CN103923213A - 结合淋巴细胞活化基因3(lag-3)之人类抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及结合淋巴细胞活化基因3（LAG-3）之人类抗体及其用途。本披露提供了以高亲和力特异性地与LAG-3相结合的分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体。较佳的是，该等抗体结合人类LAG-3。在某些实施方案中，该等抗体结合人类以及猴类之LAG-3，但不结合小鼠之LAG-3。本发明提供了抗LAG-3抗体，该等抗体可抑制LAG-3与MHC II类分子之结合并可刺激抗原特异性T细胞应答。还提供了对本发明之抗体进行编码的核酸分子、表达本发明之抗体之表达载体、宿主细胞以及方法。还提供了包括本发明之抗体之免疫缀合物、双特异性分子、以及药物组合物。本披露还提供了用于检测LAG-3之方法、连同使用本发明的抗LAG-3抗体治疗刺激性免疫反应之方法。还提供了联合治疗法，其中抗LAG-3抗体与至少一种另外之免疫刺激性抗体一起共同给药。

Description

结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)之人类抗体及其用途
本申请是申请日为2009年08月11日、中国申请号为200980139549.6、发明名称为“结合淋巴细胞活化基因3（LAG-3）之人类抗体及其用途”的发明申请的分案申请。
发明背景
淋巴细胞活化基因3或LAG-3（也称作CD223）系免疫球蛋白超基因家族之一员，并且在结构上以及遗传上与CD4有关。LAG-3并不在休眠的外周血淋巴细胞上表达，但在被活化的T细胞以及NK细胞上表达。LAG-3系由位于染色体12的短臂的远程部分、在CD4基因附近的一基因进行编码的膜蛋白，表明该LAG-3基因可能已经藉由基因重复而进化（Triebel et al.(1990)J.Exp.Med.171:1393-1405）。
类似于CD4，LAG-3已被证明与MHC II类分子进行相互作用，但不像CD4，LAG-3不与人类免疫缺陷病毒gp120蛋白进行相互作用（Baixeras et al.(1992)J.Exp.Med.176:327-337）。使用可溶的LAG-3免疫球蛋白融合蛋白（sLAG-3Ig）的研究证明了LAG-3与在细胞表面上的MHC II类直接并且特异的结合（Huard et al.(1996)Eur.J.Immunol.26:1180-1186）。
在抗原特异性T细胞应答的体外研究中，加入抗LAG-3抗体导致T细胞增殖增加、活化抗原（如CD25）的更高表达、以及更高浓度的细胞因子（例如干扰素γ以及白介素4），从而支持LAG-/MHC II类分子相互作用在下调CD4+T淋巴细胞的抗原依赖性刺激中的作用（Huard et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:3216-3221）。已经证明LAG-3的胞质内区与名为LAP的蛋白进行相互作用，此蛋白被认为是与CD3/TCR活化途径的下调有关的信号转导分子（Iouzalen et al.(2001)Eur.J.Immunol.31:2885-2891）。此外，已显示CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）在活化时表达LAG-3，并且针对LAG-3之抗体在体内以及体外均抑制由所诱导的Treg细胞所产生的阻抑，表明LAG-3有助于Treg细胞的阻抑活性（Huang,C.et al.(2004)Immunity21:503-513）。另外，已显示LAG-3藉由调节性T细胞以T细胞依赖性以及非依赖性这两种机制对T细胞稳态进行负向调节（Workman,C.J.and Vignali,D.A.(2005)J.Immunol.174:688-695）。
在某些情况下，LAG-3还已显示出具有免疫刺激作用。例如，当与未经转染的肿瘤细胞相比时，移植到同系基因小鼠中的转染了LAG-3的肿瘤细胞显示出显著的生长下降或完全消退，表明LAG-3在肿瘤细胞上的表达藉由经由MHC II类分子触发抗原呈递细胞而刺激了抗肿瘤应答（Prigent etal.(1999)Eur.J.Immunol.29:3867-3876）。另外地，当与抗原一起被给予小鼠时，已显示可溶性LAG-3Ig融合蛋白刺激体液免疫反应以及细胞免疫反应，说明可溶性LAG-3Ig可作为疫苗佐剂发挥作用（El Mir and Triebel(2000)J.Immunol.164:5583-5589）。此外，已显示可溶性人类LAG-3Ig扩大了在体外产生I型肿瘤特异性免疫（Casati et al.(2006)Cancer Res.66:4450-4460）。在Triebel(2003)Trends Immunol.24:619-622中对LAG-3的功能活性进行了进一步综述。鉴于以上原因，用于调整LAG-3活性的另外的药剂系令人感兴趣的。
发明概述
本披露提供了分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，该等人类单克隆抗体特异性结合LAG-3并且具有所希望的功能特性。该等特性包括与人类LAG-3的高亲和力结合，与人类和猴类LAG-3（猕猴和/或恒河猴LAG-3）结合，但不与小鼠LAG-3结合，抑制LAG-3与主要组织相容性（MHC）II类分子的结合和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。例如，本发明之抗体可被用于（如，在携带肿瘤的受试者或携带病毒的受试者中）检测LAG-3蛋白或刺激抗原特性性T细胞应答。
一方面，本发明涉及分离的之人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体结合人类LAG-3，并且表现出以下特性中的至少一种：
(a)结合猴类LAG-3；
(b)不结合小鼠LAG-3；
(c)抑制LAG-3与主要组织相容性（MHC）II类分子的结合；以及
(d)刺激免疫反应。
较佳的是，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少两种。更佳的是，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少三种。甚至更佳的是，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的全部四种。
在一较佳的实施方案中，该抗体刺激抗原特异性T细胞应答，例如抗原特异性T细胞应答中白介素2（IL-2）之产生。在其它实施方案中，该抗体刺激免疫反应，例如抗肿瘤应答（例如在体内肿瘤移植物模型中抑制肿瘤生长）或自身免疫反应（例如在NOD小鼠中促进糖尿病的形成）。在另一较佳的实施方案中，该抗体结合人类LAG-3的表位，该表位包括氨基酸序列PGHPLAPG（SEQ ID NO:76）。在又另一较佳的实施方案中，该抗体结合人类LAG-3的表位，该表位包括氨基酸序列HPAAPSSW（SEQ ID NO:77）或PAAPSSWG（SEQ ID NO:78）。在仍又其它的实施方案中，该抗体以1x10-7M或更小的KD与人类LAG-3相结合，或以1x10-8M或更小的KD与人类LAG-3相结合，或以5x10-9M或更小的KD与人类LAG-3相结合，或以1x10-9M或更小的KD与人类LAG-3相结合。在一实施方案中，该抗体藉由免疫组织化学法使垂体组织染色，而在另一实施方案中，该抗体藉由免疫组织化学法不使垂体组织染色。
在另一方面，本发明涉及分离的人类单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体与参考抗体交叉竞争而结合人类LAG-3，其中该参考抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:43；
(b)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:44；
(c)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:39，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:45；
(d)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:46；
(e)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:41，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:47；或者
(f)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:48。
在一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ IDNO:48的轻链可变区。
在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区系人类VH3-20基因、人类VH4-34基因、人类VH3-33基因或VH1-24基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异地结合人类LAG-3。在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L18基因、人类VK L6基因或人类VK A27基因的产物或是衍生于该基因，其中该抗体特异地结合人类LAG-3。在一较佳的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，该重链可变区系人类VH4-34基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因的产物或衍生于该基因；
(b)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK A27基因的产物或衍生于该基因；
(c)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-20基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L18基因的产物或衍生于该基因；
(d)重链可变区，该重链可变区系人类VH1-24基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因的产物或衍生于该基因；或者
(e)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因的产物或衍生于该基因；
其中该抗体特异地结合人类LAG-3。
在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO:37至42；
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO:43至48；
其中该抗体特异性结合人类LAG-3。
一较佳的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:43。
另一较佳的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:44。
另一较佳的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:39；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:45。
另一较佳的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:46。
另一较佳的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:41；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:47。
另一较佳的组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:48。
本发明之抗体可以是例如全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型。在一较佳的实施方案中，该抗体系IgG4同种型。在另一较佳的实施方案中，该抗体系IgG4同种型，其在重链恒定区的铰链区（在与如Angal et al.(1993)Mol.Immunol.30:105-108中所说明的位置241对应的位置）具有从丝氨酸到脯氨酸的突变，这样重链之间二硫桥的异质性被减小或消除。可替代地，该抗体可以是诸如Fab、Fab’或Fab’2片段之抗体片段，或单链抗体。
本披露还提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包括连接到治疗剂（例如细胞毒素或放射性同位素）的本发明之抗体、或其抗原结合部分。本披露还提供了双特异性分子，该双特异性分子包括本发明的抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分与第二功能模块相连接，该第二功能模块具有与所述抗体或其抗原结合部分相比不同的结合特异性。
还提供了含有本发明的抗体、或其抗原结合部分、或免疫缀合物、或双特异性分子，以及药学上可接受的载体的组合物。
本披露还涵盖了对本发明之抗体、或其抗原结合部分进行编码的核酸分子，连同包括此类核酸的表达载体以及包括此类表达载体的宿主细胞。还提供了使用包括此类表达载体的宿主细胞制备抗LAG-3抗体的方法，并且该等方法可包括以下步骤：(i)在该宿主细胞中表达该抗体以及(ii)从该宿主细胞中分离该抗体。
在另一方面，本发明涉及使用本发明的抗LAG-3抗体来刺激免疫反应的方法。例如，在一实施方案中，本发明提供了刺激抗原特异性T细胞应答的方法，该方法包括使所述T细胞与本发明的抗体相接触，这样刺激了抗原特异性T细胞应答。在一较佳的实施方案中，刺激了由抗原特异性T细胞进行的白介素2之产生。在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激免疫反应（例如，抗原特异性T细胞应答）的方法，该方法包括给予该受试者本发明之抗体，这样刺激了该受试者中的免疫反应（例如，抗原特异性T细胞应答）。在一较佳的实施方案中，该受试者系携带肿瘤的受试者，并且刺激了针对该肿瘤的免疫反应。在另一较佳的实施方案中，该受试者系携带病毒的受试者，并且刺激了针对该病毒的免疫反应。
在另一方面，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给予该受试者本发明之抗体，这样该受试者中的肿瘤生长受到抑制。又在另一方面，本发明提供了治疗受试者中病毒感染的方法，该方法包括给予该受试者本发明之抗体，这样该受试者中的病毒感染得到治疗。
又在另一方面，本发明提供了在受试者中刺激免疫反应的方法，该方法包括给予该受试者抗LAG-3抗体以及至少一种另外的免疫刺激性抗体，如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体，这样在该受试者中刺激了免疫反应，例如以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及抗PD-1抗体。在另一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及抗PD-L1抗体。在另一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及抗CTLA-4抗体。在一实施方案中，抗LAG-3抗体系人类抗体，如本披露的抗体。可替代地，该抗LAG-3抗体可以是例如嵌合或人源化抗体。在另一实施方案中，至少一种另外的免疫刺激性抗体（例如，抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4抗体）系人类抗体。可替代地，至少一种另外的免疫刺激性抗体可以是例如嵌合或人源化抗体。
又在另一方面中，本发明涉及制备抗LAG-3抗体的方法。该方法包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，包括选自下组的CDR1序列，该组的构成为：SEQ ID NO:1至6，选自下组的CDR2序列，该组的构成为：SEQ ID NO:7至12，和/或选自下组的CDR3序列，该组的构成为：SEQ IDNO:13至14、GGY、16至18；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包括选自下组的CDR1序列，该组的构成为：SEQ ID NO:19至24，选自下组的CDR2序列，该组的构成为：SEQ ID NO:25至30，和/或选自下组的CDR3序列，该组的构成为：SEQ ID NO:31至36；
(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变之抗体序列；并且
(c)将被改变之抗体序列表达成蛋白质。
从以下详细的说明以及实施例中本披露的其它特征及优点将是清楚的，该等说明与实施例不得被解释为限制性的。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank条目、专利、以及已公开的专利申请的内容都明确地藉由引用结合在此。
附图简述
图1A示出了25F7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列（SEQ IDNO:49）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:37）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:1）、CDR2（SEQ ID NO:7）、以及CDR3（SEQ ID NO:13）区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图1B示出了25F7人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列（SEQID NO:55）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:43）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:19）、CDR2（SEQ ID NO:25）、以及CDR3（SEQ ID NO:31）区，并指明了V与J的种系来源。
图2A示出了26H10人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列（SEQID NO:50）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:38）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:2）、CDR2（SEQ ID NO:8）、以及CDR3（SEQ ID NO:14）区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图2B示出了26H10人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列（SEQID NO:56）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:44）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:20）、CDR2（SEQ ID NO:26）、以及CDR3（SEQ ID NO:32）区，并指明了V与J的种系来源。
图3A示出了25E3人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列（SEQ IDNO:51）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:39）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:3）、CDR2（SEQ ID NO:9）、以及CDR3区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图3B示出了25E3人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列（SEQID NO:57）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:45）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:21）、CDR2（SEQ ID NO:27）、以及CDR3（SEQ ID NO:33）区，并指明了V与J的种系来源。
图4A示出了8B7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列（SEQ IDNO:52）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:40）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:4）、CDR2（SEQ ID NO:10）、以及CDR3（SEQ ID NO:16）区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图4B示出了8B7人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列（SEQ IDNO:58）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:46）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:22）、CDR2（SEQ ID NO:28）、以及CDR3（SEQ ID NO:34）区，并指明了V与J的种系来源。
图5A示出了11F2人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列（SEQ IDNO:53）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:41）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:5）、CDR2（SEQ ID NO:11）、以及CDR3（SEQ ID NO:17）区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图5B示出了11F2人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列（SEQID NO:59）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:47）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:23）、CDR2（SEQ ID NO:29）、以及CDR3（SEQ ID NO:35）区，并指明了V与J的种系来源。
图6A示出了17E5人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列（SEQ IDNO:54）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:42）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:6）、CDR2（SEQ ID NO:12）、以及CDR3（SEQ ID NO:18）区，并指明了V、D、以及J的种系来源。
图6B示出了17E5人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列（SEQID NO:60）以及氨基酸序列（SEQ ID NO:48）。描绘了CDR1（SEQ ID NO:24）、CDR2（SEQ ID NO:30）、以及CDR3（SEQ ID NO:36）区，并指明了V与J的种系来源。
图7示出了25F7的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:37）与人类种系VH4-34以及JH5b氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:61以及62）的比对。
图8示出了25F7的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:43）与人类种系Vk L6以及JK2氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:63以及64）的比对。
图9示出了26H10的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:38）与人类种系VH3-33以及JH6B氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:65以及66）的比对。
图10示出了26H10的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:44）与人类种系Vk A27以及JK3氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:67以及68）的比对。
图11示出了25E3的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:39）与人类种系VH3-20以及JH4b氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:69以及70）的比对。
图12示出了25E3的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:45）与人类种系Vk L18以及JK2氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:71以及64）的比对。
图13示出了8B7的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:40）与人类种系VH4-34以及JH5b氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:61以及62）的比对。
图14示出了8B7的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:46）与人类种系Vk L6以及JK4氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:63以及72）的比对。
图15示出了11F2的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:41）与人类种系VH1-24以及JH4b氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:73以及70）的比对。
图16示出了11F2的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:47）与人类种系Vk L6以及JK1氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:63以及74）的比对。
图17示出了17E5的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:42）与人类种系VH3-33以及2-2氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:65以及70）的比对。
图18示出了17E5的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:48）与人类种系Vk L6氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:63以及75）的比对。
图19示出由猴类LAG-3cDNA的克隆pa23-5（SEQ ID NO:93）编码的蛋白质序列与Genbank存储的恒河猴LAG-3蛋白质序列（SEQ ID NO:94）（Genbank登录号XM_001108923）的比对。外环肽区以及跨膜结构域标有下划线。在两条序列之间的一处氨基酸差异（氨基酸位置419）以加粗强调。
发明详述
本披露涉及分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，该等抗体结合人类LAG-3并且具有所希望的功能特性。在某些实施方案中，本发明之抗体来源于特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR区。本披露提供了分离的抗体、制备这种抗体的方法、包括这种抗体的免疫缀合物以及双特异性分子以及包括本发明之抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本披露还涉及使用该等抗体（例如检测LAG-3蛋白）的多种方法，连同使用本发明的抗LAG-3抗体（单独或与其它免疫刺激性抗体组合）来刺激免疫反应的多种方法。因此，本披露还提供了使用本发明的抗LAG-3抗体来例如抑制肿瘤生长或治疗病毒感染的多种方法。
为了可以更容易地理解本披露，首先定义了某些术语。其它定义在整个详细说明中给出。
术语“LAG-3”指淋巴细胞活化基因3。术语“LAG-3”包括变体、同等型、同源物、直向同源物、以及旁系同源物。例如，在某些情况下，对人类LAG-3蛋白特异之抗体可能与来自于非人类的物种的LAG-3蛋白进行交叉反应。在其它实施方案中，对人类LAG-3蛋白特异之抗体可能对人类LAG-3蛋白完全特异，并且可能不表现出物种或其它类型的交叉反应性，或可能与来自某些其它物种但不是所有其它物种的LAG-3进行交叉反应（例如与猴类LAG-3而非小鼠LAG-3进行交叉反应）。术语“人类LAG-3”指人类序列LAG-3，如具有Genbank登录号NP_002277的人类LAG-3的完整氨基酸序列。术语“小鼠LAG-3”指小鼠序列LAG-3，如具有Genbank登录号NP_032505的小鼠LAG-3的完整氨基酸序列。LAG-3在本领域还称作例如CD223。人类LAG-3序列可通过具有例如保守的突变或在非保守区的突变而不同于Genbank登录号NP_002277的人类LAG-3，而LAG-3具有基本上与Genbank登录号NP_002277的人类LAG-3的生物功能相同的生物功能。例如，人类LAG-3的一项生物功能系在LAG-3的细胞外结构域中具有一个表位，该表位被本披露的一种抗体特异性地结合或者人类LAG-3的一项生物功能系与MHC II类分子结合。
术语“猴类LAG-3”旨在涵盖由旧世界猴以及新世界猴所表达的LAG-3蛋白，包括但不限于猕猴LAG-3以及恒河猴LAG-3。猴类LAG-3的一种代表性序列系在图19以及SEQ ID NO:85中示出的恒河猴LAG-3氨基酸序列，它还被储存为Genbank登录号XM_001108923。猴类LAG-3的另一种代表性序列系在图19以及SEQ ID NO:84中示出的克隆pa23-5的可替代的恒河猴序列，如在实施例3A第3小节所说明而被分离。当与Genbank所存储的序列比较时，这个可替代的恒河猴序列在位置419上显示出一处单个氨基酸的差别。
一种特定的人类LAG-3序列与Genbank登录号为NP_002277的人类LAG-3在氨基酸序列上通常会有至少90%的同一性，并且包含多个氨基酸残基，当与其它物种（如鼠类）的LAG-3氨基酸序列相比时，该等氨基酸残基将该氨基酸序列鉴定为是人源的。在某些情况下，一种人类LAG-3与Genbank登录号为NP_002277的LAG-3在氨基酸序列上可具有至少95%，或者甚至至少96%、97%、98%或99%的同一性。在某些实施方案中，与Genbank登录号为NP_002277的LAG-3序列相比，一种人类LAG-3序列会展示出不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，与Genbank登录号为NP_002277的LAG-3序列相比，该人类LAG-3可展示出不超过5个，或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。百分比同一性可以如在此处所说明进行确定。
术语“免疫反应”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子（包括抗体、细胞因子、以及补体）的作用，该作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌性细胞、或者在自身免疫或病理炎症情况下的正常人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体中清除。
“抗原特异性T细胞应答”指由T细胞产生的应答，该应答产生于用对该T细胞特异的抗原对该T细胞的刺激。由T细胞在抗原特异性刺激时产生的反应的非限制性实例包括增殖以及细胞因子的产生（例如IL-2的产生）。
此处所指之术语“抗体”包括完整抗体以及它们的任何抗原结合片段（即“抗原结合部分”）或它们的单链。完整抗体系包括由二硫键相互连接的至少两条重（H）链以及两条轻（L）链的糖蛋白。每一条重链均包括一个重链可变区（在此缩写为VH）以及一个重链恒定区。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每一条轻链均包括一个轻链可变区（在此缩写为VL）以及一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH以及VL区可以进一步被细分为多个高可变性区，被称为互补决定区（CDR），其间散布有更为保守的被称为框架区（FR）的多个区。每个VH以及VL均由三个CDR及四个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。该等抗体的恒定区能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该等宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞（例如效应细胞）以及经典补体系统的第一成分（Clq）。
此处使用之术语抗体的“抗原结合部分”（或简称为“抗体部分”），是指抗体保留特异性结合抗原（例如LAG-3蛋白）的能力的一或多种片段。已发现抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括通过在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，它实质上是带有铰链区部分的Fab（见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY（Paul ed.,3.sup.rd ed.1993）；(iv)由VH及CH1结构域构成的Fd片段；(v)由抗体的单臂的VL及VH结构域构成的Fv片段；(vi)dAb片段（Ward et al.,(1989)Nature341:544-546），它由VH结构域构成；(vii)分离的互补决定区（CDR）；以及(viii)纳米抗体（nanobody)，含有单个可变结构域及两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH系由多个分开的基因进行编码的，但是使用重组方法藉由合成接头可以将它们连接起来，使它们形成单条蛋白链，其中VL和VH区进行配对形成单价分子（被称为单链Fv（scFv）；参见例如Bird et al.(1988)Science242:423-426；以及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883）。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。该等抗体片段系使用本领域中技术人员已知的常规方法获得，并且对该等片段采用与完整抗体相同的方式进行有用性筛选。
此处所使用之“分离之抗体”旨在表示如下的抗体，它基本上不含具备不同的抗原特异性的其它抗体（例如，特异性结合LAG-3蛋白的分离之抗体基本上不含特异性结合除LAG-3蛋白以外的抗原之抗体）。然而，特异性结合人类LAG-3蛋白的分离之抗体对于其它抗原（如来自其它物种的LAG-3蛋白）可具有交叉反应性。此外，分离之抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学物。
此处使用之术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成之抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示了针对某一特定表位的单一结合特异性及亲和力。
此处使用之术语“人类抗体”旨在包括具有如下可变区之抗体，在该等可变区中，框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫蛋白序列。此外，如果该抗体包括恒定区，则该恒定区也衍生自人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可以包含不是由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基（例如，由体外随机诱变或定点诱变引入的突变或藉由体内体细胞突变引入的突变）。然而，在此所使用之术语“人类抗体”并非旨在包括这样之抗体，其中衍生自另外的哺乳动物物种（如小鼠）的种系的CDR序列已经被移植到人类框架序列上。
术语“人类单克隆抗体”指展示出单一结合特异性之抗体，该等抗体具有如下可变区，其中框架区以及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列。在一实施方案中，人类单克隆抗体系由杂交瘤产生的，该杂交瘤包括融合至永生化细胞的从转基因的非人类动物（例如转基因小鼠）处获得的B细胞，具有包括人类重链转基因及轻链转基因的基因组。
此处使用之术语“重组人类抗体”包括藉由重组的手段制备、表达、产生、或分离的所有人类抗体，例如(a)从动物（例如小鼠）或由其制备出的杂交瘤（以下将进一步说明）中分离之抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因系转基因性的或转染色体性的、(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞（例如，从转染瘤）中分离之抗体、(c)从重组的组合的人类抗体文库中分离之抗体、以及(d)藉由任何其它方法制备、表达、产生或分离之抗体，该等方法涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上。此类重组的人类抗体具有如下可变区，其中框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，此类重组的人类抗体能经受体外诱变（或者，当使用对于人类Ig序列而言转基因的动物时，经受体内体细胞诱变），并且因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列系这样的序列，该等序列也许并不自然地存在于体内的人类抗体种系全集之中，尽管该等序列衍生自人类种系的VH和VL序列及与其相关。
术语“同种型”指由重链恒定区基因进行编码之抗体的种类（例如IgM或IgG1）。
短语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”此处可以与术语“特异地结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”指人类抗体的任何已修饰的形式，例如，该抗体与另一试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”旨在表示以下抗体，其中衍生自另一哺乳动物物种（如小鼠）的种系的CDR序列已被移植到人类框架序列上。可以在人类框架序列中进行另外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”旨在表示以下抗体，其中可变区序列系衍生于一物种而恒定区序列系衍生于另一物种，例如如下抗体，其中可变区序列衍生于小鼠抗体而恒定区序列衍生于人类抗体。
在此所使用“特异性结合人类LAG-3”之抗体意指如下抗体，它结合人类LAG-3蛋白（并且可能是来自一或多种非人类物种的LAG-3蛋白），但基本上不结合非LAG-3蛋白。较佳的是，该抗体以“高亲和力”（也就是以1x10-7M或更小的KD）结合人类LAG-3蛋白，更佳地为5x10-8M或更小，更佳地为3x10-8M或更小，更佳地为1x10-8M或更小，更佳地为5x10-9M或更小，或甚至更佳地为1x10-9M或更小。
此处使用之术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以1x10-6M或更大，更佳地为1x10-5M或更大，更佳地为1x10-4M或更大，更佳地为1x10-3M或更大，甚至更佳地为1x10-2M或更大的KD结合蛋白质或细胞。
此处使用之术语“Kassoc”或“Ka”旨在表示特定之抗体-抗原相互作用的结合速率，而此处使用之术语“Kdis”或“Kd,”旨在表示特定之抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用之术语“KD,”旨在表示解离常数，它系由Kd与Ka之比（即Kd/Ka）得到，并被表示为摩尔浓度（M）。抗体的KD值可以使用本领域已经充分确认的方法进行确定。确定抗体的KD的一较佳方法系藉由使用表面等离子共振，较佳地是使用例如系统的生物传感器系统。
术语IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原而言抗体具有的KD为1×10-7M或更小，更佳地为5×10-8M或更小，甚至更佳地为1×10-8M或更小，甚至更佳地为5×10-9M或更小，并且甚至更佳地为1x10-9M或更小。然而，对于其它抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，对于IgM同种型而言，“高亲和力”结合是指抗体具有的KD为10-6M或更小，更佳地为10-7M或更小，甚至更佳地为10-8M或更小。
术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖动物、以及爬行动物，尽管哺乳动物系较佳的，如非人类的灵长类、绵羊、犬、猫、牛、以及马。
在以下各分部中进一步详细地说明了本发明的不同方面。
具有特定功能特性的抗LAG-3抗体
本发明抗体之特征为抗体特定的功能性特征或特性。例如，该等抗体与人类LAG-3特异地结合，并且可与来自某些其它物种的LAG-3相结合，例如猴类LAG-3（例如猕猴、恒河猴），但是基本上不与来自某些其它物种的LAG-3（例如小鼠LAG-3）相结合。较佳的是，本发明之抗体以高亲和力与人类LAG-3相结合。
该抗体刺激免疫反应（如抗原特异性T细胞应答）的能力可藉由（例如）该抗体在抗原特异性T细胞应答中刺激白介素2（IL-2）的产生来说明。在某些实施方案中，本发明的抗体与人类LAG-3结合并且表现出刺激抗原特异性T细胞应答的能力。在某些实施方案中，本发明的抗体与人类LAG-3结合但并不表现出刺激抗原特异性T细胞应答的能力。评估抗体刺激免疫反应的能力的其它手段包括该抗体（如在体内肿瘤移植物模型中）抑制肿瘤生长的能力（参见，例如实施例6）或该抗体刺激自身免疫反应的能力，例如在自身免疫模型中促进自身免疫疾病的发生的能力，例如在NOD小鼠模型中促进糖尿病的发生的能力（参见，例如实施例7）。
本发明之抗体与LAG-3的结合可用本领域已充分确认的一或多种技术进行评估。例如，在一较佳的实施方案中，抗体可用流式细胞术测定法进行测试，其中该抗体与表达人类LAG-3的细胞系进行反应，例如已经被转染而能在它们的细胞表面表达LAG-3（例如人类LAG-3、猴类LAG-3（例如，恒河猴或猕猴）或小鼠LAG-3）的CHO细胞（参见，例如实施例3A中适宜的测定）。在流式细胞术测定中使用的其它适宜的细胞包括表达天然LAG-3的由抗CD3刺激的CD4+活化的T细胞。另外地或可替代地，抗体的结合，包括结合动力学（例如KD值）可在BIAcore结合测定中进行测试（参见，例如实施例3B中适宜的测定）。还有其它适宜的结合测定包括ELISA测定，例如使用重组的LAG-3蛋白（参见，例如实施例1中适宜的测定）。
较佳的是，本发明之抗体以5x10-8M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，以2x10-8M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，以5x10-9M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，以4x10-9M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，以3x10-9M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，以2x10-9M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，以1x10-9M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，以5x10-10M或更小的KD与LAG-3蛋白结合，或1x10-10M或更小的KD与LAG-3蛋白结合。
典型地，本发明的抗体与淋巴样组织（如扁桃体、脾脏或胸腺）中的LAG-3相结合，这可藉由免疫组织化学法进行检测。另外地，如在实施例8中进一步说明，本发明的某些抗LAG-3抗体如藉由免疫组织化学法所测量使垂体组织染色（例如，被保留在垂体中），而本发明的其它抗LAG-3抗体如藉由免疫组织化学法所测量不使垂体组织染色（例如，不被保留在垂体中）。因此，在一实施方案中，本发明提供了藉由免疫组织化学法使垂体组织染色的人类抗LAG-3抗体，而在另一实施方案中，本发明提供了藉由免疫组织化学法不使垂体组织染色的人类抗LAG-3抗体。
本发明较佳之抗体系人类单克隆抗体。另外地或可替代地，该抗体可以是（例如）嵌合或人源化单克隆抗体。
单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5
较佳的本发明之抗体系如在实施例1和2中所说明进行分离以及结构表征的人类单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VH氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:37至42中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VK氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:43至48中。
考虑到该等抗体中的每一种均可结合人类LAG-3，可将VH和VL序列进行“混合并匹配”以产生本发明的其它抗LAG-3结合分子。较佳的是，当VH和VL链被混合并匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列被结构相似的VH序列代替。同样地，较佳的是来自特定VH/VL对的VL序列被结构相似的VL序列代替。
因此，一方面，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO:37至42；以及
(b)轻链可变区，包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO:43至48；
其中该抗体特异性结合人类LAG-3。
较佳的重链及轻链组合包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:43；
(b)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:44；
(c)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:39，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:45；
(d)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:46；
(e)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:41，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:47；或者
(f)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:48。
在另一方面，本披露提供了多种抗体，该等抗体包括25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的重链及轻链的CDR1、CDR2及CDR3，或它们的组合。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VH CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:37至42中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VH CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:43至48中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VH CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:13至14、GGY以及16至18中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VK CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:19至24中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VK CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:25至30中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的VK CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:31至36中。CDR区系用Kabat系统绘出的（Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242）。
在该等抗体中每一种均能结合人类LAG-3、并且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2、及CDR3区提供的条件下，VH CDR1、CDR2、以及CDR3序列与VL CDR1、CDR2、以及CDR3序列可以被“混合并匹配”（即，来自不同抗体的CDR可以被混合并匹配，尽管每种抗体均必须包含VH CDR1、CDR2、以及CDR3以及VL CDR1、CDR2，以及CDR3），以产生本发明的其它抗LAG-3结合分子。使用以上所说明及实例中的结合测定（例如，ELISA、分析）可以测试此类“混合并匹配”之抗体的LAG-3结合。较佳的是，当VH CDR序列被混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被结构上相似的一或多种CDR序列代替。类似地，当VL CDR序列被混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列较佳的是被结构上相似的一或多种CDR序列代替。对于普通技术人员非常清楚的是，藉由用来自在此披露的单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的CDR序列的结构类似序列代替一或多个VH和/或VL CDR区序列可以产生新颖的VH以及VL序列。
因此，在另一方面，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区CDR1，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:1至6；
(b)重链可变区CDR2，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:7至12；
(c)重链可变区CDR3，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:13至14、GGY以及16至18；
(d)轻链可变区CDR1，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:19至24；
(e)轻链可变区CDR2，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:25至30；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:31至36；
其中该抗体特异性结合人类LAG-3。
在一较佳的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:1；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:7；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:13；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:19；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:25；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:31。
在另一较佳的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:2；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:8；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:14；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:20；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:26；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:32。
在另一较佳的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:3；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:9；
(c)重链可变区CDR3，包括GGY；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:21；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:27；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:33。
在另一较佳的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:4；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:10；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:16；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:22；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:28；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:34。
在另一较佳的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:5；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:11；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:17；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:23；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:29；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:35。
在另一较佳的实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:6；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:12；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:18；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:24；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:30；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:36。
在本领域中熟知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2域，可以单独确定抗体对关联抗原的结合特异性，并且可预测地产生多种抗体，该等抗体具有基于共同的CDR3序列的相同的结合特异性。参见，例如Klimka et al.,British J.of Cancer83(2):252-260(2000)；Beiboer et al.,J.Mol.Biol.296:833-849(2000)；Rader et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910-8915(1998)；Barbas et al.,J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(1994)；Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2529-2533(1995)；Ditzel et al.,J.Immunol.157:739-749(1996)；Berezov et al.,BIAjournal8:Scientific Review8(2001)；Igarashi et al.,J.Biochem(Tokyo)117:452-7(1995)；Bourgeois et al.,J.Virol72:807-10(1998)；Levi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4374-8(1993)；Polymenis and Stoller,J.Immunol.152:5218-5329(1994)及Xu andDavis,Immunity13:37-45(2000)。还参见美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905以及5,760,185。该等参考文献中每一篇的全文均藉由引用由此结合。
因此，本披露提供的单克隆抗体包括来自如下抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域，该抗体衍生自人类或非人类动物，其中该单克隆抗体能够特异性结合人类LAG-3。在某些方面，本披露提供的单克隆抗体包括来自非人类抗体（如小鼠或大鼠抗体）的一或多个重链和/或轻链CDR3域，其中该单克隆抗体能够特异性结合LAG-3。在一些实施方案中，此类创造性之抗体包括来自非人类抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域，与相应的亲本的非人类抗体比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
在其它方面，本披露提供的单克隆抗体包括来自人类抗体（例如，获自非人类动物的人类抗体）的一或多个重链和/或轻链CDR3域，其中该人类抗体能够特异性结合人类LAG-3。在其它方面，本披露提供的单克隆抗体包括来自第一人类抗体（例如获自非人类动物的人类抗体）的一或多个重链和/或轻链CDR3域，其中该第一人类抗体能够特异性结合人类LAG-3，并且其中来自该第一人类抗体的CDR3域替换在缺乏针对LAG-3的结合特异性的人类抗体中的CDR3域，以产生能特异性结合人类LAG-3的第二人类抗体。在一些实施方案中，此类创造性之抗体包括来自该第一人类抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域，与相应的亲本的第一人类抗体相比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
具有特定种系序列之抗体
在某些实施方案中，本发明之抗体包括来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在一较佳的实施方案中，本披露提供分离的单克隆抗体、或其抗原结合部位，包括重链可变区，该重链可变区系人类VH3-20基因、人类VH4-34基因、人类VH3-33基因或人类VH1-24基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在另一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L18基因、人类VK L6基因或人类VK A27基因的产物或是衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类VH3-20基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L18基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类VH4-34基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK A27基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类VH1-24基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。
此类抗体还可以拥有一或多项以上详细说明的功能特征，例如高亲和力与人类LAG-3结合、与猴类LAG-3结合、缺乏与小鼠LAG-3的结合、抑制LAG-3与MHC II类分子结合的能力、和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。
分别具有VH3-20及VK L18的VH及VL之抗体的实例系25E3抗体。分别具有VH4-34及VK L6的VH及VL之抗体的实例系25F7抗体以及8B7抗体。分别具有VH3-33及VK A27的VH及VL之抗体的实例系26H10抗体。分别具有VH1-24及VK L6的VH及VL之抗体的实例系11F2抗体。分别具有VH3-33及VK L6的VH及VL之抗体的实例系17E5抗体。
如在此所用，如果人类抗体的可变区从使用特定人类种系免疫球蛋白基因的系统中获得，则该抗体包含如下重链或轻链可变区，该等可变区系该种系序列的“产物”或者“衍生于”该种系序列。此类系统包括用所感兴趣的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用所感兴趣的抗原对在噬菌体上进行展示的人类免疫球蛋白基因文库进行筛选。人类抗体系人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列，藉由将该人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近（即最大%同一性）该人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列，就可以将该人类抗体鉴定为是此类抗体。人类抗体系特定的人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列，与该种系序列相比，该人类抗体可含有氨基酸差异，由于例如自然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。然而，经定的人类抗体典型地与由人类种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90%的同一性，并且当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列（例如，鼠类种系序列）进行比较时，该选定的人类抗体包含将该人类抗体鉴定为人类的氨基酸残基。在某些情况中，人类抗体与由该种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95%、或甚至至少96%、97%、98%，或99%的同一性。典型地，与由特定的人类种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，衍生于该人类种系序列的人类抗体会展示不超过10处氨基酸差异。在某些情况中，与由该种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，该人类抗体可以展示出不超过5处，或甚至不超过4处、3处、2处，或1处氨基酸差异。
同源抗体
在又另一实施方案中，本发明之抗体包括含有与此处说明的较佳抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链可变区以及轻链可变区，并且其中该抗体保留本发明的抗LAG-3抗体的所希望的功能特性。例如，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区包括氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的同源性，该组的构成为SEQ ID NO:37至42；
(b)该轻链可变区包括氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的同源性，该组的构成系：SEQ ID NO:43至48；以及
(c)该抗体特异性地结合人类LAG-3。
另外地或可替代地，该抗体还可以拥有一或多项以上所讨论的以下功能特性，例如高亲和力与人类LAG-3结合、与猴类LAG-3结合、缺乏与小鼠LAG-3的结合、抑制LAG-3与MHC II类分子结合的能力、和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。
在不同的实施方案中，该抗体可以是（例如）人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可与以上给出的序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。与以上给出的序列的VH与VL区具有高（即，80%或更大）同源性的VH与VL区之抗体，可以藉由以下方式获得：对编码SEQ ID NO:49至54或55至60的核酸分子进行诱变（例如，定点诱变或PCR介导的诱变），接着使用在此说明的功能测定针对保留的功能（即，以上所给出的功能）测试所编码的经改变之抗体。
如在此所使用，两条氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两条序列之间的百分比同一性。在这两条序列之间的百分比同一性系该等序列共享的相同位置的数目的函数（即，%同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x100），考虑到缺口（gap）的数目、以及每个缺口的长度，需要将它们引入用于这两条序列的最佳比对。正如在以下的非限制性实例中说明，使用数学算法可以完成两条序列之间的序列比较以及百分比同一性的确定。
使用已经被整合至ALIGN程序（2.0版本）中的E.Meyers和W.Miller（Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988)）的算法，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12以及缺口罚分为4，可以确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，使用已经被整合至GCG软件包（可在www.gcg.com上获得）中的GAP程序里的Needleman和Wunsch（J.Mol.Biol.48:444-453(1970)）的算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及缺口权重16、14、12、10、8、6、或4以及长度权重1、2、3、4、5、或6，可以确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
另外地或者可替代地，本披露的蛋白质序列可以作为“查询序列”进一步被使用，对公共数据库进行检索，例如来鉴定相关序列。使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序（版本2.0）可以进行此类检索。BLAST蛋白质检索可采用XBLAST程序，记分=50，字长=3而进行，以获得与本发明之抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的缺口比对，可如在Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所说明地使用带缺口的BLAST。当使用BLAST及带缺口的BLAST程序时，对应的程序（例如XBLAST及NBLAST）的默认参数系有用的。见www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修饰之抗体
在某些实施方案中，本发明之抗体包括含有CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区，其中该等CDR序列中的一或多个包括基于在此所说明的较佳抗体（例如，25F7、26H10、25E3、8B7、11F2、17E5）的限定的氨基酸序列、或它们的保守性修饰，并且其中所述抗体保留了本发明的抗LAG-3抗体的所希望的功能特性。在本领域中所理解的是，可以进行某些保守性序列修饰，该等保守性序列修饰并不去除抗原结合。参见，例如Brummell et al.(1993)Biochem32:1180-8；de Wildt et al.(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.(1998)Int.Immunol.10:341-6以及Beers et al.(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。因此，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)该重链可变区CDR3序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：氨基酸序列SEQ ID NO:13至14、GGY、以及16至18，以及它们的保守性修饰；
(b)该轻链可变区CDR3序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：氨基酸序列SEQ ID NO:31至36，以及它们的保守性修饰；以及
(c)该抗体特异性地结合人类LAG-3。
另外地或可替代地，该抗体还可以拥有以上所说明的以下功能特性中的一或多项，例如高亲和力与人类LAG-3结合、与猴类LAG-3结合、缺乏与小鼠LAG-3的结合、抑制LAG-3与MHC II类分子结合的能力和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。
在一较佳的实施方案中，该重链可变区CDR2序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：氨基酸序列SEQ ID No:7至12，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR2序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：氨基酸序列SEQ ID No:25至30，以及它们的保守性修饰。在另一较佳的实施方案中，该重链可变区CDR1序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：氨基酸序列SEQ ID No:1至6，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR1序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：氨基酸序列SEQ ID No:19至24，以及它们的保守性修饰。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如此处所使用，术语“保守性修饰”旨在表示氨基酸修饰，该等修饰不显著影响或改变包含该氨基酸序列之抗体的结合特征。此类保守性修饰包括氨基酸的替代、插入、以及删除。修饰可藉由本领域已知的标准技术（如，定点诱变以及PCR介导的诱变）被引入本发明之抗体中。保守性氨基酸替代系以下该等替代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。该等家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸），具有酸性侧链的氨基酸（例如天冬氨酸、谷氨酸），具有不带电荷的极性侧链的氨基酸（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非极性侧链的氨基酸（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有β分支侧链的氨基酸（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸），以及具有芳香侧链的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，在本发明之抗体的CDR区中的一或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基所替换，并且使用在此说明的功能测定可以针对保留的功能（即，以上给出的功能）测试被改变之抗体。
与抗LAG-3抗体结合到相同的表位上之抗体
在另一实施方案中，本披露提供了如下抗体，它们在LAG-3上所结合的表位与本发明的抗LAG-3单克隆抗体中的任何抗体在LAG-3上所结合的表位相同（即，该等抗体有能力与本发明的该等单克隆抗体中的任何抗体进行交叉竞争而与人类LAG-3相结合）。在较佳的实施方案中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5。
此类交叉竞争之抗体可基于它们在标准LAG-3结合测定中与25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E5交叉竞争的能力被鉴定。例如，可使用标准ELISA测定，其中将重组的人类LAG-3蛋白固定在板上，该等抗体之一用荧光进行了标记，并且评价了未被标记之抗体进行竞争使被标记之抗体脱离结合（off the binding）的能力。另外地或可替代地，也可以使用BIAcore分析来评价抗体的交叉竞争的能力。测试抗体抑制（例如）25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E5与人类LAG-3相结合的能力证明该测试抗体能与25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E5竞争而结合人类LAG-3，并因此与25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E一样结合人类LAG-3上的相同表位。在一较佳的实施方案中，与25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E5一样结合人类LAG-3上的相同表位之抗体系一人类单克隆抗体。如在实施例中所说明，可以对此类人类单克隆抗体进行制备并分离。
如在实施例3C中进一步所讨论，已经将25E3、25F7以及8E7与人类LAG-3的结合定位（map）于人类LAG-3的第一个细胞外结构域内的“额外(extra)环”区。该额外环区的序列在SEQ ID NO:79中给出。使用肽扫描实验将25E3与额外环区的结合定位于以下氨基酸序列：PGHPLAPG（SEQ ID NO:76），而将25F7与额外环区的结合定位于以下氨基酸序列：HPAAPSSW（SEQID NO:77），并且8B7与额外环区的结合定位于以下氨基酸序列：PAAPSSWG（SEQ ID NO:78）。因此，在一较佳的实施方案中，本发明提供了抗LAG-3抗体，该抗体结合人类LAG-3的如下表位，该表位包括氨基酸序列PGHPLAPG（SEQ ID NO:76）。在另一较佳的实施方案中，本发明提供了抗LAG-3抗体，该抗体结合人类LAG-3的如下表位，该表位包括氨基酸序列HPAAPSSW（SEQ ID NO:77）或PAAPSSWG（SEQ ID NO:78）。
经工程处理及经修饰之抗体
可以进一步藉由下述方式制备本发明之抗体：使用具有在此披露的VH和/或VL序列中的一或多个之抗体作为起始材料，对经修饰之抗体进行工程处理，这种经修饰之抗体可具有与起始抗体不同的特性。藉由在一或两个可变区（即VH和/或VL）中，例如在一或多个CDR区内和/或在一或多个框架区内中修饰一或多个残基，可以对抗体进行工程处理。另外地或可替代地，藉由在一或多个恒定区中修饰残基，例如改变该抗体的一或多项效应器功能，可以对抗体进行工程处理。
在某些实施方案中，可以使用CDR移植对抗体的可变区进行工程处理。抗体与靶抗原主要藉由位于六个重链及轻链互补决定区（CDR）中的氨基酸残基进行相互作用。由于这一原因，CDR中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以藉由构建包括被移植至框架序列（来自具有不同特性的不同抗体）上的来自特异的自然发生之抗体的CDR序列的表达载体，表达模拟特异的自然发生之抗体的特性的重组抗体系可能的（参见，例如Riechmannet al.(1998)Nature332:323-327；Jones et al.(1986)Nature321:522-525；Queenet al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370）。
因此，本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括包含CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2以及CDR3序列包含选自下组的氨基酸序列，该组的构成分别为：SEQID NO:1至6，SEQ ID NO:7至12，以及SEQ ID NO:13至14、GGY、以及16-18，以及包含CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2以及CDR3序列包含选自下组的氨基酸序列，该组的构成分别为：SEQID NO:19至24、SEQ ID NO:25至30，以及SEQ ID NO:31至36。因此，包含单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的VH以及VL CDR序列的此类抗体可包含不同于该等抗体的框架序列。
此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的参考文献中获得。例如，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“Vbase”人类种系序列数据库中找到（在互联网在http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得），连同在以下献中找到：如上所引述的Kabat et al.(1991)；Tomlinson et al.(1992)"The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops"J.Mol.Biol.227:776-798；以及Cox et al.(1994)"A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836；该等文献中每一篇的内容均明确地藉由引用结合在此。作为另一实例，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得：1-69（NG_0010109、NT_024637以及BC070333）、3-33（NG_0010109&NT_024637）、以及3-7（NG_0010109&NT_024637）。作为另一实例，在HCo12HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得：1-69（NG_0010109、NT_024637以及BC070333），5-51（NG_0010109&NT_024637），4-34（NG_0010109&NT_024637），3-30.3（CAJ556644），以及3-23（AJ406678）。
使用被称为带缺口的BLAST（Altschul et al.(1997)，如上所述）的序列相似性检索方法之一将抗体蛋白序列与已编制的蛋白质序列数据库进行比较，这对本领域技术人员而言系熟知的。
在本发明之抗体中使用的较佳框架序列系那些结构上与由本发明的选定之抗体所使用的框架序列相似的框架序列，例如类似于由本发明较佳的单克隆抗体所使用的VH3-20（SEQ ID NO:69）、VH4-34（SEQ ID NO:61）、VH3-33（SEQ ID NO:65）、或VH1-24（SEQ ID NO:73）框架序列和/或VKL18（SEQ ID NO:71）、VK L6（SEQ ID NO:63）或VK A27（SEQ ID NO:67）框架序列。VH CDR1、CDR2、以及CDR3序列，以及VK CDR1、CDR2、以及CDR3序列可以被移植至如下框架区上，该等框架区具有与在从中衍生出该框架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者该等CDR序列可以被移植至如下框架区上，该等框架区与该等种系序列相比含有一或多处突变。例如，已发现在某些情况下在框架区内对残基进行突变可能是有益的，以保持或增强该抗体的抗原结合能力（参见，例如美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370）。
另一类型的可变区修饰系在VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善所感兴趣之抗体的一或多项结合特性（例如亲和力）。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入一或多处突变，并且对抗体的结合、或其它所感兴趣的功能特性的作用可以如在此说明的以及在实施例中提供的体内或体外测定中进行评估。引入较佳的是保守性修饰（如以上所讨论）。该等突变可以是氨基酸替代、插入、或删除，但较佳地是替代。此外，典型地在CDR区中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一实施方案中，本披露提供了分离的抗LAG-3单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区包括：(a)VH CDR1区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:1至6，或与SEQID NO:1至6相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:7至12，或与SEQ ID NO:7至12相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:13至14、GGY以及16至18，或与SEQ ID NO:13至14、GGY以及16至18相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；(d)VLCDR1区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:19至24，或与SEQ ID NO:19至24相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:25至30，或与SEQ ID NO:25至30相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:31至36，或与SEQ ID NO:31至36相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列。
本发明的工程化之抗体包括以下抗体：其中在VH和/或VL内已经对框架残基进行了修饰，例如改善了抗体的特性。典型地进行了此类框架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法系使一或多个框架残基进行“回复突变”为对应的种系序列。更具体地说，已经经历了体细胞突变之抗体可以包含与从中衍生出抗体的种系序列不同的框架残基。此类残基可以藉由将该抗体框架序列与从中衍生出抗体的种系序列进行比较而被鉴定。
例如，表A示出了不同于种系的框架区氨基酸位置（使用Kabat编号系统）的区域，并示出这个位置如何藉由所指示的替代而回复突变为该种系：
另一类型的框架修饰涉及在框架区内，或甚至在一或多个CDR区内，对一或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，由此降低该抗体的潜在的免疫原性。这一方法也被称为“去免疫化”，并且美国专利公开号20030153043中进一步详细地说明了该方法。
除了在框架区或CDR区内进行的修饰之外，或可替代地，还可以对本发明之抗体进行工程处理，以在Fc区内包含修饰，以便典型地改变该抗体的一或多项功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞的细胞毒性作用。此外，本发明之抗体可以进行化学修饰（例如，一或多个化学物模块可以被附联至抗体上），或被修饰以改变其糖基化作用，再次改变该抗体的一或多项功能特性。以下对该等实施方案中的每一个均进行更详细的说明。Fc区中的残基的编号系Kabat的EU索引号的编号。
在一较佳的实施方案中，抗体系IgG4同种型抗体，该抗体包括在重链恒定区的铰链区中对应于位置228（S228P；EU索引）的位置上的丝氨酸到脯氨酸的突变。已经报导这个突变消除了铰链区中重链之间二硫桥的异质性（Angal et al.如上所述；位置241系基于Kabat编号系统的）。例如，在各种实施方案中，本发明的抗LAG-3抗体可包括连接至一人类IgG4恒定区的25F7（SEQ ID NO:37）或26H10（SEQ ID NO:38）的重链可变区，在人类IgG4恒定区中在对应于位置241的位置上的丝氨酸如在以上所述之Angal etal.中所说明已经被突变成脯氨酸。因此，对于连接至人类IgG4恒定区的25F7或26H10重链可变区而言，这种突变对应于EU索引的S228P突变。
在一实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，这样铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生了变化，例如，增加或减少。这个方法进一步说明于美国专利号5,677,425中。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化，以（例如）便于组装轻链以及重链或者增大或减小抗体的稳定性。
在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更具体地说，将一或多处氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域的界面区，这样相对于天然Fc铰链结构域的葡萄球菌蛋白A（SpA）结合而言，该抗体具有削弱的SpA结合。这一方法更详细地说明于美国专利号6,165,745中。
在另一实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。多种不同的方法系可能的。例如，如在美国专利号6,277,375中所说明，可引入以下突变中的一或多处突变：T252L、T254S、以及T256F。可替代地，为了增大生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区内进行改变以包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环中得到的补救受体（salvage receptor）结合表位，如在美国专利号5,869,046以及6,121,022中所说明。
在仍又其它的实施方案中，藉由用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变该抗体的效应器功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的一或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，这样该抗体对于效应器配体而言具有已改变的亲和力，但仍保留亲本抗体的抗原结合能力。例如，亲和力被改变的效应器配体可以是例如Fc受体或补体C1成分。这一方法更详细地说明于美国专利号5,624,821以及5,648,260中。
在另一实例中，选自氨基酸残基329、331及322的一或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，这样该抗体具有已改变的C1q结合和/或降低或已消除的补体依赖的细胞毒性作用（CDC）。这一方法更详细地说明于美国专利号6,194,551中。
在另一实例中，改变氨基酸位置231及239中的一或多个氨基酸残基，由此改变抗体的固定补体的能力。这个方法进一步说明于PCT公开文件WO94/29351中。
在又另一实例中，藉由在以下位置修饰一或多个氨基酸对Fc区进行修饰以提高该抗体介导抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）的能力和/或增加该抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这一方法进一步说明于PCT公开文件WO00/42072中。而且，已经定位出针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII以及FcRn在人类IgG1上的结合位点，并且已经说明了具有结合已被改善的变体（参见Shields et al.(2001）J.Biol.Chem.276:6591-6604）。已表明在位置256、290、298、333、334及339上特定的突变改善了对FcγRIII的结合。额外地，已表明以下组合突变体改善了FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、以及S298A/E333A/K334A。
在又另一实施方案中，对抗体的糖基化进行了修饰。例如，可以制做去糖基化之抗体（即，该抗体缺乏糖基化）。可以改变糖基化，以（例如）增加该抗体对抗原的亲和力。例如，藉由在抗体序列中改变一或多个糖基化的位点可以实现此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一或多处氨基酸替代，这导致了一或多个可变区框架糖基化位点的消除，由此在该位点处消除糖基化作用。这种去糖基化作用可增加该抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号5,714,350以及6,350,861。
另外地或可替代地，可以制做具有被改变类型的糖基化作用的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化之抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类已改变的糖基化类型增加抗体的ADCC能力。例如，藉由在具有已改变的糖基化机制的宿主细胞中表达该抗体可以实现此类碳水化合物修饰。具有已改变的糖基化机制的细胞在本领域中系已有记载的，并可被用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有已改变的糖基化之抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705以及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8（α(1,6)-岩藻糖基转移酶），这样在Ms704、Ms705、以及Ms709细胞系中表达之抗体中缺乏在它们的碳水化合物上的岩藻糖。Ms704、Ms705、以及Ms709FUT8-/-细胞系系藉由使用两种替换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因的靶向破坏而产生（参见美国专利公开号20040110704以及Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng87:614-22）。作为另一实例，EP1,176,195说明了带有在功能上被破坏的FUT8基因的细胞系（该基因对岩藻糖基转移酶进行编码），这样藉由减少或消除α-1,6键相关的酶，在这种细胞系中表达之抗体表现出低岩藻糖基化作用。EP1,176,195还说明了这样的细胞系：它们具有低的用于将岩藻糖加至与抗体的Fc区相结合的N-乙酰基葡糖胺的酶活性，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0（ATCC CRL1662）。PCT公开文件WO03/035835说明了变种的CHO细胞系Lec13细胞，它具有降低的将岩藻糖附联于与Asn（297）相连的碳水化合物的能力，这也导致在该宿主细胞中表达之抗体的低岩藻糖基化作用（还可参见Shields et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740）。具有经修饰的糖基化特性之抗体还可在鸡蛋中产生，如在PCT公开文件WO06/089231所说明。可替代地，具有经修饰的糖基化特性之抗体可在植物细胞（如浮萍（Lemna））中产生。在植物系统中用于生产抗体的方法披露于美国专利申请中，该专利申请对应于2006年8月11日提交的Alston&BirdLLP代理参考号040989/314911。PCT公开文件WO99/54342中说明了经工程处理而表达糖蛋白修饰的糖基转移酶（例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅲ（GnTIII））的细胞系，这样在经工程处理的细胞系中表达之抗体展示出增多的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高（还可参见Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17:176-180）。可替代地，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶切掉；例如，岩藻糖苷酶（α-L-岩藻糖苷酶）从抗体中除去岩藻糖基残基（Tarentino et al.(1975)Biochem.14:5516-23）。
由本披露在此所考虑之抗体的另一修饰系聚乙二醇化作用（pegylation）。可对抗体进行聚乙二醇化以例如增加该抗体的生物（例如血清）半衰期。为了对抗体进行聚乙二醇化，典型地在一或多个聚乙二醇（PEG）基团附联于该抗体或其片段的条件下，将抗体或抗体片段与PEG（如PEG的反应性酯或醛类衍生物）进行反应。较佳的是，藉由酰化反应或烷化反应使用反应性的PEG分子（或类似的反应性的水溶性聚合物）进行聚乙二醇化。在此使用之术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其它蛋白质的PEG的形式中的任何形式（如单（C1-C10）烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺）。在某些实施方案中，有待聚乙二醇化之抗体系去糖基化之抗体。对蛋白质进行聚乙二醇化的方法在本领域中系已知的，并可应用至本发明之抗体。参见例如EP0154,316以及EP0401,384。
抗体之物理特性
本披露之抗体可藉由其多种的物理特性进行表征，以检测和/或区分它们的不同类别。
本披露之抗体可在轻链或重链可变区中含有一或多个糖基化位点。此类糖基化位点可导致抗体的免疫原性提高或抗体的pK发生变化，这系因为抗原结合发生改变（Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem41:673-702；Gala andMorrison(2004)J Immunol172:5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology12:43R-56R；Parekh et al(1985)Nature316:452-7；Mimura et al.(2000)Mol Immunol37:697-706）。已知糖基化作用发生在包含N-X-S/T序列的基序中。在某些情况下，较佳地是具有不包含可变区糖基化的抗LAG-3抗体。这可以藉由选择在可变区中不包含糖基化基序之抗体，或者藉由在糖基化区域内突变残基来实现。
在一较佳的实施方案中，本披露之抗体不含有天冬酰胺同分异构位点。在N-G序列或D-G序列上有可能发生天冬酰胺的脱酰胺作用，并导致生成一异天冬氨酸残基，这将一缠绕结构引入多肽链中并且降低它的稳定性（异天冬氨酸效应）。
每种抗体均具有一独特的等电点（pI），等电点通常落在6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI典型地落在7至9.5的pH范围内，并且IgG4抗体的pI典型地落在6至8的pH范围内。推测pI在正常范围之外之抗体在体内条件下可能会有一些解折叠以及不稳定性。因此，较佳的是具有包含落入正常范围内的pI值的抗LAG-3抗体。这可以藉由选择pI在正常范围内之抗体或者藉由对带电荷的表面残基进行突变来实现。
每种抗体均具有特征性的解链温度，解链温度越高表明在体内的总体稳定性越好（Krishnamurthy R and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol3:361-71）。通常，较佳的是TM1（开始解折叠的温度）大于60℃，较佳的是大于65℃，甚至更佳的是大于70℃。使用差示扫描热量法（Chen et al(2003)Pharm Res20:1952-60；Ghirlando et al(1999)Immunol Lett68:47-52）或者圆二色性法（Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci40:343-9）可以测量抗体的解链温度。
在一较佳的实施方案中，选择不会快速降解之抗体。使用毛细管电泳法（CE）以及MALDI-MS可以测量抗体的降解（Alexander AJ and Hughes DE(1995)Anal Chem67:3626-32）。
在另一较佳的实施方案中，选择具有最低限度的聚集作用之抗体，聚集作用可能导致触发不想要的免疫反应和/或经改变的或不良的药物动力学特性。总体上，可接受之抗体的聚集度系25%或更低，较佳地是20%或更低，甚至更佳地是15%或更低，甚至更佳地是10%或更低，并甚至更佳的是5%或更低。可以使用几种技术来测量聚集，所述技术包括大小排阻柱（SEC）、高效液相层析（HPLC）、以及光散射法。
工程化抗体的方法
如以上所讨论，藉由修饰VH和/或VL序列，或其附联的一或多个恒定区，可以使用具有在此披露的VH和VL序列的抗LAG-3抗体以产生新的抗LAG-3抗体。因此，在本发明的另一方面，使用本发明的抗LAG-3抗体（如25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5）的结构特征来产生在结构上相关的抗LAG-3抗体，该抗体保留了本发明之抗体的至少一功能特性，例如结合人类LAG-3。例如，如以上所讨论，可以将25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的一或多个CDR区，或它们的突变与已知的框架区和/或其它CDR重组地组合，以产生另外的重组工程化的本发明的抗LAG-3抗体。其它类型的修饰包括上节中说明的那些修饰。用于工程化方法的起始材料系在此提供的VH和/或VL序列中的一或多个序列，或它们的一或多个CDR区。为了产生工程化之抗体，不必实际地制出一抗体（即，表达成一蛋白），该抗体具有在此提供的VH和/或VL序列中的一或多个序列、或它们的一或多个CDR区。相反，在一或多个序列中所包含的信息被用作起始材料来创造从一或多个原始序列所衍生的一或多个“第二代”序列，并接着制备该一或多个“第二代”序列并将其表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本披露提供了用于制备抗LAG-3抗体的一种方法，包括：
(a)提供：(i)一重链可变区抗体序列，包括选自下组的一CDR1序列，该组的构成为：SEQ ID NO:1至6，选自下组的一CDR2序列，该组的构成为：SEQ ID NO:7至12，和/或选自下组的一CDR3序列，该组的构成为：SEQ ID NO:13至14、GGY、16至18；和/或(ii)一轻链可变区抗体序列，包括选自下组的一CDR1序列，该组的构成为：SEQ ID NO:19至24，选自下组的一CDR2序列，该组的构成为：SEQ ID NO:25至30，和/或选自下组的一CDR3序列，该组的构成为：SEQ ID NO:31至36；
(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变之抗体序列；并且
(c)将被改变之抗体序列表达成一蛋白。
可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达被改变之抗体序列。
较佳的是，由一或一些经改变之抗体序列所编码之抗体系以下抗体，它（们）保留了在此说明的抗LAG-3抗体中的一种、一些或全部功能特性，该等功能特性包括但不限于：
(i)与人类LAG-3的高亲和力结合；
(ii)结合猴类LAG-3；
(iii)缺乏与小鼠LAG-3结合；
(iv)抑制LAG-3与MHC II类分子相结合的能力；和/或
(v)刺激一免疫反应（例如，抗原特异性T细胞应答）的能力。
使用本领域可获得的和/或在此所说明的标准测定（例如实施例中所给出那些测定）评定被改变之抗体的功能特性。
在本发明的工程化抗体的方法的某些实施方案中，可以沿抗LAG-3抗体编码序列的全长或一部分随机地或选择性地引入突变，并针对结合活性和/或在此说明的其它功能特性可对得到的经修饰的抗LAG-3抗体进行筛选。已在本领域中说明了突变的方法（参见，例如PCT公开文件WO02/092780以及WO03/074679）。
编码本发明抗体之核酸分子
本发明的另一方面涉及对本发明之抗体进行编码的核酸分子。该等核酸可存在于整个细胞中、细胞裂解物中、或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。藉由标准的技术，包括用碱/SDS处理、CsCl成带（CsCl banding）、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳、以及其它的本领域熟知的技术，当将核酸从其它的细胞成分或其它污染物，如其它细胞核酸或蛋白中纯化出来，核酸系“分离的”或“使之基本上是纯的”。参见Ausubel,et al.,ed.(1987)Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在一较佳的实施方案中，该核酸为cDNA分子。
使用标准的分子生物学技术可以获得本发明的核酸。对于藉由杂交瘤表达之抗体（例如，如以下进一步说明从携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠中制备的杂交瘤）而言，藉由标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得对由杂交瘤制作的抗体的轻链以及重链进行编码的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得之抗体（例如，使用噬菌体展示技术）而言，可以从该基因文库中回收编码此类抗体的核酸。
本发明的较佳的核酸分子系对25E3、25F7、8B7、26H10、11F2以及17E5单克隆抗体的VH以及VL序列进行编码的核酸分子。对25E3、25F7、8B7、26H10、11F2以及17E5的VH序列进行编码的DNA序列分别示于SEQID NO:49至54。对25E3、25F7、8B7、26H10、11F2以及17E5的VL序列进行编码的DNA序列分别示于SEQ ID NO:55至60。
一旦获得了编码VH和VL区段的DNA片段，则藉由标准的重组DNA技术（例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因）可以对该等DNA片段进行进一步操作。在该等操作中，编码VL或VH的DNA片段被可操作地连接至编码另一蛋白（如一抗体恒定区或一柔性接头）的另一条DNA片段上。在本文中使用之术语“可操作地连接”旨在说明将这两个DNA片段连接，这样由这两条DNA片段编码的氨基酸序列仍在阅读框内。
藉由将编码VH的DNA可操作地连接至另一编码重链恒定区（CH1、CH2及CH3）的DNA分子，可以将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中系已知的（参见例如Kabat etal.(1991)，如上所述），并且包括该等区域的DNA片段可藉由标准PCR扩增获得。该重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最佳地是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可以将编码VH的DNA可操作地连接至另一仅对重链CH1恒定区进行编码的DNA分子。
藉由将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子上，可以将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因（连同Fab轻链基因）。人类轻链恒定区基因的序列在本领域系已知的（参见，例如Kabatet al.，如上所述），并且涵盖该等区域的DNA片段可藉由标准的PCR扩增获得。在较佳的实施方案中，该轻链恒定区可以为κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至另一条编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段，这样VH和VL序列可被表达为连续的单链蛋白，其中VH和VL区域藉由柔性接头进行连接（参见，例如Bird et al.(1988)Science242:423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty et al.,(1990)Nature348:552-554）。
本发明之单克隆抗体的生产
使用熟知的Kohler and Milstein(1975)Nature256:495的体细胞杂交（杂交瘤）技术可以产生本披露的单克隆抗体（单抗）。产生单克隆抗体的其它实施方案包括B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合抗体或人源化抗体在本领域也是熟知的。参见，例如美国专利号4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370，它们的全文内容藉由引用特定地结合在此。
在一较佳的实施方案中，本发明之抗体系人类单克隆抗体。使用携带部分的人类免疫体系而不是小鼠体系的转基因或转染色体小鼠，可以产生针对人类LAG-3的此类人类单克隆抗体。该等转基因小鼠和转染色体小鼠包括在此分别称作HuMAb及KM的小鼠，并在此共同称作“人类Ig小鼠”。
HuMAb（Inc.）含有对非重排的人类重链（μ以及γ）以及κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因微型基因座，并含有使内源性μ和γ链基因座失活的靶向突变（见，例如Lonberg et al.(1994)Nature368(6474):856-859）。因此，该等小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达减少；并且响应于免疫，所引入的人类重链以及轻链转基因经历了类别转换以及体细胞突变以产生高亲和力的人类IgGκ单克隆抗体（Lonberg et al.(1994)，如上所述；在Lonberg(1994)Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101进行综述；Lonberg,N.and Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93以及Harding and Lonberg(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546）。HuMAb的制备及用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步说明于Taylor et al.(1992)Nucleic Acids Research20:6287-6295；Chen et al.(1993)International Immunology5:647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics4:117-123；Chen et al.(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor et al.(1994)International Immunology6:579-591；以及Fishwild et al.(1996)Nature Biotechnology14:845-851中，所有该等文献的全文内容均藉由引用特定地结合在此。进一步参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,429；以及5,545,807；PCT公开号WO92/03918；WO93/12227；WO94/25585；WO97/13852；WO98/24884；WO99/45962以及WO01/14424，它们的全文内容均藉由引用结合在此。
在另一实施方案中，使用在转基因以及转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠可以生产本发明的人类抗体，所述小鼠例如是携带人类重链转基因以及人类轻链转染色体的小鼠。这种小鼠在此处称作“KM”，并详细地说明于PCT公开文件WO02/43478中。这种小鼠的一种经修饰的形式（该形式进一步包括内源性FcγRIIB受体基因的纯合破坏）还说明于PCT公开文件WO02/43478中，并在此处称作“KM/FCGR2D”。此外，还可使用带有HCo7或HCo12重链转基因或带有这二者的小鼠。
另外的转基因动物实施方案包括Xenomouse（Abgenix,Inc.，美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584以及6,162,963）。另外的实施方案包括“TC小鼠”（Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727）以及携带人类重链以及轻链转染色体的牛（Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology20:889-894；PCT公开文件WO02/092812）。该等专利以及公开文件的全文内容均藉由引用特定地结合在此。
在一实施方案中，使用筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备本发明的人类单克隆抗体。参见，例如美国专利号5,223,409；5,403,484；5,571,698；5,427,908；5,580,717；5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；以及6,593,081，它们的全文内容均藉由引用结合在此。
使用SCID小鼠也可制备本发明的人类单克隆抗体，其中人类免疫细胞已被重组进入SCID小鼠，这样在免疫接种时可产生人类抗体应答。参见，例如美国专利号5,476,996以及5,698,767，它们的全文内容均藉由引用结合在此。
在另一实施方案中，使用噬菌体展示来制备人类抗LAG-3抗体，其中该噬菌体包括对之前用LAG-3进行免疫的转基因动物产生之抗体进行编码的核酸。在一较佳的实施方案中，该转基因动物系HuMab、KM、或Kirin小鼠。参见，例如美国专利号6,794,132，其全文内容藉由引用结合在此。
人类Ig小鼠之免疫接种
在本发明的一实施方案中，用经纯化的或富集的LAG-3抗原制备物、重组的LAG-3蛋白、或表达LAG-3蛋白的细胞对人类Ig小鼠进行免疫。参见，例如Lonberg et al.(1994)，如上所述;Fishwild et al.(1996)，如上所述；PCT公开文件WO98/24884或WO01/14424，它们的全文内容藉由引用结合在此。在一较佳的实施方案中，用5至50μg的LAG-3蛋白对6至16周龄的小鼠进行免疫。可替代地，使用与非LAG-3多肽相融合的一部分LAG-3。
在一实施方案中，转基因小鼠用完全弗氏佐剂中的LAG-3抗原经腹膜内（IP）或静脉内（IV）进行免疫，接着用非完全弗氏佐剂中的抗原进行后续IP或IV免疫。在其它实施方案中，使用除弗氏佐剂之外的佐剂或在佐剂缺失下的全细胞。藉由ELISA可对血浆进行筛选，并且可将来自小鼠的具有足够滴度的抗LAG-3人类免疫球蛋白的细胞用于融合。
产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤，可从被免疫的小鼠中分离出脾细胞和/或淋巴结细胞，并与合适的无限增殖化细胞系（如小鼠骨髓瘤细胞系）进行融合。为了产生抗原特异性抗体可以对得到的杂交瘤进行筛选。杂交瘤的产生在本领域系熟知的。参见，例如Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York。
产生本发明之单克隆抗体的转染瘤之生成
使用（例如）重组DNA技术与基因转染方法的组合也可以在宿主细胞转染瘤中产生本发明之抗体，如在本领域中所熟知（例如Morrison,S.(1985)Science229:1202）。在一实施方案中，对藉由标准的分子生物学技术获得的部分或全长的轻链或重链进行编码的DNA被插入到一或多个表达载体中，这样该等基因被可操作地连接至转录和翻译调节序列上。在本文中，术语“可操作地连接”旨在表示将一抗体基因连接至一载体中，这样载体中转录和翻译的控制序列起到其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。
术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子以及控制抗体链基因的转录或翻译的其它表达控制组件（例如，多腺苷酸化信号）。此类调节序列说明于，例如Goeddel（Gene Expression Technology.Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)）中。较佳的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒组件，例如衍生自巨细胞病毒（CMV）、猿病毒40（SV40）、腺病毒（如腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））以及多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。再者，调控组件由来自不同来源的序列组成，如SRα启动子系统，它包含来自SV40早期启动子以及I型人类T细胞白血病病毒的长末端重复的序列（Takebe et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472）。对表达载体及表达控制序列进行选择以便与所使用的表达宿主细胞兼容。
可以将抗体轻链基因与抗体重链基因插入该等相同的或分别的表达载体中。在较佳的实施方案中，使用可变区，藉由将该等可变区插入已经对所希望的同种型的重链恒定区以及轻链恒定区进行编码的表达载体中而生成任何抗体同种型的全长抗体基因，这样VH片段被可操作地连接至载体中的一或多个CH片段上，并且VL片段被可操作地连接至载体中的CL片段上。另外地或可替代地，重组的表达载体可以对一信号肽进行编码，该信号肽有助于从一宿主细胞中分泌抗体链。可以将抗体链基因克隆进入该载体中，这样该信号肽在框架内被连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是一免疫球蛋白信号肽或是一异源的信号肽（即，来自非免疫球蛋白的信号肽）。
本发明的重组表达载体除了携带该等抗体链基因以及调节序列之外，还可携带另外的序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列（如复制起点）及选择标记基因。选择标记基因促进其中已经导入载体的宿主细胞的选择（参见，例如美国专利号4,399,216；4,634,665以及5,179,017）。例如，选择标记基因典型地赋予已引入载体的宿主细胞，对诸如G418、潮霉素或甲氨喋呤的抗药性。较佳的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（在dhfr-宿主细胞中用于甲氨喋呤选择/扩增）以及neo基因（用于G418选择）。
为了轻链及重链的表达，藉由标准技术将编码该等重链以及轻链的一或多个表达载体转染进入一宿主细胞中。术语“转染”的不同形式旨在涵盖范围宽广的多种技术，该等技术一般被用于将外源DNA引入原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、以及类似技术。虽然在理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明之抗体，但是在真核细胞（并且最佳地是哺乳动物宿主细胞）中表达系最较佳的，因为此类真核细胞，并且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装并分泌适当折叠并且具有免疫活性之抗体。
用于表达本发明的重组抗体的较佳的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）（包括dhfr-CHO细胞，说明于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中，使用一DHFR选择标记，例如在R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中所说明）、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、以及SP2细胞。特别地，对于使用NSO骨髓瘤细胞而言，另一较佳的表达体系系GS基因表达体系，该GS基因表达体系被披露在WO87/04462、WO89/01036以及EP338,841中。当将对抗体基因进行编码的重组表达载体引入至哺乳动物宿主细胞时，藉由将宿主细胞培养一段时间足以使该抗体在该宿主细胞中得到表达，或者更佳的是，使该抗体分泌进入宿主细胞所生长的培养基，而产生该等抗体。使用标准的蛋白质纯化方法可以从培养液中回收抗体。
抗体结合至抗原的表征
藉由例如标准的ELISA可以测试本发明之抗体与人类LAG-3的结合。藉由蛋白质印迹法可进一步测试抗LAG-3人类IgG与LAG-3抗原的反应性。本发明之抗体的结合特异性还可以藉由监测抗体与表达LAG-3蛋白的细胞的结合（例如流式细胞术）而确定。该等方法在本领域系已知的。参见，例如在以上所引用的Harlow and Lane(1988)。
免疫缀合物
本发明之抗体可与一治疗剂相偶联来形成免疫缀合物，如抗体-药物缀合物（ADC）。适宜的治疗剂包括抗代谢药、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或拓扑异构酶II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素、以及抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体以及治疗剂较佳的是藉由一可切割的接头（如肽基、二硫化物、或腙接头）进行偶联。更佳的是，该接头系一肽基接头，如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val（SEQ ID NO:15）、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser、或Glu。ADC可如以下文献中所说明进行制备：美国专利号7,087,600；6,989,452；以及7,129,261；PCT公开文件WO02/096910；WO07/038658；WO07/051081；WO07/059404；WO08/083312；以及WO08/103693；美国专利公开文件20060024317；20060004081；以及20060247295；它们的披露内容藉由引用结合在此。
双特异性分子
在另一方面，本披露以双特异性分子为特征，该双特异性分子包含连接至至少一个其它功能分子的抗LAG-3抗体，其它功能分子例如是另一个肽或蛋白质（例如另一个抗体或针对受体的配体），以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。因此，如此处所使用，“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。在一较佳的实施方案中，双特异性分子包括对LAG-3的一个第一结合特异性以及对触发分子的一第二结合特异性，该触发分子招募（recruit）可杀伤表达LAG-3的靶细胞的细胞毒性效应细胞。适宜的触发分子的实例系CD64、CD89、CD16、以及CD3。参见，例如Kufer et al.,TRENDS in Biotechnology,22(5),238-244(2004)。
在一实施方案中，双特异性分子具有除一抗Fc结合特异性以及一抗LAG-3结合特异性以外的一第三特异性。该第三特异性可以是抗增强因子(EF)的，例如结合涉及细胞毒性的表面蛋白并由此提高针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，抗增强因子可结合细胞毒性T细胞（例如，经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、或ICAM-1）或其它免疫细胞，导致针对该靶细胞的免疫反应的增强。
双特异性分子能够以许多不同的形式以及尺寸生产出来。在尺寸谱的一端，双特异性分子除了不具有完全相同特异性的两个结合臂而是具有两个各自均具有不同特异性的结合臂外，保留了传统之抗体形式。在另一极端处，是由两个单链抗体片段（scFv）构成的双特异性分子，该等抗体片段藉由一肽链相连接（所谓的Bs(scFv)2构建体）。中间尺寸的双特异性分子包括由一肽基接头所连接的两个不同的F(ab)片段。该等形式以及其它形式的双特异性分子可藉由遗传工程、体细胞杂交、或化学方法来制备。参见，例如在以上引用的Kufer et al；Cao and Suresh,Bioconjugate Chemistry,9(6),635-644(1998)；以及van Spriel et al.,Immunology Today,21(8),391-397(2000)，以及其中所引用的参考文献。
药物组合物
在另一方面，本披露提供了一药物组合物，该药物组合物包括与药学上可接受的载体一起配制的本披露之抗体。它可任选地包含一或多种另外的药学活性成分，如另一抗体或一药物。本发明的药物组合物还可与（例如）另一免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂、或疫苗在联合治疗中进行给药，这样该抗LAG-3抗体增强针对疫苗的免疫反应。
药物组合物可包括任何数目的赋形剂。可使用的赋形剂包括载体、表面活化剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散助剂或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、增甜剂、防腐剂、等渗剂、以及它们的组合。适宜的赋形剂的选择以及使用在Gennaro,ed.,Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,20th Ed.（Lippincott Williams&Wilkins2003）中被传授，该文献的披露内容藉由引用结合在此。
较佳的是，药物组合物适宜于经静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药（例如，藉由注射或输注）。依据给药途径，活性化合物可用某种材料包被以使其免受可能导致其失活的酸以及其它自然条件的作用。此处所用的短语“胃肠外给药”是指除了肠及表面给药外的多种给药方式，通常藉由注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。可替代地，可经非胃肠外途径给予本发明之抗体，非胃肠外途径例如表面、表皮或粘膜给药途径，如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或表面给药。
本发明的药物化合物可以处于药学上可接受的盐的形式。“药学上可接受的盐”是指一种盐，它保留了母体化合物的所希望的生物活性并不会引起任何不希望的毒理学效应。此类盐的例子包括酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐包括那些衍生自无毒无机酸的盐，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸的盐，如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等。碱加成盐包括那些衍生自碱土金属（如钠、钾、镁、钙等）的盐，以及衍生自无毒有机胺的盐，例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺及普鲁卡因等。
药物组合物可以处于无菌水溶液或分散体的形式。它们还可以被配制成微乳液、脂质体、或者其它适合于高药物浓度的有序结构。
与载体材料相组合产生单一剂型的活性组分的量会依赖于正在进行治疗的受试者以及给药的特定方式而变化，并且通常会是产生治疗效果的组合物的量。总体上讲，在100%的范围内，与药学上可接受的载体相组合的活性成分的量将是从大约0.01%到大约99%的范围内，较佳地是从大约0.1%到大约70%，最佳地是从大约1%到大约30%。
对剂量方案进行调整以提供最佳的希望的反应（例如，治疗反应）。例如，可给予快速灌注剂，可以随时间分剂量给予，或者如治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便以及剂量统一而按剂量单位形式配制成肠胃外用的组合物尤为有利。在此使用的剂量单位形式是指用于有待治疗的受试者、适宜作为单一剂量的在物理上不连续的单位；每个单位包括与所需的药学载体相关的经计算能产生所希望的疗效的预定量的活性化合物。可替代地，抗体可以作为持续释放配制品给药，在这种情况中需要以较低频率给药。
对于抗体的给药，根据使用者的体重，剂量在大约0.0001至100mg/kg的范围内，并且更经常是0.01至5mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1至10mg/kg的范围内。一示例性治疗方案要求每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每3到6个月一次。本发明的抗LAG-3抗体的较佳的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重藉由静脉内给药，使用以下给药方案之一给予抗体：(i)每四周给予六个剂量，然后每三个月给药；(ii)每三周给药；(iii)3mg/kg体重给药一次，接着每三周按1mg/kg体重给药。在一些方法中，调整剂量使血浆抗体浓度大约是1至1000μg/ml并且在一些方法中大约是25至300μg/ml。
本发明的抗LAG-3抗体的“治疗有效剂量”较佳的是导致减轻疾病症状的严重程度、增加无疾病症状时间的频率及持续时间、或防止由于该病痛产生的损害或残疾。例如，对于携带肿瘤的受试者的治疗来说，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效剂量”较佳地是抑制至少大约20%，较佳的是至少大约40%，甚至更佳的是至少大约60%，并又最佳的是至少约80%的肿瘤生长。治疗有效量的治疗性化合物可减小肿瘤的大小，或者以其它方式改善受试者的症状，该受试者典型地是人或可以是其它哺乳动物。
该药物组合物可以是受控释放配制品，包括植入剂、经皮贴剂、以及微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容性的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可经由以下医疗装置给予治疗组合物，如(1)无针皮下注射装置（例如US5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；以及4,596,556）；(2)微型输注泵（US4,487,603）；(3)经皮装置（US4,486,194）；(4)输注器具（US4,447,233以及4,447,224）；以及(5)渗透装置（US4,439,196以及4,475,196）；该等文献的披露内容均藉由引用结合在此。
在某些实施方案中，可以对本发明的人类单克隆抗体进行配制以确保其在体内的适当分布。例如，为确保本发明的治疗化合物穿过血脑屏障，可将它们配制在脂质体中，该脂质体可另外地包括靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性运输。参见，例如US4,522,811；5,374,548；5,416,016；以及5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685；Umezawa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman et al.(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180；Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233:134；Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269:9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；以及Killion and Fidler(1994)Immunomethods4:273。
本发明之用途和方法
本发明中之抗体、抗体组合物及方法在体内和体外具有多种用处，涉及例如检测LAG-3或是藉由阻断LAG-3而增强免疫反应。在一较佳的实施方案中，本发明之抗体为人类抗体。例如，该等分子可以被给予至在体外或离体培养的细胞，或者给予人类受试者（例如在体内）以增强多种情形下的免疫性。因此，在一方面，本发明提供了一改变受试者内的免疫反应的方法，包括给予该受试者本发明之抗体、或其抗原结合部分，这样受试者体内的免疫反应发生改变。较佳的是，该应答得到增强、受到刺激或被上调。
较佳的受试者包括需要增加一免疫反应的人类患者。该方法还特别适宜于治疗患有可藉由增强一免疫反应（例如，T细胞介导的免疫反应）来治疗的病症的病人。在一具体的实施方案中，该等方法特别适宜于治疗体内癌症。为了达到免疫性的抗原特异性增强，抗LAG-3抗体可与所感兴趣的抗原一起给药，或者该抗原可早已存在于待治疗的受试者（例如，携带肿瘤或携带病毒的受试者）中。当针对LAG-3之抗体与另一药物一起给药时，这两种物质可以依次或者同时给药。
本发明还提供用于检测样本中是否存在人类LAG-3抗原或者测量人类LAG-3抗原的量的方法，包括使所述样本、以及对照样本与特异地结合人类LAG-3的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分在一定条件下相接触，所述条件使得在该抗体或其部分与人类LAG-3之间形成一复合物。然后检测复合物的形成，其中与对照样本相比，在该样本之间形成复合物的差异指示了在该样本中存在人类LAG-3抗原。此外，可使用本发明的抗LAG-3抗体经由免疫亲和纯化法来纯化人类LAG-3。
考虑到本发明的抗LAG-3抗体抑制LAG-3与MHC II类分子的结合的能力以及刺激抗原特异性T细胞应答的能力，本发明还提供了使用本发明之抗体在体内以及体外刺激、增强、或上调抗原特异性T细胞应答的方法。例如，本发明提供了刺激一抗原特异性T细胞应答的方法，该方法包括使所述T细胞与本发明之抗体相接触，这样刺激了抗原特异性T细胞应答。可使用抗原特异性T细胞应答的任何适宜的指示物来测量该抗原特异性T细胞应答。此类适宜的指示物的非限制性实例包括在该抗体的存在下T细胞增殖增加和/或在该抗体的存在下增加细胞因子的产生。在一较佳的实施方案中，刺激了由抗原特异性T细胞进行的白介素-2产生。
本发明还提供了一种在受试者体内刺激免疫反应（例如，一抗原特异性T细胞应答）的方法，该方法包括给予该受试者一本发明之抗体，这样刺激了该受试者体内的免疫反应（例如，一抗原特异性T细胞应答）。在一较佳的实施方案中，该受试者系一携带肿瘤的受试者，并且刺激了针对该肿瘤的免疫反应。在另一较佳的实施方案中，该受试者系一携带病毒的受试者，并且刺激了针对该病毒的免疫反应。
又在另一方面，本发明提供了一种抑制受试者体内肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给予该受试者一本发明之抗体，这样该受试者体内的肿瘤生长受到抑制。在又另一方面，本发明提供了一种治疗受试者体内病毒感染的方法，该方法包括给予该受试者一本发明之抗体，这样该受试者体内的病毒感染得到治疗。
本发明的该等方法以及其它方法在以下作进一步详尽的讨论。
癌症
藉由抗体阻断LAG-3可增强患者体内对癌细胞的免疫反应。一方面，本披露涉及使用抗LAG-3抗体对受试者进行体内治疗，这样癌性肿瘤的生长受到抑制。抗LAG-3抗体可单独使用，以抑制癌性肿瘤的生长。可替代地，如下所说明，抗LAG-3抗体可与其它免疫原性药剂、标准的癌症治疗、或其它抗体结合使用。
因此，在一实施方案中，本发明提供了一种抑制受试者体内肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者给予治疗有效量的抗LAG-3抗体、或其抗原结合部分。较佳的是，该抗体为人类抗LAG-3抗体（如在此说明的人类抗-人类LAG-3抗体中的任何抗体）。另外地或者可替代地，该抗体可以是嵌合或人源化抗LAG-3抗体。
较佳的使用本发明之抗体可抑制生长的癌症包括通常对免疫疗法典型地产生应答的癌症。治疗的较佳的癌症的非限制性实例包括黑色素瘤（如转移性恶性黑色素瘤）、肾癌（例如透明细胞癌）、前列腺癌（例如激素不应性前列腺癌）、乳癌、结肠癌以及肺癌（例如非小细胞肺癌）。另外地，本发明包括不应性或复发性恶性肿瘤，它们的生长可使用本发明之抗体进行抑制。
使用本发明的方法可治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部的癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌症、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌（carcinoma of the vulva）、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病（包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病）、儿童的实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统（CNS）瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱轴瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、由环境所诱发的癌症（包括那些由石棉诱发的癌症）、以及所述癌症的多个组合。本发明对于治疗转移性癌症，特别是表达PD-L1的转移性癌症也是有用的（Iwai etal.(2005)Int.Immunol.17:133-144）。
任选地，LAG-3之抗体可与一免疫原性药剂进行联合，该免疫原性药剂例如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原（包括重组蛋白、肽、以及碳水化合物分子）、细胞、以及转染了编码免疫刺激性细胞因子的基因的细胞（He et al(2004)J.Immunol.173:4919-28）。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，如肽gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞（以下进一步讨论）。
在人类中，已经表明一些肿瘤具有免疫原性，例如黑色素瘤。藉由LAG-3阻断提高T细胞活化的阈值，可活化宿主体内的肿瘤应答。
当与免疫接种方案联合时，LAG-3阻断可能是更有效的。已经设计了很多针对肿瘤的实验性疫苗接种策略（参见Rosenberg,S.(2000)Development of cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring:300-302；Khayat,D.(2000)ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.(2000),ASCOEducational Book Spring:730-738；还参见Restifo,N.and Sznol,M.,CancerVaccines,Ch.61,pp.3023-3043in DeVita et al.(eds.),1997,Cancer:Principlesand Practice of Oncology,Fifth Edition）。在该等策略之一中，使用自体或同种异体的肿瘤细胞制备疫苗。已表明当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时该等细胞疫苗系最为有效的。已表明，对于肿瘤疫苗接种而言，GM-CSF系抗原呈递的有力的活化剂（Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90:3539-43）。
对不同肿瘤中的基因表达及大规模基因表达模式的研究对所谓的肿瘤特异性抗原给出了定义（Rosenberg,SA(1999)Immunity10:281-7）。在很多情况下，该等肿瘤特异性抗原系在肿瘤中以及从其中产生肿瘤的细胞中所表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gpl00、MAGE抗原、以及Trp-2。更重要地，已显示该等抗原中有许多抗原系在宿主体内发现的肿瘤特异性T细胞的靶点。LAG-3阻断可与在肿瘤中所表达的重组蛋白和/或肽的一集合进行结合使用，以对该等蛋白质产生免疫反应。该等蛋白质通常被免疫系统视为系自身抗原，并因此对它们具有耐受性。肿瘤抗原可包括蛋白质端粒末端转移酶，该酶系合成染色体的端粒所需要的，并且在超过85%的人类癌症中并且仅在有限数目的体细胞组织中表达（Kim et al.(1994)Science266:2011-2013）。（该等体细胞组织可藉由各种手段免受免疫攻击）。由于改变蛋白质序列或在两个无关的序列（即，在费城染色体中的bcr-abl）之间生成融合蛋白的体细胞突变，或者来自B细胞肿瘤的独特型，肿瘤抗原也可以是在癌细胞中表达的“新抗原”。
其它肿瘤疫苗可包括来自牵涉人类癌症的病毒的蛋白质，例如人乳头瘤病毒（HPV）、肝炎病毒（HBV以及HCV）以及卡波西氏疱疹肉瘤病毒（KHSV）。可与LAG-3阻断进行联合使用的肿瘤特异性抗原的另一形式系从肿瘤组织自身分离出来的经纯化的热休克蛋白（HSP）。该等热休克蛋白包含来自肿瘤细胞的蛋白质片段，并且该等HSP在送递至抗原呈递细胞时对于引发肿瘤免疫性系高度有效的（Suot&Srivastava(1995)Science269:1585-1588；Tamura et al.(1997)Science278:117-120）。
树突细胞（DC）系有力的抗原呈递细胞，它们可以用于启动抗原特异性应答。DC可离体产生，并且负载有不同蛋白及肽抗原、以及肿瘤细胞提取物（Nestle et al.(1998)Nature Medicine4:328-332）。还可以藉由遗传的方法对DC进行转导以表达该等肿瘤抗原。为了进行免疫接种，还将DC直接与肿瘤细胞进行融合（Kugler et al.(2000)Nature Medicine6:332-336）。作为一疫苗接种方法，DC免疫接种可与LAG-3阻断有效地联合来活化更有力的抗肿瘤应答。
LAG-3阻断还可与标准的癌症治疗进行联合。LAG-3阻断可与化学疗法的方案有效地联合。在该等情况下，降低所给予的化疗试剂的剂量系可能的（Mokyr et al.(1998)Cancer Research58:5301-5304）。此类组合的一实例系用于治疗黑色素瘤的，与氨烯咪胺联合的抗LAG-3抗体。这种组合的另一实例系用于治疗黑色素瘤的、与白介素-2（IL-2）联合的抗LAG-3抗体。LAG-3阻断与化学治疗的联合使用，其背后的科学理论在于：细胞死亡（这系大部分化疗化合物的细胞毒性作用的结果）应导致在抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的升高。藉由细胞死亡可能导致与LAG-3阻断起到协同作用的其它联合疗法系放射、外科手术、以及激素剥夺（hormone deprivation）。该等方法中每一种方法在宿主中均生成了肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可以与LAG-3阻断进行联合。血管发生的抑制作用导致肿瘤细胞死亡，这可能使肿瘤抗原进入宿主抗原呈递途径。
LAG-3阻断抗体还可以与双特异性抗体联合使用，该等双特异性抗体可以将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向到肿瘤细胞（参见，例如美国专利号5,922,845以及5,837,243）。双特异性抗体可以用于靶向两个分别的抗原。例如抗Fc受体/抗肿瘤抗原（例如Her-2/neu）双特异性抗体已经被用于将巨噬细胞靶向肿瘤位点。这一靶向可更有效地活化肿瘤特异性应答。该等应答的T细胞分支（arm）可藉由使用LAG-3阻断得到增大。可替代地，藉由使用双特异性抗体可将抗原直接送递至DC，该等双特异性抗体结合肿瘤抗原及树突细胞特异性的细胞表面标记。
肿瘤藉由多种机制躲避宿主免疫监督。可能藉由由肿瘤表达并且具有免疫抑制性的蛋白质的失活来克服该等机制中的许多机制。该等蛋白除其它外还包括TGF-β（Kehrl et al.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050）、IL-10（Howard&O'Garra(1992)Immunology Today13:198-200）以及Fas配体（Hahne et al.(1996)Science274:1363-1365）。针对该等实体中每个实体之抗体可与抗LAG-3联合使用，以抵制免疫抑制剂的作用，并有助于宿主的肿瘤免疫反应。
活化宿主免疫反应性的其它抗体可与抗LAG-3联合使用。该等包括树突细胞表面上的分子，它们活化DC功能以及抗原呈递。抗-CD40抗体能够有效地取代T细胞辅助细胞的活性（Ridge et al.(1998)Nature393:474-478）并且可以与LAG-3抗体结合使用（Ito et al.(2000)Immunobiology201(5)527-40）。针对T细胞共刺激分子，例如CTLA-4（美国专利号5,811,097）、OX-40（Weinberg et al.(2000)Immunol164:2160-2169）、4-1BB（Melero etal.(1997)Nature Medicine3:682-685(1997)、以及ICOS(Hutloff et al.(1999)Nature397:262-266）之活化性抗体也可被提供用于使T细胞的活化水平增加。
目前，骨髓移植正被用来治疗造血性起源的多种肿瘤。尽管移植物抗宿主病系由这种治疗所致，但是从移植物抗肿瘤的应答中可获得治疗益处。LAG-3阻断可以用于提高供体移植肿瘤特异性T细胞的有效性。
还有几个实验性治疗方案，该等治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化以及扩大，以及将该等细胞过继转移进入受者，以便刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞（Greenberg&Riddell(1999)Science285:546-51）。该等方法还可以用于活化对于诸如CMV的传染源的T细胞应答。在抗LAG-3抗体存在时，离体启动可增加过继转移的T细胞的频率及活性。
传染病
本发明的其它方法可用于治疗暴露于特定毒素或病原体中的患者。因此，本发明的另一方面提供了在受试者体内治疗一种传染病的一种方法，包括给予受试者抗LAG-3抗体、或其抗原结合部分，这样受试者的传染病得以治疗。较佳的是，该抗体为人类抗人类LAG-3抗体（例如在此说明的人类抗-LAG-3抗体中的任何抗体）。另外地或可替代地，该抗体可以是一嵌合或人源化抗体。
类似于以上讨论的应用于肿瘤，抗体介导的LAG-3阻断可以单独使用，或作为佐剂与疫苗联合，以刺激针对病原体、毒素、以及自身抗原的免疫反应。特别适用于本治疗方法的病原体的实例包括：目前没有有效疫苗的病原体、或者常规疫苗不完全有效的病原体。该等病原体包括但不限于HIV、肝炎（甲型、乙型以及丙型）、流感、疱疹、贾第虫属、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌。LAG-3阻断对于由在感染期间呈现出已改变的抗原的因子，如HIV所致的已确定感染尤其有用。该等新颖的表位在抗-人类LAG-3给药期间被识别为外源的，因此引起强烈的T细胞应答，该应答不会被藉由LAG-3的负性信号减弱。
引起藉由本发明方法可治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(hepatitis)（甲型、乙型、或丙型）、疱疹病毒(herpes virus)（如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、以及CMV、爱泼斯坦－巴尔病毒(Epstein Barrvirus)）、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenza virus)、黄病毒(flaviviruses)、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒(coronavirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、轮状病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measles virus)、风疹病毒(rubella virus)、细小病毒(parvovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、HTLV病毒、登革热病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、软疣病毒(molluscumvirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒(rabies virus)、JC病毒、以及虫媒病毒性脑炎病毒(arboviral encephalitis virus.)。
引起本发明的方法可治疗的感染的病原性细菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次氏体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)以及淋球菌(gonococci)、克雷白氏菌(klebsiella)、变形菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团杆菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒杆菌中毒(botulism)、炭疽(anthrax)、鼠疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)、以及莱姆氏病(Lymes disease)细菌。
引起本发明的方法可治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌（candidia）(白色念珠菌（albicans）、克柔念珠菌（krusei）、光滑念珠菌（glabrata）、热带念珠菌（tropicalis）等）、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、曲霉(Aspergillus)（烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等）、毛霉菌目(Mucorales)的属（毛霉菌(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉(rhizopus)）、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)以及荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起本发明的方法可治疗的感染的病原性寄生物的一些实例包括痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福勒氏耐格里原虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属种(Acanthamoeba sp.)、兰伯贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、果氏巴贝虫(Babesiamicroti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在全部上述方法中，LAG-3阻断可与其它形式的免疫疗法例如细胞因子治疗（例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2）或双特异性抗体疗法进行联合，这提供了增强的肿瘤抗原呈递（参见例如，Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak(1994)Structure2:1121-1123）。
自身免疫反应
抗LAG-3抗体可能引发并扩大自身免疫反应。的确，使用肿瘤细胞以及肽疫苗诱导抗肿瘤应答显示许多抗肿瘤应答涉及抗自身反应性（van Elsaset al.(2001)J.Exp.Med.194:481-489；Overwijk,et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987；Hurwitz,(2000)如上所述；Rosenberg&White(1996)J.Immunother Emphasis Tumor Immunol19(1):81-4）。因此，可能考虑使用与不同的自身蛋白进行联合的抗-LAG-3阻断来设计接种疫苗方案，以有效地产生用于疾病治疗的、针对该等自身蛋白的免疫反应。例如，阿耳茨海默氏病涉及脑内淀粉样沉积物中Aβ肽的不适当累积；针对淀粉状蛋白之抗体应答能够清除该等淀粉样沉积物（Schenk et al.,(1999)Nature400:173-177）。
其它自身蛋白也可以用作靶标，例如用于治疗过敏症以及哮喘的IgE，以及用于治疗类风湿性关节炎的TNFα。最后，针对不同激素之抗体应答可能藉由使用抗LAG-3抗体来诱导。针对生殖激素的中和性抗体应答可用于避孕。针对特定肿瘤生长所要求的激素以及其它可溶性因子的中和性抗体应答也被认为是可能的接种疫苗靶标。
与以上所说明的抗LAG-3抗体的使用相似的方法可以用于诱导治疗性自身免疫反应，以治疗具有其它自身抗原不适当累积的患者，该等自身抗原例如淀粉样沉积物，包括阿尔茨海默氏病中的Aβ、细胞因子（如TNFα）、以及IgE。
疫苗
藉由将抗LAG-3抗体与感兴趣的抗原（例如疫苗）进行同时给药，抗LAG-3抗体可用于刺激抗原特异性免疫反应。因此，在其它方面，本发明提供了在受试者体内增强针对抗原的免疫反应的一方法，包括对受试者给予：(i)抗原；以及(ii)抗LAG-3抗体、或其抗原结合部分，这样在受试者体内的针对该抗原的免疫反应得以增强。较佳的是，该抗体为人类抗人类LAG-3抗体（例如在此说明的人类抗LAG-3抗体中的任何抗体）。另外地或可替代地，该抗体可以是一嵌合或人源化抗体。该抗原可以是，例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括在以上部分所讨论的那些抗原，例如以上所讨论的肿瘤抗原（或肿瘤疫苗）、或来自以上所说明的病毒、细菌或其它病原体的抗原。
本发明之抗体组合物（例如，人类单克隆抗体、多特异性以及双特异性分子以及免疫缀合物）的体内以及体外的合宜给药途径在本领域内系熟知的，并且可由普通技术人员进行选择。例如，抗体组合物可藉由注射（例如静脉内或皮下）进行给药。所用分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄以及体重、以及抗体组合物的浓度和/或配方。
如之前所说明，本发明的人抗LAG-3抗体可与一或其它更多的治疗剂（例如一细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂）共同给药。可将抗体连接至治疗剂（作为免疫复合物）上，或者可与该治疗剂分开给药。在后一（分开给药）情况下，抗体可以在该治疗剂给药之前、之后、或与该治疗剂同时给药、或者可以与其它已知治疗（例如抗癌治疗，如放射）共同给予。除其它之外，此类治疗剂包括抗肿瘤剂，如多柔比星（阿霉素）、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪以及环磷酰胺羟基脲，它们自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平时才是有效的。每四周一次经静脉内给予100mg/ml剂量的顺铂，而每21天一次经静脉内给予60至75mg/ml剂量的阿霉素。本发明的人类抗LAG-3抗体、或它们的抗原结合片段与化学治疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，这两种抗癌剂藉由不同的机制起作用，产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共同给药可以解决由于肿瘤细胞抗药性的形成或者抗原性的改变方面的问题，形成抗药性或抗原性改变会使肿瘤细胞与抗体不反应。
本发明的范围内还涵盖试剂盒，该等试剂盒包括本发明之抗体组合物（例如，人类抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫缀合物）以及其使用说明。该试剂盒可进一步包含至少一种另外的试剂、或者一或多种另外的本发明人类抗体（例如，人类抗体，该人类抗体具有互补活性、结合不同于第一人类抗体的LAG-3抗原中的一个表位）。试剂盒典型地包括一标签，该标签指示该试剂盒的内容物的预期用途。术语标签包括在试剂盒上或与该试剂盒一起提供的，或者以其它方式随附该试剂盒的任何书面，或记录材料。
联合治疗
在另一方面，本发明提供了联合治疗的方法，其中抗LAG-3抗体与在刺激免疫反应中有效的一或多种另外之抗体共同给药，由此进一步增强、刺激、或上调受试者体内的免疫反应。例如，本发明提供了在受试者体内刺激免疫反应的方法，该方法包括给予该受试者抗LAG-3抗体以及一或更多另外的免疫刺激性抗体，如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体，这样在该受试者体内刺激了一免疫反应，例如抑制肿瘤生长或刺激一抗病毒应答。在一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及一抗PD-1抗体。在另一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及一抗PD-L1抗体。在又另一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及一抗CTLA-4抗体。在一实施方案中，抗LAG-3抗体系一人类抗体，如本披露的一抗体。可替代地，该抗LAG-3抗体可以是（例如）嵌合或人源化抗体（例如，从小鼠LAG-3mAb中制备）。在另一实施方案中，该至少一种另外的免疫刺激性抗体（例如，抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4抗体）系一人类抗体。可替代地，该至少一种另外的免疫刺激性抗体可以是（例如）嵌合或人源化抗体（例如，从小鼠抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4抗体中制备）。
在一实施方案中，本发明提供了一种治疗过度增殖的疾病（例如癌症）的方法，该方法包括给予受试者LAG-3抗体以及CTLA-4抗体。在另外的实施方案中，给予亚治疗剂量的抗LAG-3抗体，给予亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体，或者两者均以亚治疗剂量进行给药。在另一实施方案中，本发明提供了一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖的疾病有关的不良事件的方法，该方法包括给予受试者抗LAG-3抗体以及亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，受试者系人。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体系人类序列单克隆抗体10D1（说明于PCT公开文件WO01/14424中），而抗LAG-3抗体系人类序列单克隆抗体，如此处所说明的25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5。由本发明的方法涵盖的其它的抗CTLA-4抗体包括（例如）披露于以下文献之抗体：WO98/42752；WO00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(17):10067-10071；Camacho et al.(2004)J.Clin.Oncology22(145):AbstractNo.2505(antibody CP-675206)；以及Mokyr et al.(1998)Cancer Res.58:5301-5304。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体以5x10-8M或更小的KD与人类CTLA-4相结合，以1x10-8M或更小的KD与人类CTLA-4相结合，以5x10-9M或更小的KD与人类CTLA-4相结合，或以在1x10-8M与1x10-10M之间或更小的KD与人类CTLA-4相结合。
在一实施方案中，本发明提供了一种治疗过度增殖的疾病（例如癌症）的方法，该方法包括给予受试者LAG-3抗体以及PD-1抗体。在另外的实施方案中，给予亚治疗剂量的抗LAG-3抗体，给予亚治疗剂量的抗PD-1抗体，或者两者均以亚治疗剂量进行给药。在另一实施方案中，本发明提供了一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖的疾病有关的不良事件的方法，该方法包括给予受试者抗LAG-3抗体以及亚治疗剂量的抗PD-1抗体。在某些实施方案中，受试者系人。在某些实施方案中，抗PD-1抗体系人类序列单克隆抗体，而抗LAG-3抗体系人类序列单克隆抗体，如此处所说明的25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5。人类序列抗PD-1抗体的实例包括17D8、2D3、4H1、5C4以及4A11，它们说明于PCT公开文件WO06/121168中。在某些实施方案中，抗PD-1抗体以5x10-8M或更小的KD与人类PD-1相结合，以1x10-8M或更小的KD与人类PD-1相结合，以5x10-9M或更小的KD与人类PD-1相结合，或以在1x10-8M与1x10-10M之间或更小的KD与人类PD-1相结合。
在一实施方案中，本发明提供了一种治疗过度增殖的疾病（例如癌症）的方法，该方法包括给予受试者一LAG-3抗体以及PD-L1抗体。在另外的实施方案中，给予亚治疗剂量的抗LAG-3抗体，给予亚治疗剂量的抗PD-L1抗体，或者两者均以亚治疗剂量进行给药。在另一实施方案中，本发明提供了一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖的疾病有关的不良事件的方法，该方法包括给予受试者抗LAG-3抗体以及亚治疗剂量的抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，受试者系人。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体系人类序列单克隆抗体，而抗LAG-3抗体系人类序列单克隆抗体，如此处所说明的25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5。人类序列抗PD-L1抗体的实例包括3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7以及13G4，它们说明于PCT公开文件WO07/005874中。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体以5x10-8M或更小的KD与人类PD-L1相结合，以1x10-8M或更小的KD与人类PD-L1相结合，以5x10-9M或更小的KD与人类PD-L1相结合，或以在1x10-8M与1x10-10M之间或更小的KD与人类PD-L1相结合。
由抗体阻断LAG-3以及一或多种第二靶抗原（如CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1）可增强针对患者体内癌细胞的免疫反应。一些癌症（其生长使用本披露之抗体可被抑制）包括典型地针对免疫疗法进行响应的癌症。用本披露的联合疗法进行治疗的癌症的代表性实例包括以上在用抗LAG-3抗体的单一疗法的讨论中确切地列出的那些癌症。
在某些实施方案中，此处所讨论的治疗性抗体的组合可作为药学上可接受的载体中的单一组合物同时给予，或者作为分别的组合物同时给予，其中各抗体在药学上可接受的载体中。在另一实施方案中，治疗性抗体的组合可序贯地进行给药。例如，抗CTLA-4抗体以及抗LAG-3抗体可序贯地进行给药，例如先给予抗CTLA-4抗体，而再给予抗LAG-3抗体，或者先给予抗LAG-3抗体，而再给予抗CTLA-4抗体。另外地或可替代地，抗PD-1抗体以及抗LAG-3抗体可序贯地进行给药，例如先给予抗PD-1抗体，而再给予抗LAG-3抗体，或者先给予抗LAG-3抗体，而再给予抗PD-1抗体。另外地或可替代地，抗PD-L1抗体以及抗LAG-3抗体可序贯地进行给药，例如先给予抗PD-L1抗体，而再给予抗LAG-3抗体，或者先给予抗LAG-3抗体，而再给予抗PD-L1抗体。
此外，若序贯地给予多于一个剂量的联合疗法，那么在每个给药时间点上序贯给药的顺序可相反或者保持相同的顺序，而序贯给药可与共同给药进行联合，或其任何组合。例如，抗CTLA-4抗体以及抗LAG-3抗体的组合的第一次给药可同时进行，第二次给药可序贯进行，先给予抗CTLA-4，而再给予抗LAG-3，并且第三次给药可序贯进行，先给予抗LAG-3，而再给予抗CTLA-4，等等。另外地或可替代地，抗PD-1抗体以及抗LAG-3抗体的组合的第一次给药可同时进行，第二次给药可序贯进行，先给予抗PD-1，而再给予抗LAG-3，并且第三次给药可序贯进行，先给予抗LAG-3，而再给予抗PD-1，等等。另外地或可替代地，抗PD-L1抗体以及抗LAG-3抗体的组合的第一次给药可同时进行，第二次给药可序贯进行，先给予抗PD-L1，而再给予抗LAG-3，并且第三次给药可序贯进行，先给予抗LAG-3，而再给予抗PD-L1，等等。另一代表性给药方案涉及第一次给药系序贯进行的，先给予抗LAG-3，而再给予抗CTLA-4（和/或抗PD-1和/或抗PD-L1），而随后的给药可同时进行。
任选地，抗LAG-3与一或多种另外抗体（如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体）的组合可进一步与免疫原性试剂联合，所述免疫原性试剂例如癌细胞、经纯化的肿瘤抗原（包括重组蛋白、肽、以及碳水化合物分子），细胞、以及用编码免疫刺激性细胞因子的基因进行转染的细胞（He etal.(2004)J.Immunol.173:4919-28）。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽、如肽gpl00、MAGE抗原、Trp-2、MARTl和/或酪氨酸酶、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞（以下进一步讨论）。经联合的LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断可以进一步与一接种疫苗方案进行联合，所述接种疫苗方案例如以上关于使用抗LAG-3抗体的单一疗法所详细讨论的任何接种疫苗方案。
经联合的LAG-3与CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断还可以进一步与标准的癌症治疗进行联合。例如，经联合的LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断可以有效地与化学疗法方案进行联合。在该等情况下，降低与本披露的组合进行给药的化疗试剂的剂量系可能的（Mokyr et al.(1998)Cancer Research58:5301-5304）。这种组合的一实例系抗LAG-3与抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的一组合进一步与氨烯咪胺联合用于治疗黑色素瘤。另一实例系抗LAG-3与抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的一组合进一步与白介素2（IL-2）联合用于治疗黑色素瘤。LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断与化学疗法联合使用，其背后的科学理论在于：细胞死亡（它系大部分化疗化合物的细胞毒性作用的一后果）应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原的水平升高。可导致与经联合的LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断藉由细胞死亡起到协同作用的其它组合疗法包括辐射、外科手术、以及激素剥夺。该等方法中每一种方法在宿主中均生成了肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与经联合的LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断进行联合。抑制血管发生导致肿瘤细胞死亡，这可以是进入宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原的来源。
LAG-3与CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断抗体的组合还可与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向到肿瘤细胞的双特异性抗体联合使用（参见，例如美国专利号5,922,845以及5,837,243）。双特异性抗体可以用于靶向两个分别的抗原。该等应答的T细胞分支（arm）可藉由使用经联合的LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断而得到增大。
在另一实例中，抗LAG-3与抗CTLA-4和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的组合可与以下抗肿瘤之抗体结合使用，如（利妥昔单抗(rituximab)）、（曲妥单抗(trastuzumab)）、（托西莫单抗(tositumomab)）、（替伊莫单抗(ibritumomab)）、（阿仑单抗(alemtuzumab)）、（eprtuzumab）、（贝伐单抗(bevacizumab)）、以及（erlotinib）等。藉由举例并且不希望被理论约束，采用抗癌抗体或偶联有毒素的抗癌抗体进行治疗会导致癌细胞死亡（例如肿瘤细胞），这将会增强受CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3介导的免疫反应。在一示例性实施方案中，过度增殖的疾病（例如癌肿瘤）的治疗可包括与抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体联合（同时或序贯或其任何组合）的抗癌抗体，这会增强宿主的抗肿瘤免疫反应。
肿瘤藉由多种机制躲避宿主免疫监督。该等机制中的许多机制可藉由使由肿瘤表达并且具有免疫抑制性的蛋白失活来克服。该等蛋白除其它之外还包括TGF-β（Kehrl et al.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050）、IL-10（Howard&O'Garra(1992)Immunology Today13:198-200）以及Fas配体（Hahne et al.(1996)Science274:1363-1365）。在另一实例中，针对该等实体中每个实体之抗体可与抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1的组合进行进一步联合，以抵制免疫抑制剂的作用，并有助于宿主的抗肿瘤免疫反应。
可用于活化宿主免疫反应性的其它抗体可与抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1的组合进一步联合进行使用。该等抗体包括在树状突细胞的表面上的活化DC功能以及抗原呈递的分子。抗CD40抗体（Ridge et al.，如上所述）可与抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1的组合进行结合而使用（Ito et al.，如上所述）。还可提供针对T细胞共刺激分子（Weinberg et al.，如上所述,Melero et al.如上所述,Hutloffet al.，如上所述）的其它活化性抗体用于提高T细胞活化的水平。
如以上所讨论，骨髓移植正被用来治疗造血性起源的多种肿瘤。经联合的LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1阻断可用于提高供体移植肿瘤特异性T细胞的有效性。
几个实验性治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化以及扩大，以及将该等细胞过继转移进入受者，以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞（Greenberg&Riddell，如上所述）。该等方法还可以用于活化针对诸如CMV的传染源的T细胞应答。在抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1存在下的离体活化预期可增加过继转移的T细胞的频率以及活性。
在某些实施方案中，本发明提供了一种改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖的疾病（例如癌症）有关的不良事件的方法，该方法包括给予受试者抗LAG-3抗体以及亚治疗剂量的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体。例如，本发明的方法提供了一方法，该方法藉由给予受试者非吸收性的类固醇来降低由免疫刺激性治疗性抗体所诱发的结肠炎或腹泻的发病率。由于任何接受免疫刺激性治疗性抗体的患者都处于出现由这类抗体诱发的结肠炎或腹泻的风险中，所以这一整个患者群适宜根据本发明方法的疗法。尽管已给予类固醇来治疗炎症性肠病（IBD）并防止IBD的恶化，但是它们尚未被用来预防尚未被诊断患有IBD的患者中的IBD（降低该等患者中的IBD的发病率）。与类固醇、甚至非吸收性的类固醇有关的显著的副作用已经妨碍了预防性使用。
在另外的实施方案中，LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断的一组合（即，免疫刺激性治疗性抗体抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体）可与任何非吸收性的类固醇使用进一步联合。在此所使用的“非吸收性类固醇”系一糖皮质激素，该激素显示出广泛的首过代谢，这样在肝脏中代谢后这种类固醇的生物利用率系低的，即小于约20%。在本发明的一实施方案中，非吸收性的类固醇系布地奈德(budesonide)。布地奈德系一局部起效的糖皮质激素，它在口服之后主要由肝脏被广泛代谢。（Astra-Zeneca）系一开发的pH依赖以及时间依赖的布地奈德口服配制品，以优化药物递送至回肠以及整个结肠。ENTOCORT在美国被批准用于治疗轻度至中度涉及回肠和/或升结肠的克罗恩病。用于治疗克罗恩病的ENTOCORT的通常口服剂量系6至9mg/天。ENTOCORT在被吸收之前被释放于肠道中，并且停留在肠粘膜中。一旦ENTOCORT穿过肠粘膜靶组织，它就会被肝脏中的细胞色素P450系统强代谢成为糖皮质激素活性可忽略不计的代谢产物。因此，生物利用度低（大约10%）。与首过代谢不太全面的其它糖皮质激素相比较，布地奈德的低生物利用度导致了一提高的治疗比率。与全身起效的皮质类固醇相比较，布地奈德产生较少的不良作用，包括较低的下丘脑-垂体抑制。但是，长期给予ENTOCORT会导致全身性糖皮质激素效应，如肾上腺皮质功能亢进以及肾上腺抑制。参见PDR58th ed.2004；608-610。
在仍又另外的实施方案中，LAG-3以及CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断（即，免疫刺激性治疗性抗体抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体）的一组合与非吸收性的类固醇结合可进一步与水杨酸盐（酯）进行联合。水杨酸盐（酯）包括5-ASA试剂，例如：柳氮磺吡啶（sulfasalazine）（Pharmacia&UpJohn）；奥沙拉嗪（olsalazine）（Pharmacia&UpJohn）；巴柳氮（balsalazide）（Salix Pharmaceuticals,Inc.）；以及美沙拉嗪（mesalamine）（Procter&Gamble Pharmaceuticals；Shire US；AxcanScandipharm,Inc.；Solvay）。
根据本发明的方法，与抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体以及非吸收性的类固醇进行联合给药的水杨酸盐（酯）可包括该水杨酸盐（酯）与该非吸收性的类固醇的任何重叠给药（overlappingadminstration）或序贯给药，目的系降低由免疫刺激性抗体诱发的回肠炎的发病率。因此，例如，根据本发明降低由免疫刺激性抗体诱发的回肠炎的发病率的方法涵盖同时或序贯地给予一种水杨酸盐（酯）以及一种非吸收性的类固醇（例如在非吸收性的类固醇之后6小时给予一种水杨酸盐（酯））、或它们的任何组合。此外，根据本发明，一种水杨酸盐（酯）以及一种非吸收性的类固醇可藉由相同的途径（例如这两者均藉由口服进行给药）或藉由不同的途径（例如水杨酸盐（酯）藉由口服进行给药，而非吸收性类固醇藉由直肠进行给药）进行给药，该等途径可不同于用于给予抗LAG-3以及抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体的一或多种途径。
藉由不应被解释为进一步限定的以下实例对本披露进行进一步阐述。本申请通篇引用的所有附图及所有参考文献、Genbank序列、专利及已公开的专利申请的内容均藉由引用明确地结合在此。特别地，PCT公开文件WO09/045957、WO09/073533、WO09/073546、以及WO09/054863的披露内容明确地藉由引用结合在此。
实施例1：针对LAG-3的人类单克隆抗体的产生
使用表达人类抗体基因的转基因小鼠，按照以下步骤，产生抗LAG-3人类单克隆抗体。
抗原
使用重组的人类LAG-3融合蛋白作为免疫原来产生抗人类LAG-3抗体。在某些免疫接种中，使用了一融合蛋白作为免疫原，该融合蛋白包括与人类免疫球蛋白Fc结构域（R&D Systems，Catalog#2319-L3）（D1-D4hFc）或小鼠免疫球蛋白Fc结构域（D1-D4mFc）相融合的人类LAG-3的整个细胞外区域（结构域1至4）。对于其它免疫接种而言，使用包括与小鼠免疫球蛋白Fc结构域相融合的、仅人类LAG-3的前两个细胞外结构域的一融合蛋白（D1-D2mFc）作为免疫原。使用标准的重组DNA技术来制备LAG-3融合蛋白。
转基因转染色体的KM Mouse TM 以及KM/FCGR2D Mouse TM 品系
使用表达人类抗体基因的转基因转染色体的KM MouseTM以及KM/FCGR2D MouseTM品系的小鼠制备针对人类LAG-3的完全人类单克隆抗体。
在KM MouseTM品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经被纯合地破坏，如在Chen et al.(1993)EMBO J.12:811-820中所说明的，并且内源性小鼠重链基因已经被纯合地破坏，如在PCT公开文件WO01/09187的实施例1中所说明。此外，这种小鼠品系携带一人类κ轻链转基因KCo5，如在以上所述之Fishwild et al.中所说明。该品系还包含携带人类免疫球蛋白重链基因座的SC20转染色体，如在PCT公开文件WO02/43478中所说明。KM/FCGR2DMouseTM品系除了它的基因组还包括内源性FcγRIIB基因的纯合破坏之外，与KM MouseTM品系系相同的。KM MouseTM以及KM/FCGR2D MouseTM品系还详细地说明于美国申请公开号20020199213中。
KM Mouse TM 以及KM/FCGR2D Mouse TM 的免疫
为了产生针对LAG-3的完全人类单克隆抗体，KM MouseTM以及KM/FCGR2D MouseTM品系的小鼠用以上所说明的三种不同的重组LAG-3融合蛋白（D1-D4hFc、D1-D4mFc、D1-D2,mFc）中之一进行免疫。通常的免疫方案说明于Lonberg et al.(1994)如上所述;Fishwild et al.，如上所述以及PCT公开文件WO98/24884中。第一次输注抗原时小鼠系6至16周龄。小鼠经腹膜内（IP）和/或皮下（SC）进行免疫。小鼠用10μg的重组LAG-3融合蛋白每两周免疫，进行四次，随后用20μg相同的免疫原（在作为佐剂的Ribi中）免疫两次。藉由眶后取血监测免疫反应。藉由ELISA（如以下说明）对血浆进行筛选，并且将具有足够滴度的抗LAG-3人类免疫球蛋白的小鼠用于融合。用20μg抗原经静脉内以及腹膜内对小鼠加强免疫，随后用20μg抗原静脉内加强免疫，然后处死小鼠并取出脾脏。
产生抗LAG-3抗体的KM以及KM/FCGR2D小鼠的选择
为了选择产生结合LAG-3蛋白之抗体的小鼠，藉由最初由Fishwild et al.(1996)所说明的改良的ELISA对来自用D1-D4hFc融合蛋白进行免疫的小鼠的血清进行测试。简言之，用PBS中的1μg/ml经纯化的重组LAG-3融合蛋白对微量滴定板进行包被，每孔50μl，在4℃下孵育过夜，然后用PBS中的5%的BSA以每孔200μl进行封闭。将来自被LAG-3免疫的小鼠的血浆的稀释液加至每个孔，并在环境温度下孵育1至2小时。用PBS/吐温洗涤该等板，并接着用偶联有辣根过氧化物酶（HRP）的山羊-抗人类κ轻链多克隆抗体在环境温度下孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物对该板进行显色，并由分光光度计在OD405进行分析。
对于用D1-D4mFc或D1-D2mFc融合蛋白进行免疫的小鼠而言，藉由间接的ELISA对来自该等小鼠的血清进行测试，其中在用该抗原进行包被之前使用山羊抗小鼠IgG对平板进行一小时的包被以消除与小鼠Fc部分的非特异性结合。接着如以上所说明执行相同的ELISA步骤。
将形成最高滴度的抗LAG-3抗体的小鼠用于融合。如下说明进行融合，并藉由ELISA针对抗LAG-3活性对杂交瘤上清液进行测试。
生产针对LAG-3蛋白的人类单克隆抗体的杂交瘤的产生
使用Cyto Pulse大腔细胞融合电穿孔仪（Cyto Pulse Sciences,Inc.,GlenBurnie,MD）藉由基于电场的电融合将从KM或KM/FCGR2D小鼠分离出的小鼠脾细胞融合至一小鼠骨髓瘤细胞系中。然后针对抗原特异之抗体的产生对得到的杂交瘤进行筛选。将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与四分之一数目的P3X63Ag8.6.53（ATCC,CRL1580）非分泌性小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将细胞以大约1x105个/孔接种于平底微孔滴定板中，接着在含10%胎牛血清的选择性培养基中孵育约两周，该选择性培养基中补充有RPMI中的origen（IGEN）、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、青霉素、链霉素、庆大霉素、lx HAT、以及β-巯基乙醇。1至2周后，用其中HAT被HT替换的培养基培养细胞。然后藉由ELISA（如上说明）针对人类抗LAG-3单克隆IgG抗体对各个孔进行筛选。一旦杂交瘤广泛生长发生，则通常在10至14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤进行再次接种，再次筛选，并且如果对人类IgG仍呈阳性，则藉由有限稀释将抗LAG-3单克隆抗体进行亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆在体外进行培养，以便在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。
选择杂交瘤克隆25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5用于进一步分析以及测序。
实施例2：人类抗LAG-3单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的结构表征
使用以下方案对编码由该等25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5克隆（在如实施例1中所说明）所表达的mAb的重链以及轻链可变区的cDNA序列进行测序。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)从5x106个杂交瘤细胞中制备总RNA。用SMART RACE cDNA Amplification Kit（ClontechLaboratories,Inc.,Mountain View,CA）以及SuperScript II ReverseTranscriptase（Invitrogen,Carlsbad,CA）藉由5’-RACE方案制备cDNA。使用与5’RACE通用引物混合进行配对的3’人类特异性的恒定区引物对每种抗体的V-区进行扩增。将包含V-区的PCR产物克隆进入pCR4-TOPO载体（Invitrogen,Carlsbad,CA）中并转化进入大肠杆菌菌株TOP10（Invitrogen,Carlsbad,CA）。制备小量DNA或Templiphi（GE Healthcare Biosciences,Piscataway,NJ,USA）样品，并进行DNA测序（Sequetech,Mountain View,CA）。分析生成的DNA序列的框内重排以及其它之抗体特征。经表达的蛋白藉由标准的蛋白质化学分析来表征。发现该等25E3、25F7以及26H10克隆表达包括一IgG1重链以及一κ轻链之抗体，而发现该等8B7以及17E5克隆表达包括一IgG4重链以及一κ轻链之抗体，并且发现该等11F2克隆表达包括一IgG2重链以及一κ轻链之抗体。
25F7的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别显示在图1A以及SEQID NO:49以及SEQ ID NO:37中。25F7的κ轻链可变区的核苷酸序列及氨基酸序列分别显示在图1B以及SEQ ID NO:55以及SEQ ID NO:43中。将25F7重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较（图7），显示25F7重链利用了来自于人类种系VH4-34的一VH区段（SEQID NO:61），以及来自于人类种系JH5b的一JH区段（SEQ ID NO:62）。使用CDR区测定的Kabat系统对25F7VH序列进行进一步分析，得到分别如在图1A以及SEQ ID NO:1、7以及13中所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。将25F7轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较（图8），显示25F7的κ轻链利用了来自于人类种系VK L6的一VK区段（SEQ ID NO:63），以及来自于人类种系JK2的一JK区段（SEQID NO:64）。使用CDR区测定的Kabat系统对25F7VK序列进行进一步分析，得到分别如在图1B以及SEQ ID NO:19、25以及31所示的轻链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
26H10的重链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列分别显示在图2A以及SEQ ID NO:50以及38中。26H10的轻链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列分别显示在图2B以及SEQ ID NO:56以及44中。将26H10重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较（图9），显示26H10重链利用了来自于人类种系VH3-33的一VH区段（SEQ ID NO:65），以及来自于人类种系JH6B的一JH区段（SEQ ID NO:66）。使用CDR区测定的Kabat系统对26H10VH序列进行进一步分析，得到分别如在图2A以及SEQ ID NO:2、8及14中所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。将26H10轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较（图10），显示26H10的κ轻链利用了来自于人类种系VK A27的一VK区段（SEQ ID NO:67），以及来自于人类种系JK3的一JK区段（SEQID NO:68）。使用CDR区测定的Kabat系统对26H10VK序列进行进一步分析，得到分别如在图2B以及SEQ ID NO:20、26及32所示的轻链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
25E3的重链可变区的核苷酸以及氨基酸序列分别显示在图3A以及SEQ ID NO:51以及SEQ ID NO:39中。25E3的轻链可变区的核苷酸以及氨基酸序列分别显示在图3B以及SEQ ID NO:57以及SEQ ID NO:45中。将25E3重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较（图11），显示25E3重链利用了来自于人类种系VH3-20的一VH区段（SEQID NO:69），以及来自于人类种系JH4b的一JH区段（SEQ ID NO:70）。使用CDR区测定的Kabat系统对25E3VH序列进行进一步分析，得到分别如在图3A以及SEQ ID NO:3、9以及GGY中所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。将25E3轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较（图12），显示25E3的κ轻链利用了来自于人类种系VK L18的一VK区段（SEQ ID NO:71），以及来自于人类种系JK2的一JK区段（SEQ ID NO:64）。使用CDR区测定的Kabat系统对25E3VK序列进行进一步分析，得到分别如在图3B以及SEQ ID NO:21、27以及33中所示的轻链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
8B7的重链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列分别显示在图4A以及SEQ ID NO:52以及40中。8B7的轻链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列分别显示在图4B以及SEQ ID NO:58以及46中。将8B7重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较（图13），显示8B7重链利用了来自于人类种系VH4-34的一VH区段（SEQ ID NO:61），以及来自于人类种系JH5B的一JH区段（SEQ ID NO:62）。使用CDR区测定的Kabat系统对8B7VH序列进一步分析，得到分别如在图4A以及SEQ ID NO:4、10以及16中所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。将8B7轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较（图14），显示8B7的κ轻链利用了来自于人类种系VK L6的一VK区段（SEQ ID NO:63），以及来自于人类种系JK4的一JK区段（SEQ ID NO:72）。使用CDR区测定的Kabat系统对26H10VK序列进行进一步分析，得到分别如在图4B以及SEQ ID NO:22、28以及34中所示的轻链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
11F2的重链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列分别显示在图5A以及SEQ ID NO:53以及41中。11F2的轻链可变区的核苷酸序列以及氨基酸序列分别显示在图5B以及SEQ ID NO:59以及47中。将11F2重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较（图15），显示11F2重链利用了来自于人类种系VH1-24的一VH区段（SEQ ID NO:73）、来自于人类种系2-15的一D区段、以及来自于人类种系JH4B的一JH区段（SEQ ID NO:70）。使用CDR区测定的Kabat系统对11F2VH序列进一步分析，得到分别如在图5A以及SEQ ID NO:5、11以及17中所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。将11F2轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较（图16），显示11F2的κ轻链利用了来自于人类种系VK L6的一VK区段（SEQ ID NO:63），以及来自于人类种系JK1的一JK区段（SEQ ID NO:74）。使用CDR区测定的Kabat系统对11F2的VK序列进行进一步分析，得到分别如在图5B以及SEQ ID NO:23、29及35中所示的轻链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
17E5的重链可变区的核苷酸以及氨基酸序列分别显示在图6A以及SEQ ID NO:54以及42中。17E5的轻链可变区的核苷酸以及氨基酸序列分别显示在图6B以及SEQ ID NO:60以及48中。将17E5重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列进行比较（图17），显示17E5重链利用了来自于人类种系VH3-33的一VH区段（SEQ ID NO:65）、来自于人类种系2-2的一D区段、以及来自于人类种系JH4B的一JH区段（SEQ IDNO:70）。使用CDR区测定的Kabat系统对17E5的VH序列进一步分析，得到分别如在图6A以及SEQ ID NO:6、12以及18所示的重链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。将17E5轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列进行比较（图18），显示17E5的κ轻链利用了来自于人类种系VK L6的一VK区段（SEQ ID NO:63），以及来自于人类种系JK5的一JK区段（SEQ ID NO:75）。使用CDR区测定的Kabat系统对17E5的VK序列进行进一步分析，得到分别如在图6B以及SEQ ID NO:24、30以及36中所示的轻链CDR1、CDR2以及CDR3区的示意图。
使用标准的重组DNA技术可将25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的可变区转化为任何希望的同种型的全长抗体。例如，可将编码VH及VK区的DNA克隆进入一表达载体中，该表达载体携带重链及轻链恒定区，这样该等可变区被可操作性地连接到恒定区上。可替代地，多个分别的载体可以被用于表达全长重链及全长轻链。适宜用于产生全长抗体的表达载体的非限制性实施例包括在美国专利公开号20050153394中说明的pIE载体。
实施例3：LAG-3单克隆抗体的结合特性的表征
在这个实施例中，藉由流式细胞术来检查人类抗LAG-3抗体与细胞表面LAG-3（人类、猴以及小鼠LAG-3）的结合。此外，藉由BIACORE分析来分析针对LAG-3的结合动力学。此外使用肽扫描实验进行表位作图。
A.流式细胞术研究
1.CHO-人LAG-3细胞结合
为了测试抗体与细胞表面LAG-3蛋白结合的能力，将该等抗体与一CHO细胞系一起孵育，已经对该CHO细胞系进行转染以便在细胞表面上表达人类LAG-3。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5单克隆抗体用冷的1x PFAE缓冲液（1x PBS+2%FBS，0.02%叠氮化钠，2mM Na EDTA）进行系列稀释。对于结合反应，将50μl已稀释之抗体溶液加入至包含2x105个细胞的50μl细胞悬浮液中，并将混合物在冰上孵育30分钟。然后用1xPFAE缓冲液将细胞洗涤两次。加入1:100稀释的FITC标记的山羊抗人κ轻链抗体（Bethyl Laboratories,Inc.,Cat.#A80-115F），并将混合物在4℃下孵育30分钟，之后用冷的1x PFAE缓冲液洗涤两次。在最后的洗涤后，将包含10μg/mL碘化丙啶（Roche Applied Science,Cat#1_348_639）的150μl冷的1x PFAE加入至每个溶液中，并使用FACScalibur流式细胞仪（BDBioscience）藉由流式细胞术进行抗体结合的分析。
在以下表1中总结了流式细胞术分析的结果，此表显示了与CHO-人类LAG-3结合的EC50，证明25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5有效地与细胞表面的人类LAG-3结合，其中25F7具有的EC50比25E3低约20倍，但与8B7以及26H10的EC50近似等价。11F2以及17E5的EC50结果与25E3的结果在相同的范围内。
表1：抗LAG-3抗体与表达人类LAG-3的CHO细胞的结合
抗体 EC 50 (nM)
25F7 0.45–2.52
8B7 1.93–4.44
26H10 1.81–3.64
11F2 15.12
25E3 14.9–25.39
17E5 12.3
2.被活化的人类CD4 + T细胞结合
为了测试抗体与在被活化的人类T细胞的表面上的天然人类LAG-3结合的能力，从经纯化的外周血单个核细胞中分离出休眠的CD4+T细胞，并用附着至聚苯乙烯珠粒的抗CD3与抗CD28抗体的一组合使之经受三天的刺激。25F7、8B7以及26H10单克隆抗体用冷的1x PFAE缓冲液（1x PBS+2%FBS，0.02%叠氮化钠，2mM Na EDTA）进行系列稀释。对于结合反应，将50μl被稀释之抗体溶液与50μl的PE标记的抗人类CD4（BD Bioscience,Cat#555347）进行混合。藉由以上所说明的相同的方案对被活化的T细胞进行处理。如以上所说明进行抗体结合的分析。
在以下表2中总结了流式细胞术分析的结果，该表显示了与被活化的人类CD4+T细胞结合的EC50，证明所有三种抗体都类似地与细胞表面的人类LAG-3结合。
表2：抗LAG-3抗体与被活化的人类CD4 + T细胞的结合
抗体 EC 50 (nM)
25F7 0.27–0.45
26H10 0.41–0.84
8B7 0.69–1.80
3.猴LAG-3抗原结合
为了确定抗LAG-3抗体与猴类LAG-3是否进行交叉反应，藉由RT-PCR从混合的cDNA制备物中克隆出一cDNA序列，该混合的cDNA系藉由RNA的逆转录从猕猴以及恒河猴的组织样本的集合中制备的。首先使用引物（5’正向引物:5Mcyn1408;5’-atgtgggaggctcagttcctg-3’(SEQ ID NO:91)以及3’反向引物:3Mcyn1408a;5’-gtcagagctgctccggctc-3’(SEQ ID NO:92)）使用富含GC的PCR扩增系统（Roche）从该cDNA库中对该序列进行扩增，并将其克隆进入一受体TOPO克隆载体（Invitrogen）中用于序列分析。与参考Genbank恒河猴LAG-3序列（Genbank登录号XM_001108923）相匹配的克隆随后使用第二组引物从TOPO克隆载体DNA进行再次扩增，该组引物引入了用于在哺乳动物细胞表达载体中定向克隆的限制酶位点。
对猴的LAG-3克隆pa23-5进行分离并测序。分离的猴的序列显示出与参考Genbank恒河猴LAG-3序列有99.6%的同一性。cDNA克隆pa23-3（SEQID NO:93）的氨基酸序列与来自Genbank（登录号XM_001108923）的恒河猴LAG-3（SEQ ID NO:94）的比较示于图19中。除了在位置419上的一氨基酸不同（在克隆pa23-5中的精氨酸与在Genbank恒河猴序列中的苏氨酸进行比较）外，这两条序列系相同的，并且在这个基础上推断cDNA克隆pa23-5代表恒河猴LAG-3基因序列。
克隆pa23-5的cDNA被插入到一表达构建体中，该构建体藉由核转染（Amaxa）被转染进入CHO-S悬浮细胞中。由经过分选的、耐受选择药物的克隆所进行的恒河猴LAG-3表达藉由FACS分析进行了验证。在类似于以上所说明的那些FACS测定的测定中使用过量表达恒河猴LAG-3的这种克隆的CHO细胞系来测量抗体对于这种猴的蛋白的交叉反应性。简言之，25F7、8B7以及26H10单克隆抗体用冷的1x PFAE缓冲液（1x PBS+2%FBS，0.02%叠氮化钠，2mM Na EDTA）进行系列稀释。对于结合反应，将50μl被稀释之抗体溶液加入至包含2x105个细胞的50μl细胞悬浮液中，并将混合物在冰上孵育30分钟。藉由以上所说明的相同的方案对细胞进行处理。如以上所说明进行抗体结合的分析。
在一分别的实验中，使用被活化的猕猴T细胞测试抗体与猕猴LAG-3的结合。该等猴的T细胞的体外活化系凭借与以上所说明的人类T细胞体外活化基本上相同的方案藉由对T细胞的抗CD3/抗CD28处理实现的，随后如以上对体外被活化的人类CD4+T细胞的染色所说明进行流式细胞术分析。
在以下表3中总结了使用CHO-恒河猴LAG-3细胞以及被活化的猕猴T细胞的流式细胞术分析的结果，该表显示了与表达猴类LAG-3的两种不同类型的细胞结合的EC50。该等结果显示所有之抗体有效地结合在被活化的猕猴T细胞上的LAG-3以及被转染进入CHO细胞的恒河猴LAG-3（SEQ ID NO:93）二者。然而，有一结合亲和力的层级，克隆26H10表现出最高的亲和力，该亲和力比克隆8B7以及25F7分别好约2.5倍以及6倍。在两种细胞类型之间的结合层级的差别可反映在恒河猴以及猕猴LAG-3蛋白之间的氨基酸序列差别。
表3：抗LAG-3抗体与猴类LAG-3的结合
4.小鼠LAG-3抗原结合
为了确定抗体是否与小鼠LAG-3进行交叉反应，使用小鼠T细胞杂交瘤细胞系（3A9）（已经对其进行转染以便在其细胞表面上表达小鼠LAG-3）作为靶细胞进行了类似于以上所说明的研究的流式细胞术研究，随后进行FACS分析来检测抗体结合。结果表明，与显示出强染色的对照抗小鼠LAG-3对照抗体不同，人类抗体25E3、25F7、8B7或26H10均未显示出背景水平以上的与细胞表面小鼠LAG-3的结合，证明该等抗体都不与小鼠LAG-3进行交叉反应。
B.BIACORE分析
使用一捕获方法藉由BIAcoreTM检验25E3、25F7、8B7、26H10以及17E5抗体与重组LAG-3蛋白的结合。使用抗CH1（一试剂抗体）分别捕获25E3、25F7、8B7、26H10以及17E5抗体，该抗CH1对人类抗体的重链恒定区1系特异的（Zymed,Clone HP6045，储存浓度1.0mg/ml）。将抗CH1以高密度（9700-11500RU）包被在一CM5芯片（BR-1000-14，研究级）上。基于由生产商推荐的标准固定化操作进行了包被。然后在抗CH1包被的表面上以10uL/min的流速对浓度范围从0.5至3μg/mL的25E3、25F7、8B7、26H10或17E5经纯化之抗体进行捕获，持续1分钟。将单一浓度的重组人类LAG-3融合蛋白（20nM）以25μg/mL的流速在被捕获之抗体上注射了3分钟。允许抗原解离7.5分钟。每次循环后，用25μl的25mM NaOH对芯片表面进行再生，然后用30μl的HBS-EP进行洗涤。在芯片上运行同种型对照，并且使用该等数据来减去非特异性结合。使用BIAcore控制软件v3.2，在Biacore3000表面等离振子共振仪上进行所有的实验。使用BiaEvaluationv3.2软件进行数据分析。结果显示在以下表4中。25E3、25F7、8B7、26H10以及17E5的BIAcore结果证实了流式细胞术结果，即所有五种抗体都能够以高亲和力与人类LAG-3结合。
表4：抗LAG-3抗体对重组的人类LAG-3的结合动力学
抗体 K D  x10 -9 (M)
25E3 0.09
8B7 0.09
26H10 0.10
25F7 0.47
17E5 4.53
C.表位作图
在LAG-3蛋白中，细胞外区域的免疫球蛋白样第一结构域包含一具有以下氨基酸序列的暴露的“外环”(extra loop)：GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY（SEQ ID NO:79）。为了检验25E3、25F7、8B7以及26H10与LAG-3的这一区域的结合并对由每种抗体所结合的表位作图，在整个这一区域内进行肽扫描实验。制备了对外环序列的全长进行扫描的一系列10种重叠肽并将其偶联至生物素上。为了ELISA分析，使用以链霉亲合素（Sigma-Aldrich，Cat#M5432）预包被的微孔滴定板来捕获生物素化的环肽缀合物（该缀合物以2μg/mL的浓度以100μl体积来施用），并在4℃下孵育18小时，在这之后将板洗涤3次并用封闭缓冲液（1x PBS+10%FBS）在室温下封闭1小时。紧接着，应用在封闭缓冲液中被系列稀释3倍（从10μg/mL开始）的人类抗LAG-3抗体并将该等板在室温孵育2小时，并接着洗涤三次。为了检测所结合的人类抗体，将HRP偶联的山羊抗人κ轻链抗体（Bethyl Laboratories，Cat#A80-115P）在封闭缓冲液中稀释至1μg/mL，并应用至测定孔中持续1小时，随后洗涤三次并应用TMB底物（eBioscience，Cat#00-4201-56）。在Spectramax340PC分光光度计（Molecular Dynamics,Inc.)上在650nm波长下进行光密度读数。在以下表5中总结了肽扫描实验的结果。
表5：抗LAG抗体与LAG-3外环的肽扫描的结合
LAG-3额外环肽扫描 SEQ
GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY 79 25E3 8B7 25F7 26H10
GPPAAAPGHPLA 80 - - - -
PAAAPGHPLAPG 81 ++ - - -
AAPGHPLAPGPH 82 ++ - - -
PGHPLAPGPHPA 83 + - - -
HPLAPGPHPAAP 84 ± - - -
LAPGPHPAAPSS 85 - - - -
PGPHPAAPSSWG 86 - ++ ++ -
PHPAAPSSWGPR 87 - ++ ++ -
PAAPSSWGPRPR 88 - ++ + -
APSSWGPRPRRY 89 - - - -
基于该等结果，确定了25E3抗体识别在包括氨基酸序列PGHPLAPG（SEQ ID NO:76）的细胞外环内的一区域，而25F7抗体识别在包括氨基酸序列HPAAPSSW（SEQ ID NO:77）的外环内的一区域，并且8B7似乎识别在包含氨基酸序列PAAPSSWG（SEQ ID NO:78）的细胞外环内的一区域。相比之下，可检测到26H10抗体不结合全长外环肽或更短的扫描肽中的任何肽。
在全长外环序列中对在这一研究所鉴定的区域添加下划线：
因此，该肽扫描结果表明25E3、25F7以及8B7抗体与人类LAG-3内不同但位置接近的表位进行结合。
为了进一步检验该等抗体与外环肽区域的结合，进行了另外的ELISA测定。在使用人类全长外环肽（SEQ ID NO:79）的一项ELISA测定中，确定了25E3、25F7以及8B7的结合的EC50值。另外地，使用来自恒河猴LAG-3的全长的外环肽序列（具有序GPPAPAPGHPPAPGHRPAAP YSWGPRPRRY（SEQ ID NO:90)）进行一项类似的肽ELISA，并确定了25F7以及8B7的结合的EC50值。在以下的表6中总结了结果。该等结果证实抗体25E3、25F7以及8B7能够识别人类LAG-3外环肽区域。此外，抗体25F7以及8B7还与恒河猴LAG-3外环肽区域进行结合，尽管与人类序列相比结合欠佳，这可能是由于在这个多肽中的物种序列趋异的缘故。该等结果还证实26H10抗体不能够识别LAG-3额外环肽。
表6：抗LAG-3抗体与人类以及恒河猴LAG-3额外环肽的结合
抗体 人类外环EC 50 (nM) 恒河猴外环EC 50 (nM)
25E3 0.55 未经测试
25F7 0.29-0.95 13.09
8B7 0.28-1.35 0.60
26H10 没有结合 没有结合
实施例4：抗LAG-3mAb对LAG-3与MHC II类结合的抑制
为了测试抗LAG-3抗体抑制LAG-3与MHC II类分子结合的能力，进行了一项体外结合测定，其中一种LAG-3融合蛋白（包括与小鼠Fc相融合的人类LAG-3细胞外结构域（hLAG-3-mIg））与表达人类MHC II类分子的Daudi细胞进行反应。
为了测试抗体对LAG-3与MHC II类的结合的抑制，将25E3、25F7、8B7以及26H10在PFAE缓冲液中从20μg/mL进行系列稀释，并向该等系列稀释液中加入1μg/ml的hLAG-3-mIg融合蛋白。将这一混合物在室温孵育20分钟，然后加入2x105个经1x PFAE洗涤的Daudi细胞。将这一混合物应用于Daudi细胞并在4℃下孵育30分钟。将细胞粒化（pellet）（三分钟，400xg），用1x PFAE缓冲液洗涤一次，并再次粒化，并且使用重组的PE标记的抗mIgG Fcγ第二试剂检测hLAG-3-mIg与Daudi细胞的结合。用FACScalibur流式细胞仪（BD Bioscience）进行LAG-3-mIg结合的分析。在以下的表7中总结了结果，该表显示了以nM计量的IC50值。
表7：抗LAG-3抗体对LAG-3与MHC II类结合的抑制
抗体 IC 50 (nM)
25E3 0.8-6.78
25F7 0.12-0.92
8B7 0.19–0.95
26H10 0.10
该等结果证明所有四种抗体在抑制LAG-3与MHC II类抗体的结合中都是有效的，其中25F7、8B7以及26H10显示的IC50值比25E3显示的IC50值低约7到13倍。
实施例5：抗LAG-3mAb对抗原特异性T细胞应答的刺激
为了测试抗LAG-3抗体刺激抗原特异性T细胞应答的能力，使用了一项3A9T细胞肽刺激测定（参见，例如Workman et al.(2003)J.Immunol.169:5392-5395；Workman et al.(2002)Eur.J.Immunol.32:2255-2263）。
在这项测定中，对肽HEL48-62特异的一小鼠T细胞杂交瘤3A9作为反应者T细胞（responder T cell）而被使用。将反应者3A9T细胞以逆转录病毒的方式进行转导以在其细胞表面上表达人类LAG-3或小鼠LAG-3。用来将HEL48-62肽抗原呈递给3A9细胞的抗原呈递细胞（APC）系小鼠MHC II类阳性的细胞系LK35.2。多个分别的研究确定一人类LAG-3融合蛋白能够与小鼠MHC II类分子进行结合，由此确认了LK35.2小鼠APC在这项测定中的用途。藉由白介素-2（IL-2）的产生表明了3A9细胞的抗原特异性刺激，藉由ELISA测量白介素-2的分泌（小鼠IL-2OptEIA试剂盒，BD Bioscience，Cat#555148根据制造商的建议）。
当经转染的T细胞与呈递HEL48-62肽抗原的LK35.2APC一起孵育时，人类或小鼠LAG-3在3A9T细胞上的异位表达在不存在任何抗体时导致对抗原特异性反应的抑制作用，正如由以下所显示：与对照3A9T细胞的肽的剂量反应性质相比，刺激3A9细胞产生IL-2所需的肽抗原的量增加。
为了测试抗体对抗原特异性T细胞应答的刺激，首先将APC（2.5x104个细胞）与抗原性肽（200nM）在37℃下进行预孵育30分钟，并将3A9T细胞（5.0x104个表达mLAG-3或hLAG-3的细胞或对照细胞）与从25μg/mL起经三倍系列稀释的抗hLAG-3抗体（25E3、25F7、8B7、26H10、11F2、17E5）在37℃下预孵育15分钟。然后将3A9T细胞加入至经抗原脉冲（antigen-pulsed）的APC中，并将培养物在37℃下预孵育24小时。然后收集上清液并对其测量小鼠IL-2的产生。表达人类LAG-3的3A9T细胞的结果在图8中，该图显示了以nM计量的IC50值。
表8：抗LAG-3抗体对抗原特异性T细胞应答的刺激
抗体 3A9-hLAG-3肽测定IC 50 (nM)
25F7 0.14–1.94
26H10 1.45–6.49
8B7 3.25–13.90
25E3 3.88–70.78
11F2 81.50–240
17E5 没有抑制
该等结果显示在抗原特异性T细胞应答测定中，抗体25F7、8B7以及26H10，以及（较小程度）25E3能够刺激IL-2产生，而抗体11F2表现出最小的抑制能力，并且抗体17E5在这一测定中没有功能。该等抗体均不改变测量出由对照3A9T细胞或转染了小鼠LAG-3蛋白的3A9T细胞产生的IL-2，证明了该刺激效应的特异性。
实施例6：单独的或组合的抗LAG-3mAb对肿瘤生长的抑制
为了测试抗LAG-3抗体单独或与另一免疫刺激性抗体相组合在体内抑制肿瘤细胞生长的能力，使用了两个不同的同系基因型小鼠的肿瘤移植模型。第一个模型使用鼠类Sa1N纤维肉瘤细胞。第二个模型使用鼠类MC38结肠癌细胞系。
在第一实验中，小鼠（A/J品系）在第0天各自植入2x106个Sa1N纤维肉瘤细胞，并允许肿瘤细胞生长7天。在植入后第7天、第10天以及第12天，用10mg/kg的以下抗体对小鼠进行处理：单独用抗LAG-3mAb（大鼠抗小鼠LAG-3mAb C9B7W;eBioscience,Cat.No.14-2231）、单独用抗PD-L1抗体（一抗小鼠PD-L1mAb14D8）、抗LAG-3与抗PD-L1抗体进行组合、或一IgG1同种型对照抗体。14D8mAb系一大鼠抗小鼠PD-L1抗体，该抗体已经被嵌合而包含小鼠IgG1以及小鼠κ恒定区。
在植入后测量小鼠体内肿瘤体积，持续超过50天，并确定肿瘤体积均值和中值。计算平均肿瘤生长抑制（基于同种型对照IgG1抗体的处理为0%抑制）。在以下表9中总结了植入后第24天的结果：
表9：在Sa1N肿瘤模型中的平均肿瘤生长抑制
天 IgG1 LAG-3 PD-L1 组合
24 - 68 74.9 95.8
因此，单独用抗LAG-3抗体、或单独用抗PD-L1抗体的处理导致肿瘤生长的抑制，而这两种抗体的组合导致了更大的肿瘤生长抑制。就处理组而言，到实验结束时结果是单独用抗LAG-3处理的10只小鼠中有4只没有肿瘤，而用参照IgG1抗体处理的10只小鼠中只有1只没有肿瘤。类似地，单独用抗PD-L1处理的11只小鼠中有4只变成没有肿瘤。用抗LAG-3以及抗PD-L1的组合对小鼠的处理导致10只小鼠中有9只没有肿瘤；剩余小鼠（并非没有肿瘤）具有一无痛肿瘤，这种无痛肿瘤在整个研究中仍是很小。
两项另外的研究使用了移植有鼠类MC38结肠癌细胞系的小鼠。在第一实验中，C57Bl/6小鼠在第0天各自植入2x106个MC38细胞，并在植入后第7天、第10天以及第12天单独用200μg/剂的抗LAG-3（C9B7W mAb）、单独用抗PD-1（4H2mAb）或抗LAG-3与抗PD-1的组合进行处理。使用400μg/剂的IgG1同种型匹配之抗体作为对照。4H2mAb系一大鼠抗小鼠PD-1抗体，该抗体已经被嵌合而包含小鼠IgG1以及小鼠κ恒定区。
在植入后80天确定了肿瘤体积均值、肿瘤体积中值以及%存活。该等结果显示在这一肿瘤模型（MC38）中的LAG-3单一疗法在抑制肿瘤生长上显示出很小的活性或没有显示活性，并且经处理的小鼠在实验的持续时间内均未存活。相比之下，抗PD-1单一疗法显示出显著的活性，其中10只小鼠中有4只在实验结束时没有肿瘤。此外，类似于Sa1N模型的结果，抗LAG-3加上抗PD-1的联合治疗比单独用任一处理更为有效，其中8只小鼠中有7只在实验结束时没有肿瘤。
在MC38模型的第二个实验中，C57Bl/6小鼠在第0天各自植入2x106个MC38细胞，并在植入后第5天、第8天以及第11天用200μg/剂的测试抗体和/或400μg/剂的对照IgG抗体进行处理，如下：(i)抗IgG1对照抗体；(ii)抗LAG-3mAb（C9B7W mAb）与对照IgG1一起；(iii)抗PD-1抗体（4H2）与对照IgG1一起；(iv)抗CTLA-4抗体（9D9小鼠的抗小鼠CTLA-4mAb）与对照IgG1一起；(v)抗LAG-3mAb与抗PD-1mAb一起；或者(vi)抗LAG-3mAb与抗CTLA-4mAb一起。9D9mAb系在小鼠中产生的一小鼠的抗小鼠CTLA-4抗体，在这种小鼠中内源性的小鼠CTLA-4已被敲除。
在植入后100天里确定肿瘤体积均值、肿瘤体积中值以及%存活。该等结果与第一实验相类似，即LAG-3单一疗法在抑制MC38肿瘤生长中显示出很小的活性或没有显示活性，并且经处理的小鼠在实验的持续时间内均未存活。CTLA-4单一疗法也在抑制MC38肿瘤生长上显示出很小的活性或没有显示活性，并且经处理的小鼠在实验的持续时间内均未存活。相比之下，抗PD-1单一疗法再次显示出显著的活性，其中10只小鼠中有4只在实验结束时没有肿瘤。此外，再一次显示联合疗法比单一疗法更为有效。对于用抗LAG-3与抗CTLA-4的组合处理的小鼠而言，10只中有3只在实验结束时没有肿瘤，而对于用抗LAG-3与抗PD-1的组合处理的小鼠而言，10只中有8只在实验结束时没有肿瘤。
因此，以上所说明的体内肿瘤移植研究证明，对于至少某些肿瘤模型而言，单独用抗LAG抗体处理导致在体内肿瘤生长的显著抑制。此外，对于多种肿瘤模型而言，与单独的单一疗法相比，抗LAG-3抗体与无论抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体的联合治疗导致更大的抗肿瘤活性。
实施例7：藉由抗LAG-3mAb的抑制促进NOD小鼠中自身免疫
为了测试抗LAG-3抗体刺激免疫反应的能力，如自身免疫的形成所显示的，使用糖尿病的NOD小鼠模型。已知NOD小鼠易于形成自身免疫性糖尿病。在雌性NOD小鼠中，可藉由测量血清葡萄糖追踪糖尿病的进展。因此，检查抗LAG-3治疗单独或与任一免疫刺激性抗体进行组合对雌性NOD小鼠中糖尿病形成的影响。
在第0天、第2天以及第5天用250μg/剂的以下任一项对雌性NOD小鼠进行处理：(i)抗IgG1同种型对照抗体；(ii)单独的抗LAG-3mAb（C9B7WmAb）；(iii)单独的抗PD-1mAb（4H2mAb）；(iv)单独的抗CTLA-4mAb（9D9mAb）；(v)抗LAG-3mAb与抗PD-1mAb一起；或者(vi)抗LAG-3mAb与抗CTLA-4一起。该等结果证明单独的抗LAG-3处理或单独的抗PD-1处理（但没有单独的抗CTLA-4处理）提高了转变为糖尿病表型的小鼠的数目。此外，抗LAG-3加上抗PD-1、或抗LAG-3加上抗CTLA-4的组合处理在将小鼠转变为糖尿病表型中甚至更为有效。
因此，该等结果证明在NOD小鼠中，阻断LAG-3与其受体的相互作用干扰了负性免疫调节信号，其允许更大的免疫活性，并且在经LAG-3处理的小鼠中这种更大的免疫活性可藉由用抗PD-1或抗CTLA-4抗体的组合处理得到增强。
实施例8：使用抗LAG-3mAb的免疫组织化学
在这个实验中，将经荧光标记的抗LAG-3人类抗体用于免疫组织化学实验。使用了以下FITC标记的、人类抗LAG-3抗体：25F7-FITC（F:P=2.9；IgG1形式）；25F7-G4-FITC（F:P=2.7；IgG4形式）；8B7-FITC（F:P=2.6）以及26H10-FITC（F:P=3.4）。一组淋巴样组织（确切地是扁桃体（二个样本）、脾脏（二个样本）以及胸腺（二个样本））与垂体组织（四个样本）一起得到检验。还使用经LAG-3转染的CHO细胞作为对照。使用了经丙酮固定的冷冻切片。该等切片用FITC标记的抗LAG-3抗体（0.2至5μg/ml）进行染色，随后用一兔抗FITC抗体作为搭桥抗体（bridge antibody）进行染色，并接着使用兔EnVisionTM+System Kit（Dako USA,Carpinteria,CA）进行显影。结果总结在以下表10中。
表10：使用抗LAG-3mAb的免疫组织化学
LC=淋巴细胞；+=阳性染色；-=阴性染色
如所预期，在该组淋巴样组织中检测到了LAG-3表达。另外地，所检验的这三种抗LAG-3抗体中有两种（25F7（IgG1以及IgG4形式）以及26H10）显示出保留在垂体组织中，而所检验的一抗体8B7并未显示出保留在垂体组织中。因此，免疫组织化学实验鉴定了抗LAG-3抗体的两个子集，其中一子集被保留在垂体组织中，而另一子集未保留在垂体组织中。
序列表概述
本发明涉及下述各项。
1.分离的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体结合人类LAG-3并且表现出以下特性中的至少一种：
(a)结合猴类LAG-3；
(b)不结合小鼠LAG-3；
(c)抑制LAG-3与主要组织相容性（MHC）II类分子之结合；并且
(d)刺激免疫反应。
2.如项第1项所述之抗体，其中该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少两种。
3.如项第1项所述之抗体，其中该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少三种。
4.如项第1项所述之抗体，其中该抗体表现出(a)、(b)、(c)以及(d)全部四种特性。
5.如项第1项所述之抗体，其中该抗体在抗原特异性T细胞应答中刺激白介素2（IL-2）之产生。
6.如项第1项所述之抗体，其中该抗体刺激抗肿瘤免疫反应。
7.如项第1项所述之抗体，其中该抗体结合人类LAG-3的表位，该表位包括氨基酸序列PGHPLAPG（SEQ ID NO:76）。
8.如项第1项所述之抗体，其中该抗体结合人类LAG-3的表位，该表位包括氨基酸序列HPAAPSSW（SEQ ID NO:77）或PAAPSSWG（SEQ IDNO:78）。
9.如项第1项所述之抗体，其中所述抗体以1x10-7M或更小之KD与人类LAG-3结合。
10.如项第1项所述之抗体，其中所述抗体以1x10-8M或更小之KD与人类LAG-3结合。
11.如项第1项所述之抗体，其中所述抗体藉由免疫组织化学法使垂体组织染色。
12.如项第1项所述之抗体，其中所述抗体藉由免疫组织化学法不使垂体组织染色。
13.分离的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体与参考抗体交叉竞争而结合人类LAG-3，其中该参考抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:43；
(b)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:44；
(c)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:46；
(d)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:39，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:45；
(e)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:41，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:47；或
(f)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:48。
14.如项第13项所述之抗体，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:43。
15.如项第13项所述之抗体，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:44。
16.如项第13项所述之抗体，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:46。
17.如项第13项所述之抗体，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:39，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:45。
18.如项第13项所述之抗体，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:41，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:47。
19.如项第13项所述之抗体，其中该参考抗体包括：
重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:48。
20.分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区系人类VH3-20基因、人类VH4-34基因、人类VH3-33基因或VH1-24基因之产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。
21.分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L18基因、人类VK L6基因或人类VK A27基因之产物或是衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。
22.分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，该重链可变区系人类VH4-34基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因之产物或衍生于该基因；
(b)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK A27基因之产物或衍生于该基因；
(c)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-20基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L18基因之产物或衍生于该基因；
(d)重链可变区，该重链可变区系人类VH1-24基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因之产物或衍生于该基因；或者
(e)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因之产物或衍生于该基因；
其中该抗体特异性结合人类之LAG-3。
23.如项第1项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:1；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:7；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:13；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:19；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:25；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:31。
24.如项第1项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:2；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:8；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:14；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:20；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:26；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:32。
25.如项第1项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:4；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:10；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:16；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:22；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:28；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:34。
26.如项第1项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:3；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:9；
(c)重链可变区CDR3，包括GGY；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:21；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:27；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:33。
27.如项第1项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:5；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:11；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:17；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:23；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:29；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:35。
28.如项第1项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:6；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:12；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:18；
(d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO:24；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO:30；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO:36。
29.分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括：
(a)重链可变区，该重链可变区包括一氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO:37至42；以及
(b)轻链可变区，该轻链可变区包括一氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为：SEQ ID NO:43至48；
其中该抗体特异性地结合人类LAG-3蛋白。
30.如项第29项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:43。
31.如项第29项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:44。
32.如项第29项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:46。
33.如项第29项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:39；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:45。
34.如项第29项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:41；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:47。
35.如项第29项所述之抗体，该抗体包括：
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42；以及
(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO:48。
36.组合物，包括如项第1项所述之抗体、或其抗原结合部分、以及药学上可接受之载体。
37.免疫缀合物，包括被连接至治疗剂之如项第1项所述之抗体、或其抗原结合部分。
38.组合物，包含如项第37项所述之免疫缀合物以及药学上可接受之载体。
39.如项第37项所述之免疫缀合物，其中该治疗剂系细胞毒素。
40.组合物，包含如项第39项所述之免疫缀合物以及药学上可接受之载体。
41.如项第37项所述之免疫缀合物，其中该治疗剂系放射性同位素。
42.组合物，包含如项第41项所述之免疫缀合物以及药学上可接受之载体。
43.分离的核酸分子，该核酸分子对如项第1项所述之抗体、或其抗原结合部分进行编码。
44.表达载体，包括如项第43项所述之核酸分子。
45.宿主细胞，包括如项第44项所述之表达载体。
46.用于制备抗LAG-3抗体之方法，该方法包括在如项第45项所述之宿主细胞中对该抗体进行表达，并且从该宿主细胞中分离该抗体。
47.刺激抗原特异性T细胞应答之方法，该方法包括使所述T细胞与如项1所述之抗体接触，这样刺激了抗原特异性T细胞应答。
48.如项第47项所述之方法，其中刺激了由抗原特异性T细胞进行之白介素2产生。
49.在受试者中刺激免疫反应之方法，该方法包括给予该受试者如项1所述之抗体，这样刺激了该受试者中的免疫反应。
50.如项第49项所述之方法，其中该受试者系携带肿瘤之受试者，并且刺激了针对该肿瘤的免疫反应。
51.如项第49项所述之方法，其中该受试者系携带病毒之受试者，并且刺激了针对该病毒的免疫反应。
52.抑制受试者中肿瘤细胞生长之方法，该方法包括给予该受试者如项第1项所述之抗体，这样使该受试者中之肿瘤生长得到抑制。
53.治疗受试者中病毒感染之方法，该方法包括给予该受试者如项第1项所述之抗体，这样使该受试者中之病毒感染得到治疗。
54.在受试者中刺激免疫反应之方法，该方法包括给予该受试者抗LAG-3抗体以及至少一种另外之免疫刺激性抗体，这样刺激了该受试者中的免疫反应。
55.如项第54项所述之方法，其中该至少一种另外之免疫刺激性抗体系抗PD-1抗体。
56.如项第54项所述之方法，其中该至少一种另外之免疫刺激性抗体系抗PD-L1抗体。
57.如项第54项所述之方法，其中该至少一种另外之免疫刺激性抗体系抗CTLA-4抗体。
58.如项第54项所述之方法，其中该抗LAG-3抗体系人类抗体。
59.如项第54项所述之方法，其中该抗LAG-3抗体系嵌合抗体或人源化抗体。
60.如项第54项所述之方法，其中该至少一种另外之免疫刺激性抗体系人类抗体。
61.如项第54项所述之方法，其中该至少一种另外之免疫刺激性抗体系嵌合抗体或人源化抗体。
62.制备抗LAG-抗体之方法，该方法包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，包括选自下组的CDR1序列，该组之构成为：SEQ ID NO:1至6，选自下组的CDR2序列，该组之构成为：SEQ ID NO:7至12，和/或选自下组的CDR3序列，该组之构成为：SEQ IDNO:13至14、GGY以及16至18；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包括选自下组的CDR1序列，该组之构成为：SEQ ID NO:19至24，选自下组的CDR2序列，该组之构成为：SEQ ID NO:25至30，和/或选自下组的CDR3序列，该组之构成为：SEQ ID NO:31至36；
(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变之抗体序列；并且
(c)将被改变之抗体序列表达为蛋白质。

Claims (25)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人类淋巴细胞活化基因3(LAG-3)，其中该抗体包含与SEQ ID NO:37具有至少80%氨基酸序列同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:43具有至少80%氨基酸序列同一性的轻链可变区序列。
2.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人类LAG-3，其中该抗体包含与SEQ ID NO:37具有至少85%氨基酸序列同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:43具有至少85%氨基酸序列同一性的轻链可变区序列。
3.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人类LAG-3，其中该抗体包含与SEQ ID NO:37具有至少90%氨基酸序列同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:43具有至少90%氨基酸序列同一性的轻链可变区序列。
4.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人类LAG-3，其中该抗体包含与SEQ ID NO:37具有至少95%氨基酸序列同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:43具有至少95%氨基酸序列同一性的轻链可变区序列。
5.前述权利要求任一项的抗体或其抗原结合部分，其抑制LAG-3与主要组织相容性（MHC）II类分子的结合和/或刺激免疫应答。
6.前述权利要求任一项的抗体或其抗原结合部分，其以1x10-9M或更小之KD与人类LAG-3蛋白结合。
7.前述权利要求任一项的抗体或其抗原结合部分，其以5x10-10M或更小之KD与人类LAG-3蛋白结合。
8.一种组合物，其包含前述权利要求任一项的抗体或其抗原结合部分及药学可接受载体。
9.权利要求8的组合物，其进一步包含至少一种别的免疫刺激剂。
10.权利要求9的组合物，其中所述免疫刺激剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
11.权利要求10的组合物，其中所述免疫刺激剂为抗PD-1抗体。
12.一种免疫缀合物，其包含连接至治疗剂的权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分。
13.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分的可变区。
14.一种表达载体，其包含权利要求第13的核酸分子。
15.一种宿主细胞，其包含权利要求14的表达载体，前提是该宿主细胞不是存在于人类身体中的。
16.一种用于制备抗LAG-3抗体的方法，其包括在权利要求15的宿主细胞中表达该抗体，并自该宿主细胞分离该抗体。
17.一种刺激抗原特异性T细胞应答的体外方法，其包括使所述T细胞与权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求8至11中任一项的组合物接触，使得刺激了抗原特异性T细胞应答。
18.权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求8至11中任一项的组合物制备用于刺激抗原特异性T细胞应答的药物的用途。
19.权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求8至11中任一项的组合物制备用于在受试者中刺激免疫应答的药物的用途。
20.权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求8至11中任一项的组合物制备用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的药物的用途。
21.权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求8至11中任一项的组合物制备用于治疗受试者中病毒感染的药物的用途。
22.权利要求18至21中任一项的用途，其中权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求8至11中任一项的组合物与至少一种别的免疫刺激剂组合。
23.权利要求22的用途，其中所述免疫刺激剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
24.权利要求23的用途，其中所述免疫刺激剂为抗PD-1抗体。
25.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)重链可变区，该重链可变区系人类VH4-34基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因之产物或衍生于该基因；或
(b)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK A27基因之产物或衍生于该基因；或
(c)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-20基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L18基因之产物或衍生于该基因；或
(d)重链可变区，该重链可变区系人类VH1-24基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因之产物或衍生于该基因；或
(e)重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因之产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类VK L6基因之产物或衍生于该基因；
其中该抗体特异性结合人类之LAG-3。
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