BRPI0911431B1

BRPI0911431B1 - Composição farmacêutica compreendendo um antígeno e método para aumentar o número de antígenos que podem ser ligados por um anticorpo

Info

Publication number: BRPI0911431B1
Application number: BRPI0911431-9A
Authority: BR
Inventors: Atsuhiko Maeda; Takashi Nakai; Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2021-05-11
Also published as: EP3514180B1; EP2708558A3; CR20150656A; TR201808046T4; DK2708559T3; TWI700293B; TR201808535T4; IL237599A0; PH12014502054A1; JP7177808B2; NZ602884A; CN107469077A; JP4954326B2; TWI818604B; US20210079379A1; EP2275443A4; EP2275443A1; TW201000127A; DK2708558T3; SI2708559T1

Abstract

moléculas de ligação ao antígeno que se ligam repetidamente a várias moléculas de antígeno. a presente invenção refere-se a anticorpos que possuem atividade de ligação ao antígeno mais fraca no ph endossômico inicial em comparação com aquela no ph do plasma são capazes de se ligar a várias moléculas de antígeno com uma única molécula de anticorpo, possuem meias-vidas lonas no plasma, e têm durações de tempo aumentadas nas quais podem se ligar ao antígeno.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se aos métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antígeno e métodos para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno de moléculas de ligação ao antígeno, bem como moléculas de ligação ao antígeno que possuem farmacocinética aprimorada, moléculas de ligação ao antígeno que possuem número de vezes de ligação ao antígeno aumentado e métodos para a produção destas moléculas.

Antecedentes da Técnica

[0002] Anticorpos atraem cada vez mais atenção como substâncias farmacêuticas, na medida em que são altamente estáveis no plasma e possuem poucos efeitos adversos. No momento, várias substâncias farmacêuticas de anticorpo do tipo IgG estão disponíveis no mercado e muitas outras substâncias farmacêuticas de anticorpo estão atualmente em desenvolvimento (Documentos não patente 1 e 2). Por outro lado, foram desenvolvidas várias tecnologias aplicáveis às substâncias farmacêuticas de anticorpo de segunda geração, incluindo aquelas que aumentam a função efetora, habilidade de ligação ao antígeno, farmacocinética e estabilidade, e aquelas que reduzem o risco de imunogenicidade (Documento não patente 3). Em geral, a dose necessária de uma substância farmacêutica de anticorpo é muito alta. Isso, por sua vez, causou problemas, por exemplo, alto custo de produção, além da dificuldade na produção de formulações subcutâneas. Na teoria, a dose de uma substância farmacêutica de anticorpo pode ser reduzida aprimorando-se a farmacocinética do anticorpo ou aumentando-se a afinidade entre anticorpos e antígenos.

[0003] Há relatos na literatura de métodos para o aprimoramento da farmacocinética do anticorpo usando substituição artificial de aminoácidos em regiões constantes (Documentos não patente 4 e 5). Similarmente, a maturação da afinidade foi relatada como uma tecnologia para o aumento da habilidade de ligação ao antígeno ou da atividade de neutralização de antígeno (Documento não patente 6). Essa tecnologia permite o aumento da atividade de ligação ao antígeno por introdução de mutações de aminoácidos na região CDR de uma região variável ou similar. O aumento da habilidade de ligação ao antígeno permite o aumento da atividade biológica in vitro ou a redução da dosagem, e ainda permite o aumento da eficácia in vivo (Documento não patente 7).

[0004] A capacidade de neutralização de antígeno de uma única molécula de anticorpo depende de sua afinidade. Aumentando-se a afinidade, um antígeno poderá ser neutralizado por uma quantidade menor de um anticorpo. Vários métodos podem ser usados para aumentar a afinidade do anticorpo. Além disso, caso a afinidade pudesse se tornar infinita por ligação covalente do anticorpo ao antígeno, uma única molécula de anticorpo poderia neutralizar uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente pode neutralizar duas moléculas de antígeno). No entanto, a neutralização estequiométrica de um anticorpo contra um antígeno (um anticorpo divalente contra dois antígenos) é o limite dos métodos preexistentes e, dessa forma, é impossível neutralizar completamente um antígeno com uma quantidade menor de anticorpo do que a quantidade de antígeno. Em outras palavras, o efeito de aumento da afinidade possui um limite (Documento não patente 9). Para prolongar o efeito de neutralização de um anticorpo neutralizante por algum período, o anticorpo deve ser administrado em uma dose maior do que a quantidade de antígeno produzida no corpo durante o mesmo período. Com o aprimoramento da farmacocinética do anticorpo ou com a tecnologia de maturação da afinidade isoladamente descrita acima há, dessa forma, uma limitação na redução da dose de anticorpo necessária.

[0005] Consequentemente, a fim de sustentar o efeito de neutral- zação de antígeno do anticorpo por um período-alvo com uma quantidade menor do anticorpo do que a quantidade de antígeno, um único anticorpo deve neutralizar múltiplos antígenos. Métodos para a neutralização de vários antígenos com um único anticorpo incluem a inativação de antígeno usando anticorpos catalíticos, que são anticorpos que possuem uma função catalítica. Quando o antígeno é uma proteína, ele pode ser inativado por hidrólise de suas ligações peptídicas. Um anticorpo pode neutralizar repetidamente antígenos por catalização dessa hidrólise (Documento não patente 8). Há muitos relatos prévios publicados sobre anticorpos catalíticos e tecnologias para a sua produção. No entanto, não há relatos de anticorpos catalíticos que possuam atividade catalítica suficiente como um agente farmacêutico. Especificamente, em um estudo de anticorpo in vivo para certo antígeno, não há publicação de anticorpos catalíticos que possam produzir um efeito comparável ou mais forte mesmo em doses baixas ou que produzam um efeito mais prolongado na mesma dose, comparado com um anticorpo neutralizante não catalítico comum.

[0006] Como descrito acima, não há relatos de anticorpos que possam produzir um efeito in vivo superior ao produzido por anticorpos neutralizantes comuns por meio de um único anticorpo que neutraliza várias moléculas de antígeno. Dessa forma, do ponto de vista da redução da dose e do prolongamento da durabilidade, há necessidade de novas tecnologias que permitam a produção de novas moléculas de anticorpo que possuam um efeito in vivo mais forte do que os anticorpos neutralizantes comuns por neutralização individual de várias moléculas de antígeno.

[0007] Serão mostrados abaixo documentos da técnica estabele cida relacionados à presente invenção: [Documentos da técnica estabelecida] [Documentos não patente] Documento não patente 1: "Monoclonal antibody successes in the clinic". Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Paden e Matthew C. Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1.073-1.078 (2005). Documento não patente 2: Pavlou A.K., Belsey M.J. "The therapeutic antibodies market to 2008". Eur. J. Pharm. Biopharm. Abril de 2005; 59(3): 389-96. Documento não patente 3: Kim S.J., Park Y., Hong H.J. "Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies". Mol. Cells. 31 de agosto de 2005; 20(1): 17-29, Revisão. Documento não patente 4: Hinton P.R., Xiong J.M., Johlfs M.G., Tang M.T., Keller S., Tsurushita N. "An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life". J. Immunol. 1° de janeiro de 2006; 176 (1): 346-56. Documento não patente 5: Metre V., Popov S., Borvak J., Rada C., Matesoi D., Medesan C., Ober R.J., Ward E.S. "Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis". Nat. Biotechnol. Julho de 1997; 15(7): 637-40. Documento não patente 6: Rajpal A., Beyaz N., Haber L, Cappuccilli O., Yee H., Bhatt R.R., Takeuchi T., Lamer R.A., Crea R. "A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 14 de junho de 2005; 102(24): 8.466-71. Epub 6 de junho de 2005. Documento não patente 7: Wu H., Pfarr D.S., Johnson S., Brewah Y.A., Woods R.M., Patel N.K., White W.I., Young J.F., Diener P.A. "Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract". J. Mol. Biol. 2007, 368, 652-665. Documento não patente 8: Hanson C.V., Nishiyama Y., Paul S. "Catalytic antibodies and their applications". Curr. Opin. Biotechnol. Dezembro de 2005; 16(6): 631-6. Documento não patente 9: Rathanaswami P., Roalstad S., Roskos L., Su Q.J., Lackie S., Babcook J. "Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8". Biochem Biophys Res Commun. 9 de setembro de 2005; 334(4): 1.004-13.

Sumário da invenção [Problemas a serem solucionados pela invenção]

[0008] As circunstâncias observadas acima levaram às descobertas da presente invenção. Consequentemente, um objetivo da presente invenção é o fornecimento de métodos para a ligação de moléculas de ligação aos antígenos várias vezes e métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antígeno, bem como moléculas de ligação ao antígeno que sejam capazes de se ligar aos antígenos várias vezes, moléculas de ligação ao antígeno que possuam farmacocinética aprimorada, composições farmacêuticas que contenham estas moléculas de ligação ao antígeno, e métodos para a produção destas moléculas e composições.

[Meios para a Solução dos Problemas]

[0009] Foram aqui realizados estudos dedicados sobre os métodos para a ligação de polipeptídeos que possuem habilidade de ligação ao antígeno, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno, aos antígenos várias vezes, e métodos para o aumento das meias-vidas destas moléculas no plasma (sangue) (aprimoramento de sua fármaco- cinética). Como resultado, foi descoberto que se a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno no pH endossômico inicial for menor do que sua atividade de ligação ao antígeno no pH do plasma (sangue), ela seria capaz de se ligar aos antígenos várias vezes e ter uma meia-vida plasmática mais longa.

[00010] Consequentemente, a presente invenção está relacionada aos métodos para a ligação de moléculas de ligação aos antígenos várias vezes, métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antígeno e aos métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno com farmacocinética aprimorada; a presente invenção também está relacionada às moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se ligar aos antígenos várias vezes e às moléculas de ligação ao antígeno com farmacocinética aprimorada. Mais especificamente, a presente invenção fornece: [1] uma molécula de ligação ao antígeno que possui o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), definido como a proporção da KD para o antígeno em pH 5,8 e a KD para o antígeno em pH 7,4, de 2 ou maior, [2] a molécula de ligação ao antígeno de [1], em que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 10 ou maior; [3] a molécula de ligação ao antígeno de [1], em que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 40 ou maior; [4] a molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [3], em que pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno foi substituído com histidina, ou pelo menos uma histidina foi inserida na molécula de ligação ao antígeno; [5] a molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [4], em que a molécula de ligação ao antígeno possui uma atividade antagonística; [6] a molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [5], em que a molécula de ligação ao antígeno se liga a um antígeno da membrana ou a um antígeno solúvel; [7] a molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [6], em que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo; [8] uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antígeno de qualquer um de [1] a [7]; [9] um método para o aprimoramento da farmacocinética de uma molécula de ligação ao antígeno por diminuição da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4; [10] um método para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno para uma molécula de ligação ao antígeno por diminuição da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4; [11] um método para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno por diminuição da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4; [12] um método para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente por diminuição da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4; [13] um método para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula por diminuição da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4; [14] um método para o aumento da habilidade de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar um antígeno no plasma por diminuição da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4; [15] o método de qualquer um de [9] a [14], em que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), definido como a proporção da KD para o antígeno em pH 5,8 e a KD para o antígeno em pH 7,4, é de 2 ou maior; [16] o método de qualquer um de [9] a [14], em que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 10 ou maior; [17] o método de qualquer um de [9] a [14], em que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 40 ou maior; [18] um método para o aprimoramento da farmacocinética de uma molécula de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno com histidina, ou inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; [19] um método para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno para uma molécula de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno com histidina, ou inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; [20] um método para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno com histidina, ou inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; [21] um método para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente por substituição de pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno com histidina, ou inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; [22] um método para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula, por substituição de pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno com histidina, ou inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; [23] um método para o aumento da habilidade de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar um antígeno no plasma por substituição de pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno com histidina, ou inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; [24] o método de qualquer um de [18] a [23], em que a substituição ou inserção de histidina aumenta o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), definido como a proporção da atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 e a atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4, quando comparada com o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) antes da substituição ou da inserção de histidina; [25] o método de qualquer um de [9] a [24], em que a molécula de ligação ao antígeno possui uma atividade antagonística; [26] o método de qualquer um de [9] a [25], em que a molécula de ligação ao antígeno se liga a um antígeno da membrana ou a um antígeno solúvel; [27] o método de qualquer um de [9] a [26], em que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo; [28] um método de avaliação de uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de: (a) determinação da atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0; (b) determinação da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5; e (c) seleção de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é maior do que a atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5; [29] o método de avaliação de [28], que compreende a etapa de seleção de um anticorpo cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é duas vezes ou maior do que a atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5; [30] um método de avaliação de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a um antígeno sob uma condição de pH 6,7 ao pH 10,0; (b) colocação da molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno de (a) sob uma condição de pH 4,0 ao pH 6,5; e (c) obtenção de uma molécula de ligação ao antígeno que se dissociou sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; [31] um método de avaliação de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreende as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma coluna com antígeno imobilizado sob a condição de um primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno que se ligou à coluna no primeiro pH da coluna sob a condição de um segundo pH; e (c) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído; [32] um método de avaliação de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreende as etapas de: (a) ligação de uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno a uma coluna com antígeno imobilizado sob a condição de um primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno da coluna sob a condição de um segundo pH; (c) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno eluído; e (d) obtenção da molécula de ligação ao antígeno eluído. [33] o método de avaliação de [31] ou [32], em que o primeiro pH é 6,7 a 10,0 e o segundo pH é 4,0 a 6,5; [34] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [33], em que pelo menos um ou mais aminoácidos da molécula de ligação ao antígeno foram substituídos com histidina, ou pelo menos uma histidina foi inserida na molécula de ligação ao antígeno; [35] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [33], para obtenção de uma molécula de ligação ao antígeno que seja superior em termos de retenção no plasma; [36] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [33], para obtenção de uma molécula de ligação ao antígeno que seja capaz de se ligar a um antígeno duas ou mais vezes; [37] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [33], para obtenção de uma molécula de ligação ao antígeno que seja capaz de se ligar a mais antígenos, quando comparado com seu número de sítios de ligação ao antígeno; [38] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [33], para obtenção de uma molécula de ligação ao antígeno que se dissocia de um antígeno ligado extracelularmente dentro de uma célula. [39] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [33], para obtenção de uma molécula de ligação ao antígeno que seja ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, e liberada fora da célula em uma forma livre de antígeno; [40] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [33], para obtenção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui habilidade aumentada para eliminar um antígeno no plasma; [41] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [40], em que a molécula de ligação ao antígeno é usada como uma composição farmacêutica; [42] o método de avaliação de qualquer um de [28] a [41], em que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo; [43] um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de: (a) determinação da atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0; (b) determinação da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5; (c) seleção da molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é maior do que em pH 4,0 ao pH 6,5; (d) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno selecionado em (c); e (e) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (d); [44] um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a um antígeno sob uma condição de pH 6,7 ao pH 10,0; (b) permissão de que a molécula de ligação ao antígeno ligada ao antígeno de (a) permaneça sob uma condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (c) coleta da molécula de ligação ao antígeno que se dissociou sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (d) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno obtida em (c); e 10 (e) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (d); [45] um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreende as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma coluna com antígeno imobilizado sob a condição do primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno, que está ligada à coluna no primeiro pH, da coluna sob a condição de um segundo pH; (c) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído; (d) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno obtida em (c); e (e) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (d); [46] um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreende as etapas de: (a) ligação de uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno a uma coluna com antígeno imobilizado sob a condição do primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno da coluna sob a condição do segundo pH; (c) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno eluído; (d) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído; (e) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno coletada em (d); e (f) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (o); [47] o método de produção de [45] ou [46], em que o primeiro pH é 6,7 a 10,0 e o segundo pH é 4,0 a 6,5. [48] o método de produção de qualquer um de [43] a [47], que ainda compreende a etapa de substituição de pelo menos um aminoácido da molécula de ligação ao antígeno com histidina, ou a inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno; [49] o método de produção de qualquer um de [43] a [48], em que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo; [50] uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno produzida pelo método de produção de qualquer um de [43] a [49].

[Efeitos da invenção]

[00011] A presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno únicas que se ligam repetidamente a várias moléculas de antígeno. Quando uma molécula de ligação ao antígeno se liga a várias moléculas de antígeno, a farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno pode ser aprimorada e essa molécula pode exercer efeitos in vivo superiores àqueles de moléculas de ligação ao antígeno comuns.

Breve Descrição dos Desenhos

[00012] A figura 1 é um diagrama que representa uma via de degradação de anticorpos ligados a um antígeno ligado à membrana.

[00013] A figura 2 é um diagrama que representa um mecanismo pelo qual moléculas de IgG são resgatadas por FcRn.

[00014] A figura 3 é um diagrama esquemático que representa a religação de moléculas de IgG a um novo antígeno após dissociação de um antígeno ligado à membrana dentro de endossomos.

[00015] A figura 4 é um diagrama esquemático que representa a religação de moléculas de IgG a um novo antígeno após dissociação de um antígeno solúvel dentro de endossomos.

[00016] A figura 5 é um diagrama que representa o processo de panning usando uma coluna com antígeno imobilizado.

[00017] A figura 6 apresenta gráficos que descrevem os resultados de ELISA de fago para clones adquiridos por panning de coluna. O gráfico superior representa WT e o gráfico inferior representa CL5.

[00018] A figura 7 é um gráfico que representa a atividade biológica de neutralização de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente.

[00019] A figura 8 apresenta gráficos que descrevem resultados de sensorgrama por Biacore para a ligação de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente ao receptor de IL-6 solúvel em pH 7,4. O gráfico superior representa WT; o segundo gráfico de cima representa H3pI/L73; o terceiro gráfico de cima representa H170/L82; e o inferior representa CLH5/L73.

[00020] A figura 9 apresenta gráficos que descrevem os resultados de um sensorgrama por Biacore para a ligação de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente ao receptor de IL-6 solúvel em pH 5,8. O gráfico superior representa WT; o segundo gráfico de cima representa H3pI/L73; o terceiro gráfico de cima representa H170/L82, e o gráfico inferior representa CLH5/L73.

[00021] O figura 10 apresenta gráficos que descrevem resultados de sensorgrama por Biacore para a associação (pH 7,4) e a dissociação (pH 5,8) de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH- dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana. O gráfico superior representa WT; o segundo gráfico de cima representa H3pI/L73; o terceiro gráfico de cima representa H170/L82; e o gráfico inferior representa CLH5/L73.

[00022] A figura 11 é um sensorgrama por Biacore que indica a ligação repetida de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente ao SR344.

[00023] A figura 12 é um gráfico que representa a quantidade total de antígeno ligado em um experimento de ligação repetitiva de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente ao SR344.

[00024] A figura 13 é um gráfico que representa a evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de anticorpo de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente em camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana.

[00025] A figura 14 é um gráfico que representa a evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de anticorpo de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente em macacos Cynomolgus.

[00026] A figura 15 é um gráfico que representa a evolução com o tempo das concentrações de CRP em macacos Cynomolgus, em relação aos anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH- dependente.

[00027] A figura 16 é um gráfico que representa a evolução com o tempo das concentrações de receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus do tipo não ligado em macacos Cynomolgus, em relação aos anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente.

[00028] A figura 17 apresenta gráficos que descrevem resultados de um sensorgrama por Biacore da associação (pH 7,4) e da dissociação (pH 5,8) de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH- dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana. Em ordem a partir da parte superior, são mostrados os resultados para WT, H3pI/L73- IgG1, Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1.

[00029] A figura 18 é um gráfico que representa a evolução com o tempo de plasma anticorpo concentrações de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente (WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2- IgG1 e Fv4-IgG1) em camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana.

[00030] A figura 19 apresenta gráficos que descrevem resultados de sensorgrama por Biacore para a associação (pH 7,4) e a dissociação (pH 5,8) de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH- dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana. A partir da parte superior para a inferior, são mostrados os resultados para WT, Fv4- IgG1, Fv4-IgG2 e Fv4-M58.

[00031] A figura 20 é um gráfico que mostra a evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de anticorpo de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente (WT, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2 e Fv4-M58) em camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana.

[00032] A figura 21 apresenta gráficos que descrevem resultados de sensorgrama por Biacore da associação (pH 7,4) e da dissociação (pH 5,8) de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH- dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana. A partir da parte superior para a inferior, são mostrados os resultados para Fv1-M71, Fv1-M73, Fv3-M71 e Fv3-M73.

[00033] A figura 22 é um gráfico que representa a evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de anticorpo de anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente em macacos Cynomolgus, durante administração de H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1- M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73 e Fv4-M73 a 0,5 mg/kg e durante administração de Ab de alta afinidade a 1,0 mg/kg.

[00034] A figura 23 é um gráfico que representa a evolução com o tempo das concentrações de CRP em macacos Cynomolgus, em relação aos anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH- dependente (grupos que receberam a administração de H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73 e Ab de alta afinidade).

[00035] A figura 24 é um gráfico que representa a evolução com o tempo das concentrações de receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus do tipo não ligado em macacos Cynomolgus, em relação aos anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente (grupos que receberam a administração de H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2- IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73, e Ab de alta afinidade).

[00036] A figura 25 é um diagrama que representa FR1, FR2, FR3 e FR4, juntamente com CDR1, CDR2 e CDR3 das cadeias pesadas (VH1, VH2, VH3, VH4) e das cadeias leves (VL1, VL2, VL3). Os asteriscos indicam localizações onde existem mutações de aminoácidos nas sequências alinhadas.

[00037] A figura 26 apresenta um sensorgrama por Biacore que representa a ligação pH-dependente de um anticorpo anti-IL-6, clone anti-IL6 2, à IL-6 em pH 7,4 e pH 5,5. As curvas no sensorgrama em pH 7,4 correspondem a 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 ng/ml de IL-6 dos citados acima.

[00038] A figura 27 apresenta um sensorgrama por Biacore que representa a ligação pH-dependente de um anticorpo antirreceptor de IL-31, clone anti-IL31R 1, ao receptor de IL-31 em pH 7,4 e pH 5,5. As curvas no sensorgrama em pH 5,5 correspondem a 100, 50, 25 e 12,5 ng/ml de receptor de IL-31 dos citados acima,

[00039] A figura 28 representa a evolução com o tempo da concentração plasmática de anticorpo após administração intravenosa de uma solução de mistura contendo SR344 e um anticorpo antirre- ceptor de IL-6 humana para camundongo.

[00040] A figura 29 representa a evolução com o tempo da concentração plasmática de SR344 após administração intravenosa de uma solução de mistura contendo SR344 e um anticorpo antirreceptor de IL-6 humana para camundongo.

Modo para Realizar a Invenção

[00041] A presente invenção fornece métodos para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno em moléculas de ligação ao antígeno. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno em moléculas de ligação ao antígeno por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno em moléculas de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina nas moléculas de ligação ao antígeno ou pela inserção de pelo menos uma histidina nas moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno em moléculas de ligação ao antígeno por substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácidos na região constante de anticorpo de moléculas de ligação ao antígeno.

[00042] A presente invenção também fornece métodos para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina nas moléculas de ligação ao antígeno, ou pela inserção de pelo menos uma histidina nas moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno por meio da substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácidos na região constante de anticorpo de moléculas de ligação ao antígeno.

[00043] A presente invenção também fornece métodos para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Além disso, a presente invenção fornece métodos para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina na molécula de ligação ao antígeno, ou pela inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno. Além disso, a presente invenção fornece métodos para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente por meio da substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácidos na região constante de anticorpo da molécula de ligação ao antígeno.

[00044] A presente invenção também fornece métodos para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula, por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Além disso, a presente invenção fornece métodos para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula, por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina na molécula de ligação ao antígeno ou pela inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno. Além disso, a presente invenção fornece métodos para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula, por meio da substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácidos na região constante de anticorpo da molécula de ligação ao antígeno,

[00045] A presente invenção também fornece métodos para o aumento da habilidade de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para o aumento da habilidade de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento da habilidade de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina nas moléculas de ligação ao antígeno ou pela inserção de pelo menos uma histidina nas moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento da habilidade de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por meio da substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácidos na região constante de anticorpo da molécula de ligação ao antígeno.

[00046] A presente invenção também fornece métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antíge- no. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antígeno (por prolongamento da retenção no plasma) por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina nas moléculas de ligação ao antígeno ou pela inserção de pelo menos uma histidina nas moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antígeno por substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácidos na região constante de anticorpo de moléculas de ligação ao antígeno.

[00047] Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento da habilidade das moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para o aumento da habilidade das moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento da habilidade das moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por substituição de pelo menos um aminoácido nas moléculas de ligação ao antígeno com histidina ou a inserção de pelo menos uma histidina nas moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento da habilidade das moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácidos na região constante de anticorpo de moléculas de ligação ao antígeno.

[00048] Nesse pedido, o termo "aprimoramento da farmacocinética", "melhora da farmacocinética", "farmacocinética superior" são intercam- biáveis com "aprimoramento da retenção no plasma (sangue)", "melhora da retenção no plasma (sangue)" e retenção ''superior no plasma (sangue)", respectivamente, e essas frases são sinônimas.

[00049] Nesse pedido, diminuição da atividade de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro significa que a habilidade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 está diminuída, quando comparada com aquela em pH 6,7 ao pH 10,0, de preferência, que a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 5,5 ao pH 6,5 está diminuída quando comparada com aquela em pH 7,0 ao pH 8,0 e, mais preferivelmente, que a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8 está diminuída quando comparada com aquela em pH 7,4. Consequentemente, na presente invenção, pH ácido é tipicamente pH 4,0 ao pH 6,5, de preferência pH 5,5 ao pH 6,5 e, mais preferivelmente, pH 5,8. Alternativamente, na presente invenção, pH neutro é tipicamente pH 6,7 ao pH 10,0, de preferência pH 7,0 ao pH 8,0 e, mais preferivelmente, pH 7,4.

[00050] Nesse pedido, a frase "diminuição da habilidade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro" é intercambiável com a frase "aumento da habilidade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH neutro, quando comparada com aquela em pH ácido". Em outras palavras, na presente invenção, a diferença na habilidade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno deve ser aumentada entre pHs ácidos e neutros. Por exemplo, o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) deve estar aumentado, como descrito abaixo. A diferença na habilidade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno entre pHs ácidos e neutros pode ser aumentada, por exemplo, por um ou ambos os processos de diminuição da habilidade de ligação ao antígeno em pH ácido e de aumento da habilidade de ligação ao antígeno em pH neutro.

[00051] Outras condições além do pH para determinação da atividade de ligação ao antígeno podem ser selecionadas apropriadamente por aqueles versados na técnica, e as condições não são particularmente limitadas. A atividade de ligação ao antígeno pode ser determinada, por exemplo, sob condições de tampão MES e 37°C, como descritas na seção exemplos"exemplos" deste pedido. Além disso, a atividade de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare) ou similares, como descrito na seção exemplos"exemplos" deste pedido. Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação ao antígeno solúvel poderá ser avaliada por injeção do antígeno como um analito em um chip imobilizado com a molécula de ligação ao antígeno. Alternativamente, quando o antígeno é um antígeno da membrana, a atividade de ligação ao antígeno da membrana poderá ser avaliada por injeção da molécula de ligação ao antígeno como um analito sobre um chip com antígeno imobilizado.

[00052] Na presente invenção, a diferença na atividade de ligação ao antígeno entre pHs ácidos e neutros não é particularmente limitada, desde que a atividade de ligação ao antígeno em pH ácido seja menor do que aquela no pH neutral. No entanto, o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), que é a proporção da constante de dissociação (KD) contra um antígeno em pH 5,8 e aquela em pH 7,4, é preferivelmente 2 ou maior, mais preferivelmente, 10 ou maior e, ainda mais preferivelmente, 40 ou maior. O limite superior pode ser qualquer valor, por exemplo, 400, 1.000, ou 10.000, desde que a molécula possa ser produzida por tecnologias conhecidas por aqueles versados na técnica. Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação ao antígeno poderá ser apresentada em termos da constante de dissociação (KD). Alternativamente, quando o antígeno é um antígeno da membrana, a atividade de ligação ao antígeno poderá ser apresentada em termos da constante de dissociação aparente. A constante de dissociação (KD) e a constante de dissociação aparente (KD aparente) podem ser determinadas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, com o uso de Biacore (GE Healthcare), Scatchard plot ou FACS.

[00053] Alternativamente, é possível usar, por exemplo, kd, uma constante da taxa de dissociação, como um indicador para a diferença na atividade de ligação ao antígeno entre pHs ácidos e neutros. Quando a constante da taxa de dissociação (kd) é usada como um indicador para a diferença na atividade de ligação em vez da constante de dissociação (KD), o valor de kd (pH 5,8)/kd (pH 7,4), que é uma proporção de constante da taxa de dissociação (kd) contra um antígeno em pH 5,8 e aquela em pH 7,4, é preferivelmente 2 ou maior, mais preferivelmente, 5 ou maior, ainda mais preferivelmente, 10 ou maior e, ainda mais preferivelmente, 30 ou maior. O limite superior do valor de kd (pH 5,8)/kd (pH 7,4) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor, por exemplo, 50, 100 ou 200, desde que a molécula possa ser produzida por tecnologias comuns conhecidas por aqueles versados na técnica.

[00054] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação ao antígeno poderá ser apresentada em termos da constante da taxa de dissociação (kd). Alternativamente, quando o antígeno é um antígeno da membrana, a atividade de ligação ao antígeno poderá ser apresentada em termos da constante da taxa de dissociação aparente. A constante da taxa de dissociação (kd) e a constante da taxa de dissociação aparente (kd aparente) podem ser determinadas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, com o uso de Biacore (GE Healthcare) ou FACS.

[00055] Na presente invenção, quando a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno é determinada em pHs diferentes, prefere-se que as condições da medida, exceto o pH, sejam constantes.

[00056] Os métodos para diminuição da atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4 (métodos para a fornecimento da habilidade de ligação pH-dependente) não são particularmente limitados, e podem ser qualquer método. Esses métodos incluem, por exemplo, métodos para diminuição da atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4, por substituição de aminoácidos por histidina na molécula de ligação ao antígeno ou por inserção de histidina na molécula de ligação ao antígeno. Já se sabe que um anticorpo pode receber uma atividade de ligação ao antígeno pH-dependente por substituição de aminoácidos por histidina no anticorpo (FEBS Letter, 309(1), 8.588 (1992)). Esses sítios de mutação (substituição) ou inserção de histidina não são particularmente limitados, e qualquer sítio é aceitável, desde que a atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 seja reduzida em relação àquela em pH 7,4 (o valor de KD (pH 5,8)/KD (KD 7,4) fica maior), quando comparado com antes da mutação ou inserção. Quando a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo, esses sítios incluem, por exemplo, sítios dentro de uma região variável de anticorpo. O número apropriado de sítios de mutação ou de inserção de histidina pode ser determinado adequadamente por aqueles versados na técnica. A histidina pode ser substituída ou inserida em um único sítio, ou em dois ou mais sítios. Também é possível introduzir uma mutação não histidina (mutação com aminoácidos diferentes de histidina) ao mesmo tempo. Além disso, a mutação de histidina pode ser introduzida simultaneamente com inserção de histidina. É possível substituir ou inserir histidina aleatoriamente usando um método como, por exemplo, varredura de histidina, que utiliza histidina ao invés de alanina na varredura de alanina conhecida por aqueles versados na técnica. Alternativamente, as moléculas de ligação ao antígeno cujo valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) está aumentado, quando comparado com antes da mutação, podem ser selecionadas de uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno com mutação ou inserção aleatória de histidina.

[00057] Quando histidina substitui aminoácidos de uma molécula de ligação ao antígeno ou é inserida entre aminoácidos da molécula, prefere-se, mas não necessariamente, que a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 7,4 após substituição ou inserção de histidina seja comparável com aquela em pH 7,4 antes da substituição ou da inserção de histidina. A "atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 7,4 após substituição ou inserção de histidina é comparável com aquela em pH 7,4 antes da substituição ou da inserção de histidina" significa que, mesmo após substituição ou inserção de histidina, a molécula de ligação ao antígeno retém 10% ou mais, de preferência 50% ou mais, mais preferivelmente, 80% ou mais e, ainda mais preferivelmente, 90% ou mais da atividade de ligação ao antígeno de antes da substituição ou da inserção de histidina. Quando a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno foi diminuída em função da substituição ou da inserção de histidina, a atividade de ligação ao antígeno poderá ser ajustada por introdução de substituição, eliminação, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na molécula de ligação ao antígeno, de tal modo que a atividade de ligação ao antígeno se torne comparável com aquela antes da substituição ou da inserção de histidina.

[00058] A presente invenção também inclui essas moléculas de ligação ao antígeno que possuem uma atividade de ligação comparável em consequência de substituição, eliminação, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos após substituição ou inserção de histidina.

[00059] Métodos alternativos para diminuição da atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4 incluem métodos de substituição de aminoácidos não naturais para aminoácidos em uma molécula de ligação ao antígeno, ou a inserção de aminoácidos não naturais em aminoácidos de uma molécula de ligação ao antígeno. Sabe-se que a pKa pode ser artificialmente controlada com o uso de aminoácidos não naturais (Angew. Chem. Int., Ed. 2005, 44, 34; Chem. Soc. Rev. Setembro de 2004 10: 33(7): 422-30; Amino Acids, 1999; 16 (3-4): 34579). Dessa forma, na presente invenção, podem ser usados aminoácidos não naturais ao invés da histidina descrita acima. Essa substituição e/ou inserção de aminoácido não natural pode ser introduzida simultaneamente com a substituição e/ou inserção de histidina descrita acima. Quaisquer aminoácidos não naturais podem ser usados na presente invenção. É possível usar aminoácidos não naturais conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00060] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno é uma substância que possui uma região constante de anticorpo, métodos alternativos para diminuição da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 5,8, quando comparada com aquela em pH 7,4 incluem métodos para modificação da região constante de anticorpo contida na molécula de ligação ao antígeno. Esses métodos para modificação da região constante de anticorpo incluem, por exemplo, métodos para substituição de uma região constante descrita na seção exemplos"exemplos" deste pedido.

[00061] Métodos alternativos para modificação da região constante de anticorpo incluem, por exemplo, métodos para avaliar vários isótipos da região constante (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e selecionar um isótipo que diminua a atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 (que aumente a taxa de dissociação em pH 5,8). Alternativamente, os métodos incluem aqueles para a diminuição da atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 (por aumento da taxa de dissociação em pH 5,8) por substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos de um isótipo do tipo selvagem (a sequência de aminoácidos de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 do tipo selvagem). A sequência da região de dobradiça de uma região constante de anticorpo é consideravelmente diferente entre os isótipos (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), e a diferença na sequência de aminoácidos da região de dobradiça possui um grande impacto sobre a atividade de ligação ao antígeno. Dessa forma, é possível selecionar um isótipo apropriado para diminuir a atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 (para aumentar a taxa de dissociação em pH 5,8) considerando-se o tipo de antígeno ou epitopo. Além disso, na medida em que a diferença na sequência de aminoácidos da região de dobradiça possui uma influência significativa sobre a atividade de ligação ao antígeno, sítios de substituição de aminoácido na sequência de aminoácidos preferidos de um isótipo do tipo selvagem presumívelmente estão dentro da região de dobradiça.

[00062] Quando a atividade de ligação ao antígeno da substância de ligação ao antígeno em pH 5,8 está enfraquecida comparada com aquela em pH 7,4 (quando o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) está aumentado) pelos métodos descritos acima e outros, é geralmente preferível que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) seja duas vezes ou mais, mais preferivelmente, cinco vezes ou mais e, ainda mais preferivelmente, dez vezes ou mais, quando comparado com aquele do anticorpo original, embora a invenção não seja particularmente limitada a esse valor.

[00063] Nesse pedido, o termo "aprimoramento da farmacocinética" significa prolongamento do tempo necessário para a eliminação da molécula de ligação ao antígeno do plasma (por exemplo, para alcançar o estágio em que a molécula de ligação ao antígeno não pode retornar ao plasma em função da degradação em células, ou por outras razões) após administração a um animal como, por exemplo, um ser humano, camundongo, rato, macaco, coelho ou cão, bem como o prolongamento do tempo de retenção plasmática da molécula de ligação ao antígeno que está em uma forma capaz de se ligar aos antígenos (por exemplo, que está em uma forma livre de antígeno) durante o período até que seja eliminado do plasma após administração. Até mesmo se uma molécula de ligação ao antígeno é circulada no plasma, ela não pode se ligar a um antígeno quando ele já se ligou a outro antígeno. Consequentemente, o período pelo qual a molécula de ligação ao antígeno pode se ligar recentemente a outro antígeno é prolongado (a probabilidade de se ligar a outro antígeno aumenta) por prolongamento do período em que a molécula de ligação ao antígeno está em uma forma livre de antígeno. Isso torna possível encurtar o período pelo qual o antígeno está livre de moléculas de ligação ao antígeno in vivo (em outras palavras, prolongar o período em que o antígeno está ligado por uma molécula de ligação ao antígeno). Por exemplo, a proporção de antígenos ligados às moléculas de ligação ao antígeno contra os antígenos no corpo no plasma (total de moléculas de antígeno ligadas e livres das moléculas de ligação ao antígeno) geralmente diminui em certo período de tempo após a administração das moléculas de ligação ao antígeno. No entanto, essa diminuição pode ser suprimida (por exemplo, o grau de diminuição pode ser diminuído) por prolongamento do tempo de retenção das moléculas de ligação ao antígeno em uma forma capaz de ligação aos antígenos. Isso resulta em um aumento na proporção de antígenos ligados às moléculas de ligação ao antígeno contra os antígenos no corpo em certo período de tempo após administração do anticorpo.

[00064] Especificamente, na presente invenção, o termo "aprimoramento da farmacocinética" não significa necessariamente o prolongamento (extensão) do tempo necessário para a eliminação da molécula de ligação ao antígeno após a administração. Até mesmo se o tempo necessário para a eliminação da molécula de ligação ao antígeno após administração permanecer inalterado, a farmacocinética poderá ser considerada "aprimorada" na presente invenção se: - o tempo de retenção plasmática da molécula de ligação ao antígeno que está em uma forma capaz de ligação a um antígeno (por exemplo, a molécula de ligação ao antígeno que está em uma forma livre de antígeno) estiver prolongado; - o período em que o antígeno está livre de uma molécula de ligação ao antígeno no corpo estiver encurtado (em outras palavras, o período em que a molécula de ligação ao antígeno está ligada a um antígeno está prolongado); e - a proporção de antígenos ligados às moléculas de ligação ao antígeno contra os antígenos no corpo estiver aumentada. Dessa forma, na presente invenção, o "aprimoramento da farmacocinética" engloba pelo menos: (1) prolongamento de tempo necessário para a eliminação da molécula de ligação ao antígeno do plasma após administração da molécula de ligação ao antígeno; (2) prolongamento do tempo de retenção plasmática da molécula de ligação ao antígeno em uma forma capaz de ligação a um antígeno após administração da molécula de ligação ao antígeno; (3) encurtamento do período em que o antígeno está livre de uma molécula de ligação ao antígeno no corpo após administração da molécula de ligação ao antígeno (prolongamento do período em que a molécula de ligação ao antígeno está ligada a um antígeno no corpo); e (4) aumento na proporção de antígenos ligados às moléculas de ligação ao antígeno ao antígeno no corpo.

[00065] Quando o antígeno é um antígeno solúvel presente no plasma, até mesmo se a farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno (taxa de eliminação do plasma) for equivalente, há casos em que a eliminação de antígeno ligado à molécula de ligação ao antígeno estará acelerada. A redução da farmacocinética do antígeno (aceleração da eliminação do plasma) resulta no aprimoramento relativo da farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno e, dessa forma, leva ao prolongamento do tempo da molécula de ligação ao antígeno presente no plasma em uma forma capaz de ligação aos antígenos. Dessa forma, em uma modalidade, o termo "aprimoramento da farmacocinética" de moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção inclui o aumento da taxa de eliminação de antígenos solúveis do plasma após administração das moléculas de ligação ao antígeno (a habilidade da molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos do plasma).

[00066] Na presente invenção, quando o antígeno é um antígeno da membrana, para se avaliar se uma única molécula de ligação ao antígeno se liga a vários antígenos pode-se testar se farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno está aprimorada. Para avaliar se a "farmacocinética está aprimorada" pode ser utilizado o seguinte método. Por exemplo, para se avaliar se o tempo necessário para a eliminação de uma molécula de ligação ao antígeno após administração pode ser feita a determinação de qualquer um dos parâmetros para a molécula de ligação ao antígeno, por exemplo, a meia-vida plasmática, o tempo médio de retenção plasmática e a depuração plasmática ("Pharmacokinetics: Enshu-niyora Rikai (Understanding through practice)",Nanzando). Por exemplo, quando a meia-vida plasmática ou o tempo médio de retenção plasmática de uma molécula de ligação ao antígeno administrado aos camundongos, ratos, macacos, coelhos, cães, seres humanos ou outros animais está prolongada, a farmacocinética da molécula de ligação ao antígeno é considerada como aprimorada. Esses parâmetros podem ser determinados por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os parâmetros podem ser avaliados apropriadamente por análise não comportamental usando o software de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções em anexo.

[00067] Alternativamente, pode-se avaliar se o tempo de retenção plasmática de uma molécula de ligação ao antígeno em uma forma capaz de se ligar aos antígenos após administração da molécula de ligação ao antígeno está prolongado pela medida da concentração plasmática da molécula de ligação ao antígeno livre de antígeno, e determinando-se qualquer um dos parâmetros para a molécula de ligação ao antígeno livre de antígeno, por exemplo, meia-vida plasmática, tempo médio de retenção plasmática e depuração plasmática. A concentração da molécula de ligação ao antígeno livre de antígeno no plasma pode ser medida por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, essas medidas estão descritas em Clin. Pharmacol. Abril de 2008; 48(4): 406-17.

[00068] Além disso, para avaliar se o período em que um antígeno está livre das moléculas de ligação ao antígeno no corpo após administração das moléculas de ligação ao antígeno está encurtado (o período em que a molécula de ligação ao antígeno está ligada a um antígeno no corpo está prolongado), pode-se determinar a concentração plasmática do antígeno não ligado que está livre de moléculas de ligação ao antígeno, e considerar o período em que a concentração de antígeno livre no plasma ou a proporção da quantidade de antígeno livre contra o antígeno total permanece baixa. A concentração plasmática do antígeno livre ou a proporção da quantidade de antígeno livre contra de antígeno total pode ser determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, essas medidas estão descritas em Pharm. Res. Janeiro de 2006; 23(1): 95-103. Alternativa-mente, quando o antígeno exerce alguma função in vivo, pode-se avaliar se o antígeno está ligado por uma molécula de ligação ao antígeno que neutraliza a função do antígeno (molécula antagonística) testando-se se a função do antígeno está neutralizada. Pode-se avaliar se a função do antígeno está neutralizada testando-se um marcador in vivo que reflete a função do antígeno. Pode-se avaliar se o antígeno está ligado por uma molécula de ligação ao antígeno que ativa a função do antígeno (molécula agonística) testando-se um marcador in vivo que reflete a função do antígeno.

[00069] Não há limitação específica sobre a determinação da concentração plasmática de antígeno livre e da proporção da quantidade de antígeno livre contra antígeno total e ensaio de marcador in vivo, mas a determinação é realizada preferivelmente após algum período após a administração de uma substância de ligação ao antígeno. Na presente invenção, esse período após a administração de uma substância de ligação ao antígeno não é particularmente limitado, e um período adequado pode ser determinado por aqueles versados na técnica, dependendo das propriedades da substância de ligação ao antígeno administrada, e similares. exemplos do período são: um dia após a administração de uma substância de ligação ao antígeno; três dias após a administração de uma substância de ligação ao antígeno, sete dias após a administração de uma substância de ligação ao antígeno, 14 dias após a administração de uma substância de ligação ao antígeno e 28 dias após a administração de uma substância de ligação ao antígeno.

[00070] Na presente invenção, prefere-se aprimorar a farmacoci- nética em um ser humano. Até mesmo quando a retenção plasmática no ser humano é de difícil determinação, ela pode ser prevista com base na retenção plasmática em camundongos (por exemplo, camundongos normais, camundongos transgênicos que expressam antígeno humano e camundongos transgênicos que expressam FcRn humano) ou macacos (por exemplo, macacos Cynomolgus).

[00071] Os métodos para determinação da retenção no plasma não são particularmente limitados. A determinação pode ser realizada, por exemplo, de acordo com os métodos descritos na seção exemplos"exem- plos" deste pedido.

[00072] Para se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno é capaz de se ligar aos antígenos várias vezes pode-se testar se o antígeno ligado a uma molécula de ligação ao antígeno sob a mesma condição neutra que o plasma se dissocia sob a mesma condição ácida que o endossomo, e a quantos antígenos a molécula de ligação ao antígeno pode se religar sob a condição neutra. Especificamente, a avaliação pode ser realizada permitindo-se que a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno formem um complexo sob a condição neutra, expondo-se o complexo a uma condição ácida por um período predeterminado, e depois testando-se se a molécula de ligação ao antígeno pode se religar a um antígeno sob a condição neutra, usando um dispositivo para avaliação de reações da molécula de ligação ao antígeno-antígeno como, por exemplo, Biacore. Quando a capacidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno conferida com a habilidade de ligação pH-dependente foi aumentada duas vezes em relação àquela da molécula de ligação ao antígeno antes da modificação, o número de vezes de ligação da molécula de ligação ao antígeno conferido com a habilidade ligação pH-dependente pode ser considerado como aumentado em até duas vezes em relação àquele da molécula de ligação ao antígeno antes da modificação. Alternativamente, quando o antígeno é um antígeno da membrana e, dessa forma, a molécula de ligação ao antígeno é eliminada do plasma por meio da captação e degradação mediadas por antígeno em um lisossomo, pode ser avaliado se o número de vezes de ligação da molécula de ligação ao antígeno conferido com a habilidade ligação pH-dependente está aumentado, comparado com aquele antes da modificação, por comparação da farmacocinética ou da duração da ligação ao antígeno entre a molécula de ligação ao antígeno conferido com a habilidade de ligação pH-dependente e a molécula de ligação ao antígeno, antes da modificação. Por exemplo, quando a duração da ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno conferida com a habilidade de ligação pH-dependente está prolongada duas vezes em relação àquela da molécula de ligação ao antígeno antes da modificação, o número de vezes de ligações da molécula de ligação ao antígeno conferido com a habilidade de ligação pH-dependente é considerado como estando duas vezes em relação àquele da molécula de ligação ao antígeno antes da modificação. Alternativamente, quando a concentração plasmática de um antígeno não ligado, que está livre da molécula de ligação ao antígeno, é determinada e o período em que a concentração plasmática do antígeno livre ou a proporção da quantidade do antígeno livre contra o antígeno total permanece baixa é prolongado até duas vezes, o número de vezes de ligação da molécula de ligação ao antígeno conferido com a habilidade de ligação pH-dependente é considerado como estando aumentado em até duas vezes em relação àquele da molécula de ligação ao antígeno antes da modificação.

[00073] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, se o antígeno ligado a uma molécula de ligação ao antígeno sob a condição neutra no plasma se dissocia em um endossomo e a molécula de ligação ao antígeno retorna ao plasma, a molécula de ligação ao antígeno pode novamente se ligar a um antígeno sob a condição neutra no plasma. Dessa forma, uma molécula de ligação ao antígeno que possui as características para se dissociar com um antígeno em condição ácida de um endossomo é capaz de ligação aos antígenos várias vezes. Comparado com quando o antígeno ligado a uma molécula de ligação ao antígeno não se dissocia em um endossomo (o antígeno permanece ligado à molécula de ligação ao antígeno quando retorna ao plasma), quando o antígeno ligado a uma molécula de ligação ao antígeno se dissocia em endossomos, o antígeno é liberado a um lisossomo e depois degradado e, dessa forma, a taxa de eliminação do antígeno do plasma aumenta. Ou seja, também é possível determinar se a molécula de ligação ao antígeno é capaz de ligação aos antígenos várias vezes usando a taxa de eliminação de antígeno do plasma como um índice. A taxa de eliminação do antígeno do plasma pode ser determinada, por exemplo, por administração dos antígenos (por exemplo, antígeno da membrana) e moléculas de ligação ao antígeno in vivo, e depois medindo-se a concentração de antígenos no plasma. Quando um antígeno (por exemplo, antígeno da membrana) é produzido ou secretado in vivo, a concentração plasmática de antígeno é reduzida se a taxa de eliminação do antígeno do plasma está aumentada. Dessa forma, também é possível determinar se a molécula de ligação ao antígeno é capaz de ligação aos antígenos várias vezes usando a concentração plasmática de antígeno como um índice.

[00074] Nesse pedido, o termo "aumento do número de vezes de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno" significa que o número de ciclos está aumentado quando se considera como um ciclo o processo em que uma molécula de ligação ao antígeno administrada a um ser humano, camundongo, macaco, ou similares se liga a um antígeno e é internalizada em uma célula. Especificamente, nesse pedido, o termo "molécula de ligação ao antígeno se liga duas vezes a um antígeno" significa que a molécula de ligação ao antígeno ligado a um antígeno é internalizada em uma célula e é liberada em uma forma livre de antígeno para fora da célula, e a molécula de ligação ao antígeno liberada se religa a outro antígeno e é internalizada em uma célula novamente.

[00075] Quando a molécula de ligação ao antígeno é internalizada em uma célula, ela pode estar em uma forma ligada por um único antígeno, ou por dois ou mais antígenos.

[00076] Nesse pedido, o termo "o número de vezes de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno está aumentado" não significa necessariamente que o número de vezes de ligação ao antígeno aumenta em todas as moléculas de ligação ao antígeno. Por exemplo, entre moléculas de ligação ao antígeno em uma composição de molécula de ligação ao antígeno, a proporção de moléculas de ligação ao antígeno que se ligam aos antígenos duas ou mais vezes pode aumentar, ou o número médio de eventos de ligação de moléculas de ligação ao antígeno em uma composição de molécula de ligação ao antígeno pode aumentar.

[00077] Na presente invenção, prefere-se que o número de vezes de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno aumente quando a molécula é administrada a um ser humano. No entanto, quando é difícil determinar o número de vezes de ligação ao antígeno em seres humanos, o número em seres humanos pode ser previsto com base nos resultados obtidos em um ensaio in vitro ou em medidas com a utilização de camundongos (por exemplo, camundongos transgênicos que expressam antígeno e camundongos transgênicos que expressam FcRn humano) ou macacos (por exemplo, macacos Cynomolgus).

[00078] Na presente invenção, prefere-se que uma molécula de ligação ao antígeno se ligue aos antígenos duas ou mais vezes. Por exemplo, prefere-se que, das moléculas de ligação ao antígeno em uma composição de molécula de ligação ao antígeno, pelo menos 10% ou mais, de preferência 30% ou mais, mais preferivelmente, 50% ou mais e, ainda mais preferivelmente, 80% ou mais (por exemplo, 90% ou mais, 95% ou mais, e assim por diante) se liguem aos antígenos duas ou mais vezes.

[00079] Nesse pedido, o termo "quanto do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno" significa o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno durante o período até que a molécula de ligação ao antígeno seja degradada em um lisossomo de uma célula após administração da molécula de ligação ao antígeno a um animal como, por exemplo, um ser humano, camundongo ou macaco.

[00080] Em geral, anticorpos como, por exemplo, IgG, possuem dois domínios de ligação e, dessa forma, um único anticorpo se liga a um máximo de dois antígenos. Um anticorpo ligado ao(s) antígeno(s) é internalizado em uma célula, e o anticorpo e os antígenos são degradados em um lisossomo. Em geral, anticorpos como, por exemplo, IgG, podem se ligar a um máximo de dois antígenos. Quando a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno como, por exemplo, um anticorpo, no pH endossômico está diminuída, quando comparada com aquela no pH do plasma pelos métodos da presente invenção, a molécula de ligação ao antígeno como, por exemplo, um anticorpo, internalizada em uma célula se dissocia do antígeno e é liberada para fora da célula e, dessa forma, pode se ligar a outro antígeno novamente. Em outras palavras, os métodos da presente invenção permitem que uma molécula de ligação ao antígeno se ligue a mais antígenos do que o número de sítios de ligação ao antígeno que possui. Especificamente, pela utilização dos métodos da presente invenção, por exemplo, IgG que possui dois sítios de ligação ao antígeno pode se ligar a três ou mais antígenos, de preferência quatro ou mais antígenos, durante um período até que o anticorpo seja degradado após a administração. Por exemplo, quando o anticorpo é um anticorpo neutralizante, "aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno" é intercambiável com "aumento do número de antígenos que a molécula de ligação ao antígeno pode neutralizar". Dessa forma, "ligar" pode ser substituído por "neutralizar" quando o anticorpo é um anticorpo neutralizante.

[00081] Na presente invenção, "aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno" não significa necessariamente aumento do número de antígenos que podem ser ligados por todas as moléculas de ligação ao antígeno. Por exemplo, o número médio de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno em uma composição de molécula de ligação ao antígeno pode aumentar, ou a proporção de moléculas de ligação ao antígeno que podem se ligar a mais antígenos do que o número de seus sítios de ligação ao antígeno pode aumentar.

[00082] Na presente invenção, prefere-se que o número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno aumente quando a molécula é administrada a um ser humano.

[00083] No entanto, quando é difícil determinar o número em seres humanos, ele pode ser previsto com base nos resultados obtidos por um ensaio in vitro ou pode ser feita uma medida com a utilização de camundongos (por exemplo, camundongos transgênicos que expressam antígeno e camundongos transgênicos que expressam FcRn humano) ou macacos (por exemplo, macacos Cynomolgus). Quando o anticorpo é um anticorpo neutralizante, presume-se geralmente que o número de vezes de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno acima descrito esteja correlacionado com o número de antígenos que podem ser neutralizados por uma molécula de ligação ao antígeno. Dessa forma, o número de antígenos que podem ser neutralizados por uma molécula de ligação ao antígeno pode ser determinado pelos mesmos métodos descritos acima para determinação do número de vezes de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno.

[00084] Além disso, a presente invenção fornece métodos para ligação de uma molécula de ligação ao antígeno aos antígenos duas ou mais vezes no corpo, por administração de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH ácido é menor do que aquela em pH neutro.

[00085] A presente invenção também está relacionada aos métodos para a neutralização de antígenos que são maiores em número do que o número de sítios de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno que possui a atividade neutralizante, por administração da molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH ácido é menor do que aquela em pH neutro. De preferência, a presente invenção está relacionada aos métodos para a neutralização de três ou mais antígenos, de preferência quatro ou mais antígenos por administração de IgG cuja atividade de ligação ao antígeno em pH ácido é menor do que aquela em pH neutro.

[00086] A presente invenção também está relacionada aos métodos para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Na presente invenção, o antígeno pode ser dissociado da molécula de ligação ao antígeno em qualquer lugar dentro de uma célula; no entanto, prefere-se que o antígeno seja dissociado dentro de um endossomo inicial. Na presente invenção, "um antígeno é dissociado dentro de uma célula de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente" não significa necessariamente que todos os antígenos internalizados em uma célula por meio de ligação à molécula de ligação ao antígeno são dissociados da molécula de ligação ao antígeno dentro da célula. É aceitável que a proporção de antígeno que é dissociada da molécula de ligação ao antígeno dentro de uma célula aumente, quando comparada com antes da diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro.

[00087] Além disso, a presente invenção está relacionada aos métodos para o aumento da ligação intracelular de uma molécula de ligação ao antígeno livre de um antígeno ao FcRn por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Em geral, FcRn se liga a uma molécula de ligação ao antígeno dentro de um endossomo. No entanto, presume-se que uma molécula de ligação ao antígeno ligada a um antígeno da membrana não se ligue ao FcRn. Dessa forma, em uma modalidade preferida, quando o antígeno é um antígeno ligado à membrana, a presente invenção inclui métodos para o aumento da dissociação endossômica de antígenos de moléculas de ligação ao antígeno e, dessa forma, aumento da ligação ao FcRn das moléculas de ligação ao antígeno, por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno no pH endossômico (pH ácido), quando comparada com aquela no pH do plasma (pH neutro). Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a molécula de ligação ao antígeno pode se ligar ao FcRn na presença ou ausência do antígeno. Se a dissociação do antígeno da molécula de ligação ao antígeno dentro de endossomos pode ser promovida por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno no pH intra-endossômico (ácido), quando comparada com aquela no pH do plasma (neutro), a ligação ao FcRn da molécula de ligação ao antígeno que está "livre de um antígeno" pode ser aumentada pelos métodos da presente invenção.

[00088] Independentemente se um antígeno é ligado à membrana ou solúvel, se uma molécula de ligação ao antígeno livre de um antígeno pode retornar ao plasma com FcRn, a molécula de ligação ao antígeno pode se ligar ao antígeno novamente. Repetindo-se esse processo, a molécula de ligação ao antígeno pode se ligar ao antígeno várias vezes. Na presente invenção, o termo "aumento da ligação ao FcRn de uma molécula de ligação ao antígeno dentro de uma célula" não significa necessariamente que todas as moléculas de ligação ao antígeno se ligam ao FcRn. É aceitável que a proporção de uma molécula de ligação ao antígeno livre de um antígeno que se ligue ao FcRn dentro de uma célula aumente, quando comparada com antes da diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno no pH endossômico, quando comparada com aquela no pH do plasma. Moléculas de ligação ao antígeno preferidas nos métodos da presente invenção para aumento da ligação intracelular entre a molécula de ligação ao antígeno e FcRn incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno que se ligam aos antígenos ligados à membrana (antígenos da membrana) como, por exemplo, proteínas da membrana. Outras moléculas de ligação ao antígeno preferíveis incluem moléculas de ligação ao antígeno que se ligam aos antígenos solúveis como, por exemplo, proteínas solúveis.

[00089] Os métodos de aumento da ligação de uma molécula de ligação ao antígeno e FcRn dentro de uma célula são expressos alternativamente como os métodos de promoção da ligação ao FcRn de uma molécula de ligação ao antígeno dentro de uma célula, por exemplo, dentro de endossomos.

[00090] Além disso, a presente invenção está relacionada aos métodos para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula, por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Na presente invenção, o termo "liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula" não significa necessariamente que todas as moléculas de ligação ao antígeno que foram ligadas a um antígeno e internalizadas em uma célula são liberadas em uma forma livre de antígeno para fora da célula. É aceitável que a proporção de moléculas de ligação ao antígeno que são liberadas para fora da célula aumente, quando comparada com antes da diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Prefere-se que a molécula de ligação ao antígeno liberada para fora de uma célula retenha a habilidade de ligação ao antígeno. Além disso, o método de liberação de uma molécula de ligação ao antígeno que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula em uma forma livre de antígeno para fora da célula também pode ser denominado um método de fornecimento à molécula de ligação ao antígeno de uma propriedade pela qual a molécula de ligação ao antígeno se torna mais facilmente liberada para fora da célula em uma forma livre de antígeno quando a molécula de ligação ao antígeno está ligada a um antígeno e internalizada em uma célula.

[00091] Além disso, a presente invenção está relacionada aos métodos para o aumento da habilidade das moléculas de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Na presente invenção o termo "habilidade para eliminar antígenos no plasma" refere-se à habilidade para eliminar do plasma antígenos que estão presentes no plasma, quando as moléculas de ligação ao antígeno são administradas in vivo ou são secretadas in vivo. Dessa forma, na presente invenção, o termo "aumento da habilidade da molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígeno no plasma" significa que a taxa de eliminação de antígenos do plasma quando as moléculas de ligação ao antígeno são administradas in vivo está acelerada, quando comparada com aquela antes da redução da habilidade de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno em pH ácido, quando comparada com aquela em pH neutro. Para se determinar se a habilidade da molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma está aumentada pode ser realizada, por exemplo, a administração de antígenos solúveis e moléculas de ligação ao antígeno in vivo, e depois efetuar a medida da concentração de antígenos solúveis no plasma. Quando a concentração de antígenos solúveis no plasma após a administração de antígenos solúveis e de moléculas de ligação ao antígeno é reduzida por diminuição da habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH ácido do que em pH neutro, pode ser determinado que a habilidade da molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma está aumentada.

[00092] A presente invenção também está relacionada aos métodos para o aprimoramento da farmacocinética de uma molécula de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina ou por um aminoácido não natural na molécula de ligação ao antígeno ou por inserção de histidina ou de um aminoácido não natural na molécula.

[00093] Além disso, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina ou por um aminoácido não natural na molécula de ligação ao antígeno ou por inserção de histidina ou de um aminoácido não natural na molécula.

[00094] Além disso, a presente invenção está relacionada aos métodos para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno por substituição de pelo menos um aminoácido por histidina ou por um aminoácido não natural na molécula de ligação ao antígeno ou por inserção de histidina ou de um aminoácido não natural na molécula.

[00095] A presente invenção também fornece métodos para dissociação de um antígeno dentro de uma célula de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelularmente por substituição de pelo menos um aminoácido na molécula de ligação ao antígeno com histidina ou com um aminoácido não natural, ou por inserção de histidina ou de um aminoácido não natural na molécula.

[00096] A presente invenção também fornece métodos para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula por substituição de pelo menos um aminoácido na molécula de ligação ao antígeno com histidina ou com um aminoácido não natural, ou por inserção de histidina ou de um aminoácido não natural na molécula.

[00097] A presente invenção também fornece métodos para o aumento da habilidade da molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por substituição de pelo menos um aminoácido na molécula de ligação ao antígeno com histidina ou com um aminoácido não natural, ou por inserção de histidina ou de um aminoácido não natural na molécula.

[00098] O sítio da mutação de histidina ou de aminoácido não natural (substituição, inserção etc.) não é particularmente limitado. Uma histidina ou um aminoácido não natural pode ser substituído ou inserido em qualquer sítio. Sítios preferidos de substituição ou inserção de histidina ou de um aminoácido não natural incluem, por exemplo, sítios dentro de uma região que possui um impacto sobre a habilidade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno. Por exemplo, quando a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo, esses sítios incluem uma região variável de anticorpo ou CDR. O número de mutações de histidina ou de aminoácidos não naturais não é particularmente limitado. Histidina ou um aminoácido não natural pode ser substituído ou inserido em um único sítio, ou em dois ou mais sítios. Além disso, uma eliminação, adição, inserção e/ou substituição de outros aminoácidos podem ser introduzidas simultaneamente com a substituição ou inserção de histidina ou de aminoácido não natural.

[00099] Na presente invenção, quando a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo, sítios possíveis de substituição de histidina ou de aminoácido não natural incluem, por exemplo, sítios dentro da sequência da CDR ou sequência responsável pela estrutura da CDR de um anticorpo. Esses sítios incluem, por exemplo, os sítios listados abaixo. As posições de aminoácidos estão numeradas com base na numeração de Kabat (Kabat E.A. e cols., (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH).

[000100] Cadeia pesada: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b e H102.

[000101] Cadeia leve: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92 e L94.

[000102] Entre os sítios acima, H32, H61, L53, L90 e L94 poderiam ser sítios de modificação universais,

[000103] Quando o antígeno é o receptor de IL-6 (por exemplo, receptor de IL-6 humana), sítios de modificação preferíveis incluem os seguintes (no entanto, os sítios de modificação não se limitam particularmente a esses):

[000104] Cadeia pesada: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H100b e H102.

[000105] Cadeia leve: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92 e L94.

[000106] Quando histidina ou um aminoácido não natural é substituído em vários sítios, combinações preferidas de sítios de substituição incluem, por exemplo, a combinação de H27, H31 e H35; combinação de H27, H31, H32, H35, H58, H62 e H102; combinação de L32 e L53; e combinação de L28, L32 e L53. Além disso, combinações preferidas de sítios de substituição de cadeias pesadas e leves incluem a combinação de H27, H31, L32 e L53.

[000107] Quando o antígeno é IL-6 (por exemplo, IL-6 humana), sítios de modificação preferíveis incluem os seguintes (no entanto, os sítios de modificação não se limitam particularmente a esses):

[000108] Cadeia pesada: H32, H59, H61 e H99.

[000109] Cadeia leve: L53, L54, L90 e L94.

[000110] Quando o antígeno é o receptor de IL-31 (por exemplo, receptor de IL-31 humana), sítios de modificação preferíveis incluem H33. No entanto, os sítios de modificação não se limitam particularmente a esse.

[000111] Em relação aos sítios acima, apenas um sítio pode ser substituído com histidina ou com um aminoácido não natural. Alternativamente, vários sítios podem ser substituídos com histidina ou com um aminoácido não natural.

[000112] Os métodos da presente invenção são aplicáveis a quaisquer moléculas de ligação ao antígeno, independentemente do tipo de antígeno-alvo.

[000113] As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção não são particularmente limitadas, desde que possuam a atividade de ligação específica a um antígeno de interesse. Moléculas de ligação ao antígeno preferidas da presente invenção incluem, por exemplo, substâncias que possuem um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo. O domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo inclui, por exemplo, CDR e região variável. Quando o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é CDR, a molécula de ligação ao antígeno pode incluir todas as seis CDRs de um anticorpo inteiro, ou uma, ou duas ou mais delas. Alternativamente, quando uma molécula de ligação ao antígeno inclui CDR como um domínio de ligação de um anticorpo, a CDR pode incluir uma eliminação, substituição, adição e/ou inserção de aminoácido, pode ser uma CDR parcial.

[000114] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno inclui uma região constante de anticorpo, a presente invenção está relacionada aos métodos para o aprimoramento da farmacocinética de moléculas de ligação ao antígeno por modificação (por exemplo, substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácido) da região constante de anticorpo na molécula de ligação ao antígeno.

[000115] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno inclui uma região constante de anticorpo, a presente invenção fornece métodos para o aumento do número de vezes de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno por modificação (por exemplo, substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácido) da região constante de anticorpo na molécula de ligação ao antígeno.

[000116] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno inclui uma região constante de anticorpo, a presente invenção está relacionada aos métodos para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma molécula de ligação ao antígeno por modificação (por exemplo, substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácido) da região constante de anticorpo na molécula de ligação ao antígeno.

[000117] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno inclui uma região constante de anticorpo, a presente invenção está relacionada aos métodos para dissociação, dentro de uma célula, de um antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno ligada extracelular- mente por modificação (por exemplo, substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácido) da região constante de anticorpo na molécula de ligação ao antígeno.

[000118] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno inclui uma região constante de anticorpo, a presente invenção está relacionada aos métodos para a liberação de uma molécula de ligação ao antígeno, que foi ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, em uma forma livre de antígeno para fora da célula, por modificação (por exemplo, substituição, eliminação, adição e/ou inserção de amino- ácido) da região constante de anticorpo na molécula de ligação ao antígeno.

[000119] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno inclui uma região constante de anticorpo, a presente invenção está relacionada aos métodos para o aumento da habilidade de uma molécula de ligação ao antígeno para eliminar antígenos no plasma por modificação (por exemplo, substituição, eliminação, adição e/ou inserção de aminoácido) da região constante de anticorpo na molécula de ligação ao antígeno.

[000120] Em uma modalidade preferida, a substância de ligação ao antígeno da presente invenção inclui substâncias de ligação ao antígeno que incluem uma região de ligação ao FcRn. Após internalizadas nas células, as substâncias de ligação ao antígeno que incluem uma região de ligação ao FcRn podem retornar ao plasma por uma via de resgate de FcRn. A região de ligação ao FcRn é preferivelmente um domínio que se liga diretamente ao FcRn. Uma região de ligação ao FcRn preferida inclui, por exemplo, regiões Fc de anticorpo. No entanto, a região de ligação ao FcRn da presente invenção pode ser uma região que se liga a um polipeptídeo que possui a habilidade para se ligar ao FcRn como, por exemplo, albumina ou IgG, na medida em que essa região que se liga ao polipeptídeo que possui habilidade de ligação ao FcRn pode se ligar indiretamente ao FcRn por meio de albumina, IgG etc.

[000121] Os antígenos reconhecidos por moléculas de ligação ao antígeno como, por exemplo, anticorpos de interesse, nos métodos da presente invenção não são particularmente limitados. Esses anticorpos de interesse podem reconhecer qualquer antígeno. Anticorpos cuja farmacocinética deve ser aprimorada pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, anticorpos que reconhecem antígenos da membrana como, por exemplo, proteínas receptoras (receptores ligados à membrana e receptores solúveis) e marcadores da superfície celular, e anticorpos que reconhecem antígenos solúveis como, por exemplo, citocinas. exemplos preferidos de antígenos da membrana da presente invenção incluem proteínas da membrana. exemplos de antígenos solúveis da presente invenção incluem proteínas solúveis. Antígenos reconhecidos por anticorpos cuja farmacocinética deve ser aprimorada pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-31, IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-6, receptor de OSM, gp130, receptor de IL-5, CD40, CD4, Fas, osteopontina, CRTH2, CD26, PDGF- D, CD20, fator quimiotático de monócitos, CD23, TNF-α, BMGB-1, α4 integrina, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFNy, BLyS, HLA-DR, CD52 e receptor de IL-31. Antígenos particularmente preferidos incluem o receptor de IL-6.

[000122] Além disso, a molécula de ligação ao antígeno de interesse nos métodos da presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno que possuem uma atividade antagonística (moléculas de ligação ao antígeno antagonísticas) e moléculas de ligação ao antígeno que possuem uma atividade agonística (moléculas de ligação ao antígeno agonísticas). Em uma modalidade preferida, a molécula de ligação ao antígeno inclui moléculas de ligação ao antígeno antagoníst- icas, em particular, moléculas de ligação ao antígeno antagonísticas que reconhecem antígenos da membrana como, por exemplo, receptores, ou antígenos solúveis como, por exemplo, citocinas. Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno antagonística que reconhece um receptor inibe a ligação ligante-receptor por ligação ao receptor e, dessa forma, inibe a sinalização mediada por meio do receptor.

[000123] Na presente invenção, a molécula de ligação ao antígeno de interesse não é particularmente limitada, e pode ser qualquer molécula de ligação ao antígeno. A molécula de ligação ao antígeno da presente invenção preferivelmente inclui tanto atividade de ligação ao antígeno (região de ligação ao antígeno) quanto a região de ligação ao FcRn. Em particular, a molécula de ligação ao antígeno preferida da presente invenção inclui uma região que se liga ao FcRn humano. A molécula de ligação ao antígeno que inclui tanto atividade de ligação ao antígeno quanto a região de ligação ao FcRn inclui, por exemplo, anticorpos. Os anticorpos preferidos no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, anticorpos IgG. Quando o anticorpo a ser usado é um anticorpo IgG, o tipo de IgG não é limitado; pode ser usada uma IgG que pertence a qualquer isótipo (subclasse) como, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Além disso, podem ser introduzidas mutações de aminoácidos (por exemplo, M73) na região constante de qualquer um desses isótipos de IgG. As mutações de aminoácidos a serem introduzidas incluem, por exemplo, aquelas que potencializam ou diminuem a ligação ao receptor de Fcy (Proc. Natl. Acad. Sol U.S.A. Março de 2006 4; 103(11): 4.005-10) e aquelas que potencializam ou diminuem a ligação ao FcRn (J. Biol. Chem., Março de 2001 2; 276(9): 6.591-604), mas não se limitam a esses exemplos. Alternativamente, também é possível alterar a ligação pH-dependente por seleção de uma região constante apropriada como, por exemplo, de IgG2.

[000124] Quando a molécula de ligação ao antígeno de interesse da presente invenção é um anticorpo, ele pode ser um anticorpo derivado de qualquer animal, por exemplo, um anticorpo de camundongo, um anticorpo humano, um anticorpo de rato, um anticorpo de coelho, um anticorpo de cabra ou um anticorpo de camelo. Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo modificado, por exemplo, um anticorpo quimérico e, em particular, um anticorpo modificado que inclui uma substituição de aminoácido na sequência de um anticorpo humanizado etc. Os anticorpos também incluem anticorpos biespecíficos, produtos da modificação de anticorpo ligados com várias moléculas, e polipeptídeos que incluem fragmentos de anticorpo.

[000125] "Anticorpos quiméricos" são anticorpos preparados por combinação de sequências derivadas de animais diferentes. Especificamente, o anticorpo quimérico inclui, por exemplo, anticorpos que possuem regiões variáveis (V) da cadeia pesada e leve de um anticorpo de camundongo e regiões constantes (C) da cadeia pesada e leve de um anticorpo humano.

[000126] "Anticorpos humanizados", também denominados anticorpos humanos remodelados, são anticorpos nos quais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo derivado de um mamífero não humano, por exemplo, um camundongo, são transplantadas nas CDRs de um anticorpo humano. Métodos para identificação de CDRs são conhecidos (Kabat e cols., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1987), "National Institute of Health, Bethesda", Md.; Chothia e cols., Nature (1989) 342: 877). Tecnologias gerais de recombinação genética adequadas a essa finalidade também são conhecidas (vide o Pedido de Patente Européia EP 125023; e WO 96/02576).

[000127] O termo "anticorpo biespecífico" refere-se a um anticorpo que possui, na mesma molécula de anticorpo, regiões variáveis que reconhecem diferentes epitopos. Um anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo que reconhece dois ou mais antígenos diferentes, ou um anticorpo que reconhece dois ou mais epitopos diferentes em um mesmo antígeno.

[000128] Além disso, polipeptídeos que incluem fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, scFv (Nat. Biotechnol. Setembro de 2005; 23(9): 1.126-36), anticorpos de domínio (dAb) (WO 20041058821, WO 2003/002609), scFv-Fc (WO 2005/037989), dAb-Fc e proteínas de fusão Fc. Desses, moléculas que incluem um domínio de Fc possuem a atividade de ligação ao FcRn, e são, portanto, adequadas para uso nos métodos descobertos na presente invenção.

[000129] Além disso, as moléculas de ligação ao antígeno que são aplicáveis à presente invenção podem ser moléculas similares a anticorpos. Uma molécula similar a um anticorpo é uma molécula que pode exibir funções por ligação a uma molécula-alvo (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18; 1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 463-469; Protein Science 2006, 15: 14-27) e inclui, por exemplo, DARPins (WO 2002/020565), Affibody (WO 19951001937), avímero (WO 2004/044011; WO 2005/040229) e Adnectina (WO 2002/032925). Se essas moléculas similares a anticorpos podem se ligar às moléculas- alvo de uma forma pH-dependente, é possível que uma única molécula se ligue a várias moléculas-alvo.

[000130] Além disso, a molécula de ligação ao antígeno pode ser uma proteína receptora ou uma proteína de fusão de receptor-Fc que se liga a um alvo, incluindo, por exemplo, proteína de fusão TNFR-Fc, proteína de fusão IL1R-Fc, proteína de fusão VEGFR-Fc e proteína de fusão CTLA4-Fc (Nat. Med. Janeiro de 2003; 9(1): 47-52; BioDrugs. 2006; 20(3): 151-60). Se essas proteínas receptoras e proteínas de fusão receptor-Fc podem se ligar às moléculas-alvo de uma forma pH- dependente, é possível que uma única molécula se ligue a várias moléculas-alvo.

[000131] Além disso, a molécula de ligação ao antígeno pode ser uma proteína ligante artificial ou proteína de fusão ligante artificial que se liga a um alvo e possui o efeito neutralizante, e inclui, por exemplo, IL-6 mutante (EMBO J. Dezembro de 1994 15; 13(24): 5.863-70). Se essas proteínas ligantes artificiais e proteínas de fusão ligantes artificiais podem se ligar às moléculas-alvo de uma forma pH-dependente, é possível que uma única molécula se ligue a várias moléculas-alvo.

[000132] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem incluir cadeias de açúcar modificadas. Anticorpos com cadeias de açúcar modificadas incluem, por exemplo, anticorpos com glicosilação modificada (WO 99/54342), anticorpos que são deficientes em fucose que é adicionada à cadeia de açúcar (WO 00/61739; WO 02/31140; WO 2006/067847; WO 2006/067913), e anticorpos que possuem cadeias de açúcar com GlcNAc dividido (WO 02/79255).

[000133] Embora os métodos da presente invenção não estejam limitados a qualquer teoria específica, o relacionamento entre a produção da habilidade de ligação ao antígeno em pH ácido mais fraco, quando comparada com aquela em pH neutro, o aprimoramento da farmacocinética e a ligação várias vezes ao antígeno pode ser explicado da seguinte forma:

[000134] Por exemplo, quando o anticorpo é um anticorpo que se liga a um antígeno da membrana, o anticorpo administrado no corpo se liga ao antígeno e depois é recolhido por meio de internalização em endossomos nas células junto com o antígeno e enquanto o anticorpo é mantido ligado ao antígeno. A seguir, o anticorpo se desloca para lisossomos enquanto o anticorpo é mantido ligado ao antígeno, e o anticorpo é degradado pelo lisossomo junto com o antígeno. A eliminação do plasma mediada por internalização é denominada eliminação antígeno-dependente, e esta eliminação foi relatada com várias moléculas de anticorpo (Drug Discov. Today. Janeiro de 2006; 11 (1-2): 81-8). Quando uma única molécula de anticorpo IgG se liga aos antígenos de uma forma divalente, uma única molécula de anticorpo é internalizada enquanto o anticorpo é mantido ligado às duas moléculas de antígeno, e degradado no lisossomo. Consequentemente, no caso de anticorpos típicos, uma molécula de anticorpo IgG não pode se ligar a três ou mais moléculas de antígeno. Por exemplo, uma única molécula de IgG de anticorpo que possui uma atividade neutralizante não pode neutralizar três ou mais moléculas de antígeno.

[000135] A retenção relativamente prolongada (eliminação lenta) de moléculas de IgG no plasma é causada pela função de FcRn, que sabidamente é um receptor de resgate de moléculas de IgG. Quando recolhidas em endossomos por meio de pinocitose, as moléculas de IgG se ligam ao FcRn expresso nos endossomos sob a condição ácida nos endossomos. Enquanto as moléculas de IgG que não se ligaram ao FcRn se transferem para lisossomos onde são degradadas, as moléculas de IgG que se ligaram ao FcRn se deslocam para a superfície celular e retornam novamente ao plasma por dissociação do FcRn sob a condição neutra no plasma.

[000136] Alternativamente, quando o antígeno é um antígeno que se liga a um antígeno solúvel, o anticorpo administrado no corpo se liga ao antígeno e depois é recolhido nas células enquanto o anticorpo é mantido ligado ao antígeno. Muitos anticorpos recolhidos nas células são liberados para fora das células por meio de FcRn. No entanto, como os anticorpos são liberados para fora das células com os anticorpos mantidos ligados aos antígenos, os anticorpos não podem se ligar aos antígenos novamente. Dessa forma, similar aos anticorpos que se ligam aos antígenos da membrana, no caso de anticorpos típicos, uma molécula de anticorpo IgG não pode se ligar a três ou mais moléculas de antígeno.

[000137] Os presentes inventores argumentaram que, quando anticorpos que se ligaram aos antígenos como, por exemplo, antígenos da membrana, são recolhidos em endossomos por internalização, enquanto os anticorpos que são mantidos ligados aos antígenos se deslocam para lisossomos e são degradados, os anticorpos IgG cujos antígenos se dissociaram nos endossomos poderiam se ligar ao FcRn que são expressos nos endossomos. Especificamente, os presentes inventores descobriram que um anticorpo que se liga fortemente a um antígeno no plasma, mas se liga fracamente ao antígeno dentro do endossomo, pode se ligar a um antígeno no plasma e ser recolhido enquanto mantido formando um complexo com o antígeno em endossomos nas células por meio de internalização, se dissocia do antígeno no endossomo e depois se liga ao FcRn e se desloca para a superfície celular, e retorna novamente para o plasma em um estado não ligado aos antígenos para neutralizar vários antígenos ligados à membrana. Além disso, os presentes inventores descobriram que um anticorpo que possui a propriedade de se ligar fortemente aos antígenos no plasma, mas fracamente aos antígenos no endossomo, pode se dissociar dos antígenos no endossomo, mesmo quando o anticorpo tenha se ligado a antígenos como, por exemplo, antígenos solúveis; portanto, eles são liberados novamente no plasma em um estado não ligado aos antígenos e podem neutralizar vários antígenos solúveis.

[000138] Em particular, os presentes inventores observaram que o pH no plasma era diferente do pH nos endossomos e, dessa forma, descobriram que anticorpos que se ligam fortemente aos antígenos sob a condição do pH do plasma, mas que se ligam fracamente aos antígenos sob condição de pH endossômico, eram superiores em termos de retenção no plasma, porque uma molécula de anticorpo poderia se ligar a vários antígenos.

[000139] Os endossomos, que são vesículas da membrana, formam redes no citoplasma de células eucarióticas e são responsáveis pelo metabolismo de macromoléculas no processo da membrana celular até os lisossomos. Há relatos de que o pH nos endossomos é geralmente um pH ácido de 5,5 a 6,0 (Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., Fevereiro de 2004; 5 (2): 121-32). Por outro lado, o pH no plasma é sabidamente quase neutro (normalmente, pH 7,4).

[000140] Consequentemente, uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH ácido é mais fraca que que a atividade de ligação ao antígeno em pH neutro se liga ao antígeno no plasma que possui um pH neutro, é recolhida nas células, e depois se dissocia do antígeno nos endossomos, que possuem um pH ácido. A molécula de ligação ao antígeno que se dissociou do antígeno se liga ao FcRn, se desloca até a superfície celular, e retorna novamente ao plasma em um estado não ligado aos antígenos. Como resultado, a molécula de ligação ao antígeno pode se ligar aos antígenos várias vezes, e a farmacocinética é aprimorada.

< Substâncias de Molécula de Ligação ao Antígeno >

[000141] Além disso, a presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 é menor do que aquela em pH 6,7 ao pH 10,0; de preferência moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,0 ao pH 6,0 é menor do que aquela em pH 7,0 a 8,0. Especificamente, moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 é menor do que aquela em pH 6,7 ao pH 10,0 incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4. As moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4 também podem ser expressas como moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4 é maior do que aquela em pH 5,8.

[000142] Como ocorre com as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4, desde que a atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 seja menor do que a ligação em pH 7,4, não há limitação sobre a diferença em termos de atividade de ligação, e a atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 só precisa ser menor, mesmo que ligeiramente.

[000143] Uma modalidade preferida de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4 inclui moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4 é duas vezes ou mais do que aquela em pH 5,8. Uma modalidade mais preferida da molécula de ligação ao antígeno inclui moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4 é dez vezes ou mais do que aquela em pH 5,8. Uma modalidade ainda mais preferida da molécula de ligação ao antígeno inclui moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4 é 40 vezes ou mais do que aquela em pH 5,8.

[000144] Especificamente, em uma modalidade preferida, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 que é menor do que aquela em pH 7,4, em que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), que é uma proporção da KD para o antígeno em pH 5,8 e aquela em pH 7,4, é preferivelmente 2 ou maior, mais preferivelmente, 10 ou maior e, ainda mais preferivelmente, 40 ou maior. O limite superior do valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor, por exemplo, 400, 1.000 ou 10.000, desde que a produção seja possível com o uso das tecnologias conhecidas por aqueles versados na técnica.

[000145] Em outra modalidade preferida, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4, possui um valor de kd (pH 5,8)/ kd (pH 7,4), que é uma proporção da kd para o antígeno em pH 5,8 e a kd para o antígeno em pH 7,4, que é de 2 ou maior, mais preferivelmente, 5 ou maior, ainda mais preferivelmente, 10 ou maior e, ainda mais preferivelmente, 30 ou maior. O limite superior do valor da kd (pH 5,8)/kd (pH 7,4) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor, por exemplo, 50, 100, ou 200, desde que a produção seja possível com o uso das tecnologias conhecidas por aqueles versados na técnica.

[000146] Condições além do pH nas quais a atividade de ligação ao antígeno é medida podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica, e as condições não são particularmente limitadas; no entanto, as medidas podem ser realizadas, por exemplo, sob condições de tampão MES e a 37°C, como descrito nos exemplos. Além disso, a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare) ou similares, como descrito nos exemplos.

[000147] Presumiu-se que uma molécula de ligação ao antígeno desse tipo, que se liga fracamente a um antígeno em pH ácido, se dissocie facilmente do antígeno sob a condição ácida endossômica e que, após internalização nas células, se ligue ao FcRn e seja facilmente liberada para fora das células. A molécula de ligação ao antígeno liberada para fora das células sem ser degradada dentro das células pode se ligar novamente a outros antígenos. Consequentemente, quando a molécula de ligação ao antígeno é, por exemplo, uma molécula der ligação ao antígeno neutralizante, a molécula de ligação ao antígeno que se dissocia facilmente do antígeno sob a condição ácida endossômica pode ser ligar e neutralizar antígenos várias vezes. Como resultado, moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 é menor do que aquela em pH 6,7 ao pH 10,0 são superiores em termos de retenção no plasma.

[000148] Em uma modalidade preferida, a molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4 inclui moléculas de ligação ao antígeno nas quais pelo menos um aminoácido na molécula de ligação ao antígeno é substituído com histidina ou com um aminoácido não natural, ou nas quais pelo menos uma histidina ou um aminoácido não natural foi inserido. O sítio no qual a mutação de histidina ou de aminoácido não natural é introduzida não é particularmente limitado, e pode ser qualquer sítio, desde que a atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 seja mais fraca do que em pH 7,4 (o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é maior ou o valor de kd (pH 5,8)/ kd pH 7,4) é maior), quando comparada com antes da substituição. exemplos incluem regiões variáveis e CDRs de um anticorpo, caso a molécula de ligação ao antígeno seja um anticorpo. O número de aminoácidos a serem substituídos com histidina ou com um aminoácido não natural e o número de aminoácidos a serem inseridos podem ser apropriadamente determinados por aqueles versados na técnica. Um aminoácido pode ser substituído com histidina ou com um aminoácido não natural, ou um aminoácido pode ser inserido, ou dois ou mais aminoácidos podem ser substituídos com histidina ou com aminoácidos não naturais, ou dois ou mais aminoácidos podem ser inseridos. Além disso, com exceção das substituições por histidina ou por um aminoácido não natural ou da inserção de histidina ou de um aminoácido não natural, a eliminação, adição, inserção e/ou substituição de outros aminoácidos também pode ser realizada simultaneamente. Substituições por histidina ou por um aminoácido não natural ou a inserção de histidina ou de um aminoácido não natural pode ser realizada aleatoriamente usando um método como, por exemplo, varredura de histidina, que utiliza histidina ao invés de alanina na varredura de alanina, que é conhecida por aqueles versados na técnica. As moléculas de ligação ao antígeno cujo valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) ou kd (pH 5,8)/ kd (pH 7,4) está aumentado, quando comparado com antes da mutação, podem ser selecionadas de moléculas de ligação ao antígeno nas quais a mutação de histidina ou de aminoácido não natural foi introduzida aleatoriamente.

[000149] Moléculas de ligação ao antígeno preferidas com mutação para histidina ou para um aminoácido não natural e cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4 incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4 após a mutação para histidina ou para um aminoácido não natural é equivalente à atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4, antes da mutação para histidina ou para um aminoácido não natural. Na presente invenção, o termo "uma molécula de ligação ao antígeno após mutação de histidina ou de aminoácido não natural possui uma atividade de ligação ao antígeno que é equivalente àquela da molécula de ligação ao antígeno, antes da mutação de histidina ou de um aminoácido não natural" significa que, quando a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno antes da mutação de histidina ou de um aminoácido não natural é ajustada em 100%, a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno após mutação de histidina ou de aminoácido não natural é de pelo menos 10% ou mais, de preferência 50% ou mais, mais preferivelmente, 80% ou mais e, ainda mais preferivelmente, 90% ou mais. A atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4 após mutação de histidina ou de um aminoácido não natural pode ser maior do que a atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4 antes da mutação de histidina ou de um aminoácido não natural. Quando a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno está diminuída em função da substituição ou da inserção de histidina ou de um aminoácido não natural, a atividade de ligação ao antígeno pode ser ajustada por introdução de uma substituição, eliminação, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na molécula de ligação ao antígeno, de modo que a atividade de ligação ao antígeno se torna equivalente àquela antes da substituição ou da inserção de histidina. A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação se tornou equivalente em consequência de substituição, eliminação, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos após substituição ou inserção de histidina.

[000150] Além disso, quando a molécula de ligação ao antígeno é uma substância que inclui uma região constante de anticorpo, em outra modalidade preferida da molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 é menor do que aquela em pH 7,4, a presente invenção inclui métodos para a modificação de regiões constantes de anticorpo contidas nas moléculas de ligação ao antígeno. exemplos específicos de regiões constantes de anticorpo após modificação incluem as regiões constantes descritas nos exemplos.

[000151] Quando a atividade de ligação ao antígeno da substância de ligação ao antígeno em pH 5,8 está enfraquecida quando comparada com aquela em pH 7,4 (quando valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) está aumentado) pelos métodos descritos acima, é geralmente preferível que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) seja duas vezes ou mais, mais preferivelmente, cinco vezes ou mais e, ainda mais preferivelmente, dez vezes ou mais, quando comparado com aquele do anticorpo original, mas não é particularmente limitado a esses valores.

[000152] As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ainda ter qualquer outra propriedade, desde que sua atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 seja menor do que aquela em pH 6,7 ao pH 10,0. Por exemplo, as moléculas de ligação ao antígeno podem ser agonísticas ou podem ser moléculas de ligação ao antígeno antagonísticas. Moléculas de ligação ao antígeno preferidas da presente invenção incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno antagonísticas. Em geral, uma molécula de ligação ao antígeno antagonística inibe a sinalização intracelular mediada por receptor por inibição da ligação entre um ligante (agonista) e o receptor. [000153] Além disso, a presente invenção fornece anticorpos nos quais aminoácidos em pelo menos um dos sítios indicados abaixo é substituído com histidina ou com um aminoácido não natural. As posições de aminoácidos são indicadas com base na numeração de Kabat (Kabat E.A. e cols., (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH).

[000154] Cadeia pesada: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b e H102.

[000155] Cadeia leve: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92 e L94.

[000156] Entre os sítios acima, H32, H61, L53, L90 e L94 poderiam ser sítios de modificação universais.

[000157] Quando o antígeno é o receptor de IL-6 (por exemplo, receptor de IL-6 humana), sítios de modificação preferíveis incluem os seguintes (no entanto, os sítios de modificação não são particularmente limitados a esses):

[000158] Cadeia pesada: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H100b e H102.

[000159] Cadeia leve: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92 e L94.

[000160] Quando histidina ou um aminoácido não natural é substituído em vários sítios, combinações preferidas de sítios de substituição incluem, por exemplo, a combinação de H27, H31 e H35; combinação de H27, H31, H32, H35, H58, H62 e H102; combinação de L32 e L53; e combinação de L28, L32 e L53. Além disso, combinações preferidas de sítios de substituição de cadeias pesadas e leves incluem a combinação de H27, H31, L32 e L53.

[000161] Quando o antígeno é IL-6 (por exemplo, IL-6 humana), sítios de modificação preferíveis incluem os seguintes (no entanto, os sítios de modificação não se limitam particularmente a esses):

[000162] Cadeia pesada: H32, H59, H61 e H99.

[000163] Cadeia leve: L53, L54, L90 e L94.

[000164] Quando o antígeno é o receptor de IL-31 (por exemplo, receptor de IL-31 humana), sítios de modificação preferíveis incluem H33. No entanto, os sítios de modificação não se limitam particularmente a este.

[000165] As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem reconhecer qualquer antígeno. Antígenos reconhecidos por anticorpos da presente invenção incluem especificamente as proteínas receptoras mencionadas acima (receptores ligados à membrana ou receptores solúveis), antígenos da membrana como, por exemplo, marcadores da superfície celular, e antígenos solúveis como, por exemplo, citocinas, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-31, IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-6, receptor de OSM, gp130, receptor de IL-5, CD40, CD4, Fas, osteopontina, CRTH2, CD26, PDGF-D, CD20, fator quimioatrativo de monócitos, CD23, TNF-α, HMGB-1, α4 integrina, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFNy, BLyS, HLA-DR, TGF-β, CD52 e receptor de IL-31.

[000166] Antígenos particularmente preferidos incluem o receptor de IL-6.

[000167] As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção são descritas acima. Em uma modalidade preferida da presente invenção, as moléculas de ligação ao antígeno incluem anticorpos. Anticorpos que possuem atividade de ligação ao antígeno e região de ligação ao FcRn incluem, por exemplo, anticorpos IgG. Quando o anticorpo usado é um anticorpo IgG, não há limitação quanto ao seu tipo. É possível usar IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e similares.

[000168] A origem do anticorpo da presente invenção não é particularmente limitada, e pode ser de qualquer origem. É possível usar, por exemplo, anticorpos de camundongo, anticorpos humanos, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de cabra, anticorpos de camelo, e outros. Além disso, os anticorpos podem ser, por exemplo, os anticorpos quiméricos descritos acima e, em particular, anticorpos modificados com substituições da sequência de aminoáci- dos, por exemplo, anticorpos humanizados. Os anticorpos também podem ser os anticorpos biespecíficos descritos acima, produtos da modificação de anticorpo aos quais várias moléculas foram ligadas, polipeptídeos, incluindo fragmentos de anticorpo, e anticorpos com cadeias de açúcar modificadas.

[000169] A geração de anticorpos quiméricos é conhecida. No caso de um anticorpo quimérico humano de camundongo, por exemplo, um DNA que codifica uma região V de anticorpo pode ser ligado a um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano; esta pode ser inserida em um vetor de expressão e introduzida em um hospedeiro para produzir o anticorpo quimérico.

[000170] "Anticorpos humanizados" também são denominados anticorpos humanos remodelados, e são anticorpos nos quais a região determinante de complementaridade (CDR) de um mamífero não humano, por exemplo, um camundongo, é transplantada para a CDR de um anticorpo humano. Métodos para a identificação de CDRs são conhecidos (Kabat e cols., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1987), "National Institute of Health", Bethesda, Md.; Chothia e cols., Nature (1989) 342: 877). Tecnologias gerais adequadas derecombinação genética para essa finalidade também são conhecidas (vide o Pedido de Patente Européia EP 125023; e WO 96/02576). Anticorpos humanizados podem ser produzidos por métodos conhecidos, por exemplo, a CDR de um anticorpo de camundongo pode ser determinada, e um DNA que codifica um anticorpo no qual a CDR está ligada à região framework (FR) de um anticorpo humano é obtido. Anticorpos humanizados podem então ser produzidos usando um sistema que utiliza vetores de expressão convencionais. Esses DNAs podem ser sintetizados por PCR, usando como iniciadores diversos oligonucleotídeos preparados para terem porções que se superpõem com as regiões finais tanto da CDR quanto da FR (vide o método descrito em WO 98/13388). São selecionadas FRs de anticorpo humano ligadas por meio da CDRs de tal modo que as CDRs formem uma ligação adequada ao sítio do antígeno. Se necessário, os aminoácidos nas FRs de uma região variável de anticorpo podem ser substituídos de tal modo que as CDRs do anticorpo humano remodelado possam formar uma ligação adequada ao sítio do antígeno (Sato, K. e cols., Cancer Res. (1993) 53: 10, 01-6). Os resíduos de aminoácidos nas FRs podem ser modificados para que incluam porções que se ligam diretamente a um antígeno por meio de ligações não covalentes (Amit e cols., Science (1986) 233: 747-53), porções que influenciam ou possuem um efeito sobre a estrutura da CDR (Chothia e cols., J. Mol. Biol. (1987) 196: 90117), e porções envolvidas em interações VB-VL (EP 239400).

[000171] Quando os anticorpos da presente invenção são anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados, as regiões C desses anticorpos são preferivelmente derivadas de anticorpos humanos. Por exemplo, Cy1, Cy2, Cy3 e Cy4 podem ser usadas para a cadeia H, enquanto C K e CÀ podem ser usadas para a cadeia L. Além disso, se necessário, podem ser introduzidas mutações de aminoácidos na região C de um anticorpo humano para aumentar ou reduzir a ligação ao receptor de Fcy ou FcRn, ou para aumentar a estabilidade ou produtividade do anticorpo. Um anticorpo quimérico da presente invenção preferivelmente inclui uma região variável de um anticorpo derivado de um mamífero não humano e uma região constante derivada de um anticorpo humano. Por outro lado, um anticorpo humanizado preferivelmente inclui CDRs de um anticorpo derivado de um mamífero não humano e FRs e regiões C derivadas de um anticorpo humano. As regiões constantes derivadas de anticorpos humanos preferivelmente incluem uma região de ligação ao FcRn. Esses anticorpos incluem, por exemplo, IgGs (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). As regiões constantes usadas para os anticorpos humanizados da presente invenção podem ser regiões constantes de anticorpos de qualquer isótipo. A região constante da IgG humana é preferivelmente usada, embora não se limite a ela. As FRs derivadas de um anticorpo humano, que são usadas para os anticorpos humanizados, também não são particularmente limitadas, e podem ser derivadas de um anticorpo de qualquer isótipo.

[000172] As regiões variáveis e constantes de anticorpos quiméricos e humanizados da presente invenção podem ser modificadas por eliminação, substituição, inserção e/ou adição, e similares, desde que a especificidade de ligação dos anticorpos originais seja exibida.

[000173] Como a imunogenicidade no corpo humano está reduzida, considera-se que anticorpos quiméricos e humanizados que utilizam sequências derivadas de seres humanos sejam úteis quando administrados a seres humanos para fins terapêuticos ou similares.

[000174] Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados por qualquer método. Por exemplo, anticorpos cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 seja originalmente maior ou comparável com aquela em pH 7,4 podem ser artificialmente modificados por meio da substituição de histidina descrita acima, ou similares, de tal modo que sua atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 se torna menor do que aquela em pH 7,4. Alternativamente, anticorpos cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 seja menor do que aquela em pH 7,4 podem ser selecionados por avaliação de diversos anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de anticorpos ou hibridomas, como descrito abaixo.

[000175] Quando histidina substitui aminoácidos em um anticorpo, sequências conhecidas podem ser usadas para a sequência de aminoácidos da cadeia H ou da cadeia L do anticorpo, antes da introdução de mutações de histidina, ou sequências de aminoácidos de anticorpos recém-obtidas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica também podem ser usadas. Por exemplo, os anticorpos podem ser obtidos de uma biblioteca de anticorpos, ou podem ser obtidos por clonagem de genes que codificam anticorpos a partir de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais.

[000176] Em relação às bibliotecas de anticorpos, muitas bibliotecas de anticorpos já são conhecidas, e métodos para a produção de bibliotecas de anticorpos também são conhecidos; portanto, aqueles versados na técnica podem obter adequadamente bibliotecas de anticorpos. Por exemplo, em relação às bibliotecas de anticorpos de fago, pode-se referir à literatura como, por exemplo, Clackson e cols., Nature 1991, 352: 624-8; Marks e cols., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97; Waterhouses e cols., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2.265-6; Griffiths e cols., EMBO J. 1994, 13: 324.0-60; Vaughan e cols., Nature Biotechnology 1996,14: 309-14; e Publicação de Patente Japonesa Kohyo N° (JP-A) H20-504970 (publicação Japonesa não examinada de fase nacional que corresponde a uma publicação internacional não Japonesa). Além disso, é possível usar métodos conhecidos como, por exemplo, métodos que utilizam células eucarióticas como bibliotecas (WO 95/15393) e métodos de apresentação em ribossomo. Além disso, também são conhecidas tecnologias para a obtenção de anticorpos humanos por panning usando bibliotecas de anticorpos humanos. Por exemplo, regiões variáveis de anticorpos humanos podem ser expressas na superfície de fagos como anticorpos de cadeia única (scFvs) usando métodos de apresentação em fago, e fagos que se ligam aos antígenos podem ser selecionados. A análise genética dos fagos selecionados pode determinar as sequências de DNA que codificam as regiões variáveis de anticorpos humanos que se ligam aos antígenos. Após as sequências de DNA de scFvs que se ligam aos antígenos serem descritas, podem ser produzidos vetores de expressão adequados com base nessas sequências para a obtenção de anticorpos humanos. Esses métodos já são conhecidos, e é feita referência a WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 e WO 95/15388.

[000177] Como para os métodos para a obtenção de genes que codificam anticorpos a partir de hibridomas, podem ser basicamente usadas tecnologias conhecidas que envolvem o uso de antígenos desejados ou de células que expressam os antígenos desejados como antígenos sensibilizantes, utilizando-os para realizar imunizações de acordo com métodos convencionais de imunização, fundindo-se as células imunológicas resultantes com células parentes conhecidas por métodos convencionais de fusão de células, avaliando-se as células produtoras de anticorpo monoclonal (hibridomas) por métodos convencionais de avaliação, sintetizando-se cDNAs de regiões variáveis de anticorpo (regiões V) a partir de mRNAs dos hibridomas obtidos usando transcriptase reversa, e ligando-os com DNAs que codificam as regiões constantes de anticorpo desejadas (regiões C).

[000178] Mais especificamente, antígenos sensibilizantes para a obtenção dos genes de anticorpo descritos acima que codificam as cadeias H e as cadeias L incluem tanto antígenos completos com imunogenicidade quanto antígenos incompletos que incluem haptenos e similares, sem antigenicidade; no entanto, eles não estão limitados a esses exemplos. Por exemplo, é possível usar proteínas inteiras e peptídeos parciais de proteínas de interesse. Além disso, sabe-se que substâncias que compreendem polissacarídeos, ácidos nucleicos, lipídeos, e similares, podem ser antígenos. Dessa forma, os antígenos dos anticorpos da presente invenção não são particularmente limitados. Os antígenos podem ser preparados por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, por métodos baseados em baculovírus (por exemplo, WO 98146777) e similares. Hibridomas podem ser produzidos, por exemplo, pelo método de Milstein e cols. (G. Kohler e C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46) e similares. Quando a imunogenicidade de um antígeno é baixa, a imunização pode ser realizada após ligação do antígeno com uma macromolécula que possui imunogenicidade, por exemplo, albumina. Alternativamente, se necessário, os antígenos podem ser convertidos em antígenos solúveis por sua ligação com outras moléculas. Quando são usadas como antígenos moléculas transmembrana como, por exemplo, antígenos da membrana (por exemplo, receptores), porções das regiões extracelu- lares dos antígenos da membrana podem ser usadas como um fragmento, ou células que expressam moléculas transmembrana em sua superfície celular podem ser usadas como imunógenos.

[000179] Células produtoras de anticorpo podem ser obtidas por imunização de animais com o uso de antígenos sensibilizantes apropriados descritos acima. Alternativamente, células produtoras de anticorpo podem ser preparadas por imunização in vitro de linfócitos que podem produzir anticorpos. Vários mamíferos podem ser usados para imunização; animais comumente usados incluem roedores, lagomorfos e primatas. Esses animais incluem, por exemplo, roedores como, por exemplo, camundongos, ratos e hamsters; lagomorfos como, por exemplo, coelhos; e primatas, incluindo macacos como, por exemplo, macacos Cynomolgus, macacos rhesus, babuínos e chimpanzés. Além disso, animais transgênicos que carregam repertórios de genes de anticorpo humano também são conhecidos, e anticorpos humanos podem ser obtidos pela utilização desses animais (vide WO 96/34096; Mendez e cols., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56). Ao invés de utilizar esses animais transgênicos, por exemplo, anticorpos humanos desejados que possuem atividade de ligação contra antígenos podem ser obtidos por sensibilização in vitro de linfócitos humanos com antígenos desejados ou com células que expressam os antígenos desejados, e depois fundindo os linfócitos sensibilizados com células de mieloma humano como, por exemplo, U266 (vide a Publicação de Pedido de Patente Japonesa Kokoku N° (JP-B) H01-59878 (pedido de patente Japonesa examinada, aprovada, publicada para oposição)). Além disso, os anticorpos humanos desejados podem ser obtidos por imunização de animais transgênicos que carregam um repertório completo de genes de anticorpo humano com antígenos desejados (vide WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96134096 e WO 96/33735).

[000180] A imunização do animal pode ser feita diluindo-se e suspendendo-se apropriadamente um antígeno sensibilizante em solução salina tamponada com fosfato (PBS), soro fisiológico, ou similar, e misturando-o com um adjuvante para emulsificar, se necessário. Este é então injetado por via intraperitoneal ou subcutânea em animais. A seguir, o antígeno sensibilizante misturado com adjuvante incompleto de Freund é administrado preferivelmente várias vezes a cada quatro a 21 dias. A produção de anticorpo pode ser confirmada por medida da titulação do anticorpo de interesse em soros animais com o uso de métodos convencionais.

[000181] As células produtoras de anticorpo obtidas a partir de linfócitos ou animais imunizados com um antígeno desejado podem ser fundidas com células de mieloma para gerar hibridomas com o uso de agentes de fusão convencionais (por exemplo, polietileno glicol) (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, 1986, 59-103). Quando necessário, as células do hibridoma podem ser cultivadas e desenvolvidas, e a especificidade de ligação do anticorpo produzido a partir desses hibridomas pode ser medida com o uso de métodos de análise conhecidos, por exemplo, imunopreci- pitação, radioimunoensaio (RIA) e ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). A seguir, os hibridomas que produzem anticorpos de interesse cuja especificidade, afinidade ou atividade foi determinada podem ser subclonados por métodos como, por exemplo, diluição limitante.

[000182] A seguir, os genes que codificam os anticorpos selecionados podem ser clonados a partir de hibridomas ou células produtoras de anticorpo (linfócitos sensibilizados, e similares) com o uso de sondas que podem se ligar especificamente aos anticorpos (por exemplo, oligonucleotídeos complementares às sequências que codificam as regiões constantes de anticorpo). Também é possível clonar os genes a partir de mRNA usando RT-PCR. As imunoglobulinas são classificadas em cinco classes diferentes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Essas classes são ainda divididas em várias subclassees (isótipos) (por exemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2; e similares). As cadeias H e as cadeias L usadas na presente invenção para a produção anticorpos não são particularmente limitadas, e podem se originar de anticorpos que pertencem a qualquer uma dessas classes ou subclassees; no entanto, IgG é particularmente preferida.

[000183] Nesse pedido, é possível modificar os genes que codificam a cadeia H e os genes que codificam a cadeia L usando tecnologias de engenharia genética. Anticorpos modificados geneticamente como, por exemplo, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, que foram modificados artificialmente com o objetivo de diminuir a imunogenici- dade heteróloga contra seres humanos, podem ser produzidos apropriadamente para anticorpos como, por exemplo, anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de hamster, anticorpos de carneiros e anticorpos de camelos. Anticorpos quiméricos são anticorpos que incluem regiões variáveis da cadeia H e da cadeia L de um anticorpo de um mamífero não humano, por exemplo, anticorpo de camundongo, e as regiões constantes da cadeia H e da cadeia L de anticorpos humanos. Anticorpos quiméricos podem ser obtidos por ligação de um DNA que codifica uma região variável de um anticorpo de camundongo a um DNA que codifica uma região constante de um anticorpo humano, inserção deste em um vetor de expressão e introdução do vetor em um hospedeiro para produzir o anticorpo. Um anticorpo humanizado, também denominado anticorpo humano remodelado, pode ser sintetizado por PCR com o uso de vários oligonu- cleotídeos produzidos, de tal modo que eles tenham porções superpôs- tas nas extremidades das sequências de DNA designadas para ligar as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo de um mamífero não humano como, por exemplo, um camundongo. O DNA resultante pode ser ligado a um DNA que codifica uma região constante de anticorpo humano. O DNA ligado pode ser inserido em um vetor de expressão, e o vetor pode ser introduzido em um hospedeiro para produzir o anticorpo (vide EP 239400 e WO 96/02576). FRs de anticorpo humano que estão ligadas por meio da CDR são selecionadas quando a CDR forma uma ligação favorável ao sítio do antígeno. Se necessário, os aminoácidos na região framework de uma região variável de anticorpo podem ser substituídos de tal forma que a CDR do anticorpo humano remodelado forme uma ligação adequada ao sítio do antígeno (K. Sato e cols., Cancer Res. 1993, 53: 10.01-10.06).

[000184] Além da humanização descrita acima, os anticorpos podem ser modificados para aprimorar suas propriedades biológicas, por exemplo, a ligação ao antígeno. Na presente invenção, essas modificações podem ser obtidas por métodos como, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida (vide, por exemplo, Kunkel (1910.0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), mutagênese por PCR e mutagênese com cassete. Em geral, os anticorpos mutantes cujas propriedades biológicas foram aprimoradas apresentam homologia e/ou similaridade de sequência de aminoácidos de 70% ou maior, mais preferivelmente, 80% ou maior e, ainda mais preferivelmente, 90% ou maior (por exemplo, 95% ou maior, 97%, 98% ou 99%), quando comparada com a sequência de aminoáci- dos da região variável de anticorpo original. Nesse pedido, homologia e/ou similaridade de sequência é definida como a proporção de resíduos de aminoácidos que são homólogos (o mesmo resíduo) ou similares (resíduos de aminoácidos classificados no mesmo grupo com base nas propriedades gerais de cadeias laterais de aminoácidos) aos resíduos do anticorpo original, após o valor da homologia de sequência ter sido maximizada por alinhamento de sequências e introdução de lacunas (gaps), se necessário. Em geral, resíduos de aminoácidos naturais são classificados em grupos com base nas características de suas cadeias laterais da seguinte forma: (1) hidrofóbicos: alanina, isoleucina, valina, metionina e leucina; (2) hidrofílicos neutros: asparagina, glutamina, cisteína, treonina e serina; (3) ácidos: ácido aspártico e ácido glutâmico; (4) básicos: arginina, histidina e lisina; (5) resíduos que afetam a orientação da cadeia: glicina e prolina; e (6) aromáticos: tirosina, triptofano e fenilalanina.

[000185] Em geral, um total de seis regiões determinantes de comple-mentaridade (CDRs; regiões hipervariáveis) presentes nas regiões variáveis da cadeia H e da cadeia L interagem umas com as outras para formar um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Uma região variável isoladamente também é conhecida por ser capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno, embora sua afinidade seja menor do que a afinidade do sítio de ligação inteiro. Dessa forma, genes de anticorpo que codificam a cadeia H e cadeia L da presente invenção podem codificar fragmentos, cada um incluindo o sítio de ligação ao antígeno da cadeia H ou da cadeia L, desde que o polipeptídeo codificado pelo gene retenha a atividade de ligação ao antígeno desejado.

[000186] Como descrito acima, a região variável da cadeia pesada é, em geral, constituída por três CDRs e quatro FRs. Em uma modalidade preferida da presente invenção, os resíduos de aminoácidos a serem "modificados" podem ser selecionados apropriadamente a partir de resíduos de aminoácidos, por exemplo, em uma CDR ou FR. Em geral, as modificações de resíduos de aminoácidos nas CDRs podem reduzir a habilidade de ligação ao antígeno. Dessa forma, resíduos de aminoácidos apropriados a serem "modificados" na presente invenção são selecionados preferivelmente a partir de resíduos de aminoácidos nas FRs, mas não se limitam a estes. É possível selecionar aminoácidos em uma CDR, desde que a modificação tenha sido confirmada como não redutora da habilidade de ligação. Alternativamente, pela utilização de bases de dados públicas ou similares, aqueles versados na técnica podem obter sequências apropriadas que podem ser usadas como uma FR de região variável de anticorpo de um organismo como, por exemplo, um ser humano ou um camundongo.

[000187] Além disso, a presente invenção fornece genes que codificam os anticorpos da presente invenção. Os genes que codificam os anticorpos da presente invenção podem ser quaisquer genes, e podem ser DNAs, RNAs, análogos de ácido nucleico, ou similares.

[000188] Além disso, a presente invenção também fornece células hospedeiras que carregam os genes descritos acima. As células hospedeiras não são particularmente limitadas, e incluem, por exemplo, células de E. coli e células de vários animais. As células hospedeiras podem ser usadas, por exemplo, como um sistema de produção para produzir e expressar os anticorpos da presente invenção. Sistemas de produção in vitro e in vivo estão disponíveis para sistemas de produção de polipeptídeo. Esses sistemas de produção in vitro incluem, por exemplo, sistemas de produção com a utilização de células eucarióticas ou células procarióticas.

[000189] Células eucarióticas que podem ser usadas como células hospedeiras incluem, por exemplo, células animais, células de plantas e células fúngicas. Células animais incluem: células de mamíferos, por exemplo, células CHO (J. Exp. Med., (1995) 108: 94.0), COS, HEK293, 3T3, de mieloma, BHK (rim de filhote de hamster), HeLa e Vero; células de anfíbios como, por exemplo, oócitos de Xenopus laevis (Valle e cols., Nature (1981) 291: 338-340); e células de inseto como, por exemplo, células Sf9, Sf21 e Tn5. Células CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7, células HEK293 e células BHK são usadas preferivelmente para expressar os anticorpos da presente invenção. Entre as células animais, as células CHO são particularmente preferíveis para expressão em larga escala. Vetores podem ser introduzidos em células hospedeiras, por exemplo, por métodos de fosfato de cálcio, métodos de DEAE-dextrana, métodos que utilizam lipossomo catiônico DOTAP (Boehringer- Mannheim), métodos de eletroporação e métodos de lipofecção.

[000190] Em relação às células de plantas, por exemplo, células derivadas de Nicotiana tabacum e de lentilha d'água (Lonna minor) são conhecidas como um sistema de produção de proteína. Calos podem ser cultivados a partir dessas células para a produção dos anticorpos da presente invenção. Em relação às células fúngicas, sistemas de expressão de proteína conhecidos são aqueles que utilizam células de levedura, por exemplo, células do gênero Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pombe); e células de fungos filamentosos, por exemplo, do gênero Aspergillus (por exemplo, Aspergillus niger). Essas células podem ser usadas como um hospedeiro para produção dos anticorpos da presente invenção.

[000191] Células bacterianas podem ser usadas em sistemas de produção procarióticos. Em relação às células bacterianas, são conhecidos os sistemas de produção que utilizam Bacillus subtilis, além dos sistemas de produção que utilizam E. coli descritos acima. Esses sistemas podem ser usados na produção dos anticorpos da presente invenção.

Métodos de Avaliação

[000192] A presente invenção fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH ácido é menor do que aquela em pH neutro. A presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno que podem se ligar individualmente a vários antígenos. A presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno que são superiores na retenção no plasma. A presente invenção também fornece métodos de avaliação de uma molécula de ligação ao antígeno que se dissocia dentro de uma célula de um antígeno ligado extracelularmente. A presente invenção também fornece métodos de avaliação de uma molécula de ligação ao antígeno que está ligada a um antígeno e internalizada em uma célula, e liberada para fora da célula em uma forma livre de antígeno. A presente invenção também fornece métodos de avaliação de uma molécula de ligação ao antígeno que possui habilidade aumentada para eliminar antígenos no plasma. Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno que são particularmente úteis quando usadas como composições farmacêuticas.

[000193] Especificamente, a presente invenção fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) determinação da atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0; (b) determinação da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5; e (c) seleção de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é maior do que a atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5.

[000194] Nos métodos de avaliação da presente invenção, a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 não é particularmente limitada, desde que seja uma atividade de ligação ao antígeno em um pH entre pH 6,7 e pH 10,0. No entanto, por exemplo, uma atividade de ligação ao antígeno preferida é uma atividade de ligação ao antígeno em um pH entre pH 7,0 e pH 8,0, e uma atividade de ligação ao antígeno mais preferida é uma atividade de ligação ao antígeno em pH 7,4. Além disso, a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 não é particularmente limitada, desde que seja uma atividade de ligação ao antígeno em um pH entre pH 4,0 e pH 6,5. No entanto, por exemplo, uma atividade de ligação ao antígeno preferida é uma atividade de ligação ao antígeno em um pH entre pH 5,5 ao pH 6,5 e, uma atividade de ligação ao antígeno mais preferida, é uma atividade de ligação ao antígeno em pH 5,8 ou pH 5,5.

[000195] A atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Outras condições além do pH podem ser apropriadamente determinadas por aqueles versados na técnica. A atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno pode ser avaliada como constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD aparente), taxa de dissociação (kd), taxa de dissociação aparente (kd aparente), ou similares. Essas constantes podem ser determinadas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, com o uso de Biacore (GE Healthcare), Scatchard plot ou FACS.

[000196] Nesse pedido, o termo "etapa de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é maior do que em pH 4,0 ao pH 6,5" possui o mesmo significado que "etapa de seleção de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 é menor do que aquela em pH 6,7 ao pH 10,0".

[000197] A diferença entre a atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 e aquela em pH 4,0 ao pH 6,5 não é particularmente limitada, desde que a atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 seja maior do que em pH 4,0 ao pH 6,5. No entanto, a atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é preferivelmente duas vezes ou maior, mais preferivelmente, dez vezes ou maior e, ainda mais preferivelmente, 40 vezes ou maior do que a atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5.

[000198] Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a um antígeno sob uma condição de pH 6,7 ao pH 10,0; (b) colocação da molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno de (a) sob uma condição de pH 4,0 ao pH 6,5; e (c) obtenção da molécula de ligação ao antígeno que se dissociou sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5.

[000199] Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que não se liga a um antígeno sob uma condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (b) ligação da molécula de ligação ao antígeno selecionado em (a) a um antígeno sob uma condição de pH 6,7 ao pH 10,0; e (c) obtenção da molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno sob a condição de pH 6,7 ao pH 10,0.

[000200] Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a um antígeno sob uma condição de pH 6,7 ao pH 10,0; (b) colocação da molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno de (a) sob uma condição de pH 4„0 ao pH 6,5; (c) obtenção da molécula de ligação ao antígeno que se dissociou sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (d) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno que se dissociou; e (e) obtenção da molécula de ligação ao antígeno eluído.

[000201] As etapas de (a) a (d) podem ser repetidas duas ou mais vezes. Dessa forma, a presente invenção fornece os métodos descritos acima, que ainda incluem uma etapa de repetição das etapas (a) a (d) duas ou mais vezes. O número para a repetição das etapas de (a) a (d) não é particularmente limitado; no entanto, o número é, em geral, dez ou menos.

[000202] Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que não se liga a um antígeno sob uma condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (b) ligação da molécula de ligação ao antígeno selecionado em (a) a um antígeno sob uma condição de pH 6,7 ao pH 10,0; (c) obtenção da molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno sob a condição de pH 6,7 ao pH 10,0: (d) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno que se dissociou; e (e) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído.

[000203] As etapas de (a) a (d) podem ser repetidas duas ou mais vezes. Dessa forma, a presente invenção fornece os métodos descritos acima, que ainda incluem uma etapa de repetição das etapas de (a) a (d) duas ou mais vezes. O número para a repetição das etapas de (a) a (d) não é particularmente limitado; no entanto, o número é, em geral, dez ou menos.

[000204] Quando uma biblioteca de fagos, ou similar, é usada nos métodos de avaliação da presente invenção, a etapa de amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno também pode ser uma etapa de amplificação de fagos.

[000205] Nos métodos da presente invenção, a ligação da molécula de ligação ao antígeno e do antígeno pode ser realizada sob qualquer estado, sem limitação particular. Por exemplo, a ligação da molécula de ligação ao antígeno e do antígeno pode ser realizada por contato de um antígeno com uma molécula de ligação ao antígeno imobilizado, ou por contado de uma molécula de ligação ao antígeno com um antígeno imobilizado. Alternativamente, a ligação da molécula de ligação ao antígeno e do antígeno pode ser realizada por contato do antígeno e da molécula de ligação ao antígeno em uma solução.

[000206] Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreendem as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma coluna com antígeno imobilizado sob a condição de um primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno que se ligou à coluna no primeiro pH da coluna sob a condição de um segundo pH; e (c) obtenção da molécula de ligação ao antígeno eluído.

[000207] Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é menor do que aquela em um segundo pH, que compreendem as etapas de: (a) passagem de uma molécula de ligação ao antígeno através de uma coluna com antígeno imobilizado sob a condição de um primeiro pH; (b) coleta da molécula de ligação ao antígeno que eluiu sem ligação à coluna na etapa (a); (c) ligação da molécula de ligação ao antígeno coletada em (b) a uma coluna sob a condição de um segundo pH; e (d) obtenção da molécula de ligação ao antígeno que se ligou à coluna na etapa (c).

[000208] Além disso, a presente invenção também fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreendem as etapas de: (a) ligação de uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno a uma coluna com antígeno imobilizado sob a condição de um primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno da coluna sob a condição de um segundo pH; (c) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno eluído; e (d) obtenção da molécula de ligação ao antígeno eluído.

[000209] As etapas de (a) a (c) podem ser repetidas duas ou mais vezes. Dessa forma, a presente invenção fornece os métodos descritos acima, que ainda incluem a etapa de repetição das etapas de (a) a (c) duas ou mais vezes. O número para a repetição das etapas de (a) a (c) não é particularmente limitado; no entanto, o número é, em geral, dez ou menos.

[000210] Na presente invenção, cada um do primeiro e segundo pHs pode ser qualquer pH, desde que não sejam idênticos. Em uma combinação preferida do primeiro e do segundo pHs, por exemplo, o primeiro pH é entre pH 6,7 e pH 10,0, e o segundo pH é entre pH 4,0 e pH 6,5; em uma combinação mais preferida, o primeiro pH é entre pH 7,0 e pH 8,0, e o segundo pH é entre pH 5,5 e pH 6,5; e em uma combinação ainda mais preferida, o primeiro pH é pH 7,4 e o segundo pH é pH 5,8 ou pH 5,5.

[000211] Em outra combinação preferida do primeiro e do segundo pHs, por exemplo, o primeiro pH é entre pH 4,0 e pH 6,5, e o segundo pH é entre pH 6,7 e pH 10,0; em uma combinação mais preferida, o primeiro pH é entre pH 5,5 e pH 6,5, e o segundo pH é entre pH 7,0 e pH 8,0; e em uma combinação ainda mais preferida, o primeiro pH é pH 5,8 ou pH 5,5 e o segundo pH é pH 7,4.

[000212] As moléculas de ligação ao antígeno que são avaliadas pelos métodos da presente invenção podem ser quaisquer moléculas de ligação ao antígeno. Por exemplo, é possível usar as moléculas de ligação ao antígeno descritas acima na avaliação da presente invenção. Por exemplo, é possível avaliar moléculas de ligação ao antígeno que incluem sequências ou moléculas de ligação ao antígeno naturais, incluindo sequências de aminoácidos com substituições. Moléculas de ligação ao antígeno preferidas que são avaliadas na presente invenção incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno nas quais pelo menos um aminoácido é substituído com histidina ou pelo menos uma histidina é inserida. O sítio de introdução da substituição ou da inserção de histidina não é particularmente limitado, e pode ser introduzido em qualquer sítio. Além disso, a substituição ou inserção de histidina pode ser introduzida em um sítio, ou pode ser introduzida em dois ou mais sítios. Além disso, moléculas de ligação ao antígeno preferidas que são avaliadas na presente invenção incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno que incluem regiões constantes de anticorpo modificadas.

[000213] As moléculas de ligação ao antígeno que são avaliadas pelos métodos da presente invenção podem ser diversas moléculas de ligação ao antígeno diferentes introduzidas com substituições ou inserções de histidina em sítios diferentes, por exemplo, por varredura de histidina.

[000214] Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ainda compreender a etapa de substituição de pelo menos um aminoácido na molécula de ligação ao antígeno com histidina ou a inserção de pelo menos uma histidina na molécula de ligação ao antígeno.

[000215] Nos métodos de avaliação da presente invenção, podem ser usados aminoácidos não naturais ao invés de histidina. Portanto, a presente invenção também pode ser compreendida por substituição da histidina mencionada acima com aminoácidos não naturais.

[000216] Além disso, os métodos de avaliação da presente invenção podem ainda compreender a etapa de modificação de aminoácidos de regiões constantes de anticorpo.

[000217] Substâncias de ligação ao antígeno que são avaliadas pelos métodos de avaliação da presente invenção podem ser preparadas por qualquer método. Por exemplo, é possível usar anticorpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (bibliotecas de fagos e similares), anticorpos e bibliotecas que são preparadas a partir de hibridomas obtidos por imunização de animais ou a partir de células B de animais imunizados, anticorpos e bibliotecas (bibliotecas com alto teor de histidina ou de aminoácido não natural, bibliotecas introduzidas com histidina ou aminoácido não natural em sítios específicos, e similares) preparados por introdução de mutações de histidina ou mutações de aminoácidos não naturais nos anticorpos e bibliotecas descritos acima, e assim por diante.

[000218] As moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao antígeno várias vezes, que são, dessa forma, superiores na retenção no plasma, podem ser obtidas pelos métodos de avaliação da presente invenção. Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação para a obtenção de moléculas de ligação ao antígeno que são superiores na retenção no plasma.

[000219] Além disso, as moléculas de ligação ao antígeno que podem se ligar ao antígeno duas ou mais vezes quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos, podem ser obtidas pelos métodos de avaliação da presente invenção. Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação para a obtenção de moléculas de ligação ao antígeno que podem se ligar ao antígeno duas ou mais vezes.

[000220] Além disso, as moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se ligar a mais antígenos, quando comparado com o número de seus sítios de ligação ao antígeno quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos, podem ser obtidas pelos métodos de avaliação da presente invenção. Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação para a obtenção de moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se ligar a mais antígenos, quando comparado com o número de seus sítios de ligação ao antígeno. Por exemplo, quando o anticorpo é um anticorpo neutralizante, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação para a obtenção de moléculas de ligação ao antígeno que podem neutralizar mais antígenos, quando comparado com o número dos sítios de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno.

[000221] Além disso, moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se dissociar dentro de uma célula de um antígeno ligado extracelularmente quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos, podem ser obtidas pelos métodos de avaliação da presente invenção. Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação para a obtenção de moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se dissociar dentro de uma célula de um antígeno ligado extracelularmente.

[000222] Além disso, moléculas de ligação ao antígeno que estão ligadas a um antígeno e internalizadas em uma célula e liberadas para fora da célula em uma forma livre de antígeno quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos, podem ser obtidas pelos métodos de avaliação da presente invenção. Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação para a obtenção de moléculas de ligação ao antígeno que estão ligadas a um antígeno e internalizadas em uma célula, e liberadas para fora da célula em uma forma livre de antígeno.

[000223] Além disso, moléculas de ligação ao antígeno que podem rapidamente eliminar antígenos no plasma quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos, podem ser obtidas pelos métodos de avaliação da presente invenção. Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação para a obtenção de moléculas de ligação ao antígeno com habilidade aumentada (elevada) para eliminar antígenos no plasma.

[000224] Além disso, espera-se que essas moléculas de ligação ao antígeno sejam especialmente superiores como substâncias farmacêuticas, pois a dose e a frequência de administração em pacientes podem ser reduzidas e, consequentemente, a dosagem total pode ser reduzida. Dessa forma, os métodos de avaliação da presente invenção podem ser usados como métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno para uso como composições farmacêuticas.

[000225] Além disso, a presente invenção fornece bibliotecas nas quais o teor de histidina está aumentado, quando comparadas com as bibliotecas originais. Bibliotecas que contêm moléculas de ligação ao antígeno com teor aumentado de histidina podem ser usadas nos métodos de avaliação descritos acima e nos métodos de produção descritos a seguir.

[000226] Bibliotecas com teor aumentado de histidina podem ser preparadas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, que incluem o seguinte método: vinte tipos de códons tripletos (trinucleotídeos) que codificam 20 tipos de aminoácidos podem ser incorporados em uma frequência igual quando se sintetizam ácidos nucleicos para preparar uma biblioteca pelo método de trinucleotídeo (J. Mol Biol. Fevereiro de 2008 29; 376 (4): 1.182-200). Como resultado, pode se fazer com que a posição mutada para biblioteca contenha 20 tipos de aminoácidos em probabilidade igual. A frequência de histidina na posição mutada para a biblioteca pode ser aumentada por aumento da proporção de um trinucleotídeo que codifica histidina, quando comparado com os aminoácidos restantes entre os 20 tipos na síntese.

<Métodos para a Produção de Moléculas de Ligação ao Antígeno>

[000227] A presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno no pH endossômico é menor do que aquela no pH do plasma. A presente invenção também fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno que são superiores na retenção no plasma. A presente invenção também fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno que são especialmente úteis quando usadas como composições farmacêuticas.

[000228] Especificamente, a presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) determinação da atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0; (b) determinação da atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5; (e) seleção de uma molécula de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é maior do que em pH 4,0 ao pH 6,5; (d) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno selecionado em (c); e (c) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (d).

[000229] A presente invenção também fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a um antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0; (b) permissão de que a molécula de ligação ao antígeno ligada ao antígeno de (a) permaneça sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (c) coleta da molécula de ligação ao antígeno que se dissociou sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (d) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno obtida em (o); e (e) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (d).

[000230] Além disso, a presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que não se liga ao antígeno sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (b) ligação do antígeno sob a condição de pH 6,7 ao pH 10,0 à molécula de ligação ao antígeno selecionado em (a); (c) coleta da molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno sob a condição de pH 6,7 ao pH 10,0; (d) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno coletada em (c); e (e) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (d).

[000231] Além disso, a presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a um antígeno sob a condição de pH 6,7 a 10,0; (b) permitir que a molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno em (a) permaneça sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (c) coleta da molécula de ligação ao antígeno que se dissociou sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (d) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno dissociada; (e) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído; (f) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno coletada em (e); e (g) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (f).

[000232] As etapas (a) a (d) podem ser repetidas duas ou mais vezes. Dessa forma, a presente invenção fornece os métodos descritos acima, que ainda compreendem a etapa de repetição das etapas (a) a (d) duas ou mais vezes. O número de vezes em que as etapas (a) a (d) são repetidas não é particularmente limitado; no entanto, ele é geralmente dez vezes ou menos.

[000233] Além disso, a presente invenção fornece métodos de avaliação de moléculas de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de: (a) seleção de uma molécula de ligação ao antígeno que não se liga ao antígeno sob a condição de pH 4,0 ao pH 6,5; (h) ligação do antígeno sob a condição de pH 6,7 ao pH 10,0 à molécula de ligação ao antígeno selecionado em (a); (i) coleta da molécula de ligação ao antígeno que se ligou ao antígeno sob a condição de pH 6,7 ao pH 10,0; (j) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno dissociada; (k) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído; (l) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno coletada em (e); e (m) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (f).

[000234] As etapas (a) a (d) podem ser repetidas duas ou mais vezes. Dessa forma, a presente invenção fornece os métodos descritos acima, que ainda compreendem a etapa de repetição das etapas (a) a (d) duas ou mais vezes. O número de vezes em que as etapas (a) a (d) são repetidas não é particularmente limitado; no entanto, ele é geralmente dez vezes ou menos.

[000235] Além disso, a presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreendem as etapas de: (a) ligação da molécula de ligação ao antígeno a uma coluna imobilizada com antígeno sob a condição do primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno, que está ligada à coluna sob a condição do primeiro pH da coluna sob a condição de um segundo pH; (c) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído; (d) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno coletada em (c); e (e) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (d).

[000236] Além disso, a presente invenção fornece métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação em um primeiro pH é maior do que aquela em um segundo pH, que compreendem as etapas de: (a) ligação de uma biblioteca de moléculas de ligação ao antígeno a uma coluna imobilizada com antígeno sob a condição do primeiro pH; (b) eluição da molécula de ligação ao antígeno da coluna sob a condição do segundo pH; (c) amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno eluído; (d) coleta da molécula de ligação ao antígeno eluído; (e) obtenção do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno coletada em (d); e (f) produção da molécula de ligação ao antígeno usando o gene obtido em (c).

[000237] As etapas (a) a (c) podem ser repetidas duas ou mais vezes. Dessa forma, a presente invenção fornece os métodos descritos acima, que ainda compreendem a etapa de repetição das etapas (a) a (c) duas ou mais vezes. O número de vezes em que as etapas (a) a (c) são repetidas não é particularmente limitado; no entanto, ele é geralmente dez vezes ou menos.

[000238] Quando uma biblioteca de fagos, ou similar, é usada nos métodos de produção da presente invenção, a etapa de amplificação do gene que codifica a molécula de ligação ao antígeno pode ser a etapa de amplificação de fagos.

[000239] As substâncias de ligação ao antígeno que são usadas nos métodos de produção da presente invenção podem ser preparadas por qualquer método. Por exemplo, é possível usar anticorpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (bibliotecas de fagos e similares), anticorpos e bibliotecas que são preparadas a partir de hibridomas obtidos por imunização de animais ou a partir de células B de animais imunizados, anticorpos e bibliotecas (bibliotecas com alto teor de histidina ou de aminoácido não natural, bibliotecas introduzidas com histidina ou aminoácido não natural em sítios específicos, e similares) preparados por introdução de mutações de histidina ou mutações de aminoácidos não naturais nos anticorpos e bibliotecas descritos acima, e assim por diante.

[000240] Nos métodos de produção descritos acima, a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 não é particularmente limitada, desde que a atividade de ligação ao antígeno seja aquela em um pH entre pH 6,7 e pH 10,0. Uma atividade de ligação ao antígeno preferida é aquela em um pH entre pH 7,0 e pH 8,0 e, uma atividade de ligação ao antígeno mais preferida, é aquela em pH 7,4. Alternativamente, a atividade de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 não é particularmente limitada, desde que a atividade de ligação ao antígeno seja aquela em um pH entre pH 4,0 e pH 6,5. A atividade de ligação ao antígeno preferida é aquela em um pH entre pH 5,5 ao pH 6,5 e, uma atividade de ligação ao antígeno mais preferida, é aquela em pH 5,8 ou pH 5,5.

[000241] A atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Condições além do pH podem ser determinadas apropriadamente por aqueles versados na técnica.

[000242] A etapa de seleção de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é maior do que em pH 4,0 ao pH 6,5 é sinônima à etapa de seleção de moléculas de ligação ao antígeno cuja atividade de ligação ao antígeno em pH 4,0 ao pH 6,5 é menor do que aquela em pH 6,7 ao pH 10,0.

[000243] A diferença na atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 e em pH 4,0 ao pH 6,5 não é particularmente limitada, desde que a atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 seja maior do que em pH 4,0 ao pH 6,5. A atividade de ligação ao antígeno em pH 6,7 ao pH 10,0 é preferivelmente duas vezes ou maior, mais preferivelmente, dez vezes ou maior e, ainda mais preferivelmente, 40 vezes ou maior do que aquela em pH 4,0 ao pH 6,5.

[000244] Nos métodos de produção descritos acima, a molécula de ligação ao antígeno pode ser ligada ao antígeno sob qualquer condição, e a condição não é particularmente limitada. Por exemplo, a molécula de ligação ao antígeno pode ser ligada ao antígeno por contato do antígeno com a molécula de ligação ao antígeno imobilizado, ou por contato da molécula de ligação ao antígeno com o antígeno imobilizado. Alternativamente, a molécula de ligação ao antígeno pode ser ligada ao antígeno por contato do antígeno e da molécula de ligação ao antígeno em uma solução.

[000245] Nos métodos de produção descritos acima, cada um do primeiro e do segundo pHs pode ser qualquer pH, desde que não sejam idênticos. Em uma combinação preferida do primeiro e do segundo pHs, por exemplo, o primeiro pH é entre pH 6,7 e pH 10,0, e o segundo pH é entre pH 4,0 e pH 6,5; em uma combinação mais preferida, o primeiro pH é entre pH 7,0 e pH 8,0, e o segundo pH é entre pH 5,5 e pH 6,5; e em uma combinação ainda mais preferida, o primeiro pH é pH 7,4 e o segundo pH é pH 5,8 ou pH 5,5.

[000246] Em outra combinação preferida do primeiro e do segundo pHs, por exemplo, o primeiro é entre pH 4,0 e pH 6,5, e o segundo pH é entre pH 6,7 e pH 10,0; em uma combinação mais preferida, o primeiro pH é entre pH 5,5 e pH 6,5, e o segundo pH é entre pH 7,0 e pH 8,0; e em uma combinação ainda mais preferida, o primeiro pH é pH 5,8 ou pH 5,5 e o segundo pH é pH 7,4.

[000247] As moléculas de ligação ao antígeno que são produzidas pelos métodos de produção descritos acima podem ser quaisquer moléculas de ligação ao antígeno. Moléculas de ligação ao antígeno preferidas incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno nas quais pelo menos um aminoácido é substituído com histidina ou pelo menos uma histidina foi inserida. O sítio onde esta mutação de histidina é introduzida não é particularmente limitado e pode ser introduzida em qualquer sítio. Além disso, a mutação de histidina pode ser introduzida em um sítio ou em dois ou mais sítios.

[000248] Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ainda compreender a etapa de substituição de pelo menos um aminoácido em uma molécula de ligação ao antígeno com histidina ou a inserção de pelo menos uma histidina em moléculas de ligação ao antígeno.

[000249] Nos métodos de produção da presente invenção, podem ser usados aminoácidos não naturais ao invés de histidina. Portanto, a presente invenção também pode ser compreendida por substituição da histidina mencionada acima com aminoácidos não naturais.

[000250] Além disso, em outra modalidade, as moléculas de ligação ao antígeno que são produzidas pelos métodos de produção descritos acima incluem, por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno que incluem regiões constantes de anticorpo modificadas. Consequentemente, os métodos de produção da presente invenção podem ainda compreender a etapa de modificação dos aminoácidos de regiões constantes de anticorpo.

[000251] As moléculas de ligação ao antígeno que são produzidas pelos métodos de produção da presente invenção são superiores na retenção no plasma. Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno que são superiores na retenção no plasma.

[000252] Além disso, espera-se que as moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção sejam capazes de ligação ao antígeno duas ou mais vezes quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos. Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se ligar a o antígeno duas ou mais vezes.

[000253] Além disso, espera-se que as moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção sejam capazes de ligação a mais antígenos, quando comparado com o número de seus sítios de ligação ao antígeno quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos. Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se ligar a mais antígenos, quando comparado com o número de seus sítios de ligação ao antígeno.

[000254] Além disso, espera-se que as moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção sejam capazes de se dissociar dentro de uma célula de um antígeno ligado extracelularmente quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos. Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de se dissociar dentro de uma célula de um antígeno ligado extracelularmente.

[000255] Além disso, espera-se que as moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção sejam capazes de serem ligadas a um antígeno e internalizadas em uma célula, bem como de serem liberadas para fora da célula em uma forma livre de antígeno, quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos. Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno que são capazes de serem ligadas a um antígeno e internalizadas em uma célula e serem liberadas para fora da célula em uma forma livre de antígeno.

[000256] Além disso, espera-se que as moléculas de ligação ao antígeno que são produzidas pelos métodos de produção da presente invenção sejam capazes de eliminar rapidamente antígenos do plasma quando administradas a animais como, por exemplo, seres humanos, camundongos ou macacos. Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como um método para a produção de moléculas de ligação ao antígeno com habilidade aumentada (elevada) para eliminar antígenos no plasma.

[000257] Além disso, essas moléculas de ligação ao antígeno podem reduzir o número de doses em pacientes e espera-se que sejam especialmente superiores como substâncias farmacêuticas. Dessa forma, os métodos de produção da presente invenção podem ser usados como métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno para uso como composições farmacêuticas.

[000258] Os genes obtidos pelos métodos de produção da presente invenção são tipicamente carregados (inseridos) em vetores apropriados, e depois introduzidos em células hospedeiras. Os vetores não são particularmente limitados, desde que retenham estavelmente os ácidos nucleicos inseridos. Por exemplo, quando Escherichia coli (E. coli) é usada como o hospedeiro, vetores de clonagem preferidos incluem o vetor pBluescript (Stratagene); no entanto, vários vetores disponíveis comercialmente podem ser usados. Quando se utilizam vetores para produzir as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, vetores de expressão são particularmente úteis. Os vetores de expressão não são particularmente limitados, desde que os vetores expressem as moléculas de ligação ao antígeno in vitro, em E. coli, em células em cultura ou em um corpo de um organismo. Por exemplo, o vetor pBEST (Promega) é preferido para expressão in vitro; o vetor pET (Invitrogen) é preferido para E. coli; o vetor pME18S-FL3 (N° de Acesso no GenBank AB009864) é preferido para células em cultura; e o vetor pME18S (Mol. Cell. Biol. 8: 466-472 (1988)) é preferido para corpos de organismos. Os DNAs da presente invenção podem ser inseridos nos vetores por métodos convencionais, por exemplo, por ligação com o uso de sítios de enzima de restrição ("Current protocols in Molecular Biology", edit. Ausubel e cols., (1987) Public. John Wiley & Sons, Seção 11.4-11.11).

[000259] As células hospedeiras acima não são particularmente limitadas, e várias células hospedeiras podem ser usadas, dependendo da finalidade. exemplos de células para expressão das moléculas de ligação ao antígeno incluem células bacterianas (tais como aquelas de Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces e Bacillus subtilis), células eucarióticas (tais como aquelas de levedura e Aspergillus), células de inseto (tais como de Drosophila 82 e Spodoptera SF9), células animais (por exemplo, células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293 e de melanoma de Bowes), e células de plantas. Os vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira por métodos conhecidos, por exemplo, métodos de precipitação de fosfato de cálcio, métodos de eletroporação ("Current protocols in Molecular Biology" edit. Ausubel e cols. (1981) Public. John Wiley & Sons, Seção 9.1-9.9), métodos de lipofecção e métodos de microinjeção.

[000260] As células hospedeiras podem ser cultivadas por métodos conhecidos. Por exemplo, quando se utilizam células animais como o hospedeiro, DMEM, MEM, RPMI 1640 ou IMDM podem ser usados como o meio de cultura. Elas podem ser usadas com suplementos séricos como, por exemplo, FBS ou soro fetal de bezerro (FCS). As células podem ser cultivadas em culturas sem soro. O pH preferido é de cerca de 6 a 8 durante a evolução do cultivo. A incubação é realizada tipicamente a 30 a 40°C por cerca de 15 a 200 horas. O meio é trocado, aerado ou agitado, como necessário.

[000261] Sinais de secreção adequados podem ser incorporados aos polipeptídeos de interesse de modo que as moléculas de ligação ao antígeno expressas na célula hospedeira sejam secretadas no lúmen do retículo endoplasmático, no espaço periplasmático ou no ambiente extracelular. Esses sinais podem ser endógenos às moléculas de ligação ao antígeno de interesse ou podem ser sinais heterólogos.

[000262] Por outro lado, por exemplo, sistemas de produção que utilizam animais ou plantas podem ser usados como sistemas para a produção de polipeptídeos in vivo. Um polinucleotídeo de interesse é introduzido em um animal ou planta e o polipeptídeo é produzido no corpo do animal ou planta, e depois coletado. Os "hospedeiros" da presente invenção incluem estes animais e plantas.

[000263] Os sistemas de produção que utilizam animais incluem aqueles que usam mamíferos ou insetos. É possível usar mamíferos como, por exemplo, cabras, porcos, carneiro, camundongos e bovinos (Vicki Glaser "SPECTRUM Biotechnology Applications" (1993)). Os mamíferos podem ser animais transgênicos.

[000264] Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é preparado como um gene de fusão com um gene que codifica um polipeptídeo produzido especificamente no leite, por exemplo, a β-caseina de cabra. A seguir, embriões de cabra são injetados com fragmentos de polinucleotídeo que contêm o gene de fusão, e depois transplantados em fêmeas de cabras. As moléculas de ligação ao antígeno desejadas podem ser obtidas do leite produzido pelas cabras transgênicas, que são nascidas das cabras que receberam os embriões, ou de sua prole. Podem ser administrados hormônios, como adequado, para aumentar o volume de leite que contém a molécula de ligação ao antígeno produzida pelas cabras transgênicas (Ebert e cols., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).

[000265] Insetos como, por exemplo, bichos-da-seda, podem ser usados para produzir as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. Quando se utilizam bichos-da-seda, baculovírus que carregam um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno de interesse podem ser usados para infectar bichos-da-seda, e a molécula de ligação ao antígeno de interesse pode ser obtida de seus fluidos corporais.

[000266] Além disso, quando são utilizadas plantas para produzir as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, pode ser usado, por exemplo, tabaco. Quando é utilizado tabaco, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno de interesse é inserido em um vetor de expressão de planta, por exemplo, pMON 530, e depois o vetor é introduzido em bactérias, por exemplo, Agrobacterium tumefa- ciens. Permite-se então que as bactérias infectem o tabaco como, por exemplo, Nicotiana tabacum, e as moléculas de ligação ao antígeno desejadas podem ser coletadas de suas folhas (Ma e cols., Eur. Immunol. (1994) 24: 131-138). Alternativamente, é possível infectar lentilha d'água (Lemna minor) com bactérias similares. Após clonagem, as moléculas de ligação ao antígeno desejadas podem ser obtidas das células de lentilha d'água (Cox K.M. e cols., Nat. Biotechnol. Dezembro de 2006; 24 (12): 1.591-1.597).

[000267] As moléculas de ligação ao antígeno assim obtidas podem ser isoladas do interior ou exterior (por exemplo, o meio e leite) de células hospedeiras, e purificadas como moléculas de ligação ao antígeno substancialmente puras e homogêneas. Os métodos para o isolamento e purificação de moléculas de ligação ao antígeno não são particularmente limitados, e os métodos de isolamento e purificação normalmente usados para purificação de polipeptídeos podem ser usados. As moléculas de ligação ao antígeno podem ser isoladas e purificadas selecionando-se e combinando-se apropriadamente, por exemplo, colunas cromatográficas, filtração, ultrafiltração, precipitação por salinização, precipitação de solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de SDS-poliacrila- mida, focalização isoelétrica, diálise e recristalização.

[000268] Cromatografia inclui, por exemplo, cromatografia por afinidade, cromatografia por troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia por adsorção ("Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual". Ed Daniel R. Marshak e cols., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Esses métodos cromatográficos podem ser realizados com o uso de cromatografia de fase líquida como, por exemplo, HPLC e FPLC. As colunas usadas para cromatografia por afinidade incluem colunas de proteína A e colunas de proteína G. As colunas que utilizam proteína A incluem, por exemplo, Hiper D, POROS e Sefarose F. F. (Pharmacia).

[000269] Na verdade, uma molécula de ligação ao antígeno pode ser modificada arbitrariamente, e os peptídeos podem ser parcialmente eliminados permitindo-se que uma enzima de modificação de proteína apropriada atue antes ou depois da purificação da molécula de ligação ao antígeno. Essas enzimas de modificação de proteína incluem, por exemplo, tripsina, quimotripsina, lisil endopeptidases, proteína quinases e glicosidases.

[000270] Além disso, a presente invenção fornece os anticorpos antirreceptor de IL-6 de (a) a (m) abaixo: (a) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia pesada que inclui uma sequência de aminoácidos, na qual pelo menos um de Tyr na posição 27, Asp na posição 31, Asp na posição 32, Trp na posição 35, Tyr na posição 51, Asn na posição 59, Ser na posição 63, Met na posição 106 e Tyr na posição 108 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53) foi substituído com His; (b) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia pesada (H3pI) que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Tyr na posição 27, Asp na posição 31 e Trp na posição 35 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53) foram substituídos com His; (c) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Tyr na posição 27, Asp na posição 31, Asp na posição 32, Trp na posição 35, Asn na posição 59, Ser na posição 63 e Tyr na posição 108 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53) foram substituídos com His; (d) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia pesada (H170) que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Tyr na posição 27, Asp na posição 31, Asp na posição 32, Trp na posição 35, Asn na posição 59, Ser na posição 63 e Tyr na posição 108 foram substituídos com His, e na qual Ser na posição 99 foi substituída com Val, e Thr na posição 103 foi substituída com Ile na sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53); (e) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Asp na posição 31, Tyr na posição 51, Ser na posição 63, Met na posição 106 e Tyr na posição 108 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53) foram substituídos com His; (f) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia pesada (CLH5) que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Asp na posição 31, Tyr na posição 51, Ser na posição 63, Met na posição 106 e Tyr na posição 108 foram substituídos com His, e na qual Ser na posição 99 foi substituído com Phe e Thr na posição 103 foi substituída com Ile na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53); (g) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos, na qual pelo menos um de Asp na posição 28, Tyr na posição 32, Glu na posição 53, Ser na posição 56 e Asn na posição 92 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:2 (região variável PF1L) foi substituído com His; (h) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia leve (L73) que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Asp na posição 28, Tyr na posição 32, e Glu na posição 53 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:2 (região variável PF1L) foram substituídos com His; (i) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia leve (L82) que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Tyr na posição 32 e Glu na posição 53 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53) foram substituídos com His; (j) um anticorpo que inclui uma região variável da cadeia leve (CLL5) que possui uma sequência de aminoácidos, na qual Tyr na posição 32, Glu na posição 53, Ser na posição 56 e Asn na posição 92 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:2 (região variável PF1L) foram substituídos com His; (k) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia pesada de (b) e a região variável da cadeia leve de (h); (l) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia pesada de (d) e a região variável da cadeia leve de (i); e (m) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia pesada de (f) e a região variável da cadeia leve de (h). exemplos específicos da região variável da cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos na qual pelo menos um de Tyr na posição 27, Asp na posição 31, Asp na posição 32, Trp na posição 35, Tyr na posição 51, Asn na posição 59, Ser na posição 63, Met na posição 106 e Tyr na posição 108 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:1 (região variável H53) foi substituído com His incluem, por exemplo, as seguintes regiões variáveis da cadeia pesada: - uma região variável da cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:3 (143pI) - uma região variável da cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:4 (H170) - uma região variável da cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:5 (CLH5) exemplos específicos da região variável da cadeia leve que possui uma sequência de aminoácidos na qual pelo menos um de Asp na posição 28, Tyr na posição 32, Glu na posição 53, Ser na posição 56 e Asn na posição 92 na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:2 (região variável PF1L) foi substituído com His incluem, por exemplo, as seguintes regiões variáveis da cadeia leve: - uma região variável da cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:6 (L73) - uma região variável da cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:7 (L82) - uma região variável da cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:8 (CLL5)

[000271] As posições de aminoácidos e substituições em cada um dos anticorpos H3pI, H170, CLH5, L73, L82 e CLL5 descritos acima são mostradas abaixo na tabela I. As posições de aminoácidos são mostradas com base na numeração de Kabat.

* Em WT, a cadeia H possui histidina na posição 33, enquanto a cadeia L possui histidina na posição 55.

[000272] A presente invenção fornece anticorpos que compreendem pelo menos qualquer uma das substituições de aminoácidos descritas acima em (a) a (j), e métodos para a produção dos anticorpos. Dessa forma, os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos que compreendem não apenas qualquer uma das substituições de aminoácidos descritas acima em (a) a (j), mas também substituições de aminoácidos além daquelas descritas acima em (a) a (j). Substituições de aminoácidos além daquelas descritas acima em (a) a (j) incluem, por exemplo, substituição, eliminação, adição e/ou inserção na sequência de aminoácidos de CDRs e FRs.

[000273] Além disso, a presente invenção fornece os anticorpos antirreceptor de IL-6 de (1) a (28) abaixo: (1) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia pesada (região variável VH1-IgG1) que possui a sequência de aminoácidos das posições 1 a 119 no ID. DE SEQ. n°: 21 (VH1-IgG1); (2) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia pesada (região variável VH2-IgG1) que possui a sequência de aminoácidos das posições 1 a 119 no ID. DE SEQ. n°: 22 (VH2-IgG1); (3) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia pesada (região variável VH3-IgG1) que possui a sequência de aminoácidos das posições 1 a 119 no ID. DE SEQ. n°:23 (VH3-IgG1); (4) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia pesada (região variável VH4-IgG1) que possui a sequência de aminoácidos das posições 1 a 119 no ID. DE SEQ. n°:24 (VH4-IgG1); (5) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia leve (região variável VL1-CK,) que possui a sequência de aminoácidos das posições Ito 107 no ID. DE SEQ. n°:25 (VL1-CK); (6) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia leve (região variável VL2-CK) que possui a sequência de aminoácidos das posições 1 a 107 no ID. DE SEQ. n°:26 (VL2-CK); (7) um anticorpo que inclui a região variável da cadeia leve (região variável VL3-CK) que possui a sequência de aminoácidos das posições 1 a 107 no ID. DE SEQ. n°:27 (VL3-CK); (8) um anticorpo (Fv1-IgG1) que inclui a região variável da cadeia pesada de (2) e a região variável da cadeia leve de (6); (9) um anticorpo (Fv2-IgG1) que inclui a região variável da cadeia pesada de (1) e a região variável de uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:7 (L82); (10) um anticorpo (Fv3-IgG1) que inclui a região variável da cadeia pesada de (4) e a região variável da cadeia leve de (5); (11) um anticorpo (Fv4-IgG1) que inclui a região variável da cadeia pesada de (3) e a região variável da cadeia leve de (7); (12) um anticorpo (VH3-IgG2ΔGK) que inclui uma cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:33; (13) um anticorpo (VH3-M58) que inclui uma cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:34; (14) um anticorpo (VH3-M73) que inclui uma cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:35; (15) um anticorpo (Fv4-IgG2ΔGK) que inclui a cadeia pesada de (12) e uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:27 (VL3-CK); (16) um anticorpo (Fv4-M58) que inclui a cadeia pesada de (I3) e uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:27 (VL3-CK); (17) um anticorpo (Fv4-M73) que inclui a cadeia pesada de (14) e uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:27 (VL3-CK); (18) um anticorpo (VH2-M71) que inclui uma cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:36 (VH2-M71); (19) um anticorpo (VH2-M73) que inclui uma cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:37 (VH2-M73); (20) um anticorpo (VH4-M71) que inclui uma cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:38 (VH4-M71); (21) um anticorpo (VH4-M73) que inclui uma cadeia pesada que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:39 (VH4-M73); (22) um anticorpo (Fv1-M71) que inclui a cadeia pesada de (18) e uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:26 (VL2-CK); (23) um anticorpo (Fv1-M73) que inclui a cadeia pesada de (19) e uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:26 (VL2-CK); (24) um anticorpo (Fv3-M71) que inclui a cadeia pesada de (20) e uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. n°:25 (VL1-CK); (25) um anticorpo (Fv3-M73) que inclui a cadeia pesada de (21) e uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:25 (VL1-CK); (26) um anticorpo que inclui uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. n°:25 (VL1-CK); (27) um anticorpo que inclui uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos de ID. DE SEQ. n°:26 (VL2-CK); e (28) um anticorpo que inclui uma cadeia leve que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:27 (VL3-CK).

[000274] Além disso, a presente invenção fornece as FRs e CDRs de (a) a (v) abaixo: (a) a CDR1 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:40 (VH1,2, 3, 4); (b) a CDR2 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:41 (VH1,2); (c) a CDR2 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:42 (VH3); (d) a CDR2 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:43 (VH4); (e) a CDR3 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:44 (VH1,2); (f) a CDR3 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:45 (VH3, 4); (g) a FR1 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:46 (VH1,2); (h) a FR1 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:47 (VH3, 4); (i) a FR2 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:48 (VH1,2, 3, 4); (j) a FR3 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:49 (VH1); (k) a FR3 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:50 (VH2); (l) a FR3 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:51 (VH3, 4); (m) a FR4 da cadeia pesada do ID. DE SEQ. n°:52 (VH1, 2, 3, 4); (n) a CDR1 da cadeia leve do ID. DE SEQ. n°:53 (VL1,2); (o) a CDR1 da cadeia leve do ID. DE SEQ. n°:54 (VL3); (p) a CDR2 da cadeia leve do ID. DE SEQ. n°:55 (VL1, VL3); (q) a CDR2 da cadeia leve do ID. DE SEQ. n°:56 (VL2); (r) a CDR3 da cadeia leve do ID. DE SEQ. n°:57 (VL1,2, 3); (s) a cadeia leve FR1 do ID. DE SEQ. n°:58 (VL1,2, 3); (t) a cadeia leve FR2 do ID. DE SEQ. n°:59 (VL1,2, 3); (u) a cadeia leve FR3 do ID. DE SEQ. n°:60 (VL1,2, 3); e (v) a cadeia leve FR4 do ID. DE SEQ. n°:61 (VL1,2, 3).

[000275] As respectivas sequências dos (a) a (v) acima são mostradas na figura 25. Além disso, a presente invenção fornece polipeptídeos que incluem qualquer uma das FRs e CDRs descritas acima em (a) a (v).

[000276] Os anticorpos antirreceptor de IL-6 da presente invenção também incluem fragmentos e produtos modificados de anticorpos que incluem qualquer uma das substituições de aminoácidos descritas acima. Esses fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, Fv de cadeia única (scFv) no qual Fvs de cadeias H e L estão ligados por meio de um vinculador apropriado, cadeia H de domínio único e cadeia L de domínio único (por exemplo, Nat. Biotechnol, Setembro de 2005; 23 (9): 1126-36), Unibody (WO 2007059782 A1) e SMIP (WO 2007014278 A2). A origem de anticorpos não é particularmente limitada. Os anticorpos incluem anticorpos humanos, de camundongo, de rato e de coelho. Os anticorpos da presente invenção também podem ser anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanizados, ou similares.

[000277] Especificamente, esses fragmentos de anticorpo são obtidos por tratamento de anticorpos com enzimas, por exemplo, papaína ou pepsina, ou por construção de genes que codificam esses fragmentos de anticorpo, sua inserção em vetores de expressão, e depois sua expressão em células hospedeiras adequadas (vide, por exemplo, Co, M.S. e cols., J. Immunol. (1994) 152, 2.968-2.976; Better, M. & Horwitz, A. H. "Methods in Enzymology" (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A. "Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., "Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. e cols., "Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66; Bird, R. E. e cols., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

[000278] A presente invenção fornece métodos de produção de (i) um polipeptídeo da presente invenção, ou (ii) um polipeptídeo codificado por um gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção, em que os métodos compreendem a etapa de cultivo de uma célula hospedeira que compreende um vetor no qual um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente invenção é introduzido.

[000279] Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem as etapas de: (a) cultivo de uma célula hospedeira que compreende um vetor no qual um gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção é introduzido; e (b) obtenção do polipeptídeo codificado pelo gene.

[000280] scFv é obtido por ligação das regiões V de cadeias H e L de anticorpo. Nesse scFv, a região V da cadeia H está ligada à região V da cadeia L por meio de um vinculador, de preferência um vinculador peptídico (Huston, J. S. e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 10.0, 5.879-5.883). As regiões V da cadeia H e da cadeia L em um scFv podem ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos acima. O vinculador peptídico para ligar as regiões V inclui, por exemplo, peptídeos de cadeia única arbitrários de 12 a 19 resíduos de aminoácidos.

[000281] Quando um anticorpo antirreceptor de IL-6 da presente invenção inclui uma região constante, a região constante pode ser de qualquer tipo, por exemplo, pode ser usada IgG1, IgG2 ou IgG4. A região constante é preferivelmente uma região constante de anticorpo humano. Alternativamente, a região constante pode ser uma forma modificada que inclui substituição, eliminação, adição e/ou inserção na sequência de aminoácidos de regiões constantes de IgG1 humana, de IgG2 humana ou de IgG4 humana.

[000282] Um receptor de IL-6 preferido ao qual um anticorpo antirreceptor de IL-6 da presente invenção se liga é o receptor de IL-6 humana.

[000283] Os anticorpos antirreceptor de IL-6 da presente invenção são superiores na retenção no plasma, e existem por um período prolongado no plasma em uma forma capaz de ligação ao antígeno, ou seja, receptores de IL-6 solúveis ou associados à membrana. Dessa forma, os anticorpos antirreceptor de IL-6 se ligam in vivo aos receptores de IL- 6 solúveis ou associados à membrana por um período prolongado.

[000284] Além disso, os anticorpos antirreceptor de IL-6 são capazes de se ligar a receptores de IL-6 duas ou mais vezes e, dessa forma, presume-se que sejam capazes de neutralizar três ou mais receptores de IL-6.

<Composições Farmacêuticas>

[000285] A presente invenção também está relacionada às composições farmacêuticas que incluem moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno isoladas pelos métodos de avaliação da presente invenção, ou moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção. As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção e as moléculas de ligação ao antígeno produzidas pelos métodos de produção da presente invenção são superiores na retenção no plasma e, dessa forma, espera-se que reduzam a frequência de administração das moléculas de ligação ao antígeno e, portanto, sejam úteis como composições farmacêuticas. A composição farmacêutica da presente invenção pode incluir veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[000286] Na presente invenção, o termo "composições farmacêuticas" normalmente se refere aos agentes para o tratamento ou prevenção ou teste e diagnóstico de doenças.

[000287] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, elas podem ser usadas parenteralmente, na forma de injeções de soluções estéreis ou suspensões que incluem água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, essas composições podem ser formuladas por mistura na forma de dose unitária necessária na prática de produção em Medicina geralmente aprovada, combinando-se adequadamente com veículos ou meios farmaceuticamente aceitáveis, especificamente com água estéril, soro fisiológico, óleo vegetal, emulsificante, suspensão, tensoativo, estabili- zante, agente flavorizante, excipiente, veículo, conservante, aglutinante, ou similares. Nessas formulações, a quantidade de ingrediente ativo é ajustada para obter uma quantidade apropriada em uma faixa predeterminada.

[000288] Composições estéreis para injeção podem ser formuladas com o uso de veículos como, por exemplo, água destilada para injeção, de acordo com a prática-padrão de formulação.

[000289] Soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, soro fisiológico e soluções isotônicas que contêm dextrose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio). Também é possível usar em combinação solubilizantes adequados, por exemplo, álcoois (etanol e similares), polialcoóis (propileno glicol, polietileno glicol, e similares), tensoativos não iônicos (Polissorbato 80 (TM), HCO-50, e similares).

[000290] Óleos incluem óleo de gergelim e óleos de soja. Benzoato de benzila e/ou álcool benzílico podem ser usados em combinação como solubilizantes. Também é possível combinar tampões (por exemplo, tampão fosfato e tampão de acetato de sódio), agentes tranquilizantes (por exemplo, cloridrato de procaína), estabilizantes (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e/ou antioxidantes. Ampolas adequadas são preenchidas com as injeções preparadas.

[000291] As composições farmacêuticas da presente invenção são administradas preferivelmente por via parenteral. Por exemplo, as composições podem estar na forma de dosagem para injeções, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdérmica. Por exemplo, elas podem ser administradas sistêmica ou localmente por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, ou similar.

[000292] Os métodos de administração podem ser selecionados apropriadamente considerando-se a idade e os sintomas dos pacientes. A dose de uma composição farmacêutica que contém uma molécula de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo, de 0,0001 a 1.000 mg/kg para cada administração. Alternativamente, a dose pode ser, por exemplo, de 0,001 a 100.000 mg por paciente. No entanto, a presente invenção não se limita aos valores numéricos descritos acima. As doses e os métodos de administração podem variar, dependendo do peso, da idade e dos sintomas do paciente, e similares.

[000293] Aqueles versados na técnica podem ajustar doses e métodos de administração adequados considerando-se os fatores descritos acima. Os aminoácidos contidos nas sequências de aminoá- cidos da presente invenção podem ser modificados pós-tradução. Por exemplo, a modificação de um resíduo de glutamina (Gln) no terminal N em um resíduo de ácido piroglutâmico (pGlu) por piroglutamilação é bem conhecida por aqueles versados na técnica. Naturalmente, esses aminoácidos modificados pós-tradução estão incluídos nas sequências de aminoácidos na presente invenção.

[000294] Todos os documentos da técnica estabelecida citados na especificação são aqui incorporados por referência.

Exemplos

[000295] A seguir, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos exemplos, mas não deve ser considerada como por eles limitada.

[Exemplo 1] Produção de anticorpo humanizado PM1 modificado Preparação de receptor de IL-6 humana solúvel recombinante (SR344)

[000296] Um receptor de IL-6 humana recombinante do receptor de IL-6 humana, que serviu um antígeno, foi preparado como descrito abaixo. Foi produzida uma linhagem de células CHO que expressam constantemente um receptor de IL-6 solúvel humano (daqui por diante denominado SR344) (Yamasaki, e cols., Science 1988; 241: 825-828 (GenBank # X12830)) que consiste na sequência de aminoácidos do 1° aminoácido ao 344° aminoácido no lado do terminal N, como relatado em J. Biochem., 108, 673-676 (1990).

[000297] SR344 foi purificado do sobrenadante da cultura obtido das células CHO que expressam SR344 usando três cromatografias em coluna: cromatografia em coluna de Blue Sefarose 6 FF, cromatografia por afinidade usando uma coluna na qual um anticorpo específico para SR344 é imobilizado e cromatografia em coluna por filtração em gel. A fração que eluiu como o pico principal foi usada como o produto purificado final.

Preparação de receptor de IL-6 solúvel recombinante de macaco Cynomolgus (cIL-6R)

[000298] Iniciadores de óligo DNA Rhe6Rf1 (ID. DE SEQ. n°:16) e Rhe6Rr2 (ID. DE SEQ. n°:17) foram produzidos com base na sequência gênica do receptor de IL-6 de macaco rhesus disponível publicamente (Birney e cols., Ensemble 2006, Nucleic Acids Res., Janeiro de 2006, 1; 34 (exemplar de base de dados): D556-61). Utilizando cDNA preparado a partir de pâncreas de Cynomolgus como modelo, um fragmento de DNA que codifica o comprimento total do gene do receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus foi preparado por PCR usando os iniciadores Rhe6Rf1 e Rhe6Rr2. Usando o fragmento de DNA resultante como modelo, um fragmento de DNA de 1.131 bp (ID. DE SEQ. n°:20) que codifica proteína na qual 6x His é adicionada ao terminal C da região solúvel (Met1-Pro363) que contém uma região sinalizadora do gene do receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus foi amplificado por PCR usando os iniciadores de óligo DNA CynoIL6R N-EcoRI (ID. DE SEQ. n°:18) e CynoIL6R (ID. DE SEQ. n°:19). O fragmento de DNA resultante foi digerido com EcoRI e NotI e inserido em um vetor de expressão de célula de mamífero, e este foi então usado para produzir uma linhagem CHO de expressão estável (células CHO produtoras de cyno,sIL-6R).

[000299] Um meio de cultura de células CHO produtoras de cyno,slL- 6R foi purificado com uma coluna HisTrap (GE Healthcare Biosciences), concentrado usando Amicon Ultra-15 Ultracel-10k (Millipore), e ainda purificado com uma coluna de filtração em gel Superdex 200 pg 16/60 (GE Healthcare Biosciences) para obter o produto purificado final do receptor de IL-6 solúvel de macaco Cynomolgus (daqui por diante denominado cIL-6R).

Preparação de IL-6 recombinante de macaco Cynomolgus (cIL-6)

[000300] IL-6 de macaco Cynomolgus foi preparada da seguinte forma: uma sequência de nucleotídeos que codifica os 212 aminoácidos registrados sobre N° de Acesso SWISSPROT P79341 foi produzida, clonada em um vetor de expressão de célula de mamífero, e introduzida em células CHO para produzir uma linhagem celular de expressão estável (células CHO produtoras de cyno,IL-6). Um meio de cultura de células CHO produtoras de cyno,IL-6 foi purificado com uma coluna SP- Sefarose/FF (GE Healthcare Biosciences), concentrado usando Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore), e depois ainda purificado com uma coluna de filtração em gel Superdex 75 pg 26/60 (GE Healthcare Biosciences). Este foi concentrado usando Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore) para obter um produto purificado final de IL-6 de macaco Cynomolgus (daqui por diante denominado cIL-6).

Estabelecimento de linhagem de células BaF3 que expressam gp130

[000301] Uma linhagem de células BaF3 que expressam gp130 humana foi estabelecida como indicado abaixo a fim de obter uma linhagem celular que exibe crescimento IL-6-dependente.

[000302] cDNA de gp130 humana de comprimento total (Hibi e cols., Cell 1990; 63: 1.149-1.157 (GenBank # NM_002184)) foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão pCOS2Zeo, que foi preparado por remoção do sítio de expressão do gene DHFR de pCHOI (Hirata, e cols., FEBS Letter 1994; 356: 244-248) e inserção de um sítio de expressão gênica de resistência à zeocina, para construir pCOS2Zeo/gp130. cDNA de IL-6R humano de comprimento total foi amplificado por PCR e clonado em pcDNA3.1(+) (Invitrogen) para construir hIL-6R/pcDNA3.1(+). Dez μg de pCOS2Zeo/gp130 foram misturados em células BaF3 (0,8 x 107 células) suspensas em PBS, e pulsadas usando um Gene Pulser (BioRad) em uma voltagem de 0,33 kV e capacitância de 950 μFD. As células BaF3 que passaram por introdução gênica por tratamento por eletropo- ração foram cultivadas um dia e uma noite inteiros em meio RPMI1640 (Invitrogen) contendo 0,2 ng/ml de interleucina-3 de camundongo (Peprotech) e soro bovino fetal 10% (daqui por diante denominado PBS, HyClone), e depois avaliadas por adição de meio RPMI1640 contendo 100 ng/ml de interleucina-6 humana (R&D Systems), 100 ng/ml de receptor solúvel de interleucina-6 humana (R&D Systems) e FBS 10% para estabelecer uma linhagem de células BaF3 que expressam gp130 humana (daqui por diante denominada BaF3/gp130). Como essa BaF3/gp130 prolifera na presença de interleucina-6 humana (R&D Systems) e SR344, ela pode ser usada para avaliar a atividade inibidora de crescimento (especificamente, atividade neutralizante do receptor de IL-6) do anticorpo antirreceptor de IL-6.

Produção de anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado

[000303] No contexto do presente exemplo e em qualquer outro lugar neste pedido, o termo "do tipo selvagem" é abreviado como WT, o termo "cadeia H do tipo selvagem" é abreviado como H(WT) (sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:9), e o termo "cadeia L do tipo selvagem" é abreviado como L(WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:10). Nesse contexto, foram introduzidas mutações na sequência framework e na sequência da CDR do anticorpo PM1 de camundongo humanizado descrito em Cancer Res. 15 de fevereiro de 1993; 53(4): 851-6, para produzir cadeias H modificadas H53(sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:1) e PF1H (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:11) e cadeias L modificadas L28 (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:12) e PF1L (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:2). Mais especificamente, os mutantes foram produzidos usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange (Stratagene) de acordo com o método descrito nas instruções fornecidas, e os fragmentos de plasmídeo resultantes foram inseridos em um vetor de expressão de célula de mamífero para produzir os vetores de expressão da cadeia H e vetores de expressão da cadeia L desejados. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão obtidos foram determinadas com o uso de metodologias convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica.

Expressão e purificação de anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado

[000304] Os anticorpos foram expressos pelo método descrito abaixo. A linhagem de células HEK293H derivadas de câncer renal embrionário humano (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invitrogen) suplementado com soro bovino fetal 10% (Invitrogen). As células foram plaqueadas a 10 ml por placa em placas para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING) em uma densidade celular de 5 a 6 x 105 células/ml, e cultivadas em uma incubadora de CO2 (37°C, CO2 5%) por um dia e uma noite inteiros. A seguir, o meio foi removido por aspiração, e 6,9 ml de meio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) foram adicionados. O plasmídeo preparado foi introduzido nas células pelo método de lipofecção. Os sobrenadantes da cultura resultantes foram coletados, centrifugados (aproximadamente 2.000 g, 5 min, temperatura ambiente) para remoção de células, e esterilizados por filtração através de um filtro de 0,22 μm MILLEX®-GV (Millipore) para obter os sobrenadantes. Os anticorpos foram purificados dos sobrenadantes da cultura obtidos por um método conhecido por aqueles versados na técnica usando "rProtein A Sepharose® Fast Flow" (Amersham Biosciences). Para determinar a concentração do anticorpo purificado, a absorbância foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de absorbância calculado pelo método PACE (Protein Science 1995; 4: 2.411-2.423).

[Exemplo 2] Produção de anticorpo H3pI/L73 que se liga de forma pH- dependente Método para a criação de anticorpos capazes de neutralizar antígeno várias vezes

[000305] Como as moléculas de IgG são divalentes, uma única molécula de IgG pode neutralizar até duas moléculas de antígeno quando os dois sítios se ligam aos antígenos; no entanto, ela não pode neutralizar três ou mais moléculas de antígeno. Portanto, para manter o efeito neutralizante de um anticorpo neutralizante por algum período, é necessário administrar uma quantidade do anticorpo igual ou maior do que a quantidade de antígeno produzida durante o período. Dessa forma, há uma limitação sobre a extensão na qual a dose necessária de anticorpo pode ser reduzida por aprimoramento da farmacocinética ou da afinidade do anticorpo. Portanto, caso fosse possível neutralizar duas ou mais moléculas de antígeno com uma única molécula de IgG, a mesma dose poderia aumentar a duração do efeito neutralizante ou, alternativamente, a dose de anticorpo necessária para obter a mesma duração poderia ser reduzida.

[000306] Para anticorpos neutralizantes, há dois tipos de antígenos- alvo: antígenos do tipo solúveis, que estão presentes no plasma, e antígenos ligados à membrana, que são expressos na superfície de células.

[000307] Quando o antígeno é um antígeno ligado à membrana, um anticorpo administrado se liga ao antígeno da membrana na superfície celular, e o anticorpo é subsequentemente recolhido em endossomos dentro da célula por internalização, junto com o antígeno da membrana ligado ao anticorpo. A seguir, o anticorpo que é mantido ligado ao antígeno, se move até um lisossomo, onde é degradado pelo lisossomo junto com o antígeno. A eliminação de anticorpo do plasma mediada por internalização por antígeno da membrana é denominada eliminação antígeno-dependente, e foi relatada para várias moléculas de anticorpo (Drug Discov. Today, Janeiro de 2006; 11 (1-2): 81-8). Na medida em que uma única molécula de IgG de anticorpo se liga a duas moléculas de antígeno quando se liga de forma divalente aos antígenos, e é então internalizada e degradada diretamente pelo lisossomo; um único anticorpo IgG comum não pode neutralizar duas ou mais moléculas de antígeno (figura 1).

[000308] A razão para a retenção longa (eliminação lenta) de moléculas de IgG no plasma são as funções de FcRn, sabidamente um receptor do resgate da molécula de IgG (Nat. Rev. Immunol. Setembro de 2007; 7 (9): 715-25). As moléculas de IgG que foram recolhidas em endossomos por pinocitose se ligam ao FcRn expresso em endossomos sob condições ácidas intra-endossômicas. As moléculas de IgG ligadas ao FcRn se movem até a superfície celular onde se dissociam de FcRn sob condições neutras no plasma e retornam ao plasma, enquanto as moléculas de IgG incapazes de se ligar ao FcRn prosseguem nos lisossomos, onde são degradas (figura 2).

[000309] As moléculas de IgG ligadas a um antígeno da membrana são recolhidas em endossomos intracelulares por internalização, se movem para lisossomos enquanto ligadas ao antígeno, e são submetidas à degradação. Quando um anticorpo IgG se liga de forma divalente aos antígenos, ele neutraliza duas moléculas de antígeno e é submetido à degradação junto com os antígenos. Se o anticorpo IgG, quando recolhido em endossomos intracelulares por internalização, puder se dissociar do antígeno sob condições ácidas intra-endossô- micas, o anticorpo dissociado poderá ser capaz de se ligar ao FcRn expresso nos endossomos. A molécula de IgG dissociada do antígeno e ligada ao FcRn é transferida até a superfície celular e depois dissociada do FcRn sob condições neutras no plasma retornando dessa forma, novamente ao plasma. A molécula de IgG que retornou ao plasma é capaz de se ligar a um novo antígeno da membrana novamente. A repetição desse processo permite que uma única molécula de IgG se ligue repetidamente aos antígenos da membrana permitindo, dessa forma, a neutralização de vários antígenos com uma única molécula de IgG (figura 3).

[000310] No caso de um antígeno solúvel, um anticorpo administrado se liga ao antígeno no plasma, e permanece no plasma na forma de um complexo antígeno-anticorpo. Normalmente, embora a retenção do anticorpo no plasma seja muito longa (a taxa de eliminação é muito lenta) por causa da função de FcRn, como descrito acima, a retenção de antígeno no plasma é curta (a taxa de eliminação é rápida). Dessa forma, antígenos ligados ao anticorpo mostram retenção no plasma comparável àquela do anticorpo (a taxa de eliminação é muito lenta). Antígenos são produzidos no corpo em uma taxa constante e, na ausência de anticorpo, presentes no plasma em uma concentração na qual a taxa de produção de antígeno e a taxa de eliminação de antígeno estão em equilíbrio. Na presença de anticorpo, a maioria dos antígenos está ligada aos anticorpos, resultando na eliminação muito lenta dos antígenos. Dessa forma, a concentração de antígeno no plasma aumenta, quando comparada com aquela na ausência de anticorpo (Kidney Int. 2003, 64, 697-703; J. National Cancer Institute 2002, 94(19), 1.484-1.493; J. Allergy and ClinicalImmunology 1997, 100 (1), 110-121; Eur. J. Immunol., 1993, 23; 2.0262.029). Mesmo se a afinidade do anticorpo pelo antígeno for infinita, a concentração de antígeno se elevará, na medida em que o anticorpo é eliminado lentamente do plasma, e o efeito neutralizante do anticorpo termina após as concentrações de anticorpo e antígeno se igualarem. Embora anticorpos com uma constante de dissociação (KD) mais forte possam neutralizar antígenos solúveis em uma concentração de anticorpo menor, anticorpos em uma concentração igual à metade ou menos do que a concentração de antígeno presente são incapazes de neutralizar antígenos, independentemente da potência de afinidade do anticorpo (Biochem. Biophys. Res. Commun, 9 de setembro de 2005; 334 (4): 1.00413). Como ocorre com moléculas de IgG não ligadas aos antígenos, as moléculas de IgG ligadas aos antígenos no plasma também são recolhidas em endossomos por pinocitose, e se ligam ao FcRn expresso em endossomos sob condições ácidas intra-endossômicas. As moléculas de IgG ligadas ao FcRn se movem até a superfície celular enquanto o anticorpo é mantido ligado ao antígeno, e depois se dissociam do FcRn sob condições neutras no plasma. Na medida em que as moléculas de IgG retornam ao plasma enquanto ligadas ao antígeno, elas não podem se ligar a novos antígenos no plasma. Nesse caso, se as moléculas de IgG podem se dissociar do antígeno sob condições ácidas intra-endossô- micas, o antígeno dissociado não será capaz de se ligar ao FcRn e, dessa forma, pode ser degradado por lisossomos. Por outro lado, as moléculas de IgG podem retornar ao plasma novamente por ligação ao FcRn. Como as moléculas de IgG que retornaram ao plasma já se dissociaram do antígeno em endossomos, elas são capazes de se ligar a um novo antígeno novamente no plasma. A repetição desse processo permite que uma única molécula de IgG se ligue repetidamente aos antígenos solúveis. Isso permite que uma única molécula de IgG neutralize vários antígenos (figura 4).

[000311] Dessa forma, independentemente se o antígeno é um antígeno da membrana ou um antígeno solúvel, se a dissociação de anticorpo IgG do antígeno é possível sob condições ácidas intra- endossômicas, uma única molécula de IgG seria capaz de neutralizar repetidamente antígenos. Para que anticorpos IgG se dissociem de antígenos sob condições ácidas intra-endossômicas, é necessário que a ligação antígeno-anticorpo seja consideravelmente mais fraca sob condições ácidas do que sob condições neutras. Como os antígenos da membrana na superfície celular precisam ser neutralizados, os anticorpos devem se ligar fortemente aos antígenos no pH da superfície celular, especificamente pH 7,4. Como há relatos de que o pH intra- endossômico é tipicamente pH 5,5 a 6,0 (Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. Fevereiro de 2004; 5 (2): 121-32), considera-se que um anticorpo que se liga fracamente a um antígeno em pH 5,5 a 6,0 se dissocia do antígeno sob condições ácidas intra-endossômicas. Mais especificamente, uma única molécula de IgG que se liga fortemente a um anticorpo no pH da superfície celular de 7,4 e se liga fracamente ao antígeno no pH intra-endossômico de 5,5 a 6,0 pode ser capaz de neutralizar vários antígenos e, portanto, aprimorar a farmacocinética.

[000312] Em geral, interações proteína-proteína consistem em interação hidrofóbica, interação eletrostática e ligação de hidrogênio, e a força de ligação é expressa tipicamente como uma constante de ligação (afinidade) ou constante de ligação aparente (avidez). A ligação pH-dependente, cuja força de ligação varia entre condições neutras (pH 7,4) e condições ácidas (pH 5,5 a 6,0), está presente em interações proteína-proteína de ocorrência natural. Por exemplo, a ligação mencionada acima entre moléculas de IgG e FcRn conhecida como um receptor de resgate para moléculas de IgG é forte sob condições ácidas (pH 5,5 a 6,0), mas acentuadamente fraca sob condições neutras (pH 7,4). A maioria dessas interações proteína-proteína que se alteram de forma pH-dependente está associada a resíduos de histidina. Como a pKa do resíduo de histidina está nas proximidades do pH 6,0 a 6,5, o estado de dissociação de próton de resíduos de histidina varia entre condições neutras (pH 7,4) e condições ácidas (pH 5,5 a 6,0). Especificamente, resíduos de histidina não são carregados e funcionam como receptores de átomos de hidrogênio sob condições neutras (pH 7,4), enquanto ficam carregados positivamente e funcionam como doadores de átomos de hidrogênio sob condições ácidas (pH 5,5 a 6,0). Foi relatado que a ligação pH-dependente da interação IgG-FcRn descrita acima também está associada aos resíduos de histidina presentes em IgG (Mol. Cell. Abril de 2001; 7 (4): 867-77).

[000313] Portanto, a pH-dependência pode ser reduzida para interações proteína-proteína por substituição de um resíduo de aminoácido envolvido em interações proteína-proteína com um resíduo de histidina, ou por introdução de uma histidina em um sítio de interação. Essas tentativas também foram feitas em interações proteína-proteína entre anticorpos e antígenos, e um anticorpo mutante com habilidade de ligação ao antígeno diminuída sob condições ácidas foi produzido com sucesso por introdução de histidina na sequência da CDR de um anticorpo antilisozima da clara de ovo (FEB Letter (vol. 309, N° 1, 85-88, 1992)). Além disso, foi descrito um anticorpo que é preparado por introdução de histidina em sua sequência da CDR e se liga especificamente a um antígeno no pH baixo de tecidos de câncer, mas que se liga fracamente sob condições neutras (WO 2003-105757).

[000314] Embora tenham sido relatados métodos para a introdução de dependência ao pH em reações antígeno-anticorpo, como descrito acima, ainda não foi relatada uma molécula de IgG que neutralize vários antígenos por se ligar fortemente aos antígenos no pH do fluido corporal de 7,4, mas que se ligue fracamente aos antígenos no pH intra- endossômico de pH 5,5 a 6,0. Em outras palavras, não há relatos em relação às modificações que reduzem significativamente a ligação sob condições ácidas, mantendo a ligação sob condições neutras, de tal forma que, quando comparado com um anticorpo não modificado, um anticorpo modificado se liga aos antígenos várias vezes in vivo e, dessa forma, mostra farmacocinética aprimorada, bem como duração aumentada do efeito neutralizante na mesma dose.

[000315] O receptor de IL-6 está presente no corpo na forma de receptor de IL-6 solúvel ou receptor de IL-6 da membrana (Nat. Clin. Pract. Rheumatol. Novembro de 2006; 2 (11): 619-26). Anticorpos antirreceptor IL-6 se ligam tanto ao receptor de IL-6 solúvel quanto ao receptor de IL-6 da membrana, e neutralizam sua ação biológica. Considera-se que, após ligação ao receptor de IL-6 da membrana, os anticorpos antirreceptor de IL-6 são recolhidos em endossomos intracelulares por internalização enquanto ligados ao receptor de IL-6 da membrana, e depois se movem para lisossomos enquanto os anticorpos são mantidos ligados ao receptor de IL-6 da membrana, e passam por degradação por lisossomos juntos com o receptor de IL-6 da membrana. Na verdade, foi relatado que um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado exibe depuração não linear, e sua eliminação antígeno-dependente contribui enormemente para a eliminação do anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado (The Journal of Rheumatology, 2003, 30; 71.426-1.435). Dessa forma, um anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado se liga a um ou dois receptores de IL- 6 da membrana (de forma monovalente ou divalente), e é então internalizado e degradado em lisossomos. Portanto, é possível produzir anticorpos modificados que exibam habilidade de ligação extremamente reduzida sob condições ácidas mas retenham a mesma habilidade de ligação que o anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado do tipo selvagem sob condições neutras (anticorpo antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente); múltiplos receptores de IL-6 podem ser neutralizados com um único anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado. Dessa forma, em comparação com anticorpos antirreceptor de IL-6 humanizados do tipo selvagem, anticorpos antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente podem aumentar a duração do efeito neutralizante in vivo na mesma dosagem.

Produção de anticorpo antirreceptor de IL-6 humanizado H3pI/L73 que se liga de forma pH-dependente

[000316] A introdução de histidina em uma CDR foi relatada como um método para a introdução de ligação pH-dependente à reação antígeno- anticorpo (FEBS Letter (vol. 309, N° 1,85-88, 1992)). A fim de encontrar resíduos de aminoácidos expostos na superfície da região variável do H53/PF1L produzido no exemplo 1 e possíveis resíduos que interagem com o antígeno, foi criado um modelo da região Fv de H53/PF1L por modelagem de homologia usando o software MOE (Chemical Computing Group Inc.). Um modelo tridimensional construído com base na informação de sequência de H53/PF1L foi usado para selecionar H27, H31, H35, L28, L32 e L53 (numeração de Kabat, Kabat, E.A. e cols., 1991, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH) como sítios de mutação que podem introduzir ligação ao antígeno pH- dependente por introdução de histidina. O produto nos quais os resíduos em H27, H31 e H35 em H53 produzidos no exemplo 1 foram substituídos com histidinas foi designado como H3pI (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:3), e o produto no qual os resíduos em L28, L32 e L53 em PF1L produzidos no exemplo 1 foram substituídos com histidinas foi designado como L73 (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:6).

Produção, Expressão e Purificação do Vetor de Expressão H3pI/L73

[000317] A modificação de aminoácido foi realizada para produzir anticorpos modificados em sítios selecionados. Foram introduzidas mutações em H53 (sequência de nucleotídeos: ID. DE SEQ. n°:13) e PF1L (sequência de nucleotídeos: ID. DE SEQ. n°:14) produzidos no exemplo 1 para produzir H3pI (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:3) e L73 (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:6). Mais especificamente, o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange (Stratagene) foi usado de acordo com o método descrito nas instruções fornecidas, e os fragmentos de plasmídeo resultantes foram inseridos em um vetor de expressão de célula de mamífero para produzir o vetor de expressão da cadeia H e o vetor de expressão da cadeia L desejados. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão resultantes foram determinadas usando um método conhecido por aqueles versados na técnica. H3pI/L73, que utiliza H3pI para a cadeia H e L73 para a cadeia L, foi expresso e purificado pelo método descrito no exemplo 1.

[Exemplo 3] Conferência de Habilidade de Ligação ao Antígeno pH- dependente por Modificação de His da CDR usando Tecnologia de Apresentação em Fago Produção de Molécula de scFv de Anticorpo Humanizado PM1

[000318] O anticorpo humanizado PM1, que é um anticorpo anti-IL-6R humanizado (Cancer Res. Fevereiro de 1993 15; 53 (4): 851-6), foi convertido em scFv. As regiões VH e VL foram amplificadas por PCR, e foi produzido scFv HL PM1 humanizado com a sequência vinculadora GGGGSGGGGSGGGGS (ID. DE SEQ. n°:15) entre VH e VL.

Seleção de Posições Introdutíveis por Histidina por Varredura de Histidina

[000319] PCR foi realizada usando o DNA de scFv HL PM1 humanizado produzido como modelo para produzir uma biblioteca de histidina na qual qualquer um dos aminoácidos da CDR é substituído com histidina. As porções da biblioteca foram construídas por PCR usando iniciadores nos quais o códon de um aminoácido desejado a ser mutado para a biblioteca foi substituído com CAT, um códon que corresponde à histidina, e outras porções foram construídas por PCR normal. Essas porções foram então ligadas por PCR de montagem. A biblioteca construída foi digerida com SfiI, inserida em um vetor fagomídeo pELBG lacI, que também foi digerido com SfiI, e depois usada para transformar XL1-Blue (Stratagene). As colônias resultantes foram usadas para avaliar a ligação ao antígeno por ELISA de fago e análise da sequência de HL scFv. A ELISA de fago foi realizada usando uma placa revestida com SR344 a 1 μg/ml, de acordo com J. Mol. Biol. 1992; 227: 381-388. Os clones que se ligam ao SR344 foram submetidos à análise de sequências com o uso de iniciadores específicos.

[000320] A titulação de fago foi determinada por ELISA com um anticorpo anti-Etag (GE Healthcare) e anticorpo anti-M13 (GE Healthcare). Esse valor foi então usado para selecionar posições onde a substituição do resíduo da CDR com histidina não alterava significativamente a habilidade de ligação, quando comparado com scFv PM1 humanizado, com base nos resultados de ELISA de fago para SR344. As posições selecionadas são mostradas na tabela 2. A numeração de cada resíduo estava de acordo com a numeração de Kabat (Kabat, e cols., 1991, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NHI).

Construção de Biblioteca de CDR Modificada por Histidina

[000321] Foi projetada uma biblioteca na qual os aminoácidos de resíduos da CDR não alteraram significativamente a habilidade de ligação quando substituídos com histidina, como mostrado na tabela 2 (posições introdutíveis por histidina) são sua sequência original (sequência do tipo selvagem) ou histidina. A biblioteca foi construída com base nas sequências da cadeia H PF1H e da cadeia L PF1L produzidas no exemplo 1, de tal forma que as posições mutadas para a biblioteca tenham as sequências originais ou histidinas (tanto a sequência original quanto histidinas).

[000322] As porções da biblioteca foram construídas por PCR usando iniciadores que foram projetados de tal forma que uma posição desejada a ser mutada para a biblioteca possua o códon de aminoácido original ou o códon de histidina, e outras porções foram produzidos por PCR normal, ou por PCR com o uso de iniciadores sintéticos como nas porções da biblioteca. Essas porções foram então ligadas por PCR de montagem (J. MoI. Biol. 1996; 256: 77-88).

[000323] A biblioteca foi usada para construir uma biblioteca de apresentação em ribossomo de acordo com J. Immunological Methods 1999; 231: 119-135. A fim de efetuar a tradução in vitro sem células de Escherichia coli, uma sequência de SDA (sítio de ligação de ribossomo) e o promotor T7 foram adicionados ao lado 5', e uma sequência gênica parcial 3 que serve como um vinculador para a apresentação em ribossomo foi ligada ao lado 3' com o uso de SfiI.

Aquisição de scFv com Ligação pH-dependente da Biblioteca por panning de glóbulos

[000324] A fim de concentrar apenas scFv com a habilidade para se ligar a SR344, panning foi realizado duas vezes pelo método de apresentação em ribossomo de acordo com Nature Biotechnology Dezembro de 2000; 18: 1.287-1.292. O SR344 preparado foi biotinilado usando NHS-PEO4-Biotina (Pierce) para obter um antígeno. O panning foi realizado usando 40 nM do antígeno biotinilado.

[000325] Usando o pool de DNA resultante como modelo, HL scFv foi restaurado por PCR com o uso de iniciadores específicos. Após digestão com SfiI, o HL scFv foi inserido em um vetor fagomídeo pELBG lacI, que também foi digerido com SfiI, e depois usado para transformar XL1-Blue (Stratagene).

[000326] Células de Escherichia coli que carregam o plasmídeo desejado foram desenvolvidas até 0,4 a 0,6 OD/ml em meio 2YT contendo 100 μg/ml de ampicilina e glicose 2%. Um fago auxiliar (M13KO7, 4,5 x 1011 pfu) foi adicionado a elas, cultivado estaticamente por 30 minutos a 37°C, e depois cultivado com agitação por 30 minutos a 37°C. A cultura foi transferida para um tubo de Falcon de 50 ml, centrifugada por 10 minutos a 3.000 rpm, resusspensa em meio 2YT contendo 100 μg/ml de ampicilina, 25 μg/ml de canamicina, e 0,5 mM de IPTG, e depois incubada de um dia para o outro a 30°C.

[000327] A cultura incubada de um dia para o outro foi precipitada com 2,5 M de NaCl e PEG 10%, e depois diluída com PBS para obter uma solução de biblioteca de fagos. M-PBS 10% (PBS contendo leite desnatado 10%) e 1 M de Tris-HCl foram adicionados à solução de biblioteca de fagos até a concentração final de M-PBS 2,5% e pH 7,4. O panning foi realizado por um método de panning típico usando um antígeno imobilizado em glóbulos magnéticos (J. Immunol. Methods, 20 de março de 2008; 332 (1-2): 2-9; J. Immunol, Methods, 1° de janeiro de 2001; 247 (1-2): 191-203; Biotechnol. Prog. Março-Abril de 2002; 18 (2): 212-20). Mais especificamente, 40 pmol de SR344 marcado com biotina foram adicionados à biblioteca de fagos preparada, e a biblioteca foi colocada em contato com o antígeno por 60 minutos a 37°C.

[000328] Glóbulos revestidos com estreptavidina (Dynal M-280) lavados com M-PBS 5% (PBS contendo leite desnatado 5%) foram adicionados, e a ligação foi permitida por 15 minutos a 37°C. Os glóbulos foram lavados cinco vezes com 0,5 ml de PBST (PBS contendo Tween-20 0,1%, pH 7,4) e PBS (pH 7,4). Os glóbulos foram então suspensos em 1 ml de PBS (pH 5,5) a 37°C, e o fago foi recuperado imediatamente. A solução de fago recuperada foi adicionada a 10 ml de XL1-Blue de fase de crescimento logarítmica (OD600 de 0,4 a 0,5) e ficou em repouso por 30 minutos a 37°C para infecção. As E. coli infectadas foram plaqueadas sobre uma placa de 225 mm x 225 mm contendo 2YT, 100 μg/ml de ampicilina e glicose 2%. Essas E. coli foram usadas para iniciar a cultura adicional de fagos da mesma forma descrita acima e repetir o panning 8 vezes.

Avaliação por ELISA de fago

[000329] As colônias únicas acima foram inoculadas em 100 μl de 2YT, 100 μg/ml de ampicilina, glicose 2% e 12,5 μg/ml de tetraciclina e cultivadas de um dia para o outro a 30°C. Dois μl dessa cultura foram inoculados em 300 μl de 2YT, 100 μg/ml de ampicilina e glicose 2%, e depois cultivados por 4 horas a 37°C. Um fago auxiliar (M13KO7) foi adicionado à cultura a 9 x 108 pfu, permaneceu em repouso por 30 minutos a 37°C, e depois foi agitado por 30 minutos a 37°C para infecção. Subsequentemente, o meio foi substituído com 300 μl de 2YT, 100 μg,/ml de ampicilina, 25 μg/ml de canamicina e 0,5 mM de IPTG. Após cultivo de um dia para o outro a 30°C, o sobrenadante centrifugado foi recuperado. Trezentos e sessenta μl de PBS 50 mM (pH 7,4) foram adicionados a 40 μl de do sobrenadante centrifugado e submetidos à ELISA. Uma placa de microtitulação de 96 poços StreptaWell (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μl de PBS contendo 62,5 ng/ml de SR344 marcado com biotina. Após remoção do antígeno por lavagem com PBST, o bloqueio foi realizado com 250 μl de BSA-PBS 2% por 1 hora ou mais. Após remoção do BSA-PBS 2%, o sobrenadante da cultura preparado foi adicionado e permaneceu em repouso por 1 hora a 37°C para ligação ao anticorpo. Após lavagem, 50 mM de PBS (pH 7,4) ou 50 mM de PBS (pH 5,5) foram adicionados e incubados em repouso por 30 minutos a 37°C. Após lavagem, a detecção foi realizada com um anticorpo anti-M13 conjugado à HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com BSA-PBS 2% e solução única TMB (Zymed), seguida pela adição de ácido sulfúrico para interromper a reação, e pela medida da absorbância a 450 nm.

[000330] No entanto, nenhum clone que exibe habilidade de ligação pH-dependente potente foi obtido por esse panning usando o antígeno imobilizado nos glóbulos magnéticos. Os clones que exibiam habilidade de ligação pH-dependente fraca foram submetidos à análise de sequências com o uso de iniciadores específicos. As posições nesses clones, onde a histidina estava presente em uma rate elevada, são mostradas na tabela 3.

Aquisição de scFv com Ligação pH-dependente por panning de coluna

[000331] Nenhum clone com habilidade de ligação pH-dependente forte foi obtido por panning típico usando o antígeno imobilizado em glóbulo magnético. Isso pode ser causado pelas seguintes razões: no panning com utilização de um antígeno imobilizado em glóbulos magnéticos ou em uma placa, são coletados todos os fagos que se dissociaram dos glóbulos magnéticos ou da placa sob condições ácidas. Dessa forma, os clones de fago com dependência ao pH fraca recuperados em conjunto reduzem as probabilidades de que os clones com dependência ao pH forte sejam incluídos nos clones finalmente concentrados.

[000332] Portanto, o panning com o uso de uma coluna imobilizada com um antígeno foi examinado como um método de panning mais rigoroso (figura 5). Não há relatos prévios sobre a aquisição de clones com habilidade de ligação pH-dependente pela utilização de panning com uma coluna com antígeno imobilizado. No panning com o uso de uma coluna com antígeno imobilizado, quando os fagos que se ligaram sob condições neutras são eluídos sob condições ácidas, os clones com dependência ao pH fraca se religam ao antígeno dentro da coluna e, dessa forma, são menos eluídos, permitindo que os clones fortemente pH-dependentes que se religam menos dentro da coluna sejam eluídos seletivamente pela coluna. Além disso, embora "todos" os fagos que se dissociaram sob condições ácidas sejam recuperados no panning com utilização do antígeno imobilizado em glóbulos magnéticos ou em uma placa, o panning com utilização de uma coluna imobilizada com o antígeno permite a recuperação seletiva de fagos com habilidade de ligação pH-dependente forte por permitir que um tampão ácido flua através da coluna para iniciar a eluição e recuperação apenas de "frações apropriadas".

[000333] Primeiro, uma coluna à qual o antígeno SR344 foi imobilizado foi preparada. Duzentos μl de estreptavidina Sefarose (GE Healthcare) foram lavados com 1 ml de PBS, suspensos em 500 μl de PBS, e foram colocados em contato com 400 pmol de SR344 marcado com biotina por 1 hora em temperatura ambiente. Subsequentemente, uma coluna vazia (Amersham. Pharmacia Biotech) foi preenchida com a sefarose acima e lavada com cerca de 3 ml de PBS. Os fagos da biblioteca precipitados com PEG mencionados acima foram diluídos até 1/25 com BSA-PBS 0,5% (pH 7,4), passados através de um filtro de 0,45 nm, e depois adicionados à coluna. Após lavagem com cerca de 6 ml de PBS (pH 7,4), foi permitido que 50 mM de MES-NaCl (pH 5,5) fluíssem através da coluna para eluir anticorpos que se dissociam sob pH baixo. As frações eluídas apropriadas foram coletadas, e a solução de fago recuperada foi adicionada a 10 ml de XL1-Blue de fase de crescimento logarítmica (OD600 de 0,4 a 0,5) e permaneceram em repouso por 30 minutos a 37°C.

[000334] As E. coli infectadas foram plaqueadas sobre uma placa de 225 mm x 225 mm contendo 2YT, 100 μg/ml de ampicilina e glicose 2%. Essas E. coli foram usadas para iniciar cultura de fago adicional da mesma forma como descrita acima, e repetir o panning 6 vezes.

Avaliação ELISA de fago

[000335] Os fagos resultantes foram avaliados por ELISA de fago. Os clones que apresentavam uma dependência ao pH forte foram submetidos à análise de sequências com o uso de iniciadores específicos. Como resultado, vários clones que exibem ligação pH-dependente forte, quando comparados com WT, foram obtidos. Como mostrado na figura 6, foi verificado que o clone CL5 (cadeia H: CLH5, cadeia L: CLL5) (CLH5: sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:5, CLL5: sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. n°:8) exibe ligação pH- dependente particularmente forte, quando comparado com WT. Foi confirmado, portanto, que anticorpos que exibem ligação pH-dependen- te forte, embora sejam incapazes de serem obtidos por panning típico com uso do antígeno imobilizado sobre glóbulos magnéticos, podem ser obtidos por panning com a utilização de uma coluna imobilizada com o antígeno. Portanto, verificou-se que o panning com o uso de uma coluna com antígeno imobilizado é um método altamente eficaz para a obtenção de anticorpos com ligação pH-dependente de uma biblioteca. As sequências de aminoácidos desses clones que mostram ligação pH- dependente foram analisadas e as posições onde histidina estava presente em uma probabilidade elevada nos clones concentrados são mostradas na tabela 4.[Tabela 4] Posições de substituição de histidina encontrada por biblioteca de fagos (panning de coluna)

[Exemplo 4] Expressão e purificação de anticorpo de receptor de IL-6 humanizado modificado com histidina Produção, expressão e purificação de vetor de expressão de anticorpo de receptor de IL-6 humanizado modificado com histidina

[000336] A fim de converter clones que exibem pH-dependência forte em ELISA de fago em IgG, VH e VL foram respectivamente amplificadas por PCR, digeridas com XhoI/NheI e EcoRI, e inseridas em um vetor de expressão de célula de mamífero. A sequência de nucleotídeos de cada fragmento de DNA foi determinada por um método conhecido por aqueles versados na técnica. CLH5/L73, em que CLH5 foi usado para a cadeia H, e L73 obtido no exemplo 2, foi usado para a cadeia L, foi expresso e purificado como IgG. A expressão e purificação foram realizadas pelo método descrito no exemplo 1.

[000337] Anticorpo com dependência ao pH ainda maior foi produzido por combinação de sítios de mutação. Com base nas localizações onde His estava concentrada na biblioteca de fagos, bem como na informação estrutural e similares, H32, H58, H62 e H102 em H3pI que foi obtido como uma cadeia H no exemplo 2, foram substituídos com histidina, e H95 e H99 foram ainda substituídos com valina e isoleucina, respectivamente, para produzir H170 (ID. DE SEQ. n°:4). A produção da variante foi realizada usando o método descrito no exemplo 1. Além disso, L82 (ID. DE SEQ. n°:7) foi produzido por substituição da 28a histidina de L73, que foi produzido como uma cadeia L no exemplo 2, com ácido aspártico. A produção da variante foi realizada usando o método descrito no exemplo 1. H170/L82, em que H170 foi usado para a cadeia H e L82 foi usado para a cadeia L, foi expresso e purificado como IgG usando o método descrito no exemplo 1.

[Exemplo 5] Avaliação da atividade neutralizante de IL-6R de anticorpo com ligação pH-dependente Avaliação da atividade neutralizante do receptor de IL-6 humana de clones convertidos em IgG

[000338] A atividade neutralizante do receptor de IL-6 foi avaliada para quatro anticorpos: anticorpo humanizado PM1 (WT) e H3pI/L73, CLH5/L73 e 14170/L82 produzidos nos exemplos 2 e 4.

[000339] Mais especificamente, a atividade neutralizante do receptor de IL-6 foi avaliada usando BaF3/gp130 que exibe crescimento IL- 6/receptor de IL-6-dependente. BaF3/gp130 foi lavado três vezes com meio RPMI1640 contendo FBS 10%, e depois suspenso a 5 x 104 células/ml em meio RPMI1640 contendo 60 μg/ml de interleucina-6 humana (Toray), 60 ng/ml de receptor de IL-6 solúvel humano recombinante (SR344) e FBS 10%. Cinquenta μL da suspensão foram dispensados em cada um dos poços de uma placa de 96 poços (Corning). A seguir, o anticorpo purificado foi diluído com RPMI1640 contendo FBS 10%, e 50 μl do anticorpo foram misturados em cada poço. Após cultivo por 3 dias a 37°C e CO2 5%, reagente WST-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories) diluído duas vezes com PBS foi adicionado a 20 μl/poço, e depois a absorbância a 450 nm foi imediatamente medida (comprimento de onda de referência: 620 nm) usando o "Sunrise Classic" (Tecam). Após cultivo por 2 horas, a absorbância a 450 nm foi medida novamente (comprimento de onda de referência: 620 nm). A atividade neutralizante do receptor de IL-6 foi avaliada com base na alteração da absorbância após 2 horas. Como resultado, como mostrado na figura 7, H3pI/L73, CLH5/L73 e H170/L82 demonstraram ter atividade biológica de neutralização equivalente em comparação com o anticorpo humanizado PM1 (WT).

[Exemplo 6] Análise Biacore de anticorpo com ligação pH-dependente Análise da ligação de clones com ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 solúvel

[000340] Análises cinéticas de reações antígeno-anticorpo em pH 5,8 e pH 7,4 foram realizadas com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare) nos quatro anticorpos: anticorpo humanizado PM1 (WT) e H3pI/L73, CLH5/L73 e H170/L82 produzidos nos exemplos 2 e 4 (tampão: 10 mM de MES (pH 7,4 ou pH 5,8), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%). Vários anticorpos foram ligados em um chip sensor imobilizado com proteína A/G recombinante (Pierce) por acoplamento de amina. SR344, ajustado até concentrações de 9,8 a 400 nM, foi injetado no chip como um analito. A associação e dissociação dos clones com ligação pH-dependente ao SR344 foi observada em tempo real (FIGS. 8 e 9). Todas as medidas foram realizadas a 37°C. Constantes da taxa de associação ka (1/Ms) e constantes da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare), e as constantes de dissociação KD (M) foram calculadas com base naqueles valores (tabela 5). Além disso, a proporção das afinidades em pH 5,8 e pH 7,4 foram calculadas para cada clone para avaliar a ligação pH- dependente. Todas as medidas foram realizadas a 37°C.

[000341] Como resultado do cálculo da proporção da afinidade entre pH 5,8 e pH 7,4 para cada clone, a ligação pH-dependente (afinidade) de H3pI/L73, H170/L82 e CLH5/L73 ao SR344 foi 41 vezes, 394 vezes e 66 vezes, respectivamente, cada um mostrando uma ligação pH- dependente mais de 15 vezes maior do que WT.

[000342] Anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam fortemente ao antígeno no pH do plasma de 7,4, mas se ligam fracamente ao antígeno no pH intra-endossômico de 5,5 a 6,0 ainda não tinham sido relatados. Nesse estudo, foram obtidos anticorpos que retêm a atividade biológica de neutralização equivalente ao anticorpo de receptor de IL-6 humanizado WT e a afinidade em pH 7,4, mas exibem a afinidade em pH 5,8 que era especificamente reduzida em mais de 10 vezes. [Tabela 5] Comparação da ligação de clones que se ligam de forma pH-dependente dirigidos contra SR344 ao receptor de IL-6 solúvel

[000343] Reações antígeno-anticorpo ao receptor de IL-6 da membrana em pH 5,8 e pH 7,4 foram observadas para os clones com ligação pH-dependente produzidos acima, com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare). A ligação ao receptor de IL-6 da membrana foi avaliada por avaliação da ligação ao receptor M-6 imobilizado sobre um chip sensor. SR344 foi biotinilado de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica, e o SR344 biotinilado foi imobilizado sobre o chip sensor por meio de estreptavidina por utilização da afinidade entre estreptavidina e biotina. Todas as medidas foram realizadas a 37°C, e o tampão da fase móvel continha 10 mM de MES (pH 5,8), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%. Os clones com ligação pH-dependente foram injetados sob a condição de pH 7,4 e foi permitida sua ligação ao SR344 (tampão da amostra de injeção: 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, Tween 20 0,05%), e foi observada a dissociação pH-dependente de cada clone no pH da fase móvel de 5,8 (figura 10).

[000344] A taxa de dissociação (kd (1/s)) em pH 5,8 foi calculada com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare) ajustando-se somente a fase de dissociação em pH 5,8, em que 0,5 μg/ml da amostra foi ligado em 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%, e dissociado em 10 mM de MES (pH 5,8), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%. Similarmente, a taxa de dissociação (kd (1/s)) em pH 7,4 foi calculada com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare) ajustando-se somente a fase de dissociação em pH 7,4, em que 0,5 μg/ml da amostra foi ligado em 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%, e dissociado em 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%. A constante da taxa de dissociação pH-dependente de cada clone é mostrada na tabela 6. [Tabela 6] Comparação da constante da taxa de dissociação de clones com ligação pH-dependente dirigidos contra SR344 de receptor de IL-6 da membrane

[000345] A maior dependência ao pH da proporção de dissociação foi observada em H3pI/L73, seguido por CLH5/L73 e H170/L82 em ordem descendente, e cada clone demonstrou uma dissociação pH-depen- dente maior do receptor de IL-6 da membrana do que WT. No entanto, a classificação da associação/dissociação pH-dependente foi diferente entre o receptor de IL-6 solúvel e o receptor de IL-6 da membrana. Foi descrito que H170/L82, que exibiu a maior ligação pH-dependente na análise de ligação ao receptor de IL-6 solúvel, mostrou a menor ligação pH-dependente na análise de ligação ao receptor de IL-6 da membrana. Em geral, sabe-se que, enquanto as moléculas de IgG se ligam de forma monovalente a um antígeno solúvel (afinidade), elas se ligam de forma divalente aos antígenos da membrana (avidez). Sugere-se que essa diferença no modo de ligação entre antígenos solúveis e antígenos da membrana tenha influenciado a ligação pH-dependente de H170/L82.

[Exemplo 7] Confirmação de ligação múltipla ao antígeno por anticorpo com ligação pH-dependente

[000346] Como descrito no exemplo 2, anticorpos com ligação pH- dependente podem ser capazes de se ligar aos antígenos várias vezes. Especificamente, um anticorpo com ligação pH-dependente que tenha se ligado a um antígeno é recolhido de forma não específica em endossomos, mas se dissocia do antígeno solúvel sob as condições ácidas intra-endossômicas. O anticorpo se liga ao FcRn e, dessa forma, retorna ao plasma. Como o anticorpo que retornou ao plasma não está ligado ao antígeno, ele é capaz de se ligar a um novo antígeno novamente. A repetição desse processo permite que os anticorpos com ligação pH-dependente se liguem aos antígenos várias vezes. No entanto, para anticorpos IgG que não possuem a habilidade de ligação pH-dependente, nem todos os antígenos estão dissociados dos anticorpos sob as condições ácidas intra-endossômicas. Dessa forma, esses anticorpos que retornaram ao plasma por FcRn permanecem ligados ao antígeno e, portanto, não podem se ligar a novos antígenos. Consequentemente, em quase todos os casos, cada molécula de anticorpo IgG única é capaz de neutralizar apenas dois antígenos (no caso de ligação divalente).

[000347] Portanto, foi avaliado se os três anticorpos com ligação pH- dependente (H3pI/L73, CLH5/L73 e H170/L82) construídos nos exemplos 2 e 4 eram capazes de se ligar ao antígeno SR344 várias vezes, quando comparados com o anticorpo humanizado PM1 (do tipo selvagem, WT).

[000348] Biacore (GE Healthcare) foi usado para avaliar se a ligação dos anticorpos em pH 7,4 e a dissociação em pH 5,8 eram capazes de se ligar ao antígeno várias vezes. O anticorpo a ser avaliado estava ligado a um chip sensor com proteína A/G recombinante (Pierce) imobilizada pelo método de acoplamento de amina, e foi permitido que uma fase móvel de pH 7,4 fluísse (etapa 1). Foi então permitida que a solução de SR344 ajustada ao pH 7,4 fluísse como um analito para ligar SR344 ao anticorpo em pH 7,4 (etapa 2). Essa ligação em pH 7,4 simula a ligação ao antígeno no plasma. Subsequentemente, tampão ajustado ao pH 5,8 isoladamente (não contendo SR344) foi adicionado como um analito para expor o antígeno ligado ao anticorpo às condições ácidas (etapa 3). Essa dissociação em pH 5,8 simula o estado de ligação de complexos antígeno-anticorpo em endossomos. Subsequentemente, a etapa 2 foi repetida. Isso simula a religação do anticorpo que retornou ao plasma por FcRn a um novo antígeno. Subsequentemente, a etapa 2 foi repetida para expor o complexo anticorpo-antígeno às condições ácidas. A repetição da "etapa 2 à etapa 3" várias vezes a 37°C, como descrito acima, pode simular o estado in vivo no qual os anticorpos são recolhidos repetidamente do plasma para os endossomos por pinocitose e retornados ao plasma por FcRn (Nat. Rev. Immunol. Setembro de 2007; 7 (9): 715-25).

[000349] Os clones produzidos com ligação pH-dependente descritos acima foram analisados com o uso de Biacore T 100 (GE Healthcare) quanto à sua habilidade para se ligar ao antígeno SR344 várias vezes em pH 5,8 e pH 7,4. Mais especificamente, a análise foi realizada da forma seguinte. Todas as medidas foram realizadas a 37°C. Primeiro, os anticorpos de amostra descritos acima foram ligados sobre um chip sensor com proteína A/G recombinante (Pierce) imobilizada por acoplamento de amina, em que o tampão da fase móvel era 10 mM de MES (pH 5,8), 150 mM de NaCl, e Tween 20 0,05% (etapa 1). SR344 ajustado até uma concentração de cerca de 40 nM foi injetado como um analito por 3 minutos em pH 7,4 e permitiu-se a ligação (o tampão para SR344 injetado foi 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%) (etapa 2). Subsequentemente, a injeção de SR344 foi suspensa e foi permitido que uma fase móvel de pH 5,8 fluísse por cerca de 70 segundos para expor o complexo anticorpo/SR344 sob condições ácidas (etapa 3). Dez conjuntos desse processo de ligação (etapa 2)/ exposição à acidez (etapa 3) foram repetidos continuamente para observar o sensorgrama em tempo real, que é mostrado na figura 11. WT mostrou menos dissociação de SR344 durante a exposição ácida na etapa 3 e, consequentemente, a proporção de anticorpo capaz de ligação a novos antígenos na etapa 2 subsequente foi extremamente baixa. Em contraste, verificou-se que os clones com ligação pH- dependente, particularmente H170/L82 e CLH5/173, demonstraram uma dissociação tão forte durante a exposição ácida na etapa 3 que a maioria do SR344 ligado foi dissociada e, portanto, quase todos os anticorpos eram capazes de se ligar a novos antígenos na etapa 2 subsequente. Na repetição de 10 conjuntos da ligação (etapa 2) e exposição ácida (etapa 3), quase todos os anticorpos H170/L82 e CLH5/L73 foram capazes de se ligar a novos antígenos em cada conjunto.

[000350] Os sensorgramas obtidos foram usados para calcular a quantidade de ligação de SR344 em cada conjunto para cada amostra com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare). Os valores integrados na evolução com o tempo dos 10 conjuntos são mostrados na figura 12. Os valores integrados de RU obtidos no 10° conjunto são equivalentes à quantidade total de antígenos ligados durante os dez ciclos. Os clones com ligação pH-dependente, particularmente H170/L82 e CLH5/L73, mostraram as maiores quantidades totais de antígenos ligados, em comparação com WT, e demonstraram que são capazes de se ligar repetidamente a até aproximadamente quatro vezes a quantidade de antígenos ligados por WT. Consequentemente, foi descrito que quando se confere a habilidade de ligação pH-dependente ao WT, esses anticorpos podem ser ligar repetidamente aos antígenos e, dessa forma, neutralizar vários antígenos.

[Exemplo 8] Teste PK/PD de anticorpo com ligação pH-dependente usando camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana

[000351] Os receptores de IL-6 estão presentes no corpo tanto na forma de receptor de IL-6 solúvel quanto na forma de receptor de IL-6 do tipo membrana (Nat. Clin. Pract. Rheumatol. Novembro de 2006; 2 (11): 619-26). Anticorpos antirreceptor de IL-6 se ligam aos receptores de IL-6 solúveis e receptores de IL-6 do tipo membrana e neutralizam sua ação biológica. Acredita-se que um anticorpo anti-IL-6 receptor se liga a um receptor de IL-6 do tipo membrana, seja subsequentemente recolhido em um endossomo dentro de uma célula por internalização enquanto o anticorpo é mantido ligado ao receptor de IL-6 do tipo membrana, e depois se mova até um lisossomo, mantendo-se ligado ao receptor de IL-6 do tipo membrana, onde é degradado por lisossomo junto com o receptor de IL-6 do tipo membrana. Se H3pI/L73, CLH5/L73 e H170/L82, que são os anticorpos do receptor de IL-6 com ligação pH- dependente avaliados no exemplo 6, são capazes de retornar ao plasma por meio de FcRn em consequência da dissociação sob condições ácidas dentro de endossomos, os anticorpos que retornaram ao plasma podem se ligar aos antígenos novamente. Isso permite a neutralização de vários receptores de IL-6 do tipo membrana com uma única molécula de anticorpo. Se ocorre ou não o retorno ao plasma por meio de FcRn em consequência de dissociação sob condições ácidas dentro de endossomos com os anticorpos antirreceptor de IL-6 com ligação pH- dependente construídos pode ser determinado avaliando-se se a farmacocinética desses anticorpos está aprimorada, comparada com aquela de WT.

[000352] Dessa forma, a farmacocinética em camundongos transgê- nicos com receptor de IL-6 humana (camundongos tg hIL-6R, Proc. Natl. Med. Sc., USA, 23 de maio de 1995; 92 (11): 4.862-6) foi avaliada para os quatro tipos de anticorpos, ou seja, anticorpo humanizado PM1 (do tipo selvagem: WT) e H3pI/L73, CLH5/173 e H170/L82 construídos nos exemplos 2 e 4. WT, H3pI/L73, CLH5/L73 ou H170/182 foi administrado por administração intravenosa de dose única aos camundongos tg hIL- 6R a 25 mg/kg, e foram coletadas amostras de sangue, antes da administração e ao longo do tempo. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado por 15 minutos a 15.000 rpm e 4°C para obter plasma. O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20°C ou menos, até que as medidas fossem realizadas.

[000353] A medida da concentração no plasma de camundongo foi realizada por ELISA. Foram preparadas amostras para curva de calibração em concentrações plasmáticas de 6,4, 12, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2 e 0,1 μg/ml. As amostras da curva de calibração e as amostras para medida no plasma de camundongo foram dispensadas em uma imunoplaca (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nene International)) imobilizada com F(ab')2 anti-IgG humana (específico para cadeia y) (Sigma), e permaneceu em repouso por uma hora em temperatura ambiente. Anti-IgG humana-BIOT de cabra (Southern Biotechnology Associates) e conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina (Roche Diagnostics) foram reagidos sequencialmente, e uma reação cromatográfica foi realizada pela utilização do "BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System" (Kirkegaard & Perry Laboratories) como substrato. A absorbância a 650 nm foi medida com uma leitora de microplacas. As concentrações no plasma de camundongo foram calculadas a partir da absorbância da curva de calibração com a utilização do software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). A evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de WT, bem como de H3pI/L73, CLH5/173 e H170/182 é mostrada na figura 13.

[000354] A farmacocinética foi aprimorada para H3pI/L73, CLH5/L73 e H170/L82, quando comparados com WT. Em particular, a fármaco- cinética de H3pI/L73 e CLH5/L73 foi consideravelmente aprimorada. Um anticorpo antirreceptor de IL-6 do tipo selvagem (WT) ligado ao receptor de IL-6 do tipo membrana é recolhido em um endossomo dentro de uma célula por internalização, se move até um lisossomo enquanto o anticorpo é mantido ligado ao antígeno, e depois é degradado; portanto, ele possui um tempo de residência curto no plasma. Em contraste, na medida em que a farmacocinética dos anticorpos antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente foi consideravelmente aprimorada, os anticorpos antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente retornaram ao plasma novamente por meio de FcRn em consequência da dissociação do antígeno, receptor de IL-6 do tipo membrana, sob condições ácidas dentro de endossomos.

[000355] Embora a farmacocinética tenha sido aprimorada para todos, H3pI/L73, CLH5/L73 e H170/L82, quando comparados com WT, o efeito do prolongamento do tempo de persistência no plasma de H170/L82 foi mais fraco do que aquele de H3pI/L73 e CLH5/L73. Como se acredita que as moléculas de IgG normalmente se liguem de forma divalente ao antígeno ligado à membrana, acredita-se que os anticorpos antirrecep- tor de IL-6 também se liguem de forma divalente (avidez) aos receptores de IL-6 do tipo membrana, e depois sejam internalizados. Como indicado no exemplo 6, a análise com o uso de Biacore descreveu que H170/L82 se dissociou rapidamente do receptor de IL-6 em pH 5,8 quando se ligou ao receptor de IL-6 solúvel (figura 9), mas a taxa de dissociação deste do receptor de IL-6 em pH 5,8 quando se ligou ao receptor de IL-6 do tipo membrana era extremamente lenta (figura 10). A partir desse resultado, acredita-se que a razão para o efeito fraco do prolongamento do tempo de residência no plasma de H170/L82 seja porque o anticorpo foi incapaz de se dissociar adequadamente dentro de endossomos após ter sido internalizado em função de sua dissociação lenta em pH 5,8 quando ligado ao receptor de IL-6 do tipo membrana. Especificamente, como ocorre em relação aos antígenos da membrana, foi determinado que, a fim de que uma única molécula de IgG neutralize vários antígenos da membrana, a dependência ao pH da dissociação por ligação divalente (avidez) é mais importante do que a dependência ao pH da ligação monovalente (afinidade).

[Exemplo 9] Teste PK/PD do anticorpo com ligação pH-dependente com o uso de macacos Cynomolgus

[000356] Como a farmacocinética dos anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente foi aprimorada considerávelmente no exemplo 8, os anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente retornaram ao plasma por meio de FcRn em consequência da dissociação do antígeno, receptor de IL-6 do tipo membrana, sob condições ácidas dentro de endossomos. Se os anticorpos que retornaram ao plasma pudessem se ligar aos receptores de IL-6 do tipo membrana novamente, acredita-se que a neutralização de um antígeno, o receptor de IL-6 do tipo membrana, por anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente persistiria por mais tempo do que aquela pelo anticorpo antirreceptor de IL-6 do tipo selvagem, na mesma dosagem. Além disso, como o receptor de IL- 6 solúvel também está presente entre os receptores de IL-6, acredita-se que a duração da neutralização seja mais longa para a mesma dosagem também com relação ao receptor de IL-6 solúvel.

[000357] A farmacocinética em macacos Cynomolgus foi avaliada para WT e H3pI/L73. WT ou H3pI/L73 foi administrado aos macacos Cynomolgus por administração intravenosa de dose única a 1 mg/kg, e foram coletadas amostras de sangue antes da administração e ao longo do tempo. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado por 15 minutos a 15.000 rpm e 4°C para obter plasma. O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20°C ou menos, até que as medidas fossem realizadas.

[000358] A medida da concentração no plasma de macaco Cynomol- gus foi realizada por ELISA. Primeiro, um fragmento de anticorpo F(ab')2 anti-IgG humana (específico para cadeia y) (Sigma) foi dispensado em uma placa Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) e permaneceu em repouso de um dia para o outro a 4°C para preparar as placas imobilizadas com anti-IgG humana. Amostras da curva de calibração com concentrações plasmáticas de 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1 e 0,05 μg/ml e amostras para medida de plasma de macaco Cynomol- gus diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas; 200 μl de 20 ng/ml de IL-6R de macaco Cynomolgus foram adicionados a 100 μl das amostras da curva de calibração e amostras para medida do plasma; e depois permaneceram em repouso por uma hora em temperatura ambiente. Subsequentemente, as amostras foram dispensadas na placa imobilizada com anti-IgG humana e permaneceram em repouso por mais uma hora em temperatura ambiente. Permitiu-se que anticorpo anti-IL-6R humano biotinilado (R&D) reagisse por uma hora em temperatura ambiente, e depois se permitiu que estreptavidina- PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) reagisse por uma hora. Uma reação cromatográfica foi realizada pela utilização de "TMP One Component HRP Microwell Substrate" (BioFX Laboratories) como substrato, e depois a reação foi interrompida com 1 N de ácido sulfúrico (Showa Chemical) e a absorbância a 450 nm foi medida com uma leitora de microplacas. As concentrações em plasma de macaco Cynomolgus foram calculadas a partir da absorbância da curva de calibração com a utilização do software analítico $OFTmax PRO (Molecular Devices). A evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de WT e H3pI/L73 após a administração intravenosa é mostrada na figura 14. Como resultado, a farmacocinética de H3pI/L73 estava considerávelmente aprimorada em comparação com WT em macacos Cynomolgus da mesma forma que em camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana. Como a farmacocinética de um anticorpo antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente, H3pI/L73, estava consideravelmente aprimorada, H3pI/L73 retornava ao plasma por meio de FcRn em consequência da dissociação do antígeno, receptor de IL-6 do tipo membrana, sob condições ácidas dentro de endossomos.

[000359] A fim de avaliar o grau ao qual o receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus do tipo membrana é neutralizado pela administração intravenosa de WT e H3pI/L73, foram estudados os efeitos de anticorpos da amostra sobre a proteína C reativa no plasma (CRP) induzidos por IL-6 de macaco Cynomolgus. Como a CRP é secretada quando IL-6 se liga aos receptores de IL-6 do tipo membrana, CRP serve como um indicador da neutralização de receptores de IL-6 do tipo membrana. IL-6 de macaco Cynomolgus (cyno,IL-6 preparado no exemplo 1) contendo plasma inativado de macaco Cynomolgus 1% foi administrado por via subcutânea na região lombar dos animais diariamente a 5 μg/kg do dia 3° ao 10° dia após a administração de WT ou H3pI/L73. Foram coletadas amostras de sangue da veia safena imediatamente antes do início da administração de IL-6 de macaco Cynomolgus (3° dia) e após a administração em intervalos de 24 horas (4° ao 11° dia), depois foram separadas em plasma. As concentrações de CRP de animais individuais foram medidas com Cias R CRP (Kanto Chemical) usando um analisador automatizado (TBA-120FR, Toshiba Medical Systems). A evolução com o tempo da concentração de CRP mediante indução com IL-6 de Cynomolgus com relação ao WT e H3pI/L73 é mostrada na figura 15. Como resultado, a duração da supressão de CRP foi prolongada consideravelmente por H3pI/L73 em comparação com WT. Com base nesse achado, acredita-se que um anticorpo antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente, H3pI/L73 retorne ao plasma por meio de FcRn em consequência da dissociação de seu antígeno, o receptor de IL-6 do tipo membrana, sob condições ácidas dentro de endossomos e neutralize o receptor de IL-6 do tipo membrana por religação a ele e, dessa forma, suprime a produção de CRP por um período de tempo mais longo do que WT. Em outras palavras, H3pI/L73 demonstrou ser capaz de se ligar e neutralizar o receptor de IL-6 do tipo membrana mais de uma vez, como uma única molécula de anticorpo. Como a duração da supressão da produção de CRP por H3pI/L73 está prolongada em comparação com aquela por WT, a duração de tempo em que um antígeno, o receptor de IL-6 do tipo membrana, é ligado por anticorpos era mais prolongada para H3pI/L73 do que WT.

[000360] A fim de avaliar o grau ao qual receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus solúvel é neutralizado pela administração intravenosa de WT e H3pI/L73, a concentração de receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus solúvel não ligado no plasma de macaco Cynomolgus foi medida. Todos os anticorpos do tipo IgG (IgG de macaco Cynomolgus, anticorpo antirreceptor de IL-6 humana e um complexo de anticorpo anti- receptor de IL-6 humana e receptor de IL-6 solúvel de macaco Cynomolgus) presentes no plasma foram adsorvidos à Proteína A por adição de 30 μl de plasma de macaco Cynomolgus a uma quantidade apropriada da resina "rProtein A Sepharose Fast Flow" (GE Healthcare) seca em um copo de filtro de 0,22 μm (Millipore). Após centrifugação em uma centrífuga de alta velocidade, a solução que passou através do filtro (daqui por diante denominada "solução de passagem") foi recuperada. Como a solução de passagem não contém o complexo de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana e receptor de IL-6 solúvel de macaco Cynomolgus que está ligado à proteína A, a concentração de receptor de IL-6 solúvel não ligado pode ser medida por medição da concentração de receptor de IL-6 solúvel de macaco Cynomolgus na solução de passagem. Anticorpo monoclonal anti-IL-6R humano (R&D) que foi marcado com lutécio com "Sulfo-Tag NHS Ester" (Meso Scale Discovery) e anticorpo anti-IL-6R humano biotinilado (R&D) foram misturados com amostras da curva de calibração de receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus ajustadas às concentrações de 4.000, 2.000, 1.000, 500, 250, 125 e 62,5 pg/ml, e as amostras de plasma tratadas com Proteína A, como descrito acima. Permitiu-se que as misturas reagissem por uma hora em temperatura ambiente. Subsequentemente, as misturas foram dispensadas em uma placa de 96 poços "SA-Coated Standard MA2400" (Meso Scale Discovery). Após permitir a reação por mais uma hora e lavagem, tampão de leitura T (x4) (Meso Scale Discovery) foi dispensado. Imediatamente a seguir, foi realizada a medida com "Sector Imager 2400" (Meso Scale Discovery). As concentrações de receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus foram calculadas a partir da resposta da curva de calibração pela utilização do software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). A evolução com o tempo das concentrações de receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus solúvel não ligado para WT e H3pI/L73 é mostrada na figura 16. Como resultado, a duração da neutralização do receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus solúvel por H3pI/L73 foi consideravelmente prolongada, quando comparada com aquela por WT. Com base nesse achado, acredita-se que o anticorpo antirreceptor de IL-6 com ligação pH- dependente H3pI/L73 se dissocie de seu antígeno, receptor de IL-6 solúvel, sob condições ácidas em endossomos, e retorne ao plasma por meio de FcRn e se ligue e neutralize o receptor de IL-6 solúvel novamente. Como a duração da supressão de receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus solúvel não ligado por H3pI/L73 está prolongada em comparação com aquela por WT, a duração de tempo em que um antígeno, o receptor de IL-6 solúvel, está ligado por anticorpos era mais prolongada para H3pI/L73 do que para WT.

[000361] A partir desses achados, verificou-se que o tempo até que o anticorpo desapareça do plasma, bem como o tempo em que receptores de IL-6 solúveis e do tipo membrana estão ligados pelo anticorpo no corpo, estão consideravelmente alongados para os anticorpos antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente que se ligaram mais fortemente ao antígeno em pH 7,4, que é o pH no plasma, mas se ligaram fracamente ao antígeno em pH 5,8, que é o pH dentro de endossomos, quando comparados com o anticorpo antirreceptor de IL- 6 do tipo selvagem. Isso torna possível reduzir a dosagem e a frequência da administração aos pacientes e, em consequência, a dosagem de administração total. Portanto, acredita-se que o anticorpo antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente seja particularmente vantajoso como uma substância farmacêutica para uso como um antagonista de IL-6.

[Exemplo 10] Aumento da ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana por otimização da região variável Otimização das regiões variáveis H3pI/L73 e CLH5/L82

[000362] Anticorpos que possuem habilidades de ligação pH- dependente demonstraram efeitos superiores no exemplo 9. Portanto, para melhorar ainda mais as habilidades de ligação pH-dependente, foram introduzidas mutações na sequência da CDR de CLH5 obtido no exemplo 3 para construir VH1-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:21) e VH2- IgG1 (ID. DE SEQ. n°:22). Além disso, foram introduzidas mutações na sequência framework e na sequência da CDR de H3pI para construir as cadeias modificadas VH3-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:23) e VH4-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:24). Foram introduzidas mutações nas sequências da CDR de L73 e L82 para construir as cadeias L modificadas VL1-CK (ID. DE SEQ. n°:25), VL2-CK (ID. DE SEQ. n°:26) e VL3-CK (ID. DE SEQ. n°:27). Mais especificamente, os mutantes foram construídos usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange (Stratagene) de acordo com o método descrito nas instruções em anexo, e os fragmentos de plasmídeo resultantes foram inseridos em um vetor de expressão de célula de mamífero para construir os vetores de expressão da cadeia H e vetores de expressão da cadeia L desejados. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão resultantes foram determinadas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

[000363] O anticorpo que possui VH2-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:22) como cadeia H e VL2-CK (ID. DE SEQ. n°:26) como cadeia L foi designado Fv1-IgG1, o anticorpo que possui VH1-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:21) como cadeia H e L82 as cadeia L foi designado Fv2-IgG1 , o anticorpo que possui VH4-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:24) como cadeia H e VL1-CK (ID. DE SEQ. n°:25) como cadeia L foi designado Fv3-IgG1 e o anticorpo que possui VH3-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:23) como cadeia H e VL3-CK (ID. DE SEQ. n°:27) como cadeia L foi designado Fv4- IgG1. Desses, Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 foram expressos e purificados. A expressão e purificação foram realizadas pelo método descrito no exemplo 1.

Análise da ligação de clones com ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 solúvel

[000364] Análises cinéticas de reações antígeno-anticorpo em pH 7,4 foram realizadas nos quatro tipos de anticorpos, ou seja, o anticorpo humanizado PM1 (do tipo selvagem: WT), e WT, Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 construídos nos exemplos 2 e 10, com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare) (tampão: 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, Tween 20 0,05%). Cada anticorpo foi ligado em um chip sensor no qual um F(ab)2 anti-IgG específico para cadeia y (Pierce) foi imobilizado por acoplamento de amina, e depois SR344 ajustado até uma concentração de 9,8 a 40 nM foi injetado a ele como um analito. A associação ao SR344 e a dissociação de SR344 foram observadas em tempo real para os clones com ligação pH-dependente. Todas as medidas foram realizadas a 37°C. As constantes da taxa de associação ka (1/Ms) e as constantes da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare), e as constantes de dissociação KD (M) foram calculadas com base naqueles valores (tabela 7). [Tabela 7] Comparação de constantes da taxa de dissociação de clones com ligação pH-dependente do receptor de IL-6 solúvel, SR344

[000365] Como resultado do cálculo da afinidade em pH 7,4 para cada clone, as constantes de dissociação (afinidade, valor de KD) de WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 ao SR344 foram, respectivamente, de 2,7 nM, 1,4 nM, 2,0 nM e 1,4 nM, e são quase equivalentes. Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 demonstraram ter habilidade de ligação ao receptor de IL-6 solúvel que é igual ou maior do que aquela de WT.

Análise da ligação de clones com ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana

[000366] Reações antígeno-anticorpo ao receptor de IL-6 do tipo membrana foram observadas em pH 5,8 e pH 7,4 para os quatro tipos de clones construídos, WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare). A ligação ao receptor de IL-6 do tipo membrana foi avaliada por avaliação da ligação ao receptor de IL-6 imobilizado em um chip sensor. SR344 foi biotinilado de acordo com um método conhecido entre aqueles com habilidade na técnica, e o SR344 biotinilado foi imobilizado sobre o chip sensor por meio de estreptavidina usando a afinidade entre estreptavidina e biotina. Todas as medidas foram realizadas a 37°C. O tampão da fase móvel foi 10 mM de MES (pH 5,8), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%. Os clones com ligação pH-dependente foram nele injetados sob condições de pH 7,4 para permitir que eles se liguem ao SR344 (tampão da amostra de injeção 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, Tween 20 0,05%), e depois a dissociação pH-dependente de cada clone foi observada no pH da fase móvel de 5,8 (figura 17).

[000367] As concentrações das amostras foram ajustadas para 0,25 μg/ml. A ligação foi realizada em 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%. A dissociação foi realizada em 10 mM de MES (pH 5,8), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%. Para esse caso, as constantes da taxa de dissociação (kd (1/s)) em pH 5,8 foram calculadas ajustando-se somente a fase de dissociação em pH 5,8 com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare). De forma similar, as concentrações das amostras foram ajustadas para 0,25 μg/ml, a ligação foi realizada em 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%, e a dissociação foi realizada em 10 mM de MES (pH 7,4), 150 mM de NaCl e Tween 20 0,05%, e as constantes da taxa de dissociação (kd (1/s)) em pH 7,4 foram calculadas por ajuste somente da fase de dissociação em pH 7,4 com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare). As constantes da taxa de dissociação pH-dependente de cada clone são mostradas na tabela 8. [Tabela 8] Comparação de constantes da taxa de dissociação de clones com ligação pH-dependente do receptor de IL-6 do tipo membrana, SR344

[000368] Como resultado do cálculo dependência ao pH para cada clone, as dependências ao pH de ligação ao receptor de IL-6 do tipo membrana dos quatro clones, WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1 e Fv4- IgG1 com relação ao SR344, foram de 1,0 vez, 2,59 vezes, 7,18 vezes e 5.56 vezes, respectivamente. Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 demonstraram pH-dependência maior na dissociação do receptor de IL-6 do tipo membrana do que H3pI/L73-IgG1.

[000369] Com base no que foi apresentado acima, Fv2-IgG1 e Fv4- IgG1 demonstraram ligação pH-dependente mais forte ao receptor de IL-6 do tipo membrana do que H3pI/L73-IgG1, mantendo a afinidade pelo receptor de IL-6 solúvel igual ou mais forte do que aquela de WT.

[Exemplo 11] Teste de PK/PD de anticorpos com ligação pH- dependente com regiões variáveis otimizadas usando camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana

[000370] A farmacocinética de Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1, bem como de WT e H3pI/L73-IgG1 preparados e avaliados no exemplo 10, foi avaliada usando os camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana usados no exemplo 8. WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1 ou Fv4-IgG1 foi administrado por administração intravenosa de dose única aos camundongos tg hIL-6R a 25 mg/kg, e a concentração de cada anticorpo no plasma foi medida da mesma forma que no exemplo 8. A evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 é mostrada na figura 18.

[000371] A farmacocinética de H3pI/L73-IgG1 estava aprimorada em comparação com WT da mesma forma que no exemplo 8, enquanto a farmacocinética de Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 estava ainda mais aprimorada do que H3pI/L73-IgG1. A medida das concentrações do receptor de IL- 6 não ligado, como medida em macacos Cynomolgus no exemplo 9, foi realizada nos camundongos tg hIL-6R nesse teste usando o mesmo método. Como resultado, o prolongamento da duração da neutralização do receptor de IL-6 solúvel foi confirmado para Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1 em comparação com aquele para H3pI/L73-IgG1 (dados não mostrados). Como indicado no exemplo 10, a ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana foi aprimorada para Fv2-IgG1 e Fv4-IgG1, quando comparados com H3pI/L73-IgG1. Portanto, foi indicado que o aprimoramento adicional na farmacocinética e na duração da neutralização do receptor de IL-6 solúvel em relação àqueles de H3pI/L73-IgG1 é possível por aprimoramento da ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana.

[Exemplo 12] Aprimoramento da ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana por otimização da região constante Otimização da região constante de Fv4-IgG1

[000372] Geralmente, há relatos de que a ligação aos antígenos ligados à membrana varia, dependendo da região constante do anticorpo (J. Immunol. Methods, 23 de junho de 1997; 205 (1): 67-72). As regiões constantes dos anticorpos com ligação pH-dependente preparados acima eram do isótipo IgG1. Portanto, foi feito um estudo para otimização da região constante a fim de aprimorar a ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana.

[000373] Foi introduzida uma mutação em uma região constante de ocorrência natural, ou seja, região constante IgG2 (ID. DE SEQ. n°:28), para construir região constante IgG2ΔGK (ID. DE SEQ. n°:29). Outra mutação foi introduzida na região constante IgG2ΔGK para construir a região constante M58 (ID. DE SEQ. n°:30). Foram ainda introduzidas mutações nas regiões constantes IgG2 e M58 para construir regiões constantes M71 (ID. DE SEQ. n°:31) e M73 (ID. DE SEQ. n°:32).

[000374] VH3-IgG2ΔGK (ID. DE SEQ. n°:33) foi construída por substituição da região constante de VH3-IgG1 preparado no exemplo 10 com IgG2ΔGK, VH3-M58 (ID. DE SEQ. n°:34) foi construído por substituição da região constante com M58, e VH3-M73 (ID. DE SEQ. n°:35) foi construído por substituição da região constante com M73. Mais especificamente, foram construídos vetores de expressão nos quais a porção da região constante de VH3 usada no exemplo 10 foi substituída pode uma região constante desejada por digestão com NheI/NotI e ligação. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão resultantes foram determinadas usando um método conhecido entre aqueles com habilidade na técnica.

[000375] A expressão e a purificação foram realizadas para os seguintes: Fv4-IgG2 usando VH3-IgG2ΔGK (ID. DE SEQ. n°:33) para a cadeia H e VL3-CK (ID. DE SEQ. n°:27) para a cadeia L; Fv4-M58 usando VH3-M58 (ID. DE SEQ. n°:34) para a cadeia H e VL3-CK (ID. DE SEQ. n°:27) para a cadeia L; e Fv4-M73 usando VH3-M73 (ID. DE SEQ. n°:35) para a cadeia H e VL3-CK (ID. DE SEQ. n°:27) para a cadeia L. A expressão e a purificação foram realizadas usando o método descrito no exemplo 1.

Análise da ligação de Fv4 com região constante otimizada ao receptor de IL-6 solúvel

[000376] A associação com SR344 e a dissociação de SR344 foram observadas em tempo real usando o mesmo método que o exemplo 10 para Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4-M73 assim preparados, bem como para WT. As constantes da taxa de associação ka (1/Ms) e as constantes da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas após análise da mesma forma, e depois as constantes de dissociação KD (M) foram calculadas com base naqueles valores (tabela 9). [Tabela 9] Comparação de constantes da taxa de dissociação de clones com ligação pH-dependente do receptor de IL-6 solúvel, SR344

[000377] Como resultado do cálculo da afinidade em pH 7,4 para cada clone, as constantes de dissociação (afinidade, valor de KD) de Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4-M73 ao SR344 foram de 1,4 nM, 1,3 nM, 1,4 nM e 1,4 nM, respectivamente, e elas são quase equivalentes. Isso indica que a habilidade de ligação de clones com ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 solúvel, SR344, não se altera, nem mesmo após modificação da região constante. Com base nesse achado, acredita-se que a habilidade de ligação ao receptor de IL-6 solúvel não se altere para Fv1, Fv2 e Fv3, até mesmo se a região constante for modificada similarmente.

Análise da ligação de Fv4 com região constante otimizada ao receptor de IL-6 do tipo membrana

[000378] Reações antígeno-anticorpo ao receptor de IL-6 do tipo membrana em pH 5,8 e pH 7,4 foram observadas para Fv4-IgG1, Fv4- IgG2, Fv4-M58 e Fv4-M73 assim preparados, bem como para WT, da mesma forma que no exemplo 10 com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare). Os resultados obtidos por injeção dos clones com ligação pH-dependente sob as condições de pH 7,4 para permitir a ligação ao SR344, e por observação da dissociação pH-dependente de cada clone na fase móvel de pH 5,8, são mostrados na figura 19. Foram feitas análises adicionais da mesma forma que no exemplo 10, e as taxas de dissociação pH-dependente para cada clone são mostradas na tabela 10. [Tabela 10] Comparação de constantes da taxa de dissociação de clones com ligação pH-dependente do receptor de IL-6 do tipo membrana, SR344

[000379] Como resultado do cálculo o dependência ao pH para cada clone, as dependências ao pH de Fv4-IgG, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4- M71 ao SR344 foram 5,6 vezes, 17,0 vezes, 17,6 vezes e 10,1 vezes maiores, respectivamente; dessa forma, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4-M73 demonstraram dissociação pH-dependente maior do receptor de IL-6 do tipo membrana do que Fv4-IgG1.

[000380] Com base nos resultados da análise da ligação ao receptor de IL-6 solúvel e da ligação ao receptor de IL-6 do tipo membrana usando a região variável de Fv4, verificou-se que a substituição da região constante de IgG1 para IgG2, M58 ou M73 poderia aumentar a ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana, sem causar uma alteração na afinidade ao receptor de IL-6 solúvel. Isso foi considerado similarmente para Fv1, Fv2 e Fv3.

[Exemplo 13] Teste de PK/PD de anticorpos com ligação pH-dependente que possui região constante otimizada usando camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana

[000381] A farmacocinética de Fv4-IgG1 Fv4-IgG2 e Fv4-M58 preparados no exemplo 13 foi avaliada usando os camundongos transgênicos com receptor de IL-6 humana (hIL-6R Ig camundongos) usados no exemplo 8 para examinar os efeitos da região constante sobre a farmacocinética. WT, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2 ou Fv4-M58 foi administrado aos camundongos tg hIL-6R por administração intravenosa de dose única a 25 mg/kg, e depois a medida das concentrações plasmáticas de cada anticorpo foi realizada da mesma forma que no exemplo 8. A evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de WT, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2 e Fv4-M58 é mostrada na figura 20.

[000382] Similar ao exemplo 11, a farmacocinética de Fv4-IgG1 estava aprimorada em comparação com WT, e a farmacocinética de Fv4-IgG2 e Fv4-M58 estava ainda mais aprimorada em comparação com Fv4-IgG1. A medida das concentrações de receptor de IL-6 não ligado, feitas em macacos Cynomolgus no exemplo 9, foi realizada nos camundongos tg hIL-6R nesse teste usando o mesmo método. Como resultado, o prolongamento da duração da neutralização do receptor de IL-6 solúvel foi confirmado para Fv4-IgG2 e Fv4-M58 em comparação com aquele de Fv4-IgG1 (dados não mostrados). Como indicado no exemplo 10, a ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana estava aumentada para Fv4-IgG2 e Fv4-M58, quando comparada com Fv4-IgG- 1. Portanto, foi demonstrado que o aprimoramento na ligação pH- dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana e o aprimoramento na farmacocinética e duração da neutralização do receptor de IL-6 solúvel são possíveis por substituição da região constante de IgG1 para IgG2 ou M58. Com base nesse achado, acredita-se que a farmacocinética e a duração da neutralização do receptor de IL-6 solúvel, não apenas no caso de Fv4, mas também nos casos de Fv1, Fv2 e Fv3, possam ser aprimoradas, quando comparadas com IgG1, por substituição da região constante de IgG1 para IgG2 ou M58.

[Exemplo 14] Construção de anticorpos com ligação pH-dependente que possuem regiões variáveis e constantes otimizadas

[000383] VH2-M71 (ID. DE SEQ. n°:36) e VH2-M73 (ID. DE SEQ.n°:37), que possuem M71 e M73 para a região constante de VH2-IgG1 e VH4-M71 (ID. DE SEQ. n°:38) e VH4-M73 (ID. DE SEQ. n°:39), que possuem M71 e M73 para a região constante de VH4-IgG1, foram construídos usando o mesmo método descrito acima.

[000384] Fv1-M71, que utiliza VH2-M71 para a cadeia H e VL2-CK para a cadeia L, Fv1-M73 que utiliza VH2-M73 para a cadeia H e VL2-CK para a cadeia H, Fv3-M71 que utiliza VH4-M71 para a cadeia H e VL1-CK para a cadeia L, e Fv3-M73 que utiliza VH4-M73 para a cadeia H e VL1-CK para a cadeia L, foram expressos e purificados. A expressão e a purificação foram realizadas usando o método descrito no exemplo 1.

Análises da ligação de anticorpos com ligação pH-dependente que possuem regiões variáveis e constantes otimizadas ao receptor de IL-6 solúvel

[000385] A associação ao SR344 e a dissociação de SR344 foram observadas em tempo real usando o mesmo método que o exemplo 10 para os onze tipos de anticorpos, anticorpo humanizado PM1 (do tipo selvagem: WT) e H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3- M71, Fv3-M73, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4-M73, construídos como descrito acima. As constantes da taxa de associação ka (1/Ms) e as constantes da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas por análise da mesma forma, e as constantes de dissociação KD (M) foram calculadas com base naqueles valores (tabela 11).

[Tabela 11] Comparação de constantes da taxa de dissociação de clones com ligação pH-dependente do receptor de IL-6 solúvel, SR344

[000386] Verificou-se que todos os dez tipos de clones com ligação pH-dependente resultantes possuem constantes de dissociação (afinidade, valores de KD) ao receptor de IL-6 solúvel iguais ou mais fortes do que aquela de WT.

Análises da ligação de anticorpos com ligação pH-dependente que possuem regiões variáveis e constantes otimizadas ao receptor de IL-6 do tipo membrana

[000387] Reações antígeno-anticorpo ao receptor de IL-6 do tipo membrana em pH 5,8 e pH 7,4 foram observadas da mesma forma que no exemplo 10 com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare) para os onze tipo de anticorpos, anticorpo humanizado PM1 (do tipo selvagem: WT) e H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4- IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4-M73, preparados como descrito acima. Os clones com ligação pH-dependente foram injetados sob a condição de pH 7,4 para permitir que eles se liguem SR344, e depois a dissociação pH- dependente de cada clone no pH da fase móvel, pH 5,8, foi observada. Os resultados são mostrados na figura 21 (resultados para Fv1-M71, Fv1- M73, Fv3-M71 e Fv3-M73 são mostrados na figura 21, enquanto os resultados para outros clones são mostrados nas FIGS. 17 e 19). As análises foram realizadas da mesma forma que no exemplo 10 e as dependências ao pH das constantes da taxa de dissociação de todos os onze tipos de clones são mostradas na tabela 12. [Tabela 12] Dependências de pH de constantes da taxa de dissociação de clones com ligação pH-dependente do receptor de IL-6 do tipo membrana, SR344

[000388] Os dez tipos de clones com ligação pH-dependente obtidos demonstraram habilidade de ligação pH-dependente ao receptor de IL- 6 do tipo membrana. Além disso, verificou-se que Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4- M73 demonstram ligação pH-dependente ao receptor de IL-6 do tipo membrana aumentada, em comparação com H3pI/L73-IgG1, para o qual o tempo até que o anticorpo desapareça do plasma, bem como o tempo em que o receptor de IL-6 solúvel e o receptor de IL-6 do tipo membrana estão ligados pelo anticorpo no corpo, estavam consideravelmente prolongados em comparação com WT, como mostrado em macacos Cynomolgus no exemplo 9.

[Exemplo 15] Teste PK/PD de anticorpos com ligação pH-dependente que possuem regiões variáveis e constantes otimizadas com o uso de macacos Cynomolgus Construção de anticorpo antirreceptor de IL-6 de alta afinidade conhecidos

[000389] Foi construído um vetor de expressão de célula de mamífero para expressar o anticorpo antirreceptor de IL-6 de alta afinidade VQ8F11- 21 hIgG1 descrito em US 2007/0280945 A1 (US 2007/0280945 A1, sequências de aminoácidos 19 e 27), como um anticorpo antirreceptor de IL-6 de alta afinidade conhecido. Uma região variável de anticorpo foi construída por PCR que combina óligo-DNAs sintéticos (PCR por montagem). A região constante foi amplificada por PCR pelo vetor de expressão usado no exemplo 1. A região variável de anticorpo e a região constante de anticorpo foram ligadas por PCR por montagem e inseridas em um vetor para expressão em mamíferos. Os fragmentos de DNA da cadeia H e da cadeia L resultantes foram inseridos em vetores de expressão de célula de mamífero para construir o vetor de expressão da cadeia H e o vetor de expressão da cadeia L de interesse. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão resultantes foram determinadas por um método conhecido entre aqueles com habilidade na técnica. A expressão e a purificação foram realizadas usando os vetores de expressão construídos. A expressão e a purificação foram realizadas usando o método descrito no exemplo 1 para obter o anticorpo antirreceptor de IL-6 de alta afinidade (Ab de alta afinidade).

Teste de PK/PD em macacos Cynomolgus

[000390] A farmacocinética e a eficácia farmacológica foram avaliadas em macacos Cynomolgus para os anticorpos com ligação pH-dependente H3pI/L73-IgG1 e Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73 e Fv4-M73 e o anticorpo antirreceptor de IL-6 de alta afinidade conhecido (Ab de alta afinidade). H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73 ou Fv4-M73 foi administrado aos macacos Cynomolgus por administração intravenosa de dose única a 0,5 mg/kg, enquanto o Ab de alta afinidade foi administrado por administração intravenosa de dose única a 1,0 mg/kg. Foram coletadas amostras de sangue antes da administração e ao longo do tempo. A concentração plasmática de cada anticorpo foi medida da mesma forma que no exemplo 9. A evolução com o tempo das concentrações plasmáticas de H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2- IgG1, Fv3-M73 e Fv4-M73, bem como do Ab de alta afinidade, é mostrada na figura 21. A fim de avaliar a eficácia fármacológica em termos do grau ao qual o receptor de IL-6 do tipo membrana de macaco Cynomolgus é neutralizado, IL-6 de macaco Cynomolgus foi administrada por via subcutânea na região lombar dos animais diariamente a 5 μg/kg do 3° dia ao 10° dia (do 6° ao 10° dia com relação ao Ab de alta afinidade) após a administração de anticorpo, da mesma forma que no exemplo 9. A concentração de CRP de cada animal foi medida 24 horas após cada administração. A evolução com o tempo das concentrações de CRP com a administração de cada anticorpo é mostrada na figura 22. A fim de avaliar a eficácia farmacológica em termos do grau de neutralização do receptor de IL-6 de macaco Cynomolgus solúvel, a concentração do receptor de IL- 6 solúvel não ligado de macaco Cynomolgus no plasma de macaco Cynomolgus foi medida da mesma forma que no exemplo 9. A evolução com o tempo das concentrações de receptor de IL-6 solúvel não ligado de macaco Cynomolgus com a administração de cada anticorpo é mostrada na figura 23.

[000391] Como resultado, as concentrações plasmáticas de anticorpo foram mantidas elevadas para cada um de Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2- IgG1, Fv3-M73 e Fv4-M73, em comparação com H3pI/L73-IgG1, enquanto as concentrações de CRP e do receptor de IL-6 solúvel não ligado de macaco Cynomolgus foram mantidas em níveis baixos. Especificamente, esse resultado mostrou que o tempo em que os receptores de IL-6 do tipo membrana e solúveis estão ligados pelo anticorpo (ou, em outras palavras, a duração da neutralização) foi prolongado pelos anticorpos em comparação com H3pI/L73-IgG1.

[000392] Além disso, esses anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente foram confirmados quanto aos seus efeitos de neutralização e eficácia sustentada iguais ou maiores do que aqueles do anticorpo antirreceptor de IL-6 de alta afinidade conhecido (Ab de alta afinidade) administrado a 1,0 mg/kg, em apenas metade da dosagem deste, ou seja, a 0,5 mg/kg. Portanto, foi verificado que os anticorpos com ligação pH-dependente possuem os efeitos de neutralização e eficácia sustentada superior em relação àqueles do anticorpo antirreceptor de IL-6 de alta afinidade conhecido.

[000393] Também foi confirmado que aqueles anticorpos mostrados na tabela 12, para os quais não foram feitos testes de PK/PD usando macacos Cynomolgus como nesse teste, demonstram ligação pH- dependente aumentada ao receptor de IL-6 do tipo membrana em comparação com H3pI/L73-IgG1. Portanto, acredita-se que o tempo durante o qual os receptores de IL-6 do tipo membrana e solúveis estão ligados pelos anticorpos (ou, em outras palavras, a duração da neutralização e dos efeitos de neutralização sustentada) está prolongado para os anticorpos em comparação com H3pI/L73-IgG1.

[000394] No exemplo 9, para H3pI/L73-IgG1, verificou-se que o tempo até que o anticorpo desapareça do plasma, bem como o tempo em que o receptor de IL-6 solúvel e o receptor de IL-6 do tipo membrana estão ligados pelo anticorpo no corpo (efeitos de neutralização sustentada) estão prolongados consideravelmente, quando comparados com WT, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58 e Fv4-M73, que possuem efeitos de neutralização sustentada superiores ao H3pI/L73-IgG1 e, portanto, acredita-se que tenham efeitos de neutralização sustentada acentuadamente aumentados, quando comparados com WT.

[000395] Em contraste com os anticorpos antirreceptor de IL-6, os anticorpos antirreceptor de IL-6 com ligação pH-dependente que se ligam fortemente ao antígeno no pH no plasma de pH 7,4, mas se ligam apenas fracamente ao antígeno no pH em endossomos de pH 5,8, tornam possível reduzir a dosagem do paciente e a frequência de administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 e, em consequência, podem reduzir consideravelmente a quantidade total da administração. Portanto, acredita-se que os anticorpos antirreceptor de IL-6 que se ligam de forma pH-dependente sejam extremamente superiores como uma substância farmacêutica para uso como um antagonista de IL-6.

[Exemplo 16] Construção de anticorpo com ligação pH-dependente Expressão e purificação de anticorpo antirreceptor de IL-6

[000396] Nos exemplos 1 a 15, diversos anticorpos antirreceptor de IL-6 humanizados que se ligam de forma pH-dependente ao receptor de IL-6 foram criados com sucesso por diminuição da dependência por meio da introdução de substituições de histidina e similares na região variável, em particular, nas sequências da CDR dos anticorpos antirreceptor de IL-6 humanizados. Verificou-se que todos esses anticorpos se ligam repetidamente ao receptor de IL-6 e demonstram um aprimoramento considerável em PK/PD.

[000397] Portanto, foi confirmado que a habilidade pH-dependente de um anticorpo para se ligar a um antígeno poderia ser conferida para outro anticorpo que se liga a um antígeno diferente do receptor de IL-6 com a utilização de um método similar. IL-6 humana foi selecionada como o antígeno, e um anticorpo anti-IL-6 que inclui a cadeia H (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:62) e cadeia L (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:63), que se ligam a IL-6, como descrito em WO 2004/039826, ("anti-IL6 do tipo selvagem") foi construído. Com o uso de um método conhecido por aqueles versados na técnica, fragmentos gênicos que codificam as sequências de aminoácidos do anticorpo de interesse foram inseridos em vetores de expressão de célula de mamífero para construir o vetor de expressão da cadeia H e o vetor de expressão da cadeia L de interesse. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão resultantes foram determinadas usando um método conhecido por aqueles versados na técnica. Anti-IL6 do tipo selvagem foi expresso e purificado pelo método descrito no exemplo 1.

Construção de anticorpo anti-IL-6 pH-dependente

[000398] Para conferir a habilidade pH-dependente do anticorpo para se ligar à IL-6, foram introduzidas substituições de histidina nos aminoácidos na CDR do anticorpo anti-IL-6 (anti-IL6 do tipo selvagem), incluindo a cadeia H (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:62) e a cadeia L (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:63). Por substituição de histidina nos aminoácidos da CDR e subsequentemente avaliação, foram obtidos vários clones que demonstram a ligação pH-dependente. A ligação em pH 5,5 estava reduzida significativamente, quando comparada com a ligação em pH 7,4. As posições de substituição de histidina nos clones pH-dependentes são mostradas na tabela 13. Os exemplos incluem "clone de anti-IL6 1", que inclui a cadeia H (c1) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:64) e a cadeia L (c1) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:65), e "clone de anti-IL-6 2", que inclui a cadeia H (c1) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:64) e a cadeia L (c2) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:66). O clone de anti-IL6 1 e o clone de anti-IL-6 2 foram expressos e purificados pelo método descrito no exemplo 1.

Análise da ligação de clones pH-dependentes à IL-6 humana

[000399] A análise cinética de reações antígeno-anticorpo em pH 5,5 e pH 7,4 foi realizada usando Biacore T100 (GE Healthcare) para os três tipos de anticorpos preparados, como mencionado acima: anti- IL6 do tipo selvagem, clone de anti-IL6 1 e clone de anti-IL-6 2 (tampão: DPBS(-) (pH 7,4 ou pH 5,5), 150 mM de NaCl). Os anticorpos foram ligados a um chip sensor sobre o qual proteína A/G recombinante (Pierce) foi imobilizada por acoplamento de amina, e depois IL-6 humana (Toray), ajustada até uma concentração adequada, foi injetada no chip como um analito. Todas as medidas foram realizadas a 37°C. As constantes da taxa de associação ka (1/Ms) e as constantes da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas usando o Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare), e as constantes de dissociação KD (M) foram calculadas com base naqueles valores (tabela 14). Além disso, a proporção de afinidade em pH 5,5 e pH 7,4 foi calculada para cada clone para avaliar a ligação pH-dependente.[Tabela 14] Comparação da ligação de clones pH-dependentes à IL-6

[000400] A proporção de afinidade em pH 5,5 e pH 7,4 ((KD)(pH 5,5)/(KD)(pH 7,4)) calculada, que indica a ligação pH-dependente à IL- 6 humana, foi de 0,8, 10,3 e 13,5 para anti-IL6 do tipo selvagem, clone anti-IL6 I e clone de anti-IL6 2, respectivamente. Ou seja, a habilidade de ligação pH-dependente de cada clone é mais de 10 vezes maior do que aquela de WT. Os sensorgramas do clone de anti-IL-6 2 em pH 7,4 e pH 5,5 são mostrados na figura 26.

[000401] Dessa forma, foi demonstrado que, como no caso dos anticorpos antirreceptor de IL-6, anticorpos anti-IL-6 com ligação pH- dependente que se ligam ao antígeno fortemente sob as condições neutras do plasma, mas fracamente sob condições ácidas intra- endossômicas, podem ser construídos por introdução de substituições de histidina e similares, principalmente nas sequências de aminoácidos da CDR. Como indicado nos exemplos 1 a 15, um anticorpo antirreceptor de IL-6 que possui a habilidade de ligação pH- dependente se liga repetidamente ao receptor de IL-6 e PK/PD está acentuadamente aumentada. Ou seja, foi sugerido que o clone de anti-IL-6 1 e o clone de anti-IL-6 2, que possuem a habilidade de ligação pH-dependente, se ligam repetidamente a mais antígenos com significativamente PK/PD aumentada, quando comparados com anti-IL6 do tipo selvagem.

Construção de anticorpo antirreceptor de IL-31 com ligação pH- dependente Expressão e purificação de anticorpo antirreceptor de IL-31

[000402] Nos exemplos 1 a 15, diversos anticorpos antirreceptor de IL-6 humanizados que se ligam de forma pH-dependente ao receptor de IL-6 foram criados com sucesso por fornecimento de dependência ao pH por meio da introdução de substituições de histidina e similares na região variável, em particular, nas sequências da CDR dos anticorpos antirreceptor de IL-6 humanizados. Verificou-se que todos esses anticorpos se ligam repetidamente ao receptor de IL-6 e demonstram um aumento considerável da PK/PD.

[000403] Portanto, foi confirmado que a habilidade pH-dependente de um anticorpo para se ligar a um antígeno poderia ser conferida a outro anticorpo que se liga a um antígeno diferente do receptor de IL- 6 com a utilização de um método similar. O receptor de IL-31 de camundongo foi selecionado como o antígeno, e um anticorpo antirreceptor de IL-31 que inclui a cadeia H (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:67) e a cadeia L (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:68), que se liga ao receptor de IL-31 de camundongo, como descrito em WO 2007/142325, ("anti-IL31R do tipo selvagem") foi construído. Com o uso de um método conhecido por aqueles versados na técnica, fragmentos gênicos que codificam as sequências de aminoácidos de interesse foram inseridos em vetores de expressão de célula de mamífero para construir o vetor de expressão da cadeia H e o vetor de expressão da cadeia L de interesse. As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão resultantes foram determinadas usando um método conhecido por aqueles versados na técnica. Anti-IL31R do tipo selvagem foi expresso e purificado pelo método descrito no exemplo 1.

Construção de anticorpo antirreceptor de IL-31 pH-dependente

[000404] Para conferir a habilidade pH-dependente do anticorpo para se ligar ao receptor de IL-31, foram introduzidas substituições de histidina nos aminoácidos da CDR do anticorpo antirreceptor de IL-31 (anti-IL31R do tipo selvagem) que inclui a cadeia H (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:67) e a cadeia L (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:68). Por substituições de histidina nos aminoácidos da CDR e subsequente avaliação, foram obtidos vários clones que demonstram uma ligação pH-dependente. A ligação em pH 5,5 foi reduzida significativamente, quando comparada com a ligação em pH 7,4. A posição da substituição de histidina nos clones pH-dependentes é mostrada na tabela 15. Um exemplo é o "clone anti-IL31R 1", que inclui a cadeia H (c1) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:69) e a cadeia L (W). O clone anti-IL31 R 1 foi expresso e purificado usando o método descrito no exemplo 1.

Análise da ligação de clones pH-dependentes ao receptor de IL-31 solúvel

[000405] A análise cinética de reações antígeno-anticorpo em pH 5,5 e pH 7,4 foi realizada usando Biacore T100 (GE Healthcare) para os dois tipos de anticorpos preparados, como mencionado acima: anti-IL31R do tipo selvagem e clone anti-IL31R 1 (tampão: DPBS(-) (pH 7,4 ou pH 53), 150 mM de NaCl, Tween 20 0,01%, NaN3 0,02%). Os anticorpos foram ligados a um chip sensor sobre o qual proteína A/G recombinante (Pierce) foi imobilizada por acoplamento de amina, e depois o receptor de IL-31 solúvel de camundongo (preparado de acordo com o método descrito em WO 2007/142325) ajustado até uma concentração apropriada foi nele injetado como um analito. Todas as medidas foram realizadas a 25°C. As constantes da taxa de associação ka (1/Ms) e as constantes da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare), e as constantes de dissociação KD (M) foram calculadas com base naqueles valores (tabela 16). Além disso, a proporção de afinidade em pH 5,5 e pH 7,4 foi calculada para cada clone para avaliar a ligação pH-dependente [Tabela 16] Comparação da ligação de clones pH-dependentes ao receptor de IL-31 de camundongo

[000406] A proporção de afinidade em pH 5,5 e pH 7,4 ((KD)(pH 5,5)/(KD)(pH 7,4)) calculada, que indica a ligação pH-dependente ao receptor de IL-31 de camundongo, foi de 3,2 e 1.000 para anti-IL31R do tipo selvagem e clone de anti-IL31R 1, respectivamente. Ou seja, a habilidade pH-dependente de ligação do clone anti-IL31R 1 é cerca de 300 vezes maior do que aquela de WT. Os sensorgramas para o clone anti-IL31R 1 em pH 7,4 e pH 5,5 são mostrados na figura 27.

[000407] Dessa forma, foi demonstrado que, como nos casos dos anticorpos antirreceptor de IL-6 e dos anticorpos anti-IL-6, anticorpos antirreceptor de IL-31 com ligação pH-dependente que se ligam ao antígeno fortemente sob as condições neutras do plasma, mas fracamente sob condições ácidas intra-endossômicas, podem ser construídos por introdução de substituições de histidina e similares, principalmente nas sequências de aminoácidos da CDR. Como indicado nos exemplos 1 a 15, um anticorpo antirreceptor de IL-6 que possui a habilidade de ligação pH- dependente se liga repetidamente ao receptor de IL-6 e a PK/PD está acentuadamente aumentada. Ou seja, foi sugerido que o clone anti-IL31R 1, que possui a habilidade de ligação pH-dependente, se liga repetidamente a mais antígenos com PK/PD significativamente aumentada, quando comparado com anti-IL31R do tipo selvagem.

[Exemplo 18] Ligação repetitiva ao antígeno por anticorpo com ligação pH-dependente Expressão e purificação de anticorpo administrado a camundongos

[000408] Os quatro tipos de anticorpos de receptor de IL-6 humanizados descritos abaixo foram preparados. Como os anticorpos que não se ligam de forma pH-dependente ao receptor de IL-6, WT-, que inclui H (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:9) e L (WT) (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:10), e H54/1,28- IgG1, que inclui H54 (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:70) e L28 (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:12) foram expressos e purificados usando o método indicado no exemplo 1. Como os anticorpos que se ligam de forma pH-dependente ao receptor de IL-6, H170/L82-IgG1 do exemplo 3, que inclui H170 (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:4) e L82 (sequência de aminoácidos: ID. DE SEQ. n°:7), e Fv4-IgG1 do exemplo 10, que inclui VH3-IgG1 (ID. DE SEQ. n°:23) e VL3-CK (ID. DE SEQ. n°:27), foram expressos e purificados usando o método indicado no exemplo 1.

Análise da ligação de cada tipo de anticorpo ao receptor de IL-6 solúvel

[000409] A análise cinética de reações antígeno-anticorpo em pH 7,4 e pH 5,8 foi realizada com o uso de Biacore T100 (GE Healthcare) para os quatro tipos de anticorpos preparados: WT-IgG1, H54/L28- IgG1, H170/L82-IgG1 e Fv4-IgG1 (tampão: 10 mM de MES (pH 7,4 ou pH 5,8), 150 mM de NaCl, Tensoativo-P20 0,05%). Os anticorpos foram ligados a um chip sensor sobre o qual proteína A/G recombinante (Pierce) foi imobilizada por acoplamento de amina, e SR344, ajustado até uma concentração apropriada, foi nele injetado como um analito. A associação com SR344 e a dissociação de SR344 de cada tipo de anticorpo foram observadas em tempo real. Todas as medidas foram realizadas a 37°C. As constantes da taxa de associação ka (1/Ms) e as constantes da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas com o uso do Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare), e as constantes de dissociação KD (M) foram calculadas com base naqueles valores (tabela 17).[Tabela 17] Comparação de taxas de associação (ka), taxas de dissociação (kd), e constantes de dissociação de cada tipo de anticorpo contra o receptor de IL-6 solúvel (SR344)

[000410] A proporção de afinidade (KD) em pH 5,8 e pH 7,4 para cada anticorpo foi calculada. A proporção de KD, que indica a ligação pH- dependente ao SR344, foi de 1,6, 0,7, 61,9 e 27,3 para WT-IgG1, H54/L28- IgG1, H170/L82-IgG1 e Fv4-IgG1, respectivamente. Além disso, a proporção da taxa de dissociação (ka) em pH 5,8 e pH 7,4 para cada anticorpo foi calculada. A proporção kd, que indica a taxa de dissociação pH-dependente para SR344, foi de 2,9, 2,0, 11,4 e 38,8 para WT-IgG1 H54/L28-IgG1, H170/L82-IgG1 e Fv4-IgG1, respectivamente. Dessa forma, foi confirmado que H170/L82-IgG1 e Fv4-IgG1 demonstram a ligação pH-dependente, enquanto os anticorpos convencionais WT-IgG1 e H54/L28-IgG1 pouco exibem essa habilidade. Além disso , na medida em que a afinidade (KD) desses anticorpos em pH 7,4 foi quase igual, acredita-se que sua habilidade para se ligar ao SR344 no plasma seja equivalente.

Testes farmacocinéticos in vivo com o uso de camundongos

[000411] A farmacocinética de SR344 e do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana foi avaliada após administração de SR344 (receptor de IL- 6 humana, preparado no exemplo 1), administração isolada ou simultânea de SR344 e do anticorpo antirreceptor de IL-6 humana aos camundongos que não expressam o receptor de IL-6 humana (C57BL/6J; os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana do não se ligam ao receptor de IL-6 de camundongo). Uma solução de SR344 (5 μg/ml) ou uma solução mista contendo SR344 e o anticorpo antirreceptor de IL-6 humana (5 μg/ml e 0,1 mg/ml, respectivamente) foi administrada em uma veia caudal por administração de dose única a 10 ml/kg. Como o anticorpo antirreceptor de IL-6 humana estava presente em uma quantidade em excesso adequada em relação ao SR344, acreditava-se que quase todas as moléculas de SR344 estivessem ligadas pelo anticorpo. Foram coletadas amostras de sangue em 15 minutos, 2 horas, 8 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após a administração. As amostras de sangue coletadas foram imediatamente centrifugadas por 15 minutos a 15.000 rpm e 4°C para obter o plasma. O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20°C ou menos até o momento da medida. WT-IgG1, 1- 154/L28-IgG1, H170/L82-IgG1 e Fv4-IgG1 descritos acima foram usados como os anticorpos antirreceptor de IL-6 humana.

Medida da concentração plasmática de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana por ELISA

[000412] A concentração do anticorpo para o receptor de IL-6 humana no plasma de camundongo foi medida por ELISA. O fragmento de anticorpo F(ab')2 anti-IgG humana (específico para cadeia y) (Sigma) foi dispensado sobre uma placa "Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp" (Nalge Nunc International) e permaneceu em repouso de um dia para o outro a 4°C para preparar placas com anti-IgG humana imobilizada. Amostras da curva de calibração com concentrações plasmáticas de 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 e 0,0125 μg/ml, e amostras de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas. Duzentos μl de 20 ng/ml de SR344 foram adicionados a 100 μl das amostras da curva de calibração e das amostras de plasma, e depois as amostras permaneceram em repouso por uma hora em temperatura ambiente. Subsequentemente, as amostras foram dispensadas nas placas com anti-IgG humana imobilizada, e permaneceram em repouso por uma hora em temperatura ambiente. A seguir, anticorpos anti-IL-6R humano biotinilados (R&D) foi adicionado para reagir por uma hora em temperatura ambiente. Subsequentemente, estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi adicionado para reagir por uma hora em temperatura ambiente, e a reação cromatográfica foi realizada usando "TMP One Component HRP Microwell Substrate" (BioFX Laboratories) como um substrato. Após interrupção da reação com 1 N de ácido sulfúrico (Showa Chemical), a absorbância a 450 nm foi medida por uma leitora de microplacas. A concentração no plasma de camundongo foi calculada a partir da absorbância da curva de calibração com a utilização do software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). A evolução com o tempo da concentração plasmática após a administração intravenosa medida por esse método é mostrada na figura 28.

Medida de concentração plasmática de SR344 por eletroquimioluminescência

[000413] A concentração de SR344 no plasma de camundongo foi medida por eletroquimioluminescência. Amostras da curva de calibração de SR344 ajustadas às concentrações de 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 μg/ml, e amostras de plasma de camundongo diluídas 50 vezes ou mais foram preparadas. As amostras foram misturadas com uma solução de anticorpo monoclonal anti-IL-6R humano (R&D) marcado com rutênio com "Sulfo-Tag NHS Ester" (Meso Scale Discovery), anticorpo anti-IL-6R humano biotinilado (R&D) e WT- IgG1, e depois foram reagidas de um dia para o outro a 37°C. A concentração final de WT-IgG1 foi de 333 μg/ml, que está em excesso em relação à concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humana contida nas amostras, a fim de ligar quase todas as moléculas de SR344 nas amostras ao WT-IgG1. Subsequentemente, as amostras foram dispensadas em uma placa de estreptavidina "MA400 PR" (Meso Scale Discovery), e foram reagidas por uma hora em temperatura ambiente, e a seguir foi feita a lavagem. Imediatamente após, foi dispensado tampão de leitura T (x4) (Meso Scale Discovery), a medida foi efetuada pela leitora "Sector PR 400" (Meso Scale Discovery). A concentração de SR344 foi calculada com base na resposta da curva de calibração usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). A evolução com o tempo da concentração de SR344 plasmática após a administração intravenosa medida por esse método é mostrada na figura 29.

Efeitos da ligação pH-dependente

[000414] Com relação à evolução com o tempo da concentração de anticorpo WT-IgG1 e H54/L28-IgG1, que não demonstram a ligação pH- dependente, e H170/L82-IgG1 e Fv4-IgG1, que demonstram a ligação pH-dependente, a evolução com o tempo da concentração foi aproximadamente idêntica para WT-IgG1, H54/L28-IgG1 e Fv4-IgG1, enquanto H170/L82-IgG1 foi eliminado ligeiramente mais rapidamente. Os dados da evolução com o tempo da concentração plasmática foram analisados pelo software de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsight). As meias-vidas plasmáticas de WT-IgG1, H54/L28-IgG1, Fv4/IgG1 e H170/L28-IgG1 foram de 21,0, 28,8, 26,2 e 7,5 dias,respectivamente.

[000415] Como descrito no exemplo 2, quando o antígeno é um antígeno solúvel, um anticorpo administrado se liga ao antígeno no plasma, e é retido no plasma na forma de um complexo antígeno- anticorpo. Geralmente, em contraste com o tempo de retenção plasmática extremamente longo de um anticorpo (a taxa de eliminação é extremamente baixa) por causa da função do FcRn, o tempo de retenção plasmática de um antígeno é curto (a taxa de eliminação é elevada). Dessa forma, um antígeno que está ligado a um anticorpo possui um tempo de retenção plasmática prolongado, similar àquele de um anticorpo (a taxa de eliminação é extremamente baixa). Similarmente, quando o antígeno de anticorpo de receptor de IL-6 humanizado, SR344 (receptor de IL-6 humana solúvel), foi administrado isoladamente, SR344 foi eliminado muito rapidamente (meia-vida plasmática: 0,2 dia). No entanto, no caso da administração concomitante de SR344 com um anticorpo convencional, WT-IgG1 ou H54/L28-IgG1, que não demonstra a ligação pH-dependente, a taxa de eliminação de SR344 foi consideravelmente reduzida, e o tempo de retenção plasmática de SR344 foi prolongado (meia-vida plasmática: 5,3 dias para WT-IgG1, 6,3 dias para H54/L28-IgG1). Isso ocorre porque quase todas as moléculas de SR344 estavam ligadas pelos anticorpos administrados juntos e, dessa forma, SR344 ligado pelos anticorpos tinha um tempo de retenção plasmática prolongado similar àquele do anticorpo, por causa da função do FcRn, como descrito acima.

[000416] No caso da administração concomitante de SR344 com o anticorpo H170/L82-IgG1 ou Fv4-IgG1, que demonstra a ligação pH- dependente, a eliminação de SR344 foi significativamente rápida (meia- vida plasmática: 13 dias para H170/L82-IgG1, 0,6 dias para Fv4-IgG1), quando comparada com a administração concomitante com WT-IgG1 ou H54/L28-IgG1. Essa tendência era particularmente proeminente para Fv4-IgG1. Como a afinidade de Fv4-IgG1 em pH 7,4 é equivalente ou mais forte do que aquela de WT-IgG1 e H54/L28-IgG1, acredita-se que quase todas as moléculas de SR344 estivessem ligadas ao Fv4-IgG1. Embora Fv4-IgG1 demonstre retenção plasmática equivalente ou ligeiramente mais longa e eliminação mais lenta, comparada com WT- IgG1 e H54/L28-IgG1, a eliminação de SR344 ligado ao Fv4-IgG1 foi extremamente rápida. Isso pode ser explicado pelo conceito da presente tecnologia mostrado na figura 4. No caso de anticorpos convencionais que não demonstram a ligação pH-dependente, um complexo anticorpo- antígeno solúvel é recolhido em endossomos por pinocitose no plasma, e se liga ao FcRn expresso em endossomos sob as condições intra- endossômicas ácidas. Como o complexo anticorpo-antígeno solúvel ligado ao FcRn se transfere para a superfície celular, e retorna novamente ao plasma, o antígeno ligado a o anticorpo possui um tempo de retenção plasmática prolongado similar àquele do anticorpo (a eliminação é extremamente lenta). Por outro lado, no caso de anticorpos que demonstram a ligação pH-dependente, o antígeno se dissocia do anticorpo sob condições ácidas intra-endossômicas e, dessa forma, somente o anticorpo se liga ao FcRn e retorna novamente ao plasma. Como o antígeno dissociado do anticorpo é degradado nos lisossomos sem retornar ao plasma, a eliminação do antígeno é extremamente rápida, quando comparada com a de anticorpos que não demonstram a ligação pH-dependente. Especificamente, no caso da administração concomitante de SR344 com o anticorpo WT-IgG1 ou H54/L28-IgG1, que não demonstram a ligação pH-dependente, a eliminação de SR344 é lenta em um grau similar àquele do anticorpo, já que SR344 se liga ao WT-IgG1 ou H54/L28-IgG1 tanto no plasma quanto em endossomos. Em contraste, no caso da administração concomitante de SR344 com o anticorpo H170/L82-IgG1 ou Fv4-IgG1, que demonstram a ligação pH- dependente, a eliminação de SR344 é extremamente rápida, já que SR344 se dissocia do anticorpo no ambiente intra-endossômico de pH baixo. Ou seja, como os anticorpos H170/L28-IgG1 e Fv4-IgG1, que demonstram a ligação pH-dependente, se dissocia de SR344 no ambiente intra-endossômico de pH baixo, acredita-se que a maioria do H170/L82-IgG1 ou Fv4-IgG1 que retornou novamente ao plasma com FcRn não esteja ligada ao SR344. Dessa forma, como mostrado na figura 4, foi descrito que, por dissociação de um antígeno no ambiente intra-endossômico de pH baixo e retorno ao plasma com FcRn sem ligação ao antígeno, um anticorpo que demonstra a ligação pH- dependente pode se ligar novamente a um antígeno no plasma. Também foi demonstrado que, por repetição desse processo, o anticorpo que demonstra a ligação pH-dependente pode se ligar repetidamente a vários antígenos. Isso é consistente com os dados de Biacore mostrados no exemplo 7, que demonstram que anticorpos pH- dependentes podem se ligar repetidamente aos antígenos. Dessa forma, por aumento da ligação pH-dependente de um anticorpo a um antígeno, o número de vezes de ligação repetitiva ao antígeno pode ser aumentado.

[000417] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, e o antígeno se liga a um anticorpo sob as condições neutras do plasma, mas se dissocia do anticorpo em endossomos e o anticorpo retorna ao plasma com FcRn, o anticorpo pode se ligar novamente a um antígeno sob as condições neutras do plasma. Dessa forma, um anticorpo que possui a habilidade para se dissociar de um antígeno sob as condições ácidas intra-endossômicas pode se ligar aos antígenos várias vezes. Comparado com quando um antígeno ligado a um anticorpo não se dissocia do anticorpo em endossomos (ou seja, o antígeno ligado ao anticorpo retorna ao plasma), se um antígeno ligado a um anticorpo se dissocia do anticorpo em endossomos, a taxa de eliminação do plasma do antígeno é aumentada, já que o antígeno é transportado até os lisossomos e degradado. Dessa forma, a taxa de eliminação do plasma de um antígeno pode ser usada como um índice para determinar se um anticorpo pode se ligar ao antígeno várias vezes. A determinação da taxa de eliminação do plasma de um antígeno pode ser realizada, por exemplo, por administração de um antígeno e de um anticorpo in vivo, e depois medindo-se a concentração plasmática de antígeno após a administração, como mostrado nos exemplos.

[000418] Um anticorpo que demonstra a ligação pH-dependente pode se ligar repetidamente a vários antígenos, em contraste do que ocorre com um anticorpo convencional que não demonstra a ligação pH- dependente. Dessa forma, a quantidade de anticorpo administrada pode ser reduzida consideravelmente, e os intervalos de administração podem ser muito prolongados.

[000419] A ligação repetitiva a vários antígenos desse mecanismo se baseia na reação antígeno-anticorpo pH-dependente. Dessa forma, independentemente do tipo de antígeno, se um anticorpo que demonstra a ligação pH-dependente que se liga a um antígeno em pH 7,4 do plasma, mas se dissocia do antígeno no pH intra-endossômico ácido pode ser construído, então um anticorpo desse tipo pode se ligar repetidamente a vários antígenos. Consequentemente, a presente tecnologia é útil, na medida em que pode ser aplicada não somente aos anticorpos para o receptor de IL-6, IL-6 e para o receptor de IL-31, mas geralmente a qualquer anticorpo para qualquer antígeno, independentemente do tipo de antígeno.

Claims

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que possui um valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), definido como a proporção da KD para o antígeno em pH 5,8 e KD para o antígeno em pH 7,4, de 2 ou maior, em que pelo menos um aminoácido de uma CDR do anticorpo foi substituído com histidina, ou pelo menos uma histidina foi inserida em uma CDR do anticorpo, e o anticorpo tem qualquer uma das seguintes propriedades (a) a (f) em comparação com aquele antes da substituição ou inserção de histidina: (a) a farmacocinética do anticorpo é melhorada; (b) o número de vezes de ligação ao antígeno do anticorpo é aumentado; (c) o número de antígenos que podem ser ligados pelo anticorpo é aumentado; (d) a proporção de um antígeno que é dissociado do anticorpo dentro de uma célula aumenta entre os antígenos internalizados na célula por meio da ligação ao anticorpo; (e) a proporção do anticorpo que é liberado em uma forma livre de antígeno para o exterior de uma célula aumenta entre os anticorpos que foram ligados a um antígeno e internalizados na célula; e (f) a capacidade do anticorpo de eliminar um antígeno no plasma é aumentada.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 10 ou maior.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 40 ou maior.

4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo possui uma atividade antagonística.

5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga a um antígeno da membrana ou a um antígeno solúvel.

6. Método para o aumento do número de antígenos que podem ser ligados por um anticorpo, caracterizado pelo fato de ser através da substituição de pelo menos um aminoácido de uma CDR do anticorpo com histidina, ou inserir pelo menos uma histidina em uma CDR do anticorpo, em que um valor KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4) do anticorpo, definido como a razão de KD para o antígeno em pH 5,8 e KD para o antígeno em pH 7,4 é maior em comparação com aquela antes da substituição ou inserção de histidina, e o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 2 ou maior, e o anticorpo está contido em uma composição farmacêutica.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 10 ou maior.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) é de 40 ou maior.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo possui uma atividade antagonística.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um antígeno da membrana ou a um antígeno solúvel.