JP4524780B2 - げっ歯類抗体の表面再処理 - Google Patents

Description

本発明は、抗体の可変領域（Ｖ−領域）を正確にモデル化する際に使用できる推定規則の開発に関する。これらの規則を開発して、さらに非ヒトモノクローナル抗体の可変ドメインの表面の再構築を推定分子に応用して、表面変化させること、すなわち、これらのモノクローナル抗体のＶ−領域を表面再処理（resurfacing）してヒト抗体のＶ領域の表面特性を複製することを可能にする。非ヒトモノクローナル抗体のＶ−領域を表面再処理して、ヒト抗体のＶ−領域に類似させるこの方法によれば、元の非ヒトモノクローナル抗体の結合係数（binding parameters）を維持していながら、機能面で修正を加えた抗体を生産でき、しかもこのＶ−領域上のヒト表面の提示（ presentation ）により、患者に対する治療効率が改善される。

抗体に関する一般的背景
マウスモノクローナル抗体は、検査薬として、また治療薬としてヒトの疾病治療に広く使用されている。マウスは外来抗原を用いて容易に免疫化し、幅広いスペクトルをもった各種の高親和性抗体を作成することができる。マウス、又はその他のげっ歯類抗体をヒトに導入すれば、体内に外来タンパク質を提示することになるので、例外なく体内でヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が生じる。単回投与での異質抗体の導入によって、又、例えば癌の治療用などとして幅広く使用されることによって、患者にＨＡＭＡが生成する。一般的に、マウス抗体を患者に対し幅広く使用できるのは、アナフィラキシーの問題が発生するまでの数日又は数週間の期間に限られている。同じ理由で、一旦患者にＨＡＭＡが形成されると、検査又は治療目的でマウス抗体をこれ以上使用することができなくなることが多い。

倫理上の問題はともかく、多くの理由でヒトモノクローナル抗体を生成しようとする試みが著しい成功を収めたとはいえない。ヒトモノクローナルのインビトロ生成で、高親和性を有する抗体が生成されることはめったにない。マウスを直接免疫化することによって得られるインビボ生成された広範囲のスペクトルを有する反応性抗体と比較して、ヒトリンパ球のインビトロ培養物は、限られた抗体反応を示すにぎない。さらにヒトでは、免疫寛容によって自家抗原に対する抗体の生成がうまくいかない。これらの問題を克服するために構造を修正して、マウスモノクローナル抗体の患者への使用を改善する方法の探索がなされてきた。多くの研究者はマウスモノクローナル抗体を変化させ、再整形し、又はヒト化して、これらの分子が患者の治療に適応できるように改善を行ってきた。

抗体のヒト化
Bobrzecka, K. et al.(非特許文献１：Bobrzecka, K., Konieczny, L., Laidler, P. and Rybarska, J.(1980), Immunology Letters 2, pp.151-155 )及びKonieczny et al.(非特許文献２：Konieczny, L., Bobrzecka, K., Laidler, P. and Rybarska, J.(1980), Haematologia 14 (I), pp.95-99) によって、新規なタンパク質を創造するために、ウサギやヒトの抗体を使って抗体ドメインを制御的に再配列することに関して初期の報告が出された。この報告によると、抗体のタンパク質サブユニットである、ウサギのＦａｂフラグメント及びヒトＦｃフラグメントがタンパク質ジスルフィド結合を介して結合し、新しい人工タンパク質分子又はキメラ抗体を形成する。

組換えＤＮＡ技術は、マウス抗体の可変軽鎖及び重鎖のドメインをコードするＤＮＡ配列と、ヒト抗体の軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の不変ドメインとを遺伝子融合し、最初の組換え"疑似ヒト"抗体（キメラ抗体）の産生を可能にするために使用された（非特許文献３：Morrison, S.L., Johnson, M.J., Herzenberg, L.A. 及びOi, V.T.(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, pp. 6851-6855）。

ヒトのキメラ抗体に対する動力学（kinetics） 及び免疫反応が研究されてきた（非特許文献４：LoBuglio, A.F., Wheeler, R.H., Trang, J., Haynes, A., Rogers, K., Harvey, E.B., Sun, L., Ghrayeb, J. 及びKhazaeli, M.B. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86, pp. 4220-4224）。

キメラ抗体は、多数の非ヒトアミノ酸配列を有し、ヒトにおいて免疫原性を発揮する。その結果、ヒトの抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）が患者に形成されてしまう。ＨＡＣＡは、マウスＶ−領域に向けられており、また組換えキメラ抗体に存する新しいＶ−領域／Ｃ−領域（不変領域）の接続部に向けられている。

キメラ抗体の免疫原性によって引き起こされる制約のいくつかを克服するために、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部又は相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）をコードするＤＮＡ配列が、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖のフレームワークをコードするＤＮＡ配列内の分子手段によって移植されてきた（非特許文献５：Jones, P.T., Dear, P.H., Foote, J., Neuberger, M.S. 及びWinter, G. (1986), Nature 321, pp. 522-525; 非特許文献６：Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. 及びWinter, G. (1988), Nature 322, pp. 323-327） 。再整形（reshaping ）又はヒト化抗体と称される発現組換え産物は、ヒト抗体の軽鎖又は重鎖と、マウスモノクローナル抗体の抗原認識部位、ＣＤＲ’ｓから構成される。この分野に関して、いくつかの特許出願がなされている。例えば、欧州特許公開第０２３９４００号（特許文献１）；欧州特許公開第０４３８３１０Ａ１号（特許文献２）及び第０４３８３１０Ａ２号（特許文献３）；国際公開ＷＯ ９１／０９９６７号（特許文献４）及び国際公開ＷＯ ９０／０７８６１号（特許文献５）等である。

しかし、該欧州特許（ＥＰ）公開第０２３９４００号（特許文献１）が本当に実施可能かどうかは疑問である。該出願では、最適な適合の際に、抗体の結合部位にＣＤＲループが正しく存在することが確められていない。

ＥＰ公開第０４３８３１０Ａ１号（特許文献２）及び第０４３８３１０Ａ２号（特許文献３）は、ヒトの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のＶ−領域用に固有に選択したヒトフレームワークの重要性を保護している点で、ＥＰ公開第０２３９４００号（特許文献１）より一歩進んだものとなっている。これらのＶ−領域フレームワークは、マウスモノクローナル抗体のフレームワークとの間で高い配列類似性を呈し、適切なコンフィギュレーションでＣＤＲ’ｓを提供する。しかし、配列のマッチングの基準は、抗体タンパク質、又はＤＮＡのデータベースの単なる相同性サーチに過ぎず、これをさらに深めたものではない。

国際公開第ＷＯ ９１／０９９６７号（特許文献４）は、ＥＰ公開第０２３９４００号（特許文献１）に開示される方法にさらに変化を加えようとするものである。国際公開第ＷＯ ９１／０９９６７号（特許文献４）では、ドナー配列とアクセプター・フレームワークとの相同性は重要ではなく、むしろこの出願はＬＣ及びＨＣ内の選択された一連の残基が、ヒト化において決定的な重要性を持つことを開示する。これらの位置で変化をもたらす能力が、国際公開第ＷＯ ９１／０９９６７号（特許文献４）の基礎をなしている。

国際公開ＷＯ ９０／０７８６１号（特許文献５）は、ヒト化された抗体を設計するための四つの重要な基準を提案する。１）ヒトアクセプターと非ヒトドナー配列との相同性。２）アクセプターのアミノ酸がその位置で異常な場合、アクセプターアミノ酸よりドナーの方を使用すること。３）ＣＤＲに隣接する位置では、ドナーフレームワークのアミノ酸を使用すること。４）立体模型において、側鎖原子がＣＤＲの３オングストロームの範囲内であるフレームワーク位置で、ドナーアミノ酸を使用すること。この方法によりヒト化された最初の抗体は、元のモノクローナル抗体の親和力の１／３以下を維持していた。

ＣＤＲのフレ−ムワ−クの相互作用について疑問な点が存在するために、ヒト化された抗体を設計する上記のどの方法も予測することができない。マウスフレームワークをヒトフレームワークに置き換えることで、ＣＤＲが同一のコンフォメーションを採る保証はない。なぜなら、ｉ）Ｖ_L −Ｖ_H 相互作用が、すべてのＶ−領域で同一というわけではないからであり、ｉｉ）ＣＤＲ−フレームワークの相互作用を正確に推定することが、抗原結合性接触を忠実に再生するための重要な要素だからである。

上記の方法は、抗体のヒト化に係る問題に対して一般的な解決を与えるものではない。むしろ、上記引例で概略を示した各方法では、最終的にヒト化された産物に所望の親和力を与えるために実質的にかなりの試行錯誤による探索に関係している。重要なことは、フレームワークのアミノ酸の正しい変化によって再整形されたＶ−領域が、真のヒト抗体の表面特性に類似するという保証はないという点である。従って、上記方法によってヒト化された抗体が、ヒト内で免疫原性を発揮すると結論せざるを得ない。

抗体の抗原性
再整形された組換え抗体産物を含む抗体の抗原性／免疫原性は、ヒトに導入された後、表面上の現象として観察することができる。一般的には、身体に導かれたタンパク質の表面を走査するものとして、免疫系を観察することができる。もし循環系にヒト化された抗体のＦ_V 部が"表面に現れれば"、内部残基を免疫系に提示することになる。一方、Ｆ_V 部が安定していて、密に詰め込まれている時には、Ｖ−領域及びＶ_L とＶ_H 領域との界面によって現出させられた表面残基だけが"走査"される。

抗体の再整形又は表面再処理
免疫系にタンパク質の表面を提示するという考え方に従えば、組換えＦ_V のＶ−領域の表面に接近可能なアミノ酸のみをヒト化することにより、マウスモノクローナル抗体を再設計してヒト抗体に類似させることも可能である。マウスモノクローナル抗体を表面再処理して、免疫原性を減少させることは、元のモノクローナル抗体の結合力を再整形された形で維持するという点で有益であろう。なぜなら、天然のフレームワークとＣＤＲの相互作用が維持されるからである。フレームワーク−ＣＤＲ間の相互作用の完全性を維持することの意義は、以下に要約される。

最近の研究報告によると、再構成された二つの異なるラットのモノクロ−ナル抗体、Campath-9(抗ヒトＣＤ４)が生成された（非特許文献７：Gorman, S.D., Clark, M.R., Routledge, E.G., Cobbold, S.P. 及びWaldmann, H. (1991), Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 88, pp. 4181-4185）。第一のものは、ｐＶ_H ＮＥＷ／Ｃ_G1、アクセプターＶ_H のフレームワークがＮＥＷを基礎とするヒト重鎖に由来しており、該重鎖はCampath-9 Ｖ_H と同一の残基を４７％有していた。一方、第二のものは、ｐＶ_H ＫＯＬ／Ｃ_G1、アクセプターＶ_H のフレームワークが、ヒトＫＯＬ抗体に由来しており、該抗体はCampath-9 Ｖ_H と同一の残基を７２％有していた。再整形された各抗体は、ヒトＲＥＩ抗体配列からの同一のＶ_L ドメインを含んでいた。しかし、ｐＶ_H ＫＯＬ／Ｃ_G1の組換え産物は、ｐＶ_H ＮＥＷ／Ｃ_G1の産物より実質的に大きいＣＤ４に対する親和力を有していた。この著者は、対象とするげっ歯類抗体に対し高度に相同性を有するヒトの配列が、インビトロ突然変異により、げっ歯類Ｖ−領域に転移し、"最適適合（bestfit ）"の再整形抗体を創出するという再整形法を提案した。この方法は、"最適適合"という言葉を用いて、モデリング工程を説明するが、"最適"か否かを判断する量的な公式はここでは用いられておらず、また実際にも存在しないので、該工程は主観的なものである。さらに、この論文には、表面再処理という概念について触れるところがない。

ヒトから取り出したものとは異なる抗体のフレームワーク領域の露出残基を置き換えることにより、げっ歯類由来の抗体の免疫原性を減退させるという考え方は、最近の論文で議論されているところである（非特許文献８：Padlan, E.A. (1991), Molecular Immunology 28, pp. 489-498）。この論文では、二つの抗体構造、ＫＯＬ（ヒト）及びＪ５３９（マウス）の可変ドメインについて検証する。これら二つの抗体のＦａｂフラグメントの結晶構造は、かなり詳細に説明されている。これら二つの抗体の可変ドメインの露出フレームワーク残基の溶媒接近性は、ヒト及びマウス抗体のＶ−領域のサブグループの配列データベースト比較された。この発見を基にPadlanは、ヒトの抗体内に通常存在する残基でフレームワーク領域内の露出残基を置き換えて、同種異系統の可変ドメイン［マウスＶ−領域］の抗原性を減退させることを提案した。ヒトのある配列に最も類似するマウスの配列に於いて、マウスのＶ−領域表面を"ヒト化する"べき変化数は、Ｖ−領域あたり、６個から１５個のアミノ酸である。この参考文献は、抗体の表面を別の表面に変える方法を示唆するものであって、一般的な方法については述べていない。該工程の適用形態について、二つの実施例が説明されているが、その内の一方は最悪例であって、もう一方は最適例である。

最悪例：
自己由来のＶ_H が配列決定された代表的なマウスの検査済みカッパ Ｖ_L 配列の内で、Ｓ１０７Ｖ_L はヒト化するために置き換えられるべき残基の殆どを有する。Ｓ１０７Ｖ_L は、ヒトサブグループに属するＶＫＩＶ及びＪＫ２に最も類似する。置き換えられるべき露出した又は一部露出した残基は、９位、１０位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、２２位、４１位、６３位、８０位、８３位、８５位、１００位及び１０６位にあるものである。マウスのＶ−領域のＳ１０７Ｖ_H は、ヒトサブグループに属するＶＨＩＩＩ及びＪＨ６のメンバーと、フレームワークの点で最も類似する。Ｓ１０７Ｖ_H の露出された又は一部露出した置き換えられるべき残基は、３位、４０位、６８位、７３位、７５位、７６位、８２ｂ位及び８９位にあるものである。合計２３個の残基は、Ｓ１０７の可変ドメインをヒト化するために置き換える必要がある。

最適例：
自己由来のＶ_L が配列決定された検査済みマウスＶ_H 配列の内で、ＭＯＰＣ２１Ｖ_H は、ヒト化するために置き換えられるべき最も少ない数の残基を有する。ＭＯＰＣ２１Ｖ_H は、そのフレームワークの点でヒトサブグループに属するＨＩＩＩ及びＪＨ６のメンバーに最も類似する。置き換えられるべき露出又は一部露出した残基は、１位、４２位、７４位、８２ａ位、８４位、８９位及び１０８位にあるものである。ＭＯＰＣ２１Ｖ_L は、そのフレームワークの点でヒトサブグループに属するＶＫＩＶ及びＪＫ４に最も類似する。置き換えられるべき露出又は一部露出した残基は、１位、９位、１２位、１５位、２２位、４１位、６３位、６８位、８３位及び８５位にあるものである。合計１７のアミノ酸は、ＭＯＰＣ２１の可変ドメインをヒト化するために置き換える必要がある。

上記で引用した最適及び最悪例の軽鎖の内、Ｓ１０７Ｖ_L は１５位で変化を要求し、ＭＯＰＣ２１Ｖ_L は１０位で変化を要求した。７つの変化だけがこれらの軽鎖配列の双方に共通する（下線を施した残基を参照のこと）。さらに、個々のＶ−領域をヒト化するのに置き換えられるべき重鎖残基の内、Ｓ１０７Ｖ_H は８個の位置で変化を要求し、ＭＯＰＣ２１Ｖ_H は７個の位置で変化を要求した。本例では、一つの位置だけがこれらの重鎖配列の双方に共通する（第８９位である）。

Ｓ１０７のＶ−領域のみを分析しても、ＭＯＰＣ２１中のどの残基を変化させるべきか予測することができないであろう。これは、Padlanの分析に係る表面残基が、一つの抗体の結晶構造分析を参照するだけで決定されるからである。さらに、該結晶構造の特定位置におけるアミノ酸の表面露出を規定する基礎は、連続的なグラジエント変化であり、例えば分画溶媒接近値（fractional solvent accessibility values）（非特許文献９：Padlan, E.A.(1990), Molecular Immunology 28, pp.489-498 ）が計算された。ここで０から０．２＝完全埋没、０．２から０．４＝ほとんど埋没、０．４から０．６＝部分的に埋没／部分的に露出、０．６から０．８＝ほとんど露出、０．８又はそれ以上＝完全露出を示す。露出表面残基の分析を単一の結晶構造に限定して、幅広い溶媒接近比を露出残基に課すことにより、モデリング法に計算上の誤差の余地が広いと予測される。このモデルは、他の抗体結晶構造用のデータベースで利用できる構造に関する情報の大半を考慮していない。
欧州特許公開第０２３９４００号 欧州特許公開第０４３８３１０Ａ１号 第０４３８３１０Ａ２号 国際公開ＷＯ ９１／０９９６７号 国際公開ＷＯ ９０／０７８６１号 Bobrzecka, K., Konieczny, L., Laidler, P. and Rybarska, J.(1980), Immunology Letters 2, pp.151-155 Konieczny, L., Bobrzecka, K., Laidler, P. and Rybarska, J.(1980), Haematologia 14 (I), pp.95-99 Morrison, S.L., Johnson, M.J., Herzenberg, L.A. 及びOi, V.T.(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, pp. 6851-6855 LoBuglio, A.F., Wheeler, R.H., Trang, J., Haynes, A., Rogers, K., Harvey, E.B., Sun, L., Ghrayeb, J. 及びKhazaeli, M.B. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86, pp. 4220-4224 Jones, P.T., Dear, P.H., Foote, J., Neuberger, M.S. 及びWinter, G. (1986), Nature 321, pp. 522-525; Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. 及びWinter, G. (1988), Nature 322, pp. 323-327 Gorman, S.D., Clark, M.R., Routledge, E.G., Cobbold, S.P. 及びWaldmann, H. (1991), Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 88, pp. 4181-4185 Padlan, E.A. (1991), Molecular Immunology 28, pp. 489-498 Padlan, E.A.(1990), Molecular Immunology 28, pp.489-498

本発明は、以下の事項に関する。
［１］表面再処理することによって、げっ歯類抗体またはそのフラグメントのヒト化の仕方を決定する方法であって、該方法は以下の工程：（ａ）げっ歯類抗体の可変領域の３次元モデルを構築することにより、該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの可変領域のコンホメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）構造を決定し；
（ｂ）十分な数のげっ歯類抗体可変領域の重鎖および軽鎖についてｘ線結晶学的構造から得られる相対的な接近可能性分布から、配列を整列させて、重鎖および軽鎖のフレームワーク位置のセットを得、該セットは該十分な数のげっ歯類抗体の重鎖および軽鎖と９８％同一である；
（ｃ）該工程（ｂ）で生み出されたフレームワーク位置の該セットを用いて、ヒト化される該げっ歯類抗体またはそのフラグメントのために、１セットの重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基を確定（ｄｅｆｉｎｉｎｇ）し；
（ｄ）該工程（ｃ）で確定された表面に露出するアミノ酸残基の該セットに最も緊密に同一である１セットの重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基を、ヒト抗体のアミノ酸配列から同定し、ここで該ヒト抗体からの該重鎖および軽鎖は天然にペアになるか、またはならないものであり；
（ｅ）ヒト化される該げっ歯類抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列において、該工程（ｃ）で確定された重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基の該セットを、該工程（ｄ）で同定された重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基の該セットと置換し；
（ｆ）該工程（ｅ）で明記される置換から得られる該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの該可変領域の３次元モデルを構築し；
（ｇ）該工程（ａ）および（ｆ）で構築された該３次元モデルを比較することにより、該工程（ｄ）で同定された該セットから、ヒト化される該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの相補性決定領域のあらゆる残基のいかなる原子からも５オングストローム以内にある、あらゆるアミノ酸残基を同定し；および（ｈ）該工程（ｇ）で同定されたあらゆる残基を、ヒトからオリジナルのげっ歯類アミノ酸残基に変化させ、これにより、表面に露出するアミノ酸残基のげっ歯類抗体ヒト化セットを確定し、ここで該工程（ａ）は最初に実施される必要はないが該工程（ｇ）の前に実施されねばならない、を包含する方法。
［２］前記げっ歯類抗体が抗体フラグメントである［１］に記載の方法。
［３］前記げっ歯類抗体フラグメントが単一鎖抗体、Ｆ_V フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ₂ またはＦａｂ´フラグメントである［２］に記載の方法。
［４］前記工程（ｄ）が、前記工程（ｃ）で確定された表面に露出するアミノ酸残基の前記セットに最も緊密に同一である天然にペアになる重鎖と軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基の１セットを同定する［１］または［２］に記載の方法。
［５］前記表面に露出するアミノ酸残基が、溶媒接近可能性が３０％以上の残基である［１］または［２］に記載の方法。
［６］ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントがネズミ抗体（ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である［１］または［２］に記載の方法。
［７］表面に露出するアミノ酸残基のフレームワーク位置の前記セットが第１表に示されるセットならびに図３Ａおよび図３Ｂに示される整列によって確定される［６］に記載の方法。

［８］ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントがネズミ抗体の抗Ｎ９０１である［１］又は［２］に記載の方法。
［９］表面に露出するアミノ酸残基のフレームワーク位置の前記セットが第１表に示されるセットならびに図３Ａおよび図３Ｂに示される整列によって確定される［８］に記載の方法。

［１０］表面再処理によって、げっ歯類抗体またはそのフラグメントからヒト化されたげっ歯類抗体またはそのフラグメントを生成する方法であって、該方法は、（Ｉ）クレーム１の方法を遂行し；および（II）げっ歯類抗体の表面に露出するアミノ酸残基のセットを、前記工程（ｈ）で確定された表面に露出するアミノ酸残基のげっ歯類抗体ヒト化セットで置換することにより、げっ歯類抗体またはそのフラグメントを改変することを包含する方法。
［１１］前記げっ歯類抗体が抗体フラグメントである［１０］に記載の方法。
［１２］前記げっ歯類抗体フラグメントが単一鎖抗体、Ｆ_V フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ₂ またはＦａｂ´フラグメントである［１１］に記載の方法。
［１３］前記工程（ｄ）が、前記工程（ｃ）で確定された表面に露出するアミノ酸残基の前記セットに最も緊密に同一である天然にペアになる重鎖と軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基の１セットを同定する［１０］または［１１］に記載の方法。
［１４］前記表面に露出するアミノ酸残基が、溶媒接近可能性が３０％以上の残基である［１０］または［１１］に記載の方法。
［１５］ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントがネズミ抗体である［１０］または［１１］に記載の方法。
［１６］表面に露出するアミノ酸残基のフレームワーク位置の前記セットが第１表に示されるセットならびに図３Ａおよび図３Ｂに示される整列によって確定される［１５］に記載の方法。

［１７］ヒト化されるげっ歯類抗体フラグメントまたはそのフラグメントがネズミ抗体の抗Ｎ９０１である［１０］または［１１］に記載の方法。
［１８］表面に露出するアミノ酸残基のフレームワーク位置の前記セットが第１表に示されるセットならびに図３Ａおよび図３Ｂに示される整列によって確定される［１７］に記載の方法。

発明の要約
従って、本発明の目的は、Ｖ領域上のヒトの表面部分を提示することにより、患者の治療に向上された効果を有する、ヒト化されたげっ歯類抗体またはそのフラグメント、および特にヒト化されたげっ歯類モノクローナル抗体を提供することである。この、および他の目的は、表面再処理することによって、げっ歯類抗体またはそのフラグメントのヒト化の仕方を決定する方法を提供することにより達成され、その方法は、以下を包含する：（ａ）げっ歯類抗体の可変領域の３次元モデルを構築することにより、げっ歯類抗体またはそのフラグメントの可変領域のコンホメーション構造を決定し；
（ｂ）十分な数のげっ歯類抗体可変領域の重鎖および軽鎖についてｘ線結晶学的構造から得られる相対的な接近可能性分布から、配列を整列させて、十分な数のげっ歯類抗体の重鎖および軽鎖と９８％同一な１セットの重鎖および軽鎖のフレームワークの位置を与え；
（ｃ）工程（ｂ）で生み出されたフレームワーク位置のセットを用いて、ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントのために、１セットの重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基を確定し；
（ｄ）工程（ｃ）で確定された表面に露出するアミノ酸残基のセットに最も密接に同一性を有する１セットの重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基を、ヒト抗体のアミノ酸配列から同定し、ここでヒト抗体からの重鎖および軽鎖は天然にペアになるか、または当然にはならないものであり；
（ｅ）ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列において、工程（ｃ）で確定された重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基のセットを、工程（ｄ）で同定された重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基のセットと置換し；
（ｆ）工程（ｅ）で明記される置換から得られるげっ歯類抗体またはそのフラグメントの可変領域の３次元モデルを構築し；
（ｇ）工程（ａ）および（ｆ）で構築された３次元モデルを比較することにより、工程（ｄ）で同定されたセットから、ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントの相補性決定領域のあらゆる残基のいかなる原子からも５オングストローム以内にある、あらゆるアミノ酸残基を同定し；および（ｈ）工程（ｇ）で同定されたあらゆる残基を、ヒトからオリジナルのげっ歯類のアミノ酸残基に変化させ、これにより、表面に露出するアミノ酸残基のげっ歯類抗体ヒト化セットを確定する。但し、工程（ａ）は最初に実施される必要はないが、工程（ｇ）の前に実施されねばならない。

さらに、げっ歯類抗体またはそのフラグメントから、ヒト化されたげっ歯類抗体またはそのフラグメントを産生する方法が提供される。該方法は、以下を包含する：（Ｉ）表面再処理による、げっ歯類抗体またはそのフラグメントのヒト化の仕方を決定するための前述の方法を遂行し；および（II）げっ歯類抗体の表面に露出するアミノ酸残基のセットを、上記方法の工程（ｈ）で確定された、げっ歯類抗体の表面に露出するアミノ酸残基のヒト化されたセットで置換することにより、げっ歯類抗体またはそのフラグメントを改変する。

好ましい実施態様では、げっ歯類抗体またはそのフラグメントは、ネズミの抗体であり、最も好ましくは、ネズミ抗体Ｎ９０１である。
発明の構成
ネズミおよびヒトの抗体の特異的で異なる表面パッチの存在は、ヒト中でのネズミ抗体の遺伝的免疫原性の源であり得る。固有のヒトおよびネズミ抗体のＦ_Vフラグメントのデータベースについて統計的な分析を行って、露出した表面部分の特定の残基の組み合わせが、ヒトおよびネズミの配列に特異的であることが示された。この組み合わせは、ヒトとネズミのＦ_V ドメインにおいて同じではない。しかしながら、この２つの種の抗体の表面残基のファミリーを確定するのは可能である。これらのファミリーは、ネズミ抗体を「ヒト化」または再整形する新規な方法を明らかにする。ヒト化とは、非ヒト抗体またはそのフラグメントの溶媒が接近可能な表面を、選択されたヒト抗体またはそのフラグメントの表面に似せる改変を行うことであり、その結果、改変された非ヒト抗体またはそのフラグメントは、ヒトに投与されたとき、より低い免疫原性を示す。そのようなプロセスを、本願では抗体の可変領域に適用するが、あらゆる他の抗体フラグメントに等しく適用できる。この方法は、げっ歯類抗体のヒト化に一般に適用されると考えられる。

本発明によると、ある範囲の抗体結晶構造について計算された接近可能性に基づく統計的分析が提供される。この情報を抗体配列のデータベースに適用すると、ヒトとネズミの抗体を、純粋にそれらの表面残基のプロフィールに基づき、配列レベルで区別することができる。

（合理的な表面再処理のアプローチ）本願の表面再処理のアプローチに関する、幾つかの重要な特徴がある。
１）この方法は、出発点として、既知の方法によるげっ歯類可変領域の３次元モデル構造物を使用する。
２）多数の（例えば、１２個の）抗体のＦ_V またはＦａｂフラグメントのｘ線結晶学的構造が、多数の（９８％）抗体について位置的に同一である１セットの明瞭な表面に露出するアミノ酸残基を生成するために、分析される。このセットは、その溶媒接近可能性が上記の所与の遮断（ｃｕｔ−ｏｆｆ）（典型的には、３０％）である全てのそれらの残基を同定することによって生み出され、ＫａｂｓｃｈおよびＳａｎｄｅｒ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．およびＳａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９８３）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２， ｐｐ．２２５７−２６３７）の方法を修正したものを使用して計算され、その計算では、明確な原子半径を各原子タイプに使用して、以下でより詳細に記載されるような側鎖の位置を予測する；
３）完全なヒト抗体のデータベースを使用して、ヒト重鎖および軽鎖の表面に露出するアミノ酸残基の最良のセットを、ネズミ抗体の表面に露出するアミノ酸残基のセットに対するそれらの最も緊密な同一性に基づいて、選択する；
４）げっ歯類抗体のＣＤＲｓのコンホメーション構造を保持するために、表面残基が３次元モデルから計算して、ＣＤＲ残基より５オングストローム以内であるときはいつでも、あらゆるヒトの表面に露出するアミノ酸を、オリジナルのげっ歯類の表面に露出するアミノ酸残基で置換する。

本願の一般的な表面再処理のアプローチは、 図２に図解されている。このアプローチは、２つのステージに分けられる。第１ステージでは、げっ歯類のフレームワーク（白）が保持され、表面残基のみが、げっ歯類（濃灰色の円）から、最も近いヒトのパターン（淡灰色の円）に変えられる。これにより、げっ歯類抗体の抗原性が除かれるはずである。第２ステージでは、ＣＤＲｓから５オングストローム以内の表面残基は、抗原結合およびＣＤＲのコンホメーションを保持する試みで、げっ歯類の同等物と置換される。

本願の方法は、抗体および抗体フラグメントの全体に適用される。使用され得る適切な抗体フラグメントは、当業者に容易に決定され得る。幾つかの適切なフラグメントの例には、単一鎖抗体（ＳＣＡ）、抗体のＦ_V フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ₂ フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはそれらの結合部位を含有する抗体の他の部分が含まれる。

本願に従うと、表面再処理によるげっ歯類抗体またはそのフラグメントの改変の仕方を決定する方法の中の重要な工程は、げっ歯類抗体の可変領域の３次元モデルの構築によって、ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントの可変領域のコンホメーション構造を決定することである。これは既知の方法でなされることができ、それは例えば、Ｍａｒｔｉｎら（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．、Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｊ．Ｃ．およびＲｅｅｓ，Ａ．Ｒ．（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６，ｐｐ．９２６８−９２７２；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９１），２０３，ｐｐ．１２１−１５２）および実施例２に詳細に記載されている。

Ｍａｒｔｉｎらは、図１に描かれているアルゴリズムについて記載している。このアルゴリズムは、ネズミおよびヒトの抗体に等しく適用される。従って、本発明者は、異なる種間の抗体配列の類似性（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．、Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、国立衛生研究所、米国 １９９１）に基づいて、このアルゴリズムがラットおよび他のげっ歯類の抗体に等しく使用されると予測している。

簡潔に言うと、 図１に描かれているアルゴリズムは、以下のように要約される。モデル化される抗体のフレームワーク領域は、配列の相同性に基づいて選択され、可変領域のβバレルの６個の保存ストランド上への最小自乗法適合によって構築される。軽鎖および重鎖の相補性決定領域は、規定配列（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（１９８７）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ． １９６，ｐｐ．９０１−９１７）、データベースのサーチおよびコンホメーションのサーチを組み合わせ用いて、構築される。これらの方法の詳細な説明は、本願の実施例２および上述の２つの参考文献（Ｍａｒｔｉｎら、１９８９年および１９９１年）に記載されている。

本願により、別の３次元モデルもまた、構築される。他の３次元モデルは、特定のげっ歯類抗体表面残基の位置に置換されたヒト抗体の表面アミノ酸残基を有する、げっ歯類抗体の可変領域の中にある。

この、他の３次元モデルは、次に記載する一連の工程を遂行することによって、構築される。

これらの工程の最初では、十分な数のげっ歯類抗体の可変領域の重鎖および軽鎖のｘ線結晶学的構造から得た相対的接近可能性分布より、配列を整列させて、大多数の（９８％）可変領域において同一な、表面に露出するアミノ酸残基の１セットのフレームワークの位置を得る。

本願で使用されるとき、用語「フレームワーク」は、相補性決定領域が排除された、抗体の可変領域を意味する。

「相補性決定領域」は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（Ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、国立衛生研究所、米国、１９９１）により定義された、以下の番号付けシステムに対応するアミノ酸配列を意味する。

軽鎖 Ｌ１ 残基２４−３４位
軽鎖 Ｌ２ 残基５０−５６位
軽鎖 Ｌ３ 残基８９−９７位
重鎖 Ｈ１ 残基３１−３５８位
重鎖 Ｈ２ 残基５０−５８位
重鎖 Ｈ３ 残基９５−１０２位
表面に露出するアミノ酸残基のフレームワーク位置のセットを生成するために分析される必要のある、十分な数のげっ歯類抗体フラグメントは、抗体配列のデータベースを用いて、ルーチンの実験を行なうことにより、当業者に容易に決定され得る。

ｘ線結晶学的構造は、表面に露出するアミノ酸残基の相対的接近可能性分布を測定するために、使用される。この相対的接近可能性分布により、その溶媒接近可能性が上述の所与の遮断（典型的には、３０％）であり、明確な原子半径を各原子のタイプに使用するＫａｂｓｃｈおよびＳａｎｄｅｒの方法（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．およびＳａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９８３）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２，ｐｐ．２２５７−２６３７）の改変されたものを使用して計算される、全てのそれら残基が同定される。

ｘ線結晶学的構造から測定される相対的接近可能性分布は、次に配列を整列させるために使用されることができ、該配列は、大部分の（９８％）可変領域において同一な、表面に露出するアミノ酸残基の１セットのフレームワーク位置を与える。

ネズミ抗体の可変領域に関する表面に露出するアミノ酸残基のフレームワーク位置のセットは、表１に示され、実施例１で説明されており、これは 図３Ａおよび図３Ｂに示される配列の整列および接近可能性分布を使用して生成された。

一旦、げっ歯類抗体の可変領域に対する表面に露出するアミノ酸残基の１セットのフレームワーク位置が生み出されると、ヒト化されるげっ歯類抗体の重鎖と軽鎖のペアの表面に露出する残基は、実施例１に記載され 図３Ａおよび 図３Ｂに示されるような整列の手順を使用して、同定される。これにより、ヒト化されるげっ歯類抗体または抗体フラグメントの重鎖と軽鎖のペアの、１セットの表面に露出するアミノ酸残基が確定される。

次に、完全なヒト抗体の配列のデータベースを使用して、ヒト化されるげっ歯類抗体の可変領域の表面に露出するアミノ酸残基のセットに最も緊密な位置的同一性を有するヒト抗体可変領域から、１セットの表面に露出するアミノ酸残基を同定する。ヒト抗体からの表面に露出するアミノ酸残基のセットは、天然にはペアにならない重鎖と軽鎖に対して別々に同定され得、および／または、１セットは天然のヒトの重鎖と軽鎖のペア、すなわち１個のＢ細胞またはハイブリドーマのクローンを起源とするペアから同定することができる。好ましくは、このセットは、天然のヒト重鎖と軽鎖のペアから得た１つである。

ヒト抗体の外観を具現するヒト化されたげっ歯類抗体は、次に、ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントから得た表面に露出するアミノ酸残基のセットを、ヒト抗体から得た表面に露出するアミノ酸残基のセットで置換することによって、予測される。

次に３次元モデルは、得られた、可変領域が十分に置換されているげっ歯類抗体またはそのフラグメントから構築され得る。３次元モデルは、オリジナルのげっ歯類抗体またはそのフラグメントの３次元モデルを構築するための、上述と同じ方法を使用して構築される。

この十分に「表面再処理された」すなわちヒト化された抗体の抗原性は除去されるはずであるが、処理されるべき更なる因子は、表面再処理された抗体の結合親和性または結合強度である。表面再処理によって導入される可変ドメインのフレームワーク中の変化は、ＣＤＲループのコンホメーション、従って抗体の抗原結合性に影響を与えることができる。本発明に従うと、この問題は、次の工程によって取り除かれることができ、該工程は、げっ歯類抗体可変領域の上述の両方の３次元モデルを比較することにより同定することができ、げっ歯類抗体または抗体フラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のあらゆる残基のいかなる原子からも５オングストローム以内にあると同定された、ヒト抗体可変領域の重鎖と軽鎖のペアの表面に露出するアミノ酸残基のセットから得られる、あらゆる残基を同定する。

次に、そのようにして同定されたあらゆる残基を、ヒトから、オリジナルのげっ歯類アミノ酸残基に変化させて戻す。

この方法による結果は、続いて、周知の方法により、特定のげっ歯類抗体に適用されることができる。簡潔に言うと、ヒト化される可変の重鎖と軽鎖の領域に関する遺伝子が、標準的な組換えＤＮＡ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｆ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版）を使用して、構築される。例えば、ＰＣＲ法が、使用され得る（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら （１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，ｐｐ．２４７１−２４７６）。

可変重鎖または可変軽鎖の遺伝子の構築物を、適切な発現ベクター中にサブクローン化する。適切な発現ベクターは、ヒトγまたはヒトκのいずれか一方の不変領域の遺伝子、適切なプロモーター、ヒトイムノグロブリンのリーダーペプチド（例えば、ｍｅｔ−ｇｌｙ−ｔｒｐ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｉｌｅ−ｉｌｅ−ｌｅｕ−ｐｈｅ−ｌｅｕ−ｖａｌ−ａｌａ−ｔｈｒ−ａｌａ−ｔｈｒ（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３９）、Ｏｌａｎｄｉら（１９８９）、ＰＮＡＳ ８６，ｐｐ．３８３３−３８３７）をコードする配列、および薬剤選択マーカーを有する。

重鎖および軽鎖の発現プラスミドは、例えばＳＰ２／０細胞のような適切な細胞中に、エレクトロポレーションによって同時トランスフェクトし、例えばＧ４１８のような適切な薬剤を用いて選択され得る。処理していない抗体のスクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイによって遂行される。９６ウェルのプレートを、例えばヤギ抗ヒトκ鎖抗体でコートし、軽鎖を、例えばアルカリホスファターゼと複合体化したヤギ抗ヒト抗体で検出する。

他のアプローチとして、軽鎖の構築物を、例えばＳＰ２／０細胞のような適切な細胞中に、エレクトロポレーションによってトランスフェクトし、例えばハイグロマイシン中で選択する。軽鎖発現のスクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイにより遂行され得る。９６ウェルのプレートを、例えばヤギ抗ヒトκ鎖抗体でコートし、軽鎖を、例えばアルカリホスファターゼと複合体化したヤギ抗ヒト抗体で検出する。

次に、軽鎖を生成する系を宿主として用いて、重鎖構築物中にエレクトロポレーションする。重鎖のプラスミドを、例えばネオマイシン耐性のような他の薬剤マーカーをコードしている遺伝子を含有するプラスミドとともに同時トランスフェクトし、薬剤Ｇ４１８の存在下に選択する。処理していない抗体のスクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイによって遂行される。９６ウェルのプレートを、例えばヤギ抗ヒトＦｃでコートし、例えばアルカリホスファターゼと複合体化したヤギ抗ヒト軽鎖で検出する。

ヒトに適合したげっ歯類抗体を製造するために表面再処理によりげっ歯類抗体またはそのフラグメントを修飾（modify）する方法を決定するための現在クレームされた方法の有利性は、以下の実施例および比較例を通じて記載され、該実施例および比較例は、単なる例示であり、本発明を制限することを意味しない。

Ａ） マウス抗体の分析マウス抗体（murine antibody ）のＦ_V ドメインの表面に通常接近できる位置を決定するために、接近可能性（accessability）をブルックヘブン・データベース（brookhaven database）から得た１２個のＦａｂのｘ線結晶学的構造について計算された（バーンシュタイン，エフ．，ケーツル，ティー．，ウイリアムス，ジー．，メイヤー，イー．，ブリス，エム．，ロドガース，ジェイ．，ケナード，オー．，シマノウチ，ティー．およびタスミ，エム．（１９７７），J. Mol.Biol.,１１２， ｐｐ．５３５−５４２） 。相対的な接近可能性は、プログラムＭＣを用いて計算され（ペダーソン，ジェイ．（１９９１））、該プログラムＭＣは、明白な原子半径がすべての原子について特定されるＤＳＳＰ（カブシュ，ダブリュー．およびサンダー，シー．（１９８３），Biopolymers, 22, pp.2257-2637 ）接近可能性計算ルーチン（accessability calculation routine ）の修飾されたバージョンを実行するものである。残りは、相対的な接近可能性が３０％より大きいときの表面に接近可能であるとして定義（defined）された。これらの残基の整列位置（alignment position） はすべての１２の構造物で保存されていた（９８％の同一性）。表面の接近可能なフレームワーク位置は、Ｆ_V 表面領域の４０％を構成する。残りの表面の接近可能な残基は、ＣＤＲｓおよび中間領域のＣ−末端ドメイン中にある。図３Ａおよび 図３Ｂは、１２の結晶構造の整列された配列、平均の相対的な接近可能性、及び３０％の接近可能性の遮断（cutoff）を示す。図３Ａは、１２のマウス抗体軽鎖の相対的な接近可能性の配列を示し、図３Ｂは、マウス抗体重鎖の整列及び相対的接近可能性を示す。

表面の接近可能なフレームワーク位置は、固有のヒトおよびマウスＦ_v 配列のデータベース上に地図化された（本実施例の最後のリスト参照）。これらの位置の各々における特別な残基の頻度は、第１表に示される。残基頻度が５％以上のもののみリストされている。

ヒト配列における表面残基のすべての組み合わせはマウスでは見られず、逆も同様であった（実施例の最後のリスト参照）。しかしながら、個々の位置における残基は保存されているように見える（第１表参照）。種の間で相当に異なる残基はほとんど存在しない；これらはＬ鎖の５４位および９１位、ならびにＨ鎖の１６８位および２１６位である。これらの位置のうち、２１６位だけが非保存（ＶからＹ）突然変異である。ヒトおよびマウスの抗原性の相違は、それゆえこれらの位置の残基の組み合わせにより生じると考えられる。

マウスの配列が、他のマウスのＦ_v 配列よりもヒトのＦ_v 配列に対してより遠く関連するかどうかを決定するために、相同性をデイホフ突然変異マトリクス（Dayhoff, M., Barker, W.,及び Hunt, L. (1983), Meth. Enz. 91, pp. 524-545）を用いて計算した。相同性は、表面の接近可能な配列からなるヒト及びマウスの配列パッチ（patch）のプール中のすべての配列の間で計算された。データは、次いで配列がお互いに対してプロットされる密度地図（示さない）として表した。密度地図は、「ヒト表面」から「マウス表面」を区別するために使用できる。

Ｂ） 抗体Ｎ９０１の再形態形成（reshaping）上記分析により示唆された表面再処理のアプローチを試験するために、３つのヒト化実験を行った。１）公知の構造のヒトＦ_v フレームワーク（ＫＯＬ）への伝統的なループ移植（loop grafting）（Verhoeyen, M.E., Saunders, J.A., Broderick, E.L., Eida, S.J., 及び Badley, R.A. (1991), Disease Markers 9, pp.3-4 ）；２）最も類似した鎖を用いた表面再処理アプローチ；３）最も類似した表面残基を有するヒト配列を用いた表面再処理アプローチ。

使用される抗体は、マウスの抗−Ｎ９０１抗体（グリフィンら、（１９８３）J. Imm. 130, pp.2947-2951）であった。この抗−Ｎ９０１抗体（以下、「Ｎ９０１抗体」と略す）は、ＮＫＨ−１の名前でクルター・コーポレーション（Coulter Corporation ）から入手できる。

図４Ａ及び図４Ｂの軽鎖配列および重鎖配列の整列（alignment ）は、各々オリジナルのＮ９０１抗体およびここで略述された３つのアプローチの各々において使用された配列を示す。

図４Ａ及び図４Ｂは、ヒト化の３つの方法を用いて得られた配列の整列を示す。配列は；１）オリジナルのげっ歯類Ｎ９０１；２＋３）ＫＯＬ（マーカート、エム．ダイセンホーファー，ジェイ．及びヒューバー，アール．（１９８０）， J.Mol. Biol., 141, pp.369-391）およびＫＯＬ表面を用いて再整形されたＮ９０１；４＋５）最も相同性の高い配列、Ｌ（ＫＶ２Ｆ）（クロベック，エッチ．，マインドル，エイ、およびザチュー，エッチ．（１９８５）, Nucleic Acids Res., pp.6499-6513）およびＨ（Ｇ３６００５）（シュレーダー、 エッチ．，およびワング、ジェイ．（１９９０）, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 87）およびこれらの配列を用いて再整形されたＮ９０１；６＋７）表面残基に関し最も相同性の高いＬ（ＫＶ４Ｂ）（クロベック、エッチ．、ブロンカンプ、ジー．、コンブリアート、ジー．、モシカット、アール．、ポエルンツ、エッチ．およびザチュー、エッチ．（１９８５）, Nucleic Acid Res., 3, pp.6515-6529）およびＨ（ＰＬ０１２３）（バード、ジェイ．、ガリリ、エヌ．、リンク、エム．、サイツ、ディー．およびスクラー、ジェイ．（１９８８）, J. Exp. Med., 168, pp. 229-245）およびこれらの配列を用いて再整形されたＮ９０１。番号付けは、抗体モデリング・プログラムＡＢＭ（ＡＢＭは市販のソフトウエア、Oxford Molecular Ltd., Oxford, U.K. の商標）であり、それは構造の保存に基づき、パドランらにより使用された配列の相同性に基づくものではない（カバット、イー．エイ．，ウー、ティー．ティー．、ライド−ミラー、エム．、ペリー、エッチ．エム．およびゴッツマン、ケイ．エス．（１９８７）免疫学的に興味（interest） のあるタンパク質の配列、ユー．エス．デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズ、第４版）。与えられた配列を用いてＮ９０１を再整形するために導入されなければならない配列の変化は、棒でマークされ、Ｆ_v モデルで決定された復帰突然変異（back-mutation）は、星印でマークされる。与えられた配列のＮ９０１に対する配列の相同性は、各配列の後でブラケット中に示される。

（１） 古典的なヒト化古典的なヒト化（humanization）において、理論的解釈は、公知の構造のフレームワーク上にげっ歯類ＣＤＲ’ｓを移植することであり、そうすればＣＤＲ−フレームワーク相互作用が相同性モデリングにより正確にモニターできる。ヒト化された抗体のモデルは、オリジナルのげっ歯類抗体のモデルと比較され、可能なＣＤＲ相互作用性フレームワーク残基が、ＣＤＲ’ｓの３次元形態を保持するために復帰突然変異される（整列中"＊"で示される）。本実施例において、抗体ＫＯＬが使用され、重鎖および軽鎖と各々７７および４６の低い相同性スコアを与える。

（２）最も類似した鎖の表面再処理非重複ヒト抗体配列のデータベースが、利用できるタンパク質およびヌクレオチド配列から集められた。全部で１６４個のＨ鎖と１２９個のＬ鎖が標本化された。

げっ歯類のＨ鎖およびＬ鎖は、次いで合わせられ、最も類似したヒト配列が独立に見出された（Ｇ３６００５／ＫＶ２Ｆ）（シュレーダー、エッチ．およびワング、ジェイ．（１９９０）, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87 ；クロベック、エッチ．、マインドル、エイ．、コンブリアト、ジー．、ソロン、エイ．およびザチュウ、エッチ．（１９８５）, Nucleic Acid Res., pp.6499-6513）。第１表に概説された表面残基は、次いでヒト配列の残基と合わせるためにげっ歯類の配列中で変えられた。その後、モデルが表面再処理した抗体で製造され、オリジナルのげっ歯類の抗体のモデルと比較され、すべてのＣＤＲ相互作用性残基の復帰突然変異が行われた。

（３）本発明による最も類似する表面置換この方法は、類似性が上記第１表に概説された表面残基に関してのみ計算されたことを除いては、上記の方法と同一である。

表面突然変異および次の復帰突然変異についての上記と同一の方法が行われた。この場合において、選択された配列はＰＬＯ１２３／ＫＶ４Ｂであった（バード、ジェイ．、ガリニ、エヌ．、リンク、エム．、サイツ、ディーおよびスクラー、ジェイ．（１９８８）, J. Exp. Med., 168, pp.229-245 ；クロベック、エッチ．、ブロンカンプ、ジー．、コンブリアト、ジー．、モシカト、アール．、ポエルンツ、エッチ．およびザチュウ、エッチ．（１９８５）, Nucleic Acid Res., 3, pp.6515-6529）。

以下のリストは、ヒトおよびマウスの軽鎖および重鎖抗体の可変領域における表面残基パターンを示す。該配列は、互いの類似性について並べられている。種内における適合（match）はあるが、マウスとヒトの間のパターン適合は存在しない。
マウス軽鎖表面パッチ

ヒト軽鎖表面パッチ

マウス重鎖表面パッチ

ヒト重鎖表面パッチ

抗体可変領域の三次元モデルを構築するための方法の詳細な説明本明細書の引用文献は、この実施例の最後にリストされる。

抗体Ｆａｂは、１９７２年に初めて構造決定された。それ以来、約１２個以下のＦａｂ構造が刊行されたが、その数は全抗体レパートリー（＞１０⁸ 抗体）の非常に少ない部分を示している。この抗体の多様性の分子的基礎を理解するために、多数のｘ線構造または結合部位のトポグラフィーが支配されている規則の知識が要求されるであろう。そのような予測される規則の開発が、今や抗体の可変領域がメディウム・レゾリューションｘ線構造（medium resolution x-ray structure）の構造に正確にアプローチするためにモデル化できる地点まで到達している。

同起源の抗原と抗体の相互作用は、分子認識の最も広く受け入れられたパラダイムの１つである。原子として詳細に抗原−抗体相互作用を理解するために、抗体およびその抗原との複合体の３次元構造の知識が要求される。伝統的に、その様な情報はｘ線結晶学上の研究から得られてきた（デイビーズらの総説参照（デイビーズら、１９８８））。

抗体結合部位のモデリングは、ほんの僅かの抗体しか知られていなかった時点で、最初にパドランおよびデイビーズ（パドランら、１９７６）により試みられた。にも拘らず、パドランと同僚は、鍵が異なる抗体可変ドメインのβ−シートフレームワーク領域に存在する高度の構造上の相同性にあることを認識した。抗原結合部位は、６つのインターストランド・ループ，またはＣＤＲｓ（相補性決定領域）（カバットら、１９８７）の並置により、このフレームワーク上で形成される。もし、フレームワークが相同性によりモデル化できるとき、同様にＣＤＲｓをモデル化できるであろう。パドランおよびデイビーズ（パドランら、１９７６）は、抗体構造の数がこの最大オーバーラップ手順（maximum overlap procedure）（ＭＯＰ）を完全に試験するために不十分であるけれども、ＣＤＲの長さがバックボーン・コンフォーメーションの重要な決定基であることの理由付けをした。この概念は、ペダーソンおよびリースが、抗体構造のより発展した分析に基づいて抗体結合部位をモデル化する類似のアプローチを提案する１９８０年代初期まで再度採りあげられることはなかった（ド ラ パ ら、１９８６）。

それらの必須の知識に基づいた手順は、チョシアおよびレスク（チョシアら、１９８６）の仕事により抗体で最も良く例示され、彼等は１９８６年に"鍵"残基の概念を導入することによりＭＯＰ手順を発展し、修飾した。これらの残基は、パッキング、水素結合またはトーション角度φ、ψおよびωの異常値を受け入れる能力を介して、正確なＣＤＲコンフォーメーション（チョシアら、１９８９）を決定する特別な位置で残基を有する点において異なる"規定（canonical）"構造への同じ長さのＣＤＲｓのさらなる再分（subdivision ）を許容する。類似の知識の基づいた方法が、一般的にループ・コンフォメーションを予測するために提案された（ソーントンら、１９８８；トラモンタノら、１９８９）。これらの方法は、蛋白質構造の結晶学的なデータベースに依存している。しかしながら、上記の知識に基づいた方法はいずれも全体として成功しなかった。特に、ＭＯＰまたは規定構造のアプローチは、６つのＣＤＲｓの５つにおいてのみモデリングに成功した。これは、重鎖の第３のＣＤＲ、Ｈ３は配列、長さおよび構造において他のいかなるＣＤＲｓより可変である。

この問題に対処するために、幾つかのグループが最初から結合部位をモデル化するための方法を使用することを試みた（ブルコレリおよびカープラス、１９８７）。その様な方法では、特別なＣＤＲに接近できるすべての許容できるコンフォーメーション空間を標本化することが要求される。純粋に幾何学的なアプローチの代表例は、ゴおよびシェラガ（ゴおよびシェラガ、１９７０）のものであり、より最近では、パルマーおよびシェラガ（パルマーおよびシェラガ、１９９１）のものであり、そこでは問題は、特徴的な結合長さおよび結合角度を有するポリペプチド・バックボーンの中心領域が、ループ（もし抗体ループであればＣＤＲ）の末端（end point ）の間で"鎖終止（chain closure ）"アルゴリズムにより構築されることの１つに減少される。このアルゴリズムの修飾において、ブルコレリおよびカープラス（ブルコレリおよびカープラス、１９８７）は、鎖終止手順の間に探索されたコンフォーメーション空間のドメインを非常に拡張するエネルギー最小化手順を導入した。この修飾は、コンフォーメーション探索プログラムＣＯＮＧＥＮ（ブルコレリおよびカープラス、１９８７）に組み込まれ、該プログラムはユーザーがＣＨＡＲＭＭ（ブルックスら、１９８３）標準幾何学パラメータ・セットのような標準の結合長さおよび結合角度のあらゆるセット選択することができる。最小化（モウルトおよびジェイムス、１９８６）、または分子動力学（ファインら、１９８６）のような他のアプローチは、コンフォーメーション空間を飽和できないか、または長いＣＤＲｓの問題を扱うことのできないものであった。初期のいずれの方法を行ったとしても、問題は、すべてのＣＤＲのために候補者全体の範囲内で正確な構造（この文脈で、"正確な"とは適切なｘ線構造を参照して定義される）の明確な同定を許容するような方法で、選択基準を定義することの１つである。今日まで、これは可能ではなかった。

最近、より全体論的なアプローチが、知識に基づいたものと初期の方法の利点をＣＡＭＡＬ（モデリング抗体ループのための結合したアプローチ（Combined Algorithm for Modelling Antibody Loops ））として知られる単一のアルゴリズムで結合したＣＤＲｓのモデリングに採用された（マーチンら、１９８９；マーチンら、１９９１）。以前に、このアルゴリズムは、他の５つの結晶構造コンフォーメーションの存在下に個々のＣＤＲｓをモデル化するために使用された。以下に示されるように、ＣＡＭＡＬはメディウム・レゾリューションｘ線構造のモデル化の正確なアプローチ化に、抗体結合部位の６つすべてのＣＤＲｓのバックボーン・コンフォーメーションを予測することができる。さらに、該アルゴリズムは、ＣＤＲコンフォーメーションの発生前に軽鎖および重鎖フレームワーク領域を選択し、共にフィットさせる手順を包含し、それにより全可変領域の予測が可能になる。さらに、新しいモンテカルロ（ＭＣ）刺激アニーリング法が、側鎖コンフォーメーションの決定のために開発された。

フレームワーク領域抗体のフレームワーク領域は、免疫グロブリンのＶ型領域に特徴的なβ−バレル構造を形成する保存されたβ−ラセン構造（β−ｓｔｒａｎｄ）からなる。ここで記載される手順において、各Ｖ−領域は、公知の抗体構造のデータベースから軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）のＶ−ドメインの選択のための配列相同性を用いて構築される。この２つのドメインは、次いで抗体β−バレルの最も保存されたラセン構造に適合する最小二乗法により対形成される（第２表および図５および図６）。ラセン構造の方向は、公知の抗体の結晶構造のバレルを分析することにより決定される。８個の抗体が、以下の複数構造適合プログラム（multiple structure fitting program） を用いて分析された。７個の構造は、ランダムに選択されたセットの１つの上にフィットされ、平均の座標（coordinates ）が計算された。全ての８個の構造は、次いでこれら平均座標上にフィットされ、新しい平均座標が決定された。この手順は、平均座標セット（mean coordinates set） が保存されるまで繰り返された（５〜１０サイクル）。各バレル・ポイント（Ｎ，Ｃα，Ｃ）における平均座標の分散が計算された。図５に、バレルの共役軸（conjugate axis） 上のこれらポイントの投影された位置にこの分散がプロットされる。

ストランド８並びに軽鎖および重鎖におけるストランド７の２つの残基以外の全ては、それらが平均座標から３σ（標準偏差ユニット）よりも大きな偏差を示すとき除去された。これら２つのストランドは、ＣＤＲ Ｈ３の開始点（takeoff point）を含み、ＣＤＲ Ｈ３のあらゆる知識に基づいた予測が、ＣＤＲ自身の配列および長さの変動だけでなく、参加するストランドの位置も考慮にいれなければならないことを示唆している。残りの平均座標は、ＬおよびＨ鎖がフィットされる足場として使用される。最終フレームワーク中のストランド７および８は、該構築で使用されたデータベース構造から得られた。フレームワーク・ストランドは、第２表の複数整列中に、＋でマークされている。

側鎖は、次いで"最大オーバーラップ"法を用いて置換され、該方法では、側鎖の鋳型が、親側鎖の等価なねじれと適合するよう調整された側鎖ねじれ角を用いてバックボーン原子上にあてはめられた。

結合部位結合部位の構造を予測する手順は、データベース検索とコンフォーメーション検索手順を組み合わせることである。この課題を解決するのに適当なプログラムの構成は、図７に略述される。

データベース検索は、公知の抗体構造から決定された６つのＣＤＲループの各々に拘束される距離を利用する。これらの拘束（constraints ）は、

（平均±３．５標準偏差ユニット）の検索範囲を用いて、公知のループ中のＣα−Ｃα距離を計算することにより決定される。ブルックヘブン・プロテイン・データバンク（Brookhaven Protein Databank）（バーンシュタインら、１９７７）中の全ての蛋白質を含むデータベースは、次いで求める長さのループの拘束を満足するフラグメントを検索する。ループの中間部は、次いで削除され、コンフォーメーション探索プログラムＣＯＮＧＥＮ（ブルコレリおよびカープラス、１９８７）を用いて再構築される。６または７残基のループのために、構造データベースは、バックボーンに利用できるコンフォーメーション空間を十分に飽和させるように思われ、側鎖のみがコンフォーメーション探索により構築される。６残基よりも短いループは、コンフォーメーション探索だけにより構築され、それは、これがコンピュータで実行可能であり、データベースから選ばれたループの数が、ループ長さが減少するにつれて許容できない程度に大きくなるからである。

完全な結合部位をモデリングする際に、６またはそれ以上の残基のループは他のループがないときに個々にモデル化される。もしループが連続的に構築されると、小さな誤りが蓄積され、不十分な結果を導く（マーチン、１９９０）。全てのループ・コンフォーメーションは、次いで溶媒修飾ポテンシャル（solvent modified potential）を用いて評価され、それは、ＧＲＯＭＯＳ（アクビストら、１９８５）ポテンシャルの範囲内に含まれる吸引性ファン・デア・ワールス（attractive van der Waals） および非結合エネルギー関数の静電項（electrostatic terms）を除外する。最も低い５つのエネルギー・コンフォーメーションを選択し、オリジナルのデータベース・ループ中に観察されるバックボーンねじれ角に基づき"構造決定残基"アルゴリズム（ＦＩＬＴＥＲ）を用いて選別および濾過した。データベース検索は５残基またはそれ以下の最も短いループに使用しないので、ＦＩＬＴＥＲアルゴリズムは使用できない。したがって、エネルギーは、唯一の選択基準であり、短いループはより長いループの存在下に最後に構築される。

側鎖側鎖位置の決定は、ブルコレリらにより記載された繰り返し側鎖決定アルゴリズム（ブルコレリおよびカープラス、１９８７）を用いて以前になされた。不幸にも、ＣＨＡＲＭＭ（ブルックスら、１９８３）の力の場（force field）は、露出された疎水性側鎖の正確なコンフォーメーションを選択できなかった。溶媒の非存在下では、露出された非荷電原子を有することにペナルティーはない。ＣＯＮＧＥＮもまた、多数の側鎖（６残基を超える）のコンフォーメーション空間を満たすことができない。

最近リーら（リーおよびレビット、１９９１；リーおよびサビア、１９９１）は、ＭＣ模擬アニーリング（MC simulated annealing）を用いて、多数の側鎖のコンフォーメーション空間を検索する方法を提案した。単純なエネルギー関数が、偏ったランダム酔歩運動（biased random walk） により発生するコンフォーメーションの評価に使用される：

〔式中、最初の項は、与えられた分子中の原子間の非−結合性接触を評価する単純なレナード−ジョーンズ・ポテンシャル（Lennard-Jones potential ）であり、第２項は、Ｃ−Ｃ結合のみに適用される単純ねじれ項である。〕。ねじれ項は、６０°ロータマー（rotamer）に対する関数を偏らせる。ε₀ およびκ₀ は、定数である。メトロポリス関数：

は、エネルギー関数を評価するために使用される。エネルギーの減少につながる全ての動きは許容され、正のδＥの結果となるあらゆる動きは、確率（probability）Ｐのみ許容される。この単純な方法は、アミノ酸側鎖中の１セットのねじれ角（torsion angle ）により定義される大きなコンフォーメーション空間を調べ、１セットの側鎖が存在する全体最小値（global minimum） を発見または定義するために使用できる。Ｔは、シミュレーション温度である。

この方法を用いて側鎖コンフォーメーションを探索するとき、シミュレーション・システムは、全体最小値に到達する十分前に、高温において、十分に探索された溶液空間なしに、エネルギー極小値（minima） に捕捉される。この問題は、レナード−ジョーンズ・ポテンシャルを切り捨てることにより解決でき、従って、原子がお互いに通り抜けることが許容される。実際に、この関数は、原子間の距離ｒが０に近付くにつれて無限大に収束する。

得られる側鎖コンフォーメーションの評価は、内部（コア）残基のエネルギーのみに基づいてなされ、それは良好なファン・デア・ワールス相互作用が側鎖の適切なパッキングに等しいと考えられるからである。この立場は、表面残基のコンフォーメーションを予測しようとするとき、より複雑なものになる。最小のファン・デア・ワールス相互作用は、原子のオーバーラップを最小にする側鎖コンフォーメーションの組み合わせにより得られ、これは、最小のエネルギーは、側鎖の適切なパッキングを考慮することなしに、側鎖の広がったコンフォーメーションにより得られることを意味する。

疎水性で嵩高い残基は、親水性の側鎖で遮蔽され、表面内に埋められるという事実を用い、これらの巨視的な観察を評価する単純な関数を作ることができる。これらの関数はモンテカルロ・シミュレーションの目的評価関数において行われるか、またはここでなされるように、ポスト・プロセッシング工程（post processing step）として加えられる。評価関数中に接近可能性／疎水性項を含むことは、計算を相当にゆっくりしたものとし、従ってこの項はポスト・プロセッシング関数として加えられる。使用される関数は、残基の疎水性により増加される相対的な露出表面領域のプロダクトの合計である。使用される疎水性は、コルネットら（コルネットら、１９８７）から得られる

〔式中、ｎは再構築される側鎖の数である。〕。表面領域は、モザイク状の２０面体アプローチ（チャウおよびディーン、１９８７）を用いて計算され、それは非常に正確というわけではないが、非常に多数のコンフォーメーションを評価することができる。該関数は、最終的に２０００のコンフォーメーションを評価し、最良のものとして、最小値のコンフォーメーションを選択する。

この単純なアプローチを用い、多くの自由度を持った大きな相空間を統合し、空間の完全なサンプリングを行うことができる。

抗−ハプテン、抗−ペプチドおよび２つの抗−蛋白質抗体の予測される表面構造以下のセクションにおいて、４個の異なる抗体のＦ_V 領域の予測される構造が表現され、分析される。該抗体は：＊ Ｇｌｏｏｐ−２（ダースリーおよびリース、１９８５）、そのＦａｂ構造がジェフリーら（ジェフリーら、１９９１）により決定され、ＣＡＭＡＬの開発中に技能課題として使用された抗−ライソザイム抗体。

＊ Ｄ１．３（アミットら、１９８６）、モデルコーディネートがデポジット（deposited）された後に、その非複合Ｆ_V コーディネート（coordinates ）がアール． ポルジャックらにより供給された抗−ライソザイム抗体。

＊ ３６−７１（ロゼら、１９９０）、そのＦａｂ構造がディー．アール．ロゼらにより行われ、モデル・コーディネート（model coordinates ）がデポジットされた後に、そのコーディネートが得られた抗−フェニルアルソネート抗体。

＊ ３Ｄ６（グルノーら、１９８８）、そのＦａｂ構造（Fab structure）がディー．カーターら（カーター、１９９１）により行われ、モデル・コーディネートがデポジットされた後にそのコーディネートが得られた抗−蛋白質（ＨＩＶのＧＰ４１）抗体。この抗体のために、該モデルは、ＣＤＲｓ Ｌ１，Ｌ２，Ｈ１およびＨ２のためにチョシアおよびレスク（チョシアら、１９８９；チョシアら、１９８６）の規定ループ方法（canonical loop method ）を用いて製造され、規定構造物を用いてモデル化できないＬ３およびＨ３は、ＣＡＭＡＬを用いて構築された。

全ての４つのモデルは、最も急な勾配（steepest descents）の３００サイクルを伴うＤＩＳＣＯＶＥＲ（ＴＭ バイオシム・テクノロジー（TM Biosym Technology） ）ポテンシャルを用いて、制御されたおよび制御されないエネルギー最小化に供せられ、次いで、０．０１Ｋｃａｌの範囲内への収束が起こるまでコンジュゲート勾配最小化を行う。

ｘ線構造の分解能およびＲ−因子は、モデルを構築する際に選択した親のフレームワークとともに、第３表で与えられる。該構造およびモデルは、ループの全体の適合性により比較される。β−バレル・ストランド１〜６は、既述のように、最小二乗適合（least square fitted）され、ＲＭＳ偏差が、次いでループについて計算された。モデルおよび結晶構造フレームワークを適合させるためのバックボーン（Ｎ，Ｃα，Ｃ）ＲＭＳ値は、０．４と０．９オングストロームの間であり、コアβ−バレルの保存性を示している。全ての８個のストランドを用いると、ＲＭＳ偏差は０．６と１．２オングストロームの間に観察された。

全体的適合（第４表）は、ループについての局所的最小二乗適合よりも、モデルの正確かつより現実的な方法を与える。それは、それらがＦ_V 構造の文脈においてループの全体的な位置付けを考慮するからである。局所的適合は、より低いＲＭＳ偏差を与え、第４表にも示される。局所および全体のＲＭＳ偏差の間の相違は、Ｖ_H ／Ｖ_L ドメイン・パッキングの相違、およびループの"離陸（take off）"角度および位置の相違に起因する。

第５表は、モデリング３Ｄ６から選ばれた規定ループを示す。モデルＣＤＲｓのバックボーン構造は、全体適合の後にｘ線構造物上に重ね合わせられ、図８に示される。６個のＣＤＲｓの各々の興味の一般的な特徴およびポイントは、以下に議論される。

ＣＤＲ領域の分析Ｖ−領域モデルとｘ線Ｆａｂ構造についてのＣＤＲコンフォーメーションの比較の間に、ＣＤＲのある位置に、ペプチド・バックボーンは、"ペプチド・フリップ（peptide flip）"（１，４−シフト）を受けることにより、２つのコンフォーメーションのいずれかに適合され得ることが観察された。この現象は、タイプ２ β−ターン（ポールら、１９９０）においても見られる。β−ターンの動力学シミュレーションは、φ１＝−００，ψ１＝−３０，φ２＝−９０，ψ２＝０およびφ１＝−００，ψ１＝１２０，φ２＝９０，ψ２＝０の間のトランスフォーメーション・エネルギーは、最大値で５ｋｃａｌであることが示された（ポールら、１９９０）。これは、いずれかのコンフォーメーションを選択できるに十分低い。ペプチド・フリップは、いくつかの規定クラス（canonical class ）で観察され（チョシアら、（チョシアら、１９８９）により記載されているように）、規定クラスのコンフォーメーションを決定するために使用される水素結合様式は、ペプチド・フリップを許容しないわけではない。したがって、いかなるモデリング手順も、トランスフォーメーション・エネルギーが異なるコンフォーメーション型の集団を許容するのに十分に低い場合には、これら、または他の多数のコンフォーメーションを考慮に入れるべきである。第６表は、抗体構造物の結晶学的データベースからの"ペプチド・フリップ"現象の例を示す。結晶は、コンフォーメーションの１つに"凍結"されるため、単一の結晶構造は多数のコンフォーメーションを示さないことに注意すべきである。モデリング手順の間に、トーション・クラスター・アルゴリズム（tortional clustering algorithm）を用いることにより、２つのコンフォーマー（conformer）の集団が、１セットの最初から生成していたループから容易に抽出される。

ＣＤＲ−Ｌ１Ｇｌｏｏｐ−２およびＤ１．３において、すべての５つの低エネルギー・コンフォーメーションは、ＲＭＳ分散が０．２５オングストローム（バックボーン）および０．３５オングストローム（すべての原子）未満しか違わない非常に類似したものである。ＦＩＬＴＥＲアルゴリズムは、コンフォーメーション間を区別することができず、最も低いエネルギー構造を選択する。

３Ｄ６のＣＤＲ−Ｌ１は、本来ＨｙＨＥＬ−１０から規定ループを用いて構築され、中間部は、以下の理由によりコンフォーメーション検索により再構築される。ループの５番目と８番目の残基の間（残基２８−３１）に、互いに関連する１−４シフト（ペプチド・フリップ）を含むにもかかわらず（第６表参照）、ＨｙＨＥＬ−１０およびＲＥＩ ＣＤＲ−Ｌ１ループは、同一の規定アンサンブル（canonical ensemble）中に配置される（チョシアら、１９８９）。

３６〜７１は、モデルおよび結晶構造ＣＤＲｓの間に同一の１−４シフトを示す。結晶構造およびモデルの両者は、チョシアら（チョシアら、１９８９）により定義された同一の規定クラス（canonical class ）の他のループと比較される。コンフォーメーションを決定する水素結合パターンが保存されていることが見出された。

ＣＤＲ−Ｌ２Ｄ１．３のＣＤＲ−Ｌ２は、ｘ線構造においてＣＤＲ−Ｈ３の第４位のチロシンに対してパックされた（packed）２つの隣接したスレオニン（４９、５０）を有し、従って露出した疎水性側鎖が最小になる。非最小化モデルでは、スレオニン側鎖は溶媒にさらされるが、エネルギー最小化の後、このパッキングが観察される。

ＣＤＲ−Ｌ３Ｇｌｏｏｐ−２、Ｄ１．３および３６−７１において、ループの第７位のプロリンはシス・コンフォーメーションが正確に予測される。以前に示唆されたように、ＣＤＲ−Ｌ３のコンフォーメーションは、ループ中の位置８または９（チョシアら、１９８９）におけるプロリンの存在により定められる。３Ｄ６は、いずれの位置にもプロリンを有しない。２９０のＣＤＲ−Ｌ３配列（カバットら、１９８７）のうち７のみが両方の位置にプロリンを欠き、刊行されたｘ線構造の全てにおいて、このプロリンが存在する。これは、新しい規定クラスが定義される必要があるか、または規定ルール（canonical rule） がまったく崩れてしまう位置の例示であり、いずれかの方法は使用されるに違いない。

３Ｄ６ Ｌ３ループは、７残基の長さであり、データベース・ループのみを用いて構築され、そこでは、コンフォーメーション空間が結晶学的データベース（Ｇｌｏｂａｌ ＲＭＳ： ２．０１オングストローム、Ｎ，Ｃα，Ｃ）から選ばれたフラグメントにより飽和され、ＣＡＭＡＬ（構築：Ｑ〔Ｑ（ＹＮＳ）Ｙ〕Ｓ、Ｇｌｏｂａｌ ＲＭＳ： １．９７オングストローム、Ｎ，Ｃα，Ｃ）を用いることにより飽和される。２つの手順により得られた構造の類似性は、データベース検索の有用性を示しており、より短いループのためには，それが利用可能なコンフォーメーション空間を飽和させることができることを示唆している。

ＣＤＲ−Ｈ１ＣＤＲ−Ｈ１のカバットおよびウーの定義を用い、β−シートの延長としてこのループを配置する。ペプチドのこの範囲（stretch）の広げられた性質は、コンフォーメーションの柔軟性を制限し、ＣＤＲ−Ｈ１は一般に正確にモデル化される（マーチンら、１９８９；チョシアら、１９８９）Ｇｌｏｏｐ−２およびＤ１．３において、ループの第２位のＰｈｅおよびＴｙｒ側鎖は、ＨＦＲ１の終りから２番目のＬｅｕに対して不十分に配置され、およびパックされる（第２表参照）。３６〜７１は、より一般的な嵩高い疎水性側鎖よりもむしろ、この位置に適切に配置されたＡｓｎを有する。

ＣＤＲ−Ｈ２３６−７１のＣＤＲ−Ｈ２は、配列において、Ｆ１９．９（ストロングら、１９９１）、（３６〜７１： ＹＮＮＰＧＮＧＹＩＡ（配列番号：４９２）；Ｆ１９．９： ＹＩＮＰＧＫＧＹＬＳ（配列番号：４９３））に類似している。チョシアおよびレスクにより特定された構造決定された残基は保存される一方、バックボーン・コンフォーメーションは異なる：Ｆ１９．９は、−ＰＧＮ−Ｇｌｙにおいて膨らみ（bulge）を有し、３６〜７１と比較すると、ループの中間部にコブ（kink） を有する。３６〜７１のモデルは、側鎖が十分に配置されているにもかかわらず、１−４シフトを示す。

Ｇｌｏｏｐ−２において、Ｐ２₁ 結晶構造と比較するとき、全ての原子のＲＭＳ分散は、不十分（３．００オングストローム）（ジェフリーら、１９９１）であり、これは、χ₂ ねじれ角に関し、ループの第３位のＰｈｅと第１０位のＴｙｒが約１２０°回転しているためである。Ｇｌｏｏｐ−２は、２つの異なる結晶形Ｐ２₁ およびＰ１を持つことで解決された（ジェフリーら、１９９１；ジェフリーら、１９８９）。Ｐ１構造と比較すると、側鎖はほぼ完全に配置され、全ての原子ＲＭＳ（全体適合）は２．２３オングストロームになった。

結晶形間の側鎖の協調した動きは、表面の側鎖配置の結晶化条件の効果を示している。表面側鎖が結晶中で低い移動性を表す低温度因子を示すときでさえ、その溶液中での移動性は高い。Ｇｌｏｏｐ−２ Ｐ１構造において、Ｆ_v ドメインの平均側鎖温度因子は１３．４６（σ＝８．２０）であり、一方Ｈ２のこれら２つの残基の側鎖は、３位のＰｈｅについて５．５６（σ＝０．６８）および１０位のＴｙｒについて７．１０（σ＝１．７３）の平均温度因子を示す。

ＣＤＲ−Ｈ３ＣＤＲ−Ｈ３は、カバットら（カバットら、１９８７）に示された２１残基までの全ての長さについて６つのＣＤＲｓのうちで最も可変性である。この極端な可変性はＶ−Ｄ−Ｊスプライシング（シリングら、１９８０）の結果であり、モデル抗体に試みられたとき、常に問題になる。その様なループは、短鎖（７残基まで）、中鎖（１４残基まで）および長鎖（１５残基以上）に分割できる。ＣＡＭＡＬ手順を用いると、短鎖および中鎖ＣＤＲ−Ｈ３は、同様な長さの他のＣＤＲｓと同程度に正確にモデル化される。長鎖ＣＤＲ−Ｈ３はより困難であり、現在同様な正確さで構築することはできないが、鎖のトレース（chain trace ）は正しい。

長いループが"純粋な（pure）"ループ（すなわち、すべてランダムコイルまたはターン）からなることはありそうもない。（長いＣＤＲ−Ｈ３ループ（ＭｃＰＣ６０３（ルディコフら、１９８１）：１１アミノ酸（ａａ）；ＫＯＬ（マルカートら、１９８０）：１７ａａ；Ｆ１９．９（ラスコンブら、１９８９）：１５ａａ）に対する溶媒を有する抗体の結晶構造において、該ループはβ−バレル・コアからの不規則なβ−シート伸長およびこれら２つのストランドを連結する５〜８残基のランダムコイル／ターンからなる。

ＣＤＲ−Ｈ３に対する制約を満足する長いループ（＞８残基）に対する溶媒の性質を測定するために、８〜２０残基の長さのループについて、プロテイン・データバンク（Protein Databank） の完全な検索が、ＣＤＲ−Ｈ３の公知の抗体結晶構造から決められた中間−Ｃα距離制約（inter-Ｃα distance constraints）を用いて行われた。得られたループは、次いでＤＳＳＰ（カブシュおよびサンダー、１９８３）プログラムを用いて分析され、該プログラムは、ポリペプチド構造物の二次構造を特定することができる。ループの各長さの二次構造の量は、計算され、１２残基以上のループにとって、ＤＳＳＰに記載された各クラスの範囲内で二次構造の量は一定であることが観察された。選択されたループの数も、１２残基を超える長さのループについて一定（約１５０ループ）であった。長さのアンサンブルの各々のより深い検討により、実際ループはグループ間で同じであることが示された。

この分析は、長いＣＤＲ−Ｈ３結晶構造のように、選択されたフラグメントは、５〜８残基のループにより連結されたβ−ストランドからなることを示している。長さが１２〜１３残基以上のループについては、β−ストランドが伸長していることを除いて同じループが選択される。これは、"スライディング−ラダー（sliding-ladder）"効果と呼ばれる。さらに、プロテイン・データバンクに含まれる任意の構造において、ランダム・コイルまたはターンの最大サイズは、ＤＳＳＰにより決定されたように８残基を超えない傾向がある。このことは、より長いループのコンフォーメーション空間がデータベースによって飽和されていないことを示唆している。抗体中の長いループが他の構造中の長いループと十分に異なることはありそうもないが予測の信頼性は、相応して減少されるにちがいない。

この観察により減少されるＣＡＭＡＬアルゴリズムの有用性は、どの程度か？カバットら（カバットら、１９８７）により記載された抗体配列中の異なるＣＤＲ−Ｈ３長さの発生頻度が分析された。 図１０は、Ｈ３ループの８５％以上が、ＣＡＭＡＬアルゴリズムにより正確にモデル化される４〜１４残基の間の長さを有することを示す。

Ｄ１．３のＣＤＲ−Ｈ３は、平均長さ（８残基）であるが、利用できる抗体構造中にこの長さのループは見られない。結晶構造コーディネートセットは、モデルと比較して１．９オングストロームのＲＭＳを示した。

３６−７１ループは、１２残基の長さである。そのコンフォーメーションは、β−シートの拡張（extension）を連結したショート・ループとして正確に予測される。

３Ｄ６ Ｈ３ループは、１７残基の長さである。ＫＯＬ（マルカートら、１９８０）は、同じ長さを持つ一方、それは３Ｄ６と共通なのは１残基のみであり、１つのみの保存性突然変異を有する。従って、コンフォーメーションが類似していると考える理由はない。３Ｄ６の最終的に予測されるコンフォーメーションは、結晶構造中のように、伸長したβ−シートである。３Ｄ６−Ｈ３の予測構造と結晶構造の差異は、伸長したβ−シート・ループの５−７°のねじれによる（図９参照）。その様な捩じれは、ウイルソンら（ウイルソンおよびその他）による複合体を形成し、または形成していない抗体で観察されている。このことは、長い３Ｄ６−Ｈ３ループが、フレキシブルであり、積極的に抗原とに結合に関わることを示唆する。

完全可変領域フレームワーク・β−バレルにおけるストランド位置およびＶ_L −Ｖ_H 配向性の予測は、４つの抗体の全てで正確であった。結晶構造からのバックボーン（Ｎ，Ｃα，Ｃ）ＲＭＳ分散は、０．５６〜０．８６オングストロームであり、これは、全ての場合において、特別なモデルのＶ_L およびＶ_H 領域は、異なる抗体構造に由来するという事実にかかわらずである。このことは、該方法が、正確なフレームワークの位置決めが重要であるヒト化（humanization）（ゴルマンら、１９９１）のような手順でうまくいくことを示唆する。全ての４つの抗体における全部で６つのＣＤＲｓのバックボーンは、図８に示されるように本質的に正確に予測される。これらの予測を行う上で２つの重要な点がある。第１は、フレームワーク・バレル上の各ＣＤＲの位置が正しいことである。従って、ＣＤＲ−フレームワーク相互作用は、自信を持ってモニターすることができる。Ｘ線構造からの分散のみが、以前に議論された抗体３Ｄ６のＣＤＲ−Ｈ３である。第２は、モデルおよびＸ線構造間の全ての原子のＲＭＳ分散が、側鎖の位置により支配されることである。大抵の場合、この分散は、不正確に配置され、露出された少数の側鎖（例えば、Ｄ１．３において、不正確に予測された側鎖は、Ｌ１のＴｙｒ９、Ｌ３のＴｒｐ４，Ｈ１のＴｙｒ２およびＨ３のＴｙｒ４のみである）のためである。各ＣＤＲは、他のＣＤＲｓの非存在下に構築されているので、力の場は結晶構造において見出されるものから１２０°離れたロータマー（rotamer）を選択できる。この効果は、リーらによっても観察されている（リーおよびレビット、１９９１）。

結論１４残基以下のＣＤＲ Ｈ３領域を有する抗体のために、完全可変ドメインがメディウム・レゾリューションｘ線構造（medium resolution x-ray structures）のそれへの正確なアプローチのためにモデル化された。より長いＨ３ループを有する抗体のためにＣＡＭＡＬアルゴリズムは、分子動力学シミュレーションが組み込まれる追加の手順を必要としているように思われる。

チョシアらの規定アプローチ（canonical approach） は、ＣＡＭＡＬ手順と組み合わせて上手に適用され、使用されると、（少なくともバックボーンのモデル化において）十分に働くように思われる。

これらの研究から明らかになった１つの重要な観察は、与えられたループがいくつかのコンフォーメーションで存在することができることである。特に、これはＣＤＲ−Ｌ１に起こりやすく、程度は少ないが、ＣＤＲ−Ｌ３およびより長いＣＤＲ−Ｈ３’ｓにも起こり得るように思われる。単純な組み合わせ計算によると、もしこれらの３つのループが、各々３つの異なるコンフォーメーションで存在していたとすると、与えられる結合部位は３³ ＝２７の異なる形態（topography）を有することができる。明らかに、これは交叉反応性の起源を説明し、抗原の誘導適合を可能にするであろう。

モデル化に使用された抗体配列の整列。"^*"は、ＣＤＲ領域を示す；"⁺"は、フレームワークのモデル化のための適合に使用されたβ−ストランド領域を示す。β−バレル・ストランドの命名は、（ＨまたはＬ鎖）−ＦＲ（フレームワーク領域）−（ストランド番号）であり、従って重鎖の１つのストランドは、ＨＦＲ１である。

モデルが比較される抗体結晶構造、並びにモデルを構築するために使用された親フレームワーク。Ｄ１．３の分解能データ（resolution data）は、未発表。

２４ＣＲＤｓについての各々の配列及びコンフォーメション探索構築スキーム、［］は構築領域であり、（）は鎖閉鎖（chain closure）を示し、すべての鎖が構築されている。ＲＭＳ（平均二乗距離（Root Mean Square））は、モデルと結晶構造ループコーディネート（crystal structure loop coordinates） 間の距離である。ＲＭＳ値は、２つの構造のお互いの間の保存されたコアの最小二乗フィッティング（least-square fitting） により計算され、およびループについてＲＭＳを計算することにより求められた全体的適合である。フレームワーク（Ｎ，Ｃα，Ｃ）の全ＲＭＳは、各々０．８１，０．６０，０．８６および０．５６である。

（チョシアら、（１９８９）から得た）３Ｄ６のモデルから選ばれた規定ループ（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｌｏｏｐ）

チョシアら、（１９８９）により同じ規定群（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｒｏｕｐ）に分類されたＨｙＨＥＬ−１０およびＲＥＩ由来のＣＤＲ−Ｌ１中の残基のバックボーンφおよびψ角度

本発明は、更に、以下の事項に関する。
項１．実質的に以下の工程：
（ａ）げっ歯類およびヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域プールについてｘ線結晶学的構造から得られる相対的な接近可能性分布から、位置整列を作成して、重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出する位置のセットを得、ここで全てのげっ歯類およびヒト可変領域についての整列位置は少なくとも約９８％同一である；
（ｂ）該工程（ａ）で作成された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出する位置の該セットを用いて、げっ歯類抗体またはそのフラグメントのために、１セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を確定し；
（ｃ）該工程（ｂ）で確定されたげっ歯類の表面に露出するアミノ酸残基の該セットに最も緊密に同一である１セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を、ヒト抗体のアミノ酸配列から同定し；
（ｄ）該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの可変領域フレームワークのアミノ酸配列において、該工程（ｂ）で確定された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基の該セットを、該工程（ｃ）で同定された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基の該セットと置換し；
（ｅ）該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの該可変領域および該工程（ｄ）で明記される置換から得られる該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの該可変領域の３次元モデルを構築し；
（ｆ）該工程（ｅ）で構築された該３次元モデルを比較し、該工程（ｂ）または（ｃ）で同定された該セットから、該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの相補性決定領域のあらゆる残基のいかなる原子からも５オングストローム以内にある、あらゆるアミノ酸残基を同定し；
（ｇ）該工程（ｆ）で同定されたあらゆる残基を、ヒトからオリジナルのげっ歯類アミノ酸残基に変化させ、これにより、表面に露出するアミノ酸残基のヒト化セットを確定し；（ｈ）該工程（ｂ）で確定されたげっ歯類抗体の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基のセットを、該工程（ｇ）で確定された可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基のヒト化セットに置換し；および
（ｉ）結合特異性をもつ該ヒト化げっ歯類抗体またはそのフラグメントを生産する、
（ここで、該抗体フラグメントは、該抗体の少なくとも１つの結合部位を含むものである）からなる、表面再処理することによってヒト化されたげっ歯類抗体またはそのフラグメントを生産する方法により作成された、表面再処理されたげっ歯類抗体またはそのフラグメント。
項２．前記げっ歯類抗体が抗体フラグメントである項１に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
項３．前記げっ歯類抗体フラグメントが単一鎖抗体、Ｆ_Vフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ’)₂フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである項１に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
項４．前記表面に露出するアミノ酸残基が、溶媒接近可能性が３０％以上の残基である請求項１または２に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
項５．げっ歯類抗体またはそのフラグメントがネズミ抗体である項１または２に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
項６．ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントがネズミ抗体の抗Ｎ９０１である請求項１または２に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
項７．表面に露出するアミノ酸残基のフレームワーク位置の前記セットが第１表に示されるセットならびに図３Ａおよび図３Ｂに示される整列によって確定される項１または２に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。

項８．表面再処理されたネズミ抗−Ｎ９０１抗体又はそのフラグメントであって、該抗体又はそのフラグメントは、軽鎖の可変領域において以下のアミノ酸配列を含み

そしてここで、該表面再処理されたネズミ抗−Ｎ９０１抗体又はそのフラグメントは、重鎖の可変領域において以下のアミノ酸配列を含み、ここで重鎖の可変領域における該配列は、該重鎖のＮ−末端からＣ−末端へ以下の順番で存在し、そして該重鎖の相補性決定領域によって分離される：

項９．項８に記載の表面再処理されたネズミ抗−Ｎ９０１抗体。

項１０．前記フラグメントが単一鎖抗体、Ｆ_vフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）₂ フラグメント又はＦａｂ'フラグメントである、項８に記載の抗体フラグメント。

本発明は、以下の事項にも関する。
＜項１＞
（ａ）げっ歯類およびヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域プールについてｘ線結晶学的構造から得られる相対的な接近可能性分布から、位置整列を作成して、重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出する位置のセットを得、ここで全てのげっ歯類およびヒト可変領域についての整列位置は少なくとも約９８％同一である；
（ｂ）該工程（ａ）で作成された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出する位置の該セットを用いて、げっ歯類抗体またはそのフラグメントのために、１セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を確定し；
（ｃ）該工程（ｂ）で確定されたげっ歯類の表面に露出するアミノ酸残基の該セットに最も緊密に同一である１セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を、ヒト抗体のアミノ酸配列から同定し；
（ｄ）該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの可変領域フレームワークのアミノ酸配列において、該工程（ｂ）で確定された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基の該セットを、該工程（ｃ）で同定された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基の該セットと置換し；
（ｅ）該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの該可変領域および該工程（ｄ）で明記される置換から得られる該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの該可変領域の３次元モデルを構築し；
（ｆ）該工程（ｅ）で構築された該３次元モデルを比較し、該工程（ｂ）または（ｃ）で同定された該セットから、該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの相補性決定領域のあらゆる残基のいかなる原子からも５オングストローム以内にある、あらゆるアミノ酸残基を同定し；
（ｇ）該工程（ｆ）で同定されたあらゆる残基を、ヒトからオリジナルのげっ歯類アミノ酸残基に変化させ、これにより、表面に露出するアミノ酸残基のヒト化セットを確定し；
（ｈ）該工程（ｂ）で確定されたげっ歯類抗体の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基のセットを、該工程（ｇ）で確定された可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基のヒト化セットに置換し；および、
（ｉ）結合特異性をもつ該ヒト化げっ歯類抗体またはそのフラグメントを生産する工程、
（ここで、軽鎖の可変領域において、
表面に露出する位置１のアミノ酸はD、E、A又はSのいずれか1種であり；
表面に露出する位置３のアミノ酸はV、Q、S又はYのいずれか1種であり；
表面に露出する位置５のアミノ酸はT又はLであり；
表面に露出する位置９のアミノ酸はP、S、G、A又はLのいずれか1種であり；
表面に露出する位置１５のアミノ酸はP、V又はLのいずれか1種であり；
表面に露出する位置１８のアミノ酸はR、S、T又はPのいずれか1種であり；
表面に露出する位置４６のアミノ酸はPであり；
表面に露出する位置４７のアミノ酸はGであり；
表面に露出する位置５１のアミノ酸はK又はRであり；
表面に露出する位置６３のアミノ酸はGであり；
表面に露出する位置６６のアミノ酸はD、S又はAのいずれか1種であり；
表面に露出する位置７３のアミノ酸はSであり；
表面に露出する位置８６のアミノ酸はP、A、S又はTのいずれか1種であり；
表面に露出する位置８７のアミノ酸はE、D又はGのいずれか1種であり；
表面に露出する位置１１１のアミノ酸はK、R又はNのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１１５のアミノ酸はK又はLであり；
表面に露出する位置１１６のアミノ酸はR、G又はSのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１１７のアミノ酸はQ、T、E又はPのいずれか１種であり、且つ、
ここで、重鎖の可変領域において、
表面に露出する位置１１８のアミノ酸はE又はQであり；
表面に露出する位置１２０のアミノ酸はQ又はTであり；
表面に露出する位置１２２のアミノ酸はV、L又はQのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１２６のアミノ酸はG、A又はPのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１２７のアミノ酸はG、E、A又はDのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１２８のアミノ酸はL、V又はFのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１３０のアミノ酸はK、Q又はEのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１３１のアミノ酸はPであり；
表面に露出する位置１３２のアミノ酸はG、S又はTのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１３６のアミノ酸はR、K、S又はTのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１４３のアミノ酸はGであり；
表面に露出する位置１４５のアミノ酸はT、S、N又はIのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１６０のアミノ酸はP又はSであり；
表面に露出する位置１６１のアミノ酸はGであり；
表面に露出する位置１６２のアミノ酸はK、Q又はRのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１８３のアミノ酸はD、P、A、Q又はTのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１８４のアミノ酸はS、K又はPのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１８６のアミノ酸はK、Q、R又はNのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１８７のアミノ酸はG、S又はTのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１９５のアミノ酸はT、D、N又はKのいずれか１種であり；
表面に露出する位置１９６のアミノ酸はSであり；
表面に露出する位置１９７のアミノ酸はK、I、T又はRのいずれか１種であり；
表面に露出する位置２０８のアミノ酸はR、T、K又はDのいずれか１種であり；
表面に露出する位置２０９のアミノ酸はA、P、S又はTのいずれか１種であり；
表面に露出する位置２１０のアミノ酸はE、A、D、S、Z又はVのいずれか１種であり；
表面に露出する位置２１２のアミノ酸はTであり；
表面に露出する位置２２２のアミノ酸はG、D、P、Y、V又はNのいずれか１種であり、
ここで、位置の数は、図３A及び図３Bに示される整列によって定義される）
を包含する方法により作成された、表面再処理されたげっ歯類抗体またはそのフラグメント。
＜項２＞
前記げっ歯類抗体が抗体フラグメントである＜項１＞に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
＜項３＞
前記げっ歯類抗体フラグメントが単一鎖抗体、Ｆ _V フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ’) ₂ フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである＜項１＞に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
＜項４＞
前記表面に露出するアミノ酸残基が、溶媒接近可能性が３０％以上の残基である＜項１＞または＜項２＞に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
＜項５＞
げっ歯類抗体またはそのフラグメントがネズミ抗体である＜項１＞または＜項２＞に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
＜項６＞
ヒト化されるげっ歯類抗体またはそのフラグメントがネズミ抗体Ｎ９０１である＜項１＞または＜項２＞に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
＜項７＞
表面再処理されたネズミＮ９０１抗体又はそのフラグメントであって、該抗体又はそのフラグメントは、軽鎖の可変領域において以下のアミノ酸配列を含み、ここで、軽鎖の可変領域における該配列は、該軽鎖のＮ−末端からＣ−末端へ以下の順番で存在し、そして該軽鎖の相補性決定領域によって分離される：
（１）ＤＶＬＭＴＱＴＰＤＳＬＰＶＳＬＧＤＲＡＳＩＳＣ；
（２）ＷＦＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹ；
（３）ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＭＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣ；
（４）ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ；
並びに、
ここで、該表面再処理されたネズミＮ９０１抗体又はそのフラグメントは、重鎖の可変領域において以下のアミノ酸配列を含み、ここで、重鎖の可変領域における該配列は、該重鎖のＮ−末端からＣ−末端へ以下の順番で存在し、そして該重鎖の相補性決定領域によって分離される：
（１）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ；
（２）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ；
（３）ＨＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲ；
（４）ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ．
＜項８＞
＜項７＞に記載の表面再処理されたネズミＮ９０１抗体。
＜項９＞
前記フラグメントが単一鎖抗体、Ｆ _v フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’） ₂ フラグメント又はＦａｂ’フラグメントである、＜項７＞に記載の抗体フラグメント。

参考文献リスト
エム．ジェイ．ダースレイ，ピー デ アル パ，ディー．シー．フィリップスおよびエイ．アール．リーズ・イン・メソドロジカル・サーベイズ・イン・バイオケミストリー・アンド・アナリシス，６３−６８頁、第１５巻、１９８５、プレナム・プレス（編者：イー．ライド、ジー．エム．ダブリュー．クックおよびディー．ジェイ．モレ）、第９回インターナショナル・サブセルーラー・メソドロジー・フォーラム、１９８４年９月３〜６日、ギルドフォード、英国。

アミット、エイ．ジー．、マリウザ、アール．エイ．、フィリップス、エス．イー．ブイ．およびポルジャック、アール．ジェイ．（１９８６）、２．８オングストローム分解能における抗原抗体複合体の３次元構造、サイエンス、２３３、７４７〜７５３頁。

アクビスト、ジェイ．、ファン・グンシーレン、ダブリュー．、レイフォンマーク、エム．およびタピア、オー．（１９８５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８３、４６１〜４７７頁。

バーンシュタイン、エフ．、ケツル、ティー．、ウイリアムス、ジー．、メイヤー、イー．、ブリス、エム．、ロジャース、ジェイ．、ケナード、オー．、シマノウチ、ティー．およびタスミ、エム．（１９７７）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５−５４２頁。

ブルックス、ビー．、ブルコレリ、アール．、オレイソン、ビー．、スタトクス、ディー．、スワミナサン、エス．およびカープラス、エム．（１９８３）、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、４、１８７〜２１７頁。

ブルコレリ、アール．イー．およびカープラス、エム．（１９８７）、ユニフォーム・コンフォーメーション・サンプリングにより短鎖ポリペプチド・セグメントの折り畳みの予測、バイオポリマーズ、２６、１３７〜１６８頁。

カーター、ディー．ら、（１９９１）、プロテイン・エンジニアリング、９９９９頁。

チャウ、ピー．およびディーン ピー．（１９８７）、分子認識：グノモニック投影による３ｄ表面構造比較、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．、５、９７〜１００頁。

チョシア、シー．、レスク、エイ．、レビット、エム．、アミット、エイ．、マリウザ、アール．、フィリップス、エス．およびポルジャック、アール．（１９８６）、免疫グロブリンＤ１．３の予測構造及びその結晶構造との比較、サイエンス、２３３、７５５〜７５８頁。

チョシア、シー．、レスク、エイ．エム．、トラモンタノ、エイ．、レビット、エム．、スミス−ジル、エス．ジェイ．、エア、ジー．、シェリフ、エス．、パドラン、エー．エイ．、デイビース、ディー．アール．、ツリップ、ダブリュー．アール．、コルマン、ピー．エム．、アルツリ、ピー．エム．およびポルジャック、アール．ジェイ．（１９８９）、免疫グロブリン高頻度可変領域のコンフォーメーション、ネイチャー（ロンドン）、３４２、８７７〜８８３頁。

コルネット、ジェイ．エル．、シース、ケイ．ビー．、マーガリット、エッチ．、スポウジ、ジェイ．エル．、ベルツォフスキー、ジェイ．エイ．およびデリシ、シー．（１９８７）、タンパク質の両親媒性構造を検出するための疎水性スケールおよびコンピュータ計算技術、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１９５．３、６５９−６８５頁。

ダースリー、エム．およびリーズ、エイ．（１９８５）、ＥＭＢＯ Ｊ．、４、３８３−３９２頁。

デイビース、ディー．、シェリフ、エス．およびパドラン、イー．（１９８８）、抗原抗体複合体、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６３、１０５４１〜１０５４４頁。

デ ラ パ、ピー．、サットン、ビー．、ダースリー、エム．およびリーズ、エイ．（１９８６）、３つの抗−リソチーム・モノクローナル・抗体の結合部位および抗体の１つおよびそのエピトープの間の複合体のモデリング、ＥＭＢＯＪ．、５、４１５〜４２５頁。

ファイン、アール．、ワング、エッチ．、シェンキン、ピー．、ヤルマッシュ、ディー．およびレビンタル、シー．（１９８６）、抗体高頻度可変ループコンフォーメーションｉｉの予測：多くのランダムに得られたループ・コンフォーメーションからのＭｃＰＣ６０３の最小化および分子動力学的研究、Proteins：Struct., Funct., Genet. 、１、３４２〜３６２頁。

ゴー、エヌ．およびシェラージ、エッチ．（１９７０）、鎖状分子の鎖閉鎖および局所コンフォーメーション・デフォーメーション、マクロモレキュールズ、３、１７８〜１８７頁。

ゴルマン、エス．、クラーク、エム．、ルトレッジ、イー．、コボルド、エス．およびワルドマン、エッチ．（１９９１）、治療用ＣＤ４抗体のリシェイピング（reshaping）、Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A. 、８８、４１８８−４１８５。

グルノウ、アール．、ヤーン、エス．、ポルストマン、ティー．、キーシッヒ、ティー．、シュタインケラー、エッチ．、シュタインドル、エフ．、マタノビック、ディー．、ガートラー、エル．、ダインハート、エフ．、カティンガー、エッチ．、およびフォン アール．ビー．（１９８８）、高効率ヒトＢ細胞永久ヘテロミエローマｃｂ−ｆ７、J.Immunol.Meth. 、１０６、２５７〜２６５頁。ジェフリー、ピー．（１９８９）、免疫グロブリンの構造及び特異性、D.Phil.Thesis 、オックスフォード大学。

ジェフリー、ピー．ディー．、グリクスト、アール．イー．、テイラー、ジー．エル．、およびリーズ、エイ．アール．（１９９１）、抗−ペプチド抗体Ｇｌｏｏｐ−２Ｆａｂフラグメントの結晶構造および調製物中の２．８オングストローム原稿（manuscript） 。

カバット、イー．エイ．、ウ、ティー．ティー．、レイド−ミラー、エム．、ペリー、ビー．エム．およびゴッツマン、ケイ．エス．（１９８７）、免疫学的利益を有する蛋白質の配列、ユー．エス．・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズ、第４版。

カブシュ、ダブリュー．およびサンダー、シー．（１９８３）、蛋白質二次構造の辞書、バイオポリマーズ、２２、２５７７〜２６３７頁。

ラスコンベ、エム．、アルツァリ、ピー．、ブーロット、ジー．、サルジャン、ピー．、トウガード、ピー．、ベレク、シー．、ハバ、エス．、ローゼン、イー．、ニソノフ、エイ．およびポルジャック、アール．（１９８９）、Ｆａｂｒ１９．９、ｐ−アゾベンゼンアルソネート基に特異的なマウスモノクローナル抗体、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., ８６、６０７頁。

リー、シー．およびレビット、エム．（１９９１）、タンパク質コア上の部位直接的突然変異の安定性おとび活性効果の正確な予測、ネイチャー、３５２．６３３６、４４８−４５１頁。

リー、シー．およびサビア、エス．（１９９１）、パッキング最適化による蛋白質側鎖コンフォーメーションの予測、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、２１７．２、３７３〜３８８頁。

マルカート（Marquart） 、エム．、ダイゼンホーファー、ジェイ．およびヒューバー、アール．（１９８０）、３．０オングストロームおよび１．９オングストロームの解像度における無傷の抗体分子ＫＯＬおよびその抗原結合性フラグメントの結晶学的改善および原子モデル、J.Biol.Chem.、１４１、３６９〜３９１頁。

マーチン、エイ．シー．アール．（１９９０）、抗体結合部位の分子モデリング、D. Phil. Thesis 、オックスフォード大学。

マーチン、エイ．シー．アール．、チーサム、ジェイ．シー．およびリーズ、エイ．アール．（１９８９）、抗体高頻度可変ループのモデル化、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., ８６、９２６８〜９２７２頁。

マーチン、エイ．シー．アール．、チーサム、ジェイ．シー．およびリーズ、エイ．アール．（１９９１）、「結合アルゴリズム」を用いた抗体高頻度可変ループのモデル化、Meth.Enz. イン・プレス。

モウルト、ジェイ．およびジェイムズ、エヌ．（１９８６）、Proteins：Struct., Funct., Genet. 、１、１４６頁。

パドラン、イー．、デイビーズ、ディー．、ペクト、アイ．、ジボル、ディー．およびライト、シー．（１９７６）、抗原結合部位のモデル・ビルディング研究：ＭＯＰＣ−３１５のハプテン結合部位、Cold Spring Harbor Quant.Symp.Biochem.、４１、６２７〜６３７頁・パルマー、ケイ．およびシェラガ、ジェイ．（１９９１）、Ｘ線偏向構造に適合する鎖の標準的結合構造、：固い結合構造の近似。Ｉ．ループ・コンフォーメーションの限定された検索を介した鎖閉鎖、J.Comp.Chem., １２、５０５〜５２６頁。

ポール、ピー．、バーニー、ピー．、チャンベル、エム．およびオドグソルペ、ディー．（１９９０）、ペプチド構造の束縛におけるγ−ラクタムのコンフォーメーション優先およびその役割、J.Comp-aided.Mol.Des、４、２３９〜２５３頁。

ローズ、ディー．アール．、ストロング、アール．ケイ．、マルゴリス、エム．エヌ．、ジェフター、エム．エル．およびペツコ、ジー．エイ．（１９９０）、２．９オングストロームの解像度におけるマウス抗アルソネート・モノクローナル抗体の抗原結合性フラグメント３６〜７１の結晶構造、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., ８７、３３８〜３４２頁。

ルディコフ、エス．、サトウ、ワイ．、パドラン、イー．エイ．、デイビース、ディー．アール．およびポッター、エム．（１９８１）、結晶化されたマウスＦａｂ’由来のカッパ鎖構造：ハプテン結合における結合セグメントの役割、Mol.Immunol.、１８、７０５〜７１１頁。

シリング、ジェイ．、クレビンジャー、ビー．、デイビー、ジェイ．エム．およびフード、エル．（１９８０）、デキストランに対する均一な抗体のアミノ酸配列および重鎖Ｖ−領域遺伝子セグメントのＤＮＡ再配列、ネイチャー（ロンドン）、２８３、３５〜４０頁。

ストロング、アール．、チャンベル、アール．、ローズ、ディー．、ペツコ、ジー．、シャロン、ジェイ．およびマルゴリーズ、エム．（１９９１）、マウス抗−ｐ−アゾフェニルアルソネートＦａｂ ３６−７１．１の三次元構造、Ｘ線結晶学、部位−直接的突然変異およびハプテンとの複合体のモデリング、バイオケミストリー、３０、３７３９〜３７４８頁。

ソルントン、ジェイ．、シバンダ、ビー．、エドワーズ、エム．およびバルロー、ディー．（１９８８）、蛋白質のループ領域の分析、デザインおよび修飾、トラモンタノ、エイ．、チョシア、シー．およびレスク、エイ．（１９８９）、蛋白質の中程度の大きさのループ・コンフォーメーションの構造決定、Proteins：Struct., Funct., Genet. 、６、３８２〜３９４頁。

ウイルソン、アイ．ら、オナー・オブ・サー・デイビッド・フィリップスにおける構造と機能についてのミーティングでの発表、１９９１年７月１〜３日、イギリス。

図１は、げっ歯類抗体の可変領域の３次元モデルを構築するために使用され得るアルゴリズムを示す。 図２は、本発明に従う、げっ歯類抗体またはそのフラグメントのヒト化の仕方を決定するアプローチを示すダイヤグラムである。 図３Ａおよび図３Ｂは、１２個の抗体のＦ_V 構造に関するアミノ酸残基の相対的な接近可能性を、これらの構造の配列を整列させたものにマップして、プロットしたものである。構造物Ｇｌｂ２（Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｐ．Ｄ．、哲学博士論文、オックスフォード大学、英国、１９９１）、Ｄ１．３（Ａｍｉｔ，Ａ．Ｇ．、Ｍａｒｉｕｚｚａ，Ｒ．Ａ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｓ．Ｅ．Ｖ．およびＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３，ｐｐ．７４７−７５３）、３Ｄ６（Ｇｒｕｎｏｗ，Ｒ．、Ｊａｈｎ，Ｓ．、Ｐｏｒｓｔｍａｎ，Ｔ．、Ｋｉｅｓｓｉｇ，Ｔ．、Ｓｔｅｉｎｋｅｌｌｅｒ，Ｈ．、Ｓｔｅｉｎｄｌ，Ｆ、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．、Ｇｕｒｔｌｅｒ，Ｌ．、Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｆ．、Ｋａｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．およびｖｏｎ Ｒ．，Ｂ．（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０６，ｐｐ．２５７−２６５）および３６−７１（５ｆａｂ）（Ｒｏｓｅ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｋ．、Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｍ．Ｎ．、Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．およびＰｅｔｓｋｏ，Ｇ．Ａ．（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７，ｐｐ．３３８−３４２）は、まだＢｒｏｏｋｈａｖｅｎのデータベースには存在しない。使用される他の構造物は：２ｈｆｌ（Ｓｈｅｒｉｆｆ，Ｓ．、Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ，Ｅ．Ｗ．、Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．、Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．、Ｆｉｎｚｅｌ，Ｂ．Ｃ．、Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｒ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４，ｐｐ．８０７５−８０７９）、３ｈｆｍ（Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．、Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ，Ｅ．、Ｓｈｅｒｉｆｆ，Ｓ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，Ｓ．およびＤａｖｉｅｓ，Ｄ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６，ｐｐ．５９３８−５９４２）、２ｆｂｊ（Ｍａｉｎｈａｒｔ，Ｃ．Ｒ．、Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．およびＦｅｌｄｍａｎｎ，Ｒ．Ｊ．（１９８４）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，ｐｐ．４６９−４７８）、３ｆａｂ（Ｓａｕｌ，Ｆ．Ａ．、Ａｍｚｅｌ，Ｌ．Ｍ．およびＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．（１９７８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５３，ｐｐ．５８５−５９７）、４ｆａｂ（Ｈｅｒｒｏｎ，Ｊ．、Ｈｅ，Ｘ．、Ｍａｓｏｎ，Ｍ．、Ｖｏｓｓ，Ｅ．およびＥｄｍｕｎｓｏｎ，Ａ．（１９８９）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ． ５，ｐｐ．２７１−２８０）、２ｍｃｐ（Ｓｅｇａｌ，Ｄ．、Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．、Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．、Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．およびＤａｖｉｅｓ，Ｄ．（１９７４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７１，ｐｐ．４２９８−［？？］、２ｆｂ４（Ｍａｒｑｕａｒｔ，Ｍ．、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．およびＨｕｂｅｒ，Ｒ．（１９８０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １４１，ｐｐ．３６９−３９１）および１ｆ１９（Ｌａｓｃｏｍｂｅ，Ｍ．、Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．、Ｂｏｕｌｏｔ，Ｇ．、Ｓａｌｕｊｉａｎ，Ｐ．、Ｔｏｕｇａｒｄ，Ｐ．、Ｂｅｒｅｋ，Ｃ．、Ｈａｂａ，Ｓ．、Ｒｏｓｅｎ，Ｅ．、Ｎｉｓｏｎｏｆ，Ａ．およびＰｏｌｊａｋ，Ｒ．（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８６，ｐ．６０７）である。これらの構造物は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎのエントリーコードにより命名される。ここで使用される配列の番号は、図４Ａおよび図４Ｂに記載されている。 図３Ａは、重鎖の相対的接近可能性をグラフとして示し、図３Ｂは、軽鎖の相対的接近可能性をグラフとして示している。 図４Ａおよび図４Ｂは、ヒト化の３つの方法を用いて生成される配列を整列させて示したものである。配列は：１）オリジナルのげっ歯類のＮ９０１。２＋３）ＫＯＬ（Ｍａｒｑｕａｒｔ，Ｍ．、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．およびＨｕｂｅｒ，Ｒ．（１９８０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １４１，ｐｐ．３６９−３９１）およびＫＯＬ表面を用いて再整形したＮ９０１。４＋５）最も相同性の高い配列であるＬ（ＫＶ２Ｆ）（Ｋｌｏｂｅｃｋ，Ｈ．、Ｍｅｉｎｄｌ，Ａ．、Ｃｏｍｂｒｉａｔｏ，Ｇ．、Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａ．およびＺａｃｈａｕ，Ｈ．（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｐｐ．６４９９−６５１３）およびＨ（Ｇ３６００５）（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｈ．およびＷａｎｇ，Ｊ．（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７）、およびこれらの配列を用いて再整形されたＮ９０１。６＋７）表面残基に関して最も相同性の高いＬ（ＫＶ４Ｂ）（Ｋｌｏｂｅｃｋ，Ｈ．、Ｂｒｏｎｋａｍｐ，Ｇ．、Ｃｏｍｂｒｉａｔｏ，Ｇ．、Ｍｏｃｉｋａｔ，Ｒ．、Ｐｏｈｅｌｎｚ，Ｈ．およびＺａｃｈａｕ，Ｈ．（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３，ｐｐ．６５１５−６５２９）およびＨ（ＰＬＯ１２３）（Ｂｉｒｄ，Ｊ．、Ｇａｌｉｌｉ，Ｎ．、Ｌｉｎｋ，Ｍ．、Ｓｉｔｅｓ，Ｄ．およびＳｋｌａｒ，Ｊ．（１９８８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６８，ｐｐ．２２９−２４５）、およびこれらの配列を用いて再整形したＮ９０１。 番号は、抗体モデリングプログラムＡＢＭ（市販されているソフトウェアの商標、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）で使用されたのと同じ様に付与され、これは、構造的保存性に基づくもので、Ｐａｄｌａｎらにより使用されたような配列の相同性に基づくものではない（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．、Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．、Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、第４版）。Ｎ９０１を所与の配列で表面再処理するために導入されなければならない配列上の変化は、棒で印が付けられており、Ｆ_V モデルから決定される復帰突然変異は、星印で示されている。所与の配列のＮ９０１に対する配列の相同性は、各配列の後のカッコ内に示されている。 図５は、平均的な抗体のβバレルの立体的プロットであり、座標軸は、８個の抗体構造の反復する複合的な適合を行って決定された。ストランドの７および８は、ＣＤＲ Ｈ３の「取り外し」（ｔａｋｅ ｏｆｆ）位置を含有し、Ｖ_L およびＶ_H 領域の適合に含まれない。 図６は、フレームワークを含有する８本のβシートのストランドの平均から得たＲＭＳ偏差のプロットである。ＲＭＳは、Ｆ１９．９、４−４−２０、ＮＥＷ、ＦＢＪ、ＫＯＬ、ＨｙＨＥＬ−５、ＨｙＨＥＬ−１０およびＭｃＰＣ６０３の構造物から計算された。Ｎ、Ｃα、Ｃ原子は、プロット中に含まれている。使用される残基は、整列している中に示される（表２）。最も異常な残基は、ストランドＨＦＲ４の全ての残基、ＬＦＲ１の最後の残基、およびＨＦＲ２の最初および最後の残基である。ストランドの命名法は、表２の整列の中で説明されている。ＬＦＲ１−＃１、ＬＦＲ２−＃２、ＬＦＲ３−＃３、ＬＦＲ４−＃４、ＨＦＲ１−＃５、ＨＦＲ２−＃６、ＨＦＲ３−＃７、ＨＦＲＳ４−＃８である。 図７は、ＣＡＭＥＬとして知られる全体的なモデリングプロトコールのフローチャートである。 図８は、実施例２で考察されたｘ線構造およびモデルのためにスーパーインポーズされたループの骨組のプロットである。このループは、全体的なフレームワークの適合の後に、位置決めされる。これは、最良の局所の最小二乗法の適合を示さないが、ループがどのようにフレームワーク上に全体的に位置づけされるかを示す。 図９は、実施例２で記載されたＤ１．３、３６７１、Ｇｌｏｏｐ−２の可変ドメインおよびβバレルのストランドの結晶構造およびモデルの立体的（Ｎ、Ｃ−α、Ｃ、Ｏ）表示である。結晶構造は、白抜きの結合で現し、モデルは、黒塗りの結合で示される。モデルの３Ｄ６−Ｈ３と結晶構造の間の相違は、このループの広げられたβシートのコンホメーション中の５−７度のねじれによるものである。図９Ａ：Ｄ１．３、図９Ｂ：３６−７１、図９Ｃ：Ｇｌｏｏｐ−２、図９Ｄ：３Ｄ６。 図１０は、ＣＤＲ Ｈ３ループのループの長さの分布を示すヒストグラムであり、データはＫａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．、Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．、Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、第４版）から得た。

Claims (7)

1. 表面再処理によりヒト化されたげっ歯類抗体またはそのフラグメントを製造する方法により作製された、表面再処理されたげっ歯類抗体または該抗体の少なくとも１つの結合部位を含むそのフラグメントであって、前記方法は本質的に以下の（ａ）から（ｉ）からなる、表面再処理されたげっ歯類抗体またはそのフラグメント：
   （ａ）げっ歯類およびヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域プールについてｘ線結晶学的構造から得られる相対的な接近可能性分布から、位置整列を作成して、重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出する位置のセットを得、ここで、表面に露出する位置のアミノ酸は、表１に列挙される位置に対応し、ここで全てのげっ歯類およびヒト可変領域についての整列位置は少なくとも約９８％同一である；
   （ｂ）該工程（ａ）で作成された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出する位置の該セットを用いて、げっ歯類抗体またはそのフラグメントのために、１セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を確定し；
   （ｃ）該工程（ｂ）で確定されたげっ歯類の表面に露出するアミノ酸残基の該セットに最も緊密に同一である１セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基を、ヒト抗体のアミノ酸配列から同定し；
   （ｄ）該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの可変領域フレームワークのアミノ酸配列において、該工程（ｂ）で確定された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基の該セットを、該工程（ｃ）で同定された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基の該セットと置換し；
   （ｅ）該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの該可変領域および該工程（ｄ）で明記される置換から得られる該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの該可変領域の３次元モデルを構築し；
   （ｆ）該工程（ｅ）で構築された該３次元モデルを比較し、該工程（ｂ）または（ｃ）で同定された該セットから、該げっ歯類抗体またはそのフラグメントの相補性決定領域のあらゆる残基のいかなる原子からも５オングストローム以内にある、あらゆるアミノ酸残基を同定し；
   （ｇ）該工程（ｆ）で同定されたあらゆる残基を、ヒトからオリジナルのげっ歯類アミノ酸残基に変化させ、これにより、表面に露出するアミノ酸残基のヒト化セットを確定し；
   （ｈ）該工程（ｂ）で確定されたげっ歯類抗体の可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基のセットを、該工程（ｇ）で確定された可変領域フレームワークの表面に露出するアミノ酸残基のヒト化セットに置換し；および、
   （ｉ）結合特異性をもつ該ヒト化げっ歯類抗体またはそのフラグメントを生産する工程。
2. 前記げっ歯類抗体フラグメントが単一鎖抗体、ＦVフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである請求項１に記載の表面再処理された抗体フラグメント。
3. げっ歯類抗体がネズミ抗体である請求項１または２に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
4. ヒト化されるげっ歯類抗体がネズミ抗体Ｎ９０１である請求項１または２に記載の表面再処理された抗体またはそのフラグメント。
5. 表面再処理されたネズミＮ９０１抗体又はそのフラグメントであって、該抗体又はそのフラグメントは、軽鎖の可変領域において以下のアミノ酸配列を含み、ここで、軽鎖の可変領域における該配列は、該軽鎖のＮ−末端からＣ−末端へ以下の順番で存在し、そして該軽鎖の相補性決定領域によって分離される：
   （１）ＤＶＬＭＴＱＴＰＤＳＬＰＶＳＬＧＤＲＡＳＩＳＣ；
   （２）ＷＦＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹ；
   （３）ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＭＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣ；
   （４）ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ；並びに、
   ここで、該表面再処理されたネズミＮ９０１抗体又はそのフラグメントは、重鎖の可変領域において以下のアミノ酸配列を含み、ここで、重鎖の可変領域における該配列は、該重鎖のＮ−末端からＣ−末端へ以下の順番で存在し、そして該重鎖の相補性決定領域によって分離される：
   （１）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ；
   （２）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ；
   （３）ＨＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲ；
   （４）ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ．
6. 請求項５に記載の表面再処理されたネズミＮ９０１抗体。
7. 前記フラグメントが単一鎖抗体、Ｆvフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント又はＦａｂ’フラグメントである、請求項５に記載の抗体フラグメント。

Images