Гм4-М58 далі покращилася порівняно з Ем4-
ІЧОе1. Вимірювання стосовно концентрацій незв'язаного рецептора ІІ -6, які вимірювалися у мавп супотодіи5 у Прикладі 9, здійснювали у мишей ПІІ -6К ід у цьому тесті, використовуючи такий самий спосіб. Внаслідок цього визначили, що подовження тривалості нейтралізації розчинного рецептора 1-6 підтвердилося для Ем4-Ід52 та Ем4-М58 порівняно з Ем4-ІД51 (дані не
Зо наведено). Подібно вказаному у Прикладі 10, залежне від рН зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу покращилося для Ем4-Ід52 та Ем4-М58 порівняно з Ем4-Ідс1. Отже, було показано, що покращення залежного від рН зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу та покращення фармакокінетики та тривалості нейтралізації розчинного рецептора 1!//-6 є можливим за рахунок заміщення константної ділянки від Їдсі на Ідс2 або М58. На основі цих результатів вважали, що фармакокінетику та тривалість нейтралізації розчинного рецептора І/-- 6, не тільки у випадку Ем4, але також у випадках Емі, Ем2 та Еу3, можна покращити порівняно з
ІСІ за рахунок заміщення константної ділянки від Їде1 на Іде2 або М58.
Приклад 14. Побудова антитіл, які зв'язуються залежно від рН та мають оптимізовані варіабельні та константні ділянки МН2-М71 (ЗЕО ІЮО МО: 36) та МН2-М7З (ЗЕО ІО МО: 37), що мають М71 та М7З для константної ділянки МН2-ІДО1, та МН4-М71 (5ЕО ІО МО: 38) та МН4--М7З (ЗЕБЕО ІО МО: 39), що мають М71 та М73 для константної ділянки МН4-ІДдСІ, побудували, використовуючи такий самий спосіб, як описано вище.
Ем1-М71, що використовує МН2-М71 для важкого ланцюга та МІ 2-СК для легкого ланцюга,
ЕмМІ-М73, що використовує МН2-М7З для важкого ланцюга та МІ 2-СК для легкого ланцюга, Ем3-
М71, що використовує МН4-М71 для важкого ланцюга та МІ 1-СК для легкого ланцюга, та Ем3-
М7З3, що використовує МН4-М7З для важкого ланцюга та МІ/1-СК для легкого ланцюга, експресували та очистили. Експресію та очищення здійснювали за способом, описаним у
Прикладі 1.
Аналізи зв'язування антитіл, які зв'язуються залежно від рН та мають оптимізовані варіабельні та константні ділянки, з розчинним рецептором ІІ -6
Асоціацію з та відокремлення від 5К344 спостерігали у реальному часі, використовуючи такий самий спосіб, як і у Прикладі 10, для 11 типів антитіл, а саме: гуманізованого антитіла
РМІ (природного типу) та НЗрі/Л 73-Ід4с21, Ем1-М71, Ем1-М73, Ем2-Іда1, Ем3-М71, Ем3-М73, Ема-
Іст, Ем4-Ідс2, Ем4-М58 та Ем4-М7З3, побудованих, як описано вище. Константи швидкості асоціації Ка(1/Мс) та константи швидкості дисоціації Ка (1/с) розрахували за допомогою аналізу за таким самим способом, та константи дисоціації КО (М) розрахували на основі цих значень (Таблиця 11).
Таблиця 11
Порівняння констант швидкості дисоціації клонів, що зв'язуються залежно від рН, при відокремленні від розчинного рецептора 1-6, 58344
Визначили, що усі з отриманих 10 типів клонів, що зв'язуються залежно від рН, мають константи дисоціації (афінність, значення КО) при відокремленні від розчинного рецептора І1І--6, які дорівнюють або є більш сильними порівняно з антитілом природного типу.
Аналізи зв'язування антитіл, які зв'язуються залежно від рН та мають оптимізовані варіабельні та константні ділянки, з рецептором 1-6 мембранного типу
Реакції антиген-антитіло з рецептором І/-6 мембранного типу при рН 5,8 та рН 7,4 спостерігали за таким самим способом, як і у Прикладі 10, використовуючи Віасоге Т100 (СЕ
Неайсаге), для 11 типів антитіл, а саме: гуманізованого антитіла РМІ1 (природного типу) та
НЗріл 73-ІДСа1, ЕЄм1-М71, ЕМІ-М73, Ем2-Їда, Ем3-М71, Ем3-М73, Ем4-Ідса1, Ем4-Ідсе2г, Ем4-М58 та
Ема4-М73, отриманих, як описано вище. Клони, що зв'язуються залежно від рН, випорснули при умові рН 7,4, дозволивши їм зв'язатися з 5К344, а потім спостерігали залежне від рн відокремлення кожного клону при рН рухомої фази, рН 5,8. Результати наведено на Фіг. 21 (результати для Ем1-М71, Ем1-М73, Ем3-М71 та Ем3-М73 наведено на Фіг. 21, тоді як результати для інших клонів наведено на фіг. 17 та 19). Аналізи здійснювали за таким самим способом, і як у Прикладі 10, та залежність від рН констант швидкості дисоціації усіх 11 типів клонів наведено у Таблиці 12.
Таблиця 12
Залежність від рН констант швидкості дисоціації клонів, що зв'язуються залежно від рН, при відокремленні від рецептора 1-6 мембранного типу, 5К344
Ка(1/5) Ка(1/5) ка(рноь.вука(рнт.а)
Десять тинів отриманих клонів, що зв'язуються залежно від рН, демонстрували залежну від рН зв'язувальну здатність з рецептором 1-6 мембранного типу. Крім того, визначили, що усі з
Ем1-М71, Ем1-М73, Ем2-Ідс1, Ем3-М71, Ем3-М7З3, Ем4-Ідс1, Ем4-Ідс02, Ем4-М58 та Ем4-М7З демонстрували покращене залежне від рН зв'язування з рецептором 1-6 мембранного типу порівняно з НЗрі/ 73-ІдсіІ, та для них було визначено, що час, доки антитіло не зникне з плазми, а також час, коли розчинний рецептор 1-6 та рецептор І/-6 мембранного типу зв'язуються з антитілом в організмі, подовжується суттєво порівняно з антитілом природного типу, як показано для мавп супотодіиз у Прикладі 9.
Приклад 15. Тестування ФК/ФД антитіл, які зв'язуються залежно від рН та які мають оптимізовані варіабельні та константні ділянки, із використанням мавп супотодіив
Побудова відомого високоафінного антитіла проти рецептора 1-6
Вектор експресії для клітин ссавців побудували для експресування високоафінного антитіла проти рецептора І/-6 МОВЕ11-21 пІдС1, описаного у О5 2007/0280945 А! (05 2007/0280945 АЇ, амінокислотні послідовності 19 та 27) у якості відомого високоафінного антитіла проти рецептора 1-6. Варіабельну ділянку антитіла побудували шляхом ПЛР, об'єднавши синтетичні оліго-ДНК (ПЛР-складання). Константну ділянку ампліфікували шляхом ПЛР з вектора експресії, що використовувався у Прикладі 1. Варіабельну ділянку антитіла та константну ділянку антитіла зшили шляхом ПЛР-складання та вставили у вектор для експресії у ссавців. Отримані фрагменти ДНК важкого та легкого ланцюгів вставили у вектори експресії для клітин ссавців, внаслідок чого побудували вектор експресії важкого ланцюга та вектор експресії легкого ланцюга, які представляють інтерес. Нуклеотидні послідовності отриманих векторів експресії визначили за способом, відомим звичайним фахівцям у цій галузі. Експресію та очищення здійснювали, використовуючи побудовані вектори експресії. Експресію та очищення здійснювали за способом, описаним у Прикладі 1, внаслідок чого отримали високоафінне антитіло проти рецептора 1-6 (високоафінне АБ).
Тестування ФК/ФфД у мавп Смпото!/Їди5
Фармакокінетику та фармакологічну ефективність оцінювали у мавп супотодіи5 для антитіл
НЗрі/ 73-ІДЕ1 та Ем1-М71, Ем1-М73, Ем2-Іда1, Ем3-М7З та Ем4-М73, які зв'язуються залежно від рН, та для відомого високоафінного антитіла проти рецептора 1/Ї/-6 (високоафінного АБ).
Ко) НЗріл 73-ІДа1, Єм1-М71, Ем1-М73, Ем2-Їдса1, Гм3-М7З або Рм4-М7З ввели мавпам супотоїди5 шляхом внутрішньовенної ін'єкції єдиною дозою у 0,5 мг/кг, тоді як високоафінне АЬ вводили єдиною дозою у 1,0 мг/кг шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Зразки крові узяли до ведення та з часом. Концентрацію у плазмі кожного антитіла вимірювали за таким самим способом, як і у
Прикладі 9. Зміну за часом концентрацій у плазмі НЗрі/Л 73-11, Ем1-М71, Ем1-М73, Ем2-ІдДа1,
Ем3-М7З та Рм4-М73, а також високоафінного АБ наведено на Фіг. 21. Для того, щоб оцінити фармакологічну ефективність як ступінь, до якого рецептор І/-6 мембранного типу у мавп супотодіи5 нейтралізується, І -б6 мавп супотодіи5 вводили підшкірно у нижні частини спини тварин щоденно по 5 мкг/кг з 3-го по 10-ий день (з 6-го по 10-ий день у випадку високоафінного
АБ) після введення антитіла за таким самим способом, як і у Прикладі 9. Концентрацію СЕР у кожної тварини вимірювали через 24 години після кожного введення. Зміну за часом концентрацій СКР з введенням кожного антитіла наведено на Фіг. 22. Для того, щоб оцінити фармакологічну ефективність як ступінь нейтралізації розчинного рецептора 1!/-6 мавп супотодіи5, концентрацію незв'язаного розчинного рецептора І/-6 мавп супотодіи5 у плазмі мавп супотодіиє вимірювали за таким самим способом, як і у Прикладі 9. Зміну за часом концентрацій незв'язаного розчинного рецептора І/-6 мавп супотодіи5 з введенням кожного антитіла наведено на Фіг. 23.
Внаслідок цього концентрації антитіл у плазмі підтримувалися на високому рівні для кожного з ЕМ1-М71, Ем1-М73, Бм2-ІДСї, Ем3-М7З та Ем4-М7З порівняно з НЗрі// 73-І9051, проте концентрації СКР та незв'язаного розчинного рецептора 1-6 мавп супотодіи5 підтримувалися на низькому рівні. А саме, цей результат показав, що час, коли рецептори 1-6 мембранного типу та розчинного типу зв'язуються антитілом (або, інакше кажучи, тривалість нейтралізації), подовжився завдяки антитілам порівняно з НЗрі/ 73-Ідаі.
Крім того, стосовно цих антитіл проти рецептора ІІ -6, які зв'язуються залежно від рН, було підтверджено їхні ефекти нейтралізації та безперервну ефективність, які дорівнювали або перебільшували нейтралізацію та ефективність відомого високоафінного антитіла проти рецептора 1-6 (високоафінного АБ), яке вводилося у дозі 1,0 мг/кг, тільки при половині його дози, а саме при 0,5 мг/кг. Отже, було визначено, що антитіла, які зв'язуються залежно від рн, мають ефекти нейтралізації та безперервну ефективність, переважну, порівняно з нейтралізацією та ефективністю відомого високоафінного антитіла проти рецептора 1/--6.
Було також підтверджено, що ті антитіла, які наведені у Таблиці 12 та для яких не виконувалися тестування ФК/ФД із використанням мавп супотодіи5, як у цьому тесті, демонструють покращене залежне від рН зв'язування з рецептором ІЇ-б6 мембранного типу порівняно з НЗрі//73-ІДО1. Отже, також вважають, що час, протягом якого розчинний та мембранний рецептори 1-6 зв'язуються антитілами (або, інакше кажучи, ефекти тривалості нейтралізації та безперервної нейтралізації), подовжується для антитіл порівняно з НЗрі/ 73-
ІДИ.
У Прикладі 9 визначили, що для НЗрі// 73-ІдДО1 час, доки антитіло не зникає з плазми, а також час, коли розчинний рецептор І/-б та рецептор І/-6 мембранного типу зв'язуються антитілом в організмі (ефект безперервної нейтралізації), подовжується суттєво порівняно з антитілом природного типу. Отже, вважають, що Ем1-М71, Ем1-М73, Ем2-Іда1, Ем3-М71, Ем3-
М73, Ема4-ІдСа1, Ем4-ІДСб2, Ем4-М58 та Ем4-М73, які мають переважні ефекти безперервної нейтралізації відносно НЗрі/Л/ 73-51, мають суттєво покращені ефекти безперервної нейтралізації порівняно з антитілом природного типу.
На відміну від антитіл проти рецептора ІІ 6, антитіла проти рецептора 1-6, які зв'язуються залежно від рН та які було розроблено для сильного зв'язування з антигеном при рН 7,4 у плазмі, проте тільки для слабкого зв'язування з антигеном при рН 5,8 в ендосомах, дозволяють знизити дозу пацієнту та частоту введення антитіла проти рецептора ІІ -6, та, як наслідок, вони можуть суттєво знизити загальну кількість введення. Отже, вважають, що антитіла проти рецептора 1-6, що зв'язуються залежно від рН, є надзвичайно переважними як фармацевтичні препарати для використання у якості антагоніста 1-6.
Приклад 16. Побудова антитіла проти ІІ -6, що зв'язується залежно від рн
Експресія та очищення антитіла проти 1-6
У Прикладах від 1 до 15 багато гуманізованих антитіл проти рецептора ІІ 6, які зв'язуються залежно від рН з рецептором ІІ--6, були успішно створені шляхом надання залежності внаслідок введення заміщень гістидином та їм подібного у варіабельну ділянку, зокрема, у послідовності
СОК гуманізованих антитіл проти рецептора 1-6. Визначили, що усі ці антитіла неодноразово зв'язуються з рецептором 1-6 та демонструють суттєве покращення у ФК/ФД.
Отже, було підтверджено, що залежну від рН здатність антитіла зв'язуватися з антигеном можна надати іншому антитілу, яке зв'язується з антигеном, відмінним від рецептора І1/-6, використовуючи при цьому подібний спосіб. ІЇ-6 людини вибрали як антиген, та побудували антитіло проти І--6, яке включає важкий ланцюг (природний тип) (амінокислотна послідовність:
ЗЕО ІЮО МО: 62) та легкий ланцюг (природний тип) (амінокислотна послідовність: БЕО ІЮ МО: 63), яке зв'язується з ІІ -6, як описано у УМО 2004/039826, ("природний тип проти 16" ("Апіі-ІІ 6 м/йа їуре")). Використовуючи відомий для фахівців у цій галузі спосіб, генні фрагменти, що кодують амінокислотні послідовності антитіла, які представляють інтерес, вставили у вектори експресії для клітин ссавців, внаслідок чого побудували вектор експресії важкого ланцюга та вектор експресії легкого ланцюга, які представляють інтерес. Нуклеотидні послідовності отриманих векторів експресії визначили, використовуючи відомий фахівцям спосіб. Природний тип проти 1-6 експресували та очистили за способом, описаним у Прикладі 1.
Побудова антитіла проти ІІ-6, що зв'язується залежно від рН
Щоб надати антитілу залежної від рН здатності зв'язуватися з ІІЇ-6, зробили гістидинові заміщення амінокислот у СОК антитіла проти І/-6 (проти І/-6 природного типу), включаючи важкий ланцюг (природний тип) (амінокислотна послідовність: ЗЕО ІО МО: 62) та легкий ланцюг (природний тип) (амінокислотна послідовність: ЗЕО ІЮО МО: 63). Внаслідок заміщення гістидином в амінокислотах СОК та наступного скринінгу отримали декілька клонів, що демонструють залежне від рН зв'язування. Зв'язування при рН 5,5 суттєво зменшилося порівняно зі зв'язуванням при рнН 7,4. Позиції заміщення гістидином у залежних від рН клонах наведено у
Таблиці 13. Приклади включають "клон 1 проти 1-6", що включає важкий ланцюг (с1) (амінокислотна послідовність: ЗЕ 10 МО: 64) та легкий ланцюг (с1) (амінокислотна послідовність: ЗЕБО ІО МО: 65), та "клон 2 проти ІЇ/-6", що включає важкий ланцюг (с1) (амінокислотна послідовність: ЗЕ 10 МО: 64) та легкий ланцюг (с2) (амінокислотна послідовність: БЕО ІО МО: 66). Клон 1 проти ІІ -6 та клон 2 проти 1-6 експресували та очистили за способом, описаним у Прикладі 1.
Таблиця 13. Позиції заміщення гістидином у залежних від рН клонах
НЗ2,Н59,Не1, Нео
Ї53,154,190, 194
Аналіз зв'язування залежних від рН клонів з І-6 людини
Аналіз кінетики реакцій антиген-антитіло при рН 5,5 та рн 7,4 здійснювали, використовуючи бо Віасоге Т100 (СЕ Неаївсаге) для трьох типів антитіл, отриманих, як описано вище: природний тип проти 1-6, клон 1 проти 1-6 та клон 2 проти 1-6 (буфер: ОРВБ(-) (рН 7,4 або рН 5,5), 150
ММ Масі). Антитіла зв'язали з сенсорним чипом, на якому був іммобілізований рекомбінантний білок А/З (Ріегсе), шляхом амінного з'єднання, а потім І/-б6 людини (Тогау), доведений до відповідної концентрації, випорснули на чип як аналітичний зразок. Усі вимірювання виконували при 37 "С. Константи швидкості асоціації Ка (1/Мс) та константи швидкості дисоціації Ка (1/с) розрахували, використовуючи програмне забезпечення Віасоге Т100 Емаїчайоп боймаге (СЕ
Неансаге), а константи дисоціації КО (М) розрахували на основі цих значень (Таблиця 14). Крім того, відношення афінності при рН 5,5 та рН 7,4 розрахували для кожного клону, щоб оцінити залежне від рН зв'язування.
Таблиця 14
Порівняння зв'язування з ІІ -6 залежних від рН клонів
КОо(рно5.Б)у/
Природнийтит /- 65 5 ле ЕхоУ зе ТВ
Розрахували відношення афінності при рН 5,5 та рН 7,4 («КОХрРН 5,5/КОХ(рн 7,4)), яке вказує на те, що залежне від рН зв'язування з ІЇ-б6 людини становило 0,8, 10,3 та 13,5 для антитіла природного типу проти 1І--6, клону 1 проти ІІ--6 та клону 2 проти ІІ--6, відповідно. Тобто, здатність до залежного від рН зв'язування кожного клону більш ніж у десять разів перебільшувала здатність антитіла природного типу. Сенсорграми клону 2 проти 1-6 при рН 7,4 та при рН 5,5 наведено на Фіг. 26.
Отже, було показано, що, як у випадку антитіл проти рецептора ІІ -6, антитіла проти 1-6, що зв'язуються залежно від рн, які зв'язуються з антигеном сильно за нейтральних умов у плазмі, але зв'язуються слабо за внутрішньоендосомних кислотних умов, можна побудувати шляхом здійснення заміщень гістидином та йому подібним здебільшого в амінокислотній послідовності
СОК. Як показано у Прикладах від 1 до 15, антитіло проти рецептора І1І--6, яке має здатність до залежного від рН зв'язування, неодноразово зв'язується з рецептором 1-6, та ФК/ФфД помітно покращується. Отже, припустили, що клон 1 проти ІІ -6 та клон 2 проти 1-6, які мають залежну від рН зв'язувальну здатність, неодноразово зв'язуються з більшою кількістю антигенів, при цьому ФК/ФД є суттєво покращеною порівняно з антитілом природного типу проти ІІ -6.
Приклад 17. Побудова антитіла проти рецептора ІІ--6, яке зв'язується залежно відріН
Експресія та очищення антитіла проти рецептора 1-6
У Прикладах від 1 до 15 багато гуманізованих антитіл проти рецептора ІІ -6, які зв'язуються
Зо залежно від рН з рецептором 1-6, успішно утворили шляхом надання залежності від рН завдяки здійсненню заміщень гістидином та йому подібним у варіабельній ділянці, зокрема, у послідовності СОК гуманізованих антитіл проти 1-6. Визначили, що усі з цих антитіл неодноразово зв'язувалися з рецептором 1-6 та демонстрували суттєве покращення ФК/ФД.
Отже, підтвердили, що залежну від рН здатність антитіла зв'язуватися з антигеном можна надати іншому антитілу, яке зв'язується з антигеном, відмінним від рецептора 1-6, використовуючи такий самий спосіб. Мишачий рецептор 1-31 вибрали як антиген та побудували антитіло проти рецептора ІЇ/-31, яке включає важкий ланцюг (природний тип) (амінокислотна послідовність: 5ЕО ІЮ МО: 67) та легкий ланцюг (природний тип (амінокислотна послідовність: БЕО ІЮ МО: 68) та яке зв'язується з мишачим рецептором 1-31, як описано у УМО 2007/142325 ("природний тип проти І-31К"). Використовуючи відомий фахівцям у цій галузі спосіб, генні фрагменти, що кодують амінокислотні послідовності, що представляють інтерес, вставили у вектори експресії для клітин ссавців, внаслідок чого побудували вектор експресії важкого ланцюга та вектор експресії легкого ланцюга, які представляють інтерес. Нуклеотидні послідовності отриманих векторів експресії визначили, використовуючи відомий фахівцям у цій галузі спосіб. Антитіло природного типу проти ІЇЗ1К експресували та очистили за способом, описаним у Прикладі 1.
Побудова залежного від рН антитіла проти рецептора 1І -31
Щоб надати залежної від рН здатності антитілу зв'язуватися з рецептором 1-31, зробили заміщення гістидином в амінокислотах СОК антитіла проти рецептора 1-31 (антитіло природного типу проти І-З1К), яке включає важкий ланцюг (природного типу) (амінокислотна послідовність: БЕО ІЮ МО: 67) та легкий ланцюг (природного типу (амінокислотна послідовність:
ЗЕО ІЮ МО: 68). Внаслідок заміщень гістидином в амінокислотах СОК та наступного скринінгу отримали декілька клонів, які демонструють залежне від рН зв'язування. Зв'язування при рн 5,5 було суттєво зменшеним порівняно зі зв'язуванням при рН 7,4. Позицію заміщення гістидином у залежних від рН клонах наведено у Таблиці 15. Приклад - це "клон 1 проти І-З31Е", який включає важкий ланцюг (сі) (амінокислотна послідовність: 5ЕО ІЮ МО: 69) та легкий ланцюг (природного типу). Клон 1 проти ІЇ/З1К експресували та очистили, використовуючи спосіб, описаний у
Прикладі 1.
Таблиця 15. Позиція заміщення гістидином у залежних від рН клонах нзЗ
Аналіз зв'язування залежних від рН клонів з розчинним рецептором 1-31
Аналіз кінетики реакцій антиген-антитіло при рН 5,5 та рН 7,4 здійснювали, використовуючи
Віасоге ТІ 00 (СЕ Неакйвсаге) для двох типів антитіл, отриманих, як описано вище: антитіло природного типу проти 1-31 та клон 1 проти І-З1К (буфер: ОРВЗ(-) (рН 74 або рН 5,5), 150 мМ
Масі, 0,01 95 Гмуееп 20, 0,02 95 МаМз). Ці антитіла зв'язали з сенсорним чипом, на якому був іммобілізований рекомбінантний білок А/з (Рієегсе), шляхом амінного з'єднання, а потім розчинний мишачий рецептор 1-31 (отриманий згідно зі способом, описаним у УМО 2007/142325), доведений до відповідної концентрації, випорснули на чип як аналітичний зразок.
Усі вимірювання виконували при 25 "С. Константи швидкості асоціації Ка(1/Мс) та константи швидкості дисоціації Ка(1/с) розрахували, використовуючи програмне забезпечення Віасоге ТІО0
ЕмаїІнайоп боймаге (СЕ Неайсаге), а константи дисоціації КО (М) розрахували на основі цих значень (Таблиця 16). Крім того, відношення афінності при рН 5,5 та рН 7,4 розрахували для кожного клону, щоб оцінити залежне від рН зв'язування.
Таблиця 16
Порівняння зв'язування залежних від рН клонів з мишачим рецептором 1-31
Ко(рно5.Ву/ тип шили ши ши ши ШИ того
Розрахували відношення афінності при рН 5,5 та рН 7,4 (КОХрН 5,5/(КОХ(рн 7,4)), яке
Зо вказує на те, що залежне від рН зв'язування з мишачим рецептором 1-31 становило 3,2 та 1000 для антитіла природного типу проти І/З1ЖК та для клону 1 проти ІЗ1Е, відповідно. Тобто, здатність до залежного від рН зв'язування клону 1 проти І/З1К приблизно у 300 разів перебільшувала здатність антитіла природного типу. Сенсорграми клону 1 проти І-З1Е при рн 7,4 та при рН 5,5 наведено на Фіг. 27.
Отже, було показано, що як і у випадку антитіл проти рецептора ІІ -6 та антитіл проти ІІ -6, антитіла проти рецептора 1-31, що зв'язуються залежно від рН, які сильно зв'язуються з антигеном за нейтральних умов у плазмі, але слабо зв'язуються за внутрішньоендосомних кислотних умов, можна побудувати шляхом здійснення заміщень гістидином та йому подібним здебільшого в амінокислотній послідовності СОР. Як показано у Прикладах від 1 до 15, антитіло проти рецептора ІЇ/-б, яке має здатність до залежного від рН зв'язування, неодноразово зв'язується з рецептором 1-6, та ФК/ФД помітно покращується. Отже, припустили, що клон 1 проти І-ЗІ1К, який має залежну від рН зв'язувальну здатність, неодноразово зв'язується з більшою кількістю антигенів із суттєво покращеною ФК/ФД порівняно з антитілом природного типу проти ІС З1К.
Приклад 18. Неодноразове зв'язування з антигеном антитіла, що зв'язується залежно від рн
Експресія та очищення антитіла, що вводиться мишам
Отримали чотири типи гуманізованих антитіл рецептора ІІ -6, які описано нижче. У якості антитіл, що не зв'язуються залежно від рН з рецептором 1-6, М/Т-І9051, що включає Н (природний тип) (амінокислотна послідовність: 5ЕБЕСО 10 МО: 9) та І! (природний тип (амінокислотна послідовність: 562 ІЮО МО: 10), та Н54/І 28-ІДОЇ, що включає Н54 (амінокислотна послідовність: ЗЕО І МО: 70) та 128 (амінокислотна послідовність ЗБО І МО: 12), експресували та очищували, використовуючи спосіб, описаний у Прикладі 1. У якості антитіл, що зв'язуються залежно від рН з рецептором 1-6 експресували та очищували НІ170/І 82-ІДО1 з
Прикладу 3, що включає НІ1І70 (амінокислотна послідовність. ЗЕБЕО ІЮ МО: 4) та 182 (амінокислотна послідовність: зЗЕО ІЮ МО: 7), та Ем4-ІдДс1 з Прикладу 10, що включає МНЗ-Ідаі (ЗЕО ІО МО: 23) та МІ 3-СК (ЗЕО ІЮ МО: 27), використовуючи спосіб, описаний у Прикладі 1.
Аналіз зв'язування антитіла кожного типу з розчинним рецептором 1-6
Аналіз кінетики реакцій антиген-антитіло при рН 7,4 та рН 5,8 здійснювали, використовуючи
Віасоге Т100 (СЕ Неайнсаге), для чотирьох типів антитіл, які отримали: УУТ-Ідс1, Н5а/ 28-ІДСНІ,
НІ70/182-І90І та ЕРм4-Іде1 (буфер: 10 мМ МЕЗ (рН 7,4 або рН 5,8), 150 мМ Масі, 0,05 95 сурфактант Р20). Антитіла зв'язали з сенсорним чипом, на якому був іммобілізований рекомбінантний білок А/З (Ріегсе), шляхом амінного з'єднання, та 5К344, доведений до відповідної концентрації випорснули на чип як аналітичний зразок. Асоціацію з та відокремлення від 5К344 антитіла кожного типу спостерігали у реальному часі. Усі вимірювання виконували при 37 "С. Константи швидкості асоціації Ка(1/Мс) та константи швидкості дисоціації
Ка(1/с) розрахували, використовуючи програмне забезпечення Віасоге Т100 ЕмаїЇчайоп Зоймаге (СЕ Неасаге), а константи дисоціації КО (М) розрахували на основі цих значень (Таблиця 17).
Таблиця 17
Порівняння констант швидкостей асоціації (Ка), констант швидкостей дисоціації (Ка), та констант дисоціації кожного типу антитіла проти розчинного рецептора 1І -6 (58344) зро Гор кот | ком кава ком аРнво (кову
Зразок ка(рноь.ву | Ко(рноі.ву
Розрахували відношення афінності (КО) при рН 5,8 та рН 7,4 для кожного антитіла.
Відношення КО, яке вказує на залежне від рН зв'язування з 5К344, становило 1,6, 0,7, 61,9 та 27,3 для М/Т-ІдДаІ, Н5А/Л 28-ІДдаІ, НІТ70/І 82-19 та Ем4-ІдсІ, відповідно. Крім того, розрахували відношення швидкості дисоціації (Ка) при рН 5,8 та рН 7,4 для кожного антитіла. Відношення Ка, яке вказує на швидкість залежного від рН відокремлення для 5К344, становило 2,9, 2,0, 11,4 та 38,8 для М/Т-Іда1, Н5а/ 28-91, НІТ70/ 82-ІДа1 Тагма4-Ідс1, відповідно. Отже, підтвердили, що
НІ1Т70/І 82-ІДО1 та Рм4-ІдДО1 демонструють залежне від рН зв'язування, тоді як звичайні антитіла
М/1-ІДО1 та Н54/| 28-91 ледь демонструють цю здатність. Крім того, оскільки афінність (КО) цих антитіл при рН 7,4 була майже однаковою, то вважали, що їхня здатність зв'язуватися з
ЗК344 у плазмі є еквівалентною.
Зо Тестування фармакокінетики іп мімо із використанням мишей
Фармакокінетику 5К344 та антитіла проти рецептора 1-6 людини оцінювали після введення тільки 5К344 (рецептор 1-6 людини, отриманий у Прикладі 1) або одночасного введення 5К344 та антитіла проти рецептора І--6 людини мишам, які не експресують рецептор 1І/-6 людини (С57ВГ/6у) (антитіла проти рецептора 1-6 людини не зв'язуються з мишачим рецептором 1-6).
Розчин ЗК344 (5 мкг/мл) або розчин суміші, що містив 5К344 та антитіло проти рецептора 1-6 людини (5 мкг/мл та 0,1 мг/мл, відповідно), ввели у хвостову вену єдиною дозою у 10 мл/кг.
Оскільки антитіло проти рецептора І/-б6 людини було присутнім в адекватному надлишку відносно 5К344, то вважали, що майже усі молекули 5К344 зв'язалися цим антитілом. Зразки крові брали на 15 хвилині, через 2 години, 8 годин, 1 день, З дні, 4 дні, 7 днів, 14 днів, 21 день та 28 днів після введення. Узяті зразки крові одразу центрифугували протягом 15 хвилин при 15000 обертах за хвилину та при 4 "С, внаслідок чого отримали плазму. Відокремлену плазму зберігали у морозильнику при -20 "С або нижче до часу вимірювання. Вищеописані УМТ-ІДС1,
Н5а/ 28-ІДа1, НІ70/ 82-91 та ЕРм4-ІдО1 використовували як антитіла проти рецептора 1-6 людини.
Вимірювання концентрації м плазмі антитіла проти рецептора 1-6 людини шляхом ЕЛАЙЗА
Концентрацію антитіла рецептора І/-6 людини у плазмі вимірювали шляхом ЕЛАЙЗА.
Фрагмент К(аб)2 антитіла проти людського до (специфічний до у-ланцюга) (Зідта) нанесли на імунопланшет Мипс-ІттипоРіаге Махізогр (Маїде Мипс Іпіегпайопаї) та залишили відстоюватися протягом ночі при 4 "С, внаслідок чого отримали планшети з іммобілізацією проти людського
ІЧ. Приготували зразки для калібрувальної кривої, які мали концентрації у плазмі 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 та 0,0125 мкг/мл, та зразки мишачої плазми, розведені у 100 разів або більше. 200 мкл 20 нг/мл 5К344 додали до 100 мкл зразків для калібрувальної кривої та зразків плазми, а потім ці зразки залишили відстоюватися протягом 1 години при кімнатній температурі. Після цього ці зразки помістили у планшети з іммобілізацією проти людського (До та залишили їх відстоюватися протягом 1 години при кімнатній температурі. Після цього додали біотиніловане антитіло проти людського 1І-6К (КО) для реакції протягом 1 години при кімнатній температурі.
Після цього додали 5ігеріамідіп-РОЇІУНКРВО (5гегеозресійс ЮОеїесіоп Тесппоїодіеє5) для реакції протягом 1 години при кімнатній температурі та здійснювали хромогенну реакцію із використанням ТМР Опе Сотропепі НЕР Місгоуеї! З,ибрзігате (ВіоЕхХ І арогайогієз) як субстрату.
Після припинення реакції ІМ сірчаною кислотою (5пожма Спетісаї) вимірювали поглинання при 450 нм за допомогою апарата для читання мікропланшетів. Концентрацію у мишачій плазмі розрахували з поглинання за калібрувальною кривою, використовуючи аналітичне програмне забезпечення ЗОЕТтах РКО (Моїесціаг ЮОемісе5). Зміну за часом концентрації у плазмі після внутрішньовенного введення, яку вимірили за цим способом, наведено на Фіг. 28.
Вимірювання концентрації 5К344 у плазмі за допомогою електрохемолюмінесценції
Концентрацію 5КЗ344 у мишачій плазмі вимірювали шляхом електрохемолюмінесценції.
Приготували зразки 5К344 для калібрувальної кривої, доведені до концентрації 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 та 31,25 пг/мл, та зразки мишачої плазми, розведені у 50 разів або більше. Зразки змішали з розчином моноклонального антитіла проти людського 1І-6К (КО), міченого рутенієм за допомогою 5!иМо-Тад МН Евіег (Мезо 5саіе Рібсомегу), біотинілованим антитілом проти людського І/-6К (КО) та М/Т-ІДС1, а потім залишили реагувати протягом ночі при 37 "б.
Кінцева концентрація УМТ-ІДО1 становила 333 мкг/мл, яка перебільшувала концентрацію антитіла проти людського рецептора 1-6, що містилося у зразках, з метою зв'язування майже з усіма молекулами 5К344 у зразках з УУТ-І9ОІ. Після цього зразки помістили у планшет МА400
Зо РК зігеріамідіп Ріаї (Мезо ЗсаІе Оізсомегу) та залишили реагувати протягом 1 години при кімнатній температурі, а потім виконали промивання. Одразу після того, як було розподілено буфер для зчитування Кеай Вийег Т (Х4) (Мезо 5саїЇе Оізсомегу), виконували вимірювання за допомогою зчитувача бЗесіог РК 400 Кеадег (Мезо зЗсаіе Оізсомегу). Концентрацію 5КЗ344 розрахували на основі відповіді за калібрувальною кривою, використовуючи аналітичне програмне забезпечення ЗОЕТтах РКО (Моїіесшаг Ремісе5). Зміну за часом концентрації ЗК344 у плазмі після внутрішньовенного введення за цим способом наведено на Фіг. 29.
Ефекти залежного від рН зв'язування
Щодо зміни за часом концентрації антитіл М/Т-ІДОІ та Н54/ 28-ІДСІ, які не демонструють залежне від рН зв'язування, та НІ170/ 82-ІД0О1 та Ем4-ІдДе1, які демонструють залежне від рн зв'язування, то зміна концентрації за часом була приблизно однаковою для УМТ-ІДаЇ, Н5БА/ 28-
ІДО1 та Ем4-Ід01, проте НІ170/ 82-91 вилучався незначно швидше. Дані стосовно зміни за часом концентрації у плазмі проаналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу фармакокінетики УМіпМопіїп (РіагзідпО. Періоди піврозпаду у плазмі УУТ-ІЕ1, Н5А/ 28-
Іда1, Ем4-ІдсІ1 та Н170/ 28-ІДС1 становили 21,0, 28,8, 26,2 та 7,5 діб, відповідно.
Як описано у Прикладі 2, коли антиген - це розчинний антиген, то введене антитіло зв'язується з антигеном у плазмі та утримується у плазмі у формі комплексу антиген-антитіло.
Взагалі, на відміну від надзвичайно тривалого утримання у плазмі антитіла (швидкість елімінування є надзвичайно низькою) внаслідок функції ЕсКп, час утримання у плазмі антигену є коротким (швидкість елімінування є високою). Отже, антиген, що зв'язується з антитілом, має подовжений час утримання у плазмі порівняно з часом утримання у плазмі антитіла (швидкість елімінування є надзвичайно низькою). Подібно до цього, коли вводився тільки антиген гуманізованого антитіла проти рецептора 1-6, 5К344 (розчинний рецептор 1-6 людини), тоді 5К344 надзвичайно швидко вилучався (період піврозпаду у плазмі: 0,2 доби). Проте, у випадку введення ЗК344 разом зі звичайним антитілом М/Т-ІДОІ або Н5АЛ/ 28-ІДС1, які не демонструють залежне від рН зв'язування, швидкість елімінування ЗК344 була суттєво знижена, а час утримання у плазмі 5К344 був подовженим (період піврозпаду у плазмі: 5,3 доби для М/Т-ІДС1, 6,3 доби для Н54/І 28-ІД1). Це зумовлюється тим, що майже усі молекули 5К344 зв'язалися антитілами, введеними разом, та, отже, зв'язаний з антитілом 5К344 мав подовжений період утримання у плазмі подібно до періоду антитіла, що є наслідком дії ЕсКп, описаної вище.
У випадку введення 5К344 разом з антитілами Н170/82-І9ДСІ або Ем4-Ідс1, які демонструють залежне від рН введення, елімінування 5К344 було суттєво швидшим (період піврозпаду у плазмі: 1,3 доби для НІ170/І 82-І91, 0,6 доби для Ем4-ІдсіІ), порівняно з випадком введення разом з М/1-ІДОЇ або Н54/ 28-ІДс1. Ця тенденція була особливо помітною для ГЕм4- 991. Оскільки афінність Ем4-Іде1 при рН 7,4 є такою ж самою або сильнішою, ніж афінність
М/Т-ІДСІ та Н54/І/28-ІДС1, то вважають, що майже усі молекули ЗК344 зв'язалися з Ем4-Їд(а1.
Навіть не зважаючи на те, що Ем4-Ідо1 демонструє еквівалентне або несуттєво більш тривале утримання у плазмі та повільніше елімінування порівняно з УМТ-Ідс1 Таноба/ 28-Ідаі, елімінування 5К344, зв'язаного з Ем4-Іде1, відбувалося надзвичайно швидко. Це можна пояснити концепцією цієї технології, зображеної на Фіг. 4. У випадку звичайних антитіл, які не демонструють залежного від рН зв'язування, комплекс антитіло-розчинний антиген захоплюється в ендосоми внаслідок піноцитозу у плазмі та зв'язується з БсКп, що експресується в ендосомах за внутрішньоендосомними кислотними умовами. Оскільки комплекс антитіло-розчинний антиген, зв'язаний з ЕсКп, переноситься до клітинної поверхні таким, яким він є, та знов повертається до плазми, то антиген, зв'язаний з антитілом, має подовжений час утримання у плазмі, подібний до часу утримання у плазмі антитіла (елімінування є надзвичайно повільним). З іншого боку, у випадку антитіл, що демонструють залежне від рН зв'язування, антиген відокремлюється від антитіла за внутрішньоендосомними кислотними умовами, та, отже, тільки антитіло зв'язується з ЕсКп та повертається знов до плазми. Оскільки антиген, відокремлений від антитіла, руйнується у лізосомах без повернення до плазми, то елімінування антигену відбувається надзвичайно швидко порівняно з випадком антитіл, які не демонструють залежне від рН зв'язування. Тобто, у випадку введення 5К344 разом з антитілами М/Т-ІДОІ або Н54/ 28-ІДСІ, які не демонструють залежне від рН зв'язування, елімінування 52344 відбувається так само повільно, як і елімінування антитіла, оскільки 5К344 зв'язується з М/Т-ІДС1 або Н54/| 28-І9О1 як у плазмі, так і в ендосомах. На відміну від цього, у випадку введення 5К344 разом з антитілами Н170/ 82-ІДСІ або Ем4-Ідс1, які демонструють залежне від рН зв'язування, елімінування 5К344 відбувається надзвичайно швидко, оскільки
ЗК344 відокремлюється від антитіла у внутрішньоендосомному середовищі з низьким рн.
Тобто, оскільки антитіла НІ170// 28-01 та Ем4-ІдсО1, які демонструють залежне від рн
Зо зв'язування, відокремлюються від 5344 у внутрішньоендосомному середовищі з низьким рН, то вважають, що більша частина Н170/І 82-ІДС1 або Ем4-Іде1, що повернулася знов до плазми за допомогою ЕсКп, не є зв'язаною з 5К344. Отже, як показано на Фіг. 4, виявили, що внаслідок відокремлення від антигену у внутрішньоендосомному середовищі з низьким рН та повернення до плазми за допомогою ЕсКп без зв'язку з антигеном, антитіло, що демонструє залежне від рН зв'язування, може знов зв'язуватися з антигеном у плазмі. Також було показано, що повторюючи цей процес, антитіло, що демонструє залежне від рН зв'язування, може неодноразово зв'язуватися з численними антигенами. Це підтверджується даними, отриманими за допомогою Віасоге, які наведено у Прикладі 7, які демонструють, що залежні від рН антитіла можуть неодноразово зв'язуватися з антигенами. Отже, покращуючи залежне від рН зв'язування антитіла з антигеном, можна підвищити кількість разів неодноразового зв'язування з антигеном.
Коли антиген - це розчинний антиген, а антиген зв'язується з антитілом за нейтральними умовами плазми, але відокремлюється від антитіла в ендосомах, та це антитіло повертається до плазми за допомогою ЕсКп, тоді це антитіло може знов зв'язуватися з антигеном за нейтральними умовами плазми. Отже, антитіло, що має здатність відокремлюватися від антигену за внутрішньоендосомними кислотними умовами, може зв'язуватися з антигенами багато разів. Порівняно з тим, коли антиген, зв'язаний з антитілом, не відокремлюється від антитіла в ендосомах (а саме, антиген, зв'язаний з антитілом, повертається до плазми), якщо антиген, зв'язаний з антитілом, відокремлюється від антитіла в ендосомах, тоді швидкість елімінування антигену з плазми зростає, оскільки антиген переноситься до лізосом та руйнується. Отже, швидкість елімінування з плазми антигену можна використовувати як показник для визначення, чи може антитіло зв'язатися з антигеном багато разів. Визначення швидкості елімінування антигену з плазми можна здійснити, наприклад, шляхом введення антигену та антитіла іп мімо, а потім шляхом вимірювання концентрації антигену у плазмі після введення, як показано у Прикладах.
Антитіло, яке демонструє залежне від рН зв'язування, може неодноразово зв'язуватися з багатьма антигенами на відміну від випадку зі звичайним антитілом, яке не демонструє залежне від рН зв'язування. Отже, кількість антитіла, що вводиться, можна суттєво знизити, та інтервали між введенням можна значно подовжити.
Неодноразове зв'язування з численними антигенами за цим механізмом засновано на бо залежній від рН реакції антиген-антитіло. Отже, незважаючи на тип антигену, якщо можна побудувати антитіло, яке демонструє залежне від рН зв'язування та яке зв'язується з антигеном при рН 7,4 плазми, але відокремлюється від антигену при внутрішньоендосомному кислотному рН, тоді таке антитіло може неодноразово зв'язуватися з багатьма антигенами. Отже, ця технологія є корисною тому, що її можна застосовувати не тільки до антитіл проти рецептора І - б, ІІ -6 та рецептора ІІ -31, а і взагалі до будь-якого антигену, незалежно від типу антигену.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» ЧУГЕЙ СЕЙЯКУ КАБУСІКІ КАЙСЯ (СНОСАЇ ЗЕІЇМАКИ КАВИЗНІКІ КАІЗНА) «120» СПОСІБ СКРИНІНГУ АНТИТІЛА (ВАРІАНТИ) ТА СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ АНТИТІЛА (ВАРІАНТИ) -1305 С1-АОВО1М2Р «1405» РСТ/УР2009/057309 -1415» 2009-04-10 -1505 УР 2008-104147 -151» 2008-04-11 -1505» УР 2008-247713 -151» 2008-09-26 -1505» УР 2009-068744 -151» 2009-03-19 -160» 70 «170» Раїепіп мегвіоп 3.4 «2105 1 «2115 119 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 1 пів Уа сів ев Біб обев ВвезжЕ срУ рЕб Зі їі ТВЮ Був БЕЗ йех сів
Х 5 ї6 35
ЖВвх аа бек дев ТЖВж о Сув ів Узі беж біб ТУю Беж їз Беж бвю5 Аве
ЇїЇїз ші ТУуж її бах Тух йех БУ Кі Тв Ав бук Ави Бо вх Бен тв бі ху Уві їв їів бек вхо йо Тве бек оБуж Яви бік РЕЖ дет ей був ей бех бах Уві Твх Аза вів Ар ТВЕ АЮ Ава тТУук бук СУВ в Зо зх
Віз Ах ех без йіз Аху ТВх ТВх Афв Меб Ав тує Ткр Мі біз Яку і1по їоБ ме тиж їв ві Твх Уві Зах Бек
Зо -21052 «2115107 «2125» РАТ
213» Штучна «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «40052
Авр о їіє бів Меж Тнх сів бех ко бех бек їз бах Дів дек Уві Щі 3 5 10 15 во зак Уві Тв їіз Тв Сув Сів Лів Бек бік Аз» Кіз йдех беж фуж
КО й 30 їз Аве» їх Тух 210 бів був Бхе слу ев Аа Бко пах бо їз їв
Ко о 45
Тух Тук бі век сі бен Ніс Мехк Сі Узі Вже бек Аку ББе йех 1У 5 58
Беж зу ак осві ТВ зав Ре ТВж ББе Тк Те беж Мах Бебі Аїа 55 та 75 ва піз Ав Аїв Аа Ти: Туж тує Сув Бі Сів ХУ Зал АкЯ Бва о Бо ТУжЕ п Зо 5 тиж вва ві бів 0іУ ТБ Був Уа Си шле щі 5 ї95 Ма «2105 3 «2115 119 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» З щів Уві Біо їв біз біз бек Біт ВБро Біб Бе Уві був ко Бех бли ії х 18. 15
ТвВх їни бак їво Тв Су дів ТВі бек сі МНів бах баз беж Мав Адр що 5 ЗО
Ні Аза Ні Зах Зко Уаї вк сі Бко вхо ЗУ бію фу фа сів жЖЕю
З «о 45 хів біт ТУ їїв йек бує Бек МУ Хі Тих Аво Ту Яял вхо бех бе се 55 Бо
Му Біт йху Уві Тв біб Бек Аку Авр ЖБе ех бух вав ЗО ие йех вл зо те во їео був без бек дек Уді ТВхк бів Хі ввр Тих дів бів Тук Тух Сув нн о з із Ах бех їз із ху ТВх Трх Аїв Ме дав Жук Ткр у Ба Оу іо М 119
Тв без УВА Жах Уві ех аж 115 «2105 4 «2115 119 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 4 спів Уі біб Зам біб Же Зв ЗУ Вже Сі їм; Уві Був Бо Яеж (1
Х 5 їо 15
ЖХьБХх без дек її) їж Су Аіз бві Зек ЗІ Мія Бех їі Важ Ні Ні ей 5 35
Нів біз Вів беж їжр ТВі Акоу ів Вже хо Шу бів СУ бе жа Тр 35 що 45
Хів пі Туж ї1і5 бе» тТух бек обі щі ЖВх Ніз Тух Ав о Рже Мав Фе що ВВ во їз Щі» аку ві ТБх їЗ3е Зв Аку зво Хв ех їз два ія бе овеє 55 зо ча ЗО їве бує бен йек бек Уві ТВЕ із лів Ар Тв Аза Віа бух Тух СуУув 5 що Зв
Віз дк ті без віз АжЗз Ї35 ТБж Аза Ме лев Нв Ткв фу БК БУ 100 ох Іо
Тв» беєб бві Тнх уві Зех Беж 5 «21055 «2115 119 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність
«4005 5 шШка Уві Бі ев ів па Бек Пі Во пі їм; Уві був Бха Яек ЗрзЗ
ТВх ізн: йшж бе ТВж Суб дів Уві Зв ЗУ бує Беж Же ек Ніж Аво
Вів із Тжв бек Тк Уві Зх с1іа ко Бу Бі Ра БУ їм) Бі о тТхю
Ка 48 45 її ЩУ нів їіє ЗвЕ Тук бЗех сту Хіз їх Ав тує дав Вже Ніж ТВ що вв во
МУ Зі Аха Уві бо»х Хі бек ху Аве Ти дах був дз) За Бо вет пз) ЗтТа бе Зв ах Уві Тв віз зів йво Тв аів Аза уж ЕЕ Сев ще за 5
Вів Ву Кре їв Лів Аве ї3ів Твє Азїв МНіз дар о Нів Тв Зі сім 1
ТВх Ме) Уві Три Уві Бак ех хі «2105 6 «2115 107 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 6 зве сіє сіб Мей отих оз ех бхо Вес бех їз Яех Азія бек Уві Ба ї 5 о їх
Зав дет Уві ТВх бів Тбж Суз Бі; дів Бек із Ні бів йеж Яевх Ма за В Зо ївє зви Тко Тух БІВ іп Буз Бхо Су Кв Аза Бжхз біб ем ем іа
ТУ бук біу Зех Мі Бей Мів бвх «Му Узі бжхоа ек АК Біо Зах сЗАу
Бо 5 5
Бак зіву Бак сі; ТЕ аю Бе Же Бе Тв ї3Зє Звк дек їм3 Біб Віж
БМ: вар вій Аів ТВе Тук Тк Су 1 Сів» Біт бво Зхе ев Бюе бух 85 Зо ЗБ
Таж бве Бі (105 Зі ТЕ був Уві сів її Са хо і95 -2105 7 «2115107 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 7 дав їі бів Меб Твжх зуб беж бжхо Зах ес їмюх Зах дів бах уд БУ
Азов Вес Уві ТБк їі ТВх Сше сіб Аіз беж діб Ав іє Зах бек БЕ ххх пк Ба
Кк кону КВ їснх Аввоїкр бук бів бів Був Вхо Му Був Аїв Бже сь Би: ден) Же
Туж Туж 0їіу Жак нів бен Мія Яви пі Узі Бу Бек дху КМез ек ЗУ бек ЗУ Бех ЗАУ ТВЕ Авро»оБве ТБ БВ» ТВ бів» бек Зв Без жи Ав
БВ То ЕК о
Зі) ба віз Аз ТВ ТУ Трж Су БЕ 36 СТУ Ажо вх бек кб Тжх ве ще зЗ5
Твжх Бе ші сю» ХУ ТВх Буз УВІ Сі Жіз дм ї6о 05 2105» 8 «2115107 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 8
Мар їіїз бів мес ТВк бів Явх бко Чек Бех без йеж Вів Мею ба сту
Її в 10 18 дар Бех Увх тах сіє Тих Су сію Аїв Зв мів Ав5 її Ве бек НІ шо Же ЗО їм) Ав» ТЕ Її бів сію баз Бже біб пуз вів Шко м Хмз Замх Ті 35 за 45
Тух Тух Бу беж Віз З: Нівз Нів 31» Узі Бу Бек дує Бе бек Сі що ВЕ 58 дак зі Зак св ЖЖ ве ББе Жаж Без Твьх ї1і6б беж ех їв Бій Ав
КЕ 7 ТВ во пів Аво ліз Аїа їх ТУухє Тук Сез СМу бів пі із бкз без бе ТУ
ЖнЕ ваз сі пів Зіу ТХВж Ббуз ЧУвж см гів Ох ба ях «2105 9 «2115» 448 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 9 бів Уві ів їв БЕ Сх Зак й хе Біт їз Узі джу Вжо Важ ІВ ї х 10 їх
Твх без Бех бо ТВУ Суз ТВжх Уді бЗвх сі ТУкх йах Хі ТВж Зак Аве 28 В 3
Вів аіз їв бек Тк Уві Ах Зі) Бо вхо БУ Ага ПТУ Хек сам тр
З 4 45
Їїв С Ту Кі Беж БУую йшж щу зе Те ТвВж тую вав о БВжо ж ем ва 55 БО ба Важ йха ові ТВ Ме без Аку Ав Те бек бух Ав о бжкк Бе Хах м Й У І Ук. Я 55 та я Беж зе) ха їв Вевх беж УВІ ТВ Аза із Хею Тк оАів Уві Теж Туж СжВ 5 о ва вів дтч дек Пез ліз Аа Твх ТВх Зїв Меб вВяв Тух Тжхю ББУу біб щу що 185 110
Ядвк іїівз Узі Жнж Уві Бех Зах ів Бех ТВЕ Був БУ Бо Яаж Уві кое їх З ї25 хо ії із бо бах бек їба беж Ж»: Щек Зі» щіУ Тв Аз Аів Ще
КК 35 140 еіу Сув їв Уві уз Азрвобук БВе Бхо пох бБуо Уві ТВе Уві дес Тер 145 ї50 Зк і5О
Авв бак Кі Аза їх ТВ беж сі ВЕ Ні Бе оБве Бжо Аба в Менх ї55 КК кВ щі зе» б» пі Бе) ТуУужЖ Бех Га Бек Бех УВУ Уві ЖВх Узі Буєз бе їв їі5 що ех Зах їн с1Уу ТВх Св Тв Тух Хі Сук ба Уві Авв Мія та вх і35 КТ Ох
Зах вав аж Мов ові Ар о бжа БУВ ТВі ОО хо Бу Зак Сув аю Був х х УУ Ж Ху Ух хо ва я
Жву ха таж Су Веб жо Су о Бжо Вів же 5 їні Ббеб же збу БжЗ жи Ка 5 24
Бевк чад бе бе: Бе бо Бо Му рже МУв даю ЖВЖЕ їв) Меб ї1е бе 45 ЗЕ 5 дк вх Буз Щі Узі Твс бух Уві Узі Уві Аз» Увь бах ха бро йщр хе БВ ха
Бо Фіз Узі їв бе Ав ФТкротТуж Уві Ав Бе в сів ВА Бе жа ат ща зай
Вів їша ТЬЖХ бу Бжо Ак с Бін сь» Тух два йежю Тв Ттх вк УВу 283 ди За тай ех Уві ії Тв»к Уві Бе: Вів БМ; дар о Тхр ої без ЗУ Був ЖИ
Зах з15 315 зво
ТУук їз бує бує в) йах дав був АЇЗ без хе Ав ру Жіе Бі ув аа КУ за
ТвВх їі Вес Бу діа бу Шіу бів рксо Акч 03 Бо ів УвЕ тує ТВх 340 345 350 їва бже хо бех йху Ар бів фе ТвЕ був дав шію Узі Бех їз Твх
ЗкЕ ЗЕ 365 був ба Уві їшжв ЗУ Бе Тую бхо Бах лер їіє Вів Уві Ма жк ШУ
Зах Аза СУ сів Вхо біз Аз) Ав о ТУХ СУБ ТВх Тв Вже хо Чаї Бевз
Аве ек дер Щі йеж ба Бе бео Жужє Ват Буз ем ТВх Уві Вр муз 05 5 5 беж Ахч Тхв Бі щі сі» Ба Уві Бре бек Суз Вех УВА Ма Вів ЩІ а Зх 3 ів бе Віз Аж Нів Фух Твж БЕ) Бу Бек без: Беж бе) ех Бо Ху 35 аа 445 «2105 10 «2115 214 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 10 ва хів сіб Мей Ж» зів бек Ехо Зах бак цей беж дів Беж Уж Бу» ї Ко Кз я авв Ах Уві Тву їі ТВх Св аку Віз бек бів Ар її Бех бек Тек ївзиа Акт їхр» бух ів Бі БУ ВХ сі Був ів Бхо Був Бевз гей Її
ТУЖ ТУж ТБ: Бех Ак Змі Мі Бех 031У Уві Во бек Вк Бе бюж Су
Зах зе йевх іт Те ве ББе ТВ Бе Твж Жіє беж Бек їз їв бго кВ 76 ТВ ща піз барв о їїє Віз Ж Ток Тух ба Пів пів БіУ ба о тбвх бах Бжео фух
ЗЕ Бо ва
Твх Бе Зіу Бівз Зіу Жвж був ві с3із їже Бу дка тн уві Бів вв ко Кк ї18 та шах УВі ББе Кізі Бі» Бк Бо бек вже Вів ЗБ беє Був Зах ЗУ 115 150 їі-5 йву йіз дес Уві Уві Суа Ме їннх баз дай Бе Туж Вхго Аже Бім АХ їз 135 149 муж УЖЕ сію тТКор бе Уві ЗЕ ве дів їм біб Ве Су два бах 018 345 МБО Мк їй соя Як УА Тв Сів іо аеро бЗек бук Ажр бек ТВх тую бек їз Зв ех Тв Без Тв фах бек Буш Аза двр о Тухк Ск був Мів Був Увй тех зно їн 5
Вів сСез поь УВІ ТВх Міз із ЗКУ 60 беж беж ко Чаї БЕ Був Я ї95 ОО а те дав Ах Бу БМ СВ «2105 11 «2115 119 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 11 пів ув ів без Бів Зіз Звке осі» жо бу Без УЗІі Був хо беж сій чвж їх беж їз ТВж Сез ЗіБ УВі Бвж біб Тух Вес Гі ВВЖ Аве Ахе нів ів Тбкор Зак їже тва вхо пай о бже Був» лау СЕЗ су Беє Бе Тк її пів ТУ (є Бех бує бек біу ї3З8 ТВ За З5к Ва БЕФ БбБж Же їв біж Бу бві ЖЖ Тіз Бех ху Аве ТВБХ Веб цпуз вв бів Бра вах а то т ва ївоО ПУ бю йех ех Узі ТВ Ав Аів аю ТЕ о АТвВ Аз Ту ХЕж сСув із йка уві бе» лів йхц 538 Тв Аз Ме йвр о Тух Тжр ША і У тТву їв УЗА ТВж Уві Беж вх «2105 12 «2115107 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 12 дао із Зі» Мей Те Бі бек біз» беж бе їз.) бер Дів ех Укі Су дер Бех УВА ЖТВе їів Тве Сув бів дів дек бів Ав їіє Зх беж ТУ 28 ях ке іх Ав о ТЖжхв ТУух Біб із бїшв Вхо бу Бук із Бе Б3з їм) їз її
З о 8
ЖЖК ТУх і Бек піз безе Ні бек Сі Узі гко бек ку Ва бех ПУ 50 5 «й
Зак Бі бек б3іУу ТБе йво Ве о тнЕ Бе ЖЕ їіз Жох аж бен біз дів 55 зо ТЕ о са Ав Аів Віз ТВ бух Тех Сув сів жа су дат беж їм Бже бтх щих Бі шву 16 су ТБЕ Бу Уві ще ЩОБ о 00 105 «210513 «2115 1404 «2125 ОМА 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована нуклеотидна послідовність «4005 13 зкчуззакоуца зсбшкяикеве «сБОоББоКЕУ сбвоовесеу сбБасведв сю що чЕсовнечо зодазацови босозучоес: зБовавоося зовано зацусокнсє їжа косзосевав обоаобсвобо звеісвусцес воску ссї завесщоачаї кодсевВОвОоВ кеВ сеєзузасаво яіссідазчоо ззебчасво авсвзУєкаса Зсоавенве ааскжкае 2 сов свбов звопсвевує сао тсу онуку Фо доза ЗИ звасЕсвуєа додіцасацче счосововес песо: зкбутосаво вБодесєвое ко свсвсуноду севтоцвовВ ссдодовоува дусееєевоюу Кежовуюако совок юєе що дссзводуєс засос обосекоєоь сеебзереов возасасскеи срууууеов зво щчедчесскау ЧесосесчЕ сова Кксвуомщави серукеаоює фену кровно В сиву часова озЗ обумов спеосозока сосевовакс соєвих ще
Бассосстсз зовосасОс здаооцсазев бесазовзсЕ созоцюзисма дЧасукасаве а тонзвоЗов абосвзайосе свосвасвоє вазона вав кков зесовавеше аа
Кс бле ссвасіс су насоку васесесоаза чузасовков та цЕаккосваю ксеоосссвав восоззазво вссссовсза гепооссзуУ особа ваш всаежспєече сопозсУчасдо звуссвсова засосссзвзЗ ссозацчекова «еще З чно вуса сасва Сбпосавзасв ведемо уз чсеуєк севсвуєвену за ївобасекуя несе овосзЕооЯ сасосжнвох часова сзвуданае іс зведена бобеооааова зощпескевоз зесессвсов зба восаЕ зізсовавщее Оове зазцоудсвус сссузоввос зоводсчсає впссецесое сзабеееоуца сус 115 зазаввсемзауй соззезкзЗае стчосточчс азвазщежсек вКссмзадецае сего є Та зпавУусозозох досваксонов сососпзоває засос свецІнви сумо ах 1550
Босузоусне мебкесессЕ схавсзусвва сізасвусов зесвзавувсЗсаз заз евоєу 132 чазааозЕеї сові шсво сзсоавузаЕ зезЗЗзисезЗе ЗовВосвВеба соуси ЗО віазисссооє Бекобевуце Кава 144 «2105 14 «2115 321 «2125 ОМА «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована нуклеотидна послідовність «400» 14 засасвозов бозсссвовс зосвазовус зов нса зосзсазпеув сецоЯкоавоє що зксвссквтке завозу сса Зововісвує зЗкевсскуз зсеозевссзв сову їх зіва иї озвовУсвосе звБоБаокає десосовая бок севу усуває ї80 зузЕбозцез зразок суда Біанка озсжуовоєу коссузоуюа а заззчессссу зве свсов спос Чусзаесзеє вес зккодоуєсва ЗО зоувноваой сзовавкод З. ЗаЗ «210515 «211515 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 15 пі У Мі Ві беж БУ 015 03 03 З» 035 бьУ біу бі аж «2105 16 «2115 24 «2125 ОМА 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована послідовність праймера «4005 16
Ебоссзвовзу сесуссмцве 5 3 «2105 17 «2115 24 «2125 ОМА 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована послідовність праймера «4005 17 кова чеов веБочзосоВве бан їх 2105» 18 «2115 32 «2125 ОМА
Зо «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована послідовність праймера «4005» 18 «2105 19 «2115 57 «2125 ОМА 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована послідовність праймера «4005» 19 авкідсзуусов зксвісвУка зов свое сову Бо х? -2105» 20 «2115 1131 «2125 ОМА 213» Штучна «220»
«223» Штучно синтезована нуклеотидна послідовність «400» 20 звастосвсо вісскосзсоз боЗщОоБрче чобостоЧев чек сера БО
Я ен семева й справи Клобеувеа 138 поесоседото ссосостоу Засооокаєс вовну пезаааа беробоуваюва ке бсосзссвоза увсовозочеЗа се аоовУ посох задсесчоавеї зсаакесовех їВа секковов зсссковудша всосвзсах вуоеслесасє стовоозуве захо ща ззчаазчая ссоєшесесо зтроззвусв досеовсве ссосовозазво вековісрев зо почесна сус савскозкуєв «ес очу ЗВ сся ува Ба сезвцекоїоо косі сзуЗв Бавосесоеє «вдова зЗесБоаБоуВУує зако 3 щеашенаєиея ссессовоза ссевудесує чесзка зоадааассо зоавасвуоє ВО «зоессзавачтах сюессяЗчаче спсоусевче беосовоачва остан веб сов пад ес цевно себе мно сізсасваку осв оЯ Бедесиваа БОЮ зуссзуЗазе: авосеесвщсв зах созове зЕсесвох зав ес БО тосозсзсчоз ааовоовсвУу ссассчпсесае зчУсовЗваво сссосозусює фев кое Же зідчсавузво соссаскозе зуаастовко «сс есвсвув севоЗЗЕКа заз те топазом за сззБозваваов саггсасавс везузеочко зводассово взсвесваеєа нас кзКозбоово часні зоччосчаз Зовсоабцаса «ам оопаоуВое БІ зспочаоь зосозусуча чоЗазоувоа сосоздазосо збзозчовоце собуцвсвоеа ЗК вгссазЗзаУв сексоауєвоЇ вовзслевеще дісеосос воосаоуєає овес МО казвазказЕ здасзасакко коксовоувеа спеЕссЗовЗВах двоузсазазоє кобвевукоєа їіове вуз кес созчівоова зісвссовов козбозвосуа савчочосе 13 «-2105 21 «2115 449 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 21 ж З кий ше ск дм Ж ка шани чних коуч У бо м бах ТА ців ві сів бєз Біб біз бек пі Вже БУ ії Уві Бе Ббхе Ме м : о. кох х ї 5 ЩЕ: 1ї15 тнеЕ їщих беж їв ТВХ Сув Віз Узі дек сів Тух ек їв Бех Вів дар ке вх жа йіз дів їх бах Тхю зх Акч бів ржо Бк Біт б Бу жан тів о жЖе 35 за а н сечу су х ДЯ - о ее хе Того сх дух Ж аж Ж с її біу біз її5 бек Тужє бек слу Її ТЕжх Ава Тух Аза о бхо Миж бе за цк БО ж. Ж . -ко Е ч хода Тож Же в їх їх ж 3 ему ів дер» джу Уві ТВБх їїз бек бюд бвр о бвВжх Бех Му во аж каже ех і Ар АЖ з уж, т аа а Та 5 но х : чо де Хек чих Же ТУ и х хх сухе Ме же во є Є кх,
Ме) був Без Бех Бек Узі ТИЖ Аіз ів Авю ТВЕ аів ів тую беж уж
КІ оч 5. 55 а ЗЕ ; че ду подо А жи Ял УМ ху ч чи З - ех КЕ п
Віа Аж Бе їм: Дів ахт Кіз ТвБж Зі іє дар Між ЖК пу біб щу» ще у тик су що їс95 по 3 Кому гу г У їх. ех о «м Ж яки, х. й ка и Ше хх. с КО, ї ж ся
Тйх без Узі ТВ Уві Беж Зак бів бек ТВе уж П3іУ Бхо йшвк Уві Біне ках я 5 же 1583 їх х се кл зу Має Мах Ку. СХ й Маки бак ім ку З ту с
Вкое мк діа Ехо бек Беж бує Яавж Трж бек Пе сзіу ТВжЖ дів Біш Тану і34 і35 ї4о рек ТІВ й т сх у: чик КИ Мати ХЕ ЯТЬ р. шк Мор пі Су бе); ові був бав тую бБе ее б3з ко ві Тве бві беж Тхв ах 155 Та ЩО зви леж оду ів їмз ЖВх Бек іх тв Нів Жпу РБе йко вія Уві бе їіК5 за ї75
ХФЗ у Ж я Жде Мо у - 0 Ж сезх Мая Му т ее т ж г ФЖУхсю дух
Сі бБеб бах БУ бо бух Бех Бей бех ек Та Уві Тк Уві Бу Зах 18 185 ї50 - сне я ах й о Ж о Кур че Мк СК жна Моз чу ах хо ко. тож У Я
Явк Мах З: ЗаУ ТвВх С тТВж Теж їз Суб Ав ув Ав МН був ВЕК ще я жи їж ЕЕ ее
Фк є ще дж Ж ку ке З Се КОЖ Е жук жи: Фе ше жук хз Ж дек бах Ти Муз Уві Ав Був цу Узі З ж Був ви су Азж БУВ
Тв Мів ТВ Суз Бо бе СУ вхо Ав Вко Ша бев ви ба» шШКУ ВО кий ЗО 235 й
Бах Укі бе За бра Бо жо Бт бо ув А Ти ізн: Меб Же аж жа БО еВ вхч Тв хо 51 бі Таж Сув дві Уві Уві бвв Уві веж Нав с-м Явю
З " ххх жу укр зо В КО - о ажовох шк як як ен ни А НЯ І хо біч Уві їше Ве Аве» ТЖЮр ТУЮ Уві дар осі Уві віз УвМ На Яви зва 25 ж ч Е ж. чо Ж дк ка: сх жи. Ж диски Ж дж ж ом ке. с ие те
Віз Був Жнх їв Вжо Ак ЗМ сам се ТухХ Ал» Звх ТЕЖ Тух джу УВА 2985 ка Кк ще - х щу ги де В 2-х ши ач уж Ук зе ща Га чаї ба» Сві їн Тв Узі їх Ні ів Аню ТЕВБ Бей дав ау Був БУ пу дяк дек
ЗИ Ка 15 зо ст щ ож ва мл Же шк вику кн
Тех тв Се Був З ві Зак ана був вів Бе Кже Ав о йже СО Віз те
Тек Му СУ хх у інв Ам
ЗБ 30 За
ТМічях Жж и Ж ще ї се Жах т у Тр Можу Іза ЖК ЗАЗ жа У я з
Тв їзе бек Був Лів Був Сі Шію Бо Аха Зі бжо бів Уві Тек ТВж 340 ЗБ ЗО їжи Вже же Зек АкУ Ар осі беб ТЕ бу А сію сві Беж їх ВВЕ
З аа 55 ж м т. з у ск Їх. Зх х се ЖХ со ХХ ик 2х3 З а КУ КО т жд, С ка ж Їм Уві Був зу Ве Тух ВО бек лев їіз Аів ув бі) Тв За дхув зх ке г З зво з У У еяй ная ж з ся х З п ек Ук м Не Я ск ку, ие каже КА
Мах дав обіУ чів Боо Зі бев Ав тек бух Же ТВЕ Вже Бхо За бе ах ЗО КУ ЗцО се щя жі ж Ж Я ж ех то я Жид Жов ех Кох УК жа Мол ч вар бек Авв Бі бек Кре КБе і Жук Бех був їМзо ТВх Уві варю Шув
СЯ 410 15 ; щ пджк ке -х ШУ ях В У ЗУ Жах ах їх ж, я - С як я
Бех ха їх вів іє сбьжЖ Ав Уві) ББе дес Суз Бех Уві Ме Мів са
З Зк т зо іх 430
Зх к. 3 ххх КА ку уже зу Ку Же жа Жоезія Мш Жокуїу Ж че їх
Аів із біз лев Міз бух ТУвВж СО Буш беж фенз ех Бев еж ко щІХУ сх щу ях 435 Зз4О ча 5 «2105 22 «2115» 449
«2125» РАТ 213» Штучна «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 22 сів Уві пів без -іж сб ВЕ СКУ БЕ БР Сей Уві бе вже бак З ї й їз 15
ТнЕ Бей беж їЇве тах був вів Уві бек СЕ ТУЮ ех Їів бек Яхв дев
КУ 5 За
ЧЦів біз Ткр обех їхю УВі7 Акз ів» Бтз бко Бі бів су без бе Тер 4 45
Іі пі» нія бів беж Тух бек Щі іє ТБх Ан о тТух Аве» хо Нав бек.
Б ВЕ ЩО дів дво) дху Уві Тех їі йех бку йяю о ТвВх Бех муз Аве же ВБе аж
ЩЕ ще 75 ща дода В за Ва ЗХаи цУві Жвех А1в5 ді де» Твх Вів чі Мікея Чек Се
Ті їев їв Бех бах Уві Тв АЗв ліз вве Таж вів У хух жужх уж ва ЗО З5 лів Аже Бве Пес Віз дхз Ї35 ЖБх дів Віз ев Вів Те біб ща У цю ке її
Тївх ден зі ЖК Узі Бех бек Ажа пек Тк бує 019 ВЕо Бек Уві Юа 115 її 25
То іа Аз Бхз Бех йвж Мув бек ТВж дек сію сі ТЮЕ бів Дів баб ї130 вв зав
ЗКУ Сб їз Уві Був дар ТУ ВВ» Бо піз Бк УБІі Тв Бі йвж Ткр 1945 150 І55 185
Взв зах Бі Аза беє ТЖВх Зек Бу Уві бів ТБж Без Кко бів Уві би ї855 ї70 ї75 із беж Мах Сі без Туж чех без бах дех тваі УвЬ Те Чі бо дек ї80 мВ ї9И
Бах дек ев СЕУ Твк опа те ТеХ Сб Сув дви За) дз Вів був Вже їіп5 що З
Бах ев ТВх їв Уві бе жа буз Уві піз Бко був Зе»Е Сув вв Був у ую кох а меж вже уже й я ух ие хх ет КА вк яву я кт хх У т
Твх Ні Тьх був ро Бо СУ Бо лів Вже і бнх без БУУу БФ Вхо тугих «м «ук мокре
Ка КН 5 на
ЗевЕ Уві Бе ї-шюб Бе бхо БВжо був Бо Був Авб о Же бен Меб Кіє ее а 5 БЕ
Ук Бажан и п ек У ВАШЕ хх жом г бужж З тх. же
Аа їТБж Вко із Уві Те Схув Узі) Уві Уві Аве УФ ех ів Са АЮ
Б 55 и ! чан й па а чи оч а и А НИ бо Щі Уві Шез Бе да» їжротїухю Уа Ввр су Ущі а УВІ Вже Зав їв ВО В ві ув ТВЕ Був бхо жо шах ФМ 036 Тух зва беж ТВЕ Теж Аке Уві я У З КЕ і : где с ка чо ще а ШЕ АН ху г даже Ж шк жк Я
Уві йеах Сві те Тк Узі без Нів сів ав ож Бе) Авв оду був МВ
За Зо ЗІБ ЗО бо ев бух був Уаі йаж йо Мев Вів бви Без Вів Бе ХХв са Був
КТ нас Бе - іх гутук Зв кри зи5 зЗчи КУ я А - й ч ке о, аж жу КМ ма злу ЗК дк же Му хе ле з жк її1з бевху Без діа Був Шіу 165 Ре дк Ба бхо бі» вх Жук ЖЕ зак «а зе
Заг З 355 їх Ж Же Му ж В жа Зохуу се Ж ху г ве УЖ ке т цик баз бко Рхо Вех Акт зви оЗіб Без ТБ У вав даю Узі Вас їм БВ
ЗЕ щих дж 355 ЗО ЗЕ ех. КУ хх Ух З х е їх іх ге Там осу Ме оз ХК ТТ жи Уже ОК
Сув дей Уві Був ЗГе Бке Тух Кха бек дво їїе Аіз Узі Біо Тюв ФІЗ ато 75 ЗО дих - су УЖ у Жбдхиж їх Е Машу Фо Просо. Яке шщооожжну Й
Бак айва бі ів Бжо (ох Аа два Тую Був ТвУ ТБ о Вко вже МВ Та «І тууУюу ех їж
ЗВ 35 З 00 дах дж сяк М шк хе їх Жожжх ж дж божу ко Зі г б дав бек Ав 03» бек Бе Ва їжнь бук Бех же бе Твх Уві Бар Бра зп Зо 415 о ї мк жа ЖЖ аж Ж жу с ж ги КУ - я суще ВЖИ зе
Зах йжу Тв осів бів ЗКУ йав Уві Бе бек Сув ву УА Ме жа Се о ях ло вів їем Ніж дав Бі Тук Жах 0 Муз беж фен ву Меб беж Бго БКу че кт що
З 4 Ява «2105 23 «2115» 449 «2125» РАТ
213» Штучна «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 23 сів ві бів фена зів сім ек Оу Бе Бе фе УВА Муз Бжео ЖеЖ БУВ ї 5 19 ЇВ
ЖЖ їецз бек їжа ТвжЖ СУ із бві бек су із бек Ті Зек Не дев а Ж З нів ліз Їхр ВЗех Тв Уві Ак сів Бео Бо (зу бо Су їн ШЛВ Тв
Зх 4 4 їїв і Бе Хі бах Тех бах Су йіз ТвВх Ав ТУюК зви хо бек бек
У К Е ; 50 5 ЩО ях м «у. З г "и ц г х отр ахуг У тех Ко та «шк дів ді ака бві ТнЕе Її Бех Ак Авю ба Беж бух Аве Тв о їею Туж 25 КО ТЕ во с ї - щ- Е й З оде хх з дл МУ зе Я ох їх ка уки яку їні пік Меї й» бах їз; Вк Бі сій Ар оТву зів Уві Тух фтж ув зк за вв м ку Хе ж 1 ху Н ме ї ж З -х ум, х т. МК кл яз МК т я й
Аа Ах Бех баз Аза Ажс ТВх Те йіз Меї Авв Тужх Тв 01» Піх щі» ка ща 48 су хо оаках ж суку Кз Ух З ко « А. хх же хх з я м. ку г меч ки
ЖХВх Зх УЖі Ти Уві Бек веж Ай беж бБе о Ббув'сзі» рує бвк Уві швВе 315 1355 ї255
Вже їено Аів БкО беж пек був ех тво век 3 ЗУ Тве: Зіз за бе ї55 ї55 148 віт Су цеб Уві Був йав тує БЦе Бо а ко УВА Те Уві ех ТЕВ 445 щу Ба ща
З бл ак З Ж ах МК, з Жах Сх» г їїкох ЗИ ач ще в ки т взв Звх ПУ Віз їм; ТБ Зах бі Уві Наз ЖБх Ббз БЕЗ дів Уві Бей їв вто ЕТ зів Зах дах сі їм) ТУЖ Зах і беж Хах Уві Уві ТВх Уві Буб5 Важ йах бах бен БУ ТВ Біб ТБж Ту Хі СУуз бив УЗ Авив Вів бух хе ї95 ОЗ ох ех дав ЖНЖ уз УЗА баб Був був УВІ пі хо МУв ВаеакоСух бю Суд «18 І ко
Твх Яїа Те Се Веб Бто Пух Вжо Аза Вже 3 За; беє жу су Бо ве КО 35 4
ЯЗе»х Уві Кбе їв Бе ко бхЗ БУ бБко Був бар о жвж беб Веб Кфеб йеж 545 КТ ап
Ах3 Тьх Вже Зрз Уві ТЕ Сов УБі Уві УвЕ Аве Уві йех Мів ся Деу зва еВ 273
Жхко біс: бві бе бе Аво ТжрвоТеУх УЗ Ар бін Уві Бім УВБі Бі дав
КЄ зв
Вів був ТБх Був Вко Ажу сі» паб со Жук Аве» бв8ж ТвВх бух дк УВІ
ВО -85 ЗО чваі бах Уві їзм: ТВ Уві їх Нів із Аввобкр о їнх Важ Аж ув о з35 ЗО зу Зо пе жк хх я ан Со ря сода а Ж ху
Жуж Гуз Сжв о був Уві Вежх дез Був Віз Яка Во же Жко Же мч Був
К З зза
Же жі бог цу дів бул Сік ав Бко Ах іа Бо Фів УВО ТужЖ ХВЕ 348 345 За
Я рко ко Зак Яку Аа ОМ баб ТВХ буз дав оБів Уві Веб бею Ву
БЕ ее ЗК уз а Узі Був Б3У Ббе Ту Бео Вех Ав Щі дів Уві біб Тжв БУ о 375 БЕН аж вн ПІ ів Без під вах дав Лек їню о Ффех Тве Ше бВузу Чаї. Жим аж яю су ав же ца вже ЗО тую Буш Зх ТвУх Вхо ВЕ Уві Змі
Вер Жах зв Му бах Бе Ваз Сем тек ех Буш без Же Уві Мвю був
Б 410 315
Зак Яку ТБ зів Зіз СЖу да УА БНе Бех Стеж Вес ЗЕ Межб Ві 165 о а КУ дав івои Ні дви Ніз уж ТО Бін зу ех їн дек ема бек Ку СЕ 435 48 445 їв 5 «2105» 24 «2115 449 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність
«400» 24 ж КАС Ж ух КИ НЬЯ жу Ж сюда Мк Кі що Жах їх хо шЖх зав У Фів бені ЗАВ С бек пу Во У їж Уві Бу рюо Вак 5 3 5 З 15
Ук ско дж аж ММ же жк З ї-х Жах Сх те Ж Ши 3 щі Жду КАЖУ Ж як їж без Зах їв Тв Сев віз УВА Бек сот Бів бе біз ве Ніз Аве
В жа Зо жо ос щої А - іх Яоджх Рух Жук Шуми г ж у УЖ жк Жовч жду
Ні Аів бо Мак жкр уві Ак св бо Вже Бу 5 БЖ Сам Фмуз же : м щи
Хі і бе їі бек бух бакосіж Хзе ТВ Ав Тук Аве вже ЖЖ без
ВЕ 0 дів пі захи Уві ТВх іє Вес ЗКУ Ав де аж Був Аве УВх Бею ТеЄ зе У З з : й : ком ев «жі а а ТО 5 ВО з нин нн НН На ВЧ птю у Ді хе Чнкис Жавч сук їви бів Меї Анни ех їма ху із Зі: АвБ ТВ ав Уві Тух Жуж Сув сю ду г и м 50 за - що е Жов ж Я Кан ке Ме буду Ме жі га ху
Віз ха бех їв: дів де Твх Те дів Ме дар тую Жкр о бзЗу сб Зкф чл «У от 158 їі КН
ТУ че й Же ую нн я ОН ФА ЩО Ко се ак Фе чех
Жвж ої Зв3і бвх Уві) Чех беж Аїз бек ТвЖ був біУ Бже двух шві бе 115 їжа З уд ; Ж зу ЗУ кує Му чия Зо Шо хх вах ма я з г. с вхо Бей із Бо бек Вес бте бек Тв Зех Бі ЗЕе ЖТвх дів Аів без чи «ях що 130 МА 142 ох х Уж ук ку ху. ТУ лах: В з сх Зх с же дух сх - ах і:
КУ Сув без Узі Був бр Туж КБзе Ркз біз бжо Уві Тех УЗ) Веб Тгю
За а ЖІ З Ока а5 15 МО 150
Мк Маре іх В: Кох рі ух ох Зі ку Ж Же ТО У ко, З лю.
Кв Бех ЩіУ Іа їмо ТВе бек сі Уві Не Тих ба жо із УВА Тез їтО У5 «Ж Зах КУ у. сх рух Жива жк бах ие їм Ух ср ах іх Ух сич ші бак Бак зу Бео тую Бек ба дах Бех Узі Твзі їх Уві ко Ває
НЕК їВ5 ї8о
Же М шк. жа Мово и п але фо жа СК ду ЗУНЬЯ од ау дж чи век Беж Бевз У ТК БУВ ЖЕ Тек бів Сух за За) беав Мія був Бк ярок вх. уки ск
Іа ай ОВ
КЗ о Умулю Ж ва ХтАУ суч ток з ж се ж Уста Х клю а г ож ех Ав Тв буз Уві дав обу Муз Узі біо бкЕо СУ дак Му Аве Був хі МНЕ ак
У їжа 5 ех, й З Фудеях ЧК о ше ку Ж т. годжі Жохв, її У до ри
ТЕ МНіз Твк Су Бо БК був ржхо їв ро ЗіЗ Без ва ш5ж і БЕ 5 жах ЗО еВ ав
Бак Узі бе їм Ба Вже Бо Був Бжо Був Ао ТВ їЇзсва Мет їіє Зве ки ОО ев
Аха їв Бо сіб Заі ТВХх Сев Уві Мах Уві Аве» ові Бек Вів ЗД вве жк шва 3
Тхо М) заХ БУВ бе Аза Тер Тжх Уві Ав біг Уві Біо Уві Віз Аве
Кк хво 85
Віз їв ТВ був ко йеу зі ЗА ців Туж ва беж Ти Жуж Ак УА ж кас ВО чУві бек Уві їм: Тв Уві без Кін 510 Бар їхр Ба Ав су був Аз а і; Я т сухих 335 31 ЗІ5 Кг
ТУ був Себе був Узі бек бай о буг Вів їжи Бко Абе оЖхе же вх ув 325 КВ З тТнж їіз ех ев із уз БіУ біб хо вх Ба обо бів Уві Теж ЖВЕ 348 45 ЗО г с й їх кує ех тк ту У жує Ех і г Ж шую о божі ж їве Бо Бхо Бас дк аеро бі Без ТВ Сув два Зк Узь Бек бека ЖВх
ЗАВ ЗО ЗБ ев з сх Ві Туш тбліху Стнх кув Вуе сах жу тії Ех че тка сах ак -кв ма жа мух ААУ же УК ххОо ж ею а Ва УДК НА жк ми а ЗВ зва
Зах йзв о щіУ Пів хо Ка две Ави Чек був ТВ ТВ БроО вкз Уві За
За 3 за зп ав» бек Ар Щ3іУ дек Бе Ве фей ТУЖ Звк Бу їв: ТБе баї Авробух
ОВ С зів
Зах ку Тв бів їв ХУ дев уві Бе Чех бує бат Уві Ме Ні 3 за з 430 ів їн Мі Явв ВХ уж ТвЕ сів їв ех мі ЩеХ їй йех Беж ЗУ х . що 335 348 45
КВ
«2105 25 «2115 214 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 25 дер їі бів Меб ТВ бів беж Бжо ех беж їн ЗО Айво веж МЕ Є ї В їв ї5
Зв о бдавх Уа Жви їі Тавх Суб баз Аза беж Аку Зв біз Бех Мах Нів из ХВ Зо їеч вав КМ бУуХ Бі са уз хо БУ був Аа Бо ба бе Хм Ка
ЗА 38 35
ТУук тую 1 де ів бо їво ЯвуУу Бі Уві Вхо дат вх ЖБвБе Явж СХ
ЗО б БО как піу бах бі ТВж дя» Бве ТБж Бе їх їі Бех ЗвЕ Безе сю Вів ка ча ТВ ЕВ піс дао із йіз ТБЕ ТУх ТЖух Ств о су біб Бу АБ Ак Бей бо теє ва що З
Тв бе щі Шів СБУ ТВх Був Уві йШію їі біз Бжу Твжх Уві ліз Аза
Мо ї5 Її
Вк бек 81 Бе жМе Бе Бо ко Зак Аве біо (5 їжа бук Беж сг 15 12 155
Тк Ма Зах Уві УВА Су бе Без ав Ав Бе ТУю Бхо Ву аа ЗЕз 559 155 150
МУ а 3 тую був Узі Ар Аза вів Без бів бек іт ба» бек іх
Ж 85 ЗБ їв пів Важ Узі ТВх сп оса Авр ойек бух Асю Зах ТВх Тек беж беб; ве ї«5 ї7о ї75 вх ЖВЕж Без Би їні Бех буж дів йо о ТУК 010 Муз Вів Ббуз УвЕ ТУє хо їі855 ї50 віз ств піс Уві Тв ів піз осі Зв Беж Зех руб Ук ТЬЕ був ЗБЕ
МВ еВ ОВ
Бе зв Ак іу вуз суВ
Ії «-2105» 26 «2115 214 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 26 дав Ї1е біз Мей Твж ців беж бко йех беж ей Бех Авфв беж УВУ Фе
Е ке Я ї я Кк ЗАЧ Зк МШеух МХечум В не бе з не Жскж 5
Вао» бах УА Тв їБба ТВЕ о СУуз сів ів Зех ах Алро жа Бех беж ів
В 5 ж й с ху ух» ж г : их Жухеую МЕ Ек Суду, о хо я Її ха х Е з си Я їза Ази ТхЮ Тую ЗМО ів Був БЕЗ п3б був Ач о бко ще дез бев Ко ке х сеї - ке чи ся жи ж тних уж Ук где
Фет беж ОЗБу Беж Нів їжа СА Зек ре Уві Ре Межк дош Жке беж зує
З с : їз ах Е сука ЛУК ехо СБ Ж З де Мвую о бе г З ху
Ява: пі бах щі ТБх ЗБ» БбБе ТВ Бе ТВх її бек бек сем 03 Аіїв «их ко б жлю ВИХ ха їх біжу СА а Аж сх уч Ж Хе Жахже ій дво біз Жіа ТЬх Тух ТУую Св бїх бів ХУ Аве лу бе Бжо Жук
Тв Бе піУ 015 ШіУ їж їщше Уві Зі біз а Ажу Тву чві Ай АЛ ща ца ха
БЖ щ-х ЧЕ х сх ха хи Ху; Ми ех СХ уч СК Ук хз т хе х. Зку їхе Бас ув Жве їїе Бе ко Бо Вес бар 03 бів їммх Бе Яви бі вже їхО 125
ХУ че ме Хор е І ти 3. ех - уч Жук ТТ дж у Он и НН х ге «4 х
ТВх Абе бе УВі Уві Су бе) Їж: Аза за Бе тує Бко хз із ків їув Уві Сів ТКр» Був УваМ дер вав Вів і) сіб бек ОЇ баз Бах З
ЕК ї50 ї55 ї5О ох вже тУві ТвЕ бів Зіз ве ек МУЗ Яр оба Тв Ж Зву Без Яе5Е
С уш ТИ У ан Ко. а Кун доку ік кую КК У, сх. ж Фе ФТІ у важ ЖвЖ без ТУ Зевс Зах був Діаз Хар ЖК ЗВУ Бе НІВ був У ЖЕ а З м. ХУ т Ач сх Кох ше ел Ж осжух їж чи аж Щек і мя я се ся вів Су: піс Уві ТВж із бів СКУ бе) Веб бек Вжо УВА ТБ Був Бах
БТвВе ачи АкФф ву екв дю се шк «2105 27 «2115 214 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 27 зр їі Бій Меї ТВ Зі» Бех хо йех Бех їв) ек бів Бех ЗК БУ
Х В 18 ї5 г З х ж ко о не НИ п СК Худ Му Її г дво бЗву ТВі Жах їі Твх о Сув БО; ліз Бех Твх Алхв Се Мах Зах Ні й жк КК ххх еЕЗІ ей За без ав Тв ТУ: сів Щіб Буз БВжо Щі Був Ліз Бжхо СБ їм їмз да
ТУук бек Бі бек Вїж без їв дек піт УВБЬ Буз бет вже фе меж су й як м дах зх . ом се ща ЗАЧ кх. а кя ее НЕ В КМ З йвх біт Зає бі» ТвВж Вер Бе ТВх о Бе Тв ів Хек Бех іх бій Аж
Я че 4 пк чт ж ТЕХ ех чн ач у ТВ щі3із дер дів Ма Таж Тук ТЖХ був БЖ бів БУ во Ах їн охо Теж
ЗМ ба М хо у Я х Укус сх вк и ха їм їх Ме мах Ху З Е
Тв бе сіє ів Ск бах Бу УВІ Сів Має біо вкц МЕ гві дів дій
Яжо Зак Уві Бе бі вве вхо Кхо йеб во СУБ бій Се) бу ех Бі ках жом хр І ут Ще х: г ЗИ о Х 7 с оду Х хи у жи ее х ЗУ кКЯ
Три Лів Вех Св Уві Сув їв їзуз Хя» БВ Вве Тех Во Ах 01 Вів 155 ї55 145 сек й шал. х ч о Ух у як ж хе хе Жим ую ЖК. з СХ хе Ж бу Ума бів їхю Був УВБі дею Ах ів їн Сів Шек Сб два йеж СКЗ
ХХ ха сх Ж ж УЖ 5 С» ку она н ще М хв жи с Ж сю са сх щіз век Уві ТЕ сію со Аа дек був Аве Зах ТВх Теж бах їве беве їх ЕЗ Ж ї65 ї7О 175
Бек ТВ без ВУ іа ех бух із даю Жук ОМ Бу М3з ба Мі ух
Е т І і У ів був Бан УВА Тих Ба за зіу їм оЗехк беж Бжео Зві Те Ме Ве
Ща5 о ОВ
Бе Ав» бВжу Бу зів був и шки
КК
«2105» 28 «2115 326 «2125» РАТ «213» Ното зарієп5 «400» 28 я г ех, кт, люк: лих ; У КУ Зжек Де їз Бжо Суз дек Вже
Я: іо Зао вах УВІ КВеа Ку бе Вів Бжо уз дез х дів Зак Зп Був БЕУ Бхо бат УВІ Ве Кх ук Ле хо ї5 ї КА вже
Ж хо - ях гла КУ РИШЕ Тов ау Уж ; З Зк В Мі без БК Су о їзмі Уві Був Аве Теж
Ве ТБ Беж зі Бех ТЕЖ жа 5ів бе МЕЖ МУ М Оу У ї
Мак ївх Беж зб еж ТВЖх М Бе кі ща й Ку 5 З : «ві вів Та ТЕ Щех ї ї тих Уві Бек їх Ав Хах БУ БАЗ Хама ВЕ ше бве РЕ біз вкО Уві Ти аж ек Жхю Ах кві
Щ ЩО 5 що с ки в Сумах ОКХ Їжа їх ВЕ
В у Ве жо Зі Уві Зені сій Зв йаеж БУ бек ТУх ща щіУ Уві Нів Тех Бе рхо вів Уві їні За бе їй У З ва ак во и вКж: і ШЕ ік Тех сві й йймо Вех ех дав Бе 01 Твж об ТВ їн Зах бер Уві Уві ТБ Увю бко бек Бек Ав ЕН у їжа ех ех УВІ УВА Тв бю хо пе щі яку 5 зи зв ще Ух є со. у коми УК жу сок ач «шу би г
Х З їх Звпоуві кв Нів пух Вже бек дна їв Був УВО Аве був бух ЖТпж Се ба о УВа вв яв му бе се й ве щи зу г а ку. хо Ве Суз Во йїв Бка се Шк зу Зк гг їх вх ї дів ев хе й ув Вже їв реа
ЖХвВх Узі бін Аж Був буж ств Уві Ям бу: їх
Її Мох Е у У х хх к Й суд их ох с Же їх йду»
Я в в Заг Ма іа: Хм ЖМІМ зе бе їхав Ше Її: Ва тжо Узі Акв зі х5 Бех УЗЬ КВе Ме Се Бо Вк бів Е у ї ся н , Що зв 155
Ті шк й
КУ ня ще бек узі Ві ові дав й К 8, ее п а хх Тк Ха З че пед чі щі КЯ дер
ТОВ бво Меї біз шевх Аже ТВжЖ оБже ЗВО В ЖЕ х тв 35 що що 35 143 зо й ; і іх В Бхое біз Узі) бів Бе Азв о Тюр тек сві Аве опію бах веж Мів Се бю Жжхо аа Уа са. Ра яв хе жу в їх
МО Бе: їв 145 КО КАХ х я з Ко ЗУна В щ
Ма ув Ж Муз Бо» Аж Біб Біб зіва Бе бав
Е НЕ в Нав Аа і уз ТВжЖ був БЕ З вка Ах
Уви зл ТВ Нів деп Лів ув ЖАжЖ о їя ехо : і
Ба ТО 5 і Уві В Зі їн; ТВЖж Уві тУві Ніз ват Аве Жхю сх ско Уч; ех ях У ко Гея г Жде а Та ТЕ бі Уді ІЗ ї у і:
Зах Жву бне дк Уві Узі бах Уві ще ве ї Зо теж Св був був УВІ бек Аве цуз ФУ ма вхо
Т ЗК пі У ек ЖЕ КК км. сь КК Б КА ех ее З їні вав ці МУ СБіз бую Був був Ту мук 1535 о вах ї855 ЕН зх Сук буде жи пі
Я Її еж жа тво був БІ Біб Бу АЕЯЧ и ія 5 їїіз п): був Таж Кі. Беж Без ТВ був БУ АК З дів бхо їі Біб їв ТВ Ків Ве ХВ ; ні 3 КІ М 3 й Корж я
З хо мя т "хз ВЕУ же Ху дав
Е Вих Ге У Бхо вх йжЗ сіб лю Веб жЖіе був з
З сій таї бух ТВх їв Бхо Бхо ЗвхУ аа 15 за бже Зі Тв Жух жЖвж ень Кх ня пев
ХО соя їх
Ки КК к спек А, хх Зі Бе тую Бк аж двж5 Хе м Сев о їни Уві Мта сі БНе Туж Бко аж дв Ха су те Му Жмз ЯбЧУую чів з Ма бах У Бна У ? піз Уві Бех бе ЩЕ сбув бе Уа хх у вій х Гура о ук км з й 5 кА ків Узі іє ТЖхв осів беж дев Шу» 01 вхо ОО дав дев Хух Бу же
Ей за ше тТвх бо Вже Маб їн дар о Вех вю бут бек Ве Ве За бук Бек був їео; ТБ Уві дев був беж йху Тв осів бів Бзіу дав Узі ВВ Зех суз
УЖ хюхе ій КЗ Я в; зе ке я 2 ЗВ Зп ша мак к. вух, с са «У щи КК з ть Їж Ж жа МІУ ку ех Уві Меї Нів Біб дів їв Віж без Нав Жух ТВЖ ба був Мек ев зав ЗІ 315 За
Яах їм бек Бхе Бі Бук 35 «2105» 29 «2115 324 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 29
З дою ; ше нн чи НН ЧЕ ; ко жк яко - віз Бех ЖЖ Мез Віу ко беж УА ге В» зо ів БЕ Св двх хе ї 5 що ї5
Мас Тв Бех 30 Жеж Зх Аів йів Мав о сфу Сув ївє УВІ) їжа Вер тую йо 5 ЗО
Бе Вже Ма бхо Уві бвх Уа) Зак Тхв Ав) беж Бут Аіз Жені Тнж бах ке ху ще ся Бе пі УВА Ні ТВ Бе бко Бі Уві їзма пів Зах ве Біт Зх Жук ек : У Б:
БО 5 що
Мас Зах ех Уві Узі ТВ УЗ) Без дах Бек зве Бе СЕУ тТВЕ ЗЕ ТвЕ
КВ то ТБ во
Тух Тпх Сук ав Узі йвзр ів був рхо Мевх Аз ЖВЕ був УЗА вро їв в ва З бе базі сів Ба їв су СУ ВА сів пух Вжо бхе5 сУув хе Аза вже ке їп25 113 хо Уві бів ші БЕЗ Зак Уві БВеа ізмх Бе Око Бже Муз Бжо КМ ве ії5 ї55 їх
ТВ їз; МеЄ хів Вес дк ЖВЖ бо єв) УВЬ твх Стз ві Ущі УВУ Ар
Кз ДЕК Яни Б Ку З і35 їі за
УВІ Бех Ні ЗБ двюЮ бхео Са Уві бів Бе дав фею бух Уві Аве осіУ тУвВі б0ів Уві Віз дам Віз Був Жах Був Бжа дже зів БВ БЖ Бе АВ сх о й о в і чн осо Мох жу У он а і НН
Зах ТВх Бе дк Уві сві Зак Уві їз ТБху Ужі Узі Вів Бі» Авю тТЕюЮ г. ще Б й ШИ їх г. ож бкиих Хе шу сіж їж у жу тку Ку їже Взв пі був Зі ТЕ був Сув їшз Уві МЖек Ави цу БЕф ем ко с хо я А ех Фк У ку іч Ж ки ха У и х - ще т х:
Вів йхо Ті бів був Тв її ех бУз ТВжЖ Ббуз Бі» СЮ Бжо ДЕ БК бко піз уві бує ТБж Їсмі Бко Бхо йех дже Фіз бів Меє Твж БВ Ав
Й че ж - 55 з3а 238 а
СИХ ж ж ув ж ті з а м фе Бе г Ка т в. кт; о Ук же Х тях, ОКХ н х, їй Я ват Уві ек їм ТАЖ Се ба УА іїшз Біу Ба» ТУЮ Бе йех Яр Ті
Аїв Увю бів ЖхвоОМо вк база Фі Зів Вже біб вва яв бтк о бУуз ТВЕ
ЖЖ ко Бо Ме бе бер бек Аз» обУ Беж ГОє ББе ін ехо Яавж Тед їеє ТВж Уві дяв Був Зео Аха Ткр бів біз 01іУ Ав Уві БВ Зак Суд «ек «ке дх
ХО «ЗЕ З дак ві мес Нів 1 АЇв ев Вів Бав Пів беж їх осів Був ех Бе -2105» 30 «2115 324 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 30 і: е х їх с ій су ж Сея Кк ж о й ко и ь КУ сину ж ке Чи дів ев ЖВЕ ев ЗК БЕЗ бах ва Бе ко Бе біз БжоО ЗеЕ Беб Був ї 5 ї5 ї5 сх Тезе ож Ж Кк С а М Я КЛ З якіх ЇХ жк жом ак п ї Пд ех ївВкЕ дек Фі БУ Твж дів Азв їз Бі Ста їм; Узі Муз Важ ТУЕ м «Кк кю
Я В ЗО
Ух х с чу у ху схо Урожу ох: Мак і хі р Е щ- - Ту х Буде ве бко піз жо Узі Тв Уві бек Же вази За ЗМУ Вів бе бю беж а ко -х сл вх ь с ж з - Кн КУ Кале Жбоуву, чех ди
Ше Уві Вів ТВж Бі» же Вів УВА Бей бів бек беж сіб ем бух Бек й я мох Ж
БО ВВ «о де Се сук з Фу кю Фа щи Ж Та піку ОХ стр бух М жк без Зах Жак Уві УЗ ТВе Уві Вже Ве Беж бев Бе Бу ЖЕ ск жВЕ де жи "хх БУ хг ща ЇВ ТВ во
З ре. є Ж: з м ск з Й сь. Ше з 2-й пк КЕ тук бек Суб зва Уві Аз» Міжз був хе Беж вав тнжЖ Муй УВЕ Жаю Зах ва З Зк й ще й й ек. ом ши Шо ще сан Мк У жеух а су
Фе Уві Зі ага муж век Сув УЗ б) СУ вхо Вко СУБ БЕЗ Вів ее де здЕ я м МС їх
ХУ й кі гії ах Женя Муух хх У пок м; ж - с ск А и. .
Бжие Уві Аїв щшіб Кз Бак Уві Кне їм) ЮЖіев ко бо був Вже Шев Ар
С ЯКУ ох рот ї115 КО зи5
Ж Ж ххх Не и НА М уме М А Би ух ни те « йХУух хи ЕК у жа аж
ТВж бе Мей її Бемв дк Жах хо б Уві ТБх Суд Узі Уві Узі бвр х В Е «5 Ех ах
КО 135 Ма
Ж даю Ми є ах я ж ож у хіх везе . Фмолу у р фол СА ж таі бес зів бій вве БЕ щі Уві 0)» Ббе дае» хр обех Уві Берт БІ ї55 що 155 ке ха їх Ж Тїх ке М сах Жху у Жожжах ще Кожен Ло по ших Зо ож тузі Бі МЗі Ма де вка дев ТВ був бе Ажоа біб са зЗіє5 Бе два 155 ї7О ї75
С. с з жо хе х же її ху зах Же Стук ню Ух жк ян ; 4 м ахує ек Те това Ак Уві ув) Бек Узі Зх: ЗБЕ Уві ві Вже БЖ» Ав» отже хх цк з їм іа їв5 У
Жбашіє й ху Ж сої 3 жує ти сх Б хї- 0 бах воші ххх (тях т ах я ївзе вм о біт Мув БАЗ бух БУ СУ Бу Ущі Звж вв їв Біт зі Же чия я Уа ї85 що ях
КА: Може лок В я й х Туя 2 ї Ж С Жак пі м. соках ЇХ зе Я хе Жусзхс ух се Ж дів Буо ХЕ о сіз БУ ЖиЖ Хі веж ов Тв бУуз БІшЖ зів Ко Вже БК ух у її пу те У м фе ве ку же Ж се Ен У І жч КО т жи зк
Вко пів Уві Тух ТВБх Бей Рхз ко Мах біб біб із Меб Тх буз вв ке Ка ЗВ ай із Узі Бех бе) їх Сув ої Узі Пує Біт Оз ТУЄ Бгто йеаж дер її 245 Ж 5 ж КО - у ль ож Кк Течи МУХах с ак Ме хх МВТ дів Уві піз тТкор о зім бах баз ФФ Ба Вхо Ма Ав вав Жук бух ЖОх
КО а ЕКО тв Бко Буз Маеб бви Авр бевб даю сту беж Ббе Бе Ме) СХук Зех ев я «НО 5 їево Так Заі вер їв о йех АБУ Тер ів С) Му Аве УВА БВ век уж «м КЕ 3 я У х я З в 285 5 ЗО - ч зда ЗНО а А Зх г Мо маю ру (ІЛ жа Маю т пух
Зах тві Мас Віа 10 За ен Вів без Баш Жук Твх ОБ Був ко бе дах їн Беж ко -2105 31 «2115 326 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 31 щу ч х Оу «Кі жу ах о НУ У. уче ою Ко чу чу. х їх ліз бак Те Був і ВжЕо Беж Узі Фіз» Бхо їмо Аіз бжхо Сухж Бек й 3 Бе ща ї5
Жеж ТВж Беж ми меж ТВ зв Аз ів сїУ Сув ей АЖ Уа За ТУє
КУ 25 За у Ха зу хх зн ВК жи ік се зх же Ср Ху В ау х "хх ре Бжео (із Бхоб Уі ТВх Уві ех тТхр два Зех між ів Ян ФВ Важ з аа ах ем н їз, з ж й і; З г. ЕТ КК. В ох щи о аз Ха З х У ; ча Є ку Уві Міз Жиж Біне Кже Алею Увь Лмо (хіп Мех бек сф їні ЖУю ще 5 а во подія и Жлух їх те ху же Р пужких оч жи чн Но НН с к їв Вес жах уві Ува ТВ УВА хо Бех бек Ав Бе обі ТВж бів ТвЕ 55 за ЗВ во їж ЖнЕ Сев вав Уді дав Нів Був Бе йек вав тТВх Ста Уві бар Бук в ща З їВк сві пів Ак бе су Су УБі Біб був БжЕо кКкОо сух хе» Аув Бк
Каже 5 118
Бхо Узі Аіз сь Бо Зах Уві ББе зе) Ба Кжо Без був Бжз їв Аве 115 За 155
ТВ їм Ме їз беж Зк Тв Бео Бі Уві ТВЕ Св Уві шві УВО АЮ хх - хх дея я ее ЇХ хе хм АНЯ Ук: КУ Яку мух ЖЖ бум її ху
Уаї бек нів Зі Яаю Бо БіМ Узі сів не дав Тжрв о тух Уві Деюв Є х ї т куУ КУКУЖ се 155 БО ЗБ їВО х хо З ХА з Ва буда ЩУ жи тТушлує Мода ТЗ РУ КМ ок со Ж осях чУві Віз Уві Ніз дав із БУ ТБж о фбуз Вхз Ах са Б Ба Ве Бад
У Х З
Зах Тв бе бкй ві аз Бех Узі Її ТЕ Уві в) Маж ів Вщю жфхв м ва о ви и М ЕН а МА хх У Я Зх г Гой м ххх ї18О ї55 150 - Е ще тож пе и Мун о ИщО С и Хм ук ще ше хе ух жк Е уник с їза дав Щі ев 031; бує буж Ст фе Уві Ве Вав Гу Бі Бам Бк їз ЗВ Кз с се х х. в с. о Жожнсєм жим С шк Й ж де теж КМ хх віз бБхоз їіз Бі) Був ТВЕ їла ЗеЖ Був Твх Куда ЗУ щі хо ЗК АВ
МА КБ жи як с Ге Н 3 щя к БУ я ФУ кож спе ФК дм ЖЖ а АЮ МУЮЯ Ка Е
Бтз бів стві їж Тк бо БЕ Ро бек Вч Б БМ Ме Ти цув дав и: - х су ту хх тд а 3 ЗВ ке с 4 - - шо фхук мує г жду ек Вих В Тутру Ме Жак: Ті піз бі ех їни: Би був їв! Уві Уж 1у Бе Теж ко Бех дер бів аа ах 55 жу ХУВУ ОЇ ач дру ех ах бе ТВ Ух її» люк Ж у Ж жу пох їжу "ау. МК; вів ув щи Жхюв М бек Лев шу Біб ко Сім вза дав Теж ув Же
УК 7 АК лути хе Ох г а Зах. ЖШуких ой тку перу ку у сут хх о ему Ку Жмлі Ж луг Шу хдх ех Кк
Твх рхе рЕжЄ веж бе дво Бе барв сі Зек ББе Бе бан Туж вх Гев
Ге іх жу ХУ хх юх ч сон ле ою КМ Са МАВ аж хх со -х да. зе ТвВк Узвь Азр бух бек ЕФ ТУвБ ів 035 Су Аяв УЗВі БМе Ввк ств
ЗВ БЕ
Шах За Бу Зх шо хо Жов хх М мурах аю С ШК У
Мет Уві Ма Мах Бій АХ бев Між Аїбв Міз ТУк Твжх сів Був ШеЖ Бе
За ЗИ 15 Ка ек Ж Фах Жак зда У жу дак мац Зах Мжх зр був «2105 32 5 «2115» 324 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 32 хі Хан Маск СК кт, ХА жк Ку хх ЖУху УК х Е ож бок Же ТТ сухе бач бот
Вів йваж ТЕ Був ЩОУ ко Бех УВУ Ве Бо Без Вів хо Бек Бех Був ї 5 ке ї5 з пт зу А гі ху Вік Ля іх гос ХХ жо ска о и НЕ еіхх
Мах ТвВи Зах їж Бі ТВах Аза Вів без пі був бе ві в Аяю Ух
Ук У ла
М КЕ ЗО
Ка хо Бі Бо УЗ не УВУ Вех тк» баки обеве ПУ ів їн ТНУ Меж
З ЕК
Чфкк г іх сі ж де ем лу ЖЖ Ж осуг ік ках шоу сх Жах уж Фу їі Уві йзіз Твх Бе рРхо Аів УВУ Бей Сів бек аж БУ Мез Тук йвж
Б В 5 - . с Яке ко Я хай Я : моя жо Щохо саху ВА що їм: Бех йак сві Уві Тв УБЬ бке Важ бек Ві Бі Біж ТВж Сім ти
СУ 7а 5 що теж Твх Сув дв» Уві Авв Мів бує Бко бех Лав Тих був чай Авю пук
З ) х: З З й зо ЗЕ у : уе г «ой Же хх паж Ку сао ее
Те Ущі біз вхо Був йах уж і 5 Сув вхо Бо бух Бжхо Аа о ККо їз М кн: ож ; уч є хх о ке ЗчНЯ пвх Ж мох о рази У аж Же. хе шк рив Уукі дів пі ВжЖо Бех УЗі Ве ей БІВ Рує Бхо Му жо БУ В : Х як ч зв 355
ТІ ЕВ їх
Кук с Ще ;З Ям є шк я хх аж хе сумку хх а их 255 Ж х со Мих сх. ЧЕ. у. р;
Твх бе Ме Сі Яезх йхе ТВ Був бів Уві Тв осСув УЗ УщЬ твь дво 330 ї35 145
ЗЖ- Сех і их Жах Ме г «ж п У: дока м. вх - г де
Чаї век ів жа вею же с УВА із ее во бю Теж Уві бю Піх яд тех ск щу; ї45 ї50 ї55 її хи Сов х М шо се Жду р и но х ЧО оо: НН не тк З
Обв3і щи Уві Мі ба ів бу Твж о був Бхб Ажа біб ба БМ ББе два ї855 М М
СХахх бі їУох зхгу ЗХ З бе ех ЗУ бр же М КАК Сх жо н
Зах їв) Бе Бк Уві Уві Зе»кЕ Узі без ТБХ Ві УВА Вів зів Бо Тир з гуру ЗЕ З 55
КУ ї55 150 ох Комо п ж ери ож Мк СУ ех «Ку «ек му н ч Се Ка : джу, мейБ вав оскУу Був сів ТУ бук су Му Уві) йех вав бере су Бей ее «У ки их ери ки їх КН кА ух Бач со Я УК З ех ди -к зе Ма мя ж ТУ ж кн Че вла Ехо її ЗМ бе ЩеЖ іє Бек Сев ЖЖ Був шу зів хо дкУ Б бух ях їх х тугу
РУ ії Ка
Фімхує ЛЬ ЕК ху ше Жовтих Й луком Сук ХУ ху СИ ка сб мух. ех що
Вже ща Уві бек ЖЖ За Би хе еж сфе ах оз Ме ЖЖ їж Аве ук ук му Ту з: ї
ЕВ ЗО 35 а
ГА УхЖ У г бен й жом дя г ку ЖУК Тудче Жах си - ше вій Уві Бах без їж ев Бек Уві бух сіє Бе беж Бхо Беж бею іа
У тк су 245 5 ав ів УЖ ЗО тке» ох Зах АЩчий зе ціа Бже ша Аа) ба Тк бу ТВ
Тв Вже Бо Меє і авр ех дер о ОіУ Ввк Біб Бра Бема Тек беж ух їви ТВвХх Уві Ав» цух ех Ахч Тк ЩО бів сБат Ав тв) ББа йеж Сук що ач я
Бак Уві Мей Нів 03: ЖЕ без Кі із Ні ТУ ЖЖ бів Був Бах ба
ЗО За 315 Зх
Важ Без Зак Бу «2105 33 «2115 443 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 33 дій» ові із їжа 015 біс бас У Бк 01у їв Уві уж Бкб Беж сх
Тьх їн Вес без ТБжх Сув Аїз аі беж 15 Щі беж Ті Явж Нів Авр
Ні віз тТхр беж їко Уві Бку бій Бко ко СУ біз Зі ї-е бід тр її бпьу Бе їіе бах Тує вх Бім біз ТВУ Аве; Жук Бак Жжо Вжж їх пів У Аве Уві Твж 318 Беж Акз Взрв Ав бак був Аз Твх їз Ток 5 Та 78 ко їв: ів Ме Ашвв обЯву їз дк Віз іс дер жЖнЕ діз Уві ТУЮ Жух Сув
ЕеЖ я 5 віз Зха Бах без із Ажи Тв Жиж азів Ме бер їж їж о сіу Біб Бу
Жвх о Бвое уві Те Уві Бех їж ів ах ТВ ЗУв Бі Бе ех УвЕ вне
ЖЕ на ків хо Су Важ Ажху Зех ЖВж бек а беж ТВх Аїя Аза їв 3 КУ 145 їж Су бе Уві був бво Тух роз бкз бзАб вхо Зв Твж ве бек Же 145 ї53 і55 155 зва дак осльу Аіз ії Тв Шах ЗУ Уаі Ніж ТЕ о КБе Вже Аза У бен ї55 ї7о їЗ8 ців йВек бБес З1У їн; ТУк ек бе) аж бек Узі УВА ЖВх Зв) Бе Важ
ЗО ї85 5 бах йзи Бе Сі Тв Зв Зне УЮ Тк Суб Авв уві дврв Ніз їв Ко за ща еВ паж аа ТБ ід Зві дав був ТБ Уві сіб веб ев обу Схув УВА ах 219 ХАЙ КВ
Суз Бже бо Сув Бжо Аіз бго хо Уві Дів су Бжо беж Уві Біфе ні кв я 235 45 сь -х У з н Косик МИбкужи К, дах ШИН пре З ме Пекун ЬУх бе хо без бУз Бо Був Авю о ТВю бем Ме їі Бех Зх Бк бже БУВ вах «ех лЕк
За5 яка 55
Уві ТБ Суз уві бзії Уві див УВІ Зах Нів си Явр руо сія Уваь жп ї що Зх тугу
ЗБ в жі ту З кс. х де ка тех х шк кожух. Как хх Я чн п ож
КкВеа о дав Тов ЖУЖ Уві Аве бі ві сіз Узі Вія Хо Дів Гу ФВ о бев ; : У МУЗ лек зве суху: хво за сук ле, пт СК Кл ЗУ о Кк щу хом з ц оди ни НИ сум хо Яку Бі св сів Вів вав Зах Твнж Св. Вк Уі УВІ Бех Уві Танх
Тв Уві Уві Нів бо деюБ ТЕО без ав БУ Був баз Тек був Су Бук
За ща З Зк
Узі дек вв Бе СУ їни Бко Аіїз Вжо Їїв біз Сев ТВ лів вк тва за5 а 5
ТвВх ба Бі Сів Бо Аж СІВ хо піз ба бує ХВх За Ехо ВО бах 340 345 З5о ех З ж їх ах оба ї сошШШе е е - Її я в уд ли Кв т С Ге шу й у. ака ів Бій Ме тах бух вв» Бі чВі Мех Їж Тж Су бе і ув
З55 За Зе5
СіУ М: Тук Рхо йшжх дер Сів віз тв сіз ТЕ об Бек дви БУ св та З БЕ хо сія дв Аве Тук їв Жах ТВ БО хо Мек Без дев веж аю ду 385 жо За5 во йах Бе Ба їз ФТух беж бев цем ТБ Уві Ар обтув ех дку Тхюо ов ча5 319 15 біз бі Зав УВІ) БОе бах був беж УВК Меб Нув ша Бів фе ха АЖ 450 а 335
Нівз УЖ ТВ сів Мдув бат бен Бех фей меж шко 335 4 «2105» 34 «2115 443 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 34 зп Уві Сів їв Сів ів бвх і БЮ» бу їх Уві Був Вхо бек ми я в ж ії5 твЕ їши бек їве ТВх був дів Уві бах піУ Ні бек їі» йек Нів дер
За 25 За
Нів Хі Тер бек Тжр Уві Ак бів БУ Бх» 0319 біз Щ3б беп Ме Ткр
ЗБ а ах
Хіе Щі Ббе Хі» бе Тех йех Б15 її6 Тв Дяйб Тех Аа хо беж їво
БО ЩЕ що зів Бі вхо Уві Твж із ба Ах ЗвБ Хар беж дов Ява ТВЕК баи бух 55 та 5 в їз Бін Меб лев Веб їв ху йія іо дер о Тв: дів Узі Тек тую Суз 85 за 5
Аза аку бах ви Аза БкУ ТВЕ ТБ Аіз Ме вв Теж їв Сію іо СЕУ 160 їо5 115
ТВх їв уві Те УВі беж ех біб дек ть був БіУ Вже бек У) Ра 115 їхО Ми
Бго ше Віз БЕ Веж Зв ев ех Так Звк обу бі ТвЕж Аля Аїв Бей 138 335 ЕЕ пі СУ Бео Уві уз ве» ТУ Бе Вже 30 хе Уві Тв Уві Заж То ї45 159 155 150 дав век Кі Віз йо ТВх Бах зіу Уваь Нівз ТВ бе бо Алла ВМ ев ї55 їт0 5 кх хе ї зшЯн в кух ут су У Же ху ях З ох Тк ре Кі ке Сех щі Важ бех ПіуУу без їх дек їммх беж йех Уві УББ Те За БЕЗ Зех іа Аве 150 дех дай бе ші Тву бів ТБх Тух Тк о бух Зав УВІ Аяю Нів Бу Бко чавЕ ух ЗЕ 155 и Ох дак вви Твх їжа Уві Аз туз ТВ Уві бій Аху Муз ех був УВУ жи ві 5 Зоо ; ; ще кН очи А ЧА
Стуа Вхо бко Сув Во Аів Бо Бжо Узі Віз су Боб беж Уа ве рес
Ук «в зх ра ших 835 ЗВ ж ж та жк ох уж г оуєєе Тука ушу Се ЧИ
Ова Вхо Во їхх бхз був Аве беж без) Мет бів бек ку Же ви ЗО ав БО ак - ож їЄ . ка й ух сх и в Ж СК ах т ХУ
Узі Тв був уві Уві Уві дар Уві бек св Ом ве бжо сія вх був що а ЕКЗ. й Я ц : ех З ча ЗУ НЕ Не ч Ол сжхнс Я ок
Та йза біз бух За) йзр ду Узі 30 уві Нів Аве Ака Був ЖВжх був
Й о же зе»
ТВ Ма жи
Храчиу ач ях са що У они нн З НН АН НИ й 8. ї й ко аку сі БД: ів бе дви бе Тве Ве Ака Узі тві бек Уві їв ек КУКИ
Ще 2 Ме Зх я су І гу Зх ва шен
Тнж Уві Узі біз вів Аве Тхв без зв» пу без із Теж бує Сув о ЖУв тег сум є ек ж г с
КУ Зі 315 Зо жа ЖЖ ук т й З ж й гу я су Сх кА К ї ет ях. Под о тож у ж: ї. КЯх З м
Уа ех лав ів сі їй Бжо вів Вже Сів ЗИ був ТВх Їжа Бек Здуа
ЗЕ Зо З35 уч во р ж з Ж лико іх Же зи Чи ен мух Своя Ме дя жу я ук з. «ж,
ТВ був СУ сіб Бхо ака біб БхО біг Узі Тує Твж о еб Вже Бо Бах 4 за Зо «Ху У соч х МК Жду дод ЯК ж ся А мощі є ЯНА кож х фо се жах ів ща із Мек ЗБЕ був Аше Зі уві бек їєо ТВж СУз її УВІЇ був
К БО зав пі Бе Тух Бо Зах вав її дів Уві ба тв біб Беж Взав бі пі85
З7о 375 ЗВО
Бхо 01 вай дев» тує був ТВ Тв хо Ро Меб їєй йзр о бех Аве су
ЯвЕ Бе Біб їямх Лук Зак о Був їмо ТВх Уві дзе бух Бех Аж ТювБ о ОАх 05 що чї5 піз 3 бвп о УВ)і ББе Зах Суз Звж Ужі Мебс Ні оз аж ев Мьа Авт
Ніж уж Те ав їжа беж без беж їди: Мех Бе «2105 35 «2115 443 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 35
Зів Уаз бів бо Зів 0310 бек ЗК Буз У їні Уа Був Бхо ЯЗвк 1 тТвк йей) йех йеє ТвВж буз Аів Уві беж 015 Ніж беж ТЗ бек Ні Авр хза з нює ЗМ двах ус о Кт со 1 бе Би ще піз ші Зам) 033 ЖЖ
Мів ліз ТЇкр бак Ткв Уві Акф бів Бжо Бк У ЗМ БУ зам ом Кер їїв Щі» бе Її беж Тех Ват біу їйз ТВ Ав тех бе Кхо хеє во 77 а І о де 7 КЗ
КІ Бе щО зма ке вк Уві Твж їі Вес Ако одйзр Аве дек Був Аяв ТВх їв ТУ
В та т8 во їво біз Меб Аве бах їні Аж ліз сн Авр о ТВУ дів Уві Ту Тек був як що 5 дів Аху Мах без Ліз Ак ТВ Тве Аїв Ме Ав БУХ Тр о бї 013 Зі їпа ї95 мо
ЖВжх без Уаї Же Узі Беж Зек Аїв екс ТВу Був ЗЧїУ хо Беж Уві ББа їв ї25 жо Бевз Діва Вкс бек Бк уз Бах ТВ Зах Бі бі ТВх Аз Аї Та о 135 135
Зі Сув бе) Уві Був Ар Теж РБ» Бжо 015 Бо Уві ТВх Уві бек Тжр 145 5 їв ї65
Ас бек БіУ Аза ої ТВаАх бек бі Уві бів Жвж Бе ко Аіз Уві Ба із Яех бек бі їз Теж беж йо Зех бек Уві Узі Тв УЗ Бо Зех о 185 їв ха Ява Бве Біо тТвж біз ТВ бук ТВ осСув йве Уві Ар о йая Був вже
Явк вав Твж дув УВА бер був Жак Узі піз Вк бує Бех був УВБ Ба
Сев бко Без Су Ррко із Ро Бхо Уві Аів Су Ехо Зах Уві ББЖ Тека
Кк и За ай
Бне бто бо без хо Буд вар Твж беав Мас хів беж Ах ТВж Бе» Ка та Твх бух Уві уві Узі Ар Уві Вес біз біз Авю бхо Біб Уві в
БО 5 КН
Ое дви оїхв Тех Уві Азв Фі Уві біс Уві Мі без Аз був вх Був
Бхо йку бів іо ів ббе вав бек о Твйжх Бе Аж УЮжі вж ек УдА Бе ча а уві Щі а бі дво хв бах Бл Ці Бу 03 ТУЖ Був су Беж тнЕ Уві ВІ Ні БІВ зви Же аа взяв Ку шум жк ух Му ОМ 305 о 35 зга
У: НН от че СК ехх Хеит Щх ди а га Фата МИ, Ех З т чах Жах дз Був Ф1У По Вже Аза Вже її Бій цую Жвк їі Веж ув тв їв іс пів бБжо ут 1: зЗмту ім 32 бою іч т с зу хх как ому ку вав Бжо вже а вхо Бі Уві Тк ТВж ев Бо бБуа Зв
Фів Бк Ба Ме ть буз Аза Сію Ові бах їее ТвЕ о Сетв бе УЗА був
ФУ Ва Тук Ро Важ Лзе їз Аіз ові біз Ткв олія беж два біт ів
То із Ав ДВ Ту цу ТВ Ти Ре Бо Ме Їжа Аве Яевх дввобіт
ЗИ зав зи 03 йеж Бе Се їв тує бек дже без) ТЕ Ущі Вер муж йзх Аж ТЕВ БІВ ах 330 ів віч зіу Аюй Узі Бе мех Суз йех ві Беж МіЗ Біз Аза їев Нів їж 42 95 433
Ні Тух ТВх 015 був ак Сем Бек ії) ек МЖкО -2105» 36 «2115» 445 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 36
Віз Уві щі Беаб бій Зіб йеж Зі Бхз бі їх Уві був Бжо бак се ї В 30 15
Жвху їємі аж без ТВЕ Сув вів Узі йеж св Жух бек Б Бек Не Арх кр тк ух за 5 ЗО ся у й я ж. Ша темою Же ЖЖ ху Кк ки Же Кк шоу ів із їхрвр бек ТкЮ УВІ Аа Ба» Бжхо бю ЗКУ БМ СУ Меп о скв Жею 58 Зк її пі» Ніз їїів бек ТуУух Бах шіу Сів Тв Аве Тужю Беб Бже аж Женх ка ва ЕД ка ще іх вав дк Уві Тв їі Вас вху дав о ТвВУ Вже був Зав осів Бке Зах пи У А" т Оля й Ез я щі ; У ще 5 та 5 во
Жов ж жо зе Ку ік чих. т Е ше Ух се ам й о г. з ух чт: Ко 2.
Мей МжЖе без ех Беж ув Жах оАла Вів Ав ТвЕ діз Зві Тех Бук Се вк зо 5
З к Кк: Й с Ху о Я х ке К о зує сх хо ує сх сх ч - хи ки
Ва Аа бе Зеб Аз Аж Бі» ТВ ліз Ні Авроів Тео 015 біб 615 що 108 і38
ТВж цем Уві Тих ТВі Щек Вес Аів З» ТВжЖ буз Зі Буб Зак осві ВБе 115 Ко а уча. уч ут КИ с ин жому. хо я А у. Я Гео Кі Мне ех сй с з хх ий с вже їм віз во су Зах Ажое Бах Тв Зв Зі дек ТвеЕ Аза Ач Там ї5о 55 145
Біт сСуз їв УВ3і був Авр о гук Бе бко бій Бкбе Уа Жву Чаї бек ТЕр
В но се 145 ї50 Ко їв дав беж СіУ Дів їх ТвВе беж бі Ві Ні ТВхе БЕ» обжо дів Уві Темі
Е У У З д. С її Уо 375 пов обек дек су бе ТУЮ ВК ев беж дек ТВі УА ТВ УВі бко ех ї5о їв5 ее
Ка у КК У м Костим ч й я її Я х. ік Кчж ж Рок н се кя с с. х
Зах Яви Ка обі ТвВж бів Теж Тух ТВ СУБ АВ Зах бер Мьж бе Вже
МБх ке ОВ ех Ав їж Пучз Уа Азв був ТВх Уві біб дже Був Сев ЮКв Узі с «їі 215 ай
Суг Вже Бо буз Бжо Віз Вже бхо Уві дів Бу Вжо вх Уві Бе Те 225 3 5 ав
Бе Бе Во Зв Вжо Му бе» ТВж ї-о Ме бів Звж Аж ТВЕ ВЖО Же ай 5 жав
Уві Твх був ві ба Уві АзвоУві Звук Нів 3 Авю ко жа ві Хв 2850 55 0
Та йо То» Тех УВУ Авр обі Уві 01 Уві Нів Авй вів був Твх Бу 275 БО ее тжо ху піз шіз бів Бе Ав бБав ТВЕж Еве Ах Уві Уві йежх Уві ев
ХО а ОО
Тв Узі сві Ні Бі Ар о Тжв їх азе збу Був ФІ тую ув Су Був соя раму туз Ух г
З05 ТО 315 Зо мі йзх» дез був Піб Бевз бо дів Вже їі Шфз БУ Тв її Бек Буя 325 З3о Кк
Жах бу ЗУ Сі бхо ба ія Бо біз Уві Жук Тв їз бо Вк» й
КУ За Зо ка ща ра Меє Те Був Яви сін Узі йех Її ТВе Сух ївє Узі бук
Зк ЗЕ5
САУ бе тує Бо Беж Авр ів віз Уві б Фев бів ех дез БУ ув 37 З зво
Вже біз Веб ав) Ту Пуз ТВх Жфне ке рез Меб ей Авр ойех Аве пах
БІ ке За па
Яеж Бе Бе без Тех бек бе ес ТВ УВі Вар ів Бех ДЕД ТЖр БІВ ча5 За 115 сів Бе вав УВІ ба бек Су беж УВІ МОЖЕ Ні біш Аїй їзмнз Ніз дів
С за 433
Нів Бух ТВх сі» Чу ве їзази бек бе беж ве Біб БУХ зах -2105 37 «2115 443 5 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 37 ів Уві бів бео бів Щі беж БУ Бк Бі цеб Увж Був вхо дак «ке ї й ів ї5 тТвЕ ей бек цео ТВх СУ Аїів Уві Вех спіу бує беж їі Беж На Двюр
КУ 5 3
Віз дів їхв Зек Твр Узі ку ша Бхсо Рко сіу Ба БУ Бей Же шЕю а 30 45
Хів дїУ Кіз її. бак Туж Мак 0ЖУ їі ТВ дво Тух бе Вхе Му гей ва ва дів Азео Ак УВА ТВ їіз аж бху зав о ТВх Зею Був дви ЗА Еве Ве 70 ТВ НО в то З у ї а х ро жа З. З мух Лов В дю М Тухує Ж ху
Їжа) бе їв йехс ЯЗех УБі ТВ ліз Аїв Аве їв Ат УвЬ Жук жЖужх «ув
ВЕ 5 вк
Б. ох тах В хе Хі вах А нів вд Міз ЖЕ ще іно КА дів вхо пз їни Аза ВЖУ ББе Жбе Аа Мав вар оно жке ЗАМ М ау й ЗЕ ях запо 1035 КК
Уіне фе а бу Щи лу бок З Мою бух Ж хкоу 2 У ЖЕ
Хвж без Уаі ТВх Увь Бех Бех Аіз бек Тбж Гув Зі Бк» йек Узі Бве
ТІВ ї20 185
Мат 1 зе Зк ау жк Ж аухо о дак фут ках пк З Но
Рхо без із Бо Вех бек бує Зак їВУу Бех ЗУ Сіу їх із Вів ев в «Ж ке ї3О ї5 158
Піу Су ле Уві фтв Аве Тух Ве бро біз те чаї Так Уві беж ТЕр 145 ї5И ї55 їка ст буре іх ДІ Зав б ба хх у 4 шо ах УА че що жи жна Оле Аз фен їх Вес Зі ві Ме Во ов вхо із чаї Хе 155 ї7О їт78 пев щеак Щек Бі Сем Тек дек баб ех Зех Узі Уві ТВжЖ Уві ро бах
Мак А Бізе Сі ТУВе Сів Хвж бух ТВ Сув дав ай ввр он БУЄ Вк 155 ОО ОВ
Язе Ав ТВЖ був Узі бер Був ТВх Уві сіб вже Був бас Сув бваі В
Ка ій КВ.
Суз вхо Бхо Сев Бо Афа Тео Бхо УВА дів біт БО беж ві ВВе Тим ший 3 ЗА 248
Ба рхо РЕ Був Бу Був дар ТвЖжЖ без) Ме ів бек Бк ТЕ Бо ЗК
Я 5 а чаї Тв Св Уві кі Уві дер УВї Зеж ів біз бар о бю» Зіз Уві в сь Ї х Х ІЗ ча БЕ та
ББе дав їх ТУух Уві Ввю сіу Уві піз Узі Нів Ави Дів Був ТВх Був «о 85
Рхо дкз піз біз бів бе баз За ЖБж бе хз ва Уві Зех Мал беюх 29 З Зо тТвх зві Ужі Вів ів даю їто Їх авв Біб Був Є тТУк Буг С був
З ща З КУН уві йеажх два був З3у їм: бхо Аів бко Ї16 ба Був Те зе бек мує
ЗВ ЗО 358 тих Був Сі бів бко Аж Бій бо іо УВЬ Жук ЖБх бе Бо Бжо Має зай За з58 я : х- Фк иОНИЯ по бра хх вич Фавех ЗК уж бів дів біз Меб ТВЕ бух дав 315 УВь Бех сем Тпж Су мі УВУ був
ЗБ ЗО КА
ТТ 5 цк З їбучиу ЖК шу КІ 5 їх т я Ох ех х ге ї
СУ Бе Тук Бго ве Авзро Сів Ав Уа) Зіз Тхр о Біз йехз лей сі спів зо 375 зва
З же. х. зх ххх кое з» жк з - хх дл. я. с. де с. Я - су. с соч
Вхо біз Кай Ав Тек Ге Ти Твх Бо рхо Меж Змі Авю Яве Авю іх
За Зо 85 4
Зак Ра Кв їм Тук Вес Муз їюми Тв Уві вв був Зак дже Тер ошівй 405 їв КО біз БУУ Аза Уві Бе йек Сеув бек Уа Ме йлз ім діз їв Вів 3ів 2 35 За
Маха Те Тек 3 Був аж їжа Зах їммі беж хо
ЯЗ 840 «2105 38 5 «2115 445 «2125» РАТ 213» Штучна
«223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 38 пів Уві 5 Без бів Зіз ее ЗіУу Бо су їз УВА Був Вхо дах січ 1 В 18 15
ТБЕ ії-ма ех без ТВх Сув Аїа Уві бек 01 На беж ТЬвБ Бас Н3ж БЕ ва В За
Нівз Віа Тхр Зах Тв Уві Ат Біб хе Бко баку ЗБ біу їх спам тбжв
ЗЕ 4 5
Хі 335 БВе їі бах бТбе Бах ШТ Бі ТВх бва о ТтУЄ бао БКО Те Бей 55 БО
Фів пі Ака Уві ТвЕ іє Зк Ах Азр о Аха Бек Був во ТВж без УЖ 5 то та ВІ ївщеи Щі Мас дав Зах ва дя Дів 035 Аве ТВих жа в бук тух Ср ве за 5
Е жк. н хх Е и о х г з ШИЯ дуже їх. Ух Зх хх КЗ Тк дів ку Ввх без Віз бку Тїнк отв Аів Меї Вар оТух Жжр БУ Ма Му
ЩІ 155 15 с ща . ще ; , шко фе Сб жо бат Щи же г не
Жне ївеєе уві ТНК уві бах беж ліз Бех ТВх без Бу вхо Бех УВУ ЕН ї5 155 15
Зуби З в Тен фожу: дже оче дуже їх ух Не не з о Кк З. « г ха без Аза Бо Су Жех Ася йах Тв беж бі) ву ТІ дів їв Тед ї55 14о сх вк Фомях Ж З сю Мхх Міка МУ Думок 2 КА х їй з УМ х ж « я. ще Сук без Уві був Взю ТУк бБа БЕ 013 Без Уві Бе ві ве ТЕр з45 153 па 1 ох. оду Уа « -й х сі цех ОК ЯК жу. ЧЯ хто УМ ях ФУ Зчеджл чу ак Фо
Зви чек сіу Вів ей ТВ век ОїУ В МНіз тТВЕх Ба бжо діва УВІ їх
АВ ї78 ЇВ бів бек бак сі бе ТУЮ бЗек зе) бек дек Узі УЖ тва Уві бе бах
Іва їв5 їв
Бек Авв Бра су ТВх 5 Тв Ту ТБЕ Сув зв Уві Ваю Між Був Бжо ма є КВ деж ва Тв Був Уві Ар» Буз ТВх Тв) сьо вка БУ був був УВУ Фе 5 ій 2і5 22 пу Бхе Бе Сузв хо Аіз Вухо Бо Уві Вів Біб БЕб Важ ва Ба ї5уй 25 «З аа 240 ве Вже Вже Мов Бжсе Шев ев ЖВх бе Ме бів Беж Ак ЖежЖ бко са а що У хві Твх Сув Уві Уві УВі йо Уві Бех біз щій Азо Рез 3 УВА Хо йо Кк ТО тва зва їжю ух Уві Ав» піт УЗ біз Уві Мьв дах Вів був ТВЖж ув 55 во но йхо дя щів із бів Бе бшие бЗвУу Таєс бе йхех За Уві Важ Уве бев
У «35 З три чаї Уві Вів сСіз ве Тжв без Ав жу Був Бі Жуж дув сСув дув зав Зї3 315 за чві Зак дзв о іїув Зір їз ха Азія ко Щі Зо був ТЕ же ех ув
В ЗО 335 тк уз Бі Шів рко Ака ій бжо бів Уві Жук Твж Мео Вжхо РК а век 343 ЗБ Б ха йі: біз Мес Ту Був дви пів Уві Беж без ТВж був Тк Увж їд 55 ЗО За з. кош сих дм ск а ік Ж аж йду п хх. Я:
Піт Ре Жух Рхз йеж дав Тіз жів Уві СЕ фер озве Зек Ав обу 5ів 37 ЗВ Б
ТІ их г й х Е Зо сх жи МУ ги жі ч ся н Ч ще їхо із Аза вва Туж бує ТВЕ ТЕ Бк Бе Мей фев жав Без: вро шу 35 х. рик их - в ж
Ах 350 з зів
С дух Ту їЗ Я ж че ме н ЗЕ. ч хх зх а Я с (5 - и с
Зак трпе Єпбе зей Туж бек Бу» Гео ТВх Уві. Авр МеВ Веб ака Ткр бів 305 38 415 ги х пе Кк У Ж. ТУЮ ох Ж аж же х. ЇХ ках їх, як х3: и ч КО. НО ї щі 515 дет Узі ббе дак був бек Уві Меї Нів піз дів без Вів віх
Яго зи аа пів ЖУК о бве Са бує ех без бак ев Ве Во дру був 55 а 345 «2105» 39 «2115 443 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 39 ща УВІ Сів ев Б біо бек зір хе Біт їм) Уві. бю Буо ВБвк о бін 3 5 15 15
ТБх ї-еб беж без ТВх сСув Вів Уві бек сі Нхз бас Хе Зв ів Аве и КУ
В 5 за
Нів Кіз їхр ех Тжю зії АхЗ біз Вже бо жу Фу су їм 33 ЖхВ 48 В їїз зіУ Бе» ХО» бек бує бак БУ ів ТВе Ав Ту вва вхо ТВжЖ Бей 3 де й із піт й Уві ТБх її беж Дту Зав обо Зах Був дав Жевж Тема ТУ
Х чх ве 7 -Ї за за що
Без ів Ме зв ех цеб ах Аза Бій Бер ТВж Аа ть Жук жЖеж СУ в що з
Віз вс Зах бец ів дху Твж ТБжЕ Аів Мес Авр о ТїУк ТкЕрв ШХУ Біо БЕ їз МОБ Ка: тв їв Уві їв Уві чех бек Аа бек бах Суз СТУ Вже Бах УВУ Бе ке їх ха
Без їв Віз бхо Зах бвх Був Вех ТБх ех зве БУ Же ів Аз ек 135 135 ї45
ОіуУ Сув Ха Уві був бер фукю Біе ро Сміх Бк Тай Тв Уві Бех ТЖр за їво 188 188 вх Хан Сх» В бах я Хм ТЯ з 35 с У Іі у
Ав Беж Сі Аїіз їні ТБВж о Зех фу Укі Міз Тв бне Бхо ів Узі їй 155 то їв х Каожю. -- ххх скчих се ке у жу У с, Я
Ще йек бех Щі ев Тух Бек де) Бек беж Уві УвЬ бвж Ов бо яв їх хм Ії жожу їво 185 ї5о
Жах я ЗУ С ж Кк Я ж Мк я і: дж з х з К ща Кз
Зак Аза Б» БТ ТвЕ БІ» ТВе Те Тех Су ба Уві Вер Вів Був Вхв їз5 200 за8
С с ї «щу ме как ї "ху. зо Ж сеть че ж З ко з чо дах Аз» отв був УЗзХ дер Ме Тье Уді щі вх був дек Се Уві ів а гм ск УЖ и жо -ії5 жо че к же Хе хх Ху х же аж У ко ОА сен М азу, ЖК ї я су вхо бко Суж о Бжхо Аа жо Кхо ові Аів віє Бе бах У) Ева на
СЕ ЖЕЯ сг у Ух г
Кк а ав кг
ЗМ: ке ес Коба й тож Тс Ж шву ке тд лу М ух ще ач
Та хо Кхо Сдуз хо Буз дзев Ту бач Ме: Ті ех зх ЩТВк ха 035 аа ВЕ
Уч Ух Й. не ее Я се з Ху дю чт. ре Жуха о Крах ж І
Уві ЖвЕ суз Уві У Уві йзв Уві беж сів сБіз бр» Ру біз бай в дпкх сек ще
З 85 ша є У т жк, - - ек сах СЕ Й ж й жк. - й
Без Аео То ТУ Уві їв бує Чай із Уві Ма дв Ак ее Жвж бух 75 зво 5 хо вх Бі біз Б ЖНе Авий бек ТВ Бе Бху УВЕ Уві бек Узі Се н туде зв еЗа ЗЕ за
І У ее ср КУ й К сах ще ч ем: . Я Ух ха Ура жк пах Ж
Тв Уві Уві) Ніз пів Аве Тв беб Зва соду ПУ спі бух був Су ув
З05 З Зї5 я
ЧАЇ бах вав ув ЩіУ їні Бжо із Бжо їв оса був ТВЖ Жле бек їж
ЗВ 33 за кХ , І Кк « ІЗ т дат як Се Соя Ох ї: « КЕ же Сея
Твж Був сі ів о Бхо Ажа біз бжо їв УВЬ Жую ТВжЖ Ме Вже Рух Бех
За 345 Б дів дів із Меб ТвВх Був дав даю УВІ Беж їжма ТЕЖ Сув Без Увжх жуа
ЗБ55 ЗО ЗУ - у й х ж я . яке - еко Уж со їх Хв прі «ЕХ хе
Щі Ріо Тух хо йеж Ав Тіз ів Узі Біз Тжр опію Бек Ав сію бо а т зво бує Бі: йемз два Жук Бу ТУ ТВ Бхо РЕб Ме їм бер йеж Ав оз 7 ко Е лк Е, - «щук жи зна зва Кс ап дех б» бів їх Бук беж Муз їзкз ТЕ СВі Аввро був Бек Ак Ткв Ма ай за 415 іч піУу Веп Уві Бе йек Сух йзжх УЗ) Меї Щі бів Аів їшю Ніз дів аг Я «30
Яів ТУук Так мів був Бек їж бах їх Зах Бхо «210» 40 -21155 «212» РАТ «213» Штучна «020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 40
Ніз Зв нів 5ів ТїхХю деж ї Б «2105» 41 -211516 «212» РАТ 213» Штучна «020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 41
Ніз Кіє Зак Тую Зах сф Кі ТВх А Тук дет бо Ніж ема Сх Аве «-2105 42 -211516 «212» РАТ 213» Штучна «020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 42
Ввеа їіе бек Жех ЯЗвху 03у їі ТБ Аве» Тух Авв о бхо ж бев сів озіу 3 Б 18 15 «210» 43 -211516 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 43 ї 5 18 15 «210» 44 -211510 «212» РВАТ 213» Штучна «020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 44
Твеа їни Кіз АжЗ їі тах Аза Вів Аз пів «210» 45 -211510 «212» РАТ «213» Штучна
«020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 45
Зах йед; іа же ТВ ЖажЖ Віз БеЕ Авор о тує «210» 46 «2115» 30 «212» РАТ 213» Штучна «020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 46 ців УБі щі їн Зів біз безе Бі бжо ПУ ев Уві Буд Бу5х Вех и твж їв Жак їн бвх Сув Діз Тв) Мек БУ ТУЮ ех її ве 2 В зо «-2105» 47 «2115» 30 «212» РАТ 213» Штучна «020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 47 ців укі бів їжа бів із Зах Пір бко Щ1у Бей Уві бе Вже ек ву ту без йех їв Тк о Сув дів Уві бек ру Віз Беж Хія Бах ку й ЗО «210» 48 «2115 14 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 48
Тв УВІ Ату ів Бко Бо Ш3іу Фіз ФІ їз 3 Тжв гів у «210» 49 «-2115 32 «212» РАТ 213» Штучна «020» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 49
Ах Уві Те бів Бех аку Ав» Тв бах бев Ажв біз Фо» Бек їзмі Був і В 10 ї5 іс) бек Бех Уві Те ів віз ар бе аізвз вів Тех Тух Ста дів ВХ шо ВВ Зо «2105 50 «-2115 32 «212» РАТ «213» Штучна
«223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 50 хз Уві Тв їі З» Я де» ТБж бак буз Аво осів Бе йеж бе Був ї ї 10 ї15 їчшч бах Зак Уві вк Аза Дів бер ТВк Аза УЗ ТУую Жуж СУуж Акв АхВ зо зв в «2105» 51 «-2115 32 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 51 йхоу Уві Тнж їі ех бка бер обза беж був Аве вх ем бух ее ше ї 5 їз ке
Ме Ав; Чех бен Ако Вів із Бер їх їз Узі Тех ТУж Суб й Ву «2105 52 «2115 11 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 52
Тхв осі Зіз Пі ТВ їх Уві Те Уві Звевжх бак ї В Її 2105 53 «2115 11 «212» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 53 зів Але Зах Ах Аве» Ж бах ех Не заема а «210» 54 «2115 11 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 54 бів вів бах ТЕ а ів Ве обЗек Нав бемй ак ї в 10 «2105 55 -21157 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 55
Жух Щі йех Ніж їжа їх) ах «2105 56 -21157 «212» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 56
Хух слу йеж Вів бец 18 Зах
А В
«2105» 57 «21159 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 57 «їу Щі бі дви ко Зх Вже бек ЖВЕ 3 5 «-2105 58 «2115» 23 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 58 дав тів Біб Маеї Те пів йех БжоО бах беж їз бах Аз ех УКХ ЄКу
Зазр оЗак ові ТЕ їі Тв був ов хо «2105 59 «211515 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 59 тТхр Тух Біб (ів МПув Бу 51У був й3а Бк ка ей бо Їїе Ту «2105» 60 «2115 32 «212» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 60
ПІ» Уві Бко дах ака РО» дек СІУ йек піу Щек б15 ТВк Авв Бе ТвЕ
Х 5 їз ЗБ
ТвВе тах їЗе Важ йек їама біз Віз Бо Ааровів дів Тк Фух Жуж Сув
«2105» 61 «2115 10 «212» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 61 тва Бі Фів ОЇ Те Був УМ Бач фе а ї Б жа «2105» 62 «211» 449 «212» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 62 піз б іа їви УЖі Зіз беж ЗЖу пу бе їм бо їше Ше бу Ох ї 5 18 ї5
Бах їв їже бе) ех Су віз біз беж ЗУ Біб о жме Ббе бех Бех Ве жа ка ща зів Мах Ва Фу Біб дух Сів Шах БбБжо піз БУз дк ба С фер УА
МАО ВЕКК У ІЗ І У с !
ЗБ о 5 ів піз їіз бек бек біу Зіу бек бух ТВх Тук ТУЮ ркЕо Авр отв ву що 55 5 тих ді джу Ве Твх їі Вес Ах дер обве Віа був Ав ожЖвЕ Бе тТуж
І зо 5 ва їв йіз Мат Бех бах без Ах бек щі дев ТВЖ Віз Меб Тех Тух Ку в» За З жів йхе біл їм їхо Піу Тук Щух Аїв Беб бер Жук ТУЮ фу Біб Бу дів хо у ща ЖК ЩО У х ще ї85 їа5 119 з аж їх п ХУ. «Ку ОБ га це «о я ке їх дк: ях
Твх Явжт Уі Тйж УЗі бек Бек Дів Бах ЖЕ ЗУ У же Шви Уві КВа
КЕ ТЕ мк ША У КК я Се М жахи я зе нн а НН чі Е ч г.
Еко бе) 358 Бжо Бех Зек Буж Бек ТвВк беж 15 Бі Тв із дія їв 4 ЗА хх ке ; М
ІЗ їз 14
Сі (хе бор их ав с ну КН бачту 23 Бах бе Зв Т.В
Ж Сув їеє Узі Був дер тТУукК КЦе Бо сія Бо Уві Тву Уві Шах ТЖор ак ов ух вок зх 155 МО 155 КО ще ХХ шк, г шк Зх рок как жк хх не он ще Е й и шк
Ха бек сі бів бе ТБх ех Бі УВЬ Вів ТЬе БЬБе бе із Уві Та тиж жк я їх КЯКК МБ
Я ж а Мауз їЗ 3» Ті Му ох ее ФУ хо о ту. у За ен дк щу
Зібз беж бак слу бо Тук йех бе) Шех йежх Уві Заії Тнж тві бжо ех 53 чех У їн 183 Її
Ек. Шо ху є КУ я МЧіує ту З Межа ам йМк ка -е чі се хх ска х.
Беж беж їв У ЖЖ осів ЖЖ їТУЖ Ї15 був аз Ві Бк Маж БУВ Вже
Хиххх Х хх г т ху ХУ сухе КУ У "жує гаї Пл кю жах М суку ху Же
ЯвЕ Яви ЖЖ Муз а Аво» Бу їв Узі Св Бжо буз Беж Су бо їже
Зах г тя тугу з5а8 ті ж пу ке Ж ах се ЖЖ Тк Х кечячх Ме Жужчм ЩО Фк же т сг Ки жу ЇХ ху а
Тк іа ТВх Сув бо БЕ Сув ВхО Аїва БЕО сб бе їз біб віку БЕ че шашка уж зах хай 35 5 а х я сів З я сечу ЖУК Ж їушзаю Ж акже а ОК «їж п лечу Ждан ем Слух
Мав Ві Бе беб Бе вхо Рхо був БЕ же бвв ТвЖж бе) Меб Її Бек 245 ЗВ за жов Фон Мрдчє сх ж в я ЧІ ОДНЕ жу УДОД їх сх че УК ха соло, вх ТВЖ Бхо зіз Уві Тв Сев Уві Уві Уві Ав які Зве Нв Бій дар еЗд: Ук жртуих зда ве М іч сгж «к. к. х о ЯН ее тож У га ОУН КА ч я
Бко із Уві бух Бе два хо» ТУух Уві двр Бі Уві заз УзЗЬ Нав Аж дів був ТВх Був був зо Піх піз бів бує вв беж Ти ЖУжх дк Уві аа ва За
Уві йех уві їм ТЬьЕ Уві їємх Нів Сів Яр обхр їна Два сію бує і 305 КУ ЗІ5 о
ТуУук їше Сув був Уві бек дам Бе Ав їй ро Мів Вже же са бух за 35 КУ тву їїє бат їв йів Шев ші баб Бко Ах із БЕО бів У) Жуж СВУ 338 ЗАВ за івц бхо вхо йех Аж бе біс їз ТВК Буд Вви Пав У) Бех ів ТВх ак ЗБ Зак суй бем УВА був Бу Ре Тух хо бек Ар їів ліз Маії б1в Тжрв щі
З КУ КЕКВ) вах Аав оюіу сію Бхо би бе Аза Тую уз Твху ЇВх Бе Бу Чаї те
Зах З55 з55 402
Ар Бах Аав бу Зех Біб бе іму Тух бек ов їх ТК Уві ЗБю фев аа 410 з15
Бек Атч Тбюв шій біз біт дво Узі Бе Зет Сув бву Уві Меї Нів Фі за 425 за дів без бів Азв» Мів ТуУк Тв 035 був йеж їв» Зек їшеа йех Без сш
Був «2105 63 «2115 213 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 63 щів її ЗБЕ ї«кз Хе ЗУ Бех Ббжхо біз Хі Ме Зах Авкв бек хо Бе
Ку В 19 15 піз ув УВА Тви Веб ТВ Се беж бій ек Бек бзж Св) Зах тує Ме 2 85 ЗИ
Жує їбхю Тух бів Біб Му ко Б» ех ВВ бже Бк фев бен хів тує
ЗЕ 40 45
ВЗвв Їївх бек дав се) Аів бек пі Бі Бюро УВА Ак Ббе ее Бу веж це що
Зі Зах бі ТВж Зехє Тек беж їн Твк 31 бек ху Ме Пе Аїв СГ ж ху с з бо жук су джу Как ак уж Зхах Я ж йво із Вів Тк ТУЄ їУк Су бів Же» о тТке Шеж зЗіф фрЕ бе Жук ЖЕ я щи ЗВ вве зі бут бі ЖвБжх Був Бо З їїіз був вже Ве ті Вів па го
Зах узі Ве Її Бе Бжо ко бюж двропійя бів їна Буг век БУ ЖвЕ с. Ук т-чх 1135 їо Її
ЩМіщ Ка ЗР ї со Же т я ху з є У й
Аів Бест Уві Узі Сюжа Бей їй Айва Ахез Бе Тр Бк ке бі Ві шув ї39 із о а нь хо : У ще вч ще ще ї кож - й
ТаЮ БЕи ТЕв Буг У8і зр ви Аїз їні біз Зак 01 дай бах бів біз хх ще чик і 45 Ї5а їх БО
Зак ТВЬ Тнж 030 пів Ар Бек Буж Авр оЗех ТВУ Туж йеу їні йеак ЯЗвЕ ке Кто 175
Тв бен Таж Без Зах був йіз дев Тух ло Муз Нів Муз Уві ТУЮ Ак і53 їв їз
Су ма Уві Ту На Сів бу бе бек Зах Вже Уві Твж оцУз Я» Бе ка 0 хо же ака Бі Бах бтв 3 «2105» 64 5 «2115» 449 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 64
Тих Ух ХУ - чУхУї УЗ а ше ОВ ко ух не ще Ффоя я Е дан У щи ва ув зай і Увь зм Бек сію Бе Був Бей іі Був вже сек БЕ ї В їі 15
Ваг їв Му їм: Зах о сСув Аза Ат бек ОЖу Ббе ТВ спе Беж ех ніш жи Кс Зо із Мас дек їхю» Бе дхз сав обек РЕБ ЗМ був ку їз шва тю ах 7. их чо їх г ау ж ху шШхж їж Ум ка їх Кк с ху ду КУ віз січ їі бЗех Веж БУ СфУу ех ЖЕ ТБ Тух хів Бже ба ЗВУ Ук у г зе ТМ і я же - х фра. Же сх ту К Я іЖ Ух тТвх діт бо Ба Жвж С» Зек джу Ар одво» Аїз був два ЖбЖжЖ ям) беж вк о ТВ ще х Ух ще сх с. ше ня з ке ЖЖ СМ у ххх ТКУ же ке їж ак би беж її із МеЕ Веу Бек їхмнхі бу беж із аю ТЕ дів Меаж Жух Тух був
НИ че сук і Ф«иху За» Ва с че Ві їм; Ват ЖчеЄ рух 1 хК Із іх ів ЕФ ше Бе Тхв зу Бів Жук ія дев бе СУЄ Ужр о овБау АК Ку в ща ке ее иа щі ть і фуга кує З соби 4 я ж кое о їж Бек УВА Твх Уві ех Бех Айфв йшж ТБк бує бі йо Зак Уві рве
ЗК Ех 3 чок
ОК ках 185 сах ож ка г Ж В я содкшю СВУ хе г с ск че щої. ук о
Тхо без Ат» Бо Зах Бек без бек Тв бек Біб БіуУу Твх Вів ія їз ях че : їз 35 ї439 ж аж ок Яох мн ан о АНЯ ше оч . - г м м о у шує їз Уві МУЗ Аню Тек Бі Бхо бів Бюо УВО ТВ Зла ех Ву
Її се козою Мо 145 ї5О 155 За
ЕК Мах вище Я у г ож ж Що сі ч г Фе « з ч -
Ав Мах Ще віз їз Тк оба З Уві Ніз ТВ ВБе хо дів Уві без ївЕ 17 15 а Фе парк сов НИ Я ак жи уж й схо - .
Зак бек піт бан Тух Шех їж Ззки бек Уві чаї ТВх Уві рус йдеш ик Со У є з ун ее У п ж хх ЗИ ще Усі що ; ц Й де
Жоаж дак їм У ТВ ців ТвБж ТУЮ є Шев Ав Уа дви Нха Бу вка їх У КУ.
ЕК «0 ОБ дж х їх. мя Гй 2 У. Ку Я сухе Жах Кожух ЧІ жк я ідея рю с Ку їх дл я ся вх дав Тк без Уві Авур бу БУВ УВЬ піл жо був Веж Стув Аве ЦУв гу ЧИ віт 210 ех Ка полу я жо Вк дк фіокіхо фут ах о Жело яу яі вома стути
Твеу нів Жах Сов Вже бо Сув Бхо Аза бже М їм без су ЗКУ Вже и за щі 2 ше Ж з У хе С хх ро зу Ж Хек тож. суку їх У Ке Зі с
Бак Уві Бнеа їни Ба хо ро Муз Бже ов йо ТйжЖ бе Меб сь Зах 245 Б АК
Ах ївж бко біз Уві Тв був Уві Уві Уві Авв Уві Жеє Ні Бус Аве дж ке ще джу Кк М зм ї х КЕ у ше їм ел "ках б Сх о
Бхо піз Уві бува Бе дз) їжхвр о Тук Уві вв Бі Уві са Чаї Нівз Аво 275 ВО еВ
Зіз Пуа ТЕ Муз Вже йжху бів Ми Бі Тк Два беж ТВх Жук асе обву пе до е8а ЗЕ За тТві Зву Уві їв Тв Узі їве Мі піз дер Жжер їнмз Жеу У фр а
Зо5 За Зк КІ
Тух Муз Сув бух Узі беж баян Був жів їво Бо АЖ Вхо Кі (Ма мух у ї З З )
ЗАВ йо 35 т г З х ж о "хУМ пі я ж су фут Ух ук их ше я че НН твт Тіз Бех був діа Був біУу бів рез Яка біз Бо Сів оУВЬ Тк Те зай з35 Зо тах ке йко Векх Вже Ав ін во ТвВе Був два Ка тв Вех ії Те
КЗ ЗО За
Зам Тая Я бло ту ЕВ утяє фах квоуле й чи щ оце . су ев уві Був 39 Бе їж БВхго ЯвЕ дов 18 із ві се бер а
ЗВ рр пров
КК З ак
Саух міх ху її Щи 8 5 ух пе Жбуує фол ЩМимошх МУ К їх яю х
Мах Аве піт пе бжо Сі) Аввойав бек був ТнЕ Теж бке Бк УВІ Її 85 35 зах 5
АвробБеакх Авор БУ Вех Бе БМіе Їх Тук Жах Був їні ТНк сві ЗАВ Тв 35 410 15 оку тиж о Му З їх 23 че Ф є С га ях, ее тю шк и
Маж Ак їсро зіва Б бі дав УаЯї Біш бек був бах Ва Мех нів ЩІ дів Пез НівБ Аз» Мі тує ТВ сів Був Щек їні Бех їз бас хо діт хе и «Ж 35 3435 ак
У
-2105 65 «2115 213 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005» 65 ів біз Уві цез Кіз Бі Зах ВЕ» Вів їіїв Меб ек Вів бек БЕє СрУ ї 5 іо ї5 пів був ТВі ТБ Ме Мох Суз бек вів Бех бак йеж Уві Мек Тех Мат су Ії хх
КЕ в За
Тож Ткр Тех біз ія бу Ко Зі беж бах Бу» Ажа баб ва ТЗ Тух 35 5 5 зо ТВх беж йав Нів діз век бїУ Уві Бко Уві Ажа Бе бек му ех що ЕЕ ва ке ах жк, че Покоуж «к я з хх ую дуже я З ж зм лю біу Зак ці ТВ йвж Тук беж бео Тв іє Зевк Ах Ме ТО АМа а
В То 75 ЗЕ - з х ; : Зудуеч бок 3 Ма ; Ху зу лов буму бу ПЬя йв5о йїз Аз Тв Ту Тек Св із Нів їкр ех ЗМУ Ні БЕ Тужх ЖБЕ в5 За за бвае щІіб Щі бі ве беж ев Зі біз Бу» ку ТВж УВІ вів вів Еко
Кл ММ ЗАМ ау СКХМК МУК са М Я У у - хх ов 155 310 й «ха ко Її ШйШьа» бе б» йдк дае із біз ба Був бах іш ТВЕ
Хвих УВА Ба ше ЖБа же бо важ ЯКО МУК МУК САНКАХ му ок ау ОАЛАК шк єкт з У ії іо їв
Хі ому що с гхаж гу Кк су хх Ж ха чу З и - у
Аів бек Уві Уві Суж їж бе) вв бах ВБа Туж БРжхо аку ЯМІ Віз Був
Її ії 145 у: Я 5 де ЖІ Ух сум У ЯК і". ями Ж их сх ж во -ї Мк же Уж чех
УВА Ба Тжю бу Уві Авр Авоа йів їв бів бех піт Авв йех пів сії ек Уві Теж бів ів Авор дес уж бер обах ТВх тує бах їж: бах беж і55 Уа із5 ївх їеае Тву Її беж буз йіз зр тую Зі їз Нівз був бві Тех дій зо їв5 153 су Ма УБі Тве Нав Се сут бе Яви Зег оБео баії Тв їз Дех фБ» дв аа пі ів ув «2105» 66 «2115 213 «2125» РАТ 5 «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 66
З; їі Уві їж її біз» Бех рРжо вла щі Меб бах із Бех ке су
Х В їз 15 із їз Уві Тбж Ме Те Су бек віз Вех беж беж тВЬ Бек Жуж Ме и 25 ЗИ бтУю Тїхюв о Тух 015) 030 ув Во 5іЖж Бак ех Бжо Ах беб земна бі Жук пря ро з В;
Кз 0 5 дав Тих бас Міз Ні Аїва ЯеЕ пут Уві Вк» Уві ку БНе Зес щі Бак ку бах пі ТБкЕ бек Теж Зак о їве Тве їі Бех Ах МеЕ сіз АТ був й Г5 - Боя що ва та та 5
Ха Вів вів Тк тую Тух Сузв Пів Вів Тр бе» У Нав Вже Тух тве
ЇїБе піт піу бі Тв Бе Її Січ ів Був йху Бк ув Аз АКя Бхе цю 15 ща
Хі и м веж УМ о пух ї м ХимиМ Т дхх тах ї- Я Жах ж Їх з дек Уві Бне Їїе Бі Бо Бко дек Ааею Са Шій ба бух дек іє ТВЕ 115 Зо їх
АТВ бек Уві УВІ Се без бе; Аж Азо» Тез бек Бус Вк ія Віз Бук іа 135 145 ча и жк о Жув Уві вро дж Аза без ів дек бі дай Зак спів ЩО) 145 158 ЗА ї5О дак Уві Те М ші джр бек Му Азройеаж ТВи бУужЖ беж їм) бек беж ї55 АТО Мт
Тнж без ТБ Без ек їж Аів Ввю тує Зію фуз Ні був Уві Тек, Вів і55 ї855 158 ач ї З че ххх ВІ С хе Ки сзВні є - з ка х си зум Яся жи у. х у, а х Хо со КУ с ся піч УВА ТВЕ Нів що сАю їх аж обекх Ве Уві Те Був бак БЕ» 155 по ка
Айва Ак іх ей Су «2105 67 «2115 456 «2125» РВТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 67 ців Уві ів їм Уві ців бек ші вів 16 Ві був без Бжо БУ Аза ї 5 ї8 15
Мех ові був УЗІі Вес Су бу» Вів Має бі Тух Жвж Бе ЖЕ БуУ тує шо 25 я
Тїух Меж Ні ткр о Уві йхз із вів Бхо ЗУ Бій бішЖ їжи: бле Жжю Мах 5 48 15
Зі ТО їївз би ко Ази бек саж БУЄ Зах во бУю дів Бій був Бе біз біт вхо ові Внх Меї ТБЕ дк Дао ТвУу Бех їів веж тбвЕ ів тТУх і з Х і я ч х ех з У с 4 К у ТУ ж Не ж Ту Між йХаас ме пі) їз бак до б) Аху дек А дв ТВ Ліз бі Жук ЖЖ КуВ
ВЕ Зо ВЕ й шоу. КУА де х ч дк й ЖУК ха ж їрчух хе ск
Віз аку Біз Ар УВА Уві Бже Аза Аів Меє йеж Бе Туж Жук МУ МБ й мк чн ях
КЕ: ї5 МА
З хх т же жк уче па Жосхах « х Се 5 хя Ок с :
Аво чаї Тв ЗВУ Аа СУ ТБж їеб Уа о ївЕ ові Зех бек дів Звх ТЕ 115 їх їз ау слу то з Б " чо Кук З оех З - жк я У ЖЖ я
Муз БУХ Був Бех УЗ ВВе бо нм Віа бкоО Беє беж в Бах Ж ве й хуЕх х А Ж їз 135 їа8о пух ках Ж. сах ч я Я Хоч Ки ач й н Я ки Ка Зх пли х щи в с: я як
Іф і тво оАЛ ліз зані 03 Сюе їх Уві За дар о Тук бі Вие щрх х вх 4 пра ; 145 59 їй їі ше ми КуУ че Ху оду туз Ме Шеху Те МЛ Жак ій о Макух у х лу ту. ха Узі Хвх Уві ех ТуюБ ва Зах ЩіУ Віз їва ТВж бек БіУ Уві Кі
МеВ ї78 їв хх ХК Е г хх У бікшУх РЗК У ух деЖ шо Я ек З є се ше ех їБк Бе Бо Вів тах їн Сі» Веж Ве Сфу безе ТУжЖ йех Її ве ех ож я Ж
АВ ке 350 її ї х тм їх зу ее дІх ОБ нн м? ХК о ЇМ же же Ок я ріж мех
УЮ Уві Тих Уві Еко меж Звехе Заж їжа ЗіУ ВЕ БМ ОЖНЕ ЖУК Хре су з вх сут як 185 ОВ ОВ х ха ру ке Фо. 5 жк у ну жк з су жи з ш, тку Сун СИ жу. ож и Кн ав Уві дев На уз жо ех Аха ЖЖ їв Уві Ввр Мух МуУв Уві 018 я ня и щи
Ка ІЗ шжй жо Муз Я»вЕ о Сув АзеБоБує ЖЕ Нів ЖБж Су Бо вхо Ста ркб бів ВЕ ак в'я жк НИ
БУКУ ВІ ж 4 г Жах Мо тпреж жа Ж Фе Ж КЕ суки 0 Ме хую и "тек дак зх із ей ії ПіУу Су Бжо бек Уві бе їм ББе бо Бк ую ВвО Туж 245 5 кВ дае Жвж бецс Мак ЇХ бек Зже ХвВх БЕже сів Увь ЖЖ СУуз Жві вк УВУ 283 55 то
З З ща ї ях Я скид схо щих З шкж у ФУ о В духи : Шу жи с лав Уві бек Ні Біб бе Бо із Уві (уз Ре Ав Тер о ТУх Уві Аврв ке ВО 5 піт Уві біб Уві Нів баб Аїіа їд ЖК Му Бжо дж ша ма Ма тТух дяка дає ТвВЕ ТеУє БЕ УВІ УВК Беж УЗ їж ФТВк УВА. Без Мжя ЗК Аве
ЗОх 319 ЗЕ ЗО ткр оївюо дав пі їбе їз Ту був Су Був Уві Веховав Жую Ав Мем
Бе йіз бу ів із У ТВ Ків паж був Дів був' шву бів Бо Вхх зай За Зо
Уа Жатиу чу ее пвх їди: Бу» Вт деву БК а са їм Жве фл
За бо йівз УБі ТУЮ ЖБХ З хо ЖжЖео Мек ов щур м же Ї5 З зав ЗБЕ ЗБ з КЗ о ЯК ху є Дек поже ОД г тк КЕ шу ЖУм коном що уч
Ява бів Уві дек їз ТВх Сюше без УВІ. Бу С бе Ттх бко Вех дв»
ЗТ ЗіБ зво їі Аїз та3 сів Тую Щі Вех Ав У 01 Бхо бі аа йену Тую Цув
КУБ 353 ав по їж живе бжо бу» Уві змі Аврв Зак дав» піу Бех БВе Бе о їмх уж ЗвЕ їв Бас Жак Уаї важ ув аж Ак їв Зі бів ці вав Уві бе Зв
Уа хх лк 85 ий 338
Су Бах УЖі Ме Мже зво Ав без Віз Ав Ніз бух Таж Зі був ЗвЕ 835 о 45 їжа дек Меюв ЗЕ БВео БУ Був пу «2105» 68 «2115 214 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 68 їв Вхе Уві Меб Тих 55 Вб Бо йвх Уві Зв УВА Аа Вже сі ї 5 ї5 15
Тїве ів Ак діє ТвжЕ Сув Сім біб Ав оАви бів Бі ех був ТВ УВІ ке и за
ТУж Зже Ток «Ка ба я Вже зі СМ вів Вже Уві і-ї Уві Чак ТУ
З за 45 зав дво ТВ Ав» о Ажа ко із бі бів бхо біз Аху Бе бЗех Зі із два век ці Ав ТвЕ 8із ТВх іме: ЖЖ їі ех Ак Уві пін Аза СОІУ вх "пла 5 во
Ззв ів Віз Авр отТухХ ТУуЖ Су 00 Уві Тжр о Азр о йвж бек Жвж бвв Нав а5 а 5 щ1У Уві ббз ім сі» ОЩїУ Ж Був Зб Теж УВІ Ме 3 0 ке Був па за їхе вів Ав рхе Тв Таі Твх без Бе вхо БЖ» Ве дек сія Є Їже пів ів Ави» був Аів ТВ без ВЕ СУ їео Хі Вес даю Ба ТУЮ Бко бр
З жк г МУ, з ях о ї ха ож Е сук Бі Же Кум Ме ож» їх г іш Уві Твк Тв Аа Тхр був Лів дер біє ех Вже Узі був Вів у чаї зо жах Тих був Бко Зв Бу Зі ех вав Аа Муз ТУ Аіїв Віа.
Бак бек Тух їн бак Ме Те охо із БЗіз Тхв о був ех Ні Ву ех ко ї5 Іо
Тук ек Суз сій УМ Тв Вів біз Оу Яве Теж Ув) па був ТВЖ У«ї із хо ТВХ біз Суб Важ ол пе «2105» 69 «2115» 456 «2125» РАТ 213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 69 шо ЖК т п и І І С ИН що вл Жана нє вбрхх ке ік Ущі 5і8 фен Увь пов ек 555 Зв бів ув) Буз МУ Еко іх йіз є 425 й ї З 10 15
Мер Уві був Уві Зек Сух Мув Ав век шу Жук ТНх Бе тв зі» Жуж о: В З
Нів Ме: Нів ТтТхю» Таб Ач пів Аза реко ЗЕ Сів ку Лема сл тТуюв Ме 35 5 аз
У ож хе ЛЕК пухких, хх ху Ма. З -щне ММ М х С У руху уд сі Ткр її5 АввоБхо Аза» беж БІ Бі Твж оба» Жшж Віз бів був бе ва 5 еВ ку сь 2, ху вас г щ--е че МУКУ ух с ке Сох ах То 53» се піз піу ах Узі тТвж Меї Тв ку Авроївх бе Се йеж ТВх біз тТух
КЕ 75 во
Зде Еіч й с Ж у Кох хх Зудукх -е поожо Ж о їЯМуЯ пчухх Мід фу
Майї бій ії Бех ДУ їм ах Бех дер ввв ТВ із ва Тук Тух СУуВ
ЕК Зо 55 шо м ки -- з. с Е ї: ж дня Мужик ЖИМ дл За ХЛ ж ї м. хів ака піз ав Уві Уві Рко Кіз Вів Веб беж Ве Тух бух Бу Меб з ххх жа ек ї-а 1235 11
У. в х жа вк і з Як Х Я У ве ї. я у З се я У У вві Жкр оса Ак ль ТВ їз Уві Тв Уаі Бек дек Віз бЗвжо ве 5 їхо ї25 ке й Ку й ЕЗ Ух се чу хм; ЧЕ о су. 5 ж Кука с о чне-й р я су Же їв жу Вже Зак УФ Біне йо їм: Аів Бхо Беж бек бух Зежк Жаж Звх уза щ35 142 ож ЖК, ее не м Ч Ук Жде їх. ко, ж шуй я гоже
ЗІР СБуж Тв дів Вів бе С1Ж Сув бою» Уві без й Ту Бе Бхеа 0 ях ах хочу а и до
Я МО 55 ща тре їж ОК хр В іеу В ст Б ки ЗК ще «ку я яхт Кх зуч
Тхо» Уві. Тв УВі бу ЖЕр о йяв Зех Щі Аза без Те бак сі Уві нів
МЕ 178 175 фе ЇМО ня о ки - пон и а и чин
Тв Бе бжо Аза і бев «аб бек Бах пі їжму ТУЖ Зак їж Бех бах
ТВО ївУ ща
У. ча І Б ща У шк: У Сл их ум ПЗ ху ЕР с "7 зх НН я ба ТТ й мя тва Уві тТнЕ Уузо вхс бек бах бек бви іт Хв сав ТвЕ тую ів Сув
Х З х 155 2аО 55 ав УВА Ази оНів Муз вхо беж дв) ТВ СУБ Узі даю ЗУБ БУ Ва Бе сх ху хуух
ЮА аж ве
Я я ож Жолююю жхдлк ще Фо УМ. Ким По ект Жуля роя мч Ук я. хх
Бжоз був бак Су Авробуя ТВЕ На Тв о Суз Ру ро Су РтО Абе ко
Піх а їн ЗУ Бі БЕ Беж Уві Бе їеор БР Вжо хо» був ВшО пу
Ушя юю ше Бек не Ше й Уея их Ж хуя жах Може їх Ху Ж хх
Ар обВк їмо Ме: біз Бех вх Твх бо Бін Уві ЖВх Ств Уві Уві Уву й ЧИЯ КУН иа
Бо ЕК ід жЖ-шух її Же у Мч ж Ма хе Ж ЕХ що Зах Ж иУ СД г Чу ку ЗЕ Ж хх
Яаюв Уві Зак Нів сів дя Бхо пам Уві Бу Бе Зап Ткхю їую Уві й ну Не Ва чйжх 3 Ух х її Жокдк Мк. іх Зою т я г МУ Чі «і Узі біб Уві із АБ) Вів був Сх Буж Бк вх хв БІВ зів ТУЖ х г щ х х и хочу с. з й т ква бі 7 Ко Я ПУ же "
Зап оМек Же ТУх жа Уві Уві ---к Уві їі ЖЖ Мах їв Нав сах барв і У Зо Ж ши Ко тах Мхум Жар їх Зах щі Хує б хк3х чу. З о Жиж тТЕв Мн баз Бі Без (а о ЖУх бук Су був Уві Зак За БУВ Аз ев и З ЗК б хо йів ба Їїїв ПЗ був ТВ їі беж Мув ія боб пішж біз Бко Ах
Зі зЗа8 В лу соч хх с. У зЧЯ ау дк бік с ШЕ Я жа К Пткуує 2
Зі) рхв пів уві б ТВЕ Гео Без Ббо Заеае джу аеро Піч їм Жах Буя
КЕ зво ЗБ дев осів Уві Бех гео ТВБЕ Су бен УВА без ЗіУ ББа Тук буо дет дв 70 ЗУ по син нн нич ння ще що фу ЖЖ вся вка Кк : ч
Аж Аля Уві Хв Жжхю со ех Аз ошьУ ів Бо біз Ай дав Тужх був
Х Я ; жк «вм ях
Зв5 350 КЕ 409
ЖнЕ ТвВх Бжо Бко Уві Бей) Ав ех Авр ЗУ дек бе бе ев бУуж Явх з НВ) Я
Бу їжа ХВ Уві даю мух дек бку Тв Біл біз бі Аа Уві Бееа ЯкжЕ 45 ЗБ 33
Су йвж УЖІі Меб Не ФІ Ал бе Ні бе НІВ Лех ЖКеЕоСіВ уз Важ
За 440 445
Їїво бек іє Вес бо Бі Був БУ що 55 -2105» 70 «2115» 449 «2125» РАТ «213» Штучна «220» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «400» 70 віз Уві ів беб щік біз йех Бін Вко 01У аз ВЕ Був хо Бек клі ї 5 То ї5
Твх Зї-і вх йео бах Суз Зв Уві Бех сіу Тех Швж Хі ех ба що
Ж 5 з
Віз дів Тхр Явк їхю УВІ Ак біз» Без ко бі біз бі ее Ох ТЖюЮ
Ка а а
Ії Бі ТУух їі йех Тех бек БУ Се Жвжх два Туж дав Вже ах без ща 5 ОЇ їтв пі вка Уві Жиж біз беж вжЗ Авр тах Зв Був вв Фі ЕБе вх в за ТЕ во їви був їз) йвх Зак Уві ТвВк вів Аза вав тТвх азів Аза жЖух Жук мея 5 що ЗА 4: Вже ще їви іш йхи Те Твх Бі Ме Дво бух Же іст Бе і дів вк МажЖ зей хв ах Жак жах лів мес сер мух жк Ку ке ху 108 305 її
У Ммже ШО у Чую Жах Фк жує х, Сука о ода Ж ку Туру голий ох зе їпх ів Уві їх Узі Бех ех Аза дек ТвВх бух Ще Бко бек Уві Ева ее мож хх
ВІВ жо їх з че а Тіни Жак бу Її хм Щи порах ке Їх к о Ук сх чих ее чхк -
Тко Мем лів Шо Зв яз Був Вех ЖвЕ Бех Піх сів Твж Віз 5ів бе їз 35 140 гоьЯ ем, Кока жя я ї ах їх сх пи ж пк 5 жу жу З ож З з ка щу Суд о їіїва ЗЕ був Азро» ТУЮ Бра о БЕо ска бо Узі Вж УВУ ех ТЕв 145 що і їв шина ми а А и ач и А А а А я давав беж сі дів їни ТВх беж Зі ві Ні БВ КБ Бжхо два Уві би 155 75 ТВ
Жук хх ТЗ дя шт. я я ще Мамо Ж аж КХ дюикия УК пк и ху не г» шою дек Беж (жу інмз ТУх беж Ме) йевх бек Уві ві Жиж Уві Еко Бек еКеа « хх л схе ї8о їв 150 чн жк К Я шу МК, г ММ я ух Зо ока Я у жу. Ждан
Бах беж ем АФ ЖБК осів Тих ТУ їі Сув дз» Уві Аво НЕ був Вже ро я. ач 195 ОО и ж ак ах сих х Ж жим х с шу ол со Щи Кк хх Хе чо «уж ком ще іч
Бек лав Твх Був УВІ бе У Був УВА Сів Вже Був феж Сжв оц) Бум
Го шКаЯ ук ЕХ Син ж ж шо
Я Ше т на о Я жхеех мн Уж Гріх З Ши га з - У ям хх їх Шия
Твк Яїв ТВ Сев о ВкЕб Бо бух Бо Вів вхо іо їм); іа сф ЗКУ БЕ»
В 30 35 а г чех Ач я п Вч УМ хо Ж зу ще Жди 600 М хе їх Ж окухи Кн ле ие гук
Яву тв Бін Її) Ве Бко ВЕ буз БЕБ Бех ДвротТвжх Ббеб) Ме бів Важ ха що 5 хочу ЛК Ко СО ка р чув ук ВУ Хиуз її Сх 5 КТ жи з чо КК ж НК о . я ВА тик зи аж вх ша да
Ажха Тве га з: Уві ХажЖ СУв Уві Уві бак ер Уві веж бів бо вав ко В ша шу су зх "а Як сх мис Муха ЗІ же Ж и жк Є ка жк Ко че ХУ ка щі Уві ув Ве Аза Те Кег 54 вав сі УВА Пі сах нів Ах зм леж их екс вх ВО ян
З кожждх МКі а ак кре ххх хау Ж жу му Мозу Фбаух сках с смау
Вів їж ТВ муз Бжо дха Ов шах с Тех бал бек ТЕЖ ТшжкЕ вже УВА ую у ве Аж ве: карих в Ж чх ва а КЗ їх шо Уфа кому Кк Ж БЕК Туш Сода фічних ка ЖЕ що г чві Звевк Зі без ТВ Узі їх бів сів бер» ФЕВ оббео дав осауу Ка ОЗ 305 Зо Зх КВ чує Ж «сх с г. ду «ж Ж хух Зах Ж Же до ЖУхх, у 2 5 ек.
Тех їШв Св був Уві беж Аж був й бе Б Акв о БхО Хе мя ув
У у З
ЗИ ЗО З є -к КУ З ж Ж шк ж дя З с ук хх п ше у чаш тех
Тву її5 дет му: ів їв пу сів со аку із Бо се УВУ Жук ТЕ 340 зай ЗО жо х дач лу ж Же 3. бТам3 жна тов Ве пі МВ. бах бо ТВБЕ їж Ко рез Зах Ажз дер мій ев жажЖ Був АВ Ба УЖ жах ее ЖЕ 355 КН БІ
Св Бе Уві був бі Ве Тек БЕб Бех дав Сів віз та ів жеЮ сви
Во ЗВ ЗО
Зах зв Біб пів Вжо па Ва дан Жух БУ бвЖж би йже Бк ві фам
Зео» 'вву Аяв 3 Звх Ба Вів беб бух бек уз їжа ТВХ Уві Вер оБув
Бех ха їхев ів зів сіу Бврь Узі бів бек СУуЄ ех УВІ Веж Нав Щі ів аа Ніз Ява Нів Ту ЗБх мій БУуз Зв мк Зак їх бек Крое сф їев

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб виготовлення фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, який відрізняється тим, що він включає етапи, на яких: (а) виготовляють антитіла класу Ідос, які здатні зв'язуватися з характерним антигеном, (р) визначають антигензв'язувальну активність згаданих антитіл при різних значеннях кислотних та нейтральних рн, (с) вибирають антитіло, антигензв'язувальна активність якого є рН-залежною, (4) одержують ген, що кодує антитіло, вибране на етапі (с), (є) виготовляють антитіло із використанням гена, одержаного на етапі (4), та (Ї) виготовлене на етапі (є) антитіло змішують з принаймні одним фармацевтично прийнятним носієм з одержанням фармацевтичної композиції, при цьому на етапі (с) вибирають антитіло, антигензв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж його антигензв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на етапі (с) вибирають антитіло, антигензв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 удвічі або більше перевищує його антигензв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5.
3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що кожне з антитіл, виготовлених на етапі (а), має мутацію, здійснену шляхом або заміщення принаймні однієї амінокислоти гіперваріабельної ділянки (СОК) або амінокислотного залишку 27 у важкому ланцюзі антитіла (за нумерацією за Кабрад гістидином, або вставляння принаймні одного гістидину в СОК антитіла.
кров'яна, "судина знтиген-опосердкований ендоцитоз (інтернапізація) н ВНУЯ ять вен Кн Ж ней ні нон й й зх я ж К- йо щі у я " кни ША ла че х клітина, що 10 7 ; експресує а антиген і рн роя, кислотна Я. ій че ндОоСсоМм В, ще ша Н хе ї й Кз Е як че : !
Я. з 0 кА юю винний ооо сс В сх, кит ж І ох, лав т вче БО Косово ш ше ИН А пс нн МНН у я Ку й НО дв ; у зантитіло ЄмМантиган (сер ее ексоююсссссовссскчиюєссккккннкднянндд.
Фіг. 1 й а М і що ку ше з ль ПІНОЦИТОЗ з її повернення Ії - же хе щх і ; і : В я А до плазми юри і і Ко ссооднннннн ли ши ши ни ос ОМ зу а и шим нм вна еВ Е жсортування. Ї я х 5 я : т іа зендосомМма і-й 9» Й ев нео о іх В й а й ш ла о ШИ сок шт в лізосома . зе антитіло (): ЕсВп
Фіг. 2
КИ Вільні антитнв, що судина зв'язуються З ІНШИМИ МКМ хм й й й з Я антиген-олосердкованнй ендоцитоз анигенаки (нтернапізація? й з ча її Й ч і НЯ Ж З КЛІТИННОЇ У дво че х і Її й експресую и І. ! | к вч і антен ої ще! шк | тяЯЯк Її Би На о Н і
Тон. киспотТна Шк Бі ще "ВНЛОСОМа лай ; ИН: ек че і з ШОЮ! Є і й. ! ху ОК лізосома й оч й сь окт кий : че З ше В : відокремлення від Є ацнтитилой 85: антиге ЕЕ Н їм їй пантитин ФВ антиген ВО БоВИ) о внтигену у кислотній ендосомі
Фіг. З ши віпьні антизтійа, ща У НМ г шо КООБИНУ н зв'язуються з іншими пулина, з У ма СКМ з» щщк антигенами неспецифічний бю 00000 Фа в видоцитоз в «Б 4 повернення що, ау внтА - ФЬх до плдами с ча ; но . - Щ Я ондателальня Б ОО Я зе ї Н у ін кліка | чк Ши: ій | і чу й ЗНОВ : ; я ! оно вислетна, й; іні МЧЦНН о у СНОМ,» енмен Я ую ї ще 3 ж ; нен Й й З ! 1 че ї. х і 5 і я ож Ко руйнування й рі б В ше і ВЕтиТену - Н «МИТ, ен Н СТИ, : 1 1 иБЕКИХ Ме що і Ом «п і а Б Кая і по МКК " Ї ж ШЕ НИ і і ШЕ є пи чан о: відокремлення від КЕ : антитіло фр внтиген Фред. антигену у киспотній пон ендобомі «Фіг. 4 перистальтичний насос ше й 5 - 1 ЗАЗ44 0117 колонка фагова бібліотека (ВН буфер для промивання (СН Я св г буфер для епюювання (рі вв
Фіг. 5 І я 08 т орофіЙН нення ет в Ей що хо ВН Я х ов тя З он М и вв ПО Фо. ди і Фактор розведення із Б рт нях і м і ЩЕ СЯ вена зи нн Пи и и п пк я ДД стр по Од: ди 1 Фактор розведення
Фіг. 6 р-н МНА Е не ще рр» я Норі. є я М ряенают НІЛ ВІ, х БІ шишки «хх їз ві С КЕ: ренні НОВ . Е й ї
Ж. Ви і
ІВ. Ї дини нетто А по 15 ю НН антизіло (куми)
Фіг. 7 УМ її СТЕ Я шт ПЕ і тлтюжи я ОТО Б НІ З пек - В нн оо ву зв по р рн о мив КЕ ев ЩЕ ЖюЮ 550 КО ОБО 00 ; час 5 Нав 73 Кк ОЇ нн НЕ - 0000053 НЯ 35 ХОЮ 550 о ЯМ во шкнх час і 170 ке що й С ди Птн ууеєе хін Я й Ко ЖЕ зі Е т 53 РУК Ко т й ТМ т зятя То нокмво о в п у і нн ен -еюЮ ан 156 ЯКО 250 00 аю кіжя час с она ОЗ ї шт а я клжтютняюяй що тло ПИ ЗИ ЕП СВ ЕЕ В а З ВК ПЕ ТЕ НС час Є
Фіг. 8
УЧ
ЩЕ. їн 4 тр т ттттттют тттжттж тю те в щі 7 лм С КО о ' Ї ших о ГУ клі ія м ою і ДК ОЗП. ТВ ві ї щі ї -їВ ке пн пн пінь нн пінь пінь нео пі нині «ВВ ОО й Ех. «і 5 що х час М Нарир?З що ОВУ яЯ Ше ОЗ НИ шо У що ШИ тк їй Не Х і аххтижакжчтхчажжанатта тях кіт х Др пер фр т тут рення -В ЯКО РО о хо 0 БО ВО Нео дер я час С Мнілод ва ВО щх Ж Я ЗМИВ, Ко Моз КЕ ня «15 «Є леж, Оощ Одже ми гу 1 а в збу ера яллкляли укла ця калу АКА Анти тятя я ВАЛ у ктпжтя т прати т А яля я фени Ккжлжтутннтяти тя -ВО 0-83 000-40-20 З за 40 о о ню потуг час У сно ВО Ох во рин НН я ддлначиннху й БИ: Я дж ом Ф ба в ХУ Я ша ОВ Е ее я ої її Не ї зі й пи ЩО - ОО -ЯНЬООО-2 д 8 40 що яОНю Ме б
Фіг. 9
УТ по» ло Ж Ярі -КЕ тус сеї КО Пт о « г их ї Ка Ов Ош Я с В гребля, оо М ! я (є -л пу ння нари ж Х ма ща 0 кю Вод Фан че й Ж ОН: х Ихя КУ х ан : ше вбБщ рин ша а й Щі г ве як : й «х З я НК й з я Бай вай 7 т. М 306 Я00 аб бо ОВ еліт з ВО 8ФО ОО 800 МІЯ ВЗ Е чай м во яю тт. Н «5 ВО дб Кеш що до А Ко Сн в ОО ЗО й ря М У -- ВВ зас ї Фе МИ Я ооашші у ИН М дю Зо 400 Бо 8500 7006 БО вк ей т час | я сМН5ЯУ5 1295 і ВОЗ, Во й ї коду ка М Я х Я «а : й ож Ко АВ о НН ї Ше ШО ді я ст» "еВ «а: і Ху єю учня куки шо Ки ода, при ее ду при ви ув МО ОО 00 ВОК, ді
Фіг. 10 зок УМ і кое ее вот; -- дом й 5 80: й : я М в ий ий ха БА дкеоСр кН СЕ НІШУ М М МНЕ ЕжООЖ ость В пон ЕЕ: ЩЕ з ШО і ши ше ши ве їз. х ї І | | | ! ВЕ ОВ. - її т Ії. ше АЮ ТОЇ, Бен паси ВО ши ки «й. ві 7а Ей. УВС Б ОР що НИ в а. я : ще В І ШЕ 5 ин А А Я ГІ на Я жо ше грані Ж ев ї І ПИШЕ ЩЕ Б п НЕ ЕХ шшшш ша Я й Женя ей ск Яка кА щи ода ЧО ФО ЗО о ЗБК нілоляо КЕ - Ши Х ок що т о Я ху ск ЕЕ їі і й: ; яю т і і : з Н 5 шини ие й нн НН що ковани НН шШЖ жо ямі ше ш вин нН і З ШОН НН ЩІ каш нн ШЕ: ше 1 Енн АТ Оле з де Ку ше их ми хе й чи ї З. па ще ШУ пня ВО ве и в хі нях, ТЕ й 5 ЩЕ че вк шу і Ко У : Е вд В ши й а я ит : ша Я бля А ШНЕНЕЧН ЕІ ух ОО КЗ ШЕ УНН УА ЕНН з УЗ НЕ У ЧУ МК ЕН ВО Би! ДИНЯ зни Є ЩЕ НН ! ТТ Боді ше Я Ми рн ри пат м в ши за ЯК ЗКЮ
Фіг. 11
ЩО Я пре а г є У т Ж вн її ОЗ тт рр ж ів півосі вввн З Ж з «ї пе ОО орннннннтттнннннннннннннфнннннння рі Ж ко да в и ких є НН се АНЯ ВЯ, о : ще вк ПН Шк я а т нн нн нн з нн нн я нини У - 7 Ку Її. 73 : г | Я я У и ж Е - - Ще в іо. пен м ост нн -с НЕ Та. ке ОШИ їв ще яд ЩО ЧІ Пн й ДЕ г ни М у ї Ес: Й ве ЩО В ву ШК К д рам Ве ней нене нин ин ин нин, нини нини: нн пи шин ше з ке з сте Е дк ду ; п 1 23558 78 10 кількість разів додавання антигену
Фіг. 12 чо р : ення Її я очне МАК значення . ; : : мий Я шо а нс у М п М : Же не ше оо-е-йко НІТОЛВІ значення що їй пи М ОК НК НЕ ШИЯ очі з ря хе ! їх бе Не п : ЗОЗ ЕН носі Десню СНУ ЕЕ: «М Не енНя і ЕЕ ех о ЖИ сек Ж я єв що. "ши КЕ шен, ОС Зх я Ка -3 : ї Ба а пі і нн дк донних Коня в не: ИН 128 час години;
Фіг. 13 щ- Бе кох ще : щ- тв. фен Ка Ех ще оч Я я: КА б02004006008002 час (дні)
Фіг. 14 ш- В нин ни У мк - 5 Н, . ке т о. Е кА ге ВИШ У ДІРИ и ї оон кв, с ня ко Е ів ж де о Й ше МН ше би Ме ау о 4 й б З 19 ІЗ час (дні)
Фіг. 15 є 18 | Ї и ша А Шк ло, ПИ НИ ка ще Е з кій х їх | ж КВ 5 ; х й ше В. І; ій Ж їх ге Ж Ко. ще 6 ГГ й 00009468 10 12 час (дні)
Фіг. 16
СЯ - ЗА дО Во. й ша ШИ и АТ НЙ й Я 2 М що З : щи о 7 беж -- М вій ще іх ся ро лі моляяню х роя - крони 3 ОО я що не Ма БО лю и че 5 НИ ЕВ 150 Й ще їх й Н в ро В ва. ї Її ш я « В сй шо Ки за з І : ї сш в Я вок зу проані раол пріині плівану ша бе на а Зоо во МК БОЮ Мо коя рив М ще го ТУув-і вві 130 ню А т Б їх т ї Н клени ще шк ї В св ; КЕ З -їх 4 | ї БЕН ! В БУ ЕН Б; Пе ше М і ОО З днями тт ухчьтл учня б Бон тт й рон й ха У ай сн йо НЯ ОК ЗО Яд 500 ОО лю Куй вд чі А НН 3 с ЩО: Я до і йон Ох во ; ЕЕ Б яЯ що х а ї а НН Й Ще 7 оо 200 ЗО ОО БОО ВОЮ 709. З си ук
Фіг. 17 ох С. ; са ШОК хе : з леж, 5 я Ж, форм т тт а У че е в ре ш союдбйноюю 2 зеачання ! хе чен: шана же | і ее у» же «НАРІД УЗ значення - ТК Ж о х СНИ чт їз - ще . Фш щ 10 нини шин шин слнтулни БУФЛЕЮ значення ср ше КАК ення КУЛННУЇ значеннях й В | ; з ех Ше й кокс еоскю ве вотев вової ре БА | ще тА,
НЗ. Б 1 кино оду ша г І З не Я З 1 он и п А А, о Ко Я8 КЗ 96 1хО сь жах ; час ігодини)
Фіг. 18
Ех. З зом їх щі ? і ЕХ о ши ше -- 51 ре Ко Ше КІ -х ТЕ Ж КН ГЕ Я ж і нь ЗО ЗІ Є а ще» Кол ї Ту Пескужжл, ЩО В ї в, Си 5 й ? що о БИ В то ; Ж КЕ Я ї Бе З аю ЇМ ї ж ще зи У Ух їх і: А; Де На ШУ шу ко ЖХ сх Хужк І духевуєть тт оту ут ж колу: Ух УМ ех Ух Ви СМ ПО КеОщЕ А ЩЕ ВО Ю де . У В КУ ї ні ів БУКЕТ ХХ г. МІС ех : Я с Ж зо 3 І ОО й ЕОМ їх Х ОВ Ж вв щ з з 1 и що ! її Кох К Кх ЧУ гЯ х шо КЕ ях що : Я х Я їх щи : мо ОК ЗТ їх - т о ву ОН Є У У Ж ро Н : ом, В ще і і ше х Е пл ї Км жкаитя Ще оч . Ну А : жежьундя що Кк ЖМмі ї й ож : : Я ши І стук Ж ї Е щу ї ї сек т 20 тр А КК ру З шо я с ЩО Я ЗОВ ЯКО КР КЕ 0 ВОЮ
А. З К Худ БТ -т- БУ Ва ІВ ше іє -ек і ; сю ЩІК Е: й т 5 ЕН |у її що Ж і: Я Х Ж Ж жо ви ТА Кос БМ ї х СЕХ ; : ЩОБ св ї Ж ОЗ що» ЩЕ Я Ше -- в і В ми ен ШИ техн ЗВ жи ШЕ ЩЕ 3 щ і Ї Ко ОВ огнуї : З ові Е
НІ. ОК Н г Мо Зі щі па НЕ ЯШВЯ «хх ї я УВУ. У оежалотлтуттют туту у метру МО ЧиМ по мл ко шк до З хе ОНКО ВО ЗОВ БО ВЖК КК М КО Ех М щих ЕВ с ох Ак сх, т НК їн ше Но т жен ех Х ї шк їЖ НК оч
С. зе Я ж х з ж Ж ОВД: ою ле 2 ОЇ щі ко с-м Н Е ох Ж Ж ам ; Шия ЗК ее Н ї Б х ; ї - й жо ЯВ ; аж і же Н 7 КК ВК Во ; ЕХ ща Ї вх фо КК ї - В КЕ що ї : ДК о яю КУ : ше ще СХ ЯМ фестини Зк Ж дощок що очок дохо ом еко ох ж 5
Фіг. 19 ї В осу - ЯВИ й щ та : МА ВВ дим с зашиннннн з ше М он, чшжєтжнчауиичнниии: с т | з од, | пненеф Дня Ку значеннях . хі ЖЕ З ця щ щ ї . : У Мч і «йо» КУЗЄЛОСЗЮ значених З
Ж. " ке | У
Е Ж. ІЗ чу ех я Я ї ЖК юю Е я ун нік посадки МТ значення І! ті г ! З - - і і в Т Ся . С | ЩІ п ни нн п 0 84 А та 95 156 же й р ЖУК х ча ТОДИиМИ
Фіг. 20 яд фут МО зе ШИН ЗВ Ж ЩО й ОО ЖОВ я ЕЕ ре щі пох Кк Б Я Ме бо і те це 7 Ше Б а Ши ОВ яні в; М В ї; Я 0 СУ - кивнув пи а ОН я о я юю ех Й собу Я І я руі-В 120 пе й ЖЖ Чх ХО й : й ПТУ тк рміжекнох ск а ше а 8 ЗА і и З в т ех ЛК з Я Беж с У : ки М - ом про нора Щ Й Я ню зо З щю ВО мхю ке Пе Я Тяе й ше МОЇ й «Ж оця я ЕЕ Еш кА В Б ді ох . ж во. й КУ Кс ше Н 7 7 що 0; г Но і ї М і я я З ню 03 о 00 Ою БО0 ю ОІВ А ооо як йОю Кк я що. КЕ М Бе Е сонккк п Н прі З С М 5 БАН у ща Н ща ян; Мощі; МУ | ше І Я РОЗ Оо в що ЖЮ БО 70 хи г
Фіг. 21
! лк Ї іжнккннкях Дей. СЕУ РЗК НН НВ т | Е | зання ВЕДЕННЯ значення) бе ще і Е ки МО Н І гі че ЖЕ КОХ ; і зм З І 5 тт ще нен БУАЦЄВЇ змачення т Па ше о | а нак Й хоть ох 24 зх . Е та КЕ сову х. : Я охо в НИЙ К сохеюююю МИ З Е КЕ г ! я ще че й Е ї Ши У З «М З зна меНиЯ Е ЖЕ й. У не , Ко -е а ї он нкнчктаннктн ї-е у ду се Е Е ОО, і ПОП ОП СК Е сю я Се Е шо шеше сен БУДМІЯ значення ї | ш ше 5 ; ї Е р : Е і Е зах ї ЕК люклдфдняях М й В Я : ДМ бенйенья Н ре УФХ значення : й 2: а є є і .
4 Сі З Х. КХ зе І сх вата тях - Е де ний щі їв У шк ши ВИСОКО Сг часідни а пишна фіг. 22 шо вену Коен МЕНЕ фари З ши ; Межхк | шен ї І і я БУМ З ' св пн нн у п и ня ж в шк ЩІ е ї зві інве СЯ ку ЖК сук ьоки вх тя. і. ВЕ; кіш КМ'»МИ значення ком, . ААХАААААЛАААААААААА А ААААААА А ААААЧ АААН АЛАНА Ко Ко е з Кї ї т се вен нн З г з ншшй ї Ж оон й я | фнбнюх КАВУ з
5. ру и. ШИ М Уж ззначення їЗ Й й з жк г Ко чу ЗЕ ік пи дек, ож ожкжу, еВ Вон В пен. я ШІ . жорен Ви ЗуВЧЕННЯ й З й Не т : чає іїдні) сейм ЗНАЧЕННЯ ВНСОКОВОНННОГО
Фіг. 23 сю | 7 янв НЗрІЙ. З ЮС 1 значення, Ме те : не ЧЕ а І; те ! | ці ! за чн БУДА значення не. 15 ж нннннниннининнниннненн шини | | мини ТЕ ке ШК Е ШК Е ; ва т. че а УТА значення т і ї не і
5. і! і | й х в рення МУЗ значення а ГИ Й Я Еш ши ї ге к хх НН ши Є ас З ГШЙ ще ем ге ечення М 5/5 - КА я ЕН М, най ЩІ тв 1-Й Ко че ЖОВ рення ВУД М УВ значення Ж і Вк у» нн ЖЖ ЩЕ В вик ок и че Ж в ць о і ен нн с. ! о ? й в й 100045 ее-начення внсоковоннного : т є ще за тя УЖ В дення КК КК нн юним кн час ідні)
Фіг. 24 пон нон й а з ме З я о вих З з ще З ЗОВ ее ШЕ ре До Есе ск КУ З Й І «Міна Е : нн Ще де де Н . Ж йо КМ і щу З її 5 о Б І В СІ ки Еш прати ММ Ба ЕХ І ЕЕ ' де її р ; ек ; ах М КУ Ко ! Ум я ОООЗУ ї У р оче ж ЕКО ! КУ се кі
В. Ме ре МУ 3 и ше ак де ов ок : оч ж св с їв і. в шин т бе с ШЕБЕЕЇ в ЧЕ нен ше 15555 БЕ ОБ БЕ її: Ел Ес з ния БЕ 5 Как ве ВБИВ Б ЇХ ней ММ а КО ща о 0 Е о х Кх в м «р БЕЖ. ДО моих Ж і - у 15 ме : пе їх з ш св оц) ша єв ЕЕ ж Ж жо Я ее де ня МхЕ і БЕ : й х же : КЕ кіш шен з З що ща це це пед Е В з М.В. Б і де й» бе бе» БЕ шої з ж щи ше Ше фе Бо р Ж З КІ С Б ІК С ПІ Н - В Я х Е т Я КЕ
Її. БЕ ве ше, се ще Е «днк том же ех З «3 5 ще 55 ; УТ: й ше я І ж КО Зо нер ГІ п. В ск щх ск 05 я Ж в ї : лий со. нс Бо хх а ви Ї З дна нкнтнквю я ЕЕ: ! і : Є й щі в - рий к Ге Ноель їх їй вве вкожОоКОох В ЕЕ БЕ, ВЕБ. Ек ж де ох сх я Еш БВ ше ДЕКО і ФО Ф кя кт БО Би Ух Я Га і б Ж 5 ПОВ ню де де ж ОХ з Я з та
ЕК. 1 вве х й ; ж й і ї 3 ке ж СУМ вот що ОВ ке і їй прощ ща о ще ВК ОЗ ВО я реве рок й ЩЕ Шк ПЕ фе мок я «щи 5 т КЕ ЩЕ щі м зір і кі у в У шк БЕ а фа хх ЖЖ 5 Ку Ме З Ме тії шо . В в Б В в твій 5 ЗЕ щ- ШОЇ в к ЦІ З Я щ Б : Я ЩО мая ж ж хх КОКО ЩЕ Н і вх Кі ее я Бе Б З т 5 / ж ЩЕ М Же КЕ КБ Р з 3 5 ще Б їх їла ща А Ка 5 го ве ВВ Й ВЕ ; Е Б | Е Е5У 5 г де ЯК ожсжо охо хе Б я ї- шо ще т р жо я я хе ОТИТ ке що я кожною я ра ще їж ех би г ЩО ЕчЕЧчЕЧЕе шо М зві Еш ще ЖЖ ям ЗХ 5 Ще шк 5 НН шо пон
Фіг. 75
UAA201411972A 2008-04-11 2009-04-10 Спосіб одержання фармацевтичної композиції, яка містить антитіло UA121453C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008104147 2008-04-11
JP2008247713 2008-09-26
JP2009068744 2009-03-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA121453C2 true UA121453C2 (uk) 2020-06-10

Family

ID=41161956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201411972A UA121453C2 (uk) 2008-04-11 2009-04-10 Спосіб одержання фармацевтичної композиції, яка містить антитіло

Country Status (33)

Country Link
US (10) US20110111406A1 (uk)
EP (7) EP3521311A1 (uk)
JP (15) JP4954326B2 (uk)
KR (7) KR20240113501A (uk)
CN (6) CN102993304A (uk)
AR (2) AR071656A1 (uk)
BR (2) BR122020017346B1 (uk)
CA (1) CA2721052C (uk)
CO (1) CO6311005A2 (uk)
CR (3) CR11783A (uk)
DK (3) DK2708558T3 (uk)
EC (1) ECSP10010600A (uk)
ES (4) ES2671010T3 (uk)
HK (3) HK1246158A1 (uk)
HR (3) HRP20240722T1 (uk)
HU (3) HUE067049T2 (uk)
IL (3) IL208516A (uk)
LT (1) LT2708559T (uk)
MA (1) MA32754B1 (uk)
MX (2) MX2010011184A (uk)
MY (1) MY195714A (uk)
NO (1) NO2708559T3 (uk)
NZ (4) NZ588507A (uk)
PH (2) PH12014502054A1 (uk)
PL (4) PL3514180T3 (uk)
PT (2) PT2708559T (uk)
RU (2) RU2571225C2 (uk)
SG (3) SG189775A1 (uk)
SI (2) SI2275443T1 (uk)
TR (2) TR201808535T4 (uk)
TW (7) TWI700293B (uk)
UA (1) UA121453C2 (uk)
WO (1) WO2009125825A1 (uk)

Families Citing this family (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005035753A1 (ja) * 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
EP3050963B1 (en) * 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
EP1941907B1 (en) * 2005-10-14 2016-03-23 Fukuoka University Inhibitor of transplanted islet dysfunction in islet transplantation
US8945558B2 (en) 2005-10-21 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for treating myocardial infarction comprising administering an IL-6 inhibitor
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
WO2007086490A1 (ja) * 2006-01-27 2007-08-02 Keio University 脈絡膜血管新生を伴う疾患の治療剤
WO2007114319A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
ES2654040T3 (es) 2006-03-31 2018-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos
CN101495146B (zh) 2006-04-07 2012-10-17 国立大学法人大阪大学 肌肉再生促进剂
BRPI0806812B8 (pt) * 2007-01-23 2021-09-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente para suprimir reação de rejeição crônica e uso de um inibidor de il-6
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
ES2834741T3 (es) 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
KR101665729B1 (ko) 2008-06-05 2016-10-12 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 신경침윤 억제제
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
AR073770A1 (es) * 2008-10-20 2010-12-01 Imclone Llc Anticuerpo aislado que se enlaza especificamente con, e induce la degradacion del receptor-3 del factor de crecimiento del fibroblasto humano (fgfr-3), fragmento de enlace fgfr-3 humano del mismo, composicion farmaceutica y producto que lo comprenden
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
CN105132395A (zh) * 2009-03-09 2015-12-09 生物蛋白有限公司 Mirac蛋白
AU2015204268B2 (en) * 2009-03-09 2017-03-02 Bioatla, Llc Mirac Proteins
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
SG10201703707YA (en) * 2009-03-19 2017-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecules
TWI457134B (zh) * 2009-03-19 2014-10-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Rheumatoid arthritis treatment
EP2419733A4 (en) 2009-04-13 2013-12-25 Univ Leland Stanford Junior METHODS AND DEVICES FOR DETECTING THE PRESENCE OF AN ANALYTE IN A SAMPLE
BRPI1011145A2 (pt) 2009-05-15 2016-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti-axl
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
AR080428A1 (es) 2010-01-20 2012-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
AU2011225716A1 (en) * 2010-03-11 2012-09-27 Pfizer Inc. Antibodies with pH dependent antigen binding
CN106198715B (zh) * 2010-03-12 2020-01-10 小利兰·斯坦福大学托管委员会 基于磁性传感器的定量结合动力学分析
TWI667346B (zh) * 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
SI2578231T1 (sl) 2010-05-28 2023-01-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Okrepljen protitumorski T celični odzivnik
KR20130096731A (ko) 2010-09-08 2013-08-30 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법
EP2622074B1 (en) 2010-09-30 2014-11-12 Board Of Trustees Of Northern Illinois University Library-based methods and compositions for introducing molecular switch functionality into protein affinity reagents
KR101398363B1 (ko) 2010-11-17 2014-05-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) * 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
MX367075B (es) 2011-01-28 2019-08-05 Sanofi Biotechnology Anticuerpos humanos frente a pcsk9 para su uso en metodos de tratamiento de grupos concretos de pacientes.
MX352889B (es) 2011-02-25 2017-12-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo de fc especifico para fcyriib.
WO2012132067A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
CN113999307A (zh) * 2011-03-30 2022-02-01 中外制药株式会社 改变抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的方法
EP2698431B1 (en) * 2011-03-30 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
BR112013032630B1 (pt) 2011-06-30 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
CA2848201C (en) 2011-09-16 2020-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipoprotein(a) levels by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (pcsk9)
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
WO2013047752A1 (ja) * 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 抗原の消失を促進する抗原結合分子
JP6284766B2 (ja) * 2011-09-30 2018-02-28 中外製薬株式会社 イオン濃度依存性結合分子ライブラリ
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
CA2850322C (en) 2011-09-30 2023-10-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen
JP6271251B2 (ja) * 2011-10-05 2018-01-31 中外製薬株式会社 糖鎖受容体結合ドメインを含む抗原の血漿中からの消失を促進する抗原結合分子
TWI589299B (zh) 2011-10-11 2017-07-01 再生元醫藥公司 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法
SG10202010120XA (en) 2011-10-17 2020-11-27 Regeneron Pharma Restricted immunoglobulin heavy chain mice
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
MX358220B (es) 2011-11-30 2018-08-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Portador que contiene fármaco en la célula para formar el inmunocomplejo.
JP6226752B2 (ja) 2012-02-09 2017-11-08 中外製薬株式会社 抗体のＦｃ領域改変体
ES2676031T3 (es) 2012-02-15 2018-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Cromatografía de afinidad basada en el receptor Fc
TWI617577B (zh) 2012-02-24 2018-03-11 中外製藥股份有限公司 經ＦｃγＲＩＩＢ促進抗原消失之抗原結合分子
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
SG10201607727PA (en) * 2012-03-16 2016-11-29 Regeneron Pharma Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics
PT2825037T (pt) * 2012-03-16 2019-08-07 Regeneron Pharma Animais não humanos que expressam sequências de imunoglobulinas sensíveis ao ph
HUE053310T2 (hu) 2012-03-16 2021-06-28 Regeneron Pharma Hisztidinmódosított könnyûlánc antitestek és genetikailag módosított rágcsálók ugyanennek az elõállítására
CA2870876C (en) * 2012-05-23 2019-10-01 Genentech, Inc. Selection method for therapeutic agents
EP3892638A1 (en) 2012-05-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
MX2014014678A (es) * 2012-05-30 2015-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno especifico para el tejido objetivo.
JP2013253842A (ja) * 2012-06-06 2013-12-19 Univ Of Tokyo ｐＨ依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法
KR102436654B1 (ko) 2012-06-12 2022-08-26 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
JP6309521B2 (ja) 2012-08-13 2018-04-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体
AU2013306700B2 (en) 2012-08-24 2019-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIb-specific Fc region variant
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
US10766960B2 (en) 2012-12-27 2020-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
KR102313047B1 (ko) * 2013-02-20 2021-10-19 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람화된 ｔ-세포 보조-수용체를 발현하는 마우스
LT2840892T (lt) * 2013-02-20 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nežmogaus tipo gyvūnai su modifikuotomis imunoglobulino sunkiųjų grandinių sekomis
CN105164154B (zh) * 2013-02-22 2019-06-07 瑞泽恩制药公司 表达人源化主要组织相容性复合物的小鼠
KR102309653B1 (ko) * 2013-03-11 2021-10-08 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 키메라 주요 조직적합성 복합체 （ｍｈｃ） 제ｉｉ부류 분자를 발현하는 유전자전이 마우스
SI2970497T1 (en) * 2013-03-15 2018-04-30 Bayer Healthcare Llc Variants of anti-TFPI antibodies with differential binding over the pH range for improved pharmacokinetic properties
WO2014146575A1 (en) 2013-03-19 2014-09-25 Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
JP6505079B2 (ja) 2013-03-29 2019-04-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体ｃ５を標的とする治療薬の血清半減期を増加させるための組成物及び方法
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
KR20160024906A (ko) 2013-06-07 2016-03-07 사노피 바이오테크놀로지 Ｐｃｓｋ9의 억제제를 투여함에 의한 죽상경화증의 억제 방법
US10782290B2 (en) 2013-06-11 2020-09-22 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patient, and method for determining applicability of novel therapy
TR201909967T4 (tr) 2013-09-18 2019-07-22 Regeneron Pharma Histidin ile işlenmiş hafif zincirli antikorlar ve bunu üretmeye yönelik genetik olarak modifiye edilmiş insan olmayan hayvanlar.
EP3050896B1 (en) 2013-09-27 2021-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
JPWO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2017-03-09 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
US10428157B2 (en) 2013-11-12 2019-10-01 Sanofi Biotechnology Dosing regimens for use with PCSK9 inhibitors
EP3078744B1 (en) 2013-12-04 2020-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
NZ631007A (en) 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
KR102246800B1 (ko) 2014-05-13 2021-04-30 바이오아트라, 인코퍼레이티드 조건부 활성 생체 단백질
JP7037885B2 (ja) * 2014-06-30 2022-03-17 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ｐＨ依存性抗原結合を示す抗ＴＮＦａ抗体
AU2015289613B2 (en) 2014-07-16 2021-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating patients with heterozygous familial hypercholesterolemia (heFH)
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
ES2749383T3 (es) 2014-11-06 2020-03-20 Hoffmann La Roche Variantes de la región Fc con unión al FcRn modificada y procedimientos de uso
TWI831044B (zh) 2014-11-11 2024-02-01 日商中外製藥股份有限公司 抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造及選擇抗原結合分子之方法
SG11201700841QA (en) 2014-12-19 2017-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
MY183415A (en) 2014-12-19 2021-02-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
WO2016117346A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
AU2016215049B2 (en) 2015-02-06 2021-12-02 Cell Idx, Inc. Antigen-coupled immunoreagents
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
PL3299810T3 (pl) 2015-05-19 2021-12-13 National Center Of Neurology And Psychiatry Sposób określania zastosowania nowej terapii u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (sm)
EP3549606A1 (en) * 2015-05-28 2019-10-09 Bio-rad Laboratories, Inc. Affinity ligands and methods relating thereto
CN107922507B (zh) 2015-08-18 2022-04-05 瑞泽恩制药公司 抗pcsk9抑制性抗体用来治疗接受脂蛋白单采的高脂血症患者
PE20181336A1 (es) 2015-09-18 2018-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
CA3005592C (en) * 2015-12-18 2024-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
KR20230027321A (ko) * 2015-12-18 2023-02-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
WO2017115773A1 (ja) 2015-12-28 2017-07-06 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
MX2018010988A (es) 2016-03-14 2019-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmaco terapeutico que induce lesion celular para usarse en terapia de cancer.
WO2017165464A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
UA124734C2 (uk) 2016-06-14 2021-11-10 Рідженерон Фармасьютікалз, Інк. Антитіло проти с5 і його застосування
MY193497A (en) * 2016-06-17 2022-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies and methods of use
PE20240825A1 (es) * 2016-06-17 2024-04-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y metodos de uso
CN116515950A (zh) * 2016-07-18 2023-08-01 赛尔伊迪克斯公司 抗原偶联的杂交试剂
WO2018019537A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Method for obtaining aptamers
MX2019001448A (es) * 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
SG11201901411VA (en) * 2016-08-31 2019-03-28 Bioatla Llc Conditionally active polypeptides and methods of generating them
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
EP3546574A4 (en) 2016-11-28 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN AND POLYPEPTIDE BINDING AREA INCLUDING A TRANSPORT SECTION
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US20200347143A1 (en) * 2016-12-19 2020-11-05 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Novel tnfr agonists and uses thereof
JP7191833B2 (ja) 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
ES2947735T3 (es) 2017-01-31 2023-08-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con C5
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
EP3586872A4 (en) 2017-02-24 2020-12-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PHARMACEUTICAL COMPOSITION, ANTIG-BINDING MOLECULES, TREATMENT METHODS AND SCREENING METHODS
CR20190417A (es) 2017-03-16 2019-12-06 Medimmune Ltd Anticuerpos anti-par2 y usos de los mismos referencia cruzada a solicitudes relacionadas
AU2018255938A1 (en) 2017-04-21 2019-10-31 Staten Biotechnology B.V. Anti-ApoC3 antibodies and methods of use thereof
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
GB201707484D0 (en) * 2017-05-10 2017-06-21 Argenx Bvba Method of preparing ph-dependent antibodies
JP2020522254A (ja) 2017-05-31 2020-07-30 エルスター セラピューティクス， インコーポレイテッド 骨髄増殖性白血病（ｍｐｌ）タンパク質に結合する多特異性分子およびその使用
CN110959014B (zh) 2017-07-18 2024-01-16 协和麒麟株式会社 抗人ccr1单克隆抗体
BR112020001703B1 (pt) 2017-07-27 2024-01-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc Solução aquosa estável compreendendo um anticorpo anti-c5, método para produção desta solução, uso da mesma para tratar uma condição associada ao complemento e kit terapêutico compreendendo a mesma
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
WO2019078344A1 (ja) 2017-10-20 2019-04-25 学校法人兵庫医科大学 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物
US10538583B2 (en) 2017-10-31 2020-01-21 Staten Biotechnology B.V. Anti-APOC3 antibodies and compositions thereof
MX2020004512A (es) 2017-10-31 2020-08-13 Anticuerpos anti apolipoproteina c-iii (anti-apoc3) y metodos de uso de los mismos.
CN111556895B (zh) * 2017-11-14 2024-09-13 中外制药株式会社 抗-c1s抗体及使用方法
MX2020005220A (es) 2017-11-28 2020-08-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipeptido que incluye dominio de union al antigeno y seccion de transporte.
TW201938194A (zh) 2017-12-05 2019-10-01 日商中外製藥股份有限公司 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子
EP3724226A1 (en) 2017-12-13 2020-10-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibody combinations and uses thereof
GB201802487D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Argenx Bvba Cytokine combination therapy
JP7049569B2 (ja) * 2018-03-06 2022-04-07 国立大学法人 東京大学 ｐＨ依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
MX2020009296A (es) 2018-03-15 2020-11-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-virus del dengue que tienen reactividad cruzada con el virus zika y metodos de uso.
MX2020010528A (es) 2018-04-13 2020-11-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-componente de complemento y metodos de uso.
JPWO2019230868A1 (ja) 2018-05-30 2021-06-24 中外製薬株式会社 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子
CA3104997A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to chondroitin sulfate proteoglycan 5
AU2019295279A1 (en) 2018-06-26 2021-01-21 Kagoshima University Antibody binding to cell adhesion molecule 3
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
WO2020022262A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Target cell specific cytosol-penetrating antigen-binding molecules
TWI704157B (zh) 2018-08-01 2020-09-11 日商中外製藥股份有限公司 在c5相關疾病之治療或預防中使用的醫藥組成物與治療或預防c5相關疾病的方法
BR112021002037A2 (pt) 2018-08-10 2021-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula de ligação de antígeno anti-cd137 e uso da mesma
JP7523349B2 (ja) 2018-08-29 2024-07-26 中外製薬株式会社 抗体半分子、および抗体半分子のホモ二量体形成を抑制する方法
CN113227789A (zh) * 2018-12-30 2021-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 基于pH梯度SPR的结合测定
CA3128212A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Sanofi Biotechnology Anti-il-6 receptor antibody for treating juvenile idiopathic arthritis
AU2020224680A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
AU2020224154A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2020172596A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and thereof
JP2022523197A (ja) 2019-02-21 2022-04-21 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞関連のがん細胞に結合する多機能性分子およびその使用
JP2022521937A (ja) 2019-02-21 2022-04-13 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ＮＫｐ３０に結合する抗体分子およびその使用
US20220153875A1 (en) 2019-03-19 2022-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing antigen-binding domain of which binding activity to antigen is changed depending on mta, and library for obtaining said antigen-binding domain
US20220213140A1 (en) 2019-04-10 2022-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for purifying fc region-modified antibody
GB2589049C (en) 2019-04-11 2024-02-21 argenx BV Anti-IgE antibodies
AU2020275348A1 (en) * 2019-05-15 2021-12-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha An antigen-binding molecule, a pharmaceutical composition, and a method
CA3141673A1 (en) * 2019-05-23 2020-11-26 Xiamen University Anti-hepatitis b virus antibodies and use thereof
JPWO2020246567A1 (uk) 2019-06-05 2020-12-10
MX2021014433A (es) 2019-06-05 2022-03-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union a sitio de escision de anticuerpo.
KR20220035368A (ko) * 2019-06-07 2022-03-22 아디맵 엘엘씨 조작된 ph-의존성 항-cd3 항체, 및 이의 생성 및 사용 방법
WO2020254827A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vhsquared Limited Polypeptides
EP3986931A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
EP4017878A4 (en) * 2019-08-19 2023-09-13 The Rockefeller University MANIPULATION OF PH-DEPENDENT ANTIGEN BINDING ACTIVITY IN ANTI-HIV ANTIBODIES WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
JP2021063075A (ja) 2019-10-16 2021-04-22 中外製薬株式会社 抗体、薬学的組成物、および方法
CA3164818A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
IL294226A (en) 2019-12-27 2022-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-ctla-4 antibodies and their use
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
BR112022021216A2 (pt) * 2020-04-22 2022-12-06 Kindred Biosciences Inc Anticorpos, ácido nucleico, célula hospedeira, composições farmacêuticas, métodos de produção de um anticorpo e de tratamento de uma espécie de animal de companhia e métodos para reduzir a função de sinalização de il31 em uma célula e para detectar il31 em uma amostra
JP2023523011A (ja) 2020-04-24 2023-06-01 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞関連のがん細胞に結合する多機能性分子およびその使用
JPWO2022025030A1 (uk) 2020-07-28 2022-02-03
JPWO2022025220A1 (uk) 2020-07-31 2022-02-03
CN116917316A (zh) 2020-08-26 2023-10-20 马伦戈治疗公司 与NKp30结合的抗体分子及其用途
CN116249718A (zh) 2020-08-26 2023-06-09 马伦戈治疗公司 结合至钙网蛋白的多功能性分子及其用途
CN116761818A (zh) 2020-08-26 2023-09-15 马伦戈治疗公司 检测trbc1或trbc2的方法
JPWO2022044248A1 (uk) 2020-08-28 2022-03-03
EP4288456B1 (en) * 2021-02-03 2024-09-18 Mythic Therapeutics, Inc. Anti-met antibodies and uses thereof
CA3214757A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Andreas Loew Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
EP4342984A1 (en) 2021-05-19 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for predicting in vivo pharmacokinetics of molecule
EP4355785A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
AU2022295067A1 (en) 2021-06-18 2023-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
CA3220353A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of anti-ctla-4 antibody
CA3221833A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody
WO2023139107A1 (en) 2022-01-18 2023-07-27 argenx BV Galectin-10 antibodies
MX2024009817A (es) 2022-02-09 2024-08-19 Nat Institutes Of Biomedical Innovation Health And Nutrition Anticuerpo o fragmento del mismo que se une a fcrl1.
GB202211100D0 (en) 2022-07-29 2022-09-14 Stam Jord Cornelis Lysosomal degradation
KR20240054896A (ko) 2022-10-18 2024-04-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항C1s 항체의 사용
KR20240080281A (ko) 2022-11-29 2024-06-07 엘지디스플레이 주식회사 표시 장치 및 표시 장치의 제조 방법

Family Cites Families (498)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5229888B2 (uk) 1972-02-01 1977-08-04
US4769320A (en) 1982-07-27 1988-09-06 New England Medical Center Hospitals, Inc. Immunoassay means and methods useful in human native prothrombin and human abnormal prothorombin determinations
ES521371A0 (es) * 1982-04-12 1984-05-16 Hybritech Inc Un procedimiento para la purificacion de un anticuerpo.
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
US4689299A (en) * 1982-09-30 1987-08-25 University Of Rochester Human monoclonal antibodies against bacterial toxins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6088703A (ja) 1983-10-18 1985-05-18 新日本製鐵株式会社 耐重荷重性舗装体
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JPH06104071B2 (ja) 1986-08-24 1994-12-21 財団法人化学及血清療法研究所 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体
US4801687A (en) * 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
JPS63149900A (ja) 1986-12-15 1988-06-22 Toshiba Corp 半導体メモリ
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
JPH01144991A (ja) 1987-12-02 1989-06-07 Kagaku Oyobi Ketsusei Riyouhou Kenkyusho 血液凝固第８因子の精製方法
US5670373A (en) * 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
US5322678A (en) 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
CA1332367C (en) 1988-09-28 1994-10-11 Richard Mark Bartholomew Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies
US5126250A (en) * 1988-09-28 1992-06-30 Eli Lilly And Company Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2006684C (en) 1988-12-30 1996-12-17 Charles T. Esmon Monoclonal antibody against protein c
US5202253A (en) 1988-12-30 1993-04-13 Oklahoma Medical Research Foundation Monoclonal antibody specific for protein C and antibody purification method
JPH0636741B2 (ja) 1989-11-08 1994-05-18 帝人株式会社 ヒト・プロテインｃの分離方法
WO1991012023A2 (en) 1990-02-16 1991-08-22 Boston Biomedical Research Institute Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells
US5130129A (en) 1990-03-06 1992-07-14 The Regents Of The University Of California Method for enhancing antibody transport through capillary barriers
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
GB9022547D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Purified immunoglobulin
US5795965A (en) * 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
US5468634A (en) * 1991-06-24 1995-11-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Axl oncogene
JP3087857B2 (ja) 1991-07-04 2000-09-11 東洋紡績株式会社 交編編地の染色処理方法
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
BR9204244A (pt) 1992-10-26 1994-05-03 Cofap Ferro fundido cinzento
EP0671951A4 (en) 1992-12-01 1997-05-21 Protein Design Labs Inc HUMANIZED ANTIBODIES REACTING WITH L-SELECTIN.
DE69432815T2 (de) 1993-03-19 2003-12-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine, Baltimore Wachstumsfaktor-8
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
ATE322547T1 (de) * 1993-06-10 2006-04-15 Genetic Therapy Inc Adenovirale vektoren für die behandlung der hämophilie
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
FR2707189B1 (fr) 1993-07-09 1995-10-13 Gradient Ass Procédé de traitement de résidus de combustion et installation de mise en Óoeuvre dudit procédé.
GB9314271D0 (en) 1993-07-09 1993-08-18 Inst Of Cancer The Research Cell growth factor receptors
IL107742A0 (en) 1993-11-24 1994-02-27 Yeda Res & Dev Chemically-modified binding proteins
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US6214613B1 (en) 1993-12-03 2001-04-10 Ashai Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Expression screening vector
JPH07177572A (ja) 1993-12-20 1995-07-14 Matsushita Electric Ind Co Ltd コードレス電話の留守番方法
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5945311A (en) * 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
DE4419399C1 (de) 1994-06-03 1995-03-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US8017121B2 (en) * 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
CN1162184C (zh) 1994-07-11 2004-08-18 德克萨斯州立大学董事会 用于脉管系统特异性凝血的组合物及其应用
TW416960B (en) 1994-07-13 2001-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reshaped human antibody to human interleukin-8
US6048972A (en) 1994-07-13 2000-04-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant materials for producing humanized anti-IL-8 antibodies
JP3865418B2 (ja) 1994-07-13 2007-01-10 中外製薬株式会社 ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体
CN1156460A (zh) 1994-07-13 1997-08-06 中外制药株式会社 抗人白细胞介素-8的重构人抗体
KR100261941B1 (ko) 1994-07-13 2000-07-15 나가야마 오사무 사람의 인터루킨-8에 대한 재구성 사람항체
US6309636B1 (en) 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
PT783893E (pt) 1994-10-07 2012-05-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Inibição do crescimento anormal das células sinoviais usando antagonistas de il-6 como componente ativo
EP1884524A3 (en) 1994-10-21 2008-06-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for treatment of diseases caused by IL-6 production
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5830478A (en) 1995-06-07 1998-11-03 Boston Biomedical Research Institute Method for delivering functional domains of diphtheria toxin to a cellular target
AU690474B2 (en) 1995-09-11 1998-04-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody againts alpha-chain of human interleukin 5 receptor
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
EP0938499A1 (en) 1996-07-19 1999-09-01 Amgen Inc. Analogs of cationic proteins
US7247302B1 (en) 1996-08-02 2007-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
DE69738522T2 (de) 1996-08-02 2009-04-02 Bristol-Myers Squibb Co. Ein verfahren zur inhibierung immunglobulininduzierter toxizität aufgrund von der verwendung von immunoglobinen in therapie und in vivo diagnostik
BR9713294A (pt) 1996-09-26 2000-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd "anticorpos contra proteìna relacionada a hormÈnio de paratiróide humano"
US6025158A (en) 1997-02-21 2000-02-15 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JPH10324639A (ja) 1997-03-21 1998-12-08 Chugai Pharmaceut Co Ltd Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する感作ｔ細胞関与疾患の予防・治療剤
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
JP4086908B2 (ja) 1997-04-17 2008-05-14 アムジエン・インコーポレーテツド 安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質と抗体Ｆｃ鎖とのコンジュゲートを含む組成物および方法
IL132560A0 (en) 1997-05-02 2001-03-19 Genentech Inc A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US5980893A (en) 1997-07-17 1999-11-09 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Agonist murine monoclonal antibody as a stimulant for megakaryocytopoiesis
US20020187150A1 (en) * 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
EP1916020A3 (en) 1997-08-15 2008-07-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives and/or remedies for systemic lupus erythematosus containing anti-IL-6 receptor antibody as the active ingredient
DE69838454T2 (de) * 1997-10-03 2008-02-07 Chugai Seiyaku K.K. Natürlicher menschlicher antikörper
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
ATE383875T1 (de) 1998-03-17 2008-02-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Prophylaktische oder therapeutische mittel gegen entzündliche erkrankungen des verdauungstraktes enthaltend antagonistische il-6 rezeptor antikörper
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU770555B2 (en) * 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6475718B2 (en) 1998-09-08 2002-11-05 Schering Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating the interaction between the APJ receptor and the HIV virus
AU764211C (en) * 1998-12-01 2006-03-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Humanized antibodies to gamma-interferon
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
KR20060067983A (ko) 1999-01-15 2006-06-20 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU2006225302B2 (en) 1999-03-25 2010-08-12 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
DK1188830T3 (da) 1999-06-02 2010-04-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Nyt hæmopoietinreceptorprotein NR10
US6331642B1 (en) 1999-07-12 2001-12-18 Hoffmann-La Roche Inc. Vitamin D3 analogs
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US20040058393A1 (en) 2000-04-17 2004-03-25 Naoshi Fukishima Agonist antibodies
EP1278512A2 (en) 2000-05-03 2003-01-29 MBT Munich Biotechnology AG Cationic diagnostic, imaging and therapeutic agents associated with activated vascular sites
KR101155294B1 (ko) 2000-06-16 2013-03-07 캠브리지 안티바디 테크놀로지 리미티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
AU2011244851A1 (en) 2000-07-27 2011-11-24 The John Hopkins University School Of Medicine Promyostatin peptides and methods of using same
ES2335861T3 (es) 2000-09-08 2010-04-06 Universitat Zurich Grupos de proteinas repetitivas que comprenden modulos repetitivos.
EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
EP2113516B1 (en) 2000-10-10 2014-05-21 Genentech, Inc. Antibodies against C5 inhibiting type II endothelial cell activation
AU2002213251B2 (en) 2000-10-16 2007-06-14 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2002034292A1 (fr) 2000-10-25 2002-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agents preventifs ou therapeutiques contre le psoriasis renfermant l'antagoniste de l'il-6 comme substance active
AU2000279625A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blood mmp-3 level-lowering agent containing il-6 antgonist as the active ingredient
ATE489395T1 (de) 2000-12-12 2010-12-15 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1383800A4 (en) 2001-04-02 2004-09-22 Idec Pharma Corp RECOMBINANT ANTIBODIES CO-EXPRESSED WITH GNTIII
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
US7358054B2 (en) * 2001-04-13 2008-04-15 Biogen Idec Ma Inc. Antibodies to VLA-1
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
DK2208784T3 (da) * 2001-06-22 2013-03-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Celleproliferationsinhibitorer indeholdende anti-glypican-3-antistof
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
US7432356B2 (en) 2001-08-17 2008-10-07 Genentech, Inc. Complement pathway inhibitors binding to C5 and C5a without preventing formation of C5b
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US20030190705A1 (en) 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
US7291721B2 (en) 2001-11-14 2007-11-06 Centocor, Inc. Anti-IL-6 antibodies, compositions, methods and uses
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
JP4063769B2 (ja) 2001-12-28 2008-03-19 中外製薬株式会社 タンパク質安定化方法
AU2003280410B8 (en) * 2002-01-18 2009-04-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
ES2377188T3 (es) * 2002-01-18 2012-03-23 Zymogenetics, Inc. Nuevo ligando de citocina ZCYTOR17
KR20040082421A (ko) 2002-02-11 2004-09-24 제넨테크, 인크. 빠른 항원 결합 속도를 갖는 항체 변이체
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20050130224A1 (en) * 2002-05-31 2005-06-16 Celestar Lexico- Sciences, Inc. Interaction predicting device
JP4468803B2 (ja) 2002-05-31 2010-05-26 ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシーズ・アーベー 結合剤を基板表面にカップリングさせる方法
DK1512015T3 (da) 2002-06-12 2009-07-06 Genencor Int Fremgangsmåder til forbedring af bindingsegenskaber hos et molekyle
CA2488836A1 (en) 2002-06-12 2003-12-24 Genencor International, Inc. Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
ITMI20021527A1 (it) 2002-07-11 2004-01-12 Consiglio Nazionale Ricerche Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso
EP1382969A1 (en) 2002-07-17 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Diagnosis and prevention of cancer cell invasion
US20050260213A1 (en) 2004-04-16 2005-11-24 Scott Koenig Fcgamma-RIIB-specific antibodies and methods of use thereof
US20040138118A1 (en) 2002-09-16 2004-07-15 Neil Wolfman Metalloprotease activation of myostatin, and methods of modulating myostatin activity
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217798B2 (en) 2003-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of Fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis
US7335743B2 (en) * 2002-10-16 2008-02-26 Amgen Inc. Human anti-IFN-γ neutralizing antibodies as selective IFN-γ pathway inhibitors
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
AU2003299641C1 (en) 2002-12-16 2016-06-02 Cormorant Pharmaceuticals Ab Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8)
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20040223970A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-11 Daniel Afar Antibodies against SLC15A2 and uses thereof
ATE553113T1 (de) 2003-02-28 2012-04-15 Agenus Inc Verwendung von lektinen zur förderung der oligomerisierung von glycoproteinen und antigenen molekülen
PT1601697E (pt) 2003-02-28 2007-09-04 Lonza Biologics Plc Purificação de anticorpos através de proteína a e cromatografia de troca iónica.
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
CN1756564A (zh) 2003-03-04 2006-04-05 亚历森制药有限公司 通过耐受诱导抗原递呈细胞诱导抗原呈递治疗自身免疫性疾病的方法
BRPI0408705A (pt) 2003-03-24 2006-03-07 Zymogenetics Inc método para produzir um anticorpo para um polipeptìdeo, anticorpo produzido pelo mesmo, anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um polipeptìdeo, métodos para reduzir ou inibir a proliferação ou diferenciação induzida pela il-20 de células hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética, para reduzir a inflamação induzida pela il-20, para suprimir uma resposta inflamatória em um mamìfero com inflamação, para tratar um mamìfero afligido com uma doença inflamatória, para tratar um condição patológica em um paciente associada com a atividade de il-20
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CN1829532A (zh) 2003-06-02 2006-09-06 惠氏公司 肌肉抑制素（gdf8）抑制剂和皮质类固醇联合用于治疗神经肌肉紊乱的用途
JP2005004970A (ja) 2003-06-09 2005-01-06 Hitachi Cable Ltd 複合ケーブルおよびこれを用いた先行配線システム
EP1636264A2 (en) 2003-06-24 2006-03-22 MERCK PATENT GmbH Tumour necrosis factor receptor molecules with reduced immunogenicity
US7011924B2 (en) 2003-07-30 2006-03-14 Hynix Semiconductor Inc. Photoresist polymers and photoresist compositions comprising the same
WO2005023193A2 (en) 2003-09-04 2005-03-17 Interleukin Genetics, Inc. Methods of treating endometriosis
WO2005027966A2 (en) * 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
EP2311945A1 (en) * 2003-10-14 2011-04-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies substituting for functional proteins
ES2392824T3 (es) 2003-10-17 2012-12-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agente terapéutico contra el mesotelioma
EP1675878A2 (en) 2003-10-24 2006-07-05 Avidia, Inc. Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
ATE360647T1 (de) * 2003-11-05 2007-05-15 Ares Trading Sa Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
EP1701979A2 (en) 2003-12-03 2006-09-20 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
EP1697741A4 (en) 2003-12-04 2008-02-13 Xencor Inc PROCESS FOR PRODUCING PROTEIN VARIANTS WITH INCREASED HOST STRUCTURE CONTENT AND COMPOSITIONS THEREOF
KR20130133302A (ko) * 2003-12-10 2013-12-06 메다렉스, 인코포레이티드 Ｉｐ―１０ 항체 및 그의 용도
AR048210A1 (es) 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
RU2422460C2 (ru) 2003-12-31 2011-06-27 Шеринг-Плоу Лтд. Выделенный пептид, обладающий специфической связывающей анти-gdf-8 антитело активностью, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии, клетка-хозяин, способ получения пептида, вакцинная композиция и способ вызывания иммунного ответа анти-gdf-8, способ скрининга для отбора анти-gdf-8 антитела и способ понижающего регулирования активности gdf-8 у животного
CN1918178B (zh) 2004-01-12 2012-08-22 应用分子进化公司 Fc区变体
US20050169921A1 (en) 2004-02-03 2005-08-04 Leonard Bell Method of treating hemolytic disease
US20070116710A1 (en) 2004-02-03 2007-05-24 Leonard Bell Methods of treating hemolytic anemia
ES2341461T5 (es) 2004-02-11 2014-10-29 Warner-Lambert Company Llc Procedimientos de tratamiento de la artrosis con anticuerpos ANTI-IL-6
WO2005094446A2 (en) 2004-03-23 2005-10-13 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
US8398980B2 (en) * 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
AR048335A1 (es) 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
EP1737890A2 (en) * 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
KR20070035482A (ko) 2004-03-24 2007-03-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 인터로킨-6 안타고니스트를 활성성분으로 함유하는내이장해 치료제
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
KR101699142B1 (ko) * 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
CA2572133A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Medimmune, Inc. Increasing the production of recombinant antibodies in mammalian cells by site-directed mutagenesis
DE102004032634A1 (de) 2004-07-06 2006-02-16 Sms Demag Ag Verfahren und Einrichtung zum Messen und Regeln der Planheit und/oder der Bandspannungen eines Edelstahlbandes oder einer Edelstahlfolie beim Kaltwalzen in einem Vielwalzengerüst, insbesondere in einem 20-Walzen-Sendizimir-Walzwerk
ES2372503T3 (es) 2004-07-06 2012-01-20 Bioren, Inc. Mutagénesis revisada para desarrollar polipéptidos alterados con propiedades potenciadas.
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CA2574062A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-26 Symphogen A/S Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
EP1776384B1 (en) 2004-08-04 2013-06-05 Mentrik Biotech, LLC Variant fc regions
WO2006023420A2 (en) 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Inc. Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
JP2008510466A (ja) 2004-08-19 2008-04-10 ジェネンテック・インコーポレーテッド エフェクター機能が変更しているポリペプチド変異体
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
WO2007001422A2 (en) 2004-10-22 2007-01-04 Medimmune, Inc. High affinity antibodies against hmgb1 and methods of use thereof
NZ554520A (en) * 2004-10-22 2010-03-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies
US20060115485A1 (en) 2004-10-29 2006-06-01 Medimmune, Inc. Methods of preventing and treating RSV infections and related conditions
WO2007024249A2 (en) 2004-11-10 2007-03-01 Macrogenics, Inc. Engineering fc antibody regions to confer effector function
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP2845865A1 (en) 2004-11-12 2015-03-11 Xencor Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CN101098890B (zh) 2004-11-12 2012-07-18 赞科股份有限公司 对FcRn的结合被改变的Fc变体
US20070135620A1 (en) * 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8329186B2 (en) 2004-12-20 2012-12-11 Isu Abxis Co., Ltd Treatment of inflammation using BST2 inhibitor
EP1829961A4 (en) 2004-12-22 2008-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY USING A CELL WHOSE FUCOSE CARRIER FUNCTION IS INHIBITED
DE602005020061D1 (de) 2004-12-23 2010-04-29 Novo Nordisk As Liganden mit antikörperbindender affinität
US20090087478A1 (en) 2004-12-27 2009-04-02 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Orally Deliverable and Anti-Toxin Antibodies and Methods for Making and Using Them
CA2591059C (en) 2004-12-28 2018-11-06 Innate Pharma Monoclonal antibodies against nkg2a
CA2595169A1 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
GB0502358D0 (en) 2005-02-04 2005-03-16 Novartis Ag Organic compounds
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
JP2008530132A (ja) * 2005-02-14 2008-08-07 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−３１ｒａアンタゴニストを用いて皮膚障害を治療する方法
AU2006227377B2 (en) 2005-03-18 2013-01-31 Medimmune, Llc Framework-shuffling of antibodies
AU2006230413B8 (en) 2005-03-31 2011-01-20 Xencor, Inc Fc variants with optimized properties
EP1870458B1 (en) 2005-03-31 2018-05-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha sc(Fv)2 STRUCTURAL ISOMERS
EP3050963B1 (en) * 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
ES2494921T3 (es) 2005-04-08 2014-09-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticuerpo que sustituye la función del factor VIII de coagulación sanguínea
CN103342751B (zh) * 2005-04-18 2015-12-23 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体中和剂
AU2006236417B2 (en) 2005-04-20 2011-02-03 Amgen Fremont Inc. High affinity fully human monoclonal antibodies to interleukin-8 and epitopes for such antibodies
AU2006239860B2 (en) 2005-04-25 2012-01-19 Amgen Fremont Inc. Antibodies to myostatin
US8008443B2 (en) 2005-04-26 2011-08-30 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
PE20061323A1 (es) 2005-04-29 2007-02-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el peptido amiloide beta y metodos que utilizan los mismos
PE20061324A1 (es) 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
AU2007254715B2 (en) 2005-05-06 2013-08-29 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using IL-31 antagonists
WO2006130834A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Board Of Regents, The University Of Texas System IGGl ANTIBODIES WITH MUTATED FC PORTION FOR INCREASED BINDING TO FCRN RECEPTOR AND USES THEREOF
KR101367544B1 (ko) * 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
US7557190B2 (en) 2005-07-08 2009-07-07 Xencor, Inc. Optimized proteins that target Ep-CAM
SI1912675T1 (sl) 2005-07-25 2014-07-31 Emergent Product Development Seattle, Llc zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20
US8217147B2 (en) 2005-08-10 2012-07-10 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
ES2659114T3 (es) 2005-08-19 2018-03-13 Wyeth Llc Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y usos en el tratamiento de ALS y otros trastornos asociados con GDF-8
CA2624189A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
US7635760B2 (en) 2005-10-06 2009-12-22 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
EP1951757B1 (en) 2005-10-06 2014-05-14 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
EP1941907B1 (en) 2005-10-14 2016-03-23 Fukuoka University Inhibitor of transplanted islet dysfunction in islet transplantation
US8945558B2 (en) 2005-10-21 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for treating myocardial infarction comprising administering an IL-6 inhibitor
EP1957531B1 (en) * 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AR057579A1 (es) 2005-11-23 2007-12-05 Merck & Co Inc Compuestos espirociclicos como inhibidores de histona de acetilasa (hdac)
WO2007060411A1 (en) 2005-11-24 2007-05-31 Ucb Pharma S.A. Anti-tnf alpha antibodies which selectively inhibit tnf alpha signalling through the p55r
EP1967209B1 (en) 2005-11-25 2012-06-06 Keio University Therapeutic agent for prostate cancer
US20080311122A1 (en) 2005-11-28 2008-12-18 Medimmune, Llc Antagonists of Hmgb1 and/or Rage and Methods of Use Thereof
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
EP1959991B1 (en) 2005-12-12 2013-03-20 AC Immune S.A. Therapeutic vaccine
WO2007074880A1 (ja) 2005-12-28 2007-07-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体含有安定化製剤
EA035459B1 (ru) 2005-12-29 2020-06-19 Сентокор, Инк. Антитело против il-23p19
WO2007086490A1 (ja) 2006-01-27 2007-08-02 Keio University 脈絡膜血管新生を伴う疾患の治療剤
JP2009525986A (ja) 2006-02-03 2009-07-16 メディミューン，エルエルシー タンパク質製剤
US20070190056A1 (en) 2006-02-07 2007-08-16 Ravi Kambadur Muscle regeneration compositions and uses therefor
JP4179517B2 (ja) 2006-02-21 2008-11-12 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン親和性リガンド
EP1992692B1 (en) 2006-02-21 2013-01-09 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin affinity ligand
WO2007103134A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Prolongation of survival of an allograft by inhibiting complement activity
SI2596807T1 (sl) 2006-03-08 2016-03-31 Archemix Llc Komplement vezavni aptameri in sredstva proti C5, uporabni pri zdravljenju očesnih motenj
HUE066795T2 (hu) 2006-03-15 2024-09-28 Alexion Pharmaceuticals Inc Paroxysmalis nocturnalis haemoglobinuriában szenvedõ betegek kezelése egy komplement inhibitorral
JP5374359B2 (ja) 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
KR20090013763A (ko) * 2006-03-23 2009-02-05 기린 파마 가부시끼가이샤 인간 트롬보포이에틴 수용체에 대한 아고니스트 항체
BRPI0709843A2 (pt) 2006-03-28 2011-07-26 Biogen Idec Inc anticorpos de anti-igf-1r e usos dos mesmos
WO2007114319A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
ES2654040T3 (es) * 2006-03-31 2018-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos
RU2466740C2 (ru) 2006-04-05 2012-11-20 Эбботт Байотекнолоджи Лтд. Очистка антитела
CN101495146B (zh) 2006-04-07 2012-10-17 国立大学法人大阪大学 肌肉再生促进剂
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
BRPI0711908B8 (pt) 2006-05-25 2021-05-25 Glaxo Group Ltd anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, composição farmacêutica, uso de um anticorpo anti-interleucina 18, e, método de produção de um anticorpo.
US8080248B2 (en) 2006-06-02 2011-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody
PL2041177T3 (pl) 2006-06-02 2012-09-28 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
CN101500608A (zh) * 2006-06-08 2009-08-05 中外制药株式会社 炎性疾病的预防或治疗药
ES2415655T3 (es) * 2006-06-15 2013-07-26 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Anticuerpos monoclonales que reconocen selectivamente Metanfetamina y compuestos similares a Metanfetamina
AR061571A1 (es) 2006-06-23 2008-09-03 Smithkline Beecham Corp Compuesto sal del acido toluenosulfonico de 4-{[6-cloro-3-({[(2- cloro-3-fluorofenil) amino]carbonil} amino)- 2- hidroxifenil]sulfonil] -1- piperazinacarbxilato de 1.1-dimetiletilo, composicion farmaceutica que lo comprende su uso para la fabricacion de un medicamento combinacion farmaceutica con un
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
ES2402591T3 (es) 2006-08-14 2013-05-07 Xencor Inc. Anticuerpos optimizados que seleccionan como diana CD19
DE102006038844B4 (de) 2006-08-18 2018-03-22 Robert Bosch Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Ansteuerung von Personenschutzmittel
KR101123531B1 (ko) 2006-09-05 2012-04-20 일라이 릴리 앤드 캄파니 항-마이오스타틴 항체
EP2066349B1 (en) 2006-09-08 2012-03-28 MedImmune, LLC Humanized anti-cd19 antibodies and their use in treatment of tumors, transplantation and autoimmune diseases
AU2007299843B2 (en) 2006-09-18 2012-03-08 Xencor, Inc Optimized antibodies that target HM1.24
JP2008104147A (ja) 2006-09-19 2008-05-01 Ricoh Co Ltd 撮像装置、撮像システム、画像データ処理方法およびプログラム
AU2007319576B2 (en) 2006-10-06 2014-01-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Prevention of tissue ischemia, related methods and compositions
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
WO2008121160A2 (en) 2006-11-21 2008-10-09 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target cd5
CN100455598C (zh) 2006-11-29 2009-01-28 中国抗体制药有限公司 功能人源化抗人cd20抗体及其应用
WO2008091798A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Xencor, Inc. Optimized ca9 antibodies and methods of using the same
JP5357778B2 (ja) 2007-01-23 2013-12-04 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化ｃｄ４０抗体および前記を使用する方法
BRPI0806812B8 (pt) 2007-01-23 2021-09-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente para suprimir reação de rejeição crônica e uso de um inibidor de il-6
EP2107115A1 (en) 2007-01-24 2009-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
WO2008098115A2 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Xencor, Inc. Optimized igf-1r antibodies and methods of using the same
WO2008100995A1 (en) * 2007-02-14 2008-08-21 Vaccinex, Inc. Humanized anti-cd100 antibodies
PL2426144T3 (pl) 2007-02-23 2019-05-31 Merck Sharp & Dohme Przeciwciała Anty-IL-23p19 wytworzone metodą inżynierii genetycznej
CN101646457B (zh) 2007-03-20 2013-05-01 伊莱利利公司 抗硬骨素抗体
EP2129681A2 (en) 2007-03-22 2009-12-09 Novartis Ag C5 antigens and uses thereof
CL2008001071A1 (es) 2007-04-17 2009-05-22 Smithkline Beecham Corp Metodo para obtener anticuerpo penta-especifico contra il-8/cxcl8, gro-alfa/cxcl1, gro-beta/cxcl2), gro-gama/cxcl3 y ena-78/cxcl5 humanas; anticuerpo penta-especifico; proceso de produccion del mismo; vector, hbridoma o celela que lo comprende; composicion farmceutica; uso para tratar copd, otras enfermedades.
GB0708002D0 (en) 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
CN101802197A (zh) 2007-05-14 2010-08-11 比奥根艾迪克Ma公司 单链FC（ScFc）区、包含其的结合多肽及与其相关的方法
EP2708557A1 (en) 2007-05-30 2014-03-19 Xencor, Inc. Method and compositions for inhibiting CD32B expressing cells
EP2155790A1 (en) 2007-05-31 2010-02-24 Genmab A/S Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules
KR101530723B1 (ko) 2007-06-25 2015-06-22 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 단일 쇄 항체의 서열에 기초한 공학처리 및 최적화
CN101849001B (zh) 2007-06-25 2014-07-16 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体
EP2179282B1 (en) 2007-06-29 2016-06-01 Quest Diagnostics Investments Incorporated Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromatography-mass spectrometry
EP2174667B1 (en) 2007-07-26 2017-01-04 Osaka University Agent for treatment of ophthalmia containing interleukin-6 receptor inhibitor as active ingredient
US20110105724A1 (en) 2007-08-16 2011-05-05 Stephanie Jane Clegg Novel compounds
CN101842117A (zh) 2007-08-28 2010-09-22 比奥根艾迪克Ma公司 抗igf-1r抗体及其用途
WO2009032782A2 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
EP2031064A1 (de) 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
WO2009041734A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
EP2206775B1 (en) 2007-09-26 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-il-6 receptor antibody
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
CA2700986A1 (en) 2007-09-28 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
BR122019021238B8 (pt) 2007-10-02 2021-07-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd uso de um inibidor do receptor da interleucina-6 (il-6) no tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro (gvhd)
KR100888133B1 (ko) 2007-10-02 2009-03-13 에스케이에너지 주식회사 4종의 금속성분으로 구성된 다성분계 비스무스몰리브데이트 촉매 제조방법 및 상기촉매를 이용하여1,3-부타디엔을 제조하는 방법
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
CA2702448A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying fc-fusion proteins
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
EP2228392A4 (en) 2007-11-15 2012-05-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY CAPABLE OF BINDING TO AN UNCONTROLLED GENE (ANEXELEKTO) AND USE THEREOF
CA2708065C (en) 2007-12-05 2015-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for pruritus
ES2834741T3 (es) 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
WO2009085200A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
EP3825329A1 (en) 2007-12-26 2021-05-26 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
JP5406213B2 (ja) 2008-01-18 2014-02-05 スティヒティング・サンクイン・ブルートフォールズィーニング 免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法
EP2238156B1 (en) 2008-01-29 2014-10-01 Ablynx N.V. Methods to stabilize proteins and polypeptides
AU2015227424A1 (en) 2008-04-11 2015-10-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
ES2487846T3 (es) * 2008-05-01 2014-08-25 Amgen, Inc. Anticuerpos anti-hepcindina y métodos de uso
KR101760758B1 (ko) 2008-05-14 2017-07-24 애그리컬쳐 빅토리아 서비스 피티와이 엘티디 질병 및 장애를 치료하기 위한 안지오게닌 또는 안지오게닌 아고니스트의 이용
KR101665729B1 (ko) 2008-06-05 2016-10-12 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 신경침윤 억제제
WO2010015608A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting complement protein c5
DK2796469T3 (da) 2008-09-17 2019-08-12 Xencor Inc Hidtil ukendte sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af IgE-medierede forstyrrelser
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
JP5229888B2 (ja) 2008-09-30 2013-07-03 独立行政法人産業技術総合研究所 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
EP3121197A1 (en) 2008-11-10 2017-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating complement-associated disorders
WO2010058860A1 (ja) 2008-11-18 2010-05-27 株式会社シノテスト 試料中のｃ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬
NZ592516A (en) 2008-11-25 2013-02-22 Alder Biopharmaceuticals Inc Antibodies to il-6 and use thereof
UY32341A (es) 2008-12-19 2010-07-30 Glaxo Group Ltd Proteínas de unión antígeno novedosas
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
BRPI1006998A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Biogen Idec Inc Polipeptídeos fc estabilizados com função efetora reduzida e métodos de uso
US20100292443A1 (en) * 2009-02-26 2010-11-18 Sabbadini Roger A Humanized platelet activating factor antibody design using anti-lipid antibody templates
EP2409991B1 (en) * 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
SG10201703707YA (en) 2009-03-19 2017-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecules
TWI544077B (zh) * 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
BRPI1011145A2 (pt) * 2009-05-15 2016-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti-axl
EP2435079A4 (en) 2009-05-26 2012-11-14 Univ Johns Hopkins NEW DESMINPHOSPHORYLATION ORTE FOR DIAGNOSIS AND INFLUENCING DISEASES
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
CA2766565A1 (en) 2009-06-23 2010-12-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that bind to complement proteins
US8945511B2 (en) 2009-06-25 2015-02-03 Paul Weinberger Sensitive methods for detecting the presence of cancer associated with the over-expression of galectin-3 using biomarkers derived from galectin-3
EP3916011A1 (en) 2009-06-26 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
GB0914691D0 (en) 2009-08-21 2009-09-30 Lonza Biologics Plc Immunoglobulin variants
US8709424B2 (en) 2009-09-03 2014-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-GITR antibodies
JP5837821B2 (ja) * 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP2486053B1 (en) 2009-10-06 2017-01-18 Medimmune Limited Rsv-specific binding molecule
US8568726B2 (en) 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
TR201804897T4 (tr) 2009-10-07 2018-06-21 Macrogenics Inc Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler
JP6095368B2 (ja) 2009-10-27 2017-03-15 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 機能改変するＮａｖ１．７抗体
CN101875696B (zh) 2009-11-11 2012-02-08 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗体及其制备方法与应用
EP2327725A1 (en) 2009-11-26 2011-06-01 InflaRx GmbH Anti-C5a binding moieties with high blocking activity
AU329016S (en) 2009-12-03 2009-12-22 Non Entity 49398 Induction system with integral air filter
CN102770537A (zh) 2009-12-25 2012-11-07 中外制药株式会社 用于纯化多肽多聚体的多肽的修饰方法
US9624290B2 (en) 2010-01-28 2017-04-18 Ab Biosciences, Inc. Lowered affinity antibodies and methods of making the same
CA2789416A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Glaxosmithkline Llc Novel uses
TW201127310A (en) * 2010-02-11 2011-08-16 jin-zhu Chen Step-less finetuning buckle
WO2011103584A2 (en) 2010-02-19 2011-08-25 Xencor, Inc. Novel ctla4-ig immunoadhesins
BR112012022214A2 (pt) 2010-03-01 2017-07-04 Alexion Pharma Inc métodos e composições para tratar doença de degos
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
AU2011225716A1 (en) 2010-03-11 2012-09-27 Pfizer Inc. Antibodies with pH dependent antigen binding
JP2011184418A (ja) 2010-03-11 2011-09-22 Tokyo Institute Of Technology 親和性可変抗体
TW201206466A (en) 2010-03-11 2012-02-16 Rinat Neuroscience Corp Antibodies with pH dependent antigen binding
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
EA201291133A1 (ru) 2010-04-30 2013-04-30 Алексион Фармасьютикалз, Инк. Антитела, обладающие пониженной иммуногенностью в организме человека
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
JP5904552B2 (ja) 2010-05-28 2016-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 膵癌治療剤
TW201210612A (en) 2010-06-03 2012-03-16 Glaxo Group Ltd Humanised antigen binding proteins
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
WO2012024242A1 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Amgen Inc. Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
KR20130096731A (ko) 2010-09-08 2013-08-30 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법
EP2640745B1 (en) 2010-09-10 2018-11-07 MedImmune Limited Bivalent and bispecific anti-il6/anti-il23 antibodies
JP2013541594A (ja) 2010-11-08 2013-11-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 皮下投与される抗ｉｌ−６受容体抗体
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
CA2822288A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Medimmune, Llc Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments
US20140080153A1 (en) 2011-01-07 2014-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for improving physical properties of antibody
WO2012132067A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
MX352889B (es) 2011-02-25 2017-12-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo de fc especifico para fcyriib.
EA201391248A1 (ru) 2011-03-01 2014-05-30 Эмджен Инк. Биспецифические связывающие агенты
JP5972915B2 (ja) 2011-03-16 2016-08-17 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｃ変異体
EP2698431B1 (en) 2011-03-30 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
DK2699261T3 (en) 2011-04-19 2018-09-17 Amgen Inc Method of treating osteoporosis
EP3508500A1 (en) 2011-04-29 2019-07-10 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
CN107011443B (zh) 2011-05-04 2021-04-30 奥默罗斯公司 用于抑制masp-2依赖的补体活化的组合物
BR122016016837A2 (pt) 2011-05-21 2019-08-27 Macrogenics Inc moléculas de ligação a cd3; anticorpos de ligação a cd3; composições farmacêuticas; e usos da molécula de ligação a cd3
CA2834589A1 (en) 2011-05-25 2012-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for preparing fc-containing polypeptides having improved properties
US8961981B2 (en) 2011-06-20 2015-02-24 Saint Louis University Targeting the neuromuscular junction for treatment
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
CA2850322C (en) 2011-09-30 2023-10-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
WO2013047752A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 抗原の消失を促進する抗原結合分子
JP6284766B2 (ja) 2011-09-30 2018-02-28 中外製薬株式会社 イオン濃度依存性結合分子ライブラリ
JP6271251B2 (ja) 2011-10-05 2018-01-31 中外製薬株式会社 糖鎖受容体結合ドメインを含む抗原の血漿中からの消失を促進する抗原結合分子
MX358220B (es) 2011-11-30 2018-08-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Portador que contiene fármaco en la célula para formar el inmunocomplejo.
TWI617577B (zh) 2012-02-24 2018-03-11 中外製藥股份有限公司 經ＦｃγＲＩＩＢ促進抗原消失之抗原結合分子
EA036225B1 (ru) 2012-03-14 2020-10-15 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы и их применения
HUE053310T2 (hu) 2012-03-16 2021-06-28 Regeneron Pharma Hisztidinmódosított könnyûlánc antitestek és genetikailag módosított rágcsálók ugyanennek az elõállítására
PT2825037T (pt) 2012-03-16 2019-08-07 Regeneron Pharma Animais não humanos que expressam sequências de imunoglobulinas sensíveis ao ph
CA2869048C (en) 2012-03-29 2023-10-17 Novimmune S.A. Anti-tlr4 antibodies and uses thereof
TWI619729B (zh) 2012-04-02 2018-04-01 再生元醫藥公司 抗－ｈｌａ－ｂ*２７抗體及其用途
JP5988659B2 (ja) 2012-04-09 2016-09-07 シャープ株式会社 送風機
JP6211597B2 (ja) 2012-05-01 2017-10-11 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ 新規抗体
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
EP3892638A1 (en) 2012-05-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
MX2014014678A (es) 2012-05-30 2015-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno especifico para el tejido objetivo.
CA2876397C (en) 2012-06-15 2019-08-06 Pfizer Inc. Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
SG11201408646VA (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab Bv Dimeric protein with triple mutations
JP6309521B2 (ja) 2012-08-13 2018-04-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ｐＨ依存性結合特性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
US9133269B2 (en) 2012-08-24 2015-09-15 Anaptysbio, Inc. Humanized antibodies directed against complement protein C5
AU2013306700B2 (en) 2012-08-24 2019-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIb-specific Fc region variant
TW201922795A (zh) 2012-09-10 2019-06-16 愛爾蘭商尼歐托普生物科學公司 抗ｍｃａｍ抗體及相關使用方法
DK3835310T3 (da) 2012-09-13 2024-06-03 Bristol Myers Squibb Co Fibronektinbaserede skeletdomæneproteiner, der binder til myostatin
TW201418707A (zh) 2012-09-21 2014-05-16 Alexion Pharma Inc 補體組分ｃ５拮抗劑之篩選分析
CA3023553A1 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for modulating cell signaling
EA038645B1 (ru) 2012-12-21 2021-09-28 Авео Фармасьютикалз, Инк. Антитела к gdf15
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CN105051064A (zh) 2013-01-24 2015-11-11 葛兰素史克知识产权开发有限公司 抗TNF-α抗原结合蛋白
BR112015018438A2 (pt) 2013-01-31 2017-07-18 Seoul Nat Univ R&Db Foundation anticorpo contra c5 e método para prevenir e tratar doenças relacionadas a complemento
US9481725B2 (en) 2013-03-14 2016-11-01 Alderbio Holdings, Llc Antibodies to HGF and compositions containing
US9321686B2 (en) 2013-03-15 2016-04-26 Forta Corporation Reinforcement fiber coating compositions, methods of making and treating, and uses for improved adhesion to asphalt and portland cement concrete
WO2014144080A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
EP2970508A4 (en) 2013-03-15 2016-12-14 Permeon Biologics Inc GENETICALLY MODIFIED LOADING ANTIBODIES OR ENHANCED ENHANCEMENT ENHANCEMENT TARGETING PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CN105377889B (zh) 2013-03-15 2020-07-17 Xencor股份有限公司 异二聚体蛋白
JP2016516064A (ja) 2013-03-15 2016-06-02 アムジェン インコーポレイテッド ヒト対象におけるミオスタチンの拮抗
JP6505079B2 (ja) 2013-03-29 2019-04-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体ｃ５を標的とする治療薬の血清半減期を増加させるための組成物及び方法
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
PT2981822T (pt) 2013-05-06 2020-12-07 Scholar Rock Inc Composições e métodos para modulação do fator de crescimento
KR20160021125A (ko) 2013-05-17 2016-02-24 쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스) 항-cxcl1, cxcl7 및 cxcl8 항체 및 이들의 용도
WO2014190441A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Zymeworks Inc. Heteromultimers with reduced or silenced effector function
EP3024851B1 (en) 2013-07-25 2018-05-09 CytomX Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
AU2014307589A1 (en) 2013-08-14 2016-02-11 Novartis Ag Methods of treating sporadic inclusion body myositis
JP2016531910A (ja) 2013-08-16 2016-10-13 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 移植前の臓器への補体阻害剤の投与による移植拒絶の処置
JP6456831B2 (ja) 2013-09-04 2019-01-23 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン結合ドメイン多量体
EP2853898B1 (en) 2013-09-27 2017-01-04 Medizinische Hochschule Hannover Analysis of myostatin in serum
CA2925677A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
JP2017510622A (ja) 2014-01-27 2017-04-13 ノバルティス アーゲー 筋萎縮を予測するバイオマーカー、方法および使用
EP4008726A1 (en) 2014-02-20 2022-06-08 Allergan, Inc. Complement component c5 antibodies
NZ631007A (en) 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
JP7037885B2 (ja) 2014-06-30 2022-03-17 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ｐＨ依存性抗原結合を示す抗ＴＮＦａ抗体
US10307480B2 (en) 2014-11-06 2019-06-04 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
WO2016073879A2 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Transforming growth factor-related antibodies and uses thereof
KR20170094292A (ko) 2014-12-08 2017-08-17 노파르티스 아게 근육감소증의 치료를 위한 미오스타틴 또는 액티빈 길항제
MY183415A (en) 2014-12-19 2021-02-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
SG11201700841QA (en) 2014-12-19 2017-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
WO2016117346A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
EP3277715A2 (en) 2015-03-31 2018-02-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patients
CA2982810A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors
WO2016178980A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of kindney thansplant
EP3313437A1 (en) 2015-06-26 2018-05-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for treating a patient in compliance with vaccination with eculizumab or an eculizumab variant
US10940126B2 (en) 2015-07-03 2021-03-09 Camilla Svensson Inhibition of IL-8 in the treatment of pain and/or bone loss
EP3350220B1 (en) 2015-09-15 2021-05-19 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
PE20181336A1 (es) 2015-09-18 2018-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
TW201718014A (zh) 2015-10-12 2017-06-01 諾華公司 C5抑制劑於移植相關微血管病之用途
CA3005592C (en) 2015-12-18 2024-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
KR20230027321A (ko) 2015-12-18 2023-02-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
US10233252B2 (en) 2015-12-21 2019-03-19 Wisconsin Alumni Research Foundation pH-dependent antibodies targeting the transferrin receptor and methods of use thereof to deliver a therapeutic agent
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
KR20180094110A (ko) 2016-01-08 2018-08-22 스칼러 락, 인크. 항-프로/잠재성 미오스타틴 항체 및 그의 사용 방법
WO2017123636A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment
WO2017132259A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Anti-c5 antibodies with enhanced ph switch
KR20210082548A (ko) 2016-06-13 2021-07-05 스칼러 락, 인크. 미오스타틴 억제제의 용도 및 조합 요법
UA124734C2 (uk) 2016-06-14 2021-11-10 Рідженерон Фармасьютікалз, Інк. Антитіло проти с5 і його застосування
PE20240825A1 (es) 2016-06-17 2024-04-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y metodos de uso
MY193497A (en) 2016-06-17 2022-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies and methods of use
MX2019001448A (es) 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
JP7191833B2 (ja) 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
ES2947735T3 (es) 2017-01-31 2023-08-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con C5
JP7211961B2 (ja) 2017-03-14 2023-01-24 ファイヴ プライム セラピューティクス インク 酸性ｐＨでＶＩＳＴＡに結合する抗体
CR20190417A (es) 2017-03-16 2019-12-06 Medimmune Ltd Anticuerpos anti-par2 y usos de los mismos referencia cruzada a solicitudes relacionadas
EP4272821A3 (en) 2017-04-03 2024-01-03 InflaRx GmbH Treatment of inflammatory diseases with inhibitors of c5a activity
JP7518764B2 (ja) 2017-10-26 2024-07-18 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）および非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の処置のための抗Ｃ５抗体の投薬量および投与
BR112020010916A2 (pt) 2017-12-04 2020-11-17 Ra Pharmaceuticals, Inc moduladores da atividade do complemento
TWI704157B (zh) 2018-08-01 2020-09-11 日商中外製藥股份有限公司 在c5相關疾病之治療或預防中使用的醫藥組成物與治療或預防c5相關疾病的方法
US20220213140A1 (en) 2019-04-10 2022-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for purifying fc region-modified antibody

Also Published As

Publication number Publication date
US20130303396A1 (en) 2013-11-14
US20130336963A1 (en) 2013-12-19
US20210079378A1 (en) 2021-03-18
BR122020017346B1 (pt) 2022-03-29
JP7033176B2 (ja) 2022-03-09
US10472623B2 (en) 2019-11-12
RU2014128324A (ru) 2016-02-10
TR201808046T4 (tr) 2018-06-21
JP5048866B2 (ja) 2012-10-17
EP4238993A3 (en) 2023-11-29
HUE067049T2 (hu) 2024-09-28
ECSP10010600A (es) 2011-03-31
ES2671010T3 (es) 2018-06-04
JP2021011490A (ja) 2021-02-04
EP2275443B1 (en) 2015-12-02
BRPI0911431B1 (pt) 2021-05-11
JP2012021004A (ja) 2012-02-02
CN107488228A (zh) 2017-12-19
EP2708559B1 (en) 2018-03-28
US11371039B2 (en) 2022-06-28
HRP20240722T1 (hr) 2024-08-30
US20200048627A1 (en) 2020-02-13
HK1246158A1 (zh) 2018-09-07
PL2275443T3 (pl) 2016-05-31
CR20150656A (es) 2016-01-27
EP2708558A2 (en) 2014-03-19
KR20240113501A (ko) 2024-07-22
HK1246157A1 (zh) 2018-09-07
PL2708559T3 (pl) 2018-08-31
CR20150655A (es) 2016-02-08
CN102993304A (zh) 2013-03-27
US20210079379A1 (en) 2021-03-18
US9868948B2 (en) 2018-01-16
JP5503698B2 (ja) 2014-05-28
JP7177808B2 (ja) 2022-11-24
MA32754B1 (fr) 2011-11-01
EP3056513A1 (en) 2016-08-17
EP2275443A4 (en) 2011-12-14
TWI787643B (zh) 2022-12-21
HRP20180708T1 (hr) 2018-06-29
EP2275443A1 (en) 2011-01-19
EP2708558A3 (en) 2014-07-16
PL2708558T3 (pl) 2018-09-28
EP4238993A2 (en) 2023-09-06
KR102469853B1 (ko) 2022-11-22
US9890377B2 (en) 2018-02-13
EP2708558B1 (en) 2018-03-21
ES2978400T3 (es) 2024-09-11
US11359194B2 (en) 2022-06-14
KR20210079408A (ko) 2021-06-29
JP2012116837A (ja) 2012-06-21
JP4961501B2 (ja) 2012-06-27
BRPI0911431A2 (pt) 2015-10-06
JP2019048810A (ja) 2019-03-28
PT2708559T (pt) 2018-05-16
TWI563134B (uk) 2016-12-21
AR128700A2 (es) 2024-06-05
SG10201608379YA (en) 2016-11-29
HK1246311A1 (zh) 2018-09-07
JP6417431B2 (ja) 2018-11-07
MX354670B (es) 2018-03-15
TW202423982A (zh) 2024-06-16
EP2708559A2 (en) 2014-03-19
WO2009125825A1 (ja) 2009-10-15
DK2708558T3 (en) 2018-06-14
JP2021035945A (ja) 2021-03-04
KR20170091758A (ko) 2017-08-09
AU2009234675A1 (en) 2009-10-15
IL208516A (en) 2017-11-30
JP2017081995A (ja) 2017-05-18
RU2010145939A (ru) 2012-05-20
KR20110004435A (ko) 2011-01-13
JP2022081533A (ja) 2022-05-31
CN107551270A (zh) 2018-01-09
TR201808535T4 (tr) 2018-07-23
EP3514180B1 (en) 2024-05-01
IL259956A (en) 2018-07-31
JP2014133746A (ja) 2014-07-24
TWI818604B (zh) 2023-10-11
PH12014502054B1 (en) 2015-12-07
PT2275443E (pt) 2016-03-15
SG2013027206A (en) 2014-11-27
CA2721052A1 (en) 2009-10-15
US20180282719A1 (en) 2018-10-04
EP3521311A1 (en) 2019-08-07
JP7397823B2 (ja) 2023-12-13
PH12018501850A1 (en) 2020-11-16
JP5824095B2 (ja) 2015-11-25
SI2275443T1 (sl) 2016-03-31
JP2021011491A (ja) 2021-02-04
EP2708559A3 (en) 2014-07-16
EP3514180A1 (en) 2019-07-24
DK2275443T3 (en) 2016-02-08
NZ717429A (en) 2018-07-27
JP2023138972A (ja) 2023-10-03
KR102084925B1 (ko) 2020-03-05
TW201447062A (zh) 2014-12-16
HUE028718T2 (en) 2016-12-28
CN107469077A (zh) 2017-12-15
US20130011866A1 (en) 2013-01-10
PL3514180T3 (pl) 2024-08-12
CN103251948A (zh) 2013-08-21
LT2708559T (lt) 2018-06-11
EP3514180C0 (en) 2024-05-01
TWI564021B (zh) 2017-01-01
JP4954326B2 (ja) 2012-06-13
US20110111406A1 (en) 2011-05-12
US20180282718A1 (en) 2018-10-04
PH12014502054A1 (en) 2015-12-07
JP2016026190A (ja) 2016-02-12
NZ623716A (en) 2016-04-29
US20240002836A1 (en) 2024-01-04
KR102057826B1 (ko) 2019-12-20
SG189775A1 (en) 2013-05-31
KR20200023536A (ko) 2020-03-04
SI2708559T1 (en) 2018-07-31
RU2756029C2 (ru) 2021-09-24
JP2012224633A (ja) 2012-11-15
JP2021141897A (ja) 2021-09-24
IL208516A0 (en) 2010-12-30
CN102056946A (zh) 2011-05-11
HRP20160209T1 (hr) 2016-03-25
ES2671403T3 (es) 2018-06-06
AR071656A1 (es) 2010-07-07
MY195714A (en) 2023-02-07
NZ602884A (en) 2014-08-29
TWI700293B (zh) 2020-08-01
NO2708559T3 (uk) 2018-08-25
JPWO2009125825A1 (ja) 2011-08-04
JP2024105708A (ja) 2024-08-06
RU2571225C2 (ru) 2015-12-20
KR102051275B1 (ko) 2019-12-04
CA2721052C (en) 2023-02-21
KR20190140100A (ko) 2019-12-18
KR102269708B1 (ko) 2021-06-25
NZ588507A (en) 2012-11-30
CO6311005A2 (es) 2011-08-22
MX2010011184A (es) 2011-01-20
TW202241961A (zh) 2022-11-01
IL259956B (en) 2020-11-30
IL237599A0 (en) 2015-04-30
JP6082447B2 (ja) 2017-02-15
JP7366312B2 (ja) 2023-10-20
HUE037386T2 (hu) 2018-08-28
TW201000127A (en) 2010-01-01
ES2563483T3 (es) 2016-03-15
BRPI0911431B8 (pt) 2021-05-25
CR11783A (es) 2010-12-09
TW202043265A (zh) 2020-12-01
TW201641514A (zh) 2016-12-01
DK2708559T3 (en) 2018-06-14
KR20220162801A (ko) 2022-12-08
IL237599B (en) 2018-10-31
TW201920257A (zh) 2019-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA121453C2 (uk) Спосіб одержання фармацевтичної композиції, яка містить антитіло
TWI845803B (zh) 抗ｃｃｒ８抗體及其用途
RU2760334C2 (ru) Моноклональные антитела к альфа-синуклеину для предотвращения агрегации тау-белка
CN110462038A (zh) 抗gprc5d抗体和包含所述抗体的分子
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
UA124734C2 (uk) Антитіло проти с5 і його застосування
US8318167B2 (en) Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of BMP-6
CN109563169A (zh) 抗hla-g特异性抗体
UA126806C2 (uk) АНТИТІЛО ДО БЕТА-АМІЛОЇДНОГО ПЕПТИДУ N3pGlu ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
UA123862C2 (uk) Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування
UA119570C2 (uk) Анти-ctla4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, фармацевтична композиція і їх застосування
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
UA123695C2 (uk) Епітоп склеростину, антитіло, яке зв'язує склеростин, та застосування такого антитіла для лікування захворювання, опосередкованого склеростином
CN107207591A (zh) 血脑屏障受体抗体及使用方法
UA127308C2 (uk) Активована протеазою біспецифічна молекула, яка зв'язує т-клітини
KR20190028436A (ko) 과인산화된 타우에 특이적인 항체 및 이의 사용 방법
UA125757C2 (uk) Антитіло до par2 і його застосування
CN103732623A (zh) 对TGF-β具有特异性的抗体
US20180193440A1 (en) Immunogenic compositions and expression systems
JP7328983B2 (ja) 抗ｉｌ－２７抗体及びその使用
CA2810171A1 (fr) Anticorps se liant a l'adrenomedulline et aux recepteurs de l'adrenomedulline et leurs utilisations comme medicament
CN108430455A (zh) 色氨酸衍生物用于蛋白质配制剂的用途
CN113508140A (zh) 与切断型的突变型Calreticulin结合的抗体以及骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防或治疗药
WO2016002820A1 (ja) 新規抗ヒトｏｘ４０リガンド抗体、及びこれを含む抗インフルエンザ薬
US20140199314A1 (en) Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6