TW202043265A - 重複結合複數個抗原的抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種在早期內囊胞內pH的抗原結合活性較在血漿中pH的抗原結合活性弱的抗體，該抗體可以1分子與複數個分子的抗原結合，延長血漿中半衰期，改善可與抗原結合的時間。

Description

重複結合複數個抗原的抗原結合分子
本發明關於提升抗原結合分子的藥物動力之方法、增加抗原結合分子與抗原結合次數的方法、藥物動力提升之抗原結合分子、增加抗原結合分子與抗原結合次數之抗原結合分子、以及前述之製造方法。
抗體在血漿中安定性高且副作用少，因此受到注意作為醫藥品。其中，IgG型的抗體藥物多數已上市，也是目前開發的抗體藥物的多數(非專利文獻1、2)。另外，適用於第二代抗體藥物的技術也開發出多種技術，已有提高效應物功能、抗原結合能力、藥物動力、穩定性、或降低免疫風險的技術問世(非專利文獻3)。由於抗體藥物的一般投藥量非常地高，考量製作成本高等的課題，難以製作皮下投藥的製劑。為了降低抗體藥物的投予量，考慮提高抗體藥物動力及提高抗體與抗原親和性(affinity)的方法。
提高抗體藥物動力的方法已有恆定區人工胺基酸取代的報告(非專利文獻4、5)。增加抗原結合能力、抗原中和能力的技術，已報導有親和力成熟技術(非專利文獻6)，可藉由導入可變區的CDR區等的胺基酸變異，增強對抗原的結合活性。藉由抗原結合能力的增強，可使活體外(in vitro )的生物活性提高，或者降低投予量，可進一步提高活體內(in vivo )藥效(非專利文獻7)。
此外，每1分子抗體可中和的抗原量，與親和力有關，提高親和力可以較少的抗體量中和抗原，可使用各種方法增加抗體親和力。而且，如果可使與抗原共價結合的親和力變成無限大，則可能使1分子抗體與1分子抗原(2價時為2抗原)中和。然而，以目前的方法，化學理論的1分子抗體與1分子抗原(2價時為2抗原)的中和反應有限制，以抗原量以下的抗體量不可能完全中和抗原。因此，增加親和力的效果有一限度(非專利文獻9)。中和抗體時，為了使該中和效果持續一段時間，在此期間內必須投予大於生體內所產生的抗原量之抗體量，如果只有上述提高抗體藥物動力或者親和力成熟的技術，則必要抗體投予量的降低有限制。
因此，為了使低於抗原量的抗體量在目標時間內持續抗原中和效果，必須要以1個抗體中和複數個抗原。以1個抗體中和複數個抗原的方法，例如經由使抗體具有觸媒功能的觸媒抗體，使抗原不活化。蛋白質抗原的情形下，可經由水解抗原的胜肽鍵使其不活化，此水解反應以抗體為觸媒，可重複中和(不活化)抗原(非專利文獻8)。雖然至今已有許多觸媒抗體及觸媒抗體製作技術相關報告，但以具有充分觸媒活性的觸媒抗體作為醫藥品卻未有任何報導。即對於某抗原的抗體活體試驗中，與不具有一般觸媒功能的中和抗體相比，以低用量可發揮同等以上的效果，或者以相同投予量可發揮持續的效果之觸媒抗體，至今未有報導。
因此，至今未有關於以1分子抗體中和複數個抗原並可發揮較一般中和抗體優秀的活體內效果之抗體，期望有新穎的抗體製作技術，降低投予量及延長持續性，以1抗體中和複數個抗原，且較一般中和抗體在活體內發揮效果。
本發明引用之先前技術如下： [先行技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1] Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073-1078 (2005) [非專利文獻2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96. [非專利文獻3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review. [非專利文獻4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56 [非專利文獻5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40 [非專利文獻6] Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R. [非專利文獻7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665 [非專利文獻8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications.Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec;16(6):631-6. [非專利文獻9] Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9;334(4):1004-13。
[發明所欲解決之問題]
有鑑於上述之狀況，本發明之目的為提供：使抗原結合分子與抗原複數次結合之方法、提升抗原結合分子的藥物動力之方法、可與抗原複數次結合之抗原結合分子、改善藥物動力之抗原結合分子、包含該抗原結合分子之醫藥組成物、及前述之製造方法。 [解決問題之技術手段]
本發明人等係對具有抗原結合分子等抗原結合能力之多胜肽抗原複數次結合之方法、改善血漿中半衰期(血中半衰期)(提升藥物動力)之方法，進行研究。本發明人等進而發現以在早期內囊胞(endosome)內pH的抗原結合活性較在血漿中pH的抗原結合活性弱之抗原結合分子，與抗原複數次結合，可延長血漿中半衰期。
本發明關於抗原結合分子與抗原複數次結合之方法、提升抗原結合分子的藥物動力之方法、與抗原複數次結合的抗原結合分子、提升藥物動力之抗原結合分子、提升藥物動力的抗原結合分子之製造方法。更具體地說： (1)對抗原在pH5.8的KD與在pH7.4的KD的比，KD (pH5.8)/KD(pH7.4)值為2以上的抗原結合分子。 (2)如上述(1)的抗原結合分子，其中KD(pH5.8)/KD (pH7.4)值為10以上。 (3)如上述(1)的抗原結合分子，其中KD(pH5.8)/KD (pH7.4)值為40以上。 (4)如上述(1)~(3)任一項的抗原結合分子，其特徵在於至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (5)如上述(1)~(4)任一項的抗原結合分子，其特徵為具有拮抗活性。 (6)如上述(1)~(5)任一項的抗原結合分子，其特徵在於與膜抗原或可溶型抗原結合。 (7)如上述(1)~(6)任一項的抗原結合分子，其特徵在於該抗原結合分子為抗體。 (8)包含上述(1)~(7)任一項的抗原結合分子之醫藥組成物。 (9)提高抗原結合分子的藥物動力之方法，使該抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱。 (10)增加抗原結合分子對抗原的結合次數之方法，使該抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱。 (11)增加抗原結合分子可結合抗原數之方法，使該抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱。 (12)細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內與抗原結合分子解離之方法，使該抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱。 (13)與抗原結合狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法，使該抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱。 (14)增加抗原結合分子在血漿中抗原消失能力之方法，使該抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱。 (15)如上述(9)~(14)任一項之方法，其特徵在於對抗原在pH5.8的KD與在pH7.4的KD的比，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為2以上。 (16)如上述(9)~(14)任一項之方法，其特徵在於KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為10以上的抗原結合分子。 (17)如上述(9)~(14)任一項之方法，其特徵在於KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為40以上的抗原結合分子。 (18)提高藥物動力之方法，使抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (19)增加抗原結合分子對抗原的結合次數之方法，使抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (20)增加抗原結合分子可結合抗原數之方法，使抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (21)細胞外與抗原結合分子結合的抗體在細胞內與抗原結合分子解離之方法，使該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (22)以抗原結合狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法，使該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (23)增加抗原結合分子在血漿中抗原消失能力之方法，使該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (24)如上述(18)~(23)任一項之方法，其特徵在於該抗原結合分子以組胺酸取代或組胺酸插入後，在pH5.8的抗原結合活性與在pH7.4的抗原結合活性的比，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值，大於組胺酸取代或組胺酸插入前的值。 (25)如上述(9)~(24)任一項之方法，其特徵為該抗原結合分子具有拮抗活性。 (26)如上述(9)~(25)任一項之方法，其特徵在於該抗原結合分子與膜抗原或可溶性抗原結合。 (27)如上述(9)~(26)任一項之方法，其特徵在於該抗原結合分子為抗體。 (28)抗原結合分子之篩選方法，包括以下步驟： (a)取得抗原結合分子在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性之步驟； (b)取得抗原結合分子在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性之步驟；及 (c)選擇在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的抗原結合分子之步驟。 (29)如上述(28)之篩選方法，其特徵在於選擇在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性為在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性兩倍以上的抗體。 (30)抗原結合分子之篩選方法，包括以下步驟： (a)使抗原結合分子在pH6.7~pH10.0條件下與抗原結合之步驟； (b)將(a)與抗原結合之抗原結合分子置於pH4.0~pH6.5的條件下之步驟；及 (c)取得在pH4.0~pH6.5條件下解離的抗原結合分子之步驟。 (31)抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子為在第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性者，包括以下步驟： (a)將固定抗原的柱在第一pH條件下與該抗原結合分子結合之步驟； (b)在第一pH條件下結合於該柱的抗原結合分子，在第二pH條件下由該柱溶出之步驟；及 (c)取得該溶出的抗原結合分子之步驟。 (32)抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子為在第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性者，包括以下步驟： (a)將該抗原結合分子資料庫在第一pH條件下與固定抗原的柱結合之步驟； (b)在第二pH條件下，由該柱溶出抗原結合分子之步驟； (c)放大編碼該溶出的抗原結合分子的基因之步驟；及 (d)取得該溶出的抗原結合分子之步驟。 (33)如上述(31)或(32)之篩選方法，其特徵在於該第一pH為pH6.7~pH10.0，該第二pH為pH4.0~pH6.5。 (34)如上述(28)~(33)任一項之篩選方法，其特徵在於該抗原結合分子中至少一個以上的胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。 (35)如上述(28)~(33)任一項之篩選方法，其目的在於獲得血漿中滯留性優良的抗原結合分子。 (36)如上述(28)~(33)任一項之篩選方法，其目的在於獲得可與抗原2次以上結合的抗原結合分子。 (37)如上述(28)~(33)任一項之篩選方法，其目的在於獲得可結合的抗原數較抗原結合部位多的抗原結合分子。 (38)如上述(28)~(33)任一項之篩選方法，其目的在於獲得細胞外與抗原結合在細胞內解離的抗原結合分子。 (39)如上述(28)~(33)任一項之篩選方法，其目的在於獲得以抗原結合狀態進入細胞內、以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之的抗原結合分子。 (40)如上述(28)~(33)任一項之篩選方法，其目的在於獲得增加血漿中抗原消失能力之抗原結合分子。 (41)如上述(28)~(40)任一項之篩選方法，該抗原結合分子作為醫藥組成物。 (42)如上述(28)~(41)任一項之篩選方法，其特徵為該抗原結合分子為抗體。 (43)抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟： (a)取得抗原結合分子在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性之步驟； (b)取得抗原結合分子在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性之步驟； (c)選擇在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的抗原結合分子之步驟； (d)取得編碼(c)選擇的抗原結合分子之基因的步驟； (e)使用(d)所得的基因製造抗原結合分子之步驟。 (44)抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟： (a)在pH6.7~pH10.0的條件下使抗原結合分子與抗原結合之步驟； (b)將(a)與抗原結合之抗原結合分子放置在pH4.0~pH6.5的條件下之步驟； (c)取得pH4.0~pH6.5條件下解離之抗原結合分子之步驟； (d)取得編碼(c)所得抗原結合分子的基因之步驟；及 (e)使用(d)所得基因製造抗原結合分子之步驟。 (45)抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子在第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性，包括以下步驟： (a)將固定抗原的柱在第一pH條件下與該抗原結合分子結合之步驟； (b)在第一pH條件下與結合於柱的抗原結合分子，在第二pH條件下由該柱溶出之步驟； (c)取得該溶出的抗原結合分子之步驟； (d)取得編碼(c)所得抗原結合分子的基因之步驟；及 (e)使用(d)所得基因製造抗原結合分子之步驟。 (46)抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子在第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性，包括以下步驟： (a)將抗原結合分子資料庫在第一pH條件下與固定抗原的柱結合之步驟； (b)在第二pH條件下由該柱溶出抗原結合分子之步驟； (c)放大編碼該溶出的抗原結合分子的基因之步驟； (d)取得該溶出的抗原結合分子之步驟； (e)取得編碼(d)所得抗原結合分子的基因之步驟；及 (f)使用(e)所得基因製造抗原結合分子之步驟。 (47)如上述(45)或(46)之製造方法，其特徵在於該第一pH為pH6.7~pH10.0，該第二pH為pH4.0~pH6.5。 (48)如上述(43)~(47)任一項之製造方法，更包括該抗原結合分子中至少一個以上的胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸之步驟。 (49)如上述(43)~(48)任一項之製造方法，其特徵為該抗原結合分子為抗體。 (50)包含由上述(43)~(49)任一項之製造方法所製造之抗原結合分子之醫藥組成物。 [發明效果]
本發明提供使1分子抗原結合分子重複結合複數個抗原之法。1分子的抗原結合分子與複數個抗原結合，可提升該抗原結合分子的藥物動力，活體內發揮優於一般抗原結合分子的效果。
本發明提供一種增加抗原結合分子與抗原結合次數之方法。更具體為，藉由抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，增加抗原結合分子與抗原結合次數之方法。本發明更提供一種增加抗原結合分子與抗原結合次數之方法，其特徵在於該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。本發明更提供一種增加抗原結合分子與抗原結合次數之方法，其特徵在於該抗原結合分子之抗體恆定區中的胺基酸被取代、缺失、新增及/或插入。
本發明又提供一種增加抗原結合分子可結合抗原數之方法。更具體為，藉由抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，增加抗原結合分子可結合抗原數之方法。本發明更提供一種增加抗原結合分子可結合抗原數之方法，其特徵在於該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。本發明更提供一種增加抗原結合分子可結合抗原數之方法，其特徵在於該抗原結合分子之抗體恆定區中的胺基酸被取代、缺失、新增及/或插入。
本發明又提供一種細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內與抗原結合分子解離之方法。更具體為，藉由抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內與抗原結合分子解離之方法。本發明更提供一種細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內與抗原結合分子解離之方法，其特徵在於該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。本發明更提供一種細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內與抗原結合分子解離之方法，其特徵在於該抗原結合分子之抗體恆定區中的胺基酸被取代、缺失、新增及/或插入。
本發明又提供一種與抗原結合狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法。更具體為，藉由抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，與抗原結合狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法。本發明更提供一種與抗原結合狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法，其特徵在於該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。本發明更提供一種與抗原結合狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法，其特徵在於該抗原結合分子之抗體恆定區中的胺基酸被取代、缺失、新增及/或插入。
本發明又提供一種增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法。更具體為，藉由抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法。本發明更提供一種增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法，其特徵在於該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。本發明更提供一種增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法，其特徵在於該抗原結合分子之抗體恆定區中的胺基酸被取代、缺失、新增及/或插入。
本發明又提供一種提高抗原結合分子的藥物動力之方法。更具體為，藉由抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，提高抗原結合分子的藥物動力(延長血漿中滯留性)之方法。本發明更提供一種提高藥物動力之方法，其特徵在於該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。本發明更提供一種提高藥物動力之方法，其特徵在於該抗原結合分子之抗體恆定區中的胺基酸被取代、缺失、新增及/或插入。
本發明又提供一種增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法。更具體為，藉由抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法。本發明更提供一種增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法，其特徵在於該抗原結合分子的至少一個胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸。本發明更提供一種增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力之方法，其特徵在於該抗原結合分子之抗體恆定區中的胺基酸被取代、缺失、新增及/或插入。
本發明中「藥物動力的提升」、「藥物動力的改善」、或「優良的藥物動力」可與「血漿中(血中)滯留性的提升」、「血漿中(血中)滯留性的改善」、或「優良的血漿中(血中)滯留性」互換，前述語句為相同意義。
本發明中所謂在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱，是指抗原結合分子在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性較pH6.7~pH10.0的抗原結合活性弱。較佳是指抗原結合分子在pH5.5~pH6.5的抗原結合活性較pH7.0~pH8.0的抗原結合活性弱。更佳是指抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較pH7.4的抗原結合活性弱。因此，本發明的酸性pH通常為pH4.0~pH6.5，較佳為pH5.5~pH6.5，更佳為pH5.8。本發明的中性pH通常為pH6.7~pH10.0，較佳為pH7.0~pH8.0，更佳為pH7.4。
本發明中所謂「抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力較在中性pH中的抗原結合能力弱」的表現為，抗原結合分子在中性的抗原結合能力高於酸性pH的抗原結合能力。因此，本發明中，抗原結合分子在酸性pH的抗原結合能力與在中性的抗原結合能力差異宜大(例如後述的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值宜大)。為了使抗原結合分子在酸性pH的抗原結合能力與在中性的抗原結合能力差異大，例如宜降低在酸性pH中的抗原結合能力，或提高在中性pH的抗原結合能力，又或者兩者同時進行。
定抗原的結合活性時，pH以外的條件可由熟知該技術領域者適當選擇，無特別限制，例如實施例記載以MES緩衝液在37℃下測定。又抗原結合分子的抗原結合活性之測定可由該技術領域中習知方法進行，例如實施例記載使用Biacore(GE Healthcare)等測定。當抗原為可溶型抗原時，可使抗原流過固定抗原結合分子的晶片，進行檢測(analight)，評估與可溶型抗原的結合能力。當抗原為膜型抗原時，可使抗原結合分子流過固定抗原的晶片進行檢測(analight)，評估與膜型抗原的結合能力。
本發明限於在酸性pH的抗原結合能力較在中性的抗原結合能力弱，但對於在酸性pH的抗原結合能力與在中性的抗原結合能力的差異沒有特別限制，但較佳為對抗原在pH5.8的KD與在pH7.4的KD(解離常數，Dissociation constant)的比，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值較佳為2以上，更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為10以上，宜更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為40以上。KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值的上限沒有特別限定，由於該技術領域之技術製作的限制，可為400、1000、10000等，任何數值皆可。當抗原為可溶型抗原時，抗原結合活性的值可為KD(解離常數)值，但當抗原為膜型抗原時，抗原結合活性的值可為視KD(視解離常數；apparent dissociation constant)。KD(解離常數)及視KD(視解離常數)可用該技術領域中習知方法測定，例如Biacore(GE healthcare)、斯克恰圖(Scatchard plot)、FACS等。
又本發明中顯示在酸性pH的抗原結合能力與在中性的抗原結合能力之差異的其他指標，可使用例如解離速度常數Kd(Dissociation rate constant)。使用Kd(解離速度常數)取代KD(解離常數)作為表示結合活性差異的指標時，對抗原在pH5.8的Kd(解離速度常數)與在pH7.4的Kd(解離速度常數)的比，Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值較佳為2以上，更佳為5以上，在更佳為10以上，又更佳為30以上。Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值的上限沒有特別限制，由於該技術領域之技術製作的限制，可為50、100、200等，任何數值皆可。
當抗原為可溶型抗原時，抗原結合活性的值可為Kd(解離速度常數)值，但當抗原為膜型抗原時，抗原結合活性的值可為視Kd(視解離速度常數；apparent dissociation rate constant)。Kd(解離速度常數)及視Kd(視解離速度常數)可用該技術領域中習知方法測定，例如Biacore(GE healthcare)、FACS等。
本發明中測定在不同pH中抗原結合分子的抗原結合活性，除pH以外，其他條件宜為相同。
抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱之方法(賦予pH依賴結合能力之方法)沒有特別限制，可以任何方法進行。例如抗原結合分子中的胺基酸以組胺酸取代，或者在抗原結合分子中插入組胺酸，使其在pH5.8的抗原結合能力較在pH7.4的抗原結合能力弱之方法。以組胺酸取代抗體中的胺基酸可使抗體具有pH依賴性的抗原結合活性為已知(FEBS Letter, 309(1), 85-88, (1992))。組胺酸變異(取代)或插入所導入(進行)的位置沒有特別限定，只要比變異或插入前在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值變大)即可，任何位置皆可。例如當抗原結合分子為抗體時，例如可為抗體的可變區。組胺酸變異或插入的導入(進行)數量可由該技術人士適當決定，可以只有1處以組胺酸取代，或也可只有1處插入組胺酸，亦可為2處以上的複數個位置以組胺酸取代，或者2處以上的複數個位置插入組胺酸。又可以同時導入除了組胺酸變異以外的變異(組胺酸以外的胺基酸變異)。也可以同時進行組胺酸變異及組胺酸插入。組胺酸的取代或組胺酸的插入可由該技術人士以習知的甘胺酸掃描之甘胺酸被組胺酸取代的組胺酸掃描等的方法，自由進行，由自由導入組胺酸變異或插入的抗原結合分子資料庫中，選擇較變異前KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值變大的抗原結合分子。
抗原結合分子的胺基酸以組胺酸取代，或者抗原結合分子的胺基酸中插入組胺酸的情形，沒有特別限制，但較佳為組胺酸取代或插入後的抗原結合分子在pH7.4的抗原結合活性與組胺酸取代或插入前的抗原結合分子在pH7.4的抗原結合活性相同者。此述之組胺酸取代或插入後的抗原結合分子在pH7.4的抗原結合活性與組胺酸取代或插入前的抗原結合分子在pH7.4的抗原結合活性相同者，表示該組胺酸取代或插入後的抗原結合分子為組胺酸取代或插入前的抗原結合分子之抗原結合活性的10%以上，較佳為50%以上，更佳為80%以上，又更佳為90%以上。如果經組胺酸取代或插入使抗原結合分子的抗原結合活性降低時，抗原結合分子中1或複數個胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等的抗原結合活性宜與組胺酸取代或插入前的抗原結合活性相同。本發明亦包含在上述之組胺酸取代或插入後進行1或複數個胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入使結合活性相同之抗原結合分子。
又其他使抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱之方法，例如抗原結合分子中的胺基酸以非天然胺基酸取代或抗原結合分子中的胺基酸插入非天然胺基酸之方法。非天然胺基酸已知可人為控制pKa Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34、Chem Soc Rev. 2004 Sep 10;33(7):422-30.、Amino Acids. 1999;16(3-4):345- 79.)。因此，本發明中，可以非天然胺基酸取代上述組胺酸。又上述之組胺酸取代及/或插入，以及非天然胺基酸的取代及/或插入，可同時進行。本發明所使用的非天然胺基酸可為任何的非天然胺基酸，可使用該技術領域中公知的非天然胺基酸等。
再者，當抗原結合分子為包含抗體恆定區的物質時，抗原結合分子在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱之方法，例如可改變抗原結合分子所含的抗體恆定區。此述之抗體恆定區的改變，具體例可為如實施例記載之取代為恆定區之方法。
抗體恆定區的改變方法，例如多次檢討恆定區的同型物(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，選擇在pH5.8的抗原結合活性低(在pH5.8的解離速度加快)的同型物。又野生型的同型物的胺基酸序列(野生型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4胺基酸序列)以胺基酸取代，使在pH5.8的抗原結合活性降低(在pH5.8的解離速度加快)之方法。同型物(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)抗體的恆定區的樞紐(hinge)區序列差異大，樞紐區的胺基酸序列不同對抗原結合活性產生大的影響，因此根據抗原或抗原決定部位的種類，選擇適當的同型物，可選擇在pH5.8的抗原結合活性降低(在pH5.8的解離速度加快)的同型物。又樞紐區的胺基酸序列的不同，對抗原結合活性產生大的影響，因此野生型同型物的胺基酸序列的胺基酸取代位置，希望在樞紐區。
根據上述之方法，抗原結合物質在pH5.8的抗原結合活性較在pH7.4的抗原結合活性弱(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值變大)的情形，沒有特別限制，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值，與基本的抗體相比，通常宜為2倍以上，較佳為5倍以上，更佳為10倍以上者。
本發明之所謂「提升藥物動力」，包括從抗原結合分子投予人、小鼠、大鼠、猿、兔、狗等動物開始，至血漿中消失(例如細胞內分解等，抗原結合分子不可能回到血漿中的狀態為止)的時間延長，以及抗原結合分子從投予至血漿中消失之間，與抗原可能結合的狀態(例如抗原結合分子未與抗原結合的狀態)，在血漿中滯留的時間延長。抗原結合分子雖存在血漿中，但當該抗原結合分子已經與抗原結合時，該抗原結合分子無法與新的抗原結合。因此，如果延長抗原結合分子未與抗原結合的時間，則可與新抗原結合的時間變長(與新抗原結合的機會變多)，可減少活體內抗原未與抗原結合分子結合的時間(換言之，可延長抗原與抗原結合分子結合的時間)。例如對血漿中等的活體內存在的抗原(與抗原結合分子結合的分子及未與抗原結合分子的抗原之總量)來說，與抗原結合分子結合的抗原的比例，通常在投予抗原結合分子後經過一段時間會減少。然而，如果延長抗原結合分子與抗原可能結合狀態的滯留時間，則可抑制其減少(例如降低減少的程度等)，結果對從抗體投予經過一定時間後活體內存在的抗原而言，與抗原結合分子結合的抗原比例增高。
因此，本發明之「藥物動力的提升」不必一定要延長(變長)自投予抗原結合分子至抗原結合分子消失的時間。例如抗原結合分子自投予至消失的時間不變，但是當抗原結合分子以可與抗原結合的狀態(例如抗原結合分子未與抗原結合的狀態)在血漿中滯留的時間變長時，體內抗原未與抗原結合分子結合的時間減少(換言之，抗原與抗原結合分子結合的時間變長)，或者當對體內存在的抗原而言，與抗原結合分子結合的抗原比例變高的情形時，皆包含於本發明之「藥物動力的提升」。因此，本發明之「藥物動力的提升」包括以下(1)~(4)任一種： (1)從投予抗原結合分子起，至抗原結合分子血漿中消失為止的時間延長。 (2)從投予抗原結合分子起，抗原結合分子以可與抗原結合之狀態在血漿中存在的時間延長。 (3)從投予抗原結合分子起，體內的抗原未與抗原結合分子結合的時間減少(體內抗原與抗原結合分子的結合時間延長)。 (4)對體內存在的抗原而言，與抗原結合分子結合的抗原的比例升高。
又當抗原為存在血漿中的可溶型抗原時，即使抗原結合分子的藥物動力(自血漿中消失速度)相同，抗原結合分子結合的抗原消失提早。是因為抗原的藥物動力降低(提早從血漿中消失)，對抗原相對的抗原結合分子的藥物動力提升的關係，亦即，抗原結合分子可以與抗原結合的狀態存在血漿中的時間延長有關。因此，本發明之抗原結合分子的「藥物動力的提升」的一態樣，包括從投予抗原結合分子開始，可溶型抗原的血漿中消失的速度(抗原結合分子的血漿中抗原消失能力)的上升。
本發明中1分子的抗原結合分子是否與複數個抗原結合，當抗原為膜型抗原時，可從抗原結合分子的藥物動力是否提升來判斷。是否「提升藥物動力」可由以下描述來判斷。例如從投予抗原結合分子至抗原結合分子消失的時間是否延長，可經由測定抗原結合分子的血漿中半衰期、平均血漿中滯留時間、血漿中清除率等任一項的參數(藥物動能演習理解(南山堂))來判斷。例如當投予抗原結合分子於小鼠、大鼠、猿、兔、狗、人等，血漿中半衰期變長或者平均血漿中滯留時間亦長時，可謂抗原結合分子的藥物動力提升。這些參數可由該技術領域中公知方法來測定，例如使用藥物動力分析軟體WinNonlin(Pharsight)，遵循其附上的操作書根據未區分(noncompartmental)分析適當評價。
又抗原結合分子自投予至消失的時間中，以可與抗原結合的狀態存在血漿中的時間是否延長，可測定未與抗原結合的抗原結合分子的血漿中濃度，經測定未與抗原結合的抗原結合分子的血漿中半衰期、平均血漿中滯留時間、血漿中清除率等任一項的參數來判斷。未與抗原結合的抗原結合分子的血漿中濃度測定可由該技術領域公知方法實施，例如Clin Pharmacol. 2008 Apr;48(4):406-17測定。
又從投予抗原結合分子開始，體內抗原未與抗原結合分子結合的時間是否減少(抗原與抗原結合分子的結合時間變長)，測定未與抗原結合分子結合的非結合型抗原的血漿中濃度，可判斷非結合型抗原的血漿中濃度低或對總抗原量的非結合型抗原量的比例低的維持時間。非結合型抗原的血漿中濃度或對總抗原量的非結合型抗原量的比例之測定可根據該技術領域中公知方法實施，例如Pharm Res. 2006 Jan;23(1):95-103測定。又抗原在體內顯示何種功能時，可由抗原是否經由中和抗原功能的抗原結合分子(拮抗分子)結合，或該抗原功能是否被中和來評估。抗原功能是否被中和可測定是否反應抗原功能的活體內標記物(marker)來評估。抗原是否經由活化抗原功能的抗原結合分子(拮抗分子)結合，可由測定是否反應抗原功能的活體內標記物(marker)來評估。
非結合型抗原的血漿中濃度的測定、對總抗原量的非結合型抗原的抗原量的比例之測定、活體內標記物(marker)的測定等，沒有特別限制，但宜在投予抗原結合物質經過一段時間後進行為佳。本發明中”自投予抗原結合物質經過一段時間後”，並無特別限定，根據投予的抗原結合物質的性質等由該技術人士適時決定，例如投予抗原結合物質經過1日後、投予抗原結合物質經過3日後、投予抗原結合物質經過7日後、投予抗原結合物質經過14日後、投予抗原結合物質經過28日後等。
本發明宜為提升人體中的藥物動力。當難以測量人血漿中滯留性時，可以小鼠(例如正常小鼠、人抗原表現轉殖基因鼠、人FcRn表現轉殖基因鼠等)或猿(例如食蟹猴等)的血漿中滯留性為基礎，預測人血漿中滯留性。
血漿中滯留性的測定方法沒有特別限定，例如可根據實施例記載之方法進行。
抗原結合分子是否可能與抗原複數次結合，可測定與血漿中相同中性條件下，與抗原結合分子結合的抗原在與內囊胞內相同的酸性條件下解離，再於中性條件下是否可與何種抗原結合來評估。具體來說，使用評估如Biacore的抗原結合分子-抗原反應的機器，在中性條件下形成抗原結合分子-抗原複合體，之後暴露在酸性條件下一定時間後，再於中性條件下測定抗原結合分子是否可與抗原結合而評估。與改變前抗原結合分子相比，具有pH依賴結合能力的抗原結合分子之抗原結合量增加2倍時，表示與改變前抗原結合分子相比，具有pH依賴結合能力的抗原結合分子之結合次數增加2倍。又當抗原為膜型抗原，與抗原結合的抗原結合分子經抗原進入溶酶體被分解而自血漿中消失時，與改變前抗原結合分子相比，評估具有pH依賴結合能力的抗原結合分子之藥物動力或與抗原結合時間哪一個增加，藉此可評估與改變前抗原結合分子相比，具有pH依賴結合能力的抗原結合分子之結合次數是否增加。例如與改變前抗原結合分子相比，具有pH依賴結合能力的抗原結合分子與抗原結合期增加2倍時，表示與改變前抗原結合分子相比，具有pH依賴結合能力的抗原結合分子之結合次數增加2倍。又測定未與抗原結合分子結合的非結合型抗原的血漿中濃度，非結合型抗原的血漿中濃度或對總抗原量的非結合型抗原的抗原量之比例低，維持時間為2倍延長時，表示與改變前抗原結合分子相比，具有pH依賴結合能力的抗原結合分子之結合次數增加2倍。
又當抗原為可溶型抗原時，如果在血漿中的中性條件下與抗原結合分子結合的抗原在內囊胞內解離，抗原結合分子回到血漿中，為了使抗原結合分子再於血漿中的中性條件下可與抗原結合，具有在內囊胞內的酸性條件下解離抗原性質的抗原結合分子可與抗原複數次結合。與抗原結合分子結合的抗原在內囊胞內未解離時(抗原與抗原結合分子結合的狀態回到血漿中)相比，與抗原結合分子結合的抗原在內囊胞內解離時，抗原如果到溶酶體被分解，因此抗原自血漿中的消失速度增加。亦即，以抗原自血漿中消失的速度作為指標，也可判斷抗原結合分子是否可與抗原複數次結合。抗原自血漿中消失的速度之測定，可例如投予活體內抗原(例如膜抗原)與抗原結合分子，測定投予後血漿中的抗原濃度。又抗原(例如膜抗原)在體內產生(分泌)時，如果抗原自血漿中消失的速度增加，血漿中抗原濃度降低，因此可以血漿中抗原濃度作為指標，可判斷抗原結合分子是否可與抗體複數次結合。
本發明中所謂「增加抗原結合分子與抗原的結合次數」為投予人、小鼠、猿等抗原結合分子時，抗原結合分子與抗原結合，進入細胞內的步驟為1次，增加此步驟。所以本發明中所謂「抗原結合分子與抗原2次結合」為抗原結合分子與抗原結合進入細胞內後，抗原以解離狀態釋放於細胞外，釋放的抗原結合分子再度與抗原結合，進入細胞內者。
當抗原結合分子進入細胞內時，抗原結合分子可以與1個抗原結合之狀態進入，或可以與2個或2個以上抗原結合的狀態進入。
本發明之「增加抗原結合分子與抗原的結合次數」，不必增加全部抗原結合分子的抗原結合次數，可為例如抗原結合分子組成物所含的抗原結合分子中，與抗原結合2次以上的抗原結合分子的比例升高，或抗原結合分子組成物所含的抗原結合分子的結合次數的平均值升高者等。
本發明中較佳為，投予人抗原結合分子時的抗原結合分子與抗原的結合次數增加，但在難以測定人體的抗原結合次數時，也可以活體外測定結果、小鼠(例如抗原表現轉殖基因鼠、人FcRn表現轉殖基因鼠等)或猿(例如食蟹猿等)等的測定結果為基礎，預測人體的抗原結合次數。
本發明較佳為抗原結合分子與抗原2次以上結合者，例如抗原結合分子組成物所含的抗原結合分子至少10%以上、較佳30%以上、更佳50%以上、再更佳80%以上(例如90%以上、95%以上等)的抗原結合分子與抗原2次以上結合。
本發明之「增加抗原結合分子可結合抗原數」，表示從抗原結合分子投予人、鼠、猿等動物，至細胞內溶酶體分解之時間，抗原結合分子可結合抗原數增加。
一般而言，IgG等抗體具有2個結合部位，因此1個抗體最多可以結合2個抗原，與抗原結合的抗體進入細胞內，經溶酶體與抗原共同被分解。因此，通常IgG等抗體最多可與2個抗原結合。根據本發明之方法，抗體等抗原結合分子在內囊胞內pH的抗原結合活性較在血漿中pH的抗原結合活性弱，因此進入細胞內的抗體等抗原結合分子在細胞內解離抗原，可再被釋放於細胞外與抗原結合。因此，本發明之方法可以多於抗原結合分子的抗原結合部位數的數量與抗原結合。具體地說，例如具有2個結合部位的IgG，使用本發明方法，自投予抗體至抗體分解的期間可有3個以上或4個以上的抗原結合。例如抗體為中和抗體時，「增加抗原結合分子可結合抗原數」可表示抗原結合分子可中和抗原數增加。因此，當抗體為中和抗體時，「結合」與「中和」是可以互換的。
本發明中「增加抗原結合分子可結合抗原數」，不必增加全部抗原結合分子中可結合抗原數，可為例如抗原結合分子組成物所含的抗原結合分子之可結合抗原數的平均值增加，或較抗原結合分子的抗原結合部位數多之可與抗原結合的抗原結合分子的比例提高者。
本發明中較佳為，投予人抗原結合分子時的抗原結合分子可結合抗原數增加者。但在難以測定人體該數量時，也可以活體外測定結果、小鼠(例如抗原表現轉殖基因鼠、人FcRn表現轉殖基因鼠等)或猿(例如食蟹猿等)等的測定結果為基礎，預測人體的可結合抗原數。一般來說，當抗體為中和抗體時，上述抗原結合分子與抗原的結合次數，與抗原結合分子可中和抗原數相關，因此可知抗原結合分子可中和抗原數的測定可與上述抗原結合分子與抗原的結合次數之測定相同進行。
又本發明提供一種體內抗原結合分子與抗原2次以上結合之方法，藉由投予在酸性pH中抗原結合活性較在中性pH中抗原結合活性低的抗原結合分子。
又本發明關於中和較抗原結合分子的抗原結合部位數多的抗原之方法，在具有中和活性的抗原結合分子中，藉由投予在酸性pH中抗原結合活性低於在中性pH中抗原結合活性的抗原結合分子。較佳為藉由投予在酸性pH中抗原結合活性低於在中性pH中抗原結合活性的IgG，中和3個以上、較佳為4個以上的抗原之方法。
再者，本發明關於在細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內自抗原結合分子解離之方法，經由在酸性pH中抗原結合能力較在中性pH中抗原結合能力弱的抗原結合分子。本發明中抗原自抗原結合分子解離的位置可為細胞內的任一部位，但較佳在早期內囊胞內。本發明中「在細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內自抗原結合分子解離」，不必為與抗原結合分子結合進入細胞內的所有抗原在細胞內自抗原結合分子解離，細胞內自抗原結合分子解離的抗原比例，宜高於抗原結合分子在酸性pH中的抗原結合能力低於中性pH中抗原結合能力之前者。
再者，本發明關於促進細胞內未與抗原結合的抗原結合分子與FcRn結合之方法，經由抗原結合分子在酸性pH中抗原結合能力較在中性pH中抗原結合能力弱者。例如，通常FcRn在內囊胞內與抗原結合分子結合，但當抗原結合分子與膜型抗原結合時，考量因為無法與FcRn結合，本發明之較佳態樣為，當抗原為膜型抗原時，抗原結合分子在內囊胞內pH(酸性pH)中抗原結合能力較在血漿中pH(中性pH)的抗原結合能力弱，因此促進內囊胞內的抗原結合分子自抗原解離，而促進抗原結合分子與FcRn結合之方法。例如，當抗原為可溶型抗原時，不論有無抗原的結合，抗原結合分子可與FcRn結合，但因為抗原結合分子在內囊胞內pH(酸性pH)的抗原結合能力較血漿中pH(中性pH)的抗原結合能力弱，如果可促進內囊胞內抗原自抗原結合分子解離，則可促進”未與抗原結合”之抗原結合分子與FcRn結合。
不論抗原為膜型或可溶型的哪一種，未與抗原結合的抗原結合分子如果因FcRn可回到血漿中時，可再次與抗原結合，重複此步驟，可使抗原結合分子與抗原複數次結合。本發明中「促進細胞內抗原結合分子與FcRn結合」，不必全部的抗原結合分子與FcRn結合，但宜為細胞內與FcRn結合未與抗原結合之抗原結合分子的比例，高於抗原結合分子在內囊胞內pH的抗原結合能力低於血漿中pH的抗原結合能力之前者。本發明之促進細胞內抗原結合分子與FcRn結合的方法中，較佳的抗原結合分子例如與膜蛋白等的膜型抗原(膜抗原)結合之抗原結合分子。又其他較佳抗原結合分子例如與可溶型蛋白等的可溶型抗原結合之抗原結合分子。
促進細胞內抗原結合分子與FcRn結合之方法，可為增強抗原結合分子細胞內(例如內囊胞內)與FcRn結合活性之方法。
本發明再關於以抗原結合的狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法，經由使抗原結合分子在酸性pH的抗原結合能力較中性pH的抗原結合能力弱。本發明中「以抗原結合的狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外」，不必為以抗原結合的狀態進入細胞內的所有抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外，宜為釋放於細胞外的抗原結合分子的比例高於抗原結合分子在酸性pH的抗原結合能力低於中性pH的抗原結合能力之前者。較佳為釋放於細胞外的抗原結合分子維持的抗原結合能力。當以抗原結合的狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法，也可為賦予抗原結合分子具有容易與抗原結合進入細胞內以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外的性質之方法。
本發明更關於增加抗原結合分子血漿中抗原消失能力之方法，經由使抗原結合分子在酸性pH的抗原結合能力較中性pH的抗原結合能力弱。本發明中「血漿中抗原消失能力」為抗原結合分子投予活體內或活體分泌時，血漿中存在的抗原由血漿中消失的能力。因此，本發明中「增加抗原結合分子的血漿中抗原消失能力」，宜為體內投予抗原結合分子時自血漿中抗原消失的速度快於抗原結合分子在酸性pH的抗原結合能力低於中性pH的抗原結合能力之前的速度。抗原結合分子的血漿中抗原消失能力是否增加，可由例如投予活體內可溶型抗原與抗原結合分子，測定投予後可溶型抗原的血漿中濃度來判斷。經由抗原結合分子在酸性pH的抗原結合能力低於中性pH的抗原結合能力，當可溶型抗原及抗原結合分子投予後血漿中可溶型抗原濃度降低時，抗原結合分子的血漿中抗原消失能力增加來判斷。
本發明又關於提升抗原結合分子的藥物動力之方法，經由抗原結合分子的至少1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代或者插入組胺酸或非天然胺基酸。
本發明還關於增加抗原結合分子與抗原結合次數之方法，經由抗原結合分子的至少1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代或者插入組胺酸或非天然胺基酸。
本發明又關於增加抗原結合分子可結合抗原數之方法，經由抗原結合分子的至少1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代或者插入組胺酸或非天然胺基酸。
本發明又關於細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內自抗原結合分子解離之方法，經由抗原結合分子的至少1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代或者插入組胺酸或非天然胺基酸。
本發明又關於以抗原結合狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合狀態釋放於細胞外之方法，經由抗原結合分子的至少1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代或者插入組胺酸或非天然胺基酸。
本發明又關於增加抗原結合分子血漿中抗原消失能力之方法，經由抗原結合分子的至少1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代或者插入組胺酸或非天然胺基酸。
組胺酸或非天然胺基酸的變異(取代或插入)的導入位置沒有特別限制，任何部位以組胺酸或非天然胺基酸取代皆可，或者也可為任何位置插入組胺酸或非天然胺基酸。組胺酸或非天然胺基酸的取代或插入組胺酸或非天然胺基酸的部位較佳例如，影響抗原結合分子的抗原結合能力的區域。例如抗原結合分子為抗體時，可例如抗體的可變區或CDR等。組胺酸或非天然胺基酸變異的導入數目沒有特別限定，可以只有1處以組胺酸或非天然胺基酸取代，或也可只有1處插入組胺酸或非天然胺基酸。亦可為2處以上的複數個位置以組胺酸或非天然胺基酸取代，或者2處以上的複數個位置插入組胺酸或非天然胺基酸。除了組胺酸或非天然胺基酸的取代或插入外，其他胺基酸的缺失、增加、插入及/或取代等也可同時進行。
本發明之以組胺酸或非天然胺基酸取代的位置，例如當抗原結合分子為抗體時，可考慮為抗體CDR序列或決定CDR構造的序列為改變的位置，例如以下列舉的位置。又胺基酸位置如Kabat的恆定區(Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH))所示。
重鏈：H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、H100b、H102。 輕鏈：L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92、L94。
前述的改變位置中，H32、H61、L53、L90、L94為普遍性的高改變位置。
沒有特別限定，抗原為IL-6受體(例如人IL-6受體)時的較佳改變位置如下列舉。
重鏈：H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、H100b、H102。 輕鏈：L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92、L94。
組合複數個位置以組胺酸或非天然胺基酸取代時的較佳組合，具體例如H27、H31、H35的組合；H27、H31、H32、H35、H58、H62、H102的組合；L32、L53的組合；L28、L32、L53的組合等。而且，重鏈與輕鏈的取代位置的較佳組合例如H27、H31、L32、L53的組合。
當抗原為IL-6(例如人IL-6)時較佳的改變位置如以下列舉，但沒有特別限制。
重鏈：H32、H59、H61、H99 輕鏈：L53、L54、L90、L94
當抗原為IL-31受體(例如人IL-31受體)時較佳的改變位置如H33。
前述之位置可為只有1個位置以組胺酸或非天然胺基酸取代，或複數個位置以組胺酸或非天然胺基酸取代。
本發明之方法可根據任意的抗原結合分子調整，無關標的抗原種類。
本發明之抗原結合分子為具有與對象抗原特異性結合活性之物質，沒有特別限定。抗原結合分子較佳例如具有抗體的抗原結合區域的物質。抗體的抗原結合區域例如CDR或可變區。當抗體的抗原結合區域為CDR時，可包括全長抗體所含的6個CDR全部，也可包括1個或2個以上的CDR。當抗體的抗原結合區域包含CDR時，包含的CDR也可進行胺基酸的缺失、取代、增加及/或插入等，或者也可為部分CDR。
當抗原結合分子包含抗體恆定區時，本發明關於提升抗原結合分子的藥物動力之方法，經由使抗原結合分子所含之抗體恆定區改變(胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等)。
當抗原結合分子包含抗體恆定區時，本發明關於增加抗原結合分子與抗原結合次數之方法，經由使抗原結合分子所含之抗體恆定區改變(胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等)。
當抗原結合分子包含抗體恆定區時，本發明關於增加抗原結合分子可結合抗原數之方法，經由使抗原結合分子所含之抗體恆定區改變(胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等)。
當抗原結合分子包含抗體恆定區時，本發明關於細胞外與抗原結合分子結合的抗原在細胞內與抗原結合分子解離之方法，經由使抗原結合分子所含之抗體恆定區改變(胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等)。
當抗原結合分子包含抗體恆定區時，本發明關於與抗原結合的狀態進入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合的狀態釋放於細胞外之方法，經由使抗原結合分子所含之抗體恆定區改變(胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等)。
當抗原結合分子包含抗體恆定區時，本發明關於增加抗原結合分子血漿中抗原消失能力之方法，經由使抗原結合分子所含之抗體恆定區改變(胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等)。
本發明之抗原結合物質較佳態樣，例如包含FcRn結合區域的抗原結合物質。包含FcRn結合區域的抗原結合物質可經由FcRn救援路徑進入細胞內後，再回到血漿中。FcRn結合區域較佳為直接與FcRn結合的區域。FcRn結合區域的較佳例，如抗體的FcRn區。然而，具有白蛋白(albumin)或IgG等與FcRn結合能力的多胜肽之可結合區域，可藉由白蛋白或IgG等媒介間接與FcRn結合。因此，本發明之FcRn結合區域也可為具有與該FcRn結合能力的多胜肽結合的區域。
本發明方法不特別限於辨識對象抗體等的抗原結合分子之抗原，也可為辨識任何抗原的抗體為對象。本發明之方法，例如提升藥物動力之抗體，可為辨識受體蛋白(膜結合型受體、可溶型受體)或細胞表面標記物(marker)等膜抗原的抗體、辨識細胞激素等可溶型抗原的抗體等。本發明中膜抗原的較佳例，如膜蛋白。本發明之可溶型抗原，例如可溶型蛋白。本發明之方法中，辨識提升藥物動力的抗體之抗原，具體例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-31、IL-23、IL-2受體、IL-6受體、OSM受體、gp130、IL-5受體、CD40、CD4、Fas、骨橋蛋白(osteopontin)、CRTH2、CD26、PDGF-D、CD20、單核球趨化蛋白(Monocyte Chemotactic Protein)、CD23、TNF-α、HMGB-1、α4整合素(intergrin)、ICAM-1、CCR2、CD11a、CD3、IFNγ、BLyS、HLA-DR、TGF-β、CD52、IL-31受體等。較佳抗原為IL-6受體。
本發明之方法中對象抗原結合分子可為例如具有拮抗(antagonist)活性之抗原結合分子(拮抗抗原結合分子)、具有激動(agonist)活性之抗原結合分子(激動抗原結合分子)等，較佳態樣為拮抗抗原結合分子，特別是辨識受體等膜抗原或細胞激素等可溶型抗原之拮抗抗原結合分子。例如，辨識受體之拮抗抗原結合分子，與受體結合，抑制受體與其配位體(ligand)結合，經由受體抑制訊息傳遞的抗原結合分子。
本發明中作為對象的抗原結合分子沒有特別限定，可為任何的抗原結合分子。本發明所使用的抗原結合分子較佳具有抗原結合活性(抗原結合區域)與FcRn結合區域。本發明中特別是包含與人FcRn結合區域的抗原結合分子為佳。具有抗原結合活性與FcRn結合區域的抗原結合分子，例如抗體。本發明之抗體較佳例為IgG抗體。當IgG抗體作為抗體時，不限其種類，可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等同型物(subclass)的IgG。對於此述之同型物IgG的恆定區，亦可將胺基酸變異導入如M73的恆定區部分。導入的胺基酸變異例如增加或減少與Fcγ受體的結合(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10.)、增加或減少與FcRn的結合(J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604)，但不限於此。選擇IgG2等適當的恆定區可使pH依賴結合改變。
本發明之對象抗原結合分子為抗體時，該抗體可來自小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、羊抗體、駱駝抗體等獲來自任何動物的抗體。例如也可為鑲嵌抗體，其中人型化抗體等的胺基酸序列取代之改變抗體亦可。也可以是雙重特異性抗體，使各種分子結合的抗體修飾物、含抗體片段的多胜肽等。
所謂「鑲嵌抗體」為組合不同動物來源的序列而製作的抗體。鑲嵌抗體的具體例，如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(V)及人抗體的重鏈、輕鏈的恆定區(C)所形成的抗體。
所謂「人型化抗體」亦稱為重塑(reshaped)人抗體，即來自人以外的哺乳動物之抗體，例如小鼠抗體的互補決定區(complementary determining region；CDR)移植入人抗體的CDR之抗體。測定CDR的方法為公知(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877))。一般的基因重組方法也是公知(參考EP125023或WO96/02576)。
雙重特異性抗體為在一抗體分子內具有辨識不同抗原決定部位的可變區之抗體。雙重特異性抗體可為辨識2種以上不同抗原之抗體，也可以是辨識同一抗原上不同的2個以上抗原決定部位的抗體。
含抗體片段之多胜肽例如Fab片段、F(ab)’2片段、scFv(Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36.)區域抗體(dAb)(WO2004/058821，WO2003/002609)、scFv-Fc (WO2005037989)、dAb-Fc、Fc融合蛋白等。此述之分子中，特別是含有Fc區的分子因具有與FcRn結合活性，適合用於本發明發現之方法。
又本發明可適用之抗原結合分子宜為抗體樣分子。所謂抗體樣分子為發揮與標靶分子結合功能的分子(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469、Protein Science 2006, 15:14-27)，例如DARPins(WO2002/ 020565)、Affibody(WO1995/001937)、Avimer(WO2004/ 044011， WO2005/040229)、Adnectin(WO2002/032925)等。可以是此述之抗體樣分子，但如果可對標的分子pH依賴結合，可以1分子與複數個標的分子結合。
抗原結合分子也可為與標的結合的受體蛋白及受體Fc融合蛋白，例如TNFR-Fc融合蛋白、IL1R-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白等(Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52、BioDrugs. 2006;20(3):151-60.)。可以是此述之受體蛋白質及受體Fc融合蛋白，但如果可對標的分子pH依賴結合，可以1分子與複數個標的分子結合。
抗原結合分子也可為與標的結合具有中和效果之人工配位體蛋白及人工配位體融合蛋白，例如變異IL-6(EMBO J. 1994 Dec 15;13(24):5863-70.)等。可以是此述之人工配位體蛋白及人工配位體融合蛋白，但如果可對標的分子pH依賴結合，可以1分子與複數個標的分子結合。
本發明之抗體也可改變糖鏈。糖鏈改變的抗體例，如糖基化修飾的抗體(WO99/54342等)、缺少增加糖鏈的炭藻糖(fucose)之抗體(WO00/61739、WO02/31140、WO2006/ 067847、WO2006/067913等)、具有支鏈化(bisecting) GlcNAc的糖鏈之抗體(WO02/79255等)等。
本發明之方法係根據特定之理論，沒有限定，例如在酸性pH的抗原結合能力較中性pH的抗原結合能力弱者及提升藥物動力，以及與抗原複數次結合的關聯可如以下說明。
例如，當抗體與膜抗原結合之抗體時，投予活體內的抗體與抗原結合，之後抗體以與抗原結合的狀態，與抗原一起經內在化(internalization)進入細胞內的內囊胞(endosome)。之後，抗體與抗原結合之狀態移向溶酶體(lysosome)，抗體與抗原一起經溶酶體分解。經由內在化自血漿中消失稱為抗原依賴消失，已報導有多種抗體分子(Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2):81-8)。1分子IgG抗體以2價與抗原結合時，1分子抗體以與2分子抗原結合之狀態被內在化(internalize)，以此狀態經溶酶體分解。因此一般抗體，1分子IgG抗體無法與3分子以上的抗原結合。例如具有中和活性的1分子IgG抗體，不能與3分子以上的抗原中和。
IgG分子在血漿中滯留性較長(消失晚)者作為IgG分子的救援受體，是因為已知的FcRn功能。因胞飲作用進入內囊胞的IgG分子，在內囊胞的酸性條件下，與內囊胞內表現的FcRn結合。無法與FcRn結合的IgG分子進入溶酶體，在該處被分解，而與FcRn結合的IgG分子移行至細胞表面，在血漿的中性條件下，與FcRn解離，再回到血漿中。
當抗體為與可溶型抗原結合之抗體時，投予活體內的抗體與抗原結合，之後抗體與抗原結合的狀態，進入細胞內。進入細胞內的抗體多數經FcRn釋放於細胞外，但由於與抗原結合狀態釋放於細胞外，無法與抗體再度結合。因此，與膜抗體結合的抗體相同，一般抗體無法以1分子IgG抗體與3分子以上的抗原結合。
本發明人思考經內在化(internalization)與膜抗原等抗原結合之抗體，在進入細胞內內囊胞時，對於與抗原結合狀態之抗體移到溶酶體而被分解者，內囊胞內與抗原解離的IgG抗體可與在內囊胞內表現的FcRn結合。因此發現，血漿中與抗原結合強而在內囊胞內與抗原結合弱的抗體，在血漿中與抗原結合，與抗原形成複合體的狀態，經內在化進入細胞內的內囊胞中，在內囊胞內與抗原解離後，與FcRn結合，移行至細胞表面，以未與抗原結合之狀態再回到血漿中，可中和複數個膜型抗原。而且發現，血漿中與抗原結合強、內囊胞內與抗原結合弱的性質的抗體，即使是與可溶型抗原等抗原結合時，在內囊胞內與抗原解離，因此以未與抗原結合之狀態再釋放於血漿中，可中和複數個可溶型抗原。
本發明人特別著眼於血漿中pH與內囊胞內pH的差異，發現血漿中pH條件下與抗原結合強、內囊胞內pH條件下與抗原結合弱之抗體，可以1抗體分子與複數抗原結合，血漿中滯留性優良。
內囊胞為膜小胞中之一，在真核細胞的細胞質內形成網絡，負責細胞膜至溶酶體的過程中大分子的代謝。內囊胞內的pH已報導一般為pH5.5~pH6.0酸性(Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.)。血漿中的pH已報導為約中性(通常為pH7.4)。
因此，在酸性pH的抗原結合活性較中性pH的抗原結合活性弱的抗原結合分子，在中性pH血漿中與抗原結合，進入細胞內後，在酸性pH的內囊胞內與抗原解離。與抗原解離的抗原結合分子與FcRn結合，移行至細胞表面，以未與抗原結合之狀態，再回到血漿中，結果可與抗原複數次結合，提升藥物動力。
＜抗原結合分子物質＞ 本發明提供在pH4.0~pH6.5中抗原結合活性低於在pH6.7~pH10.0中抗原結合活性之抗原結合分子，較佳為在pH5.0~pH6.0中抗原結合活性低於在pH7.0~pH8.0中抗原結合活性之抗原結合分子。在pH4.0~pH6.5中抗原結合活性低於在pH6.7~pH10.0中抗原結合活性之抗原結合分子，具體例如在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子。在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子，也可說為在pH7.4中抗原結合活性高於在pH5.8中抗原結合活性之抗原結合分子。
本發明之在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子，僅限於在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中之結合者，其結合活性的差，沒有特別限定，只要是在pH5.8中抗原結合活性較低即可。
本發明之在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子的較佳態樣，例如在pH7.4中抗原結合活性是在pH5.8中抗原結合活性的2倍以上的抗原結合分子，更佳例如在pH7.4中抗原結合活性是在pH5.8中抗原結合活性的10倍以上的抗原結合分子，再更佳在pH7.4中抗原結合活性是在pH5.8中抗原結合活性的40倍以上的抗原結合分子。
具體而言，本發明之在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子的較佳態樣，對抗原在pH5.8中KD與在pH7.4中KD比之KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為2以上，更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為10以上，再更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值為40以上。KD(pH5.8)/ KD(pH7.4)值的上限沒有特別限制，限於該技術領域中可製作之技術，可為400、1000、10000等、或任何之值。
本發明之在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子的其他態樣，對抗原在pH5.8中Kd與在pH7.4中Kd比之Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值為2以上，更佳為Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值為5以上，再更佳為Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值為10以上，再更佳為Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值為30以上。Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值的上限沒有特別限制，限於該技術領域中可製作之技術，可為50、100、200等、或任何之值。
測定抗原結合活性時pH以外的條件可由該技術人士適當選擇，沒有特別限定，例如根據實施例記載以MES緩衝液、37℃條件下測定。抗原結合分子之抗原結合活性的測定可根據該技術領域公知之技術測定，例如實施例記載之Biacore T100(GE Healthcare)等。
考慮前述在酸性pH中與抗原結合弱的抗原結合分子，在內囊胞內的酸性條件下容易由抗原解離，可知在細胞內內在化後與FcRn結合容易釋放於細胞外。沒有在細胞內被分解，釋放於細胞外的抗原結合分子可再次與抗原結合。因此，例如抗原結合分子為中和抗原結合分子時，在內囊胞內酸性條件下容易與抗原解離的抗原結合分子，可複數次與抗原結合、與抗原中和。結果使在pH4.0~pH6.5中抗原結合活性低於在pH6.7~pH10.0中抗原結合活性之抗原結合分子，為血漿中滯留性優良之抗原結合分子。
在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子的較佳態樣，例如抗原結合分子中至少1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代或插入至少1個組胺酸或非天然胺基酸之抗原結合分子。導入組胺酸或非天然胺基酸變異之位置沒有特別限定，只要與取代前相比，pH5.8中抗原結合活性較pH7.4中抗原結合活性弱的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值變大或Kd(pH5.8)/Kd(pH7.4)值變大者即可，任何位置皆可以。例如，當抗原結合分子為抗體時，例如可為抗體可變區或CDR等。以組胺酸或非天然胺基酸取代的胺基酸數或插入的胺基酸數可由該技術領域人士適當決定，可為1個胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代、插入1個胺基酸、2個以上胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代、或插入2個以上胺基酸。除了以組胺酸或非天然胺基酸取代或組胺酸或非天然胺基酸的插入以外，也可同時進行其他的胺基酸之缺失、增加、插入及/或取代等。以組胺酸或非天然胺基酸取代或組胺酸或非天然胺基酸的插入也可根據該技術領域公知之丙胺酸掃描之丙胺酸以組胺酸掃描之組胺酸取代等方法，隨意進行，隨意導入組胺酸或非天然胺基酸變異之抗原結合分子中，宜選擇與變異前相比，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值或Kd(pH5.8)/Kd (pH7.4)值變大之抗原結合分子。
進行如此組胺酸或非天然胺基酸之變異，且pH5.8中抗原結合活性低於pH7.4中抗原結合活性的抗原結合分子的較佳例，例如組胺酸或非天然胺基酸變異後在pH7.4中抗原結合活性與組胺酸或非天然胺基酸變異前在pH7.4中抗原結合活性相同的抗原結合分子。本發明所謂，組胺酸或非天然胺基酸變異後的抗原結合分子與組胺酸或非天然胺基酸變異前的抗原結合分子具有相同的抗原結合活性，表示以組胺酸或非天然胺基酸變異前之抗原結合分子之抗原結合活性為100%，組胺酸或非天然胺基酸變異後之抗原結合分子之抗原結合活性至少為10%以上，較佳為50%以上，更佳為80%以上，在更佳為90%以上者。也可以是組胺酸或非天然胺基酸變異後在pH7.4中抗原結合活性高於組胺酸或非天然胺基酸變異前在pH7.4中抗原結合活性。當以組胺酸或非天然胺基酸取代或插入而降低抗原結合分子之抗原結合活性時，可經由抗原結合分子中1或複數個胺基酸的取代、缺失、增加及/或插入等，使抗原結合活性與組胺酸取代或插入前的抗原結合活性相同。本發明亦包含因此種組胺酸取代或插入後進行1個或複數個胺基酸取代、缺失、增加及/或插入使結合活性相同之抗原結合分子。
抗原結合分子包含抗體恆定區之物質時，在pH5.8中抗原結合活性低於在pH7.4中抗原結合活性之抗原結合分子的較佳其他態樣，例如改變抗原結合分子所含的抗體恆定區之方法。改變後的抗體恆定區的具體例，如實施例記載之恆定區。
經上述方法等使抗原結合物質在pH5.8中抗原結合活性較在pH7.4中抗原結合活性弱(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值變大)時，沒有特別限定，但KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值與基本抗體相比，通常為2倍以上，較佳為5倍以上，更佳為10倍以上。
本發明之抗原結合分子只要具有在pH4.0~pH6.5中抗原結合活性低於在pH6.7~pH10.0中抗原結合活性低之性質，可具有其他任何性質，例如可為激動(agonist)抗原結合分子或拮抗(antagonist)抗原結合分子等。本發明之較佳抗原結合分子例如拮抗抗原結合分子。拮抗抗原結合分子通常抑制配位體(激動劑)與受體結合，抑制因受體媒介而向細胞內訊息傳遞之抗原結合分子。
本發明提供以下至少1處胺基酸被組胺酸或非天然胺基酸取代之抗體。胺基酸位置如Kabat的恆定區(Kabat EA et al.1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)所示。
重鏈：H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、H100b、H102 輕鏈：L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92、L94
上述改變處中，以H32、H61、L53、L90、L94為普遍性高改變處。
當抗原為IL-6受體(例如人IL-6受體)時，較佳的改變處如以下列舉之處，但沒有特別限定。
重鏈：H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、H100b、H102 輕鏈：L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92、L94
當組合數處被取代為組胺酸或非天然胺基酸時，較佳之組合具體例，如H27、H31、H35之組合；H27、H31、H32、H35、H58、H62、H102之組合；L32、L53之組合；L28、L32、L53之組合等。重鏈與輕鏈的取代處較佳組合，例如H27、H31、L32、L53之組合。
當抗原為IL-6(例如人IL-6)時，較佳的改變處如以下列舉之處，但沒有特別限定。
重鏈：H32、H59、H61、H99 輕鏈：L53、L54、L90、L94
沒有特別的限制，但當抗原為IL-31受體(例如人IL-31受體)時，較佳的改變處為H33。
辨識本發明之抗原結合分子的抗原可為任何抗原。辨識本發明之抗體的抗原，具體例如上述之受體蛋白(膜結合型受體、可溶型受體)、細胞表面標記物(marker)等的膜抗原或細胞激素等的可溶型抗原，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-31、IL-23、IL-2受體、IL-6受體、OSM受體、gp130、IL-5受體、CD40、CD4、Fas、骨橋蛋白(osteopontin)、CRTH2、CD26、PDGF-D、CD20、單核球趨化蛋白(Monocyte Chemotactic Protein)、CD23、TNF-α、HMGB-1、α4整合素(intergrin)、ICAM-1、CCR2、CD11a、CD3、IFNγ、BLyS、HLA-DR、TGF-β、CD52、IL-31等。
更佳之抗原例如IL-6受體。
本發明之抗原結合分子如上所述。
本發明中，抗原結合分子的較佳態樣例如抗體。具有抗原結合活性及FcRn結合區域的抗體，例如IgG抗體。當以IgG抗體作為抗體時，不限定其種類，可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。
本發明之抗體來源沒有特別限定，可為各種來源之抗體，例如使用小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、猿抗體、駱駝抗體等。又例如可為上述之鑲嵌抗體，其中人型化抗體等的胺基酸序列取代之改變抗體。又可為上述之雙重特異性抗體、結合各種分子之抗體修飾物、含抗體片段之多胜肽、糖鏈改變之抗體等。
鑲嵌抗體的製作為公知，例如為人鼠鑲嵌抗體時，編碼抗體V區的DNA與編碼人抗體C區的DNA連結，將表現此二者的表現載體重組，導入宿主使產生，可得鑲嵌抗體。
「人型化抗體」又稱為重塑(reshaped)人抗體，將來自人以外的哺乳動物之抗體，例如鼠抗體之互補性決定區域(complementary determining region; CDR)移植入人抗體的CDR者。測定CDR的方法已為公知(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)。一般基因重組的方法也屬公知(EP125023；WO96/02576)。人型化抗體經由公知方法，例如決定鼠抗體的CDR，將該CDR與人抗體的結構區(framework region; FR)連結之抗體，獲得編碼該抗體之DNA，使用一般人型化抗體之表現載體系統而產生。此述DNA可使用具有CDR及FR兩者末端區域重複的部分，製作數個寡核苷酸作為引子，經PCR法合成(WO98/13388)。藉由CDR連結的人抗體之FR，選擇使CDR形成良好的抗原結合部位。根據重塑人抗體之CDR形成適當的抗原結合部位，可視需要改變抗體的可變區中FR的胺基酸(Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 10.01-6)。可改變的FR中之胺基酸殘基包括與抗原直接、非共價結合的結合部分(Amit et al., Science (1986) 233: 747-53)、影響或作用CDR結構之部分(Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17)、及與VH-VL相互作用有關之部分(EP239400)。
本發明中當抗體為鑲嵌抗體或人型化抗體時，此述之抗體的C區，較佳使用來自人抗體者。例如H鏈可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4等，L鏈可使用Cκ、Cλ等。又為了增加或減少與Fcγ受體或FcRn的結合，為了改善抗體安定性及抗體產生，可視需要在人抗體C區導入胺基酸變異。本發明之鑲嵌抗體，較佳由來自人以外的哺乳動物之抗體的可變區與人抗體之恆定區所組成。另外，人型化抗體較佳由來自人以外之哺乳動物的抗體之CDR與人抗體之FR及C區所組成。人抗體之恆定區較佳包含FcRn結合區域，此抗體例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。本發明中人型化抗體所使用的恆定區宜為任何屬於同型物(isotype)的抗體之恆定區。較佳使用人IgG恆定區，但不限於此。又人型化抗體所利用的人抗體之FR，沒有特別限定，可使用任何同型物所屬之抗體者。
本發明中鑲嵌抗體及人型化抗體的可變區及恆定區，只要可顯示原始抗體結合特異性即可，可有缺失、取代、插入及/或增加等改變。
利用人序列之鑲嵌抗體及人型化抗體，人體內的免疫原性降低，因此思考可用於治療目的等投予人。
本發明之抗體可經任何方法獲得，例如原本與pH5.8的抗原結合活性高於pH7.4的抗原結合活性的抗體或抗原結合活性約相同之抗體，經由上述以組胺酸取代等，人為地使pH5.8的抗原結合活性低於pH7.4的抗原結合活性，再者，可選擇如以下所示之抗體資料庫及融合瘤所得的複數個抗體中，篩選pH5.8的抗原結合活性低於pH7.4的抗原結合活性者。
抗體中的胺基酸以組胺酸取代時，組胺酸變異導入前的抗體H鏈或L鏈之胺基酸序列可使用已知序列，或者可使用以該技術領域中公知方法新獲得的抗體胺基酸序列。例如抗體可為由抗體資料庫取得者，也可由產生單株抗體的融合瘤所得之抗體，增殖(cloning)編碼該抗體的基因而取得。
關於抗體資料庫，已有多數抗體資料庫為公知，且抗體資料庫的製作方法也是公知，因此該技術人士可選擇適當抗體資料庫進行。例如抗體噬菌體資料庫可參考Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8、Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97；Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6；Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 324.0-60；Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14；及特表平20－504970號。其他可使用將真核細胞資料庫化之方法(WO95/15393號)或微脂體(liposome)提示法等公知方法。又使用人抗體資料庫經淘選(panning)取得人抗體之技術亦屬已知。例如將人抗體的可變區作為單鏈抗體(scFv)，經由噬菌體展示法(phage display)在噬菌體表面表現，選擇與抗原結合之噬菌體。分析選取的噬菌體基因，可決定編碼與抗原結合的人抗體之可變區的DNA序列。如果得知與抗原結合的scFv之DNA序列，可製作原本適當表現該序列之表現載體而取得人抗體。此述之方法為周知，可參考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
取得編碼來自融合瘤的抗體之基因的方法，基本上使用公知技術，以所希望的抗原或表現所希望抗原的細胞作為敏化抗原，將其進行一般免疫方法而產生免疫，將得到的免疫細胞經一般細胞融合法與公知的親代細胞融合，經一般篩選法，篩選如單株抗體的抗體產生細胞(融合瘤；hybridoma)，由所得的融合瘤之mRNA使用反轉錄酶合成抗體可變區(V區)的cDNA，將其與編碼該所希望的抗原恆定區(C區)之DNA連結而得。
更具體地說，為了獲得編碼上述H鏈及L鏈的抗體基因之敏化抗原包括具有免疫原性的完全抗原，及含未顯示免疫原性的半抗原(hapten)之不完全抗原，但不限於此。例如可使用目的蛋白質之全長蛋白或部分蛋白等。其他由多醣類、核酸、脂質等所構成之物質，已知可形成抗原，本發明之抗體抗原沒有特別限定。抗原的調製可以該技術領域中公知方法進行，例如使用桿狀病毒(Baculovirus)方法(如WO98/46777等)等進行。融合瘤的製作例如Milstein等人的方法(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46))等進行。當抗原免疫原性低時，與具有免疫原性的白蛋白等大分子結合，可進行免疫。也可視需要使抗原與其他分子結合形成可溶型抗原。在以膜抗原(如受體等)狀的穿膜分子作為抗原時，可使用膜抗原的細胞外區域部分作為片段，細胞表面上表現穿膜分子的細胞作為免疫原。
抗體產生細胞可使用上述適當敏化抗原進行動物免疫而得。或者也可為產生抗體所得的淋巴球在活體外免疫，形成抗體產生細胞。產生免疫之動物可使用各種哺乳動物，一般使用囓齒目、兔目、靈長目動物。例如小鼠、大鼠、豚鼠等囓齒目；兔等兔目；食蟹猴、恆河猴、狒狒、黑猩猩等猿猴等之靈長目動物。其他已知具有保留人抗體基因之轉殖基因動物，可使用此種動物獲得人抗體(參考WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56)。代替此種轉殖基因動物之使用，例如人淋巴球在活體外以所希望抗原或表現所希望抗原之細胞發生免疫，使敏化之淋巴球與人骨髓瘤(myeloma)細胞融合，例如與U266融合，獲得具有抗原結合活性之所希望的抗體(如特公平1-59878號)。又將具有全部人抗體基因之表現(repertory)的轉殖動物，以所希望抗原免疫，可獲得所希望之人抗體(如WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735)。
動物的免疫，可經由例如使敏化抗原以磷酸緩衝液生理食鹽水(PBS)或生理食鹽水等適當稀釋、懸浮，視需要混合佐劑、乳化後，注射於動物腹腔內或皮下來進行。之後，較佳與弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)混合的敏化抗原每日數次投予4~21日。抗體產生的確認可以慣用方法測定動物血清中之抗體力價。
融合瘤可由以所希望之抗原免疫化之動物或淋巴球所得之抗體產生細胞，使用慣用的融合劑(例如聚乙二醇)，與骨髓瘤細胞融合而製作(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。視需要以培養．增殖融合瘤、免疫沉澱、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸附分析(ELISA)等公知分析法，測定該融合瘤所產生之抗體的結合特異性。之後，視需要以特異性、親和性或活性為目的，將產生該測定抗體的融合瘤經限制稀釋法等方法次選殖(subcloning)。
由具有編碼該選擇抗體之基因的融合瘤或抗體產生細胞(敏化淋巴球等)，使用與抗體特異結合的探針(例如與編碼抗體恆定區之序列互補的寡核苷酸等)，進行次選殖。又可由mRNA經RT-PCR進行選殖(cloning)。免疫球蛋白分為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM之5種不同族(class)。而且，這些族可再分為幾個次族(subclass)(同型物；isotype)(例如IgG-1、IgG-2、IgG-3、及IgG-4;IgA-1及IgA-2等)。本發明中抗體製造所使用之H鏈及L鏈宜來自這些族及次族之抗體，沒有特別限制，但較佳為IgG。
此編碼H鏈及L鏈之基因可經基因工程方法改變。例如小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、豚鼠抗體、羊抗體、駱駝抗體等抗體；以降低對人的異種免疫原性等為目的，人為改變的基因重組型抗體，例如鑲嵌抗體、人型化抗體等適當製作。鑲嵌抗體例如由小鼠抗體H鏈、L鏈的可變區及人抗體H鏈及L鏈的恆定區所組成之抗體，使編碼小鼠抗體可變區的DNA與編碼人抗體恆定區的DNA連結，將其重組於表現載體，導入宿主而產生。人型化抗體又稱為重塑(reshaped)人抗體，連接人以外的哺乳動物，例如鼠抗體的互補決定區(CDR)所設計的DNA序列，製作末端具有重疊部分的數個寡核苷酸，經PCR法合成。所得DNA與編碼人抗體恆定區的DNA連接，再將其與表現載體重組，導入宿主內而產生(EP239400；WO96/02576)。經CDR而連結之人抗體FR，互補性決定區域選擇形成良好抗原結合部位者。重塑人抗體的互補性決定區域，可視需要取代形成適當抗原結合部位之抗體的可變區之架構(framework)區之胺基酸(K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 10.01-10.06)。
除上述人型化以外，也可考慮例如為了改善與抗原結合性等抗體之生物學特性而進行之改變。本發明之改變可根據部位特異的突然變異(例如Kunkel (1910.0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488)、PCR變異、卡式(cassette)變異等方法進行。一般生物學特性被改善的抗體變異體，對原始抗體可變區之胺基酸而言，具有70%以上、較佳80%以上、更佳90%以上(例如95%以上、97%、98%、99%等)之胺基酸序列相同性及/或類似性。本說明書中，序列相同性及/或類似性之定義為，取序列相同性為最大值，視需要將序列整列化及間隙(gap)導入後，與原始抗體殘基相同(相同殘基)或類似(分類為一般的胺基酸側鏈特性相同之群的胺基酸殘基)之胺基酸殘基比例。通常，天然胺基酸殘基以其側鏈性質分類為以下之群： (1)疏水性：丙胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸； (2)中性親水性：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸、及絲胺酸。 (3)酸性：天冬胺酸、及麩胺酸； (4)鹼性：精胺酸、組胺酸、及離胺酸； (5)鏈位置影響之殘基：甘胺酸、及脯胺酸；以及 (6)芳族性：酪胺酸、色胺酸、及苯丙胺酸。
通常H鏈及L鏈的可變區中存在的全部6個互補性決定區(超可變區；CDR)相互作用，形成抗體的抗原結合部位。已知即使其中之一可變區包含全部結合部位，只有降低親和性而已，仍有辨識、結合抗原的能力。因此，編碼本發明之H鏈及L鏈的抗體基因，較佳為該基因所編碼之多胜肽維持與所希望的抗原之結合性，宜編碼含H鏈及L鏈之各種抗原結合部位的片段部分。
重鏈可變區如上述通常由3個CDR區域與4個FR區域構成。本發明之較佳態樣中，供「改變」的胺基酸殘基，例如可從位於CDR區域或FR區域的胺基酸殘基中適當選擇。一般的CDR區域之胺基酸殘基的改變，對抗原結合能力降低。因此，本發明中供「改變」的胺基酸殘基，無特別限定，但較佳為位於FR區域之胺基酸殘基中適當選擇。確認CDR經改變而未降低結合能力的情形時，可選擇其處。由人或小鼠等生物中，抗體可變區之FR可利用之序列，可為該技術人士利用公用資料庫等適當取得者。
本發明更提供編碼本發明之抗體的基因。編碼本發明抗體之基因可為任何基因，例如DNA、RNA、其他核酸類似物等。
本發明更提供具有上述基因之宿主細胞。該宿主細胞無特別限制，例如大腸桿菌或各種動物細胞等。宿主細胞例如使用為了本發明抗體之製造或表現之生產系統。為了多胜肽之製造的生產系統為活體外及活體內的生產系統。活體外的生產系統例如使用真核細胞的生產系統及使用原核細胞的生產系統。
宿主細胞可使用真核細胞，例如動物細胞、植物細胞、真菌細胞。動物細胞例如哺乳類細胞如CHO(J. Exp. Med. (1995) 108: 94.0)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK(嬰兒豚鼠腎)、HeLa、Vero等；兩生類細胞，如南非爪蛙卵母細胞(Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340)；及昆蟲細胞，如Sf9、Sf21、Tn5。本發明抗體之表現中，較佳使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7細胞、HEK293細胞、BHK細胞。動物細胞中，以大量表現為目的，較佳為CHO細胞。對宿主細胞導入受體，可使用例如磷酸鈣法、DEAE葡聚醣(dextran)法、陽離子核糖體DOTAP(Boehringer Mannheim製)法、電穿孔(electroporation)法、脂染(lipofection)法等方法進行。
植物細胞已知例如來自菸草(Nicotiana tabacum)的細胞及浮萍(Lemna minor)作為蛋白質生產系統，此細胞經組織(callous)培養方法產生本發明之抗體。真菌細胞使用酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)屬之細胞(如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)等)及絲狀菌如麴菌(Aspergillus)屬之細胞(黑麴菌(Aspergillus niger)等)之蛋白質表現系統為已知，可利用作為本發明之抗體產生宿主。
使用原核細胞時為使用細菌細胞為生產系統。細菌細胞加上上述之大腸桿菌(E. coli)，使用枯草桿菌之生產系統為已知，可利用為本發明之抗體產生。
＜篩選方法＞ 本發明提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子在酸性pH的抗原結合活性低於在中性pH的抗原結合活性。本發明又提供抗原結合分子之篩選方法，可以1分子抗原結合分子與複數個抗原結合。本發明又提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子具有優良血漿中滯留性。本發明又提供抗原結合分子之篩選方法，使在細胞外與該抗原結合分子結合之抗原在細胞內解離者。本發明又提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子以與抗原結合之狀態進入細胞內，以未與抗原結合之狀態釋放於細胞外。本發明又提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子的血漿中抗原消失能力增加者。本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子特別有用於製造醫藥組成物。
具體而言，本發明提供抗原結合分子之篩選方法，包括以下之步驟： (a)取得在pH6.7~pH10.0的抗原結合分子之抗原結合活性之步驟； (b)取得在pH4.0~pH6.5的抗原結合分子之抗原結合活性之步驟； (c)選擇在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的抗原結合分子之步驟。
本發明之篩選方法中，pH6.7~pH10.0的抗原結合分子之抗原結合活性可為pH6.7~pH10.0的抗原結合活性，無特別限制，較佳之抗原結合活性例如pH7.0~pH8.0間的抗原結合活性，更佳為pH7.4的抗原結合活性。又pH4.0~pH6.5的抗原結合活性可為pH4.0~pH6.5的抗原結合活性，無特別限制，較佳之抗原結合活性例如pH5.5~pH6.5間的抗原結合活性，更佳為pH5.8或pH5.5的抗原結合活性。
抗原結合分子的抗原結合活性可為該技術領域人士公知方法而測定，除了pH以外，其他條件可由該技術領域人士適當決定。抗原結合分子的抗原結合活性可以KD(解離常數；dissociation constant)、視KD(視解離常數；apparent dissociation constant)、解離速度Kd (解離速度；Dissociation rate)、或視Kd(Apperent dissociation rate；視解離速度)而評估。這些方法可由該技術領域中公知方法測定，可使用例如Biacore(GE healthcare)、斯克恰圖(Scatchard plot)、FACS等。
本發明中在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性之抗原結合分子之選擇步驟，意義等同在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性低於在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性的抗原結合分子之選擇步驟。
只限於在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的抗原結合分子，但不限制在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性與在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的差，較佳為在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性為在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的2倍以上，更佳為10倍以上，再更佳為40倍以上。
本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，包括以下步驟： (a)使該抗原結合分子在pH6.7~pH10.0條件下與抗原結合之步驟； (b)將該(a)與抗原結合之抗原結合分子置於pH4.0~ pH6.5的條件下之步驟；及 (c)取得在pH4.0~pH6.5條件下解離的抗原結合分子之步驟。
本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，包括以下步驟： (a)選擇在pH4.0~pH6.5條件下未與抗原結合之抗原結合分子的步驟； (b)將(a)選擇之抗原結合分子在pH6.7~pH10.0的條件下與抗原結合之步驟；及 (c)取得在pH6.7~pH10.0條件下與抗原結合之抗原結合分子的步驟。
本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，包括以下步驟： (a)使該抗原結合分子在pH6.7~pH10.0條件下與抗原結合之步驟； (b)將該(a)與抗原結合之抗原結合分子置於pH4.0~ pH6.5的條件下之步驟； (c)取得在pH4.0~pH6.5條件下解離的抗原結合分子之步驟； (d)放大編碼該解離之抗原結合分子之基因的步驟；及 (e)取得溶出的抗原結合分子之步驟。
上述(a)~(d)步驟可重複2次以上。因此，本發明提供包含重複上述方法(a)~(d)步驟2次以上之步驟。(a)~(d)步驟的重複次數沒有一定限制，通常在10次以內。
本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，包括以下步驟： (a)選擇在pH4.0~pH6.5條件下未與抗原結合之抗原結合分子的步驟； (b)將(a)選擇之抗原結合分子在pH6.7~pH10.0的條件下與抗原結合之步驟； (c)取得在pH6.7~pH10.0條件下與抗原結合之抗原結合分子的步驟； (d)放大編碼該解離之抗原結合分子之基因的步驟；及 (e)取得溶出的抗原結合分子之步驟。
上述(a)~(d)步驟可重複2次以上。因此，本發明提供包含重複上述方法(a)~(d)步驟2次以上之步驟。(a)~(d)步驟的重複次數沒有一定限制，通常在10次以內。
本發明之篩選方法中，當使用噬菌體資料庫(phage library)等時，放大編碼該抗原結合分子之基因的步驟，也可為放大噬菌體之步驟。
本發明方法中抗原與抗原結合分子的結合可以任何狀態進行，沒有特別限制。例如使固定化的抗原結合分子與抗原接觸，而使抗原結合分子與抗原結合，或使固定化的抗原與抗原結合分子接觸，使抗原結合分子與抗原結合。或者，在溶液中使抗原結合分子與抗原接觸而使抗原結合分子與抗原結合。
本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子為在第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性者，包括以下步驟： (a)將固定抗原的柱在第一pH條件下與該抗原結合分子結合之步驟； (b)在第一pH條件下結合於該柱的抗原結合分子，在第二pH條件下由該柱溶出之步驟； (c)取得該溶出的抗原結合分子之步驟。
本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子為在第一pH的結合活性低於第二pH的結合活性者，包括以下步驟： (a)將固定抗原的柱在第一pH條件下使抗原結合分子通過之步驟； (b)回收在(a)步驟中未與柱結合而溶出的抗原結合分子之步驟； (c)使(b)回收的抗原結合分子在第二pH條件下與該柱結合之步驟； (d)取得在(c)步驟中與柱結合的抗原結合分子之步驟。
本發明更提供抗原結合分子之篩選方法，該抗原結合分子為再第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性者，包括以下步驟： (a)將該抗原結合分子資料庫在第一pH條件下與固定抗原的柱結合之步驟； (b)在第二pH條件下，由該柱溶出抗原結合分子之步驟； (c)放大編碼該溶出的抗原結合分子的基因之步驟； (d)取得該溶出的抗原結合分子之步驟。
上述(a)~(c)步驟可重複2次以上。因此，本發明提供包含重複上述方法(a)~(c)步驟2次以上之步驟。(a)~(c)步驟的重複次數沒有一定限制，通常在10次以內。
本發明中第一pH與第二pH只要是各自不同的pH即可，可為任何的pH。較佳的第一pH與第二pH的組合，例如第一pH為pH6.7~10.0之間的pH，第二pH為pH4.0~6.5之間的pH之組合，更佳的組合例如第一pH為pH7.0~8.0之間的pH，第二pH為pH5.5~6.5之間的pH之組合，再更佳之組合例如第一pH為pH7.4，第二pH為pH5.8或pH5.5之組合。
其他較佳的第一pH與第二pH的組合，例如第一pH為pH4.0~6.5之間的pH，第二pH為pH6.7~10.0之間的pH之組合，更佳的組合例如第一pH為pH5.5~6.5之間的pH，第二pH為pH7.0~8.0之間的pH之組合，再更佳之組合例如第一pH為pH5.8或pH5.5，第二pH為pH7.4之組合。
本發明方法所篩選的抗原結合分子可為任何抗原結合分子，例如本發明之篩選中所使用的上述抗原結合分子。例如可篩選具有天然序列的抗原結合分子，或篩選胺基酸序列貝取代的抗原結合分子。本發明中篩選的抗原結合分子，較佳例如該抗原結合分子中至少一個以上的胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸之抗原結合分子。組胺酸的取代或插入處沒有特別限制，可導入任何位置。又組胺酸之取代或插入可導入1處，或2處以上之複數處。本發明中所篩選的抗原結合分子，較佳例如含有改變的抗體恆定區之抗原結合分子。
本發明方法中篩選的抗原結合分子可為，例如經組胺酸鏈等方法，將組胺酸的取代或插入導入不同處的複數個不同的抗原結合分子。
因此，本發明之篩選方法更包含該抗原結合分子中至少一個以上的胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸之步驟。
本發明之篩選方法也可使用非天然胺基酸取代組胺酸。因此本發明也可包括以非天然胺基酸取代上述組胺酸者。
又本發明之篩選方法可更包含改變抗體恆定區之胺基酸的步驟。
本發明之篩選方法中被篩選的抗原結合物質可由任何方法調製，例如預先存在的抗體、預先存在的資料庫(噬菌體資料庫等)、來自動物免疫所得之融合瘤或免疫動物的B細胞所製作之抗體或資料庫、前述之抗體或資料庫中導入組胺酸或非天然胺基酸變異的抗體或資料庫(高組胺酸或非天然胺基酸含率的資料庫或特定處導入組胺酸或非天然安基酸變異的資料庫等)等。
本發明之篩選方法可獲得與抗體複數次結合且血漿中滯留性優之抗原結合分子。本發明之篩選方法可利用作為為了獲得血漿中滯留性優的抗原結合分子之篩選方法。
經本發明之篩選方法，可獲得在投予人、鼠、猿等動物時，與抗原2次以上結合之抗原結合分子。因此，本發明之篩選方法可利用作為為了獲得與抗原2次以上結合之抗原結合分子之篩選方法。
又經本發明之篩選方法，可獲得在投予人、鼠、猿等動物時，與多於抗原結合分子的抗原結合部位之抗原結合的抗原結合分子。因此，本發明之篩選方法可利用作為為了獲得與多於抗原結合分子的抗原結合部位之抗原結合的抗原結合分子之篩選方法。例如當抗體為中和抗體時，本發明之篩選方法可利用作為為了獲得中和多於抗原結合分子的抗原結合部位之抗原的抗原結合分子之篩選方法。
又經本發明之篩選方法，可獲得在投予人、鼠、猿等動物時，在細胞外結合的抗原在細胞內解離之抗原結合分子。因此，本發明之篩選方法可利用作為為了獲得在細胞外結合的抗原在細胞內解離之抗原結合分子之篩選方法。
又經本發明之篩選方法，可獲得在投予人、鼠、猿等動物時，與抗原結合之狀態進入細胞內，未與抗原結合之狀態釋放於細胞外之抗原結合分子。因此，本發明之篩選方法可利用作為為了獲得與抗原結合之狀態進入細胞內，未與抗原結合之狀態釋放於細胞外之抗原結合分子之篩選方法。
又經本發明之篩選方法，可獲得在投予人、鼠、猿等動物時，可使抗原在血漿中快速消失的抗原結合分子。因此，本發明之篩選方法可利用作為為了獲得使血漿中抗原消失能力增加(高)的抗原結合分子之篩選方法。
又前述之抗原結合分子可減少對患者的投藥量或投藥頻率，可減少總投藥量的結果，可思考作為特別優良的醫藥品。因此，本發明之篩選方法可利用作為用於醫藥組成物之抗原結合分子的篩選方法。
又本發明提供，與原始的資料庫相比，含有組胺酸的比例升高的資料庫。資料庫中所含的抗原結合分子所具有的組胺酸比例升高的資料庫，可用於前述篩選方法或後述製造方法。
提高含組胺酸比例之資料庫的製作方法，可使用該技術領域公知之方法製作，例如以下之方法。為了製作資料庫合成核酸時，經三核苷酸法(J Mol Biol. 2008 Feb 29;376(4):1182-200.)，包含相等確定率的編碼20種胺基酸的20種三鹼基密碼子(三核苷酸)，使資料庫化部位含有相等確定率的20種胺基酸。此時，20種中編碼組胺酸的三核苷酸比例較其他胺基酸高，資料庫化部位中出現組胺酸的可能性增加。
＜抗原結合分子製造方法＞ 本發明提供抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子在內囊胞內pH的抗原結合活性低於在血漿中pH的抗原結合活性者。本發明又提供抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子為血漿中滯留性優良者。本發明更提供抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子特別有用於醫藥組成物之製造。
具體而言，本發明提供抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟： (a)取得抗原結合分子在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性之步驟； (b)取得抗原結合分子在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性之步驟； (c)選擇在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的抗原結合分子之步驟； (d)取得編碼由(c)選擇的抗原結合分子之基因的步驟； (e)使用(d)所得的基因製造抗原結合分子之步驟。
本發明提供抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟： (a)在pH6.7~pH10.0的條件下使抗原結合分子與抗原結合之步驟； (b)將(a)與抗原結合之抗原結合分子放置在pH4.0~ pH6.5的條件下之步驟； (c)取得pH4.0~pH6.5條件下解離之抗原結合分子之步驟； (d)取得編碼(c)所得抗原結合分子的基因之步驟； (e)使用(d)所得基因製造抗原結合分子之步驟。
本發明更提供抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟： (a)選擇在pH4.0~pH6.5的條件下未與抗原結合之抗原結合分子的步驟； (b)將(a)選擇的抗原結合分子在pH6.7~pH10.0的條件下與抗原結合之步驟； (c)取得pH6.7~pH10.0條件下與抗原結合之抗原結合分子之步驟； (d)取得編碼(c)所得抗原結合分子的基因之步驟； (e)使用(d)所得基因製造抗原結合分子之步驟。
本發明更提供抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟： (a)使抗原結合分子在pH6.7~pH10.0與抗原結合之步驟； (b)將(a)與抗原結合的抗原結合分子放置在pH4.0~ pH6.5的條件下之步驟； (c)取得在pH4.0~pH6.5的條件下解離的抗原結合分子之步驟； (d)放大編碼解離的抗原結合分子之基因的步驟； (e)取得溶出的抗原結合分子之步驟； (f)獲得編碼(e)取得的抗原結合分子之基因的步驟； (g)使用(f)所得的基因製造抗原結合分子之步驟。
上述(a)~(d)步驟可重複2次以上。因此，本發明提供包含重複上述方法(a)~(d)步驟2次以上之步驟。(a)~(d)步驟的重複次數沒有一定限制，通常在10次以內。
本發明更提供抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟： (a)選擇在pH4.0~pH6.5的條件下未與抗原結合之抗原結合分子之步驟； (b)將(a)選擇的抗原結合分子在pH6.7~pH10.0的條件下與抗原結合之步驟； (c)取得在pH6.7~pH10.0的條件下與抗原結合的抗原結合分子之步驟； (d)放大編碼解離的抗原結合分子之基因的步驟； (e)取得溶出的抗原結合分子之步驟； (f)獲得編碼(e)取得的抗原結合分子之基因的步驟； (g)使用(f)所得的基因製造抗原結合分子之步驟。
上述(a)~(d)步驟可重複2次以上。因此，本發明提供包含重複上述方法(a)~(d)步驟2次以上之步驟。(a)~(d)步驟的重複次數沒有一定限制，通常在10次以內。
本發明更提供抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子在第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性，包括以下步驟： (a)將固定抗原的柱在第一pH條件下與該抗原結合分子結合之步驟； (b)在第一pH條件下結合於該柱的抗原結合分子，在第二pH條件下由該柱溶出之步驟； (c)取得該溶出的抗原結合分子之步驟； (d)取得編碼(c)所得抗原結合分子的基因之步驟； (e)使用(d)所得基因製造抗原結合分子之步驟。
本發明更提供抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子在第一pH的結合活性高於第二pH的結合活性，包括以下步驟： (a)將該抗原結合分子資料庫在第一pH條件下與固定抗原的柱結合之步驟； (b)該柱在第二pH條件下溶出抗原結合分子之步驟； (c)放大編碼該溶出的抗原結合分子的基因之步驟； (d)取得該溶出的抗原結合分子之步驟； (e)取得編碼(d)所得抗原結合分子的基因之步驟； (f)使用(e)所得基因製造抗原結合分子之步驟。
上述(a)~(c)步驟可重複2次以上。因此，本發明提供包含重複上述方法(a)~(c)步驟2次以上之步驟。(a)~(c)步驟的重複次數沒有一定限制，通常在10次以內。
本發明之製造方法中，當使用噬菌體資料庫(phage library)等時，放大編碼該抗原結合分子之基因的步驟，也可為放大噬菌體之步驟。
本發明之製造方法中使用的抗原結合物質可由任何方法調製，例如預先存在的抗體、預先存在的資料庫(噬菌體資料庫等)、來自動物免疫所得之融合瘤或免疫動物的B細胞所製作之抗體或資料庫、前述之抗體或資料庫中導入組胺酸或非天然胺基酸變異的抗體或資料庫(高組胺酸或非天然胺基酸含率的資料庫或特定位處導入組胺酸或非天然安基酸變異的資料庫等)等。
上述製造方法中， pH6.7~pH10.0的抗原結合分子之抗原結合活性可為pH6.7~pH10.0的抗原結合活性，無特別限制，較佳之抗原結合活性例如pH7.0~pH8.0間的抗原結合活性，更佳為pH7.4的抗原結合活性。又pH4.0~pH6.5的抗原結合活性可為pH4.0~pH6.5的抗原結合活性，無特別限制，較佳之抗原結合活性例如pH5.5~pH6.5間的抗原結合活性，更佳為pH5.8或pH5.5的抗原結合活性。
抗原結合分子的抗原結合活性可為該技術領域人士公知方法而測定，除了pH以外，其他條件可由該技術領域人士適當決定。
本發明中在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性之抗原結合分子之選擇步驟，意義等同在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性低於在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性的抗原結合分子之選擇步驟。
只限於在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性高於在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的抗原結合分子，但不限制在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性與在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的差，較佳為在pH6.7~pH10.0的抗原結合活性為在pH4.0~pH6.5的抗原結合活性的2倍以上，更佳為10倍以上，再更佳為40倍以上。
上述製造方法中抗原與抗原結合分子的結合可以任何狀態進行，沒有特別限制。例如使固定化的抗原結合分子與抗原接觸，而使抗原結合分子與抗原結合，或使固定化的抗原與抗原結合分子接觸，使抗原結合分子與抗原結合。或者，在溶液中使抗原結合分子與抗原接觸而使抗原結合分子與抗原結合。
上述製造方法中，第一pH與第二pH只要是各自不同的pH即可，可為任何的pH。較佳的第一pH與第二pH的組合，例如第一pH為pH6.7~10.0之間的pH，第二pH為pH4.0~6.5之間的pH之組合，更佳的組合例如第一pH為pH7.0~8.0之間的pH，第二pH為pH5.5~6.5之間的pH之組合，再更佳之組合例如第一pH為pH7.4，第二pH為pH5.8或pH5.5之組合。
其他較佳的第一pH與第二pH的組合，例如第一pH為pH4.0~6.5之間的pH，第二pH為pH6.7~10.0之間的pH之組合，更佳的組合例如第一pH為pH5.5~6.5之間的pH，第二pH為pH7.0~8.0之間的pH之組合，再更佳之組合例如第一pH為pH5.8或pH5.5，第二pH為pH7.4之組合。
上述製造方法所製造的抗原結合分子可為任何抗原結合分子，例如抗原結合分子中至少一個以上的胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸之抗原結合分子。組胺酸的取代或插入處沒有特別限制，可導入任何位置。又組胺酸之取代或插入可導入1處，或2處以上之複數處。
因此，本發明之製造方法更包含該抗原結合分子中至少一個以上的胺基酸由組胺酸取代或插入至少一個組胺酸之步驟。
本發明之製造方法也可使用非天然胺基酸取代組胺酸。因此本發明也可包括以非天然胺基酸取代上述組胺酸者。
又上述之製造方法所製造的抗原結合分子的其他態樣，例如包含改變的抗體恆定區之抗原結合分子。因此本發明之製造方法更包括改變的抗體恆定區中之胺基酸的步驟。
本發明之製造方法所製造的抗原結合分子為血漿中滯留性優之抗原結合分子。因此，本發明之製造方法可利用作為血漿中滯留性優的抗原結合分子之製造方法。
又根據本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，在投予人、鼠、猿等動物時，可與抗原2次以上結合者。因此，本發明之製造方法可利用作為與抗原2次以上結合之抗原結合分子之製造方法。
又根據本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，在投予人、鼠、猿等動物時，可與多於抗原結合分子的抗原結合部位之抗原結合者。因此，本發明之製造方法可利用作為與多於抗原結合分子的抗原結合部位之抗原結合之抗原結合分子之製造方法。
又根據本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，在投予人、鼠、猿等動物時，可在細胞外與抗原結合分子結合之抗原在細胞內與抗原結合分子解離者。因此，本發明之製造方法可利用作為在細胞外結合之抗原在細胞內解離之抗原結合分子之製造方法。
又根據本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，在投予人、鼠、猿等動物時，可與抗原結合之狀態進入細胞內，未與抗原結合之狀態釋放於細胞外者。因此，本發明之製造方法可利用作為與抗原結合之狀態進入細胞內，未與抗原結合之狀態釋放於細胞外之抗原結合分子之製造方法。
又根據本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，在投予人、鼠、猿等動物時，可使抗原在血漿中快速消失者。因此，本發明之製造方法可利用作為使血漿中抗原消失能力增加(高)的抗原結合分子之製造方法。
又前述之抗原結合分子可減少對患者的投藥次數，可思考作為特別優良的醫藥品。因此，本發明之製造方法可利用作為用於醫藥組成物之抗原結合分子的製造方法。
本發明之製造方法中所得的基因通常被載入(插入)適當的載體而導入宿主細胞。該載體為穩定地保持插入的核酸者，沒有特別限制，例如宿主可使用大腸桿菌，選殖(cloning)用的載體較佳為pBluescript載體(Stratagene社製)等，但也可利用市售的各種載體。生產本發明之抗原結合分子的目的中，使用載體的情形，表現載體特別有用。表現載體為在試管內、大腸桿菌內、培養細胞內、生物個體內表現抗原結合分子之載體，沒有特別限制，例如試管內表現者較佳為pBEST載體(promega社製)；大腸桿菌內表現者較佳為pET載體(Invitrogen社製)；培養細胞內表現較佳為pME18S-FL3載體(GenBank Accession No. AB009864)；生物個體內表現較佳為pME18S載體(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))等。載體內本發明之DNA插入可使用常法，例如使用限制酶位置進行連接(ligate)反應(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11)。
上述宿主細胞沒有特別限制，根據目的使用各種宿主細胞。表現抗原結合分子之細胞，可例如細菌細胞(如鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大腸桿菌、鏈黴菌(Streptomyces)、枯草桿菌)、真菌細胞(如酵母菌、麴菌(Aspergillus))、昆蟲細胞(如果蠅細胞(Dorsophilla)S2、夜蛾細胞(Spodoptera)SF9)、動物細胞(如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤細胞)及植物細胞。對宿主細胞的載體導入可進行如磷酸鈣沉澱法、電穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、脂染法、微注射法等公知方法。
宿主細胞的培養可以公知方法進行。例如以動物細胞為宿主時，培養液可使用如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。也可併用FBS、胎牛血清(FCS)等血清補充液，或無血清培養來培養細胞。培養的pH較佳為約6~8。培養通常在約30~40℃進行約15~200小時，可視需要更換培養基、通氣、攪拌。
為了使宿主細胞中表現的抗原結合分子分泌於小胞體內腔、細胞週邊腔室、或細胞外環境，可重組具有適當分泌訊息為目的之多胜肽。此訊息可為對目的抗原結合分子為內因性，或為異種訊息。
此外，活體外產生多胜肽的系統，例如使用動物的生產系統或使用植物的生產系統。導入以此動物或植物為目的的多核苷酸，使在動物或植物體內產生多胜肽而回收。本發明中「宿主」包括此種動物、植物。
使用動物時，使用哺乳動物、昆蟲的產生系統。哺乳動物可使用山羊、豬、羊、鼠、牛等(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993))。使用哺乳動物時可使用轉殖基因動物。
例如，編碼本發明之抗原結合分子的多核苷酸，與編碼山羊β酪蛋白狀的乳汁中原產生的多胜肽之基因，製作成融合基因。然後，將包含此融合基因的多核苷酸片段注入山羊胚胎中，將此胚胎移植至雌山羊。由接受胚胎的山羊所生下的轉殖基因山羊或其子代所產生的乳汁，可獲得目標抗原結合分子。為了使含有該轉殖基因山羊所產生的抗原結合分子之乳汁量增加，可投予該轉殖基因山羊適當的激素(Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702)。
產生本發明之抗原結合分子的昆蟲，可使用例如蠶。使用蠶時，將編碼目的抗原結合分子的多核苷酸插入桿狀病毒(Baculovirus)，以該桿狀病毒(Baculovirus)感染蠶，自該蠶體液取得目的抗原結合分子。
使用植物產生本發明之抗原結合分子時，可使用例如菸草。使用菸草時，將編碼目的抗原結合分子之多核苷酸插入植物表現用載體，如pMON530，將此載體導入如腫瘤膿桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的細菌。將此細菌感染菸草，如煙草(Nicotiana tabacum)，由該菸草葉獲得所希望的抗原結合分子(Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8)。或以相同細菌感染浮萍(Lemna minor)，經選殖後由浮萍細胞獲得所希望的抗原結合分子(Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1591-1597)。
如此所得的抗原結合分子可由宿主細胞內或細胞外(培養基、乳汁等)分離，純化為實質上單純均勻的抗原結合分子。抗原結合分子的分離、純化，可使用一般的多胜肽純化之分離、純化方法，沒有限制。例如可適當選擇或組合層析柱、濾過、限外濾過、鹽析、溶劑沉澱、溶劑抽出、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙醯醯胺膠電泳、等電點電泳、透析、再結晶等，分離、純化抗原結合分子。
層析法例如親和性層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、膠過濾、逆相層析法、吸附層析法等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。此種層析法可使用液相層析法，例如HPLC、FPLC等液相層析法。親和性層析法所使用的柱，例如蛋白A柱、蛋白G柱。例如使用蛋白A柱，例如Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等。
在抗原結合分子純化前或純化後可視需要使適當蛋白質修飾酵素作用，或加上任意修飾，或除去部分胜肽。蛋白質修飾酵素可使用例如胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、賴醯胺內胜肽酶(lysylendopeptidase)、蛋白激酶(proteinkinase)、轉葡萄糖基酶(glucosylase)等。
＜抗IL-6受體的抗體＞ 本發明更提供以下(a)~(m)任一項記載之抗IL-6受體的抗體。 (a)抗體，包括重鏈可變區具有序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第27位Tyr、第31位Asp、第32位Asp、第35位Trp、第51位Tyr、第59位Asn、第63位Ser、第106位Met、第108位Tyr之至少1個被His取代之胺基酸序列。 (b)抗體(H3pI)，包括重鏈可變區具有序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第27位Tyr、第31位Asp、及第35位Trp被His取代之胺基酸序列。 (c)抗體，包括重鏈可變區具有序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第27位Tyr、第31位Asp、第32位Asp、第35位Trp、第59位Asn、第63位Ser、及第108位Tyr被 His取代之胺基酸序列。 (d)抗體(H170)，包括重鏈可變區具有序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第27位Tyr、第31位Asp、第32位Asp、第35位Trp、第59位Asn、第63位Ser、及第108位Tyr被His取代；且第99位Ser被Val取代；第103位Thr被Ile取代之胺基酸序列。 (e)抗體，包括重鏈可變區具有序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第31位Asp、第51位Tyr、第63位Ser、第106位Met、及第108位Tyr被His取代之胺基酸序列。 (f)抗體(CLH5)，包括重鏈可變區具有序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第31位Asp、第51位Tyr、第63位Ser、第106位Met、及第108位Tyr被His取代；且第99位Ser被Phe取代；第103位Thr被Ile取代之胺基酸序列。 (g)抗體，包括輕鏈可變區具有序列識別號：2(PH1L可變區)之胺基酸序列中第28位Asp、第32位Tyr、第53位Glu、第56位Ser、第92位Asn之至少1個被His取代之胺基酸序列。 (h)抗體(L73)，包括輕鏈可變區具有序列識別號：2(PH1L可變區)之胺基酸序列中第28位Asp、第32位Tyr、及第53位Glu被His取代之胺基酸序列。 (i)抗體(L82)，包括輕鏈可變區具有序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第32位Tyr及第53位Glu被His取代之胺基酸序列。 (j)抗體(CLL5)，包括輕鏈可變區具有序列識別號：2(PH1L可變區)之胺基酸序列中第32位Tyr、第53位Glu、第56位Ser、及第92位Asn被His取代之胺基酸序列。 (k)抗體，包括(b)的重鏈可變區及(h)的輕鏈可變區。 (l)抗體，包括(d)的重鏈可變區及(i)的輕鏈可變區。 (m)抗體，包括(f)的重鏈可變區及(h)的輕鏈可變區。
重鏈可變區包括序列識別號：1(H53可變區)之胺基酸序列中第27位Tyr、第31位Asp、第32位Asp、第35位Trp、第51位Tyr、第59位Asn、第63位Ser、第106位Met、第108位Tyr之至少1個被His取代之胺基酸序列，具體例如以下之重鏈可變區。 具有序列識別號：3(H3pI)之胺基酸序列之重鏈可變區。 具有序列識別號：4(H170)之胺基酸序列之重鏈可變區。 具有序列識別號：5(CLH5)之胺基酸序列之重鏈可變區。
輕鏈可變區具有序列識別號：2(PH1L可變區)之胺基酸序列中第28位Asp、第32位Tyr、第53位Glu、第56位Ser、第92位Asn之至少1個被His取代之胺基酸序列，具體例如以下之輕鏈可變區。 具有序列識別號：6(L73)之胺基酸序列之輕鏈可變區。 具有序列識別號：7(L82)之胺基酸序列之輕鏈可變區。 具有序列識別號：8(CLL5)之胺基酸序列之輕鏈可變區。
上述H3pI、H170、CLH5、L73、L82、及CLL5各抗體的胺基酸位置與胺基酸取代，如下表1所示。胺基酸位置以Kabat的恆定區顯示。
[表1]
位置 27 31 32 33 35 50 58 61 62 63 64 65 95 99 100B 102
H3pI H H   H H                      
H170 H H H H H   H   H       V I   H
CLH5   H   H   H     H       F I H H
位置 24 27 28 32 53 55 56 90 92 94
L73     H H H H        
L82       H H H        
CLL5       H H H H   H  
*H鏈之第33位，及L鏈之第55位，在野生型(WT)中有組胺酸的序列。
本發明提供一包括至少一種上述(a)~(j)任一項之胺基酸的抗體及該抗體的製造方法。因此，本發明之抗體亦包含上述(a)~(j)任一項之胺基酸取代，還有除上述(a)~(j)任一項之胺基酸取代以外的胺基酸取代。除上述(a)~(j)任一項之胺基酸取代以外的胺基酸取代，例如CDR部分的胺基酸序列之取代、缺失、增加及/或插入等，或FR之胺基酸序列的取代、缺失、增加及/或插入等。
本發明更提供以下(1)~(28)任一項記載之IL-6受體的抗體。 (1)抗體，包括重鏈可變區(VH1-IgG1可變區)具有序列識別號21(VH1-IgG1)之第1位至第119位之胺基酸序列。 (2)抗體，包括重鏈可變區(VH2-IgG1可變區)具有序列識別號22(VH2-IgG1)之第1位至第119位之胺基酸序列。 (3)抗體，包括重鏈可變區(VH3-IgG1可變區)具有序列識別號23(VH3-IgG1)之第1位至第119位之胺基酸序列。 (4)抗體，包括重鏈可變區(VH4-IgG1可變區)具有序列識別號24(VH4-IgG1)之第1位至第119位之胺基酸序列。 (5)抗體，包括輕鏈可變區(VL1-CK可變區)具有序列識別號25(VL1-CK)之第1位至第107位之胺基酸序列。 (6)抗體，包括輕鏈可變區(VL2-CK可變區)具有序列識別號26(VL2-CK)之第1位至第107位之胺基酸序列。 (7)抗體，包括輕鏈可變區(VL3-CK可變區)具有序列識別號27(VL3-CK)之第1位至第107位之胺基酸序列。 (8)抗體(Fv1-IgG1)，包括(2)之重鏈可變區及(6)之輕鏈可變區。 (9)抗體(Fv2-IgG1)，包括(1)之重鏈可變區及具有序列識別號：7(L82)之胺基酸序列的輕鏈可變區。 (10)抗體(Fv3-IgG1)，包括(4)之重鏈可變區及(5)之輕鏈可變區。 (11)抗體(Fv4-IgG1)，包括(3)之重鏈可變區及(7)之輕鏈可變區。 (12)抗體(VH3-IgG2ΔGK)，包括具有序列識別號：33之胺基酸序列之重鏈。 (13)抗體(VH3-M58)，包括具有序列識別號：34之胺基酸序列之重鏈。 (14)抗體(VH3-M73)，包括具有序列識別號：35之胺基酸序列之重鏈。 (15)抗體(Fv4-IgG2ΔGK)，包括(12)之重鏈及具有序列識別號：27(VL3-CK)之胺基酸序列的輕鏈。 (16)抗體(Fv4-M58)，包括(13)之重鏈及具有序列識別號：27(VL3-CK)之胺基酸序列的輕鏈。 (17)抗體(Fv4-M73)，包括(14)之重鏈及具有序列識別號：27(VL3-CK)之胺基酸序列的輕鏈。 (18)抗體(VH2-M71)，包括具有序列識別號：36(VH2- M71)之胺基酸序列之重鏈。 (19)抗體(VH2-M73)，包括具有序列識別號：37(VH2- M73)之胺基酸序列之重鏈。 (20)抗體(VH4-M71)，包括具有序列識別號：38(VH4- M71)之胺基酸序列之重鏈。 (21)抗體(VH4-M73)，包括具有序列識別號：39(VH4- M73)之胺基酸序列之重鏈。 (22)抗體(Fv1-M71)，包括(18)之重鏈及具有序列識別號：26(VL2-CK)之胺基酸序列的輕鏈。 (23)抗體(Fv1-M73)，包括(19)之重鏈及具有序列識別號：26(VL2-CK)之胺基酸序列的輕鏈。 (24)抗體(Fv3-M71)，包括(20)之重鏈及具有序列識別號：25(VL1-CK)之胺基酸序列的輕鏈。 (25)抗體(Fv3-M73)，包括(21)之重鏈及具有序列識別號：25(VL1-CK)之胺基酸序列的輕鏈。 (26)抗體，包括具有序列識別號：25(VL1-CK)之胺基酸序列之輕鏈。 (27)抗體，包括具有序列識別號：26(VL2-CK)之胺基酸序列之輕鏈。 (28)抗體，包括具有序列識別號：27(VL3-CK)之胺基酸序列之輕鏈。
本發明更提供以下(a)~(v)任一項之FR或CDR。 (a)序列識別號：40之重鏈CDR1(VH1, 2, 3, 4)。 (b)序列識別號：41之重鏈CDR2(VH1, 2)。 (c)序列識別號：42之重鏈CDR2(VH3)。 (d)序列識別號：43之重鏈CDR2(VH4)。 (e)序列識別號：44之重鏈CDR3(VH1, 2)。 (f)序列識別號：45之重鏈CDR3(VH3, 4)。 (g)序列識別號：46之重鏈FR1(VH1, 2)。 (h)序列識別號：47之重鏈FR1(VH3, 4)。 (i)序列識別號：48之重鏈FR2(VH1, 2, 3, 4)。 (j)序列識別號：49之重鏈FR3(VH1)。 (k)序列識別號：50之重鏈FR3(VH2)。 (l)序列識別號：51之重鏈FR3(VH3, 4)。 (m)序列識別號：52之重鏈FR4(VH1, 2, 3, 4)。 (n)序列識別號：53之輕鏈CDR1(VL1, 2)。 (o)序列識別號：54之輕鏈CDR1(VL3)。 (p)序列識別號：55之輕鏈CDR2(VL1, 3)。 (q)序列識別號：56之輕鏈CDR2(VL2)。 (r)序列識別號：57之輕鏈CDR3(VL1, 2, 3)。 (s)序列識別號：58之輕鏈FR1(VL1, 2, 3)。 (t)序列識別號：59之輕鏈FR2(VL1, 2, 3)。 (u)序列識別號：60之輕鏈FR3(VL1, 2, 3)。 (v)序列識別號：61之輕鏈FR4(VL1, 2, 3)。
上述(a)~(v)各序列如第25圖所示。本發明又提供包括上述(a)~(v)任一項之FR或CDR之多胜肽。
本發明之抗IL-6受體抗體可包括上述任一項之胺基酸取代之抗體片段或其修飾物。抗體片段，例如Fab、F(ab')2、Fv或以適當配位體連結H鎖及L鎖的Fv之訊息鏈Fv(scFv)、H鎖單獨區或L鎖單獨區(例如，Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36.)、Unibody (WO2007059782 A1)、SMIP(WO2007014278 A2)。抗體的來源沒有特別限制，例如人抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體等。本發明之抗體也可為鑲嵌抗體、人型化抗體、完全人型化抗體等。
具體地說，抗體經酵素，例如木瓜酵素、胃蛋白酶處理，形成抗體片段，或者建構編碼此片段之基因，將其導入表現載體，於適當宿主細胞中表現(例如Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515 、Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137.)。
因此，本發明提供製造經由本發明之多胜肽或編碼本發明多胜肽之基因所編碼的多胜肽之方法，包括培養含有編碼本發明之多胜肽之多核苷酸的載體之宿主細胞的步驟。
更具體地說，本發明提供多胜肽之製造方法，包括以下步驟： (a)培養包括導入編碼本發明多胜肽之基因的載體之宿主細胞的步驟， (b)經該基因，取得所編碼之多胜肽的步驟。
scFv獲得自連結抗體H鏈V區及L鏈V區者。此scFv中H鏈V區及L鏈V區藉由連接(ligate)而連結，較佳藉由胜肽連接(peptideligate)(Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 10.0, 5879-5883)。scFv中H鏈V區及L鏈V區也可來自上述抗體所記載任一者。連結V區的胜肽連接使用例如胺基酸12-19殘基所組成的單鏈胜肽。
本發明之抗IL-6受體抗體包括恆定區時，該恆定區可為任何形式之恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG4等。恆定區較佳為人抗體恆定區。人IgG1、人IgG2、人IgG4等恆定區可進行胺基酸序列的取代、缺失、增加及/或插入等之改變體。
本發明之抗IL-6受體抗體所結合之IL-6受體，較佳為人IL-6受體。
本發明之抗IL-6受體抗體為血漿中滯留性優良之抗體，抗IL-6受體抗體與抗原可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體可結合之狀態，存在血漿中的時間延長，活體內可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體因抗IL-6受體抗體而使結合的時間延長。又該抗IL-6受體抗體可與IL-6受體2次以上結合，可考慮中和3個以上的IL-6受體。
＜醫藥組合物＞ 本發明關於醫藥組成物，包括本發明之抗原結合分子、經本發明之篩選方法分離的抗原結合分子、或以本發明之製造方法所製造的抗原結合分子。本發明之抗原結合分子或以本發明之製造方法所製造的抗原結合分子具有優良的血漿中滯留性，期望可減少抗原結合分子的投予頻率，因而有效作為醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可包括醫藥上容許載體。
本發明中醫藥組成物為一般疾病治療或預防、或檢查、診斷之藥劑。
本發明之醫藥組成物可由該技術領域中公知方法製劑化。例如可使用水或水以外的藥學容許液之無菌性溶液、或懸浮劑之注射劑型式非經口使用。藥學上容許載體或媒介物，具體例如無菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、載劑、防腐劑、結合劑等，適當組合，考量一般認為的製藥實施所要求的單位用量型態予以混合、製劑化。此製劑的有效成份量可依使室範圍的適當容量而設定。
注射用的無菌組成物可使用如注射用蒸餾水作為載劑，根據一般製劑實施的位處方。
注射用的水溶液，例如含有生理食鹽水、葡萄糖或其他輔助藥(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張溶液。也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、聚醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子界面活性劑(聚山梨糖醇80(TM)、HCO-50等)。
油性液例如芝麻油、大豆油，可併用溶解輔助劑，如苯甲酸苯甲酯及/或苯甲醇。也可組合緩衝劑(如磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、止痛劑(普羅卡因(procaine)鹽酸)、安定劑(如苯甲醇及酚)、抗氧化劑。調製好的注射液通常填充於適當的安瓶。
本發明之醫藥組成物較佳為非經口投予。例如可為注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組成物。可為例如靜脈內注射、肌肉注射、腹腔內注射、皮下注射等全身或局部投予。
投予方法可根據患者年齡、症狀適當選擇。含有抗原結合分子的醫藥組成物的投予量可設定為，例如一次投予每1kg體重0.0001mg~1000mg的範圍。或者例如每一患者投予量為0.001~100000mg，但本發明不必限制於此數據。投予量及投予方法可根據患者體重、年齡、症狀等變動，可由該技術領域之人士考慮上述之條件而設定適當的投予量及投予方法。
本發明記載之胺基酸序列所含之胺基酸，在經過轉譯後修飾(例如N端的麩醯胺酸經焦麩醯氨化而修視為焦麩氨酸(pyroglutamic acid)，為該技術領域中已知之修飾)時，該胺基酸雖經過轉譯後修飾，也包含於本發明記載之胺基酸序列。
本說明書中所引用的所有先前技術文獻為本說明書之參考。 [實施例]
以下以實施例具體說明本發明，但本發明不限於該實施例。
[實施例1]改變的人型化PM1抗體之製作 重組可溶型人IL-6受體(SR344)之製作 抗原人IL-6受體之重組人IL-6受體如以下調製。根據J.Biochem. 108, 673-676 (1990)揭露，製作N端第1位至第344位胺基酸序列所構成的可溶型人IL-6受體(以下稱為SR344) (Yamasaki et al、Science 1988；241：825-828 (GenBank # X12830))的CHO細胞恆定表現株。
將表現SR344的CHO細胞所得的培養上清液，經過Blue Sepharose 6 FF柱層析法，將對SR344的特異性抗體固定於柱上，經過親和性層析法、膠濾過柱層析法的3個柱層析法，純化SR344。溶出主要峰的分層，作為最終純化物。
重組食蟹猴可溶型IL-6受體(cIL-6R)的製作 根據公開的紅猿的IL-6受體基因序列(Birney et al, Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34 (Database issue):D556-61.)製作原始寡DNA引子Rhe6Rf1 (序列識別號：16)、Rhe6Rr2(序列識別號：17)。將從食蟹猴胰臟所調製的cDNA作為鑄模，使用引子Rhe6Rf1、Rhe6Rr2，經PCR製造編碼食蟹猴IL-6受體全長基因之DNA片段。將得到的DNA片段作為鑄型，使用CynoIL6R N-EcoRI(序列識別號：18)及CynoIL6R C-NotI-His(序列識別號：19)之寡DNA引子，經PCR放大1131bp的DNA片段(序列識別號：20)，該DNA片段編碼包括食蟹猴IL-6受體基因訊息區域的可溶型區域(Met1-Pro363)之蛋白質，該可溶型區域的C端增加6xHis。所得DNA片段經EcoRI-NotI分解，插入動物細胞的表現載體，製作CHO恆定表現株(產生cyno.sIL-6R之CHO細胞)。
將產生cyno.sIL-6R之CHO細胞培養液以HisTrap柱(GE Healthcare Bioscience)純化後，以Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)濃縮，再經Superdex200pg16/60膠濾過柱(GE Healthcare Bioscience)純化，作成可溶型食蟹猴IL-6受體(以下稱為cIL-6R)的最終純化物。
重組食蟹猴IL-6(cIL-6R)的製作 食蟹猴IL-6如以下製作。製作SWISSPROT Accession No.P79341登記之編碼212個胺基酸之鹼基序列，選殖入動物細胞表現載體，導入CHO細胞，製作恆定表現細胞株(產生cyno.IL-6之CHO細胞)。將產生cyno.IL-6之CHO細胞培養液以SP-Sepharose/FF柱(GE Healthcare Bioscience)純化後，以Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore)濃縮，再經過Superdex75pg26/60膠濾過柱(GE Healthcare Bioscience)純化，使用Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮，作成可溶型食蟹猴IL-6受體(以下稱為cIL-6R)的最終純化物。
人gp130表現之BaF3細胞株的建立 為了獲得顯示IL-6依賴增殖性的細胞株，經下示建立表現人gp130的BaF3細胞株。
以PCR法放大全長人gp130 cDNA(Hibi et al、Cell 1990；63：1149-1157 (GenBank # NM_002184))，去除pCHOI(Hirata et al、FEBS Letter 1994；356：244-248)的DHFR基因表現部位，將表現Zeocin耐受性的基因表現部位插入表現載體pCOS2Zeo及選殖，建構pCOS2Zeo/ gp130。另以PCR法放大全長人IL-6R cDNA，選殖pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，建構hIL-6R/pcDNA3.1 (+)。取10μg的pCOS2Zeo/gp130與懸浮於PBS的BaF3細胞(0.8x107 個細胞)混合，以基因脈衝儀(gene pulser) (Bio-Rad)，加入0.33kV、950μFD容量的脈衝。經電穿孔位處理將基因導入的BaF3細胞培養於含有0.2 ng/mL鼠介白素-3(Peprotech)、10% 胎牛血清(以下稱為FBS) (HyClone)的RPMI1640培養基(Invitrogen)過夜。加入含有100 ng/mL人介白素-6(R&D systems)、100 ng/mL 人介白素-6 可溶性受體(R&D systems)及10% FBS的RPMI1640培養基並篩選，建立表現人gp130表現的BaF3細胞株(以下稱為BaF3/gp130)。BaF3/gp130可在人介白素-6(R&D systems)及SR344存在下增殖而用來評估抗IL-6受體抗體的增殖抑制活性(即IL-6受體的中和活性)。
人型化抗IL-6受體抗體的製作 根據Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6，使人型化鼠PM1抗體(野生型，以下以WT表示，H鏈WT為H(WT)(胺基酸序列 序列識別號：9)，L鏈WT為L(WT) (胺基酸序列 序列識別號：10))的架構(framework)序列及CDR序列變異，製作改變的H鏈為H53(胺基酸序列 序列識別號：1)、PF1H(胺基酸序列 序列識別號：11)；改變的L鏈為L28(胺基酸序列 序列識別號：12)、PF1L(胺基酸序列 序列識別號：2)。具體而言，使用QuikChange Site- Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，以下述說明書記載之方法，製作變異體，所得的質體片段插入動物細胞表現載體，製作目標H鏈的表現載體及L鏈的表現載體。所得之表現載體鹼基序列由該技術領域之公知方法決定。
人抗IL-6受體抗體的表現及純化 抗體的表現可用以下方法進行。將來自人胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含有10 % 胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen)，以5～6 × 105 個 /mL細胞密度加入連接細胞用的培養皿(直徑10 cm, CORNING)，每一培養皿加入10 mL，在CO2 中培養(37℃、5 % CO2 )過夜後，吸除培養基，再加入6.9 mL 的CHO-S-SFM-II (Invitrogen)培養基。製作的質體經脂染法(lipofection)導入細胞。回收所得的培養上清液後，離心分離(約2000 g、5分間、室溫)，去除細胞，再將其通入0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)，滅菌、獲得培養上清液。將該培養上清液以rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences)該技術領域中公知方法純化。純化的抗體濃度以分光光度計測量280nm的吸光度而測定。從該測量值及由PACE法計算的吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
[實施例2]pH依賴結合的抗體H3pI/L73之製作 可複數次中和抗原之抗體的製造方法 IgG分子為2價，因此以2處與抗原結合，1分子IgG分子可中和最多2分子抗原，但是不能中和3分子以上的抗原。因此為中和抗體時，為了使該中和效果維持一定時間，必須投予高於該一定時間所產生的抗原量之抗體量，對於抗體的藥物動力提升或親和力提升技術，有減少必要抗體投予量的限制。因此，1分子的IgG分子如果可以中和2分子以上的抗原，則以相同投予量可提升中和效果的持續性，且可減少維持達到相同持續性的必要投予量。
中和抗體的情形，標靶抗原的種類有存在血漿中的可溶型抗原及在細胞表面表現的膜型抗原兩種。
當抗原為膜型抗原時，投予的抗體與細胞表面上的膜抗原結合，之後抗體與膜抗原結合，與抗原一起內在化(intenalization)進入細胞內的內囊胞，之後與抗原結合之狀態移到溶酶體，抗體與抗原一起在溶酶體被分解。經內在化，使膜抗原在血漿中消失稱為抗原依賴消失，已報導有多種抗體分子(Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2): 81-8)。當1分子的IgG分子以2價與抗原結合時，則與2分子抗原結合，內在化後以結合狀態經溶酶體分解，因此，當為一般抗體時，1分子的IgG分子無法中和2分子以上的抗原(第1圖)。
IgG分子的血漿中滯留性長(消失慢)者，是因為IgG分子救援受體中已知的FcRn之功能(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25)。經胞飲作用進入內囊胞的IgG分子，在內囊胞內酸性條件下，與內囊胞內表現的FcRn結合。未與FcRn結合的IgG分子進入溶酶體，在該處被分解，但是與FcRn結合的IgG分子移到細胞表面，在血漿中的中性條件下，由FcRn解離，再回到血漿中(第2圖)。
與膜抗原結合的IgG分子經內在化進入細胞內的內囊胞，與抗原結合之狀態移到溶酶體被分解，IgG抗體以2價與抗原結合時，中和2分子抗原並與抗原共同被分解。經內在化進入細胞內內囊胞時，在內囊胞的酸性條件下，如果IgG抗體自抗原解離，則思考解離的抗體可與內囊胞內表現之FcRn結合。從抗原解離而與FcRn結合的IgG分子移到細胞表面，在血漿中的中性條件下，自FcRn解離再回到血漿中，回到血漿中的IgG分子可再度與新的膜抗原結合。經過反覆地進行，1分子的IgG分子可重複與膜型抗原結合，因此1分子的IgG分子可中和複數個抗原(第3圖)。
當抗原為可溶型抗原時，投予的抗體在血漿中與抗原結合，以抗原與抗體的複合體型態滯留在血漿中。通常對於抗體的血漿中滯留性因為上述FcRn功能而非常長(消失速度非常慢)者，抗原的血漿滯留性短(消失速度快)而與抗體結合的抗原，變成具有與抗體相同的血漿中滯留性(消失非常慢)。抗原在生體內通常以一定的速度產生，在無抗體存在下，以抗原的產生速度與抗原的消失速度配合的狀態為其濃度，抗原以該濃度存在於血漿中。當抗體存在下，抗原幾乎與抗體結合，抗原消失非常慢因此血漿中抗原濃度高於無抗體存在下者(Kidney Int. 2003, 64, 697-703、J. National Cancer Institute 2002, 94(19), 1484- 1493、J. Allergy and Clinical Immunology 1997, 100(1), 110-121、Eur. J. Immunol. 1993, 23; 2026-2029 )。假設抗體對抗原的親和力為無限大，抗原濃度上升，抗體從血漿中緩緩消失，從抗體與抗原的濃度一致以後，抗體的抗原中和效果隨時間減少。對可溶型抗原的中和效果，可為解離係數(KD)高，以少量抗體濃度中和，但是即使任何一個的親和力強，也不可能以存在的抗原濃度的1/2以下的抗體濃度中和抗原(Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9;334(4):1004-13)。與未與抗原結合的IgG分子相同，抗原結合的IgG分子也在血漿中經胞飲作用進入內囊胞，在內囊胞的酸性條件下與內囊胞內表現的FcRn結合。與FcRn結合的IgG分子與抗原結合狀態移到細胞表面，在血漿中的中性條件下從FcRn解離，IgG分子與抗原結合狀態再回到血漿中，因此不能與血漿中新的抗原結合。此時，如果在內囊胞內的酸性條件下，IgG分子可從抗原中解離，解離的抗原因為無法與FcRn結合，該抗原經溶酶體分解。另外，IgG分子與FcRn結合可能再回到血漿中。回到血漿中的IgG分子全部在內囊胞內與抗原解離，因此可在血漿中再度與新的抗原結合。反覆此過程，1分子的IgG分子可重複與可溶型抗原結合，使1分子的IgG分子可能中和複數個抗原(第4圖)。
該抗原不論是膜型抗原、可溶型抗原，如果可在內囊胞內的酸性條件下使IgG從抗原解離，則1分子的IgG分子可達到重複中和抗原。要使內囊胞內的酸性條件下IgG抗體從抗原解離，酸性條件下抗原與抗體的結合必須要較在中性條件下更弱。為了必須在細胞表面中和膜抗原，必須在細胞表面pH7.4與抗原強力結合。內囊胞內的pH已報導通常為pH5.5~pH6.0(Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.)。因此，考慮在pH5.5~pH6.0中與抗原結合弱的抗體，在內囊胞內的酸性條件下從抗原解離的抗體。亦即，如果是在細胞表面pH為pH7.4與抗原強結合，在內囊胞內pH為pH5.5~pH6.0與抗原弱結合的抗體，則1分子的IgG分子可中和複數個抗原，可提高藥物動力。
一般而言，蛋白質-蛋白質的相互作用由疏水相互作用、靜電相互作用、氫鍵所構成，該結合強度通常以結合係數(親和性；affinity)或視結合係數(親和性；avidity)來表現。在中性條件下(pH7.4)及酸性條件下(pH5.5~pH6.0)的結合強度變化之pH依賴的結合，存在於天然存在的蛋白質-蛋白質相互作用。例如上述之IgG分子與IgG分子的救援受體與已知的FcRn結合，在酸性條件下(pH5.5~pH6.0)強力結合，在中性條件下(pH7.4)結合非常弱。該多種pH依賴的結合，在變化的蛋白質-蛋白質相互作用中，該相互作用與組胺酸殘基有關。組胺酸殘基的pKa為6.0~6.5左右，因此在中性條件下(pH7.4)與酸性條件下(pH5.5~pH6.0)之間，組胺酸殘基的質子解離狀態改變。即組胺酸殘基在中性條件下(pH7.4)為未帶電荷的中性氫原子接受者之功能，在酸性條件下(pH5.5~pH6.0)為帶正電荷的氫原子提供者之功能。在已報導在上述IgG-FcRn交互作用中，存在IgG側的組胺酸殘基與pH依賴的結合有關(Mol Cell. 2001 Apr;7(4):867-77.)。
因此，關於蛋白質-蛋白質相互作用之胺基酸殘基被組胺酸取代或交互作用處導入組胺酸者，可能賦予蛋白質-蛋白質相互作用之pH依賴性。抗體-抗原間的蛋白質-蛋白質的相互作用中也進行該嘗試，在抗蛋白溶菌酶抗體的CDR序列中導入組胺酸，成功取得在酸性條件下對抗原的結合性降低的抗體變異體(FEBS Letter (vol.309, No.1, 85-88, 1992))。而且已報導經由CDR序列中導入組胺酸，在癌組織的低pH下與抗原特異地組合，但在中性條件下弱結合的抗體(WO2003105757)。
雖已報導該抗原抗體反應中導入pH依賴性之方法，但至今未有報導以在體液中pH為pH7.4中與抗原強結合，在內囊胞內pH為pH5.5~pH6.0中與抗原弱結合，1分子IgG分子中和複數個抗原的抗體。亦即沒有報導關於藉由導入維持在中性條件下結合而只有在酸性條件下的結合大幅降低的改變，與改變前的抗體相比，改變後的抗體在活體內與抗原複數次結合，使藥物動力提高，在相同投予量下提高中和效果的持續性之抗體的改變。
IL-6受體在活體內以可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體兩種型態存在(Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26.)。抗IL-6受體抗體在與可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體兩者結合，中和其生物學上的作用。抗IL-6受體抗體與膜型IL-6受體結合後，以與膜型IL-6受體結合的狀態經內在化進入細胞內的內囊胞，之後抗IL-6受體抗體與膜型IL-6受體結合之狀態一起移到溶酶體，經溶酶體分解。實際上已有報導指出，人型化抗IL-6受體抗體呈現非線性的清除(clearance)，抗原依賴的消失大於人型化抗IL-6受體抗體的消失(The Journal of Rheumatology, 2003, 30;71426-1435)。即，1分子的人型化抗IL-6受體抗體與1分子或2分子的膜型IL-6受體(以1價或2價)結合，內在化後，以溶酶體分解。因此，如果可製造天然型的人型化抗IL-6受體抗體維持在中性條件下結合且只在酸性條件下的結合大幅降低之改變抗體(pH依賴結合的抗IL-6受體抗體)，考慮以1分子人型化抗IL-6受體的抗體中和複數個分子的IL-6受體，因此與天然型的人型化抗IL-6受體抗體相比，pH依賴結合之抗IL-6受體抗體在活體內相同投予量可提高中和效果的持續性。
pH依賴結合之人型化IL-6受體抗體H3pI/L73之製作 pH依賴結合導入抗原抗體反應的方法已報導在CDR導入組胺酸之方法(FEBS Letter (vol.309, No.1, 85-88, 1992))。由實施例1製作的H53/PF1L可變區表面所露出的胺基酸殘基及抗原的相互作用，確認殘基，使用MOE軟體(Chemical Computing Group Inc.)，經同源性模式(Homology modeling)製作H53/PF1L的Fv區模式。由原始製作H53/PF1L序列資訊的立體構造模式，經組胺酸的導入，可導入與抗原pH依賴結合所考慮的變異處選擇為H27、H31、H35、L28、L32、L53(Kabat編號、Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)。H27、H31、H35的殘基被組胺酸取代的變異，以實施例1製作，導入於H53，形成H3pI(胺基酸序列 序列識別號：3)，L28、L32、L53的殘基被組胺酸取代的變異，以實施例1製作，導入於PF1L，形成L73(胺基酸序列 序列識別號：6)。
H3pI/L73的表現載體之製作、表現、純化 由選定處製作改變抗體，進行胺基酸的改變。將實施例1製作的H53(鹼基序列 序列識別號：13)及PF1L(鹼基序列 序列識別號：14)導入該變異中，製作H3pI(胺基酸序列 序列識別號：3)及L73(胺基酸序列 序列識別號：6)。具體地說，使用導入快速改變位的變異套組(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene))，根據其指示之方法製作，獲得質體片段，將該質體片段插入動物細胞的表現載體，製作目的之H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體鹼基序列根據該技術領域中公知方法決定。H鏈為H3pI，L鏈為L73之H3pI/L73的表現、純化如實施例1之方法進行。
[實施例3]使用噬菌體展示(phage display)技術賦予因CDR His改變所具有的pH依賴的抗原結合能力 人型化PM1抗體之scFv分子之製作 進行人型化抗IL-6抗體之人型化PM1抗體(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)的scFv化。VH、VL區經PCR放大，製作在VH、VL間具有連結序列GGGGSGGGGSGGGGS (序列識別號：15)的人型化PM1 HL scFv。
經組胺酸掃描選定可能導入組胺酸之位置 以製作的人型化PM1 HL scFv DNA為鑄模，經PCR製作各CDR胺基酸中之一的胺基酸為組胺酸的組胺酸資料庫。希望資料庫化的胺基酸密碼子，以相當於組胺酸的密碼子CAT作為引子進行PCR反應，建構部分資料庫，其他部分經一般PCR製作，經組合(assemble) PCR連接構成。建構的資料庫以Sfi I分解，插入相同以Sfi I分解的噬菌質體(phagemide)載體之pELBG lacI載體，轉形於XL1-Blue(stratagene)。使用所得之菌落(colony)，進行噬菌體ELISA的抗原結合性評估及HL scFv序列分析。根據J.Mol.Biol 1992 ; 227 : 381-388，使用塗布1μg/mL的SR344之培養皿，進行噬菌體-ELISA。對於認為有SR344結合性的菌落，使用特異引子進行序列分析。
以抗-Etag抗體(GE Healthcare)及抗-M13抗體(GE Healthcare)進行ELISA法計算噬菌體力價。以此數值，從對SR344的噬菌體ELISA結果與人型化PM1 HL scFv相比，將CDR殘基以組胺酸取代，選擇結合能力未大幅改變的位置。該位置如表2所示。各殘基的編號根據Kabat的恆定區(Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)。
[表2]結合能力未大幅影響的組胺酸取代位置 H31, H50, H54, H56, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H100a, H100b, H102 L24, L26, L27, L28, L30, L31, L32, L52, L53, L54, L56, L90, L92, L93, L94
CDR組胺酸改變的資料庫之建構 如表2所示，以組胺酸取代而結合能力未大幅改變的CDR殘基(組胺酸可能導入位置)之胺基酸，進行原始序列(天然型序列)或組胺酸資料庫之設計。將實施例1製作之H鏈PF1H、L鏈PF1L序列為原始序列，在資料庫的位置中建構如原始序列或組胺酸(原始序列或組胺酸任一方)之資料庫。
使用原始胺基酸密碼子或組胺酸密碼子之設計的引子進行PCR反應，在資料庫化的位置建構部分資料庫，其他部分以一般PCR或使用與該部分資料庫相同之合成引子之PCR反應製作，經組合(assemble) PCR連結建構(J.Mol.Biol 1996 ; 256 : 77-88)。
根據J. Immunological Methods 1999 ;231:119-135，使用該資料庫建構核糖體展示(ribosome display)用資料庫。為了進行大腸桿菌無細胞系活體外轉譯，在5’端增加SDA序列(核糖體連接位)、T7啟動子，核糖體展示用的連接以在3’端gene3部分序列使用Sfi I而連結。
經珠淘選(beads panning)由資料庫中取得pH依賴結合的scFv 為了只濃縮具有對SR344結合能力之scFv，根據Nature Biotechnology 2000 Dec ; 18 : 1287-1292，以核糖體展示法進行2次淘選。將調製的SR344使用NHS-PEO4-Biotin(Pierce)製作生物素化抗原。使用40 nM的生物素化抗原量進行淘選。
以所得的DNA池作為鑄模，使用特異性引子經PCR復原HL scFv。以Sfi I分解，插入同樣以Sfi I分解的噬菌質體(phagemide)載體之pELBG lacI載體，轉形於XL1-Blue(stratagene)。
培養具有目的質體的大腸桿菌於2YT/100μg/mL安比西林(Ampicilin)/2%葡萄糖培養基，增殖至0.4-0.6 O.D./mL。該處加入輔助噬菌體(helper phage) (M13KO7, 4.5x1011 pfu)，37℃下靜置培養30分鐘，並在37℃下震盪培養30分鐘後，移到50 mL Falcon管，3000rpm離心10分鐘，再懸浮於2YT/100μg/mL安比西林(Ampicilin)/ 25μg/mL康黴素(kanamycin)/0.5 mM IPTG中，30℃下增殖一晚。
將一晚培養的培養液經2.5 M NaCl/10%PEG沉澱後，以PBS稀釋，將噬菌體液作成噬菌體資料庫液。該噬菌體資料庫液中加入10% M-PBS(含10%脫脂牛乳的PBS)、1 M Tris-HCl，使終濃度為2.5% M-PBS, pH7.4。淘選使用一般方法固定於磁珠的抗原之淘選方法(J Immunol Methods. 2008 Mar 20;332(1-2):2-9.、J Immunol Methods. 2001 Jan 1;247(1-2):191-203.、Biotechnol Prog. 2002 Mar-Apr; 18(2):212-20.)。具體地說，在調製的噬菌體資料庫液中加入40pmol生物素標記的SR344，在37℃下與抗原接觸60分鐘。加入以5% M-PBS(含5%脫之牛乳的PBS)洗淨的鏈黴卵白素(Streptavidin)塗佈珠(Dynal M-280)，37℃下結合15分鐘。該珠以0.5 Ml的PBST(含0.1% Tween-20的PBS, pH7.4)及PBS(pH7.4)清洗5次。該珠於37℃下1 mL的PBS(pH5.5)中懸浮，即回收噬菌體。在回收的噬菌體溶液中添加10 mL對數增殖期(OD600 0.4-0.5)的XL1-Blue，37℃下靜置30分鐘使其感染。將感染的大腸桿菌平塗(plating)於2YT/100μg/mL安比西林(Ampicilin)/2% 葡萄糖的225 mm x 225 mm培養盤。再度從大腸桿菌開始培養，進行同上述噬菌體培養，重複8次。
以噬菌體ELISA評價 將上述單一菌落植菌於100μL 2YT/100μg/mL安比西林(Ampicilin)/2% 葡萄糖/12.5μg/mL四環黴素，30℃培養一晚。取該2μL植菌於300μL 2YT/100μg/mL安比西林(Ampicilin)/2% 葡萄糖，37℃培養4小時後，加入輔助噬菌體(helper phage) (M13KO7)9 x 108 pfu，37℃下靜置30分鐘培養，37℃下30分鐘攪拌培養使感染。之後，培養基換為2YT/100μg/mL安比西林(Ampicilin)/25μg/mL康黴素(kanamycin)/0.5 mM IPTG 300μL。繼續於30℃培養一晚，離心回收上清液。離心的上清液40μL中加入50 mM PBS(pH7.4)360μL，供ELISA使用。在StreptaWell 96微滴定盤(Roche)塗布62.5 ng/mL含有生物素標記的SR344之PBS 100μL一晚。以PBST洗淨除去抗原後，在2% BSA-PBS 250μL中阻斷(blocking)1小時以上。去除2% BSA-PBS，加入所調製的培養上清，37℃下靜置1小時，使抗體結合。洗淨後、加入50 mM PBS(pH7.4)或50 mM PBS(pH5.5)，37℃下靜置30分鐘培養。洗淨後，以2% BSA-PBS稀釋的HRP結合之抗M13抗体(Amersham Parmacia Biotech)與TMB 單一溶液(ZYMED)篩檢，加入硫酸使反應停止後，測定450 nm的吸光度。
而且，使用此固定於磁珠的抗原之淘選，獲得具有強pH依賴結合能力之選殖株。對於被認為是弱的pH依賴結合能力之選殖株，使用特異的引子進行序列分析。在前述選殖株中，高確定率形成組胺酸之位置如表3所示。
[表3]由噬菌體資料庫(磁珠淘選)發現的組胺酸取代位置 H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H102 L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92, L94
由柱淘選之資料庫取得pH依賴結合之scFv 使用一般固定於磁珠的抗原之淘選，得到具有強pH依賴結合能力的選殖株。使用固定於磁珠之抗原的淘選或使用固定於盤之抗原的淘選時，磁珠或盤在酸性條件下解離的噬菌體全部回收，因此pH依賴性弱的選殖株之噬菌體也被回收，可能是使最終濃縮的選殖株中包括具有強pH依賴性的選殖株之可能性低的原因。
此處，檢討將抗原固定於柱的淘選方法為更嚴謹條件之淘選方法(第5圖)。至今未有報導指出使用固定抗原的柱之淘選方法獲得具有pH依賴結合能力的選殖株。當使用固定抗原之柱的淘選時，考慮在中性條件下結合的噬菌體在酸性條件溶出時，pH依賴性弱的選殖株在柱內與抗原再結合而難以溶出，pH依賴性強、不易在柱內再結合之選殖株則選擇性從柱中溶出。又使用固定於磁珠的抗原之淘選或固定於盤的抗原之淘選，在酸性條件下解離的噬菌體”全部”被回收，但是使用固定抗原的柱之淘選，當柱中流出酸性條件的緩衝液，開始溶出，回收”僅適當的分層”，可選擇回收具有強pH依賴結合能力之噬菌體。
首先製作固定抗原SR344之柱。將200μL鏈黴卵白素(Streptavidin) Sepharose(GE Healthcare)以1 mL PBS清洗後，懸浮於500μL的PBS，與400 pmol生物素標記的SR344於室溫下接觸1小時間。之後，在空柱(Amersham Pharmcia Biotech)內填充上述sepharose，以約3 mL的PBS洗淨該柱。以0.5% BSA-PBS(pH7.4)稀釋上述PEG沉澱的資料庫噬菌體(library phage)為1/25，通入0.45 nm 濾器後，添加於該柱。以約6 mL的PBS(pH7.4)洗淨後，流入50 mM MES-NaCl(pH5.5)，形成低pH，溶出解離的抗體。回收適當的溶出分層，回收的噬菌體溶液添加於10 mL的對數增殖期(OD600 0.4-0.5)XL1-Blue，37℃靜置30分鐘使感染。
將感染的大腸桿菌，平塗於2YT/100μg/mL安比西林(Ampicilin)/2% 葡萄糖的225 mm x 225 mm盤中。再次由大腸桿菌培養開始，同上述之噬菌體培養，重複6次淘選。
噬菌體ELISA的評價 以噬菌體ELISA進行所得噬菌體的評價。對於被認為pH依賴性強的選殖株，使用特異的引子，進行序列分析。結果與WT相比，獲得複數個被發現pH依賴結合強的選殖株。如第6圖所示，與WT相比，確認選殖株CL5(H鎖CLH5、L鎖CLL5)(CLH5：胺基酸序列 序列識別號：5；CLL5：胺基酸序列 序列識別號：8)為特別強的pH依賴結合。使用一般固定於磁珠的抗原之淘選而未去除的強pH依賴結合的抗體，在經由使用抗原固定於柱之淘選可被取得，可知使用將抗原固定於柱之淘選非常有效地作為pH依賴結合抗體由資料庫中取得的方法。發現pH依賴結合之複數個選殖株的胺基酸序列分析結果，在濃縮的選殖株中形成高確定率之組胺酸之位置，如表4所示。
[表4]經噬菌體資料庫(柱淘選)的組胺酸取代位置 H31, H50, H58, H62, H63, H65, H100b, H102 L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92, L94
[實施例4]人型化IL-6受體抗體的組胺酸改變體之表現及純化 人型化IL-6受體抗體的組胺酸改變抗體之表現載體的製作、表現、純化 噬菌體ELISA中被認為pH依賴性強的選殖株中，為了IgG化，將VH及VL分別由PCR放大，經XhoI/NheI分解及EcoRI分解，插入動物細胞表現用載體。各DNA片段的鹼基序列由該技術領域中公知方法決定。H鏈為CLH5、L鏈為實施例2所得的L73，將CLH5/L73作成IgG，及表現、純化。表現、純化的方法如實施例1記載之方法進行。
藉由變異位置的組合，進行具有更高pH依賴性的抗體製作。噬菌體資料庫中，由His被濃縮的位置、構造情報等，H鏈為實施例2所得的H3pI之H32、H58、H62、H102以組胺酸取代，且H95以纈胺酸取代，H99以異白胺酸取代，製作H170(序列識別號：4)。改變體的製作以實施例1記載之方法進行。又L鏈為實施例2作成的L73的第28位組胺酸被天冬胺酸(Asp)取代，製作L82(序列識別號:7)。改變體的製作以實施例1記載之方法進行。以實施例1之方法，H鏈為H170，L鏈為L82，將H170/L82製作成IgG，進行表現、純化。
[實施例5] pH依賴結合抗體之IL-6中和活性評價 IgG化選殖株的人IL-6受體中和活性評價 人型化PM1抗體(野生型:WT)及以實施例2、4製作的H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82之4種，評估IL-6受體的中和活性。
具體地說，使用顯示IL-6/IL-6受體依賴性增殖的BaF3/gp130，評估IL-6受體的中和活性。將BaF3/gp130以含10% FBS的RPMI1640培養基清洗3次後，以5 x 104 細胞/mL懸浮於60 ng/mL的人介白素-6(TORAY)、60 ng/mL的重組可溶型人IL-6受體(SR344)及含10% FBS的RPMI1640培養基，於96-位盤(CORNING)每位注入50μL。其次，將純化的抗體以含10% FBS的RPMI1640稀釋，使每位以50μL分別混合。在37℃、5% CO2 條件下培養3天，每位加入20μL的PBS稀釋2倍的WST-8試藥(Cell Counting Kit-8、同仁化學研究所股份有限公司)、直接使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)測定450 nm吸光度(參考波長620 nm)。培養2小時後，再測定450 nm吸光度(參考波長620 nm)，以該2小時的吸光度變化為指標，評估IL-6受體的中和活性。結果如第7圖所示，與人型化PM1抗體(野生型：WT)相比，顯示H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82具有相同的生物學中和活性。
[實施例6]pH依賴結合抗體的Biacore分析 pH依賴結合選殖株對可溶型IL-6受體的結合分析 對人型化PM1抗體(野生型：WT)及實施例2、4製作的H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82的4種，以Biacore T100(GE Healthcare)進行在pH5.8及pH7.4中抗原抗體反應的速度理論之分析(緩衝液為10 mM MES pH7.4或pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)。由胺基加帽(amine capping)法將重組蛋白A/G(Pierce)固定於感應晶片上，使其與多種抗體結合，此處作為檢測(analight)，注入濃度調為9.8-400 nM濃度的SR344。觀察pH依賴結合的選殖株對SR344結合及解離的即時狀況(real type)(如第8、9圖)。全部測定在37℃下進行。使用Biacore T100 評估軟體(GE Healthcare)，計算結合速度常數ka(1/Ms)及解離速度常數 kd(1/s)，以該值計算解離常數KD (M)(表5)。再分別計算pH5.8與pH7.4的親和性比，評估pH依賴性結合。全部測定在37℃下進行。
分別計算pH5.8及pH7.4的親和性比值，H3pI/L73、H170/L82、CLH5/L73對SR344的pH依賴性結合(親和性)分別為41倍、394倍、66倍，每一選殖株與WT相比，皆顯示15倍以上的高pH依賴性結合。
至今未有報導在血漿中pH7.4中與抗原強結合，在內囊胞內pH5.5~pH6.0中與抗原弱結合之抗IL-6受體的抗體。在本發明的想法下，獲得具有與WT的人型化IL-6受體抗體相同生物學中和活性，以及維持在pH7.4中的親和性之狀態，只有特異在pH5.8的親和性降低10倍以上的抗體。
[表5]對SR344的pH依賴結合的選殖株之可溶型IL-6受體的結合比較
Figure 02_image001
pH依賴結合選殖株之膜型IL-6受體的結合分析 在製造的上述pH依賴結合的選殖株中，使用Biacore T100(GE Healthcare)，觀察pH5.8及pH7.4中膜型IL-6受體的抗原抗體反應。以固定在感應晶片上的IL-6受體的結合之評價，評估膜型IL-6受體的結合。根據習知方法，將SR344生物素化，利用鏈黴卵白素(Streptavidin)與生物素的親和性，藉由鏈黴卵白素(Streptavidin)將生物素化的SR344固定在感應晶片上。此測定全程在37℃下進行，移動相的緩衝液為10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20，在該處pH7.4條件下注入pH依賴結合的選殖株，使其與SR344結合中(注入樣本的緩衝液為10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)，觀察在pH5.8移動相中各選殖株的pH依賴的解離(第10圖)。
樣本濃度為0.5μg/mL，只有在10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20中結合，在10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20中解離時的pH5.8中解離相，安裝Biacore T100 評價軟體(GE Healthcare)，計算在pH5.8中的解離速度(kd(1/s))。相同地，樣本濃度為0.5μg/mL，只有在10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20中結合，在10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20中解離時的pH7.4中解離相，安裝Biacore T100 評價軟體(GE Healthcare)，計算在pH7.4中的解離速度(kd(1/s))。各選殖株的pH依賴的解離速度係數如表6所示。
[表6]對SR344之pH依賴結合的選殖株之膜型IL-6受體的解離速度係數比較
Figure 02_image003
依照解離度的pH依賴性大小順序來看，由大到小為H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82，每一選殖株皆顯示較WT高的pH依賴性的膜型IL-6受體的解離。然而，pH依賴結合、解離的順序在可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體中不同。在可溶型IL-6受體的結合分析中顯示最高pH依賴性結合的H170/L82，在膜型IL-6受體的結合分析中為最低pH依賴性結合。一般已知，在可溶型抗原中，IgG分子以1價(親和性)結合者，在膜型抗原係以2價(親和性)結合。如此可溶性抗原及膜型抗原的結合樣式不同，但卻影響H170/L82的pH依賴結合。
[實施例7]pH依賴結合的抗體對抗原複數次結合的確認 如實施例2記載，pH依賴結合的抗體可對抗原複數次結合。即與抗原結合的pH依賴結合的抗體非特異性進入內囊胞內，但在內囊胞內酸性條件下由可溶型抗原解離。抗體與FcRn結合再回到血漿中，回到血漿中的抗體由於未與抗原結合，因此可再與新的抗原結合。重複此過程，可使pH依賴結合的抗體與抗原複數次結合。然而，不具有pH依賴結合的IgG抗體，在內囊胞條件下無法使全部抗原自抗體解離，因此藉由FcRn回到血漿中的抗體與抗原結合狀態，無法再與新的抗原結合。因此，幾乎1分子IgG抗體只能與2個抗原中和(以2價結合時)。
以實施例2、4製作的H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82三種的pH依賴結合的抗體，與人型化PM1抗體(野生型WT)相比，評估是否可與抗原SR344複數次結合。
對於在pH7.4結合、在pH5.8解離，而可對抗原複數次結合者，以Biacore(GE Healthcare)評估。以胺基加帽法，將固定有重組蛋白A/G(Pierce)的感應晶片，與評價的抗體結合，流入pH7.4移動相(步驟1)。調整為pH7.4的SR344溶液作為檢測(analight)流入，使抗體在pH7.4下與SR344結合(步驟2)。在pH7.4的結合模擬血漿中抗原的結合。之後，只有將調整為pH5.8的緩衝液(不含SR344的溶液)，作為檢測(analight)流入，使與抗體結合的抗原暴露在酸性條件下(步驟3)。在pH5.8的解離模擬內囊胞內抗體抗原複合體的結合狀態。之後再進行步驟2。此模擬經由FcRn回到血漿中的抗體再與新抗原結合者。之後，再進行步驟2，使抗體抗原複合體暴露在酸性條件下。以”步驟2→步驟3”的型態在37℃下重複複數次，可模擬反覆使抗體從血漿中經胞飲作用進入內囊胞內，經由FcRn回到血漿中(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25)之體內狀態。
對上述製作的pH依賴結合的選殖株，使用Biacore T100(GE Healthcare)，分析在pH5.8, pH7.4中對抗原SR344的複數次結合能力。具體如下述進行之。測定全程在37℃下實施，首先以胺基加帽法將重組蛋白A/G(Pierce)固定在感應晶片上，移動相緩衝液為10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20，與上述樣本抗體結合(步驟1)。此作為檢測(analight)，調配約40nM濃度的SR344，在pH7.4條件下注入3分鐘(注入SR344的緩衝液為10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)，使其結合(步驟2)。之後，停止注入SR344，將pH5.8的移動相以約70秒流入，使抗體/SR344複合體暴露在酸性條件下(步驟3)。此結合(步驟2)及酸性暴露(步驟3)步驟為1組，連續重複10組，即時觀察該訊號圖，如第11圖所示。WT在步驟3酸性暴露時的SR344解離少，因此之後的步驟2中可與新抗原結合的抗體比例非常地少。對此，pH依賴結合的選殖株，特別是H170/L82與CLH5/L73，在步驟3的酸性暴露時解離極大，結合的SR344幾乎解離，因此之後步驟2中幾乎抗體可與新抗原結合。H170/L82與CLH5/L73的結合(步驟2)及酸性暴露(步驟3)即使重複10組，每組中幾乎抗體可與新抗原結合。
使用獲得的訊號圖及Biacore T100 評估軟體(Biacore)，計算各樣本的1組之SR344結合量，10組的經時加總值如第12圖所示。以10組所得的加總RU值相當為10次循環中結合的總抗原值。與WT相比，pH依賴結合的選殖株，特別是H170/L82與CLH5/L73，其結合的總抗原量最多，與WT相比顯示可重複約4倍量的抗原之結果。因此，對WT而言具有pH依賴結合者，重複與抗原結合，可中和複數個抗原。
[實施例8] pH依賴結合抗體的人IL-6受體轉殖基因鼠之PK/PD試驗 IL-6受體在體內存在有可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體兩種型態(Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26)。抗IL-6受體的抗體與可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體兩者結合，為生物學作用之中和。抗IL-6受體的抗體與膜型IL-6受體結合後，與膜型IL-6受體結合的狀態，經內在化進入細胞內內囊胞，之後以抗IL-6受體的抗體與膜型IL-6受體結合之型態移到溶酶體，一起由溶酶體分解。以實施例6評價的pH依賴結合的抗IL-6受體的抗體為H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82，如果在內囊胞內酸性條件下解離，經由FcRn回到血漿中，則回到血漿中的抗體可再度與抗原結合，以1分子抗體可與複數個膜型IL-6受體中和。在內囊胞內酸性條件下解離者，經由FcRn回到血漿中者，是否可達到製作pH依賴結合的抗IL-6受體的抗體，可評價該抗體的藥物動力與WT相比是否改善。
因此，評價人型化PM1抗體(野生型WT)及實施例2、4製作的H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82四種，在人IL-6受體轉殖基因鼠(hIL-6R tg鼠、Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23;92(11):4862-6)中的藥物動力。將WT及H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82靜脈內25 mg/kg單次投予hIL-6R tg鼠，在投予前及經時採血。採取的血液直接在4℃離心15,000rpm、15分鐘，取得血漿。分離的血漿保存在-20℃以下設定的冷凍庫中，至實施測定為止。
鼠血漿中濃度測定以ELISA法測定。調整血漿中檢測基準線試料的濃度為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1μg/mL。將檢測基準線試料與鼠血漿測定試料分別注入以抗人IgG(γ-鏈特異性) F(ab')2(Sigma社製)固相化的免疫盤(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International社製))，在室溫下靜置1小時後，依羊抗人IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates社製)及鏈黴卵白素(Streptavidin)-鹼磷酸酶共軛物(Roche Diagnostics社製)順序反應，以BluePhos 微位磷酸酶基質系統(BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System)(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)作為基質，進行顯色反應，測定微盤讀器上650nm吸光度。鼠血漿中濃度從檢測線的吸光度使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices社製)計算。WT及H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82的血漿中濃度改變如第13圖所示。
與WT相比，H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82的藥物動力皆改善。其中以H3pI/L73及CLH5/L73的藥物動力大幅改善。與膜型IL-6受體結合的天然型抗IL-6受體抗體(WT)，經內在化進入細胞內內囊胞，與抗原結合的狀態移到溶酶體分解，因此在血將中滯留性短。對此，pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在內囊胞內酸性條件下從膜型IL-6受體之抗原解離，經由FcRn再回到血漿中。
與WT相比，H3pI/L73、CLH5/L73、H170/L82的藥物動力皆改善，但是H170/L82血漿中滯留性延長效果較H3pI/L73、CLH5/L73小。通常IgG分子與膜型抗原為2價結合，因為抗IL-6受體抗體也是膜型IL-6受體以2價(親和性；avidity)結合後，被內在化。如實施例6所示，經Biacore分析中，H170/L82在與可溶型IL-6受體結合時，在pH5.8中快速從IL-6受體解離(第9圖)，但在與膜型IL-6受體結合時，在pH5.8中從IL-6受體解離速度非常慢(第10圖)。因此，H170/L82的血漿中滯留性效果小，與膜型IL-6受體結合時在pH5.8中解離慢，因此在內在化後在內囊胞內無法充分解離。亦即，對膜型抗原而言，為了使1個IgG分子中和複數個膜型抗原，從2價結合(親和性；avidity)解離的pH依賴性，較以1價結合(親和性)的pH依賴性重要。
[實施例9] pH依賴結合抗體的食蟹猴之PK/PD試驗 在實施例8中pH依賴結合的抗IL-6受體抗體之藥物動力大幅改善，因此，pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在內囊胞內酸性條件下，從膜型IL-6受體之抗原解離者，經FcRn再回到血漿中。如果再回到血漿中的抗體再度與膜型IL-6受體結合，與天然型抗IL-6受體的抗體比較，pH依賴結合的抗IL-6受體的抗體以相同投予量，持續較長對膜型抗IL-6受體之抗原的中和。又當IL-6受體以可溶型IL-6受體存在，也與可溶型IL-6受體中和有關，在相同投予量下，持續較長的中和。
對於WT及H3pI/L73，評價在食蟹猴中的藥物動力。將WT及H3pI/L73以1 mg/kg靜脈內單次投予食蟹猴，投予前及經時採血。採取的血液直接在4℃離心15,000rpm、15分鐘，得到血漿。分離的血漿存放在設定-20℃的冷凍庫中，至測定為止。
食蟹猴血漿中濃度測定以ELISA法測定。首先將抗人IgG(γ-鏈特異性) F(ab')2抗體片段(SIGMA社製)分注入免疫盤(Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International社製))。4℃靜置1晚，製作抗人IgG固相盤。調製血漿濃度為3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05μg/Ml的檢測基準線試料，以及稀釋100倍以上的食蟹猴血漿測定試料，100μL的該檢測基準線試料及血漿測定試料中加入200μL的20 ng/mL食蟹猴IL-6R，室溫下靜置1小時。之後分注於固定有抗人IgG的盤中，再於室溫下靜置1小時。之後與生物素化抗人IL-6 R抗體(R&D社製)室溫下反應1小時，再與鏈黴卵白素(Streptavidin)- PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies 社製)室溫下反應1小時，將TMB 單組成 HRP微位基質(TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories社製))作為基質，進行顯色反應，以1N-硫酸(Showa Chemical社製)反應停止後，以微盤讀器測定450nm吸光度。食蟹猴血漿中濃度由基準線的吸光度分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices社製)計算。WT及H3pI/L73的靜脈內投予後血漿中濃度變化如第14圖所示。結果為食蟹猴中與人IL-6受體轉殖基因鼠相同，與WT相比，H3pI/L73的藥物動力大幅改善。pH依賴結合的抗IL-6受體抗體之H3pI/L73的藥物動力大幅改善，因此H3pI/L73在內囊胞內酸性條件下，從膜型IL-6受體之抗原解離，經由FcRn再回到血漿中。
經由WT及H3pI/L73的靜脈內投予，評價食蟹猴的膜型IL-6受體為何種中和程度，因此，檢討以食蟹猴IL-6誘導的血漿C反應性蛋白(CRP)的檢體之影響。IL-6一旦與膜型IL-6受體結合便分泌CRP，因此CRP為膜型IL-6受體的中和指標。在WT及H3pI/L73投予後第3天(day 3)至第10天(day 10)，連日於腰背部皮下投予1%非作用食蟹猴血漿之食蟹猴IL-6(實施例1製作之cyno.IL-6) 5μg/kg。食蟹猴IL-6在投予開始前(day 3)至投予後每24小時間隔(day 4~day 11)由潛在靜脈採血，分離血漿。各個體的CRP濃度使用SAIAS R CRP(關東化學株式會社)，自動分析裝置(TBA-120FR、東芝MedicalSystems株式會社)測定。WT及H3pI/L73以食蟹猴IL-6誘導時的CRP濃度變化如第15圖所示。結果與WT相比，H3pI/L73的顯著CRP抑制期大幅延長。因此思考，pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在內囊胞內酸性條件下從膜型IL-6受體的抗原解離，經由FcRn再回到血漿中，再度與膜型IL-6受體結合而中和，抑制CRP產生的時間較WT長。亦即，H3pI/L73顯示可以抗體1分子複數次與膜型IL-6受體結合中和。與WT相比，H3pI/L73延長抑制CRP產生的時間，因此顯示H3pI/L73經膜型IL-6受體之抗原經抗體結合的時間較WT長。
經由WT及H3pI/L73的靜脈內投予，評價食蟹猴的可溶型IL-6受體為何種中和程度，因此測定食蟹猴血漿中非結合型食蟹猴可溶型IL-6受體濃度。取食蟹猴血漿30μL添加於具有乾燥的適量蛋白A(rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare))的0.22μm過濾杯(Millipore)中，使血漿中存在的全部IgG型抗體(食蟹猴IgG、抗人IL-6受體抗體及抗人IL-6受體抗體-食蟹猴可溶型IL-6受體複合體)吸附於蛋白A。之後以高速離心機旋轉，回收流出的溶液(以下稱為「通過溶液」)。通過溶液不包含與蛋白A結合的抗人IL-6受體抗體-食蟹猴可溶型IL-6受體複合體，因此藉由測定蛋白A通過溶液中食蟹猴可溶型IL-6受體濃度，可測定非結合型的可溶型IL-6受體濃度。將食蟹猴IL-6受體檢測基準線試料調製為4000、2000、1000、500、250、125、62.5 pg/mL，及上述蛋白A處理的血漿樣本與SULFO-TAG NHS酯(Meso Scale Discovery社製)釕化的單株抗人IL-6抗體(R&D社製)與生物素抗人IL-6 R抗體(R&D社製)混合，在室溫下反應1小時。之後分注於SA塗佈的標準MA2400 96位盤(Meso Scale Discovery社製)。再於室溫反應1小時，洗淨後分別加入讀取緩衝液T(×4)(Meso Scale Discovery社製)，直接以SECTOR 影像 2400(Meso Scale Discovery社製)測定。食蟹猴IL-6受體濃度由檢測基準線的反應，以分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices社製)計算。WT及H3pI/L73的非結合型食蟹猴可溶型IL-6受體濃度變化如第16圖所示。結果與WT相比，H3pI/L73大幅延長與食蟹猴可溶型IL-6受體的大量中和期。因此，pH依賴結合的抗IL-6受體抗體H3pI/L73在內囊胞內酸性條件下從抗原可溶型IL-6受體解離，經由FcRn再回到血漿中，再度與可溶型IL-6受體結合而中和。H3pI/L73與WT相比，H3pI/L73延長抑制非結合型食蟹猴可溶型IL-6受體的時間，因此顯示與WT相比，H3pI/L73延長抗原可溶型IL-6受體與抗體結合的時間。
因此發現，相對於野生型IL-6受體抗體，在血漿中pH為pH7.4時結合強，在內囊胞內pH為pH5.8時與抗原結合弱之pH依賴結合的抗IL-6受體抗體，抗體從血漿中至消失的時間以及體內可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體與抗體結合的的時間大幅延長。因此，可減少對患者的投予量或投予頻率，結果為降低總投予量，因此pH依賴結合的抗IL-6受體抗體特別優於作為IL-6拮抗劑之醫藥品。
[實施例10]可變區的最佳化而提升膜型IL-6受體的pH依賴結合 可變區H3pI/L73及CLH5/L82的最佳化 實施例9中顯示具有pH依賴結合能力的抗體發揮良好效果，更為了提高pH依賴結合能力，在實施例3所得的CLH5的CDR序列導入變異，製作VH1-IgG1(序列識別號：21)、VH2-IgG1(序列識別號：22)。又在H3pI的架構(framework)序列及CDR序列導入變異，製作VH3-IgG1(序列識別號：23)、VH4-IgG1(序列識別號：24)作為改變的H鏈。L73、L82的CDR序列導入變異，製作VL1-CK(序列識別號：25)、VL2-CK(序列識別號：26)、VL3-CK(序列識別號：27)，作為改變L鏈。具體地說，使用快速改變位導向變異套組(Stratagene)，依其說明書之方法製作變異體，獲得的質體片段插入哺乳動物表現載體，製作目標H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體的鹼基序列以該技術領域中公知方法決定。
以VH2-IgG1(序列識別號：22)為H鏈、VL2-CK(序列識別號：26)為L鏈作為Fv1-IgG1；以VH1-IgG1(序列識別號：21)為H鏈、L82為L鏈作為Fv2-IgG1；以VH4-IgG1(序列識別號：24)為H鏈、VL1-CK(序列識別號：25)為L鏈作為Fv3-IgG1；以VH3-IgG1(序列識別號：23)為H鏈、VL3-CK(序列識別號：27)為L鏈作為Fv4-IgG1。進行其中Fv2-IgG1及Fv4-IgG1的表現、純化。表現、純化如實施例1之方法進行。
pH依賴結合的選殖株之可溶型IL-6受體的結合分析 對於人型化PM1抗體(野生型WT)及實施例2、10製作的WT、H3pI/L73、Fv2-IgG1、Fv4-IgG1四種，使用Biacore T100(GE Healthcare)，分析pH7.4中抗原抗體反應之速度論的分析(緩衝液為10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)。經胺基加帽法，將抗IgGγ鏈特異性F(ab)2(Pierce)固定在感應晶片上，使其與多種抗體結合，以此作為檢測(analight)，注入濃度調為9.8-40 nM的SR344。即時觀察pH依賴結合的選殖株對SR344的結合與解離。測定全程在37℃下進行。使用Biacore T100 評價軟體(GE Healthcare)計算結合速度常數ka (1/Ms)及解離速度常數kd (1/s)，以此值計算解離常數KD (M) (表7)。
[表7]由對SR344的pH依賴結合的選殖株之可溶型IL-6受體解離之解離速度常數的比較
Figure 02_image005
分別計算出pH7.4的親和性後，對SR344的WT、H3pI/ L73-IgG1、Fv2-IgG1、Fv4-IgG1解離常數(親和性，KD值)分別為約2.7 nM,1.4 nM, 2.0 nM, 1.4 nM，顯示Fv2-IgG1、Fv4-IgG1與可溶型IL-6受體的結合能力與WT為相同以上。
pH依賴結合的選殖株對膜型IL-6受體的結合分析 製作的WT、H3pI/L73-IgG1、Fv2-IgG1、Fv4-IgG1四種，使用Biacore T100(GE Healthcare)觀察pH5.8, pH7.4中膜型IL-6受體的抗原抗體反應。評價對固定於感應晶片上的IL-6受體之結合，而評價對膜型IL-6受體的結合。SR344以該技術領域公知方法生物素化，利用鏈黴卵白素(Streptavidin)與生物素的親和性，經由鏈黴卵白素(Streptavidin)使生物素化的SR344固定在感應晶片上。測定全程37℃下進行，移動相的緩衝液為10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20，在此pH7.4條件下注入pH依賴結合的選殖株，與SR344結合(注入樣本的緩衝液為10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)，移動相的pH5.8觀測各選殖株的pH依賴的解離(第17圖)。
樣本濃度為0.25μg/mL，在10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20結合，以10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20解離時，只有在pH5.8的解離相以Biacore T100評價軟體(GE Healthcare)經調整計算pH5.8的解離速度常數(kd (1/s))。相同地，樣本濃度為0.25μg/mL，在10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20結合，在10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20解離時，只有在pH7.4解離的解離相，使用Biacore T100評價軟體(GE Healthcare)經調整計算pH7.4的解離速度常數(kd (1/s))。各選殖株的pH依賴的解離速度常數如表8所示。
[表8]對SR344的pH依賴結合的選殖株的膜型IL-6受體解離之解離速度常數比較
Figure 02_image007
分別計算pH依賴性的結果，WT、H3pI/L73-IgG1、Fv2-IgG1、Fv4-IgG1四種膜型IL-6受體對SR344的結合的pH依賴性，分別為1.0倍, 2.59倍, 7.18倍, 5.56倍，Fv2-IgG1、Fv4-IgG1顯示較H3pI/L73-IgG1高的pH依賴的膜型IL-6受體的解離。
由以上顯示，Fv2-IgG1、Fv4-IgG1維持與WT相同以上的可溶型IL-6受體之親和性，較H3pI/L73-IgG1為更強的膜型IL-6受體的pH依賴結合。
[實施例11]可變區最佳化的pH依賴抗體之人IL-6受體轉殖基因鼠的PK/PD試驗 使用實施例8的人IL-6受體轉殖基因鼠，評價實施例10製作、評價的Fv2-IgG1與Fv4-IgG1、及WT與H3pI/ L73-IgG1的藥物動力。將25 mg/kg 的WT及H3pI/ L73-IgG1、Fv2-IgG1、Fv4-IgG1靜脈內單次投予hIL-6R tg鼠，進行同實施例8的各抗體血漿濃度的測定。WT及H3pI/L73-IgG1、Fv2-IgG1、Fv4-IgG1的血漿中濃度變化如第18圖所示。
與實施例8相同，相較於WT，H3pI/L73-IgG1的藥物動力提高，而且Fv2-IgG1及Fv4-IgG1較H3pI/L73-IgG1具有更高的藥物動力。如實施例9中以食蟹猴測定的非結合型IL-6受體濃度，以相同方法測定本試驗的hIL-6R tg鼠，同時確認Fv2-IgG1及Fv4-IgG1對可溶型IL-6受體中和期較H3pI/L73-IgG1延長(未顯示數據)。根據實施例10所示，與H3pI/L73-IgG1相比，Fv2-IgG1及Fv4-IgG1與膜型IL-6受體的pH依賴結合提高，因此與膜型IL-6受體的pH依賴結合升高，可使藥物動力及與可溶型IL-6受體的中和期較H3pI/L73-IgG1高。
[實施例12]恆定區的最佳化使與膜型IL-6受體的pH依賴結合提升 Fv4-IgG1的恆定區最佳化 已報導一般對膜型抗原的結合依抗體的恆定區變化(J Immunol Methods. 1997 Jun 23;205(1):67-72.)。至今製作的pH依賴結合抗體的恆定區為IgG1同型物(isotype)。為了使其與膜型IL-6受體的pH依賴結合提升，檢討恆定區的最佳化。
天然型恆定區的恆定區IgG2(序列識別號：28)導入變異，製作恆定區IgG2ΔGK(序列識別號：29)。對恆定區IgG2ΔGK再導入變異，製作恆定區M58(序列識別號：30)。恆定區IgG2及恆定區M58再導入變異，製作恆定區M71(序列識別號：31)及M73(序列識別號：32)。
以實施例10製作的VH3-IgG1恆定區以IgG2ΔGK取代，製作VH3-IgG2ΔGK(序列識別號：33)；恆定區以M58取代，製作VH3-M58(序列識別號：34)；恆定區以M73取代，製作VH3-M73(序列識別號：35)。具體而言，實施例10使用的VH3恆定區部份經NheI/NotI分解及連接，建構以目標恆定區取代的表現載體。所得的表現載體之鹼基序列由該技術領域中公知方法決定。
對於VH3-IgG2ΔGK(序列識別號：33)為H鏈，VL3-CK(序列識別號：27)為L鏈的Fv4-IgG2；VH3-M58(序列識別號：34)為H鏈，VL3-CK(序列識別號：27)為L鏈的Fv4-M58；VH3-M73(序列識別號：35)為H鏈，VL3-CK(序列識別號：27)為L鏈的Fv4-M73，進行表現、純化。表現、純化如實施例1之方法進行。
最佳化恆定區的Fv4的可溶型IL-6受體之結合分析 關於製作的Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73及WT，同實施例10方法，即時觀察對SR344結合及解離。進行相同分析，計算結合速度常數ka (1/Ms)及解離速度常數kd (1/s)，以該值計算解離常數KD (M) (表9)。
[表9]對SR344的pH依賴結合的選殖株之由可溶性IL-6受體解離的解離速度常數比較
Figure 02_image009
分別計算pH7.4的親和性結果，Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73對SR344的解離常數(親和性，KD值)，分別為約1.4 nM,1.3 nM, 1.4 nM, 1.4 nM，顯示對SR344的pH依賴結合的選殖株對可溶型IL-6受體的結合能力，即使改變恆定區也沒有變化。因此，Fv1、Fv2、Fv3也同樣在改變恆定區時對可溶型IL-6受體的結合能力沒有改變。
最佳化恆定區的Fv4的膜型IL-6受體之結合分析 關於製作的Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73及WT，同實施例10方法，使用Biacore T100(GE Healthcare)，觀察pH5.8, pH7.4中膜型IL-6受體的抗原抗體反應。將pH依賴結合的選殖株在pH7.4條件下注入，使與SR344結合中，以pH5.8移動相，觀察各選殖株的pH依賴的解離，結果如第19圖。在進行同實施例10之方法，各選殖株的pH依賴的解離速度如表10所示。
[表10]對SR344的pH依賴結合的選殖株由膜型IL-6受體解離之解離速度常數比較
Figure 02_image011
分別計算pH依賴性的結果，Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73對SR344的pH依賴性，分別為5.6倍, 17.0倍, 17.6倍, 10.1倍，Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73顯示較Fv4-IgG1高的pH依賴的膜型IL-6受體的解離。
使用Fv4可變區的可溶型IL-6受體結合分析結果及膜型IL-6受體的結合分析結果，恆定區由IgG1被IgG2、M58及M73取代，卻未改變可溶型IL-6受體的親和性，發現可以只改善膜型IL-6受體的pH依賴結合。Fv1、Fv2、Fv3相同。
[實施例13]最佳化恆定區的pH依賴結合抗體之人IL-6受體轉殖基因鼠的PK/PD試驗 使用實施例8之人IL-6受體轉殖基因鼠(hIL-6R tg鼠)，評估實施例13製作的Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58的藥物動力，檢討恆定區對藥物動力的影響。取25 mg/kg的WT及Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58靜脈內單次投予hIL-6R tg鼠，進行同實施例8的各抗體的血漿中濃度測定。WT及Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58的血漿中濃度變化如第20圖所示。
同實施例11，與WT相比，Fv4-IgG1的藥物動力提高，而且，Fv4-IgG2、Fv4-M58較Fv4-IgG1的藥物動力更為提高。以實施例9中以食蟹猴測定之非結合型IL-6受體濃度之相同方法，測定本實施例中的hIL-6R tg鼠，確認Fv4-IgG2、Fv4-M58的可溶型IL-6受體的中和期較Fv4-IgG1的長(未顯示數據)。如實施例10所示，與Fv4-IgG1相比，Fv4-IgG2、Fv4-M58對膜型IL-6受體的pH依賴結合升高，因此恆定區由IgG1取代為IgG2或M58，使對膜型IL-6受體的pH依賴結合升高，可提升藥物動力及可溶型IL-6受體的中和期。因此，不只Fv4，Fv1、Fv2、Fv3也可將恆定區由IgG1取代為IgG2或M58，動物藥力及可溶型IL-6受體的中和期較IgG1提升。
[實施例14]可變區及恆定區最佳化之pH依賴結合抗體的製作 以上述相同之方法，製作VH2-IgG1的恆定區為M71、M73之VH2-M71(序列識別號：36)、VH2-M73(序列識別號：37)、VH4-IgG1的恆定區為M71、M73之VH4-M71(序列識別號：38)、VH4-M73(序列識別號：39)。
對H鏈為VH2-M71、L鏈為VL2-CK之Fv1-M71；H鎖為VH2-M73、L鏈為VL2-CK之Fv1-M73；H鏈為VH4-M71、L鏈為VL1-CK之Fv3-M71；H鏈為VH4-M73、L鏈為VL1-CK之Fv3-M73進行表現、純化。表現、純化如實施例1之方法進行。
可變區及恆定區最佳化之pH依賴結合抗體的可溶型IL-6受體的結合分析 使用實施例10之方法，對人型化PM1抗體(野生型：WT)及上述製作的H3pI/L73-IgG1、Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M71、Fv3-M73、Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73的11種，即時觀察對SR344的結合及解離。進行相同分析，計算結合速度常數 ka (1/Ms) 及解離速度常數 kd (1/s)，以該值計算解離常數 KD (M) (表11)。
[表11]對SR344的pH依賴結合的選殖株由可溶型IL-6受體解離的解離速度常數比較
Figure 02_image013
所得的10種pH依賴結合的選殖株全部對於可溶型IL-6受體皆具有與WT相同以上的解離常數(親和性，KD值)。
可變區及恆定區最佳化的pH依賴結合抗體對膜型IL-6受體結合分析 使用實施例10之方法，對人型化PM1抗體(野生型：WT)及上述製作的H3pI/L73-IgG1、Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M71、Fv3-M73、Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73的11種，使用Biacore T100(GE Healthcare)，觀察在pH5.8, pH7.4中對膜型IL-6受體的抗原抗體反應。pH依賴結合的選殖株在pH7.4條件下注入，與SR344結合中，移動相的pH為5.8，觀察各選殖株的pH依賴解離，結果如第21圖所示(Fv1-M71、Fv1-M73、Fv3-M71、Fv3-M73如第21圖所示，其他如第17及19圖所示)。再以實施例10相同之方法進行分析，全部11種選殖株的解離速度常數的pH依賴性如表12所示。
[表12]對SR344的pH依賴結合的選殖株由膜型IL-6受體解離的解離速度常數的pH依賴性
Figure 02_image015
所得的10種pH依賴結合的選殖株，對膜型IL-6受體顯示pH依賴結合能力。再者，實施例9中，與WT相比，食蟹猴中抗體由血漿中至消失的時間及體內的可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體經抗體結合的時間大幅延長者，與H3pI/L73-IgG1相比，Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M71、Fv3-M73、Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73任一個與膜型IL-6受體的pH依賴結合皆提升。
[實施例15]可變區及恆定區最佳化的pH依賴結合抗體之食蟹猴的PK/PD試驗 公知的高親和性抗IL-6受體抗體之製作 公知的高親和性抗IL-6受體抗體為US 2007/0280945 A1記載之高親和性抗IL-6受體抗體之VQ8F11-21 hIgG1(US 2007/0280945 A1, 胺基酸序列19及27)，將其建構在動物細胞表現用載體，使其表現。抗體可變區由重組合成的寡DNA之PCR法(聚合PCR)製作。恆定區以實施例1使用之表現載體經PCR放大。以聚合PCR法結合抗體可變區及恆定區，插入哺乳動物表現用載體。所得H鏈及L鏈DNA片段插入哺乳動物表現載體，製作目的H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體的鹼基序列由該技術領域中公知方法決定。使用製作的表現載體，進行表現、純化。表現、純化如實施例1之方法進行，獲得高親和性高IL-6受體抗體(高親和性Ab)。
來自食蟹猴的PK/PD試驗 評價pH依賴結合的抗體H3pI/L73-IgG1及Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M73、Fv4-M73及公知的高親和性抗IL-受體抗體(高親和性Ab)在食蟹猴中的藥物動力及藥效。以0.5 mg/kg的H3pI/L73-IgG1、Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M73、Fv4-M73靜脈內單次投予食蟹猴，1.0 mg/kg的高親和性Ab靜脈內單次投予，投予前及經時採血。進行同實施例9測定各抗體血漿中濃度。H3pI/L73-IgG1、Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M73、Fv4-M73、高親和性Ab的血漿中濃度變化如第21圖所示。為了評價食蟹猴的膜型IL-6受體以何種程度中和及是否中和的藥效，同實施例9，在抗體投予後第3天至第10天(高親和性Ab為第6天至第10天)，取5μg/kg食蟹猴IL-6連日皮下投予腰背部，24小時後測定各個體的CRP濃度。各抗體投予時CRP濃度變化如第22圖所示。為了評價食蟹猴的可溶型IL-6受體以何種程度中和及是否中和的藥效，同實施例9，測定食蟹猴血漿中非結合型食蟹猴可溶型IL-6受體濃度。各抗體投予時非結合型食蟹猴可溶型IL-6受體濃度變化如第23圖所示。
因此發現，與H3pI/L73-IgG1比較，Fv1-M71、Fv1- M73、Fv2-IgG1、Fv3-M73、Fv4-M73任一個皆維持抗體血漿中濃度高，CRP濃度及非結合型食蟹猴可溶型IL-6受體濃度低者。亦即顯示，與H3pI/L73-IgG1比較，膜型IL-6受體及可溶型IL-6受體經抗體結合的時間(換言之，中和的時間)被延長。
又此述之pH依賴結合的抗IL-6受體的抗體，與1.0 mg/kg投予的公知高親和性抗IL-6受體抗體(高親和性Ab)相比，確認僅一半投予量0.5 mg/kg即具有相同以上的中和效果及持續性，pH依賴結合的抗體與公知高親和性高IL-6受體抗體相比，具有優良的中和效果及持續性。
表12記載的抗體中，本實施例未實施食蟹猴PK/PD試驗的抗體，與H3pI/L73-IgG1相比，確認對膜型IL-6受體的pH依賴結合提升，因此，其與H3pI/L73-IgG1相比，可知膜型IL-6受體及可溶型IL-6受體經抗體結合的時間(換言之，中和的時間、中和效果持續性)延長。
實施例9中，H3pI/L73-IgG1與WT相比，抗體從血漿中至消失的時間，及體內可溶型IL-6受體及膜型IL-6受體經抗體結合的時間(中和效果的持續性)大幅延長。較H3pI/L73-IgG1具有優良中額效果持續性的Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M71、Fv3-M73、Fv4-IgG1、Fv4-IgG2、Fv4-M58、Fv4-M73，與WT相比，可知其顯著改善的中和效果的持續性。
因此，對於抗IL-6受體的抗體，血漿中pH為pH7.4中與抗原結合強，在內囊胞內pH為pH5.8與抗原結合弱的pH依賴結合的抗IL-6受體抗體，可減少抗IL-6受體抗體患者的投予量或投予頻率，結果可大幅減少總投予量，可知其為極優的IL-6拮抗劑之醫藥品。
[實施例16] pH依賴結合的抗IL-6抗體之製作 抗IL-6抗體之表現及純化 如實施例1~15中人型化抗IL-6受體抗體中，人型化抗IL-6受體抗體的可變區，其CDR序列的中心導入組胺酸等的取代，成功創造複數個人型化IL-6受體抗體與IL-6受體結合具有pH依賴性的抗體，其全部重複與IL-6受體結合，發現大幅改善PK/PD。
因此，與抗IL-6受體抗體不同的抗原結合之抗體中，以相同的方法，檢討抗原與抗體結合是否可賦予pH依賴性。選擇人IL-6為不同的抗原，製作WO2004/039826記載的與人IL-6結合之抗IL-6抗體(抗-IL6野生型)，由H鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：62)與L鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：63)所組成。以該技術領域公知的方法，將編碼目的抗體胺基酸序列的基因片段，插入動物細胞表現載體，製作目的H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體由該技術領域公知方法決定。抗-IL6野生型的表現及純化如實施例1之方法進行。
pH依賴的抗IL-6抗體的製作 對於由H鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：62)與L鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：63)所組成抗IL-6抗體(抗-IL6野生型)，對CDR的胺基酸導入組胺酸的插入，檢討賦予抗體與IL-6結合之pH依賴性。檢討對CDR的胺基酸以組胺酸插入，篩選結果，與在pH7.4中結合相比，在pH5.8中的結合大幅降低，得到幾個選殖株顯示pH依賴結合。pH依賴的選殖株中組胺酸取代位置如表13所示。其中例如、H鏈(c1)(胺基酸序列 序列識別號：64)與L鏈(c1)(胺基酸序列 序列識別號：65)所組成的抗-IL6選殖株1，及H鏈(c1)(胺基酸序列 序列識別號：64)及L鏈(c2)(胺基酸序列 序列識別號：66)所構成的抗-IL6 選殖株2。抗-IL6選殖株1及抗-IL6選殖株2的表現及純化如實施例1記載之方法進行。
[表13] pH依賴的選殖株中組胺酸取代位置 H32、H59、H61、H99 L53、L54、L90、L94
pH依賴結合的選殖株對人IL-6結合分析 上述製作的抗-IL6野生型、抗-IL6選殖株1、抗-IL6選殖株2的三種中，使用Biacore T100 (GE Healthcare)，實施在pH5.5及pH7.4中抗原抗體反應的速度理論分析(緩衝液為DPBS(-) pH7.4或pH5.5, 150 mM NaCl)。以胺基加帽法將重組蛋白A/G (Pierce)固定於感應應晶片上，使其與多種抗體結合，作成檢測(analight)注入調整為適當濃度的人IL-6(TORAY)。測定全程在37℃下實施。使用Biacore T100評價軟體(GE Healthcare)計算結合速度常數 ka (1/Ms) 及解離速度常數 kd (1/s)，以該值計算解離常數 KD (M) (表14)。再分別計算pH5.5與pH7.4的親和性比，評價pH依賴性結合。
[表14]對IL-6的pH依賴結合的選殖株對IL-6結合的比較
Figure 02_image017
分別計算出pH5.5與pH7.4的親和性比(KD(pH5.5)/ KD(pH7.4))的結果，對人IL-6的抗-IL6野生型、抗-IL6選殖株1、抗-IL6選殖株2的pH依賴結合分別為0.8倍、10.3倍、13.5倍，每一選殖株與WT比較，顯示10倍以上的高pH依賴結合。抗-IL6選殖株2的pH7.4與pH5.5的訊號圖如第26圖所示。
因此，不只抗IL-6受體抗體，抗IL-6抗體也在CDR序列的中心導入以組胺酸等胺基酸的取代，顯示可製作具有血漿中中性條件下與抗原強結合，內囊胞內酸性條件中與抗原結合低的pH依賴結合之抗體。如實施例1~15所示，具有pH依賴結合的抗IL-6受體抗體，經重複與IL-6受體結合，大幅改善PK/PD，因此可知，具有pH依賴結合的抗-IL6選殖株1、抗-IL6選殖株2，與抗-IL6野生型相比，與較多的抗原重複結合，大幅改善PK/PD。
[實施例17] pH依賴結合的抗IL-31受體抗體的製作 抗IL-3受體抗體的表現及純化 實施例1~15中，人型化抗IL-6受體抗體中，對人型化抗IL-6受體抗體的可變區，其CDR序列中心導入組胺酸等取代，成功地創造複數個賦予人型化抗IL-6受體抗體及IL-6受體結合之pH依賴性的抗體，其全部重複與IL-6受體結合，發現大幅改善PK/PD。
因此，與抗IL-6受體抗體不同的抗原結合之抗體，以同樣的方法，檢討抗原與抗體結合是否可賦予pH依賴性。選擇鼠IL-31受體作為不同的抗原，製作WO2007/142325記載的鼠IL-31受體結合的H鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：67)及L鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：68)所組成的抗IL-31受體抗体(抗-IL31R野生型)。以該技術領域公知的方法，將編碼目的抗體胺基酸序列的基因片段，插入動物細胞表現載體，製作目的H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體由該技術領域公知方法決定。抗-IL31R野生型的表現及純化如實施例1之方法進行。
pH依賴的抗IL-31受體抗體的製作 對於由H鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：67)及L鏈(WT)(胺基酸序列 序列識別號：68)所組成的抗IL-31受體抗体(抗-IL31R野生型)，對CDR導入組胺酸的插入，檢討賦予抗體與IL-31受體結合之pH依賴性。檢討對CDR的胺基酸以組胺酸插入，篩選結果，與在pH7.4中結合相比，在pH5.8中的結合大幅降低，得到幾個選殖株顯示pH依賴結合。pH依賴的選殖株中組胺酸取代位置如表15所示。其中一個例如H鏈(c1)(胺基酸序列 序列識別號：69)及L鏈(WT)所組成的抗-IL31R選殖株1。抗-IL31R選殖株1的表現及純化如實施例1記載之方法進行。
[表15] pH依賴的選殖株中組胺酸取代位置 H33
pH依賴結合的選殖株對可溶型IL-31受體結合分析 上述製作的抗-IL31R野生型、抗-IL31R選殖株1的兩種，使用Biacore T100 (GE Healthcare)，實施在pH5.5及pH7.4中抗原抗體反應的速度理論分析(緩衝液為DPBS(-) pH7.4或pH5.5, 150 mM NaCl, 0.01% Tween20, 0.02% NaN3 )。以胺基加帽法將重組蛋白A/G (Pierce)固定於感應應晶片上，使其與多種抗體結合，作成檢測(analight)注入調整為適當濃度的可溶型鼠IL-31受體(WO2007/142325記載之方法調製)。測定全程在25℃下實施。使用Biacore T100評價軟體(GE Healthcare)計算結合速度常數 ka (1/Ms) 及解離速度常數 kd (1/s)，以該值計算解離常數 KD (M) (表16)。再分別計算pH5.5與pH7.4的親和性比，評價pH依賴性結合。
[表16]對鼠IL-31受體的pH依賴結合的選殖株對鼠IL-31受體結合的比較
Figure 02_image019
分別計算出pH5.5與pH7.4的親和性比(KD(pH5.5)/ KD(pH7.4))的結果，對鼠IL-31受體的抗-IL31R野生型、抗-IL31R選殖株1的pH依賴結合分別為3.2倍、1000倍，選殖株1與WT比較，顯示約300倍的高pH依賴結合。抗-IL31R選殖株的pH7.4與pH5.5的訊號圖如第27圖所示。
因此，不只抗IL-6受體抗體及抗IL-6抗體，抗IL-31受體抗體也在CDR序列的中心導入以組胺酸等胺基酸的取代，顯示可製作具有血漿中中性條件下與抗原強結合，內囊胞內酸性條件中與抗原結合低的pH依賴結合之抗體。如實施例1~15所示，具有pH依賴結合的抗IL-6受體抗體，經重複與IL-6受體結合，大幅改善PK/PD，因此可知，具有pH依賴結合的抗-IL31R選殖株1，與抗-IL31R野生型相比，與較多的抗原重複結合，大幅改善PK/PD。
[實施例18] pH依賴結合的抗體與抗原重複的結合 投予鼠的抗體之表現及純化 人型化IL-6受體抗體製作成以下四種。對IL-6受體未顯示pH依賴結合的一般抗體為H(WT)(胺基酸序列 序列識別號：9)與L(WT)(胺基酸序列 序列識別號：10)所組成的WT-IgG1；H54(胺基酸序列 序列識別號：70)與L28(胺基酸序列 序列識別號：12)所組成的H54/L28-IgG1；對IL-6受體顯示pH依賴結合的抗體，如實施例3製作的H170(胺基酸序列 序列識別號：4)與L82(胺基酸序列 序列識別號：7)所組成的H170/L82-IgG1；及實施例10製作的VH3-IgG1(序列識別號：23)與VL3-CK(序列識別號：27)所組成的Fv4-IgG1，由實施例1之方法進行表現及純化。
各抗體對可溶型IL-6受體結合分析 上述製作的WT-IgG1、H54/L28-IgG1、H170/L82-IgG1、及、Fv4-IgG1的四種，使用Biacore T100 (GE Healthcare)，實施在pH5.5及pH7.4中抗原抗體反應的速度理論分析(緩衝液為10 mM MES pH7.4、或pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Surfactant-P20)。以胺基加帽法將重組蛋白A/G (Pierce)固定於感應應晶片上，使其與多種抗體結合，作成檢測(analight)注入調整為適當濃度的SR344。即時觀察各種抗體對SR344的結合與解離。測定全程在37℃下實施。使用Biacore T100評價軟體(GE Healthcare)計算結合速度常數 ka (1/Ms) 及解離速度常數 kd (1/s)，以該值計算解離常數 KD (M) (表17)
[表17]對SR344的各種抗體的可溶型L-6受體的結合速度(ka)、解離速度(kd)、解離常數(KD)之比較
Figure 02_image021
分別計算出pH5.8與pH7.4的親和性(KD值)比的結果，對SR344的WT-IgG1、H54/L28-IgG1、H170/L82-IgG1、及Fv4-IgG1的pH依賴結合(KD值比)分別為1.6倍、0.7倍、61.9倍、及27.3倍。又分別計算出pH5.8與pH7.4的解離速度(Kd值)比的結果，對SR344的WT-IgG1、H54/L28-IgG1、H170/L82-IgG1、及Fv4-IgG1的pH依賴性解離速度(Kd值比)分別為2.9倍、2.0倍、11.4倍、及38.8倍。因此，一般抗體WT-IgG1及H54/L28-IgG1幾乎未顯示pH依賴結合，但H170/L82-IgG1及Fv4-IgG1確認顯示pH依賴結合。有這些抗體在pH7.4中的親和性(KD值)約相同，可知其在血漿中對SR344的結合為相同程度。
小鼠的體內動態試驗 對未表現人L-6受體的小鼠(C57BL/6J；抗人IL-6受體的抗體未與小鼠L-6受體結合)單獨投予SR344(人IL-6受體：實施例1製作)，或者同時投予SR344及抗人IL-6受體抗體後，評價SR344及抗人IL-6受體抗體之體內動態。以10 mL/kg的SR344溶液(5μg/mL)或SR344及抗人IL-6受體抗體的混合溶液(分別為5μg/mL、0.1 mg/mL)單次投予尾靜脈。此時，對SR344的抗人IL-6受體抗體過剩，可知SR344約與全部抗體結合。在投予後15分鐘、2小時、8小時、1天、2天、3天、4天、7天、14天、21天、28天採血。採血液直接放在4℃，15,000rpm離心15分鐘，得到血漿。分離的血漿存放在設定為-20℃以下的冷凍庫，直到實施測定。抗人IL-6受體抗體使用WT-IgG1、H54/L28-IgG1、H170/L82-IgG1、及Fv4-IgG1。
以ELISA法測定血漿中抗人IL-6受體抗體濃度 鼠血漿中抗人IL-6受體抗體濃度測定以ELISA法測定。首先將抗人IgG(γ-鏈特異性) F(ab')2抗體片段(Sigma社製)分別注入免疫盤(Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp(Nalge nunc International社製))，4℃靜置一晚，作成抗人IgG固化盤。調配血漿濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/Ml的檢測基準線試料及稀釋100倍以上的鼠血漿測定試料，將該檢測基準線試料與血漿測定試料100μL中，加入200μL的20 ng/mL之SR344，室溫下靜置1小時。之後，分注於抗人IgG固化盤，再於室溫下靜置1小時。之後，使生物素化抗人IL-6 R抗體(R&D)於室溫下反應1小時，再使鏈黴卵白素(Streptavidin)-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)在室溫下反應1小時，以TMB 單組成 HRP微位基質(BioFX Laboratories)作為基質，進行顯色反應，以1N硫酸(Showa Chemical)反應停止後，測定微盤讀器上450nm吸光度。鼠血漿中濃度從檢測線的吸光度使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices社製)計算。此方法測定的靜脈內投予後的血漿中抗體濃度變化如第28圖所示。
電化學發光法的血漿中SR344濃度測定 鼠血漿中SR344濃度以電化學發光法測定。調整為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL的SR344檢測基準線試料及50倍以上稀釋的鼠血漿測定試料，以SULFO-TAG NHS酯(Meso Scale Discovery)釕化的單株抗人IL-6抗體(R&D社製)與生物素抗人IL-6 R抗體(R&D社製)及WT-IgG1溶液混合，在37℃下反應1晚。此時，WT-IgG1終濃度為較樣本所含的抗人IL-6受體抗體濃度過剩的333μg/mL，目的為樣本中約全部的SR344與WT-IgG1結合的狀態。之後分注於標準MA400 PR鏈黴卵白素(Streptavidin)盤(Meso Scale Discovery)。再於室溫反應1小時，洗淨後分別加入讀取緩衝液T(×4)(Meso Scale Discovery社製)，直接以SECTOR PR 400讀取器(Meso Scale Discovery社製)測定。SR344濃度由檢測基準線的反應，以分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices社製)計算。以方法測定的靜脈內投予後血漿中SR344濃度變化如第29圖所示。
pH依賴結合的效果 關於未顯示pH依賴結合效果的抗體WT-IgG1及H54/L28-IgG1，顯示pH依賴結合效果的抗體H170/L82-IgG1及Fv4-IgG1的抗體濃度變化，WT-IgG1、H54/L28-IgG1、及Fv4-IgG1大約相同，H170/L82-IgG1顯示較早消失。將血漿中濃度變化的數據以藥物動力分析軟體WinNonlin(Pharsight)分析結果，WT-IgG1、H54/L28- IgG1、Fv4-IgG1、H170/L82-IgG1的血漿中半衰期分別為21.0、28.8、26.2、7.5天。
如實施例2記載，抗原為可溶型抗原時，投予的抗體在血漿中與抗原結合，以抗原與抗體的複合體型態滯留在血漿中。通常抗體的血漿中滯留性因FcRn功能而非常長(消失速度非常慢)，相對於此，抗原的血漿滯留性短(消失速度快)，因此與抗體結合的抗原具有與抗體相同程度的長血漿中滯留性(消失非常慢)。單獨投予人型化IL-6受體抗體的抗原之SR344(可溶型人IL-6受體)時，同樣地，SR344極早消失(血漿中半衰期0.2天)。SR344與未顯示pH依賴結合的一般抗體WT-IgG1或H54/L28-IgG1同時投予時，SR344的消失速度明顯下降，顯示長的血漿中滯留性(血漿中半衰期：WT-IgG1 5.3天、H54/L28-IgG1 6.3天)。與SR344同時投予的抗體約全部結合，因此與上述抗體結合的SR344因FcRn功能而與抗體具有相同的長血漿中滯留性。
SR344與顯示pH依賴結合的抗體H170/L82-IgG1或Fv4-IgG1同時投予時，SR344的消失較與WT-IgG1或H54/L28-IgG1同時投予時，明顯快速(血漿中半減期：H170/L82-IgG1 1.3 天、Fv4-IgG1 0.6天)。以Fv4-IgG1特別明顯。Fv4-IgG1在pH7.4中的親和性與WT-IgG1及H54/L28-IgG1為相同以上，因此可知，SR344約全部與Fv4-IgG1結合。Fv4-IgG1與WT-IgG1及H54/L28-IgG1相比，儘管顯示相同或稍微長的血漿中滯留性的消失慢，但是與Fv4-IgG1結合的SR344的消失卻明顯快速。可由第4圖顯示之本發明概念來說明。未顯示pH依賴結合的一般抗體，抗體-可溶型抗原複合體在血漿中經胞飲作用進入內囊胞，在內囊胞的酸性條件下與在內囊胞內表現的FcRn結合，與FcRn結合的抗體-可溶型抗原複合體以該狀態移到細胞表面，再回到血漿中，因此與抗體結合的抗原具有與抗體相同的長血漿中滯留性(消失非常慢)。另外，顯示pH依賴結合的抗體在內囊胞內的酸性條件下與抗原解離，因此只有抗體與FcRn結合，再回到血漿中，從抗體解離的抗原沒有回到血漿中，被溶酶體分解，因此，抗原的消失較未顯示pH依賴結合的抗體消失明顯快速。亦即，SR344與未顯示pH依賴結合的抗體WT-IgG1及H54/L28-IgG1同時投予時，血漿中與內囊胞內SR344與WT-IgG1及H54/L28- IgG1結合而使SR344的消失與抗體相同地慢，但是SR344與pH依賴結合的抗體H170/L82-IgG1或Fv4-IgG1同時投予時，在內囊胞內低pH環境下SR344從抗體解離而使SR344極早消失。亦即，pH依賴結合的抗體H170/L82-IgG1或Fv4-IgG1在內囊胞內低pH環境下SR344解離，經FcRn再回到血漿中的H170/L82-IgG1或Fv4-IgG1多數未與SR344結合。因此，pH依賴結合的抗體，如第4圖所示，在內囊胞內低pH環境下解離抗原，以未與抗原結合狀態經FcRn回到血漿中，在血漿中可再度與新的抗原結合，重複此過程，顯示pH依賴結合的抗體可重複與複數個抗原結合。如實施例7所示的Biacore中，pH依賴結合的選殖株反應可與抗原重複結合，以對抗體的抗原之pH依賴結合增強者，可增加對抗原重複結合的次數。
當抗原為可溶型抗原時，在血漿中中性條件下與抗體結合的抗原，在內囊胞內解離，如果抗體經FcRn回到血漿中，抗體可再於血漿中中性條件下與抗原結合，因此具有在內囊胞內酸性條件下解離抗原性質的抗體，可與抗原複數次結合。與抗體結合的抗原，與在內囊胞內未解離(抗原與抗體結合狀態回到血漿中)時相比，與抗體結合的抗原在內囊胞內解離時，抗原如果移到溶酶體而被分解，因此抗原從血漿中的消失速度增加。亦即，以血漿中消失速度為指標，可判斷抗體是否可與抗原複數次結合。抗原在血漿中的消失速度之測定，可例如本實施例所示，將抗原與抗體投予體內，測定投予後血漿中的抗原濃度。
與未顯示pH依賴結合的一般抗體相比，pH依賴結合的抗體，一個抗體可重複複數次與抗原結合，因此可大幅降低抗體投予量及大幅延長投予間隔。
根據本機制與抗原複數次重複結合，根據pH依賴的抗原抗體反應，如果可製作某種抗體在血漿中pH7.4結合，在內囊胞內酸性pH抗原解離的pH依賴結合之抗體，則可以一個抗體與抗原重複複數次結合。即本發明不僅對IL-6受體、IL-6、IL-31受體，不基於抗原種類，對任何抗原的抗體皆可一般適用的技術。
無。
第1圖顯示與膜型抗原結合的抗體之分解路徑。 第2圖顯示經FcRn的IgG分子的救援機制(salvage machanism)。 第3圖顯示IgG分子在內囊胞內自膜型抗原解離，再度與新的抗原結合之模式圖。 第4圖顯示IgG分子在內囊胞內自可溶型抗原解離，再度與新的抗原結合之模式圖。 第5圖顯示固定抗原的柱淘選(column panning)。 第6圖顯示由柱淘選(column panning)所取得的選殖株的噬菌體ELISA結果圖。上圖顯示WT，下圖顯示CL5。 第7圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體的生物學中和活性。 第8圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在pH7.4與可溶型IL-6受體結合的Biacore訊號圖的結果。由上往下依序顯示WT，H3pI/L73，H170/L82，CLH5/L73。 第9圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在pH5.8與可溶型IL-6受體結合的Biacore訊號圖的結果。由上往下依序顯示WT，H3pI/L73，H170/L82，及CLH5/L73。 第10圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體與膜型IL-6受體的結合(pH7.4)及解離(pH5.8)的Biacore訊號圖的結果。由上往下依序顯示WT，H3pI/L73，H170/L82，及CLH5/L73。 第11圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體與SR344重複結合的Biacore訊號圖。 第12圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體與SR344重複結合實驗中的總抗原結合量。 第13圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在人IL-6受體轉殖基因鼠中的抗體血漿中濃度變化。 第14圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在食蟹猴(Macaca fascicularis)中的抗體血漿中濃度變化。 第15圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在食蟹猴中的CRP濃度變化。 第16圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在食蟹猴中的非結合型食蟹猴IL-6受體濃度變化。 第17圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體與膜型IL-6受體結合(pH7.4)及解離(pH5.8)的Biacore訊號圖的結果。由上往下依序顯示WT，H3pI/L73-IgG1，Fv2-IgG1，及Fv4-IgG1。 第18圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在人IL-6受體轉殖基因鼠中的WT，H3pI/L73-IgG1，Fv2-IgG1，及Fv4-IgG1抗體血漿中濃度變化。 第19圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體與膜型IL-6受體結合(pH7.4)及解離(pH5.8)的Biacore訊號圖的結果。由上往下依序顯示WT，Fv4-IgG1，Fv4-IgG2，及Fv4-M58。 第20圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體在人IL-6受體轉殖基因鼠中的WT，Fv4-IgG1，Fv4-IgG2，及Fv4-M58抗體血漿中濃度變化。 第21圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體與膜型IL-6受體結合(pH7.4)及解離(pH5.8)的Biacore訊號圖的結果。由上往下依序顯示Fv1-M73、Fv1-M73、Fv3-M71、及Fv3-M73。 第22圖顯示投予具有pH依賴結合的抗IL-6受體抗體的食蟹猴0.5mg/kg的H3pI/L73-IgG1、Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M73、及Fv4-M73以及1.0mg/kg的高親和力Ab時，抗體血漿中濃度變化。 第23圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體的食蟹猴中H3pI/L73-IgG1、Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M73、Fv4-M73及高親和力Ab的投予群之CRP濃度變化。 第24圖顯示pH依賴結合的抗IL-6受體抗體的食蟹猴中H3pI/L73-IgG1、Fv1-M71、Fv1-M73、Fv2-IgG1、Fv3-M73、Fv4-M73及高親和力Ab的投予群之非結合型食蟹猴IL-6受體濃度變化。 第25圖顯示重鏈(VH1、VH2、VH3、VH4)及輕鏈(VL1、VL2、VL3)的FR1、FR2、FR3、FR4及CDR1、CDR2、CDR3之圖。星號位處為調整的序列中胺基酸變異部位。 第26圖顯示pH依賴結合的抗IL-6抗體之抗-IL6選殖株2在pH7.4及pH5.5與IL-6結合的Biacore訊號圖的結果。在pH7.4的圖中，由上往下依序顯示100、50、25、12.5、6.25ng/mL的IL-6。 第27圖顯示pH依賴結合的抗IL-31受體抗體之抗-IL31R選殖株1在pH7.4及pH5.5與IL-31受體結合的Biacore訊號圖的結果。在pH5.5的圖中，由上往下依序顯示100、50、25、12.5ng/mL的IL-31受體。 第28圖顯示靜脈內投予鼠SR344及抗人IL-6受體抗體的混合溶液後的血漿中抗體濃度變化。 第29圖顯示靜脈內投予鼠SR344及抗人IL-6受體抗體的混合溶液後的血漿中SR344濃度變化。
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Claims (14)

  1. 一種醫藥組合物，其包含具有10以上的對抗原在pH5.8的KD與在pH7.4的KD的比之KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值的抗體， 其中該抗體的可變區的至少一胺基酸被組胺酸取代，或至少一組胺酸插入該抗體的可變區中； 且其中與前述組胺酸取代或插入前的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值相比，該組胺酸取代或插入提升了KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值。
  2. 如請求項1所述之醫藥組合物，其中該抗體具有30以上的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值。
  3. 如請求項1所述之醫藥組合物，其中前述組胺酸取代係擇自於根據Kabat編號之重鏈的第27位、第31位、第32位、第33位、第35位、第50位、第58位、第59位、第61位、第62位、第63位、第64位、第65位、第99位、第100b位、及第102位和輕鏈的第24位、第27位、第28位、第32位、第53位、第54位、第56位、第90位、第92位、及第94位所組成之群組。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之醫藥組合物，其中與該組胺酸取代前的該抗體的藥物動力相比，該抗體的藥物動力獲得改良，其中該藥物動力的改良包括： (1) 投予該抗體後，從血漿排除該抗體分子所需的時間延長； (2) 投予該抗體後，以能結合至抗原的形式之該抗體的血漿滯留時間延長； (3) 投予該抗體後，抗原在體內未與一抗原結合分子結合的期間減少，或該抗體在體內與抗原結合的期間延長；或 (4) 在體內，結合至抗原的該抗體與該抗體的比例增加。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之醫藥組合物，其中該抗體具有拮抗活性。
  6. 如請求項1至3中任一項所述之醫藥組合物，其中該抗體與膜抗原結合。
  7. 如請求項1至3中任一項所述之醫藥組合物，其中該抗體與可溶性抗原結合。
  8. 一種抗體在製造用於從血漿排除抗原之治療方法中的醫藥組合物的用途，該抗體具有10以上的對抗原在pH5.8的KD與在pH7.4的KD的比之KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值， 其中該抗體的可變區的至少一胺基酸被組胺酸取代，或至少一組胺酸插入該抗體的可變區中； 且其中與前述組胺酸取代或插入前的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值相比，該組胺酸取代或插入提升了KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值。
  9. 如請求項8所述之用途，該抗體具有30以上的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值。
  10. 如請求項8所述之用途，其中前述組胺酸取代係擇自於根據Kabat編號之重鏈的第27位、第31位、第32位、第33位、第35位、第50位、第58位、第59位、第61位、第62位、第63位、第64位、第65位、第99位、第100b位、及第102位和輕鏈的第24位、第27位、第28位、第32位、第53位、第54位、第56位、第90位、第92位、及第94位所組成之群組。
  11. 如請求項8至10中任一項所述之用途，其中與該組胺酸取代前的該抗體的藥物動力相比，該抗體的藥物動力獲得改良，其中該藥物動力的改良包括： (1) 投予該抗體後，從血漿排除該抗體分子所需的時間延長； (2) 投予該抗體後，以能結合至抗原的形式之該抗體的血漿滯留時間延長； (3) 投予該抗體後，抗原在體內未與一抗原結合分子結合的期間減少，或該抗體在體內與抗原結合的期間延長；或 (4) 在體內，結合至抗原的該抗體與該抗體的比例增加。
  12. 如請求項8至10中任一項所述之用途，其中該抗體具有拮抗活性。
  13. 如請求項8至10中任一項所述之用途，其中該抗體與膜抗原結合。
  14. 如請求項8至10中任一項所述之用途，其中該抗體與可溶性抗原結合。
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