ES2251718T3

ES2251718T3 - Nuevos genes de bacillus thuringiensis que codifican para toxinas activas contra plagas de lepidopteros.

Info

Publication number: ES2251718T3
Application number: ES95918126T
Authority: ES
Inventors: Vance Cary Kramer; Thomas Curtis Currier
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-05-30
Publication date: 2006-05-01
Anticipated expiration: 2015-05-30
Also published as: JP4038778B2; CA2191978A1; DE69534744D1; BR9507973A; EP0764210B1; WO1995034656A1; AU2417795A; CA2191978C; JPH10502525A; EP0764210A1; DK0764210T3; NZ285165A; DE69534744T2; US5530195A; PT764210E; ATE315650T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS GENES DE TOXINAS, PURIFICADOS Y AISLADOS A PARTIR DE BACILLUS THURINGIENSIS VAR. KURSTAKI, LOS CUALES SE DESIGNAN COMO CRYLE(C) Y CRYLE(D). LOS NUEVOS GENES DE TOXINAS CODIFICAN PARA PROTEINAS DE APROXIMADAMENTE 130 KDA DE TAMAÑO, Y QUE SON ACTIVAS CONTRA INSECTOS LEPIDOPTEROS. ASIMISMO, SE INCLUYEN EN LA INVENCION LAS PROTEINAS CODIFICADAS POR CRYLE(C) Y CRYL(D). ADEMAS, SE PROPORCIONAN CEPAS BACTERIANAS MICROBIOLOGICAMENTE PURAS, TRANSFORMADAS CON AL MENOS UNO DE LOS NUEVOS GENES DE TOXINAS, LAS CUALES SE PUEDEN UTILIZAR EN FORMULACIONES ENTOMOCIDAS PARA EL CONTROL DE INSECTOS LEPIDOPTEROS. OTRO ASPECTO DE LA INVENCION LO CONSTITUYEN LAS PLANTAS TRANSFORMADAS CON AL MENOS UNO DE LOS GENES DE TOXINAS, O CON FRAGMENTOS ACTIVOS DE LOS MISMOS, ESPECIALMENTE CUANDO LAS SECUENCIAS TRANSFORMADORAS HAN SIDO OPTIMIZADAS PARA SU EXPRESION EN MAIZ.

Description

Nuevos genes de Bacillus thuringiensis que codifican para toxinas activas contra plagas de lepidópteros.

La presente invención se refiere a nuevos genes que codifican para una toxina aislados de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, a las proteínas codificadas por los genes, cepas recombinantes que comprenden al menos uno de los nuevos genes de la toxina y composiciones entomocidas que contienen al menos una de las cepas recombinantes, así como plantas transgénicas que comprenden al menos uno de los nuevos genes de la toxina o sus derivados.

Bacillus thuringiensis pertenece al gran grupo de bacterias gram positivo, aeróbicas que forman endosporas. A diferencia de otras especies muy estrechamente emparentadas de Bacillus tales como B. cereus o B. anthracis, la mayoría hasta ahora conocidas como de la especie Bacillus thuringiensis, produce en el curso de su esporulación un cuerpo de inclusión paraesporal que, debido a su estructura cristalina, generalmente se llama también cuerpo cristalino. Este cuerpo cristalino está compuesto de proteínas protoxinas cristalinas insecticidamente activas, denominadas
\delta-endotoxinas.

Estos cristales de proteína son responsables de la toxicidad en insectos de Bacillus thuringiensis. La \delta-endotoxina no exhibe su actividad insecticida hasta después del aporte oral del cuerpo cristalino, cuando éste está disuelto en el jugo intestinal de los insectos objetivo. En la mayor parte de los casos el componente tóxico real se libera a partir de la protoxina como consecuencia de la división proteolítica causada por la acción de proteasas del tracto digestivo de los insectos.

Las \delta-endotoxinas de las diversas cepas de Bacillus thuringiensis están caracterizadas por una alta especificidad en lo que concierne a ciertos insectos objetivo, especialmente en lo que concierne a varias larvas Lepidópteras,
Coleópteras y Dípteras, y por un alto grado de actividad contra estas larvas. Una ventaja más en la utilización de
\delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis reside en el hecho de que las toxinas son inofensivas para los seres humanos, otros mamíferos, pájaros y peces.

Con la introducción de la ingeniería genética y las nuevas posibilidades que son el resultado de ello, el campo de las toxinas de Bacillus thuringiensis ha recibido un nuevo ímpetu. Por ejemplo, se sabe que muchas cepas que se dan en la naturaleza poseen más de una proteína de la toxina del insecto, lo que puede considerarse como un amplio espectro de actividad insecticida de estas cepas. Sin embargo, con la capacidad de transformar Bacillus genéticamente es posible crear cepas recombinantes que pueden contener una serie escogida de genes que codifican para la toxina del insecto obtenidos por el aislamiento y la clonación de fuentes que se dan en la naturaleza. Tales cepas recombinantes pueden prepararse para proporcionar cualquier espectro de actividad insecticida que pudiera ser deseado para una aplicación particular, basado en un conocimiento de la actividad insecticida de proteínas de toxina individuales. Además, también es posible crear proteínas de la toxina recombinantes que tengan una combinación escogida de funciones diseñadas para potenciar el grado de actividad insecticida contra un insecto particular o clase de insecto, o ampliar el espectro de insectos contra los cuales es activa la proteína de la toxina.

Varias proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis han sido clasificadas basado en su espectro de actividad y en la semejanza de la secuencia. La clasificación hecha por Höfte y Whiteley, Microbiol. Rev. 53:
242-255 (1989) sitúa a las proteínas cristalinas insecticidas conocidas en cuatro clases principales. Generalmente, las clases principales se definen por el espectro de actividad, siendo las proteínas CryI activas contra Lepidópteras, las proteínas CryII activas tanto contra Lepidópteras como contra Dípteras, las proteínas CryIII activas contra Coleópteras, y proteínas CryIV activas contra Dípteras.

Dentro de cada clase principal, las \delta-endotoxinas están agrupadas de acuerdo con la semejanza de la secuencia. Las proteínas CryI típicamente son producidas como proteínas protoxinas de 130-140 kDa que son escindidas proteolíticamente para producir proteínas toxinas activas de aproximadamente 60-70 kDa. La parte activa de las \delta-endotoxinas reside en la porción del extremo NH_{2} de la molécula de cadena entera. Höfte y Whiteley, supra, clasificaron las proteínas entonces conocidas CryI en seis grupos, IA(a), IA(b), IA(c), IB, IC e ID. Desde entonces, también han sido caracterizadas las proteínas clasificadas como CryIE, CryIF, CryIG, CryIH y CryIX.

Moar WJ et al. (Applied and environmental microbiology, volumen 60 (3), páginas de 896 a 902) describen la actividad insecticida de la proteína CryIIA del aíslado NRD-12 de Bacillus thurinoiensis de la subespecie kurstaki.

Van Frankenhuyzen et al. (Journal of Invertebrate Pathology, volumen 62, páginas 295-301) compara la actividad insecticida de proteínas \delta-endotoxina Cry1B. Cry1C, Cry1D y Cry1E de Bacillus thurinpiensis contra las de toxinas Cry1A para un rango de especies de insectos.

Honée et al. (Molecular Microbiology, volumen 5 (11), páginas 2799-2806) se refiere a estudios de unión de proteínas cristalinas híbridas basadas en Cry1A (b) y Cry1C.

El espectro de actividad insecticida de una \delta-endotoxina individual de Bacillus thuringiensis tiende a ser bastante estrecho, siendo una \delta-endotoxina dada activa sólo contra unos cuantos insectos. La especificidad es el resultado de la eficacia de las diversas etapas implicadas en la producción de una proteína toxina activa y su capacidad subsecuente de interactuar con las células epiteliales en el tubo digestivo del insecto.

Para ser insecticida, una \delta-endotoxina primero debe ser ingerida por el insecto, solubilizada y en la mayor parte de los casos escindida proteolíticamente para formar una toxina activa. Una vez activada, las \delta-endotoxinas se unen a las proteínas específicas presentes sobre la superficie de las células epiteliales de las vísceras del insecto por medio de un dominio específico sobre la proteína toxina. En todos los casos examinados, la unión de la proteína toxina a la víscera del insecto ocurre siempre que haya toxicidad. Después de la unión, se inserta un dominio diferente de las \delta-endotoxinas, según se piensa, en la membrana celular creando un poro que causa la ruptura osmótica de la célula epitelial visceral del insecto. La especificidad de la proteína toxina en insectos particulares, según se cree, está determinada, en gran parte, por las propiedades del dominio de unión de una \delta-endotoxina
activada.

El tamaño de la región de una \delta-endotoxina requerida para unirse a la proteína de unión de las células de las vísceras del insecto es indeterminado. Schnepf et al. (J. Biol. Chem. 265:20923-20930,1990) han demostrado que la región entre los aminoácidos 332 y 722 contribuye sustancialmente a la especificidad de CryIA(c) frente a Heliothis virescens y que hay subsecuencias dentro de esta región que contribuyen aditivamente a esta especificidad. Esta región de aminoácidos de 332 a 722 abarca tanto el "Dominio II" que determina la especificidad como el "Dominio III" que determina la orientación estructural como se define en Li et al. (Nature 353: 815-821,1991). La importancia de subsecuencias dentro de esta amplia región está acentuada además por las conclusiones de Ge et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4037-4041,1989), que identificaron una región de CryIA(a) de los aminoácidos 332 a 450 que determinaba la especificidad de la toxicidad de la proteína en el gusano de seda (Bombyx mori, Lepidóptera).

Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos genes que codifiquen para una proteína toxina y composiciones entomocidas que comprendan a los mismos.

En particular, la presente invención se refiere a nuevos genes de toxina del tipo CryIE obtenibles a partir de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, cuyos genes de la toxina codifican una proteína toxina del tipo CryIE que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe ninguna actividad contra Spodoptera exigua.

Cada uno de los nuevos genes de toxina codifica para una proteína de aproximadamente 130 kDa de tamaño y es activo contra insectos Lepidópteros. Se les ha dado a los nuevos genes de toxina la designación CryIE(c) [SEQ ID NO:1] y CryIE(d) [SEQ ID NO 7].

Por lo tanto, la presente invención se refiere particularmente a una molécula de ADN aislada que codifica para la proteína toxina CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente y que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en adelante en la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO 7, respectivamente. Además, comprende una molécula de ADN aislada que ha sido truncada para codificar el fragmento tóxico principal de la proteína toxina CryIE (c) y CryIE (d), respectivamente.

También se incluyen en la invención las proteínas producidas por CryIE(c) [SEQ ID NO:2] y CryIE(d) [SEQ ID NO 8], respectivamente y/o el fragmento tóxico principal de dichas proteínas toxinas.

La invención además se refiere a genes recombinantes y proteínas que poseen una o varias de las subsecuencias de los nuevos genes que confieren actividad contra los insectos del género Heliothis.

Es un objeto más de la invención por lo tanto proporcionar una molécula de ADN aislada que codifica para una proteína toxina en la que dicha proteína toxina comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3) y Subsecuencia B (SEQ ID NO:4) obtenible a partir de CryIE(c) o Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO:10) obtenible a partir de CryIE(d), respectivamente y que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exipua. También se incluyen moléculas de ADN aisladas en las que dicha proteína toxina comprende ambas Subsecuencia A (SEQ ID NO:3) y Subsecuencia B (SEQ ID NO:4) obtenibles a partir de CryIE(c) o la Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO:10) fácil de conseguir a partir de CryIE(d), respectivamente, o sus combinaciones. Las proteínas que se codifican por dichas moléculas de ADN también se incluyen en el alcance de la invención.

Una realización específica de la invención se refiere a una molécula de ADN aislada que codifica para la proteína toxina CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente y/o una molécula de ADN aislada que ha sido truncada para codificar el fragmento tóxico principal de dichas proteínas toxinas, cuya molécula de ADN ha sido optimizada para su expresión en plantas, pero especialmente en plantas de maíz.

La invención además se refiere a genes recombinantes y proteínas que poseen una o varias de las subsecuencias de los genes del tipo CryIE de acuerdo con la invención, pero especialmente a subsecuencias seleccionadas del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3) y Subsecuencia B (SEQ ID NO:4) obtenible a partir de CryIE(c) o Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO:10) obtenible a partir de CryIE(d), respectivamente, que confieren actividad contra los insectos del género Heliothis.

En particular, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ADN que codifica para una proteína toxina del tipo CryIE, que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, pero especialmente una proteína CryIE(c) y CryIE(d) como se muestra en la SEQ ID NO 2 y la SEQ ID NO 8, respectivamente. En una realización preferida, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende una construcción quimérica, en la que la molécula de ADN que codifica para una proteína toxina del tipo CryIE, que es activa contra la especie Heliothis pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, está bajo el control de las secuencias de expresión que son operables en microorganismos y/o
plantas.

Un aspecto adicional de la invención son cepas microbianas recombinantes, biológicamente puras, transformadas con al menos uno de los nuevos genes que pueden ser usados en formulaciones entomocidas para el control de insectos Lepidópteros. En una realización específica la invención se refiere a microorganismos seleccionados del grupo que consiste en los miembros del género Bacillus, Pseudomonas, Caulobacter, Agmellenum, Rhizobium, y Clavibacter; a baculoviruss tales como, por ejemplo, el virus de poliedrosis nuclear Autographica californica y a levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium.

La invención se refiere así además a composiciones entomocidas que comprenden al menos una de las nuevas proteínas toxinas del tipo CryIE, pero especialmente una molécula de proteína aislada que tiene la secuencia expuesta a continuación en la SEQ ID NO 2 y/o una molécula de proteína aislada que tiene la secuencia expuesta a continuación en la SEQ ID NO 8 y/o una molécula de proteína aislada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’, (SEQ ID NO:9), Subsecuencia B’ (SEQ ID NO:10) y una combinación de la Subsecuencia A, B, A' y B' en la que dicha proteína toxina es activa contra la especie Heliothis, en una cantidad insecticidamente eficaz junto con un vehículo adecuado.

En una realización preferida la invención se refiere a una composición entomocida que comprende un microorganismo recombinante, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante, que contiene al menos uno de los nuevos genes de toxina en una forma recombinante o su derivado o su mutante.

Otro aspecto más de la invención son plantas transformadas con al menos uno de los nuevos genes de toxina o sus fragmentos activos, particularmente cuando las secuencias de transformación han sido optimizadas para la expresión en plantas, pero especialmente en plantas de maíz.

En particular, la invención se refiere a plantas transformadas que comprenden una molécula de ADN que codifica para la proteína toxina CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente, o su combinación y que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta a continuación en la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO 7, respectivamente y/o una molécula de ADN aislada que ha sido truncada para codificar el fragmento tóxico principal de dichas proteínas toxinas.

La invención además se refiere a plantas transformadas que comprenden una molécula de ADN que codifica para una proteína toxina en la que dicha proteína toxina comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9), Subsecuencia B’, (SEQ ID NO 10) y una combinación de las Subsecuencias A, B, A’ y B' en la que dicha proteína toxina es activa contra la especie Heliothis.

Son preferidas dentro de la invención plantas transformadas seleccionadas del grupo que consiste en maíz, trigo, cebada, arroz, tabaco, algodón y soja.

La invención además se refiere a métodos para producir una molécula de ADN aislada de acuerdo con la invención o una proteína toxina que se codifica por dicha molécula de ADN. Los métodos para producir microorganismos recombinantes y plantas que comprenden dicha molécula de ADN también son incorporados según la presente invención así como los métodos para producir composiciones entomocidas.

En particular, la invención se refiere a un método para obtener una molécula de ADN aislada que codifica para una proteína toxina del tipo CryIE, pero especialmente del tipo CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, comprendiendo el método:

(a) aislar el ADN total de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki;

(b) establecer una genoteca de ADN genómico en un organismo huésped adecuado;

(c) sondear dicha genoteca con una molécula sonda adecuada;

(d) aislar un clon que se hibride con la molécula sonda; y

(e) analizar dicho clon para determinar su actividad insecticida.

La invención se refiere además a un método para producir una molécula protéica aislada del tipo CryIE, pero especialmente del tipo CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, comprendiendo el método:

(a) transformar un organismo huésped adecuado con una molécula de ADN recombinante que comprende una construcción quimérica, en el que la molécula de ADN que codifica para una proteína toxina del tipo CryIE que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, está bajo el control de las secuencias de expresión que son operables en dicho organismo huésped;

(b) cultivar el organismo huésped así transformado en un medio adecuado; y

(c) aislar el producto de la proteína recombinante producido por el organismo huésped transfomado bajo la expresión del gen de la toxina.

La invención además abarca un método para producir una planta transgénica que comprende transformar dicha planta con una molécula de ADN recombinante que comprende una construcción quimérica, en la que la molécula de ADN que codifica para una proteína toxina del tipo CryIE, pero especialmente del tipo CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente que es activa contra la especie Heliothis pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, está bajo el control de las secuencias de expresión que son operables en dicha planta.

Un objeto más de la invención es proporcionar un método para producir un microorganismo recombinante que comprende transformar dicho microorganismo con una molécula de ADN recombinante que comprende una construcción quimérica, en el que la molécula de ADN que codifica para una proteína toxina del tipo CryIE, que es activa contra la especie Heliothis pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, está bajo el control de las secuencias de expresión que son operables en dicho microorganismo.

La invención también se refiere a un método para producir una composición entomocida que comprende mezclar un microorganismo recombinante o una molécula de la proteína aislada de acuerdo con la invención en una cantidad insecticidamente eficaz con un vehículo adecuado.

Un objeto más de la invención es proporcionar métodos para proteger plantas contra el daño causado por insectos perjudiciales que comprenden aplicar a la planta o al área de cultivo al menos una de las nuevas proteínas toxinas de acuerdo con la invención directamente o en forma de una composición entomocida que comprende al menos una de dichas proteínas o un microorganismo recombinante, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante, conteniendo al menos uno de los nuevos genes de toxina en una forma recombinante o su derivado o su mutante. En una realización más, una planta transgénica de acuerdo con la invención puede ser usada en un método para proteger plantas contra el daño causado por un insecto perjudicial que comprende plantar una planta de acuerdo con la invención dentro de un área donde dicho insecto perjudicial puede darse.

El aislamiento y la purificación de los nuevos genes de toxina de la presente invención se describen con detalle en el Ejemplo 1. De acuerdo con el esquema de la nomenclatura de Höfte y Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242-255 (1989), las proteínas codificadas por los nuevos genes de toxina de la presente invención serían clasificadas como del tipo CryIE y se designan en este documento como CryIE(c). La región de codificación del nuevo gen de la toxina (SEQ ID NO:1) se extiende desde la posición de la base del nucleótido 196 a la posición 3723. La proteína producida por el nuevo gen de la toxina CryIE(c) tiene la secuencia de aminoácidos descrita como la SEQ ID NO 2, y además es caracterizada en el Ejemplo 5.

La región de codificación del nuevo gen de la toxina CryIE(d) (SEQ ID NO:7) se extiende desde la posición de la base del nucleótido 1 a la posición 3528. La proteína producida por el nuevo gen de la toxina CryIE(d) tiene la secuencia de aminoácidos descrita como la SEQ ID NO:8, y también está caracterizada además en el Ejemplo 5. El tamaño de ambas proteína CryIE(c) (SEQ ID NO:2) y proteína CryIE(d) (SEQ ID NO:8), como se deduce de su secuencia de ADN, es de 130,7 kDa. Es similar en tamaño a otras proteínas del tipo CryIE conocidas. A pesar de la semejanza del tamaño aparente, la comparación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por los nuevos genes de la toxina con él de la proteína del tipo CryIE antes mencionada muestra diferencias significativas entre las dos. Las proteínas CryIE(c) y CryIE(d) tienen una semejanza sólo del 81% para la proteína CryIE(a) y una semejanza sólo del 83% para la proteína CryIE(b).

Los nuevos genes de toxina CryIE(c) y CryIE(d) son idénticos en un 99% entre sí al nivel de la proteína, diferenciandose sólo en el resto de aminoácidos en las posiciones indicadas en la Tabla 1.

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TABLA 1 Diferencias de composición de los aminoácidos entre la proteína CryIE(c) (SEQ ID NO:2) y la proteína CryIE(d) (SEQ ID NO:8)

Posición del Resto	Aminoácido en CryIE (c)	Aminoácido en CryIE (d)

84	Glutamina	Histidina
187	Valina	Alanina
214	Asparagina	Treonina
229	Asparagina	Isoleucina
394	Glutamina	Histidina
437	Serina	Alanina
441	Treonina	Serina

TABLA 1 (continuación)

Posición del Resto	Aminoácido en CryIE (c)	Aminoácido en CryIE (d)

453	Histidina	Arginina
459	Asparagina	Lisina
483	Treonina	Prolina
506	Metionina	Isoleucina
729	Tirosina	Fenilalanina

Una comparación de la secuencia de bases de nucleótidos de los genes de CryIE(c) y de CryIE(d) de la presente invención con las regiones de codificación correspondientes de otros genes del tipo CryIE conocidos en la técnica indica que existen diferencias significativas entre ellos. Los genes de CryIE(c) y de CryIE(d) de la presente invención tienen sólo una homología de la secuencia del 87% con el gen de endotoxina conocido denominado CryIE (a) y sólo una homología de la secuencia del 85% con el gen de endotoxina conocido denominado CryIE (b).

Aunque las proteínas CryIE(c) y CryIE(d) de la presente invención muestran una semejanza de la secuencia limitada con las otras proteínas del tipo CryIE conocidas, exhiben actividades insecticidas distintas respecto a las de las proteínas del tipo CryIE conocidas. Como se muestra a continuación en el Ejemplo 4 y la Tabla 3, las proteínas codificadas por los nuevos genes de toxina de la presente invención son activas contra el insecto Lepidóptero Heliothis virescens. No se conocen proteínas del tipo CryIE previamente publicadas que sean activas contra este insecto perjudicial. Además, se sabe que las proteínas del tipo CryIE antes mencionadas son activas contra el insecto Lepidóptero Spodoptera exigua mientras que las proteínas CryIE(c) y CryIE(d) de la presente invención no poseen esta actividad.

CryIE(d) posee además actividad contra Spodoptera frugiperda. Finalmente, tanto las proteínas CryIE(c) como
CryIE(d) son activas contra el insecto Plutella xylostella mientras que las proteínas del tipo CryIE previamente conocidas no son tóxicas para aquel insecto particular.

La única actividad insecticida de las proteínas CryIE(c) y CryIE(d) de la presente invención contra Heliothis virescens es el resultado de dos subsecuencias localizadas en la región que atraviesa los restos de aminoácidos 332 a 622 de la proteína. Esta región corresponde a regiones identificadas en otras proteínas \delta-entotoxina como responsables de la especificidad del insecto ("Dominio II") y la orientación estructural ("Dominio III"). Véase Li et al. (Nature 353: 815-821,1991). Las subsecuencias dentro de esta región corresponden a los dominios descritos por Li et al. supra.

Las primeras subsecuencias identificadas, Subsecuencia A [SEQ ID NO:3); de CryIE(c)] y Subsecuencia A’ [SEQ ID NO:9; de CryIE(d)], atraviesan la región de aminoácidos de 332 a 465. Está caracterizado porque tiene una baja semejanza de la secuencia respecto a las otras proteínas toxinas del tipo CryI aunque se sugiere determinar aditivamente la actividad contra Heliothis virescens en base al trabajo de Schnepf et al., (J. Biol. Chem. 265:20923-20930, 1990). La Subsecuencia A también corresponde al "Dominio II" que determina la especificidad como se describe en Li et al., (Nature 353:815-821,1991).

La segunda subsecuencia identificada, Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), de CryIE(c)] y Subsecuencia B’ [SEQ ID NO:10; de CryIE(d)], atraviesa la región de aminoácidos de 466 a 622. Esta región está caracterizada por su alta semejanza de la secuencia con la región correspondiente encontrada en otra proteína de Bacillus thuringiensis,
CryIA(a), que es tan activa sobre Heliothis virescens como la nueva proteína toxina CryIE(c) o CryIE(d). La subsecuencia B corresponde al "Dominio III" de orientación estrutural como se describe en Li et al., (Nature 353:815-821, 1991). Se muestra la semejanza entre la Subsecuencia B en CryIE(c) y la región correspondiente en CryIA(a) para las dos proteínas en la Tabla 2, a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Alineación de regiones correspondientes a la Subsecuencia B de CryIE(c) de la presente invención y CryIA (a)

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El alto porcentaje de semejanza (86%) entre la región de la Subsecuencia B de la nueva proteína toxina
CryIE(c) de la presente invención y la región correspondiente de la proteína CryIA(a) indica la naturaleza conservadora de la región que confiere toxicidad para Heliothis virescens. Cuando la Subsecuencia B de la nueva proteína toxina
CryIE(c) de la presente invención es comparada con la región correspondiente para la proteína emparentada CryIE(a), que no es activa contra Heliothis virescens, se encuentra que el porcentaje de semejanza es de sólo el 63%.

Cuando se compara CryIE(d) con CryIE(c), la región del resto de aminoácido 466 al resto de aminoácido 622 de CryIE(d) se diferencia en sólo dos aminoácidos. CryIE(d) tiene una prolina en la posición 482 y una isoleucina en la posición 506, comparado con una treonina y metionina, respectivamente, para CryIE(c). Estas diferencias no afectan al porcentaje de semejanza de modo que la Subsecuencia B de CryIE(d) es también del 86% similar a la región correspondiente de la proteína CryIA(a).

La presente invención pretende cubrir a los mutantes y recombinantes o derivados de ingeniería genética del gen de CryIE(c) (SEQ ID NO 1) o del gen de CryIE(d) [SEQ ID NO 7], Por ejemplo, se sabe que las proteínas del tipo CryI deben ser escindidas proteolíticamente en un fragmento tóxico principal que es la molécula tóxica real [Höfte y Whiteley, Microbiol Rev. 53:242-255 (1989)]. Por lo tanto, una secuencia de ADN truncada que codifica para el fragmento tóxico principal de la nueva proteína toxina CryIE(c) y CryIE(d), se considera que está en la amplitud de la presente invención. Además, una proteína toxina recombinante puede ser construida usando métodos conocidos en la técnica que contiene al menos una de las subsecuencias que confieren actividad contra Heliothis virescens como se indica para CryIE(c) [véanse las SEQ ID NOS.: 3 a 4] o el gen relacionado CryIE(d) [véanse las SEQ ID NOS.: 9 a 10]. Tal proteína recombinante tendría actividad contra Heliothis virescens, además de sus propiedades nativas. Los mutantes de los genes de CryIE(c) y de CryIE(d) de la presente invención también están incluídos en la presente invención. Por ejemplo, pueden ser cambiados nucleótidos individuales, por procesos naturales o por mutagénesis dirigida, lo que a su vez crea un cambio de la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Además, la secuencia de total o la forma truncada de los genes puede ser cambiada tal que su expresión sea optimizada para plantas, de modo que los codones son escogidos para producir proteínas que tengan la misma secuencia de aminoácidos o similar a la que codifica para la forma nativa de los genes de CryIE(c) o de CryIE(d). Otras modificaciones del nuevo gen de la toxina que proporcionan una proteína con propiedades insecticidas esencialmente iguales a las de la proteína CryIE(c) (SEQ ID NO:2) o CryIE(d) [SEQ ID NO 8] también están incluidas según la presente
invención.

El gen de CryIE(c) [SEQ ID NO:1] y el gen de CryIE(d) [SEQ ID NO 7] o las subsecuencias del gen que confieren especificidad contra Heliothis virescens, son también útiles como sonda de hibridación de ADN, para descubrir genes similares del tipo CryI o genes estrechamente relacionados activos contra Heliothisvirescens en otras cepas de Bacillus thuringiensis. Los nuevos genes, o partes o sus derivados, se pueden marcar para uso como sonda de hibridación, por ejemplo, con un marcador radiactivo, usando procedimientos convencionales. La sonda de hibridación de ADN marcada puede usarse entonces de la forma descrita en el Ejemplo 1.

La utilidad de los nuevos genes de toxina presentes en una cepa recombinante de Bacillus thuringiensis se ilustra en los Ejemplos 3 a 4. También debería ser reconocido que el nuevo gen de la toxina aislado de la presente invención puede ser transferido a cualquier huésped microbiano y conferirle sus propiedades insecticidas a aquel huésped. Los huéspedes alternativos para el nuevo gen de la toxina de la presente invención pueden ser seleccionados como adecuados para clonar con ciertos fines, fines como caracterizar la forma y la función del gen o la proteína codificada, para uso como huésped de fermentación para aumentar la producción de la proteína toxina, con fines de proporcionar al menos una de las proteínas toxinas más eficaces para el insecto perjudicial objeto, o para la introducción del nuevo gen de la toxina en patógenos de insecto tales como baculovirus, un virus de la poliedrosis nuclear, por ejemplo [Autographica californica] para mejorar su eficacia.

Los nuevos genes de toxina o sus formas recombinantes pueden ser transformados en tales huéspedes alternativos usando una variedad de métodos aprobados en la técnica. Un método tal preferido es la electroporación de células microbianas, como se describe, por ejemplo, por el método de Dower (Patente de EE.UU. Nº. 5.186.800). Otro método preferido es él de Schurter et al. (Mol. Gen. Genet. 218:177-181 (1989)), que también se describe en el documento EP-A 0 342633 que se incorpora en este documento íntegramente.

Se prevé que dicho huésped alternativo sea aplicado al medio ambiente o a plantas o animales para el control de insectos. Los huéspedes de microorganismos pueden seleccionarse según se sepa se ocupan la "fitosfera" (filoplano, filoesfera, rizosfera y/o rizoplano) de una o varias cosechas de interés. Estos microorganismos se seleccionan por ser capaces de competir satisfactoriamente en ambientes particulares con los microorganismos naturales, para proporcionar un mantenimiento estable y la expresión del gen que expresa el pesticida polipéptidico, y, deseablemente, para proporcionar una mejor protección del pesticida de la degradación ambiental y de la inactivación.

Tales microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De interés particular son los microorganismos, tales como las bacterias, por ejemplo, Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De interés particular son las especies bacterianas de la fitosfera tales como las especies Bacillus, Pseudomonas syhngae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyliand, Azotobacter vinlandii, y especies de levaduras de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Crypiococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De interés particular son los microorganismos pigmentados.

La presente invención proporciona además una composición entomocida que comprende como ingrediente activo al menos una de las nuevas toxinas de acuerdo con la invención o un microorganismo recombinante que contiene al menos alguno de los nuevos genes de toxina en una forma recombinante, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contiene al menos uno de los nuevos genes de toxina en una forma recombinante, o su derivado o su mutante, junto con un adyuvante agrícola tal como un vehículo, diluyente, tensioactivo o adyuvante que promueva la aplicación. La composición también puede contener además un compuesto biológicamente activo. Dicho compuesto puede ser tanto un fertilizante como un donante micronutritivo u otras preparaciones que influyan en el crecimiento de las plantas. También puede incluirse un herbicida selectivo, insecticida, fungicida, bactericida, nematicida, moluscocida o mezclas de varias de estas preparaciones, de ser deseadas, junto con otros vehículos agrícolamente aceptables, tensioactivos o adyuvantes que promuevan la aplicación habitualmente empleados en la técnica de formulación. Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a sustancias generalmente empleadas en la tecnología de formulación, sustancias, por ejemplo, naturales o minerales regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglomerantes o fertilizantes.

La composición puede comprender de 0,1 a 99% en peso del ingrediente activo, de 1 a 99,9% en peso del adyuvante sólido o líquido, y de 0 a 25% en peso de un tensioactivo. El ingrediente activo que comprende al menos una de las nuevas toxinas de acuerdo con la invención o un microorganismo recombinante que contiene al menos uno de los nuevos genes de toxina en una forma recombinante, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contiene al menos uno de los nuevos genes de toxina en una forma recombinante, o su derivado o su mutante, o la composición que contiene dicho ingrediente activo, puede ser administrado a plantas o cosechas para protegerlas junto con ciertos otros insecticidas o sustancias químicas (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Canadá) sin pérdida de potencia. Es compatible con la mayor parte de otros materiales de pulverización agrícolas comúnmente usados, pero no debe usarse en soluciones de pulverización extremadamente alcalinas. Puede ser administrado como un polvo, una suspensión, polvo humectable o de cualquier otra forma material adecuada para aplicación agrícola.

La invención además proporciona métodos para controlar o inhibir insectos perjudiciales aplicando un ingrediente activo que comprenda al menos una de las nuevas toxinas de acuerdo con la invención o un microorganismo recombinante que contenga al menos uno del nuevo gen de la toxina en una forma recombinante o una composición que comprenda dicho ingrediente activo (a) en un ambiente en el cual se puedan dar insectos perjudiciales, (b) en una planta o parte de planta para proteger dicha planta o parte de planta del daño causado por un insecto perjudicial, o (c) en la semilla para proteger una planta que se desarrolle a partir de dicha semilla del daño causado por un insecto perjudicial.

Un método preferido de aplicación en el área de protección de la planta es la aplicación al follaje de las plantas (aplicación foliar), dependiendo del número de aplicaciones y la tasa de aplicación a la planta que se protege y del riesgo de infestación por el organismo dañino en cuestión. Sin embargo, el ingrediente activo también puede penetrar en las plantas por las raíces (acción sistémica) si el lugar de las plantas es impregnado de una formulación líquida o si el ingrediente activo se incorpora a la forma sólida en el lugar de las plantas, por ejemplo en el suelo, por ejemplo, en forma granular (aplicación al suelo). En las cosechas de arroz, tales gránulos pueden ser aplicados en cantidades dosificadas al campo de arroz inundado.

Las composiciones de acuerdo con la invención son también adecuadas para proteger materiales multiplicadores de plantas, por ejemplo, semillas, tales como frutas, tubérculos o granos, o estaquillas de plantas, de los insectos perjudiciales. El material de propagación puede ser tratado con la formulación antes de la plantación: la semilla, por ejemplo, puede ser revestida antes ser sembrada. El ingrediente activo de la invención también puede ser aplicado a los granos (revestimiento), impregnando los granos con una formulación líquida o revistiéndolos con una formulación sólida. La formulación también puede ser aplicada al sitio de plantación cuando el material multiplicador de plantas esté siendo plantado, por ejemplo, al surco de la semilla durante la siembra. La invención se refiere también a los métodos para tratar el material de multiplicación de plantas y al material de multiplicación de plantas así tratado.

Las composiciones de acuerdo con la invención que comprenden como ingrediente activo un microorganismo recombinante que contiene al menos uno de los nuevos genes de toxina en una forma recombinante, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contiene al menos uno de los nuevos genes de toxina en forma recombinante, o su derivado o su mutante pueden ser aplicados por cualquier método conocido para el tratamiento de semillas o suelo con cepas bacterianas. Por ejemplo, véase la patente de EE.UU. Nº. 4.863.866. Las cepas son eficaces para biocontrol incluso si el microorganismo no está vivo. Se prefiere, sin embargo, la aplicación del microorga-
nismo vivo.

Las cosechas que son objetivos para ser protegidas en la amplitud de la presente invención comprenden, por ejemplo, las siguientes especies de plantas:

: cereales (trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo y cosechas similares), remolacha (remolacha y remolacha de forraje), hierbas de forraje (dactilo aglomerado, festuca, y similares), drupas, manzanas y bayas (manzanas, peras, ciruelas, melocotones, almendras, cerezas, fresas, frambuesas y zarzamoras), plantas leguminosas (judías, lentejas, guisantes, sojas), plantas oleaginosas (colza, mostaza, amapola, olivas, girasoles, cocos, ricinos, granos de cacao, cacahuetes), cucurbitáceos (pepinos, tuétanos, melones), plantas fibrosas (algodón, lino, cáñamo, yute), cítricos (naranjas, limones, pomelo, mandarinas), verduras (espinaca, lechuga, espárrago, coles y otros Brassicae, cebollas, tomates, patatas, pimientos), lauraceae (aguacates, zanahorias, canela, alcanfor), árboles caducos y coníferos (por ejemplo, tilos, tejos, robles, alisos, álamos, abedules, abetos, alerces, pinos), o plantas tales como maíz, tabaco, nueces, café, caña de azúcar, té, vides, lúpulos, plátanos y árboles de caucho naturales, así como ornamentales (incluyendo materiales compuestos).

Una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contiene al menos uno del nuevo gen en una forma recombinante se aplica normalmente en forma de composiciones entomocidas y puede ser aplicada al área del cultivo o a la planta que se trate, simultáneamente o en etapas, con más compuestos biológicamente activos. Estos compuestos pueden ser tanto fertilizantes como donadores micronutritivos u otras preparaciones que influyan en el crecimiento de las plantas. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscocidas o mezclas de varias de estas preparaciones, de ser deseado junto con otros vehículos, tensioactivos o adyuvantes que promuevan la aplicación habitualmente empleados en la técnica de formulación.

El ingrediente activo de acuerdo con la invención puede usarse en forma no modificada o junto con cualquier vehículo adecuado agrícolamente aceptable. Tales vehículos son adyuvantes empleados de manera convencional en la técnica de la formulación agrícola, y por lo tanto son formulados de una manera conocida a concentrados emulsificables, pastas revestibles, soluciones directamente pulverizables o diluíbles, emulsiones diluídas, polvos humectables, polvos solubles, polvos, granulados, y también encapsulaciones, por ejemplo, en sustancias poliméricas. Como la naturaleza de las composiciones, los métodos de aplicación, tales como pulverización, atomización, polvoreado, dispersión o vertido, se escogen conforme al objetivo pretendido y las circunstancias predominantes. Tasas de aplicación ventajosas son normalmente de aproximadamente 50 g a aproximadamente 5 kg de ingrediente activo por hectárea (una hectárea, aproximadamente 2,471 acres), preferiblemente de aproximadamente 100 g a aproximadamente
2 kg de ingrediente activo/hectárea. Tasas importantes de aplicación son de aproximadamente 200 g a aproximadamente 1 kg de ingrediente activo/ha y de 200 g a 500 g de ingrediente activo/hectárea.

Para revestir semillas, las tasas de aplicación ventajosas son de 0,5 g a 1000 g de ingrediente activo por 100 kg de semilla, preferiblemente de 3 g a 100 g de ingrediente activo por 100 kg de semilla o de 10 g a 50 g de ingrediente activo por 100 kg de semilla.

Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y pueden corresponder a sustancias generalmente empleadas en la tecnología de la formulación, sustancias, por ejemplo, naturales o minerales regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglomerantes o fertilizantes. Las formulaciones, es decir, las composiciones entomocidas, preparaciones o mezclas que contienen la cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contiene el nuevo gen en una forma recombinante como ingrediente activo o sus combinaciones con otros ingredientes activos, y, cuando sea apropiado, un adyuvante sólido o líquido, se preparan de una manera conocida, por ejemplo, mezclando homogéneamente y/o moliendo los ingredientes activos con extendedores, por ejemplo, disolventes, vehículos sólidos, y en algunos casos compuestos activos de superficie (tensioactivos).

Los disolventes adecuados son: hidrocarburos aromáticos, preferiblemente las fracciones que contienen de 8 a 12 átomos de carbono, por ejemplo mezclas de xileno o naftalenos sustituidos, ftalatos tales como ftalato de dibutilo o ftalato de dioctilo, hidrocarburos alifáticos tales como ciclohexano o parafinas, alcoholes y glicoles y sus éteres y ésteres, tales como etanol, etilenglicolmonometilo o éter de monoetilo, cetonas tales como ciclohexanona, disolventes polares fuertes tales como N-metil-2-pirrolidona, dimetilsulfóxido o dimetilformamida, así como aceites vegetales o aceites vegetales epoxidados tales como aceite epoxidado de coco o aceite de soja; o agua.

Los vehículos sólidos usados, por ejemplo, para polvos y polvos dispersibles, son cargas minerales normalmente naturales tales como calcita, talco, caolín, montmorillonita o atapulgita. Para mejorar las propiedades físicas también es posible añadir ácido silícico altamente dispersado o polímeros absorbentes altamente dispersados. Los vehículos adsorbentes granulados adecuados son del tipo porosos, por ejemplo piedra pómez, ladrillo roto, sepiolita o bentonita; y los vehículos no adsorbentes adecuados son materiales tales como calcita o arena. Además, puede ser usado un gran número de materiales pregranulados de naturaleza inorgánica u orgánica, por ejemplo especialmente la dolomita o restos de plantas pulverizadas.

Dependiendo de la naturaleza de los ingredientes activos que se formulan, los compuestos tensioactivos adecuados son tensioactivos no iónicos, catiónicos y/o aniónicos que tienen buenas propiedades emulsionantes, de dispersión y humectantes. El término "tensioactivos" también se entenderá que comprende a las mezclas de tensioactivos. Los tensioactivos aniónicos adecuados pueden ser tanto jabones solubles en agua como compuestos tensioactivos sintéticos solubles en agua. Los jabones adecuados son sales de metal alcalino, sales de metal alcalino-térreo o sales de amonio no sustituidas o sustituidas de ácidos grasos superiores (C_{10}-C_{22}), por ejemplo, las sales de sodio o potasio de ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales que pueden ser obtenidas, por ejemplo, a partir de aceite de coco o aceite de sebo. Tensioactivos además adecuados son también las sales del ácido graso de metiltaurina así como fosfolípidos modificados y no modificados.

Con más frecuencia, sin embargo, se usan tensioactivos denominados sintéticos, especialmente sulfonatos grasos, sulfatos grasos, derivados de sulfatos de benzimidazol o alquilarilsulfonatos. Los sulfonatos grasos o los sulfatos están por lo general en formas de sales de metal alcalino, sales de metal alcalino-térreo o sales de amonio no sustituidas o sustituidas y generalmente contienen un radical alquilo C_{8}-C_{22} que también incluye el resto alquilo de radicales acilo, por ejemplo, la sal de sodio o calcio del ácido lignosulfónico, de dodecilsulfato, o de una mezcla de sulfatos de alcoholes grasos obtenidos a partir de ácidos grasos naturales. Estos compuestos también comprenden las sales de ésteres del ácido sulfúrico y ácidos sulfónicos de aductos de alcohol graso/óxido de etileno. Los derivados sulfonados de benzimidazol contienen preferiblemente 2 grupos de ácido sulfónico y un radical de ácido graso que contiene aproximadamente de 8 a 22 átomos de carbono. Los ejemplos de alquilarilsulfonatos son las sales de sodio, calcio o trietanolamina del ácido dodecilbencenosulfónico, ácido dibutilnaftalenosulfónico, o de un producto de condensación del ácido naftalenosulfonico/formaldehído. Son también adecuados los fosfatos correspondientes, por ejemplo, sales del éster del ácido fosfórico de un aducto de p-nonilfenol con de 4 a 14 moles de óxido de etileno. Los tensioactivos no iónicos son preferiblemente derivados del éter de poliglicol de alcoholes alifáticos o cicloalifáticos, o ácidos grasos saturados o insaturados y alquilfenoles, conteniendo dichos derivados de 3 a 30 grupos de éter de glicol y de 8 a 20 átomos de carbono en el resto hidrocarburo (alifático) y de 6 a 18 átomos de carbono en el resto alquilo de los alquilfenoles.

Tensioactivos no iónicos además adecuados son los aductos solubles en agua de poli(óxido de etileno) con poli(propilenglicol), etilendiaminopolipropilenglicol y alquilpolipropilenglicol que contiene de 1 a 10 átomos de carbono en la cadena alquilo, cuyos aductos contienen de 20 a 250 grupos de etilen-glicol-éter y de 10 a 100 grupos de éter de propilenglicol. Estos compuestos por lo general contienen de 1 a 5 unidades de etilenglicol por unidad de propilenglicol. Los ejemplos representativos de tensioactivos no iónicos son nonilfenolpolietoxietanoles, éteres de poliglicol de aceite de ricino, aductos de polipropileno/óxido de polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol y octilfenoxipolietoxietanol. Ésteres de ácidos grasos de polioxietileno-sorbitán, tales como trioleato de polioxietileno-sorbitán, son también tensioactivos no iónicos adecuados.

Los tensioactivos catiónicos son sales de amonio preferiblemente cuaternarias que contienen, como N-sustituyente, al menos un radical alquilo C_{8}-C_{22} y, como otros sustituyentes, radicales alquilo inferior no sustituido o halogenado, bencilo o alquilo inferiores de hidroxilo. Las sales están preferiblemente en forma de haluros, metilsulfatos o etilsulfatos, por ejemplo, cloruro de esteariltrimetilamonio o bromuro de bencildi-(2-cloroetil)etilamonio.

Los tensioactivos habitualmente empleados en la técnica de formulación son descritos, por ejemplo, en "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", Industria editorial MC del Corp. Ridgewood, N.J., 1979; Doctor Helmut Stache, "Tensid Taschenbuch" (Manual de Tensioactivos), Carl Hanser Verlag, Munich/Viena.

Otra característica particularmente preferida de una composición entomocida de la presente invención es la persistencia del ingrediente activo cuando se aplica a plantas y suelo. Las causas posibles para la pérdida de actividad incluyen inactivación por luz ultravioleta, calor, exudados de hoja y pH. Por ejemplo, a un pH alto, particularmente en presencia de un agente reductor, los cristales de las \delta-endotoxinas son solubilizados y de esta se vuelven más accesibles a la inactivación proteolítica. El alto pH de la hoja también podría ser importante, particularmente cuando la superficie de la hoja puede estar en el intervalo de pH 8-10. La formulación de una composición entomocida de la presente invención puede tratar estos problemas incluyendo aditivos para ayudar a prevenir la pérdida del ingrediente activo o encapsulan-
do el material de tal modo que el ingrediente activo sea protegido de la inactivación. La encapsulación puede ser lograda químicamente (McGuire y Shasha, J Econ Entomol 85:1425-1433,1992) o biológicamente (Barnes y Cummings, 1986; documento EP-A 0 192 319). La encapsulación química implica un procedimiento en el cual el ingrediente activo es revestido de un polímero mientras que la encapsulación biológica implica la expresión de genes de \delta-endotoxina en un microbio. Para la encapsulación biológica, el microbio intacto que contiene la proteína de la \delta-endotoxina se usa como ingrediente activo en la formulación. La adición de protectores UV podría reducir eficazmente el daño por irradiación. La inactivación debido al calor también podría ser controlada por la inclusión de un aditivo apropiado.

Se prefieren dentro de la presente solicitud formulaciones que comprendan microorganismos vivos tales como un ingrediente activo en forma de células vegetativas o más preferible en forma de esporas, de estar disponibles. Las formulaciones adecuadas pueden consistir, por ejemplo, en geles políméricos que son reticulados con cationes polivalentes y que comprendan a estos microorganismos. Esto se describe, por ejemplo, en D.R. Fravel. et al. En Phytopathology, vol. 75, Nº. 7, 774-777, 1985 para alginato como material polimérico. También se sabe de esta publicación que pueden ser usados conjuntamente materiales vehículos. Estas formulaciones por lo general se preparan mezclando soluciones de polímeros que se dan naturalmente o polímeros sintéticos que forman gel, por ejemplo alginatos, y soluciones de sales acuosas de iones metálicos polivalentes tal que forman gotitas individuales, siendo posible para los microorganismos ser suspendidos en uno de los dos o en ambas soluciones de reacción. La formación de gel comienza con la mezcla en forma de gotas. Es posible el secado posterior de estas partículas de gel. Este procedimiento se llama gelificación ionotrópica. Dependiendo del grado de secado, se forman partículas compactas y duras a partir de polímeros que se reticulan estructuralmente vía cationes polivalentes y que comprenden a los microorganismos y un vehículo presente predominantemente uniformemente distribuido. El tamaño de las partículas puede aumentar hasta 5 mm.

Composiciones basadas en polisacáridos parcialmente reticulados que, además de un microorganismo, por ejemplo, también pueden comprender ácido silícico finamente dividido como material vehículo, dándose la reticulación, por ejemplo, vía iones Ca^{++}, se describen en el documento EP-A1-0 097 571. Las composiciones tienen una actividad en agua de no más de 0,3. W.J. Cornick et al. describen en un artículo de revisión [“New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases”, páginas 345-372, Alan R. Litises, Inc. (1990)] varios sistemas de formulación, gránulos con vermiculita como vehículo y perlas de alginato compactas preparadas por un procedimiento de gelificación ionotrópica que se menciona. Tales composiciones también se describen en D.R. Fravel en “Pesticide Formulations and Application Systems”: Volumen 11, ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials, Filadelfia, 1992, páginas de 173 a 179 y puede usarse para formular los microorganismos recombinantes de acuerdo con la invención.

Las composiciones entomocidas de la invención por lo general contienen de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 99%, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 95%, y más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 90% del ingrediente activo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 99,9%, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 99%, y más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 95% de un adyuvante sólido o líquido, y de aproximadamente 0 a aproximadamente 25%, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25%, y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20% de un tensioactivo.

En una realización preferida de la invención las composiciones entomocidas contienen por lo general de 0,1 a 99%, preferiblemente de 0,1 a 95%, de una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contiene al menos uno de los nuevos genes en una forma recombinante, o su combinación con otros ingredientes activos, de 1 a 99,9% de un adyuvante sólido o líquido, y de 0 a 25%, preferiblemente de 0,1 a 20%, de un tensioactivo.

Mientras que los productos comerciales preferiblemente son formulados como concentrados, el usuario final empleará normalmente formulaciones diluidas de concentración sustancialmente inferior. Las composiciones entomocidas también pueden contener otros ingredientes, tales como estabilizadores, antiespumantes, reguladores de la viscosidad, aglomerantes, agentes de pegajosidad así como fertilizantes u otros ingredientes activos para obtener efectos especiales.

Un objeto más de la invención se refiere a plantas transgénicas que comprenden al menos uno de los nuevos genes de toxina de acuerdo con la invención. Una planta huésped que exprese los nuevos genes de toxina de la invención tendrá un mayor resistencia con el ataque de insectos y así estará mejor equipada para soportar pérdidas de cosecha asociadas con tal ataque.

Por planta se propone cualquier especie de planta que pueda ser transformada genéticamente por métodos conocidos en la técnica. Los métodos conocidos en la técnica para la transformación de plantas se discuten a continuación. Las plantas huésped incluyen, pero no están limitadas, a aquellas especies antes enumeradas como cosechas
objetivo.

Se ha descubierto que el uso del codon de un gen de la toxina de Bacillus thuringiensis nativo es considerablemente diferente del que es típico de un gen de planta. En particular, el uso del codon de un gen de Bacillus thuringiensis nativo es muy diferente de él de un gen de maíz. Por consiguiente, el mRNA de este gen no puede ser utilizado de manera eficiente. El uso del codon podría influir en la expresión de genes a un nivel de traducción o transcripción o procesamiento del mRNA. Para optimizar un gen de la toxina para la expresión en plantas, por ejemplo en maíz, el uso del codon se optimiza usando los codones que son más preferidos en el maíz (codones preferidos del maíz) en la síntesis de un gen sintético que codifica la misma proteína que se encuentra para la secuencia del gen de la toxina nativo. El uso del codon preferido de maíz optimizado es eficaz para la expresión de altos niveles de la proteína de Bt insecticida. Además pueden encontrarse detalles para construir genes de toxina optimizados por maíz sintético en el documento WO 93/07278, incorporado íntegramente en este documento como referencia.

También pueden diferenciarse los genes de toxina derivados de microorganismos de los genes de plantas. Los genes de planta se diferencian de los genes encontrados en microorganismos porque su ARN transcrito no posee la secuencia del sitio de unión del ribosoma definido adyacente a la metionina de iniciación. Por consiguiente, pueden potenciarse genes microbianos por la inclusión de un iniciador de traducción eucariota convencional en el ATG. Clontech (catálogo1993/1994, página 210) ha sugerido la secuencia GTCGACCATGGTC (SEQ ID NO:5) como un iniciador de traducción convencional para la expresión del gen uidA de E. coli en plantas. Además, Joshi (Nucl Acids Res 15: 6643-6653 (1987)) ha comparado muchas secuencias de plantas adyacentes a ATG y sugiere la TAAACAATGGCT convencional (SEQ ID NO:6). En las situaciones en las que se encuentran dificultades en la expresión de los ORF microbianos en plantas, la inclusión de una de estas secuencias en el ATG de iniciación puede mejorar la traducción. En tales casos, los tres últimos nucleótidos convencionales no pueden ser apropiados para la inclusión en la secuencia modificada debido a su modificación del segundo resto AA. Las secuencias preferidas adyacentes a la metionina de iniciación pueden diferenciarse entre especies de plantas diferentes. Inspeccionando la secuencia de genes del maíz presente en la base de datos del GenBank/EMBL pueden ser distinguidos qué nucleótidos adyacentes a ATG deben ser modificados para potenciar la traducción del gen de la toxina introducido al maíz.

Además, se ha demostrado que la eliminación de sitios de unión no válidos puede potenciar la expresión y la estabilidad de los genes introducidos. Los genes clonados de fuentes no de plantas y no optimizados para la expresión en plantas pueden contener motivos que pueden ser reconocidos en plantas como sitios de unión 5' o 3'. Por consiguiente, el procedimiento de transcripción puede ser terminado antes de tiempo, generando mRNA truncado o deleccionado. Los genes de toxina pueden ser modificados por ingeniería genética para eliminar estos sitios de unión no válidos usando las técnicas conocidas en la técnica.

Se sabe que muchas proteínas de \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis en realidad se expresan como protoxinas. Estas protoxinas se solubilizan en ambientes alcalinos de vísceras de insecto y son convertidas proteolíticamente por proteasas en un fragmento tóxico principal (Höfte y Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242-255 (1989)). Para las proteínas de \delta-endotoxina de la clase CryI, el fragmento tóxico principal se localiza en la mitad del extremo N de la protoxina. Está en la amplitud de la presente invención que pueden ser usados genes que codifican la forma de protoxina de la cadena entera o el fragmento truncado tóxico principal de la nueva proteína toxina en vectores de transformación de plantas para conferirles propiedades insecticidas en la planta huésped.

Pueden ser introducidas moléculas de ADN recombinantes en las células de la planta de un número de modos aprobados en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que la opción del método podría depender del tipo de planta, es decir monocotiledónea o dicotiledónea, tratada para la transformación. Los métodos adecuados para transformar células de planta incluyen la microinyección (Crossway et al., BioTechniques 4:320-334 (1986)), electroporación (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986), transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)), transferencia génica directa (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)), y aceleración de partículas balísticas usando dispositivos disponibles de Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (véase, por ejemplo, Sanford et al., patente de EE.UU. Nº. 4.945.050; y McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)). Véase también, Weissinger et al., Anual. Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-37 91987) (cebolla); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (soja); McCabe et al., Bio/technology 6:923-926 (1988) (soja); Datta et al., Bio/technology 8:736-740 (1990) (arroz); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (1988) (maíz); Klein et al., Bio/technology 6:559-563 (1988) (maíz); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (maíz); Fromm et al., Bio/technology 8:833-839 (1990); y Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990) (maíz); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990) (cloroplastos del tabaco); Koziel et al. (Biotechnology 11:194-200 (1993)) (maíz); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989) (arroz); Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991) (arroz); Solicitud de patente europea EP 0 332 581 (dactilo aglomerado y otros Pooideae); Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) (trigo); Weeks et al. (Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993) (trigo); Wan et al. (Plant Physiol. 104:37-48 (1994) (cebada); Umbeck et al. (Bio/technology 5:263-266 (1987) (algodón).

Un grupo de realizaciones particularmente preferido para la introducción de moléculas de ADN recombinantes en el maíz por bombardeo de microproyectiles puede encontrarse en el documento WO 93/07278, incorporado íntegramente en este documento como referencia. Una realización preferida adicional es el método de transformación de protoplastos para el maíz como se describe en la solicitud de patente europea EP 0 292 435, incorporada íntegramente en este documento como referencia.

Además están comprendidas en la amplitud de la presente invención plantas transgénicas, en plantas fértiles transgénicas particulares transformadas mediante los procesos anteriormente mencionados y su progenie asexual y/o sexual, que todavía comprende una molécula de ADN aislada que codifica para una proteína toxina del tipo CryIE de acuerdo con la invención, que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua.

La planta transgénica de acuerdo con la invención puede ser una planta dicotiledónea o monocotiledónea. Son preferidas las plantas monocotiledóneas de la familia Graminaceae que implican a las plantas Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale y Setaria.

Son especialmente preferidos maíz transgénico, trigo, cebada, sorgo, centeno, avena, hierbas de césped y arroz.

Entre las plantas dicotiledóneas son preferidas especialmente en este documento soja, algodón, tabaco, remolacha, colza y girasol.

El término “progenie” se entiende que comprende a ambas progenies "asexualmente" y "sexualmente" generadas de plantas transgénicas. Esta definición también significa que se incluyen a todos los mutantes y variantes obtenibles mediante procesos conocidos, tales como, por ejemplo, la fusión de células o la selección de mutantes y que todavía exhiben las propiedades características de la planta inicial transformada, junto con todos los productos de reticulación y fusión del material de planta transformado.

Otro objeto de la invención concierne al material de proliferación de las plantas transgénicas.

El material de proliferación de las plantas transgénicas se define en relación con la invención como cualquier material de planta que puede ser propagado sexualmente o asexualmente in vivo o in vitro. Particularmente preferido en la amplitud de la presente invención son protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, óvulos, cigotos, junto con cualquier otro material de multiplicación obtenido a partir de plantas transgénicas.

Las partes de plantas, como por ejemplo flores, tallos, frutos, hojas, raíces que provienen de plantas transgénicas o su progenie antes transformada mediante el procedimiento de la invención y que consisten por lo tanto, al menos en parte, en células transgénicas, son también un objeto de la presente invención.

La transformación de plantas puede ser emprendida con una especie de ADN única o especies de ADN múltiples (es decir, co-transformación) y ambas de estas técnicas son adecuadas para uso con los nuevos genes de toxina de la presente invención.

Los métodos que usan una forma de transferencia génica directa o transferencia mediada por Agrobacterium por lo general, pero no necesariamente, son emprendidos con un marcador seleccionable que puede proporcionar resistencia para un antibiótico (kanamicina, higromicina o metotrexato) o un herbicida (fosfinotricina). La opción del marcador seleccionable para la transformación de la planta no es, sin embargo, crítica para la invención.

Numerosos vectores de transformación están disponibles para la transformación de la planta, y pueden ser usados los genes de esta invención junto con cualquiera de tales vectores. La selección del vector para uso dependerá de la técnica de transformación preferida y la especie objetivo para la transformación. Para ciertas especies objetivos, pueden ser preferidos diferentes marcadores selección de herbicidas o antibióticos. Los marcadores de selección usados rutinariamente en la transformación incluyen el gen nptII que confiere resistencia para kanamicina y antibióticos afines (Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White et al., Nucl Acids Res 18:1062 (1990), Spencer et al. Theor Appl Genet 79:625-631 (1990)), el gen hph que confiere resistencia para el antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931,1984), y el gen dhfr, que confiere resistencia para metotrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2:1099-1104 (1983).

Muchos vectores están disponibles para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Estos típicamente llevan al menos unos extremos de secuencia de T-ADN e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). En una realización preferida, el nuevo gen de la toxina de la presente invención puede ser insertado en cualquiera de los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001 para uso con Agrobacterium. Estos casetes de vector para la transformación mediada por Agrobacterium pueden ser construidos de la manera siguiente. PTJS75kan fue creado por digestión con NarI de pTJS75 (Schmidhauser y Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)) permitiendo la escisión del gen de la resistencia a la tetraciclina, seguido por la inserción de un fragmento AccI de pUC4K que lleva un NPTII (Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al..Nature 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Los enlazantes XhoI fueron ligados al fragmento EcoRV de pCIB7 que contenía los extremos izquierdo y derecho de T-ADN, una gen quimérico nos/nptII seleccionable de planta y el polienlazador pUC (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), y el fragmento digerido por XhoI fue clonado en pTJS75kan digerido por SalII para crear pCIB200 (véase también el documento EP 0 332 104, ejemplo 19). El PCIB200 contiene los siguientes sitios de restricción de polienlazante únicos: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, y SalI. El PCIB2001 es un derivado de pCIB200 que es creado por la inserción en un polienlazante de sitios de restricción adicionales. Sitios de restricción únicos en el polienlazante de PCIB2001 son EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI, y StuI. El PCIB2001, además de contener estos sitios de restricción únicos también tienen selección de kanamicina en plantas y bacterias, extremos izquierdo y derecho del T-ADN para la transformación mediada por Agrobacterium, la función de trfA derivada de RK2 para la movilización entre E. coli y otros huéspedes, y las funciones de OriT y OriV también de RK2. El polienlazante pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión de plantas que contienen sus propias señales reguladoras.

Un vector útil adicional para la transformación mediada por Agrobacterium es el vector binario pCIB10 que contiene un gen que codifica para la resistencia a kanamicina para la selección en plantas, secuencias del extremo derecho e izquierdo de T-ADN e incorpora secuencias del plásmido de amplio rango de huésped pRK252 permitiendo con ello replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Su construcción se describe en Rothstein et al. (Gene 53:153-161 (1987)). Varios derivados de pCIB10 han sido construidos incorporando el gen para higromicina B fosfotransferasa descrito por Gritz et al. (Gene 25:179-188 (1983)). Estos derivados permiten la selección de células de plantas transgénicas en higromicina sólo (pCIB743), o higromicina y kanamicina (pCIB715, pCIB717).

Otras técnicas de transformación que no se basan en Agrobacterium, los métodos denominados de transferencia génica directa, son también útiles para la introducción del nuevo gen de la toxina de la presente invención, incluyendo la transformación por bombardeo de microproyectil, captación de protoplasto (por ejemplo, PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector para estos métodos depende en gran parte de la selección preferida para la especie que se transforma.

Un tal vector útil para técnicas de transferencia génica directa en combinación con la selección por el herbicida Basta (o fosfinotricina) es pCIB3064. Este vector se basa en el plásmido pCIB246, que comprende al promotor CaMV 35S en fusión operacional con el gen GUS de E. coli y el terminador transcripcional CaMV 35S y es descrito en la solicitud publicada PCT WO 93/07278, incorporada en este documento como referencia. El gen que proporciona la resistencia a la fosfinotricina es el gen bar de Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Este vector es adecuado para la clonación de casetes de expresión de plantas que contienen sus propias señales reguladoras.

Un vector de transformación adicional es el pSOG35 que utiliza dihidrofolato reductasa del gen de E. coli (DHFR) como marcador seleccionable que confiere resistencia para metotrexato. Fue usada PCR para amplificar al promotor 35S (\sim800 pares de bases), intron 6 del gen Adh1 del maíz (\sim550 pares de bases) [Lou et al., Plant J. 3:393-403,1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12:3983-4000,1984] y 18 pares de bases de la secuencia líder de GUS no traducida de pSOG10 [véase también Jefferson et al. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447-8451 (1986)]. Un fragmento de 250 pares de bases que codifica para el gen de dihidrofolato reductase tipo II de E. coli también fue amplificado por PCR y estos dos fragmentos de PCR fueron ensamblados con un fragmento SacI-PstI de pBI221 (Clontech) que comprendía la estructura del vector pUC19 y el terminador de nopalina sintasa. El ensamblaje de estos fragmentos generó pSOG19 que contenía al promotor 35S en fusión con la secuencia del intron 6, el líder GUS, el gen DHFR y el terminador de nopalina sintasa. El reemplazo del líder GUS en pSOG19 con la secuencia líder del vector del virus del moteado del maíz clorótico check (MCMV) generó el vector pSOG35. PSOG19 y pSOG35 llevan el gen pUC para la resistencia a ampicilina y tienen los sitios HindIII, SphI, PstI y EcoRI disponibles para la clonación de secuencias extrañas.

Los nuevos genes de toxina de la presente invención, como su secuencia nativa o como secuencias sintéticas optimizadas como se describen anteriormente, pueden fusionarse operativamente en una variedad de promotores para la expresión en plantas incluyendo promotores constitutivos, inducibles, temporalmente regulados, regulados en el desarrollo, químicamente regulados, preferidos de tejido y específicos de tejido para preparar moléculas de ADN recombinantes, es decir, genes quiméricos. Los promotores constitutivos preferidos incluyen los CaMV 35S y promotores 19S [Fraley et al., patente de EE.UU. Nº. 5.352.605., expedida el 04 de octubre de 1994). Un promotor preferido además se deriva de una cualquiera de los diversos genes de actina, que se sabe que se expresan en la mayor parte de tipos de células. Los casetes de expresión del promotor descritos por McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991)) pueden ser modificados fácilmente para la expresión del nuevo gen de la toxina y son particularmente adecuados para el uso en huéspedes de monocotiledóneas.

Otro promotor constitutivo preferido más se deriva de ubiquitina, que es otro producto génico conocido por acumularse en muchos tipos de células. El promotor ubiquitina ha sido clonado a partir de varias especies para uso en plantas transgénicas (por ejemplo, girasol - Binet et al. Plant Science 79: 87-94 (1991), maíz - Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)). El promotor ubiquitina del maíz ha sido desarrollado en sistemas de monocotiledóneas transgénicos y su secuencia y vectores construidos para la transformación de monocotiledóneas se describen en la publicación de patente EP 0 342 926. El promotor de ubiquitina es adecuado para la expresión del nuevo gen de la toxina en plantas transgénicas, especialmente monocotiledóneas.

Promotores específicos de tejido o preferenciales de tejido útiles para la expresión del nuevo gen de la toxina en plantas, particularmente en maíz, son los que dirigen la expresión en raíces, médulas, hojas o polen. Tales promotores se describen en el documento WO 93/07278, incorporado íntegramente como referencia en este documento. Los promotores químicamente inducibles útiles para dirigir la expresión del nuevo gen de la toxina en plantas se describen en el documento EP-A 0 332 104, incorporado íntegramente en este documento como referencia.

Además de promotores, hay una variedad de terminadores transcripcionales también disponibles para uso en construcción de genes quiméricos usando el nuevo gen de la toxina de la presente invención. Los terminadores transcripcionales son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgen y su poliadenilación correcta. Los terminadores transcripcionales apropiados y los que se sabe que funcionan en plantas incluyen el terminador CaMV 35S, el terminador tml, el terminador de nopalina sintasa, el terminador rbcS E9 del guisante y otros conocidos en la técnica. Estos pueden usarse en ambos monocotiledóneas y dicotiledóneas.

También se han encontrado numerosas secuencias que potencian la expresión génica desde dentro de la unidad transcripcional y estas secuencias pueden ser usadas junto con el nuevo gen de la toxina de esta invención para aumentar su expresión en plantas transgénicas.

Se han demostrado que varias secuencias intron potencian la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, los introns del gen Adh1 del maíz se ha encontrado que potencian considerablemente la expresión del gen natural bajo su promotor específico cuando se introduce en células de maíz (Callis et al., Genes develop. 1: 1183-1200 (1987)). Las secuencias intron rutinariamente se incorporan en vectores de transformación de plantas, típicamente dentro del líder no traducido.

También se conocen un número de secuencias líder no traducidas derivadas de virus para potenciar la expresión, y éstas son particularmente eficaces en células dicotiledóneas. Específicamente, las secuencias líder del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV, la "\Omega-Secuencia"), vector del Virus del Moteado del Maíz Clorótico (MCMV)
y el Virus del Mosaico de la Alfalfa (AMV) se ha demostrado que son eficaces para potenciar la expresión
(por ejemplo, Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15; 65-79
(1990)).

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Análisis SDS-PAGE de las proteínas CryIE(c) y CryIE(d) individualmente expresadas en las cepas de Bacillus thuringiensis recombinantes CGB311 y CGB313, respectivamente.

Banda 1, marcadores de peso molecular; banda 2, CBG311 5 I; banda 3, CGB313 10 I; banda 4, CGB311 20 I; 5, marcadores de peso molecular; 6, marcadores de peso moleculares; banda 7, CBG313 5 I; banda 8, CGB313 10 I; banda 9, CGB313 20 I; 10 marcadores de peso molecular.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes describen además los materiales y métodos usados para llevar a cabo la invención y los resultados subsecuentes. Se ofrecen mediante la ilustración, y su descripción no debe ser considerada como una limitación de la invención reivindicada.

Ejemplos de formulación

El ingrediente activo usado en los ejemplos de formulación siguientes son las cepas recombinantes de Bacillus thuringiensis denominadas CGB311 y CGB313, que contienen respectivamente pCIB5618 y pCIB5621, y que expresan los nuevos genes de la toxina CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente. Tanto CGB313 como CGB311 fueron depositados el 1 de junio de 1994 en el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilinois 61604, EE.UU. y les fueron asignados el número de entrada NRRL B-21274 y NRRL B-21273, respectivamente.

A1. Polvos humectables

	\hskip9mm a)	\hskip9mm b)	\hskip9mm c)

esporas de Bacillus thuringiensis	25%	50%	75%
Lignosulfonato de sodio	5%	5%	\hskip9mm - -
laurilsulfato de sodio	3%	\hskip9mm - -	5%
diisobutilnaftalenosulfonato de sodio	\hskip9mm - -	6%	10%
octilfenol-polietilenglicol-éter (7-8 moles de óxido de etileno)	\hskip9mm - -	\hskip9mm 2%	\hskip9mm - -
altamente dispersado ácido silicid	5%	10%	10%
caolín	62%	27%	\hskip9mm - -

\vskip1.000000\baselineskip

Las esporas se mezclan a fondo con los adyuvantes y la mezcla se muele a fondo en un molino adecuado, permitiéndose a los polvos humectables que puedan ser diluidos con agua para dar suspensiones a las concentraciones deseadas.

A2. Concentrado emulsificable

esporas de Bacillus thuringiensis	10%
octilfenol-polietilenglicol-éter (4-5 moles de óxido de etileno)	3%
dodecilbencenosulfonato de calcio	3%
éter de poliglicol de aceite de ricino (36 moles de óxido de etileno)	4%
ciclohexanona	30%
mezcla de xileno	50%

Las emulsiones de cualquier concentración requerida pueden ser obtenidas a partir de este concentrado por dilución con agua.

A3. Polvos

	\hskip9mm a)	\hskip9mm b)

esporas de Bacillus thuringiensis	5%	8%
talco	95%	\hskip9mm - -
caolín	\hskip9mm - -	92%

El preparado para usar polvos se obtiene mezclando el ingrediente activo con los vehículos y moliendo la mezcla en un molino adecuado.

A4. Granulado del extrusor

esporas de Bacillus thuringiensis	10%
lignosulfonato de sodio	2%
carboximetilcelulosa	1%
caolín	87%

El ingrediente activo o la combinación son mezclados y molidos con los adyuvantes y la mezcla se humedece posteriormente con agua. La mezcla se extrae, se granula y se seca en una corriente de aire.

A5. Gránulado revestido

esporas de Bacillus thuringiensis	3%
polietilenglicol (peso en mol 200)	3%
caolín	94%

El ingrediente activo o la combinación se aplican uniformemente en un mezclador con el caolín humedecido con polietilenglicol. Se obtienen gránulados revestidos no pulverulentos de esta manera.

A6. Concentrado en suspensión

esporas de Bacillus thuringiensis	40%
etilenglicol	10%
nonilfenol-polietilenoglicol-éter (15 moles de óxido de etileno)	6%
lignosulfonato de sodio	10%
carboximetilcelulosa	1%
solución de formaldehído acuosa del 37%	0,2%
aceite de silicona en forma de una solución acuosa del 75%	0,8%
agua	32%

El ingrediente activo o la combinación son mezclados fuertemente con los adyuvantes que dan un concentrado de suspensión del cual pueden ser obtenidas las suspensiones a cualquier concentración deseada por dilución con agua.

Ejemplo 1 Clonación y aislamiento del nuevo gen de la toxina

El ADN total fue aislado de una cepa apropiada de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Para aislar el CryIE(c), la cepa usada fue CGB316 y para CryIE(d) la cepa usada fue CGB323. Un cultivo de la cepa apropiada fue cultivado de noche en caldo L a 25ºC a 150 revoluciones por minuto de agitación en un agitador rotatorio. El cultivo entonces fue centrifugado, y resuspendido en sacarosa del 8%, Tris 100 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, NaCl 50 mM y lisozima 2 mg/ml, y fue incubado durante 30 minutos a 37ºC. Cincuenta mg/ml de proteinasa K y SDS a una concentración final del 0,2% fueron añadidos después y la mezcla resultante fue incubada a 50ºC hasta que la solución se hizo muy viscosa. Un volumen igual de fenol/cloroformo fue añadido a la mezcla viscosa, fue agitado y centrifugado para separar las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa fue mezclada entonces con 1 g/ml de CsCI y 150 \mug/ml de bromuro de etidio, fue colocada en un tubo de Nalgene UltraLok de 33 ml y fue centrifugada a 45.000 revoluciones por minuto durante 16 horas en un rotor de ultracentrifugadora Ti50 de Beckman. La banda de ADN resultante fue visualizada con una fuente de luz UV y fue eliminada con una jeringuilla usando una aguja de calibre 16. La contaminación de bromuro de etidio fue eliminada de la muestra de ADN por extracción de alcohol de isoamilo. El ADN aislado fue precipitado con 2 volúmenes de etanol del 100% y fue centrifugado. El pelet del ADN resultante fue lavado con etanol del 70%. El pelet de ADN fue secado y resuspendido en Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM.

Quince \mug de ADN aislado de cada cepa fueron digeridos con 0,1 unidades de Sau3A / \mug de ADN a 37ºC. 3, 5 y 10 minutos después de la adición de la enzima de restricción fueron eliminadas muestras de 5 \mug de la mezcla de digestión, fue añadido EDTA preparado a una concentración final de 10 mM y fue colocado sobre hielo. Una alícuota de cada digestión regulada en el tiempo fue cargada en un gel de agarosa del 0,8% utilizando un tampón Tris-borato-EDTA (TBE; Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Sambrook et al. editores. Cold Spring Harbor Press: Nueva York (1989)) y fue corrido de la noche a la mañana a 25 voltios en un sistema de electrofóresis de gel modelo MPH IBI [Kodak, Rochester, Nueva York]. El ADN lambda digerido con HindIII fue usado como marcadores de peso molecular para el corrido del gel. Después de la electrofóresis, los fragmentos de ADN en el intervalo de 6-9 kilobytes fueron cortados del gel. El ADN fue electroeluído de las láminas del gel de agarosa colocándolos en una trampa de electroelución de Nanotrap [ISCO, Lincoln, Nebraska] y utilizando un Little Blue Tank de ISCO [ISCO, Lincoln, Nebraska) con un sistema tampón y corriente usando el procedimiento descrito por el proveedor del aparato. Después de la electroelución, el ADN aislado fue precipitado por la adición de un volumen 1/10 de acetato de sodio 3 M, pH 4,8, 2,5 volúmenes de etanol del 100% y luego fue centrifugado. El pelet del ADN resultante fue lavado con etanol del 70% y fue centrifugado. El pelet de ADN fue secado y resuspendido en Tris 10 mM a pH 8,0, EDTA 1 mM.

La unión en pUCi9 [Biolabs de Nueva Inglaterra, Beverly, Massachusetts, EE.UU.] de los fragmentos de ADN aislados que tenían los tamaños de 6-9 kilobytes fue hecho usando 4 \mul de la solución de ADN anterior, 1 \mul de una solución de 100 ng/\mul de pUC19 que antes fue digerido con Bam HI y fue tratado con fosfatasa alcalina de ternero, 1 \mul 10X de tampón de unión, 3 \mul de agua y 1 \mul que contenía 3 unidades de T4 ligasa. Esta mezcla fue incubada a 15ºC de la noche a la mañana. Los plásmidos resultantes basados en PUC19 que contenían los fragmentos de ADN insertados aislados de la cepa de Bacillus thuringiensis fueron transformados en células competentes DH5\alpha de E. coli [Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.]. Esto fue logrado combinando la mezcla de unión con 200 ml de células bacterianas, colocandolas sobre hielo durante 1-2 horas y con calefacción subsecuente a 42ºC durante 90 segundos. Después del tratamiento, la solución bacteriana fue mezclada con 200 \mul de medio SOC (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al. editores, Cold Spring Harbor Press: Nueva York (1989)), fue colocada a 37ºC durante 45 minutos y fue colocada sobre placas de L-agar que contenían ampicilina de 100 \mug/ml para seleccionar a los transformados. Las placas fueron incubadas de la noche a la mañana a 37ºC.

Las colonias transformadas que surgen después de la incubación de noche fueron sometidas al procedimiento de hibridación de colonia como se describe en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al. editores, Cold Spring Harbor Press: Nueva York (1989). En breve, un círculo de filtro 2000 de Nitroplus de 85 mm [Micron Separations, Westboro, Massachusetts, EE.UU.] fue colocado sobre cada placa de agar que contenía colonias transformadas y luego fueron retiradas. Después del quitar el filtro, las placas fueron colocadas de nuevo a 37ºC hasta que las colonias transformadas fueran visibles de nuevo. Los filtros con las colonias sobre ellos fueron tratados para liberar el ADN de las células bacterianas primero sobre papel Whatman saturado con SDS del 10%, después NaOH 0,5 N-NaCl
1,5 M, después NaCl 1,5 M - Tris 0,5 M a pH 7,4 durante 3 minutos cada uno. Los filtros entonces fueron tratados con 2X SSC y el ADN bacteriano liberado fue fijado a los filtros por entrecruzamiento con UV usando un Stratalinker (Stratagene) a 0,2 mJoule.

Aproximadamente 6 placas con 100-200 colonias/placa fueron preparadas para los fragmentos de ADN aislados de cada cepa de Bacillus thuringiensis. La prehibridación y la hibridación del filtro fueron llevadas a cabo en una solución 10X de solución de Denhardt [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al. editores, Cold Spring Harbor Press: Nueva York (1989)], 150 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, SDS del 1%, fosfato de sodio 50 mM a pH 7, EDTA 5 mM, 6X SSC, pirofosfato de sodio del 0,05%. La prehibridación fue a 65ºC durante 4 horas y la hibridación fue a 65ºC durante 18 horas con 1 millón de cpm/ml de una sonda marcada con
^{32}P-dCTP en un volumen de 50 ml. Las sondas de ADN radiomarcadas fueron preparadas usando un sistema de marcaje de imprimación aleatoria BRL [GIBCO-BRL, Grand Island, Nueva York, EE.UU.] y las cuentas no incorporadas fueron eliminadas usando Columnas Nick (Pharmacia).

Los filtros fueron sondados con un fragmento de cryIB radiomarcado generado por la reacción en cadena de la polimerasa. El fragmento generado atraviesa la región de 461-1366 pares de bases del gen cryIB. Las sondas de hibridación fueron hervidas 5 minutos antes de la adición a la solución de hibridación. Los filtros fueron lavados dos veces en 50 ml de 2X SSC, SDS del 0,5% a 65ºC durante 20 minutos. Los filtros sondados y lavados fueron expuestos a una película de rayos X X-Omat AR de Kodak con pantallas de intensificación Cronex Lightning Plus de Dupont a -80ºC. Aquellas colonias que fueron positivas por hibridación fueron identificadas y escogidas de los las placas recultivadas. Las colonias escogidas fueron estratificadas sobre L-agar con ampicilina de 100 \mug/ml. El ADN del plásmido fue aislado de cada cultivo estratificado usando el método alcalino minipreparatorio descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al. editores, Cold Spring Harbor Press: Nueva York (1989).

Los clones denominados CGE5618 [que llevaban el gen para CryIE(c)] y CGE5621 [que llevaban el gen para CryIE(d)] fueron aislados. Ambos clones contenían un plásmido recombinante que fue demostrado por el procedimiento anterior que poseían un fragmento de ADN aislado de cepa de Bacillus thuringiensis CGB316 (gen de CryIE(c)) y CGB323 (gen de CryIE(d)) que fueron hibridados positivamente en la sonda de CryIB.

El fragmento de ADN aislado de las cepas de Bacillus thuringiensis apropiadas y contenidas en los plásmidos recombinantes nombrados anteriormente fue clonado de nuevo en pHT3101 [Arantes et al., Gene 108,115-119,1991], un vector vehículo que permite la manipulación del plásmido en E. coli o en Bacillus thuringiensis. PHT3101 está compuesto de pUC18, un replicón Bt y un gen de eritromicina para la selección en Bt (Lereclus et al., FMS Microbiology Letters 60: 211-218,1989). El plásmido recombinante que contenía el ADN clonado de Bacillus thuringiensis fue aislado de las células E. coli usando procedimientos estándar (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al. editores, Cold Spring Harbor Press: Nueva York (1989)). Para eliminar el ADN de Bacillus thuringiensis clonado del plásmido recombinante, el plásmido aislado de cada clon fue digerido con las enzimas de restricción Sac I y
Bbu I. Las mezclas de digestión fueron cargadas entonces en un gel de agarosa del 1% de SeaPlaque® usando el sistema tampón TBE y fue sometido a electroforesis de la noche a la mañana a 25 voltios. Después de la electrofóresis, un fragmento de ADN de aproximadamente 7 kilobytes en tamaño fue aislado del gel usando los procedimientos anteriores descritos. El fragmento de ADN aislado del gel fue ligado en pHT3101 usando el procedimiento antes descrito combinando 5 \mul del fragmento de agarosa fundido (65ºC) y 4 \mul de pHT3101 de 10 ng/ml.

El ADN de Bacillus thuringiensis aislado de la cepa CGB316 y ligado en pHT3101 fue denominado pCIB5618. La cepa de E. coli que contenía el plásmido pCIB5618 fue denominado CGE5618. El ADN aislado de la cepa CGB323 y ligado en pHT3101 fue denominado pCIB5621. La cepa de E. coli que contenía el plásmido pCIB5621 fue denominada CGE5621. Tanto CGE5621 como CGE5618 fueron depositados el 1 de junio de 1994 en el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EE.UU. y les fueron asignados el número de entrada NRRL B-21276 y NRRL B-21275, respectivamente.

Ejemplo 2 Análisis de secuencia de ADN del nuevo gen de la toxina y homología de secuencia de proteína deducida para otros genes CryI

La secuencia de ADN de cada nuevos genes de toxina de la presente invención fue obtenida sintetizando primero los iniciadores de secuenciación usando un sintetizador de ADN modelo 380B de Applied Biosystems. Los iniciadores fueron usados entonces en las reacciones de secuenciación del ADN. La secuenciación fue realizada usando el método de terminación de cadena o dideoxi (Sanger et al., Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467, 1977). Las reacciones de secuenciación fueron llevadas a cabo usando el sistema Sequenase (US Biochemical Corp.) y el análisis de gel realizado en geles de 40 cm de poliacrilamida del 6% con urea 7 M en tampón Tris-Borato-EDTA (BRL Gel-Mix 6). Para CryIE(d), la secuenciación del ADN fue obtenida a partir de un Secuenciador de ADN de Applied Biosystems, Modelo 373A, de acuerdo con el protocolo sugerido del fabricante. El análisis de secuencias fue hecho usando el Software de Análisis de Secuencia del “Genetic Computer Group” de la Universidad de Wisconsin (UWGCG) y usando el programa de secuenciación de “Gene Codes Corp.” (Ana Arbor, Michigan).

Según el esquema de nomenclatura de Höfte y Whiteley, Microbiol. Rev. 53, 242-255 (1989) las proteínas codificadas por los nuevos genes de toxina serían clasificadas como un tipo CryIE, y han sido designadas en este documento como CryIE(c) y CryIE(d). Ambos genes de la presente invención codifican para una proteína cristalina de 1176 aminoácidos con una masa molecular predicha de 130,7 kDa. La secuencia de nucleótidos completa de cada nuevo gen de la toxina aislado se describe en la SEQ ID NO:1 para CryIE(c) y en la SEQ ID NO:7 para CryIE(d). La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína codificada CryIE(c) se describe en la SEQ ID NO:2 y la proteína codificada CryIE(d)
se describe en la SEQ ID NO:8. Usando el programa FASTA disponible en UWGCG, la secuencia de ADN de los dos nuevos genes de la toxina de la presente invención tiene una identidad de secuencia del 99%. Tanto CryIE(c) como CryIE(d) cada uno tiene una identidad de secuencia del 87% para el gen de endotoxina conocido denominado CryIE(a) (Nº. de entrada del GenBank/EMBL M73252) y una identidad de secuencia del 85% para el gen de endotoxina conocido CryIE(b) (Nº. de entrada del GenBank/EMBL M73252). La secuencia de la proteína deducida tanto para CryIE(c) como para CryIE(d) tiene una semejanza del 83% para CryIE(b) y una semejanza del 81% para CryIE(a).

Ejemplo 3 Transformación de Bacillus thuringiensis con los nuevos genes de toxina

El gen clonado para la nueva toxina presente en los plásmidos recombinantes pCIB5618 y pCIB5621 fue transformado en el derivado no cristalífero de Bacillus thuringiensis denominado CGB324. La transformación fue lograda por el método de Schurter et al. (Mol. Gen. Genet. 218:177-181 (1989)), que también se describe en el documento EP-A 0 342 633 que se incorpora en este documento íntegramente.

Las esporas de CGB324 fueron inoculadas en 10 ml de caldo L y fueron incubadas de la noche a la mañana a 25ºC en un agitador rotatorio a 100 revoluciones por minuto. Después de la incubación, el cultivo se diluye 50 veces en caldo L y se incuba además a 30ºC en un agitador rotatorio a 250 revoluciones por minuto hasta que el cultivo alcanzó un OD_{550} de 0,2. Las células bacterianas se cultivan por centrifugación y se resuspenden en un volumen 1/40 de tampón de electroporación helado (sacarosa 400 mM, MgCl_{2} 1 mM, tampón fosfato 7 mM, pH 6,0, glicerol del 20%). La centrifugación y la resuspensión de las células se repite como se describe anteriormente. Cuatrocientos \mul de las células resuspendidas se añaden a la cubeta de un Genepulser con una separación de las puntas de electrodo de 0,4 cm. El ADN del plásmido se añade a las células en la cubeta y se mantiene a 4ºC durante 10 minutos. El ADN del plásmido se transfiere a las células por electroporación usando una capacitancia de 25 F y una intensidad de campo magnético de 1300 V. Las células tratadas entonces fueron mantenidas a 4ºC durante 10 minutos adicionales, luego fueron diluidas con 1,6 ml de caldo L y fueron incubadas durante 4 horas a 30ºC en un agitador rotatorio a 250 revoluciones por minuto. Las células entonces fueron puestas en placas con agar T3 (3 g de Triptona, 2 g de Triptosa, 1,5 g de extracto de levadura, 0,05 g de MgCl_{2}, fosfato de sodio 50 mM a pH 6,8) conteniendo 25 \mug/ml de eritromicina y fueron incubadas a 30ºC durante 24-36 horas para visualizar las colonias. Las colonias individuales fueron escogidas de las placas y corridas sobre T3 nuevo que contenía eritromicina y fueron cultivadas hasta la esporulación. Las células transformadas de CGB324 que produjeron cuerpos de proteína cristalinos, indicativos de la expresión de los nuevos genes de toxina, fueron identificadas con el microscopio.

La cepa recombinante de Bacillus thuringiensis que contenía pCIB5618 y que expresaba el nuevo gen de la toxina CryIE(c) fue designado como CGB311. La cepa recombinante de Bacillus thuringiensis que contenía pCIB5621 y que expresaba el nuevo gen de la toxina CryIE(d) fue designado como CGB313. Tanto CGB313 como CGB311 fueron depositados el 1 de junio de 1994 en el “Agricultural Research Service”, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EE.UU. y les fueron asignados el número de entrada NRRL B-21274 y NRRL B-21273, respectivamente.

Ejemplo 4 Bioensayo en insectos de nuevos genes de la toxina expresados en Bacillus thuringiensis recombinante

Los bioensayos en insectos fueron llevados a cabo añadiendo mezclas de espora/cristal a preparaciones de dietas artificiales. Por ejemplo, la dieta fundida del insecto artificial cuncunilla grasienta fue vertida en placas Petri Gellman con tapa a presión de 45 mm. Las soluciones de ensayo de mezclas de espora/cristales de cepas de Bacillus thuringiensis recombinante CGB311 y CGB313 fueron preparadas usando diluciones de una suspensión de 1 mg/ml en Triton X-100 del 0,01% diseñado para proporcionar un intervalo de concentraciones de ensayo para cada muestra. Después de la solidificación de la dieta fundida, 100 \mul de la dilución apropiada de Bt en Triton X-100 del 0,01% fueron extendidos sobre la superficie y las placas se secaron al aire. Diez insectos en la primera fase de Spodoptera exguia (gusano verde cogollero), S. fugiperda (cogollero), u Ostrinia nubilalis (gusano barrenador europeo) y que tenían menos de 24 horas fueron colocados en la superficie de dieta durante un total de 30 insectos en la primera fase para cada concentración de espora/cristal analizada. El ensayo fue incubado a 30ºC en oscuridad completa durante 72 horas. El porcentaje de mortalidad fue registrado al final del período de
ensayo.

El ensayo para Heliothis virescens (gusano bellotero) fue similar al ensayo anterior con las diferencias siguientes. Grupos de 24 pocillos del cultivo celular Costar fueron usados con una superficie específica individual de cada pocillo de 2,26 cm^{2} y fueron aplicados 15 \mul de la dilución espora/cristal a la superficie de la dieta artificial solidificada. Una larva de H. virescens de menos de 24 horas se colocó en cada pocillo para un total de 24 insectos para cada concentración de espora/cristal analizada. Los pocillos fueron revestidos de dos pedazos de Parafilm y un pedazo de Teri-Kimwipe® [Fisher Scientific, Pittsburg, Pensylvania, EE.UU.] para prevenir la fuga de los insectos de los pocillos. El ensayo fue incubado a 30ºC durante 72 horas después de que fuera registrado el porcentaje de mortalidad. La mortalidad de fondo para todos los ensayos fue del 0-15%.

Fueron realizados bioensayos con Plutella xylostella incorporando alícuotas de una mezcla de espora/cristal de
50 mg/ml en dieta de P. xyostella artificial fundida (Biever y Boldt, Annals of Entomological Society of America, 1971; Shelton, et al., J. Ent. Sci. 26:17) a una concentración apropiada. Los 4 ml de la dieta tóxica mezclados fueron vertidos en tazas plásticas limpias de 1 onza líquida (28,413 mililitros) (Bioserve product Nº. 9051). Diluciones subsecuentes fueron hechas añadiendo la dieta no tóxica a la concentración anterior. Una vez que la dieta se enfrió, 5 P. xyostella recién nacidas de una colonia de laboratorio adaptada para dieta fueron colocadas en cada taza que contenía la dieta y luego fueron cubiertas con una tapa blanca de papel (Bioserve product Nº. 9049). Veinte larvas fueron analizadas por concentración. Las bandejas de las tazas fueron colocadas en una incubadora durante 3 días a 72ºF (22,20ºC) con un ciclo de luz:oscuridad de 14:10 (horas). El porcentaje de mortalidad en porcentaje fue registrado al final del período del ensayo.

Los resultados del bioensayo de las nuevas toxinas se resumen en la Tabla 3, a continuación.

TABLA 3 Actividades relativas de las nuevas toxinas en insectos seleccionados

Toxinas de Insecto	Spodoptera	Spodoptera	Heliothis	Ostrinia	Plutella
	exigua	frugiperda	virescens	nubilalis	xylostella
CGB313 conteniendo
cryIE(c) de la presente
invención	-	-	+	-	++
CGB313 conteniendo
cryIE(d) de la presente	-	++	+	na	+++
invención
CryIE (a) ^{\underline{1/}}	++	na	-	na
CryIA (a) ^{\underline{1/}}	-	na	++	na	-

+++ = 1 ng/cm^{2} <LC_{50} <10 ng/cm^{2}
++ \hskip2mm = 10 ng/cm^{2} <LC_{50} <100 ng/cm^{2}
+ \hskip4mm = 100 ng/cm^{2} <LC_{50} <1000 ng/cm^{2}
- \hskip4,7mm = LC_{50}> 1000 ng/cm^{2}
na \hskip2,5mm = datos no disponibles
^{\underline{1/}} \hskip3,6mm = datos tomados de Koziel et al., en: Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Vol. 11, págs. 171-228,
\hskip9mm 1993, Intercept Ltd., Hampshire, Reino Unido.

Ejemplo 5 Análisis SDS-PAGE de la proteína de la nueva toxina

Fueron preparadas soluciones madre de espora/cristal de la cepa recombinante CGB311 y CGB313 (20 mg/ml) en Triton X-100 del 0,1% de polvos liofilizados. Una porción de 100 \mul de la disolución madre fue tratada con
25 \mul de NaOH 0,4 N durante 5 minutos a temperatura ambiente, después 125 \mul de SDS del 4%, glicerol del 20%, 3-mercapto-etanol del 10%, azul de bromofenol del 0,01%, y Tris-HCl 0,125 M a pH 6,8 (Brussock, S.M., y T.C. Currier (1990), en: Analytical chemistry of B.thuringiensis. LA. Hickle y W.L. Fitch, editores, American Chemical Society). Esta solución fue calentada entonces a 100ºC durante 2 minutos. Las muestras fueron centrifugadas durante 60 s a 14.000 g en una microcentrifugadora Eppendorf 5415. Las muestras fueron corridas en una SDS-PAGE del
4-12% (Novex) y fueron controladas como se describe por el proveedor. Los geles fueron teñidos en azul de Coomassie del 0,2%, metanol del 40% y ácido acético del 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente y decoloradas con metanol del 40%, ácido acético del 10%. Los geles fueron explorados usando un Densitómetro de Molecular Dynamics Personal y los datos fueron analizados usando Microsoft Excel. La figura 1 muestra una banda de la proteína en el peso molecular esperado basado en la secuencia de la proteína deducida para cada uno de los nuevos genes de
toxina.

Ejemplo 6 Transformación del maíz con el nuevo gen de la toxina

La transformación del maíz con al menos uno de los nuevos genes de la toxina preparados de acuerdo con cualquiera de los métodos anteriores se logra por bombardeo de microproyectil de embriones zigóticos inmaduros o callo embriogénico propagable en serie del tipo I con un vector de transformación de planta adecuado que comprende dichos genes de toxina.

6.1 Construcción de vectores de transformación de planta

Numerosos vectores de transformación están disponibles para la transformación de plantas, y pueden usarse los genes de esta invención junto con cualquier tal vector. La selección del vector para el uso dependerá de la técnica de transformación preferida y la especie objetivo para la transformación. Para ciertas especies objetivos, pueden ser preferidos o diferentes marcadores de selección antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección usados rutinariamente en la transformación incluyen el gen nptII que confiere resistencia para kanamicina y antibióticos relacionados (Messing y Vierra, Gene 79:259-268 (1982); Bevan et al. Nature 304.184-187 (1983)), el gen bar que confiere resistencia para el herbicida fosfinotricina (White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990), Spencer et al. Theor Appl Genet 79: 625-631 (1990)), el gen hph que confiere resistencia para el antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931), y el gen dhfr que confiere resistencia para el metotrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2 (7): 1099-1104 (1983)).

(a) Construcción de vectores adecuados para la transformación de Agrobacterium

Muchos vectores están disponibles para transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Estos típicamente llevan al menos una secuencia del extremo de T-ADN e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Debajo es descrita la construcción de dos vectores típicos.

Construcción de pCIB200 y pCIB2001

Los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001 se usan para la construcción de vectores recombinantes para uso con Agrobacterium y se construyen de la manera siguiente. PTJS75kan es creado por la digestion de NarI de pTJS75 (Schmidhauser y Helinski, J Bacteriol. 164:446-455 (1985)) permitiendo la escisión del gen de la resistencia a la tetraciclina, seguido de la inserción de un fragmento de AccI de pUC4K que lleva un NPTII (Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Los enlazantes de XhoI se ligan al fragmento de EcoRV de pCIB7 que contenía los extremos izquierdo y derecho del T-ADN, un gen quimérico nos/nptII seleccionable de planta y el polienlazante pUC (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), y el fragmento digerido de XhoI se clonó en pTJS75kan digerido de SalI para crear pCIB200 (véase también el documento EP 0 332 104, ejemplo 19 [1338]). El PCIB200 contiene los sitios de restricción polienlazantes siguientes únicos: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, y SalI. El PCIB2001 es un derivado de pCIB200 que es creado por la inserción en el polienlazante de sitios de restricción adicionales. Sitios de restricción únicos en el polienlazante de pCIB2001 son EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI, y StuI. El PCIB2001, además de contener estos sitios de restricción únicos también tienen extremos selección de kanamicina bacterianas y de plantas izquierdo y derecho del T-ADN para la transformación mediada por Agrobacterium, la función de trfA derivada de RK2 para la movilización entre E. coli y otros huéspedes, y las funciones de OriT y OriV también de RK2. El polienlazante pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión de plantas que contienen sus propias señales reguladoras.

Construcción de pCIB10 y sus derivados de selección de higromicina

El vector binario pCIB10 contiene un gen que codifica para la resistencia a la kanamicina para selección en plantas, secuencias del extremo derecho e izquierdo de T-ADN e incorpora secuencias del plásmido pRK252 de amplio rango de huésped permitiéndole replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Su construcción se describe en Rothstein et al. Gene 53:153-161 (1987).

Varios derivados de pCIB10 han sido construidos que incorporan el gen para la higromicina B fosfotransferasa descrito por Gritz et al., Gene 25:179-188 (1983)). Estos derivados permiten la selección de células de plantas transgénicas en higromicina sólo (pCIB743), o higromicina y kanamicina (pCIB715, pCIB717) [Rothstein et al.. Gene 53:153-161 (1987)].

(2) Construcción de vectores adecuados para transformación sin Agrobacterium

La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens evita el requerimiento para las secuencias de T-ADN en el vector de transformación escogido y por consiguiente los vectores que carecen de estas secuencias pueden ser utilizados además de vectores como los descritos anteriormente que contienen secuencias de T-ADN. Las técnicas de transformación que no se basan en Agrobacterium incluyen la transformación vía bombardeo de partículas, captación de protoplasto (por ejemplo, PEG y electroporación) y la microinyección. La opción del vector depende en gran parte de la selección preferida para la especie que se transforma. A continuación se describe la construcción de algunos vectores típicos.

Construcción de pCIB3064

El pCIB3064 es un vector derivado de PUC adecuado para técnicas de transferencia génica directa en combinación con la selección por el herbicida basta (o fosfinotricina). El plásmido pCIB246 comprende al promotor CaMV 35S en fusión operacional con el gen GUS de E. coli y el terminador transcripcional de CaMV 35S y se describe en la solicitud publicada PCT WO 93/07278. El promotor 35S de este vector contiene dos secuencias 5' de ATG del sitio inicial. Estos sitios se mutan usando técnicas de PCR estándar de tal modo que se eliminen los ATG y generen los sitios de restricción SspI y PvuII. Los nuevos sitios de restricción están a 96 y 37 pares de bases del sitio SalI único y a 101 y 42 pares de bases del sitio inicial real. El derivado resultante de pCIB246 se denomina pCIB3025. El gen GUS se escinde entonces de pCIB3025 por la digestión con SalI y SacI, los términos dados obtusos y religados para generar el plásmido pCIB3060. El plásmido pJIT82 se obtiene del Centro John Innes, Norwich y el fragmento Smal de 400 pares de bases que contiene el gen bar de Streplomyces viridochromogenes se escinde y se inserta en el sitio HpaI de pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J 6:2519-2523 (1987)). Esto generó pCIB3064 que comprende el gen bar bajo el control del promotor CaMV 35S y el terminador para la selección del herbicida, un gen fro con resistencia para la ampicilina (para la selección en E. coli) y un polienlazante con los sitios únicos SphI, PstI, HindIII, y BamHI. Este vector es adecuado para la clonación de casetes de expresión de plantas que contienen sus propias señales reguladoras.

Construcción de pSOG19 y pSOG35

El pSOG35 es un vector de transformación que utiliza el gen de dihidrofolato reductasa de E. coli (DHFR) como marcador seleccionable que confiere resistencia para metotrexato. Se usó la PCR para amplificar al promotor 35S (\sim800 pares de bases), intron 6 del gen Adh1 del maíz (\sim550 pares de bases) [Lou et al., Plant J. 3: 393-403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12: 3983-4000, 1984] y 18 pares de bases de la secuencia líder GUS no traducida de pSOG10. Un fragmento de 250 pares de bases que codifica el gen tipo II de dihidrofolato reductasa de E. coli también se amplifica por PCR y estos dos fragmentos de PCR se montan con un fragmento de SacI-PstI de pBI221 (Clontech) que comprendía la estructura del vector pUC19 y el terminador de nopalina sintasa. El ensamblaje de estos fragmentos generó pSOG19 que contenía al promotor de 35S en fusión con la secuencia 6 del intron, la líder de GUS, el gen DHFR y el terminador de nopalina sintasa. El reemplazo del líder de GUS en pSOG19 con la secuencia líder del virus del moteado del maíz clorótico (MCMV) generó el vector pSOG35. Los PSOG19 y pSOG35 llevan el gen pUC para la resistencia a la ampicilina y tienen los sitios HindIII, SphI, PstI y EcoRI disponibles para la clonación de secuencias extrañas.

pSOG 10

Este vector de expresión de \beta-glucuronidasa (GUS) se deriva del plásmido pB1121, comprado en los Laboratorios Clonetech, Palo Alto, California. El intron 6 del gen Adh1 del maíz se amplifica por PCR a partir del plásmido pB428, descrito en Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81:4125-4128 (1987), usando los iniciadores de oligonucleotido SON0003 y SON0004.

\vskip1.000000\baselineskip

SON0003:: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3’

SON0004:: 5'-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3’

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de reacción de la PCR se digiere con endonucleasa de restricción BamHI, rompiendo el sitio de BamHI añadido sobre el extremo 5' de cada iniciador de la PCR. El fragmento de ADN resultante se purifica en un gel de agarosa y se liga en el sitio de BamHI de pBI121, que está entre el promotor CaMV35S y el gen GUS. El ADN ligado se transforma en E.coli y se clona con el intron 6 de Adh1 en la misma orientación cuando el gen GUS se identifica por la digestión de restricción.

pSOG 19

Este vector de expresión de dihidrofolato reductasa (DHFR) se deriva fusionando el promotor 35S y el intron 6 de Adh1 de pSOG10 al gen DHFR del plásmido pHCO, descrito en Bourouis y Jarry, EMBO J. 2:1099-1104 (1983). El promotor 35S y el intron 6 de Adh1 son producidos por la amplificación PCR del fragmento de pSOG10 utilizando los iniciadores SON0031 y SON0010.

\vskip1.000000\baselineskip

SON0031:: 5'-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3’

SON0010:: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’

\vskip1.000000\baselineskip

El fragmento resultante se digiere con endonucleasas de restricción PstI y BspHI y se purifica en un gel de aga-
rosa.

La región de codificación de DHFR se produce por la amplificación PCR de pHCO utilizando los iniciadores SON0016 y SON0017.

\vskip1.000000\baselineskip

SON0016:: 5'-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3'

SON0017:: 5'-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3’

\vskip1.000000\baselineskip

El fragmento resultante se digiere con endonucleasas de restricción NsoI y SacI y se purifica en un gel de aga-
rosa.

Los dos fragmentos descritos anteriormente se ligan en un fragmento de vector preparado a partir de pBI121 por la digestión con endonucleasas de restricción PstI y SacI y la purificación del fragmento de 3 kilobytes que contiene la región del terminador Nos y la región pUC19 de pBI121 en un gel de agarosa. Estos tres modos de unión fusionan el promotor 35S-intron 6 de AdhI-gen de DHFR-terminador Nos en el orden correcto y la orientación para la expresión funcional en plantas.

pSOG 30

Este vector de expresión de GUS se deriva de pSOG 10 por la inserción del líder del virus del moteado del maíz clorótico (MCMV), descrito en Lommel et al., Virology 181:382-385 (1991), en el lider del gen 35S-Gus no traducido por una unión de tres vías.

Ambas cadenas de la secuencia líder de proteína cápsida de 17 pares de bases MCMV más las lecturas de endonucleasa de restricción apropiadas se sintetizan y se templan. El fragmento bicatenario resultante se digiere con BamHI y NcoI y se purifica en un gel de acrilamida.

La región de codificación del gen GUS se amplifica por PCR utilizando los iniciadores SON0039 y SON0041 y pBI121 como plantilla.

\vskip1.000000\baselineskip

SON0039:: 5'-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3’

SON0041:: 5'-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3’

\vskip1.000000\baselineskip

Estos iniciadores añadieron un sitio NcoI a los extremos 5’ de GUS y un sitio SacI a los extremos 3' de GUS. El fragmento resultante se digiere con endonucleasas de restricción NcoI y SacI y se purifica en un gel de agarosa.

El gen GUS se elimina del plásmido pSOG 10 por digestión con la endonucleasa de restricción SacI y digestión parcial con la endonucleasa de restricción BamHI. El vector resultante, que tiene un sitio BamHI y un sitio SacI para insertar de nuevo una región de codificación detrás del promotor 35S-intron 6 de AdhI, se purifica en un gel de agarosa.

Los tres fragmentos descritos anteriormente se ligan en una unión de tres modos para producir una fusión génica con la estructura: promotor 35S -intron 6 de Adh1-líder MCMV-GUS-terminador Nos, todo en la estructura del vector pUC19.

pSOG 35

El vector marcador seleccionable de DHFR es idéntico a pSOG19, excepto en que el líder MCMV es insertado en el líder no traducido del gen DHFR para potenciar la traducción. Es creado en dos etapas. Primero, la región de codificación de GUS en pSOG32, un vector idéntico a pSOG30 excepto que contiene a un promotor modificado Adh más bien que 35S, es sustituido por la región de codificación de DHFR de pSOG19 escindiendo GUS con NcoI y SacI y uniendo en el DHFR como un fragmento de NcoI-SacI. Este causa el vector pSOG33 que tiene la estructura génica promotor Adh-intron 6 de Adh1-líder MCMV-región de codificación de DHFR-terminador Nos, con un sitio BglII entre el promotor y el Intron y un sitio SacI entre la región de codificación y el terminador. El fragmento de BglII-SacI se aísla por digestión con la endonucleasa de restricción y la purificación en gel de agarosa, y se liga en los sitios BamHI y SacI de pSOG30, sustituyendo la región de codificación intron 6 de Adh1-líder MCMV-Gus de pSOG30 con la región de codificación intron 6 de Adh1-líder MCMV-DHFR de pSOG33.

6.2 Construcción de casetes de expresión de plantas

Las secuencias génicas deseadas para la expresión en plantas transgénicas en primer lugar se montan en casetes de expresión detrás de un promotor adecuado y cadena arriba de un terminador de transcripción adecuado. Estos casetes de expresión después pueden ser transferidos fácilmente a los vectores de transformación de plantas descritos anteriormente en el Ejemplo 6.1.

Selección del promotor

La selección de un promotor usado en casetes de expresión determinará el modelo de expresión espacial y temporal del transgen en la planta transgénica. Los promotores seleccionados expresarán transgenes en tipos de células específicos (tales como células epidérmicas de la hoja, células del mesófilo, células de corteza de raíz) o en tejidos específicos u órganos (raíces, hojas o flores, por ejemplo) y esta selección reflejará la posición deseada de la expresión del transgen. De forma alternativa, el promotor seleccionado puede conducir a la expresión del gen bajo un promotor inducido por luz u otro temporalmente regulado. Una alternativa más es que el promotor seleccionado químicamente sea regulado. Esto proporcionaría la posibilidad de inducir la expresión del transgen sólo cuando se desee y causado por el tratamiento con un inductor químico.

Terminadores transcripcionales

Una variedad de terminadores transcripcionales está disponible para su uso en casetes de expresión. Estos son responsables de la terminación de transcripción más allá del transgen y su poliadenilación correcta. Los terminadores transcripcionales apropiados y los que se sabe que funcionan en plantas y que incluyen el terminador CaMV35S, el terminador tmI, el terminador de nopalina sintasa, el terminador rbcS E9 del guisante. Estos pueden ser usados en ambas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

Secuencias para la potenciación o regulación de la expresión

Se han encontrado numerosas secuencias que potencian la expresión génica desde dentro de la unidad transcripcional y estas secuencias pueden ser usadas junto con los genes de esta invención para aumentar su expresión en plantas transgénicas.

Se ha demostrado que varias secuencias intron potencian la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen Adh1 del maíz potencian considerablemente la expresión del gen tipo natural bajo su promotor específico cuando se introduce en células del maíz. Se sabe que el Intron 1 tiene una expresión particularmente eficaz y realzada en construcciones de fusión con el gen de cloramfenicol acetiltransferasa (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)). En el mismo sistema experimental, el intron del gen bronze1 del maíz tenía un efecto similar en la potenciación de la expresión (Callis et al., supra). Secuencias de intron fueron incorporadas rutinariamente en vectores de transformación de plantas, típicamente dentro del líder no traducido.

También se conocen un número de secuencias líder no traducidas derivadas del virus que potencian la expresión, y estos son particularmente eficaces en células dicotiledóneas. Específicamente, se ha demostrado que las secuencias líder del Virus del Mosaico de Tabaco (TMV, la "Secuencia W"), vector del virus del moteado del maíz clorótico (MCMV), y el Virus del Mosaico de la Alfalfa (AMV) son eficaces en la potenciación de la expresión (por ejemplo, Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990))

Reconocimiento del producto génico dentro de la célula

Se conocen varios mecanismos para reconocer productos génicos que existen en plantas y han sido caracterizadas con algún detalle las secuencias que controlan el funcionamiento de estos mecanismos. Por ejemplo, el reconocimiento de productos génicos para el cloroplasto se controla por una secuencia de señal encontrada en el extremo amino terminal de varias proteínas y que es escindido durante la captación a cloroplasto proporcionando la proteína madura (por ejemplo, Comai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Estas secuencias de señal pueden ser fusionadas con productos génicos heterólogos para realizar la entrada de productos heterólogos en el cloroplasto (van den Broeck et al. Nature 313:358-363 (1985)). La codificación del ADN para secuencias de señal apropiadas puede ser aislada del extremo 5’ de los cDNA que codifican para la proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima sintasa EPSP, la proteína GS2 y muchas otras proteínas que se saben que se localizan en el cloroplasto.

Otros productos génicos se localizan en otros orgánulos tales como la mitocondria y el peroxisoma (por ejemplo, Unger et al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). Los cDNA que codifican para estos productos también pueden ser manipulados para realizar el reconocimiento de productos heterólogos génicos en estos orgánulos. Los ejemplos de tales secuencias son las ATPasas nucleares codificadas y las isoformas de aspartato amino transferasa específicas para las mitocondrias. El reconocimiento para los cuerpos de proteínas celulares ha sido descrito por Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)).

Además han sido caracterizadas las secuencias que causan el reconocimiento de productos génicos en otros compartimentos de la célula. Las secuencias amino terminales son responsables de reconocer al ER, el apoplasto, y la secreción extracelular de células de aleurona (Koehler y Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)). Además, las secuencias amino terminales junto con las secuencias carboxi terminales son responsables del reconocimiento en vacuolas de los productos génicos (Shinshi et al. Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).

Por la fusión de las secuencias de reconocimiento apropiadas descritas anteriormente en las secuencias del transgen de interés es posible dirigir el producto del transgen a cualquier orgánulo o compartimento celular. Para el reconocimiento del cloroplasto, por ejemplo, la secuencia de señal del cloroplasto del gen de RUBISCO, el gen de CAB, el gen de EPSP sintasa, o el gen de GS2 se fusiona en el marco en el terminal amino ATG del transgen. La secuencia de señal seleccionada debería incluir el sitio de división conocido y la fusión construida debería tener cualquier aminoácido en cuenta después del sitio de división que requiera para la división. En algunos casos este requerimiento puede ser realizado por la adición de un pequeño número de aminoácidos entre el sitio de división y el transgen ATG o de forma alternativa con el reemplazo de algunos aminoácidos dentro de la secuencia del transgen. Las fusiones construidas para la captación en el cloroplasto pueden ser analizadas por su eficacia en la respuesta del cloroplasto por traducción in vitro de construcciones in vitro transcritas seguido por la respuesta del cloroplasto in vitro usando las técnicas descritas por (Bartlett et al. en: Edelmann et al. (Editores) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. págs 1081-1091 (1982); Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986)). Estas técnicas de construcción son conocidas en la técnica y son igualmente aplicables a mitocondrias y a peroxisomas. La opción de reconocimiento que puede requerirse para la expresión de los transgenes dependerá de la localización celular del precursor requerido como punto de partida para la ruta dada. Estos por lo general serán citosólicos o cloroplásticos, aunque pueden ser en algunos casos mitocondriales o peroxisomales. Los productos de expresión del transgen normalmente no requerirán el reconocimiento para ER, apoplasto o vacuola.

Los mecanismos descritos anteriores para el reconocimiento celular pueden ser utilizados no sólo junto con sus promotores específicos, sino que también junto con promotores heterólogos para efectuar el reconocimiento de una célula específica objetivo conforme a la regulación transcripcional de un promotor que tenga un modelo de expresión diferente al del promotor del que la señal de reconocimiento se deriva.

6.3. Transformación del maíz

Para la transformación usando embriones inmaduros zigóticos, se autopolinizan espigas y se obtienen embriones inmaduros zigóticos aproximadamente 10 días más tarde. Aproximadamente ochocientos embriones inmaduros zigóticos se dividen entre placas de reconocimiento diferentes que contienen un medio capaz de inducir y apoyar la formación de callo embriogénico. Los embriones inmaduros zigóticos se transfieren inmediatamente al mismo medio, pero conteniendo sacarosa del 12%. Después de 5 horas, los embriones inmaduros zigóticos se bombardean con un plásmido o plásmidos usando el dispositivo PDS-1000/He de BioRad. El plásmido o los plásmidos comprenden un marcador seleccionable tal como un gen que confiere resistencia para la fosfinotricina y el nuevo gen de la toxina preparado para suministrar y expresar en el maíz de acuerdo con la descripción anterior. El plásmido o los plásmidos son precipitados en partículas de oro de 1 \mum esencialmente de acuerdo con el procedimiento publicado por BioRad. Las partículas se impulsan usando una presión de explosión de 1550 psi de helio. Cada placa objetivo es disparada dos veces con el plásmido y la preparación de partículas de oro. Ya que el plásmido o los plásmidos comprenden un gen quimérico que codifica para la resistencia a fosfinotricina esta sustancia se usa para seleccionar células transformadas in vitro. El agente de selección se aplica en 10 mg/L durante el día de suministro génico y se aumenta a 40 mg/L después de aproximadamente un mes. El callo embriogénico así obtenido se regenera en presencia del agente de selección de fosfinotricina. Las plantas se obtienen a partir de las líneas de callo embriogénico resistentes a fosfinotricina. Las plantas regeneradas son analizadas por su resistencia a un insecto susceptible. Todas las plantas que son resistentes al insecto también expresan el nuevo gen quimérico de la toxina introducido como se demuestra por la detección de las nueva proteína toxina en la planta usando un ensayo ELISA. Las plantas resistentes al insecto y la expresión del nuevo gen de la toxina introducido son transformados.

Para la transformación del maíz usando callo embriogénico del tipo I, el callo se obtiene a partir de embriones inmaduros zigóticos usando técnicas de cultivo estándar. Para el suministro génico, se preparan aproximadamente 300 mg del callo tipo I cortando con un bisturí de hojas o subcultivando 3-5 días antes del suministro génico. Antes del suministro génico, el callo preparado se coloca en el nuevo medio de cultivo semisólido que contiene sacarosa del 12%. Después de aproximadamente 4 horas, el tejido se bombardea usando el dispositivo PDS-1000/HE Biolistic de BioRad. El plásmido o los plásmidos que comprenden el marcador seleccionable como un gen que confiere resistencia para la fosfinotricina y el nuevo gen de la toxina preparado para el suministro y la expresión en el maíz de acuerdo con la descripción anterior son precipitados en partículas de oro de 1 \mum usando esencialmente el protocolo estándar de BioRad. Aproximadamente 16 horas después del suministro génico, el callo se transfiere al medio de cultivo estándar que contiene sacarosa del 2% y fosfinotricina de 1 mg/L. El callo se subcultiva bajo selección durante 8 semanas, después de que los callos supervivientes y en crecimiento sean transferidos al medio de regeneración estándar para la producción de plantas. Las plantas regeneradas se analizan para la resistencia a un insecto susceptible. Todas las plantas que son resistentes al insecto también expresan el nuevo gen quimérico de la toxina introducido como se demuestra por la detección de la nueva proteína toxina en la planta usando un ensayo ELISA. Las plantas resistentes al insecto y la expresión del nuevo gen de la toxina introducido son transformados.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel experto de los expertos en la técnica a la que esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente en este documento son incorporadas en cuanto al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera indicada específicamente e individualmente para ser incorporada como referencia.

Aunque la invención precedente haya sido descrita en algún detalle por medio de ilustración y ejemplo con el objeto de una mayor claridad de entendimiento, es obvio que puedan ser practicados ciertos cambios y modificaciones en la amplitud de las reivindicaciones añadidas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: CIBA-GEIGY AG

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Klybeckstr. 141

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Basel

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Suiza

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (CP): 4002

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO.: +41 61 69 11 11

\vskip0.500000\baselineskip

(H): FAX: + 41 61 696 79 76

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TELEX: 962 991

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: “NUEVO GEN DE BACILLUS THURINGIENSIS QUE CODIFICA PARA UNA TOXINA ACTIVA CONTRA INSECTOS”

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco 3.5''

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC de IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION PARA LA SEQ ID NO.:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4003 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Bacillus thuringiensis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: kurstaki

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: CGB316

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: promotor

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 96..124

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /función= "región del promotor putativa"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: RBS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 185..190

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 196..3723

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /producto= "proteína CryIE(c) de cadena completa"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA :

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1191..1590

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /nota= "Esta región de la secuencia de DNA de CryIE(c) codifica para la secuencia de aminoácidos denominada Sub-Secuencia A"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1591..2061

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /nota= "Esta región de la secuencia de DNA de CryIE(c) codifica para la secuencia de aminoácidos denominada Sub-Secuencia B"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:1

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

5

6

7

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1176 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:2:

11

12

13

14

15

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 133 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Region

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..133

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /nota= "Sub-Secuencia A" de CryIE(c)

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 157 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..157 (D) OTRAS INFORMACIONES: /nota= "Sub-Secuencia B" de CryIE(c)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..13

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /nota^{=} "secuencia de un iniciador de translación de planta convencial (Clontech)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGACCATG GTC

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..12

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /nota= "secuencia de un iniciador de translación de planta convencial (Joshi)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAACAATGG CT

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3531 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA :

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..3528

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /producto= "proteína Cry IE(d) de cadena completa"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

21

23

24

25

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1176 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 133 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..133

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRAS INFORMACIONES: /nota="Sub-Secuencia A' de CryIE(d)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 157 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..157 (D) OTRAS INFORMACIONES: /nota="Sub-Secuencia B' de CryIE(d)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

39

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador SON0003 usado para construir pSOG10

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador SON0004 usado para construir pSOG10

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador SON0031 usado para construir pSOG19

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador SON0010 usado para construir pSOG19

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador SON0016 usado para construir pSOG19

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTACCATGGCCACATAGAACACC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA EQ ID NO.:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador SON0017 usado para construir pSOG19

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador S0N0039 usado para construir pSOG30

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPTION: iniciador SON0041 usado para construir pSOG30

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): TEÓRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC

\hfill

24

Claims

1. Una molécula de ADN aislada que codifica para una proteína toxina, en la que dicha proteína toxina comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO 10), que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua.

2. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que dicha proteína toxina comprende ambas Subsecuencia A (SEQ ID NO:3) y Subsecuencia B (SEQ ID NO:4).

3. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que dicha proteína toxina comprende ambas Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO 10).

4. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que dicha proteína toxina es CryIE(c) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en este documento en la SEQ ID NO:2.

5. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que dicha proteína toxina es CryIE(d) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en este documento en la SEQ ID NO:8.

6. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 4 que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en este documento en la SEQ ID NO:1.

7. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 5 que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en este documento en la SEQ ID NO:7.

8. La molécula de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha proteína toxina es una proteína recombinante.

9. La molécula de ADN aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que ha sido optimizada para su expresión en plantas.

10. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 9 que ha sido optimizada para su expresión en el maíz.

11. La molécula de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 que codifica el fragmento tóxico principal de la proteína toxina CryIE(c) y CryIE(d), respectivamente.

12. Una molécula de proteína aislada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO:10), que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua.

13. Una molécula de proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende ambas Subsecuencia A (SEQ ID NO:3) y Subsecuencia B (SEQ ID NO:4).

14. Una molécula de proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende ambas Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO:10).

15. Una molécula de proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 12 que tiene la secuencia expuesta en este documento en la SEQ ID NO 2.

16. Una molécula de proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 12 que tiene la secuencia expuesta en este documento en la SEQ ID NO 8.

17. Una molécula de proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 que es una proteína recombinante.

18. Una molécula de ADN recombinante que comprende al menos una de las moléculas de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que codifica para una proteína toxina que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua.

19. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 18 que comprende una construcción de ADN quimérico, en la que la molécula de ADN está bajo el control de las secuencias de expresión que son operables en microorganismos y/o plantas.

20. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende una construcción de ADN quimérico, en la que la molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 está bajo el control de las secuencias de expresión que son operables en plantas.

21. Un microorganismo recombinante transformado con al menos una de las moléculas de ADN aisladas de acuerdo con la reivindicación 19.

22. Un microorganismo recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica para una proteína toxina en la que dicha proteína toxina comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’ (SEQ ID NO 9), Subsecuencia B’ (SEQ ID NO 10) y una combinación de las Subsecuencias A (SEQ ID NO:3), B (SEQ ID NO:4). A’ (SEQ ID
NO 9), y/o B’ (SEQ ID NO 10), en la que dicha proteína toxina es activa contra la especie Heliothis.

23. El microorganismo recombinante de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que dicho microorganismo recombinante se selecciona del grupo que consiste en los miembros del género Bacillus, Pseudomonas, Caulobacter, Agmellenum, Rhizobium, y Clavibacter o es un baculovirus o una levadura.

24. El microorganismo recombinante de la reivindicación 23, en el que dicho microorganismo recombinante es el virus de la poliedrosis nuclear Autographica californica.

25. El microorganismo recombinante de la reivindicación 23, en el que dicho microorganismo recombinante es Bacillus thuringiensis.

26. Una composición entomocida que comprende el microorganismo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 en una cantidad insecticidamente eficaz junto con un vehículo adecuado.

27. Una composición entomocida que comprende una molécula de proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en una cantidad insecticidamente eficaz junto con un vehículo adecuado.

28. Una planta transformada que comprende al menos una molécula de ADN que codifica para una proteína toxina en la que dicha proteína toxina comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’ (SEQ ID NO 9), Subsecuencia B’ (SEQ ID
NO 10) y una combinación de las Subsecuencias A (SEQ ID NO:3), B (SEQ ID NO:4), A' (SEQ ID NO 9), y/o B’ (SEQ ID NO 10), en la que dicha proteína toxina es activa contra la especie Heliothis.

29. Una planta transformada que comprende la molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

30. Una planta transgénica que se transforma con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

31. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 30 que se transforma con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 20.

32. Una célula de planta transformada que comprende la molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

33. Una célula de planta transformada que se transforma con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

34. Una célula de planta transformada de acuerdo con la reivindicación 33 que se transforma con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 20.

35. Una célula de planta transformada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34 que es una célula de polen o un cigoto.

36. La planta transformada o la célula de planta de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35 en la que dicha planta y célula de planta se seleccionan respectivamente del grupo que consiste en maíz, trigo, cebada, arroz, tabaco, algodón y soja.

37. La planta transformada o la célula de planta de la reivindicación 36 que es una planta de maíz o una célula de una planta de maíz, respectivamente.

38. Un método para obtener una molécula de ADN aislada que codifica para una proteína toxina que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO 10), y que es activa contra la especie Heliothis, pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, comprendiendo el método:

(a) aislar el ADN total de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki;

(b) establecer una genoteca de ADN genómico en un organismo huésped adecuado,

(c) sondear dicha genoteca con una molécula sonda que comprende ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

(d) aislar un clon que se hibride con la molécula sonda; y

(e) sondear dicho clon respecto a su actividad insecticida.

39. Un método para producir una molécula de proteína aislada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Subsecuencia A (SEQ ID NO:3), Subsecuencia B (SEQ ID NO:4), Subsecuencia A’ (SEQ ID NO:9) y Subsecuencia B’ (SEQ ID NO 10), y que es activa contra la especie Heliothis pero que no exhibe actividad contra Spodoptera exigua, comprendiendo el método:

(a) transformar un organismo huésped adecuado con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

(b) cultivar el organismo huésped así transformado en un medio adecuado; y

(c) aislar el producto de proteína recombinante producido por el organismo huésped transformado bajo la expresión del gen de la toxina.

40. Un método para producir un microorganismo recombinante que comprende transformar dicho microorganismo con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19.

41. Un método para producir una planta transgénica o célula de planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37 que comprende transformar dicha planta y célula de planta, respectivamente, con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

42. Un método para producir una composición entomocida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27 que comprende mezclar el microorganismo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 o una molécula de proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en una cantidad insecticidamente eficaz con un vehículo adecuado.

43. Un método para proteger plantas contra el daño causado por un insecto perjudicial que comprende aplicar a la planta o al área de crecimiento de dicha planta una composición entomocida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27.

44. Un método para proteger plantas contra el daño causado por un insecto perjudicial que comprende aplicar a la planta una proteína toxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17.

45. Un método para proteger plantas contra el daño causado por un insecto perjudicial que comprende plantar una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, 36 y 37 dentro de un área donde dicho insecto perjudicial puede darse.

46. El uso de una composición entomocida de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27 para proteger plantas contra el daño causado por un insecto perjudicial.