ES2927547T3

ES2927547T3 - Anticuerpos humanos que se unen al gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) y sus usos

Info

Publication number: ES2927547T3
Application number: ES19186310T
Authority: ES
Inventors: Kent B Thudium; Alan J Korman; Heidi Leblanc; Mark Yamanaka; Mark Selby; Kyra Zens
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2009-08-11
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2029-08-11
Also published as: CL2018001903A1; SI2320940T1; CA2734335C; PL3597216T3; KR20230165352A; ES2768576T3; JP2017052765A; WO2010019570A2; CN102176921B; CN103923213A; US20210261662A1; NZ590991A; NZ602780A; PT3597216T; US11530267B2; SMT201500125B; ZA201101009B; LT3597216T; HRP20200070T1; US20190276538A1

Abstract

La presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados y porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen a LAG-3 humano, en particular anticuerpos y porciones de anticuerpos de unión a antígeno que pueden inhibir la unión de LAG-3 a moléculas MHC de Clase II y que pueden estimular antígenos. -respuestas de células T específicas. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos y las porciones de anticuerpos que se unen a antígenos de la invención, así como las composiciones e inmunoconjugados de los anticuerpos y las porciones de anticuerpos que se unen a antígenos de la invención. Esta descripción también proporciona el uso de los anticuerpos y las porciones de anticuerpos de unión a antígeno de la invención en terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanos que se unen al gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) y sus usos

Antecedentes de la invención

El gen de activación de linfocitos 3 o LAG-3 (también conocido como CD223), es un miembro de la familia de los supergenes de inmunoglobulina y está relacionado estructural y genéticamente con CD4. LAG-3 no se expresa en linfocitos de sangre periférica en reposo, pero se expresa en linfocitos T activados y en células NK. LAG-3 es una proteína de membrana codificada por un gen ubicado en la parte distal del brazo corto del cromosoma 12, cerca del gen CD4, lo que sugiere que el gen LAG-3 puede haber evolucionado a través de la duplicación de genes (Triebel et al. (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405).

De manera similar a CD4, se ha demostrado que LAG-3 interactúa con las moléculas del MHC de Clase II pero, a diferencia de CD4, LAG-3 no interactúa con la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humana (Baixeras et al. (1992) J. Exp. Med. 176:327-337). Los estudios que utilizan una proteína de fusión de inmunoglobulina LAG-3 soluble (sLAG-3Ig) demostraron la unión directa y específica de LAG-3 al MHC de clase II en la superficie celular (Huard et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:1180-1186).

Se describen anticuerpos monoclonales, o fragmentos y derivados de los mismos, que reaccionan con regiones definidas de la proteína LAG-3 (documento WO 91/010682 A1). Los anticuerpos monoclonales para LAG-3 se usan en métodos de detección y aislamiento de linfocitos Th1, así como en métodos de diagnóstico de enfermedades mediadas por Th1 (documentos US 6.197.524 B1; WO 97/003695 A1).

En estudios in vitro de respuestas de linfocitos T específicos de antígeno, la adición de anticuerpos anti-LAG-3 llevó a una mayor proliferación de linfocitos T, una mayor expresión de antígenos de activación como CD25 y a mayores concentraciones de citocinas tales como interferón gamma e interleucina-4, lo que apoya un papel para la interacción LAG-/MHC de clase II en la regulación negativa de la estimulación de linfocitos T CD4+ dependiente de antígeno (Huard et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:3216-3221; WO 95/030750 A2). Se ha demostrado que la región intracitoplasmática de LAG-3 interactúa con una proteína denominada LAP, que se cree que es una molécula de transducción de señales implicada en la regulación negativa de la vía de activación de CD3/TCR (Louzalen et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31:2885-2891). Asimismo, se ha demostrado que los linfocitos T CD4+CD25+ reguladores (Treg) que expresan LAG-3 tras la activación y los anticuerpos para LAG-3 inhiben la supresión por linfocitos Treg inducidos, tanto in vitro como in vivo, lo que sugiere que LAG-3 contribuye a la actividad supresora de los linfocitos Treg (Huang, C. et al. (2004) Immunity 21:503-513). Más aún, se ha demostrado que LAG-3 regula negativamente la homeostasis de los linfocitos T mediante los linfocitos T reguladores tanto en mecanismos independientes como dependientes de linfocitos T (Workman, CJ y Vignali, D.A. (2005) J. Immunol. 174:688-695).

En determinadas circunstancias, LAG-3 también ha demostrado tener efectos inmunoestimuladores. Por ejemplo, las células tumorales transfectadas con LAG-3 trasplantadas en ratones singénicos mostraron una reducción marcada del crecimiento o una regresión completa en comparación con las células tumorales no transfectadas, lo que sugiere que la expresión de LAG-3 en las células tumorales estimuló una respuesta antitumoral al desencadenar células presentadoras de antígeno a través de moléculas del MHC de clase II (Prigent et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:3867-3876). Adicionalmente, se ha demostrado que la proteína de fusión soluble Ig-LAG-3 estimula las respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares cuando se administra a ratones junto con un antígeno, lo que indica que la Ig-LAG-3 soluble puede funcionar como un adyuvante de vacuna (El Mir y Triebel (2000) J. Immunol. 164:5583-5589). Asimismo, se ha demostrado que la Ig-LAG-3 humana soluble amplifica la generación in vitro de inmunidad específica de tumor de tipo I (Casati et al. (2006) Cancer Res. 66:4450-4460). La actividad funcional de LAG-3 se revisa adicionalmente en Triebel (2003) Trends Immunol. 24:619-622. En vista de lo anterior, los agentes adicionales para modular la actividad de LAG-3 son de interés.

Kocak et al. (2006) Cancer Research 66:7276-7284 describen que la terapia combinada con antígeno-4 anti-CTL y anticuerpos anti-4-1BB, mejora la inmunidad contra el cáncer y reduce la autoinmunidad.

Sumario

En un primer aspecto, la invención reivindicada se refiere a un anticuerpo anti-LAG-3 y a un anticuerpo inmunoestimulador adicional para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto o para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3 y el anticuerpo inmunoestimulador adicional, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti PD-Ll o un anticuerpo anti-CTLA-4.

En un segundo aspecto, la invención reivindicada se refiere a un anticuerpo anti-LAG-3 para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto o para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo inmunoestimulador adicional, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll o un anticuerpo anti-CTLA-4.

En un tercer aspecto, la invención reivindicada se refiere a un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto o para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo inmunoestimulador además de un anticuerpo anti-LAG-3, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

La referencia a un anticuerpo anti-LAG-3 y/o a un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método significa que se refiere a dicho primer, segundo y/o tercer aspecto de la invención reivindicada. La referencia a un anticuerpo de la invención significa que se refiere a dicho anticuerpo para su uso en los métodos de acuerdo con la invención reivindicada.

Para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a LAG-3 y que tienen propiedades funcionales deseables. Estas propiedades incluyen unión de alta afinidad a LAG-3 humano, la unión a LAG-3 humano y de mono (por ejemplo, LAG-3 de mono cinomolgo y/o de mono rhesus) pero no al LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de LAG-3 con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II y/o la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T específicos de antígeno. Los anticuerpos de la invención se pueden usar, por ejemplo, para detectar la proteína LAG-3 o para estimular respuestas de linfocitos T específicos de antígeno, tal como en un sujeto portador de tumor o un sujeto portador de virus.

En un aspecto y para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se une a LAG-3 humano y presenta al menos una de las siguientes propiedades:

(a) se une al LAG-3 de mono;

(b) no se une al LAG-3 de ratón;

(c) inhibe la unión de LAG-3 con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II; y (d) estimula una respuesta inmunitaria.

Preferentemente, el anticuerpo presenta al menos dos de las propiedades (a), (b), (c) y (d). Más preferentemente, el anticuerpo presenta al menos tres de las propiedades (a), (b), (c) y (d). Aún más preferentemente, el anticuerpo presenta las cuatro propiedades (a), (b), (c) y (d).

En una realización preferida, el anticuerpo estimula una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno, tales como la producción de interleucina-2 (IL-2) en una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno. En otras realizaciones, el anticuerpo estimula una respuesta inmunitaria tal como una respuesta antitumoral (por ejemplo, inhibe el crecimiento tumoral en un modelo in vivo de injerto tumoral) o una respuesta autoinmunitaria (por ejemplo, promueve el desarrollo de diabetes en ratones NOD). En otra realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo de LAG-3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76). En otra realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo de LAG-3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) o PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). En otras realizaciones más, el anticuerpo se une al LAG-3 humano con una Kd de 1 x 10'7 M o menor, o se une al LAG-3 humano con una K^dde 1 x 10'8 M o menor, o se une al LAG-3 humano con una K^dde 5 x 10'9 M o menor, o se une al LAG-3 humano con una Kd de 1 x 10'9 M o menor. En una realización, el anticuerpo tiñe el tejido hipofisario por inmunohistoquímica, mientras que en otra realización, el anticuerpo no tiñe el tejido hipofisario por inmunohistoquímica.

En otro aspecto y para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo compite de forma cruzada por unirse al LAG-3 humano con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43.

(b) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44.

(c) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45.

(d) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46.

(e) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47.

(f) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48.

En una realización preferida, el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En otra realización preferida, el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. En otra realización preferida, el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45. secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. En otra realización preferida, el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45. En otra realización preferida, el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46. En otra realización preferida, el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47. En otra realización preferida, el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48.

En otro aspecto y para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen Vh 3-20 humano, un gen Vh 4-34 humano, un gen Vh 3 33 humano o un gen Vh 1-24 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En otro aspecto y para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen Vk L18 humano, un gen Vk L6 humano o un gen Vk A27 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En una realización preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que es el producto o procede de un gen V^h4-34 humano, y una región variable de cadena ligera que es el producto o procede de un gen V^kL6 humano;

(b) una región variable de cadena pesada que es el producto o procede de un gen V^h3-33 humano, y una región variable de cadena ligera que es el producto o procede de un gen Vk A27 humano;

(c) una región variable de cadena pesada que es el producto o procede de un gen V^h3-20 humano, y una región variable de cadena ligera que es el producto o procede de un gen V^kL18 humano;

(d) una región variable de cadena pesada que es el producto o procede de un gen Vh 1-24 humano, y una región variable de cadena ligera que es el producto o procede de un gen Vk L16 humano

(e) una región variable de cadena pesada que es el producto o procede de un gen Vh 3-33 humano, y una región variable de cadena ligera que es el producto o procede de un gen V^kL16 humano;

en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano.

En otro aspecto y para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37-42;

(b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 43-48;

en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano.

Una combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43.

Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44.

Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45.

Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46.

Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47.

Otra combinación preferida comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48.

Los anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo de un isotipo IgG1, IgG2 o IgG4. En una realización preferida, el anticuerpo es de un isotipo IgG4. En otra realización preferida, el anticuerpo es de un isotipo IgG4 que tiene una mutación de serina a prolina en la región de bisagra de la región constante de la cadena pesada (en una posición correspondiente a la posición 241 tal como se describe en Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108), de modo que la heterogeneidad del puente disulfuro de entre cadenas pesadas se reduce o se elimina. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, tales como los fragmentos Fab, Fab' o Fab'2, o anticuerpos de cadena simple.

Para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, esta divulgación también proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención, o una porción de unión a antígeno del mismo, unida a un agente terapéutico, por ejemplo, una citotoxina o un isótopo radiactivo. Para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, esta divulgación también proporciona una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la invención, unida a un segundo resto funcional que tiene una especificidad de unión diferente de dicho anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo.

Para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, también se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, o un inmunoconjugado o una molécula biespecífica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento también se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, de la invención, así como vectores de expresión que comprenden tales ácidos nucleicos y células hospedadoras que comprenden tales vectores de expresión. También se desvelan métodos para preparar anticuerpos anti-LAG-3 usando las células hospedadoras que comprenden dichos vectores de expresión y pueden incluir las etapas de (i) expresar el anticuerpo en la célula hospedadora y (ii) aislar el anticuerpo de la célula hospedadora.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-LAG-3 y/o a un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en métodos de estimulación de las respuestas inmunitarias utilizando los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención. Por ejemplo, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de estimulación de una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno que comprende poner en contacto de dichos linfocitos T con un anticuerpo de la invención de manera que se estimule una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno. En una realización preferida, el linfocito T específico de antígeno estimula la producción de interleucina 2. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno) en un sujeto, que comprende administrar un anticuerpo de la invención al sujeto de manera que en el sujeto se estimule una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno). En una realización preferida, el sujeto es un sujeto portador de un tumor y se estimula una respuesta inmunitaria contra el tumor. En otra realización preferida, el sujeto es un sujeto portador de un virus y se estimula una respuesta inmunitaria contra el virus.

En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención de tal manera que el crecimiento del tumor se inhibe en el sujeto. En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para tratar una infección vírica en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención de tal manera que la infección vírica se trate en el sujeto.

En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, es decir, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, de tal manera que se estimule una respuesta inmunitaria en el sujeto, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o para estimular una respuesta antivírica. En una realización, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-1. En otra realización, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización más, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-CTLA-4. En una realización, el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo de la divulgación. Como alternativa, el anticuerpo anti-LAG-3 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado. En otra realización, el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional (es decir, el anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o anti-CTLA-4) es un anticuerpo humano. Como alternativa, el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado.

En otro aspecto y para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la invención se refiere a un método para preparar un anticuerpo anti-LAG-3. El método comprende:

(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-12, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-14, GGY y 16-18; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19-24, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25-30, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31-36;

(b) alterar al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y

(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

Otras características y ventajas de la presente divulgación se desprenden de la siguiente descripción detallada y ejemplos, que no deben interpretarse como limitativos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 49) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 37) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 25F7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 7) y CDR3 (SEQ ID NO: 13) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 1B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 55) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 43) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 25F7. Las regiones CDR1 (^sE^qID NO: 19), CDR2 (SEQ ID NO: 25) y CDR3 (SEQ ID NO: 31) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 50) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 38) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 26H10. Las regiones CDR1 (s Eq ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 8) y CDR3 (SEQ ID n O: 14) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 56) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 44) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 26H10. Las regiones CDR1 (s Eq ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 26) y Cd R3 (SEQ ID NO: 32) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 51) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 39) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 25E3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 9) y ^cD^r3 están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 57) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 45) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 25E3. Las regiones CDR1 (s Eq ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 27) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.

La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 52) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 8B7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 10) y CDR3 (SEQ ID NO: 16) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 58) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 46) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 8B7. Las regiones CDR1 (^sE^qID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 28) y C^dR3 (SEQ ID NO: 34) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.

La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 53) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 41) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 11F2. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 11) y CDR3 (SEQ ID NO: 17) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 59) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 47) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 11F2. Las regiones CDR1 (s Eq ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 35) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.

La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 54) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 42) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 17E5. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 6), CDR2 (SEQ ID NO: 12) y CDR3 (SEQ ID NO: 18) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.

La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 60) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 48) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 17E5. Las regiones CDR1 (^sE^qID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 30) y CDR3 (SEQ ID NO: 36) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.

La Figura 7 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 25F7 (SEQ ID NO: 37) con la línea germinal humana Vh 4-34 y secuencias de aminoácidos JH5b (SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente).

La Figura 8 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 25F7 (SEQ ID NO: 43) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 y JK2 (SEQ ID NO: 63 y 64, respectivamente).

La Figura 9 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 26H10 (SEQ ID NO: 38) con la línea germinal humana V^h3-33 y secuencias de aminoácidos JH6B (S^eQ ID NO: 65 y 66, respectivamente).

La Figura 10 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 26H10 (SEQ ID NO: 44) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk A27 y JK3 (SEQ ID NO: 67 y 68, respectivamente).

La Figura 11 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 25E3 (SEQ ID NO: 39) con la línea germinal humana VH 3-20 y secuencias de aminoácidos JH4b (SEQ ID NO: 69 y 70, respectivamente).

La Figura 12 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 25E3 (SEQ ID NO: 45) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L18 y JK2 (SEQ ID NO: 71 y 64, respectivamente).

La Figura 13 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 8B7 (SEQ ID NO: 40) con la línea germinal humana V^h4-34 y secuencias de aminoácidos JH5b (SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente).

La Figura 14 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 8B7 (SEQ ID NO: 46) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 y JK4 (SEQ ID NO: 63 y 72, respectivamente).

La Figura 15 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 11F2 (SEQ ID NO: 41) con la línea germinal humana V^h1-24 y secuencias de aminoácidos JH4b (SEQ ID NO: 73 y 70, respectivamente).

La Figura 16 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 11F2 (SEQ ID NO: 47) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 y JK1 (SEQ ID NO: 63 y 74, respectivamente).

La Figura 17 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 17E5 (SEQ ID NO: 42) con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana V^h3-33 y 2-2 (SEQ ID NO: 65 y 70, respectivamente).

La Figura 18 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 17E5 (SEQ ID NO: 48) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L6 (SEQ ID NO: 63 y 75, respectivamente).

La Figura 19 muestra la alineación de la secuencia de proteína codificada por el clon de ADNc de LAG-3 de mono pa23-5 (SEQ ID NO: 93) con la secuencia de proteína LAG-3 de mono rhesus depositada en Genbank (SEQ ID NO: 94) (N.° de registro de Genbank XM_001108923). La región de bucle extra del péptido de y el dominio transmembrana están subrayados. La diferencia de un aminoácido entre las dos secuencias (posición de aminoácido 419) se resalta en negrita.

Descripción detallada de la invención

Para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a LAG-3 humano y que tienen propiedades funcionales deseables. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención proceden de secuencias de la línea germinal de cadena pesada y ligera y/o comprenden características estructurales particulares tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. Para su uso en los métodos de acuerdo con la presente invención, esta divulgación proporciona anticuerpos aislados, métodos de preparar tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. La presente divulgación también se refiere a métodos de uso de los anticuerpos, tales como para detectar la proteína LAG-3, así como a métodos de uso de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención para estimular respuestas inmunitarias, solos o junto con otros anticuerpos inmunoestimuladores. Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en los métodos de uso de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención, por ejemplo, para la inhibición del crecimiento tumoral o el tratamiento de una infección vírica.

Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, se definen previamente determinados términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

El término "LAG-3" se refiere al gen de activación de los linfocitos 3. El término "LAG-3" incluye variantes, isoformas, homólogos, ortólogos y parálogos. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para una proteína LAG-3 humana pueden, en determinados casos, reaccionar de manera cruzada con una proteína ^lAG-3 de una especie que no sea humana. En otras realizaciones, los anticuerpos específicos para una proteína LAG-3 humana pueden ser completamente específicos para la proteína LAG-3 humana y pueden no mostrar especies u otros tipos de reactividad cruzada, o pueden reaccionar de forma cruzada con LAG-3 de ciertas otras especies pero no todas otras especies (por ejemplo, reaccionan de forma cruzada con LAG-3 de mono, pero no con LAG-3 de ratón). El término "LAG-3 humano" se refiere a la secuencia de LAG-3 humano, tal como la secuencia de aminoácidos completa de LAG-3 humano que tiene el número de registro de Genbank NP_002277. El término "LAG-3 de ratón" se refiere a la secuencia de LAG-3 de ratón, tal como la secuencia de aminoácidos completa de LAG-3 de ratón que tiene el número de registro de Genbank NP_032505. LAG-3 también se conoce en la técnica como, por ejemplo, CD223. La secuencia de LAG-3 humano puede diferir de la de LAG-3 humano del número de registro de Genbank NP_002277 al tener, por ejemplo, mutaciones conservadas o mutaciones en regiones no conservadas y el LAG-3 tiene sustancialmente la misma función biológica que el LAG-3 humano del número de registro de Genbank NP_002277. Por ejemplo, una función biológica del LAG-3 humano es tener un epítopo en el dominio extracelular del LAG-3 que está unido específicamente por un anticuerpo de la presente divulgación o una función biológica del LAG-3 humano es la unión a las moléculas del MHC de clase II.

El término "LAG-3 de mono" pretende abarcar las proteínas LAG-3 expresadas por los monos del Viejo Mundo y del Nuevo Mundo, incluidos, entre otros, el LAG-3 de mono cinomolgos y el LAG-3 de mono rhesus. Una secuencia de aminoácidos representativa para el LAG-3 de mono es la secuencia de aminoácidos del LAG-3 de mono rhesus que se muestra en la Figura 19 y la SEQ ID NO: 85, que también se deposita como el N.° de registro de Genbank XM_001108923. Otra secuencia de aminoácidos representativa para el LAG-3 de mono es la secuencia alternativa del clon pa23-5 de mono rhesus que se muestra en la Figura 19 y la SEQ ID NO: 84, aislada tal como se describe en el Ejemplo 3A, subsección 3. Esta secuencia alternativa de rhesus exhibe una única diferencia de aminoácidos, en la posición 419, en comparación con la secuencia depositada por Genbank.

Una secuencia particular de LAG-3 humano será generalmente al menos el 90 % idéntica en la secuencia de aminoácidos a LAG-3 humano de N.° de Registro de Genbank NP_002277 y contiene restos de aminoácidos que identifican la secuencia de aminoácidos como humana en comparación con las secuencias de aminoácidos de LAG-3 de otras especies (por ejemplo, de murino). En determinados casos, un LAG-3 humano puede ser al menos el 95 %, o incluso al menos el 96 %, 97 %, 98%, o 99% idéntica en secuencia de aminoácidos al LAG-3 de N.° de Registro de Genbank NP_002277. En determinadas realizaciones, una secuencia de LAG-3 de humano no mostrará más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de LAG-3 de N.° de Registro de Genbank NP_002277. En determinadas realizaciones, el LAG-3 humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de LAG-3 de N.° de Registro de Genbank NP_002277. El porcentaje de identidad se puede determinar tal como se describe en el presente documento.

La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que da como resultado un daño selectivo sobre, la destrucción de o la eliminación en el cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una "respuesta de linfocitos T específicos de antígeno" se refiere a las respuestas de un linfocito T que es resultado de la estimulación del linfocito T con el antígeno para el cual el linfocito T es específico. Los ejemplos no limitantes de respuestas de un linfocito T tras la estimulación específica de antígeno incluyen la proliferación y la producción de citocinas (por ejemplo, la producción de IL-2).

El término "anticuerpo" al que se hace referencia en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, la "porción de unión a antígeno") o cadenas simples de los mismos. Los anticuerpos enteros son glucoproteínas que comprenden al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como V^h) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviado en el presente documento como V^l) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, C^l. Las regiones V^hy V^lpueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, de sus siglas en inglés). Cada V^hy V^lestá compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del clásico sistema del complemento.

La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente la "parte del anticuerpo"), tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse de manera específica a un antígeno (por ejemplo, una proteína de LAG-3). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^ly C^h1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra (véase, FUNDAMENTAL IMM^uN^oLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios V^hy C^h1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios V^ly V^hde un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V^h; (vii) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (viii) un nanocuerpo, una región variable de cadena pesada que contiene un único dominio variable y dos dominios constantes. Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^ly V^h, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína en la que las regiones V^ly V^hse aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883). También se pretende que los anticuerpos de cadena única estén abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia y se seleccionan en función de su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a LAG-3 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes de las proteínas LAG-3). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una proteína LAG-3 humana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las proteínas LAG-3 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión sencilla por un epítopo concreto.

La expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como las regiones CDR provienen de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Asimismo, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también proviene de las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como de un ratón, se han injertado en secuencias flanqueantes humanas.

La expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad de unión única, que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como las regiones CDR provienen de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresó, se creó o se aisló por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo (descrito más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante combinatoria de anticuerpos humanos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR provienen de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V^hy V^lde los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de, y están relacionadas con, las secuencias V^hy V^lde la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

La expresión "derivados de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

La expresión "anticuerpo humanizado" pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como de un ratón, se han injertado en secuencias flanqueantes humanas. Se pueden realizar modificaciones adicionales de la región marco dentro de las secuencias marco humanas.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos en los que las secuencias de región variable provienen de una especie y las secuencias de región constante provienen de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de región variable provienen de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante provienen de un anticuerpo humano.

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente a LAG-3 humano" pretende referirse a un anticuerpo que se une a la proteína LAG-3 humana (y posiblemente a una proteína LAG-3 de una o más especies no humanas) pero que no se une sustancialmente a proteínas que no son LAG-3. Preferentemente, el anticuerpo se une a una proteína LAG-3 humana con "alta afinidad", es decir, con una K^dde 1 x 10^{' 7}M o menor, más preferentemente de 5 x 10^‘8M o menor, más preferentemente de 3 x 10^‘8M o menor, más preferentemente de 1 x 10' ⁸M o menor, más preferentemente de 5 x 10^‘9M o menor y más preferentemente de 1 x l0 ^‘9M o menor.

La expresión "no se une sustancialmente" a una proteína o células, tal como se usa en el presente documento, significa que no se une o no se une con una alta afinidad a la proteína o las células, es decir, se une a la proteína o células con una K^dde 1 x 10^‘6M o más, más preferentemente de 1 x 10^‘5M o más, más preferentemente de 1 x 10^‘4M o más, más preferentemente de 1 x 10^-3M o más, incluso más preferentemente de 1 x 10^‘2M o más.

El término "K^d" o " Ka", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a la tasa de asociación de una interacción particular antígeno-anticuerpo, mientras que el término "Kdis" o "Kd", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de asociación en equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término "K^d", tal como se usa en el presente documento, está pensado para referirse a la constante de disociación, que se obtiene de la proporción de Kd frente a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de K^dpara anticuerpos pueden determinarse usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la K^dde un anticuerpo es mediante el uso de resonancia de plasmón superficial, preferentemente usando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®.

La expresión "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una K^dde 1 x 10^‘7M o menor, más preferentemente de 5 x 10^‘8M o menor, incluso más preferentemente de 1x10^‘8M o menor, incluso más preferentemente de 5 x 10^‘9M o menor e incluso más preferentemente de 1 x 10^‘9M o menor para un antígeno diana. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una K^dde 10^‘6M o menor, más preferentemente de 10^‘7M o menor, incluso más preferentemente de 10^‘8M o menor.

El término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles, aunque se prefieren los mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos.

Diversos aspectos de la invención se describen en más detalle en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos anti-LAG-3 que tienen propiedades funcionales particulares

Los anticuerpos de la invención se caracterizan por características funcionales particulares o propiedades de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente al LAG-3 humano y pueden unirse al LAG-3 de ciertas otras especies, por ejemplo, ^lAG-3 de mono (por ejemplo, monos cinomolgos y monos rhesus), pero no se une sustancialmente al LAG-3 de ciertas otras especies, por ejemplo, LAG-3 de ratón. Preferentemente, un anticuerpo de la invención se une al LAG-3 humano con alta afinidad.

La capacidad del anticuerpo para estimular una respuesta inmunológica, tal como una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno, puede estar indicado por, por ejemplo, la capacidad del anticuerpo para estimular la producción de interleucina-2 (IL-2) en una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención se une al LAG-3 humano y presenta la capacidad de estimular una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno. En otras realizaciones, un anticuerpo de la invención se une al LAG-3 humano pero no presenta la capacidad de estimular una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno. Otros medios para evaluar la capacidad del anticuerpo para estimular una respuesta inmunológica incluyen la capacidad del anticuerpo para inhibir el crecimiento tumoral, como en un modelo in vivo de injerto tumoral (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6) o la capacidad del anticuerpo para estimular una respuesta autoinmunitaria, tal como la capacidad de promover el desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria en un modelo autoinmunitario, tal como la capacidad de promover el desarrollo de diabetes en el modelo de ratón NOD (véase, por ejemplo, el Ejemplo 7).

La unión de un anticuerpo de la invención a LAG-3 se puede evaluar usando una o más técnicas bien establecidas en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, se puede analizar un anticuerpo mediante un ensayo de citometría de flujo en el que el anticuerpo reacciona con una línea celular que expresa LAG-3 humano, tal como las células CHO que se han transfectado para expresar LAG-3 (por ejemplo, LAG-3 humano, o LAG-3 de mono (por ejemplo, mono rhesus o mono cinomolgo) o LAG-3 de ratón) en su superficie celular (véase, por ejemplo, Ejemplo 3A para un ensayo adecuado). Otras células adecuadas para su uso en ensayos de citometría de flujo incluyen los linfocitos T CD4+ activados estimulado con anti-CD3, que expresan LAG-3 natural. Adicionalmente, o como alternativa, la unión del anticuerpo, incluyendo la cinética de unión (por ejemplo, el valor de Kd) se puede probar en ensayos de unión BIAcore (véase, por ejemplo, Ejemplo 3B para ensayos adecuados). Todavía otros ensayos de unión adecuados incluyen ensayos ELISA, por ejemplo usando una proteína LAG-3 recombinante (ver, por ejemplo, Ejemplo 1 para un ensayo adecuado).

Preferentemente, un anticuerpo de la invención se une a una proteína LAG-3 con una K^dde 5 x 10'8 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una K^dde 2 x 10'8 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una K^dde 5 x 10'9 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una Kd de 4 x 10'9 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una Kd de 3 x 10'9 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una Kd de 2 x 10'9 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una K^dde 1 x 10'9 M o menor, se une a una proteína LAG-3 con una K^dde 5 x 10'1° M o menor, o se une a una proteína LAG-3 con una Kd de 1 x 10'1° M o menor.

Normalmente, un anticuerpo de la invención se une a LAG-3 en tejidos linfoides, tales como la amígdala, el bazo o el timo, que pueden ser detectados por inmunohistoquímica. Adicionalmente, tal como se describe adicionalmente en el Ejemplo 8, ciertos anticuerpos anti-LAG-3 de la invención tiñen el tejido hipofisario (por ejemplo, se retienen en la hipófisis) según se mide por inmunohistoquímica, mientras que otros anticuerpos anti-LAG-3 de la invención no tiñen el tejido hipofisario (por ejemplo, no se retienen en la hipófisis) tal como se mide por inmunohistoquímica. Por consiguiente, en una realización para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo humano anti-LAG-3 que tiñe el tejido hipofisario por inmunohistoquímica, mientras que en otra realización para su uso en los métodos de acuerdo con la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo humano anti-LAG-3 que no tiñe el tejido hipofisario por inmunohistoquímica.

Los anticuerpos preferidos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Adicionalmente, o como alternativa, los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados.

Anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5

Los anticuerpos preferidos de la invención son los anticuerpos monoclonales humanos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 aislados y caracterizados estructuralmente tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Las secuencias de aminoácidos de Vh de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en las s Eq ID NO: 37-42, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de V^kde 25F7, 26H1°, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en las ^sE^qID NO: 43 48, respectivamente.

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse al LAG-3 humano, las secuencias de Vh y Vl se pueden "mezclar y combinar" para crear otras moléculas de unión a anti-LAG-3 de la invención. Preferentemente, cuando las cadenas V^hy V^lse mezclan y se combinan, una secuencia de V^hde un emparejamiento particular V^h/V^lse reemplaza por una secuencia de Vh estructuralmente similar. De manera análoga, preferentemente, una secuencia de Vl de un emparejamiento particular V^h/V^lse reemplaza por una secuencia de V^lestructuralmente similar.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo que comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37-42; y

en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano.

Las combinaciones preferidas de cadena pesada y ligera incluyen:

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de V^hde 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en las SEQ ID NO: 37-42, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de V^hde 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en las SEQ ID NO: 43-48, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de V^hde 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en las SEQ ID NO: 13-14, GGY y 16-18, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de V^kde 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en la SEQ ID NO: 19-24, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de V^kde 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en las SEQ ID NO: 25-30. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de la V^kde 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se muestran en las SEQ ID NO: 31-36, respectivamente. Las regiones CDR se delinean utilizando el sistema Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.Uu ., Publicación de NIH N.° 91-3242).

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse al LAG-3 humano y que la CDR1 proporciona principalmente la especificidad de unión al antígeno, las regiones CDR2 y CDR3, las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de V^hy las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de V^lse pueden "mezclar y combinar" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y combinar, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de V^h, y una c DR1, una CDR2 y una CDR3 de V^l) para crear otras moléculas de unión a anti-LAG-3 de la invención. La unión de LAG-3 de tales anticuerpos "mixtos y combinados" se puede probar usando los ensayos de unión descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA, análisis Biacore®). Preferentemente, cuando las secuencias de CDR de V^hse mezclan y se combinan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de V^hparticular se reemplaza por una secuencia o secuencias de CDR estructuralmente similares. De manera análoga, cuando las secuencias de CDR de V^lse mezclan y se combinan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de V^hparticular preferentemente se reemplaza por una secuencia o secuencias de CDR estructuralmente similares. Será evidente para el experto en la materia que las nuevas secuencias de V^hy V^lse pueden crear sustituyendo una o más secuencias de la región de CDR de V^hy/o V^lcon secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR desveladas en el presente documento para los anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5.

Por consiguiente, en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo que comprende

(a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6;

(b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-12;

(c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-14, GGY y 16-18;

(d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19-24;

(e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25-30; y

(f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31-36;

en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano.

En una realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 7;

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 13;

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 19;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 25; y

(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 31.

En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 8;

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 14;

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 20;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26; y

(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 32.

En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 3;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 9;

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende GGY;

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 21;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 27; y

(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 33.

En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 10;

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16;

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 22;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28; y

(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 34.

En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 11;

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17;

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 23;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 29; y

(f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 35.

En otra realización preferida, el anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 6;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 12;

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 18;

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 30; y

(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 36.

Es bien sabido en la técnica que el dominio CDR3, independientemente de los dominios CDR1 y/o CDR2, solo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo para un antígeno afín y que se pueden generar múltiples anticuerpos de manera predecible que tengan la misma especificidad de unión basada en una secuencia de c DR3 común. Véase, por ejemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol.

296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92:2529-2533 (1995); Ditzel et al., J. Immunol.

157:739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:4374-8 (1993); Polymenis y Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) y Xu y Davis, Immunity 13:37-45 (2000). Véase también, las patentes de Estados Unidos N.° 6.951.646; 6.914.128; 6.090.382; 6.818.216; 6.156.313; 6.827.925; 5.833.943; 5.762.905 y 5.760.185.

En consecuencia, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo procedente de un animal humano o no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a LAG-3 humano. En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a LAG-3. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos de la invención que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir por la unión con; (b) conservan las características funcionales; (c) se unen al mismo epítopo; y/o (d) tienen una afinidad de unión similar a la del correspondiente anticuerpo parental no humano.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a LAG-3 humano. En otros aspectos, la presente la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a LAG-3 humano y en donde el dominio CDR3 del primer anticuerpo humano reemplaza un dominio ^cDR3 en un anticuerpo humano que carece de especificidad de unión a LAG-3 para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse específicamente a LAG-3 humano. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos de la invención que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir por la unión con; (b) conservan las características funcionales; (c) se unen al mismo epítopo; y/o (d) tienen una afinidad de unión similar a la del primer anticuerpo humano parental correspondiente.

Anticuerpos que tienen secuencias particulares de la línea germinal

En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de la línea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de línea germinal particular.

Por ejemplo, en una realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es producto de o deriva de un gen humano de Vh 3-20, de un gen humano de Vh 4-34, de un gen humano de Vh 3-33 o de un gen humano de V^h1-24, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En otra realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena ligera que es el producto de o deriva de un gen humano de Vk L8, de un gen humano de V^kL6 o de un gen humano de V^kA27, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En otra realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen humano de V^h3-20 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen humano de Vk L18, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En otra realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen humano de V^h4-34 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen humano de Vk L6, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En otra realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen humano de V^h3-33 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen humano V^kA27, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En otra realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen humano de V^h1-24 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen humano de V^kL6, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano. En otra realización preferida, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen humano Vh 3-33 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen humano de V^kL6, en donde el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano.

Dichos anticuerpos también pueden poseer una o más de las características funcionales descritas en detalle anteriormente, tales como la unión de alta afinidad al LAG-3 humano, la unión al LAG-3 de mono, la falta de unión al LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de LAG-3 a las moléculas del MHC de clase II y/o la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T específicos de antígeno.

Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 3-20 y Vk L18, respectivamente, es el anticuerpo 25E3. Los ejemplos de anticuerpos que tienen Vh y Vl de Vh 4-34 y Vk L6, respectivamente, son los anticuerpos 25F7 y 8B7. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 3-33 y Vk A27, respectivamente, es el anticuerpo 26H10. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 1-24 y Vk L6, respectivamente, es el anticuerpo 11F2. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene V^hy V^lde V^h3-33 y V^kL6, respectivamente, es el anticuerpo 17E5.

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o la selección de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana presentada en fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana más cercana en secuencia (es decir, mayor % de identidad) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de línea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o a la introducción intencionada de mutaciones de sitio dirigido. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado normalmente es al menos el 90 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana y contiene restos de aminoácidos que identifican al anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal de murino). En determinados casos, un anticuerpo humano puede ser al menos el 95 %, o incluso al menos el 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de la línea germinal humana no mostrará más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal humana. En determinados casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

Anticuerpos homólogos

En otra realización más, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde:

(a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80 % homóloga a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37-42; (b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80 % homóloga a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 43-48; y (c) el anticuerpo se une específicamente al LAG-3 humano.

De manera adicional o alternativa, el anticuerpo puede poseer una o más de las siguientes propiedades funcionales tratadas anteriormente, tales como la unión de alta afinidad al LAG-3 humano, la unión al LAG-3 de mono, la falta de unión al LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de LAG-3 a las moléculas del MHC de clase II y/o la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T específicos de antígeno.

En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de V^hy/o V^lpueden ser del 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homólogas a las secuencias expuestas anteriormente. Un anticuerpo que tiene las regiones de Vh y Vl que tienen alta homología (es decir, el 80 % o más) con las regiones de Vh y Vl de las secuencias expuestas anteriormente, puede obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican las SEQ ID NO: 49-54 o 55-60, seguido de la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función conservada (es decir, las funciones establecidas anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. (es decir, % de homología = n.° de posiciones idénticas / n.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes a continuación.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E.

Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando al algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Adicionalmente, o como alternativa, las secuencias de proteína de la presente invención se pueden usar además como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de proteínas en BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de anticuerpos de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, son útiles los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticuerpos con modificaciones conservativas

En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento (p. ej., 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2, 17E5), o modificaciones conservativas de las mismas, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención. Se entiende en la técnica que se pueden realizar ciertas modificaciones de secuencia conservativas que no eliminan la unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem.272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley y O'Connell (1993) Biochem.

32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 y Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde:

(a) la secuencia de CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13-14, GGY y 16-18, y modificaciones conservativas de las mismas;

(b) la secuencia de CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 31-36, y modificaciones conservativas de las mismas; y

(c) el anticuerpo se une específicamente a LAG-3 humano.

Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo puede poseer una o más de las siguientes propiedades funcionales descritas anteriormente, tales como la unión de alta afinidad al LAG-3 humano, la unión al LAG-3 de mono, la falta de unión al LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de LAG-3 a las moléculas del MHC de clase II y/o la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T específicos de antígeno.

En una realización preferida, la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de las ^sE^qID NO: 7-12, y sus modificaciones conservativas; y la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25-30, y sus modificaciones conservativas. En otra realización preferida, la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6, y sus modificaciones conservativas; y la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19-24, y sus modificaciones conservativas.

En varias realizaciones, los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "modificaciones conservativas de secuencia" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas. (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por consiguiente, uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden reemplazarse con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede analizarse para determinar la función conservada (es decir, las funciones establecidas anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos anti-LAG-3

En otra realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo en LAG-3 como cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 de la invención (es decir, anticuerpos que tienen la capacidad de competir cruzadamente para unirse al LAG-3 humano con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención). En realizaciones preferidas, los anticuerpos de referencia para estudios de competición cruzada pueden ser los anticuerpos monoclonal 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5.

Dichos anticuerpos de competencia cruzada pueden identificarse en función de su capacidad de competir de forma cruzada con 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y/o 17E5 en ensayos convencionales de unión a LAG-3. Por ejemplo, pueden usarse ensayos ELISA convencionales en los que se inmoviliza una proteína LAG-3 humana recombinante en la placa, uno de los anticuerpos está marcado con fluorescencia y se evalúa la capacidad de los anticuerpos no marcados para competir por la unión del anticuerpo marcado. Adicionalmente, o como alternativa, el análisis BIAcore se puede utilizar para evaluar la capacidad de los anticuerpos para competir de forma cruzada. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la unión, por ejemplo, de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y/o 17E5 a ^lAG-3 humano, demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y/o 17E5 por la unión a LAG-3 humano y, por lo tanto, se une al mismo epítopo en LAG-3 humano que 25F7, 26H10, 25E3, 8^b7, 11F2 y/o 17E5. En una realización preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en LAG-3 humano que 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse tal como se describe en los Ejemplos.

Tal como se trata en detalle en el Ejemplo 3C, la unión de 25E3, 25F7 y 8B7 al LAG-3 humano se ha mapeado a una región de "bucle extra" dentro del primer dominio extracelular del LAG-3 humano. La secuencia de la región de bucle adicional se establece en la SEQ ID NO: 79. Usando un experimento de exploración de péptidos, la unión de 25E3 a la región de bucle adicional se ha mapeado a la siguiente secuencia de aminoácidos: PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76), mientras que la unión de 25F7 a la región de bucle adicional se ha mapeado a la siguiente secuencia de aminoácidos: HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) y la unión de 8B7 a la región de bucle adicional se ha asignado a la siguiente secuencia de aminoácidos: PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). Por consiguiente, en una realización preferida para su uso en los métodos según la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 que se une a un epítopo de LAG-3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76). En otra realización preferida para su uso en los métodos según la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 que se une a un epítopo de LAG-3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos HPAAPSSW (S^eQ ID NO: 77) o PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78).

Anticuerpos diseñados y modificados genéticamente

Un anticuerpo de la invención puede prepararse además usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de V^hy/o V^ldesveladas en el presente documento puede usarse como material de partida para diseñar genéticamente un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar genéticamente modificando uno o más restos en una o ambas regiones variables (es decir, V^hy/o V^l), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones marco. Adicionalmente, o como alternativa, se puede diseñar genéticamente un anticuerpo modificando los restos en la(s) región(es) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) función(es) efectora(s) del anticuerpo.

En determinadas realizaciones, el injerto de CDR puede usarse para diseñar regiones variables de anticuerpos. Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana de manera predominante a través de los restos de aminoácidos que están localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos de origen natural construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo específico de origen natural insertadas en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. EE.UU. 86:10029-10033; Patentes de los EE.UU. N.° 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370).

Por consiguiente, otra realización de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o a una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden un secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6, SEQ ID NO: 7-12 y SEQ ID NO: 13-14, GGY y 16-18, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19-24, SEQ ID NO: 25-39 y SEQ ID NO: 31-36, respectivamente. Por tanto, tales anticuerpos que contienen las secuencias de CDR de V^hy V^lde los anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5 pueden contener diferentes secuencias marco de estos anticuerpos.

Dichas secuencias marco se pueden obtener a partir de bases de datos públicas de ADN o de referencias publicadas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat et al. (1991), citado anteriormente; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de la línea germinal de la cadena pesada que se encuentran en el HuMAb de ratón HCo7 están disponibles en los números de registro de Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). Como otro ejemplo, las siguientes secuencias de la línea germinal de la cadena pesada que se encuentran en el HuMAb de ratón HCo12 están disponibles en los números de registro de Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) y 3-23 (AJ406678).

Las secuencias de proteínas de anticuerpos se comparan con una base de datos de secuencias de proteínas compiladas usando uno de los métodos de búsqueda de similitud de secuencia llamado Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) citado anteriormente), que es bien conocido por los expertos en la materia.

Las secuencias marco preferidas para su uso en los anticuerpos de la invención son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco usadas por anticuerpos seleccionados de la invención, p. ej., similar a las secuencias marco de V^h3-20 (SEQ ID NO: 69), V^h4-34 (SEQ ID NO: 61), V^h3-33 (SEQ ID NO: 65) o V^h1-24 (SEQ ID NO: 73) y/o a las secuencias marco de V^kL18 (SEQ ID NO: 71), V^kL6 (SEQ ID NO: 63) o V^kA27 (SEQ ID NO: 67) usadas por los anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de V^h, y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de V^k, pueden insertarse en regiones marco que tienen la secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de línea germinal del que proviene la secuencia marco, o las secuencias de CDR pueden insertarse en regiones marco que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que en determinados casos es beneficioso mutar restos en las regiones marco para conservar o potenciar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véase, por ejemplo, la patentes de Estados Unidos N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370).

Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones de CDR1, la CDR2 y/o la CDR3 de VH y/o VL, para mejorar de este modo una o más propiedades de unión (por ejemplo, la afinidad) del anticuerpo de interés. La mutagénesis de sitio dirigido o la mutagénesis mediada por PCR se pueden realizar para introducir la(s) mutación(es), y el efecto sobre la unión de los anticuerpos y otra propiedad de interés, se puede evaluar en ensayos in vitro o in vivo tal como se describe en el presente documento y se proporciona en los Ejemplos. Preferentemente, se introducen modificaciones conservativas (tal como se trató anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, pero preferentemente son sustituciones. Además, normalmente no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR están alterados.

Por consiguiente, en otra realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 1-6; (b) una región VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-12, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 7-12; (c) una región Vh CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-14, g Gy y 16-18, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 13-14, GGY y 16-18; (d) una región VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19-24, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 19-24; (e) una región Vl CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25-30, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 25-30; y (f) una región Vl CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31-36, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 31-36.

Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética de la invención incluyen aquellos en los que se han hecho modificaciones en los restos de la región marco en Vh y/o Vl, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones en la región marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más restos de la región marco a la correspondiente secuencia de la línea germinal. De manera más específica, un anticuerpo que se ha sometido a una mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que proviene el anticuerpo.

Por ejemplo, La Tabla A muestra las regiones donde una posición de aminoácidos de la región marco (usando el sistema de numeración Kabat) difiere de la línea germinal y cómo esta posición puede ser retromutada a la línea germinal por las sustituciones indicadas:

Otro tipo de modificación en la región marco implica mutar uno o más restos en la región marco o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de linfocitos T para reducir de este modo la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Esta estrategia también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 20030153043.

Además o como alternativa a las modificaciones hechas en la región marco o en las regiones CDR, los anticuerpos de la invención se pueden diseñar genéticamente para que incluyan modificaciones en la región Fc, normalmente, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Asimismo, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) se puede modificar para alterar su glucosilación, para alterar de nuevo una o más propiedades del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice de EU de Kabat.

En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo de isotipo IgG4 que comprende una mutación de serina a prolina en una posición correspondiente a la posición 228 (S228P; Índice EU) en la región de bisagra de la región constante de la cadena pesada. Se ha documentado que esta mutación abolió la heterogeneidad de los puentes disulfuro de entre cadenas pesadas en la región de bisagra (Angal et al. citado anteriormente; la posición 241 se basa en el sistema de numeración Kabat). Por ejemplo, en diversas realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención puede comprender la región variable de la cadena pesada de 25F7 (SEQ ID NO: 37) o de 26H10 (SEQ ID NO: 38) unida a una región constante de IgG4 humana en la que la serina, en una posición correspondiente a la posición 241 como se describe en Angal et al., citado anteriormente, se ha mutado a prolina. Por tanto, para las regiones variables de cadena pesada de 25F7 y 26H10 unidas a una región constante de IgG4 humana, esta mutación se corresponde con una mutación S228P según el índice EU.

En una realización, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que se altera el número de restos de cisteína en la región de bisagra, por ejemplo, se aumenta o se disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en la Patente de Estados Unidos N.° 5.677.425. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. De manera más específica, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra-Fc de manera que el anticuerpo tiene una unión a la proteína A estafilocócica (SpA) deteriorada en relación con la unión a SpA de Fc-bisagra natural. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de Estados Unidos N.° 6.165.745.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las mutaciones siguientes: T252L, T254S, T256F, tal como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.277.375. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, se puede alterar el anticuerpo en la región CH1 o CL para que contenga un receptor de rescate de unión al epítopo tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, tal como se describe en las patentes de EE.UU. N.° 5.869.046 y 6.121.022.

En otras realizaciones más, se altera la región Fc sustituyendo al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los restos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse con un resto de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc del componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe en detalle en las Patentes de EE.UU. N.° 5.624.821 y 5.648.260.

En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los restos de aminoácidos 329, 331 y 322 se pueden sustituir por un resto de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una unión a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de Estados Unidos N° 6.194.551.

En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones de aminoácidos 231 y 239 se alteran para alterar así la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación de PCT WO 94/29351.

En otro ejemplo más, se modifica la región Fc para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor F^cymodificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación de PCT WO 00/42072. Además, los sitios de unión sobre la IgG1 humana para F^cyRI, F^cyRII, F^cyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Se demostró que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a F^cyRIII. Adicionalmente, se demostró que los siguientes mutantes combinados mejoran la unión de F^cyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En otra realización más, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación marco de la región variable para eliminar de ese modo la glucosilación en ese sitio. Tal aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N.° 5.714.350 y 6.350.861.

Adicionalmente, o como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras GlcNAc bisectadas aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glucosilación alterada aumentan la capacidad de CCDA de los anticuerpos. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. Las células con la maquinaria de glucosilación alterada se han descrito en la materia y se pueden usar como células hospedadoras en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (a (1,6) -fucosiltransferasa), de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8-/- fueron creadas por la alteración dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazo (véase la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 20040110704 y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, el documento EP 1.176.195 describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima relacionada con el enlace a-16. El documento EP 1.176.195 también describe líneas celulares que tienen una baja actividad enzimática para agregar fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo o no tiene la actividad enzimática, por ejemplo, la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La Publicación de PCT WO 03/035835 describe una variante de la línea celular CHO, células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a los hidratos de carbono enlazados a Asn(297), dando también como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Los anticuerpos con un perfil de glucosilación modificado también se pueden producir en huevos de gallina, tal como se describe en la publicación PCT WO 06/089231. Como alternativa, los anticuerpos con un perfil de glucosilación modificado pueden producirse en células vegetales, tales como Lemna. Los métodos para la producción de anticuerpos en un sistema vegetal se describen en la solicitud de patente de EE. UU. correspondiente al expediente del abogado de Alston & Bird LLP N.° 040989/314911, presentado el 11 de agosto de 2006. La publicación de PCT WO 99/54342 describe líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo la p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que tales anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas genéticamente presentan estructuras GlcNac bisectadas aumentadas que dan como resultado una actividad de CCDA aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Como alternativa, los restos de fucosa del anticuerpo pueden escindirse usando una enzima fucosidasa; por ejemplo, la fucosidasa a-L-fucosidasa elimina los restos de fucosilo de los anticuerpos (Tarentino et al. (1975) Biochem.

14:5516-23).

Otra modificación de los anticuerpos en el presente documento que se contempla en la presente divulgación es la pegilación. Se puede pegilar un anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la vida media biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o el fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). Tal como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono (C1-C10) alcoxipoli- polietilenglicol o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la materia y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0154 316 y EP 0401 384.

Propiedades físicas de los anticuerpos

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden caracterizar por sus diversas propiedades físicas, para detectar y/o diferenciar diferentes clases de los mismos.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener uno o más sitios de glucosilación en la región variable de la cadena ligera o pesada. Dichos sitios de glucosilación pueden dar como resultado un aumento de la inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración de la pK del anticuerpo debido a la unión al antígeno alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala y Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se sabe que la glucosilación se produce en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-LAG-3 que no contenga glucosilación de región variable. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glucosilación en la región variable o mutando restos dentro de la región de glucosilación.

En una realización preferida, los anticuerpos de la presente divulgación no contienen sitios de isomerismo de asparagina. La desamidación de la asparagina puede tener lugar en secuencias N-G o D-G y dar como resultado la creación de un resto de ácido isoaspártico que introduce un pliegue en la cadena del polipéptido y disminuye su estabilidad (efecto del ácido isoaspártico).

Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pI), que generalmente cae en el intervalo de pH de entre 6 y 9,5. El pI para un anticuerpo de IgG1 generalmente se encuentra dentro del intervalo de pH de 7-9,5 y el pI para un anticuerpo IgG4 normalmente se encuentra dentro del intervalo de pH de 6-8. Se especula que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal pueden tener cierto desarrollo e inestabilidad bajo condiciones in vivo. Por consiguiente, se prefiere tener un anticuerpo anti-LAG-3 que contenga un valor de pI que se encuentre en el intervalo normal. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos con un pI en el intervalo normal o mutando restos de superficie cargados.

Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, indicado una temperatura de fusión más alta una mayor estabilidad general in vivo (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). En general, se prefiere que el T^mi(la temperatura de despliegue inicial) sea mayor de 60 °C, preferentemente mayor de 65 °C, incluso más preferentemente mayor de 70 °C. El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir usando calorimetría diferencial de barrido (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) o dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

En una realización preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La degradación de un anticuerpo se puede medir usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS (Alexander AJ y Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

En otra realización preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación mínimos, que pueden llevar a la activación de una respuesta inmunológica no deseada y/o a propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables. En general, los anticuerpos son aceptables con una agregación del 25 % o menos, preferentemente del 20 % o menos, incluso más preferentemente del 15 % o menos, incluso más preferentemente del 10 % o menos e incluso más preferentemente del 5 % o menos. La agregación se puede medir mediante varias técnicas, incluida la columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y dispersión de luz.

Métodos de diseño genético de anticuerpos

Tal como se trató anteriormente, los anticuerpos anti-LAG-3 que tienen las secuencias de V^hy V^ldesveladas en el presente documento pueden usarse para crear nuevos anticuerpos anti-LAG-3 modificando las secuencias de V^hy/o V^l, o las regiones constantes unidas a las mismas. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, por ejemplo, 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5, se usan para crear anticuerpos anti-LAG-3 estructuralmente relacionados que conservan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión al LAG-3 humano. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco conocidas y/u otras CDR para crear más anticuerpos anti-LAG-3 de la invención diseñados genéticamente por recombinación, tal como se ha tratado anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de diseño genético es una o más de las secuencias de V^hy/o de V^lproporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado genéticamente, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de V^hy/o V^lproporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Más bien, la información contenida en la(s) secuencia(s) se usa como material de partida para crear una(s) secuencia(s) de "segunda generación" que proviene de la(s) secuencia(s) original(es) y luego la(s) secuencia(s) de "segunda generación" se prepara y expresa como una proteína.

Por consiguiente, en otra realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-LAG-3 que comprende:

(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-12 y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-14, GGY y 16-18; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19-24, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25-30 y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31-36;

(b) alterar al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y

(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

Se pueden usar técnicas convencionales de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpos alterada.

Preferentemente, el anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias de anticuerpos alteradas es uno que conserva una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-LAG-3 descritos en el presente documento, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero sin limitación:

(i) unión de alta afinidad a LAG-3 humano;

(ii) unión al LAG-3 de mono;

(iii) falta de unión al LAG-3 de ratón

(iv) una capacidad para inhibir la unión de LAG-3 a moléculas de MHC de clase II; y/o

(v) la capacidad de estimular una respuesta inmunológica (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno).

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse utilizando ensayos convencionales disponibles en la materia y/o descritos en el presente documento, tales como los establecidos en los Ejemplos.

En ciertas realizaciones de los métodos de diseño genético de anticuerpos de la invención, las mutaciones pueden introducirse de forma aleatoria o selectiva junto con toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpos anti-LAG-3 y los anticuerpos anti-LAG-3 modificados resultantes pueden seleccionarse para la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales tal como se describe en el presente documento. Los métodos de mutación se han descrito en la técnica (véase, por ejemplo, las Publicaciones de PCT WO 02/092780 y WO 03/074679).

Moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención

Otro aspecto de la invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aísla" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas convencionales, que incluyen el tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la materia. Véase, Ausubel et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico para su uso en la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y pueden contener o no secuencias intrónicas. En una realización preferida, El ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos para su uso en la invención pueden obtenerse usando técnicas convencionales de biología molecular. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que llevan genes de inmunoglobulina humana como se describe más adelante), Los ADNc que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo producido por el hibridoma se pueden obtener mediante técnicas convencionales de amplificación por PCR o de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de presentación de fagos), un ácido nucleico que codifica tales anticuerpos puede recuperarse de la biblioteca de genes.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas para su uso en la invención son las que codifican las secuencias de Vh y V^lde los anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de V^hde 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 y 17E5 se muestran en las SEQ ID NO: 49-54, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de Vl de 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 y 17E5 se muestran en las SEQ ID NO: 55-60, respectivamente.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos de Vh y Vl, estos fragmentos de ADN pueden manipularse aún más mediante técnicas convencionales de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpos de longitud completa, a genes de fragmentos Fab o a un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica V^lo V^hestá operativamente unido a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresión "unido operativamente", tal como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.

El ADN aislado que codifica la región V^hse puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de la región constante de la cadena pesada humana son conocidas en la técnica (véase por ejemplo, Kabat et al. (1991), anteriormente citado) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo más preferentemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región V^lse puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica V^la otra molécula de ^aDⁿque codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de la región constante de la cadena ligera humana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat et al., citado anteriormente) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR convencional. En las realizaciones preferidas, la región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican V^hy V^lestán operativamente unidos a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal manera que las secuencias de V^hy V^lpueden expresarse como una proteína de cadena única contigua, con las regiones de V^ly V^hunidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Producción de anticuerpos monoclonales de la invención

Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente divulgación pueden producirse usando la técnica de hibridación de células somáticas (hibridoma) bien conocida de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Otras realizaciones para producir anticuerpos monoclonales incluyen la transformación vírica u oncogénica de linfocitos B y técnicas de presentación en fagos. Los anticuerpos quiméricos o humanizados también son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, la patentes de Estados Unidos N.° 4.816.567; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370.

En una realización preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el LAG-3 humano pueden generarse usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones mencionados en el presente documento como HuMAb Mouse® y KM Mouse®, respectivamente, y se denominan colectivamente en el presente documento "ratones de Ig humana".

El HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias humanas de inmunoglobulina de cadena pesada (|j y y) y ligera k no reorganizadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de las cadenas j y k (véase, por ejemplo, Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o k de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humana introducidos se someten a cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgGK humanos de alta afinidad (Lonberg et al. (1994), anteriormente citado; revisado en Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding y Lonberg (1995) Ann. NY Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y el uso del HuMAb Mouse®, y las modificaciones genómicas llevadas por tales ratones, se describe adicionalmente en Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véase, además, la patentes de Estados Unidos N.° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.770.429; y 5.545.807; las publicaciones de PCT N.° WO 92/03918; WO 93/12227; WO 94/25585; WO 97/13852; WO 98/24884; WO 99/45962 y WO 01/14424.

En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden generarse usando un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Este ratón se denomina en el presente documento "KM mouse®" y se describe en detalle en la publicación de PCT WO 02/43478. Una forma modificada de este ratón, que comprende además una alteración homocigótica del gen del receptor endógeno FcyRIIB, también se describe en la publicación de PCT WO 02/43478 y se hace referencia en el presente documento como un "ratón KM/FCGR2D®". Además, pueden usarse ratones con los transgenes de cadena pesada HCo7 o HCo12 o ambos.

Las realizaciones animales transgénicas adicionales incluyen el Xenomouse (Abgenix, Inc., la patentes de Estados Unidos N.° 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963). Otras realizaciones incluyen "ratones TC" (Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97:722-727) y vacas que llevan transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894; publicación de PCT WO 02/092812).

En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos anti-LAG-3 de la invención se preparan usando métodos de presentación en fagos para la selección sistemática en bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. N.° 5.223.409; 5.403.484; 5.571.698; 5.427.908; 5.580.717; 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; y 6.593.081.

Los anticuerpos monoclonales humanos anti-LAG-3 de la invención también se pueden preparar usando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunológicas humanas de modo que se pueda generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N.° 5.476.996 y 5.698.767.

En otra realización, los anticuerpos anti-LAG-3 humanos se preparan usando la presentación en fagos donde los fagos comprenden ácidos nucleicos que codifican anticuerpos generados en animales transgénicos previamente inmunizados con LAG-3. Preferentemente, el animal transgénico es un ratón HuMab, KM, o Kirin. Véase, en la patente de EE.UU. N.° 6.794.132.

Inmunización de ratones de Ig humana

Los ratones de Ig humana se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida de un antígeno LAG-3, proteína LAG-3 recombinante, o células que expresan una proteína LAG-3. Véase, por ejemplo, Lonberg et al. (1994), anteriormente citado; Fishwild et al. (1996), anteriormente citado; las Publicaciones de PCT WO 98/24884 o ^wO 01/14424. Preferentemente, los ratones de 6-16 semanas de vida se inmunizan con 5-50 jg de proteína LAG-3. Como alternativa, se usa una porción de LAG-3 fusionada a un polipéptido no de LAG-3.

Los ratones transgénicos pueden inmunizarse por vía intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV) con antígeno LAG-3 en adyuvante completo de Freund, seguido de posteriores inmunizaciones IP o IV con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Como alternativa, se usan adyuvantes distintos de Freund o células enteras en ausencia de adyuvante. El plasma puede seleccionarse mediante ELISA y las células de ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-LAG-3 pueden usarse para fusiones.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos anti-LAG-3 de la invención, los esplenocitos y/o las células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados pueden aislarse y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden seleccionarse para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. La generación de hibridomas es bien conocida en la materia. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York.

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales de la invención

Los anticuerpos de la invención también se pueden producir en un transfectoma de células hospedadoras usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). En una realización, El ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa obtenidas mediante técnicas estándar de biología molecular se inserta en uno o más vectores de expresión, de modo que los genes estén unidos operativamente a secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales. En este contexto, la expresión "unido operativamente" pretende referirse a que se liga un gen de anticuerpo en un vector, de tal forma que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector cumplen con su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo.

El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, c A (1990)). Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados del citomegalovirus (CMV), el virus del simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, se pueden usar secuencias reguladoras no víricas, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de p-globina. Más aún, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes orígenes, tales como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos T humanos tipo 1 (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). EL vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión empleada.

El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados. En las realizaciones preferidas, las regiones variables se usan para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera del isotipo deseado de modo que el segmento V^hestá operativamente unido al segmento o a los segmentos C^hdentro del vector y el segmento Vl está operativamente unido al segmento Cl dentro del vector. Adicionalmente, o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpos de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector, de tal forma que el péptido de señal se une en fase al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no de inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante para su uso en la invención, pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, Patentes de los EE.UU. N.° 4.399.216; 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, el gen marcador de selección confiere normalmente resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, a una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr- con selección/amplificación en metotrexato) y el gen neo (para selección en G418).

Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, se transfectan los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una gran variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras procariotas o eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferentemente células hospedadoras de mamífero, es la más preferida porque tales células eucariotas, y en particular células de mamíferos, son más propensas que las células procariotas a ensamblar y segregar un anticuerpo plegado e inmunológicamente activo.

Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, tal como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma ⁿS^o, células COS y células SP2. En particular, para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión génica GS desvelado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Caracterización de la unión de anticuerpos al antígeno

Los anticuerpos de la invención pueden probarse para la unión al LAG-3 humano mediante, por ejemplo, ELISA convencional. Las IgG humanas antiLAG-3 pueden analizarse adicionalmente para determinar la reactividad con un antígeno LAG-3 mediante análisis por transferencia de Western. La especificidad de unión de un anticuerpo de la invención también se puede determinar controlando la unión del anticuerpo a las células que expresan una proteína LAG-3, por ejemplo, citometría de flujo. Estos métodos son conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988), anteriormente citado.

Inmunoconjugados

Los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse con un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado tal como un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF). Los agentes terapéuticos adecuados incluyen anti metabolitos, agentes alquilantes, ligantes del surco menor del ADN, intercaladores de ADN, reticulantes de ^aDⁿ, inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de exportación nuclear, inhibidores del proteosoma, inhibidores de la topoisomerasa I o II, inhibidores de la proteína de choque térmico, inhibidores de tirosina quinasa, antibióticos y agentes antimitóticos. En el CAF, el anticuerpo y el agente terapéutico se conjugan preferentemente a través de un enlazador escindible tal como un peptidilo, disulfuro, o un enlazador de hidrazona. Más preferentemente, el enlazador es un enlazador de peptidilo tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 15), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser o Glu. Los CAF pueden prepararse tal como se describe en las Patentes de los Estados Unidos N.° 7.087.600; 6.989.452; y 7.129.261; las publicaciones de PCT N.° WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; y WO 08/103693; las publicaciones de patentes de EE. UU. 20060024317; 20060004081; y 20060247295.

Moléculas biespecíficas

En otro aspecto, la presente divulgación presenta moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-LAG-3 unido a al menos otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión diferentes o moléculas diana. Por consiguiente, tal como se usa en el presente documento, "molécula biespecífica" incluye moléculas que tienen tres o más especificidades. En una realización preferida, la molécula biespecífica comprende una primera especificidad de unión para LAG-3 y una segunda especificidad de unión para una molécula desencadenante que recluta células efectoras citotóxicas que pueden eliminar una célula diana que expresa LAG-3. Los ejemplos de moléculas desencadenantes adecuadas son CD64, CD89, CD16 y CD3. Véase, por ejemplo, Kufer et al., TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004).

En una realización, una molécula biespecífica tiene, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-LAG-3, una tercera especificidad. La tercera especificidad puede ser para un anti-factor de mejora (EF), por ejemplo, una molécula que se une a una proteína de superficie involucrada en la actividad citotóxica y por lo tanto aumenta la respuesta inmunológica contra la célula diana. Por ejemplo, el anti-factor de mejora puede unir un linfocito T citotóxico (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, o ICAM-1) u otra célula inmunológica, dando como resultado una mayor respuesta inmunológica contra la célula diana.

Las moléculas biespecíficas pueden venir en muchos formatos y tamaños diferentes. En un extremo del espectro de tamaños, una molécula biespecífica conserva el formato de anticuerpo tradicional, salvo que, en lugar de tener dos brazos de unión de idéntica especificidad, tiene dos brazos de unión, cada uno con una especificidad diferente. En el otro extremo están las moléculas biespecíficas que consisten en dos fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) unidos por una cadena peptídica, una construcción llamada Bs(scFv)2. Las moléculas biespecíficas intermedias incluyen dos fragmentos F(ab) diferentes unidos por un enlace de peptidilo. Las moléculas biespecíficas de estos y otros formatos pueden prepararse mediante diseño genético, hibridación somática, o métodos químicos. Véase, por ejemplo, Kufer et al, citado anteriormente; Cao y Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); y van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391 - 397 (2000), y las referencias citadas en esos documentos.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, y para el uso en los métodos de acuerdo con la invención, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente divulgación formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente puede contener uno o más principios farmacéuticamente activos adicionales, tales como otro anticuerpo o un fármaco. Las composiciones farmacéuticas para su uso en la invención también se pueden administrar en una terapia de combinación con, por ejemplo, otro agente inmunoestimulador, agente anticanceroso, un agente antivírico o una vacuna, de tal manera que el anticuerpo anti-LAG-3 mejora la respuesta inmunológica contra la vacuna.

La composición farmacéutica puede comprender cualquier número de excipientes. Los excipientes que se pueden usar incluyen vehículos, agentes tensioactivos, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinantes sólidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, solubilizantes, colorantes, agentes aromatizantes, recubrimientos, agentes disgregantes, lubricantes, edulcorantes, conservantes, agentes isotónicos y combinaciones de los mismos. La selección y el uso de excipientes adecuados se enseña en Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed. (Lippincott Williams y Wilkins 2003).

Preferentemente, una composición farmacéutica es adecuada para vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo puede estar revestido con un material para protegerlo de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivarlo. La frase "administración por vía parenteral" tal como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración oral y tópica, habitualmente mediante inyección e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión. Como alternativa, un anticuerpo de la invención se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos farmacéuticos para su uso en la invención pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y que no produce ningún efecto toxicológico indeseado. Ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos alifáticos mono- y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, W-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles. También se pueden formular en una microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco.

La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto a tratar y el modo particular de administración y generalmente será esa cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, del cien por ciento, esta cantidad variará desde aproximadamente el 0,0l % a aproximadamente el noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 70%, lo más preferentemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente el 30 % de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar en el tiempo varias dosis divididas, o la dosis se puede reducir proporcionalmente o aumentarse tal como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosificación unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico necesario. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente.

Para la administración del anticuerpo, la dosis varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, con el anticuerpo administrado usando una de las siguientes pautas de dosificación: (i) cada cuatro semanas por seis dosis, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpos en plasma de aproximadamente 1-1000 pg/ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 pg/ml.

Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención preferentemente da como resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido al padecimiento de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de sujetos con tumor, una "dosis terapéuticamente eficaz" inhibe preferentemente el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente el 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente el 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente el 60 %, y aún más preferentemente en al menos aproximadamente el 80 % en relación con sujetos no tratados. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o mejorar los síntomas en un sujeto, que es normalmente un humano o puede ser otro mamífero.

La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar a través de dispositivos médicos tales como (1) dispositivos de inyección hipodérmica sin aguja (por ejemplo, los documentos US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; y 4.596.556); (2) bombas de microinfusión (el documento US 4.487.603); (3) dispositivos transdérmicos (el documento US 4.486.194); (4) aparatos de infusión (los documentos US 4.447.233 y 4.447.224); y (5) dispositivos osmóticos (los documentos US 4.439.196 y 4.475.196).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención atraviesan la barrera hematoencefálica, pueden formularse en liposomas, que además puede comprender restos de direccionamiento para mejorar el transporte selectivo a células u órganos específicos. Véase, por ejemplo, los documentos US 4.522.811; 5.374.548; 5.416.016; y 5.399.331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen y Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; y Killion y Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y métodos de la invención

Los anticuerpos, las composiciones de anticuerpos y los métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades in vitro e in vivo que implican, por ejemplo, la detección de LAG-3 o la mejora de la respuesta inmunológica por bloqueo de LAG-3. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos humanos. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar la inmunidad en varias situaciones. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para modificar una respuesta inmunológica en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la invención de tal manera que se modifica la respuesta inmunológica en el sujeto. Preferentemente, se mejora la respuesta, se estimula o se regula positivamente.

Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que necesitan potenciar una respuesta inmunológica. Los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tienen un trastorno que puede tratarse aumentando la respuesta inmunológica (por ejemplo, la respuesta inmunológica mediada por linfocitos T). En una realización particular, los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento in vivo del cáncer. Para lograr una mejora de la inmunidad específica de antígeno, los anticuerpos anti-LAG-3 pueden administrarse junto con un antígeno de interés o el antígeno ya puede estar presente en el sujeto a tratar (por ejemplo, un sujeto portador de un tumor o un sujeto portador de un virus). Cuando los anticuerpos para LAG-3 se administran junto con otro agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o de manera simultánea.

Adicionalmente, en el presente documento se desvelan métodos para detectar la presencia de antígeno LAG-3 humano en una muestra, o medir la cantidad de antígeno LAG-3 humano, que comprende poner en contacto la muestra y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al LAG-3 humano, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o parte del mismo y el LAG-3 humano. Entonces se detecta la formación de un complejo, en donde una formación de complejo de diferencia entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno LAG-3 humano en la muestra. Además, los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención pueden usarse para purificar LAG-3 humano mediante purificación por inmunoafinidad.

Dada la capacidad de los anticuerpos anti-LAG-3 de la invención para inhibir la unión de LAG-3 a las moléculas de MHC de clase II y estimular las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno, en el presente documento se desvelan métodos de uso in vitro e in vivo de los anticuerpos de la invención para estimular, mejorar o regular positivamente las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para estimular una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno que comprende poner en contacto dichos linfocitos T con el anticuerpo de la invención de modo que se estimule una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno. Cualquier indicador adecuado de una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno puede usarse para medir la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno. Los ejemplos no limitantes de tales indicadores adecuados incluyen una mayor proliferación de linfocitos T en presencia del anticuerpo y/o aumentar la producción de citocinas en presencia del anticuerpo. En una realización preferida, se estimula la producción de interleucina-2 por el linfocito T específico de antígeno.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno) en un sujeto, que comprende administrar un anticuerpo de la invención al sujeto de tal manera que se estimule una respuesta inmunológica (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno) en el sujeto. En una realización preferida, el sujeto es un sujeto portador de tumor y se estimula una respuesta inmunológica contra el tumor. En otra realización preferida, el sujeto es un sujeto portador de virus y se estimula una respuesta inmunológica contra el virus.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo de la invención de modo que el crecimiento del tumor se inhiba en el sujeto. En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de tratamiento de infección vírica en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención de modo que la infección vírica se trate en el sujeto.

Estos y otros usos de la invención se analizan con más detalle a continuación.

Cáncer

El bloqueo de LAG-3 por anticuerpos puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-LAG-3 y/o a un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en el tratamiento in vivo de un sujeto, usando un anticuerpo anti-LAG-3 de tal manera que se inhibe el crecimiento de tumores cancerosos. Un anticuerpo anti-LAG-3 puede usarse solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, un anticuerpo anti-LAG-3 puede usarse junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos estándar contra el cáncer u otros anticuerpos, tal como se describe a continuación. Sin embargo, la invención reivindicada se refiere a un anticuerpo anti-LAG-3 y/o a un anticuerpo inmunoestimulador para su uso combinado en la estimulación de una respuesta inmunitaria y en el tratamiento del cáncer en un sujeto.

Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o a un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-LAG-3, o una porción de unión a antígeno del mismo. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano anti-LAG-3 (como cualquiera de los anticuerpos humanos anti-LAG-3 humanos descritos en el presente documento). Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-LAG-3 quimérico o humanizado.

Los cánceres preferidos cuyo crecimiento puede inhibirse usando los anticuerpos de la invención incluyen cánceres que normalmente responden a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, metastásico melanoma maligno), cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico). Adicionalmente, la invención incluye neoplasias refractarias o recurrentes cuyo crecimiento se puede inhibir usando los anticuerpos de la invención.

Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse usando los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, incluyendo el cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículos, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo aquellos inducidos por amianto, y combinaciones de dichos cánceres. La presente invención también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos, especialmente cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144).

Opcionalmente, los anticuerpos contra LAG-3 se pueden combinar con un agente inmunogénico, tales como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes (He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (tratado en detalle a continuación).

En humanos, algunos tumores han demostrado ser inmunogénicos, como los melanomas. Al aumentar el umbral de activación de los linfocitos T por el bloqueo de LAG-3, las respuestas tumorales en el hospedador se pueden activar.

Es probable que el bloqueo de LAG-3 sea más eficaz cuando se combina con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., Cancer Vaccines, Cap. 61, pág. 3023-3043 en DeVita et al. (eds.), 1997, Cáncer: Principles and Practice of Oncology, Quinta Edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que el GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 3539-43).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en diversos tumores ha conducido a la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que se originó el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos de tumor encontrados en el hospedador. El bloqueo de LAG-3 puede usarse junto con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor con el fin de generar una respuesta inmunitaria contra estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como antígenos propios y por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y en solo un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al. 1994) Science 266: 2011-2013). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario por diversos medios). El antígeno tumoral también puede ser "neo-antígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia proteica o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (HPV), virus de la hepatitis (VHB y VHC) y virus del herpes sarcoma de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico del tumor que puede usarse junto con el bloqueo de LAG-3 son las proteínas de choque térmico purificadas (HSP) aisladas del propio tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficientes en la administración a las células que presentan antígeno para provocar la inmunidad tumoral (Suot y Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).

Las células dendríticas (DC) son potentes células de presentación de antígeno que pueden usarse para preparar respuestas específicas de antígeno. Las DC pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos de proteínas y péptidos, así como con extractos de células tumorales (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las DC también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las DC también se han fusionado directamente a células tumorales con el propósito de inmunización (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunación, la inmunización DC puede combinarse eficazmente con el bloqueo de LAG-3 para activar respuestas antitumorales más potentes.

El bloqueo de LAG-3 también se puede combinar con tratamientos convencionales contra el cáncer. El bloqueo de LAG-3 puede combinarse efectivamente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutica administrado (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-LAG-3 en combinación con descarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-LAG-3 en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. La razón científica detrás del uso combinado del bloqueo de LAG-3 y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado la sinergia con el bloqueo de LAG-3 a través de la muerte celular son radiación, cirugía y privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con el bloqueo de LAG-3. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de células tumorales que pueden alimentar el antígeno tumoral en las rutas de presentación del antígeno hospedador.

Los anticuerpos de bloqueo de LAG-3 también se pueden usar en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor Fca o Fcy a las células tumorales (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar anticuerpos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado compuestos biespecíficos de anti-receptor Fc/anti-antígeno tumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas tumorales específicas. El grupo de linfocitos T de estas respuestas aumentará mediante el uso del bloqueo de LAG-3. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las DC mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospedador mediante una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen entre otras TGF-p (Kehrl, J. et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard y O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200) y ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363 1365). Los anticuerpos para cada una de estas entidades pueden usarse en combinación con anti-LAG-3 para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias tumorales por parte del hospedador.

Se pueden usar otros anticuerpos que activan la respuesta inmunitaria del hospedador en combinación con anti-LAG-3. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función DC y la presentación del antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad de los linfocitos T colaboradores (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) y se puede utilizar junto con los anticuerpos de LAG-3 (Ito et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). La activación de anticuerpos contra moléculas coestimuladoras de linfocitos T como CTLA-4 (por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.811.097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160 2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262 266) también pueden proporcionar niveles incrementados de la activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Mientras que la enfermedad del injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de injerto frente a tumor. El bloqueo de LAG-3 puede usarse para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados donantes.

También hay varios protocolos de tratamiento experimental que involucran la activación ex vivo y la expansión de linfocitos T específicos de antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores para estimular los linfocitos T específicos de antígeno contra el tumor (Greenberg y Riddell (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también se pueden usar para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como el CMV. La activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-LAG-3 puede aumentar la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

Enfermedades infecciosas

La invención también se refiere a un anticuerpo anti-LAG-3 y/o a un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en el tratamiento de pacientes que se han expuesto a toxinas o a patógenos particulares. Por consiguiente, otro aspecto de la invención proporciona anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, o una porción de unión a antígeno del mismo, de tal manera que el sujeto sea tratado de la enfermedad infecciosa. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano anti-LAG-3 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-LAG-3 humanos descritos en el presente documento). Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado.

Similar a su aplicación a los tumores como se ha analizado anteriormente, el bloqueo de LAG-3 mediado por anticuerpos se puede usar solo o como adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria contra patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los que actualmente no existe una vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero sin limitación, VIH, Hepatitis (A, B, y C), gripe, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. El bloqueo de LAG-3 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como el VIH que presentan antígenos alterados durante el transcurso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración de anti-LAG-3 humano, provocando así una fuerte respuesta de linfocitos T que no se amortigua por las señales negativas a través de LAG-3.

Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones tratables mediante métodos descritos en el presente documento incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), herpes virus (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, y c Mv , virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones tratables mediante procedimientos de la divulgación incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables mediante los métodos descritos en el presente documento incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables mediante los métodos descritos en el presente documento incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.

En todos los métodos anteriores, el bloqueo de LAG-3 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia tales como tratamiento con citocinas (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación de antígenos tumorales mejorada (véase, por ejemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).

Reacciones autoinmunitarias

Los anticuerpos anti-LAG-3 pueden provocar y amplificar respuestas autoinmunitarias. De hecho, la inducción de respuestas antitumorales usando células tumorales y vacunas peptídicas revela que muchas respuestas antitumorales implican antirreactividades (van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) anteriormente citado; Rosenberg y White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4). Por lo tanto, es posible considerar el uso del bloqueo anti-LAG-3 junto con diversas autoproteínas para diseñar protocolos de vacunación para generar eficazmente respuestas inmunitarias contra estas autoproteínas para el tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer implica la acumulación inapropiada de péptido Ap en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas de anticuerpos contra el amiloide son capaces de eliminar estos depósitos amiloides (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177).

Otras autoproteínas también pueden usarse como dianas tales como IgE para el tratamiento de alergia y asma, y TNFa para la artritis reumatoide. Finalmente, las respuestas de anticuerpos a varias hormonas pueden ser inducidas por el uso de anticuerpos anti-LAG-3. Para la anticoncepción se pueden utilizar respuestas de anticuerpos neutralizantes a hormonas reproductivas. La respuesta de anticuerpos neutralizantes a hormonas y otros factores solubles que se requieren para el crecimiento de tumores particulares también pueden considerarse como posibles dianas de vacunación.

Pueden usarse métodos análogos como se ha descrito anteriormente para el uso del anticuerpo anti-LAG-3 para la inducción de respuestas terapéuticas autoinmunitarias para tratar pacientes que tienen una acumulación inapropiada de otros auto-antígenos, tales como depósitos amiloides, incluyendo Ap en la enfermedad de Alzheimer, citocinas tales como TNFa e IgE.

Vacunas

Los anticuerpos anti-LAG-3 pueden usarse para estimular respuestas inmunológicas específicas de antígeno mediante la administración conjunta de un anticuerpo anti-LAG-3 con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). Por consiguiente, los anticuerpos anti-LAG-3 pueden usarse en un método para mejorar una respuesta inmunitaria para un antígeno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) un anticuerpo anti-LAG-3, o su porción de unión a antígeno, de forma que se mejora una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-LAG-3 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-LAG-3 humanos descritos en el presente documento). Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno vírico, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitativos de tales antígenos incluyen los analizados en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) analizados anteriormente, o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Las vías de administración adecuadas de las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas e inmunoconjugados multiespecíficos y biespecíficos) de la invención in vivo e in vitro son bien conocidos en la técnica y pueden ser seleccionados por los expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpos.

Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos anti-LAG-3 humanos de la invención pueden administrarse conjuntamente con uno u otros agentes terapéuticos más, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede estar unido al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después o simultáneamente con el agente o pueden coadministrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticancerosa, por ejemplo, radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino bleomicina sulfato, carmustina, clorambucilo, dacarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí solos, son solamente eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/ml de dosis una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa en forma de una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La administración conjunta de los anticuerpos anti-LAG-3 humanos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerígenos que operan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Dicha coadministración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las hará no reactivas con el anticuerpo.

También se desvelan en el presente documento kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la invención (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones para su uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno LAG-3 distinto del primer anticuerpo humano). Los kits incluyen normalmente una etiqueta que indica el uso pretendido del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit.

Terapia de combinación

La invención se refiere a terapia de combinación en la que un anticuerpo anti-LAG-3 se coadministra con uno o más anticuerpos adicionales que son eficaces para estimular las respuestas inmunológicas para así potenciar aún más, estimular o regular positivamente las respuestas inmunológicas en un sujeto. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para estimular una respuesta inmunológica en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-LAG-3 y uno o más anticuerpos inmunoestimuladores adicionales, es decir, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, de tal manera que se estimula una respuesta inmunológica en el sujeto, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o para estimular una respuesta antivírica. En una realización, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-1. En otra realización, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización más, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-CTLA-4. En una realización, el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo de la divulgación. Como alternativa, el anticuerpo anti-LAG-3 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado a partir de un mAb anti-LAG-3 de ratón). En otra realización, el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional (por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o anti-CTLA-4) es un anticuerpo humano. Como alternativa, el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado a partir de un anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o anti-CTLA-4 de ratón).

En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprende administrar un anticuerpo de LAG-3 y un anticuerpo de CTLA-4 a un sujeto. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-CTLA-4 se administra a una dosis subterapéutica, o ambos se administran a una dosis subterapéutica. En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti-LAG-3 y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4 a un sujeto. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 es el anticuerpo monoclonal de secuencia humana 10D1 (descrito en la publicación de PCT WO 01/14424) y el anticuerpo anti-LAG-3 es el anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 25F7, 26H10, 25E3, 11F2 o 17E5, descrito en el presente documento. Otros anticuerpos anti-CTLA-4 abarcados por los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, los divulgados en: WO 98/42752; WO 00/37504; la patente de EE.UU. N.° 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Resumen N.° 2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 se une al CTLA-4 humano con una K^dde 5 x 10'8 M o menor, se une al CTLA-4 humano con una K^dde 1 x 10'8 M o menor, se une al CTLA-4 humano con una K^dde 5 x 10'9 M o menor, o se une al CTLA-4 humano con una K^dde entre 1 x 10'8 M y 1 x 10'1° M o menor.

En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprende administrar un anticuerpo de LAG-3 y un anticuerpo de PD-1 a un sujeto. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-1 se administra a una dosis subterapéutica, o ambos se administran a una dosis subterapéutica. En otra realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti-LAG-3 y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-PD-1 a un sujeto. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 25F7 descrito en el presente documento. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 de secuencia humana incluyen 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 4A11, que se describen en la publicación de PCT WO 06/121168. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se une al PD-1 humano con una K^dde 5 x 10'8 M o menor, se une al PD-1 humano con una K^dde 1 x 10'8 M o menor, se une al PD-1 humano con una K^dde 5 x 10'9 M o menor, o se une al PD-1 humano con una K^dde entre 1 x 10'8 M y 1 x 10' 10 M o menor.

En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprende administrar el anticuerpo de LAG-3 y un anticuerpo de PD-L1 a un sujeto. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-L1 se administra a una dosis subterapéutica, o ambos se administran a una dosis subterapéutica. En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti-LAG-3 y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-PD-L1 a un sujeto. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5 descrito en el presente documento. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 de secuencia humana incluyen 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4, que se describen en la publicación de PCT WO 07/005874. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 se une al PD-L1 humano con una K^dde 5 x 10'8 M o menor, se une al PD-L1 humano con una K^dde 1 x 10'8 M o menor, se une al PD-L1 humano con una K^dde 5 x 10'9 M o menor, o se une al PD-L1 humano con una K^dde entre 1 x 10'8 M y 1 x 10' 10 M o menor.

El bloqueo de LAG-3 y de uno o más antígenos diana secundarios tales como CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 por anticuerpos, puede mejorar la respuesta inmunitaria con las células cancerosas en el paciente. Los cánceres cuyo crecimiento puede inhibirse usando los anticuerpos de la divulgación instantánea incluyen cánceres que normalmente responden a la inmunoterapia. Los ejemplos representativos de cánceres para el tratamiento con la terapia de combinación de la divulgación instantánea incluyen aquellos cánceres específicamente enumerados anteriormente en la discusión de la monoterapia con anticuerpos anti-LAG-3.

En determinadas realizaciones, la combinación de anticuerpos terapéuticos discutidos en el presente documento puede administrarse simultáneamente como una composición única en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o simultáneamente como composiciones separadas con cada anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la combinación de anticuerpos terapéuticos puede administrarse secuencialmente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-LAG-3 pueden administrarse secuencialmente, tales como el anticuerpo anti-CTLA-4 que se administra primero y el anticuerpo anti-LAG-3 segundo, o el anticuerpo anti-LAG-3 que se administra primero y el anticuerpo anti-CTLA-4 segundo. Adicionalmente, o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-LAG-3 pueden administrarse secuencialmente, tales como el anticuerpo anti-PD-1 que se administra primero y el anticuerpo anti-LAG-3 segundo, o el anticuerpo anti-LAG-3 que se administra primero y el anticuerpo anti-PD-1 segundo. Adicionalmente, o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-L1 y un anticuerpo anti-LAG-3 pueden administrarse secuencialmente, tales como el anticuerpo anti-PD-L1 que se administra primero y el anticuerpo anti-LAG-3 segundo, o el anticuerpo anti-LAG-3 que se administra primero y el anticuerpo anti-PD-L1 segundo.

Asimismo, si se administra secuencialmente más de una dosis de la terapia combinada, el orden de la administración secuencial puede invertirse o mantenerse en el mismo orden en cada punto temporal de administración, las administraciones secuenciales se pueden combinar con administraciones simultáneas o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-LAG-3 puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con anti-CTLA-4 primero y anti-LAG-3 segundo, y la tercera administración puede ser secuencial con anti-LAG-3 primero y anti-CTLA-4 segundo, etc. Adicionalmente, o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-LAG-3 puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con anti-PD-1 primero y anti-LAG-3 segundo, y la tercera administración puede ser secuencial con anti-LAG-3 primero y anti-PD-1 segundo, etc. Adicionalmente, o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-L1 y anticuerpo anti-LAG-3 puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con anti-PD-L1 primero y anti-LAG-3 segundo, y la tercera administración puede ser secuencial con anti-LAG-3 primero y anti-PD-L1 segundo, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede implicar una primera administración que es secuencial con anti-LAG-3 primero y anti-CTLA-4 (y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1) en segundo lugar, y las administraciones posteriores pueden ser simultáneas.

Opcionalmente, la combinación de anti-LAG-3 y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, los anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1) pueden combinarse adicionalmente con un agente inmunogénico, tales como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes (He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (tratado en detalle a continuación). Un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 puede combinarse adicionalmente con un protocolo de vacunación, tal como cualquiera de los protocolos de vacunación discutidos en detalle anteriormente con respecto a la monoterapia con anticuerpos anti-LAG-3.

Un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 también se puede combinar con tratamientos estándar contra el cáncer. Por ejemplo, un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, es posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la divulgación instantánea (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 en combinación con decarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo es una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado del bloqueo de LAG-3 y de CTLA-4 y/o de PD-1 y/o de PD-L1 con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden producir sinergia con un bloqueo combinado de LAG-3 y de CTLA-4 y/o de PD-1 y/o de PD-L1 a través de la muerte celular incluyen radiación, cirugía o privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con un bloqueo combinado de LAG-3 y de CTLA-4 y/o de PD-1 y/o de PD-L1. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de las células tumorales, que puede ser una fuente de antígeno tumoral alimentado en las vías de presentación del antígeno del hospedador.

También se puede usar una combinación de anticuerpos de bloqueo de LAG-3 y de CTLA-4 y/o de PD-1 y/o de PD-L1 en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor Fca o F^cya las células tumorales (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar anticuerpos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. El brazo de linfocitos T de estas respuestas se aumentaría mediante el uso de un bloqueo combinado de lAG-3 y de CTLA-4 y/o de PD-1 y/o de PD-L1.

En otro ejemplo, una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 se puede usar junto con anticuerpos antineoplásicos, tales como Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), Zevalin® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab), Avastin® (bevacizumab) y Tarceva® (erlotinib) y similares. A modo de ejemplo y sin querer estar ligados a la teoría, el tratamiento con un anticuerpo anticancerígeno o un anticuerpo anticancerígeno conjugado con una toxina puede llevar a la muerte de células cancerosas (por ejemplo, células tumorales) que potenciarían una respuesta inmunológica mediada por CTLA-4, PD-1, PD-L1 o LAG-3. En una realización ilustrativa, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor canceroso) puede incluir un anticuerpo anticanceroso en combinación con anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1, de manera simultánea o secuencial o cualquier combinación de los mismos, que puede potenciar una respuesta inmunológica antitumoral por parte del hospedador.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospedador mediante una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas, que se expresan por los tumores y que son inmunosupresores. Estos incluyen, entre otros, TGF-p (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163 : 1037-1050), IL-10 (Howard y O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200) y ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363 1365). En otro ejemplo, Los anticuerpos para cada una de estas entidades pueden combinarse adicionalmente con una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 para contrarrestar los efectos de los agentes inmunosupresores y favorecer respuestas inmunológicas antitumorales por parte del hospedador.

Otros anticuerpos que pueden usarse para activar la respuesta inmunológica del hospedador se pueden usar además en combinación con una combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función DC y la presentación del antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 (Ridge et al., citado anteriormente) puede usarse junto con una combinación de anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o de anti-PD-1 y/o de anti-PD-L1 (Ito et al. citado anteriormente). Otros anticuerpos activadores de las moléculas coestimuladoras de linfocitos T Weinberg et al., citado anteriormente, Melero et al., citado anteriormente, Hutloff et al., citado anteriormente) también pueden proporcionar mayores niveles de activación de linfocitos T.

Tal como se trató anteriormente, el trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. se puede usar un bloqueo combinado de LAG-3 y CTLA-4 y/o de PD-1 y/o de PD-L1 para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados por donante.

Varios protocolos de tratamiento experimental implican la activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos de antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores para linfocitos T específicos de antígeno contra tumor (Greenberg y Riddell, citado anteriormente). Estos métodos también se pueden usar para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como el CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de los anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 aumente la frecuencia y actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-LAG-3 y/o un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer) con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar el anticuerpo anti-LAG-3 y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 a un sujeto. Por ejemplo, la incidencia de colitis o diarrea inducida por anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores puede reducirse mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Debido a que cualquier paciente que recibirá un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador está en riesgo de desarrollar colitis o diarrea inducida por dicho anticuerpo, toda esta población de pacientes es adecuada para la terapia de acuerdo con los métodos de la presente invención. Aunque los esteroides se han administrado para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y prevenir exacerbaciones de la EII, no se han utilizado para prevenir (disminuir la incidencia de) EII en pacientes que no han sido diagnosticados con EII. Los efectos secundarios significativos asociados a los esteroides, incluso esteroides no absorbibles, han desalentado el uso profiláctico.

En realizaciones adicionales, una combinación del bloqueo de LAG-3 y CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 (es decir, los anticuerpos terapéuticos inmunoestimulantes anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o los anticuerpos anti-PD-1 y/o anti-PD-L1) pueden combinarse adicionalmente con el uso de cualquier esteroide no absorbible. Tal como se usa en el presente documento, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que presenta un metabolismo extenso de primer paso tal que, tras el metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, menos de aproximadamente el 20 %. En una realización de la invención, el esteroide no absorbible es budesonida. La budesonida es un glucocorticosteroide de acción local, que se metaboliza ampliamente, principalmente por el hígado, después de la administración oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesonida que depende del pH y del tiempo, desarrollada para optimizar la administración del fármaco al íleon y a todo el colon. ENTOCORT EC® está aprobado en los EE.UU. para el tratamiento de la enfermedad de Crohn leve a moderada que afecta al íleon y/o al colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORT EC® para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT EC® se libera en los intestinos antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa intestinal, ENTOCORT EC® se metaboliza ampliamente por el sistema del citocromo P450 en el hígado a metabolitos con actividad glucocorticoide insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (alrededor del 10 %). La baja biodisponibilidad de budesonida da como resultado una relación terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides con un metabolismo de primer paso menos extenso. La budesonida produce menos efectos adversos, incluyendo menos supresión hipotalámica-hipofisaria, que los corticosteroides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT EC® puede producir efectos sistémicos de glucocorticoides, tales como hipercorticismo y supresión suprarrenal. Véase PDR 58th ed. 2004; 608-610.

En otras realizaciones adicionales, una combinación de bloqueo de LAG-3 y CTLA-4 y/o de PD-1 y/o de PD-L1 (es decir, los anticuerpos terapéuticos inmunoestimulantes anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o los anticuerpos anti-PD-1 y/o anti-PD-L1) junto con un esteroide no absorbible pueden combinarse adicionalmente con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA tales como, por ejemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia y UpJohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia y Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

De acuerdo con los usos médicos de la presente invención, un salicilato administrado en combinación con los anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y un esteroide no absorbible puede incluir cualquier administración superpuesta o secuencial del salicilato y el esteroide no absorbible con el fin de disminuir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores. Por consiguiente, por ejemplo, los métodos para reducir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores de acuerdo con la presente invención incluyen la administración de un salicilato y un no absorbible simultáneamente o secuencialmente. (por ejemplo, se administra un salicilato 6 horas después de un esteroide no absorbible), o cualquier combinación de los mismos. Además, de acuerdo con la presente invención, un salicilato y un esteroide no absorbible pueden administrarse por la misma vía (por ejemplo, ambos se administran por vía oral) o por diferentes vías (por ejemplo, un salicilato se administra por vía oral y un esteroide no absorbible se administra por vía rectal), que pueden diferir de la(s) vía(s) utilizada(s) para administrar los anticuerpos anti-LAG-3 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra LAG-3

Los anticuerpos monoclonales humanos anti-LAG-3 se generaron usando ratones transgénicos que expresan genes de anticuerpos humanos, como se expone a continuación.

Antígenos

Las proteínas de fusión LAG-3 humanas recombinantes se usaron como inmunógeno para generar anticuerpos anti-LAG-3 humanos. En ciertas inmunizaciones, una proteína de fusión que comprende la región extracelular completa (dominios 1-4) de LAG-3 humano fusionado a un dominio Fc de inmunoglobulina humana (R&D Systems, n.° de catálogo 2319-L3) (D1-D4 hFc) o un dominio Fc de inmunoglobulina de ratón (D1-D4 mFc) se usó como inmunógeno. Para otras inmunizaciones, se utilizó como inmunógeno una proteína de fusión que comprende solo los dos primeros dominios extracelulares de LAG-3 humano fusionado a un dominio Fc de inmunoglobulina de ratón (D1-D2 mFc). Las proteínas de fusión LAG-3 se prepararon utilizando técnicas convencionales de ADN recombinante.

Cepas transgénicas transcromosómicas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™

Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos contra LAG-3 humano usando ratones de las cepas transcromosómicas transgénicas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™, que expresan genes de anticuerpos humanos.

En la cepa KM Mouse™, el gen endógeno de la cadena ligera kappa de ratón se ha alterado homocigóticamente tal como se describe en Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen endógeno de cadena pesada de ratón se ha alterado homocigóticamente tal como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación de PCT WO 01/09187. Asimismo, esta cepa de ratón lleva un transgén de cadena ligera kappa humana, KCo5, tal como se describe en Paulsen et al., citado anteriormente. La cepa también contiene el transcromosoma SC20, que lleva el locus de la cadena pesada de Ig humana, tal como se describe en la publicación PCT WO 02/43478. La cepa KM/FCGR2D Mouse ™ es la misma que la cepa KM Mouse™, excepto que su genoma también comprende una alteración homocigótica del gen endógeno F^cyRIIB. Las cepas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™ también se describen en detalle en la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos N.° 20020199213.

Inmunizaciones de KM Mouse ™ y KM/FCGR2D Mouse™:

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos contra LAG-3, los ratones de las cepas KM Mouse™ y KM/FCGR2D Mouse™ se inmunizaron con una de las tres proteínas de fusión recombinantes LAG-3 diferentes descritas anteriormente (D1-D4 hFc, D1-D4 mFc, D1-D2, mFc). Los esquemas generales de inmunización se describen en Lonberg. et al. (1994) citado anteriormente; Fishwild et al., citado anteriormente y la publicación de PCT WO 98/24884. Los ratones tenían 6-16 semanas de vida tras la primera infusión de antígeno. Los ratones fueron inmunizados por vía intraperitoneal (IP) y/o subcutánea (SC). Los ratones fueron inmunizados quincenalmente cuatro veces con 10 |jg de la proteína de fusión recombinante LAG-3, seguido de la inmunización dos veces con 20 |jg del mismo inmunógeno en Ribi como adyuvante. La respuesta inmunológica se controló mediante hemorragias retroorbitales. El plasma se analizó mediante ELISA (como se describe a continuación), y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-LAG-3 se usaron para las fusiones. Antes del sacrificio y la extracción de los bazos, los ratones recibieron un refuerzo por vía intravenosa e intraperitoneal de 20 jg de antígeno seguido de un posterior refuerzo intravenoso con 20 jg de antígeno.

Selección de ratones KM y KM/FCGR2D que producen anticuerpos anti-LAG-3

Para seleccionar ratones que producen anticuerpos que se unen a la proteína LAG-3, los sueros de ratones inmunizados con la proteína de fusión D1-D4 hFc se analizaron mediante un ELISA modificado como se describió originalmente por Fishwild et al. (1996). Brevemente, las placas de microtitulación se revistieron con proteína de fusión LAG-3 recombinante purificada a 1 jg/m l en PBS, 50 jl/pocillos incubados a 4 °C durante la noche, luego se bloqueó con 200 jl/pocillo de BSA en PBS al 5 %. Se agregaron diluciones de plasma de ratones inmunizados con LAG-3 a cada pocillo y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con un anticuerpo policlonal anti-cadena ligera kappa de humano en cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollaron con sustrato ABTS y se analizaron por espectrofotómetro a una DO de 405.

Para los ratones inmunizados con las proteínas de fusión D1-D4 mFc o D1-D2 mFc, los sueros de estos ratones se analizaron mediante ELISA indirecto utilizando anti-IgG de ratón en cabra para recubrir las placas durante una hora antes del recubrimiento con el antígeno para eliminar la unión inespecífica a la parte Fc del ratón. Luego se llevaron a cabo las mismas etapas de ELISA descritas anteriormente.

Los ratones que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-LAG-3 se usaron para fusiones. Las fusiones se realizaron tal como se describe a continuación y los sobrenadantes de hibridoma se analizaron para determinar la actividad anti-LAG-3 mediante ELISA.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para proteínas LAG-3

Los esplenocitos de ratón, aislados de los ratones KM o KM/FCGR2D, se fusionaron mediante electrofusión basada en un campo eléctrico utilizando un electroporador de fusión selectiva de cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD) a una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes fueron seleccionados para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Las suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionaron a un cuarto del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580). Las células se colocaron en placas a aproximadamente 1 x 105/pocillo en placa de microtitulación de fondo plano, seguido de aproximadamente dos semanas de incubación en medio selectivo que contiene suero de ternera fetal al 10 %, suplementado con origen (IGEN) en RPMI, L-glutamina, piruvato de sodio, HEPES, penicilina, estreptamicina, gentamicina, 1x HAT y p-mercaptoetanol. Después de 1-2 semanas, Las células se cultivaron en un medio en el que el HAT se reemplazó por HT. Luego, los pocillos individuales se seleccionaron mediante ELISA (descrito anteriormente) para detectar anticuerpos monoclonales IgG anti-LAG-3 humanos. Una vez que se produjo un crecimiento extenso de hibridoma, el medio se controló generalmente después de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos fueron reemplazados, seleccionados de nuevo y, si aún eran positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 se subclonaron al menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables se cultivaron in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpos en medio de cultivo tisular para una caracterización adicional.

Se seleccionaron los clones de hibridoma 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 para su posterior análisis y secuenciación.

Ejemplo 2: Caracterización estructural de anticuerpos monoclonales humanos anti-LAG-325F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5

Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los mAb expresados por los clones 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5, tal como se describe en el Ejemplo 1, se secuenciaron usando el siguiente protocolo. El ARN total se preparó a partir de 5 x 106 células de hibridoma usando el Mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). El ADNc se preparó mediante el protocolo 5'-RACE con el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) y la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las regiones V de cada anticuerpo se amplificaron usando un cebador 3' de región constante específico para humanos, junto con la mezcla de cebador 5' RACE. Los productos de PCR que contienen la región V se clonaron en el vector pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en la cepa TOP10 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se prepararon muestras de ADN Miniprep o Templiphi (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) y se sometieron a secuenciación de ADN (Sequetech, Mountain View, CA). Las secuencias de ADN resultantes se analizaron para reordenamientos dentro del marco y otras características de los anticuerpos. Las proteínas expresadas se caracterizaron mediante análisis químico convencional de proteínas. Se descubrió que los clones 25E3, 25F7 y 26H10 expresan un anticuerpo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera kappa de IgG1, mientras que se descubrió que los clones 8B7 y 17E5 expresaban un anticuerpo que comprendía una cadena pesada y una cadena ligera kappa de IgG4 y que el clon 11F2 expresaba un anticuerpo que comprendía una cadena pesada y una cadena ligera kappa de IgG2.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 25F7 se muestran en la Figura 1A y en la SEQ ID NO: 49 y 37, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera kappa de 25F7 se muestran en la Figura 1B y en la SEQ ID NO: 55 y 43, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 25F7 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas (Figura 7) mostró que la cadena pesada de 25F7 utiliza un segmento V^hde la línea germinal humana V^h4-34 (SEQ ID NO: 61), y un segmento JH de la línea germinal humana JH5b (SEQ ID NO: 62). El análisis adicional de la secuencia de V^hde 25F7 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 1A y en las SEQ ID NO: 1, 7 y 13, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 25F7 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas (Figura 8 ) mostró que la cadena ligera kappa de 25F7 utiliza un segmento V^kde la línea germinal humana V^kL6 (SEQ ID NO: 63) y un segmento J^kde la línea germinal humana JK 2 (SEQ ID NO: 64). El análisis adicional de la secuencia de Vk de 25F7 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 1B y en las SEQ ID NO: 19, 25 y 31, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 26H10 se muestran en la Figura 2A y en la SEQ ID NO: 50 y 38, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 26H10 se muestran en la Figura 2B y en la SEQ ID NO: 56 y 44, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 26H10 con la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida (Figura 9) mostró que la cadena pesada de 26H10 utiliza un segmento V^hde la línea germinal humana V^h3-33 (SEQ ID NO: 65), y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6 B (SEQ ID NO: 66 ). El análisis adicional de la secuencia de V^hde 26H10 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 2A y en las SEQ ID NO: 2, 8 y 14, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 26H10 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas (Figura 10) mostró que la cadena ligera kappa 26H10 utiliza un segmento Vk de la línea germinal humana V^kA27 (^sE^qID NO: 67) y un segmento J^kde la línea germinal humana JK 3 (SEQ ID NO: 68 ). El análisis adicional de la secuencia de V^kde 26H10 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 2B y en las SEQ ID NO: 20, 26 y 32, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 25E3 se muestran en la Figura 3A y en la SEQ ID NO: 51 y 39, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 25E3 se muestran en la Figura 3B y en la SEQ ID NO: 57 y 45, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 25E3 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas (Figura 11) mostró que la cadena pesada de 25E3 utiliza un segmento Vh de la línea germinal humana Vh 3-20 (SEQ ID NO: 69), y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b (SEQ ID NO: 70). El análisis adicional de la secuencia de Vh de 25E3 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 3A y en las SEQ ID NO: 3, 9 y GGY, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 25E3 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas (Figura 12) mostró que la cadena ligera kappa 25E3 utiliza un segmento Vk de la línea germinal humana Vk L18 (SEQ ID NO: 71) y un segmento Jk de la línea germinal humana JK 2 (SEQ ID NO: 64). El análisis adicional de la secuencia de V^kde 25E3 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 3B y en las SEQ ID NO: 21, 27 y 33, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 8B7 se muestran en la Figura 4A y en la SEQ ID NO: 52 y 40, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 8B7 se muestran en la Figura 4B y en la SEQ ID NO: 58 y 46, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 8B7 con la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida (Figura 13) mostró que la cadena pesada de 8B7 utiliza un segmento Vh de la línea germinal humana Vh 4-34 (SEQ ID NO: 61), y un segmento JH de la línea germinal humana JH 5B (SEQ ID NO: 62). El análisis adicional de la secuencia de Vh de 8B7 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 4A y en las SEQ ID NO: 4, 10 y 16, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 8B7 (Figura 14) con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas mostró que la cadena ligera de kappa 8B7 utiliza un segmento Vk de la línea germinal humana V^kL6 (SEQ ID NO: 63) y un segmento J^kde la línea germinal humana JK 4 (SEQ ID NO: 72). El análisis adicional de la secuencia de Vk de 26H10 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 4B y en las SEQ ID NO: 22, 28 y 34, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 11F2 se muestran en la Figura 5A y en la SEQ ID NO: 53 y 41, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 11F2 se muestran en la Figura 5B y en la SEQ ID NO: 59 y 47, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 11F2 con la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida (Figura 15) mostró que la cadena pesada de 11F2 utiliza un segmento Vh de la línea germinal humana Vh 1-24 (SEQ ID NO: 73), un segmento D de la línea germinal humana 2 15, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4B (SEQ ID NO: 70). El análisis adicional de la secuencia de V^hde 11F2 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 13A y en las SEQ ID NO: 5, 11 y 17, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 11F2 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas (Figura 16) mostró que la cadena ligera kappa 11F2 utiliza un segmento Vk de la línea germinal humana V^kL6 (SEQ ID NO: 63) y un segmento J^kde la línea germinal humana JK 1 (SEQ ID NO: 74). El análisis adicional de la secuencia de Vk de 11F2 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 5B y en las SEQ ID NO: 23, 29 y 35, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 17E5 se muestran en la Figura 6A y en la SEQ ID NO: 54 y 42, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 17E5 se muestran en la Figura 6 B y en la SEQ ID NO: 60 y 48, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 17E5 con la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida (Figura 17) mostró que la cadena pesada de 17E5 utiliza un segmento Vh de la línea germinal humana Vh 3-33 (SEQ ID NO: 65), un segmento D de la línea germinal humana 2 2, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4B (SEQ ID NO: 70). El análisis adicional de la secuencia de Vh de 17E5 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 6 A y en las SEQ ID NO: 6 , 12 y 18, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 17E5 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas (Figura 18) mostró que la cadena ligera kappa 17E5 utiliza un segmento Vk de la línea germinal humana V^kL6 (SEQ ID NO: 63) y un segmento J^kde la línea germinal humana JK 5 (SEQ ID NO: 75). El análisis adicional de la secuencia de Vk de 17E5 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 6 B y en las SEQ ID NO: 24, 30 y 36, respectivamente.

Las regiones variables 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 pueden convertirse en anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo deseado utilizando técnicas convencionales de ADN recombinante. Por ejemplo, el ADN que codifica las regiones Vh y Vl se puede clonar en un vector de expresión que lleva las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de modo que las regiones variables estén unidas operativamente a las regiones constantes. Como alternativa, se pueden usar vectores separados para la expresión de la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión adecuados para su uso en la creación de anticuerpos de longitud completa incluyen los vectores pIE descritos en la publicación de patente de EE.UU. N.° 20050153394.

Ejemplo 3 : Caracterización de las propiedades de unión de anticuerpos monoclonales de LAG-3

En este ejemplo, la citometría de flujo examinó la unión de los anticuerpos humanos anti-LAG-3 a LAG-3 de superficie celular (LAG-3 de humano, de mono y de ratón). Asimismo, la cinética de unión a LAG-3 se analizó mediante análisis BIACORE. Aún más, se realizó un mapeo adicional de epítopos usando un experimento de exploración de péptidos.

A. Estudios de citometría de flujo

1. Unión a LAG-3 humano en células CHO

Para probar la capacidad de los anticuerpos para unirse a la proteína LAG-3 de la superficie celular, los anticuerpos se incubaron con una línea celular CHO que se había transfectado para expresar LAG-3 humano en la superficie celular. Los anticuerpos monoclonales 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se diluyeron en serie con tampón PFAE frío a 1x (PBS a 1x FBS al 2 %, azida de sodio al 0,02 %, Na EDTA 2 mM). Durante la reacción de unión, se añadieron 50 |jl de solución de anticuerpo diluida a una suspensión celular de 50 j l que contenía 2 x 105 células y la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron después dos veces con tampón PFAE a 1x. Se añadió una dilución 1:100 de anticuerpo anti-cadena ligera kappa humana en cabra marcado con FITC (Bethyl Laboratories, Inc., N.° de cat. A80-115F) y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 4 °C, seguido de un lavado de dos veces con tampón frío PFAE a 1x. Tras el lavado final, se añadieron 150 j l de PFAE frío a 1x que contenía 10 jg/m l de yoduro de propidio (Roche Applied Science, N.° de Cat 1_348_639) a cada solución y se realizó un análisis de unión de anticuerpos mediante citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACScalibur (BD Bioscience).

Los resultados del análisis de citometría de flujo se resumen a continuación en la Tabla 1, que muestra la CE50 para la unión a LAG-3 humano en CHO, demostrando que 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 y 17E5 se unen eficazmente a LAG-3 humano en la superficie celular, con 25F7 con una CE50 aproximadamente 20 veces menor de 25E3 pero con una CE50 aproximadamente equivalente a la de 8B7 y 26H10. Los resultados de CE50 para 11F2 y 17E5 estuvieron en el mismo intervalo que para 25E3.

T l 1: ni n ni r ni-LA - ^ l l H x r n LA - h m no

2. Unión de linfocitos T CD4+ humanos activados

Para probar la capacidad de los anticuerpos para unirse al LAG-3 humano natural en la superficie de los linfocitos T humanos activados, los linfocitos T CD4+ restantes se aislaron de células mononucleares de sangre periférica purificada y se sometieron a tres días de estimulación con una combinación de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 fijados a perlas de poliestireno. Los anticuerpos monoclonales 25F7, 8B7 y 26H10 se diluyeron en serie con tampón PFAE frío a 1x (PBS a 1x FBS al 2 %, azida de sodio al 0,02 %, Na EDTA 2 mM). Durante la reacción de unión, Se mezclaron 50 pl de solución de anticuerpo diluida con 50 pl de anti-CD4 humano marcado con PE (BD Bioscience, n.° de cat. 555347). Los linfocitos T activados se procesaron mediante el mismo protocolo descrito anteriormente. El análisis de la unión del anticuerpo se realizó como se describió anteriormente.

Los resultados del análisis de citometría de flujo se resumen a continuación en la Tabla 2, que muestra la CE50 para la unión a los linfocitos T CD4+ humanos activados, lo que demuestra que los tres anticuerpos se unen de manera similar al LAG-3 humano de la superficie celular.

Ta l 2: ni n ni r ni-LA - linf i T D4+ h m n iv os

3. Unión al antígeno LAG-3 de mono

Para determinar si los anticuerpos anti-LAG-3 reaccionan de forma cruzada con el LAG-3 de mono, se clonó una secuencia de ADNc mediante RT-PCR a partir de una preparación de ADNc agrupado preparado mediante transcripción inversa de ARN a partir de una colección de muestras de tejido de mono rhesus y cinomolgo. La secuencia se amplificó primero del grupo de ADNc usando cebadores (cebador directo 5': 5Mcyn1408; 5'-atgtgggaggctcagttcctg-3 '(SEQ ID NO: 91) y cebador inverso 3': 3Mcyn1408a; 5'-gtcagagctgctccggctc-3' (Se Q ID NO: 92)) usando un sistema de amplificación por PCR rico en GC (Roche) y se clonó en un vector de clonación TOPO receptor (Invitrogen) para el análisis de secuencia. Los clones que coinciden con la secuencia de LAG-3 de mono rhesus de Genbank de referencia (N° de registro de Genbank Xm_001108923) se reamplificaron posteriormente a partir del ADN del vector de clonación TOPO utilizando un segundo conjunto de cebadores que incorporaron sitios de enzimas de restricción para la clonación direccional en un vector de expresión de células de mamífero.

El clon pa23-5 de LAG-3 de mono se aisló y se secuenció. La secuencia de mono aislada exhibió un 99,6% de identidad con la secuencia LAG-3 de mono rhesus de Genbank de referencia. En la Figura 19 se muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos del clon de ADNc pa23-3 (SEQ ID NO: 93) con el LAG-3 de mono rhesus (S^eQ ID NO: 94) de Genbank (número de registro XM_001108923). Las dos secuencias son idénticas, excepto por una diferencia de un aminoácido en la posición 419 (arginina en el clon pa23-5 frente a treonina en la secuencia de rhesus de Genbank) y basándose en esto se concluye que el clon de ADNc pa23-5 representa la secuencia del gen LAG-3 de rhesus.

El ADNc del clon pa23-5 se insertó en una construcción de expresión, que se transfectó en células en suspensión CHO-S por nucleofección (Amaxa). La expresión de LAG-3 de rhesus por clones resistentes a fármacos seleccionados y clasificados se verificó mediante análisis por FACS. Esta línea celular CHO clonal que sobreexpresa el LAG-3 de rhesus se usó en ensayos FACS similares a los descritos anteriormente para medir la reactividad cruzada de los anticuerpos a la proteína de mono. Brevemente, los anticuerpos monoclonales 25F7, 8B7 y 26H10 se diluyeron en serie con tampón PFAE frío a 1x (PBS a 1x FBS al 2 %, azida de sodio al 0,02 %, Na E^dTA 2 mM). Durante la reacción de unión, se añadieron 50 pl de solución de anticuerpo diluida a una suspensión celular de 50 pl que contenía 2 x 105 células y la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos. Las células fueron procesadas por el mismo protocolo descrito anteriormente. El análisis de la unión del anticuerpo se realizó como se describió anteriormente.

En un experimento independiente, se probó la unión de los anticuerpos al LAG-3 de mono cinomolgo usando linfocitos T activados de mono cinomolgo. La activación in vitro de estos linfocitos T de mono se logró mediante el tratamiento con anti-CD3/anti-CD28 de los linfocitos T mediante esencialmente el mismo protocolo descrito anteriormente para la activación in vitro de linfocitos T humanos, seguido por un análisis de citometría de flujo realizado como se describió anteriormente para la tinción de linfocitos T CD4+ humanos activados in vitro.

Los resultados de los análisis de citometría de flujo utilizando LAG-3 de rhesus en CHO y los linfocitos T activados de cinomolgo se resumen a continuación en la Tabla 3, que muestra CE50 para la unión a los dos tipos diferentes de células que expresan el LAG-3 de mono. Estos resultados mostraron que todos los anticuerpos se unen eficazmente tanto a LAG-3 en los linfocitos T activados de cinomolgo al LAG-3 de rhesus (SEQ ID NO: 93) transfectado en células CHO. Hay una jerarquía, sin embargo, de afinidades de unión, presentando el clon 26H10 la mayor afinidad, que es aproximadamente 2,5 y 6 veces mejor que la de los clones 8B7 y 25F7, respectivamente. La diferencia en la jerarquía de unión entre los dos tipos de células puede reflejar diferencias en la secuencia de aminoácidos entre las proteínas LAG-3 de rhesus y de cinomolgo.

T l : ni n ni r n i-LA - LA - m n

4. Unión al antígeno LAG-3 de ratón

Para determinar si los anticuerpos reaccionaron de forma cruzada con el LAG-3 de ratón, se realizaron estudios de citometría de flujo similares a los descritos anteriormente utilizando como línea diana una línea celular de hibridoma de linfocitos T de ratón (3A9) que se había transfectado para expresar LAG-3 de ratón en su superficie celular, seguido de análisis por FACS para detectar la unión de anticuerpos. Los resultados indicaron que, en contraste con un anticuerpo de control anti-LAG3 de ratón que mostró una fuerte tinción, ninguno de los anticuerpos humanos 25E3, 25F7, 8B7 o 26H10 presentó unión por encima de los niveles de fondo al LAG-3 de ratón en superficie celular, demostrando que ninguno de estos anticuerpos reacciona de forma cruzada con el LAG-3 de ratón.

B. Análisis BIACORE

BIAcore™ examinó la unión de los anticuerpos 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 y 17E5 a la proteína LAG-3 recombinante utilizando un método de captura. Los anticuerpos 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 y 17E5 fueron capturados cada uno usando anti-CH1, un anticuerpo reactivo que es específico para la región constante de cadena pesada 1 del anticuerpo humano (Zymed, Clon HP6045, conc. de solución madre de 1,0 mg/ml). El anti-CH1 fue recubierto en una microplaca CM5 (BR-1000-14, Research Grade) a alta densidad (9700-11500UR). El recubrimiento se realizó basándose en el procedimiento de inmovilización convencional recomendado por el fabricante. El anticuerpo purificado 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 o 17E5, con concentraciones que varían de 0,5-3 pg/ml, se capturó después en la superficie recubierta con anti-CHa a un caudal de 10 pl/min durante 1 minuto. Se inyectó una concentración única de proteína de fusión LAG-3 humana recombinante (20 nM) sobre el anticuerpo capturado durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 25 pg/ml. Se permitió que el antígeno se disociara durante 7,5 minutos. La superficie de la microplaca se regeneró después de cada ciclo con 25 pl de NaOH 25 mM seguido de 30 pl de lavado con HBS-EP. Los controles de isotipo se ejecutaron en la microplaca y los datos se usaron para restar la unión inespecífica. Todos los experimentos se llevaron a cabo en un instrumento de resonancia de plasmón superficial Biacore 3000, utilizando el programa informático BIAcore Control v 3.2. El análisis de los datos se realizó con el programa informático BiaEvaluation v3.2. Los resultados se muestran en la Tabla 4 siguiente. Los resultados de BIAcore para 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 y 17E5 confirman los resultados de la citometría de flujo de que los cinco anticuerpos son capaces de unirse con alta afinidad al LAG-3 humano.

Tabla 4: Cin i ni n l ni r ni-LA - l LA - h m n r ombinante

C. Mapeo de epítopos

En la proteína LAG-3, el primer dominio similar a inmunoglobulina de la región extracelular contiene un "bucle extra" expuesto que tiene la secuencia de aminoácidos: GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 79). Para examinar la unión de 25E3, 25F7, 8B7 y 26H10 a esta región de LAG-3, y mapear el epítopo unido por cada anticuerpo, se realizó un experimento de exploración de péptidos en esta región. Se preparó y se conjugó con biotina una serie de 10 péptidos superpuestos que se escanearon en toda la longitud de la secuencia de bucle adicional. Para el análisis ELISA, se utilizaron placas de microtitulación pre-recubiertas con estreptavidina (Sigma-Aldrich, N.° de Cat. M5432) para capturar los conjugados de péptidos de bucle biotinilados aplicados en un volumen de 100 pl a una concentración de 2 pg/ml y se incubaron 18 horas a 4 °C, después de lo cual las placas se lavaron 3 veces y se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 hora con tampón de bloqueo (PBS a 1x FBS al 10 %). A continuación, se aplicaron anticuerpos humanos anti-LAG-3 diluidos en serie 3 veces en tampón de bloqueo a partir de 10 pg/ml y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se lavaron tres veces. Para detectar el anticuerpo humano unido, se diluyó un anticuerpo anti-cadena ligera kappa humana en cabra conjugado con HRP (Bethyl Laboratories, n.° de cat. A80-115P) a 1 pg/ml en tampón de bloqueo y se aplicó a los pocillos de ensayo durante 1 hora seguido de tres lavados y aplicación de sustrato TMB (eBioscience, n.° de cat. 00-4201-56). Las lecturas de densidad óptica a una longitud de onda de 650 nm se realizaron en un espectrofotómetro Spectramax 340PC (Molecular Dynamics, Inc.). Los resultados del experimento de exploración de péptidos se resumen a continuación en la Tabla 5.

Basándose en estos resultados, se determinó que el anticuerpo 25E3 reconoció una región dentro del bucle extracelular que comprende la secuencia de aminoácidos PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76), mientras que el anticuerpo 25F7 reconoció una región dentro del bucle extra que comprende la secuencia de aminoácidos HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) y 8B7 parecía reconocer una región dentro del bucle extracelular que comprende la secuencia de aminoácidos PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). En contraste, no se pudo detectar la unión del péptido de bucle extra de longitud completa o cualquiera de los péptidos de exploración más cortos por el anticuerpo 26 H10.

Las regiones identificadas en este estudio están subrayadas en la secuencia de bucle adicional de longitud completa:

Por consiguiente, los resultados de la exploración de péptidos indican que los anticuerpos 25E3, 25F7 y 8B7 se unen a epítopos diferentes aunque estrechamente localizados dentro del LAG-3 humano.

Para examinar más a fondo la unión de estos anticuerpos a la región de péptido de bucle extra, se realizaron ensayos ELISA adicionales. En un ensayo ELISA que utiliza el péptido de bucle extra humano de longitud completa (SEQ ID NO: 79), se determinaron los valores CE50 para la unión de 25E3, 25F7 y 8B7. Adicionalmente, se realizó un ELISA de péptido similar usando la secuencia de péptido de bucle extra de longitud completa del LAG-3 de mono rhesus, que tiene la secuencia GPPAPAPGHPPAPGHRPAAP YSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 90) y se determinaron los valores de CE50 para la unión para 25F7 y 8B7. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 6. Los resultados confirman que los anticuerpos 25E3, 25F7 y 8B7 son capaces de reconocer la región peptídica de bucle extra de LAG-3 humano. Además, los anticuerpos 25F7 y 8B7 también se unen a la región peptídica de bucle extra de LAG-3 de rhesus, aunque menos bien en comparación con la secuencia humana, lo que puede deberse a la secuencia de especies divergentes en este polipéptido. Los resultados también confirman que el anticuerpo 26H10 no es capaz de reconocer el péptido de bucle adicional de LAG-3.

T l : ni n ni r ni-LA - i l xr LA - h m n rh

Ejemplo 4: Inhibición de la unión de LAG-3 a MHC de Clase II por mAb anti-LAG-3

Para probar la capacidad de los anticuerpos anti-LAG-3 para inhibir la unión de LAG-3 a las moléculas de MHC Clase II, se realizó un ensayo in vitro de unión en el que una proteína de fusión LAG-3, que comprende el dominio extracelular LAG-3 humano fusionado con Fc de ratón (hLAG-3-mIg), reaccionó con células Daudi, que expresan moléculas MHC de clase II humanas.

Para probar la inhibición de anticuerpos de la unión de LAG-3 a MHC Clase II, 25E3, 25F7, 8B7 y 26H10 se diluyeron en serie a partir de 20 pg/ml en tampón PFAE y a estas diluciones en serie se les añadió 1 pg/ml de proteína de fusión hLAG-3-mIg. Esta mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de añadir 2x105 células Daudi lavadas con PFAE a 1x. La mezcla se aplicó a células Daudi y se incubó a 4 °C durante 30 minutos. Las células se sedimentaron (tres minutos, a 400 xg), se lavaron una vez con tampón PFAE a 1x y se volvieron a sedimentar, y se detectó la unión de hLAG-3-mIg a las células Daudi usando un reactivo secundario anti-mIgG Fcy marcado con PE recombinante. El análisis de la unión de LAG-3-mIg se realizó con el citómetro de flujo FACScalibur (BD Bioscience). Los resultados se resumen en la Tabla 7 siguiente, que muestra los valores de CI50 en nM.

Tabla 7: Inhibición de la unión de LAG-3 a MHC de Clase II por anticuerpos anti-LAG-3

Los resultados demuestran que los cuatro anticuerpos son eficaces para inhibir la unión de LAG-3 a los anticuerpos MHC de Clase II, presentando 25F7, 8B7 y 26H10 valores de CI50 aproximadamente de 7 a 13 veces más bajos que los de 25E3.

Ejemplo 5: Estimulación de la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno por mAb anti-LAG-3

Para probar la capacidad de los anticuerpos anti-LAG-3 para estimular una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno, se usó un ensayo de estimulación del péptido con linfocitos T 3A9 (véase, por ejemplo, Workman et al. (2003) J. Immunol. 169:5392-5395; Workman et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:2255-2263).

En este ensayo, un hibridoma de linfocitos T de ratón, 3A9, específico para el péptido HEL48-62, se utilizó como el linfocito T de respuesta. El linfocito T 3A9 de respuesta se transdujo retrovíricamente para expresar LAG-3 humano o LAG-3 de ratón en su superficie celular. La célula presentadora de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) utilizada para presentar el péptido antigénico HEL48-62 para los linfocitos 3A9 fue la línea celular LK35.2 positiva para MHC de clase II de ratón. Estudios separados determinaron que una proteína de fusión LAG-3 humana era capaz de unirse a moléculas de MHC de clase II de ratón, validando así el uso de APC de ratón LK35.2 en este ensayo. La estimulación específica de antígeno de linfocitos 3A9 se indicó mediante la producción de interleucina-2 (IL-2), cuya secreción se midió mediante ELISA (kit OptEIA de ratón IL-2, BD Biosciences, n.° de cat 555148 según las recomendaciones del fabricante).

Expresión ectópica de LAG-3 humano o de ratón en los linfocitos T 3A9, en ausencia de cualquier anticuerpo, llevó a un efecto inhibitorio sobre las respuestas específicas de antígeno cuando los linfocitos T transfectados se incubaron con las APC LK35.2 que presentan el péptido antigénico HEL48-62, según lo indicado por un aumento en la cantidad de péptido antigénico necesario para estimular la producción de IL-2 por los linfocitos 3 A9 en comparación con el perfil de respuesta a la dosis del péptido de los linfocitos T 3A9 de control.

Para probar la estimulación de anticuerpos de la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno, las APC (2,5x104 células) se preincubaron primero con el péptido antigénico (200 nM) durante 30 minutos a 37 °C y los linfocitos T 3A9 (5,0x104 células que expresan mlAG-3, hLAG-3 o células de control) se preincubaron con un anticuerpo anti-hLAG-3 (25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2, 17E5), diluidos en serie en dilución triple de 25 pg/ml) durante 15 minutos a 37 °C. Los linfocitos T 3A9 se añadieron luego a las APC pulsadas con antígeno y el cultivo se incubó durante 24 horas a 37 °C. Los sobrenadantes se recolectaron y se midieron para la producción de IL-2 de ratón. Los resultados para los linfocitos T 3A9 que expresan LAG-3 humano se encuentran en la Tabla 8, que muestra los valores de CI50 en nM.

Tabla 8: Estimulació ticuerpos anti-LAG-3

Los resultados muestran que los anticuerpos 25F7, 8B7 y 26H10, y en menor medida 25E3, fueron capaces de estimular la producción de IL-2 en un ensayo de respuesta de linfocitos T específicos de antígeno, mientras que el anticuerpo 11F2 presentó una capacidad mínima para inhibir y el anticuerpo 17E5 no fue funcional en este ensayo. Ninguno de los anticuerpos alteró la producción de IL-2 medida por los linfocitos T de control 3A9 o los linfocitos T 3A9 transfectados con proteína LAG-3 de ratón, lo que demuestra la especificidad del efecto estimulante.

Ejemplo 6 : Inhibición del crecimiento tumoral por mAb anti-LAG-3, solo o en combinación

Para probar la capacidad del anticuerpo anti-LAG-3, solo o en combinación con otro anticuerpo inmunoestimulador, para inhibir el crecimiento de células tumorales in vivo, se utilizaron dos modelos diferentes de injerto tumoral de ratón singénico. El primer modelo utilizó células de fibrosarcoma SalN de murino. El segundo modelo utilizó la línea celular de cáncer de colon MC38 de murino.

En un primer experimento, los ratones (cepa A/J) se implantaron cada uno con 2 x 106 células de fibrosarcoma SalN el día 0 y las células tumorales se dejaron crecer durante siete días. El día 7, el día 10 y el día 12 después de la implantación, los ratones se trataron con 10 mg/kg de un mAb anti-LAG-3 solo (el mAb anti-LAG-3 de ratón en rata C9B7W; eBioscience, n.° de cat. 14-2231), un anticuerpo anti-PD-L1 solo (un mAb anti-PD-L1 de ratón 14D8), los anticuerpos anti-LAG-3 y anti-PD-L1 en combinación, o un anticuerpo de control de isotipo IgG1. El mAb 14D8 es un anticuerpo anti-PD-L1 de ratón en rata que se ha quimerizado para que contenga las regiones constantes de IgG1 y kappa de ratón.

Se midieron los volúmenes tumorales en los ratones durante más de 50 días después de la implantación y se determinaron los volúmenes tumorales medios y medianos. Se calculó la inhibición media del crecimiento tumoral (basándose en el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo IgG1 siendo el 0 % de inhibición). Los resultados para el día 24 después de la implantación se resumen a continuación en la Tabla 9:

Tabla 9: Inhi i i n m i l r imi n m r l n l m l umor Sa1N

Por consiguiente, el tratamiento solo con anticuerpo anti-LAG3 o solo con anticuerpo anti-PD-L1, dio como resultado la inhibición del crecimiento tumoral, mientras que la combinación de ambos anticuerpos condujo a una mayor inhibición del crecimiento tumoral. Con respecto a los grupos de tratamiento, al final del experimento, los resultados fueron que 4 de 10 ratones tratados con anti-LAG3 solo quedaron libres de tumores, mientras que solo 1 de cada 10 ratones tratados con el anticuerpo IgG1 de control quedó libre de tumores. De manera similar, 4 de 11 ratones tratados solo con anti-PD-L1 quedaron libres de tumor. El tratamiento de ratones con la combinación de anti-LAG3 y anti-PD-L1 dio como resultado que 9 de 10 ratones quedaran libres de tumor; el ratón restante no libre de tumor tuvo un tumor indolente que permaneció pequeño durante todo el estudio.

Dos estudios adicionales utilizaron ratones implantados con células de la línea celular de cáncer de colon MC38 de murino. En el primer experimento, los ratones C57B1/6 fueron implantados cada uno con 2 x 106 células MC38 en el día 0, y fueron tratados en el día 7, el día 10 y el día 12 después de la implantación con 200 pg/dosis de anti-LAG-3 solo (mAb C9B7W), anti-PD-1 solo (el mAb 4H2) o anti-LAG-3 y anti-PD-1 en combinación. Un anticuerpo IgG1 isotipo compatible, a 400 pg/dosis, se utilizó como control. El mAb 4H2 es un anticuerpo anti-PD-1 de ratón en rata que se ha quimerizado para que contenga las regiones constantes de IgG1 y kappa de ratón.

El volumen tumoral medio, el volumen tumoral mediano y el % de supervivencia se determinaron a los 80 días después de la implantación. Los resultados mostraron que la monoterapia con LAG-3 en este modelo tumoral (MC38) mostró poca o ninguna actividad para inhibir el crecimiento tumoral y ninguno de los ratones tratados sobrevivió a la duración del experimento. En contraste, la monoterapia anti-PD-1 mostró actividad significativa, con 4 de 10 ratones libres de tumor al final del experimento. Además, similar a los resultados con el modelo Sa1N, la terapia combinada de anti-LAG-3 más anti-PD-1 fue más efectiva que cualquier tratamiento solo, con 7 de 8 ratones libres de tumor al final del experimento.

En un segundo experimento con el modelo MC38, los ratones C57Bl/6 fueron implantados cada uno con 2 x 106 células MC38 en el día 0, y fueron tratados en el día 5, el día 8 y el día 11 después de la implantación con 200 pg/dosis de anticuerpo de prueba y/o 400 pg/dosis de anticuerpo IgG de control, como sigue: (i) un anticuerpo de control anti-IgG1; (ii) un mAb anti-LAG-3 (mAb C9B7W) junto con el IgG1 de control; (iii) un anticuerpo anti-PD-1 (4H2) junto con el IgG1 de control; (iv) un anticuerpo anti-CTLA-4 (el mAb anti-CTLA-4 de ratón 9D9) junto con el IgG1 de control; (v) el mAb anti-LAG-3 junto con el mAb anti-PD-1; o (vi) el mAb anti-LAG-3 junto con el mAb anti-CTLA-4. El mAb 9d 9 es un anticuerpo anti-CTLA-4 de ratón que se generó en un ratón en el que el CTLA-4 de ratón endógeno se había eliminado.

El volumen tumoral medio, el volumen tumoral mediano y el % de supervivencia se determinaron durante más de 100 días después de la implantación. Los resultados fueron similares al primer experimento en que la monoterapia con LAG-3 mostró poca o ninguna actividad en la inhibición del crecimiento del tumor MC38 y ninguno de los ratones tratados sobrevivió a la duración del experimento. La monoterapia con CTLA-4 también mostró poca o ninguna actividad en la inhibición del crecimiento tumoral de MC38 y ninguno de los ratones tratados sobrevivió a la duración del experimento. En contraste, la monoterapia anti-PD-1 nuevamente mostró una actividad significativa, con 4 de 10 ratones libres de tumor al final del experimento. Además, de nuevo la terapia combinada fue más efectiva que la monoterapia. Para los ratones tratados con la combinación de anti-LAG-3 y anti-CTLA-4, 3 de 10 ratones estaban libres de tumor al final del experimento y para los ratones tratados con la combinación de anti-LAG-3 y anti-PD-1, 8 de 10 ratones estaban libres de tumor al final del experimento.

Por consiguiente, los estudios in vivo de injerto tumoral descritos anteriormente demostraron que, para al menos ciertos modelos tumorales, el tratamiento con anticuerpos anti-LAG solo resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral in vivo. Asimismo, para múltiples modelos tumorales, la terapia de combinación del anticuerpo anti-LAG-3 junto con el anticuerpo anti-PD-1, el anticuerpo anti-PD-L1 o el anticuerpo anti-CTLA-4 dieron como resultado una actividad antitumoral aún mayor que la monoterapia sola.

Ejemplo 7: Promoción de la autoinmunidad en ratones NOD por inhibición por mAb anti-LAG-3

Para probar la capacidad del anticuerpo anti-LAG-3 para estimular una respuesta inmunológica, tal como lo indica el desarrollo de la autoinmunidad, se utilizó el modelo de diabetes en ratones NOD. Se sabe que los ratones NOD son propensos a desarrollar diabetes autoinmunitaria. Se puede seguir la progresión de la diabetes en ratones NOD hembra midiendo la glucosa en suero. Por consiguiente, se examinó el efecto del tratamiento anti-LAG-3, solo o en combinación con anticuerpos inmunoestimuladores, sobre el desarrollo de diabetes en ratones hembra NOD.

Se trataron ratones hembra NOD el día 0, el día 2 y el día 5 con 250 pg/dosis de: (i) un anticuerpo de control de isotipo IgG1; (ii) mAb anti-LAG-3 solo (mAb C9B7W); (iii) mAb anti-PD-1 solo (mAb 4H2); (iv) mAb anti-CTLA-4 solo (mAb 9D9); (v) mAb anti-LAG-3 junto con mAb anti-PD-1; o (vi) mAb anti-LAG-3 junto con anti-CTLA-4. Los resultados demostrados con el tratamiento anti-LAG-3 solo o con el tratamiento anti-PD-1 solo (pero no con el tratamiento anti CTLA-4 solo) aumentaron el número de ratones que se convirtieron al fenotipo diabético. Además, el tratamiento combinado de anti-LAG-3 más anti-PD-1, o anti-LAG-3 más anti-CTLA-4, fue aún más eficaz en la conversión de ratones al fenotipo diabético.

Por consiguiente, estos resultados demuestran que el bloqueo de la interacción de LAG-3 con su receptor interfirió con una señal inmunorreguladora negativa que permitió una mayor actividad inmunológica en los ratones NOD, y esta mayor actividad inmunológica en los ratones tratados con LAG-3 podría mejorarse mediante el tratamiento combinado con anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4.

Ejemplo 8: Inmunohistoquímica utilizando mAb anti-LAG-3

En este experimento, se usaron anticuerpos humanos anti-LAG-3 marcados con fluorescencia en experimentos de inmunohistoquímica. Se utilizaron los siguientes anticuerpos humanos anti-LAG-3 marcados con FITC: 25F7-FITC (F:P = 2,9; versión de IgG1); 25F7-G4-FITC (F:P = 2,7; versión de IgG4); 8B7-FITC (F:P = 2,6) y 26H10-FITC (F:P = 3,4). Se examinó un panel de tejidos linfoides, específicamente amígdalas (dos muestras), bazo (dos muestras) y timo (dos muestras), junto con tejido hipofisario (cuatro muestras). Las células CHO transfectadas con LAG-3 también se usaron como control. Se utilizaron secciones de criostato fijadas con acetona. Las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-LAG-3 marcado con FITC (0,2-5 |jg/ml), seguido de tinción con un anticuerpo anti-FITC de conejo como anticuerpo puente y luego se visualizaron usando el Kit de sistema EnVision™+ de conejo (Dako USA, Carpinteria, CA). Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 10.

T l 1 : Inm n hi ími iliz n mA An i-LA -

Como cabía esperar, la expresión de LAG-3 se detectó en el panel de tejido linfoide. Adicionalmente, dos de los tres anticuerpos anti-LAG-3 examinados, 25F7 (versiones IgG1 e IgG4) y 26H10, presentaron retención en el tejido hipofisario, mientras que un anticuerpo examinado, 8B7, no mostró esta retención en el tejido hipofisario. Por consiguiente, el experimento de inmunohistoquímica identificó dos subconjuntos de anticuerpos anti-LAG-3, en donde un subconjunto se retiene en el tejido hipofisario y el otro subconjunto no se retiene en el tejido hipofisario.

RESUMEN DEL LISTADO DE SECUENCIAS

Claims

R E IV IN D IC A C IO N E S

1. Un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo inmunoestimulador adicional, para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3 y el anticuerpo inmunoestimulador adicional, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

2. Un anticuerpo anti-LAG-3 para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo inmunoestimulador adicional, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti CTLA-4.

3. Un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo inmunoestimulador además de un anticuerpo anti-LAG-3 y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti CTLA-4.

4. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la respuesta inmunitaria es una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno.

5. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la respuesta inmunitaria es contra un tumor.

6. Un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo inmunoestimulador adicional, para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3 y el anticuerpo inmunoestimulador adicional, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

7. Un anticuerpo anti-LAG-3 para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo inmunoestimulador adicional, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

8. Un anticuerpo inmunoestimulador para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo inmunoestimulador además de un anticuerpo anti-LAG-3, y en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-CTLA-4.

9. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el cáncer es un cáncer metastásico.

10. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el cáncer es una neoplasia refractaria o recurrente.

11. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el cáncer es melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), cáncer renal (p. ej., carcinoma de células claras), cáncer de próstata (p. ej., adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), cáncer de mama, cáncer de colon o cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón no microcítico).

12. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde el cáncer es melanoma maligno cutáneo o intraocular.

13. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 tiene la capacidad de inhibir la unión de LAG-3 con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II.

14. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 tiene la capacidad de estimular la producción de interleucina-2 (IL-2) en una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno.

15. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.

16. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 es un isotipo IgG4.

17. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.

18. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-1.

19. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-PD-L1.

20. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el anticuerpo inmunoestimulador adicional es un anticuerpo anti-CTLA-4.

21. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 se coadministra con el anticuerpo inmunoestimulador adicional.

22. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 y el anticuerpo inmunoestimulador adicional se administran simultáneamente como una composición única en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o simultáneamente como composiciones separadas con cada anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 y el anticuerpo inmunoestimulador adicional se administran secuencialmente.

24. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, que comprende además administrar un agente quimioterapéutico.

25. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, que comprende además radiación, cirugía o privación de hormonas.

26. El anticuerpo anti-LAG-3 y/o el anticuerpo inmunoestimulador para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, que comprende además administrar un inhibidor de la angiogénesis.