KR101740171B1

KR101740171B1 - Ｂ７―ｈ１에 대한 표적화된 결합 물질

Info

Publication number: KR101740171B1
Application number: KR1020157031862A
Authority: KR
Inventors: 크리스토프 쿠에바; 미셸 모로; 스콧 하몬드; 마라트 알림자노브; 존 밥쿡; 이안 폴츠; 자스팔 싱 캉; 로라 세키로브; 멜라니 보일; 마티외 코도지; 로스 스튜어트; 캐슬린 앤 멀그루
Original assignee: 메디뮨 리미티드
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2017-05-25
Also published as: SI3279215T1; FR19C1001I1; CA2778714C; JP6480561B2; US11518809B2; CN102918058A; KR101573109B1; HUE037159T2; SI2504364T1; LT2504364T; PL2504364T3; JP2017070294A; CY2019003I2; CY1119743T1; NZ628923A; US20140356353A1; PL3279215T3; EP2504364B1; MX343747B; JP6047646B2

Abstract

B7-H1에 대한 인간 모노클로날 항체, 및 B7-H1의 활성 및/또는 발현과 관련된 질환의 진단에서, 및 치료를 위한 상기 항체의 용도를 개시한다. 추가로, 상기 항체를 발현하는 하이브리도마 또는 다른 세포주를 개시한다.

Description

Ｂ７―Ｈ１에 대한 표적화된 결합 물질{TARGETED BINDING AGENTS AGAINST B7-H1}

본 발명은 B7-H1 단백질에 대한 표적화된 결합 물질, 및 상기 물질의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 B7-H1에 대한 완전 인간 모노클로날 항체, 및 상기 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 또한 상기 표적화된 결합 물질 또는 항체를 발현하는 세포주에 관한 것이다. 기술된 표적화된 결합 물질은 B7-H1의 활성 및/또는 발현과 관련된 질환의 진단제로서, 및 상기 질환의 치료를 위해 유용하다.

적응성 면역 반응은 T 세포 및 B 세포로 지칭되는 두 주요 부류의 림프구의 활성화, 선택, 및 클로날 증식을 포함한다. 항원과 조우한 후, B 세포는 항체 분비 세포를 증식시키고, 그로 분화하는 반면, T 세포는 항원 특이 이펙터 세포를 증식시키고, 그로 분화한다. T 세포 활성화는 T 세포와 항원 제시 세포(APC: antigen-presenting cell) 사이의 여러 신호전달 이벤트를 필요로 하는 다단계 과정이다. T 세포가 활성화되도록 하기 위해서는 2가지 유형의 신호가 휴지기 T 세포에게로 전달되어야 한다. 제1 유형은 항원 특이 T 세포 수용체(TcR: T cell receptor)에 의해 매개되며, 면역 반응에 대한 특이성을 부여한다. 제2의 공동자극성인 유형은 반응의 크기를 조절하고, T 세포 상의 보조 수용체를 통해 전달된다.

1차 공동자극성 신호는 활성화 CD28 수용체의 리간드인 B7-1 또는 B7-2의 진입시에 상기 수용체를 통해 전달된다. 대조적으로, 같은 B7-1 또는 B7-2에 의해 억제 CTLA-4 수용체가 진입하였을 때에는 T 세포 반응이 약화된다. 따라서, CTLA-4 신호는 CD28에 의해 매개되는 공동자극을 길항시킨다. 항원 농도가 높을 때, CD28 공동자극이 CTLA-4 억제 효과보다 더 중요하다. CD28 및 CTLA-4 발현의 일시적인 조절을 통해 활성화와 억제 신호 사이의 균형이 유지되고, 자가면역 발생으로부터 보호되면서 동시에 효과적인 면역 반응이 확실히 발생하게 된다.

최근, CD28 및 CTLA-4, 및 그의 B-7 유사 리간드의 분자적 동족체가 확인되었다. ICOS는 CD28 유사 공동자극 수용체이다. PD-1(프로그램화된 사멸 1: Programmed Death 1)은 억제 수용체이자, CTLA-4의 대응물이다. 이러한 개시 내용은 B7-H1에 의해 매개되는 면역 반응의 조절에 관한 것이다.

PD-L1로도 알려져 있는 B7-H1은 그 크기가 대략 53 kDa인 I형 막횡단 단백질이다. 인간에서, B7-H1은 활성화된 및 무반응성/탈진 T 세포 상에서, 순수한 및 활성화된 B 세포 상에서 뿐만 아니라, 골수성 수지상 세포(DC: dendritic cell), 단핵구 및 비만 세포 상에서인 것을 비롯한, 다수의 면역 세포 상에서 발현된다. 이는 또한 그의 발현이 염증성 에피소드가 진행되는 동안 증진되는 곳인, 췌장섬, 간 쿠퍼(Kupffer) 세포, 혈관 내피 및 선택된 상피, 예를 들어, 기도 상피 및 신세뇨관 상피를 비롯한, 비면역 세포 상에서도 발현된다. B7-H1 발현은 또한 유방 종양, 결장 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 신장 종양(신세포암종 포함), 위 종양, 방광 종양, 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer), 간세포암(HCC: hepatocellular cancer), 및 췌장암 뿐만 아니라, 흑색종을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 종양 상에서 그 수준이 증가되어 있는 것으로 밝혀졌다.

B7-H1은 2개의 세포외 Ig 도메인, 1개의 N 말단 V형 도메인에 이어지는 C형 도메인을 포함하는, B7 패밀리 단백질의 구성원이다. 길이가 30개의 아미노산인 세포내 도메인은 뚜렷한 신호전달 모티프를 포함하고 있지는 않지만, 이는 단백질 키나제 C 인산화를 위한 잠재적인 부위는 보유하고 있다. 뮤린의 B7-H1 형태는 인간의 B7-H1 형태와 69%의 아미노산 동일성을 보유하며, 이는 또한 보존 구조를 공유한다.

B7-H1은 2개의 대체 리간드에 결합하는 것으로 알려져 있는데, 이중 첫번째 것인 PD-1은 원래는 활성화 유도성 아포프토시스를 겪은 T 세포주에서 확인된 50-55 kDa의 I형 막횡단 수용체이다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포, 및 단핵구 뿐만 아니라, 다른 면역계 세포 상에서도 발현되며, 이는 B7-H1(PD-L1) 및 관련 B7-DC(PD-L2), 둘 모두에 결합한다. 두번째 것은 B7 패밀리 구성원인 B7-1인데, 이는 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구 및 항원 제시 세포 상에서 발현된다.

PD-1은 그의 세포외 영역 중 단일의 Ig V 유사 도메인을 포함하는 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리의 한 구성원이다. PD-1 세포질 도메인은 2개의 티로신을 포함하는데, 막에 가장 인접한 티로신(마우스 PD-1의 경우, VAYEEL)은 ITIM(면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프: immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motif) 내에 위치한다. PD-1 상에 ITIM가 존재한다는 것은 상기 분자가 세포질 포스파타제를 동원함으로써 항원 수용체 신호전달을 약화시키는 역할을 한다는 것을 시사하는 것이다. 인간 및 뮤린 PD-1 단백질은 약 60%의 아미노산 동일성을 공유하고, 4개의 잠재적인 N 당화 부위를 보존하고 있으며, Ig V 도메인을 정의하는 잔기를 공유한다. 세포질 영역 중의 ITIM 및 카르복시 말단 티로신(인간 및 마우스의 경우, TEYATI) 주변의 ITIM 유사 모티프 또한 인간 및 뮤린 오르토로그 사이에서 보존된다.

PD-1/B7-H1 축을 통해 이루어지는 신호전달은 T 세포 반응을 음성적으로 조절함으로써 면역계 내의 중요한 비관련 작용을 수행하는 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이러한 조절은 흉선에서의 T 세포 발생, 만성 염증성 반응 조절, 및 말초 관용 및 면역 회피, 둘 모두의 유지에 관여한다. 이러한 작용들의 중요한 성질은 자가면역 표현형을 보이는, PD-1이 결핍된 마우스에서 예시된다. C57BL/6 마우스에서 PD-1이 결핍되면 만성 진행성 루푸스 유사 사구체신염 및 관절염이 유발된다. Balb/c 마우스에서, PD-1 결핍은 심장 조직 특이 자기 반응 항체 존재에 기인하여 중증의 심근병증을 일으킨다. B7-H1/B7-1을 통한 신호전달 작용은 덜 명확하기는 하지만, 이는 또한 음성 조절 신호를 T 세포 및 항원 제시 세포, 둘 모두에 전달하는 것에 관여하는 것으로 간주된다.

종양 세포 상에 B7-H1이 발현되면, 이는 종양이 면역계에 의한 검출 및 제거를 회피하는 데 도움을 주는 것으로 여겨진다. 이와 관련하여 B7-H1은 종양 침투 T 림프구의 탈진 및 무반응화, 면역 억제 사이토카인의 종양 미세 환경으로의 분비 자극, 억제 조절성 T 세포 작용 자극, 및 종양 세포 특이 세포독성 T 세포에 의한 용해로부터의 B7-H1 발현 종양 세포 보호를 비롯한 수개의 대체 기전을 통해 작용한다.

일반적으로, 면역 반응 억제와 관련된 질병, 예를 들어, 암 및 만성 바이러스 감염을 치료하는 안전하고 효과적인 치료 방법이 요구되고 있다. 이러한 질병에 관여하는 면역 반응을 조절하는 것은 B7-H1/PD-1 경로를 조작함으로써 달성될 수 있다.

본 발명은 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1의 생물학적 활성을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명은 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1 활성을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1의 PD-1에 대한 결합을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 B7-H1 유도성 T 세포 억제를 차단하여 항종양 면역을 증진시키는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 추가로 하기 활성들: T 세포 증식, 혼합 림프구 반응에서의 IFN-γ 및/또는 IL-2 분비 중 하나 이상을 추가로 자극시킬 수 있는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 본 발명의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1의 생물학적 활성을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 생물학적 활성을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

본 발명의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1 활성을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 B7-H1 활성을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

본 발명의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 PD-1에 대한 결합을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 것과 비교하여 B7-H1/PD-1 수용체 리간드 결합을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질은 ES-2 세포 상에서 발현된 인간 B7-H1에의 PD-1/Fc의 결합을 억제할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 1 nM, 0.5 nM, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07 또는 0.06 nM 미만의 IC50으로 결합을 억제한다. 추가로, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 1 nM부터 약 0.06 nM까지; 또는 약 0.5 nM부터 약 0.06 nM까지; 또는 약 0.1 nM부터 약 0.06 nM까지; 또는 약 1 nM부터 약 0.1 nM까지; 또는 약 1 nM부터 약 0.5 nM까지의 IC50을 가진다.

본 발명의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 그의 리간드 B7-1에 대한 결합을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 것과 비교하여 B7-H1/B7-1 수용체 리간드 결합을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 억제한다.

본 발명의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1 유도성 종양 증식을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 B7-H1 유도성 종양 증식을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1 유도성 종양 세포 생존을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 B7-H1 유도성 종양 세포 생존을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 A375 또는 HPAC 암 세포주의 종양 성장을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 이소타입 대조군과 비교하여 30일까지 암 세포 성장을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 종양 반응성 T 세포의 B7-H1 매개 억제를 저해함으로써 항종양 세포용해 T 세포 활성을 증진시키는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 종양 반응성 T 세포 활성의 B7-H1 매개성 억제를 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 항종양 면역을 증진시키는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 항종양 면역을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 증진시킨다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 세포 증식을 억제하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 표적화된 결합 물질 부재하에서 발생하는 세포 증식을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여, B7-H1을 발현하는 종양 세포에 대한 특이적인 세포용해(CTL) 활성을 증가시키는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 100 nM, 50 nM 또는 1 nM 이하의 EC50을 가진다. 추가로, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 100 nM부터 약 1 nM까지; 또는 약 50 nM부터 약 1 nM까지; 또는 약 20 nM부터 약 1 nM까지; 또는 약 100 nM부터 약 50 nM까지; 또는 약 100 nM부터 약 70 nM까지의 EC50을 가진다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 100 nM 이하의 EC50으로 T 세포 증식의 B7-H1 매개 억제를 저해하는 표적화된 결합 물질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 100 nM 이하, 예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 nM의 EC50을 가진다. 추가로, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 100 nM부터 약 10 nM까지; 또는 약 50 nM부터 약 10 nM까지; 또는 약 20 nM부터 약 10 nM까지; 또는 약 100 nM부터 약 50 nM까지; 또는 약 100 nM부터 약 70 nM까지; 또는 약 100 nM부터 약 80 nM까지의 EC50을 가진다.

표적화된 결합 물질은 또한 종양 세포 부착, 운동성, 침윤 및 세포 전이를 억제하고, 추가로, 표적화된 결합 물질은 종양 성장을 감소시키는 데 유용하다. 이를 달성시킬 수 있는 기전으로는 B7-H1 활성 억제를 포함할 수는 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 항체이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 모노클로날 항체이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체 또는 그의 단편이다. 그러한 모노클로날 항체는 본원에서 항B7-H1 항체 또는 본 발명의 항체로도 지칭될 수 있다.

항체, 모노클로날 항체 및 인간 모노클로날 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입, 예를 들어, IgG2인 항체를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 IgG2 이소타입의 완전 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 이소타입은 다른 이소타입과 비교하여 이펙터 작용을 유도하는 잠재능이 감소되어 있으며, 이를 통해 독성은 감소될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 IgG1 이소타입의 완전 인간 모노클로날 항체이다. IgG1 이소타입은 다른 이소타입과 비교하여 항체 지향 세포 매개성 세포독성(ADCC: Antibody Directed Cell-mediated Cytotoxicity)을 유도하는 잠재능이 증가되어 있으며, 이를 통해 효능은 개선될 수 있다. IgG1 이소타입은 다른 이소타입, 예를 들어, IgG4와 비교하여 개선된 안정성을 가지며, 이로써 생체이용성은 개선될 수 있고/제조가 용이해질 수 있으며/반감기는 연장될 수 있다. 한 실시양태에서, IgG1 이소타입의 완전 인간 모노클로날 항체는 z, za 또는 f 알로타입의 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 하기들: B7-H1에 대한 고도한 결합 친화성, 시험관내 및 생체내에서 B7-H1 활성을 억제할 수 있는 능력, B7-H1 매개성 종양 세포 생존을 억제할 수 있는 능력, 및 종양 반응성 T 세포의 B7-H1 매개 억제를 저해할 수 있는 능력 중 하나 이상으로부터 선택되는 치료상 바람직한 특성을 가지며, 이는 결국 종양 세포 증식, 운동성, 침윤, 전이, 및 종양 성장을 감소시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 매우 고도한 친화도(Kd)로 B7-H1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 5 나노몰(nM) 미만의 결합 친화도(Kd)로 B7-H1에 결합한다. 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 4 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM 또는 1 nM 미만의 Kd로 결합한다. 추가로, 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 5 nM 내지 약 1 nM; 또는 약 5 nM 내지 약 2 nM; 또는 약 5 nM 내지 약 3 nM; 또는 약 5 nM 내지 약 4 nM; 또는 약 3 nM 내지 약 1 nM; 또는 약 2 nM 내지 약 1 nM의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 950 피코몰 (pM) 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 900 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 800 pM, 700 pM 또는 600 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 500 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 400 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 추가의 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 300 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 일부 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 200 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 일부 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 100 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 추가로, 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 900 pM 내지 약 100 pM; 또는 약 900 pM 내지 약 200 pM; 또는 약 900 pM 내지 약 300 pM; 또는 약 900 pM 내지 약 400 pM; 또는 약 900 pM 내지 약 500 pM; 또는 약 900 pM 내지 약 600 pM; 또는 약 900 pM 내지 약 700 pM; 또는 약 200 pM 내지 약 100 pM; 또는 약 300 pM 내지 약 200 pM; 또는 약 400 pM 내지 약 300 pM의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 일부 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 55 pM 또는 50 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 일부 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 60 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 일부 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 55 pM 미만의 Kd로 B7-H1에 결합한다. 추가로, 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 약 100 pM 내지 약 50 pM; 또는 약 100 pM 내지 약 70 pM; 또는 약 100 pM 내지 약 80 pM; 또는 약 100 pM 내지 약 90 pM; 또는 약 70 pM 내지 약 50 pM; 또는 약 60 pM 내지 약 50 pM; 또는 약 55 pM 내지 약 50 pM의 Kd로 B7-H1에 결합한다. Kd는 본원에 기술된 방법, 또는 당업자에게 공지된 방법(예를 들어, BIA코어 분석법(BIAcore assay), ELISA)(Biacore International AB: 스웨덴 웁살라 소재)을 사용함으로써 평가될 수 있다. 본 발명의 표적화된 결합 물질은 당업계에 보고된 항체와 비교하여 B7-H1에 대해 상당히 개선된 결합 친화성을 가진다.

본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 결합 특성은 또한 해리 속도 또는 회합 속도(각각 k_오프 및 k_온)를 참조로 하여 측정될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 BIA코어 분석법에 의해 측정할 때, 10⁴ M^-1s^-1 이상, 5 X 10⁴ M^-1s^-1 이상, 10⁵ M^-1s^-1 이상, 2 X 10⁵ M^-1s^-1 이상, 5 X 10⁵ M^-1s^-1 이상, 10⁶ M^-1s^-1 이상, 5 X 10⁶ M^-1s^-1 이상, 10⁷ M^-1s^-1 이상, 5 X 10⁷ M^-1s^-1 이상, 또는 10⁸ M^-1s^-1 이상의 k_온 속도(항체(Ab) + 항원(Ag)^k온→ Ab-Ag)를 가질 수 있다. 추가로, 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 BIA코어 분석법에 의해 측정할 때, 약 5 X 10⁴ M^-1s^-1 내지 약 5 X 10⁸ M^-1s^-1; 또는 약 5 X 10⁵ M^-1s^-1 내지 약 5 X 10⁸ M^-1s^-1; 또는 약 5 X 10⁶ M^-1s^-1 내지 약 5 X 10⁸ M^-1s^-1; 또는 약 5 X 10⁷ M^-1s^-1 내지 약 5 X 10⁸ M^-1s^-1의 k_온 속도를 가진다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 BIA코어 분석법에 의해 측정할 때, 5x10^-1s^-1 미만, 10^-1s^-1 미만, 5x10^-2s^-1 미만, 10^-2s^-1 미만, 5x10^-3s^-1 미만, 10^-3s^-1 미만, 5x10^-4s^-1 미만, 10^-4s^-1 미만, 5x10^-5s^-1 미만, 10^-5s^-1 미만, 5x10^-6s^-1 미만, 10^-6s^-1 미만, 5x10^-7s^-1 미만, 10^-7s^-1 미만, 5x10^-8s^-1 미만, 10^-8s^-1 미만, 5x10^-9s^-1 미만, 10^-9s^-1 미만, 5x10^-10s^-1 미만, 10^-10s^-1 미만의 k_오프 속도((Ab-Ag)^k오프 →항체 (Ab) + 항원 (Ag))를 가질 수 있다. 추가로, 일부 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 BIA코어 분석법에 의해 측정할 때, 약 1 X 10^-4s^-1 내지 약 1 X 10^-5s^-1; 또는 약 1 X 10^-4s^-1 내지 약 5 X 10^-4s^-1의 k_오프 속도를 가진다.

본 발명의 표적화된 결합 물질은 인간 B7-H1에 특이적으로 결합한다. 일부 예에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질은 다른 면역 공동조절성 단백질, 예를 들어, 인간 PD-L2, 인간 B7-H2, 인간 B7-H3, 인간 CD28, 인간 CTLA-4 및 인간 PD-1에는 결합하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질은 다른 종으로부터 유래된 다른 B7-H1 단백질과 교차 반응성이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질은 사이노몰거스 원숭이 B7-H1과 교차 반응성이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질은 마우스 B7-H1, 예를 들어, 2.7A4와 교차 반응성이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질은 사이노몰거스 원숭이 B7-H1과, 및 마우스 B7-H1, 예를 들어, 2.7A4와 교차 반응성이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질은 사이노몰거스 원숭이 B7-H1과 교차 반응성이지만, 마우스 B7-H1, 예를 들어, 2.9D10 및 2.14H9와는 교차 반응성이 아니다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 하기 표 8에 제시된 중쇄 서열(VH) 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT의 중쇄 서열 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 경쇄 난잡은 당업계에 잘 확립되어 있고, 따라서, 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT, 또는 본원에 개시된 또 다른 항체의 중쇄 서열 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체는 추가로 하기 표 9에 제시된 경쇄 서열(VL) 또는 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT, 또는 본원에 개시된 다른 항체의 경쇄 서열(VL) 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT의 중쇄 서열 중 어느 하나를 포함하고, 추가로 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT의 상응하는 경쇄 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 9에 제시된 경쇄 서열 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT의 경쇄 서열 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.7A4의 중쇄 서열 중 어느 것, 및 추가로 항체 2.7A4의 경쇄 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.14H9의 중쇄 서열 중 어느 것, 및 추가로 항체 2.14H9의 경쇄 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.9D10의 중쇄 서열 중 어느 것, 및 추가로 항체 2.9D10의 경쇄 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.7A.4OPT의 중쇄 서열 중 어느 것, 및 추가로 항체 2.7A.4OPT의 경쇄 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.14H9OPT의 중쇄 서열 중 어느 것, 및 추가로 항체 2.14H9OPT의 경쇄 서열을 포함하는 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 표적 결합제는 하기 표 1에 제시된 모노클로날 항체 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 표적 결합제는 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 결합제는 모노클로날 항체 2.7A4이다. 특정 다른 실시양태에서, 표적 결합제는 모노클로날 항체 2.14H9이다. 추가의 다른 실시양태에서, 표적 결합제는 모노클로날 항체 2.9D10이다. 특정 실시양태에서, 표적 결합제는 모노클로날 항체 2.7A4OPT이다. 특정 다른 실시양태에서, 표적 결합제는 모노클로날 항체 2.14H9OPT이다. 추가의 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 상기 모노클로날 항체 중 어느 것으로부터 유도될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 각각 2008년 11월 19일자로 번호 41598로, 2008년 11월 19일자로 번호 41597로, 및 2008년 11월 19일자로 번호 41599하로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G, 2.14H9_G, 및 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄 가변 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 각각 2008년 11월 19일자로 번호 41598로, 2008년 11월 19일자로 번호 41597로, 및 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G, 2.14H9_G, 및 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 가변 도메인 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 CDR 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 도메인 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 경쇄 가변 도메인 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41597로 NCIMB에 기탁된, 2.14H9_G로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 중쇄 가변 도메인 서열 및 2008년 11월 19일자로 번호 41599로 NCIMB에 기탁된, 2.9D10_NG로 명명된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 8에 제시되어 있는 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 CDR1(HCDR1), 중쇄 CDR2(HCDR2) 및 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 9에 제시되어 있는 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 CDR1(LCDR1), 경쇄 CDR2(LCDR2) 및 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 또는 3.18G1의 CDR 중 어느 하나로부터 선택되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 또는 3.18G1의 CDR 중 어느 하나로부터 선택되는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

추가의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하고, 표 9에 제시되어 있는 CDR2 중 하나 및 CDR3 서열 중 하나를 포함하는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체이다. 추가의 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 추가로 표 8에 제시되어 있는 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 추가로 표 8 및/또는 표 9에 제시되어 있는 CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 추가로 표 8 및/또는 표 9에 제시되어 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 8에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 9에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 8에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 9에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 8에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 9에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 8에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.14H9의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 9에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.14H9의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 8에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.9D10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 9에 제시되어 있는 완전 인간 모노클로날 항체 2.9D10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

당업계의 숙련가는 CDR을 쉽게 결정할 수 있을 것이라는 것에 주목한다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]을 참조한다. 카바트는 여러 종의 항체 이소타입으로부터의 면역글로불린 쇄를 다중으로 서열 정렬시킨다. 정렬된 서열은 단일 넘버링 체계인 카바트 넘버링 체계에 따라 넘버링된다. 카바트 서열은 1991년도 간행본에서 업데이트되었으며, 전자 서열 데이터베이스로서 이용가능하다(현재는 카바트 데이터베이스 웹사이트로부터 이용가능; 또한 문헌 [Nucleic Acids Research, 2000, 28(1), 214-218] 참조). 임의의 면역글로불린 서열은 카바트 참조 서열과 함께 정렬시킴으로써 카바트에 따라 넘버링될 수 있다. 따라서, 카바트 넘버링 체계는 면역글로불린 쇄의 넘버링에 대한 균일한 체계를 제공한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 서열 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나의, 또는 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 골격 영역 및 CDR, 구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3에 걸쳐 있는 인접한 서열을 포함하는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체이다. 본 발명의 추가의 실시양태는 서열 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나의, 또는 표 8 및 표 9에 제시되어 있는 골격 영역 및 CDR, 구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3에 걸쳐 있는 인접한 서열을 포함하는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 모노클로날 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT의 서열 중 어느 하나의, 또는 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 골격 영역 및 CDR, 구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3까지에 걸쳐 있는 인접한 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 모노클로날 항체 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT, 또는 2.14H9OPT의 서열 중 어느 하나의, 또는 표 8 및 표 9에 제시되어 있는 골격 영역 및 CDR, 구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3에 걸쳐 있는 인접한 서열을 포함하는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 CDR3 서열; 또는 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열 중 어느 하나; 또는 표 8에 제시되어 있는 경쇄 가변 도메인 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 또는 표 9에 제시되어 있는 중쇄 가변 도메인 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.

한 실시양태는 서열 번호 2, 서열 번호 7, 서열 번호 12, 서열 번호 17, 서열 번호 22, 서열 번호 27, 서열 번호 32, 서열 번호 37, 서열 번호 42, 서열 번호 47, 서열 번호 52, 서열 번호 57, 서열 번호 62, 서열 번호 67, 서열 번호 72, 또는 서열 번호 77을 포함하는 서열을 포함하는 것인, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.

한 실시양태는 서열 번호 2의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 것인, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 7의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 2의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 7의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 12의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 17의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 12의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 17의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 22의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 27의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 22의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 27의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 32의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 37의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 32의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 37의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 42의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 47의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 42의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 47의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 52의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 57의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 52의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 57의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 62의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 67의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 62의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 67의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 72의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 추가로 서열 번호 77의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 완전 인간 모노클로날 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체, 또는 그의 항원 결합부는 서열 번호 72의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열 번호 77의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 본원에 개시된 CDR, 골격 영역 및 CDR(구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3)에 걸쳐 있는 인접한 서열, 본원에 개시된 경쇄 또는 중쇄 서열, 또는 본원에 개시된 항체의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 변이체는 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 골격 영역 및 CDR(구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3)에 걸쳐 있는 인접한 서열, 본원에 개시된 경쇄 또는 중쇄 서열, 또는 본원에 개시된 모노클로날 항체 중 임의의 것에 20, 16, 10, 9개 이하 정도, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 정도의 아미노산 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입을 가지는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다. 변이체는 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 골격 영역 및 CDR(구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3)에 걸쳐 있는 인접한 서열, 본원에 개시된 경쇄 또는 중쇄 서열, 또는 본원에 개시된 모노클로날 항체 중 임의의 것에 1, 2, 또는 3개의 아미노산 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입을 가지는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다. 변이체는 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 표 8 또는 표 9에 제시되어 있는 골격 영역 및 CDR(구체적으로 FR1부터 FR4 또는 CDR1부터 CDR3)에 걸쳐 있는 인접한 서열, 본원에 개시된 경쇄 또는 중쇄 서열, 또는 본원에 개시된 모노클로날 항체 중 임의의 것과 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다. 두 아미노산 서열의 동일성(%)은 쌍별 단백질 정렬을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 변이체는 천연적으로 발생되거나, 재조합 DNA 기법 또는 돌연변이 유발 기법을 사용하여 시험관내에서 천연 서열을 공학처리함으로써 도입된 변이를 본원에 개시된 CDR 서열 또는 경쇄 또는 중쇄 중에 포함한다. 천연적으로 발생된 변이체는 외래 항원에 대한 항체가 생성되는 동안 상응하는 생식 계열 뉴클레오티드 서열 중 생체내에서 생성된 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 변이체는

(a) 서열 번호 3과 동일하거나, 서열 번호 3과 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

(b) 서열 번호 4와 동일하거나, 서열 번호 4와 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2;

(c) 서열 번호 5와 동일하거나, 서열 번호 5와 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3;

(d) 서열 번호 8과 동일하거나, 서열 번호 8과 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

(e) 서열 번호 9와 동일하거나, 서열 번호 9와 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

(f) 서열 번호 10과 동일하거나, 서열 번호 10과 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 가진 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 변이체는

(a) 서열 번호 23과 동일하거나, 서열 번호 23과 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

(b) 서열 번호 24와 동일하거나, 서열 번호 24와 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2;

(c) 서열 번호 25와 동일하거나, 서열 번호 25와 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3;

(d) 서열 번호 28과 동일하거나, 서열 번호 28과 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

(e) 서열 번호 29와 동일하거나, 서열 번호 29와 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

(f) 서열 번호 30과 동일하거나, 서열 번호 30과 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 가진 서열을 포함하는 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 유도체는 2개 이상의 항체가 함께 연결되어 있는 항체인 이종항체일 수 있다. 유도체는 화학적으로 변형된 항체를 포함한다. 그 예로는 하나 이상의 중합체, 예를 들어, 수용성 중합체, N 연결, 또는 O 연결 당질, 당, 인산염, 및/또는 상기와 같은 다른 분자의 공유 부착을 포함한다. 유도체는 부착되는 분자의 유형 또는 위치에 있어서 천연적으로 발생된 항체 또는 출발 항체와 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 추가로 천연적으로 항체 상에 존재하는 하나 이상의 화학기의 결실을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 2를 포함하는 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 2를 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 2는 하기 표 10의 각 열에 명시되어 있는 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 2를 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 2는 하기 표 10에 명시되어 있는 생식 계열 잔기 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 임의의 4개, 또는 5개 모두를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 2를 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 2는 하기 표 10의 각 열에 명시되어 있는 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 2를 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 2는 하기 표 10에 명시되어 있는 생식 계열 잔기 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 임의의 4개, 임의의 5개, 또는 5개 모두를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 7을 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 7은 하기 표 11의 각 열에 명시되어 있는 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나 및 하기 표 11의 각 열에 명시되어 있는 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 7을 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 7은 하기 표 11에 명시되어 있는 생식 계열 잔기 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 임의의 4개, 임의의 5개, 또는 5개 모두를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 12를 포함하는 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 12를 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 12는 하기 표 12의 각 열에 명시되어 있는 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 12를 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 12는 하기 표 12에 명시되어 있는 생식 계열 잔기 중 어느 하나, 임의의 2개, 또는 2개 모두를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 17을 포함하는 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 17을 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 17은 하기 표 13의 각 열에 명시되어 있는 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 17을 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 17은 하기 표 13에 명시되어 있는 생식 계열 잔기 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 임의의 4개, 또는 4개 모두를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 27을 포함하는 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 27을 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 27은 하기 표 14의 각 열에 명시되어 있는 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 27을 포함하는 서열을 포함하는데, 여기서, 서열 번호 27은 하기 표 14에 명시되어 있는 생식 계열 잔기 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 또는 3개 모두를 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1에 대한 결합에 대해 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체와 경쟁하는 표적화된 결합 물질이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, B7-H1에 대한 결합에 대해 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체와 경쟁하는 항체가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 B7-H1에 대한 결합에 대해 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나와 경쟁한다. "경쟁한다"라는 것은 표적화된 결합 물질 또는 항체가 B7-H1에 대한 결합에 대해 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나와 경쟁한다는 것을 나타내며, 즉, 경쟁은 단방향성인 것을 나타낸다.

본 발명의 실시양태는 B7-H1에 대한 결합에 대해 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나와 교차 경쟁하는 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다. "교차 경쟁한다"라는 것은 표적화된 결합 물질 또는 항체가 B7-H1에 대한 결합에 대해 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나와 경쟁하는 것, 및 그 반대인 경우를 나타내며, 즉, 경쟁은 양방향성인 것을 나타낸다.

본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체와 동일한, 인간 B7-H1의 세포외 도메인 상의 에피토프 또는 에피토프들에 결합하는 표적화된 결합 물질 또는 항체이다. 본 발명의 실시양태는 또한 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT 중 어느 하나와 인간 B7-H1의 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프 또는 에피토프들에 결합하는 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 122번 위치의 Asp 및 125번 위치의 Arg로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 중 적어도 하나 이상을 포함하는 인간 B7-H1 상의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기 3개의 아미노산 잔기, 즉 122번 위치의 Asp, 125번 위치의 Arg 및 113번 위치의 Arg 중 2개 이상을 포함하는 인간 B7-H1 상의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 인간 B7-H1 상의 에피토프에 결합하는데, 여기서, 항체는 인간 B7-H1 상의 54번 위치의 Ile, 117번 위치의 Ser, 및 121번 위치의 Ala에 대한 결합을 나타내지 않는다. 추가의 실시양태에서, 113번 위치의 Arg가 Ala로, 또는 Tyr로, 또는 Leu로 돌연변이화된 경우, 경쟁 분석법에 의해 측정할 때, 야생형 B7-H1에 대한 결합과 비교하여, 본 발명의 항체는 인간 B7-H1에 결합할 수 있는 그의 능력을 상실한다. 추가의 실시양태에서, 125번 위치의 Arg가 Ala로, 또는 Gln으로, 또는 Ser로 돌연변이화된 경우, 경쟁 분석법에 의해 측정할 때, 야생형 B7-H1에 대한 결합과 비교하여, 본 발명의 항체는 인간 B7-H1에 결합할 수 있는 그의 능력을 상실한다. 추가의 실시양태에서, 123번 위치의 Arg가 Ala로, 또는 Phe로, 또는 Thr로 돌연변이화된 경우, 경쟁 분석법에 의해 측정할 때, 야생형 B7-H1에 대한 결합과 비교하여, 본 발명의 항체는 인간 B7-H1에 결합할 수 있는 그의 능력을 유지한다. 상기 예에서, 항체는 2.14H9이다. 또 다른 예에서, 항체는 2.14H9OPT이다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 하기 아미노산, 122번 위치의 Asp 및 20번 위치의 Thr 중 적어도 하나 이상을 포함하는 인간 B7-H1의 세포외 도메인 상의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 B7-H1 상의 하기 3개의 아미노산 잔기, 즉 19번 위치의 Phe, 20번 위치의 Thr 및 122번 위치의 Asp 중 2개 이상에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 인간 B7-H1 상의 하기 3개의 아미노산 잔기, 즉 54번 위치의 Ile, 115번 위치의 Met, 117번 위치의 Ser 및 121번 위치의 Ala 중 1 이상에 대한 결합을 나타내지 않는다. 추가의 실시양태에서, 19번 위치의 Phe가 Ala로, 또는 Gly로, 또는 Ser로 돌연변이화된 경우, 경쟁 분석법에 의해 측정할 때, 야생형 B7-H1에 대한 결합과 비교하여, 본 발명의 항체는 인간 B7-H1에 결합할 수 있는 그의 능력을 상실한다. 추가의 실시양태에서, 20번 위치의 Thr이 Ala로, 또는 Val로, 또는 Asp로 돌연변이화된 경우, 경쟁 분석법에 의해 측정할 때, 야생형 B7-H1에 대한 결합과 비교하여, 본 발명의 항체는 인간 B7-H1에 결합할 수 있는 그의 능력을 상실한다. 추가의 실시양태에서, 122번 위치의 Asp가 Asn으로, 또는 Glu로 돌연변이화된 경우, 경쟁 분석법에 의해 측정할 때, 야생형 B7-H1에 대한 결합과 비교하여, 본 발명의 항체는 인간 B7-H1에 결합할 수 있는 그의 능력을 상실한다. 추가의 실시양태에서, 123번 위치의 Arg가 Ala로, 또는 Phe로, 또는 Thr로 돌연변이화된 경우, 본 발명의 항체는 인간 B7-H1에 결합할 수 있는 그의 능력을 유지한다. 일례에서, 항체는 2.7A4이다. 또 다른 예에서, 항체는 2.7A4OPT이다.

한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 이중특이성 항체이다. 이중특이성 항체는 동일하거나 상이한 단백질 상의 2 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 가진 항체이다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 ([Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]; [Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991)]; [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]; [Kostelny et al., J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992)]; [Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]; [Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)]; 미국 특허 번호 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,81호; 제95,731,168호; 제4,676,980호; 및 제4,676,980호, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; 및 EP 03089) 참조).

본원에 기술된 본 발명의 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1 작용에 영향을 주는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 다른 실시양태는 B7-H1에 대한 고도한 결합 친화도, B7-H1 신호전달 억제에 대한 고도한 선택성, 낮은 독성, PD-1 수용체 활성을 차단시킬 수 있는 능력, 면역 억제를 통해 이루어지는 B7-H1 유도성 종양 세포 생존을 억제할 수 있는 능력, 항종양 면역의 B7-H1 매개 억제를 저해할 수 있는 능력을 비롯한, 치료적 관점에서 바람직한 특성을 가지며, 결국 이러한 특성을 통해 신생물성 질환을 비롯한 증식성 또는 침윤 관련 질환, 및/또는 성장할 수 있는 종양 세포의 능력을 시험관내 및 생체내에서 억제할 수 있는 것인, B7-H1에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체 및 그의 제제에 관한 것이다. 추가의 다른 실시양태는 B7-H1 매개 T 세포 억제를 저해하는 것을 필요로 하는 동물에게 유효량의, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 투여하여 동물에서 B7-H1 매개 T 세포 억제를 저해하는 방법에 관한 것이다. 추가의 다른 실시양태는 유의적인 인간 항키메라 항체(HACA: Human Anti-Chimeric Antibody) 반응을 일으키지 않음으로써, 반복 투여를 허용하는, B7-H1에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체 및 그의 제제에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체 중 어느 것을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 본원에 기술된 항체 중 임의의 것의 완전 인간 모노클로날 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT 중 어느 하나의 경쇄 또는 중쇄를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT 중 어느 하나의 경쇄 및 중쇄를 코딩한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은, 엄격한 또는 그보다 낮은 정도로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 본원에 기술된 표적화된 결합 물질 또는 항체 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 벡터가 본원 상기 기술된 표적화된 결합 물질을 코딩하는 것인, 본원 상기 기술된 핵산 분자 또는 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 벡터가 본원 상기 기술된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 것인, 본원 상기 기술된 핵산 분자 또는 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 벡터는 완전 인간 모노클로날 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT 중 어느 하나의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT 중 어느 하나의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본원 상기 기술된 핵산 분자 중 임의의 것으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본원 상기 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포를 1 초과의 벡터를 포함할 수 있다.

당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 항체는 이롭게는 예를 들어, 폴리클로날, 올리고클로날, 모노클로날, 키메라, 인간화된, 및/또는 완전 인간 항체일 수 있다.

본 발명의 실시양태가 임의의 특정 형태의 항체 또는 생성 또는 생산 방법으로 한정되는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체의 결합 단편이다. 예를 들어, 표적화된 결합 물질은 (예를 들어, 무손상 인간 Fc 영역을 가지는) 전장의 항체 또는 항체 결합 단편 (예를 들어, 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, Fv, dAb 또는 다른 주지된 항체 단편)일 수 있다. 추가로, 항체는 단일 도메인 항체, 예를 들어, 카멜리드, 또는 B7-H1에 결합하는 인간 단일 VH 또는 VL 도메인, 예를 들어, dAb 단편일 수 있다.

본원에 기술된 본 발명의 실시양태는 또한 이러한 항체를 생산하는 세포를 제공한다. 세포의 예로는 B7-H1에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마, 또는 재조합적으로 생성된 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, CHO 세포의 변이체(예를 들어, DG44) 및 NSO 세포를 포함한다. CHO 세포의 변이체에 대한 추가의 정보는 문헌 [Andersen and Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15, 456-462] (그 전문이 본원에 참고로 인용된다). 항체는 항체를 분비하는 하이브리도마, 또는 항체를 코딩하는 유전자 또는 유전자들로 형질전환 또는 형질감염된 재조합적으로 공학처리된 세포로부터 제조될 수 있다.

추가로, 본 발명의 한 실시양태는 핵산 분자가 발현하여 표적화된 결합 물질 또는 항체가 생산되도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양한 후, 표적화된 결합 물질 또는 항체를 회수함으로써 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체를 생산하는 방법이다. 한 실시양태는 핵산 분자가 발현하여 항체가 생산되도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양한 후, 항체를 회수함으로써 본 발명의 항체를 생산하는 방법이다. 추가의 다른 실시양태는 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 항체를 발현하는 숙주 세포를 배양한 후, 상기 배양물로부터 상기 항체를 단리하는 방법에 의해 생산된 본 발명의 항체를 포함한다.

본 발명의 실시양태는 또한 항체 생산을 위해 숙주 세포내로 형질감염되었을 때에 항체 또는 그의 단편의 수율을 증가시키기 위해 최적화된 핵산 서열을 포함하는, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 임의 핵산 분자도 포함한다는 사실을 인식하여야 한다.

본원의 추가의 실시양태는 포유동물을 B7-H1을 발현하는 세포, B7-H1, 정제된 B7-H1, 또는 그의 단편을 포함하는 단리된 세포막으로 포유동물을 면역화시켜 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1의 생물학적 활성을 억제하는 표적화된 항체, 및/또는 그의 하나 이상의 오르토로고스 서열 또는 단편을 생산하는 방법을 포함한다.

본원의 추가의 실시양태는 포유동물을 B7-H1을 발현하는 세포, B7-H1, 정제된 B7-H1, 또는 그의 단편을 포함하는 단리된 세포막으로 포유동물을 면역화시켜 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1의 생물학적 활성을 억제하는 고친화성 항체, 및/또는 그의 하나 이상의 오르토로고스 서열 또는 단편을 생산하는 방법을 포함한다.

다른 실시양태는 B7-H1에 특이적으로 결합하여 B7-H1의 생물학적 활성을 억제하는 단리된 항체의 생성 및 확인에 기초한다. B7-H1은 다수의 종양 유형에서 발현된다. B7-H1에 특이적으로 결합하는 항체는 면역 억제를 통해B7-H1 매개성 종양 세포 생존을 방해하고, 항종양 면역 반응의 B7-H1 매개 억제를 저해함으로써 결국에는 종양 세포 침윤, 전이, 종양 성장, 및 다른 특성을 감소시킬 수 있다.

추가로, 항체는 항체를 분비하는 하이브리도마, 또는 항체를 코딩하는 유전자 또는 유전자들로 형질전환 또는 형질감염된 재조합적으로 공학처리된 세포로부터 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체를 생산하는 하이브리도마가 존재한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산하는 하이브리도마가 존재한다. 한 실시양태에서, 하이브리도마는 완전 인간 모노클로날 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 하이브리도마는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산한다. 별법으로, 하이브리도마는 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT와 동일한 에피토프 또는 에피토프들에 결합하는 항체를 생산할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마는 B7-H1에 대한 결합에 대해 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT와 경쟁하는 항체를 생산할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마는 B7-H1에 대한 결합에 대해 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT와 교차 경쟁하는 항체를 생산할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체 또는 그의 결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여함으로써 동물에서 증식성 또는 침윤 관련 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 증식성 또는 침윤 관련 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 상기 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 본 발명의 항체이고, 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여함으로써 동물에서 B7-H1 매개성 성분과 함께, 세포 증식성 또는 침윤 관련 질환을 억제하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 B7-H1 매개성 성분과 함께, 증식성 또는 침윤 관련 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 상기 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 본 발명의 항체이고, 이는 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하여 동물에서 종양 세포 침윤, 세포 전이 또는 종양 성장을 억제하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 종양 세포, 침윤, 세포 전이 또는 종양 성장 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 본 발명의 항체이고, 2.7A4, 2.14H9 또는 2.9D10, 2.7A4OPT 또는 2.14H9OPT로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 신생물성 질환을 앓는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하여 신생물성 질환을 앓는 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 신생물성 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 비신생물성 질환을 앓는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하여 비신생물성 질환을 앓는 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 비신생물성 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 만성 바이러스 감염을 앓는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하여 만성 바이러스 감염을 앓는 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 만성 바이러스 감염 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 악성 종양을 앓는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하여 악성 종양을 앓는 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 악성 종양 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증을 앓는 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하여 B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증을 앓는 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 추가로 B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증 치료를 필요로 하는 동물을 선별하고, 동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 표적화된 결합 물질을 투여하는 것을 포함한다.

악성 종양은 고형 종양, 예를 들어, 흑색종, 피부암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경아교종, 간세포(간)암종, 담낭암, 갑상샘종양, 골암, 위(gastric, stomach)암, 전립샘암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 외음부암, 자궁내막암, 고환암, 방광암, 폐암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 신세포암종, 결장암, 결장직장, 췌장암, 식도암종, 뇌/CNS 암, 두부경부암, 신경세포암, 중피종, 육종, 담도(담관암종), 소장 샘암종, 소아암, 표피양암종, 육종, 늑막/복막암 및 백혈병(급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 포함), 및 다발성 골수종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

치료가능한 증식성 또는 침윤 관련 질환으로는 신생물성 질환, 예를 들어, 흑색종, 피부암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 타액선, 신경아교종, 간세포(간)암종, 담낭암, 갑상샘종양, 골암, 위(gastric, stomach)암, 전립샘암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 외음부암, 자궁내막암, 고환암, 방광암, 폐암, 교모세포종, 갑상샘암, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 결장직장암, 췌장암, 식도암종, 뇌/CNS 암, 신경세포암, 두부경부암, 중피종, 육종, 담도(담관암종), 소장 샘암종, 소아암, 표피양암종, 육종, 늑막/복막암 및 백혈병(급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 포함), 및 다발성 골수종을 포함한다. 치료가능한 만성 바이러스 감염으로는 인간에서 HIV, B형 간염 바이러스(HBV: hepatitis B virus), 및 C형 간염 바이러스(HCV: hepatitis C virus), 원숭이에서 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV: simian immunodeficiency virus), 및 마우스에서 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV: lymphocytic choriomeningitis virus)를 포함한다.

질환 관련 세포 침윤 및/또는 증식은 비정상의 비바람직한 또는 병적 세포 침윤 및/또는 증식, 예를 들어, 종양 관련 세포 침윤 및/또는 증식일 수 있다.

한 실시양태에서, 신생물성 질환은 하기 암종: 유방암종, 결장암종, 결장직장암종, 전립샘암종, 위(stomach)암종, 위(gastric)암종, 난소암종, 식도암종암종, 췌장암종, 담낭암종, 비소세포 폐암암종, 갑상샘암종, 자궁내막암종, 두부경부암종, 신장암종, 신세포암종, 방광암종 및 신경아교종 중 어느 하나로부터 선택되는 고형 종양이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단독으로 B7-H1에, 또는 부분적으로 B7-H1에 의존하는 종양을 앓는 환자에서 B7-H1을 억제하는 데 사용하는 데 적합하다.

본 발명의 추가의 실시양태는 증식성 또는 침윤 관련 질환을 앓는 동물 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 증식성 또는 침윤 관련 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 동물에서 B7-H1 매개성 성분과 함께, 증식성 또는 침윤 관련 질환 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 B7-H1 매개성 성분과 함께 증식성 또는 침윤 관련 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 동물에서 종양 세포 침윤, 세포 전이 또는 종양 성장 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 종양 세포 침윤, 세포 전이 또는 종양 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 신생물성 질환을 앓는 동물 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 신생물성 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 병인이 감염체와 관련이 있는 질환, 예를 들어, 간세포암, 위암, 또는 자궁경부암을 앓는 동물 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 신생물성 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 신생물성 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 비신생물성 질환을 앓는 동물 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 비신생물성 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 만성 바이러스 감염을 앓는 동물 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 비신생물성 질환 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 용도는 추가로 안구 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환 및 패혈증을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 악성 종양을 앓는 동물 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 악성 종양 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증을 앓는 동물 치료용 약제 제조에서 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용도는 추가로 B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증 치료를 필요로 하는 동물을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 증식성 또는 침윤 관련 질환을 앓는 동물 치료용 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 동물에서 종양 세포 침윤, 세포 전이 또는 종양 성장을 앓는 동물 치료용 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증을 앓는 동물 치료용 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함한다.

한 실시양태에서,

증식성 또는 침윤 관련 질환;

신생물성 질환;

비신생물성 질환;

악성 종양; 또는

만성 바이러스 감염; 또는

B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증 치료는 상기 언급된 질환 또는 병증 중 어느 것을 관리하거나, 호전시키거나, 예방하는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 신생물성 질환 치료는 종양 성장 억제, 종양 성장 지연, 종양 퇴행, 종양 위축, 치료 중단시 종양이 재성장할 때까지 소요되는 시간의 장기화, 종양 재발까지 소요되는 시간의 장기화, 질환 진행의 저속화를 포함한다.

한 실시양태에서, B7-H1 발현과 관련된 질환 또는 병증 치료는 B7-H1을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체를 투여한 후, 제거제를 투여하여 혈액으로부터 과량의 혈중 항체를 제거한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 치료하고자 동물은 인간이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 완전 인간 모노클로날 항체 2.7A4, 2.14H9 및 2.9D10로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 실시양태는 본원에 기술된 표적화된 결합 물질, 및 치료제를 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료제는 독소이다. 다른 실시양태에서, 치료제는 방사성 동위원소이다. 추가의 다른 실시양태에서, 치료제는 약학 조성물이다.

또 다른 측면에서, 환자에서 암성 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에게 완전 인간 항체 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함한다. 완전 인간 항체 컨쥬게이트는 B7-H1에 결합할 수 있는 항체 및 제제를 포함한다. 제제는 독소, 방사성 동위원소, 또는 암 세포를 사멸시키는 또 다른 물질이다. 이로써, 항체 컨쥬게이트는 암 세포를 사멸시킨다.

한 측면에서, B7-H1에 특이적으로 결합하는 컨쥬게이션된 완전 인간 항체를 제공한다. 제제가 항체에 부착되고, 항체가 세포에 결합하게 되면 제제가 세포로 전달되게 된다. 한 실시양태에서, 상기 컨쥬게이션된 완전 인간 항체는f B7-H1의 세포외 도메인에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 및 컨쥬게이션된 독소는 B7-H1을 발현하는 세포에 의해 내재화된다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 세포독성제이다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 예를 들어, 사포린, 또는 아우리스타틴, 슈도모나스 외독소, 겔로닌, 리신, 칼리케마이신 또는 메이탄신 기반 면역컨쥬게이트 등이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 제제는 방사성 동위원소이다.

본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가의 항체, 또는 화학요법 약물 또는 방사선 요법 또는 치료적 백신과 함께 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 항종양 면역의 B7-H1 매개성 억제를 차단하는 B7-H1 항체의 모노클로날, 올리고클로날 또는 폴리클로날 항체는 종양 세포 증식을 억제하는 것으로 보이는 약물과 함께 병용하여 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 환자 또는 환자의 시료 중 B7-H1의 존재 여부 및/또는 그의 수준을 검출하는 데 본원에 개시된 항체가 사용되는, 질환 또는 병증을 진단하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 환자 시료는 혈액 또는 혈액 혈청 또는 뇨이다. 추가의 실시양태에서, 항B7-H1 항체를 사용하여 B7-H1의 발현 및/또는 과발현을 확인하는 것을 포함하는, 위험 인자를 확인하는 방법, 질환을 진단하는 방법, 및 질환 병기를 분류하는 방법을 제시한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 세포 상의 B7-H1에 선택적으로 결합하는 완전 인간 항체 컨쥬게이트를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 항체 컨쥬게이트는 B7-H1에 특이적으로 결합하는 항체 및 표지를 포함한다. 본 방법은 추가로 환자에서 표지의 존재를 관찰하는 것을 포함한다. 표지의 양이 상대적으로 높다면, 이는 질환의 위험이 상대적으로 높다는 것을 나타낼 것이며, 표지의 양이 상대적으로 낮다면, 이는 질환의 위험이 상대적으로 낮다는 것을 나타낼 것이다. 한 실시양태에서, 표지는 녹색 형광 단백질이다.

본 발명은 추가로 본원에 개시된 항체를 환자로부터 유래된 생물학적 시료와 접촉시키고, 상기 항체와, 상기 시료 중의 B7-H1 사이의 결합 수준을 검출하는 것을 포함하는, 환자 시료 중 B7-H1의 존재 여부 및/또는 그의 수준을 분석하는 방법을 제공한다. 더축 구체적인 실시양태에서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 혈청 또는 세포를 본원에 개시된 항체와 함께 접촉시킨 후, B7-H1의 존재 여부에 대해 검출함으로써 세포에서 B7-H1의 발현과 관련된 병증을 진단하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 병증은 신생물성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는 증식성 또는 침윤 관련 질환일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물 조직, 세포, 또는 체액 중 B7-H1을 검출하기 위한 분석용 키트를 포함한다. 상기 키트는 B7-H1 관련 질환을 스크리닝하는 데 유용할 것이다. 키트는 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체, 및 존재할 경우, 표적화된 결합 물질 또는 항체와 B7-H1의 반응을 지시하는 수단을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, B7-H1에 결합하는 항체는 표지된 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 비표지된 1차 항체이고, 키트는 추가로 1차 항체를 검출하는 수단을 포함한다. 한 실시양태에서, 검출 수단은 항면역글로불린인 표지된 2차 항체를 포함한다. 항체는 형광색소, 효소, 방사성 핵종 및 방사선 불투과성 물질로 이루어진 군에서 선택되는 마커로 표지될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체는 보체를 고정시킬 수 있고, 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity)에 참여할 수 있는 그의 능력을 증진시키도록 변형될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 이펙터 세포를 활성화시킬 수 있고, 항체 의존성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cytotoxicity)에 참여할 수 있는 그의 능력을 증진시키도록 변형될 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 이펙터 세포를 활성화시킬 수 있고, 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 참여할 수 있는 그의 능력을 증진시킬 뿐만 아니라, 보체를 고정시킬 수 있고, 보체 의존성 세포독성(CDC)에 참여할 수 있는 그의 능력을 증진시키도록, 둘 모두를 위해 변형될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체는 보체를 고정시킬 수 있고, 보체 의존성 세포독성(CDC)에 참여할 수 있는 그의 능력을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 이펙터 세포를 활성화시킬 수 있고, 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 참여할 수 있는 그의 능력을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체는 이펙터 세포를 활성화시킬 수 있고, 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 참여할 수 있는 그의 능력을 감소시킬 뿐만 아니라, 보체를 고정시킬 수 있고, 보체 의존성 세포독성(CDC)에 참여할 수 있는 그의 능력을 감소시키도록, 둘 모두를 위해 변형될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체 및 본 발명의 조성물의 반감기는 적어도 약 4 내지 7일이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체 및 본 발명의 조성물의 평균 반감기는 적어도 약 2 내지 5일, 3 내지 6일, 4 내지 7일, 5 내지 8일, 6 내지 9일, 7 내지 10일, 8 내지 11일, 8 내지 12일, 9 내지 13일, 10 내지 14일, 11 내지 15일, 12 내지 16일, 13 내지 17일, 14 내지 18일, 15 내지 19일, 또는 16 내지 20일이다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체 및 본 발명의 조성물의 평균 반감기는 적어도 약 17 내지 21일, 18 내지 22일, 19 내지 23일, 20 내지 24일, 21 내지 25일,일, 22 내지 26일, 23 내지 27일, 24 내지 28일, 25 내지 29일, 또는 26 내지 30일이다. 추가의 실시양태에서, 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체 및 본 발명의 조성물의 반감기는 최대 약 50일일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 조성물의 반감기는 당업계에 공지된 방법에 의해 연장될 수 있다. 결국, 상기와 같은 연장을 통해 항체 조성물의 투여량 및/또는 투약 빈도는 감소될 수 있다. 생체내 반감기가 개선된 항체, 및 그를 제조하는 방법은 미국 특허 번호 제6,277,375호; 및 국제 공개 번호 WO 98/23289 및 WO 97/3461에 개시되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 용기는 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체를 포함하는 조성물, 및 조성물이 B7-H1의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포 부착, 침윤, 혈관형성, 및/또는 증식 관련 질환을 치료하는 데 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 인서트 또는 라벨을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 표적화된 결합 물질 또는 항체, 및 치료를 필요로 하는 피험체에게 모노클로날 항체를 투여하라고 지시하는 설명 지침서를 포함하는, B7-H1의 발현을 포함하는 질환을 치료하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 단백질 제제를 제공한다. 이는 비천연적으로 발생된 Fc 영역, 예를 들어, 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 영역이다. 본 발명의 변이체 Fc 영역는 또한 아미노산 결실, 부가, 및/또는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.

Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 변이체 단백질은 비교되는 분자와의 비교시 증진된 혈청 반감기를 가진다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 239번, 330번 및 332번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체를 제공한다. 임의로, Fc 영역은 추가로 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252번, 254번, 및 256번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 추가의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산, 및 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252Y, 254T 및 256E로 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234번, 235번 및 331번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235F, 235Y, 235E 및 331S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체를 제공한다. 추가로 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235F, 및 331S의 비천연적으로 발생된 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235Y, 및 331S의 비천연적으로 발생된 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235E, 및 331S의 비천연적으로 발생된 아미노산 잔기를 포함한다. 임의로, Fc 영역은 추가로 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252번, 254번, 및 256번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 추가의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235F, 235Y, 235E 및 331S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산; Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235F, 및 331S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하고; 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252Y, 254T 및 256E로 이루어진 군에서 선택되는 것인, Fc 변이체를 제공한다. 본원에서 사용될 때, "OPT" 및 "TM"이라는 명칭은 동의어이고, 이는 항체 의존성 세포 매개성 세포독성 및 보체 의존성 세포독성을 일으킬 수 있는 그의 능력을 제거하기 위해 IgG 분자의 힌지에 L234F 및 L235E, 및 CH2 도메인에 P331S인 3가지 돌연변이를 도입하도록 공학처리된 본 발명의 항체를 기술하는 데 사용된다(문헌 [Oganesyan V. et al. (2008), Acta Cryst., D64: 700-704]).

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 239번, 330번 및 332번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 임의로, Fc 영역은 추가로 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252번, 254번, 및 256번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 추가의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 239D, 330L 및 332E로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하고; 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252Y, 254T 및 256E로 이루어진 군에서 선택되는 것인, Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234번, 235번 및 331번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235F, 235Y, 235E 및 331S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 것인, Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 임의로, Fc 영역은 추가로 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252번, 254번, 및 256번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에 추가의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235F, 235Y, 235E 및 331S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하고; 하나 이상의 위치에 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산이 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 252Y, 254T 및 256E로 이루어진 군에서 선택되는 것인, Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다.

비천연적으로 발생된 Fc 영역을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 결실은 부위 지정 돌연변이 유발법(문헌 [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)]), PCR 돌연변이 유발법(문헌 [Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)]), 및 카세트 돌연변이 유발법(문헌 [Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)])을 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이 유발 방법에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게, 부위 지정 돌연변이 유발법은 오버랩 연장 PCR 방법에 의해 수행된다(문헌 [Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989)]). 오버랩 연장 PCR 기법(문헌 [Higuchi, 상기 문헌 동일])은 또한 임의의 원하는 돌연변이(들)를 표적 서열(출발 DNA)에 도입하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 오버랩 연장 방법에서 제1 라운드 PCR은 외부 프라이머(프라이머 1)와 내부 돌연변이 유발형 프라이머(프라이머 3)로, 별도로 제2 외부 프라이머(프라이머 4) 및 내부 프라이머(프라이머 2)로 표적 서열을 증폭시켜, 2개의 PCR 세그먼트(세그먼트 A 및 B)를 수득하는 것을 포함한다. 내부 돌연변이 유발형 프라이머(프라이머 3)는 원하는 돌연변이(들)를 명시하는 표적 서열에 미스매치를 포함하도록 디자인된다. PCR 제2 라운드에서, PCR 제1 라운드의 생성물(세그먼트 A 및 B)은 2개의 외부 프라이머(프라이머 1 및 4)를 이용한 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 전장의 PCR 세그먼트(세그먼트 C)를 제한 효소로 절단하고, 생성된 제한 단편을 적절한 벡터 내로 클로닝한다. 돌연변이 유발법의 제1 단계로, (예를 들어, Fc 융합 단백질, 항체 또는 단순하게 Fc 영역을 코딩하는) 출발 DNA를 돌연변이 유발 벡터 내로 작용가능하게 클로닝한다. 원하는 아미노산 치환을 반영하여 프라이머를 디자인하였다. 변이체 Fc 영역을 생성하는 데 유용한 다른 방법들이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 미국 특허 공개 번호 2004/0002587 및 PCT 공보 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351 참조).

본 발명의 일부 실시양태에서, ADCC 및 CDC 이펙터 작용을 증진시키기 위해 본원에서 제공하는 항체의 당화 패턴을 변형시킨다. 문헌 ([Shields RL et al., (2002) JBC. 277:26733]; [Shinkawa T et al., (2003) JBC. 278:3466] 및 [Okazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239])를 참조한다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 단백질은 하나 이상의 공학처리된 당형태, 즉, Fc 영역을 포함하는 분자에 공유적으로 부착된 당질 조성물을 포함한다. 공학처리된 당형태는 이펙터 기능을 증진 또는 감소시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 공학처리된 당형태는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 공학처리된 변이체 발현 균주를 이용하여, 하나 이상의 효소, 예를 들어, DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTI11)의 공발현에 의해, 각종 유기체 또는 각종 유기체의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자의 발현에 의해, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후에 당질을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 공학처리된 당형태를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 문헌 ([Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180]; [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294]; [Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473], 미국 특허 번호 제6,602,684호; 미국 시리얼 번호 제10/277,370호; 미국 시리얼 번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1)에 기술된 것; 포틸레전트(Potillegent)™ 기술(Biowa, Inc. Princeton, N.J.); 글리코MAb(GlycoMAb)™ 당화 공학처리 기술(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌 (WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49])를 참조한다.

Fc 영역의 당화는 이펙터 기능을 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다는 것 또한 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 ([Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180]; [Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294]; [Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473], 미국 특허 번호 제6,602,684호; 미국 시리얼 번호 제10/277,370호; 미국 시리얼 번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; 포틸레전트™ 기술(Biowa, Inc. Princeton, N.J.); 글리코MAb™ 당화 공학처리 기술(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland) 참조). 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의Fc 영역은 아미노산 잔기의 변경된 당화를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기의 당화가 변경되면 이펙터 기능은 저하된다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기의 당화가 변경되면 이펙터 기능은 증가하게 된다. 구체적인 실시양태에서, Fc 영역의 푸코실화는 감소되어 있다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 비푸코실화되어 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0226867 참조).

도 1은 비드 분석법에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 T 세포 증식에 미치는 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 DCMLR 분석법에서 본 발명의 항B7-H1 항체에 의한 T 세포 증식 증진을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 DCMLR 분석법에서 본 발명의 항B7-H1 항체에 의한 IFN-γ 방출을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 IgG 부류 전환 및 생식 계열화가 항체 활성에 미치는 영향을 평가하는 인간 PD-1/인간 B7-H1 리간드 억제 분석법에서 본 발명의 항B7-H1 항체에 의한 항B7-H1 IC50의 95% 신뢰 구간을 보여주는 그래프이다.
도 5는 공동조절성 항원에 대한 본 발명의 항B7-H1 항체의 교차 반응성을 평가하기 위해 수행된 ELISA 분석법으로부터 얻은 결과를 보여주는 선 그래프이다.
도 6은 시험관내 Tet-면역 회상 분석법에서 본 발명의 항B7-H1 항체의 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 Tet-면역 회상 분석법을 사용하여 수행된 본 발명의 항B7-H1 항체의 효현 작용 활성에 관한 테스트로부터 얻은 결과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 8A/B/C는 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 HPAC 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.
도 9A/B/C는 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 A375 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.
도 10A/B는 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 HPAC 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.
도 11은 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 HPAC 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.
도 12A/B/C/D는 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 A375 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.
도 13A/B는 T 세포의 존재 및 부재하에 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 A375 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.
도 14A/B는 T 세포의 존재 및 부재하에 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 A375 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.
도 15는 마우스 이종이식 모델에서 본 발명의 항B7-H1 항체가 A375 세포에 미치는 효과를 보여주는 선 그래프이다.

정의

달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업계의 당업자에게 공통으로 이해되는 의미를 가진다. 추가로, 본문 중에서 달리 요구하지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술한 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 하이브리드화와 관련되어 사용되는 명명법 및 기술 은 당업계에서 주지되어 있고 공용되는 것이다.

재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성법 및 조직 배양 및 형질전환법(예를 들어, 전기영동, 리포펙틴 등)에 대해서는 표준 방법을 사용하였다. 효소 반응 및 정제법은 제조사의 설명에 따라 수행하거나 당업계에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술한 바와 같이 수행하였다. 상기의 기법 및 과정들은 일반적으로 당업계에 주지되어 있고, 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 논의된 다양한 일반 참조 문헌 및 보다 구체적인 참조 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행되었다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001))](본원에 참고로 포함된다). 본원에 기술한 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 제약 화학 등과 관련되어 사용되는 명명법, 실험 과정 및 기법들은 당업계에서 주지되어 있고 공용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 제형 및 환자의 치료 및 전달 등에 대해서는 표준 기법을 사용하였다.

본 개시내용과 관련하어 사용된 바와 같이, 달리 언급하지 않으면, 하기의 용어들은 다음의 의미를 가지는 것으로 이해하여야 한다:

길항제 또는 억제제는 폴리펩티드, 핵산, 당질, 지질, 소분자량 화합물, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, RNA 간섭(RNAi: RNA interference), 안티센스, 재조합 단백질, 항체 또는 그의 단편 또는 컨쥬게이트 또는 그의 융합 단백질일 수 있다. RNAi에 대해서는 문헌 [Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev. 2003 Dec;55(4):629-48. Review)]을, 안티센스에 대해서는 문헌 [Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 2003 Oct 28;2003 (206):pe47.]을 참조한다.

화합물은 분자량이 약 2,000 달톤 미만인 임의 소분자량 화합물을 의미한다.

"B7-H1"이라는 용어는 인간 B7-H, B7H1, B7-H1, B7 동족체 1, CD274 항원, PDCD1L1, PDCD1LG1, PDCD1 리간드 1, PDL1, PD-L1, 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1 전구체, 또는 프로그램화된 사멸 리간드 1을 의미한다.

표적화된 결합 물질, 예를 들어, 항체와 관련하여 "중화" 또는 "∼을 억제한다"라는 용어는 표적 항원의 활성을 제거, 감소, 또는 현저히 감소시킬 수 있는 상기 물질의 능력을 의미한다. 따라서, 본 발명의 "중화" 항B7-H1 항체는 B7-H1의 활성을 제거하거나 또는 현저히 감소시킬 수 있다. B7-H1에 특이적으로 결합할 수 있는 중화, 길항 또는 억제 항체는 예를 들어, B7-H1이 그의 동족 리간드에 결합하는 것을 차단함으로써 작용할 수 있다. 이상적으로, B7-H1에 대한 중화 항체는 T 세포 면역의 B7-H1 매개 억제를 저해한다. B7-H1에 특이적으로 결합할 수 있는 중화, 길항 또는 억제 항체는 B7-H1이 PD-1에 및/또는 B7-1에 결합하는 것을 억제함으로써 작용할 수 있다.

"B7-H1의 생물학적 활성을 억제한다"라는 것은 본 발명의 표적화된 결합 물질 또는 항체 부재하에서 발생하는 생물학적 활성과 비교할 때 B7-H1 활성을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 만큼 억제하는 것을 포함한다.

본원에서 사용될 때, "폴리펩티드"라는 용어는 천연 단백질, 또는 폴리펩티드 서열의 단편 또는 유사체를 의미하는 일반적인 명칭이다. 따라서, 천연 단백질, 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간 중쇄 면역글로불린 분자 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린 분자를 비롯하여, 예를 들어, 카파 또는 람다 경쇄 면역글로불린 분자 등의 경쇄 면역글로불린 분자와 함께 중쇄 면역글로불린을, 및 그 반대를 포함하는 조합으로 형성된 항체 분자, 및 그의 단편 및 유사체를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 또한 인간 중쇄 면역글로불린 분자 또는 그의 단편만을 단독으로 포함할 수 있다.

본원에서 사용될 때, 대상에게 적용되는 "천연적으로 발생된"이라는 용어는 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 자연계의 공급원에서 단리될 수 있고, 실험실 등에서 인간이 의도적으로 변형시키지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 천연적으로 발생된 것이다.

본원에서 사용될 때, "제어 서열"이라는 용어는 코딩 서열에 연결되어 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 작용하거나, 영향을 미치는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 그러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 달라지는데; 원핵 생물인 경우, 상기 제어 서열로는 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵 생물인 경우, 상기 제어 서열로는 일반적으로 프로모터, 인핸서, 인트론, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 신호 서열, 및 5' 및 '3 비번역 영역을 포함한다. "제어 서열"이라는 용어는 최소한 발현 및 프로세싱을 위해서는 반드시 존재하여야 하는 성분들 모두를 포함하는 것으로 하며, 존재하는 것이 도움이 되는 추가의 성분들, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 언급되는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 길이가 10 염기 이상인 중합체 형태의 뉴클레오티드를 의미하는데, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 중 한 유형의 변형된 형태의, 또는 RNA-DNA 이종 이중체일 수 있다. 이 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.

본원에서 언급되는 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 천연적으로 발생된 뉴클레오티드, 및 천연적으로 발생, 및 비천연적으로 발생된 연결부에 의해서 함께 연결된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이가 200 염기 이상인 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 바람직하게, 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 10 내지 60 염기이고, 가장 바람직하게는 그 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40 염기이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 유전자 돌연변이체의 구성에서 사용하기 위해 이중 가닥일 수도 있지만, 보통 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 프로브용으로서 단일 가닥이다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본원에서 언급되는 "천연적으로 발생된 뉴클레오티드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급되는 "변형된 뉴클레오티드"라는 용어는 변형되거나 치환된 당 기 등을 가진 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급되는 "올리고뉴클레오티드 연결부"라는 용어는 올리고뉴클레오티드 연결부, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)]; [Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)]; [Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)]; [Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991)]; [Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))]; 미국 특허 번호 제5,151,510호(스텍 등); [Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)])(그의 개시내용이 본원에 참고로 포함된다)을 참조한다. 원하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 검출을 위한 표지를 포함할 수 있다.

본원에서 언급되는 "선택적으로 하이브리드화한다"라는 용어는 검출가능하게 특이적으로 결합한다라는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 그의 단편은 비특이 핵산에의 상당량의 검출가능한 결합을 최소화시키는 하이브리드화 및 세척 조건하에서 핵산 가닥에 선택적으로 하이브리드화한다. 고도로 엄격한 조건을 사용하여 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 논의된 바와 같은 선택적 하이브리드화 조건을 달성할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 항체 단편과 관심의 대상이 되는 핵산 서열 사이의 핵산 서열 상동성은 80% 이상이 될 것이며, 더욱 전형적으로 85%, 90%, 95%, 99%, 및 100% 이상인 상동성 증가가 바람직하다.

엄격한 하이브리드화 조건으로는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC: sodium chloride/sodium citrate)(0.9 M NaCl/90 mM 시트르산Na, pH 7.0) 중 필터 결합 DNA에의 하이브리드화를 수행한 후, 약 50-65℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS 중 세척을 1회 이상 수행하는 것, 예를 들어, 약 45℃에서 6X SSC 중 필터 결합 DNA에의 하이브리드화를 수행한 후, 약 60℃에서 0.1X SSC/0.2% SDS 중 세척을 1회 이상 수행하는 고도로 엄격한 조건, 또는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 다른 엄격한 하이브리드화 조건을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예를 들어, 문헌 [Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3] 참조).

두 아미노산 서열 간에 부분적인 또는 완전한 동일성이 존재한다면, 이 두 서열은 "상동성"이다. 예를 들어, 85% 상동성이란 두 서열이 최대로 매치될 수 있도록 정렬되었을 때, 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미하는 것이다. 최대로 매치될 수 있도록 하는데 갭(매치된 두 서열 중 어느 것에 존재)이 허용되며: 5 이하의 갭 길이가 바람직하고, 2 이하의 갭 길이가 더욱 바람직하다. 별법으로, 및 바람직하게, 상기 용어가 본원에서 사용될 때, 두 단백질 서열(또는 그로부터 유래된, 길이가 약 30 아미노산 이상인 폴리펩티드 서열)은 6 이상의 갭 패널티 및 돌연변이 데이터 매트릭스를 이용하는 프로그램 ALIGN 을 이용하여 정렬 점수가 (표준 편차 단위로) 5를 넘는다면 상동성이다. 문헌 [Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10]을 참조한다. 최적으로 정렬되었을 때, ALIGN 프로그램을 이용하여 이들 아미노산이 50% 이상으로 동일하다면, 이 두 서열 또는 그의 일부는 더욱 바람직하게 상동성이다. 두 오르토로고스 서열 내에 상동성인 상이한 영역이 존재할 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 마우스 및 인간 오르토로그의 작용성 부위는 비작용성 영역에 비하여 상동성 정도가 더 높을 수 있다.

본원에서 사용될 때, "∼에 상응하는"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부와 상동성(즉, 동일하지만, 엄격하게 진화적으로 관련성이 있는 것은 아님)이거나, 또는 폴리펩티드 서열이 참조 폴리펩티드 서열과 동일한 것을 의미한다.

대조적으로, "∼에 상보적인"이라는 용어는 상보성 서열이 참조 폴리펩티드 서열의 전체 또는 일부와 상동성인 것을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 참조 서열 "TATAC"에 상응하고, 참조 서열 "GTATA"와 상보적이다.

"서열 동일성"이라는 용어는 비교창에 걸쳐서 두 폴리펩티드 또는 아미노산 서열이 동일하다(즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 잔기 대 잔기 기준으로 동일하다)라는 의미이다. "서열 동일성 비율(%)"이라는 용어는 비교창에 걸처 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 개수를 결정하여 매치되는 위치의 개수를 계산하고, 매치되는 위치의 개수를 비교창 내 전체 위치수(즉, 창 크기)로 나누어, 그 값에 100을 곱해서 서열 동일성의 비율을 산출한다. 본원에서 사용될 때, "실질적인 동일성"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이 18개 이상의 뉴클레오티드(6개 이상의 아미노산) 위치로 이루어진 비교창, 빈번하게는 24-48개 이상의 뉴클레오티드(8-16개 이상의 아미노산) 위치로 이루어진 비교창에 걸친 참조 서열과 비교할 때, 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90 내지 95% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특징을 나타내는 것이며, 여기서, 서열 동일성의 비율(%)은 비교창에 걸쳐서 참조 서열의 총 20% 이하의 결실 또는 부가를 포함할 수 있는 서열에 대해서 참조 서열을 비교하여 산출한다. 참조 서열은 보다 더 큰 서열의 서브세트일 수 있다. 본원에서 사용될 때, 20종의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 일반적인 용법에 따른다. 예를 들어, 문헌 [Immunology - A Synthesis (2^nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)])(본원에 참고로 포함된다)을 참조한다. 20종의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들어, α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 다른 비통상적인 아미노산 또한 본 발명의 폴리펩티드를 위한 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티린, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 다른 유사 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표시법은 표준 용법 및 규정에 따라서 왼쪽 방향이 아미노 말단 방향이고, 오른쪽 방향이 카르복시 방향이다. 유사하게, 달리 명시되지 않는 한, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 신생 RNA 전사체의 5'→3' 부가 방향을 전사 방향이라 지칭하고; RNA와 동일한 서열을 가지며, RNA 전사체의 5'에서 5' 말단인 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "상류 서열"로 지칭하고; RNA와 동일한 서열을 가지고 RNA 전사체의 3'에서 3' 말단인 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "하류 서열"이라고 지칭한다. 폴리펩티드에 대해 적용되는 바, "실질적인 동일성"이라는 용어는 디폴트 갭 가중치를 이용하여 예를 들어, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 두 펩티드 서열이 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 99% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 가진 잔기의 상호교환성을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 가진 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 가진 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이며; 아미드 함유 측쇄를 가진 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 가진 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 가진 아미노산 군은 리신, 아르기닌 및 히스티틴이며; 황 함유 측쇄를 가진 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열내 소수의 변동은 본 발명에 포함되는 것으로 간주되는데, 단, 아미노산 서열의 변동은 본원에서 기술한 항체 또는 면역글로불린 분자에 대한 서열 동일성을 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80%, 90%, 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 유지할 경우이다. 특히, 보존적 아미노산 치환이 고려된다. 보존적 치환은 관련된 측쇄를 가진는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 코딩되는 아미노산은 일반적으로 하기 패밀리로 분류된다: (1) 산성 = 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (9) 비하전된 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 더욱 바람직한 패밀리에서, 세린 및 트레오닌은 지방족-히드록실 패밀리이고; 아스파라긴 및 글루타민은 아미드 함유 패밀리이며; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 패밀리이고; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 방향족 패밀리이다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린으로 루신의 고립 치환, 글루타메이트로 아스파르테이트, 치환, 세린으로 트레오틴 치환 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사 치환은 특히 이러한 치환이 골격 부위 내 아미노산을 포함하지 않으면 생성된 분자의 결합 기능 또는 특성에 주요한 영향을 주지 않는 것으로 예측하는 것은 타당하다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드를 생성하는지에 대해서는 폴리펩티드 유도체의 비활성을 분석하여 용이하게 결정할 수 있다. 분석법은 본원에 상세하게 기술되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업계의 숙련가라면 쉽게 제조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 말단 및 카르복시 말단은 기능성 도메인의 경계 부근에 존재한다. 구조적 및 기능성 도메인은 공공 또는 개인 서열 데이터베이스에 대해 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열의 비교를 통해 확인할 수 있다. 바람직하게, 전산화 비교 방법을 사용하여 공지 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에 존재하는 서열 모티프 또는 예측되는 단백질 입체형태 도메인을 확인할 수 있다. 공지의 3차 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다(문헌 [Bowie et al. Science 253: 164 (1991)]). 따라서, 상기 예들은 본원에 기술된 항체에 따라서 구조 및 기능성 도메인을 정의하는데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조 입체형태를 당업자가 인식할 수 있다는 것을 보여준다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 각각 빈번하게 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화된다. 이러한 잔기는 중성 또는 염기성 조건하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화된 형태는 본 발명의 범주내 포함된다.

일반적으로, 단백질에서 시스테인 잔기는 시스테인-시스테인 이황화 결합에 관여하거나, 또는 상기 잔기가 폴딩된 단백질 영역의 한 부분일 경우에는 입체적으로 이황화 결합 형성으로부터 보호된다. 단백질에서 이황화 결합 형성은 복잡한 과정으로서, 이는 환경의 산화 환원 전위에 의해, 및 전문 티올 이황화 교환 효소에 의해 결정된다(문헌 ([Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984]; [Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44,2002])). 시스테인 잔기가 단백질 구조에서 한 쌍을 가지지 않고, 폴딩에 의해 입체적으로 보호되지 않을 경우, 이는 이황화 셔플링이라고 공지되어 있는 과정으로 용액으로부터 유리 시스테인과 함께 이황화 결합을 형성할 수 있다. 이황화 스크램블링이라고 공지되어 있는 또 다른 과정에서, 유리 시스테인은 또한 천연적으로 발생된 이황화 결합(예를 들어, 항체 구조에 존재하는 것)을 간섭할 수 있는데, 이를 통해 결합은 감소하게 되고, 생물학적 활성은 저하되고/거나, 안정성은 감소하게 된다.

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 가수분해에 대한 감응성을 감소시키는 것, (2) 산화에 대한 감응성을 감소시키는 것, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화성을 변경시키는 것, (4) 결합 친화성을 변경시키는 것, 및 (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것이다. 유사체는 천연적으로 발생된 펩티드 서열 이외의 다른 서열의 다양한 무테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게, 보존적 아미노산 치환)은 천연적으로 발생된 서열(바람직하게, 분자간 접촉부를 형성하는 도메인(들) 바깥쪽 폴리펩티드의 일부)에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 보체 서열의 구조적 특징을 실질적으로는 변화시키지 않아야 한다(예를 들어, 치환 아미노산이 모체 서열에 존재하는 나선을 파괴하지 않아야 하거나, 또는 모체 서열을 특징화하는 다른 유형의 2차 구조를 파괴하지 않아야 한다). 당 업계에서 인지되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 ([Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton et at. Nature 354:105 (1991)](이들 각각이 본원에 참고로 포함된다). 추가로, 상기 방법을 사용하여 쇄내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산을 치환시키거나, 결실시킴으로써 하나 이상의 쇄내 이황화 결합이 없는 항체 분자를 생성할 수 있다.

"CDR 영역" 또는 "CDR"이라는 용어는 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 항체의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역을 나타내는 것으로 한다. CDR은 카바트 체계에 따라 정의될 수 있다(문헌 [Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington], 및 후속 판). 항체는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. 본원에서 CDR 또는 CDR들이라는 용어는 경우에 따라, 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 친화성에 의한 결합을 담당하는 아미노산 잔기 다수를 포함하는 이들 영역 중 하나 또는 이들 영역 중 수개 또는 심지어는 그 전체를 나타내기 위해 사용된다.

중쇄의 세번째 CDR(HCDR3)은 보다 큰 크기 가변성을 가진다(본질적으로 다양성을 초래하는 유전자 정렬 기전에 기인하는 보다 더 큰 다양성을 가진다). 공지된 가장 긴 길이는 26개의 아미노산이지만, 2개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. CDR 길이는 또한 특정의 기본 골격이 제공할 수 있는 길이에 따라 달라질 수 있다. 기능면에 있어서, HCDR3은 부분적으로는 항체 특이성을 결정하는 역할을 한다(문헌 ([Segal et al., PNAS, 71 :4298-4302, 1974], [Amit et al., Science, 233:747-753, 1986], [Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901-917, 1987], [Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989], [Caton et al., J. Immunol, 144: 1965-1968, 1990, Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990], [Sharon et al., J. Immunol, 144:4863-4869, 1990], [Kabat et al., J. Immunol, 147: 1709-1719, 1991])).

본원에서 언급되는 "CDR 세트"라는 용어는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 세트란 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, LCDR 세트란 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

그에 대한 아미노산 서열이 본원에 기술되어 있는 것을 비롯한 것으로, B7-H1에 대한 표적 결합제 및 항체에 사용될 수 있는 것인 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 또는 돌연변이화 방법, 및 바람직한 특징을 사용한 항원 표적화 스크리닝 방법에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 특징의 예로는 항원에 특이적인 공지의 항체와 비교하여, 항원에 대한 결합 친화도 증가; 활성이 공지되어 있는 경우, 항원에 특이적인 공지의 항체와 비교하여, 항원 활성 중화 증가; 특정 몰비에서 항원에 대해 공지의 항체 또는 리간드와 경쟁할 수 있는 구체화된 경쟁능; 리간드-수용체 복합체를 면역침전시킬 수 있는 능력; 구체화된 에피토프에 결합할 수 있는 능력; 선형 에피토프, 펩티드 결합 스캔, 예를 들어, 선형 및/또는 한정된 형태에서 스크리닝된 펩티드를 이용하여 확인된 펩티드 서열; 비연속 잔기에 의해 형성된 형태의 에피토프; B7-H1, 또는 하류 분자의 새로운 생물학적 활성을 조절할 수 있는 능력; B7-H1에 결합하고/거나 그를 중화시킬 수 있는 능력, 및/또는 임의의 다른 바람직한 특성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 항원 결합 부위의 아미노산 서열내 치환을 위해 필요한 기법은 당업계에서 이용가능하다. 본원에 개시된 항체 분자의 변이체는 본 발명에서 제조될 수 있고, 사용될 수 있다. 구조/특성 활성 관계에 다변수 데이터 분석 기법을 적용함에 있어서 컴퓨터 화학의 주도하에(문헌 [Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984]), 항체의 활성 특성의 정량적 관계는 예를 들어, 통계학적 회귀, 패턴 인식 및 분류와 같은 주지의 수학적 기법을 이용하여 도출해 낼 수 있다(문헌 ([Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998)]; [Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995)]; [Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000)]; [Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999)]; [Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002)]; [Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery])). 일부 경우에, 항체의 특성은 항체 서열의 실험적 및 이론적 모델에서 유도될 수 있으며(예를 들어, 가능성이 있는 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 특성의 분석), 기능적 및 3차원 구조 및 이들의 특성은 단독으로 및 조합적으로 고려될 수 있다. VH 도메인과 VL 도메인으로 구성된 항체 항원 결합 부위는 전형적으로 폴리펩티드의 6개 루프에 의해 형성된다: 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터 3개, 및 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터 3개. 공지의 원자 구조를 가진 항체의 분석으로 서열과 항체 결합 부위의 3차원 구조 사이의 관련성이 밝혀졌다. 이들 상관관계는 VH 도메인에서 세번째 영역(루프)을 제외하고, 결합 부위 루프는 소수의 주쇄 형태: 정규 구조 중 하나를 가진다는 것을 의미한다. 특정 루프에서 형성된 정규 구조는 루프와 골격 영역, 둘 모두의 주요 부위에 있는 특정 잔기들의 존부 및 크기에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다.

서열 구조 상관관계에 관한 본 연구는 공지의 서열을 가진 항체 및 알려지지 않은 3차 구조의 항체에서 이들 잔기를 예측하는데 사용될 수 있는데, 이는 그의 CDR 루프의 3차원적 구조를 유지함으로써, 결합 특이성을 유지하는 데 중요하다. 이와 같은 예측은 예측과 선두의 최적화 실험 결과와의 비교를 통해 뒷받침될 수 있다. 구조적 접근법에서, 임의로 자유롭게 이용가능하거나, 또는 시판용 패키지, 예를 들어, WAM을 이용하여 항체 분자의 모델을 생성할 수 있다. 이어서, 단백질 시각화 및 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어, 인사이트 II(Insight II)(Accelrys, Inc.) 또는 딥 뷰(Deep View)는 CDR에서 각 위치에 가능한 치환을 평가하는데 이용될 수 있다. 이어서, 이와 같은 정보를 이용하여 활성에 최소한 또는 유익한 효과를 가지거나 또는 기타 바람직한 특성을 부여할 수 있는 치환을 수행할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "폴리펩티드 단편"이라는 용어는 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실을 가지지만, 나머지 아미노산 서열은 예를 들어, 전장의 cDNA 서열로부터 유추된 천연적으로 발생된 서열에서 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편의 길이는 전형적으로 5, 6, 8 또는 10개 이상의 아미노산, 바람직하게는 14개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 아미노산, 보통은 50개 이상의 아미노산, 더욱더 바람직하게는 70개 이상의 아미노산이다. 본원에서 사용될 때, "유사체"라는 용어는 유추된 아미노산 서열의 일부분과 실질적으로 동일한 25개 이상의 아미노산으로 이루어진 세그먼트로 구성되며, 하기 특성들 중 1 이상을 가지는 폴리펩티드를 지칭한다: (1) 적합한 결합 조건하에서의 B7-H1에의 특이적인 결합, (2) 적절한 B7-H1-단백질 결합을 차단할 수 있는 능력, 또는 (3) B7-H1 활성을 억제할 수 있는 능력. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연적으로 발생된 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체의 길이는 전형적으로 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 적어도 50개 이상이고, 천연적으로 발생된 전장의 폴리펩티드와 동일한 길이를 가지는 경우도 종종 있을 수 있다.

제약 산업에서 펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 가지는 비펩티드 약물로서 흔히 사용된다. 이러한 유형의 비펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도미메틱"이라고 지칭된다(문헌 ([Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)]; [Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)]; 및 [Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)])(이는 본원에 참고로 포함된다). 이와 같은 화합물들은 흔히 컴퓨터에 의한 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 등가의 치료적 또는 예방적 효과를 발휘하도록 하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱는 예를 들어, 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 가진 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 주지된 방법에 의해 --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂-CH₂--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂--, 및 --CH₂SO-로 이루어진 군에서 선택되는 연결부에 의해 하나 이상의 펩티드 연결부가 임의로 치환되어 있다. 컨센서스 서열 중 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D 아미노산으로(예를 들어, L 리신 대신 D 리신으로) 체계적으로 치환시킴으로써 보다 안정적인 펩티드를 생성할 수 있다. 추가로, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 제한된 펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해(문헌 [Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)](이는 본원에 참고로 포함된다)), 예를 들어, 펩티드를 폐환화시키는 분자내 이황화 브릿지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "항체" 및 "항체들"(면역글로불린들)은 단독의 또는 공지 기법에 의해 제공되는 다른 아미노산 서열과의 조합된 형태의, 올리고클로날 항체, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(전장의 모노클로날 항체 포함), 카멜화된 항체, 키메라 항체, CDR 이식된 항체, 다중 특이적 항체, 이중 특이적 항체, 촉매 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 완전 인간 항체, 항이디오타입 항체 및 가용성 또는 결합된 형태로 표지될 수 있는 항체들 뿐만 아니라, 그의 단편, 변이체 또는 유도체일 수 있다. 항체는 임의의 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 항체는 항원의 항원 결정기의 특징에 상보적인 전하 분포 및 내부 표면 모양을 가지는 3차원 결합 공간을 보유하는 폴리펩티드 쇄의 폴딩으로부터 형성된 결합 도메인 1 이상으로 구성된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 포함한다. 항체는 전형적으로 각 쌍이 하나는 "경쇄" 및 "중쇄"를 가지는, 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍을 포함하는 4량체 형태를 가진다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역이 항체 결합 부위를 형성한다. 천연 항체는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종4량체 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유 이황화 결합에 의해 연결되어 있으며, 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄 간의 이황화 연결부의 개수는 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격화된 쇄내 이황화 브릿지를 가진다. 각 중쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인(VH)에 이어서, 수개의 불변 도메인을 가진다. 각 경쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인(VL)과 그의 다른 한쪽 단부에 1개의 불변 도메인을 가진다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 경쇄는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 근거하여 람다 쇄 또는 카파 쇄로 분류된다. 카파 경쇄의 가변 도메인은 또한 VK로 표시할 수도 있다. "가변 영역"이라는 용어는 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인을 설명하는데 이용될 수도 있다. 특정 아미노산 잔기들은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 보인다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역이 항체 결합 부위를 형성한다. 이들 항체들은 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다.

"항체" 또는 "항체들"이라는 용어는 본 발명의 항체들의 결합 단편들을 포함하는데, 예시적인 단편은 단일 쇄 Fv(scFv: single-chain Fv), 단일 쇄 항체들, 단일 도메인 항체들, 도메인 항체들, Fv 단편, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편, 이황화 안정화된 가변 영역(dsFv: disulfide-stabilised variable region), 디아바디, 항이디오타입(항Id) 항체들(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항Id), 인트라바디, 선형 항체들, 단일 쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체들 및 상기 언급된 것들 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 포함한다. 특히, 항체들은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학상 활성인 단편, 즉, 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스가 될 수 있다.

효소 파파인으로 항체를 분해하면, "Fab" 단편이라 알려져 있는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 항원 결합 활성은 없지만 결정화 능력을 보유하는 "Fc" 단편이 생성된다. 항체들을 효소 펩신으로 분해하면 F(ab')₂ 단편이 생성되는데, 항체 분자의 두 아암(arm)이 서로 연결된 상태로 유지되며, 두 항원 결합 부위를 가진다. F(ab')₂ 단편은 항원에 가교결합되는 능력을 가진다.

본원에 기술된 "Fv"는 항원 인식 및 항원 결합 부위, 둘 모두를 보유하는 항체의 최소 단편을 의미한다. 이 영역은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 서로 단단한 비공유적 또는 공유적 회합으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이와 같은 배위에서, 각 가변 도메인의 3개 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 한정시킨다. 총괄하여, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 대한 특이성을 가지는 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 친화도가 낮기는 하지만, 항원을 인식하고 항원에 결합하는 능력을 보유한다.

본원에서 사용될 때, "Fab"는 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "dAb"은 인간 항체의 최소 기능적 결합 단위가 되는 항체 단편을 지칭한다. "dAb"는 단일 도메인 항체이며, 항체 중쇄의 가변 도메인(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 도메인(VL 도메인)을 포함한다. 각 dAb는 6개의 천연적으로 발생된 CDR 중 3개를 포함한다(문헌 ([Ward et al., Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989)]; [Holt, et al., Domain antibodies: protein for therapy, Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)])). 11 내지 15 kDa 범위의 분자량을 가지며, 단편 항원 결합 단편 (Fab)2보다는 4배 더 작고, 단일 쇄 Fv(scFv) 분자 크기의 절반이다.

본원에서 사용될 때, "카멜리드(Camelid)"는 경쇄가 없는, 그럼에도 불구하고 광역의 항원 결합 레파토리를 보유하는 중쇄 이량체로 구성된 항체 분자를 지칭한다(문헌 [Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363:446-448]).

"디아바디"라는 용어는 2개의 항원 결합 부위를 가지는 작은 항체 단편을 말하는데, 이들 단편들은 경쇄 가변 도메인(V_L)에 중쇄 가변 도메인(V_H)이 동일한 폴리펩티드 쇄에서 연결(V_H-V_L)된 것을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 두 도메인이 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 이용하게 되면, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하도록 강요받게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 만들어진다. 디아바디는 예를 들어, 문헌 (EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)])에 더욱 자세하게 설명되어 기술되어 있다

전체 항체의 단편들은 항원 결합 기능을 실행할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 결합 단편의 예는 (문헌 [Ward, E.S. et al., (1989) Nature 341, 544-546]) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (문헌 [McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554]), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (문헌 [Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490]), 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌 ([Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)], [McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554], [Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490])); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 두 도메인이 서로 회합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 것인 단일 쇄 Fv 분자(scFv)(문헌 ([Bird et al., (1988) Science, 242, 423-426], [Huston et al., (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883])); (viii) 이중특이성 단일 쇄 Fv 이량체(문헌 PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구성된 다가 또는 다중 특이성 단편인 "디아바디"(문헌 (WO 94/13804; [Holliger, P. (1993) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448]))가 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결시키는 이황화 브릿지의 도입에 의해 안정화될 수 있다(문헌 [Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]). CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디 또한 제조될 수 있다(문헌 [Hu, S. et al., (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061]). 결합 단편의 다른 예로는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯한 몇 개의 잔기가 추가되었다는 점에서 Fab 단편과 차이를 보이는 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH가 있다.

"가변"이라는 용어는 가변 도메인의 특정 부위들은 서열에 있어서 항체간에 상당한 차이를 보이며, 그의 특정 항원에 대해 각 특정 항체의 결합 특이성을 담당한다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전역에 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 둘 모두에서 상보성 결정 영역(CDR: Complementarity Determining Region)라고 불리는 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존되는 부위는 골격 영역(FR: framework region)이라고 명명된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 각 가변 도메인은 4개의 FR 영역을 포함하는데, 대개 3개의 CDR에 의해 연결된 β 쉬트 형상을 취하며, 이는 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 β 쉬트 구조의 일부분을 형성한다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역과 함께 근접하게 결합되어 있으며, 다른 쇄로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 불변 도메인은 일반적으로 항원 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항원 결합 친화도에 영향을 줄 수 있으며, 다양한 이펙터 기능을 나타내며, 예를 들어, 항체는 ADCC, CDC, 및/또는 아포프토시스에 참여하는 기능을 나타낼 수 있다.

본원에서 사용될 때, "초가변 영역"이라는 용어는 항원에 항체가 결합하는 것에 관여하는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭하는 것이다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]), 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 26-32(L1), 50-52 (L2) 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); 문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 잔기는 CDR 측면에 위치하는 가변 도메인 잔기이다. FR 잔기는 키메라, 인간화된, 인간, 도메인 항체, 디아바디, 백신바디, 선형 항체, 및 이중특이성 항체에 존재한다.

본원에서 사용될 때, "표적화된 결합 물질," "표적화된 결합 단백질," "특이 결합 단백질" 등의 용어는 표적 부위에 우선적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 항체, 또는 그의 결합 단편을 의미한다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 단 하나의 표적 부위에 대해 특이적이다. 다른 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 1 초과의 표적 부위에 대해 특이적이다. 한 실시양태에서, 표적화된 결합 물질은 모노클로날 항체일 수 있고, 표적 부위는 에피토프일 수 있다. 표적화된 결합 물질은 도메인이 이종성 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 비항체 단백질 스캐폴드내 융합되어 있거나, 포함되어 있는 것인, 항체의 1 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, CDR)을 포함할 수 있다.

항체의 "결합 단편"은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된다. 결합 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb 및 단일 쇄 항체를 포함한다. "이중특이성" 또는 "이작용성" 항체를 제외한 항체는 각각의 그의 결합 부위가 동일한 것으로 이해되어야 한다. (시험관내 경쟁 결합 분석에 의해 측정하였을 때) 과량의 항체가 대응 수용체에 결합된 수용체의 양을 약 20%, 40%, 60% 또는 80% 이상, 더욱 통상적으로는 약 85%보다 많이 감소시킨 경우, 항체는 수용체의 대응 수용체에의 부착을 실질적으로 억제한 것이다.

에피토프는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 예를 들어, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 구성되며, 항상 그런 것은 아니지만, 특이적인 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라, 특이적인 전하 특징도 가질 수 있다. 해리 상수가 ≤1 μM인 경우, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM 인 경우, 항체는 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.

본원에서 사용될 때, "제제"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 지칭한다.

B7-H1 폴리펩티드와 관련하여 "활성인" 또는 "활성"이라는 것은 천연 B7-H1 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 가지는 B7-H1 폴리펩티드의 부위를 지칭한다. 본원에서 사용될 때, "생물학적"이라는 것은 천연 B7-H1 폴리펩티드의 활성으로 인한 생물학적 기능을 지칭한다. 바람직한 B7-H1의 생물학적 활성으로는 예를 들어, B7-H1 유도성 세포 증식, 세포 부착 및 침윤을 포함한다.

본원에서 사용될 때, "포유동물"이란 포유동물로 간주되는 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게, 포유동물은 인간이다.

본원에서 사용될 때, "동물"이란 포유동물로 간주되는 동물을 포함한다. 바람직하게, 동물은 인간이다.

"환자"라는 용어는 인간 및 수의학적 피험체를 포함한다.

"mAb"라는 용어는 모노클로날 항체를 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "리포좀"이란 본 발명의 B7-H1 폴리펩티드 또는 B7-H1 폴리펩티드에 대한 항체들을 포함할 수 있는 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용할 수 있는 소형 소포체를 의미한다.

본원에서 사용될 때, "표지" 또는 "표지된"이라는 것은 폴리펩티드에 검출가능한 부분을 부가하는 것을 의미하는데, 예를 들어, 방사성 동위원소 표지, 형광 표지, 효소 표지, 화학발광성 표지화 또는 비오티닐 기를 부가하는 것을 의미한다. 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종으로는 ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹¹³¹I을 포함할 수 있고, 형광 표지로는 로다민, 란탄족 인광체, 또는 FITC를 포함할 수 있으며, 효소 표지로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제를 포함할 수 있다.

추가의 표지로는 일례로, 제한하는 것은 아니지만, 효소, 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제("G6PDH": glucose-6-phosphate dehydrogenase), α-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코스 아밀라제, 카르보닉 안히드라제, 아세틸콜린에스터라제, 리소자임, 말레이트 데히드로게나제 및 퍼옥시다제; 염료; 추가적인 형광 표지 또는 형광 물질은 예를 들어, 플루오레세인 및 그의 유도체들, 형광색소, GFP(GFP: "Green Fluorescent Protein"), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 및 플루오로스카민을 포함하고; 형광체, 예를 들어, 란탄족 크립테이트, 및 킬레이트, 예를 들어, 유로피움(Europium) 등(Perkin Elmer and Cisbio Assays); 화학발광 표지 또는 화학형광물질, 예를 들어, 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄; 감작제; 코엔자임; 효소 기질; 예를 들어, 라텍스 또는 탄소 입자와 같은 입자; 금속 졸; 결정립; 리포좀; 염료, 촉매 또는 다른 검출가능한 기로 추가 표지될 수 있는 세포 등; 분자, 예를 들어, 비오틴, 디곡시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘; 독소 부분, 예를 들어, 슈도모나스 외독소(PE(Pseudomonas exotoxin) 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아(Diptheria) 독소 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체, 보툴리눔(botulinum) 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신 또는 그의 세포독성 단편, 예를 들어, 리신 A, 아브린 또는 그의 세포독성 단편, 사포린 또는 그의 세포독성 단편, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 독소 또는 그의 세포독성 단편 및 브리오딘(bryodin) 1 또는 그의 세포독성 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 독소 부분을 포함한다.

본원에서 사용될 때, "약학 제제 또는 약물"이라는 용어는 환자에게 적절하게 투여되었을 때, 원하는 치료적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, 다른 화학적 용어들은 문헌 [The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)](이는 본원에 참고로 포함된다)에 예시된 바와 같은, 당업계의 일반적인 용법에 따라 사용된다.

본원에서 사용될 때, "실질적으로 순수한"이라는 것은 목적 종이 우세하게 존재하는 종이며(즉, 몰량에 기초하여 조성물 중에 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부하게 존재하는 종), 바람직하게 실질적으로 정제된 분획은 목적 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 (몰량에 기초하여) 약 50% 이상을 포함하는 조성물이라는 것을 의미한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 초과, 더욱 바람직하게는 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 포함할 것이다. 가장 바람직하게는, 목적 종은 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 종으로 구성된 것인, 본질적으로 균질인 상태로 정제된다(종래 검출 방법에 의해 조성물 중 어떤 오염 물질 종도 검출될 수 없다).

"항체 의존성 세포 매개성 세포독성" 및 "ADCC"는 Ig Fc 수용체(FcR: Fc receptor)를 발현하는 비특이 세포독성 세포(예를 들어, 자연살(NK: Natural Killer) 세포, 단핵구, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고, 이어서, 표적 세포를 용해시키는 세포 매개성 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포 상의 FcRs 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464페이지 표 9에 요약되어 있다. 관심의 대상이 되는 ADCC 활성을 평가하기 위해, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기술된 시험관내 ADCC 분석법을 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 분석법에 유용한 이펙터 세포로는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell) 및 자연살(NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 관심의 대상이 되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1988)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.

"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 항체가 그의 세포 사멸 기능을 수행하는 기전을 의미한다. 보체의 제1 구성 성분인 C1q가 Ig, IgG 또는 IgM의 Fc 도메인에 결합하여, 항원과 복합체가 됨으로써 이 기전은 개시된다(문헌 [Hughs-Jones, N.C., and B. Gardner. 1979. Mol. Immunol. 16:697]). C1q는 인간 혈청에 70 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 ∼410 kDa의 구조상 복잡한 대형 당단백질이다(문헌 [Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151]). 두 세린 프로테아제, C1r 및 C1s와 함께, C1q는 보체의 제1성분인 복합체 C1을 형성한다. C1의 활성화와, 이에 따른 보체 캐스캐이드의 개시를 위해 C1q의 N 말단 구형 헤드 2 이상이 Ig의 Fc에 결합되어야만 한다(문헌 [Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37: 151]).

본원에서 사용될 때, "항체 반감기"라는 용어는 항체 분자의 투여 후 그의 평균 생존 시간의 측정치인 항체의 약동학적 특성을 의미한다. 항체 반감기는 환자의 신체 또는 그의 특정 구역, 예를 들어, 혈청 또는 혈장에서(즉, 순환 반감기), 또는 다른 조직에서 공지량의 면역글로불린이 50% 제거되는 데 소요되는 시간으로서 표시될 수 있다. 반감기는 하나의 면역글로불린 또는 면역글로불린 부류마다 가변적일 수 있다. 일반적으로, 항체 반감기의 증가는 투여된 항체에 대해 순환계에서 평균 체류 시간(MRT: mean residence time)을 증가시킨다.

"이소타입"이라는 용어는 항체의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 분류를 지칭다. 항체의 불변 도메인은 항원에 대한 결합에는 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 주어진 인간 항체 또는 면역글로불린은 5가지 주요 면역글로불린 중 하나로 지정된다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 부류 중 수개는 예를 들어, IgG1(감마 1), IgG2(감마 2), IgG3(감마 3), 및 IgG4(감마 4), 및 IgA1 및 IgA2와 같이 서브클래스(이소타입)로 추가적으로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 명명된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 구조 및 3차원적 형태는 주지되어 있다. 다양한 인간 면역글로불린 부류 중에서, 단지 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgM 만이 보체를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4는 Fc 감마 수용체에 결합하여, 이를 통해 ADCC를 비롯한 다양한 이펙터 기능을 매개하는 것으로 알려져 있다. 인간 경쇄 불변 영역은 2개의 주요 부류, 카파 및 람다로 분류될 수 있다.

원하는 경우, B7-H1에 특이적으로 결합하는 항체의 이소타입은 다른 이소타입의 생물학적 활성을 이용할 수 있도록 전환될 수 있다. 예를 들어, 일부 환경에서, B7-H1에 대한 치료제 항체로서의 항체 생성과 관련하여 항체가 보체를 고정시킬 수 있고, 보체 의존성 세포독성(CDC)에 참여할 수 있는 것이 바람직할 것이다. 이와 같은 능력이 있는 항체 이소타입들이 다수 존재하며, 제한없이, 하기: 뮤린 IgM, 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgA, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3을 포함한다. 다른 실시양태에서, B7-H1에 대한 치료제 항체로서의 항체 생성과 관련하여 항체가 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 항체 의존성 세포독성(ADCC)에 참여할 수 있는 것이 바람직할 것이다. 이와 같은 능력이 있는 항체 이소타입들이 다수 존재하며, 제한없이, 하기: 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3을 포함한다. 생성된 항체는 처음부터 이와 같은 이소타입을 보유해야 할 필요는 없지만, 다만 생성됨에 따라 항체는 임의의 이소타입을 보유할 수 있고, 항체는 당업계에 주지된 종래 기법을 사용하여 이후에 이소타입으로 전환될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기와 같은 기법으로는 그 중에서도 직접적인 재조합 기법의 사용(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,397호 참조), 세포-세포 융합 기법(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,916,771호 및 제6,207,418호 참조)를 포함한다.

일례로, 본원에서 논의된 항B7-H1 항체는 완전 인간 항체이다. 항체가 B7-H1에 대해 바람직한 결합을 보유한다면, 쉽게 이소타입으로 전환됨으로써 (항체 특이성 및 그의 친화성의 일부를 정의하는) 동일한 가변 부위를 여전히 계속하여 보유하는 인간 IgM, 인간 IgG1, 또는 인간 IgG3 이소타입으로 생성될 수 있다. 이어서, 이와 같은 분자는 보체를 고정시키고, CDC에 참여할 수 있고/거나, 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 결합하고, ADCC에 참여할 수 있을 것이다.

"전혈 분석법"은 천연 이펙터의 공급원으로서 비분획화된 혈액을 사용한다. 혈액은 혈장 중에 FcR 발현 세포 이펙터, 예를 들어, 다형핵 세포(PMN: polymorphonuclear cell) 및 단핵 세포(MNC: mononuclear cell)와 함께 보체를 포함한다. 따라서, 전혈 분석법을 통해 시험관내에서 ADCC 및 CDC 이펙터 기전 둘 모두의 시너지를 동시에 평가할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "치료적 유효"량이란 피험체에게 약간의 개선 또는 이익을 제공하는 양이다. 또 다른 방식으로 표현하자면, "치료적 유효"량이란, 1 이상의 임상 증상을 어느 정도 경감, 완화, 및/또는 감소시키는 양이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 질병과 관련된 임상 증상은 당업자에게 주지되어 있다. 추가로, 피험체에게 어느 정도 이익이 되는 한, 치료적 효과가 완전하거나 치유력이 있어야 할 필요는 없다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

인간 암의 예로는 방광 종양, 유방 종양, 전립샘 종양, 기저 세포암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌암 및 CNS 암(예를 들어, 신경아교종 종양), 자궁경부암, 융모막암종, 결장 및 직장암, 결합 조직 암, 소화계 암; 자궁내막암, 식도암; 안암; 두부경부암; 위암; 상피내 신생물; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예를 들어, 소세포 및 비소세포); 림프종(호지킨 및 비호지킨 림프종 포함); 흑색종; 골수종, 신경아세포종, 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입, 및 인두); 난소암; 췌장암, 망막아세포종; 횡문근육종; 직장암, 신장암, 호흡계 암; 육종, 피부암; 위암, 고환암, 갑상샘암; 자궁암, 비뇨계 암 뿐만 아니라, 다른 암종 및 육종을 포함한다.

인간 만성 감염의 예로는 HIV, B형 간염 바이러스(HBV), 및 C형 간염 바이러스(HCV)를 포함한다.

본원에서 사용될 때, "및/또는"이라는 용어는 두가지 명시된 특징 또는 성분들 각각을 그 나머지 다른 하나와 함께, 또는 포함하지 않은 상태로 구체적으로 개시하는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들어 "A 및/또는 B"는 마치 각각이 본원에서 개별적으로 기술된 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B로 각각 구체적으로 개시하는 것으로 이해하여야 한다.

항체 구조

기본적인 항체 구조 단위는 4량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 4량체는 각 쌍이 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 가지는 것인 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 구성된다. 각 쇄의 아미노 말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 구성된 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시 말단부는 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 카파와 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 입실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgA, 및 IgE의 항체 이소타입으로 정의된다. 경쇄 및 중쇄에서 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 연결되어 있으며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 된 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))](모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)을 참조한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역이 항체 결합 부위를 형성한다.

따라서, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 가진다. 이작용성 또는 이중특이성 항체를 제외하면, 2개의 결합 부위는 동일하다.

쇄는 모두 3개의 초가변부위에 의해 연결된 상대적으로 보존되는 골격 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타내며, 이는 또한 CDR로도 명명된다. 각 쌍의 두 쇄에 있는 CDR은 특이 에피토프에 결합될 수 있도록 골격 영역에 의해 정렬된다. N 말단으로부터 C 말단에 이르기까지 경쇄 및 중쇄 둘 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 아미노산을 배정하는 것은 문헌 ([Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 [Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)])의 정의에 따라 수행된다.

이중특이성 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 상이한 결합 부위를 가지는 인위적인 하이브리드 항체이다. 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 연결을 비롯한, 다양한 방법들에 의해 이중특이성 항체들을 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)], [Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)])를 참조한다. 이중특이성 항체는 단일 결합 부위(예를 들어, Fab, Fab', 및 Fv)를 가지는 단편의 형태로는 존재하지 않는다.

항원에 대한 결합을 위해서 VH 또는 VL 도메인이 단독으로 사용될 수도 있지만, 전형적으로 VH 도메인은 VL 도메인과 함께 쌍을 형성하여 항체 항원 결합 부위를 제공한다. VH 도메인(표 9 참조)은 VL 도메인(표 13 참조)과 쌍을 형성할 수 있고, 이로써 VH 및 VL 도메인, 둘 모두를 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다.

인간 항체 및 항체의 인간화

인간 항체는 뮤린 또는 래트의 가변 및/또는 불변 영역을 보유하는 항체와 관련된 문제들 중 일부를 해소시켜 준다. 이와 같은 뮤린 또는 래트 유래의 단백질이 존재하면 항체들은 신속하게 제거되거나, 환자에 의해 항체에 대한 면역 반응이 유도될 수 있다. 뮤린 또는 래트 유래의 항체의 활용을 회피하기 위하여, 설치류, 다른 포유동물 또는 동물에 도입함으로써 작용성 인간 항체 유전자좌를 설치류, 다른 포유동물 또는 동물이 완전 인간 항체를 생산할 수 있도록 한다.

완전 인간 항체를 제조하는 한 방법은 인간 중쇄 유전자좌와 카파 경쇄 유전자좌의, 크기가 최대 1,000 kb 미만인 생식 계열로 설정된 단편을 포함하도록 공학처리된 것인, 제노마우스(XenoMouse)^® 마우스 계통을 사용함으로써 수행된다. 문헌 ([Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)] 및 [Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)])을 참조한다. 제노마우스^® 계통은 암젠, 인크.(Amgen, Inc.: 미국 캘리포니아주 프레몬트)로부터 이용가능하다.

이어서, 상기 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있고, 뮤린 면역글로불린 분자 및 항체 생산에는 결함을 가지고 있다. 상기를 달성하는 데 사용되는 기술은 미국 특허 출원 시리얼 번호 제08/759,620호(1996년 12월 3일 출원) 및 국개 특허 출원 번호 WO 98/24893(1998년 6월 11일 공개) 및 WO 00/76310(2000년 12월 21일 공개)(상기의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)에 개시되어 있다. 또한 문헌 [Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)](상기의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)을 참조한다.

제노마우스^® 마우스 계통 생산은 추가로 미국 특허 출원 시리얼 번호 제07/466,008호(1990년 1월 12일 출원), 제07/610,515호(1990년 11월 8일 출원), 제07/919,297호(1992년 7월 24일 출원), 제07/922,649호(1992년 7월 30일 출원), 제08/031,801호(1993년 3월 15일 출원), 제08/112,848호(1993년 8월 27일 출원), 제08/234,145호(1994년 4월 28일 출원), 제08/376,279호(1995년 1월 20일 출원), 제08/430,938호(1995년 4월 27일 출원), 제08/464,584호(1995년 6월 5일 출원), 제08/464,582호(1995년 6월 5일 출원), 제08/463,191호(1995년 6월 5일 출원), 제08/462,837호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,853호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,857호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,859호(1995년 6월 5일 출원), 제08/462,513호(1995년 6월 5일 출원), 제08/724,752호(1996년 10월 2일 출원), 제08/759,620호(1996년 12월 3일 출원), 미국 공개 2003/0093820(2001년 11월 30일 출원), 및 미국 특허 번호 제6,162,963호, 제6,150,584호, 제6,114,598호, 제6,075,181호, 및 제5,939,598호 및 일본 특허 번호 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, 및 3 068 507 B2에 논의되고, 설명되어 있다. 또한, 유럽 특허 번호 EP 0 463 151 B1(1996년 6월 12일 등록), 국제 특허 출원 번호 WO 94/02602(1994년 2월 3일 공개), 국제 특허 출원 번호 WO 96/34096(1996년 10월 31일 공개), WO 98/24893(1998년 6월 11일 공개), WO 00/76310(2000년 12월 21일 공개)을 참조한다. 상기 인용된 특허, 출원, 및 참조 문헌들 각각의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

대체 접근법으로, 젠팜 인터내셔날 인크.(GenPharm International, Inc.)을 비롯한 다른 경우에는 "미니유전자좌" 접근법을 이용하였다. 미니유전자좌 접근법에서, 외인성 Ig 유전자좌는 Ig 유전자좌로부터 유래된 조각(개별 유전자)을 포함함으로써 모방된다. 따라서, 하나 이상의 V_H 유전자, 하나 이상의 D_H 유전자, 하나 이상의 J_H 유전자, mu 불변 영역, 및 일반적으로 제2 불변 영역(바람직하게, 감마 불변 영역)이 동물내로의 삽입을 위한 구조물로 형성된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 제5,545,807호(Surani 등) 및 미국 특허 번호 제5,545,806호, 제5,625,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,877,397호, 제5,874,299호, 및 제6,255,458호(이들 각각은 Lonberg 및 Kay), 미국 특허 번호 제5,591,669호 및 제6,023,010호(Krimpenfort 및 Berns), 미국 특허 번호 제5,612,205호, 제5,721,367호, 및 제5,789,215호(Berns 등), 및 미국 특허 번호 제5,643,763호(Choi and Dunn), 및 젠팜 인터내셔날의 미국 특허 출원 시리얼 번호 제07/574,748호(1990년 8월 29일 출원), 제07/575,962호(1990년 8월 31일 출원), 제07/810,279(1991년 12월 17일 출원), 제07/853,408호(1992년 3월 18일 출원), 제07/904,068호(1992년 6월 23일 출원), 제07/990,860호(1992년 12월 16일 출원), 제08/053,131호(1993년 4월 26일 출원), 제08/096,762호(1993년 7월 22일 출원), 제08/155,301호(1993년 11월 18일 출원), 제08/161,739호(1993년 12월 3일 출원), 제08/165,699호(1993년 12월 10일 출원), 제08/209,741호(1994년 3월 9일 출원)(상기 출원의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 또한 유럽 특허 번호 0 546 073 Bl, 국제 특허 출원 번호 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 및 미국 특허 번호 제5,981,175호(상기 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)를 참조한다. 추가로, 문헌 ([Taylor et al., 1992], [Chen et al., 1993], [Tuaillon et al., 1993], [Choi et al., 1993], [Lonberg et al., (1994)], [Taylor et al., (1994)], 및 [Tuaillon et al., (1995)], [Fishwild et al., (1996)])(상기의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)를 참조한다.

기린(Kirin)은 또한 마이크로 셀 융합을 통해 염색체 큰 조각, 또는 전체 염색체를 도입하는 것인, 마우스로부터의 인간 항체 생산을 입증하였다. 유럽 특허 출원 번호 773 288 및 843 961(상기의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)를 참조한다. 추가로, 기린의 Tc 마우스와 메다렉스(Medarex) 미니유전자좌(Humab) 마우스를 교배시켜 얻은 결과물로서 KM™ 마우스를 생성하였다. 이들 마우스는 기린 마우스의 인간 IgH 트랜스염색체, 및 젠팜 마우스의 카파 쇄 트랜스진을 보유한다(문헌 [Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102)]).

인간 항체는 또한 시험관내 방법에 의해 유도될 수 있다. 적합한 예로는 파지 디스플레이(CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion(예전 Proliferon), Affimed), 리보좀 디스플레이(CAT), 효모 디스플레이 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

항체 제조

본원에 기술된 바와 같이, 항체는 하기 기술하는 제노마우스^® 기술을 사용함으로써 제조하였다. 상기 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있고, 뮤린 면역글로불린 분자 및 항체 생산에는 결함을 가지고 있다. 상기를 달성하는 데 사용되는 기술은 본원 배경 기술 섹션에 개시되어 있는 특허, 출원, 및 참조 문헌에 개시되어 있다. 그러나, 특히, 마우스의 트랜스진 생산, 및 그로부터 유래된 항체에 대한 바람직한 실시양태는 미국 특허 출원 시리얼 번호 제08/759,620호(1996년 12월 3일 출원), 및 국제 특허 출원 번호 WO 98/24893(1998년 6월 11일 공개), 및 WO 00/76310(2000년 12월 21일 공개)(상기의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)에 개시되어 있다.

상기 기술을 사용함으로써 다양한 항원에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 제조하였다. 본질적으로, 제노마우스^® 계열의 마우스를 관심의 대상이 되는 항원(예를 들어, B7-H1)으로 면역화시키고, 림프계 세포(예를 들어, B-세포)를 과면역화된 마우스로부터 회수하고, 회수된 림프구를 골수형 세포주와 융합시켜 무한증식 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 관심의 대상이 되는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인한다. 본원에서는 B7-H1에 특이적인 항체를 생산하는 다중 하이브리도마 세포주를 생산하는 방법을 제공한다. 추가로, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 비롯한, 상기 세포주에 의해 생산된 항체의 특징 규명을 제공한다.

별법으로, 골수종 세포에 융합시켜 하이브리도마를 생성하는 대신, B 세포를 직접 분석할 수 있다. 예를 들어, CD19+ B 세포를 과면역 제노마우스^® 마우스로부터 단리하고, 항체 분비 혈장 세포로 증식 및 분화될 수 있도록 한다. 이어서, 세포 상등액으로부터의 항체를 B7-H1 면역원에 대한 반응성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝한다. 또한, B7-H1의 단편에 대한 면역반응성에 대해 상등액을 스크리닝하여 B7-H1 상의 작용상 관심의 대상이 되는 도메인에 대한 결합에 대해 상이한 항체의 정보를 추가로 찾아낸다. 또한, 항체를 다른 관련 인간 단백질 및 래트, 마우스, 비인간 영장류, 예를 들어, 사이노몰거스 원숭이, B7-H1의 오르토로그에 대해 스크리닝하여, 종간 교차 반응성을 측정할 수 있다. 관심의 대상이 되는 항체를 포함하는 웰로부터의 B 세포는 개체로부터 또는 풀링된 웰로부터 하이브리도마를 제조하는 융합을 비롯한 다양한 방법들에 의해, 또는 EBV에 의한 감염에 의해, 또는 공지의 무한증식 유전자에 의한 형질감염 후, 적절한 배지에 플레이팅함으로써 무한증식화될 수 있다. 별법으로, 이어서, 원하는 특이성을 가진 항체를 분비하는 단일 혈장 세포를 B7-H1 특이적인 용혈 플라크 분석법을 이용하여 단리한다(예를 들어, 문헌 [Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)] 참고). 용해를 위해 표적화된 세포는 B7-H1 항원으로 코팅된 양의 적혈구 세포(SRBC: sheep red blood cell)인 것이 바람직하다.

관심의 대상이 되는 면역글로불린 및 보체를 분비하는 혈장 세포를 포함하는 B 세포 배양물의 존재하에, 플라크 형성은 관심의 대상이 되는 혈장 세포 주변의 양의 적혈구 세포의 특이적인 B7-H1 매개성 용해를 나타낸다. 플라크 중심에 존재하는 단일 항원 특이성 혈장 세포가 단리될 수 있고, 항체의 특이성을 코딩하는 유전자 정보는 단일 혈장 세포로부터 분리된다. 역전사에 이어서 PCR(RT-PCR)를 이용하여, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 클로닝할 수 있다. 이어서, 상기와 같이 클로닝된 DNA를 추가로 적합한 발현 벡터, 바람직하게는 벡터 카세트, 예를 들어, pcDNA, 더욱 바람직하게는, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 포함하는 pcDNA 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이어서, 생성된 벡터를 숙주 세포, 예를 들어, HEK293 세포, CHO 세포로 형질감염시키고, 전사를 유도하거나, 형질변환체를 선별하거나, 또는 바람직한 서열들을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하도록 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.

이해하는 바와 같이, 본원에 기술된 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서도 발현될 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 서열을 이용하여 적합한 포유동물 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 바이러스(또는 바이러스 벡터) 내로 폴리뉴클레오티드를 패키징시키고, 숙주 세포에 바이러스(또는 벡터)를 형질도입시키는 것, 또는 미국 특허 번호 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호(상기 특허는 본원에 참고로 포함된다)에 예시화된 것과 같은 당업계에 공지된 형질감염 방법에 의한 것을 비롯한, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내로 도입시키기 위한 임의의 공지 방법에 의해 형질전환시킬 수 있다. 사용되는 형질전환 방법은 형질전환시키고자 하는 숙주에 따라 달라진다. 포유동물 세포 내로 이종성 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 이러한 방법으로는 덱스트란 매개성 형질감염, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌 매개성 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀 내로의 폴리뉴클레오티드의 캡슐화 및 DNA의 핵내로의 직접적인 미세주입을 포함한다.

발현용 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 주지되어 있으며, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포암종 세포(예를 들어, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포 및 다른 세포주 다수를 포함하나, 이에 한정되지 않는, NCIMB로부터 이용가능한 무한증식 세포주 다수를 포함한다. 어떤 세포주가 고발현 수준을 가지는지, 및 구성적 B7-H1 결합 특성을 가진 항체를 생산하는지를 측정함으로써 특히 바람직한 세포주를 선별할 수 있다.

세포-세포 융합 기법에서, 임의의 원하는 이소타입을 가진 중쇄를 보유하는 골수종, CHO 세포 또는 다른 세포주가 제조되고, 경쇄를 보유하는 또 다른 골수종, CHO 세포 또는 다른 세포주가 제조된다. 이후, 상기 세포들은 융합될 수 있고, 무손상 항체를 발현하는 세포주가 단리될 수 있다.

따라서, 상기에서 논의된 바와 같이 원하는 "구조적" 속성을 충족하는 항체 후보물질이 생성되는 바, 일반적으로 이소타입 전환을 통하여 최소한 특정의 원하는 "기능적" 속성을 가지는 항체들을 제공할 수 있다.

항체 서열

본 발명의 실시양태는 하기 표 1에 열거된 항체를 포함한다. 이 표에는 상응하는 중쇄 및 경쇄 유전자의 가변 도메인 및 폴리펩티드의 서열 번호와 함께, 항체의 식별 번호가 각각 기재되어 있다. 각 항체 서열은 식별 번호로 제공된다.

mAb ID 번호:	서열	서열 번호
2.7A4	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	1
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	2
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	6
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	7
2.9D10	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	11
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	12
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	16
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	17
2.14H9	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	21
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	22
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	26
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	27
2.20A8	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	31
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	32
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	36
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	37
3.15G8	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	41
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	42
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	46
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	47
3.18G1	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	51
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	52
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	56
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	57
2.7A4OPT	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	61
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	62
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	66
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	67
2.14H9OPT	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	71
	중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	72
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열	76
	경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열	77

치료적 투여 및 제제

본 발명의 실시양태는 질환 치료에 유용한 항B7-H1 항체의 멸균 약학 제형을 포함한다. 상기와 같은 제제는 B7-H1이 하나 이상의 그의 동족 리간드에 결합하는 것을 억제함으로써, 예를 들어, 혈청 또는 조직 B7-H1이 비정상적으로 상승된 상태인 병리학적 병태를 치료할 것이다. 본 발명의 항체는 바람직하게 B7-H1 활성을 잠재적으로 억제할 수 있거나, B7-H1이 하나 이상의 그의 동족 리간드에 결합하는 것을 억제할 수 있는 적절한 친화도를 보유하며, 바람직하게는 인간에 빈번하지 않게 투약할 수 있도록 하는 적절한 작용 지속 시간을 가진다. 장기화된 작용 지속 시간을 통해 대체 비경구 경로, 예를 들어, 피하 또는 근육내 주사에 의해 덜 빈번하고 더욱 용이한 투약 스케줄을 가질 수 있을 것이다.

예를 들어, 항체의 동결건조 또는 재구성 이전 또는 이후에 멸균 필터 막을 통하과시키는 여과에 의해 멸균 제제를 제조할 수 있다. 항체는 보통 동결건조된 형태로 또는 용액으로 보관될 것이다. 치료적 항체 조성물을 일반적으로 멸균 접속 포트를 가지는 용기, 예를 들어, 제제 회수를 위한 어댑터, 예를 들어, 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는 마개가 있는 바이알 정맥내 투여 용액 백 또는 바이알에 넣는다.

항체의 투여 경로는 공지 방법에 따르는데, 예를 들어, 정맥, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 경막내 주사 또는 주입, 흡입 또는 병소내 경로, 종양 부위에 직접 주사 또는 하기에서 명시된 지속 방출형 시스템을 이용한 주사 또는 주입이 될 수 있다. 항체는 바람직하게는 주입 또는 볼루스 주사에 의해 연속적으로 투여된다.

치료적으로 사용되는 항체의 유효량은 예를 들어, 치료 대상, 투여 경로, 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 요법사는 최적의 치료 효과를 얻는데 필요한 투여량을 적정하고, 투여 경로를 변형시키는 것이 바람직하다. 전형적으로, 임상의는 투여량이 원하는 효과를 발휘할 때까지 항체를 투여할 것이다. 이와 같은 요법의 진행은 종래 분석 또는 본원에 기술된 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.

본원에 기술된 항체는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합물로 제조될 수 있다. 이러한 치료적 조성물은 정맥내로, 또는 코 또는 폐를 통해, 바람직하게는 액상 또는 분말 에어로졸(동결건조된 형태)로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 원하는 바에 따라 비경구적으로 또는 피하로 투여될 수 있다. 전신 투여될 경우, 치료적 조성물은 멸균성이고, 발열성 물질을 함유하지 않으며 pH, 등장성, 및 안정성을 고려하여 비경구적으로 허용되는 용액 중에 포함되어야 한다. 이러한 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 간략하면, 본원에 기술된 화합물의 투약 제제는 바람직한 순도를 가진 화합물과 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 혼합함으로써 보관 또는 투여용으로 제조된 것이다. 상기 물질은 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 이는 완충액, 예를 들어, TRIS HCl, 인산염, 시트르산염, 아세트산염 및 다른 유기 산 염; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산; 저분자량(약 10개 잔기 미만의) 펩티드, 예를 들어, 폴리아르기닌, 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민산, 아스파르트산 또는 아르기닌; 단당류, 이당류, 및 셀룰로스 또는 그의 유도체, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 비롯한 다른 당질; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당 알콜, 예를 들어, 만닛톨 또는 소르비톨; 카운터이온, 예를 들어, 나트륨 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 트윈(TWEEN), 플루로닉스(PLURONICS) 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.

주사용 멸균 조성물은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20^th ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)]에 기술된 바와 같이, 종래 제약 관행에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 비히클, 예를 들어, 물 또는 천연적으로 발생된 식물성 오일, 예로서, 참깨유, 땅콩유, 또는 면실유 또는 합성 지방 비히클, 예로서, 에틸 올레이트 등에 활성 화합물을 용해 또는 현탁시키는 것이 바람직할 수 있다. 완충액, 보존제, 항산화제 등을 허용된 제약 관행에 따라 혼입할 수 있다.

지속 방출형 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드를 포함하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 이때 매트릭스는 모양을 갖춘 물품, 필름, 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 문헌 ([Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277] 및 [Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105])에 기술된 것과 같은 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트, 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 번호 제3,773,919호, EP 58,481), L-글루타민산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(문헌 [Sidman et al., Biopolymer (1983) 22:547-556]), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(문헌 [Langer et al., 상기 문헌 동일]), 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, 루프론 데포(LUPRON Depot)™(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프로리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)을 포함한다.

중합체, 예를 들어, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 동안에 걸쳐 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 장시간 동안 체내 남아 있을 경우, 37℃에서 수분에의 노출 결과로서 상기 단백질은 변성되거나 응집될 수 있고, 이로 인해 생물학적 활성은 손실되고, 면역원성에도 변화가 일어날 수 있다. 관여하는 기전에 따라 단백질 안정화를 위한 합리적인 전략법이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 이황화 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우, 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하여 특이 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화시킬 수 있다.

지속 방출형 조성물은 또한 현탁액에서 결정을 유지시킬 수 있는 적절한 제형내 현탁된 항체 결정 제제를 포함한다. 이러한 제제는 피하 또는 복강내로 주사되었을 때, 지속 방출형 효과를 나타낼 수 있다. 다른 조성물은 또한 리포좀내에 포획된 항체를 포함한다. 상기와 같은 항체를 포함하는 리포좀은 공지 방법에 따라 제조된다: (문헌 (미국 특허 번호 DE 3,218,121; [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324).

주어진 환자에 제공되는 항체 제제의 투여량은 질환의 중증도 및 유형, 체중, 성별, 식이, 투여 기간 및 경로, 다른 약물 처치 및 다른 관련 임상적 인자들을 비롯한, 약물 작용을 변형시키는 것으로 공지된 다양한 인자들을 고려하여 담당의에 의해 결정될 수 있을 것이다. 치료상 유효한 투여량은 시험관내 또는 생체내 방법에 의해 결정될 수 있다.

본원에 기술된, 치료적으로 사용되는 항체의 유효량은 예를 들어, 치료 대상, 투여 경로, 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 요법사는 최적의 치료 효과를 얻는데 필요한 투여량을 적정하고, 투여 경로를 변형시키는 것이 바람직하다. 상기 언급된 인자들에 따라, 환자의 체중당 전형적인 일일 투여량 범위는 약 0.0001 mg/kg, 0.001 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg 내지 최대 100 mg/kg, 1,000 mg/kg, 10,000 mg/kg일 수 있다. 상기 언급된 인자들에 따라, 투여량은 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg 사이, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg 사이, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg 사이, 0.0001 내지 2 mg/kg 사이, 0.0001 내지 1 mg/kg 사이, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg 사이, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg 사이, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg 사이, 0.0001 내지 0.15 mg/kg 사이, 0.0001 내지 0.10 mg/kg 사이, 0.001 내지 0.5 mg/kg 사이, 0.01 내지 0.25 mg/kg 사이 또는 0.01 내지 0.10 mg/kg 사이일 수 있다. 전형적으로, 임상의는 투여량이 원하는 효과를 발휘할 때까지 치료적 항체를 투여할 것이다. 이와 같은 요법의 진행은 종래 분석 또는 본원에 기술된 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.

본 발명의 항체의 용량은 반복될 수 있고, 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3 개월 이상, 또는 6개월 이상의 간격을 두고 진행될 수 있다.

본원에 기술된 조성물 및 방법에 따른 치료적 엔티티의 투여는 적합한 담체, 부형제 및 개선된 수송, 전달, 내성 등을 제공하는 제형 내로 도입되는 다른 물질과 함께 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 제형은 예를 들어, 분제, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질들, 지질(양성 또는 음성) 함유 소포체(예를 들어, 리포펙틴(Lipofectin)™), DNA 컨쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형 겔, 카르보왁스를 포함하는 반고형 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물 중 임의의 것들은 제형내 활성 성분이 제형에 의해 비활성화되지 않고, 제형은 생리학적으로 양립되며, 그리고 투여 경로에 내성을 가진다면, 본 발명에 따른 치료 및 치료법에 적절할 수 있다. 제약 화학자들에게 주지된 제형, 부형제, 및 담체 관련된 추가 정보를 위해 문헌 ([Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)], [Wang W. "Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)], [Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000)], [Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 그에 인용된 문헌을 참조한다.

다른 치료제의 디자인 및 생성

본 발명에 따라, 및 B7-H1과 관련하여 제조되고 특징이 규명된 항체의 활성에 기초하여, 항체 부분 이외의 다른 치료적 양식의 디자인을 촉진시키고, 당업자에게 개시한다. 이러한 양식으로는, 제한없이, 고급 항체 치료제, 예를 들어, 이중특이성 항체, 면역독소 및 방사성 표지된 치료제, 단일 항체 V 도메인, V 영역 스캐폴드 이외의 것에 기초한 항체 유사 결합제, 단일 도메인 항체, 펩티드 치료제 생성, 신규 스캐폴드의 B7-H1 결합 도메인, 유전자 치료법, 특히 인트라바디, 안티센스 치료제 및 소형 분자를 포함한다.

항원 결합 부위는 비항체 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등에 CDR을 배열하거나(문헌 ([Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6]; [Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284:1141-1151]; [Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469])), 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하기 위해 단백질 스캐폴드내 루프의 아미노산 잔기를 무작위화하거나, 돌연변이화시킴으로써 제공될 수 있다. 단백질 중 신규한 결합 부위를 공학처리하기 위한 스캐폴드는 문헌 [Nygren et al. (Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469)]에 상세하게 리뷰되어 있다. 항체 모방체에 대한 단백질 스캐폴드는 WO/0034784(상기 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)(여기서, 발명자들은 1 이상의 무작위화된 루프를 가진 피브로넥틴 III형 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 기술하였다)에 개시되어 있다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어, HCDR이 이식되는 데 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리의 임의의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비인간 단백질일 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드의 이점은 적어도 일부 항체 분자보다는 더 작은 스캐폴드 분자의 항원 결합 부위를 제공할 수 있고/거나, 더 쉽게 제조할 수 있다는 점이다. 크기가 작은 결합 구성원은 생리학적 특성, 예를 들어, 세포내로 진입할 수 있는 능력, 조직 내로 깊숙이 침투할 수 있거나, 다른 구조내의 표적에 도달할 수 있는 능력, 표적 항원의 단백질 공간내 결합할 수 있는 능력을 부여할 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드의 항원 결합 부위를 사용하는 것은 문헌 [Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004]에 리뷰되어 있다. 안정적인 골격과 하나 이상의 가변 루프를 가지는 단백질이 전형적인데, 여기서, 루프 또는 루프들의 아미노산 서열을 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이화시켜 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 생성할 수 있다. 그러한 단백질로는 S. 아우레우스(S. aureus)로부터의 단백질 A의 IgG 결합 도메인, 트랜스페린, 알부민, 테트라넥틴, 피브로넥틴(예를 들어, 10번째 피브로넥틴 III형 도메인), 리포칼린 뿐만 아니라, 감마 결정질 및 다른 어필린(Affilin)™ 스캐폴드(Scil Proteins)를 포함한다. 다른 접근법의 예로는 분자내 이황화 결합을 가진 소형 단백질인 시클로티드에 기초한 합성 "미소체," 미소단백질(베르사바디(Versabodies)™, Amunix) 및 안키린 반복 단백질(DARPins, Molecular Partners)을 포함한다.

항체 서열 및/또는 항원 결합 부위 이외에도, 본 발명에 따른 표적화된 결합 물질은 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 폴딩된 도메인을 형성하거나, 또는 항원에 결합할 수 있는 능력 이외에도 또 다른 작용성의 특징을 분자에 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 표적화된 결합 물질은 검출가능한 표지를 보유할 수 있거나, (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통해) 독소 또는 표적 부분 또는 효소에 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 표적화된 결합 물질은 (예를 들어, 효소 도메인 중) 촉매 부위 뿐만 아니라, 항원 결합 부위를 포함하며, 여기서, 항원 결합 부위는 항원에 결합함으로써 촉매 부위를 항원에 표적화시킬 수 있다. 촉매 부위는 예를 들어, 절단에 의해 항원의 생물학적 기능을 억제할 수 있다.

보체 고정이 바람직하게 기여하는 경우에서, 고급 항체 치료제의 생성과 관련하여, 이중특이성 항체, 면역독소 또는 방사성 표지를 사용하여 세포 사멸에 대한 보체 의존성을 피할 수 있다.

예를 들어, (i) 하나는 B7-H1에 특이적이고, 또 다른 하나는 제2 분자에 특이적인 것으로서, 서로 컨쥬게이션된 두 항체, (ii) B7-H1에 특이적인 제1 쇄 및 제2 분자에 특이적인 제2 쇄를 가진 단일 항체, 또는 (iii) B7-H1 및 다른 분자에 특이성을 가진 단일 쇄 항체를 포함하는 이중특이성 항체가 생성될 수 있다. 이러한 이중특이성 항체는 주지된 기법을 이용하여 생성할 수 있는데; 예를 들어, (i) 및 (ii)와 관련하여, 예를 들어, 문헌 ([Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994)] 및 [Wright and Harris, 상기 문헌 동일])을 참조할 수 있고, (iii)과 관련하여, 예를 들어, 문헌 [Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)]를 참조할 수 있다. 각각의 경우, 제2 특이성은 원하는 바에 따라 형성될 수 있다. 예를 들어, 제2 특이성은 제한없이 CD16 또는 CD64(예를 들어, 문헌 [Deo et al. Immunol. Today 18:127 (1997)] 참조) 또는 CD89(예를 들어, 문헌 [Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)] 참조)를 비롯한 중쇄 활성화 수용체에 대해 형성될 수 있다.

항체는 또한 당업계에 주지된 기법을 사용함으로써 면역독소로서 작용할 수 있도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)]을 참조한다. 또한, 미국 특허 번호 제5,194,594호도 참조할 수 있다. 방사성 표지된 항체 제조와 관련하여, 상기 변형된 항체는 또한 당업계에 주지된 기법을 사용함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)]을 참조한다. 또한, 미국 특허 번호 제4,681,581호, 제4,735,210호, 제5,101,827호, 제5,102,990호(RE 35,500), 제5,648,471호, 및 제5,697,902호를 참조한다. 각 면역독소 또는 방사성 표지된 분자는 다량체 효소 서브유니트 올리고머화 도메인을 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있을 것이다.

항체가 제제(예를 들어, 방사성 동위 원소, 약학 조성물 또는 독소)에 연결되어 있을 때, 상기 제제는 세포분열 억제제, 알킬화제, 대사길항 물질, 항혈관신생제, 아포프토시스제, 알칼로이드제, COX-2, 및 항생제 및 그의 조합으로 이루어진 군에서 선택된, 제약 특성을 보유하는 것으로 간주된다. 제제는 질소 머스터드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로조우레아, 트리아젠, 엽산 유사체, 안트라시클린, 탁산, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 대사길항 물질, 항생제, 효소, 에피포도필로톡신, 백금 배위 복합체, 빈카 알칼로이드, 치환된 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질 억제제, 길항제, 엔도스타틴, 탁솔, 캄포테신, 옥살리플라틴, 독소루비신 및 그의 유사체 및 그의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 독소의 예로는 추가로 겔로닌, 슈도모나스 외독소(PE), PE40, PE38, 디프테리아 독소, 리신, 아브린, 알파 독소, 사포린, 리보뉴클레아제(RN아제), DN아제 I, 스타필로코커스(Staphylococcal) 엔테로독소 A, 포크위드 항바이러스 단백질, 겔로닌, 슈도모나스 내독소, 칼리케마이신 및 에스페라마이신과 같은 엔다이인 패밀리 분자 구성원 뿐만 아니라, 그의 유도체, 조합 및 변형을 포함한다. 화학적인 독소는 듀오카르마이신(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,703,080호 및 미국 특허 번호 제4,923,990호 참조), 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜파란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스 백금, 에토포시드, 블레오마이신 및 5-플루오로우라실로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 화학요법제의 예로는 또한 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드(Ara-C), 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소테레(독세탁셀), 부술판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜파란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미토산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라마이신(미국 특허 번호 제4,675,187호 참조), 멜파란 및 기타 관련 질소 머스타드를 포함한다. 적합한 독소 및 화학요법제는 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)] 및 [Goodman And Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)]에 기술되어 있다. 다른 적합한 독소 및/또는 화학요법제는 당업자에게 공지되어 있다.

방사성 동위 원소의 예로는 국소화 및/또는 요법에 이용될 수 있는 감마 방사체, 양전자 방사체, 및 x 선 방사체, 및 요법에 이용될 수 있는 베타 방사체 및 알파 방사체를 포함한다. 진단, 예후 및 병기 분류에 유용한 것으로 이미 언급된 방사성 동위 원소 또한 치료제로 유용하다.

항암제 또는 항백혈병제의 비제한적인 예로는 안트라시클린, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신(다우노마이신), 이다루비신, 데토루부신, 카르미노마이신, 에피루비신, 에소루비신 및 모르폴리노 및 치환된 유도체, 그의 조합 및 변형을 포함한다. 예시적인 약학 제제로는 시스 백금, 탁솔, 칼리케아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파미드, 프레드니손, 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로미드, 탈리도미드, 및 블레오마이신 및 그의 유도체, 조합 및 변형을 포함한다. 바람직하게는, 항암제 또는 항백혈병제는 독소루비신, 모르폴리노독소루비신 또는 모르폴리노다우노루비신이다.

본 발명의 항체는 또한 포유동물, 바람직하게는 인간에서 비변형된 항체의 것보다 큰 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 가지는 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체 반감기는 약 15일 초과, 약 20일 초과, 약 25일 초과, 약 30일 초과, 약 35일 초과, 약 40일 초과, 약 45일 초과, 약 2개월 초과 약 3개월 초과 약 4개월 초과, 또는 약 5개월 초과이다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 반감기 증가는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 혈청 역가를 증가시키고, 이로써, 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고/거나, 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 줄일 수 있게 한다. 생체내 증가된 반감기를 가지는 항체들 또는 이의 단편들은 본 기술 분야에 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있다. 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 그의 단편은 당업자에게 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 그의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여한다고 확인된 아미노산 잔기를 변형(예를 들어, 치환, 결실, 또는 부가)시킴으로써 생성될 수 있다(예를 들어, 국제 공개 번호 WO 97/34631 및 WO 02/060919(이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다) 참조). 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 그의 단편은 상기 항체 또는 항체 단편에 중합체 분자, 예를 들어, 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 부착시킴으로써 생성될 수 있다. PEG는 상기 항체 또는 항체 단편의 N 또는 C 말단에 PEG를 부위 특이적으로 컨쥬게이션시킴으로써, 또는 리신 잔기에 존재하는 입실론 아미노기를 통하여 다중작용성 링커의 존재 또는 부재하에 상기 항체 또는 항체 단편에 부착될 수 있다. 생물학적 활성을 최소로 손실시키는 선형 또는 분지형 중합체 유도화가 사용될 것이다. PEG 분자가 항체에 적절하게 컨쥬게이션될 수 있도록 하기 위해 SDS-PAGE 및 질량 분석법을 통해 컨쥬게이션 정도를 면밀히 모니터할 수 있을 것이다. 비반응 PEG는 예를 들어, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 컨쥬게이트로부터 분리될 것이다.

당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 상기 실시양태에서, 친화도 값이 중요할 수 있지만, 항체의 특정 기능에 따라 다른 인자 또한 그만큼 또는 그 이상으로 중요할 수 있다. 예를 들어, 면역독소(항체와 회합된 독소)의 경우, 항체의 표적에 대한 결합 작용이 유용할 수 있지만; 일부 실시양태에서는, 독소를 세포내로 내재화시키는 것이 바람직한 최종 결과이다. 따라서, 이러한 상황하에서는 내재화율(%)이 높은 항체가 바람직할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 내재화 효율(%)이 높은 항체가 고려된다. 높은 내재화 효율(%)은 내재화된 항체의 비율(%)로서 측정될 수 있고, 낮은 수치부터 100% 까지 될 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 0.1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99, 및 99-100%가 고효율이 될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 바람직한 효율은 다른 실시양태에서, 예를 들어, 관련된 제제, 부위로 투여될 수 있는 항체의 양, 항체-제제 복합체의 부작용, 치료하고자 하는 문제의 유형(예를 들어, 암 유형) 및 중증도에 따라 차이를 보일 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 B7-H1의 발현 변화와 관련된 질환 또는 질병을 스크리닝하기 위해 포유동물의 조직 또는 세포에서 B7-H1 발현을 검출하는 분석용 키트를 제공한다. 키트는 B7-H1에 결합하는 항체, 및 존재할 경우, 항원과 항체의 반응을 지시하는 수단을 포함한다.

일부 실시양태에서, B7-H1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물, 및 조성물이 B7-H1 발현에 의해 매개되는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 인서트 또는 라벨을 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 바람직하게, 포유동물, 및 더욱 바람직하게, 인간이 B7-H1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공받는다.

병용법

본원에서 정의된 항종양 치료법은 단독 요법으로서 적용될 수 있거나, 또는 본 발명의 화합물 이외에도, 통상적인 외과술, 골수 및 말초 줄기 세포 이식, 또는 방사능요법 또는 화학요법을 포함할 수 있다. 이와 같은 화학요법은 다음 범주의 항종양제 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

(i) 의료 종양학에서 사용되는, 다른 항증식성/항신생물성 약물 및 그의 조합물, 예를 들어, 알킬화제(예를 들어, 시스-플라틴, 옥살플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜파란, 클로람부실, 부술판, 테모졸아미드 및 니트로조우레아); 대사길항 물질(예를 들어, 겜시타빈, 항엽산제, 예를 들어, 플루오로피리미딘, 예로서, 5-플루오르우라실 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드 및 히드록시우레아); 항종양 항생제(예를 들어, 안트라시클린, 예로서, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 세포분열 억제제(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 예로서, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈 및 탁소이드, 예로서, 탁솔 및 탁소테레 및 폴로키나제 억제제); 및 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 에피포도필로톡신, 예로서, 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸 및 캄포테신);

(ii) 세포증식 억제제, 예를 들어, 항에스트로겐(예를 들면, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 랄옥시펜, 드롤로옥시펜, 및 이도옥시펜), 항안드로겐(예를 들면, 비칼루타미드, 플루타미드, 니루타미드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 효현제(예를 들면, 고세레린, 루프로렐린 및 부세렐린), 프로게스토겐(예를 들어, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및 5α-리덕타제 억제제, 예를 들어, 피나스테리드;

(iii) 항침투제(예를 들면, c-Src 키나제 패밀리 억제제, 예로서, 4-(6-클로로-2,3-메틸렌디옥시아닐리노)-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]-5-테트라히드로피란-4-일옥시퓌나졸린(AZD0530; 국제 특허 출원 WO 01/94341) 및 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-{6-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]-2-메틸피리미딘-4-일아미노}티아졸-5-카르복스아미드(다사티닙, BMS-354825; 문헌 [J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661]), 및 메탈로프로테이나제 억제제, 마리마스타트, 유로키나제 플라스미노겐 활성인자 수용체 작용 억제제, 카텝신 활성 억제제, 세린 프로테아제 억제제, 예를 들어, 마트리프타제, 헵신, 유로키나제, 인테그린 αvβ6 작용 억제제;

(iv) 세포독성제, 예를 들어, 플루다라빈, 2-클로로데옥시아데노신, 클로람부실 또는 독소루비신 및 그의 조합, 예를 들어, 플루다라빈 + 시클로포스파미드, CVP: 시클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손, ACVBP: 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 빈데신 + 블레오마이신 + 프레드니손, CHOP: 시클로포스파미드 + 독소루비신 + 빈크리스틴 + 프레드니손, CNOP: 시클로포스파미드 + 미톡산트론 + 빈크리스틴 + 프레드니손, m-BACOD: 메토트렉세이트 + 블레오마이신 + 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 덱사메타손 + 루코보린, MACOP-B: 메토트렉세이트 + 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손 고정 용량 + 블레오마이신 + 루코보린, 또는 ProMACE CytaBOM: 프레드니손 + 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 에토포시드 + 시타라빈 + 블레오마이신 + 빈크리스틴 + 메토트렉세이트 + 루코보린.

(v) 성장 인자 기능 억제제: 예를 들어, 상기와 같은 억제제로는 성장 인자 항체 및 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 항erbB2 항체 트라스투주맙[허셉틴(Herceptin)™], 항EGFR 항체 파니투무맙, 항erbB1 항체 세툭시맙[에르비툭스(Erbitux), C225] 및 문헌 [Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp 11-29]에 개시되어 있는 임의의 성장 인자 또는 성장 인자 수용체 항체를 포함하고; 상기와 같은 억제제로는 또한 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, 표피 성장 인자 패밀리 억제제(예를 들어, EGFR 패밀리 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(게피티닙, ZD 1839), N- (3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(에를로티닙, OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린-4-아민(CI 1033), erbB2 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, 라파티닙, 간세포 성장 인자 패밀리 억제제, 혈소판 유래 성장 인자 패밀리 억제제, 예를 들어, 이마티닙, 세린/트레오닌 키나제 억제제(예를 들어, Ras/Raf 신호전달 억제제, 예를 들어, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 예를 들어, 소라페닙(BAY 43-9006)), MEK 및/또는 AKT 키나제를 통한 세포 신호전달 억제제, 간세포 성장 인자 패밀리 억제제, c-kit 억제제, ab1 키나제 억제제, IGF 수용체(인슐린 유사 성장 인자) 키나제 억제제; 오로라 키나제 억제제(예를 들어, AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 및 AX39459) 및 시클린 의존성 키나제 억제제, 예를 들어, CDK2 및/또는 CDK4 억제제, 및 생존 신호전달 단백질 억제제, 예를 들어, Bcl-2, Bcl-XL, 예를 들어, ABT-737을 포함하고;

(vi) 항혈관신생제, 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자의 효과를 억제하는 것들[예를 들어, 항혈관 내피 세포 성장 인자 항체, 베바시주맙(아바스틴(Avastin)™) 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474; 예를 들어 WO 01/32651의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린(AZD2171; WO 00/47212의 실시예 240), 바탈라닙(PTK787; WO 98/35985) 및 SU11248(수니티닙; WO 01/60814), 국제 특허 출원 W097/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO 0O/47212 및 WO 01/32651에 개시되어 있는 화합물, 항혈관 내피 성장 인자 수용체 항체, 예를 들어, 항KDR 항체 및 항flt1 항체) 및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물(예를 들어, 리노미드, 인테그린 ανβ3 기능 및 안지오스타틴 억제제)] 또는 콜로니 자극 인자 1(CSF1: colony stimulating factor 1) 또는 CSF1 수용체(AZD2171에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌 [Wedge et al (2005) Cancer Research. 65(10):4389-400]에서 살펴볼 수 있다. AZD6474에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌 [Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cancer. 92 Suppl 1:S6-13]에서 살펴볼 수 있다. 상기 두 공개 문헌들 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다;

(vii) 혈관 손상제, 예를 들어, 콤브레타스타틴 A4 및 국제 특허 출원 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213에 개시된 화합물;

(viii) 안티센스 요법, 예를 들어, 상기 열거한 표적에 대한 것들, 예를 들어, ISIS 2503, 항ras 안티센스 또는 G3139(Genasense), 항bcl2 안티센스;

(ix) 유전자 요법 접근법, 예를 들어, 이상 유전자 예를 들어, 이상 p53 또는 이상 BRCA1 또는 BRCA2 를 교체하기 위는 접근법, GDEPT(유전자 유도 효소 프로드럭 요법: gene-directed enzyme pro-drug therapy) 접근법, 예를 들어, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 세균 니트로리덕타제 효소를 사용하는 방법 및 화학요법 및 방사선 요법에 대한 환자 내성을 증가시키기 위한 접근법, 예를 들어, 다중 약물 내성 유전자 요법을 포함하는 유전자 요법 접근법;

(x) 면역요법 접근법, 예를 들어, 알렘투주맙(캠패스-1H™), CD52에 대한 모노클로날 항체를 사용한 치료, 또는 CD22에 대한 항체를 사용한 치료, 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키기 위한 생체외 및 생체내 접근법, 사이토카인, 예를 들어, 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자를 이용한 형질감염, T 세포 무반응 감소를 위한 접근법, 예를 들어, CTLA-4 기능을 억제하는 모노클로날 항체를 이용한 치료법, 형질감염된 면역 세포, 예를 들어, 사이토카인 형질감염 수지상 세포를 이용한 접근법, 사이토카인 형질감염된 종양 세포주를 이용한 접근법 및 항이디오타입 항체를 이용한 접근법, 생체외에서 관심의 대상이 되는 특이 항원에 대해 비특이적으로 활성화되거나, 표적화된 T 세포를 사용한 입양 T 세포 전달을 포함하는 면역요법 접근법;

(xi) 백신화 접근법, 예를 들어, 특이 바이러스 감염, 예를 들어, HIV 또는 HBV에 대한 백신을 사용한 치료법, 또는 특이 종양 항원에 대한 백신을 사용한 치료법을 포함한 백신화 접근법;

(xii) 단백질 분해 억제제, 예를 들어, 프로테아좀 억제제, 예를 들어, 벨카데(Velcade)(보르테조미드(bortezomid)); 및

(xiii) 생체요법적 치료적 접근법, 예를 들어, 수용체 리간드를 격리시키고, 수용체에의 리간드 결합을 차단하거나, 수용체 신호전달을 감소시키는 (예를 들어, 수용체 분해의 증진 또는 발현 수준 저하에 기인) 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 항체 또는 가용성 외부 수용체 도메인 구조)을 이용하는 것을 포함하는 방법.

한 실시양태에서, 본원에서 정의된 항종양 치료법은 본 발명의 화합물 이외에도 의료 종양학에서 사용되는, 다른 항증식성/항신생물성 약물 및 그의 조합물, 예를 들어, 알킬화제(예를 들어, 시스-플라틴, 옥살플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜파란, 클로람부실, 부술판, 테모졸아미드 및 니트로조우레아); 대사길항 물질(예를 들어, 겜시타빈, 항엽산제, 예를 들어, 플루오로피리미딘, 예로서, 5-플루오르우라실 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드 및 히드록시우레아); 항종양 항생제(예를 들어, 안트라시클린, 예로서, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 세포분열 억제제(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 예로서, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈 및 탁소이드, 예로서, 탁솔 및 탁소테레 및 폴로키나제 억제제); 및 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 에피포도필로톡신, 예로서, 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸 및 캄포테신)를 이용한 치료법을 포함할 수 있다.

이러한 공동 치료법은 치료의 개별 성분을 동시 투약, 연속 투약 또는 별개로 투약함으로써 달성될 수 있다. 이러한 배합 생성물은 상기 기술된 용량 범위 내에서 본 발명의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 승인된 용량 범위 내의 다른 약학적 활성 제제를 사용한다.

실시예

수행한 실험 및 얻은 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 설명을 위한 목적으로 제공된 것이며, 본원에서 개시한 것을 한정하는 것으로서 해석되서는 안 된다.

실시예 1: 재조합 인간 B7-H1의 발현

중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 사용하여 이미지(Image) 클론 7262208(ATCC)로부터 인간 B7-H1 cDNA(문헌 [Dong, H. et al., 1999, Nat. Med. 5:1365-1369])를 증폭시킨 후, pcr3.1Bid 벡터의 Nhe 1 및 EcoR1 부위 내로 클로닝하였다. 상기 구조물을 CHO 세포(American Type Tissue Collection, 카탈로그 번호 CCL-61)로 리포펙션시키고, 형광 활성 세포 분류(FACS: fluorescent activated cell sorting) 분석에 의해 세포 표면상의 발현에 대해 확인하였다.

인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 인간 B7-H1의 세포외 도메인(아미노산 잔기 1-239)은 R&D 시스템즈 인크.(R&D Systems Inc.)(카탈로그 번호 156-B7-100)로부터 구입하였다.

실시예 2: 면역화 및 적정

면역화

제노마우스^® 마우스(제노마우스 계통: XMG2(IgG2 카파/람다) 및 XMG4(IgG4 카파/람다) Amgen, Inc. Vancouver, British Columbia, Canada)를 5-10 ㎍의 B7-H1/Fc 키메라 단백질 또는 실시예 1에 기술된 재조합 인간 B7-H1을 발현하는, 1-2x10⁶개의 CHO 세포로 연속적으로 면역화시켜 인간 B7-H1에 대한 모노클로날 항체를 발생시켰다.

미국 특허 출원 시리얼 번호 제08/759,620호(1996년 12월 3일 출원), 및 국제 특허 출원 번호 WO 98/24893(1998년 6월 11일 공개), 및 WO 00/76310(2000년 12월 21일 공개)(상기의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 방법에 따라 면역화를 수행하였다. 면역화 프로그램은 하기 표 2에 요약되어 있다.

역가에 의한 수거물에 대한 동물 선별

ELISA 분석법을 사용하여 면역화된 마우스로부터 유래된 혈청 중 항체의 역가를 측정하였다. 플레이트(Corning Costar, 카탈로그 번호 3368)를 인간 B7-H1/Fc 단백질(R&D Systems Inc., 카탈로그 번호 156-B7-100)로 코팅하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 염소 항마우스 IgG Fc 항체 및 마우스 항인간 IgG 항체를 사용하여 B7-H1 특이 항체를 검출하였다. 전형적으로, 림프구 단리 및 하이브리도마 생성을 위해 각 면역화 코호트 내에서 역가가 가장 높은 동물 5마리를 선별하였다.

면역화 프로그램에 관한 요약
군	면역원	계통	마우스 수	면역화 경로
1	재조합 인간 B7-H1/Fc 단백질	IgG2	10	IP/SC, 2회/wk, 5주 동안
2	재조합 인간 B7-H1/Fc 단백질	IgG4	10	IP/SC, 2회/wk, 5주 동안
3	인간 B7-H1을 발현하는 CHO 세포	IgG2	10	IP/SC, 2회/wk, 5주 동안
4	인간 B7-H1을 발현하는 CHO 세포	IgG4	10	IP/SC, 2회/wk, 5주 동안
"IP"는 "복강내"를 의미하고, "SC"는 "피하"를 의미한다.

실시예 3: 림프구 회수, B 세포 단리, 하이브리도마 융합 및 생성

경추 탈골에 의해 면역화된 마우스를 희생시키고, 배출되는 림프절을 수거하고, 각 코호트로부터 풀링하였다. DMEM 중에서 분쇄시켜 조직으로부터 세포를 유리시킴으로써 림프구양 세포를 해리시키고, 세포를 DMEM 중에 현탁시켰다. 세포를 계수하고, 1x10⁸개의 림프구당 0.9 ml DMEM을 세포 펠릿에 첨가하여 세포를 완만히 그러나, 완전하게 재현탁시켰다. 1x10⁸개의 세포당 100 ㎕의 CD90+ 자기 비드를 사용하여, 4℃에서 15분 동안 세포를 자기 비드와 함께 인큐베이션시켜 세포를 표지하였다. 최대 10⁸개의 양성 세포(또는 최대 2x10⁹개의 전체 세포)를 함유하는 자기적으로 표지된 세포 현탁액을 LS+ 칼럼상에 로딩하고, 칼럼을 DMEM으로 세척하였다. CD90 음성 분획(이들 세포 대부분은 B 세포인 것으로 예상되었다)으로서 전체 유출액을 수집하였다.

상기로부터 얻은 세척시킨 농축된 B 세포와, ATCC(카탈로그 번호 CRL 1580)로부터 입수한 비분비성 골수종 P3X63Ag8.653 세포(문헌 [Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550])를 1:1의 비율로 혼합하여 융합을 수행하였다. 800 x g으로 원심분리하여 세포 혼합물을 완만히 펠릿화시켰다. 상등액을 완전히 제거한 후, 2분 이하의 시간 동안 2-4 mL의 프로나제(Pronase) 용액(CalBiochem, 카탈로그 번호 53702; PBS 중 0.5 mg/ml)으로 세포를 처리하였다. 이어서, 3-5 ml의 FBS를 첨가하여 효소 활성을 중단시키고, 전기 세포 융합 용액(ECFS, 0.3 M 수크로스, Sigma, 카탈로그 번호 S7903, 0.1 mM 아세트산 마그네슘, Sigma, 카탈로그 번호 M2545, 0.1 mM 아세트산 칼슘, Sigma, 카탈로그 번호 C4705)을 사용하여 현탁액의 총 부피를 40 ml로 조정하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고, 세포를 40 ml ECFS 중에 재현탁시켰다. 상기 세척 단계를 반복하고, 세포를 2x10⁶ 세포/ml의 농도로 다시 ECFS 중에 재현탁시켰다.

융합 발생기(모델 ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 전기 세포 융합을 수행하였다. 사용된 융합 챔버의 크기는 2.0 ml였고, 하기와 같이 기구를 설정하여 사용하였다:

· 정렬 조건: 전압: 50 V, 시간: 50 sec.

· 막 분해: 전압: 3000 V, 시간: 30 μsec.

· 융합 후 유지 시간: 3 sec.

ECF 후, 멸균 조건하에서 세포 현탁액을 융합 챔버로부터 주의하여 제거하고, 동일 부피의, L-글루타민, 펜/스트렙(pen/strep), OPI(옥살로아세테이트, 피루베이트, 소 인슐린)(모두 Sigma로부터 입수) 및 IL-6(Boehringer Mannheim)이 보충된, 하이브리도마 배양 배지(Hybridoma Culture Medium)(DMEM, JRH Biosciences), 15 % FBS(Hyclone)를 함유하는 멸균 튜브로 옮겼다. 세포를 37℃에서 15-30분 동안 인큐베이션시킨 후, 5분 동안 400 x g(1,000 rpm)로 원심분리시켰다. 세포를 소량의 하이브리도마 선별 배지(Hybridoma Selection Medium)(0.5xHA로 보충된 하이브리도마 배양 배지(Sigma, 카탈로그 번호 A9666))에 완만히 재현탁시키고, 최종적으로 96 웰 플레이트당 총 5x10⁶개의 B 세포 및 웰당 200 ㎕로 플레이팅하는 것에 기초하여 추가의 하이브리도마 선별 배지를 사용하여 부피를 적절히 조정하였다. 세포를 완만히 혼합하고, 96 웰 플레이트로 피펫팅하고, 성장시켰다. 7 또는 10일째, 배지의 절반을 제거하고, 하이브리도마 선별 배지를 세포에 다시 제공하였다.

하이브리도마를 선별 배지 중에서 통상적으로 성장시켰다. 하이브리도마로부터 수집된 완전 상등액을 하기 실시예 4-5에 기술된 바와 같이 다양한 분석법으로 테스트하였다. 간략히 언급하자면, 3 자릿수로 시작하는 항체, 예를 들어, 3.15G8은 IgG4이고, 2 자릿수로 시작하는 항체, 예를 들어, 2.9D10은 IgG2이다.

실시예 4: 세포 결합된 인간 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H1에 대한 결합

전장의 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 B7-H1을 일시적으로 발현하는 293T 세포에 결합할 수 있는 분비된 항체의 능력을 평가하기 위해 하이브리도마 세포로부터 수집된 상등액을 테스트하였다. 모의 형질감염된 293T 세포주를 음성 대조군으로서 사용하였다. 2% FBS를 함유하는 PBS 중에 희석된 세포를 384 웰 플레이트(Corning Costar, 카탈로그 번호 3712) 중 40 ㎕/웰에 2,500-3,000개의 발현 세포 및 15,000-17,500개의 모의 형질감염된 세포인 밀도로 시딩하였다. 플레이팅한 후 즉시, 10 ㎕/웰의 하이브리도마 상등액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1.5 hr 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 10 ㎕/웰의 Cy5-컨쥬게이션된 염소 항인간 IgG Fc(700 ng/ml, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-175-098)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 3 h 동안 인큐베이션시킨 후, FMAT 8200 기구(Applied Biosystems) 상에서 형광 신호를 판독하였다. 6개의 하이브리도마 상등액에 대한 결과를 하기 표 3에 제시하였다.

실시예 5: B7-H1/PD-1 수용체-리간드 결합 억제

항체를 함유하는 상등액의 상대 효능값을 측정하기 위해, CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 B7-H1에의 인간 PD-1/Fc 단백질의 결합을 억제할 수 있는 상기 항체의 능력을 평가하였다. 25,000개의 세포/웰을 50 ㎕의 배지 중 384 웰 조직 배양 플레이트(Corning Costar, 카탈로그 번호 3712)의 웰에 플레이트하였다. 다음날, 50 ㎕/웰의 희석된(1:5) 하이브리도마 상등액을 첨가하고, 플레이트를 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 비오틴화된 인간 PD-1/Fc 단백질(R&D Systems, 카탈로그 번호 1086-PD)을 1.25 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 실온에서 20 min 동안 3.7% 포름알데히드 및 3% 소 혈청 알부민을 함유하는, 100 ㎕의 PBS 중에 고정시켰다. 세포를 세척하고, 실온에서 10 min 동안 0.6% H202 및 3% 소 혈청 알부민을 함유하는, 100 ㎕의 PBS 중에서 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 4℃에서 30 min 동안 1:4,000로 희석된 50 ㎕의 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 스트렙트아비딘 중에서 인큐베이션시켰다. 세포를 세척한 후, 신호를 검출하였다. 데이터를 (OD최대-OD최소)의 비율(%)로 나타내었는데, 여기서, OD최대는 비오틴 컨쥬게이션된 인간 PD-1/Fc 단백질 존재하에 무관한 하이브리도마 상등액과 함께 인큐베이션된 세포를 사용하여 수득된 평균값이고, OD최소는 비오틴-컨쥬게이션된 인간 PD-1/Fc 단백질 부재하에 무관한 하이브리도마 상등액과 함께 인큐베이션된 세포를 사용하여 수득된 평균값이다. 최대 반응이 0%라는 것은 하이브리도마 상등액에 의해 B7-H1/PD-1 결합이 100% 억제되었다는 것을 나타내는 것이다(표 4).

실시예 6: 정제된 항B7-H1 항체의 인간 B7-H1, 인간 B7-DC, 마우스 B7-H1에 대한 결합

인간 B7-H1, B7-DC, 마우스 B7-H1 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H1에 결합할 수 있는 정제된 항체의 능력을 FACS 분석법에 의해 측정하였다. 간략하면, 리포펙트아민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen, 카탈로그 번호 11668)을 사용하여 293T 세포를 인간 B7-H1 또는 인간 B7-DC로 모의 형질감염시키거나, 또는 일시적으로 형질감염시켰다. 마우스 B7-H1을 발현하는 마우스 J558 세포를 ATCC로부터 입수하였다(카탈로그 번호 TIB-6). 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS(FACS 완충액) 중에 재현탁시키고, 바닥이 V자형인 플레이트에 50,000개의 세포/웰로 시딩하였다. FACS 완충액 중에 희석된 항B7-H1 및 이소타입 대조군 항체를 5 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. FACS 완충액으로 세척한 후, 염소 항인간 Fc Cy5(5 ㎍/ml, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-175-098) 및 7-AAD(5 ㎍/ml)를 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 15 min 동안 인큐베이션시킨 후, FACS 완충액으로 다시 세척하고, FACS칼리버(FACSCalibur) 기구 상에서 판독하였다. 하기 표 5는 인간 B7-H1에 의해 형질감염된 293T 세포에 결합할 수 있는 정제된 항체(5 ㎍/ml)의 능력을 제시한다. 인간 B7-DC에 의해 형질감염된 293T 세포, 또는 마우스 B7-H1을 발현하는 J558 세포에는 선택된 항체 중 어느 것도 결합하지 않았다. 마우스 항인간 B7-DC(PD-L2) 항체(R&D systems 카탈로그 번호 MAB1224, 염소 항마우스 Fc Cy5로 검출됨, Jackson Immunoresearch)를 B7-DC 발현에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. PE-컨쥬게이션된 래트 항마우스 B7-H1 항체(eBioscience, 클론 M1H5, 염소 항래트 Fc Cy5로 검출됨, Jackson Immunoresearch)를 마우스 B7-H1 발현에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.

실시예 7: 정제된 인간 항B7-H1 항체의 자극받은 인간 및 사이노몰거스 원숭이 T 세포에 대한 결합

96 웰의 고결합 플레이트를 PBS 중에 1 ㎍/ml로 희석된 100 ㎕/웰의 항CD3 항체(OKT3 클론, eBioscience, 카탈로그 번호 160037)와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. T 세포 농축용 키트(StemCell Technologies, 카탈로그 번호 19051)를 사용하여 인간 T 세포를 냉동 류코팩(leukopack)으로부터 단리하였다. 항CD3 mAb로 코팅된 플레이트를 PBS로 세척하고, 정제된 T 세포를 360,000개의 세포/웰로 200 ㎕의 ICM 배지에 첨가하고, 72시간 동안 배양하였다. 이어서, T 세포를 수거하고, FACS 완충액 중에서 세척하고, 96 웰의 바닥이 V자형인 분석용 플레이트 중에 1 ㎍/ml의 최종 농도로 희석된 정제된 항B7-H1 항체 또는 무관한 인간 IgG2 또는 IgG4 항체와 함께 혼합하였다(50 ㎕/웰). 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, T 세포를 FACS 완충액 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, Cy5-컨쥬게이션된 염소 항인간 IgG Fc 항체(5 ㎍/ml, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-175-098) 및 7-AAD(10 ㎍/ml)로 염색하였다. 세포를 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨 후, FACS 완충액로 다시 세척하고, FACS칼리버 기구 상에서 판독하였다. 전방 및 측방 산란 뿐만 아니라, 7-AAD에 대한 음성 염색에 기초하여 분석하기 위해 생 림프구 집단을 선택하였다.

사이노몰거스 원숭이 T 세포의 활성화를 위해, 96 웰의 고결합 플레이트를 PBS 중에 1 ㎍/ml로 희석된 100 ㎕/웰의 염소 항마우스 IgG Fc 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS로 세척하고, ICM 배지(클론 SP-34, BD 카탈로그 번호556610) 중에 1 ㎍/ml로 희석된 항CD3 항체와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 사이노몰거스 원숭이 PBMC를 말초 혈액(Bioreclamation, 카탈로그 번호CYNWBCPT)으로부터 단리하였다. 항CD3 mAb로 코팅된 플레이트를 PBS로 세척하고, 단리된 PBMC를 200 ㎕의 ICM 배지 중에 ∼200,000개의 세포/웰로 첨가하고, 72시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고, FACS 완충액 중에서 세척하고, 96 웰의 바닥이 V자형인 분석용 플레이트 중에 1 ㎍/ml의 최종 농도로 희석된 정제된 항B7-H1 항체 또는 무관한 인간 IgG2 또는 IgG4 항체와 함께 혼합하였다(50 ㎕/웰). 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 FACS 완충액 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, Cy5-컨쥬게이션된 염소 항인간 IgG Fc 항체(5 ㎍/ml, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-175-098), FITC-컨쥬게이션된 항CD3 항체 (1:25로 희석됨, Biospecialty) 및 7-AAD(10 ㎍/ml)로 염색하였다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, FACS 완충액로 다시 세척하고, FACS칼리버 기구 상에서 판독하였다. 전방 및 측방 산란 뿐만 아니라, CD3 마커에 대한 양성 염색 및 7-AAD에 대한 음성 염색에 기초하여 분석하기 위해 원숭이 T 림프구 집단을 선택하였다. 하기 표 6은 활성화된 인간 T 세포 뿐만 아니라, 활성화된 사이노몰거스 원숭이 T 세포에 결합할 수 있는 정제된 항B7-H1 항체(1 ㎍/ml)의 능력을 제시한다.

실시예 8: B7-H1/PD-1 수용체-리간드 결합 억제

ES-2 세포(ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1978)의 표면 상에 발현된 인간 B7-H1에의 인간 PD-1/Fc 단백질의 결합을 억제할 수 있는 정제된 인간 항B7-H1 항체의 능력을 평가하였다. 간략하면, 50,000개의 세포/웰을 50 ㎕의 PBS 중 384 웰 조직 배양 플레이트(Corning Costar, 카탈로그 번호 3712)의 웰에 플레이트하였다. 이어서, 50 ㎕/웰의 희석된 모노클로날 항체를 2.5, 0.5, 0.1, 0.02, 0.004, 0.008, 0.00016 nM의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2회에 걸쳐 세척하고, 100 ㎕/웰의 비오틴화된 인간 PD-1/Fc 단백질(10 ㎍/ml, R&D Systems, 카탈로그 번호1086-PD)을 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 1회에 걸쳐 세척하고, 100 ㎕/웰의 Cy5 -컨쥬게이션된 스트렙트아비딘을 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 2% FCS를 함유하는 PBS로 다시 세척하고, FACS칼리버 기구 상에서 판독하였다. 일부 웰을 비오틴-컨쥬게이션된 인간 PD-1/Fc의 존재 또는 부재하에서 무관한 인간 IgG2 및 IgG4 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션시켜 B7-H1/PD-1 결합 억제의 최소(0%) 및 최대(100%) 수준을 설정하였다. 곡선 피트 툴(그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software))를 이용하여 항체 농도와 관련된 억제율(%)을 분석함으로써 각 항체에 대한 IC50값을 계산하였고, 이를 하기 표 7에 제시하였다.

실시예 9: 항B7-H1 항체가 CD4 T 세포 증식에 미치는 효과 측정

비드 상에서 항CD3 항체와 함께 공동으로 제시되는 B7-H1 단백질이 CD3 매개 T 세포 활성화를 억제하는 것으로 입증되었다(문헌 ([Freeman et al., J. Exp. Med., 2000, 192 (7):1027-1034]; [Bennet et al., The Journal of Immunology, 2003, 170:711-718])). CD3 매개 T 세포 활성화의 B7-H1 매개성 억제를 간섭할 수 있는 정제된 인간 모노클로날 항B7-H1 항체의 능력을 하기와 같이 측정하였다.

간략하면, 5x10⁸개의 비드/ml의 세척된 토실 활성화된 Dyna비드(Dynabeads) M-450(Invitrogen, 카탈로그 번호 140.13)을 37℃에서 24시간 동안 진탕시키면서 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.4-8.0) 중에서 50 ㎍/ml의 마우스 항인간 CD3 항체(BD Bioscience, 카탈로그 번호 555329)로 코팅하였다. 4x10⁸개의 CD3으로 코팅된 비드/ml를 추가로 160 ㎍/ml의 재조합 인간 IgG1Fc(R&D Systems, 카탈로그 번호 110-HG-100)와 커플링시키거나, 또는 80 ㎍/ml의 인간 IgG1Fc 단백질과 조합된 80 ㎍/ml의 재조합 인간 B7-H1/Fc 단백질(R&D Systems, 카탈로그 번호 156-B7-100)(총 농도 160 ㎍/ml)과 커플링시키고, 37℃에서 24시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 이어서, 비드를 실온에서 1시간 동안 0.05% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 중에서 인큐베이션시키고, PBS(pH7.4) 중 0.1% BSA 및 2 mM EDTA에서 4회에 걸쳐 세척하고, 마지막으로 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지 중에 5x10⁷개의 비드/ml로 재현탁시켰다.

피콜-플라크 플러스(Ficoll-Paque Plus)(GE Healthcare 17-1440-03) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 백혈구 분리 반출 팩으로부터 말초 혈액 단핵구를 단리하고, 무혈청 RPMI 1640(Gibco 22400-089) 중에 재현탁시키고, 다이날 CD4 음성 단리용 키트(Dynal CD4 Negative Isolation Kit)(Invitrogen, 카탈로그 번호 113-37D)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 CD4+ T 세포를 PBMC로부터 단리하였다. 10 ㎕의 코팅된 비드를 시료 튜브에서 10 ㎕의 희석된 항B7-H1 또는 대조군 IgG2/4 항체와 혼합하고, 진탕기 상에서 RT하에 304시간 동안 인큐베이션시켰다. 정제된 CD4+ T 세포를 96 웰 프레이트(Corning, 카탈로그 번호 3603) 중 10⁵개의 세포/80 ㎕/웰로 플레이팅하고, 비드 항체 믹스를 20 ㎕/웰로, 100 ㎕/웰의 총 부피로 첨가하였다. 항CD3 항체 및 인간 IgG1Fc 단백질로 코팅된 비드를 사용하여 B7-H1 억제 효과 부재하의 세포 활성화를 측정하였다. 세포를 5일 동안 배양하고, 상등액을 수거하고, BD 인간 IFN-γ ELISA 키트 II(BD 카탈로그 번호550612)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 IFN-γ 방출에 대해 분석하였다. 5일째 10 ㎕/웰의 알라마르블루(AlamarBlue)(Invitrogen DAL 1025)를 첨가함으로써 세포 증식을 측정하였다. 세포를 5시간 동안 인큐베이션시키고, 545 nm의 여기 파장 및 600 nm의 방출 파장을 사용하여 스펙트라맥스 게미니 EM(SpectraMax Gemini EM) 분광광도계 상에서 형광을 측량하였다. 데이터를 OD최대 비율(%)로 나타내었는데, 여기서, OD최대는 항CD3/IgG1Fc로 활성화된 T 세포를 사용하여 수득된 평균값이다. 도 1을 참조한다.

실시예 10: 수지상 세포-T 세포 혼합 림프구 분석법에 의한 항B7-H1 항체가 CD4 T 세포 활성화에 미치는 효과 측정

수지상 세포-T 세포 혼합 림프구(DCMLR: dendritic cell-T-cell mixed lymphocyte) 분석법으로 B7-H1에 대한 항체에 의해 이루어지는 T 세포 활성화 증진을 측정하였다. 앞서 기술된 바와 같이(문헌 [Curr Protoc Immunol. 2001 May; Chapter 7: Unit 7.32]) 단핵구 전구체로부터 수지상 세포를 생성하였다. 피콜-플라크 플러스 밀도 구배 원심분리를 사용하여 백혈구 분리 반출 팩으로부터 말초 혈액 단핵구를 단리하고, 무혈청 RPMI 1640(Gibco 22400-089) 중에 재현탁시키고, T150 세포 배양 플라스크(Corning 430825)에 부착될 수 있도록 하였다. 37℃에서 1시간 경과 후, 비부착 세포를 제거하고, 5% 인간 혈청(Invitrogen 34005100)이 보충된 RPMI 중에서 세포를 배양하였다. 사이토카인을 최종 농도 2 ng/ml GM-CSF(BD Biosciences 550068) 및 10 ng/ml IL-4(BD Biosciences 554605)에 첨가하였다. 사이토카인을 포함하는 새 배지를 매 2-3일마다 첨가하였다. 배양 6일째, 세포를 20 ng/ml의 TNF-α(BD Biosciences 554618)로 성숙화시키고, 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 성숙 수지상 세포를 수거하고, 표현형을 분석학, 추후 사용을 위해 냉동시켰다.

자기 단리용 키트(Dynal 113.17)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 CD4+ T 세포를 PBMC로부터 단리하고, 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [J Immunol. 2003 Apr 1;170(7):3637-44]) 1차 MLR에서 배양하였다. 1.5E5 동종이형 CD4+ 반응 T 세포를 1:2.5인 T 세포:수지상 세포 비로 수지상 세포와 함께 96 웰의 바닥이 평평한 마이크로타이터 플레이트(Costar 3595)에서 배양하였다. 수지상 세포 시료를 100 ㎍/ml의 미토마이신 C(Sigma M4287)로 처리한 후, 공배양물에 첨가하여 임의의 증식이 림프구를 오염시키지 못하도록 하였다. 항체를 최종 부피 200 ㎕의 RPMI + 10% 인간 혈청 중에 다양한 농도로 첨가하였다. 5일째 [³H] 티미딘(1 μci/웰, Perkin-Elmer NET027001MC)을 사용하여 16 h 펄스에 의해 티미딘 혼입량을 측정하였다. 상등액을 수거한 후, 방사성 표지화하고, 루미넥스(Luminex) 분석(BioRad 171-B11921)에 의해 제조사의 설명서에 따라 IFN-γ 방출에 관해 분석하였다. 항B7-H1 항체에 의한 T 세포 증식 증진에 관해 수행된 반복 실험을 통해 얻은 결과는 도 2에 제시되어 있다. 상응하는 IFN-γ 방출은 도 3에 제시되어 있다.

실시예 11: B7-H1 항체에 관한 구조 분석

항체의 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열에 대한 서열 분석을 수행하여 그의 DNA 서열을 확인하였다. 항B7-H1 항체에 대한 완전한 서열 정보는 각 감마 및 카파 또는 람다 쇄 조합에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 서열 목록에 제공되어 있다. 가변 중쇄 서열을 분석하여, VH 패밀리 및 J 영역 서열을 확인하였다. 이어서, 서열을 번역하여 1차 아미노산 서열을 확인하고, 생식 계열 VH 및 J 영역 서열과 비교하여 체세포 과돌연변이를 평가하였다.

하기 표 8 및 9는 항체 중쇄 영역을 그들의 동족 생식 계열 중쇄 영역과, 및 항체 경쇄 영역을 그들의 동족 생식 계열 경쇄 영역과 비교한 표이다. 아미노산 넘버링은 수치적 넘버링에 의해 이루어졌다.

면역글로불린 유전자는 면역 반응의 성숙화 기간 동안 V, D 및 J 유전자 세그먼트 사이의 재조합, 이소타입 전환, 및 가변 영역에서의 과돌연변이를 비롯한 다양한 변형을 경험하게 된다. 재조합 및 체세포 과돌연변이는 항체 다양성 생성 및 친화성 성숙을 위한 토대가 되지만, 이는 또한 상기 면역글로불린을 상업적으로 치료제로서 생산하는 것을 어렵게 만들 수 있거나, 항체의 면역원성 위험을 증가시킬 수 있는 연속적인 경향을 일으킬 수 있다. 일반적으로, CDR 영역내 돌연변이는 친화성 및 작용 개선에 기여할 수 있지만, 골격 영역내 돌연변이는 면역원성 위험을 증가시킬 수 있다. 골격 돌연변이를 생식 계열로 복귀시키면, 항체의 활성은 확실히 어떤 부정적 영향도 받지 않으면서 상기와 같은 위험은 감소될 수 있다. 일부 구조상의 경향은 다양화 과정에 의해 생성될 수 있거나, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 기여하는 생식 계열 서열내 존재할 수 있다. 그 근원과는 상관없이, 생성물의 불안정화, 응집, 이종성, 또는 면역원성 증가를 일으킬 수 있는 잠재적인 구조상의 경향을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 비바람직한 경향의 예로는 (이황화 결합을 스크램블링시키거나, 가변성 술프히드릴 부가물을 형성할 수 있는) 쌍을 이루지 않은 시스테인, (구조 및 활성의 이종성을 일으키는) N 연결 당화 부위 뿐만 아니라, 탈아미드화(예를 들어 NG, NS), 이성체화(DG), 산화(노출된 메티오닌), 및 가수분해(DP) 부위를 포함한다.

면역원성 위험을 감소시키고, 선도 항체의 약학적 특성을 개선시키기 위해 생식 계열로부터의 돌연변이수를 감소시키고/거나, 구조상의 경향을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 특정 항체가 그의 각 생식 계열 서열과 아미노산 수준에 있어서 차이를 보일 경우, 항체 서열은 생식 계열 서열로 역돌연변이화될 수 있다. 그러한 교정 돌연변이는 표준 분자 생물학적 기법을 사용하여 돌연변이화된 위치 중 1, 2, 3개 이상의 위치, 또는 그의 임의의 조합된 위치에서 발생할 수 있다. 하기 표 10-14에는 mAb 2.9D10, 2.7A4 및 2.14H9에 대한 생식 계열로의 역변이 위치가 제시되어 있다. 각 열은 굵은체로 표시된 위치에서의 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합을 나타낸다. 아미노산 위치는 수치적 넘버링으로 나타내었다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 이종성에 영향을 줄 수 있는 서열 중 임의의 구조상 경향을 대체하는 것을 포함한다. 그러한 경향으로는 당화 부위, 쌍을 이루지 않은 시스테인, 표면 노출된 메티오닌 등을 포함한다. 그러한 이종성의 위험을 감소시키기 위해, 상기와 같은 구조상 경향 하나 이상이 제거될 수 있도록 변형시키는 것이 제안된다.

한 실시양태에서, 하나 이상의 컨센서스 N 연결 당화 부위를 항체 생식 계열 또는 항체 서열로부터 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 상기와 같은 당화 부위를 쉽게 확인할 수 있다. 전형적으로, N 연결 당화 컨센서스 부위의 서열은 Asn-임의의 AA-Ser 또는 Thr 서열을 가지는데, 여기서, 중간의 아미노산은 프롤린(Pro)은 될 수 없다. 또 다른 일례로, 쌍을 이루지 않은 시스테인은 단독으로, 또는 다른 구조상의 변형과 함께 대체될 수 있다. 쌍을 이루지 않은 시스테인은 유사한 측쇄 특성을 가진 적절한 아미노산, 예를 들어, 세린으로 돌연변이화될 수 있다.

본원에서 언급하는 바와 같이, 최적인 서열은 하나 이상의 위치에서 그의 생식 계열 서열로 역돌연변이화된 서열, 또는 하나 이상의 다른 경향, 예를 들어, 구조상의 경향을 제거할 수 있도록 변형될 수 있는 서열이다. 최적화된 서열로는 또한 하나 이상의 위치에서 그의 생식 계열 서열로 역돌연변이화되고, 추가로 또한 하나 이상의 구조상의 경향을 제거할 수 있도록 변형된 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 2를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 2는 표 10의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 2는 표 10에 명시된 생식 계열 잔기들 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 임의의 4개, 임의의 5개, 또는 5개 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 2는 표 10의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 구체적인 일례에서, 비생식 계열 서열은 F가 Y로 변경된 80번 위치, 및 K가 R로 변경된 87번 위치에서 생식 계열로 역돌연변이화된다. 하기 표 15에 제시되어 있는 바와 같이, 상기 서열의 구체적인 예는 2.7A4VHOPT이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 7을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 7은 표 11의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 7은 표 11에 명시된 생식 계열 잔기들 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 임의의 4개, 임의의 5개, 또는 5개 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 7은 표 11의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 특정 생식 계열 서열로 돌연변이화된 2.7A4 가변 경쇄 도메인의 구체적인 예로는 하기 표 15에 제시되어 있는 바와 같은 (비생식 계열 서열이 17번 위치에서 A → T, 및 104번 위치에서 R → K로 돌연변이화되어 최적화된) 2.7A4VLOPT를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 12를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 12는 표 12의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 22는 표 12에 명시된 생식 계열 잔기들 중 어느 하나, 임의의 2개, 또는 2개 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 12는 표 12의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 17을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 17은 표 13의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 17은 표 13에 명시된 생식 계열 잔기들 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 임의의 4개, 또는 4개 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 17은 표 13의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 서열 번호 17은 서열 번호 17에의 비생식 계열화 변형에 의해 변경되거나, 추가로 변경될 수 있다. 일례로, 서열 번호 17은 37번 위치에서 F → Y, 및 50번 위치에서 F → Y로 변경될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 표적화된 결합 물질 또는 항체는 서열 번호 27을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 27은 표 14의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 27은 표 14에 명시된 생식 계열 잔기들 중 어느 하나, 임의의 2개, 임의의 3개, 또는 3개 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 27은 표 14의 각 열에 명시된 생식 계열 및 비생식 계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함한다. 특정 생식 계열 서열로 돌연변이화된 2.7A4 가변 경쇄 도메인의 구체적인 예로는 하기 표 15에 제시되어 있는 바와 같은 (비생식 계열 서열이 104번 위치에서 E → K로 돌연변이화되어 최적화된) 2.14H9OPT를 포함한다.

2.14H9의 중쇄는 서열 번호 22이 아미노산 31에서 R → S로 변경될 수 있다.

특이적인 생식 계열화의 일례

비생식 계열화된(NG: non-germlined) 항B7-H1 항체 2.7A4, 2.14H9 및 2.9D10의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이터베이스(Tomlinson, 1997; http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 중의 공지된 인간 생식 계열 서열에 대해 정렬하고, 서열 유사도에 의해 가장 유사한 생식 계열을 확인하였다. 항B7-H1 항체에 대한 가장 유사한 생식 계열 매치는 표 16 및 17에 기재되어 있다. 변경되지 않은 버니어(vernier) 서열(문헌 [Foote & Winter, J Mol Biol. Mar20:224(2):487-99, 1992])을 고려하지 않고, 변경된 위치를 표 18에 기재하였다.

항체 2.7A4를 고려하면, V_H 도메인의 골격에는 2개가 변경되어 있고, VL 도메인의 골격에는 2개가 변경되어 있다. V_H 도메인의 경우, 카바트 번호 79 및 83(또는 수치적 넘버링에 의하면 잔기 80 및 87)에 위치하고, V_L 도메인의 경우, 카바트 번호 18 및 103(또는 수치적 넘버링에 의하면 잔기 17 및 104)에 위치하는 이들 잔기는 인간 생식 계열로 복귀되었다. 표 18을 참조한다. 항체 2.14H9의 경우, V_H 도메인의 골격에는 어떤 변경도 없었고, V_L 도메인의 골격에는 1개가 변경되어 있다. V_L 도메인의 경우, 카바트 번호 103(또는 잔기를 수치적 넘버링에 의해 계산했을 때, 104)에 위치하는 상기 잔기는 인간 생식 계열로 복귀되었다. 표 18을 참조한다. 항체 2.9D10의 경우, V_H 도메인의 골격에는 어떤 변경도 없었고, V_L 도메인에는 카바트 번호 36 및 49(또는 수치적 넘버링에 의하면 잔기 37 및 50)에 위치하는 2개가 변경되어 있다. 그러나, 상기 2개의 잔기는 버니어 위치에 위치하며, 이는 CDR 루프 구조를 변경시키지 않도록 돌연변이화된 것은 아니다.

적절한 돌연변이 유발형 프라이머를 이용하여 표준 부위 지정 돌연변이 유발 기법을 사용함으로써 상기 아미노산 잔기의 생식 계열화를 수행하였다. 생식 계열화된 서열은 항체 명칭 다음에 접두사 "OPT"를 가지고 있으며, 예를 들어, 2.7A4VHOPT, 2.7VLOPT 및 2.14H9VLOPT가 있다. 이어서, 생식 계열화된 IgG를 인간 B7-H1/hPD-1 리간드 억제 분석법으로 재평가하여 항체에서 시험관내 활성의 감소는 일어나지 않았다는 것을 확인하였다.

생식 계열화된 항B7-H1 항체 대 비생식 계열화된 항B7-H1 항체에 대한 활성의 예는 도 4에 제시되어 있다.

유전자 합성 및 IgG1 및 IgG1-TM으로의 리포맷에 관한 예

각각 전체 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터내로 V_H 및 V_L 도메인을 서브클로닝하여 클론을 scFv로부터 IgG 포맷으로 전환시켰다. V_H 도메인을 벡터 pEU15.1에 클로닝시켜 IgG1을 발현시키거나, 또는 벡터 pEU15.1-TM에 클로닝시켜 IgG1-TM 항체를 발현시켰다. 두 벡터 모두 포유동물 세포에서 전체 IgG 중쇄를 발현시킬 수 있는 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 포함하였다. 벡터 pEU15.1-TM은 변형된 pEU15.1 인간 IgG1 벡터이다. 이를 공학처리하여 3개의 돌연변이를 도입하였는데, 힌지에는 L234F 및 L235E를, 및 IgG 분자의 CH2 도메인에는 P331S를 도입하여 항체 의존성 세포 매개성 세포독성 및 보체 의존성 세포독성을 일으킬 수 있는 그의 능력을 제거하였다(문헌 [Oganesyan V. et al. (2008), Acta Cryst., D64: 700-704]). 적절한 돌연변이 유발형 프라이머를 이용하여 표준 부위 지정 돌연변이 유발 기법을 사용함으로써 벡터 공학처리를 수행하였다.

조절 인자를 사용하여 인간 람다 및 카파 경쇄 불변 도메인 발현을 위해 각각 pEU4.4 및 pEU3.4 벡터내로 V_L 도메인을 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 벡터는 원래는 문헌 [Vaughan et al. (Nature Biotechnology 14(3):309- 314, 1996]에 기재되어 있다. 상기 벡터는 간단히 OriP 요소를 도입함으로써 공학처리하였다.

IgG를 수득하기 위해 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터로 EBNA-HEK293 포유동물 세포(Invitrogen R620-07)를 형질감염시켰다. IgG를 발현시키고, 배지로 분비시켰다. 수거물을 풀링한 후, 스핀 다운시킨 후, 정제시켰다. 시료의 임의의 내독소 오염을 막기 위해 사전에 살균처리된 AKTA 발현 정제 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 단백질 A 크로마토그래피에 의해 IgG를 정제하였다. 1 mL 하이트랩(HiTrap)™ MabSelectSure™ 칼럼(GE Healthcare, 11-0034-93) 상에 배양 상등액을 로딩하고, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 250 mM NaCl을 세척하였다. 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.0)을 사용하여 칼럼으로부터 결합된 IgG를 용리시키고, 1M Tris-HCl(pH 9.0)를 첨가하여 중화시켰다. Nap 10 칼럼(Amersham, 17-0854-02)을 사용하여 용리된 물질의 완충액을 PBS로 교환하고, 여과시킨 후, 단백질 농도 및 내독소 수준을 측정하였다. IgG의 아미노산 서열에 기초하여 흡광 계수를 이용하여 분광광도법에 의해 IgG 농도를 측정하였다(문헌 [Vaughan et al. 상기 문헌 동일]). 1-0.1 EU/mL 및 10-0.1 EU/mL LAL 카트리지(Charles River Laboratories, PT520)로 피팅된 엔도세이프 PTS 휴대용 테스트 시스템(Endosafe PTS Portable Test System)을 사용하여 내독소 수준을 측정하였다. SDS-PAGE에 의해 정제된 IgG를 분해에 대해 분석하였다.

인간 B7-H1/hPD-1 리간드 억제 분석법으로 IgG1-TM 포맷의 항B7-H1 항체를 평가하고, 동일하지만 IgG1 포맷인 항체와 비교하여 항체에서 IgG 이소타입 전환에 기인한 시험관내 활성의 감소는 일어나지 않았다는 것을 확인하였다(도 4).

실시예 12: 인간 B7-H1/FC 결합 인간 PD-1/FC-HTRF ^® 분석

기술된 분석법은 세척 단계가 필요없는, HTRF^® 분석 기술을 사용한 균질 TR-FRET 분석법이다. PBS에 1 nM으로 희석된 5 ㎕/웰의 비오틴화된 PD-1/Fc를 코스타(Costar) 3676 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 분석용 완충액(PBS + 0.1% BSA + 0.8M KF)에 4 nM으로 희석된 5 ㎕/웰의 스트렙트아비딘 XL^ent(CisBio)을 첨가하였다. PBS에 5 ㎕/웰의 희석된 시료 물질 적정량을 관련 웰에 첨가하였다. 전체 결합을 정의하기 위해 웰당 5 ㎕의 PBS 또는 관련 시료 완충액을 첨가하였다. 비특이 결합을 정의하기 위해 과량의 (600 nM) 비표지된 B7-H1/Fc 또는 PD-1/Fc를 사용하였다. 최종 공정으로, 분석용 완충액에 1:100로 희석된 5 ㎕/웰의 크립테이트 표지된 B7-H1/Fc(크립테이트 표지 - CisBio, B7-H1/Fc - RnD Systems)를 첨가하였다. 분석용 플레이트를 실온에서 3시간 동안 방치한 후, HTRF^® 상용성 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

항B7-H1 항체에 대한 인간 PD-1/인간 B7-H1 리간드 억제 분석에서의 IC50 측정 결과에 관한 예는 하기 표 19에 제시되어 있다. 모든 항인간 B7-H1 항체는 IgG1-TM 포맷이었다.

실시예 13: 인간 B7-H1/FC 결합 인간 B7-1/FC-HTRF ^® 분석

기술된 분석법은 세척 단계가 필요없는, HTRF^® 분석 기술을 사용한 균질 TR-FRET 분석법이다. PBS에 8 nM으로 희석된 5 ㎕/웰의 비오틴화된 B7-1/Fc를 코스타 3676 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 분석용 완충액(PBS + 0.1% BSA + 0.8M KF)에 20 nM으로 희석된 5 ㎕/웰의 스트렙트아비딘 XL^ent(CisBio)을 첨가하였다. PBS에 5 ㎕/웰의 희석된 시료 물질 적정량을 관련 웰에 첨가하였다. 전체 결합을 정의하기 위해 웰당 5 ㎕의 PBS 또는 관련 시료 완충액을 첨가하였다. 비특이 결합을 정의하기 위해 과량의 (200 nM) 비표지된 B7-H1/Fc 또는 B7-1/Fc를 사용하였다. 최종 공정으로, 분석용 완충액에 1:100로 희석된 5 ㎕/웰의 크립테이트 표지된 B7-H1/Fc(크립테이트 표지-CisBio, B7-H1/Fc-RnD Systems)를 첨가하였다. 분석용 플레이트를 4℃에서 밤새도록 방치한 후, 실온으로 회복시키고, HTRF^® 상용성 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

항B7-H1 항체에 대한 인간 B7-1/인간 B7-H1 리간드 억제 분석에서의 IC50 측정 결과에 관한 예는 하기 표 20에 제시되어 있다. 모든 항인간 B7-H1 항체는 IgG1-TM 포맷이었다.

실시예 14: 다른 면역 공동조절성 단백질과 항B7-H1 항체의 교차 반응성

다른 면역 공동조절성 분자에 대한 항B7-H1 IgG1-TM 항체의 교차 반응성을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. ELISA는 4℃에서 밤새도록 맥시소르프(MaxiSorp) 플레이트(NUNC)를 250 ng/웰의 인간 B7-H1(R&D Systems, 156-B7), 인간 PD-L2(R&D Systems, 1224-PL), 인간 B7-H2(R&D Systems, 165-B7), 인간 B7-H3(R&D Systems, 1027-B3), 인간 CD28(R&D Systems, 342-CD), 인간 CTLA-4(R&D Systems, 325-CT) 및 인간 PD-1(R&D Systems, 1086-PD)의 세포외 도메인(ECD: extracellular domain)으로 코팅한 후, 실온에서 1 h 동안 3% 건조 우유를 함유하는 PBS로 상기 플레이트를 차단시켰다. 뮤린 B7-H1(R&D Systems, 1019-B7)의 ECD를 코팅하여 뮤린 교차 반응성 또한 조사하였다. 3% 건조 부유를 함유하는 PBS에 100 nM으로 희석된 비오틴화된 항B7-H1 IgG1-TM을 실온에서 2 h 동안 인큐베이션시켜 결합시켰다. 0.2 ㎍/mL의, 유로퓸 N1로 표지된 스트렙트아비딘(Perkin Elmer, 1244-360)을 사용하여 결합된 비오틴화된 IgG를 검출하였다. 시판용 항체 마우스 IgG2a 항인간 B7-H1(R&D Systems, MAB156), 마우스 IgG2b 항인간 PD-L2(R&D Systems, MAB1224), 마우스 IgG2b 항인간 B7-H2(R&D Systems, MAB165), 마우스 IgG1 항인간 B7-H3(R&D Systems, MAB1027), 마우스 IgG1 항인간 CD28(R&D Systems, MAB342), 마우스 IgG2a 항인간 CTLA-4(Abeam, ab33320), 마우스 IgG2b 항인간 PD-1(R&D Systems, MAB1086) 및 래트 IgG2a 항마우스 B7-H1(R&D Systems, MAB1019)을 사용하여 NUNC 플레이트에의 항원 코팅을 입증하는 대조군 실험을 수행하였다. 실온에서 2h 동안 3% 건조 부유를 함유하는 PBS 중에서 5 ㎍/mL의 1차 항체를 인큐베이션시켰다. 실온에서 1h 동안 3% 건조 부유를 함유하는 PBS에 1:5,000로 희석된 2차 항체 항마우스 IgG 퍼옥시다제 컨쥬게이트(Sigma, A2554) 또는 항래트 IgG 퍼옥시다제 컨쥬게이트(Sigma, A5795)를 인큐베이션시킨 후, TMB(Sigma, T0440)를 첨가하여 검출을 수행하였다. 맥시소르프 눈크 플레이트 상에서 8개의 항원 모두가 검출될 수 있었다. 5 ㎍/mL의 IgG1 이소타입 대조군로 코팅된 웰을 사용하여 비특이 결합을 측정하였다. 교차 반응성은 인간 B7-H1에 대해 상대적인 항원에 대한 특이 결합율(%)로서 계산하였다.

8개의 면역 공동조절성 항원 패널에 대한 3개의 항B7-H1 IgG1-TM 항체 2.7A4OPT, 2.9D10 및 2.14H9OPT의 교차 반응성을 3회에 걸쳐 측정하였다. 항체 농도 100 nM에서, 항B7-H1 항체 3개 모두 본 발명자들이 테스트한 7개의 인간 면역 공동조절성 분자 중 어느 것에도 교차 반응성을 보이지 않았다(도 5). IgG1-TM 항B7-H1 항체 2.7A4OPT는 뮤린 B7-H1에 대해 측정가능한 정도의 교차 반응성을 보였는데, 인간 B7-H1에 대한 결합을 100%로 하였을 때, 그와 비교하여 신호 수준은 5.3%였다. 테스트된 나머지 두 항B7-H1 항체, 2.9D10 및 2.14H9OPT는 뮤린 B7-H1에 대해 어떤 교차 반응성도 보이지 않았다(도 5).

실시예 15: 인간 및 사이노몰거스 B7-H1에 대한 항B7-H1 항체의 친화도

BIA코어(BIA) T100 기구(BIAcore: 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 단량체 인간 및 사이노몰거스 B7-H1에 대한 IgG1-TM 포맷의 항B7-H1 항체의 결합 친화도 및 역동학적 파라미터를 측정하였다. 간략하면, 25℃에서 전개용 완충액으로서 HBS-EP 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20)을 사용하여 실험을 수행하였다. 제조사의 설명서(BIAapplications Handbook, BIAcore)에 따라 CM5 센서 칩(BIAcore)의 표면 상에 IgG를 친화성 포획시키고, 이는 CM5 표면 상에 아민 커플링되어 ∼500 반응 단위(RU: Response Unit)의 밀도를 얻었다. 재조합 단량체 인간 또는 사이노몰거스 B7-H1 플래그His(FlagHis)₁₀ 세포외 도메인(ECD)을 피분석물로서 사용하였다. 전개용 완충액 중의 B7-H1 ECD(200-3.12 nM) 희석액을 60초 동안 100 ㎕/min의 일정한 유속으로 주사하였다. 모든 측정값은 대조군(활성화된 것-불활성화된 것) 유식 세포 뿐만 아니라, 블랭크(피분석물 농도 0) 주사로 이중 참조된 것을 사용하여 수득된 센서그램을 감산하여 기준선에 대한 것으로 보정하였다. T-100 BIA이벨류에이션(T-100 BIAevaluation) 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 분석하고, 국소 R_최대 및 0으로 설정된 벌크 굴절률을 사용하여 단순 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델로 피팅하였다. 2 이상의 독립된 실험으로부터 얻은 데이터를 계산하였다. 친화성 포획된 IgG의 수준을 250 RU 미만으로 유지시킴으로써 물질 수송 효과를 제한하였다. 테스트된 항체 모두를 사용하여 수득한 센서그램은 우수한 피트를 제공하는 1차 지수의 1:1 결합 모델로 쉽게 피팅될 수 있었고, 일관되게 Chi² 값은 ≤ 0.3이었다.

단량체 인간 B7-H1에 대한 항B7-H1 항체 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT의 친화도는 각각 1 nM 및 175 pM이었다 (표 21).

단량체 사이노몰거스 B7-H1에 대한 항B7-H1 항체 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT의 친화도는 각각 835 pM 및 367 pM이었다(표 22). 친화도는 인간 B7-H1에 대한 것과 매우 유사한 바, 상기 두 항체는 사이노몰거스 B7-H1에 대해 강력한 교차 반응성을 가지고 있는 것이다.

실시예 16: 항B7-H1 항체의 에피토프 지도화

항B7-H1 항체의 결합에 관여하는 인간 B7-H1 잔기를 확인하기 위해 에피토프 지도화를 수행하였다. 뮤린 PD-1과 복합체를 형성하는 인간 B7-H1의 세포외 도메인의 구조는 앞서 문헌에 기술되어 있으며(문헌 [Lin, D et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 105, p3011-3016]), 14개의 B7-H1 잔기가 PD-1에 대한 결합에 관여하는 것으로 밝혀졌다(표 23).

항B7-H1 항체는 인간 B7-H1에 대한 결합을 위해 인간 PD-1과 경쟁하는 바(실시예 5, 8 및 12), 본 발명자들이 인간 및 마우스 PD-1에의 B7-H1 결합 경계 간의 차이가 무시할 정도로 작다고 가정할 경우(두 종간의 세포외 도메인 서열의 동일성 62%), 항B7-H1 항체는 상기 14개의 잔기 중 일부와 상호작용하여야 한다. 표 23에 기술된 14개의 위치들 모두에 대해 단일 아미노산 B7-H1 돌연변이체가 생성될 수 있을 것이다. 파지 ELISA에 의해 항B7-H1 항체에 대한 결합에 대해, 및 HTRF^® 경쟁 분석법으로 인간 B7-H1에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있는 항B7-H1 항체의 능력에 대해 돌연변이체들을 테스트하였다. 기술된 항B7-H1 항체들 모두 IgG1-TM 포맷이었다.

파지 디스플레이 발현을 위한 박테리오파지 유전자 III과 융합된 인간 B7-H1 세포외 도메인 유전자의 클로닝

DNA2.0 인크.(DNA2.0 Inc.)에 의해 인간 B7-H1 단백질(Uniprot 수탁 번호 Q9NZQ7, 아미노산 [19-238])의 세포외 도메인에 대한 유전자 코딩을 외부적으로 합성하고, 프라이머 B7-H1 FOR(5'-AATAATGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTTACCGTGACGGTACCG-3') 및 B7-H1 REV(5'-AATAATGCGGCCGCCCTTTCGTTTGGGGGATGC-3')를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킴으로써 각각 5' 및 3' 말단에 Sfi I 및 Not I 제한 부위를 도입하였다. 이어서, Sfi I 및 Not I 제한 부위를 사용하여 PCR 생성물을 pCANTAB6 벡터에 방향적으로 클로닝하였다(문헌 [McCafferty J. et al., 1994, Appl. Biochem. Biotechnol., Vol. 47, pl57-173]). 결찰물로 사용하여 E. 콜라이(E. coli)를 형질전환시키고, 서열분석에 의해 개별 콜로니를 스크리닝하여 B7-H1 형질전환체를 확인하고, 이를 B7-H1_pCANTA6이라고 명명하였다.

B7-H1 돌연변이체 생성 및 확인

완전히 무작위화된 NNS 프라이머(표 24) 및 DNA 주형으로서의 플라스미드 B7-H1_pCANTA6을 사용하여 PD-1 경계면의 14개의 잔기들 모두에서의 포화 돌연변이 유발에 의해 B7-H1 돌연변이체를 생성하였다. 제조사의 설명서에 따라 스트라진 퀵체인지 다중 부위 유도 돌연변이 유발용 키트(Stratagene's QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit)(카탈로그 번호 200513)를 사용하여 돌연변이 유발을 수행하였다. 돌연변이 유발형 반응을 사용하여 E. 콜라이 균주 TGI를 형질전환시키고, 서열분석에 의해 개별 콜로니를 스크리닝하여 B7-H1 형질전환체를 확인하였다. 가능성을 지닌 280개(20개의 아미노산 x 14개의 위치) 중 총 252개의 변이체가 확인되었고, 396 웰 배양 플레이트에서 최고의 것을 선별하였다.

항B7-H1 항체에 대한 결합에 대한 B7-H1 돌연변이체의 파지 ELISA

유전자 III 단백질과 융합된 B7-H1 세포외 도메인이 파지 표면에서 디스플레이될 수 있다는 것을 확인한 후, 파지 ELISA에 의해 항B7-H1 항체 2.14H9OPT, 2.7A4OPT 또는 참조 Ab#1에의 B7-H1 돌연변이체의 결합에 대해 평가하였다. 최고의 것으로 선별된 TGI 배양물을 성장시키고, M13K07 헬퍼 파지로 중복감염시켜 그의 표면에서 B7-H1 돌연변이체를 디스플레이하는 파지 입자를 생산하였다. 파지 상등액을 PBS+3% 탈지유 중에서 차단시키고, 사전에 밤새도록 PBS 중 1 ㎍/mL 2.14H9OPT, 2.7A4OPT 또는 참조 항체 #1로 코팅된 눈크 맥시소르브(NUNC MaxiSorb) 플레이트 중에서 인큐베이션시키고, PBS+3% 탈지유로 차단시켰다. 비오틴화된 항M13 2차 항체(Progen)와 함께 인큐베이션시킨 후, 유로퓸(Perkin Elmer)과 커플링된 스트렙트아비딘을사용하여 결합된 파지를 검출하였다.

PD-1 경계면에 위치하는 14개의 인간 B7-H1 잔기 중에서 4개(Asp26, Tyr56, Glu66 및 Lys124)가 테스트된 3개의 항B7-H1 항체 중 어느 것에 대한 결합에도 관여하지 않았다. 이를 알라닌 또는 글리신으로 대체한 경우에도 결합 신호에는 어떤 유의적인 영향을 미치지 못했다. 파지 ELISA 데이터에 기초하여, 정제된 단백질을 사용함으로써 10개의 다른 위치들 각각에 대해 2 내지 3개의 중요한 변이를 나타내는 총 28개의 돌연변이체를 선별하여 그의 결합 프로파일을 확인하였다.

생화학적 경쟁 분석법

인간 B7-H1 야생형 및 돌연변이체의 세포외 도메인을 세균에서 발현시키고, 앞서 기술된 바와 같이 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다(문헌 [Bannister D. et al., 2006, Biotechnology and bioengineering, 94, 931-937]).

HTRF® 경쟁 분석법을 통해 항B7-H1 항체의 HIS FLAG 태깅된 B7-H1에 대한 결합을 측정하였다. 상기 기술된 바와 같이 제조된 비태깅된 B7-H1 시료의 적정은 항B7-H1 항체에 대한 결합에 대해 HIS FLAG 태깅된 B7-H1과 경쟁하게 됨으로써 분석 신호는 감소하게 될 것이다. 항체 2.14H9OPT, 2.7A4OPT 및 참조 항체 #1을 사용하여 정제된 야생형 또는 돌연변이체 B7-H1의 상대적인 결합에 관한 특징을 규명하는 경쟁 분석법을 확립시켰다. 이를 통해 어떤 B7-H1 잔기가 항체 결합에 필요한지를 확인하였다. 10 ㎕의 B7-H1 시료를 384 웰 저용량의 분석용 플레이트(Corning 3673)에 첨가하였다. 이어서, 제조사의 설명서에 따라(ThermoFisher, 53051) DyLight649에 컨쥬게이션된 5 ㎕의 0.29nM 2.14H9OPT, 또는 1.15 nM 2.7A4OPT, 또는 1.15 nM 참조 항체 #1, 및 0.43 nM 항FLAG 크립테이트(Cisbio International, 61FG2KLB) 및 1.25 nM HIS FLAG 태깅된 인간 B7-H1의 혼합 용액 5 ㎕를 첨가하였다. 분석용 플레이트를 실온에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 엔비젼(EnVision) 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간 분해 형광을 판독하였다.

3개의 추가 B7-H1 잔기(Ile54, Ser117 및 Ala121)는 2.14H9OPT 및 2.7A4OPT에 대한 결합에 관여하지 않았는데, 그 이유는 상기 잔기에 대한 B7-H1 돌연변이체의 IC₅₀이 야생형 B7-H1과 비교할 때 유사하거나, 또는 아주 조금 변형되었기 때문이다. 야생형 및 나머지 B7-H1 돌연변이체들 모두에 대한 3가지 항B7-H1 항체의 경쟁 데이터는 하기 표 25에 요약되어 있다.

Arg113 및 Arg125는 2.14H9OPT에 대한 결합에 강력하게 관여하였다. Ala 또는 다른 아미노산(113번 위치의 경우, Tyr 또는 Leu, 125번 위치의 경우, Gln 또는 Ser)으로 대체한 경우, 상기 항체의 결합은 전체적으로 일어나지 않았다. 2.7A4OPT 또는 참조 항체 #1에 대한 상기 B7-H1 돌연변이체의 결합 프로파일은 야생형 B7-H1과 유사하였다. 이는 결합이 일어나지 않은 이유는 예를 들어, 비폴딩된 단백질과 같은 B7-H1의 일반적인 구조적 변형 때문이 아니라, 상기 잔기가 2.14H9OPT 결합에 직접적으로 관여하기 때문이다. 상기 데이터를 통해서 2.14H9OPT 결합 에피토프는 2.7A4OPT 및 참조 항체 #1 에피토프와 상이하다는 것도 입증되었다. Met1l5, Asp122 및 Tyr123은 또한 2.14H9OPT에 대한 결합에 관여하지만, 그 정도는 더 적었다. Met115를 Ala로 대체한 경우, 2.14H9OPT 또는 2.7A4OPT에 대한 결합에는 어떤 영향도 없었지만, Asn으로 대체한 경우에는 2.7A4OPT가 아닌, 2.14H9OPT에 대한 결합 활성이 전체적으로 상실되었다. 유사한 방식으로, Asp 122를 Asn으로 대체한 경우에는 참조 항체 #1이 아닌, 2.14H9OPT에 대한 결합에 영향을 주었다. Tyr123을 Ala 또는 Thr로 돌연변이화시킨 경우, 2.7A4OPT가 아닌 2.14H9OPT에 대한 결합 프로파일을 현저하게 변형시켰다. 흥미롭게도, Phe로 대체한 경우, 2.14H9OPT에 대한 결합에는 어떤 변화도 없었으며, 이는 티로신 123의 히드록실기가 결합 상호작용에 관여하지 않는다는 것을 제안한다.

Phe19, Thr20 및 Asp122는 2.7A4OPT에 대한 결합에 강력하게 관여하였다. 상기 위치에서의 B7-H1 돌연변이체들 모두 상기 항체에 대해 결합하지 않았지만, 2.14H9OPT 또는 참조 항체 #1에는 야생형 B7-H1과 유사한 방식으로 결합하였으며, 단, 예외적으로 B7-H1 D122E 돌연변이체는 상기 두 항체에 덜 효율적으로 결합하였다. 상기 3개의 잔기는 2.7A4OPT mAb 결합 에피토프에 특이적이었고, 2.14H9OPT 또는 참조 항체 #1 에피토프와는 공유하지 않는 것이었다. Arg113 또한 2.7A4OPT 에피토프에 관여하였지만, 그 정도는 더 적었다. Ala로 대체한 경우, 상기 항체에 대한 결합에는 어떤 영향도 미지지 않았지만, Tyr 또는 Leu 돌연변이는 전체적으로 결합을 상실하였다. 113번 위치의 상기와 같은 돌연변이는 참조 항체 #1에 대한 결합에는 어떤 영향을 주지 못했는데, 이는 B7-H1 돌연변이체가 여전히 정배향 입체형태라는 것을 나타낸다. 예를 들어, Tyr과 같은 벌키 아미노산으로 대체할 경우, 일부 입체 장애를 도입할 수 있었다. 상기 결과는 Arg113이 2.7A4OPT 항체와의 접촉에는 직접적으로 관여하지 않지만, 실제 결합 에피토프에는 매우 가까이 위치한다는 것을 제안한다.

본 실시예를 통해 3개의 항B7-H1 항체 2.14H9OPT, 2.7A4OPT 및 참조 항체 #1은 B7-H1 경계면에 있어 PD-1과는 상이한 결합 에피토프를 가진다는 것이 입증되었다. 추가로, 상기 항체는 또한 PD-1 경계면에는 위치하지 않는 다른 인간 B7-H1 잔기에도 결합할 수 있는 가능성이 있다.

실시예 17: 최적에 못미치는 농도의 면역 회상 항원에 대한 기억 T 세포 반응에 대해 항B7-H1 항체가 미치는 효과 측정

PD-1과 B7-H1의 상호작용이 항원 특이 T 세포 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 상기 억제에 대해 항B7-H1 항체가 미치는 효과를 평가하기 위해 차선의 항원 면역 회상 분석법을 수행하였다.

제조사의 설명서에 따라 피콜-플라크 플러스(GE Healthcare 17-1440-03) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 혈액 연막층으로부터 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 단리하였다. 단리한 후, 세포를 1% 펜/스트렙(GIBCO,. 15140) 및 4% 인간 AB 혈청(Invitrogen 34005)이 보충된 RPMI 1640 글루타맥스 I(RPMI 1640 Glutamax I) 배지(GIBCO,.61870)에 재현탁시킨 후, 이어서, 0.1 ㎍/mL 파상풍 톡소이드(Calbiochem 582231)의 존재 또는 부재하에 37℃, 5% C0₂에서 웰당 1x10⁵개의 세포인 밀도로 96 웰의 바닥이 둥근 조직 배양 플레이트(Corning, 3799)에서 배양하였다. 3일 동안 배양한 후, IgG1-TM 포맷의 항B7-H1 항체 또는 이소타입 대조군을 명시된 농도로 첨가하고, 추가로 2일 동안 37℃로 회복시키고, 이 시점에서 상등액을 수거하고, DELFIA에 의해 인터페론-γ 수준에 대해 분석하였다. 항B7-H1 항체에 의한 인터페론-γ 방출 증진에 대해서는 도 6에 제시되어 있다.

항B7-H1 항체 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT는 인터페론-γ의 방출을 증가시킬 수 있었다. 상기 데이터를 통해 항원 특이 T 세포 반응을 증진시킬 수 있는 2.9D10, 2.7A4OPT 및 2.14H9OPT의 능력을 확인하였다.

실시예 18: 최적 농도의 면역 회상 항원에 대한 기억 T 세포 반응에 대해 항B7-H1 항체가 미치는 효과 측정

B7-H1이 잠재적인 억제 신호전달 특성을 가지는 것으로 제안되었다. 항원 면역 회상 반응을 억제할 수 있는 능력을 조사함으로써 상기와 같은 억제 신호전달을 구동시킬 수 있는 효현제로서 작용하는 항B7-H1 항체의 잠재능을 테스트하였다.

제조사의 설명서에 따라 피콜-플라크 플러스(GE Healthcare 17-1440-03) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 혈액 연막층으로부터 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 단리하였다. 단리한 후, 세포를 1% 펜/스트렙(GIBCO,. 15140) 및 4% 인간 AB 혈청(Invitrogen 34005)이 보충된 RPMI 1640 글루타맥스 I 배지(GIBCO,.61870)에 재현탁시킨 후, 이어서, 다양한 농도의 IgG1-TM 포맷의 항B7-H1 항체 또는 이소타입 대조군의 존재 또는 부재하에 5 ㎍/mL 파상풍 톡소이드(Calbiochem 582231)와 함께 37℃, 5% C0₂에서 웰당 1x10⁵개의 세포인 밀도로 96 웰의 바닥이 둥근 조직 배양 플레이트(Corning, 3799)에서 배양하였다. 공수용체에 대한 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. 5일 동안 배양한 후, 증식성 활성을 평가하기 위해 대략 16시간 동안 0.5 μCi/웰 적정된 티미딘으로 세포를 펄스화시켰다.

도 7에 제시된 바와 같이, 양성 대조군과는 달리, 2.9D10, 2.7A4 및 2.14H9 항B7-H1 항체의 경우, 어떤 억제 효과도 관찰되지 않았다. 이는 2.9D10, 2.7A4 및 2.14H9 항체가 어떤 효현 활성도 없는 순수한 길항제라는 것을 제안한다.

실시예 19: 항B7-H1 항체의 종양 성장 억제 활성

면역손상 NOD/SCID(비비만성 당뇨병/중증 복합 면역결핍증: non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency) 마우스를 사용하여 이종이식 마우스 모델에서의 항인간 B7-H1 항체의 생체내 활성을 조사하였다. 인간 B7-H1을 발현하는 인간 암 세포주, 및 건강한 기증자의 말초 혈액 단핵구 세포로부터 단리되고 동종반응성 이펙터 T 세포를 농축시키기 위해 배양된 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 피하로(SC) 마우스에 생착시켰다. 인간 췌장암 세포주 HPAC 또는 인간 흑색종 세포주 A375를 접종받은 마우스에게 복강내(IP) 용량의 항인간 B7-H1 항체를 투여하였다. 종양 부피가 2,000 ㎣가 될 때까지, 또는 육안적 종양 괴사가 있을 때까지 종양 성장에 대한 항체의 효과를 관찰하였다.

CD4+ 및 CD8+ T 세포주를 생성하기 위해, 20 mL의 전혈당 1 mL의 로제트셉(RosetteSep) T 세포 농축 생성물을 첨가함으로써 건강한 기증자로부터 유래된 인간 PBMC를 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대해 농축시켰다. 이어서, 20분 동안 인큐베이션시킨 후, 로제트셉 DM-L 밀도 배지를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 원심분리 후, 세포를 PBS로 세척하고, 10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지 중에 재현탁시켰다. 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 rhIL-2로 보충된 배지 중에서 7-10일 동안 따로따로 배양하고, 이들을 각각 미토마이신 C로 처리된 A375 또는 HP AC 세포와 조합하였다. T 세포를 수집하고, rhIL-2로 보충된 배지 중에서 7-10일 동안 다시 따로따로 배양하고, 미토마이신 C로 처리된 A375 또는 HP AC 세포와 조합하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 수집하고, 1:1 비로 조합하였다.

A375 및 HPAC 암 세포주 및 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대해 농축된 PBMC를 명시된 이펙터 대 표적(E:T: effector-to-target) 비로 피하(SC) 투여하기 직전에 혼합하였다. 각 암 세포주에 대한 세포 접종 개수는 실험적 종양 형성 용량 연구에 의해 사전에 결정되었다: 일반적으로, 총 부피 0.2 mL 중 2.5 x 10⁶개의 세포를 각 동물에 생착시켰다.

6마리의 동물을 각 실험군으로 배정하였다. 동물은 이소타입 대조군 인간 IgG2a 또는 IgG1OPT(본원에서 "IgG1TM"으로도 명명된다) 항체 또는 IgG1OPT 포맷의 항B7-H1 항체 2.14H9 IgG2a, 2.14H9OPT, 2.7A4OPT 또는 참조 항체 #1을 투여받았다. 총 8회에 걸쳐 독립 실험을 수행하였고, 각 실험에 대한 연구 디자인은 하기 표 26-33에 제시되어 있다. 기술된 항B7-H1 항체는 명시되는 경우를 제외하고는 IgG1OPT 포맷이었다.

암/이펙터 T 세포 생착 후 1시간 경과시, 제1 용량(200 ㎕)의 테스트 물품을 IP 투여하고; 동물은 연구 3, 5, 8 및/또는 10일째 최대 4회에 걸쳐 추가 용량의 테스트 물품을 투여받았다. 일부 연구에서 동종반응을 증진시키기 위한 양성 대조군으로서, 암/이펙터 T 세포 생착 후 1시간 경과시, rhIL-2를 IP 투여하고; 동물은 4일간 연속하여 4회에 걸쳐 추가의 1일 용량의 rhIL-2를 투여받았다. 주당 1 또는 2회에 걸쳐 각 동물에서의 종양 형성에 대해 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스로 측정하고; 하기 식을 사용하여 종양 부피(V)를 계산하였다:

V(㎣) = 0.5 (길이 (mm) x 너비 (mm) x 너비 (mm)/2).

각 군에 대해, 결과는 산술 평균으로 기록하였다. 종양 성장 억제(TGI: tumor growth inhibition) 비율(%)로서 표시되는 항암 효과는 하기 방법에 의해 계산하였다:

TGI(%) = [1 - (처리군의 평균 종양 V) / (대조군의 평균 종양 V)] x 100.

연구 1에서, 항B7-H1 항체 2.14H9 IgG2a 및 2.7A4OPT는 30일째 이소타입 대조군과 비교할 때 HPAC(췌장) 암 세포의 성장을 최대 61% 및 50%> 만큼 유의적으로 억제하였다(도 8 및 표 26).

연구 2에서, 항B7-H1 항체 2.14H9OPT 및 2.7A4OPT는 39일째 이소타입 대조군과 비교할 때 HPAC(췌장) 암 세포의 성장을 최대 70% 및 68% 만큼 억제하였다(도 9 및 표 27).

연구 3에서, 항B7-H1 항체 2.14H9OPT는 30일째 이소타입 대조군과 비교할 때 HPAC(췌장) 암 세포의 성장을 최대 60% 만큼 유의적으로 억제하였다(도 10 및 표 28).

연구 4에서, 항B7-H1 항체 2.14H9OPT는 22일째 이소타입 대조군과 비교할 때 HPAC(췌장) 암 세포의 성장을 최대 74% 만큼 유의적으로 억제하였다(도 11 및 표 29).

연구 5에서는 A375 (흑색종) 이종이식 모델에서 2.14H9 IgG2a 또는 2.7OPT 항B7-H1 항체를 IP 투여한 경우에도 29일째 이소타입 대조군과 비교할 때 종양 성장을 각각 64% 및 61% 정도 만큼 유의적으로 억제하였다(도 12 및 표 30).

연구 6에서, 항B7-H1 항체 2.14H9OPT는 T 세포와 조합되었을 때 25일째 이소타입 대조군과 비교할 때 A375(흑색종) 암 세포의 성장을 최대 77% 만큼 유의적으로 억제하였다(도 13 및 표 31).

연구 7에서, 항B7-H1 항체 2.14H9OPT는 T 세포와 조합되었을 때 25일째 이소타입 대조군과 비교할 때 A375(흑색종) 암 세포의 성장을 최대 82% 만큼 유의적으로 억제하였다(도 14 및 표 32).

연구 8에서, 항B7-H1 항체 2.14H9OPT는 T 세포와 조합되었을 때 25일째 이소타입 대조군과 비교할 때 A375(흑색종) 암 세포의 성장을 최대 93% 만큼 유의적으로 억제하였다(도 15 및 표 33).

본 결과는 항인간 B7-H1 항체 2.14H9 IgG2a, 2.14H9OPT 및 2.7A4OPT가 인간 암의 이종이식 마우스 모델에서 강력한 생체내 항암 활성을 가진다는 것을 입증하며, 상기 항인간 B7-H1 항체가 B7-H1을 발현하는 암을 앓는 환자 치료를 위한 단일제 요법으로서 활성을 가질 수 있다는 증거를 제공한다.

참고 문헌 인용

특허, 특허 출원, 논문, 서적 등, 및 그에 인용된 참고 문헌을 비롯한 본원에서 인용된 모든 참고 문헌은 기존과는 다른 정도로 그 전문이 본원에서 참고로 인용된다. 2009년 11월 24일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제61/264,061호, 그의 도면 및 서열은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.

등가물

상기 작성된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하는 데 충분할 것으로 간주된다. 상기 설명 및 실시예에서는 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태를 설명하였으며, 본 발명에 의해 최적 모드로 주시되는 것을 기술하였다. 그러나, 상기 내용을 문서로 아무리 상세하게 설명되었다 할지라도, 본 발명은 다양한 여러 방식으로 수행될 수 있고, 본 발명은 첨부되는 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 함을 이해할 것이다.

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SEQUENCE LISTING <110> Alimzhanov, Marat Babcock, John Boyle, Melanie Chodorge, Matthieu Foltz, Ian Hammond, Scott Queva, Christophe Kang, Jaspal Singh Morrow, Michelle Sekirov, Laura <120> Targeted Binding Agents Against B7-H1 <130> MED0543.PCT <150> US 61/264,061 <151> 2009-11-24 <160> 80 <170> Cambridge Antibody Technology patent software version 1.0 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4 <400> 1 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg ccagtggctt tacattcagt acctactcca tgaactgggt ccgccaggca 120 ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctcatcca gtggcgacta catctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgttc 240 ctgcagatga actccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacctg 300 gtgacatcca tggtggcctt cgactactgg ggtcagggca ctctcgtcac agtgtcctct 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu 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gcgacgccct gcctcagaaa tacgtgttct ggtatcagca gaagtccggc 120 caggcccctg tgctggtgat ctacgaggac tccaagcggc cttccggcat ccctgagcgg 180 ttctccggct cctcttccgg caccatggcc accctgacca tctctggcgc ccaggtggag 240 gacgaggccg actactactg ctactccacc gacagatccg gcaaccacag agtgtttggt 300 gggggtacta gactgaccgt gctg 324 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4 <400> 7 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15 Ala Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Gln Lys Tyr Val 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Arg Ser Gly Asn His 85 90 95 Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4 <400> 8 Ser Gly Asp Ala Leu Pro Gln Lys Tyr Val Phe 5 10 <210> 9 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40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Trp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 13 Ser Tyr Trp Met Ser 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 14 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 15 Asp Trp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Asp Met Asp Val 5 10 <210> 16 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 16 gagatcgtgc tgacccagtc ccctggcacc ctgtctctgt ctcccggcga gagagccacc 60 ctgtcttgcc gggcctccca gtccgtgtcc tccaactacc tcgcctggtt ccagcagaaa 120 cccggtcagg cccctagact gctgatcttc ggcacctcct ccagagccac cggcatccct 180 gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc caggctggaa 240 cctgaggact tcgctgtgta ctattgccag cagtacggct cctccatctt caccttcgga 300 ccaggaacaa aggtcgacat caaa 324 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ile 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 18 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 19 Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.9D10 <400> 20 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ile Phe Thr 5 <210> 21 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 21 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcttgggt gcgccaggct 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccaac atcaaacagg atggctctga gaagtactac 180 gtggactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc ccgggagggc 300 ggatggttcg gcgagctggc cttcgattac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360 tct 363 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 23 Arg Tyr Trp Met Ser 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 24 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 25 Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr 5 10 <210> 26 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 26 gagatcgtgc tgacccagtc ccctggcacc ctgtctctgt ctcccggcga gagagccacc 60 ctgtcttgcc gggcctccca gcgggtgtcc tcctcctacc tggcctggta tcagcagaaa 120 cccggacagg cccctaggct gctgatctac gacgcctcct ccagagccac cggcatccct 180 gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240 cctgaggact ttgccgtgta ttactgccag cagtacggct ccctgccttg gaccttcggc 300 cagggaaccg aggtggagat caaa 324 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 28 Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 29 Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9 <400> 30 Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr 5 <210> 31 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 31 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatgcca tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcggct attcgtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctt 300 cactatgata gtagtggtta tcttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 32 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu His Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 33 Asn Tyr Ala Met Ser 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 34 Ala Ile Arg Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 35 Asp Leu His Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Asp Tyr 5 10 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 36 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattcgc agctggttag cctggtatca gcagaaaccg 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct atatccaggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggtttagcg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ile Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 38 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp Leu Ala 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 39 Ala Ile Ser Arg Leu Gln Ser 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.20A8 <400> 40 Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr 5 <210> 41 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 41 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaggtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgttt 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagagttcag 300 ctctacagtg actactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctct 357 <210> 42 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gln Leu Tyr Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 43 Ser Tyr Trp Met Ser 5 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 44 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 45 Val Gln Leu Tyr Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 5 10 <210> 46 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 46 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaatca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccggtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatttag caacttacta ttgtcaacag agtcacagtc tccctccgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 48 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 49 Ala Ala Ser Gly Leu Gln Ser 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.15G8 <400> 50 Gln Gln Ser His Ser Leu Pro Pro Thr 5 <210> 51 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 51 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggagac ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaac agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtggta gtggtggttt cacattctcc 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240 ctgcagatga acagcctgag agtcgaggac tcggccgtat attcctgtgc gaaagtcctt 300 gttggattta acaatggctg ctgggactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 52 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 52 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Phe Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Lys Val Leu Val Gly Phe Asn Asn Gly Cys Trp Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 53 Ser Tyr Ala Met Ser 5 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 54 Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Phe Ser Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 55 Val Leu Val Gly Phe Asn Asn Gly Cys Trp Asp Tyr 5 10 <210> 56 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 56 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta atgatcatgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 57 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 57 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Asn Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 58 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 59 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 5 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 3.18G1 <400> 60 Gln Val Trp Asp Ser Ser Asn Asp His Val Val 5 10 <210> 61 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 61 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg ccagtggctt tacattcagt acctactcca tgaactgggt ccgccaggca 120 ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctcatcca gtggcgacta catctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacctg 300 gtgacatcca tggtggcctt cgactactgg ggtcagggca ctctcgtcac agtgtcctct 360 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Val Thr Ser Met Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 63 Thr Tyr Ser Met Asn 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 64 Ser Ile Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 65 Asp Leu Val Thr Ser Met Val Ala Phe Asp Tyr 5 10 <210> 66 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 66 tcttacgagc tgacccagcc tccttccgtg tccgtgtctc caggacagac ggccagaatc 60 acctgttccg gcgacgccct gcctcagaaa tacgtgttct ggtatcagca gaagtccggc 120 caggcccctg tgctggtgat ctacgaggac tccaagcggc cttccggcat ccctgagcgg 180 ttctccggct cctcttccgg caccatggcc accctgacca tctctggcgc ccaggtggag 240 gacgaggccg actactactg ctactccacc gacagatccg gcaaccacag agtgtttggt 300 gggggtacta agctgaccgt gctg 324 <210> 67 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 67 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Gln Lys Tyr Val 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Arg Ser Gly Asn His 85 90 95 Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 68 Ser Gly Asp Ala Leu Pro Gln Lys Tyr Val Phe 5 10 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 69 Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser 5 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.7A4_opti <400> 70 Tyr Ser Thr Asp Arg Ser Gly Asn His Arg Val 5 10 <210> 71 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 71 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcttgggt gcgccaggct 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccaac atcaaacagg atggctctga gaagtactac 180 gtggactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc ccgggagggc 300 ggatggttcg gcgagctggc cttcgattac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360 tct 363 <210> 72 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 73 Arg Tyr Trp Met Ser 5 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 74 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 75 Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr 5 10 <210> 76 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 76 gagatcgtgc tgacccagtc ccctggcacc ctgtctctgt ctcccggcga gagagccacc 60 ctgtcttgcc gggcctccca gcgggtgtcc tcctcctacc tggcctggta tcagcagaaa 120 cccggacagg cccctaggct gctgatctac gacgcctcct ccagagccac cggcatccct 180 gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240 cctgaggact ttgccgtgta ttactgccag cagtacggct ccctgccttg gaccttcggc 300 cagggaacca aggtggagat caaa 324 <210> 77 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 77 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 78 Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 79 Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 2.14H9_opti <400> 80 Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr 5

Claims

B7-H1에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은
서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1;
서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2;
서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3;
서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1;
서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2; 및
서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3; 또는
서열 번호 63의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1;
서열 번호 64의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2;
서열 번호 65의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3;
서열 번호 68의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1;
서열 번호 69의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2; 및
서열 번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3
을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 항체 또는 이의 단편.
제2항에 있어서, 상기 항체는 완전 인간 모노클로날 항체인 항체 또는 이의 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은
서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 도메인; 또는
서열 번호 62의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 67의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 도메인
을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제4항에 있어서, 상기 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 dAb 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 단편인 것인 항체 또는 이의 단편.
제4항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 도메인은 기탁 번호 41598로 국립 산업 및 해양 박테리아 보존기관(NCIMB)에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드 내의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 도메인은 기탁 번호 41598로 NCIMB에 기탁된, 2.7A4_G로 명명된 플라스미드 내의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 항체 또는 이의 단편.
제4항에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역은 Kabat에 기재된 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때, 234F, 235F 및 331S 잔기를 특징으로 하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항의 항체를 코딩하는 핵산 분자.
제8항의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 형질감염된 숙주 세포.
제9항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 제8항의 핵산 분자에 의해 코딩되는 항체를 발현하는 단계, 및 배양물로부터 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 종양 치료용 약학 조성물로서, 상기 종양은 유방 종양, 결장 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 신장 종양, 위 종양, 방광 종양, 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer), 간세포암(HCC: hepatocellular cancer), 췌장암 및 흑색종으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 종양 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물로서, 상기 종양은 유방 종양, 결장 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 신장 종양, 위 종양, 방광 종양, 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer), 간세포암(HCC: hepatocellular cancer), 췌장암 및 흑색종으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 종양 치료용 약학 조성물.